RS49895B - Postupak za dobijanje selektovanog organskog proizvoda - Google Patents

Abstract

1. Postupak za dobijanje selektovanog organskog proizvoda, naznačen time, što pomenuti postupak obuhvata: a) dobijanje mikro organizama sa crabtree-negativnim fenotipom; b) kultivisanje crabtree-negativnog mikroorganizama u prvom medijumu za kultivisanje sa izvorom ugljenika pri prvom skupu uslova za kultivisanje koji potpomažu ćelijsko disanje; i c) kultivisanje crabtree-negativnog mikro organizama u medijumu za kultivisanje sa izvorom ugljenika pri drugom skupu uslova za kultivisanje koji potpomažu proizvodnju selektovanog organskog proizvoda, i gde nije proizvedeno više od 0.3 grama biomase po gramu izvora ugljenika konzumiranom pri drugom skupu uslova za kultivisanje.

Description

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi na postupke materijale koji se koriste za sintezu organskih proizvoda.

STANJE TEHNIKE

Organski proizvodi kao što je mlečna kiselina imaju različite industrijske primene. Na primer, organske kiseline mogu se upotrebljavati za sintezu plastičnih materijala kao i drugih proizvoda. Da bi se zadovoljile sve veće potrebe za organskim proizvodima, razvijaju se efikasniji i isplatljiviji postupci za njihovu proizvodnju. Jedan takav metod uključuje upotrebu bakterija. Naročito, određene bakterije mogu proizvoditi velike količine određenog organskog proizvoda pod određenim uslovima fermentacije. Međutim, upotreba živih bakterija kao fabrika je limitirana nemogućnošću bakterija da rastu u medijumu za rast u kome se akumuliraju organski proizvodi. Da bi se prevazišla ova ogarničenja, razvijene su različite tehnike za prečišćavanje tokom sinteze proizvoda. Dodatno, pokušalo se sa upotrebom drugačijih mikroorganizama od bakterija. U stvari,Sacharomyces cerevisae,za koju se zna da je tolerantna na kiseline, genetički je modifikovana u cilju proizvodnje mlečne kiseline. Naročito, ćelijeS. cerevisaemodifikovane tako što je ćelijama obezbeđena cDNK laktat dehidrogenaze govečeta (bovine lactate dehvdrogenase) i izmenjeni geni za endogenu piruvat dekarboksilazu (PDC1, PDC5 i PDC6). Dok su ove modifikovane ćelijeS. cerevisaeproizvodile nešto mlečne kiseline, ćelijski rast je bio suprimiran što je dovelo do zaključka da su poboljšanja neophodna i za ćelijski rast i za proizvodnju mlečne kiseline.

SUŠTINA PRONALASKA

Ovaj pronalazak generalno se odnosi na postupke i materijale za sintezu organskih proizvoda. Naročito, pronalazak obezbeđuje ćelije kvasca, metode za kultivisanje ćelija kvasca, metode za pravljenje ćelija kvasca, konstrukte nukleinskih kiselina i postupke i materijalie za proizvodnju različitih organskih proizvoda. Pronalazak se bazira na otkriću da određeni mikroorganizmi (na primer bakterijski i gljivični mikroorganizmi) mogu biti genetski manipulisani tako da poseduju sposobnost da pod određenim uslovima u kulturi, rastu, koriste različite izvore ugljenika za rast kao i proizvodnju proizvoda, i proizvodnju željenih organskih proizvoda za komercijalne potrebe. Na primer, ćelije kvasca koje su ovde obezbeđene mogu da rastu i proizvode organski proizvod kada se kultivišu na niskoj pH i visokoj temperaturi. Posedovanje sposobnost brzog rasta i efikasne proizvodnje organskog proizvoda pod na primer, uslovima niske pH i visoke temperature ima naročitu prednost. Pogotovo sposobnost mikroorganizama da tolerišu niske pH omogućava izbegavanje održavanja konstantne pH okruženja, što može biti jako teško ili skupo tokom procesa proizvodnje na veliko. Dodatno, postupci i materijali neophodni za izdvajanje željenog organskog proizvoda iz smeše (broth) niske pH mogu biti mnogo praktičniji i efikasniji nego oni koji su potrebni za izdvajanje istog organskog proizvoda iz smeše koja ima neutralnu pH. Na primer, određeni proizvodi organskih kiselina mogu precipitirati iz rastvora kako pH rastvora opada ispod vređnosti pKa proizvoda, i tako se omogućava da izdvajanje proizvoda bude veoma jednostavno. Dalje, sposobnost mikroorganizama da tolerišu visoke temperature omogućava da se izbegne potreba za održavanjem niskih temperatura tokom rasta i faza proizvodnje. Jasno je da smanjujući potrebu za snižavanjem temperature u velikim (zapreminski) rezervoarima sa smešom (broth) tokom procesa proizvodnje na veliko, sveukupni proces proizvodnje biva efikasniji i jeftiniji. Dodatno, sposobnost mikroorganizama da tolerišu i niske pH i visoke temperature obezbeđuje pogodan postupak za sprečavanje kontaminacije drugim manje tolerantnim mikroorganzimima tokom procesa proizvodnje na veliko.

Važno je da se naglasi da kritičan aspekt koji se odnosi na sposobnost proizvodnje željenog organskog proizvoda za komercijalnu upotrebu može biti specifična produktivnost tokom koje se željeni organski proizvod proizvodi. Na primer, obezbeđujući visoko specifičnu produktivnost korišćenjem postupaka i materijala koji su ovde opisani može da dopusti mikroorganizmu da stvara energiju neophodnu za održavanje ćelija kada se izlože uslovima koji vladaju u kulturi kao što su niska pH i visoka temperatura. Ova potrebna energija može biti proizvedena pre preko puteva fermentacije pod anaerobnim uslovima, nego preko respiratornih puteva. Dobijanje energije preko puteva fermentacije ima naročitu prednost za proizvodnju proizvoda koji ne zahtevaju respiratorni put jer u suštini sav izvor ugljenika može da se koristi za proizvodnju željenog organskog proizvoda.

Ovaj pronalazak se takođe bazira na otkriću da korišćenje izvora ugljenika od strane određenih genetski manipulisanih mikroorganizma može biti kontrolisano i usmereno uglavnom ka proizvodnji ili biomase ili željenog organskog proizvoda. Uopšteno, pronalazak obuhvata dva tipa procesa kultivisanja. Jedan proces kultivisanja uključuje kultivisanje mikroorganizama pod određenim specifičnim uslovima u kulturi koji potpomažu proizvodnju biomase, dok drugi uključuje drugu različitu grupu uslova, što zavisi od vrste mikroorganizma kao i od željenog krajnjeg rezultata, koji potpomažu proizvodnju željenog organskog proizvoda. Jasno je da posedovanje sposobnosti manipulacije korišćenja različitih izvora ugljenika tokom procesa proizvodnje na veliko omogućava proizvođaču veću fleksibilnost i kontrolu nego što je do sada bilo moguće.

Dodatno, pronalazak se bazira na otkriću da određeni mikroorganizami mogu biti genetički manipulisani tako da većina, ako ne i sav, izvor ugljenika se koristi za proizvodnju ili biomase ili željenog organskog proizvoda. Naročito, pronalazak obezbeđuje ćelije kvasca koje su modifikovane tako da su inaktivirani putevi biosinteze koji skreću upotrebu izvora ugljenika od proizvodnje biomase ili željenog organskog proizvoda. Inaktivirajući ovakve biosintetske puteve obezbeđuju se mikroorganizmi koji mogu efikasno da rastu i proizvode željeni organski proizvod.

Uopšteno, pronalazak opisuje ćelije kvasca koje sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline, sa egzogenim molekulom nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima enzimatsku aktivnost u ćeliji. Nukleinska kiselina može biti ubačena u genom ćelije. Enzimatska aktivnost dovodi do stvaranja organskog proizvoda koji u određenim ostvarenjima se sekretuje iz ćelije. Ćelija dalje ima "crabtree" negativni fenotip i proizvodi organski proizvod. Ćelija može da bude na primer, iz rodaKluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, TrichosporoniliYamadazyma.Organski proizvod može biti na primer, fermentacioni proizvod, organska kiselina ili karboksilat kao laktat. U jednom ostvarenju polipeptid može imati laktat dehidrogenaznu aktivnost. Na primer, egzogena nukleinska kiselina može da kodira bakterijsku dehidrogenazu ili gljivičnu laktat dehidrogenazu kaoK. alctisgljivična laktat dehidrogenaza.

U drugom ostvarenju ćelija sadrži četiri molekula nukleinske kiseline koji kodiraju različite polipeptide. Na primer, prvi od četiri egzogena molekula nukleinskih kiselina može da kodira prvi polipeptid koji ima laktat dehidrogenaznu aktivnost, drugi može da kodira drugi polipeptid koji ima CoA-transferaznu aktivnost, treći može da kodira treći polipeptid koji ima laktil-CoA-transferaznu aktivnost i četvrti može da kodira četvrti polipeptid koji ima akrilil-CoA- hidrataznu aktivnost. Ovakva ćelija može da proizvede akrilat kao karboksilatni proizvod. Alternativno prvi od četiri egzogena molekula nukleinskih kiselina može da kodira prvi polipeptid koji ima 2-dehiđro-3-đeoksi-D-pentanoat aldolaznu aktivnost, drugi može da kodira drugi polipeptid koji ima ksilonat dehidrataznu aktivnost, treći može da kodira treći polipeptid koji ima ksilonolaktonaznu aktivnost i četvrti može da kodira četvrti polipeptid koji ima D-ksiloza dehidrogenaznu aktivnost. Ovakva ćelija može da proizvede karbohidrat kao D-ksilozu, kao organski proizvod.

U još jednom ostvarenju, ćelija sadrži šest molekula nukleinske kiseline koji kodiraju različite polipeptide. Na primer, prvi od šest egzogenih molekula nukleinskih kiselina može da kodira prvi polipeptid koji ima 2,5-dioksovalerat dehidrogenaznu aktivnost, drugi može da kodira drugi polipeptid koji ima 5-dehidro-4-deoksi-D-glukarat dehidrogenaznu aktivnost, treći može da kodira treći polipeptid koji ima glukarat dehidrogenaznu aktivnost, četvrti može da kodira četvrti polipeptid koji ima aldehid dehidrogenaznu aktivnost, peti može da kodira peti polipeptid koji ima glukuronolakton reduktaznu aktivnost i šesti može da kodira šesti polipeptid koji ima L-gulonolakton oksidaznu aktivnost. Ovakva ćelija može da proizvede vitamin, na primer L-askorbat, kao organski proizvod.

Organski proizvod može da sadrži više od tri atoma ugljenika, i može da bude na primer, amino kiselina.

U drugom ostvarenju, ćelija je sposobna da kataboliše pentozni ugljenik kao što su riboza, arabinoza, ksiloza i liksoza.

U drugom ostvarenju ćelija ima redukovanu piruvat dekarboksilaznu aktivnost ili redukovanu alkoholnu dehidrogenaznu aktivnost. Na primer, ćelija može da ne poseduje kompletnu piruvat dekarboksilaznu aktivnost. Redukovana piruvat dekarboksilazna aktivnost može biti posledica prekinutog genskog lokusa, gde lokus normalno poseduje nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira piruvat dekarboksilazu. Alternativno ćelija može da sadrži antisens molekul, kao ribozim, koji odgovara endogenoj nukleinsko kiselinskoj sekvenci, gde antisens molekul redukuje piruvat dekarboksilaznu aktivnost. Ćelija može takođe da sadrži dodatan molekul nukleinske kiseline koji funkcioniše kao plazmid ubica.

U drugom ostvarenju enzimska aktivnost polipeptida koji kodira egzogena nukleinska kiselina dovodi do formiranja organskog proizvoda upotrebom NADH.

U drugom ostvarenju, ćelija proizvodi makar 60 grama organskog proizvoda na svakih 100 grama glukoze koja se konzumira kada se ćelija kultiviše pod optimalnim uslovima za proizvodnju organskog proizvoda.

U drugom aspektu pronalazak opisuje ćeliju, na primer ćeliju kvasca, koja sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline, gde egzogeni molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid koji potpomaže katabolizam pentoznog ugljenika od strane ćelije. Polipeptid može biti na primer, ksilozo reduktaza, ksilitol dehidrogenaza ili ksiluokinaza, i pentozni ugljenik može biti na primer riboza, arabinoza, ksiloza i liksoza. Ćelija može dalje da kataboliše heksozni ugljenik i može ako treba istovremeno kataboliše heksozni ugljenik i pentozni ugljenik. Heksozni ugljenik može biti, na primer, aloza, altroza, glukoza, manoza, guloza, iodoza, fruktoza, galaktoza i taloza.

Sa drugog aspekta, pronalazak opisuje ćeliju kvasca koja koja sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline, gde egzogeni molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid koji potpomaže akumulaciju acetil-CoA u citoplazmi ćelije. Polipeptid može biti polipeptid koji poseduje citrat liaznu aktivnost, ili može biti mitohondrijalni membranski polipeptid koji potpomaže permeabilnost mitohondrijalne membrane za acetil-CoA. Ćelija može da ima redukovanu piruvat dekarboksilaznu aktivnost ili redukovanu alkohol dehidrogenaznu aktivnost. Alternativno, ćelije kvasca mogu da ne poseduju etanolnu proizvodnju i mogu da imaju viši nivo rasta pod uslovima kultivisanja kada nema etanola i acetata u odnosu na nivo rasta koji se može zapaziti kod ćelija kvasca sa kojima se poredi, koje nemaju proizvodnju etanola.

U još jednom aspektu pronalazak opisuje ćeliju kvasca koja ima redukovanu aktivnost mitohondrijalnog polipeptida, gde ćelija ima crabtree negativni fenotip. Ovakva ćelija može biti iz rodaKlnyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, TrichosporoniliYamadazyma.Ćeliji može kompletno da nedostaje aktivnost. Ćelija može da sadrži izmenjen lokus, gde lokus normalno uključuje nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira mitohondrijalni polipeptid. Mitohondrijalni polipeptid može da bude enzim iz Krebsovog ciklusa. Dalje, ćelija može da akumulira proizvod iz Krebsovog ciklusa. Ćelija može da uključi egzogeni molekul nukleinske kiseline, gde egzogeni molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid koji ima enzimsku aktivnost u ćeliji, i ta enzimska aktivnost dovodi do stvaranja organskog proizvoda, tako da ćelija proizvodi organski proizvod. Organski proizvod može biti na primer, citrat, a-keto glutarat, sukcinat, fumarat, malat i oksaloacetat. Polipeptid može biti polipeptid koji učestvuje u katabolizmu laktata ili acetata.

U dodatnom aspektu pronalazak opisuje postupak za proizvodnju organskog proizvoda. Postupak uključuje dobijanje ćelija kvasca, gde ćelije uključuju egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji poseduje enzimatsku aktivnost u ćeliji, gde enzimska aktivnost dovodi do stvaranja organskog proizvoda i gde ćelije imaju crabtree negativni fenotip i kultivisanje ćelija u medijumu za kulturu koji omogućavaju proizvodnju produkta. Ćelije kvasca mogu biti iz rodaKluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, TrichosporoniliYamadazyma.Organski produkt može biti fermentacioni proizvod, proizvod izveden od piruvata, organski proizvod koji sadrži više od tri atoma ugljenika, karboksilat, karbohidrat, amino kiselina, vitamin ili lipidni proizvod. Dalje organski proizvod može biti laktat, glicerol, akrilat, ksiloza, askorbat, citrat, izocitrat, a-keto glutarat, sukcinil-CoA, sukcinat, fumarat, malat i oksaloacetat. U nekim ostvarenjima, organski proizvod se sekretuje od strane ćelija. Postupak može da rezultira u ćelijama koje imaju redukovanu piruvat dekarboksilatnu aktivnost ili redukovanu alkoholno dehidrogenaznu aktivnost. Enzimatska aktivnost može da dovede do formiranja organskog proizvoda upotrebom NADH.

Ćelije koje se proizvedu ovim postupkom mogu da proizvedu makar 60 grama organskog proizvoda na svakih 100 grama glukoze koja se konzumira kada je korak kultivisanja ćelija optimalan za proizvodnju organskog proizvoda. Medijum za kultivisanje, koji može biti tečan, može da uključi inhibitor ćelijskog disanja, kao što je antimicin A, cijanid ili azid. Korak kultivisanja može da uključi rast ćelija u anaerobnim uslovima za kojim sledi kontakt pomenutih ćelija sa inhibitorom ćelijskog disanja.

U alternativnom ostvarenju, korak kultivisanja uključuje inkubiranje ćelija u anaerobnim uslovima. U daljem alternativnom ostvarenju korak kultivisanja uključuje rast ćelija u aerobnim uslovima za kojim sledi inkubiranje ćelija u anaerobnim uslovima. Korak kultivisanja može takođe da uključi kultivisanje ćelija na temperaturama iznad oko 35°C.

U jednom ostvarenju, medijum za kultivisanje ima organsku pH vrednost koja je manja od oko 3.0, i/ili inorgansku pH vrednost manju od otprilike 3.0. U drugom ostvarenju medijum sadrži pentozni ugljenik kao što je riboza, arabinoza, ksiloza ili liksoza. Medijum takođe može da sadrži hidrolizat kukuruznih vlakana koji ima na primer pH vrednost između oko 2.0 i oko 6.5.

U drugom aspektu, pronalazak opisuje postupak za proizvodnju organskog proizvoda, postupak obuhvata a) dobijanje ćelija kvasca koje sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipepid koji potpomaže katabolizam pentoznog ugljenika od strane ćelije, gde ćelija sadrži enzimsku aktivnost koja dovodi do formiranja pomenutog organskog proizvoda i b) kultivisanje ćelija u medijumu za kultivisanje koji omogućava de se organski proizvod proizvede.

U još drugom aspektu, pronalazak opisuje postupak za proizvodnju organskog proizvoda, postupak obuhvata a) dobijanje ćelija kvasca gde ćelije sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipepid koji potpomaže akumulaciji acetil-CoA u citoplazmi ćelije i gde ćelije sadrže enzimsku aktivnost koja dovodi do formiranja organskog proizvoda i b) kultivisanje ćelija u medijumum za kultivisanje koji omogućava de se organski proizvod proizvede.

U drugom aspektu, pronalazak opisuje postupak za proizvodnju organskog proizvoda, postupak obuhvata a) dobijanje ćelija kvasca koje imaju redukovanu aktivnost mitohondrijalnog enzima, gde redukcija aktivnosti dovodi do akumulacije organskog proizvoda i b) kultivisanje pomenutih ćelija u medijumu za kultivisanje koji omogućava de se pomenuti organski proizvod proizvede.

U drugom aspektu, pronalazak opisuje postupak kultivisanja ćelija kvasca koje imaju crabtree negativni fenotip, metod uključuje kultivisanje ćelija u medijumu za kultivisanje, gde medijum ima organsku pH vrednost koja je manja od oko 3.0, i/ili inorgansku pH vrednost manju od otprilike 3.0. Korak kultivisanja može takođe da uključi kultivisanje ćelija na temperaturama iznad oko 35°C. Medijum za kultivisanje može da uključi inhibitor ćelijskog disanja. Medijum za kultivisanje može takođe da uključi i pentozni ugljenik. U drugom ostvarenju medijum za kultivisanje može da uključi i hidrolizat kulairuznih vlakana.

U drugom aspektu pronalazak opisuje postupak za kultivisanje ćelija kvasca koje imaju crabtree negativni fenotip, postupak koji uključuje kultivisanje ćelija u medijumu za kultivisanje, gde medijumu za kultivisanje uključuje hidrolizat kukuruznih vlakana.

U drugom aspektu pronalazak opisuje postupak za kultivisanje ćelija kvasca koje imaju crabtree negativni fenotip, postupak koji uključuje kultivisanje ćelija u medijumu za kultivisanje na temperaturama većim od oko 35°C, gde medijum za kultivisanje ima inorgansku pH vrednost manju od otprilike 3.0.

U drugom aspektu pronalazak opisuje postupak za kultivisanje ćelija kvasca koje imaju crabtree negativni fenotip, postupak koji uključuje kultivisanje ćelija u medijumu za kultivisanje na temperaturama većim od oko 35°C, gde medijum za kultivisanje ima pentozni ugljenik.

U drugom aspektu pronalazak opisuje postupak za kultivisanje ćelija kvasca koje imaju crabtree negativni fenotip, postupak koji uključuje kultivisanje ćelija u medijumu za kultivisanje na temperaturama većim od oko 35°C, gde medijum za kultivisanje ima hidrolizat kukuruznih vlakana.

U drugom aspektu pronalazak opisuje nukleinsko kiselinski konstrukt koji uključuje rekombinantnu sekvencu i selektovanu sekvencu, gde rekombinantna sekvenca odgovara genomskoj sekvenci ćelije koja ima crabtree negativni fenotip, gde genomska sekvenca kodira enzim koji eksprimira ćelija, i selektovana sekvenca kodira enzim koji dovodi do formiranja organskog proizvoda u ćeliji. Selektovana sekvenca može biti u okviru rekombinovane sekvence tako da je selektovana sekvenca ograničena na svakom kraju sa rekombinantnom sekvencom.

U drugom aspektu, pronalazak opisuje postupak za pravljenje rekombinantne ćelije kvasca, uključujući dobijanje ćelije kvasca koja poseduje crabtree negativni fenotip, selekđonisanje krajnjeg proizvoda, identifikovanje koji egzogeni enzim ili enzimi treba da se dodaju ćeliji da bi se proizveo krajnji proizvod, identifikovanje koji egzogeni enzim ili enzimi čija aktivnost treba da se redukuje u pomenutoj ćeliji da bi se proizveo pomenuti krajnji proizvod, dodavanje jednog identifikovanog egzogenog enzima ili enzima obezbeđenoj ćeliji kvasca, i redukovanje aktivnosti jednog egzogenog enzima ili enzima u obezbeđenoj ćeliji kvasca tako da ćelija proizvodi krajnji proizvod u uslovima kulture.

U drugom aspektu, pronalazak opisuje hidrolizat kukuruznih vlakana, hidrolizat koji ima pH vrednosti između oko 2.0 i/ili oko 6.5. Hidrolizat uključuje glukozu, ksilozu i arabinozu. Hidrolizat može da uključi oko 40 grama/l glukoze, oko 40 grama/l ksiloze i/ili 20 grama/l arabinoze. Alternativno hidrolizat može da uključi oko 38.7 grama/l glukoze, oko 39.a grama/1 ksiloze i oko 20.7 grama/l arabinoze i oko 1.6 grama/l furfurala.

U drugom aspektu, pronalazak opisuje proizvodnju organskog proizvoda uključujući a) kultivisanje miltfoorganizma u uslovima za kulture, gde mikroorganizam ima redukovanu enzimatsku aktivnost; enzimatska aktivnost može biti piruvat đekarboksilazna, alkohol dehidrogenazna, aldehid dehidrogenazna ili acetil-CoA sintetazna aktivnost; mikroorganizam pokazuje nivo rasta u odsustvu etanola i acetata koji je najmanje 30 % od zapaženog rasta odgovarajućeg mikroorganizma koji nema pomenutu redukovanu enzimatsku aktivnost, i b) promenu uslova u kulturi da bi se potpomogla proizvodnja organskog proizvoda.

U drugom aspektu pronalazak opisuje postupak za proizvodnju organskog proizvoda, uključujući a) kultivisanje mikroorganizma u uslovima za kulture koji potpomažu ćelijskom disanju, gde mikroorganizam ima redukovanu enzimatsku aktivnost; enzimatska aktivnost može biti piruvat dekarboksilaza, alkoholna dehidrogenazna ili aldehidna dehidrogenaza ili acetil CoA sintetazna aktivnost, sa mikroorganizmom koji pokazuje nivo rasta u odsustvu etanola i acetata koji je najmanje 30 % od zapaženog rasta odgovarajućeg mikroorganizma koji nema pomenutu redukovanu enzimatsku aktivnost, i b) promenu uslova u kulturi da bi se redukovalo ćelijsko disanje i tako potpomogla proizvodnja organskog proizvoda.

Ako se drugačije ne definiše, svi ovde upotrebljeni naučni i tehnički izrazi imaju isto značenje kao i opše razumljivi termini koji su poznati prosečnom stručnjaku iz ove oblasti tehnike, na koju se ovaj pronalazak i odnosi. Iako se postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su opisani ovde mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog pronalaska, odgovarajući postupci i materijali su opisani u daljem tekstu. Sve publikacije, primene patenta, patenti i druge reference ovde pomenute su objedinjene u potpunosti referencom. U slučaju sukoba, ova specifikacija, uključujući definicije, će biti odlučujuća. Dodatno, materijali postupci i primeri su samo ilustrativni i nemaju nameru da budu limitirajući.

Ostale osobine i prednosti pronalaska biće očigledne iz detaljnog opisa koji sledi, i iz patentnih zahteva.

OPIS CRTEŽA

Slika 1 je dijagram koji prikazuje pHES plazmid.

Slika 2 je dijagram koji prikazuje pSEH plazmid.

Slika 3 je dijagram koji prikazuje nastanak pCRII plazmida koji sadrže ili Lh-Idh ili Pa-Idh.

Slika 4 je dijagram koji prikazuje Idh/pCRII plazmide.

Slika 5 je dijagram koji prikazuje nastanak pHES plazmida koji sadrže Lh-Idh ili Pa-Idh.

Slika 6a je dijagram koji prikazuje nastanak piruvat dekarboksilaznog (PDC) 'knockout' fragmenta. Slika 6b je dijagram koji prikazuje 5.5kbp fragment koji okružujeK. marksianus1.7kbp PDC1.

Slika 6c je dijagram koji prikazuje deleciju 400bp od 5.5kbp PDC homologog regiona i inserciju gena za rezistenciju na kanamicin.

Slika 6d je dijagram koji prikazuje region od 4kb koji sadrži gen za rezistenciju na kanamicin i 2.3kbp PDC1 koji ga okružuje.

Slika 6e je dijagram koji prikazuje 7.5kbpK. thermotoleransPDC1 i region oko njega.

Slika 6f je dijagram koji prikazuje deleciju od 750bp iz 1.7kbp PDC1 gena i inserciju gena za rezistenciju na kanamicin.

Slika 7 je grafčka šema rasta (optička gustina-OD) naspram vremena (sati) zaKluyveromyces marksianuskultivisan na niskoj pH (pH 2.5) i visokoj temperaturi (40°C).

Slika 8 je grafčka šema rasta (OD) naspram vremena (sati) zaK marksianuskultivisan u glukozi, ksilozi ili arabinozi na 30°C.

Slika 9 je grafčka šema rasta (OD) naspram vremena (sati) zaK. marksianuskultivisan u hidrolizatu kukuruznih vlakana na 30°C.

Slika 10 je grafčka šema rasta (OD) naspram vremena (sati) zaK. marksianuskultivisan na 30°C i označenoj pH.

Slika 11 je grafčka šema rasta (OD) naspram vremena (sati) zaK. marksianuskultivisan na 30°C i označenoj pH u prisustvu 40 grama mlečne kiseline.

Slika 12 prikazuje tri grafčke šeme (A) proizvodnje biomase; (B) konzumiranja glukoze; i (C) proizvodnje etanola kodS. itvarumiK marksianuskada su kultivisani u mineralnom medijumu sa 2% glukozom u aerobnim ulsovima.

Slika 13 prikazuje tri grafčke šeme (A) proizvodnje biomase; (B) konzumiranja glukoze; i (C) proizvodnje etanola kodS. uvarumiJC marksianuskada su kultivisani u mineralnom medijumu sa 2% glukozom u anaerobnim ulsovima.

Slika 14 je plazmidna mapa PDC1 promotornog vektora.

DETALJNI OPIS

Pronalazak obezbeđuje postupke i materijale za proizvodnju organskih proizvoda. Posebno pronalazak obezbeđuje ćelije kvasca, postupke za njihovo kultivisanje, postupke za pravljenje ćelija kvasca, konstrukte nukleinskih kiselina i postupke i materijale za proizvodnju različitih organskih proizvoda.

Ćelije kvasca koje su ovde obezbeđene mogu se kloristiti za proizvodnju organskih proizvoda. Ovakvi organski proizvodi mogu imati široku primenu. Na primer, organski proizvodi koje su proizvele ovde opisane ćelije kvasca mogu se koristiti kao prezervativi ili aditivi u hrani, farmaceutskim ili kozmetičkim proizvodima, i mogu se upotrebni za pravljenje plastike kao i drugih proizvoda.

Za potrebe ovog pronalaska organski proizvod je bilo koje jedinjenje koje sadrži atom ugljenika. Na primer, organski proizvodi su karboksilat (na pr. laktat, akrilat, citrat, izocitrat, cc-ketoglutarat, sukcinat, fumarat, malat, oksalacetat), karbohidrati (na pr. D-ksiloza), alditoli (na pr. ksilitol, arabitol, ribitol), amino kiseline (na pr. glicin, triptofan, glutamat), lipidi, estri, vitamini (na pr. L-askorbat), pilioli (na pr. glicerol, 1,3-propandiol, eritriol), aldehidi, alkeni, alkini, i ketoni. Tako da organski proizvod može da ima jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više atoma ugljenika. Dodatno, organski proizvod može da ima molekulsku težinu koja je manja od oko 1000 (na pr. manje od oko 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ili 100). Na primer, D-ksiloza (C5H10O5) je organski proizvod koji ima molekulsku težinu od 150. Dalje organski proizvod može biti fermentacioni proizvod. Izraz fermentacioni proizvod koji se ovde koristi odnosi se na bilo koje organsko jedinjenje koje nastaje u procesu fermentacije. Uopšteno govoreći proces fermentacije uključuje anaerobnu enzimsku konverziju organskih jedinjenja kao što su karbohidrati do jedinjenja kao što su etil alkohol, što rezultira stvaranjem energije u obliku adenozin trifosfata (ATP). Prema tome, fermentacija se razlikuje od ćelijskog disanja u tome što se organski proizvod, a ne molekularni kiseonik koristi kao akceptor elektrona. Primeri fermentacionih proizvoda uključuju, bez limitiranja, acetat, etanol,butirat, i laktat.

Organski proizvodi mogu takođe biti proizvodi izvedeni iz piruvata. Izraz "izveden iz piruvata" koji se ovde koristi odnosi se na bilo koje jedinjenje koje se sintetiše iz piruvata kroz ne više od petnaest enzimatskih koraka. Enzimatski korak je bilo koja hemijska reakcija ili serija reakcija katalizovana polipeptidom koji ima enzimatsku aktivnost. Izraz "poilipeptid koji ima enzimatsku aktivnost" koji se ovde koristi odnosi se na bilo koji polipeptid koji katalizuje hemijsku reakciju drugih supstanci a da se pri tome kada se završi reakcija ili reakcije sama ne menja niti uništava. Tipično enzimatski polipeptid katalizuje formiranje jednog ili više proizvoda od jednog ili više substrata. Ovakvi polipeptidi mogu posedovati bilo koji tip enzimatske aktivnosti uključujući, ali bez limitiranja, enzimatsku aktivnost povezanu sa enzimom kao što je, akonitaza, izocitrat dehidrogenaza, ketoglutarat dehidrogenaza, citrat sintaza, 2,5-dioksovalerat dehidrogenaza, 5-dehidro-4-deoksi-D-glukarat dehidrogenaza, glukarat dehidrataza, aldehid dehidrogenaza, glukuronolakton reduktaza, L-gulonolakton oksidaza, 2-dehidro-3-deoksi-D-pentanoat aldolaza, ksilonat dehidrataza, ksilonolaktonaza, D-ksilozo dehidrogenaza, laktat dehidrogenaza, CoA-transferaza, laktil-CoA dehidrataza ili akrili-CoA hidrataza.

Važno je naglasiti da polipeptid koji ima određenu enzimatsku aktivnost može da bude polipeptid koji je ili normalno rasprostranjen u prirodi ili se ne nalazi u prirodi. Polipeptid koji se normalno nalazi u prirodi je bilo koji polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu koja se nalazi u prirodi, uključujući "wild type" i polimorfne polipeptide. Ovakvi polipeptidi koji se normalno nalaze u prirodi mogu se dobiti iz bilo koje vrste, uključujući, bez limitiranja, sisarske, gljivične i bakterijske vrste. Polipeptid koji se ne nalazi u prirodi je bilo koji polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu koja se ne nalazi u prirodi. Tako polipeptid koji se ne nalazi u prirodi može biti mutirana verzija polipeptida koji se normalno nalazi u prirodi ili konstruisanog polipeptida. Na primer, polipeptid koji se ne nalazi u prirodi i poseduje citrat sintetaznu aktivnost može biti mutirana verzija polipeptida koji se normalno nalazi u prirodi koji ima citrat sintetaznu aktivnost koji zadržava makar deo citrat sintetzane aktivnosti. Polipeptid može biti mutiran na primer, adicijama sekvence, delecijama i/ili supstitucijama.

Organski proizvod nije proizvod izveden iz piruvata ako je taj proizvod sintetisan iz piruvata u više od petnaest enzimatskih koraka. Primeri proizvoda izvedenih iz piruvata uključuju, bez limitiranja, citrat, a-ketoglutarat, sukcinat, fumarat, malat, oksaloacetat, 2-dehidro-3-deoksi-D-ksilonat, D-ksilonat, D-ksiloza, akrilat, acetat, etanol, butirat i laktat.

Za potrebe ovog pronalaska karboksilatni proizvodi, koji mogu biti u formi "slobodne kiseline" ili "soli", biće upućeni na upotrebu nomenklature za formu soli. Na primer, mlečna kiselina se odnosi na laktat. Tako u ovom slučaju usvojiće se da izraz "laktat" uključuje mlečnu kiselinu kao i laktat.

Izraz "nukleinska kiselina" koji se ovde koristi obuhvata obe, i DNK i RNK, uključujući cDNK, genomsku DNK i sintetičku (na pr. hemijskim putem sintetisanu) DNK. Nukleinska kiselina može biti dvolančana ili jednolančana. Jednolančana, nukleinska kiselina može biti sense lanac ili antisense lanac. Dodatno nukleinska kiselina može biti cirkularna ili linearna.

Izraz "egzogeni" koji se ovde koristi sa u kontekstu sa molekulom nukleinske kiseline i određenim ćelijama odnosi se na bilo koji molekul nukleinske kiseline koji ne vodi poreklo iz te određene ćelije koja se može naći u prirodi. Tako svi molekuli nukleinske kiseline koja ne vodi poreklo iz prirode smatraju se da su egzogeni za ćeliju kada se ubace u ćeliju. Važno je naglasiti da molekuli nukleinske kiseline koji se ne nalaze u prirodi mogu da sadrže nukleinsko kiselinske sekvence ili fragmente nukleinsko kiselinske sekvence koji se mogu naći u prirodi, obezbeđuju molekul nukleinske kiseline koji kao celina ne postoji u prirodi. Na primer, molekul nukleinske kiseline koji sadrži genomske DNK sekvence u okviru ekspresionog vektora se smatra da se ne nalazi kao takav molekul nukleinske kiseline u prirodi, i zato se smatra daje egzogen za ćeliju kada se jednom ubaci u ćeliju, jer molekul nukleinske kiseline kao celina (genomska DNK plus vektorska DNK) ne postoji u prirodi. Tako bilo koji vektor, autonomno replicirajući plazmid, ili virus (na pr. retrovirus, adenovirus ili herpes virus) koji kao celina ne postoji u prirodi smatra se da je da molekul nukleinske kiseline koji se ne nalazi u prirodi. Iz ovoga sledi đa fragmenti genomske DNK dobijeni PCR-om (lančana reakcija polimeraze) ili tretmanom restrikcionom endonukleazom kao i cDNK smatra se da predstavljaju molekul nukleinske kiseline koji se ne nalazi u prirodi jer postoje kao odvojeni molekuli koji se ne mogu naći u prirodi. Takođe sledi da bilo koji molekul nukleinske kiseline koji sadrži promotrosku sekvencu i sekvencu koja kodira polipeptid (na pr. cDNK ili genomsku DNK) u rasporedu koji ne može da se nađe u prirodi, smatra se da predstavlja molekul nukleinske kiseline koji ne postoji u prirodi.

Izraz "endogeni" odnosi se na genomski materijal koji nije egzogen. Uopšteno, endogeni genomski materijal se razvija u organizmu, tkivu ili ćeliji i nije ubačen niti modifikovan rekombinantnom tehnologijom. Endogeni genomski materijal uključuje u okviru svog područja, prirodno nastale varijacije.

Takođe je važno naglasiti da molekul nukleinske kiseline koji se može naći u prirodi može biti egzogen za određenu ćeliju. Na primer, ceo hromozom izolovan iz ćelije osobe X može se smatrati egzogenira molekulom nukleinske kiseline u odnosu na ćeliju osobe Y jednom kada se hromozom ubaci u Y-ovu ćeliju.

Kao što se ovde koristi, fraza "genetički modifikovan" se odnosi na organizam čiji je genom modifikovan, na primer, adicijom, supstitucijom ili delecijom genetskog materijala. Postupci za dodavanje ili deletiranje genetskog materijala su poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na njih, random mutagenezu, tačkaste mutacije, uključujući insercije, delecije i supstitucije, knock-out tehnologiju i transformaciju organizma sa nukleinsko kiselinskim sekvencama koristeći rekombinantnu tehnologiju, uključujući oba i stabilne i prelazne transformante. Ćelije kvasca mogu takođe da katabolizuju škrob, bilo prirodno ili usled genetske modifikacije, a mogu čak i biti genetski modifikovane da katabolizuju celulozu putem dodavanja na primer, celulaze koja se bazira na gljivama.

1. Ćelije kvasca koje imaju crabtree- negativni fenotip

Pronalazak obezbeđuje različite genetski modifikovane ćelije kvasca koje imaju crabtree-negativni fenotip. Ovakve rekombinantne ćelije kvasca mogu se koristiti za proizvodnju organskih proizvoda. Na primer, pronalazak obezbeđuje ćeliju kvasca koja ima crabtree-negativni fenotip, i sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji poseduje enzimatsku aktivnost koja dovodi do formiranja organskog proizvoda. Ovakve ćelije kvasca su u okviru područja koje obuhvata pronalazak, one proizvode organski proizvod. Tipično, ćelije kvasca ovog pronalaska proizvode organski proizvod sa prinosom koji je najmanje oko 40 grama (na pr. najmanje oko 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ili 95 grama) organskog proizvoda za svakih 100 grama glukoze koja se konzumira kada se kultivišu pod uslovima optimalnim za proizvodnju proizvoda. Kada se određuje prinos proizvodnje organskog proizvoda za određene ćelije kvasca, može se koristiti bilo koji metod. Videti a.g. Kiers et al.,Yeast,14(5):459-469 (1998). Takođe je naglašeno da enzimatska aktivnost kodirajućeg polipeptida može da dovede do formiranja organskog proizvoda na način kada konzumira NADH. Drugim rečima, proizvodnja organskog proizvoda može da zahteva NADH kao izvor energije. Izraz "NAD" se odnosi na kofaktore koji služe kao nosači vodonika ili elektrona, pogotovu u reakcijama oksido-redukcije, dok izraz "NADH" se odnosi na redukovanu formu NAD. Primeri organskih proizvoda čija sinteza zahteva NDDH uključuju, bez ograničavanja, laktat, etanol, acetat i akrilat. Tipično ćelije kvasca u okviru područja pronalaska katabolišu heksozni ugljenik kao što je glukoza. Međutim, ovakve ćelije kvasca mogu da katabolišu pentozni ugljenik (na pr. ribozu, arabinozu, ksilozu i liksozu). Drugim rečima, ćelije kvasca u okviru pronalaska mogu ili prirodno da koriste pentozni ugljenik ili mogu biti modifikovane da koriste pentozni ugljenik. Na primer, ćeliji kvasca može da se doda egzogeni molekuk nukleinske kiseline koji kodira ksilozo reduktazu, ksilitol dehidrogenazu, i/ili ksilulokinazu tako da ksiloza može da se kataboliše. Ćelije kvasca mogu takođe da katabolizuju škrob, bilo prirodno ili usled genetske modifikacije, a mogu čak i biti genetski modifikovane da katabolizuju celulozu putem dodavanja na primer, celulaze koja se bazira na gljivama.

Ćelija kvasca koja poseduje carbtree-negativni fenotip je bilo koja ćelija kvasca koja ne pokazuje crabtree efekat. Izraz "crabtree-negativni" odnosi se na oba, i organizam koji se nalazi u prirodi genetski modifikovan organizam. Ukratko, crabtree efekat se definiše kao inhibicija utroška kiseonika od strane mikroorganizma kada se kultiviše u aerobnim uslovima usled prisustva visoke koncentracije glukoze (na pr. 50 grama glukozc/1). Drugim rečima, ćelija kvasca koja poseduje crabtree-pozitivni fenotip nastavlja da fermentiše bez obzira na dostupnost kiseonika zbog prisustva glukoze, dok ćelija kvascaa koja ima crabtree-negativni fenotip ne pokazuje inhibiciju potrošnje kiseonika uzrokovanu glukozom. Primeri ćelija kvasca koje tipično imaju crabtree-negativni fenotip uključuju, bez ograničavanja, ćelije kvasca iz sledećih rodova:Kh( yveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, TrichosporoniliYamadazyma.

Kao što je ovde opisano, pronalazak obezbežuje različite rekombinantne ćelije kvasca koje su sposobne da proizvedu različite organske proizvode. Na primer, ćelija kvasca može da sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji poseduje laktat dehidrogenaznu aktivnost tako da se proizvodi laktoza. Primeri ovakvog polipeptida uključuju, bez ograničenja, laktat dehidrogenazu govečeta, bakterijsku laktat dehidrogenazu i gljivičnu laktat ehidrogenazu (na pr.K. lactisiliK. thermotoleransgljivična laktat ehidrogenaza). Ponovo, polipeptid koji ima enzimatsku aktivnost kao laktat ehidrogenaznu aktivnost može biti prirodan ili se ne može naći u prirodi.

Važno je naglasiti da ćelije kvasca koje su ovde opisane mogu da sadrže jednu kopiju, ili više kopija (na pr. 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 ili 150 kopija), određenog egzogenog molekula nukleinske kiseline. Na primer, ćelija kvasca može da sadrži oko 50 kopija egzogenog molekula nukleinske kiseline X kao i 75 kopija egzogenog molekula nukleinske kiseline Y. U ovim slučajevima svaki različiti molekul nukleinske kiseline može da kodira različiti polipeptid koji ima svoju jedinstvenu enzimatsku aktivnost Na primer, ćelija kvasca može da sadrži oko četiri različita egzogena molekula nukleinske kiseline tako da se proizvodi akrilat. U ovom primeru takva ćelija kvasca može da sadrži prvi egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima laktat dehidrogenaznu aktivnost, drugi koji kodira polipeptid koji ima CoA-transferaznu aktivnost, treći koji kodira polipeptid koji ima laktil-CoA-transferaznu aktivnost i četvrti koji kodira polipeptid koji ima akrilil-CoA- hidrataznu aktivnost. U drugom primeru ćelija kvasca može da sadrži četiri egzogena molekula nukleinske kiseline tako da se proizvodi D-ksiloza. Posebno, ovakva ćelija kvasca može da sadrži prvi egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima 2-dehidro-3-deoksi-D-pentanoat aldolaznu aktivnost, drugi koji kodira polipeptid koji ima ksilonat dehidrataznu aktivnost, treći koji kodira polipeptid koji ima ksilonolaktonaznu aktivnost i četvrti koji kodira polipeptid koji ima D-ksilozo dehidrogenaznu aktivnost. U još jednom primeru ćelija kvasca može da sadrži šest različitih egzogenih molekula nukleinske kiseline tako da se vitamin L-askorbat proizvodi. Posebno, ovakva ćelija kvasca može da sadrži prvi egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima 2,5-dioksovalerat dehidrogenaznu aktivnost, drugi kodira polipeptid koji ima 5-dehidro-4-deoksi-D-glukarat dehidrogenaznu aktivnost, treći kodira polipeptid koji ima glukarat dehidrogenaznu aktivnost, četvrti kodira polipeptid koji ima aldehid dehidrogenaznu aktivnost, peti kodira polipeptid koji ima glukuronolakton ređuktaznu aktivnost i šesti kodira polipeptid koji ima L-gulonolakton oksiđaznu aktivnost.

Važno je da se naglasi da enzimatski polipeptid može da se koristi tako daje željeni organski proizvod optički čist (na pr. 90, 95, 99% čist). Na primer, polipeptid koji ima (L)-laktat dehidrogenaznu aktivnost može da se koristi za proizvodnju (L)-laktata.

Ćelije kvasca u okviru područja koje obuhvata ovaj pronalazak mogu takođe imati redukovanu enzimatsku aktivnost kao redukovanu piruvat dekarboksilaznu i/ili alkoholno dehidrogenaznu aktivnost. Termin "redukovan" koji se ovde koristi u kontekstu ćelije i određene enzimske aktivnosti odnosi se na smanjen nivo enzimatske aktivnosti u odnosu na izmerenu u ćelijama kvasca iste vrste sa kojima se poredi. Tako ćelija kvasca kojoj nedostaje piruvat dekarbiksilazna aktivnost se smatra da ima redukovanu piruvat dekarbiksilazna aktivnost pošto većina, ako ne i sve ćelije kvasca sa kojima se poredi imaju makar neku piruvat dekarbiksilazna aktivnost. Ovakve redukovane enzimatske aktivnosti mogu biti rezultat smanjene koncentracije enzima, smanjene specifične aktivnosti enzima ili posledica njihove kombinacije. Mnogi različiti postupci mogu se koristiti za pravljenje ćelije kvasca koja ima redukovanu enzimatsku aktivnost. Na primer, ćelija kvasca može biti konstruisana tako da ima izmenjen lokus koji kodira enzim upotrebom obične mutageneze ili knock-out tehnologije. Videti npr.,Methods in Veasl genetics(1997 izdanje), Adams, Gottschling, Kaiser, and Stern, Cold Spring Harbour Press (1998). Alternativno antisens tehnologija množe da se koristi da bi se redukovala enzimatska aktivnost. Na primer, ćelija kvasca može da se konstruiše tako da sadrži cDNK koja kodira antisens molekul koji sprečava da se enzim napravi. Izraz "antisens molekul" koji se ovde koristi obuhvata bilo koji molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvence koje odgovaraju kodirajućem lancu endogenog polipeptida. Antisens molekul takođe može da ima sekvence koje ga okružuju (na pr. regulatorne sekvence). Tako antisens molekuli mogu biti ribozimi ili antisens oligonukleotidi. Ribozim može da

ima bilo koju opštu strukturu, bez limitiranja, strukturu šnale, glave čekića ili sekire, a obezbeđeđeni molekul seče RNK.

Ćelije kvasca koje imaju redukovanu enzimatsku aktivnost mogu se identifikovati upotrebom bilo koje metode. Na primer, ćelije kvasca koje imaju redukovanu piruvat dekarbiksilazna aktivnost mogu se lako identifikovati upotrebom opšte poznatih metoda. Videti npr., Ulbrich,Methods in ezymology18:109-115(1970).

2. Ćelija kvasca sa crabtree- pozitivnim i crabtree- negativnim fenotipom

Pronalazak takođe obezbeđuje različite genetički manipulisane ćelije kvasca koje ne treba da imaju crabtree-negativni fenotip, tj., takve ćelije mogu biti ili crabtree-pozitivne ili crabtree-negativne. Ovakve rekombinantne ćelije kvasca mogu da se koriste za proizvodnju organskih proizvoda. Na primer, pronalazak obezbeđuje ćeliju kvasca koja sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline koja koja kodira polipeptid koji potpomaže katabolizam pentoznog ugljenika (npr., riboze, arabinoze, ksiloze i liksoze) od strane ćelije. Specifično, ćelija kvasca može da ima egzogeni molekul nukleinske kiseline koja koja kodira ksilol reduktazu, ksilitol dehidrogenazu i/ili ksilulokinazu tako da ksiloza može da se kataboliše na efikasniji način. Dodatno, ćelije kvasca sposobne da katabolišu pentozni ugljenik mogu da katabolišu heksozni ugljenik (npr., alozu, altrozu, glukozu, manozu, gulozu, iodzu, galaktozu i talozu) ili sekvencijalno ili istovremeno. Na primer, ćelija kvasca može biti tako konstruisana da se ksiloza i glukoza katabolišu istovremeno. Naglašeno je da se ćelije kvasca koje imaju povećanu sposobnost da katabolišu pentozni ugljenik mogu koristiti za konstruisanje ćelija kvasca koje mogu da proizvode organske proizvode iz izvora pentoznog ugljenika. Ova karakteristika pogotovo ima prednost jer izvori pentoznog ugljenika kao ksiloza su uglavnom jeftiniji nego izvori heksoznog ugljenika kao što je glukoza. Drugi izvori ugljenika koji se mogu katabolizovati uključuju, bez limitiranja, melibiozu, saharozu, fruktozu, rafmozu, stahiozu, škrob (npr., kukuruzni škrob i pšenični škrob) i hidrolizate (npr., hidrolizat kukuruznih vlakana i drugi celulozni hidrolizati).

Dodatno, pronalazak obezbeđuje ćelije kvasca koje sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji potpomaže akumulaciju acetil-CoA u citoplazmi ćelije. Na primer, ćelija kvasca može da ima egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid iz memebrane mitohondrije koji potpomaže permeabilnost acetil-CoA kroz memranu mitohondrije. Naglašeno je da mnoge ćelije kvasca kojima nedostaje sposobnost proizvodnje etanola ne mogu da rastu u odsustvu etanola i acetata. Tipično, ćelije kvasca kojima nedostaje sposobnost da proizvode etanol kada na bilo koji način nedostaje aktivnost piruvat dekarboksilaze ili alkoholne dehidrogenaze. Na primer, crabtree-pozitivni kvasac (npr.,Saccharomyces)kome nedostaje piruvat dakarboksilazna aktivnost slabo raste u odsustvu etanola i acetata. Zato manipulisanje ovakvog crabtree-pozitivnog kvasca u cilju da se redukuje proizvodnja etanola da bi se preusmerilo iskorišćevanje piruvata ka drugim organskim proizvodima (npr., laktat i akrilat) dovodi do slabih karakteristika rasta kad su odsutni etanol i acetat, pogotovo jer carbtree-pozitivni kvasac limitira ćelijsko disanje u prisustvu glukoze. Kao što je ovde opisano ćelije koje mogu da potpomažu akumulaciju citoplamatskog acetil-CoA na neki drugi način nego onaj koji se oslanja na citoplazmatsku koncentraciju acetata i aktivnost acetil-CoA sintaze mogu da rastu u odsustvu etanola i acetata čak i kada nisu u stanju da proizvode etanol. Naglašeno je da ćelije kvasca koje imaju sposobnost da rastu u odsustvu etanola i acetata i nemaju mogućnost da proizvode etanol, mogu da preusmere korišćenje piruvata za proizvodnju organskih proizvoda, drugih od etanola.

Svaki tip kvasca može da sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji potpomaže akumilaciju acetil-CoA u citoplazmi ćelije. Na primer, ćelija kvasca sa crabtree-negativnim ili crabtree-pozitivnim fenotipom može da sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji potpomaže akumilaciju acetil-CoA u citoplazmi ćelije. Tipično ovakve ćelije mogu biti identifikovane na sledeće načine: 1) manipulisanjem ćelije koja sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline tako da joj nedostaje piruvat dekarboksilatna ili alkohol dehidrogenazan aktivnost, 2) određivanjem karakteristika rasta ćelija kada se ćelije kultivišu u prisustvu titrirajućih količina respiratornog inhibitora (npr., antimicin A, cijanid ili azid), i 3) poređenjem ovih karakteristika rasta sa onima koji se beleže za uporedivim ćelijama kvasca koje ne sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline tako, ali koji je bio manipulisan i nema piruvat dekarboksilatnu ili alkohol dehidrogenaznu aktivnost. Ćelije kvasca za koje se odredi da imaju povoljnije karakteristike rasta usled prisustva egzogenog molekula nukleinske kiseline ovakvim poređenjem smatraju se da sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji potpomaže akumilaciju acetil-CoA u citoplazmi ćelije.

Ćelije kvasca koje sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji potpomaže akumilaciju acetil-CoA u citoplazmi ćelije mogu takođe imati redukovanu enzimsku aktivnost, kao na primer redukovanu piruvat dekarboksilatnu i/ili alkohol dehidrogenaznu aktivnost. Na primer ćeliji kvasca može da nedostaje sposobnost proizvodnje etanola. Tipično ovakva ćelija ima stopu rasta , u uslovima kada nema etanola i acetata, koja je veća (npr., oko 5,10,20, 35, 50,75,100, 150,200 posto, ili više) nego stopa rasta koja je zabeležena kod uporedivih ćelija kvasca (npr., ćelije kvesca kojima

nedostaje sposobnost proizvodnje etanola) koje ne sadrže egzogenu nukleinsku kiselinu, i ako se kultivišu u sličnim uslovima (na. pr., uslovi kultivisanja kada nema etanola i acetata).

Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju kvasca koja ima redukovanu aktivnost polipeptida. Ovakve ćelije kvasca mogu da imaju crabtree-negativni ili crabtree-pozitivni fenotip. Na primer, ćelija kvasca u okviru oblasti ovog pronalaska može da ima redukovanu aktivnost polipeptida plazma membrane (npr., trensporter plazma membrane), citoplazmatskog polipeptida (npr., piruvat dekarboksilaze) i/ili mitohondrijalnog polipeptida (npr., piruvat dehidrogenaze). Izraz "transporter plazma membrane" odnosi se na polipeptid koji olakšava kretanje organskih proizvoda kroz plazma membranu. Primeri ovakvih polipeptida uključuju. Bez limitiranja transportere karboksilne kiseline kao JEN1 kodS. cervisae(Genebank broj pristupa U24155). Izraz "mitohondrijalni polipeptidi" odnosi se na bilo koji polipeptid koji funkcioniše u mitohondriji uključujući bez limitiranja, piruvat dehidrogenazu, polipeptide koji učestvuju u katabolizmu laktata ili acetil-CoA (npr., citohrom b2 polipeptidi) i enzime Krebsovog ciklusa. Enzimi Krebsovog ciklusa uključuju akonitazu, izocitrat dehidrogenazu, ketoglutarat dehidrogenazu, sukcinat tiokinazu, sukcinat dehidrogenazu, fumarazu, malat dehidrogenazu i citrat sintatazu. Kao što je ovde opisano ćelija kvasca koja ima redukovanu enzimatsku aktivnost uključuje ćeliju kvasca kojoj nedostaje kompletno određena enzimatska aktivnost. Važno je naglasiti da se izraz "redukovan" koji se ovde upotrebljava u odnosu na ćeliju kvasca i aktivnost polipeptida, odnosi na sniženi nivo aktivnosti u donosu na onaj koji se dobija poređenjem sa ćelijom kvasca iste vrste pod sličnim uslovima. Zato ćelija kvasca kojoj nedostaje određena transportna aktivnost smatra se da ima redukovanu transportnu aktivnost ako se poredi sa ćelijom koja ima makar neku transportnu aktivnost. Ovakva redukovana polipeptidna aktivnost može biti rezultat snižene koncentracije polipeptida, snižene specifične aktivnosti polipeptida ili njihove kombinacije. Na primer lokus koji ima sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mitohondrijalni polipeptid može da bude inaktivisana na primer uobičajenom mutagenezom ili knock-out tehnologijom.

Naglašeno je da ćelije kvasca sa redukovanom aktivnošću mitohondrijalnog enzima mogu da akumuliraju proizvode Krebsovog ciklusa (npr., citrat, izocitrat, a-ketoglutarat, sukcinil-CoA, sukcinat, fumarat, malat i oksalacetat). Na primer, ćelije kvasca sa redukovanom fumaraznom aktivnošću mogu da akumuliraju fumarat. Dodatno ćelije kvasca mogu da sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipepeptid koji ima enzimsku aktivnost koja vodi ka formiranju takvog organskog proizvoda da ćelija proizvodi organski proizvod.

Važno je naglasiti da neki proizvodi Kerbsovog ciklusa (npr., a-ketoglutarat i sukcinil-CoA) ne mogu da prođu kroz membranu mitohondrije. Zato redukucija aktivnost određenog enzima Krebsovog ciklusa će rezultovati akumulacijom određenog proizvoda Krebsovog ciklusa u unutrašnjosti mitohondrije. U ovakvim slučajevima ćelije kvasca sa redukovanom aktivnošću enzima Krebsovog ciklusa mogu biti konstruisane da sadrže jedan ili više molekula nukleinske kiseline, od kojih svaki kodira polipeptid koji ima drugačiju enzimatsku aktivnost, tako da se željeni proizvod Krebsovog ciklusa akumulira u citoplazmi. Na primer, redukovanje aktivnosti ketoglutarat dehidrogenaze dovešće do akumulacije cc-ketoglutarata, što će za posledicu imati akumulaciju izocitrata. a-ketoglutarat ne može da prođe kroz membranu mitohondrije, dok izocitrat može da prođe kroz membranu mitohondrije. Tako se izocitrat može akumulirati u citoplazmi ćelije. Međutim, ćelije kvasca mogu takođe da sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima izocitrat dehidrogenaznu aktivnost i da ekspresija ovog funkcionalnog polipeptida u citoplazmi može proizvesti citoplazmatski a-ketoglutarat. Tako redukujući aktivnost određenih enzima Krebsovog ciklusa i obezbeđujući egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira iste (ili različite) enzime Krebsovog ciklusa tako da su oni funkcionalni u citoplazmi, može dovesti do proizvodnje različitih proizvoda Krebsovog ciklusa (ili proizvoda izvedenih iz proizvoda Krebsovog ciklusa) u citoplazmi.

Dalje, pronalazak obezbeđuje ćeliju kvasca koja ima redukovanu aktivnost enzima koji preusmerava korišćenje ugljenika od proizvodnje ili biomase ili željenog organskog proizvoda. Na primer, enzimi u okviru puteva glicerola ili acetoina mogu biti izmenjeni na takav način da izvor ugljenika u medijumu za kultivisanje se predominantno koristi za proizvodnju biomase ili željenog organskog proizvoda. Primeri enzima glicerolskog puta uključuju, bez limitiranja dihidroksiaceton fosfat reduktazu. Primeri enzima acetionskog puta uključuju, bez limitiranja, a-acetolaktat sintetazu i a-acetolaktat dekarboksilazu. Ponovo bilo koji postupak može da se koristi za redukovanje aktivnosti enzima.

Osim toga, bilo koja od ovde dobijenih ćelija kvasca može da sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline koji funkcioniše kao plazmid ubica. Izraz "plazmid ubica" koji se ovde koristi odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji obezbeđuje jednoj vrsti kvasca sposobnost da ubije drugu vrstu kvasca. Na primer, ćelije kvasca iz rodaKlyveromyceskoje sadrže plazmid ubicu mogu da spreče rast kvasca iz rodaSaccharomyces.Tako ćelije kvasca koje sadrže plazmid ubicu se mogu koristiti za sprečavanje problema kontaminacije koji se javlja tokom proizvodnog procesa na veliko. Dodatno, bilo koji tip plazmida ubice može da se ubaci u ćeliju kvasca. Na primer, plazmid ubica izolovan izK. ladismože da se da ćeliji kvascaK. mancianus.Ćelije kvasca sa plazmidom ubicom se mogu lako identifikovati poznatim metodama. Videti, npr., Gunge et al.,J. Bacteriol.145(l):382-390 (1981); Gunge I Kitada,Eur. J. EpidemioL,4:409-414 (1988); I Wesolowski-Louvel et al.,Nonconventional yeasts in Biotechnohgy: Klyveromyces lactis,ed. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlin, p. 138-201

(1996).

Takođe bilo koja od ovde dobijenih ćelija kvasca može da sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid sa ATP-aznom aktivnošću koja je tako mođifikovana da ćelija kvasca postaje tolerantnija na niske pH vrednosti sredine. Na primer, ćeliji kvasca može biti data ATP-aza koja efikasno održava nisku citoplazmatsku koncentraciju protona kada je ekstarcelularna koncentracija protona visoka. Ovakvi polipeptidi mogu se konstruisati kao što je opisao Morsomme et al,( EMBO J.15:5513-5526(1996)).

Važno je naglasiti da bilo koja od ovde opisanih rekombinantnih ćelija kvasca može da sadrži kombinaciju opisanih genetskih manipulacija. Na primer, ćelija kvasca sa crabtree-negativnim fenotipom može da sadrži egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima citrat liaznu aktivnost kao i egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima enzimatsku aktivnost koja vodi ka formiranju organskog proizvoda.

3. Odgovarajući organizmi

Različiti organizmi su pogodni za upotrebu u skladu sa pronalaskom. Pored crabtree-negativnih i crabtree-pozitivnih mikroorganizama kvasca kaoSaccharomyces sp,uključujućiS. cerviseaei .uvarum, Klyveromycessp, uključujućiK, thermotolerans, K lactisiK. marxianus, Pichia, Hansenula,uključujućiH. polymorpha, Candida, Trichosporon, Yamadazyma,uključujućiY. siipitisiliTorulaspora pretoriensis,organizmi iz različitih mikrobijalnih vrsta mogu takođe poslužiti kao domaćini za proizvodnju mlečne kiseline. Na primer, organizam kao što jeRhyzopus oryzae,prirodni proizvođač mlečne kiseline, može biti genetički modifiokvan za toleranciju na kiseline, poboljšanje prinosa i optički čiste mlečne kiseline.Aspergillus spp,su takođe poznati da proizvode razne organske kiseline kao limunsku kiselinu, i da tolerišu niske pH. Dostupni su postupci za genetičko modifikovanjeAspergillus spp,da bi se proizvodila mlečna kiselina. Dodatno, gljive kao Rhizopus iliAspergillus spp, proizvode enzime koji im omogućavaju da degradiraju škrob i druge polimere ugljenih hidrata do monomera ugljenih hidrata za upotrebu istih kao izvora ugljenika.

Prokarioti kaoEscherichia coli, Zymomonas mobilisiBacillus spp.su ili mogu biti genetički modifikovani za proizvodnju mlečne kieline. Mikroorganizmi koji su identifikovani kaoBacillus coagulanssu takođe prirodni proizvođači mlečne kiseline koji se mogu dalje genetički modifikovati radi poboljšanja proizvodnje mlečne kiseline na niskim pH.

Dodatno, ekstremofilni organizmi iz familijeArcheamogu da tolerišu ekstremno niske pH i visoke temperature. Genetička modifikacija odabranih vrsta iz familije može da obezbedi soj za proizvodnju mlečne kiseline.

4. Genetski aspekt

Molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima enzimatsku aktivnost može biti identifikovan i izolovan pomoću bilo kojeg postupka. Na primer, standardne tehnike sekvenciranja nukleinske kiseline i softverski programi koji prevode sekvencu nukleinske kiseline u amino kiselinsku sekvencu bazirani na genetskom kodu, mogu se koristiti za određivanje da li ili ne određena nukleinska kiselina ima sekvencu homologu sa poznatim enzimskim polipeptidima. Softver za poravnanje sekvenci kao MEGALIGN<R>(DNASTAR, Madison, WI, 1997) može se koristiti za upoređivenje različitih sekvenci. Dodatno, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju poznate enzimatske polipeptide mogu se mutirati korišćenjem poznatih tehnika za kloniranje (npr., site directed mutageneza). Moguće mutacije uključuju, bez limitiranja, delecije, insercije i bazne supstitucije kao i kombinacije delecija, insercija i baznih supstitucija. Dalje, baze podataka nukleinskih kiselina i amino kiselina (npr., GenBank<R>) mogu se koristiti za identifikaciju sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptid sa enzimatskom aktivnošću. Ukratko, bilo koja amino kiselinska sekvenca koja ima deo homologije sa polipeptidom koji poseduje enzimatsku aktivnost, ili bilo koja nukleinsko kiselinska sekvenca koja ima deo homologije sa sekvencom koja kodira polipeptid koji poseduje enzimatsku aktivnost može se koristiti kao zahtev za pretragu GenBank<R>. Identifikovani polipeptid se zatim može analizirati da bi se odredilo dali ima ili ne enzimatsku aktivnost.

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptid koji ima enzimatsku aktivnost mogu biti identifikovani i dobijeni pomoću poznatih tehnika i procedura molekularnog kloniranja ili sinteze nukleinskih kiselina, uključujući PCR. PCR se odnosi na proceduru ili tehniku u kojoj ciljna nukleinska kiselina se umnožava na način sličan onom opisano u U.S. patentni broj 4,683,195, i ovde su opisane dodatne modifikacije procedure. Uopšteno, informacija o sekvenci od krajeva regiona od interesa ili još dalje se koriste za dizajniranje oligonukleotidnih prajmera koji su identični ili slični sekvenci suprotnog lanca potencijalne matrice koja treba da se amplifikuje. Pomoću PCR-a sekvenca nukleinske kiseline se može umnožiti sa DNK ili RNK. Na primer, sekvenca nukleinske kiseline može se izolovati PCR umnožavanjem iz ukupne ćelijske RNK, ukupne genomske DNK, cDNK kao i iz sekvenci bakteriofaga, plazmida, virusa i sličnih. Kada se koristi RNK kao matrica, reverzna transkriptaza se može upotrebni za sintezu komplementarnih DNK lanaca.

Dalje, tehnike hibridizacije nuklinske kiseline mogu se koristiti za identifikaciju i dobijanje molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji poseduje enzimatsku aktivnost. Ukratko, bilo koji molekul nukleinske kiseline koji kodira poznati enzimatski polipeptid, ili njegov fragment, može da se koristi kao proba za identifikaciju sličnih molekula nukleinske kiseline hibridizacijom pod uslovima umerene do visoke strogosti (stringencv). Zatim ovakvi slični molekuli nukleinske kiseline mogu biti izolovani, sekvencirani i analizirani da bi se odredilo da li koidrani polipeptid poseduje enzimatsku aktivnost.

Hibridizacija se može izvesti Southern ili Northern analizom da bi se identifikovala DNK ili RNK sekvenca, koja hibridizuje sa probom. Proba može biti obeležena radioizotopom kao što je<32>P, anzimom, digoksigeninom ili biotinilacijom. DNK ili RNK koja se analizira može se elektroforetski razdvojiti na agaroznom ili poliakrilamidnom gelu, prebaciti na nitrocelulozu, najlon ili drugu odgovarajuću membranu i hibridizovati sa probom pomoću standardnih tehnika poznatih u ovoj oblasti kao one opisane u odeljku 7.39-7.52 Sambrook et al., (1989)Molecular Cloning,second edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainvievv, NY. Tipično proba je najmanje 20 nukleotida dugačka. Na primer, proba koja odgovara sekvenci od 20 nukleotida koja kodira sisarsku citrat liazu može se koristiti za identifikaciju molekula nukleinske kiseline koji kodira gljivični polipeptid sa citrat liaznom aktivnošću. Dodatno mogu se koristiti probe duže ili kraće od 20 nukleotida.

Bilo koji metod se može korisititi za ubacivanje molekula nukleinske kiseline u ćeliju. U stvari mnogi postupci za ubacivanje nukleinske kiseline u ćelije kvasca su poznate onima obučenim u ovoj oblasti. Na primer, transformacija, elektroporacija, konjugacija i fuzija protoplasta su postupci koji se često koriste za ubacivanje nukleinske kiseline u ćeliju kvasca, Videti, npr., Ito et al.,J. Bacteriol.153:163-168 (1983); Durens et al.,Curr, Genet.18:7-12 (1990); i Becker i Guarente,Methods in Enzimology194:182-187 (1991).

Važno je naglasiti da egzogeni molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u okviru ćelije kvasca iz ovog pronalaska može da se održava u ćeliji u bilo kojoj formi. Na primer, egzogeni molekuli nukleinske kiseline mogu se integrisati u genom ćelije i održavati u stanju epizoma. Drugim rečima, ovde opisane ćelije kvasca mogu da sadže jednu kopiju ili više kopija (npr., 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 ili 150 kopija) određenog molekula nukleinske kiseline kao što je gore opisano.

Postupci za ekspresiju amino kiselinske sekvence iz egzogenog molekula nukleinske kiseline poznati su onima obučenim iz ove oblasti. Ovi postupci obuhvataju, bez limitiranja, konstruisanje nukleinske kiseline tako da regulatorni element potpomaže ekspresiju nukleinsko kiselinske sekvence koja kodira polipeptid. Tipično, regulatorni element je DNK sekvenca koja reguliše ekspresiju drugih DNK sekvenci na nivou transkripcije. Tako regulatorni elementi ulkjučuju, bez limitiranja, promotore, ubrzivače i slične. Osim toga, postupci za ekspresiju polipeptida iz egzogenog molekula nukleinske kiseline u kvascu poznati su stručnjacima iz ove oblasti tehnike. Na primer, dobro su poznati konstrukti nukleinskih kiselina koji su sposobni da eksprimiraju egzogeni polipeptid uKlyveromyces.Videti, npr., US patentni broj 4, 859,596 i 4,943,529.

Kao što je ovde opisano, ćelije kvasca iz oblasti ovog pronalaska sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline koji na primer kodira polipeptid koji poseduje enzimatsku aktivnost koja vodi ka formiranju organskog proizvoda. Postupci za identifikaciju ćelija koje sadrže egzogeni molekul nukleinske kiseline poznati su onima obučenim iz ove oblasti. Ovi postupci obuhvataju, bez limitiranja, PCR i tehnike hibridizacije nukleinskih kiselina kao Northern i Southern analize. U nekim slučajevima tehnike imunohistohemije i biohemije mogu se koristiti za određivanje da li ćelija sadrži određenu nukleinsku kiselinu detekcijom ekspresije kodirajućeg enzimatskog polipeptida koji je kodiran od strane određenog molekula nukleinske kiseline. Na primer, antitelo specifično za kodirajući enzim može se upotrebiti za određivanje da li ili ne određena ćelija kvasca sadrži kodirajući enzim. Dalje, biohemijske tehnike mogu se koristiti za određivanje da li ćelija sadrži određeni molekul nukleinske kiseline koji kodira enzimatski polipeptid detekcijom organskog proizvoda koji nastaje kao posledica ekspresije enzimatskog polipeptida. Na primer, detekcija laktata posle unošenja egzogenog molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid sa laktat dehidrogenaznom aktivnošću u ćeliju kvasca koja normalno ne eksprimira ovaj polipeptid može da ukaže na to da ćelija kvasca ne samo da sadrži ubačeni molekul nukleinske kiseline već i da eksprimira kodirani enzimatski polipeptid iz ubačenog egzogenog molekula nukleinske kiseline. Postupci za detekciju specifičnih enzimatskih aktivnosti ili prisustva određenih organskih proizvoda poznati su onima obučenim iz ove oblasti. Na primer, prisustvo laktata može se odrediti kao što je opisano na drugom mestu. Videti Wittw et al.,J. Basic Microbiol.29:707-716 (1989).

Pronalazak takođe obezbeđuje konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži rekombinantnu sekvencu i odabranu sekvencu. Izraz "rekombinantna sekvenca" koji se ovde koristi odnosi se na bilo koju nukleinsko kiselinsku sekvencu koja odgovara genomskoj sekvenci koja se nalazi u ćeliji. Rekombinantne sekvence opisane ovde mogu se koristiti za usmeravanje rekombinantnih događaja tokom pravljenja knock-out organizama. Drugim rečima rekombinantne sekvence mogu se koristiti za specifičnu promenu lokusa koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira određeni enzim. Izraz "odabrana sekvenca" koji se ovde koristi uključuje bilo koju nukleinsko kiselinsku sekvencu. Tipično odabraba sekvenca kodira polipeptid koji poseduje enzimatsku aktivnost koja vodi ka formiranju organskog proizvoda u ćeliji. Tako konstrukti nukleinskih kiselina ovog pronalaska mogu se koristiti za knock-out endogene enzimske aktivnosti i dodavanje egzogene enzimske aktivnosti u jednom koraku. U većini slučajeva odabrana sekvenca je u okviru rekombinantne sekvence tako daje odabrana sekvenca oivičena na svakom kraju sa rekombinantnom sekvencom.

5. Proizvodnja organskog proizvoda i postupci kultivisanja

Pronalazak obezbeđuje postupke za proizvodnju organskih proizvoda korišćenjem ćelija kvasca ili drugih mikrobijalnih ćelija obezbeženih ovde. Ovi postupci obuhvataju dobijanje ćelija kvasca i kultivisanje obezbeđenih ćelija kvasca u medijumu za gajenje tako da se proizvodi organski proizvod (npr., glicerol, akrilat, ksiloza, askorbat, laktat, citrat, izocitrat, a-ketoglutarat, sukcinil-CoA, sukcinat, fumarat, malat i oksalacetat). Uopšteno medijum za gajenje i/ili uslovi gajenja mogu se klasifikovati u jednu od dve kategorije: oni koji potpomažu respiraciju i/ili proizvodnju biomase i oni koji smanjuju ćelijsku respiraciju. Tipično medijum za gajenje/ili uslovi gajenja koji potpomažu respiraciju koriste se u situacijama gde je potreban brz rast, ili gde organski proizvod koji treba da se proizvede ne može da se proizvede bez respiracije. Ovakvi organski proizvodi mogu da uključe, bez limitiranja, proizvode Krebsovog ciklusa. Sa druge strane, medijum za gajenje i/ili uslovi gajenja koji koji smanjuju ćelijsku respiraciju koriste se u situacijama gde nije potreban ili poželjan brz rast, ili gde organski proizvod koji treba da se proizvede može da se proizvede bez respiracije. Ovakvi organski proizvodi mogu da uključe, bez limitiranja, laktat, akrilat i ksilozu. Kao što se ovde koristi izraz "potpomaže ćelijsku respiraciju" ili "potpomaže proizvodnju biomase" kada se odnose na na uslove kultivisanja, znači da uslovi gajenja bakterija se održavaju tako da se izvor ugljenika u medijumu za gajenje predominantno metaboliše oksidativnom respiracijom ili za proizvodnju biomase. Ovde korišćen izraz "biomasa" odnosi se na suvu težinu organizma. Ovde korišćen izraz "predominantno metaboliše da bi proizveo biomasu" znači da makar 0.3 grama biomase se proizvede po gramu izvora ugljenika (u formi ugljenog hidrata) koji se konzumira (npr., makar oko 0.4, 0.45, 0.5 ili 0.6 grama biomase). Generalno između oko 0.3 i 0.6 grama biomase se proizvede po garmu izvora ugljenika. Metode za određivanje količine biomase (ćelijska suva težina) u kulturi su poznate i uključuju, na primer metod koji je opisao Postma te al, "Enzvmatic analvsis of the Crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures ofSaccharomyces cervisae", Appl. Environ, Microbiol,53,468-477 (1989); i Kiers et al., "Regulation of alcoholic fermentation in batch and chemostat cultures ofClyveromyces lactisCBS 2359," Yeast, 14,459-469 91998). Postupci za određivanje količine konzumiranog izvora ugljenika su poznati i uključuju na primer HPLC metodologije.

Treba da se naglasi da efikasnost korišćenja izvora ugljenika može da zavisi od izvora ugljenika i organizma. Tako dok kompleksni medijum za rast koji uključuje izvor ugljenika drugi nego ugljeni hidrat može da koristiti, količina proizvedene biomase po gramu izvora ugljenika odnosi se na samo količinu biomase proizvedenu po gramu konzumiranog izvora ugljenih hidrata.

Uopšteno medijum za gajenje koji sadrži inhibitor ćelijske respiracije (npr., antimicin A, cijanid i azid) može da redukuje ćelijsku respiraciju, dok odsustvo ovakvih inhibitora može da potpomogne ćelijsku respiraciju. Isto tako anaerobni uslovi kultivisanja mogu da redukuju respiraciju, dok aerobni uslovi kultivisanja mogu da potpomognu ćelijsku respiraciju. Anaerobni uslov je bilo koji uslov gde se unosi kiseonik ili se prirodno nalazi i služi kao substrat za respiratorni put. Uopšteno izraz "aerobno" odnosi se na uslove kultivisanja u kojima se medijum za gajenje održava pod protokom vazduha od najmanje 0.1 VVM (zapremina vazduha/zapremina tečnosti/minut) (npr., veći od 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0,1.5 ili 2.0 VVM). Ako se koristi drugi gas nego vazduh tada normalan V VM se podešava na ekvivalent vazduha koji se bazira na količini kiseonika u gasu. Alternativno "aerobno" se može definisati kao medijum za kultivisanje koji ima sadržaj rastvorenog kiseonika od najmanje 2 posto (npr., najmanje 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75 ili 80 posto) u odnosu na količinu prisutnu u zasićenim uslovima sa vazduhom pod atmosferskim pritiskom.

Anaerobni uslov je bilo koji uslov gde se kiseonik namerno ili prirodno čini nedostupnim za respiratorni put, što dovodi do na primer, proizvodnje redukovanog proizvoda kao etanola. Uopšteno, uslov gde medijum za kultivisanje ima sadržaj rastvorenog kiseonika (RK) manji od oko 2% (npr., manji od oko 1.5, 1.0 ili 0.5% ili podjednako 0%) se smatra anaerobni uslov. Isto tako, uslov u kome VVM (zapremina vazduha/zapremina tešnosttfminut) manji od 0.1 (npr., manji od oko 0.005 ili podjednak sa oko 0) smatra se anaerobnim uslovom. Tipično izraz "vazduh" koji se ovde koristi u odnosu na VVM odnosi se na vazduh koji postoji u atmosferi. Drugi uslovi kultivisanja koji mogu uticati na ćelijsku respiraciju uključuju bez limitiranja, pH, temperaturu i prisustvo određenog izvora ugljenika (npr., glukoza). Važno je naglasiti da neki medijumi za kultivisanje i/ili uslovi kultivisanja koji potpomažu ćelijsku respiraciju u okviru jedne vrste kvasca mogu da redukuju ćelijsku respiraciju u okviru druge vrste. Na primer, prisustvo glukoze u medijumu za kultivisanje redukuje ćelijsku respiraciju u ćelijama kvasca sa crabtree-pozitivnim fenotipom dok imaju malo ili nimalo efekta na ćelijsku respiraciju u ćelijama kvasca sa crabtree-negativnim fenotipom.

Direkciona manipulacija uslova gajenja tokom komercialne proizvodnje može biti važan korak u ostvarivanju optimalnog novoa proizvodnje željenog organskog proizvoda koji je ovde opisan. Tipično ćelija kvasca iz oblasti ovog pronalska gaji se u uslovima koji potpomažu ćelijsku respiraciju da bi se proizvela signifikantna ćelijska gustina. Na primer, ćelije kvasca mogu se staviti u sud za gajenje i davati im glukozu i kiseonik. Tipično, pod uslovima koji potpomažu ćelijsku respiraciju vreme udvostručenja za mikroorganizme obezbeđene ovde je manje od 10 sati (npr., manje od oko 8, 5 ili 3 sata). Kada ćelije dostignu signifikantnu gustinu, uslovi gajenja mogu se prebaciti na uslove koji redukuju ćelijsku respiraciju tako da se proizvodi organski proizvod koji nije potreban za ćelijsku respiraciju. Na primer, ćelije kvasca se mogu prebaciti u sud za gajenje i davati im glukozu, ali ne i kiseonik. Na ovaj način direkcionim manipulisanjem uslova gajenja tako da se oni prebacuju iz aerobnih u anaerobne može se dobiti optimalni nivo proizvodnje željenog proizvoda. Alternativno u nekim slučajevima ćelije mogu biti gajene samo u uslovima koji potpomažu ćelijsku respiraciju tako da se proizvodi organski proizvod potreban za ćelijsku respiraciju. Naglašeno je da ćelijska masa u sudu za proizvodnju je veća od oko 2g/L (npr., veća od oko 4, 6 ili 8 g/L)

Tokom gajenja temperatura može biti viša od oko 35°C (npr., više do oko 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ili 45 °C). Dodatno medijum za gajenje može biti tečan. Medijum za kultivisanje tipično sadrži izvor ugljenika. Tipično izvor ugljenika uljučuje ugljeni hidrat koji sadrži svež materijal. Tipično hranljivi medijum takođe sadrži izvor azota. Poželjno je da izvor azota uključuje kombinaciju organskog i neorganskog azotnog jedinjenja.

Po jednom načinu rada, može postojati zahtev da se ispuni veliki sud za fermentaciju sa medijumom za gajenje uključujući i potrebne hranjive sastojke i sve ugljene hidrate neophodne za proizvodnju biomase i za proizvodnju željenog proizvoda. Posuda može da funkcioniše pod takvim uslovima da se proizvodnja biomase inicijalno dešava - na primer obezbeđivanjem aerobnih uslova i zatim se prebacuje na anaerobne uslove za proizvodnju željenog prizvoda.

U altenativnom načinu gajenja koristi se manji sud za proizvodnju bioomase sa visokim nivoom hranjivih sastojaka i dovoljno ugljenih hidrata za proizvodnju na primer 200g/l biomase. Sadržaj posude može se zatim prebaciti u veći sud, koji sadrži drugi medijum za gajenje sa manje hranjivih sastojaka, na primer samo glukozu kao izvor ugljenika ili drugi izvor ugljenika, ugljeni hidrat u vodi. Posuda može da funkcioniše u anaerobnim uslovima za proizvodnju željenog neorganskog proizvoda. Rast biomase je redukovan zbog redukovanog nivoa hranjivih sastojaka i anaerobnih uslova.

U poželjnom ostvarenju ovog pronalaska hranljivi medijum se odnosi na samo željeni materijal u cilju dobijanja jednostavnijeg oporavka željenog proizvoda. Upotreba aerobnog rasta može da omogući korišćenje jednostavnijeg medijuma u odnosu na potreban medijum za gajenje u anaerobnim uslovima. Mnogi ovde opisani kvasci mogu se gajiti u aerobnim uslovima u medijumu koji se sastoji samo od šećera neorganskog izvora azota, tragova minerala i nekih vitamina.

Pre dodavanja organskog proizvoda medijumu za kultivisanje kao rezultata fermentacije ili drugih procesa, medijum za gajenje ima uglavnom pH između oko 5.0 i 7.0. Međutim, kako se organski proizvodi kao organske kiseline sekretuju u medijum za kultivisanje od strane mikroorganizma pH medijum za kultivisanje ima tendenciju da se smanjuje. Izraz "organska pH" koji se ovde koristi odnosi se na pH svojstvene organskim jedinjenjima koji su prisutni u medijumu kao što su karboksilati, na primer mlečna kiselina. Izraz "neorganska pH" koji se ovde koristi odnosi se na pH svojstvene neorganskim jedinjenjima kao HC1 ili H2SO4. Medijum za kultivisanje može imati organsku pH vrednosti manju od oko 3.0 (npr., manje od oko 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6 ili 1.5) ili neorgansku pH vrednost manju od oko 3.0 (npr., manje od oko 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6 ili 1.5). Svaki izvor ugljenika može se koristiti tokom procedure gajenja. Na primer, medijum sa pentoznim ugljenikom (npr., ribozom, arabinozom, ksilozom ili liksozom) može se koristiti. Dodatno može se koristiti medijum sa hidrolizatom kukuruznih vlakana. Hidrolizat kukuruznih vlakana može da ima pH verdnosti između 2.0 i 6.5. Tipično hidrolizat kukuruznih vlakana sadrži glukozu, ksilozu i arabinozu. Na primer hidrolizat kukuruznih vlakana može da ima oko 40g/l glukoze, oko 40g/l ksiloze i oko 40g/l arabinoze.

Sledeći postupci se mogu koristiti za proizvodnju u velikim količinama. Prvo veliki rezervoar (npr., rezervoar od 50-, 100-, 200- ili više galona) koji sadrži odgovarajući medijum za kultivisanje sa na primer, heksoznim i/ili pentoznim ugljenikom se inokuliše sa određenim mikroorganizmom. Posle inokulacije uslovi kultivisanja se mogu manipulisati tako da se izvor ugljenika predominantno koristi za proizvodnju biomase. Na primer, medijum za kultivisanje može da se manipuliše tako da ima pH vrednost oko 7.0, temperaturu od oko 35°C i sadržaj rastvorenog kiseonika takav da kreira aerobno okruženje u rezervoaru. Primećeno je da se željeni organski proizvod može proizvoditi tokom faze proizvodnje biomase. Kada se jednom dostigne dovoljna biomasa, smeša koja sadrži mikroorganizme može da se prebaci u drugi rezervoar. Drugi rezervoar može biti bilo koje veličine. Na primer, drugi rezervoar može biti veći, manji ili iste veličine kao i prvi rezervoar. Tipično drugi rezervoar je veći od prvog rezervoara tako da medijum za kultivisanje u ovom drugom rezervoaru može biti isti ili drugačiji od onog koji se koristio u prvom rezervoaru. Na primer, prvi rezervoar može da sadrži medijum sa ksilozom ili arabinozom dok drugi rezervoar može da sadrži medijum sa glukozom.

Kada se prebace, uslovi kultivisanja u drugom rezervoaru mogu se manipulisati tako da izvor ugljenika se predominantno koristi za proizvodnju organskog proizvoda gde organski proizvod uključuje, između ostalog, proizvod izveden iz piruvata i ugljendioksida (CO2) ali ne uključuje biomasu (na pr. suva ćelijska težina). Kao što se ovde upotrebljava izraz "predominantno proizvodi" "selektovani organski proizvod" ili "selektovani proizvod izveden iz piruvata" kada se odnosi na uslove kultivisanja, misli se na to da izvor ugljenika u medijumu za kultivisanje se metaboliše, tipično fermentacionim procesom (i ako nije neophodno), da bi se formiralo makar 0.5 grama organskog proizvoda po gramu upotrebljenog izvora ugljenika (npr., najmanje 0.6, 0.75 ili 0.8 grama organskog proizvoda). Postupci za određivanje količine proizvedenog organskog proizvoda i/ili izvora ugljenika utrošenog su poznati i uključuju na primer HPLC.

Kao što je ranije opisano, efikasnost upotrebe izvora ugljenika može da varira u zavisnosti od substrata ili organizma. Prema tome, dok se može koristiti kompleksni medijum za kultivisanje koji sadrži izvor ugljenika drugačiji od ugljenog hirata (npr., amino kiseline), količina dobijenog organskog proizvoda ili proizvoda izvedenog iz piruvata po gramu izvora ugljenika odnosi se samo na količinu organskog proizvoda ili proizvoda izvedenog iz piruvata po gramu ugljenog hidratnog izvora ugljenika koji se konzumira. Poželjno je da na ovom nivou nije proizvedeno više od 0.3 grama biomase po gramu izvora ugljenika (npr., ne više od 0.2, 0.1 ili 0.05 grama biomase).

Na primer, medi jum za kultivisanje može da se manipuliše tako da sadrži sadržaj rastvorenog kiseonika koji stvara anaerobne uslove okruženja u rezervoaru, ili sadrži inhibitor ćelijske respiracije. Dodatno, medijum za kultivisanje može biti manipulisan tako da se održavaju određene pH vrednosti (npr., kisela, neutralna ili bazna pH vrednost). Alternativno, pH kulture se može podešavati periodično bez odražavanja određene pH. Tipično kada se proizvodi organska kiselina pH medijum za kultivisanje se održava iznad najmanje oko 1.5 (npr., najmanje od oko 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 ili 7.0). Dalje kako mikroorganizam kataboliše obezbeđeni izvor ugljenika, temperatura u rezervoaru će da raste. Tako medijum za kultivisanje može biti manipulisan tako da se održava određena temperatura. Alternativno, temperatura medijuma za kultivisanje može se periodično podešavati bez održavanja određene temperature. Tipično, temperatura manja od oko 45°C (npr., manja od oko 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36 ili 35°C) se održava kada se koriste toplotno neosetljivi mikroorganizmi. Naglašeno je da se biomasa može proizvoditi tokom ove faze proizvodnje organskog proizvoda. Dodatno, uslovi kultivisanja u drugom rezervoaru mogu se prebaciti od onih koji potpomažu proizvodnju proizvoda ka onima koji potpomažu proizvodnju biomase, ivice versa,jednom ili više puta. Na primer, uslovi kultivisanja u drugom rezervoaru mogu biti anaerobni najveći deo vremena sa kratkim pulsevima rastvorenog kiseonika tako da peiodično postoje aerobni uslovi.

U drugom postupku, anaerobni uslovi mogu biti modifikovani da povećaju metaboličku energiju kultivisanih mikroorganizama, na primer, dodavanjem terminalnog akceptora elektrona. Kao što se ovde koristi - izraz "metabolička energija" odnosi se na energiju (u smislu ATP-a), dobijenu od organizma iz energetskog izvora (kao izvora ugljenika). Pod istim uslovima količina dobijene metaboličke energije od strane organizma metabolizmom izvora ugljenika je veća nego količina energije dobijena iz istog izvora ugljenika pod različitim uslovima.

Žive ćelije su visoko organizovane i moraju kreirati red međusobno da bi preživele i rasle. Da bi se red održao u organizmu, hiljade različitih hemijskih reakcija se dešavaju u organizmu u isto vreme. Na primer ćelije imaju potrebu za energijom za biosintetske reakcije kao što su reakcije polimerizacije DNK, RNK i proteina i formiranje metaboličkih proizvoda. Ćelije takođe trebaju energiju da bi unele substrat u ćeliju, održavale metabolite u ćeliji, održavale odgovarajući turgorni pritisak i unutrašnji pH i za pokretljivost.

Pošto se energija ne može ni stvoriti ni uništiit, ćelija zahteva ulaz energije iz okruženja da bi zadržala red. Energija se uglavnom dobija iz okruženja u obliku elektomagnetne radijacije ili hemijske energije. Energija dobijena iz okruženja se upotrebljava od strane ćelije na jedan od dva generalna biohemijska mehanizma: nivo fosforilacije substrata i transport elektrona.

Generalno, pod anaerobnim uslovima ATP ("ćelijska valuta" za energiju) se proizvodi nivoom fosforilacije substrata. Na nivou fosforilacije substrata energija se oslobađa iz hemijskih veza i akumulira uglavnom u obliku ATP-a.

Primer nivoa fosforilacije substrata je konverzija glukoze do piruvata glikolizom:

Glukoza = 2 piruvata + 2 ATP + 2H2

Piruvat se zatim može prebaciti u mlečnu kiselinu:

Piruvat + 2H2= Laktat

Neto energija koja se proizvede gornjom transformacijom je jednaka 2ATP-a.

Piruvat se dalje može obrađivati do ciklusa trikarboksilne kiseline (TCA) i akumulirati dodatnu energiju i vođonikove atome:

Piruvat + 3H2= 3C02+ ATP + 5H2

Neto reakcija za glukoznu respiraciju:

Glukoza + 6 H20 = 6 C02+ 4ATP + 12H2

Tako nivoom fosforilacije substrata kompletna respiracija glukoze do C02će obezbediti neto energiju ekvivalentnu 4ATP-a i 24 vodonikovih atoma.

U "transportu elektrona" oksido-redukcioni potencijali jedinjenja koji sačinjavaju "lanac transporta elekrona" su tako uravnoteženi da svaki član može da se redukuje redukovanom formom prethodnog člana. Tako redukujuća moć kao elektroni mogu da se kreću kroz lanac molekula nosača do terminalnog akceptora elektrona kao što je kiseonik (02), azot (N2) i fumarat. Dodavanje terminalnog akceptora elektrona kao kiseonika, azota ili fumarata u medijum za kultivisanje može da obezbedi mikroorganizmima povišenu metaboličku energiju (npr., povećanu proizvodnju ATP-a za istu količinu korišćenja izvora ugljenika). Kiseonik je najpovoljniji terminalni akceptor elektrona.

Na primer, ako se koristi kiseonik kao terminalni akceptor elektrona vođonik može biti obrađivan kroz lanac transporta elekrona i može da obezbedi ćeliji dodatnih 1.5 ATP- po atomu vodonika i 3ATP- po atomu kiseonika. Generalno, količina metaboličke energije može se odrediti merenjem odnosa količine upotrebljenog kiseonika u odnosu na količinu upotrebljene glukoze. Tabela 1 predstavlja očekivana maksimalna i minimalna poboljšanja prinosa energije (molovi ATP-a po molovima glukoze) kada se doda kiseonik tokom proizvodnje u funkciji prinosa proizvoda koji se smanjuje zbog gubitka piruvata u TCA ciklusu (i konsekventno zbog respiracije). Maksimalni % poboljšanja je izračunat na osnovu pretpostavke daje P/O odnos 3 dok je minimalni % poboljšanja je izračunat na osnovu pretpostavke da je P/O odnos 0.5. Tabela 2 pokazuje procenjenu maksimalnu količinu kiseonika konzumiranu po molu konzumirane glukoze. Dodavanje kiseonika može da potpomogne minimalni rast koji sprečava biosintezu ugljenika ostavljajući male količine ugljenika dostupnim za respiraciju (i tako za korišćenje kiseonika).

Tako da bi se poboljšala metabolička energija mikroorganizama u ćelijskoj kulturi može se dodati kiseonik ćelijskim kulturama kao terminalni akceptor elektrona. Dok maksimalni molarni prinos mlečne kiseline iz glukoze je 2 mola laktata po molu glukoze i molarni prinos ATP-a iz glukoze je 2 mola ATP-a po molu glukoze, dodavanje kiseonika kao terminalnog akceptora elektrona dopušta da se deo piruvata kanališe do ciklusa limunske kiseline (TCA) gde se konvertuje u CO2i energiju. Tako obezbeđivanje terminalnog akceptora elektrona "povećava metaboličku energiju" mikroorganizma.

Perusmeravanje piruvata ka ciklusu TCA imaće tendenciju da redukuje proizvedenu količinu priozvoda izvedenih iz piruvata (kao mlečna kiselina). Na primer, redukcija prinosa može da rezultuje u generisanju 2.6 puta većoj metaboličkoj energiji za mikroorganizam, 20% redukcija prinosa može da rezultuje u generisanju 4.2 puta većoj metaboličkoj energiji i 50% redukcija prinosa može da rezultuje u generisanju 9 puta većoj metaboličkoj energiji za mikroorganizam.

Očekuje se da kasnije faze procesa, kada su prisutne veće količine metaboličkog proizvoda, kao mlečna kiselina, da tada ćelija može da zahteva više metaboličke energije da bi zadržala funkciju.

Tako može biti poželjno da se mikroorganizam izloži u okviru anaerobnih uslova medijuma za kultivisanje kratkim pulsevima ratsvorenog kiseonika. Poželjno je da "kratak puls rastvorenog kiseonika" rezultira u medijumu za kultivisanje koji ima koncentraciju rastvorenog kiseonika nc veću od 0.5 posto, poželjno između oko 0.1 i 0.5 posto. Alternativno, stopa rasta ili održavanje ćelije mikroorganizma tokom anaerobne fermentacije može biti povećano dodavanjem dodatnog terminalnog akceptora elektrona kao nitrata ili fumarata. Kiseonik se dodaje u nivou dovoljnom samo da poveća metaboličku energiju mikroorganizma dok se produktivnost održava na željeniom nivou. Mora se paziti da bi se izbegao preterani gubitak prinosa. Ova tehnika se može koristiti takođe za pomoć u konzumiranju rezidualnih šećera i tako da se dalje pojednostavi proces oporavka.

6. Postupci za prečiŠavanie organsko<g>proizvoda

Kada se proizvede, bilo koja metoda se može koristiti za izolovanje željenog proizvoda. Na primer, poznate tehnike razdvajanja mogu se koristiti za uklanjanje biomase od smeše, i poznate procedure za izolovanje (npr., procedure ekstrakcije, destilacije i izmene jona) mogu se koristiti da bi se dobio organski proizvod iz smeše bez mikroorganizama. Videti na<p>r.U.S. patent broj 4,275,234; U.S. patent broj 5,510,526; U.S. patent broj 5,831,122; U.S. patent broj 5,641,406; i međunarodnu patentnu prijavu broj WO 93/00440. Dodatno, željeni organski proizvod može biti izolovan dok se proizvodi, ili može biti izolovan iz smeše posle terminacije faze proizvodnje proizvoda. Važno je naglasiti da uslovi kultivisanja u drugom rezervoaru mogu biti manipulisani tako da se poboljšava proces izolacije. Na primer, pH i temperatura u drugom rezervoaru mogu biti manipulisani tako da željeni organski proizvod precipitira iz rastvora ili je u obliku koji je mnogo pristupačniji za izolaciju. Specifično, pH vrednost organske kiseline pri kojoj može da precipitira iz rastvora je kada je pH smeše manja od pKa vrednosti organske kiseline. Na primer, uslovi kultivisanja dok se proizvodi glutamiska kiselina mogu biti takvi daje pH manji od 2.19, što je pKa vrednost za glutamisku kiselinu. Tako manipulisanjem pH, temperature i sadržaja smeše može da se olakša izolacija organskog proizvoda. Dodatno kvasac genetički manipulisan na određen način može biti selektovan i/ili specifični uslovi gajenja mogu biti manipulisani tako da bilo koji bioprodukti u smeši su takvi da ne ometaju oporavak željenog organskog proizvoda.

Razume se da ovde opisani postupci i materijali mogu biti adaptirani za upotrebu za bilo koji tip procesa kultivisanja uključujui, bez limitiranja, procese koji se odnose na procese "kontinulane fermentacije" i "serijske fermentacije". Dodatno, mikroorganizmi koji se koriste za procese proizvodnje mogu biti povraćeni i ponovo se koristiti u kasnijim proizvodnim procesima. Na primer, bilo koji izvor ugljenika može da se koristi. Na primer, aloza, altroza, glukoza, manoza, guloza, iodoza, galaktoza, taloza, melibioza, saharoza, fruktoza, rafinoza, stahioza, riboza, arabinoza, ksiloza, liksoza, škrobovi kao kukuruzni škrob i pšenični škrob, i hidrolizati kao hidrolizat kukuruznih vlakana i drugi celulozni hidrolizati mogu se koristiti kao izvori ugljenika za poroizvodnju ili biomase ili želejnog organskog proizvoda. Dodatno biio koji medijum se kože koristiti. Na primer, mogu se koristiti standardni medijum za kultivisanje (npr., kvaščev minimalni medijum i YP medijum (ekstrakt kvasca lOg/L, smeŠa peptona 2.g/L)) kao i medijumi kao "corn steep water" i "corn steep liquor".

Značajna prednost ovog pronalaska je da poželjni mikroorganizmi, pogotovo oni gajeni u aerobnim uslovima, mogu koristiti minimalni medijum. Anareobna proizvodnja tipično ne zahteva dodatne hranjive materije, tako da finalni proizvod može biti izolovan iz relativno čiste fermentacione smeše bilo kojim tehnikom za separaciju. Ekstrakcija tečnost-tečnost je dobro poznata tehnika za separaciju organskih kiselina od fermentacione smeše i dovodi do značajnog prečišćavanja. U ovom pronalaksu veruje se da jednostavniji, jeftiniji, manjnje energetski zahtevni sistemi mogu takođe biti korisni.

U jednom ostvarenju ovaj pronalazak koristi genetički modifikovan kvasac sa crabtree-negativnim fenotipom u tipu procesa "voz" koji indukuje prebacivanje u metaboličkom putu posle dostizanja kritične ćelijske gustine i u kom vremenu je neophodno dramatično povećanje specifične produktivnosti želejnog organskog proizvoda. Tipični postupak za indukciju prebacivanja metaboličkog puta je pomeranje biomase iz visoko aerisane posude u anaerobnu posudu, izazivajući gladovanje za kiseonikom. Naglašeno je da se poznati ugljeni hidrati (npr., glukoza ili ksiloza) mogu koristiti kao izvori ugljenika tokom obe, i faze rasta i proizvodne faze. Upotreba genetički modifikovanog kvasca koji ima crabtree-negativni fenotip može da bude kritičan za uspeh ovog ostvarenja. Dodatno specifična produktivnost željenog organskog proizvoda može biti kritična za uspeh. Izraz "specifična produktivnost" koji se ovde koristi odražava količinu proizvedenog organskog proizvoda i predstavljen je brojem grama proizvedenog organskog proizvoda po gramu biomase (suve težine) po satu t.j., g/(g<*>satu). Tipično, specifična produktivnost organskog proizvoda, kao lakatata i akrilata je veća nego oko 0.1 g/(g<*>satu), na primer, veća od 0.2 g/(g<*>satu), ili veća od 0.5 g/(g<*>satu). Obezbeđivanjem visoko specifične produktivnosti kao što je ovde opisano, energija potrebna za održavanje ćelije može se dobiti preko puta fermentacije proizvoda pod totalnim anaerobnim uslovima, pre nego da se oslanja na aeraciju da bi se stvarale visoke količine energije preko respiratornog puta. Naglašeno je da potpuno anaerobne posude se aerišu nivoom manjim od oko 0.1 VVM. U određenim situacijama proizvodnje neće se koristiti aeracija. Dodatno, prinos (t.j., g organskog proizvoda/g konzumiranog izvora ugljenika) u ovom ostvarenju tipično je veći od oko 70 tež.% i proizvodi se bez dodavanja izvora ugljenika kao etanola ili acetata. U nekim slučajevima da bi se dobila specifična produktivnost potrebna za generisanje neophodne energije za održavanje ćelije, može biti potrebno da se pojača put od glukoze do piruvata u cilju obezbeđivanja potrebnih enzima za proizvodnju željenog proizvoda.

U drugom ostvarenju, proces tipa "voz" može biti dizajniran tako da samo visoko aerisana posuda za rast je opremljena mogućnošću sterilizacije. Anaerobna posuđa za proizvodnju tipično radi na temperaturama većim od 35°C (npr., većim od 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ili 45°C). Nekoliko divljih sojeva kvasca biće u mogućnosti da prežive i kompetiraju sa genetički modifikovanim kvascem na takvim temperaturama, na kojima pH pada tokom proizvodnje proizvoda, pogotovo jer neće imati pojačan put fermentacije koji može da stvori energiju za održavanje ćelije. Dodatno, kvasac se može konstruisati tako da sadrži "plazmid ubicu" kao što je ovde opisano, koji može da spreči kvasac drugih vrsta u perživljavanju.

Pronalazak takođe obezbeđuje različite metode za kultivisanje ćelija kvasca. Na primer, ćelija kvasca sa crabtree-negativnim fenotipom može da se kultiviše sa medijumom za kultivisanje koji ima ili organske pH vrednosti manje od oko 3.0, ili sadži hidrolizat kukuruznih vlakana. Druge metode za kultivisanje ćelija kvasca uključuju, bez limitiranja, ćelije kvasca za kultivisanje sa crabtree-negativnim fenotipom na temperaturi većoj od oko 35°C sa medijumom za kultivisanje koji ima ili neorgansku pH vrednosti manje od oko 3.0, ili sadži pentozni izvor ugljenika ili hidrolizat kukuruznih vlakana.

Dalje, pronalazak obezbeđuje proces za pravljenje organskog proizvoda. Ovaj proces uključuje gajenje mikroorganizma u uslovima za kultivisanje, i promenu uslova kultivisanja da bi se potpomogla proizvodnja organskog proizvoda. U ovom procesu, mikroorganizam ima redukovanu piruvat dekarboksilzanu, alkohol dehidrogenaznu, aldehid dehidrogenaznu, i/ili acetilCoA sintetaznu aktivnost i pokazuje stepen rasta u odsustvu etanola i acetata koji je najmanje 30 posto (npr., oko 35,40, 50, 75, 100, 150, 200 posto, ili više) u odnosu na onaj uočen kod odgovarajućeg mikroorganizma koji nema redukovanu piruvat dekarboksilzanu, alkohol dehidrogenaznu, aldehid dehidrogenaznu, i/ili acetilCoA sintetaznu aktivnost. Tipično, uslovi kultivisanja koji potpomažu ćelijsku respiraciju koriste se u situacijama gde je potreban brz rast, ili gde se organski proizvod koji treba proizvesti ne može proizvesti bez ćelijske respiracije, dok uslovi kultivisanja koji redukuju ćelijsku respiraciju se koriste tamo gde nije potreban brz rast, ili gde se organski proizvod koji treba proizvesti može proizvesti bez ćelijske respiracije.

Pronalazak će biti dalje opisan u sledećim primerima, koji ne limitiraju obim pronalaska koji je opisan patentnim zahtevima.

PRIMERI

Primer 1- Rekombinantni plazmid pHES/ nSEH

0.5 ug plazmida pGAD424 opisani od strane Chien et al.( Proc. Nat' l AcadSci.,88(21 ):9578-9582

(1991)) je digeriran sa restrikcionim enzimom Hindlll. Smeša sa digestijom je razdvojena elektroforezom na 0.8% agaroznom gelu, u TBE puferu. Fragment od 5.9 kbp je dalje prečišćen sa gela kao što je opisao Sambrook et al.,( Molecular Cloning,second edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainview, NY, (1989)). Dizajniranje komplementarni par sintetičkih oligomera od 92 bp sa višestrukim mestima koje prepoznaju restrikcioni enzimi. Prvi je bio fwd hes oligo sa sledećom sekvencom:

Dnigi

je nazvan comp hes oligo i ima sledeću sekvencu:

S'-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCACTAGTAGATCTACGCGTGGTACCC

TGCAGGGATCCCCCGGGGAATrCAAGCTTGGG-3' (SEQ ID NO:2). 500 nm dva komplementarna oligomera su zagrevana u toku 10 minuta a zatim polako ohlađena do sobne temperature. Dvostruka DNK od 92 bp je digerirana sa Hindlll i vezan za 5.9 kbp pGAD424 koji je takođe isečen sa Hindlll. Ligaciona smeša je korišćena za transformacijuE. coliDH10B (elektromaks ćelije, Life technologies, Rockville, MD) elektroporacijom koja je opisana od strane Sambrook et al., (Molecular Clonong, second edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainview, NY, (1989)). RekombinantnaE. colije zasejana na LB (Lauria-Bertani) šolju i ćelije koje sadrže plazmid su selektovane pomoću 100 ug/ml antibiotika ampicilina. Plazmidna DNK iz ampicilin rezistentnih klonovaE. colije pregledana na prisustvo dva plazmida pHES ipSEH (slikal i 2). Dva plazmida se razlikuju u orjentaciji sintetičkih oligomera u odnosu na vektorski promotor alkoholne dehidrogenaze-ADH1.

Primer 2-PCR amplifikaciia nukleinske kiseline koja kodira laktat dehidrogenazuiz

Lactobacitlus helveticusiPediococcus acidialactici

Genomska DNK je izolovana iz prekonoćne kultureLactobacitlus helveticus(ATCC 10797) iPediococcus acidialactici(ATCC 25741) pomoću PUREGENER kita za izolovanje DNK (Gentra svstems, Minneapolis, MN). PCR prajmeri su dizajnirani u cilju izolovanja nukleinske kiseline koja kodira laktat dehidrogenazu iz genommske DNKL helveticus(lh-ldh oligo-i) iP. acidilactici(pa-ldh oligo-i). Ovi prajmeri su dizajnirani na osnovu objavljenih genskih sekvenci za laktat dehidrogenaze u bazama podatka genskih banaka (Genebank) bazama podatka, i imaju sledeće sekvence:

3' pa-ldh, 5'- CCAAGATCTITATTrGTATTGTTTTTCAGCAAG-3' (SEQ ID NO:6). Prajmeri su optimizovani pomoću softvera Primer designer nabavljenim od Sci-ed softvvare (Durham, NC). Upotrebljen je jedan urnol genomske DNK zajedno sa 100 nmola prajmera. Pfu DNK polimeraza (New England Biolabs) je korišcena za PCR amplifikaciju nukleinske kiseline laktat dehidrogenaze (LDH), kao što je opisao Sambrook et al,( Molecular Cloning,second edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainvievv, NY, (1989)).

Slična strategija je upotrebljena za izolaciju nukleinske kiseline koja kodira L-laktat dehidrogenazu iz genomske DNK mikroorganizma kao što jeBacillus sp.,na primerBacillus megaterium(ATCC 6458) iliRhizopus oryzae(ATCC 76275) ili bilo koji organizam koji proizvodi laktat dehidrogenazu (uključujući mikroorganizme kao što su gljive i bakterije i višećelijski organizmi kao sisari) ili iz tkiva organizma koji proizvodi laktat dehidrogenazu. Genomska DNK je izolovana iz kultura organizama koje rastu pomoću PUREGENER<®>kita za izolovanje DNK (Gentra svstems, Minneapolis, MN). Odgovarajući PCR prajmeri su dizajnirani u cilju izolovanja nukleinske kiseline koja kodira laktat dehidrogenazu iz genomske DNK bazirani na osnovu LDH genskih sekvenci za te vrste koje su dostupne u genskim bankama (Genebank). Uopšteno upotrebljen je jedan umol genomske DNK zajedno sa 100 nmola odgovarajućih prajmera. Pfu DNK polimeraza (New England Biolabs) ili bilo koja prikladna DNK polimeraza je korišćena za amplifikaciju nukleinske kiseline laktat dehidrogenaze (LDH), iz odgovarajuće genomske DNK pomoću PCR tehnologije, na primer kao što je opisao

Sambrook et al.,( Molecular Cloning,second edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainvievv, NY,

(1989)).

Alternativno, nukleinska kiselina koja kodira laktat dehidrogenazu je izolovana izKlyveromyces thermotoleransATCC 52709,Trichoderma ReeseiATCC 13631,Torulaspora pretoriensisATCC 36245, ili bilo kojeg drugog organizma koji proizvodi laktat dehidrogenazu, koristeći jednu od sleđećih metoda. 1) Genomska cDNK biblioteka iz jednog od ovih organizama je klonirana u standardniE. coliekspresioni vektor ka što je pUC19 korišćenjem standardni tehnika (Sambrook et al., (1989)Molecular Cloning: a laboratory manual,2nd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainview, NY). E. coli (Idh'plT) mutantni soj NZN111 (Bunch et al., (1997)"The IdhA gene encodingthe fermentative lactat gehydrogenase o/ Escherichia coli"Mierobiologv, 143:187-95) je transformisan sa ovom bibliotekom i ćelije su gajene u anaerobnim uslovima u M9 medijumu obogaćenim sa kazamino kiselinom. Bilo kojaE. colikoja raste u ovakvim uslovima kodira ili laktat dehidrogenazu ili je revertant za lđh ili pfl. Pozitivne (kolonije koje se formiraju u anaerobnim uslovima) se pregledaju na LDH aktivnost pomoću kolorimetrijskog eseja - laktat specifičnog premaza top-agara (LASSO) koji je u sanju da razlikuje (L)-LDH I (D)-LDH (Witte et al.,J. Basic Microbiol.29:707-716 (1989). Plazmidna DNK iz klonova za koje se pretpostavlja da eksprimiraju L-laktat dehidrogenazu se dalje izoluje i sekvencira. 2)K thermotoleransATCC 52709,T. reeseiATCC13631 iTorulaspora pretoriensisATCC 36245 su eukarioti koji proizvode L-mlečnu kiselinu kada se gaje u anaerobnim uslovima (Witte et al.,J. Basic Microbiol.29:707-716 (1989). Tako na osnovu ove metode, makar jedan od ovih sojeva se gaju u anaerobnim uslovima da bi se indukovala laktat dehidrogenazna enzimska aktivnost. Ekstrakt oslobođen iz ćelija se zatim dobija standardnim metodama i prolazi neku od poznatih procedura za prečišćavanje proteina da bi se izolovao enzim laktat dehidrogenaza. Postupci za prečišćavanje laktat dehidrogenaze su poznati (Kelly et al., (1978)" Affinity chromatography of hacterial lacatte dehidrogenases",Biochem J, 171(3):543-7). Kada je protein prečišćen, parcijalno se seče i sekvencira da bi mu se odredila amino kiselinska sekvenca. Amino kiselinska sekvenca se zatim koristi za dizajniranje degenerativnih prajmera da bi se izolovao gen koji kodira laktat dehidrogenazu iz genomske DNK.

Eukariotska LDH, kao ona izolovana izK. thermotoleransiliTriochoderma reeseiiliTorulaspora pretoriensismože da funkcioniše bolje (u smislu efikasnosti transkripcije, efikasnosti translacije i/ili proetinske aktivnosti u kvascuK. marksianusu poređenju sa LDH iz bakterijskih izvora kao što suBacillusiliLactobacillus.3) Koristeći poznate sekvence gena za laktat dehidrogenazu kod eukariota koje su dostupne u Genebank, degenerativni prajmeri su dizajnirani da bi se se izolovao enzim laktat dehidrogenaza iz genomske DNK izK. thermotoleransATCC 52709,T. reeseiATCC13631 iliTorulaspora pretoriensisATCC 36245. Konzervirano NAD+ vezujuće mesto i mesto za vezivanje piruvata u okviru LDH genske sekvence se koriste za dizajniranje degenerativnih prajmera. Upotrebljen je jedan umol genomske DNK zajedno sa 100 nmola prajmera. Pfu DNK polimeraza (New England Biolabs) ili bilo koja prikladna DNK polimeraza je korišćena za amplifikaciju fragmenta nukleinske kiseline L+ laktat dehidrogenaze (LDH), pomoću poznatih metoda PCR-a, na primer kao onih koje je opisao Sambrook et al.,( Molecular Cloning,second edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainvievv, NY, (1989)).

Primer3 -KloniranjeL . helvetic i P . acidilacticiu vektor pCRII

PCR-om amplifikovani LDH DNK prizvodi ligirani su sa pCRII vektorom (Slike 3 14) pomoću TA kita za kloniranje nabavljenim od Invitrogen (Carlsbad, CA). Ligaciona smeša je korišćena za transformaciju E.coli DH10B postupkom koji je opisao Sambrook et al.,( Molecular Cloning,second edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainvievv, NY, (1989)). PCRII vektori iz kita omogućili su brzo kloniranje PCR produkta na osnovu instrukcije proizvođača. pCRII vektori sa LDH genima izL. helveticusiP. acidilacticiprikazani su na slici 4.

Primer 4-Rekombinantni plazmid pLh Idh- HES/ pPA ldh- HESsaL . helveticusiP . acidilactici

LDHgenimau pHES vektoru

PCRII vektori sa LDH genima izL. helveticusi P.acidilacticisečeni su odgovarajućim restrikcionim endonukleazama. pHES vektor je slično digestiran sa istim restrikcionim endonukleazama. Insert od 1 kbp koji sadrži LDH iz pCRII vektora je zatim ligiran sa o.6 kbp pHES vektorom pomoću T4 DNK ligaze kao što je opisao Sambrook et al.,( Molecular Cloning,second edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainvievv, NY, (1989)). Ligaciona smeša je korišćena za transformacijuE. coliDH10B (elektromaks ćelije, Life technologies, Rockville, MD), i rekombinantni klonovi su selektovani na rezistenciju na ampicilin. DNK izolovana iz rekombinantnih klonova analizirana je da bi se potvrdilo prisustvo pLh ldh-HES i pPA ldh-HES vektora (slika 5). Ovi vektori sadrže gene koji kodiraju LDH izL. helveticusiP. acidilacticiu pHES vektoru koji stoje pod kontrolom promotora za alkoholnu dehidrogenazu kvasca (ADH1).

Primer 5 - KloniranjeBacillussp,Rhizovus orvzae , K . thermotolerans , Trichoderma reseeiili

Torulaspora pretoriensisgena za LDH za ekspresiju upotrebom promotoraSacharomvcesPDC1

gena

Iako je moguće koristiti promotor laktat dehidrogenaze poreklom izRhizopus oryzae, K, thermotolerans, Trichoderma reseeiiliTorulaspora pretoriensisza kontrolu ekspresije gena za laktat dehidrogenazu kloniranu uK. marxianus,PDC1 promotor izSacharomyces cervisiaemože da se koristi kao kontrolor ekspresije izolovanog gena za laktat dehidrogenazu. Glikolitički promotoriSacharomyces cervisiaeuspešno su se koristili za ekspresiju gena u slojevimaKlyueromyces.(Gelissen i Hollenberg, (1997)" Application ofyeast in gene expression studies: a comparison of Sacharomycescervisiae, Hanensula polvmorpha and Llyveromyces lactis - a review," Gene, 190(l):87-97).

Prema tome, PDC1 promotor izSacharomyces cervisiaese dobija dizajniranjem odgovarajućih oligomernih prajmera koristeći genomsku sekvencuSacharomyces cervisiaekoja je dostupna u Genebank-u. Genska sekvenca PDC1 i regioni od lkb koji okružuju PDC1 gen umnožavaju se PCR tehnologijom. Dobijeni DNK fragment od 4 kb sadrže i promotor i terminator koji kontrolišu ekspresiju PDC1 gena. Mnogostruka mesta za restrikcione enzime uključena su između promotora i terminatora koji kontrolišu ekspresiju PDC1 gena tako da se različiti LDH geni mogu ubaciti i biti pod kontrolom promotora i terminatora PDC1 gena. DNK fragment od 4 kb je ubačen u pogodan vektor, kao pUC19 koji se bazira naSacharomyces cervisiaeiliE. colišatl (shuttle) vektoru. Zatim se LDH gen ubacuje u vektor na jedno od višestrukih mesta za kloniranje, pod kontrolu promotora i terminatora tako da je ekspresija gena za laktat dehidroigenazu kontrolisana PDC1 promotorom i terminatorom, (slika 14). Alternativno drugi glikolitički promotoriSacharomyces cervisiaekao oni koji kontrolišu ekspresijuSacharomyces cervisiaegena za gliceraldehid-3 fosfat dehidrogenazu ili fosfo-glicerat kinazu mogu biti upotrebljeni na sličan način za ekspresiju kloniranog LDH gena uK. marxianus.

Primer 6 - Umnožavanje linearnih fragmenata homologe DNK za remećenje gena za piruvat

dekarboksilazu.

Oligomerni prajmer od 82 bp (5'kmPDClKo) dizajniranje tako da sadrži 51 bp identični sa 5' krajem piruvat dekarboksilaze (PDC) izK. mancianusi 30 bp identičnih sa 5' krajem ADH1 promotora iz pHES vektora. Sekvenca 5'KmPDClKo je sledeća:

5'-TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACCCAAACCAAATAATTGCAATGCAAC

TTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCT-3' (SEQ ID NO:7). Sekvenca za PDC1 gene iz kvasca( K. marksianusiliY. stipitisili//. polymorpha)dobijena je na osnovu podnete sekvence u Genebank-u. Slično ovome reverzni oligomer od 79 bp (3'kmPDClKo) dizajniran je tako da da sadrži 54 bp identični sa 3' krajem PDC gena izK. marxianusi 22 bp identičnih sa 3' krajem ADH1 terminatora. Sekvenca 3'KmPDClKo je sledeća:

5' -TTATA AAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATCTCTTTATCCTCTCCCTCTCTAC AT

GCCGGTAGAGGTGTGGTCA-3' (SEQ ID NO:8). Prajmeri su dizajnirani da bi se umnožio linearni DNK fragment iz pLhldh-HES i pPaldh-HES plazmida tako da fragment sadrži ceo gen za laktat dehidrogenazu zajedno sa promotorim i terminatorom ADH1 (slika 6). Proizvod umnožen PCR-om takođe sadrži krajeve gde homologe sekvence iz iliK. marxianusPDC1,Yamadazyma stipitisPDC1 i PDC2,Hansenula polymorphaPDC1 i PDC2 reakcija umnožavanja urađena je pomoću Pfu DNK polimeraze (New England Biolabs, Beverlv, MA). 100 ng pLhldh-HES i pPaldh-HES upotrebeljeno je u reakciji zajedno sa 5 unit-a (jedinica) polimeraze i 100 nmol-a oligomera. Reakcija je izvedena na osnovu protokola koje su opisali Sambrook et al.,( Molecular Cloning,second edition, Cold Spring Harbour Laboratorv, Plainvievv, NY, (1989)). Slika 6 prikazuje finalni linearni proizvod sa opisanim homolozima.

Alternativni konstrukti su pripremlejni da bi se poboljšala verovatnoća dobijanja pdc negativnih sojevaK. marxianus.Za pripremu ovih konstrukata izolovan je fragment od 5.5 kbp koji okružujeK. marxianus1.7 kbp PDC1 gen (slika 6b) pomoću PCR-a i tehnike hodanja genoma (gene vvalking, Clonetech). Fragment od 5.5 kbp je zatim kloniran u pCRII TA vektor za kloniranje (Invitrogen) pomoću standardnih metoda. Deo od otprilike 370 bp blizu sredine kodirajućeg regiona od 1.7 kbp PDC1 je uklonjen izK. mancianus5.5 kbp fargmenta restrikcionim sečenjem (Sambrook). Uklonjeni fragment ima sledeću sekvencu:

Gen za rezistenciju na kanamicin i njegov promotor izolovan je iz pPIC9K vektora (Invitrogene) pomoću standardne tehnologije sečenja (videti Sambrook et al.), kloniran u mesto u okviru 5.5 kbp iz koga je gore identifikovani fragment uklonjen. pPIC9K (Invitrogene) gen za rezistenciju na kanamicin i njegov promotor ubačeni su tako daje sekvenca insertovanog regiona sledeća: Dobijeni konstrukt sadrži G418 gen za rezistenciju koga okružuje približno 5 kbp pdc region kao stoje prikazano na slici 6c. Napravljen je sličan DNK konstrukt koji sadrži internalni G418 gen koga okružuje približno 2.3 kbp PDC iz K. mancianus u pCRII vektoru kao što je prikazano na slici 6d.

Primer 7 - Upotreba linearnog DNK fragmenta za remećenje endogene PDC kodirajuće sekvence

i za istovremeno ubacivanje LDH kodiraiuće sekvence

Linearni DNK fragment dobijen PCR-om opisan u primeru 5 korišćen je za transformacijuK. mancianus, Yamadazyma stipitisiliHansenula polymorpha.Protokol za transformaciju je opisan od strane Wesolowski-Louvel et al.( Nonconventional yeasts in biotechnology: Klyveromyces lactis,ed. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlin, p. 138-201 (1996)). Ukratko, 5 ml prekonoćne kulture je oboreno i isprano sa elektroporacionim puferom (10 nM Tric-HCl, 270 nM saharoza, 1 nM MgCl2, pH 7.5). Isprane ćelije su inkubirane 30 minuta na 30°C u puferu za inkubaciju (ekstrakt kvasca 5g/l, pepton broth lOg/1, glukoza 10 g/l, 25 nM DTT, 20 nM HEPES, pH 8.0). Na kraju ovog perioda ćelije su ponovo isprane i resuspendovane u 400ul inkubacionog pufera. 200 ng DNK je dodato ovim ćelijama i ćelije su pulsirane pomoću Bio Rad Gene Pulser na 1800 volti, 1000 oma i 25 p.F u kivetama od 0.4 cm.

Ćelije su zasejane na regularne YPD šolje (ekstrakt kvasca 10g/l, pepton broth 20g/l, glukoza 20 g/l, i 15% agar) i kolonije su se regenerisale tokom 72 sata. Svaka od šolja sa kolonijama je ponovo identično zasejana (replica plated) na sveže YPD šolje i inkubirana 48 sati. Kolonije su zatim prekrivene sa 6.5% mekim agarom (soft agar) (0.5% agar u 300mM tris-HCl, 187 mM glutamat, pH 8.3). Mešavina za bojenje (3.2 ml 1% agara, 1.6 ml 120 mM Tris, 75 mM glutamat, pH 8.3, 0.4 ml 2 mg/ml fenazin metosulfata, sedam unit-a glutamat piruvat transaminaze i 7 unit-a L(+) laktat dehidrogenaze iz mišića svinje) dodato je na prekrivene šolje. Sojevi kvasca sa visokom količinom L(+) formiraju plave oreole u okviru 10-120 minuta. Ovaj metod je sličan metodu koji predlažu Subden et al.( Canadian J. Microbiol.,28:883-886 (1982)) i modifikovano od strane Witte et al,( J. Basic Microbiol.29:707-716 (1989)). Kolonije se selektuju i DNK izolovana iz kolonija se testira PCR analizom i sekvencira radi detekcije izmenjenog gena za piruvat dekarboksilazu.

U drugom ostvarenju, klonovi gore opisani u primeru 6 i prikazani na slikama 6c i 6d seku se sa dva restrikciona enzima (videti Sambrook et al.) Što dovodi do stvaranja oko 3 mikrograma DNK fragmenta koji sadrži homolog PDC region koji uključuje središnju sekvencu u koju je ubačen gen za rezistenciju na kanamicin.K. mancianus jetransformisan sa fragmentom pomoću poznatih tehnika, kao što je elektroporacija da bi se poremetio pdcK. mancianus.

Uopšteno metod elektroporacije se odvijao sleđećim redosledom: a) kultura mikroorganizma raste u YPAD-u preko noći (oko 15h) u zapremini 20 ml; b) 500ul kulture prebaciti u epruvete za mikrofugu, centrifugirti @4K, 4 min, baciti supernatant; c) isprati talog sa lml hladnog EP (EP= pufer za elektroporaciju: lOmM Tris-HCl, pH 7.5, 270mM saharoza, lmM MgCh); d) resuspendovati je u 1 ml IP (IP= pufer za inkubaciju: YPD, 25mM DTT, 20mM HEPES, pH 8.0) e) šejkirati @800 oum, 30C, 30 min u Eppendorf termomikseru; f) oboriti u centrifugi, isprati jednom sa EP, resuspendovati u 400ul EP; g) dodati 3 mikrograma fragmenta DNK (u vodi, lOmM Tris-Cl, pH 8.5) inkubirati na ledu 30 min; h) prebaciti u 0.4cm kivete za elektroporaciju. Bio-Rad Gene Pulsar podešavanja: 1000V, lOOOoma, 50uF. Vremenska konstanta posle pulsa: oko 20msec; i) prebaciti u Morton Closure epruvete od 3 ml, inkubirati bez šejkiranja na 30°C tokom 1 sata. Dodati 400ul tečnog YPAD medijuma (YPAD: lOg Yeast Extract-ekstrakt kvasca, 20g peptona, 20g glukoze, lOOmg Adenin Hemisulfata. Zapremina=lL. Bez podešavanja pH), šejkirati na @800oum, 30°C tokom 1 sata u Eppendorf termomikseru; k) dodati 400u tečnog YAPD i ostaviti da se oporave 4-6 sati j) oboriti u epruvetama za mikrofugu @4K, 4 min, odbaciti supernatant, resuspendovati u 400ul IM sorbitola; k) plejtovati na 200ug/ml G418 selektivnim šoljama i; 1) inkubirati na 30°C tokom tri do pet dana.

Kolonije su proverene ponovnim zasejavanjem (second patching) na 300ug/ml G418. Genomska DNK je izolovana iz sekundarnih kolonija kvasca (secondarv yeast patch) pomoću standardne pripreme genoma (Sambrook). Izolovani genom je proveren pomoću PCR-a na 1) prisustvo kanamicinskog fragmenta pomoću odgovarajućih prajmera i uslova (Sambrook) i 2) odsustvo izmenjenog pdc regiona pomoću odgovarajućih prajmera i uslova PCR-a. Kolonije pozitivne za selekcioni marker i negativne za pdc izmenjeni region su zatim kultivisane i analizirane na HPLC-u zbog fiziologije. Genomska DNK iz ovih sojeva je dalje analizirana pomoću Southern hibridizacione analize (southern hvbridization analvsis).

Primer 8- Osobine rasta ćelija

1.NizakpH/visoka temperatura

Prekonoćne kultureK. marxianusinokulisane su sa 50 ml minimalnog medijuma za kvasac po receptu Kiers et al.( Jeast,14(5):459-469 (1998). 100 g/l glukoze dodato je kao izvor ugljenika. Prekonoćne kulture držane su na 40°C i inokulisane u medjium koji je takođe bio na 40°C. Dodavanje inokolutanta promenilo je pH medijuma sa 5.5 na 2.5. Tokom eksperimenta pH je ostala 2.5. Koncentracija glukoze merena je pomoću YSI membrane, i optička gustina (OD) merena je spektrofotomerom.

Glukoza je iskorišćavana tokom 72 sata, što ukazuje na to da metabolička aktivnost se odigrava u uslovima gajenja pri niskoj pH i visokoj temperaturi tokom tog vremenskog perioda (slika 7), Dodatno biomasa se smanjila samo malo tokom perioda od 48 do 72 sata što ukazuje da ćelijski katabolizam preovlađuje anabolizam (s!ika7).

2.Izvori pentoznogšećera

Prekonoćne kultureK mancianusinokulisane su u tri flaska od 50 ml koji sadrže minimalni medij ume za kvasac po receptu Kiers et al.( Yeast,14(5):459-469 (1998). Svaki od tri flaska sadržao je različiti izvor ugljenika. Prvi je sadržao 10 postotnu glukozu, drugi je sadržao 10 postotnu D-ksilozu, a treći je sadržao 10 postotnu L-arabinozu. Ovi flaskovi su inkubirani na 30°C i periodično su mereni OD-ovi.

Posle 40 sati, prinos biomase za kulture kvasca kultivisane sa glukozom ili ksilozom bio je sličan, dok je prinos biomase za kulture kvasca kultivisane sa arabinozom bio niži (slika 8). Poredeći rast kulture kvasca kultivisane sa glukozom sa onim kultivisanim sa ksilozom ili arabinozom otkriveno je inicijalno lag vreme rasta. Kvasac gajen sa arabinozom imao je lag vreme od nekoliko sati dok je lag vreme za kvasac gajen sa ksilozom bilo mnogo izrazitiji (slika 8). Prisustvo ovog lag vremena ukazuje na to da ćelije kvasca trebaju vreme da se adaptiraju na ksilozu i arabinozu kao izvor ugljenika. Pretpostavlja se daje ovo vreme potrebno da se indukuje sinteza polipeptida koji se nenormalno eksprimiraju.

3.Hidrolizat kukuruznih vlakanapri niskojpH

Prekonoćne kultureK. mancianusinokulisane su u flaskove sa minimalnim medijumom za kvasac po receptu Kiers et al.( Yeast,14(5):459-469 (1998). Svaki flask je sadržao kao izvor ugljenika 30% hidrolizat kukuruznih vlakana. Ukratko, hidrolizat kukuruznih vlakana je pripremljen u reakciji u kojoj je kukuruznim vlaknima dodata 1.2% sumporna kiselina na 145°C tokom 25 minuta. Tokom reakcije hemiceluloza je razlagana do monomemih proizvoda arabinoze, ksiloze i glukoze. Usled visoke temperature tokom reakcije, deo arabinoze i ksiloze se razložio do furnirala, dok se deo glukoze razložio do hidroksimetilfurfurala. HPLC analiza hidrolizata otkrila je prisustvo 38.7 grama/L glukoze, 39.1 grama/L ksiloze , 20.7 grama/L arabinoze i 1.6 grama/l furfurala. Dodatno, pH hidrolizata je bila 1.51. Pre kultivisanja kvasca pH hidrolizata je podešena na 3.0. Tokom eksperimenta kultivisanja, OD je merena periodiCno.

Ćelije kvasca su bile sposobne da generišu biomasu kada su kultivisane sa hidrolizatom kukuruznih vlakana (slika 9).

4. Različiti pH uslovi

Prekonoćne kultureK. marxianusinokulisane su u četiri flaska koji su sadržali YPD medijum za kvasac (ekstrakt kvasca lOg/L, pepton broth 20g/L, glukoza 20 g/L). Svaki flask imao je različit pH, koji je podešavan sa HCl.-om. Tokom eksperimenta kultivisanja, temperatura je održavana na 30°C, i periodično su mereni OD-ovi. Rast je zabeležen u svim flaskovima (slika 10).

5. Različiti pH uslovi/ mlečna kiselina

Prekonoćne kultureK. mancianusinokulisane su u četiri flaska koji su sadržali YPD medijum za kvasac (ekstrakt kvasca lOg/L, pepton broth 20g/L, glukoza 20 g/L) kao i 40g/L mlečne kiseline. Dodavanje mlečne kiseline rezultovalo je u pH 2.8. Zato pH u tri flaska je podešena na označenu pH pomoću NaOH. Tokom eksperimenta kultivisanja, temperatura je održavana na 30°C, i periodično su mereni OD-ovi. Rast je zabeležen u svim flaskovima (slika 11).

Primer 9 - Rekombinantne ćelije sposobne za proizvodnju akrilil- CoA

Organizam koji ne može da koristi akrilat kao izvor ugljenika (na pr.E. coli)transformisan je sa genomskom DNK bibliotekom izClostridium propionicum.DNK bibliotekaC. propionicumnapravljena je pomoću pHEPES plazmida tako da eksprimira fragment od 10 kbp iz genomaC. propionicum.TransformisaneE. colizasejane su na selekcioni medijum sa akrlatnom kiselinom kao jedinim izvorom ugljenika. Samo one ćelije koje imaju sposobnost da asimiluju akrilat, mogu da rastu. Akrilat se normalno asimiluije konverzijom u laktat koja je posredovana enzimom. Dalje laktat može biti konvertovan u piruvat i korišćen od strane ćelija preko Krebsovog ciklusa.

Jednom kada se selektuje transformisana ćelijaE. coli,izolije se DNK plazmid iz genomske biblioteke, i ubačen fragment se sekvencira. Kada je sekvenciran, fragment se pregleda da li ima otvorene okvire čitanja da bi se odredila kodirajuća sekvenca za enzime koji učestvuju u konverziji između laktata i akrilata (na pr. laktoil-CoA dehidrogenaza i CoA transferaza).

Izolovani klonovi koji sadrže kodirajuće sekvence za ove enzime ubacuju se u ćelije kvasca kao što je opisano u primeru 6, koje sadrže laktat dehidrogenazu i nemaju piruvat dekarboksilaznu aktivnost. Selekcija rekombinantnih ćelija kvasca koje sadrže ubačenu nukleinsku kiselinu urađena je pomoću G418 (300 g/l). Kada su izolovane rekombinantne ćelije kvasca rastu aerobno na glukozi, a zatim se prebacuju u ananaerobne uslove. Smeša (broth) se zatim pokupi i analizira za akrilat standardnim metodama HPLC analize kao što je opisao Danner et al.( Biotechnological production of acrylic acid from biomass,In: Applied biochemistrv and Biotechnologv, Vol. 70-72 (1998)).

Primer 10-Rekombinantne ćelije sposobne za proizvodnju askorbata

Konstruisani su ekspresioni vektori tako da se eksprimiraju sledeći polipeptidi: 2.5-dioksivalerat dehidrogenaza, 5-dehidro-4-deoksi-D-glukarat dehidrataza, glukarat dehidrataza, aldehid dehidrataza, glukuronolakton reduktaza i L-gluonolakton oksidaza. Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju ove polipeptide izolovane su iz različitih mikroorganizama. Kada su konstruisani, ekspresioni vektori se transformišu u ćelije kvasca elektroporacijom. Kada su tamsformisane ćelije kvasca se analiziraju da bi se odredilo da li proizvode ili ne proizvode L-askorbat.

Primer 11 - Rekombinantne ćelije sposobne za proizvodnju D- ksiloze

Konstruisani su ekspresioni vektori tako da se eksprimiraju sledeći polopeptidi: 2-dehidro-3-deoksi-D-pentanoat aldolaza, ksilonat dehidrataza, ksilonolaktonaza i D-ksilozo dehidrogenaza. Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju ove polipeptide izolovane su izPseudomonas sp.Kada su konstruisani, ekspresioni vektori se transformišu u ćelije kvasca elektroporacijom. Kada su transformisane ćelije kvasca se analiziraju da bi se odredilo da li proizvode ili ne proizvode D-ksilozu ili drugi pentozno ugljenično jedinjenje.

Primer 12-Rekombinantne ćelije sposobne za proizvodnju citrata

PCR prajmeri dizajnirani su na osnovu sekvence nukleinske kiseline za akonitazuS. cervisiae(ACOl, Genebank broj za pristup-acession number M33131). Ovi prajmeri se koriste za kloniranje nukleinske kiseline koja kodira akonitazu iz vrstaKlyveromyces, YamadazymailiHansenula.Kada je sekvenciran linearni konstrukti se pripremaju kao što je opisano u primeru 5, i koriste se za remećenje nukleinske kiseline koja kodira akonitazu u ćelijama kvasca. Selekcioni marker koji se upotrebljava je antibiotik G418 umesto proizvodnje laktata kao što je opisano u primeru 5. Nukleinska kiselina koja obezbeđuje rezistenciju na antibiotik G418 je neomicin/kanamicin gen. Ovaj gen je dobijen iz pPIC9K vektora (InVitrogen) i ubačen u pHES vektor. Ćelije kvasca transformisane sa linearnim fragmentima dobijenim PCR-om , koji su konstruisani tako da imaju krajeve homologe sa ACOl kao što je opisano u tekstu iznad. Linearni fragment je dizajniran da kodira G418 gen za rezistenciju. Samo ćelije koje imaju integrisan linearni fragment na mestu nukleinske kiseline koja kodira akonitaze rezistentne su na antibiotik. Ove ćelije se analiziraju pomođu PCR-a da bi se videlo da li je integracija odgovarajuća. Ćelije kvasca dobijene ovim postupkom imaju delimično funkcionalni TCA ciklus, i mogu da prekomerno proizvode (over produce) citrat. Citrat se transportuje kroz mitohondrijalnu membranu u smešu za uzgajanje (broth). Dodatno, ove ćelije kvasca dobijaju egzogeno molekul nukleinske kiseline koji kodira enzim kao što je ATP-citrat liaza tako da mogu katalizovati konverziju akumulisanog citrata u oksalacetat (videti primer 13).

Primer 13 -Rekombinantnećelije sposobne za ekspresiju citrat liazeucitosolu

Crabtree-pozitivne ćelije kvasca transformisane su sa pHES plazmidom koji sadrži sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid sa ATP-citrat liaznom aktivnišću. Ova nukleinska kiselina izolovana je izE. coli, Kleibsella pneumoniae(Genebank broj za pristup-acession number X79817) ili iz drugih objavljenih izvora. Kada su transformisane, ćelije kvasca se analiziraju da li mogu ili ne, da koriste šećere za proizvodnju velikih količina akumulacije lipida. Dodatno, ćelije kvasca se analiziraju da bi se odredilo da li imaju ili ne, ATP-citrat liaznu aktivnost kao što je opisao Holdsvvorth et al.( J. Gen. Microbiol.,134:2907-2915 (1998)). Ćelije kvasca koje imaju ATP-citrat liaznu aktivnost sposobne su da obezbede citosolni acetat u aerobnim uslovima preko puta koji je drugačiji od razlaganja aldehida do acetata preko aldehid dehidrogenaze. Dodatno, kada takav kvasac nema piruvat dekarboksilaznu ili aldehid dehidrogenaznu aktivnost, trebalo bi da može da obezbedi acetat za biosintezu preko Krebsovog ciklusa.

Primer 14-Rekombinantne ćelije nesposobne da koriste laktat kao izvor ugljenika

Ćelije kvasca su tako napravljene da je aktivnost transportera karboksilne kiseline redukovana slično kao i JEN1 polipeptid kodS. cervisae.Ovakve ćelije kvasca imaće smanjenu sposobnost da transportuju laktate, i tako će manje efikasno koristiti laktate. Aktivnost transportera karboksilne kiseline u ćelijama kvasca je redukovana remećenjem lokusa koji sadrži kodirajuću sekvencu za ovaj

polipeptid. Prvo, homolog JEN1 polipeptidu je izolovan iz domaćinske ćelije pomoću degenerativnih prajmera dizajniranih na osnovu dostupne sekvence za JEN1 (Genebank broj za pristup-acession number U24155). Kada se izoluje iz domaćina, nukleinska kiselina se sekvencira. Remećenje kodirajuće sekvence za ovaj polipeptid se izvodi po procedurama opisanim u primeru 11. Linearni fragmenti su dobijeni kodirajući homologi regioni JEN1 sekvencama kao i ceo G418 gen za rezistenciju. Ovaj linearni fragment se integriše u JEN1 genomsku sekvencu što dovodi do remećenja aktivnosti. Ćelije kojima nedostaje aktivnost transportera karboksilne kiseline identifikuju se pomoću njihove nemogućnosti da transportuju karboksilnu kiselinu, i tako ne mogu da rastu kada se gaje na laktatu.

Dodatno, ćelije su modifikovane tako da je redukovana aktivnost funkcionalnog ekvivalenta polipeptidu citohroma b2 kod S.cerviseae.Polipeptid citohrom b2 omogućavaS. cerviseaeda metaboliše laktat u mitohondrijama. Prvo degenerativni prajmeri dizanirani su iz sekvenceSaccharomycescitohroma b2 (Genebank broj za pristup-acession number Z46729). Kada je izolovan, klon je sekvenciran. Remećenje kvaščevog homologa citohromu b2 je urađeno pomoću metode opisane uMethods in Yeast genetics(Eds. Alison et al., Cold Spring Harbor Press (1997)). Ova rekombinantna ćelija kvasca neće moći da koristi laktat kao izvor ugljenika.

Primer 15-Proizvodnja lakatata u velikoj količini

Dobijene su i izolovane različite varijanteK. marxianusćelija koje imaju redukovanu PDC aktivnost. Svaka varijanta je napravljena tako da sadrži različiti broj kopija egzogene nukleinske kiseline koja kodira polipeptid sa LDH aktivnošću. LDH polipeptid vodi poreklo iz različitih izvora. Ovakve varijante ćelija imaju različitu specifičnu produktivnost mlečne kiseline na 40°C.

Svaka varijanta se kultiviše u sudu u aerobnim uslovima sa stopom protoka vazduha od 1.5 VVM i sadržajem rastvorenog kiseonika od 30%, sve do ćelijske gustine od oko 60 g/l, suve mase. Kada se dobije dovoljna gustina, protok vazduha se isključuje i uslovi u sudu se prebacuju na anaerobne. Nikakva baza se ne dodaje. Može se videti da varijante sa najvišom specifičnoom produktivnosti tokom anaerobne faze mogu da ne samo brže proizvode mlečnu kiselinu, nego dostižu veću koncentraciju pri nižoj pH, nego varijante sa niskom specifičnom produktivnošću. Prinos proizvoda u glukozi tokom proizvodne faze može da pređe 90%.

Određene varijante se odabiru i ponovo gaje na isti način osim što je protok vazduha smanjen na 0.1 VVM, umesto daje potpuno isključen. Pod ovakvim uslovima, finalna pH u sudu može da bude niža i koncentracija laktata može da bude viša nego u uslovima bez protoka vazduha. Prinos proizvoda u glukozi može da se redukuje ali ostaje na nivou od oko 90%. Kada se ponovi test, ali sa protokom vazduha od 0.5 VVM, prinos proizvoda u glukozi se redukuje na manje od 80%.

Primer 16 - Proizvodnja lakatata na velikoj skali pomoću serije seriskih fermentacija

KulturaK. marxiamtskoja nema PDC aktivnost i ima LDH aktivnost je korišćena kao inokulum u seriji serijskih fermentacija. Svaka fermentacija se odvija u sve većem sudu, svaki je sterilisan pre upotrebe. Dodatno, svaki sud je snabdeven protokom vazduha od 1.5 VVM i mešan je dovoljno da se održi nivo rastvorenog kiseonika iznad 10%. Finalni sud ima zapreminu od 6,000 L. Sudovi se takođe drže na 45°C da bi se povećalo preživljavanje genetički modifikovanih ćelijaK. marxianusu odnosu na divlji soj kvasca i drugih mikroorganizama. Svaki sud je napunjen sa standardnim medijumom za kultivisanje za optimalni rast.

Sadržaj finalnog suda, sa gustinom ćelija od 100 grama ćelija/L, suve osnove, je prebačen u prethodno skuvani sud za proizvodnju koji ima zapreminu od 300,000 L. Opcionalno dodaju se dodatne ćelije dobijene filtriranjem iz prethodnog proizvodnog procesa. Ćelijska gustina u proizvodnom sudu je 6 grama ćelija/l, suve osnove. Glukoza se dodaje do nivoa od 80g/l. Uslovi u sudu su anaerobni sa temperaturom od 42°C tokom perioda od 25 sati. Specifična produktivnost je veća od 0.5 grama laktata/(gram biomasa<*>sat) do kraja procesa kada produktivnost počinje da opada. Jednom kada počne da opada produktivnost, ćelije se uklanjaju i čuvaju za ponovnu upotrebu. Finalna koncentracija laktata može da bude 75g/l na pH 2.8. Posle uklanjanja biomase, rastvor se koncentruje isparavanjem do koncentracije laktata od 50%. Slobodne kiseline (oko 86% od ukupnog laktata) se ekstrahuju tečnom ekstrakcijom u organske i ponovo ekstrahuju na visokim temperaturama u vodu. Rafinat koji sadrži laktatne soli se ili prešišćava i reciklira kao pufer u produkcionora sudu, ili se aciđifikuje na primer sumpornom kiselinom i prečisti.

Primer 17 - Poređenie aerobne proizvodnje crabtree- negativnih( K marksianus )i crabtree

pozitivnih( S . uvarum )organizama

Crabtree-negativni( K. marksianus)i crabtree pozitivni( S. uvarum)organizmi, svaki ponaosob, su kulitvisani u aerobnom i anaerobnom fermentoru (serijski fermenter). "Serijsko" kultivisanje je rađeno na 30°C u laboratorijskim fermentorima sa radnom zapreminom od 1.5L. pH je održavan na 5.0+/-0.1 automatskim dodavanjem 2 molxL"' kalijum hidroksida (KOH). Fermentor je napunjen vazduhom (aerobne kulture) ili azotnim gasom (anaerobne kulture) brzinom priticanja 0.8 min'<1>i mešan na 800 oum. Koncentracija rastvorenog kiseonika je stalno nadgledana pomoću elektrode za kiseonik (Ingold, tip 34 100 3002). U aerobnim kulturama koncentracija rastvorenog kiseonika je održavana iznad 60%. Po 10 ml uzorka je uzimano u određenim vremenskim intervalima za određivanje suve mase i koncentracije metabolita. Tween-80 i ergosterol su dodavani anaerobnim kulturama da bi se obezbedila jedinjenja za sintezu masnih kiselina.

Tokom eksponencijalne faze rasta, i suva masa i OD660 kultura kvasca, i koncentracije glukoze i etanola u supernatantu određivane su u određenim intervalima. Izračunata je specifična stopa proizvodnje etanola (qetanoimmol x g'<1>x h'<1>) pomoću sledeće formule uz korišćenje linearne regresione analize:

dE/dt (stopa povećanja koncentracije etanola u kulturi - mmol x l"<1>x h"<1>) i dCx/dt (stopa povećanja koncentracije biomase - g x l"<1>x h"<1>) izračunati su korišćenjem ralike na dijagramima koncentracije etanola i biomase naspram vrema. umax (h"1). Maksimalna specifična stopa rasta u glukozi je procenjena iz eksponencijalnog dela dijagrama-a dCx naspram vreme. Za računanje specifične stope uzimanja glukoze (<q>giukozammol x g"<1>x h'<1>), dE je zamenjena sa dG (količina glukoze konzumirane u toku jednog sata).

U anaerobnim serijskim kulturama, sojeviKlnyveromycesiSaccharomycessu pokazivali maksimalnu stopu rasta u glukozi 0.4h_<1>i 0.28h"'. Visoka koncentracija glukoze i rezultujuća visoka stopa rasta kulture Saccharomvces dovela je do visoke stopi aerobne alkoholne fermentacije (tabela 3, slika 1). Specifična stopa uzimanja glukoze je bila oko 2 puta veća za sojSaccharomycesu odnosu na sojKluyveromyces,usled snažne alkoholne fermentacije. Sa energetskog stanovišta alkoholna fermentacija predstavlja manje efikasan način generisanja ATP-a za ćeliju. Prinos biomase u glukozi bio je 0.38g/g zaKluyveromycesi 0.14g/g zaSaccharomyces uvarum.Prinos etanola u glukozi bio je nula za crabtree negativni fenotip vreste Kluyveromyces 1.83mmol/mmol zaSaccharomyces,kulturom sa crabtree pozitivnim fenotipom.

Tabela 3: Maksimalna specifična stopa rasta (q, mol(g biomasa)"<1>h'<1>) proizvodnje etanola i korišćenja glukoze, prinos biomase (g/g), prinos proizvoda (mmol/mmol), i obnavljanje ugljenika (u %, izračunato samo za anaerobne kulture), tokom eksponencijalnog rasta u serijskim kulturamaSaccharomyces uvarumiKluyveromyces marksianusu mineralnom medijumu koji sadrži 2% (wt/vol) glukoze.

U anaerobnim serijskim kulturama, specifična stopa rasta i prinos biomase za obe vrste bio je veoma nizak ako se uporede az aerobnim uslovima (tabela 3, Slikal i 2). Za sojeveKluyveromycesiSaccharomycesprinos biomase je 0.07 i 0.09 g/g. Oba soja su se pokazala podjednako u odnosu na specifičnu stopu fermentacije alkohola u anaerobnim uslovima. Ovo je potvrđeno korišćenjem podataka proizvodnje C02.

Uopšteno ovaj primer demonstrira da je aerobna proizvodnja biomase brža nego anaerobna, i da prinos biomase pod aerobnim uslovima je veći za crabtree-negativni organizam (jer kod carbtree-pozitivnog organizma, odigrava se i alkoholna fermentacija uz upotrebu glukoze). Ovaj primer takođe pokazuje da fermentacioni proizvod (u ovom slučaju etanol) se proizvodi istom stopom za oba i carbtree pozitivne i crabtree-negativne organizme pod anaerobnim uslovima. Tako aerobna faza rasta obezbeđuje visok prinos biomase i zatim anaerobna faza fermentacije kanališe metaboličku energiju u smeru proizvodnje proizvoda (pre nego za dalji rast). Sveukupno, proces u kome je proizvodnja odvojena od rasta obezbeđuje veću fleksibilnost procesa i bolju kontrolu nad sveukupnim prinosom.

Primer 18 - Poboljšana proizvodnja laktata u domaćinskom soju koji prirodno proizvodi u L-mlečnu kiselinu: umnožavanje linearnih fragmenata homologih DNK za remećenje gena za

piruvat dekarboksilazu

Kvasac Klyuveromycetes thermotolerans( K. thermotolerans) jeprirodni proizvođač L-mlečne kiseline (Kutzman and Fell, (1998) "The Yeast, A Taxonomic study"pp.24.-241; Elsevier Science B.

V.;Amsterdam, The Netherlands).K. thermotoleransposeduje prirodno gen za laktat dehidrogenazu (Idh) koji omogućava proizvodnju L-mlečne kiseline. Količina L-mlečne kiseline koja se proizvede u anaerobnim uslovima je oko 4% g/g od upotrebljene glukoze, dok se ostatak glukoze na kraju prevodi u etanol (42.5% g/g glukoze konzumirano), glicerol (3% g/g glukoze konzumirano) i acatat (0.3% g/g glukoze konzumirano).

Region od 600 bp PDC1 je izolovan izK. thermotoleransupotrebom konsenzus prajmera konstruisanih na osnovu sekvence dobijene poređenjem PDC1 genske sekvence izK. maxianisiK. lactis.PDC1 fragment je zatim sekvenciran (Sanger) i uporebljen za izolaciju fragmenta od 7.5 kbp koji okružujeK. thermotoleranspdcl (slika 6) pomoću PCR-a i tehnike hodanja genomom (genome vvalking techniques) (Clonetech). Fragment od 7.5 kbp je zatim kloniran u pCRII vektor za kloniranje (Invitrogen). Deo od oko 730 bp u blizini sredine kodirajućeg regiona PDC1 uklonjen je iz fragmenta od 7.5 kbpK. thermotolerans.DeoK. thermotoleranspdcl koji je uklonjen restrikcionom digestijom ima sledeću sekvencu

(ID sekvence Br.XX). Gen koji kodira rezistenciju na kanamicin. uključujući i njegov promotor, zatim je izolovan iz pPIC9K vektora (Invitrogcn) resrikcionom digcstijom (Sambrook) i kloniran u mesto u okviru 7.5 kbp iz koga je uklonjen fragment od 730 bp. Sekvenca gena za rezistenciju na kanamicin i njegovog promotora iz pPIC9K vektora (Invitrogen) je sledeća:

(ID sekvence Br.9). Dobijeni konstrukt uključuje gen koji kodira rezistenciju na kanamicin (G418) okružen sa oko 6.8 kbp regiona iz PDC kao što je prikazano na slici 6f.

Konstrukt opisan na slici 6f je digeriran sa dva restrikciona enzima (Sambrook) i dobijeno je oko 3 mikrograma fragmenta DNK koji sadrži homolog region PDC-u i srednje sekvence sa ubačenim genom koji kodira rezistenciju na kanamicin.K. thermotoleransje transformisan sa fragmentom pomoću poznatih tehnika za transformaciju, kao što je elektroporacija da bi se poremetio PDC izK. thermotolerans.Metod elektroporacije se odvijao sledećim redosledom: a) kultura mikroorganizma raste u YPAD-u preko noći (oko 15h) u zapremini 20 ml; b) 500ul kulture prebaciti u epruvete za mikrofugu, centrifugirati @4K, 4 min, baciti supernatant; c) isprati talog sa lml hladnog EP (EP= pufer za elektroporaciju: lOmM Tris-HCl, pH 7.5, 270mM saharoza, lmM MgCl2); d) resuspendovati je u 1 ml IP (IP= pufer za inkubaciju: YPD, 25mM DTT, 20mM HEPES, pH 8.0) e) šejkirati @800 oum, 30C, 30 min u Eppendorf termomikseru; f) oboriti u centrifugi, isprati jednom sa EP, resuspendovati u 400ul EP; g) dodati 3 mikrograma fragmenta DNK (u vodi, lOmM Tris-Cl, pH 8.5) inkubirati na ledu 30 min; h) prebaciti u 0.4cm kivete za elektroporaciju. Bio-Rad Gene Pulsar podešavanja: 1000V, lOOOoma, 50uF. Vremenska konstanta posle pulsa: oko 20msec; i) prebaciti u Morton Closure epruvete od 3 ml, inkubirati bez šejkiranja na 30°C tokom 1 sata; j) Dodati 400ul tečnog YPAD medijuma (YPAD: lOg Yeast Extract-ekstrakt kvasca, 20g peptona, 20g glukoze, lOOmg Adenin Hemisulfata. Zapremina-IL. Bez podešavanja pH), šejkirati na @800oum, 30C tokom 1 sata u Eppendorf termomikseru; k) dodati 400ul tečnog YAPD i ostaviti da se oporave 4-6 sati; 1) oboriti u epruvetama za mikrofugu @4K, 4 min, odbaciti supernatant, resuspendovati u 400ul IM sorbitola, i plejtovati na lOOug/ml G418 selektivnim šoljama; i 1) inkubirati na 30°C tokom tri do pet dana.

Kolonije su proverene ponovnim zasejavanjem (second patching) na šolje za kulture koje sadrže 200ug/ml G418. Genomska DNK je izolovana iz sekundarnih kolonija kvasca (secondarv yeast patch) pomoću standardne pripreme genoma (Sambrook). Izolovani genom je proveren pomoću PCR-a na 1) prisustvo kanamiacinskog fragmenta pomoću odgovarajućih prajmera i uslova (Sambrook) i 2) odsustvo izmenjenog PDC regiona pomoću odgovarajućih prajmera i uslova PCR-a. Kolonije pozitivne za selekcioni marker i negativne za PDC izmenjen region su kultivisane za dalji rad, na primer genomska DNK iz ovih sojeva je dalje analizirana pomoću Southern hibridizacione analize (southern hybridization analysis).

DRUGA OSTVARENJA

Razume se da je opis pronalaska zajedno sa njegovim detaljnim opisom, ima nameru da ilustruje, a ne da limitira obim pronalaska, koji je definisan obimom priloženih patentnih zahteva. Drugi aspekti, prednosti i modifikacije su u okviru obima patentnih zahteva koji slede.

Claims (18)

1. Postupak za dobijanje selektovanog organskog proizvoda, naznačen time, što pomenuti postupak obuhvata: a) dobijanje mikroorganizama sa crabtree-negativnim fenotipom; b) kultivisanje crabtree-negativnog mikroorganizama u prvom medijumu za kultivisanje sa izvorom ugljenika pri prvom skupu uslova za kultivisanje koji potpomažu ćelijsko disanje; i c) kultivisanje crabtree-negativnog mikroorganizama u medijumu za kultivisanje sa izvorom ugljenika pri drugom skupu uslova za kultivisanje koji potpomažu proizvodnju selektovanog organskog proizvoda, i gde nije proizvedeno više od 0,3 grama biomase po gramu izvora ugljenika konzumiranom pri drugom skupu uslova za kultivisanje.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je crabtree-negativan mikroorganizam genetički modifikovan.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što selektovani organski proizvod obuhvata proizvod izveden iz piruvata.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što crabtree-negativan mikroorganizam je genetski modifikovan da uključuje egzogeni laktat dehiđrogenazni gen, a proizvod izveden iz piruvata je laktat.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time, što je laktat dehiđrogenazni gen izabran iz grupe koju dine goveđa laktat dehidrogenaza, bakterijska laktat dehidrogenaza i gljivična laktat dehidrogenaza.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što izvor ugljenika u prvom medijumu za kultivisanje sadrži glukozu.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što izvor ugljenika u drugom medijumu za kultivisanje sadrži glukozu.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što prvi skup uslova za kultivisanje obuhvata aerobne uslove.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što drugi skup uslova za kultivisanje obuhvata anaerobne uslove.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 3 za dobijanje selektovanog proizvoda koji potiče iz piruvata, naznačen time, što dalje obuhvata d) kultivisanje mikroorganizma pod trećim skupom uslova za kultivisanje koji obuhvata medijum za kultivisanje sa sredstvom koje povećava metaboličku energiju mikroorganizma.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, naznačen time, što prvi skup uslova za kultivisanje obuhvata aerobne uslove, a drugi skup uslova za kultivisanje obuhvata anaerobne uslove.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 10, naznačen time, što drugi i treći skup uslova za kultivisanje obuhvata medijum za kultivisanje koji sadrži glukozu.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 10, naznačen time, što sredstvo koje povećava metaboličku energiju mikroorganizma obuhvata kiseonik.

14. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je mikroorganizam kvasac izabran iz grupe koju čineKluyveromyces, Pichia, Hansermla, Candida, TrichsporoniYamadazyma,

15. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je crabtree-negativan mikroorganizam genetički modifikovan da obuhvata egzogeni laktat deMrJjogenazni gen, proizvod koji potiče od piruvata je laktat, izvor ugljenika u prvom i drugom skupu medijuma za kultivisanje uključuje glukozu, prvi skup uslova za kultivisanje obuhvata aerobne uslove i drugi skup uslova za kultivisanje obuhvata anaerobne uslove.

16. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je mikroorganizam kvasac iz rodaKluyveromyces.

17. Upotreba genetički modifikovanog mikroorganizma, koji ima crabtree-negativan fenotip, u postupku za proizdonju mlečne kiseline, gde pomenuti postupak obuhvata aerobnu fazu i anaerobnu fazu.

18. SojK, Thermotoleranskvasca kome nedostaje sposobnost proizvodnje etanola ili ima smanjenu sposobnost proizvodnje etanola u odnosu na divlji tip kvasca istog soja ima endogeni laktat dehiđrogenazni gen.