RS20050401A - Frakcija albumina izvedena iz plazme sa smanjenom količinom prekalikrena - Google Patents

Abstract

Frakcije koja sadrži albumin i ima redukovani sadržaj prekalikrein aktivatora (PKA) i postupak proizvodnje iste koji se sastoji od koraka: (a) rekonstitucija mase V, (Cohn-ovo deljenje na frakcije), (b) izvodjenje koraka koncentracije frakcije dobijene u koraku (a), (c) zagrevanje frakcije dobijene u koraku (b) u rasponu od 50°C do 70°C radi dobijanja dovoljnog vremena da se frakcija pasterizuje, i (d) opciono punjenje dobijene frakcije za upotrebu.

Description

FRAKCIJA ALBUMINA IZVEDENA IZ PLAZME SA SMANJENOM

KOLIČINOM PREKALIKREINA

Sadašnji pronalazak je u vezi sa postupkom proizvodnje albuminom obogaćene frakcije koja ima redukovani prekalikrein aktivator (PKA) i frakcije koja sadrži albumin koja ima redukovani prekalikrein aktivator (PKA) koje se mogu dobiti postupkom pronalaska.

STANJE TEHNIKE

Preparati koji sadrže albumin se upotrebljavaju kao infuzioni rastvori za pacijente kojima su oni neophodni. Da bi se dobila veće fiziološko okruženje tečnosti daje se infuzijom pacijentima supstitucija koja sadrži ne samo soli u fiziološkoj koncentraciji već i albumin kao dodatno sredstvo. Preparati albumina mogu sadržati prekalikrein aktivator, koji može voditi do neželjenih sporednih efekata, što se može desiti mešanjem prekalikrein aktivatora u renin-angiotenzin sistem.

OPIS PRONALASKA

Predmet ovog pronalaska je da se smanji PKA sadržaj u plazmi izvedenih frakcija koje sadrže albumin. Sledeći je predmet da se obezbedi frakcija koja sadrži albumin koja ima redukovanu PKA vrednost.

Predmet je rešen postupkom proizvodnje albiminom obogaćene frakcije koja ima redukovani prekalikrein aktivator (PKA) koji se sastoji od sledećih koraka:

(a) rekonstitucija mase V, (Cohn-ovo deljenje na frakcije),

(b) izvođenje koraka koncentracije frakcije dobijene u koraku (a),

(c) zagrevanje frakcije dobijene u koraku (b) u rasponu od 50°C do

70°C radi dobijanja dovoljnog vremena da se frakcija pasterizuje, i (d) opciono punjenje dobijene frakcije radi upotrebe.

U realizaciji sadašnjeg pronalaska drugi korak pasterizacije se obavlja nakon punjenja.

Tačnije, korak inkubacije se obavlja na 50 do 70°C u trajanju od bar 5 sati, naročito 10 sati.

Počevši sa rekonstitucijom mase V i opcionog dodavanja pomoćnih filtera, filtriranje se obavlja pretpostavljeno sa filterom koji ima veličinu pore oko 0,2 (.im. Ukoliko je to neophodno, mora se obaviti podešavanje pH. Vrednost pH treba da bude u rasponu od 7,2 - 7,6. Tipično se obavlja ultrafiltriranje do 8% (w/v) sadržaja proteina nakon čega dolazi diafiltriranje i sledeće ultrafiltriranja zbog koncentracije proteina. Ovo vodi do koncentracija proteina od bar 20%. Potom se može obaviti još jedno filtriranje pretpostavljeno sa membranom koja ima veličinu pore od oko 0,2 pm.

Dodaju se stabilizatori, kao što je na primer 0,08 mmol/g albumin i iz N-acetil-DL-triptofana i natrijum kaprilata, što je praćeno daljim podešavanjem pH u rasponu od 6,7 do 7,3. Podešavanje sadržaja proteina i natrijum se postiže i pasterizacija u masi se obavlja pretpostavljeno u rasponu od 58°C do 65°C bar 9 sati. Ovaj korak je praćen sterilnim filtriranjem. Uzorak se skladišti manje od 2 nedelje na 2°C do 25°C. Sterilna masa albumina se podvrgava daljem krajnjem sterilnom filtriranju i punjenju. Nakon punjenja može biti obavljen drugi korak pasterizacije pod sličnim uslovima kao što prethodno opisano. Može se dodati dalji korak inkubacije. Nakon vizuelne inspekcije preparat je spreman za skladištenje i upotrebu.

Postupak ovog pronalaska takođe obezbeđuje frakciju koja sadrži albumin

i ima redukovani prekalikrein aktivator (PKA).

Sadržaj PKA albumina pronalaska je manji od 12 lU/mL, pretpostavljeno 10 lU/mL, pri čemu je PKA utvrđen prema European Pharmakopoeia, četvrto izdanje, 2.6.15, p. 147-148.

Pronalazak je dalje opisan sledećim neograničavajućim primerima.

Primeri

Primer 1

Masa V se suspenduje u, od njene težine, 1,6 većoj težini vode za ubrizgavanja > 6 sati na -2 ± 2 °C. Dodaju se pomoćni filteri proizvodu i preparat se meša 30 minuta. Dubinski filter se prethodno opere sa vodom za ubrizgavanja i potom sa 10% (v/v) etanolom. Rastvor se razbistri propuštanjem kroz dubinski filter i potonji 0,2 jim filter membrane. Filter se naknadno opere sa 10% etanolom u vodi za ubrizgavanja. Vrednost pH se podesi na 7,4 + 0,2 sa 3 M rastvora natrijum hidroksida.

Ultrafiltriranjem kroz membrane dobija se koncentracija proteina od 8% sa limitom isključenja od 10 kDalton-a. Koncentrat se diafiltrira spram > 3 puta većom količinom 0,5 M rastvora natrijumhlorida, praćeno sa < 3 puta većom količinom vode za ubrizgavanja. Nakon diafiltriranja, rastvor albumina se koncentriše do koncentracije proteina od otprilike 22% ultrafiltriranjem na < + 15°C. Rastvor se razbistri propuštanjem kroz dubinski filter i potom 0,2 [im filter membrane. Dubinski filter se prethodno opere sa vodom za ubrizgavanja.

Potom se 0,0106 g kaprilne kiseline/g proteina i 0,0182 g N-acetil-DL-triptofan/g proteina rastvori u 10% (w/v) natrijum hidroksida i dodaje se rastvoru albumina uz sporo mešanje. Vrednost pH se podesi do 7.0 ± 0,3. Rastvor albumina se podesi na koncentraciju proteina od 200 ± 10g/L dodavanjem vode za ubrizgavanja. Sadržaj natrijuma se podesi na 150 ± 7,5 mmol/L dodavanjem natrijumhlorida. Rastvor se meša bar 9 sati na 58

- 65°C. Rastvor albumina se sterilno filtrira kroz filter membrane

sterilizujućeg stepena nominalne veličine pore od tipično 0,2nm. Ispravnost sterilnog filtera se testira pre i nakon upotrebe odgovarajućim postupkom testa kao što se to preporučuje specifikacijom proizvođača. Sterilno filtrirani albumin se skladišti na +2°C - +25°Cne duže od dve nedelje. Sterilni rastvor se puni upotrebom krajnjeg 0,2 \ im sterilnog filtera pod aseptičkim uslovima u depirogene sudove za infuziju, koji se zatvaraju sa sterilizovanim butil-zaptivačima i zapečate aluminijumskim kapicama. Ispravnost sterilnog filtera se testira pre nakon upotrebe kao što je preporučeno specifikacijom proizvođača. Zapremina punjenja se prati kroz ceo postupak punjenja. Pasterizacija se uradi prema European Pharmacopoeia. Konačni kontejneri se inkubiraju prema European Pharmacopoeia. Nakon perioda inkubacije, vrši se vizuelna inspekcija svih sudova na određenu kontaminaciju, zamućenost, defekte sudova ili zatvarača. Defektni preparati se odbacuju. Svi sudovi se skladište na +2°Cdo +25°C.

Primer 2:

Masa V se suspenduje u, od njene težine, 1,6 većoj težini vode za ubrizgavanja > 6 sati na -2 ± 2 °C. Dodaju se pomoćni filteri proizvodu i preparat se meša 30 minuta. Dubinski filter se prethodno opere sa vodom za ubrizgavanja i potom sa 10% etanolom. Rastvor se razbistri propuštanjem kroz dubinski filter i potonji 0,2 pm filter membrane. Filter se naknadno opere sa 10% etanolom u vodi za ubrizgavanja. Vrednost pH se podesi na 7,4 ± 0,2 sa 3 M rastvora natrijum hidroksida. Ultrafiltriranjem kroz membrane dobija se koncentracija proteina od 8% sa limitom isključenja od 10 kDalton-a. Koncentrat se diafiltrira spram > 3 puta količinom 0,5 M rastvora natrijumhlorida, praćeno sa < 3 puta količinom vode za ubrizgavanja. Nakon diafiltriranja, rastvor albumina se koncentriše do koncentracije proteina od otprilike 26% ultrafiltriranjem na < + 15°C. Rastvor se razbistri propuštanjem kroz dubinski filter i potom 0,2 (im filter membrane. Dubinski filter se prethodno opere sa vodom za ubrizgavanja. Potom se 0,0106 g kaprilne kiseline/g proteina i 0,0182 g N-acetil-DL-triptofan/g proteina rastvori u 10% natrijum hidroksidu i dodaje se rastvoru albumina uz sporo mešanje. Vrednost pH se podesi do 7.0 ± 0,3. Rastvor albumina se podesi na koncentraciju proteina od 250 ± 12g/L dodavanjem vode za ubrizgavanja. Sadržaj natrijuma se podesi na 150 + 7,5 mmol/L dodavanjem natrijumhlorida. Rastvor se meša bar 9 sati na 58 - 65°C. Rastvor albumina se sterilno filtrira kroz filter membrane sterilizujućeg stepena nominalne veličine pore od tipično 0,2 pm. Ispravnost sterilnog filtera se testira pre i nakon upotrebe odgovarajućim postupkom testa kao što se to preporučuje specifikacijom proizvodđača. Sterilno filtrirani albumin se skladišti na +2°C- +25°Cne duže od dve nedelje. Sterilni rastvor se puni upotrebom krajnjeg 0,2 pm stelinog filtera pod aseptičkim uslovima u depirogene sudove za infuziju, koji se zatvaraju sa sterilizovanim butil-zaptivačima i zapečate aluminijumskim kapicama. Ispravnost sterilnog filtera se testira pre nakon upotrebe kao što je preporučeno specifikacijom proizvođača. Zapremina punjenja se prati kroz ceo postupak punjenja. Pasterizacija se uradi prema European Pharmacopoeia. Konačni kontejneri se inkubiraju prema European Pharmacopoeia. Nakon perioda inkubacije, vrši se vizuelna inspekcija svih sudova na određenu kontaminaciju, zamućenost, defekte sudova ili zatvarača. Defektni preparati se odbacuju. Svi sudovi se skladište na +2°C do +25°C.

Primer 3:

Masa V se suspenduje u, od njene težine, 1,6 većoj težini vode za ubrizgavanja > 6 sati na -2 ± 2 °C. Dodaju se pomoćni filteri proizvodu i preparat se meša 30 minuta. Dubinski filter se prethodno opere sa vodom za ubrizgavanja i potom sa 10% etanolom. Rastvor se razbistri propuštanjem kroz dubinski filter i potonji 0,2 pm filter membrane. Filter se naknadno opere sa 10% etanolom u vodi za ubrizgavanja. Vrednost pH se podesi na 7,4 ± 0,2 sa 3 M rastvora natrijum hidroksida. Ultrafiltriranjem kroz membrane dobija se koncentracija proteina od 8% sa limitom isključenja od 10 kDalton-a. Koncentrat se diafiltrira spram > 3 puta količinom 0,5 M rastvora natrijumhlorida, praćeno sa < 3 puta količinom vode za ubrizgavanja. Nakon diafiltriranja, rastvor albumina se koncentriše do koncentracije proteina od otprilike 22% ultrafiltriranjem na manje od + 15°C. Rastvor se razbistri propuštanjem kroz dubinski filter i potom 0,2 pm filter membrane. Dubinski filter se prethodno opere sa vodom za ubrizgavanja. Potom se 0,0106 g kaprilne kiseline/g proteina i 0,0182 g N-acetil-DL-triptofan/g proteina rastvori u 10% natrijum hidroksidu i dodaje se rastvoru albumina uz sporo mešanje. Vrednost pH se podesi do 7.0 + 0,3. Rastvor albumina se podesi na koncentraciju proteina od 200 + 10g/L dodavanjem vode za ubrizgavanja. Sadržaj natrijuma se podesi na 150 ± 7,5 mmol/L dodavanjem natrijumhlorida. Rastvor se meša bar 10 sati na 58 - 65°C. Rastvor albumina se sterilno filtrira kroz filter membrane sterilizujućeg stepena nominalne veličine pore od tipično 0,2 pm. Ispravnost sterilnog filtera se testira pre i nakon upotrebe odgovarajućim postupkom testa kao što se to preporučuje specifikacijom proizvođača. Sterilno filtrirani albumin se skladišti na +2°C - +25°C ne duže od dve nedelje. Rastvor albumina se podešava na koncentraciju proteina od 50 ± 2,5 g/L dodavanjem vode za ubrizgavanja. Vrednost pH se podesi do 7.0 ± 0,3. Sadržaj natrijuma se podesi na 150 ± 7,5 mmol/L dodavanjem natrijumhlorida. Rastvor albumina se skladišti na +2°Cdo + 25°C ne duže od 24 sata nakon punjenja. Sterilni rastvor se puni upotrebom krajnjeg 0,2 pm stelinog filtera pod aseptičkim uslovima u depirogene sudove za infuziju, koji se zatvaraju sa sterilizovanim butil-zaptivačima i zapečate aluminijumskim kapicama. Ispravnost sterilnog filtera se testira pre nakon upotrebe kao što je preporučeno specifikacijom proizvođača. Zapremina punjenja se prati kroz ceo postupak punjenja. Pasterizacija se uradi prema European Pharmacopoeia. Konačni kontejneri se inkubiraju prema European Pharmacopoeia. Nakon perioda inkubacije, vrši se vizuelna inspekcija svih sudova na određenu kontaminaciju, zamućenost, defekte sudova ili zatvarača. Defektni preparati se odbacuju. Svi sudovi se skladište na +2°C do +25°C.

Prekalikrein aktivator

Prekalikrein aktivator (PKA) aktivira prekalikrein u kalikrein i može se ogledom utvrditi njegova sposobnost da čepa hromoforu od supstrata sintetičkog peptida tako da se brzina cepanja može izmeriti spektrofotometrički i koncentracija PKA izračunati upoređenjem sa referentnim preparatom kalibriranim u Internacionalnim Jedinicama (IU).

Internacionalna jedinica je aktivnost navedene količine Internacionalnog standarda koja sadrži zamrznuti-osušeni prekalikrein aktivator. Ekvivalentnost u Internacionalnim jedinicama Internacionalnog standarda je utvrđena od strane VVorld Healt Organization (Svetska zdravstvena organizacija).

Pripremanje prekalikrein supstrata

Da se izbegne aktiviranje koagulacije, krv ili plazma koji se koriste za pripremanje prekalikreina mora doći u kontakt samo sa plastičnim ili silikonom-tretiranim staklenim površinama. Staviti 9 zapremina ljudske krvi u 1 zapreminu antikoagulantnog rastvora (ACD, CPD ili 38 g/L natrijumcitrata) kome je dodat 1 mg/mL heksadimetrin bromida. Smeša se centrifugira pri 3600 g tokom 5 minuta. Odvojiti plazmu i centrifugirati ponovo pri 6000 g tokom 20 minuta da se natalože krvno pločice. Odvojiti sa krvnim pločicama siromašnu plazmu i dijalizovati spram 10 zapremina pufera A 20 h. Upotrebiti dijalizovanu plazmu na koloni za hromatografiju koja sadrži agaroza-DEAE radi jonsko izmenjivačke hromatografije koja je uravnotežena u puferu A i jednaka je dvostrukoj zapremini plazme. Elutovati sa kolone puferom A na 20 mL/cm<2>/h. Sakupiti eluat u frakcijama i zabeležiti absorbancu na 280 nm (2.2.25). Sakupiti u lokve frakcije koje sadrže prvu najvišu vrednost proteina tako da je zapremina lokve otprilike 1,2 puta veća od zapremine krvnim pločicama siromašne plazme.

Testirati lokvu supstrata na odsustvo kalikrein aktivnosti mešanjem 1 dela sa 20 delova prethodno zagrejanog rastvora hromogenog supstrata koji se ima upotrebiti u ogledu i inkubirati na 37 °C 2 minuta. Supstrat je odgovarajući ukoliko je povećanje absorbance manje od 0,001 po minuti. Dodati rastvoru u lokvi 7 g/L natrijumhlorida i filtrirati upotrebom filtera membrane (poroznost 0,45 (im). Zalediti filtrat u delovima i skladištiti na - 25 °C; supstrat može biti zamrznut-osušen pre skladištenja.

Izvesti sve postupke od početka hromatografije do zaleđivanja u delovima tokom jednog radnog dana.

Ogled

Ogled se pretpostavljeno obavlja upotrebom automatskog analizatora enzima na 37 °C, sa zapreminama, koncentracijom supstrata i vremenima inkubacije podešenim tako da je brzina reakcije linearna bar do 35 lU/mL. Standardi, uzorci i prekalikrein supstrat mogu biti razblaženi ukoliko je to neophodno upotrebom pufera B.

Inkubirati razblažene standarde ili uzorke sa prekalikrein supstratom 10 minuta tako da zapremina nerazblaženog uzorka ne prelazi 1/10 ukupne zapremina inkubacione smeše da se izbegnu greške izazvane varijaciojom u jonskoj snazi i pH u inkubacionoj smeši. Inkubirati smešu ili njen deo sa bar jednakom zapreminom rastvora odgovarajućeg sintetičkog hromogenog supstrata, za koji je poznato da je specifičan za kalikrein (na primer, N-benzoil-L-prolil-L-fenilalanil-L-arginin 4-ntroanilid acetata R ili D-prolil-L-fenilalanil-L-arginin-4-nitroanilid-dihidrohlorid R), rastvoren u puferu B. Zabeležiti brzinu promene u absorbanci po minutu tokom 2 minuta do 10 minuta pri talasnoj dužini specifičnoj za supstrat koji se upotrebljava. Pripremiti prazan ogled za svaku smešu uzorka ili standarda upotrebom pufera B umesto prekalikrein supstrata.

Korigovati AA/min oduzimanjem vrednosti dobijene za korespondirajući prazni ogled. Iscrtati krivu kalibracije upotrebom tako dobijenih vrednosti za referentno pripremanje i svaku pojedinačnu koncentraciju; upotrebom krive utvrditi PKA aktivnost preparata koji se ima ispitati.

Rastvoriti sastojke u vodi, podesiti pH na 8,0 sa 2 M hlorovodonične kiseline i razblažiti do 1000 mL sa vodom.

Rastvoriti sastojke u vodi, podesiti pH na 8,0 sa 2 M hlorovodonične kiseline i razblažiti do 1000 mL sa vodom.

Claims (7)

1. Postupak proizvodnje albuminom obogaćene frakcije koja ima redukovani sadržaj prekalikrein aktivatora (PKA),naznačen time,što se sastoji od koraka: (a) rekonstitucija mase V, (Cohn-ovo deljenje na frakcije), (b) izvođenje koraka koncentracije frakcije dobijene u koraku (a), (c) zagrevanje frakcije dobijene u koraku (b) u rasponu od 50°C do 70°C radi dobijanja dovoljnog vremena da se frakcija pasterizuje, i (d) opciono punjenje dobijene frakcije za upotrebu.

2. Postupak prema zahtevu 1,naznačen time,što se nakon punjenja obavlja drugi korak pasterizacije.

3. Postupak prema zahtevu 1 i/ili 2,naznačen time,što je izveden korak inkubacije.

4. Postupak prema zahtevu 3,naznačen time,što je korak inkubacije obavljen pod sledećim uslovima tokom 10 dana na 30-32 °C ili tokom 4 nedelje na 20-25 °C.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 4,naznačen time,što se pasterizacija obavlja tokom vremenskog perioda od bar 9h pri temperaturi od 58 do 65 °C.

6. Frakcija koja sadrži albumin koja ima redukovani prekalikrein aktivator (PKA),naznačena time,što se može dobiti postupkom bar jednog od zahteva 1 do 5.

7. Albumin prema zahtevu 6,naznačen time,što ima PKA sadržaj manji od 12 lU/mL, pretpostavljeno 10 lU/mL, pri čemu je PKA utvđen prema European Pharmacopeia, četvrto izdanje.