RS51829B

RS51829B - Ljudska antitela specifična za interleukin 15 (il-15)

Info

Publication number: RS51829B
Application number: YU15104A
Authority: RS
Inventors: Jan G. J. Van De Winkel; Marcus Antonius Van Dijk; Janine Schuurman; Arnout F. Gerritsen; Ole Baadsgaard
Original assignee: Genmab A/S.
Priority date: 2001-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2012-02-29
Also published as: EA200400345A1; WO2003017935A3; EP1425389A2; HUP0402653A2; WO2003017935A2; KR20040047796A; HK1066828A1; PT1425389E; ATE531390T1; IL160358A0; US20030138421A1; US7153507B2; JP2005503151A; EA014802B1; NO20040752L; PL217752B1; ZA200401144B; CN1571836A; HUP0402653A3; CY1112447T1

Abstract

LJUDSKA ANTITELA SPECIFIČNA ZA INTERLEUKIN 15 (IL-15). Izolovano humano monoklonalno antitelo koje se vezuje za humani IL-15,koje sadrži varjabilne region humanog teškog lanca koji obuhvataju CDR1, CDR2i CDR3 sekvence i varjabilne region humanog lakog lanca koji obuhvataju CDR1,CDR2 i CDR3 sekvence, naznačeno time, štoa) CDR3 sekvenca varjabilnog regiona humanog teškog lanca obuhvata CDR3 amino kiselinsku sekevncu prikazanu na slici 2 (SEQ ID NO:2) i sekvenca CDR3 varjabilnog regiona lakog lanca obuhvata CDR3 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 3 (SEQ ID NO:4);b) CDR2 sekvenca varjabilnog regiona humanog teškog lanca obuhvata CDR2 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 2 (SEQ ID NO:2) i CDR2 sekvenca varjabilnog regiona humanog lakog lanca obuhvata CDR2 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 3 (SEQ ID NO:4) ; ic) CDR1 sekvenca varjabilnog regiona humanog teškog lanca obuhvata CDR1 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 2 (SEQ ID NO:2) i CDR1 sekvenca humanog lakog lanca obuhvata CDR1 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 3 (SEQ ID NO:4).Prijava sadrži još 59 patentnih zahteva.

Description

lnterleukin-15 (IL-15) je proinflamatomi citokin, glikoprotein od 14-15 kD. Objavljeno je da se konstitutivno izlučuje u razim ćelijama i tkivima, uključujući monocite i makrofage, fibroplaste, keratinocite i dendritične ćelije (VValdmann i Tagaya, 1999; Fehinger i Caligiuri, 2001). Ovo izlučivanje pod inflamatomim uslovima je nadregulisano, kao što je objavljeno za monocite, stimulisane sa IFN-y i LPS, ili kod infekcije sa virusima, bakterijama ili protozoama (Kirman et al., 1998; VValdmann et al., 1998; VValdmann i Tagaya, 1999; Fehniger i Caliguri, 2001). Pored toga, kod hroničnih inflamatomih bolesti, kao što je reumatoidni artritis, lokalno stvoreni IL-15 verovatno pojačava inflamaciju uključivanjem i aktivacijom sinovijalnih T-ćelija. Predloženo je da efekti izazvani sa ovim IL-15 igraju ključnu ulogu u patogenezi bolesti (Kirman et al., 1998; Mclnnes et al., 1996; Mclnnes et al., 1997; Mclnnes i Liew, 1998; Fehniger i Caligiuri, 2001).

Ispitivanjain vitrosu pokazala da IL-15 deli nekoliko bioloških aktivnosti sa IL-2, zato što dele komponente receptora. Receptor IL-15 prezentovan na T-ćelijama sadrži jedinstven a-lanac, IL-15Ra, ali sa IL-2R deli p-lanac i y-lanac. Posledica toga je da oba receptora koriste iste elemente signalizacije Jak/STAT. Međutim, na osnovu složene regulacije i diferencijalnog izlučivanja IL-2 i IL-15 i njihovih receptora, objavljene su kritične razlike u funkcijamain vivo(Korman et al., 1998; VValdmann i Tagava, 1999; VValdmann et al., 2001). Važno je takođe da se naglasi uloga IL-15 koja nije preterana u razvoju, preživljavanju, širenju i funkciji prirodnih ćelija ubica (NK), NK-T-ćelija i intraepitelijalnih limfocita (Kennedv et al., 2000; Liu et al., 2000).

Mclnnes i saradnici (Mclnnes et al., 1997; Mclnnes and Liew, 1998) su objavili indukovano stvaranje TNF-a, posle stimulacije sa IL-15 u T-ćelijama, dobijenim iz pacijenata sa reumatoidnim artritisom. Pored toga, pokazano je da T-ćelije iz periferne krvi, aktivirane sa IL-15, značajno indukuju stvaranje TNF-a u makrofagama, preko mehanizma koji zavisi od kontakta ćelija. Zbog destruktivne uloge TNF-a. kod reumatoidnog artritisa, inhibicija ovog citokina smanjuje dejstvo bolesti (Bathon et al., 2000, Klippel, 2000; Lovel et al., 2000; Maini i Tavlor, 2000).

Po prvi put ovaj pronalazak je zasnovan na generisanju i izolovanju potpuno humanih monoklonalnih antitela koja se specifično vezuju za IL-15 i koja inhibiraju proinflamatome efekte koje izaziva IL-15, kao i na karakterizaciji ovih novih antitela i prikazivanju njihove terapeutske vrednosti u tretiranju raznih bolesti posredovanih sa IL-15. Na primer, ovde je pokazano da ova humana antitela inhibiraju i stvaranje TNFa i proliferaciju T-ćelija, a obe su integralno uključene u inflamatome poremećaje. Prema tome, humana antitela iz ovog pronalaska predstavljaju poboljšano sredstvo za tretiranje ili prevenciju takvih poremećaja (i bilo kog drugog poremećaja posredovanog sa IL-15), što se može pripisati njihovoj jedinstvenoj specifičnosti (npr. specifičnost po epitopu i vrsti), afinitetu, strukturi, funkcionalnoj aktivnosti i činjenici da su u potpunosti humana, što ih čini značajno manje imunogenim i terapeutski efikasnijim i korisnijim kada se ordiniraju humanim pacijentima, nego što su to druga antitela IL-15, generisana ranije (npr. mišja i humanizovana antitela). Ovaj pronalazak se takođe zasniva na otkriću novih terapeutskih primena antitela koja inhibiraju IL-15, kao što su humana tela opisana ovde, uključujući tretman inflamatornih bolesti, kao što su reumatoidni artritis, psorijaza, odbacivanje transplantata i kanceri.

Izolovana humana antitela iz ovog pronalaska su mnoštvo izotipova antitela, kao što su lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, iGM, lgA1, lgA2, IgAsec, IgD i IgE. Tipično, to su izotipovi lgG1 (npr. igG1k), lgG3 i IgM. Ova anitela mogu biti čitave dužine (npr. antitelo lgG1 ili lgG3), ili mogu da budu samo deo koji vezuje antigen (npr. Fab, F(ab')2, Fv, fragment jednog lanca Fv, izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) ili kombinacija dva ili više izolovanih CDR).

U jednoj realizaciji, humana antitela su rekombinantna antitela. U posebnoj realizaciji, humana antitela su kodifikovana humanim teškim lancem IgG i humanim kapa lakim lancem nukleinskih kiselina, koji sadrži sekvencije nukleotida u njihovim varijabilnim regionima, kao stoje pokazano u SEQ ID NO:1 i u SEQ ID NO:3, respektivno, i njihovim modifikacijama konzervativne sekvencije. U drugoj realizaciji, humana antitela obuhvataju varijabilne regione teškog IgG lanca i lakog kapa lanca, obuhvatajući sekvencije aminokiselina koje su pokazane u SQ ID NO:2 i u SEQ ID NO:4, respektivno, i njihove modifikacije konzervativne sekvencije.

Humana antitela iz ovog pronalaska se mogu stvarati rekombinantno u ćelijama domaćina, kao što su transfektome (npr. transfektoma koja se sastoji od besmrtnih ćelija CHO ili ćelija limfocita) koje sadrže nukleinske kiseline koje kodifikuju teške i lake lance antitela, ili se mogu dobiti direktno iz hibridoma koje izlučuju antitelo (npr. to su B ćelije dobijene iz transgenih ne-humanih životinja, npr. transgenih miševa, koji maju genom koji sadrži humani teški lanac transgena i humani laki lanac transgena koji kodifikuju antitelo, pripojen besmrtnoj ćeliji). U posebnoj realizaciji ova antitela stvaraju hibridome, koje se ovde navode kao 146B7, ili ćelije domaćina (npr. CHO ćelije) transfektoma, koje sadrže nukleinske kiseline humanog teškog lanca i humanog lakog lanca, koji sadrže sekvencije nukleotida u njihovim varijabilnim regionima, kao što je pokazano u SEQ ID NO: 1 i 3, respektivno, i njihove konzervativne modifikacije. U posebnim realizacijama, ova antitela stvaraju hibridomi, koji se ovde navode kao 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8. U poželjnoj realizaciji, ovo antitelo se specifično vezuje za epitop lociran na p- i/ili y-lancu, u domenu interkacije IL-15.

U sledećoj realizaciji humana antitela iz ovog pronalaska se specifično vezuju za humani IL-15 i inhibiraju svojstvo IL-15 da izaziva proinflamatorne efekte, npr. inhibiraju stvaranje TNFa i/ili inhibiraju proliferaciju T ćelija, kao što su ćelije PBMC ili CTLL-2T, nakon vezivanja IL-15 za receptor IL-15. Tipično, humana antitela se vezuju za IL-15 sa ravnotežnom konstantomdisocijacije (Kd) manjom od približno10"<7>M, kao što je manjom od približno10"<8>M, 10"<9>Mili 10"<10>M, ili čak i nižom, kada se određuje tehnologijom površinske rezonancije plazmona (SPR) na istrumentu BIACORE 3000, koristeći humani IL-15 kao analit, a antitelo kao ligand. U posebnoj realizaciji, ovo antitelo se vezuje za humani IL-15 sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od približno 6,5*10"<8>M.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitela, ili delove antigena za vezivanje, iz ovog pronalaska. U skladu sa tim, vektori rekombinantnog izlučivanja obuhvataju nukleinske kiseline koje kodiraju atitelo iz ovog pronalaska, a ćelije domaćina, transficirane sa ovakvim vektorima, takođe su obuhvaćene ovim pronalaskom, kao i postupci pravljenja antitela iz ovog pronalaska, kultivisanjem ovakvih ćelija domaćina.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na vektor izlučivanja koji sadrži sekvenciju nukleotida koja kodira teški i laki varijabilni region, a sadrže sekvencije aminokiselina, prikazane u SEQ ID NO:2 i u SEQ ID NO: 4, respektivno, i njihove konzervativne modifikacije. Njihovi primeri suin vitrovektori transkripcije/ translacije koji koriste, na primer, lizate retikulocita.

U još jednom aspektu, ovaj pronalazak daje izolovane B-ćelije iz transgenih ne-humanih životinja, npr. transgenog miša, koje su u stanju da izlučuju razne izotipove humanih monoklonalnih antitela (npr. IgG, IgA i/ili IgM), koji se specifično vezuju za IL-15. Poželjno je da se ovako izolovane B-ćelije dobijaju iz transgene ne-humane životinje, npr. transgenog miša, imunizovanog sa prečišćenim ili obogaćenim preparatom antigena IL-15 i/ili ćelijama koje izlučuju IL-15. Poželjno je da transgena ne-humana životinja, npr. trensgeni miš, ima genom koji sadrži humani teški lanac transgena i humani laki lanac transgena. Izolovane B-ćelije se zatim učine besmrtnim, kako bi bile izvor (npr. hibridoma) humanih monoklonalnih antitela za IL-15.

U skladu sa tim, ovaj pronalazak daje takođe hibrodomu, koja je u stanju da stvara humana monoklonalna antitela koja se specifično vezuju za IL-15. U jednoj realizaciji, ova hibridoma obuhvata B-ćelije dobijene iz transgene ne-humane životinje, npr. transgenog miša, koja ima genom koji sadrži humani teški lanac transgena i humani laki lanac transgena, pripojen besmrtnim ćelijama. Transgena ne-humana životinja se može imunizovati sa prečišćenim ili obogaćenim preparatom antigena IL-15 i/ili ćelijama koje izlučuju IL-15, kako bi generisala hibridome koje stvaraju antitelo. Posebni hibridomi, koji se daju ovim pronalaskom, su 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8.

U još jednom aspektu, ovaj pronalazak daje transgenu ne-humanu životinju, kao što je transgeni miš, koja izlučuje humana monoklonalna antitela koja se specifično vezuju za IL-15. U posebnoj realizaciji, transgena ne-humana životinja je transgeni miš, koji ima genom koji sadrži humani teški lanac transgena i humani laki lanac transgena. Ova transgena ne-humana životinja može da se imunizuje sa prečišćenim ili obogaćenim preparatom antigena IL-15 i/ili ćelijama koje izlučuju IL-15. Poželjno je da transgena, ne-humana životinja, npr. transgeni miš, bude u stanju da stvara mnoštvo izotipova humanih monoklonalnih antitela za IL-15 (npr. IgG, IgA i/ili IgM) time što podleže rekombinaciji C-D-J i promeni izotipa.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje postupke za stvaranje humanih monoklonalnih antitela koja specifično reaguju sa IL-15. U jednoj realizaciji, ovaj postupak obuhvata imunizovanje transgene ne-humane životinje, npr. transgenog miša, koja ima genom koji sadrži humani teški lanac transgena i humani laki lanac transgena, sa pečišćenim ili obogaćenim preparatom antigena IL-15 i/ili ćelija koje izlučuju IL-15. Zatim se dobiju B-ćelije životinje (npr. B-ćelije slezine) i spoje sa mijelomom ćelija, formirajući besmrtne ćelije hibridoma koje izlučuju humana monoklonalna antitela protiv IL-15.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak karakteriše humano anti-IL-15 antitelo, konjugovano sa terapeutskim ostatkom, npr. citotoksičnim lekom, enzimatski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, radioaktivnim izotopom ili malim molekulom, koji je lek protiv kancera.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje preparate, npr. farmaceutske i dijagnostičke preparate, koji sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač i najmanje jedno humano monklonalno antitelo iz ovog pronalaska, koje se specifično vezuje za IL-15. Ovaj preparat može još da obuhvati i druge terapeutske agense, kao što su drugi imunosupresivni agensi ili hemoterapeutski agensi.

U još jednom aspektu, ovaj pronalazak daje postupke za inhibiranje proinflamatomih efekata IL-15, kao što su inhibiranje stvaranja TNFa i/ili proliferacija B-ćelija, poželjno bez inhibiranja aktivnosti (npr. stvaranja TNFa i/ili proliferacije T ćelija) strukturno srodnih proteina/citokina (npr. IL-2), koristeći jedan ili više humanih antitela iz ovog pronalaska.

Humana antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti za tretiranje i/ili prevenciju bolesti posredovanih sa IL-15, ordiniranjem antitela pacijentima koji pate od tih bolesti.

Primeri bolesti koje se mogu tretirati (npr. ublažiti) ili sprećiti, korišćenjem postupaka i preparata iz ovog pronalaska, su, ali bez ograničavanja istima, inflamatomi poremećaji, kao što je artritis (npr. psorijatični artritis ili reumatoidni atritis), uključujući aktivni reumatoidni artritis i juvenilni reumatoidni artritis), inflamatoma bolest utrobe. Na primer, pokazano je da ova antitela smanjuju parakeratozu, smanjuju debljinu epiderma i smanjuju proliferaciju keratinocita kod psorijaze. Pokazano je takođe da antitela smanjuju inflamaciju i/ili sprečavaju hemotaksiju aktiviranih leukocita u reumatoidnom artritisu. Pored toga, ova antitela se mogu koristiti za tretiranje odbacivanja transplantata. Uz to, ova antitela se mogu koristiti za tretiranje brojnih bolesti u kojima dolazi do neovaskularizacije posredovane sa IL-15, kao što su rast tumora i kanceri, npr, leukemija T ćelija.

Humana antitela iz ovog pronalaska, mogu se takođe kombinovati sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa, kao što su anti-inflamatomi agensi, DMARD (antireumatski lekovi koji modifikuju bolest), imunosupresivni agensi, hemoterapeutici i agensi za psorijazu.

U jednoj realizaciji, subjekat se može i dodatno tretirati sa jednim ili više agenasa koji pojačavaju inhibiciju proinflamatomog efekta antitela, npr. anti-inflamatomi agens, kao što je steroidni lek ili NSAID (nesteroidni anti-inflamatomi lek). Poželjni agensi su, na primer, aspirin i drugi salicilati, inhibitori Cox-2, kao što je dofecoxib (Vioxx) i celecoxib (Celebrex), NSAID, kao što je ibuprofen (Motrin, Advil), fenoprofen (Nalfon), naproksen (Naprosvn), sulindac (Clinoril), diklofenak (Voltaren), piroksikam (Feldene), ketoprofen (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumeton (Relafen), etodolak (Lodine), oksaprozin (Daypro) i indometacin (Indocin).

U sledećoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se mogu ordinirati sa jednim ili više DMARD, kao što su metatreksat (Rheumatrex), hidroksihlorokin (Plaguenil), sulfasalazin (Asulfidine), inhibitori sinteze pirimidina, npr. leflunomide

(Arava), agensi za blokiranje receptora IL-1, npr. anakinra (Kineret) i agensi za blokiranje TNFa, npr. etanercept (Enbrel), infliksimab (Remicade) i adalimumab.

U drugoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se mogu ordinirati u kombinaciji sa jednim ili više imunosupresivnih agenasa, kao što je ciklosporin (Sandimmune, Noral) i azatioprin (Imural).

U sledećoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se mogu ordinirati u kombinaciji sa jednim ili više hemoterapeutika, kao što su doksorubicin (Adriamicin), cisplatin (Platinol), beomicin (Blenoxane), karmustin (Gliadel), ciklofosfamid (Cytoxan, Procytox, Neosar) i hloramubic (Leukeran). Humana antitela u skladu sa ovim pronalaskom se mogu takođe ordinirati zajedno sa terapijom pomoću zračenja.

U sledećoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se mogu ordinirati u kombinaciji sa jednim ili više agenasa za tretiranje psorijaze, kao što su površinske medikacije koje sadrže katran uglja, A vitamin, kortizon ili druge kortikosteroide, oralne ili injektibilne medikacije, kao što su kortikosteroidi, metotraksat, retionoidi, npr. acikretin (Neogitason) ili ciklosporin (Sandimmune, Neoral). Drugi tretmani mogu biti izlaganje sunčevoj svetlosti ili fototerapija.

U sledećoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se mogu ordinirati u kombinaciji sa drugim antitelima, kao što su antitela specifična na CD4 i antitela specifična na IL-2. Kombinacija ovih humanih antitela i antitela specifičnih za CD4 ili antitela specifičnih za IL-2, smatraju se naročito korisnim za tretman autoimunih bolesti i odbacivanja transplantata.

U još jednom aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za detekcijuin vitroiin vivoprisustva antigena IL-15 u uzorku, npr. za dijagnozu bolesti posredovanih sa IL-15. U jednoj realizaciji ovo se postiže dovođenjem u kontakt uzorka koji treba da se testira, zajedno sa kontrolnim uzorkom, sa humanim monoklonalnim antitelom iz ovog pronalaska, ili sa njegovim delom koji se vezuje za antigen, pod uslovima koji dozvoljavaju stvaranje kompleksa između antitela i IL-15. Tada se detektuje stvaranje kompleksa (npr, korišćenjem ELISA) u oba uzorka, a statistički značajna razlika u kompleksima između uzoraka je indikacija prisustva antigena IL-15 u testiranom uzorku.

Ostale karakteristike i pogodnosti ovog pronalaska biće jasniji iz detaljnog opisa koji sledi i patentnih zahteva.

Kratak opis slika

Slika 1 obuhvata grafike koji pokazuju vezivanje humanih aspecifičnih antitela IL-15, 146B7, 147H5, 404A8 i 404E4, za humani IL-15 (hlL-15) i za mutant-proteine IL-15, Q108S i D8SO108S. Ispituju se serijska razblaženja antitela u pogledu njihovog vezivanja za mutant-proteine IL-15 D8SO108S i O108S, pomoću

ELISA.

Slike 2 i 3 pokazuju sekvencije aminokiselina (SEQ ID NO: 2 i 4) i nukleotida ISEG ID NO: 1 i 3) regiona VHi VL, respektivno, iz antitela 146B7. Naznačeni su noseći skelet strukture (ili framework) (FR) i regioni koji određuju komplementarnost (CDR).

Slike 4A-D su grafici koji pokazuju inhibiciju oslobađanja TNFa posredovanu sa IL-15, pomoću antitela 146B7. Humani PBMC se inkubiraju 72 h sa hlL-15 (0, 50, 100 ng/mL), u kombinaciji sa antitelom 146B7, ili sa izotipom kao kontrolnim antitelom (0,1, 1, 10 ug/mL). Količina stvorenog TNFa se meri pomoću ELISA. Pokazani su podaci za dva zdrava volontera.

Slika 5 je grafik koji pokazuje efekat antitela 146B7 na stvaranje TNF-a, posredovano sa IL-2 ili IL-15. Inkubiraju se 72 h humane PBMC sa hlL-15 (0, 50, 100 ng/mL), ili sa hlL-2 (100 ng(mL), u kombinaciji sa 146B7 (0,1, 1, 10 ug/mL). Količina stvorenog TNFa se meri pomoću ELISA.

Slika 6 je grafik koji pokazuje aktivnost antitela 146B7, 146H5, 404A8 i 404E8 na proliferaciju CTLL-2 indukovanu sa hlL-15. Ćelije CTLL-2, izgladnjivane sa hlL-2, inkubiraju se 48 h sa h-IL-15 (60 pg/mL), u kombinaciji sa serijskim razblaženjima 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8. Meri se ugradnja [<3>H]-timidina da se izrazi proliferacija (imp/min). Rezultati se prikazuju kao srednje vrednosti.

Slike 7-9 su grafici koji pokazuju inhibitomu aktivnost antitela 146B7 (Slika 7), 404E8 (slika 8) i 404A8 (Slika 9) na proliferaciju PBMC indukovanu sa IL-15. Humane PBMC se inkubiraju 72 h sa hlL-15 (0, 25, 100 ng/mL; Slike 7A, 8A i 9A, respektivno) ili sa hlL-2 (0, 10, 100 ng/mL; Slike 7B, 8B i 9B, respektivno), u kombinaciji sa 146B7 (slika 7), 404E4 (Slika 8) ili 404A8 (Slika 9), pri 0,1, 1, 10 ug/mL Meri se ugradnja [<3>H]-timidina, da se izrazi proliferacija (imp/min).

Slika 10 je grafik koji pokazuje vezivanje antitela 146B7 za monocite stimulisane sa IFNy. Kultivišu se do 2 dana humane PBMC u prisustvu IFNy (500 jed./mL), na 37°C. Određuje se intenzitet fluorescencije najmanje 5000 ćelija po uzorku, posle analize citometrijom i selekcije talasnih dužina, na monocitima. Podaci pokazuju indeks stimulacije (S.l. = (srednja fluorescencija pozitivnog obojenja)/

(srednja fluorescencija osnovnog obojenja)).

Slika 11 pokazuje vezivanje humanih monocita sa antitelom 146B7 (panel B) ili izotipom antitela kao kontrolom (panel A). Izolovane su humane PBMC, a citospini se naprave posle kultivisanja ćelija sa IFHy (500 jed./mL). Ćelije se kontra oboje hematoksicilinom.

Slika 12 pokazuje vezivanje humane psorijatične kože sa 146B7 (panel B) ili sa izotipom antitela kao kontrolom (hlgG1) (panel A). Humani psorijatični plakovi su dobijeni od pacijenata, posle obavljene saglasnosti, i čuvani su na -80°C, do testiranja. Tkiva se oboje sa biotinilovanim antitelima i učine vidljivim posle aktivacije peroksidaze rena.

Slika 13A je grafik koji pokazuje procenat nukleitidovanih ćelija u tkivu reumatoidnog artritisa, posle tretmana SCID miševa sa 146B7, ili sa tečnim nosačem. Tkiva se boje sa hematoksilinom i eozinom (H&E), pa analiziraju pomoću Photo Shop-a, verzija 6,0. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti i s.e.m. (standardna geška merenja) nukleusa (kao procenat od ukupne površine) miševa, posle tretmana sa 146B7 (n=4) ili tretmana sa tečnim nosačem (n=2). Slika 13B pokazuje reprezentativno obojenje tkiva ksenografta RA sa H&E, kod SCID miševa, posle tretmana sa 146B7 (panel B) ili sa PBS (panel A).

Slika 14 je grafik koji pokazuje efekte tretmana antitelom 146B7 miševa sa SCID/psorijazom. Biopsije su fiksirane u formalinu, pa obložene parafinom i obojene sa H&E i za Ki-67 antigen jezgra. Slika 14A pokazuje jačinu psorijaze, vrednovanu preko debljine epiderma, koja je merena od stratum corneum-a do početka nabora ivice. Slika 14B pokazuje debljinu epiderma merenu od stratum comeum-a pa do najdubljeg dela nabora ivice. Slika 14c pokazuje stepen parakeratoze. Slika 14 D pokazuje broj inflamatomih mononukleamih ćelija u gornjem delu kože. Slika 14E pokazuje broj Ki-67+ cikliziranih keratinocita.

Slika 15 pokazuje H&E bojenje humane psorijatične kože transplantirane u SCID miševe, posle tretmana sa antitelom 146G7 (panel C), sa CsA (panel B) ili sa tečnim nosačem (panel A). Tri nedelje posle transplantacije miševi su primili PBS (placebo), CsA (ciklosporin A) (Sandoz) sa dozom od 10 mg/kg, svakog drugog dana, tokom 15 dana, ili 146B7, sa dozom 20 mg/kg, 1. dana i 10 mg/kg 8. i 15. dana. Nedelju dana posle zadnje injekcije, miševi su žrtvovani, pa je iz svakog ksenografta uzeta biopsija sa probojcem od 4 mm. Biopsije se fiksiraju u formalinu, za oblaganje parafinom i bojenje sa H&E.

Slika 16 pokazuje bojenje sa Ki-67 humane psorijatične kože, transplantirane u SCID miševe, posle tretmana sa 146B7 (panel C), sa CsA (panel B) ili sa tečnim nosačem (panel A). Tri nedelje posle transplantacije miševi primaju PBS (placebo), CsA (ciklosporin A) (Sandoz) sa dozom 10 mg/kg, svakog drugog dana, tokom 15 dana, ili 146B7 sa dozom 20 mg/kg, 1. dana i 10 mg/kg 8. i 15. dana. Nedelju dana posle zadnje injekcije, miševi se žrtvuju, pa se sa svakog ksenografta uzme biopsija sa probojcem od 4 mm. Biopsije se fiksiraju u formalinu, za oblaganje parafinom i bojenje sa Ki-67 antigenom jezgra.

Slika 17 je grafik koji pokazuje vezivanje antitela 146B7 za mesto vezivanja receptora IL-15. Ploče se oblože sa IL-15R« i inkubiraju se sa IL-15. Posle 10 min u bazenčie se doda biotinilovani 146B7. Vezivanje 146B7 za mesto vezivanja receptora 11-15 se vrednuje na 405 nm, u čitaču ELISA.

Slika 18 je grafik koji pokazuje vezivanje antitela 146B7 za IL-15, posle vezivanja IL-15 za njegov receptor, koji se izlučuje u ćelijama Raji. Posle inkubacije sa IL-15 ćelija Raji, koje izlučuju IL-15, doda se ćelijama, posle 10 min, biotinilovani 146B7. Vezivanje 146B7 za IL-15 vezan na receptom, vrednuje se analizom

FACS.

Detaljan opis pronalaska

Ovaj pronalazak daje nova terapeutska sredstva zasnovana na antitelima za tretiranje i dijagnistiku poremećaja posredovanih sa IL-15 (tj. poremećaja izazvanih proinflamatomim efektima IL-15). Naziv "proinflamatomi efekti IL-15", kako se ovde koristi, obuhvata humoralne ili ćelijski posredovane imuno odgovore izazvane sa IL-15, kao što su stvaranje TNFa i drugih inflamatomih medijatora i angažovanje/ili proliferaciju T-ćelija. Terapije iz ovog pronalaska koriste izolovana humana monoklonalna antitela koja se specifično vezuju za epitop prisutan na IL-15.

U jednoj realizaciji humana antitela se stvaraju u ne-humanoj transgenoj životinji, npr. transgenom mišu, koja je u stanju da stvara mnogostruke izotipove humanih monoklonalnih antitela za IL-15 (npr. IgG, IgA i/ili IgE), ili da podleže V-D-J rekombinaciji ili zameni izotopa. U skladu sa tim, razni aspekti ovog pronalaska su antitela i njihovi farmaceutski proizvodi, kao i ne-humane transgene životinje, B-ćelije, transfektome ćelije domaćina i hibridome, za pravljenje monoklonalnih antitela. Postupci upotrebe antitela iz ovog pronalaska za detekciju ćelija za koje se vezuje IL-15 i/ili inhibiciju funkcija posredovanih sa IL-15, biloin vitroiliin vivo,takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom. Obuhvaćeni su takođe postupci za agense koji ciljaju ćelije za koje se vezuje IL-15.

Da bi se ovaj proalazak brže razumeo, prvo će se definisati neki termini. Dodatne definicije se daju tokom detaljnog opisivanja.

Nazivi "IL-15", "antigen IL-15" i "interleukin 15" koriste se ovde naizmenično, i obuhvataju bilo koji od varijanata ili izoforma koje prirodno izlučuju ćelije.

Naziv "antitelo" se ovde odnosi na čitavo antitelo i na bilo koji fragment koji vezuje antigen (tj. "deo koji vezuje antigen") ili jedan njegov lanac. "Antitelo" se odnosi na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca uzajamno povezana disulfkJnim vezama, ili njihov deo koji vezuje antigen. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skaćeno Vl) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži jedan domen, CL. Regioni VHi VLse dalje dele na regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima određivanja komplementarnosti (CDR), koji su raspoređeni između regiona koji su očuvaniji, a nazivaju se regioni nosećeg skeleta strukture (FR). Svaki VHi VL je sastavljen od tri CDR i četiri FR, koji su raspoređeni od amino-kraja do karboksi-kraja u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže domen vezivanja koji stupa u interakciju sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju kod vezivanja imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući razne ćelije imunosistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog komplementarnog sistema.

Naziv "deo koji vezuje antigen" antitela (ili jednostavno "deo antitela"), kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržava svojstvo specifilnog vezivanja za antigen (npr. IL-15). Pokazano je da funkcija antitela vezivana za antigen može da se obavi preko fragmenata čitave dužine antitela. Primeri vezivih fragmenata antitela, obuhvaćeni nazivom "deo koji vezuje antigen", su (i) fragment Fab, monovalentni fragment koji se sastoji od Vl, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2fragment, dvovalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu savijanja; (iii) Fd fragment se sastoji od Vhi CH1 deomena; (iv) Fv fragment se satoji od VLi Vhdomena jedne grane antitela; (v) dAb fragment (VVard et al.,Nature,1999, 341, 544-546), koji se sastoji od Vhdomena; i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR), ili (vii) kombinacija dva ili više izolovanih CDR, koji opciono mogu biti pripojeni uz sintetski linker. Pored toga, mada se dva domena Fv fragmenta, Vli VH, kodiraju odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, korišćenjem rekombinantnih metoda, preko sintetskog linkera koji im omogućava da naprave jedinstveni proteinski lanac u kome par regiona Vli Vhformira monovalentne molekule (poznat kao Fv jedinstvenog lanca (csFv); videti npr. Bird et al.,Science,1988, 242, 423-426; i Huston et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA1988, 85, 5879-5883). Takva antitela jedinstvenog lanca su takođe obuhvaćena unutar naziva "deo koji vezuje antigen" antitela. Ovi fragmenti antitela se dobijaju korišćenjem konvencionalnih tehnika, koje su poznate onima koji su verziraniu stanje tehnike, a ti fragmenti se koriste za široko ispitivanje i razne upotrebe, na isti način kao nedirnuta antitela.

Naziv "monoklonalno antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje pokazuje specifičnost i afinitet vezivanja jedino za određeni epitop. U skladu sa tim, naziv "humano monoklonalno antitelo" se odnosi na antitelo koje pokazuje ovakvu specifičnost vezivanja, a ima varijabilne i konstantne regione koji su izvedeni iz humane skevencije germ-soja imunoglobulina. U jednoj realizaciji, humana monoklonalna antitela se stvaraju pomoću hibrodoma, koje uključuju B-ćelije dobijene iz transgene ne-humane životinje, npr. transgenog miša, a imaju genom koji sadrži humani teški lanac transgena i laki lanac transgena, spojene u besmrtnoj ćeliji.

Naziv "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde koristi, obuhvata sva antitela koja se dobijaju, izlučuju, stvaraju ili izoluju rekombinantnim sredstvima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomalna za gene humanog imunoglobulina ili hidbridoma dobijenih iz nje (biće još opisana u Odlejku I, niže), (b) antitela izolovana iz ćelija domaćina transformisanih tako da izlučuju to antitelo, npr. iz transfektoma; (c) antitela izolovana iz biblioteke rekombinantnih, kombinatornih humanih antitela, i (d) antitela dobijena, izlučena, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim načinom, koji obuhvata spajanje sekvencija gena humanog imunoglobulina sa drugim sekvencijama DNK. Ovakva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione iz humane sekvencije imunoglobulina germ-soja. Međutim, u nekim realizacijma, ova rekombinantna humana antitela se mogu podvrgnuti mutageneziin vitro(ili, ako se koristi životinja transgena za humane sekvencije Ig, somatskom mutagenezomin vivo),pa tako sekvencije aminokiselina regiona VHi VLovih rekombinantnih antitela su sekvencije koje, iako izvedene iz, i srodne humanim sekvencijama germ-soja Vhi VL, ne moraju da prirodno postoje unutar repertoara humanog germ-soja antitelain vivo.

Kako se ovde koristi, "heterologno antitelo" se definiše u vezi sa transgenim ne-humanim organizmom, koji proizvodi to antitelo. Ovaj naziv se odnosi na antitelo koje ima sekvenciju aminokiselina ili kodifikovanu sekvenciju nukleinskih kiselina koja odgovara onoj koja se nalazi u organizmu koji ne čini transgena ne-humana životinja, a obično vrste koja se razlikuje od transgene ne-humane životinje.

"Izolovano antitelo", kako se ovde koristi, namera je da se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela, koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za IL-15 je u suštini bez antitela koja se specifično vezuju za antigene različite od IL-15). Međutim, izolovano antitelo

koje se specifično vezuje za epitop IL-15, ima ukršetnu neaktivnost sa drugim srodnim citokinima, ili sa drugim proteinima IL-15 iz različitih živih vrsta. Međutim, ovo antitelo se uvek prvenstveno vezuje za humani IL-15, izolovano antitelo je tipično u suštini bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednoj realizaciji ovog pronalaska, kombinacija "izolovanih" monoklonalnih antitela koja imaju različite specifičnosti IL-15, se kombinuje u dobro definisani preparat.

"Specifično vezivanje", kako se ovde koristi, odnosi se na vezivanje antitela na predodređeni antigen. Tipično, ovo antitelo se vezuje sa afinitetom (Kd) približno manjim od10"<7>M, kao što je približno manjim od lO^M,10"<9>M ili 10"10M, ili čak i nižim, kada se određuje tehnologijom rezonancije površinskih plazmona (SPR) u instrumentu BIACORE 300, korišćenjem rekombinantnog humanog IL-15 kao analita, a antitela kao liganda, i vezuje se na predodređeni antigen sa afinitetom koji je najmanje dvostruko veći od vezivanja ne-sepcifičnog antigena (npr. BSA; kazein) koji je različit od predodređenog antigena, ili blisko srodnog antigena. Fraze, "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen", koriste se ovde naizmenično sa terminom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".

Simbol "Kd" ovde se koristi sa namerom da se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen.

"tzotip", kako se ovde koristi, označava klasu antitela (npr. IgM ili lgG1) koja je kodirana teškim lancem konstantnog regiona gena.

"Zamena izotipa", kako se ovde koristi, odnosi se na pojavu kojom se klasa, ili izotip, antitela menja iz jednog Ig klase u jedan iz druge Ig klase.

"Nezamenjiv izotip", kako se ovde koristi, odnosi se klasu izotipa teškog lanca koja se stvara kada se ne odigrava zamena izotipa; CH gen koji kodira nezamenjivi izotip, tipično je prvi CH gen, odmah silazno od funkcionalno preuređenog VDJ gena. Zamena izotipa se klasifikuje kao klasična ili ne-klasična

zamena izotipa. Klasična zamena izotipa se dešava rekombinantnim događanjima koji sadrže najmanje jedan region zamenjene sekvencije u transgenu. Ne-klasična zamena izotipa se može dogoditi, na primer, homolognom rekombinacijom između humanog aMi humanog Z? (izbacivanje povezano sa 8). Alternativni ne-klasični mehanizmi zamene, kao što je, između ostalih, inter-transgena i/ili inter-hromozomalna rekombinacija, može da se dogodi i ostvari zamenu izotipa.

"Zamena sekvencije", kako se ovde koristi, odnosi se na one sekvencije DNK koje su odgovorne za zamene rekombinacije. "Donor zamene" sekvencije, tipično region u zamene, biće 5' (tj. uzlazno) od regiona konstrukta, koji treba da se izbaci tokom zamene rekombinacije. Region "akceptora zamene" biće zmeđu regiona konstrukta koji treba da se izbaci i konstantnog regiona zamene (npr. y, s itd.). Pošto ne postoji specifično mesto gde se rekombinacija uvek odigrava, konačna sekvencija gena tipično je nepredvidiva iz konstrukta.

"Shema glikozilovanja", kako se ovde koristi, definiše shemu ugljenohidratnih jedinki koje se kovalentno vezuju za protein, određenije za imunoglobulinski protein. Shema glikozilovanja heterolognog antitela može se karakterisati tako što je u suštini slična shemi glikoziolovanja koja se dešava u prirodi na antitelima stvorenim u vrstama ne-humanih transgenih životinja, gde će onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike shvatiti da je shema glikozilovanja heterolognog antitela sličinija shemi glikozilovanja u vrsti ne-humane transgene životinje, nego u vrsti iz koje su CH geni transgena izvedeni.

Naziv "nalazi se u prirodi" ovde se koristi primenjen na neki objekat, označavajući činjenicu da se taj objekat može naći u prirodi. Na primer, sekvencija polipeptida ili polinukleida, koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koji se može izolovati iz izvora u prirodi, a koja nije namemo modifikovana od strane čoveka u laboratoriji, nalazi se u prirodi.

Naziv "preraspoređen" ovde se koristi da označi konfiguraciju mesta teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina, gde je V segment smešten neposredno uz D-J ili J-segment, u konformaciji koja bitno kodira kompletan Vhili VLdomen, respektivno. Preuređeno mesto gena imunoglobulina može se idenifikovati poređenjem sa germ-sojem DNK; preuređeno mesto će imati najmanje jedan rekombinovani heptamerni/nonamerni element homologije.

Naziv "nije preuređen" ili "konfiguracija germ-soja", koristi se ovde pozivajući se na V segment, i odnosi se na konfiguraciju gde V segment nije rekombinovan, stim da je neposredno uz D ili J segment.

Naziv "molekul nukleinske kiseline", ovde se koristi sa namerom da uključi molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednostruko upreden ili dvostruko upreden, poželjno je da je to dvostruko upredena DNK.

Naziv "izolovani molekul nukleinske kiseline" ovde se koristi pozivanjem na nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili delove antitela (npr. Vh, Vl, CDR3) koji se vezuju za IL-15, a namera je da se odnosi na molekul nukleinske kiseline u kome sekvencije nukleotida kodiraju antitelo ili deo antitela bez drugih sekvencija nukleotida, a kodiraju antitela ili delove antitela koji vezuju antigene različite od IL-15, druge sekvencije koje mogu u prirodi da predstavljaju krila nukleinske kiseline u humanoj genomskoj DNK. SEQ ID NO: 1-4 odgovaraju sekvencijama nukleotida i aminokiselina koje sadrže teški lanac (Vh) i laki lanac (VL) varijabilnih regiona humanog anti-IL-15 antitela 146B7, iz ovog pronalaska. Posebno, SEQ ID NO:1 i 2 odgovaraju VHantitela 146B7, a SEQ ID NO: 3 i 4 odgovaraju Vlantitela 146B7.

Ovaj pronalazak obuhvata takođe "modifikacije konzervativne sekvencije" sa sekvencije prikazane sa SEQ ID NO: 1-4, tj. modifikacije sekvencije nukleotida i aminokiselina koje značajno ne utiču ili menjaju vezujuće karakteristike antitela kodirane sekvencijom nukleotida ili koji sadrže sekvenciju aminokiselina. Ove modifikacije konzervativne sekvencije su supstitucije, adicije i izbacivanja nukleotida i aminokiselina. Modifikacije se mogu unositi u SEQ ID NO: 1-4 standardnim tehnikama, koje su poznate u stanju tehnike, kao što su ka mestu usmerena mutageneza i mutageneza posredovana sa PCR. Supstitucije konzervativnih aminokiselina su one u kojima se ostatak aminokiseline zamenjuje sa ostatkom aminokiseline koja ima sličan bočni lanac. Familije ostataka aminokiselina koje imaju slične bočne lance su definisane u stanju tehnike. Ove familije su aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolamim bočnim lancima (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-račvastim bočnim lancima (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, hiditidin). Dakle, predviđeni nebitni ostatak aminokiseline u humanom anti-IL-15 antitelu, poželjno je da se zameni sa drugim ostatkom aminokisline iz iste familije bočnog lanca.

Alternativno, u drugoj realizaciji, mutacije se mogu uvesti nasumice, ćelom dužinom ili delimično na sekvenciji koja kodira anti-IL-15 antitelo, kao što je saturaciona mutageneza, a dobijena modifikovana anti-IL-15 antitela se mogu koristiti za ispitivanje aktivnosti vezivanja.

Prema tome, antitela kodirana sa sekvencijom nukleotida (varijabilni region teškog i lakog lanca), koja su ovde opisana, i/ili sadrže sekvenciju aminokiselina (varijabilni region teškog i lakog lanca), koja je ovde opisana (tj. SEQ. ID NO: 1-4) su u suštini slična antitela kodirana pomoću ili koja sadrže slične sekvencije koje su bile konzervativno modifikovane. Dalja diskusija, o tome kako se takva, u suštini slična antitela, mogu generisati na osnovu delimičnih sekvencija (tj. varijabilnih regiona teškog i lakog lanca), koje su opisane u SEQ ID NO: 1-4, daje se u nastavku.

Kod nukleinskih kiselina naziv "suštinska homologija" ukazuje da su dve nukleinske kiseline, ili njihove naznačene sekvencije identične, ako su optimalno poravnate ili upoređene, sa odgovarajućim umetanjima ili izbacivanja nukleotida, u najmanje oko 80% nukleotida, obično najmanje oko 90% do 95%, poželjnije najmanje oko 98% do 99,5% nukleotida. Alternativno, suštinska homologija postoji kada će segmenti da se hibridizuju pod selektivnim uslovima hibridizacije u komplementarni oblik vlakna.

Procent indentičnosti između dve sekvencije je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvencije (tj. % homologije = # identičnih pozicija / ukupan # pozicija)x100, uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koje treba uvesti za optimalno poravnavanje dve sekvencije. Poređenje sekvencija i određivanje procenta identičnosti između dve sekvencije se može obaviti korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je opisano u ne-ograničavajućim primerima, niže.

Procent identičnosti između dve sekvencie nukleotida može se odrediti korišćenjem programa GAP u paketu softvera GCG (dostupan na http://www.gcg.com), korišćenjem matrice NVVSgapdna.CMP i težine praznine (gap) 40, 50, 60, 70 ili 80, i dužine ove težine 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Procent identičnosti između dve sekvencije nukleotida ili aminokiselina, može se odrediti takođe korišćenjem algoritma koji su dali E. Mevers i W. Miller{ CABIOS,1989, 4:11-17) koji je ugrađen u program ALIGN (verzija 2.0), koristeći PAM120 tabelu ostataka težine, gap length penaltv 12 i gap penaltv 4. Uz to, procent identičnosti između dve sekvencije aminokiselina se može odrediti korišćenjeme algoritma koji su dali Needleman i VVunsch( J. Mol. Biol.1970, 48, 444-453) koji je ugrađen u program GAP u paketu softvera GCG (dostupan na http:/ Avww. qcq. com). koristeći ili matricu Blossum 62 ili matricu PAM250, i težinu praznine 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4, i dužinu težine 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.

Sekvencije nukleinskih kiselina i proteina iz ovog pronalaska mogu se dalje koristiti kao "sekvencija za istraživanje" da se obavi pretraživanje javnih baza podataka, u pogledu, na primer, identifikacije srodnih sekvencija. Takva pretraživanja se mogu obaviti korišćenjem NBLAST i XBLAST programa (verzija 2.0), koju su dali Altschul et al., uJ. Mol. Biol.1990, 215, 403-410. BLAST pretraživanja nukleotida se mogu obaviti sa programom NBLAST, rezultat = 100, dužina reči = 12, da se dobiju sekvencije nukleotida homologne molekulima nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska. BLAST pretraživanja proteina se mogu obaviti sa programom XBLAST, rezultat = 50, dužina reči = 3, da se dobiju sekvencije aminokiselina homologne sa molekulima proteina iz ovog pronalaska. Da se dobiju poravnanja sa prazninama u svrhu poređenja, može se koristiti Gapped BLAST, kao što su opisali Altschul et al., uNucleic Acids Res.1997, 25(17), 3389-3402. Kada se koriste BLASt i Gapped BLAST programi, mogu se koristiti paramateri po ditbltu respektivnih programa (npr. XBLAST i NBLAST) . Videti http://www-ncbi.nlm.nih.gov.

Nukleinske kiseline mogu biti u celim ćelijama, u lizatu ćelija, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjenja suštinski čistom", kada se prečisti standardnim tehnikama od drugih ćelijskih komponenti, ili drugih kontaminanata, npr. drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, uključujući tretman alkalija/SDS, banding tehnika sa CsCI, hromatografija na koloni, elektroforeza u agarskom gelu i druge dobro poznate u stanju tehnike. Videti F. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biolog/<*>, Greene Publishing i Wiley Interscience, New York, 1987.

Preparati nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, mada su često u nativnoj sekvenciji (izuzev mod'rfikovanih restrikcionih mesta i slično), bilo od cDNK, genomskoj ili njihovim smešama, mogu se mutirati, u skladu sa standardnim tehnikama koje obezbeđuju sekvencije gena. Za kodirane sekvencije, ove mutacije mogu, ako se želi, da utiču na sekvencije aminokiselina. Podrazumevaju se naročito sekvencije suštinski homologne ili izvedene iz nativnih V, D, J, konstantnih, zamena ili drugih takvih sekvencija koje su ovde opisane (gde "izvedene" ukazuje da je sekvencija identična ili modifikovana iz druge sekvencije).

Nukleinska kiselina je "operabilno povezana" kada se stavi u funkcionalni odnos sa dugom sekvencijom nukleinskih kiselina. Na primer, promoter ili pojačavač je operabilno povezan sa kodirajućom sekvencijom ukoliko utiče na transkripciju te sekvencije. U pogledu transkripcije regulatomih sekvencija, operabilno povezan znači da su sekvencije DNK koje su povezane u kontaktu, tamo gde je potrebno da se spoje dva proteina koji kodiraju regione, koji su u kontaktu i unutar riding frejma. Za sekvencije zamene, operabilno povezan kazuje da su sekvencije u stanju da ostvaruju zamenu rekombinacije.

Naziv "vektor", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je u stanju da transportuje drugu nukleinsku kiselinu, za koju je vezan. Jedan tip vektora je "plazmid", koji se odnosi na cikličnu dvostruko upletenu spiralu DNK, u koju se mogu vezivati dodatni segmenti DNK. Sledeći tip vektora je virusni vektor, gde dodatni segmenti DNK mogu da se vezuju u virusni genom. Neki vektori su u stanju autonomne replikacije u ćeliji domaćina u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalne sisarske vektore). Drugi vektori (npr. ne-epizomalni sisarski vektori) mogu da se integrišu u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i tako se replikuju zajedno sa genomom domaćina. Pored toga, neki vektori su u stanju da usmeravaju izlučivanje gena sa kojima su operabilno povezani. Takvi vektori se ovde citiraju kao "vektori rekombinantnog izlučivanja" (ili jednostavno, "vektori izlučivanja"). Obično su vektori izlučivanja, korisni u tehnikama rekombinantne DNK, često u obliku plazmida. U ovoj prijavi "plazmid" i "vektor" se mogu koristiti naizmenično, pošto je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora. Međutim, namera je da ovaj pronalazak obuhvati i druge oblike vektora izlučivanja, kao što su virusni vektori (npr. retrovirusi sa defektnom replikacijom, adenovtrusi i adeno-srodni virusi), koji pružaju ekvivalentne funkcije.

Naziv "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćina"), kako se ovde koristi, označava ćeliju u koju je unet vektor izlučivanja. Podrazumeva se da su ovi nazivi namenjeni ne samo određenoj ćeliji subjekta, nego i potomcima takve ćelije. Zato što se neke modifikacije mogu dogoditi u narednim generacijama, usled njihove mutacije ili uticaja sredine, i takav potomak može, u stvari, da ne bude identičan roditeljskoj ćeliji, ali je još uvek unutar obima naziva "ćelija domaćina", kako se ovde koristi.

Naziv "subjekt", kako se ovde koristi, je bilo koje humano ili ne-humano biće. Na primer, postupci i preparati iz ovog pronalaska se mogu koristiti za tretiranje subjekta sa inflamatomom bolešću, kao što je artritis, npr. reumatoidni artritis. Naziv "ne-humana životinja" ili "ne-humano biće" obuhvata sve kičmenjake, npr. sisare i ne-sisare, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, perad, vodozemci, reptili itd.

Razni aspekti ovog pronalaska su opisani u više detalja u odeljcima koji slede.

I. Pobijanje humanih antitela za IL- 15

Humana monoklonalna antitela iz ovog pronalaska mogu se dobiti korišćenjem raznih poznatih tehnika, kao što je tehnika hibridizacije standardnih somatskih ćelija, koju su opisali Kohleri Milstein, uNature,1975, 256. 495. Mada su tehnike hibridizacije somatskih ćelija poželjne, u principu mogu se koristiti i druge tehnike za stvaranje monoklonalnih antitela, npr. virusne ili onkogene transformacije B limfocita, tehnike izlaganja fagama, koje koriste biblioteke gena humanih antitela.

Poželjan životinjski sistem za generisanje hibridoma koji proizvode humana monoklonalna antitela iz ovog pronalaska, je mišji sistem. Stvaranje hibridoma u mišu je dobro poznato u stanju tehnike, uključujući protokole imunizacije i tehnike izolovanja i spajanja imunizovanih splenocita.

U jednoj realizaciji, humana monoklonalna antitela protiv IL-15 generišu se korišćenjem transgenih ili transhromozomalnih miševa, koji nose delove humanog imuno sistema, radije nego mišjeg sistema. U jednoj realizaciji, ovaj pronalazak koristi transgene miševe, koji se ovde nazivaju "HuMAb miševi", koji sadrže u humanom genu imunoglobulina mestašca koja kodiraju nepreuređene sekvencije imunoglobulina (ni y) teškog iklakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogena mesta n iklanca (Lonberg, N. et al.,Nature,1994, 368(6474), 856-859). U skladu sa tim, miševi pokazuju smanjeno izlučivanje mišjeg IgM ili k, a kao odgovor na imunizaciju, unešeni humani teški i laki lanci transgena, podležu klasi zamenjivanja i somatske mutacije, generišući humana monoklonalna antitela IgGic visokog afiniteta (Lonberg N. et al., 1994, vidi gore; dat kao pregled u Lonberg, N." Handbook of Experimental Pharmacology",1994, 113, 65-93; i u Harding, F. i Lonberg, N.,Ann. N. Y. Acad. Sci.1995, 764, 536-546). Dobijanje HuMAb miševa detaljno je opisano u Odeljku II., niže, i u Taylor, L. et al.,NucleicAcid Research,1992, 20, 6287-6295; Chen, J. et al.,International lmmunofogy,1993, 5, 647-656; Tuaillon et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1993, 90, 3720-3724; Choi et al.,Nature Genetics,1993, 4, 117-123; Chen, J. et al.,EMBO J.1993, 12, 821-830; Tuaillon et al.,J. Immunol.1994, 152, 2912-2920: Lonberg et al.,Nature,1994, 368(6474). 856-859; Lonberg, N.,Handbook of Experimental Pharmacology,1994, 113. 49-101; Tavlor, L. et al.,Interantional lmmunology,1994, 6, 579-591; Lonberg, N i Huszar, D.,Intem. Rev. Immunol.1995, 13, 65-93; Harding, F. i Lonberg, N.Ann. N. Y. Acad. Sci.1995, 764, 536-546; Fishwild, D. et al.,Nature Biotechnology,1996, 14, 845-851. Videti još i u U.S. Patent-ima No. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299 i 5,770,429; svi su Lonberg-a i Kay-a i GenPharm International; U.S: Patent No. 5,545,807, Surani et al.; zatim u International Publication No. WO 98/24882, objavljenoj 11. juna 1998; WO 94/25585, objavljenoj 10. novembra 1994; WO 93/1227, objavljenoj 24. juna 1993; WO 92/22645, objavljenoj 23. decembra 1992; WO 92/03918, objavljenoj 19. marta 1992. Dobijanje HC012 transgenih miševa HuMAb je posebno opisano u Primeru 2.

Imunizacije

Da bi generisali potpuno humana monoklonalna antitela za IL-15, transgeni ili transhromozomalni miševi, koji sadrže humane gene imunoglobulina (npr. Hco12, Hco7 ili KM miševi), mogu se imunizirati sa prečišćenim ili obogaćenim preparatom antigena IL-15 i/ili ćelijama koje izlučuju IL-15, kao što su opisali, na primer, Lonberg et al., uNature,1994, 368(6474). 856-859; Fishwild et al.,Nature Bk) tchnology,1996, 14. 845-851 i WO 98/24884. Alternativno, miševi se mogu imunizovati sa DNK koja kodira humani IL-15. Poželjno je da miševi budu stari 6-16 nedelja, posle prve infuzije. Na primer, prečišćeni ili obogaćeni preparat (5-50 ug) antigena IL-15 može da se koristi za imunizaciju HuMAb miševa intraperitonealnim putem. U slučaju da imunizacije, koje koriste prečišćene ili obogaćene preparate antigena IL-15 de daju antitela, miševi se mogu takođe imunizovati ćelijama koje izlučuju IL-15, npr. sojem ćelija koji promoviše imuno odgovore.

Kumulativno iskustvo sa raznim antigenima je pokazalo da je odgovor transgenog miša HuMAb najbolji kada se prvo imunizuje intrapeirtonealno (IP) ili subkutano (SC) sa antigenom u kompletnom Freund-ovom adjuvantu, posle čega slede, svake druge nedelje, IP/SC imunizacije (sve do ukupno 10) sa antigenima u kompletnom Freund-ovom adjuvantu. Imuno odgovor se može pratiti tokom ovog protokola imunizacije preko uzoraka plazme dobijenih retroorbitalnim uzimanjem krvi. Plazma se može ispitivati pomoću ELISA (kao što je opisano niže), a miševi sa dovoljnim titrom antil-IL-15 humanog imunoglobulina mogu se koristiti za fuzije. Miševi se mogu ojačati intravenozno sa antigenom, 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine.

Genehsanje hibridoma koje stvaraju humana monoklonalna antitela za IL- 15

Za generisanje hibridoma koje stvaraju humana monoklonalna antitela za IL-15, mogu se izolovati splenociti i ćelije limfnih čvorova miševa i fuzionisati u odgovarajući soj besmrtnih ćelija, kao što je soj ćelija mišjeg mijeloma. Dobijeni hibridomi se mogu zatim ispitati na stvaranje antitela specifičnih za antigen. Na primer, suspenzije pojedinačnih ćelija limfocita slezine iz imunizovanih miševa mogu se fuzionisati sa SP2/0-Ag8.653 ćelijama mijeloma miša koji ih ne izlučuje (ATCC, CRL 1580) sa 50% PEG( m/ V).Ćelije se mogu zasejati sa približno 1*10<5>, na mikrotitarske ploče sa ravnim dnom, posle čegla sledi dve nedelje inkubacije u selektivnom medijumu, koji pored uobičajenih reagenasa sadrži 10% seruma klona fetusa, 5-10% faktora kloniranja origen hibridoma (IGEN) i 1XHAT (Sigma). Posle približno dve nedelje, ćelije se mogu kultivisati u medijumu, u kojeme se HAT zameni sa HT. Bazenčići se pojedinačno ispituju sa ELISA na humana anti-IL-15 monoklonalna IgM i IgG antitela. Kada dođe do ekstenzivnog rasta hibridoma, medijum se može nadgledati obično posle 10-14 dana. Hibridomi koji izlučuju antitelo mogu se ponovo zasejati, pa ako su još uvek pozitivni na humana antil-IL-15 monoklonalna antitela IgG, mogu se subklonirati najmanje dva puta sa ograničenim razblaživanjem. Stabilni subkloni se mogu zatim kultivisatiin vitro,da generišu antitelo u medijumu kulture tkiva, radi karakterisanja.

Generisanje transfektoma koje stvaraju humana monoklonalna antitela za IL- 15

Humana antitela iz ovog pronalaska mogu se stvarati u transfektomama ćelija domaćina, koristeći na primer, kombinaciju tehnika rekombinantne DNK i metoda transfekcije gena, što je dobro poznato u stanju tehnike (Morrison, S.,Science,1985, 229, 1202).

Na primer, u jednoj realizaciji gen ili geni od interesa, npr. geni humanog antitela, mogu se povezati u vektor za izlučivanje, kao što je eukariotsko izlučivanje plazmida, korišćeno u sistemu izlučivanja GS gena, opisanom u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338 841, ili u dugim sistemima izlučivanja, koji su dobro poznati u stanju tehnike. Prečišćeni plazmid sa kloniranim genima antitela, može se uneti u eukariotske ćelije domaćina, kao što su CHO-ćelije ili NSO-ćelije, ili alternativno, druge eukariotske ćelije, kao što su ćelije izvedene iz biljaka, gljivica ili ćelija kvasca. Postupak koji se koristi za unošenje ovih gena mogao bi biti postupak koji je opisan u stanju tehnike kao elektroporacija, lipofektin, lipofektamin ili drugi. Posle unošenja antitela ovih gena u ćelije domaćina, mogu se ćelije koje izlučuju ovo antitelo identifikovati, i selekcionisati. Ove ćelije predstavljaju transfektome, koje se zatim mogu pojačati u pogledu nivoa njihovog izlučivanja i obogatiti, tako da proizvode antitela. Iz bistrih delova ovih kultura i/ili ćelija mogu se izolovati i prečistiti rekombinantna antitela.

Alternativno, antitela ovih kloniranih gena mogu se izlučivati u dugim sistemima za izlučivanje, kao što jeE. coli,ili u kompletnim organizmima, ili se mogu sintetski izlučivati.

Upotreba delimičnih sekvencija antitela za izlučivanje neoštećenih antitela

Antitela stupaju u interakciju sa ciljanim antigenima, prvenstveno preko ostataka aminokiselina smeštenih u šest teških i lakih lanaca regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Iz tog razloga, sekvencije aminokiselina u CDR, su raznovrsnije između pojedinačnih antitela, nego između sekvencija van CDR. Zato što su sekvencije CDR odgovorne za većinu interakcija antitelo-antigen, moguće je da se izlučuju antitela koja imitiraju svojstva specifičnih antitela koja se nalaze u prirodi, konstruisanjem vektora za izlučivanje koji imaju sekvencije CDR iz specifičnog antitela koje se nalazi u prirodi, graftovanog na sekvenciju nosećeg skeleta strukture sa različtog antitela sa različitim svojstvima (videti, npr. Riechmann, L. et al.,Nature,1998, 332. 323-327; Jones, P. et al.,Nature,1986, 321. 522-525; i Queen, C. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA,1989, 86, 10029-10033). Ove sekvencije nosećeg skeleta strukture mogu se dobiti iz javnih baza podataka DNK, koji obuhvataju sekvencije germ-soja gena antitela. Ove sekvencije germ-soja se razlikuju od zrelih sekvencija gena antitela, zato što ne obuhvatau kompletno združene varijabilne gene, koji su formirani V(D)J spajanjem tokom sazrevanja B ćelija. Sekvencije germ-soja takođe se razlikuju od sekvencija sekundarnog repertoara antitela visokog afiniteta, pojedinačno ravnomemih u varijabilnom regionu. Na primer, somatske mutacije nisu relativno česte u regionu nosećeg skeleta strukture na delu sa amino-kraja. Na primer, somatske mutacije nisu relativno česte u regionu 1 nosećeg skeleta strukture na delu sa amino-kraja i u regionu 4 na delu sa karboksi kraja. Pored toga, mnoge somatske mutacije ne menjaju značajno svojstva vezivanja antitela. Iz tog razloga, nije potrebno da se dobije čitava sekvencija DNK određenog antitela, kako bi se ponovo stvorilo neoštećeno rekombinantno antitelo koje ima svojstva vezivanja slična istima u originalnom antitelu (videti, PCT/US99/05535, podnet 12. marta 1999). Za ovu svrhu, tipično je dovoljna delimična sekvencija teškog i lakog lanca, koja se prostire u CDR regionima. Delimična sekvencija se koristi za određivanje koja promenljiva germ-soja i priključenih segmenata gena doprinosi rekombinovanim varijabilnim genima antitela. Sekvencija germ-soja se zatim koristi u delovima koji nedostaju iz varijabilnog regiona. Vodeće sekvencije teškog i lakog lanca se otcepljuju tokom sazrevanja proteina i ne doprinose svojstvima konačnog antitela. Da bi se dodale sekvencije koje nedostaju, mogu se kombinovati klonirane sekvencije cDNK sa sintetskim oligonukleotidima preko vezivanja ili pojačavanja pomoću PCR. Alternativno, čitav varijabilni region se može sintetizovati kao skup kratkih oligonukleotida koji se preklapaju, pa kombinovati preko pojačavanja sa PCR, da se kreira potpuno sintetski klon varijabilnog regiona. Ovaj proces može da ima neke prednosti, kao što je eliminisanje ili prikljičivanje naročitih resktrikcionih mesta, ili optimizacija posebnih kodona.

Sekvencije nukleotida transkripata teškog i lakog lanca hibridoma koriste se za dizajniranje preklapajućeg seta sintetskih oligonukleotida, da bi se stvorile sintetske V sekvencije sa identičnim kapacitetima kodiranja aminokiselina, kao kod prirodnih sekvencija. Sintetske frekvencije teškog i kapa lanca mogu da se razlikuju od prirodnih sekvencija na tri načina: vlakna ponovljenih baza nukleotida se prekinu da se olakša sinteza oligonukleotida i amplifikacija PCR; ugrađuju se optimalna mesta za iniciranje translacije, u skladu sa Kozak-ovim pravilima (Kozak, 1991,J. Biol. Chem.1991, 266L, 19867019870), a mesta Hindlll se stvaraju uzlazno od mesta za inicijaciju translacije.

Za varijabilne regione i teškog i lakog lanca, optimizovano kodirana i odgovarajuće ne-kodirana vlakna sekvencije se prekidaju silazno 30-50 nukleotida, približno oko sredine odgovarajućeg ne-kodirajućeg oligonukleotida. Dakle, za svaki lanac, oligonukleotidi se mogu sakupiti u preklapajuće dvostruko uvijene setove koji imaju segmente od 150-400 nukleotida. Ovi skupovi se zatim koriste kao šabloni za proizvodnju proizvoda amplifikacije PCR od 150-400 nukleotida. Tipično, jedan varijabilni region seta oligonukleotida će se razbiti u dva skupa koji su odvojeno amplifikovani, generišući dva preklapajuća PCR proizvoda. Ovi preklapajući proizvodi se zatim kombinuju pomoću PCR amplifikacije formirajući kompletan varijabilni region. Može takođe biti poželjno da se uključi preklapajući fragment konstantnog regiona teškog ili lakog lanca (uključujući mesto Bbsl lakog kapa lanca, ili Agel mesto teškog gama lanca) u amplifikaciju PCR da se generišu fragmenti koji se lako mogu klonirati u konstrukte vektora za izlučivanje.

Rekonstruisani varijabilni regioni teškog i lakog lanca se zatim kombinuju sa kloniranim promoterom, liderom sekvencije, inicijatorom translacije, liderom sekvencije, konstantnim regionom, 3' netransliranjem, poliadenilovanjem i završetkom transkripcije sekvencija da formiraju konstrukte vektora za izlučivanje. Konstrukti za izlučivanje teškog i lakog lanca mogu se kombinovati u jedan vektor, ko-transficirati, serijski transficirati, ili odvojeno transficirati u ćelijama domaćina, a zatim fuzionisati da se formira ćelija domaćina koja izlučuje oba lanca.

Plazmidi koji se koriste u konstruisanju vektora za izlučivanje za humani IgGic, opisani su niže (Primer 1). Ovi plazmidi su konstrisani tako da PCR amplifikovane sekvencije V teškog i V kapa lakog lanca cDNK mogu da se koriste da se rekonstruišu kompletni minigeni teškog i lakog lanca. Ovi plazmidi se mogu koristiti za izlučivanje potpuno humanih antitela IgGnc ili lgG4K. Potpuno humana ili himema antitela iz ovog pronalaska su takođe i lgG2, lgG3, IgE, IgA, IgM i IgD antitela. Slični plazmidi se mogu konkstruisati za izlučivanje drugih izotipova teškog lanca, ili za izlučivanje antitela koja sadrže lake lambda lance.

Dakle, u sledećem aspektu ovog pronalaska, koriste se strukturne karakteristike humanih anti-IL-15 antitela iz ovog pronalaska, 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4, za kreiranje strukturno srodnih humanih anti-IL-15 antitela, koja zadržavaju najmanje jedno funkcionalno svojstvo antitela iz ovog pronalaska, kao što je vezivanje za IL-15. Određenije, jedan ili više CDR regiona 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4 mogu da se rekombinantno kombijuju sa poznatim humanim regionima nosećeg strukturnog skeleta i sa CDR, da se stvaraju druga, rekonbinantno-skrojena, humana anti-IL-15 antitela iz ovog pronalaska.

U skladu sa time, u sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak daje postupak za dobijanje anti-IL-15 antitela, koji se sastoji od: dobijanja antitela koje sadrži: (1) teški lanac humanih regiona nosećeg strukturnog skeleta i teški lanac humanih CDR, gde najmanje jedan od teških lanaca humanih CDR sadrži sekvenciju aminokiselina koja se bira između sekvencija aminokiselina CDR pokazanih na Slici 2 (ili odgovarajućih ostataka aminokiselina u SEQ ID NO: 2); i (2) laki lanac humanog regiona nosećeg strukturnog skeleta i laki lanac humanih CDR, gde najmanje jedan teški lanac humanih CDR sadrži sekvenciju aminokiselina koja se bira između selekcija CDR prikazanih na Slici 3 (ili odgovarajućih ostataka aminokiselina u SEQ ID NO: 4); gde antitelo zadržava svojstvo da se vezuje za IL-15.

Ovo svojstvo antitela da se vezuje za IL-15, može se odrediti korišćenjem standarnih testova vezivanja, kao što su oni koji su opisani u Primerima (npr.

ELISA).

Pošto je u stanju tehnike dobro poznato da antitela teškog i lakog lanca domena CDR igraju naročito značajnu ulogu u specifičnosti/afinitetu vezivanja antitela za antigen, rekombinantna antitela iz ovog pronalaska, dobijena kao što je gore opisano, poželjno je da sadrže teški i laki lanac CDR iz 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4. Ova antitela mogu još da sadrže CDR2 iz 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4. Ova antitela mogu još da sadrže CDR1 iz 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4. Ova antitela mogu još da sadže bilo koje kombinacije ovih CDR.

Prema tome, u sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak daje još anti-IL-15 antitela koja sadrže: (1) teški lanac humanih regiona nosećeg strukturnog skeleta , teški lanac humanog regiona CDR1, teški lanac humanog regiona CDR2 i teški lanac humanog regiona CDR3, pri čemu se teški lanac humanog regiona CDR3 bira između CDR3 iz 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4, na primer, teški lanac humanog regiona CDR iz 146B7 je pokazan na Slici 2 (ili odgovarajući ostaci aminokiselina u SEQ ID NO: 2); i (2) laki lanac humanog regiona nosećeg strukturnog skeleta , laki lanac humanog regiona CDR1, laki lanac humanog regiona CDR2, laki lanac humanog regiona CDR3, gde se laki lanac humanog regiona CDR3 bira između CDR iz 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4, na primer laki lanac humanog regiona CDR iz 146B7 je pokazan na Slici 3 (ili odgovarajući ostaci aminokiselina u SEQ ID NO: 4), gde antitelo vezuje IL-15. Antitelo može još da sadrži teški lanac CDR2 i/ili laki lanac CDR2 iz 146B7,146H5, 404A8 i 404E4. Antitelo može još da sadrži teški lanac CDR1 i/ili lakil lanac CDR1 iz 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4.

Regioni CDR1, 2 i/ili 3 iz ovako skrojenih antitela opisanih gore, mogu se sastojati od tačne jedne ili više sekvencija aminokiselina, kao što su one iz 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4, koje su opisane ovde. Međutim, stručnjak koji je uobičajeno verziran shvata da su moguće izvesne devijacije od tačnih sekvencija CDR u 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4, a da se ipak zadrži svojstvno antitela da efikasno vezuje IL-15 (npr. modifikacije konzervativne sekvencije). Prema tome, u sledećoj realizaciji, skrojeno antitelo može da bude sastavljeno od jednog ili više CDR koji su, na primer, 90%, 95%, 98% ili 99,5% identični sa jednom ili više CDR iz 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4.

Pored jednostavnog vezivanja za IL-15, skrojena antitela, kao što su ona opisana gore, mogu se birati u pogledu zadržavanja ili drugih funkcionalnih svojstava antitela iz ovog pronalaska, kao što su: (1) vezivanje za humani IL-15 i inhibiranje proinflamatornih efekata izazvanih sa IL-15; (2) inhibiranje stvaranja TNFa ili proliferacije T ćelija izazvano sa IL-15; (3) vezivanje za humani IL-15 sa konstantom ravnoteže disocijacije (Ko) manjom od približno 10~<7>M, kada se određuje tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (SPR) na instrumentu BIACORE 3000, korišćenjem rekombinantnog humanog IL-15 kao analita, a antitela kao liganda; (4) vezivanje za epitop smešten na (3- i/ili y-lancu domena za interakciju humanog IL-15; (5) interferiranje sa vezivanjem Asp<8>humanog IL-15 za p-jedinicu receptora humanog IL-15 i/ili Gln108 y-jedinicu receptora humanog IL-15; (6) vezivanje za receptor vezani humani IL-15; (7) vezivanje za humani IL-15 i inhibiranje svojstva humanog IL-15 da indukuje parakeratozu; (8) vezivanje za humani IL-15 i inhibiranje svojstva humanog IL-15 da indukuje debljanje epiderma; (9) vezivanje za humani IL-15 i inhibiranje svojstva humanog IL-15 da indukuje proliferaciju keratinocita; i/ili (10) vezivanje za humani IL-15 i inhibiranje svojstva humanog IL-15 da indukuje hemotaksiju aktiviranih leukocita.

Karakterizacija humanih monoklonalnih antitela za IL- 15

Humana monoklonalna antitela iz ovog pronalaska se mogu karakterisati vezivanjem za IL-15, koristeći razne poznate tehnike. Obično, antitela se prvo karakterišu pomoću ELISA: Ukratko, mikrotitarske ploče se oblože sa prečišćenim IL-15 u OBS, a zatim blokiraju sa irelevantnim proteinima, kao što je albumin iz goveđeg seruma (BSA) razblažen u PBS. Razređenja plazme iz miševa imunizovanih sa IL-15, se dodaju u svaki bazenčić, pa se inkubiraju 1-2 h na 37°C. Ploče se operu sa PBS/Tween 20, a zatim inkubirajul h na 37°C sa kozjim-anti-humanim IgG Fc-specifičnim poliklonalnim ragensom, konjugovanim sa alkalnom fosfatazom. Posle pranja, ploče se razvijaju sa ABTS substratom i analiziraju preko OD na 405 nm. Poželjno je da se miševi, kod kojih su se razvili najveći titri, koriste za fuzije.

Gore opisani ELISA test se može koristiti za ispitivanje antitela, a time i hibridoma, koje proizvode antitela koja pokazuju pozitivnu reaktivnost sa imunogenim IL-15. Hibridome koje se vezuju, poželjno sa visokim afinitetom, za IL-15, mogu se zatim sub-klonirati i dalje karakterisati. Jedan klon iz svakog hibridoma, koji zadržava reaktivnost roditeljskih ćelija (pomoću ELISA), može se zatim odabrati za pravljenje banke ćelija za prečišćavanje antitela.

Da bi se prečistila humana anti-IL-15 antitela, odabrane hibridome mogu da se uzgajaju u roler-bocama, dvo-iitarskim spiner-balonima ili drugim sistemima za kultivisanje. Gornji bistri slojevi se mogu filtrirati i koncentrisati pre hromatografije po afinitetu sa protein A-sefarozom (Pharmacija, Piscataway, NJ), da bi se prečistio protein. Posle izmene pufera sa PBS, može se odrediti koncentracija pomoću OD280, koristeći za koeficijent ekstinkcije 1,43, ili poželjno nefelometrijskom analizom. IgG se može proveriti pomoću gel elektroforeze i metodom specifičnim za antigen.

Da bi se odredilo da li se odabrana humana anti-IL-15 monoklonalna antitela vezuju za pojedine epitope, svako antitelo se može biotinilovati, korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa (Pierce, Rockford, IL). Vezivanje biotinilovanog Mab se može detektovati pomoću probe obeležene streptavidinom. Da bi se odredio izotip pečišćenih antitela, može se obaviti ELISA za izotip, koristeći poznate tehnike. Na primer, bazenčići mikrotitarskih ploča se mogu obložiti sa 10 ug/mL, sa anti-humanim Ig, preko noći, na 4°C. Posle blokiranja sa 5% BSA, ploče reaguju sa 10 ug/mL monoklonalnih antitela ili prečišćenim izotipom kao kontrolom, na temperaturi okoline, tokom 2 h. Bazenčići zatim reaguju sa probama specifično konjugovanim ili sa humanim lgG1, ili drugim humanim izotipom. Ploče se razviju i analiziraju kao što je opisano gore.

Da bi se testiralo vezivanje monoklonalnih antitela za žive ćelije koje izlučuju IL-15, može se koristiti protočna citometrija. Ukratko, sojevi ćelija i/ili humane PBMC koje izlučuju za membranu vezani IL-15 (gajen pod standardnim uslovima uzgajanja), pomešaju se raznim koncentracijama monoklonalnih antitela u PBS, koji sadrži 0,1% BSA i 0,01% NaN3, na 4°C, tokom 1 h. Posle pranja, ćelije reaguju sa anti-humanim IgG antitelom, obeleženim sa fluoresceinom, pod istim uslovima kao za bojenje primarnog antitela. Uzorci se mogu analizirati pomoću instrumenta FACScan, koristeći svetio i svojstva bočnog rasipanja na otvoru, na pojedinim ćelijama, pa se određuje vezivanje obeleženih antitela. Može se koristiti alternativni test, koji koristi fluorescentnu mikroskopiju (pored, ili umesto) testa protočne citometrije. ćelije se mogu obojiti tačno kao što je opisano gore, pa ispitivati fluorescentnom mikroskopijom. Ovaj postupak dozvoljava vizuelizaciju pojedinačnih ćelija, ali može imati smanjenu osetljivost, zavisno od gustine antigena.

Anti-IL-15 humani IgGs može se još testirati na reaktivnost sa IL-15 antigenom, pomoću bojenja VVestern blotting. Ukratko, mogu da se dobiju ekstrakti ćelija iz ćelija koje izlučuju IL-15, pa podvrgnu elektroforezi u natrijum-dodecilsulfat-poliakrilamidnom gelu. Posle elektroforeze, razdvojeni antigeni se prebace na nitrocelulozne membrane, blokiraju sa 20% mišjim serumom, i probaju sa monoklonalnim antitelom koje se testira. Vezivanje humanog IgG se može detektovati korišćenjem anti-humane IgG alkalne fosfataze, pa razviti sa

tabletama BCIP/NBT substrata (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

II. Dobiianie trans<g>enih i transhromozomalnih nehumanih životinja koje<g>enerišu

humana monoklonalna anti- IL- 15 antitela.

U još jednom aspektu ovog pronalaska, daju se transgene i transhromozomalne ne-humane životinje, kao što su transgeni ili transhromozomalni miševi, koje su u stanju da izlučuju humana monoklonalna antitela koja se specifično vezuju za IL-15. U posebnoj realizaciji, ovaj pronalazak daje transgenog ili transhromozomalnog miša, koji ima genom koji sadrži teški lanac humanog transgena, tako da taj miš stvara humana anti-IL-15 antitela, kada se imunizuje sa IL-15 antigenom i/ili ćelijama koje izlučuju IL-15. Teški lanac humanog transgena se može integrisati u hromozomalnu DNK miša, kao što je slučaj kod transgenih, npr. HuMAb miševa, što je ovde detaljno opisano i dato kao primer. Alternativno, teški lanac humanog transgena se može održavati ekstra-hromozomalno, kao u slučaju transhromozomalnih (npr. KM) miševa, kao što je opisano u WO 02/43478 (objavljen 6. juna 2002). Ovakvi transgeni i tranhromozomalni miševi su u stanju da stvaraju mnoštvo izotipova humanih monoklonalnih antitela za IL-15 (npr. IgG, IgA i/ili IgE), podležući V-D-J rekombinaciji i zameni izotipa. Zamena izotipa se može odigrati, npr. klasičnom ili ne-Wasičnom zamenom izotipa.

Dizajn transgene ili transhromozomalne ne-humane životinje, koji odgovara na stranu stimulaciju antigenom sa heterolognim repertoarom antitela, zahteva da se heterologni transgeni imunoglobulina sadrže unutar funkcije transgene životinje, korektno kroz čitav put razvoja B-ćelija. Na primer, to obuhvata zamenu izotipa heterolognog teškog lanca transgena. Pema tome, transgeni su konstruisani tako da proizvode zamenu izotipa i jedno ili više od sledećih antitela: (1) visok nivo izlučivanja i specifičan za tip ćelije, (2) funkcionalno preuređenje gena, (3) aktivaciju i odgovor na isključivanje alelomorfa, (4) izlučivanje dovoljnog primarnog repertoara, (5) transdukcija signala, (6) osmotska hipermutacija, i (7) dominacija mesta transgenog antitela tokom imuno odgovora.

Ne mora se udovoljiti svima od prethodnih kriterijuma. Na primer, u onim realizacijama gde su endogena mesta imunoglobulina transgene životinje fukcionalno prekinuta, ovaj transgen ne mora da aktivira isključenje alelomorfa. Dalje, u onim realizacijama gde transgen sadrži funkcionalno preuređen teški i/ili laki lanac gena imunoglobulina, drugi kriterijum funkcionalnog preuređenja gena nije potreban, bar za transgen koji je već preuređen. Za oslanjanje na molekularnu imunologiju, videti "Fundamenta! Immunologv", 2. izdanje, 1989, Paul VVilliam E., urednik, Raven Press, N.Y.

U nekim realizacijama, transgene ili transhromozomalne ne-humane životinje, koje se koriste za generisanje humanih monoklonalnih antitela iz ovog pronalaska, sadrže preuređene, ne-preuređene ili kombinaciju preuređenih i ne-preuređenih heterolognih transgena teškog i lakog lanca imunoglobulina u germ-soju transgene životinje. Svaki od teških lanaca transgena sadrži bar jedan CHgen. Pored toga, teški lanac transgena može sadržati funkcionalne sekvencije zamene izotipa, koje su u stanju da podrže zamenu izotipa heterolognog transgena koji kodira mnoštvo Chgena u B-ćelijama transgene životinje. Ove sekvencije zamene mogu biti one koje se nalaze u prirodi, u germ-soju mesta imunoglobulina, sastavljene od vrsta koje služe kao izvor Chgena u transgenu, ili takve sekvencije zamene mogu da se izvedu iz onih koje se dešavaju u vrstama koje treba da prime konstrukt transgena (transgena životinja). Na primer, konstrukt humanog transgena koji se koristi za stvaranje transgenog miša, može da stvori višu frekvenciju događanja zamene izotipa, ukoliko ugrađuje sekvencije zamene slične onima koje se nalaze u prirodi, na mestu teškog lanca miša, pošto su verovatno sekvencije zamene miša optimizirane da funkcionišu sa mišjim sistemom enzima rekombinaze zamene, dok humane sekvencije zamene to nisu. Sekvencije zamene mogu biti izolovane i klonirane konvencionalnim metodama kloniranja, ili se mogu sintetizovati iznova, preklapanjem sintetskih oligonukleotida, dizajniranih na bazi objavljenih informacija o sekvenciji, koje se odnose na sekvencije regiona zamene imunoglobulina (Mills et al.,Nucl. Acids Res.1991, 15, 7305-7316; Sideras et al.,Intl. Immunol.1989, 1 631-642). Za svaku od prethodnih transgenih životinja, funkcionalno preuređen teški i laki lanac transgena imunoglobulina, nalaze se u značajnoj frakciji B-ćelija transgene životinje (najmanje 10 procenata).

Transgeni koji se koriste za generisanje transgenih životinja iz ovog pronalaska su težak lanac transgena koji sadrži DNK koja kodira bar jedan varijabilni segment gena, jedan segment različitosti gena, jedan segment spajanja gena i najmanje jedan segment konstantnog regiona gena. Laki lanac transgena imunoglobulina sadrži DNK koja kodira najmanje jedan varijabilni segment gena, jedan segment spajanja gena i najmanje jedan segment konstantnog regiona gena. Segmenti gena koji kodiraju segmente teškog i lakog lanca gena su heterologni u transgenoj ne-humanoj životinji, po tome što su izvedeni iz, ili odgovaraju, DNK koja kodira teški i laki lanac segmenata gena imunoglobulina iz vrste koju čini transgena ne-humana životinja. U jednom aspektu ovog pronalaska, transgen je konstruisan tako da su pojedinačni segmenti gena ne-preuređeni, tj. nisu preuređeni tako da kodiraju funkcionalno laki ili teški lanac imunoglobulina. Ovakvi ne-preuređeni transgeni potpomažu rekombinaciju V, D i J segmenata gena (funkcionalno preuređenje), a poželjno je da potpomažu ugradnju celokupog ili dela segmenta D regiona gena u preuređeni teški lanac imunoglobulina unutar transgene ne-humane životinje, kada se izloži antigenu IL-15.

U altemtaivnoj realizaciji, transgeni sadrže ne-preuređeno "mini-mesto". Ti transgeni tipično sadrže znatan deo segmenata C, D i J, kao i subset V segmenata V. U tim konstruktima transgena, razne regulacione sekvencije, npr. promoteri, pojačavači, klasa regiona zamene, sekvencije spajanja donora i spajanja akceptora za procesiranje RNK, rekombinacioni signali i slično, sadržane su odgovarjuće sekvencije koje se izvode iz heterolgne DNK. Ove regulacione sekvencije mogu biti ugrađene u transgen, iz iste ili srodne vrste ne-humane životinje, koja se koristi u ovom pronalasku. Na primer, segmenti humanog gena imunoglobulina se mogu kombinovati u transgen sa sekvencijom pojačavača imunoglobulina iz glodara, za korišćenje u transgenom mišu. Alternativno, sintetske regulacione sekvencije se mogu ugraditi u transgen, pri čemu te sintetske regulacione sekvencije nisu honologne sa funkcionalnom sekvencijom DNK, za koju se zna da se nalazi u prirodi u genomima sisana. Sintetske regulacione sekvencije se dizajniraju u skladu sa pravilima konsenzusa, kao što je, na primer, ono koje specificira dozvoljene sekvencije mesta za spajanje akceptora ili motiva promoter/pojačavač. Na primer, mini mesto sadrži deo genomskih mesta imunoglobulina koja imaju najmanje jedno interno izbacivanje (tj. sa kraja tog dela) ne-esencijalnog dela DNK (npr. sekvencija za intervenisanje; intron ili njegov deo), u poređenju sa germ-sojem Ig mesta koji se nalazi u prirodi.

U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, koristi se transgena ili transhromozomalna životinja za generisanje humanih antitela za IL-15, koja sadrži najmanje jedan, tipično 2-10, a ponekad 25-50 ili više kopija transgena, opisanog u Primeru 12 VVO 98/24884 (npr. pHC1 ili pHC2), pasmina životinje koja sadrži jednu kopiju lakog lanca transgena, opisanu u Primerima 5, 6, 8 ili 14, u VVO 98/24884, i potomstvo te pasmine sa JHizbačenim iz životinje, kao što je opisano u Primeru 10 u VVO 98/24884. Životinje su pasmine koja je homozigotna za svaku od ove tri osobine. Te životinje imaju sledeći genotip: jedna kopija (na haploidni set hromozoma) humanog teškog lanca, ne-preuređenog mesta (opisan u Primeru 12 u VVO 98/24884), jednu kopiju (po haploidnom setu hromozoma) preuređenog humanog konstrukta K lakog lanca (opisan u Primeru 14 u VVO 98/24884) i izbacivanje na svakom endogenom mestu mišjeg teškog lanca, koji uklanja sve funkcionalne segment Jh(opisano u Primeru 10, u VVO 98(24884). Te životinje su pasmine miša koji su homozigotni u pogeldu izbacivanja segmenata JH(Primer 10 u VVO 98/24884), dajući naslednike koji su homozigotni za izbacivaje JHla hemizigotni za humane konstrukte teškog i lakog lanca. Dobijene životinje se injektiraju sa antigenima i koriste se za stvaranje humanih monoklonalnih atitela protiv ovih gena.

B ćelije, izolovane iz te životinje, su monospecifične u pogledu na humane teške i lake lance, zato što sadrže samo jednu kopiju svakog gena. Pored toga, oni su monospecifični u odnosu na humane ili mišje teške lance, zato što su i endogene mišje kopije teškog lanca gena nefunkcionalne, zahvaljujući izbacivanju regiona JHza premošćivanje, kao što je opisano u Primeru 9 i 12, u VVO 98/24884. Pored toga, značajna frakcija B ćelija će biti monospecifična u odnosu na humane ili mišje lake lance, zato što izlučivanje samo jedne kopije preuređenog humanog lakogklanca gena, će alelomorfno i izotipično isključiti preuređenje endogenih mišjih genaki X, lanca u znatnoj frakciji B-ćelija.

Transgeni i transhromozomalni miševi koji su korišćeni u ovom pronalasku, pokazuju svaranje imunoglobulina sa značajnim repertoarom, koji je u suštini idealno sličan onome u nativnom mišu. Tako, na primer, u realizacijama gde se inaktiviraju endogeni Ig geni, ukupni sadržaji imunoglobulina se kreću od oko 0,1 do 10 mg/mL seruma, poželjno 0,5 do 5 mg/mL seruma, a idealno najmanje oko 1,0 mg/mL. Kada se u transgenog miša unese transgen koji je u stanju da ostvaruje zamenu na IgG sa IgM, u odraslom mišu odnos IgG prema IgM u serumu je poželjo oko 10:1. Odnos IgG prema IgM je mnogo manji kod nezrelog miša. Obično, više je od oko 10%, poželjno 40 do 80% od izlučivanja B ćelija slezine i limfnih čvorova, koje izlučuju samo humani IgG protein.

Idealno, repertoar aproksimira isti kod nativnog miša, obično najmanje oko 10%, poželjno 25 do 50% ili više. Obično, stvaraće se najmanje oko hiljadu različitih imunoglobulina (idealno IgG), poželjno 10<4>do 10<6>ili više, zavisno prvenstveno od broja različitih V, J i D regiona koji su uneti u genom miša. Ovi imunoglobulini će tipično prepoznavati oko polovine ili više visoko antigenih proteina, npr. protein A stafilokoka. Tipično, imunoglobulini pokazuju afinitet (KD) prema prethodno odabranim antigenima, koji je manji od 10"<7>M, kao što je manji od 10"<8>M, 10"8 M ili 10"10 M, ili čak i manji.

U nekim realizacijama može biti poželjno da se generišu miševi sa predodređenim repertoarima, da se ograniči selekcija V gena predstavljenih u odgovoru antitela na predodređeni tip antigena. Teški lanac transgena koji ima predodređeni repertoar, može da sadrži, na primer, humane Vh gene koji se pretežno koriste u odgovorima antitela na predodređeni tip antigena u humanim bićima. Alternativno, neki VHgeni se mogu isključiti iz definisanog repertoara zbog različitih razloga (npr. imaju malu verovatnoću kodiranja V regiona visokog afiniteta prema predodređenom antigenu; imaju nisku sklonost da podležu somatskoj mutaciji i izoštravanju afiniteta; ili su imunogeni prema izvesnim humanim bićima). Dakle, pre preuređenja transgena koji sadrži teške ili lake lance segmenata gena, takvi segmenti gena se mogu lako identifikovati, npr. hibridizacijom ili sekvencioniranjem DNK, da li su iz vrste ili organizma koji se razlikuje od transgene životinje.

Transgeni i transhromozomalni miševi, kao što je opisano gore, mogu se imunizovati sa, na primer, prečišćenim ili obogaćenim preparatom antigena IL-15 i/ili ćelijama koje izlučuju IL-15. Alternativno, transgeni miševi se mogu imunizovati sa DNK koja kodira humani IL-15. Ti miševi će zatim stvarati B-ćelije koje podležu klasi zamene preko intra-transgene rekombinacije zamene (cis-zamena) i izlučivati imunoglobuline koji su reaktivni sa IL-15. Ovi imunoglobulini mogu biti humana antitela (nazivaju se takođe "humana sekvencija antitela"), gde su polipeptidi teškog i lakog lanca kodirani sa humanom sekvencijom transgena, koja može da ima sekvencije izvedene somatskom mutacijom i rekombinantnim spajanjima V regiona, kao i sekvencijom kodiranom sa germ-sojem; ova humana antitela se mogu citirati kao da su suštinski identična sekvenciji polipetida koja je kodirana humanim VLili VHsegmentom gena i humanim segmentom JLili Dhi Jh, čak iako su prisutne druge sekvencije germ-soja, kao rezultat somatske mutacije i spajanja diferencijalnih V-J i V-D-J rekombinacija. Varijabilni regioni svakog lanca antitela tipično su bar 80% kodirani humanim germ-sojem V, J i, u slučaju teških lanaca, D segmentima gena; često je najmanje 85% varijabilih regiona kodiranih sekvencijama humanog germ-soja prisutnog na transgenu; često je 90 do 95 %, ili više, sekvencija varijabilnih regiona kodirano sa sekvencijama humanog germ-soja, prisutnog na transgenu. Međutim, pošto se sekvencije koje nisu iz germ-soja, unose somatskom mutacijom i VJ i VDJ spajanjem, humane sekvencije antitela često imaju neke sekvencije varijabilnog regiona (a manje često sekvencije konstantnog regiona) koje nisu kodirane humanim V, D ili J segmentima gena, koje se nalaze u humanim transgenima u germ-soju miševa. Tipično, ove sekvencije koje nisu iz germ-soja (ili pojedinačne pozicije nukleotida) će stvarati klaster u, ili u blizini CDR, ili u regionima gde se zna da somatske mutacije stvaraju klastere.

Humana antitela koja se vezuju za predodređeni antigen mogu da potiču iz zamene izotipa, kao što je stvaranje humanih antitela koja sadrže humanu sekvencijuylanca (kao što je y1,y2, y2Bili y3) i humanu sekvenciju lakog lanca (kao što jek). Ovako zamenjeni izotip humanih antitela često sadrži jednu ili više somatskih mutacija, tipično u varijabilnom regionu, a često u, ili unutar oko 10 ostataka CDR), kao rezultat sazrevanja afiniteta i selekcije B ćelija od strane antigena, naročito posle sekundarnog (ili naknadnog) zaražavanja antigenom. Ova humana antitela visokog afiniteta mogu imati afinitete vezivanja (Kd) ispod10-<7>M, kao što je ispod lO^M, 10"9 M ili 10"<10>M, ili čak i niže.

Sledeći aspekt ovog pronalaska su B ćelije izvedene iz transgenih ili transhromozomalnih miševa, koji su ovde opisani. Ove B ćelije se mogu upotrebiti za generisanje hibridoma koji izlučuju humana monoklonalna antitela, koja se sa visokim afinitetom (npr. manjim od 10"<7>M) vezuju za humani IL-15. Dakle, u sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak daje hibridomu koja proizvodi humano antitelo koje ima afinitet (Kd) ispod 10~<7>M, kao što je ispod 10"<8>M, 10"<9>M ili 10"<10>M, ili čak i niži, kada se određuje tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (SPR), pomoću isntrumenta BIACORE 3000, koristeći rekombinantni humani IL-15 kao analit, a antitelo kao ligand za vezivanje humanog IL-15, pri čemu antitelo sadrži: - humanu sekvenciju lakog lanca sastavljenu od: (1) lakog lanca varijabilnog regiona kodiranog segmentom humanog Vlgena i segmentom humanog Jl, i (2) lakim lancem konstantnog regiona koji ima sekvenciju polipeptida koja je u suštini identična sa sekvencijom polipeptida koja je kodirana segmentom humanog Clgena; i - humanu sekvenciju teškog lanca sastavljenu od: (1) teškog lanca varijabilnog regiona koja ima sekvenciju polipetida koja je u suštini identična sa sekvencijom polipeptida koja je kodirana segmentom humanog VHgena, opciono D regiona i segmentom humanog Jh, i (2) konstantnim regionom koji ima sekvenciju polipeptida koja je u suštini identična sa sekvencijom polipeptida kodiranom sasegmentom humanog Chgena.

Razvijanje humanih monoklonalnih tela visokog afiniteta prema IL-15 može se olakšati postupkom ekspandiranja repertoara segmenata varijabilnog regiona humanog gena u transgenom mišu koji ima genom koji sadrži transgen humanog imunoglobulina, a pomenuti postupak se sastoji od unošenja u genom transgena V gena koji sadrži segmente V regiona gena koji nisu prisutniu pomenutom integrisanom transgenu humanog imunoglobulina. Često, transgen V regiona je veštački hromozom iz kvasca, koji sadrži deo seta segmenta humanog Vhili Vl(Vk) gena, koji se može prirodno nalaziti u humanom genomu, ili se može zajedno sastaviti, posebnim rekombinantnim metodama, koje mogu da uključe prekoredne ili preskočene segmente V gena. Često je najmanje pet ili više funkcionalnih segmenata V gena sadržano u YAC U ovoj varijaciji, moguće je napraviti transgenog miša nastalog metodom ekspanzije V repertoara, gde taj miš izlučuje lanac imunoglobulina koji sadrži sekvenciju varijabilnog regiona kodiranu sa segmentom V regiona gena koji je prisutan u V regionu transgena i C regionu kodiranom za humani Ig transgen. Pomoću metoda ekspanzije V repertoara, mogu se generisati transgeni miševi koji imaju najmanje 5 različitih V gena; kao što miševi mogu da sadrže i najmanje oko 24 V gena, ili više. Neki segmenti V gena mogu biti ne-fukcionalni (npr. pseudogeni i slično); ovi segmenti se mogu zadržati ili se mogu selektivno izbaciti rekombinantnim metodama koje stoje na raspolaganju verziranom stručnjaku, ukoliko se to želi.

Kada se jedanput skroji germ-soj tako da sadrži funkcionalni YAC koji ima ekspandirani repertoar V segmenta, koji u suštini nije prisutan u humanom Ig transgenu koji sadrži segmente J i C gena, ovo svojstvo se može unaprediti i preneti kao soj u druge genetske osnove, uključujući osnove gde se funkcionalni YAC, koji ima ekspandirani repertoar V segmenta, unosi u germ-soj miša, koji ima različiti humani Ig transgen. Višestruko funkcionalni YAC, koji imaju ekspandirani repertoar V segmenta, mogu da se usade u germ-soj tako da rade sa humanim Ig transgenom (ili višestrukim humanim Ig transgenima). Mada se ovde pominju kao transgeni YAC, ovi transgeni, kada se integrišu u genom, mogu u suštini da nemaju sekvencije kvasca, kao što su sekvencije koje se zahtevaju za autonomnu replikaciju u kvascu; ove sekvencije se opciono mogu ukloniti genetskim inženjeringom (npr. npr. restrikcijom digestije gel elaktroforezom sa pulsirajućim poljem, ili drugom pogodnom metodom) pošto replikacija u kvasac više nije neophodna (tj. pre unošenja u mišju ES ćeliju ili mišji prozigot). Metode propagacije svojstva izlu&'vanja humane sekvencije imunoglobulina, obuhvataju uzgajanje transgenih miševa koji imaju jedan ili više transgena humanog Ig, i opciono imaju takođe funkcionalnu YAC koja ima ekspandirani repertoar V segmenta. Oba segmenta gena, Vhi VL, mogu biti prisutna u XAC. Transgeni miš se može uzgajati sa bilo kojom željenom osnovom, uključujući osnove koje se oslanjaju na druge humane transgene, uključuju« humane Ig transgene i/ili transgene koji kodiraju druge humane limfocitne proteine. Ovaj pronalazak daje takođe humanu sekvenciju imunoglobulina visokog afiniteta, koju stvaraju transgeni miševi koji imaju ekspanidrani repertoar V regiona transgena YAC. Mada je prethodno opisana poželjna realizacija transgene životinje iz ovog pronalaska, podrazumevaju se i druge realizacije, koje su klasifikovane u četiri kategorije: I. transgene životinje koje sadrže ne-preuređeni teški i preuređeni laki transgen imunoglobulina; II. transgene životinje koje sadrže ne-preuređeni teški i ne-preuređeni laki transgen imunoglobulina; III. transgene životinje koje sadrže preuređeni teški i ne-preuređeni laki transgen imunoglobulina; i IV. transgene životinje koje sadrže preuređeni teški i preuređeni laki transgen imunoglobulina;

Od ovih kategorija transgene životinje, poželjan redosled prioriteta je kao što sledi: ll>l>lll>IV, gde su endogeni laki lanci gena (ili bar K gen) nokautirani homolognom rekombinacijom (ili drugim metodom), i l>ll>lll>IV, gde endogeni laki lanci gena nisu nokautirani, već mora da dominira izdvajanje alelomorfa.

III. Koniuaati/ imunotoksina i antitela

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak predstavlja humano anti-IL-15 monoklonalno antitelo konjugovano u terapeutski ostatak, kao što je citotoksin, lek (npr. imunosupresant) ili radioaktivni izotop. Kada se konjuguju sa citotoksinom, ovi konjugati antitela se nazivaju "imunotoksini". Citotoksin ili citotoksični agens je bilo koji agens koji je štetan za ćelije (npr, ubija ih). Primeri su taxol, cvtochalsin B, gramicidin D, etidijumbromid, emetine, mitomvcin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, dexonjbicin, daunorubicin, dihidroksiandtracion-dion, m*rtoxyntrone, mithramvcin, actinomvcin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propanolol i puromycin i njihovi analozi i homolozi. Terapeutski agensi su, ali ne i ograničeni njima, antimetaboliti (npr. methotrexate, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanidin, cvtarabine, 5-fluorouracil dekarbazin), agensi za alkilovanje (npr. mechlorethamine, thioepa chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU) i lomustine (CCNU), cyclothosphamide, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomycin C i cis-dihtorofiaminplatin(ll) (DDP)cisplatin), antracilini (npr. daunorubicin (ranije daunomycin) i doxorubicin), antibiotici (npr. dactinomycin (ranije actinomycin), bleomycin, mithramycin i anthramycin (AMC)) i anti-mitotički agensi (npr. vincristine i vinblastine). Antitelo iz ovog pronalaska se može konjugovati sa radioaktivnim izotopom, npr. radioaktivnim jodom, da generiše citotokični radioaktivno farmaceutsko sredstvo za tretiranje poremećaja povezanog sa IL-15, kao što je kancer.

Konjugati antitela iz ovog pronalaska se mogu koristiti za modifikovanje datog biološkog odgovora. Terapeutski ostatak ne treba shvataiti kao ograničavanje klasičnihj hemijskih terapeutskih agenasa. Na primer, ostatak leka može biti protein ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Ti proteini mogu biti, na primer, enzimatski aktivni toksin, ili njegov aktivni fagment, kao što su abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin ili toksin difterije; proteina, kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-^; ili mođifikatori biološkog odgovora, kao što su na primer, limfokini, interieukin-1 flL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije granulocitnih kolonija ("G-CSF") i drugi citokini ili faktori rasta.

Tehnike konjugovanja ovih terapeutskih ostataka sa antitelima su dobro poznate, videti, npr. Amon et al., članak Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapv, u "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapv", uredn. Reisfeld et al., str. 243-256 (Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al, članak Antibodies for Drug Deliverv, u "Controlled Drug Deliverv" (2. izdanje), uredn. Robinson et al., str. 623-53 (Marcel Dekker, Ine, 1987); Thorpe, članak Antibodv Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapv: a Review, u "Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications", uredn. Pincera et al., str-475-506 (1985); članak Analvsis, Results and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibodv in Cancer Therapv, u "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapv", uredn. Baldwin et al., str. 303-16 (Academic Press, 1985); i Thorpe et al., članak The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates, uImmunol. Rev.1982, 62,119-58.

IV. Farmaceutski preparati

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje preparat, npr. farmaceutski preparat, koji sadrži jedno ili kombinaciju humanih monoklonalnih antitela, ili jedan ili više njegovih delova koji vezuju antigen iz ovog pronalaska, formulisan zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. U poželjnoj realizaciji, ovi preparati su kombinacija višestruko (npr. dva ili više) izolovanih humanih antitela iz ovog pronalaska. Poželjno je da se svako antitelo iz preparata vezuje za određeni, unapred odabrani epitop IL-15.

Farmaceutski preparati iz ovog pronalaska mogu takođe da se ordiniraju u kombinovanoj terapiji, tj. kombinovano sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može biti preparat iz ovog pronalaska sa najmanje jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa, kao što su anti-inflamatomi agensi, DMARD (antireumatski lekovi koji modifikuju bolest), imunosupresivni agensi, hemoteraputska sredstva i agensi za psorijazu. Farmaceutski preparati iz ovog pronalaska mogu se takođe ordinirati povezano sa terapijom radioaktivnog zračenja. Istovremeno ordiniranje sa drugim antitelima, kao što su antitela specifina na CD4 i antiela specifična na IL-2, takođe su obuhvaćena ovim pronalaskom. Te kombinacije sa antitelima specifičnim na CD4 ili antitelima specifičnim na IL-2, smatraju se naročito korisnim u tretmanu autoimunih bolesti i odbacivanja transplantata.

Naziv "farmaceutski prihvatljiv nosač", kako se ovde koristi, je bilo koji ili svi rastvarači, disperzione sredine, obloge, antibakterijski i fungicidni agensi, izotonični agensi i agensi koji odlažu absorpciju, i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno je da nosač bude pogodan za intravenozno, intramuskulamo, subkutano, parenteralno, spialno ili epidermalno ordiniranje (npr. injekcijom ili infuzijom). Zavisno od puta ordiniranja, aktivno jedinjenje, tj, antitelo, specifični ili multispecifični molekul, mogu biti obloženi materijalom koji štiti to jedinjenje od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu da inaktiviraju to jedinjenje.

"Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na so koja zadržava željenu biološku aktivnost polaznog jedinjenja i ne daje nikakve neželjene toksikološke efekte

(videti, npr. Berge, S.M. et al., uJ. Pharm. Sci.1977, 66, 1-19). Primeri takvih soli su kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli su one koje se izvode iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina, kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanoinske kiseline, hidroksi alkanoinske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične surfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli su one koje se izvode iz alkalnih i zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, a isto tako iz netoksičnih organskih amina, kao što su N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain u slično.

Preparat iz ovog pronalaska se može ordinirati brojnim metodama, koje su poznate u stanju tehnike. Kao što zna verzirani stručnjak, put i/ili način ordiniranja će varirati zavisno od željenih rezultata. Aktivna jedinjenja se mogu pripremiti sa nosačima koji će štititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za oslobađanje. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilenvinilacetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Mnogi postupci za pripremanje takvih formulacija su patentirani i obično poznati onima koji su verzirani u stanje tehnike. Videti npr. "Sustained and Controlled Release Drug Deliverv Svstems", uredn. J.R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Da bi se ordiniralo jedinjenje iz ovog pronalaska nekim od puteva ordiniranja, može biti potrebno sa se jedinjenje obloži sa, ili istovremeno ordinira sa jedinjenjem od materijala koji sprečava inaktivaciju. Na primer, jedinjenje se može ordinirati tako da sadrži odgovarajući nosač, na primer, lipozom ili razblaživač. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači su rastvor soli i vodeni rastvori pufera. Lipozomi su emulzije voda-u-ulju-u vodi CGF, kao i konvencionalni lipozomi (Strejan et al.,J. Neuroimmunol.1984, 7, 27).

Farmaceutski prihvatljivi nosači su sterilni vodeni rastvori ili disperzije i sterilni prahovi, za samostalno pripremanje sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. Upotreba ovih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u stanju tehnike. Izuzimajući samo ukoliko neki od konvencionalnih medijuma ili agenasa nije inkompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, podrazumeva se njihova upotreba u farmaceutskim preparatima iz ovog pronalaska. Dodatna aktivna jedinjenja se mogu takođe ugraditi u ove preparate.

Tipično, terapeutski preparati moraju biti sterilni i stabilni pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Preparat se može formilisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga sređena struktura, pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperziona sredina, koji mogu biti, na primer, voda, etanol, poliol (na primer, glicerin, propilenglikol i tečni polietilenglikol, i slično) i njihova pogodna smeša. Odgovarajući fluiditet se može održavati, na primer, upotrebom obloge, kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica, u slučaju disperzije, ili upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je da preparat sadrži izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole, kao što je manitol, sorbitol, ili natrijum-hlorid. Produžena absorpcija injektibilnih preparata se može postići uključivanjem u preparat agensa koji odlaže absorpciju, na primer, soli monostearata i želatina.

Sterilni injektibilni preparati se mogu dobiti ugradnjom željene količine aktivnog jedinjenja u odgovarajući rastvarač, sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, već prema potrebi, posle čega sledi sterilizacija mikrofiltriranjem. Obično se disperzije pripremaju ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni tečni nosač, koji sadrži bazični disperzioni medijum, i potrebne druge sastojke, između gore nabrojanih. U slučaju sterilnih prahova, za dobijanje sterilnih injektibilnih rastvora, poželjne metode dobijanja su vakuum sušenje i sušenje smrzavanjem (liofilizacija), koji daju prah aktivnog sastojka, plus bilo koji dodatni, željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora.

Režimi doziranja se podešavaju tako da obezbede optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, može se ordinirati jedna bolus-injekcija, nekoliko podeljenih doza se može ordinirati tokom vremena, ili se doza može proporcionalno smanjiti ili povećati prema potrebi u terapeutskim situacijama. Na primer, humana antitela iz ovog pronalaska se mogu ordinirati jedan ili dva puta nedeljno subkutanom injekcijom, ili jedan ili dva puta mesečno subkutanom injekcijom. Posebno je pogodno formulisanje parenteralnih preparata u obliku jedinične doze, radi lakšeg ordiniranja i uniformnosti doziranja. Oblik jedinične doze, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinične doze podešene za pojedinačno doziranje subjekata koji treba da se tretiraju; svaka jedinica sadrži pedodređenu količinu aktivnog jedinjenja, za koju je izračunato da ima željeni terapeutski efekat, zajedno sa zahtevanim farmaceutskim nosačem. Specifikaciju jediničnih oblika za doziranje iz ovog pronalaska diktira, a direktno zavisno od: (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapeutskog efekta koji treba da se postigne; i (b) ograničenja vezanih za tehniku pripremanja, kao što je aktivno jedinjenje za tetman osetljivih pojedinaca.

Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanata su: (1) antioksidanti rastvomi u vodi, kao što je askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum-bisulfat, natrijum-metabisulfrt, natrijum-sulfit i slično; (2) antioksidanti rastvomi u ulju, kao što je askorbil-palmitat, butilovani hidrokisanizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lec'rtin, propilgalat, alfa-tokoferol i slično; i (3) agensi za helatiranje metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično.

Za terapeutske preparate, formulacije iz ovog pronalaska su one koje su pogodne za oralno, nazalno, površinsko (uključujući bukalno i sublingvalno), rektalno, vaginalno i/ili parenteralno ordiniranje. Pogodno je da se ove formulacije daju u obliku jedinične doze, a mogu se pripremiti bilo kojim od metoda poznatih u stanju tehnike farmacije. Količina aktivnog sastojka, koja se može kombinovati sa materijalom nosača za dobijanje jediničnog oblika za doziranje, varira, zavisno od subjekta koji se tretira i posebnog načina ordiniranja. Količina aktivnog sastojka , koja se može kombinovati sa materijalom nosača za dobijanje oblika jedinične doze, obično je količina preparata koja proizvodi terapeutski efekat. Obično, izuzimajući stoprocentnu, ova količina se kreće od oko 0,001% do oko 90% aktivnog sastojka, poželjno od oko 0,005 % do oko 70 %, a najpoželjnije odoko 0,01% do oko 30%.

Formulacije iz ovog pronalaska koje su pogodne za vaginalno ordiniranje su pesarije, tamponi, kreme, gelovi, paste, pene ili sprejovi, formulacije koje sadrže nosače za koje je pozato u stanju tehnike da su odgovarajući. Oblici doze za površinsko ili transdermalno ordiniranje preparata iz ovog pronalaska su prahovi, sprejovi, masti, paste, kreme, losionil, gelovi, rastvori, flasteri i inhalanti. Aktivno jedinjenje se može mešati pod sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, i sa bilo kojim od prezervativa, pufera ili propelanata, koji su neophodni.

Fraze "parenteralno ordiniranje" ili "ordinirano parenteralno" se ovde koriste da označe načine ordiniranja koji se razlikuju od enteralnog ili površinskog ordiniranja, obično injekcijama, a to su, ali bez ograničavanja, intravenozno, intramuskulamo, intreaarterijsko, intratekalno, intrakapsularno, intraorbitalno, intrakardijalno, intradermalno, intraperitonealno, intratrahealno, subkutano, subkutikulamo, intraartikulamo, subkapsulamo, subarahnoidno, intraspinalno, epiduralno i intrastemalno injektiranje i infuzija.

Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača, koji se mogu koristiti u farmaceutskim preparatima iz ovog pronalaska, su voda, etanol, poliol (kao što je glicerin, propilenglikol, polietilenglikol i slično) i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje i injektibilni organski estri, kao što je etiloleat. Odgovarajući fluiditet se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem određene veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.

Ovi preparati mogu takođe da sadrže adjuvante, kao što su prezervativi, sredstvaza kvašenje, emulgatori i sredstva za dispergovanje. Sprečavanje prisustva mikroorganizama se može obezbediti procedurama sterilizacije, videti gore, i unošenjem raznih antibakterijskih i fungicidnih agenasa, na primer parabena, hlorobutanola, fenolsorbinske kiseline i slično. Takođe, može biti poželjno da se u ove preparate uključe i izotonični agensi, kao što su šećeri, natrijum-hlorid i slično. Pored toga, produžena absorpcija injektibilnog farmaceutskog oblika se može ostvariti uključivanjem agenasa koji odlažu absorpciju, kao što su aluminijum-monostearat i želatin.

Kada se jedinjenja iz ovog pronalaska ordiniraju kao farmaceutska sredstva, humanim ili animalnim bićima, ona se mogu davati sama ili kao farmaceutski preparat koji sadrži, na primer, od 0,001 do 90% (poželjnije od 0,005 do 70%, kao što je od 0,01 do 30%) aktivnog sastojka, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Bez obzira na odabrani put ordiniranja, jedinjenja iz ovog pronalaska, koja se mogu koristiti u pogodnom hidratisanom obliku, i/ili farmaceutski preparati iz ovog pronalaska, se formulišu u farmaceutski prihvatljive oblike za doziranje, konvencionalnim metodama, koje su poznate onima koji su verzirani u stanje tehnike.

Stvarni sadržaji doze aktivnih sastojaka u farmaceutskim preparatima iz ovog pronalaska mogu se varirati, tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postozanje željenog terapeutskog odgovora za posmatranog pacijenta, preparat i naćin ordiniranja, bez da je toksična za pacijenta. Odabrani sadržaj doziranja će zavisiti od brojnih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost posmatranog preparata iz ovog pronalaska koji se koristi, ili njegovog estra, soli ili amida, puta ordiniranja, vremena ordiniranja, brzine izlučivanja posmatranog jedinjenja koje se koristi, trajanja tretmana, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa posmatranim preparatom koji se koristi, starosti, pola, mase, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji treba da se tretira i sličnih faktora, što je dobro poznato u stanju tehnike medicine. Uobičajeno verziran lekar ili veterinar može lako da odredi i prepiše efikasnu količinu farmaceutskog preparata koja je potrebna. Na primer, lekar ili veterinar može početi sa dozama jedinjenja iz ovog pronalaska upotrebljenog u farmaceutskom preparatu, na nivou nižem od potrebnog, kako bi se postigao željeni terapeutski efekat, pa da postepeno povećava dozu, sve dok se ne postigne željeni efekat. Obično, pogodna dnevna doza preparata iz ovog pronalaska je količina jedinjenja koje je u najnižoj dozi efikasno u ostvarivanju terapeutskog efekta. Ova efikasna doza će obično zavisiti od faktora oji su opisani gore. Poželjno je da ordiniranje bude intravenozno, intramuskularno, intrapeirtonealno ili subkutano, poželjno ordiniranje je neposredno uz ciljano mesto. Ukoliko se želi, efikasna dnevna doza terapeutskih preparata se može ordinirati u dve, tri, četiri, pet, šest ili više sub-doza, ordiniranih odvojeno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono, u obliku jedinične doze. lako je moguće da se jedinjenje iz ovog pronalaska ordinira samo, poželjno je da se to jedinjenje ordinira kao farmaceutska formulacija (preparat).

Terapeutski preparati se mogu ordinirati pomoću medicinskih uređaja, koji su poznati u medicini. Na primer, u poželjnoj realizaciji, terapeutski preparat iz ovog pronalaska se može ordinirati hipodermičkim injekcionim uređajem bez igle, kao što su uređaji opisani u U.S. Patent-ima No. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824 ili 4,596,556. Primeri dobro-poznatih implantata i modula, korisnih za ovaj pronalazak su: U. S. Patent No. 4,487,603, koji opisuje implantacionu mikro-infuzionu pumpu za oslobađanje medikamenta kontrolisanom brzinom; U.S. Patent No. 4,486,194, koji opisuje terapeutski uređaj za ordiniranje medikamenta kroz kožu; U.S. Patent No., 4,447,233, koji opisuje infuzionu pumpu za medikament, za oslobađanje medikamenta preciznom brzinom infuzije; U.S: Patent No., 4,447,224, koji opisuje implantacioni infuzioni aparat sa varijabilnim protokom, za kontinualno oslobađanje leka; U.S. Patent No. 4,439,196, koji opisuje sistem za osmotsko oslobađanje leka, koji ima odeljke sa više komora; i U.S. Patent No. 4,475,196, koji opisuje sistem za osmotsko oslobađanje leka. Mnogi drugi ovakvi implanti, sistemi za oslobađanje i moduli su poznati onima koji su verzirani u stanje tehnike.

U nekim realizacijama humana monoklonalna antitela iz ovog pronalaska se formulišu tako da obezbede ispravnu raspodeluin vivo.Na primer, barijera krv-mozak (BBB) isključuje mnoga jako hidrofilna jedinjenja. Da bi se obezbedilo da terapeutska jedinjenja iz ovog pronalaska prolaze kroz BBB (ukoliko se to želi), ona se mogu formulisati, na primer, kao lipozomi. Za metode dobijanja lipozoma, videti npr. U.S. Pantent-e No. 4,522,811; 5,374,548 i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jedan ili više ostataka koji se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, pa tako pojačavaju ciljano oslobađanje leka (videti, npr. V.V. Ranade,J. Clin. Pharmacol.1989, 29, 685). Primeri ciljanih ostataka su folati i biotin (videti, npr. U.S. Patent No. 5,416,016, Loew et al.); manozidi (Umezawa et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun.1995, 153, 1038); antitela (P.G. Bloeman et al.,FEBS Lett.1995, 357, 140; M. Owais et al.,Antimicrob. Agents Chemother.1995, 39, 180); surfaktant receptora proteina A (Briscoe et al.,Am. J. Physiol.1995, 1233.134), razne vrste koje mogu sa sadrže formulacije iz ovog pronalaska, kao i komponente molekula iz ovog pronalaska; str. 120 (Schreier et al.,J. Biol. Chem.,1994, 269, 9090); videti takođe K. Keinanen; M.L. Laukkanen,FEBS Lett.1994, 346, 123; J.J. Killinon; I.J.Fidler,Immunomethods,1994, 4, 273. U jednoj realizaciji ovog pronalaska terapeutska jedinjenja iz ovog pronalaska se formulišu u lipozome; u poželjnijoj realizaciji ovi lipozomi sadrže ciljani ostatak. U najpoželjnijoj realizaciji, terapeutska jedinjenja u lipozomima se oslobađaju bolus-injekcijom na mesto u neposrednoj blizini tumora ili infekcije. Preparat mora biti fluidan, do te mere da se može lako injektirati iz šprica. Mora biti stabilan pod uslovima proizvodnje i skladištenja, i mora biti zaštićen od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice.

"Terapeutski efikasna doza" za reumatoidni artritis, poželjno je da proističe iz ACR20 Preliminarv Defintion of Improvement za pacijente, još poželjnije iz ACR50 Preliminarv Defintion of Improvement, a još poželjnije iz ACR70 Preliminarv Defintion of Improvement.

ACR20 Preliminarv Defintion of Improvement se definiše kao: >20% poboljšanja u: broju mekih zglobova (TCJ) i u broju oteklih zglobova (SWJ) i >20% poboljšanje u 3 od sledećih 5 ocena: ocena bola pacijenta (VAS), globalna ocena pacijenta (VAS), globalna fizička ocena (VAS), hendikepiranost na osnovu vlastite ocene pacijenta (HAQ), reaktant u akutnoj fazi (CRP ili ESR).

ACR50 i ACR70 se definišu na isti način, sa >50% i >70% poboljšanja, respektivno. Za ostale detalje videti Felson et al., u članku American College of Rheumatologv Preliminarv Definiton of Improvements in Rheumatoid Arthritis, uArthritis Rheumatism1995, 38, 727-735.

Svojstvo jedinjenja da inhibira kancer može se oceniti u sistemu na modelu životinje, predvidivom u pogledu efikasnosti na humane tumore. Alternativno, ovo svojstvo preparata se može oceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira, kao što su testovi inhibicijein vitro,poznati verziranom stručnjaku. Terapeutski efikasna količina terapeutskog jedinjenja može smanjiti veličinu tumora, ili na drugi način ublažiti simptopme kod subjekta. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike u stanju je da odredi te količne, na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, ozbiljnost simptoma kod subjekta, a naročito odabranog preparata i puta ordiniranja.

Sposobnost antitela za tretiraje ili prevenciju psorijaze može se takođe vrednovati u skladu sa metodama koje su poznate u stanju tehnike.

Preparat mora biti sterilan i fluidan, bar u meri da se preparat može osloboditi iz šprica. Pored vode, nosač može biti zotonični puferovan slani rastvor, etanol, poliol (na primer, glicerin, propilenglkol i tečni polietilenglikol, i slično) i pogodne njihove smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge, kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzije, i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je da se u preparat uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi, kao što su manitol ili sorbitol, i natrijum-hlorid. Dugotrajna absorpcija injektibilnih preparata se može ostvariti unošenjem u sastav agensa koji odlaže absorpciju, na primer, aluminijum-monostearata ili želatina.

Kada je aktivno jedinjenje pogodno zaštićeno, kao što je opisano gore, to jedinjenje se može ordinirati oralno, na primer, sa inertnim razblaživačem, ili jestivim nosačem.

V. Upotrebe i postupci ovog pronalaska

Humana anti-IL-15 antitela za IL-15 iz ovog pronalaska (uključujući derivate i konjugate tih antitela) i preparati koji sadrže ta antitela, mogu se koristiti u raznimin vitro i in vivodijagnostičkim i terapeutskim primenama.

Ujednoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se koriste za inhibiranje stvaranja TNFa u T ćelijama, i/ili monocitima/makrofagama, izazvanim sa IL-15, poželjno bez inhibiranja stvaranja TNFa indukovanogsa drugim citokinima, kao što je IL-2. Dovođenjem u kontakt antitela sa IL-15 (npr. ordiniranjem tog antitela subjketu), sposobnost IL-15 da signalizira preko receptora IL-15 je inhibirana, pa je tako inhibirano stvaranje TNFa u T-ćelijama i/ili monocitima/makrofagama. Poželjna antitela se vezuju za epitope (npr. određene sub-jedinice, kao što je gama-subjedinica) koji su specifični za IL-15, pa stoga prvenstveno inhibiraju stvaranje TNFa indukovano sa IL-15, ali ne interferiraju sa stvaranjem TNFa pomoću strukturno srodnih citokina, kao što je IL-2.

U drugoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se koriste da inhibiraju angažovanje i/ili proliferaciju T ćelija, indukovanu sa IL-15, poželjno bez inhibiranja prolrferacije T ćelija indukovane sa drugim strukturno srodnim citokinima, kao što je IL-2. Kao i kod stvaranja TNFa, dovođenjem u kontakt antitela sa IL-15 (npr. ordiniranjem tog antitela subjektu), inhibira se svojstvo IL-15 da signalizira preko receptora IL-15, pa se tako inhibira stimulacija T ćelija sa IL-15.

U skladu sa tim, u još jednoj realizaciji ovog pronalaska daje se postupak za tretiranje ili prevenciju poremećaja posredovanog sa IL-15 (npr. autoimune bolesti, kao što su psorijaza, reumatoidni artritis ili inflamatoma bolest utrobe, ili infektivna bolest, kao što je HlV), ordiniranjem subjektu humanog antitela iz ovog pronalaska, u količini koja je efikasna za tretiranje ili prevenciju tog poremećaja. Ovo antitelo se može ordinirati samo, ili zajedno sa drugim terapeutskim agensom, kao što je anti-inflamatomi agens, npr. steroidni ili ne-steroidni inflamatomi agens, ili citotoksin, koji deluje zajedno sa, ili sinergistički sa antitelom u tretmanu ili prevenciji bolesti posredovane sa IL-15.

U posebnoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se koriste za tretiranje ili prevenciju reumatoidnog artritisa (RA). Antitela ograničavaju ulogu koju igra IL-15 u napredovanju inflamacije, povezane sa bolešću, kao što je RA. T ćelije, a naročito CD4+T-pomagači ćelije, su uključene u iniciranje i održavanje inflamatomog procesa kod RA. Drugi citokin, TNFa, takođe učestvuje u inflamatomim putevima koji konačno vode destrukciji zgloba i onesposobljavanju pacijenta sa RA. Lokalna sinteza IL-15 igra ključnu ulogu i u aktivaciji i angažovanju T ćelija i u indukciji TNF-a i drugih inflamatomih citokina. Uloga IL-15 u napredovanju RA obuhvata proces kojim IL-15, koji sintetizuju makrofage, indukuje angažovanje T ćelija. Aktivirane T ćelije zatim: (1) održavaju aktivaciju makrofaga; i (2) indukuju stvaranje TNF-a. Stimulisane makrofage promovišu sintezu još više IL-15 i aktivaciju T ćelija i tako nastavlaju ciklus. Pored ovih efekata na TNF-a i makrofage, IL-15 aktivira takođe neutrofile i utiče na lokalno lučenje imunoglobulina iz B ćelija, a naročito reumatoidnog faktora sinteze.

U skladu sa tim, anti-IL-15 antitela iz ovog pronalaska se mogu koristiti za prevenciju ili blokiranje prethodnih efekata IL-15, koji izazivaju RA, pa se stoga, mogu koristiti za prevenciju i tretman ove bolesti. Na primer, anti-IL-15 antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti za inhibiranje inflamacije i/ili sprečavanje hemotaksije aktiviranih leukocita, uključenih u RA.

Humana antitela iz ovog pronlaska se mogu koristiti za inhibiciju napredovanja strukturnog oštećenja pacijenata sa reumatoidnim artritisom, koji imaju neadekvatan odgovor na metotreksat, ili za smanjenje znakova i simptoma i odlaganja strukturnih oštećenja kod pacijenata sa umerenim ili jako aktivnim reumatoidnim artritisom, uključujući one kojima prethodno nije nedostajao tretman sa DMARD.

Humana antitela iz ovog pronalaska se mogu takođe koristiti da blokiraju ili inhibiraju druge efekte IL-15. U raznim ćelijama i tkivima, uključujući monocite i makrofage, fibroplaste, dendritične ćelije i keratinocite, izlučuje se IL-15. Keratinociti su glavni konstituenti epiderma i epitelne podloge mukozalnog tkiva. Kontrola rasta keratinocita je posredovana kompleksnom mrežom citokina i faktora rasta, od kojih neke stvaraju sami keratinociti. IL-15, izveden iz keratinocita doprinosi akumulaciji, proliferaciji i preživljavanju T ćelija u psorijatičnom plaku. Poznate se mnoge bolesti gde je povećan broj keratinocita, što dovodi do hiperplazije epiderma, koja je odgovorna bar za neke od simptoma srodnih bolesti. Ove bolesti su hronične bolesti, kao što je psorijaza i atopični dermatitis, kao i stanja kao što je hronični ekcem ruku, kontaktni dermatitis, virusne bradavice (povezane sa HPV), limfom kutanih T ćelija, neusklađeno zarastanje rana, kao što je neusklađeno zarastanje rana usled dijabetesa. Prema tome, ovaj pronalazak daje postupak za tretiranje ili prevenciju takvih poremećaja, ordiniranjem pacijentu humanog anti-IL-15 antitela iz ovog pronalaska, u količini koja je efikasna za tretiranje ili prevenciju tog poremećaja. Na primer, anti-IL-15 antitela iz ovog pronalaska se mogu koristiti za blokiranje ili inhibiciju parakeratoze kod psorijaze, smanjivanje debljine epiderma kod psorijaze i smanjivanje proliferacije keratinocita kod psorijaze. IL-15 takođe moduliše funkciju ćelija intestinalnog epitela (Reinecker et al.,Gastroenterology,1996, 111. 1706-13). Specifično, IL-15 može da izazove modifikacije na mukozalnim ćelijama epitela i na sojevima ćelija intestinalnog epitela, pa stoga, učestvuje u patogenezi inflamatorne bolesti utrobe, npr. trbušne bolesti. Uloga IL-15 u tim bolestima je pokazana kroz selektivnu nad-reprezentaciju ćelija IL-15+ u tankom crevu netretiranih pacijenata sa trbušnom bolešću (VVO 00/02582). Tako, pokazano je da IL-15 direktno učestvuje u inicijaciji i održavanju trbušne bolesti. Prema tome, u sledećoj realizaciji, anti-ll-15 humana antitela iz ovog pronalaska (tj. koja inhibiraju pro-inflamatorne efekte IL-15), mogu da se koriste za tretiranje i/ili prevenciju trbušne bolesti, ordiniranjem pacijentu ovog antitela u efikasnoj količini da se tretira ili spreči taj poremećaj.

Pored toga, nađeno je od strane pronalazača ovog pronalaska, da IL-15 takođe promoviše stvaranje novih krvnih sudova, proces koji se zove neovaskularizacija ili angiogeneza. U skladu sa tim, još jedna upotreba antitela iz ovog pronalaska je za prevenciju ili tretman bolesti u kojima učestvuje neovaskularizacija. Pored inflamatomih bolesti, ove bolesti su razni kanceri, koji se oslanjaju na, ili su karakterisani neovaskulairzacijom. Humana antitela iz ovog pronalaska mogu se takođe koristiti za blokiranje ili inhibiciju efekata IL-15, povezanih sa infektivnim bolestima, kao što je HIV. Prema tome, sledeća upotreba antitela iz ovog pronalaska je prevencija ili tretman infektivnih bolesti, npr. HIV-1.

Na primer, ova antitela se mogu koristitiin vitroiin vivoza dijagnozu raznih bolesti posredovanih sa IL-15. Specifično, ova antitela se mogu koristiti za detekciju sadržaja IL-15 ili sadržaja ćelija koje sadrže IL-15 na površini njihove membrane, ili vezanih za njihove receptore (humani IL-15 vezan za receptor). Detekcija ovih sadržaja IL-15 se zatim može korelisati sa nekim simptomima bolesti. Alternativno, ova antitela se mogu koristiti za inhibiranje ili blokiranje funkcije IL-15, što, za uzvrat, može sprečiti ili ublažiti simptome bolesti izazvane funkcijom IL-15.

Kao što je ranije opisano, humana anti-IL-15 antitela iz ovog pronalaska se mogu istovremeno ordinirati sa jednim ili više terapeutskih agenasa, npr. sa imunosupresivnim agensom ili anti-inflamatomim agensom, za povećanje ukupnog anti-inflamatomog efekta. Ova antitela se mogu vezati za agens (kao imunokompleks) ili se mogu ordinirati odvojeno od agensa. U poslednjem slučaju (odvojeno ordiniranje) antitelo se može ordinirati pre, posle ili paralelno sa agensom. Pogodni terapeutski agensi su, između ostalih, anti-inflamatomi agensi, DMARD (antireumatski lekovi koji modifikuju bolesti), imunosupresivni agensi, hemoterapeutici i agensi za psorijazu. Humana antitela, u skladu sa ovim pronalaskom, mogu takođe da se ordiniraju zajednički sa terapijom zračenjem.

U drugoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se mogu ordinirati u kombinaciji sa drugim antitelima, kao što su specifična antitela na CD4 i specifična antitela na IL-2. Kombinacija humanih antitela iz ovog pronalaska sa antitelima specifičnim na CD4 ili antitelima specifičnim na IL-2, smatraju se naročito korisnim za tretiranje autoimunih bolesti i odbacivanja transplantata.

Unutar obima ovog pronalaska su takođe kompleti koji sadrže humana anti-IL-15 antitela iz ovog pronalaska, i opciono, uputstvo za upotrebu. Ovaj komplet mode još da sadrži jedno ili više dodatnih humanih antitela iz ovog pronalaska (npr. humano antitelo koje ima komplementarnu aktivnost kojom se vezuje za epitop na IL-15 antigenu, koji se razlikuje od prvog humanog antitela).

Prema tome, pacijentima koji su tretirani sa antitelima iz ovog pronalaska može se dodatno ordinirati (pre ili istovremeno sa, ili nakon ordiniranja humanog antitela iz ovog pronalaska) drugi terapeutski agens, kao što je anti-inflamatomi agens, koji pojačava ili povećava terapeutski efekat humanih antitela.

U još jednoj realizaciji, humana antitela iz ovog pronalaska se mogu koristiti da ciljano vode jedinjenja (npr. terapeutski agensi, obeleživači, citotoksini, imunosupresanti, itd.) u ćelije koje za njihovu površinu imaju vezan IL-15 (npr. vezan za membranu ili vezan za receptor IL-15, preko vezivanja tih jedinjenja za antielo. Dakle, ovaj pronalazak daje takođe postupke za lokalizacijuex vivo, in vivoiliin vitroćelija koje izlučuju IL-15 i receptor 11-15 (npr. sa detektabilnim obeležjem, kao što je radioaktivni izotop, fluorescentno jedinjenje, enzim, ili kofaktor enzima).

Druge realizacije ovog pronalaska su opisane u Primerima koji slede.

Ovaj pronalazak je ilustrovan još i primerima koji slede, ali koje ne treba shvatiti kao dalje ograničenje. Sadržaj spiska sekvencija, slike i svi citati, patenti i publikovane patentne prijave koje su navedene kroz ovu prijavu, izričto su ovde priključeni kroz citat.

Primeri

Primer 1. Generisanje miševa sa ciljem na Crnu.

Konstnjkciia vektora ciljanog na CMD .

Plazmid pICEmu sadrži EcoRI/Xho fragment mesta mišjeg Ig teškog lanca, koji obuhvata mi-gen, dobijen iz Balb/C genomske biblioteke lambda fage (Marcu et al.,Cell,1980, 22, 187). Ovaj genomski fragment je sub-kloniran u Xhol/EcoRI mesta plazmida PiCEMI9H (Marsh et al.,Gene,1984, U32U, 481-485). Sekvencije teškog lanca u pICEmu prostiru se silazno od mesta EcoRI lociranog samo 3' od mi intonskog pojačavača, na mestu Xhol, lociranom približno 1 kb silazno od poslednjeg transmembranskog eksona na mi genu; međutim, većina mi zamena ponovljenog regiona je izbačena propuštanjem krozE. coli.

Ciljani vektor se konstruiše kao što sledi. Fragment od 1,3 kb Hindlll/Smal se iseče sa pICEmu, pa subklonira u pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) digestiranog sa Hindlll/Smal. Ovaj fragment pICEmu se prostire od mesta Hindlll, lociranog približno 1 kb 5' od Cmu1 do mesta Smal, lociranog unutar Cmu1. Dobijeni plazmid se digestira sa Srna I/Spe I, pa se umetne fragment od približno 4 kb Smal/Ybal iz PICEmu, koji se prostire od mesta Srna I, u Cmu1 3' pa do mesta Xbal, lociranog silazno od poslednjeg Crnu eksona. Dobijeni plazmid, pTAR1 se linearizuje na mestu Sma1, pa se umetne kaseta neo izlučivanja. Ova kaseta se sastoji od neo gena u transkripcionoj kontroli mišjeg promotera fosfoglicerat kinaze (pgk) (fragment Xbal/Taql; Adra et al.,Gene,1987, 60, 65-74) koji sadrži mesto za oliadenilovanje pgk (fragment Pvull/Hindlll; Boer et al.,Biochemical Genetics,1990, 28, 299-308). Ova kaseta se dobija iz plazmida pKJ1 (opisali Tybulewitz et al.,Cell,1991, 65, 1153-1163), iz koga je neo kaseta isečena kao fragment EcoRI/Hundlll, pa subklonirana u EcoRI/Hindlll digestiranog pGEM-7Zf(+), da bi se generisao pGEM-7 (KJ1). Ova neo-kaseta se iseče iz pGEN-7 (KJ1), digestijom sa EcoRI/Sall, sa blantiranim krajem, pa subklonira na mesto Smal plazmida pTAR1, sa suprotnom orijentacijom genomskih sekvencija Crnu. Dobijeni plazmid se linearizuje sa Not I, a ubaci se kaseta herpes simpleks virusa timidin kinaze (tk), da se dozvoli obogaćenje ES klonima koji nose homologne rekombinacije, kao što su opisali Mansour et al. uNature, 1988,336, 348-352. Ova kaseta se sastoji od kodirajuce sekvencije tk gena ograničenog sa mišjim pgk promoterom i mestom za oliadenilovanje, kao što su opisali Tybulewitz et al., uCell,1991, 65, 1153-1163. Dobijeni ciljani vektor CMD sadrži ukupno 5,3 kb homologije sa mestom teškog lanca i dizajniran je da generiše mutant mi gena u koji je ubačena kaseta neo-izlučivanja na jedinstvenom mestu Smal, prvog eksona Crnu. Ciljani vektor se linearizuje sa Pvul, koji seče unutar sekvencija plazmida, pre elektroporacije u ćelije ES.

Generisanje i analiza ciljanih ćeliia ES

Ćelije AB-1 ES (McMahon, A.P. i Bradley, A.,Cell,1990, 62, 1073-1085) su gajene u mitotički neaktvnim slojevima za hranjenje ćelija SNL76/7 (ibid.), u suštini kao što je opisano (Robertson, E.J., u Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach" (urednik E.J. Robertson), Oxford: IRL Press,

str. 71-112, 1987). Linearizovani ciljani vektor CMD se elektroporira u AB-1 ćelije po metodu koji su opisali Hasty et al. (Hasty, R:R: et al.,Nature,1991. 350. 243-246). Elektroporirane ćelije se zaseju u Petrijeve šolje prečnika 100 mm, sa gustinom (1-2)*10<6>ćelija/šolja. Posle 24 h, medijumu se dodaju G418 (200 ug/mL aktivne komponente) i FIAU (5xi0"<7>M), pa se dopusti da se kloni rezistentni prema leku razviju tokom 8-9 dana. Pokupe se kloni, tripsinizuju, podele u dve porcije i dalje ekspandiraju. Polovina ćelija izvedena iz svakog klona se zamrzne, a druga polovina analizira na homolognu rekombinaciju između vektora i ciljnih sekvencija.

Analiza DNK se obavlja hibridizacijom po metodu Southern blot. DNK se izoluje iz klona, kao što su opisali Laird et al. (Laird, P.W. et al.,Nucleic Acids Res.1991, 19, 4293). Izolovana genomska DNK se digestira sa Spel, i ispita sa fragmentom 915 bp Sad, probe A (videti Sliku 1), koja se hibridizuje u sekvenciju između mi intronskog pojačavača i regiona mi zamene. Proba A detektuje fragment Spel sa mesta divljeg tipa, i dijagnostičku traku od 7,6 kb sa mi lokacije, koja je homologno rekombinovana sa CMD ciljanim vektorom (kaseta neo-izlučivanja sadrži mesto Spel). Iz 1132 G418 i FIAU rezistentnih klonova, ispitanih analizom Southern blot, 3 su pokazivala traku od 7,6 kb Spel, koja je indikativna za homolognu rekombinaciju na mi lokalciji. Ova tri klona su još digestirana sa enzimima Bg1l, BstXI i EcoRI, da se proveri da li se je vektor integrisao homologno u mi gen. Kada se hibridizuje sa probom A, analiza Southern blot divljeg tipa DNK, digestiranog sa Bg1l, BstXI, ili EcoRI stvara fragmente od 15, 7,3 i 12,5 kb, respektivno, dok je prisustvo ciljanog mi alelemorfa naznačeno fragmentima od 7,7, 6,6 i 14,3 kb, respektivno. Sva 3 pozitivna klona detektovana sa Spel digestijom pokazala su očekivane restrikcione fragmente Bg1l, BstXI i EcoRI, koji su dijagnostički za umetanje neo kasete u ekson Cmu1.

Generisanje miševakoii nose mutirani mi gen

Tri klona ciljana u ES, označena brojevima 264, 272 i 408, otkrave se pa injektiraju u C57BL/6J blastocite, kao što je opisao Bradlev (Bradlev, A., u "Teratocarcinomas and Embrvonic Stem Cells: a Practical Approach" (urednik EJ. Robertson), Oxford: IRL Press, str. 113-151, 1987). Injektovani blastociti se prebace u uterus pseudotrudnih ženki da se generišu himemi miševi, koji predstavljaju smešu ćelija izvedenih iz ulaznih ES ćelija i blastocita domaćina. Iznos doprinosa ES ćelija himeri se može vizuelno oceniti preko količine obojenja obloge agoutija (agouti, vrsta glodara), izvedene iz soja ćelija ES, na crnoj osnovi C57BL/6J. Kloni 272 i 408 poizvode samo nizak procent himera (tj. nizak procent agouti pigmentacije), ali klon 264 je proizveo visok procent muških himera. Ove himere su gajene, pa su sparene sa ženkama C57BL(6J, tako da su generisani potomci agoutija, indikativni za prenos germ-soja sa genoma ES ćelije. Ispitivanje ciljanog mi gena je obavljeno analizom Southern blot digestirane DNK sa Bg11, iz repnih biopsija (kao što je gore opisano za analizu ES ćelija DNK). Približno oko 50% potomstva agoutija je pokazalo hibridizujuću traku Bg11 od 7,7 kb, pored trake divljeg tipa od 15,7 kb, pokazujući prenos germ-soja sa ciljanog mi gena.

Analiza transgenih miševa za funkcionalnu inaktivaciiu mi gena

Da bi se odredilo da li umetanje neo kasete u Cmu1 inaktivira teški IgG lanac gena, himera klona 264 je gajena sa homozgotnim mišem za JHD mutaciju, što inaktivira izlučivanje teškog lanca, kao rezultat izbacivanja segmenata JH gena (Chen et al.,Immunol.1993, 5, 647-656). Generisana su četiri potomka agoutija. Serum, dobijen iz ovih životinja, starih 1 mesec, testiran je pomoću ELISA na prisustvo mišjeg IgM. U dva od četiri potomka potpuno je nedostajao IgM (videti Tabelu 1). Genotipiziranje ove četiri životinje analizom pomoću Southern blot DNK iz biopsije repa, pomoću digestije sa Bg11, i hibridizacije sa probom A (videti Sliku 1) i digestijom sa Stul i hibridizacijom sa 475 bp EcoRI/StuI fragmentom (ibid.), pokazalo je da su životinje koje ne izlučuju serumski IgM one u kojima jedan alelomorf sa lokacije teškog lanca nosi mutaciju JHD, a drugi alelomor mutaciju Cmu1. Heterozigotni miševi za mutaciju JHD pokazuju sadržaje Ig u serumu za divlji tip. Ovi podaci pokazuju da mutacija Cmu1 inaktivira izlučivanje mi gena.

Tabela 1 pokazuje sadržaje IgM u serumu, detektovane pomoću ELISA, za miševe koji nose i CMD i JHD mutacije (CMD/JHD), za miševe heterozigotne za JHD mutaciju (+/JHD), za divlji tip (129Sv*C57BL/6J)F1 miševe (+/+) i za miševe deficitarne sa B ćelijama homozigotne za JHD mutaciju (JHD/JHD).

Primer 2. Generisanje transoenskih miševa HC012

HC012 humani transgen teškog lanca

Transgen HC012 je generisan istovremenim injektiranjem inserta od 80 kb pHC2 (Tavlor et al.,Int. Immunol.,1994, 6, 579-591) i inserta od 25 kb pVx6. Plazmid pVx6 je konstruisan kao što je opisano niže.

Fragment od 8,5 kb Hindlll/SA1I DNK, koji sadrži germ-soj humanog Vh1-18 (DP-14) gena, zajedno sa približno 2,5 kb 5'-bočne i 5 kb 3'-bočne genomske sekvencije, subklonira se u plazmid vektor pSP72 (Promega, Madison, Wl), da bi se generisao plazmid p343.7.16. Fragment od 7 kb BamHI/Hindlll DNK, koji sadrži germ-soj humanog Vh5-51 (DP-73) gena, zajedno sa približno 5 kb 5 '-bočne i 1 kb 3'-bočne genomske sekvencije, klonira se u pBR322, zasnovan na plazmidu klonirajućeg vektora pGP1f (Tavlor et al.,Nucleic Acidc Res.,1992, 20, 6287-6295), a bi se generisao plazmid p251f. Novi klonirajući vektor se izvodi iz pGP1f, pGP1k (SEQ ID NO:13), digestira se sa EcoRV/BamHI, i vezuje za fragment od 10 kb EcoRV/BamHI DNK, koji sadrži germ-soj humanog VH3-23

(DP47) gena, zajedno sa približno 4 kb 5'-bočne i 5kb 3'-bočne genomske sekvencije. Dobijeni plazmid, p112.2RR.7 se digestira sa BamHI/Sa1l i vezuje sa 7 kb prečišćenog inserta BamHI/Sa1l iz p251f. Dobijeni plazmid pVx4 se digestira sa Xhol i vezuje sa insertom od 8,5 kb Xhol/Sa1l iz p343.7.16.

Dobije se klon sa Vh1-18 genom iste orijentacije kao i druga dva V gena. Zatim se ovaj klon, označen sa pVx6, digestira sa Noti, a prečišćeni insert od 26 kb se istovremeno injektira, zajedno sa prečišćenim insertom od 80 kb Noti iz pHC2 u molskom odnosu 1:1, u pronukleus poludnevnog embriona (C57BL(6J * DBA/2J)F2, kao što su opisali Hogan et al. (B. Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratorv Manual", 2. izdanje, 1994, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Plainview, NY). Nastala su tri nezavisna soja transgenih miševa, koji sadrže sekvencije i iz Vx6 i iz HC2, iz miševa koji su se razvili iz injektiranih embriona. Ovi sojevi su označeni sa (HC012)14881, (HCO12)15083 i (HC12)15087. Svaki od ova tri soja je zatim gajen sa miševima koji sadrže CMD mutaciju, opisanu u Primeru 1, JKD mutaciju (Chen et al.,EMBO J.,1993, 12, 811-820) i (Kco5)9272 transgen (Fishwald et al.,Nature BiotechnofogyI,1996, 14, 845-851). Dobijeni miševi izlučuju humani teški i laki kapa lanac transgena, sa homozigotnom osnovom za raskidanje endogenih mišjih mesta teškog i lakog kapa lanca.

Primer 3. Stvaranje humanih monoklonalnih antitela protiv IL- 15

Transgeni miševi HCo12 i HCo7, generisani kao što je opisano gore, i dobavljeni iz Medarex, San Jose, CA, USA, imunizovani su sa humanim rekombinantnim IL-15 (hlL-15, lmmunex Corp. Seattle, USA), sa dodatkom ili kompletnog Freund-ovog adjuvanta (CFA, partija No. 121024LA, Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA), ili sa nekompletnim Freund-ovim adjuvantom (ICFA, partija No. 121195LA, Difco, subkutano (SC), intraperitonealno (IP) ili intravenozno (IV). U nekoliko primera za imunizaciju je korišćen hlL-15 kuplovan sa KLH. Posle nekoliko injekcija sa hlL-15, sa dodatkom ili kompletnog ili nekompletnog Freund-ovog adjuvanta, testiran je serum miševa na prisustvo humanih antitela usmerenih protiv IL-15.

Sheme imunizovanja transgenih miševa, koje su dovele do konačnih klonova 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8:

Miš broj 146 ( HCo12), ID 995- 146, ženka

170699 SC 12 ug hlL-15u CFA (Difco, partija No. 121024 LA)

010799 SC 12 ug hlL-15u CFA (Difco, partija No. 121195 LA)

150799 SC 12 pg hlL-15u CFA

020899 SC 12 ug hlL-15-KLH u ICFA

070999 SC 12 ug hlL-15-KLH u ICFA

280999 SC 12Mg hlL-15-KLH u CFA

111099 IV 30 pghlL-15uPBS

121099 IV 30 pg hlL-15 u PBS

151099 fuzija ćelija limfnog čvora i slezine ovog miša sa SP2/0

Miš broj 404 ( HCo12), ID 997- 404, ženka

201099 IP 25M9hlL-15-KLH u CFA (Difco, partija No. 121024 LA) 031199 IP 12,5 pg hlL-15, 12,5 pg hlL-15-KLH, 25 pg u ICFA

(Difco, partija No. 121195 LA)

101199 IV 12,5MghlL-15, 12,5 pghlL-15-KLH

121199 IV 12,5 pgnlL-15, 12,5 pg hlL-15-KLH

19199 fuzija ćelija limfnog čvora i slezine ovog miša sa SP2/0

Medi / um kulture

Medijum fizionog partnera ( FMP) :

Dulbecco-ovom medijumu, modifikovanom sa Iscoves, doda se 100 lU/mL penicilina, 100 pg/mL streptomicina, 1 mM Na-piruvat, 0,5 mL p-merkaptoetanol (Life Technologies, Paislev, Scotland) i 10% toplotom inaktivisani serum kravljeg fetusa (HvCIone, Utah, USA).

Medijum selekcije fuzije ( FSM) :

FPM sa dodatkom 30 mL Fakora kloniranja Origen hibridoma (IGEN, Gaithersburg, MD, USA), HAT (1 fiola, koncentracija preporučena od proizvođača, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) i 0,5 mg/mL kanamicina (Life Tehnologies, Paislev, Scotland).

Medijum fuzionog kloniranja ( FCM) :

FMP sa dodatkom 20 mL Fakora kloniranja Origen hibridoma (IGENm Gaithersburg, MD, USA), HAT (1 fiola, koncentracija preporučena od proizvođača, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) i 0,5 mg/mL kanamicina (Life Tehnologies, Paislev, Scotland).

Preparat hibridoma: fuzija ćelija slezine i limfnih čvorova sa ćelijama SP2/ 0

mijeloma

Da bi se dobile hibridome izvađeni su slezina, ingvinalni i para-aortni limfni čvorovi iz miševa. Suspenzije pojedinačnih čelija slezine i ćelije limfnih čvorova su pomešane sa ćelijama SP2/0 mijeloma u ćelijskom odnosu 1:2. Ćelije su centrifugirane, a pelete su lagano resuspendovane u 1 mL polietilenglikola (50 %

( m/ V)u PBS, Sigma-Aldrich, Irvine, UK), na 37°C. Posle 60 s mešanja ćelija, doda se 25 mL FMP-2, pa se ćelije 30-60 min inkubiraju na 37°C. Posle inkubacije, ćelije se kultivišu do koncentracije ćelija od 0,75*10<5>ćelija po bazenčiću ( u 100 pL), na pločama sa 96 bazenčića, u FSM. Posle 3 dana u svaki bazenčić se doda 100 pL FSM.

Fuzija HCo7 i HCo12 iz slezine i limfnih čvorova miševa se imunizuje sa hlL-15, što za rezultat ima generisanje nekolko hibridoma koji stvaraju antitela usmerena protiv IL-15. Izolovana su sledeća četiri stabilna klona, koja stvaraju potpuno humana anti-IL-15antitela: (1) 146LyD7F7B7, koje je preimenovano u 146B7; (2) 146DE2E12A2H5, koje je preimenovano u 146H5; (3) 404CG11B7E4 koje je preimenovano u 404E4; i (4) 404FB12E7A8, koje je preimenovano u 404A8. Svi ovi klonovi su iz potklase humanih lgG1/k.

Ispitivanje hibridoma

Između 7. i 11. dana posle fuzije, bazenčici se ispituju na prisustvo humanih antitela, koristeći sledeće testove ELISA: ELISA za ispitivanje prisustva humanog IgG u bistrim slojevima iznad kulture. Za obavljanje ELISA, da bi se detektovalo prisustvo humanih IgG antitela, doda se 100 pL/bazenčić 0,9 pg/mL antitela zečjih-a-k-lakih lanaca (DAKO, Glostrup, Denmark), u slanom fosfatnom puferu (PBS), na ELISA-ploču Nunc Maxisorp (inkubacija preko noći na sobnoj temperaturi). Posle blokiranja ploče sa PBS, uz dodatak pilećeg seruma (2%, LrfeTechnologies, Paislev, Scotland) i Tween-20 (0,05%; PBSTC), dodaju se bistri slojevi iznad kulture. Posle 1,5 h inkubacije, ploče se operu zečjim-a-humanim IgG (fragmenti Fab-2), konjugovanim sa peroksidazom rena (DAKO, GLostrup, Denmark) 0,5 pg/mL razblaženom u PBSTC. Posle 1 h inkubiranja, bazenčici se operu, pa doda substrat, ABTS (2,2'-azinobis-3-etilbenzitiazolin-sulfonska kiselina, Roche Diagnostics, Mannheim, Germanv), u skladu sa protokolom proizvođača, a vezivanje antitela se vrednuje na 405 nm na čitaču EI808 ELISA-reader (Bio-tek Instruments, VVinooski, VT,

USA).

ELISA za ispitivanje prisustva antitela specifičnih za IL-15.

Bazenčići, koji sadrže humana IgG/k antitela, testiraju se dalje na prisustvo humanih anti-IL-15 antitela u testu ELISA specifičnom za IL-15. Za obavljanje ELISA, doda se 100 pL/bazenčić 1 pgmL IL-15, u slanom fosfatnom puferu (PBS), na ELISA-ploči Nunc Maxisorp (inkubacija preko noći, na sobnoj temperaturi). Posle blokiranja ploče sa PBS, uz dodatak pilećeg seruma (2%, Life Technologies, Paislev, Scotland) i Tween-20 (0,05%; PBSTC), dodaju se bistri slojevi iznad kulture. Posle 1,5 h inkubacije, ploče se operu a-humanim IgG Fc, konjugovanim sa peroksidazom rena (Jackson Immuno research, West Grove, Pennsvlvania, USA)) u razblaženju 1/5.000 u PBSTC. Posle 1 h inkubiranja, bazenčici se operu, pa doda substrat, ABTS (2,2'-azinobis-3-etilbenzitiazolin-sulfonska kiselina, Roche Diagnostics, Mannheim, Germanv), u skladu sa protokolom proizvođača, a vezivanje antitela se vrednuje na 405 nm na čitaču EI808 ELISA-reader (Bio-tek Instruments, VVinooski, VT, USA).

Subkloniranje hibridoma

Da bi se dobili stabilni sojevi antil-IL-15 ćelija, hibridome se subkloniraju pri čraničnom razblaženju ćelija (oko 0,5 ćelija/bazenčić) na ploči sa 96 bazenčića.

Ovi subklonovi se testiraju posle približno 10 dana sa gore pomenutim IL-15 ELISA. Tokom nekoliko procedura subkloniranja, FSM se menja u fazama preko FCM do FPM. Izotip subklonova je određivan pomoću ELISA, opisanog niže.

Određivanje izotipa anti- IL- 15 antitela pomoću ELISA

Za obavljanje izotipa-ELISA, doda se 100 pL/bazenčić 1 pg/mL anti-humanog Fc (Jackson Immuno research) u slani fosfatni pufer (PBS) na ELISA-ploču Nunc Maxisorp (inkubacija preko nod, na sobnoj temperaturi). Posle blokiranja ploče sa PBS, uz dodatak pilećeg seruma (2%, LifeTechnologies, Paislev, Scotland) i Tween-20 (0,05%; PBSTC), dodaju se bistri slojevi iznad kulture. Posle 1,5 h inkubacije, ploče se operu mišjim-a-HulgG1, konjugovanim sa alkalnom fosfatazom (Zymed, plaats, land) ili mišjim-a-HulgG1, konjugovanim sa peroksidazom rena (Zymed). Posle 1 h inkubiranja, bazenčići se operu, pa doda substrat, ABTS (2,2'-azinobis-3-etilbenztiazolin-sulfonska kiselina, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), u skladu sa protokolom proizvođača. Vezivanje antitela se vrednuje na 405 nm na čitaču EI808 ELISA-reader (Bio-tek Instruments, VVinooski, VT, USA).

Primer 4.Specifičnost epitopa potpuno humanih anti- IL- 15 antitela

Da bi funkcionisala terapeutski i da bi inhibirala proinflamatome efekte izazvane sa IL-15, antitela specifična za IL-15 treba da prepoznaju epitope IL-15 koji učestvuju u interakciji sa IL-2Rp-lancem i/ili y-lancem receptora IL-15.

Proteini mutanti (opisali su ih Pettit et al.) se koriste za vrednovanje specifičnosti epitopa potpuno humanih anti-IL-15 antitela, 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4. Upotrebljeni mutanti IL-15 su mutant IL-15 Q108S (Gln na 108 ostatku je zamenjen sa Ser; mutacija na mestu interakcije u y-lancu) i mutant D8SO.108S (Gln na 108 ostatku je zamenjen sa Ser i Asp u položaju 8 je supstituisan sa Ser, mutacije i u p i u y-lancu na mestima interakcije IL-15).

ELISA za određivanje vezivanja specifičnih hlL- 15 antitela, 146B7, 146H5,

404AB i 404E4 za hlL- 15 iza proteine mutanta IL- 15

Za obavljanje ELISA, doda se 100 pL/bazenčić 1 pg/mL IL-15 ili hlL-15 mutant proteina u slani fosfatni pufer (PBS) na ELISA-ploču Nunc Maxisorp za oblaganje. Posle blokiranja ploče sa PBS, uz dodatak pilećeg seruma (2%, LifeTechnologies, Paislev, Scotland) i Tween-20 (0,05%; PBSTC), inkubiraju se serijska razblaženja antitela specifičnih za hlL-15. Posle pranja sa a-humanim IgG Fc, konjugovanim sa peroksidazom (Jackson Immuno research, VVest Grove, Pennsvlvania, USA), doda se PBSTC razblažen 1/5.000. Posle pranja substrata, doda se ABTS (2,2'-azinobis-3-etilbenztiazolin-sulfonska kiselina, Roche Diagnostics, Mannheim, Germanv), u skladu sa protokolom proizvođača. Vezivanje antitela se vrednuje na 405 nm na čitaču EI808 ELISA-reader (Bio-tek Instruments, VVinooski, VT, USA).

Vezivanje potpuno humanih antiela specifičnih za IL-15, 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4, za hlL-15 i za IL-15 O.108S i D8SO.108S, prikazano je na Slici 1. Ni 146B7 ni 146H5 nisu bili u stanju da se vezuju za ove mutant-proteine IL-15. Pošto oba mutanta nose mutaciju O.108S, epitop kog prepoznaju 146B7 i 146H5 je unutar kritičnih domena IL-15, koji stupaju u interakciju say-lancem receptora IL-15. Međutim, 404A8 i 404E4 su oba bili u stanju da vezuju mutant-proteine, pa stoga ova anetitela prepoznaju i epitope izvan domena interakcije p- i y-lanca IL-15. Oba, 146B7 i 146H5, vezuju se za IL-15 u regionu koji stupa u interakciju sa y-lancem receptora IL-15. Ovo je saglasno sa podacima dobijenim iz testova proliferacije, gde su korišćena potpuno humana anti-IL-15 antitela iz ovog pronalaska. Kao što je detalnije opisano niže, ni 404A8, ni 404E4 nisu u stanju da inhibiraju priiferaciju ćelija CTLL-2 i humanih PBMC, indukovanu sa IL-15. Međutiim i 146B7 i 146H5 su u stanju da inhibiraju proliferaciju indukovanu sa IL-15. Dalje, inhibicija proliferacije se postiže blokiranjem interakcije IL-15 say-subjedinicom receptora IL-15.

Primer 5. Sekvencije Vh i Vi regiona 146B7

Sekvencija nukleotida i izvedena sekvencija aminokiselina preuređenih domena Vhi VLu 146B7 su određeni korišćenjem sledećih procedura. Ove sekvencije daju informacije koje se odnose na Vhi VLfamilije germ-sojeva koje su korićene; tačke mutacija u ovim sekvencijama germ-sojeva su usled sazrevanja afiniteta B-ćelija, za vreme imunizacije životinje.

Pripremanje RNK

Ukupna RNK se priprema iz 5x10<6>hibridoma ćelija 146B7, sa RNAzol (Biogenesis, Poole, England), u skladu sa protokolom proizvođača.

Pripremanje cDNK<r>

Pripremi se cDNK od RNK iz 146B7, iz ukupno 3 pg RNK, sa MV reversnom transkriptazom, sa puferom (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germanv), oligo d(T)i5(Promega, Madison, Wl, USA), dNTP (Boehringer Mannheim corp., USA) i RNAsin (Promega), u skladu sa protokolom proizvođača.

Prajmeri PCR upotrebljeni za amplifikaciju regiona Vhi VLza kloniranje

Korišćeni parovi prajmera:

PCR uslovi korišćeni za amplifikaciju VHi Vlregiona za kloniranje

PCR reakcije su obavljane sa AmpliTaq polimerazom (Perkin Elmer) na sistemu GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA,

USA).

Protokol ciklizacije PCR:

94° 2' 11 ciklusa 94° 30"

65" 30", minus 1° po ciklusu

72° 30 "

30 ciklusa 94° 30 "

55° 30"

72° 30"

72° 10'

hlađenje do 4°.

Kloniranje Vhi VLu pGEMT- vektorskom sistemu I

Posle analiziranja PCR proizvoda u agaroza gelu, proizvodi se prečiste sa S-400 ili S-300 mikrospin kolonama (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ. USA), ili sa kompletom QIAEX II Gel Extraction Kit (Ojagen GmbH, Hilden, Germany). Za svaki eksperiment kloniraju se 2 nezavisno amplifikovana PCR proizvoda, koristeći FR1 ili vodeće prajmere za svaki od VHi VLregiona, u pGEMT-vektorskom sistemu I (Promega), u skladu sa protokolom proizvođača.

Posle transformacije uE. coliDH5<x, pojedinačne kolonije se ispitaju pomoću PCR za kolonije, koristeći T7 i SP6 prajmere, 30 cklusa na 55°. Plazmid DNK iz svake pojedinačne kolonije se prečisti koristeći Ojaprep Spin miniprep kit (Qiagen). Za dalju analizu obavi se digestija saNco1/ Not1(NE Biolabs, United Kingdom i Roche Diagnostics) i analiza sa agaroza gelom.

Sekvencioniranje

V-regioni se sekvencioniraju posle kloniranja u pGEMT-vektor sistemu I. Koriste se 17 i Sp6 prajmeri (Eurogentec, Luik, Belgium), u kombinaciji sa kompletom za sekvencije: ABI Prism BigDve Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Niosystems, VVarrigton, Velika Britanija), u skladu sa protokolom. Reakcije se obavljaju na uređaju ABI PRISM 377 Sequencer (PE Applied Biosystems), a sekvencije se analiziraju sa programom DBAStar, Seqmanll. Sekvencije se zatim svrstaju u germ-soj sekvencija V-gena u VBASE (www.mrc-cpe-cam.ac.uk/imt-doc(public/intro-htm).

Kloniranje i sekvencioniranje VHi VLregiona 146B 7

Vhi Vlregioni iz hibridoma 146B7 amplifikovani su sa PCR i klonirani sa pGEMT-vektor sistemom I, da bi se odredila sekvencija cDNK. Sekvencije nukleotida i odgovarajućih aminokiselina su pokazane na Slici 2 (SEQ ID NO: 1 i 2) i na Slici 3 (SEQ ID NO: 3 i 4), respektivno. Pokazani su takođe osnovna struktura skeleta (ili frejmvork) (FR) i regioni koji određuju komplementarnost (CDR). Familija germ-soja sa Vh-region u 146B7, u skladu sa sravnjivanjem u V-bazi: Vh5-51 (VH5-subgrupa), D2-15/d2 (DHsegment), JH4b (JHsegment). Familija germ-soja za Vlregion u 146B7, u skladu sa sravnjivanjem u V-bazi: A27 (VKlII-subgrupa) i Jk2 (Jksegment). Više irrformacija u pogledu Vhi VL-domena je pokazano u bazi podataka Kabat fottftffiflftf^^ ili u http://www.Vbase.com.

Primer 6. Karakteristike afiniteta vezivanja 146B7

Afinitet 146B7 je analiziran tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (SPR), koristeći instrument BIACORE 3000 za određivanje biomolekulamih interakcija proteina, u skladu sa sledećom procedurom. Detektuju se promene u signalu SPR u površinskom sloju, izazvane biomolekulamim vezivanjem, označavajući pramenu masene koncentracije u površinskom sloju. Afinitet se iskazuje korišćenjem sledećih definicija: ka= konstanta brzine asocijacije (M"<1>s"<1>);

kd= konstanta brzine disocijacije (s~<1>);

Ka = konstanta ravnoteže asocijacije = k*/kd(M"<1>); i

KD= konstanta ravnoteže disocijacije = kd/ka(M).

Obavljaju se različite procedure da bi se dobio afinitet 146B7 prema humanom IL-15 (hlL-15). Humani rekombinantni IL-15, od dva različita snabdevača (lmmunex corp., Seattle, USA i Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) se kupluju u senzorski čip CM5. Jedinjenje kuplovano sa ovim senzorskim čipom se definiše kao ligand. U drugim eksperimentima 146B7 se koristi kao ligand.

U svakoj kinetičkoj analizi, vezivanje analita, 146B7 ili hlL-15, adaptirano ligandu kuplovanom na senzorski čip, poredi se sa vezivanjem za senzorski čip referentne kontrole CM5. Testiraju se serijska razblaženja analita (0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 pg/mL). Krive asocijacije i disocijacije se fituju za monomerske interakcije na Lengmirovom modelu 1:1, da bi se odredile kai kdi izračunate Kai KD. Svi podaci se analiziraju korišćenjem programa BIA-Evaluation Version 3.1. Za bivalentne interakcije koristi se model "bivalentni analit". Sve analize su korigovane zbog pomeranja osnovne linije. Da bi se odredio afinitet 146B7, meri se afinitet antitela 146B7 prema humanom rekombinantnom IL-15, od dva dobavljača, lmmanex i Peprotech, na isntrumentu BIACORE 3000. Koristeći 146B7 kao ligand i hlL-15 kao analit, određena je monovalentna interakcija (fitovanjem Lengmirove krive 1:1).

Afinitet 146B7 prema IL-15 (lmmunex Corp.) meren je kao što sledi:

Konstanta brzine asocijacije, ka: 1,O7(±O,17)xl0<5>M"<1>s"1

Konstanta brzine disocijacije, kd.- 6,56(±0,09)x 10"3 s"<1>

Konstanta ravnoteže asocijacije, Ka: 1,55 (±0,21)xio<7>M"<1>

Konstanta ravnoteže disocijacije, Kd". 6,59 (dtO.SS^lO"<8>M

Za određivanje aviditeta 146B7, kao ligand je korišćen IL-15 (lmmunex Corp.), a 146B7 kao analit. Kada su analizirani dobijeni podaci, korišćenjem fitovanja Lengmirove krive (1:1), bivalentna interakcija antitela je iskazana, i određen je aviditet antitela.

Aviditet 146B7 prema IL-15 (lmmunex Corp.) meren je kao što sledi:

Konstanta brzine asocijacije, ka: 7,30(±0,81)x10<5>M"<1>s"<1>

Konstanta brzine disocijacije, kj. 1 ,45(±2,05)x10~3 s"1

Konstanta ravnoteže asocijacije, KA: 5,03 (±3,40)*10<8>M"<1>

Konstanta ravnoteže disocijacije, KD: 1,55 (±1,24)* 10"9 M

Određeni su takođe, afinitet i aviditet za 146B7, prema IL-15 Peprotech. Nisu opažene bitne razlike u afinitetu i aviditetu za dva različita izvora IL-15.

Kao što se opisuje u primeru niže, u pogledu inhibicije humanim interleukinom-15, proliferacija ćelija CTLL-2 i PBMC, indukovana hlL-15, sa potpuno humanim anti-IL-15 antitelima, 146B7 inhibira, na način koji zavisi od doze, proliferaciju indukovanu sa IL-15, što je mereno ugrađivanjem [<3>H]-timidina. Koncentracija IC50, za 50% inhibiciju, (funkcionalniji način određivanja afiniteta), računata iz ovih eksperimenata inhibicije proliferacije, izračunata je kao 3,1 ±0,91 nM. Ova vrednost IC50je saglasna sa aviditetom, merenim pomoću BIACORE 3000 (KD= 1,5 nM), korišćenjem 146B7 kao liganda, a rekombinantnog humanog IL-15 kao analita, što potvrđuje merenja afiniteta i aviditeta, koja su ovde obavljena.

Primer 7. Inhibiciia stvaranja TNF- a indukovana sa hlL- 15. pomoću potpuno

humanih antitela anti- IL- 15

Efekat potpuno humanih anti-IL-15 antitela, 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8, na stvaranje TNF-a indukovano sa IL-15, ispitivano je korišćenjem mononukleamih ćelija dobijenih iz periferne krvi (PBMC) zdravih volontera, korišćenjem sledeće procedure. Za vrednovanje specifičnosti IL-15, ispitan je takođe efekat ovih antitela na stvaranje TNF-a posredovano sa IL-2.

Kultura ćelija

Kulture se održavaju u RPMI-1640 sa 2 mM L-glutaminom, 100 lU/mL penicilina, 100 pg/mL streptomicina (svi iz Life Technologies, Paiselv, Škotska) i 10% toplotom inaktiviranog seruma telećeg fetusa (HvCIone, Utah, USA).

Prečišćavanje mononukleamih ćelija iz periferne krvi ( PBMC)

Svežoj humanoj krvi, uzetoj od zdravih volontera, nakon što su informisani za dobijanje saglasnosti, doda se heparin protiv koagulacije. Prečišćavanje PBMC se obavlja centrifugiranjem sa gradijentom gustine, koristeći centrifugu Ficoll (Pharmacia, Uppsala, Švedska).

Testirano jedinjenje

hlL-15, partija broj: 6870-011, lmmunex corp., Seattle, VVashigton, USA

hlL-2, Chiron Benelux BV, Amsterdam, Holandija

Korišćena su potpuno humana antitela: 146B7 (šarža: 070101) i 146B7RDJVV07, 404A8 (šarža: 030101) i 404E4 (šarža: 0,80101) i izotip kontrolnog antitela T1 (97-2B11-2B-12, šarža: 190900).

Inhibicija indukovana sa humanim IL- 15 ( hIL- 15) ili sa hlL- 2 stvaranja TNF- a sa

PBMC, sa anti- IL- 15 antitelima

Kultivišu se PBMC, trostruko ili četvorostruko na ploči sa 9 bazenčića ravnog dna, sa 1,5*10<5>ćelija po bazenčiću, u prisustvu ili u odsustvu hlL-2 ili hlL-15, i sa ili bez anti-IL-15 antitela. Kao negativna kontrola služi izotip kontrolnog antitela (T1). Kao pozitivna kontrola za proliferaciju dodaje se Concanavalin A (2,5 pL/mL, Calbiochem). Ćelije se 72 h inkubiraju na 37<8>C i 5% CO2. Sakupe se gornji bistri slojevi za kvantitativno određivanje humanog TNF-a, pomoću ELISA (U-CyTech, Utrecht, Holandija).

Efekti 146B7 i izotipa kontrolnig antitela su testirani na stvaranje TNF-a pomoću PBMC, posredovano sa IL-15. Pokazano je da 146B7 inhibira stvaranje TNF-a posredovano sa hlL-15 na način zavisan od doze, dok izotip kontrolnog antitela nije inhibirao stvaranje TNF-a indukovano sa hlL-15 (Slika 6). Prikazani su podaci za dva zdrava volontera. Pokazano je da 404E4 i 404A8 nisu u stanju da inhibiraju stvaranje TNF-a indukovano sa hlL-15.

Da bi se osigurala specifičnost anti-IL-15 antitela, vrednovan je njihov efekat na stvaranje TNF-a posredovano sa hlL-2. Nema inhibicije stvaranja TNF-a posredovanog sa IL-2, koja je indukovana sa 146B7 (Slika 7). Nije opažena od doze zavisna inhibicija, bilo sa 404E4 ili sa 404A8, na stvaranje TNF-a posredovano sa hlL-2.

Od doze zavisna inhibicija stvaranja TNF-a posredovanog sa hlL-15, opažena je samo za 146B7, ali ne i za 404E4 i 404A8. Inhibitorski efekat je specifičan za hlL-15. Stvaranje TNF-a indukovano sa IL-2 nije inhibirano.

Primer 8. Inhibicija proliferaciie CTLL- 2 ćelija i PBMC indukovane humanim

interieukinom- 15 ( hlL- 15). pomoću potpuno humanih anti- IL- 15 antitela

Testirana su antitela 146B7, 146H5, 404E4 i 404A8 u pogledu njihove sposobnosti da inhibiraju proliferaciju T-ćelija, koristeći CTLL-2 ćelije (Gillis et al., 1978) i mononukleame ćelije iz periferne krvi (PBMC), korišćenjem sledeće procedure.

Kultura ćelija

Kulture se održavaju u RPMI-1640 sa 2 mM L-glutaminom, 100 lU/mL penicilina, 100 pg/mL streptomicina (svi iz Life Technologies, Paiselv, Škotska) i 10% toplotom inaktiviranog seruma telećeg fetusa (HvCIone, Utah, USA), ćelije CTLL-2 (Gillis et al., 1978) se održavaju u gore pomenutom medijumu, sa dodatkom 36 jedinica hlL-2 / mL (Chiron Benelux BV, Amsterdam, Holandija), pa su izgladnjivane 3-4 dana po hlL-2, pre početka eksperimenta. Ćelije CTLL-2 se operu tri puta pre upotrebe.

Prečišćavanje mononuklearnih ćelija iz periferne krvi ( PBMC)

Testrano jedinjenje

hlL-15, partija broj: 6870-011, lmmunex corp., Seattle, VVashigton, USA

hlL-2, Chiron Benelux BV, Amsterdam, Holandija

anti-IL-15 antitela korišćena u testu za CTLL-2 u ovom saopštenju, pokazana su na Slici 8: 146B7, 146H5, 404A8 i 404E4.

anti-IL-15 antitela koja su korišćena u testovima za PBMC: 146B7 (šarža 070101), 404A8 (šarža: 030101) i 404E4 (šarža: 0,80101).

Inhibicija proliferacije CTLL- 2 indukovane humanim IL- 15 ( hlL- 15) ili sa hlL- 2,

pomoću anti- IL- 15 antitela

U svakom eksperimentu, ćelije se zasejavaju u triplikatu, na ploču sa 96 bazenčića, sa 5M03 ćelija po bazenčiću, u prisustvu ili u odsustvu ili hlL-2 ili hlL-15. Da bi se vrednovao efekat proliferacije, doda se svako od četiri anti-IL-15 antitela. Ćelije se inkubiraju 16 h, na 37°C i 5% CO2. Na 4 h pred sakupljanje žetve (Harvester 96 Mach II M, Tomtec, Orange, CT, USA) doda se [<3>H]-timidin (1 pCi/bazenčić, Amersham Life Sciences, Little Chalfont, Buckinhamshire, Velika Britanija).

Kao što je pokazano na Slici 8 proliferacija ćelija CTLL-2 indukovana sa IL-15 je smanjena pomoću 146B7 i 146H5, na način zavisan od doze, što se odražava smanjenom ugradnjom [<3>H]-timidina. I 404E4 i 404A8 nisu u stanju da blokiraju proliferaciju CTLL-2 indukovanu sa IL-15.

Inhibicija proliferacije PBMC indukovane saAjIL-15/// hlL- 2, pomoćua/7f/-IL-15

antitela

Kultivišu se PBMC u triplikatu, na ploči sa 96 bazenčića, sa dnom U-oblika (Nunc, Nalge Nunc International, Danska), sa 5*10<4>ćelija/bazenčić, u prisustvu ili u odsustvu hlL-2 ili hlL-15 i anti-IL-15 antitela. Kao pozitivna kontrola za proliferaciju dodaje se Concanavalin A (2,5 pL/mL, Calbiochem). Ćelije se 72 h inkubiraju na 37°C i 5% CO2. Na 16 h pred sakupljanje žetve (Harvester 96, Tomtec, Orange, CT, USA) doda se [<3>H]-timidin (1 uCi/bazenčić, Amersham Life Sciences, Little Chalfont, Buckinhamshire, Velika Britanija).

Zavisno od doze 146B7 je u stanju da inhibira ugradnju [<3>H]-timidina indukovanu sa IL-15, pa stoga inhibira proliferaciju (IC50= 3,1±0,91 nM). I 404E i 404A8 nisu u stanju da blokiraju proliferaciju PBMC indukovanu sa hlL-15. 146H5 nije testiran, u skladu sa podacima dobijenim iz prethodno obavljenih eksperimenata. Da bi se osigurala specifičost 146B7, 404E4 i 404A8 prema IL-15, ova antitela su vrednovana takođe u pogledu njihovog efekta na proliferaciju posredovanu sa IL-2. Ni jedno od testiranih anti-IL-15 antitela nije ispoljilo efekat na poliferaciju indukovanu sa IL-2 (slika 9).

Primer 9. Humano anti- IL- 15 antitelo iz 146B7 se vezuie za humani IL- 15.

prisutan u humanim PBMC

Testirana jedinjenja

Humane PBMC su dobijene od zdravih volontera, nakon što su informisani za dobijanje saglasnosti.

Antitelo 146B7 (šarža broj MDX015), Medarex Inc., Milpitas, SA, USA.

Biotinilovanje 146B7 i humanog IgG

Prvo se razblaži N-hidroksisukcinimido-biotin (Sigma) u DMSO (konačno razblaženje: 100 mg/mL), a zatim u 0,1 M NaHCC«3 (konačno razblaženje: 1 mg/mL, Sigma). Na 1 mg antitela (razblaženog u 1 mL), doda se 600 pL rastvora biotina (mrak, 2 h, ST). Dijalizuje se rastvor antitelo-biotin u kaseti za dijalizu slide-a-lyzerw (10.000 MWCO, Pierce, Perbio Science, Holandija) (preko noći, na 4°C), kako bi se uklonio neobeleženi biotin. Sledećeg dana se određuje koncentracija biotinilovanih antitela, pomoću spektrometrije (Ultrospec 2100pro) OD na 280 nm.

Stimulacija periferne krvi

Da bi se indukovao IL-15, uzme se krv iz vene zdravih volontera. PBMC se kultivišu u RPMI 1640 (Biovvhittaker Europe), uz dodatak penicilina (5 lU/mL), streptomicina (50 pg/mL), L-glutamina (2 mM) (Biovvhittaker Europe) i 10% seruma telećeg fetusa (Optimum C241, Multicel, Vvlscent Inc.), maksimalno 2 dana (37°C), pa se stimulišu sa 500 U/mL IFNy (Boehringer, Ingelheim).

Protočna citometrija

Ćelije se prethodno inkubiraju sa 10% humanim AB serumom (CLB, Amsterdam, Holandija) u RPM11640 (Biovvhittaker Europe), uz dodatak penicilina (5 lU/mL), streptomicina (50 pg/mL), L-glutamina (2 mM) (Biovvhittaker Europe) i 10% seruma telećeg fetusa (Optimum C241, Multicell, VVisent Inc.). Posle permeabilizacije (20 min, 4°C, u Cytofix/Cytoperm™ kompletu, Becton Dickinson, San Diego, CA) i pranja u puferu Perm(Wash™ (Cytofix/Cytoperm™ Kit), podvrgnu se PBMC bojenju IL-15 pomoću protočne citometrije. Kontinualna permeabilnost se postiže korišćenjem pufera PermA/Vash™ (Cytofix/Cytoperm™ Kit) kroz proceduru bojenja. Posle inkuubacije ćelija sa biotiniloanim 146B7 ili sa biotinilovanim hlLG1 (20 pg/mL, 30 min, 4°C) i pranja u puferu PemrvVVash™, ćelije se inkubiraju sa streptavidin/phycoerythrin-om (DAKO) 30 min (4°C). Određuje se fluorescencija najmanje 5000 ćelija po uzorku, posle analize protočne citometrije (FACS Calibur, Becton Dickinson) i odabirući monocite, korišćenjem softvera CellOuest Pro. Podacipokazuju indeks stimulacije (S.I.),koji se izračunava kao što sledi: S.l. = (srednja fluorescencija pozitivnog obojenja) /

(srednja fluorescencija osnovnog polaznog obojenja).

Imunociteohemija

Da bi se detektovalo prisustvi IL-15 u humanim monocitima, naprave se preparati citospina cetokupnih uzoraka krvi. Posle stavljanja 5*10<4>ćelija (200 pL) na Superfrost<®->Plus mikroskopske slajdove (Menzel), slajdovi se suše na vazduhu (<60min), fiksiraju u 2% paraformaldehidu/PBS (8 min, 4°C), operu sa PBS i ponovo osuše na vazduhu. Pre bojenja, citospin preparati se permeabilizuju u PBS (+0,1% saponin; PBSS), koji se zatim koristi kroz celu proceduru bojenja. Da se blokira endogena aktivnost peroksidaze, citospin preparati se inkubiraju sa 0,05 vol% vodonk-peroksida, razblaženog u puferu limunska kiselina/fosforna kiselina (pH 5,8, 20 min, ST). Posle pranja sa PBSS, blokira se endogena aktivnost biotina u skladu sa uputstvima proizvođača (Biotin Blocking Kit, Vector Lab, DAKO). Posle pranja u PBSS, blokiraju se nespecifična mesta za vezivanje inkubacijom citospin preparata sa 10 vol% humanog prikupljenog AB-seruma (CLB, Amsterdam, Holandija) (30 min) u PBSS. Posle toga, citospin preparati se inkubiraju sa biotinilovanim primarnim antitelom (60 min, ST) i posle pranja sa PBSS, sa streptavidinom kompleksiranim sa biotinilovanom peroksidazom rena (streptABComplx/HRP, DAKO; 1:100 u PBSS, koji sadrži 2% humanog AB seruma; 30 min, ST). Posle pranja u PBSS citospin preparati se inkubiraju sa 3-amino-9-etilciklokarbazolom (0,5 mg/mL) i H2O2(0,01%), u natirjum-acetatnom puferu (50 mM, pH 4,9) tokom 10 min (ST), za detekciju aktivnosti HRP. Citospinovi se peru 5 min tekućom vodom iz česme, kontra-boje 1 min sa hematoksilinom (DAKO), peru još 5 min tekućom vodom iz česme, pa ubace u faramount ili glicer-gel (DAKO).

Protočna citomethja

Vezivanje 146B7 za humane monocite, stimulisane sa IFNy, je pokazano na Slici 12. Biotinilovani 146B7 se vezuje za nestimulisane monocite, čime se pokazuje prisustvo IL-15 u nestimulisanim ćelijama. Stimulacija monocita sa IFNy vodi povećanom vezivanju 146B7 za ćelije, sa maksimumom koji se dostiže u prvom danu kultivisanja. Kontrolno antitelo, hlgG1, pokazuje slabo vezivanje za nestimulisane monocite. Stimulacija sa IFNy povećava vezivanje hlgG1 preko povećanog izlučivanja receptora Fcy na monocitima.

Imunocitohemija

Slika 13 pokazuje bojenje humanih monocita sa 146B7, ili sa kontrolnim antitelom, hlgG1. Jasno crveno obojenje citoplazme se opaža posle inkubacije ćelija sa 146B7, ali ne i sa kontronim antitelom. Prema tome, 146B7 vezuje hIL-15 u monocitima, a to vezivanje je nadregulisano posle stimulisanja sa IFNy. Slika 13 takođe pokazuje da je bojenje IL-15 prvenstveno unutarćelijsko.

Primer 10. Humano anti- IL- 15 antitelo 146B7 vezuje IL- 15 u tkivima pomoću

imunohistohemije

Testirana jedinjenja

Humana psorijatička koža - uzorci tkiva su dobijeni nakon dobijanja saglasnosti. Louise Villadsen, Department of Dermatologv, Gentofte Universitv Hospital, Copenhagen, Danska.

Antitelo 146B7 (šarža broj MDX015), Medarex, Milpitas, CA, USA.

Biotinilovani 146B7 i humani IgG

Prvo se razblaži N-hidroksisukcinimido-biotin (Sigma) u DMSO (konačno razblaženje: 100 mg/mL), a zatim u 0,1 M NaHC03(konačno razblaženje: 1 mg/mL, Sigma). Na 1 mg antitela (razblaženog u 1 mL), doda se 600 pL rastvora biotina (mrak, 2 h, ST), rastvor antitelo-biotin se dijalizuje u kaseti za dijalizu slide-a-lvzer™ (10.000 MVVCO, Pierce, Perbio Science, Holandija) (ON, 4°C), da se ukloni neobeleženi biotin. Sledećeg dana određuje se koncentracija biotinilovanih antitela pomoću spektrometrije (Ultrospec 2100pro), OD na 280 nm.

Imunohistohemija

Tkiva se čuvaju na -80°C do testiranja. Posle otapanja, isečci tkiva se fiksiraju u acetonu (10 min, ST), pa suše na vazduhu. Da se blokira endogena aktivnost peroksidaze, isečci se inkubiraju sa 0,05 vol% vodonik-perokida (H2O2), razblaženog u puferu limunska kiselina/fosfat (pH 5,8, 20 min, ST). Posle pranja sa PBS-Tween 20 (PBST, 0,05 vol%), blokira se endogena aktivnost biotina u skladu sa uputstvima proizvođača (Biotin Blocking Kit, Vecto Lab., DAKO). Posle pranja sa PBST, blokiraju se nespecifična mesta za vezivanje inkubiranjem isečaka tkiva sa 10 vol% humanog prikupljenog AB-seruma (CLB, Amsterdam, Holandija) (30 min) u PBST. Serum se izbledi, a isečci naknadno inkubiraju sa biotinilovanim primamim antitelom (146B7 ili hlgG1) razblaženim u PBS, koji sadrži 2% humanog AB seruma, tokom 60 min (ST). Isečci se operu u PBST. Posle pranja u PBST, svi isečci tkiva se inkubiraju sa streptABCoplex/HRP (DAKO; 1:100 razblaženje u PBS, koji sadrži 2% humanog AB seruma; 30 min, ST). Posle pranja u PBST, isečci se inkubiraju sa 3-amino-9-etilkarbazolom (0,5 mg/mL) i H2O2(0,01%) u natrijum-acetatnom puferu (50 mM, pH 4,9) tokom 10 min (ST), da bi se detektovala aktivnost HRP. Sekcije se peru 5 min tekućom vodom iz česme, kontra oboje sa hematoksilinom (DAKO), tokom 1 min, peru još 5 min tekućom vodom iz česme, i konačno ubace u faramount ili glicer-gel

(DAKO).

Rezultati

Jasno citoplazmičko obojenje keratinocita u psorijatičkoj koži je opaženo posle bojenja isečaka tkiva sa 146B7, ali ne i sa kontrolnim antitelom (Slika 14; 146B7 boji IL-15-pozitivne keratinocite, dobijene iz psorijatičnog plaka).

Primer 11. Humano anti- IL- 15 antitelo 146B7 blokira IL- 15 u himerama SCID

mišieo- humanog tkiva: značajna inhibicija inflamaciie i u artrftisnom i u

psoriiatičnom tkivu.

Testirana jedinjenja

Sinovijalno tkivo, dobijeno od pacijenata sa juvenilnim reumatoidnim artritisom, nakon dobijene saglasnosti; Alexi Grom, odeljenje pedijatrijske reumatologije, Children's Hospital Medical Center, Cincinati, Ohio, USA.

Biopsije keratoma, uzorci tkiva, nakon dobijene saglasnosti. Louise Villasden, Department of Dermatologv, Gentofte Universitv Hospital, Copenhagen, Danska. Antitelo 146B7 (šarža MDX015), Medarex Inc., Milpitas, Ca, USA, za eksperimente sa psorijazom.

Antitelo 146B7 (šarža broj 15-00RDJVV07), Medarex Inc., Milpitas, Ca, USA, za eksperimente sa reumatoidnim artritisom.

Blokiranje IL- 15 u SCID miševima - himere humanog sinovijalnog tkiva

Uzorci svežeg sinovijalnog tkiva se dobiju od pacijenata sa juvenilnim artritisom, posle hirurške zamene zgloba. Uzorci se sakupe pod sterilnim uslovima. Fragmenti samlevenog tkiva iz celog uzorka sinovijalnog tkiva, dobro se pomnešaju da se obezbedi homogenost svakog preparata. Mlevena tkiva (2-4 grafta po životinji; 100 mg po jednom mestu) se potkožno ugraftuju u leđa SCID/NOD miševa (Jackson Laboratories). Svaka životinja primi 146B7 (500 pg, i.p.) ili PBS, na dan implantacije grafta, i u sledeće dane posle implantacije: 7, 14 i 21. Životinje se žrtvuju 28. dana posle implantacije. Iseku se sinovijalni graftovi i stave u formalin zbog H&E bojenja.

Kvantitativno određivanje H& E bojenja tkiva himera SCID miš- humano

sinovijalno tkivo ( modifikovan postupak Lehr- a et al, iz J. Histochem. Cytochem.

1997, 45, 1559)

Posle dobijanja digitalnih likova (2600*2060, jpg) isečaka dobijenih iz himera SCID miš-humano sinovijalno tkivo, korišćenjem objektiva Y10 (Zeiss mikroskop; softver Axiovision), podaci se analiziraju kompjuterom, korišćenjem Photoshop. Version 6.9 (Adobe Svstems, Mountain View, CA), pa se redukuju na 1300*1300 piksela.

Unutar svake sekcije odabere se šest polja X10, tako da najbolje odražavaju ukupno obojenje tkiva na ćelom slajdu. Posle selekcije svih obojenih jezgara (čarobni štapić na tamnom nukleusu, sa tolerancijom 10), generiše se grafik optičke gustine odabranih površina, pa se registruje srednji intenzitet obojenja (posle izbora komande similar/image histogram). Posle toga, odabere se pozadina, a obojenje kvantitativno odredi (čarobni štapić na osnovi, sa tolerancijom 10). Izračuna se intenzitet obojenja kao razlika između bojenja jezgra i bojenja osnove. Ovo označava citohemijski indeks, u artibramim jedinicama. Podaci su pokazani kao srednja vrednost i s.e.m.. Podaci se analiziraju Student-ovim testom.

Blokiranje IL- 15 u himerama miševi SCID - humano psorijatično tkivo

Biopsije keratoma, dobijene iz psorijatičnog piaka dva pacijenta, se podele pa transplantiraju u miševe C.B.-17 SCID (Jacskon Laboratories). Tri nedelje posle transplantacije miševi dobiju PBS (placebo), CsA (ciklosporin A) (Sandoz), sa dozom 10 mg/kg svakog drugog dana, tokom 15 dana, ili 146B7, sa dozom 20 mg/kg 1. dana, a 10 mg/kg 8. i 15. dana. Nedelju dana posle poslednje injekcije miševi se žrtvuju, a iz svakog ksenografta se uzme biopsija sa probojcem od 4 mm. Ove biopsije se fiksiraju u formalinu, za oblaganje parafinom i bojenje sa H&E i antigenom jezgra Ki-67.

Kvantitativno određivanje imunohistohemijskog obojenja tkiva himera miš SCID -

humano psorijatično tkivo.

Isečci obojeni sa H&E se vrednuju u pogledu debljine epiderma (pm), stepena parakeratoze (ocene od 0-3) i broja inflamatomih mononukleamih ćelija u gornjem delu kože. Isečci obojeni sa Ki-67 se vrednuju brojem keratinocit/mm<2>u cirkulamom isečku. Izračunaju se srednje vrednosti za 4 miša u svakoj tretiranoj grupi, a podaci za svakog pacijenta se zbirno predstavljaju kao srednja vrednost i s.e.m.

Model SCID/ RA

Mikroskopsko pregledanje isečaka pokazuje da tamno obojena jezgra pripadaju infiltriranim ćelijama. Stoga, broj ovih jezgara (meren kao relativna površina) smatra se merom infiltracije. Injektiranje 146B7 smanjuje broj infiltriranih ćelija u zapaljeno sinovijalno tkivo, u poređenju sa tretmanom sa tečnim nosačem (Slika 15a, p<0,05). Slika 15b ilustruje efekte 146B7 na infiltraciju ćelija u ksenograft sinovijalnog tkiva, i pokazuje smanjene broja ćelija sa tamnim jezgrima, u poređenju sa tretmanom sa tečnim nosačem.

Model SCID/ psorijaza

Slika 16 pokazuje miševe SCID/psorijaza, tretirane sa 146B7 ili sa kontrolom. U poređeju sa tečnim nosačem, PBS, injekcije 146B7 smanjuju jačinu psorijaze, vrednovano debljinom epiderma od stratum comeum-a do početka naborane ivice (Slika 16A)): PBS (177,8±42,2 pm), CsA (91 ±15,2 Qm), 146B7 (62,5±9,1 pm). Smanjenje debljine opaženo je takođe i kada je mereno od stratum someum-a do najdubljeg dela naboranih ivica (Slika 16B): PBS (433,8±32,1 pm), CsA (303,8±62,9 pm) i 146B7 (208±33,8 pm). Takođe, pomoću 146B7 smanjen je i stepen parakeratoze (Slika 16C): PBS (1,6±0,4), CsA (1,3±0,3), 146B7 (0,5±0,3). Pored toga, 146B7 smanjuje broj inflamatomih mononukleamih ćelija u gornjem delu kože (Slika 16D): PBS (33,3±1,9 mononukleamih ćelija), CsA (19,4±8,5, i 146B7 (16,4±0,1). Izlučivanje humanog proteina Ki-67 je strogo povezano sa proliferacijom ćelije. Za vreme međufaze, antigen se može detektovati isključivo unutar jezgra, dok kod mitoze većina ovog proteina se premešta na površinu hromozoma. Činjenica da je protein Ki-67 prisutan tokom svih aktivnih faza ćelijskog ciklusa (G(1), S, G(2) i mitoza), ali je odsutan iz ostalih ćelija (G(0)), predstavlja odličan marker za određivanje tako-zvanog udela frakcije rasta date populacije ćelija. Pokazalo se da 146B7 smanjuje broj Ki-67+ cirkulami keratinociti (Slika 16E): PBS (247,9±24,1), CsA (116,0±24,1), 146B7 (73,8±9,9).

Tretman sa 146B7 inhibira infiltraciju inflamatomih ćelija u zapaljeno tkivo na modelima humani SCID, za reumatoidni artritis. Pored toga, kod SCID miševa sa ugraftovanih humanim psorijatičnim plakom, tretman sa 146B7 smanjuje jačinu psorijaze, poredeći sa tretmanom sa CsA. Zaista, tretman sa 146B7 dovodi do bitnog smanjenja inflamacije, debljine epiderma, broja izdeljenih keratinocita i jačine parakeratoze kod humano/CSID miševi.

Primer 12. Humano anti- IL- 15 antitelo 146B7 prepoznaje IL- 15 vezan za

receptor

Test jedinjenja

hlgG1 - humano kontrolno antitelo (Sigma).

Antitelo 146B7 - Medarex Inc., MDX015.

Raji ćelije, sa konstituitivnim izlučivanjem IL-15Ra (Martin Glennie, Tenovus Research Laboratorv, Southhampton General Hospital, Southhampton, Vel. Britanija).

Biotinilovanje 146B7 i humanog IgG

N-hidroksisukcinimido-biotin (Sigma) prvo se razblaži u DMSO (konačno razblaženje: 100 mg/mL), a zatim 0,1 M NaHC03(konačno razblaženje: 1 mg/mL, Sigma). Na 1 mg antitela (razblaženog u 1 mL), doda se 600 pL rastvora biotina (mrak, 2 h, ST). Rastvor antitelo-biotin se dijalizuje u kaseti za dijalizu sa slide-a-analyzer<®->om (10.000 MWCO, Pierce, Perbio Science, Holandija) (preko noći, na 4°C), da bi se uklonio neobeleženi biotin. Sledećeg dana odredi se koncentracija biotinilizovanog antitela pomoću spektrometrije (Ultrospec 2100pro), kao OD na 280 nm.

Vezivanje 146B7 u kompleks IL- 15- IL- 15Ra, pomoću ELISA

Posle oblaganja (preko noći, sobna temperatura) mikrotitarskih ploča sa ravnim dnom (Greiner) sa IL-1Ra(R&D Svstems, Minneapolis, MN, USA), ploče se inkubiraju sa PBS i pilećim serumom (2%, ST, 60 min). Posle pranja u PBS (+ 0,05% Tween 20: PBST), ploče se inkubiraju sa nekoliko puta razblaženim neobeleženim IL-15 (50 pL, ST, lmmunex, Seattle, USA). Posle 10 min, u bazenčiće se dodaju biotinilizovana antitela (50 pL) u različitim koncentracijama (90 min, na sobnoj temperaturi). Posle pranja u PBST ploče se inkubiraju 60 min, sobna temperatura) sa streptavidin-poliperoksidazom rena (CLB, Amsterdam, Holandija), razblaženim 1:10.000 u PBST-C(PBST i 2% pilećeg seuma). Na kraju, ploče se operu i zatim inkubiraju sa ABTS (azinobis-3-etilbenztiazolin-sulfonska kiselina, Roche Department, Manneheim, Nemačka) u puferu ABTS, u skladu sa protokolom proizvođača. Bojena reakcija se zaustavi sa 2% oksalnom kiselinom (50 pL). Vezivanje se vrednuje na 405 nm, na čitaču ELISA EL808 (BioTek Instruments, VVinooski, VT, USA).

Vezivanje146B7 za kompleks IL- 15- IL- 15R u Raji ćelijama

Raji ćelije se prethodno inkubiraju (20 min, 4°C) sa 10% humanim skupljenim AB serumom (CLB, Amsterdam, Holandija) u puferu FACS (PBS, 0,05% BSA, 0,02% NaN03). Raji ćelije [(1-2)*10<5>ćelija/mL] se stave u bazenčiće, pa se doda 50 pL neobeleženog IL-15 u nekoliko koncentracija (razblaženog u puferu FACS sa 10% humanogAB seruma). Posle 30 min inkubacije (4°C) i pranja dva puta u puferu FACS, doda se 50 pL biotinilovanih antitela (146B7 ili hlgH1) u bazenčiće (30 min, 4°C). Posle pranja dva puta u puferu FACS, u svaki bazenčić se doda 50 pL streptavidin-ficoeritrina (30 min, 4°C). Posle dva puta pranja u puferu FACS, ćelije se razmute u 200 mL pufera FACS, pa se određuje intenzitet frluorescencije za najmanje 5000 ćelija po uzorku, posle analize protočnom citometrijom (FACS Calibur, Becton Dickinson), koristeć softver CellQuest. Podaci daju indeks stimulacije (S.l.) koji se računa kao što sledi: S.l. = (srednja fluorescencija pozitivnog obojenja) / (srednja fluorescencija osnovnog obojenja).

ELISA

Vezivanje 146B7 za IL-15R kompleks, pomoću ELISA, prikazano je na Slici 19. Vezivanje 146B7 raste sa porastom koncentracije vezivanja IL-15 za njegov receptor. Nisu opaženi efekti vezivanja kontrolnog antitela za IL-15 ili za IL-15R.

Vezivanje za Raji ćelije koje izlučuju IL- 15R

Vezivanje 146B7 za kompleks IL-15 / IL-15R je pokazano na Slici 20. 146B7 se vezuje za kompleks IL-15 / IL-15R na način zavisan od doze. Nije opaženo vezivanje hlgG1 za kompleks IL-15 / IL-15R u Raji ćelijama (Slika 20).

146B7 je u stanju da se vezuje za IL-15, posle vezivanja ovog citokina za njegov receptor. 146B7 se vezuje za epitop IL-15, koji ne učestvuje u vezivanju za njegov receptor.

Literatura

Bathon J.M., Martin, R.W., Fleishmann R.M., Tesser J. R., Schiff M.H., Keystone E.C., Genovese M.C., VVasko M.C., Moreland, L.W., VVeaver A.L., Markenson J. i Finck B.K., "A Comparison if Etanercept and Methotrexate in Patients with Eariy Rheumatoid Arthritis", uN. Eng. J. Med.2000, 343. 1586-93.

Fehniger T.A. i Caligiuri M.A:, "Interleukin 15: Biology and Relevance to Human Disease",u Blood,2001, 97, 14-28.

Fishvvild D.M., O'Donell S.L., Bengoechea T., Hudson D.V., Harding F., Bemhard S.L., Jones D., Kay R.M., Higgins K.M., Schramm S.R. i Lonberg N., "High-avidity Human IgGk Monoclonal Antibodies from a Novel Strain of Minilocus Transgenic Mice", uNature Biochem.1996,14, 845-51

Gillis S., Ferm M.M., Ou W. i Smith K.A., "T-cell Growth Factor Parameters of Production and Quantitative Microassay for Activity", uJ. Immunol.1978,120, 2027-32.

Kennedy M.K., et al., "Reversible Deffects in Natural Killer and Memory CD8 T Cell Lineages in IL-15 Deficient Mice", uJ. Exp. Med.2000, 191, 771-80.

Kirman I., Vainer B. i Nielsen O.H., "lnterieukin-15 and its Role in Chronic lnflamatory Diseases", uInflam. Res.1998, 47, 285-9.

Kippel J.H., "Biologic Therapy for Rheumatoid Arthritis", uN Eng. J. Med.2000, 343, 1640-1.

Kdhler G. i Milstein C, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificrty", uNature,1975, 256, 495-7.

Liu C.C., Perussia B. i Young J.D., "The Emerging Role of IL-15 in NK-cell Developmenf, uImmunol. Today,2000, 21, 113-6.

Lovell D.J., Giannini E.H., Reiff, A., Cawkwell G.D., Silverman E.D., Nocton J.J., Stein, L.D., Gedalia A., llowite N.T., VVallace C.A., VVhitmore J. i Finck, B.K., "Etanercept in Children with Polvarticular Juvenile Rheumatoid Arthritis. Pediatric Rheumatology Collaborative Study Group", uN. Eng. J. Med.2000, 342, 763-9.

Maini R.N. i Taylor P C:, "Anti-cytokine Therapy for Rheumatoid Arthritis", uAnnu. Rev. Med.2000, 61, 207-29.

Mclnnes I.B., al-Mughales J., Field M., Leung, B.P., Huang, F.P., Dbcon R., Sturrock R.D., Vvllkinson P.C. i Liew F.Y., "The Role of lnterleuktn-15 in T-cell Migration and Activation in Rheumatoid Arthritis", uNat. Med.1996, 2,175-82.

Mclnnes I.B., Leung, B.P., Sturrock R.D., Field M. i Liew F.Y., "Interleukin-15 Mediates T Cell-dependent Regulation of Tumor Necrosis Factor-alpha Production in Rheumatoid Arthritis", uNat. Met.1997, 3, 189-95.

Mclnnes I.B., i Liew F.Y., "Interleukin 15: a Proinflammaton/Role in Rheumatoid Arthritis Svnovitis", uImmunol. Today,1998,19, 75-9.

Oppenheimer-Marks, etal.,J. Clin. Investig.1997,101, 1261-72.

Pettit D.K., BonnertT.P., Eisenman J., Srinivasan S., Paxton R., Beers C, Lynch D., Miller B., Yost J., Grabstein K.H. i Gombotz W.R., "Structure Function Studies of Interleukin 15 Using Site-specific Mutagenesis, Polyethylene Glycol Conjugation, and Homology Modeling", uJ. Biol. Chem.1997, 272, 2312-8.

Ruchatz, et al.,J. Immunol.1998,160, 5654-60.

VValdmann T., Tagaya Y. i Bamford R., "lnterleukin-2, lnterieukin-15, and Their Receptor", uInt. Rev. Immunolo.,1998, 16, 205-26.

VValdmann T.A., Dubois S. i Tagaya Y., "Contrasting Roles of IL-12 and IL-15 in the Life and Death of Lymphocytes. Implication for lmmunotherapy", ulmmunity,2001,14.105-110.

VValdmann T.A. i Tagaya Y., "The Multifaceted Regulation of Interleukin-15 Exprešsion and the Role of this Cythokine in NK Seli Differentiation and Host Response to Intercellular Pathogens", uAnnu. Rev. Immunol., 1999,17, 19-49.

Ekvivalenti

Oni koji su verzirani u stanje tehnike shvataju da je moguće obezbediti, ne koristeći više od rutinskog eksperimentisanja, dobijanje mnogih ekvivalenata specifičnih realizacija ovog pronalaska koje su ovde opisane. Namera je da i ti ekvivalenti budu obuhvaćeni patentnim zahtevima koji slede. Bilo koja kombinacija realizacija opisane ovde u zavisnim patentnim zahtevima podrzaumeva se da je unutar obima ovog pronalaska.

Ukiučivanie kroz citat

Sve ovde citirane publikacije, patenti i priključene patentne prijave, u celini su uključeni kroz citat.

Claims

1. Izolovano humano monoklonalno antitelo koje se vezuje za humani IL-15, koje sadrži varjabilne region humanog teškog lanca koji obuhvataju CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence i varjabilne region humanog lakog lanca koji obuhvataju CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, naznačeno time, što a) CDR3 sekvenca varjabilnog regiona humanog teškog lanca obuhvata CDR3 amino kiselinsku sekevncu prikazanu na slici 2 (SEQ ID NO:2) i sekvenca CDR3 varjabilnog regiona lakog lanca obuhvata CDR3 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 3 (SEQ ID NO:4); b) CDR2 sekvenca varjabilnog regiona humanog teškog lanca obuhvata CDR2 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 2 (SEQ ID NO:2) i CDR2 sekvenca varjabilnog regiona humanog lakog lanca obuhvata CDR2 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 3 (SEQ ID NO:4); i c) CDR1 sekvenca varjabilnog regiona humanog teškog lanca obuhvata CDR1 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 2 (SEQ ID NO: 2) i CDR1 sekvenca humanog lakog lanca obuhvata CDR1 amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 3 (SEQ ID NO: 4).

2. Antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time, što sadrži varjabilne regione humanog teškog i lakog lanca koji obuhvataju amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 2 (SEQ ID NO:2) i na slici 3 (SEQ ID NO:4), respektivno.

3. Antitelo prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što je kodirano sa humanim teškim IgG lancem i humanim lakim kapa lancem nukleinskih kiselina, koje u njihovim varijabilnim regionima sadrže nukleotidne sekvence prikazane na slici 2 (SEQ ID NO: 1) i slici 3 (SEQ ID NO: 3), respektivno.

4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što je antitelo u stanju da a) inhibira proinflamatorne efekte indukovane sa IL-15; b) inhibira stvaranje TNFa i proliferaciju T ćelija indukovanu sa IL-15; c) inhibira proliferaciju T ćelija indukovanu sa IL-15, sa vrednošću IC5omanjom od približno 100 nM, određenom u testu inhibicije proliferacije; d) inhibira proliferaciju T ćelija indukovanu sa IL-15, sa vrednošću IC5omanjom od približno 10 nM, određenom u testu inhibicije proliferacije; e) vezuje humani IL-15 sa ravnotežnom konstantnom disocijacije (Kd) ispod 10"<7>M, određenom tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (SPR), koristeći rekombinantni humani IL-15 kao analit, a antitelo kao ligand; ili f) vezuje za epitop, lociran na domenu humanog IL-15 koji intereaguje sap-lancem ili y-lancem.

5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se antitelo vezuje epitop lociran na y-lancu domena za interakciju humanog IL-15.

6. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što antitelo interferira sa vezivanjem Asp<8>u humanom IL-15 za p-jedinicu receptora humanog IL-15, ili vezivanjem Gln<108>u humanom IL-15 za y-jedinicu receptora humanog IL-15.

7. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što antitelo vezuje humani IL-15 receptor koji je već vezan za IL-15 receptor.

8. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što se to antitelo bira iz grupe koju čine lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgAsec, IgD i IgE antitelo.

9. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što sadrži teški lgG1 lanac.

10. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što antitelo predstavlja fragment ili jednolančano antitelo.

11. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što predstavlja celo antitelo.

12. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time, što je dobijeno iz hibridome koja sadrži B ćeliju dobijenu iz transgene ne-humane životinje koja ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca, spojene sa imortalizovanom ćelijom, gde transgeni humani teški lanac i laki lanac kodiraju teški i laki lanac antitela, respektivno.

13.In vitropostupak za inhibiciju indukovanu sa IL-15, ali ne sa IL-2, stvaranja TNFa u T ćelijama ili monocitima, naznačen time, što obuhvata dovođenje u kontakt IL-15 sa antitelom prema bilo kom od prethodnih zahteva.

14.In vitropostupak za inhibiciju indukovanu sa IL-15, ali ne sa IL-2, proliferacije T ćelija, naznačen time, što obuhvata dovođenje u kontakt IL-15 u prisustvu pomenutih T ćelija sa antitelom prema bilo kom od prethodnih zahteva 1-12.

15.In vitropostupak prema patentom zahtevu 14, naznačen time, što su T ćelije mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC) ili CTLL-2 ćelije.

16. Hibridoma koja sadrži B ćeliju dobijenu iz transgene ne-humane životinje koja ima genom koji se sastoji od transgena humanog teškog lanca i transgena lakog lanca, spojenih za imortalizovanu ćeliju, naznačena time, što ta hibridoma stvara antitelo prema bilo kom od zahteva 1-12 i gde transgeni humanog teškog i lakog lanca kodiraju težak lanac i laki lanac antitela, respektivno.

17. Hibridoma prema zahtevu 16,naznačenatime, što stvara humano monoklonalno antitelo kodirano sa humanim teškim IgG lancem i humanim lakim kapa lancem nukleinskih kiselina.

18. Hibridoma koja proizvodi antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, kodirano sa humanim teškim IgG lancem i humanim lakim kapa lancem nukleinskih kiselina,naznačena time,što u varijabilnim regionima sadrže sekvencije nukleotida prikazane na slici 2 (SEQ ID NO: 1) i na slici 3 (SEQ ID NO: 3), respektivno.

19. Hibridoma koja proizvodi antitelo prema bilo kom od zahteva 1-12 koja ima varijabilne regione humanog teškog IgG lanca i lakog kapa lanca,naznačenatime, što sadrži sekvence aminokiselina prikazane na slici 2 (SEQ ID NO: 2) i na slici 3 (SEQ ID NO: 4), respektivno.

20. Humano antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva 1-12, koje stvara transfektoma,naznačena time,što sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju humani teški lanac i humani laki lanac.

21. Transfektoma koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju humani teški lanac i humani laki lanac,naznačenatime, što transfektoma stvara detektabilnu količinu antitela prema bilo kom od zahteva 1-12.

22. Transfektoma prema Zahtevu 21, koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju humani teški lanac i humani laki lanac,naznačenatime, što u njihovim varijabilnim regionima sadrže sekvencije nukleotida prikazane kao SEQ ID NO: 1 i sa SEQ ID NO: 3.

23. Transgena ne-humana životinja koja eksprimira antitelo prema bilo kom od zahteva 1-12,naznačena time,što ta transgena ne-humana životinja ima genom koji se sastoji od humanog teškog lanca transgena i humanog lakog lanca transgena, što humani teški i laki lanac transgena kodiraju teške i lake lance antitela, respektivno.

24. Postupak za dobijanje antitela prema bilo kom od zahteva 1-12, naznačen time, što se sastoji od: - imunizovanja transgene ne-humane životinje koja ima genom koji se sastoji od transgena humanog teškog lanca i transgena humanog lakog lanca, sa humanim IL-15, ili sa ćelijama koje i eksprimiraju humani IL-15, kao što su antitela stvorena u B ćelijama takve životinje i gde transgeni humanog teškog i lakog lanca kodiraju teške i lake lance antitela, respektivno; - izolovanja B ćelija te životinje; - fuzionisanja tih B ćelija sa ćelijama mijeloma da nastanu imortalizovane ćelije hibridoma koje izlučuju humana monoklonalna antitela specifična za IL-15; i - izolovanja humanih monoklonalnih antitela specifičnih za IL-15, iz gornjeg bistrog sloja kulture ove hibridome.

25. Imunokonjugat, naznačen time, što sadrži antitelo prema bilo kom od zaheva 1-12 i neki terapeutski agens.

26. Imunokonjugat prema zahtevu 25, naznačen time, što je terapeutski agens imunosupresivni agens.

27. Imunokonjugat prema zahtevu 25, naznačentime,što je terapeutski agens anti-inflamatomi agens koji se bira iz grupe koju čine steroidni anti-inflamatomi agens, ne-steroidni anti-inflamatomi agens i DMARD.

28. Imunokonjugat prema Zahtevu 25, naznačen time, što je terapeutski agens citotoksični agens.

29. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži antitelo prema ma kom zahtevu od 1-12 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

30. Kompozicija prema zahtevu 29, naznačena time, što sadrži još i neki terapeutski agens.

31. Kompozicija prema zahtevu 30, naznačena time, što je taj agens neki imunosupresivni agens.

32. Kompozicija prema zahtevu 31, naznačena time, što je taj imunosupresivni agens ciklosporin.

33. Kompozicija prema zahtevu 30, naznačena time, što je taj agens anti-inflamatomi agens koji se bira iz grupe koju čine neki steroidni anti-inflamatomi agens i neki ne-steroidni anti-inflamatomi agens.

34. Kompozicija prema zahtevu 30, naznačena time, što je je taj agens DMARD, koji se bira iz grupe koju čine metotreksat, etanercept i infliksimab.

35. Kompozicija prema zahtevu 30, naznačena time, što je taj agens hemoterapeutski agens koji se bira iz grupe koju čine doksorubicin, cisplatin, bleomicin, carmustin, ciklofosfamid i hlorambucil.

36. Kompozicija prema zahtevu 30, naznačena time, što je taj agens neki agens za tretiranje psorijaze.

37. Kompozicija prema zahtevu 30, naznačena time, što je taj agens neko antitelo.

38. Kompozicija prema zahtevu 37, naznačena time, što se antitelo bira iz grupe koju čine antitelo specifično za CD4 i antitelo specifično za IL-2.

39. Upotreba efikasne količine antitela prema bilo kom od zahteva 1-12 u postupku dobijanja leka za tretiranje ili prevenciju poremećaja posredovanog sa humanim IL-15, gde se taj poremećaj bira iz grupe koju čine psorijaza, artritis, inflamatorna bolest creva, kancer, odbacivanje transplantata i infektivna bolest.

40. Upotreba prema zahtevu 39, naznačena time, što artritis predstavlja reumatoidni artritis.

41. Upotreba prema zahtevu 39, naznačena time, što se sastoji još od istovremenog ordiniranja nekog terapeutskog agensa.

42. Upotreba prema zahtevu 41, naznačena time, što je taj agens imunosupresivni agens.

43. Upotreba prema zahtevu 42, naznačena time, što je taj imunosupresivni agens ciklosporin.

44. Upotreba prema zahtevu 41, naznačena time, što je taj agens anti-inflamatorni agens koji se bira iz grupe koju čine neki steroidni anti-inflamatorni agens i neki ne-steroidni anti-inflamatorni agens.

45. Upotreba prema zahtevu 41, naznačena time, što se agens DMARD bira iz grupe koju čine metotreksat, etanercept i infliksimab.

46. Upotreba prema zahtevu 41, naznačena time, što je taj agens hemoterapeutski agens koji se bira iz grupe koju čine doksorubicin, cisplatin, bleomicin, carmustin, ciklofosfamid i hlorambucil.

47. Upotreba prema zahtevu 41, naznačena time, što je taj agens neki agens za tretiranje psorijaze.

48. Upotreba prema zahtevu 41, naznačena time, što je taj agens neko antitelo.

49. Upotreba prema zahtevu 48, naznačena time, što se antitelo bira iz grupe koju čine antitelo specifično za CD4 i antitelo specifično za IL-2.

50. Upotreba antitela prema ma kojem zahtevu 1-12 u postupku dobijanja leka za tretiranje ili prevenciju psorijaze.

51. Upotreba prema zahtevu 50, naznačena time, što antitelo inhibira sposobnost IL-15 da indukuje parakeratozu.

52. Upotreba prema zahtevu 50, naznačena time, što antitelo inhibira sposobnost IL-15 da indukuje debljanje epiderma.

53. Upotreba prema Zahtevu 50, naznačena time, što to antitelo inhibira sposobnost IL-15 da indukuje proliferaciju keratinocita.

54. Upotreba antitela prema ma kojem zahtevu 1-12 u postupku dobijanja leka za tretiranje ili prevenciju reumatoidnog artritisa.

55. Upotreba prema zahtevu 54, naznačena time, što antitelo inhibira sposobnost IL-15 da indukuje hemotaksiju aktiviranih leukocita.

56.In vitropostupak za diagnoziranje bolesti posredovane sa IL-15, detekcijom prisustva antigena IL-15, ili ćelija koje eksprimuju IL-15 u uzorku, naznačen time, što obuhvata - dovođenje u kontakt uzorka i kontrolnog uzoraka sa humanim antitelom prema bilo kom od zahteva 1-12, pod uslovima koji dozvoljavaju stvaranje kompleksa između antitela, ili njegovog dela, i IL-15; i - detektovanje stvaranja kompleksa, gde je razlika u stvaranju kompleksa između uzorka, u poređenju sa kontrolnim uzorkom, indikativna za prisustvo IL-15 u uzorku.

57. Izolovna nukleinska kiselina, koja što sadrži sekvenciju nukleotida koja kodira varijabilni region antitela prema bilo kom od zahteva 1-12, naznačena time, što se sekvencija nukleotida bira iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 3.

58. Ekspresioni vektor, naznačen time, što sadrži sekvenciju nukleotida prema zahtevu 57.

59. Ekspresioni vektor, koji sadrži sekvenciju nukleotida koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca antitela prema bilo kom od zahteva 1-12, naznačen time, što sadrži aminokiselinske sekvencije prikazane u SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4, respektivno.

60. Transfektoma, naznačena time, što sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu 59.