RS50013B - Himerni gen koji kodira antigene determinante četiri proteina l.infantum - Google Patents

Abstract

Protein, naznačen time, što (a) ima aminokiseinsku sekvencu kao što je dato u SEQ ID No.1 ili (b) ima najmanje 90% identičnih amino kiselina sa aminokiselinskom sekvencom u SEQ ID No.1 i koja generiše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi ili životinja. Prijava ima14 nezavisnih i 7 zavisnih zahteva.

Description

PREDMET PRONALASKA

Predmetna specifikacija se odnosi na protein

(a) sa aminokiselinskom sekvencom kao što je dato u SEQ ID No. 1 ili

(b) koji ima najmanje 90% identičnih amino kiselina sa aminokiselinskom sekvencom u SEQ ID No.1 i koja generiše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi i životinja ili na polinukleotide koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira protein pronalaska koji je koristan za prevenciju ili lečenje leihmanioze, posebno leišmanijaze pasa. Očigledna svrha navedenog leži u upotrebi sekvence gena ili proteina koji je dobijen od himernog gena za dobijanje farmaceutskih kompozicija za prevenciju ili lečenje leišmanijaze, posebnocaninusleišmanijaze, koja može biti prisutna u telu pacijenta, na primer kao vakcina ili preparat monoklonalnog antitela. Ovaj pacijent ne mora biti pas, u pitanju može biti i čovek koji pati od neke bolesti koja obuhvata i imuno-depresiju. Da bi se ovo postiglo, proizvešće se himerni gen koji kodira protein nazvan (a) sa aminokiselinskom sekvencom kao što je dato u SEQ ID No. 1 ili (b) sa najmanje 90% identilnih amino kiselina sa adminokiselinskom sekvencom SEQ ID No.1 i koja generiše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi ili životinja, nastalog iz" in vitro"sinteze himernog gena konstruisanog" ad hoc"gde himerni gen sadrži pet antigenih determinanti od četiri različita proteina. Proizvod je konfigurisan kao visoko osetljiv (senzitivan) i specifičan za - na primer - generisanje zaštitnih imunih odgovora protivcaninusLeišmanijaze, ili za pripremanje antitela nacaninusLeišmanijazu.

OBLAST PRONALASKA

Predmetni .pronalazak je od koristi u industriji koja se bavi proizvodnjom farmaceutskih proizvoda uopšte.

STANJE TEHNIKE

Parazitske protozoe roda Leishmania (leišmanija) su etiološki agensi koji uzrokuju Leišmanijazu, čitav spektar bolesti koje su rasprostranjene po svetu i koje su karakteristične po tome što raste broj najrazličitijih kliničkih simptoma ovih bolesti.

Glavne forme Leišmanijaze su zoonotske, a ljudi se smatraju sekundarnim domaćinima.

Vrste koje su označene kao L. infantum, koje su široko rasprostranjene u mnogim Mediteranskim oblastima su uzrok Visceralne Leišmanijaze (VL) kod ljudi i kod pasa.

U stvari, psi inficirani sa L. infantum predstavljaju glavne životinjske zalihe ovog parazita, posebno tokom dugog inkubacionog perioda pre nego što se mogu primetiti prvi klinički simptomi.

Epidemiološki podaci pokazuju da postoji direktna korelacija između pojavecaninusLeišmanijaze i prenošenja parazita na ljude. Iz ovog razloga u kampanjama koje se vode radi kontrole širenja bolesti, od posebne je važnosti rano otkriće bolesti ili infekcije.

Parazit se prenosi na domaćina kičmenjaka (vertebrata) kao bičara promastigota, i to preko ujeda muve iz familije "Phlebotominae", zatim parazit ulazi u ćelije mononuklearnih faga gde se unutar fago-lizozomske strukture diferenciraju i reprodukuju kao amastigoti.

Inficirane ćelije se sakupljaju u određenim tkivima, uglavnom u slezini, jetri i limfnim čvorovima. Procenjeno je daje leišmanijazom inficirano oko 15 miliona ljudi, i svake godine u svetu se pojavi 500 000 novih kliničkih slučajeva, uglavnom u nerazvijenim i zemljama u razvoju.

U jugo-zapadnim zemljama Evrope, Visceralna Leišmanijaza (VL) jeste zoonotska bolest uzrokovana vrstama L. infantum, kao što je ranije već pomenuto. Skorašnji podaci dobijeni kroz epidemiološke studije pokazuju da je alarmantnan broj slučajeva gde se javlja ova infekcije.

U Italiji saopšteni podaci o pojavi VL kreću se u opsegu od 14.4% do 37% u zavisnosti od regiona.

U Portugalu, tačnije u oblasti oko Lisabona nađena je stopa seropozitivnih od 8.4%, i u oblasti Francuskih primorskih Alpa nađeni su različiti centri učestanosti koji variraju između 3.2% i 17.1%.

U Španiji, učestanost leišmanijaze zavisi od zone koja je proučavana. U Kataloniji dobijena je prosečna stopa učestanosti od 9.3%, mada je u nekim mestima nađeno čak 18% inficiranih pasa.

Na ostrvu Majorka, stopa učestanosti je 14%, a druge stope koje su nađene su: 2.4% u Murcia, 8.8% u Granadi, od 10 do 15% u Salamanki, 5.25% u provinciji Madrid, i 14% u Caceres.

lako se može smatrati da je broj slučajeva VL kod ljudi koji je uzrokovao L. infantum relativno nizak, visok procenat pacijenata sa imuno-depresijom koji postaju inficirani Leishmania-om može se povezati sa visokim nivoom ove bolesti kod pasa.

Činjenica je da, na jugu Evrope, 50% odraslih koji su inficirani leišmanijazom su takođe pacijenti koji su inficirani HIV virusom. S druge strane, prema ovim podacima o Leishmania - HIV ko-infekciji, procenjeno je da nivo infekcije (parazitima) može biti jedan ili dva reda veličine viši od ove slike koja je data zbog postojanja velikog broja nedetektovanih infekcija.

Opšta karakteristika različitih tipova Leishamania infekcije jeste da ona izaziva snažan humoralni odgovor kod domaćina. Dakle, trenutno se najviše koriste dijagnostički postupci (metode) koje su bazirani na serološkim tehnikama.

Opisano je da se ova antitela detektuju čak i tokom asimptomatske faze bolesti kod prirodno i eksperimentalno izazvanih infekcija.

Osetljivost i specifičnost ovih postupaka zavisi od tipa, izvora i čistoće antigena koji je korišćen. U imunološkim postupcima koji su trenutno komercijalizovani, kompletne promastigote i preparati koji su manje ili više pripfemljeni od njih, su upotrebljeni kao izvor antigena. Ovaj postupak normalno vodi do unakrsnih reakcija sa serumom pacijenata koji pate od lepre, tuberkuloze, Afričke tripanozomanijaze, Chagas-ove bolesti, malarije i drugih parazitoza.

Osetljivost i specifičnost seroloških postupaka zavisi od tipa, izvora i čistoće upotrebiljenog antigena. Prošlih godina je opisan veliki broj Leishmania antigena, od kojih se neki mogu smatrati kao proteini specifični za parazit.

Među ovim proteinima koji su specifični za parazit, treba pomenuti površinsku proteazu GP63, površinski glikoprotein gp46 i lipofosfoglikan vezan za KMP-11 protein.

Dodatna gupa Leishmania antigena je formirana od evolutivno očuvanih proteina, kao stoje kinezin, termički indukovani proteini, aktin i tubulin.

Kao deo strategije za razvoj specifičnog serološkog dijagnostičkog sistema zacaninusleišmanijazu, sproveden je laboratorijski baziran projekat za identifikaciju antigena L. infantum, pomoću imuno-detekcijskog traženja ekspresione biblioteke za gene L. infantum korišćenjem psećeg seruma sa aktivnom visceralnom leišmanijazom.

Primećeno je da većina antigena koji su izolovani ovom metodom pripada familiji proteina koji su očuvani (konzervirani) tokom evolucije. Identifikacija B epitopa ovih antigena ukazuje, međutim, da su u svim slučajevima antigene determinante bile lokalizovane u regionima koji nisu dobro očuvani.

Posebno, kiselinske ribozomalne proteine LiP2a i LiP2b prepoznaje više od 80% VL seruma.

Potvrđeno je da ovi proteini sadrže antigene determinante specifične za bolest, i da se rekombinantni proteini LiP2a i LiP2b iz kojih je uklonjen fragment, mogu upotrebiti kao specifično sredstvo kojim je moguće razlikovati VL od Chagas-ove bolesti.

Takođe je pokazano da PO ribozomalni protein kod L. infantum-a, očuvan visoko na evolutivnom nivou, je prepoznatljiv po visokom procenat psećeg VL seruma. Osim toga, antigene determinante su isključivo nađene na C-terminusu proteina, odnosno u regionu koji pokazuje nizak stepen evolutivne očuvanosti.

Zapaženo je da su u 78% VL psećeg seruma takođe prisutna i antitela protiv H2A proteina, i potvrđeno je da uprkos identičnim sekvencama kod svih H2A proteina kod eukariotskih organizama, humoralni odgovor na ovaj protein u VL serumima je praktično izazvan determinantama specifičnim za Leishmania protein H2A.

Antigene determinante koje prepoznaje VL pseći serum su nađene na oba kraja H2A proteina.

Očigledno rešenje problema, koji je dat ovim radom, bi bio pronalazak koji bi omogućio sklapanje sintetičkog himernog gena koji sadrži DNK regione koji kodiraju antigene determinante specifične za proteine LiP2a, LiP2b, LiPO, i H2A, sa namerom da se konstruiše protein bogat antigenim determinantama.

Međutim, koliko je aplikant upoznat, trenutno ne postoji pronalazak koji obuhvata karakteristike koje su opisane kao idealne, u nameri da se postigne željeni cilj. Ovaj cilj jeste konstrukcija proteina koji je bogat antigenim determinantama, i koji će nastati iz sklapanja himernog sintetičkog gena, koji sadrži DNK regione koji kodiraju antigene determinante specifične za gore pomenute proteine.

OPIS PRONALASKA

U prvom aspektu, pronalazak se odnosi na protein koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je dato za SEQ ID No. 1, koji sadrži jednu ili više antigenih determinanti četiri proteina L. infantum ili na protein koji iam najmanje 90% identičnu sekvencu amino kiselina sa adminokiselinskom sekvencom SEQ ID No. 1 i koji gereriše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi ili životinja,

U narednom aspektu, pronalazak se odnosi na polineukleotidnu sekvencu koja kodira protein pronalaska, posebno na polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom prema SEQ ID No.2 koristan za prevenciju ili lečenjecaninusleišmanijaze.

U sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži protein koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano za SEQ ID No.1 ili protein koji ima najmanje 90% indenitčnu aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom amino kiselina u SEQ ID No.1 i koja generiše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi ili životinja; ili na polinukleotid sa nukelotidnom sekvencom koja kodira protein pronalaska, posebno polinukleotid sa nukelotidnom sekvencom u skladu sa SEQ ID No,2. U jednoj realizaciji, kompozicija je farmaceutska kompozicija, posebno vakcina.

Tako, u narednom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije za prevenciju i lečenje, ljudi ili životinja leišmanijaze, koji sadrži protein sa aminokiselinskom sekvencom kao što je dato za SEQ ID No.1 ili protein koji ima najmanje 90% indentičnu aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom amino kiselina u SEQ ID No.1 i koji genereiše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi ili životinja.

Dalje, pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije za prevenciju i/ili lečenje leišmanijaze, kod ljudi i/ili životinja, koja sadrže protein sa aminokiselinskom sekvencom kao što je dato u SEQ ID No.1 ili protein koji ima najmanje 90% indentičnu aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom amino kiselina u SEQ ID No.1 i koji genereiše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi ili životinja kombinovan sa preotinom LiHsp70, celim ili fragmentisanim.

U slerećem aspketu, pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije za prevenciju i lečenje leišmanijaze.kod ljudi ili životinja, koja sadrži polinukleotid sa nukelotidnom sekvencom koja kodira proteina pronalaska, posebno polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu koja kodia SEQ ID No.2.

Sledeći aspekt pronalaska odnosi se na farmaceutske kompozicije za prevenciju i lečenje leišmanijaze kod ljudi li životinja, koje sadrže DNK vektor koji nosi: 1) polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira protein pronalaska, posebno polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom u skaldu sa SEQ ID No.2, i 2) sekvencu nukleotida koja kodira protein LiHsp70 ili negove varijante koje se

razlikuju u odnosu na očuvanv/ amino kiseline.

U sledećoj realizaciji, farmaceutska kompozicija pronalaska sadrži antitela usmerena na protein koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je dato u SEQ ID No.1 ili protein koji ima najmanje 90% indentičnu aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom amino kiselina u SEQ ID No.1 i koji genereiše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi ili životinja

Pronalazak se takođe odnosi na vakcinu koja može da stimuliše proizvodnju antitela da prepoznaju Leishmania parazi, pri čemu je vakcina bazirana na farmaceutskoj kompoziciji pronalaska.

Farmaceutski preparati pronalaska mogu još da sadrže sve poznate adjuvanse, rastvarače, pufere itd. poznate per se za farmaceutske kompozicije i/ili vakcine.Tačnije, mogu da sadrže fiziološke adjuvanse koji kompopziciju čini pogodnom za intraperitonealnu, subkutanu ili intramuskulamu administraciju.

Za prevenciju leišmanijaze, čoveku će se administrirati vakcina koja sadrži protein pronalaska, za izazivanje zaštitni imuni odgovor.

Administraciju preparata, antitela i/ili vakcina pronalaska moguće je sprovesti na način poznat per se, kao što je oralno, intramuskularno, intravenozno, subkutano, (ukapavanjem) infuzije itd.. Poželjno je da se preparat ili vakcina injektiraju, dok se za preparat antitela može koristiti infuzija.

Detaljnije, pronalazak se odnosi na himerni gen koji je formiran od DNK sekvence koja kodira antigene determinante četiri proteina L. infantum, kodirajući protein koristan za farmakološke potrebe, posebno za prevenciju i/ili lečenje leišmanijaze, posebnocaninusleišmanijaze, i dobijanje finalnog proizvoda ili konstrukcije himernog gena koji kodira polipeptid koji sadrži sve odabrane antigene determinante, okarakterisan time da koristi strategiju kloniranja u kojoj klon koji eksprimuje protein rUPO-Ct-Q se koristi kao inicijalni vektor, i ovom vektoru se upotrebom pogodnih restrikcionih mesta , sekvencijalno dodaju fragmenti DNK koji kodiraju proteine LiP2a-Q, LiP2b-Q, LiH2A-Ct-Q, LiH2A-Nt-Q, i posle svakog koraka kloniranja izvodi se ispravno orijentisanje svakog od umetaka kao i veličine ekspresionih proizvoda, kompletno izvedena sekvenca amino kiselina krajnjeg fuzionog proteina, pPQV, eksprimovana u pMal vektor je:

Pronalazak se takođe odnosina koji sadrži protein sa aminokiselinskom sekvencom kao što je dato za SEQ ID No.1 ili protein koji ima najmanje 90% indentičnu aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom amino kiselina u SEQ ID No.1 i koji genereiše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi ili životinja; i na polinukelotid koji sdrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein pronalaska, posebno polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID No.2 koristan u farmakološe svrhe, posebno za prevenciju i/ili lečenje leišmanijaze, posebnocaninusleišmanijaze. Posebno se odnosi na polinukleotide i proteine sa DNK i aminokiseilnskom sekvencom kao što je dato u daljem tekstu, eksprimovan u vektor PQ31. Aminokiselinska sekvenca sadrži fragment vektora (AA1-37). Ostatak arhinokiselinske sekvence je identičan SEQ ID No.3 osim grupe MBP i prvih sedam amino kiselina (AA 1-7):

I farmacutske kompozicije za prevenciju i lečenje leišmanijaze kod ljudi i životinja, koje sadrže ovaj protein ili polinukleotid koji sadrži ovu DNK. Ovaj protein u skladu sa SEQ ID No.1 je izveden od umetanja gena PQV u ekspresioni vektor pQE31. Ovde pomenuti himerni gen najpre kodira polipeptid koji ima molekulsku masu od 38 kD i izoelektričnu tačku od 7.37.

Transformisani domaćin koji sadrži polinukleotid prema pronalsku je takođe obuhvaćen predmetnim pronalaskom. U jednoj realizaciji, domaćin je bakterija. Ovaj domaćin se može upotrebiti u postupku za dobijanje proteina pronalaska, pri čemu postupak obuhvata korake: a) gajenje transformisanog domaćina prema pronalasku pod uslovima koji dovode do ekspresije proteina i b) regenracije proteina, po izboru.

Prema pronalasku, dobijen je sintetički himerni gen koji kodira protein pronalaska. Dobijen je spajanjem, sadrži DNK region koji kodira antigene determinane koje su specifične za proteine LiP2a, LiP2b, LiPO i H2A, i na ovaj način konstruiše protein koji je bogat antigenim determinantama. Dobijeni himerni gen je eksprimovan uEscherichia colii proizvod je analiziran na svoje antigene osobine. Rezultati potvrđuju da ovaj himerni protein zadržava sve antigene determinante matičnih proteina i da sadrži važan farmaceutski upotrebljiv element za primenu u slučajevima pseće VL, sa osetljivošću koja osciluje između 80% do 93%, i specifičnošću između 96% do 100%.

Posebno, himerni gen formiran od DNK sekvence koja kodira antigene determiante četiri proteina L. infantum i protein koji je njime kodiran, koristan je za prevenciju i/ili lečenjecaninusleišmanijaze i protein dobijen ovim pronalaskom, je proizvoden kroz sledeće stupnjeve, odnosno:

- konstrukcija himernog gena. Metodologija.

Strategija kloniranja.

Kloniranje DNK sekvenci koje kodiraju antigene determinante histona

proteina H2A.

Kloniranje sekvenci koje kodiraju rLiP2a-Q i rLiP2b-Q.

Kloniranje sekvence rLiPO-Q.

Kloniranje himernog gena.

- konstrukcija himernog gena iz konstrukcije intermedijarnih proizvoda.

Kloniranje epitopa specifičnih za L. infantum antigene.

- konstrukcija finalnog proizvoda.

Konstrukcija himernog gena koji kodira polipeptid koji sadrži sve izabrane antigene determinante.

- po izboru, ekspresija sekvence koja je ovako dobijena

- Procena finalnog proizvoda.

Serumi.

Prečišćavanje proteina

Elektrofbreza proteina i imuno-analize.

Merenja pomoću Fast-ELISA

- Procena finalnog proizvoda.

Antigene osobine

Osetljivost i specifičnost himernog proteina CP u serumu predstavlja dijagnozu pseće VL.

Strategija koja se poštuje prilikom kloniranja sekvenci DNK koje kodiraju svaku od izabranih antigenih determinanti jeste ista u svim slučajevima, i u prvom koraku, sekvenca od interesa je umnožena uz pomoć PCR-a i uz upotreba specifičnih oligonukleotida koji na krajevima sadrže ciljeve za restrikcione enzime.

Za korak kloniranja, umnožen proizvod je usmeren pomoću odgovarajućeg restrikcionog enzima i umetnut u odgovarajuće restrikciono mesto pUC18 plazmida.

Posle sekvenciranja DNK, umetak je regenerisan i sub-kloniran na odgovarajuće restrikciono mesto modifikovanog plazmida koji je označen kao pMAL-c2. Modifikacija je izvedena umetanjem terminacionog kodona nizvodno od cilja Hindlll u polilinkeru pMal-c2, označavajući dobijeni plazmid kao pMAL-c2<*>. ;U pogledu kloniranja DNK sekvence koja kodira antigene determinante histonskog proteina H2A, potrebno je istaći da cDNK klona cL71, koja kodira histon H2A L. infantum je upotrebljena kao templat za PCR reakcije, i za umnožavanje DNK, koja kodira N-terminalni region histona H2A, preciznije rLiH2A-Nt-Q, upotrebljeni su sledeći oligonukleotidi: ;poziciji 204-224 sekvence cL71). ;Sekvence koje su uključene u oligonukleotide za kloniranje i koje nisu prisutne kod matične sekvence cL-71, označene su polucrnim slovima. ;Amplifikovan fragment DNK je kloniran direktno sa restrikcionog mesta Xmnl pMAl-c2<*>.

Fragment je sekvenciran pomoću inicijatora #1234 ma1E i antigenog C-terminalnog regiona H2A histona, posebno rLiH2A-Ct-Q, je umnožen pomoću sledećih oligonukleotida. To su:

komplementaran u odnosu na poziciju 456-476 plazmida cL71).

Triplet koji kodira prolin (označen kao GGG posle podvučenih slova) je sadržan u antisens oligonukleotidu, restrikciono mesto EccRI koje je sadržano u oba oligonukleotida za kloniranje je označeno podvučenom linijom.

Po pitanju kloniranja sekvenci koje kodiraju rLiP2a-Q, potrebno je istaći da su regioni od interesuja umnoženi PCR-om od molekula cDNK koji kodiraju LiP2a i LiP2b.

Oligonukleotidi koji su upotrebljeni za konstruisanje ekspresionog klona LiP2a-Q, jesu sledeći:

Potrebno je istaći da su podvučena restrikciona mesta Sa11 pripojena 5' krajevima oligonukleotida.

Pri konstrukciji ekspresionog klona LiP2b-Q, oligonukleotidi koji su upotrebljeni su:

Na 5' krajevima oligonukleotida restrikciona mesta su uključena za enzim Xbal (podvučeno), i zbog potreba kloniranja uključen je dodatni triplet koji kodira prolinski ostatak, i to nizvodno.

Uzimajući u obzir kloniranje sekvence rLiPO-Q, potrebno je istaći da se kloniranje DNK sekvence C-terminalnog regiona proteina PO , L infantum-a izvodi umnožavanjem klona cDNK nazvanog L27 i sledećih oligonukleotida:

cDNK) I inicijator sekvence pUC18 (#1211), umnožena DNK je usmerena enzimima Pstl+Hindlil, sa kasnijim umetanjem u pMAL-c2plazmid.

Dobijeni klon je označen kao pPQI i potrebno je istaći da je restrikciono mesto Pstl uključeno u nukleotid sasens(podvučena sekvenca) i daje restrikcioni cilj Hindlll prisutan u cDNK L27.

Po pitanju kloniranja himernog gena, potrebno je istaći da su sekvence DNK koje kodiraju pet antigenih determinanti povezanih u himerni gen, i ovo povezivanje je izvršeno na klonu pPQI, kome su kodirajući regioni za antigene regione LiP2a-Q sekvencijalno dodati u 3' pravcu (označavajući rezultat kloniranja kao pPOII), LiP2b-Q (klon pPQIII), LiH2a-Ct-Q (klon pPQIV) I LiH2A-Nt-Q (klon pPQV).

Konačno, umetak dobijen nakon Sacl+Hindlll razlaganja finalnog pPQV klona, je umetnut u pQE31 ekspresioni plazmid, pri čemu je dobijeni klon označen kao pPQ.

OPIS CRTEŽA

Da bi upotpunili dati opis i i da bi pomogli bolje razumevanje karakteristika predmetnog pronalaska, prisutnom otkriću je dodata, kao njegov integralni deo, zbirka projekata ilustrativne prirode koji nisu ograničavajući. Dato je sledeće: Slika 1. Predstavlja ekspresiju (A), prečišćavanje u amiloznim kolonama (B) i antigenost (C: VVestern blot; D: ELISA) svakog od rekombinantnih proteina fuzionisanog sa maltoza- vezujućim proteinom. Slika ispod D takođe predstavlja reaktivnost u ELISA svakog od rekombinantnih proteina u odnosu na ceo protein.

Slika 2. Grafički prikaz različitih vektora smatrajući da se dobija himerni gen kao predmet datog pronalaska, od koga će se dobiti važan protein pomoću kojeg će se sprovoditi tačne dijagnoze životinjama ili ljudima koji pokazuju simptome leišmanijaze.

Slika 3. Prikazuje identifikaciju proteina koji je dobijen od himernog gena fuzionisanog sa MBP proteinom, čije je dobijanje prikazano na slici 2.

Slika 4. Predstavlja ekpresiju (A), prečišćavanje u amiloznim kolonama (B) i antigenost (C: VVestern blot; F: ELISA) intermedijarnih i krajnjih himernih proteina fuzionisanih sa maltoza- vezujućim proteinom (PO.I-PGV). Slika takođe prikazuje ekspresiju himernog proteina (D traka 1), prečišćavanje u Ni-Nt agaroznim kolonama (D traka 2) i antigenost prečišćenog proteina u odnosu na VL serum (E:Westem blot) i u odnosu na prikupljene serume (F: PQ u ELISA).

Slika 5. Prikazuje konačno sintetizovan grafički prikaz reaktivnosti najrazličitijihcaninusseruma, podeljenih u tri grupe. Prva grupa obuhvata životinje sa pravom infekcijom L. infantum-om. Druga grupa uključuje serum dobijen od pasa sa različitim kliničkim simptomima, ali koji nisu inficirani Leishmaniom, i treća grupa je napravljena od petnaest kontrolnih seruma od zdravih pasa. Ova slika pokazuje značaj predmetno pronalaska za izvođenje seroloških dijagnoza VL.

POŽELJNA REALIZACIJA PRONALASKA

Himerni gen formiran od sekvenci DNK koje kodiraju antigene determinante četiri proteina L. infantum-a, koristan za serološke dijagnozecaninusleišmanijaze i protein dobijen kao što je predloženo, se sastoje od konstrukata intermedijernih proizvoda. U prvom slučaju, izvršeno je kloniranje epitopa specifičnih za antigene L. infantum-a, što je podešeno na osnovu ranijih studija antigenih osobina antigena četiri proteina L. infantum-a (LiP2q, PiPO, LiP2b, LiH2a), koji omogućavaju da B epitopi budu definisani za ove proteine i koji su specifično prepoznati psećim serumom VL-a.

Sa željom da se unapredi antigena specifičnost ovih antigena s obzirom na proteine L infantum-a, od ovih proteina su klonirane specifične antigene determinante. Posle delecije izvesnih regiona ovih proteina, oni se mogu prepoznati pomoću seruma životinja koje su nosioci VL i drugih različitih bolesti.

Upotrebom specifičnih oligonukleotida i umnožavanjem pomoću regiona PCR specifičnih za gene Lip2a, LiP2b, PO i H2A, konstruisano je nekoliko klonova koji eksprimiraju rekombinantne proteine rLiPO-Ct-Q, rLiP2a-Q, rLiP2b-Q, rUH2A-Ct-Q i rLiH2A-Nt-Q, detaljnije su opisani u delu opisuja pronalaska koji se odnosi na metodologiju, gde su opisani detalji kloniranja.

Upotrebljeni su sledeći rekombinantni proteini:

- rLiPO-Ct-Q, koji odgovara 30 C-terminalnim ostacima ribozomalnog proteina LiPO. - rLiP2a-Q i rLiP2b-Q, koji su dobijeni od ribozomalnih proteina LiP2a i LiP2b respektivno. - Dva sub-regiona histona H2A, koji odgovara 46 N-temninalnim ostacima (xLiH2A-Nt-Q), i 67 C-terminalnim ostacima (ostaci (xLiH2A-Ct-Q).

Svaki od rekombinantnih proteina fuzionisan sa maltoza- vezujućim proteinom (MBP) je eksprimovan uE. Coli,kao što je prikazano na Slici 1A, i oni su prečišćeni afmitenom hromatografijom amiloznoj koloni B. Posle postupka prečišćavanja izvedena je elektroforeza na rekombinantne proteine (trake 1 do 5).

U cilju analiziranja da lije rekombinantne proteine prepoznao pseći VL serum, inkubiran jeVVestern blot,koji sadrži rekombinantne proteine u smeši od tri pseća VL seruma. Budući daje serum prepoznao sve ove proteine, zaključeno je da su antigene determinante koje su prisutne u matičnim proteinima zadržane i i rekombinantnim proteinima (C).

Antigene osobine rekombinantnih proteina su upoređivane sa antigenim determinantama matičnih antigena i to pomoću FAST ELISA, testiranje na skup od 26 psećih VL seruma, kao što je prikazano u jednom delu Slike 1D, i činjenica da serumi pokazuju slične vrednosti reaktivnosti, i na izabrane antigene regione i na odgovarajuće kompletirane proteine, ukazuje na toda se nije došlo do promene antigenog epitopa tokom procedure kloniranja.

S obzirom na konstrukciju finalnog proizvoda, tačnije himernog gena koji kodira polipeptid koji sadrži sve izabrane antigene determinante, potrebno je istaći da je praćena strategija kloniranja prikazana na Slici broj 2 deo A. Prikazani su intermedijarni proizvodi dobijeni tokom postupka.

Klon koji eksprimuje protein ttiPO-Ct-Q (pPQI) je upotrebljen kao inicijalni vektor, i fragmenti DNK koji kodiraju proteine rLiPO-Ct-Q, rUP2a-Q, rLiP2b-Q, rtJH2A-Ct-Q i rLiH2A-Nt-Q su sekvencijalno dodati pomoću odgovarajućih restrikcionih mesta.

Posle svakog koraka kloniranja, ispravna orijentacija svakog od umetaka je izvedena iz veličine ekspresionih proizvoda, i konačno celokupna nukleotidna sekvenca finalnog klona pPQV je određena i amino kiselinska sekvenca izvedena iz sekvence predstavljena na Slici 3.

Dobijeni polipeptid ima molekulsku masu od 38 kD, sa izoelektričnom tačkom od 7.37, uključujući i spejser (razdvajajuće) sekvence koje kodiraju prolin, je podvučen na Slici 3. Cilj ovoga je da se uspešno razdvoje antigeni domeni i da se izbegnu moguće tercijarne konformacije koje bi mogle da utiču na stabilnost i antigenost finalnog proizvoda.

Ekspresija i regeneracija (obnavljanje) svakog od intermedijernih proizvoda je prikazana na Slici 4, pod A i pod B. Kao što se i očekivalo, posle svake adicije, veličina ekspresionog proizvoda u vektoru pMAL postepeno se povećava sve dok ne dostigne molekularnu težinu od 80 kDa, pri čemu se zapaža izvestan stepen rupture tokom prečišćavanja.

Himerni gen je takođe kloniran u pQE plazmid, vektor koji omogućava ekspresiju proteina sa fragmentom od 6 histidina na krajnjem N-terminusu. Dobijeni klon i rekombinantni proteini su označeni kao pPQ i PO, respektivno.

Nivo ekspresije proteina kod bakterija transfonmisanih pPQ plazmidom i prečišćeni proteini su prikazani na Slici 4, pod D, sa PQ proteinom, prečišćenim afinitetnom hromatografijom u uslovima denaturacije, stabilniji je od rekombinantnog pPQV proteina koji je prikazan na Slici 4, odsek D traka 2.

Da bi se procenio finalni proizvod upotrebljene su serije materijala, i naravno i neke tehnike, kao što je opisano u daljem tekstu.

Korišćeni su VL serumi dobijeni od pasa različitog porekla. Životinje su klinički i analitički procenjivane u odgovarajućoj laboratoriji, genralno u Odseku za Parazitologiju, i svi pozitivni serumi su ispitivani na indirektnu imuno-fluorescenciju (IIF).

Prisustvo amastigota parazita ovih životinja je potvrđeno direktnim posmatranjem popitealnih i preskapularnih limfnih čvorova, i drugom grupom od 33 seruma VL koji potiču sa drugih regiona, gde je data pozitivna dijagnoza u ELISA naspram ukupnih proteinskih ekstrakata parazita i/ili pomoću IIF.

Dobijeni serumi pasa koji su nisu pogođeni VL-om, već nekom drugom bolešću, su različitiog porekla. Unutar ove grupe seruma nađene su sledece infekcije:

Mesocestoides spp.

Dyphylidium caninum

Uncinaria stenocephala

Toxocara canis

Dipetalonema dranunculoides

Demodex canis

Babesia cannis

Ehrkichia cannis

Ricketsia ricketsiae.

Ostatak seruma je dobijen od pasa koji su pokazivali različite kliničke simptome koji nisu povezani sa bilo kojim infektivnim procesom, i dobijene su kontrole seruma (kontrolni serumi), od petnaest pažljivo kontrolisanih zdravih životinja.

Prečišćavanje rekombinantnih proteina eksprimovanih klonovima pMAI-c2 je izvedena afinitetnom hromatografijom na amiloznim kolonama, i prečišćavanje rekombinantnog proteina eksprimovanog pPQ klonom je izvedeno na Ni-NTA kolonama ispunjenih smolom u uslovima denaturacije (Qiagen).

Za analizu proteina, izvršena je elektroforeza na 10% poliakrilamidnom gelu u prisustvu SDS-a, i pod standardnim uslovima. Imunološke analize proteina koji su razdvojeni elektroforezom su izvršene na nitroceluloznim membranama na koje su premešteni proteini. Premeštenii proteini su blokirani pomoću suvog 5% obranog mleka u PBS puferu sa 0.5% Tvveen 20.

Filteri su sekvencijalno dovođeni u kontakt sa primamim i sekundarnim anti-serumom u blokirajućim rastvorima i kao sekundarno antitelo je korišćen imuno-konjugat koji je označen peroksidazom, vizualizujući specifično vezivanje pomoću ECL sistema.

Slika 4E prikazujeVVestern blotPO.proteina

Umesto klasične ELISA korišćena je Fast-ELISA, aktivacija antigena je izvođena 12 sati na sobnoj temperaturi.

Pločice su aktivirane sa 100^1 antigena čija je koncentracija u svim slučajevima iznosila 2ug/ml.

Posle aktivacije pločice sa komoricama su inkubirane 1 sat sa blokirajućim rastvorom (0.5% obrano mleko u prahu rastvoreno u PBS - 0.5% Tvveen 20 i serum su razblaženi tristotine puta u blokirajućem rastvoru).

Komorice su inkubirane sa serumom 2 sata na sobnoj temperaturi, i posle izlaganja antitelu komorice su isprane sa PBS-Tween 20.

Antitela obeležena peroksidazom upotrebljena su kao druga antitela pri razblaženju od 1:2000 i razvijena je boja reakcije upotrebom supstrata ortofenilendiamin, merenjem apsorpcija na 450 nm.

U pogledu evaluacije finalnog proizvoda treba napomenuti da su antigene karakteristike određene pomoću podesnih metoda ispitivanja reaktivnosti psećih VL seruma na himerni protein i na svaki od intermedijernih proizvoda" VVestern b/oftesta.

Svi intermedijerni proizvodi, kao i konačni proizvod pPQV, su zadržali antigenost tokom celog procesa kloniranja (Slika 4C).

Takođe bi trabalo naglasiti da je rekombinantni protein koji je eksprimovao plazmid pPQ prepoznat pomoću VL seruma. Sa clijem da se dobije preciznija analiza antigenih karakteristika himernog proteina i međuproizvoda, izvedena je analiza reaktivnosti velikog broja različitih psećih VL seruma na rekombinante proteinie fast-Eliza testom, kao što je prikazano u delu F slike 4. Može se podvući činjenica da se osetljivost različitih međuprodukata kloniranja povećava nakon svake adicije. Treba takođe istaći i to da pQI protein, kao i PQII protein, prepoznaje većina VL seruma. Ovaj odnos je veći za protein PQIII dok proteine PQIV, PQV i PQ praktično prepoznaju svi serumi.

Uzimajući u obzir gore navedeno, procenat prepoznavanja koji je pokazao serum sličan je u slučaju testiranja himernih proteina PQV i PQ kao i u slučaju testiranja smeše rekombinantnih proteina rLiPO-Ct-Q, rLiP2a, rLiP2b i rLiH2a. Primećeno je da su antigene karakteristike svih 5 odabranih antigenskih regiona prisutne u proizvodu ekspresije PQ, pa bi stoga ovaj proizvod mogao biti korišćen u dijagnozi umesto smeše individualno eksprimiranih antigena.

Sa osvrtom na određivanje da li himerni protein može biti iskorišćen za dijagnozu psećeg VL seruma i u skladu sa prikladnom analizom velikog broja psećih seruma na ovaj protein i imajući na umu kliničke karakteristike životinja, pseći serumi su klasifikovani u tri grupe. Prva grupa se sastojala od seruma pasa sa pravom infekcijom L. infantum-om. Druga grupa sastavljena je od seruma pasa koji su imali različite kliničke simptome ali koji nisu inficirani Leishmania-om i, uključujući pse koji su inficirani parazaitima koji se razlikuju od Leishmania-e i koji mogu da pokazuju kliničke simptome koji se mogu opmešati sa simptomima zapaženim su tokom leišmanijaze.

Treća grupa je sastavljena od kontrolnih seruma koji vode poreklo od zdravih pasa.

Na slici broj 5 srednje vrednosti reaktivnosti prikazane su za svaku grupu seruma, pri čemu je reaktivnost VL seruma dostizala srednju vrednost reaktivnosti od 0.8 (S. D. = 0.4).

U okviru ove grupe reaktivnost 12 seruma bila je pozitivna ali manja od 0.35, dok je reaktivnost 10 seruma dostizala vrednosti između 0.35 i 0.5. Uočeno je daje reaktivnost 23 seruma varirala između 0.5 i 1.0, pri čemu je 14 seruma pokazivalo reaktivnost veću od 1.0.

Srednja vrednost apsorpcije seruma druge grupe, odnosno grupe inficirane nekim drugim parazitima, a ne Leishmania-om, iznosi 0.2 (S. D. = 0.003) i reaktivnost kontrolnih seruma, odnosno treće grupe seruma, jetse 0.1 (S.D. = 0.003). Samo dva seruma iz grupe 2 pokazivala su reaktivnost između 0.35 i 0.40.

Napred navedeni podaci pokazuju da himerni protein PQ u FAST ELIZA ima senzitivnost od 80% za dijagnozu VL, ako je granična vrednost definisana kao srednja vrednost reaktivnosti seruma grupe 2 plus tri S. D.-a {odnosno 0.35).

Senzitivnost analizirane grupe dostiže 93% ako je granična vrednost definisana reaktivnim vrednostima kontrolne grupe. Protein Q ima specifičnost od 96% za dijagnozu VL, kada je granična vrednost definisana gorepomenutim serumima grupe 2. Specifičnost od 100% u testu postignuta je kada su uzete u obzir vrednosti reaktivnosti zdravih pasa.

Postupak koji se koristio je sledeći:

1. - Mikrotitarske pločice su pokrivene antitelima inkubiranim sa 100 \ x\ rastvora koji sadrži 1 ng/ml antigena rastvorenog u puferu PBS - 0.5% Tween 20 - 5% obrano mleko (Pufer A).

Inkubacija je vršena 12 sati na sobnoj temperaturi, i zatim su pločice ispirane tri puta istim puferom koji ne sadrži nijedan antigen. Suve pločice sa antigenima se mogu čuvati na sobnoj temperaturi. 2. - Prva inkubacija komorica je izvedena sa serumom životinje pri razblaženju od 1/200 u puferu A. Inkubacija traje jedan sat. 3. - Komorice su isprane puferom A, kao što je opisano pod 1, tri puta bočicama za ispiranje. 4. - Inkubirani su sa drugim antitelom {IgG obeležen peroksidom) razblažen 1:2000 u puferu A, inkubacija se izvodi 1 sat. 5. - Komorice su isprane još jednom puferom A tri puta, kao što je naznačeno pod tri, i kao što je tamo već naglašeno, koristi se bočica za ispiranje. 6. - Reaktivnost je otkrivena upotrebom orto-fenilendiamin supstrata i merenjem apsorpcije na 450 nm.

Identifikovan je protein koji se koristi za dijagnoze dobijen iz himernog gena, i nukleotidna sekvenca koja kodira pomenuti protein, je sledeća:

Smatra se da nije neophodno proširiti ovaj opis u cilju toga da prosečan stručnjak razume opseg pronalaska i prednosti koje ovaj pronalazak donosi.

Materijal, forma, veličina i raspored elemenata su podložan promenama, pod uslovom da to nisu promene suštine pronalaska.

Termini kojima je opisan ovaj pronalazak je potrebno uvek shvatati u širem smislu, a ne posmatrati ih kao ograničavajuće.

Vakcina protiv Leishmania-e

Snažan imunitet koji se javlja posle oporavka od kutane leišmanijaze daje veliki doprinos razvoju profilaktičkih vakcina protiv ove bolesti. Ovakav imunitet se dobija indukcijom T odgovora kojije povezan sa proizvodnjom inflamatornih citokina koji aktiviraju makrofage i uništavaju parazite. Imunološka memorija u slučajevima infekcije se verovatno postiže stalnim prisustvom parazita u domaćinu u procesu koji je poznat kao prateći imunitet.

Prve analize koje se odnose na vakcinisanje protivLeishmania-etokom 40-tih godina koriste žive parazite kao imunogene. Ove analize su vodile ka proizvodnjii vakcina koje su davale značajnu zaštitu od naknadne reinfekcije. Ipak, saznanje o mogućnosti da živi organizmi mogu da proizvedu realne infekcije vodilo je ka takvim programima vakcinisanja koje dugo nije bilo moguće zameniti, i nasuprot tome, interesovanje je fokusirano na vakcine koje su bazirane na mrtvim parazitima. Ove analize su dale prvi dokaz o mogućnosti proizvodnje delotvornih vakcina inokulacijom parazita. Vakcine koje se sastoje od subjedinica strogo su fokusirane na proteinske antigene zbog toga što ih je lako identifikovati, izolovati i klonirati. Međutim, neophodno je uzeti u obzir da ne moraju svi potencijalni molekuli vakcine da budu proteini. U stvari, lipofosfoglikan (LPG) igra važnu ulogu prilikom početnih faza infekcije. Glavni problem pri upotrebi podjedinica može nastati iz činjenice da se ne mora javiti odgovor na pojedinačan antigen u genetički raznovrsnoj populaciji

Vakcinisanje nukleinskim kiselinama koje nose gene koji kodiraju proteineLeishmania- euključuje administraciju genetičkog materijala parazita u domaćina.

Prvi DNK vektor za administraiju je kao vakcina koja sadrži gp63 gen. Takođe, PSA-2 gen je uveden u plazmid i proučavano je da li on proizvodi Th-1 odgovor i da li indukuje odbranu.

Naša grupa je nedavno opisala veštački protein označen kao Q, koji se sastoji od nekoliko antigenih fragmenata od četiri proteina vrsteLeishmania infantum(posebno, Lip2a, Lip2b, PO i H2A), za koji je, pošto je upotrebljen kao antigen, dokazano da ima značajnu ulogu u dijagnostifikovanjucaninusleišmanijazu, sa 93% osetljivosti i 100% specifičnosti kada se uporedi sa serumima kontrolnih životinja koje nisu inficirane.

Isto tako, naša grupa je pokazala da je protein hsp70 vrsteLeishmania infantumvažan cilj imunog odgovora kod infekcija prouzrokovanim infekcijom ovim parazitom.

U cilju proučavanja mogućnosti mogućnost da se protein Q upotrebi za izgradnju odbrambenih sistema protiv infekcije saLeishmania infantum,i to i sam i u kombinaciji sa Hsp70, napravljene su tri serije eksperimenata na hrčku kao modelu. Eksperiment je napravljen tako da se otkrije da li imunizacija proteinom Q kratkotrajno štiti životinje od infekcije, drugo da proveri da li ih imunizacija štiti duži vremenski period i kao treće bilo je potrebno ispitati ovaj zaštitni efekat posle imunizacije sa dva proteina zajedno. Posle toga je proučavano, i kroz kratkoročne i dugoročne analize, da li je protein Q sposoban da izazove imuni odgovor koji smanjuje koncentraciju parazita u jetri i u slezini posle infekcije saLeishmania infantumkod većine imunizovanih životinja i da li imunizacija proteinima Q+Hsp70 takođe induluje značajan odgovor na oba proteina i vodi ka značajnijem smanjenju koncentracije parazita kod većine imunizovanih životinja.

Primer 1: Imunizacija Q proteinom

Četiri životinje su imunizovane sa pet mikrograma proteina Q rastvorenog u 40 mikrolitara Freund-ovog adjuvansa, i još četiri životinje su imunizovane istom količinom adjuvansa emulgovanog h sa 40 mikrolitara PBS rastvora soli bez proteina. Kod prve imunizacije, upotrebljen je celokupni Freund-ov adjuvans kombinovanjem sa proteinom, dok je kod sledeće dve imunizacije upotrebljen samo deo Freund-ovog adjuvanta za reakciju sa proteinom i to u istom odnosu protein/adjuvans. U intervalima od po petnaest dana izvedene su tri intraperitonealne imunizacije. Od druge nedelje posle svake izvršene imunizacije i tokom celog perioda imunizacije, uzimani su uzorci krvi da bi se merio humoralni odgovor na protein Q u ELISA analizama. Zapaženo je da već u drugoj nedelji posle prve imunizacije postoji pozitivan IgG odgovor na protein Q, a da je ovaj odgovor bio visok druge nedelje posle infekcije, i povećava se sa vremenom imunizacije dostižući titre od 1/100.000. Isto tako, zapaženo je da imuni odgovor na protein Q nije značajnije modifikovan posle infekcije parazitom (Slika 1).

Petnaest dana posle treće imunizacije, životinje su inficirane dozom od 10<5>promastigota parazita, diferenciranih iz infektivnih amastigota koji potiču od inficiranog

hrčka. Prethodno je provereno da li je inokulum u stanju da indukuje jaku parazitemiju kao i bolest, četiri meseca posle adminsitracije parazita, kod 100% inficiranih životinja. Tabela 1 pokazuje nivo parazitemije po mg tkiva jetre i slezine, kontrolnih i vakcinisanih životinja. Moguće je zapaziti da kod svih vakcinisanih životinja koncentracija (opterećenja) parazita u jetri opada u odnosu na kontrole, i da se ovo dešava u značajnoj meri kod 75% vakcinisanih životinja. Kada je ispitana koncentracija parazita u slezini, moguće je zapaziti

da je takođe kod 75% životinja ova koncentracija značajno manja nego kod kontrola, RPL dostiže 83%-86%. Životinja kod koje je PRL bio 20% u jetri, ima 48% istog u slezini.

Tabela 1. Koncentracija parazita u jetri I slezini hrčka vakcinisanog proteinom Q intraperitonealno. Posle četiri nedelje od infekcije, koncentracija parazita je merena pstupkom ograničenih razblaženja (kratkotrajno). Opterećenje parazitima je izraženo kao broj parazita po miligramu tkiva. RPL = smanjenje opterećenja parazitima u %.

Hrčak imunizovan Q proteinom

Brojevi predstavljaju srednju vrednost tn određivanja

Kontrole

4 hrčka 14 + 5 295 ± 30

Brojevi predstavljaju srednju vrednost 4 životinje.

Primer 2

Da bi se potvrdio efekat vakcinisanja proteinom Q na smanjenje koncentracije parazita u dužem vremenskom periodu, koristeći drugi put inokulacije, 4 životinje su subkutano injektirane sa 5 mikrograma proteina Q rastvorenog u 40 mikrolitara PBS-a i pomešane sa 40 mikrolitara Freund-ovog adjuvansa. U prvoj imunizaciji, iskorišćen je celokupni Freund-ov adjuvansi, dok je kod dva sledeća, deo Freund-ovog adjuvansa iskorišćen kako je prethodno naznačeno. Vakcinacija je asdministrirana u tri doze u intervalima od po petnaest dana. Petnaest dana posle treće imunizacije životinjama je administriran inokulum od 10<5>infektivnih parazita. Tokom celokupnog trajanja imunizacije i tokom celog perioda infekcije (pet meseci) uziman je uzorak krvi da bi se odredila vrsta humoralnog odgovora na protein Q i na sve proteine parazita. Na Slici 2 dato je kao i u prethodnom slučaju, da je već posle druge nedelje od imunizacije kod tri miša odgovor na protein Q bio pozitivan, i daje odgovor na protein bio vrlo visok posle dve nedelje od prve imunizacije. Odgovor je i dalje bio vrlo visok i posle ostalih imunizacija, dostižući titar od 1/75.000 u nedelji posle treće imunizacije. Kod jedne od životinja odgovor na protein Q je bio sporiji, iako je do kraja eksperimenta odgovor dostigao isti nivo kao i kod ostalih životinja. Shodno ovom, iz podataka koji su dobijeni i iz primera 1 i iz primera 2, moguće je zaključiti da je stepen imunog odgovora na protein, na oba načina: intraperitonealnog i subkutanog, veoma brz, iako je u isto vreme odgovor intraperitonealnog puta dostigao veće titre (1/75.000 naspram 1/30.000). Slika 3 prikazuje odgovor na protein Q kod kontrolnih životinja. Moguće je zapaziti da je reaktivnost na ovaj protein primećena 12-14 nedelja posle infekcije, kada se i primećuju prvi simptomi potencijalne leišmanijaze kod inficiranih životinja. Tabela 2 prikazuje nivoe parazitemije u jetri i slezini kod kontrolnih i vakcinisanih životinja. Može se videti da je 50% životinja bilo zaštićeno na nivou jetre, s obzirom da je redukcija u nivou parazitemije bila vrlo visoka (87-89%). Jedna od životinja nije bila zaštićena, dok je kod drugih životinja smanjenje koncentracije parazita bila 22%, Suprotno, smanjenje koncentracije parazita iznosi od 98-99% kod 100% životinja na nivou slezine.

Tabela 2. Koncentracija parazita u jetri i slezini hrčaka vakcinisanih Q proteinom subkutano. Posle 20 nedelja od inficekcije, koncentracija parazita je merena postpkom ograničenog razblaženja (dug vremenski period). Koncentracija parazita je izražena kao broj parazita po miligramu tkiva. RPL = redukcija opterećenja parazita u %.

Hrčci imunizovani Q proteinom

Kontrole

4 hrčka 1.8xI06±1.2x10<s>5.2xl08±2.6xl07

Brojevi predstavljaju srednju vrednost koncentracije (opterećenja) parazita kod 4 životinje.

Ako Q protein može da se upotrebi za izgradnju odbrambenih sistema u formulacijama koje sadrže protein LiHsp70 vrsteLeishmania infantum,eksperiment je izveden sa Balb/c miševima. Zapaženo je daje posle imunizacije, koncentracija (opterećenje) parazita u jetri i u slezini značajno smanjena, pri čemu je kod nekih životinja i manja za četiri reda veličine.

Primer 3: Imunizacija proteinom Q + protein Hsp70 u Freund-ovom adjuvansu

Svakom od četiri hrčka intraperitonealno je injektirano 5 mikrograma proteina Q i 5 mikrograma proteina LiHsp70 rastvorenog u 40 mikrolitara PBS-a i emulgovan u 40 mikrolitara Freund-ovog adjuvansa. Kod prve imunizacije.upotrebljenaje celokupna količina Freund-ovog adjuvansa, dok je kod sledeće dve imunizacije iskorišćen samo deo Freund-ovog adjuvansa i to na način koji jeprethodno opisan. Vakcinacija je administrirana u tri doze u intervalima od po petnaest dana.

Petnaest dana posle treće imunizacije životinjama je administriran inokulum od 10<6>infektivnih parazita preko intrakardijalno i zatim su žrtvovani u 22. nedelji. Svake dve nedelje, tokom celog perioda imunizacije i tokom ćele infekcije uzimana im je krv da bi se odredio stepen imunog odgovora na protein Q i na protein LiHsp70.

Relativna koncentracija (opterećenja) parazita kod miševa imunizovanih Q

proteinom plus LiHsp70 jeprikazan u Tabeli 3. Zapaženo je da su sve životinje bile visoko zaštićene i kod nekih od njih u slezini redukcija je iznosila reda veličine skoro dva-tri. puta

Tabela 3. Relativna koncentracija (opterećenje) parazita kod Balb/c miševa imunizovanih sa Q plus LiHsp70 proteinom posle 4 meseca od infekcije.

Miševi imunizovani proteinom Q i LiHsp70

Kontrole

4 miša 5.1x10<4>+2x10<3>3.2x10<6>±8x10<4>

Brojevi predstavljaju srednju vrednost koncentracije parazita za 4 životinje.

Tabele4 i 5 pokazuju da su sve životinje iz Primera 1 i 2 imunološki odgovorile na protein Q, i da je od druge nedelje posle imunizacije odgovor na protein Q bio visok i da se ovaj odgovor povećao posle druge imunizacije (nedelja 4).Tabela6 pokazuje da je odgovor na protein LiHsp70 tokom trajanja celog eksperimenta bio takođe pozitivan, iako niži od odgovora na protein Q iz Primera 3.

Tabele 4 i 5. Imuni odgovor kod 4 hrčka injektiranih intraperitonealno sa 5 mikrograma proteina Q (Tabela 4- Primer 1, kraktoročno) i imuni odgovor 4 hrčka injektiranih subkutano sa 5 mikrograma proteina Q (Tabela 5 - Primer 2, dugoročno).

Kontrolni miševi

Kontrolni miševi

Primer 4: Imunizacija Q proteinom + BCG Balb/c miševa

Miševima Balb/c, četiri komada, intraperitoenalno je injektirano 5 mikrograma Q proteina i 10<6>jedinica za stvaranje kolonije{ Colony Forming Units, CFU)BCG-a (bacille Calmette-Gu-ri) rastvoreno u 40 mikrolitara PBS-a. Imunizacija je sprovedena u tri doze, u razmacima od 15 dana. Petnaestog dana posle treće imuniazcija, miševima je administriran inokulum infektivnih parazita od 10<6>BCN150L Infantum- a,intrakardijalno. Vake dve nedelje tokom trajanja imunizacije i infekcije, uzimani su uzorci krvi za testiranje stepena humoralnog osgovora na Q protein. Životinje su žrtvovane posle 8 nedelja infekcije.

Tabela 7 (A i b) da munizovane životinje reaguju pozitivno (pozitivan odgovor) na Q protein od početka druge nedelje i ovaj odgovor progresivno raste dok ne postigne vrednost od 400,000 u većini slučajeva. Tabela 8 pokazuje razliku u opterećenju parazitima između jetre i slezine kod vakcinisanih i kontrolnih životinja.

Broj 3 je ekvivalentan prekoračenju u mernom sistemu.

Serumi su uzimani na početku svake od naznačenih nedelja.

Prva imunizacija je izvedena na dan 0, druga na dan 15 i treća na dan 30.

Tabela8. Koncentracija parazita u jetri i slezini kod Balb/c miševa subkutano vakcinisanih proteinom Q + 10<6>BCG-a. Osam nedelja posle infekcije, optičkim mikroskopom je određivana koncentracija parazita (opterećenje parazitima) u isečcima tkiva i to merenjem različitih polja koja sadrže 7000 ćelija sa jedrom. Koncentracija parazita je predstavljena kao količina parazita po miligramu tkiva, pri čemu je prethodno izračunato da je 1 parazit na 1000 ćelija sa jedrom ekvivalentan približnoj količini 210 parazita po miligramu tkiva. RPB = redukcija parazitskog opterećenja, %.

Kontrole

4 životinje srednja vrednost 400 ±15 4155 ±30 n.d. paraziti se ne mogu detektovati u 5000 ćelija sa jedrom.

Claims (22)

1. Protein, naznačen time, što (a) ima aminokiseinsku sekvencu kao što je dato u SEQ ID No.1 ili (b) ima najmanje 90% identičnih amino kiselina sa aminokiselinskom sekvencom u SEQ ID No.1 i koja generiše imuni odgovor na leišmanijazu kod ljudi ili životinja.

2. Polinukleotid, naznačen time.što sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein prema zahtevu 1.

3. Polinukelotid prema zahtevu 2, naznačen time, što je nukleotidna sekvenca SEQ ID No.2.

4. tranformisan ne-humani domaćin koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 2 ili 3.

5. Transformisan domaćin prema zahtevu 4, naznačen time, što je domaćin, bakterija.

6. Postupak za proizvodnju proteina prema zahtevu 1, nazačen time, što obuhvata korake: (a) gajenja transformisanog domaćina prema zahtevima 4 ili 5 pod uslovima pogodnim za ekpsresiju proteina i b) regeneraciju proteina, po izboru.

7. Kompozicija, naznačena time, što sadrži protein prema zahtevu 1.

8. Kompozicija, naznačena time, što sadrži polinukleotid prema zahtevima 2 ili 3.

9. Kompozicija prema zahtevima 7 ili 8, naznačena time, što je kompozicija, farmaceutska kompozicija.

10. Farmaceutaska kompozicija za prevenciju i lečenje, leišmanijaze kod ljudi i životinja, naznačena time, što sadrži protein prema zahtevu 1.

11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10, naznačena time, što sadrži i fiziološki adjuvans, podogan za intraperitonealnu, subkutanu iii intramuskulamu administraciju.

12. Farmaceutska kompozicija prema zahtevima 10 ili 11, naznačena time, što sadrži još i protein LiHsp70, potpun ili fragmentisan, ili njegove varijante.

13. Farmaceutska kompozicija za prevenciju i lečenje leišmanijaze kod ljudi i životinja, naznačena time, što sadrži polinukleotid prema zahtevima 2 ili 3.

14. Farmaceutska kompozicija prema jednom od zahteva 10-12, naznačena time, što je kompozicija, vakcina.

15. Protein prema zahtevu 1 za upotrebu u prevenciji ili lečenju leišmanijaze kod ljudi ili životinja.

16. Polinukleotid prema zahtevima 2 ili 3 za upotrebu u prevenciji ili lečenju leišmanijaze kod ljudi ili životinja.

17. Farmaceutska kompozicija prema jednom od zahteva 10-12 ili 14 za upotrebu u pervenciji ili lečenju leišmanijaze kod ljudi ili životinja.

18. Protein prema zahtevu 1 za upotrebu u generisanju imunog odgovora.

19. Farmaceutska kompozicija prema jednom od zahteva 10-12 i 14 za upotrebu u generisanju imunog odgovora.

20. Farmaceutska kompozicija, naznačen time, što sadrži antitela usmerena na protein prema zahtevu 1.

21. Upotreba farmaceutske kompozicije prema zahtevima 10-14,17,19 ili 20 za dobijanje leka za prevenciju ili lečenje lišmanijaze kod ljudi ili životinja.

22. Upotreba prema zahtevu 21, naznačena time, što je lek, vakcina.