Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS20050530A - Vezivna sredstva koja inhibiraju miostatin - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS20050530A - Vezivna sredstva koja inhibiraju miostatin - Google Patents

Vezivna sredstva koja inhibiraju miostatin

Info

Publication number
RS20050530A
RS20050530A YUP-2005/0530A YUP53005A RS20050530A RS 20050530 A RS20050530 A RS 20050530A YU P53005 A YUP53005 A YU P53005A RS 20050530 A RS20050530 A RS 20050530A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peptide
amino acid
myostatin
binding
neutral
Prior art date
Application number
YUP-2005/0530A
Other languages
English (en)
Inventor
Hq Han
Hosung Min
Thomas Charles Boone
Original Assignee
Amgen Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc., filed Critical Amgen Inc.,
Publication of RS20050530A publication Critical patent/RS20050530A/sr
Publication of RS52815B publication Critical patent/RS52815B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/06—Anabolic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Ovaj pronalazak obezbeđuje vezivna sredstva koja uključuju peptide sposobne da vezuju miostatin i inhibiraju njegovo delovanje. U jednom aspektu, vezivno sredstvo uključuje najmanje jedan peptid koji vezuje miostatin, a koji je direktno ili indirektno vezan za najmanje jedan vehikulum kao što je polimer ili neka Fc oblast. Vezivna sredstva iz ovog pronalaska produkuju povećanje posne mišićne mase kada se primenjuju na životinjama, a smanjuju odnos između sala i mišića. Terapeutske kompozicije koje sadrže vezivna sredstva iz ovog pronalaska su korisne za lečenje oboljenja u kojima dolazi do gubitka mišića i drugih metaboličkih poremećaja, uključujući dijabetes i gojaznost.

Description

VEZIVNA SREDSTVA KOJA INHIBIRAJU MIOSTATIN
Ova prijava traži zaštitu sa pozivom na United States privremenu prijavu serijski broj 60/435,923, prijavljenu 20. decembra 2002., oslanjajući se na celokupno otkriće i uz inkorporiranje u referencama.
POLJE PRONALASKA
Pronalazak se odnosi na faktore rasta, a posebno na miostatin kao faktor rasta i sredstva koja vezuju miostatin i inhibiraju njegovo delovanje.
POREKLO PRONALASKA
Miostatin, takođe poznat kao faktor 8 rasta/diferencijacije (GDF-8), je član familije transformirajućeg faktora -[3 rasta (TGF-(3) za koji se zna daje uključen u regulaciju mase skeletnih mišića. Većina članova TGF-P-GDF familije se ne-specifično pojavljuju u mnogim tipovima tkiva i ispoljavaju različita pleitrofična delovanja. Međutim, miostatin se u velikoj meri pojavljuje u ćelijama rasta i tkivu skeletnih mišića kod odraslih i igra osnovnu ulogu u nekontrolisanom rastu skeletne muskulature (Mc Pherron i sardnici, Nature (London) 387, 83-90 (1997.)). Nedavne studije, međutim, ukazuju da pojava niskih vrednosti miostatina može da se registruje u kardijačnom, adipoznom i pre-adipoznom tkivu.
Proten miostatin je dobro sačuvan u evoluciji (Mc Pherron i sardnici PNAS USA 94:12457-12461 (1997.)). Biološki aktivan C-terminalni region miostatina ima 100 posto identičnu sekvencu sa sekvencama ljudi, miševa, pacova, goveda, pileta i ćurke. Takođe se čini daje funkcija niostatina sačuvana kroz vrste. Ovo je evidentirano iz fenotipova životinja koje imaju mutaciju u miostatin genu. Dve vrste goveda, Belgian Blue (Hanset R., Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production, eds, King, J.W.G. & Menissier, F. (Nijhoff, The Hague, The Netherlands), strane 437-449) i Piedmontese (Masoero, G.& Poujardieu, B, Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production, eds., Kin, J.W.G. & Menissier, F. (Nijhoff, The Hague, The Netherlands), strane 450-459) su karakteristične po fenotipu "udvostručene mišićavosti" i povećanju mišićne mase. Za ove vrste je pokazano da imaju mutacije u regionu kodiranja miostatin gena (Mc Pherron i saradnici (1997.) (kao ranije). Dodatno, miš kod koga je ciljano izbrisan gen koji kodira miostatin (Mstn) pokazuje dramatično povećanje mišićne mase bez odgovarajućeg porasta masnoće. Pojedinačni mišići Mstn"<7>" miša su teži aproksimativno 100 do 200 procenata u odnosu na kontrolne životinje, stoje posledica hipertrofije i hiperplazije mišićnog vlakna (Zimmers i saradnici, Science 296, 1486 (2002.)).
Primena miostatina na izvesnim vrstama miša je pokazala da dolazi do stanja koja su slična oboljenjima kod kojih se gubi mišićna masa, kao što su, na primer, kancer, AIDS i distrofija mišića. Davanje miostatina u obliku CHO ćelija koje produkuju miostatin mišu bez timusa dovodi do mršavljenja uz visok stepen gubitka mase, smanjenja skeletne mišićne mase do 50% uz dodatni gubitak masti i ozbiljne hipoglikemije (Zimmers i saradnici, kao ranije).
Gubitak miostatina ima za rezultat retenciju mišićne mase i smanjenje akumulacije masti sa starenjem. Pokazano je daje povećanje mase adipoznog tkiva i smanjenje mišićne mase sa godinama u proporciji sa vrednostima miostatina kako je određeno upoređivanjem masti i mišićne mase kod Mstn<+/+>sa Mstn"<7>" odraslog onesvešćenog miša ( Mc Ferron i saradnici, J. Clin. Invest. 109, 595 (2002.)). Mstn'</>' miša pokazuje smanjenje akumulacije masti sa godinama u poređenju sa Mstn+/+ miša.
Miostatin može dodatno da ima ulogu u održavanju vrednosti glukoze u krvi i može da utiče na razvoj dijabetesa u nekim slučajevima. Na primer, poznato je da je rezistencija skeletnih mišića na preuzimanje insulina stimulisanog glukozom najranija poznata manifestacija ne-insulin-zavisnog (tip 2) dijabetes melitusa (Corregan i saradnici, Endocrinology, 128: 1682 (1991.)). Danas je poznato da nedostatak miostatina delimično umanjuje fenotipove gojaznosti i dijabetesa kod dva modela miševa, letalan žuti agouti (A<y>) (Yen i saradnici, FASEB J.8:479 (1994.)) i gojazan (Lep<ob/ob>). Akumulacija masti i ukupna telesna masa A<y/a>Mstn"<7>" dvostruko mutantnog miša je dramatično smanjena u poređenju sa A<y/a>Mstn<+/+>miša (Mc Ferron i saradnici (2002.) kao ranije). Dodatno, vrednosti glukoze u krvi A<y/a>Mstn"<7>" miša je dramatično niža nego kod A<y/a>Mstn<+/+>miša nakon egzogenog dodavanja glukoze, što ukazuje da smanjenje miostatina poboljšava metabolizam glukoze. Slično tome, Lep<ob/ob>Mstn"<7>" miša pokazuje smanjenje akumulacije masti kada se uporedi sa Lep<ob7ob>Mstn<+7+>fenotipom.
Prema tome, postoje brojne evidencije kod životinja sa povećanim pojavljivanjem fenotipova i onesvešćenih životinja da miostatin može da doprinese brojnim metaboličkim oboljenjima, uključujućroboljenja koja dovode do gubitka mišićne mase, dijabetesa, gojaznosti i hiperglikemije.
KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na vezivna sredstva koja vezuju miostatin i inhibiraju njegovo delovanaje. Vezivna sredstva obuhvataju najmanje jedan peptid koji je sposoban da veže miostatin. Peptidi koji vezuju miostatin su preferirano dugački između približno 5 i približno 50 amino kiselina, još pogodnije između približno 10 i 30 amino kiselina, a najpoželjnije je da su dugački između približno 10 i 25 amino kiselina. U jednom aspektu, peptid koji vezuje miostati obuhvata sekvencu amino kiseline WMCPP (SEQ ID NO:633). U narednom aspektu, peptidi koji vezuju miostatin obuhvataju sekvencu amino kiseline Caia?Wa3 WMCPP ( SEQ ID NO:352), pri čemu suaua2i a3izabrani od neutralne hidrofobne, neutralne polarne ili bazne amino kiseline. U narednom aspektu, peptid koji vezuje miostatin obuhvata sekvencu Cbib?Wb^ WMCPP ( SEQ ID NO:353\ pri čemu je b, izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R; b2 je izabran od bilo koje R, S ili Q; b3 je izabran od bilo koje P, R i Q i pri čemu je peptid dugačak između 10 i 50 amino kiselina i njihove fiziološki prihatljive soli. U narednom aspektu, peptid koji vezuje miostatin uključuje formulu:
CiC7c^C4CsCfiCc7c«Wcc) WMCPPcinCiiCi7Cn(SEO ID NO:354), pri čemu je:
cinema ili je bilo koja amino kiselina;
c2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c4nema ili je bilo koja amino kiselina;
c5nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c6nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
c7 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
c8 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
c9 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; i
Ciodo Cn je bilo koja amino kiselina; i pri čemu je peptid dugačak između 20 i 50 amino kiselina;i njihove fiziološki prihvatljive soli.
Naredni aspekt peptida koji vezuje miostatin obuhvata formulu: did7d^dtd^Cc7cxWdg WMCPPd1ndiidndn(SEO ID NO:355), pri čemu je: d!nema ili je bilo koja amino kiselina;
d2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
d3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
d4nema ili je bilo koja amino kiselina;
dsnema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
d6nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
d7 je izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R;
d8 je izabran od bilo koje R, S,Q;
d9 je izabran od bilo koje P, R i Q, i di0do doje izabrana od bilo koje amino kiseline, i pri čemu je peptid dugačak između 20 i 50 amino kiselina; i njihove fiziološki prihvatljive soli.
Naredni aspekti vezivnih sredstava obuhvataju najmanje jedan od sledećih peptida: (1) peptid koji je sposoban da veže miostatin, pri čemu peptid uključuje sekvencu WYe,e2Ye3G(SEQ ID NO: 356)
pri čemu je eiP, S ili Y,
e2 je C ili Q, i
e3je G ili H, pri čemu je peptid dugačak između 7 i 50 amino kiselina i njihove fiziološki prihvatljive soli;
(2) peptid koji je sposoban da veže miostatin, pri čemu peptid uključuje sekvencu f,EMLf2SLf3f4LL, (SEQ ID NO: 455)
pri čemu je fi M ili I,
f2 je bilo koja amino kiselina,
f3 je L ili F,
f4jeE,QiliD;
i pri čemu je peptid dugačak između 7 i 50 amino kiselina; i njihove fiziološki prihvatljive soli;
(3) peptid koji je sposoban da veže miostatin, pri čemu peptid obuhvata sekvencu Lg1g2LLg3g4LL(SEQ ID NO: 456), pri čemu
g,jeQ, DiliE,
g2jeS, Q,Dili E,
g3 je bilo koja amino kiselina,
g4 je L, W, F ili Y i pri čemu je peptid dugačak između 8 i 50 amino kiselina; i njihove fiziološki prihvatljive soli;
(4) peptid koji je sposoban da veže miostatin, pri čemu peptid uključuje sekvencu hih^^hsb^li/hghg (SEQ ID NO: 457), pri čemu
h, je Rili D,
h2 je bilo koja amino kiselina,
h3jeA, T, S ili Q,
I14 je L ili M,
h5 je L ili S,
h6 je bilo koja amino kiselina,
h7 je F ili E,
h8je W, Fili C,
h9 je L, F, M ili K,
i pri čemu je peptid dugačak između 9 i 50 amino kiselina; i njihove fiziološki prihvatljive soli.
U jednom aspektu, vezivna sredstva iz ovog pronalaska dalje uključuju najmanje jedan vehikulum kao što je polimer ili neki Fc domaćin i mogu dalje da uključe najmanje jednu sekvencu linkera. U ovom aspektu, vezivna sredstva iz ovog pronalaska su sastavljena tako daje najmanje jedan peptid koji vezuje miostatin vezan za najmanje jedan vehikulum. Peptid ili peptidi su vezani direktno ili indirektno preko sekvence linkera za vehikulum na N-terminalu, C-terminalu ili na sidekain amino kiselini peptida. U ovom aspektu, vezivna sredstva ovog pronalaska imaju sledeću opštu strukturu: (X 1 )a-F 1 -(X 2)b, ili njene multimere;
I 12
pri čemu je F vehikulum, a X i X su svaki nezavisno izabrani od
-(L')c-P<1>; -(l'^-<p>'-clV<p2>;
-(LVP'KLVP^LVP3; i
-(L^-P'KLV<p>'-C<L>V<p>^L<4>)^<4>;
pri čemu su P , P , P i P peptidi koji mogu da vezuju miostatin; a
L1, L<2>, L<3>i L4 su svaki ponaosob linkeri; a a, b, c, d, e i f su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom daje bar jedan od a i b 1, i njihove fiziološki prihvatljive soli.
U različitim aspektima vezivnih sredstava koja imaju ovu opštu strukturu,
peptidi P<1>, P<2>, P<3>i P<4>mogu nezavisno da budu izabrani od jednog ili više bilo kog peptida koji obuhvata sekvence koje su prethodno date. P<1>, P<2>, P<3>i P<4>su nezavisno izabrani od jednog ili više peptida koji obuhvataju bilo koju od sledećih sekvenci: SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID
NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 456 ili SEQ ID NO: 457.
U narednom aspektu, vezivna sredstva obuhvataju peptide koji su spojeni sa nekim Fc područjem ili direktno ili indirektno i na taj način obezbeđujua tela peptida. Tela peptida iz ovog pronalaska pokazuju veliki afinitet vezivanja za miostatin i mogu da inhibiraju delovanje miostatina, što je pokazano iin vitro,koristeći ispitivanja na bazi ćelija, i na životinjama.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koje uključuju polinukleotide za kodiranje peptida, tela peptida, varijanti i derivata peptida i tela peptida iz ovog pronalaska.
Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski prihvatljive kompozicije koje uključuju jedno ili više vezivnih sredstava iz ovog pronalaska.
Vezivna sredstva iz ovog pronalaska inhibiraju delovanje miostatinain vitro
iin vivo.Vezivna sredstva iz ovog pronalaska povećavaju posnu mišićnu masu kod tretiranih životinja i procentualno smanjuju masnu masu u odnosu na ukupnu težinu životinja. Vezivna sredstva za miostatin iz ovog pronalaska povećavaju čvrstinu mišića kod tretiranih modela životinja.
Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za inhibirianje delovanja miostatina kod životinja, uključujući ljude, primenom efektivne doze jednog ili više vezivnih sredstava na subjektu. Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za povećanje posne mišićne mase kod životinja, uključujući ljude, primenom efektivne doze jednog ili više vezivnih sredstava. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupke za lečenje oboljenja povezanih sa miostatinom primenom efektivne doze jednog ili više vezivnih sredstava za miostatin u obliku farmaceutski prihvatljive kompozicije na subjektu. Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje oboljenja u kojima dolazi do gubitka mišićne mase, uključujući distrofiju mišića, gubljenje mišićne mase kod kancera, AIDS, reumatoidni artritis, oštećenje bubrega, uremiju, hronično oštećenje srca, sarkopeniju povezanu sa godinama, dugotrajnu vezanost za krevet, oštećenje kičmene moždine, šlog, frakturu kosti. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupke za lečenje metaboličkih oboljenja, uključujući gojaznost, dijabetes, hiperglikemiju i gubitak koštane mase.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za povećanje mišićne mase kod životinja koje se koriste za ishranu primenom efektivne doze jednog ili više vezivnih sredstava za miostatin na životinji.
Ovaj pronalazak obezbeđuje ispitivanja koja koriste jedno ili više vezivnih sredstava za miostatin za identifikaciju i kvantitativno određivanje miostatina u uzorku. Ispitivanje može biti dijagnostička analiza za merenje ili praćenje nivoa miostatina kod jedinki sa poremećajem ili bolešću povezanom sa miostatinom.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 pokazuje delovanje miostatina izmereno delovanjem pojavljene luciferaze (y-osa) u odnosu na koncentraciju (x-osa) za TN8-19 peptid QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO: 32) i TN8-19 tela peptida (pb) da se odredi IC5oza svaki, koristeći ispitivanje G2C12 pMARE luciferaze, kako je opisano u niže datim Primerima. Telo peptida ima nižu IC50vrednost u odnosu na peptid.
Slika 2 je grafik koji pokazuje povećanje ukupne telesne težine za CD1 nu/nu miša koji je tretiran sa rastućim dozama lx mTN8-19-21 tela peptida u toku četrnaest dana, u poređenju sa mišem koji je tretiran sa huFc kontrolnim uzorkom, kako je opisano u Primeru 8.
Slika 3A pokazuje povećanje mase gastroknemius mišića pri autopsiji kod miša tretiranog kao na Slici 2 (Primer 8). Slika 3B pokazuje povećanje posne mase koje je određeno pomoću NMR 0-tog dana u poređenju sa 13-tim danom eksperimenta kako je opisano u Primeru 8.
Slika 4 pokazuje povećanje posne telesne mase kako za CD1 nu/nu miša koji je dve nedelje tretiran injekcijama sa povećanim dozama lx mTN8-19-32 tela peptida, kako je određeno pomoću NMR 0-tog dana i 13-tog dana eksperimenta koji je opisan u Primeru 8.
Slika 5A pokazuje povećanje posne telesne mase kako za CD1 nu/nu miša koji je dve nedelje tretiran injekcijama sa povećanim dozama lx mTN8-19-7 u poređenju sa 2x mTN8-19-7 i u poređenju sa kontrolnom životinjom za 35 dana kako je opisano u Primeru 8. Slika 5B pokazuje povećanje težine posnog dela trupa pri autopsiji za verzije lx i 2x sa 1 mg/kg i 3 mg/kg, u poređenju sa životinjama koje su dobijale vehikulum (xuFc) (kontrolne životinje).
Slika 6A pokazuje povećanje posne mišićne mase u odnosu na telesnu težinu kod zrelogmdxmiša koji je nakon sazrevanja tretiran sa lx mTN8-19-33 telom peptida ili huFc vehikulumom sa 10 mg/kg svaki dan u toku tri meseca. Slika 6B pokazuje promenu u masnoj masi u poređenju sa telesnom težinom koja je određena pomoću NMR za istog miša nakon 3 meseca tretmana.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbeđuje vezivna sredstva koja su sposobna da vezuju miostatin i inhibiraju njegovo delovanje. Sredstva koja vezuju miostatin mogu da se koriste u ispitivanjima, za identifikaciju, kvantitativno određivanje ili praćenje vrednosti miostatina kod životinja. Sredstva iz ovog pronalaska koja vezuju miostatin redukuju delovanje miostatina. Sredstva iz ovog pronalaska koja vezuju miostatin povećavaju posnu mišićnu masu kod životinja, smanjuju količinu masti u odnosu na telesnu težinu i povećavaju čvrstinu mišića. Sredstva iz ovog pronalaska koja vezuju miostatin mogu da se koriste za lečenje različitih metaboličkih poremećaja u kojima miostatin igra ulogu, uključujući oboljenja kod kojih dolazi do gubljenja mišićne mase, kao što je distrofija mišića, gubljenje mišićne mase zbog kancera, AIDS, reumatoidni artritis, oštećenje bubrega, uremija, hronično oštećenje srca, dugotrajna vezanost za krevet, oštećenje kičmene moždine, šlog i sarkopenija povezana sa godinama, kao i druga metabolička oboljenja, uključujući dijabetes, gojaznost, hiperglikemiju i gubitak koštane mase, primenom na subjektu terapeutske doze jednog ili više vezivnih sredstava u obliku farmaceutski prihvatljive kompozicije.
Miostatin
Miostatin, faktor rasta, takođe poznat kao GDF-8, je poznat kao negativni regulator tkiva skeletne muskulature. Miostatin se sintetiše u inaktivnom obliku preproteina koji se aktivira proteolitičkim cepanjem (Zimmers i saradnici, kao ranije) (2002.)). Prekursor proteina se čepa tako da se dobija neki HN2-terminalni inaktivni prooblik i aproksimativno protein sa amino kiselinom 109 i COOH-terminalni položajem u obliku homodimera približno 25 kDa, koji je zreo, aktivni oblik (Zimmers i saradnici, kao ranije) (2002.)). Danas se veruje da sazreli dimer cirkuliše u krvi kao inaktivni latentni kompleks vezan za propeptid (Zimmers i saradnici, kao ranije) (2002.)).
Kako se ovde koristi, naziv "miostatin potpune dužine" se odnosi na sekvencu ljudskog preproteina potpune dužine koju su opisali Mc Pherron i saradnici, kao ranije (1997.), a odnosi se i na polipeptide potpune dužine, uključujući alelične varijante i homologe unutar vrsta koje su takođe opisali Mc Pherron i saradnici, kao ranije (1997.). Kako se ovde koristi, naziv "prooblik" ili "propeptid" se odnosi na inaktivni protein sa HN2-terminalom koji se čepa tako da oslobađa aktivni protein sa COOH-terminalom. Kako se ovde koristi, naziv "miostatin" ili "zreo miostatin" se odnosi na zreo, biološki aktivan polipeptid sa COOH-terminalom u obliku monomera, dimera ili multimera ili u nekom drugom obliku. "Miostatin" ili "zreo miostatin" se takođe odnosi na fragmente biološki aktivnog miostatina kao i na polipeptide, uključujući aleličke varijante, isprepletane varijante i spojene peptide i polipeptide. Objavljeno je da zreo miostatin protein sa COOH-terminalom ima 100% sekvence identične sa mnogim vrstama, uključujući čoveka, miša, pile, svinju, ćurku i pacova (Lee i saradnici, PNAS 98, 9306 (2001.)). Miostatin može ili ne može da obuhvati dodatne terminalne ostatke, kao što su obeležene sekvence ili ostaci metionina i lizina i/ili prikačene ili spojene sekvence proteina u zavisnosti od načina izrade.
Kako se ovde koristi, naziv "sposoban da vezuje miostatin" ili "ima afinitet da vezuje miostatin" se odnosi na vezivno sredstvo ili peptid koje se vezuje za miostatin kako je pokazano u ELISA testu faga, BIAcore® ili KinExA™ analizama koje su opisane u niže datim Primerima.
Kako se ovde koristi, naziv "sposoban da modifikuje delovanje miostatina" se odnosi na delovanje nekog sredstva ili kao agonista ili kao antagonista u odnosu na najmanje jedno biološko delovanje miostatina. Kako se ovde koristi, "agonist" ili "mimetičko" delovanje se odnosi na sredstvo koje ima biološko delovanje uporedivo sa proteinom koji je u interakciji sa željenim proteinom, kako je opisano, na primer, u internacionalnoj prijavi WO 01/83525, objavljenoj 2. maja 2001., koja je ovde inkorporirana u referenci.
Kako se ovde koristi, naziv "inhibiranje delovanja miostatina" ili "ima antagonističko delovanje" se odnosi na sposobnost peptida ili vezivnog sredstva da redukuju ili blokiraju delovanje ili signaliziranje miostatina, kako je pokazano ili uin vitrotestovima, kao što je, na primer, ispitivanje delovanja pMARE C2C12 ćelije na bazi miostatina iliin vivotestiranjem životinje, kako je opisano u daljem tekstu.
Strkturasredstavakoja vezuju miostatin
U jednom aspektu, vezivna sredstva iz ovog pronalaska uključuju najmanje jedan peptid za vezivanje miostatina koji je kovalentno vezan za najmanje jedan vehikulum, kao što je polimer ili neka Fc oblast. Vezivanje peptida za koje je vezan miostatin za najmanje jedan vehikulum treba da poveća efikasnost vezivnog sredstva kao terapeutskog sredstva povećavanjem biološke aktivnosti sredstva i/ili smanjenjem degradacijein vivo,povećavanjem polu-životain vivo,redukcijom toksičnosti ili imunogeničnostiin vivo.Vezivna sredstva ovog pronalaska mogu dalje da uključe vezivnu sekvencu koja sadrži peptid i vehikulum. Peptid ili peptidi su vezani direktno ili indirektno preko sekvence linkera za vehikulum na N-terminalu, C-terminalu ili sidekain amino kiselini peptida. U ovom aspektu, vezivna sredstva iz ovog pronalaska imaju sledeću strukturu: (X')a-F'-(X<2>)b, ili njene multimere;
1 12
pri čemu je F vehikulum, a X i X su svaki nezavisno izabrani od
-(LVP1; -(LVP'-CLVP2;
-( V) c- F]-( L2) d- T>2-( L\- P3; i
-(L^-P'-^d-P^LVP<3->^<4>)^<4>;
pri čemu su P<1>, P<2>, P<3>i P<4>peptidi koji mogu da vezuju miostatin; a
L<1>, L<2>, L<3>i L<4>su svaki ponaosob linkeri; a a, b, c, d, e i f su svaki nezavisno 0 ili 1 pod uslovom daje bar jedan od a i b 1.
Bilo koji peptid koji sadrži cisteinil ostatak može da bude unakrsno vezan sa narednim peptidom koji sadrži Cys, ili oba mogu da budu vezana za vehikulum. Bilo koji peptid koji ima više od jednog Cys ostatka može isto tako da formira intrapeptidnu disulfidnu vezu.
U jednom aspektu, vehikulum je neka Fc oblast, kako je definisano u daljem tekstu. Ovaj aspekt se još naziva i "telo peptida". Kako se ovde koristi, naziv "telo peptida" se odnosi na molekulu koja uključuje antitelo Fc oblasti vezano za najmanje jedan peptid. Produkcija tela peptida je generalno opisana u PCT publikaciji WO 00/24782, objavljenoj 4. maja 2000., koja je ovde inkorporirana u reference. Primeri tela peptida su dati kao lx i 2x konfiguracije sa jednom kopijom i dve kopije peptida (vezane zajedno) tim redom, kako je opisano u niže datim Primerima.
Peptidi
Kako se ovde koristi, naziv "peptid" se odnosi na molekule od približno 5 do približno 90 amino kiselina vezanih peptidnim vezama. Peptidi iz ovog pronalaska imaju dužinu preferirano između približno 5 do približno 50 amino kiselina, još poželjnije između približno 10 i 30 amino kiselina, a najpoželjnije između probližno 10 i 25 amino kiselina i mogu da se vezuju za protein miostatina.
Peptidi ovog pronalaska mogu da uključe deo sekvence prirodno dobijenih proteina, mogu da uključe slučajno izabrane sekvence izdvojene od prirodno dobijenih proteina ili mogu da uključe potpuno proizvoljne sekvence. Peptidi iz ovog pronalaska mogu da se generišu bilo kojim postpukom koji je poznat u tehnici, uključujući hemijske sinteze, digestiju proteina ili rekombinovanu tehnologiju. Prikaz faga i proveravanje RNA-peptida i druge slične tehnike proveravanja su posebno korisne za generisanje peptida koji su sposobni da vezuju miostatin. Tehnologija prikaza faga je, na primer, opisana u Scott i saradnici, Science 249: 386 (1990.); Devlin i saradnici, Science 249: 404 (1990.); US Patent broj 5.223,409, objavljen 29. juna 1993.; US Patent broj 5,733,731 objavljen 31. marta 1998.; US Patent broj 5,498,530 objavljen 12. marta 1996.; US Patent broj 5,432,018 objavljen 11. jula 1995.; US Patent broj 5,338,665 objavljen 16. avgusta 1994.; US Patent broj 5,922,545 objavljen 13. jula 1999.; WO 96/40987, objavljena 19. decembra 1996., i WO 98/15833, objavljena 16. aprila 1998., koje su sve ovde inkorporirane u reference. Korišćenjem datoteke za fag, sekvence slučajno izabranog peptida se iskazuju fuzijom sa omotačem proteina filamentoznog faga. Uobičajeno, iskazani peptidi su podeljeni po ili specifičnom ili ne-specifičnom afinitetu prema ciljanoj molekuli. Zadržani fagi mogu da budu obogaćeni pomoću više uzastopnih ciklusa prečišćavanja i repropagacije afiniteta. Najbolje vezani peptidi se uzimaju za dalje analize, na primer, korišćenjem ELISA faga, kako je opisano u daljem tekstu, a zatim se sekvencioniraju. Opciono mogu da se kreiraju i provere podaci o mutagenezama za narednu optimizaciju sekvenci najboljih vezivnih sredstava (Lowman, Ann Rev Biophvs Biomol Struct 26: 401-24 (1997.)).
Ostali postupci generisanja peptida koji vezuju miostatin obuhvataju tehnike dodatne selekcije po afinitetu koje su poznate u tehnici. Peptidi iz datoteke mogu da se spoje u karboksilnim terminusima lak represora i da se javeu E. coli.Drugi postupak na baziE. colidozvoljava ispoljavanje na spoljašnjoj ćelijskoj membrani fuzijom sa lipoproteinom povezanim sa peptidoglikanom (PAL). U daljem tekstu, ovi i slični postupci se zbirno označavaju kao" E. coliispoljavanje". U narednom postupku, translacija proizvoljno izabrane RNA se zaustavlja pre oslobađanja ribozoma što za rezultat ima da su polipeptidi iz datoteke i dalje vezani sa svojim povezanim RNA. U daljem tekstu, ovaj i slični postupci se zbirno označavaju kao "ispoljavanje ribozoma". Drugi postupci uključuju hemijske veze peptida za RNA. Videti, na primer, Roberts i Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94: 12297-303 (1997.). U daljem tekstu, ovaj i slični postupci se zbirno označavaju kao "proveravanje RNA-peptid". Postupci proveravanja dva-hibridna kvasca takođe mogu da se koriste za identifikaciju peptida iz pronalaska koji se vezuju za miostatin. Dodatno, razvijene su grupe hemijski izdvojenih peptida u kojima su peptidi imobilizirani na stabilnom, ne-biološkom materijalu kao što su štapići polietilena ili smole permeabilne za rastvarač. Druga grupa hemijski izdvojenih peptida koristi fotolitografiju za proveru peptida imobiliziranih na staklenim pločicama. U daljem tekstu, ovaj i slični postupci se zbirno označavaju kao "proveravanje hemijskog peptida". Provera hemijskog peptida može da bude prednost tako što dozvoljava upotrebu D-amino kiselina i drugih analoga, kao i ne-peptidnih elemenata. Oba, i biološki i hemijski postupak, su objavljeni u Wells and Lowman, Curr Opin Biotechnol 3: 355-62 (1992.).
Dodatno, selektovani peptidi koji su sposobni da vezuju miostatin mogu dalje da se poboljšavaju pomoću "racionalnog dizajna". U ovom pristupu, vrše se postepene izmene na sekvenci peptida i uočen je efekat supstitucije na afinitet ili specifičnost vezivanja peptida ili na neke druge osobine peptida pri odgovarajućim analizama. Jedan primer ove tehnike je supstitucija po jednog ostatka sa alaninom, što je označeno kao "put alanina" ili "proveravanje alanina". Kada su zamenjena dva ostatka, to se označava kao "dvostruki put alanina". Nastali peptid koji sadrži supstituisane amino kiseline se ispituje na pojačano delovanje ili neka dodatna poboljšanja osobina.
Dodatno, analiza strukture protein-protein interakcije može takođe da se koristi za predlog peptida koji podražavaju interakciju većeg proteina. U takvoj analizi, kristalna struktura proteina može da sugeriše identitet i relativnu orijentaciju kritičnih ostataka proteina od kojih može da se dizajnira peptid. Videti, na primer, Takasaki i saradnici, Nature Biotech 15: 1266 (1977.). Ovi postupci mogu takođe da se koriste za istrživanje interakcije između ciljanog proteina i peptida izabranog pojavom faga ili drugim procesima selekcije afiniteta, na taj način sugerišući dalje modifikacije peptida kako bi se povećao afinitet vezivanja i sposobnost peptida da inhibira delovanje proteina.
U jednom aspektu, peptidi iz ovog pronalaska se generišu kao familije sličnih peptida. Primeri peptida su predstavljeni sa SEQ ID NO: 1 do 132. Ovi primerni peptidi su izdvojeni procesom selekcije u kojima su oni koji najbolje vezuju generisani tehnologijom ispoljavanja faga, zatim se analiziraju pomoću ELISA faga kako bi se tehnikom selekcije afiniteta, kao što je tehnologija pojave faga, kako je ovde opisano, dobili kandidati peptida. Međutim, peptidi iz ovog pronalaska mogu da se dobiju bilo kojim od brojnih poznatih postupaka, uključujući hemijske sinteze, kako je opisano u daljem tekstu.
Peptidi iz ovog pronalaska mogu dalje da se poboljšaju postupkom "sazrevanja afiniteta". Ovaj postupak je usmeren ka povećanju afiniteta ili aktivnosti peptida i tela peptida iz ovog pronalaska korišćenjem pojave faga ili drugih selektivnih tehnologija. Na osnovu slaganja sekvenci, na primer, može da se generiše grupa koja dovodi do pojave sekundarnog faga u kojoj se "jezgro" amino kiselina (određeno od usaglaašenih sekvenci) održava konstantnim ili se menja u zavisnosti od učestanosti događanja. Alternativno, sekvenca pojedinačnog peptida može da se koristi za generisanje promene usmerene ka datoteci pojave faga. Tabelisanjem ovih grupa pod strogim uslovima mogu da se dobiju peptidi sa jačim vezivanjem za miostatin, selektivnim vezivanjem za miostatin ili sa nekim dodatnim željenim osobinama. Međutim, peptidi koji imaju sekvence zrelog afiniteta mogu zatim da se produkuju bilo kojim od poznatih postupaka, uključujući hemijske sinteze ili rekombinacije. Ovi peptidi se koriste za generisanje vezivnih sredstava, kao što su tela peptida različitih konfiguracija koja pokazuju veću inhibitornu aktivnost u ispitivanjima baznih ćelija iin vivoispitivanjima.
Niže dati Primer 6 opisuje afinitet "prvog kruga" peptida, koji su prethodno opisani, da u toku sazrevanja produkuju srodne zrele peptide. Primeri srodnih sazrelih tela peptida su dati u Tabelama IV i V. Rezultanta lx i 2x tela peptida dobijena od ovih peptida se zatim dalje karakteriše prema afinitetu ka vezivanju, po sposobnosti da neutrališu delovanje miostatina, po specifičnosti za miostatin nasuprot drugim članovima TNF(3 familije i za dodatnuin vitroiin vivoaktivnost, kako je opisano u daljem tekstu. Peptidi i tela peptida sazrela po afinitetu se označavaju sa prefiksom "m" ispred svog imena familije kako bi se razlikovali od prvog kruga peptida iste familije.
Primeri prvog kruga peptida koji su izabrani za dalje sazrevanje prema afinitetu u skladu sa ovim pronalaskom, obuhvataju sledeće peptide: TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO:33) i linearne peptide Linear-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEQ ID NO: 104), Linear-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV (SEQ ID NO:l 17), Linear-17 RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEQ ID N0:119), Linear-20 YREMSMLEGLLDVLERLQHY (SEQ ID NO: 122), Linear-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEQ ID NO: 123), Linear-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEQ ID NO: 126). Familije peptida sazrelih po afinitetu za svaki od ovih su pokazane u niže datim Tabelama IV i V.
Peptidi iz ovog pronalaska takođe obuhvataju varijante i derivate izabranih peptida koji su sposobni da vezuju miostatin. Kako se ovde koristi, naziv "varijanta" se odnosi na peptide koji imaju jednu ili više amino kiselina ubačenih, izbačenih ili supstituisanih u originalnoj sekvenci amino kiseline, a koji su i dalje sposobni da se vezuju za miostatin. Ubačene i supstituisane varijante mogu da sadrže prirodne amino kiseline, kao i ne-prirodno dobijene amino kiseline. Kako se ovde koristi, naziv "varijanta" obuhvata fragmente peptida koji i dalje zadržavaju sposobnost vezivanja za miostatin. Kako se ovde koristi, naziv "derivat" se odnosi na peptide koji su hemijski modifikovani na neki način koji se razlikuje od varijanti ubacivanja, izbacivanja i supstitucije. Varijante i derivati peptida i tela peptida iz ovog pronalaska su mnogo potpunije opisani u daljem tekstu.
Vehikulumi
Kako se ovde koristi, naziv "vehikulum" se odnosi na molekul koji može da se veže za jedan ili više peptida iz ovog pronalaska. Preferirano, vehikulumi pružaju najmanje jednu željenu osobinu vezivnog sredstva iz ovog pronalaska. Verovatno je da bi sami peptidi bili uklonjeniin vivoili renalnom filtracijom, ili mehanizmima celularnog klirensa u retikuloendotelijalnom sistemu ili proteolitičkom degradacijom. Vezivanjem za vehikulum se poboljšava terapeutska vrednost vezivnog sredstva redukcijom degradacije vezivnog sredstva i/ili povećavanjem polu-života, redukcijom toksičnosti, redukcijom imunogenicitosti i/ili povećavanjem biološke aktivnosti vezivnog sredstva.
U primere vehikuluma spadaju Fc oblasti; linearni polimeri, kao što su polietilen glikol (PEG), polilizin, dekstran; polimer račvastog lanca (videti, na primer, US Patent broj 4,289,872 od Demvalter i saradnika, objavljen 15. septembra 1981.; US Patent broj 5,229,490 od Tam, objavljen 20. jula 1993.; WO 93/21259 od Frechet i saradnika, objavljen 28. oktobra 1993.); lipid; grupa holesterola (kao što je steroid); karboksilat ili oligosaharid; ili bilo koji prirodni ili sintetski protein, polipeptid ili peptid koji se vezuje za odgovarajući receptor.
U jednom aspektu, vezivna sredstva za miostatin iz ovog pronalaska imaju najmanje jedan peptid vezan za najmanje jedan vehikulum (F<1>, F<2>) preko N-terminusa, C-terminusa ili bočnog lanca ostataka jedne od amino kiseline peptida. Takođe mogu da se koriste i višestruki vehikulumi; kao što je neka Fc oblast na svakom terminusu ili neka Fc oblast na terminusu, a PEG grupa na drugom terminusu ili bočnom lancu.
Neka Fc oblast je jedan od preferiranih vehikuluma. Kako se ovde koristi, naziv "Fc oblast" obuhvata nativnu Fc i Fc varijantu molekula i sekvenci, kako je definisano u daljem tekstu. Kako se ovde koristi, naziv "nativni Fc" se odnosi na ne-antigen vezani fragment antitela ili sekvence amino kiselina tog fragmenta koji je produkovan tehnikama rekombinovanja DNA ili enzimatičkim ili hemijskim cepanjem osnovnih antitela. Preferirani Fc je potpuni ljudski Fc i može da potiče od bilo kog imunoglobulina, kao što su IgGl i IgG2. Međutim, ovde su takođe uključeni Fc molekuli koje su delimično humani ili potiču od ne-humanih vrsta. Nativni Fc molekuli su stvoreni od monomernih polipeptida koji mogu da se vežu u dimerne ili multimerne oblike kovalentnim (to jest, disulfidnim vezama) i nekovalentnim asocijacijama. Broj intermolekularnih disulfidnih veza između monomernih subtipova nativnih Fc molekula je u rasponu od 1 do 4 u zavisnosti od klase (na primer, IgG, IgA, IgE) ili podgrupa (na primer, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Jedan primer nativnog Fc je disulfidno-vezani dimer koji nastaje od papaina digestijom nekog IgG (videti Ellison i saradnici (1982.), Nucl Acids Res 10: 4071-9). Kako se ovde koristi, naziv "nativni Fc" se koristi da označi monomerne, dimerne i multimerne oblike.
Kako se ovde koristi, naziv "Fc varijanta" se odnosi na modifikovani oblik nativne Fc sekvence pod uslovom da se održava vezivanje za željeni receptor, kako je opisano, na primer u WO 97/34631 i WO 06/32478, koje su obe ovde inkorporirane u referencama. Fc varijante mogu da se konstruišu, na primer, supstitucijom ili brisanjem ostataka, ubacivanjem ostataka ili skraćivanjem delova koji sadrže mesta vezivanja. Ubačeni ili supstituisani ostaci mogu takođe da budu izmenjene amino kiseline, kao što su peptidomimetičke ili D-amino kiseline. Fc varijante mogu da budu poželjne zbog brojnih razloga, od kojih je nekoliko opisano u daljem tekstu. Primeri Fc varijanti obuhvataju molekule i sekvence u kojima: 1. Uklonjena su mesta koja su uključena u formiranje disulfidne veze. Ovakvim uklanjanjem može da se izbegne reakcija sa drugim proteinima koji sadrže cistein a koji su prisutni u matičnoj ćeliji koja se koristi za izradu molekule iz pronalaska. U ovu svrhu, segment koji sadrži cistein na N-terminusu može da se skrati ili cistein ostaci mogu da se izbrišu ili supstituišu sa drugim amino kiselinama (na primer, alanil, seril). Cak i kada se uklone cistein ostaci, jedan lanac Fc oblasti može i dalje da formira dimeričnu Fc oblast koja se drži zajedno nekovalentnim vezama. 2. Nativni Fc se modifikuje tako da postane mnogo kompatibilni)i sa izabranom osnovnom ćelijom. Na primer, može da se ukloni PA sekvenca pored N-terminusa tipičnog nativnog Fc što može da prepozna digestivni enzim uE- colikao što je prolin iminopeptidaza. Takođe može da se doda metionil ostatak na N-terminusu, posebno kada se molekula pojavljuje u rekombinantnom obliku u bakterijskoj ćeliji kao što jeE- coli.3. Deo N-terminusa nativnog Fc se ukloni da se spreči heterogeničnost N-terminusa kada se pojavljuje u selektovanoj osnovnoj ćeliji. U ovu svrhu, može da se izbriše bilo koji ostatak od prvih 20 amino kiselina na N-terminusu, posebno oni na položajima 1, 2, 3, 4 i 5. 4. Uklanja se jedno ili više položaja glikosilacije. Ostaci koji se obično glikoziliraju (na primer, asparagin) mogu da pruže citolitički odgovor. Ovi ostaci mogu da se izbrišu ili supstituišu sa neglikozilirnim ostacima (na primer, alanin). 5. Položaji koji su obuhvaćeni interakcijom sa komplementom, kao što je Clq mesto vezivanja, se uklone. Na primer, može da se izbriše ili supstituiše EKK sekvenca humanog IgGl. Iskorišćeni komplement ne mora da predstavlja prednost za molekule iz ovog pronalaska i na taj način može da se izbegne ovakva Fc varijanta. 6. Uklanjaju se položaji koji ometaju vezivanje za Fc receptore koji nisu sačuvani receptori. Nativni Fc može da ima položaje za interakciju sa izvesnim ćelijama belih krvnih zrnaca koje nisu potrebne za fuziju molekule iz ovog pronalaska i zato treba da se uklone. 7. Uklanja se položaj ADCC. ADCC položaji su poznati u tehnici. Videti, na primer, Molec Immunol 29 (5): 633-9 (1992.) u vezi sa ADCC položajima u IgGl. Ovi položaji takođe nisu poželjni za fuziju molekule iz ovog pronalaska i zato treba da se uklone. 8. Kada se nativni Fc izdvoji iz ne-humanog antitela, nativni Fc može da se humanizira. Da bi se humanizovao nativni Fc, obično se supstituišu izabrani ostaci u ne-humanom nativnom Fc sa ostacima koji se normalno nalaze u humanom nativnom Fc. Tehnike za humanizaciju antitela su dobro poznate u tehnici.
Naziv "Fc oblast" obuhvata molekule u monomernom ili multimernom obliku, bilo da su digestirani iz celog antitela ili dobijeni drugim sredstvima. Kako se ovde koristi, naziv "multimer" kada se primenjuje na Fc oblasti ili molekule koji uključuju Fc oblasti, odnosi se na molekule koje imaju dva ili više polipeptidna lanca spojena kovalentno, nekovalentno ili na oba načina, to jest, kovalentnim i nekovalentnim interakcijama. IgG molekule obično formiraju dimere; IgM, pentamere; IgD dimere; i IgA monomere, dimere, trimere i tetramere. Multimeri mogu da se formiraju korišćenjem sekvence i aktivnosti koja je rezultat nativnog Ig izvora Fc ili derivatizacijom takvog nativnog Fc. Naziv "dimer", kada se primenjuje na Fc oblasti ili molekule koje uključuju Fc oblasti, odnosi se na molekule koje imaju dva polipeptidna lanca spojena kovalentno ili ne-kovalentno.
Dodatno, alternativni vehikulum u skladu sa ovim pronalaskom je protein ne-Fc oblast, polipeptid, peptid, antitelo, fragment antitela ili mala molekula (na primer, peptidomimetičko jedinjenje) sposobno za vezivanje na izabrani receptor.
Na primer, kao vehikulum može da se upotrebi polipeptid, kako je opisano u US
Patentu broj 5,739,277, objavljenom 14. aprila 1998., od strane Presta i saradnika. Peptidi takođe treba da se selektuju pojavom faga za vezivanje na FcRn izabranom receptom. Ovakva jedinjenja za vezivanje na izabrnom receptom su takođe obuhvaćena unutar značenja "vehikulum" i potpadaju pod okvir ovog pronalaska. Ovakvi vehikulumi se selektuju radi povećanja polu-života (na primer, izbegavanjem sekvenci koje prepoznaju proteaze) i za smanjenje imunogeničnosti (na primer, favorizovanjem ne-imunogeničnih sekvenci, kako je otkriveno u humanizaciji antitela).
Dodatno, polimerni vehikulumi mogu takođe da se upotrebe za konstrukciju vezivnih sredstava iz ovog pronalaska. Sada su raspoloživa različita sredstva za vezivanje hemijskih radikala koji su upotrebljivi kao vehikulumi, videti, na primer, Patent Cooperation Treatv ("PCT") Internacionalne publikacije broj WO 96/11953 pod naslovom "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods" koja je ovde u celini inkorporirana u referencama. Ova PCT publikacija otkriva, između ostalih stvari, selektivno vezivanje polimera rastvorljivih u vodi za N-terminuse proteina.
Preferirani polimerni vehikulum je polietilen glikol (PEG). PEG grupa može da bude bilo koje pogodne molekulske težine i može da bude linearna ili račvasta. Prosečna molekulska težina PEG-a je preferirano u rasponu od približno 2 kDa do približno 100 kDa, još poželjnije od približno 5 kDa do približno 50 kDa, a najpoželjnije od približno 5 kDa do približno 10 kDa. PEG grupe se generalno vezuju za jedinjenja iz pronalaska acilacijom ili reduktivnom alkilacijom reaktivne grupe na PEG radikalu (na primer, neka aldehidna, amino, tiol ili estarska grupa) za reaktivnu grupu na jedinjenju iz pronalaska (na primer, neka aldehidna, amino ili estarska grupa). Korisna strategija za PEGilaciju sintetičkih peptida se sastoji od kombinacije, preko formiranja konjugata veziva u rastvoru, peptida i PEG radikala, od kojih svaki ima specijalnu funkcionalnost koja je uzajamno reaktivna sa ostalima. Peptidi lako mogu da se izrade uobičajenim sintezama čvrste faze, kako je poznato u tehnici. Peptidi se "prethodno aktiviraju" sa nekom od odgovarajućih funkcionalnih grupa na specifičnom položaju. Prekursorsi se prečiste i potpuno okarakterišu pre reakcije sa PEG radikalom. Ligacija peptida sa PEG se obično vrši u vodenoj fazi i može jednostavno da se prati analitičkom HPLC sa reverznom fazom. PEGilirani peptidi mogu jednostavno da se prečiste preparativnom HPLC i okarakterišu analitičkom HPLC, analizama amino kiselina i laserskom desorpcijom masene spektrometrije.
Polisaharidni polimeri su naredni tip polimera rastvorljivih u vodi koji mogu da se koriste za modifikaciju proteina. Dekstrani su polisaharidni polimeri koji uključuju pojedinačne subjedinice glukoze pretežno vezane sa 1-6 veza. Sam dekstran je raspoloživ u velikom broju molekularnih težina i uglavnom je raspoloživ u molekulskim težinama od približno 1 kDa do približno 70 kDa. Dekstran je pogodan polimer rastvorljiv u vodi za upotrebu u ovom pronalasku kao vehikulum, sam ili u kombinaciji sa drugim vehikulumom (na primer, Fc). Videti, na primer, WO 96/11953 i WO 96/05309. Zabeležena je upotreba dekstrana u konjugaciji sa terapeutskim i dijagnostičkim imunoglobulinima; videti na primer, Evropsku patentnu publikaciju broj 0 315 456 koja je ovde inkorporirana u referenci. Kada se, u skladu sa ovim pronalaskom, koristi dekstran kao vehikulum, preferiranje dekstran od približno 1 kDa do približno 20 kDa.
Linkeri
Vezivna sredstva iz ovog pronalaska mogu opciono dalje da obuhvate "linker" grupu. Linkeri prvenstveno služe kao spona između peptida i vehikuluma ili između dva peptida vezivnih sredstava iz ovog pronalaska. U jednom aspektu, linker čini amino kiseline vezane zajedno peptidnim vezama, preferirano od 1 do 20 amino kiselina vezanih peptidnim vezama, pri čemu su amino kiseline izabrane od 20 prirodno dobijenih amino kiselina. Jedna ili više ovih amino kiselina može da bude glikolizirana, što je jasno stručnjaku sa iskustvom u tehnici. U jednom aspektu, 1 do 20 amino kiselina je izabrano od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. Preferirano, linker čine većina amino kiselina koje su stereohemijski nepromenjene, kao što su glicin i alanin. Prema tome, primeri linkera su poliglicini (posebno (Gly)5, (Gly)8), poli(Gly-Ala) i polialanini. Kako se ovde koristi, oznaka "g" se odnosi na glicin homeopeptid linkere. Kako je pokazano u Tabeli II, "gn" se odnosi na 5x gly linker na N-terminusu, dok se "gc" odnosi na 5x gly linker na C-terminusu. Takođe su preferirane kombinacije Gly i Ala. Jedan primer sekvence linkera koji je koristan za konstrukciju vezivnih sredstava iz ovog pronalaska je sledeći: gsgsatggsgstassgsgsatg (Seq ID No: 305). Ova sekvenca linkera je označena i kao "k" ili lk sekvenca. Oznake "kc", kako je dato u Tabeli II, se odnose na k linker na C-terminusu, dok se oznaka "kn" odnosi na k linker na N-terminusu.
Linkeri iz ovog pronalaska mogu takođe da budu ne-peptidni linkeri. Na primer, mogu da se koriste alkil linkeri, kao što je -NH-(CH2)s-C(0)-, pri čemu je s = 2-20. Ovi alkil linkeri mogu dalje da se supstituišu sa grupom koja nije stereohemijski ometena, kao što su niža alkil (na primer, Ci-Cć) niža acil, halogen (na primer, Cl, Br), CN, NH2, fenil grupa itd. Primer ne-peptidnog linkera je PEG linker i ima molekulsku težinu od 100 do 5000 kDa, preferirano 100 do 500 kDa. Peptidni linkeri mogu da budu izmenjeni da se formiraju derivati na isti način kao i prethodno.
Primerivezivnih sredstava
Vezivna sredstva iz ovog pronalaska obuhvataju najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin. U jednom aspektu, peptid koji vezuje miostatin ima dužinu između približno 5 i približno 50 amino kiselina, u narednom aspektu između približno 10 i 30 amino kiselina i u narednom aspektu između približno 10 i 25 amino kiselina. U jednom aspektu, peptid koji vezuje miostatin uključuje sekvencu amino kiseline WMCPP (SEQ ID NO:633). U narednom aspektu, peptid koji vezuje miostatin uključuje sekvencu amino kiseline Caia ?Wa3 WMCPP ( SEQ ID NO:352), pri čemu su ai, a2i a3izabrani od neutralne hidrofobne, neutralne polarne ili bazne amino kiseline. U narednom aspektu, peptid koji vezuje miostatin uključuje sekvencu amino kiseline Cbib?Wbi WMCPP ( SEQ ID NO:353), pri čemu je biizabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R; b2 je izabran od bilo koje R, S ili Q; b3 je izabran od bilo koje P, R i Q i pri čemu je peptid dugačak između 10 i 50 amino kiselina; i njihove fiziološki prihatljive soli. U narednom aspektu, peptid koji vezuje miostatin uključuje formulu:
CiC2c3C4CsCftCc7CsWcQ WMCPPcinCnCpCi3(SEO ID NO:354), pri čemu je:
cinema ili je bilo koja amino kiselina;
c2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c4nema ili je bilo koja amino kiselina;
c5nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c6nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c7 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
c8je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
c9 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; i
Ciodo C13 je bilo koja amino kiselina; i pri čemu je peptid dugačak između 20 i 50 amino kiselina; i njihove fiziološki prihvatljive soli.
Naredni aspekt peptida koji vezuje miostatin uključuje formulu:
d|d2d,d4dACc7cRWdg WMCPPdind,,dndn (SEQ ID NO:355), pri čemu je:
dinema ili je bilo koja amino kiselina;
d2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
d3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
djnema ili je bilo koja amino kiselina;
d5nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino
kiselina;
d6nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
d7 je izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R;
d8 je izabran od bilo koje R, S,Q;
dg je izabran od bilo koje P, R i Q, i diodo d[3 je izabrana od bilo koje amino kiseline, i pri čemu je peptid dugačak između 20 i 50 amino kiselina; i njihove fiziološki prihvatljive soli.
Naredni aspekti vezivnih sredstava uključuje najmanje jedan od sledećih
peptida:
(1) peptid koji je sposoban da veže miostatin, pri čemu peptid uključuje
sekvencu WYe,e?Ye,G, (SEQ ID NO: 356)
pri čemu je eiP, S ili Y,
e2 je C ili Q, i
e3je G ili H, pri čemu je peptid dugačak između 7 i 50 amino kiselina i
njihove fiziološki prihvatljive soli;
(2) peptid koji je sposoban da veže miostatin, pri čemu peptid uključuje
sekvencu f. EMLkSLf^LL, (SEQ TD NO: 455)
pri čemu je f]M ili I,
f2 je bilo koja amino kiselina,
f3 je L ili F,
f4jeE,QiliD;
i pri čemu je peptid dugačak između 7 i 50 amino kiselina i njihove fiziološki
prihvatljive soli;
(3) peptid koji je sposoban da veže miostatin, pri čemu peptid uključuje
sekvencu Lg^gpLLgig^L, (SEQ ID NO: 456), pri čemu
g, je Q, Dili E,
<g>2jeS,Q,DiliE,
g3 je bilo koja amino kiselina,
g4 je L, W, F ili Y i pri čemu je peptid dugačak između 8 i 50 amino kiselina
i njihove fiziološki prihvatljive soli;
(4) peptid koji je sposoban da veže miostatin, pri čemu peptid uključuje
sekvencu hih2h3h4h5h6h7h8h9(SEQ ID NO: 457), pri čemu
h, je Rili D,
h2 je bilo koja amino kiselina,
h3jeA, T, S ili Q,
h4je L ili M,
h5 je L ili S,
h6 je bilo koja amino kiselina,
I17 je F ili E,
h8je W,Fili C,
h9jeL, F, MiliK,
i pri čemu je peptid dugačak između 9 i 50 amino kiselina; i njihovih fiziološki prihvatljivih soli.
U jednom aspektu, vezivna sredstva iz ovog pronalaska dalje uključuju najmanje jedan vehikulum kao stoje polimer ili neka Fc oblast i može dalje da uključi najmanje jednu sekvencu linkera. U ovom aspektu, vezivna sredstva iz ovog pronalaska su sastavljena tako daje najmanje jedan peptid koji vezuje miostatin kovalentno vezan za najmanje jedan vehikulum. Peptid ili peptidi su vezani direktno ili indirektno preko sekvence linkera za vehikulum na N-terminalu, C-terminalu ili na sidekain amino kiselini peptida. U ovom aspektu, vezivna sredstva ovog pronalaska imaju sledeću opštu strukturu: (X')a-F<1->(X<2>)b, ili njene multimere;
• 1 • 12
pri čemu je F vehikulum, a X iX su svaki nezavisno izabrani od
-(L')c-P<1>;-(LVP'-CLVP<2>;
.( Ll) c- ?l-( L2) d- P2-( L\- ?\i
-(L')c-P<1->(L<2>)đ-P<2->(<L3>)e-P<3->(L<4>)rP<4>;
pri čemu su P<1>, P<2>, P<3>i P<4>peptidi koji mogu da vezuju miostatin; a
L<1>,L2, L<3>i L4 su svaki ponaosob linkeri; a a, b, c, d, e i f su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom daje bar jedan od a i b 1; i njihove fiziološki prihvatljive soli.
U različitim aspektima vezujućih sredstava koja imaju ovu opštu strukturu, peptidi P<1>, P<2>, P<3>i P<4>mogu nezavisno da budu izabrani od jednog ili više bilo kog peptida koji uključuje sekvence koje su prethodno date. P<1>, P<2>, P<3>i P<4>su nezavisno izabrani od jednog ili više peptida koji uključuju bilo koju od sledećih sekvenci: SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 456 ili SEQ ID NO: 457.
U daljem aspektu, vehikulumi vezivnih sredstava koja imaju prethodno datu opštu formulu su Fc oblasti. Dakle, peptidi su spojeni za neku Fc oblast ili direktno ili indirektno i na taj način obezbeđuju tela peptida. Tela peptida iz ovog pronalaska pokazuju veliki afinitet vezivanja za miostatin i mogu da inhibiraju delovanje miostatina što je pokazanoin vitroanalizama iin vivotestiranju na životinjama, kako je ovde dato.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline, uključujući polinukleotide koji kodiraju peptide, tela peptida i varijante i derivate peptida i tela peptida ovog pronalaska. Primeri sekvenci nukleotida su dati u daljem tekstu.
Varijante i derivati peptida i tela peptida
Vezivna sredstva iz ovog pronalaska takođe obuhvataju varijante peptida i tela peptida koji su ovde opisani. Pošto i peptidi i tela peptida iz ovog pronalaska mogu da se opišu po nazivima sekvence njihove amino kiseline, može da se kaže da se nazivi "varijante" i "derivati" primenjuju na sam peptid ili peptid kao komponentu tela peptida. Kako se ovde koristi, naziv "varijante peptida" se odnosi na peptide ili tela peptida koji imaju ubačen, izbrisan ili supstituisan jedan ili više ostataka amino kiseline u originalnoj sekvenci amino kiseline i koji zadržavaju sposobnost da se vezuju za miostatin i da modifikuju njegovo delovanje. Kako se ovde koristi, fragmenti peptida ili tela peptida su obuhvaćeni definicijom "varijante".
Jasno je da bilo koji dati peptid ili telo peptida može da sadrži jedan ili dva ili sva tri tipa varijanti. Varijante sa ubačenim i supstituisanim delovima mogu da sadrže prirodne amino kiseline kao i ne-prirodno dobijene amino kiseline, ili obe.
Varijante peptida i tela peptida takođe obuhvataju zrele peptide i tela peptida u kojima su uklonjene sekvence nosača ili signala, a nastali proteini imaju dodatne amino terminalne ostatke čije amino kiseline mogu da budu prirodne ili ne-prirodne. Tela peptida sa dodatnim metionil ostatkom na amino kiselini položaja -1 (Mef'-telo peptida) su obuhvaćeni, kao i tela peptida sa dodatnim metionin i lizin ostacima na položajima -2 i -1 (Mef2-Lys"'-). Varijante koje imaju dodatne Met, Met-Lys, Lys ostatke (ili jedan ili više baznih ostataka, generalno) su posebno korisne za pojačavanje produkcije rekombinantnog proteina u bakterijskim ćelijama domaćina.
Varijante peptida ili tela peptida iz ovog pronalaska takođe obuhvataju peptide koji imaju dodatne ostatke amino kiseline koji nastaju upotrebom specifičnih sistema pojavljivanja. Na primer, upotreba komercijalno raspoloživih vektora koji iskazuju željeni polipeptid kao deo produkta fuzije glutation-S-transferaza (GST) obezbeđuje željeni polipeptid koji ima dodatni glicin ostatak na amino kiselini položaja -1 nakon cepanja GST komponente iz željenog polipeptida. Varijante koje nastaju od pojavljivanja u drugim sistemima vektora su takođe obuhvaćene ovim pronalaskom, uključujući one u kojima su nastavci histidina inkorporirani u sekvencu amino kiseline, generalno na karboksi i/ili amino terminusima sekvence.
U jednom primeru se dobijaju varijante sa ubačenim delovima, pri čemu se jedan ili više ostataka amino kiseline, ili prirodno dobijenih ili ne-prirodno dobijenih amino kiselina, dodaju u sekvencu amino kiseline peptida. Ubačeni delovi mogu da se nalaze najednom ili na oba terminusa proteina, ili mogu da budu pozicionirani u okviru unutrašnjih regiona sekvence amino kiseline tela peptida. Varijante sa umetnutim delovima sa dodatnim ostacima najednom ili na oba terminusa mogu da obuhvate, na primer, spojene proteine i proteine koji obuhvataju označene ili obeležene amino kiseline. Varijante sa umetnutim delovima obuhvataju peptide u kojima se jedan ili više ostataka amino kiseline dodaju u sekvencu amino kiseline peptida ili u njihove fragmente.
Varijante sa umetnutim delovima takođe obuhvataju spojene proteine pri čemu je amino i/ili karboksi terminus peptida ili tela peptida spojen za naredni polipeptid, njegov fragment ili amino kiseline koje se generalno ne prepoznaju kao deo sekvence bilo kog specifičnog proteina. Primeri ovakvih spojenih proteina su imunogenični polipeptidi, proteini sa dugačkim cirkulacionim polu-životima, kao što su imunoglobulin u konstantnim regionima, marker proteini, proteini ili polipeptidi koji omogućavaju prečišćavanje željenog peptida ili tela peptida i delovi polipeptida koji potpomažu formiranje multimernih proteina (kao što su motivi isprepletanog leucina koji su korisni u dimer formaciji/stabilnost).
Ovaj tip varijanti sa umetnutim delovima generalno ima sve ili znatan broj delova nativne molekule vezane na N-ili C-terminusu za ceo ili deo drugog polipeptida. Na primer, spojeni proteini obično uključuju vodeće sekvence iz drugih vrsta kako bi se dozvolilo pojavljivanje rekombinantnog proteina u heterolognom domaćinu. Naredni korisni spojeni protein obuhvata dodavanje imunološki aktivnog domaćina, kao što je antitelo epitop, kako bi se omogućilo prečišćavanje spojenog proteina. Inkluzija mesta cepanja na ili pored položaja spajanja omogućava uklanjanje nepotrebnih polipeptida nakon prečišćavanja. Druge korisne fuzije obuhvataju vezivanje funkcionalnih domaćina, kao što su aktivni položaji iz enzima, glikolizaciju domaćina, celularne ciljane signale ili transmembranske regione.
Postoje različiti komercijalno raspoloživi sistemi za ispoljavanje spojenih proteina koji mogu da se koriste u ovom pronalasku. U posebno korisne sisteme spadaju, ali bez ograničenja na, sistem glutation-S-transferaza (GST) (Pharmacia), sistem maltoza vezujući protein (NEB, Beverlev, MA), FLAG sistem (IBI, New Haven, CT) i 6xHis sistem (Qiagen, Chatsworth, CA). Ovi sistemi su sposobni da produkuju rekombinovane peptide i/ili tela peptida koja imaju samo mali broj dodatnih amino kiselina koja verovatno neće u velikoj meri negativno da utiču na delovanje peptida ili tela peptida. Na primer, i FLAG sistem i 6xHis sistem dodaju samo kratke sekvence, oba su poznata kao slabo antigenična i koji ne deluju negativno na formiranje polipeptida u njegovu nativnu konformaciju. Naredna fuzija N-terminala koja treba da bude korisna je fuzija Met-Lys dipeptida na N-terminalnom regionu proteina ili peptida. Ovakva fuzija može da dovede do poželjnog povećavanja pojave proteina ili aktivnosti.
Drugi sistemi fuzije produkuju hibride polipeptida gde je poželjno da se
odseče fuzioni partner iz željenog peptida ili tela peptida. U jednom aspektu fuzioni partner je vezan za rekombinovano telo peptida preko sekvence peptida koja sadrži specifičnu sekvencu prepoznavanja za proteazu. Primeri pogodnih sekvenci su one koje prepoznaju Tobacco Etch Virus proteazu (Life Technologies, Gaithersbourg, MD) ili Factor Xa (New England Biolabs, Beverlv, MA).
Pronalazak takođe obezbeđuje spojene polipeptide koji uključuju ceo ili deo peptida ili dela peptida iz ovog pronalaska u kombinaciji sa skraćenim faktorom tkiva (tTF). tTF je vaskularno ciljajuće sredstvo koje sadrži skraćeni oblik humanog proteina koji izaziva koagulaciju i koji deluje kao sredstvo za zgrušavanje krvi u krvnim sudovima tumora, kako je opisano u US Patentima brojevi: 5,877,289; 6,004,555; 6,132,729; 6,132,730; 6,156,321; i Evropskom patentu broj EP 0988056. Spajanje tTF za anti-miostatinsko telo peptida ili peptid, ili njihove fragmente omogućava oslobađanje anti-miostatin antagonista na ciljanim ćelijama, na primer, ćelijama skeletne muskulature, ćelijama kardiačne muskulature, fibroblastima, pre-adipocitima i moguće je adipocitima.
U narednom aspektu, pronalazak obezbeđuje varijante sa izbacivanjem, pri čemu se jedan ili više ostataka amino kiseline u peptidu ili telu peptida ukloni. Uklanjanje može da se izvede najednom ili na oba terminusa tela peptida ili uklanjanjem jednog ili više ostataka unutar sekvence amino kiseline tela peptida. Varijante sa uklonjenim delovima obavezno obuhvataju sve fragmente peptida ili tela peptida.
U narednom aspektu, pronalazak obezbeđuje supstituisane varijante peptida i tela peptida iz pronalaska. Supstituisane varijante obuhvataju one peptide i tela
peptida u kojima je jedan ili više ostataka amino kiseline uklonjeno i zamenjeno sa jednom ili više alternativnih amino kiselina, pri čemu amino kiseline mogu da budu prirodno dobijene ili ne-prirodno dobijene. Supstituisane varijante generišu peptide ili tela peptida koji su "slični" originalnom peptidu ili telu peptida po tome što dve molekule sadrže izvestan procenat identičnih amino kiselina. Supstituisane varijante obuhvataju supstitucije na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 i 20 amino kiselina u okviru peptida ili tela peptida, pri čemu broj supstituenata može da bude na deset procenata amino kiselina peptida ili tela peptida. U jednom aspektu, supstituenti su po prirodi umereni, međutim, pronalazak takođe obuhvata supstituente koji nisu umereni, a takođe obuhvata i nekonvencionalne amino kiseline.
Identitet i sličnost povezanih peptida i tela peptida može lako da se izračuna poznatim postupcima. U ovakve postupke spadaju, ali bez ograničenja na, oni postupci koji su opisani u Computational Molecular Biologv, Lesk, A.M. izdanje Academic Press, New York (1993.), Computer Analvsis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and Griffin, H.G., izdavači Humana Press, New Jersev (1004.), Sequence Analvsis in Molecular Biologu, von Heinje, G., Academic Press (1987.), Sequence Analysis Primer, Gribakov, M. and Devereux, J., izdavači M. Stockton Press, New York (1991.) and Carillo i sarfadnici, SIAM J. Applied Math., 48, 1073 (1988.).
Preferirani postupci za određivanje povezanosti ili procenta identičnosti dva peptida ili tela peptida ili polipeptida i peptida su izrađeni tako da daju najveću moguću istovetnost između testiranih sekvenci. Postupci za određivanje identičnosti su opisani u javno raspoloživim kompjuterskim programima. Preferirani kompjuterski programi postupaka za određivanje identičnosti između dve sekvence obuhvataju, ali bez ograničenja na, GCG paket programa, uključujući GAP (Devereux i saradnici, Nucl. Acid, Res., 12:387 (1984.), Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul i saradnici, J. Mol. Biol., 215-403-10 (1990.). BLASTX program je javno raspoloživ od strane National Center for Biotechnology Information (NCBI) i drugih izvora (BLAST Manual, Altsachul i saradnici, NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894., Altschul i saradnici, kao gore (1990.). Dobo poznat Smith Waterman algoritam može takođe da se koristi za određivanje identičnosti.
Izvesne date šeme za uređivanje sekvenci dve amino kiseline može za rezultat da ima slaganje samo kratkog regiona dve sekvence, a ovaj mali uređeni region može da ima veoma veliki identitet sekvence čak i ako nema značajnog odnosa između punih dužina dve sekvence. U skladu sa tim, u nekim aspektima, izabrani metod uređenja će dovesti do uređenja koji obuhvata najmanje deset procenata pune dužine ciljanog polipeptida koji se upoređuje, to jest, najmanje 40 susednih amino kiselina je sekvencirano od najmanje 400 amino kiselina koje se upoređuju, 30 susednih amino kiselina je sekvencirano od najmanje 300 do približno 400 amino kiselina koje se upoređuju, najmanje 20 susednih amino kiselina je sekvencirano od 200 do približno 300 amino kiselina koje se upoređuju i najmanje 10 susednih amino kiselina je sekvencirano od približno 100 do 200 amino kiselina koje se upoređuju. Na primer, koristeći kompjuterski algoritam GAP (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dva polipeptida za koje treba da se utvrdi procenat identičnih sekvenci, se uredi za optimalno slaganje njihovih respektivnih amino kiselina ("usklađeno rastojanje", kako je određeno algoritmom). U izvesnim aspektima, određeno početno rastojanje (koje se obično izračunava kao 3 X prosečne dijagonale; "prosečna dijagonala" je prosečna dijagonala upoređujućeg matriksa koji se koristi; "dijagonala" je skor ili broj koji je dat za svako savršeno slaganje amino kiseline sa određenim matriksom za upoređivanje) i određeno produženo rastojanje (koje je obično 1/10 puta određenog početnog rastojanja), kao i uporedni matriks, kao što su PAM 250 ili BLOSUM 62 se koriste u konjugaciji sa algoritmom. U izvesnim aspektima, standardni uporedni matriks (videti Dayhoff i saradnici, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978.) za PAM 250 uporedni matriks; Henicoff i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 10915-10919 (1992.) za BLOSUM 62 uporedni matriks) se takođe koristi kao algoritam.
Na primer, u izvesnim aspektima, parametri za upoređivanje sekvence polipeptida mogu da budu urađeni na sledeći način: Algoritam: Needleman i saradnici, J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970.); uporedni matriks: BLOSUM 62 od Henikoff i saradnika, kao ranije (1992.); određeno rastojanje: 12; određeno rastojanje dužine. 4; prag sličnosti: 0, bez određenih rastojanja na kraju.
U izvesnim aspektima, parametri za upoređivanje sekvence molekule polinukleoida (nasuprot sekvenci amino kiseline) mogu da se izrade na sledeći način: Algoritam: Needleman i saradnici, kao ranije (1970.); uporedni matriks: slaganje = +10, ne slaganje = 0; određeno rastojanje: 50; određeno rastojanje dužine: 3.
Ostali primeri algoritama, određena početna rastojanja, određena rastojanja nastavka, uporedni matriksi, graničnici sličnosti itd., mogu da se koriste, zajedno sa onima koji su dati u programskom priručniku, Wisconsin Package, verzija 9, septembar 1997. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da izvrši odgovarajući izbor koji zavisi od specifičnosti upoređivanja koje se vrši, kao što su DNA-za-DNA, protein-za-protein, protein-za-DNA; i dodatno, da li se vrši upoređivanje između datih parova sekvenci (u tom slučaju su generalno preferirani GAP ili BestFit) ili između jedne sekvence i velike baze podataka sekvenci (u tom slučaju su preferirani FASTA ili BLASTA).
Stereoizomeri (na primer, D-amino kiseline) dvadeset uobičajenih (prirodno dobijenih) amino kiselina, ne-prirodno dobijenih amino kiselina kao što su a-, a-disupstituisane amino kiseline, N-alkil amino kiseline, laktatna kiselina i druge neuobičajene amino kiseline mogu takođe da budu pogodne komponente za peptide iz ovog pronalaska. Primeri ne-prirodno dobijenih amino kiselina obuhvataju, na primer: aminoadipinsku kiselinu, beta-alanin, beta-aminopropionatnu kiselinu, aminobutiratnu kiselinu, piperidinsku kiselinu, aminokaprionatnu kiselinu, aminoheptanoatnu kiselinu, aminoizobutiratnu kiselinu, aminopimelitnu kiselinu, diaminobutiratnu kiselinu, dezmozin, diaminopimelitnu kiselinu, diaminopropionatnu kiselinu, N-etilglicin, N-etilaspargin, hiroksilizin, alo-hidroksilizin, hidroksiprolin, izodezmozin, alo-izoleucin, N-metilglicin, sarkozin, N-metilizoleucin, N-metilvalin, norvalin, norleucin, oritin, 4-hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, e-N,N,N-trimetillizin, e-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, a-N-metilarginin i druge slične amino kiseline i amino kiseline (na primer, 4-hidroksiprolin).
Prirodno dobijeni ostaci mogu da se podele u (preklapajuće) grupe na osnovu zajedničkih osobina bočnog lanca: 1) prirodno hidrofobne: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Met, Phe; 2) prirodno polarne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Gly; 3) kisele: Asp, Glu; 4) bazne: His, Lys, Arg;
5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i
6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Supstitucije amino kiselina mogu da budu konzervativne, čime se dobijaju peptidi koji imaju funkcionalne i hemijske karakteristike slične originalnom peptidu. Konzervativne supstitucije amino kiselina uključuju izmenu člana jedne od prethodnih grupa sa drugim članom iste grupe. Konzervativne izmene mogu da obuhvate ostatke nekonvencionalne amino kiseline, koji su obično inkorporirani hemijskim sintezama peptida pre nego sintezama u biološkim sistemima. Ovo obuhvata peptidomimetike i druge reverzne ili invertne oblike radikala amino kiselina.
Ne-konzervativne supstitucije mogu da uključe promenu člana jedne od ovih grupa sa članom iz naredne grupe. Ove promene mogu da dovedu do znatnih modifikacija u funkcionalnim i/ili hemijskim karakteristikama peptida. Čineći takve promene, u skladu sa nekim aspektima, treba voditi računa o hidropatičnom indeksu amino kiselina. Svaka amino kiselina ima svoj hidropatični indeks na bazi svoje hidrofobnosti i karakteristikama naelektrisanja. To su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9) i arginin (-4.5).
Važnost hidropatičnog indeksa amino kiseline u dodeli interaktivne biološke funkcije na proteinu je poznata u tehnici. Kyt i saradnici, J. Mol. Biol; 157: 105-131 (1982.). Poznato je da neke amino kiseline mogu da budu supstituisane sa drugim amino kiselinama koje imaju sličan hidropatični indeks ili skor, a i dalje zadržavaju slično biološko delovanje. Izmenama na osnovu hidropatičnog indeksa, u izvesnim aspektima, obuhvaćene su amino kiseline čiji je hidropatični indeks u okviru +/- 2. U nekim aspektima obuhvaćene su one kiseline čiji je hidropatični indeks u okviru +/- 1, a u nekim aspektima one čiji je hidropatični indeks u okviru +/- 0.5.
Takođe je poznato u tehnici da supstitucija sličnih amino kiselina može efikasno da se izvrši na bazi hidrofilnosti, posebno kada tako nastalo biološko funkcionalno telo peptida ili peptid treba da se upotrebi u imunološkim aspektima, kao u ovom slučaju. U izvesnim aspektima, najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, regulisana hidrofilnošću njegovih susednih amino kiselina, je u korelaciji sa imunogenetičnošću i antigenetičnošću, to jest, sa biološkim karakteristikama proteina.
Naredne vrednosti hidrofilnosti su određene za ove ostatke amino kiselina: arginin (+ 3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0 +/- 1); glutamat (+3.0 +/- 1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5+/- 1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5); i triptofan (-3.4). Pri izmenama na osnovu sličnih vrednosti hidrofilnosti, u nekim aspektima je obuhvaćena supstitucija čije su hidrofilne vrednosti u okviru +/- 2, u nekim slučajevima su obuhvaćene one kiseline čije su hidrofilne vrednosti u okviru +/- 1, a u izvesnim aspektima, one kiseline čije su hidrofilne vrednosti u okviru +/- 0.5. Stručnjak sa iskustvom u tehnici može takođe da identifikuje epitope od sekvenci primarne amino kiseline na osnovu hidrofilnosti. Ovi regioni su takođe označeni kao "regioni epitopičnog jezgra".
Primeri supstitucija amino kiselina su navedeni u niže datoj Tabeli 1.
Stručnjak sa iskustvom u tehnici će moći da produkuje varijante peptida i tela peptida iz ovog pronalaska, na primer, proizvoljno izabranim supstituentima i testirajući dobijen peptid ili telo peptida na sposobnost vezivanja pomoću analiza koje su ovde opisane.
Dodatno, stručnjak sa iskustvom u tehnici može da razmotri studije strukture-funkcionalnosti ili analize trodimenzionalne strukture da bi identifikovao ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za delovanje ili za strukturu. Imajući u vidu ovakvu komparaciju, stručnjak može da predvidi važnost ostataka amino kiselina u proteinu koji odgovaraju ostacima amino kiselina koji su važni za delovanje ili strukturu u sličnim proteinima. Sa ovako predviđenim ostacima važnih amino kiselina stručnjak sa iskustvom u tehnici može da se odluči za slične hemijske supstitucije amino kiselina. Nakon toga, varijante mogu da se snime pomoću analiza delovanja kako je ovde opisano.
Brojne naučne publikacije su posvećene predviđanju sekundarne strukture, videti Moult, J. Curr. Op. In Biotech, 7(4); 422-427 (1996.), Chou i saradnici, Biochemistrv, 13(2): 222-245 (1974.); Chou i saradnici, Biochemistrv, 113(2): 211-222 (1974.); Chou i saradnici, Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978.); Chou i saradnici, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276 i Chou i saradnici, Biophvs, J., 26: 367-384 (1979.). Osim toga, sada su raspoloživi kompjuterski programi kao pomoć pri predviđanju sekundarne strukture. Jedan postupak predviđanja sekundarne strukture se zasniva na homolognim modelima. Na primer, dva polipeptida ili proteina koji imaju više od 30% identičnih sekvenci, ili sličnost veću od 40%, često imaju sličnu strukturnu topologiju. Porast broja baza podataka o strukturi proteina (PDB) omogućio je poboljšanje predvidljivosti sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj foldova unutar proteinske strukture. Videti, Hol i saradnici, Nucl. Acid. Res., 27 (1): 244-247 (1999.). Sugerisano je (Brenner i saradnici, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997.)) da postoji ograničen broj foldova u datom proteinu i da kada se jednom razreši kritičan broj struktura, predviđanje strukture postaje neuporedivo tačnije.
Dodatni postupci predviđanja sekundarne strukture obuhvataju "urezivanje"
(Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997.); Sippl i saradnici, Structure, 4(1): 15-19 (1996.)), "analizu profila" (Bovvie i saradnici, Science, 253: 164-170 (1991.); Gribskov i saradnici, Meth. Enzym; 183:146-159 (1990.); Gribskov i saradnici, Proc. Nap. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987.)) i "evolucionarno povezivanje" (videti Hol, kao ranije (1999.) i Brenner, kao ranije (1997.)).
U izvesnim aspektima, varijante peptida ili tela peptida uključuju varijante glikosilacije pri čemu je jedno ili više mesta glikosilacije, kao N-vezivno mesto glikosilacije, dodato na telo peptida. Neko N-vezivno mesto glikosilacije se karakteriše sekvencom: Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, pri čemu ostatak amino kiseline označen kao X može da bude ostatak bilo koje amino kiseline izuzev prolina. Supstitucija ili adicija ostataka amino kiseline da se stvori ova sekvenca obezbeđuje potencijalno novo mesto za adiciju nekog N-vezivnog karbohidratnog lanca. Alternativno, supstitucije koje eliminišu ovu sekvencu će ukloniti postojeći N-vezani karbohidratni lanac. Takođe je data preraspodela N-vezanog karbohidratnog lanca, pri čemu je eliminisano jedno ili više N-vezivnih mesta glikosilacije (obično ona koja su prirodno dobijena), a stvara se jedno ili više novih N-vezivnih mesta.
Pronalazak takođe daje "derivate" peptida ili tela peptida ovog pronalaska. Kako se ovde koristi, naziv "derivat" se odnosi na modifikacije koje nisu, ili u dodavanju u, ubacivanju, brisanju ili supstituciji ostataka amino kiseline koji zadržavaju sposobnost da se vezuju za miostatin.
Preferirano, modifikacije koje su izvršene na peptidima iz ovog pronalaska da bi se dobili derivati, su prirodno kovalentne i uključuju, na primer, hemijske veze sa polimerima, lipidima, drugim organskim i neorganskim radikalima. Derivati pronalaska mogu da se izrade kako bi se povećao polu-život tela peptida u cirkulaciji, ili mogu da se izrade tako da poboljšaju kapacitet koji se želi postići za telo peptida prema željenim ćelijama, tkivima iil organima.
Pronalazak dalje obuhvata derivate vezivnih sredstava koji su kovalentno modifikovani tako da uključe jedan ili više dodataka polimera rastvorljivih u vodi, kao što su polietilen glikol, polioksietilen glikol ili polipropilen glikol, kako je opisno u US Patentima brojevi: 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 i 4,179,337. U druge korisne polimere koji su poznati u tehnici spadaju monometoksi-polietilen glikol, dekstran, celuloza ili drugi polimeri na bazi karbohidrata, poli-(N-vinil pirolidon)-polietilen glikol, propilen glikol homopolimeri, ko-polimer polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilirani polioli (na primer, glicerol) i polivinil alkohol, kao i mešavina ovih polimera. Posebno su preferirana tela peptida kovalentno modifikovana sa podjedinicama polietilen glikola (PEG). Polimeri rastvorljivi u vodi mogu da se vezuju na specifičnim položajima, na primer, na amino terminusu tela peptida, ili su proizvoljno vezani za jedan ili više bočnih lanaca polipeptida. Upotreba PEG za poboljšanje terapeutskog kapaciteta vezivnih sredstava (na primer, tela peptida i posebno za humanizaciju antitela je opisana u US Patentu broj 6,133,426 od strane Gonzalesa i saradnika, objavljen 17. oktobra 2000.
Pronalazak se takođe odnosi na peptid i/ili deo vehikuluma koji se izdvajaju iz sredstava koja vezuju miostatin. Ovakvi derivati mogu da poboljšaju rastvorljivost, apsorpciju, biološki polu-život i slično kod jedinjenja. Radikali mogu alternativno da eliminišu ili smanje bilo koji neželjeni sporedni efekat jedinjenja i slično. Primeri derivata obuhvataju jedinjenja u kojima:
1. Derivat ili neki njegov deo je cikličan. Na primer, deo peptida može da bude tako modifikovan da sadrži dva ili više ostatka Cys (na primer u linkeru) koji može da ciklizuje formiranjem disulfidne veze. 2. Derivat je unakrsno vezan ili može da bude sposoban da stvori unakrsne veže između molekula. Na primer, deo peptida može da bude modifikovan tako da sadrži jedan Cys ostatak i na taj način da bude sposoban da formira intermolekularnu disulfidnu vezu sa sličnom molekulom. Derivati mogu takođe da budu unakrsno vezani preko svog C-terminusa. 3. Jedna ili više peptidnih [-C(0)NR-] veza se zameni sa ne-peptidnim vezama. Primeri ne-peptidnih veza su -CH2-karbamat [-CH2-OC(0)NR-], fosfonat, -CH2-sulfonamid [-CH2-S(0)2NR-], urea [-NHC(0)NH-], -CH2-sekundarni amin i alkilovani peptid [-C(0)NR<5-, pri čemu je R6niži alkil]. 4. N-terminus se derivatizuje. Obično, N-terminus može da se aciluje ili modifikuje u supstituisani amin. U primere derivatnih grupa N-terminala spadaju -NRR, (nije -NH2), -NRC(0)R,, -NRC(0)OR,, -NRS(0)2R,, -NHC(0)NHRi, sukcinimid ili benziloksikarbonil-NH- (CBZ-NH-), pri čemu su R i R\svaki nezavisno vodonik ili niži alkil, i pri čemu fenil prsten može da bude supstituisan sa 1 do 3 supstituenta izabrana iz grupe koja sadrži CrC4alkil, Ci-C4aloksi, hloro i bromo grupe. 5. Slobodni C-terminus se derivatizuje. Obično, C-terminus se esterifikuje ili amiduje. Na primer, stručnjak sa iskustvom može da koristi postupke koji su opisani u tehnici da doda (NH-CH2-CH2-NH2)2u jedinjenja na C-terminuse jedinjenja iz ovog pronalaska. Isto tako, stručnjak sa iskustvom može da upotrebi postupke koji su opisani u tehnici da doda -NH2(ili "zatvori" sa -CH2- grupom) na C-terminuse jedinjenja iz ovog pronalaska. U primere derivatnih grupa na C-terminalu spadaju, na primer, -C(0)R2grupa, pri čemu je R2niža alkoksi grupa ili -NR3R4grupa, pri čemu su R3i R4nezavisno vodonik ili CrC8 alkil grupa (preferirano CrC4 alkil grupa). 6. Disulfidna veza se zameni sa drugim, preferirano mnogo stabilnijim, unakrsno vezanim radikalom (na primer, neka alkilen grupa). Videti, na primer, Bhatnagar i saradnici, J. Med. Chem. 39: 3814-9 (1996.), Alberts i saradnici, Thirteenth Am. Pep. Symp, 357-9 (1993.). 7. Ostaci jedne ili više pojedinačnih amino kiselina se modifikuju. Poznata su različita sredstva za stvaranje derivata koja reaguju specifično sa izabranom stranom lanca ili terminalom ostataka, kako je detaljno opisano u daljem tekstu.
Lizinil ostaci i ostaci amino terminala mogu da reaguju sa sukcinatom ili drugim anhidridima karboksilatne kiseline čime se menja naelektrisanje lizinil ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivaciju ostataka koji sadrže alfa-amino grupe uključuje imidoestre kao što su pikolinimidat; pirodoksal fosfat; piridoksal; hloroborhidrid; trinitrobenzensulfonatna kiselina; O-metilizourea; 2,4-pentandion; i reakciju sa glioksilatom uz transaminazu kao katalizator.
Arginil ostaci mogu da se modifikuju reakcijom sa bilo kojim ili kombinacijom više uobičajenih reagenasa, uključujući fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija arginil ostataka zahteva da se takva reakcija izvodi u baznim uslovima zbog velike pKa gvanidin funkcionalne grupe. Pored toga, ovi reagensi mogu da reaguju sa lizin grupama kao i sa arginin epsilon-amino grupom. Specifična modifikacija tirozil ostataka je intenzivno proučavana, sa posebnim interesovanjem za uvođenje spektralnih oznaka u tirozil ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili sa tetranitrometanom. Najčešće se koriste N-acetilimidazol i tetranitrometan da se formiraju O-acetil tirozil vrste i 3-nitro derivati, tim redom.
Grupe karboksilne strane lanca (aspartil ili glutamil) mogu selektivno da se modifikuju reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N-R'), kao što su 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-(4-etil)karbodiimid ili l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)karbodiimid. Isto tako, aspartil i glutamil ostaci mogu da se konvertuju u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijum jonima.
Glutaminil i asparaginil ostaci mogu da se deamiduju u odgovarajuće glutamil ili aspartil ostatke. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju pod srednje kiselim uslovima. Jedan ili drugi oblik ovih ostataka su obuhvaćeni okvirom ovog pronalaska.
Cisteinil ostaci mogu da se zamene sa ostacima amino kiseline ili drugim radikalima ili eliminisanjem disulfidne veze ili, suprotno tome, stabilnim unakrsnim vezivanjem. Videti, na primer, Bhatnagar i saradnici, (kao ranije).
Derivatizacija sa bifunkcionalnim sredstvima je korisna za unakrsno vezivanje peptida ili njihovih funkcionalnih derivata za osnovni matriks nerastvorljiv u vodi ili za druge makromolekularne vehikulume. U najčešće korišćena sredstva za unakrsno vezivanje spadaju, na primer, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimid estri, na primer, estri sa 4-azidosalicilatnom kiselinom, homobifunkcionalni imidoestri, uključujući disukcinimidil estre, kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat) i bifunkcionalne maleimide, kao što je bis-N-maleimido-l,8-oktan. Derivatizirajuća sredstva, kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat, daju fotoaktivne međuproizvode koji mogu da formiraju unakrsne veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, matriksi nerastvorni u vodi, kao što su karbohidrati aktivirani cijanogen bromidom i reaktivni supstrati opisani u US Patentima brojevi 3,969,987; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 se koriste za imobilizaciju proteina.
Karbohidratne (oligosaharidne) grupe mogu pogodno da se vežu za mesta u proteinima koja su poznata kao mesta za glikozilaciju. Generalno, O-vezani oligosaharidi se vezuju za serin (Ser) ili treonin (Thr) ostatke dok se N-vezani oligosaharidi vezuju za asparagin (Asn) ostatke kada su oni deo sekvence Asn-X-Ser/Thr, gde X može da bude bilo koja amino kiselina izuzev prolina. X je preferirano jedna od 19 prirodno dobijenih amino kiselina izuzev prolina. Strukture N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i ostaci šećera nađeni u svakom tipu su različite. Jedan tip šećera koji se često nalazi na oba ostatka je N-acetilneuraminatna kiselina (označena kao sialitna kiselina). Sialitna kiselina je obično terminalni ostatak i N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i, zbog svog negativnog naelektrisanja, može da odgovara kiselim osobinama glikoziliranog jedinjenja. Ovakvo mesto(a) može da bude inkorporirano u linkerima jedinjenja iz ovog pronalaska i preferirano su glikozilirani ćelijom u toku rekombinantne produkcije polipeptidnih jedinjenja (na primer, u ćelijama sisara, kao što su CHO, BHK, COS). Međutim, ovakva mesta mogu takođe da budu glikozilirana sintetskim ili semi-sintetskim procedurama koje su poznate u tehnici.
Druge moguće modifikacije obuhvataju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, oksidaciju atoma sumpora u Cys, metilaciju alfa-amino grupa lizin, arginin i histidin strana lanaca [videti, na primer, Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (VV.H.Freeman & Co., San Francisco), strane 79-86 (1983.)].
Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu isto tako da se menjaju na DNA nivou. DNA sekvenca bilo kog dela jedinjenja može da se promeni u kodone koji su mnogo kompatibilniji sa izabranom ćelijom domaćinom. ZaE. coli,koja je preferirana ćelija domaćin, u tehnici su poznati optimalni kodoni. Kodoni mogu da se supstituišu kako bi se eliminisala mesta restrikcije ili da se uključe neaktivna mesta restrikcije, koja mogu da pomognu u obradi DNA u izabranoj ćeliji domaćinu. Vehikulum, linker i peptid DNA sekvenci mogu da se modifikuju tako da uključe bilo koju od prethodno pomenutih izmena sekvenci.
Takođe su obuhvaćeni i dodatni derivati koji uključuju ne-peptidne analoge koji obezbeđuju stabilnu strukturu ili smanjenu biodegradaciju. Mimetički analozi peptida mogu da se izrade na osnovu izabranih inhibitornih peptida zamenom jednog ili više ostatka sa nepeptidnim radikalima. Preferirano, nepeptidni radikali dozvoljavaju peptidu da zadrži svoju neutralnu konfirmaciju ili stabiliše preferiranu, bioaktivnu konfirmaciju, čime zaržava sposobnost da prepozna i veže miostatin. U jednom aspektu, dobijeni mimetički analog pokazuje povećani afinitet za vezivanje miostatina. Jedan primer postupka za izradu nepeptičkih mimetičkih analoga od peptida je opisan u Nachman i saradnici, Regul. Pept. 57: 359-370 (1995.). U koliko se želi, peptidi iz pronalaska mogu da se modifikuju, na primer, glikozilacijom, amidacijom, karboksilacijom ili fosforilacijom, ili stvaranjem soli dodatkom kiselina, amida, estara, posebno C-terminalnih estara i N-acilderivata peptida iz pronalaska. Tela peptida mogu takođe da se modifikuju tako da se stvore derivati peptida formiranajem kovalentnih ili ne-kovalentnih kompleksa sa drugim radikalima. Kovalentno vezani kompleksi mogu da se izrade vezivanjem hemijskih radikala za funkcionalne grupe na delu lanaca amino kiselina koji sadrže tela peptida ili na N- ili C-terminusima.
Posebno, anticipirano je da peptidi mogu da se konjuguju za označene grupe, uključujući, ali bez ograničenja na, radioobeležene, fluorescentno obeležene grupe, neki enzim (na primer, koji katalizuje kolorimetrijsku ili fluorometrijsku reakciju), substrat, čvrsti matriks ili nosač (na primer, biotin ili avidin). U vezi sa tim, pronalazak obezbeđuje molekulu koja uključuje molekulu tela peptida, pri čemu molekula preferirano dalje uključuje obeleženu grupu izabranu iz grupe koja sadrži radioobeleženu, fluorescentno obeleženu grupu, enzim, substrat, čvrsti matriks i nosač. Ovakva obeležavanja su dobro poznata stručnjaku sa iskustvom u tehnici, na primer, biotin obeležavanja su posebno interesantna. Upotreba ovakvih obeležavanja je dobro poznata stručnjaku sa iskustvom u tehnici i opisana je u, na primer, US Patentima brojevi 3,817,837; 3,850,752; 3,996,345; i 4,277,437. Druga obeležavanja koja mogu da budu korisna uključuju, ali bez ograničenja na, radioaktivna obeležavanja, fluorescentna obeležavanja i hemiluminescentna obeležavanja. U US Patente koji sadrže upotrebu ovakvih obeležavanja spadaju, na primer, US Patentni brojevi 3,817,837; 3.850,752; 3,939,350; i 3,996,345. Bilo koje telo peptida iz ovog pronalaska može da uključi jedan, dva ili više bilo kog od ovih obeležavanja.
Postupci za izradu peptida i tela peptida
Peptidi iz ovog pronalaska mogu da se generišu pomoću velikog broja različitih postupaka koji su poznati u tehnici. Na primer, ovakvi peptidi mogu da se sintetišu u rastvoru ili na čvrstoj podlozi, u skladu sa uobičajenim tehnikama. Različiti automatski sintesajzeri su komercijalno rasploživi i mogu da se koriste u skladu sa poznatim protokolima. Videti, na primer, Stewart and Young (kao ranije); Tan i saradnici, J Am Chem Soc, 105: 6442, (1983.); Merrifield, Science 232: 341-347 (1986.); Baranv and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, izdavači Academic Press, New York, 1-284; Baranv i saradnici, Int J Pep Protein Res, 30: 705-739 (1987.); i US Patent broj 5,424,398, koji su svi ovde inkorporirani u referencama.
Postupci sinteze čvrste faze peptida koriste kopoli(stiren-divinilbenzen) koji sadrži 0.1-1.0 mM amina/g polimera. Ovi postupci za sintezu peptida koriste butiloksikarbonil (t-BOC) ili 9-fluorenilmetiloksi-karbonil (FMOC) zaštitu alfa-amino grupa. Oba postupka uključuju sintezu po fazama pri čemu se u svakoj fazi dodaje po jedna amino kiselina, počevši od C-terminusa peptida (videti, Coligan i saradnici, Curr Prot Immunol, Wiley Interscience, 1991., unit 9). Po završenoj hemijskoj sintezi, sintetički peptid može da se deprotektuje uklanjanjem t-BOC ili FMOC zaštitnih grupa amino kiselina i da se odvoji od polimera tretmanom sa kiselinom na sniženoj temperaturi (na primer, tečni HF-10% anizol, u toku približno 0.25 do približno 1 sat na 0°C. Nakon evaporacije reagenasa, peptidi se ekstrahuju iz polimera sa 1% rastvorom acetatne kiseline, ekstrakt se nakon toga liofilizira pri čemu se dobija sirovi materijal. Ovaj materijal može normalno da se prečisti tehnikama kao što je gel-filtracija na Sephadex G-15, koristeći kao rastvarač 5% acetatnu kiselinu. Liofilizacijom odgovarajućih frakcija na koloni se dobijaju se homogeni peptidi ili derivati peptida koji nakon toga mogu da se karakterišu standardnim tehnikama, kao što su analiza amino kiselina, hromatrografija na tankom sloju, visoko efikasna tečna hromatografija, spektroskopija ultravioletne apsorpcije, molarna rotacija, rastvorljivost i određivanje kvantiteta Edmanovom degradacijom čvrste faze.
Tehnike iskazivanja faga mogu da budu posebno efikasne u identifikaciji peptida iz ovog pronalaska, kako je prethodno opisano. Ukratko, izradi se datoteka faga (koristeći, na primer, ml 13, fd, ili lambda fag), pokazujući inserte od 4 do približno 80 ostataka amino kiseline. Inserti mogu, na primer, da predstavljaju kompletnu degeneraciju ili devijaciju poretka. Inserti koji sadrže fag koji se vezuje za željeni antigen se izdvoje i ovaj proces se ponavlja više puta da bi se izvršila reselekcija faga koji se vezuje za željeni antigen. Sekvencija DNA se vrši kako bi se identifikovale sekvence pojavljenih peptida. Na ovaj način može da se odredi minimalni linearni deo sekvence koji se vezuje za željeni antigen. Proces može da se ponovi korišćenjem podataka devijacije u kojima se nalaze inserti koji sadrže deo ili cele minimalne linearne delove plus jedan ili više dodatnih degenerativnih ostataka ispred ili iza njih. Ovim tehnikama mogu da se identifikuju peptidi iz pronalaska sa znatno većim afinitetom vezivanja za miostatin od sredstava koja su ovde već identifikovana.
Nezavisno od načina na koji su izrađeni peptidi, molekula nukleinske kiseline koja obeležava svaki ovakav peptid može da se generiše pomoću standardnih postupaka rekombinacije DNA. Nukleotidnom sekvencom ovakvih molekula može na odgovarajući način da se manipuliše bez promene sekvence amino kiseline koju obeležavaju da bi se objasnila degeneracija koda nukleinske kiseline, kao i da bi se objasnila prednost kodona u određenoj osnovnoj ćeliji.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koje uključuju polinukleotidne sekvence kojima se obeležavaju peptidi i tela peptida ovog pronalaska. Ove molekule nukleinske kiseline uključuju vektore i konstrukcije koje sadrže polinukleotide kojima se obeležavaju peptidi i tela peptida iz ovog pronalaska, kao i varijante i derivati peptida i tela peptida. Primeri molekula nukleinske kiseline su prikazani u niže datim Primerima.
Tehnike rekombinovanja DNA takođe obezbeđuju pogodan postupak za izradu cele dužine tela peptida i drugih velikih polipeptida vezivnih sredstava iz ovog pronalaska ili njihovih fragmenata. Polinukleotid koji obeležava telo peptida ili fragment može da se ubaci u pojavni vektor koji, s druge strane, može da se ubaci u osnovnu ćeliju za produkciju vezivnog sredstva iz ovog pronalaska. Izrada primera tela peptida iz ovog pronalaska je opisana u niže datom Primeru 2.
Brojne pojave sistema vektor/domaćin mogu da se koriste za iskazivanje peptida i tela peptida iz pronalaska. Ovi sistemi obuhvataju, ali bez ograničenja na, mikroorganizme kao što su bakterije transformisane sa rekombinovanim bakteriofagom, vektora iskazivanja plazmida ili kozmida DNA; kvasac transformisan sa vektorom iskazivanja kvasca; sistemi ćelije insekta inficirni sa vektorom iskazivanja virusa (na primer, bakulovirus); sistemi biljne ćelije transfektovani sa vektorom izraženog virusa (na primer, mozaični virus karfiola, CaMV; mozaični virus duvana, TMV) ili transformisani sa vektorom iskazivanja bakterije (na primer, Ti ili Pbr322 plazmid) ili sistemi životinjske ćelije. Jedna od preferiranih linija ćelije domaćina jeE. coliloza 2596 (ATCC#202174) koja se koristi za iskazivanje tela peptida kako je opisano u niže datom Primeru 2. Ćelije sisara koje su korisne u produkciji rekombinovanog proteina obuhvataju, ali bez ograničenja na, VERO ćelije, HeLa ćelije, ćelijske linije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), COS ćelije (kao što je COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 i 293 ćelije.
Naziv "vektor iskazivanja" se odnosi na plazmid, fag, virus ili vektor za isticanje polipeptida od polinukleotidne sekvence. Vektor iskazivanja može da uključi transkriptionalnu jedinicu koja uključuje komplet (1) genetičkog elementa ili elemenata koji imaju regulacionu ulogu u isticanju gena, na primer, promoteri ili pojačivači, (2) strukturu ili sekvencu koja obeležava vezivno sredstvo koje je transkribovano u mRNA i preneseno u protein i (3) odgovarajuće transkripcije inicijalnih ili terminantnih sekvenci. Strukturne jedinice koje treba da se koriste u kvascu ili eukariotičnim sistemima iskazivanja, preferirano obuhvataju vodeću sekvencu koja omogućava ekstracelularnu sekreciju prenetog proteina od strane ćelije domaćina. Alternativno, kada se rekombinovani protein iskazuje bez vodeće ili transportne sekvence, može da obuhvati amino ostatak termilnalnog metionila. Ovaj ostatak zatim može ili ne mora da se otcepi od iskazanog rekombinovanog proteina kako bi se dobio finalni produkt peptida.
Na primer, peptidi i tela peptida mogu rekombinovano da se iskažu u kvascu pomoću komercijalno raspoloživog sistema iskazivanja, na primer, Pichia Expression Svstem (Invitrogen, San Diego, CA) po uputstvima proizvođača. Ovaj sistem se takođe oslanja na pre-pro-alfa sekvencu za direktnu sekreciju, ali transkripcija inserta je pokrenuta promoterom alkohol oksidaze (AOXl) indukcijom sa metanolom. Izlučeni peptid se prečisti iz kvasca kao medijuma za rast pomoću postupaka koji se koriste za prečišćavanje peptida iz supernatanta bakterija i ćelija sisara.
Alternativno, cDNA koja enkodira peptide i tela peptida, može da se klonira u vektor iskazivanja bakulovirusapVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Ovaj vektor može da se koristi u skladu sa uputstvima proizvođača (PharMingen) da se inficiraju ćelije Spodoptera frugiperda u sF9 medijumu bez proteina i za produkciju rekombinovanog proteina. Rekombinovani protein može da se prečisti i koncentruje iz medijuma pomoću kolone heparin-Sepharoza (Pharmacia).
Alternativno, peptid ili telo peptida može da se iskaže u sistemu insekta. Sistemi insekta za iskazivanje proteina su dobro poznati stručnjacima sa iskustvom u tehnici. U jednom ovakvom sistemu, nuklearni polihedrozni virus Autographa californica (AcNPV) može da se koristi kao vektor za iskazivanje stranih gena u ćelijama Spodoptera frugiperda ili u larvama Trichoplusia. Kodirana sekvenca peptida može da se klonira u neesencijalni region virusa, kao što je polihedrin gen i da se stavi pod kontrolu polihedrin promotera. Uspešno ubacivanje peptida će učiniti inaktivnim polihedrin gen i produkovaće rekombinantni virus koji nema omotač od proteina. Rekombinantni virusi mogu da se koriste za infekciju ćelija S. frugiperda ili larve Trichoplusia u kojima se pojavljuje peptid (Smith i saradnici, J Virol 46:584 (1983.); Engelhard i saradnici, Proc Nat Acad Sci (USA) 91: 3224-7 (1994.): U narednom primeru, DNA sekvenca koja enkodira peptid može da se amplificira sa PCR i klonira u odgovarajući vektor, na primer, pGEX-3X (Pharmacia). Vektor pGEX je dizajniran tako da produkuje spojeni protein koji uključuje glutation-S-transferazu (GST), enkodiran sa vektorom i protein enkodiran sa DNA fragmentom ubačenim na položaju kloniranja vektora. Počeci za PCR mogu da se generišu tako da obuhvate, na primer, odgovarajuće mesto rascepa. Tamo gde se koristi samo fuzija radikala za omogućavanje iskazivanja ili, s druge strane, nije poželjna kao način vezivanja peptid umetka, spojeni rekombinovani protein može nakon toga da se rascepi od GST dela spojenog proteina. Konstrukcija pGEX-3x/peptid specifičnog vezivnog sredstva se transformišeu E. coliXL-1 Blue Cells (Stratagene, La Jolla, CA), a pojedinačni transformanti se izoluju i uvećaju. Plazmid DNA iz pojedinačnih transformanata može da se prečisti i parcijalno sekventuje pomoću automatskog sekvencera kako bi se potvrdilo prisustvo ubačenog specifičnog vezivnog sredstva koje je enkodirano nukleinskom kiselinom odgovarajuće orijentacije.
Spojeni protein, koji može da se produkuje kao nerastvorljivo telo uključeno u bakteriju, može da se prečisti na sledeći način. Ćelije domaćini se sakupe centrifugiranjem; isperu u 0.15 M NaCl, 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA; i tretiraju sa 0.1 mg/ml lizozoma (Sigma, St. Louis, MO) 15 minuta na sobnoj temperaturi. Lizat može da se izbistri soniranjem, a ostaci ćelija mogu da se prevedu u pelete centrifugiranjem 10 minuta na 12000 X g. Spojeni protein koji sadrži pelete može da se resuspenduje u 50 mM Tris, pH 8 i 10 mM EDTA, postavi preko 50% glicerola i centrifugira 30 minuta na 6000 x g. Peleta može da se resuspenduje u standardnom puferu fosfatnih soli (PBS) bez Mg++ i Ca++. Spojeni protein može dalje da se prečisti frakcionisanjem resuspendovane pelete u denaturisanom SDS-PAGE (Sambrook i saradnici, kao ranije). Gel može da se potopi u 0.4 M rastvoru KC1 da se vizualizuje protein, koji može da se iseče i prevede u elektrolit u puferu koji rastvara gel, a koji ne sadrži SDS. U koliko je GST/spojeni protein produkovan u bakteriji kao rastvorljivi protein, može da se prečisti pomoću GST Purification Module (Pharmacia).
Spojeni protein može da bude izložen digestiji za cepanje GST od peptida iz pronalaska. Reakcija digestije (20-40 mg spojenog proteina, 20-30 jedinica humanog trombina (4000 U/mg, Sigma)) u 0.5 ml PBS može da se inkubira 16-48 sati na sobnoj temperaturi i sipa preko denaturisanog SDS-PAGE gela kako bi se razdvojili produkti reakcije. Gel može da se potopi u 0.4 M rastvor KC1 da bi se videli pojasevi proteina. Identitet pojasa proteina koji odgovara očekivanoj molekulskoj težini peptida može da se potvrdi analizom sekvence amino kiseline pomoću automatskog sekvencera (Applied Biosvstems Model 473A, Foster City, CA). Alternativno, identitet može da se potvrdi pomoću HPLC i/ili masenom spektrometrijom peptida.
Alternativno, DNA sekvenca, kojom je enkodiran peptid, može da se klonira u plazmid koji sadrži željeni promoter i, opciono, vodeću sekvencu (Better i saradnici; Science 240: 1041-43 (1988.)). Ovako konstruisana sekvenca može da se potvrdi automatskim sekvenciranjem. Nakon toga, plazmid može da se transformišeu E. colilozu MCI061 pomoću standardnih procedura koje koriste inkubaciju CaCl2i tretman bakterije toplotnim šokovima (Sambrook i saradnici, kao ranije). Transformisana bakterija može da raste u LB medijumu u koji je dodat karbenicilin, a produkcija očekivanog proteina može da se indukuje rastom u pogodnom medijumu. U koliko je prisutna, vodeća sekvenca može da deluje na sekreciju peptida i može da se pocepa u toku sekrecije.
U tehnici su dobro poznati sistemi u kojima je domaćin ćelija sisara, a koji se koriste za iskazivanje rekombinantnih peptida i tela peptida. Loze ćelije domaćina mogu da se izaberu zbog određene sposobnosti da procesuju pojavu proteina ili da produkuju izvesne post-translacione modifikacije koje su korisne u obezbeđivanju delovanja proteina. Ovakve modifikacije proteina obuhvataju, ali bez ograničenja na, acetilaciju, karboksilaciju, glikozilaciju, fosforilaciju, litipidaciju i acilaciju. Različite ćelije domaćini, kao što su CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 i slične, imaju specifičnu celularnu mašineriju i karakteristične mehanizme za ovakva post-translaciona delovanja i mogu da se izaberu kako bi se osigurala korektna modifikacija i obrada uvedenih, stranih proteina.
Preferirno je da se transformisane ćelije koriste za produkciju dugotrajnih, visoko-prinosnih proteina. Kada se jednom ovakve ćelije transformišu sa vektorima koji sadrže selektivne markere, kao i kasete željenih pojavljivanja, ćelije mogu da se ostave da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu pre nego što se prebace u selektivni medijum. Selektivni marker je dizajniran tako da omogući rast i oporavak ćelija koje uspešno iskazuju uvedene sekvence. Rezistentne grupe stabla transformisanih ćelija mogu da se proliferizuju korišćenjem tehnika kulture tkiva koje odgovaraju korišćenoj liniji ćelija.
Brojni sistema selekcije mogu da se koriste za oporavak ćelija koje su transformisane zbog produkcije rekombinantnog proteina. Ovakvi sistemi selekcije obuhvataju, ali bez ograničenja na, HSVtimidin kinazu, hipoksantin-guanin fosforibosiltransferazu i gene adenin fosforibosiltransferaze u tk-, hgprt- ili aprt-ćelijama. Takođe, rezistentni anti-metaboliti mogu da se koriste kao baza selekcije za dhfr koji prenosi rezistenciju na metotreksat; gpt koji prenosi rezistenciju na mikofenolnu kiselinu; neo koji prenosi rezistenciju na aminoglikozid G418 i prenosi rezistenciju na florsulfuron; i hygro koji prenosi rezistenciju na higromicin. Dodatni selektivni geni koji mogu da budu korisni, obuhvataju trpB, koji omogućava ćelijama da koriste indol umesto triptofana, ili hisD, koji omogućava ćelijama da koriste histinol umesto histidina. Markeri koji daju vizuelnu identifikaciju za transformate uključuju anthocijanine, (3-glukuronidazu i njen supstrat, GUS i luciferazu i njen supstrat, luciferin.
Prečišćavanje i ponovno spajanje vezivnih sredstava
U nekim slučajevima, vezivna sredstva kao što su peptidi i/ili tela peptida iz ovog pronalaska treba ponovo da se "prepakuju" i oksiduju u odgovarajuću tercijernu strukturu, a disulfidne veze se generišu da bi bila biološki aktivna. Ponovo spajanje može da se izvede korišćenjem brojnih procedura koje su poznate u tehnici. Ovakvi postupci obuhvataju, na primer, izlaganje solubiliziranog polipeptidnog sredstva pH obično iznad 7 u prisustvu haotropnog sredstva. Izbor haotropa je sličan sa izborom koji se koristi za solubilizaciju inkluzionog tela, međutim, haotrop se obično koristi u nižoj koncentraciji. Primeri haotropnih sredstava su gvanidin i urea. U većini slučajeva, rastvor za prepakivanje/oksidaciju takođe sadrži redukciono sredstvo plus njegov oksidni oblik u specifičnom odnosu da generiše odgovarajući redoks potencijal koji dozvoljava izmešanom disulfidu da dovede do formiranja cistein mostova. Među obično korišćene redoks parove spadaju cistein/cistamin, glutation/ditiobisGSH, bakar hlorid, ditiotreito DTT/ditian DTT i 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-bME. U mnogim slučajevima može da se koristi korastvarač za povećanje efikasnosti prepakivanja. Obično korišćeni korastvarači su glicerol, polietilen glikol različitih molekulskih težina i arginin.
Može da bude poželjno da se peptidi i tela peptida iz ovog pronalaska prečiste. Tehnike prečišćavanja proteina su veoma dobro poznate stručnjacima sa iskustvom u tehnici. Najednom nivou, ove tehnike uključuju sirovo frakcionisanje proteinskih i ne-proteinskih frakcija. Kada se razdvoje peptidi i/ili tela peptida od drugih proteina, peptidi ili polipeptidi koji nas interesuju mogu dalje da se prečiste hromatografskim i elektroforetičnim tehnikama da bi se postiglo delimično ili kompletno prečišćavanje (ili prečišćavanje do homogenosti). Analitičke metode koje su posebno pogodne za izradu tela peptida i peptida iz ovog pronalaska su hromatografija sa jonskim izmenjivačem, hromatografija sa isključenjem; elektroforeza poliakrilamidnog gela; izoelektrično fokusiranje. Posebno efikasan metod prečišćavanja peptida je brza proteinska tečna hromatografija ili čak HPLC.
Neki aspekti ovog pronalaska se odnose na prečišćavanje, a u posebnim aspektima, na potpuno prečišćavanje tela peptida ili peptida iz ovog pronalaska. Kako se ovde koristi, naziv "prečišćena tela peptida ili peptidi" treba da se odnosi na kompoziciju, koja može da se odvoji od drugih komponenti, pri čemu je telo peptida ili peptid prečišćeno do bilo kog stepena u odnosu na stanje koje se može dobiti prirodnim putem. Stoga se naziv prečišćeni peptid ili telo peptida takođe odnosi na telo peptida ili peptid koje je izolovan iz sredine u kojoj se prirodno nalazi.
Generalno, "prečišćen" se odnosi na kompoziciju peptida ili tela peptida koja je podvrgnuta frakcionisanju kako bi se uklonile razne druge komponente, a ova kompozicija u velikoj meri zadržava svoju iskazanu biološku aktivnost. Kada se koristi naziv "u velikoj meri prečišćen", ovo se odnosi na kompoziciju peptida ili tela peptida u kojoj telo peptida ili peptid formira glavnu komponentu kompozicije, time što predstavlja približno 50%, približno 60%, približno 70%, približno 80%, približno 90%, približno 95% ili više proteina u kompoziciji.
U svetlu ovog pronalaska, stručnjaci u tehnici poznaju različite metode za kvantifikovanje stepena prečišćenosti peptida ili tela peptida. Ovo obuhvata, na primer, određivanje aktivnosti specifičnog vezivanja aktivne frakcije ili procenu količine peptida ili tela peptida unutar frakcija pomoću SDS/PAGE analiza. Preferirani metod za procenu čistoće frakcije peptida ili tela peptida je da se izračuna vezivna aktivnost frakcije, da se ova sposobnost vezivanja uporedi sa inicijalnim ekstraktom i da se tako izračuna stepen prečišćenosti ovde procenjen pomoću "-puta prečišćeno". Stvarne jedinice koje se koriste kao reprezenti količine aktivnosti vezivanja će, naravno, da zavise od određene tehnike ispitivanja koja je izabrana da prati prečišćavanje i u zavisnosti da li ili ne peptid ili telo peptida pokazuje merljivu aktivnost vezivanja.
Različite tehnike pogodne za korišćenje u prečišćavanju su dobro poznate stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Ovo obuhvata, na primer, precipitaciju sa amonijum sulfatom, PEG, antitelima (imunoprecipitacija) i slično, ili denaturaciju toplotom, a zatim centrifugiranjem; faze hromatografije kao što su hromatografija po afinitetu (na primer, Protein-A-Sefaroza), izmena jona, gel filtracija, reverzna faza, hidroksilapatit i hromatografija po afinitetu; izoelektrično fokusiranje; elektroforezu gela; i kombinacije ovih i drugih tehnika. Kako je generalno poznato u tehnici, veruje se da redosled izvođenja različitih faza prečišćavanja može da se izmeni ili da izvesne faze mogu da se preskoče, a da se i dalje dobije pogodan postupak za izradu potpuno prečišćenog vezivnog sredstva.
Ne postoji opšti zahtev da vezivna sredstva iz ovog pronalaska moraju uvek da se obezbede u njihovom najčistijem stanju. U stvari, produkti vezivnog sredstva koji su u manjoj meri prečišćeni mogu da budu korisni u nekim aspektima. Delimično prečišćavanje može da se izvede upotrebom manjeg broja faza prečišavanja u kombinaciji ili upotrebom različitih oblika iste generalne šeme prečišćavanja. Na primer, procenjuje se da hromatografija na koloni sa jonskim izmenjivačima koja se izvodi na HPLC aparatu, generalno za rezultat ima više "puta" bolju prečišćenost nego ista tehnika kada se koristi sistem hromatografije sa niskim pritiskom. Metodi koji pokazuju niži stepen relativne prečišćenosti mogu da imaju prednost u ukupnom oporavku peptida ili tela peptida ili u održavanju vezivne aktivnosti peptida ili tela peptida.
Poznato je da migracija peptida ili polipeptida može da varira, ponekad značajno, sa izmenom uslova SDS/PAGE (Capaldi i saradnici, Biochem Biophv Res Comm., 76: 425 (1977.)). Zbog toga je jasno da pod različitim uslovima elektroforeze vidljive molekulske težine dobijenih produkata prečišćenih ili delimično prečišćenih vezhivnih sredstava mogu da variraju.
Delovanje vezivnih sredstava za miostatin
Nakon izrade, vezivna sredstava iz ovog pronalaska su ispitivana na sposobnost da vezuju miostatin i inhibiraju ili blokiraju delovanje miostatina. Za određivanje sposobnosti sredstva da inhibira ili blokira delovanje miostatina korišćena su brojna ispitivanja ili testovi na životinjama. Nekoliko ispitivanja koja su korišćena za karakterizaciju peptida i tela peptida iz ovog pronalaska je opisano u niže datim Primerima. Jedna analiza je C2C12 pMARE-luc analiza koja se izvodi upotrebom ćelijske linije koja odgovara na miostatin (C2C12 mioblasti) transfektovane sa vektorom iskazane luciferaze koji sadrži elemente miostatin/aktivin odgovora (MARE). Primeri tela peptida se ispituju sa pre-inkubiranim serijama tela peptida razblaženih sa miostatinom, a zatim se ćelije izlažu mešavini za inkubaciju. Utvrdi se rezultujuće delovanje luciferaze i izradi se titraciona kriva iz serije razblaženja tela peptida. Nakon toga se odredi IC50(koncentracija tela peptida koja postiže 50% inhibicije delovanja miostatina mereno delovanjem luciferaze). Druga analiza koja je opisana u daljem tekstu je BIAcore® za određivanje kinetičkih parametara ka(konstanta brzine asocijacije), kd(konstanta brzine disocijacije) i KD(konstanta ravnoteže disocijacije) za vezivna sredstva za miostatin. Niže vrednosti konstanti ravnoteže disocijacije (KD, iskazano u nM) ukazuju na veći afinitet tela peptida za miostatin. U dodatna ispitivanja spadaju ispitivanje blokiranja, da se odredi da lije vezivno sredstvo, kao što je telo peptida, neutralisano (sprečava vezivanje miostatina za njegov receptor), ili ne-neutralisano (ne sprečava vezivanje miostatina za njegov receptor); ispitivanje selektivnosti, čime se određuje da li se vezivna sredstva iz ovog pronalaska selektivno vezuju za miostatin a ne za druge članove TGF(3 familije; i KinEx A™ ispitivanja ili ispitivanja ravnoteže na bazi rastvorljivosti, kojima se takođe određuje Kd, a koje se uzimaju kao mnogo osetljivije u nekim situacijama. Ove analize su opisane u Primeru 3.
Slika 1 pokazuje IC5opeptida u poređenju sa IC50tela peptida nastalog od peptida. Ovo pokazuje daje telo peptida značajno efikasnije u inhibiranju delovanja miostatina nego sam peptid. Dodatno, tela peptida sa razvijenim delovanjem generalno pokazuju poboljšane IC50i KDvrednosti u poređenju sa osnovnim peptidima i telima peptida. IC50vrednosti za brojne primere tela peptida sa razvijenim afinitetom su pokazane u niže datoj Tabeli VII i Primeru 7. Dodatno, u nekim slučajevima, izradom 2x verzije tela peptida, gde su dva peptida vezana u tandemu, povećava se aktivnost tela peptida iin vitroiin vivo.
In vivoaktivnosti su pokazane u niže datim Primerima. Aktivnosti vezivnih sredstava obuhvataju anaboličko delovanje uz povećanje posne mišićne mase kod životinjskih modela, kao i smanjenje masne mase u odnosu na ukupnu telesnu težinu kod tretirnih životinjskih modela i povećanje jačine mišića u životinjskim modelima.
Upotreba vezivnih sredstava za miostatin
Vezivna sredstva za miostatin iz ovog pronalaska se vezuju za miostatin i blokiraju ili inhibiraju pojavu miostatina unutar ciljanih ćelija. Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke i reagense za redukciju količine ili delovanja miostatina u
životinjama primenom efikasne doze jednog ili više vezivnih sredstava za miostatin na životinji. U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke i reagense za tretiranje oboljenja povezanih sa miostatinom kod životinja koji uključuju primenu efikasne doze jednog ili više vezivnih sredstava na životinji. U ova oboljenja povezana sa miostatinom spadaju, ali bez ograničenja na, različiti oblici gubljenja mišićne mase, kao i metaboličkih oboljenja kao što su dijabetes i slična oboljenja i oboljenja degeneracije kostiju, kao što je osteoporoza.
Kao što je pokazano u niže datom Primeru 8, primeri tela peptida iz ovog pronalaska znatno povećavaju posnu mišićnu masu kod CD1 nu/nu modela miša. Ovain vivoaktivnost je u korelaciji sain vitrovezivnim i inhibitornim delovanjem koji su niže opisani za ista tela peptida.
Oboljenja praćena gubitkom mišićne mase obuhvataju distrofije, kao što su Duhenova distrofija mišića, progresivna distrofija mišića, Bekerov dip distrofije mišića, Dejerin-Landouzi distrofija mišića, Erbova distrofija mišića i infantilna neuroaksonalna distrofija mišića. Na primer, blokiranjem miostatina upotrebom antitelain vivose poboljšava distrofični fenotip mdx modela miša sa Duhenovom distrofijom mišića (Bogdanovich i saradnici, Nature 420, 28 (2002.)). Tela peptida iz ovog pronalaska procentualno povećavaju posnu mišićnu masu u odnosu na telesnu težinu i procentualno smanjuju masnu masu u odnosu na telesnu težinu kada se primene na zrelom mdx modelu miša.
Dodatna oboljenja gubljenja mišićne mase su ona koja nastaju od hroničnih bolesti kao što su amiotrofična lateralna skleroza, kongestivna obstruktivna bolest pluća, kancer, AIDS, oštećenje bubrega i reumatoidni artritis. Na primer, kaheksija ili gubljenje mišićne mase i gubitak telesne težine je indukovano kod miša bez timusa sistemskim davanjem miostatina (Zimmers i saradnici, kao ranije). U drugom primeru, nađeno je da se povećava serumska i intramuskularna koncentracija proteina imunoreaktivnog sa miostatinom kod čoveka koji pokazuje gubitak mišićne mase uzrokovan AIDS-om, a obrnut je slučaj sa mišićnom masom bez sala (Gonzalez-Cadavid i saradnici, PNAS USA 95: 14938-14943 (1998.)). Dodatna stanja koja nastaju kao posledica gubitka mišićne mase mogu da se razviju iz neaktivnosti zbog onesposobljenosti kao što je vezanost za invalidska kolica, duža vezanost za krevet kao posledica šloga, bolesti, povrede kičmene moždine, frakture ili traume kosti i atrofije mišića u bezvazdušnom prostoru (letovi u svemir). Na primer, nađeno je da se plazma miostatin imunoreaktivni protein povećava nakon dugog boravka u krevetu (Zachwieja i saradnici, J Gravit Phvsiol. 6(2): 11 (1999.). Takođe je otkriveno da mišići pacova koji su izloženi bezvazdušnom prostoru u toku letova speis šatla pokazuju povećanu količinu miostatina u poređenju sa mišićima pacova koji nisu izloženi tim uslovima (Lalani i saradnici, J-Endocrin 167 (3): 417-28 (2000.)).
Dodatno, povećanje masnoće u mišićima povezano sa godinama i atrofija mišića povezana sa godinama izgleda daje povezana sa miostatinom. Na primer, prosečna vrednost miostatin-imunoreaktivnog proteina u serumu raste sa godinama u grupama mladih (19-35 godina), srednjih-godina (36-75) i starih (76-92) muškaraca i žena, dok je prosečna mišićna masa i masa bez sala opala sa godinama u ovim grupama (Yarasheski i saradnici, J Nutr Aging 6(5): 343-8 (2002.)). Takođe je pokazano da se kod miša bez gena za miostatin povećava miogeneza a smanjuje adipogeneza (Lin i saradnici, Biochem Biophvs Res Commun 291(3): 701-6 (2002.), što kod odraslih ima za rezultat povećanje mišićne mase i smanjenje akumulacije sala i sekrecije leptina. Primeri tela peptida poboljšavaju odnos posne mišićne mase prema salu kod odraslog mdx miša kako je pokazano u daljem tekstu.
Dodatno, pronađeno je da se miostatin javlja u malim vrednostima u srčanom mišiću, a pojava je povećana nakon kardiomiocitoze posle infarkta (Sharma i saradnici, J Cell Phvsiol 180(1): 1-9 (1999.)). Prema tome, smanjivanjem vrednosti miostatina u srčanom mišiću može da se poboljša oporavak srčanog mišića nakon infarkta.
Čini se da miostatin takođe utiče na metabolička oboljenja, uključujući dijabetes tip 2, neinsulinski zavistan dijabetes melitus, hidperglikemiju i gojaznost. Na primer, pokazano je da nedostatak miostatina poboljšava gojazne i dijabetične fenotipove kod dva modela miša (Yen i saradnici, kao ranije). U niže datim Primerima je pokazano da smanjenje aktivnosti miostatina primenom inhibitora iz ovog pronalaska smanjuje salo u mišićima kod životinja, uključujući modele ostarelih životinja. Prema tome, smanjivanjem kompozicije sala primenom inhibitora iz ovog pronalaska poboljšavaju se dijabetes, gojaznost i hiperglikemična stanja kod životinja.
Dodatno, povećanje mišićne mase redukcijom vrednosti miostatina može da se poboljša jačina kostiju i redukuje osteoporoza i druga degenerativna oboljenja kostiju. Takođe je otkriveno, na primer, da miševi sa manjkom miostatina pokazuju povećan sadržaj minerala i gustinu ključne kosti kod miša i povećan sadržaj minerala u travekularnoj i kortikalnoj kosti u regionima gde se vezuju mišići, i povećanu mišićnu masu (Hamrick i saradnici Calcif Tissue Int 71(1): 63-8 (2002.)).
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupke i reagense za povećavanje mišićne mase kod životinja koje se koriste u ishrani primenom efektivne doze vezivnog sredstva za miostatin na životinji. Kako je zreo C-terminalni miostatin polipeptid identičan kod svih testiranih vrsta, očekuje se da vezivna sredstva za miostatin budu efikasna u povećavanju mišićne mase i smanjenju sala kod bilo koje vrste važne za ishranu, uključujući goveda, piliće, ćurke i svinje.
Vezivna sredstva iz ovog pronalaska mogu da se koriste sama ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima kako bi povećali svoja terapeutska delovanja ili smanjili potencijalne neželjene efekte. Vezivna sredstva iz ovog pronalaska poseduju jednu ii više poželjnih ali neočekivanih kombinacija osobina za poboljšanje terapeutske vrednosti sredstva. Ove osobine obuhvataju povećanje aktivnosti, povećanje rastvorljivosti, smanjenje degradacije, povećanje polu-života, smanjenje toksičnosti i smanjenje imunogeničnosti. Prema tome, vezivna sredstva iz ovog pronalaska su korisna za produženje režima lečenja. Dodatno, osobine hidrofilnosti i hidrofobnosti jedinjenja iz pronalaska su dobro izbalansirane i na taj načinje poboljšana njihova mogućnost i zain vitro,a posebno zain vivoupotrebu. Posebno, jedinjenja iz pronalaska imaju odgovarajući stepen rastvorljivosti u vodenom medijumu, što dozvoljava apsorpciju i bioraspoloživost u organizmu, dok takođe imaju određeni stepen rastvorljivosti u lipidima, što dozvoljava jedinjenjima da prolaze kroz ćelijsku membranu do predpostavljenog mesta delovanja, kao što je na primer mišićna masa.
Vezivna sredstva iz ovog pronalaska su korisna za lečenje "subjekta" ili bilo koje životinje, uključujući ljude, kada se primene u efektivnim dozama u odgovarajućoj kompoziciji,.
Dodatno, vezivna sredstva za miostatin iz ovog pronalaska su korisna za detekciju i kvantifikaciju miostatina u brojnim analizama. Ove analize su mnogo detaljnije opisane u daljem tekstu.
Generalno, vezivna sredstva iz ovog pronalaska su korisna kao sredstva za vezivanje i imobilizaciju miostatina u različitim analizama, slično onima koje su opisane u, na primer, Asai, izdavač; Methods in Cell Biologv, 37, Antibodies in Cell Biologv, Academic Press, Inc., New York (1993.). Vezivno sredstvo može da bude obeleženo na neki način ili može da reaguje sa trećom molekulom, kao što je antitelo kao anti-vezivno sredstvo koje je obeleženo kako bi omogućilo detekciju i kvantifikaciju miostatina. Na primer, vezivno sredstvo ili treća molekula može da se modifikuje sa radikalom koji može da se detektuje, kao što je biotin, koji nakon toga može da se veže za četvrtu molekulu, kao što je enzim-obeleženi streptavidin ili neki drugi protein. (Akerstrom, J Immunol 135: 2589 (1985.); Chaubert, Mod Pathol 10:585 (1997.)).
U toku bilo koje određene analize, mogu da se zahtevaju faze inkubacije i/ili ispiranja nakon svake kombinacije reagenasa. Faze inkubacije mogu da variraju od približno 5 sekundi do nekoliko sati, preferirano od približno 5 minuta do približno 24 sata. Međutim, vreme inkubacije zavisi od formata analize, zapremine rastvora, koncentracije i slično. Obično se analize izvode na sobnoj temperaturi, mada mogu da se izvode i na različitim temperaturama.
Ne- kompetitivna analiza vezivanja:
Analiza vezivanja može da bude ne-kompetitivnog tipa u kome se količina vezanog miostatina meri direktno. Na primer, u jednoj preferiranoj "sendvič" analizi, vezivno sredstvo može da bude direktno vezano za čvrsti supstrat gde je imobilizovano. Ovo imobilizovano sredstvo se nakon toga vezuje za miostatin koji se nalazi u test uzorku. Nakon toga se imobilizovani miostatin vezuje sa obeleženim sredstvom, kao što je obeleženo antitelo za miostatin koje može da se detektuje. U narednoj preferiranoj "sendvič" analizi, može da se doda drugo sredstvo koje je specifično za vezivno sredstvo, a sadrži detektabilni radikal kao što je biotin, za koji može specifično da se veže treća obeležena molekula, kao što je streptavidin. (Videti Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratorv Manual, CH14, Cold Spring Harbor Laboratorv, NY (1998.), što je ovde inkorporirano u referneci).
Kompetitivna analiza vezivanja:
Analiza vezivanja može da bude kompetitivnog tipa. Količina miostatina koji se nalazi u uzorku se meri indirektno, merenjem količine izmeštenog miostatina ili zamenjenog od strane vezivnog sredstva za miostatin koji se nalazi u uzorku. U jednoj preferiranoj analizi kompetitivnog vezivanja, poznata količina miostatina koja je obično obeležena se doda u uzorak, a uzorak se zatim spoji sa vezivnim sredstvom. Količina obeleženog miostatina koja se veže za vezivno sredstvo je obrnuto proporcionalna koncentraciji miostatina koji se nalazi u uzorku. (Po protokolima koji su nađeni u, na primer, Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratorv Manual, CH14, strane 579-583, kao ranije).
U narednoj preferiranoj kompetitivnoj analizi vezivanja vezivno sredstvo se imobilizuje na čvrstom supstratu. Količina miostatina vezanog za vezivno sredstvo može da se odredi ili merenjem količine miostatina koji se nalazi u kompleksu miostatin/vezivno sredstvo, ili alternativno, merenjem količine preostalog nekompleksiranog miostatina.
Analize drugih vezivanja
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje Western blot metode za detekciju ili kvantifikaciju prisustva miostatina u uzorku. Tehnika generalno uključuje razdvajanje proteina iz uzorka elektroforezom gela na bazi molekulske težine i transferisanje proteina do pogodnog čvrstog nosača, kao što su nitrocelulozni filter, najlon filter ili derivati najlon filtera. Uzorak se inkubira sa vezivnim sredstvima ili njihovim fragmentima koji vezuju miostatin, a nastali kompleks se detektuje. Ova vezivna sredstva mogu da budu direktno obeležena ili alternativno mogu zatim da se detektuju pomoću obeleženih antitela koja se specifično vezuju za vezivno sredstvo.
Dijagnostička ispitivanja
Vezivna sredstva ili njihovi fragmenti iz ovog pronalaska mogu da budu korisna za dijagnozu stanja ili oboljenja koja karakterišu povećane količine miostatina. Dijagnostička ispitivanja za visoke vrednosti miostatina obuhvataju metode koje uključuju vezivno sredstvo i marker za detekciju miostatina u fluidima ljudskog tela, ekstraktima ćelija ili specifičnim ekstraktima tkiva. Na primer, vrednosti miostatina u serumu mogu kod pojedinaca da se mere više puta kako bi se odredio početak gubljenja mišića u vezi sa godinama ili neaktivnošću, kako je opisano, na primer, Yarasheski i saradnici, kao ranije. Pokazano je daje rast vrednosti miostatina u korelaciji sa prosečnim smanjenjem mišićne mase i mase bez sala sa povećanjem broja godina u grupama muškaraca i žena (Yarasheski i saradnici, kao ranije). Vezivna sredstva iz ovog pronalaska mogu da budu korisna za praćenje povećanja ili smanjenja vrednosti miostatina u toku, na primer, određenog vremenskog razmaka. Vezivna sredstva mogu da se koriste u ovakvim analizama sa ili bez modifikacija. U preferiranom dijagnostičkom ispitivanju, vezivna sredstva se obeležavaju vezivanjem za, na primer, obeleženu ili označenu molekulu. Poznat je veliki broj različitih obeleženih i označenih molekula, od kojih su neke već ovde opisane. Posebno, ovaj pronalazak je koristan za dijagnostikovanje bolesti kod ljudi.
U tehnici su poznati različiti protokoli za merenje miostatin proteina koristeći vezivna sredstva za miostatin. Primeri obuhvataju analizu imunosorbenta za koji je vezan enzim (ELISA), radioimunoanalizu (RIA) i sortiranje fluorescentnih aktiviranih ćelija (FACS).
Za dijagnostičke primene, u izvesnim aspektima vezivna sredstva iz ovog pronalaska su obično obeležena sa detektibilnim radikalom. Detektibilni radikal može da bude bilo koji radikal koji može da produkuje, ili direktno ili indirektno, detektibilni signal. Na primer, detektibilni radikal može da bude radioizotop, kao što su<3>H,<I>4C,32P,35Sili<I25>I, fluorescentno ili hemiiluminescentno jedinjenje, kao što su fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin; ili neki enzim, kao što su alkalna fosfataza, P-galaktozidaza ili peroksidaza rena (Bayer i saradnici, Meth Enz, 184: 138 (1990.)).
Farmaceutske kompozicije
Farmaceutske kompozicije vezivnih sredstava za miostatin, kao što su ovde opisana tela peptida, potpadaju pod okvir ovog pronalaska. Takve kompozicije uključuju terapeutski ili profilaktički efektivnu količinu vezivnog sredstva za miostatin, njegov fragment, varijantu ili derivat, kako je ovde opisano, u mešavini sa farmaceutski prihvatljivim sredstvom. U preferiranom aspektu, farmaceutske kompozicije uključuju antagonist vezivnog sredstva koji delimično ili potpuno inhibira miostatin u mešavini sa farmaceutski prihvatljivim sredstvom. Obično su vezivna sredstva za miostatin dovoljno prečišćena za primenu na životinjama.
Farmaceutska kompozicija može u formulaciji da sadrži materijale za modifikaciju, održavanje ili konzervisanje, na primer, pH, osmolariteta, viskoziteta, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvorljivosti ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije kompozicije. U pogodne materijale formulacije spadaju, ali bez ograničenja na, amino kiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobna sredstva; antioksidansi (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen sulfit); puferi (kao što su boratni, bikarbonatni, Tris-HCL, citratni, fosfatni, puferi drugih organskih kiselina); sredstva za dopunjavanje (kao što su manitol ili glicin); helatna sredstva (kao stoje etilendiamin tetraacetatna kiselina (EDTA)); kompleksna sredstva (kao što su kofein, polivinilpirolidin, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); punioci; monosaharidi; disaharidi i drugi karbohidrati (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteini (kao što su serum albumina, želatin ili imunoglobulini); sredstva za bojenje; sredstva za korigovanje ukusa i za razblaživanaje; emulgujuća sredstva, hidrofilni polimeri (kao što je polivinilpirolidin); polipeptidi male molekulske težine; katjoni koji formiraju soli (kao što je natrijum); konzervansi (kao što su benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarači (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); alkoholi dobijeni od šećera (kao što su manitol ili sorbitol); suspendujuća sredstva; surfaktanti ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, estri sorbitana, polisorbati, kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol ili tiloksapal); sredstva za poboljšanje stabilnosti (saharoza ili sorbitol); sredstva za pojačavanje toničnosti (kao što su halidi alkalnih metala (preferirano natrijum ili kalijum hlorid), manitol, sorbitol); vehikulumi za oslobađanje; razblaživači; ekscipijenti i/ili farmaceutska pomoćna sredstva. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18<th>Edition, A.R. Gennaro, izdavač Mack Publishing Companv, 1990.).
Optimalnu farmaceutsku kompoziciju će da odredi stručnjak sa iskustvom u tehnici u zavisnosti od, na primer, nameravanog načina primene, načina oslobađanja i željene doze. Videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, kao ranije. Takve kompozicije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanjain vivoi brzinu klirensain vivovezivnog sredstva.
Primarni vehikulum ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može po prirodi da bude ili vodeni ili nevodeni. Na primer, pogodan vehikulum ili nosač može da bude voda za injekcije, fiziološki rastvor soli ili veštački cerebrospinalni fluid koji može da bude obogaćen sa drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu primenu. Dalji primer vehikuluma su neutralno puferisani slani rastvor ili soli izmešane sa serumom albumina. Drugi primeri farmaceutskih kompozicija uključuju Tris pufer čiji je pH približno 7.0-8.5, ili acetatni pufer čiji je pH približno 4.0-5.5, koji mogu još da uključe sorbitol ili njegove pogodne supstituente. U jednom aspektu ovog pronalaska, kompozicija vezivnog sredstva može da se izradi za čuvanje mešanjem izabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim sredstvima formulacije (Remington's Pharmaceutical Sciences, kao ranije) u obliku liofilizirane pogače ili u obliku vodenog rastvora. Dalje, produkt vezivnog sredstva može da se formuliše kao liofilizat pomoću odgovarajućih ekscipijenata, kao što je saharoza.
Farmaceutske kompozicije mogu da budu izabrane za parenteralno oslobađanje. Alternativno, kompozicije mogu da budu namenjene za inhalaciju ili za unutrašnje oslobađanje, kao što je u slučaju oralne, auralne, oftalmične, rektalne ili vaginalne primene. Izrada ovakvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je u okviru stanja tehnike.
Komponente formulacije su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive na mestu primene. Na primer, puferi se koriste da održe kompoziciju u fiziološkom pH ili malo nižem pH, obično u rasponu pH od približno 5 do približno 8.
Kada se želi parenteralna primena, terapeutska kompozicija za upotrebu u ovom pronalasku mora da bude u obliku apirogenog, parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji uključuje željeno vezivnog sredstvo u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Posebno poželjan vehikulum za parenteralne injekcije je sterilna destilovana voda u kojoj se vezivno sredstvo formuliše kao sterilan, izotoničan rastvor koji je odgovarajuće konzervisan. Još jedan preparat može da obuhvati formulaciju željene molekule sa nekim sredstvom, kao što su injektibilne mikrosfere, bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (polilaktatna kiselina, poliglikolatna kiselina), kuglice ili lipozome, čime se obezbeđuje kontrolisano ili odloženo oslobađanje produkta, koji nakon toga može da se oslobodi preko depo injekcija. Takođe može da se koristi hijaluronska kiselina koja može da ima efekat promovišanja produženog trajanja u cirkulaciji. Druga pogodna sredstva za uvođenje željene molekule obuhvataju implantantne oblike za oslobađanje leka.
U narednom aspektu, farmaceutske formulacije koje su pogodne za parenteralnu primenu mogu da se formulišu u vodenim rastvorima, preferirano u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što su Hankov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki puferovan rastvor soli. Suspenzije vodenih injekcija mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Dodatno, suspenzije aktivnih jedinjenja mogu da se izrade kao odgovarajuće injekcije u obliku uljanih suspenzija. U pogodne lipofilne rastvarače ili vehikulume spadaju masna ulja, kao što je sezamovo ulje, ili sintetski estri masnih kiselina, kao što su etil oleat, trigliceridi ili lipozomi. Ne-lipidni polikatjonski amino polimeri mogu takođe da se koriste za oslobađanje aktivnog jedinjenja. Opciono, suspenzija može takođe da sadrži pogodne stabilizatore ili sredstva za povećanje rastvorljivosti jedinjenja, čime se omogućava izrada rastvora veće koncentracije. U drugom aspektu, farmaceutska kompozicija može da se formuliše za primenu inhalacijom. Na primer, vezivna sredstva mogu da se formulišu u obliku suvog praška za inhalaciju. Rastvori za inhalaciju sa polipeptidom ili molekulom nukleinske kiseline mogu takođe da se formulišu sa propelantom za aerosol oslobađanje. U još jednom od aspekata, rastvori mogu da se koriste kao nebulizeri. Pulmonarna primena je detaljnije opisana u PCT prijavi broj PCT/TJS94/001875, gde su opisana oslobađanja hemijski modifikovanih proteina u plućima.
Takođe se očekuje da izvesne formulacije mogu da se primene oralno. U jednom aspektu ovog pronalaska, molekule vezivnog sredstva koje se primenjuju na ovaj način mogu da se formulišu sa ili bez onih nosača koji se obično koriste u jedinjenjima čvrstog doziranog oblika, kao što su tablete i kapsule. Na primer, kapsula može da bude izrađena tako da oslobađa aktivni deo formulacije u delu gastrointestinalnog trakta kada je bioraspoloživost maksimalna a pre-sistemska degradacija minimalna. Mogu da se uključe i dodatna sredstva kako bi se omogućila apsorpcija molekule vezivnog sredstva. Razblaživači, sredstva za korigovanje ukusa, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, lubrikansi, suspendujuća sredstva, sredstva za dezintegraciju tablete i vezivna sredstva mogu takođe da se upotrebe.
Farmaceutske kompozicije za oralnu primenu mogu takođe da se formulišu upotrebom farmaceutski prihvatljivih nosača koji su dobro poznati u tehnici, u doziranim oblicima koji su pogodni za oralnu primenu. Ovakvi nosači omogućavaju da se farmaceutske kompozicije formulišu u obliku tableta, pilula, dražeja, kapsula, tečnosti, gelova, sirupa, emulzija, suspenzija i slično, koje pacijent guta.
Farmaceutski preparati za oralnu upotrebu mogu da se dobiju kombinovanjem aktivnih jedinjenja sa čvrstim ekscipijentom i pretvaranjem dobijene mešavine u granule (opciono nakon mlevenja) da se dobiju tablete ili jezgra dražeja. U koliko se želi, mogu da se dodaju pogodne pomoćne materije. U pogodne ekscipijente spadaju karbohidratni ili proteinski punioci, kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol i sorbitol; škrob od kukuruza, pšenice, pirinča, krompira i drugih biljaka; celuloza, kao što su metil celuloza, hidroksipropilmetil-celuloza ili natrijum karboksimetilceluloza; gume, uključujući arapsku gumu i tragakantu; i proteini, kao što su želatin i kolagen. U koliko se želi, mogu da se dodaju dezintegratori ili sredstva za solubilizaciju, kao što su unakrsno vezani polivinil pirolidon, agar i aglininska kiselina ili njene soli, kao stoje natrijum alginat.
Jezgra dražeja mogu da se koriste u konjukciji sa pogodnim omotačima, kao što je koncentrovani rastvor šećera koji takođe može da sadrži arapsku gumu, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilen glikol i/ili titanijum dioksid, rastvore laka i odgovarajuće organske rastvarače ili mešavine rastvarača. U omotače tableta ili dražeja mogu takođe da se dodaju sredstva za bojenje ili pigmenti da bi se identifikovao produkt ili okarakterisala količina aktivnog jedinjenja, to jest doza.
Farmaceutski preparati koji se koriste oralno takođe obuhvataju čvrste kapsule izrađene od želatina, kao i mekane, zatvorene kapsule izrađene od želatina i omotača kao što su glicerol ili sorbitol. Čvrste kapsule mogu da sadrže aktivne sastojke izmešane sa puniocima ili vezivnim sredstvima, kao što su laktoza ili škrobovi, lubrikansima, kao što su talk ili magnezij um stearat i opciono, stabilizatorima. U mekanim kapsulama, aktivna jedinjenja mogu da budu rastvorena ili suspendovana u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja, rastvori ili tečni polietilen glikoli sa ili bez stabilizatora.
Naredna farmaceutska kompozicija može da uključi efektivnu količinu vezivnog sredstva u mešavini sa netoksičnim ekscipijentima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi ili nekom drugom odgovarajućem vehikulumu mogu da se pripreme rastvori u jediničnom doznom obliku. U pogodne ekscipijente spadaju, ali bez ograničenja na, inertni razblaživači, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza ili kalcijum fosfat; ili vezivna sredstva kao što su škrob, želatin ili akacija; ili lubrikantna sredstva, kao što su magnezijum stearat, stearatna kiselina ili talk.
Druge farmaceutske kompozicije biće jasne stručnjaku sa iskustvom u tehnici, uključujući formulacije u kojima su molekule vezivnog sredstva u formulacijama sa odloženim ili kontrolisanim oslobađanajem. Tehnike za formuiisanje drugih različitih načina za odloženo ili kontrolisano oslobađanje, kao što su nosači lipozoma, bio-erodibilne mikrokapsule ili porozne perlice i depo injekcije su takođe poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Videti, na primer, PCT/US 93/00829 u kome je opisano kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za oslobađanje farmaceutskih kompozicija. Dodatni primeri preparata sa odloženim oslobađanjem uključuju matrikse semipermeabilnih polimera u obliku određenih proizvoda, kao što su filmovi ili mikrokapsule. U matrikse sa odloženim oslobađanjem spadaju poliestri, hidrogeli, poliaktidi (US 3,773,919, EP 58,481), kopolimeri L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman i saradnici, Biopolvmers, 22: 547-556 (1983.), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer i saradnici, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277, (1981.); Langer i saradnici, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982.)), etilen vinil acetat (Langer i saradnici, kao ranije) ili poli-D(-)-3-hidroksibutiratna kiselina (EP 133,988). Kompozicije sa odloženim oslobađanjem takođe obuhvataju lipozome koji mogu da se izrade bilo kojom od nekoliko metoda koje se poznate u tehnici. Videti, na primer, Eppstein i saradnici, PNAS (USA), 82: 3687 (1985.); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.
Farmaceutska kompozicija koja treba da se koristi zain vivoprimenu obično mora da bude sterilna. Ovo može da se postigne filtracijom kroz sterilne membranske filtere. Kada je kompozicija liofilizirana, sterilizacija ovakvog produkta može da se vrši ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicija za parenteralnu primenu može da se čuva u liofiliziranom obliku ili u obliku rastvora. Dodatno, parenteralne kompozicije se generalno stavljaju u kontejnere koji imaju pristupačan sterilan ulaz, na primer, kesa sa intravenoznim rastvorom ili boca koja ima zatvarač koji može da se probije hipodermičnom injekcionom iglom.
Kada je farmaceutska kompozicija formulisana, može da se čuva u sterilnim bocama u obliku rastvora, suspenzije, gela, emulzije, čvrste supstance ili dehidriranog ili liofiliziranog praška. Ovakve formulacije mogu da se čuvaju ili u obliku u kakvom se koriste ili u obliku (na primer, liofilizata) koji pre primene zahteva rekonstituciju.
U specifičnom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na setove za produkciju jedinica za primenu pojedinačnih doza. Svaki set može da sadrži zajedno jedan kontejner koji ima suvi protein i drugi kontejner koji ima vodenu formulaciju. U okviru ovog pronalaska su takođe i setovi koji sadrže pojedinačne ili višestruke prethodno napunjene brizgalice (na primer, tečne brizgalice i liobrizgalice).
Efektivna količina farmaceutske kompozicije koja se koristi u terapiji zavisiće na primer, od terapeutskog konteksta i predmeta terapije. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da proceni da će odgovarajuće vrednosti doze za tretman varirati u zavisnoti delimično od oslobađanja molekule, indikacije zbog koje se koristi molekula vezivnog sredstva, načina primene, veličine (telesne težine, površine tela ili veličine organa) i stanja (godine i opšte zdravstveno stanje) pacijenta. U skladu sa tim, lekar može da odredi dozu i da modifikuje način primene kako bi se dobio optimalan terapeutski efekat. Uobičajena doza može da bude u rasponu od približno 0.1 mg/kg do približno 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od faktora koji su prethodno navedeni. U drugim aspektima doza može da bude u rasponu od 0.1 mg/kg do približno 100 mg/kg; ili 1 mg/kg do približno 100 mg/kg; ili 5 mg/kg do približno 100 mg/kg.
Za bilo koje jedinjenje, terapeutski efektivna doza može inicijalno da se proceni ili ispitivanjem u ćelijskoj kulturi ili na životinjskim modelima, kao što su miševi, pacovi, zečevi, psi, svinje ili majmuni. Životinjski model može takođe da se koristi za određivanje odgovarajućeg raspona koncentracije i načina primene. Ovi podaci mogu zatim da se koriste za određivanje odgovarajućih doza i načina primene kod ljudi.
Tačne doze se određuju u zavisnosti od faktora koji su povezani sa subjektom koji zahteva tretman. Doza i primena su podešeni tako da obezbede dovoljne vrednosti aktivnog jedinjenja ili da održe željeni efekat. Faktori koji se uzimaju prilikom određivanja doze i načina primene obuhvataju ozbiljnost bolesnog stanja, opšte zdravstveno stanje subjekta, godine, telesnu težinu i pol subjekta, vreme i frekvenciju primene, kombinacije lekova, osetljivost na terapiju i odgovor na terapiju. Farmaceutske kompozicije sa dugotrajnim delovanjem mogu da se primenjuju svaka 3 do 4 dana, svake nedelje ili dvonedeljno, u zavisnosti od polu-života i brzine klirensa određene formulacije.
Frekvencija doziranja zavisi od farmakokinetičkih parametara molekule vezivnog sredstva u upotrebljenoj formulaciji. Obično, kompozicija se primenjuje sve dok se doziranjem ne postigne željeni efekat. Stoga, kompozicija može da se primenjuje kao pojedinača doza ili kao višestruka doza (uz istu ili različitu koncentraciju/doza) po vremenu ili kao kontinuirana infuzija. Dalje određivanje odgovarajuće doze se vrši rutinski. Odgovarajuće doziranje-može da se procenjuje na osnovu odnosa odgovarajuća doza-vrednost odgovora.
Način primene farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima, na primer, oralno, injekcijama, i to intravenozno, intraperitonealno, intracerebralno (intraparenhimalno), intracerebroventrikularno, intramuskularno, intraokularno, intraarterijalno, intraportalno, intralezionalnim putevima, intramedularno, intratekalno, intraventrikularno, transdermalno, subkutano, intraperitonealno, intranazalno, enteralno, topično, sublingvalno, uretralno, vaginalno ili rektalnim sredstvima, sistemima za odloženo oslobađanje ili implantantima. Gde se želi, kompozicije mogu da se primene pomoću velikih injekcija ili kontinuiranom infuzijom ili implantacijom.
Alternativno ili dodatno, kompozicija može da se primeni lokalno implantacijom membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na kome su apsorbovane ili enkapsulirane željene molekule. Kada se koristi sredstvo za implantaciju, implantant može da se ubaci u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a oslobađanje željene molekule može da bude difuzijom, pulsiranjem ili kontinuirano.
U nekim slučajevima, može da bude poželjna upotreba farmaceutskih kompozicija naex vivonačin. U ovakvim slučajevima, ćelije, tkiva ili organi koji su uklonjeni iz pacijenta se izlažu farmaceutskim kompozicijama, a nakon toga se ćelije, tkiva i/ili organi ponovo implantiraju natrag u pacijenta.
U drugim slučajevima, vezivno sredstvo iz ovog pronalaska, kao stoje telo peptida, može da se oslobodi implantiranjem izvesnih ćelija koje su proizvod genetskog inžinjeringa, koristeći postupke kao što su ovde opisani, za pojavu i uklanjanje polipeptida. Takve ćelije mogu da budu životinjske ili humane ćelije i mogu da budu autologne, heterologne ili ksenogenične. Opciono, ćelije mogu da budu umrtvljene. Da bi se umanjila šansa imunološkog odgovora, ćelije mogu da se enkapsuliraju da bi se izbegla infiltracija okolnog tkiva. Enkapsulirani materijali su obično biokompatibilni, semi-permeabilni polimerni omotači ili membrane koje dozvoljavaju oslobađanje proteinskog produkta ali sprečavaju destrukciju ćelija od strane imuno sistema pacijenta ili od strane drugih detrimentalnih faktora iz okolnog tkiva.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže vezivna sredstva iz ovog pronalaska se primenjuju na subjektu u svrhu lečenja bilo kog poremećaja povezanog sa miostatinom. Ovo uključuje oboljenja u kojima dolazi do gubitka mišićne mase, uključujući, ali bez ograničenja na, distrofiju mišića, gubljenje mišića kod kancera, AIDS, atrofiju mišića, reumatoidni artritis, oštećenja bubrega/uremiju, hronično oštećenje srca, dugotrajnu vezanost za krevet, oštećenje kičmene moždine, šlog i sarkopeniju uslovljenu godinama. Kao dodatak, ove kompozicije se primenjuju u lečenju gojaznosti, dijabetesa, hiperglikemije i za povećanje gustine kostiju.
Za pronalazak koji je opisan, naredni primeri su dati kao način ilustracije, a ne kao ograničavajući faktor.
Primer 1
Identifikacija miostatin-vezujućih peptida
Tri grupe filamentoznih faga, TN8-IX (5 x IO<9>nezavisnih transformanata), TN12-I (1.4 x IO<9>nezavisnih transformanata) i linearni (2.3 x IO<9>nezavisnih trnsformanata) (Dyax Corp.) se koriste za selekciju miostatin vezujućeg faga. Svaka grupa se inkubira na miostatin-obloženim površinama i podvrgava različitim uslovima tabelisanja: ne-specifična eluacija i specifična eluacija uz upotrebu rekombinantnog humanog aktivin receptora IIB/Fc himere (R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) ili eluaciju miostatin propeptida, kako je opisano u daljem tekstu. Za sve tri grupe, fagi se eluiraju na ne-specifičan način za prvi krug selekcije, dok se receptor i promiostatin koriste u drugom i trećem krugu selekcije. Procedure selekcije se izvode na način koji je niže opisan.
Izrada miostatina
Miostatin protein se produkuje rekombinantnou E. coliK-12 lozi 2596 (ATCC#202174) na sledeći način. Polinukleotidi koji kodiraju humanu promiostatin molekulu se kloniraju u pAMG21 vektoru iskazivanja (ATCC No. 98113) koji se izdvaja iz vektora iskazivanja pCFM1656 (ATCC No.69576) i sistema vektora iskazivanja koji je opisan u United States Patent broj 4,710,473 po proceduri koja je opisana u objavljenoj Internacionalnoj patentnoj prijavi WO 00/24782. Polinukleotidi koji enkodiraju promiostatin se dobijaju od vektora iskazivanja sisara. Kodirani region se proširi upotrebom standardnog PCR postupka i po PCR osnovama za uvođenje položaja restrikcije za Ndel i BamHI.
PCR produkt i vektor se digestiraju za oba enzima, mešaju i povežu. Produkt povezivanja se trasformišeu E. coliloze #2596. Pojedinačne kolonije se mikroskopski provere na pojavljivanje rekombinantnog proteina u obliku inkluzionih tela. Plazmid se izoluje i sekvencira kroz kodirani region rekombinantnog gena kako bi se verifikovala genetička tačnost. Bakterijska pasta se generiše iz 10 L fermenta na 37° koristeći metod serija. Kultura se indukuje sa HSL pri gustini ćelija od 9.6 OD600i pokupi šest sati kasnije pri gustini od 104 OD6oo- Pasta se čuva na -80°C. PastaE. coliu kojoj se javlja promiostatin se lizira u mikrofluidizeru na 16,000 psi i centrifugira da se izoluje nerastvorljiva inkluzivna frakcija tela. Inkluzivna tela se resuspenduju u gvanidin hidrohloridu koji sadrži ditiotreitol i solubiliziraju na sobnoj temperaturi. Nakon toga se razblaže 30 puta u vodenom puferu. Razblaženi promiostatin se nakon toga koncentruje, a pufer promeni sa 20 mM tris pH 8 i prenese u kolonu anjonskih izmenjivača. Kolona anjonskih izmenjivača se eluira sa povećavajućim gradijentom natrijum hlorida. Frakcije koje sadrže promiostatin se izvuku. Promiostatin koji je produkovanu E. coli jenestao iz prvih 23 amino kiselina, a počinje da se javlja sa metioninom pre ostatka 24 asparagina. Da se produkuje zreo miostatin, povučeni promiostatin se enzimatski iscepa između propeptida i C terminala zrelog miostatina. Dobijena mešavina se zatim nanese na C4-rp HPLC kolonu koristeći povećavajući gradijent acetonitrila koji sadrži 0.1% trifluoroacetatne kiseline. Frakcije koje sadrže zreli miostatin se izvuku i suše u brzom vakuumu.
Rekombinantni zreli miostatin produkovan izE. colise testira u mioblastu C2C12 na osnovu analize koja je opisana u daljem tekstu i nađeno je daje potpuno aktivan u poređenju sa rekombinantnim miostatinom pacova koji je komercijalno produkovan u sistemu ćelija sisara (R and D Svstems, Inc., Minneapolis, Minnesota). Zreli miostatin produkovan uE. colise koristi u pokazivanju faga i proveravanju analiza koje su opisane u daljem tekstu.
Priprema kiveta obloženih miostatinom
Miostatin se imobilizuje na 5 ml Immuno™ (NUNC), pri koncentraciji od 8 ug miostatin proteina u 1 ml 0.1 M pufera natrijum karbonata (pH 9.6). I Immuno™ kiveta se inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi uz orbitalno mućkanje. Nakon toga se Immuno™ kiveta obložena miostatinom blokira dodavanjem 5 ml 2% mleko-PBS i inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi uz rotiranje. Dobijena Immuno™ kiveta obložena miostatiom se zatim tri puta ispere sa PBS, a zatim se podvrgne procedurama selekcije. Dodatne Immuno™ kivete se takođe izrade za negativne selekcije (bez miostatina). Za svaku fazu ispiranja, pet do deset Immuno™ kiveta se podvrgne prethodnoj proceduri, izuzev onih Immuno™ kiveta koje su obložene sa 1 ml 2% BSA-PBS umesto miostatin proteina.
Negativna selekcija
Za svaki uslov ispiranja, približno 100 nasumice izabranih grupa ekvivalenata za TN8-IX i TN12-I grupe (5 x 1011 pfu za TN8-I-X i 1.4 x IO11 pfu za TN12-I) i približno 10 nasumice izabranih grupa ekvivalenata za linearnu grupu
(2.3 x IO<10>pfu) se alikvotira iz osnovne grupe i razblaži do zapremine 1 ml sa PBST (PBS sa 0.05% Tween-20). 1 ml razblažene osnovne grupe se doda u Immuno™ kivetu pripremljenu za negativnu selekciju i inkubira 10 minuta na sobnoj temperaturi uz orbitalno mućkanje. Supernatant faga se izdvoji i doda u drugu Immuno™ kivetu za narednu fazu negativne selekcije. Na ovaj način se izvrši pet do deset faza negativne selekcije.
Selekcija za vezani miostatin
Nakon poslednje faze negativne selekcije, supernatant faga se doda u pripremljene Immuno™ kivete obložene miostatinom. Immuno™ kiveta se inkubira jedan sat na sobnoj temperaturi uz orbitalno mućkanje čime se omogućava specifičnom fagu da se veže za miostatin. Nakon što se supernatant odbaci, Immuno™ kiveta se približno 15 puta ispere sa 2% mleko-PBS, 10 puta sa PBST i 2 puta sa PBS za tri kruga selekcije sa sve tri grupe (TN8-IX, TN12-I i Linearne grupe), izuzev što se za drugi krug selekcije sa TN8-IX i TN12-I grupama, Immuno™ kivete isperu približno 14 puta sa 2% mleko-PBS, 2 puta sa 2% BSA-PBS, 10 puta sa PBST i 1 put sa PBS.
Ne- specifična eluacija
Nakon poslednje faze ispiranja, vezani fagi se eluiraju iz Immuno™ kivete dodavanjem 1 ml 100 mM rastvora trietilamina (Sigma, St. Louis, Missouri) u toku 10 minuta inkubacije uz orbitalno mućkanje. pH rastvora koji sadrži fag se zatim neutrališe sa 0.5 ml IM rastvora Tris-HCl (pH 7.5).
Receptor ( humani Aktivin receptor) eluacija vezanog faga
Za krugove 2 i 3, nakon poslednje faze ispiranja, vezani fagi se eluiraju iz Immuno™ kivete dodavanjem 1 ml 1 uM proteina receptom (rekombinovani humani aktivin receptor IIB/Fc himera, R and D Sivstems, Inc., Minneapolis, Minnesota), uz 1 sat inkubacije za svaki uslov.
Propeptidna eluacija vezanog faga
Za krugove 2 i 3, nakon poslednje faze ispiranja, vezani fagi se eluiraju iz Immuno™ kivete dodavanjem 1 ml 1 uM propeptidnog proteina (izrađen kako je prethodno opisano) uz 1 sat inkubacije za svaki uslov.
Amplifikacija faga
Sveža kulturaE. coli(XL-1 Blue MRF') se ostavi da raste do OD6oo= 0.5 u LB medijumu koji sadrži 12.5 ug/ml tetraciklina. Za svaki uslov ispiranja, 20 ml ove kulture se ohladi na ledu i centrifugira. Peleta bakterija se resuspenduje u 1 ml rastvora min A soli.
Svaka mešavina iz različitih metoda eluacije se doda u koncentrovani uzorak bakterije i inkubira 15 minuta na 37°C. U svaku mešavinu se doda 2 ml NZCYM medijuma (2 x NZCYM, 50 ug/ml ampicilin) i inkubira 15 minuta na 37 °C. Dobijenih 4 ml rastvora se prenese na veliku NZCTM agar ploču koja sadrži 50 ug/ml ampicilina i inkubira u toku noći na 37 °C.
Svaka mešavina bakterija/fag koja je u toku noći izrasla na velikoj NZCYM agar ploči se prenese u 35 ml LB medijuma, a agar ploča se dalje ispere sa dodatnih 35 ml LB medijuma. Dobijena mešavina bakterija/fag u LB medijumu se centrifugira do izdvajanja pelete bakterije. 50 ul supernatanta faga se prenese u novu kivetu, doda se 12.5 ml rastvora PEG (20% PEG8000, 3.5 M rastvor amonijum acetata) i inkubira na ledu 2 sata da se precipitira fag. Precipitirani fagi se izdvoje centrifugiranjem i resuspenduju u 6 ml pufera za resuspendovanje faga (250 mM NaCl, 100 ml mM Tris pH 8, 1 mM EDTA). Ovaj rastvor faga se dalje prečišćava izdvajanjem preostalih bakterija centrifugiranjem i precipitiranjem faga drugi put dodavanjem 1.5 ml rastvora PEG. Nakon faze centrifugiranja, peleta faga se resuspenduje u 400 ul PBS. Ovaj rastvor se podvrgne finalnom centrifugiranju da se oslobodi ostataka bakterije. Titar rezultata izrade faga se ispituje formiranjem standardnog plaka (Molecular Cloning, Maniatis i saradnici, treće izdanje).
Dodatni krugovi selekcije i amplifikacije
U drugom krugu, amplificirani fag (10<11>pfu) iz prvog kruga se koristi kao početni fag za sprovođenje faza selekcije i amplifikacije. Amplificirani fag (10<11>pfu) iz drugog kruga se zatim koristi kao početni fag za sprovođenje trećeg kruga selekcije i amplifikacije. Nakon faza eluacije trećeg kruga, mala frakcija eluiranog faga se zaseje kao u prethodno opisanoj analizi formiranja plaka. Pojedinačni plakovi se pokupe i prenesu u mikrotitarske ploče sa 96 otvora koja sadrže po 100 ul TE pufera u svakom otvoru. Ove glavne ploče se inkubiraju u toku noći na 4°C, čime se omogućava fagima da eluiraju u TE pufer.
Analiza kloniranja
ELISA faga
Kloni faga se podvrgavaju ELISA faga, a zatim sekvenciraju. Sekvence se rangiraju na način koji je diskutovan u niže datom tekstu.
ELISA faga se izvodi na sledeći način. KulturaE. coliXL-1 Blue MRE' se ostavi da raste sve dok OD6oone dostigne 0.5. 30 ul ove kulture se podeli na jednake delove u svaki od 96 otvora mikrotitarske ploče. 10 ul eluiranog faga se doda u svaki otvor i ostavi 15 minuta na sobnoj temperaturi da inficira bakteriju. Nakon toga se u svaki otvor doda približno 120 ul LB medijuma koji sadrži 12.5 ug/ml tetraciklina i 50 ug/ml ampicilina. Mikrotitarna ploča se zatim inkubira u toku noći na 37°C uz mućkanje. Miostatin protein (2 ug/ml u 0.1 M puferu natrijum karbonata, pH 9.6) se upotrebi za oblaganje Maxisorp™ ploče (NUNC) sa 96 otvora na 4°C u toku noći. Kao kontrola, posebna Maxisorp™ ploča se obloži sa 2% BSA pripremljenog u PBS.
Sledećeg dana, tečnost u proteinom obloženim Maxisorp™ pločama se odbaci, ploče tri puta isperu sa PBS i svaka ploča se blokira sa 300 ul 2% rastvor mleka 1 sat na sobnoj temperaturi. Rastvor mleka se odbaci, a otvori se tri puta isperu sa rastvorom PBS. Nakon poslednje faze ispiranja, u svaki protein-obloženi otvor Maxisorp™ ploče se doda približno 50 ul PBST-4% mleko. Približno 50 ul kultura razvijenih u toku noći iz svakog otvora na mikrotitarskoj ploči sa 96 otvora se prenese u odgovarajuće otvore obložene miostatinom, kao i u kontrolne ploče obložene sa 2% BSA. 100 ul mešavine u dve vrste ploča se inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi. Tečnost iz Maxisorp™ ploča se odbaci, a otvori se isperu približno tri puta sa PBST, a zatim dva puta sa PBS. HRP-konjugovano anti-M13 antitelo (Amersham Pharmacia Biotech) se razblaži do približno 1 : 7.500 i 100 ul razblaženog rastvora se doda u svaki otvor Maxisorp™ ploča i inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi. Tečnost se ponovo odbaci, a otvori se isperu približno tri puta sa PBST a zatim dva puta sa PBS. 100 ul LumiGlo™ hemiluminescentnog substrata (KPL) se doda u svaki otvor Maxisorp™ ploča i inkubira približno 5 minuta da bi došlo do reakcije. Hemiluminescentna jedinica Maxisorp™ ploča se čita na čitaču ploče (Lab Svstems).
Sekvenciranje klonova faga
Za svaki klon faga, pripremi se šablon sekvenciranja po PCR metodu. Naredni oligonukleotidni par se koristi za proširenje nukleotidnog fragmenta 500: #1:5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3' (Seq ID No: 294) i bazni #2: 5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3' (Seq ID No: 295). Naredna mešavina se izrađuje za svaki klon
Termocikler (GeneAmp PCR Svstem 9070, Applied Biosvstem) se koristi za pokretanje sledećeg programa: [94°C u toku 5 minuta; 94 °C u toku 30 sekundi, 55 °C u toku 30 sekundi, 72 °C u toku 45 sekundi] x 30 ciklusa; 72 °C u toku 7 minuta; hlađenje na 4°C. PCR produkt iz svake reakcije se očisti upotrebom QIAquick Multiwell PCR Purification kit (Qiagen) po protokolu koji je dao proizvođač. PCR očišćeni produkt se proverava sipanjem 10 ul iz svake PCR reakcije izmešane sa 1 ul boje (10X BBXS obojenog aragosa gela) na 1% aragosa gelu. Preostali produkt se zatim sekvencira koristeći ABI377 Sequencer (Perkin Elmer) po protokolu koji preporučuje proizvođač.
Rangiranje i analiza sekvenci
Sekvence peptida koje su prenete iz sekvenci nukleotida su u korelaciji sa vrednostima ELISA. Klonovi koji pokazuju visoke hemiluminescentne jedinice u otvorima obloženim miostatinom, a niske hemiluminescentne jedinice u otvorima obloženim sa 2% BSA se identifikuju. Identifikuju se sekvence koje se javljaju više puta. Moguće sekvence izabrane na bazi ovih kriterij uma se podvrgavaju daljim analizama kao tela peptida. Aproksimativno se analizira 1200 pojedinačnih klonova. Od ovoga se izabere približno 132 peptida za generisanje tela peptida iz ovog pronalaska. Oni su pokazani u niže datoj Tabeli I. Peptidi koji imaju SEQ ID No: 1-129 se koriste za generisanje tela peptida istog imena. Peptidi koji imaju SEQ ID No: 130-141, pokazani u Tabeli I, uključuju dva ili više peptida iz SEQ ID No: 1-132 vezanih pomoću linker sekvence. SEQ ID No: 1-130-141 se takođe koriste za generisanje tela peptida istog imena.
Usaglašene sekvence su određene za TN-8 izdvojenu grupu peptida. Oni su sledeći:
Za sve prethodne usaglašene sekvence, podvučeno "jezgro sekvenci" od svake usaglašene sekvence je položaj na kome se javlja amino kiselina. "X" se odnosi na bilo koju prirodno dobijenu ili modifikovanu amino kiselinu. Dva cisteina sadržana u jezgru sekvenci su fiksne amino kiseline u TN8-IX grupi.
Primer 2
Generisanje tela peptida
Konstrukcija DNA enkodiranih peptid- Fc spojenih proteina
Peptidi koji su sposobni da vezuju miostatin se koriste sami ili u kombinaciji jedan sa drugim tako da nagrade spojene proteine u kojima je peptid spojen sa Fc oblašću humanog IgGl. Sekvenca amino kiseline Fc dela svakog tela peptida je sledeća (od amino terminusa do karboksil terminusa):
Peptid se spaja u N konfiguraciji (peptid je vezan za N-terminus Fc regiona), C konfiguraciji (peptid je vezan za C-terminus Fc regiona) ili u N,C konfiguraciji (peptid je vezan i za N i za C terminuse Fc regiona). Separatni vektori se koriste za iskazivanje fuzija N-terminala i fuzija C-terminala. Svako telo peptida je izgrađeno otpuštanjem parova oligonukleotida ("oligos") za izabrani fag nukleinske kiseline da bi se generisala dvostruko umetnuta sekvenca nukleotida koja enkodira peptid. Ove molekule polinukleotida su izrađene kao ApaL do XhoI fragmenti. Fragmenti se vezuju ili u pAMG21-Fc vektor N-terminala za N-terminalnu orijentaciju ili u pAMG21-Fc-C-terminalni vektor za C-terminalnu orijentaciju koji su prethodno digestovani sa ApAli i XhoI. Nastale mešavine ligata se transformišu elektroporacijom u ćelijeE. coliloze 2596 ii 4167 (hsdR-varijanta ćelija loze 2596) po standardnim procedurama. Klonovi se proveravaju po sposobnosti da produkuju produkt rekombinovanog proteina i po sposobnosti da poseduju fuzioni gen koji ima ispravnu sekvencu nukleotida. Takav pojedinačni klon se izabere za svaki modifikovani peptid.
Mnoge konstrukcije su stvorene pomoću alternativnog vektora označenog pAMG21-2xBs-N(ZeoR) Fc. Ovaj vektor je sličan sa prethodno opisanim vektorom, izuzev što se digestija vektora izvodi sa BsmBI. Neke sekvence spojenih peptida su konstruisane na oba kraja Fc. U takvim slučajevima, vektor je mešavina pAMG21-2xBs-N(ZeoR) Fc i pAMG21-2xBs-C Fc.
Konstrukcija pAMG21
Iskazani plazmid pAMG21 (ATCC No.98113) se izdvaja od iskazanog vektora pCFM1656 (ATCC No.69576) i sistema iskazanih vektora koji su opisani u United States Patentu broj 4,710,473 a nakon toga po proceduri koja je opisana u objavljenoj Internacionalnoj patentnoj prijavi WO 00/24782, koje su sve ovde inkorporirane u referencama.
Fc N- terminalni vektor
Fc N-terminalni vektor se konstruiše pomoću pAMG21 Fc_Gly5_Tpo vektora kao šablon. 5' PCR bazni (ispod) je dizajniran tako da ukloni Tpo peptidnu sekvencu u pAMG Tpo Gly5 i zameni je sa polilinkerom koji sadrži ApaLI i XhoI položaje. Koristeći ovaj vektor kao šablon, PCR se izvodi sa produženom polimerazom koristeći sledeći bazni 5' i univerzalni bazni 3':
Bazni 5': 5'-
Nastali PCR produkt se prečisti na gelu i digestuje sa restriktivnim enzimima Ndel i BsrGI. I plazmid i polinukleotid kojim se enkodira određeni peptid, zajedno sa svojim linkerom se prečiste na gelu koristeći Qiagen (Chatsvvorth, CA) rotirajuće kolone za gel prečišćavanje. Nakon toga se plazmid i umetak vezuju po standardnim procedurama vezivanja, a nastala vezivna mešavina se transfofmiše u ćelijeE. coli(loza 2596). Izdvoje se pojedinačni klonovi i vrši se DNA sekvenciranje. Identifikuje se ispravan klon i on se koristi kao izvor vektora za modifikovane peptide koji su ovde opisani.
Konstrukcija Fc C- terminalnog vektora
Fc C-terminalni vektor se konstruiše pomoću pAMG21 Fc_Gly5_Tpo vektora kao šablon. Bazni 3' PCR je dizajniran tako da se ukloni sekvenca Tpo peptida i zameni sa polilinkerom koji sadrži ApaLI i XhoI položaje. PCR se izvodi sa produženom polimerazom koristeći univerzalni bazni 5' i bazni 3'.
Nastali PCR produkt se prečisti na gelu i digestuje sa restriktivnim enzimima BsrGI i BamHI. I plazmid i polinukleotid kojim se enkodira određeni peptid, zajedno sa svojim linkerom se prečiste na gelu koristeći Qiagen rotirajuće kolone za gel prečišćavanje. Nakon toga se plazmid i umetak vezuju po standardnim procedurama vezivanja, a nastala vezivna mešavina se transformiše u ćelijeE. coli(loza 2596). Loza 2596 (ATCC # 202174) je lozaE. colimodifikovana na K-12 tako da sadrži promoter luksa i dva lambda temperaturna senzitivna represora, cI857s7 i lac I<Q>represor. Izdvoje se pojedinačni klonovi i vrši se DNA sekvenciranje. Identifikuje se ispravan klon i on se koristi kao izvor za svako telo peptida koje je ovde opisano.
Pojavljivanja u E . coli
Kulture svake konstruisane pAMG21-Fc fuzijeu E. colilozi 2596 rastu na 37°C u Terrific Broth medijumu (videti Tartof i Hobbs, "Improved media for drowing plasmid and cosimid clones", Bethesda Research Labs Focus, Tom 9, strana 12, 1987., citirano u gore pomenutoj referenci Sambrook i saradnici). Indukcija iskazivanja produkta gena iz luxPR promotera se izvodi nakon dodavanja sintetičkog autoinduktora, N-(3-oksoheksanoil)-DL-homoserin laktona, u medijum kulture do finalne koncentracije od 20 nanograma po mililitru (ng/ml). Kulture se inkubiraju narednih šest sati na 37°C. Nakon toga se kulture bakterija mikroskopski ispitaju na prisustvo ubačenih tela i izdvoje centrifugiranjem. U indukovanim kulturama se dobijaju refraktivna ubačena tela koja ukazuju da su se Fc-fuzije najverovatnije produkovale u nerastvornoj frakcijiE. coli.Pelete ćelija se lizirajau direktno resuspenzijom u Laemmli uzorku pufera koji sadrži 10% (3-merkaptoetanola a zatim se analiziraju pomoću SDS-PAGE. U najvećem broju slučajeva se dobija intenzivno Coomass- obojena grupa odgovarajuće molekulske težine na SDS-PAGE gelu.
Sklapanje i prečišćavanje tela peptida
Ć relijese razbiju u vodi (1/10 zapremina/zapremina) homogenizacijom pod
visokim pritiskom (od 3 do 15000 psi) i inkluzivna tela se izdvoje centrifugiranjem (4000 RPM u J-6B u toku 30 minuta). Inkluzivna tela se solubilizuju u 6M rastvoru gvanidina, 50 mM Tris, 8 mM DTT, na pH 8.0 u toku 1 sat na sobnoj temperaturi u odnosu 1/10. Solubilizovana mešavina se 25 puta razblaži u 4 M rastvoru uree,
20% glicerola, 50 mM Tris, 160 mM arginina, 3 mM cisteina, 1 mM cistamina na pH 8.5. Mešavina se inkubira u toku noći na niskoj temperaturi. Nakon toga se mešavina dijalizira sa 10 mM Tris pH 8.5, 50 mM NaCl i 1.5 M uree. Nakon dijalize u toku noći, pH dijalizata se podesi na pH 5 sa acetatnom kiselinom. Precipitat se ukloni centrifugiranjem, a supernatant se napuni u SP-sfernu brzo protočnu kolonu uravnoteženu u 10 mM NaAc, 50 mM NaCl, pH 5, 4°C. Nakon punjenja, kolona se ispere do bazne linije sa 10 mM NaAc, 50 mM NaCl, pH 5.2. Kolona se razvije sa 20 zapremina kolone gradijentom od 50 mM - 500 mM NaCl u acetatnom puferu. Alternativno, nakon ispiranja do bazne linije, kolona se ispere sa 5 zapremina kolone 10 mM rastvorom fosfata pH 7.0 i kolona razvije sa 15 zapremina kolone gradijentom od 0-400 mM NaCl u fosfatnom puferu. Frakcije kolone se analiziraju pomoću SDS-PAGE. Izdvoje se frakcije koje sadrže dimerično telo peptida. frakcije se takođe analiziraju gel filtracijom da se odredi da li je prisutan bilo kakav agregat.
Brojna tela peptida se izrađuju od peptida iz Tabele I. Peptidi su vezani za molekulu humanog IgGl Fc da formiraju tela peptida iz Tabele II. Prema telima peptida iz Tabele II, C konfiguracija ukazuje daje imenovani peptid vezan na C-terminusu Fc. N konfiguracija ukazuje daje imenovani peptid vezan za N-terminus Fc. N,C konfiguracija ukazuje da je jedan peptid vezan za N-terminus, a jedan za C-terminus svake Fc molekule. Oznaka 2x ukazuje da su dva imenovana peptida vezana u tandemu jedana za drugi, a takođe su vezani za N ili C terminus, ili oba N,C Fc, razdvojena pokazanim linkerom. Dva peptida vezana u tandemu a razdvojena linkerom su naznaka, na primer, za Miostatin-TN8-29-19-8g, što ukazuje daje TN8-29 peptid vezan preko (gly)8 linkera za TN8-19 peptid. Peptidi su vezani za Fc preko sekvence (gly)5linkera u koliko nije drugačije navedeno. U nekim slučajevima, peptidi su vezani preko k linkera. Linker označen kao k ili lk se odnosi na gsgsatggsgstassgsgsatg (Seq ID No: 301) sekvencu linkera, pri čemu se kc odnosi na linker vezan za C-terminus Fc, a kn se odnosi na linker vezan za N-terminus Fc. U niže datoj Tabeli II, kolona 4 se odnosi na sekvencu linkera koji spaja Fc sa prvim peptidom, a peta kolona se odnosi na konfiguraciju N ili C, ili oba.
Pošto Fc molekula dimerizuje u rastvoru, tela peptida konstruisana tako da imaju jedan peptid će stvarno biti dimeri sa dve kopije peptida i dve Fc molekule, a IX verzije koje imaju dva peptida u tandemu će stvarno biti dimer sa četiri kopije peptida i dve Fc molekule.
Pošto su tela peptida data u Tabeli II iskazana uE. coli,prvi ostatak amino kiseline je Met (M). Prema tome, tela peptida u N konfiguraciji su, na primer, Met-peptid-linker-Fc, ili Met-peptid-linker-peptid-linker-Fc. Tela peptida u C konfiguraciji su aranžirana, na primer, kao Met-Fc-linker-peptid ili Met-Fc-linker-peptid-liniker-peptid. Tela peptida u C,N konfiguraciji su kombinacija oba, na primer, Met-peptid-linker-Fc-linker-peptid.
Sekvence nukleotida koje enkodiraju egzemplarna tela peptida su niže date u Tabeli II. Sekvence polinukleotida koji enkodiraju egzemplarno telo peptida iz ovog pronalaska obuhvataju sekvencu nukleotida koja enkodira Fc sekvencu polipeptida kao što je:
Dodatno, uključeni su polinukleotidi koji enkodiraju ggggg linker kao što je sledeći:
5'-GGTGGAGGTGGTGGT-3' (Seq ID No: 302)
Nukleotid koji enkodira telo peptida takođe obuhvata kodon koji enkodira metionin ATG i stopira kodon kao što je TAA.
Prema tome, struktura prvog tela peptida u Tabeli II je TN8-Conl sa C konfiguracijom a (gly)5linker je sledeći: M-Fc-GGGGG-KDKCKMWHWMCKPP (Seq ID No: 303).
Primer polinukleotida koji enkodira ovo telo peptida može da bude:
Primer3
In vitroispitivanja
Analiza delovanja miostatina na bazi C2C12 ćelije
Ovo ispitivanje pokazuje sposobnost inhibitora koji se testira da neutrliše miostatin merenjem stepena inhibiranja vezivanja miostatina za njegov receptor. Celijska linija koja beleži odgovor na miostatin se generiše transfekcijom C2C12 ćelija mioblasta (ATCC No.:CRL-1772) sa pMARE-luc konstrukcijom. pMARE-luc konstrukcija je izrađena kloniranjem dvanaest puta ponavljane CAGA sekvence, koja predstavlja elemente miostatin/aktivin odgovor (Dennler i saradnici, AMBO 17: 3091-3100 (1998.)) u pLuc-MCS zabeleženom vektoru (Stratagene cat # 219087) iznad TATA kutije. Mioblast C2C12 ćelije prirodno se pojavljuju u miostatin/aktivin receptorima na površini svoje ćelije. Kada se miostatin veže za ćelijske receptore, aktivira se Smad putanja i dolazi do fosforilacije Smad veza za element odgovora (Macias-Silva i saradnici, Cell 87:1215 (1996.)), što za rezultat ima pojavljivanje gena luceraze. Nakon toga se aktivnost luciferaze meri pomoću komercijalnog seta za ispitivanje zabeležene luciferaze (cat # E4550, Promega, Madison, WI) u skladu sa protokolom koji je dao proizvođač. Stabilna linija C2C12 ćelija koja je transfektovana sa pMARE-luc (C2C12/pMARE klon # 44) se koristi za merenje aktivnosti miostatina u skladu sa sledećom procedurom.
Podjednaki brojevi zabeleženih ćelija (C2C12/pMARE klon # 44) se stave u 96 otvora kultura. Prvi krug provere koji koristi dva razblaživanja tela peptida se izvodi sa koncentracijom miostatina fiksiranoj na 4 nM. Rekombinovani zreli miostatin se pre-inkubira dva sata na sobnoj temperaturi sa telima peptida na 40 nM i 400 nM, tim redom. Zabeležene ćelije kulture se tretiraju šest sati sa miostatinom sa ili bez tela peptida. Aktivnost miostatina se meri određivanjem aktivnosti luciferaze u tretiranim kulturama. Ovo ispitivanje se koristi za inicijalnu identifikaciju aktivnosti tela peptida koji inhibira aktivnost signala miostatina u zabeleženom ispitivanju. Nakon toga, generiše se devet tačaka titracione krive sa fiksiranom koncentracijom miostatina od 4 nM. Miostatin se preinkubira sa svakom od sledećih devet koncentracija tela peptida: 0.04 mM, 0.4 nM, 4 nM, 20 nM, 40 nM, 200 nM, 400 nM, 2 uM i 4 uM u toku dva sata pre dodavanja mešavine u određenu ćelijsku kulturu. IC50vrednosti su za brojne primere tela peptida date u Tabeli III, a za afinitet zrelih tela peptida u Tabeli VIII.
BIAcore® analiza
Analiza afiniteta svakog kandidata miostatin tela peptida se izvodi na BIAcore® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) aparaturi koristeći senzorski čip CM5 i 0.005% P20 surfaktanta (BIAcore, Inc.) kao tečni pufer. Rekombinantni zreli miostatin protein se imobilizuje na stepen istraživanja CM5 senzorskog čipa (BIAcore, Inc.) preko primarnih amino grupa, koristeći Amine Coupling Kit (BIAcore, Inc.), u skladu sa protokolom koji je naveo proizvođač.
Ispitivanje direktnog vezivanja se koristi za proveru i rangiranje tela peptida prema njihovoj sposobnosti da se vežu za imobilizirani miostatin. Ispitivanje vezivanja se izvodi injekciranjem dve koncentracije (40 i 400 nM) svakog mogućeg tela peptida za vezivanje miostatina u imobiliziranu površinu miostatina, pri brzini protoka od 50 ul/minut u toku 3 minuta. Nakon 3 minuta disocijacije, površina se regeneriše. Na krivama vezivanja se kvantitativno uporede intenzitet signala vezivanja, kao i brzina disocijacije. Kinetički parametri vezivanja tela peptida uključujući ka(konstanta brzine asocijacije), kd(konstanta brzine disocijacije) i KD(konstanta ravnoteže disocijacije) se određuju upotrebom BIA evaluacije 3.1 kompjuterskog programa (BIAcore, Inc.). Niže konstante ravnoteže disocijacije (iskazane u nM), veći afinitet tela peptida za miostatin. Primeri vrednosti KDtela peptida su pokazani u niže datoj Tabeli III, a u Tabeli VI su date vrednosti za afinitet zrelih tela peptida.
Ispitivanje blokiranja na ActRIIB/ Fc površini
Ispitivanja blokiranja se izvode korišćenjem imobilizovanog ActRIIB/Fc (R & D Systems, Minneapolis, MN) i miostatina u prisustvu i odsustvu tela peptida sa BIAcore® sistemom ispitivanja. Ispitivanja se koriste za klasifikaciju tela peptida kao nisu neutralizujući (oni koji ne sprečavaju vezivanje miostatina za ActRIIB/Fc) ili neutralizujućih (oni koji sprečavaju vezivanje miostatina za ActRIIB/Fc). Prvo se odredi osnova vezivanja miostatin-ActRIIB/Fc bez prisustva bilo kog tela peptida.
Za početne studije provere, tela peptida se razblaže do 4 nM, 40 nM i 400 nM u uzorku pufera i inkubiraju sa 4 nM miostatina (takođe razblažen u uzorku pufera). Telo peptida: mešavina liganda se ostavi da postigne ravnotežu na sobnoj temperaturi (najmanje 5 sati), a zatim se injektuje 20 do 30 minuta preko površine imobiliziranog ActRIIB/Fc pri brzini protoka od 10 ul/minut. Povećanje odgovora vezivanja (u odnosu na kontrolno vezivanje bez prisustva tela peptida) ukazuje da vezivanje tela peptida za miostatin nije neutralizujuće. Smanjenje odgovora na vezivanje (upoređujući sa kontrolom), ukazuje da vezivanje tela peptida za miostatin blokira vezivanje miostatina za ActRIIB/Fc. Izabrana tela peptida se dalje karakterišu ispitivanjem blokiranja serija potpune koncentracije da bi se izdvojile IC50vrednosti (za neutralizujuća tela peptida) ili EC50vrednosti (za ne-neutralizujuća tela peptida). Uzorci tela peptida se serijski razblaže od 200 nM do 0.05 mM u uzorku pufera i inkubiraju na sobnoj temperaturi sa 4 mM miostatina da se postigne ravnoteža (minimum pet sati) pre injektovanja preko površine imobilizovanog ActRIIB/Fc u toku 20 do 30 minuta, pri brzini protoka od 10 ul/minut. Nakon injektovanja uzorka, vezani ligand se ostavi 3 minuta da disocira. Nanošenjem signala vezivanja u odnosu na koncentraciju tela peptida izračunavaju se IC50vrednosti za svako telo peptida u prisustvu 4 nM miostatina. Na primer, ispitivanjem na bazi ćelije je pronađeno da tela peptida TN8-19, L2 i LI 7 inhibiraju aktivnost miostatina, ali vezivanje za TN-8-19 ne blokira interakcije miostatin/ ActRIIB/Fc, što ukazuje da se TN-8-19 vezuje za različit epotip od druga dva tela peptida.
Vezivanje epitopa za tela peptida
Prečišćeno telo peptida se imobilizuje na BIAcore čipu da se zaaštiti miostatin pre ubacivanja drugog tela peptida, a određuje se količina drugog tela peptida vezanog za zaštićeni miostatin. Samo tela peptida sa jasnim epitopima će da se vežu za zaštićeni miostatin, omogućujući na taj način vezivanje tela peptida sa epitopom koji ima slične ili jasne osobine vezivanja. Na primer, pokazano je da se tela peptida TN8-19 i L23 vezuju za različite epitope na miostatinu.
Ispitivanje selektivnosti
Ova ispitivanja se izvode upotrebom BIAcore® tehnologije za određivanje selektivnosti vezivanja tela peptida za druge članove TGFp familije. ActRIIB/Fc, TGFpRII/Fc i BMPR-IA/Fc (svi dobijeni od R & D Systems, Minneapolis, MN) su kovalentno spojeni senzorski čipovi istraživačkog stepena u skladu sa protokolom koji sugeriše proizvođač. Zbog toga što BIAcore ispitivanja detektuju promene u indeksu refrakcije, razlika između detektovanog odgovora sa injekciranjem preko površine imobiliziranog receptora u poređenju sa detektovanim odgovorom sa injekciranjem preko kontrolne površine bez bilo kog tela peptida, predstavlja stvarno vezivanje Aktivina A, TGFpi, TGF(33 i BMP4 za receptore, tim redom. Sa pre-inkubacijom tela peptida i TGFp molekula, promene (povećanje ili smanjenje) u odgovoru na vezivanje ukazuju na vezivanje tela peptida za molekule TGFp familije. Sva tela peptida iz ovog pronalaska se vezuju za miostatin ali ne za Activin A, TGF<p>l, TGF<p>3 ili BMP4.
Ispitivanja ravnoteže KinEx A™
Ispitivanja ravnotežnog vezivanja u rastvoru upotrebom KinEx A™ tehnologije (Sapidvne Instrumets, Inc.) se koriste za određivanje ravnoteže disocijacije (KD) miostatina vezanog za molekule tela peptida. Smatra se daje ovo ispitivanje u rastvoru mnogo osetljivije nego BIAcore ispitivanje za iste uzorke. Reacti-Gel™ 6X se prethodno, u toku noći obloži sa približno 50 ug/ml miostatina, a zatim blokira sa BSA. 30 pM i 100 pM uzoraka tela peptida se inkubira sa različitim koncentracijama (0.5 pM do 5 nM) miostatina u uzorku pufera 8 sati na sobnoj temperaturi pre nego što se propuste kroz kuglice obloženog miostatina. Količina tela peptida vezanog za kuglice se kvantifikuje fluorescentno (Cy5) obeleženim anti-humanim-Fc antitelom koze na 1 mg/ml u superbloku. Signal vezivanja je proporcionalan sa koncentracijom slobodnih antitela u ravnoteži sa datom koncentracijom miostatina. KDse dobij a iz nelinearne regresije konkurentnih krivih, koristeći model dvostruke-krive homogenog vezivanja najednom mestu, koji je dat u KinEx A™ softveru (Sapidvne Instruments, Inc.).
Primer 4
Komparacija inhibitora miostatina
Sposobnost tri primera tela peptida iz prvog kruga da se vežu za (Kd) i inhibiraju (IC50) je upoređivana sa KDi IC50vrednostima dobijenim za rastvorljiv protein spojen sa receptorom actRIIB/Fc (R & D Systems, Inc., Minneapolis, Minn.). IC5ovrednosti su dobijene upotrebom pMARE luc ispitivanja na bazi ćelije koje je opisano u Primeru 3, a KDvrednosti su određene korišćenjem Biacore® analize opisane u Primeru 3.
Tela peptida imaju IC50koji je poboljšan u odnosu na receptor/Fc inhibitor i afinitete vezivanja koji su uporedivi u dva tela peptida sa receptor/Fc.
Primer 5 Komparacija sposobnosti peptida i tela peptida da inhibiraju miostatin
Naredna sekvenca peptida: QGHCTRWPWMCPPY (TN8-19) (SEQ ID
NO:33) se koristi za konstrukciju odgovarajućeg tela peptida TN8-19(pb) u skladu sa procedurom koja je opisana u prethodnom Primeru 2.1 sam peptid i telo peptida su praćeni prema aktivnosti inhibiranja miostatina analizom na bazi C2C12 koja je prethodno opisana u Primeru 3. Iz Slike 1 može da se vidi daje IC50(efektivna koncentracija za inhibiranje pedeset procenata miostatina) za telo peptida značajno manja nego kod peptida i stoga je sposobnost peptida da inhibira delovanje miostatina značajno poboljšana njegovom stavljanjem u konfiguraciju tela peptida.
Primer 6
Generisanje afinitet-zrelih peptida i tela peptida
Nekoliko peptida iz prvog kruga koji se koriste za generisanje tela peptida je izabrano prema afinitetu sazrevanja. Izabrani peptidi obuhvataju sledeće: cistein ograničene TN8-19, QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO:33) i linearne peptide Linear-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEQ ID NO: 104); Linear-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV (SEQ ID NO:l 17); Linear-17 RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEQ ID NO:l 19); Linear-20 YREMSMLEGLLDVLERLQHY (SEQ ID NO: 122); Linear-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEQ ID NO: 123); Linear-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEQ ID NO: 126). Na osnovu saglasnosti sekvence, generišu se datoteke usmerene ka pojavi sekundarnog faga u kojima se amino kiseline "jezgra" (određeno iz saglasnosti sekvence) drže konstantnim ili mogu da se polarišu prema učestanosti događanja. Alternativno, pojedinačna sekvenca peptida može da se koristi za generisanje polarizacije, usmerene ka datoteci pojavljivanja faga. Tabelisanje ovakve datoteke na osnovu mnogo oskudnijih uslova može da dovede do peptida sa pojačanim vezivanjem za miostatin, selektivnim vezivanjem za miostatin ili sa nekim dodatnim željenim osobinama.
Produkcija pojačanih oligosa za datoteke
Oligonukleotidi se sintetizuju u DNA sintesajzeru koji je 91% "pojačan" na sekvencama jezgra, to jest, svaka solucija je 91% odgovarajuće baze (A, G, C ili T) i 3% svakog od ostala 3 nukleotida. Za TN8-19 familiju, na primer, 91% pojačanog oligonukleotida koji se koristi za konstrukciju datoteke sekundarnog faga je sledeći:
gde "N" ukazuje daje svaki od četiri nukleotida A, T, C i G podjednako predstavljen, K pokazuje da su G i T podjednako predstavljena, a mala slova predstavljaju mešavinu 91% označene baze i 3% svake od ostalih baza. Familija oligonukleotida izrađenih na ovaj način je PCR pojačana kako je prethodno opisano, vezana za fagenisane vektore, na primer, modifikovani pCES 1 plazmid (Dyax), ili bilo koji raspoloživ fagenisani vektor, u skladu sa protokolom koji je prethodno opisan. Sve generisane datoteke sekundarnog faga su 91% pojačane i imaju između 1 i 6.5 x IO<9>nezavisnih transformanata. Datoteke su tabelisane na način kako je prethodno opisano, ali uz sledeće uslove:
Tabelisanje kruga 1:
Broj upisanih faga: 10 19 -10 1 "3 cfu fagemida
Postupak selekcije: Nunc Immuno Tube selekcija
Negativna selekcija: 2 x sa Nunc Immuno Tubes obloženim sa 2% BSA u toku 10
minuta svaki
Tabelisanje oblaganja: obloga sa 1 ug miostatin proteina u 1 ml 0.1 M pufera
natrijum karbonata (pH 9.6)
Vreme vezivanja: 3 sata
Uslovi ispiranja: 6 x 2%-mleko-PBST; 6 x PBST; 2 x PBS
Uslov eluacije: 100 mM TEA eluacija
Tabelisanje kruga 2:
Broj upisanih faga: 1011 cfu fagemida
Postupak selekcije: Nunc Immuno Tube selekcija
Negativna selekcija: 2 x sa Nunc Immuno Tubes obloženim sa 2% BSA u toku 30
minuta svaki
Tabelisanje oblaganja: obloga sa 1 ug miostatin proteina u 1 ml 0.1 M pufera
natrijum karbonata (pH 9.6)
Vreme vezivanja: 1 sat
Uslovi ispiranja: 15 x 2%-mleko-PBST; 1 x 2%-mleko-PBST u toku lh; 10 x 2%-BSA-PBS, 1 x 2%-BSA-PBST u toku lh, 10 x PBST i 3 x PBS Uslov eluacije: 100 mM TEA eluacija
Tabelisanje kruga 3:
Broj upisanih faga: IO10 cfu fagemida
Postupak selekcije: Nunc Immuno Tube selekcija
Negativna selekcija: 6 x sa Nunc Immuno Tubes obloženim sa 2% BSA u toku 10
minuta svaki
Tabelisanje oblaganja: obloga sa 0.1 ug miostatin proteina u 1 ml 0.1 M pufera
natrijum karbonata (pH 9.6)
Vreme vezivanja: 1 sat
Uslovi ispiranja: 15 x 2%-mleko-PBST, 1 x 2%-mleko-PBST u toku lh, 10 x 2%-BSA-PBST, 1 x 2%-BSA-PBST u toku lh, 10 x PBST i 3 x
PBS
Uslov eluacije: 100 mM TEA eluacija
Tabelisanje drugih datoteka dobijenih peptida sa pojačanim vezivanjem za miostatin. Pojedinačno selektovani klonovi su podvrgnuti ELISA faga, kako je prethodno opisano, i sekvencirani.
Sledeća afmitetno-zrela TN8-19 familija peptida je pokazana u niže datoj Tabeli IV.
Usaglašena sekvenca dobijena od afinitetno-zrele TN-8-19-1 preko Con2 (isključujući mTN8 con6 sekvence), kako je prethodno opisano, je Caia?Wa^ WMCPP (SEO ID NO:352). Svi ovi peptidi uključuju sekvencu WMCPP (SEQ ID NO:633). Podvučene amino kiseline predstavljaju amino kiseline jezgra koje se nalaze u svim aspektima, a a)? a2i a3su izabrani od neutralne hidrofobne, neutralne polarne ili bazne amino kiseline. U jednom aspektu ovih usaglašenih sekvenci, Cb,b9Wb3 WMCPP ( SEQ ID NQ:353), b, je izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R; b2 je izabran od bilo koje R, S ili Q; b3je izabran od bilo koje P, R i Q. Svi ovi peptidi uključuju sekvencu WMCPP (SEQ ID NO:633). Mnogo detaljnije analize afinitetno sazrelih TN8 sekvenci, koje uključuju SEQ ID NO:352, daju sledeću formulu:
CiC2c^C4CsCftCc7CsWcQ WMCPPcinCiiCi9Cn(SEQ ID NO:354), pri čemu je:
Cinema ili je bilo koja amino kiselina;
c2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c4nema ili je bilo koja amino kiselina;
c5nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
c6nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
c7 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
c8 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
C9 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; i pri čemu suCiodoC]3bilo koja amino kiselina.
U jednom aspektu prethodne formulacije, b7 je izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R; b8 je izabrano od bilo koje amino kiseline R, S ili Q; a b9 je izabran od bilo koje kiseline P, R i Q. Ovo daje sledeću sekvencu: did7d3d4d4(sCc7csWdg WMCPPd1nd1 ,dndn (SEQ ID NO:355), pri čemu je: d!nema ili je bilo koja amino kiselina;
d2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
d3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
d4nema ili je bilo koja amino kiselina;
d5nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;
d6nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina;
d7 je izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R;
d8je izabran od bilo koje R, S, Q;
d9 je izabran od bilo koje P, R i Q, a di0do d13 je izabran od bilo koje amino kiseline.
Usaglašena sekvenca mTN8 con6 serije je Wyeie?Ye3G (SEQ ID NO:356) gde je eiP, S ili Y; e2 je C ili Q, a e3 je G ili H.
Kao dodatak za TN-19 afinitetno zrelu familiju, produkovani su dodatno afinitetno zreli peptidi iz linearnih L-2, L-15, L-17, L-20, L-21 i L-24 peptida prvog kruga. Ove familije su predstavljene u niže datoj Tabeli V.
Afinitetno zreli peptidi dati u Tabelama IV i V se nakon toga sakupe u tela peptida kako je prethodno opisano i analiziraju pomoćuin vivoanaliza.
Afinitetno zreli L2 peptidi uključuju usaglašenu sekvencu fi EMLf?SLf3f4LL (SEQ ID NO:455), pri čemu je f]M ili I; f2je bilo koja amino kiselina; f3je L ili F; a f4 je E, Q ili D.
Familija afinitetno zrelih L15 peptida uključuje sekvencu Lgig2LLg3g4L (SEQ ID NO:456), pri čemu je g, Q, D ili E, g2 je S, Q, D ili E, g3 je bilo koja amino kiselina, a g4 je L, W, F ili Y. Afinitetno zrela LI7 familija uključuje sekvencu: hih^l^hshćhvhghg (SEQ ID NO:457), pri čemu je hiR ili D; h2 je bilo koja amino kiselina; h3 je A, T, S ili Q; h4 je L ili M; h5 je L ili S;h(, jebilo koja amino kiselina; h7 je F ili E; h8 je W, F ili C; i h9 je L, F, M ili K. Usaglašene sekvence mogu takođe da se odrede za mL20, mL21 i mL24 familije peptida koje su prethodno pokazane.
Tela peptida su konstruisana od ovih afinitetno zrelih peptida, kako je prethodno opisano, koristeći linker vezan za Fc oblast humanog IgGl, koji ima SEQ ID NO:296 na N-terminusu (N konfiguracija), na C-terminusu (C konfiguracija) Fc, ili na oba N i C terminusa (N, C konfiguracije), kako je opisano u prethodno datom Primeru 2. Imenovani peptidi su vezani za C ili N terminuse preko 5 glicina (5G), 8 glicina ili k sekvence linkera. U 2X verziji tela peptida, peptidi su vezani sa linkerima kao što su 5 gly, 8 gly ili k. Afinitetno zreli peptidi ili tela peptida su označeni sa malim "m", kao što je, na primer, mTN8-19-22. Tela peptida iz ovog pronalaska dalje sadrže 2 mesta sjedinjavanja gde se peptidi sjedinjavaju u fagemidne vektore. Pozicija ovih položaja sjedinjavanja je AQ— peptid—LE. Tela peptida generalno obuhvataju ove dodatne amino kiseline (mada one nisu obuhvaćene sekvencama peptida koje su navedene u tabelama). U nekim telima peptida LE amino kiseline su uklonjene iz sekvenci peptida. Ova tela peptida su označena kao -LE.
Primeri tela peptida, i primeri sekvenci polinukleotida koji ih enkodiraju, su dati u niže datoj Tabeli VI. Ova tabela obuhvata primere sekvenci tela peptida (nasuprot samom peptidu), kao što je 2x mTN8-19-7 (SEQ ID NO:615) i telo peptida sa izbačenom sekvencom LE (SEQ ID NO:617). Kao objašnjenje, sekvenca linkera u verzijama 2x se odnosi na linker između tandema peptida. Ove sekvence tela peptida sadrže Fc, linkere, AQ i LE sekvence. Prateća sekvenca nukleotida kodira sekvencu peptida pored AQ/LE linker sekvenci, u koliko su prisutne, ali ne kodira naznačeni linker.
Primer 7
In vitroproveravanje afinitetno zrelih tela peptida
Naredni primeri tela peptida se proveravaju u skladu sa protokolima koji su prethodno dati da bi se dobile vrednosti za KDi IC50. Tabela VII pokazuje raspon KDvrednosti za izabrana afinitetno zrela tela peptida u poređenju sa matičnim telima peptida, kako je određeno analizama na bazi rastvora KinExA™ ili BIAcore® analizom. Ove vrednosti pokazuju povećanje afiniteta vezivanja afinitetno zrelih tela peptida za miostatin u poređenju sa matičnim telima peptida. Tabela VIII pokazuje IC50vrednosti za brojna afinitetno zrela tela peptida. Raspon vrednosti je dat u ovoj tabeli.
Primer 8
Anabolička aktivnost primera tela peptidain vivo
Za određivanje efikasnosti tela peptida iz ovog pronalaska koja uključuju humani Fc region (huFc)in vivose koristi CD 1 nu/nu model miša (Charles River Laboratories, Massachusettes). Ovaj model odgovara na inhibitore iz ovog pronalaska sa rapidnim anaboličnim odgovorom koji je povezan sa povećanjem suve mišićne mase i povećanjem miofibrilarnih proteina, ali nije u vezi sa akumulacijom sadržaja vode u telu.
U jednom primeru, efikasnost lx tela peptida mTN8-19-21in vivo jepokazana narednim eksperimentom. Grupa od 10 CD1 nu/nu miševa starih 8 nedelja se dva puta nedeljno ili jedanput nedeljno tretira sa dozama od 1 mg/kg, 3 mg/kg i 10 mg/kg (subkutane injekcije). Kontrolna grupa od CD1 nu/nu miševa starih 8 nedelja je dva puta nedeljno (subkutane injekcije) primala xuFc (vehikulum) u dozi od 10 mg/kg. Životinje su merene svaki drugi dan, a posna masa je određena pomoću NMR 0-tog dana i 13-tog dana. Nakon toga, 14-tog dana su životinje žrtvovane i određena je veličina fibuloznog mišića. Rezultati su pokazani na Slikama 2 i 3. Slika 2 pokazuje povećanje ukupne telesne težine miša nakon 14 dana primanja različitih doza tela peptida u poređenju sa kontrolnom grupom. Kao što se vidi sa Slike 2, svaka od doza pokazuje povećanje telesne težine u poređenju sa kontrolnom grupom, pri čemu svaka doza pokazuje statistički značajno povećanje nakon kontrole 14-tog dana. Slika 3 pokazuje promenu u posnoj masi tela 0-tog i 13-tog dana, kako je određeno sa NMR, kao i promenu u težini fibuloznog mišića izvađenog iz životinje 14-tog dana.
U narednom primeru, lx mTN8-19-32 telo peptida se primenjuje na CD1 nu/nu mišu subkutanom injekcijom u dozi od 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg i 30 mg/kg, dva puta nedeljno, u poređenju sa huFc kontrolom (vehikulum). Životinje tretirane sa telom peptida pokazuju povećanje u ukupnoj telesnoj težini (nije pokazano), kao i povećanje posne mase tela 13-tog dana u poređenju sa 0-tim danom, što je određeno NMR merenjem. Povećanje posne telesne mase je pokazano na Slici 4.
U narednom primeru, lx afinitetno zrelo telo peptida se poredi sa 2x afinitetno zrelim telom peptida nain vivoanaboličku efikasnost. CD1 nu/nu mužjaci miša (10 životinja po grupi) se dva puta nedeljno tretiraju sa injekcijama od 1 mg/kg i 3 mg/kg lx mTN8-19-7 i 2x mTN8-19-7 u toku 35 dana, dok kontrolna grupa (10 životinja) dva puta nedeljno prima injekcije huFc (3 mg/kg). Kako je pokazano na Slici 5, tretman sa 2x telom peptida ima za rezultat veće povećanje telesne mase i veće povećane težine posnog dela trupa, utvrđeno autopsijom, u poređenju sa lx telom peptida ili kontrolnom grupom.
Primer9
Povećanje snage mišića
4 meseca stari mužjaci C57B/6 miševa se tretiraju 30 dana sa po 5 mg/kg 2x mTN8-19-33, 2x mTN8-19-7 nedeljno, podeljeno u dve subkutane injekcije, a kontrolna grupa se tretira sa huFc vehikulumom (10 životinja/grupa). Životinje se ostave da se oporave bez davanja injekcija. Snaga grča se meri 18-tog dana perioda oporavka. Snaga grča se meri upotrebom Columbia Instruments metra, model 1027 dsm (Columbus, Ohio). Tretman telom peptida ima za rezultat značajno povećanje u snazi grča, kod životinja koje su tretirane sa 2x mTN8-19-33 pokazuje se povećanje od 14% u snazi grča u poređenju sa miševima tretiranih vehikulumom, dok za 2x mTN8-19-7 se pokazuje povećanje od 15% u snazi grča u poređenju sa kontrolnom grupom miševa.
Primer 10
Farmakokinetika
Farmakokinetički eksperimentiin vivose izvode upotrebom reprezentatitvnih tela peptida bez LE sekvenci. Doze od 10 mg/kg i 5 mg/kg se primenjuju na CD1 nu/nu mišu i određuju se sledeći parametri: Cmax (ug/ml), oblast ispod krive (Auc) (ug-h/ml) i polu-život (h). Nađeno je da 2x verzije afinitetno zrelih tela peptida imaju značajno duži polu-život nego lx verzije. Na primer, lx afinitetno zreli mTN8-19-22 ima polu-život u životinjama od približno 50.2 sata, dok 2x mTN8-19-22 ima polu-život od približno 85.2 sata. Afinitetno zreli lx mTN8-19-7 ima polu-život od približno 65 sati, dok 2x mTN8-19-7 ima polu-život od približno 106 sati.
Primer 11
Tretmanmdxmiša
Pokazano je da tela peptida iz ovog pronalaska povećavaju posnu mišićnu masu kod životinja i korisna su u tretmanu oboljenja koja uključuju gubljenje mišićne mase. Distrofija mišića je jedno od tih oboljenja. Model miša za Duhenen distrofiju mišića je Duhenmdxmiš (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Zreli, 10 meseci starimdxmiševi se tretiraju tri meseca sa ili telom peptida lx mTN8-19-33 (n = 8/grupa) ili sa vehikulumom huFc proteinom (N = 6/grupa). Raspored doziranja je svaki drugi dan, 10 mg/kg, subkutane injekcije. Tretman sa telom peptida ima pozitivan efekat u povećanju i održavanju telesne mase kod zrelihmdxmiševa. Značajno povećanje telesne težine je dobijeno u grupi koja je tretirana sa telom peptida, u poređenju sa huFc-tretiranom kontrolnom grupom, kako je pokazano na Slici 6A. Dodatno, NMR analizom je otkriveno daje odnos posnog i masnog dela telesne težine značajno povećan kod zrelihmdxmiševa kao rezultat tretmana telom peptida u predenju sa kontrolnom grupom, a da je procenat masti u odnosu na telesnu težinu smanjen kod miševa tretiranih sa telom peptida u poređenju sa kontrolnom grupom, kako je pokazano na Slici 6B.
Ovaj pronalazak nije ograničen okvirom specifičnih aspekata koji su ovde opisani, koji samo treba da ilustruju pojedine aspekte pronalaska, a funkcionalni ekvivalentni postupci i komponente su pronalazak. Stvarno, različite modifikacije pronalaska kao dodatak onima koje su ovde pokazane i opisane će postati jasne stručnjaku sa iskustvom u tehnici iz prethodnih opisa i pratećih grafika. Ovakve modifikacije treba da budu obuhvaćene okvirom patentnih zahteva koji slede.

Claims (37)

  1. Traži se patentna zaštita za: 1. Vezivno sredstvo koje uključuje najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin, pri čemu peptid uključuje sekvencu amino kiseline WMCPP (SEQ ID NO: 633).
  2. 2. Vezivno sredstvo u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je peptid dugačak između 5 i 50 amino kiselina.
  3. 3. Vezivno sredstvo koje uključuje najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin, naznačeno time što peptid uključuje sekvencu amino kiseline Caia2Wa3WMCPP (SEQ ID NO: 352), pri čemu su aa, a2 i a3izabrani od neutralne hidrofobne, neutralne polarne ili bazne amino kiseline i pri čemu je peptid dugačak između 10 i 50 amino kiselina.
  4. 4. Vezivno sredstvo koje uključuje najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin, naznačeno time što peptid uključuje sekvencu Cb,b7Wb. WMCPP (SEQ ID NO: 353), pri čemu bije izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R; b2 je izabran od bilo koje R, S, Q; b3je izabran od bilo koje P, R i Q,
    i pri čemu je peptid dugačak između 10 i 50 amino kiselina.
  5. 5. Vezivno sredstvo koje uključuje najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin, naznačeno time što peptid uključuje sekvencuCiC2c3c4c5c6Cc7C8Wc9WMCPPc1oC11c12Ci3(SEQ ID NO: 354), pri čemu je:Cinema ili je bilo koja amino kiselina; c2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; c3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; c4nema ili je bilo koja amino kiselina; c5nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina;C6nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; c7 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; c8 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; C9 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; iCiodoC!3je bilo koja amino kiselina;
    i pri čemu je peptid dugačak između 20 i 50 amino kiselina.
  6. 6. Vezivno sredstvo koje uključuje najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin, naznačeno time što peptid uključuje sekvencu: did2d3d4d ACc7csWdQ WMCPPdind,,d,7dn (SEQ ID NO: 355), pri čemu je: dinema ili je bilo koja amino kiselina; d2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; d3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; d4nema ili je bilo koja amino kiselina; d5nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; d6nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; d7 je izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R; dg je izabran od bilo koje R, S,Q; d9 je izabran od bilo koje P, R i Q, i diodo d]3je izabrana od bilo koje amino kiseline, i pri čemu je peptid dugačak između 20 i 50 amino kiselina.
  7. 7. Vezivno sredstvo koje uključuje najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin, naznačeno time što peptid uključuje sekvencu WYe,e2Ye3G(SEQ ID NO: 356) pri čemu je ejP, S ili Y, e2 je C ili Q, i e3 je G ili H, pri čemu je peptid dugačak između 7 i 50 amino kiselina.
  8. 8. Vezivno sredstvo koje uključuje najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin, naznačeno time što peptid uključuje sekvencu fi EMLf2SL£f£LL. (SEQ ID NO: 455) pri čemu je fi M ili I, f2je bilo koja amino kiselina, f3 je L ili F, f4jeE,Qili D; i pri čemu je peptid dugačak između 7 i 50 amino kiselina.
  9. 9. Vezivno sredstvo koje uključuje najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin, naznačeno time što peptid uključuje sekvencu Lg^g jLLg^L, (SEQ ID NO: 456), pri čemu gi je Q, D ili E, g2jeS, Q,Dili E, g3je bilo koja amino kiselina, g4 je L, W, F ili Y i pri čemu je peptid dugačak između 8 i 50 amino kiselina.
  10. 10. Vezivno sredstvo koje uključuje najmanje jedan peptid sposoban da vezuje miostatin, naznačeno time što peptid uključuje sekvencu hih2h3h4h5h6h7h8h9 (SEQ ID NO: 457), pri čemu h, je Rili D, h2 je bilo koja amino kiselina, h3jeA, T, Sili Q, h4 je L ili M, h5 je L ili S, h6 je bilo koja amino kiselina, h7 je F ili E, h8 je w, F ili C, h9 je L, F, M ili K, i pri čemu je peptid dugačak između 9 i 50 amino kiselina.
  11. 11. Vezivno sredstvo naznačeno time što navedeno sredstvo ima strukturu: (X<1>)a-F<1->(X<2>)b, ili njene multimere; 1 12
    pri čemu je F vehikulum, a X i X su svaki nezavisno izabrani od -(l')c-<p>'; -(L')c-P'-(L<2>)d-P<2>; -(L1 )C-P1 -(L2)d-P2-(L3)e-P3; i -(LVP^L<2>)d-P<2->(L<3>)e-P<3->(L<4>)rP<4>;pri čemu suP<1>,P2, P<3>i P<4>peptidi koji mogu da vezuju miostatin, pri čemu je svaki L<1>, L<2>, L<3>i L<4>linkers; a a, b, c, d, e i f su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom daje najmanje jedan od a i b 1.
  12. 12. Vezivno sredstvo u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačeno time što jedan ili više peptida koji vezuju miostatin uključuje sekvencu amino kiseline WMCPP (SEQ ID NO: 633), pri čemu je peptid dugačak između 10 i 50 amino kiselina.
  13. 13. Vezivno sredstvo u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačeno time što jedan ili više peptida koji vezuju miostatin uključuje sekvencu amino kiseline Caia?Wa3 WMCPP (SEQ ID NO: 352), pri čemu su aI?a2i a3izabrani od neutralne hidrofobne, neutralne polarne ili bazne amino kiseline i pri čemu je peptid dugačak između 10 i 50 amino kiselina.
  14. 14. Vezivno sredstvo u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačeno time što jedan ili više peptida koji vezuju miostatin svaki nezavisno uključuje sekvencu amino kiseline Cb,b2Wb3 WMCPP (SEQ ID NO: 353), pri čemu bije izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R; b2 je izabran od bilo koje R, S, Q; b3 je izabran od bilo koje P, R i Q,
    i pri čemu je peptid dugačak između 10 i 50 amino kiselina.
  15. 15. Vezivno sredstvo u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačeno time što jedan ili više peptida koji vezuju miostatin svaki nezavisno uključuje sekvencu amino kiseline ci c2c3c4CsC6Cc7C8 Wcg WMCPPcioc11 ci?cn (SEQ ID NO: 354), pri čemu je:Cinema ili je bilo koja amino kiselina; c2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; c3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; c4nema ili je bilo koja amino kiselina; c5nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; c6nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; c7 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; c8 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; c9 je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; i ciodo C13 je bilo koja amino kiselina; i pri čemu je peptid dugačak između 20 i 50 amino kiselina.
  16. 16. Vezivno sredstvo u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačeno time što jedan ili više peptida koji vezuju miostatin svaki nezavisno uključuje sekvencu amino kiseline did^d^d^C^Cj^dg WMCPPdiodi idpdn (SEQ ID NO: 355), pri čemu je: dinema ili je bilo koja amino kiselina; d2nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; d3nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; d4nema ili je bilo koja amino kiselina; d5nema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili kisela amino kiselina; dćnema ili je neutralna hidrofobna, neutralna polarna ili bazna amino kiselina; d7je izabran od bilo koje amino kiseline T, I ili R; d8 je izabran od bilo koje R, S,Q; d9 je izabran od bilo koje P, R i Q, i diodo d)3 je izabrana od bilo koje amino kiseline, i pri čemu je peptid dugačak između 20 i 50 amino kiselina.
  17. 17. Vezivno sredstvo naznačeno time što navedeno sredstvo ima 112 strukturu (X )a-F -(X )b, ili njene multimere; • • 1 12 • •
    pri čemu je F vehikulum, a X i X su svaki nezavisno izabrani od -(L')c-P<1>;-(LVP'-CLVP2; -(L'^-P'-CL2)^2-^3^3; i -(L<1>)c-P<1->(L<2>)d-P<2->(L<3>3)e-P4<3->(L<4>)rP<4>; pri čemu su P , P , P i P peptidi koji mogu da vezuju miostatin, a pri čemu je svaki od jednog ili više P<1>, P<2>, P<3>i P<4>nezavisno izabran iz grupe koja sadrži: (a) peptid koji uključuje sekvencu amino kiseline WYeie?YeiiG(SEQ ID NO: 356), pri čemu je ei P, S ili Y, e2 je C ili Q, i e3 je G ili H; (b) peptid koji uključuje sekvencu amino kiseline f 1 EMLf2SLf3f4LL, (SEQ ID NO: 455), pri čemu je f]M ili I, f2je bilo koja amino kiselina, f3je L ili F, f4jeE, Q ili D; (c) peptid koji uključuje sekvencu amino kiseline Lgig? LLg3g4L, (SEQ ID NO: 456), pri čemu gije Q, D ili E, g2 je S, Q, D ili E, g3je bilo koja amino kiselina, g4 je L, W, F ili Y; (d) peptid koji uključuje sekvencu amino kiseline hih2h3h4h5h6h7h8h9(SEQ ID NO: 457), pri čemu hije R ili D, h2 je bilo koja amino kiselina, h3 je A, T, S ili Q, h4 je L ili M, h5 je L ili S, h6 je bilo koja amino kiselina, h7 je F ili E, h8 je w, F ili C i h9 je L, F, M ili K;
    pri čemu je peptid dugačak između 9 i 50 amino kiselina,
    pri čemu su svi L<1>, L<2>, L<3>i L4 linkersi; a a, b, c, d, e i f su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom daje najmanje jedan od a i b 1.
  18. 18. Vezivno sredstvo naznačeno time što navedeno sredstvo ima strukturu (X<1>)a-F<1->(X<2>)b, ili njene multimere; • 1 • 12 •
    pri čemu je F vehikulum, a X i X su svaki nezavisno izabrani od -(iA-P1; -(LVP'-CLVP<2>;-(L VP'-(L2)d-P2-(L3)e-P3; i ^L^e-P^VP^VP^VP4; pri čemu su P1, P<2>, P3 i P4 peptidi koji mogu da vezuju miostatin i nezavisno su izabrani od SEQ ID NO: 305 do 351 i SEQ ID NO: 357 do 454; pri cemu su svi L<]>, L<2>, L<3>i L<4>linkersi;
    a a, b, c, d, e i f su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom daje najmanje jedan od aib 1.
  19. 19. Vezivno sredstvo u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 11 do 18, naznačeno time što je vehikulum neka Fc oblast.
  20. 20. Sekvenca polinukleotida naznačena time što enkodira vezivno sredstvo iz patentnog zahteva 19.
  21. 21. Vektor iskazivanja naznačen time što uključuje polinukleotid iz patentnog zahteva 20.
  22. 22. Ćelija domaćin naznačena time što uključuje vektor iskazivanja u skladu sa patentnim zahtevom 21.
  23. 23. Ćelija domaćin u skladu sa patetnim zahtevom 22, naznačena time što je ćelija prokariotična ćelija.
  24. 24. Ćelija domaćin u skladu sa patetnim zahtevom 22, naznačena time što je ćelija eukariotična ćelija.
  25. 25. Farmaceutska kompozicija koja uključuje efektivnu količinu vezivnog sredstva u skladu sa bilo kojim od patentih zahteva 1 ili 11 u mešavini sa njegovim farmaceutski prihvatljivim nosačem.
  26. 26. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 25, naznačena time što je vehikulum neka Fc oblast.
  27. 27. Postupak za inhibiciju delovanja miostatina na subjektu, naznačen time što uključuje primenu efektivne količine vezivnog sredstva u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1, 3 ili 11 na subjektu.
  28. 28. Postupak za povećavanje posne mišićne mase kod subjekta, naznačen time što uključuje primenu na subjektu kompozicije u skladu sa patentnim zahtevom 25.
  29. 29. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 28, naznačen time što je subjekat životinja koja se koristi u ishrani.
  30. 30. Postupak za povećavanje odnosa posne mišićne mase prema salu kod subjekta, naznačen time što uključuje primenu na subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije u skladu sa patentnim zahtevom 25.
  31. 31. Postupak za lečenje bolesti gubljenja mišića kod subjekta, naznačen time što uključuje primenu na subjektu terapeutski efektivne količine kompozicije u skladu sa patentnim zahtevom 25.
  32. 32. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 31, naznačen time što je oboljenje izabrano od distrofije mišića, amiotrofične lateralne skleroze, kongestivnog obstruktivnog oboljenja pluća, hroničnog oštećenja srca, kancera, AIDS, renalnog oštećenja, uremije, reumatoidnog artritisa, sarkopenije povezane sa godinama i gubljenja mišićne mase zbog dugotrajne vezanosti za krevet, oštećenja kičmene moždine, šloga, frakture kostiju i starosti.
  33. 3 3. Postupak lečenj a metaboličkih poremećaj a povezanih sa miostatinom kod subjekta, naznačen time što ukljčuje primenu na subjektu
    terapeutski efektivne količine kompozicije u skladu sa patentnim zahtevom 25.
  34. 34. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 33, naznačen time što je metabolički poremećaj izabran od dijabetesa, gojaznosti, hiperglikemije i gubitka koštane mase.
  35. 35. Postupak za detekciju miostatina u uzorku, naznačen time što uključuje kontakt uzorka sa vezivnim sredstvom u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 11 i detekciju vezanog kompleksa.
  36. 36. Postupak za merenje miostatina u uzorku, naznačen time što uključuje kontakt uzorka sa vezivnim sredstvom u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 11 i merenje vezanog kompleksa.
  37. 37. Postupak za dijagnostiku poremećaja povezanog sa miostatinom kod subjekta, naznačen time što uključuje kontakt uzorka uzetog od subjekta sa vezivnim sredstvom u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 11 i detekciju vezanog kompleksa.
YU20050530A 2002-12-20 2003-12-19 Vezivna sredstva koja inhibiraju miostatin RS52815B (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43592302P 2002-12-20 2002-12-20
PCT/US2003/040781 WO2004058988A2 (en) 2002-12-20 2003-12-19 Binding agents which inhibit myostatin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS20050530A true RS20050530A (sr) 2007-09-21
RS52815B RS52815B (sr) 2013-10-31

Family

ID=32682298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU20050530A RS52815B (sr) 2002-12-20 2003-12-19 Vezivna sredstva koja inhibiraju miostatin

Country Status (27)

Country Link
US (7) US7511012B2 (sr)
EP (2) EP1581649B1 (sr)
JP (3) JP4959137B2 (sr)
KR (9) KR20150013350A (sr)
CN (2) CN102382172A (sr)
AR (2) AR042545A1 (sr)
AT (1) ATE496938T1 (sr)
AU (2) AU2003301195B2 (sr)
BR (1) BR0317538A (sr)
CA (2) CA2510893C (sr)
CY (1) CY1111388T1 (sr)
DE (1) DE60335915D1 (sr)
DK (1) DK1581649T3 (sr)
EA (1) EA009056B1 (sr)
ES (1) ES2359562T3 (sr)
IL (3) IL169168A0 (sr)
ME (1) MEP57508A (sr)
MX (1) MXPA05006521A (sr)
NO (2) NO335982B1 (sr)
NZ (1) NZ541253A (sr)
PL (1) PL383616A1 (sr)
PT (1) PT1581649E (sr)
RS (1) RS52815B (sr)
SI (1) SI1581649T1 (sr)
TW (1) TWI328456B (sr)
WO (1) WO2004058988A2 (sr)
ZA (1) ZA200505481B (sr)

Families Citing this family (173)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MEP42108A (en) 1998-10-23 2011-02-10 Kiren Amgen Inc Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity
TW200526779A (en) 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
BR0307871A (pt) 2002-02-21 2005-04-12 Wyeth Corp Proteìnas contendo domìnio de folistatina
EP1572909A4 (en) 2002-02-21 2007-06-06 Wyeth Corp PROTEIN CONTAINING A DOMAINE OF FOLLISTATIN
US7193069B2 (en) * 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
MXPA05002968A (es) * 2002-09-16 2005-09-08 Univ Johns Hopkins Activacion de miostatina por metaloproteasa, y metodos de modular la actividad de miostatina.
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) * 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
BR0317538A (pt) * 2002-12-20 2005-11-29 Amgen Inc Agente ligante, sequência de polinucleotìdeo, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, métodos de inibir a atividade de miostatina, de aumentar a massa muscular magra e a razão de massa muscular magra para gordura, de tratar uma doença de emaciação muscular e um distúrbio metabólico relacionado com miostatina em um indivìduo, de detectar e medir miostatina em uma amostra, e, de diagnosticar um distúrbio relacionado com miostatina em um indivìduo
RU2322261C2 (ru) * 2003-06-02 2008-04-20 Уайт Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
ES2383300T3 (es) * 2003-11-13 2012-06-20 Hanmi Holdings Co., Ltd Fragmento Fc de IgG para un vehículo de fármacos y procedimiento para su preparación
EP1699820A2 (en) 2003-12-31 2006-09-13 Schering-Plough Ltd. Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
US9045553B2 (en) 2004-05-27 2015-06-02 Acceleron Pharma, Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
JP2008500373A (ja) * 2004-05-27 2008-01-10 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）／ココ（Ｃｏｃｏ）誘導体およびそれらの使用
US8143380B2 (en) * 2004-07-08 2012-03-27 Amgen Inc. Therapeutic peptides
WO2006036834A2 (en) 2004-09-24 2006-04-06 Amgen Inc. MODIFIED Fc MOLECULES
CA2594276A1 (en) 2004-12-30 2006-07-13 Schering-Plough Ltd. Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
NZ538097A (en) * 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
JP2008537777A (ja) * 2005-03-23 2008-09-25 ワイス Ｇｄｆ−８調節剤に対する免疫応答の検出
EP1864138A2 (en) * 2005-03-23 2007-12-12 Wyeth Detection of gdf-8 modulating agents
BRPI0611901A2 (pt) 2005-06-14 2012-08-28 Amgen, Inc composição, liofilizado, kit, e, processo para preparar uma composição
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
EP1951756B1 (en) * 2005-10-06 2015-01-07 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US20090163579A1 (en) * 2005-10-14 2009-06-25 Daniel Raederstorff Novel use of nutraceutical compositions
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
WO2007067616A2 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Amgen Inc Uses of myostatin antagonists
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
BRPI0716249A2 (pt) 2006-09-05 2013-09-03 Lilly Co Eli anticorpos antimiostatina
WO2008051383A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Amgen Inc. Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
CA2671983A1 (en) * 2006-12-08 2009-06-19 Acceleron Pharma Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
US7947646B2 (en) 2007-03-06 2011-05-24 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides
EP2162540A2 (en) 2007-05-22 2010-03-17 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
WO2009015345A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
CA2685540C (en) 2007-08-03 2018-10-16 Graham Michael Wynne Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
MX2010002249A (es) * 2007-08-31 2010-03-17 Amgen Inc Formulacion de proteina de estado solido.
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
CA2723987C (en) 2008-05-14 2019-06-11 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Use of angiogenin or angiogenin agonists for treating diseases and disorders
JP5611222B2 (ja) 2008-11-26 2014-10-22 アムジエン・インコーポレーテツド アクチビンｉｉｂ受容体ポリペプチドの変異体及びその使用
EP3366692A1 (en) 2009-06-22 2018-08-29 Amgen, Inc Refolding proteins using a chemically controlled redox state
AU2010266093B2 (en) 2009-06-25 2013-06-27 Amgen Inc. Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system
US8945511B2 (en) * 2009-06-25 2015-02-03 Paul Weinberger Sensitive methods for detecting the presence of cancer associated with the over-expression of galectin-3 using biomarkers derived from galectin-3
WO2011050333A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Amgen Inc. Vial adapter and system
JO3340B1 (ar) * 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
SG186094A1 (en) 2010-06-07 2013-01-30 Amgen Inc Drug delivery device
SG187867A1 (en) 2010-08-16 2013-03-28 Amgen Inc Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
AU2012236573B2 (en) 2011-03-31 2016-06-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
HUE042822T2 (hu) 2011-04-20 2019-07-29 Amgen Inc Automata befecskendezõ szerkezet
WO2012153337A2 (en) * 2011-05-11 2012-11-15 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anti-microbial peptides and uses of same
PL3045187T3 (pl) 2011-10-14 2019-09-30 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
EA201992617A1 (ru) 2011-10-26 2020-03-10 Амген Инк. Способы уменьшения или устранения модификации и разложения белка, обусловленных воздействием уф-излучения
FR2982860B1 (fr) * 2011-11-18 2015-07-10 Ass Fr Contre Les Myopathies Utilisation de la fibromoduline et du lumican pour augmenter la masse musculaire
HK1203384A1 (en) 2011-12-19 2015-12-11 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
RU2634407C2 (ru) 2012-03-26 2017-10-26 Эксселла Хелт Инк. Фрагменты пищевых белков и способы их применения
EP2831100A4 (en) 2012-03-26 2016-02-10 Pronutria Inc NUTRIENT PROTEINS AND METHOD
EP2831098A4 (en) 2012-03-26 2016-12-07 Axcella Health Inc LOADED NUTRIENT PROTEINS AND METHODS
US9700071B2 (en) 2012-03-26 2017-07-11 Axcella Health Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
AU2013204740C1 (en) 2012-05-10 2015-10-01 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Methods of treating cancer using angiogenin or an angiogenin agonist
US9873739B2 (en) 2012-08-01 2018-01-23 Ikaika Therapeutics, Llc Mitigating tissue damage and fibrosis via latent transforming growth factor beta binding protein (LTBP4)
ES2860954T3 (es) 2012-11-21 2021-10-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
WO2014119753A1 (ja) * 2013-01-31 2014-08-07 学校法人 東京薬科大学 マイオスタチン阻害ペプチド
AU2014212014A1 (en) 2013-02-01 2015-08-27 Amgen Inc. Administration of an anti-activin-A compound to a subject
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
US10646664B2 (en) 2013-03-15 2020-05-12 Amgen Inc. Body contour adaptable autoinjector device
TWI614041B (zh) 2013-03-15 2018-02-11 安美基公司 用於注射器之匣盒
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
KR101523065B1 (ko) * 2013-06-19 2015-05-27 한국기초과학지원연구원 입자크기가 제어된 금 나노입자의 제조방법 및 제조된 금 나노입자를 이용한 비색식 강산 검출방법
TW201601741A (zh) * 2013-09-09 2016-01-16 品特生物療法有限公司 用於治療ｅｓｒｄ病患之ｐｅｗ的肌肉生長抑制素拮抗劑
RU2016110800A (ru) 2013-09-25 2017-10-30 Пронутриа Биосайенсис, Инк. Составы и композиции для поддержания и увеличения мышечной массы, силы и результативности, и способы их производства и использования
CA3168888A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
SG11201602876WA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Amgen Inc Injector and method of assembly
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
AU2015256082C1 (en) 2014-05-07 2020-09-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CN111840696B (zh) 2014-06-03 2022-12-20 安姆根有限公司 可控制药物递送系统和使用方法
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP3206739B1 (en) 2014-10-14 2021-12-01 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
EP3215175A4 (en) 2014-11-06 2018-06-27 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
JP6484345B2 (ja) 2015-02-17 2019-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置
WO2016138434A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
ES2856936T3 (es) 2015-04-23 2021-09-28 Univ Washington State Suministro del gen Smad7 como un agente terapéutico
CN106191215B (zh) 2015-04-29 2020-03-24 中国科学院上海生命科学研究院 肌肉萎缩相关的蛋白质分子标记Dkk-3的筛选及其应用
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
DK3334747T5 (da) 2015-08-13 2024-10-07 Amgen Inc Ladet dybdefiltrering af antigenbindende proteiner
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
HRP20211081T1 (hr) 2015-09-15 2021-10-15 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latentna miostatinska protutijela i njihove uporabe
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
CN115814077A (zh) 2016-01-08 2023-03-21 供石公司 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
RU2613420C1 (ru) * 2016-04-13 2017-03-16 Сергей Михайлович Юдин Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата
ES2981471T3 (es) * 2016-04-25 2024-10-09 Five Prime Therapeutics Inc NOPE para el tratamiento de la pérdida de masa muscular y la debilidad muscular patológicas
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342B1 (en) 2016-07-01 2025-03-12 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US10150115B2 (en) * 2016-07-21 2018-12-11 Spacepharma SA System and method for rehydrating powder and delivering the rehydrated powder to a reactor
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
PT3528787T (pt) 2016-10-21 2026-03-11 Amgen Inc Formulações farmacêuticas e métodos para produzir as mesmas
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP4218817A3 (en) * 2017-01-06 2023-09-06 Scholar Rock, Inc. Methods for treating metabolic diseases by inhibiting myostatin activation
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
EP3592403B1 (en) 2017-03-06 2025-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
ES3023742T3 (en) 2017-03-28 2025-06-03 Amgen Inc Plunger rod and syringe assembly system
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
JP7195276B2 (ja) 2017-06-22 2022-12-23 アムジエン・インコーポレーテツド デバイス起動による衝突／衝撃の低減
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
IL270784B2 (en) 2017-07-14 2023-11-01 Amgen Inc Needle insertion-extraction system with a double torsion spring system
JP7649105B2 (ja) 2017-07-21 2025-03-19 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
EP3668567B1 (en) 2017-08-18 2026-02-18 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
ES2971450T3 (es) 2017-10-06 2024-06-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
IL273582B2 (en) 2017-11-03 2024-12-01 Amgen Inc Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
MA50557A (fr) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc Pistons pour dispositifs d'administration de médicament
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
MX2020005066A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinyector con deteccion de detencion y punto final.
EP3569614A1 (en) 2018-05-18 2019-11-20 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Compounds and methods for the immobilization of myostatin-inhibitors on the extracellular matrix by transglutaminase
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
KR102042352B1 (ko) 2018-07-16 2019-11-07 강릉원주대학교산학협력단 땅콩 껍질 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물
KR102259645B1 (ko) 2018-07-16 2021-06-02 강릉원주대학교산학협력단 구멍쇠미역 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
US12151089B2 (en) 2018-10-05 2024-11-26 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
TW202541859A (zh) 2018-10-15 2025-11-01 美商安進公司 具有阻尼機構之藥物遞送裝置及自動注射器
WO2020081480A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
MX2021004510A (es) 2018-10-23 2021-06-08 Amgen Inc Calibracion automatica y mantenimiento automatico de modelos espectroscopicos de raman para predicciones en tiempo real.
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
WO2020132647A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
WO2020139977A1 (en) 2018-12-26 2020-07-02 Northwestern University Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder
AU2020263289B2 (en) 2019-04-24 2025-05-22 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
WO2021158469A1 (en) 2020-02-03 2021-08-12 Amgen Inc. Multivariate bracketing approach for sterile filter validation
JP2024523779A (ja) 2021-05-21 2024-07-02 アムジェン インコーポレイテッド 薬物容器用の充填レシピを最適化する方法
JP2025500732A (ja) 2021-10-27 2025-01-15 アムジエン・インコーポレーテツド 分光法を使用して薬剤を監視するための深層学習ベースの予測
WO2023096232A1 (ko) * 2021-11-25 2023-06-01 (주)네오크레마 신규 펩티드 및 이의 용도
US20250082720A1 (en) * 2021-11-25 2025-03-13 Neo Cremar Co., Ltd. New peptide and uses thereof
KR102726402B1 (ko) * 2021-11-25 2024-11-05 (주)네오크레마 지방전구세포의 증식과 지방세포로의 분화를 억제하는 신규 펩티드 및 이의 용도
KR102726401B1 (ko) * 2021-11-25 2024-11-05 (주)네오크레마 지방전구세포의 증식과 지방세포로의 분화를 억제하는 신규 펩티드 및 이의 용도
CN115403657A (zh) * 2022-06-23 2022-11-29 浙江大学 一种TGF-β3生长因子的亲和多肽及其应用
EP4638496A1 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Scholar Rock, Inc. Selective and potent inhibitory antibodies of myostatin activation
WO2025037108A2 (en) 2023-08-15 2025-02-20 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modified thrombopoietin
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US5750375A (en) 1988-01-22 1998-05-12 Zymogenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions
WO1993006843A1 (en) * 1991-10-08 1993-04-15 Duke University Peptides corresponding to antigenic determinants of htlv
US6607884B1 (en) 1993-03-19 2003-08-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-8
US7393682B1 (en) * 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
DK0690873T3 (da) 1993-03-19 2003-09-29 Univ Johns Hopkins Med Vækstdifferentieringsfaktor-8
US6465239B1 (en) 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US5994618A (en) 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
AU756620B2 (en) * 1997-07-14 2003-01-16 University Of Liege Mutations in the myostation gene cause double-muscling in mammals
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
GB2333706A (en) 1998-02-02 1999-08-04 Merck & Co Inc Method for increasing muscle mass in animals
US6369201B1 (en) * 1998-02-19 2002-04-09 Metamorphix International, Inc. Myostatin multimers
JP4544742B2 (ja) * 1998-05-06 2010-09-15 メタモーフイクス・インコーポレーテツド Ｇｄｆ−８の阻害による糖尿病の処置法
EP1027608B1 (en) * 1998-07-30 2010-01-20 Odyssey Thera, Inc. Protein fragment complementation assays
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
MXPA01007366A (es) * 1999-01-21 2002-06-04 Metamorphix Inc Inhibidores de factores de crecimiento y diferenciacion y usos de los mismos.
US6284882B1 (en) * 1999-06-10 2001-09-04 Abbott Laboratories Myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof
TR200400621T2 (tr) * 1999-07-20 2004-08-23 Pharmexa A/S GDF-8 aktivitesinin aşağı doğru düzenlenmesi için bir yöntem.
US7368534B2 (en) 2000-01-18 2008-05-06 Orico Limited Myostatin and mimetics thereof
EP1383793B1 (en) * 2000-03-29 2011-10-19 DGI BioTechnologies, L.L.C. Insulin and igf-1 receptor agonists and antagonists
CA2432474C (en) * 2000-12-23 2012-06-26 Dyax Corp. Fibrin binding polypeptides useful inter alia in medical imaging processes
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
BR0317538A (pt) 2002-12-20 2005-11-29 Amgen Inc Agente ligante, sequência de polinucleotìdeo, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, métodos de inibir a atividade de miostatina, de aumentar a massa muscular magra e a razão de massa muscular magra para gordura, de tratar uma doença de emaciação muscular e um distúrbio metabólico relacionado com miostatina em um indivìduo, de detectar e medir miostatina em uma amostra, e, de diagnosticar um distúrbio relacionado com miostatina em um indivìduo
RU2322261C2 (ru) 2003-06-02 2008-04-20 Уайт Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний
WO2005032578A1 (en) 2003-10-06 2005-04-14 Monash University Therapeutic method
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
ES2383300T3 (es) 2003-11-13 2012-06-20 Hanmi Holdings Co., Ltd Fragmento Fc de IgG para un vehículo de fármacos y procedimiento para su preparación
EP3006039B1 (en) 2004-03-02 2021-01-06 Acceleron Pharma Inc. Alk7 polypeptides for use in promoting fat loss
ATE557042T1 (de) 2004-03-23 2012-05-15 Lilly Co Eli Anti-myostatin-antikörper
WO2006036834A2 (en) * 2004-09-24 2006-04-06 Amgen Inc. MODIFIED Fc MOLECULES
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
PL2407486T3 (pl) 2005-08-19 2018-05-30 Wyeth Llc Przeciwciała antagonistyczne względem GDF-8 i zastosowania w leczeniu ALS i innych zaburzeń związanych z GDF-8
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1

Also Published As

Publication number Publication date
RS52815B (sr) 2013-10-31
EA009056B1 (ru) 2007-10-26
CN102382172A (zh) 2012-03-21
KR20150013350A (ko) 2015-02-04
TW200505474A (en) 2005-02-16
EP1581649A2 (en) 2005-10-05
US20120083442A1 (en) 2012-04-05
KR20140004805A (ko) 2014-01-13
ES2359562T3 (es) 2011-05-24
NZ541253A (en) 2010-03-26
IL169168A0 (en) 2007-07-04
US7803923B2 (en) 2010-09-28
JP2006524034A (ja) 2006-10-26
CN101287484B (zh) 2012-10-10
WO2004058988A2 (en) 2004-07-15
AR042545A1 (es) 2005-06-22
US20090220491A1 (en) 2009-09-03
EP1581649B1 (en) 2011-01-26
KR101304718B1 (ko) 2013-09-05
KR20130036378A (ko) 2013-04-11
CA2774928A1 (en) 2004-07-15
US8071538B2 (en) 2011-12-06
EP1581649A4 (en) 2008-10-08
EP2272864A3 (en) 2011-02-16
MXPA05006521A (es) 2005-08-26
AU2010201389A1 (en) 2010-04-29
ATE496938T1 (de) 2011-02-15
IL205266A0 (en) 2011-07-31
AR097588A2 (es) 2016-03-23
EA200501000A3 (ru) 2007-04-27
WO2004058988A3 (en) 2007-11-15
AU2003301195A1 (en) 2004-07-22
NO335982B1 (no) 2015-04-13
KR20050091015A (ko) 2005-09-14
BR0317538A (pt) 2005-11-29
NO20141479L (no) 2005-09-08
US20130230515A1 (en) 2013-09-05
IL205265A0 (en) 2011-07-31
US20090227517A1 (en) 2009-09-10
IL205265A (en) 2017-01-31
US20150175687A1 (en) 2015-06-25
US7928075B2 (en) 2011-04-19
MEP57508A (en) 2011-05-10
JP2010193888A (ja) 2010-09-09
KR20160045936A (ko) 2016-04-27
ZA200505481B (en) 2008-01-30
KR20120060250A (ko) 2012-06-11
EA200501000A2 (ru) 2006-06-30
EP2272864A2 (en) 2011-01-12
PT1581649E (pt) 2011-04-13
NO20053545L (no) 2005-09-08
TWI328456B (en) 2010-08-11
DE60335915D1 (de) 2011-03-10
US8920798B2 (en) 2014-12-30
US7511012B2 (en) 2009-03-31
US20040181033A1 (en) 2004-09-16
PL383616A1 (pl) 2008-04-14
CA2510893C (en) 2012-07-10
NO20053545D0 (no) 2005-07-19
SI1581649T1 (sl) 2011-09-30
AU2003301195B2 (en) 2010-01-07
US20100330072A1 (en) 2010-12-30
JP2013048622A (ja) 2013-03-14
JP4959137B2 (ja) 2012-06-20
KR20110086881A (ko) 2011-08-01
CY1111388T1 (el) 2015-08-05
HK1084419A1 (en) 2006-07-28
KR20120037517A (ko) 2012-04-19
CN101287484A (zh) 2008-10-15
CA2510893A1 (en) 2004-07-15
DK1581649T3 (da) 2011-05-02
KR20150107899A (ko) 2015-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS20050530A (sr) Vezivna sredstva koja inhibiraju miostatin
AU2010214673B2 (en) Uses of myostatin antagonists
AU2013216655B2 (en) Binding agents which inhibit myostatin
AU2016202981A1 (en) Binding agents which inhibit myostatin
HK1152953A (en) Binding agents which inhibit myostatin
AU2013213714A1 (en) Uses of myostatin antagonists
HK1084419B (en) Binding agents which inhibit myostatin