NO305685B2 - Ekkogene partikler, fremgangsmate for fremstilling av slike, anvendelser derav, diagnostikum eller terapeutikum inneholdende partiklene samt fremstilling derav. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører ekkogene partikler inneholdende gass og et formgivende stoff, hvorved overflaten av partiklene er i det vesentlige glatt og formen inneholder ingen eller 1 til 10 konkave overflatesegmenter eller overflaten er ikke glatt og inneholder 1 til 10 konkave overflatesegmenter og som kan passere lungen i blodkretsløpet og anvendelse derav, spesielt som diagnostika og terapeutika. Dessuten angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av nevnte ekkogene partikler.

Ultralydsdiagnostikken har funnet meget bred anvendelse innen medisinen på grunn av den komplikasjonsløse, enkle håndteringen. Ultralydsbølger reflekteres ved grenseflatene mellom forskjellige vevsarter. De derved dannede ekkosignalene forsterkes elektronisk og synliggjøres.

Synliggjørelsen av blodkar og indre organer ved hjelp av ultralyd tillater generelt ikke synliggjørelsen av den deri tilstedeværende blodstrømmen. Væsker, spesielt blod, gir bare ultalydskontrast når det består tetthetsforskjeller til omgivelsene. Som kontrastmiddel anvendes innen den medisinske ultralydsdiagnostikken for eksempel stoffer som inneholder gasser eller produserer gasser, idet impedansforskj ellen mellom gass og omgivende blod er vesentlig større enn den mellom væsker eller faste legemer og blod (LevineR.A., J. Am. Coll. Cardiol 3: 28, 1989; Machi, i.J. CU 11:3, 1983).

I litteraturen er det kjent flere fremgangsmåter for fremstilling og stabilisering av gassblærer. I US-patent 4.276.885 beskrives fremstillingen av gassblærer med definert størrelse, som er omgitt av en gelatinomhylling som beskytter gassblærene mot sammenflytning. Oppbevaringen av de ferdige gassblærene kan bare foregå i nedfrossen tilstand, hvorved gassblærene for anvendelse igjen må bringes til kroppstemperatur.

EP-A2-0 123 235 og 0 122 624 beskriver gasser inneholdende ultralyd-kontrastmiddel som består av blandinger av grenseflateaktive stoffer med et fast stoff i en flytende bærer. Ultralyd-kontrastmidlet fremstilles ved en omstendelig maleprosess med en luftstrålemølle. De derved oppnådde partiklene har bare en begrenset bruksvarighet fordi de raskt mister de innesluttede gassene.

EP-A2-0 224 934 beskriver ultralyd-kontrastmiddel i form av gassfylte gelatin- eller albuminhullegemer. En ulempe er imidlertid anvendelsen av kroppsfremmede eller denaturerte kroppsegne proteiner, på grunn av den dermed forbundne allergene risikoen. Til grunn for foreliggende oppfinnelse ligger den oppgave å finne ekkogene partikler som reflekterer, absorberer, diffrakterer, henholdsvis sprer, ultralydbølger og følgelig gir en tydelig kontrast til omgivende vev, som er så små og stabile at de uten vesentlig gasstap og i det vesentlige kvantitativt når det venstre hjertekammeret etter intravenøs tilførsel og som lar seg fremstille raskt og enkelt.

Det er funnet at kvaliteten av ekkogene partikler spesielt avhenger av formen og overflatene av disse partiklene. Det viste seg at de ekkogene partiklene med konkave overflatesegmenter vesentlig bedre kan passere lungen i blodkretsløpet og bevirke en høyere kontrast i ultralyd. Disse ekkogene partiklene har en luft-vanngrenseflate hvis spredningstverrsnitt ved ultralydsundersøkelser er meget høy. Ekkogene partikler med i det vesentlige glatt overflate kan passere lungene av virveltyper i blodkretsløpet uten at partiklene utfiltreres i stor grad.

Oppfinnelsen vedrører således ekkogene partikler, inneholdende en gass og et formgivende stoff eller en stoffblanding som er biologisk nedbrytbar og/eller utskillbar og som i blodkretsløpet hos virveldyr kan passere lungen, kjennetegnet ved at (a) overflaten av de ekkogene partiklene er i alt vesentlig glatt og formen av de ekkogene partikler inneholder ingen eller 1 til 10 konkave overflatesegmenter eller overflaten av de ekkogene partiklene er ikke-glatt og formen av de ekkogene partiklene inneholder 1 til 10 konkave overflatesegmenter, og at (b) den maksimale innbøyningen av det konkave overflatesegmentet utgjør fra 30 til 90% av det minste partikkeltverrsnittet og at 10 til 60% av de ekkogene partiklene oppviser minst ett konkavt overflatesegment pr. partikkel.

Foretrukne trekk ved de ekkogene partikler ifølge oppfinnelsen fremgår fra de medfølgende krav 2 -11 og som angitt detaljert nedenfor i beskrivelsen.

Ekkogene partikler er partikler med en diameter som ved 90% av partiklene når fra 0,1 fim til 20 um, fortrinnsvis fra 0,2 um til 7 um, spesielt fra 0,5 um til 3 um. Disse partiklene er videre i stand til å reflektere, absorbere, diffraktere henholdsvis spre lydbølger.

Med konkave overflatesegmenter av en ekkogen partikkel menes en partikkel som minst oppviser en innoverbuet overflate. Til partiklene ifølge oppfinnelsen hører partikler med en maksimal innbøyning av det konkave overflatesegmentet på fra 30 til 90%, spesielt 50 til 90%, av det minste partikkeltverrsnitt. Et videre kjennetegn er at 10 til 60%, spesielt 30 til 40%, av de ekkogene partikler oppviser minst ett konkavt overflatesegment pr. partikkel.

Antallet konkave overflatesegmenter når fra 1 til 10, fortrinnsvis 1 til 5, spesielt 1 til 3.

Partiklene kan også oppvise en glatt overflate. Med en i det vesentlige glatt overflate av en ekkogen partikkel menes overflater som ved en 10.000 gangers forstørrelse ikke lar erkjenne noen strukturforskjeller på overflaten, dvs. forstyrrelser på overflaten av denne partikkelen som opphøyninger eller fordypninger har i det vesentlige mindre enn 100 nm avstand fra den midlere overflaten av partikkelen, spesielt 90 til 50 nm, fortrinnsvis 60 til 80 nm. Den midlere partikkeloverflaten fremgår fra gjennomsnittet av forhøyningene og fordypningene på overflaten. Til forstyrrelsene på overflaten hører forandringer av den homogene overflaten som i det elektronmikroskopiske bildet ser ut som forhøyelser, broer, forkastninger, trappe-, trinn-, skjell- eller sjiktformig oppbygning av overflaten samt hull, fordypninger eller porer i overflatene.

Egenskapen ved partikkelen ifølge oppfinnelsen at den kan passere lungen av virveldyr i blodkretsløpet fastslås eksempelvis ved at den ekkogene partikkelen under sterile betingelser injiseres i en perifer vene av et forsøksdyr. Et ultralydshode av en ultralydsinnretning holdes på thoraks hos forsøksdyret slik at det oppnås et typisk tverrsnitt gjennom det høyre og venstre hjertekammeret. Så snart ultralyd-kontrastmidlet når det høyre hjertekammer, kan man på monitoren av ultralydsinnretningen fastslå hvordan det ved kontrastmidlet merkede blodet når det høyre forkammeret, deretter den høyre ventrikkelen og til slutt forlater hjertet igjen via pulmonalarterien. Etter lungepassasjen observeres i det venstre hjertekammeret en signifikant kontrastøkning ved hjelp av kontrastmidlet.

Deri ekkogene partikkelen inneholder gass, eksempelvis luft, nitrogen, edelgass som helium, neon, argon eller krypton, hydrogen, karbondioksyd, oksygen eller blandinger derav. Den ekkogene partikkelen fylles med gass eksempelvis ved at partikkelen lagres i en tilsvarende gassatmosfære eller ved spraytørkingen direkte ved fremstillingen utvinnes den i en tilsvarende gassatmosfære.

Under formgivende stoffer eller stoffblandinger forstås alle forbindelser hvormed man kan fremstille partikler som inneholder minst et konkavt overflatesegment. Hertil hører eksempelvis naturlig forekommende polymerer eller syntetisk fremstillbare polymerer, lipider som i vandige oppløsninger danner miceller eller lavmolekylære aminosyrer, fett

eller karbohydrater.

Under biologisk nedbrytbart og/eller utskillbart formgivende stoff eller stoffblanding forstås stoffer som i legemet av dyr, mennesker eller planter omdannes til utoksiske nedbrytningsprodukter eller utskilles. Nedbrytningen kan foregå enzymatisk, hydrolytisk eller ved delvis eller fullstendig oppløsning av stoffene eller dekomponering av partikkelen i mindre underenheter i vann. Utskillelsen av nedbrytningsproduktene foregår via nyre, hud, lunge eller tarm. Når stoffene helt eller delvis går i oppløsning i vann eller ikke nedbrytes, eksempelvis ved lavmolekylære karbohydrater, foregår utskillelsen uten nedbrytning via nyrene.

Formgivende stoffer eller stoffblandinger, som er biologisk nedbrytbare og/eller utskillbare, velges fra følgende gruppe: polyester, av a-, 13-, y- eller s-hydroksykarboksylsyre, eksempelvis poly-s- kaprolakton, polyhydroksysmørsyre, polymelkesyre eller

polyhydroksyvaleriansyre,

kopolymerer av de ovenfor nevnte polyesterne med hverandre eller med

polyglykolsyre,

polykondensater som inneholder 2,3-O-alkylidenvinsyre, 2,3-O-alkyliden-L-treitol, furo-[2,5]-grupper eller tereftalater,

polyaminodikarbok-

sylsyre-koimider som polysuccinimid-ko-a,B-(butyloksykarbonyl-propionyloksyetyl)-D,L-aspartamid,

polyaminosyrer som polyglutaminsyre, polyasparaginsyre eller polylysin, som reagerer basisk eller surt i vandig oppløsning, samt deres

derivater,

polyamider eksempelvis polylysinmetylesterfumarsyre-ko-glutaramid eller

polyhydroksyetylaspartamid,

polyortoester,

polyanhydrider for eksempel slike som er sammensatt av sebacinsyre og bis(p-karboksyfenoksy)propan,

gelatin for eksempel hydrofobt modifisert,

albuminer for eksempel okseserumalbumin,

polysakkarider for eksempel dekstraner, stivelse eller basiske eller sure derivater derav,

polymetylenmalonat,

sukker for eksempel glukose, galaktose, laktose eller sakkarose, fettsyrer med 8 til 20 karbonatomer,

aminosyrer som proteinogene aminosyrer og deres hydrofobe derivater, alkoholer med 12 til 20 karbonatomer eller

lipider som fosfolipider.

Spesielt foretrukket inneholder de ekkogene partiklene ifølge oppfinnelsen biologisk nedbrytbare og/eller utskillbare polymerer fra følgende gruppe: polyamider, polykondensater, polyhydroksysmørsyre eller polyaminodikarboksylsyre-ko-imider.

De ovenfor nevnte formgivende stoffene eller stoffblandingene kan fremstilles ved fremgangsmåter kjent fra litteraturen (OEP-0.327.490; EP-0.398.935; EP-0.458.079; EP-0.123.235; EP-0.224.934, EP-0.245.840, M. Bomstein et al., Die Pharmazie, 49, hefte 9, 1989, s. 585 ff,; J.W. Freytag, J. Microencapsulation, 2, hefte 1, 1985, s. 31-38; Y. Kawashima et al., J. Pharmaceutical Sciences, 81, hefte 2,1992, s. 135 ff., EP-0.077.752, EP-0.131.540).

De ovenfor nevnte polykondensatene inneholder i det vesentlige minst 95 mol-% av gjentagende strukturenheter med formel I

hvor Ri står for

a) forbindelse med formel II

hvor R<5> og R<6> betyr inerte rester,

b) rettkjedet eller forgrenet alkyl, alkenyl, cykloalkyl eller cykloalkenyl, som kan være

substituert med en eller flere inerte rester,

c) aryl, en- eller flerkjernede, enkelt- eller flersubstituert med inerte rester,

d) forbindelser med formel V

e) heterocyklisk rest, som kan være en- eller flerkjemet og kan være enkelt eller

flersubstituert med inerte rester,

hvor X står for

a) -O-,

b) - NH - eller

c) - S -,

hvor R<2> står for

a) forbindelse med formel III

hvor R<5> og R<6> har den ovenfor angitte betydningen,

b) rettkjedet eller forgrenet alkyl, alkenyl, cykloalkyl eller cykloalkenyl, som kan være substituert med en eller flere inerte rester,

c) en- eller flerkjemet aryl, enkelt- eller flersubstituert med inerte rester,

d) heterocyklisk rest som kan være en- eller flerkjemet og enkelt- eller flersubstituert med inerte rester, eller

d) forbindelse med formel VI

hvor R.<5> og R<5> har den ovenfor angitte betydningen,

under den forutsetning at mer enn 50 mol-% av restene R^ og/eller R^ er tilstede i polykondensatet med formel I, hvor Ri står for en forbindelse med formel II og/eller R^ for en forbindelse med formel III, eller at mer enn 5 mol-% av restene Ri og R^ er tilstede i polykondensatet med formel I, hvor a) Ri står for en forbindelse med formel V og R^ for en forbindelse med formel VI, eller

b) R<1> står for fenyl[ 1,2], fenyl[ 1,3] eller fenyl[ 1,4] og

R<2> står for en forbindelse med formel VI.

Under begrepet "inerte rester" forstås substituenter som ikke reagerer med hverandre under fremstillings- og bearbeidelsesbetingelsene for polykondensatene ifølge oppfinnelsen eller som ved hjelp av beskyttelsesgrupper forhindres i å reagere med hverandre. Inerte rester kan eksempelvis være uorganiske rester som halogen, eller det kan dreie seg om organiske rester som alkyl, alkenyl, cykloalkyl, cykloalkenyl, alkoksy eller dialkylaminoalkyl.

Funksjonelle grupper som ved hjelp av beskyttelsesgrupper forhindres fra å delta i reaksjonen, er eksempelvis amino eller hydroksy.

Kjente beskyttelsesgrupper er for eksempel benzyloksy- eller fenylsulfonylgruppen.

Heterocykliske rester kan være en- eller flerkjernede og oppviser spesielt et eller to oksygen-, nitrogen- eller svovelatomer i kjernen.

Aryl står for en aromatisk karbonring. Flerkjernede arylrester kan være kondensert med hverandre, eller lineært forbundet med hverandre via C-C-bindinger eller via brogrupper som for eksempel -O-, -COO-, -CH2-, -CO-NH-, -S-, -CO-eller en -S02-gruppe.

Eksempler på flerkjernede aromatiske arylrester er 4,4'-bifenyl, naftalin-1,5- eller -2,6-grupper eller naftalin-1,8-grupper.

For fremstilling av de ovenfor nevnte polykondensatene omsetter man et dikarboksylsyreklorid med formel X

med en eller flere av diolene, diaminene, ditioforbindelsene eller diazinene med formlene XI, XII, XIII eller XTV,

hvor R.<1>, R<2>, r<7> og R^ har den ovenfor angitte betydningen.

Dikarboksylsyrekloridet med formel X og de enkelte diol-, diamin-, ditio- eller diazintypene med formlene XI, XII, XIII eller XIV kan også anvendes i form av blandinger med hverandre.

Det er selvinnlysende for fagmannen at summen av alle fra dikarboksylsyrene (A) avledede strukturenhetene og summen av alle fra ditiolene, ditioforbindelsene, diaminene og diazinene (B) avledede strukturenhetene er i det vesentlige like, dvs. at de er forskjellige med maksimalt ca. 1%, fortrinnsvis ca. maksimalt 0,2%, spesielt at de er like innenfor rammen av de praktiske måle- og doseringsmulighetene.

Molekylvekten for de dannede polyamidene kan blant annet styres ved valget av mengdeforholdene mellom A og B. Disse utvalgskriteriene er kjente for fagmannen innen området polykondensasjon.

Eksempler på egnede dikarboksylsyrer, hvorfra dikarboksylsyrekloridene med formel X avledes er 2,3-O-isopropyliden-L-vinsyre, 2-klortereftalsyre, furandikarboksylsyre, 2-bromtereftalsyre, 2-metyltereftalsyre og spesielt 2,3-O-isopropyliden-L-vinsyre.

Eksempler på egnede diaminer med formel XII er lysinmetylester, naftalin-1,4-diamin, naftalin-l,5-diamin, naftalin-2,6-diamin og spesielt lysinmetylester eller diaziner.

Eksempler på egnede dioler med formel XI er vinsyredietylester, 2,3-O-isopropyliden-L-treitol og vinsyrediisopropylester.

Kondensasjonen av de ovenfor omtalte komponentene utføres generelt i oppløsning.

For dette formålet oppløses de monomere forbindelsene som skal omsettes med hverandre som regel i et organisk oppløsningsmiddel. Det organiske oppløsningsmidlet inneholder derved fortrinnsvis minst et oppløsningsmiddel som for eksempel N-metyl-2-pyrrolidin, N,N-dimetylacetamid, pyridin, tetrametylurea, N-metyl-2-piperidon, diklormetan, N,N'-dimetyletylenurea, N-metylkaprolaktam, N-acetylpyrrolidin, N,N-dimetylpropylenurea. For fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det foretrukne organiske oppløsningsmidlet pyridin, diklormetan, furan eller en blanding av disse forbindelsene.

Ved en foretrukket form av gjennomføring av oppløsningsmiddelpolymeirsasjonen blandes monomerene 2,3-O-isopropyliden-L-vinsyrediklorid og vinsyredietylester i en blanding av pyridin og diklormetan under kraftig omrøring. Polykondensasjonstemperaturene når ved oppløsningspolymerisasjonen vanligvis fra - 20°C til +120°C, fortrinnsvis fra +10°C til +100°C. Spesielt gode resultater oppnås ved reaksjonstemperaturer på +10°C til +80°C.

Summen av konsentrasjonene av monomere forbindelser i

polymerisasjonsblandingsoppløsningen kan innstilles under hensyntagen til den ønskede polymerisasjonsgraden, den ønskede viskositeten for polymerisasjonsblandingen, typen av anvendte monomere forbindelser, typen av anvendt oppløsningsmiddel og den ønskede polymerisasjonstemperaturen. Den gunstigste summen av konsentrasjonene kan derved bestemmes på grunnlag av en rekke forforsøk for forløpet av polymerisa-sjonen.

Polykondensasjonsreaksjoner utføres fortrinnsvis slik at etter avslutning av reaksjonen foreligger 2 til 15, fortrinnsvis 5 til 15 vekt-% av polykondensat i oppløsningen. Spesielt gode resultater oppnås ved konsentrasjoner på 5,0 til 10 vekt-%.

Under forløpet av polykondensasjonen øker molekylvekten for polymeren og dermed også viskositeten av reaksjonsblandingen. Det oppnås molekylvekt fra 500 til 1.000.000, fortrinnsvis 3.000 til 100.000. Det oppnås som regel viskositeter på mer enn 0,1 dl-g"<l> (Staudinger-indeks, dimetylformamid, 25°C).

Når polymeroppløsningen har nådd den for videre bearbeidelse påkrevde viskositeten, kan polykondensasjonen stoppes på vanlig måte ved tilsats av mono funksjonelle forbindelser, som for eksempel acetylklorid. Deretter kan det dannede og løst til amidoppløsningsmidlet bundne hydrogenkloridet nøytraliseres ved tilsats av basiske stoffer. Egnede for dette formålet er eksempelviss pyridin, trietylamin, morfolin, men spesielt pyridin.

Det som utgangsstoff anvendbare 2,3-O-alkyliden-L-vinsyredikloridet oppnår man eksempelvis ved omsetning av vinsyrealkylester med 2,2-dimetoksypropan til de tilsvarende vinsyredialkylesteracetonketalene analogt omsetningene beskrevet av M. Carmack et al. (J. Org, Chem. 33, 1968, s. 2171-2173). Disse vinsyredialkylesteracetonketalene overføres med alkalihydroksyder til de tilsvarende saltene og overføres deretter ved omsetning med fosfortriklorid, fosforpentaklorid, oksalylklorid eller tionylklorid til de tilsvarende L-vinsyredikloirdderivatene.

Fremstillingen av 2,3-O-alkyliden-L-treitol foregår eksempelvis ved omsetning av vinsyredialkylesteracetonketal med LiAltfy til den tilsvarende 2,3-0-alkyliden-2-trekol (P.W. Feit, J. Med. Chem. 7,1964, s. 14-17).

Furandikarboksylsyrediklorider er eksempelvis oppnåelige ved fremgangsmåten beskrevet av Moore og Kelley (American Chemical Society, 11, nr. 3, 1978, s. 568-573).

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av den ekkogene partikkelen ifølge oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at det formgivende stoffet eller stoffblandingen oppløses i et egnet oppløsningsmiddel eller en

oppløsningsmiddelblanding og oppløsningen underkastes deretter en spraytørking.

Videre kan det også anvendes andre fremgangsmåter, for eksempel emulgeringsfremgangsmåter eller utfellingsfremgangsmåter for fremstilling av partiklene ifølge oppfinnelsen (M. Bornschein et al, Die Pharmazie, 44, hefte 9, 1989, s. 585 ff; Y-Kawashima et al., J. Pharm. Sciences, 81, hefte 2, 1992, s. 135 ff).

Spraytørkingen foregår eksempelvis ved prinsippet med dyseforstøvning i samstrøm, dvs. retningen av oppløsningen som skal forstøves og tørrluften forløper i samme retning.

For fremstilling av den ekkogene partikkelen ifølge oppfinnelsen har følgende innstillinger av de vesentlige innstillingsparametrene på en spraytørker (Biichi 190; Biichi GmbH, Eislingen) vist seg egnede. Inngangstemperaturen utgjør 15°C til 200°C, spesielt 20°C til 100°C. Temperaturen kan imidlertid også variere innen vide grenser og avhenger i det vesentlige av det anvendte oppløsningsmidlet og polymeren.

Under inngangstemperatur forstås temperaturen av tørkeluften som suges inn gjennom innretningen ved hjelp av en aspirator. I stedet for luft kan det naturligvis også anvendes en annen gass, dersom arbeidet som skal gjennomføres krever dette.

Ved spraytørking av en oppløsning fjernes oppløsningsmidlet helt eller delvis, derved omvandles de flytende oppløsningsdråpene til partikler. For at oppløsningsmidlet ved forstøvning av materialet som skal tørkes i en luftstrøm skal fordampe under kontakttiden som står til disposisjon, må temperaturen av luftstrømmen ligge over eller i nærheten av kokepunktet for oppløsningsmidlet.

Som utgangstemperatur betegnes den temperaturen som luftstrømmen, som fører faststoffpartiklene med seg, oppviser før inntreden i syklonen. Utgangstemperaturen resulterer fra kombinasjonen av inngangstemperatur, aspiratorinnstilling, pumpeinnstillling samt konsentrasjon av spraymaterialet og ikke minst også avhengig

av fordampningsvarmen for oppløsningsmidlet.

Med aspiratoren suges tørkeluften gjennom innretningen og dermed frembringes samtidig et undertrykk. Med regulering av aspiratorytelsen forhøyes eller reduseres på den ene siden mengden av den oppvarmede tørkeluften og på den andre siden reguleres det i apparaturen herskende undertrykket. Et trykk som ligger i området fra 10 til 100 mbar under trykket utenfor apparaturen, spesielt på 30 til 70 mbar, er foretrukket.

Oppgaven til transportpumpen er å sprøyte sprayløsningen inn i innretningen, en pumpeytelse på 100-500 ml/t har vist seg hensiktsmessig.

Som spraystrøm forstås den for forstøvning av oppløsningen, emulsjonen eller dispersjonen nødvendige mengden trykkluft. I stedet for trykkluft kan man naturligvis også anvende en annen gass.

Spraystrømmen kan innstilles på innretningen i området fra 100 til 800 Nl/t (NI = normalliter) spesielt 600 til 800 Nl/t.

Som oppløsningsmiddel eller oppløsningsmiddelblandinger egner seg eksempelvis vann, tetrahydrofuran, diklormetan, furan, DMSO (dimetylsulfoksyd), dioksan eller aceton.

Dersom sprayproduktet etter en prøvespraying ikke viser en glatt overflate, så kan glatte overflater fremstilles ved tilsats av polymermyknere som DMSO eller glycerol til oppløsningsmidlet.

Dersom sprayproduktet etter en prøvespraying viser glatte overflater og runde partikler, så kan det ved tilsats av utfellingsmidler og/eller temperaturforandringer oppnås konkave overflateinnbuktninger.

Formen av partiklene ifølge oppfinnelsen gir seg i det vesentlige fra fremstillingsfremgangsmåten og valget av parametere. Partikkelen ifølge oppfinnelsen med konkave overflatesegmenter avledes eksempelvis fra runde partikler med en konstant diameter eller hullegemer. Det forekommer også former som ser ut som begre, skalker, sigarer eller sylindere. Partiklene kan være monolittiske eller foreligge som hullegemer, for eksempel som hule innoverkrummede halvkuler. Monolittiske partikler er slike som i det vesentlige er fylt av det formgivende stoffet; hullegemer har et mer eller mindre stort gassfylt innerrom. Hule innoverkrummede halvkuleformige partikler kan oppstå ved mer eller mindre sterke innklemminger av hulkuler. Videre har spindelformige former med to innbuktninger av en rund partikkel vist seg gunstig. Alle de nevnte formene har vist seg som egnede ekkogene partikler.

Fordelingen av formene i en ved spraytørking fremstilt charge kan variere innenfor vide grenser. Gunstig har charger vist seg å være hvori minst 5%, fortrinsvis 5 til 90%, spesielt 10 til 60%, spesielt foretrukket 30 til 40% av partiklene, oppviser minst et konkavt overflatesegment. Fordelingen av formene kan bestemmes ved datamaskinstøttet bildeanalyse ved rasterelektroniske opptak av partikkelen eller kan foregå ved hjelp av et cytofotometer.

De ekkogene partiklene ifølge oppfinnelsen kan også oppvise en glatt overflate. Dette trekket kan eksempelvis bestemmes ved elektronmikroskopiske undersøkelser, spesielt ved hjelp av rasterelektronmikroskopi (REM). Derved prepareres partikkelen ved standardfremgangsmåter for elektronmikroskopi og kontrastbehandles. Som kontrastmiddel for REM-opptak har metallpådampninger, for eksempel med gull, vist seg fordelaktig. Glatte overflater av partikler fremtrer på REM-opptakene som homogene flater med i det vesentlige konstant gråtone. Forstyrrelser av overflaten gjenkjenner man ved forskjellige gråtoner. Forstyrrelser har en avstand fra den midlere overflaten av partikkelen på mer enn 100 nm.

Partikler ifølge oppfinnelsen med glatte overflater er ikke fullstendig frie for forstyrrelser på overflatene. Antallet forstyrrelser pr. um<2> strekker seg fra 0 til 4, fortrinnsvis 0,5 til 3, spesielt 1 til 3. Kvaliteten av den glatte overflaten kan eksempelvis bestemmes ved at man på REM-opptakene av partiklene ifølge oppfinnelsen med glatt overflate velger ut kvadratiske arealer med en kantlengde på 0,5 um og bestemmer antallet forstyrrelser på overflatene. En glatt overflate er kjennetegnet ved at ved et tilfeldig valg av 10 kvadratiske arealer finnes 0 til 10 forstyrrelser på overflaten, fortrinnsvis i gjennomsnitt fra 1 til 7,5, spesielt 2,5 til 7,5.

Fordelingen av partiklene ifølge oppfinnelsen med glatt overflate i en ved spraytørking fremstilt charge kan variere innenfor vide grenser. Gunstig har charger vist seg å være hvori minst 10%, fortrinnsvis 10 til 90%, spesielt 20 til 60%, spesielt foretrukket 30 til 40% av partiklene oppviser en glatt overflate.

Ved den beskrevne fremgangsmåten kan de formgivende stoffene anvendes alene eller også som blanding. Disse formgivende stoffene kan også anvendes i blanding med andre biologisk nedbrytbare og/eller biologisk godtagbare polymerer, for eksempel dekstraner, polyetylenglykoler, hydroksyetylstivelse og andre nedbrytbare eller utskillbare polysakkarider eller fysiologisk godtagbare hjelpestoffer (for eksempel DMSO, glycerol eller andre polymermyknere).

Oppfinnelsen vedrører videre diagnostika og terapeutika som er kjennetegnet ved at de inneholder ekkogene partikler ifølge oppfinnelsen ved siden av farmasøytisk egnede og fysiologisk godtagbare bærestoffer, og eventuelt ytterligere tilsats- og/eller hjelpestoffer.

De ekkogene partiklene ifølge oppfinnelsen overføres før anvendelse ved tilsats av en eller flere farmasøytisk egnede og fysiologisk godtagbare bærere og eventuelt ytterligere tilsats- og/eller hjelpestoffer til en egnet diagnostisk eller terapeutisk anvendelsesform. De ekkogene partiklene suspenderes eksempelvis før anvendelse ved tilsats av vann og blanding.

Således tilveiebringer oppfinnelsen også en fremgangsmåte for fremstilling av et diagnostikum eller terapeutikum, kjennetegnet ved at man bringer ekkogene partikler ifølge oppfinnelsen i en egnet diagnostisk eller terapeutisk administrasjonsform ved hjelp av en farmasøytisk egnet og fysiologisk akseptabel bærer og eventuelt ytterligere tilleggs-og/eller hjelpestoffer.

Ved tilsats av osmotisk aktive stoffer, eksempelvis koksalt, galaktose, glukose, fruktose, kan den fysiologiske isotonien for partikkelsuspensjonen fremstilles. Videre kan det tilblandes suspensjonshjelpestoffer som dekstraner eller tilsatsstoffer som kolloidale infusjonsoppløsninger for plasmasubstitusjon til partikkelsuspensj onene.

Ved den beskrevne fremgangsmåten for fremstilling av ekkogene partikler ifølge

oppfinnelsen kan man nå partikkelstørrelser hvorved 90% av partiklene har en diameter på 0,1 um til 15 um, spesielt oppnås det partikkelstørrelsesfordelinger, hvorved 90% av partiklene er mindre enn 3 um. Større partikler siktes ut ved hjelp av en siktvevnad som har en maskevidde på 1 um til 50 um, spesielt 3 um til 15 um. Ved anvendelse av disse ekkogene partiklene som ultralyd-kontrastmiddel for diagnose av hjerte-kretsløps-sykdommer har partikkelstørrelser på 0,1 um til 7 um vist seg fordelaktige, fortrinnsvis anvendelser partikkelstørrelser på 0,1 um til 3 um. De ekkogene partiklene injiseres eksempelvis i blodbanen. Pr. injeksjon anvendes det 0,1 mg til 1000 mg av de

ekkogene partiklene, fortrinnsvis 1 mg til 100 mg.

De ekkogene partiklene kan imidlertid også anvendes oralt, for å gjøre mage-tarmkanalen tilgjengelig for en ultralydsundersøkelse.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en anvendelse av de ekkogene partikler ifølge oppfinnelsen for fremstilling av diagnostika for synliggjøring av blodkretsløpet eller organer som forsyres med blod.

Dessuten tilveiebringer oppfinnelsen anvendelsen av de ekkogene partikler ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et diagnostikum for konsentrering av hulrom i mennesker, dyr og planter.

De ekkogene partiklene ifølge oppfinnelsen kan anvendes så vel for diagnostiske som også terapeutiske fremgangsmåter. Anvendelsen av de ekkogene partiklene ifølge opprinnelsen er ikke bare begrenset til synliggjørelsen av blodstrømmen i den høyreventrikulære delen av blodkretsløpet etter venøs tilførsel. De ekkogene partiklene kan med utmerket resultat anvendes for undersøkelse av venstre hjerteside og av myocard. Videre er det også mulig å synliggjøre andre organer som tilføres blod som lever, milt, nyre eller hjerne, med disse ekkogene partiklene.

Som nevnt tidligere, egner de ekkogene partiklene ifølge oppfinnelsen seg imidlertid også for synliggjørelse av hulrom i mennesker, dyr eller planter, eksempelvis urinblære, urinleder, livmor, vagina, xylem eller ploem. 1 de følgende eksemplene beskrives oppfinnelsen nærmere. Prosentangivelser refererer til vekten, så fremt ikke annet er angitt.

Eksempel 1

Bestemmelse av formen og lungetilgjengeligheten for de ekkogene partiklene.

Den gjennomsnittlige størrelsen, formen og overflatebeskaffenheten karakteriseres ved hjelp av rasterelektroniske opptak.

For dette formålet strøs de ekkogene partiklene på et ledende dobbeltklebebånd og pådampes gull i et katodeforstøvningsanlegg - sjikttykkelse ca. 1,8 nm, trykk ca. 1x10" <2> mbar (forstøvningsanlegg type 07 120B, Balzerz Union). Fremstillingen av REM-bildene foregår med et "Camscan"-rasterelektronmikroskop, type serie 4; vippevinkel 15°; høyspenning 20 kV, arbeidsavstand 24 mm; sekundærelektroner, arbeidsvakuum ca. 2 • 10"^ mbar.

I ethvert tilfelle dispergeres 30 mg partikler i 2 ml suspensjonshjelpemiddel, bestående av 200 mg "Dextran 40" (firma Roth, Tyskland), 10 mg polysorbat og 16 mg NaCl i destillert vann og filtreres deretter med siktevevnader (15 um og 3 um maskevidde) og lyofiliseres.

Lungetilgjengeligheten for partiklene undersøkes in vivo. 30 mg av de filtrerte partiklene resuspenderes i 1,5 ml destillert vann ved hjelp av en glasstav. Med en injeksjonssprøyte injiseres denne suspensjonen i en perifer vene. Et ultralydshode av en ultralydsinnretning (Toshiba, FSH 160a, Japan) holdes på Thorax av forsøksdyret slik at et typisk tverrsnitt gjennom høyre og venstre hjertekammer oppnås. Så snart ultralyd-kontrastmidlet når det høyre hjertekammeret, kan man på monitoren av ultralydsinnretningen registrere hvordan det med kontrastmiddel merkede blodet når det høyre forkammeret, deretter den høyre ventrikkelen og deretter igjen forlater hjertet via pulmonararterien. Etter lungepassasjen forsterkes kontrasten i det venstre hjertekammeret tydelig ved hjelp av kontrastmidlet.

Eksempel 2

Fremstilling av polysuccinimid-ko-a,B-(hydroksyetyl)-D,L-aspartamid (70:30)

10 g (103 mmol) polyanhydroasparaginsyre oppløses i ca. 40 ml N,N-dimetylformamid (DMF) eventuelt under forsiktig oppvarming. Til denne oppløsningen tilsettes det dråpvis 1,83 g (30 mmol) nydestillert 2-aminoetanol og det omrøres ved romtemperatur over natten. Reaksjonsblandingen utfelles i butanol og vaskes flere ganger med tørr aceton. Tørkingen foregår i vakuum ved forhøyet temperatur. Det hvite, vannoppløselige produktet oppstår i et utbytte på tilnærmet 100% og undersøkes NMR-spektroskopisk med henblikk på rester av DMF og butanol. Det anvendte molare forholdet mellom polyanhydroasparaginsyre og aminoetanol tilsvarer tilnærmet kopolymersammensetningen.

Eksempel 3

Fremstilling av polysuccinimid-ko-a,B-(nonyl-karbonyloksyetyl)-D,L-aspartamid

(50:50)

6 g av et polysuccinimid-k<q->a,B-(hydroksyetyl)-D,L-aspartamid (50:50) (= 24 mmol hydroksyetylgrupper), som er fremstilt analogt eksempel 4 fra

polyanhydroasparaginsyre (MG = 14000) og 2-aminoetanol (molart forhold 2:1), oppløses i 100 ml tørr DMF, blandes med 8 g (100 mmol) tørr pyridin og avkjøles til 0°C. Det tilsettes langsomt, dråpvis 9,6 g destillert dekansyreklorid.

Blandingen omrøres over natten og utfelles i 0,5 1 eter. Det utfelte produktet frasuges, vaskes med eter, aceton, vann, aceton og eter.

Man oppnår ca. 8 g av en hvit, fullstendig substituert polymer (NMR-kontroll), som for eksempel er oppløselig i diklormetan og THF, i ethvert tilfelle med et spor DMSO eller i metanol/diklormetanblandinger.

Eksempel 4

Fremstilling av polysuccinimid-ko-a,B-(nonyl-karbonyloksyetyl)-D,L-aspartamid

Analogt eksempel 2 fremstilles forskjellige polysuccinimid-ko-a,B-(nonyl-karbonyloksyetyl)-D,L-aspartamider blant annet med sammensetning 70:30, 50:50 og 30:70 fra polyanhydroasparaginsyrer med forskjellig molekylvekt (MG = 7000; ca. 13000; 30000) og omsettes med dekansyreklorid, som beskrevet i eksempel 5, til de tilsvarende polysuccinimid-ko-a,B-(nonyl-karbonyloksyetyl)-D,L-aspartamidene.

a) polysuccinimid-ko-a,B-(nonylkarbonyloksy-etyl)-D,L-aspartamid (70:30) fra polyanhydroasparaginsyre (MG = 7000); karakterisert ved hjelp av

NMR.

b) polysuccinimid-ko-a,B-(nonylkarbonyloksy-etyl)-D,L-aspartamid (70:30) fra polyanhydroasparaginsyre (MG = 14000); karakterisert ved hjelp av

NMR.

c) polysuccinimid-ko-a,B-(nonylkarbonyloksy-etyl)-D,L-aspartamid (70:30) fra polyanhydroasparaginsyre (MG = 30000); karakterisert ved hjelp av

NMR.

Eksempel 5

20 gpolyanhydroasparaginsyre-ko-a,B-(nonylkarbonyloksyetyl)-D,L-aspartamid 70:30 (fremstilt som i eksempel 6b) oppløses i 400 ml diklormetan og sprayes til partikler under følgende betingelser i en spraytørker ("Mini Spray Dryer Biichi 190", Biichi GmbH, Eislingen):

Spravbetingelser

Utbytte: ca. 8 g

Etter spraytørkingen utgjør diklormetankonsentrasjonen i partiklene mindre enn 0,05%. Den gjennomsnittlige størrelsen, formen og overflatebeskaffenheten karakteriseres ved hjelp av rasterelektroniske opptak; lungetilgjengeligheten for partiklene bestemmes som i eksempel 1.

100 mg av de fremstilte partiklene suspenderes i en 1% "Haemaccelloppløsning"

(Behring Werke AG, Marburg, Tyskland) og filtreres gjennom en siktvevnad (10 um). Filtratet lyofiliseres deretter og anvendes for bestemmelse av lungetilgjengeligheten.

De fremstilte partiklene har i rasterelektronmikronskop en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på 2 um og en glatt overflate. Videre er disse partiklene lungetilgj engelige.

Ca. 15% av partiklene er runde hulkuler, 50% av partiklene er hulkuler som oppviser en kuleformig innklemming, slik at det oppstår en halvkuleformig hulkule. Skalltykkelsen for disse halvkuleformede hulkulene kan ved maksimal innklemming beskrives ved ligningen rm - rj = 2 d (d = skalltykkelse, rm = radius for den ytre halvkulen), rj = radius for den indre, konkave halvkulen). Når det foreligger en ikke-ideel halvkuleform, så bestemmes radiusen fra det relative midtpunktet av den innklemte

hulkulen.

Ca. 25% av partiklene er hulkuler med 2 til 5 forskjellig store innklemminger.

Eksempel 6

Fra polyhydroksysmørsyre "Type 159PHB" (ICI Biological Products Ltd.) fremstilles ifølge en fremgangsmåte av J.K. Embleton, B.J. Tighe (J. Microencapsulation, 1992, bind 9, nr. 1, 73-87) partikler ved såkalt "dobbelt emulsjons-oppløsningsmiddel-fordampningsprosess". Fordampningen foregår ved romtemperatur. Partiklene fraksjoneres ved sentrifugering og filtrering gjennom en 10 um siktevevnad. Deretter registreres en partikkelandel på 35% med konkave overflatesegmenter i filtratet ved hjelp av rasterelektron-mikroskopi.

Likeledes gjennomføres fordampningen ved 40°C og deretter fraksjoneres det. På denne måten bestemmes for sammenligning en fraksjon med en partikkelandel på bare 5% med konkave overflatesegmenter ved hjelp av rasterelektronmikroskopi.

Eksempel 7 ( LMFG 50/ 50)

Fremstilling av poly(L-lysirimetylesterfumarsyre/L-lysinmetylesterglutaramid)

Kopolymer 50:50 (LMFG 50:50)

0,7 g glutarsyrediklorid og 0,84 g fumarsyrediklorid oppløses i 170 ml CH2CI2. Denne oppløsningen tilsettes ved romtemperatur under kraftig omrøring til en oppløsning av 2,91 g L-lysinmetylester og 3,0 g Na2C03 i 120 ml H2O. Den øyeblikklige inntredende polykondensasjonen avbrytes etter 15 minutter ved tilsats av 120 ml 1 N vandig HC1. Ved innføring av vanndamp utdrives så metylenkloridet. Den varme, vandige blandingen filtreres og det faste produktet vaskes flere ganger med vann.

Utbytte: 1,3 g (60% av teoretisk) etter vakuumtørking (20 timer).

Eksempel 8

2 g polymer fra eksempel 7 oppløses i 100 ml DMSO og forstøves ved ca. 200°C inngangstemperatur i en "Mini Spray Dryer Biichi 190". Den gjennomsnittlige størrelsen og overflatebeskaffenheten karakteriseres ved hjelp av rasterelektroniske opptak (se tabell 1). I ethvert tilfelle 50 mg partikler suspenderes i 2 ml suspensjonshjelpemiddel (1% "Haemaccel" i isotont vann) og filtreres deretter med siktevevnader (15 um og 3 um maskevidde) og lyofiliseres.

Eksempel 9

2 g polyhydroksysmørsyre "Type 159 PHB" (ICI Biological Products Ldt.) oppløses i 100 mLfuran-diklormetan (9:1) og forstøves ved ca. 45°C i "Biichi Mini Spray Dryer" til partikler og viderebearbeides analogt eksempel 8.

Eksempel 10

En oppløsning av 2 g polyhydroksysmørsyre "Type 159 PHB" (ICI Biological Products Ldt.) oppløses i 100 ml diklormetan/MeOH (1:2), forstøves ved ca. 45°C i "Biichi Mini Spray Dryer" til partikler og viderebearbeides analogt eksempel 8.

Eksempel 11

2 g poly-e-kaprolakton (Polysciences 19561) oppløses i et omfang på 2% i diklormetan og forstøves ved romtemperatur i "Biichi Mini Spray Dryer" til partikler og viderebearbeides analogt eksempel 8.

Lungetilgjengeligheten for partiklene fra eksemplene 8 til 11 undersøkes in vivo og bestemmes som i eksempel 1.

Den etterfølgende tabellen viser resultatene:

Claims (17)

1. Ekkogene partikler, inneholdende en gass og et formgivende stoff eller en stoffblanding som er biologisk nedbrytbar og/eller utskillbar og som i blodkretsløpet hos virveldyr kan passere lungen, karakterisert ved at (a) overflaten av de ekkogene partiklene er i alt vesentlig glatt og formen av de ekkogene partikler inneholder ingen eller 1 til 10 konkave overflatesegmenter eller overflaten av de ekkogene partiklene er ikke-glatt og formen av de ekkogene partiklene inneholder 1 til 10 konkave overflatesegmenter, og at (b) den maksimale innbøyningen av det konkave overflatesegmentet utgjør fra 30 til 90% av det minste partikkeltverrsnittet og at 10 til 60% av de ekkogene partiklene oppviser minst ett konkavt overflatesegment pr. partikkel. •

2. Ekkogene partikler ifølge krav 1, karakterisert ved at det som formgivende stoff inneholdes minst en polymer fra den følgende gruppen: polyestere av a-, B-, y- eller e-hydroksykarbonsyrer; kopolymerer av polyesterne med hverandre eller med polyglykolsyre; polyamider; polyaminosyrer; polyortoestere; polykondensater som inneholder 2,3-Oalkylidenvinsyre, 2,3-O-alkyliden-L-treitol, furo-[2,5]-grupper eller tereftalater; polyaminodikarboksylsyre-ko-imider; polyanhydrider; polymetylenmalonat; gelatiner; albuminer eller polysakkarider eller minst ett formgivende stoff fra gruppen sukker; fettsyrer; aminosyrer; alkoholer med 12 til 20 karbonatomer eller lipider.

3. Ekkogene partikler ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det som formgivende stoff inneholdes minst en polymer fra følgende gruppe: poly-s-kaprolakton; polyhydroksysmørsyre; polymelkesyre; polyhydroksyvaleriansyre; polyglutaminsyre; polyasparaginsyre; polylysin; polysuccinimid-ko-a,fi-(butyloksykarbonyl-propionyloksyetyl)-D,L-aspartamid; polyanhydrider av sebacinsyre og bis(p-karboksyfenoksy)propan; polylysinmetylesterfumarsyre-ko-glutaramid; dekstraner; stivelse; basiske eller sure derivater av dekstraner eller stivelse; polyhydroksyetylaspartamid; okseserumalbumin; hydrofobt modifiserte gelatiner samt minst ett formgivende stoff fra følgende gruppe glukose; galaktose; laktose; sakkarose, fettsyrer med 8 til 20 C-atomer, proteinogene aminosyrer, hydrofobe derivater av proteinogene aminosyrer, fosfolipider eller blandinger derav.

4. Ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det som formgivende stoff inneholdes minst en polymer fra følgende gruppe: polyamider; polykondensater; polyhydroksysmørsyre eller polyaminodikarboksylsyre-ko-imider.

5. Ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den maksimale innbøyningen til det konkave overflatesegmentet utgjør 50% til 90% av det minste partikkeltverrsnittet.

6. Ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 5, karakterisert ved at de som gass inneholder luft, nitrogen, en edelgass, hydrogen, karbondioksyd, oksygen eller blandinger derav.

7. Ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 6, karakterisert ved at partiklene er monolittiske eller foreligger som hullegeme.

8. Ekkogene partikler ifølge krav 7, karakterisert ved at hullegemet oppviser 2 til 10 konkave overflatesegmenter.

9. Ekkogene partikler ifølge krav 7, karakterisert ved at 30 til 40% av de ekkogene partikler oppviser minst ett konkavt overflatesegment pr. partikkel.

10. Ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 5, karakterisert ved at overflaten oppviser 0 til 4, spesielt 1 til 3, forstyrrelser pr. um<2>.

11. Ekkogene partikler ifølge krav 10, karakterisert ved at minst 10%, spesielt 20 til 60%, av de ekkogene partikler oppviser 0 til 4, spesielt 1 til 3, forstyrrelser pr. um<2>.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 11, karakterisert ved at det formgivende stoffet eller stoffblandingen oppløses i et egnet oppløsningsmiddel eller en oppløsningsmiddelblanding og oppløsningen underkastes en spraytørking.

13. Diagnostikum eller terapeutikum, karakterisert ved at det inneholder ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 11 eller fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 12, ved siden av farmasøytisk egnede og fysiologisk akseptable bærestoffer og eventuelt ytterligere tilleggs- og/eller hjelpestoffer.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av et diagnostikum eller terapeutikum ifølge krav 13, karakterisert ved at man bringer ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 11 eller fremstilt ifølge krav 12 i en egnet diagnostisk eller terapeutisk administrasjonsform ved hjelp av en farmasøytisk egnet og fysiologisk akseptabel bærer og eventuelt ytterligere tilleggs- og/eller hjelpestoffer.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at man filtrerer de ekkogene partikler gjennom et filterstoff med en maskevidde på fra 1 um til 50 um, spesielt fra 3 um til 15 um.

16. Anvendelse av de ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 11 eller fremstilt ifølge fremgangsmåten ifølge krav 12 for fremstilling av et diagnostikum for synliggjørelse av blodkretsløpet eller av organer som forsynes med blod.

17. Anvendelse av de ekkogene partikler ifølge ett eller flere av kravene 1 til 11 for fremstilling av et diagnostikum for kontrastering av hulrom hos mennesker, dyr eller planter.