RS49804A - Citotoksični protein i njegova upotreba - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na novi citotoksični protein (M toksin, toksin koji razara mukozni sloj) produkovan od strane Helicobacter pylori, i njegovu upotrebu. Ovaj pronalazak obezbeduje citotoksični protein (M toksin) produkovan od Helicobacter pylori, delimični peptid i antitumorski agens koji sadrži citotoksični protein. Protein je dobijen kultivisanjem transformanta koji je transformulisan sa rekombinantnim vektorom koji sadrži DNK koja kodira citotoksični protein. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu proteina.

Description

CITOTOKSIČN! PROTEIN I NJEGOVA UPOTREBA

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak odnosi se na novi citotoksični protein (M toksin, toksin koji razara mukozni sloj) koji produkujeHelicobacter pylorii njegovu upotrebu.

Stanje tehnike

Smatra se da ljudi dobijaju često razne gastritise, čir želudca i rak želuca zbogHelicobacter pylon.Očigledan direktni citotoksični faktor, koji uzrokuje razaranje eitehjalnih ćelija želudca i nepovratnu smrt ćelija na početku ovih bolesti, nije još taćno određen. Faktor koji menja pH sredine i imune reakcije u stomaku, faktor koji se pričvršćuje za epitelijalne ćelije želudca pomoćuHelicobacter pylori.ili uklanja karakteristike samih bakterija, je naznačen kao faktor kO|i razvija ovakve bolesti Međutim, do sada nije jasno da li je destrukcija želudačne mukGze koja pokreće gastritis, čir i kancer želudca povreda u bilo kojem procesu, ili šta je direktni faktor koji je odgovoran za destrukciju želudačne mukoze. Izolovan je samo vakuolizirajuci toksin koji ima citotoksičnost. ali on ima slabu aktivnost citotoksičnosti i reverzibilnu citotoksičnu aktivnost. Kao fatalni citotoksični faktor patogenog faktora, on nije pronađen niin vivonitiin vitro.

Mnogi istarživači procenjuju daHelicobacter pylori,kao što je gore opisano, u stomačnoj srediniin vivo,izlučuje direktni citotoksični faktor za ćelije želudačne mukoze. Uzevši u obzir važnost bolesti, sve sekvcnce gena su potvrđene 1996. Međutim, uprkos upotrebi seruma, nemoguće je da se izoluje i identifikuje verovatni toksin zbog uslova razdvajanja, zbog teških uslovima kultivisanja i uslova prečišćavanja i ne utvrđenim sistemom procene toksina.

Problemi koje treba da reši pronalazak

Jedan problem je da protein koji je odgovoran za izazivanje gastritisa, čira želudca i kancera želudca putem infekcije saHelicobacter,je nađen, postupak masovne produkcije toksičnog proteina je ustanovljen, identifikovan je novi M toksin i utvrđeni su postupci dijagnoze i sknninga. Koristeći ove postupke bila je želja da se odgovorni toksin iz citotoksičnog faktora za ćelije želudačne mukoze kontroliše, i razvijeni su preventivni i agensi za tretiranje gastritisa, čira želudca. raka želudca i tome slično i pronađen je postupak za upotrebu toksina.

Opis pronalaska

Izumitelji ovog pronalaska ozbiljno su istraživali da reše gore pomenuti problem i identifikuju novi toksin koji uzrokuje nepovratnu smrt ćelije kada seHelicobacter pylorikultiviše u uslovima bez seruma koji su slični sredini u stomaku koja je različita od uobičajene. Otkriveno je da ovaj toksin ima toksičnu snagu 1000 do 100000 puta po jedinici gore pomenutog vakuolizirajućeg toksina, i on uzrokuje nepovratnu smrt ćelije, kod ćelija raznih toplokrvnih životinja koje ne sadrže samo želudačne epitelijalne ćelije nego takođe i imunocite. Izumitelji ovog pronalaska su ponovljivo istraživali ove aspekte da bi došli do predmetnog pronalaska.

Naime, pronalazak obezbeđuje sledeće, (1) Citotoksični protein koji sadrži protein koji je najmanje 70% ili više identičan u odnosu na sekvencu amino kiseline predsatvljenu sa SEQ ID

Dr. 1. (2) Delimični peptid citotoksičnog proteina opisan u zantevu 1. okaraktensan time što protein ima istu citotoksičnu aktivnost kao što je ona koju ima sekvenca amino kiseline predstavljena sa SEO ID br. 1. (3) Citotoksični protein iz zahteva 1 ili zahteva 2, gde je protein produKovan saHelicobacter pylori.(4) Citotoksični protein iz zahteva 1 ili zahteva 2, gde je protein dobijen kultivisanjem transformanta koji je transformisan sa rekombinantmm vektorom koji sadrži DNK iz SEQ ID br. 2 koji kodira citotoksični protein iz zahteva 1 ih 2 (5) Citotoksični protein iz zahteva 4 gde je transformant deponovan prijavom br. FERM BP-8218 u Nacionalnom institutu za naprednu industrijsku nauku i tehnologiju (IPOD). (6) Antitumor agens koji sadrži citotoksični protein iz zahteva 1 ili 2. (7) Monoklonalno antitelo protiv specifičnog citotoksičnog proteina koji je dobijen putem imunizacije sa proteinom citotoksina iz zahteva 1 ili 2 protiv sisara. (8) Monoklonalno antitelo iz zahteva 7 koje je produkovano sa hibndoma klonom prijava br. FERM BP-8222. (9) Monoklonalno antitelo iz zahteva 7 koje je produkovano sa hibndoma klonom prijava br. FERM BP-8223. (10) Monoklonalno antitelo iz zahteva 7 koje je produkovano sa hibndoma klonom prijava br. FERM BP-8224. (1 1) Specifično poliklonalno antitelo protiv citotoksičnog proteina koje je dobijeno imumzacijom sa citotoksičnim proteinom iz zahteva 1 i 2 protiv sisara (12) Postupak za detektovanje i dijagnostifikovanje citotoksičnog proteina iz zahteva 1 ili 2 gde je upotrebljeno monoklonalno antitelo ili poliklonalno antitelo opisano u bilo kom od zahteva 7-11. (13) Agens za sprečavanje i tretiranje kancera želudca i čira želudca izazvan citotoksičnim proteinom iz zahteva 1 ili 2, gde je upotrebljeno monoklonalno antitelo ili poliklonalno antitelo opisani u bilo kom od zahteva 7-11. (14) Postupak za skrining jedinjenja koje promoviše ili inhibira aktivnost proteina iz zahteva 1 ili 2, gde je aktivnost inhibicije umnožavanja ćelija, aktivnost citotoksičnosti ili smrti ćelije, procenjena poređenjem između negativnih ili pozitivnih kontrolnih grupa sa ćelijama toplokrvnih životinja. (15) Kit za skrining jedinjenja ili njegovih soli koji promovišu ili inhjbiraju aktivnost proteina iz zahteva 1 ili 2, gde je sadržan protein iz zahteva 1 ili 2. (16) Jedinjenje ili njegova so koji promovišu ili inhibiraju aktivnost proteina iz zahteva 1 ili 2, gde je jedinjenje dobijeno pomoću skrining postupka iz zahteva 14 ili sa kitom za skrining prema zantevu 15. (17) Medikament koji sadrži jedinjenje ili njegovu so. gde jedinjenje ima aktivnost inhibiranja citotoksićne aktivnosti u ćelijama toplokrvnih životinja sa proteinom iz zahteva 1 ili 2. (18) Medikament iz zahteva 17. koji je agens za sprečavanje ili tretiranje gastritisa, čira želudca, kancera želudca i bolesti za koje je pokazano da su uzrokovane sa M toksinom putem postupka skrininga iz zahteva 14 ili sa kitom za skrining iz zahteva 15.

Kratak opis slika

Slika 1. pokazuje anjon izmenjivačku hromatografiju uzoraka dobijenih u primeru 1. a pokazuje aktivnost M toksina za svaku frakciju i apsorbance ispranog proteina, b pokazuje SDS-PAGE putem bojenja srebrnom bojom frakcija od 16 do frakcije 22 u hromatografiji a. c pokazuje trake proteina toksina prenete na PVDF membranu putem elektroblotinga. d i e pokazuju morfološke promene HeLa ćelija 24 časa nakon izlaganje kontrolnom ekstraktu i ekstraktu koji uključuje citotoksin u koncentraciji od 1 nM, respektivno. Skala bara, 5 um.

Slika 2. pokazuje promenu morfologije ćelije sa toksinom dobijenim rekombinacijom, gena u primeru 3. a pokazuje negativnu kontrolu HeLa ćelija nakon 6 časova, b i c pokazuju HeLa ćelije nakon 3 časa i nakon 6 časova i dodavanja 5 nM rekombinantnog M toksina, d pokazuje CRL7407 (ATCC) normalnih humanih ćelija želudca negativne kontrole nakon 6 časova, e i f pokazuju CRL7407 ćelije nako 3 časa i 6 časova dodavanja 5 nM rekombinantnog M toksina.

Slika 3. pokazuje osetljivost za M toksin nekoliko vrsta ćelija kancera u primeru 3. Ona je određena putem WST postupka. X osa pokazuje koncentraciju M toksina u supstratu a Y osa pokazuje direktnu apsorbancu talasne dužine od 415 nm ili relativni odnos kada je apsorbanca negativne kontrole procenjena na 100%. HLF: pacovske hepatoma. debelo crevo 26: karcinom debelog creva miša.

Slika 4. je kao i na slici 3. T24: humani kancer bešike. OVK18: humani kancer ovarijuma. KLM-1: humani kancer pankreasa. A-549: humani kancer pluća. Ca9-22: humani kancer desni. CRL1500: humani kancer dojke.

Slika 5. pokazuje vvestern bloting monoklonalnog antitela koje je izvedeno u primeru 8 Sva uvećanja razblaženja kultivisanih supernatanta hibndoma ćelija su 20 puta.

Slika 6. Pokazuje aktivnost M toksina sa kalcijum alginatom kao apsorbeniom u primeru 9. Negativna kontrola sadrži 10 mM Tris pufer pH 7.7 sam kao supstrat i pozitivna kontrola sadrži supstrat i 10 mM M toksina. X osa pokazuje broj svake frakcije koja je prošla kroz kalcijum alginat kolonu. Prosečna koncentracija svake frakcije je 10 nM i bilo koja od frakcija pokazuje najmanje 10 nM ili više. Kada su crvena zrnca uništena, koncentracije hemoglobina u rastvoru su porasle Y osa pokazuje 415 nm apsorbance.

Slika 7. pokazuje, u primeru 10, procenat vijabilnosti HeLa ćelija koje pokazuju inhibitornu aktivnost M toksina putem apsorpcije aktiviranog ugljenika u primeru 10. X osa pokazuje broj kolona svake frakcije ispirka. Koncentracije M toksina su u prošeku 10 nM i svaka od njih je najmanje 10 nM ili više. Y osa pokazuje procenat dobijen deljenjem vrednosti toksičnosti svake frakcije sa pozitivnom kontrolom koja je merena pomoću WST postupka.

Slika 8. pokazuje kao i slika 7. Ona pokazuje procenat vijabilnosti u HeLa ćelijama CM-celuloze i kalcijum alginata pokazujući inhibiciju aktivnosti M toksina puten apsorpcije u primeru 10.

Najbolji način za korišćenje pronalaska

Protein koji ima istu sekvencu ammo kiseline ili gotovo u potpunosti identičnu sekvencu ammo kiseline sa sekvencom amino kiseline predstavljenom sa SEQ ID br. 1 ovog pronalaska može biti protein koji je poreklom iz bakterijskih sojevaHelicobacter pylon,na pnmer NCTC 11637, NCTC 11916. DT 61A, NCTC 11639, R85-13 6P, R85-13-12F, R85-13-11P T31213-NTB, J99. 4, U2-1, 85D08, MC903. MC123, Tx30a, 26695. UA1182 i tome slično, ili može biti sintetisani protein.

Kao gotovo u potpunosti identična sekvenca ammo kiseline sekvenca predstavljena sa SEQ ID br. 1, sekvence amino kiseline koje imaju homologiju od oko 70% ili više, poželjno oko 80% ili više, još poželjnije oko oko 90% ili više. još više poželjno oko 95% ili više. može biti dato primerom. Kao protein koji ima gotovo u potpunosti identičnu sekvencu amino kiseline kao sekvenca amino kiseline predstavljena sa SEQ ID br. 1, protein koji ima gotovo u potpunosti istu aktivnost kao što je ona od proteina koji ima sekvencu amino kiseline predstavljenu sa SEQ ID br. 1, može se dati primerom. Kao gotovo u potpunosti ista aktivnost, aktivnost umnožavanja aktivnosti inhibicije ćelije, citotoksična aktivnost ili aktivnost koja uzrokuje smrt ćelije, može biti data primerom. Termin, gotovo u potunosti isti, označava da te aktivnosti imaju isti kvalitet, na primer, u fiziološkoj herniji ili farmakologiji. Shodno tome. poželjno je da aktivnost citotoksina i tome slično ima isti kvalitet, na primer, oko 0.1-100 puta, poželjno oko 0.5-10 puta, još poželjnije oko 0.5-2 puta. Stepen ovih aktivnosti ili faktor kvantiteta molekularnih težina proteina može biti različit. Aktivnost umnožavanja aktivnosti inhibicije ćelije, citotoksična aktivnost ili aktivnost uzrokovanja smrti ćelija može se odrediti postupcima dobro poznatim u praksi, na primer, putem postupka neodređenog skrimnga.

Kao protein predmetnog pronalaska, sledeći proteini mogu se predstaviti .kao pnmeri: sekvenca amino kiseline koja odseca 1-150 (poželjno 1-50) amino kiselina u sekvenci amino kiseline predstavljene sa SEQ ID br. 1; sekvenca ammo kiseline koja dodaje 1-100 (poželjno 1-30) amino kiselina u sekvenci amino kiseline predstavljene sa SEQ ID br. 1; sekvenca amino kiseline koja ubacuje 1-50 (poželjno 1-30) amino kiselina u sekvencu amino kiseline predstavljene sa SEQ ID br. 1; sekvenca amino kiseline koja 1-50 (poželjno 1-30) ammo kiselina u sekvenci arnino kiseline predstavljene sa SEQ ID br. 1 supstituisana sa drugim aminokiselinama: ili protein koji sadrži kombinaciju sekvenci ovih amino kiselina, koji je nazvan mucin.

Kada je sekvenca amino kiseline ubačena, isečena ili supstituisana kao što je opisano gore. pozicija ubacivanja, isecanja ili supstitucije nije specifično ograničena.

U proteinu ove patentne prijave, u skladu sa upobičajenom praksom, leva strana je N kra| (amino kraj) i desna strana je C kraj (karboksilni kraj). U proteinima ovog pronalaska, koji sadrži protein koji ima u sekvencu amino kiseline predstavljenu sa SEQ ID br. 1. C kraj je obično karboksil grupa (-COOH) ili karboksilat (-COO-), ali može biti amid (-CONH,) ili estarska grupa (-COOR). gde je R C, 5 alki) grupa od metil, etil, n-propil. izopropil. n-butil i tome slično. C,.fcikloalkil grupa od ciklopentil, cikloheksil i tome slično. C5aril grupa od fenil, u-naitil i tome slično, benzil, fenetil i tome slično, fenil-C,.2alkil grupa od benzil, feneti! i tome slično, ili C,.,. aralkil grupa od a-naftil-C;.2alkil grupa od a-naftilmetila i tome slično. Kada protein ovog pronalaska ima karboksil grupu (ili karboksilat) na nekoj drugoj poziciji a ne na C kraju, proteini koji imaju amido ili estenfikovane grupe su sadržani u proteinu ovog pronalaska. Kao estar može biti upotrebljen estar gore pomenutog C kraja. Dalje u proteinima ovog pronalaska postoji protein u kojem je amino grupa od ostatka amino kiseline (na primer, metioninski ostatak) na N kraju zaštićena sa zaštitnom grupom (na primer, C,.6acil grupom od C,.6alkanoil grupe ih sličnom formil grupom, acetil grupom ili tome slično); protein u kojem je ostatak glutaminske kiseline N kraja produkovan incizijomin vivoje promenjen u grupu piroglutaminske kiseline: protein kojem je supstituentska grupa bočnog lanca amino kiseline u molekularnoj (na primer, - OH, SH, amino grupa, imidazol grupa, indol grupa, guanidino grupa ili tome slično) zaštićena sa pogodnom zaštitnom grupom (na primer. C,.5acil grupom, ili sličnom od C,.6alkanoil grupom ili nalik na formil grupu): ili konjugovani protein ili tome slično od takozvanih glikoproteina za koji je lanac šećera vezan.

Kao delimični peptid proteina ovog pronalaska, to može biti delimićni peptid od gore pomenutih proteina ovog pronalaska i poželjno, on ima slične aktivnosti (na primer. aktivnost inhibicije umnožavanja ćelija, citotoksičnu aktivnost i tome slično) u odnosu na proteine ovog pronalaska. Kao primer, može se uzeti peptid sekvence amino kiseline koja ima najmanje 20% ili više, poželjnije 50% ili više, još poželjnije 70% ili više, dalje poželjno 90% ili više i najpoželjnije 95% ili više u sekvenci amino kiseline ovog pronalaska, i ima aktivnost inhibicije umnožavanja ćelija, citotoksičnu aktivnost ili aktivnost uzrokovanja smrti ćelije. Delimični peptid ovog pronalaska mogu biti sledeći peptidi: 1-5 (poželjno 1-3) amino kiseline su isečene u sekvenci amino kiseline; 1-10 (poželjno 1-5 (još poželjnije 1-3) amino kiseline su dodane sekvenci amino kiseline: 1-5 (poželjno 1-3) amino kiseline su ubačene u sekvencu amino kiseline: ili 1-5 (poželjno 1-3) amino kiseline su supstituisane drugim amino kiselinama.

I ako delimični peptid ovog pronalaska ima obično karboksil grupu (-COOH) ili karboksilat (-COO-) na C kraju, kao što je prikazano u gornjim proteinima predmetnog pronalaska. C kraj može biti amid (-CONH2) ili estar (COOR) gde R ima isto značenje kao što je prikazano gore. Dalje, u delimičnom peptidu ovog pronalaska, kao što je pokazano u gornjim proteinima ovog pronalaska, postoji peptid u kojem amino grupa ostatka amino kiseline (na primer. ostatak metionina) na N kraju zaštićen sa zaštitnom grupom; protein koji je ostatak glutaminske kiseline N kraja i produkovan sa incizijom in vivo je promenjen u grupu piroglutaminske kiseline; protein kojem je supstituentska grupa bočnog lanca amino kiseline u molekulu zaštićena sa pogodnom zaštitnom grupom ili konjugovani protein ili tome slično od takozvanih glikoproteina i za koje je šećerni lanac vezan. Delimični peptid ovog pronalaska može se upotrebiti kao antigen za konstruisanje antitela, tako da aktivnost inhibicije umno-žavanja ćelija, citotoksična aktivnost ili tome slično nisu neophodno potrebni.

Kao so proteina ili delimičnog peptida ovog pronalaska mogu se upotrebiti soli fiziološki prihvatljivih kiselina (na primer, neorganske kiseline ili organske kiseline) ili baza (na primer, soli alkalnib metala) i poželjno se mogu upotrebiti fiziološki prihvatljive kisele adicione soli. Kao takve soli. na primer. postoje soli neorganskih kiselina (na pnmer, hlorovodonične kiseline, fosforne kiseline, bromvodonične kiseline, sumporne kiseline), organske kiseline (na pnmer. sirćetna kiselina, mravlja kiselina, propionska kiselina, fumarična kiselina, maleična kiselina, sukcminska kiselina, tartančna kiselina, limunska kiselina, malićna kiselina, oksalna kiselina, benzoićna kiselina, metansumporna kiselina, benzen sumporna kiselina). Proteini i soli ovog pronalaska mogu se produkovati dobro poznatim postupcima za pripremanje proteina iz bilo kojeg tipa soja gore pomenutogHelicobacter pylori,ili kultivisanjem transformanta koji sadrži DNK koja kodira gore pomenuti protein. Oni dalje mogu biti produkovani u skladu sa postupkom za sintetizovanje peptida koji je bio gore pomenut. Kada su proteini produkovani iz bilo kog od sojevaHelicobacter pylori.proteini iz bakterijske ćelije su centrifugirani putem ultrasoničnog razbijanja, zatim su ekstrahovani taloženjem amonijum sulfatom i tome slično, i ekstrahovana tečnost je prečišćena i razdvojena kombinovanom hromatografijom kao što je jono izmenjivačka hromatografija i hidrofobna hrcmatografija.

U sintezi proteina mogu biti upotrebljeni delimični peptid, njegove soli ili njegov amid ovog pronalaska, komercijalno dostupne smole za sintezu proteina. Kao takve smole, mogu kao pnmer poslužiti sledeće smole: hlormetil smola, hidroksimetil smola, benzhidril amin smola, aminometil smola. 4-benziloksibenzilalkohol smola, 4-metilbenzhidril amin smola, PAM smola. 4-hidroksimetilmetilfenilacetoamidmetil smola, poliakrilamid smola, 4-(2'.4'-dimetoksifenilhidroksiinetil) fenoksi smola, 4-(2',4'-dimetoksifenii-Fmoc aminoetil) fenoksi smola. Koristeći takve smole, amino kiselina čije a-amino grupe i funkcionalne grupe bočnih lanaca su pogodno zaštićene, konde-nzovane su na smoli da se susretnu sa željenom sekvencom proteina dobro poznatim postupkom kondenzacije. Na kraju reakcije, protein je isečen iz smole i nekoliko zaštitnih grupa je isečeno. Zatim su dobijeni njegovi željeni proteini ili amidi putem postupaka za formiranje unutrašnjih disulfidnih veza u više razblaženom rastvoru. Uzevši u obzir gore pomenutu konde-nzaciju zaštitnih grupa amino kiselina, nekoliko vrsta aktivirajućih agenasa za sintezu proteina može se upotrebiti i posebno se mogu upoptrebiti karbodiimidi. Kao takvi karbodiimidi mogu se upotrebiti DCC, N'.N'-diizopropilkarbodiimid, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid i tome slično. U aktivaciji sa tim karbodiimidima. zaštićene amino kiseline mogu se dodati direktno smoli sa dodatnim agensom za kontrolisanje racemizacije (na primer, HOBt ili HOOBt), ili se mogu dodati smoli nakon prethodne aktivacije zaštićene amino kiseline kao anhidrida simetrične kiseline ili HOBt estra ili HOOBt estra.

Kao rastvarač koji se koristi u aktivaciji zaštićene amino kiseline ili kondenzacije sa smolom, on se može odabrati od poznatih rastvaraća koji su upotrebljivi za reakciju kondenzacije proteina. Kao takav rastvarač mogu se upotrebiti kiseli amidi kao što je N.N-dimetilformamid, N,N-dimetiacetoamid i N-metilpirolidon, halogenizovani ugljovodonici kao što su metilen hlorid i hloroform. alkoholi kao što su trifluoroetanol, sulfoksidi kao što su dime-tilsulfoksid, piridin. etri kao što su dioksan i tetrahidrofuran. nitrili kao što su acetonitril i propionitril, estn kao što su metil acetat i etil acetat, i njihove mešavine. Reakciona temperatura je pogodno odabtana iz poznatih raspona koji se mogu upotrebiti u reakciji za formiranje proteinskih veza, i obično je prigodno odabrana od -20°C - 50°C. Aktivirani derivati amino kiseline su obično upotrebljeni 1.5-4 puta molarnih ekvivalenata. Kao test rezultat reakcije ninhidrina, kada je kondenzacija nedovoljna, reakcije kondenzacije mogu se ponoviti bez isecanja zaštitnih grupa da se izvede dovoljna kondenzacija. Kada se ne može izvesti dovoljna kondenzacija pomoću ponovljenih reakcija, nereagovane amino kiseline su acetilirane sa sirćetmm anhidridom ili acetimidazolom, tako da uzastopne reakcije nemaju uticaja.

Kao zaštićene grupe polaznog materijala mogu se upotrebiti, na primer, Z, Boe, t-pentiloksikarbonil, izoborniloksikarbonil, 4-metoksibenziloksi-karbonil. Cl-Z, Br-Z, adamantiloksi-karbonil. trifluoroacetil. ftaloil. formil, 2-nitrofenilsulfenii, difenilfosfintiod, Fmoc i tome slično. Karboksilne grupe mogu se zaštititi, na pnmer, alkil-esterifikacijom (na pnmer, aikil-esteriacija pravog, razgranatog li cikličnog lanca metil, etil, propil, butil, t-butil, ciklopentil. cikloheksil. cikloheptil, ciklooktil i 2-adamantil) aralkilesteracijom (na primer. benzilestar. 4-nitrobenzilestar. 4-metoksibenzilestar. 4-hlorobenzilestar, benzhidnlestar). fenacilesteracijom. benziloksikarbonilhi-dradidacijom. t-butoksikarbonilhidradidacijom, tritilhidradidacijom i tome slično. Hidroksiina grupa senna može biti zaštićena, na primer, estenfikacijom ili eteracijom. Kao pogodne grupe ova estenfikacije mogu se upotrebiti, na primer, niže(C,.,) alkanoil grupe kao što su acetil grupa, acil grupa kao što je benzoil grupa ili grupe izvedene od karbonata kao što je benziioksikarboml grupa i etoksikarbonil grupa. Kao grupe pogodne za eteraciju za primer mogu poslužiti benzil grupa, tetrahidropiranil grupa i t-butil grupa. Kao zaštićene grupe od fenolne hidroksune grupe tirozina. na primer, mogu se upotrebiti Bzl. C.;-Bzl, 2-nitrobenzil, Br-Z i t-butil. Kao zaštićene grupe od imidazola od histidina, na primer. mogu se upotrebiti Tos, 4-metoksi-2.3.6-trimetilbe-nzensulfonil, DNP, benziloksimetil, Bum, Boe, Trt i Fmoc.

Kao aktivirane karboksil grupe polaznog materijala mogu se upotrebiti, na primer, odgovarajući kiseli anhidndi, azidi i aktivirani estri (estnalkohola (na primer, pentahlorofenol. 2,4,5-tnhlorfenol. 2,4-dinitrofenol, cijanometilalkohol, paranitrofenol, HONB, N-hidroksisukcimid, N-hidroksiftalmid i HOBt)). Kao aktivirane amino grupe polaznih materijala mogu se upotrebiti, na primer, odgovarajući fosforni amidi. Kao postupak za uklanjanje (eliminaciju) zaštitnih grupa mogu se upotrebiti. na primer, katalitička redukcija u vodoničnoj struji u prisustvu katalizatora Pd-crnog ili Pd-ćumura; kiseli tretman sa anhidrovanim vodonik fluridom, metan sumpornom kiselinom, trifluormetan sumpornom kiselinom, trifluorsirćetnom kiselinom ili njenim mešavinama: tretmanbazama sa diizopropiletilamin, trietilamin. piperidin, piperadin ili rome slično; ih redukcija sa natrijumom u tečnom amonijaku. Reakcija eliminacije putem upotrebe gornjeg kiselog tretmana je obavljana obično na temperaturi od od -20°C - 40°C. U kiselom tretmanu, efikasno je da se doda agens koji hvata katjon kao što je anisol, fenol, tioanizol. metakrezol, parakrezol. dimetilsulfid.1,4-butanditriol Hi 1,2-etanditiol. 2.4-dinitrofenil grupa upotrebljena kao zaštitna grupa imidazola od histidina je uklonjena tretmanom sa tiofenolom. Formil grupa koja je upotrebljena kao indol zaštitna grupa od tnptofana uklonjena je kiselim tretmanom u prisustvu gornjeg 1,2-etanditiola, 1,4-butanditiola ili tome slično i dalje može biti uklonjen tretmanom sa alkalijama sa razblaženim rastvorom natrijum hidroksida, razblaženim amonijakom i tome slično.

Zaštita funkcionalnih grupa koja ne treba da učestvuje u reakciji polaznog materijala i zaštitnih grupa, eliminaciji zaštitnih grupa, aktivaciji funkcionalne grupe koja učestvuje u reakciji ili slično mogu biti prigodno odabrani od dobro poznatih grupa i načina. Kao drugi postupci zadobijanie amida proteina, na primer, produkovani su a-karboksil grupa od karboksi i krajnja grupa amino kiseline je zaštićena putem amidacije, peptidni lanac (protein) je produžen do željene dužine lanca na strani amino lanca, protein kod kojeg zaštitna grupa a-amino grupe na N-kraju peptidnog lanca je eliminisana i protein čija zaštitna grupa od karboksil grupe na C-kraju peptida, i oba peptida su kondenzovana u rastvoru mešavine kao što je opisano gore. Posebnost reakcije kondenzacije je pomenuta gore. Zaštitni protein dobijen kondenzacijom je prečišćen, sve zaštićene grupe su uklonjene gornjim postupkom, i sirovi protein se može dobiti Sirovi protein je prečišćen koristeći poznate načine prečišćavanja, glavne frakcije su liofilizirane i željeni amid proteina se može dobiti. Da se dobiju estri proteina, na primer, a-karboksil grupe od karboksi-kraja amino kiseline je kondenzovana sa željenim alkoholima da se dobiju estri amino kiseline, estri su tretirani kao što je pokazano u amidima proteina i željeni estri proteina se mogu dobiti.

Delimični peptid ili soli ovog pronalaska mogu se produkovati postupcima dobro poznatim u praksi za sintetizovanje peptida ili isecanje proteina ovog pronalaska sa pogodnom peptidazom. Kao postupak za sintezu peptida može se upotrebiti, na primer, postupak sinteze čvrste faze ili postupak sinteze tečne faze. Naime, delimični peptid sposoban da konstituiše delimični peptid ovog pronalaska ili amino kiselinu je kondenzovan sa preostalim đelovima, kada produkt ima zaštitnu grupu, zaštitna grupa je eliminisana i može se produkovati željeni peptid.

Na primer kao dobro poznati postupci kondenzacije i eliminacije zaštitnih grupa, sledeći postupci mogu poslužiti kao primer. M. Bodanszkv i M A. Ondetti. Sinteza peptida. Interscience Publishers. New York (1969): Schroeder i Luebeke. Peptid. Academic Press. New York (1965): Nobuo lzumiya i sar.. Fundamentalna i eksperimentalna sinteza peptida. Maruzen Co . (1975): Haruaki Yajima ■ Shunpei Sakakibara. Eksperimentalne lekcije iz biohemije 1. Chemistrv of protems IV. 205 (1977). Haruaki Yajima i sar.. Kontinuirano razviće medikamenata, vol 14. Sinteza peptida. Hirokavva Shoten. Dalje nakon reakcije delimični peptid ovog pronalaskamožebiti prečišćen uobičajnim postupcima prečišćavania, na primer. ekstrakcijom rastvarača. desti-lacijom, kolonskom hromatografijom, tečnom hromatografijom. rekristalizacijom i njihovim kombi-nacijama Kada je delimični peptid dobijen gornjim postupcima, on se može promeniti u prigodnu so poznatim postupkom ili sličnim postupkom Kada |e dobijana so đelimičnog peptida ona se može promeniti u oslobođeno jedinjenje ili drugu so poznatim postupkom ih sličnim postupkom.

Kao DNKkoja kodira protein ovog pronalska može se upotrebiti bilo koje jedinjenje. koje sadrži osnovnu sekvencu koja kodira gore pomenuti protein ovog pronalaska. Dalje se može upotrebiti genomska DNK, genomska DNK biblioteka, gore pomenuta cDNK izvedena iz ćelija i tkiva, gore pomenuta cDNK biblioteka izvedena iz ćelija i tkiva, ili sintetička DNK. Vektor upotrebljen u biblioteci može biti odabran od bilo kog od baktenofaga. plazmida. kozmida, fagemida i tome slično. Upotreba ukupne RNK ili frakcije RNK pripremljene iz gornjih ćelija ili tkivamožebiti direktno amplifikovana polimcraznom lančanom reakcijom reverzne transknptaze (dalje označen kao RT-PCR postupak). Kao DNK koja kodira protein ovog pronalaska kao primer može poslužiti bilo koja od sledećih DNK: na primer, DNK kaoja sadrži sekvencu baze predstavljenu sa SEQ ID br.2 ili DNK koja ima sekvencu baze koja hibridizuje sa sekvencom baze predstavljenu sa SEQ ID br.2 pod uslovima visoke strogoće i kodira protein koji ima gotovo u potpunosti istu aktivnost kao protein ovog pronalaska (na primer. citotoksičnu aktivnost).

Dalje uobličavanje. mogu se upotrebiti DNK koja kodira protein koji ima sekvencu amino kiseline predstavljenu sa SEQ ID br.1, DNK koja ima sekvencu baze predstavljenu sa SEQ IDbr.2.

Kao DNK koja kodira delimični peptid ovog pronalska može se upotrebiti bilo koja od DNK koja sadrži gornje sekvence baze koje kodiraju delimični peptid ovog pronalaska. Dalje, mogu se upotrebiti genomska DNK, genomska biblioteka DNK, gore pomenuta cDNK izvedena iz ćelija i tkiva, gore pomenutabibliotekacDNK izvedena iz ćelija i tkiva ili sintetička DNK. Kao DNK koja kodira delimični peptid ovog pronalaska, na primer, bilo koja od sledećih DNK može biti uzeta za primer: na primer, DNK koja ima delimičnu sekvencu DNK koja ima sekvencu baze predstavljenu sa SEQ ID br.2 ili DNK koja ima delimičnu sekvencu DNK, koja ima sekvencu baze koja hibridizuje sa sekvencom baze predstavljenom sa SEQ ID br.2 pod uslovima visoke strogoće i kodira protein koji ima gotovo u potpunosti istu aktivnost kao protein ovog pronalaska (na primer, citotoksičnu aktivnost).

Kao postupak kloniranja DNK perfektno kodiranje proteina ovog pronalaska ili đelimičnog peptida (ovde dalje u opisu kloniranja i ekspresije DNK koja kodira ovaj protein i slične, slučaj po slučaj ovi proteini i slični su skraćeni kao protein ovog pronalaska) koristeći sintetisani DNK prajmer koji ima delimičnu sekvencu baze proteina ovog pronalaska, amplifikovan je poznatim PCR postupkom ili je DNK kombinovana u pogodan vektor selektovana sa hibndizacijom sa frakcijom DNK ili sintetisana DNK koja kodira deo ili ceo region proteina ovog pronalaska. Hibridizacioni postupak može se obaviti kao što je to opisano u, na primer, Molekularno kloniranje, 2. izd. , J. Sambrook et a!., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989). Kada se koristi komercijalno dostupna biblioteka onda se može izvesti postupkom opisanim u priključenom objašnjenju. Promene sekvenci baze DNK mogu se izvesti koristeći poznati kit kao što je MutanTM-G (koji su produkovali Takara Shuzou Co.), MutanTM-K (koji su produkovali Takara Shuzou Co.) ili tome slično, koristeći poznati kit, kao' što je Gapped-ov dupleks postupak, Kunkel postupak, dobro poznati postupci ili slični postupci. DNK koja kodira klonirani protein može se upotrebiti onakva kakva je ili se može digestirati sa restrikcionim enzimom ako je potrebno, ili dodavanjem veznika. DNK može imati ATG, GTG ili TTG kao inicijalni kodon za translaciju na 5' bočnom kraju i TAA, TGA ili TAG kao termmacioni translacioni kodon na 3' bočnom kraju Kodon inicijacije translacije i kodon terminacije translaoje mogu se dodati koristeći prigodni sintetički DNK adapter, Ekspresioni vektor proteina ovog pronalaska može se produkovati. na primer, pomoću (i) isecanja željene DNK iz DNK koja kodira protein ovog pronalaska, i (u) tako što je frakcija DNK vezana nizvodno od promotora u pogodnom ekspresionom vektoru.

Kao vektor, može se upotrebiti plazmid izveden izEcherichia coli(kao što je pBR322, pBR325. pUC12.OUC13 ili pET3C), plazmid izveden izBacillus subtilis(kao što je pUBUO. pTP5 ili pC194), plazmid (kao što je pSH19, pSH15). bakteriofag izveden iz kvasca, baktenofaga kao što je/. fag, životinjski virus kao što je retro virus, vakcinia virus, Bakulc virus ili tome slično, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV ili pcDNAI/Neo. Kao promotor koji se upotrebljava u ovom pronalasku može se upotrebiti bilo koji promotor pogodan za domaćina koji se koristi za ekspresiju gena. Na primer, kada se koriste životinjske ćelije kao domaćin, mogu poslužiti, na primer, SRa promotor, SV40 rani promotor, HIV • LTR promotor. CMV promotor ili HSV-TK promotor. U ovim promotorima poželjno se mogu koristiti CMV (citomegalovirus) promotor, SRa promotor. Kada je zaEcherichiadomaćin porodica gljiva preferirani su trp promotor, lac promotor, recA promotor,/>.PL promotor, Ipp promotor ili T7 promotor. Kada |e zaBacillusdomaćin porodica gljiva poželjni su SP01 promotor, SP02 promotor ili penP promotor. Kada je comaćin kvasac poželjni su PH05 promotor, PGK promotor, GAP promotor ili ADH promotor. Kada su domaćini ćelije insekata poželjni su P10 promotor ili tome slično.

Ako je to potrebno kao drugi ekspresioni vektori u odnosu na gore pomenute vektore, mogu se upotrebiti vektori koji sadrže pojačivač, seiekcioni marker. replikacioni početak od SV40 (u daljem tekstu prikladno skraćen kao SV40ori) ili njima slični. Kao primer selekcionih markera mogu se upotrebiti, na pnmer, gen redukcionog enzima dihidro folne kiseline u daljem tekstu prikladno skraćen kao dhrf) (rezistentan na metotreksa; (MTX), gen rezistencije na amoicilin (u daljem tekstu skraćen na Ampr) gen rezistencije na neomicin (u daljem tekstu skraćen na Neor) G418 rezistencije i gen za rezistenciju na kanamicin. Posebno kada se upotrebi dhfr gen kao seiekcioni marker korišćenjem ćelija kineskog brčka defektnih za dhfr gen, kombinovane ćelije mogu biti odabrane pomoću medijuma koji ne sadrži timidin. Dalje, ako je neophodno, signalna sekvenca koja je doterana za domaćina je dodana na N bočni kraj proteina ovog pronalaska. Kada je zaEcherichiadomaćin porodica gljiva mogu se upotrebiti PhoA signalna sekvenca. OmpA signalna sekvenca ili tome slično. Kada je zaBacillusdomaćin porodična gljiva mogu se upotrebiti signalna sekvenca a-amilaze, signalna sekvenca supticilina, i tome slično. Kada je domaćin kvasac, mogu se upotrebiti MFcc signalna sekvenca, a SUC2 signalna sekvenca, SUC2 signalna sekvenca ili njoj slična. Kada je domaćin životinjska ćelija, može se upotrebiti signalna sekvenca insulina, signalna sekvenca molekularnog antitela ili tome slično. Koristeći vektor koji sadrži DNK koja kodira tako konstruisani protein ovog pronalaska, može se produkovati transformant.

Kao domaćin može se upotrebiti, na primer, rodEcherichia,rodBacillus.kvasac, ćelije insekata, životinjske ćelije i tome slično. Kao jedan oblik rodaEcherichia,mogu se upotrebiti, na primer,Echerichia coliK12, DH1, DH5a (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. vol. 60. 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acid Research Vol. 9, 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biologv, Vol. 120, 517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biologv, Vol. 41, 459 (1969), C600 (Genetics. Vol. 39, 44011954)) ili njima slični. Kao rodBacillusmože se upotrebiti, na primer,Bacillus subtilisMI114 (Gene, Vol. 24, 255 (1983), 207-21 (Journal of Biochemistry, Vol. 95. 87 (1984)) ili njima slični. Kao kvasac može se upotrebitiSaccharomyces cerevisiaeAH22, AH22R. NA87-11A, DKD-5D, 20B-12,Schizosacharomyces pombeNCYC1913, NCVC2036,Pichia pastorisKM71 ili tome slično.

Kao ćelije insekata mogu se upotrebiti, na primer. kada je virus AcNPV. ćelijeSpodoptera frugiperda:Sf ćelije. MG1 ćelije izvedene od srednjeg crevaTrichoplusia ni.High Five TM ćelije izvedene od jajaTrichoplusia ni.ćelije izvedene odMamestra brassicae.ćelije izvedene odEstigmena acreaili njima sličnih. Kada je virus BmNPV, mogu se upotrebiti N ćelijeBombyx mori:BmN ćelije ili njima slične. Kao Sf ćelije mogu se upotrebiti, na primer, Sf9 ćelije (ATCC CRL1711), Sf21 ćelije (Vaughn, J.L. i sar., In Vivo, 13, 213-217 (1977)) ili njima slične. Kao insekti mogu se upotrebiti. na primer, larve svilene bube (Maeda i sar.. Nature, Vol. 315. 592 (1985)). Kao ćelije životinja mogu se upotrebiti, na primer, majmunske ćelije COS-7. Vero. CHO ćelije kineskog hrčka (u daljem tekstu skraćene na CHO ćelije). CHO ćelije kineskog hrčka defektne za dhfr (u daljem tekstu skraćene na CHO(dhfr-) ćelije), L ćelije miša. At-20 ćelije miša, ćelije mijeloma miša. GH3 pacova, humane FL ćelije i njima slične. Štaviše. može se koristiti nekoliko vrsta normalnih humanih ćelija, na primer, ćelije jetre, splenocite, nervne ćelije, ćelije neuroglije, |3 ćelije slezine. ćelije koštane srži, ćelije mezangijuma. Langerhans-ove ćelije ćelije kože. ćelije epitelijuma, endctelijuma, fibroblasta, fibroćelije. ćelije mišića, masne ćelije, imunološke ćelije (na primer, makrofage. T ćelije. B ćelije, prirodne ćelije ubice, mastoidne ćelije, neutrofilne, bazofilne, eozinofilne, monocite), megakanocite, sinovijalne ćelije, ćelije rskavice. koštane ćelije, osteoblaste, osteklaste, ćelije mamalnih žlezda, hepatične ćelije, intersticijalne ćelije ili prekursor ćelije, stim ćelije ili ćelije kancera. Transformacija rodaEcherichiamože se izvesti, na primer postupkom opisanim u Proc. Natl Acad. Sci. USA, Vol 69, 2110 (1972), Gene, Vol. 17, 107 (1982) ili tome slično.

Transformacija rodaBacillusmože se obaviti, na primer, postupkom opisanim u Molecular and General Genetics, Vol.168, 111 (1979) ili na sličan način. Transformacija kvasca može se izvesti, na primer, postupkom opisanim u Methods in Enzymology, Vol. 194. 182-187

(1991), . Natl Acad. Sci. USA. Vol. 75, 1929 (1978) ili na sličan način. Transformacija ćelija insekata ili insekata može se obaviti, na primer, postupkom opisanim u Bio/Technology, 6. 47-55

(1988) ili na sličan način.

Transformacija životinjskih ćelija može se izvesti, na primer, postupcima opisanim u Cell Engineering, izdvojeni volumen 8, Eksperimentalni protokoli za novi inženjering ćelija I. 263-267

(1995), publikovano od strane Shjunsha, i Virology, Vol. 52, 456 (1973). Koristeći gornje postupke, mogu se dobiti transformanti, koji su transformisani sa ekspresionim vektorima koji sadrže DNK koja kodira protein. Kada su transformanti čiji su domaćini rodEcherichiaili rodBacilluskultivisani. tečni medijum je pogodan kao medijum koji se koristi u kulturi. U medijumu su sadržani izvori ugljenika, izvori azota, neorganski i njima slični koji su neophodni za rast transformanata. Koa izvori ugljenika dobar primer su, na primer, glukoza, dekstrin, rastvorljivi škrob, sukroza ili njima slični. Kao izvori azota mogu se upotrebiti, na primer, neorganski ili organski materijali kao što su soli amonijaka, nitrati, likvor potopljenog kukuruza, pepton, kazein, ekstrakt mesa, kolači pasulja, ekstrakt krompira i tome slično. Kao neorganski materijali primerno se mogu upotrebiti, na primer. kalcijum hlorid, mononatrijum fosfat i magnezijum hlorid. Mogu se dodati ekstrakti kvasca, vitamini, materijali koji stimulišu rast i tome slično. Poželjno se koristi pH medijuma 5-8.

Kao medijum za kultivisanje rodaEcherichiapoželjan je, na primer, M9 medijum koji sadži glukozu i kazaminsku kiselinu (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431 - 433. Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972). Ako je neophodno za efikasno delovanje promotora može biti dodan, na primer, agens kao što je 3/3-indol akrilna kiselina. Kada je domaćin rodEcherichia,kultura se obično izvodi na temperaturi od oko 15~43°C tokom 3-4 časa, ako je neophodno može biti dodano aerisanje ili mešanje. Kada je domaćin-zaBacillusporodica gljiva kultura se obično obavlja na temperaturi od oko 30~40°C tokom oko 6-24 časa. ako je neophodnomožebiti dodano aerisanje ili mešanje.

Kada je transformant kome je domaćin kvasac kultivisan, kao primerni medijum koristi se. na primer. Burkholder-ov minimalni medijum (Bostain, K.L., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol,

77. 4505 (1980)) ili SD medijum koji sadrži 0.5% kazaminske kiseline (Bitter, G. A. i sar. Proc Nat. Acad. So. USA. Vol. 81, 5330 (1984)). Najradije se koristi medijum na pH 5-8. Kultura se obično obavlja na temperaturi od 20~35°C tokom oko 24-72 časa, ako je neophodno može biti dodano aensanie ili mešanje. Kada je transfonnant kultivisan u domaćinu ćeliji msekta ili insektu.Kao medijum može se upotrebiti Grace-ov medijum za insekte (Grace. T.C.C., Nature, 195, 788

(1962) uz staDilno dodavanje imobilisanog 10% goveđeg seruma ili tome slično. Najradije se koristi medijum na pH 6.2-5.4. Kultura se obično obavlja na temperaturi od 27°C tokom oko 3-5 dana, ako je neophodno može biti dodano aerisanje ili mešanje. Kada se transformant kome je domaćin životinjska ćelija kao medijum se koristi, na primer. MEM medijum koji sadrži oko 5-20% goveđeg fetalnog seruma (Science, Vol. 122, 501 (1952)), DMEM medijum (Virologv, Vol. 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medijum (Journal of the American Medical Association. Vol. 199, 519 (1967). 199 medijum (Proceeding of the Societv for the Biological Medicine, Vol. 73, 1

(1950)) ili tome slično. Kultura se obično obavlja na temperaturi od 30-40°C tokom oko15-60 časova, ako je neophodno može biti dodano aerisanie ili mešanje. Kao što je opisano gore, protein ovog pronalaska može se produkovati od ćelija transformanata.

Za razdvajanje i prečišćavanje proteina ovog pronalaska, na primer, sledeći postupci mogu se prigodno upotrebiti. Kada je protein ovog pronalaska ekstrahovan iz kultivisanih gljiva ili ćelija nakon kulture, gljive ili ćelije su sakupljene dobro poznatim postupkom, suspendovane u pogodnom puferu i uništene sa sa ultrazvuKom. lizozimom i/ili postupkom zamrzavanje-topljenje i tome slično. Zatim je dobijena sirova ekstrahovana tečnost proteina centrifugiranjem ili filtriranjem. Sredstvo za denaturisanje proteina, kao što je urea ili guanioin hlorovodomk, površinski-aktivni agens kao što je tntonX-100TM, mogu biti sadržani u puferu. Kada je protein izlućen u tečni medijum, nakon što je kultura dovršena, gljive ili ćelije supernatanta su razdvojene dobro poznatim postupkom i supernatant je sakupljen. Tako dobijem supernatant kulture ili protein koji je sadržan u tečnom ekstraktu je prečišćen kombinacijom dobro poznatih postupaka separacije i prečišćavanja. Ovi dobro poznati postupci separacije i prečišćavanja su postupci koji koriste tehniku oslobađanja od soli ili rastvaranje sa postupkom taloženja rastvarača. postupak dijalize, postupak koji koristi razlike u molekularnoj težini kao što je ultrafiltracija i elektroforeza na SDS-poliaknlamidnom gelu i tome slično, postupak koji koristi razlike u naelektrisanju kao što je jono izmenjivačka hromatografija, postupak koji koristi razliku u hidrofobnosti kao što je hidrofobna hromatografija. postupak koji koristi specifični afinitet kao što je afinitetna hromatografija. postupak koji koristi razliku u hidrofobnosti kao što je tečna hromatografija velike brzine reverzne faze, postupak koji koristi razliku izoelektnčnih tačaka kao što je izoelektroforeza, mogu svi biti upotrebljeni.

Kada je takav protein dobijen u slobodnom obliku on može biti pretvoren u so pomoću dobro poznatog postupka ili sličnim postupkom. S druge strane, kada je protein dobijen u obliku soli on se može pretvoriti u slobodni oblik ili u drugu so pomoću dobro poznatog postupka ili sličnim postupkom. Protein produkovan od strane rekombinanta može biti dalje reagovan sa prigodnim enzimom za modifikaciju proteina pre ili nakon prečišćavanja proteina da se po potrebi modifikuje ili delimično ukloni polipeptid. Kao modifikaciom enzim proteina može se upotrebiti, na primer, tripsin, himotripsin, arginilendopeptidaza, proteinkinaza. glikozid i tome slično. Aktivnosti tako dobijenog proteina ovog pronalaska ili njegovih soli mogu se odrediti eksperimentom sa vezivanjem sa obeleženim veznikom i enzimskim imuno ogledom koristeći specifično antitelo ili tome slično.

Antitela za protein, delimični peptid ili soli ovog pronalaska, mogu biti poliklonalno antitelo ili monoklonalno antitelo pod uslovom da antitela mogu prepoznati protein, delimični peptid ili soli. Antitela za protein, parcijalni peptid ili soli ovog pronalaska (u opisu antiotela koji sledi ovaj protein i njemu sličan može se obeležiti kao protein ovog pronalaska) mogu biti produkovana koristeći protein kao antigen i sa dobro poznatim postupkom za proizvodnju antitela ili anti-seruma.

Proizvodnja monoklonalnog antitela

(a) Proproizvodnja ćelija monoklonalnog antitela: Protein ovog pronalaska se daje toplokrvnim životinjama na poziciji, na kojoj može da se davanjem produkuje antitelo. sam ili sa nosačem ili razblaživačem. Pn davanju, da se pojača efekat produkcije antitela mogu se davati kompletni Freund-ov adjuvans ili nekompletni Freund-ov adjuvans. Davanje se obično obavlja jednom svake 2-6 nedei|a i ukupno 2-10 puta. Toplokrvne životinje su. na primer. majmuni, zečevi, psi. zamorci, miševi, pacovi, ovce, koze, pilići i tome slično, poželjni su miševi i pacovi Pn proizvodnji ćelija za proizvodnju monoklonalnog antitela, upotrebljena je toplokrvna životinja imunizovana sa antigenom, na primer, miševi. Dobro prepoznatljivo mišje antitelo, je ooabrano od mišje slezine ili limfe sakupljene nakon 2-5 dana posle finalne imunizacije, a ćelije za produkciju monoklonalnog antitela sadržane u slezini ili hmfi su fuzionisane sa ćelijama mieloma iste vrste ili različitih vrsta životinja da se pripremi hibridom za produkciju monoklonalnog antitela. Vrednost antitela u serumu može biti određena, na primer. postupkom u kojem je antiserum reagovan sa prethodno pomenutim obeleženim proteinom i merenjem aktivnosti obeleženog agensa vezanog za antitelo. Fuziona operacija može se izvesti poznatim postupkom, kao što je postupak Kohler i Milstein (Nature, 256. 495 (1975)). Kao fuzioni promocioni agens može se upotrebiti. na primer. polietilen glikol (PEG), Sendai virus, i tome slično, poželjan je

PEG.

Kao pnmerni mijelomi mogu pooslužiti, na primer, ćelije mijeloma toplokrvnih životinja, kao što su, NS-1, P3U1, SP2/0. AP-1 i AP1, poželjno P3U1. Poželjni odnos za broj ćelija koje produkuju antitela (ćelije slezine) prema broju mijeloma ćelija je oko 1:1-20:1. PEG (poželjno PEG1000-PEG6000) dodan je u koncentraciji od oko 10-80%, i inkubacija je izvedena na temperaturi od oko 20-40°C, poželjno 30-37°C tokom 1-10 minuta, i fuzija ćelija |e efikasno izvedena. U sknningu produkcije monoklonalnog hibridoma može se upotrebiti nekoliko vrsta postupaka, na primer, postoji postupak u kojem je supernatant kulture hibridoma dodat čvrstoj fazi (kao što je mikro ploča) apsorbujući direktno protein antigen ili sa nosačem, i anti-imunoglobinsko antitelo, koje je obeleženo sa radioaktivnim materijalom ili enzim kvasca, (kada su ćelije koje su korišćene za fuziju ćelija poreklom od miša upotrebljen je anti-mišji imunoglobin) ili je dodan protein A, tako da se detektuje monoklonalno antitelo vezano za čvrstu fazu: i postupak u kojem je dodan supernatant kulture hibridoma čvrstoj fazi apsorbujući anti-imunoglobinsko antitelo ili protein A, protein koji obeležava radioaktivni materijal ili enzim kavasca je dodan i detektovano je vezivanje monoklonalnog antitela za čvrstu fazu. Selekcija monoklonalnog antitela može se obaviti poznatim postupkom ili metodom sličnim njemu. Obično se ona može izvesti pomoću medijuma za životinjske ćelije kojima je dodan HAT (hipoksantin. amino pterin, timidin). Kao medijum za selekciju i gajenje može se upotrebiti bilo koji medijum na kojem se može gajiti hibridom. Može se upotrebiti. na primer, RPMI 1640 medijum koji sadrži 1-20%, poželjno 10-20%, goveđeg fetalnog seruma. GIT medijum 1-10% goveđeg fetalnog seruma (proizvedenog od strane Wako Junvaku Kougvou Co.) ili medijum koji ne sadrži serum za kulturu hibridoma (SFM-101, Nissui Seivaku Co.). Temperatura kulture obično je 20~40°C. poželjno 37°C. Vreme kultivisanja obično je 5 dana - 3 nedelje, poželjno 1 nedelja - 2 nedelje. Kultura se može obično izvoditi u 5% ugljendioksidu. Vrednost antitela supernatanta hibndoma kulture može se odrediti, kao što je prikazano u gore pomenutom postupku za merenje vrednosti antitela u antiserumu. (b) Prečišćavanje monoklonalnog antitela: Razdvajanje i prečišćavanje monoklonalnog antitela može se obaviti poznatim postupkom, na primer, postupkom razdvajanja i prečišćavanja za imunoglobuline (kao što je postupak uklanjanja soli. postupak taloženja alkohola,' postupak izoelektričnog taloženja, postupak elektroforeze, postupak apsorpcije i desorpcije sa jonoizmenjivačem (na primer, DEAE), postupkom ultracentruifugiranja, postupkom gel filtracije, ili specifičnim postupkom prečišćvanja u kojem je samo antitelo sakupljeno sa aktivnim apsorbensom, kao što je antigen-vezujuća čvrsta faza ili protein A ili protein G i veza je oslobođena da se dobije antitelo.

[Proizvodnja poliklonalnog antitela]

Poliklonalno antitelo ovog pronalaska može se proizvesti poznatim postupkom ili sličnim postupkom Na primer, koristeći sam imunoantigen (proteinski antigen) ili kompleks munoantigena i nosećeg proteina, on imunizuje toplokrvnu životinju koristeći isti postupak, kao u gore pomenutom postupku za proizvodnju monoklonalnog antitela, materijali koji sadrže antitelo za protein ovog pronalaska su sakupljeni i antitelo je razdvojeno i prečišćeno Za kompleks munoantigena za imunizaci|u toplokrvne životinje i nosećeg proteina, jedna vrsta nosećeg proteina i odnos mešavine nosača prema heptanu nisu važni za uslove u kojima će antitelo biti produkovano za heptan imunizovan sa unakrsnim vezivanjem sa nosačem. Na primer. goveđi serum albumin. goveđi cikloglobulin, hemocijanin, ih tome slično, mogu se upotrebiti za sjedinjavanje sa heptanom u težinskom odnosu od 0.1-20, poželjno oko 1-5 do jednog dela neptana. U sparivanju heptana i nosača može se upotrebiti nekoliko vrsta kondenzacionih agenasa, kao što su aktivni estarski agensi, koji sadrže glutaraldehid, karbodiimid. aktivni esrar maleimida, tiol grupu i ditiopiridil grupu. Proizvodi kondenzacije su dati delovima toplokrvnih životinja sposobnih da produkuju antitela zajedno sa njim samim ili nosačem ili razblaživačem. Da se pojača sposobnost proizvodnje antitela pri davanju mogu se dati kompletan Freund-ov adjuvans ili nekompletan Freund-ov adjuvans. Davanje se obično izvodi jednom u svake 2-6 nedelja i ukupno je oko 3-10 puta. Poliklonalno antitelo može se sakupiti iz krvi, ascita. poželjno iz krvi toplokrvne životinje imunizovane gornjim postupkom. Vrednost poliklonalnog antitela u antiserumu je određena istim postupkom opisanim u gornjem određivanju vrednosti antitela u antiserumu. Razdvajanje i prečišćavanje poliklonalnog antitela može se obaviti istim postupkom razdvajanja i prečišćavanja imunoglobulina, kao i u gornjem razdvajanju i prečišćavanju monoklonalnog antitela. _

Agens za tretiranje koji sadrži protein ili delimični peptid ovog pronalaska i protein ovog pronalaska i tome slično ima citotoksičnu aktivnost u odnosu na kancer, tako da se agens može upotrebiti kao agens za ekstrakciju bolesnih tkiva (ekstrakt sadrži cele i delimične, poželjno delimične ekstrakte) i posebno za tretiranje fiksnog kancera. Kada je protein ovog pronalaska i tome slično, upotrebljen kao gore, kao agens za tretiranje i prevenciju, on je upotrebljen nakon što je prečišćen najmanje 90%, poželjno 95% ili više, još poželjnije 98% ili više i dalje poželjno 99% ili više.

Inhibitorna aktivnost proteina ovog pronalaska na proliferaciju ćelija kancera ili slično može se odrediti poznatim postupkom, ili aktivnošću citotoksina ili aktivnošću koja uzrokuje smrt ćelije, određena je poznatim postupkom ili sličnim postupkom, poželjno postupkom opisanim u prethodno pomenutim eksperimentima. Kao primerna test jedinjenja, mogu poslužiti, na primer, peptidi, proteini, ne-peptidna jedinjenja, sintetička jedinjenja, fermentacioni produkti, ekstrakti ćelija, ekstrakti biljaka, ekstrakti životinjskih tkiva i krvna plazma. Ova jedinjenja mogu biti nova jedinjenja ili poznata jedinjenja.

Jedinjenja ili soli dobijem skrining postupkom ili kit za skrining ovog pronalaska odabrani su od gornjih test jedinjenja. produkata fermentacije, ćelijskih ekstrakata, ekstrakata životinjskog tkiva i krvne plazme. Ova jedinjenja imaju aktivnost inhibiranja citotoksične aktivnosti proteina ovog pronalaska ili tome slično ili inhibicionu aktivnost proliferacije kancer ćelije proteina ovog pronalaska ili tome slično. Kao soli jedinjenja mogu se upotrebiti soli slične solima proteina ovog pronalaska.

Kada su jedinjenja koja su dobijena korišćenjem skrining postupka ili kita za skrining, upotrebljena kao gornji agensi za tretman, ona se mogu upotrebiti uobičajenim načinima. Na primer, ona su upotrebljena kao tablete, kapsule, eliksiri, mikrokapsule, sterilni rastvori, suspenzije ili tome slično. Tako dobijeni farmaceutski preparati su sigurni i imaju nisku toksičnost, na primer, mogu se davati ljudima, toplokrvnoj životinji (kao što su miševi, pacovi, zečevi, koze, svinje, krave, konji, ptice, mačke, psi, majmuni i tome slično). Dozne težine jedinjenja ili niegovih soli menjaju se prema delovanju. bolesti, načinu doziranja i tome slično Uobičajeno se odraslima može davati (procenjeni na 60 kg težine) 0.1-100 mg jedinjenja po danu. poželjno oko 1.0-50 mg, još poželjnije oko1.0-20 mg. Pri parenteralnom davanju, doza jedinjenja koja varira prema objektu, oolesti i tome slično, obično je kod odraslih (procenjeni na 50Kg težine) prigodno oko 0.01-30 mg jedinjenja po danu, još poželjnije oko 0.1-20 mg. dalje poželjno oko 0.1-10 mg putem intravenske injekcije. Kod drugih životinja, može se upotrebiti doza težine koja je procenjena za 60 kg

Skrining jedinjenja kandidata lekova za bolesti: Pošto protein ovog pronalaska ili tome slično ima citotoksičnu aktivnost, jedinjenja ili soli koji promovišu funkciju (kao što je citotoksična aktivnost) proteina ovog pronalaska ili tome slično, na primer. mogu se upotrebiti kao agensi za tretiranje kancera. S druge strane, soli koje inhibiraju funkciju proteina ovog pronalaska ili tome slično, na primer. mogu se upotrebiti kao agensi za tretiranje i prevenciju gastritisa ili čira želudca. Shodno tome. protein ovog pronalaska ili tome slično su efektivno upotrebljeni kao reagensi za skrining jedinjenja ili soli koji promovišu ili inhibiraju funkciju proteina ovog pronalaska ili tome slično.

Naime, ovaj pronalazak obezbeđuje (1) postupak sknninga okarakterisan time što se protein ili delimični peptid ili soli ovog pronalaska koriste, i postupak skrinuje jedinjenja promovišući funkciju (kao što je citotosična aktivnost) proteina ili đelimičnog peptida ili soli ovog pronalaska, ili postupak skrinuje jedinjenje koje inhibira funkciju (kao što je citotosična aktivnost) proteina ili đelimičnog peptida ili soli ovog pronalaska. Jedinjenja koja promovišu funkciju mogu se skraćeno prikazati kao 'promotori' a jedinjenja koja inhibiraju funkciju skraćeno se označavaju dalje kao 'inhibiton'.

Štaviše, ovaj pronalazak obezbeđuje (2) kit za skrining promotora ili inhibitora. okarakterisan time što su u njemu sadržani protein ili delimični peptid ili soli ovog pronalaska. Gornji kit može se skraćeno označiti u daljem tekstu kao 'kit za skrining ovog pronalaska'. U jednom obliku, na primer, u gornjem (1) on obezbeđuje postupak za skrining promotora ili inhibitora, okarakterisan time što se poređenje vrši između slučajeva (i) i (ii). Slučaj (i) je kada su protein ili delimični peptid ili soli ovog pronalaska kontaktirani sa ćelijom koja je normalna ćelija koja sadrži ćeliju krvi izvedeniu iz tkiva gornjih toplokrvnih životinja (poželjno ljudi) ih gore pomenutih ćelija kancera. Slučaj (ii) je kada su protein ili delimični peptid ili soli ovog pronalaska kontaktirani sa ćelijom koja je normalna ćelija koja sadrži ćeliju krvi izvedenu iz tkiva gornjih toplokrvnih životinja (poželjno ljudi) ili gore pomenutih ćelija kancera i test jedinjenja.

Dalje, u jednom obliku u gornjem (2) on obezbeđje kit za skrining promotora ih inhibitora, okarakterisan time što sadrži protein ili delimični peptid ili soli ovog pronalaska i ćeliju izvedeni iz tkiva gornjih toplokrvnih životinja (poželjno ljudi) ili gore pomenute ćelije kancera i tome slično.

Dalje, konkretno, u skrining postupku, slučaj (i) i slučaj (ii) su okarakterisani time što su citotoksične aktivnosti proteina ovog pronalaska i tome slično određene i upoređene.

Citotoksična aktivnost, aktivnost inhibicije umnožavanja ćelija i aktivnost koja uzrokuje smrt ćelije, proteina ovog pronalaska ili njemu sličnog, mogu biti određeni poznatim postupkom ili sličnim postupkom. Međutim, još konkretnije. koristeći utvrđene ćelijske linije i tome slično, dalje, supstrat koji sadrži test jedinjenje, negativnu kontrolu koja je supstrat koji sadrži test jedinjenje i pozitivnu kontrolu koja je supstrat koji sadrži M toksin, tri od njih Hi dve su upotrebljene, Poredeći brojeve ćelija pod uslovima koji zadovoljavaju statističku značajnost, mhibitorna aktivnost citotoksične aktivnosti ili aktivnosti umnožavanja ćelija, ili određeni uzorak koji ima inhibitornu aktivnost citotoksične aktivnosti ili aktivnosti umnožavanja ćelija, mogu biti detektovani na osnovu prisustva Hi otsustva aktivnosti Hi povećanja i smanjenja. Ćelije koie se koriste u postupku detekcije su, na primer, brojanja normalnih ćelija krvnih ćelija izvedenih od tkiva gore pomenutih toplokrvnih životinja (poželjno ljudi) ili gore pomenute ćelije kancera nekoliko vrsta toplokrvnih životinja (na primer. kancer endometrijuma, kancer dojke, kancer želudca. karcinom jetre, kancer slezine.Karcinom mokraćne bešike. kancer debelog creva. kancer prostate,kancer pluća,kancerbubrega, neuroblastoma, kancerunnarnebešike. maligni melanom, kancer jezika, karcinom gingiva, t'ibroblasti miša, bubreg afričkog zelenog majmuna, kancer jetre pacova i tome slično).

Kao pnmerna test jedinjenja mogu poslužiti, na primer. peptidi, proteini, ne-peptidna jedinjenja. sintetska jedinjenja, produkti fermentacije, ekstrakti ćelija, biljni ekstrakti, ekstrakti životinjskog tkiva i tome slično. Ova jedinjenja mogu biti nova jedinjenja ili poznata jedinjenja. Za izvođenje gornjeg skrining postupka, protein ovog pronalaska ili tome slično je suspendovan u puferu pogodnom za skrining i uzorci proteina ovog pronalaska ili tome slično su pripremljeni. Kao pufer može se upotrebiti. fosfatni pufer sa pH oko 4-10 (poželjno 6-8). tns-hlorovodonik puier ili tome slično, koji ne inhibira reakciju proteina ovog pronalaska ili tome slično.

Kao konkretni primen postupka skrininga. nakon ispitivanja sknninga mogu se navesti (1) postupak za oirektno opažanje promena ćelija pod mikroskopom i brojanje ćelija sa hemocitometrom ili tome slično (2) postupak u kojem je uhvaćena promena kalijuma, hemoglobina i tome slično, koji su isprani iz ćelija putem ćelijske smrti, (3) postupak za određivanje preostalih živih ćelija nakon reakcije sa solima tetrazolijuma ili tome slično. (4) postupak za određivanje preostalih živih ćelija sa radioaktivno obeleženom supstancom, (5) postupak za potvrđivanje ćelijske smrti putem indukcije apoptoze ćelija i tome slično. Na primer. kao jedinjenje koje povećava citotoksičnu aktivnost proteina pronalska ili tome slično može se odabrati test jedinjenje u kojem je citotoksična aktivnost u -gornjem slučaju (ii) upoređena-sa gornjim slučajem (i) povećana za oko 20% ili više, još poželjnije 30% ili više, dalje poželjno 50% ili više. S druge strane, kao jedinjenje koje inhibira citotoksičnu aktivnost proteina ovog pronalaska ili tome slično može biti odabrano test jedinjenje čija je citotoksična aktivnost u gornjem slučaju (ii) upoređena sa gornjim slučajem (i) povećana za oko 20% ili više.još poželjnije 30% ili više, dalje poželjno 50% ili više. Ovo može biti izvedeno kao postupak za skrining visoke propustljivosti, U sledećem respektivno je upotrebljen, kao postupak (2), postupak za određivanje hemoglobina putem hemolitičke reakcije i kao postupak (3), WST postupak. U postupcima, su odabrani aktivni ugljenik. CM celuloza alginat kao apsorbenti koji pokazuju anti-M toksin aktivnost.

Dalje je mogućno da se ispitaju i uporede rastvori koji sadrže tu anjonsku kontrolu, pozitivnu kontrolu i test jedinjenja, sa životinjskim modelima da se potvrde efekti nivoa kod životinja u anti-M toksičnim materijalima. U ovim slučajevima mogu se upotrebiti mnoge vrste toplokrvnih životinja. Posebno se mogu upotrebiti miš, pacov, pas i majmun. Kao infektivni modeli efektivno se koriste mongolski gerbil, miš i majmun.

Kada su jedinjenja dobijena postupkom skrininga ili kita za skrining ovog pronalaska upotrebljena kao i gore kao agensi za tretiranje ili prevenciju, ova jedinjenja mogu se upotrebiti na uobičajene načine. Na primer, koristeći iste postupke farmaceutskih preparata proteina pronalaska, oni se koriste kao tablete, kapsule, eliksiri, mikrokapsule, sterilni rastvori, suspenzije ili tome slično. Tako dobijni preparati su sigurni i imaju nisku toksičnost, na primer. oni se mogu davati ljudima ili toplokrvnim životinjama (kao što su miš, pacov, zec. koza, prase, krava, konj, ptica, mačka, pas, majmun i tome slično). Dozne težine jedinjenja ili njegovih soli menjaju se prema delovanju, bolesti, načinu doziranja i tome slično. Kada se jedinjenja koriste za da se poveća funkcija proteina ovog pronalaska ili tome slično, kao agens regeneracije nakon uklanjanja bolesnih tkiva, obično se kod odraslih (procenjeni na 60 kg težine) može davati oralno 0,1-100 mg jedinjenja po danu, poželjno oko 1.0-50 mg, još poželjnije oko 1.0-20 mg. Kod drugih životinja, može se upotrebiti doza težine koja je procenjena za 60 kg.

Kvantifikovanje proteina ili đelimičnog peptida ili soli ovog pronalaska:

Antitela za protein ovog pronalaska ili tome slično (obično u daljem tekstu skraćeno označeni kao antitela ovog pronalaska) mogu specifično prepoznati protein ovog pronalaska ih tome slično, tako da se mogu upotrebiti za kvantifikovanje proteina ovog pronalaska ih tome slično u test tečnosti. posebno za kvantifikaciju sa imunizacionom sendvičtehnikom. Naime, ovaj pronalazak obezbeđuje (i) postupak za kvantifikovanje proteina ovog pronalaska ih tome slično u test tečnosti, okarakterisan time što su. antitelo ovog pronalaska i test tečnost i protein ovog pronalaska ili tome slično, kompetitivno reagovani, odnosi obeleženog proteina ovog pronalaska ili tome slično koji se vezuju za antitelo su određeni, i (ii) postupak za kvantifikaciju proteina ovog pronalaska ili tome slično u test tečnosti, okarakterisan time što su test tečnost i antitelo nerastvorljivi u nosaču i što je drugo obeleženo antitelo ovog pronalaska reagovano istovremeno ili kontinuirano, i zatim je doređena aktivnost obeleženog agensa u nerstvorljivom nosaču. U gornjem postupku kvantifikacije (ii), poželjno jedno antitelo je antitelo koje prepoznaje N krajeve proteina ovog pronalaska ili tome slično, drugo antitelo je antitelo koje reaguje sa C krajem proteina ovog pronalaska ili tome slično.

Štaviše koristeći monoklonalno antitelo za protein ovog pronalaska ili tome slično

(povremeno skraćeno prikazan u daljem tekstu kao monoklonalno antitelo ovog pronalaska)

može biti obavljena kvantifikacija proteina ovog pronalaska ili tome slično, i dalje se detekcija može izvesti koristeći bojenje tkiva. Kao ti objekti mogu se upotrebiti sami molekuli antitela, ili se mogu upotrebiti frakcije molekula antitela F(ab')2. Fab', ili Fab. Kvantifikacija proteina ovog pronalaska ili tome slično ne treba da bude ograničena korišćenjem ovog pronalsaka. Na primer. kvantifikacija antitela, antigena ili antitelo-antigen kompleksa, koji odgovara količini antigena (na "primer. količina proteina) u test tečnosti je određena hemijski ili fizički, dobijena količina je određena standardnom krivom koja je formirana pomoću standardne tečnosti koja sadrži poznate količine antigena. Radije se koriste, na primer, nefelometrija, postupak kompeticije, postupak imunometrije i postupak sendviča. Kada se razmatra osetljivost i specifičnost prethodno pomenuti sendvič postupak je poželjan. Kao primerni agensi za obeležavanje u postupku određivanja sa obeleženom supstancom, koriste se na primer, radioaktivni izotop, enzim, fluorescentna supstanca, luminescentna supstanca i tome slično. Kao radioaktivni izotop može se koristiti, na primer [,25l],[i3'l],[3H],[KC]. Kao enzim mogu se upotrebiti stabilni ili visoko aktivni izotopi, na primer, [3-galaktozidaza, p-glukozidaza, alkilfosfataza, peroksidaza, dehidrogenaza maleične kiseline i tome slično. Kao fluorescentna supstanca može se upotrebiti. na primer, fluoreskamin, fluorescin izotiocijanat i tome slično. Kao luminescentna supstanca može se upotrebiti. na primer. luminol, derivati luminola, luciferin, lucigenin i tome slično. Štaviše. za vezivanje antitela ili antigena i agensa za obeležavanje može se upotrebiti biotin-avidin.

Nerazdavjanje antigena ih antitela može se obaviti fizičkom apsorpcijom ili hemijskim vezivanjem koje se obično koristi za nerazdvajanje proteina ili enzima. Kao nosač mogu se, na pnmer, upotrebiti nerastvorljivi polisaharidi, kao što su agaroza, dekstran i celuloza, sintetičke smole, kao što su polistiren, poliakrilamid i silikon, ili staklo. U sendvič postupku, test tečnost je reagovana sa nerazdvojivim monoklonalnim antitelom ovog pronalaska (primarna reakcija), zatim je reagovana sa drugim obeleženim monoklonalnim antitelom ovog pronalska (sekundarna reakcija), i aktivnost obeleženog agensa na nerastvorljivi nosač je određena da bi se odredila količina proteina ovog pronalaska u test tečnosti. Primarna reakcija i sekundarna reakcija mogu se promeniti. Inače se ove reakcije mogu izvesti u isto vreme ili pomeranjem polaznih vremena. Agens za obeležavanje i postupak nerazdvajanja mogu biti tretirani isto kao ove reakcije. U imuno ogledu koristeći sendvič postupak nije neophodno da antitelo koje je upotrebljeno kao antitelo za čvrstu fazu ili antitelo za obeležavanje budu istog tipa. Mešavina dva ili više tipova antitela može se upotrebiti za poboljšanje određivanja osetljivosti. U postupku određivanja proteina ovog pronalska i tome slično, koristeći sendvič metod ovog pronalska, upotrebljena monoklonalna antitela u primarnoj reakciji i u sekundarnoj reakciji poželjno imaju različite delove za koje se protein ovog pronalaska i tome slično vezuju. Naime, kao antitela upotrebljena u primarnoj reakciji i sekundarnoj reakciji, na primer, kada se antitelo upotrebljeno u sekundarnoj reakciji prepoznaje C kraj proteina ovog pronalska i tome slično, antitelo upotreblieno u primarnoj reakciji prelerntno prepoznaje deo izuzev C kraja, na pnmer. N kraj.

Monoklonalno antitelo ovog pronalaska, može se upotrebiti u sistemu za određivanje sem sendvič postupka, kao što je kompetitivni postupak, ih imunometnjsk; postupak ili nefelometnja. U postupku kompeticije. antigeni i obeleženi antigeni u test tečnosti su kompetitivno reagovani. sa antitelima i zatim sa nereagovanirn obeleženim antitelima (F) i sa obeleženim antigenima (B) vezanim za antitela. zatim su razdvojeni (B/F separacija), obeležena količina B ili F je određena i količina antigena je kavntifikovana. U reakcionom postupku, rastvorljiva antitela se koriste kao antitela. U B/F razdvajanju, na primer. upotrebljen je postupak tečne faze u kojem je upotrebljen polietilenglikol ili drugo antitelo za gornje antitelo, i postupak čvrste faze u kojem je upotrebljeno antitelo čvrste faze kao prvo antitelo, ili je rastvorljivo antitelo upotrebljeno kao prvo antitelo i antitelo čvrste faze koje je upotrebljeno kao drugo antitelo. U imunometrijskom postupku, antigeni i antigeni čvrste faze u test tečnosti su kompetitivno reagovani sa obeleženim antitelima definitivne količine i zatim su čvrsta faza i tečna faza razdvojene. Inače, antigeni u test tečnosti i obeležena antitela koja su količinski u višku su reagovana, antitela čvrste faze su dodata da vežu nereagovana obeležena antitela za čvrstu fazu i čvrsta faza i tečna faza su razdvojene. Kontinuirano, obeležena količina bilo koje od obe faze je određena i količina antigena u test tečnosti je određena. U nefelometriji količina nerastvorljivih taloga pojavila se kao rezultat reakcije antigen-antitelo u gelu ili rastvoru. Kada je količina antigena u test tečnosti mala, dobijena je i mala količina taloga, poželjno se može upotrebiti laserenfelometrija koristeći lasersko odsecanje i tome slično. -

Kada se primene ti imunološki postupci određivanja u postupku određivanja ovog pronalaska, posebni uslovi i utvrđivanje operacija nisu neophodni. Dodavanjem tehničkih ideja koje su uobičajene u oblastima, uobičajenim uslovima i operacionim postupcima u svakom postupku, može se konstruisati utvrđeni sistem proteina ovog pronalaska i tome slično. Kao detalji ovih uobičajenih tehničkih načina mogu se citirati opšte knjige, specijalizovane knjige, na primer, Kan Ine izdanje. Fiadioimuno ogled, Kodan-sha (1974), Kan Ine izdanje, Fiadicimuno ogled, nastavak, Kodansha (1979), Eiji Ishikavva i sar. izdanje, Imunoenzimometrijski ogled, Igaku Shoin (1978), Eiji lshikawa i sar. izdanje, Imunoenzimometrijski ogled, 2. izdanje, Igaku Shoin (1982), Eiji Ishikavva i sar. izdanje, Imunoenzimometrijski ogled, 3. izdanje, Igaku Shoin

(1987), Igaku Shoin (1987), Postupci u ENZIMOLOGIJI, vol. 70, Imunohemijske tehnike (deo A): ibid., vol. 73, Imunohemijske tehnike (deo B): ibid., vol. 74, Imunohemijske tehnike (deo C): ibid., vol. 84, (Imunohemijske tehnike (deo D: Odabrani imunoogledi): ibid., vol. 92, (Imunohemijske tehnike (deo E: Monoklonalna antitela i opšti postupci imunoogleda): ibid., vol. 121. (Imunohemijske tehnike (deo I: tehnologija hibridoma i monoklonalna antitela). svi su publikovani od strane Academic Press Co.. mogu se citirati. Kao što je opisano gore. koristeći antitelo ovog pronalaska, protein ovog pronalaska i tome slično može se osetljivo kvantifikovati. Štaviše, kvantifikujući koncentracije proteina ovog pronalaska i tome slično koristeći antitelo ovog pronalaska, kada je povećana koncentracija proteina ovog pronalaska i tome slično određena kod pacijenata sa infekcijomHelicobacter pylon,pacijenti su oboleli, na primer, gastritis, čir želudca, kancer želudca, valvularna bolest, dijabetes melitus, razni kanceri (kao što je kancer endometrijuma. endometriom, kancer dojke, kancer debelog creva. kancer prostate, kancer pluća, karcinom jetre, kancer slezine, karcinom mokraćne bešike, kancer bubrega, neuroblastoma, kancer bešike, maligni melanom i tome slično). Inače je mogućno da se dijagnosticira da je mogućnost daljeg morbiditeta visoka. Antitelo ovog pronalaska može se upotrebiti za detekciju proteina ovog pronalaska i tome slično u test tečnosti kao što je telesna tečnost ili tkiva. Ono se upotrebljava za formiranje kolonskog antitela koristeći prečišćavanje proteina ovog pronalaska i tome slično, detekciju proteina ovog pronalaska i tome slično u svakoj frakciji pri prečišćavanju i analizi i ponašanje proteina ovog pronalaska i tome slično u test ćelijama.

Lek koji sadrži antitelo ovog pronalaska, antitelo ovog pronalaska (neutralizujuće antitelo) koje poseduje delovanje neutralizacije aktivnosti proteina ovog pronalaska i tome slično može biti upotrebljen za tretiranje i prevenciju bolesti kao što je gastritis, čir želudca, kancer želudca. valvularna bolest, dijabetes melitus. različiti kanceri (kao što je kancer entiometnjuma, encometriom. kancer dojke, kancer debelog creva, kancer prostate, kancer pluća, karcinom jetre, kancer slezine. karcinom mokraćne bešike. kancer bubrega, neuroblastoma. kancer bešike. maligni melanom i tome slično). Humanizovano antitelo ovog pronalaska za protein ovog pronalaska i tome slično može se upotrebiti za tretiranje i sprečavanje bolestikao što je gastritis, čir želudca, kancer želudca. valvularne bolesti, dijabetes melitus, različitih kancera (kao što je kancer endometnjuma. endometnom. kancer dojke, kancer debelog creva,kancer prostate, kancer pluća, karcinom jetre, kancer slezine. karcinom mokraćne bešike, kancer bubrega, neuroblastom. kancer bešike. maligni melanom i tome slično). Humanizovano antitelo može se formirati saDozivom na postupke opisane u Nat Biotechnol. 14, 845-851 (1996). Nat Genet. 15.146-156 (1997) i PNAS. 97(2). 722-727 (2000). U onom što sledi, neutralizujuća antitela ovog pronalaska su skraćena kao antitela ovog pronalaska.

Gornji agensi za tretiranje i prevenciju koji sadrže antitelo ovog pronalaska mogu se davati oralno ili parenteralno kao tečnosti onakvi kakvi jesu ili kao medicinski preparat pogodnog doznog oblika za ljude i sisare (kao što su miš, zec, koza, prase, krava, mačka, pas, majmun i tome slično). Doziranje agensa je promenjeno prema objektu, bolesti, stanju bolesti, načinu doziranja i tome slično. Kada se agensi koriste za tretiranje ili prevenciju tumora endometrijuma doza antitela ovog pronalaska je obično 0.01-20 mg/kg težine, poželjno 0.1-10 mg/kg, još poželjnije 0.1-5 mg/kg težine oko 1-5 puta po danu. poželjno oko 1-3 puta po danu. Prigodno je da se agens daje intravenskom injekcijom. Doza u drugim oralnim ili parenteralnim davanjima takođe može biti u skladu sa gornjim doziranjem. Antitelo ovog pronalaska može se davati kao pogodni medicinski preparat. Medicinski preparat koji se koristi za davanje sadrži farmakološki dostupan nosač za gornje antitelo ili soli. razblaživač ili isparivač. Takav preparat može se obezbediti kao dozni oblik pogodan za oralno ili parenteralno davanje. Na primer, naime, kao preparat za oralno davanje dozni oblik ie čvrst ili tečan, konkretno tableta (koja sadrži tabletu obavljenu šećerom i tabletu obavijenu filmom), pilulu, granulu. prah, kapsulu (koja sadrži meku kapsulu), emulziju, suspenziju ili tome slično. Takav preparat je pripremljen poznatim postupkom i on može sadržati nosač koji se uobičajeno koristi, razblaživač ili isparivač. Na primer, kao nosač za tabletu i ekscipijent mogu se upotrebiti laktoza. škrob, sukroza. magnezijum stearat i tome slično.

Gore pomenuti brojevi listinga sekvenci pokazuju sekvence koje slede.

SEQ ID br. 1: on pokazuje sekvencu amino kiseline izvedenu odHelicobacter pylon60190 (M toksin).

SEQ ID br. 2: on pokazuje sekvencu baze DNK koja kodira protein (M toksin) ovog pronalaska izveden odHelicobacter pylori60190, koji ima sekvencu amino kiseline predstavljenu sa SEQ ID br.1.

SEQ ID br. 3: on pokazuje sekvencu prajmera (sintetički) DNK upotrebljenu u primeru 3.

SEQ ID br. 4: on pokazuje sekvencu baze prajmera (sintetički) DNK upotrebljenu u primeru 3.

Transformant.Echerichia coliM toksin/pET30EK/LIC/DH5 a dobijen u gore pomenutom primeru 3 je deponovan putem prijava br. FERM BP-8218 17. oktobra 2002 u National Institute of Advanced Industrial Scienc and Tecbnologv (IPOD). Štaviše. hibridoma klon br 4, dobijen u gore pomenutom primera 4. deponovan je kao prijava br. FERM BP-8222 kao BALB-c / P3U1/004-1G9 23. oktobra 2002 u National Institute of Advanced Industrial Scienc and Technologv (IPOD). Dalje je hibridoma klon br. 101 deponovan kao prijava br. FERM BP-8223 kao BALB-c / P3U1/101-1 C10 23. oktobra 2002 u National Institute of Advanced Industrial Scienc and Technologv (IPOD). Hibridoma klon br. 116 je deponovan kao prijava br. FERM BP-8224 kao BALB-c / P3U1/116-5 D7 23. oktobra 2002 u National Institute of Advanced Industrial Scienc and Technologv (IPOD).

PRIMERI

Ovai pronalazak će se mnogo bolje shvatiti sa pozivanjem na sledeće primere. Međutim, ovi primen su namenjeni da ilustruju pronalazak i nisu zamišljeni tako da ograniće obim ovog pronalaska. Manipulacija gena korišćenjemE. colibila je u skladu sa postupkom opisanim u Molekularnom kloniranju.

Primer 1: Postupak za prečišćavanje i ekstrakciju toksina ovog pronalaska izHelicobacter

pylori

Helicobacter pylorimože se dobiti razdvajanjem soja koji je već ustanovljen (na primer, American Tvpe Culture Collection) ili putem kultivisanja soja izdvojenog iz kliničkih test uzoraka. U ovom primeru upotrebljen je izdvojeni sojHelicobacter pylori60190. Koristeći agar medijum u koji je dodan 5% goveđi serum (proizvedenog od strane Sigma Co.) u Brain Heart Infusion agar medijum (proizveden od strane Difco Co.), ovaj izdvojeni soj je subkultivisan u 2-5 pasaža tokom 1-2 nedelje na temperaturi od 37°C i vlažnosti od 90% ili više pod mikroaerobnim uslovima (C025-10%). Pod mikroskopom je potvrđeno da ćelije nisu bile mrtve niti su bile u koloidnom obliku nego su uspešno rasle. Ćelije su prenete na Brain Heart Infusion agar medijum (proizveden od strane Difco Co.) ploču koja nije sadržala serum nego 5% 2,6-di-O-metil-(3-ciklodekstrin. Kada su kulture i uslovi rasta potvrđeni pod istim uslovima kao što je opisano gore, ćelije su prenete u kulture koje su sadržale 2,6-di-0-metil-(3-ciklodekstrin sa postupnim smanjenjima korak po korak, tj. 2%, 1% i 0.5% koncentracije.

U tečnoj kulturi Brain Heart Infusion koja sadrži 0.5% 2.6-di-O-metil-(3-ciklodekstnna ćelije su kultivisane na temperaturi od 37<J>C pod mikroaerobnim uslovima tokom oko 16 časova, uz mućkanje sa rotirajućim šejkerom na 100-120 rpm. Istaložene bakterijske ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 10000 x g tokom 20 minuta. One su suspendovane u 10 m.M Tris-HCI pH 7.7 puferu (skaraćeno označenom u daljem tekstu kao pufer A. Potpuni pH je 6.1 ili više. zato što ie pH ciljnog proteina pl 6.08) i sonifikovane. Nakon čuvanja preko noći na temperaturi od - 80°C, ćelije su sonifikovane ponovo i centrifugirane na 100000 x g tokom 60 minuta. Ekstrahovan je najviši sloj od tri izdvojena sloja.

Ekstrahovana tečnost je grubo prečišćena sa 70% rastvorom amonijum sulfata. Nastali ekstrakt je prečišćen sa jono izmenjivačkom hromatografijom sa anjon izmenjivačkom smolom ili perlama koje imaju relativno veće dijametre čestica (DEAE Sephacel of Amersham Pharmacia Biotech AB). Pufer A je upotrebljen kao pufer za uravnotežavanje, i mešavina pufera A i rastvora 0.3 M NaCI je upotrebljena kao ispirać. Koristeći pufer A i ispirač ćelije su ekstrahovane gradijentom koncentracije. Prigodna količina svake frakcije dodavana je kap po kap u bunarčiće u koje su zasejane HeLa ćelije i procenjen je vijabilitet ćelija u svakom bunarčiću. Evaluacija je obavljena koristeći WST ogled pomoću kitova za brojanje ćelija (DOJIN Labioratones). U poređenju sa kontrolom, frakcije koje su pokazivale značajno manju varijabilnost i frakcije koje su imale relativno poklapajuće poraste krivih proteina, procenjene su zajedno sa rezultatima eleKtroforeze da se upotrebe kao jednostavne frakcije za sledeći postupak prečišćavanja.

Hidrofobna hromatografija (Phenvl Sepharose CL-4B, Amersham Pharmaci Biotech AB) koja ima različit sistem razdvajanja od one koja je sledeći put odabrana. Upotrebljen je ravnotežni pufer koji je sadržao 1M amonijum sulfat u 10 mM fosfatnog pufera. Upotrebljen je pufer za ispiranje koji je sadržao 40% etilen glikola u 10 mM fosfatnog pufera. Nakon što su ćelije ekstrahovane sa gradijentom koncentracije, svaki uzorak je procenjen istim postupkom kao što je opisano gore.

Uzorci ekstrahovani gornjim postupkom ponovo su ekstrahovani putem anion izmenjivačke hromatografije sa perlicama koje su imale relativno male prečnike ćestica (RESOURCE Q od Amersham Pharmatia Biotech AB). Pufer A je upotrebljen kao ravnotežni pufer, i mešavina pufera A i rastvora soli 1M Nad je upotrebljena kao pufer za ispiranje. Koristeći hromatografiju konačno je dobijen protein sa jednom trakom sa molekulskom težinom oko 41000. Tip i redosled ovih hromatografija mogu se promeniti i mogu se dodati druge.

Nakon što je nastala signalna traka obojena sa Coomassie Bnlhant Blue, ona je prepisana na nitroceluloznu membranu ili (polivimlidon difluorid) membranu sa bloting aparatom i analizirana sa sekvencerom amino kiselina. Kao rezultat, kao što je opisano gore, sekvenca ammo kiseline N krajeva genskog lokusa HP1037 registrovane baze podataka (Helicobacter pvlori 22695) poklopila se sa 95% (19 baza u 20 baza). (Slika 1).

Primer 2: Sekvence amino kiseline i sekvence DNK postupkom tehnologije proizvodnje gena

U ovom primeru upotrebljen je izdvojeni sojHelicobacter pylori60190. Kao što je opisano gore, sve analize gena različitih sojevaHelicobacter pylori22695 već su obavljene ranije. Homologi genski lokus može se proceniti pretraživanjem baze podataka TIGR (The Institute for Genomic Research). Nađeno je da genski lokusHelicobacter pylori22695 kodira homologi protein.

Kloniranje proteina ovog pronalaska obavljeno je iz rezultata. NaimeHelicobacter pylon60190 je upotrebljen kao matrica, prvo su formirani pogodni prajmeri konvencionalnih mnogih grupa zasnovani na genskom lokusu HP1037 i genskom lokusu HP1036 uzvodno i genskom lokusu HP1038 nizvodno (na 5' mestu i 3' mestu) da se obavi sekvenciranje. Upotrebljana je DNK polimeraza koja ima dokazanu funkciju čitanja. Svaka grupa prajmera je konstituisana tako da sadrži dovoljno mutualnih delova prajmera. i izvedeno je pluralno sekvenciranje od 5' mesta i 3' mesta. Nastale DNK sekvence prikazane su u SEQ ID br. 2 listinga sekvenci. Sekvence amino kiseline prikazane su u SEQ ID br. 1.

Primer 3

Eksperiment ekspresije toksičnog proteina putem rekombinacije

U ekspresionom eksperimentu upotrebljena jeE coli.Za ekspresiju upotrebljeni su vektor pET-30EK/l_IC (produkovan od strane Novagen Co,) iE. coliBL21 (DE3). Sens prajmer bio je SEQ ID br. 3 koji ubacuje GACGACGACCAAG na 5' mestu sens lanca kodu toksičnog proteina izvedenog odHelicobacter py! ori60190 koji je kloniran u primeru 2. Antisens prajmer bio je SEQ ID br. 4 koji ubacuje GAGGAGAAGCCCGGTTA na 5' mestu. Ubačeni geni su formirani postupkom PCR-a koristeći gornje prajmere. Ubačeni geni su pripremljeni u prisustvu 25 mM dATP i 100 mM DDT sa T4 DNK polimerazom da se fituje za LIC mesto vektora i zagrejanim u prisustvu 25 mM EDTA. Formirani rekombinant je ponovo sekvenciran da se potvrdi da je bio identičan sa SEQ ID br. 1. On je dalje transformisan uE. coliBL21 (DE3) radi ekspanzije i kultivisan u LB medijumu koji je sadržao 30 ug/ml kanamicina.

Obavljeno je mućkanje kultura da se dobije 0.4 OD600 na temperaturi od 37°C pri 250 rpm. Izopropil-beta-tiogalaktozid je dodan da se dobije konačna koncentracija 1 mM, mešavina je dalje muićkana tokom 2 časa. Pošto je fuzionisani protein formirao inkluziono telo.E. colije sakupljena centrifugiranjem i inkluziono telo proteina je dobijeno sa BugBuster reagensom i Benzonase Nuclease (obe su dostupne od Novagen Co.). Protein je razdvojen postupkom elektroforeze na natrijum dodecil sulfat-poliaknlamidnom gelu (SDS-PAGE) i odgovarajuća signalna traka je potvrđena bojenjem srebrom.Proteinje ponovo upleten i upoređen sa kontrolom pomoću WST reagensa (Dojin Chemical Laboratories Ltd. Cell Counting Kit) koristeći HeLa ćelije i druge ćelije toplokrvnih životinja. Kao rezultati, značajne razlike u preživljavanju su arocenjene i nađeno je da ekspresioni protein ima podjednake karakteristike sa onim od prečišćenih proteina. Nađeno je na ekspresioni protein ima istu aktivnost u normalnim ćeliiama želudca kao i u HeLa ćelijama cervikainih kancerskih ćelija (slika 2). Takođe je nađeno da protein ima široku aktivnost ne samo u drugim humanim tkivima nego i u ćelijama sisara (slika 3. slika 4).

Primer 4.

Formiranje monoklonalnog anti-M toksičnog antitela:

Ekspresija 240 ug M toksina, koji je ponovo zavijen, je data subkutano na nekoliko pozicija BALB/C mišu. Četiri dana nakon konačne imunizacije, disekovana je slezina miša i filtrirana pod pritiskom sa čeličnim presama i suspendovana u Eagle modifikcvanom esencijalnom medijumu (MEM) da se dobije suspendovan rastvor ćelija slezine. Kao ćelije za fuziju ćelija upotrebljene su ćelije mijeloma P3-X63. Ag 8. U1 (P3U1) izvedene od BALB/C miša su upotrebljene kao ćelije za fuziju ćelija. [Savremeni trendovi u mikrobiologiji i imunologiji. 81.

1 (1978)]. Fuzija ćelija je izvedena u skladu sa originalnim postupkom [Nature, 256, 495

(1975)]. Naime, ćelije slezine i P3U1 su isprane respektivno sa MEM koji ne sadrži serum tri puta i pomešane pn 6.6:1 odnosu ćelija slezine i P3U1 brojeva. Ćelije su istaložene centrifugiranjem na 750 x g tokom 15 minuta. Ceo supernatant je uklonjen i talog je odsečen. dodano |e 0.3 ml 45% polietilen glikola (PEG) 6000 (proizveden od strane VVako Junvaku Co.) i mešavina je ostavljena da se inkubira u tanku-sa toplom vodom na 37°C tokom 7 minuta de se obavi fuzija, nakon fuzije, ćelijama je dodan MEM u ograničenoj količini i dodano je ukupno 15 ml MEM-a. Mešavina je centrifugirana na 750 x g tokom 15 minuta i supernatant je uklonjen. Talog ćelija je suspendovan u GIT medijumu (proizveden od strane VVako Junvaku Co ) (GIT-10% FCS) koji je sadržao 10% goveđeg fetalnog seruma, da se dobije PsUT od 2 x 10<3>na 1 ml, zasejano u višestruke posude sa 24-bunarčića (proizveden od strane lwaki Co.) u količini od 1 ml po bunarčiću u 168 bunarčića. Nakon zasejavanja ćelije su inkubirane u inkubatoru sa 5% ugljen diksidom na temperaturi od 37°C. Nakon 24 časa dodan je GIT-10% FCS medijum (HAT medijum) koji je sadržao HAT (hipoksantin 1 x IO'<1>M, aminopterin 4 x 10' M i timidin 1.6 x 10"<J>M) u količini od 1 ml po bunarčiću da se inicira HAT selektivna kultivacija. Nakon 4 do 7 dana, 1 ml stare tečnosti je odliveno i HAT selektivna kultivacija je produžena dodavanjem 1 ml HAT medijuma. Umnožavanje hibridoma je konstatovano nakon 9 dana od početka ćelijske fuzije i supernatant je sakupljen. Vrednost antitela u odnosu na supernatant je određena sledećim postupkom. Naime, 100 ul supernatanta kulture i 100 ul HRP-obeleženog M toksina, koji je razblažen 200 puta sa puferom C, dodati su u svaki bunarčić mikroploča sa vezanim anti-miš imunoglobulinskim antitelom i reagovani preko noći na temperaturi od 4°C. Nakon što su ploče isprane sa PBS, da se obavi vezivanje u mikropločama anti-miš imunoglobulinskih antitela, prvo je pipetiran 0.1 M karbonatni puferski rastvor, pH 9.6 koji je sadržao kozje anti-miš imunoglobulinsko antitelo (IgG frakcija, produkovna od strane DAKO Co.) 100 ug/ml u mikroploče sa 96 bunarčića u 100 ul po ploči, i ostavljeno da stoji tokom 24 časa na temperaturi od 4'C. Zatim su ploče isprane sa slanim fosfatnim puferom (PBS. ph 7.4), 25% Brock Ace (robna marka, produkovano od strane Yukjirushi Milk Products Co.) i PBS, pH 7.2 koji je sadržao 0.1% NaN3je pipetirano u svaki po 300 ul da se blokira vezivanje delova u višku u bunarčićima i tretirano najmanje 24 časa temperaturi od 4°C. U svaki bunarčić gornjih mikroploča koji vezuju anti-miš imunoglobulinsko antitelo, dodan je mišji anti-serum 100 ul, koji je razblažen sa puferom EC [0.02 M fosfatni pufer, pH 7.0 koji sadrži 0.2% BSA, 0.4 M NaCI, 0.4% Brock Ace, 0.05% CHAPS (3-[(3-choiamidopropil)dimetil-amoniio]-1 -propansulfonat), 2 mM EDTA i 0.1 NaN3]i reagovano tokom 16 časova na temperaturi od 4°C. Zatim su ploče isprane sa PBS, pH 7.4 i HRP-obeleženim ponovo uvijenim toksin proteinom, dodano je 100 ul i reagovano tokom 7 časova na sobnoj temperaturi. Gornje ponovno uvrtanje proteina toksina je pripremljeno u gornjem primeru 3 razblaživanjem 100 puta sa puferom C [0.02 M fosfatni pufer. pH 7.0 koji sadrži 1% BSA. 0.4 M NaCI i 2 mM EDTA]. Ploče su zatim isprane sa PBS. pH 7 4. TMB sistemom zamene peroksidazom za mikrobunarčiće (KIRKEGAARD and PERRY LAB , dostupnim pod strane Funakoshi Yakuhin) dodano je 100 ul i reagovano na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta da se odredi aktivnost enzima na čvrstoj fazi. Nakon što je reakcija zaustavljena dodavanjem 100 ul 1 M fosforne kiseline, određena je absorbanca na 450 nm sa čitačem ploča (MTP-120, produkovanim od strane Corona Co). U skaldu sa ovim postupcima određena je aktivnost enzima na čvrstoj fazi. Kao rezultat nađena je vrednost antitela u 18 bunarčića od odabranih 123 bunarčića i hibridomi su zamrznuti i čuvani. Hibndomi 6 bunarčića br. 4, br. 53, br 61. br 76, br 101 i br 116 su klonirani postupkom razblaživanja. U kloniranju dodane su timocite BALB/C miša kao hranljive ćelije u količini 5 x10<3>po bunarčiću. Nakon kloniranja određena je vrednost antitela supernatanta istim postupkom. Pozitivni klonovi bili su br 4, br 101 i br 116. Ovi klonovi bili su hibndomi koji produkuju antitelo na ekspresiju M toksina.

Primer 5

Određivanje klase i subklase monoklonalnih antitela:

Postupkom opisanim u primeru 4 formirane su anti-zec IgG-vezujuće mikroploče. Naime. 0.1 M karbonatnog pufera koji je sadržao koziji anti- pH 9.6 je pipetirano u mikroploče od 96 bunarčića u količini 100 uL po bunarčiću i ostavljeno na temperaturi od 4°C tokom 24 časa. Ploče su zatim isprane sa slanim fosfatnim puferom (PBS, ph 7.4). 25% Brock Ace (robna marka, produkovano od strane Yukjirushi Milk Products Co.) i PBS, pH 7.2 koji je sadržao 0.1% NaN3je pipetirano po 300 uL u svaki da se blokira višak vezivanja delova u bunarčiću i tretirano tokom najmanje 24 časa na temperaturi od 4°C. Anti-zec IgG antitelo-vezujuće mikroploče. pufer EC 50 uL i subtip specifično antitelo 100 uL koje je sadržalo izo-tip tipizirajući kit produkovan od strane Bio-Rad Laboratories dodani su da reaguju tokom jednog dana na temperaturi od 4°C. Nako što su ploče isprane sa PBS, pH 7.4 supernatant kulture hibridoma koji je opisan gore je dodan i reagovao je tokom 1 dan na temperaturi od 4°C. Ploče su isprane sa PBS. pH 7.4 i HRP-obeleženi ponovo upleteni toksin protein 100 uL, koji je pripremljen u gornjem primeru 3 razblaživanjem 100 puta sa puferom C [0.02 M fosfatni pufer. pH 7.0 koji sadrži 1% BSA, 0.4 M NaCI i 2 mM EDTA] je dodano i reagovano tokom 6 časova na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBS, pH 7.4 i aktivnost enzima na čvrstoj fazi je određena postupkom opisanim u primeru 4. Kao rezultat subklase monoklonalnog antitela proizvedene ovim hibridomima bile su br. 4 (IgGl), br. 101 (lgG2b) i br. 116 (lgG2a)

Primer 6

Postupak za proizvodnju mišje ascitne tečnosti hibridoma:

Hibridomi br. 4, br. 101 i br 116 bili su mišje ascite. Prethodno je miševima dato parenteralno 0.5 ml mineralnog ulja. Miševima (BALB/C ženke) je ovaj gornji rastvor dat parenteralno u koncentraciji 1-3 x10° ćelija/miš i ascite koje su sadržale antitelo su sakupljene nakon 6-20 dana. Monoklonalno antitelo je prečišćeno iz dobijenih ascita sa protein-A kolonom. Naime, ascite oko 25 ml su razblažene sa istom zapreminom vezujućeg pufera (3.5M NaCI, 1.5M glicin, koji je sadržao 0.05% NaN3, pH 9.0), rastvor je istaložen u rekombinantnu protein-A-agarozu (Repligen Co.) kolonu, koja je prethodno uravnotežena sa puferom za vezivanje, specifično antitelo je isprano sa puferom za ispiranje (0.1M pufer limunske kiseline, pH 3.0, koji je sadržao 0.05% NaN3). Isprana tečnost je dijalizirana sa PBS pH 7.4 na temperaturi od 4°C toko 2 dana i filtrirana radi uklanjanja bacila sa filterom od 0.22 um (produkovanog od strane Millipore Co.) i čuvano na temperaturi od -80°C.

Primer 7

Pripremanje poliklonalnog antitela M toksina

4.1 mg citotoksičnog proteina toksina M ovog pronalaska je pomešano sa Freund-ovim potpunim adjuvansom i mešavinom je subkutano imunizovan zec. Nakon jedne nedelje. ista količina M toksina je pomešana sa Freund-ovim nepotpunim adjuvansom i mešavinom je dalje subkutano imunizovan zec. Nakon imunizacije sakupljena krv je centrifugirana da se uklone hematocitne komponente i dobijen je anti-serum

Primer 8

Analiza M toksina sa VVestern blottng-om

SDS uzorak pufera Koji je sadržao 2-merkaptoetanol je dodan supernatantu dobijenom u primeru 3, mešavina je podvrgnuta elektroforezi sa peptide-PAGE (TEFCO) i električno preneta na PVDF membranu (Amersham). Svako antitelo (2 ug/ml) dobijeno u primeru 4 i primeru 6 je upotrebljeno kao primarno antitelo. HRP (peroksidaza rena) -obeležno-anti-zec i anti-miš IgG antitela (razblaženje 2000 puta; Dako) su upotrebljeni kao sekundarna antitela. Bojenje je izvedeno sa ECL VVestern Blot Detection Svstem (Amersham). rezultat je bio da je potvrđeno da je svako primarno antitelo prepoznalo ekspresioni protein. (Slika 5).

Primer 9

Aktivni ugalj (0.2-0.1 mm u prečniku), CM celuloza i kalcijum alginat. svaki u po 0.5 ml, napunjeni su u tri kolone. Nakon uravnotežavanja sa Tris puferom 10 mM, pH 7.7, 0.5 ml M toksina 400 nM koji imaju aktivnost ponovnog uplitanja dodati su svakoj koloni i ove kolone su blokirane i ostavljene da stoje 60 minuta na temperaturi od 25°C. U međuvremenu, sam tris pufer i tris pufer koji je sadržao isti M toksin su ostavljeni da stoje pod istim uslovima. Sve kolone su zatim otvorene, svakih 100 ul koji su kapali iz kolona su razdvojeni, dalje je svakih 0 5 ml Tris-pufera dodato svakoj koloni i svakih 100 ul je sakupljeno. Celokupna krv normalnih odraslih osoba je centrifugirana 2-3 puta na 800 x g tokom 10 minuta sve dok supernatant nije postao proziran. 10 ul istaloženih eritrocita je dodano u 990 ul 10 mM Tris pufera koji je upotrebljen kao pozitivna kontrola. Na sličan način je 10 ul istaloženih eritrocita dodano u 0.9% soli 10 mM Tris pufera i upotrebljeno kao negativna kontrola. Uzorci su sakupljeni iz gornjih kolona. 1 zapremina eritrocita na 100 zapremine uzorka dodano je uzorcima. Kontrole i uzorci su upoređeni relativnim koncentracijama ispranog hemoglobina sa višestrukim čitačem ploča (Biorad) putem meranja kao apsorbanca od 415 nm. (Slika 6).

Primer 10

Odnosi u kojima su HeLa ćelija (ćelije humanog kancera cerviksa uterusa) izložene frakcijama iz svake kolone iz primera 9 i vijabilitet određeni su postupkom VVST koristeći so tetrazolijum. HeLa ćelije su kultivisane na pločama sa 96 bunarčića tokom 24 časa u proporciji 10000 ćelija po bunarčiću. Negativna kontrola same tečnosti kulture, tečnosti svakog uzorka i pozitivna kontrola od 20 nM proteina toksina respektivno su dodani svakom bunarčiću i oni su kultivisani tokom 12 časova na temperaturi od 37°C. Koristeći kit za brojanje ćelija (DOJIN LABORATORIES Ltd Co.) odnosi vijabilnosti ćelija detektovani sa VVST postupkom su mereni kao apsorbanca na talasnoj dužini od 415 nm. (Slika 7, slika 8).

Industrijskaprimenjivost

Protein i delimični peptid ovog pronalaska i tome slično mogu se upotrebiti, na primer, za tretiranje agensa kancera. Antitelo ovog pronalaska može se upotrebiti da se identifikuje protein ovog pronalska u krvi, tkivu, urinu i izlučevinama sakupljenih od test pacijenata i da se potvrdi infekcija saHelicobacter pylori.On se dalje koristi za kvantifikaciju proteina ovog pronalaska. Protein ovog pronalaska može se upotrebiti kao skrining agens jedinjenja koja povećavaju ili inhibiraju aktivnosti proteina ovog pronalaska.

Claims (18)

1. Citotoksični protein, naznačen time što sadrži protein kop ima najmanje 70% ili više identičnosti sa sekvencom amino kiseline predstavljene sa SEQ ID br. 1

2. Delimični peptid citotoksičnog proteina prema zahtevu 1, naznačen time što protein ima istu citotoksičnu aktivnost kao onaj sa sekvencom ammo kiseline predstavljene sa SEQ ID br. 1.

3 Citotoksični protein prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je protien proizveden odHelicobacter pylori.

4Citotoksični protein prema zahtevu 1 ili zahevu 2. naznačen time što je protein dobijenKultivisanjem transformanta koji je transformisan sa rekombinantnin vektorom koji sadrži DNK od SEQ ID br. 2. koji kodira citotoksični protein prema zahtevu 1 ili 2.

5. Citotoksični protein prema zahtevu 4, naznačen time što je transformant deponovan sa prijavom br. FERM ESP-8218 u National Institute of Advanced Industrial Scienc and Technologv (IPOD).

6. Antitumorski agens, naznačen time što sadrži citotoksični protein prema zahtevu 1 ili 2

7. Monoklonalno antitelo specifično protiv citotoksičnog proteina, naznačeno time što je dobijeno imunizacijom sa citotoksičnim proteinom iz zahteva 1 ili 2 protiv sisara.

8. Monoklonalno antitelo prema zahtevu 7, naznačeno time što je produkovano sa hibridoma klonom prijava br. FERM BP-8222.

9. Monoklonalno antitelo prema zahtevu 7, naznačeno time što je produkovano sa hibridoma klonom prijava br. FERM BP-8223.

10. Monoklonalno antitelo prema zahtevu 7, naznačeno time što je produkovano sa hibridoma klonom prijava br. FERM BP-8224.

11. Poliklonalno antitelo specifično protiv citotoksičnog proteina, naznačeno time što je dobijeno imunizacijom sa citotoksičnim proteinom iz zahteva 1 ili 2 protiv sisara.

12. Postupak za detektovanje i dijagnostifikovanje citotoksičnog proteina prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je upotrebljeno monoklonalno antitelo ili poliklonalno antitelo opisano u bilo kom od zahteva 7-11.

13. Agens za prevenciju i tretiranje kancera želudca, gastritisa, čira želudca koji su izazvani sa citotoksičnim proteinom prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je upotrebljeno monoklonalno antitelo ili poliklonalno antitelo opisano u bilo kom od zahteva 7-11.

14. Postupak za skrining jedinjenja koje promoviše inhibitornu aktivnost proteina prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je inhibitorna aktivnost umnožavanja ćelija, citotoksična aktivnost ili smrt ćelija procenjena poređenjem između negativnih ili pozitivnih kontrolnih grupa sa ćelijama toplokrvnih životinja.

15. Kit za skrining jedinjenja ili njegove soli koje podstiče ili inhibira aktivnost proteina prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time što sadrži protein iz zahteva 1 ili 2.

16. Jedinjenje ili njegova so koje podstiče ili inhibira aktivnost proteina prema zahtevu 1 ih 2. naznačeno time što je jedinjenje dobijeno skrining postupkom prema zahtevu 14 ih sa kitom za skrining prema zahtevu 15.

17 Medikament koji sadrži jedinjenje ;h njegovu so, naznačen ume što jedinjenje ima inhibitornu citotoksičnu aktivnost ćelija toplokrvnih životinja sa proteinom iz zahteva 1 ih 2.

18. Medikament prema zahtevu 17. naznačen time što je agens za sprečavanje ili tretman gastritisa, čira želudca, raka želudca i bolesti koje postupkom skrininga prema zahtevu 14, ili sa kitom za skrining prema zahtevu 15, pokazuju da su uzrokovane sa M toksinom.