RS20050664A - Kompozicije vakcine na bazi gangliozida za subkutanozno davanje - Google Patents

Abstract

Opisane su kompozicije vakcine u kojima su kombinovani gangliozidi i OMP iz N. meningitidis tako da obrazuju proteolipozome veoma male veličine (VSSP – very small size proteoliposomes) za subkutanozno davanje, ove kompozicije ne zahtevaju nijedan drugi dodatni adjuvant. Opisane kompozicije omogućavaju imunološke tretmane sa gangliozidima, naročito N-AcGM3/VSSP i N-GcGM3/VSSP, pokazujući prednosti usled manje agresivne reakcije na mestu injekcije i mgou biti korišćeni na jednostavniji način koji je bolji za pacijente.

Description

KOMPOZICIJE VAKCINE NA BAZI GANGLIOZIDA ZA SUBKUTANOZNO DAVANJE

Ovaj pronalazak se odnosi na kompozicije vakcina za subkutanozno davanje koje sadrže gangliozide korisne za imunološko lečenje autoimunih bolesti, infektivnih bolesti i tumora, bez dodatnih adjuvanata.

Duže vremena je poznato korišćenje imunološkog lečenja za autoimune bolesti i kancer, na primer u USA -A-4965198 patentu koji opisuje upotrebu gangliozida GM2 u sprečavanju i lečenju takvih bolesti. U okviru patetnta EP-A-661061 i patenta US-A-6149921, kompozicije vakcine su opisane u cilju stimulacije ili povećanja odgovora antitela protiv gangliozida koji se sastoji od imunogena i imunološkog adjuvanta.

Opisani imunogeni su VSSP (very small siže proteoliposomes - proteoliposomi veoma male veličine) koji se sastoje od udruživanja N-AcetilGM3 i N-GlikolilGM3 gangliozida od sad pa nadalje: (N-AcGM3) i (N-GcGM3), sa proteinskim kompleksom kao spoljašnjom membranom (OMP-outer membrane protein complex) iz Neisseriameningitidis.

Takvi imunogeni od sada pa nadalje će biti nazivani N-AcGM3A/SSP i N-GcGM3A/SSP; su veoma mali i praktično nevidljivi za elektronski mikroskop, rastvorni u vodi i povećanog kapaciteta plutanja.

Za kompozicije vakcina opisane u EP-A-661061 i USj-A-6149921 bilo je potrebno korišćenje adjuvanata, kao što je dobro poznati Freund-ov nekompletni adjuvant.

U okviru patenta VVO-A-02145746, opisane kompozicije vakcine sadrže (A) jedan ili više antigena sa niskom imunogenošću; (B) VSSP sa inkorporisanim gangliozidima, uglavnom N-AcGM3A/SSP i N-GcGM3A/SSP; i (C) eventualno jedan ili više adjuvanata.11I I U radu Carr A. et al., objavljenom uMelanoma Research,2001, Vol. 11, pp 219-227, opisana je anti-tumorna aktivnost vakcine koja sadrži N-AcGM3 gangliozid kod miševa koji pate od melanoma B16.

U tom članku takođe je proučavan uticaj prisustva imunološkog adjuvanta, naročito kompletnog Freund-ovog adjuvanta ili nekompletnog Freund-ovog adjuvanta kao što je adjuvant Montanide ISA 51. Vakcine su davane intramuskularno i zaključak koji se javlja je da miševi imunizirani sa N-AcGM3A/SSP, sa bilo kojim od adjuvanata, Freund-ovim ili Montanide ISA 51, pokazuju IgM i IgG anti-N-AcGM3 odgovor u 8 nedelji (Tabela 1). Nasuprot tome, N-AcGM3/VSSP vakcina bez i jednog adjuvanta ne pokazuje imunološki odgovor (strana 223, desna kolona).

Prema tome stanje tehnike opisuje vakcine koje sadrže VSSP konjugovan sa gangliozidima koji su formulisani sa adjuvantima, uglavnom Freund-ovim (kompletnim ili nekompletnim) ili Montanide ISA 51.

Međutim dobro je poznao da kada se daju parenteralno, takvi adjuvanti, naročito Freund-ov kompletni adjuvant, izazivaju neke nepoželjne sporedne efekte kao' što su hronična zapaljenja na mestu injekcije, eventualni granulom i sterilne abcese ili ulcerozne nekroze tkiva. Montanide ISA 51 je manje agresivan, ali takođe može izazvati neke inflamatorene bolesti.

Bilo bi jako poželjno sa stanovišta njihove primene u imunološkom letenju autoimunih, infektivnih bolesti i bolesti tumora imati nove kompozicije vakcina gangliozida koje su manje agresivne na mestu injekcije i koje bi se mogle lakše koristiti sa manje neugodnosti za pacijenta.

Autori prikazanog pronalska su otkrili da vakcine gangliozida formulisane sa VSSP, kada se daju subkutanozno mogu biti korišćene bez adjuvanata dok će još biti pnsutne bitne imunološke osobine.

Ciljevi prikazanog pronalaska su nove kompozicije vakcine koje uključuju VSSP, poželjno N-AcGM3/VSSP i N-GcGM3A/SSP, koje ne sadrže ni jedan imunološki adjuvant i daju se subkutanozno. ' 1

Takođe je predmet prikazanog pronalaska postupak za lečenje pacijenata kojima je potrebno pojačanje njihovog imunološkog odgovora koje se sastoji od subkutanoznog davanja kompozicija vakcina gangliozida, poželjno N-AcGM3A/SSP i N-GcGM3A/SSP, koje ne sadrže ni jedan imunološki adjuvant.

Takođe predmet prikazanog pronalska su kompozicije vakcine N-AcGM3A/SSP i/ili N-GcGM3A/SSP koje ne sadrže druge antigene komponente drugačije od gangliozida ili bilo koji drugi imunološki adjuvant i daju se subkutanozno.

Kompozicije vakcine kao predmet ovog pronalaska sastoje se od rastvora ili vodene disperzije jednog ili više gangliozida i njihove inkluzije u OMP iz N.meningitidis(VSSP), sposobne da stimuliše imunološki odgovor subkutanoznim davanjem bez dodatnog imunološkog adjuvanta. ?

VSSP su visoko stabilni gangliozidi u hidrofobnom udruženju sa proteinskim kompleksom kao spoljašnjom membranom iz Neisseriameningitidis,bez potrebe za kovalentnim vezivanjem. Takvi sistemi gangliozid-protein su opisani u patentima EP-A-661061 i US-A-6149921, i takođe u različitim publikacijama, na primer, Estevez et al.Vaccine,1999; Vol. 18(1-2): pp 190-197. U tim dokumentima takođe je opisan postupak za njihovo pobijanje.

Među gangliozidima uključenim u VSSP, poželjni su N-AcGM3 i N-GcGM3, a naročito je poželjan N-AcGM3.

Detaljni opis imunogenosti oba konjugovana gangliozida kao i njihova primena kao sredstva protiv kancera i stimulansa stečenog imuniteta može se naći u^gore pomenutim dokumentima i u revijalnom članku: Bitton R. Et al.,Oncology Reports(2002), Vol 9, pp 267-276, i u skorijim saopštenjima i naučnim skupovima kao na primer Šesti latino-američki kongres imunologije (The 6<th>Latin-American Congress of Immunologv) koje je održan u Havani 9 decembra, 2002, saopštenje Saurez G. et al." Phase I clinical trial of

the ganglioside cancer vaccine N- Acetil- GM3A/ SSP/ Montanide ISA 51 in advanced breast

cancer patients".

Kompozicije vakcine koje ne sadrže druge antigene komponente osim gangliozida su poželjan predmet pronalska od kojih je naročito poželjan onaj koji sadrži kao jedinu imunogenu komponentu N-AcGM3 (N-AcGM3A/SSP) i ili N-GcGM3 (N-GcGM3A/SSP), od kojih je naročito poželjna ona koja sadrži samo N-AcGM3A/SSP.

Kompozicije vakcine kao predmet prema prikazanom pronaslku su rastvori ili vodene disperzije VSSP koje eventualno mogu sadržati druge netoksične, neiritirajuće rastvarače kompatibilne sa vodom, koji se normalno koriste u za parenteralnu upotrebu farmaceutici, kao što je polietilenglikoli.

Koncentracija konjugovanog gangliozida u rastvorima , ili vodenim(disperzijama je nekritična i može biti u opsegu od 0.03% - 3% (tež/v), poželjno između 0,04 % i 2,5 %

(tež/v). Opseg SC davanih doza, korišćenih za vakcine prema prikazanom pronalasku, je između used 50^g i 2, 4 mg, poželjno između 200 \ ig i 2 mg.

Osnovna karakteristika kompozicija vakcina, kao predmeta ovog pronalaska, je da su one namenjene za subkutanozno davanje bez dodatnog imunološkohg adjuvanata.: ,

Imunološki adjuvanti su često korišćeni u formulacijama vakcina. Takvi adjuvanti pospešuju imunoloko dejstvo na različite načine: Stvaranje naslaga antigena na injekcionom mestu os|obađanjern i otpuštanjem

antigena u sistemskom obliku.

Pomaganje antigenu da dođe do slezine i limfnih čvorova pomoću nastanka uljanih

mikro kapljica koje lako zarobe makrofazi.

Direktnim i indirektnim aktiviranjem ćelija uključenih u imuni odgovor.

Najpoznatiji imunološki adjuvanti su: Freund-ov, kompletni ? i nekompletni,

Montanide ISA, Ribi adjuvanti, Hunter-ov TiterMax, aluminijumove soli, Gerbu adjuvant, O.S-21, itd.

Iznenađujuće i neočekivano autori prikazanog pronalska su ustanovili da kada se gangliozidA/SSP vakcine daju SC, adjuvanti mogu biti kompletno eliminisani. Ovo je, uprkos stanju tehnike, isključeno gotovo potpuno za intramuskularno davanje

Prema tome prikazani pronalazak predstavlja neospornu prednost što se tiče svih lokalnih inflamatornih problema koji nastaju od upotrebe adjuvanata. Ovaj postupak vakcinacije sa gangliozidima je jednostavno efikasniji i manje agresivan za pacijente.

U sledećim primerima uključeni su uporedni eksperimentalni podaci koji omogućavaju pokazivanje imunološke efiksanosti kompozicije vakcine bez imunoloških adjuvanata.

Primer1:

Korišćenjem postupka opisanog u primeru 3 US-A-6149921 patenta, pripremljena je vodena kompozicija vakcine (pufer Tris-HCI) koja sadrži 2,4 mg/mL N-AcGM3A/SSP. U alikvot takve imunogene kompozicije dodata je ista zapremina Montanide ISA 51 adjuvanta (Seppic Pariš, France). U isto vreme drugom alikvotu dodata je identična zapremina Tris-HCI.

Dobijene su dve kompozicije vakcine:

A: Vodeni rastvor koji sadrži 1, 2 mg/mL N-AcGM3A/SSP. , ,

B: Emulzija v/u koja sadrži 1, 2 mg/mL N-AcGM3/VSSP. ' f

Izabrani su ženski miševi 50 C57BL/6 sa telesnom težinom između 18-20 g, i organizovani u 5 eksperimentalnih grupa, od kojih svaka sadrži 10 životinja.

Grupa 1 (kontrola) životinja je inokulirana intramuskularno, dana 0, 14, 28 i 42, sa 0, 1 mL soli fosfatnog pufera (PBS). /

Grupa 2 životinja je inokulirana intramuskularno, dana 0, 14, 28 i 42, sa 0,

1 mL kompozicije vakcine B (120 pg N-AcGM3/VSSP).

Grupa 3 (kontrola) životinja je inokulirana subkutanozno, dana 0, 14, 28 i 42, sa 0, 1 mL (PBS).

Grupa 4 životinja je inokulirana subkutanozno, dana 0, 14, 28 i 42, sa 0, 1 mL kompozicijom vakcine B (120 ng N-AcGM3/VSSP). ' ■ ' ! j j |

Grupa 5 životinja je inokulirana subkutanozno, dana 0, 14, 28 i 42, sa 0, 1 mL kompozicijom vakcine A (120 ng N-AcGM3A/SSP).

Miševi u svim grupama su izazivani dana 63 sa 5x10<3>ćelija melanoma MB16F10 subkutanozno (0,2 mL).

Životinje su odvojene od dana 0 i sledeći paramteri su određeni dva puta nedeljno: zapremina tumora, preživljavanje i vreme napredovanja.

Dobijeni su sledeći rezultati:

Zapremina tumora:

Na slici 1, prikazana je kinetika rasta tumora za svaku eksperimentalnu grupu. Mann-Whitney (dvostrani) U test je korišćen da se proceni statistička značajnost u sparenim grupama, vrednosti zapremine tumora pojedinačnih životinja dana 33 posle izazivanja tumora.

Ovaj statistički postupak je naročito pogodan za procenjivanje ove vrste eksperimenata u kojima prirodna raspoređenost podataka je u vezi sa biloškim slučajem. , ,

P vrednost predstavlja verovatnoću u vezi sa praktičnom vrednošću izračunatu iz uzorka i omogućava definisanje bliskosti alfa vrednosti (značajnosti) izračunatu pomoću vrednosti sa grafička i stvarne vrednosti potvrđivanjem nulte hipoteze (p> 0,05)

Rezultati su prikazani na slici 1 i tabeli 1

Iz slike 1 i tabele 1 može se vodeti da miševi grupe 5, vakcinisani subkutanozno sa kompozicijom koja je predmet prikazanog pronalska, pokazuju značajan pad u zapremini tumora u odnosu na druge grupe u eksperimentu i odgovarajuće kontrole.

Preživljavanje

Ovi parametri procenjuju kapacitet vakcinacije za povećanje životnog raspona imuniziranih životinja na tumor koji je smrtonosan kao što je MB16. Ovaj parametar je meren u danima u poređenju sa preživljavanjem kod životinja koje nisu tretirane. Za statističku značajnost korišćen je Long-Rank-ov test.

Dobijene vrednosti su prikazane na Slici 2 i u Tabeli 2. U tabeli 2 fraza 'referentna grupa X' označava grupu koja je poređena sa svakom kolonom.

Ovi rezultati pokazuju da miševi uključeni u grupu 5, SC vakcinisani sa formulacijom koja je predmet prikazanog pronaslka pokazuju najduže preživljavanje posle inokulacije tumora.

Vreme napredovanja ;'j • ! Vreme napredovanja je parametar koji procenjuje period koji je potreban tumoru da bude očigledan kod svake životinje pojedinačno, meren od trenutka inokulacije. U tabeli 3 prikazani su rezultati:

Kod miševa kod kojih se nije razvio tumor u vreme završetka eksperimenta, smatrarjo je da je napredovanje 60 dana.

Uticaj na produženo vreme napredovanja je očigledno veoma poželjan parametar za dobijanje zanačajnih razlike u vakcini protiv kancera i prema rezultatima primećenim u Tabeli 3, životinje grupe 5, SC vakcinisane sa VSSP kompozicijom koja je predmet prikazanog pronaslka, pokazuju bitne pozitivne rezultate.

Regresija tumora

U grupama 4 i 5, koje odgovaraju subkutanoznoj vakcinaciji sa i bez adjuvanata, primećena je životinja sa regresijom tumora. Kod životinje u grupi 4 tumor je meren dana 19 od inokulacije koji praktično nije rastao do dana 35 kada je bio negativan. Miš iz grupe 5 pokazuje prisustvo tumora pipanjem dana 26 od inokulacije, a dana 29 je zabeležen kao negativan.

' ii

• i

Celokupna procena

Rezultati eksperimenata pokazuju da kompozicija vakcine kao predmet ovog pronalaska povećava vreme preživljavanja i vreme napredovanja, a u isto vreme smanjuje brzinu rasta tumora na značajan način u odnosu na kontrolnu grupu koja je tretirana sa PBS.

S druge strane, davanje kompozicije vakcine koja sadrži adjuvant Monta1 nide i ISA 51i; štiti samo kada se daje intramuskularno pokazujući ukupnu neefikasnost kada se daje subkutanozno.

Ukratko, subkutanozna vakcinacija sa kompozicijama vakcine kao predmetom ovog pronalska, pokazuje superiorne rezultate u odnosu na rezultate dobijene na intramuskularni način sa kompozicijama vakcine koje sadrže adjuvant Montanid-nog tipa.

Kratak opis slika.

Slika 1 predstavlja grafik razvijanja zapremine tumora u 5 grupa životinja podvrgnutim različitim tretmanima vakcina i izazivanih na maligni tumor.

Slika 2 predstavlja grafik koji omogućava povećani parametar preživljavanja u 5 grupa eksperimentalnih životinja.

Claims (7)

1. - Ko mpozicije vakcine, naznačene time, što sadrže rastvor ili vodenu disperziju jednog ili više gangliozida obuhvćenih VSSP, sposobnih da stimulišu imuni odgovor subkutanoznim davanjem bez dodatnog imunološkog adjuvanta.

2. - Kompozicija vakcine prema zahtevu 1, naznačena time, što gangliozidi obuhvaćani VSSP su izabrani od N-AcGM3 i N-GcGM3.

3. - Kompozicija vakcine prema zahtevu 2, naznačena time, što gangliozid obuhvaćen VSSP je N-AcGM3.

4. - Kompozicija vakcine prema zahtevu 1, naznačena time, što (kompozicija ne sadrži druge antigene različite od gangliozida.

5. - Kompozicije vakcina prema zahtevima 2 i 4, naznačene time, što sadrže jedinstvene imunološke komponente N-AcGM3A/SSP i/ili N-GcGM3A/SSP.

6. - Kompozicija vakcine prema zahtevu 5, naznačena! time', što sadrži jedino komponetu N-AcGM3A/SSP.

7. - Postupak za lečenje pacijenata koji zahtevaju ponovno podsticanje imunološkog odgovora koji obuhvata subkutanozno davanje kompozicije vakcine opisane u zahtevima 1 do 6. ; . ,