RS52904B - Mikrornk (mirnk) mir-21 za dijagnozu i terapeutske svrhe - Google Patents

Abstract

Jedinjenje, naznačeno time, da sadrži modifikovani oligonukleotid koji obuhvata 12 do 30 spojenih nukleozida, pri čemu modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miR-21 ili njenim prekursorom, za upotrebu u tretmanu, prevenciji ili dijagnozi fibroze u nekom subjektu.Prijava sadrži još 14 patentnih zahteva.

Description

POLJE PRONALASKA

[0001]Ovaj pronalazak se odnosi na polje mikroRNK (miRNK), a posebno miR-21 i njene nizvodne mete za dijagnozu, prevenciju i/ili terapiju fibroze i drugih bolesti. Ovaj pronalazak se dodatno odnosi na kompozicije, postupke i upotrebe za tretman fibroze. Takvi postupci obuhvataju moduliranje i inhibiranje delovanja miRNK u subjektu koji ima fibrozu.

POZADINA PRONALASKA

[0002]MikroRNK molekuli su široka klasa malih ne-kodirajućih RNK koji kontrolišu različite biološke procese uključujući glavne signalne puteve uz pomoć regulisanja ekspresije komplementarnih mRNK meta (Ambros, 2004). Narušena regulacija mikroRNK u brojnim bolestima je uzrokovana uz pomoć alteracija u genomu (Mi et al., 2007), diferencijalne ekspresije ili viralnih infekcija koji u nekim slučajevima menjaju mikroRNK funkciju u tumor supresorima ili onkogenima. MikroRNK su nedavno povezane sa regulisanjem različitih srčanih funkcija u serijama elegantnih genetičkih studija (Care et al., 2007; Yang et al, 2007). Cheng et al. Pokazuju da moduliranje miR-21 ekspresije prekoantisense-potpomognutim iscrpljivanjem ima značajno negativan efekat na kardiomiocitnu hipertrofiju (American Journal of Pathologv, vol. 170, str. 1831-1840). Tatsuguchi et al. pokazuju inhibiciju endogenog miR-21 ili miR-18b povećava hipertrofički rast (Journkl of Molecular and Cellular Cardiologv, vol. 42, str. 1137-1141). Mada ove studije pomažu da se razotkriju uloge mikroRNK u fiziologiji srca, rastu i morfogenezi, detaljni molekularni mehanizmi za mikroRNK u putevima bolestiin vivosu slabo poznati. Jedno-lančani oligonukleotidni mikroRNK antagonisti mogu da utišaju endogene mikroRNKin vitroiin vivorezultirajući efektima na mRNK meti i na nivou belančevina i metabolizma (Kruetzfeldt et al., 2005; Esau et al, 2006). Ovi nalazi su usmereni ka aplikaciji mikroRNK antagonista zain vivovalidaciju mikroRNK funkcije i, možda još važnije, ka novom terapeutskom pristupu.

KRATKI SADRŽAJ

[0003]Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida, pri čemu pomenuti modifikovani oligonukleotid poseduje nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miR-21 ili sa njenim prekursorom, za upotrebu u tretmanu, prevenciji ili dijagnozi fibroze u nekom subjektu.

[0004]Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida, dok pomenuta nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miR-21 ili sa njegovim prekursorom, za upotrebu u tretmanu fibroproliferativnog poremećaja.

[0005]Ovaj pronalazak takođe obezbeđujein vitropostupak za dijagnostiku fibroze koji se sastoji od sledećih koraka: a. obezbeđivanje primerka koji je uzet od pacijenta za kojeg se pretpostavlja da pati od fibroze;

b. merenje ekspresije miR-21;

pri čemu povećani nivo miR-21 upoređeno sa kontrolnim primerkom pokazuje fibrozu ili predispoziciju za nju.

[0006]Ovaj pronalazak takođe obezbeđujein vitropostupak za pretraživanje farmaceutski aktivnog jedinjenja za tretman i/ili prevenciju fibroze ili predispozicije na nju, koji obuhvata korake: a. obezbeđivanja primerka koji sadrži miR-21; b. dovođenja u kontakt supstancije-kandidata sa primerkom; c. određivanje efekta supstancije-kandidata na primerku;

pri čemu promena miR-21 pokazuje farmaceutski aktivno jedinjenje.

[0007]Ovo razotkrivanje se odnosi na promotorski region iz mikroRNK, na upotrebu mikroRNK, posebno miR-21, i na slične elemente za dijagnozu i za proizvodnju leka za tretman i/ili prevenciju fibroze i/ili bolesti koja je povezana sa fibrozom. Dodatno, ovo razotkrivanje se odnosi na brojne anft'.sms'e-oligonukleotide protiv miR-21 meta. Ćelija koja je dificijentna na miR-21, promotorski region i miR-21 mete i njihov nokaut-organizam su takođe obuhvaćeni. Konačno, razotkrivanje je usmereno na postupak za dijagnozu fibroze i/iii bolesti koje su povezane sa fibrozom i na postupak za pretragu farmaceutski aktivnog jedinjenja za tretman fibroze i/ili bolesti koje su povezane sa fibrozom.

[0008] Ovde su obezbeđeni i postupci za tretman fibroze, koji obuhvataju davanje subjektu koji ima ili se sumnja da ima fibrozu jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna na miRNK.

[0009] Ovde su obezbeđeni postupci koji obuhvataju identifikovanje subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu; i administriranje pomenutom subjektu jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida, gde pomenuta nukleobazna sekvenca iz pomenutih modifikovanih oligonukleotida je komplementarna sa miRNK ili njenim prekursorom.

[0010] Ovde su obezbeđeni postupci koji obuhvataju administriranje subjektu koji pokazuje rizik da razvije fibrozu jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa njenim prekursorom, čime se sprečava fibroza. U nekim izvedbama, pomenuta fibroza je fibroza jetra. U nekim izvedbama, pomenuta fibroza je fibroza pluća. U nekim izvedbama, pomenuta fibroza je fibroza kože. U nekim izvedbama, pomenuta fibroza je staračka fibroza. U nekim izvedbama, pomenuta fibroza je srčana fibroza. U nekim izvedbama, pomenuta fibroza je fibroza bubrega. U nekim izvedbama, pomenuta fibroza je fibroza slezine.

[0011] Ovde su obezbeđeni postupci koji obuhvataju administriranje subjektu koji ima ili se sumnja da ima fibrozu jedinjenje koje obuhvata modifikovane oligonukleotide koji se sastoje od 12 do 30 spojenih nukleozida i imaju nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa njenim prekursorom, gde pomenuti subjekt ima najmanje jednu srčanu bolest ili stanje.

[0012] Ovde su obezbeđeni postupci koji obuhvataju identifikovanje subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu, pri čemu pomenuti subjekt ima najmanje jedni srčanu bolest ili stanje; i administriranje subjektu jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji obuhvata 12 do 30 spojenih nukleozida, pri čemu nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miRNK ili sa njenim prekursorom.

[0013] U jednoj izvedbi, srčana bolest ili stanje je izabrano iz grupe koja obuhvata srčanu hipertrofiju, hipertenzivni kvar srca, dijastolički kvar srca, sistolički kvar srca, glikogenozu (bolest skladištenja povezana sa srcem), kardiomiopatiju, konstruktivni perikarditis, bolest koronarnih arterija, akutnu miokardijalnu infarkciju, hroničnu miokardijalnu infarkciju, kvar desnog srca, srčane aritmije, fibrozu povezanu sa miokardom i bolest srčanih zalistaka. U jednoj izvedbi, kardiomiopatija je izabrana iz grupe koja obuhvata dilatativnu kardiomiopatiju, hipertrofičku kardiomiopatiju sa opstrukcijom, hipertrofičku kardiomiopatiju bez opstrukcije, restriktivnu kardiomiopatiju, aritmogenu kardiomiopatiju desnog ventrikula i dijabetsku kardiomiopatiju.

[0014] U jednoj izvedbi, bolest srčanih zalistaka je izabrana iz grupe koja obuhvata stenozu mitralnih zalistaka, stenozu zalistaka aorte, stenozu trikuspidalnih zalistaka i stenozu plućnih zalistaka.

[0015] U jednoj izvedbi, bolest srčanih zalistaka je izabrana iz grupe koja obuhvata insuficijenciju mitralnih zalistaka, insuficijenciju zalistaka aorte, insuficijenciju trikuspidalnih zalistaka i insuficijenciju plućnih zalistaka.

[0016J U jednoj izvedbi, ovde obezbeđeni postupci dodatno obuhvataju administriranje jednog ili više dodatnih farmaceutskih agenasa.

[0017] U jednoj izvedbi, pomenuto administriranje ublažava porast težine srca, dilataciju levog ventrikula ili oštećenje frakcijskog skraćivanja.

[0018] U jednoj izvedbi, pomenuto administriranje sprečava porast srčane težine, dilatacije levog ventrikula ili oštećenje frakcijskog skraćivanja.

[0019] U jednoj izvedbi, pomenuto administriranje poboljšava srčanu funkciju.

[0020]U jednoj izvedbi, pomenuto administriranje obuhvata intravenoznu administraciju, subkutanu administraciju, intraarterijalnu administraciju ili intrakardijalnu administraciju.

[0021] Ovde su obezbeđeni postupci za tretman fibroze, koji se sastoje od administracije subjektu koji ima ili se sumnja da ima fibrozu jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji sadrži 12 do 30 spojenih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom, gde pomenuti subjekt ima najmanje jednu bolest ili stanje jetra.

[0022] Ovde su obezbeđeni postupci koji obuhvataju identifikovanje subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu, gde pomenuti subjekt ima najmanje jednu bolest ili stanje jetra; i administriranje subjektu neko jedinjenje koje obuhvata modifikovanje oligonukleotida koji sadrži 12 do 30 spojenih nukleozida, gde nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom. U jednoj izvedbi, pomenuta bolest ili stanje jetra je hronična ozleda jetra. U drugoj izvedbi, pomenuta bolest ili stanje jetra je infekcija sa virusom hepatitisa. U jednoj izvedbi, pomenuta infekcija sa hepatitisom je infekcija sa virusom hepatitisa C. U jednoj izvedbi, pomenuta bolest ili stanje jetra je ne-alkoholni steatohepatitis. U jednoj izvedbi, pomenuta administracija obuhvata intravenoznu administraciju ili subkutanu administraciju. U jednoj izvedbi, pomenuta bolest ili stanje jetra je ciroza. U jednoj izvedbi, pomenuta administracija poboljšava funkciju jetra.

[0023] Ovde su obezbeđeni postupci za tretman fibroze, koji obuhvataju administriranje subjektu koji ima ili se sumnja da ima fibrozu neko jedinjenje koji sadrži modifikovani oligonukleotid koji sa sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom, gde pomenuti subjekt ima najmanje jednu bolest ili stanje pluća.

[0024] Ovde su obezbeđeni postupci koji obuhvataju identifikovanje subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu, gde pomenuti subjekt ima najmanje jednu bolest ili stanje pluća; i administriranje subjektu neko jedinjenje koji obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida, gde nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miRNK ili sa jednim prekursorom. U jednoj izvedbi, pomenuta najmanje jedna bolest ili stanje je hronična opstruktivna bolest pluća. U nekim izvedbama, pomenuto administriranje obuhvata pulmonalnu administraciju.

[0025] Ovde su obezbeđeni postupci za tretman fibroze, koji obuhvataju administriranje subjektu koji ima ili se sumnja da ima fibrozu neko jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom, gde pomenuti subjekt ima najmanje jednu drugu bolest ili stanje.

[0026] Ovde su obezbeđeni postupci koji obuhvataju identifikovanje subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu, gde pomenuti subjekt ima najmanje jednu drugu bolest ili stanje; i administriranje pomenutom subjektu neko jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida, gde nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom. U nekim izvedbama, pomenuta najmanje jedna druga bolest ili stanje je plućna hipertenzija. U nekim izvedbama, pomenuta najmanje jedna druga bolest ili stanje je bolest povezana sa krvnim sudovima. U nekim izvedbama, pomenuta bolest povezana sa krvnim sudovima je izabrana iz grupe koja obuhvata arterijsku krutost, medijasklerozu i arteriosklerozu. U drugim izvedbama, pomenuta najmanje jedna druga bolest ili stanje je skleroza creva. U nekim izvedbama, najmanje jedna druga bolest ili stanje je sistemska skleroza. U nekim izvedbama, pomenuta najmanje jedna druga bolest ili stanje je izabrana iz grupe koja obuhvata retroperitonealnu fibrozu, proliferativnu fibrozu, neoplastičnu fibrozu, nefrogenu sistemsku fibrozu, injekcijsku fibrozu, medijastinalnu fibrozu, mijelofibrozu, sindrom post-vazektomijske boli i reumatoidni artritis.

[0027] U nekim izvedbama, administracija ublažava fibrozu. U nekim izvedbama, administracija usporava daljnju progresiju fibroze. U nekim izvedbama, administracija zaustavlja daljnju progresiju fibroze. U nekim izvedbama, administracija redukuje fibrozu. U nekim izvedbama, administracija redukuje sadržaj kolagena.

[0028] Ovde su obezbeđeni postupci za tretman fibroproliferativnog poremećaja koji obuhvataju administriranje subjektu koji ima ili se sumnja da ima fibroproliferativni poremećaj neko jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida, gde nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miRNK ili nekim njenim prekursorom, čime se tretira pomenuti fibroproliferativni poremećaj.

[0029] U nekim izvedbama, administriranje obuhvata intravenoznu administraciju, subkutanu administraciju, plućnu administraciju, intraarterijalnu administraciju ili intrakardijalnu administraciju.

[0030] Ovde su obezbeđeni postupci za inhibiranje fibroblastne proliferacije koji obuhvataju kontaktiranje fibroblasta sa jedinjenjem koje sadrži modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida, gde nukleobazna sekvenca pomenutog modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miRNK ili sa njenim prekursorom, čime se inhibira fibroblastna proliferacija.

[0031] Ovde su obezbeđeni postupci za stimulisanje fibroblastne apoptoze koji obuhvataju kontaktiranje fibroblasta sa nekim jedinjenjem koje sadrži modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida, gde nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotid je komplementarna sa miR-21 ili sa njenim prekursorom, čime se vrši stimulisanje fibroblastne apoptoze.

[0032] Ovde su obezbeđeni postupci za povećavanje količine belančevine Sproutv 1 u fibroblastu koji obuhvataju kontaktiranje fibroblasta sa jedinjenjem koje sadrži modifikovani oligonukleotid koji se sastoji od 12 do 30 spojenih nukleozida, gde nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miRNK ili sa njenim prekursorom, čime se stimuliše ekspresija belančevine Sproutv 1.

[0033J Ovde su obezbeđene kompozicije za inhibiranje MikroRNK. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid je neka nukleobazna sekvenca koja je komplementarna sa nukleobaznom sekvencom koja je najmanje 80% identična sa miR-21 ili sa njenim prekursorom. U nekim izvedbama miR-21 ima nukleobaznu sekvencu koja je označena kao SEQ ID Br: 1. U nekim izvedbama, pomenuti miR-21 prekursor ima nukleobaznu sekvencu koja je označena kao SEQ ID Br: 11.

[0034] U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata od 12 do 30 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 12 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 13 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 14 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata od 15 do 24 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 15 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid sadrži 16 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 17 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 18 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 19 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 20 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 21 spojeni nukleozid. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 22 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 23 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, pomenuti modifikovani oligonukleotid obuhvata 24 spojena nukleozida.

[0035] U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida nema više od dve pogrešno-spojene baze u odnosu na nukleobaznu sekvencu miR-21 ili njenog prekursora. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida nema više od jedne pogrešno-spojene baze u odnosu na nukleobaznu sekvencu miR-21 ili njenog prekursora. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida nema pogrešno-spojenih baza u odnosu na nukleobaznu sekvencu miR-21 ili njenog prekursora.

[0036] U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida obuhvata najmanje 15 kontinuiranih nukleobaza iz nukleobazne sekvence SEQ ID Br: 12. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida obuhvata najmanje 16 kontinuiranih nukleobaza iz nukleobazne sekvence SEQ ID Br: 12. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida obuhvata najmanje 17 kontinuiranih nukleobaza iz nukleobazne sekvence SEQ ID Br: 12. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida obuhvata najmanje 18 kontinuiranih nukleobaza iz nukleobazne sekvence SEQ ID Br: 12. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida obuhvata najmanje 19 kontinuiranih nukleobaza iz nukleobazne sekvence SEQ ID Br: 12. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida obuhvata najmanje 20 kontinuiranih nukleobaza iz nukleobazne sekvence SEQ ID Br: 12. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida obuhvata najmanje 21 kontinuiranu nukleobazu iz nukleobazne sekvence SEQ ID Br: 12. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida obuhvata najmanje 22 kontinuirane nukleobaze iz nukleobazne sekvence SEQ ID Br: 12.

[0037] U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida obuhvata nukleobaznu sekvencu SEQ ID Br: 12.

[0038] U nekim izvedbama, pomenuto jedinjenje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji je spojen na ligand. U nekim izvedbama ima strukturu (III)

Gde

[0039] Svaki Q je nezavisno 2'-0-metil modifikovani nukleozid; x je

[0040]Jedan od A i B je S, dok je drugi O;

yje

[0041]Svaki od z<1>, z<2>,zi z4 je nezavisno x ili y;

n=6-17

Lje

[0042] Gde: XjeN(CO)R7 ili NR7;

Svaki od R',R<3>i R9 je nezavisno H, OH ili -CH2OR<b>pod uslovom da najmanje jedan od R<1>, R3 i R9 je OH i najmanje jedan od R<1>, R<3>i R9 je -CH2OR<b>;

R7 je R<d>ili Cj-C2oalkil supstituisan sa NR<c>R<d>ili NHC(0)R<d>;

R<c>jeHiliC,-C6alkil;

R<d>je radikal ugljenog-hidrata; ili radikal steroida, koji je ponekad privezan na najmanje jednim radikalom ugljenog-hidrata; a

R<b>je

sa tim da jedan od A i Bje S, dok je ostali O.

[0043] U nekim izvedbama, Rd je holesterol. U nekim izvedbama, svaki od z<1>, z<2>, z<3>i z je

sa tim da jedan od A i Bje S, dok je ostali O.

[0044] U nekim izvedbama, R<1>je -CH2OR<b>. U nekim izvedbama, R<9>je OH. U nekim izvedbama, R<1>i R<9>sutrans.U nekim izvedbama, R<1>i R<3>sutrans.U nekim izvedbama, R<3>je -CH2OR<b>. U nekim izvedbama, R<l>je OH. U nekim izvedbama, R<1>i R<3>sutrans.U nekim izvedbama, R<3>i R<9>sutrans.U nekim izvedbama, R<9>je CH2OR<b>. U nekim izvedbama, X je NC(0)R<7>. U nekim izvedbama, R7 je - CH2(CH2)3CH2NHC(0)R<d>.

[0045] U nekim izvedbama, najmanje jedno inter-nukleozidno spajanje je modifikovano inter-nukleoziđno spajanje. U nekim izvedbama, svako inter-nukleozidno spajanje je modifikovano inter-nukleozidno spajanje. U nekim izvedbama, najmanje jedno inter-nukleozidno spajanje je fosforotioatno inter-nukleozidno spajanje. U nekim izvedbama, svako inter-nukleozidno spajanje je fosforotioatno inter-nukleozidno spajanje. U nekim izvedbama, najmanje jedan nukleozid obuhvata neki modifikovani šećer. U nekim izvedbama, mnoštvo nukleozida obuhvata neki modifikovani šećer. U nekim izvedbama, svaki nukleozid obuhvata neki modifikovani šećer. U nekim izvedbama, svaki nukleozid obuhvata 2'-0-metoksietilni šećer. U nekim izvedbama, svaki od mnoštva nukleozida obuhvata 2'-0-metoksietilni šećer i svaki od mnoštva nukleozida obuhvata 2'-fluoro šećer. U nekim izvedbama, svaki modifikovani šećer je nezavisno izabran iz 2'-0-metoksietilnog šećera, 2'-fluoro šećera, 2'-0-metilnog šećera ili bicikličkog šećera. U nekim izvedbama, najmanje jedan nukleozid obuhvata neku modifikovanu nukleobazu. U nekim izvedbama, modifikovana nukleobaza je 5-metilcitozin. U nekim izvedbama, najmanje jedan nukleozid obuhvata citozin, gde pomenuti eitozin je 5-metilcitozin. U nekim izvedbama, svaki citozin je 5-metilcitozin.

[0046] U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je najmanje 90% komplementarna sa nukleobaznom sekvencom iz SEQ ID Br: 1. U nekim izvedbama, nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je najmanje 95% komplementarna sa nukleobaznom sekvencom iz SEQ ID Br: 1. U nekim izvedbama, pomenuta nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je 100% komplementarna sa nukleobaznom sekvencom iz SEQ ID Br: 1. U nekim izvedbama, nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotid je komplementarna sa nukleobaznom sekvencom iz SEQ ID Br: 1 u svojoj punoj dužini. U nekim izvedbama, nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je najmanje 90% komplementarna sa nukleobaznom sekvencom iz SEQ ID Br: 11. U nekim izvedbama, nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je najmanje 95% komplementarna sa nukleobaznom sekvencom iz SEQ ID NO: 11. U nekim izvedbama, nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je 100% komplementarna sa nukleobaznom sekvencom iz SEQ ID Br: 11. U nekim izvedbama, miR-21 nukleobazna sekvenca obuhvata nukleobaznu sekvencu iz SEQ ID Br: 1. U nekim izvedbama, prekursorska nukleobazna sekvenca obuhvata nukleobaznu sekvencu iz SEQ ID NO: 11.

[0047]U nekim izvedbama, pomenuto jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid se priprema kao farmaceutska kompozicija. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se priprema kao farmaceutska kompozicija.

[0048] U nekim izvedbama, pomenuto jedinjenje sadrži modifikovani oligonukleotid. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid je neki jedno-lančani modifikovani oligonukleotid. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid je nekiantisense-oligonukleotid.

[0049] Ovde su obezbeđene kompozicije za upotrebu u tretmanu, prevenciji i/ili ublažavanju fibroze. Dodatno su ovde obezbeđena jedinjenja koja obuhvataju modifikovane oligonukleotide koji imaju nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK, za upotrebu u tretmanu, prevenciji i/ili ublažavanju fibroze.

[0050] Ovde su obezbeđeni a/tf/sense-oligonukleotidi koji su komplementarni sa miR-21 za proizvodnju leka za tretman i/ili prevenciju fibroze.

[0051] Ovde su obezbeđeniflrtfr'i-ertse-oligonukleotidikoji su komplementarni sa miR-21 za upotrebu u tretmanu i/ili prevenciju fibroze.

[0052] Ovde je obezbeđena upotreba miR-21 i/ilianfeerae-oligonukleotidaprotiv miR-21 za tretman fibroze.

[0053] Ovde je obezbeđena upotreba miR-21 i/ili a«fee^e-oligonukleotida protiv miR-21 za upotrebu u dijagnozi fibroze.

KRATKI OPIS CRTEŽA

[0054]

Sl.l Narušeno reguiisanje miR-21 u srčanim bolestima i predominantna ekspresija u srčanim fibroblastima

(a) Analiza mikroRNK-ekspresije uz pomoć mikročipa. RNK je izolovana iz levog ventrikularnog miokarda mišjeg modela kvara srca (J31AR-TG miševi) tokom ranih (tri meseca starosti), srednjih (šest meseci starosti) i kasnih faza (dvanaest meseci)

kvara srca. Ekspresija je prikazana kao snaga regulacije naspram divljeg tipa kontrole miR-21 koja je označena crvenim. Podaci su za 3-4 nezavisne hibridizacije po grupi. (b)LevoNorthem-blot analiza miR-21 ekspresije tokom različitih faza kvara srca u miševima plAR-TG.DesnoKvantitativna analiza podataka iz gornjeg panela. (c)LevoNorthern-blot analiza miR-21 ekspresije bez kvara i sa kvarom humanog levog ventrikularnog miokarda.DesnoKvantitativna analiza zrele forme miR-21 bez kvara i sa kvarom humanog levog ventrikularnog miokarda. (d)Gore Neonatalnikardiomiociti obojeni sa 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) i antitelo usmereno protiv cc-aktinina nakon transfekcije sa smrvljenom-miR (kontrola-pre-miR, 50 nM, 72 h), sintetičkom miR-21 (pre-miR-21, 50 nM, 72 h) i miR-21 inhibitorom (anti-miR-21, 50 nM, 72 h). Kardiomiociti su kultivirani u kontrolisanim uslovima (vidi Dodatne metode) ili su stimulisani sa FCS (5%) tokom 48 h.DoljeKvantitativna analiza pojedinačnih veličina kardiomiocita (histogramska analiza). n>200 kardiomiociti su analizirani po grupi. (e)GoreStvaranje transgeničnih miševa koji eksprimiraju miR-21 pod kontrolom alfa-MHC promotora.SredinaNorthern-blot zrele miR-21 u divljem tipu (WT) i u transgeničnoj (TG) životinji.DoljePresek srčanih delova iz divljeg tipa i miR-21-transgenični miševi obojeni sa ciljem određivanja opšte morfologije (HE-boja) i raspored kolagena (Sirius crveno). (f) miR-21 ekspresija u srčanim fibroblastima i kardiomiocitima. Northern-blot{ Gore)i kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu{ Dolje).Svi prikazi srednje pogreške su SEM. n=3-6 za a-f.

SI. 2 Inhibicija Sprourvl preko miR-21 otklanja represiju ERK-signaliziranja i pojačava preživljavanje fibroblasta

(a) Srca iz SprvlLacZ +/- miševa obojena sa X-gal. Makroskopska{ gore)i mikroskopska{ dolje)analiza pokazuje detekciju LacZ u srčanim fibroblastima. Kratka crna crta označava 100 um. Velika cma crta pokazuje 10 um

(b, c)GoreDetekcija SPRY1, ERK1/2 i fosfo-ERKl/2 kod kvara humanih levih ventrikula (b) i nakon transfekcije ko-kultiviranih kardiomiocita i fibroblasta sa smrvljenom-mikroRNK (Pre-miR™ negativna kontrola #2, 50 nM, 72 h), sintetičkom miR-21 (pre-miR-21, 50 nM, 72 h) ili miR-21 inhibitorom (anti-miR-21, 50 nM, 72

h).DoljeKvantitativna analiza Western-blot rezultata.

(d)GoreOdređivanje SPRY1, ERK1/2, fosfo-ERKl/2 nakon siRNK-potpomognutog nokdauniranja SPRY1 (150 nM, 72 h) ili tretmana sa smrvljenom siRNK (150 nM, 72 h) u ko-kultiviranim srčanim ćelijama.DoljeKvantitativna analiza Western-blot rezultata. (e)GoreFACS analiza aneksin V-pozitivnih srčanih fibroblasta nakon tretmana sa smrvljenim-mikroRNK (kontrola-pre-miR, 100 nM, 72 h), sintetičkom miR-21 (pre-miR-21, 100 nM, 72 h), miR-21 antagonistima (anti-miR-21, 100 nM, 72 h) ili odgovarajućim kontrolama (100 nM, 72 h).DoljeKvantitativna analiTA aneksin V-pozitivnih ćelija nakon odgovarajućih tretmana. (f)GoreFGF2 koncentracija kod supernatanata kultivisanih srčanih fibroblasta nakon tretmana sa smrvljenom-mikroRNK (kontrola pre-miR, 100 nM, 72 h), sintetičkom miR- 21 (pre-miR-21, 100 nM, 72 h) ili miR-21 antagonistima (anti-miR-21, 100 nM, 72 h) ili (dolje) nakon siRNK-potpomognutog nokdauna SPRY1 (150 nM, 72 h) ili tretmana sa smrvljenom siRNK (150 nM, 72 h). Sve oznake srednje pogreške pokazuju SEM. n=3-6 za a-f. SI. 3 Terapeutsko utišavanje miR-21in vivosprečava srčanu fibrozu i kvar srca (a)GoreFluorescencijska mikroskopska detekcija Cy3 i DAPI bojanje kod levog ventrikularnog srca nakon injekcije Cy3-označenih modifikovanih oligonukleotida preko jugularne vene. Kontrole su primile PBS injekcije.DoljeMiševi su podvrgnuti konstrukciji transaorte (TAC) ili lažnom operacijom pa su primili kontrolu preko injekcije (PBS, 200 ul) ili antagomir-21 (200 ul; 80 mg/kg/d); 24 h post-operativni period tokom sledeća tri dana. (b)GoreNorthern-blot analiza miR-21 ekspresije kod ne-tretiranih (kontrola) i miševa tretiranih sa antagomir-21 nakon TAC.DoljeKvantitativna analiza ekspresije srčanog miR-21. (c)GoreWestern-blot analiza SPRY1, ERK1/2 i fosfo-ERKl/2 kod miševa nakon lažne-operacije ili nakon TAC-tretmana sa kontrolom ili antagomir-21. Ekspresija G beta je prikazana kao postojana kontrola.DoljeKvantitativna analiza Western-blot rezultata. (d) Sekcije srca nakon bojenja sa Sirius crvenim za detekciju miokardijalne fibroze kod kontrolnih miševa i miševa tretiranih sa antagomir-21. (e) Kvantitativna analiza miokardijalne fibroze( levo)i težina srce/telo( desno)kod kontrolnih miševa i miševa tretiranih sa antagomir-21. (f)GoreGlobalna analiza transkriptoma mišjeg genoma u srčanom tkivu nakon lažne-operacije ili nakon TAC tretmana sa kontrolom ili antagomir-21. Crvene (zelene) kutije pokazuju značajno (p<0.05) inducirane (reprimirane) gene.DoljeNormalizacija povišeno regulisanih gena koji kodiraju za belančevine koje su uključene u miokardijalnoj fibrozi nakon TAC uz pomoć tretmana sa antagomir-21. (g) EhoKardiografska analiza. LVD, dijametar levog ventrikula; FS, frakcionalno skraćivanje. (h) Predloženi mehanizami koji objašnjavaju otklanjanje represije srčanog ERK signaliziranja preko miR-21-potpomognute inhibicije SPRY1. Sve srednje pogreške pokazuju SEM, n=3-6 za a-g.

SI. 4 Transkripcijsko regulisanje miR-21

(a) Konzerviranost sekvenci u regionima miR-21-promotora iz različitih vrsta upoređeno sa humanim miR-21-promotorom. Crte pokazuju stepen konzerviranosti. (b) Aktivnost luciferaze u humanim konstruktima miR-21-promotora. Progresivno skraćivanje nativnog promotora dovodi do identifikacije regiona od 117 bp koji je odgovoran za ekspresiju miR-21. n=3. (c) Podaci za luciferazu iz humanih konstrukata miR-21-promotora nakon delecije/mutacije individualnih veznih mesta za transkripcijske faktore. n=3. SI. 5 Nokdaun stalno eksprimirane miR-21 inducira srčani fenotip kod zebrica (a)LevoLateralni pogled MO-kontrolnih embriona i miR-21 morfanata na 80 hpf. A, atrijum; V, ventrikul; tamne strelice označavaju perikardijalni edem.Desno goreSrca koja su bila injektirana sa kontrolom-morfolino (MO-kontrola) pokazuju normalnu srčanu morfologiju tokom 80 h post-fertilizacije (hpf). Srca su bila prstenasta, endokardijalni i miokardijalni slojevi su dobro razvijeni, ventrikul (V) i atrijum (A) je odvojen uz pomoć atrio-ventrikularnog (AV) prstena.DoljemiR-21 morfanti (MO-1 injektirani) razvijaju perikardijalni edem zbog gubitka ventrikularne kontraktilnosti i pokazuju skraćene repove, dok razvoj drugih organskih sistema se odvija normalno. (b) Inhibicija miR-21 funkcije uz pomoć dva različita morfolino-modifikovanafl/jtoe^<g->oligonukleotida (MO-1, n=496 i MO-2, n=460) dovodi do identičnih

fenotipova kod >90% injektiranih embriona. Podaci su za 3 nezavisna injektiranja po grupi. (c) Miokardijalna funkcija pokazana kao frakcionalno skraćivanje (FS) ventrikularne komore kod MO-kontrola (n=6) i miR-21 morfanata injektiranih sa dva različita morfolino (MO-1, n=8 i MO-2, n=8) kod 48, 72, 96 i 120 hpf. Ventrikularni FS ventrikula miR-21 morfanata snažno se smanjuju tokom vremena.

SI. 6 Efikasnost transfekcije kod kultiviranih kardiomiocita

(a) Neonatalni kardiomiociti iz kulture su transfektirani miR-21 označenom sa Cy-3 (50 nM, 72 h, Ambion, SAD) i obojeni sa DAPI( desno).Za uporedbu kardiomiociti iz kulture su obojeni samo sa DAPI( levo).(b) Northern-blot analiza miR-21 ekspresije kod kardiomiocita iz kulture nakon transfekcije sa smrvljenom-mikroRNK (kontrola-pre-miR, 50 nM, 72 h), miR-21 inhibitorom (anti-miR-21, 50 nM, 72 h) ili sintetičkom miR-21 (pre-miR-21, 50 nM, 72 h).

Sve pogreške pokazuju SEM; n=3-6 za a) i b).

SI. 7 MikroRNK-vezna mesta u 3'UTR izSprylgena

GorePromena ekspresije brojnih mikroRNK sa veznim mestima u 3'UTR izSprylgena.

DoljemikroRNK sa veznim mestima u 3'UTR analizirani sa mikroRNK mikročipovima su prikazani u sivom. Cds=kodirajuća sekvenca

SI. 8 Podaci za ekspresiju miR-21 preko PCR u realnom vremenu

Osim određivanja uz pomoć Northern-blot, ekspresija miR-21 je analizirana uz pomoć PCR u realnom vremenu u tkivu levog ventrikula miševa nakon lažne-operacije, lažnog+antagomir-21 tretmana, TAC i TAC+antagomir-21 tretmana( levo),kao i u srcima miševima divljeg tipa i miR-21 transgenih miševa( desno).n=4-6 po grupi.

Podaci nisu prikazani:

[0055] Pretraga teoretskih miR-21 meta je otkrila 22 poznata potencijalno ciljna gena, od kojih se za 8 pokazalo da su eksprimirani u srčanom tkivu. Kombinacija tri različita alata za predviđanje različitih meta su identifikovala Spryl (sproutvl) kao veoma verovatnog kandidata.

Transkripcijsko regulisanje miR-21

[0056] Postoji konzerviranost sekvenci u regionu miR-21-promotora iz različitih vrsta u uporedbi sa humanim miR-21-promotorom. Pokazana je aktivnost luciferaze kod humanih konstrukata miR-21-promotora nakon delecije/mutacije pojedinačnih veznih mesta za transkripcijske faktore. Progresivno skraćivanje nativnog promotora dovodi do identifikovanje regiona od 117 bp koji je odgovoran za ekspresiju miR-21. n=3.

Efikasnost transfekcije u kardiomiocitima iz kulture

[0057] Kultivirani neonatalni kardiomiociti su transfektirani sa miR-21 označenom sa Cy-3 (50 nM, 72 h, Ambion, SAD) i obojeni sa DAPI. Za uporedbe, kultivirani kardiomiociti su obojeni samo sa DAPI. Uz pomoć Northern-blota je analizirana miR-21 ekspresija kod kultiviranih kardiomiocita nakon transfekcije sa smrvljenom-mikroRNK (kontrola-pre-miR, 50 nM, 72 h), miR-21 inhibitorom (anti-miR-21, 50 nM, 72 h) ili sintetičkom miR-21 (pre-miR-21,50nM, 72 h).

MikroRNK-vezna mesta u 3.UTR iz Spryl gena

[0058] Postoji promena u ekspresiji brojnih mikroRNK sa veznim mestima u 3'UTR iz Spryl gena. mikroRNK sa veznim mestima u 3'UTR su analizirani uz pomoć mikroRNK mikročipova.

Podaci za ekspresiju miR-21 preko PCR u realnom vremenu

[0059] Osim određivanja uz pomoć Northern-blota, ekspresija miR-21 je analizirana uz pomoć PCR u realnom vremenu u tkivu levog mišjeg ventrikula nakon lažne-operacije, Iažnog+miR-21 antagonist tretmana, TAC i TAC+miR-21 antagonist tretmana kao i u srcima iz miševa divljeg tipa i miR-21 transgeničnih miševa.

DETALJAN OPIS

Definicije

[0060] "Fibroza" znači formiranje ili razvoj viška fibroznog veznog tkiva u nekom organu ili tkivu. U nekim izvedbama, fibroza se javlja kao reparativan ili reaktivan proces. U nekim izvedbama, fibroza se javlja kao odgovor na oštećenje ili ozledu. Termin "fibroza" treba da se razume kao formiranje ili razvoj viška fibroznog veznog tkiva u nekom organu ili tkivu kao reparativan ili reaktivan proces, protivno formiraju fibroznog tkiva kao normalnog konstituenta nekog organa ili tkiva.

[0061]^ntoms-e-oligonukleotidtreba da se razume kao oligonukleotid koji ima određenu sekvencu koja je komplementarna sa drugom sekvencom, a posebno kao sekvenca koja je komplementarna sa miR-21. Meta miR-21 treba da se razume kao da obuhvata nizvodnu metu miR-21. Veoma je važno da se primeti da će inhibicija miR-21, na primer preko nekog oligonukleotida sa sekvencom koja je barem komplementarna sa miR-21 dovesti do otklanjanja represije ili čak prekomerne ekspresije miR-21 meta, poput Sproutv i slično.

[0062] "Subjekt" označava humanu ili ne-humanu životinju koja je izabrana za tretman ili terapiju.

[0063] "Subjekt koji se sumnja da ima" označava subjekta koji pokazuje jedan ili više kliničkih indikatora bolesti ili stanja.

[0064] "Subjekt koji se sumnja za ima fibrozu" označava subjekta koji pokazuje jedan ili više kliničkih indikatora fibroze.

[0065] "Sprečavanje" ili "prevencija" se odnosi na odgađanje ili zaustavljanje pojave, razvoja ili progresije stanja ili bolesti tokom određenog vremenskog perioda, uključujući nedelje, mesece ili godine.

[0066] "Tretman" ili "tretiranje" označava aplikaciju jedne ili više specifičnih procedura koje se kriste za lečenje ili ublažavanje neke bolesti. U nekim izvedbama, specifična procedura je administriranje jednog ili više farmaceutskih agenasa.

[0067] "Ublažavanje" označava smanjivanje jačine najmanje jednog indikatora stanja ili bolesti. U nekim izvedbama, ublažavanje uključuje odgađanje ili stopiranje progresije jednog ili više indikatora stanja ili bolesti. Jačina indikatora može da se odredi uz pomoć subjektivnih ili objektivnih merenja koja su poznata stručnjacima u polju.

[0068] "Subjekt koji ima potrebu od" označava subjekta koji je identifikovan kao takav koji ima potrebu od terapije ili tretmana.

[0069J "Administriranje" označava davanje farmaceutskog agensa ili kompozicije subjektu, i uključuje, ali bez ograničenja, administriranje uz pomoć medicinskih profesionalaca ili samo-administriranje.

[0070] "Parenteralna administracija" označava administraciju preko injekcije ili infuzije.

[0071] Parenteralna administracija uključuje, ali bez ograničenja, supkutanu administraciju, intravenoznu administraciju, intramuskularnu administraciju, intraarterijalnu administraciju i intrakranijalnu administraciju.

[0072] "Supkutana administracija" označava administraciju odmah ispod kože.

[0073] "Intravenozna administracija" označava administraciju u venu.

[0074] "Intraarterijalna administracija" označava administraciju u arteriju.

[0075] "Intrakardijalna administracija" označava administraciju u srce. U nekim izvedbama, intrakardijalna administracija se provodi uz pomoć katetera. U nekim izvedbama, intrakardijalna administracija se provodi uz pomoć hirurgije na otvorenom srcu.

[0076] "Pulmonalna administracija" označava administraciju u pluća.

[0077] "Poboljšava funkciju jetra" označava promene u funkcijama jetra koje se kreću ka normalnim parametrima. U nekim izvedbama, funkcija jetra se procenjuje uz pomoć merenja molekula koji su pronađeni u krvi subjekta. Na primer, u nekim izvedbama, poboljšava funkcija jetra se meri uz pomoć redukovanja nivoa transaminaze u jetrinoj krvi.

[0078]"Farmaceutska kompozicija" označava mešanje supstancija koje su prikladne za administriranje pojedincu šta uključuje neki farmaceutski agens. Na primer, farmaceutska kompozicija može da obuhvata modifikovani oligonukleotid i sterilni vodeni rastvor.

[0079J "Farmaceutski agens" označava supstanciju koja obezbeđuje terapeutski efekt kada se administrira subjektu.

[0080] "Aktivni farmaceutski sastojak" označava supstanciju u farmaceutskoj kompoziciji koji obezbeđuje željeni efekat.

[0081] "Ciljna nukleinska kiselina," "ciljna RNK" "ciljni RNK transkript" i "meta nukleinske kiseline", svi označavaju bilo koju nukleinsku kiselinu koja može da se cilja saantisense-jedinjenjima.

[0082] "Ciljanje" označava postupak za dizajn i selekciju nukleobazne sekvence koja hibridizuje sa ciljanom nukleinskom kiselinom i inducira željeni efekat.

[0083] "Ciljano prema" označava postojanje nukleobazne sekvence koja omogućava hibridizaciju sa ciljnom nukleinskom kiselinom sa ciljem da se potakne željeni efekat. U nekim izvedbama, željeni efekat je ograničen na ciljnu nukleinsku kiselinu.

[0084] "Modulacija" označava perturbaciju funkcije ili delovanja. U nekim izvedbama, modulacija označava povećanje genske ekspresije. U nekim izvedbama, modulacija označava smanjenje genske ekspresije.

[0085] "Ekspresija" označava bilo koju funkciju i korake uz pomoć kojih informacija kodirana u nekom genu može da se konvertuje u strukture koje su prisutne i operativne u ćeliji.

[0086] "5' ciljno mesto" se odnosi na nukleobaznu sekvencu ciljane nukleinske kiseline koja je komplementarna sa krajnjim 5'-delom nukleobazne sekvence nekog određenog oligonukleotida. [0087J"3' ciljno mesto" označava nukleobaznu sekvencu ciljne nukleinske kiseline koja je komplementarna sa krajnjim 3'-delom pomenute nukleobazne sekvence nekog određenog oligonukleotida.

[0088]"Region" označava deo spojenih nukleozida u nekoj nukleinskoj kiselini. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa regionom iz ciljne nukleinske kiseline. Na primer, u nekim takvim izvedbama, modifikovani oligonukleotid je komplementaran sa regionom iz miRNK stabljika-omča sekvencom. U nekim takvim izvedbama, modifikovani oligonukleotid je 100% identičan prema regionu iz miRNK stabljika-omča sekvence.

[0089]"Segment" označava manji deo nekog regiona.

[0090]"Nukleobazna sekvenca" označava raspored kontinuiranih nukleobaza, u 5' prema 3' orijentaciji, nezavisno od bilo kojeg šećera, spajanja i/ili nukleobazne modifikacije.

[0091]"Kontinuirane nukleobaze" označavaju nukleobaze koje su raspoređene jedna iza druge u nekoj nukleinskoj kiselini.

[0092J"Nukleobazna komplementarnost" označava sposobnost dviju nukleobaza da se spare ne-kovalentno preko vodonikovog spajanja.

[0093]"Komplementarno" označava da je prva nukleobazna sekvencu najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identičnu, ili je 100% identična sa komplementom druge nukleobazne sekvence preko regiona od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ili više nukleobaza, ili to da dve sekvence hibridizuju u rigoroznim hibridizacijskim uslovima. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja je 100% komplementarna sa miRNK, ili sa njenim prekursorom, može da ne bude 100% komplementaran sa miRNK, ili sa njenim prekursorom, preko cele dužine modifikovanog oligonukleotida.

[0094] "Komplementarno" označava sposobnost za nukleobaznim sparivanjem među prve nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline.

[0095] "Komplementarnost preko cele dužine" označava da je svaka nukleobaza iz prve nukleinske kiseline sposobna da se spari sa svakom nukleobazom na odgovarajućoj poziciji u drugoj nukleinskoj kiselini. Na primer, u nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid u kojem svaka nukleobaza ima komplementarnost prema nukleobazi u nekoj miRNK, pomenuti poseduje komplementarnost na celoj dužini miRNK.

[0096] "Procenat komplementarnosti" označava broj komplementarnih nukleobaza u nukleinskoj kiselini podeljen sa dužinom nukleinske kiseline. U nekim izvedbama, procenat komplementarnosti nekog modifikovanog oligonukleotida označava broj nukleobaza koje su komplementarne ciljnoj nukleinskoj kiselini, podeljen sa brojem nukleobaza modifikovanog oligonukleotida. U nekim izvedbama, procenat komplementarnosti nekog modifikovanog oligonukleotida označava broj nukleobaza koje su komplementarne sa miRNK, podeljen sa brojem nukleobaza iz modifikovanog oligonukleotida.

[0097] "Procenat veznog regiona" označava procenat regiona koji je komplementaran sa nekim regionom oligonukleotida. Procenat veznog regiona može da se izračuna deljenjem broja nukleobaza iz ciljnog regiona koje su komplementarne sa oligonukleotidom sa dužinom ciljnog regiona. U nekim izvedbama, procenat veznog regiona je najmanje 80%, najmanje 85%), najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100%.

[0098] "Procenat identičnosti" označava broj nukleobaza u prvoj nukleinskoj kiselini koje su identične sa nukleobazama na odgovarajućim pozicijama u drugoj nukleinskoj kiselini, podeljen sa totalnim brojem nukleobaza u prvoj nukleinskoj kiselini.

[0099] "Značajno identičan", kako se ovde koristi, može da znači da su prva i druga nukleobazna sekvenca najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identične ili 100% identične, preko regiona od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,-75, 80, 85, 90, 95, 100 il više nukleobaza.

[0100]"Hibridizuje" označava spajanje komplementarnih nukieinskih kiselina koje nastupa preko nukleobazne komplementarnosti.

[0101] "Pogrešno sparene baze" označava nukleobazu iz prve nukleinske kiseline koja nije sposobna da se spari sa nukleobazom na odgovarajućoj poziciji iz druge nukleinske kiseline.

[0102} "Ne-komplementarna nukleobazna sekvenca" označava dve nukleobazne sekvence koje nisu sposobne da se spare preko vodonikovih veza.

[0103[ "Identičan" označava da se poseduje ista nukleobazna sekvenca.

[0104] "miRNK" ili "miR" označava ne-kodirajuću RNK sa 18 do 25 nukleobaza koja hibridizuje i reguliše ekspresiju kodirajuće RNK. U nekim izvedbama, miRNK je produkt rezanja pre-miRNK uz pomoć encima Dicer. Primeri miRNK su pronađeni u miRNK bazi koja je poznata kao miRBase ( http:// mikrornk. sanger. ac. uk/).

[0105] "Pre-miRNK" ili "pre-miR" označava ne-kodirajuću RNK koja ima strukturu ukosnice, koja sadrži miRNK. U nekim izvedbama, pre-miRNK je produkt rezanja pri-miR uz pomoć ribonukleaze specifične za dvo-lančanu RNK poznatu kao Drosha.

[0106] "Stabljika-omča sekvenca" označava RNK koja ima strukturu ukosnice i sadrži zrelu miRNK sekvencu. Pre-miRNK sekvence i stabljika-omča sekvence mogu da se preklapaju. Primeri za stabljika-omča sekvence mogu da se pronađu u miRNK bazi poznatoj kao miRBase ( http:// mikrornk. sanger. ac. uk/).

[0107] "Pri-miRNK" ili "pri-miR" označava ne-kodirajuću RNK koja ima strukturu ukosnice koja je supstrat za ribonukleazu specifičnu za dvo-lančanu RNK (Drosha).

[0108] "miRNK prekursor" označava transkript koji dolazi iz genomske DNA i koji obuhvata ne-kodirajuću, strukturnu RNK koja obuhvata jednu ili više miRNK sekvenci. Na primer, u nekim izvedbama miRNK prekursor je pre-miRNK. U nekim izvedbama, miRNK prekursor je pri-miRNK.

[0109]"Monocistronski transkript" označava miRNK prekursor koji sadrži pojedinačnu miRNK sekvencu.

[0110] "Policistronski transkript" označava miRNK prekursor koji sadrži dve ili više miRNK sekvence.

[0111]"iS'eeć/-region"označava nukleotide 2 do 6 ili 2 do 7 sa 5-kraja zrele miRNK sekvence.

[0112] "Oligomerno jedinjenje" označava jedinjenje koje obuhvata polimer od spojenih monomernih podjedinica.

[0113] "Oligonukleotid" označava polimer spojenih nukleozida, od kojih svaki može da bude modifikovan ili ne-modifikovan, nezavisno jedan od drugoga.

[0114] "Internukleozidno spajanje koje se pojavljuje prirodno" označava 3-5' fosfodiestersko spajanje među nukleozidima.

[0115] "Prirodni šećer" označava šećer koji se nalazi u DNA (2'-H) ili RNK (2-OH).

[0116] "Naturalna nukleobaza" označava nukleobazu koja nije modifikovana u odnosu na njenu prirodnu formu.

[0117] "Internukleozidno spajanje" označava kovalentno spajanje između susednih nukleozida.

[0118] "Spojeni nukleozidi" označava nukleozide koji su spojeni uz pomoć kovalentne veze.

[0119] "Nukleobaza" označava heterociklički ostatak koji je sposoban da se spaja sa drugom nukleobazom na ne-kovalentan način.

[0120] "Nukleozid" označava nukleobazu koja je spojena na šećer.

[0121]"Nukleotid" znači nukleozid koji ima fosfatnu grupu koja je kovelentno vezana na šećer iz nukleozida.

[0122]"miR antagonist" znači modifikovani oligonukleotid koji je komplementaran sa miRNK, ili sa nekim njenim prekursorom. Na primer, "miR-X antagonist" znači modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobazu koja je komplementarna sa miR-X. U nekim izvedbama, antagonist jer miR-21 antagonist.

[0123]"Modifikovani oligonukleotid" znači oligonukleotid koji ima jednu ili više modifikacija u odnosu na prirodan terminus, šećer, nukleobazu i/ili internukleozidno spajanje.

[0124]"Jedno-lančani modifikovani oligonukleotid" znači modifikovani oligonukleotid koji nije hibridizovan na komplementarni lanac.

[0125]"Modifikovano internukleozidno spajanje" označava bilo koju pramenu u prirodnom internukleozidnom spajanju.

[0126]"Fosforotioatno internukleozidno spajanje" označava spajanje između nukleozida gde jedan od atoma, koji ne stvaraju most, je atom sumpora.

[0127]"Modifikovani šećer" označava supstituciju i/ili bilo kakvu promenu u odnosu na prirodni šećer.

[0128]"Modifikovana nukleobaza" znači bilo koju supstituciju i/ili promenu u odnosu na prirodnu nukleobazu.

[0129]"5-metilcitozin" znači citozin koji je modifikovan sa metilnom grupom koja je spojena sa 5' poziciji.

[0130]"2'-0-metil šećer" ili "2'-OMe šećer" znači šećer koji ima O-metilnu modifikaciju na 2' poziciji.

[0131]"2'-0-metoksietil šećer" ili "2-MOE šećer" označava šećera koji ima O-metoksietil modifikaciju na 2' poziciji.

[0132] "2'-0-fluoro šećer" ili "2'-F šećer" znači šećer koji ima fluoro modifikaciju na 2' poziciji.

[0133] "Biciklički šećerni ostatak" znači šećer modifikovan uz pomoć spajanja mostom dva ne-geminalna atoma iz prstena.

[0134] "2-O-metoksietil nukleozid" znači 2'-modifikovani nukleozid koji ima 2-0-modifikaciju sa metoksietil šećerom.

[0135] "2-fluoro nukleozid" znači 2'-modifikovani nukleozid koji ima 2'-fluoro šećernu modifikaciju.

[0136J "2-O-metil" nukleozid znači 2'-modifikovani nukleozid koji ima 2'-0-metil šećernu modifikaciju.

[0137] "Biciklički nukleozid" znači 2'-modifikovani nukleozid koji ima biciklički šećerni ostatak.

[0138] "Motiv" znači obrazac modifikovanih i/ili ne-modifikovanih nukleobaza, šećera i/ili internukleozidnih spajanja u nekom oligonukleotidu.

[0139] "Potpuno modifikovani oligonukleotid" označava da su svaka nukleobaza, svaki šećera i/ili svako internukleozidno spajanje modifikovani.

[0140] "Uniformno modifikovani oligonukleotid" označava da svaka nukleobaza, svaki šećer i/ili svako internukleozidno spajanje ima istu modifikaciju preko celog modifikovanog oligonukleotida.

[0141]"Stabilizirajuća modifikacija" označava modifikaciju nukleozida koja obezbeđuje pojačanu stabilnost modifikovanom oligonukleotidu, u prisutnosti nukleaza, u odnosu na onu koja postoji kod 2'-deoksinukleozida koji su spojeni uz pomoć fosfodiesterskih internukleozidnih spajanja. Na primer, u nekim izvedbama, stabilizirajuća modifikacija je stabilizirajuća modifikacija nukleozida. U nekim izvedbama, stabilizirajuća modifikacija je modifikacija internukleozidnog spajanja.

[0142]"Stabilizirajući nukleozid" označava nukleozida modifikovanog sa ciljem da se obezbedi pojačana nukleazna stabilnost nekog oligonukleotida, u odnosu na onu koja postoji kod 2'-deoksinukleozida. U jednoj izvedbi, stabilizirajući nukleozid je 2'-modifikovani nukleozid.

[0143]"Stabilizirajuće internukleozidno spajanje" označava internukleozidno spajanje koje obezbeđuje pojačanu nukleaznu stabilnost nekog oligonukleotida u odnosu na onu koja je obezbeđena sa fosfodiesterskim internukleozidnim spajanjem. U jednoj izvedbi, stabilizirajuće internukleozidno spajanje je fosforotioatno internukleozidno spajanje.

Pregled

[0144]Ovde je otkriveno da modifikovani oligonukleotidi, koji su komplementarni sa miR-21, predstavljaju farmaceutski agens za inhibiciju miR-21. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotidi se administriraju subjektu koji ima bolest koja je karakterizovana uz pomoć pozitivne regulacije miR-21. U nekim izvedbama, pomenuta bolest je rak. U nekim izvedbama, pomenuta bolest je kvar srca. U nekim izvedbama, pomenuta bolest je fibroza. Fibroza nastaje zbog pojave viška fibroznog veznog tkiva u nekom organu ili tkivu kao odgovor na oštećenje ili ozlede. Ako se ne tretira, fibroza može da dovede od brojnih stanja srca, pluća, bubrega, jetra i kože, među ostalim tkivima.

[0145] Ovde je otkriveno da miR-21 iz fibroblasta igra centralnu ulogu u fibrozi. Povećanje nivoa miR-21 je dovelo do preživljena fibroblasta, dok je supresija endogene miR-21 inducirala smrt ćelije apoptozom. Tako, ovde je identifikovan mehanizam preko kojeg miR-21 reguliše preživljenje fibroblasta. Aberantna proliferacija fibroblasta i preživljenje mogu da dovedu do fibroze. Prema tome, modifikovani oligonukleotidi, koji su komplementarni sa miR-21, su farmaceutski agensi za tretman fibroze. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid, koji je komplementaran sa miR-21, jeantisense- oligonukleotidkomplementaran sa miR-21.

[0146] Pronalazači su pokazali kritičnu ulogu miR-21 iz fibroblasta i SPRY1 u srcu (SI. 3h). Ovi podaci pokazuju da stres-inducirana i miRNK-potpomognuto aktivisanje ERK-MAPkinaze može da značajno reguliše srčanu fibrozu. Ova studija prikazuje prvi primer terapeutske aplikacije mikroRNK u nekom modelu za bolest. Specifično, antagonizirajuće miR-21 su sprečile strukturnu i funkcionalnu degeneraciju u mišjem modelu. Ovi nalazi sugerišu novu terapeutsku ulaznu tačku kod kvara srca i pokazuju široki terapeutski potencijal mikroRNK antagonista.

[0147] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu miR-21,antisense-oligonukleotida protiv miR-21 i/ili na metu miR-21 za proizvodnju leka za tretman i/ili prevenciju fibroze i/ili bolesti koje su povezane sa fibrozom.

[0148] Ovaj pronalazak se posebno odnosi na srčano-specifične bolesti koje uključuju fibrozu (= bolesti povezane sa fibrozom), poput srčanu hipertrofiju, bolest hipertenzivnog srca, dijastoličkog i sistoličkog kvara srca, bolesti skladištenja koje su povezane sa srcem, poputM. Fabry,kardiomiopatije, na primer kardiomiopatija, hipertrofna kardiomiopatija sa i bez opstrukcije, restriktivna kardiomiopatija, aritmogena kardiomiopatija desnog ventrikula i druge forme kardiomiopatija, poput na primer dijabetske kardiomiopatije, konstruktivnog perikarditisa, bolesti koronarnih arterija, miokardijalne infarkcije, akutnog i hroničnog kvara desnog srca, srčanih aritmija zbog fibroze, miokarditisa povezanog sa fibrozom, bolesti srčanih zalistaka koje dovode do stenozu zalistaka ili insuficijenciju (na primer skleroza), na primer stenoza i/ili insuficijencija mitralnih zalistaka, stenoza i/ili insuficijencija zalistaka aorte, stenoza i/ili insuficijencija trikuspidalnih zalistaka, stenoza i/ili insuficijencija plućnih zalistaka.

[0149] U dodatnom aspektu ovaj pronalazak obuhvata druge bolesti koje uključuju fibrozu (= bolesti povezane sa fibrozom), ali koje nisu povezane sa srčanim sistemom. Ne-ograničavajući primeri su fiboza pluća, hronične opstruktivne bolesti pluća, plućna hipertenzija, fibroza jetra zbog toksične okoline, hepatitis i/ili sekundarni kvar desnog srca, fibroza kože, na primer razvoj keloida nakon ozlede, bolesti povezane sa krvnim sudovima, poput krutih arterija, povezane sa starenjem ili hipertenzijom, medij asklerozu, arteriosklerozu, starosnu fibrozu različitih organa, sklerozu creva, na primer Crohn-ova bolest, sistemska skleroza i CREST sindrom itd., fibroza bubrega, neoplastična fibroza i/ili reumatoidni artritis.

[0150]Dodatne dobro poznate bolesti i poremećaji povezani sa fibrozom su na primer endomiokardijalna fibroza i idiopatska mioKardiopatija, ciroza koja nastaje iz fibroze jetra, idiopatska plućna fibroza, intersticijalna bolest pluća, medijastinalna fibroza, mijelofibroza, sindrom post-vazektomične boli, retroperitonealna fibroza i nefrogena sistemska fibroza.

[0151]Svi aspekti ovoga pronalaska, a posebno aspekti koji su pomenuti u pridruženim zahtevima mogu da se koriste za dijagnozu, tretman i/ili prevenciju već pomenutih bolesti, poremećaja i stanja, koji su prikazani kao posebni primeri. Lista nije ograničena.

[0152]U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na strategije za moduliranje miR-21. U drugoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na strategije za moduliranje, na primer prekomerna ekspresija i/ili pozitivno regulisanje meta miR-21. Moguće modulacije su naprave za implantiranje, poput viralnih vektora i liposomalnih formulacija itd., sistema za transfer gena, sunđera i slično.

[0153]Sprouty (SPRY1) je ovde definisan kao meta miR-21. Oba miR-21 i SPRY1 su eksprimirani u srčanim fibroblastima, među drugim tipovima ćelija. Povećanje ekspresije miR-21 u srčanim fibroblastima potiče snažnu represiju ekspresije SPRY belančevine i dodatno pojačava aktivnost ERK-MAPkinaze. U preferiranoj izvedbi, meta je izabrana iz grupe koja se sastoji od Sproutyl (SPRY1), posebno SEQ ID Br: 7 ili SEQ ID Br: 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl,Nfib, Lnxl i Rtn4.

[0154]U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na anfr'.sera'e-oligonukleotiđ protiv (ili komplementaran sa) SEQ ID Br: 2 do SEQ ID Br: 4, Sproutyl (SPRY1), a posebno SEQ ID Br: 7 ili SEQ ID Br 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnxl i/ili Rtn4 za dijagnozu, tretman i/ili prevenciju fibroze i/ili bolesti koje su povezane sa fibrozom. U nekim aspektima, a«/«e«5e-oligonukleotid koji je komplementaran sa metom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od Sproutyl (SPRY1), a posebno SEQ ID Br: 7 ili SEQ ID Br: 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnxl i/ili Rtn4, interferiše sa sposobnosti mikroRNK, poput miR-21, da se veže na metu i da inhibira ekspresiju izabrane mete. U nekim aspektima, takavantisense-oligonukleotid obuhvata jednu ili više nukleozidnih modifikacija.

[0155] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na ćeliju koja ne sadrži miR-21, SEQ ID Br: 2 do SEQ ID Br: 4, Sproutyl (SPRY1), a posebno SEQ ID Br: 7 ili SEQ ID Br: 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnxl i/ili Rtn4.

[0156] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na nokautirani-organizam ne-humanog sisara koji ne sadrži miR-21, SEQ ID Br: 2 to SEQ ID Br: 4, Sproutyl (SPRY1), a posebno SEQ ID Br: 7 ili SEQ ID Br: 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnxl i/ili Rtn4 kao model za fibrozu i/ili bolesti povezane sa fibrozom. Takođe su ovde obuhvaćene transgenične životinje, a posebno ne-humani sisari koji prekomerno eksprimiraju miR-21.

[0157] Ovde je otkriveno da miR-21 iz fibroblasta doprinosi kvaru srca. Analiza primeraka srčanog tkiva iz levog ventrikula od subjekata sa stanjem kvara srca u zadnjoj fazi usled idiopatske diktirane kardiomiopatije pokazuju povećanu ekspresiju miR-21 i reprimiranu ekspresiju SPRY1 belančevine. Dodatno, ERK-MAPkinaza je bila aktivisana u primercima iz pomenutih subjekata, ako šta je pokazano uz pomoć povećanog omera fosfor-ERK/ERK. Ovde je otkriveno da u životinjskom modelu kvara srca, administracija modifikovanog oligonukleotida, koji je komplementaran sa miR-21, rezultuje značajnim usporavanjem srčane fibroze. Kvar srca je karakterizovan sa, među ostalim parametrima, srčanom fibrozom. Prema tome, modifikovani oligonukleotidi, koji su komplementarni sa miR-21, su farmaceutski agensi sa kojima može da se tretira srčana fibroza.

[0158] Ovde je takođe otkriveno da u životinjskom modelu kvara srca, usporavanje srčane fibroze je povezano sa usporavanjem povećanja težine srca. Dodatno, procena srčane funkcije uz pomoć ehoKardiografije je otkrila da administracija modifikovanog oligonukleotida, koji je komplementaran sa miR-21, sprečava dilataciju levog ventrikula i normalizuje parametre frakcijskog skraćivanja. Kvar srca može da se karakterizuje uz pomoć, među drugim parametrima, povećanja težine srca, dilacije levog ventrikula i poremećaja frakcionog skraćivanja. Prema tome, modifikovani oligonukleotidi, koji su komplementarni sa miR-21, su terapeutski agensi za tretman, ublažavanje i prevenciju kvara srca koje je povezano sa srčanom fibrozom.

[0159]U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na region promotora iz mikroRNK (miRNK) koji sadrži modifikaciju belančevine kalcijum/cAMP odgovora (CREB) i/ili veznog mesta u faktoru odgovora seruma (SRF) za dijagnozu, prevenciju i/ili terapiju fibroze i/ili bolesti koje su povezane sa fibrozom.

[0160]U jednoj izvedbi, pomenuti promotorski region, gen za mirR-21 i/ili 3'UTR iz brojnih mRNK mogu da sadrže polimorfizme, mutacije, a posebno tačkaste mutacije, delecije, skraćenja i/ili inverzije. Svi ovi amandmani u odnosu na divlji-tip sekvence dovode dode novonastanka novog miR-21 veznog mesta ili do deleciju miR-21 veznog mesta. U drugoj izvedbi, pomenuta modifikacija promotorskog regiona je izabrana iz grupe koja se sastoji od tačkaste mutacije, skraćenja, delecije i inverzije. Dodatno, promotorski region može da se izabere iz grupe koja obuhvata SEQ ID Br: 2 do SEQ ID Br: 4.

Dijagnostičke primene

[0161]U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu miR-21,antisense-oligonukleotida protiv miR-21 i/ili mete miR-21 za dijagnozu fibroze i/ili bolesti koje su povezane sa fibrozom.Antisense- o\ igonuk\ eotidtreba da se razume kao oligonukleotid koji ima takvu sekvencu koja je komplementarna prema nekoj drugoj sekvenci, a posebno sekvenca koja je komplementarna sa miR-21. Meta miR-21 može takođe da se razume tako da obuhvata niz vodnu metu miR-21. Veoma je važno da se pomene da će inhibicija miR-21, na primer preko nekog oligonukleotida sa sekvencom koja je barem komplementarna sa miR-21, dovesti do otklanjanja represije ili čak prekomeme ekspresije meta miR-21, poput Sproutv i slično.

[0162]U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za dijagnozu fibroze i/ili bolesti koje su povezane sa fibrozom koji obuhvata korake: (a) obezbeđivanja primerka od pacijenta za kojeg se pretpostavlja da pati od fibroze i/ili bolesti povezane sa fibrozom; (b) merenje ekspresije miR-21, Sproutyl (SPRY1), a posebno SEQ ID Br: 7 ili SEQ ID Br: 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnxl i/ili Rtn4;

[0163Jgde povećani nivo miR-21 i/ili smanjeni nivo Sproutv 1 (SPRY1), a posebno SEQ ID Br: 7 ili SEQ ID Br: 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnxl i/ili Rtn4 u uporedbi sa kontrolnim primerkom pokazuje fibrozu i/ili bolesti koje su povezane sa fibrozom ili predispoziciju prema toj bolesti.

[0164] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za pretraživanje farmaceutski aktivnog jedinjenja za tretman i/ili prevenciju fibroze i/ili bolesti koje su povezane sa fibrozom ili predispoziciju prema toj bolesti, koji obuhvata korake: (a) Obezbeđivanja primerka koji sadrži miR-21, Sproutvl (SPRY1), a posebno SEQ ID Br: 7 ili SEQ ID Br: 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnxl i/ili Rtn4; (b) Kontaktiranje supstance kondidata sa primerkom; (c) Određivanje efekta supstance kandidata na primerku; pri čemu menjanje miR-21, Sproutvl (SPRY1), a posebno SEQ ID Br: 7 ili SEQ ID Br: 8, Tgfbi, Kriti, Pitx2, Fasl, Nfib, Lnxl i/ili Rtn4 ukazuje na farmaceutski aktivno jedinjenje.

Neke bolesti i stanja

[0165] Ovde su obezbeđeni postupci za tretman subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu. Takođe su ovde obezbeđeni postupci za tretman subjekta koji je identifikovan kao takav koji ima ili se sumnja da ima fibrozu. U nekim izvedbama, takvi postupci obuhvataju administriranje subjektu modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21.

[0166] Dodatno su ovde obezbeđeni postupci za prevenciju fibroze u subjektu koji pokazuje rizik da razvije fibrozu. U nekim izvedbama, takvi postupci obuhvataju administriranje subjektu, koji pokazuje rizik da razvije fibrozu, modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa njenim prekursorom. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21.

[0167] U nekim izvedbama, fibroza je jetrina fibroza. U nekim izvedbama, fibroza je plućna fibroza. U nekim izvedbama, fibroza je kožna fibroza. U nekim izvedbama, fibroza je srčana fibroza. U nekim izvedbama, fibroza je bubrežna fibroza. U nekim izvedbama, fibroza je plućna fibroza. U nekim izvedbama, fibroza je starosna fibroza. U nekim izvedbama, fibroza je fibroza slezine.

[0168] U nekim izvedbama, subjekt koji ima ili se sumnja da ima fibrozu ima najmanje jednu srčanu bolest ili stanje. U nekim izvedbama, subjekt je identifikovan kao takav koji ima ili se sumnja da ima fibrozu ima najmanje jednu srčanu bolest ili stanje. U nekim izvedbama, takvi postupci obuhvataju davanje subjektu modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim prekursorom. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21.

[0169]U nekim izvedbama, srčana bolest ili stanje je srčana hipertrofija. U nekim izvedbama, srčana bolest ili stanje je kardiomiopatija. U nekim izvedbama, kardiomiopatija je dilatativna kardiomiopatija, hipertrofička kardiomiopatija sa opstrukcijom, hipertrofička kardiomiopatija bez opstrukcije, restriktivna kardiomiopatija, aritmogena kardiomiopatija desnog ventrikula ili dijabetska kardiomiopatija.

[0170]U nekim izvedbama, srčana bolest ili stanje je bolest koronarnih arterija. U nekim izvedbama, srčana bolest ili stanje je bolest skladištenja povezana sa srcem, konstriktivni perikarditis, akutna miokardijalna infarkcija, hronična miokardijalna infarkcija, srčana aritmija ili fibroza povezana sa miokarditisom.

[0171]U nekim izvedbama, srčana bolest ili stanje je kvar srca. U nekim izvedbama, kvar srca je hipertenzivni kvar srca, dijastolički kvar srca, sistolički kvar srca ili kvar desnog srca.

[0172] U nekim izvedbama, srčana bolest ili stanje je bolest srčanih zalistaka. U nekim izvedbama, bolest srčanih zalistaka je stenoza mitralnih zalistaka, stenoza zalistaka aorte, stenoza trikuspidalnih zalistaka ili stenoza plućnih zalistaka. U nekim izvedbama, bolest srčanih zalistaka je insuficijencija mitralnih zalistaka, insuficijencija zalistaka aorte, insuficijencija trikuspidalnih zalistaka ili insuficijencija plućnih zalistaka.

[0173] Ovde su obezbeđeni postupci za tretman subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu, pri čemu pomenuti subjekt ima jetrinu bolest ili stanje. U nekim izvedbama, subjekt koji ima ili se sumnja da ima fibrozu ima najmanje jednu jetrinu bolest ili stanje. U nekim izvedbama, pomenuti postupci obuhvataju administriranje subjektu modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21. U nekim izvedbama, jetrina bolest ili stanje je hronična ozleda jetre. U nekim izvedbama, jetrina bolest ili stanje je infekcija sa virusom hepatitisa. U nekim izvedbama, infekcija sa hepatitisom je infekcija sa virusom hepatitisa C. U nekim izvedbama, jetrina bolest ili stanje je ne-alkoholni steatohepatitis. U nekim izvedbama, jetrina bolest ili stanje je ciroza.

[0174] Ovde su obezbeđeni postupci za tretman subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu, pri čemu pomenuti subjekt ima najmanje jednu bolest ili stanje jetra. Takođe, ovde su obezbeđeni postupci za tretman subjekta koji je identifikovan da ima ili se sumnja da ima fibrozu, pri čemu pomenuti subjekt ima najmanje jednu bolest ili stanje pluća. U nekim izvedbama, takvi postupci obuhvataju administriranje subjektu modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21. U nekim izvedbama, plućna bolest ili stanje je hronična opstruktivna bolest pluća.

[0175] Ovde su obezbeđeni postupci za tretman subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu, pri čemu pomenuti subjekt ima najmanje jednu drugu bolest ili stanje. Takođe, ovde su obezbeđeni postupci za tretman subjekta koji je identifikovan da ima ili se sumnja da ima fibrozu, gde pomenuti subjekt ima najmanje jednu drugu bolest ili stanje. U nekim izvedbama, takvi postupci obuhvataju administriranje subjektu neki modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njezinim prekursorom. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21. U nekim izvedbama jedna druga bolest ili stanje je plućna hipertenzija. U nekim izvedbama jedna druga bolest ili stanje je bolest povezana sa krvnim sudovima. U nekim takvim izvedbama, bolest koja je povezana sa krvnim sudovima je krutost arterija, medijaskleroza ili arterioskleroza. U nekim izvedbama jedna druga bolest ili stanje je skleroza creva. U nekim izvedbama druga bolest ili stanje je sistemska skleroza. U nekim izvedbama jedna druga bolest ili stanje je retroperitonealna fibroza, proliferativna fibroza, neoplastična fibroza, nefrogena sistemska fibroza, injekcijska fibroza, medijastinalna fibroza, mijelofibroza, sindrom post-vazektomijske boli ili reumatoidni artritis.

[0176] Ovde su obezbeđeni postupci za tretman subjekta koji ima fibroproliferativni poremećaj. U nekim izvedbama takvi postupci obuhvataju administriranje subjektu koji ima ili se sumnja da ima fibroproliferativni poremećaj neki modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK li sa nekim njenim prekursorom. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21.

[0177] Ovaj pronalazak se dodatno odnosi na tretmane za rak na bazi miRNK-21 koji uključuju ciljanje specifičnih tumora uz pomoć moduliranja SPRY-1 -potpomognutog ERK signaliziranja u tumorskim ćelijama. Poznato je da je miR-21 prekornerno eksprimirana u puno različitih tipova raka uključujući rak ezofagusa, adenokarcinom debelog creva, rak dojke, gliome, glioblastome, rak jajnika, hepatocelularni rak, rak glave i vrata, hroničnu limfocitnu leukemiju, rak pankreasa, da pomenemo samo neke.

[0178] Prema tome, ovaj pronalazak se takođe odnosi na dijagnozu, prevenciju i/ili terapiju već pomenutih tipova raka. Sve karakteristike koje su pomenute u zahtevima mogu da se kombinuju sa razotkrivanjima pomenutih tipova raka.

Određene rute za administraciju

[0179] U nekim izvedbama, administriranje subjektu obuhvata parenteralnu administraciju. U nekim izvedbama, administriranje subjektu obuhvata intravenoznu administraciju. U nekim izvedbama, administriranje subjektu obuhvata subkutanu administraciju.

[0180] U nekim izvedbama, administriranje subjektu obuhvata intra-arterijalnu administraciju. U nekim izvedbama, administriranje subjektu obuhvata intra-kardijalnu administraciju. Prikladna sredstva za intra-kardijalnu administraciju uključuju upotrebu katetera ili administriranje tokom operacije na otvorenom srcu.

[0181] U nekim izvedbama, administracija uključuje plućnu administraciju. U nekim izvedbama, plućna administracija obuhvata dostavu oligonukleotida (u formi aerosoli) u pluća subjekta uz pomoć inhalacije. Nakon inhalacije aerosolnog oligonukleotida subjektu, pomenuti oligonukleotid se raspoređuje po ćelijama u normalnom plućnom tkivu i tkivu koje je pod zapaljenjem, uključujući alveolarne makrofage, eozinofile, epitelijum, endotelijum krvnih sudova i bronhiolarni epitelijum. Prikladna naprava za dostavu farmaceutske kompozicije koja obuhvata modifikovani oligonukleotid uključuje, ali bez ograničenja; standardnu napravu za nebulizer. Formulacije i postupci za moduliranje veličine kapi koji koriste naprave za nebulizovanje sa namerom da se ciljaju specifični delovi respiratornog trakta i pluća su dobro poznati stručnjacima u polju. Dodatne prikladne naprave uključuju inhalere za suvi puder ili inhalere za tačno određenu dozu.

[0182] U nekim izvedbama, farmaceutske kompozicije se administriraju sa ciljem da se postigne lokalno umesto sistemsko izlaganje. Na primer, naprave za plućnu administraciju dostavljaju farmaceutsku kompoziciju u pluća, sa minimalnim sistemskim izlaganjem.

[0183] Dodatne prikladne rute za administraciju, ali bez ograničenja, su oralna, rektalna, transmukozalna, intestinalna, enteralna, topikalna, preko čepića, intratekalna, intraventrikularna, intraperitonealna, intranazalna, intraokularna, intramuskularaa, intramedularna i intratumoralna.

Određeni klinički ishodi

[0184] U nekim izvedbama, ovde pomenuti postupci obezbeđuju klinički željeni ishod za subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu.

[0185] U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je ublažavanje povećanja težine srca. U nekim takvim izvedbama, klinički željeni ishod je ublažavanje dilacije levog ventrikula. U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je ublažavanje narušenog frakcionalnog skraćivanja. U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je prevencija povećanja težine srca. U nekim takvim izvedbama, klinički željeni ishod je prevencija dilacije levog ventrikula. U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je prevencija narušenog frakcionalnog skraćivanja.

[0186] U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je poboljšana srčana funkcija.

[0187] U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je ublažavanje fibroze. U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je usporavanje daljnje progresije fibroze. U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je stopiranje daljnje progresije fibroze. U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je redukcija fibroze. U nekim izvedbama, klinički željeni ishod je redukcija sadržaja kolagena.

[0188] U nekim izvedbama, terapeutski željeni ishod je poboljšana funkcija jetra. Funkcija jetra može da se proceni uz pomoć testa za funkciju jetra, koji meri, među ostalim, nivo jetrinih transaminaza u krvi. U nekim izvedbama, subjekt koji ima nenormalnu funkciju jetra ima povećani nivo jetrinih transaminaza u krvi. Jetrene transaminaze iz krvi uključuju alanin aminotransferazu (ALT) i aspartat aminotransferazu (AST). U nekim izvedbama, subjekt koji ima nenormalnu funkciju jetra pokazuje povećani nivo bilirubina u krvi. U nekim izvedbama, subjekt ima nenormalne nivoe albumina u krvi. U nekim izvedbama, postupci koji su ovde obezbeđeni menjanju nivoe ALT, AST, bilirubina i/ili albumina u krvi na taj način da jedan ili više od pomenutih nivoa dolazi bliže normalnim granicama.

[0189] U nekim izvedbama, funkcija jetra subjekta se procenjuje uz pomoć Child-Pugh klasifikacijskog sistema, koji definiše tri klase funkcije jetra. U ovom klasifikacijskom sistemu, merenjima se pripisuju bodovi svakoj od pet kategorija: nivo bilirubina, nivo albumina, nivo protrombina, ascit i encefalopatija. Jedan bod se pripisuje za svaku od sledećih karakteristika: krvni bilirubin manje od 2.0 mg/dl; krvni albumin više od 3.5 mg/dl; protrombinsko vreme manje od 1.7 Internacionalnog normalizovanog omera (INR); nema ascita; ili nema encefalopatije. Dva boda se pripisuju za svaku od sledećih karakteristika: krvni bilirubin od 2-3 mg/dl; krvni bilirubin od 3.5 do 2.8 mg/dl; prothrombinsko vreme od 1.7-2.3 INR; ascit je blag do srednji; ili encefalopatija je blaga. Tri boda se pripisuju svakoj od sledećih karakteristika: bilirubin veći od 3.0 mg/dl; krvni albumin manji od 2.8 mg/dl; protrombinsko vreme veće od 2.3 INR; ascit je jak do težak; ili encefalopatija je jaka. Rezultati se sređuju, a Klasa A se pripisuje ishodu od 5-6 bodova, Klasa B za ishod od 7-9 bodova i Klasa C se pripisuje za ishod od 10-15 bodova. U nekim izvedbama, pomenuti postupci koji su ovde obezbeđeni dovode do poboljšanja funkcije jetra izmerene uz pomoć Child-Pugh klasifikacionog sistema.

Određeni ćeiijski fenotipovi

[0190] Ovde su obezbeđeni postupci za inhibiciju proliferacije fibroblasta. Takođe su ovde obezbeđeni postupci za stimuliranje apoptoze u fibroblastima. Dodatno su obezbeđeni postupci za povećanje belančevine Sproutv 1 u fibroblastu. U nekim izvedbama, takvi postupci obuhvataju kontaktiranje fibroblasta sa jedinjenjem koje obuhvata modifikovani oligonukleotid i ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21.

[0191] U nekim izvedbama, fibroblast jein vitro.U nekim izvedbama, fibroblast jein vivo.U nekim izvedbama, kontaktiranje se pojavljujein vitro.U nekim izvedbama, kontaktiranje se pojavljujein vivo.U nekim izvedbama, kontaktiranje se pojavljujeex vivo.

Određene dodatne terapije

[0192] Tretmani za fibrozu mogu da obuhvataju više od jedne terapije. Kao takvi su u nekim izvedbama ovde obezbeđeni postupci za tretman subjekta koji ima ili se sumnja da ima fibrozu koji obuhvataju administriranje najmanje jedne terapije zajedno sa administriranjem modifikovanog oligonukleotida koji ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom.

[0193] U nekim izvedbama, pomenuti postupci ovde obezbeđeni obuhvataju administriranje jednog ili više dodatnih farmaceutskih agenasa. U nekim izvedbama, dodatni farmaceutski agensi uključuju, ali bez ograničenja, diuretike (na primer, sprionolakton, eplerenon, furosemid), inotrope (na primer, dobutamin, milrinon), digoksin, vazodilatore, inhibitore encima koji konvertuje angiotensin II (ACE) (na primer, kaptopril, enalapril, lizinopril, benazepril, kinapril, fosinopril i ramipril), blokere receptora angiotensin II (ARB) (na primer, kandesartan, irbesartan, olmesartan, losartan, valsartan, telmisartan, eprosartan), blokere kalcijumskih kanala, izosorbid dinitrat, hidralazin, nitrati (na primer, izosorbid mononitrat, izosorbid dinitrat), hidralazin, beta-blokere (na primer, karvedilol, metoprolol) i natriuretičke peptide (na primer, nesiritid).

[0194] U nekim izvedbama, dodatna terapija može da bude farmaceutski agens koji pojačava imuno sistem tela, uključujući ciklofosfamid niske-doze, timostimulin, vitamine i nutricione dodatke (na primer, antioksidansi, uključujući vitamine A, C, E, beta-karotene, cink, selenijum, glutaton, koencim Q-10 i ehinacea) i vakcine, na primer, imunostimulirajući kompleks (ISCOM), koji obuhvata vakcinsku formulaciju koja kombinuje multimeričku prezentaciju antigena i nekog dodatka.

[0195]U nekim takvim izvedbama, dodatna terapija je izabrana sa ciljem da tretira ili ublaži nus-pojave jedne ili više farmaceutskih kompozicija iz ovoga pronalaska. Takve nus-pojave uključuju, bez ograničenja, nus-reakcije injekcije, abnormalnosti testa jetrine funkcije, abnormalnosti renalne funkcije, toksičnost jetre, renalna toksičnost, abnormalnosti centralnog nervnog sistema i miopatije. Na primer, povećani nivoi aminotransferaze u serumu mogu da ukazuju na toksičnost jetre ili abnormalnosti funkcije jetra. Na primer, povećani bilirubin može da ukazuje na toksičnost jetra ili abnormalnosti funkcije jetra.

[0196]U nekim izvedbama, jedna ili više farmaceutskih kompozicija iz ovoga pronalaska i jedna ili više drugih farmaceutskih agenasa se administriraju istovremeno. U nekim izvedbama, jedna ili više farmaceutskih kompozicija iz ovoga pronalaska i jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa se administriraju u različita vremena. U nekim izvedbama, jedna ili više farmaceutskih kompozicija iz ovoga pronalaska i jedan ili više drugih farmaceutskih agenasa su pripremljeni zajedno u jednoj formulaciji. U nekim izvedbama, jedna ili više farmaceutskih kompozicija iz ovoga pronalaska i jedan ili više farmaceutskih agenasa su pripremljeni odvojeno.

Određene farmaceutske kompozicije

[0197]U nekim izvedbama, jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid, koji je komplementaran sa miRNK, ili sa nekim njenim prekursorom, i koji je ovde opisan, se priprema kao farmaceutska kompozicija za tretman fibroze. U nekim izvedbama, jedinjenje koje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu, koja je komplementarna sa miRNK ili sa nekim njenim prekursorom, se priprema kao farmaceutska kompozicija za prevenciju fibroze.

[0198]U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska se administrira u formi dozne jedinice (na primer, tableta, kapsula, bolus i slično). U nekim izvedbama, takve farmaceutske kompozicije obuhvataju modifikovani oligonukleotid u dozi koja je izabrana iz 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 55 mg, 60 mg, 65 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 85 mg, 90 mg, 95 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg, 140 mg, 145 mg, 150 mg, 155 mg, 160 mg, 165 mg, 170 mg, 175 mg, 180 mg, 185 mg, 190 mg, 195 mg, 200 mg, 205 mg, 210 mg, 215 mg, 220 mg, 225 mg, 230 mg, 235 mg, 240 mg, 245 mg, 250 mg, 255 mg, 260 mg, 265 mg, 270 mg, 270 mg, 280 mg, 285 mg, 290 mg, 295 mg, 300 mg, 305 mg, 310 mg, 315 mg, 320 mg, 325 mg, 330 mg, 335 mg, 340 mg, 345 mg, 350 mg, 355 mg, 360 mg, 365 mg, 370 mg, 375 mg, 380 mg, 385 mg, 390 mg, 395 mg, 400 mg, 405 mg, 410 mg, 41 5 mg, 420 mg, 425 mg, 430 mg, 435 mg, 440 mg, 445 mg, 450 mg, 455 mg, 460 mg, 465 mg, 470 mg, 475 mg, 480 mg, 485 mg, 490 mg, 495 mg, 500 mg, 505 mg, 510 mg, 515 mg, 520 mg, 525 mg, 530 mg, 535 mg, 540 mg, 545 mg, 550 mg, 555 mg, 560 mg, 565 mg, 570 mg, 575 mg, 580 mg, 585 mg, 590 mg, 595 mg, 600 mg, 605 mg, 610 mg, 615 mg, 620 mg, 625 mg, 630 mg, 635 mg, 640 mg, 645 mg, 650 mg, 655 mg, 660 mg, 665 mg, 670 mg, 675 mg, 680 mg, 685 mg, 690 mg, 695 mg, 700 mg, 705 mg, 710 mg, 715 mg, 720 mg, 725 mg, 730 mg, 735 mg, 740 mg, 745 mg, 750 mg, 755 mg, 760 mg, 765 mg, 770 mg, 775 mg, 780 mg, 785 mg, 790 mg, 795 mg, and 800 mg. U nekim takvim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska obuhvata dozu modifikovanog oligonukleotida koja je izbrana iz 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg i 800 mg.

[0199] U nekim izvedbama, farmaceutski agens je sterilni liofilizovani modifikovani oligonukleotid koji se nalazi u prikladnom razređivaču, na primer, sterilna voda za injekciju ili sterilni slani rastvor za injekciju. Re-konstituisani produkt se administrira kao supkutana injekcija ili kao intravenozna infuzija nakon razređivanja u slanom rastvoru. Liofilizovani lek sa sastoji od modifikovanog oligonukleotida koji je pripremljen u vodi za injekciju, ili u slanom rastvoru za injekciju, kojem je podešen pH na 7.0-9.0 uz pomoć kiseline ili baze tokom pripreme, a nakon toga je liofilizovan. Liofilizovani modifikovani oligonukleotid može da sadrži 25-800 mg modifikovanog oligonukleotida. Treba da se razume da ovo obuhvata 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 i 800 mg modifikovanog liofilizovanog oligonukleotida. Liofilizovani lek može da se pakuje u prozirnoj bočici od 2 mL Tipa I (tretiranu sa amonijum sulfatom), koja je pokrivena sa gumenim zatvaračem od bromobutila i zapečećena sa aluminijumskim pečatom FLIP-OFF<*>.

[0200] U nekim izvedbama, kompozicije iz ovoga pronalaska mogu dodatno da sadrže druge dodatne komponente koje se uobičajeno nalaze u farmaceutskim kompozicijama, u nivoima koji su uobičajeni za stanje tehnike u tom području. Tako, na primer, pomenute kompozicije mogu da sadrže dodatne, kompatibilne, farmaceutski-aktivne materijale poput, na primer, anti-pruritike, astringente, lokalne anestetike ili agense protiv zapaljenja ili mogu da sadrže dodatne materijale koji su korisni u fiziološkim formulacijama sa različitim doznim formama kompozicija iz ovoga pronalaska, poput boja, agenasa za okus, prezervativa, anti-oksidanasa, opacifijera, agenasa za ugušćivanje i stabilizatora. Međutim, takvi materijali, kada su dodani, ne treba da interferišu sa biološkim delovanjima komponenata kompozicija iz ovoga pronalaska. Pomenute formulacije mogu da se sterilizuju i, ako je poželjno, pomešaju sa pomoćnim agensima, na primer, lubrikanatima, prezervativima, stabilizatorima, agensima za vlaženje, emulzifijerima, solima koje utiču na osmotski pritisak, puferima, koloranatima, agensima za okus i/ili aromatskim supstancijama i slično, koje ne deluju štetno na oligonukleotid iz formulacije.

[0201] U nekim izvedbama, farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska obuhvataju jedan ili više modifikovanih oligonukleotida i jedan ili više ekscipijenata. U nekim takvim izvedbama, pomenuti ekscipijenti su izabrani iz vode, slanog rastvora; alkohola, polietilen glikola, želatina, laktoze, amilaze, magnezijum stearata, talka, silicijumove kiseline, viskoznog parafina, hidroksimetilceluloze i polivinilpirolidona.

[0202] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska je pripremljena uz pomoć poznatih tehnika, uključujući, ali bez ograničenja, mešanje, rastvaranje, granulovanje, tehnike stvaranja dražeja, tehnike stvaranja praha, emulzifikovanje, enkapsuliranje, postupka hvatanja ili tabelatovanja.

[0203] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska je tečnost (na primer, suspenzija, eliksir i/ili rastvor). U nekim takvim izvedbama, tečna farmaceutska kompozicija se priprema uz pomoć korišćenja sastojaka koji su poznati stanju tehnike, uključujući, ali bez ograničenja, vodu, glikole, ulja, alkohole, agense za okus, prezervative i agense za bojanje.

[0204] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska je čvrsta materija (na primer, puder, tabelata i/ili kapsula). U nekim takvim izvedbama, čvrsta farmaceutska kompozicija koja obuhvata jedan ili više oligonukleotida se priprema uz pomoć sastojaka koji su poznati stanju tehnike, uključujući, ali bez ograničenja, škrobove, šećere, razređivače, agense za granulovanje, lubrikante, veznike i agense za raspadanje.

[0205] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska se formuliše kao depot-preparat. Određeni takvi depot-preparati tipično deluju duže od ne-depot-preparata. U nekim izvedbama, takvi preparati se administriraju uz pomoć implantacije (na primer supkutano ili intramuskularno) ili uz pomoć intramuskulane injekcije. U nekim izvedbama, depot-preparati se pripremaju uz pomoć prikladnih polimernih ili hidrofobnih materijala (na primer, emulzija u nekom prihvatljivom ulju) ili jonskih izmenjivača, ili kao prikladni derivati za spajanje, na primer, kao rastvorljiva so za spajanje.

[0206] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska obuhvata sistem za dostavu. Primeri sistema za dostavu uključuju, ali bez ograničenja, liposome i emulzije. Određeni sistemi za dostavu su korisni za pripremu nekih farmaceutskih kompozicija uključujući one koje obuhvataju hidrofobna jedinjenja. U nekim izvedbama se koriste određeni organski rastvarači poput dimetilsulfoksid.

[0207] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska obuhvata jedan ili više molekula za tkivnu-specifičnu dostavu koji su predviđeni da dostave jedan ili više farmaceutskih agenasa iz ovoga pronalaska u specifična tkiva ili tipova ćelija. Na primer, u nekim izvedbama, farmaceutske kompozicije uključuju liposome koji su prekriveni sa tkivno-specifičnim antitelom.

[0208] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska obuhvata sistem sa ko-rastvaračem. Određeni sistemi sa ko-rastvaračem obuhvataju, na primer, benzil alkohol, ne-polarni surfaktant, organski polimer koji može da se meša sa vodom i nekom vodenom fazom. U nekim izvedbama, takvi sistemi sa ko-rastvaračem su korisni za hidrofobna jedinjenja. Primer pomenutog sistema sa ko-rastvaračem, koji ne ograničava, je sistem sa VPD ko-rastvaračem, koji je rastvor apsolutnog etanola koji sadrži 3% w/w benzil alkohola, 8% w/v ne-polarnog surfaktanta Polisbrbate 80™ i 65% w/v polietilen glikola 300. Proporcije takvih sustema sa ko-rastvaračima mogu da variraju značajno bez da seriozno menjaju njihovu rastvorljivost i karakteristike toksičnosti. Dodatno, identitet komponenti ko-rastvarača može da varura: na primer, drugi surfaktanti migu da se koriste umesto Polisorbata 80™; frakciona veličina polietilen glikola može da varira; drugi biokompatiblni polimeri miogu da zamene polietilen glikol, na primer, polivinil pirolidon; i drugi šećeri ili polisaharidi mogu da zamene dekstrozu.

[0209]U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska obuhvata sistem sa odgođenim-otpuštanjem. Ne-ograničavajući primer takvih sistema za odgođeno-otpuštanje je semi-permeabilni matriks čvrstih hidrofobnih polimera. U nekim izvedbama, sistemi za odgođeno-otpuštanje mogu da, u zavisnosti o njihovoj hemijskoj prirodi, oslobode farmaceutske agense tokom perioda koji se meri časovima, danima, nedeljama ili mesecima.

[0210] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska se priprema za oralnu administraciju. U nekim takvim izvedbama, farmaceutska kompozicija se formuliše uz pomoć kombinovanja jednog ili više jedinjenja koji sadrže modifikovani oligonukleotid sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivim nosiocima. Određeni takvi nosioci omogućavaju pomenutim farmaceutskim kompozicijama da se formulišu kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, gusti rastvori, suspenzije i slično, za oralnu upotrebu od strane subjekta. U nekim izvedbama, farmaceutske kompozicije za oralnu upotrebu se dobijaju uz pomoć mešanja oligonukleotida sa jednim ili više krutih ekscipijenata. Prikladni ekscipijenti uključuju, ali bez ograničenja, filere, poput šećera, uključujući laktozu, saharozu, manitol ili sorbitol; celulozne preparate poput, na primer, kukuruznog škroba, pšeničnog škroba, škroba od pirinača, škroba od krompira, želatina, gume tragakant, metil celuloze, hidroksipropilmetil-celuloze, natrijum karboksimetilceluloze i/ili polivinilpirolidona (PVP). U nekim izvedbama, takve mešavine se ponekad mrve, a ponekad im se dodaju pomoćne materije. U nekim izvedbama, stvaraju se takve farmaceutske kompozicije gde se dobijaju tablete ili jedra dražeja. U nekim izvedbama, se dodaju agensi za raspadanje (na primer, unakrsno-spojeni polivinil pirolidon, agar ili alginska kiselina ili njene soli, poput natrijum alginata).

[0211] U nekim izvedbama, jedra dražeja su omotana. U nekim takvim izvedbama, mogu da se koriste koncentrisani rastvori šećera, koji ponekad mogu da sadrže gumu arabiku, talk, polivinil pirolidon, karbopol gel, polietilen glikol i/ili titanijum dioksid, bistre rastvore i prikladne organske rastvarače ili mešavine rastvarača. Boje ili pigmenti mogu da se dodaju u

tablete ili premaze za dražeje.

[0212] U nekim izvedbama, farmaceutske kompozicije za oralnu administraciju supush- fit-kapsule načinjene od želatina. Određenepush- Jit- kapsuleobuhvataju jedan ili više farmaceutskih agenasa iz ovoga pronalaska pomešanih sa jednim ili više filera poput laktoze, veznika poput škrobova i/ili lubrikanata poput talka ili magnezijum stearata i, ponekad, stabilizatora. U nekim izvedbama, farmaceutske kompozicije za oralnu administraciju su meke, zatvorene kapsule načinjene od želatina i plasticizera, poput glicerola ili sorbitola. U nekim mekim kapsulama, jedan ili više farmaceutskih agenasa iz ovoga pronalaska su rastvoreni ili suspendovani u prikladnim tečnostima, poput masnih ulja, tečnog parafina ili tečnih polietilen glikola. Dodatno, mogu da se dodaju stabilizatori.

[0213] U nekim izvedbama, farmaceutske kompozicije se pripremaju za bukalnu administraciju. Određene takve farmaceutske kompozicije su tabelate ili pilule koje su formulisane na konvencionalan način.

[0214] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija se priprema za administraciju preko injekcije (na primer, intravenozno, supkutano, intramuskularno itd.). U nekim takvim izvedbama, farmaceutska kompozicija obuhvata nosilac i je formulisana u vodenom rastvoru, poput vode ili fiziološki kompatibilnih pufera poput Hanks-ovog rastvora, Ringer-ovg rastvora ili fiziološkog slanog pufera. U nekim izvedbama, mogu da budu uključeni i drugi sastojci (na primer, sastojci koji poboljšavaju rastvorljivost ili služe kao prezervativi). U nekim izvedbama, suspenzije za injektiranje se pripremaju uz pomoć odgovarajućih tečnih nosioca, agenasa za suspendovanje i slično. Određene farmaceutske kompozicije za injekciju se pripremaju u unitarnim doznim formama, na primer, ampule ili multi-doznu kontejneri. Određene farmaceutske kompozicije za injekciju su suspenzije, rastvori ili emulzije u ulju ili vodenim prenosnicima, i mogu da sadrže agense za formulisanje poput agenasa za suspendovanje, stabilizovanje i/ili dispergovanje. Određeni rastvarači prikladni za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama za injekciju uključuju, ali bez ograničenja, lipofilne rastvarače i masna ulja, poput ulja sušama, esteri sintetskih masnih kiselina, poput etil oleata ili triglicerida, i liposome. Suspenzije za vodenu injekciju mogu da sadrže supstancije koje povećavaju viskoznost suspenzije, poput natrijum karboksimetil celuloze, sorbitola ili dekstrana. Ponekad, takve suspenzije mogu takođe da sadrže odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost farmaceutskih agenasa sa ciljem da omoguće pripremu visoko koncentrisanih rastvora.

[0215]U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija se priprema za transmukozalnu administraciju. U nekim takvim izvedbama, u formulaciji se koriste penetranti koji su prikladni za određenu barijeru koja treba da se pređe. Takvi penetranti su opšte poznati stanju tehnike.

[0216] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija se priprema za administraciju uz pomoć inhalacije. Određene takve farmaceutske kompozicije za inhalaciju se pripremaju u formi aerosolnog spreja u pakovanju pod pritiskom ili u nebulizeru. Određene takve farmaceutske kompozicije sadrže propelant, na primer, dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan, ugljenik dioksid ili neki drugi prikladan gas. U nekim izvedbama koje koriste aerosol pod pritiskom, dozna jedinica može da bude određena uz pomoć zalistaka koji dostavlja određenu količinu. U nekim izvedbama, mogu da se formulišu kapsule i punjenja za inhaler ili insuflator. Određene takve formulacije sadrže mešavinu praha farmaceutskog agensa iz ovoga pronalaska i prikladan puder za bazu poput laktoze ili škroba.

[0217] U nekim izvedbama; farmaceutska kompozicija se priprema za rektalnu administraciju, poput čepića ili retencijskih enema. Određene takve farmaceutske kompozicije sadrže poznate sastojke, poput putera od kakaa i/ili drugih glicerida.

[0218] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija se priprema za topikalnu administraciju. Određene takve farmaceutske kompozicije obuhvataju pomešane baze za vlaženje, poput masti i krema. Prikladne baze za masti uključuju, ali bez ograničenja, petrolatum, petrolatum plus isparljive silikone i lanolin i vodu u uljanim emulzijama. Prikladne baze za kreme uključuju, ali bez ogranilenja, hladan krem i hidrofilnu mast.

[0219] U nekim izvedbama, farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska obuhvata modifikovani oligonukleotid u terapeutski aktivnoj količini. U nekim izvedbama, terapeutski efektivna količina je dovoljna da spreći, olakša ili ublaži simptome bolesti ili da produži preživljenje subjekta koji se tretira. Određivanje terapeutski efektivne količine je dobro poznato stručnjacima u polju.

[0220]U nekim izvedbama, jedan ili više modifikovanih oligonukleotida iz ovoga pronalaska se formuliše kao pro-lek. U nekim izvedbama, nakonin vivoadministracije, pro-lek se hemijski konvertuje u biološki, farmaceutski ili terapeutski aktivniju formu modifikovanog oligonukleotida. U nekim izvedbama, pro-lekovi su korisni zbog toga šta su lakši za administraciju u uporedbi sa odgovarajućom aktivnom formom. Na primer, u nekim instancama, pro-lek može da bude više bio-dostupan (na primer, preko oralne administracije) u uporedbi sa odgovarajućom aktivnom formom. U nekim instancama, pro-lek može da ima poboljšanu rastvorljivost u uporedbi sa odgovarajućom aktivnom formom. U nekim izvedbama, pro-lekovi su manje rastvorljivi u vodi u uporedbi sa odgovarajućom aktivnom formom. U nekim instancama, takvi pro-lekovi poseduju superiorniju mogućnost prolaska kroz ćelijsku membranu, pri čemu je rastvorljivost u vodi štetna za mobilnost. U nekim izvedbama, pro-lek je ester. U nekim takvim izvedbama, ovaj ester se metabolički hidrolizuje u karboksilnu kiselinu nakon administracije. U nekim instancama, pomenuta karboksilna kiselina koja sadrži jedinjenje je odgovarajuća aktivna forma. U nekim izvedbama, pro-lek obuhvata kratak peptid (poliaminokiselina) koji je spojen na kiselu grupu. U nekim takvim izvedbama, pomenuti peptid je porezan nakon administracije sa ciljem da se formira odgovarajuća aktivna forma.

[0221JU nekim izvedbama, pro-lek se proizvodi uz pomoć modifikovanja farmaceutski aktivnog jedinjenja na takav način da će aktivno jedinjenje biti regenerisano nakonin vivoadministracije. Pomenuti pro-lek može da se stvori tako da menja metaboličku stabilnost transportnih karakteristika leka, sa ciljem da se prikriju nus-pojave ili toksičnost, da se poboljša okus leka ili da se promene druge karakteristike ili svojstva leka. Poznavajući farmakodinamičke postupke i metabolizam lekovain vivo,stručnjaci, jednom kada je farmaceutski aktivno jedinjenje poznato, mogu da dizajniraju pro-lekove pomenutog jedinjenja (vidi, na primer, Nogradv (1985) Medicinal Chemistrv A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, str. 388-392).

Određena jedinjenja

[0222]U nekim izvedbama, ovde obezbeđeni postupci obuhvataju administraciju jedinjenja koje sadrži modifikovani oligonukleotid. U nekim izvedbama, jedinjenje se sastoji od modifikovanog oligonukleotida.

[0223] U nekim takvim izvedbama, jedinjenje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji je hibridizovan sa komplementarnim lancem, na primer, jedinjenje koje obuhvata dvo-lančano oligomerno jedinjenje. U nekim izvedbama, hibridizacija modifikovanog oligonukleotida sa komplementarnim lancem formira najmanje jedan tupi kraj. U nekim takvim izvedbama, hibridizacija modifikovanog oligonukleotida sa komplementarnim lancem formira rupi kraj na svakom terminusu dvo-lančanog oligomernog jedinjenja. U nekim izvedbama, terminus modifikovanog oligonukleotida obuhvata jedan ili više dodatno spojenih nukleozida u odnosu na broj spojenih nukleozida iz komplementarnog lanca. U nekim izvedbama, jedan ili više dodatnih nukleozida se nalazi na 5'-terminusu modifikovanog oligonukleotida. U nekim izvedbama, jedan ili više dodatnih nukleozida se nalazi na 3'-terminusu modifikovanog oligonukleotida. U nekim izvedbama, najmanje jedna nukleobazna iz nukleozida iz jednog ili više dodatnih nukleozida je komplementarna sa ciljnom RNK. U nekim izvedbama, svaka nukleobaza od svakog od jednog ili više dodatnih nukleozida je komplementarna sa ciljnom RNK. U nekim izvedbama, terminus komplementarnog lanca obuhvata jedan ili više spojenih nukleozida u odnosu na broj spojenih nukleozida iz modifikovanog oligonukleotida. U nekim izvedbama, jedan ili više dodatno spojenih nukleozida se nalazi na 3'-terminusu komplementarnog lanca. U nekim izvedbama, jedan ili više dodatnih spojenih nukleozida se nalazi na 5'-terminusu komplementarnog lanca. U nekim izvedbama, dva dodatna spojena nukleozida su spojena na terminus. U nekim izvedbama, jedan dodatno spojen nukleozid je spojen na terminusu.

[0224] U nekim izvedbama, jedinjenje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji je konjugiran na jedan ili više ostataka šta pojačava delovanje, ćelijsku distribuciju ili ćelijski ulazak nastalih anfee^e-oligonukleotida. U nekim takvim izvedbama, ostatak je holesterolski ostatak ili lipidni ostatak. Dodatni ostaci za konjugaciju uključuju ugljo-hidrate, fosfolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrakinon, akridin, fluoresceine, rodamine, kumarine i boje. U nekim izvedbama, konjugovana grupa je spojena direktno na modifikovani oligonukleotid. U nekim izvedbama, konjugirana grupa je spojena na modifikovani oligonukleotid uz pomoć ostataka za spajanje koji je izabran iz amino, hidroksila, karboksilne kiseline, tiola, hemijskih ne-zasičenja (na primer, dvostruke ili trostruke veze), 8-amino-3,6-dioksaoktanoične kiseline (ADO), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-l-karboksilata (SMCC), 6-aminoheksanoične kiseline (AHEX ili AHA), supstituisanog Cl-CIO alkila, supstituisanog ili ne-supstituisanog C2-C10 alkenila i supstituisanog ili ne-supstituisanog C2-C10 alkinil. U nekim takvim izvedbama, supstituentna grupa je izabrana iz hidroksila, amino, alkoksi, karboksi, benzila, fenila, nitro, tiola, tioalkoksi, halogena, alkila, arila, alkenila i alkinila.

[0225]U nekim takvim izvedbama, pomenuto jedinjenje obuhvata modifikovani oligonukleotid koji ima jednu ili više grupa za stabilizovanje koje su spojene na jedan ili oba terminusa modifikovanog oligonukleotida sa ciljem da pojačaju karakteristike poput, na primer, nukleaznu stabilnost. Među stabilizirajućim grupama su uključene i ca/7-strukture. Ove terminalne modifikacije štite modifikovani oligonukleotid od egzonukleazne degradacje, i mogu da pomognu tokom dostave i/ili lokalizovanja u ćeliji. Pomenuta cap-struktura može da se nalazi na 5-terminusu (5'-cap) ili na 3'-terminus (3'-cap); ili može da bude prisutna na oba kraja. Ca/?-strukture uključuju, na primer, invertne deoksi abaznecap- ove.

[0226]Prikladne cap-strukture uključuju 4',5'-metilen nukleotid, l-(beta-D-eritrofuranozil) nukleotid, 4'-tio nukleotid, karbociklički nukleotid, 1,5-anhidroheksitol nukleotid, L-nukleotid, alfa-nukleotid, nukleotid sa modifikovanom bazom, fosforoditioatno spajanje, treo-pentofuranozilni nukleotid, aciklički 3',4'-seko nukleotid, aciklički 3,4-dihidroksibutilni nukleotid, aciklički 3,5-dihidroksipentilni nukleotid, 3'-3'-invertni nukleotidni ostatak, 3-3'-invertni abazni ostatak, 3'-2'-invertni nukleotidni ostatak, 3'-2'-invertni abazni ostatak, 1,4-butandiol fosfat, 3'-fosforamidat, heksilfosfat, aminoheksil fosfat, 3'-fosfat, 3'-fosforotioat, fosforoditioat, premošćeni metilfosfonatni ostatak i ne-premošćeni metilfosfonatni ostatak 5'-amino-alkil fosfat, l,3-diamino-2-propil fosfat, 3-aminopropil fosfat, 6-aminoheksil fosfat, 1,2-aminododecil fosfat, hidroksipropil fosfat, 5'-5'-invertni nukleotidni ostatak, 5'-5'-invertni abazni ostatak, 5'-fosforamidat, 5'-fosforotioat, 5'-amino, premošćeni i/ili ne-premošćeni 5'-fosforamidat, fosforotioat i 5'-merkapto ostatak.

Određene nukleobazne sekvence

[0227]Ovde su obezbeđeni postupci za tretman ili prevenciju fibroze. U nekim izvedbama, pomenuti postupci obuhvataju administraciju farmaceutske kompozicije koja obuhvata modifikovani oligonukleotid. U nekim izvedbama, pomenuti postupci obuhvataju administraciju jedinjenja koje sadrži modifikovani oligonukleotid. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili nekim njenim prekursorom. U nekim izvedbama, miRNK je miR-21.

[0228] Nukleobazne sekvence zrelih miRNK i njihove odgovarajuće stabljika-omča sekvence, ovde opisane, su sekvence koje mogu da se pronađu u miRBase, a to je baza podataka koja može da se pretražuje preko internetske mreže i sadrži miRNK sekvence i anotacije, a nalazi se na adresi http:// mikrornk. sanger. ac. uk/. Upisi u miRBase bazi podataka predstavljaju predviđeni deo ukosnice iz miRNK transkripta (stabljika-omča), sa informacijom o lokaciji i sekvenci zrele miRNK sekvence. miRNK stabljika-omča sekvence u bazi podataka nisu nužno prekursori miRNK (pre-miRNK), i mogu da istovremeno uključuju pre-miRNK i neke bočne sekvence iz predviđenog primarnog transkripta. miRNK nukleobazne sekvence, ovde opisane, obuhvataju bilo koju verziju miRNK, uključujući sekvence koje su opisane u Release 10.0 iz miRBase baze podataka i sekvence koje su opisane u bilo kojem ranijem Release iz miRBase baze podataka. Novi ispis sekvenci iz baze može da dovede do promene imena nekih miRNK. Takav ispis može da rezultuje u varijaciji zrele miRNK sekvence. Jedinjenja iz ovoga pronalaska obuhvataju modifikovane oligonukleotide koji su komplementarni sa bilo kojom verzijom nukleobaznih sekvenci miRNK koje su ovde opisane.

[0229] Treba da se shvati daje bilo koja nukleobazna sekvenca, koja je ovde predstavljena, nezavisna o bilo kojoj modifikaciji na šećernom ostatku, internukleozidnom spajanju ili nukleobaze. Dodatno treba da se razume da nukleobazna sekvenca koja obuhvata U takođe obuhvata istu nukleobaznu sekvencu u kojoj je 'U' zamenjen sa T na jednoj ili više pozicija koje sadrže 'U." Obrnutu, treba da se shvati da nukleobazna sekvenca koja obuhvata T takođe obuhvata istu nukleobaznu sekvencu u kojoj je T zamenjen sa 'U' na jednoj ili više pozicija koje sadrže T.

[0230] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miRNK ili nekim njenim prekursorom, šta znači da nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identična sa komplementom od miRNK ili njenim prekursorom preko regiona od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ili više nukleobaza, ili da dve sekvence hibridizuju u rigoroznim uslovima hibridizacije. Prema tome, u nekim izvedbama, nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida može da ima jednu ili više pogrešno-sparenih baza u odnosu na ciljnu miRNK ili ciljni prekursor miRNK, i je sposobna da hibridizuje sa svojom ciljnom sekvencom. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je 100% komplementarna sa miRNK ili njenim prekursorom. U nekim izvedbama, nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miRNK ćelom svojom dužinom.

[0231] U nekim izvedbama, miR-21 ima nukleobaznu sekvencu 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3' (SEQ ID Br: 1). U nekim izvedbama, miR-21 stabljika-omča sekvenca ima nukleobaznu sekvencu 5'-UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACC

AGUCGAUGGGCUGUCUGACA-3' (SEQ ID Br: 11).

[0232] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima sekvencu koja je komplementarna sa nukleobaznom sekvencom miR-21 koja je prikazana u SEQ ID Br: 1.

[0233] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima sekvencu koja je komplementarna sa nukleobaznom sekvencom miRNK iz stabljika-omča sekvence koja je prikazana kao SEQ ID Br: 11. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa regionom nukleobaza 8-29 iz SEQ ID Br: 11. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima sekvencu koja je komplementarna sa regionom nukleobaza 46 do 66 iz SEQ ID Br: 11.

[0234] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja obuhvata nukleobaznu sekvencu 5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3' (SEQ ID Br: 12).

[0235] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja obuhvata nukleobaznu sekvencu koja je prikazana kao SEQ ID Br: 12.

[0236] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa nukleobaznom sekvencom pri-miR koja obuhvata miR-21.

[0237] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa nukleobaznom sekvencom koja je najmanje 80% identična sa nukleobaznom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID Br: 1. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa nukleobaznom sekvencom koja je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96% ili najmanje 98% identična sa nukleobaznom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID Br: 1.

[0238] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa nukleobaznom sekvencom koja je najmanje 80% identična sa nukleobaznom sekvencom stabljika-omča miR-21 koja je prikazana u SEQ ID Br: 11. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa nukleobaznom sekvencom koja je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96% ili najmanje 98% identična sa nukleobaznom sekvencom stabljika-omča miR-21 koja je prikazana u SEQ ID Br: 11.

[0239] U nekim izvedbama, nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je komplementarna ćelom svojom dužinom sa već pomenutom miRNK nukleobaznom sekvencom ili sa njenim prekursorom. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja ima jednu krivo-sparenu bazu u odnosu na nukleobaznu sekvencu iz zrele miRNK ili njenog prekursora. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja ima dve krivo-sparene baze u odnosu na nukleobaznu sekvencu iz miRNK ili njenog prekursora. U nekim takvim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja ima ne više od dve krivo-sparene baze u odnosu na nukleobaznu sekvencu zrele miRNK ili njenog prekursora. U nekim takvim izvedbama, krivo-sparene nukleobaze su kontinuirane. U nekim takvim izvedbama, krivo-sparene nukleobaze nisu kontinuirane.

[0240] U nekim izvedbama, broj spojenih nukleozida u modifikovanom oligonukleotidu je jednaki dužini zrele miRNK kojoj su komplementarni.

[0241] U nekim izvedbama, broj spojenih nukleozida iz modifikovanog oligonukleotid je manji od dužine zrele miRNK kojoj su pomenuti komplementarni. U nekim takvim izvedbama, broj spojenih nukleozida iz modifikovanog oligonukleotida je manji za jedan od dužine zrele miRNK kojoj su pomenuti komplementarni. U nekim takvim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima jedan nukleozid manje na 5'-terminusu. U nekim takvim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima jedan nukleozid manje na 3'-terminusu. U nekim takvim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima dva nukleozida manje na 5'-terminusu. U nekim takvim izvedbama, modifikovani oligonukleotid ima dva nukleozida manje na 3'-terminusu. Modifikovani oligonukleotid koji ima broj spojenih nukleozida koji je manji od dužine miRNK, pri čemu svaka nukleobaza iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarna svakoj nukleobazi na odgovarajućoj poziciji u miRNK, predstavlja modifikovani oligonukleotidu koji ima nukleobaznu sekvencu koja je 100% komplementarna tom delu miRNK sekvence.

[0242] U nekim izvedbama, broj spojenih nukleozida iz modifikovanog oligonukleotida je veći od dužine miRNK kojoj su pomenuti komplementarni. U nekim takvim izvedbama, nukleobaza nekog dodatnog nukleozida je komplementarna nukleobazi iz stabljika-omča sekvence miRNK. U nekim izvedbama, broj spojenih nukleozida iz modifikovanog oligonukleotida je veći za jedan u odnosu na dužinu miRNK kojoj je pomenuti komplementaran. U nekim takvim izvedbama, dodatni nukleozid se nalazi na 5'-terminusu iz modifikovanog oligonukleotida. U nekim takvim izvedbama, dodatni nukleozid se nalazi na 3'- terminusu modifikovanog oligonukleotida. U nekim izvedbama, broj spojenih nukleozida iz modifikovanog oligonukleotida je veći za dva u uporedbi sa dužinom miRNK kojoj su pomenuti komplementarni. U nekim takvim izvedbama, dva dodatna nukleozida se nalaze na 5'-terminusu iz modifikovanog oligonukleotida. U nekim takvim izvedbama, dva dodatna nukleozida se nalaze na 3'-terminusu modifikovanog oligonukleotida. U nekim takvim izvedbama, jedan dodatan nukleozid je lociran na 5'-terminusu, a jedan dodatan nukleozid je lociran na 3'-terminusu modifikovanog oligonukleotida.

[0243] U nekim izvedbama, deo pomenute nukleobazne sekvence modifikovanog oligonukleotida je 100% komplementaran nukleobaznoj sekvenci miRNK, ali pomenuti modifikovani oligonukleotid nije 100% komplementaran preko cele dužine. U nekim takvim izvedbama, broj nukleozida iz modifikovanog oligonukleotida koji je 100% komplementaran je veći od dužine miRNK. Na primer, modifikovani oligonukleotid koji sadrži 24 spojena nukleozida, pri čemu pomenute nukleobaze nukleozida 1 do 23 su sve komplementarne odgovarajućim pozicijama u miRNK koja je duga 23 nukleobaze, ima 23 nukleozidni deo koji je 100% komplementaran nukleobaznoj sekvenci miRNK i otprilike 96% ukupno komplementaran nukleobaznoj sekvenci miRNK.

[0244] U nekim izvedbama, nukleobazna sekvenca modifikovanog oligonukleotida je 100% komplementarna delu nukleobazne sekvence miRNK. Na primer, modifikovani oligonukleotid koji sadrži 22 spojena nukleozida, pri čemu nukleobaze iz nukleozida 1 do 22 su sve komplementarne odgovarajućoj poziciji u miRNK koja je duga 23 nukleobaze, je 100%. komplementaran delu od 22 nukleobaze iz nukleobazne sekvence iz miRNK. Takav modifikovani oligonukleotid ima otprilike 96%> ukupnu komplementarnost sa nukleobaznom sekvencom cele miRNK, i ima 100% komplementarnost sa delom od 22 nukleobaze u miRNK.

]0245] U nekim izvedbama, deo nukleobazne sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je 100% komplementaran delu nukleobazne sekvence miRNK, ili sa njenim prekursorom. U nekim takvim izvedbama, 15 kontinuiranih nukleobaza iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarno sa 15 kontinuiranih nukleobaza iz miRNK, ili sa njenim prekursorom. U nekim takvim izvedbama, 16 kontinuiranih nukleobaza iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarno sa 16 kontinuiranih nukleobaza iz miRNK, ili sa njenim prekursorom. U nekim takvim izvedbama, 17 kontinuiranih nukleobaza iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarno sa 17 kontinuiranih nukleobaza iz miRNK, ili sa njenim prekursorom. U nekim takvim izvedbama, 18 kontinuiranih nukleobaza iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarno sa 18 kontinuiranih nukleobaza iz miRNK, ili sa njenim prekursorom. U nekim takvim izvedbama, 19 kontinuiranih nukleobaza iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarno sa 19 kontinuiranih nukleobaza iz miRNK, ili sa njenim prekursorom. U nekim takvim izvedbama, 20 kontinuiranih nukleobaza iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarno sa 20 kontinuiranih nukleobaza iz miRNK, ili sa njenim prekursorom. U nekim takvim izvedbama, 22 kontinuirane nukleobaze iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarno sa 22 kontinuirane nukleobaze iz miRNK; ili sa njenim prekursorom. U nekim takvim izvedbama, 23 kontinuirane nukleobaze iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarno sa 23 kontinuirane nukleobaze iz miRNK, ili sa njenim prekursorom. U nekim takvim izvedbama, 24 kontinuirane nukleobaze iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarno sa 24 kontinuirane nukleobaze iz miRNK, ili sa njenim prekursorom.

Određeni modifikovani oligonukleotidi

[0246] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid sadrži 12 do 30 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid sadrži 15 do 25 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid sadrži 19 do 24 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid sadrži 21 do 24 spojena nukleozida.

[0247] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 12 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 13 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 14 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 15 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 16 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 17 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 18 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 19 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 20 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 21 spojenog nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 22 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 23 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 24 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 25 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 26 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 27 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 28 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 29 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid se sastoji od 30 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid obuhvata spojene nukleozide koji su izabrani iz kontinuiranih nukleobaza iz SEQ ID Br: 12.

Određene modifikacije

[0248] Modifikovani oligonukleotid iz ovoga pronalaska obuhvataju jednu ili više modifikacija u nukleobazi, šećeru i/ili internukleozidnom spajanju. Modifikovana nukleobaza, šećer i/ili internukleozidno spajanje mogu da se koriste umesto ne-modifikovane forme zbog poželjnih karakteristika poput, na primer, pojačanog ćelijskog ulaska, pojačanog afiniteta za druge oligonukleotidne mete ili mete od nukleinskih kiselina i povećane stabilnosti u prisutnosti nukleaza.

[0249] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid iz ovoga pronalaska obuhvata jedan ili više modifikovanih nukleozida. U nekim takvim izvedbama, modifikovani nukleozid je stabilizirajući nukleozid. Primer za stabilizirajuće nukleozide je šećer-modifikovani nukleozid.

[0250] U nekim izvedbama, modifikovani nukleozid je šećer-modifikovani nukleozid. U nekim takvim izvedbama, šećer-modifikovani nukleozidi mogu da dodatno obuhvataju prirodne ili modifikovane heterocikličke bazne ostatke i/ili prirodna ili modifikovana internukleozidna spajanja i mogu da uključuju dodatne modifikacije nezavisne od šećerne modifikacije. U nekim izvedbama, šećer-modifikovani nukleozid je 2-modifikovani nukleozid, gde je šećerni prsten modifikovan na ugljeniku na 2' iz prirodne riboze ili 2-deoksiriboze.

[0251] U nekim izvedbama, 2'-modifikovani nukleozid ima biciklički šećerni ostatak. U nekim takvim izvedbama, pomenuti biciklički šećerni ostatak je D šećer u alfa konfiguraciji. U nekim takvim izvedbama, pomenuti biciklički šećerni ostatak je D šećer u beta konfiguraciji. U nekim takvim izvedbama, pomenuti biciklički šećerni ostatak je L šećer u alfa konfiguraciji. U nekim takvim izvedbama, pomenuti biciklički šećerni ostatak je L šećer u beta konfiguraciji.

[0252] U nekim izvedbama, pomenuti biciklički šećerni ostatak obuhvata premosnu grupu među 2'- i 4'-ugljenikovih atoma. U nekim takvim izvedbama, premosna grupa obuhvata od 1 do 8 spojenih biradikalnih grupa. U nekim izvedbama, pomenuti biciklički šećerni ostatak obuhvata od 1 do 4 spojenih biradikalnih grupa. U nekim izvedbam, pomenuti biciklički šećerni ostatak obuhvata 2 ili 3 spojene biradikalne grupe. U nekim izvedbam, pomenuti biciklički šećerni ostatak obuhvata 2 spojene biradikalne grupe. U nekim izvedbam, spojena biradikalna grupa je izabrana iz -O-, -S-, -N(R,)-, -C(R,)(R2)-, -C(R|)=C(R,)-, -C(R,)=N-, - C(=NR,K -Si(R,)(R2)-, -S(=0)2-, -S(=0)-, -C(=0)- i -C(=S)-; gde svaki R, i R2je, nezavisno, H, hidroksil, C1-C12alkil, supstituisani Ci-Ci2alkil, C2-Ci2alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C]2alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, Cs-C20aril, supstituisani Cs-C2oaril, heterociklički radikal, supstituisani heterociklički radikal, heteroaril, supstituisani heteroaril, C5-C7aliciklički radikal, supstituisani C5-C7aliciklički radikal, halogen, supstituisani oksi (-0-), amino, supstituisani amino, azido, karboksil, supstituisani karboksil, acil, supstituisani acil, CN, tiol, supstituisani tiol, sulfonil (S(=0)2-H), supstituisani sulfonil, sulfoksil (S(=0)-H) ili supstituisani sulfoksil; a svaka supstituisana grupa je, nezavisno, halogen, Ci-C]2alkil, supstituisani C|-C|2alkil, C2-Ci2alkenil, supstituisani C2-Ci2alkenil, C2-Ct2alkinil, supstituisani C2-Ci2alkinil, amino, supstituisani amino, acil, supstituisani acil, Cj-C)2aminoalkil, Ci-Ci2aminoalkoksi, supstituisani C|-Ci2aminoalkil, supstituisani Q-Ci2aminoalkoksi ili zaštitna grupa.

[0253] U nekim izvedbama, pomenuti biciklički šećerni ostatak je premošćen između 2' i 4' ugljenikovih atoma sa biradikalnom grupom koja je izabrana iz -0-(CH2)p-, -0-CH2-,-0-CH2CH2-, -O-CH(alkil)-, -NH-(CH2)P-, -N(alkil)-(CH2)p-, -O-CH(alkil)-, -(CH(alkil))-(CH2)P-, -NH-0-(CH2)p-, -N(alkil)-0-(CH2)p- ili -0-N(alkil)-(CH2)p-, gde p je 1, 2, 3, 4 ili 5, a svaka alkilna grupa može da bude dodatno supstituisana. U nekim izvedbama, p je 1, 2 ili 3.

[0254] U nekim izvedbama, 2'-modifikovani nukleozid obuhvata 2'-substituentnu grupu koja je izabrana iz halo, alila, amino, azido, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O-, S- ili N(Rm)-alkila; O-, S- ili N(Rm)-alkenila; O-, S- ili N(Rm)-alkinila; O-alkilenil-O-alkila, alkinila, alkarila, aralkila, O-alkarila, O-aralkila, 0(CH2)2SCH3, 0-(CH2)2-0-N(Rm)(Rn) ili 0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn), gde svaki Rmi Rnje, nezavisno, H, amino-zaštitna grupa ili supstituisani ili ne-supstituisani Ci-Cioalkil. Pomenute 2'-supstituentne grupe mogu da budu dodatno supstituisani sa jednom ili više supstituentnim grupama koje su nezavisno izabrane iz hidroksila, amino, alkoksi, karboksi, benzila, fenila, nitro (N02), tiola, tioalkoksi (S-alkil), halogen, alkila, arila, alkenila i alkinila.

[0255] U nekim izvedbama, 2'-modifikovani nukleozid obuhvata 2'-supstituentnu grupu koja je izabrana iz F, NH2, N3, OCF3, 0-CH3, 0(CH2)3NH2, CH2-CH=CH2, 0-CH2-CH=CH2, OCH2CH2OCH3, 0(CH2)2SCH3, 0-(CH2)2-0-N(Rm)(Rn), -0(CH2)20(CH2)2N(CH3)2i N-supstituisanog acetamida (0-CH2-C(=0)-N(Rm)(Rn) gde svaki Rmi Rnje, nezavisno, H, amino-zaštitna grupa ili supstituisani ili ne-supstituisani Ci-Ci0alkil.

[0256]U nekim izvedbama, 2-modifikovani nukleozid obuhvata 2'-supstituentnu grupu koja je izabrana iz F, OCF3, 0-CH3, OCH2CH2OCH3, 2'-0(CH2)2SCH3, 0-(CH2)2-0-N(CH3)2, - 0(CH2)20(CH2)2N(CH3)2i 0-CH2-C(=0)-N(H)CH3.

[0257] U nekim izvedbama, 2'-modifikovani nukleozid obuhvata 2'-supstituentnu grupu koja je izabrana iz F, 0-CH3i OCH2CH2OCH3.

[0258] U nekim izvedbama, šećer-modifikovani nukleozid je 4'-tio modifikovani nukleozid. U nekim izvedbama, šećer-modifikovani nukleozid je 4'-tio-2'-modifikovani nukleozid. 4'-tio modifikovani nukleozid ima P-D-ribonukleozid gde 4-0 je zamenjen sa 4'-S. 4'-tio-2'-modifikovani nukleozid je 4'-tio modifikovani nukleozid u kojem je 2'-OH zamenjen sa 2'-supstituentnom grupom. Prikladne 2'-supstituentne grupe uključuju 2-OCH3, 2'-0-(CH2)2-OCH3i 2'-F.

[0259] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid iz ovoga pronalaska obuhvata jednu ili više internukleozidnih modifikacija. U nekim takvim izvedbama, svako internukleozidno spajanje modifikovanog oligonukleotida je modifikovano internukleozidno spajanje. U nekim izvedbama, modifikovano internukleozidno spajanje obuhvata fosforni atom.

[0260] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid iz ovoga pronalaska obuhvata najmanje jedno fosforotioatno internukleozidno spajanje. U nekim izvedbama, svako internukleozidno spajanje modifikovanog oligonukleotida je fosforotioatno internukleozidno spajanje.

[0261] U nekim izvedbama, modifikovano internukleozidno spajanje ne obuhvata fosforni atom. U nekim takvim izvedbama, internukleozidno spajanje nastaje preko alkilnog internukleozidnog spajanja sa kratkim lancem. U nekim takvim izvedbama, internukleozidno spajanje nastaje uz pomoć cikloalkilnih internukleozidnih spajanja. U nekim takvim izvedbama, internukleozidno spajanje nastaje kao mešano internukleozidno spajanje između heteroatoma i alkila. U nekim takvim izvedbama, internukleozidno spajanje nastaje u formi mešanih internukleozidnih spajanja između heteroatoma i cikloalkila. U nekim takvim izvedbama, internukleozidno spajanje nastaje preko jednog ili više heteroatomskih internukleozidnih spajanja sa kratkim lancem. U nekim takvim izvedbama, internukleozidno spajanje nastaje preko jednog ili više heterocikličkih internukleozidnih spajanja. U nekim takvim izvedbama, internukleozidno spajanje ima amidnu kičmu. U nekim takvim izvedbama, internukleozidno spajanje ima mešane delove, kao N, O, S i CH2.

[0262] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid obuhvata jednu ili više modifikovanih nukleobaza. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid obuhvata jedan ili više 5-metilcitozina. U nekim izvedbama, svaki citozin iz modifikovanog oligonukleotida sadrži 5-metilcitozin.

[0263[ U nekim izvedbama, modifikovana nukleobaza je izabrana iz 5-hidroksimetil citozina, 7-deazagvanina i 7-deazaadenina. U nekim izvedbama, modifikovana nukleobaza je izabrana iz 7-deaza-adenina, 7-deazagvanozina, 2-aminopiridina i 2-piridona. U nekim izvedbama, modifikovana nukleobaza je izabrana iz 5-supstituisanih pirimidina, 6-azapirimidina i N-2, N-6 i 0-6 supstituisanih purina, uključujući 2 aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinitcitozin.

[0264] U nekim izvedbama, modifikovana nukleobaza obuhvata policiklički heterocikal. U nekim izvedbama, modifikovana nukleobaza obuhvata triciklički heterocikal. U nekim izvedbama, modifikovana nukleobaza obuhvata fenoksazinski derivat. U nekim izvedbama, fenoksazin može da bude dodatno modifikovan sa ciljem da formira nukleobazu koja je poznata stanju tehnike kao G-stezaljka.

Određeni oligonukleotidni motivi

[0265] Prikladni motivi za modifikovane oligonukleotide iz ovoga pronalaska uključuju, ali bez ograničenja, potpuno modifikovane, uniformno modifikovane, pozicijski modifikovane i gapmer. Modifikovani oligonukleotidi koji imaju potpuno modifikovani motiv, uključujući i uniformno modifikovani motiv, mogu da se dizajniraju tako da ciljaju zrele miRNK. Alternativno, modifikovani oligonukleotidi koji imaju potpuno modifikovani motiv, uključujući i uniformno modifikovani motiv, mogu da se dizajniraju da ciljaju određena mesta u pri-miRNK ili pre-miRNK, sa ciljem blokiranja procesiranja miRNK prekursora u zrele miRNK. Modifikovani oligonukleotidi koji imaju potpuno modifikovani motiv ili uniformno modifikovani motiv su efektivni inhibitori miRNK aktivnosti. (0266] U nekim izvedbama, potpuno modifikovani oligonukleotid obuhvata šećernu modifikaciju na svakom nukleozidu. U nekim takvim izvedbama, množina nukleozida su 2'-O-metoksietil nukleozidi, a preostali nukleozidi su 2'-fluoro nukleozidi. U nekim takvim izvedbama, svaki od mnoštva nukleozida je 2'-0-metoksietil nukleozid, a svaki od mnoštva nukleozida je biciklički nukleozid. U nekim takvim izvedbama, potpuno modifikovani oligonukleotid dodatno obuhvata najmanje jedno modifikovano internukleozidno spajanje. U nekim takvim izvedbama, svako internukleozidno spajanje potpuno šećer-modifikovanog oligonukleotida je neko modifikovano internukleozidno spajanje. U nekim izvedbama, potpuni šećer-modifikovani oligonukleotid dodatno obuhvata najmanje jedno fosforotioatno internukleozidno spajanje. U nekim takvim izvedbama, svako internukleozidno spajanje iz potpuno šećer-modifikovanog oligonukleotida je fosforotioatno internukleozidno spajanje.

[0267] U nekim izvedbama, potpuno modifikovani oligonukleotid je modifikovani na svakom internukleozidnom spajanju. U nekim takvim izvedbama, svako internukleozidno spajanje iz potpuno modifikovanog oligonukleotida je fosforotioatno internukleozidno spajanje.

[0268] U nekim izvedbama, uniformno modifikovani oligonukleotid sadrži istu šećernu modifikaciju na svakom nukleozidu. U nekim takvim izvedbama, svaki nukleozid iz modifikovanog oligonukleotida obuhvata 2'-0-metoksietil šećernu modifikciju. U nekim izvedbama, svaki nukleozid iz modifikovanog oligonukleotida obuhvata 2'-0-metil šećernu modifikciju. U nekim izvedbama, svaki nukleozid iz modifikovanog oligonukleotida obuhvata 2'-fluoro šećernu modifikciju. U nekim takvim izvedbama, uniformno-modifikovani oligonukleotid dodatno obuhvata najmanje jedno modifikovano internukleozidno spajanje. U nekim takvim izvedbama, svako internukleozidno spajanje iz uniformno šećer-modifikovanog oligonukleotida je modifikovano internukleozidno spajanje. U nekim izvedbama, uniformno šećer-modifikovani oligonukleotid dodatno obuhvata najmanje jedno fosforotioatno internukleozidno spajanje. U nekim takvim izvedbama, svako internukleozidno spajanje iz uniformno šećer-modifikovanog oligonukleotida je fosforotioatno internukleozidno spajanje.

[0269] U nekim izvedbama, uniformno modifikovani oligonukleotid sadrži iste modifikacije u internukleozidnom spajanju. U nekim takvim izvedbama, svako internukleozidno spajanje iz uniformnog modifikovanog oligonukleotida je fosforotioatno internukleozidno spajanje.

[0270] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid obuhvata istu šećernu modifikaciju u svakom nukleozidu, a dodatno sadrži jednu ili više modifikacija internukleozidnog spajanja. U nekim takvim izvedbama, modifikovani oligonukleotid obuhvata jedno modifikovano internukleozidno spajanje na 5'-terminusu i jedno modifikovano internukleozidno spajanje na 3'-terminusu. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid sadrži dva modifikovana internukleozidna spajanja na 5'-terminusu i dva modifikovana internukleozidna spajanja na 3'-terminusu. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid obuhvata dva modifikovana internukleozidna spajanja na 5'-terminusu i tri modifikovana internukleozidna spajanja na 3'-terminusu. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid obuhvata dva modifikovana internukleozidna spajanja na 5'-terminusu i četiri modifikovana internukleozidna spajanja na 3'-terminusu. U nekim takvim izvedbama, modifikovano internukleozidno spajanje je fosforotioatno internukleozidno spajanje.

[0271] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid je predstavljen sa sledećom formulom III:

[0272] U nekim takvim izvedbama, jedinjenje je predstavljeno sa formulom III. U nekim izvedbama, Q je 2'-0-metil modifikovani nukleozid. U nekim izvedbama, x je fosforotioat. U nekim izvedbama, yje fosfodiester. U nekim izvedbama, svaki zl, z2, z3 i z4 je, nezavisno fosforotioat ili fosfodiester. U nekim izvedbama, n jer 6 do 17. U nekim izvedbama, L je holesterol. U nekim izvedbama, nje 12 do 17.

[0273] U nekim izvedbama, x je

[0274]Jedan od A i Bje S, dok je drugi O;

yje

[0275]Svaki od zl, z2, z3 i z4 je nezavisno x ili y;

n = 6-17

Lje

[0276]Gde: XjeN(CO)R7 ili NR7;

Svaki R<1>, R<3>i R9 je nezavisno, H, OH ili -CH2OR<b>pod uslovom da najmanje jedan od R<1>, R<3>i Ry je OH, a najmanje jedan odR<1>, R<3>iR<9>je-CH2OR<b>;

R7 je R<d>ili CrC20alkil supstituisan sa NRcRd ili NHC(0)R<d>;

R<c>jeHiliC,-C6alkiI;

R<d>je ugljeno-hidratni radikal; ili je steroidni radikal, koji je ponekad vezan na najmanje jedan ugljeno-hidratni radikal; a

R<b>je

gde je jedan od A i B predstavljen sa S dok je drugi O.

J0277]U nekim izvedbama, Rd je holesterol. U nekim izvedbama, svaki z<1>,z<2>,z<3>i z4 je

gde jedan od A i B je S, dok je drugi O.

[0278] U nekim izvedbama, R<1>je -CH2ORb U nekim izvedbama, R<9>je OH. U nekim izvedbama, R<1>i R<9>sutrans.U nekim izvedbama, R9 je OH. U nekim izvedbama, R<1>i R<3>sutrans.U nekim izvedbama, R<J>je -CH2OR<b>. U nekim izvedbama, R<1>je OH. U nekim izvedbama, R<1>i R<3>sutrans.U nekim izvedbama, R9 je OH. U nekim izvedbama, R<3>i R<9>sutrans.U nekim izvedbama, R<9>je CH2OR<b>. U nekim izvedbama, R<1>je OH. U nekim izvedbama, R<l>i R<9>sutrans.U nekim izvedbama, X je NC(0)R<7>. U nekim izvedbama, R7 je - CH2(CH2)3CH2NHC(0)Rd.

[0279J U nekim izvedbama, pozicijski modifikovani oligonukleotid sadrži regione spojenih nukleozida, u kojima svaki nukleozid iz svakog regiona obuhvata isti šećerni ostatak, i gde svaki nukleozid iz svakog regiona obuhvata šećerni ostatak koji je različit od onog u susednom regionu.

[0280] U nekim izvedbama, pozicijski modifikovani oligonukleotid sadrži najmanje 10 2'-fluoro modifikovana nukleozida. Takav pozicijski modifikovani oligonukleotid može da bude predstavljen sa sledećom formulom I:

svaki Nuii Nu3 je, nezavisno, stabilizirajući nukleozid;

najmanje 10 Nu2su 2'-fluoro nukleozidi;

svaki Li, L2i L3 je, nezavisno, internukleozidno spajanje;

svaki Tii T2je, nezavisno, H, hidroksil-zaštitna grupa, neka ponekad spojena grupa-konjugat ilicapping- grupa;

ni je od 0 do oko 3;

n2 je od oko 14 do oko 22;

n3 je od 0 do oko 3; i

kada nije 0, tada Tinije H ili hidroksil-zaštitna grupa, a ako n3je 0, tada T2nije H ili hidroksil-zaštitna grupa.

[0281] U nekim takvim izvedbama, ni i n3 su, nezavisno, svaki od 1 do oko 3. U nekim izvedbama, n, i n3su, nezavisno, svaki od 2 do oko 3. U nekim izvedbama, n, je 1 ili 2, a n3 je 2 ili 3. U nekim izvedbama, nji n3su svaki 2. U nekim izvedbama, najmanje jedan od ni i n3 je veći od nula. U nekim izvedbama, ni i n3 su svaki za sebe veći od nula. U nekim izvedbama, jedan od ni i n3 je veći od nula. U nekim izvedbama, jedan od ni i n3 je veći od jedan.

[0282]U nekim izvedbama, n2je od 16 do 20. U nekim izvedbama, n2je od 17 do 19. U nekim izvedbama, n2 je 18. U nekim izvedbama, n2 je 19. U nekim izvedbama, n2 je 20.

[0283]U nekim izvedbama, oko 2 do oko 8 od Nu?nukleozida su stabilizirajući nukleozidi. U nekim izvedbama, od oko 2 do oko 6 od Nu2nukleozida su stabilizirajući nukleozidi. U nekim izvedbama, od oko 3 do oko 4 od Nu2nukleozida su stabilizirajući nukleozidi. U nekim izvedbama, 3 od Nu2nukleozida su stabilizirajući nukleozidi.

[0284]U nekim izvedbama, svaki od Nu2stabilizirajućih nukleozida je odvojen od Nu3stabilizirajućih nukleozid sa 2 do oko 8 2'-fluoro nukleozida. U nekim izvedbama, svaki od Nu2stabilizirajućih nukleozida je odvojen od Nu3stabilizirajućih nukleozida sa 3 do oko 8 2'-fluoro nukleozida. U nekim izvedbama, svaki od Nu2stabilizirajućih nukleozida je odvojen od Nu3stabilizirajućih nukleozida sa 5 do oko 8 2'-fluoro nukleozida.

[0285| U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid obuhvata od 2 do oko 6 Nu2stabilizirajućih nukleozida. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid obuhvata 3 Nu2stabilizirajućih nukleozida.

[0286]U nekim izvedbama, svi Nu2stabilizirajući nukleozidi su spojeni u zajedničku kontinuiranu sekvencu. U nekim izvedbama, najmanje dva od Nu2stabilizirajućih nukleozida je odvojeno sa najmanje jednim 2'-fluoro nukleozidom. U nekim izvedbama, svaki od Nu2stabilizirajućih nukleozida je odvojen sa najmanje jednom 2'-fluoro nukleozidom.

[0287]U nekim izvedbama, najmanje dve kontinuirane sekvence Nu?2'-fluoro nukleozida su odvojene sa najmanje jednim stabilizirajućim nukleozidom pri ćemu svaka od pomenutih kontinuiranih sekvenci ima isti broj 2'-fluoro nukleozida.

[0288]U nekim izvedbama, Tji T2su svi, nezavisno, H ili hidroksil-zaštitna grupa. U nekim izvedbama, najmanje jedan od T| i T2je 4,4'-dimetoksitritil. U nekim izvedbama, najmanje jedan od T| i T2je neka ponekad spojena konjugatna grupa. U nekim izvedbama, najmanje jedan od T| i T2jecapping- grupa.U nekim izvedbama, pomenutacapping- grupaje invertna deoksi abazna grupa.

[0289]U nekim izvedbama, pozicijski modifikovani oligonukleotid obuhvata najmanje jedno modifikovano internukleozidno spajanje. U nekim takvim izvedbama, svako internukleozidno spajanje pozicijski modifikovanog oligonukleozida je modifikovano internukleozidno spajanje. U nekim izvedbama, najmanje jedno internukleozidno spajanje pozicijski modifikovanog oligonukleotida je fosforotioatno internukleozidno spajanje. U nekim takvim izvedbama, svako internukleozidno spajanje pozicijski modifikovanog oligonukleotida je fosforotioatno internukleozidno spajanje.

[0290]U nekim izvedbama, pozicijski modifikovani motiv je predstavljen sa sledećom formulom II, koja predstavlja modifikovani oligonukleotid koji sadrži spojene nukleozide:

Nuii Nu5su, nezavisno, 2' stabilizirajući nukleozidi;

Nu2i Nu4su 2'-fluoro nukleozidi;

NU3je 2'-modifikovani nukleozid;

svaki od ni i n5 je, nezavisno, od 0 do 3;

suma n2 i n4 je među 10 i 25;

n3 je od 0 do 5; a

svaki Tii T2je, nezavisno, H, hidroksil-zaštitna grupa, neka ponekad spojena konjugatna grupa ilica/?/?//ig-grupa.

[0291] U nekim izvedbama, suma n2 i n4 je 16. U nekim izvedbama, suma n2 i n4 je 17. U nekim izvedbama, suma n2 i n4 je 18. U nekim izvedbama, ni je 2; n3 je 2 ili 3; a n5 je 2.

[0292] U nekim izvedbama, Nuii Nussu, nezavisno, 2'-modifikovani nukleozidi.

[0293] U nekim izvedbama, Nu, je 0-(CH2)2-OCH3, Nu3je 0-(CH2)2-OCH3, Nu5je O-(CH2)2-OCH3. T, je H, a T2je H.

[0294] U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid koji je komplementaran sa miRNK i sadrži 22 spojena nukleozida ima Formulu II koja je izabrana iz Tabele A, gde je svako internukleozidno spajanje fosforotioatno internukleozidno spajanje. U nekim izvedbama, modifikovani oligonukleotid koji ima Formulu II izabranu iz Tabele A ima nukleobaznu sekvencu SEQ ID Br: 12.

[0295] Modifikovani oligonukleotid koji imagapmer- motivmože da ima interni region koji se sastoji od spojenih 2'-deoksinukleotida, a eksterni regioni se sastoje od spojenih 2'-modifikovanih nukleozida. Takavgapmermože da bude dizajniran sa ciljem da izazove rezanje prekursora miRNK sa RNazom H. Interni 2'-deoksinukleozidni region služi kao supstrat za RNazu H, šta omogućava rezanje prekursora miRNK prema kojem se modifikovani oligonukleotid cilja. U nekim izvedbama, svaki nukleozid iz svakog eksternog regiona sadrži isti 2'-modifikovani nukleozid. U nekim izvedbama, jedan eksterni region je uniformno sastavljen od prvog 2'-modifikovanog nukleozida, a preostao eksterni region je uniformno sastavljen od drugog 2'-modifikovanog nukleozida.

[0296] Modifikovani oligonukleotid koji imagapmer- motivmože da ima šećernu modifikaciju na svakom nukleozidu. U nekim izvedbama, interni region je uniformno sastavljen od prvog 2'-modifikovanog nukleozida, a svaki od bočnih je uniformno sastavljen od drugog 2'-modifikovanog nukleozida. U nekim takvim izvedbama, interni region je uniformno sastavljen od 2'-fluoro nukleozida, a svaki eksterni region je uniformno sastavljen od 2'-0-metoksietil nukleozida.

[0297] U nekim izvedbama, svaki eksterni region izgapmerase sastoji od spojenih 2'-0-metoksietil nukleozida. U nekim izvedbama, svaki eksterni region izgapmerase sastoji od spojenih 2'-0-metiI nukleozida. U nekim izvedbama, svaki eksterni region izgapmerase sastoji od 2'-fluoro nukleozida. U nekim izvedbama, svaki eksterni region izgapmerase sastoji od spojenih bicikličkih nukleozida.

[0298] U nekim izvedbama, svaki nukleozid iz jednog eksternog regiona izgapmeraobuhvata 2'-0-metoksietil nukleozide, a svaki nukleozid iz preostalog eksternog regiona se sastoji od različitih 2'-modifikacija. U nekim takvim izvedbama, svaki nukleozid iz jednog eksternog regiona izgapmerase sastoji od 2'-0-metoksietil nukleozida, a svaki nukleozid iz preostalog eksternog regiona obuhvata 2-O-metil nukleozide. U nekim takvim izvedbama, svaki nukleozid iz eksternog regiona izgapmerase sastoji od 2-O-metoksietil nukleozida, a svaki nukleozid od preostalog eksternog regiona obuhvata 2-fluoro nukleozide. U nekim takvim izvedbama, svaki nukleozid iz eksternog regiona izgapmeraobuhvata 2'-0-metil nukleozide, a svaki nukleozid iz preostalog eksternog regiona obuhvata 2'-fluoro nukleozide. U nekim takvim izvedbama, svaki nukleozid iz eksternog regiona izgapmeraobuhvata 2-0-metoksietil nukleozide, a svaki nukleozid iz preostalog eksternog regiona obuhvata bicikličke nukleozide. U nekim takvim izvedbama, svaki nukleozid iz eksternog regiona izgapmerase sastoji od 2-O-metiI nukleozida, a svaki nukleozid iz preostalog eksternog regiona se sastoji od bicikličkih nukleozida.

[0299] U nekim izvedbama, nukleozidi iz eksternog regiona obuhvataju dve ili više šećernih modifikacija. U nekim izvedbama, nukleozidi iz svakog eksternog regiona obuhvataju dve ili više šećernih modifikacija. U nekim izvedbama, najmanje jedan nukleozid iz eksternog regiona obuhvata 2'-0-metoksietil šećer, a najmanje jedan nukleozid iz istog eksternog regiona obuhvata 2'-fluoro šećer. U nekim izvedbama, najmanje jedan nukleozid iz eksternog region sadrži 2'-0-metoksietil šećer, a najmanje jedan nukleozid iz istog eksternog regiona sadrži biciklički šećerni ostatak. U nekim izvedbama, najmanje jedan nukleozid iz eksternog regiona sadrži 2'-0-metil šećer, a najmanje jedan nukleozid iz istog eksternog regiona sadrži biciklički šećerni ostatak. U nekim izvedbama, najmanje jedan nukleozid iz eksternog regiona sadrži 2'-0-metil šećer, a najmanje jedan nukleozid iz istog eksternog regiona sadrži 2'-fluoro šećer. U nekim izvedbama, najmanje jedan nukleozid iz eksternog regiona sadrži 2'-fluoro šećer, a najmanje jedan nukleozid iz istog eksternog regiona sadrži biciklički šećerni ostatak.

[0300] U nekim izvedbama, svaki eksterni region izgapmerasadrži isti broj spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, jedan eksterni region iz gapmera sadrži broj spojenih nukleozida koji je različit od onog kod preostalog eksternog regiona.

[0301] U nekim izvedbama, eksterni region sadrže, nezavisno, od 1 do 6 nukleozida. U nekim izvedbama, eksterni region sadrži 1 nukleozid. U nekim izvedbama, eksterni region sadrži 2 nukleozida. U nekim izvedbama, eksterni region sadrži 3 nukleozida. U nekim izvedbama, eksterni region sadrži 4 nukleozida. U nekim izvedbama, eksterni region sadrži 5 nukleozida. U nekim izvedbama, eksterni region sadrži 6 nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži od 17 do 28 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži od 17 do 21 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 17 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 18 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 19 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 20 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 21 spojenog nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 22 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 23 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 24 spojena nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 25 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 26 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 27 spojenih nukleozida. U nekim izvedbama, interni region sadrži 28 spojenih nukleozida.

Određeni kvantitativni testovi

[0302]Efektiantisense- mblbi' c\] QmiRNK nakon administracije modifikovanih oligonukleotida mogu da se procene uz pomoć brojnih postupaka koji su poznati stanju tehnike. U nekim izvedbama, pomenuti postupci treba da se koriste sa kvantitativnim miRNK nivoima u ćelijama ili tkivimain vitroiliin vivo.U nekim izvedbama, promene nivoa miRNK se mere uz pomoć analize mikročipova. U nekim izvedbama, promene nivoa miRNK se mere uz pomoć jednog od nekoliko komercijalno dostupnih PCR testova, poput TaqMan<®>MikroRNK Assay (Applied Biosvstems). U nekim izvedbama,antisense- m' hibicijamiRNK je procenjena uz pomoć merenja mRNK i/ili nivoa belančevina iz ciljne miRNK.Antisense-inhibicija miRNK, opšte uzeto, dovodi do povećanja nivoa mRNK i/ili belančevina ciljne miRNK.

Određeni eksperimentalni modeli

[0303]U nekim izvedbama, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za korišćenje i/ili testiranje modifikovanih oligonukleotida iz ovoga pronalaska u nekom eksperimentalnom modelu. U nekim izvedbama, eksperimentalni modeli se koriste sa ciljem da se proceni efikasnost modifikovanih oligonukleotida iz ovoga pronalaska u tretmanu fibroze. Stručnjaci u polju su sposobni da izaberu i modifikuju protokole za takve eksperimentalne modele sa ciljem da se proceni neki farmaceutski agens iz ovoga pronalaska.

[0304]Modifikovani oligonukleotidi mogu najpre da budu testirani u ćelijama u kulturi. Prikladni tipovi ćelija uključuju one koje su povezane sa tipovima ćelija u kojima je poželjna dostava modifikovanih oligonukleotidain vivo.Na primer, prikladni tipovi ćelija za ispitivanje modifikovanih oligonukleotida za tretman fibroze uključuju fibroblaste, kardiomiocite i stelatne ćelije.

[0305]U nekim izvedbama, stepen do kojeg neki modifikovani oligonukleotid inhibira delovanje miRNK se procenjuje u ćelijama u kulturi. U nekim izvedbama, inhibicija miRNK delovanja može da se proceni uz pomoć merenja nivoa miRNK. Alternativno, mogu da se izmere nivoi predviđene ili potvrđene mete miRNK. Inhibicija delovanja miRNK može da dovede od povećanja mRNK i/ili belančevine iz miRNK mete. Dodatno, u nekim izvedbama, mogu da se izmere određeni fenotipni ishodi. Na primer, prikladni fenotipni ishodi uključuju inhibiciju ćelijske proliferacije, indukciju ćelijske smrti i/ili indukciju apoptoze.

[0306]Nakonin vitroidentifikacije nekog modifikovanog oligonukleotida koji efektivno inhibira delovanje miRNK, modifikovani oligonukleotidi se dodatno testiraju uz pomoć eksperimentalnih modela.

[0307]Prikladni eksperimentalni modeli za testiranje farmaceutskih agenasa za tretman fibroze, uključujući farmaceutske agense koji obuhvataju modifikovane oligonukleotide koji su komplementarni sa miR-122, uključuju model inducirane hipertrofije zbog opterećenja pritiskom, koji je ovde opisan.

[0308]Dodatni eksperimentalni modeli za testiranje farmaceutskih agenasa za tretman fibroze uključuju, ali bez ograničenja, dijetin model dificijencije metionin holina (MCD)

(vidi, na primer, Yamaguchi et al, Hepatologv, 2008,47, 625-635), db/db spontanu gojaznost kod miševa, dijabetes i masna jetra. Hranjenje takvog miša pod MCD dijetom inducira ne-alkoholni steatohepatitis (NASH) i fibrozu jetra tokom 4 do 8 nedelja. Modifikovani oligonukleotidi koji imaju nukleobazu koja je komplementarna sa miRNK se testiraju u ovom modelu sa ciljem da se ispita njihov efekat na fibrozu jetra.

[0309]Sledeći primeri su navedeni sa ciljem da se bolje ilustruju neke izvedbe iz ovoga pronalaska. Ne treba da se smatra da pomenuti na bilo koji način ograničavaju široke okvire ovoga pronalaska.

Primeri

Primer 1: Uloga miR-21 u srčanim bolestima

[0310] Analiza mikročipova u modelu transgeničnog miša sa srčanim kvarom (srčano-ograničena prekomema ekspresija pi-adrenergičnog receptora (Engelhardt et al., 1999)) je otkrila de-regulaciju ekspresijskog potpisa srčane mikroRNK sa porastom jačine bolesti (SI. 1

a). Dok je miR-21 ekspresija bila skromna u normalnom miokardu, pomenuta mikroRNK je bila među najjače regulisanim mikroRNK tokom kvara srca. U stvari, kod miševa sa kvarom

srca krajne faze, miR-21 je pojedinačno najjače pozitivno regulisana mikroRNK (SI. 1 a). KvantitativnaNorthern- b\ o\analiza je potvrdila pozitivnu regulaciju miR-21 u miševa i dodatno je otkrila primetnu pozitivnu regulaciju kod humanog kvara srca (SI. 1 b, c). Povećana ekspresija miR-21 prekursora, kao šta je bilo procenjeno izNorthern- blotanalize sugeriše transkripcijski mehanizam. Tako, humani miR-21 promotor je studiran u više detalja. miR-21 promotorski region je identifikovan i je visoko konzerviran u nekoliko vrsta (SI. 4 a). Studije ekspresije humanih miR-21 (SI. 4 a-c) potvrđuju njegovu transkripcijsku regulaciju preko dva transkripcijska faktora, belančevine kalcijum/cAMP odgovora (CREB) i faktora serumskog odgovora (SRF), koje se klasično aktivišu tokom srčanog stresnog odgovora. Delecija CREB i mutacija SRF veznih mesta u miR-21 promotoru dovodi do značajnog smanjivanja ekspresije miR-21 kao odgovor na serumsku stimulaciju, uključujući glavnu ulogu za ova dva transkripcijska faktora kod regulisanja miR-21 (SI. 4 c). Esencijalna uloga za miR-21 u srčanoj morfologiji i funkciji je otkrivena preko pristupa na bazi morfolino u bajasiranoj pretrazi sa ciljem da se nokdaunira nekoliko stalno eksprimiranih mikroRNK kod zebrica. Nokdaun miR-21 dovodi do dramatičnog narušavanja srčane strukture i funkcije (SI. 5). Više od 95% injektiranih životinja je pokazivalo masivnu perikardijalnu efuziju (SI. 5a, inset i b) i narušenu ventrikularnu funkciju kao šta je određeno uz pomoć video-mikroskopije (SI. 5 c).

[0311] Sa ciljem da se detaljno studiraju esencijalne funkcije miR-21 u srcu sisara, ovi pronalazači su podesili ekspresiju miR-21 u izoliranim kardiomiocitima. Pronalazači su transfektovali sintetske miR-21-prekursore kao i a/j//sense-miR-21-inhibitore, pri čemu su rutinski postigli transfekcijsku efikasnost od >95% za dostavu oligonukleotida (SI. 6 a). Prekomema ekspresija miR-21 dovodi do robusnog porasta zrele miR-21, dok inhibicija miR-21 kompletno suprimira endogenu ekspresiju miR-21 kao šta je određeno uz pomoć Northern-blot analize (SI. 6 b). Međutim, niti porast ni supresija nivoa miR-21 u kardiomiocitima značajno utiče na morfologiju, veličinu ili broj primarnih kardiomiocita iz pacova u stanju mirovanja ili u stanju hipertrofije kardiomiocita (SI. 1 d). Kardiomiocitno-specifična miR-21 iz transgeničnog miša, koji prekomerno eksprimira miR-21 (25-puta) u odnosu na životinje divljeg tipa, nije pokazala očiti srčani fenotip sa intaktnom strukturom levog ventrikularnog miokarda i odsustvo intersticijalne fibroze (SI. 1 e, na dnu). U suprotnosti sa značajno povećanom ekspresijom miR-21 kod kvara srca, ovi podaci pokazuju da manipulacija sa nivoima ekspresije miR-21 u izolovanim kardiomiocitima i u kardiomiocitno-specifičnom miR-21 iz modela transgeničnih miševa ne podržava ideju o postojanju značajne funkcije miR-21 u srcu kao šta je primećeno kod zebrica i značajno povećanu ekspresiju miR-21 tokom kvara srca. Prema tome, ovi pronalazači su u sledećem koraku ispitali potencijalnu ulogu miR-21 u ne-kardiomiocitnim tipovima ćelija, na primer, srčanim fibroblastima. Koristećiin situhibridizaciju, slabi signali miR-21 su otkriveni u normalnom miokardu, dok kod miokarda usled kvara, hibridizacijski signali su bili značajno pojačani. Kod većeg povećanja, hibridizacijski signal je ograničen primarno na male intersticijalne ćelije, verojatno srčani fibroblasti.Koristeći pre- plating- pr oceđuru,pronalazači su frakcionirali srca neonatalnih pacova u frakcije kardiomiocita i fibroblasta. Tada su pronalazači detektirali endogenu ekspresiju miR-21 primarno u srčanim fibroblastima (SI. 1

<f>)-

Primer 2: miR-21 de-reprimira ERK-signaliziranje u srčanim fibroblastima

[0312JEkspresija MiR-21 se selektivno pojačava u brojnim humanim tumorima (Lu et al., 2005; Lorio et al., 2005) pa je pokazano da doprinosi u rastu tumora i njihovom širenju preko različitih mehanizama u različitim ćelijama. Budući da se čini da miR-21 cilja različite mRNK na način koji je specifičan za tip ćelija, pronalazači su odlučili da ispitaju potencijalne srčane specifične mete miR-21. Koristeći bioinformatički pristup, pronalazači su pretražili nekoliko baza mikroRNK tražeći potencijalne mete miR-21 sa seed-sekvencama koje sadrže 3' UTR i uz pomoć sparivanja bočnih nukieotida, a analiza je bila fokusirana na kandidate sa prijavljenom srčanom ekspresijom. Kratki opis je prikazan u Tabeli 1 ispod.

[0313]Pretraga teoretskih meta miR-21 je otkrila 22 poznata potencijalna gena-meta, od kojih je za 8 prethodno pokazano da se eksprimiraju u srčanom tkivu. Kombinacija tri različite mete uz pomoć alata za predviđanje je otkrila Spryl (sproutvl) kao veoma verojatnog kandidata. Sproutvl (SPRY1), poznat inhibitor Ras/MEK/ERK-puta (Hanafusa et al., 2002, Časci et al., 1999) se pojavljuje kao potencijalna meta zbog svojeg visokog rezultata i značajnog nivoa ekspresije u srcu (Tabela 1). 3'UTR izSprylmRNK sadrži nekoliko predviđenih mikroRNK veznih mesta, od kojih samo jedno odgovara sa idejom da je mikroRNK visoko pozitivno regulisan tokom srčane bolesti (miR-21, vidi SI. 7). Sa ciljem da se odredi tip ćelija u kojima je Spryl eksprimiran, pronalazači su koristili alelSpryl,u kojem lacZ gen je zamenio deo kodirajuće sekvenceSpryl.Testovi za ekspresiju lacZ pokazuju značajno bojanje kod mišjih srca odraslih životinja (SI 2 a). Veće povećanje je identifikovalo tačkasti obrazac ekspresije Spryl koji potiče od intersticijalnih fibroblasta (SI 2 a,donji panel).Tako, miR-21 i njegova meta, Spryl, su ko-eksprimirani u srčanim fibroblastima, a ne u frakciji sa kardiomiocitima. U skladu sa ovim nalazima, nije pronađena detektabilna negativna regulacija ekspresije SPRY1 u transgeničnim miševima koji su prekomerno eksprimirali miR-21 na način koji je specifičan za kardiomiocite. Dodatno, srčani CREB, transkripcijski aktivator ekspresije miR-21 (SI. 4), lokalizuje ekskluzivno samo u fibroblastima. Pronalazači su tada testirali važnost pomenutih nalaza u odnosu na ljudsku bolest. Analiza primeraka iz levog ventrikularnog srčanog tkiva iz pacijenata koji su patili od kvara srca krajnje faze zbog idiopatski dilatirane kardiomiopatije su pokazali povećanu ekspresiju miR-21 (SI. lc) i značajnu represiju ekspresije belančevine SPRY1 (SI. 2 b). Ovi nalazi su praćeni sa aktivisanjem ERK-MAPkinaze, šta je potvrđeno uz pomoć povećanog omera fosfo-ERK/ERK (SI. 2 b).

[0314] Funkcije MiR-21 su tada karakterizovane u ko-kulturama intersticijalnih fibroblasta i kardiomiocita sa ciljem da se imitira kompozicija intaktnog srčanog tkiva. Pronalazači su ispitali funkciju miR- 21 uz pomoć transfekcije sintetskih miR-21 prekursorskih molekula ili inhibitora. Povećanje miR-21 je dovelo do snažne represije ekspresije belančevine SPRY1 i povećanog aktivisanja ERK-MAPkinaze (SI. 2 c). SiRNK-potpomognuto Spryl utišavanje je također dovelo do aktivisanja ERK-MAPkinaze (SI. 2 d). Pronalazači su sledeće procenili dali je miR-21-potpomognuta de-represija ERK-MAPkinaznog signaliziranja u fibroblastima dovoljna da utiče na preživljenje fibroblasta. U skladu sa potencijalnom ulogom ERK-MAPkinaznog signaliziranja u miokardijalnoj fibrozi, porast nivoa miR-21 dovodi do preživljenje srčanih fibroblasta, dok supresija endogene miR-21 potiče apoptotsku ćelijsku smrt (SI. 2 e). Pronalazači su takođe pronašli da regulisanje ekspresije SPRY1 preko miR-21 može da bude kritično za sekretornu funkciju srčanih fibroblasta, jer prekomema ekspresija miR-21 kao i utišavanje ekspresije SPRY1 uz pomoć siRNK značajno povećava sekreciju faktora rasta 2 (FGF2) iz fibroblasta u supernatantu (SI. 2 f). Ova studija je otkrila novu signalnu paradigmu u kvaru srca, gde ponovna ekspresija miR-21 tokom srčane bolesti povećava aktivnost ERK-MAPkinaze preko inhibicije SPRYi. U srcu sisara, ovaj mehanizam može da reguliše preživljenje fibroblasta i na taj način značajno utiče na stepen intersticijalne fibroze i srčanog re-modeliranja.

Primer 3: Terapeutsko utišavanje miR-21in vivo

[0315] Sa ciljem da se proceni funkcija miR-21in vivo,u normalnim uslovima i tokom kvara srca, delovanje miR-21 je inhibirano uz pomoć modifikovanog oligonukleotida koji je komplementaran sa miR-21 (miR-21 antagonist). Mišji model hipertrofije indukovane prekomernim pritiskom je korišćen kao model za kvar humanog srca. U ovom modelu je postignut reproducibilni srčani odgovor na stres uz pomoć konstrukcije transverzne aorte (TAC). Ovaj model značajno sliči humanom kvaru srca zbog toga jer njegov obrazac odgovara promenama mikroRNK i mRNK u globalnim ekspresijskim profilima (Thum et al. 2007).

[0316] Sa ciljem da se utvrdi lokalizacija antagomir-21 u srcu, Cy-3-označeni antagomir-21 je injektiran intravenozno preko katetera u jugularnoj veni. Primećeno je snažno bojanje kroz ceo levi ventrikularni miokard (SI. 3 a), šta pokazuje da su modifikovani oligonukleotidi, koji su komplementarni sa miR-21, bili distribuirani u srčano tkivo. miR-21 antagonist sadrži 2'-O-metil šećere na svakom nukleozidu, dva fosforotioatna internukleozidna spajanja na 5'-krajnjem terminusu oligonukleotida, tri fosforotioatna internukleozidna spajanja na 3'-krajnjem terminusu oligonukleotida i holesterol spojen preko hidroksiprolinolnog linkera. miR-21 antagonisti su imali nukleobaznu sekvencu SEQ ID Br: 1 ili SEQ ID Br: 12. Netretirani (lažni) ili TAC-operisani miševi su tretirani sa antagomir-21 ili kontrolnim oligonukleotidom u dozama od 80 mg/kg tokom tri uzastopna dana. Tretman sa antagomir-21 snažno pojačava ekspresiju srčane miR-21 tokom tri nedelje kao šta je određeno uz pomoć Northern-blotova (SI. 3b) i PCR analizom u realnom vremenu (SI. 8). Ovaj tretman je kompletno okrenuo TAC-indukovanu negativnu regulaciju SPRY1 i aktivisanje ERK-MAPkinaze tokom prekoračenja pod pritiskom do nivoa koji su primećeni kod lažno-operisanih miševa (SI. 3 c). Intersticijalna fibroza i težina srca su značajno povećani tri nedelje nakon TAC kod netretiranih miševa, ali su snažno zaustavljeni kod tretmana sa antagomir-21 (Sls. 3 d, e). Tako, sadržaj kolagena u miokardu je esencijalno normalizovan uz pomoć tretmana sa antagomir-21. Dodatno, tamo gde se težina srca udvostručila tri nedelje nakon TAC, tretman sa antagomir-21 je sprečio hipertrofiju. Kod lažno-operisanih miševa, tretman sa antagomir-21 nije rezultirao sa značajnim promenama u težini srca ili intersticijalnom fibrozom, šta ukazuje da nema vidljivog efekta antagonizma miR-21 u normalnom srcu ili preko kardiotoksičnosti tokom tretmana sa antagomir-21. Nakon TAC operacije i tretmana sa antagomir-21, globalna analiza transkriptoma je otkrila normalizaciju različitih de-regulisanih gena (SI. 3 f). Specifično, kod gena koji su visoko pozitivno regulisani tokom srčane fibroze poput kolagena lcđ, kolagena 3 a 1, biglikana, fibromodulina ili faktora rasta iz veznog tkiva, regulacija pomenutih je smanjena nakon specifične inhibicije miR-21 za 42%, 39%, 44%, 38% i 37% (SI. 3f donjipanel).U dodatnim studijama, srčana funkcija je procenjena uz pomoć ehoKardiografije. Krajnji-dijastolički dijametri levog ventrikula su značajno povećani tri nedelja nakon TAC, a frakcionalno skraćivanje je poremećeno (SI. 3 g), šta se uobičajeno primećuje kod humanog kvara srca. Kada se uporedi sa kontrolama, tretman sa antagomir-21 je sprečio dilataciju levog ventrikula i normalizovao parametre frakcionalnog skraćivanja esencijalno do nivoa koji su primećeni kod lažno-operisanih životinja (SI. 3 g). Slični rezultati su dobiveni tokom tretmana sa antagomir-21 u modelu srčane bolesti indukovane sa izoproterenolom.

[0317J Proveden je dodatni eksperiment, u kojem su miševi podvrgnuti prekomernom pritisku levog ventrikla tokom tri nedelja pre tretmana sa antagomir-21. Tokom ovog perioda, životinje su pokazale značajnu hipertorfiju levog ventrikula, fibrozu i poremećenu srčanu funkciju. Nakon pomenutog perioda od tri nedelja, miševi su tretirani sa antagomir-21 i posmatrani tokom dodatne tri nedelje. Dok su životinje tretirane sa kontrolom pokazale progresivno narušavanje funkcije levog ventrikula, kao i intersticijalnu fibrozu i srčanu hipertrofiju, životinje tretirane sa antagomir-21 su pokazale značajno zaustavljanje narušavanja srčane funkcije kao i regresiju srčane hipertrofije i fibroze.

[0318] Ovi podaci ukazuju na kritičnu ulogu fibroblastne miR-21 i SPRY1 u srcu. Abnormalna ekspresija miR-21 u srčanim fibroblastima inhibira ekspresiju belančevine SPRY1, šta dovodi do porasta delovanja ERK-MAP kinaze. Kao posledica, to povećava preživljenje srčanih fibroblasta i intersticijske fibroze i do remodeliranje srca šta je karakteristično za kvar srca. Ovaj model (kratko prikazan na SI. 3 h) procenjuje primarnu ulogu aktivisanja srčanih fibroblasta tokom bolesti miokarda. Antagonizovanje miR-21 u mišjem modelu srčane bolesti je sprečilo strukturno i funkcionalno propadanje. Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za tretman fibroze, koji obuhvataju administraciju modifikovanog oligonukleotida koji je komplementaran sa miR-21. Ovaj pronalazak dodatno obezbeđuje postupke za tretman fibroze koja je povezana sa srčanom bolesti, koji obuhvataju administriranje modifikovanog oligonukleotida koji je komplementaran sa miR-21.

Primer 4: miR-21 regulacija puta ekstra-ćelijske kinaze MAPK regulisane signalom

[0319]Maligna transformacija normalnih ćelija raka zahteva sticanje nekoliko onkogenih svojstava poput ne-kontrolisane diobe ćelija, rezistenciju na programiranu smrt (apoptoza), invaziju i angiogenezu. Genetičke promene često rezultuju u konstitutivno aktivisanje uobičajenih nizvodnih signalnih transdukcijskih putova poput kinazne kaskade mitogen aktivisane belančevine (MAP) koja uključuje c-RAF-1, MEK-1, ERK 1/2, p38 i JNK i druge. Kinazne kaskade mitogen-aktivisane belančevine (MAPK) su ključni signalni putevi koji su uključeni u regulisanju proliferacije normalnih ćelija, preživljenju i diferencijaciji. Aberantno regulisanje MAPK kaskada doprinosi raku i drugim humanim bolestima. Posebno, MAPK put ekstra-ćelijske kinaze regulisane signalom (ERK) je bio predmet intenzivnog ispitivanja koje je dovelo do razvoja farmakoloških inhibitora za tretman raka. Kod normalnih ćelija, dobro je utvrđeno daje aktivisanje kinaze ERK 1/2 regulisano uz pomoć receptorskih tirozin kinaza poput EGF-receptora i receptora za faktor rasta krvnih-pločica (PDGFR) preko aktivisanja Ras, koji sa svoje strane aktiviše RAF-1/MEK-I/ERK 1/2 kaskadu. Zbog toga šta je ovaj signalni transdukcijski put hiper-aktivisan kod brojnih humanih tumora, razvijeni su različiti inhibitori receptorskih tirozin kinaza, Ras, c-RAF-1 i MEK-1 ili se nalaze na različitim stepenima razvoja. Tretman raka je prema tome možda moguć uz pomoć administriranja efektivne količine inhibitora RAF-l/MEK-l/P-ERK 1/2 puta.

[0320]Sproutv (SPRY) je familija intra-ćelijskih belančevina koje su endogeni regulatori receptorskih tirozin kinaznih putova poput Ras/MAP kinaznog puta. Sisari eksprimiraju četiri izoforme Sproutv, koje deluju kao inhibitori ćelijske diferencijacije koja je potaknuta faktorom rasta, migracije i proliferacije. Pronalazači su identifikovali sproutv-1 koji inhibira ERK fosforilaciju šta može da dovede do modulacije nastanka tumora. Pronalazači sugerišu da pozitivno regulisanje miR-21 u mnogim humanim tumorima inhibira sproutv-1 šta aktiviše ERK i dovodi do pojačanog formiranja tumora i njegove progresije. Antagonizam miR-21 (na primer, preko antagomir-21) je prema tome sposoban da spreći i/ili uspori nastanak tumora i/ili njegovu progresiju.

Primer5: Eksperimentalne procedure

Analize ekspresije ( MikroRNK mikročip, Analiza Affymetrix Genechip, Northern- blot,

PCR u realnom vremenu)

[0321] Profili MikroRNK (Castoldi et al., 2007) i globalne ekspresije mRNK su dobiveni iz RNK preparata iz mišjeg miokarda levog ventrikula. De-regulisane mikroRNK su potvrđene uz pomoć Northern-blota i stabljika-omča specifičnom PCR u realnom vremenu. Za oba oligonukleotidna mikročipa i točkastih mikroRNK mikročipova, analiza podataka je provedena uz pomoć korišćenja R paketa iz projekta Bioconductor ( www. bioconductor. ore) kao šta je pre opisano (Thum et al., 2007).

Analiza miR- 21 promotora

[0322] 24 h nakon izolacije, ćelije su transfektovane sa 1 ug reporterskog plazmida koristeći uspostavljeni liposomalni transfekcijski postupak (Lipofectamine, Invitrogen, SAD). Nakon 12 h medijum je nabijen sa medijumom bez FCS. 24 h kasnije ćelije su tretirane sa 5% FCS tokom 8 h, a preostala grupa je kultivirana bez FCS. Aktivnost luciferaze je izmerena tokom lize ćelija koristeći komplet hemikalija Dual Luciferase (Promega, Nemačka) u skladu sa instrukcijama proizvođača.

Izolacija kardiomiocita, kultiviranje i eksperimenti transfekcije

[0323] Neonatalni kardiomiociti su izolirani kao šta je pre opisano (Merkle et al., 2007). Veličina kardiomiocita je određena iz digitalnih snimaka koristeći programski paket AxioVision LE 4.1 (Carl Zeiss Vision GmbH, Jena, Nemačka). Kulture kardiomiocita su transfektovane sa prekursorom i inhibitorima miR-21 (Ambion, SAD) ili siRNK protiv sproutvl (Promega, Nemačka). Koristeći odgovarajuće stanje kulture pronalazači su takođe proveli eksperimente sa srčanim fibroblastima i ko-kulturama fibroblasta/kardiomiocita.

Održavanje zebrica, mikro- injekcija morfolino antismse- oligonukleotida i određivanje

srčane funkcije

[0324] Standardni morfolino-modifikovani oligonukleotid je usmeren protiv zrele dre-miR-21 (MO-1 = 5'- GCCAACACCAGTCTGATAAGCTA-3'), a takođe multi-blokirajući morfolino-modifikovani oligonukleotid je korišćen sa ciljem da interferiše u više koraka tokom miR-21 procesiranja i funkcije (MO-2 = 5'-TGTAACAGCCAACACCAGTCTGATAAGCTAT -3'). Standardni kontrolni oligonukleotid

(MO-kontrola) (GENETOOLS, LLC) je injektiran u istoj koncentraciji kao negativna kontrola. Morfolino su mikro-injektirani embrijima zebrice u fazi jedne ćelije, a celokupna morfologija i posebno funkcija srca su procenjeni tokom nekoliko vremenskih tačaka tokom razvoja. Snimljene su slike i filmovi, a ventrikularno frakcionalno skraćivanje je izmereno 48, 72, 80, 96 i 120 h nakon fertilizacije (hpf) kao šta je opisano ranije (Rottbauer et al., 2005).

Mišji modeli srčane hipertrofije i srčanog kvara

[0325] Transaortna konstrukcija je provedena uz pomoć rutinskih postupaka. Transgenični miševi sa betal-adrenergičnim receptorom (linija TG4) su detaljno opisni ranije (Engelhardt etal., 1999).

Primerci humanog srca

[0326] Pronalazači su ispitali srčano tkivo iz pacijenata koji su bili podvrgnuti transplantacijom zbog kvara srca u krajnjoj fazi usled dilatativne kardiomiopatije i, za uporedbu, primerke zdravih srca odraslih osoba. Odmah nakon odstranjivanja, parčići tkiva su uzeti sa levog ventrikula, a izvađeno tkivo je naglo smrznuto u tečnom azotu i spremljeno na -80° C do analize.

Postupci za predviđanje mikroRNK meta

[0327] Baze podataka mikroRNK i alati za predviđanje meta miRBase ( http:// mikrornk. sanger. ac. uk/), PicTar ( http:// pictar. bio. nyu. edu/) i TargetScan ( http:// www. targetscan. org/ index. html) su korišćeni sa ciljem da se identifikuju mete mikroRNK.

Western- blot i analiza srčane fibroze

[0328] Lizati belančevina iz primeraka srca ili ko-kulture su pripremljeni kao šta je opisano ranije (Buitrago et al., 2005), a ekspresija Spryl, ERK 1/2, fosfoERKl/2 i G beta je detektirana kao šta je opisano ovde. Za analizu morfologije i fibroze, srca su fiksirana u 4% formalinu i uklopljena u parafin. Prerezi tkiva (5 um) iz LV su obojeni sa hematoksilinom i eozinom ili pikrosirius crvenim. Prerezi obojeni sa pikrosirius crvenim su ispitani uz pomoć mikroskopa Nikon ECLIPSE 50i koji je bio opremljen sa filterima sa ciljem da se dobije cirkularno polarizovana iluminacija. Slike tkiva su dobivene sa sočivima na objektivima od 20x, snimljene su sa ohlađenom digitalnom kamerom (DS-5Mc, Nikon) i analizirane uz pomoć programa za analizu slika SigmaScan Pro 5.0 (SPSS Inc., SAD). Sadržaj kolagena je izračunat kao procenat površine svake slike (izražen u pikselima).

Transgeni miševi aMHC- miR- 21

[0329] Transgeni miševi koji su prekomerno eksprimirali miR-21 su dobiveni uz pomoć pro-nuklearne injekcije fertilizovanih oocita iz FVB/N miševa sa transgenom konstruktom koji sadrži sekvencu zrele miR-21, koja je okružena uzvodno sa 154 bp i nizvodno sa 136 bp nativne prekursorske sekvence koja je pod kontrolom promotora mišjeg a-miozinskog teškog lanca (aMHC).

X- gal bojanje miokarda iz Spry- lacZ miševa

[0330] Srca su sakupljena iz Spryl-lacZ +/- miševa i fiksirana tokom 2 h u PBS koji sadrži 2% formaldehid i 0.05% glutaraldehid. Nakon toga, srca su isprana 4 puta tokom 30 min sa 0.01% Na-desoksiholatom, 0.02% Nonidet P-40, 2 mM MgCl2i 2 mM EGTA u PBS. Za detekciju aktivnosti B-galaktozidaze, srca su inkubirana u rastvoru za ispiranje koji je sadržavao 0.5 mg/ml X-gal, 10 mM K3Fe(CN)6i 10 mM, K4Fe(CN)6na 37° C. Za celokupnu analizu, srca su prenesena u 30% glicerol, a digitalne slike su snimljene uz pomoć kamere Nikon Digi-tal DXM1200F i programa ACT-1. Za histološku analizu, srca su dehidrirana i izopropanolu, očišćena u ksilenu i prenesena u parafin. Parafinski prerezi od 10 um su načinjeni uz pomoć standardnih protokola i sve je dokumentirano.

Injektiranje i detekcija modifikovanih oligonukleotida

[0331] Kateter je permanentno uveden u jugularnu venu mužjaka miševa soja C57/BI6 (10-12 nedelja starih) pre TAC procedure. 24 h nakon TAC je injektirano 80 mg/kg/d modifikovanog oligonukleotida tokom 3 dana preko katetera u jugularnoj veni. Kao pozitivna kontrola za efektivu dostavu (Cy3-označeni modifikovani oligonukleotid) je injektirano 80 mg/kg jednom kroz kateter, a srce je odstranjeno 3 h kasnije, fiksirano pa je posmatrano Cy3 bojanje uz pomoć fluorescentne mikroskopije.

Apoptoza fibroblasta i FGF2 proizvodnja

[0332] Nakon tretmana sa miR-21 prekursorima, inhibitori ili odgovarajuće kontrole, Aneksin V-pozitivni fibroblasti su izmereni uz pomoć FACS analize (komplet hemikalija Annexin-VFLUOS, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemačka). Proveden je test Encim-spojenog imunosorbenta (ELISA) sa ciljem da se kvantifikuju FGF2 koncentracije u supernatantima miR-21 moduliranih srčanih fibroblasta. Test FGF2 je proveden uz pomoć kompleta hemikalija Cmantikine FGF Basic Immunoassav (R&D Svstems, Minneapolis, SAD) u skladu sa instrukcijama proizvođača.

Statistička analiza

[0333]Prosečni podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM. Statistička analiza je provedena uz pomoć programskog paketa Prism (GraphPad, San Diego, CA) ili StatView (SAS Institute Inc., Cary, SAD). Korišćeni su i ANO VA nakon Bonferroni-jevog testa i Student t-testa. Razlike su smatrane značajnima kada je P<0.05, a označeni su sa zvezdama.<*>označava p<0.05,<**>označava p<0.01 ,<***>označava p<0.005.

RNK izolacija, RT- PCR u realnom vremenu i Northern- blot

[0334]Za ekspresiju totalne RNK iz smrznutih tkiva ili kultura ćelija je korišćen komplet hemikalija RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Nemačka) u skladu sa instrukcijama proizvođača. MiRNK su izolovani uz pomoć TRIZOL (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) ili kompleta hemikalija miRNK Isolation (mirVana™, Ambion, SAD). Integritet izolovane RNK je potvrđen uz pomoć denaturirajuće agaroza-gel elektroforeze ili kapilarnom elektroforezom (Bioanalyzer 2100; Agilent) kao šta je opisano (Thum and Borlak, 2004). Za PCR u realnom vremenu, pronalazači su koristili aparat iCycler iQ™ Real-Time PCR Detection System (BioRad, Nemačka).

[0335]Pronalazači su koristili meta-specifičnu stabljika-omča strukturu i reverzni transkripcijski prajmer, a nakon reverzne transkripcije su koristili specifične Taqman hibridizacijske probe sa ciljem da se kvantifikuje ekspresija miR-21 (Test TaqMan miR-21 MikroRNK, Applied Biosystems, Foster City, SAD). Mali nuklearni RNK molekul U6B (RNU6B) je umnožen kao kontrola (TaqMan MicroRNA Assay Controls, Applied Biosystems, Foster City, SAD). Svi miRNK primerci su dobiveni iz izolata koji imaju istu koncentraciju totalne RNK.

[0336]Za Northern-blot analizu, 3 ug totalne RNK je nabijeno u 15% akrilamid, 6M uree, i TBE gela zajedno sa odgovarajućim DNK markerom. Nakon elektroforeze, RNK je prenesena na najlonsku membranu (Qiabrane' Nilon, Qiagen) uz pomoć polu-suhog prenosa. Membrane su tada pre-hibridizovane tokom 1 h na 65° C u hibridizacionom puferu (ULTRAhyb-01igo Hvbridzation Buffer, Ambion, SAD). LNA oligonukleotidi (detekcijske probe miRCURY LNA Array; Exiqon) koji su od pre bili označeni sa T4 kinazom (Exiqon) i<32>P-ATP su tada dodani u pufer, a membrane su hibridizovane preko noći na 42° C. Nakon toga, blot je ispran tri puta na sobnoj temperaturi tokom 3 min (u 0.2xSSC), a nakon toga i jedan put na 42° C tokom 15 min. Nakon toga je sve izloženo u fosfoimager-u.

Analiza ekspresije mikroRNK

[0337] Za analizu ekspresije mikroRNK na mikročipu, Pronalazači su posebno purifikovali mikroRNK uz pomoć flashPAGE Fractionator system (Ambion, SAD). mikroRNK koji su dobiveni iz 8 ug totalne RNK su označeni sa bojom Cy3 (Molecular Probes, Carlsbad, Calif.) uz pomoć kompleta hemikalija mirVana mikroRNK Labeling (Ambion, SAD) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Svaki primerak je hibridizovan u posebnom mikročipu. Hibridizacija mikroRNK u mikročipu, purifikacija mikroRNK i obogaćivanje, označavanje i procedure hibridizacije na mikročipu su provedene u skladu sa priručnikom Ambion mirVana ( www. ambion. com/ techlib/ prot/) ili kao šta je opisano u 2. Sakupljanje podataka je provedeno uz pomoć programa ScanAlyze (Eisen-Lab, Lawrence Berkeley National Lab (LBNL), Berkeley, SAD). Alternativno, 5 ug totalne RNK je označeno sa Cy3-konjugiranim RNK linkerom (Dharmacon, USA) pa je hibridizovano sa platformom mikročipa za postizanje genomskog profiliranja miRNK [miChip; probe za hvatanje koje su imobilizirane na mikročipu odgovaraju (211 humanih, 51 mišjih) jedinstvenim humanim miRNK kao šta je uloženo u miRbase, verzija 6.1]. Intenziteti hibridizacijskih signala su dobiveni uz pomoć skenera Axon (4000B, Molecular Dynamics) sa identičnim podešavanjima foto-umnoživača. Dodatne analize su provedene uz pomoć programa Genepix 6 (Molecular Dynamics) i Excel. Ekspresija MiR-21 je potvrđena uz pomoć specifičnih analiza sa TaqMan RT-PCR i Northern-blot.

Analiza globalnog transkriptoma

[0338] Za analizu transkriptoma, reverznu transkripciju, sinteza drugog-lanca i čišćenja dvo-lančane cDNA su provedeni u skladu sa protokolima Affymetrix (One-Cycle cDNA synthesis Kit, Affymetrix, SAD) započinjući sa 2 ug totalne RNK (n=4 kontrolnih srca nakon lažne-operacije, n=4 leva ventrikula nakon TAC i placebo tretman; n=4 leva ventrikula nakon TAC i tretman sa miR-21 antagonistom). Sinteza biotin-označenih cRNK je provedena uz pomoć kompleta hemikalija IVT Labeling (Affymetrix, SAD). Koncentracija cRNK je određena, distribucija veličina fragmenata cRNK je proverena uz pomoć gel-elektroforeze. Korišćeno je 15 ug fragmentirane cRNK za hibridizaciju mišjeg genoma 430 2.0 GeneChip (Affymetrix, USA). Za analizu podataka sa mikročipova su korišćeni R paketi iz projekta Bioconductor ( www.bio conductor. org). Intenziteti nastalih signala su normalizovani uz pomoć stabilizacije varijance. Kvalitet svih grupa podataka je testirana i statistički analizirana uz pomoć programskog paketalimma(Linear Models for Mikroarray Analysis) sa ciljem da se izaberu geni koji su eksprimirani diferencijalno.

Eksperimenti srčane ko- kulture i transfekcijske procedure mikroRNK/ siRNK

[0339] Kardiomiociti iz neonatalnih pacova su izolirani i kultivirani uz pomoć postupaka koji su poznati od ranije (Merckle et al., 2007). Za analizu miR-21 modulacije veličine kardiomiocita, čiste kulture kardiomiocita su korišćene uz pomoć uvođenja koraka koji prethode sadnji sa ciljem da se isključi kontaminacija sa ne-kardiomiocitima (na primer, fibroblasti). Više od 95% kultiviranih kardiomiocita se boji sa bojom koja označava aktinin, šta pokazuje visoku čistoću ćelijske kulture. Smrvljena-miR (pre-negativna kontrola #2, Ambion; 50 nmol/L, 72 h), miR-21 prekursorske molekule (pre- MiR, Ambion; 50 nmol/L, 72 h) ili miR-21 antagonisti (anti-miR, Ambion; 50 nmol/L, 72 h) su transfektovani uz pomoć postupka koji se bazira na liposomima (Lipofectamine, Invitrogen, SAD; vidi 6 za detalje). Kardiomiociti su kultivirani sa niskom koncentracijom FCS (0.1%, uslovi kontrole) ili 48 h sa visokom koncentracijom FCS (5.0%) sa ciljem da se indukuje hipertrofija kardiomiocita. Za određivanje veličine ćelija, površinski areal neonatalnih kardiomiocita (72 h nakon transfekcije) je izračunat u formatu pločice sa 96-rupica (gustoća sadnje je 40.000 ćelija/rupica) uz pomoć programskog paketa AxioVison Rel 4.4 (Carl Zeiss GmbH, Jena, Nemačka). Podaci su izraženi kao srednja vrednost ±SEM.

[0340] Sa ciljem da se imitirajuin vivosrčana stanja, pronalazači su koristili sistem ko-kulture kardiomiocita i srčane fibroblaste ignorirajući korak pre sadnje kao šta je opisano malopre. Ovde, Pronalazači su detaljno studirali ekspresiju Spry-1 i Erk aktivisanja nakon transfekcije smrvljene-miR (50 nmol/L, 72 h), miR-21 prekursorskih molekula (50 nmol/L, 72 h) ili miR-21 antagonista (50 nmol/L, 72 h). U odvojenim eksperimentima, smrvljena siRNK ili specifični siRNK kokteli protiv Spryl (tri različite mikroRNK, 16.7 nmol/L svaka) su transfektovani u ko-kulturu. Efikasnost transfekcije je praćena preko PCR u realnom vremenu (TaqMan MikroRNK Assavs, Applied Biosvstems) i Northern-blot analizom.

Alati za predviđanje mikroRNK meta

[0341] Algoritam miRanda (Griffiths-Jones et al., 2006) je korišćen sa ciljem da se skeniraju potencijalna miR-21 vezna mesta u 3' UTR sekvencama iz humanog i mišjeg genoma. Nakon toga je provedena Karlin-Altschul-ova normalizacija (miRBase Targets version 4.0; http:// mikrornk. sanger. ac. uk/ targets/ v4/). Detaljno, Pronalazači su koristili podatke iz baze miRBase (Verzija 4, Sanger Institute; SAD) pa su sortirali potencijalne miR-21 mete uz pomoć algoritama "veliki broj konzervisanih vrsta; >6"), "mala p-vrednost; <0.001" i visoki rezultat iz baze miRBase; >15. Ova procedura je otkrila 22 poznata gena kao potencijalne mete za miR-21, od kojih su 8 od ranije poznati kao takvi koji se eksprimiraju u tkivu srca na osnovu njihovih profila GEO-ekspresije ( http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ geo/) (vidi Tabelu 1). 5 gena je dodatno predviđeno da su mete za miR-21 uz pomoć bazu podataka PicTar miRNK 9 (Krek et al., 2005) ( http:// pictar. bio, nyu- edu/). Koristeći program za predviđanje meta TargetScan miRNK (Whitehead Institute for Biomedical Research, SAD, Release 4.0; juli 2007; http://\ vww. targetscan. org/), pronalazači su identifikovali mete sa konzervisanim mestima prepoznanja od 8-mera za miR-21, ali samo za dve mete. Spryl je tada bio studiran u detalje.

Western - blot

[0342] Lizati belančevina iz odstranjenih srca ili kultiviranih fibroblasta/kardiomiocita su pripremljeni kao šta je opisano ranije (Buitrago et al., 2005). Ekstrakti (20-50 ug belančevina po liniji) su pomešani sa puferom za nabijanje primeraka i u redukovanom stanju odvojeni na 10% SDS-poliakrilamidnim gelovima. Belančevine su elektro-prenesene na PVDF membranu (Immun-Blot®, Bio-Rad). Bendovi su detektirani uz pomoć hemiluminescentnog testa (ECL Plus, Amersham). Pronalazači su koristili antitela protiv sproutv-1 (Santa Cruz, sc-30048, razređenje 1:250-1:500), Erkl/2 (Cell Signaling, #9102, razređenje 1:1000); fosfo-Erkl/2 (Cell Signaling, #9101, razređenje 1:1000) i G-p (Santa Cruz Biotechnologv, sc-378, razređenje 1:1000), kao i odgovarajuća sekundarna antitela (Anti-mišje-HRP (Cell Signaling, #7076, razređenje 1:10000; Anti-zečje-HRP (Cell Signaling, #7074, razređenje 1:10000).

InvivoTAC model i administracija modifikovanog oligonukleotida

[0343] Pronalazači su koristili mužjake miša soja C57BL/6 (10-12 nedelja starosti, 25 g) iz zbirke Charles River Laboratories (Sulzfeld, Nemačka). Transaortna konstrukcija (TAC) je stvorena uz pomoć 7-0 suture koja je omotana dva puta oko aorte i igle opsega 27. Igla je tada nežno uvučena, šta dovodi do 80% sužavanja aorte. Tokom istih operacija, u jugularnu venu je uvučen kateter uz pomoć standardnih hirurških procedura. Sekvence su: antagomir-21, 5'-oUsoCsoAoAoCoAoUoCoAoGoUoCoUoGoUoAoAoGsoCsoUsoAs-Chol-3'. Svi nukleotidi koji se koriste u sintezi su 2'-OMe modifikovani (Indeks 'o'). Indeks V predstavlja fosforotioatno spajanje; "Cy3" pokazuje oznaku od Cy3 boje na 5'-kraju pomenutog oligo; "Hol" predstavlja holesterol spojen preko hidroksiprolinolnog spajanja. Tretman je započeo 24 h nakon TAC, a životinje su primile injekcije sa PBS ili miR-21 antagonistom preko uvučenog katetera u jugularnu venu (tri uzastopna dana, injekcije PBS ili miR-21 antagonista u jugularnu venu su sa dozama od 80 mg po kg telesne težine u 0.2 ml po injekciji. Kao pozitivna kontrola za efektivnu srčanu dostavu, preko katetera u jugularnu venu je injektiran Cy-3-označen modifikovani oligonukleotid (antagomir-181a) (80 mg/kg), srce je odstranjeno 3 h kasnije, fiksirano, a bojanje sa Cy3 je ispitano uz pomoć fluorescentne mikroskopije.

Analiza srčane funkcije

[0344] Nakon 3 nedelja TAC, miševi su anestezirani sa izofluranom, a srčane dimenzije i funkcija su analizirani uz pomoć 15-MHz puls-talas Doppler ehoKardiografijom. Tada je odstranjeno srce, izmereno nakon odstranjivanja pred-komore pa je podvrgnuto dodatnoj analizi. EhoKardiografske studije su provedene pod blagom anestezijom uz spontanu respiraciju koristeći izofluran. Dva nezavisna ultra-sonografera iskusna u snimanju glodara uvučena u eksperimentalne grupe su izvela ehoKardiografiju, radeći sa aparatom Toshiba Power Vision 6000 sa transducerom od 15 MHz. Snimljeni su 2D levo-parasternalni pogledi na kratkoj-osi u nivou papilarnih mišića. Tačno pozicioniranje proba je procenjeno uz pomoć kružne pojave šupljine levog ventrikula (LV) nakon angulacije i kraniokaudalnih kretanja transducera. Površina LV krajnje dijastole je izračunata iz pomoć ručnog preklapanja endokardijalne granice, a nakon toga planimetrijski preko programskog paketa Nice (Toshiba Medical Systems). Simultana transverzalna preklapanja u M-modusu su snimljena uz pomoć kursora koji je postavljen na sredini LV šupljine. Frakcionalno skraćivanje je izračunato kao staje pre opisano (Collins et al., 2001).

Detekcija srčane fibroze

[0345]Mišja srca su fiksirana u 4% puferovanom formalinu i uklopljena u parafin. Prerezi od 5 um obojeni sa pikrosirius crveno su ispitani uz pomoć mikroskopa Nikon ECL1PSE 50i koji je opremljen sa filterima sa ciljem da se obezbedi kružno polarizovana iluminacija (Whittaker et al., 1994). Donji filter je postavljen iznad prstena od iris dijagrama mikroskopskog polja, dok je gornji filter konstruisan iz kombinacije pločice od četvrtine-talasa koja je bila postavljena ispod linearnog polarizera koji je bio tako postavljen da je njegova transmisijska os bila na 45° u odnosu na brzu os same talasne pločice. Oba filtera su ukrštena, a tada su postavljena tako da je pozadina vidnog polja bila tamna koliko je to moguće. Slike tkiva su dobivene sa sočivima na objektivu od 20x, snimljene su sa ohlađenom digitalnom kamerom (DS-5Mc, Nikon) i analizirane su uz pomoć programa za analizu slika SigmaScan Pro 5.0 (SPSS Inc., SAD). Precizno, originalne (kružno polarizovane) slike, su razvijene u cijan, žuto, magenta i crnim komponentama (koristeći automatizovanu funkciju CYMK koja je obezbeđena sa analizom slika). Crna komponenta je oduzeta od polarizovane slike. Pre oduzimanja, crna komponenta je adekvatno podešena na sjajnost sa ciljem da se obezbedi eliminacija intersticijalnog prostora i ne-kolagenskih elemenata, ali tako da se sačuvaju naj-tanja kolagenska vlakna (potvrđeno je inspekcijom). Tada, oduzeta slika je podvrgnuta odvajaju boja na njihove komponente tona, zasićenja, vrednosti (HSV) uz pomoć automatizovane funkcije HSV koja se nalazi u programu za slike. Dobiven je histogram frekvencija tona iz razrešene 8-bitne tonske slike, koja sadrži 256 boja. Korišćene su sledeće definicije za ton: crveno 2-9 i 230-256, narandžasto 10-38, žuto 39-51, zeleno 52-128. Raspon tona 129-229 sadrži intersticijalni prostor i ne-birefringentne elemente tkiva. Određen je broj piksela u rasponima tona za crveno, narandžasto, žuto i zeleno, i sve je izraženo kao procenat totalnog broja kolagenskih piksela, šta je sa svoje strane izraženo kao procenat od totalnog broja piksela u slici.

Apoptoza fibroblasta i FGF- 2 proizvodnja

[0346]Srčani fibroblasti koji su dobiveni uz pomoć pre-sadnje tokom izolacije kardiomiocita su kultivirani do postizanja sup-konfluencije. Čistoća ćelija je >95% na osnovu bojanja sa markerom za fibroblaste, anti-pacov prolil-4-hidroksilaza (Acris Antibodies, AF5110-1, podaci nisu pokazani). Nakon tretmana sa miR-21 prekursorima, inhibitorima ili odgovarajućim kontrolama (vidi pre), Annexin V-pozitivni fibroblasti su izmereni uz pomoć analize FACS (Annexin-VFLUOS kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemačka). Tast encim-spojenog imunosorbenta (ELISA) je proveden sa ciljem da se kvantifikuju FGF-2 koncentracije u supernatantima miR-21 moduliranih srčanih fibroblasta. FGF-2-određivanje je provedeno uz pomoć kompleta hemikalija Quantikine FGF Basic Immunoassav (R&D Svstems, Minneapolis, SAD) u skladu sa instrukcijama proizvođača.

Reference

[0347J

Ambros,V. The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350-355 (2004). Buitrago,M. et al. The transcriptional repressor Nab 1 is a specific regulator of pathological cardiac hypertrophy. Nat Med 11, 837-844 (2005).

Care,A. et al. MicroRNA-133 controls cardiac hypertrophy. Nat Med 13, 613-618

(2007).

Casci,T., Vinos,J. & Freeman,M. Sprouty, an Intracellular Inhibitor of Ras Signaling. Cell 96, 655-665(1999).

Castoldi,M. et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA 12, 913-920 (2006).

Collins,K.A. et al. Accuracy of echocardiographic estimates of left ventricular mass in mice. Am J Physiol Heart Circ Phvsiol 280, H1954-H1962 (2001).

Engelhardt,S., Hein,L., Wiesmann,F. & Lohse,M.J. Progressive hypertrophy and heart failure in beta 1 -adrenergic receptor transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences 96, 7059-7064 (1999).

Griffiths-Jones,S., Grocock,R.J., van Dongen,S., Bateman,A. & Enright,A.J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research 34, D140-D144 (2006).

Hanafusa,H., Torii.S., Yasunaga,T. & Nishida,E. Sproutyl and Sprouty2 provide a control mechanism for the Ras/MAPK signalling pathway. Nat Cell Biol 4, 850-858

(2002).

lorio, M.V. et al. MicroRNA Gene Expression Dcrcgulation in Human Breast Cancer. Cancer Res 65, 7065-7070 (2005).

Kruetzfeldt J, et al. Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature 438, 685-689 (2005).

Lu,J. et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 435, 834-838 (2005).

Merkle,S. et al. A Role for Caspase-1 in Heart Failure. Circ Res 100, 645-653 (2007). Mi,S. et al. MicroRNA expression signatures accurately discriminate acute lymphoblastic leukemia from acute myeloid leukemia. Proceedings of the National Academyof Sciences 104, 19971-19976 (2007).

Rottbauer,W. et al. VEGF-PLC{gamma} 1 pathway controls cardiac contractility in the embryonic heart. Genes Dev. 19, 1624-1634 (2005).

Thum,T. & Borlak,J. Mechanistic role of cytochrome P450 monooxygenases in oxidized low-density lipoprotein-induced vascular injury: therapy through LOX-l receptor antagonism? Circ Res 94, e 1 -13 (2004).

Thum,T. et al. MicroRNAs in the Human Heart: A Clue to Fetal Gene Reprogramming in Heart Failure. Circulation 116,258-267 (2007).

Yang,B. et al. The muscle-specific microRNA miR-1 regulates cardiac arrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2. Nat Med 13, 486-491

(2007).

LISTA SEKVENCI

[0348]

Claims (15)

1. Jedinjenje, naznačeno time, da sadrži modifikovani oligonukleotid koji obuhvata 12 do 30 spojenih nukleozida, pri čemu modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa miR-21 ili njenim prekursorom, za upotrebu u tretmanu, prevenciji ili dijagnozi fibroze u nekom subjektu.

2. Jedinjenje iz zahteva 1 za upotrebu iz zahteva 1, naznačeno time, da (i) je pomenuta fibrozna bolest fibroza jetra, srčana fibroza, bubrežna fibroza, plućna fibroza, kožna fibroza, fibroza koja je povezana sa starosti ili fibroza slezine; i/ili gde (ii) pomenuti subjekt ima najmanje jednu bolest ili stanje koje je izabrano iz srčane bolesti ili stanja, jetrine bolesti ili stanja i plućne bolesti ili stanja.

3. Jedinjenje iz zahteva 1 ili 2 za upotrebu iz zahteva 1 ili 2, naznačeno time, da pomenuti tretman ili prevencija dodatno obuhvata administriranje jednog ili više dodatnih farmaceutskih agenasa.

4. Jedinjenje iz zahteva 2 za upotrebu iz zahteva 2, naznačeno time, da pomenuta srčana bolest ili stanje je izabrana iz grupe koja obuhvata srčanu hipertrofiju, hipertenzivni kvar srca, dijastolički kvar srca, sistolički kvar srca, bolest skladištenja povezana sa srcem, kardiomiopatiju, konstruktivni perikarditis, bolest koronarne arterije, akutnu infarkciju miokarda, hroničnu infarkciju miokarda, kvar desnog srca, srčane aritmije, fibrozu koja je povezana sa miokarditisom i bolest srčanih zalistaka, ili gde najmanje jedna od bolesti ili stanja jetra je hronična ozleda jetra, infekcija sa virusom hepatitisa, ne-alkoholni steatohepatitis, ciroza, ili gde najmanje jedna od bolesti ili stanja pluća je hronična opstruktivna plućna bolest ili idiopatska plućna fibroza.

5. Jedinjenje iz zahteva 1 za upotrebu iz zahteva 1, naznačeno time, da pomenuti subjekt ima najmanje jednu drugačiju bolest ili stanje koje je izabrano iz grupe koja obuhvata plućnu hipertenziju, bolest povezanu sa krvnim sudovima, sklerozu creva, retroperitonealnu fibrozu, proliferativnu fibrozu, neoplastičnu fibrozu, nefrogenu sistemsku fibrozu, injekcijsku fibrozu, medijastinalnu fibrozu, mijelofibrozu, sindrom post-vazektomijskog bola, reumatoidni artritis.

6. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 5 za upotrebu iz zahteva od 1 do 5, naznačeno time, da administriranje pomenutog jedinjenja u subjekt a. ublažava fibrozu; b. usporava daljnu progresiju fibroze; c. stopira dodatnu progresiju fibroze; d. redukuje fibrozu; i/ili e. redukuje sadržaj kolagena.

7. Jedinjenje, naznačeno time, da obuhvata modifikovani oligonukleotid koji sadrži 12 do 30 spojenih nukleozida, pri čemu nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je komplementarna sa miR-21 ili njenim prekursorom, za upotrebu u tretmanu fibroproliferativnog poremećaja.

8. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 7 za upotrebu iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 7, naznačeno time, da modifikovani oligonukleotid sadrži 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ili 24 spojena nukleozida i/ili nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida ima najmanje 15, najmanje 16, najmanje 17, najmanje 18, najmanje 19, najmanje 20, najmanje 21 ili najmanje 22 kontinuirane nukleobaze iz nukleobazne sekvence iz SEQ ID Br: 12, i/ili gde pomenuta nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida ima ne više od dve krivo-sparene baze u odnosu na nukleobaznu sekvencu miR-21 ili njenog prekursora.

9. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 8 za upotrebu iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 8, naznačeno time, da pomenuto jedinjenje sadrži modifikovani oligonukleotid koji je konjugiran na ligand, pri čemu pomenuti ligandje ponekad holesterol.

10. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 9 za upotrebu iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 9, naznačeno time, da najmanje jedno internukleozidno spajanje je modifikovano internukleozidno spajanje, ili gde svako internukleozidno spajanje je modifikovano internukleozidno spajanje, pri čemu ponekad pomenuto najmanje jedno, ili svako od modifikovanih internukleozidnih spajanja je fosforotioatno internukleozidno spajanje.

11. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 10 za upotrebu iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 10, naznačeno time, da svaki od mnoštva nukleozida sadrži modifikovani šećer, ili gde svaki nukleozid sadrži modifikovani šećer; pri čemu ponekad svaki od pomenutog mnoštva modifikovanih šećera, ili svaki od pomenutih modifikovanih šećera, je nezavisno izabran iz 2-O-metoksietil šećera, 2'-fluoro šećera, 2-O-metil šećera ili bicikličkog šećernog ostatka.

12. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 11 za upotrebu iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 11, naznačeno time, da najmanje jedan nukleozid sadrži neku modifikovanu nukleobazu, i gde pomenuta modifikovana nukleobaza ponekad je 5-metilcitozin.

13. Jedinjenje iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 12 za upotrebu iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 12, naznačeno time, da pomenuta nukleobazna sekvenca iz modifikovanog oligonukleotida je najmanje 90% komplementarna, najmanje 95% komplementarna, ili je 100% komplementarna sa nukleobaznom sekvencom iz SEQ ID Br: 1.

14. In vitropostupak za dijagnosticiranje fibroze, naznačen time, da obuhvata korake: a. obezbeđivanja primerka koji je dobiven od pacijenta za kojeg se smatra da pati od fibroze; b. merenja ekspresije miR-21; pri čemu povećani nivo miR-21 upoređeno sa kontrolnim primerkom ukazuje na fibrozu ili na predispoziciju za pomenutu.

15. In vitropostupak za pretragu farmaceutski aktivnog jedinjenja za tretman i/ili prevenciju fibroze ili predispoziciju na nju, naznačen time, da obuhvata korake a. obezbeđivanja primerka koji sadrži miR-21; b. kontaktiranja supstance-kandidata sa primerkom; c. određivanja efekta supstance-kandidata na primerak; pri čemu promena miR-21 ukazuje na farmaceutski aktivno jedinjenje.