RS20050975A

RS20050975A - Sredstva za specifično vezivanje faktora rasta hepatocita

Info

Publication number: RS20050975A
Application number: YUP-2005/0975A
Authority: RS
Inventors: Teresa Burgess; Larry Green; Ke Zhang; Angela Coxon
Original assignee: Amgen Inc.,; Abgenix Inc.,
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2008-06-05
Also published as: RS53476B; JP2012235783A; US8609090B2; EP1648998A2; HK1087437A1; CN103880955A; AU2004265595A1; WO2005017107A3; IL172906A0; ZA200803050B; KR20060054321A; PL1648998T3; TW201319088A; CA2532027A1; EP1648998A4; PT1648998E; ES2523837T3; EP1648998B1; AR086510A2; JP5105874B2

Abstract

Opisana su sredstva za specifično vezivanje koja interaguju sa faktorom rasta hepatocita (HGF). Opisani su postupci za lečenje kancera upotrebom farmaceutski efikasne količine sredstva za specifično vezivanje HGF. Opisani su postupci za određivanje količine HGF u uzorku korišćenjem sredstava za specifično vezivanje HGF.

Description

SREDSTVAZASPECIFIČNO VEZIVANJE FAKTORA RASTA HEPATOCITA

[001] Predmetna prijava se poziva na U.S. privremenu prijavu br. 60/488,681, podnesenu 18. jula 2003, koja je ovde u potpunosti inkorporirana po referenci.

Oblast pronalaska

[002] Predmetni pronalazak se odnosi na sredstva za specifično vezivanje koja se vezuju za faktor rasta hepatocita (HGF). Takođe su opisani preparati, postupci proizvodnje navedenih preparata i postupci lečenja različitih poremećaja, kao što su različite vrste kancera, uključujući ali ne ograničavajući se na solidne tumore i hematološke maligne promene.

Pozadina pronalaska

[003] Faktor rasta hepatocita (HGF) identifikovan je kao potentan mitogen za hepatocite. HGF je takođe identifikovan kao sekretorni protein fibroblasta i glatkih mišićnih ćelija, koji izaziva mobilnost epitelnih ćelija. U literaturi se HGF naziva još i faktor rasipanja (Scatter Factor, SF).

[004] HGF je multifunkcionalni heterodimerni polipeptid koji uglavnom proizvode ćelije mezenhima. a koji deluje kao ligand za Met receptor tirozin kinazu (Met). Humani Met receptor je poznat i pod imenom "c-met". Pokazano je da signalna transdukcija niz put Met receptor tirozin kinaze - HGF (Met - HGF) dovodi do niza različitih ćelijskih odgovora, koji uključuju, ali nisu ograničeni se na, proliferaciju (mitozu), rasipanje (pokretljivost), stimulaciju ćelijskog kretanja kroz matriks (invaziju), i razgranatu morfogenezu.In v/'vo,Met-IIGF signalni put (Met - HGF) igra ulogu u neuralnoj indukciji, regeneraciji jetre, zarastanju rana, angiogenezi, invaziji, morfološkoj diferencijaciji i normalnom embriološkom razvoju. Uz ove funkcije, Met - HGF par ima ulogu i u nastanku humanih kancera. Pokazano je da je aberantna Met - HGF signalizacija uključena u tumorigenezu, posebno u razvoj invazivnih i metastatičkih fenotipova. Pronađeno je i da određeni patogeni, kao što je malarija, koriste aberantnu Met - HGF signalizaciju. Videti Carrolo et al., Nat Med. 2003 9 (11): 1363 - 9 (12 oktobar 2003), čiji je sadržaj ovde inkorporiran u potpunosti po referenci za bilo koju svrhu da se koristi.

[005] Dalje, neke grupe istraživača tvrde da bi HGF mogao da ima ulogu i u angiogenezi i poremećajima angiogeneze, kao što su proliferativna dijabetska retinopatija ili makulama degeneracija. Videti, npr. Grant, D. S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 90 (5) 1937 - 41 (1993); Bussolino et al., J. Cell. Biol., 119 (3): 629 - 641 (1992); Montesano et al., Cell, 67: 901 - 908 (1991); Canon et al, Br. J. Ophtalmol. 84 (7): 732 - 5 (2000). Moguće je i da HGF igra ulogu u apoptozi, odnosno programiranoj ćelijskoj smrti. Tumori mogu da nastanu i kada regulatorni mehanizmi ne uspeju da održe ravnotežu između proliferacije i apoptoze, te se ćelije nagomilavaju u prevelikom broju. HGF može da utiče i na proliferaciju i na apoptozu, u zavisnosti od biološkog konteksta.

[006] Kako je HGF uključen u mnoge fiziološke procese, u nekim slučajevima je korisno da postoje molekuli koji mogu da regulišu njegovu aktivnost. Na primer, u nekim slučajevima, takvi molekuli mogu da budu korisni u lečenju različitih vrsta kancera.

Suština pronalaska

[007] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani polipeptid koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (complementaritv determining region, CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od CDRla, CDR2a i CDR3a

gde CDRla sadrži aminokiselinsku sekvencu abcdefghijklmnopq, gde

je aminokiselina a izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina i glutamina; aminokiselina b izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i alanina; aminokiselina c je serin; aminokiselina d je glutamin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparaginske kiseline; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina i izoleucina, ili nije prisutna; aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina h je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina i je serin ili nije prisutna; aminokiselina j je serin ili nije prisutna; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i treonina, ili nije prisutna;

aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, izoleucina i valina; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina, asparagina i asparaginske kiseline; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i serina; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, triptofana i asparagina; aminokiselina p je leucin; a aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina, glicina i asparagina;

gde CDPv2a sadrži aminokiselinsku sekvencu r s t u v w x, gde je aminokiselina r izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, alanina, valina, glutaminske kiseline i glicina; aminokiselina s je alanin, aminokiselina t je serin, aminokiselina uje izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina i alanina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, asparagina i treonina;

gde CDR3a sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e' f g' h', gde je aminokiselina

y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i leucina; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparagina i arginina; aminokiselina a' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina. histidina, alanina i serina; aminokiselina b' je izabrana iz grupe koja se«sastoji od fenilalanina, tirozina, asparaginske kiseline, asparagina i izoleucina; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparagina; aminokiselina d' je izabrana iz grupe koja se sastoji od probna, tirozina, treonina, fenilalanina, asparaginske kiseline, leucina i triptofana; aminokiselina e'je prolin; aminokiselina f je prolin ili nije prisutna; aminokiselina g'

je triptofan, leucin. prolin, tirozin ili izoleucin; a aminokiselina h'je treonin ili asparagin; a

gde je polipeptid, vezan za teški lanac antitela, u stanju da veže faktor rasta hepatocita

(HGF).

[008] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani polipeptid koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) koji je izabran iz grupe koja se sastoji od CDRlb. CDR2b i CDR3b, gde CDRlb sadrži aminokiselinsku sekvencu a b c d e f g, gde je aminokiselina a serin ili nije prisutna; aminokiselina b je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina c je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline, glicina, serina, valina, treonina i izoleucina; aminokiselina d je tirozin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i glicina; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, metionina i triptofana; a aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od histidina, asparagina i serina; gde CDR2b sadrži aminokiseinsku sekvencu h i j k 1 m n o p q r s t u v w x, gde je aminokiselina h izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, tirozina, valina, asparagina i glutaminske kiseline; aminokiselina i je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, fenilalanina i valina; aminokiselina j je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina, triptofana i tirozina; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, serina, tirozina i histidina; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i glicina; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, treonina, asparagniske kiseline, serina, izoleucina i asparagina; aminokiselina p jc izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, izoleucina i lizina; aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i tirozina; aminokiselina r je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i histidina; aminokiselina s je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina i asparagina; aminokiselina t je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparaginske kiseline i prolina; aminokiselina u je izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina i serina; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina, valina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i lizina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina; gde CDR3b sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e' f g' h' i' j' k' 1' m' n<1>o' p' q' r', gde je aminokiselina y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, serina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, histidina, prolina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina a' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, tirozina i leucina, ili nije prisutna; aminokiselina b'je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, asparagina, glicina, histidina, tirozina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina c<1>je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina, serina, glutaminske kiseline, tirozina, glicina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina d' je glicin ili nije prisutna; aminokiselina e' je izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina f je asparaginska kiselina, ili nije prisutna; aminokiselina g' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i arginina, ili nije prisutna; aminokiselina h' je serin ili nije prisutna; aminokiselina i' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina j'je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina k' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, fenilalanina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina 1' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, histidina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina m' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glicina, asparaginske kiseline, prolina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina n' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, valina, tirozina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina o' je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, alanina, glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina p' je izabrana iz grupe koja se sastoji od metionina, fenilalanina i tirozina; aminokiselina q' je asparaginska kiselina, a aminokiselina r' je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina, tirozina, izoleucina i prolina; a

gde je polipeptid, vezan za laki lanac antitela, u stanju da veže HGF.

[009] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano sredstvo za specifično vezivanje, gde to sredstvo za specifično vezivanje sadrži: (i) prvi polipeptid koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od CDRla, CDR2a i CDR3a,

gde CDRla sadrži aminokiselinsku sekvencu abcdefghijklmnopq, gde je aminokiselina a izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina i glutamina; aminokiselina b izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i alanina; aminokiselina c je seri::; aminokiselina d je glutamin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparaginske kiseline; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina i izoleucina, ili nije prisutna; aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina h je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina i tirozina, Hi nije prisutna; aminokiselina i je serin ili nije prisutna; aminokiselina j je serin ili nije prisutna; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i treonina, ili nije prisutna; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, izoleucina i valina; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina, asparagina i asparaginske kiseline; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i serina; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, triptofana i asparagina; aminokiselina p je leucin; a aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina, glicina i asparagina;

gde CDR2a sadrži aminokiselinsku sekvencu r s t u v w x, gde je aminokiselina r izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, alanina, valina, glutaminske kiseline i glicina; aminokiselina s je alanin, aminokiselina t je serin, aminokiselina uje izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina i alanina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, asparagina i treonina;

gde CDPoa sadrži aminokiselinsku sekvencu yza'b' c' d' e' f g' I<V>, gde je aminokiselina

y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i leucina; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparagina i arginina; aminokiselina a' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, histidina, alanina i serina; aminokiselina b' je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina, tirozina, asparaginske kiseline, asparagina i izoleucina; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparagina; aminokiselina d' je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, tirozina, treonina, fenilalanina, asparaginske kiseline, leucina i triptofana; aminokiselina e' je prolin; aminokiselina f je prolin ili nije prisutna; aminokiselina g'

je triptofan, leucin, prolin, tirozin ili izoleucin; a aminokiselina h' je treonin ili asparagin; a

gde je prvi polipeptid, vezan za teški lanac antitela, u stanju da veže faktor rasta hepatocita (HGF), i (ii) drugi polipeptid, koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od CDRlb, CDR2b i CDR3b,

gde CDRlb sadrži aminokiselinsku sekvencu a b c d e f g, gde je aminokiselina a serin ili nije prisutna; aminokiselina b je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina c je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline, glicina, serina, valina, treonina i izoleucina; aminokiselina d je tirozin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i glicina; aminokiselina f jc izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, metionina i triptofana; a aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od histidina, asparagina i serina;

gde CDR2b sadrži aminokiseinsku sekvencu h i j k 1 m n o p q r s t u v w x, gde je aminokiselina h izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, tirozina, valina, asparagina i glutaminske kiseline; aminokiselina i je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, fenilalanina i valina; aminokiselina j je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina, triptofana i tirozina; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, serina, tirozina i histidina; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i glicina; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, treonina, asparaginske kiseline, serina, izoleucina i asparagina; aminokiselina p je izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, izoleucina i lizina; aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i tirozina; aminokiselina r je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i histidina; aminokiselina s je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina i asparagina; aminokiselina t je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparaginske kiseline i prolina; aminokiselina u je izabrana iz grupe koja

se sastoji od lizina i serina; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina, valina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i lizina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina;

gde CDR3b sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e' f g' h' i' j' k' 1' m' n' o' p' q' r', gde je aminokiselina y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, serina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, histidina, prolina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina a' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, tirozina i leucina, ili nije prisutna; aminokiselina b'je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, asparagina, glicina, histidina, tirozina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina, serina, glutaminske kiseline, tirozina, glicina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina d' je glicin ili nije prisutna; aminokiselina e' je izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina f je asparaginska kiselina, ili nije prisutna; aminokiselina g' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i arginina, ili nije prisutna; aminokiselina h' je serin ili nije prisutna; aminokiselina i' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina j' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina k<1>je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, fenilalanina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina 1' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, histidina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina m' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glicina, asparaginske kiseline, prolina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina n' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, valina, tirozina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina o' je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, alanina, glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina p' je izabrana iz grupe koja se sastoji od metionina, fenilalanina i tirozina; aminokiselina q' je asparaginska kiselina, a aminokiselina r' je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina, tirozina, izoleucina i prolina; a

gde je drugi polipeptid, vezan za laki lanac antitela, u stanju da veže HGF.

[010] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani polipeptid koji sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24, 26. 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 i 42.

[011] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani polipeptid koji sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25, 27. 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 i 43.

[012] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži bar jednu nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 i 19.

[013] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži bar jednu nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20.

[014] U nekim predmetnim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od CDRla, CDR2a i CDR3a gde CDRla sadrži aminokiselinsku sekvencu abcdefghijklmnopq, gde je aminokiselina a izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina i glutamina; aminokiselina b izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i alanina; aminokiselina c je serin; aminokiselina d je glutamin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparaginske kiseline; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina i izoleucina, ili nije prisutna; aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina h je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina i je serin ili nije prisutna; aminokiselina j je serin ili nije prisutna; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i treonina, ili nije prisutna; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, izoleucina i valina; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina, asparagina i asparaginske kiseline; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i serina: aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, triptofana i asparagina; aminokiselina p je leucin; a aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina, glicina i asparagina; gde CDR2a sadrži aminokiselinsku sekvencu r s t u v w x, gde je aminokiselina r izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, alanina, valina, glutaminske kiseline i glicina; aminokiselina s je alanin, aminokiselina t je serin, aminokiselina u je izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina. serina i asparaginske kiseline; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina i alanina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, asparagina i treonina;

gde CDR3a sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e<1>f g' h\ gde je aminokiselina

y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i leucina; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparagina i arginina; aminokiselina a' je izabrana iz grupe koja se

sastoji od tirozina, histidina, alanina i serina; aminokiselina b'je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina, tirozina, asparaginske kiseline, asparagina i izoleucina; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparagina; aminokiselina d' je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, tirozina, treonina, fenilalanina, asparaginske kiseline, leucina i triptofana; aminokiselina e'je prolin; aminokiselina f je prolin ili nije prisutna; aminokiselina g'

je triptofan, leucin, prolin, tirozin ili izoleucin; a aminokiselina h'je treonin ili asparagin; a

(HGF).

[015] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od CDRlb, CDR2b i CDR3b gde CDRlb sadrži aminokiselinsku sekvencu a b c d e f g, gde je aminokiselina a serin ili nije prisutna; aminokiselina b je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina c je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline, glicina, serina, valina, treonina i izoleucina; aminokiselina d je tirozin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i glicina; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, metionina i triptofana; a aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od histidina, asparagina i serina; gde CDR2b sadrži aminokiseinsku sekvencu h i j k 1 m n o p q r s t u v w x, gde je aminokiselina h izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana. tirozina, valina, asparagina i glutaminske kiseline; aminokiselina i je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, fenilalanina i valina; aminokiselina j je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina, triptofana i tirozina; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, serina, tirozina i histidina; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i glicina; aminokiselina n jc izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, treonina, asparaginske kiseline, serina, izoleucina i asparagina; aminokiselina p je izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, izoleucina i lizina; aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i tirozina; aminokiselina r je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i histidina; aminokiselina s je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina i asparagina; aminokiselina t je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparaginske kiseline i prolina; aminokiselina uje izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina i serina; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina, valina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i lizina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina; gde CDR3b sadrži aminokiselinsku sekvencu yza'b' c' d' e' f g' h' i' j' k' 1' m' n' o' p' q' r', gde je aminokiselina y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, serina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, histidina, prolina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina a'je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, tirozina i leucina, ili nije prisutna; aminokiselina b' je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, asparagina, glicina, histidina, tirozina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina. serina, glutaminske kiseline, tirozina, glicina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina d' je glicin ili nije prisutna; aminokiselina e' je izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina f je asparaginska kiselina, ili nije prisutna; aminokiselina g' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i arginina, ili nije prisutna; aminokiselina h' je serin ili nije prisutna; aminokiselina i' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina j' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina k' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, fenilalanina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina 1'je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, histidina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina m' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glicina, asparaginske kiseline, prolina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina n' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, valina, tirozina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina o' je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, alanina, glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina p' je izabrana iz grupe koja se sastoji od metionina, fenilalanina i tirozina; aminokiselina q'je asparaginska kiselina, a aminokiselina r'je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina, tirozina, izoleucina i prolina; a

gde je polipeptid, vezan za laki lanac antitela, u stanju da veže HGF.

[016] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu ćelijsku liniju koja proizvodi antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1,2.4.4,2.12.1,2.40.1 i 3.10.1.

[017] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak inhibicije vezivanja HGF za Met koji podrazumeva primenu sredstva za specifično vezivanje HGF.

[018] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

[019] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji se suštinski sastoji od bar jedne aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

[020] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje sredstvo za specifično vezivanje koje je u stanju da veže bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

[021] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili antigen vezujući domen koji je u stanju da veže bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

[022] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja antitela koje je u stanju da veže faktor rasta hepatocita (HGF), koji obuhvata primenu bar jednog polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165 kod životinje i dobijanje antitela koje je u stanju da veže HGF iz te životinje.

[023] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjivanje ili sprečavanje vezivanja sedstva za specifično vezivanje za faktor rasta hepatocita (HGF), koji obuhvata primenu polipeptida koji sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

[024] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjivanje ili sprečavanje vezivanja specifičnog sredstva za vezivanje za faktor rasta hepatocita (HGF), koji obuhvata primenu polipeptida koji se sastoji od bar jedne aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

[025] Druga rešenja predmetnog pronalaska biće jasno vidljiva iz opisa koji je ovde dat.

Kratak opis slika

[026] Slika 1A predstavlja grafički prikaz kapa lakih lanaca određenih antitela na HGF

uz prikaz odnosa njihovih matičnih linija. Identifikacije gena matičnih linija date su sa desne strane oznake antitela. Slika 1 B pokazuje poravnate aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona kapa lakih lanaca određenih antitela na HGF. Identifikacije gena matičnih linija date su sa leve strane. CDR regioni su prikazani kao debele linije iznad poravnatih sekvenci.

[027] Slika 2A prikazuje predstavlja grafički prikaz gama teških lanaca određenih antitela na HGF uz prikaz odnosa njihovih matičnih linija. Identifikacije gena matičnih linija date su sa desne strane oznake antitela. Slika 2 B pokazuje poravnate aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona gama teških lanaca određenih antitela na HGF. Identifikacije gena matičnih linija date su sa leve strane. CDR regioni su prikazani kao debele linije iznad poravnatih sekvenci.

[028] Slika 3 prikazuje DNK sekvence koje kodiraju varijabilne regione iz lakih i teških lanaca određenih antitela na HGF. Ime antitela, oznaka matične linije i ID broj sekvence naznačeni su za svaku sekvencu. Sekvenca za prirodni signalni peptid je podvučena. Takođe su prikazane i DNK sekvence konstantnih regiona humanih kapa, IgGl i IgG2 molekula.

[029] Slika 4 prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakih i teških lanaca određenih antitela na HGF. Ime antitela, oznaka matične linije i ID broj sekvence naznačeni su za svaki sekvencu. Sekvenca za prirodni signalni peptid je podvučena. Takođe su prikazane i aminokiselinske sekvence konstantnih regiona humanih kapa, IgGl i IgG2 molekula.

[030] Slika 5 prikazuje aminokiselinske sekvence regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) lakih i teških lanaca određenih antitela na HGF. Ime antitela, oznaka matične linije i ID broj sekvence naznačeni su za svaki sekvencu. Slika 5 A prikazuje aminokiselinske sekvence CDR lakih lanaca određenih antitela na HGF. Slika 5 B prikazuje aminokiselinske sekvence CDR teških lanaca određenih antitela na HGF.

[031] Slika 6 prikazuje rezultate određivanja KDodređenih antitela na HGF, koji sc razmatraju u primeru 8. Slika 6 A prikazuje podatke dobijene kinetičkim postupkom. Slika 6 B prikazuje podatke dobijene u postupku ravnoteže/rastvora.

[032] Slika 7 prikazuje autoradiograme Western blotova, kojima je ispitivana sposobnost vezivanja određenih antitela za humani HGF i mišji HGF, što se razmatra u primeru 8. Ploče na levoj strani (trake 1 - 4) prikazuju autoradiograme dobijene u eksperimentima izvođenim pod neredukcionim uslovima. Ploče na desnoj strani (trake 5-8) prikazuju autoradiograme dobijene u eksperimentima izvođenim pod redukcionim uslovima.

[033] Slika 8 prikazuje podatke dobijene FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) postupkom u eksperimentima razmatranim u primeru 8, kojima je ispitivano vezivanje određenih antitela za određene ciljne molekule. Na vrhu slike 8 prikazani su FACS podaci kontrolnih uzoraka koji ne sadrže sredstvo za specifično vezivanje. Ploče 1 i 2 (s leva) prikazuju podatke kontrolnih uzoraka koji ne sadrže ciljne molekule inkubirane sa FITC i PE, respektivno. Ploče 3 i 4 prikazuju podatke kontrolnih uzoraka koji sadrže, respektivno, FITC i PE obeležene d5 HGF, ali ne sadrže specifično sredstvo za vezivanje. Ploče ispod pune linije prikazuju FACS podatke dobijene u eksperimentima u kojima je ispitivano pet antitela na HGF. Za svako antitelo, u prvoj ploči (s leva) prikazani su podaci kontrolnih uzoraka koji ne sadrže ciljane molekule, dok su u drugoj, trećoj i četvroj ploči prikazani podaci dobijeni u eksperimentima u kojima su ciljni molekuli bili, respektivno, humani HGF, mišji HGF i humani d5 HGF.

[034] Slika 9 A je šematski prikaz plazmida koji kodira avidin koji se nastavlja na višestruko mesto za kloniranje, korišćenog za dobijanje fuzionih proteina koji sadrže avidin i ciljni protein, kao što je razmatrano u primeru 8. Slika 9 B prikazuje sekvencu kokošjeg avidina.

[035] Slike 10 A i 10 B su šematski prikazi određenih fuzionih proteina i rezultata testova vezivanja u kojima se ti proteini koriste, što se razmatra u primerima 8 C i 8 D. Slika 10 C je šematski prikaz određenih fuzionih proteina koji nose tačkaste mutacije, insercije ili delecije. Slika 10 D prikazuje aminokiselinske sekvence humanog i mišjeg HGF u regionu aminokiselina 451 - 731 (sekvenca čiji je ID broj 120 i 121, respektivno), gde je naznačena odgovarajuća koncenzus sekvenca (sekvenca čiji je ID broj 122).

[036] Slike 11 A i 11 B prikazuju HPLC analize iz eksperimenata zaštite humanog HGF od proteaza, koji su opisani u primeru 8 E. Slika 11 C prikazuje aminokiselinske sekvence peptida zaštićenih od proteolitičke digestije vezivanjem za antitelo 2.12.1 u tom eksperimentu.

[037] Slike 12 A - 12 D prikazuju rezultate testova kompetitivnog vezivanja koji su razmatrani u primeru 8.

[038] Slika 13 prikazuje podatke o IC50 dobijene iz testova neutralizacije koji su razmatrani u primeru 9.

[039] Slika 14 prikazuje podatke dobijene u testovima neutralizacije u PC3 ćelijama, koji su razmatrani u primeru 10.

[040] Slika 15 prikazuje podatke dobijene u testovima inhibicije u U-87 ćelijama, koji su razmatrani u primeru 10.

[041] Slika 16 prikazuje rezultate eksperimenata razmatranih u primeru 11, u kojima je procenjivan uticaj određenih antitela na HGF na U-87 MG ksenograftne tumore u miševima. Slika 16 A prikazuje podatke o uticaju povećanja doze antitela 2.4.4 na rast U-87 MG ksenograftnih tumora u modelu minimalne preostale bolesti. Slika 16 B prikazuje podatke o uticaju povećanja doze antitela 2.4.4 na rast U-87 ksenograftnih tumora u modelu razvijene bolesti. Slike 16 C, 16 D, 16 E i 16 F prikazuju podatke dobijene u uporednim eksperimentima testiranja antitela na HGF u modelu minimalne preostale bolesti u U-87 (16 C i 16 D) i modelu razvijene bolesti u U-87 (16 E i 16 F).

Detaljanopispronalaska

[042] Treba imati u vidu da su i prethodni kratki opis predmetnog pronalaska, kao i detaljni opis koji sledi dati samo kao primer i objašnjenje i da ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska koji je definisan pridodatim patentnim zahtevima. U predmetnom pronalasku, pojmovi u jednini odnose se i na pojmove u množini, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. U predmetnom pronalasku, pod pojmom "ili" podrazumeva se "i / ili" osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Dalje, upotreba reči "uključujući", kao i njenih varijacija kao što su "uključuje" i "uključen", nije ograničavajuća. Takođe, pojmovi kao što su "element" ili "sastojak" podrazumcvaju elemente i sastojke koji sadrže samo jednu jedinicu, kao i elemente i sastojke koji sadrže više od jedne podjedinice, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Takođe, pod pojmom "delić" ili "deo" podrazumeva se kako deo neke celine, tako i potpuna celina.

[043] Naslovi odeljaka koji se koriste u predmetnom pronalasku služe samo u organizacione svrhe i ne srne se smatrati da na bilo koji način ograničavaju predmetnu materiju. Svi dokumenti, ili delovi dokumenata, koji su citirani u predmetnom pronalasku, uključujući ali

se ne ograničavajući na patente, patentne zahteve, članke, knjige i radove, u predrhentom pronalasku su inkorporirani u potpunosti po referenci u bilo koje svrhe.

Definicije

[044] Standardne tehnike mogu da se koriste za postupke rekombinantne DNK, sintezu oligonukleotida, kao i za dobijanje i transformaciju kultura tkiva (npr. elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu da se izvode prema specifikacijama proizvođača, prema uobičajenim postupcima poznatim u oblasti na koju se predmetni pronalazak odnosi, ili na način koji je opisan u predmetnom pronalasku. Navedene tehnike i procedure mogu da se izvode prema uobičajenim postupcima dobro poznatim stručnjacima u oblasti na koju se predmetni pronalazak odnosi, kao i na način koji je opisan u različitim opštim ili specifičnim referenciranim dokumentima koji su citirani i razmatrani u predmetnom pronalasku. Videti, npr. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)), koji je ovde inkorporiran u potpunosti po referenci u bilo koje svrhe da se koriste. Osim ukoliko su date specifične definicije, nomenklatura korišćena za pojmove iz, kao i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hernije, sintetske organske hernije, kao i medicinske i farmaceutske hernije koje su opisane u predmetnom pronalasku su one koje su dobro poznate i u uobičajenoj upotrebi u oblasti na koju se predmetni pronalazak odnosi. Za hemijsku sintezu, hemijsku analizu, farmaceutsku pripremu, formulaciju i dopremanje, kao i za lečenje pacijenata, mogu da se koriste standardne tehnike.

[045] U skladu sa već iznetim napomenama, a ukoliko nije drugačije naznačeno, smatraće se da sledeći pojmovi imaju sledeća značenja:

[046] Pod pojmom "faktor rasta hepatocita" ili "HGF" podrazumeva se polipeptid kakav je opisan u Nakamura et al., Nature 342: 440 - 443 (1989) ili njegovi fragmenti, kao i slični polipeptidi, koji uključuju ali nisu ograničeni na alelske varijante, varijante isecanja (splajsinga), varijante derivatizacije, supstitucione varijante, i/ili insercione varijante, fuzione polipeptide, i homologe različitih bioloških vrsta. U nekim rešenjima, HGF polipeptid sadrži i terminalne ostatke kao što su, bez ograničenja, ostaci vodeće ("leader") sekvence, ostaci za ciljanje, metioninski ostanci na amino kraju, lizinski ostaci, ostaci za obeležavanje ("tag") i/ili-ostaci fuzionisanih proteina.

[047] Pod pojmom "sredstvo za specifično vezivanje" podrazumeva se prirodan ili sintetski molekul koji se specifično vezuje za ciljani molekul. Primeri sredstava za specifično vezivanje uključuju, ali nisu ograničeni na proteine, peptide, nukleinske kiseline, ugljene hidrate, lipide i niskomolekulska jedinjenja. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje je antitelo. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje jc antigen vezujući region.

[048] Pod pojmom "sredstvo za specifično vezivanje HGF" podrazumeva se sredstvo za specifično vezivanje koje se specifično vezuje za bilo koji deo HGF. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF je antitelo na HGF. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje je antigen vezujući region.

[049] Pod pojmom "poliklonsko antitelo" podrazumeva se heterogena smeša antitela koja vezuju različite epitope istog antigena.

[050] Pod pojmom "monoklonska antitela" podrazumeva se skup antitela koja kodira isti molekul nukleinske kiseline. U nekim rešenjima, monoklonska antitela proizvodi jedinstveni hibridom ili neka druga ćelijska linija, ili neka transgena životinja. Monoklonska antitela tipično prepoznaju isti epitop. Pojam "monoklonska" nije ograničen ni na jedan način dobijanja antitela.

[051] Pod pojmom "himerno antitelo" podrazumeva se antitelo kod kojeg je deo antitela homologan sekvenci određene vrste ili određene klase antitela, dok je njegov drugi deo homologan sekvenci druge vrste ili klase antitela. Videti, npr. U.S. Patent br. 4,816,567 i Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 6851 - 6855 (1985).

[052] Pod pojmom "antitelo sa presađenim CDR" podrazumeva se antitelo kod kojeg je CDR jednog antitela ubačen u okvir drugog antitela. U nekim rešenjima, antitelo iz kojeg je dobijen CDR i antitelo iz kojeg je dobijen okvir pripadaju različitim vrstama. U nekim rešenjima, antitelo iz kojeg je dobijen CDR i antitelo iz kojeg je dobijen okvir pripadaju različitim izotipovima.

[053] Pod pojmom "multi - specifično antitelo" podrazumeva se antitelo čija se dva ili više varijabilnih regiona vezuju za različite epitope. Epitopi mogu da budu na istim ili različitim ciljnim molekulima. U nekim rešenjima, multi - specifično antitelo je "bi - specifično antitelo" koje prepoznaje dva razločita epitopa na istim ili različitim antigenima.

[054] Pod pojmom "katalitičko antitelo" podrazumeva se antitelo za koje je vezan jedan

ili više katalitičkih ostataka. U nekim rešenjima, katalitičko antitelo je citotoksično antitelo, koje sadrži citotoksični ostatak.

[055] Pod pojmom "humanizovano antitelo" podrazumeva se antitelo čiji deo okvira ili ceo okvir potiču od čoveka, ali ceo ili deo jednog ili više CDR potiču od neke druge vrste, npr.

od miša.

[056] Pod pojmom "potpuno humano antitelo" podrazumeva se antitelo čiji i CDR i okvir sadrže sekvence humanih antitela. U nekim rešenjima, potpuno humana antitela proizvode se u drugim sisarima, uključujući ali se ne ograničavajući na, miševe, pacove i zečeve. U nekim rešenjima, potpuno humana antitela nastaju u ćelijama hibridoma. U nekim rešenjima, potpuno humana antitela se proizvode rekombinantnim postupcima.

[057] Pod pojmom "anti - idiotipsko antitelo" podrazumeva se antitelo koje specifično vezuje drugo antitelo.

[058] Pod pojmom "specifično vezuje" podrazumeva se sposobnost sredstva za specifično vezivanje da veže ciljni molekul - metu sa većim afinitetom nego neki molekul koji nije njegova meta. U nekim rešenjima, specifično vezivanje podrazumeva vezivanje za ciljni molekul sa afinitetom koji je bar 10, 50, 100, 250, 500 ili 1000 .puta veći od afiniteta za molekul koji nije meta. U nekim rešenjima, afinitet se određuje afinitetnim ELISA testom. U nekim rešenjima, afinitet se određuje BIAcore testom. U nekim rešenjima, afinitet se određuje kinetičkim postupcima. U nekim rešenjima, afinitet se određuje postupcima ravnoteže/rastvora.

[059] Pod pojmom "epitop" podrazumeva se deo molekula koji može da se veže za sredstvo za specifično vezivanje. U nekim rešenjima, epitopi obično sadrže hemijski aktivne grupe na površini molekula, kao što su, na primer, aminokiseline ili bočni lanci ugljenih hidrata, koje imaju i specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike kao i specifično raspoređeno naelektrisanje. Epitopi mogu biti kontinualni i nekontinualni. U nekim rešenjima, epitopi mogu da budu imitatorski (mimetički), na taj način što sadrže trodimenzionalnu strukturu koja je slična onoj na epitopu koji je korišćen za dobijanje antitela, a da ne sadrže ni jedan ili da sadrže samo deo aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u epitopu koji je korišćen za dobijanje antitela.

[060] Pod pojmom "inhibirajući i/ili neutrališući epitop" podrazumeva se epitop koji svojim vezivanjem za sredstvo za specifično vezivanje dovodi do smanjenja biološke aktivnostiin vivo, in vitroi/iliin situ.U nekim rešenjima, neutrališući epitop se nalazi na biološki aktivnom regionu na ciljnom molekulu ili je sa njim spregnut.

[061] Pod pojmom "aktivirajući epitop" podrazumeva se epitop koji svojim vezivanjem

za sredstvo za specifično vezivanje dovodi do aktivacije ili održanja biološke aktivnostiin vivo,

in vitroi/iliin situ.U nekim rešenjima, aktivirajući epitop nalazi se na biološki aktivnom regionu ciljnog molekula, ili je za njega vezan.

[062] Pod pojmom "izolovani polinukleotid" u predmetnom pronalasku se podrazumeva polinukleotid genomskog, cDNK ili sintetskog porekla ili porekla koje je kombinacija navedenih, gde, po svom poreklu, "izolovani polinukleotid" (1) nije vezan sa celim ili'delom polinukleotida u kojem se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi, (2) je vezan sa polinukleotidom sa kojim u prirodi nije vezan, ili (3) se ne pojavljuje u prirodi kao deo veće sekvence.

[063] Pod pojmom "izolovani protein" u predmetnom pronalasku podrazumeva se protein koji kodira cDNK, rekombinantna RNK ili je sintetskog porekla, ili neka kombinacija navedenih, koji (1) je oslobođen prisustva bar nekih proteina sa kojima se u prirodi nalazi, (2) je suštinski oslobođen prisustva drugih proteina iz istog izvora t.j. iz iste vrste, (3) je eksprimiran u ćeliji različite vrs:e ili (4) se ne nalazi u prirodi.

[064] Pojam "polipeptid" u predmetnom pronalasku koristi se kao opšti pojam da bi se opisali nativni proteini, ili modifikacije takvih proteina koje sadrže delecije, adicije i/ili supstitucije jednog ili više aminokiselinskih ostataka nativne sekvence. U nekim rešenjima, polipeptidi imaju delecije, adicije i/ili supstitucije bar jednog ali ne više od 50, 30, 20, 15, 10, 8,

5 ili 3 aminokiselinska ostatka nativne sekvence.

[065] U predmetnom pronalasku, kada se govori o objektu, pod pojmom "koji se pojavljuje u prirodi" podrazumeva se da se taj objekat može naći u prirodi. Na primer, za polipeptidnu ili polinukleotidnu sekvencu koja je prisutna u nekom organizmu (uključujući viruse) koji može da se izoluje iz prirodnog izvora a koji čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji ili na neki drugi način kaže se da se pojavljuje u prirodi.

[066] Pojam "operativno vezane" u predmetnom pronalasku odnosi se na komponente koje su u takvom odnosu da mogu da funkcionišu svaka na svoj predviđen način. Na primer, kontrolna sekvenca je "operativno vezana" sa kodirajućom sekvencom ako je vezana za-nju na takav način da se ekspresija kodiraj uče sekvence odvija pod uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnom sekvencom.

[067] Pod pojmom "kontrolna sekvenca" u predmetnom pronalasku podrazumeva se polinukleotidna sekvenca koja može da utiče na ekspresiju i obradu kodiraj uče sekvence za koju je vezana. Priroda takvih kontrolnih sekvenci može da bude različita u zavisnosti od organizma domaćina. Prema nekim rešenjima, kontrolne sekvence kod prokariota mogu da sadrže promoter, mesto za vezivanje ribozoma i sekvencu za terminaciju transkripcije. Prema nekim rešenjima, kontrolne sekvence kod eukariota mogu da sadrže promotere, jedan ili više pojačivača i sekvencu za terminaciju transkripcije. U nekim rešenjima, "kontrolna sekvenca" može da sadrži i vodeće sekvence i/ili fuzione partnerske sekvence.

[068] Pod pojmom "polinukleotid" u predmetnom pronalasku podrazumeva se polimerni oblik nukleotida koji je dugačak najmanje 10 baza. U nekim rešenjima, baze mogu da budu ribonukleotidi ili dezoksiribonukleotidi, ili modifikovani oblici bilo koje od ove dve vrste nukleotida. Pojam podrazumeva i jednolančane i dvolančane oblike DNK.

[069] Pod pojmom "oligonukleotid" u predmetnom pronalasku podrazumevaju se nukleotidi koji se pojavljuju u prirodi kao i modifikovani nukleotidi povezani oligonukleotidnim vezama koje se pojavljuju u prirodi i/ili oligonukleotidnim vezama koje se ne pojavljuju u prirodi. Oligonukleotidi su podjedinice polinukleotida koje se, uopšteno gledano, sastoje od najviše 200 baza. U nekim rešenjima, oligonukleotidi su dugački od 10 do 60 baza. U nekim rešenjima, oligonukleotidi su dugački 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 baza.Oligonukleotidi mogu da budu jednolančani i dvolančani, npr. za upotrebu pri stvaranju genskog mutanta. Oligonukleotidi mogu da budu "sens" (kodirajući) ili "antisens"

(komplementarni) nukleotidi.

[070] Pod pojmom "nukleotidi koji se pojavljuju u prirodi" u predmetnom pronalasku podrazumevaju se ribonukleotidi i dezoksiribonukleotidi. Pod pojmom "modifikovani nukleotidi" podrazumevaju se nukleotidi sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama ili slični. Pod pojmom "oligonukleotidne veze" podrazumevaju se veze kao što su fosforotioati, fosforoditioati, fosforoselenoati, fosforodiselenoati, fosforoanilotioati, fosforaniladati, fosforoamidati i slične. Videti, npr. LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1968); Stec et al. J. Am.Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al. Anti - Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87 - 108 (F. Eckstein, urednik, Oxford Universitv Press, Oxford, Engleska (1991)): Stec et al. U.S. Pat. br. 5,151,510; Uhlmann & Pevman Chemical Revievvs 90: 543 (1990); sadržaj iznet u ovim dokumentima je ovde inkorporiran u potpunosti po referenci za bilo koju svrhu da se koristi. U nekim rešenjima, oligonukleotid može da sadrži i obeleživač za detekciju.

[071] Stepen identičnosti i sličnost srodnih polipeptida mogu lako da se izračunaju poznatim postupcima. Ovi postupci obuhvataju, bez ograničenja, one koji su opisani u Computational Molecular Biologv, Lesk A. M. urednik, Oxford Universitv Press, Nevv York

(1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. \V. urednik, Academic Press, Nevv York (1993); Computer Analvsis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M. & Griffin,

H. G., urednici, Humana Press, New Jersev (1994); Sequence Analvsis in Molecular Biologv, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analvsis Primer, Gribskov, M. & Devereux,

J., urednici, M. Stockton Press, Nevv York (1991); i Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988).

[072] Određeni postupci za određivanje stepena identičnosti osmišljeni su tako da daju podatke o najvećem poklapanju testiranih sekvenci. Postupci za određivanje identičnosti opisani su u računarskim programima dostupnim javnosti. Postupci za utvrđivanje identičnosti koji koriste računarske programe obuhvataju, bez ograničenja: GCG programski paket, uključujući GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12: 387 (1984)); Genetics Computer Group, Universitv of Winsconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul ct al., J. Mol. Biol., 215: 403 - 410 (1990)). BLASTX program je dostupan javnosti preko National Center for Biotechnologv Information (NCBI) i iz drugih izvora( BLAST Manucil,Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al.,supra(1990)). Dobro poznati Smith Waterman algoritam takođe može da se koristi za određivanje identičnosti.

[073] Određene šeme za poravnavanje dve aminokiselinske sekvence mogu da dovedu

do preklapanja samo manjeg regiona dve sekvence, a ovaj mali podudarni deo može da ima veoma visok stepen identičnosti sekvence, čak i ako ne postoji značajna sličnost tc dve sekvence u njihovoj punoj dužini. Shodno tome, u nekim rešenjima, izabrani postupak određivanja podudarnosti (GAP program) daće kao rezultat podudarnost koja se proteže na bar 50 uzastopnih aminokiselinskih ostataka ciljnog polipeptida.

[074] Na primer, korišćenjem računarskog algoritma GAP (Genetics Computer Group, Universitv of Wisconsin, Madison, WI), dva polipeptida za koja se utvrđuje procenat identičnosti sekvence se poravnavaju da bi se dobilo optimalno preklapanje njihovih aminokiselinskih sekvenci ("segment podudarne sekvence" koji utvrđuje algoritam). U nekim rešenjima, uz algoritam se koriste i penalizacija za otvaranje praznina (koja se izračunava kao 3 x prosečna dijagonala; "prosečna dijagonala" je prosečna vrednost dijagonale upotrebljenog matriksa za poređenje; "dijagonala" je vrednost ili broj koji dati matriks za poređenje dodeljuje svakoj savršeno preklopljenoj aminokiselini), penalizacija za nastavak praznine (koja je obično 1/10 penalizacije za otvaranje praznine), kao i malrkis za poređenje kao što je PAM 250 ili BLOSUM 62. U nekim rešenjima, algoritam koristi i standardni matrkis za poređenje (videti Davhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 (3) (1978), za PAM 250 matriks za poređenje; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 : 10915 - 10919 (1992) za BLOSUM 62 matriks

za poređenje).

[075] U nekim rešenjima, parametri poređenja polipeptidne sekvence uključuju sledeće podatke: Algoritam: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48 : 443 - 453 (1970); Matriks za poređenje: BLOSUM 62, Henikoff et al., gore navedeno (1992);

Penalizacija za otvaranje praznine: 12

Penalizacija za dužinu praznine: 4

Prag sličnosti: 0

[076] GAP program može da bude koristan uz upotrebu gore navedenih parametara. U nekim rešenjima, gore navedeni parametri su standardni parametri za poređenje polipeptida (bez penalizacije za praznine na kraju) pri korišćenju GAP algoritma.

[077] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni region čija je sekvenca bar 90% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 i 43. U nekim rešenjima. sredstvo za specifično vezivanje sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni region čija je sekvenca bar 95% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 i 43. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni region čija je sekvenca bar 99% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25. 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 i 43.

[078] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje sadrži laki lanac koji sadrži varijabilni region čija je sekvenca bar 90% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 i 42. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje sadrži laki lanac koji sadrži varijabilni region čija je sekvenca bar 95% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 i 42. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje sadrži laki lanac koji sadrži varijabilni region čija je sekvenca bar 99% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24. 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 i 42.

[079] U predmetnom pronalasku, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice koriste se na uobičajen način. Videti Immunologv ~ A Svnthesis (2. izdanje, E. S. Golub & D. R. Gren, urednici, Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), koja je ovde inkorporirana u potpunosti po referenci za bilo koju svrhu da se koristi. Stereoizomeri (t.j. D - aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi, kao što su a-, a- disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina i druge nekonvencionalne aminokiseline takođe mogu da budu pogodni sastojci za polipeptide predmetnog pronalaska. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4-hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, e-N,N,N-trimetillizin, e-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acctilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, a-N-metilarginin, kao i druge slične aminokiseline i iminokiseline (npr. 4-hidroksiprolin). U oznakama polipeptida korišćenim u predmetnom pronalasku, sa leve strane se nalazi amino kraj dok se sa desne strane nalazi karboksi kraj, što je u skladu sa standardnom primenom i konvencijom.

[080] Shodno tome, osim ukoliko je naznačeno drugačije, levi kraj jednolančane polinukleotidne sekvence je 5' kraj; kod dvolančanih polinukleotidnih sekvenci, smer na levo je označen kao 5' smer. Smer od 5' ka 3' kraju nastajućeg RNK transkripta označen je kao smer transkripcije; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su okrenuti svojim 5' krajem ka 5' kraju RNK transkripta označavaju se kao "uzvodne sekvence"; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su okrenuti svojim 3' krajem ka 3' kraju RNK transkripta označavaju se kao "nizvodne sekvence".

[081] Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da obuhvate i aminokiselinske ostatke koji se ne javljaju u prirodi, koji se obično ugrađuju tokom hemijske sinteze peptida a ne tokom sinteze u biološkim sistemima. Oni obuhvataju peptidnc mimetike i druge izmenjene ili inverzne oblike ostataka aminokiselina.

[082] Ostaci koji se javljaju u prirodi mogu da se podele u klase prema zajedničkim osobinama bočnih lanaca: 1) hidrofobni: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) kiseli: Asp, Glu; 4) bazni: His, Lys, Arg;

5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i

6) aromatični: Trp, Tyr, Phe;

[083] Na primer, nekonzervativne supstitucije mogu da podrazumevaju zamenu člana jednog od ovih klasa članom neke druge klase. Takvi supstituisani ostaci mogu da se uvedu u regione humanih antitela koji su homologi sa ne-humanim antitelima, ili u nehomologe regione molekula.

[084] Kod uvođenja ovih promena, prema nekim rešenjima, može da se uzme u obzir hidropatički indeks aminokiselina. Svakoj aminokiselini dodeljen je hidropatički indeks na osnovu njene hidrofobičnosti i naelektrisanja. Oni su: izoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenilalanin (+2,8); cistein/cistin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glicin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); triptofan (-0,9); tirozin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lizin (-3,9); i arginin (-4,5).

[085] U struci je poznat značaj hidropatičkog indeksa aminokiselina u obezbeđivanju interaktivne biološke uloge proteina. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105 - 131 (1982). Zna se da određene aminokiseline mogu da budu supstituisane drugim aminokiselinama koje imaju sličan hidropatički indeks ili vrednost, a da pri tom zadrže sličnu biološku aktivnost. Kod uvođenja promena na osnovu hidropatičkog indeksa, u nekim rešenjima, primenjuje se supstitucija aminokiselina čiji su hidropatički indeksi u okviru ± 2. U nekim rešenjima, primenjuje se supstitucija onih čiji su hidropatički indeksi u okviru ± 1, a u nekim rešenjima, onih u okviru ± 0,5.

[086] U struci je takođe poznato da supstitucije sličnih aminokiselina mogu praktično

da se zasnivaju na hidrofilnosti, posebno u slučajevima u kojima je biološki funkcionalan protein ili peptid koji na taj način nastaje namenjen za upotrebu u imunološkim rešenjima, kao što je slučaj sa predmetnim pronalaskom. U nekim rešenjima, najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, određena hidrofilnošću njegovih susednih aminokiselina, u korelaciji je sa njegovom imunogenošću i antigenošću, t.j. sa biološkim svojstvom tog proteina.

[087] Sledeće vrednosti hidrofdnosti dodeljene su ovim aminokiselinskim ostacima: arginin (+3,0); lizin (+3,0); aspartat (+3,0 ± 1); glutamat (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glicin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cistein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); izoleucin (-1,8); tirozin (-2,3); fenilalanin (-2,5): i triptofan (-3,4). Kod uvođenja promena zasnovanih na sličnim vrednostima hidrofilnosti, u nekim rešenjima, primenjuje se supstitucija aminokiselina čije su vrednosti hidrofilnosti u okviru ± 2. U nekim rešenjima, primenjuje se supstitucija onih čije su vrednosti hidrofilnosti u okviru ± 1, a u nekim rešenjima, onih u okviru ± 0,5. Takođe je moguće identifikovati epitope preko primarnih sekvenci aminokiselina na osnovu hidrofilnosti. Ove regije označene su i kao "regioni epitopskog jezgra".

[088] Primeri supstitucije aminokiselina dati su u tabeli I.

[089] Stručnjak u ovoj oblasti moći će da odredi pogodne varijante polipeptida kao što

je ovde opisano, koristeći dobro poznate tehnike. U nekim rešenjima, stručnjak u ovoj oblasti može da odredi pogodne delove molekula koji mogu da se promene bez gubljenja aktivnosti, tako što će za cilj promene birati one regione za koje se veruje da nisu važni za aktivnost. U nekim rešenjima, moguće je odrediti ostatke i delove molekula koji su konzervirani među sličnim polipeptidima. U nekim rešenjima, čak i delovi koji bi mogli da budu značajni za biološku aktivnost ili strukturu mogu da pretrpe konzervativnu supstituciju aminokiselina bez gubljenja biološke aktivnosti ili bez negativnih uticaja na strukturu polipeptida.

[090] Uz to, stručnjak u ovoj oblasti može da prouči studije strukture i funkcije u kojima su identifikovani ostaci u sličnim polipeptidima, koji su značajni za aktivnost ili strukturu. Uzimajući u obzir takvo poređenje, moguće je predvideti značaj aminokiselinskih ostataka u proteinu koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima važnim za aktivnost i strukturu sličnih proteina. Stručnjak u ovoj oblasti može da se odluči za supstitucije takvih značajnih aminokiselina hemijski sličnim aminokiselinama.

[091] Stručnjak u ovoj oblasti može, takođe, da analizira trodimenzionalnu strukturu i sekvencu aminokiselina u odnosu na tu strukturu kod sličnih polipeptida. Uzimajući u obzir takve informacije, stručnjak u ovoj oblasti može da predvidi poravnavanje aminokiselinskih ostataka antitela u odnosu na njegovu trodimenzionalnu strukturu. U nekim rešenjima, stručnjak u ovoj oblasti može da se odluči da ne uvodi radikalne promene aminokiselinskih ostataka za koje se predviđa da će se naći na površini proteina, s obzirom da takvi ostaci mogu da igraju ulogu u važnim interakcijama sa drugim molekulima. Uz to, stručnjak u ovoj oblasti može da napravi nekoliko probnih varijanti koje sadrže samo po jednu aminokiselinsku supstituciju na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Ove varijante potom mogu da se ispitaju korišćenjem testova aktivnosti koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Ovakve varijante mogu da se koriste za prikupljanje informacija o tome koje su varijante odgovarajuće. Na primer, ako se otkrije da promena određenog aminokiselinskog ostatka dovodi do gubitka, ili nepoželjnog smanjenja aktivnosti, ili do neodgovarajuće aktivnosti, moguće je izbegavati varijante sa takvom pramenom. Drugim rečima, na osnovu informacija prikupljenih u ovakvim, rutinskim eksperimentima, stručnjak u ovoj oblasti može lako da odredi aminokiselinske ostatke čiju dalju supstituciju treba izbegavati, bilo samu bilo u kombinaciji sa drugim mutacijama.

[092] Postoji više naučnih publikacija posvećenih predviđanju sekundarne strukture. Videti Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7 (4): 422 - 427 (1996); Chou et al., Biochemistry, -13 (2): • 222 - 245 (1974); Chou et al., Biochemistrv, 113 (2): 211 - 222 (1974); Chou et al., Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45 - 148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem, 47: 251 - 276 i Chou et al., Biophvs. J., 26: 367 - 384 (1979). Uz to, sada su dostupni računarski programi koji mogu da pomognu u predviđanju sekundarne strukture. Jedan od postupaka za predviđanje sekundarne strukture zasniva se na modeliranju na osnovu homologije. Na primer, dva polipeptida ili proteina koja imaju identičnost sekvence veću od od 30%, ili sličnost veću od 40%, često imaju slične strukturne topologije. Skorašnji razvoj proteinske strukturne baze podataka (Protein structural database, PDB) omogućio je veću predvidljivost sekundarne strukture, uključujući i potencijalni broj savijanja u okviru strukture polipeptida ili proteina, videti Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27 (1): 244 - 247 (1999). Pretpostavljeno je (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3): 369 - 376 (1997)) da postoji ograničen broj savijanja za dati protein ili polipeptid i da će se, kada se razreši kritičan broj struktura, tačnost strukturnih predviđanja dramatično povećati.

[093] Drugi postupci za predviđanje sekundarne strukture uključuju "tkanje" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7 (3): 377 - 87 (1997); Sippl et al., Structure, 4 (1): 15 - 19 (1996)), "analizu profila" (Bovvie et al., Science, 253: 164 - 170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183: 146 - 159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13): 4355 - 4358 (1987)) i "evolutivno povezivanje" (Videti Holm,supra(1999) i Brenner,supra(1997)).

[094] U nekim rešenjima, varijante sredstava za specifično vezivanje obuhvataju i glikozilovane varijante, kod kojih je broj i/ili tip mesta glikolizacije promenjen u odnosu na aminokiselinsku sekvencu originalnog molekula. U nekim rešenjima, proteinske varijante sadrže veći ili manji broj N - vezivnih mesta glikozilacije nego nativni protein. N - vezivno mesto glikozilacije karakteriše sekvenca: Asn - X - Ser ili Asn - X - Thr, gde aminokiselinski ostatak označen kao X može da bude bilo koji aminokiselinski ostatak osim prolina. Supstitucija aminokiselinskih ostataka u cilju dobijanja ove sekvence obezbeđuje potencijalno novo mesto za adiciju N - vezanog ugljenohidratnog lanca. Suprotno tome, supstitucije koje dovode do eliminacije ove sekvence uklanjaju postojeći N-vezani ugljenohidratni lanac. Takođe je moguća promena mesta N - vezanih ugljeno hi dratnih lanaca, na taj način što se eliminiše jedno ili više N - vezanih mesta glikozilacije (obično onih koja se javljaju u prirodi) dok se istovremeno stvara jedno ili više novih N - vezanih mesta. Dodatne poželjne varijante antitela obuhvataju cisteinske varijante kod kojih je, u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom nativnih proteina, jedan ili više cisteinskih ostataka deliran ili supstituisan nekom drugom aminokiselinom (npr. serinom). Cisteinske varijante mogu da budu od koristi u slučajevima kada antitela moraju ponovo da se saviju u biološki aktivnu konformaciju kao, na primer, nakon izolacije nerastvornih inkluzionih tela. Uopšteno gledano, cisteinske varijante imaju manje cisteinskih ostataka od nativnog proteina, i obično imaju paran broj cisteinskih ostataka da bi se interakcije nesparenih cisteina svele na najmanju moguću meru.

[095] Prema nekim rešenjima, aminokiselinske supstitucije su one kojima se: (1) smanjuje podložnost proteolizi, (2) smanjuje podložnost oksidaciji, (3) menja afinitet vezivanja za formiranje proteinskih kompleksa, (4) menjaju afiniteti vezivanja i/ili (5) dodaju ili menjaju druga fizičko-hemijska ili funkcionalna svojstva datim polipeptidima. Prema nekim rešenjima, jednostruke ili višestruke aminokiselinske supstitucije (u nekim rešenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se izvrše u sekvenci koja se javlja u prirodi (u nekim rešenjima, u delu polipeptida koji ne pripada domenu (domenima) koji učestvuju u formiranju kontakata između molekula). U nekim rešenjima, konzervativna aminokiselinska supstitucija obično ne dovodi do značajnih promena u strukturnim karakteristikama roditeljske sekvence (t.j. aminokiselina koja je uvedena supstitucijom ne bi trebalo da teži da naruši heliks koji se javlja u roditeljskoj sekvenci, niti bi trebalo da narušava bilo koje druge oblike sekundarne strukture koji karakterišu roditeljsku sekvencu). Primeri sekundarnih i tercijernih struktura koji su poznati u struci opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, urednik, W. H. Freeman & Companv, Nevv York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden & J. Tooze, urednici, Garland Publishing, Nevv York, N. Y. (1991)); i Thorton et al., Nature 354: 105

(1991), koji su ovde inkorporirani u potpunosti po referenci.

[096] Pojam "derivat" odnosi se na molekul koji sadrži hemijsku modifikaciju različitu

od insercija, delecija ili supstitucija aminokiselina. U nekim rešenjima, derivati sadrže kovalentne modifikacije, koje uključuju ali nisu ograničeni na hemijsko vezivanje za polimere, lipide, ili druge organske ili neorganske ostatke. U nekim rešenjima, hemijski modifikovano sredstvo za specifično vezivanje može da ima duži poluživot u cirkulaciji nego sredstvo za specifično vezivanje koje nije hemijski modifikovano. U nekim rešenjima, hemijski modifikovano sredstvo za specifično vezivanje može da ima povećan kapacitet ciljanja za željene ćelije, tkiva i/ili organe. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje koje je derivat je kovalentno modifikovano tako da sadrži jedan ili više vezanih polimera rastvornih u vodi, uključujući, ali se ne ograničavajući na, polietilen glikol, polioksietilen glikol, ili polipropilen glikol. Videti, npr. U.S. Patente br.: 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 i 4,179,337. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje koje je derivat sadrži jedan ili više polimera, uključujući, ali se ne ograničavajući na monometoksi-polietilen glikol, dekstran, celulozu, ili druge polimere na bazi ugljenih hidrata, poli-(N-vinil pirolidonj-polietilen glikol, homopolimere propilen glikola, kopolimer polipropilen oksida/etilen oksida, polioksietiiovane poliole (npr. glicerol) i polivinil alkohol, kao i smeše takvih polimera.

[097] U nekim rešenjima, derivat je kovalentno modifikovan jedinicama polietilen glikola (PEG). U nekim rešenjima, jedan ili više polimera rastvornih u vodi vezano je zajedno ili više specifičnih mesta, na primer, na amino terminalnom kraju derivata. U nekim rešenjima, jedan ili više polimera rastvornih u vodi vezani su po slučajnoj raspodeli za jedan ili više bočnih lanaca derivata. U nekim rešenjima, PEG se koristi da bi se poboljšao terapijski kapacitet sredstva za specifično vezivanje. U nekim rešenjima, PEG se koristi da bi se poboljšao terapijski kapacitet humanizovanog antitela. Neka takva rešenja opisana su, na primer, u U.S. Patentu br. 6,133,426 koji je ovde inkoproriran u potpunosti po referenci za koju god svrhu da se koristi.

[098] Pojam "polipeptidni fragment" se u predmetnom pronalasku odnosi na polipeptid koji ima deleciju na svom amino terminalnom kraju i/ili na svom karboksi terminalnom kraju. U nekim rešenjima, fragmenti su dugački bar 5 do 478 aminokiselinskih ostataka. Treba imati u vidu da su u nekim rešenjima fragmenti dugački bar 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ili 450 aminokiselinskih ostataka.

[099] Peptidni analozi su u uobičajenoj upotrebi u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa svojstvima analognim onim koje imaju peptidi prema kojima su sintetisani. Ovakva ne-peptidna jedinjenja nazvana su "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici". Fauchere,

J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber & Freidinger TINS str. 392 (1985); i Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), koji su ovde inkoprorirani po referenci za koju god svrhu da se koriste. Ovakva jedninjenja se često razvijaju uz pomoć računarskog molekulskog modeliranja. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu da se koriste za postizanje sličnog terapijskog i profilaktičkog efekta. Uopšteno, peptidomimetici su strukturno slični polipeptidu koji je uzet za primer (t.j. polipeptidu koji ima biohemijska svojstva ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali imaju jednu ili više peptidnih veza opciono zamenjenih vezom izabranom iz grupe koja se sastoji od: --CH2NH-, --CH2S--, --CH2-CH2-, -CH=CH~ (cis i trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2- i -CH2SO-, postpupcima koji su dobro poznati u struci. Sistemska supstitucija jednog ili više aminokiselinskih ostataka koncenzus sekvence D-aminokiselinskim ostatkom istog tipa (npr. D-lizin umesto L-lizina) može da se koristi u nekim rešenjima kako bi se dobio stabilniji peptid. Uz to, zatvoreni polipeptidi koji sadrže koncenzus sekvencu ili u značajnoj meri identičnu varijaciju koncenzus sekvence mogu da se dobiju postupcima poznatim u struci (Rizo & Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387

(1992) koji je ovde inkoproriran po referenci za koju god svrhu da se koristi); na primer, dodavanjem unutrašnjih ostataka cisteina koji mogu da formiraju intramolekulske disulfidne mostove koji cikluzuju peptid.

[0100] Pojmovi "antitelo" ili "peptid(i) antitela" odnose se na intaktno antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment koji kompetira sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje. U nekim rešenjima, vezujući fragmenti dobijeni su tehnikama rekombinantne DNK. U nekim rešenjima, vezujući fragmenti dobijaju se enzimskim ili hemijskim isecanjem iz intaktnih antitela. Vezujući fragmenti uključuju, ali se ne ograničavaju na Fab, Fab', F(ab')2, Fv i jednolančana antitela.

[0101] Pojam "teški lanac" odnosi se na svaki polipeptid koji ima dovoljan deo sekvence varijabilnog regiona da bi imao specifičnost za ciljni molekul. Pojam "laki lanac" odnosi se na svaki polipeptid koji ima dovoljan deo sekvence varijabilnog regiona da bi imao specifičnost za ciljni molekul. Teški lanac potpune dužine obuhvata domen varijabilnog regiona, Vhi tri domena konstantnog regiona, ChI, Ch2 i Ch3. Vhdomen se nalazi na amino terminalnom kraju polipeptida, dok se CH3 domen nalazi na njegovom karboksi terminalnom kraju. Pojam "teški lanac", kada se koristi u predmetnom pronalasku, obuhvata teški lanac potpune dužine' kao i njegove fragmente. Laki lanac potpune dužine sadrži domen varijabilnog regiona, VLi domen konstantnog regiona, Cl- Kao i kod teškog lanca, domen varijabilnog regiona lakog lanca nalazi se na amino terminalnom kraju. Pojam "laki lanac", kada se koristi u predmetnom pronalasku, obuhvata laki lanac potpune dužine kao i njegove fragmente. Fab fragment se sastoji od jednog lakog lanca i ChI i varijabilnog regiona jednog teškog lanca. Teški lanac Fab fragmenta ne može da formira disulfidni most sa drugim molekulom teškog lanca. Fab' fragment sadrži jedan laki lanac i jedan teški lanac koji sadrži veći deo konstantnog regiona, između ChI i Ch2 domena, takav da može da dođe do stvaranja disulfidnog mosta između dva teška lanca tako da se formira F(ab')2 molekul. Fv region sadrži varijabilne regione i teškog i lakog lanca, ali ne sadrži konstantne regione. Jednolančana antitela su Fv molekuli kod kojih su varijabilni regioni lakog i teškog lanca povezani fleksibilnim linkerom tako da formiraju jedan polipeptidni lanac koji formira antigen vezujući region. Jednolančana antitela detaljno su opisana u, npr. WO 88/01649 i U.S. Patentima br. 4,946,778 i 5,260,203.

[0102] Pojam "varijabilni region" ili "varijabilni domen" odnosi se na deo lakog i/ili teškog lanca antitela, koji obično obuhvata približno 120 do 130 aminokiselinskih ostataka na amino terminalnom kraju teškog lanca, i oko 100 do 110 aminokiselinskih ostataka na amino terminalnom kraju lakog lanca. U nekim rešenjima, varijabilni regioni različitih antitela veoma se razlikuju u aminokiselinskoj sekvenci, čak i među antitelima u okviru iste vrste. Varijabilni region antitela obično određuje specifičnost datog antitela za njegov ciljni molekul.

[0103] Pojam "imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment" odnosi se na polipeptidni fragment koji sadrži bar varijabilne domene imunoglobulinskog teškog ranca i imunoglobulinskog lakog lanca. U nekim rešenjima, imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment je u stanju da veže ligand, sprečavajući vezivanje liganda za njegov receptor, čime se gubi biološki odgovor koji je rezultat vezivanja liganda za receptor. U nekim rešenjima, imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment je u stanju da se veže za receptor, sprečavajući vezivanje liganda za njegov receptor, čime se gubi biološki odgovor koji je rezultat vezivanja liganda za taj receptor. U nekim rešenjima, imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment je u stanju da se veže za receptor i da ga time aktivira ili inaktivira.

[0104] U nekim rešenjima, podrazumeva se da su sva vezivna mesta bivalentnog antitela različitog od "multispecifičnog" ili "multifunkcionalnog" antitela identična.

[0105] Sredstvo za specifično vezivanje značajno inhibira adheziju liganda za receptor onda kada višak sredstva za specifično vezivanje smanjuje količinu receptora vezanog za protivreceptor za najmanje 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ili više (prema merenjima uin vitrotestovima kompetitivnog vezivanja).

[0106] Pojam "ciljni molekul" se odnosi na molekul ili deo molekula koji može da bude vezan od strane sredstva za specifično vezivanje. U nekim rešenjima, ciljni molekul može da ima jedan ili više epitopa. U nekim rešenjima, ciljni molekul je antigen.

[0107] Pojam "epitop" obuhvata bilo koju polipeptidnu determinantu koja može da se veže za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. U nekim rešenjima, epitopske determinante obuhvataju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil grupe i, u nekim rešenjima, mogu da imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region antigena koji se vezuje za antitelo. U nekim rešenjima, kaže se da antitelo specifično vezuje neki antigen kada u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula antitelo najradije prepoznaje taj, ciljani antigen. U nekim rešenjima, kaže se da antitelo specifično vezuje neki antigen kada je konstanta disocijacije<<>1 uM, u nekim rešenjima, kada je konstanta disocijacije < 100 nM a u nekim rešenjima, kada je konstanta disocijacije<<>10 nM.

[0108] Pojam "sredstvo" se u predmetnom pronalasku koristi da označi hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt dobijen iz bioloških materijala.

[0109] Kada se koriste u predmetnom pronalasku, pojmovi "obeležen" i "obeleživač" odnose se na ugrađivanje markera koji može da se detektuje, npr. ugrađivanje aminokiseline koja je radioaktivno obeležena ili vezivanje biotinskog ostatka za polipeptid, obzirom da biotin može da se detektuje obeleženim avidinom (npr. streptavidinom koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja može da se detektuje optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). U nekim rešenjima, i sam marker - obeleživač može da bude terapeutsko sredstvo. U struci su poznati različiti postupci koji mogu da se koriste za obeležavanje polipeptida i glukoproteina. Primeri obeleživača za polipeptide obuhvataju, ali nisu ograničeni na sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr. 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I), fluorescentne obeleživače (npr. FITC, rodamin, lantanide s fosforom), enzimske obeleživače (npr. peroksidazu iz rena, P-galaktozidazu, luciferazu, alkalnu fosfatazu), hemiluminescentne, biotinilne grupe, prethodno određene polipeptidne epitope koje prepoznaju sekundarni reporteri (npr. sekvence leucinskog rajsferšluskog para, vezivna mesta za sekundarna antitela, metal - vezujući domeni, epitopski obeleživači). U nekim rešenjima, obeleživači se vezuju za molekul preko spejsera različitih dužina da bi se smanjile potencijalne sterne smetnje.

[0110] U predmetnom pronalasku, pojam "biološki uzorak" obuhvata, ali nije ograničen na, bilo koju količinu supstance koja je dobijena iz živog organizma ili iz organizma koji je nekada bio živ. Takvi živi organizmi obuhvataju, ali se nisu ograničeni na ljude, miševe, majmune, pacove. zečeve i druge životinje. Takve supstance obuhvataju, ali nisu ograničene na, krv, serum, urin, ćelije, organe, tkiva, kosti, koštanu srž, limfne čvorove i kožu.

[0111] Pojam "kancer" obuhvata, ali nije ograničen na solidne tumore i hematološke maligne promene. Primeri kancera obuhvataju, ali nisu ograničeni na kancer dojke, kolorektalni kancer, želudačni karcinom, gliom, skvamocelarni kancer glave i vrata, nasledni i sporadični papilarni bubrežni karcinom, leukemiju, limfom, Li - Fraumeni sindrom, maligni pleuralni mezoteliom, melanom, multipli mijelom, nesitnoćelijski karcinom pluća, osteosarkom, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer prostate, sitnoćelijski kancer pluća, sinovijalni sarkom, tiroidni karcinom i karcinom tranzicionih ćelija mokraćne bešike.

[0112] Pojam "HGF aktivnost" obuhvata bilo koji biološki efekat HFG. U nekim rešenjima, HGF aktivnost je Met - HGF aktivnost. U nekim rešenjima, HGF aktivnost je aktivnost HGF nezavisna od Met.

[0113] Pojam "Met - HGF signalizacija" obuhvata interakciju HGF sa Met receptorom.

[0114] Pojam "Met - HGF aktivnost" obuhvata bilo koju biološku aktivnost koja se javlja kao rezultat Met - HGF signalizacije. Primeri ovih aktivnosti obuhvataju, ali nisu ograničeni na neuralnu indukciju, regeneraciju jetre, zarastanje rana, rast, invaziju, morfološku diferencijaciju, embriološki razvoj, rasipanje, proliferaciju, apoptozu, pokretljivost ćelija, metastazu, migraciju, adheziju ćelija, približavanje integrina u grozdove, fosforilaciju paksilina, nastanak fokalnih adhezija, kao i kancer koji je posledica aberantne Met - HGF signalizacije.

[0115] Pojam "aberantna Met - HGF signalizacija" obuhvata bilo koje okolnosti pod kojima Met - HGF signalizacija ne uspeva da stimuliše bilo koju od Met - HGF aktivnosti, kada bi u normalnim uslovima signalizacija dovela do te aktivnosti. Aberantna Met - HGF signalizacija takođe obuvata i sve okolnosti pod kojima Met - HGF signalizacija dovodi do manje Met - HGF aktivnosti od one koja bi se dobila pri normalnoj signalizaciji. Aberantna aktivnost takođe obuhvata i sve okolnosti pod kojima Met - HGF signalizacija dovodi do veće Met - HGF aktivnosti od one koja bi se dobila pri normalnoj signalizaciji. Aberantna Met - HGF signalizacija može da dovede do, na primer, nekih vrsta kancera.

[0116] Pojam "aktivnost HGF nezavisna od Met" odnosi se na bilo koju od bioloških aktivnosti na koje utiče HGF, a koje ne zavise od vezivanja HGF za Met rceptor. Takve aktivnosti obuhvataju, ali nisu ograničene na biološke aktivnosti na koje utiče interakcija HGF sa drugim receptorima i biološke aktivnosti na koje HGF utiče preko drugih puteva, npr. Ron ili met/ron heterodimera.

[0117] Pojam "aberantna HGF aktivnost" odnosi se na sve okolnosti pod kojima je HGF aktivnost veća ili manja nego što bi trebalo da bude. U nekim okolnostima, aberantna HGF aktivnost je posledica aberantne Met - HGF signalizacije. U nekim okolnostima, aberantna aktivnost HGF je posledica povišene koncentracije HGF. U nekim rešenjima, aberantna HGF aktivnost je posledica snižene koncentracije HGF.

[0118] U predmetnom pronalasku, pojam "farmaceutsko sredstvo ili lek" podrazumeva hemijsko jedinjenje ili preparat koji je, kada se pacijentu da na pravilan način, u stanju da indukuje željeni terapijski efekat.

[0119] U predmetnom pronalasku, pojam "modulator" se odnosi na jedinjenje koje menja aktivnost ili funkciju molekula. Na primer, modulator može da izazove povećanje ili smanjenje intenziteta neke aktivnosti ili funkcije nekog molekula u poređenju sa intenzitetom aktivnosti ili funkcije u odsustvu modulatora. U nekim rešenjima, modulator je inhibitor, koji smanjuje intenzitet bar jedne aktivnosti ili funkcije molekula. Određeni primeri aktivnosti i funkcija molekula obuhvataju, ali nisu ograničeni na, afinitet vezivanja, cnzimsku aktivnost i signalnu transdukciju. Određeni primeri inhibitora obuhvataju, ali nisu ograničeni na, proteine, peptide, antitela, peptitela, ugljene hidrate i male organske molekule. Peptitela su opisana u, npr. U.S. Patentu br. 6.660,843 (što odgovara PCT prijavi br. WO01/83525).

[0120] U predmetnom pronalasku, "značajno čist" podrazumeva da je predmetna vrsta najzastupljenija prisutna vrsta (t.j. na molarnoj osnovi je zastupljenija nego bilo koja. druga pojedinačna vrsta u tom preparatu). U nekim rešenjima, značajno prečišćena frakcija je preparat u kome predmetna vrsta predstavlja najmanje oko 50% (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekulskih vrsta. U nekim rešenjima, značajno čist preparat će sadržati više od oko 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% svih makromolekulskih vrsta prisutnih u preparatu. U nekim rešenjima, predmetna vrsta prečišćena je do suštinske homogenosti (vrste koje je kontaminiraju ne mogu da budu detektovane u preparatu korišćenjem konvencionalnih postupaka detekcije), gde se preparat sastoji, suštinski, od samo jedne makromolekulske vrste.

[0121] Pojam "pacijent" odnosi se na humane pacijente kao i na životinje.

Određeni primeri sredstava za specifično vezivanje

[0122] U nekim slučajevima, HGF se vezuje za Met receptor što dovodi do fosforilacije Met. U nekim slučajevima, normalna fosforilacija Met izazvana vezivanjem HGF reguliše različite ćelijske odgovore. U nekim slučajevima, aberantna Met - HGF signalizacija u korelaciji je sa različitim humanim oboljenjima. Na primer, u nekim slučajevima, previsoka aktivnost HGF je u korelaciji sa nekim kancerima. Stoga, u nekim slučajevima, modulacija HGF aktivnosti može da bude terapeutski korisna. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje HGF koriste se da bi se smanjila HGF aktivnost koja je abnormalno visoka. U nekim rešenjima, smanjivanje abnormalno visoke HGF aktivnosti smanjuje tumorigensku aktivnost i smanjuje uznapredovalost kancera. Prema nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje HGF koriste se za lečenje kancera. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje HGF koriste se za sprečavanje nastanka kancera.

[0123] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF koristi se za lečenje kancera sa normalnom HGF aktivnošću. Kod takvih kancera, na primer, smanjenje HGF aktivnosti na vrednost manju od normalne može da dovede do terapeutskog efekta.

[0124] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF koristi se za modulaciju bar jedne Met - HGF aktivnosti. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF koristi se za modulaciju bar jedne aktivnosti HGF nezavisne od Met. U nekim rešenjima, za modulaciju HGF aktivnosti koristi se više od jednog sredstva za specifično vezivanje HGF.

[0125] U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje HGF su potpuno humana antitela. U nekim rešenjima, obezbeđene su nukleotidne sekvence koje kodiraju, kao i aminokiselinske sekvence koje sadrže teške i lake lance imunoglobulinskih molekula, posebno sekvence koje odgovaraju varijabilnim regionima. U nekim rešenjima, obezbeđene su sekvence koje odgovaraju regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), specifično od CDR1 do CDR3. Prema nekim rešenjima, obezbeđena je ćelijska linija hibridoma koja eksprimira takav imunoglobulinski molekul. Prema nekim rešenjima, obezbeđena je ćelijska linija hibridoma koja eksprimira takvo monoklonsko antitelo. U nekim rešenjima, ćelijska linija hibridoma izabrana je iz grupe koja se sastoji od bar jedne od 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 i 3.10.1. U nekim rešenjima, obezbeđeno je prečišćeno humano monoklonsko antitelo na humani HGF.

[0126] Mogućnost kloniranja i rekonstrukcija humanih lokusa čija se dužina meri megabazama u veštačkim hromozomima kvasca (Yeast Artificial Chromosomes, YAC) i njihovog ubacivanja u matičnu liniju miševa omogućava pristup razlikovanju funkcionalnih komponenti veoma velikih i grubo mapiranih lokusa, kao i razvoju korisnih modela humanih bolesti. Dalje, korišćenje ovakve tehnologije za supstituciju mišjih lokusa njihovim humanim ekvivalentima moglo bi da dovede do boljeg razumevanja ekspresije i regulacije proizvoda humanih gena tokom razvoja, njihove komunikacije sa drugim sistemima i njihove uloge u nastanku i progresiji bolesti.

[0127] Važna praktična primena ovakve strategije ogleda se u "humanizaciji" mišjeg humoralnog imunog sistema. Uvođenje humanih imunoglobulinskih (Ig) lokusa u miševe čiji su endogeni Ig geni prethodno inaktivirani otvara mogućnosti za proučavanje mehanizama koji su u osnovi programirane ekspresije i sastavljanja antitela, kao i njihove uloge u razvoju B ćelija. Dalje, ovakva strategija može da obezbedi izvor za proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela (Mab). U nekim rešenjima, očekuje se da će potpuno humana antitela svesti na najmanju meru imunogene i alergijske odgovore koji se javljaju pri primeni mišjih ili derivatizovanih mišjih Mab, pa će se stoga, u nekim rešenjima, povećati efikasnost i bezbednost upotrebe primenjenih antitela. U nekim rešenjima, potpuno humana antitela mogu da se koriste za lečenje hroničnih ili rekurentnih humanih bolesti, kao što su kancer, malarija, ili proliferativna dijabetska retinopatija, što ponekad podrazumeva ponavljanu primenu antitela.

[0128] Moguće je proizvesti sojeve miševa kod kojih je proizvodnja mišjih antitela deficijentna, a kojima su uvedeni veliki fragmenti humanih Ig lokusa, pri čemu se očekuje da će takvi miševi proizvoditi humana antitela u nedostatku mišjih antitela. Veliki humani fragmenti mogu da sačuvaju veliku raznolikost varijabilnih delova gena, kao i pravilnu regulaciju proizvodnje antitela i ekspresije. Eksploatacijom mišjih mehanizama za diverzifikaciju i selekciju antitela. kao i usled smanjene imunološke tolerancije za humane proteine, širok repertoar humanih antitela dobijen u ovakvim sojevima miševa može da sadrži potpuno humana antitela visokog afiniteta za antigen koji se proučava, uključujući i humane antigene. Upotrebom tehnologije hibridoma, moguće je dobiti i selekcionisati antigen - specifična humana Mab sa željenom specifičnošću. Neki primeri ovakvih postupaka opisani su u WO 98/24893, U. S.

Patent br. 5,545,807, EP 546073B1 i EP 546073A1.

[0129] U nekim rešenjima, moguća je upotreba konstantih regiona iz drugih vrsta uz upotrebu humanih varijabilnih regiona.

Struktura antitela koja se javljaju u prirodi

[0130] Strukturne jedinice antitela koja se javljaju u prirodi najčešće sadrže tetramer. Svaki takav tetramer je obično sastavljen od dva identična para polipeptidnih lanaca, gde svaki par ima jedan "laki" lanac potpune dužine (u nekim rešenjima, 25 kDa) i jedan "teški" lanac potpune dužine (u nekim rešenjima, 50 - 70 kDa). Amino terminalni deo svakog lanca obično sadrži varijabilni region od oko 100 do 110 aminokiselinskih ostataka koji obično igra ulogu u prepoznavanju antigena. Karboksi terminalni kraj svakog lanca obično sadrži konstantni region koji može da igra ulogu u efektorskoj funkciji. Humani laki lanci se obično klasifikuju kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci se obično klasifikuju kao mi, delta, gama, alfa ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA ili IgE, respektivno. IgG ima nekoliko podklasa, koje obuhvataju, ali nisu ograničene na IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4. IgM ima podklase koje obuhvataju, ali nisu ograničene na IgMl i IgM2. IgA je na sličan način podeljen na podklase koje obuhvataju, ali nisu ograničene na IgAl i IgA2. U okviru lakih i teških lanaca potpune dužine, varijabilni i konstantni regioni su obično povezani "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselinskih ostataka, dok teški lanac takođe obuhvata i "D" region od oko 10 aminokiselinskih ostataka. Videti, npr. Fundamental Immunologv poglavlje 7 (Paul, W. urednik, 2. izdanje Raven Press, N. Y. (1989)) (koja je ovde inkorporirana u celosti po referenci za koju god svrhu da se koristi). Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac obično formiraju antigen vezujuće mesto.

[0131] Varijabilni regioni obično pokazuju istu opštu strukturu koji čine relativno konzervirani okvirni regioni (FR) kojima su pridružena tri hipervarijabilna regiona koji se takođe nazivaju i regioni za određivanje komplementarnosti (CDR). CDR iz dva lanca svakog para su obično postavljeni tako da su im poravnati okvirni regioni, što može da omogući vezivanje za specifični epitop. Od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju, varijabilni regioni i lakog i teškog lanca obično sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Određivanje pripadnosti aminokiselina svakom od domena obično je u skladu sa definicijama Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.

(1987 & 1991)) ili Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878 - 883 (1989).

[0132] U nekim rešenjima, teški lanac antitela vezuje se za antigen u odsustvu lakog lanca antitela. U nekim rešenjima, laki lanac antitela vezuje se za antigen u odsustvu teškog lanca antitela. U nekim rešenjima, antigen vezujući region antitela vezuje se za antigen u odsustvu lakog lanca antitela. U nekim rešenjima, antigen vezujući region antitela vezuje se za antigen u odsustvu teškog lanca antitela. U nekim rešenjima, pojedinačni varijabilni region se specifično vezuje za antigen u odsustvu drugih varijabilnih regiona.

[0133] U nekim rešenjima, definitivno određivanje linije CDR i identifikacija ostataka koji čine vezujuće mesto antitela postiže se rešavanjem strukture antitela i/ili rešavanjem strukture kompleksa antitelo - ligand. U nekim rešenjima, ovo može da se postigne upotrebom bilo koje od različitih tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti, kao što je kristalografija X zraka. U nekim rešenjima, različiti postupci analize mogu da se upotrebe da bi se identifikovali ili barem približno odredili CDR regioni. Primeri takvih postupaka obuhvataju, ali nisu ograničeni na Kabat definiciju, Chothia definiciju, AbM definiciju i kontaktnu definiciju.

[0134] Kabat definicija je standard za dodeljivanje brojeva aminokiselinskim ostatacima antitela i obično se koristi za identifikaciju CDR regiona. Videti, npr. Johnson & Wu, Nucleic Acids Res, 28: 241 - 8 (2000). Chothia definicija je slična Kabat definiciji, s tim što Chothia definicija uzima u obzir pozicije određenih strukturnih regiona petlji. Videti, npr. Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901 - 17 (1986); Chothia et al., Nature 342: 877 - 83 (1989). AbM definicija koristi integrisan skup računarskih programa za modeliranje strukture antitela koje proizvodi Oxford Molecular Group. Videti, npr. Martin et al., Proc Natl Acad Sci (SAD) 86: 9268 - 9272

(1989); AbM™, računarski program za modeliranje varijabilnih regiona antitela, Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd. AbM definicija modelira tercijernu strukturu antitela iz primarne sekvence korišćenjem kombinacije baza podataka znanja iab initiopostupaka, kao što su oni opisani u Samudrala et al., Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach, PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl. 3: 194 - 198 (1999). Kontaktna definicija se zasniva na analizi dostupnih kompleksnih kristalnih struktura. Videti, npr. MacCallum et al., J Mol Biol, 5: 732 - 45 (1996).

[0135] Prema konvenciji, CDR regioni u teškom lancu obično se nazivaju Hl, H2 i H3 a brojevi su im dodeljeni redom u smeru od amino terminalnog kraja ka karboksi terminalnom kraju. CDR regioni u lakom lancu se obično nazivaju LI, L2 i L3, a brojevi su im dodeljeni redom u smeru od amino terminalnog kraja ka karboksi terminalnom kraju.

Bispecifična ili bifunkcionalna antitela

[0136] Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo je obično veštačko hibridno antitelo koje sadrži dva različita para teški/laki lanac i dva različita vezivna mesta. Bispecifična antitela mogu da se dobiju različitim postupcima koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr. Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79: 31S - 321

(1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547 - 1553 (1992).

Preparati antitela

[0137] Prema nekim rešenjima, predmetni pronalazak obuhvata određena antitela koja se specifično vezuju za HGF. U nekim rešenjima, antitela se dobijaju imunizacijom antigenom. Pojam "antigen" označava molekul koji se koristi da u životinjama izazove proizvodnju antitela koja su u stanju da se vežu za taj antigen i/ili za neki drugi ciljni molekul. U nekim rešenjima, antitela mogu da se dobiju imunizacijom pomoću HGF potpune dužine, rastvornim oblikom HGF, varijantom HGF dobijenom splajsovanjem, ili njihovim fragmentima. U nekim rešenjima, antitela predmetnog pronalaska mogu da budu poliklonska ili monoklonska i/ili mogu da budu rekombinantna antitela. U nekim rešenjima, antitela predmetnog pronalaska su humana antitela dobijena, na primer, imunizacijom transgenih životinja koje su u stanju da proizvedu humana antitela (videti, na primer, PCT Objavljenu prijavu, br. WO 93/12227).

[0138] U nekim rešenjima, mogu da se upotrebe određene strategije za manipulaciju sopstvenih osobina antitela, kao što je afinitet antitela za njegov ciljni molekul. Ovakve strategije obuhvataju, ali nisu ograničene na upotrebu mutageneze specifične za mesto ili mutageneze po slučajnom rasporedu polinukleotidnog molekula koji kodira antitelo da bi se dobila varijanta tog antitela. U nekim rešenjima, nakon proizvodnje, varijante antitela se testiraju da bi se izdvojile one varijante koje pokazuju željenu promenu, t.j. povećan ili smanjen afinitet.

[0139] U nekim rešenjima, aminokiselinski ostaci na koje se cilja u strategijama mutageneze su oni u CDR. U nekim rešenjima, cilja se na aminokiselinske ostatke u okvirnim regionima varijabilnih domena. U nekim rešenjima, pokazano je da ovakvi okvirni regioni doprinose osobinama vezivanja ciljnog molekula kod nekih antitela. Videti, npr. Hudson, Curr Opin Biotech, 9: 395 - 402 (1999) i reference u njemu.

[0140] U nekim rešenjima, proizvode se manje i efikasnije ispitane biblioteke varijanti antitela ograničavanjem slučajne ili mutageneze specifične za mesto na hipermutaciona mesta u CDR, mesta koja odgovaraju oblastima koje su najviše sklone mutacijama tokom procesa somatske afinitetne maturacije. Videti, npr. Chowdhury & Pastan, Nature Biotech, 17: 568 - 572

(1999) i reference u njemu. U nekim rešenjima, određeni tipovi DNK elemenata mogu da se upotrebe za identifikaciju hiper - mutacionih mesta koja obuhvataju, ali nisu ograničena na, tetrabaznu sekvencu koja sadrži purin (A ili G), zatim guanin (G), zatim pirimidin (C ili T) a zatim ili adenozin ili tirozin (A ili T) (t.j. A/G - G - C/T - A/T). Još jedan primer DNK elementa koji može da se upotrebi za identifikaciju hipermutacionih mesta je serinski kodon; A - G - C/T.

[0141] U r.ekim rešenjima, antitela su humanizovana. U nekim rešenjima, humanizovano antitelo je značajno neimunogeno za ljude. U nekim rešenjima, humanizovano antitelo ima suštinski isti afinitet za ciljni molekul kao i antitelo iz neke druge vrste iz koga je dobijeno humanizovano antitelo. Videti npr. U. S. Patent 5,530,101, U. S. Patent 5,693,761; U. S. Patent 5,693,762; U. S. Patent 5,585,089.

[0142] U nekim rešenjima, identifikovani su oni aminokiselinski ostaci varijabilnog domena antitela koji mogu da budu modifikovani bez gubitka nativnog afiniteta antigen vezujućeg domena, istovremeno smanjujući imunogenost tog antitela. Videti, npr. U. S. Patente br. 5,766,886 i 5,869,619.

[0143] U nekim rešenjima, modifikacija antitela postpucima koji su poznati u struci obično je osmišljena tako da dovede do povećanja afiniteta za vezivanje ciljnog molekula i/ili da smanji imunogenost tog antitela za primaoca. U nekim rešenjima, humanizovana antitela su modifikovana tako da su eliminisana mesta glikozilacije da bi se povećao afinitet antitela za njegov specifični antigen. Videti, npr. Co et al., Mol Immunol 30: 1361 - 1367 (1993). U nekim rešenjima, za dobijanje humanizovanih antitela se koriste tehnike kao što su "preoblikovanje", "hiperhimerizacija" ili "lakiranje / promena površine". Videti, npr. Vaswami et al., Annals of Allergv, Asthma k Immunol 81: 105 (1998); Roguska et al., Prot Engineer 9: 895 - 904 (1996); i U. S. Patent br. 6,072,035. U nekim ovakvim rešenjima, ovakve tehnike obično smanjuju imunogenost antitela smanjujući broj stranih ostataka, ali ne sprečavaju anti-idiotipske i anti-alotipske odgovore nakon ponavljanih primena antitela. Određeni drugi postupci za smanjivanje imunogenosti opisani su, npr. u Gilliland et al., J Immunol 62 (6): 3663 - 71 (1999).

[0144] U nekim slučajevima, humanizovanje antitela dovodi do gubitka kapaciteta za vezivanje antigena. U nekim rešenjima, humanizovana antitela su "imitirana unazad". U nekim ovakvim rešenjima, humanizovano anititelo je mutirano da bi se ubacio jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u antitelu donatora. Videti, npr. Saladanha et al., Mol Immunol 36: 709- 19 (1999).

[0145] U r.ekim rešenjima, regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela na HGF mogu da se presade na okvirne regione (FR) iz iste, ili druge, vrste. U nekim rešenjima, CDR varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela na HGF mogu da se presade na koncenzusne humane FR. Da bi se formirali koncenzusni humani FR, u nekim rešenjima, aminokiselinske sekvence nekoliko humanih teških lanaca ili lakih lanaca se poravnavaju da bi se identifikovala koncenzusna aminokiselinska sekvenca. U nekim rešenjima, FR teškog lanca ili lakog lanca antitela na HGF zamenjuju se FR iz različitog teškog lanca ili lakog lanca. U nekim rešenjima, retki aminokiselinski ostaci u FR teških i lakih lanaca antitela na HGF nisu zamenjeni, dok su ostali aminokiselinski ostaci FR zamenjeni.* Retki aminokiselinski ostaci su specifični aminokiselinski ostaci koji se nalaze na mestima na kojima se obično ne nalaze u FR. U nekim rešenjima, presađeni varijabilni regioni iz antitela na HGF mogu da se upotrebljavaju uz konstantni region koji je različit od konstantnog regiona antitela na HGF. U nekim rešenjima, presađeni varijabilni regioni su deo jednolančanog Fv antitela. Presađivanje CDR opisano je, npr. u U. S. Patentima br. 6,180,370, 6,054,297, 5,693,762, 5,859,205, 5,693,761, 5,565,332, 5,585,089 i 5,530,101, kao i u Jones et al., Nature 321: 522 - 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 - 327 (1988); Verhoeven et al., Science 239: 1534 - 1536 (1988), Winter, FEBS Letts 430: 92 - 94 (1998), koji su ovde inkorporirani po referenci za bilo koju svrhu da se koriste.

[0146] U nekim rešenjima, tehnika eksprimiranja u fagu koristi se za dobijanje monoklonskih antitela. U nekim rešenjima, takvim tehnikama se dobijaju potpuno humana antitela. U nekim rešenjima, polinukleotid koji kodira pojedinačan fragment Fab ili Fv antitela se eksprimira na površini fagne čestice. Videti, npr. Hoogenboom et al., J Mol Biol 227: 381

(1991); Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991); U. S. Patent br. 5,885,793. U nekim rešenjima, fagi se ispituju da bi se identifikovali oni čiji fragmenti antitela imaju afinitet za ciljni molekul. Stoga, određeni ovakvi procesi imitiraju selekciju imunog sistema kroz izlaganje repertoara fragmenata antitela na površini filamentoznog bakteriofaga, i potom, kroz selekciju faga prema njihovom vezivanju za ciljni molekul. U nekim ovakvim procedurama, izoluju se visoko afinitetni funkcionalno agonistični fragmenti antitela. U nekim ovakvim rešenjima, potpuni repertoar humanih gena za antitela dobija se kloniranjem prirodno rearanžiranih humanih V gena iz limfocita iz periferne krvi. Videti, npr. Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (SAD) 87: -8095 - 8099(1990).

[0147] Prema nekim rešenjima, antitela predmetnog pronalaska dobijaju se korišćenjem transgenog miša kojem je uveden značajan deo humanog genoma odgovornog za proizvodnju antitela, ali koji je učinjen đeficijentnim za proizvodnju endogenih, mišjih antitela. Ovakvi miševi su tada u stanju da proizvode humane imunoglobulinske molekule i antitela. Tehnologije koje se koriste za postizanje ovog rezultata objavljene su u patentima, zahtevima i referencama objavljenim ovde. u specifikaciji. U nekim rešenjima, mogu da se upotrebe postupci poput onih opisanih u PCT objavljenoj prijavi br. WO 98/24893 ili u Mendez et al, Nature Genetics 15: 146

- 156 (1997), koji su ovde inkorporirani po referenci za bilo koju svrhu da se koriste.

[0148] Prema nekim rešenjima, potpuno humana monoklonska antitela specifična za HGF dobijaju se na sledeći način. Transgeni miševi koji sadrže humane imunoglobulinske gene imunizuju se željenim antigenom, t.j. HGF, iz miševa se dobijaju limfne ćelije (kao što su B ćelije) koje eksprimiraju antitela. Ovako dobijene ćelije fuzionišu se sa ćelijskom linijom tipa mijeloida da bi se dobile besmrtne ćelijske linije hibridoma, a ovakve ćelije hibridoma se zatim ispituju da bi se identifikovale one ćelijske linije hibridoma koje prizvode antitela specifična za željeni antigen. U nekim rešenjima, obezbeđuje se dobijanje ćelijske linije hibridoma koja proizvodi antitela specifična za HGF.

[0149] U nekim rešenjima, potpuno humana antitela proizvode se ekspresijom rekombinantne DNK u ćelijama domaćina ili ekspresijom u ćelijama hibridoma. U 'nekim rešenjima, antitela se proizvode korišćenjem tehnike izlaganja na fagima koja je prethodno opisana.

[0150] U nekim rešenjima, potpuno humana antitela proizvode se izlaganjem humanih splenocita (B ili T ćelija) antitigenuin vitro,zatim uvođenjem ćelija koje su bile izložene antigenu u miša čiji je imuni sistem narušen, t.j. SCID ili nod/SCID. Videti, napr. Brams et al., J Immunol, 160: 2051 - 2058 (1998); Carballido et al., Nat Med, 6: 103 - 106 (2000). U nekim ovakvim pristupima, presađivanje humanog fetalnog tkiva u SCID miševe (SCID - hu) dovodi do dugotrajne hematopojeze i razvoja humanih T - ćelija. Videti, npr. McCune et al., Science 241: 1532 - 1639 (1988); Ifversen et al., Sem Immunol 8: 243 - 248 (1996). U nekim slučajevima, humoralni imuni odgovor ovakvih himernih miševa zavisi od uporednog razvoja humanih T - ćelija u ovim životinjama. Videti, npr. Martensson et al., Immunol 83: 1271 - 179

(1994). U nekim pristupima, u SCID miševe se presađuju humani limfociti iz periferne krvi. Videti, npr. Mosier et al, Nature 335: 256 - 259 (1988). U nekim ovakvim rešenjima, kada se ovakve presađene ćelije tretiraju ili sredstvom za pripremu, kao što je Stafilokokni enterotoksin A (SEA), ili anti-humanim CD 40 monoklonalnim antitelima, primećuje se veći stepen proizvodnje B ćelija. Videti, npr. Martensson et al., Immunol 84: 224 - 230 (1995); Murphv et al.,Blood 86: 1946 - 1953 (1995).

[0151] U nekim rešenjima, antitela predmetnog pronalaska dobijena su iz bar jednog od sledećih hibridoma: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1,2.4.4, 2.12.1,2.40.1 i 3.10.1. U nekim rešenjima. sredstva za specifično vezivanje se vezuju za HGF konstantom Kood IO"<8>, IO"<9>

ili 10"<10>M. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje se vezuju za HGF konstantom

disocijacije (KD) koja je u opsegu od približno 0,099 do približno 0,79 nM, što se meri kinetičkim postupcima (Slika 6A). U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje se vezuju za HGF konstantom KDkoja je u opsegu od manje od 10 pM do približno 54 pM, što se meri postupcima ravnoteže/rastvora (Slika 6B).

[0152] U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje sadrže imunoglobulinski molekul koji je bar jedan od izotipova IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD i IgM. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje sadrže humani kapa laki lanac i/ili humani teški lanac. U nekim rešenjima, teški lanac je jedan od izotipova IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD ili IgM. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje klonirana su za ekspresiju u ćelijama sisara. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje sadrže konstantni region koji je različit od konstantnog regiona izotipova IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD i IgM.

[0153] U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje sadrže humani kapa laki lanac i humani IgGl teški lanac. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje sadrže humani kapa laki lanac i humani IgG2 teški lanac. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje sadrže humani kapa laki lanac i humani IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD ili IgM teški lanac. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje sadrže varijabilne regione antitela vezane za konstantni region koji nije ni konstanti region IgGl izozipa, ni konstantni region IgG2 izotipa. U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje klonirana su za ekspresiju u ćelijama sisara.

[0154] U nekim rešenjima, konzervativne modifikacije teških i lakih lanaca antitela iz bar jedne od ćelijskih linija hibridoma: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 i 3.10.1 (i odgovarajuće modifikacije kodirajućih nukleotida) će proizvesti antitela na HGF koja imaju funkcionalne i hemijske karakteristike slične onima koje imaju antitela hibridomskih linija 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 i 3.10.1. Nasuprot tome, u nekim rešenjima, značajne modifikacije u funkcionalnim i/ili hemijskim karakteristikama antitela na HGF mogu da se dobiju izborom supstitucija u sekvenci aminokiselinskih ostataka teških i lakih lanaca koje se značajno razlikuju po svom uticaju na zadržavanje (a) strukturne molekularne kičme u oblasti u kojoj se supstitucija nalazi, na primer, na održavanje konformacije pločice ili heliksa, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na mestu supstitucije ili (c) dimenzija bočnog lanca.

[0155] Na primer, "konzervativna supstitucija aminokiselinskog ostatka" može da podrazumeva supstituciju nativnog aminokiselinskog ostatka nenativnim ostatkom na način koji prouzrokuje malu ili nikakvu promenu polarnosti ili naelektrisanja aminokiselinskog ostatka u toj poziciji. Dalje, bilo koji nativni ostatak u polipeptidu može da bude supstituisan alaninom, kao stoje prethodno opisano za "skenirajuću alaninsku mutagenezu".

[0156] Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede poželjne supstitucije aminokiselinskih ostataka (bilo da su konzervativne ili nekonzervativne) u trenutku kada su te supstitucije poželjne. U nekim rešenjima, supstitucije aminokiselinskih ostataka mogu da se koriste za identifikaciju važnih ostataka antitela na HGF, ili za povećavanje ili smanjivanje afiniteta antitela za HGF koja su ovde opisana.

[0157] U nekim rešenjima, antitela predmetnog pronalaska mogu da budu eksprimirana u ćelijskim linijama različitim od ćelijskih linija hibridoma. U nekim rešenjima, sekvence koje kodiraju određena antitela mogu da se koriste za transformaciju odgovarajuće domćinske ćelije sisara. Prema nekim rešenjima, transformacija može da se izvrši bilo kojim od poznatih postupaka za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer, pakovanje polinukleotida u virus (ili u viralni vekor) i transdukciju ovog virusa (ili vektora) u ćeliju domaćina, ili procedurama transfekcije poznatim u struci, kao što je navedeno u U. S. Patentima br. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 i 4,959,455 (ovi patenti su ovde inkorporirani po referenci za bilo koju svrhu da se koriste). U nekim rešenjima, izbor procedure transformacije koja se koristi može da zavisi od domaćina kojeg treba transformisati. Postupci uvođenja heterologih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznati u struci i obuhvataju, ali nisu ograničeni na transfekciju posredovanu dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozome i direktnu mikroinjekciju DNK u jezgro.

[0158] Sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u struci, i obuhvataju, ali nisu ograničeni na mnoge ćelijske linije učinjene besmrtnim, koje su dostupne kroz American Type Culture Collection (ATCC), obuhvatajući, bez ograničenja, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunčadi hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), humane ćelije hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2) i druge ćelijske linije. U nekim rešenjima, selekcija ćelijskih linija može da se izvrši tako što će se odrediti koje ćelijske linije imaju visok nivo ekspresije i proizvode antitela sa konstitutivnim svojstvima vezivanja za HGF. Pogodni vektori ekspresije za sisarske domaćinske ćelije su dobro poznati.

[0159] U nekim rešenjima, sredstva za specifično vezivanje sadrže jedan ili više polipeptida. U nekim rešenjima, može da se upotrebi bilo koji od različitih sistema vektor/domaćin da bi se eksprimirao polinukleotidni molekul koji kodira polipeptide. Ovakvi sistemi obuhvataju, ali nisu ograničeni na mikroorganizme, kao što su bakterije transformisane rekombinantnim bakteriofagom, plazmidnim, ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima; kvasci transformisani viralnim ekspresionim vektorima; sistemi ćelija insekata inficiranih viralnim ekspresionim vektorima (npr. bakulovirus); sistemi biljnih ćelija transficiranih viralnim ekspresionim vektorima (npr. mozaični virus karfiola, CaMV, mozaični virus duvana, TMV) ili transformisanih bakterijskim ekspresionim vektorima (npr. Ti ili pBR322 plazmid); ili sistemi životinjskih ćelija.

[0160] U nekim rešenjima, polipeptid se rekombinantno eksprimira u kvascu. Određena ovakva rešenja upotrebljavaju ekspresione sisteme koji su komercijalno dostupni, npr. Pichia Expression Svstem (Invitrogen, San Diego, CA), prema uputstvima proizvođača. U nekim rešenjima, ovakav sistem se oslanja na pre - pro - alfa sekvencu za usmeravanje sekrecije. U nekim rešenjima. transkripcija ubačenog dela je pod kontrolom promotora alkoholne oksidaze (AOXl), a započinje nakon indukcije metanolom.

[0161] U nekim rešenjima, sekretovani polipeptid se prečišćava iz podloge za rast kvasca. U nekim rešenjima, postupci koji se koriste za prečišćavanje polipeptida iz podloge za rast kvasca isti su kao oni koji se koriste za prečišćavanje polipeptida iz supernatanata iznad bakterijskih i ćelija sisara.

[0162] U nekim rešenjima, nukleinska kiselina koja kodira polipeptid klonira se u bakulovirusni ekspresioni vektor, kao što je pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). U nekim rešenjima, takav vektor može da se koristi prema uputstvima proizvođača (PharMingen) da bi se inficirale ćelije Spodoptera frugiperda u sF9 podlozi bez proteina i da bi se dobio rekombinantni polipeptid. U nekim rešenjima, polipeptid se prečišćava i koncentruje iz podloge korišćenjem kolone heparin - sefaroze (Pharmacia).

[0163] U nekim rešenjima, polipetid se eksprimira u sistemu ćelija insekata. Neki sistemi ćelija insekata za ekspresiju polipeptida su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti. U jednom od ovakvih sistema, koristi se Autographa californica nuklearni polihedrinski virus (AcNPV) kao vektor za ekspresiju stranih gena u ćelijama Spodoptera frugiperda ili u larvama Trichoplusia. U nekim rešenjima. molekul nukleinske kiseline koji enkodira polipeptid može da bude ubačen u neesencijalni gen virusa, na primer, u okviru gena za polihedrin, i stavljen pod kontrolu promotora tog gena. U nekim rešenjima, uspešna insercija molekula nukleinske kiseline će inaktivirati neesencijalni gen. U nekim rešenjima, ova inaktivacija ima za posledicu osobinu koja može da se detektuje. Na primer, inaktivacija gena za polihedrin dovodi do proizvodnje virusa bez proteinskog omotača.

[0164] U nekim rešenjima, rekombinantni virusi mogu da se upotrebe za infekciju ćelija

S. frugiperda ili larvi Trichoplusia. Videti, npr. Smith et al., J Virol 46: 584 (1983); Engelhard et

al., ProcNatl Acad Sci (USA) 91: 3224 - 7 (1994).

[0165] U nekim rešenjima, polipeptidi nastali u bakterijskim ćelijama dobijaju se kao nerastvorna inkluziona tela u bakterijama. U nekim rešenjima, ćelije domaćina koje sadrže ovakva inkluziona tela sakupljaju se centrifugiranjem; ispiraju se u 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, lmM EDTA; a zatim tretiraju rastvorom lizozima koncentracije 0,1 mg/ml (Sigma, St. Louis, MO) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. U nekim rešenjima, lizat se izbistrava sonikacijom, a ostaci ćelija uklanjaju centrifugiranjem tokom 10 minuta na 12000 xg. U nekim rešenjima, talog koji sadrži polipeptid se resuspenduje u u 50 mM trisu, pH 8, i 10 mM EDTA; ovom suspenzijom se nadsloji 50% glicerol; zatim se smeša centrifugira 30 minuta na 6000 x g. U nekim rešenjima, taj talog može da se resuspenduje u standardnom fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS) u kome nema Mg<++>i Ca<++>. U nekim rešenjima, polipeptid se dalje prečišćava frakcionisanjem resuspendovanog taloga u denaturišućem SDS poliakrilamidnom gelu (Videti, npr. Sambrook et al.,supra).U nekim rešenjima, ovakav gel može da se potopi u 0,4 M KC1 da bi se vizuelizovao protein, ta traka može da se iseče iz gela i polipeptid može iz njega da se izdvoji elektroelucijom u radnom puferu za elektroforezu bez SDS. Prema nekim rešenjima, fuzioni protein Glutation-S-Transferaze (GST) proizvodi se u bakterijama kao rastvorni protein. U nekim rešenjima, ovakav GST fuzioni protein se prečišćava upotrebom GST Purification Module (Pharmacia).

[0166] U nekim rešenjima, poželjno je da se određeni peptidi "ponovo uviju". U nekim rešenjima, takvi polipeptidi se dobijaju upotrebom određenih rekombinantnih sistema koji su ovde opisani. U nekim rešenjima, polipeptidi se "ponovo uvijaju" i/ili oksiduju da bi se dobila željena tercijerna struktura i/ili nagradile disulfidne veze. U nekim rešenjima, ovakva struktura i/ili veze su u vezi sa biološkom aktivnošću polipeptida. U nekim rešenjima, ponovno uvijanje se postiže korišćenjem bilo koje od brojnih procedura koje su u struci poznate. Primeri ovih postupaka obuhvataju, ali nisu ograničeni na, izlaganje solubilizovanog polipeptidnog sredstva pH vrednosti koja je obično veća od 7 u prisustvu haotropnog sredstva. Primer haotropnog sredstva je guanidin. U nekim rešenjima, rastvor za ponovno uvijanje/oksidaciju sadrži i redukujuće sredstvo i oksidovani oblik tog redukujućeg sredstva. U nekim rešenjima, redukujuće sredstvo i njegov oksidovani oblik prisutni su u razmeri koja će obezbediti određeni redoks potencijal koji omogućava premeštanje disulfidnih veza. U nekim rešenjima, ovo premeštanje omogućava nastanak cisteinskih mostova. Primeri redoks parova obuhvataju, ali nisu ograničeni na cistein/cistamin, glutation/ditiobisGSH, kupri hlorid, ditiotreitol DTT/ditian DTT i 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-bME. U nekim rešenjima, da bi se povećala efikasnost ponovnog uvijanja koristi se ko-rastvarač. Primeri ko-rastvarača obuhvataju, ali nisu ograničeni na glicerol, polietilen glikol različitih molekulskih masa i arginin.

[0167] U nekim rešenjima, zapravo se prečišćava polipeptid. Određene tehnike za prečišćavanje poznate su stručnjacima u ovoj oblasti. U nekim rešenjima, prečišćavanje proteina podrazumeva grubo odvajanje polipeptidnih frakcija od ne-polipeptidnih frakcija. U nekim rešenjima, polipeptidi se prečišćavaju korišćenjem hromatografskih i/ili elektroforetskih tehnika. Primeri postupaka prečišćavanja polipeptida obuhvataju, ali nisu ograničeni na taloženje amonijum sulfatom; taloženje polietilen glikolom; imunoprecipitaciju; denaturaciju toplotom praćenu centrifugiranjem; hromatografiju koja obuhvata, ali nije ograničena na afinitetnu hromatografiju (npr. Protein - A - Sepharose), jonoizmenjivačku hromatografiju, ekskluzionu hromatografiju i reverzno faznu hromatografiju; gel filtraciju; hidroksilapatitnu hromatografiju; izoelektrofokusiranje; elektroforezu na poliakrilamidnom gelu; i kombinacije ovakvih i drugih tehnika. U nekim rešenjima, polipeptid se prečišćava brzom proteinskom tečnom hromatografijom ili tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom (HPLC). U nekim rešenjima, koraci u prečišćavanju mogu da se promene ili mogu da se izostave određeni koraci, a da se pri tom ipak dobije odgovarajući postupak za pripremu značajno prečišćenog polipeptida.

[0168] U nekim rešenjima, kvantifikuje se stepen prečišćenosti polipeptidnog preparata. Određeni postupci za kvantifikaciju stepena prečišćenosti poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Primeri ovakvih postupaka obuhvataju, ali nisu ograničeni na određivanje specifične aktivnosti vezivanja preparata i određivanje količine polipeptida u preparatu SDS/PAGE analizom. Primeri postupaka za određivanje prečišćenosti polipeptidnog preparata sadrže izračunavanja vezivne aktivnosti preparata i poređenja te aktivnosti sa vezivnom aktivnosti prvog ekstrakta. U nekim rešenjima, rezultati ovog izračunavanja izražavaju se kao "puta prečišćen". Jedinice u kojima se izražava količina vezivne aktivnosti zavise od konkretnog testa koji se koristi.

[0169] U nekim rešenjima, polipeptid je delimično prečišćen. U nekim rešenjima, delimično prečišćavanje može da se postigne korišćenjem manjeg broja koraka prečišćavanja ili korišćenjem drugačijih oblika iste opšte šeme prečišćavanja. Na primer, u nekim rešenjima, katjonitska jonoizmenjivačka hromatografija u koloni koja se koristi u aparaturi za HPLC će, uopšteno gledano, dati više "puta prečišćen" preparat nego ista tehnika kada se koristi u sistemu za hromatografiju pri nižem pritisku. U nekim rešenjima, postupci koji dovode do manjeg stepena prečišćenosti mogu da daju veći ukupan prinos polipeptida, ili da donose prednost u odnosu na održavanje vezivne aktivnosti polipeptida.

[0170] U nekim slučajevima, elektroforetska pokretjivost polipeptida može da se menja, nekad i značajno, u zavisnosti od različitih uslova izvođenja SDS/PAGE. Videti, npr. Capaldi et al., Biochem BicphvsVRes Comm, 76: 425 (1977). Treba uzeti u obzir da, pod različitim uslovima elektroforeze, očitane molekulske mase prečišćenih ili delimično prečišćenih polipeptida mogu da budu različite.

Neki primeri epitopa

[0171] U nekim rešenjima, obezbeđeni su epitopi koje prepoznaju anti - HGF antitela (videti, npr. Primer 8, Slike 10 i 11, i sekvence čiji su ID brojevi 164 i 165). U nekim rešenjima, HGF epitop može da se upotrebi da bi se sprečilo vezivanje anti - HGF antitela, ili sredstva za specifično vezivanje, za HGF. U nekim rešenjima, HGF epitop može da se upotrebi da bi se smanjilo vezivanje anti - HGF antitela, ili sredstva za specifično vezivanje, za HGF. U nekim rešenjima, HGF epitop može da se upotrebi da bi se značajno inhibiralo vezivanje anti - HGF antitela, ili sredstva za specifično vezivanje, za HGF. Epitop značajno inhibira vezivanje anti - HGF antitela, ili sredstva za specifično vezivanje, za HGF kada dodavanje tog epitopa u višku smanjuje količinu anti - HGF antitela, ili sredstva za specifično vezivanje, vezanog za HGF za bar oko 20%, 40 %, 60%, 80%, 85% ili više. U nekim rešenjima, HGF epitop može da se upotrebi da veže anti - HGF antitelo, ili sredstvo za specifično vezivanje. U nekim rešenjima, HGF epitop može da se upotrebi za identifikaciju antitela ili sredstva za specifično vezivanje koja se vezuju za HGF. U nekim rešenjima, HGF epitop može da se upotrebi za izolovanje antitela ili sredstva za specifično vezivanje koja se vezuju za HGF. U nekim rešenjima, HGF epitop može da se upotrebi za dobijanje antitela ili sredstava za specifično vezivanje koja se vezuju za HGF. U nekim rešenjima, HGF epitop može da se upotrebi kao imunogen za dobijanje antitela ili sredstava za specifično vezivanje koja se vezuju za HGF. U nekim rešenjima, HGF epitop može da se da životinji, da bi se nakon toga iz te životinje dobila antitela koja se vezuju za HGF. U nekim rešenjima, HGF epitop može da se upotrebi za ometanje normalne HGF - Met signalizacije.

Određene terapijske primene

[0172] U nekim rešenjima, obezbeđeni su postupci za lečenje kancera koji obuhvataju primenu terapijski efikasne količine jednog ili više sredstava za specifično vezivanje HGF. U nekim rešenjima, obezbeđeni su postupci za lečenje kancera koji obuhvataju davanje terapijski delotvorne količine jednog ili više sredstava za specifično vezivanje HGF i još nekog terapijskog sredstva.

[0173] U nekim rešenjima, obezbeđeni su postupci za lečenje ili prevenciju malarije koji obuhvataju primenu terapijski delotvorne količine jednog ili više sredstava za specifično vezivanje HGF. U nekim rešenjima, obezbeđeni su postupci za lečenje ili prevenciju malarije koji obuhvataju primenu terapijski delotvorne količine jednog ili više sredstava za specifično vezivanje HGF i još nekog terapijskog sredstva.

[0174] U nekim rešenjima, obezbeđeni su postupci za lečenje ili prevenciju proliferativne dijabetske retinopatije koji obuhvataju primenu terapijski delotvorne količine jednog ili više sredstava za specifično vezivanje HGF. U nekim rešenjima, obezbeđeni su postupci za lečenje ili prevenciju proliferativne dijabetske retinopatije koji obuhvataju primenu terapijski delotvorne količine jednog ili više sredstava za specifično vezivanje HGF i još nekog terapijskog sredstva.

[0175] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF se primenjuje samo. U nekim rešenjima, primena sredstva za specifično vezivanje HGF prethodi primeni bar još jednog terapijskog sredstva. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF se primenjuje istovremeno sa primenom bar još jednog terapijskog sredstva. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF se primenjuje nakon primene bar još jednog terapijskog sredstva. Terapijska sredstva obuhvataju, ali nisu ograničena na bar još jedno sredstvo za terapiju kancera. Primeri sredstava za terapiju kancera obuhvataju, ali nisu ograničeni na terapiju zračenjem i hemoterapiju.

[0176] Farmaceutski preparati predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju u kombinovanoj terapiji, t.j. u kombinaciji sa drugim sredstvima. U nekim rešenjima. kombinovana terapija podrazumeva sredstvo za specifično vezivanje koje je u stanju da veže HGF, u kombinaciji sa bar još jednim anti - angiogenetskim sredstvom. Sredstva obuhvataju, ali nisu ograničena na, hemijske preparate pripremljenein vitrosintetički, antitela, antigen vezujuće regione, radionuklide, kao i njihove kombinacije i konjugate. U nekim rešenjima, sredstvo može da deluje kao agonist, antagonist, alosterični modulator ili toksin. U nekim rešenjima, sredstvo može da deluje tako što inhibira ili stimuliše svoj ciljni molekul (npr. aktivacija ili inhibicija receptora ili enzima) i na taj način promoviše ćelijsku smrt ili zaustavlja rast ćelija.

[0177] Hemoterapijski tretmani obuhvataju, ali nisu ograničeni na anti - neoplastična sredstva koja obuhvataju, ali nisu ograničena na alkilujuća sredstva koja obuhvataju: azotne plikavce kao što su mehloretamin, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan i hlorambucil; nitrozouree, kao što su karmustin (BCNU), lomustin (CCNU) i semustin (metil - CCNU); Tembdal™

(temozolamid), etilenimine/metilmelamine kao što su trietilenmelamin (TEM), trietilen, tiofosforamid (tiotepa), heksametilmelamin (HMM, altretamin); alkil sulfonate kao što je

busulfan; triazine kao što je dakarbazin (DTIC); antimetabolite, uključujući analoge folne kiseline kao što su metotreksat i trimetreksat, anaoge pirimidina kao što su 5-fluoruracil (5FU), fluordeoksiuridin, gemcitabin, citozin arabinozid (AraC, citarabin), 5-azacitidin, 2,2'-difluordeoksicitidin, analoge purina kao što su 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, azatioprin, 2-deoksikoformicin (pentostatin), eritrohidroksinoniladenin (EHNA), fludarabin fosfat i 2-hlordeoksiadenozin (kladribin, 2-CdA); prirodne proizvode uključujući antimitotičke lekove kao što je paklitaksel, alkaloidi zimzelena uključujući vinblastin (VLB), vinkristin i vinorelbin, taksoter, estramustin i estramustin fosfat; pipodofdotoksine kao što su etopozid i tenipozid; antibiotike kao što su aktimomicin D, daunomicin (rubidomicin), doksorubicin, mitoksantron, idarubicin, bleomicini, plikamicini (mitramicini), mitomicinC i aktinomicin; enzime kao što je L - asparaginaza; modifikatore biološkog odgovora kao što su interferon - alfa, IL-2, G-CSF i GM-CSF; različita sredstva uključujući koordinativne komplekse platine kao što su cisplatin i karboplatin, antracendione kao što je mitoksantron, supstituisane uree kao što je hidroksiurea, derivate metilhidrazina uključujući N-metilhidrazin (MIH) i prokarbazin, adrenokortikalne supresante kao što su mitotan (o,p'-DDD) i aminoglutetimid; hormone i antagoniste uključujući adrenokortikosteroidne antagoniste kao što su prednizon i njegovi ekvivalenti, deksametazon i aminoglutetimid; Gemzar™ (gemcitabin), progestine kao što su hidroksiprogesteron kaproat, medroksiprogesteron acetat i megestrol acetat; estrogene kao što su dietilstilbestrol i ekvivalenti etinil estradiola; antiestrogene kao što je tamoksifen; androgene uključujući testosteron propionat i fluoksimesteron/ekvivalente; antiandrogene kao što je flutamid, analoge gonadotropin - oslobađajućeg hormona i leuprolid; kao i nesteroidne antiandrogene kao što je flutamid.

[0178] Terapije kancera, koje mogu da se primenjuju uz sredstvo za specifično vezivanje HGF. takođe obuhvataju, ali nisu ograničena na ciljane terapije. Primeri ciljanih terapija obuhvataju, ali nisu ograničeni na korišćenje terapeutskih antitela. Primeri terapeutskih antitela obuhvataju, ali nisu ograničeni na mišja, mišja/humana himerna, antitela sa presađenim CDR, humanizovana i potpuno humana antitela, kao i sintetička antitela koja obuhvataju, ali nisu ograničena na ona izabrana testiranjem biblioteka antitela. Primeri antitela obuhvataju, ali nisu ograničeni na ona koja vezuju proteine na površini ćelije Her2, CDC20, CDC33, glikoprotein sličan mucinu i receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) koji su prisutni na tumorskim ćelijama, i koja mogu opciono da imaju citostatičke i/ili citotoksične efekte na tumorske ćelije koje na svojoj površini imaju ove proteine. Primeri antitela takođe uključuju HERCEPTIN<1M>(trastuzumab), koji može da se koristi u lečenju raka dojke i drugih vrsta kancera i RITUXAN™

(rituksimab), ZEVALIN™ (ibritumomab tiuksetan), GLEEVEC™ i LYMPHOCIDE™

(epratuzumab), koji mogu da se koriste u lečenju ne - Hodžkinosnovog limfoma i drugih vrsta

kancera. Određeni primeri antitela takođe uključuju ERBITUX<rM>(IMC-C225); ertinolib (Iressa); BEXXAR™ (Jod 131 tositumomab); inhibitore KDR (receptor kinaznog domena); anti VGF antitela i antagoniste (npr. Avastin™ i VEGAF - TRAP); anti VEGF receptor antitela i antigen vezujuće domene; anti - Ang-1 i Ang-2 antitela i antigen vezujuće domene; antitela na Tie-2 i druge Ang-1 i Ang-2 receptore; Tie-2 Ugande; antitela na inhibitore Tie-2 kinaze; kao i Campath<®>(Alemtuzumab). U nekim rešenjima, sredstva za lečenje kancera su polipeptidi koji selektivno indukuju apoptozu u tumorskim ćelijama, uključujući, ali bez ograničenja na TRAIL, polipeptid srodan TNF.

[0179] U nekim rešenjima, sredstva za terapiju kancera su anti - angiogena sredstva koja smanjuju angiogenezu. Ovakva sredstva obuhvataju, ali nisu ograničena na IL-8; Kampat, B-FGF; FGF antagoniste; Tek antagoniste (Cerretti et al., U.S. Publikacija br. 2003/0162712; Cerretti et al., U.S. Patent br. 6,413,932 i Cerretti et al., U.S. Patent br. 6,521,424, koji'su svi ovde inkorporirani po referenci za bilo koju svrhu da se koriste); anti - TWEAK sredstva (koja obuhvataju, ali nisu ograničena na antitela i antigen vezujuće regione); rastvorne antagoniste TWEAK receptora (Wiley, U.S. Patent br. 6,727,225); domen ADAM dezintegrina da antagonizuje vezivanje integrina za njegove Ugande (Fanslovv ct al., U.S. Publikacija br. 2002/0042368); anti - eph receptor i anti - efrin antitela; antigen vezujući regioni ili antagonisti (U.S. Patentni br. 5,981,245; 5,728,813; 5,969,110; 6,596,852; 6,232,447; 6,057,124 i članovi njihovih patentnih familija); anti - VEGF sredstva (npr. antitela ili antigen vezujući regioni koji specifično vezuju VEGF ili rastvorne VEGF receptore ili njihove ligand vezujuće regione) kao što su Avastin™ i VEGF - TRAP™, kao i anti-VEGF receptor sredstva (t.j. antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju za njega), EGFR inhibitorna sredstva (t.j. antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju za njega) kao što su panitumumab, IRESSA™

(gefitinib), TARCEVA™ (erlotinib), anti - Ang - 1 i anti - Ang - 2 sredstva (t.j. antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju za njih ili njihove receptore, t.j. Tie-2/TEK), kao i anti - Tie-2 kinaze inhibitorna sredstva (t.j. antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju i inhibiraju aktivnost faktora rasta, kao što su antagonisti faktora rasta hepatocita (HGF. poznatog i kao faktor rasipanja) i antitela ili antigen vezujući regioni koji se specifično vezuju za njegov receptor "c-met"; anti - PDGF - BB antagonisti; antitela i antigen vezujući domeni na PDGF - BB Ugande; kao i inhibitori PDGFR kinaze.

[0180] U nekim rešenjima, sredstva za terapiju kancera su inhibitori angiogeneze. Primeri takvih inhibitora obuhvataju, ali nisu ograničeni na SD-7784 (Pfizer, SAD); cilengitid (Merck KGaA, Nemačka, EPO 770622); pegaptanib oktanatrijum (Gilead Sciences, 'SAD); Alfastatin (BioActa. Velika Britanija); M-PGA (Celgene, SAD, US 5712291); ilomastat (Arriva, SAD, US 5892112); semaksanib (Pfizer, SAD, US 5792783); vatalanib (Novartis, Švajcarska); 2-metoksiestradiol (EntreMed, SAD); TLC ELL - 12 (Elan, Irska); anekortav acetat (Alcon, SAD); alfa - Dl48 Mab (Amgen, SAD); CEP - 7055 (Cephalon, SAD); anti - Vn Mab (Crucell, Holandija); DAC: antiangiogenik (ConjuChem, Kanada); Angiocidin (InKine Pharmaceutical, SAD); KM - 2550 (Kyowa Hakko, Japan); SU - 0879 (Pfizer, SAD); CGP - 79787 (Novartis, Švajcarska, EP 970070); ARGENT tehnologiju (ARIAD, SAD); YIGSR - stelt (Johnson & Johnson, SAD); fragment fibrinogena - E (BioActa, Velika Britanija); inhibitor angiogeneze (Trigen, Velika Britanija); TBC - 1635 (Encvsive Pharmaceuticals, SAD); SC - 236 (Pfizer, SAD); ABT - 567 (Abbott, SAD); Metastatin (EntreMed, SAD); inhibitor angiogeneze (Tripep, Švedska); maspin (Sosei, Japan); 2-metoksiestradiol (Oncologv Sciences Corporation, SAD); ER-68203-00 (IVAX, SAD); Bencfin (Lane Labs, SAD); Tz - 93 (Tsumura, Japan); TAN - 1120 (Takeda, Japan); FR - 111142 (Fujisawa, Japan, JP 02233610); faktor pločica 4 (RepliGen, SAD, EP 407122); antagonist faktora rasta vaskularnog endotelijuma (Borean, Danska); terapiju kancera (Universitv of South Carolina, SAD); bevacizumab (pINN) (Genentech, SAD); inhibitore angiogeneze (SUGEN, SAD); XL - 784 (Exelixis, SAD); MAb, alfa5beta3 integrin, druge generacije (Applied Molecular Evolution, SAD & Medlmmune, SAD); genska terapiju, retinopatiju (Oxford BioMedica, Velika Britanija); enzastaurin hidrohlorid (USAN), (Lilly, SAD); CEP 7055 (Cephalon, SAD & Sanofi - Svnthelabo, Francuska); BC 1 (Genoa Institute of Cancer Research. Italija); inhibitor angiogeneze (Alchemia, Australija); antagonist VEGF (Regeneron, SAD); rBPI 21 i antiangiogenik izveden iz BPI (XOMA, SAD); PI 88 (Progen, Australija); cilengitid (pINN) (Merck KGaA, Nemačka; Munich Technical University, Nemačka, Scripps Clinic ar.d Research Foundation, SAD); cetuksimab (INN), (Aventis, Francuska); AVE 8062 (Ajinomotc . Japan); AS 1404 (Cancer Research Laboratory, Novi Zeland); SG 292 (Telios, SAD); Endostatin (Boston Childrens Hospital, SAD); ATN 161 (Attenuon, SAD); ANGIOSTATIN (Boston Childrens Hospital, SAD); 2-metoksiestradiol (Boston Childrens Hospital, SAD>: ZD 6474 (AstraZeneka, Velika Britanija); ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals. Velika Britanija); PPI 2458 (Praecis, SAD); AZD 9935 (AstraZeneka, Velika Britanija); AZD 2171 (AstraZeneka, Velika Britanija); vatalanib (pINN) (Novartis, Švajcarska & Schering AG, Nemačka); inhibitore puta tkvinog faktora (EntreMed, SAD); pegaptanib (Pinn)

(Gilead Sciences. SAD); ksantorizol (Yonsei University, Južna Koreja); vakcinu, zasnovanu na genima, VEGF - 2 (Scripps Clinic and Research Foundation, SAD); SPV5.2 (Supratek, Kanada); SDX 103 (University of California at San Diego, SAD); PX 478 (ProIX, SAD); METASTATIN (EntreMed, SAD): troponin I (Harvard University, SAD); SU 6668 (SUGEN, SAD); 0X1 4503 (OXiGENE, SAD); o-guanidine (Dimensional Pharmaceuticals, SAD); motuporamin C (British

Columbia Universitv, Kanada); CDP 791 (Celltech Group, Velika Britanija); atiprimod (pINN)

(GlaxoSmithKline. Velika Britanija); E 7820 (Eisai, Japan); CYC 381 (Harvard Uni<y>ersity, SAD); AE 941 (Aeterna, Kanada); vakcinu, angiogenezu (EntreMed, SAD); inhibitor aktivatora plazminogena urokinaze (Dendreon, SAD); oglufanid (pINN) (Melmotte, SAD); HIF - 1 alfa inhibitore (Xenova, Velika Britanija); CEP 5214 (Cephalon, SAD); BAY RES 2622 (Bayer, Nemačka); Angiocidin (InKine, SAD); A6 (Angstrom, SAD); KR 31372 (Korea Research Institute of Chemical Technology, Južna Koreja); GW 2286 (GlaxoSmithKline, Velika Britanija); EHT 0101 (ExonHit, Francuska); CP 868596 (Pfizer, SAD); CP 564959 (OSI, SAD); CP 547632 (Pfizer, SAD); 786034 (GlaxoSmithKline, Velika Britanija); KRN 633 (Kirin Brewery, Japan); sistem za dopremanje lekova, intraokularni, 2-metoksiestradiol, (EntreMed, SAD); angineks (Maastricht University, Holandija & Minnesota University, SAD); ABT 510 (Abbott, SAD); AAL 993 (Novartis, Švajcarska); VEGI (ProteomTech, SAD); inhibitore faktora nekroze tumora - alfa (National Institute on Aging, SAD); SU 11248 (Pfizer, SAD & SUGEN, SAD); ABT 518 (Abbott, SAD); YH16 (Yantai Rongchang, Kina); S-3APG (Boston Childrens Hospital, SAD & EntreMed, SAD); Mab, KDR (ImClone Systems, SAD); Mab alfa5 beta 1 (Protein Design, SAD); inhibitor KDR kinaze (Celltech Group, Velika Britanija & Jonhson & Johnson, SAD); GFB 116 (South Florida University, SAD & Yale University, SAD); CS 706 (Sankyo, Japan); kombretastatin A4 prolek (Arizona State University, SAD); hondroitinaza AC (IBEX, Kanada); BAY RES 2690 (Bayer, Nemačka); AGM 1470 (Harvard University, SAD, Takeda, Japan & TAP, SAD); AG 13925 (Agouron, SAD); tetratiomolibrad (University of Michigan, SAD): GCS 100 (Wayne State University, SAD); CV247 (Ivy Medical, Velika Britanija); CKD 732 (Chong Kun Dang, Južna Koreja); Mab, faktor rasta vaskularnog endotelijuma (Xenova, Velika Britanija); irsogladin (INN) (Nippon Shinvaku, Japan); RG, 13577 (Aventis, Francuska); WX 360 (Wilex, Nemačka); skvalamin (pINN), (Genaera, SAD); RPI 4610, (Sirna, SAD); terapiju kancera (Marinova, Australija); inhibitore heparanaze (InSight, Izrael); KL 3106 (Kolon, Južna Koreja); Honokiol (Emory University, SAD); ZK CDK (Schering AG, Nemačka); ZK Angio (Schering AG, Nemačka); ZK 229561 (Novartis, Švajcarska i Schering AG, Nemačka); XMP 300 (XOMA, SAD); VGA 1102 (Taisho, Japan); modulatore VEGF receptora (Pharmacopeia, SAD); antagoniste VE-kadherin-2 (ImClone Systems, SAD); Vazostatin (National Institute of Health, SAD); vakcinu, Flk-1 (ImClone Systems, SAD); TZ 93 (Tsumura, Japan); TumStatin (Beth Israel Hospital, SAD); nepotpuni rastvorili FLT 1 (receptor 1 vaskularnog endotelijalnog faktora rasta), (Merck & Co, SAD); ligande Tie-2 (Rageneron, SAD); inhibitor trombospondina 1 (Alleghenv Health, Education and Research Foundation, SAD); 2-benzensulfonamid, 4-(5-(4-hlorfenil)-3-(trilluormetil)-lH-

pirazol-l-il)-; Arriva; i C-Met.AVE 8062 ((2S)-2-amino-3-hidroksi-N-[2-metoksi-5-[(lZ)-2-(3,4,5-trimetoksifenil)etenil]fenil]propanamid monohidrohlorid); metelimumab (pINN)

(imunoglobulin G4, anti-(humani transformacioni faktor rasta .beta.l(dimer humanog monoklonskog CAT 192 .gama.4 - lanca)), disulfid sa dimerom humanog monoklonskog CAT 192 .kapa. - lanca); ligand Flt3; ligand CD 40; interleukin-2; interleukin-12; ligand 4-1BB; anti-4-1BB antitela; antagoniste TNF i antagoniste TNF receptora, uključujući TNFR/Fc, antagoniste TWEAK i antagoniste TWEAK-R, uključujući TWEAK-R/Fc; TRAIL; antagoniste VEGF uključujući anti-VEGF antitela; antagoniste VEGF receptora (uključujući VEGF-R1 i VEGF-R2, koji su takođe poznati kao Flt 1 i Flk 1 ili KDR); antagoniste CD 148 (označenog i kao DEP-1, ECRTP i PTPRJ, videti Takahashi et al, J. Am. Soc. Nephrol. 10: 2135 - 45 (1999), koji je ovde inkorporiran u potpunosti po referenci za koju god svrhu da se koristi); inhibitor trombospondina 1 i inhibitor jednog ili oba Tie-2 ili liganada Tie-2 (kao što je Ang-2). U struci je poznato više inhibitora Ang-2, uključujući i anti-Ang-2 antitela opisana u objavljenoj SAD Patentnoj prijavi br. 20030124129 (koja odgovara PCT aplikaciji br. V/O03/030833) i SAD Patentu br. 6,166,185, čiji je sadržaj ovde inkorporiran u potpunosti po referenci. Uz to, u struci su poznata i anti-Ang-2 peptitela, koja mogu da se pronađu u, na primer, objavljenoj SAD Patentnoj prijavi br. 20030229023 (koja odgovara PCT aplikaciji br. WO03/057134) i objavljenoj SAD Patentnoj prijavi br. 20030236193, čiji je sadržaj ovde inkorporiran u potpunosti po referenci.

[0181] Određena terapijska sredstva protiv kancera obuhvataju, ali nisu ograničena na: talidomid i analoge talidomida (N-(2,6-diokso-3-piperidil)ftalimid); natrij um tekogalan (sulfonovani polisaharid peptidoglikan); TAN 1120 (8-acetil-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,l 1-lrihidroksi-l-metoksi-10[[oktahidro-5-hidroksi-2-(2-hidroksipropil)-4,10-dimetilpirano[3,4-d]-1.3,6-dioksazocin-8-il]oksi]5,12-naftacendion); suradista (tetranatrij umova so 7,7'-[karbonilbis[imino(l-metil-lH-pirol-4,2-diil)karbonilimino(l-metil-lH-pirol-4,2-diil)karbonilimino]]bis-l,3-naftalendisulfonske kiseline); SU 302; SU 301; SU 1498 ((E)-2-cijano-3-[4-hidroksi-3,5-bis(lmetiletil)fenil]-N-(3-fenilpropil)-2-propenamid); SU 1433 (4-(6,7-dimetil-2-kvinoksalinil)-l,2-benzendiol); ST 1514; SR 25989; rastvorni Tie-2; derivate SERM; farmos; semaksanib (pIrsrN)(3-[(3,5-dimetil-lH-pirol-2-il)metilen]-l,3-dihidro-2H-indol-2-on); S 836; RG 8803; RESTIN; R 440 (3-( 1 -metil-1 H-indol-3-il)-4-( 1 -metil-6-nitro-1 H-inđol-3-il)-1H- .. pirol-2,5-dion); R 123942 (l-[6-(l,2,4-tiadiazol-5-il)-3-piridazinil]-N-[3-(trifluormetil)fenil]-4-piperidinamin); inhibitor prolil hidroksilaze; gene čija je ekspresija povećana pri progresiji (progression elevated genes); prinomastat (INN) ((S)-2,2-dimetil-4-[[p-(4-piridiloksi)fenil]sulfonil]-3-tiomorfolinkarbohidroksaminska kiselina); NV 1030; NM 3 (8-hidroksi-6-metoksi-alfa-metil-l-okso-lH-2-benzopiran-3-sirćetna kiselina); NF 681; NF 050; MIG; METH 2; METH 1; manasantin B (alfa-[l-[4-[5-[4-[2-(3,4-dimetoksifenil)-2-hidroksi-l-metiletoksi]3-metoksifenil]tetrahidro-3,4-dimetil-2-furanil]-2-metoksifenoksi]etil]-l,3-benzodioksol-5-metanol); KDR monoklonsko antitelo; alfa5beta3 integrnisko monoklonsko antitelo; LY 290293 (2-amino-4-(3-piridinil)-4H-nafto[l,2-b]piran-3-karbonitril); KP 0201448; KM 2550; integrin-specifične peptide; INGN 401; GYKI 66475; GYKI 66462; grinstatin (101-354-plazminogen (humani)); gensku terapiju za reumatoidni artritis, kancer prostate, kancer jajnika, gliom, endostatin, kolorektalni kancer, ATF BTPI, gene antiangiogeneze, inhibitor angiogeneze, ili angiogenezu; inhibitor gelatinaze, FR 111142 (5-metoksi-4-[2-metil-3-(3-metil-2- butenil)oksiranii]-l-oksaspiro[2.5]okt-6-il estar 4,5-dihidroksi-2-heksenske kiseline); forfenimeks (pINN) ((S)-alfa-amino-3-hidroksi-4-(hidroksimetil)benzensirćetna kiselina); antagonist fibronektina (1-acetil-L-prolil-L-histidil-L-seril-L-cisteinil-L-aspartamid); inhibitor receptora faktora rasta fibroblasta; antagonist faktora rasta fibroblasta; FCE 27164 (heksanatrijumova so 7,7'-[karbonilbis[imino(l-metil-lH-pirol-4,2-diil)karbonilimino(l-metil-lH-pirol-4,2-diil)karbonilimino]]bis-l,3,5-naftalentrisulfonske kiseline); FCE 26752' (8,8'-[karbonilbis[imino( 1 -metil-1 H-pirol-4,2-diil)karbonilimino( 1 -metil-1 H-pirol-4,2-diil)karbonilimino]]bis-l,3,6-naftalentrisulfonska kiselina); aktivatorski polipeptid II endotelijalnih monocita; VEGFR antiesens oligonukleotid; anti-angiogenske i tropne faktore; ANCHOR angiostatsko sredstvo; endostatin; Del-1 angiogeni protein; CT 3577; kontortrostatin; CM 101; hondroiiinaza AC; CDP 845; KanStatin; BST 2002; BST 2001; BLS 0597; BIBF 1000; ARRESTTN; apoinigren (1304-1388-kolagen tipa XV (prekursor humanog gena COL15A1 alfa-1 lanca)); angioinhibin; aaATIII; A 36; 9alfa-fluormedroksiprogesteron acetat ((6-alfa)-17-(acetiloksi)-9-flucr-6-metil-pregn-4-en-3,20-dion); 2-metil-2-ftalimidino-glutarna kiselina (2-(l,3-dihidro-l-okso-2H-izoindol-2-il)-2-metilpentandikarboksilna kiselina); BC-1 monoklonsko antitelo obeleže::o Itrijumom 90; Semaksanib (3-(4,5-dimetilpirol-2-il-metilen)indolin-2-on)(C15 H14 N2 O); PI 88 (fosfomanopentozo sulfat); Alvocidib (4H-l-benzopiran-4-on, 2-(2-hlorfenil)-5,7-dih:droksi-8-(3-hidroksi-l-metil-4-piperidinil)-cis-(-)-) (C21 H20 Cl N 05); E 7820; SU 11248 ((2-dietilaminoetil)amid 5-[3-fluor-2-okso-l,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-lH-pi:ol-3-karboksilne kiseline) (C22 H27 F N4 02); Skvalamin (holestan-7,24-diol, 3- [[3-[(4-aminobutil)aminopropil]amino]-, 24-(hidrogensulfat), (3.beta.,5.alfa.,7.alfa.)-) (C34 H65 N3 05 S); Eriohrom Blek T; AGM 1470 (karbaminska kiselina, (hloracetil)-, 5-metoksi-4-[2-metil-3-(3-met:l-2-butenil)oksiranil]-l-oksapiro[2,5]okt-6-il estar, [3R-[3alfa,4alfa(2R,3R),5beta,6beta]]) (Cl9 H28 Cl N 06); AZD 9935; BIBF 1000; AZD 2171; ABT 828; KS-interleukin-2; Uteroglobin; A 6; NSC 639366 (l-[3-(dietilamino)-2-hidroksipropilam;no]-4-(oksiran-2-ilmetilamino)antrakinon fumerat) (C29 H29 N3 04 . C4 H4 04); ISV 616; anti-ED-B fuzioni proteini; HUI 77; Troponin I; BC-1 monoklonsko antitelo; SPV 5.2; ER 68203; CKD 731 ((3R,4S,5S,6R)-4-[2(R)-metil-3(R)-3(R)-(3-metil-2-butenil)oksiran-2-il]-5 -metoksi-1 -oksaspiro[2.5] okt-6-il estar 3 -(3,4,5 -trimetoksifenil)-2(E)-propenske kiseline) (C28 1138 08); IMC-1C11; aaATIII; SC 7; CM 101; Angiokol; Kringl 5; CKD 732 (3-[4-[2-(dimetilamino)etoksi]fenil]-2-(E)-propenska kiselina) (C29 H41 N 06); U 995; Kanstatin; SQ 885; CT 2584 (l-[ll-(dodecilamino)-10-hidroksiundecil]-3,7-dimetilksantin)

(C30 H55 N5 03); Slamozin: EMAP II; TX 1920 (l-(4-metilpiperazino)-2-(2-nitro-lH-l-imidazoil)-l-etanon) (CIO H15 N5 03); inhibitor Alfa-v Beta-x; CHIR 11509 (N-(l-propinil)glicil-[N-(2-naftil)]glicil-[N-(karbamoilmetil)]glicin bis(4-metoksifenil)metilamiđ) (C36 H37 N5 06); BST 2002; BST 2001; B 0829; FR 111142; (3R,4S,5S,6R)-4-[l(R),2(R)-epoksi-l,5-dimetil-4-heksenil]-5-metoksi-l-oksaspiro[2.5]oktan-6-il estar 4,5-dihidroksi-2(E)-heksenske kiseline (C22 H34 07); kao i inhibitore kinaza koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, N-(4-hlorfenil)-4-(4-piridinilmetil)-l-ftalazinamin;4-[4-[[[[4-hlor-3-(trifluormetil)fenil]amino]karbonil]amino]fenoksi]-N-metil-2-piridinkarboksamid; N-[2-(dietilamino)etil]-5-[(5-fluor-l,2-dihidro-2-okso-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-lH-pirol-3-karboksamid; 3-[(4-brom-2,6-difluorfenil)metoksi]-5-[[[[4-(l-pirolidinil)butil]amino]karbonil]amino]-4-izotiazolkarboksamid; N-(4-brom-2-fluorfenil)-6-metoksi-7-[(l-metil-4-piperidinil)metoksi]-4-kinazolinamin; 3-[5,6,7,13-tetrahidro-9-[(l-metiletoksi)metil]-5 -okso-12H-indeno [2,1 -ajpirolo [3,4-c]karbazol-12-il]propil estar N,N-dimetil-glicina; N-[5-[[[5-(l,l-dimetiletil)-2-oksazolil]metil]tio]-2-tiazolil3-4-piperidinkarboksamid; N-[3-hlor-4-[(3-fluorfenil)metoksi]fenil]-6-[5-[[[2-(metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4-kinazolinamin; 4-[(4-metil-l-piperazinil)metil]-N-[4-metil-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]-fenil]benzamid; N-(3-hlor-4-fluorfenil)-7-metoksi-6-[3-(4-morfolinil)propoksi]-4-kinazolinamin; N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoksietoksi)-4-kinazolinamin; N-(3-((((2R)-l-metil-2-pirolidinil)metil)oksi)-5-(trifluormetil)fenil)-2-((3-(l,3-oksazol-5-il)fenil)amino)-3-piridinkarboksamid; 2-(((4-fluorfenil)metil)amino)-N-(3-((((2R)-l-metil-2-pirolidinil)metil)oksi)-5-(trifluormetil)fenil)-3-piridinkarboksamid; N-[3-(azetidin-3-ilmetoksi)-5-trifluormetil-fenil]-2-(4-fluor-benzilamino)-nikotinamid; 6-fluor-N-(4-(l-metiletil)fenil)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinkarboksamid; 2-((4-piridinilmetil)amino)-N-(3-(((2S)-2-pirolidinilmetil)oksi)-5-(trifluonnetil)fenil)-3- ' piridinkarboksamid; N-(3-(l,l-dimetiletil)-lH-pirazol-5-il)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinkarboksamid; N-(3,3-dimetil-2,3-dihidro-l-benzofuran-6-il)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinkarboksamid; N-(3-((((2S)-l-metil-2-pirolidinil)metil)oksi)-5-(trifluormetil)fenil)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinkarboksamid; 2-((4-piridinilmetil)amino)-N-(3-((2-(l-

pirolidinil)etil)oksi)-4-(trifluormetil)fenil)-3-piridinkarboksamid; N-(3,3-dimetil-2,3-dihidro-lH-indol-6-il)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinkarboksamid; N-(4-(pentafluoretil)-3-(((2S)-2-pirolidinilmetil)oksi)fenil)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinkarboksamid; N-(3-((3-azetidinilmetil)oksi)-5-(trifluormetil)fenil)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-pi^ N-(3.(4-piperidiniloksi)-5-(trifluormetil)fenil)-2-((2-(3-piridinil)etil)amino)-3-piridinkarboksan^ N-(4,4-dimetil-1,2.3,4-tetrahidro-izokinolin-7-il)-2-( 1 H-indazol-6-ilamino)-nikotinamid; 2-( 1H-indazol-6-ilamino)-N-[3-(l-metilpirolidin-2-ilmetoksi)-54rifluormetil-fenil]-m N-[l-(2-dimetilamino-acetil)-3,3-dimetil-2,3-dihidro-1 H-indol-6-il]-2-( 1 H-indazol-6-ilamino)-nikotinamid; 2-( 1 H-indazol-6-ilamino)-N- [3 -(pirolidin-2-ilmetoksi)-5 -trifluormetil-fenil]-nikotinamid; N-(l-acetil-3,3-dimetil-2,3-dihidro-lH-indol-6-il)-2-(lH-indazol-6-ilamino)-nikotinamid; N-(4.4-dimetil-1 -okso-1,2,3,4-tctrahidro-izokinolin-7-il)-2-( 1 H-indazol-6-ilamino)-nikotinamid; N- [4-(terc-butil)-3-(3 -piperidilpropil)fenil] [2-( 1 H-indazol-6-ilamino)(3 - piridil)]karboksamid; N-[5-(terc-butil)izoksazol-3-il][2-(lH-indazol-6-ilamino)(3-piridil)]karboksamid; i N-[4-(terc-butil)fenil][2-(lH-indazol-6-ilamino)(3-piridil)]karboksarnid, kao i inhibitore kinaza objavljene u U.S. Patentima br. 6,258,812; 6,235,764; 6,630,500; 6,515,004; 6,713.485; 5,521,184; 5,770,599; 5,747,498; 5,990,141; U.S. Publikacije br. US20030105091; i publikacijama PCT br. WO01/37820; WO01/32651; WO02/68406; WO02/66470; WO02/55501; WO04/05279; WO04/07481; WO04/07458; VVO04/09784; WO02/59110; WO99/45009; V/098/35958; WO00/59509; W099/61422; WO00/12089; i WO00/02871, pri čemu je svaka od ovih publikacija ovde inkorporirana u potpunosti po referenci za koju god svrhu da se koristi.

[0182] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF može da se primeni pre, istovremeno sa. i nakon primene terapijskog sredstva protiv kancera. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF može da se primeni profilaktički kako bi se sprečio ili ublažio gubitak koštane mase usled metastaza kancera. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF može da se primeni u cilju lečenja postojećeg stanja gubitka koštane mase usled metastaza.

[0183] Primeri kancera obuhvataju, ali nisu ograničeni na, kancer dojke, kolorektalni kancer, gastrični karcinom, gliom, skvamocelarni kancer glave i vrata, nasledni i sporadični papilarni renalni kancer, leukemiju, limfom, sindrom Li-Fraumeni, maligni pleuralni mezoteliom, melanom, multipli mijelom, nesitnoćelijski kancer pluća, osteosarkom, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer prostate, sitnoćelijski kancer pluća, sinovijalni sarkom, tiroidni karcinom i karcinom prelaznog epitela mokraćne bešike.

[0184] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF može da se koristi samostalno ili sa bar jednim dodatnim terapeutskim sredstvom za lečenje kancera. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF se koristi zajedno sa terapeutski delotvornom količinom dodatnog terapeutskog sredstva. Primeri terapeutskih sredstava koja mogu da se primene zajedno sa sredstvom za specifično vezivanje HGF obuhvataju, ali nisu ograničena na članove geldanamicinske porodice anisamicinskih antibiotika; Pro-HGF; antagonnist Grb2 Src homologije 2; modulator Gabl; dominantno negativni Src; von-Hippel-Landau inhibitor uključujući, ali se ne ograničavajući na vortmanin; inhibitore P13 kinaze; druge anti-receptorske terapije, anti EGFR, COX-2 inhibitor, Celebrex™, Vioxx™; vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF), modulator VEGF, faktor rasta fibroblasta (FGF), modulator FGF, faktor rasta eplderma (EGF); modulator EGF; faktor rasta keratinocita (KGF), molekul srodan KGF, modulator KGF; modulator matrkiksne metaloproteinaze (MMP).

[0185] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF se koristi sa posebnim terapeutskim sredstvima za lečenje različitih kancera. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF se koristi sa posebnim terapeutskim sredstvima za lečenje ili sprečavanje malarije. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF se koristi sa posebnim terapeutskim sredstvima za lečenje ili prevenciju proliferativne dijabetske retinopatije. U nekim rešenjima, u zavisnosti od stanja i željenog stepena lečenja, mogu da se primene dva, tri ili više sredstava. U nekim rešenjima, ovakva sredstva mogu da budu obezbeđena zajedno, u okviru istog preparata. U nekim rešenjima, ovakva sredstva i sredstvo za specifično vezivanje HGF mogu da budu obezbeđeni zajedno, u okviru istog preparata. U nekim rešenjima, takva sredstva mogu da budu formulisana zasebno, i obezbeđena zajedno u okviru tretmanskog kompleta. U nekim rešenjima. ovakva sredstva i sredstvo za specifično vezivanje HGF mogu da budu formulisani zasebno, i obezbeđeni zajedno u okviru tretmanskog kompleta. U nekim rešenjima, ovakva sredstva mogu da budu obezbeđena zasebno. U nekim rešenjima, kada se primenjuju kroz gensku terapiju, geni koji kodiraju proteinska sredstva i/ili sredstvo za specifično vezivanje HGF mogu da budu obuhvaćeni istim vektorom. U nekim rešenjima, geni koji kodiraju proteinska sredstva i/ili sredstvo za specifično vezivanje HGF mogu da budu pod kontrolom istog promoterskog regiona. U nekim rešenjima, geni koji kodiraju proteinska sredstva i/ili sredstvo za specifično vezivanje HGF mogu da budu u odvojenim vektorima.

[0186] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske prepara'te koji sadrže sredstvo za specifično vezivanje HGF zajedno sa farmaceutski prihvatljivim diluentom, nosiocem, solubilizatorom, emulzifikatorom, konzervansom i/ili adjuvasnom.

[0187] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže sredstvo za specifično vezivanje HGF i terapeutski delotvornu količinu bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim diluentom, nosiocem, solubilizatorom, emulzifikatorom, konzervansom i/ili adjuvasnom.

[0188] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak je usmeren ka terapijama koje-sadrže sredstvo za specifično vezivanje HGF i bar jedan inhibitor serin proteaze, kao i postupke lečenja koji obuhvataju upotrebu ovakvih terapija. U nekim rešenjima, terapija sadrži sredstvo za specifično vezivanje HGF, inhibitor serin proteaze i bar jedan dodatni molekul koji je ovde opisan.

[0189] U nekim slučajevima, poremećaj ravnoteže proteaze/inhibitora proteaze može da dovede do razaranja tkiva pod dejstvom proteaza, uključujući, bez ograničavanja, invaziju tumora na normalno tkivo što dovodi do metastaza.

[0190] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF može da se koristi sa bar jednim terapeutskim sredstvom protiv zapaljenja. U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF može da se koristi sa bar jednim terapeutskim sredstvom protiv poremećaja imunog sistema. Primeri terapeutskih sredstava protiv zapaljenja i poremećaja imunog sistema obuhvataju, ali nisu ograničeni na inhibitore ciklooksigenaze tipa 1 (COX-l) i ciklooksigenaze tipa 2 (COX-2), male molekule modulatore mitogen-aktivirane protein kinaze od 38kDa (p38-MAPK); male molekule modulatore unutarćelijskih molekula uključenih u puteve zapaljenja, gde takvi unutarćelijski molekuli obuhvataju, ali nisu ograničeni na jnk, IKK, NF-kB, ZAP70 i Ick. Neki primeri terapeutskih sredstava protiv zapaljenja su opisani u, na primer, C. A. Dinarello i L. L. MoldavverProinjlammatory and Anti- Inflammatory Cytokines in Rheitmatoid Arthritis: A Primer for Clinicians,treće izdanje (2001), Amgen Inc. Thousand Oaks, CA.

[0191] U nekim rešenjima, farmaceutski preparati će obuhvatati više od jednog različitog sredstva za specifično vezivanje HGF. U nekim rešenjima, farmaceutski preparati će obuhvatati više od jednog sredstva za specifično vezivanje HGF, gde sredstva za specifično vezivanje HGF vezuju više od jednog epitopa.

[0192] U nekim rešenjima, poželjno je da prihvatljiva sredstva za formulaciju budu netoksična za primaoce pri upotrebljenim dozama i koncentracijama.

[0193] U nekim rešenjima, farmaceutski preparat može da sadrži sredstva za formulaciju koja služe za modifikaciju, održavanje ili konzervaciju, na primer, pH, osmolalnosti, viskoziteta, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije preparata. U nekim rešenjima, prihvatljiva sredstva za formulaciju obuhvataju, ali nisu ograničena na aminokiseline (kao stoje glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobna sredstva; antioksidanse (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen sulfit); pufere (kao što su boratni, bikarbonatni, Tris-HCl, citratni, fosfatni ili puferi drugih organskih kiselina); sredstva za bubrenje (kao što su manitol ili glicin); helatore (kao što je etilen diamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); sredstva za kompleksiranje (kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklođekstrin); punioce; monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini); boje, arome i sredstva za razblaživanje; emulzifikatore; hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide male molekulske mase; kontrajone za izgradnju soli (kao što je natrijum); konzervanse (kao što su benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što su manitol ili sorbitol); sredstva za suspendovanje; surfaktante ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, estri sorbitana, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); sredstva za stabilizaciju (kao što su saharoza ili sorbitol); sredstva za povećavanje toničnosti (kao što su halidi alkalnih metala, poželjno je da to budu natrijum ili kalijum hlorid, manitol, sorbitol); vehikulume za dopremanje; diluente; ekscipijente i/ili farmaceutske adjuvanse.{ Remington' s Pharmaceutical Sciences,18. izdanje, A. R. Gennaro, urednik, Mack Publishing Companv (1990)).

[0194] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF i/ili terapeutski molekul je povezan sa vehikulumom za produžavanje poluživota, poznatim u struci. Ovakvi vehikulumi obuhvataju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol i dekstran. Takvi vehikulumi su opisani, na primer. u U.S. Prijavi serijski br. 09/428,082 i objavljenoj PCT prijavi br. \VO 99/25044, koje su ovde ikorporirane po referenci u potpunosti u bilo koju svrhu da se koriste.

[0195] U nekim rešenjima, optimalni farmaceutski sastav odrediće stručnjak u ovoj oblasti, u zavisnosti od, na primer, željenog puta primene, načina dopremanja i željene doze. Videti, na primer,Remington' s Pharmaceutical Sciences,gore naveden. U nekim rešenjima, ovaj sastav može da utiče na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanjain vivoiin vivoklirens antitela predmetnog pronalaska.

[0196] U nekim rešenjima, primarni vehikulum ili nosilac u farmaceutskom preparatu može da bude, po svojoj prirodi, voden ili ne-voden. Na primer, u nekim rešenjima, pogodni vehikulum ili nosilac može da bude voda za injekcije, fiziološki rastvor ili rastvor veštačke cerebrospinalne tečnosti, kome mogu da budu dodata druga sredstva koja su uobičajena za preparate za parenteralnu primenu. U nekim rešenjima, neutralni puferisani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa albuminom iz seruma su dalji primeri vehikuluma. U nekim rešenjima, farmacetuski preparati sadrže Tris pufer pH od oko 7,0 do 8,5, ili acetatni pufer pH od oko 4,0 do 5,5, koji dalje mogu da sadrže sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U nekim rešenjima, preparat koji sadrži sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, može da bude pripremljen za čuvanje mešanjem izabranog preparata koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim sredstvima za formulaciju( Remington' s Pharmaceutical Sciences,supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u nekim rešenjima, preparat koji sadrži sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, može da bude formulisan kao liofilizat korišćenjem pogodnih ekscipijenata kao što je saharoza.

[0197] U nekim rešenjima, farmaceutski preparati predmetnog pronalaska mogu da budu određeni za parenteralno dopremanje. U nekim rešenjima, preparati mogu da budu određeni za inhalaciju ili za dopremanje kroz digestivni trakt, kao što je oralno dopremanje. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih preparata je u okviru veštine stručnjaka u ovoj oblasti.

[0198] U nekim rešenjima, sastojci za formulaciju su prisutni u koncentracijama koje su prihvatljive za način primene. U nekim rešenjima, koriste se puferi za održavanje preparata na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, obično u okviru pH vrednosti od oko 5 do oko 8.

[0199] U nekim rešenjima, kada se razmišlja o parenteralnoj primeni, terapeutski preparat može da bude u obliku vodenog rastvora prihvatljivog za parenteralnu primenu slobodnog od prisustva pirogena, koji sadrži željeno sredstvo za specifično vezivanje HGF sa ili bez dodatnih terapeutskih sredstava, u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. U nekim rešenjima, vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, koji je konzervisan na pogodan način. U nekim rešenjima, preparat može da obuhvata formulaciju željenog molekula sa nekim sredstvom, kao što su mikrosfere za injekcije, bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polimlečna kiselina ili poliglikolna kiselina), granulice ili lipozomi, koje može da obezbedi kontrolisano ili produženo oslobađanje proizvoda, a koja može da bude primenjena kao depo injekcija. U nekim rešenjima, može da se koristi i hijaluronska kiselina, koja može da produži prisustvo u cirkulaciji. U nekim rešenjima, za primenu željenog molekula mogu da se koriste implantabilna sredstva za dopremanje.

[0200] U nekim rešenjima, farmaceutski preparat može da bude formulisan za inhalaciju.

U nekim rešenjima. sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, može da bude formulisano kao suvi prah za inhalaciju. U nekim rešenjima, inhalacioni rastvor koji sadrži sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, može da bude formulisan sa propelentom za dopremanje u obliku aerosola. U nekim rešenjima, rastvori mogu da budu nebulizovani. Pulmološka primena je dalje opisana u PCT prijavi br. PCT/US94/001875, koja opisuje pulmološko dopremanje hemijski modifikovanih proteina.

[0201] U nekim rešenjima, predpostavlja se da bi preparati mogli da se primene oralno.

U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, koje se primenjuje na ovaj način, može da bude formulisano sa ili bez onih nosilaca koji se obično koriste u pripremi čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule.

U nekim rešenjima, kapsula može da bude pripremljena tako da se aktivni sastojak preparata oslobodi u onoj tački gastrointestinalnog trakta u kojoj je biodostupnost najveća a presistemska degradacija najmanja. U nekim rešenjima, preparat može da sadrži najmanje jedno dodatno sredstvo koje olakšava apsorpciju sredstva za specifično vezivanje HGF i/ili bilo kog od dodatnih terapeutskih sredstava. U nekim rešenjima, mogu da se upotrebe još i sredstva za razblaživanje, arome, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, lubrikanti, sredstva za suspendovanje, sredstva za dezintegraciju tableta i vezivna sredstva.

[0202] U nekim rešenjima, farmaceutski preparat može da obuhvata delotvornu količinu sredstva za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, u smeši sa netoksičnim ekscipijentima koji su pogodni za proizvodnju tableta. U nekim rešenjima, rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili nekom drugom pogodnom vehikulumu, moguće je pripremiti rastvore u jediničnim doznim oblicima. U nekim rešenjima, pogodni ekscipijenti obuhvataju, ali nisu ograničeni na, inertna sredstva za razblaživanje, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza ili kalcijum fosfat; ili vezivna sredstva, kao što su škrob, želatin, ili guma akacija; ili lubrikante kao što su magnezij um stearat, stearinska kiselina ili talk.

[0203] Dodatni farmaceutski preparati će biti očigledni stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući formulacije koje podrazumevaju sredstva za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, u formulacijama sa sredstvima koja omogućavaju dugotrajno ili kontrolisano oslobađanje. U nekim rešenjima, tehnike za formulisanje različitih sredstava koja omogućavaju dugotrajno ili kontrolisano oslobađanje kao što su lipozomni nosioci, bio-erodibilne čestice ili porozne granulice i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, na primer, PCT prijavu br. PCT/US93/00829, koja opisuje kontrolisano oslobađanje iz poroznih polimernih mikročestica za dopremanje farmaceutskih preparata. U nekim rešenjima, preparati sa dugotrajnim oslobađanjem mogu da obuhvataju i polupropustljive polimerne matrikse u obliku, na primer, filmova ili mikrokapsula. Matriksi sa dugotrajnim oslobađanjem mogu da obuhvataju poliestre, hidrogelove, polilaktide (S.A.D. 3,773,919 i EP 058,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil- L-glutamata (Sidman et al,Biopolimers. 22:547 - 556 (1983)), poli (2-hidroksietil-metakrilata) (Langer et al,J. Biomed. Mater. Res.,15: 167 - 277 (1981) i Langer,Chem. Tech.,12: 90 - 105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer et al., gorenavedeno) ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (EP 133,988). U nekim rešenjima, preparati sa dugotrajnim oslobađanjem takođe mogu da obuhvataju lipozome, koji mogu da budu pripremljeni na bilo koji od nekoliko načina koji su poznati u struci. Videti, npr., Eppstein et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82: 3688 - 3692; EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0204] Farmaceutski preparat namenjen za upotrebuin vivoprimenom je obično sterilan.

U nekim rešenjima, ovo se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. U nekim rešenjima, u kojima je preparat liofilizovan, ovakva sterilizacija može da se izvrši ili pre liofilizacije, ili nakon liofilizacije i ponovnog rastvaranja. U nekim rešenjima, preparat za parenteralnu primenu može da se čuva u liofilizovanom obliku ili u obliku rastvora. U nekim rešenjima, preparati za parenteralnu primenu se, uopšteno govoreći, čuvaju u sudovima u kojima je moguć sterilan prilaz, na primer, u kesi sa rastvorom za intravensku primenu ili u bočici čiji je čep moguće probušiti iglom za hipodermične injekcije.

[0205] U nekim rešenjima, kada je farmaceutski preparat formulisan, može da se čuva u sterilnim bočicama u obliku rastvora, suspenzije, gela, emulzije, čvrste supstance ili dehidratisanog ili liofilizovanog praha. U nekim rešenjima, ovakve formulacije mogu da se čuvaju ili u obliku koji je spreman za neposrednu upotrebu ili u obliku (npr., liofilizata) koji se ponovno rastvara (rekonstituiše) pre upotrebe.

[0206] U nekim rešenjima, predmetni pronalazak se odnosi na komplete za dobijanje pojedinačnih doznih jedinica. U nekim rešenjima, svaki od kompleta može da sadrži po jednu bočicu sa suvim proteinom i po jednu bočicu sa vodenom formulacijom. U nekim rešenjima predmetnog pronalaska, obuhvaćeni su kompleti koji sadrže pojedinačne, kao i unapred napunjene špriceve sa više komora (npr., špriceve sa tečnošću i liošpriceve).

[0207] U nekim rešenjima, delotvorna količina farmaceutskog preparata koji sadrži sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, koju je potrebno primeniti u terapiji će zavisiti od, na primer, vrste i cilja terapije. Stručnjak u ovoj oblasti će zapaziti da će, stoga, odgovarajuće doze za terapiju zavisiti, delom, od molekula koji se doprema, indikacije zbog koje se primenjuje sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, načina primene i veličine (telesne mase, telesne površine ili veličine organa) i/ili stanja (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. U nekim rešenjima, kliničar može da prilagodi dozu i modifikuje način primene kako bi obezbedio optiijialano terapeutsko dejstvo. U nekim rešenjima, tipična doza može da bude u opsegu od oko 0,1 ug/kg do oko 100 mg/kg, ili i više; ili 1 ug/kg do oko 100 mg/kg; ili 5 ug/kg do oko 100 mg/kg.

[0208] U nekim rešenjima, pri određivanju učestalosti primene uzimaće se u obzir farmakokinetički parametri sredstva za specifično vezivanje HGF i/ili bilo kog dodatnog terapeutskog sredstva u primenjenoj formulaciji. U nekim rešenjima, kliničar će primenjivati preparat sve dok se ne dostigne doza koja postiže željeno dejstvo. U nekim rešenjima, preparat, stoga, može da se primeni u pojedinačnoj dozi, ili u dve ili više doza (koje mogu i ne moraju da sadrže jednake količine željenog molekula) u određenom vremenskom periodu, ili kao kontinualna infuzija preko implanta ili katetra. Dalje fino prilagođavanje pogodne doze rutinski će odrediti stručnjaci sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti, i ono spada u opseg rutinskih zadataka koje ovi stručnjaci obavljaju. U nekim rešenjima, pogodne doze mogu da se odrede upotrebom odgovarajućih podataka o zavisnosti odgovora od primenjene doze.

[0209] U nekim rešenjima, način primene farmaceutskog preparata jc u saglasnosti sa poznatim postupcima, npr., oralno, intravenskim, intraperitonealnim, intracerebralnim (intraparenhimalnim), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, intraokularnim, intraarterijalnim, intraportalnim ili intralezionim injekcijama, sistemima sa dugotrajnim oslobađanjem ili implantima. U nekim rešenjima, preparati mogu da se primene bolus injekcijama ili kontinualno, infuzijom, ili implantom.

[0210] U nekim rešenjima, preparat može da se primeni topijski, implantacijom membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji je adsorbovan ili u kome je enkapsuliran željeni molekul. U nekim rešenjima, kada se koristi implant, on može da se usadi u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a željeni molekul može da se doprema difuzijom, bolusom sa vremenski programiranim otpuštanjem ili kontinualnom primenom.

[0211] U nekim rešenjima, može da bude poželjnaex vivoupotreba farmaceutskog preparata koji sadrži sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva. U takvim slučajevima, ćelije, tkiva i/ili organi koji su eksplantirani iz pacijenta se izlažu dejstvu farmaceutskog preparata koji sadrži sredstvo za specifično vezivanje HGF, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, nakon čega se ćelije, tkiva i/ili organi reimplantiraju u pacijenta.

[0212] U nekim rešenjima, sredstvo za specifično vezivanje HGF i/ili bilo koje dodatno terapeutsko sredstvo mogu da se dopremaju implantacijom određenih ćelija koje su modifikovane genetskim inžinjeringom, upotrebom postupaka poput onih koji su ovde opisani, kako bi eksprimirale i sekretovale polipeptide. U nekim rešenjima, takve ćelije mogu da budu humane ili životinjske ćelije, i mogu da budu autologe, heterologe ili ksenogenične. U nekim rešenjima, ćelije mogu da budu imortalizovane. U nekim rešenjima, kako bi se smanjila mogućnost imunog odgovora, ćelije mogu da budu enkapsulirane da bi se izbegla infiltracija u okolna tkiva. U nekim rešenjima, materijali za enkapsulaciju su obično biokompatibilne, semipermeabilne polimerne kapsule ili membrane koje omogućavaju oslobađanje proteinskih proizvoda ali sprečavaju uništenje ćelija dejstvom imunog sistema pacijenta ili drugih štetnih faktora iz okolnih tkiva.

Primeri

[0213] Primeri koji slede, uključujući izvršene eksperimente i dobijene rezultate, dati su ovde samo u ilustrativne svrhe te se neće smatrati ograničavajućim za predmetni pronalazak.

Primer 1

Pobijanje anti- HGF hibridoma

[0214] Antitela na HGF su dobijena iz miševa XenoMice<®>(Abgenix, Fremont, CA), koji sadrže humane gene za imunoglobuline. Za dobijanje antitela upotrebljene su tri grupe miševa XenoMice<®>, grupe la, lb i 2, kao što je prikazano u tabeli 1. Grupa la se sastojala od miševa XenoMice<®>soja XMG2, koji proizvode potpuno humana IgG2Kantitela. Miševi iz grupe la su imunizovani na HGF. HGF je dobijen upotrebom standardnih rekombinantnih tehnika, korišćenjem sekvence iz Nakamura et al.,Nature342: 440 - 443 (1989).

[0215] Grupa lb takođe se sastojala od miševa XenoMice<®>soja XMG2, ali su miševi iz grupe lb imunizovani na HGF koji je hemijski konjugovan sa T-ćelijskim epitopom (TCE) čija je sekvenca: Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Cys (sekvenca čiji je ID br. 47). TCE je konjugovan sa HGF upotrebom Sulpho-SMCC (Pierce, kataloški br. 22322) i ditiotreitola (Fisher Scientific). Dobijeni konjugovani TCE - HGF odvojen je od nekonjugovanog peptida u Centricon<®>koloni (Amicon).

[0216] Grupa 2 se sastojala od miševa XenoMice<®>soja XMG1, koji proizvode potpuno humana IgG 1K antitela. Miševi iz grupe 2 su imunizovani konjugovanim TCE - HGF koji je prethodno opisan.

[0217] U miševe iz sve tri grupe ubrizgan je antigen (bilo HGF, bilo TCE - HGF) osam puta. prema rasporedu prikazanom u tabeli 1. Tokom prvih imunizacija, svakom mišu je injektovano ukupno 10 ug antigena u jastučiće na zadnjim nogama (5 ug po jastučiću). Ove injekcije su sadržale TiterMax<®>Gold adjuvans (Sigma, kataloški br. T2684). Davanjem injekcija 2 do 7, svakom mišu je ubrizgano ukupno 5 ug antigena u alum gel adjuvansu (adjuvans sa aluminijum fosfatnim gelom, Superfos Biosector a/s, koji distribuira E. M. Sergant Pulp and Chemical Co., Cliiton NJ, kataloški br. 1452-250). Poslednja injekcija sadržala je ukupno 10 ug antigena po mišu i nije sadržala adjuvans.

[0218] Dva dana nakon šeste injekcije uzeti su uzorci krvi iz svakog miša. Ovi uzorci krvi su ispitivani ELISA testom kako bi se odredio titar antitela na HGF. U ovim ELISA testovima, ploče sa po 96 polja (Fisher Scientific, kataloški br. 12-565-136) su obložene HGF u 0,1 M karbonatnom puferu (pH 9,6). Dodati su uzorci krvi, te su ploče inkubirane dva časa na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, ploče su isprane tri puta rastvorom za ispiranje (0,05 % Tvveen u PBS), pa je dodato po 100 ul sekundarnog antitela u svako polje. Kao sekundarno antitelo upotrebljeno je kozje anti-humani IgGFc antitelo konjugovano sa peroksidazom iz rena (Southern Biotech kataloški br. 9060-05). Nakon inkubiranja tokom jednog časa na sobnoj temperaturi, ploče su isprane, te je u svako polje dodato po 100 jal TMB rastvora za razvijanje (BioFX Lab kataloški br. TMSK-0100-01). Nakon deset minuta, u svako polje je dodato po 50 ul TMB rastvora za zaustavljanje reakcije (BioFX Lab kataloški br. STPR-0100-01). Apsorbanca je očitavana na čitaču ELISA ploča, pri talasnoj dužini od 450 nm.

[0219] Četiri dana nakon poslednje injekcije, miševi su žrtvovani, a njihovi drenažni limfni čvorovi su sakupljeni, te su iz njih izolovani limfociti. Limfociti iz miševa svake od grupa zasebno su spojeni. Kako bi se u uzorcima povećala koncentracija B ćelija, T ćelije su odvojene dodavanjem anti-CD90 magnetnih granulica (Miltenyi Biotech kataloški br. 491-01) a zatim propuštanjem limfocita kroz LS<+>kolonu (Miltenyi Biotech kataloški br. 424-01).

[0220] Svaki od tri uzorka limfocita sa povećanom koncentracijom B-ćelija zatim je fuzionisan sa ćelijama P3 mijeloma, upotrebom aparata za elektroćelijsku fuziju (Gene-tronic, Inc., Model ECM 2001), kako bi se dobili hibridomi. Tri grupe fuzionih linija hibridoma posejane su u ploče od po 96 polja, pri gustini od 1 x IO<6>ubačenih limfocita sa povećanom koncentracijom B-ćelija po polju, u podlozi za hibridome (za sastojke videti tabelu 2) koja sadrži hipoksantin-azaserin (Sigma). Linije hibridoma gajene su u kulturi 14 dana na 37°C, u 15% CO2.

[0221] Nakon 14 dana, supernatanti kulture ispitani su ELISA testom kako bi se utvrdilo prisustvo humanih IgG antitela na HGF, korišćenjem protokola koji je prethodno opisan za testiranje uzoraka krvi. Supernatanti kulture koji se dali pozitivan rezultat pri ovom ELISA testu su dalje ispitivani na prisustvo humanog kapa lanca u drugom ELISA testu. U tom, drugom ELISA testu, uslovi su bili identični kao pri prvom ELISA testu, s tim što je kao sekundarno antitelo korišćeno kozje antitelo na humani kapa lanac, konjugovano sa peroksidazom iz rena. Hibridomi koji su dali pozitivan rezultat u oba ELISA testa su dalje razmnožavani kako bi se dobilo 5 ml supernatanta zain vitrofunkcionalne testove,0kojima će biti reči u primerima 8 i 9. Ispitivani su supernatanti iz 82 klona koji odgovaraju miševima iz grupe la, 42 klona koji odgovaraju miševima iz grupe lb i 176 klonova koji odgovaraju miševima iz grupe 2.

[0222] Na osnovu rezultata ovih funkcionalnih testova, identifikovano je nekoliko linija koje proizvode antitela na HGF. Za izolovanje tri do šest klonova iz svake linije korišćeno je ograničavajuće razblaženjc. Klonovi su označavani prema broju linije hibridoma (napr. 1.24) i broju klona (npr. 1.24.1). U funkcionalnim testovima o kojima će biti reči u primerima 8 i*9 nisu pronađene razlike između različitih klonova određene linije. Ovi izolovani klonovi su razmnoženi, svaki za sebe, u 50 - 100 ml podloge za hibridom, te su gajeni u kulturi do izumiranja (t.j. dok nije ostalo manje od 10% vijabilnih ćelija). Koncentracija i specifičnost antitela na HGF u supernatantima ovih kultura određene su u ELISA testovima iin vitrofunkcionalnim testovima, kao što je objašnjeno u primerima 8 i 9. Identifikovano je deset hibridoma sa najvišim titrom antitela na HGF. Ovi hibridomi su označeni kao 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 i 3.10.1.

Primer 2

Pobijanje antitela iz hibridoma

[0223] Antitela su dobijena iz deset hibridoma opisanih u primeru 1, korišćenjem jednog

od dva različita sistema: Integra boca i "spinner" boca (boca za mešanje kulture) sa uvođenjem inertnog gasa (sparged spinners).

Integra boce

[0224] Sedam linija hibridoma, 2.12.1, 1.24.2, 1.29.1, 1.74.1, 1.75.1, 1.60.2 i 2.40.1, su gajeni, svaki za sebe, u T75 bocama u 20 ml HSFM podloge (videti tabelu 2 za sastav podloge). Kada su kulture hibridoma u T75 bocama dostigle skoro konftuentan rast, prebačene su u Integra boce (Integra Biosciences, Integra CL 1000, kataloški br. 90 005).

[0225] Integra boca je boca za gajenje ćelijske kulture koja je membranom podeljena u dva odeljka, mali odeljak i veliki odeljak. Zapremine od po 20 do 30 ml ćelija hibridoma, sa minimalnom gustinom ćelija od 1 x IO<6>ćelija po mililitru, svake od sedam linija hibridoma, prenesene su u male odeljke sedam Integra boca u Integra podlozi (videti tabelu 2 za sastojke Integra podloge). Zapremine od po 1 1 same Integra podloge prenesene su u velike odeljke Integra boca. Membrana koja razdvaja dva odeljka propustljiva je za hranljive sastojke male molekulske mase, ali je nepropustljiva za ćelije hibridoma i antitela koja one proizvode. Na taj način, ćelije hibridoma i antitela koja su one proizvele ostaju u malom odeljku.

[0226] Nakon nedelju dana, iz oba odeljka svih sedam Integra boca podloga je uklonjena

i zamenjena svežom Integra podlogom. Podloge sakupljene iz sedam malih odeljaka čuvane su odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, ponovo su sakupljene podloge iz malih odeljaka. Podloga sakupljena iz malog odeljka nakon prve nedelje pripojena je podlozi sakupljenoj iz'malog odeljka nakon druge nedelje, za svaku liniju hibridoma posebno. Pobijenih sedam uzoraka

podloge iz sedam linija hibridoma je centrifugirano da bi se odvojile ćelije i otpadni materijal (15 min na 3000 rpm), nakon čega su dobijeni supernatanti profiltrovani (0,22 um).

" Spinner" boce sa uvođenjem inertnog gasa ( 31)

[0227] Tri linije hibridoma, 3.10.1, 2.4.4 i 2.12.1 gajene su odvojeno u T75 bocama, u 20 ml HSFM podloge. Kada su hibridomi dostigli potrebnu ćelijsku gustinu, prebačeni su u TI75 boce. Slično tome, kada su hibridomi dostigli dovoljnu ćelijsku gustinu u TI 75 bocama, prebačeni su u "spinner" boce od 100 ml, pa zatim u "spinner" boce od 500 ml i konačno, u "spinner" boce od 1 1. Kada su ćelije dostigle dovoljnu gustinu u "spinner" bocama od 1 1, prebačene su u "spinner" boce od 3 1 (Bellco Biotechnologv, kataloški br. 1965-300, sa bočnim dodatkom kataloški br. 1965-30003).

[0228] "Spinner" boca od 3 1 sa uvođenjem inertnog gasa je stakleni sud u kome se kulture mešaju magnetnom mešalicom koju kontroliše magnetna platforma. Boca je povezana na gasnu cevčicu kojom se dovodi 5% CO2i vazduh.

Hibridom 3. 10. 1

[0229] U dve "spinner" boce od 3 1 sa uvođenjem inertnog gasa zasejane su ćelije hibridoma iz linije hibridoma 3.10.1 u HSFM podlozi, sa dodacima koji su navedeni u tabeli 3, u kojoj su predstavljeni uslovi rasta u ove dve boce sa uvođenjem inertnog gasa.

[0230] Kulture su gajene 15 dana i sakupljene kada je vijabilnost bila manja od 20%, što je utvrđeno u testu ekskluzije tripan plavog. Sakupljanje se sastojalo od centrifugiranja, 15 minuta na 7000 rpm a zatim filtriranja dobijenog supernatanta kroz 0,22 um filter. Produktivnost je određena merenjem količine proteina prisutne u krajnjim sakupljenim uzorcima, korišćenjem HPLC proteina A. a rezultati su navedeni u tabeli 3.

Hibridom 2. 4. 4

[0231] U pet "spinner" boca sa uvođenjem inertnog gasa zasejane su ćelije hibridoma linije hibridoma 2.4.4 u HSFM podlozi, sa dodacima navedenim u tabeli 4, u kojoj su navedeni uslovi rasta za ovih pet boca sa uvođenjem inertnog gasa.

[0232] Kulture su gajcne 7, 8 ili 10 dana, kao što je navedeno u tabeli 4, i sakupljene kada je vijabilnost ćelija bila ispod 20%, kao što je prethodno opisano.

Hibridom 2. 12. 1

[0233] U šest "spinner" boca sa uvođenjem inertnog gasa zasejane su ćelije hibridoma linije hibridoma 2.12.1 u HSFM podlozi, sa dodacima navedenim u tabeli 5, u kojoj su navedeni uslovi rasta za ovih šest boca sa uvođenjem inertnog gasa.

[0234] Kulture su gajene 7 ili 11 dana, kao što je navedeno u tabeli 5, a sakupljene su kada je vijabilnost bila ispod 20%, kao što je prethodno opisano.

Primer 3

Kloniranje i analiza sekvence teških i lakih lanaca antitela

A. Kloniranje lakih lanaca

[0235] Deset hibridoma (1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 i 3.10.1) identifikovani su kao hibridomi koji eksprimiraju monoklonska antitela na HGF, kao što je razmatrano u primeru 1. Iz svakog od ovih hibridoma izolovane su ukupne RNK korišćenjem TRIzoP reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA). 5' krajevi ovih deset ukupnih RNK prilagođeni su za 5' brzu amplifikaciju cDNK krajeva (5' Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE), upotrebom GeneRacer<®>kompleta (Invitrogen). Ovih deset preparata RNK sa modifikovanim 5' krajevima su, potom, upotrebljeni u deset odvojenih RACE reakcija, pri čemu se u svakoj koristio prajmer sa slučajnom sekvencom ("random primer") sa adapterom za produženje (5'- GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT -3') (sekvenca čiji je ID broj 48), kako bi se dobilo deset molekula cDNK.

[0236] Deset cDNK molekula su zatim amplifikovani u odvojenim lančanim reakcijama polimeraze (Polvmerase Chain Reaction, PCR) kako bi se dobilo deset amplifikovanih sekvenci kapa lakih lanaca. Za svaku od ovih reakcija, kao prajmer za reakciju u smeru "ka napred" korišćen je GeneRacer<®>prajmer za reakciju "ka napred" (forward nested primer) (5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA 3') (sekvenca čiji je ID broj 49). Prajmer za reverznu reakciju (5'- GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG -3') (sekvenca čiji je ID broj 50) određenje tako da vezuje sekvencu komplementarnu kapa lakom lancu.

[0237] Svaka od deset amplifikovanih sekvenci kapa lakih lanaca je, potom, pojedinačno vezana u odvojene pCR4-TOPO plazmide (Invitrogen). Dobijenih deset plazmida, od kojih je svaki sadržao jednu od deset sekvenci kapa lakih lanaca, su zatim, odvojeno amplifikovani u bakterijama, te je sekvencirano po nekoliko klonova od svakog plazmida. Ove sekvence su upotrebljene za određivanje PCR prajmera za amplifikaciju deset sekvenci kapa lakih lanaca sa otvorenim ramom čitanja iz kloniranih plazmida. na sledeći način.

[0238] Kompleti prajmera za svaku od deset PCR sadržali su 5'- prajmer i 3'- prajmer. Svaki 5'- prajmer sadržao je deo komplementaran sekvenci amino kraja sekvence konkretnog kapa lakog lanca, optimizovanu Kozakovu sekvencu i jedno ili više restrikcionih mesta. Na primer, sekvenca 5'- prajmera korišćena za reakciju sa plazmidom koji je dobijen iz hibridoma 3.10.1 bilaje: 3'- prajmer za svaku od PCR sadržao je deo komplementaran sekvenci karboksil kraja sekvence konkretnog kapa lakog lanca, uključujući terminacioni kodon i restrikciono mesto. Na primer, sekvenca 3'- prajmera korišćenog u reakciji sa plazmidom koji je dobijen iz hibridoma 3.10.1 bilaje:

[0239] Odvojeni kompleti prajmera korišćeni su u odvojenim PCR reakcijama sa odgovarajućim kloniranim plazmidima kako bi se amplifikovalo deset kodirajućih regiona sekvenci kapa lakih lanaca. Deset proizvoda amplifikacije iz ovih reakcija odvojeno je izolovano u gelu i prečišćeno korišćenjem QIAquick<®>Gel Extraction kompleta (kataloški br. 28704, Qiagen, Valencia, CA). Ovi prečišćeni proizvodi su zatim odvojeno isečeni upotrebom odgovarajućih restrikcionih enzima, kako bi se dobili kodirajući regioni sekvenci kapa lakih lanaca oslobođeni plazmida. Na primer, prečišćeni proizvod koji odgovara hibridomu 3.10.1 isečen jeXba\iSalienzimima, na mestima koja su uvedena upotrebom prajmera tokom PCR amplifikacije odgovarajućeg kloniranog plazmida, kao što je prethodno opisano. Dobijeni kodirajući regioni sekvence kapa lakih lanaca, dobijeni digestijom restrikcionim enzimima, ponovo su, svaki za sebe, izolovani i prečišćeni u gelu korišćenjem QIAquick<g) Gel Extraction kompleta (kataloški br. 28704, Qiagen, Valencia, CA).

[0240] Ovih deset prečišćenih kodiraj ućih regiona sekvenci kapa lakih lanaca dobij enih digestijom restrikcionim enzimima su, potom, svaki za sebe vezani u sisarski ekspresioni vektor, pDSRa20 (WO 90/14363), kako bi se dobilo deset odvojenih ekspresionih vektora kapa lakih lanaca koji odgovaraju deset originalnih hibridoma. Ovih deset sekvenci kapa lakih lanaca ubačenih u ekspresioni vektor su, potom, sekvencirani. Potvrđeno je da ekspresioni vektor pDSRa20 koji sadrži kodirajući region kapa lakog lanca dobijenog iz hibridoma 3.10.1 (pDSRa20:3.10.1) sadrži 5473 baznih parova, uključujući PCR fragment od 719 baznih parova, koji kodira 235 aminokiselinskih ostataka (uključujući 20 aminokiselinskih ostataka signalne sekvence kapa lanca) 3.10.1 kapa lakog lanca. Ovaj ekspresioni vektor sadržao je sedam funkcionalnih regiona, kao što je navedeno u tabeli 6.

B. Kloniranje teških lanaca

[0241] Varijabilni regioni teških lanaca antitela na HGF iz deset hibridoma su klonirani korišćenjem istih postupaka koji su korišćeni za lake lance, kao što je prethodno razmatrano u primeru 3A. Ukupne RNK iz deset hibridoma su izolovane, zatim modifikovane na 5' kraju za RACE i upotrebljene za dobijanje cDNK molekula kao što je već opisano u primeru 3A.

[0242] Ovih deset cDNK molekula amplifikovano je u odvojenim PCR reakcijama kao što je već opisano za lake lance u primeru 3 A, osim što je prajmer za reverznu reakciju (5'- GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA -3' (sekvenca čiji je ID broj 53)) određen tako da vezuje sekvencu komplementarnu varijabilnom regionu teškog lanca. Kao prajmer za reakciju u smeru "ka napred" ponovo je korišćen GeneRacer<®>prajmer za reakciju "ka napred" (5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA 3') (sekvenca čiji je ID broj 49).

[0243] Svaka od deset sekvenci amplifikovanih varijabilnih regiona teških lanaca odvojeno je vezana u zasebni pCR4-TOPO pazmid. Dobijenih deset plazmida, od kojih svaki sadrži jednu od sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca su, potom, zasebno amplifikovani u bakterijama, te je sekvencirano nekoliko klonova svake od njih, kao što je prethodno opisano za lake lance u primeru 3A. Ove sekvence su korišćene za određivanje PCR prajmera za amplifikaciju svakog od varijabilnih regiona teških lanaca iz kloniranih plazmida, na sledeći način.

[0244] Kompleti prajmera za svaku od deset PCR reakcija određeni su istom strategijom koja je korišćena za lake lance, što je prethodno razmatrano u primeru 3A. Svaki 5'- prajmer sadržao je deo komplementaran sekvenci amino kraja datog varijabilnog regiona teškog lanca, optimizovanu Kozakovu sekvencu i jedno ili više restrikcionih mesta. Na primer, sekvenca 5'-prajmera upotrebljenog za amplifikaciju varijabilnog regiona teškog lanca koji je dobijen iz hibridoma 3.10.1 bilaje:

[0245] 3'- prajmeri korišćeni za svaku od PCR reakcija sadržali su deo komplementaran karboksil kraju koncenzusne sekvence datog varijabilnog regiona teškog lanca, uključujući terminacioni kodon i restrikciono mesto. Na primer, sekvenca 3'- prajmera korišćenog za amplifikaciju varijabilnog regiona teškog lanca koji je dobijen iz hibridoma 3.10.1 bilaje:

[0246] Odvojeni kompleti prajmera korišćeni su za odvojene PCR reakcije sa odgovarajućim kloniranim plazmidima, kako bi se amplifikovalo deset sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca. Dobijenih deset proizvoda amplifikacije iz ovih reakcija odvojeno je izolovano u gelu i prečišćeno korišćenjem QUIAquick Gel Extraction kompleta i odgovarajućih restrikcionih enzima, kao što je prethodno opisano za lake lance u primeru 3A. Dobijene sekvence varijabilnih regiona teških lanaca, dobijene digestijom restrikcionim enzimima, ponovo su zasebno izolovane u gelu i prečišćene korišćenjem QUIAquick Gel Extraction komplćta kao stoje prethodno opisano u primeru 3A.

[0247] Tri od ovih deset prečišćenih sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca dobijenih digestijom restrikcionim enzimima, i to one dobijene iz hibridoma 3.10.1, 1.24.1 i 2.4.4, su, potom, odvojeno vezane u sisarski ekspresioni vektor pDSRa20:hIgGCH, kako bi se dobila tri ekspresiona vektora teških lanaca IgGl. Ekspresioni vektor pDSRa20:hIgGCHje isti kao pDSRa20, osim što sadrži još i sekvencu konstantnog regiona IgGl. Ekspresioni vektor pDSRa20:hIgGCH opisan je u tabeli 7.

[0248] Sckvencirane su ubačene sekvence varijabilnih regiona teških lanaca tri IgGl ekspresiona vektora. Ekspresioni vektor pDSRa20:hIgGCHkoji sadrži varijabilni region teškog lanca dobijen iz hibridoma 3.10.1 (pDSRct20:hIgGCH:3.10.1) opisan je u tabeli 8.

[0249] Svaka od deset prečišćenih sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca odvojeno je vezana u pDSRa20 sisarski ekspresioni vektor zajedno sa sekvencama koje kodiraju konstantni region IgG2, kako bi se dobilo deset IgG2 ekspresionih vektora. Svaki od deset dobijenih IgG2 ekspresionih vektora (označenih kao pDSRa20:hIgG2:br. hibridoma) sadržao je sekvence koje kodiraju konstantni region IgG2 i jednu od deset sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca. Deset ubačenih sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca su sekvencirane kako bi se potvrdilo da sadrže iste sekvence varijabilnog regiona teškog lanca koje su identifikovane u kloniranim plazmidima pCR4-TOPO klonova. Ekspresioni vektor pDSRa20:hIgG2 koji sadrži varijabiln region teškog lanca dobijen iz hibridoma 2.12.1 (pDSRct20:hIgG2:2.12.1) opisan je u tabeli 9.

[0250] cDNK sekvence varijabilnih regiona kapa lakih lanaca (sekvence čiji su ID brojevi: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 i 19), konstantnog regiona kapa lakog lanca (sekvenca čiji je ID broj 21), varijabilnih regiona teških lanaca (sekvence čiji su ID brojevi 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,

16, 18 i 20), kao i konstantnih regiona teških lanaca IgGl i IgG2 (sekvence čiji su ID brojevi: 22

i 23) prikazane su na slici 3.

[0251] Određene su polipeptidne sekvence koje se očekuju na osnovu svake od ovih cDNK sekvenci. Očekivane polipeptidne sekvence varijabilnih regiona kapa lakih lanaca (sekvence čiji su ID brojevi: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 i 42), konstantnog regiona kapa lakog lanca (sekvenca čiji je ID broj 44), varijabilnih regiona teških lanaca (sekvence čiji su ID brojevi 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 i 43), kao i konstantnih regiona teških lanaca IgGl i IgG2 (sekvence čiji su ID brojevi: 45 i 46) prikazane su na slici 4.

[0252] Na osnovu podataka o sekvencama, određeni su matični geni iz kojih su dobijeni varijabilni regioni teških i lakih lanaca. Identitet matičnih gena naznačen je pored odgovarajućih linija hibridoma u slikama 1, 2, 3 i 4. Dalja analiza srodnosti sekvenci (slike 1B i 2B) dala je rezultate prikazane na dendrogramima prikazanim na slici 1A (varijabilni regioni kapa lakih lanaca) i slici 2A (varijabilni regioni teških lanaca).

Primer 4

Prolazna ekspresija u 293T ćelijama

[0253] U deset odvojenih ko-transfekcija, 293T ćelije su ko-transficirane ekspresionim vektorom pDSRa20 koji sadrži sekvencu kapa lakog lanca opisanu u primeru 3A (vektor lakog lanca) i ekspresionim vektorom pDSRa20 koji sadrži sekvencu teškog lanca opisanu u primeru 3B (vektor teškog lanca). U ovih deset odvojenih ko-transfekcija, 293T ćelije su ko-transficirane i vektorom lakog lanca i vektorom teškog lanca koji su dobijeni iz jednog od hibridoma opisanih u primeru 1. Konkretno, za ko-transfekciju vektora koji su dobijeni iz hibridoma 3.10.1, upotrebljen je vektor teškog lanca koji sadrži igGl (pDSRa20:hIgGCH."3.10.1). Za ko-transfekcije vektora koji su dobijeni iz ostalih devet hibridoma korišćeni su oni koji sadrže teške lance IgG2 (pDSRa20:hIgG2:br. hibridoma). Ko-transfekcije su izvršene korišćenjem ili Fugene 6 ili X-TremeGene RO-1539 (oba od Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), prema uputstvima proizvođača.

[0254] Ko-transfekcije su prvo vršene upotrebom adherentnih 239T ćelija u standardnim "roler" bočicama. U "roler" bočicama zasejano je 4 xl0<7>do 5 x IO<7>ćelija po bočici u DMEM koja sadrži 5% fetalni goveđi serum (FBS) (Hvclone, kataloški br. SH 30070.03), IX neesencijalnih aminokiselina (Sigma, kataloški br. M 7145), IX penicilin/streptomicin (Sigma, kataloški br. P7539 (10.000 U/ml penicilin/streptomicin)) i IX natrijum piruvat (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kada su ćelije dostigle 60-70% konfluentnosti, vektor teškog lanca i vektor lakog lanca koji su dobijeni iz konkretnog hibridoma su ko-transficirani u ćelije tokom 24 časa, nakon čega je podloga zamenjena istom podlogom ali u kojoj nema seruma. Podloga bez seruma je sakupljena i zamenjena svežom podlogom bez seruma dva puta, 48 i 96 časova nakon ko-transfekcije, te je ukupna zapremina sakupljene podloge bez seruma iznosila 1,25 1.

[0255] Deset odvojenih ko-transfekcija je ponovljeno, uz upotrebu 239T ćelija adaptiranih na podlogu bez seruma, u suspenziji, u podlozi koja je prethodno opisana, bez seruma. Vektori teškog lanca i vektori lakog lanca dobijeni iz konkretnog hibridoma ko-transficirani su u ćelije, pri čemu je zapremina kulture iznosila 500 ml. Transficirane ćelije su inkubirane tokom 7 dana, nakon čega je sakupljena kondicionirana podloga bez seruma.

Primer 5

Ekspresija antitela i kloniranje CHO ćelija

[0256] Ćelije jajnika kineskog hrčka deficijentne za DHFR (CHOd") upotrebljene su za dobijanje stabilne ekspresije rekombinantnih antitela na HGF. U deset odvojenih ko-transfekcija, CHOd" ćelije su ko-transficirane i vektorom teškog lanca i vektorom lakog lanca, koji su dobijeni

iz jednog od hibridoma koji su opisani u primeru 1, kao što je opisano u primeru 4. Ko-transfekcije su izvršene upotrebom standardnog kalcijum fosfatnog postupka.

[0257] Transficirane ćelije iz svake od deset ko-transfekcija gajene su zasebno u selektivnoj podlozi koja je sadržala DMEM sa visokom koncentracijom glukoze, kojoj nedostaje hipoksantin - timidin (Gibco/BRL, Carlsbad, CA, kataloški br. 11965), sa 5% dijalizovanim fetalnim goveđim serumom. Ovakva podloga, kojoj nedostaje hipoksantin - timidin, omogućava selekciju onih ćelija koje eksprimiraju rekombinantni DHFR enzim. Podloge is svakog od poraslih transfektanata su ispitivane na prisustvo humanih antitela korišćenjem standardnih ELISA testova.

Primer 6

Ekspresija antitela na HGF u CHOd" klonovima

[0258] Po šest uzoraka od svakog od deset različitih stabilnih CHOd" klonova opisanih u primeru 5, od kojih svaki različiti klon eksprimira jedno od deset različitih antitela na HGF, gajeno je zasebno u podlozi za rast. Podloga za rast je DMEM sa visokom koncentracijom glukoze (Gibco/BRL, Carlsbad, CA, kataloški br. 11965), kojoj su dodati 5% dijalizovani FBS, neesencijalne aminokiseline i L-glutamin (Life Technologies, Carlsbad, CA). Ove ćelije su gajene na 37 °C, pri 5% CO2.

[0259] Kada su klonovi CHOd" dostigli stadijum rasta u šest polja, u podlogu za*rast je dodat lOnM metotreksat kako bi se amplifikovala ekspresija antitela. Nakon što su ćelije dostigle konfluentan rast, premeštene su u šolje od 100 mm. Koncentracija metotreksata je povećana sa 10 nM na 20 nM, na 50 nM, na 100 nM, na 250 nM, na 500 nM, na 1 uM, na 2 uM, na 4 uM i konačno, na 10 uM. Ćelije su gajene pri svakoj od ovih koncentracija tokom najmanje jedne nedelje, sve dok se nisu dovoljno adaptirale na datu koncentraciju metotreksata, što je određeno vizuelno.

[0260] Kondicionirane podloge iz svakog od klonova ispitivane su pri svakoj od koncentracija metotreksata, kako bi se odredio stepen ekspresije svakog od antitela na HGF. Podloga je ispitivana standardnim ELISA testovima i testovima sa sendvičima sa TR fluorescencijom ("time-resolved fluorescence", TRF) kako bi se semi-kvantitativno odredilo vezivanje antitela na HGF za ploče koje su obložene humanim HGF.

[0261] Klonovi amplifikovani metotreksatom sa najvećim stepenom ekspresije antitela prilagođeni su na rast u podlozi za produkciju bez seruma na sledeći način. Klonovi su tripsinizacijom odv ojeni od suda u kome su rasli u kulturi, centrifugirani i ponovo suspendovani u 50 ml podloge za produkciju bez seruma pri gustini ćelija od 4 x 10<3>ćelija/ml u bočici za mešanjc sa čvrstim poklopcem od 250 ml. Kulture su inkubirane u toploj sobi na 37 °C i mućkane pri oko 125 RPM. Svakih 3 do 4 dana, ćelije su centrifugirane i razblaživane na gustinu od 4 x IO5 ćelija ml svežom podlogom za produkciju bez seruma. Sveža podloga za produkciju bez seruma dodavana je približno deset puta u svaku od kultura, kako bi se završila ova faza prilagođavanja.

Primer 7

Prečišćavanje antitela iz kondicioniranih podloga rekombinantnih ćelija

[0262] Sakupljene su podloge iz kultura hibridoma opisanih u primeru 1, kultura 293T ćelija u kojima je vršena prolazna ekspresija opisana u primeru 4, kultura stabilnih transfektanata opisanih u primeru 5, kao i iz kultura klonova amplifikovanih metotreksatom, opisanih u primeru 6. Podloge iz svakog od ovih izvora su koncentrovane deset puta, svaka za sebe, u spiralno namotanoj kaseti za ultrafiltraciju YM30 (Milipore, Bedford, MA, kataloški br. S10Y30), prema uputstvima proizvođača. Koncentracija antitela prisutna u svakoj od koncentrovanih podloga određena je upotrebom tečne hromatografije visoke performanse (HPLC).

[0263] Antitela su prečišćena iz uzoraka koncentrovanih podloga prečišćavanjem na afinitetnoj smoli, korišćenjem rekombinantne Protein A Sepharose (rProA) (Amersham, Piscataway, NJ, kataloški br. 17-1279-03). rProA je prvo isprana četiri puta fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS). Nakon poslednjeg ispiranja, napravljena je smeša isprane rProA u PBS mešanjem jednakih zapremina rProA i PBS. Ova rProA smeša je dodata u svaki od uzoraka koncentrovanih podloga, u količini od oko 1 ul rProA smeše na svakih 5 ug antitela u uzorku podloge, s tim da ni ujedan uzorak podloge nije dodato manje od 50 ul rProA smeše. Dobijene smeše rProA/uzoraka podloge su potom centrifugirane, kako bi se staložila rProA. Frakcije supernatanta koje su sadržale nevezane proteine su odbačene. Staložene rProA su zasebno resuspendovane, svaka u po 0,5 ml PBS. Uzorci resuspendovane rProA su potom prebačeni u Spin-X kivete od 0,45 pm (CoStar, Corning, NY, kataloški br. 8162), i centrifugirani kako bi se odstranio PBS. rProA i Spin-X kivetama je zatim isprana 3 puta sa po 0,5 ml PBS.

[0264] Frakcije antitela su eluirane sa rProA u Spin-X kivetama dodavanjem 1,5 zapremina 0,1 M glicina, pH 2,7 i inkubacijom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Spin-X kivete su potom centrifugirane, te su eluati iz svake od Spin-X kiveta pojedinačno sakupljeni. Elucija je ponovljena a dva eluata iz svake pojedinačne Spin-X kivete su spojena. pH spojenih eluata neutralisan je jednom dvadesetpetinom zapremine 1,0 M Trisa, pH 9,2. Svaki uzorak je, zatim, proceđen kroz novu Spin-X kivetu kako bi se uklonile čestice.

[0265] Koncentracija proteina u konačnim preparatima određena je Bredofrdovim testom, uz upotrebu humanog IgG kao standarda. Za procenu čistoće, uzorci svakog od konačnih preparata su analizirani u zasebnim trakama na SDS-PAGE gelu, obojeni bojom Coomassie, te je gel vizuelno ispitan.

Primer 8

Karakterizacija vezivanja antitela za HGF

A. Merenja afiniteta

[0266] Analiza afiniteta 6 antitela na HGF opisanih u primeru 6 (onih koja su dobijena iz hibridoma 3.10.1, 2.4.4, 2.12.1, 1.29.1, 1.75.1 i 1.74.3) izvršena je korišćenjem BIAcore<®>3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), prema uputstvima proizvođača. Kao radni pufer, u ovim analizama je korišćen je PBS sa 0,005% P20 surfaktantom (Biacore, Inc., Piscatavvav, NJ). Rekombinantni protein G (Pierce, Rockford, IL) je imobilizovan za CM5 senzorski čip istraživačkog kvaliteta (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) preko primarnih amino grupa, korišćenjem Amine Coupling kompleta (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), prema uputstvima proizvođača.

[0267] U šest odvojenih uzoraka, po oko 200 rezonancionih jedinica ("resonance units", RU) svakog od šest antitela na HGF odvojeno je vezano za imobilizovani Protein G prema uputstvima proizvođača. Uzorci koji su sadržali različite koncentracije (0 - 100 nM) humanog HGF ubrizgavani su preko površine vezanog antitela pri brzini protoka od 50 ul/min, tokom 3 minuta. Kinetički parametri vezivanja antitela, uključujući ka(konstantu brzine asocijacije), kd(konstantu brzine disocijacije) i Kd(konstantu ravnoteže disocijacije), određeni su pomoću BIA evaluation 3.1 računarskog programa (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Niske konstante ravnoteže disocijacije ukazuju na veći afinitet antitela za HGF. Podaci su prikazani na slici 6A.

[0268] Vrednosti KDsvakog od četiri antitela na HGF (onih koja su dobij ena iz hibridoma 2.4.4, 1.29.1, 1.74.2 i 2.12.1) takođe su merene postupkom koji se zasniva na vezivanju pri ravnoteži. Ovaj postupak izveden je pomoću BIAcore<®>3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), uz upotrebu PBS sa 0,005% P20 surfaktantom (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) kao radnog pufera. Četiri antitela su odvojeno imobilizovana za CM5 senzorski čip istraživačkog kvaliteta (Biacore. Inc., Piscataway, NJ) preko primarnih amino grupa, korišćenjem Amine Coupling kompleta (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), prema uputstvima proizvođača.

[0269] U odvojenim testovima, svako od četiri antitela na HGF, u različitim koncentracijama (od 0,01 nM do 50 nM) je odvojeno inkubirano sa svakom od dve koncentracije (0,05 nM i 1 nM) humanog HGF u PBS sa 0,005% P20 surfaktantom i 0,1 mg/ml BSA na sobnoj temperaturi, tokom najmanje šest časova. Svaki od ovih uzoraka je zatim ubrizgan preko površine CM5 senzorskog čipa na koji je imobilizovano to isto antitelo na HGF. Dobijeni signal vezivanja bio je proporcionalan slobodnom HGF u rastvoru. Konstanta ravnoteže disocijacije

(Kd) je dobij ena iz nelinearne regresione analize kompeticionih krivih, korišćenjem modela dvostruke krive sa homogenim vezivanjem na istom mestu (KinExA software, Sapidvne Instruments Inc., Boise ID). Ove vrednosti konstanti ravnoteže disocijacije date su na slici 6B.

B. Specifičnost vezivanja antitela za HGF

[0270] Humani HGF je ili eksprimiran u CHO ćelijama, ili je nabavljen preko R&D Svstems (R&D Svstems, Minneapolis, MN, kataloški br. 294-HG-005). Rekombinantni mišji HGF je dobijen korišćenjem sekvence iz Liu et al.,Molecular cloning and characterization od cDNA encoding mouse hepatocyte growth factor,Biochim Biophvs Acta. 16: 1216 (2): 299 - 300

(1993). Rekombinantni mišji HGF dobijen je ili ekspresijom u ćelijama insekata, korišćenjem bakulovirusa kao vektora, ili ekspresijom u 293T ćelijama. U bilo kom slučaju, mišji HGF je prečišćen heparin sulfatnom afinitetnom hromatografijom.

[0271] Pokazano je da je svaki od preparata humanog i mišjeg HGF biološki aktivan. Humani HGF je izazvao humanu Met fosforilaciju zavisnu od doze u humanim PC3 ćelijama (ATCC Manassas, VA # CRL 1435) i u mišjim 4T1 ćelijama (ATCC Manassas, VA # CRL ' 2531). Mišji HGF je izazvao Met fosforilaciju u mišjim 4T1 ćelijama, ali ne i u humanim PC3 ćelijama.

[0272] Humani HGF i mišji HGF su analizirani u odvojenim trakama u SDS PAGE gelovima. Humani HGF i mišji HGF su, svaki ponaosob, propušteni kroz gel u koncentracijama od po 100 ng/traci i 10 ng/traci. Neke SDS PAGE su vršene pri neredukujućim uslovima, dok su druge, na drugim gelovima, vršene pri redukujućim uslovima uz upotrebu beta merkaptoetanola. Humani HGF i mišji HGF u SDS PAGE gelovima su prebačeni na nitrocelulozne membrane. Ove membrane su odvojeno inkubirane sa jednim od deset antitela na HGF opisanih u primeru 6. Svako od deset antitela na HGF je odvojeno inkubirano sa -nitroceluloznim membranama dobijenim iz gelova koji su sadržali humani HGF i mišji HGF, analiziranih pri redukujućim uslovima i nitroceluloznim membranama dobijenim iz gelova koji su sadržali humani HGF i mišji HGF, analiziranih pri neredukujućim uslovima. Membrane su potom inkubirane sa kozjim anti-humanim IgG antitelom vezanim za HRP (Pierce, Rockford, IL, kataloški br. 31412). Signal iz tog kozjeg anti-humanog IgG antitela vezanog za HRP detektovan je elektrohemiluminescencijom (ECL™; Amersham Pharmacia Biotech, Piscatavvav, NJ, kataloški br. RPN2106), prema uputstvima proizvođača.

[0273] Na slici 7 su prikazani gelovi u kojima je testirano svako od deset antitela na HGF opisanih u primeru 6. Ploče na levoj strani pokazuju gelove u kojima je svako od antitela testirano uz upotrebu 100 ng humanog HGF (traka 1), 10 ng humanog HGF (traka 2), 100 ng mišjeg HGF (traka 3) i 10 ng mišjeg HGF (traka 4), pod neredukujućim uslovima. Ploče na desnoj strani pokazuju gelove u kojima je svako od antitela testirano uz upotrebu 100 ng humanog HGF (traka 5), 10 ng humanog HGF (traka 6), 100 ng mišjeg HGF (traka 7) i 10 ng mišjeg HGF (traka 8), pod redukujućim uslovima. Svako od testiranih antitela na HGF vezivalo se za humani HGF pod neredukujućim uslovima (trake 1 i 2). Ni jedno od testiranih antitela na HGF nije pokazalo značajno vezivanje za mišji HGF pod neredukujućim uslovima (trake 3 i 4),

niti za humani HGF (trake 5 i 6) ili mišji HGF (trake 7 i 8) pod redukujućim uslovima.

C. Mapiranje epitopa korišćenjem fuzionih proteina

[0274] Sisarski ekspresioni vektor koji sadrži cDNK sekvencu koja kodira kokošji avidin odmah pored višestrukog mesta za kloniranje vektora pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA, kataloški br. VO44-50) dobijen je korišćenjem standardnih molekularnih tehnika (Slika 9A). Taj vektor je obuhvatao signalnu sekvencu kokošjeg avidina (Slika 9B), kako bi se omogućila sekrecija eksprimiranih fuzionih proteina. Ekspresioni vektori su dobijeni ubacivanjem sekvence koja kodira konkretni ciljni protein u višestruko mesto za kloniranje ekspresionog vektora fuzionog proteina. Dobijeni fuzioni konstrukti su, svaki ponaosob, kodirali avidin na N-terminalnom kraju ciljnog proteina.

[0275] Upotrebom ove tehnike, dobijeni su fuzioni proteini koji sadrže avidin fuzionisan

sa ciljnim proteinom: humanim HGF potpune dužine; d5 HGF, koji je varijanta humanog HGF dobijena isecanjem koja se javlja u prirodi (Rubin, J. et al., PNAS 88:415 - 419 (1991)); mišjim HGF potpune dužine; himerom br. 1 koja sadrži N-terminalni deo humanog HGF (aminokiselinske ostatke 32 do 505) i C-terminalni deo mišjeg HGF (aminokiselinske ostatke 508 do 728); himerom br. 2 koja sadrži N-terminalni deo mišjeg HGF (aminokiselinske ostatke 33 do 506) i C-terminalni deo humanog HGF (aminokiselinske ostatke 506 do 728); i himerom br. 3 koja sadrži N-terminalni deo humanog HGF (aminokiselinske ostatke 32 do 582) i C-terminalni deo mišjeg HGF (aminokiselinske ostatke 583 do 728).

[0276] Na slici 10 prikazan je šematski prikaz fuzionih proteina. N-terminalni domen HGF sadrži četiri domena perece ("kringle"), a prikazanje pravougaonicima označenim kao Kl

do K4. C-terminalni domen HGF homolog je serin proteazama. Taj domen je prikazan linijama. Prazni pravougaonici i pune linije označavaju humane HGF sekvence. Osenčeni pravougaonici i tačkaste linije označavaju mišje sekvence.

[0277] Pojedinačni fuzioni proteini prolazno su eksprimirani u 293T ćelijama, tako što je svaki pojedinačni ekspresioni vektor sa jednim od fuzionih proteina odvojeno transficiran, korišćenjem Lipofectamine (Gibco BRL, Carlsbad, CA, kataloški br. 18324) prema uputstvima proizvođača. Kondicionirane podloge su sakupljene i ispitane približno 48 časova nakon transfekcije.

[0278] U odvojenim uzorcima, pet od deset antitela na HGF opisanih u primeru .6 (ona koja su dobijena iz hibridoma 2.4.4, 1.74.1, 1.75.1, 3.10.1 i 2.12.1) odvojeno je inkubirano sa fuzionim proteinima koji sadrže svaki od sledećih ciljnih proteina: humani HGF potpune dužine, d5 HGF i mišji HGF. Nakon inkubacije, fuzioni protein u svakom od uzoraka odvojeno je vezan korišćenjem granulica obloženih biotinom (Spherotech Inc., Libertvville, IL, kataloški br. TP-60-5). Dobijeni kompleksi granulica-proteina obeleženi su dodavanjem anti-avidin antitela obeleženog FITC (Vector Lab, Burlingame, CA, kataloški br. SP-2040). Prisustvo antitela na HGF određeno je dodavanjem kozjeg anti humanog F(ab')2 antitela obeleženog fikoeritinom (PE) (Southern Biotech Associates, Ine, Birmingham, AL, kataloški br. 2043-09).

[0279] Ovi uzorci su, potom, analizirani pomoću ćelijskog sortera aktiviranog fluorescencijom (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS). Kompleksi na granulicama obeleženi FITC (što je ukazivalo na prisustvo avidina) i/ili PE (što je ukazivalo na prisustvo antitela na HGF) detektovani su pomoću Becton Dickinson Bioscience FACScan (BD, Franklin Lakes, NJ). Na slici 8 su dati grafički prikazani rezultati dobijeni FACS analizom za pet testiranih antitela na HGF.

[0280] U odvojenim uzorcima, dva od deset antitela na HGF opisanih u primeru 6 (ona dobijena iz hibridoma 2.12.1 i 2.4.4) odvojeno su inkubirana sa fuzionim proteinima koji sadrže svaki od sledećih ciljnih proteina: humani HGF potpune dužine, d5 HGF i mišji HGF, himeru br. 1, himeru br. 2 i himeru br. 3. Ovi uzorci su analizirani pomoću FACS, kao što je prethodno opisano.

[0281] Na slici 10A, desno od šematskog dijagrama, prikazani su rezultati dobijeni u ovim eksperimentima vezivanja. Ni antitelo 2.12.1, ni antitelo 2.4.4 nisu se vezivala za himeru br. 1.1 antitelo 2.12.1, i antitelo 2.4.4 vezivala su se za himeru br. 2. Antitelo 2.4.4 vezalo se sa himeru br. 3. Antitelo 2.12.1 nije se vezalo za himeru br. 3.

D. Dalje mapiranie epitopa korišćenjem fuzionih proteina

[0282] Da bi se dobilo više informacija o epitopu(ima) HGF za koji se vezuju antitela 2.4.4 i 2.12.1, konstruisane su i analizirane dalje himere mišjeg/humanog HGF kao što je prethodno opisano u primeru 8C (slika 10B). Prajmeri korišćeni za dobijanje himera dati su u tabeli 10.

[0283] Na slici 10B prikazani su šematski crteži mišjih i humanih himernih molekula HGF pripremljenih za ovo ispitivanje, pri čemu je na desnoj strani slike prikazano vezivanje antitela 2.12.1 i 2.4.4 za svaku od himera. Himere br. 1 do 3 korišćene u ovom ispitivanju su identične himerama br. 1 do 3 opisanim u primeru 8C i slici 10A. Himere br. 4 do 6 su sadržale sve veće delove N-terminalnog kraja mišjeg HGF u, u drugim pogledima, potpuno humanom molekulu HGF. Himera br. 7 sadržala je aminokiselinske ostatke 507 do 585 mišjeg HGF u, u drugim pogledima, potpuno humanom molekulu HGF, a himera br. 8 je sadržala aminokiselinske ostatke 507 do 585 humanog HGF u, u drugim pogledima, potpuno mišjem molekulu HGF. Himera br. 9 je konstruisana od aminokiselinskih ostataka 1 do 585 mišjeg HGF i aminokiselinskih ostataka 586 do 731 humanog HGF.

[0284] Vezivanje antitela 2.4.4 i 2.12.1 za himerne proteine ispitano je kao stoje opisano

u primeru 8C. Nakon inkubacije, bilo antitela 2.4.4 ili antitela 2.12.1 sa jednim od fuzionih proteina, fuzioni proteini u svakom uzorku su odvojeno vezani za granulice obložene biotinom (Spherotech Inc., Libertvville, IL, kataloški br. TP-60-5). Dobijeni kompleksi granulica i proteina obeleženi su dodavanjem anti-avidin antitela obeleženog FITC (Vector Lab, Burlingame, CA, kataloški br. SP-2040). Prisustvo antitela na HGF određeno je dodavanjem kozjeg anti humanog F(ab')2 antitela obeleženog fikoeritinom (PE) (Southern Biotech Associates, Ine, Birmingham, AL, kataloški br. 2043-09). Ovi uzorci su, potom, analizirani pomoću ćelijskog sortera aktiviranog fluorescencijom (FACS). Kompleksi na granulicama obeleženi FITC (što je ukazivalo na prisustvo avidina) i/ili PE (što je ukazivalo na prisustvo antitela na HGF) detektovani su pomoću Becton Dickinson Bioscience FACScan (BD, Franklin Lakes, NJ). U nekim slučajevima, nakon normalizacije ekspresije upotrebom FITC, nakon vezivanja antitela za PE obeleživač izvršena je jednobojna FACS analiza. Ovaj postupak povećava osetljivost testa i pomaže merenje vezivanja konstrukta koji nisu eksprimirani u visokim koncentracijama.

[0285] Kao što je prikazano na slici 10B, i antitelo 2.4.4 i 2.12.1 vezuju se za himeru br. 8 (slika 10B), koja sadrži aminokiselinske ostatke 507 do 585 humanog HGF. Ovi rezultati ukazuju da taj region sadrži ostatke koji su, direktno ili indirektno, uključeni u vezivanje antitela 2.4.4 i 2.12.1 za HGF. Himere koje su sadržale mišje sekvence u ovom istom regionu od 507 do 585 (himere br. 7 i 9) nisu se vezivale za antitela 2.4.4 i 2.12.1. Himera 3 nije se vezivala za antitelo 2.12.1 ali se vezivala za antitelo 2.4.4, bez obzira na prisustvo aminokiselinskih ostataka 507 do 585 humanog HGF.

[0286] Kako bi se dobilo više informacija o aminokiselinskim ostacima 507 do 585 humanog HGF (GWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSR--DLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLM, sekvenca čiji je ID broj 123)

(videti sliku 10D), pripremljeni su mutanti HGF koji sadrže specifične tačkaste mutacije kojima se aminokiselinski ostaci iz humane sekvence zamenjuju aminokiselinskim ostacima iz mišje sekvence u okviru regiona aminokiselinskih ostataka 507 do 585 (slika 10C), korišćenjem prajmera datih u tabeli 10. Konstruisani su fuzioni proteini humanog HGF - avidina, koji sadrže pet pojedinačnih aminokiselinskih zamena sekvence humanog HGF sekvencom mišjeg HGF, koje nisu jedna do druge (Genbank red. br. NM_000601 i NM_010427, respektivno). Pripremljena su još dva dodatna konstrukta, jedan koji sadrži inserciju dva aminokiselinska ostatka u sekvencu humanog HGF, a drugi koji sadrži deleciju dva aminokiselinska ostatka iz sekvence mišjeg HGF (slika 10C).

[0287] Ovi konstrukti su eksprimirani i analizirani ispitivanjem vezivanja, kao što je objašnjeno u primerima 8C i 8D. Nakon inkubacije bilo antitela 2.4.4 ili antitela 2.12.1 sa jednim od mutiranih proteina, mutirani proteini u svakom uzorku su odvojeno vezani korišćenjem granulica obloženih biotinom (Spherotech Inc., Libertvville, IL, kataloški br. TP-60-5). Dobijeni kompleksi granulica i proteina obeleženi su dodavanjem anti-avidin antitela obeleženog FITC (Vector Lab, Burlingame, CA, kataloški br. SP-2040). Prisustvo antitela na HGF određeno je dodavanjem kozjeg anti humanog F(ab')2 antitela obeleženog fikoeritinom (PE) (Southern Biotech Associates, Ine, Birmingham, AL, kataloški br. 2043-09). Ovi uzorci su, potom, analizirani pomoću ćelijskog sortera aktiviranog fluorescencijom (FACS). Kompleksi na granulicama obeleženi FITC (što je ukazivalo na prisustvo avidina) i/ili PE (što je ukazivalo na prisustvo antitela na HGF) detektovani su pomoću Becton Dickinson Bioscience FACScan (BD, Franklin Lakes, NJ). U nekim slučajevima, nakon normalizacije ekspresije upotrebom FITC, nakon vezivanja antitela za PE obeleživač izvršena je jednobojna FACS analiza. Ovaj postupak povećava osetljivost testa i pomaže merenje vezivanja konstrukta koji nisu eksprimirani u visokim koncentracijama.

[0288] Pronađeno je da mutacije u aminokiselinskom ostatku 561, ali ne i u aminokiselinskim ostacima 592, 601 ili 647, ometaju vezivanje između mutiranog humanog HGF i antitela 2.12.1, kao i između mutiranog humanog HGF i antitela 2.4.4. Mutacija u aminokiselinskom ostatku 555 ometala je vezivanje antitela 2.12.1, ali nije uticala na vezivanje antitela 2.4.4. Insercija dva aminokiselinska ostatka iz sekvence mišjeg HGF, 540N i 541K, koje nisu prisutne u sekvenci humanog HGF (videti sliku 10D), ometala je vezivanje oba antitela. Delecija ove dve aminokiseline iz sekvence mišjeg HGF nije dovela do vezivanja ni jednog od ova dva antitela za mišji HGF.

E. Mapiranje epitopa testovima zaštite od proteaza

[0289] Komplementarni klasični testovi zaštite od proteaza su takođe izvršeni kako bi se identifikovali epitopi HGF koje vezuje antitelo 2.12.1. Videti Yi & Skalka,Mapping Epitopes of

Monoclonal Antibodies Against HIV- 1 Integrase with Limited Proteolysis and Matrix - Assisted

Laser Desorption Ionization Time- of- Flight Mass Spectrometry,Biopolimers (Peptide Science)

55: 308 - 318 (2000). Humani HGF (30 ug/ul) je pomešan sa antitelom 2.12.1 (40ug/4ul) u 200

ml 0,1 M Tris pufera, pH 7,5 i inkubiran na ledu 30 minuta. Digestija tripsinom (1 ug) vršena je na 37°C tokom jednog časa. Digestiran materijal propušten je kroz reverzno faznu HPLC kako bi se peptidi razdvojili. Paralelno je izvršena i digestija samo humanog HGF, bez antitela 2.12.1. Smeša je propuštena kroz HPLC kolonu (Vydac C18, 2,1 x 150 mm, Vydac Inc., Hesperia, CA),

u 0,1% trifluorsirćetne kiseline (TFA), sa elucionim gradijentom od 2 do 35 % acetonitrila u 0,1

% TFA. UV signali eluiranih peptida beleženi su pomoću HP 1090 HPLC uređaja (Hevvlett Packard, Palo Alto). Dve HPLC mape su upoređene kako bi se utvrdilo koji su peptidi bili zaštićeni antitelom 2.12.1 (slika 11A).

[0290] Potom je izvršeno sekvenciranje sa N-terminalnog kraja, kao i masena spektrometrija, kako bi se identifikovali specifični zaštićeni peptidi. Sekvenciranje peptida sa N-terminalnog kraja izvršeno je pomoću Edmanove degradacije na ABI-Procise sekvenceru proteina (Applied Biosystems, Foster City, CA). U svakom ciklusu, aminokiseline su identifikovane pomoću retencionih vremena na povezanom HPLC uređaju i pomoću poređcnja sa standardima aminokiselina. Masena spektrometrija zaštićnih fragmenata izvršena je na Perceptive Voyager masenom sprektrometru (Applied Biosystems, Farmingham, MA). Laserska desorpciona jonizacija potpomognuta matriksom ("Matrix assisted laser desorption ionization", MALDI) izvršena je korišćenjem 4-hidroksicijanocimetne kiseline (HCCA) ili sinapinske kiseline kao matriksa. Molekulske mase su određene pomoću kalibracije u odnosu na poznate standarde (oskidovani beta lanac insulina i citohrom c).

[0291] a podjedinica humanog HGF obuhvata aminokiselinske ostatke 32 do 494, a p podjedinica obuhvata aminokiselinske ostakte 495 do 728 (videti Swiss-Prot unos P14210 za humani HGF). Antitelo 2.12.1 koje se vezuje za HGF štitilo je dva vrha, T33 i T38.6. (slika 11 A). Vrh T38.6 sadržao je dva peptida, koja su oba odgovarala sekvencama na početku, ili blizu početka p podjedinice zrelog HGF (videti sliku 10D, sekvenca koja počinje podvučenim, masnim slovima (VVNGIPTRTN (sekvenca čiji je ID broj 172)) i sliku 11C). T33 je dobijen iz a podjedinice (slika 11C). Na osnovu masene spektrometrije, dobijeno je da su mase dva polipeptida u vrhu T38.6 7165 i 6840 daltona, respektivno. Na osnovu mogućih mesta hidrolize tripsinom prisutnih u sekvenci HGF (videti, na primer, ostatak arginina na položaju 559 humanog HGF, označen masnim, podvučenim slovima na slici 10D), predpostavlja se da argininski ostatak na položaju 559 definiše C-terminalni kraj zaštićenog peptida.

[0292] Još jedan komplementarni eksperiment osmišljen je kako bi se ispitali peptidi koji vezuju antitela. Smeša HGF i antitela 2.12.1 izložena je digestiji tripsinom tokom jednog časa, kao što je prethodno opisano, nakon čega je profiltrirana korišćenjem Microcon<®>10 (Milipore Corp., Bedford, MA) kako bi se uklonili nevezani peptidi. Predpostavljalo se da će vezani peptidi da zaostanu na membrani zajedno sa antitelom 2.12.1. Smeši peptida i antitela 2.12.1 dodat je intaktni humani HGF (15 ug) kako bi se vezani peptid(i) eluirao(li) iz kompleksa. Uzorak je inkubiran preko noći na 4 °C, nakon čega je ponovo profdtriran korišćenjem Microcon<®>10 kako bi se odvojili peptidi koje je eluirao HGF od antitela i intaktnog HGF. Oba uzorka (vezani i nevezani peptidi) su analizirana reverzno faznom HPLC (slika 11B). Vezani peptidi su izolovani pomoću HPLC, nakon čega je izvršeno sekvenciranje sa N-terminalnog kraja, kao i masena spektrometrija, kao što je prethodno opisano.

[0293] Kada je HGF korišćen za eluciju peptida, dobijen je veliki peptidni vrh (T48 na slici 11B) koji je eluiran sa kompleksa antitelo-HGF i za koji je, sekvenciranjem sa N-terminalnog kraja, utvrđeno da sadrži iste dve sekvence iz P podjedinice koje su pronađene u vrhu T38.6, kao što je prethodno opisano. Na osnovu masene spektrometrije dobijena je heterogena veličina peptida u vrhu T48, usled čega je bilo nemoguće precizno odrediti C-terminalni kraj na osnovu ovih podataka. Tri preostala vrha (obeležena kao # na slici 11B) nisu sadržala peptide, ili su sadržala peptide nepoznatog porekla, koji hisu u vezi sa HGF.

[0294] Ova dva eksperimenta, zajedno, ukazala su na to da je N-terminalni kraj beta podjedinice HGF deo epitopa za antitelo 2.12.1. Ovi podaci dopunjavaju podatke iz primera 8D,

u kome je pronađeno da se epitopi koji su uključeni u vezivanje nalaze između aminokiselinskih ostataka 507 i 585 humanog HGF. Mutaciona analiza i molekulske mase zaštićenih peptida pokazuju da se epitop humanog HGF koji vezuje antitelo nalazi između aminokiselinskih ostataka 495 i 556 humanog HGF.

F. Kompetitivno vezivanje antitela

[0295] Antitela na HGF opisana u primeru 6, dobijena iz hibridoma 2.4.4 (antitelo 2.4.4)

i antitela na HGF dobijena iz hibridoma 2.12.1 (antitelo 2.12.1) obeležena su pomoću FITC za upotrebu u testovima kompetitivnog vezivanja, kao što sledi. Antitela 2.4.4 i 2.12.1 odvojeno su dijalizovana u PBS, pH 8,5. FITC obeleživač (mešani izomeri [5(6)-SFX sukcinimidil estara 6-fluorescein-5- (i 6-)-karboksamido]heksanske kiseline]) (Molecular Probes. kataloški br. F-2181) dodat je svakom od dva dijalizovana antitela pri molarnom odnosu 5 : 1 (obeleživač : antitelo), iz koncentrovanog rastvora FITC obeleživača koncentracije 5 mg/ml u DMSO. Ove smeše su inkubirane na sobnoj temperaturi (20 do 22 °C), preko noći, u mraku. Smeše su, potom, odvojeno propuštene kroz kolone Pharmacia PD-10 (Amersham, Piscataway, NJ) koje su ekvilibrisane u PBS. Apsorbanca dobijenih preparata očitana je na spektrofotometru na 280nM i 495 nM. Koncentracije antitela u ovim preparatima izračunate su korišćenjem apsorbance na 280nm. Odnos obeleženog antitela i neobeleženog antitela izračunat je prema sledećoj formuli:

Gde je Ax apsorbanca obeleživača na 495 nm, E ekstinkcioni koeficijent obeleživača koji

je 77500. Obično je antitelo obeleženo u odnosu 3 : 1 (FITC - obeleženo antitelo : neobeleženo antitelo).

[0296] Merena je sposobnost svakog od dva obeležena antitela da kompetiraju za vezivanje svakom od ostalih devet antitela na HGF. Svako od dva obeležena antitela na HGF odvojeno je inkubirano sa HGF, pri čemu je svako od dva obeležena antitela na HGF takođe odvojeno inkubirano sa HGF u prisustvu pedcsetostrukog molarnog viška jednog od drugih devet antitela na HGF, koje nije obeleženo. Tako je, u devet odvojenih uzoraka, obeleženo antitelo 2.4.4 odvojeno inkubirano sa HGF u prisustvu svakog od devet ostalih antitela na HGF, koja nisu obeležena. Shodno tome, u devet odvojenih uzoraka, obeleženo antitelo 2.12.1 odvojeno je inkubirano sa HGF u prisustvu svakog od devet ostalih antitela na HGF, koja nisu obeležena. Svaka od ovih kombinacija ponovljena je i sa d5 varijantom HGF dobijenom isecanjem umesto HGF potpune dužine.

[0297] Pozitivna kontrola kompeticije u ovim testovima kompetitivnog vezivanja podrazumevala je inkubaciju svakog obeleženog antitela sa pedesetostrukim molarnim viškom istog tog antitela. ali neobeleženog. Prema tome, antitelo 2.12.1 obeleženo pomoću FITC, inkubirano je u prisustvu, i odvojeno u odsustvu, pedesetostrukog molarnog viška neobeleženog antitela 2.12.1. Isto tako, antitelo 2.4.4 obeleženo pomoću FITC, inkubirano je u prisustvu, i u odsustvu, pedesetostrukog molarnog viška neobeleženog antitela 2.4.4. Kao što je i očekivano, signali fluorescencije uzoraka koji su inkubirani u prisustvu pedesetostrukog molarnog viška neobeleženog antitela bili su značajno slabiji od signala fluorescencije iz uzoraka u koje nisu dodata neobeležena antitela.

[0298] Profili vezivanja dati su na slici 12. Na slikama 12A i 12B prikazani su eksperimenti u kojima je korišćeno obeleženo antitelo 2.12.1. Objašnjenje krivih u svim graficima na slikama 12A i 12B: A: negativna kontrola (antitelo 2.12.1 obeleženo pomoću FITC bez HGF); B: pozitivna kontrola (antitelo 2.12.1 obeleženo pomoću FITC sa HGF); C: antitelo 1.74.1; D: antitelo 1.75.1; E: antitelo 1.29.1; F: antitelo 3.10.1; G: antitelo 1.61.3; H: antitelo 1.24.1; I: antitelo 1.60.1; J: antitelo 2.40.1; K: antitelo 2.12.1; L: antitelo 2.4.4. Na slici 12A prikazani su rezultati testa kompetitivnog vezivanja uz upotrebu fluorescentnog antitela 2.12.1 sa d5 varijantom HGF dobijenom isecanjem kao ciljnim proteinom. Na slici 12B prikazani su rezultati testa kompetitivnog vezivanja uz upotrebu fluorescentnog antitela 2.12.1 sa HGF potpune dužine kao ciljnim proteinom. Na slikama 12C i 12D prikazani su eksperimenti u kojima je korišćeno obeleženo antitelo 2.4.4. Objašnjenje krivih u svim graficima na slikama 12C i 12D: A: negativna kontrola (antitelo 2.4.4 obeleženo pomoću FITC bez HGF); B: pozitivna kontrola (antitelo 2.4.4 obeleženo pomoću FITC sa HGF); C: antitelo 1.74.1; D: antitelo 1.75.1; E: antitelo 1.29.1; F: antitelo 3.10.1; G: antitelo 1.61.3; H: antitelo 1.24.1; I: antitelo 1.60.1; J: antitelo 2.40.1; K: antitelo 2.12.1; L: antitelo 2.4.4. Na slici 12C prikazani su rezultati testa kompetitivnog vezivanja uz upotrebu fluorescentnog antitela 2.4.4 sa d5 varijantom HGF dobijenom isecanjem kao ciljnim proteinom. Na slici 12D prikazani su rezultati testa kompetitivnog vezivanja uz upotrebu fluorescentnog antitela 2.4.4 sa HGF potpune dužine kao ciljnim proteinom.

[0299] Podaci ukazuju da svako od deset antitela na HGF kompetira svakom od dva obeležena antitela za vezivanje za HGF potpune dužine ili d5 HGF (npr., antitela 2.12.1, 1.24.1 i 2.4.4 potpuno kompetiraju FITC obeleženom antitelu 2.12.1, slika 12A i 12B, vrhovi H, K i L, respektivno). Druga antitela su samo delimično kompetirala za vezivanje (npr., antitela 2.12.1, 2.40.1 i 1.61.3 delimično kompetiraju FITC obeleženom 2.4.4, slike 12C i 12D, vrhovi K, J i G, respektivno).

Primer 9

Neutrališući ELISA testovi

[0300] Neutrališući ELISA test razvijen je kako bi se utvrdilo da li antitela opisana u primeru 6 mogu da ometaju vezivanje Met-HGF. Delphia ploče sa po 96 polja (kataloški br. AAAND-0001, Wallac Inc., Gaithersburg, MD) obeležene su HGF dodavanjem 100 ul HGF, pri koncentraciji 6,25 ug/ml po polju. Ploče su inkubirane na 37 °C tokom 1 časa, ili na 4 °C preko noći. Ploče su potom blokirane pomoću 5% BSA (kataloški br. 50-61-00, KPL, Gaithersburg, MD) u PBS koji sadrži 0,1% Tween 20, tokom 1 čas na sobnoj temperaturi uz mućkanje.

[0301] Uzorci za ispitivanje pripremljeni su odvojenim mešanjem Met (2nM, 0,256 ug/ml) i različitih koncentracija datog antitela na HGF koje se ispituje. Ispitivane su sledeće koncentracije: 667 nM, 223nM, 74,1 nM, 24,7 nM, 8,2 nM, 2,7 nM, 0,91 nM, 0,30 nM, 0,10 nM

i 0,034 nM. Zapremina od 100 ul uzorka koji se ispituje dodata je u svako polje na ploči. Ploče su potom inkubirane na 4 °C preko noći, a zatim isprane 4 puta pomoću PBS koji sadrži 0,1% Tvveen 20. Nakon toga, dodato je po 100 ul biotinilovanog anti-cMetR antitela pa polju (kataloški br. BAF358, R&D Svstems Inc., Minneapolis, MN), koncentracije 2 p.g/ml. Ovo antitelo se vezuje za Met-HGF komplekse na ploči, ali se ne vezuje za anti-HGF antitelo vezano za HGF na ploči. Ploče su potom inkubirane 2 časa bez mućkanja, a zatim isprane 4 puta pomoću PBS koji sadrži 0, 1% Tvveen 20. Dodat je Eu-streptavidin (razblaženje 1 : 1000 u test puferu) (kataloški br. 1244-360, Wallac Inc., Gaithersburg, MD) te su ploče mućkane na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Ploče su potom isprane 4 puta pomoću PBS koji sadrži 0,1% Tvveen 20. Nakon toga, dodato je po 100 ul pufera za pojačavanje (Wallac Inc., kataloški br. 1244-105, Gaithersburg, MD). Nakon najmanje 5 minuta, rezultati su očitavani pomoću postupka sa europijumom na Victor 2 (1420 Multilabel Counter, Wallac Inc., Gaithersburg, MD).

[0302] Procenat inhibicije vezivanja Met za HGF (t.j., neutralizacije) je izračunat, te su određene i IC5ovrednosti korišćenjem jednačine za fitovanje sa 4 parametra Excelfit, verzija 2.0.6 (Microsoft Ine, Seattle, WA). U prisustvu antitela na HGF opisanih u primeru 6, vezivanje Met za HGF je neutralisano. Podaci dobijeni u ovim eksperimentima prikazani su na slici 13.

Primer 10

Neutralizacija u ćelijama

A. Fosforilacija Met

[0303] HGF izaziva fosforilaciju Met u PC-3 ćelijama (ATCC, Manassas, VA # CRL 1435). PC-3 ćelije su gajene u pločama za gajenje kulture sa po 96 polja Falcon (VWR, San Diego, CA, kataloški br. 62740-081), dodavanjem 1 x IO4 PC-3 ćelija po polju u 100 ul RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, kataloški br. 11875-093) koji sadrži 5% fetalnog goveđeg seruma (Hvclone. Logan, UT, kataloški br. SH 30070.03) i 1 x penicilin, streptomicin, glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, kataloški br. 10378-016). Nakon 24 časa rasta na 37 °C pod 5% C02, ćelije su isprane jednom u DMEM sa niskom koncentracijom glukoze (Invitrogen, Carlsbad, CA, kataloški br. 11885-084) koja sadrži 0,1% goveđi serum albumin (Sigma, Louis, MO, kataloški br. A-3156) i inkubirane 18 do 20 časova u 100 ul podloge DMEM sa niskom koncentracijom glukoze koja sadrži 0,1% goveđi serum albumin (Sigma, Louis, MO, kataloški br. A-3156).

[0304] Po osam različitih razblaženja svakog od deset antitela na HGF opisanih u primeru 6 odvojeno je prirpemljeno serijskim razblaživanjem u podlozi (DMEM sa niskom koncentracijom glukoze sa 0,1% goveđim serum albuminom) koja sadrži 200 ng/ml HGF. Koncentracije antitela na HGF u odvojenim razblaženjima bile su 200 nM, 67 nM, 22 nM, 7 nM, 2,5 nM, 1 nM. 0,3 nM i 0,10 nM datog antitela na HGF. Ova razblaženja antitela/HGF inkubirana su 30 minuta na 37 °C.

[0305] PC-3 ćelije su isprane jednom pomoću DMEM sa niskom koncentracijom glukoze koja sadrži 0,1% goveđi serum albumin. Potom je u odvojena polja sa PC-3 ćelijama odvojeno dodato po 100 ul svakog razblaženja antitela/HGF. Nakon 10 minuta inkubacije na 37 °C pod 5% CO2, razblaženja antitela/HGF su aspirirana iz polja; a ploče su ostavljene na ledu 1 do 2 minuta. Ćelije su jedanput isprane ledeno hladnim PBS koji sadrži 0,3 mM natrijum-orto vanadata (Sigma. Louis, MO, kataloški br. S-6508). Isprane ćelije su inkubirane 15 do 30 minuta na ledu, u 60 ul pufera za liziranje koji sadrži 1% Triton X-100 (Pierce, Rockford, IL, kataloški br. 28314), 50 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 0,3 mM natrijum-orto vanadata (Sigma, Louis, MO, kataloški br. S-6508) i IX koktela inhibitora proteaza (Sigma, kataloški br. P-8340).

[0306] Granulice obložene anti-Met antitelom su dobijene inkubacijom Dvnabeads M-280 Streptavidin (IGEN International, Gaithersburgh, MD, kataloški br. 110029) sa 4 ug/ml kozjeg anti Met-biotin (R&D Svstems Inc., Minneapolis, MN, kataloški br. BAF 358) 30 minuta na sobnoj temperaturi u PBS koji sadrži 0,1% goveđi serum albumin (Sigma, St. Louis, MO, kataloški br. A-7888), 0,1% Tvveen 20 (Biorad, Hercules, CA, kataloški br. 170-6531). Zapremina od 25 ul granulica obloženih anti-Met antitelom, po polju, postavljena je u ploče za testiranje od po 96 polja Costar (Corning, NY, kataloški br. 3365).

[0307] U svako polje koje sadrži granulice obložene anti-Met antitelom odvojeno je dodata zapremina od 25 ul svakog od različitih lizata PC-3 ćelija. Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi uz mućkanje. U svako polje dodata je zapremina od 12,5 ul PBS koji sadrži 1% goveđi serum albumin (Sigma, St. Louis, MO, kataloški br. A-7888), 0,1% Tween 20 (Biorad, Hercules, CA, kataloški br. 170-6531) i 0,04 p.g anti-fosfotirozin antitela 4G10 (Upstate Biotechnologv, Lake Placid, NY, kataloški br. 05-321), te su ploče inkubirane 1 čas na sobnoj temperatri uz mućkanje. Potom je dodata zapremina od 12,5 ul PBS koji sadrži 1% goveđi serum albumin, 0,1% Tween 20 i 8 ug/ml anti-mišjeg ORI-TAG obeleživača (IGEN International, Gaithersburgh, MD, kataloški br. 110087) te su ploče inkubirane 30 minuta na sobnoj temperatri uz mućkanje. Signal (izražen u IGEN jedinicama) je izmeren na IGEN M8 čitaču (IGEN International, Gaithersburgh, MD). IC50vrednosti su izračunate upotrebom jednačine za fitovanje sa četiri parametra i Excelfit softverskog paketa, verzija 2.0.6 (Microsoft Inc., Seattle WA). Rezultati iz ova dva eksperimenta, u IGEN formatu, prikazani su na slici 14. IC50vrednosti za svako od deset antitela na HGF bile su u opsegu niskih nanomolarnih do subnanomolarnih vrednosti.

B. Neutralizacija U-87 rasta/preživljavanja

[0308] U-87 MG ćelije (ATCC # HTB-14) su linija humanog glioblastoma koja eksprimira i Met i HGF. Rast/preživljavanje tih ćelija u kulturi ne pojačava se dodatkom egzogenog HGF. Međutim, izgleda da endogeni Met aktivira endogeni HGF pod uslovima rasta. Ometanje vezivanja endogenog HGF za endogeni Met može da dovede do smanjenja rasta i/ili preživljavanja.

[0309] U-87 ćelije gajene su u test pločama sa po 96 polja (Corning, NY, kataloški br. 3365) dodavanjem 800 ćelija po polju i IMEM podlozi (Gibco BRL, Rockville, MD, kataloški br. 11125-028) koja sadrži 5% FBS. Nakon približno 24 časa, svaka od jedanaest različitih koncentracija svakog od deset antitela na HGF opisanih u primeru 6, dodata je u odvojeno polje sa U-87 MG ćelijama. U tim odvojenim razblaženjima koncentracije antitela na HGF bile su 100 ug/ml, 33,3 ug/ml, 11,1 p.g/ml, 3,7 ug/ml, 1,2 pg/ml, 0,4 ug/ml, 0,05 ug/ml, 0,015 ng/ml, 5,1 ng/ml i 1,7 ng/ml datog antitela na HGF.

[0310] Sedam dana nakon dodatka antitela na HGF, podloga je uklonjena iz ploča a ćelije su fiksirane pomoću 100 pl 10% trihlorsirćetne kiseline (Sigma Inc., St. Louis, MO, kataloški br. T-9159) po polju i inkubirane na 4 °C tokom 1 do 2 časa. Polja su isprana 5 puta česmenskom vodom. Fiksirane ćelije su obojene pomoću 100 u.1 0,4% sulforodamina B (Sigma, St. Louis, MO, kataloški br. S-9012) u 1% sirćetnoj kiselini (Fisher, Pittsburgh, PA, kataloški br. UN2789), inkubacijom deset minuta na sobnoj temperaturi. Nakon bojenja, ćelije su isprane pet puta 1% sirćetnom kiselinom i osušene na vazduhu. Optička gustina na 540 nm merena je na čitaču mikrotitar ploča (SpectraMax PLUS, Molecular Devices, Sunnvvale, CA). Optička gustina je proporcionalna ukupnoj količini proteina prisutnoj u jednostrukom sloju ćelija, te je stoga mera preživljavania/deobe ćelija u toku sedmodnevnog perioda ispitivanja. Da bi se izračunale IC50vrednosti, izračunat je procenat inhibicije u odnosu na ćelije inkubirane sa izotipom kontrolnog antitela, ili bez antitela. IC50vrednosti izračunate su upotrebom jednačine za fitovanje sa četiri parametra i Excelfit softverskog paketa, verzija 2.0.6 (Microsoft Inc., Seattle

WA).

[0311] Podaci dobijeni u ova dva eksperimenta prikazani su na slici 15. Svih deset antitela na HGF opisanih u primeru 6 inhibirala su rast/preživljavanje U-87 MG ćelija. IC5ovrednosti za svako antitelo obično su bile manje od 100 nM.

Primer 11

Neutralizacija u ksenograftnim tumorima

A. Model minimalne zaostale bolesti sa U-87 MG ksenograftom

[0312] U-87 MG ćelije gajene su do skoro konfluetnog rasta, nakon čega su suspendovane u podlozi bez seruma pri koncentraciji od 25 x IO<6>ćelija/ml. Vizuelno je procenjeno da su ćelije >98,5 % vijabilne, pomoću ekskluzije tripan plavog. Kako bi se ispitalo pojedinačno antitelo na HGF, 5 x IO6 U-87 MG ćelija u podlozi bez seruma ubrizgano je potkožno u desni bok pedeset ženki golokožih miševa (CD1 Nu/Nu, Charles River Laboratories, Wilmington, Mass.). Pedeset miševa podeljeno je u pet grupa od po deset miševa.

[0313] Svakom mišu u datoj grupi od deset miševa data je intraperitonealna injekcija sa istom dozom istog antitela na HGF opisanog u primeru 7, ili IgGl konstantnog regiona (kontrola izotipa). Ispitivane su sledeće doze antitela: 1 ug, 3 ug, 10 pg i 30ug po injekciji. Injekcije antitela davane su dva puta nedeljno tokom četiri nedelje, počev od drugog dana nakon injekcije U-87 MG ćelija. Veličina tumora i telesna masa merene su dva puta nedeljno tokom 30 dana, te je izračunavana zapremina tumora upotrebom formule: dužina x širina x visina. Rezultati su analizirani pomoću statističkog programa StatVievv<®>(SAS Institute, Inc., Cary, N.C.) korišćenjem ponovljenih ANOVA merenja, koje prati Šefov post hoc test.

[0314] U odvojenim eksperimentima ispitano je svako od deset antitela na HGF opisanih

u primeru 6. Eksperiment merenja odgovora u zavisnosti od doze za antitelo 2.4.4 prikazanje na slici 16A. Vreme primene terapije označeno je strelicama, dok su doze date u legendi. U zagradama je dat broj životinja (od deset) koje nisu imale merljiv tumor, za svaku dozu. Za dve najviše ispitane doze, 10 ug primenjenih dva puta nedeljno i 30 pg primenjenih dva puta nedeljno, inhibicija rasta tumora bilaje statistički značajna u odnosu na kontrolne životinje koje su primale kontrolu izotopa u dozi od 30 ug dva puta nedeljno (humani IgG2, # PK16.3.1, Abgenix Inc., Fremont, CA). Slaba, ali ne i statistički značajna inhibicija uočena je kod 2 niže doze (1 i 3 pg dva puta nedeljno) antitela 2.4.4. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška; n = 10 životinja po grupi a statistički značajnim je smatrano p < 0,05. Eksperimenti u kojima je ispitano ostalih devet antitela na HGF iz primera 6 pokazali su sličnu inhibiciju rasta tumora pri višim dozama.

B. U-87 MG model razvijene bolesti

[0315] U-S7 MG ćelije u podlozi bez seruma ubrizgane su u golokože miševe, prema proceduri opisanoj u primeru 11 A. Tumori su ostavljeni da rastu tokom približno dve nedelje dok nisu dostigli zapreminu od oko 200 mm<3>, pre nego što je započeto intraperitonealno davanje antitela na HGF. Miševi su tretirani dva puta nedeljno antitelom 2.4.4, pri dozi od 200 pg, 100 ug ili 30 p.g, počev od šesnaestog dana, kao što je označeno strelicama na slici 16B. Zapremina tumora je merena i ocenjivana kao što je prethodno opisano. U zagradi je dat broj životinja (od deset) koje nisu imale merljiv tumor tridesetog dana. Pri svim dozama je uočena potpuna inhibicija rasta tumora U-87 MG. Statistički značajna regresija razvijenih tumora postignuta je do dvadeset devetog dana. U odvojenim eksperimentima, svako od deset antitela na HGF opisanih u primeru 6, ispitano je u ovom modelu i uočena je potpuna inhibicija pri višim dozama svakog od antitela.

C. Rangiranje antitela u modelu minimalne preostale bolesti sa U-87 MG

[0316] Kako bi se utvrdila relativna specifičnost deset antitela na HGF opisanih u primeru 6 u modelu U-87 MG tumora opisanom u promeru 11 A, izabrane su niske doze koje su samo delimično inhibirale rast tumora u modelu minimalne preostale bolesti. Preliminarna ispitivanja odgovora u zavisnosti od doze ukazala su da bi davanje 5 ug dva puta nedeljno dalo parcijalnu inhibiciju antitelima na HGF. Sprovedena je serija uporednih eksperimenata u kojima je poređeno 5 različitih antitela na HGF. Rezultati dobijenu u dva od ovih eksperimenata prikazani su na slikama 16C i 16D. Oznakom<**>obeležena su ona antitela na HGF koja su značajno inhibirala rast tumora u poređenju sa PBS i izotipskom kontrolom IgG2 antitela (p < 0,0001).

[0317] Slični eksperimenti utvrđivanja redosleda efikasnosti izvedeni su i upotrebom modela razvijene bolesti sa U-87 MG, opisanog u primeru 11B. U ovim eksperimentima korišćena je doza od 10 ug, dva puta nedeljno. Rezultati dobijeni u dva od ovih eksperimenata prikazani su na slikama 16E i 16F.

Claims

1. Izolovani polipeptid naznačen time što sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od CDRla, CDR2a i CDR3a, gde CDRla sadrži aminokiselinsku sekvencu abcdefghijklmnopq, gde je aminokiselina a izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina i glutamina; aminokiselina b izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i alanina; aminokiselina c je serin, aminokiselina d je glutamin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparaginske kiseline; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina i izoleucina, ili nije prisutna; aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina h je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina i je serin ili nije prisutna; aminokiselina j je serin ili nije prisutna; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i treonina, ili nije prisutna; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, izoleucina i valina; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina, asparagina i asparaginske kiseline; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i serina; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, triptofana i asparagina; aminokiselina p je leucin; a aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina, glicina i asparagina; gde CDR2a sadrži aminokiselinsku sekvencu r s t u v w x, gde je aminokiselina r izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, alanina, valina, glutaminske kiseline i glicina; aminokiselina s je alanin, aminokiselina t je serin, aminokiselina u je izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina i alanina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, asparagina i treonina; gde CDR3a sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e' f g' h', gde je aminokiselina y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i leucina; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparagina i arginina; aminokiselina a'je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, histidina, alanina i serina; aminokiselina b'je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina, tirozina, asparaginske kiseline, asparagina i izoleucina; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparagina; aminokiselina d' je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, tirozina, treonina, fenilalanina, asparaginske kiseline, leucina i triptofana; aminokiselina e' je prolin; aminokiselina f je prolin ili nije prisutna; aminokiselina g' je triptofan, leucin, prolin, tirozin ili izoleucin; a aminokiselina h' je treonin ili asparagin; a gde je polipeptid, vezan za teški lanac antitela, u stanju da veže faktor rasta hepatocita (HGF).

2. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24, 26, 28, 30, 32, 34,

36, 38, 40 i 42.

3. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 i 69.

4. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 i 79.

5. Polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 i 89.

6. Polipeptid prema zahtevima 1 do 5, naznačen time što je polipeptid sredstvo za specifično vezivanje.

7. Polipeptid prema zahtevima 1 do 5, naznačen time što je polipeptid antitelo.

8. Izolovani polipeptid naznačen time što sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od CDRlb, CDR2b i CDR3b, gde CDRlb sadrži aminokiselinsku sekvencu a b c d e f g, gde je aminokiselina a serin ili nije prisutna; aminokiselina b je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina c je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline, glicina, serina, valina, treonina i izoleucina; aminokiselina d je tirozin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i glicina; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, metionina i triptofana; a aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od histidina, asparagina i serina; gde CDR2b sadrži aminokiseinsku sekvencu hijklmnopqrstuvwx, gde je aminokiselina h izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, tirozina, valina, asparagina i glutaminske kiseline; aminokiselina i je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, fenilalanina i valina; aminokiselina j je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina, triptofana i tirozina; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, serina, tirozina i histidina; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i glicina; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, treonina, asparagniske kiseline, serina, izoleucina i asparagina; aminokiselina p je izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, izoleucina i lizina; aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i tirozina; aminokiselina r je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i histidina; aminokiselina s je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina i asparagina; aminokiselina t je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparaginske kiseline i prolina; aminokiselina uje izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina i serina; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina, valina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i lizina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina; gde CDRJb sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e' f g' h' i' j' k' 1' m' n' o' p' q' r', gde je aminokiselina y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, serina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, histidina, prolina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina a' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, tirozina i leucina, ili nije prisutna; aminokiselina b'je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, asparagina, glicina, histidina, tirozina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina, serina, glutaminske kiseline, tirozina, glicina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina d' je glicin ili nije prisutna; aminokiselina e' je izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina f je asparaginska kiselina, ili nije prisutna; aminokiselina g' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i arginina, ili nije prisutna; aminokiselina h' je serin ili nije prisutna; aminokiselina i' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i tirozina. ili nije prisutna; aminokiselina j'je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina k' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, fenilalanina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina 1' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, histidina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina m' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glicina, asparaginske kiseline, prolina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina n' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, valina, tirozina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina o'je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, alanina, glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina p' je izabrana iz grupe koja se sastoji od metionina, fenilalanina i tirozina; aminokiselina q' je asparaginska kiselina, a aminokiselina r' je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina, tirozina, izoleucina i prolina; a gde je polipeptid, vezan za laki lanac antitela, u stanju da veže HGF.

9. Polipeptid prema zahtevu 8, naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37,39,41 i 43.

10. Polipeptid prema zahtevu 8, naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 i 99.

11. Polipeptid prema zahtevu 8, naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 i 109.

12. Polipeptid prema zahtevu 8, naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 i 119.

13. Polipeptid prema zahtevima 8 do 12, naznačen time što je polipeptid sredstvo za specifično vezivanje.

14. Polipeptid prema zahtevima 8 do 12, naznačen time što je polipeptid antitelo.

15. Izolovano sredstvo za specifično vezivanje naznačeno time što sredstvo za specifično vezivanje sadrži: (i) prvi polipeptid koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od CDRla, CDR2a i CDR3a, gde CDRla sadrži aminokiselinsku sekvencu abcdefghijklmnopq, gde je aminokiselina a izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina i glutamina; aminokiselina b izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i alanina; aminokiselina c je serin; aminokiselina d je glutamin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparaginske kiseline; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina i izoleucina, ili nije prisutna; aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina h je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina i je serin ili nije prisutna; aminokiselina j je serin ili nije prisutna; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i treonina, ili nije prisutna; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, izoleucina i valina; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina, asparagina i asparaginske kiseline; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i serina; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, triptofana i asparagina; aminokiselina p je leucin; a aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina, glicina i asparagina; gde CDR2a sadrži aminokiselinsku sekvencu r s t u v w x, gde je aminokiselina r izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, alanina, valina, glutaminske kiseline i glicina; aminokiselina s je alanin, aminokiselina t je serin, aminokiselina uje izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina i alanina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, asparagina i treonina; gde CDR3a sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e' f g' h', gde je aminokiselina y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i leucina; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparagina i arginina; aminokiselina a' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, histidina, alanina i serina; aminokiselina b' je izabrana iz grupe koja se.sastoji od fenilalanina. tirozina, asparaginske kiseline, asparagina i izoleucina; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparagina; aminokiselina d' je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, tirozina, treonina, fenilalanina, asparaginske kiseline, leucina i triptofana; aminokiselina e'je prolin; aminokiselina f je prolin ili nije prisutna; aminokiselina g' je triptofan, leucin, prolin, tirozin ili izoleucin; a aminokiselina h'je treonin ili asparagin; a gde je prvi polipeptid, vezan za teški lanac antitela, u stanju da veže faktor rasta hepatocita (HGF); i .... (ii) drugi polipeptid, koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od CDRlb, CDR2b i CDR3b, gde CDRlb sadrži aminokiselinsku sekvencu a b c d e f g, gde je aminokiselina a serin ili nije prisutna; aminokiselina b je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina c je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline, glicina, serina, valina, treonina i izoleucina; aminokiselina d je tirozin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i glicina; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, metionina i triptofana; a aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od histidina, asparagina i serina; gde CDR2b sadrži aminokiseinsku sekvencu hij klmnopqrstuvwx, gde je aminokiselina h izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, tirozina, valina, asparagina i glutaminske kiseline; aminokiselina i je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, fenilalanina i valina; aminokiselina j je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina, triptofana i tirozina; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, serina, tirozina i histidina; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i glicina; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, treonina, asparaginske kiseline, serina, izoleucina i asparagina; aminokiselina p je izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, izoleucina i lizina; aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i tirozina; aminokiselina r je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i histidina; aminokiselina s je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina i asparagina; aminokiselina t je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparaginske kiseline i prolina; aminokiselina uje izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina i serina; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina, valina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i lizina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina; gde CDR3b sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e' f g' h' i' j' k' 1' m' n<1>o' p' q' r', gde je aminokiselina y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, serina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, histidina, prolina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina a'je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, tirozina i leucina, ili nije prisutna; aminokiselina b'je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, asparagina, glicina, histidina, tirozina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina, serina, glutaminske kiseline, tirozina, glicina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina d' je glicin ili nije prisutna; aminokiselina e' je izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina f je asparaginska kiselina, ili nije prisutna; aminokiselina g' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i arginina, ili nije prisutna; aminokiselina h' je serin ili nije prisutna; aminokiselina i' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i tirozina. ili nije prisutna; aminokiselina j' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina k' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, fenilalanina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina 1' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, histidina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina m' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glicina, asparaginske kiseline, prolina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina n' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, valina, tirozina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina o' je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, alanina, glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina p' je izabrana iz grupe koja se sastoji od metionina, fenilalanina i tirozina; aminokiselina q' je asparaginska kiselina, a aminokiselina r' je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina. tirozina, izoleucina i prolina; a gde je drugi polipeptid, vezan za laki lanac antitela, u stanju da veže HGF.

16. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 i 42.

17. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25,27, 29,31,33,35,37,39,41 i 43.

18. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što "sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 24 i 25.

19. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 26 i 27.

20. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 28 i 29.

21. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 30 i 31.

22. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 32 i 33.

23. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 34 i 35.

24. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 36 i 37.

25. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 38 i 39.

26. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 40 i 41.

27. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence sekvenci čiji su ID brojevi: 42 i 43.

28. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 60, 61,62, 63, 64,65, 66, 67, 68 i 69.

29. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 70,71,72,73,74,75,76, 77, 78 i 79.

30. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 i 89.

31. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 i 99.

32. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 i 109.

33. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži bar jednu od aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 i 119.

34. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži: teški lanac koji sadrži prvi varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 i 43; i laki lanac koji sadrži drugi varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 i 42.

35. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 34, naznačeno time što sredstvo za specifično vezivanje ima bar jedno svojstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od: a) kompetira za vezivanje za HGF bar jednom antitelu izabranom iz grupe koja se sastoji od 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 i 3.10.1; b) vezuje se za isti epitop na HGF '• • kao i bar jedno od antitela izabranih iz grupe koja se sastoji od: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 i 3.10.1; i c) vezuje se za isti antigen za koji se vezuje i bar jedno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4,2.12.1,2.40.1 i 3.10.1.

36. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 15, naznačeno time što sadrži: teški lanac koji sadrži prvi varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 90%, 95% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sas.toji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 i 43; i laki lanac koji sadrži drugi varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 90%, 95% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 i 42.

37. Sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 36, naznačeno time što sredstvo za specifično vezivanje ima bar jedno svojstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od: a) kompetira za vezivanje za HGF bar jednom antitelu izabranom iz grupe koja se sastoji od 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 i 3.10.1; b) vezuje se za isti epitop na HGF kao i bar jedno od antitela izabranih iz grupe koja se sastoji od: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 i 3.10.1; i c) vezuje se za isti antigen za koji se vezuje i bar jedno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1,2.40.1 i 3.10.1.

38. Sredstvo za specifično vezivanje prema bilo kom zahtevu od 15 do 37, naznačeno time što je sredstvo za specifično vezivanje antitelo.

39. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što su teški lanac i laki lanac povezani linkerom.

40. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što je pojedinačno-Fv antitelo.

41. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što je imunološki funkcionalni fragment imunoglobulina.

42. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što je Fab antitelo.

43. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što je Fab' antitelo.

44. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što je (Fab')2antitelo.

45. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što je potpuno humano antitelo.

46. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što je humanizovano antitelo.

47. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što je himerno antitelo.

48. Antitelo iz zahteva 38, naznačeno time što antitelo inhibira vezivanje HGF za c-Met receptor.

49. Izolovani polipeptid naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 i 42.

50. Izolovani polipeptid naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 i 43.

51. Izolovani molekul nukleinske kiseline naznačen time što sadrži bar jednu nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,

17 i 19.

52. Izolovani molekul nukleinske kiseline naznačen time što sadrži bar jednu nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20.

53. Izolovani molekul nukleinske kiseline naznačen time što kodira polipeptid koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od: CDRla, CDR2a i CDR3a, gde CDRla sadrži aminokiselinsku sekvencu abcdefghijklmnopq, gde je aminokiselina a izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina i glutamina; aminokiselina b izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i alanina; aminokiselina c je serin; aminokiselma d je glutamin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparaginske kiseline; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina i izoleucina, ili nije prisutna; aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina h je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina i je serin ili nije prisutna; aminokiselina j je serin ili nije prisutna; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i treonina, ili nije prisutna; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, izoleucina i valina; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina, arginina, asparagina i asparaginske kiseline; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i serina; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, triptofana i asparagina; aminokiselina p je leucin; a aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina, glicina i asparagina; gde CDR2a sadrži aminokiselinsku sekvencu r s t u v vv x, gde je aminokiselina r izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, alanina, valina, glutaminske kiseline i glicina; aminokiselina s je alanin, aminokiselina t je serin, aminokiselina u je izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina i leucina; aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina i alanina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, asparagina i treonina; gde CDR3a sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e' f g' h', gde je aminokiselina y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i leucina; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparagina i arginina; aminokiselina a' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, histidina, alanina i serina; aminokiselina b' je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina, tirozina, asparaginske kiseline, asparagina i izoleucina; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina, glicina i asparagina; aminokiselina d' je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, tirozina, treonina, fenilalanina, asparaginske kiseline, leucina i triptofana; aminokiselina e' je prolin; aminokiselina f je prolin ili nije prisutna; aminokiselina g' je triptofan, leucin, prolin, tirozin ili izoleucin; a aminokiselina h' je treonin ili asparagin; a gde je polipeptid, vezan za teški lanac antitela, u stanju da veže faktor rasta hepatocita (HGF).

54. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 53 naznačen time što sadrži nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 i 19.

55. Izolovani molekul nukleinske kiseline naznačen time što kodira polipeptid koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) izabran iz grupe koja se sastoji od: CDRlb, CDR2b i CDR3b, gde CDRlb sadrži aminokiselinsku sekvencu a b c d e f g, gde je aminokiselina a serin ili nije prisutna; aminokiselina b je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina c je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparaginske kiseline, glicina, serina, valina, treonina i izoleucina; aminokiselina d je tirozin; aminokiselina e je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i glicina; aminokiselina f je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, metionina i triptofana; a aminokiselina g je izabrana iz grupe koja se sastoji od histidina, asparagina i serina; gde CDR2b sadrži aminokiseinsku sekvencu hijklmnopqrstuvwx, gde je aminokiselina h izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana, tirozina, valina, asparagina i glutaminske kiseline; aminokiselina i je izabrana iz grupe koja se sastoji od izoleucina, fenilalanina i valina; aminokiselina j je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina, triptofana i tirozina; aminokiselina k je izabrana iz grupe koja se sastoji od prolina, serina, tirozina i histidina; aminokiselina 1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina, serina i asparaginske kiseline; aminokiselina m je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i glicina; aminokiselina n je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina o je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, treonina, asparagniske kiseline, serina, izoleucina i asparagina; aminokiselina p je izabrana iz grupe koja se sastoji od treonina, izoleucina i lizina; aminokiselina q je izabrana iz grupe koja se sastoji od asparagina i tirozina; aminokiselina r je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina i histidina; aminokiselina s je izabrana iz grupe koja se sastoji od alanina i asparagina; aminokiselina t je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina, asparaginske kiseline i prolina; aminokiselina uje izabrana iz grupe koja se sastoji od lizina i serina; aminokiselina v je izabrana iz grupe koja se sastoji od fenilalanina. valina i leucina: aminokiselina w je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutamina i lizina; a aminokiselina x je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i serina; gde CDR3b sadrži aminokiselinsku sekvencu y z a' b' c' d' e' f g' h' i' j' k' 1' m' n' o' p' q' r', gde je aminokiselina y izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, serina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina z je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, histidina, prolina i glicina, ili nije prisutna; aminokiselina a' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, tirozina i leucina, ili nije prisutna; aminokiselina b' je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, asparagina, glicina, histidina, tirozina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina c' je izabrana iz grupe koja se sastoji od arginina, serina, glutaminske kiseline, tirozina, glicina i fenilalanina, ili nije prisutna; aminokiselina d'je glicin ili nije prisutna; aminokiselina e'je izabrana iz grupe koja se sastoji od triptofana i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina f je asparaginska kiselina, ili nije prisutna; aminokiselina g' je izabrana iz grupe koja se sastoji od serina i arginina, ili nije prisutna; aminokiselina h' je serin ili nije prisutna; aminokiselina i' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina j' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina k' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, fenilalanina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina 1' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, asparaginske kiseline, histidina i triptofana, ili nije prisutna; aminokiselina m' je izabrana iz grupe koja se sastoji od tirozina, glicina, asparaginske kiseline, prolina i serina, ili nije prisutna; aminokiselina n' je izabrana iz grupe koja se sastoji od glicina, valina, tirozina i asparaginske kiseline, ili nije prisutna; aminokiselina o' je izabrana iz grupe koja se sastoji od leucina, alanina, glicina i tirozina, ili nije prisutna; aminokiselina p' je izabrana iz grupe koja se sastoji od metionina, fenilalanina i tirozina; aminokiselina q' je asparaginska kiselina, a aminokiselina r' je izabrana iz grupe koja se sastoji od valina, tirozina, izoleucina i prolina; a gde je polipeptid, vezan za laki lanac antitela, u stanju da veže HGF.

56. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 55, naznačen time što sadrži nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 i 20.

57. Ćeliju domaćina naznačenu time što sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 53.

58. Ćeliju domaćina naznačenu time što sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 55.

59. Izolovanu ćelijsku liniju naznačenu time što proizvodi sredstvo za specifično vezivanje iz zahteva 34 ili 36.

60. Izolovanu ćelijsku liniju prema zahtevu 59 naznačenu time što je sredstvo za specifično vezivanje antitelo.

61. Izolovanu ćelijsku liniju naznačenu time što proizvodi antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od 1.24.1. 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1,2.40.1 i 3.10.1.

62. Preparat naznačen time što sadrži sredstvo za specifično vezivanje iz zahteva 34 ili 36 i farmaceutski prihvatljiv nosilac.

63. Preparat prema zahtevu 62 naznačen time što je sredstvo za specifično vezivanje antitelo.

64. Preparat naznačen time što sadrži sredstvo za specifično vezivanje prema zahtevu 34 ili 36 i bar jedno sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji od: članova geldanamicinske porodice anisamicinskih antibiotika; Pro-HGF; antagonnista Grb2 Src homologije 2; modulatora Gabl; dominantno negativnog Src; von-Hipel-Landau inhibitora; nesteroidnog antiinflamatornog leka (NSAID); COX-2 inhibitora, Celebrex™ (celekoksib), Vioxx™ (rofekoksib); vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF), modulatora VEGF; modulatora faktora rasta fibroblasta (FGF); modulatora faktora rasta epiderma (EGF); faktora rasta keratinocita (KGF); molekula srodnog KGF; modulatora KGF; modulator matrkiksne metaloproteinaze (MMP); IL-2; Proleukina; Herceptina; Rituksana; Zevalina; Eritubaksa; epratuzumaba; antitela na OPGL; inhibitora Ang-2; antitela na VEGF-2; avastatina; antineoplastičnog sredstva; antimitotičkog sredstva; antimetabolita; i alkil sulfonata.

65. Preparat prema zahtevu 64, naznačen time što je sredstvo za specifično vezivanje antitelo.

66. Postupak za lečenje kancera kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu preparata iz zahteva 62.

67. Postupak za lečenje kancera kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu preparata iz zahteva 63.

68. Postupak za lečenje kancera kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu preparata iz zahteva 64.

69. Postupak za lečenje kancera kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu preparata iz zahteva 65.

70. Postupak lečenja solidnog tumora kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu preparata iz zahteva 62.

71. Postupak lečenja solidnog tumora kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu preparata iz zahteva 63.

72. Postupak lečenja solidnog tumora kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu preparata iz zahteva 64.

73. Postupak lečenja solidnog tumora kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu preparata iz zahteva 65.

74. Postupak lečenja kancera kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu sredstva za specifično vezivanje iz zahteva 34 ili 36 i bar jednog hemoterapijskog tretmana.

75. Postupak prema zahtevu 74 naznačen time što se sredstvo za specifično vezivanje primenjuje pre primene hemoterapijskog tretmana.

76. Postupak prema zahtevu 74 naznačen time što se sredstvo za specifično vezivanje primenjuje istovremeno sa primenom hemoterapijskog tretmana.

77. Postupak prema zahtevu 74 naznačen time što se sredstvo za specifično vezivanje primenjuje nakon primene hemoterapijskog tretmana.

78. Postupak lečenja kancera kod pacijenta naznačen time što sadrži primenu sredstva za specifično vezivanje iz zahteva 34 ili 36 i radioterapije.

79. Postupak prema zahtevu 78 naznačen time što se sredstvo za specifično vezivanje primenjuje pre primene radioterapije.

80. Postupak prema zahtevu 78 naznačen time što se sredstvo za specifično vezivanje primenjuje istovremeno sa primenom radioterapije.

81. Postupak prema zahtevu 78 naznačen time što se sredstvo za specifično vezivanje primenjuje nakon primene radioterapije.

82. Postupak za određivanje koncentracije faktora rasta hepatocita (HGF) u uzorku naznačen time što obuhvata dovođenje uzorka u dodir sa sredstvim za specifično vezivanje iz zahteva 34 ili 36.

83. Postupak prema zahtevu 82 naznačen time što je sredstvo za specifično vezivanje antitelo.

84. Postupak za inhibiciju vezivanja HGF za Met naznačen time što obuhvata primenu sredstva za specifično vezivanje HGF.

85. Postupak prema zahtevu 84 naznačen time što je sredstvo za specifično vezivanje antitelo.

86. Postupak prema zahtevu 84 naznačen time što sredstvo za specifično vezivanje sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 25, 27, 29, 31, 33. 35, 37, 39, 41 i 43.

87. Postupak prema zahtevu 84 naznačen time što sredstvo za specifično vezivanje sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 24, 26, 28, 30, 32. 34, 36, 38, 40 i 42.

88. Polipeptid naznačen time što sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

89. Polipeptid naznačen time što se suštinski sastoji od bar jedne aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

90. Sredstvo za specifično vezivanje naznačeno time što je u stanju da veže bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

91. Antitelo ili antigen vezujući domen naznačen time što je u stanju da veže bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

92. Postupak dobijanja antitela koje je u stanju da veže faktor rasta hepatocita (HGF) naznačen time što sadrži primenu bar jednog polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165 na životinju i dobijanja antitela koje je u stanju da veže HGF iz životinje.

93. Postupak smanjenja ili sprečavanja vezivanja bilo kog od sredstava za specifično vezivanje iz zahteva 18 do 27 za faktor rasta hepatocita (HGF) naznačen time što podrazumeva primenu polipeptida koji sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

94. Postupak smanjenja ili sprečavanja vezivanja bilo kog od polipeptida iz zahteva 18 do 27 za faktor rasta hepatocita (HGF) naznačen time što podrazumeva primenu polipeptida koji se sastoji od bar jedne aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

95. Postupak smanjenja ili sprečavanja vezivanja sredstva za specifično vezivanje za faktor rasta hepatocita (HGF) naznačen time što podrazumeva primenu polipeptida koji sadrži bar jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.

96. Postupak smanjenja ili sprečavanja vezivanja sredstva za specifično vezivanje za faktor rasta hepatocita (HGF) naznačen time što podrazumeva primenu polipeptida koji se sastoji od bar jedne aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od sekvenci čiji su ID brojevi: 164 i 165.