RS50994B - Postupak za dobijanje (s)-3-cijano-5-5metilheksanoinske kiseline pomoću enzima - Google Patents

Abstract

Postupak za dobijanje (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline, naznačen time, što se sastoji od koraka:(a) dovođenja u kontakt racemskog 2-izobutil-sukcinonitrila sa nekim enzimskim katalizatorom koji ima aktivnost nitrilaze u medijumu reakcije; i(b) izolovanja (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline iz medijuma reakcije; i opciono, izolovanja neizmenjenog (R)-2-izobutil-sukcinonitrila.Prijava sadrži još 7 patentnih zahteva.

Description

OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak daje postupke za konverziju pomoću enzima 2-izobutil-sukcinonitrila u (S)-3-cijano-5-metilheksanoinsku kiselinu, koja je koristan intermedijar u sintezi (S)-3-(aminometil)-5-metilheksanoinske kiseline (pregabalin-a). Pregabalin se može koristiti za tretiranje nekih cerebralnih bolesti, na primer, za tretman i prevenciji poremećaja sa napadima, bola i psihotičkih poremećaja. Pošto je pregabalin efikasan u poboljšavanju cerebralnih funkcija, on je koristan takođe i u tretmanu gerijatrijskih pacijenata.

STANJE TEHNIKE

Enzimska hidroliza organskih nitrila u odgovarajuće karboksilne kiseline i amide pruža značajan alternativni sintetski postupak za široki spektar korisnih jedinjenja. Konvencionalna hemijska hidroliza nitrila u odgovarajuće karboksilne kiseline i amide tipično se obavlja korišćenjem neke jake kiseline ili baze kao katalizatora, na visokim temperaturama reakcije, što je čini neprihvatljivom za jedinjenja koja sadrže osetljive funkcionalne grupe. Pored toga, slaba selektivnost hemijske hidrolize može da dovede do neželjenih sporednih proizvoda, zajedno sa velikim količinama neorganskih soli. Na suprot tome, enzimska hidroliza nitrila se dešava pod blagim uslovima (neutralno pH, 30°C), sa potencijalnom visokom hemo-, regio- i stereoselektivnošću. Dodatna prednost je što se izbegava stvaranje sporednih proizvoda i neorganskih soli.

Najbolje poznate industrijske primene enzima za konverziju nitrila su dobijanje akrilamida (T. Nagasavva et al.,Tibtech.,10, 402-408, (1992) i nikotinamida (T. Nagasavva et al.,Appl. Environ. Microbiol.,54, 1766-1769, (1998)), koje koriste nitril hidratazu izRhodococcus rhodochrousJ1. Nekoliko skorašnjih preglednih članaka (L. Martinkova et al.,Current Organic Chemistry, 7.1279-1295 (2003) i D. Covvan et al.,Extremophiles,2, 207-216 (1998)) opisuju biohemiju i potencijalnu primenu enzima u industriji, za konvertovanje nitrila.

Enzimsku hidrolizu nitrila katalizuju nitrilaze, koje konvertuju nitrile u odgovarajuće karboksilne kiseline, i nitril hidrataze, koje konvertuju nitrile u odgovarajuće amide. Amidaze, koje hidrolizuju amide u odgovarajuće karboksilne kiseline, mogu se u kombinaciji sa nitril hidratazama, koristiti za konverziju nitrila u karboksilne kiseline.

Upotreba enzima nitrilaze za dobijanje karboksilne kiseline iz odgovarajućeg nitrila je opisana u WO 02/072856. Ugradnja enzima u polimernu matricu, sa umrežavanjem, daje katalizator sa poboljšanim fizičkim i biohemijskim integritetom.

Regioselektivno dobijanje co-nitrilkarboksilnih kiselina iz alifatičnih a,co-dinitrila pomoću biokatalizatora je opisano u U.S. Patent No. 5,814,508. Na primer, koristi se katalizator sa aktivnošću nitrilaze za konvertovanje 2-metilglutaronitrila u 4-cijanopentanoinsku kiselinu.

K. Yamamoto, et al. J. Ferment.Bioengineering,73, 125-129 (1992) opisuju upotrebu ćelija mikroba koje imaju aktivnost i nitril hidrataze i amidaze, za konvertovanjetrans1,4

-dicijanocikloheksana u črans-4-cijanocikloheksankarboksilnu kiselinu.

Regioselektivne biokatalitičke konverzije dinitrila u cijano supstituisane karboksilne kiseline, objavljene su za niz alifatičnih jedinjenja a.co-dinitrila, korišćenjem ćelija mikroba koje imaju aktivnost alifatične nitrilaze, ili kombinaciju nitril hidrataze i amidaze (J. E. Gavagan et al.J. Org. Chem.,63, 4792-4801, (1998)).

Stereoselektivne enzimske konverzije nitrila opisane su za dobijanje hiralnih karboksilnih kiselina i amida, obogaćenih jednim enantiomerom (M VVieser et al., poglavlje u "Stereoselective Biocatalvsis", Marcel Dekker Inc.: New York, 2000, 461-486). Stereoselektivni enzim nitrilaza izAlcaligenes faecalisATCC 8750 se koristi za dobijanje (R)-bademove kiseline iz racemskog mandelonitrila (K. Yamamoto et al.,Appl. Environ. Microbiol.,57, 3028-3032(1991)). Nitrilaza izRhodococcus rhodochrousNCIMB 11216 prvenstveno hidrolizuje (+)-2-metilheksanitril u racemskoj smeši 2-metilheksanitrila, ostavljajući neizreagovali (-)-2-metilheksanitril (M. Gradlev et al.,Biotechnology Lett.,16, 41-46(1994)). U U.S. Patent No. 5,593,871 opisan je proces za dobijanje amida 2-alkanoinske kiseline, obogaćenih jednim enantiomerom, iz nitrila, koristeći mikroorganizme koji sadrže stereoselektivne nitril hidrataze. Enantimerno čiste a-amino kiseline i amidi su dobijeni iz racemskih a-aril i ct-alkil-substituisanih nitrila glicina, koristećiRhodococcus sp.AJ270 koji sadrži stereoselektivnu nitril hidratazu i stereoselektivnu amidazu (M.-C. Wang et al.,J. Org. Chem.,67, 6542(2002)).

Terapeutska vrednost racemskog pregabalin-a, naročito efikasnog kao antikonvulzant, nađeno je da se može pripisati prvenstveno (S)-enantiomeru. U skladu sa ciljem dobijanja vredne terapije lekom pregabalin-om, ispitivani su brojni putevi sinteze do jedinjenja obogaćenog (S)-enantiomerom. Na primer, asimetrično hidrogenovanje odgovarajućeg cijano supstituisanog olefina, a zatim redukcijom cijano grupe u odgovarajući amin, daje pregabalin koji je u suštini obogaćen(S) enantiomerom (United States Patent Application Publication No. 2003/0212290).

Sinteza pregabalin-a, njegovih derivata i analoga pomoću čisto hemijskih postupaka je opisana u United States Patent 6,642,398; 6,635,673; i 6,046,353.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

U procesu iz ovog pronalaska postiže se regio- i stereoselektivna biokatalitička konverzija korišćenjem enzimskih katalizatora, koji imaju aktivnost nitrilaze.

Ovaj pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje (S)-enantiomera jedinjenja formule

I;

u kome C3 ima (S) konfiguraciju;

koji se sastoji od koraka:

(1a) dovođenja u kontakt jedinjenja formule II:

sa enzimskim katalizatorom, koji ima aktivnost nitrilaze u medijumu reakcije; i (1b) izolovanja (S)-izomera jedinjenja formule I iz medijuma reakcije; i, opciono izolovanja neizmenjenog (R)-izomera jedinjenja II.

Jedinjenje formule I je korisno za sintetizovanje jedinjenja koja imaju farmaceutsku aktivnost kao i pregabalin.

U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, jedinjenje formule II je racemska smeša koja sadrži 3R i 3S izomere.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na proces kojim se racemski 2-izobutil-sukcinonitril konvertuje u (S)-3-cijano-5-metilheksanoinsku kiselinu, a koji se sastoji od sledećih koraka: (2a) dovođenja u kontakt racemskog 2-izobutil-sukcinonitrila sa enzimskim katalizatorom, koji ima aktivnost nitrilaze, u nekom medijumu reakcije;

i

(2b) izolovanja (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline iz vodene smeše; i, opciono izolovanja neizmenjenog (R)-2-izobutilsukcinonitrila.

Poželjno je da medijum reakcije čini neki vodeni medijum.

U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, izolovani i neizmenjeni (R)-izomer jedinjenja II se zatim racemizuje zagrevanjem sa slabom bazom, u prisustvu nekog organskog rastvarača. Poželjna baza je 1,8-diazabiciklo[5.4.0.]undec-7-en, a poželjan rastvarač je toluen. Opciono, nastali racemat jedinjenja II se može reciklirati u koracima (1a) ili (2a) gore pomenutih procesa.

U jednoj realizaciji ovog procesa enzimski katalizator je u obliku celih ćelija mikroba, ekstrakta ćelija mikroba, delimično prečišćenih enzima, prečišćenih enzima ili enzimskih katalizatora koji su imobilizovani na nekom nosaču.

U sledećoj realizaciji ovog pronalaska, enzimski katalizator je delimično prečišćeni enzim. Primeri delimično prečišćenih enzima su, ali ne i njima ograničeni, NIT-101, NIT-102, NIT-103 (BioCatalvtics Inc., Pasadena, CA), i nitrilaze izArabidopsis thaliana(Julich Fine Chemicals, Julich, Germanv).

U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, nitrilaza kao enzimski katalizator je imobilizovana na nekom nosaču. Primeri imobilizovanih nitrilaza kao enzimskih katalizatora su, ali ne i ograničeni njima, NIT-102 C2 (BioCatalvtics Inc., Pasadena, CA), NIT-102 imobilizovan na Eupergit-u (Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Germanv) i nitrilaza izArabidopsis thalianaimobilizovana na Eupergit-u. U jednoj poželjnoj realizaciji imobilizovana nitrilaza, kao enzimski katalizator, je NIT-102 C2.

U sledećoj realizaciji, medijum reakcije čini destilovana voda ili puferovana voda. Poželjno je da puferovana voda bude puferovana na pH u opsegu od oko 5.0 do oko 10.0, a najpoželjnije na pH u opsegu od oko 6.0 do oko 8.0.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na proces za dobijanje (S)-3-(aminometil)-5-metilheksanoinske kiseline (pregabalin), koji se sastoji od koraka : (a) dovođenja u kontakt racemskog 2-izobutil-sukcinonitrila sa enzimskim katalizatorom, koji ima aktivnost nitrilaze, u nekom medijumu reakcije; (b) izolovanja (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline iz medijuma reakcije; (c) konvertovanja (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline u so kiseline; i (d) hidrogenovanja ove soli kiseline da se dobije (S)-3-(aminometil)-5-metil-heksanoinska kiselina (pregabalin).

Poželjno je da so kiseline ima formulu

gde M predstavlja Na, K, Li, NH4, NH2R<6>R<7>,NH3R<1>ili NH(R<6>)2R<7>, gde su R<6>iR<7>,svaki nezavisno, (Ci-C6)alkil.

Pogodnosti radi, ovde su prikupljeni neki termini koji se koriste u ovoj prijavi, u primerima i priključenim patentnim zahtevima. Ukoliko se drugačije ne definiše, svi tehnički i naučni termini, koji se ovde koriste, imaju isto značenje koje obično podrazumeva onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike kome ovaj pronalazak pripada.

Termin "alkil" je ravna ili račvasta grupa sa od 1 do 8 atoma ugljenika, uključujući, ali bez ograničavanja, metil, etil, propil, butil, izo-butil i terc-butil.

Termin "cikloalkil", kako se ovde koristi, obuhvata ostatke izvedene iz cikličnih ugljovodonika koji sadrže od tri do sedam atoma ugljenika u prstenu, uključujući ostatke cikličnih ugljovodonika supstituisane sa ravnim ili račvastim alkil ostacima.

Termin "alkoksi", kako se ovde koristi, označava "alkil-O-", gde je "alkil" definisan gore.

Termin "alkenil", namera je da obuhvati ugljovodonične lance, bilo ravne ili račvaste konfiguracije, koji sadrže jednu ili više dvogubih veza ugljenik-ugljenik koje su u bilo kojoj stabilnoj poziciji duž lanca, kao što su etenil i propenil. Alkenil grupe tipično imaju od 2 do oko 12 atoma ugljenika, tipičnije od 2 do oko 8 atoma ugljenika.

Termin racemat, kako se ovde koristi, označava ekvimolarnu smešu nekog para enantiomera. Racemat se obično formira kada sinteza dovodi do generisanja nekog stereocentra. Kako se ovde koristi, termin racemska smeša znači racemat.

Kako se ovde koristi, termin enantiomeri se odnosi na jedinjenja koja se na molekulskom nivou ne mogu superponirati sa likom jednog i drugog u ogledalu. Enantiomeri mogu postojati ili u (R) ili u (S ) konfiguraciji.

Kako se ovde koristi, termin stereoselektivna sinteza se odnosi na hemijsku reakciju koja dovodi do formiranja jednog stereoizomera ili smeše izomera obogaćene jednim izomerom, između dva ili više mogućih stereoizomera.

Kako se ovde koristi, termin regioselektivan, odnosi se na reakciju koja se odigrava na jednom atomu ili grupi atoma, između dva ili više mogućih atoma ili grupa atoma. Regioselektivna hidroliza nekog dinitrila dovodi do konverzije jedne nitril grupe u karboksilnu grupu.

"°C" označava stepene Celsius-a;

Termin "enzimski katalizator", kako se ovde koristi, označava neki katalizator koga karakteriše ili aktivnost neke nitrilaze ili kombinacija aktivnosti nitril hidrataze i aktivnosti amidaze. Ovaj katalizator može biti u obliku cele ćelije mikroba, permeabilizovane ćelije (ili ćelija) mikroba, ekstrakta jedne ili više ćelijskih komponenti ćelije mikroba, delimično pečišćenog jednog ili više enzima, ili prečišćenog jednog ili više enzima.

Kako se ovde koristi, termin višak enantiomera se odnosi na molski udeo dominantnog enantiomera u smeši enantiomera, iskazan kao procenat.

Termin "vodena reakciona smeša" označava smešu substrata i enzimskog katalizatora, većinom u vodenom medijumu.

Termin "aktivnost nitrilaze" označava aktivnost enzima kojom se konvertuje nitril grupa u grupu karboksilne kiseline.

Termin "aktivnost nitril hidrataze" kako se ovde koristi, označava aktivnost enzima kojom se konvertuje nitril grupa u amidnu grupu.

Termin "aktivnost amidaze" označava aktivnost enzima kojom se konvertuje amidna grupa u grupu karboksilne kiseline.

ATCC je američka zbirka vrsta kultura, American Type Culture Collection, locirana u 10801 University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, U.S.A. BioCatalvtics Inc. je lociran u 129 N. Hill Avenue, Suite 103, Pasadena, CA, 91106, U.S.A. Julich Fine Chemicals GmbH je lociran u Rudolf-Schulten-StraUe 5, D-52428 Julich, Germanv.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak daje enzimski postupak za dobijanje alifatične cijanokarboksilne kiseline formule I, iz dinitrila, formule II. Bilo koji pogodan postupak, koji se obično koristi u stanju tehnike, može se upotrebiti za dobijanje polaznih materijala dinitrila (II). Shema 1 se odnosi na specifičnu realizaciju ovog pronalaska, koja koristi hemo-enzimski postupak za konverziju 2-izobutil-sukcinonitrila (V) u (S)-3-cijano-5-metilheksanoinsku kiselinu (VI). Jedinjenje VI se može koristiti kao intermedijar u sintezi pregabalin-a (VII), kao što ilustruje Shema 2. Korak 3. u Shemi 1, predstavlja racemizacija sporednog proizvoda (R)-izomera (Va) i zatim recikliranje u Koraku 2.

U Koraku 1 Sheme 1, stvara se racemski 2-izobutil-sukcinonitril (V), pomoću kondenzovanja izovaleraldehida (III) sa etilcijanoacetatom (IV), a zatim adicijom KCN. Ovaj racemat nastaje iz stereocentra stvorenog na ugljeniku C3 u jedinjenju V.

Korak 2 u Shemi 1 opisuje regio- i stereoselektivnu hidrolizu racemata dinitrila V, koja daje (S)-3-cijano-5-metilheksanoinsku kiselinu (VI) i neizmenjeni (R)-izomer V.

Hidroliza 2-izobutil-sukcinonitrila (V), katalizovana nitrilazom, u (S)-3-cijano-5-metilheksanoinsku kiselinu VI, je i regioselektivna i stereoselektivna. Regioselektivnost se zasniva na konverziji cijano grupe u karboksilnu grupu samo na C1 atomu ugljenika. Ova reakcija je stereoselektivna zbog toga što je u ovu konverziju prvenstveno uključen (S)-enantiomer V, ostavljajući (f?)-enantiomer u suštini neizmenjen.

Kao što ilustruje Shema 2, kisela so Via, S-cijanokiseline VI, se hidrogenuje u sledećem koraku, tako da se dobije (S)-3-(aminometil)-5-metilheksanoinska kiselina (pregabalin). Ova reakcija se obavlja u prisustvu nekog katalizatora za hidrogenovanje, poželjno Raney-nikla. Prihvatljive kisele soli jedinjenja formule Via, su one u kojima M predstavlja Na, K, Li, NH4, NH2R<6>R<7>,NH3R<6>ili NH(R<6>)2R<7>, gde su R<6>i R<7>,nezavisno, (Ci-C6)alkil.

SHEMA 1

U regio- i stereoselektivnoj konverziji racemata V u (S)-cijanokiselinu VI, kao što je pokazano u Shemi I, enzim nitrilaza reaguje prvenstveno sa (S) enantiomerom. Prema tome, kako napreduje konverzija reakciona smeša postaje sve više obogaćena sa (R) enantiomerom Va.

Sledeći aspekt je izbegavanje ekonomski korisnog otpada, recikliranjem ili ponovnom upotrebom neizmenjenog (R)-dinitrila Va. Stoga, u nastavku se opisuje postupak za racemizaciju (R)-dinitrila (Korak 3, u Shemi 1) i zatim recikliranje u Koraku 2 Sheme 1.

Razni enzimi, koji imaju aktivnost nitrilaze ili kombinaciju aktivnosti hidrataze i amidaze nitrila, i mogu se pronaći u protokolima testiranja, kao što su tehnike obogaćivanja izolovanjem, koje prvo biraju mikroorganizme na bazi njihove sposobnosti da rastu u medijumima koji sadrže ovaj obogaćeni nitril. Tehnike obogaćivanja izolovanjem tipično obuhvataju upotrebu medijuma sa ograničenim sadržajem ugljenika ili ograničenim sadržajem azota, uz dodatak obogaćenog nitrila, koji može biti nitrilni substrat za željenu biokonverziju, ili neko strukturno slično nitrilno jedinjenje. Mikroorganizmi koji poseduju aktivnost nitrilaze prvenstveno se mogu selekcionisati na osnovu njihove sposobnosti da rastu u medijumima koji su obogaćeni nitrilom. Gavagan et al.,{ Appl. Microbiol. Biotechnol.52, 654-659, (1999)) su koristili tehnike obogaćivanja da izoluju Gram-negativnu bakteriju,Acidovorax facilis72W (ATCC 55746), iz tla, koristeći 2-etilsukcinonitril kao izvor azota iz tla. Pokazano je da jeAcidovorax facilis72W (ATCC 55746) koristan za selektivnu konverziju 2-metilglutaronitrila u 4-cijanopentanoinsku kiselinu. Tehnike obogaćivanja su takođe korišćene za izolovanje termofilne bakterijeBacillus pallidusDac521, koja katalizuje konverziju 3-cijanopiridina u nikotinsku kiselinu (Almatavvah i Covvan,Enzyme Microb. Technol.25; 718-724(1999)). Mikroorganizmi izolovani tehnikama obogaćivanja se mogu testirati na aktivnost hidrolize nitrila, dovođenjem u kontakt suspenzija ćelija mikroba sa jedinjenjem nekog nitrila, pa testiranjem na prisustvo odgovarajuće karboksilne kiseline, korišćenjem analitičkih postupaka, kao što su hromatografija tečnosti visoke performanse, gas-tečnost hromatografija ili hromatografija tečnosti i masene spektrometrije (LCMS). Tehnike za testiranje aktivnosti hidrolize nitrila pomoćuAcidovorax facilis72W (ATCC 55746) su objavljene u US Patent No. 5,814,508.

Kada se izoluju mikroorganizmi koji imaju aktivnost nitrilaze ili aktivnosti nitril hidrataze i amidaze, može se upotrebiti enzimski inženjering za poboljšanje raznih aspekata enzima. Ova poboljšanja mogu biti od koristi za postupak iz ovog pronalaska, a to su povećanje selektivnosti, katalitičke efikasnosti enzima, povećanje stabilnosti na višim temperaturama i širi opseg pH, i omogućavanje da enzim radi u nekom medijumu reakcije, obuhvatajući smešu pufera u vodi i organskog rastvarača.

Mogu se koristiti razne tehnike za dobijanje enzimskog katalizatora koji ima aktivnost nitrilaze ili aktivnosti nitril hidrataze i amidaze, pored toga što imaju poboljšan prinos, proizvodnost i kvalitet proizvoda, pogodne za specifični proces biokonverzije, kao što su, ali bez ograničavanja, tehnike enzimskog inženjeringa, kao što su postupci racionalnog dizajna, koji obuhvataju mutagenezu usmerenu na određeno mesto, i tehnike dirigovane evolucije, koje koriste nasumičnu mutagenezu ili tehnike mešanja

DNK.

Pogodni enzimski katalizatori za konverziju jedinjenja formule II u jedinjenje formule I su u obliku celih ćelija mikroba, permeabilizovanih ćelija mikroba, delimično prečišćenih enzima, ekstrakta ćelija mikroba, delimično prečišćenih enzima ili prečišćenih enzima, a ovi katalizatori se mogu imobilizovati na nekom nosaču.

Ovaj proces se može obaviti u jednoj fazi, dovođenjem u kontakt 2-izobutil-sukcinonitrila sa enzimskim katalizatorom u destilovanoj vodi, ili u vodenom rastvoru nekog pufera, koji će održavati početno pH reakcije između 5.0 i 10.0, poželjno između 6.0 i 8.0. Pogodni agensi za puferovanje su kalijum-fosfat i kalcijum-acetat. Kako reakcija napreduje, pH reakcione smeše se može menjati usled stvaranja amonijumove soli karboskilne kiseline, iz odgovarajuće funkcionalnosti nitrila u dinitrilu. Ova reakcija se može voditi bez kontrole pH, ili se tokom reakcije može dodavati pogodna kiselina ili baza, da se održava željeni pH. Međutim, kao što je gore naznačeno, moguće je dobiti enzimske katalizatore korišćenjem tehnologija, kao što su enzimski inženjering i dirigovana evolucija, koji će raditi efikasno unutar šireg opsega pH.

Ovaj proces se može obaviti u reakcionim smešama koje se sastoje od dve faze: vodene faze, koja inicijalno sadrži enzim i rastvoreni 2-izobutil-sukcinonitril, i organske faze, koja se uglavnom sastoji od racemskog 2-izobutil-sukcinonitrila. Dvofazne reakcione smeše se dobijaju dodavanjem 2-izobutil-sukcinonitrila u vodeni rastvor enzima i agenasa za puferovanje, tako da količina dodatog 2-izobutil-sukcinonitrila prelazi njegovu granicu rastvorljivosti. Granica rastvorljivosti u vodi 2-izobutil-sukcinonitrila, u 50 mM kalijum-fosfatu (30°C, pH 7.5) je približno 0.06M. Tokom trajanja reakcije formira se amonijumova so (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline i njena koncentracija raste u vodenoj fazi, dok se organska faza smanjuje po zapemini i postaje obogaćena sa (R)-2-izobutil-sukcinonitrilom. Alternativno, ovaj proces se može takođe obaviti u reakcionim smešama koje se sastoje od tri faze: vodene faze, koja inicijalno sadrži rastvoreni 2-izobutil-sukcinonitril, organske faze, koja se uglavnom sastoji od racemskog 2-izobutil-sukcinonitrila, i čvrste faze, koja se sastoji od enzima imobilizovanog na nekom nerastvornom nosaču. Trofazne reakcione smeše se dobijaju po proceduri koja je opisana za dvofaznu reakcionu smešu, izuzev što se koristi enzim imobilizovan na nerastvornom nosaču, umesto ne-imobilizovanog enzima.

Opciono, enzim se može imobilizovati na nekoj polimernoj matrici ili na nekom nerastvornom nosaču. Imobilizovani enzimski katalizatori se mogu koristi ponovljeno, u kontinualnim procesima, i mogu se odvojiti od proizvoda enzimskog procesa mnogo lakše nego ne-imobilizovani enzimski katalizatori. Postupci za imobilizovanje enzima u polimernoj matrici, kao što je kalcijum-alginat ili polikarilamid, ili na nerastvornom nosaču, kao što je Celite, dobro su poznati onima koji su verzirani u stanju tehnike. NIT-102 C2 (BioCatalvtics Inc., Pasadena, CA), koji je enzim nitrilaza, je imobilizovan na nerastvornom nosaču, i naročito je pogodan za konverziju II u III, zato što se može ponovljeno koristiti i u šaržnim i u kontinualnim procesima. Koncentracija NIT-102 C2 koja se koristi u nekoj reakciji bira se takod a se dobije željena brzina reakcije i zavisi od specifične aktivnosti katalizatora i koncentracije substrata. Tipično, NIT-102 C2 se koristiu opsegu od 0.001 g do 0.3 g vlažne mase po ml_ reakcione zapremine, s tim da je poželjan opseg od 0.01 do 0.15 g vlažne mase po ml_ reakcione zapremine.

Pored toga, nekoliko liofilizovanih lizata, dobijenih iz ćelija mikroba, označenih kao NIT-101, NIT-102, NIT-103 (BioCatalvtics Inc., Pasadena, CA), i nitrilaza izArabidopsis thaliana(Julich Fine Chemicals, Julich, Germanv), takođe su korisni za konverziju II u III. Kontakt NIT-101, NIT-102, NIT-103 i nitrilaze izA. thalianasa jedinjenjem I, u vodenoj reakcionoj smeši dovodi do formiranja jedinjenja II. Reakcije koje koriste NIT-101, NIT-102, NIT-103 i nitrilazu izArabidopsis thaliana,mogu se obavljati u dvofaznim reakcionim smešama, koristeći koncentracije katalizatora koje se kreću od 0.001-0.04 g suve mase po mL reakcione zapremine, s tim da je poželjan opseg od 0.002 - 0.02 g suve mase po mL reakcione zapremine.

Temperatura reakcije hidrolize bira se tako da se optimizuju i brzina reakcije i stabilnost aktivnosti enzimskog katalizatora. Temperatura ove reakcije može biti u opsegu od temperature mržnjenja gornje suspenzije (oko 0°C), pa do 60°C, s tim da je poželjan opseg temperature reakcije od 5°C to 35°C.

Izolovanje (3S) izomera jedinjenja formule I i izolovanje neizmenjenog (3R) izomera jedinjenja formule II se može obaviti korišćenjem pogodnih tehnika razdvajanja, izolovanja i prečišćavanja, koje su dobro poznate onima koji su verzirani u stanju tehnike.

U poželjnom postupku izolovanja, neizmenjeni (3R) izomer jedinjenja formule II se odvaja od osnovne vodene reakcione smeše ekstrakcijom sa nekim organskim rastvaračem, kao što je etilacetat. Poželjno je da se so kiseline (3S) izomera jedinjenja formule I rastvori u vodenom sloju, a zatim izoluje, prvo zakišeljavanjem, pa ekstrakcijom sa nekim organskim rastvaračem, kao što je etilacetat.

Jedinjenje formule I se može koristiti za sintezu jedinjenja, kao što je pregabalin, koje nalazi upotrebu u tretmanu poremećaja kao što su epilepsija, konvulzija, anksioznost, bol, i neurodegenerativni poremećaji, uključujući Alzeimer-ovu bolest, Huntington-ovu bolest i Parkinson-ovu bolest.

PRIMER 1

Pobijanje 2- izobutil- sukcinonitrila

Smeša etil cijanoacetata (733 g, 6.48 mol), izovaleraldehida (613.9 g, 7.13 mol), piperidina (5.5 g, 0.065 mol) i heksana (0.5 L), drži se pod refluksom, uz kontinualno uklanjanje vode. Kada se voda više ne može sakupiti, smeša se ohladi, pa destiliše pod vakuumom, da se ukloni rastvarač. Zaostalom ulju se doda izopropanol (1 L), zatim rastvor kalijum-cijanida (422 g, 6.48 mol) u vodi (2 L). Tokom dodavanja rastvora kalijum-cijanida reakciona smeša se drži ispod 35 °C, a zatim se 4 h drži na približno 35°C. Reakciona smeša se destiliše na atmosferskom pritisku dok se ne dostigne temperatura 95 °C, pa se zatim 5 h refluksuje na toj temperaturi. Reakciona smeša se ohladi, razblaži vodom (0.5 L), pa ekstrahuje sa 1 L metil terc-butil etra (MTBE). Ovaj MTBE ekstrakt se opere vodom (0.5 L), osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtrira, i koncentriše pod vakuumom, dajući 873.4 g 2-izobutil-sukcinonitrila, kao ulje. Prečišćeni uzorci 2-izobutil-sukcinonitrila mogu se dobiti vakuum destilacijom (90°C, na 0.366 mbar).

<1>H NMR (CDCI3, 400 MHz): 8 0.93 - 0.99 (m, 6H), 1.43 - 1.50 (m, 1H), 1.71 - 1.78 (m, 1 H), 1.81 -1.91 (m, 1H), 2.69 (d, 2H, J = 6.5 Hz), 2.90 - 2.97 (m, 1 H).

PRIMER2

Pobijanje ( S)- 3- cijano- 5- metilheksanoinske kiseline iz 2- izobutil- sukcinonitrila sa NIT-101, NIT- 102, NIT- 103 i nitrilazomiz Arabidopsis thaliana

Šaržira se svaka od tri staklene fiole od 8 mL, opremljene sa zatvaračem na zavrtanj, sa 2-izobutil-sukcinonitrilom (20 mg), 1 mL 50 mM kalijum-fosfatnog pufera (pH 7.5, 2 mM dithiotreitol (PTT)) i 10 mg enzima nitrilaze, koji se bira između NIT-101, NIT-102 ili NIT-103 (Biocatalvtics Inc., Pasadena, CA). Jedna staklena fiola od 8 mL, opremljena zatvaračem na zavrtanj, šaržira se sa 2-izobutilsukcinonitrilom (20 mg) i 1 mL rastvora nitrilaze izArabidopsis thalianau 50 mM fosfatnom puferu (pH 7.8), koji sadrži 100 mM etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EPTA) i 2 mM PTT (Julich Fine Chemicals, Julich, Germanv). Četiri reakcione smeše se 15 h mešaju sa magnetnim mešalicama na 30°C, a zatim pojedinačno ekstrahuju etilacetatom (2x6 mL). Posle uklanjanja etilacetatnih ekstrakta, vodena faza se tretira sa 4M HCI (0.15 mL), pa ekstrahuje etilacetatom (3x6 mL). Etilacetatni ekstrakti zakišeljene vodene faze se koncentrišu pod vakuumom, dajući 7.8 mg (prinos 34.2%), 8.8 mg (prinos 38.6%), 8.1 mg (prinos 35.5%), and 4.0 mg (prinos 17.5%) (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline ((S)-CMHA), za reakcije obavljene sa NIT-101, NIT-102, NIT-103, i nitrilazomiz A. thaliana,respektivno. Uzorci (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline iz svake od ovih reakcija se tretiraju sa viškom (trimetilsilil)diazometana, dajući njihove metilestarske derivate, pa se analiziraju pomoću gasne hromatografije (GC) na koloni Chiraldex™ G-TA (30 M x 0.25 mm ID, debljina filma 125 pm) zbog određivanja čistoće enantiomera. Čistoće enantiomera

proizvoda reakcije sa NIT-101, NIT-102, NIT-103 i nitrilazom izA. thaliana,bile su 96.3%, 91.1 %, 95.5%, i 98.5% e.e., respektivno. (e.e. označava " višak enantiomera").

PRIMER3

Pobijanje ( S)- 3- ciiano- 5- metilheksanoinske kiseline iz 2- izobutil- sukcinonitril pomoću

NIT- 102

Reakcioni sud od 125 mL, sa grejnom oblogom koja se drži na 30°C, šaržira se sa 2-izobutil-sukcinonitrilom (3.33 g), NIT-102 (0.5 g) i 122 mL 50 mM kalijum-fosfatnog pufera (pH 7.5), koji sadrži 5 mM PTT i 1 mM EDTA (pufer reakcije). Posle 12.5 h mešanja, smeša proizvoda se ekstrahuje etilacetatom (4 x 50 mL). Ovi etilacetatni ekstrakti se uklone, a vodenoj fazi se pH podesi na 2.5, sa 4M HCI, pa se ekstrahuje etilacetatom (3 x 50 mL). Kombinuju se etilacetatni ekstrakti iz zakišeljene vodene faze, osuše sa anhidrovanim MgS04, filtriraju, i koncentrišu pod vakuumom, dajući 1.56 g (S)-CMHA (41.1%). Uzorak proizvoda reakcije se tretira sa (trimetilsilil)diazometanom, pa analizira pomoću GC, kao što je opisano u Primeru 2, i odredi čistoća enantiomera od 98.5% e.e.

<1>H NMR (CDCI3, 400 MHz): 5 0.93 - 0.97 (m, 6H), 1.30 - 1.37 (m, 1H), 1.61 - 1.68 (m, 1H), 1.82-1.89 (m, 1H), 2.57- 2.63 (m, 1 H), 2.72 - 2.78 (m, 1 H), 2.98 - 3.06 (m, 1 H).

PRIMER4

Pobijanje kaliium-( S)- 3- cijano- 5- metilheksanoata iz 2- izobutilsukcinonitrila

sa NIT- 102 C2

Dva reakciona suda od 125 mL, sa grejnom oblogom koja se drže na 30°C, šaržiraju se sa 2-izobutil-sukcinonitrilom (6.81 g), NIT-102 C2 (1.70 g) i 118.2 mL pufera reakcije. Posle 24 h mešanja, dekantira se smeša proizvoda, ostavljajući enzimski katalizator u reakcionim sudovima. Poda se pufer reakcije (20 mL) u svaki reakcioni sud, meša približno 2 min, zatim dekantira i doda smešama proizvoda. Ova reakcija se ponovi, dodavanjem 2-izobutil-sukcinonitrila (6.81 g) i pufera reakcije (118.2 mL) u svaki reakcioni sud, a reakcione smeše se 24 h mešaju. Posle završetka četiri reakcije u svakom sudu (ukupno osam šaržnih reakcija), kombinuju se smeše proizvoda, pa ekstrahuju sa MTBE (3 x 500 mL). Ovi MTBE ekstrakti se odvoje, a vodenoj fazi se podesi pH na 2.1, sa fosfornom kiselinom, pa se ekstrahuje sa MTBE (2 x 500 mL). Ovaj MTBE ekstrakt zakišeljene vodene faze se koncentriše pod vakuumom do ulja, koje se tretira vodom (100 mL) i sa KOH (8.5 g). Dobijeni rastvor se koncentriše pod vakuumom, dajući 24.2 g (31.3%) kalijum (S)-3-cijano-5-metilheksanoata. Metil (S)-3-cijano-5-metilheksanoat se dobija iz kalijum (S)-3-cijano-5-metilheksanoata, pa analizira pomoću hiralne GC i odredi čistoća enantiomera od 99.1 % e.e.

<1>H NMR (D20, 400 MHz): 5 0.75 - 0.78 (m, 6H), 1.18 -1.25 (m, 1H), 1.43 -1.50 (m, 1H), 1.53- 1.68 (m, 1H), 2.28-2.38 (d, 2H, J = 6.5Hz), 2.86 - 2.93 (m, 1 H).

PRIMER5

Pobijanje ( S)- 3- cijano- 5- metilheksanoinske kiseline iz 2- izobutil- sukcinonitrila,

sa NIT- 102 C2.pod azotom

Atmosfera

Reakcioni sud od 125 mL, sa grejnom oblogom koja se drži na 30°C, šaržira se sa 2-izobutil-sukcinonitrilom (6.53 g), NIT-102 C2 (2.61 g) i 120 g pufera reakcije, pa produvava azotom. Pobijena smeša se 24 h meša, a zatim dekantira u staklenu bocu od 250 mL, ostavljajući katalizator u reakcionom sudu. Ova reakcija se ponovi, ponovnim šaržiranjem reakcionog suda koji već sadrži korišćeni katalizator, sa 2-izobutil-sukcinonitrilom (6.53 g) i 120 g pufera reakcije i produvava azotom, a dobijena smeša se 24 h meša. Uzorci reakcije (0.1 mL) se pomešaju sa 0.4 mL smeše voda: metanol:trifluorosirćetna kiselina (60:40:0.09, v/v/v), pa analiziraju pomoću HPLC, na koloni Symmetry™ C8 (150 x 3.9 mm), koja se drži na 30 °C. Ova kolona se eluira sa smešom voda:metanol:trifluorosirćetna kiselina (60:40:0.09, v/v/v), a detekcija se obavlja pomoću detektora indeksa prelamanja.

Obavljeno je ukupno pedeset šaržnih reakcija sa recikliranjem katalizatora. Kombinovane su smeše proizvoda iz dve uzastopne šarže reakcije, pa ekstrahovane etilacetatom (2 x 150 mL). Zatim se vodenoj fazi podesi pH na 2, sa 4M HCI, pa se ekstrahuje etilacetatom (2 x 150 mL). Kombinuju se etilacetatni ekstrakti zakišeljene vodene faze, osuše iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtriraju, i koncentrišu pod vakuumom, dajući (S)-CMHA. Iz pedeset šaržnih reakcija dobijeno je ukupno 160.8 g (prinos 43.2%) (S)-CMHA. Početne brzine reakcije pod brojem jedan, dvadeset šest i pedeset, bile su 14.8, 17.4 i 15.1 mM (S)-CMHA/h, respektivno. Hiralna GC analiza metilestarskog derivata (S)-CMHA, izolovanog iz šaržnih reakcija 39 do 50, pokazala je prosečnu čistoću enantiomera od 99.0 % e.e.

PRIMER 6

Pobijanje ( S)- 3- ciiano- 5- metilheksanoinske kiseline iz 2- izobutil- sukcinonitrila sa

NIT- 102 C2, u atmosferi azota

Obavljen je niz šaržnih reakcija konverzije 2-izobutil-sukcinonitrila u (S)-CMHA, koristeći NIT-102 C2, kao što je opisano u Primeru 5, izuzev što su reakcije vođene u atmosferi okoline, umesto u atmosferi azota. Uzorci reakcije su analizirani pomoću HPLC, kao što je opisano u Primeru 5.

Obavljeno je ukupno pedeset šaržnih reakcija sa recikliranim katalizatorom u atmosferi okoline. Početne brzine reakcije, određene iz uzoraka reakcije uzimanih tokom 4 sata, bile su 14.2, 13.2 i 9.3 mM (S)-CMHA/h za reakcije pod brojem jedan, dvadeset šest i pedeset, respektivno.

PRIMER 7

Pobijanje terc- butilamonijum ( S)- 3- cijano- 5- metilheksanoata

Smeše proizvoda iz konverzije 2-izobutil-sukcinonitrila u (S)-CMHA (Primer 6, reakcije 37 - 44) se kombinuju, pa ekstrahuju etilacetatom (2 x 250 mL). Ovi etilacetatni ekstrakti se osuše iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtriraju i koncentrišu pod vakuumom, dajući ulje (32.5 g, prinos 62.2%) koje je u glavnini (R)-2-izobutil-sukcinonitril. Vodenom sloju se podesi pH na 2, sa 4M HCI, pa se ekstrahuje etilacetatom (2 x 250 mL). Ovi etilacetatni ekstrakti se koncentrišu do zapremine od 470 mL, pa se mešaju, dok im se u kapima dodaje terc-butilamin (15.9 mL, 151.5 mmol). Sakupi se filtriranjem nastala bela kristalna so, pa se preko noći suši na vazduhu, dajući 30.0 g t-butilamonijum (S)-3-cijano-5-metilheksanoata. Pobije se metil (S)-3-cijano-5-metilheksanoat iz t-butilamonijum (S)-3-cijano-5-metilheksanoata, pa se analizira pomoću hiralne GC, i odredi čistoća enantiomera od 99.5% e.e.

<1>H NMR (CDCb, 400 MHz): 5 0.90 - 0.94 (m, 6H), 1.26 - 1.32 (m, 10H), 1.54 - 1.61 (m, 1H), 1.78 -1.88 (m, 1H), 2.30 - 2.35 (m. 1H), 2.43 - 2.50 (m, 1H), 2.96 - 3.04 (m, 1 H).

PRIMER 8

Pobijanje ( S)- 3- aminometil- 5- metilheksanoinske kiseline iz kalijum ( S)- 3- cijano- 5-

metilheksanoata

Smeša kalijum (S)-3-cijano-5-metilheksanoata (20 g, 103.5 mmol), vode (50 mL), 45% KOH (12 g), izopropanola (12 g) i Raney-nikla mućka se preko noći u Parr-ovom aparatu-mućkalici, pod pritiskom vodonika od 3,4 bar. Ova smeša se filtrira, zagreje na približno 50°C, tretira sirćetnom kiselinom (6.5 mL), pa preko noći meša na sobnoj temperaturi. Smeši se zatim podesi pH, tako da bude malo iznad pH 7, pomoću 45% KOH, pa se koncentriše pod vakuumom da se ukloni glavnina izopropanola. Ovoj smeši se doda izopropanol (20 mL), pa se zatim zakiseli sa sirćetnom kiselinom, meša preko noći na sobnoj temperaturi i filtrira, dajući 4.3 g (S)-3-aminometil-5-metilheksanoinske kiseline, kao beli kristalni talog. Određena čistoća enantiomera bila je 100% e.e. preko dobijanja derivata (S)-3-aminometil-5-metilheksanoinske kiseline, korišćenjem Marfev-ovog reagensa (Na-(2,4-dinitro-5-fluorofenil)-L-alaninamid) i analizom pomoću HPLC na koloni BPS Hvpersil C18 (250 x 4.6 mm, 5P), uz eluiranje sa smešom acetonitril: 1% trietilamin (pH 3) (38:62, v/v).

PRIMER 9

Pobijanje ( S)- 3- aminometil- 5- metilheksanoinske kiseline iz t- butilamonijum ( S)- 3- cijano-5- metilheksanoata

Smeša t-butilamonijum (S)-3-cijano-5-metilheksanoata (26 g, 113.9 mmol), vode (48.8 mL), etanola (35.8 mL), KOH (7.2 g, 91% pelete), i sunđerastog nikla™ (A-7000, 16.3 g ovlažen vodom, Activated Metals & Chemicals, Inc., Sevierville. TN), mućka se preko noći u Parr-ovom aparatu-mućkalici, pod pritiskom vodonika od 3,4 bar. Ova smeša se filtrira (Celite), a filter-kolač opere vodom (10 mL) i etanolom (5 mL). Filtratu se doda sirćetna kiselina (9.4 mL), a dobijena smeša se preko noći meša na 4°C. Proizvod se filtrira, opere sa 10 mL izopropil alkohola, i osuši pod vakuumom, dajući 11.1 g (61%) bele čvrste supstance. Deo (10.0 g) ovog materijala se kristališe iz 1:1 smeše izopropil alkohola i vode, dajući 8.8 g of (S)-3-aminometil-5-metilheksanoinske kiseline, sa 100% ee.

PRIMER 10

Racemizacija ( R)- 2- izobutil- sukcinonitrila, koristeći DBU

Racemizacija (R)-2-izobutil-sukcinonitrila se obavlja na materijalu koji se izoluje iz biokonverzije racemskog 2-izobutil-sukcinonitrila sa NIT-102 C2. Smeša (R)-2-izobutil-sukcinonitrila (1.36 g, 10 mmol, 69% ee), toluena (5 mL) i 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-ena (DBU, 0.076 g, 5 mmol) se refluksuje 2 h. U reakciju se doda voda (10 mL), a dobijena smeša se ekstrahuje etilacetatom (2x10 mL). Kombinovani organski ekstrakti se redom operu sa 5% HCI (20 mL) i zasićenim natrijum-hloridom u vodi (20 mL), osuše iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtriraju, i koncentrišu pod vakuumom, dajući racemski 2-izobutil-sukcinonitril (1.14 g, 84%). Čistoća enantiomera je određena pomoću GC, koristeći kolonu Chiraldex™ G-TA (30 M x 0.25 mm ID, debljina filma 125 pm).

PRIMER 11

Racemizacija ( R)- 2- izobutil- sukcinonitrila korišćenjem smole Amberlite<®>IRA- 400

Smola Amberlite<®>IRA-400 (1 g vlažna masa, Rohm & Haas, Philadelphia, PA) se 10 min meša sa 5% NaOH (10 mL), pa ispire vodom, sve dok voda posle ispiranja ne bude neutralna. Smoli se dodaju etanol (25 mL) i (R)-2-izobutil-sukcinonitril (69% ee), pa se dobijena smeša 2 h refluksuje. Reakciona smeša se filtrira i koncentriše pod vakuumom. Ostatak se rastvori u etilacetau (25 mL) i opere vodom (3 x 100 mL). Organska faza se osuši iznad anhidrovanog magnezijum-sulfata, filtrira, i koncentriše pod vakuumom dajući racemski 2-izobutil-sukcinonitril (0.81 g, 81%).

Claims (8)

1. Postupak za dobijanje (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline, naznačen time, što se sastoji od koraka: (a) dovođenja u kontakt racemskog 2-izobutil-sukcinonitrila sa nekim enzimskim katalizatorom koji ima aktivnost nitrilaze u medijumu reakcije; i (b) izolovanja (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline iz medijuma reakcije; i opciono, izolovanja neizmenjenog (R)-2-izobutil-sukcinonitrila.

2. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što se pomenuti izolovani neizmenjeni (R)-2-izobutil-sukcinonitril iz koraka (b), racemizuje u racemski 2-izobutil-sukcinonitril, zagrevanjem sa nekom bazom, u nekom rastvaraču.

3. Postupak prema Zahtevu 2, naznačen time, što se korak (a) ponavlja korišćenjem racemskog 2-izobutil-sukcinonitrila, koji je racemizovan iz izolovanog neizmenjenog (R)-2-izobutil-sukcinonitrila iz koraka (b).

4. Proces za dobijanje (S)-3-aminometil-5-metilheksanoinske kiseline (pregabalin-a) naznačen time, što se sastoji od koraka: (a) dovođenja u kontakt 2-izobutil-sukcinonitrila sa nekim enzimskim katalizatorom koji ima aktivnost nitrilaze, u nekom medijumu reakcije; (b) izolovanja (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline iz tog medijuma reakcije; (c) konvertovanja (S)-3-cijano-5-metilheksanoinske kiseline u kiselu so; i (d) hidrogenovanja ove kisele soli uz formiranje (S)-3-aminometil-5-metilheksanoinske kiseline (pregabalin-a).

5. Proces prema Zahtevu 4, naznačen time, što se neizmenjeni (R)-2-izobutil-sukcinonitril u koraku (a) izdvaja iz medijuma reakcije.

6. Proces prema Zahtevu 5, naznačen time, što se pomenuti neizmenjeni (R)-2-izobutil-sukcinonitril iz koraka (a) racemizuje zagrevanjem sa nekom bazom, u nekom organskom rastvaraču, formirajući racemski 2-izobutil-sukcinonitril, a korak (a) se ponavlja, uz korišćenje pomenutog racemskog 2-izobutil-sukcinonitrila.

7. Proces prema Zahtevu 4, naznačen time, što pomenuti enzimski katalizator predstavlja neka nitrilaza, u obliku celih ćelija mikroba, permeabilizovanih ćelija mikroba, ekstrakta ćelija mikroba, delimično prečišćenih enzima, prečišćenih enzima ili enzimskog katalizatora imobilizovanog na nekom nosaču.

8. Proces prema Zahtevu 4, naznačen time, što se pomenuti enzimski katalizator bira iz grupe koju čine NIT-101, NIT-102, NIT-103 i nitrilaza izArabidopsis thaliana.