RS54756B1

RS54756B1 - Antigen vezujući proteini za proprotein konvertazu subtilizin keksin tip 9 (pcsk9)

Info

Publication number: RS54756B1
Application number: RS20160312A
Authority: RS
Inventors: Simon Mark Jackson; Nigel Pelham Clinton Walker; Derek Evan Piper; Bei Shan; Wenyan Shen; Joyce Chi Yee Chan; Chadwick Terence King; Randal Robert Ketchem; Christopher Mehlin; Teresa Arazas Carabeo; Qiong Cao
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2008-08-22
Publication date: 2016-10-31
Also published as: IL317213A; JP2023071833A; SI2215124T1; US20090142352A1; US20140357850A1; KR101494932B1; US20140228557A1; EP3202791A1; CN101932607B; US8871914B2; CY2016029I1; JP2016182114A; KR20220031734A; FR16C0025I1; US20140228547A1; SI2215124T2; ES2917423T3; CR11328A; US20140357853A1; CY1117940T1

Abstract

Monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za humani PCSK9 i koje je neutralizujuće zato što je višak pomenutog antitela ili njegovog fragmenta sposoban da redukuje količinu PCSK9 vezanu za LDLR u ogledu kompetitivnog vezivanja in vitro, gde su pomenuto monoklonalno antitelo ili njegov fragment u kompeticiji za vezivanje PCSK9 sa(a) antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanca sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 49; i varijabilni region lakog lanca sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 23; ili(b) antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanca sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 67; i varijabilni region lakog lanca sekvence amino kiseline u SEQ IDNO: 12.Prijava sadrži još 22 patentna zahteva.

Description

[0001] OBLASTPRONALASKA

[0002] Ovaj pronalazak odnosi se na antigen vezujuće protein koji se vezuju za proprotein konvertazu subtilizing keksin tip 9 (PCSK9), njihovu primcnu i postupke za pripremanje tih antigen vezujućih proteina.

[0003] POZADINA RAZLIČITIH OSTVARENJA

[0004] Proprotein konvertaza suntilizin keksin tip 9 (PCSK9) je serin proteaza uključena u regulisanje nivoa proteina Hpoprotcin receptora male gustine (LDLR) (Hortonet al..2007; Seidah i Prat, 2007).ln vitraeksperimenti pokazali su da dodavanje PCSK9 HepG2 ćelijama smanjuje nivoe LDLR na površini ćelije (Benjannetet al.,2004; Lagaceet al.2006; Maxwellet al.,2005; Parket al.2004). Eksperimenti sa miševima pokazali su da povećanje niovoa POSK9 proteina smanjuje nivoe LDLR proteina u jetri (Benjannetet al.,2004: Lagaceet al.,2006; Maxwellet al.,2005; Parket a/.,2004), dok PCSK9 nokaut miševi imaju povećane nivoe LDLR u jetri (Rashidet al.,2005). Preterana ekspersija PCSK9 u miševima izaziva povećanje ukupnog holesterola u plazmi (Maxwe!let al.2004). Pored toga. identifikovane su različite humane PCSK9 mutacije koje rezultiraju bilo u povećanju ili u smanjenju nivoa LDL plazme (Kotovvskiet al,2006; Zhaoet al, 2006).Pokazano je daje PCSK9 u direktnoj iterakciji sa LDLR proteinom, putem endocitoziranja zajedno sa LDLR, i da koimunofluorescira sa LDLR putem endosomalne putanje (Lagaceet al,2006). Nije zapažena razgradnja LDLR od strane PCSK9 , a mehanizam kojim snižava vanćelijskc nivoe LDLR proteina je neizvestan.

[0005] PCSK9 je prohormon-proprotein konvertaza u subtilizin (S8) familiji serin proteaza (Scidahet al,2003). Ljudi imaju devet prohormon-proprotein konvertaza koje mogu biti podeljene između S8A i S8B podfamilije (Rawlingset al.2006). Furin, PCI/PC 3, PC2, PACE4, PC4, PC5/PC6 i PC7/PC8/LPC/SPC7 su klasifikovani u podfamiliju S8B. Kristalne NMR strukture različitih domena iz furina miševa i PCI ukazuju na subtilizin-sličnc pro- i katalitičke domene, a P domen direktno C-terminala na katalitički domen (Henrichet al..2003; Tangreaet al.,2002). Na osnovu sličnosti sekvence amino kiseline unutar ove podfamilije, predviđa se da svih sedam Članova imaju iste strukture (Henrichet al..2005). SKI-1/S1P i PCSK9 klasifikovani su u podfamiliju S8A. Uporedivanja sekvenci sa ovim proteinima takođe ukazuju na prisustvo subtilzsin-slične pro- i katalitičke domene (Sakaiet al,1998: Seidahet al,2003; Scidahet al,1999). U ovim proteinima C-terminal sekvence amino kiseline do katalitičkog domena više je promenljiv i ne ukazuje na prisustvo P domena.

[0006] Prohormon-proprotein konvertaze se iskazuju kao zimogeni i razvijaju se višefaznim postupkom. Funkcija pro-domena u ovom postupku je dvostruka. Pro-domcn prvo deluje kao pratilac i neophodan je za ispravno nizanje katalitičkog domena (Ikemuraet al.1987). Kada se katalitički domen naniže, dolazi do autokatalize između prodomena i katalitičkog domena . Posle ove početne reakcije cepanja, pro-đomen ostaje vezan za katalitički domen gde on zatim deluje kao inhibitor katalitičke aktivnosti (Fuet al.2000). Kada su uslovi odgovarajući. razvijanje se odvija sa drugim kalalitičkim događanjem na mestu unutar pro-domena (Andersonet al,1997). Nakon ovog drugog događanja cepanja, dolazi do disocijacije pro-domena i katalitičkog domena, što dovodi do aktivne proteaze. PCSK9 se procesira u HR i izdvaja u plazmi (Grozdanovet al2006). Nivoi PCSK9 su pod kontrolom puetm proteolize od strane drugih članova familije proprotein konvertaze (Benjannet et al.. 2006).

[0007] Aulocataliza PCSK9 zimogena odigrava se između Glnl 52 i Seri 53 (VFAOJSIP)

[0008] (Naureekieneet al,2003), i pokazano je daje potrebna za sopslveno lučenje iz ćelija (Seidahet al.2003). Drugo autokatalitičko događanje na mestu unutar pro-domena PCSK9 nije zapaženo. Prečišćeni PCSK9 sastoji se od dve vrste koje mogu biti razdvojene neređukujućim SDS-PAGE; pro-domen na 17 Kd, a katalitički plus C-terminal domeni na 65 Kd. Nije izolovan PCSK9 bez svog inhibitomog pro-domena, a merenja katalitičke aktivnosti PCSK9 bila su promenljiva (Naureekieneet al,2003; Seidahet al,2003).

[0009] SUŠTINA RAZLIČITIH OSTVARENJA

[0010] U nekim ostvarenjima, ovaj pronalazak obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9.

[0011] U nekim aspektima ovaj pronalaz obuhvata monoklonalno antitelo ili njegov fragment koje se vezuje za humani PCSK9 i koje je neutralizujuće zato što je višak pomenutog antitela ili njgeovog fragmenta sposoban da redukuje kolilčinu PCSK9 vezanu za LDLR u ogledu kompetitivnog vezivanjain vitro,pri čemu je monoklonalno antitelo ili njegov fragment u kompeticiji za vezivanje PCSK9 sa (a) antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanea sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 49; i varijabilni region lakog lanca sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 23; ili (b) antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanea sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 67: i varijabilni region lakog lanca sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 12.

[0012] U drugom aspektu . ovaj pronalazak obuhvata antigen vezujući protein . u kojem se

[0013] (A)pomenuti antigen vezujući protein specifično vezuje za humani PCSK9 i on je neutralizujući zato stoje višak pomenutog antigen vezujućeg proteina sposoban da

[0014] redukuje količinu PCSK9 vezanu za LDLR u ogledu kompetitivnog vezivanjain vi tro,gde pomenuti antigen vezujući protein obuhvata bilo:

[0015] (i)

[0016] (a) kombinaciju varijabilnog domena lakog lanca i varijabilnog domena teškog lanca odabranu iz grupe kombinacija koju čine: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 9 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO IDNO: 71; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 10 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 72: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 12 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO IDNO: 67: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 16 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 52: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 17 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 51; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 20 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90%> identična sa SEO ID NO: 54; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 21 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO IDNO: 55; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 22 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 56; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 23 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO IDNO: 49; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 57; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 26 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 50; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 30 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 64; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 31 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID<N>O: 62; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 33 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ IDNO: 65: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 35 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 79; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 36 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ IDNO: 80; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 37 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 76; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 38 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 77; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 39 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90%> identična sa SEO I<D>NO: 78: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 40 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ IDNO: 83; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 461 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEO IDNO: 459; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 465 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEO IDNO: 463; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 473 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 471; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 477 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 475; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 485 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 483: (ii) (a) CDRH1 koji obuhvata SEO ID NO: 308. CDRH2 koji obuhvata SEO ID NO: 175. i CDRH3 koji obuhvata SEO ID NO: 180 ili

[0017] (b) CDRFJ1 koji obuhvata SEO ID NO: 368. CDR112 koji obuhvata SEQ ID

[0018] NO: 175. i CDRH3 koji obuhvata SEO ID NO: 1 80

[0019] i

[0020] CDRL1 koji obuhvata SEQ ID NO: 158. CDRL2 koji obuhvata SEO IDNO: 162, i CDRL3 koji obuhvata SEQ ID NO: 395; (iii) CDRH1 koji obuhvata SEO ID NO: 368. CDRH2 koji obuhvata SEO ID NO: 174, i CDRH3 koji obuhvata SEQ ID NO: 180 i CDRL1 koji obuhvata SEQ ID NO: 158. CDRL2 koji obuhvata SEQ ID NO: i62. i CDRL3 koji obuhvata SEQ ID NO: 164; ili (iv) CDRH1 koji obuhvata GFTFSSYWMS. CDRH2 koji obuhvata SIKQDGSEKYYVDSVKG i CDRH3 koji obuhvata DLVLMVYDIDYYYYGMDV i CDRL1 koji obuhvata RSSQSLLHSNGYNYLD. CDRL2 koji obuhvata LGSNRAS i CDRL3 koji obuhvata MOALOTPLT;

[0021] ili

[0022] (B) pomenuli antigen vezujući protein obuhvata

[0023] (a) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID

[0024] NO: 23, i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 49; ili

[0025] (b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID

[0026] NO: 23, u kojem je prvi ostatak glutaminska kiselina umcsto glutamina, i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEO ID NO: 49. u kojem je prvi ostatak glutaminska kiselina umesto glutamina.

[0027] Takode je opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9 koji obuhvata: A) jedan ili više komplementarno određujućih regiona teškog lanca (CDRH) odabranih iz grupe koja se satoji od: (i) CDRH1 iz CDRH1 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 74. 85. 71. 72. 67. 87. 58. 52. 51. 53, 48. 54. 55. 56. 49. 57. 50. 91. 64. 62. 89. 65. 79. 80. 76, 77. 78. 83. 69. 81. i 60: (ii) CDRH2 iz CDRII2 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEO ID NO: 74. 85. 71. 72. 67, 87. 58. 52. 51. 53. 48. 54. 55. 56. 49. 57, 50. 91. 64. 62. 89. 65. 79. 80. 76. 77. 78. 83. 69. 81. i 60: (ih) CDR1I3 iz CDRH3 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEO ID NO: 74, 85. 71. 72. 67. 87. 58. 52. 51. 53. 48. 54. 55. 56. 49. 57. 50, 91. 64. 62. 89. 65. 79. 80. 76. 77. 78. 83. 69. 81. i 60: i (iv) CDRH iz (i), (ii), i (iii) koji sadrži jednu ili više amino kiselinskih substitucija. isključenja ili uključenja od ne više od 4 amino kiseline: B)jedan ili više komplementarno određujućih regiona lakog lanca (CDRE) odabranih iz grupe koja se satoji od: (i) CDRL1 z CDRL1 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEO IDNO: 5. 7, 9, 10, 12. 13, 15. 16. 17. 18. 19. 20,21,22, 23, 24, 26,28,30,31,32,33.35, 36, 37, 38. 39, 40. 42. 44. i 46; (ii) CDRL2 iz CDRL2 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5,7,9, 10, 12, 13. 15. 16. 17, 18. 19.20.21.22.23,24,26,28.30.31. 32. 33. 35. 36. 37. 38. 397 40, 42. 44, i 46; (iii) CDRL3 iz CDRL3 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13. 15. 16, 17, 18. 19.20.21.22.23.24.26,28, 30. 31. 32, 33. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 42. 44. i 46; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više amino kiselinskih substitucija. isključenja ili uključenja od ne više od 4 amino kiseline; ili C) jedan ili više CDRH teškog lanca iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B). U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein obuhvata najmanje jedan CDRH iz A)i najmanje jedan CDRL iz B). U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein obuhvata najmanje dva CDRH iz A) i najmanje dva CDRL iz B). U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein obuhvata pomenute CDRIIL CDRH2, CDRH3. CDRL1, CDRE2 i CDRL3. U nekim ostvarenjima. CDRH iz A) odabran je iz najmanje jedne od grupe koju čine: (i) CDRH I sekvenca amino kiseline odabrana od CDRH1 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67, 79, 89, i 49; (ii) CDRH2 sekvenca amino kiseline odabrana od CDRH2 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 67, 79, 89, i 49; (iii) CDRH3 sekvenca amino kiseline odabrana od CDRH3 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67, 79, 89, i 49; i (iv) CDRH iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više amino kiselinskih substitucija, isključenja ili uključenja od ne više od 2 amino kiseline. Dodatno. CDRL iz B) odabran je najmanje iz jedne grupe koju čine: (i) CDRL1 sekvenca amino kiseline odabrana od CDRL1 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 35. 32. i 23: (ii) CDRL2 sekvenca amino kiseline odabrana od CDRL2 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 12. 35, 32, i 23: (iii) CDRL3 sekvenca amino kiseline odabrana od CDRL3 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 32. 35, 32, i 23; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više amino kiselinskih substitucija, isključenja ili uključenja ne više od dve amino kiseline; ili Cjjedan ili više CDRH teškog lanca iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B. U nekim ostvarenjima, CDRH iz A) bira se iz najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRH1 sekvence amino kiseline iz CDRH1 sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 67: (ii) CDRH2 sekvence amino kiseline iz CDRI 12 sekvence amino kiseline u SEO ID NO: 67: (iii) CDRH3 sekvence amino kiseline iz CDRI13 sekvence amino kiseline u SEO ID NO: 67: i (iv) CDRI1 iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više amino kiselinskih substitucija, isključenja ili uključenja ne više od 2 amino kiseline: pomenuti CDRL iz B) bira se iz najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRL1 sekvence amino kiseline iz CDRL1 sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: )2: (ii) CDRL2 sekvence amino kiseline iz CDRL2 sekvence amino kiseline u SEO ID NO: 12: (iii) CDRL3 sekvence amino kiseline iz CDRL3 sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 12: i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više amino kiselinskih substitucija. isključenja ili uključenja ne više od 2 amino kiseline; ili C) jedan ili više CDRJ1 teškog lanca iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata A) CDRH1 iz CDRH1 sekvence u SEO ID NO: 67. CDRII2 iz CDRH2 sekvence u SEO ID NO: 67. i CDRI 13 iz CDRI 13 sekvence u SEQ ID NO: 67. i B) CDRL1 iz CDRL1 sekvence u SEQ ID NO: 12. CDRL2 iz CDRL2 sekvence u SEQ ID NO: 12. i CDRL3 iz CDRL3 sekvence u SEO ID NO: 12. Ovde je takođe opisan antigen vezujući protein koji obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji ima najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa sekvencom amino kiseline odabrana iz grupe koju čine SEO ID NO: 74. 85, 71, 72. 67. 87. 58. 52. 51, 53. 48. 54. 55. 56, 49. 57. 50. 91. 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81. i 60. i/ili varijabilni region lakog lanca (VL) koji ima najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa sekvencom amino kiseline odabrane iz grupe koju čine SEO IDNO: 5. 7.9, 10, 12. 13, 15. 16. 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24. 26. 28.30.31, 32, 33. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 42. 44. i 46. VH može imati najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa sekvencom amino kiseline odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49. 57, 50, 91, 64, 62. 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60, i/ili VL može imai najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa sekvencom amino kiseline odabrana iz grupe koju čine SEO ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 3 7. 18, 19, 20, 21, 22. 23, 24, 26, 28. 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42. 44. i 46. VH može biti odabrano iz grupe koju čine SEQ IDNO: 74, 85,71, 72, 67, 87.58, 52, 51,53. 48, 54. 55, 56, 49. 57, 50,91,64, 62. 89, 65, 79. 80. 76, 77, 78, 83, 69, 81. i 60, i/ili VL može biti odabrano iz grupe koju čine SEO IDNO: 5. 7,9, 10, 12. 13, 15. 16. 17, 18. 19.20.21.22. 23.24.26.28.30.31.32.33,35, 36. 37. 38. 39. 40. 42, 44. i 46.

[0028] U nekim aspektima, izolovani antigen vezujući protein specifično se vezuje za epitop koji je vezan od sirane bilo kojeg ovde opisanog A VP.

[0029] Takođe je opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9. gde antigen vezujući protein obuhvata: A) jedan ili više CDR teškog lanca fCDRI I) izabran između najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRH1 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRH1 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 74. 85. 71. 72. 67. 87. 58. 52. 5 1. 53. 48. 54. 55. 56. 49. 57. 50. 91. 64. 62. 89. 65. 79. 80. 76. 77. 78. 83. 69. 81. i 60: (ii) CDRH2 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRH2 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 74. 85, 71. 72. 67. 87. 58. 52. 51. 53. 48. 54. 55. 56. 49. 57. 50. 91. 64. 62. 89. 65. 79. 80. 76. 77, 78. 83. 69, 81. i 60; i (iii) CDRI 13 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRH3 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 74. 85. 71. 72. 67, 87, 58. 52. 51, 53, 48, 54, 55. 56. 49. 57. 50, 91. 64. 62, 89. 65. 79, 80. 76. 77. 78. 83. 69. 81, i 60; B) jedan ili više CDR lakog lanca (CDRL) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRL1 sa najmanje 80%) sekvencijalnog identiteta sa CDRL1 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 5. 7. 9. 10. 12. 13. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 26. 28, 30. 31, 32. 33, 35. 36, 37. 38. 39. 40, 42, 44. i 46: (ii) CDRL2 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRL2 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5,7, 9. 10, 12. 13. 15. 16. 17. 1 8. 19. 20.21.22. 23.24.26. 28. 30.31.32.33.35.36.37. 38. 39. 40. 42. 44. i 46; i (iii) CDRL3 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRL3 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 5. 7. 9, 10, 12. 13. 15. 16. 17. 18. 19, 20. 21. 22. 23. 24. 26. 28, 30. 31, 32. 33, 35, 36, 37. 38. 39, 40. 42. 44. i 46: ili C) jedan ili više CDRH teškog lanca iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata: A) jedan ili više CDRI I odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRH1 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRH 1 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 74. 85. 71. 72. 67. 87. 58. 52. 51. 53. 48. 54. 55, 56, 49, 57. 50, 91. 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76. 77, 78, 83, 69, 81, i 60; (ii) CDRH2 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRH2 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72. 67. 87, 58, 52, 51. 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91. 64, 62. 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; i (iii) CDRH3 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRH3 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87. 58. 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80. 76, 77. 78. 83. 69. 81. i 60; B) jedan ili više CDRL odabran između najmanje jednog uz grupe koju Čine: (i) CDRL1 sa najmanje 90%> sekvencijalnog identiteta sa CDRL1 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO IDNO: 5, 7. 9. 10, 12. 13. 15. 16. 17. 18. 19.20. 21. 22. 23. 24. 26.28. 30. 31. 32. 33. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 42. 44. i 46; (ii) CDRL2 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRL2 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju Čine SEO ID NO: 5. 7, 9. 10. 12. 13, 15, 16, 17, 18, 19. 20. 21. 22. 23. 24. 26. 28. 30. 31. 32. 33. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 42. 44. i 46; i (iii) CDRL3 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRL3 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEO ID NO: 5. 7. 9. 10. 12. 1 3. 1 5. 16. 1 7. 1 8. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 26. 28. 30. 3 1. 32. 33. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 42. 44. i 46: iliC)jedan ili više CDRH teškog lanea iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B).

[0030] U nekim aspketima. ovaj pronalazak obuhvata izolovani antigen vezujući protein koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca odabranih iz grupe kombinacija koje se sastoje od: varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 10 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEO ID NO: 72: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 12 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 67: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 17 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 51; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 23. i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEO ID NO: 49; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEO ID NO: 35 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEO ID NO: 79: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 461 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 459; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 465. i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 463; i varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SF>Q ID NO: 485 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 483. pri čemu se antigen vezujući protein specifično vezuje za PCSK9.

[0031] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein specifično se vezuje za epitop koji je vezan najmanje jednim od ovde opisanih antigen vezujućih proteina. U nekim ostvarenjima, sekvenca amino kiseline AVP-a bira se iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 35. 23, i neke njihove kombinacije. U nekim ostvarenjima, teški lanac AVP-a obuhvata CDRH3 iz SEQ ID NO: 67, CDRH2 iz SEQ ID NO: 67. i CDRH1 iz SEQ ID NO:67. a pomenuti laki lanac obuhvata CDRL3 iz SEQ ID NO: 12, CDRL2 iz SEQ ID NO: 12, i CDRL1 iz SEQ ID NO: 12. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo. poliklonalno antitelo, rekombinanlno antitelo, humano antitelo. humanizovano antitelo. himerično antitelo, multispecifično antitelo. ili neki fragment tih antitela. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein jea Fab fragment. Fab' fragment. F(ab')2 fragment, Fv fragment, dijatelo. ili molekul antitela sa pojedinačnim lancem. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je humano antitelo. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je IgGl-, IgG2- IgG3- ili lgG4-tipa. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je IgG4- ili lgG2-tipa. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein vezuje se za markirnu grupu. 11 nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein jeukompeticiji za vezivanje za PCSK9 sa nekim ovde opisanim antigen vezujućim proteinom. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo. poliklonalno antitelo, rekombinantno antitelo. humano antitelo. humanizovano antitelo, himerično antitelo. multispecifično antitelo. ili neki fragment tih antitela. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je Fab fragment, Fab' fragment. F(ab')<2>fragment, Fv fragment, dijatelo. ili molekul antitela sa pojedinačnim lancem. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein vezan je za markirnu grupu. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein redukujc vezivanje PCSK9 za LDLR. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein snižava količinu prisutnog LDL-a u subjektu kada mu se daje. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein snižava količinu holesterola u serumu prisutnog u subjektu kada se daje tom subjektu. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein povećava količinu LDLR-a prisutnog u subjektu kada se daje tom subjektu.

[0032] U nekim aspektima, ovaj pronalaz obuhvata vektor koji obuhvata ovde opisan molekul nukleinske kiseline. U nekim ostvarenjima, ovaj pronalazak obuhvata ćeliju domaćina koja obuhvata ovde opisani molekul nukleinske kiseline.

[0033] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata izolovani isolated antigen vezujući protein koji je u kompeticiji za vezivanje za PCSK9 sa ovde opisanim antigen vezujućim proteinom.

[0034] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata molekul nukleinske kiseline koji enkodira ovde odgovarajuće opisan antigen vezujući protein.

[0035] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata najmanje jedan ovde opisan antigen vezujući protein.

[0036] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata AVP kakav je ovde opisan za upotrebu za tretiranje ili prevenciju stanja povezanih sa povišenim nivoima holesterola u serumu pacijenta, obuhvatajući davanje pacijentu kome je to potrebno efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina

[0037] Takodc je opisan AVP kakav je ovde opisan za upotrebu u sprečavanju inhibiranja vezivanja PCSK9 za LDLR kod subjekta, koji obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog antigen vezujućeg proteina.

[0038] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata antigen vezujući protein koji se selektivno vezuje za PCSK9, gde se antigen vezujući protein vezuje za PCSK9 sa K<d>koja je manja od 100 pM.

[0039] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata AVP kako je ovde opisan</>a upotrebu u tretiranju ili prevenciji stanja povezanih sa povišenim nivoima holesterola u serumu subjekta, gde upotreba obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina simultano ili sekvenci jalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina.

[0040] Takođe je opisan AVP kakav je ovde opisan za primenu u snižavanju nivoa holesterola u serumu subjekta, pri čemu upotreba obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina.

[0041] Takođe je opisan AVP kakav je ovde opisan za primenu u snižavanje nivoa holesterola u serumu subjekta, pri čemu upotreba obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina, simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina.

[0042] Takođe je opisan AVP kakav je ovde opisan za primenu u povećavanju nivoa LDLR proteina kod subjekta, gde primena obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog odve opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina.

[0043] Takodc je opisan AVP kakav je ovde opisan za primenu u povećavanju nivoa LDLR proteina kod subjekta, gde primena obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog o

[0044] vde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina.

[0045] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata ovde opisani AVP i agens koji podiže dostupnost nivoa LDLR proteina. U nekim ostvarenjima, agens koji podiže dostupnost LDLR proteina obuhvata statin. U nekim ostvarenjima, statin se bira iz grupe koju Čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin. rozuvastatin, simvastatin, i neku njihovu kombinaciju.

[0046] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obuhvata postupak pripreme ovde opisanog antigen vezujućeg proteina, koji obuhvata fazu pripremanja pomenutog antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina koja sekreluje pomenuti antigen vezujući protein.

[0047] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata najmanje jedan ovde opisani antigen vezujući protein i farmaceutski prihvatljivi ekscipijens. U nekim ostvarenjima, ova farmaceutska kompozicija dalje obuhvata dodatni aktivni agens. U nekim ostvarenjima, pomenuti dodatni aktivni agens bira se iz grupe koju čine radioizotop. radionuklid. toksin, ili terapeutsku ili hemoretapeutsku grupu.

[0048] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata ovde opisani AVP za primenu u tretiranju ili prevenciji stanja vezanog za povišeni nivo holesterola u serumu pacijenta. Primena obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog antigen vezujućeg proteina. U nekim ostvarenjima, to stanje je hiperholesterolemija.

[0049] Takođe je opisan AVP kakav je ovde opisan za primenu u inhibiranju vezivanja PCSK9 za LDLR kod pacijenta, koja obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog odgovarajućeg antigen vezujućeg proteina kakav je ovde opisan.

[0050] U jednom aspketu, ovaj pronalazak obuhvata antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK9 sa K<đ>kojaje manja od 100 pM. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se vezuje sa K<d>kojaje manja 10 pM. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se sa K<d>kojaje manja od 5 pM.

[0051] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata AVP kakav je ovde opisan za upotrebu u tretiranju ili prevenciji stanja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu subjekta, gde pomenuta upotreba obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine namanje jednog izolovanog antigen vezujućeg proteina kakav je ovde opisan simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina. U nekim ostvarenjimaagens koji podiže dostupnost LDLR proteina obuhvata statin. U nekim ostvarenjima, taj statin bira se iz grupe koju Čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin. lovastatin, mevastatin. pitavastatin, pravastatin. rozuvastatin. simvastatin. i neka njihova kombinacija.

[0052] Takođe je opisan AVP kakav je ovde opisan za primenu u snižavanju nivoa holesterola u serumu subjekta. Ta upotreba obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina.

[0053] Takođe je opisan AVP kakav je ovde opisan za primenu u snižavanju nivoa holesterola u serumu subjekta, koja obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog izolovanog antigen vezujućeg proteina, kakvo je ovde opisano, simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina. U nekim ostvarenjima agens koji podiže dostupnost LDLR proteina obuhvata statin. U nekim ostvarenjima, taj statin bira se iz grupe koju čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin. lovastatin. mevastatin. pitavastatin. pravastatin. rozuvastatin. simvastatin, i neka njihova kombinacija.

[0054] Takođe je opisan AVP kakav je ovde opisan za primenu u povećavanju nivoa LDLR proteina kod subjekta putem davanja subjektu efektivne količine najmanje jednog ovde izolovanog antigen vezujućeg proteina kako je ovde opisano.

[0055] Takođe je opisan AVP kakav je ovde opisan za primenu u povećavanju nivoa LDLR proteina kod subjekta putem davanja subjektu efektivne količine najmanje jednog izolovanog antigen vezujućeg proteina, kakvo je ovde opisano, simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina. U nekim ostvarenjima agens koji podiže dostupnost nivoa LDLR proteina obuhvata statin. U nekim ostvarenjima, taj statin bira se iz grupe koju čine atorvastatin. cerivastatin, fluvastatin. lovastatin, mevastatin. pitavastatin, pravastatin. rozuvastatin. simvastatin. i neka njihova kombinacija.

[0056] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata neutralizujuće antitelo koje se vezuje za PCSK9 i redukuje receptor lipoproteina niske gustine (LDLR) snižavajući efekat PCSK9 na LDLR. U nekim ostvarenjima, to antitelo specifično se vezuje za PCSK9. U nekim ostvarenjima, to antitelo se vezuje za katalitički domen PCSK9. U nekim ostvarenjima, to antitelo se vezuje za epitop unutar ostataka 31-447 SLQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima, to antitelo se vezuje za PCSK9 koji ima sekvencu amino kiseline koja je najmanje 90% identična SEO ID NO: 3.

[0057] Takođe je opisan neutralizujući antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK9. pri čemu se antigen vezujući protein vezuje za PCSK9 na mestu unutar ostataka 31-447 SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima, kada se antigen vezujući protein veže za PCSK9. to antitelo se pozicionira 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK.9: SI53,1154, P155, R194. D238. A239. 1369. S372. D374, C375. T377. C378. F379. V380. S381. W156. N157. L158. E159. II193. E195, H229. R237. G240. K243. D367. 1368, G370. A371. S373. S376, 0382. W72. F150. A151, 01 52. T214. R215. F216. H217. A220. S221. K222. S225. H226, C255. Q256. G257. K258. N317. F318. 1347. L348. G349. T350. L351. E366. D367. D374, V380, S381, 0382, S383, G384, K69. D70, P71, SMS, V149. Dl86, TI87, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290. G291, G316, R319, Y325. V346, G352, T353, G365.1368, 1369, S372, S373. C378, F379. T385. S386, Q387, S153, S188, 1189, Q190, SI91, Dl92, R194, E197,G198, R199. V200, D224, R237, D238, K243. S373. D374, S376, T377, F379,1154, TI 87, H193, E195.1196. M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247,1369, S372. C375, ili C378. U nekim ostvarenjima, antitelo se pozicionira 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: SI 53.1154, P155, R194. D238, A239. 1369. S372, D374. C375. T377. C378, F379, V380, S381. W156, N157. L158. E159. H193. E195. IT229. R237. G240. K243. D367.1368. G370, A371. S373, S376, ili Q382. U nekim ostvarenjima, to antitelo se pozicionira 5 angstrema iii manje od najmanje jednog od sledećih sotataka PCSK9: SI 53. 1154. P155. R194. D238. A239.1369. 5372. D374, C375, T377. C378. F379, V380. ili S381. U nekim ostvarenjima, to antitelo se pozicionira 5 angstrema ili manje od najmanje dva od sledećih sotataka PCSK9: SI53. 1154. P155. R194. D238. A239.1369. S372. D374. C375. T377. C378. 1 379, V380. ili S381. U nekim ostvarenjima, to antitelo je 5 angstrema ili manje od najmanje četiri od sledećih ostataka PCSK9: SI53.1154. P155. R194. D238. A239. 1369. S372. D374. C'375. T377. C378. F379. V380. ili S381. U nekim ostvarenjima, to antitelo je pozicionirano 8 angstrema ili manje pd najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: W72. F150. A151. 0152. T214. R2I5. F216. H217. A220. S221. K222. S225. H226. C255. 0256. G257. K258. N317. F318. T347. L348, G349. T350. L351. E366. D367, D374. V380. S381. 0382. S383. G384. K69. D70. P71. S148. V149. D186. T187. E211, D212, G213, R218. 0219. C223. D224, G227. I I229, L253, N254. G259. P288. A290. G291, G316, R319, Y325, V346. G352. T353. G365,1368. 1369. S372, 5373. C378, F379, T385. S386, ili Q387. U nekim ostvarenjima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK.9: W72. F150. A151, Q152, T2I4, R215. F216. H217. A220. S221. K222. S225. H226, C255. 0256. G257, K258. N317, F318, T347, L348. G349. T350. L35I. E366, D367, D374. V380. S381. 0382. S383. ili G384. U nekim ostvarenjima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje dva od sledećih ostataka PCSK9: W72. Fl 50, A151, Ql 52. T214, R215. F216. H217. A220, S221. K222. S225. H226. C255. 0256. G257, K258. N317. F318. T347, L348. G349, T350, L351, E366, D367. D374, V380. S381. 0382. S383. ili G384. U nekim ostvarenjima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje četiri od sledećih ostataka PCSK9: W72, F150, A151,Q152. T214. R215. F216,H217. A220. S221. K222. S225.11226. C255. 0256. G257. K258. N317, F318. T347. L348, G349, T350. L351, E366. D367. D374. V380, S381. 0382, S383.ili G384. U nekim ostvarenjima, to antitelo je pozicionirano 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, SI 88.1189, Ql 90, SI 91, Dl 92, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238. K243, S373, D374, S376, T377, F379,1154, T187, H193, E195.1196, M201, V202, C223. T228, S235, G236. A239, G244, M247,1369. 5372, C375, ili C378. U nekim ostvarenjima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, SI 88,1189, Ql 90. SI91, Dl92, R194. E197, G198. R199. V200, D224, R237, D238. K243, S373. D374. S376. T377, ili F379. U nekim ostvarenjima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje dva od sledećih ostataka PCSK9: SI 53. SI 88.1189. 0190. SI 91, Dl 92, R194. E197. G198. R199, V200, D224. R237, D238. K243. S373. D374. S376. T377. ili F379. U nekim ostvarenjima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje četiri od sledećih ostataka PCSK9: S153, S188,1189, 0190. S191, D192, R194. E197. G198. R199. V200. D224. R237. D238, K243. S373, D374. S376. T377. ili F379.

[0058] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata neutralizujuće antitelo koje se vezuje za PCSK9. pri čemu se to antitelo vezuje za PCSK.9 i smanjuje izglednost da se PCSK9 veže za

[0059] LDLR.

[0060] U nekim ostvarenjima, antitelo ili antigen vezujući molekul koji sc vezuje za PCSK9 se podrazumeva. To antitelo vezuje se za PCSK9 na mestu unutar ostataka 31 -447 SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima, antitelo ili antigen vezujući molekul. kada je vezan za PCSK9. pozicioniran je 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: SI 53. 1154, P155. R194. D238. A239. 1369. S372. D374. C375, T377. C378. F379. V380. S381. W156, NI57. LI58, E159. Hl93. E195,11229, R237. G240, K243, D367,1368, G370. A37L 5373, S376. 0382. W72. F150, A151, Q152, T214. R215. F216. H217. A220. S221. K.222. S225,11226, C255, Q256. G257, K258, N317. F318. T347. L348, G349, T350, L35L E366, D367, D374. V380. S38I. Q382. S383, G384. K69. D70, P71. 8148. VI49. Dl 86. TI 87. E211. D212, G213. R218. 0219. C223, D224. G227. H229. L253. N254. G259. P288. A290, G291, G316. R319, Y325, V346. G352. T353. G365.1368. 1369. S372, S373. C378, F379, T385, S386, 0387, SI53. SI88. 1189. 0190. S191. D192. R194. LI97. G198, R199. V200. D224. R237. D238. K243, S373, D374. S376. T377, F379. 1154. TI 87. H193. E195. 1196. M201. V202. C223, T228. S235, G236. A239, G244, M247, 1369. S372, C375. ili C378.

[0061] U nekim ostvarenjima, obezbeđeno je izolovano antitelo ili antigen vezujući molekul koje blokira vezivanje antitela za PCSK9 unutar 8 angstrema od ostatka PCSK9. U nekim ostvarenjima ostatak PCSK9 bira se između najmanje jednog od sledećeih PCSK9 ostataka: SI53. II54, P155, R194, D238. A239, 1369. S372, D374. C375, T377. C378. F379. V380. S381, W156. N157. L158. E159. II193. E195, FI229, R237. G240. K243. D367. 1368. G370. A371. S373, S376, 0382, W72. F150, A151, Q152. T214, R215, F216.11217, A220. S221, K222, S225,11226, C255, 0256, G257, K258, N317, F318. T347. L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374. V380, S381, Q382, S383, G384, K69. D70, P71, S148, V149. Dl86, T187. E211, D212. G213, R218, 0219, C223, D224, G227, H229. L253, N254, G259, P288, A290. G291, G316, R319, Y325, V346. G352. T353, G365. 1368,1369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, SI 53, SI88.1189, Q190, S191, Dl92. R194, E197, G198. R199, V200, D224, R237, D238, K243. S373. D374, S376, T377. F379.1154. TI 87, Hl 93. E195. 1196. M201. V202. C223. T228, S235. G236, A239, G244. M247.1369. S372. C375. ili C378.

[0062] U nekim ostvarenjima, obezbedeno je izolovano antitelo ili antigen vezujući molekul koji se vezuje za PCSK9 na poziciji koja se preklapa sa pozicijom na kojoj se LDLR vezuje za PCSK9. U nekim ostvarenjima, pozicija na kojoj se LDLR vezuje za PCSK9 uključuje najmanje jedan amino kiselinski ostatak odabran iz grupe koju čine: S153.1154. P155. R194. D238. A239.

[0063] 1369. S372. D374. C375. T377. C378. F379. V380. i S38L

[0064] U nekim ostvarenjima, obezbedeno je izolovano antitelo ili antigen vezujući molekul koji se vezuje za PCSK.9. U nekim ostvarenjima, antitelo ili antigen vezujući molekul smanjuje izglednost da će se EGFa vzati za PCSK9 unutar 8 angstrema od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: SI 53. 1154, P155. R194. D238. A239. 1369. S372. D374. C375. T377. C378. F379, V380. S381, W156.N157. LI58. E159. Hl 93. E195. H229. R237. G240. K243. D367. 1368. G370. A371. S373. S376. ili 0382.

[0065] U nekim ostvarenjima, obezbedeno je antitelo. antigen vezujući protein, ili antigen vezujući molekul koji se vezuje za površinu PCSK9 koja se preklapa sa površinom na kojoj se vezuje EGFa. vezuje Ab 211312, i/ili nezuje 31H4. U nekim ostvarenjima, antitelo, antigen vezujući protein, ili antigen vezujući molekul se vezuju za PCSK9 na način koji je sličan onom prikazanom u priloženim crtežima.

[0066] U nekim ostvarenjima, gore pomenuta ostvarenja su neutralizujuća antitela ili antigen vezujući proteini. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein nije LDLR ili njegov fragment (kao što je EGFa).

[0067] Takođe je opisao izolovano neutralizujuće antitelo, gde je antitelo vezano za PCSK.9. antitelo je smešteno 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: T468. R469. M470, A471. T472, R496, R499. 1-501. A502, O503. R510. II512. F515. P540. P541, A542. E543. H565. W566. E567. V568. E569. R592. E593. S465. G466. P467. A473. 1474. R476. G497. E498. M500. G504. K506. L507. V508. A511. N513, A514. G516. V536. T538. A539. A544. T548, D570. L571, H59L A594. S595. i H597 iz SEO ID NO: 3. U nekim ostvarenjima, antitelo je smešteno 5 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: T468, R469. M470, A471, T472, R496, R499, E501. A502, O503, R510, H512, F5I5, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, i E593 iz SEQ IDNO: 3.

[0068] Takodc jc opisan izolovani antigen vezujući protein koji obuhvata: A) CDRH1 iz CDRH1 sekvence u SEQ ID NO: 89, CDRH2 iz CDRH2 sekvence u SEQ ID NO: 89, i CDRH3 iz CDRI 13 sekvence u SEO ID NO: 89, i B) CDRL1 iz CDRL1 sekvence u SEQ ID NO:32, CDRL2 iz CDRL2 sekvence u SEQ ID NO:32. i CDRL3 iz CDRE3 sekvence u SEQ ID NO:32.

[0069] Takođe je opisan izolovani antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK9 protein iz SEQ ID NO: 1 pri čemu je vezivanje između pomenutog izolovanog antigen vezujućeg proteina i varijantnog PCSK9 proteina manje od 50% od vezivanja između izolovanog antigen vezujućeg proteina i PCSK9 proteina iz SEO ID NO: 1 i/ili SEO ID NO: 303. U nekim ostvarenjima, varijantni PCSK9 protein obuhvata najmanje jednu mutaciju ostatka na položaju odabranom iz grupe koju čine 207. 208. 185. 181, 439. 513. 538. 539. 132. 351. 390. 413, 582. 162. 164. 167. 123. 129. 311. 313. 337. 519. 521, i 554. kako je prikazano u SEO IDNO: 1. U nekim ostvarenjima, najmanje ta jedna mutacija odabrana je iz grupe koja obuhvata ili koju čine R207E. D208R. E181R. R185E. R439E, E5I3R. V538R. E539R. T132R. S351R. A390R. A413R, i E582R. U nekim ostvarenjima, najmanje ta jedna mutacija odabrana je iz grupe koju čine D162R. R164E, E167R, S123R. E129R. A311R. D313R, D337R. R519E. H521R,i 0554R.

[0070] Takođe jc opisan antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK-9 protein iz SEO ID NO: 303 na prvi način i vezuje se za varijantu PCSK9 na drugi način. Varijanta PCSK.9 ima najmanje jednu tačkastu mutaciju na položaju odabranom iz grupe koja obuhvata ili koju čine: 207, 208, 185, 181.439. 513. 538, 539. 132.351. 390. 413. 582. 162. 164, 167, 123, 129. 311. 313. 337, 519. 521. i 554 iz SEQ ID NO: 303 i /ili SEO ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, prvi način obuhvata prvi EC50. prvi Bmax,ili prvi EC50 i prvi Bmax. U nekim ostvarenjima, drugi načinobuhvata drugi FX50, drugi Bmax. ili drugi EC50 i drugi Bmax. Vrednost za prvi način različit je od vrednosti za drugi način. U nekim ostvarenjima, prvi način obuhvata prvi EC50. dok drugi način uključuje drugi EC50, a gde se tačkasta mutacija bira iz grupe koja se sastoji od ili obuhvata: R207E. D208R, E181R, R185E. R439E. E513R. V538R. E539R. T132R, S351R. A390R. A413R. i E582R. U nekim ostvarenjima, prvi EC50 je najmanje za 20% različit od drugog EC50. U nekim ostvarenjima, prvi EC50 je najmanje za 50% različit od drugog EC50. U nekim ostvarenjima, drugi EC50 ima veću numeričku vrednost od prvog EC50. U nekim ostvarenjima, prvi EC50 određen je multipleksnim ogledom vezivanja kuglice. U nekim ostvarenjima, drugi EC50 jc veći od 1 um. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein je neulralizujući antigen vezujući protein. U nekim ostvarenjima, neutralizujući antigen vezujući protein je kompetitivno neutralizujući antigen vezujući protein. U nekim ostvarenjima. neutralizujući antigen vezujući protein je ne-kompetitivni neutralizujući antigen vezujući protein. U nekim ostvarenjima, prvi način obuhvata prvi Bmax, a drugi način obuhvata drugi Bmax koji je različit od prvog Bmax. Varijanta PCSK9 ima najmanje jednu tačkastu mutaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od ili obuhvata: D162R, R164E, E167R. SI23R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R,i Q554R. U nekim ostvarenjima, drugi Bmax je oko 10% prvog Bmax. U nekim ostvarenjima, prvi Bmax je najmanje 20% različit od drugog Bmax. U nekim ostvarenjima, prvi Bmax je najmanje 50% različit od drugog Bmax.

[0071] Takođe je opisan izolovani antigen vezujući protein koji sc vezuje za PCSK.9 protein iz SEQ ID NO: 3, pri čemu epitop antigen vezujućeg proteina uključuje najmanje jednu od sledećih amino kiselina iz SEO ID NO: 1: 207. 208. 181. 185. 439, 513, 538. 539. 132, 351. 390. 413. 582, 162. 164, 167, 123, 129,311.313,337,519, 521. i 554.

[0072] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata izolovani neutralizujući antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK9 protein obuhvatajući sekvencu amino kieline iz SEQ ID NO: 1. pri čemu neutralizujući antigen vezujući protein umanjuje LDLR eickat snižavanja PCSK9 na LDLR. Takođe je ovde opisan antigen vezujući protein koji je LDLR ne-kompetilivni neutralizujući antigen vezujući protein. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein je LDLR kompetitivni neutralizujući antigen vezujući protein.

[0073] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata izolovani antigen vezujući protein, kod koga pomenuti antigen vezujući protein obuhvata: AJ CDRH1 iz CDRH1 sekvence u SEO ID NO: 49. CDRI 12 iz CDRI 12 sekvence u SEO ID NO: 49. i CDRH3 iz CDRH3 sekvence u SEO ID NO: 49, i B) CDRL1 iz CDRL1 sekvence u SEQ ID NO:23. CDRL2 iz CDRL2 sekvence u SEQ ID NO:23. i CDRL3 iz CDRL3 sekvence u SEQ ID NO:23.

[0074] Takođe je opisana kompozicija koja obuhvata kristalizovani PCSK9 protein i antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK.9. Ova kompozicija obuhvata kristalizovani PCSK9 protein takav da se trodimenzionalna struktura PCSK9 proteina može odrediti do rezolucije od oko 2.2 angstrema ili boljoj. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein je antitelo ili njegov fragment.

[0075] Takođe je opisan kristalizovan PCSK9 protein i najmanje jedna sekcija EGFa LDLR proteina, gde je EGFa sekcija LDLR proteina vezana od strane PCSK9 proteina, pri čemu je pomenuti kristalizovani PCSK9 protein takav da se trodimenzionalna struktura PCSK9 proteina može utvrditi do rezolucije od oko 2.2 angstrema ili boljoj. U nekim ostvarenjima, molekulski model nalazi se na kompijuterski čitljivom medijumu.

[0076] Takođe je opisana primena antigen vezujućeg proteina kakav je ovde opisan, za pripremanje medikamenta za snižavanje holesterola u serumu.

[0077] Takođe je opisana primen antigen vezujućeg proteina kakav je ovde opisan, za pripremanje medikamenta za tretiranje ili prevenciju stanja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu subjekta.

[0078] KRATAK OPIS CTREŽA

[0079] FIG. 1A prikazuje amino kiselinsku sekvencu zrele forme PCSK9 sa podvučenim pro-domenom. FIG. IB<1>-IB<4>prikazuju sekvence amino kiseline i nukleinske kiseline PCSK9 sa podvučenim pro-domenom i signalnom sekvencom u podebljanoj Štampi. FIG. 2A-2D su tabele poredenja sekvenci različitih lakih lanaca različitih antigen vezujućih proteina.

[0080] FIG. 2C nastavak sekvence započete na FIG. 2A.

[0081] FIG. 2D nastavak sekvence započete na FIG. 2B.

[0082] FIG. 3A-3D su tabele poredenja sekvenci različitih teških lanaca različitih antigen vezujućih proteina.

[0083] FIG. 3C nastavak sekvence započete na FIG. 3A.

[0084] FIG. 3D nastavak sekvence započele na FIG. 3B.

[0085] FIG. 3E-3.IJ prikazuju sekvence amino kiseline i nukleinske kiseline za varijabilne domene nekih ostvarenja antigen vezujućih proteina.

[0086] FIG. 3K.K prikazuje amino kiselinske sekvence za različite konstantne domene.

[0087] FIG. 3LL-3BBB prikazuju sekvence amino kiseline i nukleinske kiseline varijabilnih domena nekih ostvarenja antigen vezujućih proteina. FIG. 3CCC-3JJJ su tabele poredenja sekvenci različitih teških i lakih lanaca nekih ostvarenja antigen vezujućih proteina.

[0088] FIG. 4A je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za humani PCSK9.

[0089] FIG. 4B je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za humani PCSK9.

[0090] FIG. 4C je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za makaki PCSK.9.

[0091] FIG. 4D je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za makaki PCSK9.

[0092] FIG. 4E jc kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za misiji PCSK9.

[0093] FIG. 4F jc kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za misiji PCSK.9.

[0094] FIG. 5A prikazuje rezultate SDS PAGE eksperiemenla koji uključuje PCSK9 i različite antigen vezujuće proteine, koji prikazuje relativnu čistoću i koncentraciju proteina.

[0095] FIG. 5B i 5C prikazuje grafikone Biacore ogleda ravnoteže rastvora za 21 BI2.

[0096] FIG. 5D prikazuje grafikon kinetika iz Biacore ogleda hvatanja.

[0097] FIG. 5E prikazuje bar grafikon koji prikazuje bining rezultate za tri AVP-a.

[0098] FIG. 6A kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG2 za PCSK9 u in vitro PCSK9: LDLR ogledu vezivanja. FIG. 6B kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG4 za PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR ogledu vezivanja. FIG. 6C kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG2 za PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR ogledu vezivanja. FIG. 6D kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG4 za PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR ogledu vezivanja. FIG. 7A kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 lgG2 u ogledu ćelijskog LDL unosa, koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK.9. FIG. 7B je kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31FI4 IgG4 u ogledu ćelijskog LDL unosa, koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9. FIG. 7C je kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21 BI2 IgG2 u ogledu ćelijskog LDL unosa koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9. FIG. 7D je kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21 BI2 lgG4 u ogledu ćelijskog LDL unosa, koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9. FIG. 8A je grafikon koji prikazuje sposobnost smanjivanja serum holesterola AVP 31H4 kod miševa, promene u odnosu na IgG kontrolne tretirane miševe (<*>p< 0.01). FIG. 8B je grafikon koji prikazuje sposobnost smanjivanja serum holesterola AVP 3 IH4 kod miševa, promene u odnosu na vreme = nula časova (# p. 0.05). FIG. 8C je grafikon koji prikazuje efeakt AVP 31H4 na nivoe IIDL holesterola kod C57B1/6 miševa (* p< 0.01). FIG. 8D je grafikon koji prikazuje efekat AVP 31H4 na nivoe IIDL holesterola kod C57B1/6 miševa (# p< 0,05). FIG. 9 prikazuje western blot analizu sposobnosti AVP 31H4 da poveća LDLR protein u jetri koji je prisutan posle različitih vremenskih tačaka. FIG. 10A je grafikon koji prikazuje sposobnost antigen vezujućeg proteina 31114 da smanji ukupni serum holesterol kod divljih miševa, relativno. FIG. 10B je grafikon koji prikazuje sposobnost antigen vezujućeg proteina 31H4 da smanji IIDL kod divljih miševa. FIG. 10C jc grafikon koji prikazuje sposobnost smanjivanja serum holesterola različitih antigen vezujućih proteina 31FI4 i 16F12. FIG. 11 A pokazuje protokol unosa za testiranje trajanja i sposobnosti smanjivanja serum holesterola antigen vezujućih proteina.

[0099] FIG. 11B je grafikon koji prikazuje rezultate protokola u FIG. 11 A.

[0100] FIG. 12A prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 21B12 u HepG2 ćelijama. FIG. 12B prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 31H4 u HepG2 ćelijama. FIG. 12C prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 25A7.1, neneutrališuće antitelo. (nasuprot "25A7" neutrališućem antitelu) u HepG2 ćelijama. FIG. 12D prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 21 B12 u I IepG2 ćelijama sa prekomernom ekspresijom PCSK.9. FIG. 12E prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 31H4 u HepG2 ćelijama sa prekomernom ekspresijom PCSK9. FIG. 12F prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 25A7.1, neneutrališuće antitelo. (nasuprot "25A7" neutrališućem antitelu) u IIepG2 ćelijama sa prekomernom ekspresijom PCSK.9. FIG. 13A prikazuje različite lake lance amino kiselinskih sekvenci različitih AVPa za PCSK9. Tačke (.) označavaju da nema amino kiseline.

[0101] FIG. 13B prikazuje kladogram lakog lanca za različite AVPe za PCSK9.

[0102] FIG. 33C prikazuje različite teške lance amino kiselinskih sekvenci različitih AVPa za PCSK9. Tačke (.) označavaju da nema amino kiseline.

[0103] FIG. 13D prikazuje dendrogram teškog lanca za različite AVPe za PCSK9.

[0104] FIG. 13E prikazuje poređenje lakih i teških CDR-ova i oznake grupa od kojih se dobija konsenzus.

[0105] FIG. 13F prikazuje konsenzus sekvence Grupa 1 i 2.

[0106] FIG. 13G prikazuje konsenzus sekvence Grupa 3 i 4.

[0107] FIG. 13FI prikazuje konsenzus sekvence Grupa 1 i 2. Tačke (.) označavaju identične ostatke.

[0108] FIG. 131 prikazuje konsenzus sekvence Grupe 2. Tačke (.) označavaju identične ostatke.

[0109] FIG. 13J prikazuje konsenzus sekvence Grupa 3 i 4. Tačke {.) označavaju identične ostatke. FIG. 14A je grafikon koji prikazujein vivosposobnost smanjivanja LDL različitih AVPa (pri 10 mg/kg). FIG.14B je grafikon koji prikazuje in vivosposobnost smanjivanja LDL različitih AVPa (pri 30 mg/kg). FIG. 15A i FIG. 15B su tabele poredenja sekvenci različitih lakih lanaca različitih ostvarenja antigen vezujućih proteina.

[0110] FIG. 15B nastavak sekvence započele u FIG. 1 5A.

[0111] FIG. 15C i FIG. 15D su tabele poredenja sekvenci različitih lakih lanaca različitih ostvarenja antigen vezujućih proteina.

[0112] FIG. 15D nastavak sekvence započete u FIG. 15C.

[0113] FIG. 16A je prikaz gela korišćenog da se testira sposobnost Ab 21B12 da se veže za ProCat ili VD delove PCSK9. FIG. 16Bje prikaz gela korišćenog da se testira sposobnost Ab 31H4 da se veže za ProCat ili VD delove PCSK9.

[0114] FIG. 17 je prikaz strukture PCSK.9 i EGFa dela LDLR.

[0115] FIG. 18A je prikaz strukture PCSK9 i 31H4 Ab.

[0116] FIG. 18B je prikaz strukture PCSK9 i 31114 Ab.

[0117] FIG. 19A jc prikaz strukture PCSK9. 31H4 Ab. i 21 BI2 Ab.

[0118] FIG. 19B je prikaz strukture PCSK9 i 21 BI2 Ab.

[0119] FIG. 20A je prikaz strukture PCSK.9 i EGFa iz LDLR prekrivenog strukturom antitela 31H4 i 21B12 vezanih za PCSK9.

[0120] FIG. 20B je prikaz strukturnog modela PCSK9 i LDLR.

[0121] FIG. 20C je prikaz strukturnog modela PCSK9 i LDLR iz alternativne perspektive.

[0122] FIG. 20D je prikaz strukturnog modela PCSK.9 i LDLR sa uključenim strukturnim predstavljanjem 31114 i 21 BI2. FIG. 20E je prikaz strukturnog modela u FIG. 20D. rotiranog za 90 slepeni oko ubeležene ose. FIG. 20F je prikaz strukturnog modela u FIG. 20D. rotiranog za 1 80 slepeni oko ubeležene ose.

[0123] FIG. 21A je prikaz strukture PCSK.9 i 31A4.

[0124] FIG. 21B je prikaz strukture PCSK9 i 31A4.

[0125] FIG. 21C je prikaz strukture PCSK9 i 31A4.

[0126] FIG. 21D je prikaz strukturnog modela cele dužine PCSK9 i 31A4.

[0127] FIG. 22 je set AVP sekvenci koje identifikuju različite razlike između humanih AVP sekvenci i AVP sekvenci koje su odgajene u E. coli i upotrebljene za kristalne strukture.

[0128] FIG. 23 je tabela različitih bining rezultata.

[0129] F"IG. 23A je prvi deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.

[0130] FIG. 23B je drugi đeo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.

[0131] FIG. 23C je treći deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.

[0132] FIG. 23D je četvrti deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.

[0133] FIG. 24A je prikaz vveslcrn blota pod ne-redukovanim uslovima.

[0134] FIG. 24B je prikaz vvestern blota pod redukovanim uslovima.

[0135] FIG. 25A je prikaz pokrovne površine PCSK9.

[0136] FIG. 25B je prikaz pokrovne površine PCSK9.

[0137] FIG. 25C je prikaz pokrovne površine PCSK9.

[0138] FIG. 25D je prikaz pokrovne površine PCSK9.

[0139] FIG. 25E je prikaz pokrovne površine PCSK9.

[0140] FIG. 25F je prikaz pokrovne površine PCSK9.

[0141] FIG. 26 je poređenje sekvence PCSK9 amino kiselinske sekvence i svih ostataka koji su mutirali u PCSK9 varijantama radi ispitivanja epitopa različitih antitela. FIG. 27A prikazuje 21 BI 2 pogođeni epitop. kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 21BI2. FIG. 27B prikazuje 31H4 pogođeni epitop. kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9. sa 31H4 i 21BI. FIG. 27C prikazuje 31A4 pogođeni epitop. kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK.9,00 sa 31II4 i 21B12. FIG. 27D prikazuje 12FI11 pogođeni epitop. kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 31H4 i 21 BI2. FIG. 27L prikazuje 3C4 pogođeni epitop. kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK.9. sa 31H4 i 21B12. FIG. 28A je grafikon koji ilustruje sposobnost vezivanja različitih AVPa za različite delove PCSK9. FIG. 28B je grafikon koji ilustruje sposobnost vezivanja različitih AVPa za različite delove PCSK9.

[0142] FIG. 28C je grafikon koji poredi sposobnost vezivanja LDLR od strane dva AVPa.

[0143] FIG. 28D je grafikon koji poredi aktivnost ćelijskog unosa LDL od strane dva AVPa.

[0144] DETALJNI OPIS ODREĐENIH PRIMERNIH OSTVARENJA

[0145] Ovde su opisani antigen vezujući proteini (kao Što su antitela i njihovi funkcionalni vezujući fragmenti) koji sc vezuju za PCSK9. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za PCSK9 i sprečavaju PCSK9 da funkcioniše na različite načine. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini blokiraju ili redukuju sposobnost PCSK9 da interreaguje sa drugim supstancama. Na primer. u nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje sc za PCSK9 na takav način da sprečava, ili redukuje, verovatnoću da će se PCSK9 vezati za LDLR. U drugim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za PCSK9 ali ne blokiraju sposobnost PCSK9-ova da interreaguje sa LDLR. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini su humana monoklonalna antitela.

[0146] Kao što će biti prihvaćeno od stručnjaka, u svetlu ovog pronalaska, menjanje interakcija između PCSK9 i LDLR može povećati količinu LDLR koja je dostupna za vezivanje za LDL. što povratno smanjuje količinu LDL u serumu kod subjekta, rezultirajući redukcijom nivoa holesterola u serumu subjekta. Kao takvi, antigen vezujuću proteini za PCSK9 i kompozicije koje obuhvataju isti mogu se upotrebiti za tretiranje subjekata sa povišenim nivoima holesterola u serumu, koji su pod rizikom od povišenih nivoa holesterola u serumu, ili onih koji mogu imati koristi ođ redukcije nivoa holesterola u serumu. Prema tome. različite upotrebe i tehnike za snižavanje, održavanje, ili prevenciju povećanja holesterola u serumu su takođe ovde opisane. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein omogućuje vezivnje između PCSK9 i LDLR, ali antigen vezujući protein sprečava ili redukuje sporednu aktivnost PCSK9 na LDLR. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein sprečava ili redukuje vezivanje PCSK9 za LDLR.

[0147] Da bi bilo pogodnije, sledeća poglavlja generalno ističu različita značenja termina koji sc ovde koriste. Sledeći ovu diskusiju, generalni aspekti koji razmatraju antigen vezujuće proteine su diskutovani. za kojim slede specifični primeri koji prikazuju karakteristike različitih ostvarenja antigen vezujućih proteina i kako se oni mogu upotrebiti.

[0148] Definicije i ostvarenja

[0149] Mora da se shvati da i gore pomenuti generalni opis i detaljni opisi koji slede su primerni i samo radi objašnjenja i nisu restriktivni u odnosu na pronalazak kao što je podneto u zahtevima. U ovoj prijavi, upotreba jednine uključuje množinu sem ako je specifično naznačeno drugačije. U ovoj prijavi, upotreba ..ili" znači ..i/ili" sem ako je naznačeno drugačije. Scm toga. upotreba termina „uključujući", kao i drugih oblika, kao što je „uključuje" i „uključeno", nije ograničavajuća, takođe, termini kao što je "element" iii "komponenta" obuhvataju i elemente i komponente obuhvatajući jednu jedinicu i elemente i komponente koji obuhvataju više od jedne podjedinice sem ako je specifično naznačeno drugačije. Takođe, upotreba termina "deo" može uključiti deo grupe ili celu grupu.

[0150] Naslovi poglavlja su ovde upotrebljeni samo radi organizacione namene i ne treba da se protumače kao ograničavajući za opisanu predmetnu materiju. Kao što se koristi prema ovom pronalasku, sledeći termini, sem ako je naznačeno drugačije, treba da se shvate tako da imaju sledeća značenja: Termin „proprotein konvertaza subtilizin keksin tip 9" ili ..PCSK9" odnosi se na polipeptid kao što je izneto u SEO ID NO: 1 i/ili 3 ili njegove fragmente, kao i srodne polipeptide. koji uključuju, ali nisu ograničeni na. alelske varijante, spojene varijante, izvedene varijante, supstitucione varijante, delecione varijante, i/ili insercione varijante uključujući adiciju N-lerminalnog metionina, fuzione polipeptide. i interspecijske homologe. U određenim ostvarenjima, PCSK9 polipeptid uključuje terminalne ostatke, kao što su, ali bez ograničenja na, ostatke vodećih sekvenci, ciljne ostatke, amino terminalne metionin ostatke, lizin ostatke, tag ostatke i/ili ostatke fuzionog proteina. „PCSK9" se takode označava i kao FH3, NARC1, IICH0LA3, proprotein konvertaza subtilizin/keksin tip 9, i neuralna apoptozis regulisana konvertaseza 1. PCSK9 gen kodira proprotein konvertaza protein koji pripada podporodici proteinaze K porodice sekretornc subtilaze. Termin „PCSK9" označava i proprotein i produkt koji je generisan nakon autokatalisanja proproteina. Kada je iznet samo autokatalizovani produkt (kao što se to odnosi na antigen vezujući protein koji se selektivno vezuje za isečeni PCSK9). protein se može označiti kao "zreo", „rascepljen"...proizveden" ili ..aktivn" PCSK9. Kada je izneta samo neaktivna forma, protein sc može označiti kao „neaktivan", "pro-oblik". ili „neproizveden" oblik PCSK9. Termin PCSK9 onako kako se ovde koristi takođe uključuje alele koji se prirodno javljaju, kao što su mutacije D374Y. S127R i F216L. Termin PCSK9 takode obuhvata PCSK9 molekule koji inkorporiraju post-translacione modifikacije sekvence PCSK9 amino kiseline, kao što su PCSK.9 sekvence koje su glikozilirane. PEGilirane, PCSK9 sekvence iz kojih je iseeena signalna sekvenca. PCSK9 sekvence iz kojih je isečen pio domen isečen iz katalitičkog domena ali nije odvojen od katalitičkog domena (npr.. FIG.. 1 A i 1 B).

[0151] Termin „PCSK9 aktivnost" uključuje bilo koji biološki efekt PCSK9. U određenim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da interreauguje ili se vezuje za supstrat ili receptor. U nekim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 je predstavljena sa sposobnošću PCSK9 da se vezuje za LDL receptor (LDLR). U nekim ostvarenjima. PCSK9 se vezuje za i katalizuje reakciju koja uključuje LDLR. U nekim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da izmeni (npr.. redukuje) dostupnost LDLR. U nekim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da poveća količinu LDL kod subjekta. U nekim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da smanji količinu LDLR koja je dostupna da se vezuje za LDL. U nekim ostvarenjima „PCSK9 aktivnost" uključuje bilo koju biološku aktivnost koja je nastala od signaliranja PCSK9. Primerne aktivnosti uključuju, ali nisu ograničene na. PCSK9 vezivanje za LDLR, PCSK9 enzimsku aktivnost koja iseca LDLR ili druge proteine, PCSK9 vezivanje za druge proteine koji nisu LDLR koje olakšava PCSK9 delovanje. PCSK9 izmene APOB sekreciju (Sun X-M i sar. "Dokazi efekata mutantnog PCSK9 na sekreciju apoliproteina B kao slučaj neuobičajeno snažne dominantne hiperholesterolemije. Human Molecular Genetics 14: 1161-1169. 2005 i Ouguerram K i sar. "Metabolizam apolipoproteina BI00 u autozomalno-dominantnoj hiperholesterolemije vezanoj za mutacije u PCSK9. Arterioscler thromb Vase Biol. 24: 1448-1453. 2004). PCSK9ovu ulogu u regeneraciji jetre i diferenciranju neuronskih ćelija (Seidah NG i sar. "Sekretorni proprotein konvertaza neuralno apoptozis-regulisana konvertaza 1 (NARC-1): Regeneracija jetre i diferencijacija neurona" PNAS 100: 928-933, 2003), i PCSK9ova uloga u hepatičnom metabolizmu glukoze (Costet i sar., "Hepatična ekspresija PCSK9 je regulisana statusom ishrane preko insulina i sterol regulatornog element-vezujućeg proteina lc" J. Biol. Chem. 281(10):6211-18, 2006).

[0152] Termin „hiperholesterolemija", onako kako se ovde koristi, odnosi se na stanje u kojem su nivoi holesterola povišeni iznad željenog nivoa. U nekim ostvarenjima, to znači da su nivoi holesterola u serumu povišeni. U nekim ostvarenjima, željeni nivo uzima u obzir različite „faktore rizika" koji su poznati stručnjaku (i koji su opisani ili izneti ovde referencom).

[0153] Termin „polinukleotid" ili „nukleinska kiselina" uključuje i pojedinačne jedno-lančane i dvo-lančane nukleotidne polimere. Nukleotidi koji obuhvataju polinukleotid mogu biti ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Pomenute modifikacije uključuju modifikacije baza kao što su derivati inozina. modifikacije riboze kao što je 2'.3'-dideoksiriboza. i modifikacije inlernukleotidne veze kao što su fosfortioat. i<b>sforditioat, fosforselenoat. fosfordiselenoat. fosforanilotioat. fosibraniladat i fosforamidat.

[0154] Termin ..oligonukleotid" označava polinukleotid koji obuhvata 200 ili manje nukleotida. U nekim ostvarenjima, oligonukleotidi su 10 do 60 baza u dužinu. {' drugim ostvarenjima, oligonukleotidi su 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. ili 20 do 40 nukleotida u dužinu. Oligonukleotidi mogu biti jedno lančan i ili dvolančani. npr.. za upotrebu u konstrukciji mutantnog gena. Oligonukleotidi mogu biti sens iii antisens oligonukleotidi. Oligonukleotid može uključiti obeleživač. uključujući radioobeleživač. fluorescentni obeleživač. hapten ili antigeni obeleživač. za oglede detekcije. Oligonukleotidi se mogu upotrebiti. na primer. kao PCR prajmeri, prajmeri za kloniranje ili hibridizacione probe.

[0155] „Izolovani molekul nukleinske kiseline" označava genomsku DNK ili RNK, mRNK, cDNK. ili sintetičko poreko ili neku njihovu kombinaciju koja nije vezana sa svim ili delom od polinukleotida u kojem je izolovani polinukleotid nađen u prirodi, ili je vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi. Za potrebe ovog pronalaska, trebalo bi da se shvati da „molekul nukleinske kiseline obuhvata" određenu nukleotidnu sekvencu koja ne obuhvata intaktne hromozome. Izolovanii molekuli nukleinske kiseline „obuhvatajući" specifične sekvence nukleinske kiseline mogu uključiti, u dodatku na specifične sekvence. kodirajuće sekvence sve do deset ili čak do dvadeset drugih proteina ili njihovih delova. ili mogu uključiti operativno vezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju kodirajućeg regiona navedenih sekvenci nukleinske kiseline, i/ili mogu uključiti verktor sekvence.

[0156] Sem ako je određeno drugačije, kraj s levc strane bilo koje jedno-lančane sekvence ovde je 5' kraj: pravac sa leve strane sekvenci dvo-lančanog polinukleotida je označen kao 5' pravac. Pravac od 5' do 3' dodavanja nastajućih RNK transkripata je označen kao transkripcioni pravac; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koje su 5' do 5' kraj RNK transkripta su označene kao „uzvodne sekvence"; regioni sekvence na lancu DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koje su 3' do 3' kraj RNK transkripta su označene kao „nizvodne sekvence".

[0157] Termin „kontrolna sekvenca" odnosi se na polinukleotidnu sekvencu koja može uticati na ekspresiju i procesovanje kodirajućih sekvenci za koje je vezana. Priroda takvih kontrolnih sekvenci može zavisiti od organizma domaćina. U određenim ostvarenjima, kontrolne sekvence za prokariote mogu uključiti promotor, mesto vezivanja ribozoma. i sekvencu prekidanja transkripcije. Na primer. kontrolne sekvence za eukariote mogu uključiti promotore koji obuhvataju jedno ili mnoštvo mesta prepoznavanja za transkripcione faktore, sekvence pojačivače transkripcije, i sekvencu prekidanja transkripcije...Kontrolne sekvence" mogu uključiti vodeće sekvence i/ili fuzione partner sekvence.

[0158] Termin ..vektor" označava bilo koji molekul ili entitet (npr.. nukleinsku kiselinu, plazmid. bakteriofag ili virus) upotrebljen da sc prenese informacija koja kodira protein u ćeliju domaćina.

[0159] Termin ..ekspresioni vektor" ili ..ekspresioni konstrukt" odnosi se na vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije domaćina i koji sadrži sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu (zajedno sa ćelijom domaćinom) ekspresiju jednog ili više heterolognih kodirajućih regiona operativno vezanih za njih. Ekspresioni konstrukt može uključiti, ali nije ograničen na. sekvence koje utiču ili kontrolišu transkripciju, translaciju. i. ako su prisutni introni, deluju na uplitanje RNK kodirajućeg regiona koji je tu operativno vezan.

[0160] Onako kako se ovde koristi, „operativno vezani" znači da su komponente na koje je termin primenjen u vezi koja im omogućuje da obave svoje bitne funkcije pod pogodnim uslovimna. Na primer, kontrolna sekvenca u vektoru koji je „operativno vezan" za sekvencu koja kodira protein je tu vezan tako da se ekspresija sekvence koja kodira protein postigne pod uslovima koji su saglasni sa Iranskripcionom aktivnošću kontrolnih sekvenci.

[0161] Termin „ćelija domaćin" označava ćeliju koja je bila transformisana. ili je sposobna da se transformiše, sa sekvencom nukleinske kiseline i na taj način eksprimira gen za koji postoji interes. Termin uključuje potomstvo roditeljske ćelije, bez obzira da li je potomstvo identično u morfološkom ili genetičkom smislu u odnosu na originalnu roditeljsku ćeliju, sve dok je gen za koji postoji interes prisutan.

[0162] Termin „transfekcija" znači uzimanje strane ili egzogene DNK od strane ćelije, i ćelija je „transfektovana" kada je egzogena DNK uvedena unutar ćelijske membrane. Jedan broj tehnika transfekcije je dobro poznat u oblasti i dat jc ovde u pronalasku.Vidi.npr.. Graham i sar.. 1973. Virologv 52:456; Sambrook i sar., 2001, Molekularno kloniranje: Laboratorijski praktilum,supra;Daviš i sar., 1986,Osnovni metodi u molekularnoj biologiji,Elsevier; Cbu i sar., 1981, Gene 13:197. Takve tehnike se mogu upotrebiti da se uvede jedan ili više egzogenih DNK grupa u pogodne ćelije domaćine.

[0163] Termin „transformacija" odnosi se na promenu u genetičkim karakteristikama ćelije i ćelija je transformisana kada je modifikovana tako da sadrži novu DNK ili RNK. Na primer, ćelija je transformisana kada je genetički modifikovana u odnosu svoje nativno stanje putem uvođenja novog genetičkog materijala preko transfekcije. transdukcijc. ili drugih tehnika. Nakon transfekcije ili transdukcije, transformišuća DNK se može rekombinovati sa onom u ćeliji putem fizičke integracije u hromozom ćelije, ili se može održavati prolazno kao epizomalni element bez da bude replikovan, ili se može replikovati nezavisno kao plazmid. Smatra sc da je ćelija „stabilno transformisana'1 kada je DNK replikovana sa dcobom ćelije.

[0164] Termin „polipeptid" ili „protein" označava makromolekul koji ima sekvencu amino kiseline nativnog proteina, a to je. protein produkovan od ćelije koja sc javlja u prirodi i koja nije rekombinantna; ili je produkovan od strane genetički-konstrisane ili rekombinantne ćelije, i sadrži molekule koji imaju sekvencu amino kiseline nativnog proteina, ili molekule koji imaju delecije od. adicije na, i/ili supstitucije jedne ili više amino kiselina od nativne sekvence. Termin takođe uključuje polimere amino kiseline u kojima su jedna ili više amino kiselina hemijski analozi odgovarajućih amino kiselina ili polimera koji sc javljaju u prirodi. Termini „polipeptid" i ..protein" specifično obuhvataju PCSK9 antigen vezujuće proteine, antitela. ili sekvence koje imaju delecije od, adicije na. i/ili supstitucije jedne ili više amino kiselina od antigen-vezujućeg proteina. Termin „polipeptidni fragment" odnosi sc na polipeptid koji ima amino-terminalnu deleciju, karboksil-terminalnu deleciju, i/ili internu deleciju u poređenju sa nativnim proteinom potpune dužine. Takvi fragmenti mogu takođe sadržati modifikovane amino kiseline u poređenju sa nativnim proteinom. U određenim ostvarenjima, fragmenti su dugački oko pet do 500 amino kiselina. Na primer. fragmenti mogu biti dugački najmanje 5, 6, 8. 10, 14. 20. 50, 70, 100, 1 10, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ili 450 amino kiselina. Korisni polipeptidni fragmenti uključuju imunološki funkcionalne fragmente antitela. uključujući domene vezivanja. U slučaju PCSK9-vezujućeg antitela, korisni fragmenti uključuju ali nisu ograničeni na CDR region, varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca, deo lanca antitela ili samo njegov varijabilni region uključujući dva CDR-a. i tome slično.

[0165] Termin „izolovani protein" kada je upotrebljen označava da je subjektov protein (1) bez najmanje nekih drugih proteina sa kojima se uobičajeno nalazi. (2) u osnovi je bez drugih proteina iz istog izvora, npr.. od iste vrste, (3) eksprimiran od strane ćelije kod različitih vrsta. (4) izdvojen od najmanje oko 50 posto od polinukleotida. lipida, ugljovodonika, ili drugih materijala sa kojima je vezan u prirodi, (5) operativno jc vezan (sa kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom sa kojim nije vezan u prirodi, ili (6) ne javlja se u prirodi. Tipično, „izolovani protein" se sastoji od najmanje oko 5%, od najmanje oko 10%, od najmanje oko 25%, od najmanje oko 50% od datog uzorka. Genomska DNK, cDNK, mRNK ili druge RNK. sintetičkog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija mogu kodirati takav izolovani protein. Poželjno je izolovani protein gotovo u potpunosti bez proteina ili polipeptida ili drugih zagađivača sa kojima se nalazi u prirodnoj sredini i koji će se uplitati u njegovu terapeutsku, dijagnostčku, profilaktičku, istraživačku ili drugu upotrebu.

[0166] Termin „amino kiselina" uključuje njeno normalno značenje u ovoj oblasti.

[0167] ..Varijanta" polipeptida (npr.. antigen vezujući protein, ili antitelo) obuhvata sekvencu amino kiseline u kojoj su jedan ili više ostataka amino kiseline ubačeni u. delecirani iz i/ili supstituisani iz sekvence amino kiseline u drugu polipeptidni! sekvencu. Varijante uključuju Tuzi one proteine.

[0168] Termin ..identičnost" odnosi se na vezu između sekvenci dva ili više poiipeptidna molekula ili dva ili više molekula nukleinske kiseline, kao što je određeno poklapanjem i poređenjem sekvenci...Procenat identičnosti" označava procenat identičnih ostataka između amino kiselina ili nukleotida u poredenim molekulima i izračunat je na osnovu veličine najmanjeg molekula koji je poređen. Za ta izračunavanja, prekidi u poklapanjima (ako ih ima) su poželjno uključeni posebnim matematičkim modelom ili računarskim programom (tj.. „algoritmom"). Metodi koji se mogu upotrebiti da se izračuna identičnost preklopljenih nukleinskih kiselina ili polipeptida uključuju one koji su opisani uRačunarska molekulama biologija,(Lcsk, A. M„ izd.), 1988, New York: Oxford Universitv Press; Bioračunarska informatika i genomski projekti, (Smith. D. W.. izd.). 1993. New York: Academic Press; Računarska analiza podataka o sekvencama. Deo I. (Griffin. A. M.. i Griffin. II. G., izd.), 1994. New Jersev: Humana Press: von Heinje, G.. 1987. Analiza sekvence u molekularnoj biologiji. Nevv York: Academic Press; Priručnik za analizu sekvence. (Gribskov. M. i Devereux, J.. izd.). 1991, New York: M. Stockton Press: i Carillo i sar.. 1988. S1AM J. Applied Math. 48:1073,

[0169] U izračunavanju procenta identičnosti, sekvence koje se porede su tipično preklopljene na način koji daje najveće poklapanje između sekvenci. Jedan primer računarskog programa koji se može upotrebiti da sc odredi procenat identičnosti je GCG programski paket, koji uključuje GAP (Devereux i sar.. 1984. Nucl. Acid Res. 12:387: Genetics Computer Group. Universitv of Wisconsin, Madison. Wl). računarski algoritam GAP je upotrebljen da se preklope dva polipeptida ili polinukleotida za koje treba da se odredi procenat identičnosti sekvence. Sekvence su preklopljene radi optimalnog poklapanja njihove odgovarajuće amino kiseline ili nukleotida („poklopljeni interval", kao što je to određeno sa algoritmom). Kazna koja nastaje zbog gapa (koja je izračunata kao 3x prosečna dijagonala, pri čemu je „prosečna dijagonala" prošek dijagonale matrice poredenja kojaje upotrebljena; „dijagonala" je suma ili broj pridođat svakom savršenom poklapanju amino kiseline sa određenom matricom za poređenje) i gap proširena kazna (kojaje obično 1/10 puta gap kazne otvaranja), kao i matrice za poređenje kao što su PAM 250 ili BLOSUM 62 su upotrebljene zajedno sa algoritmom. U određenim ostvarenjima, standardna komparaciona matrica( vidi,DayhoiTi sar., 1978,Atlas sekvence proteina i struktura5:345-352 za PAM 250 komaparacionu matricu; HenikofT i sar., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 za BLOSUM 62 komaparacionu matricu) je takode upotreblje od strane algoritma.

[0170] Primeri parametara koji se mogu upotrebiti u određivanju procenta identičnosti za polipeptidne ili nukleotiđne sekvence koristeći GAP program su sledeći:

[0171] • Algoritam: Needleman i sar., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453

[0172] • Komaparaciona matrica: BLOSUM 62 od Henikoff i sar.1992. sitpra

[0173] • Gap kazna: 12 (ali bez kazne za krajnje gapove)

[0174] • Kazna za dužinu gapa: 4

[0175] • Prag sličnosti: 0

[0176] Određene šeme preklapanja za poklapanje dve sekvence amino kiseline mogu rezultirati poklapanjem samo kratkog regiona dve sekvence. i taj mali poklopljeni region može imati vrlo visoku identičnost sekvence čak i ako nema značajne veze između pune dužine dve sekvence. Prema tome, odabrani melod preklapanja (GAP program) može se doterati ako se to želi da bi to rezultiralo poklapanjem koje ima interval od najmanje 50 ili drugi broj kontinuiranih amino kiselina ciljnog polipeptida.

[0177] Onako kako se ovde koriste, dvadeset konvencionalnih (npr.. koje se javljaju prirodno) amino kiselina i njihove skraćenice slede konvencionalnu upotrebu. VidiImunologija- Sinteza (2.izdanje, E. S. Golub i D. R. Gren. izd.. Sinauer Associates. Sunderland. Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr.. D-amino kiseline) od dvadeset konvencionalnih amino kiselina, ne prirodne amino kiseline kao što su a-, a-disupstituisane amino kiseline. N-alkil amino kiseline, laktonska kiselina, i druge nekonvencionalne amino kiseline mogu biti takodc pogodne komponente za polipeptide predmetnog pronalaska. Primeri nekonvencionalnih amino kiselina uključuju: 4-hidroksiprolin. y-karboksiglutamat. e-N.N,N-trimetiIizin.<E>-N-acetillizn. O-fosfoserin. N-acetilserin. N-formilmetionin. 3-metilhistiđin. 5-hidroksilizin. o-N-metilarginin. i druge slične amino kiseline i imino kiseline (npr.. 4-hiđroksiprolin). U obeležavanju polipeptida koje se ovde koristi, pravac sa leva je amino terminalni pravac a pravac s desna je karboksi-terminalni pravac, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.

[0178] Slično tome, sem ako je naznačeno drugačije, pravac sa levog kraja sekvence jednolančanog polinukleotida je 5' kraj i; pravac sa leva sekvenci dvo-lančanog polinukleotida je označen kao 5' pravac. Pravac od 5' do 3' dodavanja nascentnog RNK transkripta je naznačeno kao pravac transkripcije; regioni sekvence na lancu DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5' prema 5' kraju RNK transkripta su označeni kao „uzvodne sekvence"; regioni sekvence lanca DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3' prema 3' kraju RNK transkripta naznačeni su kao „nizvodne sekvence."

[0179] Konzervativne supstitucije amino kiseline mogu obuhvatiti ostatke amino kiselina koje se ne javljaju prirodno, koje su tipično inkorporirane putem hemiske sinteze peptida pre nego sa sintezom u biološkim sistemima. Oni uključuju peptidomimetike i druge reverzne ili invertovane oblike grupa amino kiselina.

[0180] Ostaci koji sc prirodno javljaju mogu se podelili u klase na osnovu uobičajenih karakteristika bočnog lanca:

[0181] 1) hidrofobne: norleucin. Met. Ala. Val. Leu. lle:

[0182] 2) neutralne hidrofi ine: Cvs. Ser. Thr. Asn. Gln:

[0183] 3) kisele: Asp. Glu:

[0184] 4) bazne: His, I,yz. Arg;

[0185] 5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly. Pro: i

[0186] 6) aromatične: Trp. Tyr, Phe.

[0187] Na primer, ne-konzervativne supstitucije mogu uključiti razmenu jednog broja jedne od tih klasa za članove druge klase. Takvi supstituisani ostaci se mogu uvesti, na primer. u regione humanog antitela koja su homologna sa ne-humanim antitelima. ili u ne-homologe regione molekula.

[0188] U pravljenju promena antigen vezujući protein ili PCSK9 protein, prema određenim ostvarenjima, mora da se uzme u obzir hidropatični indeks aminokiseline. Svakoj amino kiselini je pripisan hidropatični indeks na osnovu njene hidrofobnosti i karakteristika naelektrisanja. Oni su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8): cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8): glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5): glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5): lizin (-3.9); i arginin (-4.5).

[0189] Važnost hidropatičnog indeksa amino kiseline u davanju interaktivne biološke funkcije proteina je shvaćena u oblasti. Kyte i sar...1. Mol. Biol.. 157:105-131 (1982). Poznato je da određene amino kiseline mogu biti supstituisane drugim amino kiselinama koje imaju sličan hidropatični indeks ili rezultat i još uvek zadržavaju sličnu biološku aktivnost. U pravljnju promena zasnovanih na hidropatičnom indeksu, u određenim ostvarenjima, supstitucija amino kiselina čiji hidropatični indeksi su u okviru ±2 je uključena. U određenim ostvarenjima, oni koji su u okviru ±1 su uključeni, i u određenim ostvarenjima, oni koji su u okviru ±0.5 su uključeni.

[0190] Takođe je shvaćeno u ovoj oblasti da supstitucija sličnih amino kiselina može efikasno da se obavi na osnovu hidrofilnosti, posebno gde je biološki funkcionalni protein ili peptid tako kreiran namenjen za upotrebu u imunološkim ostvarenjima, kao što je to u ovoj situaciji. U određenim ostvarenjima, najveća lokalna prosečna vrednost hidrofilnosti proteina, koja jc vođena sa hidrofilnošćui susednih amino kiselina, u korelaciji jc sa njenom imunogenošću i antigenošću, tj.. sa biološkim karakteristikama proteina.

[0191] Sledeće vrednosti hidrofilnosti pridodate su tim ostacima amino kiselina: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0 ± 1): glutamat (+3.0 ± 1); serin ( i 0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2): glicin (0): trconin (-0.4); prolin (-0.5 + 1): alanin (-0.5): histidin (-0.5); cistein (-1.0): metionin (-1.3): valin (-1.5): leucin (-1.8): izolcucin (-1.8): tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5) i triptofan (-3.4). Pri pravljenju promena zasnovanih na sličnim vrednostima hidrofilnosti. u određenim ostvarenjima, supstitucija amino kiselina čije vrednosti hidrofilnosti su u okviru ±2 su uključene, u određenim ostvarenjima, one čije vrednosti hidrofilnosti su u okviru ±1 su uključene, u određenim ostvarenjima, one koje su u okviru ±0.5 su uključene. Neko može takode da identifikuje epitope iz primarnih sekvenci amino kiseline na osnovu hidrofilnosti. Ovi regioni su takode označeni kao „epitopni regioni jezgra."

[0192] Primerne supstitucije amino kiseline su iznete u Tabeli 1.

[0193]

[0194] Termin ..derivat" odnosi se na molekul koji uključuje hemijske druge modifikacije, a na insercije. delecije, ili supstitucije amino kiselina (ili nukleinskih kiselina). U određenim ostvarenjima, derivati obuhvataju kovalentne modifikacije, uključujući, ali bez ograničenja na. hemisko vezivanje sa polimerima. lipidima. ili drugim organskim ili neorganskim grupama. U određenim ostvarenjima, hemiski modifikovan antigen vezujući protein može imali veći polu-život cirkulisanja od antigen vezujućeg proteina koji nije hemiski modifikovan. U određenim ostvarenjima, hemiski modifikovan antigen vezujući protein može imati poboljšan kapacitet ciljanja za željene ćelije, tkiva, i/ili organe. U nekim ostvarenjima, izvedeni antigen vezujući protein je kovalenlno modifikovan da uključi jedan ili više u vodi rastvorijivih pričvršćenja polimera. uključujući, ali bez ograničenja na. polietilen glikol. polioksietilen glikol, ili polipropilen glikol.Vidunpr.. U.S. Patent br: 4.640.835. 4.496.689, 4.301,144. 4,670,417.4.791.192 i 4.179,337. U određenim ostvarenjima, izvedeni antigen vezujući protein obuhvata jedan ili više polimera. uključujući, ali bez ograničenja na. monometoksi-polietilen glikol. dekstran, celulozu, ili druge ugljovodonične zasnovane polimere. poli-(N-vinil pirolidon)- polietilen glikol, propilen glikol homopolimere, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimer, polioksielilirane poliole (npr., glicerol) i polivinil alkohol, kao i mešavine takvih polimera.

[0195] U određenim ostvarenjima, derivat je kovalentno modifikovan polietilen glikolom (PEG) podjedinicama. U određenim ostvarenjima, jedan ili više u vodi rastvorljivih polimera je vezan na jdenoj ili vise specifičnih pozicija, na primer, amino terminusu, derivata. U određenim ostvarenjima, jedan ili više u vodi rastvorljivih polimera je po principu slučajnosti pričvršćen za jedan ili više bočnih lanaca derivata. U određenim ostvarenjima, PEG je upotrebljen da poboljša terapcutski kapacitet za antigen vezujući protein. U određenim ostvarenjima. PEG je upotrebljen da poboljša terapeutski kapacitet za humanizovano antitelo. Određeni takvi metodi su diskutovani u. na primer. u U.S. Patentu br. 6.133.426.

[0196] Analozi peptida se uobičajeno koriste u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa karakteristikama analoga u odnosu na one od templet peptida. Ovi tipovi ne-peptidnih jeđinjenja su označeni terminom „peptidni mimetici" ili „peptiđomimetici". Fauchcre. J., Adv. Drug Res.. 15:29 (1986): Veber & Freidinger. TINS. str. 392 (1985): i Evans i sar...1. Med. Chem.. 30:1229

[0197] (1987). Takva jeđinjenja su često razvijena uz pomoć kompjuterizovanog molekularnog modelovanja. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapcutski korisnim peptidima mogu se upotrebiti da se prođukuje sličan terapeutski ili profilaktički efekat. Generalno su peptiđomimetici strukturno slični paradigmi polipeptida (tj.. polipeptida koji ima biohemisku karakteristiku ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo. ali ima jednu ili više peptidnih veza po potrebi zamenjenih sa vezom odabranom ođ: —CFb NH—. — CEE S—. — CEb - CFi2 --, -CH=CEl-(cis i trans),-COCH<2>--. -CH(OH)CH<2>-. i -CH<2>SO-. sa metodima koji su dobro poznati u oblasti. Sistematska supstitucija jedne ili više amino kiselina konsenzus sekvence sa D-amino kiselinom istog tipa (npr., D-lizin na mestu L-lizina) može se upotrebiti u određenim ostvarenjima da se generišu još stabilniji peptidi. Sem toga. napregnuti peptidi koji obuhvataju konsenzus sekvencu ili gotovo u potpunosti identičnu varijaciju konsenzus sekvence mogu se generisati putem metoda poznatih u praksi (Rizo i Gierasch. Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992)): na primer, putem dodavanja internih ostataka cisterna sposobnih da formiraju intramolekularne disulfidne mostove koji ciklizuju peptid. Termin ..koji se prirodno javlja" onako kako se koristi kroz prijavu u vezi sa biološkim materijalima kao što su polipeptidi. nukleinske kiseline, ćelije domaćina, i tome slično, odnosi se na materijale koji se nalaze u prirodi ili u obliku materijala koji je nađen u prirodi. „Antigen vezujući protein" („AVP") onako kako je ovde upotrebljen označava bilo koji protein koji vezuje određeni ciljni antigen. U trenutnoj prijavi, određeni ciljni antigen je PCSK.9 protein ili njegov fragment. „Antigen vezujući protein" uključuje ali nije ogrničen na antitela i njegove vezujuće delove, kao što su imunološki funkcionalni fragmenti. Peptitela su drugi primer antigen vezujućih proteina. Termin „imunološki funkcionalni fragment" (ili jednostavno „fragment") antitela ili imunoglobulinski lanac (težak ili laki lanac) antigen vezujući protein, onako kako se ovde koristi, je vrsta antigen vezujućeg proteina koji obuhvata deo (bez obzira kako je taj deo dobijen ili sintetisan) antitela kojem nedostaju najmanje neke amino kiseline prisutne u lancu pune dužine ali koja su još uvek sposoba da se specifično vezuju za antigen. Takvi fragmenti su biološki aktivni u tome što se oni vezuju za ciljni antigen i mogu biti u kompeticiji sa drugim antigen vezujućim proteinima, uključujući intaktna antitela, za vezivanje na dati epitop. U nekim ostvarenjima, fragmenti su neutralizujući fragmenti. U nekim ostvarenjima, fragmenti mogu blokirati ili redukovati verovatnoću interakcije između LDLR i PCSK9. U jednom aspektu, takav fragment će zadržati najmanje jedan CDR prisutan u lakom ili teškom lancu pune dužine, i u nekim ostvarenjima će obuhvatati pojedinačni teški lanac i/ili laki lanac ili njegov deo. Ovi biološki aktivni fragmenti mogu se produkovati pomoću tehnika rekombinantne DNK. ili sc mogu produkovati enzimatskim ili heinijskim isecanjem antigen vezujućih proteina, uključujući intaktna antitela. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na. Fab. dijatelo (teški lanac varijabilnog domena na istom polipeptidu kao i laki lanac varijabilnog domena, vezan preko kratkog peptidnog veznika koji je prekratak da dozvoli sparivanje između dva domena na istom lancu). Fab'. F(ab')2. Fv, domen antitela i pojedinačni-lanac antitela. i mogu biti izvedeni iz bilo kog sisarskog izvora, uključujući ali bez ogrničenja na čoveka. miša. pacova. kamilu ili zeca. Dalje je zamišljeno da funkcionalni deo antigen vezujućih proteina otkrivenih ovde. na primer. jedan ili više CDRova. mogu biti kovalentno vezni za drugi protein ili za rnali molekul da se kreira terapeutski agens usmeren na određenu metu u telu. koji poseđuje bifunkcionalnc terapeutske karakteristike, ili ima produženi polu-život u serumu. Kao što će biti prihvaćeno od stručnjaka, antigen vezujući protein može uključiti neprotein komponente. U nekim poglavljima ovog pronalaska, primeri AVPa su ovde opisani u terminima „broj/slovo/broj" (npr.. 25A7). U tim slučajevima, tačno ime označava specifično antitelo. A tako je. AVP nazvan 25A7 nije neophodno isti kao antitelo nazvano 25A7.1. (sem ako su oni eksplicitno izneti kao isti u specifikaciji, npr.. 25A7 i 25A7.3). Kao što će to stručnjak shvatiti, u nekim ostvarenjima LDLR nije antigen vezujući protein. U nekim ostvarenjima, vezujuće podsekcije LDLR nisu antigen vezujući proteini, npr., F'GFa. U nekim ostvarenjima, drugi molekuli kroz koje PCSK9 signalirain vivonisu antigen vezujući proteini. Takva ostvarenja biće eksplicitno iđentifikovana kao takva. Određeni antigen vezujući proteini opisani ovde su antitela ili su izvedeni od antitela. U određenim ostvarenjima, struktura polipeptida antigen vezujućih proteina je zasnovana na antitelima, uključujući, ali bez ograničenja na, monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domen antitela, sintetička antitela (ponekad ovde naznačena kao „mimetici antitela"), himerična antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuziona antitela (ponekad ovde naznačena kao „konjugati antitela"). i njihovi fragmenti, respektivno. U nekim ostvarenjima, AVP obuhvata ili se sastoji od avimera (Čvrsto vezujućih peptida). Ovi raznovrsni antigen vezujući proteini su ovde dalje opisani. „Fc" region obuhvata dva teška lanca fragmenata obuhvatajući Oil i Cn2 domene antitela. Dva teška lanca fragmenata drže sc zajedno sa dve ili više disulfidnih veza i sa hidrofobnim interakcijama C<h>3 domena. „Fab fragment" obuhvata jedan laki lanac i Cnl i variablne regione jednog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može formirati đisulfidnu vezu sa molekulom drugog teškog lanca. ,,Fab' fragment" obuhvata jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži VH domen i Cnl domen i takođe region između Cnl i Cn2 domena, tako da međulančana disulfidna veza može da se formira između dva teška lanca dva Fab' fragmenta da se formira F(ab')? molekul. .,F(ab')2 fragment" sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona između Cnl i Oi2 domena, tako da je međulančana disulfidna veza formirana između dva teška lanca. F(ab')2 fragment je, prema tome. komponovan od dva Fab<1>fragmenta koji se drže zajedno sa disullidnom vezom između dva teška lanca. ..Fv region" obuhvata varijabilne regione i od teških i od lakih lanaca, ali mu nedostaju konstantni regioni. .Jedno-lančana antitela" su Fv molekuli u kojima su varijabilni regioni teških i od lakih lanaca povezani sa fleksibilnim veznikom da formiraju pojedinačni polipeptidni lanac, koji formira antigen vezujući region. Jedno lančana antitela su detaljno diskutovana u međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 88/01649 i Patentnoj prijavi Sjedinjenih Država br. 4.946,778 i br. 5,260,203. ..Domen antitela" je imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više Vh regiona su kovalentno vezana sa peptidnim veznikom da se kreira bivalentni domen antitela. Dva V<h>regiona bivalentnog domena antitela mogu ciljati isti ili različite antigene. ..Bivalent antigen vezujući protein" ili ..bivalentno antitelo" obuhvata dva antigen vezujuća mesta. U nekim slučajevima, dva vezjujuća mesta imaju iste antigen specifikacije. Bivalent antigen vezujući proteini i bivalent antitela mogu biti bispecifična.vidi, infra.Bivalent antitelo koje nije „višestruko specifično" ili „višestruko funkcionalno" antitelo, u određenim ostvarenjima, tipično se podrazumeva da ima identično svako mesto svog vezivanja. „Višestruko specifični antigen vezujući protein" ili „višestruko specifično antitelo" jc ono koje cilja više od jednog antigena ili epitopa. „Bispccifični". „dvostruko-specifični" ili "bifunkcionalni" antigen vezujući protein ili antitelo je hibridni antigen vezujući protein ili antitelo, respektivno, koje ima dva različita antigen vezujuća mesta. Bispecifični antigen vezujući proteini i antitela su vrsta višestruko specifičnih antigen vezujućih proteinskih antitela i mogu se produkovati putem mnoštva metoda uključujući, ali bez ograničenja na, fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata.Vidi.npr., Songsivilai i Lachmann. 1990. Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny i sar., 1992. J. Immunol. 148:1547-1553. Dva mesta vezivanja bispeciličnog antigen vezujućeg proteina ili antitela će se vezali za dva različita epitopa. koji mogu da se nađu na istim ili različitim proteinskim metama. Za antigen vezujući protein kaže se da ..specifično vezuje" svoj ciljni antigen kada je konstanta disocijacije (K<d>) 51 0~<7>M. AVP specifično vezuje antigen sa ..visokim afinitetom" kada je Kj<<>5 x 10<">'<J>M. i sa ..vrlo visokim afinitetom" kada je K(i<<>5x 10"<10>M. U jednom ostvarenju. AVP ima K,i od <10~<y>M. U jednom ostvarenju, disocijacija je <1 x 10°. U drugim ostvarenjima, AVPi će se vezati za humani PCSK9 sa K<d>od između oko 10"<y>M i IO"<13>M. u još jednom drugom ostvarenju AVPi će se vezati sa K<d><

5 x IO'"<1>. Kao što će to biti shvaćeno od stručnjaka, u nekim ostvarenjima, neki ili svi antigen vezujući fragmenti mogu se specifično vezati za PCSK9. Antigen vezujući protein je „selektivan" kada se vezuje za jednu metu mnogo čvršće nego što se vezuje za drugu metu. „Antigen vezujući region" podrazumeva protein, ili deo proteina, koji specifično vezuje specifični antigen (npr., paratop). Na primer, onaj deo antigen vezujućeg proteina koji sadrži ostatke amino kiseline koji interreaguju sa antigenom i donose antigen vezujućem proteinu njegovu specifičnost i afinitet za antigen je označen kao ..antigen vezujući region". Antigen vezujući region tipično uključuje jedan ili više „komplementarno vezujućih regiona"

[0198] (..CDRova"). Određeni antigen vezujući regioni takođe uključuju jedan ili više „skeletnih" regiona. ,.CDR" je sekvenca amino kiseline koja doprinosi specifičnosti vezivanja antigena i afinitetu. „Skeletni" regioni mogu doprinositi u održavanju odgovarajuće konformacije CDRova da se pokrene vezivanje između antigen vezujućeg regiona i antigena. Strukturno, skeletni regioni se mogu locirati u antitelima izmđu CDRova. Primeri skeleta i CDR regiona prikazani su u FIG.. 2A-3D, 3CCC-3JJJ. i 15A-15D. U nekim ostvarenjima, sekvence za CDRove za laki

[0199] lanac antitela 3B6 su sleđeće: CDRI TLSSGYSSYEVD (SEQ ID NO: 279); CDR2 VDTGGIVGSKGE (SEQ ID NO: 280); CDR3 GADHGSGTNFVVV (SEQ ID NO: 281), i FRove su sledeće: FR1 QPVLTQPLFASASLGASVTLTC (SEQ ID NO: 282); FR2

[0200] WYQQRPGKGPRFVMR (SEQ ID NO: 283); FR3 GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC (SEQ ID NO: 284); i FR4 FGGGTKLTVL

[0201] (SEQ ID NO: 285).

[0202] U određenim ostvarenjima, obezbedeni su rekombinantni antigen vezujući proteini koji vezuju PCSK9, na primer humani PCSK.9. U tom kontekstu, „rekombinantni antigen vezujući protein" je protein napravljen koristeći rekombinantne tehnike, tj.. preko ekspresije rekombinantne nukleinske kiseline kao što je to ovde opisano. Metodi i tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina su dobro poznate u oblasti.

[0203] Termin „antitelo" odnosi se na intaktni imunoglobulin bilo kog izotopa, ili njegovog fragmenta koji može biti u kompeticiji sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje za ciljni antigen, i uključuje, na primer. himerična. humanizovana. potpuno humana, i bispecifična antitela. „Antitelo" je vrsta antigen vezujućeg proteina. Intaktno antitelo će generalno obuhvatati najmanje dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, ali u nekim slučajevima može uključili manje lanaca kao što je kod antitela koja se prirodno javljaju kod kamelida koja mogu obuhvatati samo teške lance. Antitela mogu se izvesti samo iz jednog izvora, ili mogu biti „himerična", što znači da različiti delovi antitela mogu biti izvedeni iz dva različita antitela kao Što jc dalje opisano dole. Antigen vezujući proteini, antitela. ili vezujući fragmenti mogu se produkovati u hibridomima. tehnikama rekombinantne DNK. ili enzimskim ili hemijskim isecanjem intaktnih antitela. Sem ako je naznačeno drugačije, termin ..antitelo" uključuje, u dodatku na antitela koja obuhvataju dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, derivate, varijante, fragmente, i njihove mutacije, čiji primeri su opisani dole. Sem toga. osim ako su eksplicitno isključena, antitela uključuju monoklonalna antitela, bispecifična antitela. minitela. domene antitela, sintetička antitela (ponekad ovde označena kao ..mimetici antitela"), himerična antitela. humanizovana antitela. humana antitela, fuziona antitela (ponekad ovde označena kao „konjugovana antitela"). i njihove fragmente, respektivno. U nekim ostvarenjima, termin takođe obuhvata peptitela.

[0204] Strukturne jedinice antitela koja se prirodno javljaju tipično obuhvataju tetramer. Svaki takav lelramer tipično je komponovan od dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan pune dužine „laki" (u nekim ostvarenjima, oko 25 kDa) i jedan pune dužine ..teški" "lanac (u odrešenim ostvarenjima, oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca tipično uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više amino kiselina koje su tipično odgovorne za prepznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca tipično definiše konstantni region koji može biti odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci su tipično klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci tipično su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon, i definišu izotop antitela kao IgM, IgD. IgG, IgA, i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko podklasa, uključujući, ali bez ograničenja na. IgGl. IgG2, IgG3, i IgG4. IgM ima podklase uključujući, ali bez ograničenja na, IgMl i IgM2. IgA je slično podeljcn u podklase uključujući, ali bez ograničenja na, IgAl i IgA2. U okviru lakih i teških lanaca pune dužine, tipično su varijabilni i konstantni regioni spojeni sa ,,J" regionom od oko 12 ili vise amino kiselina, sa teškim lancem koji takođe uključuje ,.D" region od oko 10 ili više amino kiselina.Vidi,npr.,Osnovna imunologija,pog. 7 (Paul. W.. izd.. 2, izd. Raven Press. N.Y. (1989)). Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac tipično formiraju antigen vezujuće mesto.

[0205] Varijabilni regioni tipično pokazuju neku generalnu strukturu od relativno kozerviranih skeletnih regiona (FR) spojenih zajedno sa tri hiper varijabilna regiona, takođe nazvana komplementarno đeterminišući regioni ili CDRovi. CDRovi od dva lanca od svakog para tipično su poravnati sa skeletnim regionima. koji mogu omogućiti vezivanje za specifični epitop. Od N-terminalnog do C-terminalnog. varijabilni regioni i lakog i teškog lanca tipično obuhvataju domene FR1. CDRI, FR2. CDR2. FR3. CDR3 i FR4. Dodeljivanje amino kiselina svakom domenuje je tipično u skladu sa definicijama Rabat sekvenci proteina od imunološkog interesa (National Institutes of Health. Bethesda. Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk. J. Mol. BioL 196:901-917 (1987): Chothia i sar.. Nature. 342:878-883 (1989).

[0206] U određenim ostvarenjima, teški lanac antitela vezuje se za antigen u otsustvu antitela lakog lanca. U određenim ostvarenjima, laki lanac antitela vezuje se za antigen u otsustvu antitela teškog lanca. U određenim ostvarenjima, antitelo vezujući region vezuje se za antigen u otsustvu antitela lakog lanca. U određenim ostvarenjima, antitelo vezujući region vezuje sc za antigen u otsustvu antitela teškog lanca. U određenim ostvarenjima, pojedinačni varijabilni region specifično se vezuje za antigen u otsustvu drugog varijabilnog regiona.

[0207] U određenim ostvarenjima, definitivni nacrt CDR i identifikacija ostataka koji obuhvataju vezujuće mesto antitela je obavljena putem rešavanja strukture antitela i/ili sa rešavanjem strukture kompleksa antitelo-veznik. U određenim ostvarenjima, koja mogu biti obavljena sa bilo kojom od mnoštva tehnika poznatih stručnjaku, kao što je kristalografija X-zracima. U određenim ostvarnjima. mogu se upotrebiti različiti metodi analize da se idenlifikuju ili učine približnim CDR regioni. Primeri takvih metoda uključuju, ali nisu ograničeni na. Kabat definiciju. Chothia definiciju. AbM definiciju i kontaktnu definiciju.

[0208] Kabat definicija je standard za numcrisanje ostataka u antitelu i tipično se upotrebljava da se iđentifikuju CDR regioni.Vidi,npr., Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000). Chothia definicija je slična Kabat definiciji, ali Chothia definicija uzima u obzir pozicije određenih strukturnih petlji regiona.Vidi,npr., Chothia i sar., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia i sar.. Nature. 342: 877-83 (1989). AbM definicija koristi integrisane nastavke računarskih programa produkovanih od strane Oxford Molecular Group koja modelira strukturu antitela.Vidi,npr., Martin i sar., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); "AbM™, kompjuterski program za modeliranje varijabilnih regiona antitela". Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd. AbM definicija modeluje tercijarnu strukturu antitela za primarnu sekvencu koristeći kombinaciju baza podataka znanja iab iniliometode, kao što su oni opisani od strane Samudrala i sar., "Ab initio predviđanje strukture proteina pomoću pristupa kombinovane hijerarhije" u PROTEINS. Structure. Function and Genetics SuppL. 3:194-198 (1999). Kontaktna definicija je zasnovana na analizi dostupnih kompleksnih kristalnih struktura.Vidi,npr., MacCallum i sar...1. Mol. Biol.. 5:732-45 (1996).

[0209] Prema konvenciji. CDR regioni u teškom lancu su tipično označeni kao 111. 112. i H3 i numerisani su uzastopno u pravcu od amino kraja do karboksi kraja. CDR regioni u lakom lancu su tipično označeni kao LI. L2. i L3 numerisani su uzastopno u pravcu od amino kraja do karboksi kraja.

[0210] Termin ..laki lanac" uključuje laki lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijailnog regiona da obezbede specifično vezivanje. Laki lanac pune dužine uključuje domen varijabilnog regiona, V|„ i domen konstantnog regiona, Cj.. Domen varijabilnog regiona lakog lanca je na amino-kraju polipeptida. Laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance.

[0211] Termin „teški lanac" uključuje teški lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijabilnog regiona da da obezbede specifično vezivanje. Teški lanac pune dužine uključuje domen varijabilnog regiona. V<h>. i tri domena konstantnog regiona. C<h>L Cn2, i C<h>3. Vi i domen je na amino-kraju polipeptida. i Cn domeni su na karboksi-kraju, sa Cn3 koji je najbliže karboksi-kraju polipeptida. Teški lanci mogu biti od bilo kog izotopa, uključujući IgG (uključujući IgGl. IgG2, lgG3 i IgG4 podtipove). IgA (uključujući IgAl i IgA2 podtipove), IgM i IgE.

[0212] Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo tipično je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita teška/laka para lanaca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela mogu se produkovati mnoštvom tehnika, uključujući, ali bez ograničenja na. fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata.Vidi,npr., Songsivilai i sar., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321

[0213] (1990); Kostelny i sar., J. Immunol.. 148:1547-1553 (1992).

[0214] Neke vrste sisara takođe produkuju antitela koja imaju samo jedan teški lanac.

[0215] Svaki pojedinačni imunoglobulinski lanac je tipično sastavljen od nekoliko „imunoglobulinkish domena", od kojih se svaki sastoji od približno 90 do 110 amino kiselina i ima karakteristike uvijene šeme. Ovi domeni su osnovne jedinice od kojih su komponovana antitela polipeptida. Kod ljudi. IgA i IgD izotipovi sadrže četiri teška lanca i četiri laka lanca: IgG i lgE izotipovi sadrže dva teška lanca i dva laka lanca; i IgM izotip sadrži pet teških lanaca i pet lakih lanaca. C region teškog lanca tipično obuhvata jedan ili više domena koji mogu biti odgovorni za cfektorsku funkciju. Broj domena konstantnog regiona teškog lanca zavisiće od izotipa. IgG teški lanci, na primer, sadrže tri domena C regiona poznatih kao Cnl. C<h>2 i C<h>3. Antitela koja su obezbedena mogu imati bilo koji od tih izotipova i podtipova. U određenim ostvarenjima predmetnog pronalazka. anti-PCSK9 antitelo jc od IgG2 iii IgG4 podtipa.

[0216] Termin „varijabilni region" ili ..varijabilni domen" odnosi sc na deo lakih i/ili teških lanaca antitela. tipično uključujući približno amino-kraj 120 do 130 amino kiselina u teškom lancu i oko 100 do 110 amino terminalnih amino kiselina u lakom lancu. U određenim ostvarenjima, varijabilni regioni različitih antitela ekstenzivno se razlikuju u sekvenci amino kiseline čak i među antitelima od iste vrste. Varijabilni region antitela tipično određuje specifičnost određenog antitela za njegovu metu.

[0217] Termin ..neutralizujući antigen vezujući protein" ili ..neutralizujuće antitelo" odnosi se na antigen vezujući protein ili antitelo, respeklivno, koje se vezuje za veznik i sprečava ili redukuje biološki efekat tog veznika. To se može uraditi, na primer. putem direktnog blokiranja mesta vezivanja na vezniku ili putem vezivanja za veznik i menjajući sposovnost veznika da se veže putem indirektnih načina (kao što je strukturno ili energetsko menjanje u vezniku). U nekim ostvarenjima, termin može takođe označili antigen vezujući protein koji sprečava protein za koji je vezan da obvi biološku funkciju. U procenjivanju vezivanja i/ili specifičnosti antigen vezujućeg proteina, npr.. antitela ili njegovog imunološki funkcionalnog fragmenta, antitelo ili fragment mogu gotovo u potpunosti inhibirati vezivanje veznika za njegovog partnera vezivanja kada višak antitela redukuje količinu partnera za vezivanje za veznik za najmanje oko 1-20. 20-30%. 30-40%). 40-50%. 50-60%, 60-70%. 70-80%. 80-85%, 85-90%). 90-95%. 95-97%, 97-98%. 98-99% ili više (kao što je mereno uin vitroogledu kompetitivnog vezivanja). U nekim ostvarenjima, u slučaju PCSK9 antigen vezujućih proteina, kao što je neutralizujući molekul može se smanjiti sposobnost PCSK9 da vezuje LDLR. U nekim ostvarenjima, sposobnost neutralizovanja je okarakterisana i/ili opisana preko ogleda kompeticije. U nekim ostvarenjima. sposobnost neutralizovanja je opisana u terminima ICso ili EC<50>vrednosti. U nekim ostvarenjima. AVPi 27B2, 13H1, 13B5 i 3C4 su ne-neutralizujući AVPi, 3B6, 9C9 i 31A4 su slabo neutralizujući. i preostali AVPi u Tabeli 2 su snažni neutralizatori. U nekim ostvarenjima, antitela ili antigen vezujući proteini neutralizuju putem vezivanja za PCSK.9 i sprečavanja PCSK9 da se vezuje za LDLR (ili ređukujući sposobnost PCSK9 da se vezuje za LDLR). U nekim ostvarenjima, antitela ili AVPi neutralizuju putem vezuvanja za PCSK9, i dok još uvek omogućuju da se PCSK9 vezuje za LDLR. sprečavanje ili redukovanje PCSK9 je posredovalo degradaciju LDLR. Prema tome. u nekim ostvarenjima, neutralizujući AVP ili antitelo može još uvek dozvoliti PCSK9/LDLR vezivanje, ali će sprečiti (ili redukovati) uzastopno PCSK9 uključeno degradiranje LDLR.

[0218] Termin „meta" odnosi se na molekul ili deo molekula sposoban da se vezuje sa antigen vezujućim proteinom. LJ nekim ostvarenjima, meta može imati jedan ili više epitopa. U određenim ostvarenjima, cilj je antigen. Upotreba ..antigen" u frazi „antigen vezujući protein" jednostavno označava da sekvenca proteina koja obuhvata antigen može biti vezana sa antitelom. U tom kontekstu, ona ne zahteva da protein bude strani ili da je sposoban da indukuje imuni odgovor.

[0219] Termin ..u kompeticiji" kada se koristi u kontekstu antigen vezujućih proteina (npr., neulralizujućih antigen vezujućih proteina ili neutralizujućih antitela) koja su u kompeticiji za isti epitop označava kompeticiju između antigen vezujućih proteina kao što je određeno sa ogledom u kojem je antigen vezujući protein (npr,. antitelo ili njegov imunološki funkcionalan fragment) bio testiran da li sprečava ili inhibira (npr., redukuje) specifično vezivanje referentnog antigen vezujućeg proteina (npr., veznik, ili referentno antitelo) za uobičajeni antigen (npr., PCSK.9 ili njegov fragment). Brojni tipovi ogleda kompetitivnog vezivanja mogu se upotrebiti da se odredi da li je neki antigen vezujući protein u kompeticiji sa drugim, na primer: direktni ili indirektni radioimuno ogled čvrste faze (RIA). direktni ili indirektni enzimski imuno ogled čvrste faze (LIA). sendvič ogled kompeticije( vidi.npr., Stahii i sar.. 1983,Metodi u enzimologiji9: 242-253); direktni biotin-avidin čvrste faze E1A( vidi.npr., Kirkland i sar., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) direktni ogled obeležavanja čvrste faze. direktni sendvič ogled obeležavanja čvrste faze( vidi.npr Elarlovv i Lane, 1988. Antitela. A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Press); direktni ogled obeležavanja čvrste faze RIA koristeći 1-125 obeleživač( vidi,npr., More! i sar., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); direktnit biotin-avidin čvrste faze EIA( vidi.npr., Cheung, i sar.. 1990. Virologv 176:546-552}: i direktni obeleženi RIA (Moldenhauer i sar.. 1990. Scand. J. Immunol. 32:77-82). Tipično, takav ogled uključuje upotrebu vezivanja prečišćenog antigena za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo šta od toga. neobeleženi test antigen vezujući protein i obeleženi referentni antigen vezujući protein. Kompetitivna inhibicija je merena putem određivanja količine vezivanja obeleživača za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu test antigen vezujućeg proteina. Uobičajeno je test antigen vezujući protein prisutan u višku. Antigen vezujući proteini idcntifikovani sa ogledom kompeticije (kompcticija antigen vezujućih proteina) uključuje vezivanje antigen vezujućih proteina za isti epitop kao i referentni antigen vezujući proteini i vezivanje antigen vezujućih proteina za susedni epitop dovoljno proksimalno u odnosu na epitop vezan sa referentnim antigen vezujućim proteinom da se javi sterična prepreka. Dodatni detalji koji se odnose na metode za određivanje kompethivnog vezivanja su obezbeđeni ovde u primerima. Obično, kada je kompetitivni antigen vezujući protein prisutan u višku, on će inhibirati (npr.. redukovati) specifično vezivanje za referentni antigen vezujući protein za uobičajeni antigen za najmanje 40-45%. 45-50%. 50-55%). 55-60%. 60-65%. 65-70%. 70-75% ili 75% ili više. U nekim slučajevima, vezivanje je inhibirano za najmanje 80-85%, 85-90%. 90-95%. 95-97%. ili 97% ili više.

[0220] Termin ..antigen" odnosi se na molekul ili deo molekula sposoban da se veže sa selektivno vezujućim agensom, ko što je antigen vezujući protein (uključujući, npr.. antitelo ili njegov imunološki funkcionalni fragment). U nekim ostvarenjima, antigen je sposoban da sc upotrebi u životinji da se produkuju antitela sposobna da se vezuju za taj antigen. Antigen može posedovati jedan ili više epitopa koji su sposobi da interreaguju sa različitim antigen vezujućim proteinima, npr.. antitelima.

[0221] Termin ..epitop" uključuje bilo koju determinantu sposobnu da se vezuje sa antigen vezujućim proteinom, kao što je antitelo ili za T-ćelijski receptor. Epitop je region antigena koji je vezan sa antigen vezujućim proteinom koji cilja antigen, i kada je antigen protein, uključuje specifične amino kiseline koje direktno kontaktiraju antigen vezujući protein. Najčešće, epitopi se nalaze na proteinima, ali u nekim slučajevima mogu se smestiti na drugu vrstu molekula, kao što su nukleinske kiseline. Determinante epitopa mogu uključiti hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su amino kiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonile grupe, i mogu imati specifične tro dimenzionalnc strukturne karakteristike, i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Generalno, antitela specifična za određeni ciljni antigen će preferentno prepoznati epitop na ciljnom antigenu u kompleksnoj mešavini proteina i/ili makromolekula.

[0222] Onako kako se ovde koristi, „gotovo u potpunosti čist" znači da je opisani tip molekula preovlađujuće prisutna kod tip, a to je. na molarnoj osnovi mnogo učestaliji nego bilo koji drugi tip u istoj mešavini. U određenim ostvarenjima, gotovo u potpunosti čist molekul je kompozicija u kojoj tip objekta obuhvata najmanje 50% (na molarnoj osnovi) od svih prisutnih makromolekularnih tipova. U drugim ostvarenjima, gotovo u potpunosti čista kompozicija će obuhvatati najmanje 80%, 85%, 90%. 95%>, ili 99% od svih makromolekularnih tipova prisutnih u kompoziciji. U drugim ostvarenjima, ciljni tip je prečišćen do esencijalne homogenosti pri čemu kontaminirani tipovi ne mogu da se detektuju u kompoziciji putem konvencionalnih metoda detekcije i, prema tome se kompozicija sastoji od pojedinačno detektabilnih makromolekularnih tipova.

[0223] Termin „agens" se koristi ovde da naznači hemijsko jedinjenje. mešavinu hemijskih jeđinjenja. biološki makromolekul ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala.

[0224] Onako kako se koriste ovde, termini ..obeleživač" ili ..obeleženi" odnosi se na inkorporaciju detektabilnog markera. npr., putem inkorporacije radioobeležene amino kiseline ili pričvršćenja za polipeptid biotin grupa koji sc mogu detektovali markiranim avidinom (npr., fluorescentni marker koji sadrži streptavidin ili enzimatskom aktivnošću koja se može detektovati sa optičkim ili kolorimctrijskim metodima). U određenim ostvarenjima, obeleživač ili marker može takođe biti terapeutski. Različiti mtodi obeležavanja polipeptida i glikoprotcina poznati su u oblasti i mogu se upotrebiti. Primeri obeleživača za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na. sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.. TI. "C. bN. "S,<yo>Y.<w>T<c>. mIn. llyL<l3l>I). fluorescentne obeleživačc (npr.. FITC. rodamin. lantanid fosfor), enzimatske obeleživače (npr., peroksidaza rena. [i-galaktozidaza. luciferaza. alkalina fosfataza). hemiluminescentne. biotinil grupe, prethodno određene polipeptidne epitope prepoznale od strane sekundarnog reportera (npr.. leucin ziper par sekvence. mesla vezivanja za sekundarna anlilela. domeni koji vezuju metal, lagovi epitopa). U određenim ostvarenjima, obeleživači su pričvršćeni sa razdvajajućim granama različitih dužina da se redukuju potenci jalne sterične prepreke.

[0225] Termin „biološki uzorak", onako kako sc ovde koristi, uključuje, ali bez ograničenja na, bilo koju količinu supstance od žive stvari ili prethodno žive stvari. Takve žive stvari uključuju, ali nisu ograničene na, ljude, miševe, majmune, pacovc. zečeve, i druge životinje. Takve supstance uključuju substance, ali bez ograničenja na. krv. serum, urin, ćelije, organe, tkiva, kosti, kosinu srž, limfne Čvorove, i kožu.

[0226] Termin „kompozicija farmaceutskog agensa" (ili agens ili lek) onako kako se ovde koristi odnosi se na hemijsko jedinjenje, kompoziciju, agens ili lek sposoban da indukuje željeni terapeutski efekt kada se daje na odgovarajući način pacijentu. Nije neophodan više nego jedan tip sastojka.

[0227] Termin „terapeutski efektivna količina" odnosi se na količinu PCSK.9 antigen vezujućeg proteina koja je određena da produkuje terapeutski odgovor kod sisara. Takve terapcutski efektivne količine sc mogu lako potvrditi od strane stručnjaka.

[0228] Termin „modulator", onako kako se ovde koristi, je jedinjenje koje menja ili zamenjuje aktivnost ili funkciju molekula. Na primer, modulator može uzrokovati povećanje ili smanjenje u magnitudi određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa magnitudom aktivnosti ili funkcije zapaženom u otsustvu modulatora. U određenim ostvarenjima, modulator je inhibitor, koji smanjuje magnitudu najmanje jedne aktivnosti ili funkcije molekula. Određene primerne aktivnosti ili funkcije molekula uključuju, ali nisu ograničene na, afinitete vezivanja, enzimatsku aktivnost, i transdukciju signala. Određene primerne inhibicije uključuju, ali nisu ograničene na, proteine, peplide. antitela, peptitela. ugljovodonike ili male organske molekule. Peptitcla su opisana u. npr., U.S. Patent br. 6.660,843 (koji odgovara PCT prijavi br. WO 01/83525).

[0229] Termini „pacijent" i "subjekt" sc koriste naizmenično i uključuju humane i nc-humane životinjske subjekte kao i one sa formalno dijagnostifi kovan im poremećajima, one bez formalno prepoznatih poremećaja, one koji primaju medicinsku negu. one koji su pod rizikom da razviju poremećaje, itd.

[0230] Termin ..tretiranje" i ..tretman" uključuju terapcutske tretmane, profilakličke tretmane, i primene u kojima neko redukuje rizik da će subjekt razviti poremećaj ili drugi faktor rizika. Tretman ne zahleva kompletno lečcnjc poremećaja i obuhvata ostvarenja u kojima neko redukuje simptome ili istaknute faktore rizika.

[0231] Termin ..sprečava" ne zahteva 100% eliminaciju mogućnosti ili događaja. Radije, on označava da je verovatnoća odigravanja događaja redukovana u prisustvu jeđinjenja ili metoda.

[0232] Standardne tehnike se mogu upotrebiti za rekombinantnu DNK. sinteze oligonukleotida. i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporaciju, lipofekciju). Enzimatske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu se izvesti prema upotstvima proizvođača ili kao što se to uobičajeno obavlja u praksi ili je opisan ovde u pronalasku. Sledeće tehnike i procedure mogu se generalno izvesti prema konvencionalnim metođima dobro poznatim u praksi i kao što je opisano u različitim opštim i više specifičnim referencama koje su citirane i diskutovane kroz predmetnu prijavu.Vidi,npr., Sambrook i sar..Molekularno kloniranje: lahoraririjski priručnik (2.izd.. Colđ Spring Harbor Eaboratorv Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (1989)). Sem ako su obezbeđene specifične definicije, nomenklature koje su upotrebljene u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitička hernija, sintetička organska hernija, i medicinska i farmaceutska hernija koje su opisane ovde su one dobro poznate i uobičajeno upotrebljene u praksi. Standardne tehnike se mogu upotrebiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparacije. formulacije, i isporuku, i tretman pacijenata.

[0233] Antigen vezujući proteini za PCSK9

[0234] Proprotein konvertaza subtilizin keksin tip 9 (PCSK9) je serin proteaza uključena u regulciju nivoa niske gustine lipoproteinskog receptora (LDLR) proteina (Ilorton i sar., 2007; Seidah i Prat, 2007). PCSK9 je prohormon-proprotein konvertaza u subtilizin (S8) porodici serin proteaza (Seidah i sar., 2003). Primerna humana PCSK9 sekvenca amino kiseline je prezentovana kao SLQ ID NO; 1 i 3. u FIG. IA (opisuje ,,pro" domen proteina kao što je podvučeno) i FIG. 1B (prikazuje signalnu sekvencu podebljano i pro domen podvučen). Primerna humana PCSK9 kodirajuća sekvenca je predstavljena kao SEQ ID NO: 2 (FIG. 1B). Onako kako je ovde opisano, PCSK9 proteini mogu takođe uključiti fragmente pune dužine PCSK9 proteina. Struktura PCSK9 proteina je nedavno bila razrešena od strane dve grupe (Cunningham i sar.. Nature Structural & Molecular Biologv. 2007. i Piper i sar., Structure. 15:1-8, 2007). PCSK9 uključuje signalnu sekvencu. N-terminalni prodomen. subtilizin-nalik katalitički domen i C-terminalni domen.

[0235] Antigen vezujući proteini (AVPi) koji vezuju PCSK9. uključujući humani PCSK.9, su obezbedeni ovde. U nekim ostvarenjima, obezbedeni antigen vezujući proteini su polipeptidi koji obuhvataju jedan ili više komplementarnih determinišućih regiona (CDRovi). kao što su ovde opisani. U nekim antigen vezujućim proteinima. CDRovi su ugrađeni u ..skeletni" region. koji orijentiše CDR(ove) lako da je dostignuta odgovarajuća antigen vezjuća karakteristika CDR(ova). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini koji su ovde obezbedeni mogu interferirati sa. blokirali, redukovati ili modulisati interakciju između PCSK9 i LDLR. Takvi antigen vezujući proteini su označeni kao "neutralizujući." U nekim ostvarenjima, vezivanje između PCSK9 i LDLR može se još uvek odigrati, čak i ako je antigen vezujući protein neutralizujući i vezan za PCSK9. Na primer, u nekim ostvarenjima. AVP sprečava ili redukuje sporedne uticaje PCSK9 na LDLR bez blokiranja LDLR mesta vezivanja na PCSK9. Tako, u nekim ostvarenjima. AVP moduliše ili menja sposobnost PCSK9 da rezultira degradacijom LDLR. bez da mora da spreči interakcije vezivanja između PCSK9 i LDLR. Takvi AVPi mogu bi<l>i specifično opisani kao ,,ne-kompetitivno neutrališući" AVPi. U nekim ostvarenjima, neutralizujući AVP sc vezuje za PCSK9 na lokaciji i/ili način koji sprečava PCSK9 da se vezuje za LDLR. Takvi AVPi mogu biti specifično opisani kao ..kompetitivno neutralizujući" AVPi. Oba od gornjih neutralizatora mogu rezultovatui velikom količinom slobodnog LDLR koji je prisutan u subjektu, koji rezultira sa više LDLR vezanog za LDL (redukujući na taj način količinu LDL kod subjekta). U odgovoru, to rezultira redukcijom u količini serum holesterola prisutnog kod subjekta.

[0236] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obezbedeni ovde su sposobni da inhibiraju PCSK9-posredovanu aktivnost (uključujući vezivanje). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini koji se vezuju za te epitope inhibiraju,inter alia,interakcije između PCSK9 i LDLR i druge fiziološke efekte posredovane sa PCSK9. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini su humani, kao što su potpuno humana antitela za PCSK9.

[0237] U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za katalitički domen PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za zreli oblik PCSK.9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje u prodomenu PCSK9. U nekim ostvarenjima. AVP se selektivno vezuje za zreli oblik PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje na katalitički domen na takav način da PCSK9 ne može da se veže ili veže sa istom efikasnošću kao LDLR. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se ne vezuje za c-terminus katalitičkog domena. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se ne vezuje za n-terminus katalitičkog domena. U nekim ostvarenjima, AVP se ne vezuje za n-ili c-terminus PCSK9 proteina. U nekim ostvarenjima, AVP vezuje bilo koji od epitopa vezanih sa antitelima koja su ovde diskulovana. U nekim ostvarenjima, to se može odrediti putem ogleda kompeticijc između antitela otkrivenih ovde i drugih antitela. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za epitop vezan sa jednim ili više antitela opisanih u Tabeli 2. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za specifično konformaciono stanje PCSK9 tako da se spreči PCSK9 da interreaguje sa LDLR. li nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za V domen PCSK9. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za V domen PCSK9 i sprečava (ili redukuje) PCSK9 od vezivanja za LDLR. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za V domen PCSK9. i dok ne sprečava (ili redukuje) vezivanje PCSK9 za LDLR. AVP sprečava ili redukuje sporedne aktivnosti posredovane kroz PCSK9 na LDLR.

[0238] Antigen vezujući proteini koji su ovde opisani višestruko su korisni. Neki od antigen vezujućih proteina, na primer. su korisni u ogledu specifičnog vezivanja, afinitetnog prečišćavanja PCSK.9, u određenim humanim PCSK9 ili njegovim veznicima i u ogledima skrininga da se identifikuju drugi antagonisti PCSK9 aktivnosti. Neki od antigen vezujućih proteina su korisni za inhibiciju vezivanja PCSK9 za LDLR. ili inhibiranje PCSK9-posredovane aktivnosti.

[0239] Antigen vezujući proteini mogu sc upotrebiti u mnoštvu terapeutskih primena. kao što je ovde objašnjeno. Na primer, u nekim ostvarenjima PCSK9 antigen vezujući proteini su korisni za tretiranje stanja vezanih sa PCSK9, kao što su poremećaji vezani sa holesterolom (ili poremećaji vezani sa serum holesterolom") kao što je hiperholesterolemija, kao što je ovde dalje opisano. Druge upotrebe antigen vezujućih proteina uključuju, na primer, dijagnozu PCSK9-vezanih bolesti ili stanja i skrining oglededa se odredi prisustvo ili otsustvo PCSK.9. Neki od antigen vezujućih proteina opisanih ovde su korisni u tretiranju posledica, simptoma, i/ili patologija vezanih sa aktivnošću PCSK9.

[0240] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini koji su obezbedeni obuhvataju jedan ili više CDRova (npr., 1,2,3,4, 5 ili 6 CDRova). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata (a) polipeptidnu strukturu (b) jedan ili više CDRova koji su ubačeni u i/ili spojeni sa polipeptidnom strukturom. Polipeptidna struktura može imati mnoštvo različitih oblika. Na primer. ona može biti, ili obuhvatiti, skelet antitela koja se prirodno javljaju, ili njihov fragment ili njegovu varijantu, ili mogu biti kompletno sintetičke prirode. Primeri različitih polipeptidnih struktura su opisani dalje dole.

[0241] U određenim ostvarenjima, polipeptidna struktura antigen vezujućih proteina je antitelo ili je izvedena od antitela, uključujući, ali bez ograničenja na. monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domene antitela. sintetička antitela (ponekad označena ovde kao „mimetici antitela"). himerična antitela. humanizovana antitela, fuziona antitela (ponekad označena ovde kao „konjugati antitela"). i delove ili fragmente od svakog, respektivno. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein je imunološki fragment antitela (npr., Fab. Fah', F(ab')i<->ili scFv). Različite strukture su dalje ovde opisane i definisane.

[0242] Neki od antigen vezujućih proteina ovde obezbedenih specifično i/ili selektivno se vezuju za humani PCSK9. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein specifično i/ili selektivno se vezuje za humani PCSK9 protein koji ima i/ili obuhvata ostatake 153-692 od SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima AVP se specifično i/ili selektivno vezuju za humani PCSK.9 koji ima i/ili obuhvata ostatake 31-152 od SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima. AVP se selektivno vezuje za humani PCSK9 protein kao što je prikazano na FIG. IA (SEQ ID NO: 1). U nekim ostvarenjima, antigen vezjući protein specifično se vezuje za najmanje jedan fragment od PCSK9 proteina i/ili protein PCSK9 pune dužine, sa ili bez signalne sekvence.

[0243] U nekim ostvarenjima gde je antigen vezujući protein upotrebljen za terapeutske primene, antigen vezujući protein može inhibirati. interferirati sa. ili modulisati jednu ili više bioloških aktivnosti PCSK9. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se specifično za humani PCSK9 i/ili ili gotovo u potpunosti inhibira vezivanje humanog PCSK9 za LDLR za najmanje oko 20%-40%. 40-60%, 60-80%>, 80-85%. ili više (na primer. putem merenja uin vitroogledu kompetitivnog vezivanja). Neki od antigen vezujućih proteina koji su ovde obezbedeni su antitela. U nekim ostvarenjima, AVP ima K<<]>manje od (vezuje se mnogo čvršće) od IO"<7>. 10"<s>. 10<">y

. 10"<UI>. 10'<11>, 10"<12>, 10'<13>M. U nekim ostvarenjima. AVP ima IC<?>o za blokiranje vezivanja LDLR za PCSK.9 (D374Y, varijnta visokog afiniteta) od manje od 1 mikroM, 1000 nM do 100 nM. 100 nM do 10 nM, lOnM do 1 nM. lOOOpM do 500pM. 500 pM do 200 pM. manje od 200 pM, 200 pM do 1 50 pM. 200 pM do 100 pM. 100 pM do 10 pM. 10 pM do 1 pM.

[0244] Jedan primer IgG2 konstantnog domena teškog lanca od anti-PCSK9 antitela predmetnog pronalaska ima sekvencu amino kiseline kao stoje prikazana u SEQ ID NO: 154, FIG. 3KK.

[0245] Jedan primer IgG4 konstantnog domena teškog lanca od anti-PCSK9 antitela predmetnog pronalaska ima sekvencu amino kiseline kao što je prikazana u SEQ ID NO: 155, FIG. 3KK

[0246] Jedan primer kapa konstantnog domena lakog lanca anti-PCSK9 antitela ima sekvencu amino kiseline kao što je prikazana u SEQ ID NO: 157, FIG. 3KK.

[0247] Jedan primer lambda konstantnog domena lakog lanca od anti-PCSKL9 antitela ima sekvencu amino kiseline kao što je prikazana u SEQ ID NO: 156. FIG. 3KK.

[0248] Varijabilni regioni imunoglobulinskih lanaca generalno pokazuju istu ukupnu strukturu, obuhvatajući relativno konzerviran region kostura (FR) spojen sa tri hipervarijabilna regiona. mnogo češće nazvana „komplemetarni determinišući regioni " ili CDRovi. CDRovi od dva lanca od svakog teškog lanca/laki lanac para spomenutih gore tipično su poravnati sa regionima kostura da formiraju strukturu koja se vezuje specifično sa specifičnim epitopom na ciljni protein (npr.. PCSK9). Od N-kraja do C-kraja. varijabilni regioni lakog i teškog lanca koji se prirodno javljaju i jedni i drugi tipično konformiraju sa sledećim redosledom elemenata: FR1. CDRI. FR2. CDR2. FR3. CDR3 i FR4. Pronađen je sistem numerisanja za dodeljivanjc brojeva amino kiselinama koje zauzimaju pozicije na svakom od tih domena. Ovaj sistem numerisanja jc definisan u Kabatovom Sekvence proteina od imunološkog interesa (1987 i 1991. N1II. Belhesda. VID), ili Chothia & Lcsk. 1987. J. Mol. Biol. 196:901-917: Chothia i sar.. 1989. Nature 342:878-883.

[0249] Razni varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca su ovde obezbedeni i opisani su u

[0250] FIG. 2A-3J.I i 3LL-3BBB. U nekim ostvarenjima, svaki od tih varijabilnih regiona može se pričvrstiti za gornji teški i laki lanac konstantnog regiona da formira kompletno antitelo teškog i lakog lanca, respektivno. Dalje, svaka od tako generisanih sekvenci teškog i lakog lanca može se kombinovati da formira kompletnu strukturu antitela.

[0251] Specifični primeri nekih od varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela koja su obezbedena i njihove odgovarauće sekvence amino kiseline su sumarizovane u TABELI 2.

[0252] Ponovo, svaki od primernih varijabilnih teških lanaca nabrojan u Tabeli 2 može se kombinovati sa bilo kojim od primernih varijabilnih lakih lanaca prikazanih u Tabeli 2 da se formira antitelo. Tabela 2 prikazuje primerno sparivanje lakih i tečkih lanaca nađeno kod nekoliko antitela koja su ovde otkrivena. U nekim situacijama, antitela uključuju najmanje jedan varijabilni teški lanac i jedan varijabilni laki lanac od onih nabrojanih u Tabeli 2. U drugim slučajevima, antitelo sadrži dva identična laka lanca i dva identična teška lanca. Kao jedan primer. antitelo ili antigen vezujući protein može uključiti teški lanac i laki lanac, dva teška lanca, ili dva laka lanca. U nekim ostvarenjima antigen vezujući protein obuhvata (i/ili se sastoji od) 1. 2. i/ili 3 teška i/ili laka CDRova od najmanje jedne od sekvenci nabrojanih u Tabeli 2 (CDRovi za sekvence su podvučeni u FIG-ama 2A-3D. i drugim ostvarenjima u FIG. 3CCC-3.TJJ i 15A-15D). U nekim ostvarenjima, svih 6 CDRova (CDR1-3 od lakog (CDRL1. CDRL2. CDRL3) i CDR1-3 od teškog (CDRH1. CDRH2. i CDRH3)) su deo AVP. U nekim ostvarenjima. 1. 2. 3. 4. 5. ili više CDRova su uključeni u AVP. U nekim ostvarenjima, jedan teški i jedan laki CDR od CDRova u sekvenci u Tabeli 2 je uključen u AVP (CDRovi za sekvence u Tabeli 2 su podvučeni u FlG-ama 2A-3D). U nekim ostvarenjima, dodatne sekcije (npr.. kao što je prikazano u FIG. 2A-2D. 3A-3D. i druga ostvarenja u 3CCC-3J.IJ i 15A-15D) su takođe uključeni u AVP. Primeri CDRova i FRova za teške i lake lance zabeleženi u Tabeli 2 su podvučeni u FIG. 2A-3D (i drugim ostvarenjima u FIG. 3CCC-3JJJ i 15A-15D). Opcione varijabilne sekvence lakog lanca (uključujući CDRI. CDR2. CDR3. FR1. FR2. FR3. i FR4) mogu se izabrati od sledećih: 5. 7, 9. 10. 12. 13. 15. 16. 1 7. 18. 19, 20. 21. 22. 23, 24, 26. 28. 30. 31. 32, 33. 35. 36, 37. 38, 39. 40. 42. 44. i 46. Opcione varijabilne sekvence teškog lanca (uključujući CDRI. CDR2, CDR3. FRI, FR2. FR3, i FR4) mogu se izabrati od sledećih: 74. 85, 71, 72. 67. 87. 58. 52, 51, 53. 48. 54. 55. 56. 49. 57. 50. 91. 64, 62, 89, 65, 79. 80. 76. 77. 78. 83. 69, 81, i 60. U nekim od zapisa na FIG. 2A-3D. varijatcije sekvenci ili alternativne veze od CDRova i FRova su iđentifikovane. Ove alternative su identifikovane sa "vi" sledeći AVP ime. Pošto je većina ovih alternativa minorna u prirodi, samo delovi sa razlikama su prikazani u tabeli. Shvaćeno je da je preostali deo lakog ili teškog lanca isti kao što je prikazano za osnovni AVP u drugim panelima. Prema tome. na primer. 19H9vl u FIG. 2C ima isti FRI, CDRI, i FR2 kao 19H9 u FIG. 2A postoje jedina razlika zabeležena u FIG. 2C. Za tri sekvence nukleinske kiseline (AVPi 26E10. 30B9. i 31B12), obezbeđene su dodatne alternativne sekvence nukleinske kiseline u FIG.. Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, nije potrebno da se više nego jedna takva sekvenca upotrebi u kreiranju antitela ili AVP. I sakako. u nekim ostvarenjima, samo jedan ili nijedan od specifičnih teških ili lakih lanaca nukleinskih kiselina mora da bude prisutan.

[0253] U nekim ostvarenjima, AVP je kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline koja može koditrati bilo koju sekvencu proteina iz Tabele 2.

[0254] U nekim ostvarenjima, AVP se selektivno vezuje za PCSK9 koji se vezuje za LDLR (npr., autokatalizovani oblik molekula). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se ne vezuje za c-kraj katalitičkog domena (npr., 5. 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40 većina amino kiselina u c-kraj u). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se ne vezuje za n-kraj katalitičkog domena (npr., 5. 5-10, 10-15, 15-20. 20-25. 25-30. 30-40 većina amino kiselina u n-kraju). U nekim ostvarenjima. AVP vezuje amino kiseline sa amino kiselinama 1-100 od zrelog oblika PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za amino kiseline u (i/ili sekvenca amino kiseline se sastoji od) amino kiseline 31-100. 100-200. 31-152. 153-692, 200-300. 300-400, 452-683. 400-500, 500-600. 31-692, 31-449, i/ili 600-692. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za katalitički domen. U nekim ostvarenjima, neutralizujući i/ili ne-neutralizujući AVP se vezuje za prodomen. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje i za katalitički domen i za prodomen. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje i za katalitički domen tako da vrši opstrukciju područja na kataličkom domenu koji interreaguje sa pro domenom. U nekim ostvarenjima. AVP sc vezuje za katalitički domen na lokaciji ili površini ka kojoj pro domen interreaguje sa kao što jc naglašeno Piper i sar. (Structurc 15:1-8 (2007). uključujući strukturna predstavljanja u njima). U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za katalitički domen i restrikuje mobilnost pro-domena. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za katalitički domen bez vezivanja za pro-domen. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za katalitički domen bez vezivanja za pro-domen. dok sprečava da se pro-domen reorejentiše da omogući PCSK9 da se veže za LDLR. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za isti epitop kao oni okolni ostatci 149-152 od pro-domena u Piper i sar. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za udubljenje (kao što jc istaknuto u Piper i sar.) u V domenu. U nekim ostvarenjima, AVPi se vezuje za histidin-bogati region proksimalno udubljnju na V domenu. U nekim ostvarenjima, takva antitela (koja se vezuju za V domen) nisu neutralizujuća. U nekim ostvarenjima, antitela koja se vezuju za V domen su neutralizujuća. U nekim ostvarenjima, neutralizujući AVPi sprečavaju vezivanje PCSK9 za LDLR. U nekim ostvarenjima, neutralizujući AVPi. dok sprečavaju PCSK9 da degradadira LDLR. ne sprečavaju vezivanje PCSK9 za LDLR (na primer AVP 31A4). U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za, ili blokira najmanje jedan od histidina opisanih u Figuri 4 u članku Piper i sar. U nekim ostvarenjima. AVP blokira kataliličku trijadu u PCSK.9.

[0255] U nekim ostvarenjima, antitelo se selektivno vezuje za varijantu PCSK9 proteina, npr.. D374Y preko divljeg tipa PCSK9. U nekim ostvarenjima, ova antitela se vezuju za varijantu najmanje dva puta jaču od divljeg tipa, i poželjno 2-5, 5-10. 10-100. 100-1000. 1000-10.000 puta ili više za mulantni nego za divlji tip (kao što je mereno preko K<d>). U nekim ostvarenjima, antitelo selektivno inhibira varijantu D374Y PCSK9 od interreagovanja sa LDLR preko divljeg tipa PCSK9-ova sposobnost da interreaguje sa LDLR. U nekim ostvarenjima, ova antitela blokiraju sposobnost varijante da se vezuje za LDLR mnogo jace od sposobnosti divljeg tipa npr., najmanje dva puta jače od divljeg tipa, i poželjno 2-5. 5-10. 10-100. 100-1000 puta ili više mutant nego divlji tip (kao što je mereno preko IC<50>). U nekim ostvarenjima, antitelo se vezuje za i neutralizuje i divlji tip PCSK9 i varijantne oblike PCSK9. kao i D374Y na sličnim nivoima. U nekim ostvarenjima, antitelo se vezuje za PCSK9 da se sprečc varijante LDLR u vezivanju za PCSK.9. U nekim ostvarenjima, varijante LDLR su najmanje 50% identične humanom LDLR. Napomenuto je da su varijante LDLR poznate stručnjacima (npr., Brovvn MS i sar.. "kalcijumski kavezi, kisela kupatila i reciklirajući receptori" Nature 388: 629-630. 1997). U nekim ostvarenjima. AVP može podići nivoe efektivnosti LDLR u heterozigotnoj porodičnoj hiperholesterolemiji (gde je prisutan gubitak funkcije varijante LDLR).

[0256] U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za (ali ne blokira) varijante PCSK9 koje su najmanje 50%. 50-60. 60-70. 70-80. 80-90. 90-95. 95-99. ili više procenata identične obliku PCSK9 prikazanom u FIG. 1A i/ili FIG. 1B. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za (ali ne blokira) variante PCSK9 koje su najmanje 50%. 50-60. 60-70. 70-80. 80-90. 90-95. 95-99. ili više procenata identične zrelom obliku PCSK9 prikazanom u FIG. 1A i/ili FIG. 1 B. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za i sprečava varijante od PCSK9 koje su najmanje 50%. 50-60. 60-70. 70-80. 80-90. 90-95. 95-99. ili više procenata identične obliku PCSK9 prikazanom u FIG. 1A i/ili FIG. 1B od interreagovanja sa LDLR. U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za i sprečava varijante PCSK9 koje su najmanje 50, 50-60. 60-70, 70-80. 80-90, 90-95. 95-99, ili više procenta identične zrelom obliku PCSK9 prikazanom u FIG. 1B od interreagovanja sa LDLR. U nekim ostvarenjima, varijanta PCSK9 je humana varianta, kao sto je varijanta na poziciji na 474, E620G, i/ili E670G. U nekim ostvarenjima, aminokiselina na poziciji 474 je valin (kao i kod drugih ljudi) ili treonin (kao što je kod makakija i miša). Pošto su podaci unakrsne reaktivnosti ovde predstavljeni smatra se da će predmentna antitela lako da sc vezuju za gornje varijante.

[0257] U nekim ostvarenjima. AVP se vezuje za epitop koji je vezan sa jednim ili više antitela opisanih u Tabeli 2. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za specifično konformaciono stanje PCSK9 tako da spreče da PCSK9 interreaguje sa LDLR.

[0258] H uman i zo van i antigen vezujući proteini ( npr.. antitela)

[0259] Kao što je ovde opisano, antigen vezujući protein za PCSK9 može obuhvatiti humanizovano antitelo i/ili njegov deo. Važna praktična primena takve strategije je "humanizacija" mišjeg humoralnog imunog sistema.

[0260] U određenim ostvarenjima, a humanizovano antitelo je gotovo u potpunosti nc-imunogeno kod ljudi. U određenim oblicima, humanizovano antitelo ima gotovo u potpunosti isti afinitet za metu kao antitelo iz druge vrste od koje je izvedeno humanizovano antitelo.Vidi,npr.. U.S. Patent 5,530,101, U.S. Patent 5.693.761; U.S. Patent 5.693,762; U.S. Patent 5.585,089.

[0261] U određenim ostvarenjima identifikovane su amino kiseline varijabilnog domena antitela koje mogu biti modifikovane bez umanjivanja prirodnog afiniteta domena vezivanja antigena dok se istovremeno redukuje njegova imunogenost.Vidi,npr., U.S. Patent br. 5.766,886 i 5,869.619.

[0262] U određenim ostvarenjima modifikacija antitela metodama poznatim u oblasti je tipično dizajnirana tako da se postigne povećani afinitet vezivanja za metu i/ili da se redukuje imunogenost antitela u primaocu. U određenim ostvarenjima humanizovana antitela su modifikovana da se eliminišu mesta glikozilacije sa ciljem da se poveća afinitet antitela za njegov srodni antigen.Vidi.npr.. Co i sar.. Mol. Immunol.. 30:1361-1367 (1993). U određenim ostvarenjima, tehnike kao što je "ponovno oblikovanje", "hipcrliimcrizacija." ili "oblaganje/obnavljanje površine" su upotrebljene da sc produkuju humanizovana antitela.Vidi.npr.. Vasvvami i sar.. Annals of Allergy, Asthma. & Immunol. 81:105 (1998): Roguska i sar., Prot. Engineer.. 9:895-904 (1996): i U.S. Patent br. 6.072.035. U određenim takvim ostvarenjima, takve tehnike tipično ređukuju imunogenost antitela putem redukovanja broja stranih ostataka, ali ne sprečavaju anti-idiotipne i anli-alotipne odgovore praćene ponovljenim davanjem antitela. Određeni drugi metodi za redukovanje imunogenosti su opisani, npr. u Gilliland i sar., J. Immunol.. 62(6): 3663-71 (1999).

[0263] U određenim slučajevima, humanizacija antitela rezultira gubitkom kapaciteta vezivanja antigena. U određenim ostvarenjima, humanizovana antitela su „ponovo mutirana". U određenim takvim ostvarenjima, humanizovano antitelo je mulirano tako da uključi jedan ili više ostataka amino kiseline nađene u donorskom antitelu.Vidi.npr.. Saldanha i sar„ Mol Immunol 36:709-19

[0264] (1999).

[0265] U određenim ostvarenjima komplementarni delerminišući regioni (CDRovi) varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela za PCSK.9 mogu se graftovati u skeletne regione (FRove) iz iste, ili druge vrste. U određenim ostvarenjima. CDRovi varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela za PCSK9 mogu se graftovati u konsenzus humanih FRova. Da se kreiraju konsenzus humani FRovi. u određenim ostvarenjima, FRovi iz humanih sekvenci amino kiselina teških ili lakih lanaca su poravnati da se identifikuju sekvence konsenzus amino kiseline. U određenim ostvarenjima. FRovi antitela za PCSK9 teški ili laki lanac su zamenjeni sa FRovima iz različitog teškog ili lakog lanca. U određenim ostvarenjima, retke amino kiseline u FRovima teških i lakih lnaca antitela za PCSK9 nisu zamenjene, dok je ostatak FR amino kiselina zamenjen. Retke amino kiseline su specifične amino kiseline koje su na pozicijama na kojima se one ne nalaze uobičajeno u FRovima. U određenim ostvarenjima, graftovani varijabilni regioni od antitela za PCSK9 mogu se upotrebiti sa konstantnim regionom koji je različit od konstantnog regiona od antitela za PCSK.9. U određenim ostvarenjima, graftovani varijabilni regioni su deo pojedinačnog lanca Fv antitela. CDR graftovanje jc opisano u. npr., u U.S. Patent br. 6,180,370, 6,054,297. 5,693,762, 5,859.205, 5,693,761. 5.565,332. 5.585,089. i 5.530,101, i u Joncs i sar.. Nature. 321: 522-525 (1986); Riechmann i sar.. Nature. 332: 323-327 (1988); Verhoeven i sar., Science, 239:1534-1536 (1988). Winter. FEBS Letts.. 430:92-94 (1998).

[0266] Humani antigen vezujući proteini ( npr.. antitela)

[0267] Kao što je ovde opisano, antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK9 može obuhvatati humano (tj., potpuno humano) antitelo i/ili njegov deo. U određenim ostvarenjima, obezbeđne su nukleotidne sekvence koje kodiraju, sekvence amino kiseline obuhvataju. teški ili laki lanac imunoglobulinskih molekula, posebno sekvence koje odgovaraju varijabilnim regionima. U određenim ostvarenjima obezbeđene su, sekvence koje odgovaraju komplementarnom determinišućem regionu (CDRovi). specifično od CDRI do CDR3. Prema određenim ostvarenjima obezbeđena je ćelijska linija hibriđoma koja eksprimira takav imunoglobulinski molekul. Prema određenim ostvarenjima obezbeđena je ćelijska linija hibriđoma koja eksprimira takav imunoglobulinski molekul antitela. Prema određenim ostvarenjima obezbeđena je ćelijska linija hibriđoma koja eksprimira takvo monoklonalno antitelo. U određenim ostvarenjima obezbeđena je ćelijska linija hibriđoma jc odabrana od najmanje jedne ćelijske linije opisane u Tabeli 2. npr., 21 BI2. 16F 12 i 31H4. U određenim ostvarenjima, prečišćeno humano monoklonalno antitelo je humani PCSK9.

[0268] Neko može konstruisati mišje sojeve deflcijentne za produkciju mišjeg antitela sa velikim fragmentima humanog Ig lokusa u predviđanju da će taj miš produkovati humana antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki humani Ig fragmenti mogu sačuvati veliku varijabilnu gensku raznovrsnost kao i odgovarajuću regulaciju produkcije antitela i ekspresije. Putem eksploatisanja mišje mašinerije za raznovrsnost antitela i selekciju i nedostatak imunoološke tolerantnosti na humane proteine, repertoar reprodukovanih humanih antitela u tim mišjim sojevima može dati visok afinitet potpuno humanih antitela protiv bilo kog antigena za koji postoji zainteresovanost, uključujući humane antigene. Koristeći tehnologiju hibriđoma. antigen-specifični humani MAbovi sa opisanom speciflćnošću mogu se produkovati i odabrati. Određeni primerni metodi su opisani u WO 98/24893. U.S. Patentu br. 5.545.807, KP 546073. i EP 546073.

[0269] U određenim ostvarenjima, neko može upotrebiti konstantne regione od drugih vrsta koje nisu humane zajedno sa humanim varijabilnim regionom(ima).

[0270] Sposobnost da se klonira i rekonstruiše humani lokus megabazne veličine u veštačkim hromozomima kvasca (YACovi) i da se oni unesu u mišju germinativnu liniju obezbeđuje pristup rasvetljavanju funkcionalnih komponenti vrlo velikih ili grubo mapiranih lokusa kao i generisanje korisnih modela humanih bolesti. Sem toga, upotreba takve tehnologije za supstituciju mišjeg lokusa sa njegovim humanim ekvivalentima može obezbediti uvid u ekspresiju i regulaciju produkata humanog gena tokom razvića. njihove komunikacije sa drugim sistemima, i njihovo uključivanje u indukciju i progresiju bolesti.

[0271] Humana antitela izbegavaju neke od problema vezanih sa antitelima koja poseduju mišje ili pacovske varijabilne i/ili konstantne regione. Prisustvo takvih mišjih ili pacovskih izvedenih proteina može dovesti do brzog čišćenja antitela ili može voditi do generisanja imunog odgovora protiv antitela od strane pacijenta. Sa ciljem da sc izbegne upotreba mišjih ili pacovskih izvedenih antitela. potpunih humanih antitela može sc generisati kroz uvođenjem lokusa funkcionalnog humanog antitela u glođara. drugog si sara ili životinju tako da glodar, drugi sisar ili životinja produkuju potpuna humana antitela.

[0272] Humanizovana antitela su ona antitela koja. dok inicijalno polaze od sekvenci amino kiseline koju sadrže koje nisu humane, imaju najmanje neke od tih ne humanih sekvenci amino kiseline antitela zamenjene sa sekvencama humanog antitela. To je u kontrastu sa humanim antitelima. u kojima je antitelo kodirano (ili sposobno da bude kodirano) sa genima koje poseduje<č>ovek.

[0273] Antigen vezujuće varijante proteina

[0274] Druga antitela koja su obezbeđena su varijante AVPa nabrojanih gore formiranih sa kombinacijom ili pod delovima varijabilnih teških i varijabilnih lakih lanaca prikazanih u Tabeli 2 i obuhvataju varijabilne lake i/ili varijabilne teške lance koji imaju svaki najmanje 50%. 50-60. 60-70, 70-80%. 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%. 97-99%, ili više 99% identiteta sa sekvencama amino kiseline od sekvenci iz Tabele 2 (ili cela sekvenca ili poddeo sekvence. npr., jedan ili više CDR). U nekim slučajevima, takva antitela uključuju najmanje jedan teški lanac i jedan laki lanac, dok u drugim slučajevima varijantni oblici sadrže dva identična laka lanca i dva identična teška lanca (ili njihove pddelove). U nekim ostvarenjima, poređenje sekvence u FIG. 2A-3D (i 13A-13J i drugim ostvarenjima u 15A-I5D) mogu se upotrbiti sa ciljem da se identifikuju delovi antitela koji se mogu modifikovafi zapažanjem onih varijanti koje pogađaju vezivanje i one varijante za koje se pokazuje da ne utiču na vezivanje. Na primer. poređenjem sličnih sekvenci, neko može identilikovati te (npr.. određene amino kiseline) koje se mogu modifikovati i kako se mogu modifikovati a da još uvek zadrže (ili poboljšaju) funkcionalnost AVP. U nekim ostvarenjima, varijante AVPa uključuju one konsenzus grupe i sekvence prikazane u FIG. 13A, 13C. 13F, 13G, 13H, 131 i/ili 13J i varijacije su omogućene na pozicijama identifikovanim kao varijable u FIG.. CDRovi prikazani u FIG. 13A. 13C. 13F, i 13G su definisani na osnovu hibridne kombinacije iz Chothia metoda (zasnovanog na lokaciji strukturne petlje regiona,vidi,npr., „Standardne konformacije za kanoniske strukture imunoglobulina". Bissan Al-Lazikani. Arthur M. Lesk i Cyrus Chothia,Journal of Molecular Biolog}',273(4): 927-948. 7 November (1997)) i Kabat metoda (zasnovanog na varijabilnosti sekvence.vidi.npr.,Sekvence proteina od imunološkog interesa,peto izdanje. NIH Publikacija br. 91-3242. Kabat i sar., (1991)). Svaki ostatak određen sa bilo kojim metodom je uključen u konačnu listu CDR ostataka (i predstavljen na FIG,. 13A. 13C. 13F. i I3G). CDRovi u FIG.. 13H, 131. i 13J su dobijni sa samim Kabat metodom. Sem ako jc određeno drugačije, đefinisane konsenzus sekvence. CDRovi. i FRovi u FIG. 13H-13J će dellnisati i kontrolisati zabeležene CDRovc i FRovc za iznete AVPove u FIG. 13.

[0275] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata teški lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 90% identičnu sekvenci amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 74. 85. 71. 72. 67. 87. 58. 52. 51. 53. 48. 54. 55. 56. 49. 57. 50. 91. 64, 62. 89. 65. 79. 80. 76. 77. 78, 83. 69. 81. i 60. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata teški lanac koji obuhvata varijabilni region. koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 95% identičnu sekvenci amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 74. 85. 71. 72. 67. 87, 58. 52. 51, 53. 48, 54, 55, 56, 49. 57, 50, 91, 64, 62. 89. 65. 79. 80. 76, 77, 78. 83. 69. 81, i 60. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata teški lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 99%> identičnu sekvenci amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 74. 85. 71, 72. 67, 87, 58, 52, 51. 53, 48. 54. 55. 56. 49. 57. 50, 91, 64. 62. 89. 65. 79. 80. 76. 77. 78, 83. 69. 81, i 60.

[0276] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%). 90-95%), i/ili 95-99%) identična sa jednim ili više CDRova od CDRova u njmanje jedenoj od sekvnei od SEO ID NO: 74, 85. 71. 72. 67. 87. 58. 52. 51. 53. 48. 54, 55. 56. 49. 57. 50, 91, 64. 62.89, 65. 79. 80, 76. 77, 78, 83. 69. 81. i 60. U nekim ostvarenjima prisutan je 1. 2. 3. 4, 5. ili 6 CDR (svaki je najmanje 90%. 90-95%>. i/ili 95-99% identičan sa gornjim sekvencama).

[0277] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%. 90-95%>. i/ili 95-99%> identična sa jednim ili više FRova od FRova u najmanje jednoj sekvenci od SEO ID NO: 74. 85. 71. 72. 67. 87. 58. 52. 51. 53. 48, 54. 55. 56. 49. 57. 50. 91. 64.

[0278] 62, 89, 65. 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U nekim ostvarenjima prisutan je 1, 2, 3. ili 4 FR (svaki je u najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identičan sa gornjim sekvencama).

[0279] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata laki lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 90%> identičnu sa sekvencom amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9. 10, 12, 13, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21. 22. 23, 24, 26. 28. 30. 31. 32. 33. 35. 36, 37, 38, 39. 40; 42, 44. i 46. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata laki lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 95% identičnu sa sekvencom amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEO ID NO: 5. 7, 9. 10. 12. 13. 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. 22, 23, 24. 26. 28, 30. 31, 32. 33. 35. 36. 37, 38. 39. 40; 42, 44. i 46. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata laki lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 99% identičnu sa sekvencom amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEO ID NO: 5. 7. 9. 10. 12. 13. 15. 16. 17. 18. 19, 20. 21. 22. 23. 24. 26. 28. 30. 31. 32. 33. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 42. 44. i 46.

[0280] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata sekvencu koja je u najmanje 90%). 90-95%). i/ili 95-99%) identična sa jednim ili više CDRova od CDRova u najmanje jednoj od sekvenci od SFQ ID NO: 5. 7. 9. 10. 12. 13. 15. 16. 17. 1 8. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 26. 28. 30. 31. 32. 33. 35. 36, 37. 38. 39. 40. 42. 44. i 46. U nekim ostvarenjima prisutan je 1. 2. 3, 4. 5, ili 6 CDR (svaki je najmanje 90%. 90-95%. i/ili 95-99% identičan gornjim sekvencama).

[0281] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata sekvencu koja je u najmanje 90%), 90-95%o, i/ili 95-99%> identična sa jednim ili više FRova od FRova u najmanje jednoj od sekvenci od SEO IDNO: 5. 7, 9. 10. 12, 13. 15. 16, 17, 18, 19, 20,21.22, 23.24. 26. 28. 30.31. 32. 33. 35, 36. 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U nekim ostvarenjima prisutan je 1. 2. 3. ili 4 FR (svaki je najmanje 90%, 90-95%o, i/ili 95-99%) identičan gornjim sekvencama).

[0282] U svetlu ovog pronalaska, stručnjak će biti u stanju da odredi pogodne varijante od AVPa kao što su ovde dalje iznetc koristeći dobro poznate tehnike. U određenim ostvarenjima, stručnjak može iđentifikovati pogodna područja molekula koja mogu biti promenjena bez uništavanja aktivnosti sa ciljnim regionima za koje sc ne veruje da su važni za aktivnost. U određenim ostvarenjima, neko može iđentifikovati ostatke i delove molekula koji su konzervirani medu sličnim polipeptidima. U određenim ostvarenjima, čak i područja koja mogu bili važna za biološku aktivnost ili strukturu mogu biti predmet konzervativnih supstitucija amino kiseline bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez štetnih uticaja na polipeptidnu strukturu.

[0283] Sem toga. stručnjak može sagledati studije struktra-funkcija identifikujući ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za aktivnost ili strukturu. U svetlu takvih poredenja, neko može predvideti važnost ostataka amino kiseline u proteinu koji odgovaraju ostacima amino kiseline koji su važni za aktivnost ili strukturu u sličnim proteinima. Stručnjak može tragati za hemijski sličnim supstitucijama amino kiseline za takve predviđene važne ostatke amino kiseline.

[0284] Stručnjak može takodc analizirati tro-dimenzionalnu strukturu i sekvencu amino kiseline u odnosu na tu strukturu u sličnim AVPa. U svetlu takve informacije, stručnjak može predvideti poklapanje ostataka amino kiseline antitela u odnosu na njegovu tro-dimenzionalnu strukturu. U određenim ostvarenjima, stručnjak može izabrati da ne napravi radikalne promene ostataka amino kiseline predviđenih da budu na površini proteina, pošto takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Štavišc. stručnjak može generisati test varijante koje sadrže supstituciju pojedinačne amino kiseline na svakom željenom ostatku amino kiseline. Varijante mogu zatim da se pregledaju koristeći oglede aktivnosti poznate stručnjku. Takve varijante se mogu upolrebit da se sakupe informacije o pogodnim varijantama. Na primer. ako neko otkrije da promena u oderđeni ostatak amino kiseline rezultira uništenjem, neželjenim redukovanjem. ili nepogodnom aktivnosti, varijante sa takvom pramenom mogu se izbeći. Drgim rečima. na osnovu informationcija sakupljenih iz takvih rutinskih eksperimenata, stručnjak može lako odrediti amino kiseline gde dalje supstitucije treba da se izbegnu bilo same ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.

[0285] Jedan broj naučnih publikacija je posvećen predviđanu sekundarne strukture.VidiMoult J.. Curr. Op. in Biotech.. 7(4):422-427 (1996). Chou i sar.. Biochemistry. 13(2):222-245 (1974): Chou i sar., Biochemisiry, 113(2):211-222 (1974); Chou i sar., Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou i sar., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 i Chou i sar.. Biophvs. J.. 26:367-384 (1979). Štaviše, računarski programi su trenutno dostupni da pomognu u predviđanju sekundarne strukture. Jedan metod u predviđanju sekundarne strukture je zasnovan na modeliranju homologije. Na primer. dva polipeptida ili proteina koji imaju identičnost sekvence veću od 30%. ili sličnost veću od 40% često imaju slične strukturne topologije. Skorašnji rast baze podataka za strukturne proteine (PDB) obezbedio je povećanu mogućnost predviđanja sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj zavoja u strukturi polipeptida ili proteina.VidiHolm i sar.. Nucl. Acid. Res.. 27(1 ):244-247 (1999). Sugerisano je (Brenner i sar.. Curr. Op. Struct. Biol.. 7(3):369-376 (1997)) da postoji ograničeni broj zavoja u datom polipeptidu ili proteinu i da jednom kada kritični broj struktura bude razrešen. predviđanja strukture će postali dramatično više pouzdana.

[0286] Dodatni metodi za predviđanje sekundarne strukture uključuju ..zavijanje" (Jones. D.. Curr. Opin. Struct. Biol.. 7(3):377-87 (1997); Sippl i sar.. Structure, 4(1): 15-19 (1996)). ,.analizu profila" (Bovvie i sar., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov i sar., Meth. Enzym., 183:146-159

[0287] (1990); Gribskov i sar., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84(13):4355-4358 (1987)), i „cvoluciono vezivanje" (Vidi Holm,supra(1999). iBrenner, supra(1997)).

[0288] U određenim ostvarenjima, varijante antigen vezujućeg proteina uključuju glikozilaciju varijanti u kojoj je broj i/ili tip mesta glikozilacije izmenjen u poređenju sa sekvencama amino kiseline roditeljskog polipeptida. U određenim ostvarenjima, varijante proteina obuhvataju veći ili manji broj N-vezanih mesta glikozilacije od nativnog proteina. N-vezano mesto glikozilacije je okarakterisano sa sekvencom: Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr. gde ostatak amino kiseline označen kao X može bili bilo koji ostatak amino kiseline sem prolina. Supstitucija ostataka amno kiseline da se kreira ta sekvenca obezbeđuje potencijalno novo mesto za dodavanje N-vezanog ugljovodoničnog lanca. Alternativno, supstitucije koje eliminišu tu sekvencu će ukloniti postojeći N-vezani ugljovodonični lanac. Takođe jc obezbeđen rearanžman N-vezanih ugljovodoničnih lanaca u kojim N-vezana mesta glikozilacije (tipično ona koja se prirodno javljaju) su eliminisana i kreirano je jedno ili više novih N-vezanih mesta. Dodatne poželjne varijante antitela uključuju varijante cisteina u kojima su jedan ili više cisteinskih ostataka delecirani iz ili supstituisani sa drugom amino kiselinom (npr.. serin) u poređenju sa roditeljskom sekvencom amino kiseline. Varijante cisteina mogu bi<l>i korisne kada antitela moraju da se ponovo uviju u biološki aktivnu komformaciju kao što je nakon izolacije nerastvorljivih inkluzionih tela. Varijante cisteina generalno imaju manje ostataka cisteina od nativnog proteina, i tipično imaju isti broj da minimizuju interakcije koje nastaju zbog nesparenih cisteina.

[0289] Prema određenim ostvarenjima, supstitucije amino kiselina su one koje: (1) redukuju suspeklnost na proteolizu, (2) redukuju suspektnost na oksidaciju, (3) menjaju afinitet vezivanja za formiranje proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja, i/ili (4) donose ili modifikuju druge fizikokohemijske ili funkcionalne karakteristike takvih polipeptida. Prema određenim ostvarenjima, pojedinačne ili višestruke supstitucije amino kiseline (u određenim ostvarenjima, konzervativne supstitucije amino kiseline) mogu se napraviti u sekvenci koja se prirodno javlja (u određenim ostvarenjima, u delu polipeptida izvan domena formiranja intermolekularnih kontakata). U određenim ostvarenjima, konzervativna supstitucija amino kiseline tipično ne može da gotovo u potpunosti promeni strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr., zamena amino kiseline ne bi trebalo da ima tendenciju da razbije spiralu koja se javlja u roditeljskoj sekvenci. ili raskinc druge tipove sekundarne strukture koja karakteriše roditeljsku sekvencu). Primeri u oblasti prepoznatljivih polipeptida sekundarnih i tercijernih struktura opisani su uProteini, strukture i molekularni principi(Creighlon. Ed.. W. H. Erccman i Companv, New York (1984));Uvod u strukturu proteina(C. Branden & J. Tooze. izd., Garland Publishing, Nevv York, N.Y. (1991)); i Thornton i sar.. Nature, 354:105 (1991).

[0290] U nekim ostvarenjima, varijante su varijante sekvenci nukleinske kiseline od AVPa ovde otkrivenih. Stručnjak će prihvatiti da gornja diskusija može da se upotrebi za identifikovanje, procenu, i/kreiranje varijanti AVP proteina i takođe za sekvence nukleinske kiseline koje mogu kodirati te varijante proteina. Prema tome. sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju te varijante proteina (kao i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju AVPe u Tabeli 2. ali su različite od onih koje su ovde eksplicitno otkrivene) su predviđene. Na primer, AVP varijanta može imati najmanje 80, 80-85, 85-90, 90-95. 95-97. 97-99 ili više identičnosti sa najmanje jednom sekvencom nukleinske kiseline opisanom u SEQ ID NOs: 152. 153. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98, 99. 100, 101. 102. 103, 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110, 111. 112. 113. 114. 115. 116, 117, 118. 119. 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. 132, 133, 134, 135. 136. 137, 138. 139. 140. 141, 142, 143. 144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151 ili najmanje jedan do šest (i različiti broj njihovih kombinacija) od CDR(ova) kodiranih sa sekvencom nukleinske kiseline u SEO ID NOs: 152, 153, 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100, 101. 102. 103. 104. 105. 106, 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. 138. 139. 140. 141. 142, 143. 144, 145, 146. 147. 148. 149, 150. i 151.

[0291] U nekim ostvarenjima, antitelo (ili sekvenca nukleinske kiseline koja ga kodira) je varijanta ako sekvenca nukleinske kiseline koja kodira određeni AVP (ili sekvenca nukleinske kiseline sama po sebi) može selektivno hibridizovati za bilo koju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira proteine u Tabeli 2 (kao što je, ali bez ograničenja na SEO ID NO: 152, 153, 92. 93. 94,95.96.97. 98, 99, 100. 101, 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110, 1 11. 112. 113, 114. 115, 116, 117. 118. 119, 120. 121, 122, 123. 124, 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131, 132. 133. 134. 135. 136, 137, 138, 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146, 147. 148. 149, 150, i 151) pod strogim uslovima. U jednom ostvarenju, pogodni umereno strogi uslovi uključuju prethodno ispiranje u rastvoru 5XSSC: 0.5% SDS. 1.0 mM EDTA (pH 8.0): hibridizovanje na 50° C. -65° C, 5xSSC. preko noći ili. u slučaju homologije među vrstama, na 45° C sa 0.5xSSC; praćenog sa dva puta ispiranjem na 65° C tokom 20 minuta sa svakim od 2x. 0.5x i 0.2xSSC koji sadrži 0.1 % SDS. Takve hibridizujuće DNK sekvence su takođe u okviru cilja ovog pronalaska, pošto su nukleotidne sekvence koje. zbog degeneracije koda. kodiraju polipeptid antitela koji je kodiran sa sekvencom hibridizujuće DNK i sekvence amino kiseline koje su kodirane sa sekvencama tih nukleinskih kiselina. U nekim ostvarenjima, varijante CDRova uključuju sekvence nukleinske kiseline i sekvence amino kiseline kodirane od strane onih sekvenci, koje hibridizuju sa jednim ili više CDRova u okviru sekvenci zabeleženih gore (pojedinačni CDRovi mogu se lako odrediti u svetlu FIGURA. 2A-3D, i drugih ostvarenja u FIG. 3CCC-3.IJJ i 15A-15D). Fraza „selektivno hibridizuje" u ovom kontekstu odnosi se na detektabilno i selektivno vezivanje. Polinukleotidi, oligonukleotidi i njihovi fragmenti prema pronalasku selektivno hibridizuju sa lancima nukleinske kiseline u uslovima hibridizacije i ispiranja koji minimizuju prihvatljive količine detektabilnog vezivanja za nespecifične nukleinske kiseline. Uslovi visoke strogoće mogu se upotrebiti da se dostignu uslovi selektivne hibridizacije kao što su poznati u oblasti i ovde diskulovani. Generalno, homologija sekvence nukleinske kiseline između polinukleotida, oligonukleotida, i fragmenata pronalaska i sekvence nukleinske kiseline za koju postoji zainteresovanost biće najmanje 80%. ili još tipičnije sa poželjno rastućim homologijama od najmanje 85%, 90%, 95%. 99%. i 100%). Dve sekvence amino kiseline su homologne ako postoji delimična ili kompletna identičnost između tih sekvenci. Na primer. 85% homologije znači daje 85% amino kiselina identično kada se dve sekvence preklope radi maksimalnog poklapanja. Gapovi (u bilo kpjoj od dve sekvence koje su preklopljene) su omogućeni da bi se maksimizovalo poklapanje: dužine gapova od 5 ili manje su poželjnije sa 2 ili manje što je još poželjnije. Alternativno i poželjno, dve sekvence proteina (ili polipcptidnc sekvence izvedene od njih od najmanje 30 amino kiselina u dužinu) su homologne. kao što jc taj termin ovde upotrebljen. ako imaju rezultat poklapanja od najviše 5 (u standardnim jedinicama devijacije) koristeći program ALIGN sa mutacionom matricom podataka i gap kaznom od 6 ili više. Vidi Davhoff. M. ().. u Atlas sekvenci proteina i strukture, str. 101-110 (Volumen 5. National Biomedical Research Foundation (1972)) i Supplement 2 tog volumena, str. 1-10. Dve sekvence ili njihovi delovi su mnogo poželjnije homologni ako su njihove amino kiseline više od ili jednake 50%> identične kada su optimalno preklopljene koristeći ALIGN program. Termin „ogovara tome" ovde se koristi da označi da je polinukleotidna sekvenca homologna (tj.. je identična, ali ne striktno evolutivno srodna) ćelom ili delu referentne polinukleotidne sekvence. ili da je polipeptidna sekvenca identična referentnoj polipeptidnoj sekvenci. Nasuprot tome. termin „komplementarna sa" se ovde koristi tako da označi da je komplementarna sekvenca homologna svim delovima referentne polinukleotidne sekvence. Radi ilustrovanja. nukleotidna sekvenca „TATAC" odgovara referentnoj sekvenci „TATAC" i komplementarna je referentnoj sekvenci „GTATA".

[0292] Priprema antigen vezujućih proteina ( npr.. antitela)

[0293] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini (kao što su antitela) produkovani su putem imunizacije sa antigenom (npr., PCSK9). U određenim ostvarenjima, antitela se mogu produkovati putem imunizacije sa PCSK9 pune dužine, raslvorljivim oblikom PCSK.9, samim katalitičkim domenom, zrelim oblikom PCSK9 prikazanim na FIG. 1 A, rascepljenom varijantom od PCSK9, ili njegovim fragmentom. U određenim ostvarenjima, antitela pronalaska mogu biti poliklonalna ili monoklonalna, i/ili mogu biti rekombinantna antitela. U određenim ostvarenjima, antitela pronalaska su humana antitela pripremljena, na primer, putem imunizacije transgenih životinja sposobnih da produkuju humana antitela (vidi, na primer, PCT publikovanu patentnu prijavu br. WO 93/12227).

[0294] U određenim ostvarenjima, mogu se upotrebiti određene strategije da se manipulišu bitne karakteristike antitela, kao sto je afinitet antitela za njegovu metu. Takve strategije uključuju, ali nisu ograničene na, upotrebu za mesto specifične ili slučajne mutageneze polinukleotiđnih molekula koji kodiraju antitelo da se generiše varijanta antitela. U određenim ostvarenjima, takvo generisanje je praćeno pregledanjem za varijante antitela koja pokazuju željenu promenu. npr.. povećan ili smanjen afinitet.

[0295] U određenim ostvarenjima, ostaci amino kiseline naciljani u mutagenim strategijama su oni u CDRovima. U određenim ostvarenjima, amino kiseline u regionima kostura varijabilnih domena su ciljevi. U određenim ostvarenjima, pokazano je da takvi regioni kostura doprinose karakteristikama vezivanja za metu u određenim antitelima.Vidi.npr, Huđson. Curr. Opin. Biotech.. 9:395-402 (1999) i reference u njemu.

[0296] U određenim ostvarenjima, manje ili više efektivno pregledane biblioteke varijanti antitela su produkovane pomoću slučajne restrikcije ili mutageneze usmerene na mesto do hiper-mutacionih mesta u CDRovima. koji su mesta koja odgovaraju područjima sklonim da mutiraju tokom mutacionih procesa somatičnih afiniteta.Vidi,npr., Chowdhury & Paslan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) i reference koje su tu. U određenim ostvarenjima, određeni tipovi DNK elemenata mogu se upotrebiti da se identifikuju hiper-mutacina mesta uključujući, ali bez ograničenja na, određene direktne i invertovane ponovke, određene konsenzus sekvence. određene sekundarne strukture, i određene palindrome. Na primer. takvi DNK elementi koji se mogu upotrebiti da se identifikuju hiper-mutacina mesta uključuju, ali bez ograničenja na. tetrabazne sekvence koje sadržr purin (A ili G). praćene sa guaininom (G), praćene sa pirimidinom (C ili T). praćene sa bilo adenozinom ili timidinom (A ili T) (tj„ A/G-G-C/T-A/T). Drugi primer DNK elementa koji se može upotrebiti da se identifikuju hiper-mutacina mesta je serin codon. A-G-C/T.

[0297] Priprema potpuno humanih AVPa ( npr.. antitela)

[0298] U određenim ostvarenjima, tehnika izlaganja faga je upotrebljena da se generišu monoklonalna antitela. U određenim ostvarenjima, takve tehnike produkuju potpuno humana monoklonalna antitela. U određenim ostvarenjima, polinukleotid koji kodira pojedinačni Fab ili Fv fragment antitela je eksprimiran na površini Čestica faga.Vidi,npr.. lloogcnboom i sar., J. Mol. Biol.. 227: 381 (1991); Marks i sar., J Mol Biol 222: 581 (1991); U.S. Patent br. 5,885,793. U određenim ostvarenjima, fagovi su „skrinovani" da se identifikuju fragmenti onih antitela koji imaju afinitet za metu. Tako, određeni takvi procesi mimikriraju imunu selekciju kroz izložene repertoare fragmenata antitela na površini filamentoznog bakteriofaga, i uzastopnu selekciju faga sa njihovim vezivanjem za metu. U određenim takvim procedurama, visoki afinitet fragmenata funkcionalno neutralizujućih antitela su izolovani. U takvim određenim ostvarenjima (diskutovanim dole mnogo detaljnije), kompletni repertoar gena humanih antitela je kreiran kloniranje prirodno rearanžiranih humanih V gena iz limfocita periferne krvi.Vidi,npr., Mullinax i sar.. Proc Natl Acad Sci (USA). 87: 8095-8099 (1990).

[0299] Prema određenim ostvarenjima, antitela pronalaska su pripremljena putem upotrebe transgenog miša koji ima značajan deo humanog antitela koji produkuje genom koji je ubačen ali koji je učinjen đeficijentnim u produkciji endogenih, mišjih antitela. Takvi miševi, su zatim, sposobni da produkuju humane imunoglobulinske molekule i antitela i deficijentni su u produkciji mišjih molekula imunoglobulina i antitela. Tehnologije koje su upotrebljene da se dostigne taj rezultat su otkrivene u patentima, prijavama i referencama koje su prikazane ovde u specifikaciji. U određenim ostvarenjima, neko može upotrebiti metode kao što su oni otkriveni u PCT publikovanoj prijavi br. WO 98/24893 ili u Mendez i sar.. Nature Genetics. 15:146-156

[0300] (1997).

[0301] Generalno, potpuno humani monoklonalni AVPi (npr.. antitela) specifična za PCSK.9 mogu se produkovati na sledeći način. Transgeni miševi koji sadrže gene humanog imunoglobulina su imunizovana sa antigenom za koji postoji interes, npr. PCSK.9, dobijene su limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) od miševa sa određenim antitelom. Takve obnovljene ćelije su fuzionisane sa ćelijskom linijom mieloidnog tipa da se pripreme besmrtne ćelijske linije hibriđoma. i u takvim ćelijskim linijama hibriđoma je rađen skrining i selektovane su đa se identifikuju ćelijske linije hibriđoma koje produkuju antitela specifična za antigen za koji postoji interes. U određenim ostvarenjima, obezbeđena je produkcija ćelijske linije hibriđoma koja produkuje antitela specifična za PCSK9.

[0302] U određenim ostvarenjima, potpuno humana antitela prođukovana su izlaganjem humanih splenocita (B ili T ćelije) antigenuin vitro,i zatim rekonstituisanjem izloženih ćelija kod imunokompromitovanog miša. npr., SCID ili nod/SCTD.Vidi,npr., Brams i sar.. J.Immunol. 160: 2051-2058 (1998); Carballido i sar.. Nat. Med.. 6: 103-106 (2000). U određenim takvim pristupima, engraftovanje humanog fetalnog tkiva u SCID miševe (SCID-hu) rezultira đogotrajnom hematopoezom i razvićem humane T-ćelije.Vidi,npr., McCune i sar.. Science, 241:1532-1639 (1988); Ifversen i sar., Sem. Immunol., 8:243-248 (1996). U određenim slučajevima, humoralni imuni odgovor kod takvih himeričnih miševa je zavisan od zajedničkog razvitka humanih T-ćelija u životinji.Vidi,npr., Martcnsson i sar., Immunol., 83:1271-179

[0303] (1994) . U određenim pristupima, humani limfociti periferne krvi su transplantirani u SCID miševe.Vidi,npr., Mosier i sar.. Nature, 335:256-259 (1988). U određenim takvim ostvarenjima, kada su takve transplantirane ćelije tretirane ili sa agensom za započinjanje, kao što je Staphvlococcal Entcrotoxin A (SEAili sa anti-humanim CD40 monoklonalnim antitelima, detektovan je viši nivo produkcije B ćelija.Vidi,npr., Martensson i sar., Immunol.. 84: 224-230

[0304] (1995) ; Murphy i sar.. Blood. 86:1946-3 953 (1995),

[0305] Prema tome. u određenim ostvarenjima, potpuna humana antitela se mogu produkovati ekspresijom rekombinantne DNK u ćeliji domaćina ili ekspresijom u hibriđoma ćelijama. U drugim ostvarenjima, antitela se mogu produkovati koristeći tehnike izlaganja faga opisane ovde.

[0306] Antitela koja su ovde opisana pripremljena su kroz upotrebu XenoMouse* tehnologije, kao što je ovde opisano. Takvi miševi, onda, su sposobni da produkuju molekule humanog imunoglobulina i antitela i đeficijentni su u odnosu na produkciju molekula mišjeg imunoglobulina i antitela. Za ostvarenje toga upotrebljene su tehnologije koje su otkrivene u patentima, prijavama i referencama ovde prikazanim u pozadini poglavlja. Posebno, međutim, poželjnio ostvarenje transgene produkcije miševa i njihovih antitela je otkriveno u U.S. patentnoj prijavi serijski br. 08/759.620, podnetoj s decembra. 1996 i međunarodnoj patentnoj prijavi WO 98/24893. publikovanoj 11 juna. 1998 i WO 00/76310. publikovanoj 21 decembra. 2000.Vidi takođeMendez i sar.. Nature Genelics. 15:146-156 (1997).

[0307] Kroz upotrebu takve tehnologije, produkovana su potpuno humana monoklonalna antitela za mnoštvo antigena. U osnovi, XenoMouse* linije miševa su imunizovane sa antigenom za koji postoji interes( npr.PCSK9). limfatične ćelije (kao što su B-ćelijc) su izdvojene iz hiper-imunzovanih miševa, i obnovljeni limfociti su fuzionisani sa ćelijskom linijom mieloidnog-tipa da se pripremi besmrtna ćeljska linija hibriđoma. Ove ćelijske linije hibriđoma su skrinovane i selektovanc da se idenlifikuje ćelijska linija hibriđoma koja produkuje antitela specifična za antigen za koji postoji interes. Ovde su obezbedeni metodi za produkciju višestrukih ćelijskih linija hibriđoma koje produkuju antitela specifična za PCSK9. Dalje je ovde obezbeđena karakterizacija antitela produkovanih od takvih ćelijskih linija, uključujuću analizu nukleotida i sekvence amino kiseline od teškog i lakog lanca takvih antitela.

[0308] Produkcija XenoMouse" sojeva miševa je dalje diskutovana i istaknuta u U.S. Patentnoj prijavi serijski br. 07/466.008. podnetoj 12 januara. 1990. 07/610.515, podnetoj 8 novembra, 1990, 07/919.297, podnetoj 24 jula, 1992. 07/922.649. podnetoj 30 jula, 1992. 8/031,801, podnetoj 15 marta, 1993. 08/112,848, podnetoj 27 avgusta, 1993, 08/234,145, podnetoj 27 aprila, 1994, 08/376,279, podnetoj 20 januara, 1995, 08/430, 938, podnetoj 27 aprila, 1995, 08/464,584, podnetoj 5 juna, 1995, 08/464,582, podnetoj 5 juna, 1995, 08/463,191, podnetoj 5 juna, 1995, 08/462,837, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,853, podnetoj 5 juna. 1995, 08/486,857, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,859, podnetoj 5 juna, 1995, 08/462,513, podnetoj 5 juna, 1995, 08/724,752, podnetoj 2 oktobra, 1996, 08/759,620. podnetoj 3 decembra, 1996, U.S. publikacije 2003/0093820, podnetoj 30 novembra, 2001 i U.S. Patent br. 6,162.963. 6,150.584. 6.114.598. 6,075.181. i 5.939.598 i Japanski Patent br. 3 068 180 B2. 3 068 506 B2, i 3 068 507 B2.Vidi takođeE>ropski Patent br.. EP 0 463 151 BI. stipendija publikovan 12 juna, 1996. Internatcionalnu patentnu prijavu br.. WO 94/02602. publikovanu 3 februara. 1994. Internatcionalnu patentnu prijavu br.. WO 96/34096. publikovanu 31 oktobra, 1996, WO 98/24893. publikovanu 11 juna. 1998. WO 00/76310. publikovanu 21 decembra. 2000.

[0309] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc.. su koristili „minilokus" pristup. U mini lokus pristupu, eg</>.ogeni Ig lokus je mimikriran kroz inkluziju komada (individualnih gena) iz Ig lokusa. Prema tome. jedan ili više Vn gena, jedan iii više Dn gena, jedan ili više Ju gena. mu konstantni region. i obično sekundarni konstantni region (poželjno gama konstantni region) su formirani u konstrukt za inserciju u životinju. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patentu br. 5.545.807 od Surani i sar. i U.S. Patent br. 5.545.806. 5.625.825. 5,625,126. 5.633,425. 5.661.016. 5.770.429. 5.789.650. 5,814.318. 5.877.397, 5.874.299. i 6.255,458 svaki od Lonberg & Kav. U.S. Patent br. 5.591.669 i 6.023.010 od Krimpenfort & Bems, U.S. Patent br. 5,612.205, 5,721.367, i 5.789,215 od Bems i sar., i U.S. Patent br. 5,643,763 od Choi & Dunn. i GenPharm International U.S. Patentna prijava serijski br. 07/574,748, podneta 29 avgusta, 1990. 07/575.962, podneta 31 avgusta, 1990, 07/810,279, podncta 17 decembra, 1991. 07/853.408. podneta 18 marta. 1992. 07/904.068. podneta 23 juna. 1992, 07/990,860, podneta 16 decembra. 1992. 08/053,131. podneta 26 aprila, 1993, 08/096.762, podneta 22 jula. 1993, 08/155.301, podneta 18 novembra, 1993, 08/161,739. podneta 3 decembra. 1993. 08/165,699, podneta 10 decembra. 1993. 08/209,741. podneta 9 marta. 1994.Vidi takođeEvropski Patent br. 0 546 073 BI. Internacionalnu patentnu prijavu br. WO 92/03918. WO 92/22645. WO 92/22647. WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569. WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852. i WO 98/24884 i U.S. Patent br. 5.981.175.Vidi daljeTavlor/' sar.,1992. Chen/ sar.,1993, Tuaillon /sar.,1993, Choi /sar..1993, Lonberg /sar..

[0310] (1994). Taylori sar..(1994), i Tuailloni sar..(1995). Fishvvilđi sar..(1996).

[0311] Kirin je takode pokazao generisanje humanih antitela od miševa u kojima, kroz mikroćelijsku fuziju uvedeni veliki delovi hromozoma, ili celi hromozomLVidiEvropsku patentnu prijavu br. 773 288 i 843 961. Sem toga generisani su KM™ miševi, koji su rezultat ukrštanja Kirin's Tc miševa sa Medarex's minilokus (Humab) miševima. Ovi miševi poseduju humani IgM transhromozom od Kirin miševa i kapa lanac transgena od Genpharm miševa (Ishida i sar.. Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

[0312] Humana antitela mogu se takode izvesti pomoćuin vitrometoda. Pogodni primeri uključuju ali nisu ograničeni na izlaganje faga (CAT, Morphosvs, Dyax, Biosite/Medarcx, Xoma<?>Symphogen, Alexion (ranije Proliferon). Affimed) ribozom displej (CAT). kvasac displej. i tome slično.

[0313] U nekim ostvarenjima, antitela koja su ovde opisana poseduju teške lance humanog IgG4 kao i teške lance lgG2. Antitela takode mogu biti od drugih humanih izotipova uključujući IgG 1. Antitela su posedovala visoke afinitete, tipično su posedovali Kd od oko IO<">6

do oko 10"'J M ili niže. kada se meri različitim tehnikama.

[0314] Kao što će biti prihvaćeno, antitela se mogu eksprimirati u drugim ćelijskim linijama koje nisu ćelijske linije hibriđoma. Sekvence koje kodiraju određena antitela mogu se upotrebiti da se transformiše pogodna sisarska ćelija domaćin. Transformacija se može obaviti bilo kojim poznatim metodom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukovanje ćelije domaćina sa virusom (ili vektorom) ili putem procedura transfekcije poznatih u oblasti, kao što jc dato u primerima u U.S. Patentima br. 4.399.216. 4.912.040. 4.740.461. i 4.959.455. Procedura transformacije koja je upotrebljena zavisiće od domaćina koji se transformiše. Metodi za uvođenje heterolognih polipeptida u sisarske ćelije su dobro poznati u oblasti i uključuju transfekciju posredovanu sa dekstranom. taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu sa polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju. enkapsulaeiju polinukleotida u lipozomima, i direktnu mikroinjekciju DNK u jedro.

[0315] Sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u praksi i uključuju mnoge besmrtne ćelijske linije dostupne od American Type Culture Collection (ATCC), uključujući ali bez ograničenja na ćelije ovarijuma kinskog brčka (CHO). HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK). ćelije bubrega majmuna (COS). ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr.. Hep G2). humane epitelijalne ćelije bubrega 293. i jedan broj drugih ćelijskih linija. Posebno poželjne ćelijske linije, koje se radije koriste, su odabrane kroz određivanje koje ćelijske linije imaju visoke nivoe ekspresije i produkuju antitela sa odgovarajućim PCSK9 karakteristikama vezivanja.

[0316] U određenim ostvarenjima, antitela i/ili AVP su produkovani sa najmanje jednim od sledećih hibriđoma: 21 BI2, 31H4. 16F12. i bilo kog drugog hibriđoma nabrojanog u Tabeli 2 ili otkrivenog u primerima. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za PCSK9 sa konstantom disocijacije (Krj) manjom od približno 1 nM,npr.,1000 pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, 10 pM to 1 pM. i/ili I pM do 0.1 pM ili manje.

[0317] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju molekul imunoglobulina od najmanje jednog od IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, Ig E, IgA, IgD. i IgM izotipa. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i/ili humani teški lanac. U određenim ostvarenjima, teški lanac je od IgGl, IgG2, IgG3, IgG4. IgE, IgA, IgD, ili IgM izotipa. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini su klonirani za ekspresiju u sisarskim ćelijama. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju drugi konstantni region, a ne konstantni regioni od IgGl. IgG2. IgG3. lgG4, IgE, IgA, IgD. i IgM izotipa.

[0318] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG2 teški lanac. Li određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani lambda laki lanac i humani lgG4 teški lanac. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgGl. IgG3. IgE. IgA. IgD ili IgM teški. U drugim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG2 teški lanac. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG4 teški lanac. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgGl, IgG3, IgE. IgA. IgD ili IgM teški lanac. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju variabilne regione antitela vezane za konstantni region koji nije ni konstantan region za IgG2 izotip, niti je konstantni region za lgG4 izotip. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini su klonirani radi ekspresije u sisarskim ćelijama.

[0319] U određenim ostvarenjima, konzervativne modifikacije teških i lakih lanaca antitela od najmanje jednog od linija hibriđoma: 21B12. 31114 i 16F12 (i odgovarajuće modifikacije za kodirajuće nukleotide) će produkovati antitela za PCSK9 koja imaju funkcionalne i hemijske karakteristike slične onima od antitela za linije hibriđoma: 21 BI2. 31114 i 16F12. Nasuprot tome, u određenim ostvarenjima, bitne modifikacije u funkcionalnim i/ili hemijskim karakteristikama antitela za PCSK9 mogu se obaviti putem selekcije supstitucija u sekvenci amino kiseline teških i lakih lanaca koje se značajno razlikuju u njihovom efektu na održavanje (a) strukture molekularnog kostura u području supstitucije, na primer. kao pločasta ili spiralna konformacija, (b) naeleklrisanja ili hidrofobičnosti molekula na ciljnom mestu. ili (c) mase bočnog lanca.

[0320] Na primer. „konzervativne supstitucije amino kiseline" mogu uključiti supstitucije nativnih ostataka amino kiseline sa ne nativnim ostatkom tako da ima malo ili nema efekta na polaritet ili naelektrisanje ostataka amino kiseline na toj poziciji. Sem toga, bilo koji nativni ostatak u polipcptidu može takođe biti supslituisan sa alaninom, kao što je bilo prethodno opisano za „alanin skaning mutagenezu".

[0321] Željene supstitucije amino kiseline (bilo da su konzervativne ili ne konzervativne) mogu se odrediti od strane stručnjaka u trenutku kada su takve supstitucije poželjne. U određenim ostvarenjima, supstitucije amino kiseline mogu se upotrebiti da se identifikuju važni ostaci od antitela za PCSK9, ili da se poveća ili smanji afinitet antitela za PCSK9 kao što je ovde opisano.

[0322] U određenim ostvarenjima, antitela ovog pronalaska mogu se eksprimirati u drugim ćelijskim linijama u odnosu na ćelijske linije hibriđoma. U određenim ostvarenjima, sekvence koje kodiraju određena antitela mogu se uzeti za transformaciju pogodnih sisarskih ćelija domaćina. Prema određenim ostvarenjima, transformacija se može obaviti sa bilo kojim poznatim metodom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukovanje ćelije domaćina sa virusom (ili vektorom) ili putem procedure transfekcije poznate u oblasti, kao što je dato primerima u U.S. Pat. br. 4.399.216. 4.912.040. 4.740.461. i 4.959.455. U određenim ostvarenjima, procedura transformacije koja je upotrebljena zavisiće od domaćina koji treba da se transformiše. Metodi za uvođenje heterologih polipeptida u sisarske ćelije su dobro poznati u praksi i uključuju, ali nisu ograničeni na. transfekciju posredovanu sa dekstranom. taloženje kalcij um fosfatom, transfekciju posredovanu sa polibrenom. fuziju protoplasta. eiektroporaciju, enkapsulaeiju polinukleotida u lipozomima. i direktnu mikroinjekciju DNK u jedro.

[0323] Sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u oblasti i uključuju, ali nisu ograničene na, mnoge besmrtne ćelijske linije dostupne od American Type Culture Collection (ATCC), uključujući ali bez ograničenja na ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO). HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BUK), ćelije bubrega majmuna (COS). ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr.. Hep G2). ijedan broj drugih ćelijskih linija. U određenim ostvarenjima, ćelijske linije se mogu odabrati putem određivanja koja ćelijska linija ima više nivoe ekspresije i produkuje antitela sa konstitutivnim I IGF karakteristikama vezivanja. Odgovarajući ekspresioni vektori za sisarske ćelije domaćine su dobro poznati.

[0324] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju jedan ili više polipeptida. U određenim ostvarenjima, bilo koji od mnoštva ekspres ioni h vektora/sistema domaćina može se upotrebiti da se eksprimiraju molekuli polinukleotida koji kodiraju polipeptide koji obuhvataju jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP, Takvi sistemi uključuju ali nisu ograničeni na, mikroorganizme, kao što su bakterije transformisane sa rekombinantnim bakteriofagom, plazmid. ili kosmid DNK ekspresione vektore: kvasac transformisan sa ekspresionim vektorima kvasca; ćelijske sisteme insekata inficirane sa ekspresionim vektorima virusa (npr.. bakulovirus); biljne sisteme ćelija transfektovane sa ekspresionim vektorima virusa (npr., mozaični virus karfiola, CaMV, mo</>aični virus duvana, TMV) ili transformisan sa bakteriskim ekspresionim vektorima (npr.. Ti ili pBR322 plazmid); ili životinjskim ćelijskim sistemima.

[0325] U određenim ostvarenjima, polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti, ili sam AVP, je rekombinantno eksprimiran u kvascu. Određena, takva ostvarenja, koriste komercijalno dostupne ekspresione sisteme, npr..PichiaExpression Svstem (Invitrogcn. San Diego, CA), prateći uputstva proizvođača. U određenim ostvarenjima, takav sistem se zasniva na pre- pro- alfa sekvenci da usmeri sekreciju. U određenim ostvarenjima, transkripcija inserta je vođena sa promoterom alkohol oksidaze (AOXl) nakon indukcije sa metanolom.

[0326] U određenim ostvarenjima, izlučeni polipeptid obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili je sam AVP prečišćen iz medijuma za rast kvasca. U određenim ostvarenjima, metođ koji je upotrebljin da se prečiste polipeptidi iz medijuma za rast kvasca je isti kao oni koji su upotrebljeni da sc prečiste polipeptidi iz bakterijskih i sisarskih supernatanta.

[0327] U određenim ostvarenjima, nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti, ili je sam AVP. jc klonira u ekspresioni vektor bakulovirusa. kao što je pVL1393 (PharMingen. San Diego, CA). U određenim ostvarenjima, takav vektor se može upotrebiti u skladu sa uputstvima proizvođača (PharMingen) da se inficiraju ćelijeSpodoplera frugiperdau sF9 medij um bez proteina i da se produkuje rekombinantni polipeptid. U određenim ostvarenjima, polipeptid je prečišćen iz takvokg medijuma upotrebom heparin-Sefaroza kolone (Pharmacia).

[0328] U određenim ostvarenjima, polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP je eksprimiran u insektskom sistemu. Određeni insektski sistemi za ekspresiju polipeptida su dobro poznati stručnjacima. U jednom takvom sistemu.Aulographa califomicajedari polihedrozis virus (AeNPV) je upotrebljen kao vektor da se eksprimiraju strani geni ućelijama Spodoptera frugiperdaili u larvamaTrichoplusia.U određenim ostvarenjima, molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid može se ubaciti u neesencijalni gen virusa, na primer, unutar polihedrin gena. i staviti pod kontrolu promotara za taj gen. U određenim ostvarenjima, uspešne insercijc molekula nukleinske kiseline učiniće neesencijalni gen inaktivnim. U određenim ostvarenjima, ta inaktivacija rezultira deteklabilnim karakteristikama. Na primer. inaktivacija polihedrin gena rezultira produkcijom virusa koji nemaju proteinski omotač.

[0329] U određenim ostvarenjima, mogu se upotrebiti rekombinantni virusi da se inficiraju ćelijeS. frugiperdaili larveTrichophisia. Vidi,npr., Smith i sar., J. Virol., 46: 584 (1983); Engelhard i sar., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7 (1994).

[0330] U određenim ostvarenjima, polipeptidi koji obuhvataju jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP napravljen u bakterijskim ćelijama produkovani su kao nerastvorljiva inkluziona tela u bakterijama. U određenim ostvarenjima, ćelije domaćini koje obuhvataju takva inkluziona tela sakupljeni su centrifugiranjem; isprani u 0.15 M NaCl. 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA; i tretirani sa 0.1 mg/ml lizozima (Sigma, St. Louis. MO) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturei. U određenim ostvarenjima, lizat je izbistren sonikacijom. i ćelijski ostatak je istaložen centrifugiranjem tokom 10 minuta na 12.000 X g. U određenim ostvarenjima, talog koji je sadržao polipeptid je resuspendovan u 50 mM I ris. pH 8. i 10 mM EDTA; izliven preko 50% glicerola; i centrifugiran tokom 30 minuta na 6000 X g. U određenim ostvarenjima, taj talog se može resuspendovati u standardnom fosfatnom puferizovanom slanom rastvoru (PBS) bez Mg<T+>i Ca". U određenim ostvarenjima, polipeptid je dalje prečišćen putem frakcionisanja resuspendovanog taloga u denaturišućem-SDS poliakrilamid gelu{ Vidi,npr., Sambrook i sar..supra).U određenim ostvarenjima, takav gel može se potopiti u 0.4 M KC1 da se vizalizuje protein, koji se može iseći i elektroisprati u gel-tekućem puferu koji nema SDS. Prema određenim ostvarenjima. Glutamil-S-Transferaza (GST) fuzioni protein je produkovan u bakteriji kao rastvorljivi protein. U određenim ostvarenjima, takav GST fuzioni protein je prečišćen koristeći GST Purification Module (Pharmacia).

[0331] U određenim ostvarenjima, poželjno je da se „ponovo uviju" određeni polipeptidi. npr.. polipeptidi koji obuhvataju jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP. U određenim ostvarenjima, takvi polipeptidi su produkovani koristeći određene rekombinantne sisteme diskutovane ovde. U određenim ostvarenjima, polipeptidi su „ponovo uvijeni" i/ili oksidisani da formiraju željenu tercijarnu strukturu i/ili da generišu disulfidne veze. U određenim ostvarenjima, takve strukture i/ili veze su vezane sa određenim biološkim aktivnostima polipeptida. U određenim ostvarenjima, ponovno uvijanje je ostvareno koristeći bilo koju od brojnih procedura poznatih u oblasti. Primemi metodi uključuju ali nisu ograničeni na. izlaganje rastvorljivog polipeptidnog agensa do pll tipično iznad 7 u prisustvu haotropičkog agensa. Primemi haotropični agens je guanidin. U određenim ostvarenjima, ponovno uvijanje/oksidacija rastvor takode sadrži redukcioni i oksidacioni oblik tog redukcionog agensa. U određenim ostvarenjima, redukcioni agens i njegov oksidacioni oblik prisutni su u odnosu koji će generisati određeni redoks potencijal koji omogućuje da se dogodi disulfidno pomeranje. U određenim ostvarenjima, takvo pomeranje uključuje formiranje cisteinskih mostova. Primerni redoks parovi uključuju, ali nisu ograničeni na, cistein/cistamin, glutation/ditiobisGSH. bakar hlorid, ditiotreitol DTT/ditian DTT, i 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-bME. U određenim ostvarenjima, upotrebljen je ko-rastvarač da se poveća efikasnost ponovnog uvrtanja. Primerni korastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na, glicerol, polietilen glikol različitih molekulskih težina, i arginin.

[0332] U određenim ostvarenjima, neko gotovo u potpunosti prečišćava polipeptid koji obuhvata jednu iii više AVP komponenti ili sam AVP. Određene tehnike prečišćavanja proteina poznate su stručnjacima. U određenim ostvarenjima, prečišćavanje proteina uključuje sirovo frakcionisanje polipeptidnih frakcija iz ne-polipeplidnih frakcija. U određenim ostvarenjima, polipeptidi su prečišćeni koristeći hromatografiju i/ili elektroforetske tehnike. Primerni metodi prečišćavanja uključuju, ali nisu ograničeni na, taloženje sa amonijum sulfatom; taloženje sa PEG; imuno taloženje; toplotnu denaturaciju praćenu sa centrifugiranjem; hromatografiju. uključujući, ali bez ograničenja na. afinitetnu hromatografiju (npr.. Protein-A-Sefaroza). jono izmenjivačku hromatografiju. ekskluzionu hromatografiju. i hromatografiju reverzne faze; gel filtraciju: hidroksiapatitnu hromatografiju; izoelektrično fokusiranje: poliakrilamidnu gel elektroforezu; i kombinacije takvih i drugih tehnika. U određenim ostvarenjima, polipeptid je prečišćen sa brzom hromatografijom tečnog proteina ili sa tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom (HPEC). U određenim ostvarenjima, koraci prečišćavanja mogu se promeniti ili se određeni koraci mogu izostaviti, a da to rezultira još uvek pogodnim metodom za preparaciju gotovo u potpunodti prečišćenog polipeptida.

[0333] U određenim ostvarenjima, neko kvantiflkuje stepen prečišćavanja preparacije polipeptida. Određeni metodi za kvantifikovanje stepena prečišćavanja poznati su stručnajku. Određeni primerni metodi uključuju, ali nisu ograničeni na. određivanje specifične aktivnosti vezivanja preparacije i procenjivanjc količine polipeptida u preparaciji sa SDS/PAGE analizom. Određeni primerni metodi za procenu koliličine prečišćavanja polipeptidne preparcije obuhvataju izračunavanje aktivnosti vezivanja preparacije i poređenje aktivnosti vezivanja inicijalnog ekstrakta. U određenim ostvarenjima, rezultati takvog izračunavanja su izneti kao „savijeno prečišćavanje." Jedinice koje su upotrebljene da se predstavi količina aktivnosti vezivanja zavise od određenog ogleda koji je izveden.

[0334] U određenim ostvarenjima, polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP jc delimično prečišćen. U određenim ostvarenjima, delimično prečišćavanje može se obaviti korišćenjem manje koraka prečišćavanja ili korišćenjem različitih oblika iste opšte šeme prečišćavanja. Na primer. u određenim ostvarenjima, katjoivizmenjivačka kolonska hromatografija izvedena koristeći HPLC aparat će generalno rezultirati u većem ..savujajućem prečišćavanju" nego kad ista tehnika koristi sistem hromatografije niskog-pritiska. U određenim ostvarenjima, metodi koji rezultiraju nižim stepenom prečišćavanja mogu biti korisni u totalnom obnavljanju polipeptida, ili u održavanju aktivnosti vezivanja peptida.

[0335] U određenim slučajevima, elektroforetska migracija polipeptida može varirati, nekad značajno, u okviru različitih uslova SDS/PAGE.Vidi.npr., Capaldi i sar., Biochem. Biophvs. Res. Comm.. 76: 425 (1977). Biće shvaćeno da pod različitim uslovima elektrolbreze, očigledne molekulske težine prečišćenog ili delimično prečišćenog polipeptida mogu biti različite.

[0336] Primerni epitopi

[0337] Obezbedeni su epitopi za koje se anti-PCSK9 antitela vezuju. U nekim ostvarenjima, epitopi koji su vezani za antitela pronalaska su posebno korisni. U nekim ostvarenjima, korisni su antigen vezjući proteini koji se vezuju za bilo koji od epitopa koji su vezani za ovde opisana antitela. U nekim ostvarenjima, posebno su korisni epitopi vezani sa bilo kojim od antitela pobrojanih u Tabeli 2 i FIG. 2 i 3. U nekim ostvarenjima, epitop je jedan od katalitičkih domena PCSK.9.

[0338] U određenim ostvarenjima. PCSK9 epitop može se upotrebiti da se spreči (npr.. redukuje) vezivanje anti-PCSK9 antitela ili antigen vezujućeg proteina za PCSK9. U određenim ostvarenjima. PCSK9 epitop može se upotrebiti da smanji vezivanje anti-PCSK9 antitela ili antigen vezujućeg proteina za PCSK9. U određenim ostvarenjima. PCSK9 epitop može se upotrebiti da gotovo u potpunosti inhibira vezivanje anti-PCSK9 antitela ili antigen vezujućeg proteina za PCSK9.

[0339] U određenim ostvarenjima. PCSK9 epitop može se upotrebiti da izoluje antitela ili antigen vezujuće proteine koji se vezuju za PCSK9. U određenim ostvarenjima, PCSK9 epitop može se upotrebiti da generiše antitela ili antigen vezujuće proteine koji se vezuju za PCSK9. U određenim ostvarenjima, PCSK9 epitop ili sekvenca koja obuhvata PCSK9 epitop može se upotrebiti kao imunogen da generiše antitela ili antigen vezujuće proteine koji se vezuju za PCSK9. U određenim ostvarenjima. PCSK9 epitop može se davati životinji, i antitela koja se vezuju za PCSK9 se nakon toga mogu dobiti iz životinje. U određenim ostvarenjima, PCSK9 epitop, ili sekvenca koja obuhvata PCSK9 epitop. mogu se upotrebiti da interferiraju sa normalnom PCSK9-posredovanom aktivnošću, kao što je vezivanje PCSK9 sa LDLR.

[0340] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini otkriveni ovde vezuju se specifično za N-terminalni prodomen, subtilizin-nalik katalitičkom domenu i/ili a C-terminalnom domenu. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za supstrat-vezujuće udubljenje od PCSK-9 (opisano u Cunningham i sar.).

[0341] U nekim ostvarenjima, domen(i)/region(i) koji sadrže ostatke koji su u kontaktu sa ili su zatrpani od strane antitela mogu se iđentifikovati putem mutiranja specifičnih ostataka u PCSK.9 (npr., antigen divljeg tipa) i odrediti da li antigen vezujući protein može da veže mutirani ili varijantu PCSK.9 proteina. Putem pravljenja jednog broja pojedinačnih mutacija, mogu se iđentifikovati ostaci koji imaju direktnu ulogu u vezivanju ili koji su dovoljno blizu antitelu tako da mutacija može uticati na vezivanje između antigen vezujućeg proteina i antigena. Na osnovu znanja o tim amino kiselinama, domen(i) ili region(i) antigena koji sasdrže ostatke u kontaktu sa antigen vezujućim proteinom ili pokrivene sa antitelom mogu se razjasniti. Takvi domeni mogu uključiti vezivanje epitopa antigen vezujućeg proteina. Jedan specifični primer ovog generalnog pristupa koristi arginin/glutaminska kiselina protokol pregledanja (vidi. npr.. Nanevicz. T.. i sar.. 1995..1. Biol. Chcm., 270:37. 21619-21625 i Zupnick. A., i sar.. 2006. J. Biol. Chem.. 281:29. 20464-20473). Generalno, arginin i glutaminske kiseline su supstituisani sa (tipično pojedinačno) amino kiselinom u polipeptidu divljeg tipa zato što su te amino kiseline naelektrisane i ogromne i. prema tome. imaju potencijal da raskinu vezivanje između antigen vezujućeg proteina i antigena u regionu antigena, gde je uvedena mutacija. Arginini koji postoje u antigenu divljeg tipa su zamenjeni sa glutaminskom kiselinom. Dobijeno je mnoštvo takvih pojedinačnih mutanata i sakupljeni rezultati vezivanja su analizirani da se odredi koji ostaci deluju na vezivanje.

[0342] Primer 39 opisuje jedno takvo skeniranje arginin/giutaminske kiseline PCSK9 za PCSK.9 antigen vezujuće proteine koji su ovde obezbedeni. Serija mutantnih PCSK9 antigena je kreirana, tako da svaki mutantni antigen ima pojednačnu mutaciju. Vezivanje svakog mutantnog PCSK9 antigena sa različitim PCSK9 AVPom je mereno i poređeno sa sposobnosti odabranih AVPa da vezuju divlji tip PCSK9 (SEQ ID NO: 303).

[0343] Izmena (na primer. redukcija ili povećanje) u vezivanju između antigen vezujućeg proteina i varijante PCSK9, onako kako je ovde upolrebljena, znači da postoji promena u afinitetu vezivanja (npr., kao što je mereno poznatim metodama kao što je Biacore testiranje ili ogled zasnovan na perlici opisan dole u primerima). EC<50>, i/ili naelektrisanje (na primer, redukcija) u ukupnom kapacitetu vezivanja antigen vezujućeg proteina (na primer. kao što je evidentirano sa smanjenjem u Bmax u plotu koncentracija antigen vezujućeg proteina u odnosu na koncentraciju antigena). Značajna izmena u vezivanju označava da je mutirani ostatak direktno uključen u vezivanje za antigen vezujući protein, ili je u neposrednoj blizini vezanom proteinu, kada je vezujući protein vezan za antigen.

[0344] U nekim ostvarenjima, značajna redukcija u vezivanju znači da je afinitet vezivanja, EC50. i/ili kapacitet između antigen vezujućeg proteina i mutantnog PCSK9 antigena redukovan za više od 10%, više od 20%, više od 40 %, više od 50 %, više od 55 %. više od 60 %, više od 65 %>, više od 70 %, više od 75 %, više od 80 %, više od 85 %, više od 90% ili više od 95%, u odnosu na vezivanje između antigen vezujućeg proteina i divljeg tipa PCSK9 (npr., prikazano u SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: (303). U određenim ostvarenjima, vezivanje je redukovano ispod detektabilnih ograničenja. U nekim ostvarenjima, značajna redukcija u vezivanju je evidentirana kada je vezivanje antigen vezujućeg proteina za varijantu PCSK.9 proteina imanje od 50% (na primer, manje od 40%, 35%, 30%, 25%. 20%, 15% ili 10%) od vezivanja zapaženog između antigen vezujućeg proteina i divljeg tipa PCSK9 proteina (na primer. protein od SHQ ID NO: 1 i/ili SEO ID NO: (303). Takvo merenje vezivanja može se obaviti koristeći mnoštvo ogleda vezivanja poznatih u oblasti. Specifičan primer jednog takvog ogleda je opisan u Primeru 39.

[0345] U nekim ostvarenjima, obezbedeni su antigen vezujući proteini koji pokazuju značajno niže vezivanje za varijantu PCSK9 proteina u kojem je ostatak u divljem tipu PCSK9 proteina (npr., SEO ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303 supstituisan sa argininom ili glutaminskom kiselinom. U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano ili povećano za varijantu PCSK9 proteina koja ima bilo koju. ili više (npr.. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. ili 244) od sledećih mutacija: R207E. D208R. R185E. R439E. E513R, V538R. E539R, T132R. S351R, A390R. A413R, E582R. D162R. R164E. E167R. S123R, E129R. A311R. D313R. D337R. R519E, U521R. i 0554R u poređenju sa divljim tipom PCSK.9 proteina (npr., SEO ID NO: 1 ili SEO ID NO: 303. U kratkoj napomeni upotrebljenoj ovde. format je: ostatak divljeg tipa: pozicija u polipeptidu: mutantni ostatak, sa numerisanjem ostataka kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 1 iii SEO ID NO: 303.

[0346] U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2. 3, 4. 5, ili više) mutacija na sledećim pozicijama: 207, 208, 185. 181. 439. 513, 538. 539. 132. 351. 390. 413, 582, 162, 164, 167. 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521. i 554. kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK.9 proteina (npr.. SEO ID NO: 1 ili SEO ID NO: 303. U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano. ili povećano, za mutant PCSK9 koji ima jednu ili više (npr.. 1. 2. 3, 4, 5, ili više) mutacija na sledećim pozicijama: 207, 208, 185, 181. 439. 513, 538. 539. 132, 351. 390, 413. 582. 162. 164. 167, 123. 129. 311. 313. 337. 519. 521. i 554, kao što jc prikazano u SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK.9 proteina (npr.. SEO ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303). U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je gotovo u potpunosti redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr.. 1. 2. 3. 4. 5. ili više) mutacija na sledećim pozicijama: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132. 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, u okviru SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.

[0347] U nekim ostvarenjima, vezivanje AVP je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK.9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) od sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E. E513R. V538R. E539R, T132R, S351R. A390R. A413R. E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R. A311R. D313R, D337R, R519E. H521R, i 0554R u okviru SEO ID NO: 1 ili SEO ID NO: 303. u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303).

[0348] U nekim ostvarenjima, vezivanje AVP je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1. 2. 3. 4. 5. itd.) od sledećih mutacija: R207E, D208R. R185E, R439E, E513R, V538R. E539R. T132R, S351R, A390R, A413R, i E582R u okviru SEO ID NO: I ili SEO ID NO: 303. u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEO ID NO: 1 ili SEO ID NO: 303). U nekim ostvarenjima, vezivanje je redukovano. U nekim ostvarenjima, zapažena je redukcija u vezivanju kao promena u EC50. U nekim ostvarenjima, promena u EC50 je povećanje numeričke vrednosti EC50 (i. prema tome. smanjenje vezivanja).

[0349] U nekim ostvarenjima, vezivanje AVP jc značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr.. 1. 2. 3. 4. 5. itd.) od sledećih mutacija: D162R. R164E, E167R. SI23R, E129R. A311R. D313R. D337R. R519E. 1I521R. i 0554R u okviru SEO ID NO: 1. u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr.. SEO ID NO: 1 ili SEO ID NO: 303). U nekim ostvarenjima, vezivanje je redukovano. U nekim ostvarenjima, redukcija u vezivanju je zapažena kao promena u Bmax. U nekim ostvarenjima, pomak u Bmax je redukcija maksimalnog signala generisanog sa AVP. U nekim ostvarenjima, da bi amino kiselina bila deo epitopa. Bmax je redukovan za najmanje 10%, na primer. redukcija na bilo koju od sledećih količina: 20. 30. 40, 50. 60, 70. 80, 90. 95. 98. 99. ili 100 procenata može. u nekim ostvarenjima, naznačiti daje ostatak ili njegov đeo epitop.

[0350] Iako su varijantni oblici koji su samo nabrojani izneti u odnosu na divlji tip sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. biće prihvaćeno da u alelskoj varijanti PCSK9 amino kiselina na identičnoj poziciji može da se razlikuje. Antigen vezujući proteini koji pokazuju značajno niže vezivanje za takve alelske oblike PCSK9 su takode predviđeni. Shodno tome, u nekim ostvarenjima, bilo koje od gornjih ostvarenja može se uporedili sa alelskom sekvencom. pre negom sa čistom sekvencom divljeg tipa prikazanoj na FIG. 1A

[0351] U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano za varijantu PCSK9 proteina u kojoj je ostatak na odabranoj poziciji u divljem tipu PCSK9 proteina mutiran u bilo koji drugi ostatak. U nekim ostvarenjima, ovde opisane zamenc arginin/glutaminska kiselina upotrebljene su da se identifikuju pozicije. U nekim ostvarenjima, alanin je upotrebljen da se identifikuju pozicije.

[0352] Kao što je zabeleženo gore, ostaci direktno uključeni u vezivanje, ili pokriveni, sa antigen vezujućim proteinom mogu se iđentifikovati iz rezultata pregledanja. Ovi ostaci mogu, prema tome, obezbediti naznaku za regione domena od SEQ ID NO: 1 (ili SEQ ID NO: 303 ili SEQ ID NO: 3) koji sadrže region(e) vezivanja za koji se antigen vezujući proteini vezuju. Kao Što se može videti iz rezultata sumarizovanih u Primeru 39, u nekim ostvarenjima antigen vezujući protein vezuje se za domen koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina: 207. 208, 185. 181, 439. 513. 538. 539. 132.351. 390, 413, 582. 162. 164. 167. 123. 129. 311. 313, 337, 519, 521. i 554 od SEO ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina: 207. 208. 185. 181, 439. 513. 538, 539. 132. 351, 390. 413. 582. 162. 164. 167. 123. 129. 311. 313. 337. 519. 521. i 554 od SEO ID NO: 1 ili SEO ID NO: 303.

[0353] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina 162. 164. 167. 207 i/ili 208 od SEO ID NO: 1 ili SEO ID NO: 303. U nekim ostvarenjima, više nego jedan (npr.. 2. 3. 4. ili 5) od identifikovanih ostataka su deo regiona koji je vezan sa AVP. U nekim ostvarenjima. AVP je u kompeticiji sa AVP 21 BI 2.

[0354] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina 185 od SEO IDNO: 1 ili SEO ID NO: 303. U nekim ostvarenjima. AVP je u kompeticiji sa AVP 31H4.

[0355] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina 439, 513, 538, i/ili 539 od SEO ID NO: 1 ili SEO ID NO: 303. U nekim ostvarenjima, više nego jedan (npr.. 2, 3, ili 4) od identifikovanih ostataka je deo regiona koji se vezuje sa AVP. U nekim ostvarenjima, AVP je u kompeticiji sa AVP 31A4.

[0356] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina 123, 129, 311, 313, 337. 132. 351. 390. i/ili 413 od SEO ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim ostvarenjima, više nego jedan (npr.. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. ili 9) od identifikovanih ostataka je deo regiona koji se vezuje sa AVP. U nekim ostvarenjima, AVP je u kompeticiji sa AVP 121111.

[0357] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina 582. 519. 521. i/ili 554 od SEO ID NO: 1 ili SEO ID NO: 303. U nekim ostvarenjima, više nego jedan (npr., 2, 3, ili 4) od identifikovanih ostataka je deo regiona koji se vezuje sa AVP. U nekim ostvarenjima. AVP je u kompeticiji sa AVP 3C4.

[0358] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se vezuje za gore pomenute regione u okviru fragmenta ili pune dužine sekvence od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U drugim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za polipeptide koji se sastoje od tih regiona. Pozivanje na ,,SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303" označava da jedan ili obc od tih sekvenci mogu biti upotrebljene ili relevantne. Fraza ne naznačava da samo jedna treba da bude upotrebljena.

[0359] Kao što je primećeno gore, gornje opisne napomene su specifične za pozicije amino kiseline za pozivom na SEO ID NO: 1. Međutim, generalno kroz prijavu, napomene su napravljene za Pro/Cat domen koji počinje na poziciji 31, koji je obezbeđen u SEQ ID NO: 3. Kao što je dole naznačeno, SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 303 nemaju signalnu sekvencu PCSK9. Kao takvo, bilo kakvo poređenje između tih različitih otkrića mora uzeti u obzir tu razliku u numerisanju. Konkretno, bilo koja pozicija amino kiseline u SEQ ID NO: 1. će odgovarati pozicijo amino kiseline 30 amino kiselina dalje u proteinu u SEQ ID NO: 3. Na primer. pozicija 207 iz SEO ID NO: 1. odgovara poziciji 237 iz SEQ ID NO: 3 (puna dužina sekvence. i sistem numerisanja upotrebljen u predmetnom pronalasku generalno). Tabela 39.6 ističe kako gore pomenute pozicije, koje sc odnose na SEO ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303) odgovaraju SEO ID NO: 3 {koji uključuje signalnu sekvencu). Prema tome. bilo koje od gore pomenutih dostignuća koja su opisana u odnosu na SEQ ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303), su opisana u vezi sa SEQ ID NO: 3. prema pomenutim odgovarajućim pozicijama.

[0360] U nekim ostvarenjima. AVP 21B12 se vezuje za epitop uključujući ostatke 162-167 (npr.. ostatke D162-E167 od SEQ ID NO: 1). U nekim ostvarenjima. AVP 121111 se vezuje za epitop koji uključuje ostatke 123-132 (npr.. S123-T132 od SEQ ID NO: 1). U nekim ostvarenjima, AVP 12H11 se vezuje za epitop koji uključuje ostatke 311-313 (npr.. A311-D313 od SEQ ID NO: 1). U nekim ostvarenjima. AVPi se mogu vezati za epitop koji uključuje bilo koji od tih lanaca sekvenci.

[0361] Kompeticioni antigen vezujući proteini

[0362] U drugom aspektu, obezbedeni su antigen vezujući proteini koji su u kompeticiji sa jednim od primernih antitela ili funkcionalnih fragmenat koji sc vezuju za epitop ovde opisan za specifično vezivanje za PCSK9. Takvi antigen vezujući proteini mogu sc takođe vezati za isti epitop kao jedan od ovde datih primerom antigen vezujućih proteina, ili preklapajući epitop. Za antigen vezujuće proteine i fragmente koji su u kompeticiji sa. ili se vezuju za isti epitop. kao primerni antigen vezujući proteini očekivano je da pokazuju slične funkcionalne karakteristike. Primerni antigen vezujući proteini i fragmenti uključuju one opisane gore, uključujući one sa teškim i lakim lancima, domenima varijabilnog regiona i CDRove uključene u TABELU 2 i/ili FIG. 2-3 i 15. Prema tome, kao specifičan primer, antigen vezujući proteini koji su obezbedeni uključuju one koji su u kompeticiji sa antitelom ili antigen vezujućim proteinom koji ima: (a) svih 6 od CDRova pobrojanih za antitelo nabrojano u FIG. 2-3 i 15;

[0363] (b) VH i VL pobrojanih za antitelo nabrojano u Tabeli 2; ili

[0364] (c) dva laka lanca i dva teška lanca kao što je određeno za antitelo nabrojano u Tabeli 2.

[0365] Određene terapeutske upotrebe i farmaceutske kompozicije

[0366] U određenim slučajevima, PCSK.9 aktivnost je u korelaciji sa jednim brojem humanih bolesnih stanja. Na primer. u određenim slučajevima, previše ili premalo PCSK9 aktivnosti je u korelaciji sa određenim stanjima, kao Što je hiperholesterolemija. Prema tome. u određenim slučajevima, modulirajuća aktivnost PCSK9 može biti terapeutski korisna. L određenim ostvarenjima, neutralizujući antigen vezujući protein za PCSK9 upotrebljen je da se mođuliše najmanje jedna PCSK9 aktivnost (npr., vezivanje za LDLR). Takva upotreba može tretirati i/ili soprečiti i/ili redukovati rizik od poremećaja koji su u odnosu sa povišenim nivoima holesterola ili u kojima su bitni povišeni nivoi holesterola.

[0367] Kao što ćc biti očigledno stručnjaku, u svetlu predmetnog pronalaska, poremećaji koji se odnose na, uključuju, ili mogu biti pod uticajem variranja holesterola. LDL. ili LDLR nivoa mogu se ispitati različitim ostvarenjima antigen vezujućih proteina. U nekim ostvarenjima. ..poremećaj vezan za holesterol" (koji uključuje ..poremećaje vezane za serum holesterol") uključujući bilo koji ili više od sledećih: hiperholesterolemiju. srčane bolesti, metaboličke sindrome, dijabetes, koronarne srčane bolesti, šlog. kardiovaskularne bolesti. Alchajmerovu bolest i generalnu dislipidemiju. koje se mogu manifestovati. na primer. sa povišenim ukupnim serum holesterolom. povišenim LDL. povišenim trigliceridima. povišenim VLDL, i/ili nižim HDL. Neki ne-ograničavajući primeri primarnih i sekundarnih dislipidemija koje se mogu tretirati koristeći AVP, bilo sam, bilo u kombinaciji sa jednim ili više drugih agensa uključuju metaboličke sindrome, dijabetes melitus, porodičnu kombinovanu hiperlipidemiju, porodičnu hipertrigliceridemiju, porodične hiperholesterolemije. uključujući heterozigotnu hiperholesterolemiju. homozigotnu hiperholesterolemiju, porodični defektivni apoplipoprotein B-IOO: poligensku hiperholesterolemiju: bolest uklanjanja ostatka, hepatičnu delicijenciju lipaze: dislipidemiju sekundarnu u odnosu na bilo koju od sledećih: dijetarnu indiscreciju. hipotiroidizam. lekove uključujući estrogensku i progestinsku terapiju, beta-blokere i tiazid diuretike; nefrotični sindrom, hronično otkazivanje bubrega. Kušing-ov sindrom, primarni biliarni cirozis. bolest čuvanja glikogena, hepatom. holestazis. akromegalija, insulinom. defincijencija izolovanog hormona rasta i alkohol-indukovanu hipertrigliceridemiju. AVP može takode bili koristan u sprečavanju, ili tretiranju bolesti aterosklcroze. kao što su. na primer. koronarne bolesti srca, bolest koronarne arteruje, bolest periferne arterije, slog (ishaemični i hemoragični), angina pektoris, ili cerebrovasckularne bolesti i akutni koronarni sindrom, infarkt miokarda. U nekim ostvarenjima, AVP je koristan u redukovanju rizika od: ne fatalnog srčanog napada, fatalnog i ne fatalnog sloga, određenih tipova hirurgije srca, hospitalizacije zbog otkazivanja srca, bola u grudima kod pacijenata sa bolestima srca, i/ili kardiovaskularnih događaja zbog ustanovljavanja bolesti srca kao što je prc srčanog udara, pre hirurgije srca. i/ili bola u grudima sa dokazima zapušenih arterija. U nekim ostvarenjima. AVP se može upotrebiti da se redukuje rizik od povratka kardovaskulamih događaja.

[0368] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, bolesti ili poremećaji koji se generalno razmatraju (ili zbog tretiranja ili zbog preventive) kroz upotrebu statina mogu takođe imati koristi od primene instant antigen vezujućih proteina. Sem toga, u nekim ostvarenjima, poremećaji ili bolesti koji mogu imati koristi od prevencije sinteze holesterola ili povećne ekspresije LDLR mogu se takođe tretirati različitim ostvarenjima antigen vezujućih proteina. Sem toga. kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, upotreba anti-PCSK9 antitela može biti posebno korisna u tretmanu dijabetesa. Nije samo dijabetes faktor rizika za koronarnu bolest srca. već insulin povećava ekspresiju PCSK9. To znači da. ljudi sa dijabetesom imaju podignute nivoe lipida u plazmi (što može biti vezano sa visokim nivoima PCSK9) i mogu imati koristi od snižavanja tih nivoa. To je generalno diskutovano mnogo detaljnije u Costet i sar. (..Ekspresija hepatičnog PCSK9 je regulisana putem nutricionog statusa preko slerol regulatornih elcment-vezujoćih proteina 1C". J. Biol. Chem., 281: 6211-6218. 2006). koja je ovde u popunosti inkorporirana referencom.

[0369] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein je davan onima koji imaju diabetes melitus, abdominalni aortni aneurizam, alerosklerozis i/ili perifernu vaskularnu bolest sa ciljem da se smanje nivoi holesterola u serumu do sigurnijeg raspona. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein je davan pacijentima koji su pod rizikom da razviju bilo koji od ovde pomenutih poremećaja. U nekim ostvarenjima. AVPi se daju subjektima koji puše, imaju hipetenziju ili porodičnu istoriju ranih srčanih napada.

[0370] U nekim ostvarenjima, subjektima se daje AVP ako imaju umeren rizik ili viši od 2004 NCEP ciljeva tretmana. U nekim ostvarenjima, subjektima se daje AVP ako je subjektov nivo LDL holesterola više od 160 mg/dl. U nekim ostvarenjima. AVP se daje ako je subjektov nivo LDL holesterola viši od 130 (i oni imaju umercni ili srednje visok rizik prema 2004 NCEP ciljevima tretmana). U nekim ostvarenjima. AVP se daje ako je subjektov nivo LDL holesterola viši od 100 (i oni imaju visok ili vrlo visok rizik prema 2004 NCEP ciljevima tretmana).

[0371] Lekar će biti u stanju da odabere odgovarajuće naznake za tretman i ciljne nivoe lipida u zavisnosti od individualnog profila određenog pacijenta. Jedan dobro-prihvaćeni standard za vođenje tretmana hiperlipidemije je Treći izveštaj nacionalnog edukacionog programa za holesterol (NCEP) Ekspertski panel na detekciji, cvaluaciji, i treatmanu visokog krvnog holesterola kod odraslih (Adult Treatment Panel III) Konačni izveštaj, National Institutes of Health, NIH Publication br. 02-5215 (2002), štampana publikacija kojaje ovde inkorporirana sa referencom u cei i ni.

[0372] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini za PCSK9 su upotrebljeni da se smanji količina aktivnosti PCSK9 od abnormalno visokog nivoa ili čak normalnog nivoa. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini za PCSK9 su upotrebljeni da se tretira ili spreči hiperholesterolemija i/ili u pripremanju medikamenata za to i/ili za druge poremećeje vezane sa holesterolom (kao što su oni koji su zabeleženi ovde). U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 je upotrebljen da se tretiraju ili spreče stanja kao što je hiperholesterolemija u kojoj je aktivnost PCSK9 normalna. U takvim slanjima, na primer. redukcija aktivnosti PCSK9 do ispod normalnog može obezbediti terapeutski efekt.

[0373] U nekim ostvarenjima, više nego jedan antigen vezujući protein za PCSK9 je upotrebl jen da se moduliše aktivnost PCSK9.

[0374] U određenim ostvarenjima pronalaska, ovde su obezbedeni antigen vezujući proteini za upotrebu u tretiranju poremećaja vezanih sa holesterolom. kao što je hiperholesterolemija obuhvatajući davanje terapeutski efektivne količine jednog ili više antigen vezujućih proteina za PCSK9 i drugog terapeutskog agensa.

[0375] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje sam. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje pre davanja najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje konkurentno sa davanjem najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje uzastopno sa davanjem najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. U drugim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje pre davanja najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. Terapeutski agensi (osim od antigen vezujućih proteina), uključuju, ali nisu ograničeni na, najmanje jedan drugi holesteroi-snižavajući (serum i/ili ukupni telesni holesterol) agens ili izvesni agens. U nekim ostvarenjima, za agens koji povećava ekspresiju LDLR. zapaženo je da povišava nivoe HDL u serumu, snižava nivoe LDL ili snižava nivoe triglicerida. Primerni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na. slatine (atorvastatin. cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin. rosuvastatin. simvastatin). nikotinska kiselina (Niacin) (NIACOR, NIASPAN (sporo oslobađajući niacin), SLO-NIACIN (sporo oslobađajući niacin)). Fibrična kiselina (LOPID (Gemfibrozil), TRICOR (fenofibrat), Bile kiselina sekvestranti (OUESTRAN (holestiramin), kolescvelam (WELCHOL), COLESTID (colestipol)), inhibitori apsorpcije holesterola (ZETIA (ezctimib)), kombinovana nikotinska kiselina sa slatinom (ADVICOR (LOVASTATIN i NIASPAN), kombinovani statin sa inhibitorom apsorpcije (VYTORIN (ZOCOR i ZETIA) i/ili Hpiđ modifikujući agens. U nekim ostvarenjima, AVP je kombinovan sa PPAR gama agonstima, PPAR alfa/gama agonisti, inhibitori skvalen sintaze, CETP inhibitori, anti-hipertenzivi, anti-dijabetički agensi (kao što su sulfonil urec. insulin, GLP-1 analozi. DDPIV inhibitori), ApoB modulatori, MTP inhibitori i/ili tretmani obliteralne arterioskleroze. U nekim ostvarenjima. AVP je kombinovan sa agensom koji povišava nivo LDLR proteina kod subjekta, kao što su slatini, određeni citokini kao što je onkostatin M. estrogen. i/ili određeni biljni sastojci kao što je berberin. U nekim ostvarenjima. AVP je kombinovan sa agensom koji povišava nivoe holesterola u serumu kod subjekta (kao što su određeni anti-psihoticki agensi, određeni inhibitori IIIV protcaze. faktori ishrane kao što je visoka fruktoza. sukroza. holesterol ili određene masne kiseline i određeni jedarni receptor agonisti i antagonisti za RXR. RAR. LXR. FXR). U nekim ostvarenjima, AVP je kombinovan sa agensom koji povišava nivo PCSK9 kod subjekta, kao što su statin i/iii insulin. Kombinacija ova dva može omogućiti da neželjeni sporedni efekti drugih agensa budu umanjeni sa AVP. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, u nekim ostvarenjima, AVP je kombinovan sa drugim agensom/jedinjenjem. U nekim ostvarenjima. AVP i drugi agens se daju konkurentno. U nekim ostvarenjima. AVP i drugi agens se ne daju istovremeno, sa AVP koji se daje pre ili nakon davanja agensa. U nekim ostvarenjima, subjekt prima i AVP i drugi agens (koji povišava nivo LDLR) tokom istog perioda prevencije, javljanja poremećaja, i/ili perioda tretmana.

[0376] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se davati u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovano sa drugim agensima. U određenim ostvarenjima, kombinovana terapija obuhvata antigen vezujući protein sposoban za vezivanje PCSK9, u kombinaciji sa najmanje jednim antiholesterolskim agensom. Agensi uključuju, ali nisu ograničeni na.in vitrosintetički pripremljene hemijske kompozicije, antitela. antigen vezujuće regione. i njihove kombinacije i konjugale. U određenim ostvarenjima, agens može delovati kao agonist. antagonist, alosterični modulator. ili toksin. U određenim ostvarenjima, može delovati tako da inhibira ili stimuliše svoju metu (npr.. aktivacija ili inhibicija receptora ili enzima), i tako podstiče povećanu ekspresiju LDLR ili smanjuje nivoe serum holesterola.

[0377] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se davati pre. u konkurenciji sa. konkurentno sa, i nakon tretmana sa agensom koji snižava holesterol (serum i/ili ukupni holesterol). U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se davati profilaktički da se spreČi ili umanji razvoj hiperholesterolemije, bolesti srca, dijabetesa, i/ili bilo kojeg od poremećaja vezanih sa holesterolom. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se davati za tretman postojećeg stanja hiperholesterolemije. U nekim ostvarenjima, AVP odlaže početak poremećaja i/ili simptoma vezanih sa poremećajem. U nekim ostvarenjima. AVP je obezbeđen subjektu kojem nedostaju bilo kakvi simptomi bilo kojeg poremećaja vezanih za holesterol ili njihov podskup.

[0378] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 je upotrebljen sa određenim lerapeulskim agensima da se tretiraju različiti poremećaji vezani za holesterol. kao što je hiperholesterolemija. U određenim ostvarenjima, u svetlu stanja i željenog nivoa tretmana, mogu se davati dva, tri ili više agensa. U određenim ostvarenjima, takvi agensi se mogu obezbediti zajedno sa inkluzijom u istoj formulaciji. U određenim ostvarenjima, takav agens(i) i antigen vezujući protein za PCSK.9 mogu se obezbediti zajedno sa inkluzijom u istoj formulaciji. U određenim ostvarenjima, takav agens se može formu li sali odvojeno i obezbediti zajedrio sa inkluzijom u kitu za tretman. U određenim ostvarenjima, takvi agensi i antigen vezujući proteini za PCSK9 mogu se formulisati odvojeno i obezbediti zajedno sa inkluzijom u kilu za tretman. U određenim ostvarenjima,<l>akvi agensi se mogu obezbediti odvojeno. U određenim ostvarenjima, kada se daju putem genske terapije, geni koji kodiraju proteinske agense i/ili antigen vezujući protein za PCSK9 mogu se uključiti u isti vektor. U određenim ostvarenjima geni koji koditaju proteinske agense i/ili antigen vezujući protein za PCSK9 mogu biti pod kontrolom istog promotorskog regiona. U određenim ostvarenjima, geni koji koditaju proteinske agense i/ili antigen vezujući protein za PCSK.9 mogu biti u odvojenim vektorima.

[0379] U određenim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju antigen vezujući protein za PCSK9 zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, rastvaračem, emulzifikatorom. sedstvom za čuvanje i/ili ađjuvansom.

[0380] U određenim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju antigen vezujući protein za PCSK9 i terapeutski efektivnu količinu najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem. nosačem, rastvaračem. emulzifikatorom. sedstvom za čuvanje i/ili ađjuvansom.

[0381] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može sc upotrebiti sa najmanje jednim lerapeulskim agensom za zapaljenja. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se upotrebiti sa najmanje jednim lerapeutskim agensom za imuni poremećaj. Primerni terapeutski agensi za zapaljenja i imune poremećaje uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklooksigenazu tipa 1 (COX-l) i ciklooksigenazu tipa 2 (COX-2) inhibitore malih molekula modulatora od 38 kDa mito gen-akti vi rane protein kinaze (p38-MAPK); male molekule modulatore intraćelijskih molekula uključenih u zapaljenske puteve. pri čemu takvi intraćelijski molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, jnk, IKK, NF-<k>B, ZAP70, i Ick. Određeni primerni terapeutski agensi za zapaljenja su opisani, npr.. u CA. Dinarello & L.L. MoldavverProzapaljenski i anti- zapaljenski citokini u reumatoidnom artritisu: Primeri za kliničareTreće izdanje (2001) Amgen Ine. Thousand Oaks, CA.

[0382] U određenim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije ćc uključiti više od jednog različitog antigen vezujućeg proteina za PCSK9. U određenim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije će uključiti više od jednog različitog antigen vezujućeg proteina za PCSK9 pri Čemu antigen vezujući proteini za PCSK9 vezuju više od jednog epitopa. U nekim ostvarenjima, različiti antigen vezujući proteini neće biti u komprticiji sa nekim drugim za vezivanja za PCSK9. U nekim ostvarenjima, bilo koji antigen vezujući proteini prikazani u Tabeli 2 i FIG. 2 i/ili 3 mogu se kombinovati zajedno u farmaceutskim kompozicijama.

[0383] U određenim ostvarenjima, prihvatljivi materijali za formulaciju poželjno su netoksični za primaoce u upotrebljenim dozama i koncentracijama. U nekim ostvarenjima, formulacioni materijal(i) su za s.c. i/ili I.V. davanje. U određenim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija može sadržati formulacione materijale za modifikovanje. održavanje ili čuvanje, na primer. pll. osmoznost. viskoznost. bistrina, boja, izotoničnost. miris, sterilnost, stabilnost, stopa raslvaranja ili oslobađanja, apsorpcija ili prodiranje kompozicije. U određenim ostvarenjima, pogodni formulacioni materijali uključuju, ali nisu ograničeni na. amino kiseline (kao što su glicin. glutamin, asparagin. arginin ili lizin): antimikrobijalne agense: antioksidante (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfil ili natrijum hidrogen-sulfit); puferc (kao što su borat. bikarbonat. Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline): agense povećanja mase (kao što su manitol ili glicin); helatirajuće agense (kao što su etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); agense kompleksovanja (kao što su kafein. polivinilpirolidon. beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodckstrin): popunjivačc; monosaharide; disaharide; i druge ugljovodonike (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini): proteine (kao što su serum albumin. želatin ili imunoglobulini); agense za bojenje, ukus i razblaživanje; agense za emulzifikovanje; hiđrofilni polimeri (kao sto je polivinilpirolidon); polipeptidi niže molekulske težine: kounterioni koji formiraju soli (kao što je natrijum); sredstva za čuvanje (kao što su benzalkonijum hlorid. benzoična koselina. salicilna koselina. timerosal. fenetil alkohol, metilparabcn. propilparaben, hlorhcksidin. sorbična koselina ili vodonik peroksid): rastvarači (kao što su glicerin. propilen glikol ili polietilen glikol); šećerni alkoholi (kao što su manitol ili sorbitol): agensi za suspendovanje; površinska sredstva ili agensi za vlaženje (kao što su pluronici. PEG. sorbitan estri, polisorbati kao što je polisorbat 20, polisorbat 80. triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agensi za pojačavanje stabilnosti (kao što su sukroza ili sorbitol); agensi za pojačanje toničnosti (kao što su alkalni metal halidi. poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); nosači za isporuku; razblaživači; ekscipijensi i/ili farmaceutska pomoćna sredstva.

[0384] ( Remingtonove farmaceutske nauke,18. Izdanje, A.R. Gennaro, izd., Mack Publishing Compani

[0385] (1995). U nekim ostvarenjima, formulacija obuhvata PBS; 20mM NaOAC, pH 5.2. 50mM NaCl; i/ili lOmM NAOAC, pH 5.2. 9% sukrozu.

[0386] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK.9 i/ili a terapeutski molekul je vezan za nosač koji produžuje polu-život poznat u praksi. Takvi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol. glikogen (npr.. glikozilacija AVP). i dekstran. Takvi nosači su opisani, npr., u U.S. prijavi serijski br. 09/428.082. sada US Patent br. 6.660.843 i publikovana PCT prijava br. WO 99/25044. koje su ovde radi bilo koje namene inkorporirane sa referencom.

[0387] U određenim ostvarenjima, optimalna farmaceutska kompozicija će biti određena od strane stručnjaka nakon, na primer. namenjene putanje davanja, formata isporuke i željene doze. Vidi. na primer.Remingtonove farmaceutske nauke, supra.U određenim ostvarenjima, takve kompozicije mnogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, stopu oslobađanjain vivoi stopu bistrenjain vivoantitela pronalaska.

[0388] U određenim ostvarenjima, primarno sredstvo ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti ili vodene ili ne vodene prirode. Na primer, u određenim ostvarenjima, pogodno sredstvo ili nosač može biti voda za injekcije, fiziološki slani rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, po mogućnosti snabdevena sa drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralno davanje. U nekim ostvarenjima, slani rastvor obuhvata izotonični fosfatni puferizovani slani rastvor. U određenim ostvarenjima, neutralni puferizovani slani rastvori ili slani rastvori pomešani sa serum albuminom su dalje primerna sredstva. U određenim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije obuhvataju Tris pufer od oko pH 7.0-8.5. ili sirćetni pufer od oko pH 4.0-5.5, koji može dalje uključiti sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U određenim ostvarenjima, kompozicija koja obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, može se pripremiti za čuvanje mešanjem odabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim formulacionim agensom( Remingtonove farmakološke nauke, supra)u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim ostvarenjima, kompozicija koja obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, može biti formulisana kao liofilizat koristeći odgovarajući ekscipijens kao što je sukroza.

[0389] U određenim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija može se odabrati za parenteralnu isporuku. U određenim ostvarenjima, kompozicije sc mogu odabrati za inhalaciju ili za isporuku kroz digestivni trakt, kao stoje oralno. Preparacija takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je u okviru sposobnosti određenog stručnjaka.

[0390] U određenim ostvarenjima, formulacione komponente su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto davanja. U određenim ostvarenjima, koriste se puferi da se održi kompozicija na fiziološkom pH ili neznatno nižem pH. obično u rasponu pH od oko 5 do oko 8.

[0391] U određenim ostvarenjima, kada je razmatrano parenteralno davanje, lerapeutska kompozicija može biti u obliku bez pirogena. parenteralno prihvatljivi vodeni rastvor obuhvata željeni antigen vezujući protein za PCSK.9. sa ili bez dodatnih terapeutskih agensa, u u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U određenim ostvarenjima, nosač za parenteralne injekcije jc sterilna destilovana voda u koju je antigen vezjući protein za PCSK9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, sačuvan na odgovarajući način. U određenim ostvarenjima, preparacija može uključiti formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilne mikrosfere. bio-erodibilne čestice, polimerna jeđinjenja (kao što su polilaktonska kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi. koji mogu obezbediti kontrolisano ili odloženo oslobađanje produkta koji se onda može isporučiti preko depot injekcije. U određenim ostvarenjima, hijaluronska kiselina može takođe da se upotrebi, i može efekat pokretanja odloženog trajanja u cirkulaciji. U određenim ostvarenjima, mogu se upotrebiti implantabilne naprave za isporuku leka da se uvede željeni molekul.

[0392] U određenim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija se može formulisati za inhalaciju. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, se može formulisati kao suvi prah za inhalaciju. U određenim ostvarenjima, inhalacioni rastvor obuhvata antigen vezujući protein za PCSK.9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, koji se može formulisati sa propelantom za isporuku sa aerosolom. U određenim ostvarenjima, rastvori mogu biti nebulizovani. Plućno davanje je dalje opisano u PCT prijavi br. PCT/US94/001875. koja opisuje plućnu isporuku hemijski modifikovanih proteina.

[0393] U određenim ostvarenjima, predviđeno je da se formulacija može davati oralno. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, koji sc daje na taj način može se formulisati sa iii bez tih nosača uobičajeno koristeći pravljenje čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. U određenim ostvarenjima, kapsule se mogu dizajnirati tako da oslobode aktivni deo formulacije u određenoj tački u gastrointestinalnom traktu kada je biodoslupnosl maksimizovana a prc-sistemska degradacija je minimizovana. U određenim ostvarenjima, najmanje jedan dodatni agens može se uključiti da olakša apsorpciju antigen vezujućeg proteina za PCSK9 i/ili bilo koji dodatni terapeutski agens. U određenim ostvarenjima, razblaživači, agensi za ukus, voskovi za tačku topljenja, ulja povrća, lubrikanti, agensi za suspendovanje, agensi za dezintegraciju tableta, i veziva se mogu takođe upotrebiti.

[0394] U određenim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija može uključiti efektivnu količinu antigen vezujućeg proteina za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, u mešavini sa ne toksičnim ekscipijensima koji su pogodni za pripremanje tableta. U određenim ostvarenjima, putem rastvaranja tableta u sterilnoj vodi, ili drugom odgovarajućem nosaču, mogu se pripremiti rastvori u jediničnom doznom obliku. U određenim ostvarenjima, pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na. inertne razblaživače. kao Što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat. laktoza. ili kalcijum fosfat; ili agensi za vezivanje, kao što su škrob, želatin, ili akacija; ili agensi za podmazivanje kao što su magnezij um stearat. stearinska kiselina, ili tak.

[0395] Dodatne farmaceutske kompozicije biće očigledne stručnjacima, uključujući formulacije koje uključuju antigen vezujuće proteine za PCSK.9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, u formulacijama za odloženu, ili kontrolisanu ispruku. U određenim ostvarenjima, tehnike za fonnulisanje mnoštva drugih načina za odloženu ili kontrolisanu ispruku. kao što su nosači lipozoma. bio-razgradljive mikročestice ili porozne perlice ili depo injekcije, su takođe poznati stručnjacima. Vidi. na primer. PCT prijavu br. PCT/US93/00829 koji opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija. U određenim ostvarenjima, preparacije sa odloženim oslobađanjem mogu uključiti polupropustljive matrice polimera u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova, ili mikrokapsula. Matrice za odloženo oslobađanje mogu uključiti poliestre, hidrogelove, polilaktide (U.S. 3,773,919 i EP 058.481). kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman i sar.. Biopolvmers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hiđroksietilmetakrilat) (Langer i sar.. J. Biomed. Mater. Res.. 15:167-277 (1981) i Langer. Chem. Tech.. 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer i sar.,supra)ili poli-D(-)-3-hidroksibutiričnu kiselinu (FP 133.988). U određenim ostvarenjima, kompozicije sa odloženim oslobađanjem mogu takođe uključiti lipozome, koji se mogu pripremiti sa bilo kojim od nekoliko metoda poznatih u oblasti.Vidi.npr., Elppstein i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:3688-3692 (1985): EP 036.676; EP 088.046 i EP 143,949.

[0396] Farmaceutske kompozicije koje treba da se koriste za davanjein vivotipično su sterilne. U određenim ostvarenjima, to se može postići filtracijom kroz sterilne fil<l>racione membrane. U određenim ostvarenjima, u kojima se kompozicija liofilizuje. sterilizacija koja koristi ovaj metod može se izvesti bilo pre, ili nakon liofilizacije i rekonstilucije. U određenim ostvarenjima, kompozicija za parenteralno davanje može se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. U određenim ostvarenjima, parenteralne kompozicije generalno su stavljene u kontejner koji ima sterilni ulazni pristup, na primer, vrećica za intravenski rastvor ili vijal koji ima zapušač koji se može probušiti hipodermalnom injekcionom iglom.

[0397] U određenim ostvarenjima, jednom kada je farmaceutska kompozicija formulisana. ona se može čuvati u sterilnim vijalima kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta materija ili kao dehdrirani ili liofilizirani prah. U određenim ostvarenjima, takve formulacije mogu se čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu (npr., liofiliziranom) koji se rekonstituiše pre davanja,

[0398] U određenim ostvarenjima, obezbedeni su kitovi za produkciju pojedinačne dozne jedinice. U određenim ostvarenjima, kit može sadržati i prvi kontejner koji ima osušeni protein i drugi kontejner koji ima vodenu formulaciju. U određenim ostvarenjima uključeni su kitovi koji obuhvataju pojedinačne i višekomorne prethodno napunjenen siringe (npr., tečne siringe i liosiringe).

[0399] U određenim ostvarenjima, efektivna količina farmaceutske kompozicije koja ouhvata antigen vezujući protein za PCSK9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, koja treba da se upotrebi terapeutski zavisiće. na primer. od terapeutskog konteksta i ciljeva. Stručnjak će shvatiti da odgovarajući đozni nivoi za tretman, prema određenim ostvarenjima, će prema tome varirati zaviseći. delom od isporučenog molekula, indikacije za koju je antigen vezujući protein za PCSK.9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, bio upotrebljen. načina davanja, i veličine (telesne težine, površine tela ili veličine organa) i/ili kondicije (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. U određenim ostvarenjima, kliničar može litrovati dozu i modifikovati način davanja moda dobije optimalni terapeutski efekat. U određenim ostvarenjima, tipična doza može biti u rasponu od oko 0.1 pg/kg pa sve do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od faktora spomentutih gore. LI određenim ostvarenjima, doziranje može biti u rasponu 0.1 ug/kg sve do 100 mg/kg; ili 1 u.g/kg sve do oko 100 mg/kg; ili 5 p-g/kg sve do oko 100 mg/kg.

[0400] U određenim ostvarenjima, frekvenca doziranja će uzeti u obzir farmakokinetičke parametre antigen vezujućeg proteina za PCSK9 i/ili bilo koje dodatne terapeutske agense u upotrebljenoj formulaciji. U određenim ostvarenjima, kliničar će davati kompoziciju sve dok nije dostignuta doza koja dostiže željeni efekat. U određenim ostvarenjima, kompozicija može. prema tome, da se daje kao pojedinačna doza. ili kao dve ili više doza (koje mogu ili ne mogu sadržali istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija preko implantacione naprave ili katetera. Dalje usavršavanje odgovarajuće doze radi se rutinski od strane stručnjaka i u obimu je zadataka koji im se rutinski zadaju. U određenim ostvarenjima, odgovarajuće doziranje može se potvrditi kroz upotrebu odgovarajućih podataka doznog odgovora. U nekim ostvarenjima, količina i frekvenca davanja može uzeti u obzir željeni nivo holesterola (serum i/ili ukupni) koji terba da se dobije i subjektove trenutne nivoe holesterola, nivoe LDL, i/ili nivoe LDLR, koji se svi mogu dobiti metodima koji su dobro poznati stručnjacima.

[0401] U određenim ostvarenjima, način davanja farmaceutske kompozicije je u skladu sa upotrebama, npr. oralno, putem intravenske injekcije, intraperitonealno. intracerebralno (intra-parenhimalno), intracerebroventrikularno. intramuskulamo, subkutano. inlra-okularno. intraarterijalno, intraportalno. ili intralezionim načinima; sa sistemima za odloženo oslobađanje ili sa implantacionim napravama. U određenim ostvarenjima, kompozicije se mogu davati sa bolus injekcijom ili kontinuirano sa infuzijom, ili sa implantacionom napravom.

[0402] U određenim ostvarenjima, kompozicija se može davati lokalno preko implantacije membrane, sundera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji je željeni molekul bio apsorbovan ili inkapsuliran. U određenim ostvarenjima, gde se koristi naprava za implantaciju. naprava se može implantirati u bilo koje stabilno tkivo ili organ, i isporuka željenog molekula može biti preko difuzije, bolusa za vremensko oslobađanje, ili kontinuirano davanje.

[0403] U određenim ostvarenjima, može biti poželjno da se upotrebi farmaceutska kompozicija koja obuhvata antigen vezujući protein za PCSK.9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, nacx vivonačin. U takvim slučajevima, ćelije, tkiva i/ili organi koji su uklonjeni iz pacijenta su izloženi farmaceutskim kompozicijama koje sadrže antigen vezujući protein za PCSK9. sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, nakon čega ćelije, tkiva i/ili organi su uzastopno implantirani nazad u pacijenta.

[0404] U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 i/ili ili bilo koji dodatni terapeutski agenas mogu se isporučiti putem implantiranja određenih ćelija koje su bile konstruisane genetičkim inžinjeringom, koristeći metode kao što su oni koji su ovde opisani, da se eksprimiraju i izlučuju određeni polipeptidi. U određenim ostvarenjima, takve ćelije mogu bili životinjske ili humane ćelije, i mogu biti autologne. heterologne, ili ksenogenične. U određenim ostvarenjima, ćelije mogu biti besmrtne. U određenim ostvarenjima, sa ciljem đa se smanji šansa za imunološki odgovor, ćelije mogu biti inkapsulirane da se izbegne infiltracija okolnih tkiva. U određenim ostvarenjima, materijali za inkapsulaciju su tipično biokompatibilni, polu-permeabilni polimerični omotači ili membrane koji omogućuju oslobađanje proteinskog produkta(ata) putem sprečavanja destrukcije ćelija od strane pacijentovog imunog sistema ili sa drugim štetnim faktorima iz okolnih tkiva.

[0405] Zasnovano na sposobnosti AVPa da značajno neutralizuju aktivnost PCSK9 (kao što je dole prikazano u Primerima), ovi AVPi će imati terapeutske efekte u tretiranju i prevenciji simptoma i stanja koji nastaju od PCSK9-posredovane aktivnosti, kao što je hiperholesterolemija.

[0406] Dijagnostičke primene

[0407] U nekim ostvarenjima, AVP je upotrebljen kao dijagnostičko oruđe. AVP se može upotrebiti da sc proceni količina PCSK9 prisutna u uzorku i/ili subjektu. Kao što će to biti prihvaćeno od strane stručnjaka, takvi AVPi ne moraju biti neutralizujući AVPi. U nekim ostvarenjima, dijagnostički AVP nije neutralizujući AVP. U nekim ostvarenjima, dijagnostički AVP vezuje se za različit epitop u odnosu onaj na koji se vezuje neutralizujući AVP. U nekim ostvarenjima, dva AVPa nisu u kompeticiji jedan sa drugim.

[0408] U nekim ostvarenjima, AVPi otkriveni ovde upotrebljeni su ili su obezbeđerni u kitu za oglede i/ili metodu za detekciju PCSK9 u sisarskim tkivima ili ćelijama sa ciljem da se pregledaju/dijagnostifikuju bolesti ili poremećeji vezani sa promenama u nivoima PCSK9. Kit obuhvata AVP koji vezuje PCSK9 i načine pokazivanje vezivanja AVP sa PCSK9. ako je prisutno, i po potrebi nivoe PCSK9 proteina. Mogu se upotrebiti različiti načini za naznačavanje prisustva AVP. Na primer. fluorofori. koji nisu molekulske probe, ili enzimi mogu biti vezani za AVP i prisustvo AVP se može zapaziti na različite načine. Metod za pregledanje takvih poremećaja može uključili upotrebu kita. ili jednostavno upotrebu jednog od otkrivenih AVPova i određivanje da li se AVP vezuje za PCSK9 u uzorku. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, visoki ili povišeni nivoi PCSK9 će rezultirati većim količinama vezivanja AVP za PCSK9 u uzorku. Prema lome. stepen vezivanja AVP može se upotrebiti da se odredi koliko ima PCSK9 u uzorku. Subjekti ili uzorci sa određenom količinom PCSK9 koja je viša od prethodno određene količine (npr.. količina ili raspon koji će imati osoba bez PCSK9 srodnog poremećaja) može se okarakterisati kao da ima PCSK9 posredovan poremećaj. U nekim ostvarenjima. AVP se daje subjektu koji uzima statin, sa ciljem da se odredi da li statin ima povećanu količinu PCSK9 kod subjekta.

[0409] U nekim ostvarenjima, AVP je ne-neutralizujući AVP i upotrebljen je da se odredi količina PCSK9 kod subjekta koji prima AVP i/ili tretman slatinom.

[0410] PRIMERI

[0411] Primeri koji slede, uključujući izvedene eksperimente i dobijene rezultate, obezbedeni su samo sa svrhom ilustracije i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće za predmentni pronalazak.

[0412] PRIMER 1

[0413] Imunizacija i titrovanje

[0414] Generisanje anti- PCSK9 antitela i hibriđoma

[0415] Antitela zrele forme PCSK9 (prikazano kao sekvenca u FIG. 1A, sa podvučenim pro-domenom), su odgajena u XenoMouse<*>' miševima (Abgenix, Fremont, CA), a to su miševi koji sarže humane imunoglobulinske gene. Dve grupe Xenofvlouse*' miševa, grupa 1 i 2, su korišćeni za proizvodnju antitela za PCSK9. Grupa 1 uključuje miševe XenoMouse* soja XMG2-KL, koji proizvode u celini humana IgG2K i lgG2A. antitela. Grupa 1 miševa jc imunizovana sa humanim PCSK9. PCSK9 je pripremljn standardnim rekombinantnim tehnikama upotrebom sekvence iz GenBank sa referencom (NM_174936). Grupa 2 je uključila miševe XenoMouse<l<:>soja XMG4-KL, koji proizvode u celini humana IgG4<K>- i IgG4A, antitela. Miševi grupe 2 su takođe imunizovani sa humanim PCSK.9.

[0416] U miševe iz ovih grupa su ubrizgani antigeni jedanaest puta. prema protokolu iz Tabele 3. U inicijalnoj imunizaciji. u svakog miša je ubrizgano ukupno 10 ug antigena isporučenih intraperitonealno u stomak. Uzastopna povećanja su 5ug doza i metod ubrizgavanja se kolebao između intrapcritonealnog ubrizgavanja u abdomen i subkutanog ubrizgavanja u bazu repa. Za intraperitonealno ubrizgavanje antigen je pripreman kao emulzija sa Titermax H Gold (Sigma. CatUT2684) i za subkulana ubrizgavanja antigen je mešan sa Alum (aluminijum fosfatom) i CpG oligo. U ubrizgavanju 2 preko 8 i 10. u svakog miša je ukupno ubrizgano 5 ug antigena u adjuvansnom alum gelu. Finalno ubrizgavanje 5 pg antigena po mišu je isporučeno u Fosfo puferizovaomslanom rastvoru i isporučeno na 2 mesta 50% IP u stomak 50% SQ u bazu repa. Program imunizacije je sumarizovan u Tabeli 3. dole prikazanoj.

[0417] Protokol korišćen za titar XenoMouse životinja je bio sledeći: Costar 3368 medij um vezujuće ploče bile su presvučene sa neulravadinom( a)8ug/ml (50ul/bunarčić) i inkubirane na 4 °C u 1XPBS/0.05% azidu preko noći. Isprane su pomoću TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Ploče su blokirane upotrebom 250ul 1XPBS/1% mleka i inkubirane tokom najmanje 30 minuta na ST. Blok jc ispran korišćenjem TiterTek 3- cikusa ispiranja sa RO vodom. Neko je zatim hvatao b-humane PCSK9 @ 2ug/ml u lXPBS/l%mleko/10mM Ca2+ (razblaživač ogleda) 50ul/bunarčiću i inkubirao tokom lč na ST. Zatim su isprane koristeći TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Za primarna antitela, serum je titrovan 1:3 u duplikatu od 1:100. Ovo je obavljeno u razblaživaču ogleda 50ul/bunarčiću i inkubirano tokom 1Č na ST. Potom su isprane koristeći TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Sekundarno antitelo bilo je kozije anti Humano IgG Fc HRP( a)400 ng/ml u razblaživaču ogleda 50ul/bunarčiću. Ovo je inkubirano tokom 1Č na ST. Ovo je zatim isprano korišćenjem TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom i nežno osušeno na papirnom ubrusu. Za supstrat jc korišćen jedan-korak TMB rastvor (Neogen. Leksington. Kentaki) (50ul/bunarČić) i dozvoljeno je da sc razvije tokom 30 min na ST.

[0418] Protokol praćen u ELISA ogledu bio je sledeći: za uzorake koji su sadržali b-PCSK9 sa ne V5His tagom primenjen je sledeći protokol: Primenjene su Costar 3368 medijum vezujuće ploče (Corning Life Sciences). Ploče su presvučene sa neutravadinom na 8 ug/ml u lXPBS/0.05%Azidu. (50 ul/bunarčić). Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane korišćenjem Titertck M384 ispirača ploča (Titertek. Huntsville. AL). Obavljena su 3-ciklusa ispiranja. Ploče su blokirane sa 250 pl 1XPBS/1% mleka i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su potom isprane upotrebom M384 ispirača ploča. Obavljena su 3-ciklusa ispiranja. Hvatanje je bilo b-hu PCSK9. bez V5 taga. i dodano je 2 ug/ml u 1XPBS/1% mleko/lOmM Ca<2>i (40 ul/bunarčić). Ploče su zatim inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Obavljena su 3-ciklusa ispiranja. Serumi su titrovani 1:3 u duplikatu od 1:100. i sirovi H je bio šlepa proba za serum. Ti trovanje je obavljeno u razblaživaču za ogled, u zapremini od 50 ul/bunarčiću. Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Dalje je obavljeno 3-ciklusno ispiranje. Kozji i humani anti humani IgG Fc IIRP na 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1% mleko/lOmM Ca<2+>(50 ul/bunarčić) je dodan u ploču i inkubirano je 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane još jednom, koristeći a 3-ciklusno ispiranje. Ploče su zatim osušene sa papirnim ubrusima. Konačno, 1 korak TMB (Neogen. Lcxington. Kcntuckv) (50 ul/bunarčić) je dodan u ploču i ugašen sa IN hlorovodoničnom kiselinom (50 pl/bunarčić) nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.

[0419] Pozitivne kontrole za detekciju vezivanja PCSK9 u pločama bile su rastvorljivi LDL receptor (R&D Svstems. Cat #2148LD/CF) i a poliklonalno zečije anti-PCSK9 antitelo (Caymen Chemical #10007185) titrovano 1:3 u duplikatu od 3 pg/ml u razblaživaču za ogled. LDLR je detektovan sa kozjim anti LDLR (R&D Svstems. Cat //AF2148) i zečjim anti koza IgGFc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml; zečje polikolonalno je detektovano sa kozjim anti-zec IgG Fc u koncentraciji od 400 ng/ml u razblaživaču za ogled. Negativne kontrole su bili čisti XMG2-KL i XMG4-KL serum titrovan 1:3 u duplikatu od 1:100 u razblaživaču za ogled.

[0420] Za uzorke koji su obuhvatali b-PCSK9 sa V5His tagom upotrebljen je sledeći protokol: upotrebljene su Costar 3368 ploče sa medijumom za vezivanje (Corning Life Sciences). Ploče su obavijcne sa neutravadinom na 8 ug/ml u lXPBS/0.05%Azid; (50 ul/bunarčić). Ploče su bile inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek M384 ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Obavljeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 250 ul od 1XPBS/1% mleka i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su su zatim isprane koristeći M384 ispirač ploča. Obavljeno je 3-ciklusno ispiranje. Hvatanje je bilo b-hu PCSK.9, sa V5 tagom. i dodano jc na 2 pg/ml u 1XPBS/1% mleko/lOmM Ca2+ (40 ul/bunarčić). Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Obavljeno je 3-ciklusno ispiranje. Serum je titrovan sa 1:3 u duplikatu od 1:100. i sirovi H je bio šlepa proba za serum. Titrovanje je obavljeno u razblaživaču za ogled, pri zapremini od 50 ul/bunarčić. Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći M384 ispirač ploča koji radi koristeći 3-ciklusno ispiranje. Kozji anti humani IgG Fc HRP na 400 ng/ml u 1XPBS/1% mleko/1 OmM Ca2+jc dodan na 50 ul/bunarčić u ploči i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo jednom isprane, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Ploče su zatim osušene sa papirnim ubrusima. Konačno, 1 korak TMB (Neogen. Lexington. Kentuckv) 50 ul/bunarciću) je dodan ploči i ploča je ugašena sa IN hlorovodoničnom kiselinom (50 ul/ bunarčiću) nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm koristeći Titertek čitać ploča.

[0421] Pozitivna kontorola LDLR. zečji anti-PCSK9 titrovan 1:3 u duplikatu iz 3 pg/ml u razblaživaču za ogled. LDLR detekcija sa kozjim anti-LDLR (R&D Svstems. Cat #AF2148) zečjim anti-koza IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml; zečji poli detektovan sa kozjim anti-zec IgG Fc u koncentraciji od 400 ng/ml u razblaživaču za ogled. Humani anti-IIis 1.2.3 i anti-V5 1.7.1 titrovani u 1:3 u duplikatu od 1 pg/ml u razblaživaču za ogled: oba detektovana sa kozjim anti-hurnani IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml u razblaživaču za ogled. Negativna kontrola bio je čisti XMG2-KL i XMG4-KL serum titrovan 1:3 u duplikatu od 1:100 u razblaživaču za ogled.

[0422] Titrovi antitela protiv humanog PCSK9 testirani su sa ELISA ogledom za miševe imunizovane sa rastvorenim antigenom kao što je opisano. Tabela 4 sumarizuje podatke ELISA i ukazuje da su postojali neki miševi koji su bili specifični za PCSK9. Vidi. npr.. Tabelu 4. Prema tome. na kraju programa imunizacije. 10 miševa (podebljano u Tabeli 4) su odabrani za žetvu, i izolovane su splenocitc i limfociti iz slezina i limfnih čvorova respektivno. kao što je ovde opisano.

[0423] PRIMER 2

[0424] Oporavak limfoeita, izolacije B-ćclija, fuzijei igcnerisanje hibriđoma

[0425] Ovaj primer ističe kako su imune ćelije oporavljene i kako su generisani hibridomi. Odabrani imunizovani miševi su žrtvovani pomoću cervikalne dislokacije i drenirani limfni čvorovi su prikupljeni i sjedinjeni iz svakog kohorta. B ćelije su izdvojene iz limfnog tkiva usitnjavanjem u DMEM da se oslobode ćelije iz tkiva, i ćelije su suspendovane u DMEM. Ćelije su izbrojane, i 0.9 ml DMEM na 100 milona limfoeita je dodano u talog ćelija da sc ćelije lagano, ali kompletno resduspenduju.

[0426] Limfociti su pomešani sa ćelijama nesekretornog mijeloma P3X63Ag8.653 nabavljenim od ATCC, cat.# CRL 1580 (Kearney i sar., (1979) J.Immunol123, 1548-1550) u odnosu od 1:4. Mcšavina ćelija je lagano istaložena centrifugiranjem na 400 x g 4 min. Nakon dekantovanja supernatanta, ćelije su lagano pomešane koristeći pipetu od 1 mi. Prethodno zagrejani rastvor PEG/DMSO od Sigma (cat# P7306) (3 ml na milion B-ćelija) je dodavan polako uz nežno pretresanje tokom 1 min a zatim 1 min mešanja. Prethodno zagrejani IDMEM (2 ml na milion B-ćelija) (DMEM bez glutamina, L-giutamina. pen/slrep. MEM ne-esencijalne amino kiseline (sve od lnvitrogena). je zatim dodavan tokom 2 minuta uz nežno mućkanje. Konačno je prethodno zagrejani IDMEM (8 ml na IO<6>B-ćelija) dodavan tokom 3 minuta.

[0427] Euzionisanc ćelije su oborene dole 400 x g 6 min i resuspendovane u 20 ml selektivnog medijuma (DMEM (Invitrogen). 15 % FBS (Ilvclone). snabdevenim sa L-glutaminom. pen/strep. MEM ne-esencijalne amino kiselinama, natrijum piruvalom. 2-MerkaptoetanoIom (sve od lnvitrogena). HA-Azaserine Hypoxanthine i OPI (oksatacetat. piruvat. goveđi insulin) (oba od Sigma) i IL-6 (Boehringer Mannhcim)) na milion B-ćelija. Ćelije su bile inkubirane tokom 20-30 min na 37 °C i zatim resuspendovane u 200 ml selekcionog medijuma i kultivisane tokom 3-4 dana u TI75 Ilaskovima pre stavljanja u ploče sa 96 bunarčića. Prema<l>ome. proizvedeni su hibridomi koji su produkovali antigen vezujuće proteine za PCSK9.

[0428] PRIMER 3

[0429] Selekcija PCSK9 antitela

[0430] Dati primer ističe kako su okarakterisani i odabrani različiti PCSK9 antigen vezujući proteini. Procenjeno je vezivanje odabranih antitela (produkovanih iz hibriđoma proizvedenih u primerima 1 i 2) za PCSK9. Selekcija antitela je zasnovana na podacima vezivanja i inhibicije PCSK9 vezivanja za LDLR i afiniteta. Vezivanje za rastvorijivi PCSK9 je analizirano sa ELISA, kao što jc opisano dole. BIAcore® (površinska plazmon rezonanca) je upotrebljen da se kvantifikuje afinitet vezivanja.

[0431] Primarni skrining

[0432] Obavljen je primami skrining za antitela koja se vezuju za divlji tip PCSK9. Primarni skrining je izveden na dve žetve. Primarni skrining je obuhvatao ELISA ogled i bio jc izveden koristeći sledeći protokol: Upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom u koncentraciji od 4 ug/ml u lXPBS/0.05%Azid, u zapremini od 40 ul/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći . Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 ul od lXPBS/I%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane. Ponovo je izvedeno 3-ciklusno ispiranje. Uhvaćeni uzorak je biotiniliran-PCSK9, bez V5 taga, i dodan je u 0.9 pg/ml u 1XPBS/1% mleko/lOmM Ca2+ u zapremini od 40 p.l/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 10 ul supernalanta je preneto u 40 ul od l XPBS/l%mleko/10mM Ca2+ i inkubirano 1.5 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 40 ul/bunarčić kozjeg anti-humani IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u lXPBS/l%mleko%10mM Ca2+ jc dodan ploči i inkubiran 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane još jednom, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Konačno je ploči dodan 40 ul/bunarčić od One-stcp TMB (Neogen. Lexington. Kentuckv) i gašenje sa 40 ul/bunarčić od IN hlorovodonične kiseline je izvedeno nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.

[0433] Primarni skrining rezultirao je sa ukupno 3104 antigen specifičnih hibriđoma koji su identifikovani iz dve žetve. Na osnovu najviših FLISA OD. 1500 hibriđoma po žetvi je bilo uspešno od ukupno 3000 pozitivnih.

[0434] Konfirmacioni skrining

[0435] 3000 pozitivnih je ponovo skrinovano na vezivanje za to divlji tip PCSK9 da se potvrdi da su stabilni hibridomi ustanovljeli. Skrining je izveden na sledeći način: upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčiča (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 3 ug/ml u lXPBS/0.05%Azid u zapremini od 40 ul/bunarčiću. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 pl od lXPBS/l%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći M384 ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Uhvaćeni uzorak bio je b-PCSK9. bez V5 taga, i dodan je u 0.9 ug/ml u lXPBS/l%mleko/10mM Ca2-l- u zapremini od 40 ul/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći 3-ciklusno ispiranje. 10 ul supernatanta je preneto u 40 ul od lXPBS/l%mleko/10mM Ca2+ i inkubirano 1.5 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 40 ul/bunarčić

[0436] od koza anti-humani IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u lXPBS/l%mleko/10mM Ca2+ je dodan ploči, i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane ponovo još jednom, koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. Konačno. 40 pl/bunarčić od One-step TMB (Neogen. Lexington, Kentuckv) je dodan ploči i ugašen sa 40 ul/bunarčić od IN hlorovodoničnc kiseline nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Ukupno 2441 pozitivnih sc ponovilo u drugom skriningu. Ova antitela su zatim upotrebljena u uzastopnim skrininzima.

[0437] Skrining mišje unakrsne- reaktivnosti

[0438] Panel hibriđoma je skrinovan na unakrsnu rcaktivnost za mišji PCSK9 da bi bili sigurni da antitela mogu da se vezuju i za humani i za mišji PCSK9. Upotrebljen je sledeći protokol u pregledu unakrsne reaktivnosti: upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčića (Corning Lile Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 3 ug/ml u !XPBS/0.05%Azid u zapremini od 40 ul/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek. Huntsville. AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 ul od 1 XPBS/l%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izveden je 3-ciklus ispiranja. Uhvaćeni uzorak je biotinilran-mišji PCSK9, i dodan je u 1 ug/ml u ]XPBS/l%mleko/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 ul/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 50 ul supernatanta je preneto u ploče i inkubirano 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim ponovo isprane koristeći 3-ciklusno ispiranje. 40 pl/bunarčić kozjeg anti-humani IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u lXPBS/l%mleko/10mM Ca<24>je dodano ploči i ploča je inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane još jednom, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Konačno. 40 pl/bunarčić od One-step TMB (Neogen. Lexington. Kentuckv) je dodan ploči i ugašen sa 40 ul/bunarčić IN hlorovodonične kiseline nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Zapaženo je da 579 antitela unakrsno reaguje sa mišjim PCSK9. Ta antitela su zatim upotrebljena u uzastopnim skrininzima.

[0439] Skrining D374Y mutantnog vezivanja

[0440] D374Y mutacija u PCSK9 je dokumentovana u humanoj populaciji (npr., Timms KM i sar. Mutacija PCSK9 uzrokuje autozomalno-dominantnu hiperholesterolemiju u Utah pedigreu". Hum. Gcnet. 114: 349-353. 2004). Sa ciljem da sc odredi da li su antitela bila specifična za divlji tip ili se takođe vezuju za D374Y od PCSK9. uzorci su zatim skrinovani na vezivanje za mutantnu PCSK9 sekvencu koja obuhvata mutaciju D374Y. Protokol za skrining je bio sledeći: u skriningu su upotrebljene Costar 3702 medijum vezjuće ploče sa 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 4 ug/ml u lXPBS/0.05% Azid u zapremini od 40 pl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći . Pioče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 pl od lXPBS/l%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su obavije ne sa biotinilranim humanim PCSK9 D374Y u koncentraciji od 1 ug/ml u lXPBS/l%mleko/10mMCa<2+>i inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Kasnije je istrošeni suprnatant kulture hibriđoma razblažen sa 1:5 u PBS/mleko/Ca<2+>(10 ml plus 40 ml) i inkubiran tokom 1 Časa na sobnoj temperaturi. Dalje je 40 ul/bunarčić zečji anti-humani PCSK9 (Cayman Chemical) i humani anti-His 1.2.3 1:2 na lug/ml u 1XPBS/1 %mleko/l0mMCa2+ titrovan na ploče, koje su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. 40 ul/bunarčić od kozjeg anti-humani IgG Fc HRP u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u lXPBS/l%mleko/10mM Ca<2>~ je dodano u ploču i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. 40 pl/bunarčić od kozjeg anti-zec IgG Fc HRP u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u lXPBS/l%mieko/10mM Ca<2>+je dodano u ploču i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Konačno. 40 pl/bunarčić od One-step TMB ("Neogen. Lexington. Kentucky) je dodan u ploču i ugašen sa 40 pl/bunarčić sa IN hlorovodoničnom kiselinom nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Preko 96% pozitivnih hitova divljeg PCSK9 je takode vezalo PCSK9.

[0441] Skrining velikog obima blokiranja veznika receptora

[0442] Za skrinovanje antitela koja blokiraju vezivanje PCSK9 za LDLR. razvijen je ogled koristeći D374Y PCSK9 mutant. Mutant jc upotrebljen u ovom ogledu zato što ima viši nivo afiniteta vezivanja za LDLR omogućujući da se razvije mnogo osetljiviji ogled blokiranja veznika receptora. Upotrebljen je sledeći protokol u skriningu blokiranja veznika receptora: upotrebljene su Costar 3702 medijum veujućc ploče od 384 bunarčića (Corning Life Sciences) u skriningu. Ploče su obavijene sa kozjim anti-LDLR (R&D Cat #AF2148) u 2 ug/ml u 1 XPBS/0.05%iAzid u zapremini od 40 pl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek. Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 ul od 1XPBS/1% mlcko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Uhvaćeni uzorak je bio LDLR (R&D, Cat #2148LD/CF), i dodan je u 0.4 ug/ml u lXPBS/l%mIeko/10mM Ca2+" u zapremini od 40 ul/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa i 10 minuta na sobnoj temperaturi. Istovremeno. 20 ng/ml biotiniliranog humanog D374Y PCSK9 je inkubirano sa 15 mikrolitara istrošenog supernatanla hibriđoma u Nunc polipropilen pločama i koncentracija istošenog supernatanla je razblažena 1:5. Ploče su zatim pre-inkubirane tokom oko 1 časa i 30 minuta na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 50 p.l/bunarčić od pre-inkubirane mešaviine je preneto u LDLR obavijene ELISA ploče i inkubirano tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Da se detektuje LDLR-vezivanje b-PCSK9, u ploče je dodano 40 ul/bunarčić streptavidin HRP na 500 ng/ml u razblaživaču za ogled. Ploče su inkubirane tokom 1 Časa na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Konačno. 40 pl/bunarčić od One-step TMB (Neogen. Lexington, Kentuckv) jc dodano u ploče i ugašeno sa 40 ul/bunarčić sa IN hlorovodoničnom kiselinom nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Skrining je iđentillkovao 384 antitela koja blokiraju interakciju između PCSK9 i LDLR bunarčića. 100 antitela je snažno blokiralo interakciju (OD < 0.3). Ova antitela su inhibirala interakciju vezivanja PCSK9 i LDLR više od 90% (više od 90% inhibicije).

[0443] Ogled vezivanja veznika receptora na blokirani podskup

[0444] Ogled veznika receptora je zatim ponovljen koristeći mutantni enzim na 384 članom podskupu neutralizatora identifikovanih u prvom ogledu velikog obima inhibicije veznika receptora. Isti protokol je upotrebljen u skriningu ogleda 384 članog podskupa blokera kao što je obavljeno u skriningu velikog obima inhibicije veznika receptora. Ovaj ponovljeni skrining je potvrdio početne skrining podatke.

[0445] Ovaj skrining podskupa 384 člana identifikovao je 85 antitela koja su blokirala interakciju između PCSK9 mutantnog enzima i LDLR više od 90%.

[0446] Ogled vezivanja veznika receptora blokera koji vezuju divlji tip PCSK9 ali ne i D374Y mutant

[0447] U početnom panelu 3000 supova bilo je 86 antitela za koja je pokazano da se specifično vezuju za divlji tip PCSK9 a ne za huPCSK9(D374Y) mutant. Tih 86 supova je testirano na sposobnost da blokira divlji tip PCSK9 vezivanja za LDLR receptor. Upotrebljen je sledeći protokol: u skriningu su upotrebljene Costar 3702 medijum vezjuće ploče od 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa anti-His 1.2.3 u 10 ug/ml u lXPBS/0.05% Azid u zapremini od 40 ul/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek. Huntsville. AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 ul od lXPBS/l%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. LDLR (R&D Systems, #2148LD/CF ili R&D Systems, #2148LD) je dodan u 5 pg/ml u lXPBS/l%mleko/10mM Ca2+ u zapremini od 40 pl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče bile isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. Istovremeno, biotinilirani humani PCSK9 divljeg tipa je pre-inkubiran sa istošenim supernatantom hibriđoma u Nunc polipropilen pločama. 22 p_l sup hibriđoma je preneto u 33ul od b-PCSK9 u koncentraciji od 583 ng/ml u lXPBS/l%mleko/10mMCa2+, dajući konačnu b-PCSK9 koncentraciju = 350 ng/ml i istrošeni supernalant u konačnom razblaženju od 1:2.5. Ploče su bile pre-inkubirane tokom približno 1 časa i 30 minula na sobnoj temperaturi. 50 ul/bunarčić od pre-inkubirane mešavine je preneto na LDLR uhvaćene ELISA ploče i inkubirano tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. 40 ul/bunarčić streptavidin HRP na 500 ng/ml u razblaživaču za ogled je dodano u ploče. Ploče su inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Konačno. 40 pl/bunarčić od One-step TMB (Neogen. Lexington. Kentucky) je dodano u ploču i ugašeno sa 40 ul/bunarčić sa IN hlorovodoničnom kiselinom nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.

[0448] Rezultati skrininga

[0449] Na osnovu rezultata opisanih ogleda, identifikovano je nekoliko linija hibriđoma koje produkuju antitela sa smanjenim interakcijama sa PCSK9. Upotrebljeno je ograničavajuće razblaživanje da se izoluje značajan broj klonova od svake linije. Klonovi su označeni prema broju linije hibriđoma (npr. 21B12) i broju klona (npr. 21B12.1). Generalno nisu detektovane razlike među razlilčitim klonovima određene linije putem ovde opisanog funkcionalnog ogleda. U nekoliko slučajeva, klonovi su identifikovani od određene linije koja se ponašala drugačije u funkcionalnom ogledu, na primer, nađeno je da 25A7.1 ne blokira PCSK9/LDLR ali je bio 25A7.3 (označen ovde kao 25A7) neutralizujući. Izolovani klonovi su svaki prošireni u 50-100 ml hibriđoma medija i ostavljeni da rastu do iscrpljivanja, (tj., manje od oko 10% vijabilnosti ćelija). Koncentracija i potenlnost antitela za PCSK9 u supernatantima tih kultura je određena sa ELISA i sain vitrofunkcionalnim testiranjem, kao što je ovde opisano. Kao rezultat ovde opisanog skrininga, identifikovani su hibridomi sa najvišim titrom antitela za PCSK9. Odabrani hibridomi su prikazani na FIG. 2A-3D i u Tabeli 2.

[0450] PRIMER 4.1

[0451] Produkcija humanog 31H4 IgC4 antitela iz hibriđoma

[0452] Ovaj primer generalno opisuje kako je jedan od antigen vezujućih proteina proizveden od linije hibriđoma. Produkcioni rad je upotrebio 50 ml generisanog iscrpljenog supernatanla praćenog sa prečišćavanjem proteina A. Integra produkcija je korišćena za povećanje količine i izvedena je kasnije. Linija hibriđoma 31H4 je odgajena u '175 flaskovima u 20 ml medija (Integra Media, Table 5). Kada je hibridom bio gotovo tečan u T75 flaskovima, on je prenel u Integra flask (Integra Biosciences, Integra CL10OO, cal# 90 005).

[0453] Integra flask je flask za ćelijsku kulturu koji je podeljen membranom u dve komore, malu komoru i velku komoru. Zapremina od 20-30 ml hibriđoma ćelija u minimumu ćelijske gusline od lxl0<6>ćelija po ml od 31 H4 linije hibriđoma je stavljena u malu komoru Integra flaska u Integra medijumu (vidi Tabelu 5 za komponente Integra medijuma). Integra medijum sam (1L) je stavljen u veliku komoru Integra flaska. Membrana koja razdvaja dve komore je propusna za hranjive sastojke male molekulske težine ali jc nepropusna za ćelije hibriđoma i za antitela koja produkuju te ćelije. Prema tome. hibriđoma ćelije i antitela koja produkuju te hibriđoma ćelije su zadržana u maloj komori.

[0454] Nakon jedne nedelje. medijum je uklonjen iz obe komore Integra flaskova i zamenjen sa svežim Integra medijumom. Sakupljeni medijumi iz malih komora su zadržani odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, medijumi iz male komore su ponovo sakupljeni. Sakupljeni medijumi iz 1 nedelje iz linije hibriđoma su kombinovani sa sakupljenim međijumima iz 2 nedelje iz linije hibriđoma. Nastali sakupljeni uzorci medijuma iz hibriđoma linije su oboreni da se uklone ćelije i ostatak (15 minuta na 3000rpm) i nastali supernatant je filtriran (0.22um). Pročišćeni uslovni medijumi su napunjeni u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijumi se mogu prvo koncentrovati a zatim napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena sa ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Vezana antitela proteina na Protein A koloni su obnovljena sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM Citrat, pH 3.0). Sakupljeni antigeni proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjeni su sa hromatografijom ekskluzije veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 31H4 proteine su Q-Sepharose HP na pl l 7.8-8.0. Antitelo je isprano sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolona.

[0455] PRIMER4.2

[0456] Produkcija rckombinantnih 31H4 humanih IgG2 antitela iz transfektovanih ćelija

[0457] Ovaj primer ističe kako su 31H4 IgG2 antitela produkovana iz transfektovanih ćelija. 293 ćelije za prolaznu ekspresiju CHO ćelije za stabilnu ekspresiju su transfcktovane sa plazmiđima koji kodiraju teške i lake lance 31H4. Uslovni medijum iz transfektovanih ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum se može prvo koncentrovati pa onda napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifiČna vezivanja su uklonjena ekstenzivnim ispiranjem sa PRS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom {kao što je 50 mM citrat. pH 3.0). Sakupljena anali tela proteina u protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao što jc Q Sepharose smola. Specifični 1EX uslovi za 31H4 proteine su Q-Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Anlilelo je isprano sa NaCI gradijent od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolone.

[0458] PRIMER5

[0459] Produkcija humanih 21 BI2IgG4antitela iz hibriđoma

[0460] Ovaj primer ističe kako je antitelo 21B12 IgG4 produkovano iz hibriđoma. Ilibridom linija 21B12 je odgajena u T75 flaskovima u medijumu (Integra Međia. Tabela 5). Rada su hibridomi postali gotovo tečni u T75 flaskovima. oni su transformisani u Integra flaskovima (Integra Bioscienccs. Integra CL 1000, cat# 90 005).

[0461] Integra flask je flask za ćelijsku kulturu koji je podeljen membranom u dve komore, malu komoru i velku komoru. Zapremina od 20-30 ml hibriđoma ćelija u minimumu ćelijske gustine od 1 x 106 ćelija po ml od 31 H4 linije hibriđoma je stavljena u malu komoru Integra flaska u Integra medijumu (vidi Tabelu 5 za komponente Integra medija). Integra medijum sam (1L) je stavljen u veliku komoru Integra flaska. Membrana koja razdvaja dve komore jc propusna za hranjive sastojke male molekulske težine ali je nepropusna za ćelije hibriđoma i za antitela koja produkuju te ćelije. Prema tome. hibriđoma ćelije i antitela koja produkuju te hibriđoma ćelije su zadržana u maloj komori. Nakon jedne nedelje. medijumi su uklonjeni iz obe komore Integra flaskova i zamenjeni sa Integra medijumom. Sakupljeni medijumi iz malih komora su zadržani odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, medijumi iz malih komora su ponovo sakupljeni. Sakupljeni medijum iz 1 nedelje iz linije hibriđoma je kombinovan sa sakupljenim medijumom iz 2 nedelje od hibriđoma linije. Nastali sakupljeni uzorci medijuma iz linije hibriđoma su oboreni da se uklone ćelije i otpad (15 minuta na 3000 rpm) i nastali supcrnatant je filtriran (0.22 pm). Izbistreni uslovni medijumi su napunjeni u Protein A Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum je prvo koncentrovan i onda napunjen u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena sa ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjeni su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao Što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 31114 proteine su Q-Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitelo je isprano sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolone.

[0462] PRIMER 6

[0463] Produkcija humanih 21B12 IgC2 antitela iz transfektovanih ćelija

[0464] Ovaj primer ističe kako je antitelo 21 BI2 lgG2 produkovano iz transfektovanih ćelija. Ćelije (293 ćelija za prolaznu ekspresiju i CHO ćelija za stabilnu ekspresiju) su transfektovane sa plazmiđima koji kodiraju teške i lake lance 21 BI2. Uslovni medijum iz hibriđoma ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Uslovni medijum iz transfektovanih ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum se može prvo koncentrovati pa onda napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolona (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na na anjon zamenjujućoj smoli kao sto je 0 Sepharose smola. Specifični IF,X uslovi za 21B12 proteine su SP-Sepharose HP na pH 5.2. Antitela su isprana sa 25 kolonskim zapreminama pufera koji sadrži NaCl gradijent od 10 mM-500 mM u 20 mM natrijum acetatnog pufera.

[0465] PRIMER7

[0466] Produkcija humanih 16F12 IgG4 antitela iz hibriđoma

[0467] Ovaj primer ističe kako je antitelo 16F12 IgG4 produkovano iz hibriđoma. Linija hibriđoma 16F12 je odgajena u T75 flaskovima u mediju (vidi Tabelu 5). Kada su hibridomi postali gotovo tečni u T75 flaskovima, oni su transformisani u Integra flaskovima (Integra Bioscicnces, Integra CL 1000, cat# 90 005).

[0468] Integra flask je flask za ćelijsku kulturu koji jc podeljen membranom u dve komore, malu komoru i velku komoru. Zapremina od 20-30 ml hibriđoma ćelija u minimumu ćelijske gustine od lxl0<ć>ćelii a po ml od 31 114 linije hibriđoma je stavljena u malu komoru Integra flaska u Integra medijumu (vidi Tabelu 5 za komponente Integra medijuma). Integra medijum sam (1L) je stavljen u veliku komoru Integra flaska. Membrana koja razdvaja dve komore je propusna za hranjive sastojke male molekulske težine ali je nepropusna za ćelije hibriđoma i za antitela koja produkuju te ćelije. Prema tome, hibriđoma ćelije i antitela koja produkuju te hibriđoma ćelije su zadržana u maloj komori.

[0469] Nakon jedne nedelje, medijumi su uklonjeni iz obe komore Integra flaskova i zamenjeni sa Integra medij umom. Sakupljeni medijumi iz malih komora su zadržani odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, medijumi iz malih komora su ponovo sakupljeni. Sakupljeni medijum iz 1 nedelje iz linije hibriđoma je kombinovan sa sakupljenim medijumom iz 2 nedelje od hibriđoma linije. Nastali sakupljeni uzorci medijuma iz linije hibriđoma su oboreni da se uklone ćelije i otpad (15 minula na 3000 rpm) i nastali supernatanl je filtriran (0.22 um), lzbistreni uslovni medijumi su napunjeni u Protein A Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum je prvo koncentrovan i onda napunjen u Protein A Sepharose kolonu. Nc-specifiČna vezivanja su uklonjena sa ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao sto je 50 mM citrat. pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao stoje Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 16F12 proteine su Q Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitela su isprana sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolona.

[0470] PRIMER 7.1

[0471] Produkcija humanih 16E12 IgG2 antitela od transfektovanih ćelija

[0472] Ovaj primer ističe kako je antitelo 16FI2 lgG2 produkovano iz transfektovanih ćelija. Ćelije (293 ćelije za prolaznu ekspresiju i CHO ćelije za stabilnu ekspresiju) su transfektovanc sa plazmiđima koji kodiraju teške i lake lance 161-12. Uslovni medijum iz hibriđoma ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum jc napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Uslovni medijum iz transfektovanih ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum sc može prvo koncentrovati pa onda napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne- specifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijorn na anjon zamenjujućoj smoli kao Što je SP Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 16F12 proteine su SP-Scpharose HP na pH 5.2. Antitela su isprana sa 25 kolonskim zapreminama pufera koji sadrži NaCl gradijent od 10 mM-500 mM u 20 mM natrijum acetatnog pufera.

[0473] PRIMER 7.2

[0474] Analiza sekvence teških i lakih lanaca antitela

[0475] Sekvence nukleinske kiseline i amino kiseline za lake i teške lance gornjih antitela određene su sa Sanger (dideoksi) nukleotidnim sekvenciranjem. Sekvence amino kiseline su zatim izvedene za sekvence nukleinske kiseline. Sekvence nukleinske kiseline za varijabilne regione su prikazane u f IG. 3E-3J.I.

[0476] cDNK sekvence za lambda laki lanac varijabilnog regiona od 31 114. 21B12. i 16F12 su određene i obelođanjne kao SEO ID NOs: 153. 95. i 105 respektivno.

[0477] cDNK sekvence za teški lanac varijabilnog regiona od 31H4. 21 BI2, i I6F12 su određene i obelodanjene kao SEO ID NOs: 152. 94. i 104 respektivno.

[0478] Lambda laki lanac konstantni region (SEQ ID NO: 156). i IgG2 i IgG4 teški lanac konstantni region (SEO ID NOs: 154 i 155) su prikazani u FIG. 3KK.

[0479] Određene su polipeplidne sekvence predviđene od svake od tih cDNK sekvenci. Predviđene polipelidne sekvence za varijabilne regione lambda lakog lanca od 31114, 21 BI2. i 16F12 su predviđene i obelodanjene u SEQ ID NOs: 12. 23: i 35 respektivno, konstantni region lambda lakog lanca (SEQ ID NO: 156). varijabilni regioni teškog lanca 3 1IT4, 21 BI2. i 16F12 su predviđeni i obelodanjeni kao (SEQ ID NOs. 67. 49. i 79 respektivno. IgG2 i IgG4 konstantni regioni lambda teškog lanca (SEO ID NOs: 154 i 155).

[0480] FRI, CDRI. FR2. CDR2. FR3. CDR3. FR4 deobe su prikazane u FIG 2A-3D.

[0481] Na osnovu podataka o sekvenci. određeni su geni germinativne linije iz kojih su svaki varijabilni region teškog lanca ili lakog lanca izvedeni. Identitet gena germinativne linije je naznačen u susedstvu odgovarajuće linije hibriđoma u FIG. 2A-3D i svaka jc predstavljena sa SEO ID NO. FIG.. 2A-3D takođe opisuju sekvence određenih amino kiselina za dodatna antitela koja su okarakterisana.

[0482] PRIMER 8

[0483] Određivanje izoelekričnih tačaka tri antitela

[0484] Teorijski pl-ovi antitela zasnovanih na sekvenci amino kiseline su određeni da imaju vrednosti 7.36 za 16F12; 8.47 za 21B12; i 6.84 za 31H4.

[0485] PRIMER 9

[0486] Karaktcrizacija vezivanja antitela za PCSK9

[0487] Pošto je identifikovan broj antitela koja se vezuju za PCSK.9, upotrebljeno je nekoliko pristupa da se kvantifikuje i dalje okarakteriše priroda vezivanja. U jednom aspektu studije, obavljena je Biacore analiza afiniteta. U drugom aspektu studije obaljena je KinExA<B>analiza afiniteta. Upotrebljeni uzorci i puferi u ovim studijama su dole prikazani u Tabeli 6.

[0488] Mcrcnje afiniteta BlAcore"

[0489] BIAcore® (naprava za površinsku rezonancu plazmona. Biacore. Inc.. Piscatavvav. NJ) analiza afiniteta za 21B12 antitela za PCSK9 opisana u Primeru je izvedena prema uputstvima proizvođača.

[0490] Ukratko, eksperimenti površinske rezonance plazmona izvedeni su koristeći Biacore 2000 optičke biosenzore (Biacore, GE Healthcare. Piscatavvav. NJ). Svako pojedinačno anti-PCSK9 antitelo jc imobilizirano u istraživačkom-stepenu CMS biosenzor čipu putem amin-sjedinjavanja u nivoima koji daju maksimum odgovora vezivanja komponente (Rmax) ne više od 200 jedinica rezonanse (RU). Koncentracija PCSK9 proteina je menjana u dvostrukim intervalima (komponenta) i injektovana je preko imobilizirane površine antitela (u stopi protoka od 100 ul/inin tokom 1.5 minula). Svež HBS-P pufer (pH 7.4. 0.01 M Hepcs. 0.15 M NaCl, 0.005% površinsko sredstvo P-20. Biacore) snabdeven sa 0.01% BSA jc upotrebljen kao pufer za vezivanje. Afiniteti vezivanja svakog anti-PCSK9 antitela su izmereni u odvojenim eksperimentima protiv svakog od humanih, mišjih, i rezus majmuna PCSK9 proteina na pH 7.4 (upotrebljene koncentracije bile su 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, i 0 nM).

[0491] Sem toga, takođe su izmereni afiniteti vezivanja antitela za humani PCSK9 pri pll 6.0 sa pH 6.0 HBS-P pufcrom (pH 6.0. 0.01 M Hepes. 0.15 M NaCl, 0.005% površinsko sredstvo P-20, Biacore) snabdevenim sa 0.01%o BSA. Dobijeni signal vezivanja je proporcionalan slobodnom PCSK.9 u rastvoru. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je dobijena putem nelinearne regresione analize kompetitivnih krivi koristeći dvostruku krivu modela homogenog vezivanja na jednom mestu (KinExA® softver, Sapidyne Instruments Inc.. Boise, ID) (n=l za 6.0 pH tura). Interesantno je da se pokazalo da antitela pokazuju čvršći afinitet vezivanja pri nižem pH (kada jeKdbio 12.5. 7.3, i 29 pM za31H4, 21B12. i 16F12 respektivno).

[0492] Parametri kinetike vezivanja antitela uključujući ka (konstanta stope vezivanja), kd (konstanta stope disocijacije). i KD (konstanta ravnotežne disocijacije) su određeni koristeći BIA procenu 3.1 računarski program (BIAcore. Inc. Piscatavvav. NJ). Niža konstanta ravnotežne disocijacije ukazuje na viši afinitet antitela za PCSK9. KD vrednosti određene sa BIAcore<*>analizom afiniteta predstavljene su u Tabeli 7.1. prikazanoj dole.

[0493] Tabela 7.2 prikazuje k on i koir stope.

[0494] Merenje afiniteta KinRxA®

[0495] KinExA® (Sapidvne Instruments, Inc., Boise, ID) analiza afiniteta 16F12 i 31H4 je obavljena prema uputstvima proizvođača. Ukratko, Reacti-Gel™ (6x) (Pierce) su pre-obavijene sa humanim, V5-tagovanim rczus ili His- tagovanim mišjim PCSK9 proteinima i blokirani sa BSA. 10 ili 100 pM od svakog antitela 16F12 ili antitela 31H4 i jedan od PCSK9 proteina su zatim inkubirani sa različitim koncentracijama (0.1 pM - 25 nM) od PCSK9 proteina na sobnoj temperaturi tokom 8 Časova pre nego što su propušteni kroz PCSK9-obavijenc perle. Količina perla-vezanih 16F12 ili 31H4 je kvantifikovana sa fluorescentno (Cy5) obeleženim kozjim anti-humanim IgG (H+L) antitelom (Jackson Immuno Research). Signal vezivanja je proporcionalan koncentraciji slobodnog 16FI2 ili 31H4 u ravnoteži vezivanja. Konstanta ravnotežne disocijacije (KD) je dobijena putem nelinearne regresivne analize kompetitivnih krivi koristeći dvostruku krivu modela homogenog vezivanja na jednom mestu. KinExA® Pro softver jc upotrebljen u analizi. Krive vezivanja generisane u ovoj analizi su predstavljene kao FIG. 4A-4F.

[0496] I 16F12 i 31114 antitela pokazala su sličan afinitet za humani i od rezus majmuna PCSK9. ali približno 10-250 puta manji afinitet za mišji PCSK9. Od dva testirana antitela koristeći KinExA" sistem, antitelo 31114 je pokazalo viši afinitet i za humani i od rezus majmuna PCSK.9 sa 3 i 2 pM K<d>. respektivno. 16F12 je pokazao neznatno slabiji afinitet pri 15pM Kn za humani PCSK9 i 16 pM K<d>za rezus majmuna PCSK9.

[0497] Rezultati KinExA" analize afiniteta sumirani su u Tabeli 8.1 prikazanoj dole.

[0498]

[0499] Sem toga. SDS PAGE jc pokrenut da se proveri kvalitet i kvantitet uzoraka i prikazan je na FIG. 5A. cPCSK9 je pokazao oko 50% manje na gelu i takođe na osnovu koncentracije aktivnog vezivanja izračunate iz KinF.xA® ogleda. Prema tome, KD od mAbs do cPCSK9 je doterana kao 50%> od aktivnog u prisutnom cPCSK9.

[0500] BlAcore rastvor ogleda ravnotežnog vezivanja je upotrebljen da sc izmere Kd vrednosti za AVP 21 BI2. 21B12.1 jc pokazao mali signal koristeći KinExA ogled, prema tome. primenjen je biacore rastvor ogled ravnoteže. Pošto nije zapaženo značajno vezivanje na vezivanju antitela za imobilisanu površinu PCSK9. 21B12 antitelo je imobilisano protokom ćelija 4 od CM5 čipom koristeći amin sjedinjavanje sa gustinom oko 7000 RU. Protok ćelija 3 je upotrebljen kao pozadinska kontrola. 0.3, 1, i 3 nM od humanog PCSK9 ili od rezus majmuna PCSK9 su pomešani sa serijskim razblaženjima od 21B12.1 uzoraka antitela (u rasponu od 0.001 - 25 nM) u PBS plus 0.1 mg/ml BSA, 0.005% P20. Vezivanje slobodnog PCSK9 u mešanim rastvorima je mereno putem ubrizgavanja preko 21 BI2.1 površine antitela. 100% PCSK.9 signala vezivanja na površinu 21B12.1 je određeno u otsustvu mAb u rastvoru. Smanjen PCSK9 odgovor vezivanja sa rastućim koncentracijama od mAb ukazalo je na vezivanje PCSK9 za mAb u rastvoru, što je blokiralo PCSK9 da se veže za imobilizovanu peptidnu površinu. Plotovanjem PCSK9 signala vezivanja u odnosu na koncentracije mAb. izračunat je KD iz tri seta krivih (0.3, 1 i 3nM fiksirana PCSK9 koncentracija) koristeći model homogenog vezivanja na jednom mestu u KinExA Pro™ softveru. I ako cPCSK9 ima nižu koncentraciju proteina zapaženu iz KinExA ogleda i SDS-gela. njegova koncentracija nije ovde dolerana pošto koncentracija od cPCSK9 nije upotrebljena za izračunavanje KD. Rezultati su prikazani u Tabeli 8.2 niže i FIG. 5B-5D. FIG. 5B prikazuje rezultate iz ogleda ravnotežnog rastvora za tri različite koncentracije hPCSK9 za hPCSK9. FIG. 5C prikazuje slični set rezultata za mPCSK9. FIG. 5D prikazuje rezultate iz gornjeg biacore ogleda hvatanja.

[0501] PRIMER 10

[0502] Bining epitopa

[0503] Kompcticiona ELISA je upotrebljena za bining anti-PCSK9 antitela. Ukratko, da bi se odredilo da li dva antitela pripadaju istom epitop binu, jedno od antitela (mAbl) je prvo obavljeno na ELISA ploču (NUNC) u 2 u/ml putem inkubacije preko noći. Ploča je zatim isprana i blokirana sa 3%> BSA. U međuvremenu, 30 ng/ml biotiniliranog hPCSK9 je inkubirano sa drugim antitelom (mAb2) tokom 2 časa na sobnoj temperaturi. Mešavina je primenjena na obavijeni mAbl i inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. ELISA ploča jc zatim isprana i inkubirana sa Neutravidin-HRP (Pierce) na razblaženjima od 1:5000 tokom 1 časa. Nakon drugog ispiranja, ploča je inkubirana sa TMB supstratom i signal je detektovan na 650 nm koristeći Titertek čitač ploča. Antitela sa istim profilima vezivanja su grupisana zajedno u isti epitop bin. Rezultati studija biniga antitela predstavljeni su u Tabeli 8.3.

[0504] Dodatno ispitivanje bininga epitopa izvedeno je koristeći BIAcorc. Tri mAbova, 16F12, 21B12 i 31H4. su imobilisani na protoku ćelija 2. 3 i 4 sa gustinom oko 8000 RU. 5 nM PCSK9 od čoveka, miša i rezus majmuna su ubrizgani preko površina mAb da se dostigne oko 100 do 500 RU. lOnM mAbova su ubrizgani preko površine PCSK9. Zatim je zabeleženo vezivanje tri mAbova za tri različita PCSK9 proteina preko tri mAbova.

[0505] Ako dva mAbova imaju slični epitop na antigenu. mAb 1 neće pokazati vezivanje za antigen koji jc već vezan za mAb 2. Ako dva mAbova imaju različite epilope na antigenu, mAbl će pokazati vezivanje za antigen vezan za mAb2. FIG. 5E prikazuje te epitop bining rezultate u obliku grafikona za tri mAbs na humanom PCSk9. Sličan obrazac je zapažen za mPCSK9 i cPCSK9. Kao što je prikazano na grafikonu. 16F12 i 31H4 izgleda da dele sličan epitop. dok 21 BI2 izgleda da ima različit epitop.

[0506] PRIMER 11

[0507] Efikasnost 3IH4 i 21B12 u blokiranju vezivanja Đ374V PCSK9/LDLR

[0508] Ovaj primer obezbeđuje IC50 vrednosti za dva antitela u blokiranju sposobnosti PCSK9 D374Y da se vezuje za LDLR. Providne ploče sa 384 bunarčića (Costar) obavijene su sa 2 mikrograma/mi kozjeg anti-LDL receptor antitela (R&D Svstems) razblaženog u puferu A (100 mM natrijum kakodilat. pH 7.4). Ploče su snažno isprane sa puierom A i zatim blokirane tokom 2 časa sa puferom B (1% mleko u puferu A). Nakon ispiranja, ploče su inkubirane tokom 1.5 časa sa 0.4 mikrograma/ml od LDL receptora (R&D Svstems) razblaženog u puferu C (pufer B snabdeven sa 10 mM CaCb). Istovremeno sa ovom inkubacijom, 20 ng/ml biotiniliranog D374Y PCSK9 jc inkubirano sa različitim koncentracijama 31114 IgG2. 31H4 IgG4. 21B12 IgG2 ili 21B12 IgG4 antitela, koje je razblaženo u puferu A. ili samom puferu A (kontrola). Ploče koje su sadržale LDL receptor su isprane i biotinilirane D374Y PCSK9/antitelo tnešavina je preneta u njih i inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Vezivanje biotiniliranog D374Y za LDL receptor je detektovano inkubacijom sa streptavidin-HRP (Biosource) na 500 ng/ml u puferu C praćenog sa TMB supstratom (KPL). Signal je ugašen sa IN HC1 i apsorbanca jc očitana na 450 nm.

[0509] Rezultati ovog vezivanja prikazani su na FIG. 6A-6D. Sumarizovano. 1C50 vrednosti su određene za svako antitelo i nađeno je da su bile 199 pM za 31114 IgG2 (FIG. 6A). 156 pM za 31114 IgG4 (FIG. 6B). 170pMza21B12 IgG2 (FIG. 6C). i 169 pM za 21 B12 IgG4 (FIG. 6D).

[0510] Antitela su takođe blokirala vezivanje divljeg tipa PCSK9 za LDLR u tom ogledu.

[0511] PRIMER 12

[0512] Ogled uzimanja LDL od strane ćelije

[0513] Ovaj primer pokazuje sposobnost različitih antigen vezjućih proteina da redukuju uzimanje LDL od strane ćelija. Humane HepG2 ćelije su zasejane u crne ploče sa prozirnim sa 96-bunarČića (Costar) u koncentraciji od 5x10<3>ćelija po bunarčiću DMEM medijumu (Mediatech, Ine) snabdevenim sa 10% FBS i inkubirane na 37 °C (5% COi) preko noći. Da sc formira kompleks PCSK9 i antitelo. 2 ug/ml od D374Y humanog PCSK.9 je inkubirano sa različitim koncentracijama antitela razblaženim u puferu za uzimanje (DMEM sa 1%> FBS) ili samom puferu za uzimanje (kontrola) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja ćelija sa PBS. mešavina D374Y PCSK9/antiteIo je preneta u ćelije, a nakon toga u LDL-B0D1PY (lnvitrogcn) razblaženim u puferu za uzimanje u konačnoj koncentraciji od 6 ug/ml, Nakon inkubacije tokom 3 časa na 37 °C (5% CO<2>). ćelije su snažno isprane sa PBS i fluorescentni signal ćelije je detektovan sa Safire™ (TEČAN) na 480-520nm (ekscitacija) i 520-600nm (emisija).

[0514] Rezultati ogleda ćelijskog uzimanja prikazani su na FIG. 7A-7D. Sumarizovano. 1C50 vrednosti su određene za svako antitelo i nađeno je da su bile 16.7 nM za 3 1 H4 IgG2 (FIG. 7A). 13.3 nM za 31H4 IgG4 (FIG. 7B). 13.3 nM za 21 BI2 IgG2 (FIG. 7C). i 18 nM za 21 BI2 IgG4 (FIG. 7D). Ovi rezultati pokazuju da primenjeni antigen vezujući proteini mogu redukovati efekat PCSK9 (D374Y) da blokira LDE uzimanje od strane ćelija Antitela su takode blokirala efekat divljeg tipa PCSK9 u ovom ogledu.

[0515] PRIMER 13

[0516] Efekat snižavanja serum holesterola sa 31H4 antitelom u 6. danu studije

[0517] Sa ciljem da se proceni snižavanje ukupnog serum holesterola (TC) u divljem tipu (WT) miševa putem terapije antitelom protiv PCSK9 proteina, izvedena je sledeća procedura.

[0518] Mužjaci WT miševa (C57BL/6 soj. starosti 9-10 nedelja. 17-27 g) dobijeni od Jackson Laboratorv (Bar Harbor, ME) hranjeni su normalnom hranom (Flarland-Teklad, Diel 2918) tokom trjanja eksperimenta. Miševima je davano ili anti-PCSK9 antitelo 31114- (2 mg/ml u PBS) ili kontrolni IgG (2 mg/ml u PBS) u nivoima od lOmg/kg kroz repnu venu miša pri 1-0. Ne tretirani miševi su takođe postavljeni sa strane kao prirodna kontrolna grupa. Dozirane grupe i vreme žrtvovanja su prikazani u Tabeli 9.

[0519] Miševi su žrtvovani sa C02 asfihijacijom u prethodno određenim vremenskim tačkama prikazanim u Tabeli 9. Sakupljena je krv preko vena eava u eppendoiT tube i ostavljena jc da se zgrušava na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Uzorci su zatim oboreni u sto noj centrifugi na 12,000xg tokom 10 minuta da se razdvoji serum. I kupni holesterol u serumu i IIDL-C su mereni koristeći Hitachi 912 klinički analizator i Roche/Hitachi l'C i HDL-C kitove.

[0520] Rezultati eksperimenta su prikazani na FIG. 8A-8D. Sumarizovano. miševi kojima je davano antitelo 31 H4 pokazali su smanjenje nivoa holesterola u serumu tokom trajanja eksperimenta (FIG. 8A i FIG. 8B). Sem<l>oga. zapaženo je da su miševi takođe pokazali smanjenje nivoa HDL (FIG. 8C i FIG. 8D). Za FIG. 8A i FIG. 8C procenat promene u odnosu na kontrolu IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0.01.HP<0.05). Za FIG. 8B i FIG 8D. procenat promene u odnosu na ukupni holesterol u serumu i nivoe HDL merene kod prirodnih životinja na t-0č(<*>P<0.01.#P<0.05).

[0521] U odnosu na snižavanje nivoa HDL, napomenuto je da će stručnjak shvatiti da smanjenje IIDL kod miševa nije znak da će se smanjenje IIDL dogoditi kod ljudi i jednostavno dalje reflektuje da su nivoi holesterola u serumu u organizmu smanjeni. Primećeno je da miševi transportuju glavninu serum holesterola u česticama lipoprotcina visoke gustine (HDL) koje su različite kod ljudi koji nose glavninu serum holesterola na LDL česticama. Kod miševa merenje ukupnog serum holesterola najbliže prati nivo serum HDL-C. Mišji IIDL sadrži apolipoprotein E (apoE) koji je veznik za LDL receptor (LDLR) i omogućuje mu da se očisti od LDLR. Prema tome. isptivanje HDL je odgovarajući indikator za pvaj primer. kod miševa (uz razumevanje da smanjenje u HDL nije očekivano za ljude). Na primer. humani HDL. nasuprot tome. ne sadrži apoR i nije veznik za LDLR. Pošto PCSK9 povećavaju ekspresiju LDLR kod miša, jetra može očistiti više I IDL i, prema tome, sniziti nuivoe serum HDL-C.

[0522] PRIMER 14

[0523] Efekat antitela 31H4 na nivoe LDLR u studiji od 6 dana

[0524] Ovaj primer pokazuje da antigen vezujući protein menja nivo LDLR kod subjekta, kao Što je predviđeno, tokom vremena. Western blot analiza izvedena je sa ciljem da potvrdi efekat antitela 31H4 na nivoe LDLR. 50-100 mg tkiva jetre dobijenog od žrtvovanih miševa opisanih u Primeru 13 je homogenizovano u 0.3 ml RIPA pufera (Santa Cruz Biotechnologv Inc.) koji je sadržao kompletan inhibitor proteaze (Roche). Homogenat jc inkubiran na ledu tokom 30 minuta i centrifugiran da sc istaloži ćelijski otpad. Koncentracija proteina u supernatantu je merena koristeći reagense za BioRad protein ogled (BioRad laboratorije). lOOug proteina jc denaturisano na 70 °C tokom 10 minuta i odvojeno na 4-12% Bis-Tris SDS gradijent gelu (Invitrogen). Proteini su prcneti u 0.45 pm PVDL membrane (Invitrogen) i blokirani u puferu za ispiranje (5()mM 'Iris P1I7.5. 150mM KaCL. 2mM CaC12 i 0.05% Twcen 20) koji je sadržao 5% nemasnog mleka tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Biol je zatim proban sa kozjim anti-miš LDLR antitelom (R&D svstem) 1:2000 ili anti-B aklin (sigma) 1:2000 tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Blot je ispran snažno i inkubiran sa goveđim anti-koza IgG-ITRP (Santa Cruz. Biotechnologv Inc.) 1:2000 ili kozjim anti-miš IgG-IIRP (Upstate) 1:2000. nakon i časa inkubacije na sobnoj temperaturi, blot jc potpuno ispran i imuno reaktivne trake su detektovane koristeći HCL plus kit (Amersham biosciences). Western blot je pokazao povećanje u nivoima LDLR proteina u prisustvu antitela 31H4, kao što je prikazano na FIG. 9.

[0525] PRIMER 15

[0526] Efekat snižavanja serum holesterola od antitela 31H4 u studiji od 13 dana

[0527] Sa ciljem da se proceni snižavanje ukupnog serum holesterola (TC) u miševima divljeg tipa (WT) preko terapije antitelom protiv PCSK9 proteina u studiji od 13 dana, izvedena je sledeća procedura.

[0528] Mužjaci WT miševa (C57BL/6 soj. starosti 9-10 nedelja. 17-27 g) dobijeni od Jackson Laboratorv (Bar Harbor, ME) normalno su hranjeni (Harland-Teklad, Diet 2918) tokom trajanja eksperimenta. Miševima je davano ili anti-PCSK9 antitelo 31H4 (2 mg/ml in PBS) ili kontrolni IgG (2 mg/ml in PBS) u nivou od 10 mg/kg kroz repnu venu miša na 1=0. Prirodni miševi su takode stavljeni sa strane kao prirodna kontrolna grupa.

[0529] Grupe doza i vreme žrtvovanja prikazani su u Tabeli 10. Životinje su žrtvovane i isečene su im jetre i pripremljene kao u Primeru 13.

[0530] Kada je eksperiment od 6 dana proširen do studije od 13 dana. zapažen je isti efekat snižavanja serum holesterola kao i u studiji od 6 dana takođe i u studiji od 13 dana Određenije, životinje dozirane sa 10 mg/kg pokazale su 31 % smanjenje u serum holesterolu 3 dana. što se postupno vratilo na pre-dozne nivoe u 13 danu. FIG. 10A prikazuje rezultate ovog eksperimenta. FIG. 10C prikazuje rezultate ponavljanja gornje procedure sa lOmg/kg dozom od 31H4. i sa drugim antitelom, I6F12. takode na lOmg/kg. Dozne grupe i vreme žrtvovanja su prikazani u Tabeli 11.

[0531] Kao što je prikazano na FIG. 10C i 16F12 i 31H4 su rezultirali sa značajnim i suštinskim smanjenjem ukupnog serum holesterola nakon samo jedne doze i obezbedili su korist tokom preko jedne nedelje (10 dana ili više). Rezultati iznete studije od 13 dana bili su konzistentni sa rezultatima prvog od 13 dana studije, sa zapaženim smanjenjem u nivoima serum holesterola od 26% u danu 3. Za FIG. 10A i FIG. 10B. procenat promene je u odnosu na kontrolni IgG u istoj vremenskoj tački (<*>P<0.01). Za FIG. 10C. procenat promene je u odnosu na kontrolni IgG u istoj vremenskoj tački (<*>P<0.05).

[0532] PRIMER 16

[0533] Efekat antitela 31H4 na nivoe HDL u studiji od 13 dana

[0534] Nivoi HDL za životinje u Primeru 15 su takođe ispitani. Nivoi HDL se smanjuju kod miševa. Još određenije, životinje dozirane sa 10 mg/kg pokazale su 33% smanjenje u nivoima HDL 3 dana. što se postupno vratilo na pre-dozne nivoe u danulj. FIG. 10B prikazuje rezultate eksperimenta. Postojalo jc smanjenje u nivoima HDL od 34% u danu 3. FIG. 10B prikazuje rezultate ponovljenog eksperimenta 13 dana.

[0535] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, iako će antitela snižavati mišji IIDL, ne očekuje se da se to dešava kod ljudi zbog razlika u HDL kod ljudi i drugih organizama (kao što su miševi). Prema tome, smanjenje u mišjem IIDL nije indikativno za smanjenje u humanom

[0536] HDL.

[0537] PRIMER 17

[0538] Ponovljeno davanje antitela produkuje kontinuirane koristi od antigen vezujućih peptida

[0539] Sa ciljem da se verifikuje da se rezultati dobijeni u Primerima gore mogu produžiti u dalje koristi sa dodatnim dozama, ponovljeni su eksperimenti iz Primera 15 i 16 sa procedurom doziranja prikazanom na FIG. 11A. Rezultati su prikazani na FIG. 1 LB. Kao što se može videti na grafikonu u FIG. 1IB. dok su oba seta miševa pokazali značajno smanjenje u ukupnom serum holesterolu zato što su svi miševi primili početnu injekciju 31H4 antigen vezujućeg proteina, miševi koji su primili dodatnu injekciju 31H4 AVP pokazali su kontinuiranu redukciju ukupnog serum holesterola. dok su oni koji su primili samo kontrolnu injekciju eventualno pokazali povećanje ukupnog serum holesterola. Za FIG. 11. procenat promene u odnosu na prirodne životinje na t 0 časova (<*>P<0.01.<**>P<0.0()1).

[0540] Rezultati iz ovog primera pokazuju da. za razliku od drugih tretmana holesterola. u kojima ponovljena primena dovodi do redukcije u efikasnosti zbog bioloških doterivanja kod subjekta, predmetni pristup ne izgieda da pati od toga tokom vremena koje je ispitano. Staviše. ovo sugerišc da povratak nivoa ukupnog serum holesterola ili HDL holesterola na polaznu osnovu, zapažen u prethodnim primerima. nije rezultat neke otpornosti na tretman koji je razvijen od strane subjekta, već pre od iscrpljivanja dostupnosti antitela kod subjekta.

[0541] PRIMER18

[0542] Mapiranje epitopa humanih anti PCSK9 antitela

[0543] Ovaj primer ističe metode za određivanje koji su ostaci u PCSK9 uključeni u formiranje dela epitopa za antigen vezujuće proteine ovde obelodanjene za PCSK9.

[0544] Sa ciljem da se odrede epitopi za koje se određeni AVPi predmetnog pronalaska vezuju, epitopi AVPa mogu da se mapiraju koristeći sintetičke peptide izvedene od specifične sekvence PCSK9 peptida.

[0545] Peptidna područja SPOTova (Sigma Genosvs) mogu se upotrebiti da se ispituju molekularne interakcije humanih anti-PCSK9 antitela sa njihovim peptidnim epitopom. SPOT tehnologija je zasnovana na sintezi peptida čvrste faze u formatu pogodnom za sistematsku analizu epitopa antitela. Sinteza uobičajene matrice oligopeptida dostupna je komercijalno od strane Sigma-Genosys. Može se dobiti peptidna matrica preklopljenih oligopeptida izvedenih iz sekvence amino kiseline od PCSK9 peptida. Matrica može sadržati seriju od 12-mer peptida kao tačaka na polipropilenskom membranskom listu. Peptidna matrica može obuhvatiti celu dužinu zrele sekvence PCSK.9. Svaki uzastopni peptid može se predstaviti sa 1 ostatkom od prethodnog, dajući uklopljenu, preklapajuću biblioteku matrica oligopeptida. Membrana koja nosi peplide može reagovati sa različitim anti-PCSK9 antitelima (1 mikrogram/ml). Vezivanje mAbova za peptide vezane za membranu može se proceniti sa imuno ogledom vezanim za enzime koristeći HRP-konjugovano sekundarno antitelo a nakon toga sa pojačanom hemilumincsccncijom (ECL).

[0546] Sem toga, funkcionalni epitopi mogu se mapirati sa kombinatornim skaniranjem alanina. U tom procesu može se upotrebiti kombinatorna alanin-skening strategija da se identifikuju amino kiseline PCSK.9 proteina koje su neophodne za interakciju sa anti-PCSK9 AVPa. Da se to postigne, može se upotrebiti drugi set SPOT matrica za skaniranje alanina. Panel varijantnih peptida sa supstitucijama alanina u svakom od 12 ostataka može sc skanirati kao i gore. To će omogućiti da epitopi za AVPe za humani PCSK.9 budu mapirani i identifikovani.

[0547] U alternativnom načinu, pod uslovom da je moguće da je epitop konformacioni, mogu se upotrebiti kombinacija skaniranja alanina i/ili skaniranja arginina. kokristalizacijc antitela FAB/PCSK9. i ograničene proleolize/LC-MS (tečna hromalografija masenog spek.) da se identifikuju epitopi.

[0548] PRIMER 19

[0549] Upotreba PCSK9 antitela za tretman poremećaja vezanih sa holesterolom Humani pacijent koji pokazuje poremećaj vezan za holesterol (u kojem redukcija u holesterolu (kao što je serum holesterol) može biti korisna) je primio terapeutski efektivnu količinu PCSK9 antitela, 31H4 (ili. na primer. 21B12 ili 16F12). U određenim periodima vremena tokom tretmana, pacijent je posmatran da sc odredi da li su simptomi poremećaja opali. Nakon tretmana, nađeno je da pacijent koji je prolazio kroz tretman sa PCSK9 antitelom ima redukovane nivoe serum holesterola. u poređenju sa pacijentima koji nisu tretirani.

[0550] PRIMER 20

[0551] Upotreba PCSK9 antitela za tretman hiperholesterolemije

[0552] Humani pacijent koji pokazuje simptome hiperholesterolemije je tretiran sa terapeutski efektivnom količinom PCSK9 antitela. kao sto je 31H4 (ili. na primer, 21B12 ili 16F12). U određenim periodima vremena tokom tretmana, pacijent je posmatran da se odredi da li je opao nivo serum holesterola. Nakon tretmana, nađeno je da pacijent koji je primio tretman sa PCSK9 antitelima ima redukovane nivoe serum holesterola u poređenju sa pacijentima sa artritisom koji nisu primili tretman.

[0553] PRIMER 21

[0554] UpotrebePCSK9 antitela za prevenciju koronarnih srčanih bolesti i/ili povratnih kardiovaskularnih događaja

[0555] Identifikovan jc humani pacijent koji je pod rizikom da razvije koronarnu srčanu bolest. Pacijentu je davana terapeutski efektivna količina PCSK.9 antitela. kao Što su 31H4 (ili, na primer, 21B12 ili 16F12). bilo sami, konkurentno ili uzastopno sa statinom, npr., simvastatinom. U određenim periodima vremena tokom tretmana, humani pacijent je praćen da se odredi da li su se pacijentovi ukupni nivoi serum holesterola promenili. Tokom preventivnog tretmana, nađeno je da pacijent koji je primio tretman sa PCSK9 antitelima ima redukovan serum holesterol smanjujući tako njegov rizik od koronarne srčane bolesti ili povratka kardiovaskularnih događaja u poređenju sa pacijentima koji nisu primili tretman.

[0556] PRIMER 22

[0557] Upotreba PCSK9 antitela kao dijagnostičkog agensa

[0558] Enzim-vezani imunosorbent ogled (ELISA) za detekciju PCSK9 antigena u uzorku može se upotrebiti da se dijagnostifikuju pacijenti koji pokazuju visoke nivoe produkcije PCSK9. U tom ogledu, bunarčići mikrotitar ploče, kao šio je mikrotitar ploča sa 96-bunarčića ili mikrotitar ploča sa 384-bunarčića. su apsorbovani nekoliko časova sa prvim potpuno humanim monoklonalnim antitelom usmernim protiv PCSK9. Imobilizirano antitelo služi kao antitelo za zarobljavanje za bilo koji PCSK9 koji može biti prisutan u test uzorku. Bunarčići su isprani i tretirani sa agensom za blokiranje kao što je protein mleka ili albumin da se spreči nespecifična apsorpcija na sastojak.

[0559] Nakon toga bunarčići su tretirani sa test uzorkom suspektnim da sadrži PCSK9. ili sa rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak može biti. na primer. uzorak seruma od pacijenta koji je pod sumnjom da ima nivoe antigena u cirkulaciji koji se smatraju dijagnostičkim za patologiju.

[0560] Nakon ispiranja test uzorka ili standarda, bunarčići su tretirani sa drugim potpuno humanim monoklonalnim PCSK9 antitelom koje je obeleženo konjugovanjem sa biotinom. Takođe se može upotrebiti monoklonalno ili inisje ili poreklom od druge vrste. Obeleženo PCSK9 antitelo služi kao antitelo za detekciju. Nakon ispiranja viška sekundarnog antitela. bunarčići su tretirani sa avidin-konjugovanom peroksidazom rena (HRP) i pogodnim hromogenim substralom. Koncentracija antigena u test uzorcima je određena putem poredenja sa standardnom krivom razvijenom iz standardnih uzoraka.

[0561] Ovaj ELISA ogled obezbeđuje visoku specifičnost i vrlo osetljiv ogled za detekciju PCSK9 antigena u test uzorku.

[0562] Određivanje koncentracije PCSK9 proteina kod subjekata

[0563] Sendvič ELISA može kvantifikovati nivoe PCSK9 u humanom serumu. Dva potpuno humana monoklonalna PCSK9 antitela iz sendvič ELISA, prepoznaju različite epitope na PCSK9 molekulu. Alternativno mogu da se upotrebe monoklonalna antitela miša ili ona poreklom od druge vrste. ELISA je izvedena na sledeći način: 50 uL PCSK.9 antitela za hvatanje u puferu za obavijanje (0.1 M NaHCCb, pH 9.6) u koncentraciji od 2 ug/mL je obavijeno na ELISA ploče (Fisher). Nakon inkubacije na 4° C preko noći. ploče su tretirane sa 200 uL pufera za blokiranje (0.5% BSA, 0.1% Tween 20. 0.01% Timerosal u PBS) tokom i časa na 25° C. Ploče su isprane (3x) koristeći 0, 05% Twecn 20 u PBS puferu za ispiranje. WB). Normalni ili serumi pacijenta (Clinomics. Bioreclaimation) su razblaženi u puferu za blokiranje koji je sadržao 50% humanog seruma. Ploče su inkubirane sa uzorcima seruma preko noći na 4° C. isprane sa WB. i zatim inkubirane sa 100 uL/bunarčić od biotiniliranog detekcionog PCSK.9 antitela tokom 1 časa na 25° C. Nakon ispiranja, ploče su inkubirane sa HRP-S<l>reptavidinom tokom 15 minuta, isprane kao i prethodno, i zatim tretirane sa 100 uL/bunarčić od o-fenileneđiamina u H<2>O: (Sigma rastvor za razvijanje) za generisanje boje. Reakcija je zaustavljena sa 50 uL/bunarčić od 11 >S( )•. (2M) i analizirana koristeći ELISA čitač ploča na 492 nm. Koncentracija PCSK9 antigena u uzorcima seruma je izračunata putem poredenja razblaženja prečišćenog PCSK9 antigena koristeći program fitovanja četvoro parametarske krive.

[0564] Određivanje koncentracije PCSK9 varij ante proteina kod subjekata

[0565] Koraci istaknuti gore mogu se izv esti koristeći antitela koja su zabeležena ovde i koja se vezuju i za divlji tip PCSK9 i varijantu PCSK9 (D374Y). Dalje se mogu upotrebiti antitela koja se vezuju za divlji tip ali ne i za mutant (ponovo koristeći slični protokol kao što je istaknut gore) da se odredi da li je PCSK9 prisutan kod subjekta divlji tip ili je D374Y varianta. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati koji su pozitivni za obe ture biće divlji tip, dok će oni koji su pozitivni za prvu turu, ali ne i za drugu turu antitela, uključuju D374Y mutaciju. Postoje visoke frekvenec mutacija u populaciji koje su poznate i mogu imati koristi posebno od agensa kao što su AVPi obelodanjeni ovde.

[0566] PRIMER 23

[0567] Upotreba PCSK9 antigen vezujućeg proteina za prevenciju hiperholesterolemije Humani pacijent koji je pod rizikom da razvije hiperholesterolemiju je identifikovan preko analize porodične istorijc i/ili stila života, i/ili trenutnih nivoa holesterola. Subjektu je regularno davana (npr.. jednom nedeljno) terapcutski efektivna količina PCSK9 antitela. 31H4 (ili, na primer. 21B12 ili 16F12). U određenim vremenskim periodima tokom tretmana, pacijent je praćen da se odredi da li su sc nivoi serum holesterola smanjili. Nakon tretmana, nađeno je da subjekti koji su prošli kroz preventivni tretman sa PCSK9 antitelima imaju snižene nivoe serum holesterola, u poređenju sa subjektima koji nisu tretirani.

[0568] PRIMER 24

[0569] PCSK9 AVPi dalje regulišu LDLR u prisustvu statina

[0570] Ovaj primer pokazuje da AVPi za PCSK9 produkuju dalje povećanje dostupnosti LDLR kada se upotrebe u prisustvu statina, pokazujući da se dalje koristi mogu postići kombinovanom upotrebom ova dva.

[0571] HepG2 ćelije su zasejane u DMEM sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i odgajene do

[0572] - 90% konfluence. Ćelije su tretirane sa naznačenim količinama mevinolina (statin, Sigma) i PCSK.9 AVPa (FIG.. 12A-I2C) u DMEM sa 3% FBS tokom 48 časova. Pripremljeni su ukupni ćelijski lizati. 50 mg ukupnih proteina je razdvojeno sa gel elektroforezom i preneto na PVDF membranu. Imunoblotovi su obavljeni koristeći zec anti-humani LDL receptor antitelo (Fitzgerald) ili zec anti-humana b-aktin antitela. Pojačani hemiluminescentni rezultati su prikazani na gornjim panelima FIG. 12A-12C. Intenziteti traka su kvantifikovani sa ImageJ sovtverom i normalizovani sa b-aktinom. Relativni nivoi LDLR su prikazani na panelima

[0573] FIGURA 12A-12C. AVPi 21B12 i 31H4 su PCSK9 neutralizujuća antitela. dok 25A7.1 nije neulralizujuće antitelo.

[0574] Takode su kreairane HepG2-PCSK9 ćelije. One su bile stabilna FlepG2 ćelijska linija transfeklovana sa humanim PCSK9. Ćelije su zasejane u DMEM sa 10% goveđim fetalnim serumom (FBS) i rasle do -90%. konfluence. Ćelije su tretirane sa naznačenim količinama mevinolina (Sigma) i PCSK9 AVPi (FIG.. 12D-12F) u DMEM sa 3%> FBS tokom 48 časova. Pripremljeni su ukupni ćelijski lizati. 50 mg ukupnih proteina je razdvojeno sa gel elektroforezom i preneto u PVDF membranu. Imunoblotovi su obavljeni koristeći zec anti-humani LDL receptor antitelo (Fitzgerald) ili zec anti-humani b-aktin antitelo. Pojačani hemiluminescentni rezultati su prikazani na gornjim panelima. Intenziteti traka su kvantifikovani sa ImageJ softverom i normalizovani sa b-aktinom.

[0575] Kao što se može videti u rezultatima prikazanim na FIG. 12A-12F, povećane količine normalizujućeg antitela i povećane količine statina generalno rezultiraju povećanjem nivoa LDLR. Ovo povećanje u efektivnosti za povećane nivoe AVP je posebno evidentno u FIG. 12D-12F, u kojima su ćelije takođe bile transfektovane sa PCSK9, omogućujući AVPima da demonstriraju efektivnost u većem obimu.

[0576] Interesntno je da se. kao što je pokazano u rezultatima u poređenju FIG. 12D-12F prema 12A-12C. uticaj koncentracija AVP na nivoe LDLR povećao dramatično kada je PCSK9 bio produkovan od strane ćelija. Sem toga. jasno je da neutralizovanje AVPa (21 BI2 i 31H4) rezultira većim povećanjem nivoa LDLR, čak i u prisustvu statina. nego za 25A7.1 AVP (ne-neutralizator), pokazujući da se mogu postići dodatne koristi od uporebe i statina i AVPa za PCSK.9.

[0577] PRIMER 25

[0578] Konsenzussekvence

[0579] Konsenzus sekvence su određene koristeći standardnu filogenetsku analizu CDRova koji odgovaraju VH i VL od anti-PCSK9 AVPa. Konsenzus sekvence su određene održavajući CDRove pripojene u okviru iste sekvence koja odgovara VH ili VL. Ukratko, sekvence amino kiseline koje odgovaraju celim varijabilnim domenima ili od VH ili od VL su pretvorene u PASTA formatirajući radi jednostavnosti u procesovanju komparativnih poklapanja i predviđanja filogenczc. Dalje su regioni skeleta ovih sekvenci zamenjeni sa veštačkom veznom sekvencom ("bbbbbbbbbb" čuvara mesta. ne-specifični konstrukt nukleinske kiseline) tako da samo ispitivanje CDRova može da se obavi bez uvođenja pozicije bilo koje amino kiseline otežavajući neravnotežu zbog koinciđentnih događaja (npr.. kao što su ne srodna antitela koja slučajno dele uobičajeni nasledni skelet germinativne linije) održavajući još uvek CDRove zajedno u okviru iste sekvence koja odgovara VH ili VL. VII ili VL sekvence ovog formata bile su zatim podvrgnute poklapanju radi utvrđivanja sličnosti koristeći program koji koristi standardni ClutalW-like algoritam (vidi. Thompson i sar.. 1994.Nac/ eic Acids Res.22:4673-4680). Kazna stvaranja gapa od 8.0 je upotrebljena zajedno sa kaznom za proširivanje gapa od 2.0. Ovaj program takode generiše filogramc (ilustracije tilogenetskog stabla zasnovane na poklapanjima sličnosti sekvenci koristeći ili UPGMA (neuravnotežene grupe sparivanja, koristeći aritmetičke srednje vrednosti) ili Neighbor-Joining metode (vidi. Saitou i Nei. 1987,Molecular Biolog}'and Evolulion4:406-425) da se konstruiše i ilustruje sličnost i udaljenost grupe sekvenci preko poredenja dužine grana i grupisanja. Oba metoda su produkovala slične rezultate ali UPGMA-izvedena stabla su definitivno upotrebljena kao metođ koji koristi jednostavnije i mnogo konzervativnije pretpostavke. UPGMA-izvedena stabla su generisana tamo gde je za slične grupe sekvenci definisano da imaju manje od 15 supstitucija na 100 ostataka (vidi. legendu na ilustraciji drveta radi skaliranja) medu pojedinačnim sekvencama u okviru grupe i upotrebljene su da se definiše kolekcija konsenzus sekvenci. Rezultati poredenja su prikazani na FIGRAMA 13A-13J. U FIG. 13H. grupe su bile odabrane tako da su sekvence u lakom lancu te klade takode klade u teškom lancu i imaju manje od 15 supstitucija.

[0580] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati predstavljeni na FIG. 13A-13J predstavljaju veliku količinu pokazatelja o tome koje su odrede amino kiselina važne (na primer. onih amino kiselina koje su konzervirane) i za koje pozicije amino kiseline je verovatno da će biti izmenjene (na primer. one pozicije koje imaju različite amino kiseline za različite AVPe).

[0581] PRIMER 26

[0582] Mišji model za PCSK9 i AVP sposobnost snižavanja LDLin vivo

[0583] Za generisanje miša koji prekomerno eksprimira humani PCSK9. tri nedelje stari WT C57B1/6 miševi su injektirani u repnu venu davanjem različitih koncentracija adeno vezanog virusa (AAV), rckombinantno modifkovani da eksprimira humani PCSK.9. da odredi korektni titar koji će obezbediti povećanje LDL-holesterola koje se može meriti kod miševa. Koristeći ovaj određeni virus koji eksprimira humani PCSK9. određeno je da će 4.5 x 10E12 pfu od virusa rezultirati sa nivoom LDL-holesterola od približno 4()mg/dL u cirkulišućoj krvi (normalni nivoi LDL kod WT miševa su približno 10 mg/dL). Nađeno je đa su nivoi humanog PCSK9 kod tih životinja približno 13ug/mL. Generisana je kolonija miševa koristeći ove injekcione kriterijume.

[0584] Jednu nedelju nakon injekcije, miševi su procenjeni na nivoe LDL-holesterola, i po principu slučajnosti podcijeni u različite grupe za tretman. Životinje su zatim tretirane, putem injekcije u repnu venu. pojedinačne bolus injekcije iii od lOmg/kg ili 30mg/kg od 16F12. 21B12, ili 31H4 antigen vezujućih proteina. IgG2 AVP je davan u odvojenim grupama životinja kao doznih kontrola. Podgrupe životinja (n=6-7) su zatim eutanizovane 24 i 48 časova nakon AVP davanja. Nije bilo efekta na nivoe LDL-holesterola nakon IgG2 davanja u bilo kojoj dozi. I 31 H4 i 21B12 su pokazali značajno snižavanje LDL-holesterola do i uključujući 48 časova naknadnog davanja, u poređenju sa lgG2 kontrolom (prikazano na FIG. 14A i 14B u dve različite doze). 16F12 pokazuje intermedijerne odgovore snižavanja LDL-holesterola. sa nivoima koji se vraćaju na polaznu liniju približno od 40mg/dL u 48 časovnim vremenskim tačkama. Ovi podaci su konzistentni sa podacimain vitrovezivanja (Biacore i Kinexa), koji pokazuju ekvivalentne afinitete vezivanja koji su blizu između 31H4 i 21B12. a i manji afinitet ođl6F12 za humani PCSK9.

[0585] Kao što se može videti u rezultatima, ukupni holesterol i HDL-holesterol su redukovani sa PCSK9 AVPima u modelu (i ukupno HDL-C su podignuti gore kod VvT miševa zahvaljujući prekomernoj ekspresiji PCSK9). Dok izgleda da se snižavanje holesterola u ovom modelu dešava tokom realtivno kratkog perioda vremena, veruje se da jc to zbog nivoa humanog PCSK9 koji je prisutan, što je suprafiziološki visoko u ovom modelu. Sem toga. pošto je ekspresija vodena sa AAV. ne postoji regulacija ekspresije PCSK9. U ovim figuarama. {<*>) označava P<0.05, i (<**>) označava P<0.005 u poređenju sa nivoima LDL-holesterola zapaženim u IgG2 kontroli injektovanih životinja u istoj tački vremena. Nivo od 13 mikrograma/ml u serumu humanog PCSK9 kod miševa odgovara približno 520-pula povećanju iznad endogenih nivoa kod mišjeg PCSK9 (<~>25 ng/ml), i približno 75-puta povećanje iznad prosečnog humanog nivoa u serumu (<~>175 ng/ml). Prema tome, antigen vezujući proteini bi trebalo da su čak još više efikasni kod ljudi.

[0586] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, gornji rezultati pokazuju da prikladnost mišjeg modela za testiranje antigen vezujućih proteina na sposobnost da izmene serum holesterol kod subjekta. Stručnjak će takođe prepoznati da je upotreba mišjeg HDL da se prate nivoi serum holesterola kod miša, i ako korisna za praćenje nivoa serum holesterola kod miša. nije indikativna za uticaj AVPa na humani HDL kod ljudi. Na primer, Cohen i sar. {..Variranje sekvence u PCSK9, niski LDL. i zaštita protiv koronarne bolesti srca". N Engl J Med. 354:1264-1272. 2006) su pokakazali da nedostatak bilo kakvog efekta od nivoa PCSK9 na gubitak funkcije mutacija na humanom HDL (od čega je većina inkorporirana sa referencom). Prema tome, stručnjak će prihvatiti da sposobnost AVP da snižava mišji HDL (kojem nedostaje LDL) nije indikativna za sposobost AVPa da snižavaju humani HDL. 1 ustvari, kao što je prikazano od strane Cohen-a. to nije verovatno da se dogodi za neutralizujuća antitela kod ljudi.

[0587] PRIMER 27

[0588] 31H4 i 21 BI2 se vezuju za ProCat region PCSK9

[0589] Ovaj primer opisuje jedan metod za određivanje gde se različita antitela vezuju za PCSK9.

[0590] ProCat (31-449 od SLQ ID NO: 3) ili V domen (450-692 od SEO ID NO: 3) od PCSK9 proteina je kombinovan bilo sa antitelom 31114 ili sa 21B12. Uzorci su analizirani sa nativnim PAGL radi formiranja kompleksa. Kao što se može videti na FIG. 16A i FIG. 16B. gel pomaci su bili prisutni za ProCat / 31114 i ProCat / 21B12 uzorke, pokazujući da se antitela vezuju za ProCat domen.

[0591] PRIMER 28

[0592] LDLR EGFa domen se vezu je za katalitički domen PCSK9

[0593] Ovaj primer predstavlja rešenu kristalnu strukturu PCSK9 ProCat (31-454 od SEQ ID NO: 3) vezanu za LDLR EGFa domen (293-334) na 2.9 A rezolucije (za koju su uslovi opisani dole u Primerima).

[0594] Prikaz strukture PCSK9 vezanog za EGFa je dat na FIG. 17. kristalna struktura (i njen opis na FIG. 17) otkrivaju da se EGFa domen od LDLR vezuje za katalitički domen od PCSK9. Sem toga. izgleda da se interakcija PCSK9 i EGFa dešava preko površine PCSK9 koja je između ostataka D374 i SI53 u strukturi prikazanoj na FIG. 17.

[0595] Specifični ostaci amino kiselina jezgra PCSK9 interakcione površine vezuju se sa LDLR EGFa domenom deilnisani kao PCSK9 ostaci koji su unutar 5 A od EGFa domena. Ostaci jezgra su sledeći: SI53, 1154, P155, R194, D238. A239, 1369, S372. D374, C375, T377. C378, F379, V380,i S381.

[0596] Granični PCSK9 ostaci amino kiseline od intcrakcione veze sa LDLR EGFa domenom su definisani kao PCSK9 ostaci koji su 5-8 A od EGFa domena: Granični ostaci su sledeći: W156, NI57, LI58, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, 1368, G370, A37L S373. S376, i Q382. Ostaci koji su podvučeni su gotovo ili kompletno pokriveni u okviru PCSK9.

[0597] Kao što će biti prihvaćeno od sirane stručnjaka, rezultati iz ovog primera pokazuju gde ineterreaguju PCSK9 i EGFa. Prema tome, antitela koja ineterreaguju sa, ili blokiraju bilo koji od tih ostataka, mogu biti korisna antitela koja inhibiraju interakciju između PCSK9 i EGFa domena od LDLR (i/ili LDLR generalno). U nekim ostvarenjima, antitela koja. kada se vežu za PCSK9, ineterreaguju sa ili blokiraju bilo koji od gornjih ostataka su u okviru 15-8. 8. 8-5, ili 5 angstrema od gornjih ostataka i predviđena su da obezbede korisnu inhibiciju vezivanja PCSK9 za LDLR.

[0598] PRIMER 29

[0599] 31H4 interreagujesaostacima amino kiseline iodpro- i od katalitičkih domena PCSK9

[0600] Ovaj primer predstavlja kristalnu strukturu pune dužine PCSK9 (N533A mutant iz SEO ID NO: 3) vezanu za Fab fragment od 31H4. određenu do rezolucije 2.3 A (za koju su uslovi opisani u Primerima dole). Ova struktura, prikazana u FIG. 18A i 18B. pokazuje da se 31H4 vezuje za PCSK9 u regionu katalitičkog mesta i pravi kontakt sa ostacima amino kiseline i iz prodomena i katalitičkog domena.

[0601] Prikazana struktura takođe omogućuje nekom da identilikuje specifične ostatke amino kiseline jezgra PCSK9 za interakcionu među vezu od 31 114 sa PCSK9. To je definisano kao ostaci koji su u okviru 5 A od 31H4 proteina. Ostaci jezgra su sledeći: W72, F150, A151, Q152, T2I4. R215. F216. H217. A220, S22L K222. S225. H226. C255. 0256. G257. K258. N317. F318, T347, L348, G349, T350, L351. E366. D367. D374. V380, S381, 0382, S383, i G384.

[0602] Strukture su takođe upotrebljene za identifikaciju graničnih ostataka amino kiseline PCSK9 za interakciju sa vezom sa 31H4. Ti ostaci bili su PCSK9 ostaci koji su bili 5-8 A od 31H4 proteina. Granični ostaci su sledeći: K69. D70. P71. SMS. V149. D186, T187, E211, D212, G213, R218, 0219. C223. D224, G227. H229. L253, N254, G259. P288. A290, G29L G316, R319, Y325. V346. G352. T353. G365. 1368. 1369. S372. S373. C378. F379. 1'385. S386, i Q387. Ostaci amino kiseline koji su kompletno pokriveni u PCSK9 proteinu su podvučni.

[0603] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka. FIG. 18B prikazuje interakciju između CDRova na antigen vezujućem proteinu i PCSK9. Kao takav, model omogućuje stručnjaku da identifikuje ostatke i/ili CDRove koji su posebno važni u paratopu. i koji su ostaci manje kritični za paratop. Kao što se može vidcti na FIG. 18B, teški lanci CDRI. CDR2, i CDR3 su najdirektnije uključeni u vezivanje antigen vezujućih proteina za epitop. sa CDRovima iz lakog lanca koji su relativno daleko od epitopa. Zbog toga. vrlo je verovatno da su moguće veće varijacije u lakim lancima CDRova bez prekomemog ometanja vezivanja antigen vezujućih proteina za PCSK9. U nekim ostvarenjima, ostaci u strukturama koji direktno iterreaguju su konzervirani (ili alternativno konzervativno zamenjeni) dok ostaci koji ne iterreaguju direktno jedan sa drugim mogu biti zamenjeni u većem obimu. Tako, stručnjak, na osnovu datih tehnika, može predvideti koji ostaci i područja antigen vezujućih proteina mogu da se variraju bez prekomemog ometanja sposobnosti antigen vezujućih proteina da se vezuju za PCSK9. Na primer. oni ostaci koji su locirani bliže PCSK9 kada je antigen vezujući protein vezan za PCSK9 su oni koji verovatno igraju mnogo važniju ulogu u vezivanju antigen vezujućeg proteina za PCSK9. Kao i gore. ti ostaci se mogu podeliti na one koji su u okviru 5 angstrema od PCSK9 i one koji su između 5 i 8 angstrema. Specifični ostaci amino kiseline jezgra 31H4 interakcione veze sa PCSK9 su definisani kao 31114 ostaci koji su u okviru 5 A od PCSK9 proteina. Za teški lanac, ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: T28. S30. S31. Y32. S54. S55, S56. Y57. 158. S59. Y60. N74. A75. R98. Y 100. F102. W103. SI04. A105. Y106. Y107. Dl08. A109. i Dl 11. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: L48. S51. Y93. i S98. Za teški lanac, oni ostaci koji su u okviru 5-8 A od PCSK9 proteina uključuju sledeće: G26. F27. F29. W47. S50. 151. S52. S53. K65, F68. 1 69. 170. S71. R72. D73, K76, N77. D99. Dl01. F110. i VI12. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5-8 angstrema od PCSK9 uključuju A31. G32. Y33, D34, H36. Y38. 150. G52. N55. R56. P57. S58. D94. S95, S96, L97, G99 i SI00.

[0604] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati iz Primera 29 pokazuju gde antitela za PCSK9 mogu intcrreagovati na PCSK9 i da pri tome još uvek blokiraju PCSK9 od interreagovanja sa HGVa (i prema tome LDLRj.Prema tome. antigen vezujući proteini koji interreaguju sa bilo kojim od tih ostataka PCSK9, ili koji blokiraju bilo koji od tih ostataka (npr., od drugih antigen vezujućih proteina koji se vezuju za te ostatke), mogu biti korisni kao antitela koja inhibiraju interakciju PCSK9 i EGFa (i prema tome LDLR). Prema tome, u nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini koji interreaguju sa bilo kojim od gonjih ostataka ili interreaguju sa ostatcima koji su u okviru 5 A od gornjih ostataka su predviđeni da obezbede korisnu inhibiciju PCSK9 vezivanja za LDLR. Slično tome, antigen vezujući proteini koji blokiraju bilo koji od gornjih ostataka (koji se mogu odrediti, na primer, preko ogleda kompeticije) takođe mogu biti korisni za inhibiciju PCSK9/LDLR interakcije.

[0605] PRIMER 30

[0606] 21B12 vezuje se za katalitički domen PCSK9, ima udaljeno mesto vezivanja od 31H4 i

[0607] može se vezati za PCSK9 istovremeno sa 31H4

[0608] Ovaj primer predstavlja kristalnu strukturu PCSK9 ProCat (31 -449 od SEO ID NO: 3) vezanu za Fab fragmente od 31H4 i 21 BI2, određene na rezoluciji od 2.8 A (za koju su uslovi opisani u Primerima dole). Kristalna struktura, opisana u FIG. 19A i FIG. 19B, pokazuje da 31H4 i 21B12 imaju udaljena mesta vezivanja na PCSK9 i da se oba antigen vezujuća proteina mogu vezati za PCSK9 istovremeno. Struktura pokazuje da 21B12 interreaguje sa ostacima amino kiseline od katalitičkog domena PCSK9. U toj strukturi, interakcija između PCSK9 i 31H4 je slična onoj koja je zapažena gore.

[0609] Specifični ostaci amino kiseline jezgra PCSK9 interakcione veze sa 21 BI 2 su definišani kao PCSK9 ostaci koji su u okviru 5 A od 21B12 proteina. Ostaci jezgra su sledeći: S153. S188. 1189, Q190, SI91. Dl92. R194, E197. G198. R199. V200, D224. R237. D238. K243. S373. D374. S376. T377. i F379.

[0610] Granični ostaci amino kiseline PCSK9 interakcione veze sa 21B12 su đefinisani kao PCSK9 ostaci koji su bili 5-8 A od 21B12 proteina. Granični ostaci su sledeći: 1154. TI 87. III93. E195. 1196. M201. V202. C223. T228. S235. G236. A239. G244. M247. 1369. S372. C375. i C378. Ostaci amino kiseline koji su gotovo ili kompletno pokriveni u okviru PCSK9 proteina su podvučeni.

[0611] Kao što će bi<l>i prihvaćeno od strane stručnjaka. FIG. 19B prikazuje interakciju između CDRova na antigen vezujućem proteinu i PCSK9. Kao takav, model omogućuje stručnjaku da iđentifikujc ostatke i/ili CDRove koji su posebno važni za paratope i koji su ostaci manje kritični za paratop. Kao što se može videti u strukturi, pokazuje se da teški lanac CDR2 i laki lanac CDRI blisko intereaguju sa epilopom. Dalje, se pokazuje da teški lanac CDRI. teški lanac CDR3 i laki lanac CDR3. blisko intereaguju sa epitopom. ali ne i blisko sa prvim setom CDRova. Konačno se pokazuje da je laki lanac CDR2 na nekoj distanci od epitopa. Prema tome je vrovatno da je veća varijacija CDRova moguća bez prekomemog ometanja vezivanja sa antigen vezujućim proteinom za PCSK9. U nekim ostvarenjima, ostaci u strukturama koji direktno interreaguju su konzervisani (ili alternativno konzervativno zamenjeni) dok ostaci koji ne intereaguju direktno jedan sa drugim mogu biti menjani u većem obimu. Prema lome, stručnjak, na osnovu prisutnih tehnika, može predvideti koji ostaci i podrčja antigen vezujućih proteina mogu da se variraju bez prekomemog ometanja sposobnosti antigen vezujućih proteina da se vezuju za PCSK9. Na primer, oni ostaci koji su bliže PCSK9 kada se antigen vezujući protein vezuje za PCSK9 su oni koji verovatno igraju mnogo važniju ulogu u vezivanju antigen vezujućeg proteina za PCSK9. Kao i gore, ti ostaci sc mogu podeliti na one koji su u okviru 5 angstrema od PCSK9 i one koji su između 5 i 8 angstrema. Specifični ostaci amino kiseline jezgra 21 BI2 interakcione veze sa PCSK.9 su definisani kao 21B12 ostaci koji su u okviru 5 A od PCSK9 proteina. Za teški lanac, ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: 130. S31, Y32, G33. W50. S52, F53, Y54, N55. N57. N59, R98, G99. Y100, i G101. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: G30, G31, Y32. N33. S34, F.52, Y93, T94, S95, T96. i S97. Za teški lanac, ostaci koji su u okviru 5-8 A od PCSK9 proteina uključuju sledeće: T28. L29, 134, S35, W47, V51. G56. T58. Y60, T72, Ml02, i Dl03. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5-8 angstrema od PCSK9 uključuju sledeće: S26. V29, V35, Y51, N55. S92, M98. i V99.

[0612] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati iz Primera 30 pokazuju gde antigen vezujući proteini za PCSK9 mogu interreagovati na PCSK9 i još uvek blokirali PCSK9 od interreagovanja sa EGFa (i na taj način sa LDLR). Prema tome. antigen vezujući proteini koji intereaguju sa bilo kojim od ostataka PCSK9 ili koji blokiraju bilo koji od tih ostataka mogu biti korisni za antitela koja inhibiraju interakcije PCSK9 i EGFa (i na taj način LDLR). Prema tome. u nekim ostvarenjima, antitela koja interreaguju sa bilo kojim od gornjih ostataka ili iterreaguju sa ostacima koji su u okviru 5 A od gornjih ostataka su predviđeni đa obezbede korisnu inhibiciju vezivanja PCSK9 za LDLR. Slično tome. antigen vezujući proteini koji blokiraju bilo koji od gornjih ostataka (koji se mogu odrediti, na primer. preko ogleda inhibicije) mogu bi<l>i korisni za inhibiciju interakcije PCSK9/LDLR.

[0613] PRIMER 31

[0614] Interakcija između EGFa, PCSK9iantitela

[0615] Struktura ternarnog kompleksa (PCSK9 / 31 114 / 21B12) iz gornjeg primera je položena na PCSK9 / EGFa strukturu (određenu kao što je opisano u Primeru 28) i rezultirala je kombinacijom prikazanom na FIG. 20A. Ta figura pokazuje područja na PCSK9 koja se mogu uspešno naciljati da inhibiraju interakciju PCSK9 sa EGFa. Figura pokazuje da se i 31H4 i 21B12 delimično poklapaju sa pozicijom od EGFa domena od LDLR i sterično interferiraju sa njegovim vezivanjem za PCSK9. Sem toga. kao što sc može videti u strukturama, 21 BI2 direktno intereaguje sa podsetom ostataka amino kiseline koji su specifično uključeni u vezivanje za LDLR EGFa domen.

[0616] Kao što je pomenuto gore, analiza kristalnih struktura identifikovala je specifične amino kiseline uključene u interakciju između PCSK9 i partner proteina (<.>jezgro i granični regioni veze na PCSK9 površini) i prostornih zahteva tih partner proteina da interreaguju sa PCSK9. Strukture sugerišu načine da se inhibira interakcija između PCSK9 i LDLR. Prvo, kao što je primećeno gore. vezivanje agensa za PCSK9 gde deli ostatke zajedničke sa mestom vezivanja za EGFa domen od LDLR, inhibiraće interakciju između PCSK9 i LDLR. Drugo, agens koji se vezuje uobičajeno spolja od ostataka može sterično interferirati sa EGFa domenom ili regionima od LDLR koji su ili N- ili C-terminal prema EGFa domenu da sc spriči interakcija između PCSK9 i LDLR.

[0617] U nekim ostvarenjima, ostaci koji su uključeni i u EGFa vezivanje i koji su blizu područja gde sc gore pomenuti antigen vezujući proteini vezuju su posebno korisni za manipulisanje sa PCSK.9 vezivanjem za LDLR. Na primer, ostaci amino kiseline između veza obično i u regionu jezgra i graničnom regionu za različite partnere vezivanja su nabrojani u Tabeli 12 dole. Ostaci amino kiseline kompletno pokriveni sa PCSK9 proteinom su podvučeni.

[0618] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, u nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za i/ili blokiraju najmanje jedan od gore pomenutih ostataka.

[0619] PRIMER 32

[0620] StrukturneinterakcijeLDLRi PCSK9

[0621] Model pune dužine PCSK9 vezivanja za punu dužinu predstavljenog LDLR jc napravljen koristeći PCSK9 ProCat (31-454 od SEO ID NO: 3)/EGFa kompleksne strukture. Struktura pune dužine PCSK9<1>(Piper. D.E. i sar. Kristalna struktura PCSK9: regulator plazma LDL-holesterola.Structure15, 545-52 (2007)) je položena na PCSK9 ProCat 31-454 od kompleksa i strukture LDLR u njegovoj niskoj pH konformaciji (Rudenko. G. i sar. Struktura LDL receptora izvanćelijskog domena pri endozomalnompH. Science298. 2353-8 (2002)) je položena na EGFa domen iz kompleksa. Prikazi modela dati su na FIG. 20B i 20C. EGFa domen je naznačen sa okruženjem na slici. FIG. pokazuju regione LDLR izvan neposrednog domena vezivanja EGFa koji leži u neposrednoj blizini PCSK9. FIG. 20D-20F prikazuju gornju interakciju, zajedno sa prezentacijom mreže površine antitela 31 114 i 21 BI2 iz tri različita ugla. Kao što je jasno iz opisa, ne samo da antitela mogu da interreaguju i/ili interferiraju sa interakcijom LDLR sa PCSK9 na aktuelnom mestu vezivanja, nego izgleda da i druge sterične interakcije mogu da se takođe pojave.

[0622] U svetlu gornjih rezultata, jasno je da antigen vezujući proteini koji sc vezuju za PCSK9 mogu takođe inhibirati interakciju između PCSK9 i LDLR sukobljavanjem sa različitim regionima LDLR (ne samo na mestu na kojem interreaguju LDLR i PCSK.9). Na primer, može se sukobiti sa ponovkom 7 (R7), EGFb domen, i/ili (p-propclcr domen.

[0623] Ostvarenja antigen vezujućih molekula koji se vezuju za ili blokiraju interakciju EGFa sa PCSK9

[0624] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, Primeri 28-32, i njihove prateće FIG.. obezbeduju detaljan opis kako i gde EGFa iterreaguje sa PCSK9 i kako dva predstavnika neutralizujućih antigen vezujućih proteina. 21 BI2 i 31H4 interreaguju sa PCSK9 i produkuju njihov neutralizujući efekat. Tako će. stručnjak biti u stanju da identifikuje antigen vezujuće molekule koji mogu slično da redukuju vezivanje između EGFa (uključujući LDLR) i PCSK9 pomoću identifikovanja drugih antigen vezujućih molekula koji se vezuju na ili blizu najmanje jedne od istih lokacija na PCSK9. I dok su odgovarajuće lokcije (ili epitopi) na PCSK9 identifikovani na FIG. i ovom opisu, takođe može biti korisno da sc opišu ta mesta kao da su u okviru seta distanci od ostataka koji su bili identifikovani toliko blizu EGFa mesta vezivanja. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul će se vezali za ili u okviru 30 angstrema od jednog ili više od sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEO II) NO: 3): SI53. 1154. P155. R194, D238, A239. 1369. S372. D374. C375. T377. C378. F379. V380. S381, W156. NI57, LI58, E159. 11193. E195, H229, R237. G240. K243. D367, 1368. G370. A371. S373. S376. 0382, W72, F150, A15L Q152, T214, R215, F216, H217, A220. S221. K222, S225. H226, C255, 0256. G257. K258. N317, F318, T347, L348. G349, T350, L351, F366. D367. D374, V380, S38L 0382, S383, G384, K69. D70. P71. S148. V149. D186. T187. E211. D212. G213, R218, 0219. C223, D224, G227, H229, L253. N254. G259, P288. A290. G291, G316, R319. Y325, V346. G352. T353. G365, 1368, 1369, S372, S373. C378. F379. T385. S386. Q387, SI53, SI88, 1189. O190. SI91. Dl92. R194, E197, G198. R199. V200. D224, R237. D238, K243. S373. D374. S376, T377, F379,1154. TI 87. H193. E195. 1196, M201. V202, C223. T228, S235, G236, A239, G244, M247, 1369, S372. C375. ili C378. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul vezuje sc u okviru 30 angstrema od jednog ili više sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEO ID NO: 3): SI53. 1154. P155, R194. D238. A239, 1369, S372, D374. C375. T377, C378. F379, V380, S381. W156, NI 57. LI58. E159. Hl93. E195, 11229. R237. G240, K243, D367, 1368, G370, A371, S373. S376. ili Q382. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul će se vezati za ili u okviru 30 angstrema od jednog ili više sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ ID NO: 3): W72, F150, A15L 0152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, 0256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366. D367, D374, V380. S381. Q382. S383, G384, K69. D70. P71. S148, V149. Dl86, T187, E211. D212. G213, R218. 0219. C223. D224. G227, 11229. L253, N254, G259. P288. A290. G291. G316, R319. Y325, V346, G352. T353, G365. 1368. 1369. S372, S373, C378, F379, T385, S386, ili Q387. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul će se vezati za ili u okviru 30 angstrema od jednog ili više sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ IDNO: 3): S153, S188. 1189. O190. S191, D192, R194, E197. G198. R199, V200, D224. R237. D238, K243, S373. D374, S376. T377, F379. 1154. TI87. Hl93. E195. 1196, M201. V202. C223. T228, S235. G236. A239. G244, M247.1369. S372, C375. ili C378.

[0625] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul se vezuje 30. 30-25. 25-20. 20-15. 15-8. 8, 8-5. 5. 5-4. 4 ili manje angstrema od jednog ili više od gornjih ostataka. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul. koji se vezuje za PCSK9. je u okviru najmanje jedne od gornjih distanci, za više od jednog od gore pomenutih ostataka. Na primer. u nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul je u okviru jedne od navedenih distanci (npr.. 30. 30-25, 25-20, 20-15. 15-8. 8. 8-5. 5. 5-4. 4 ili manje) za najmanje 2, 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15, 16, 17, 18, 19. 20. 20-25. 25-30. 30-35. 35-40. 40-45. 45-50. 50-55. 55-60. 60-65. 65-70. 70-75 ili više od gornjih ostataka. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul je u okviru jedne od nabrojanih distanci za najmanje 1-10. 10-20. 20-30. 30-40, 40-50. 50-60. 60-70. 70-80. 80-90. 90-95, 95-99, 99-100% od ostataka identifikovanih u svakoj grupi od njihove podgrupe (kao što su samo oni površinski ostaci u grupi). Sem ako se specifično tvrdi drugačije, distanca između antigen vezujućeg molekula i PCSK9 je najkraća distanca između kovalentno vezanog atoma na PCSK9 i kovalentno vezanog atoma od antigen vezujućeg molekula koji su najbliži atomu PCSK9 i antigen vezujućeg molekula. Slično tome. sem ako se specifično tvrdi drugačije, distanca između ostatka (na antigen vezujućem molekulu ili PCSK.9) i drugog proteina (bilo PCSK9 ili antigen vezujući molekul respektivno), je distanca od najbliže tačke na identifikovanom ostatku do najbližeg kovalentno vezanog dela drugog proteina. U nekim ostvarenjima, distanca se može meriti iz kičme lanaca amino kiseline. U nekim ostvarenjima, distanca se može meriti između ivice paratopa i ivice (najbliže jedna drugoj) epitopa. U nekim ostvarenjima, distanca se može meriti između centra površine paratopa i centra površine epitopa. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, ovaj opis je primenjiv za svaki od pojedinačnih setova ovde popisanih ostataka. Na primer. gornji rasponi su zamišljeni generalno i specifično za ostatke od 8 angstrema pobrojane u Primerima 28-32 i ostatke 5 angstrema pobrojane u Primerima 28-32.

[0626] U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul se vezuje za površinu PCSK9 koja je vezana sa najmanje jednim od EGFa, 21B12, ili 31H4. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul vezuje se za PCSK9 na lokacijama koje se preklapaju sa lokacijama interakcije između PCSK.9 i EFGa. Ab 31H4, i/ili Ab 21B12 (kao stoje opisano gore u primerima i FIG.). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul vezuje se za PCSK9 na poziciji koja je još dalje od jednog od gore nabrojanih ostataka. U nekim ostvarenjima, takav antigen vezujući molekul može još uvek biti efektivan u ncutralizovanju antigen vezujućeg molekula.

[0627] U nekim ostvarenjima, struktura katalitičkog domena PCSK9 može se opisti kao da je bila generalno trouglasta (kao što jc prikazano na FIG. 19A). Prva strana trougla jc prikazana kao vezana za 31 114. Druga strana trougla je prikazana kao vezana sa 21 BI 2, i treća strana trougla je pozicionirana prema dnu stranice, odmah iznad „FIG. 19A" obeležja. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekuli koji se vezuju za prvu i/ili drugu stranu katalitičkog domena od PCSK.9 mogu biti korisni kao neutralizujuća antitela pošlo oni mogu bilo direktno ili sterično interferirati sa EGFa koji se vezuje za PCSK9. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, kada su antigen vezujući molekuli dovoljno veliki, kao što je potpuno antitelo. antigen vezujući molekul ne mora direktno da se vezuje za mesto vezivanja EGFa sa ciljem da interferira sa vezivanjem EGFa za PCSK9.

[0628] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, dok je EGFa domen od LDLR bio upotrebljen u mnogo primera, modeli i strukture su još uvek primenjivi na to kako ćc LDLR protein pune dužine intereagovati sa PCSK9. U stvari, dodatna struktura prisutna na LDLR proteinu pune dužine predstavlja dodatni proteinski prostor koji se može dalje blokirati sa jednim od antigen vezujućih molekula. U tom slučaju, ako antigen vezujući molekul blokira ili inhibira vezivanje EGFa za PCSK9, verovatno će biti najmanje kao, ako ne i više, efektivan sa LDLR proteinom pune dužine. Slično tome. antigen vezujući molekuli koji su u okviru postavljene distance ili blokiraju različite ostatke koji su relevantni za inhibiciju EGFa vezivanja, verovatno će biti isto efektivni, ako ne i više efektivni, za LDLR pune dužine.

[0629] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, bilo koji molekul koji blokira ili se vezuje za gore pomenute PCSK9 ostatke (ili u okviru pobrojanih distanci), ili koji inhibira jednu ili više interakcija zabeleženih u gornjim primerima i FIG.. može se upotrebiti da inhibira interakciju EGFa (ili LDLR generalno) i PCSK9. Kao takav, molekul ne mora da bude ograničen na antigen vezujući „protein", pošto bilo koji antigen vezujući molekul može takodc poslužiti za zahtevane namene. Primeri antigen vezujućih molekula uključuju aptamere. koji mogu biti ili oligonukleinska kiselina ili peptidni molekuli. Drugi primeri antigen vezujućih molekula uključuju avimere, peptitela, male molekule i polimere, i modifikovane verzije EGFa koje mogu povećati svoj afinitet za PCSK9 i/ili polu život, kao što su mutacija amino kiselina, glikozilacija. pegilacija, fuzija Fc i fuzija avimera. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, u nekim ostvarenjima LDLR nije antigen vezujući molekul. U nekim ostvarenjima, vezujuće podsekcije LDLR nisu antigen vezujući molekuli, npr., EGFa. U nekim ostvarenjima, drugi molekuli preko kojih PCSK9 signalirain vivonisu antigen vezujući molekuli. Takva ostvarenja će biti eksplicitno identifikovana kao takva.

[0630] PRIMER 33

[0631] Ekspresijaiprečišćavanjeuzoraka proteina

[0632] Ovaj primer opisuje neka ostvarenja načina kako su različita ostvarenja PCSK9 proteina/varijanti napravljena i prečišćena (uključujući LDLR EGFa domen). PCSK9 proteini/varijante (npr., PSCK9 31-692 N533A, PCSK9 449TEV i PCSK9 ProCat 31-454) su eksprimirani u IIi-5 ćelijama insekta inficiranim bakulovirusom sa N-terminalnim signalnim melitin proteinom od pčele praćenim sa His6 tagom. PCSK.9 proteini su prečišćeni sa nikl atinitelnom hromatografijom. jono izmenjivačkom hromatografijom i hromatografijom izuzimanja veličine. Melittin-IIis6 tag je uklonjen tokom prečišćavanja putem isecanja sa TEV proteazom. Konstrukt PCSK9 449TEV je upotrebljen da se generiše PCSK9 ProCat (31-449) i V domen (450-692) uzorci. Ovaj konstrukt je imao TEV mesto isecanja proteaze ubačeno između PCSK9 ostataka 449 i 450. Za kristalografiju varijante N555A pune dužine. PCSK9 31-454 fragment, i PCSK9 449TEV varijanta za kristalografiju. post rTEV protein produkt je takođe uključio inicijalnu GAMG sekvencu. Prema tome. post iTEV isecanje, tih proteina bilo je GAMG-PCSK9. Sem toga, PCSK9 449TEV protein je uključen u sekvencu ,,ENLYFQ" (SEQ ID NO: 403) ubačenu između pozicija H449 i G450 od SEQ ID NO: 3. Nakon isecanja sa rTEV, PCSK9 ProCat protein generisan iz ovog konstrukta bio jc GAMG-PCSK9 (31 -449)-ENLYFQ i V domen generisan iz ovog konstrukta bio jc PCSK9 (450-692) od SEQ ID NO: 3.

[0633] 21B12 i 31H4 Fab fragmenti su eksprimirani uE. voli.Ovi proteini su prečišćeni sa nikl afinitetnom hromatografijom. hromatografijom izuzimanja veličine i jono izmenjivačkom hromatografijom.

[0634] LDLR EGFa domen (293-334) je eksprimiran kao GST fuzioni protein uE. col i.EGFa domen je prečišćen sa jono izmenjivačkom hromatografijom. glutation sefaroza afinitetnom hromatografijom i hromatografijom izuzimanja veličine. GST protein jc uklonjen tokom prečišćavanja sa isecanjem pomoću PreScission proteaze.

[0635] PRIMER34

[0636] Formiranjekompleksa i kristalizacija

[0637] Ovaj primer opisuje kako su napravljeni kompleksi i kristali upotrebljeni u Primerima ispitivanjima gornjih strukura.

[0638] PCSK9 31-692 N533A / 31H4 kompleks je napravljen mešanjem 1.5 molarnog viška 31H4 Fab sa PCSK9. Kompleks je prečišćen hromatografijom izuzimanja veličine da se ukloni višak 31114 Fab. PCSK9 31-692 N533A / 31H4 kompleks kristalizuje u 0.1 M Tris pH 8.3, 0.2 M natrijum acetatu. 15% PEG 4000, 6% soli dekstran sulfat natrijuma (Mr 5000).

[0639] PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21 BI 2 kompleks je napravljen prvo pomoću mešanja 1.5 molarnog viška od 3 3H4 Fab sa PCSK9 31-449. Kompleks je razdvojen od viška 31H4 kolonskom hromatografijom izuzimanja veličine. 1.5 molarni višak od 21B12 Fab je zatim dodan u PCSK9 31-449 / 31H4 kompleks. Ternarni kompleks je razdvojen od viška 21B12 pomoću prečišćavanja sa kolonskom hromatografijom izuzimanja veličine. PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21 BI2 kompleks kristalizuje u 0.1 M Tris pll 8.5. 0.2 M jedno baznom amonijum fosfatu. 50% MPD.

[0640] PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa kompleks je napravljen mešanjem 1.2 molarnog viška od EGFa domena sa PCSK9 31-454. PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa domen kompleks kristalizuje u 0.2 M kalijum formatu. 20% PEG 3350.

[0641] PRIMER 35

[0642] Sakupljanje podataka i određivanje strukture

[0643] Ovaj primer opisuje kako su sakupljeni setovi podataka i kako su određene strukture za ispitivanje Primera gornjih struktura

[0644] Početni setovi podataka za PCSK9 31-692 N533A / 31114 i PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 kristale su sakupljeni na Rigaku FR-E X-zrak izvoru. PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa set podataka i set podataka više rezolucije za PCSK9 31-692 N533A / 31H4 i PCSK9 ProCat 31-449 / 31 114 / 21 BI2 kristale su sakupljeni na Berkeley Advanced Eight Source beamline 5.0.2. Svi setovi podataka su obrađeni sa denzo/scalepack ili HKL2000 (Otwinowski. Z., Borek. D.. Majevvski. W. & Minor. W. Multiparametarsko skaliranje difrakcionih intenziteta.Acta CrystaIlof>r.A 59, 228-34 (2003)).

[0645] PCSK9 / 31H4 kristali rastu u C2 prostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=264.9. b=137.4. c=69.9 A. P=102.8° i difrakcijom do 2.3 A rezolucije. PCSK9 / 31H4 struktura je razrešena sa molekularnom zamenom sa programom MOLREP (CCP4 nastavak: programi za kristalografiju proteina.Acta Crystallogr D Biol Crvstallogr50. 760-3 (1994) koristeći PCSK9 strukturu (Piper, D.E. i sar. Kristalna struktura PCSK9: regulator plazma LDE-holestcrola.Struct ure15. 545-52 (2007)) kao polazni istraživački model. Držeći PCSK9 31-692 rastvor fiksiran, varijabilni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Držeći PCSK.9 31-692 / rastvor varijabilnog domena antitela fiksiran, konstantni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Kompletna struktura je poboljšana sa višestrukim rundama građenja modela sa Quanta i usavršavanjem sa cnx. (Brunger, A.T. i sar. Kristalografija i NMR sistem: Novi softver pogodan za određivanje makromolekulame strukture.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr54. 905-21 (1998)).

[0646] PCSK9 / 31H4 / 21 BI 2 kristali rastu u P21212 prostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=138.7, b-246.2, c=51.3 A i difrakcijom do 2.8 A rezolucije. PCSK.9 / 31H4 / 21B12 struktura je razrešena sa molekularnom zamenom sa programom MOLREP koristeći PCSK9 ProCat / 31 H4 varijabilni domen kao polazni istraživački model. Držeći PCSK9 ProCat / 31 H4 fiksiran varijabilni domen. izvedena je pretraga za konstantni domen antitela. Držeći PCSK9 ProCat / 31 H4 / 21 BI2 fiksiran konstantni domen. varijabilni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Kompletna struktura je poboljšana sa višestrukim rundama građenja modela sa Cjuanta i usavršavanjem sa cnx.

[0647] PCSK9 / EGFa kristali domena rastu u prostornoj grupi P6522 sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=b=70.6. c=321.8 A i difrakcijom do 2.9 A rezolucije. PCSK9 / EGFa struktura domena je razrešena sa molekularnom zamenom sa programom MOLREP koristeći PCSK9 ProCat kao polazni istraživački model. Analiza mapa elektronske gustine pokazala jc jasnu elektronsku gustinu za EGFa domen. LDLR EGFa domen je ručno filovan i model je poboljšan sa višestrukim rundama građenja modela sa Ouanta i usavršavanjem sa cnx.

[0648] Interakcije jezgra međuveze amino kiselina su određene kao da su svi ostaci amino kiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 5 A od PCSK9 partner proteina. 5 A je odabrano kao granična distanca regiona jezgra da se omogući atomima u okviru van der Waal-ovog radijus plus moguća vodom-posredovana vodonična veza. Granične interakcije međuveza amino kiselina su određene kao da su svi ostaci amino kiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 8 A od PCSK9 partner proteina ali koji nisu uključeni u interakcionu listu jezgra. Manje od ili jednako 8 A jc odabrano kao granična distanca graničnog regiona da se omogući proširenje za dužinu amino kiseline arginina. Amino kiseline koje dostižu te kriterijume distance su izračunate sa programom PyMOL. (DeLano. W.L. The PyMOL Molekularni grafički sistem. (Palo Alto, 2002)).

[0649] PRIMER 36

[0650] Kristalna strukturaPCSK9 i 31A4

[0651] Određena je kristalna struktura 31A4/PCSK9 kompleksa.

[0652] Ekspresija i prečišćavanje uzoraka proteina

[0653] PCSK9 449TEV (PCSK9 konstrukt sa TEV mestom isecanja proteaze ubačenim između ostatka 449 i 450, numerisanje u skladu sa SEQ ID NO: 3) je eksprimiran u EIi-5 ćelijama insekta zaraženim bakulovirusom sa N-terminalnim melitin signalnim peptidom pčele praćenim sa His<6>tagom. PCSK9 protein je prečišćen prvo sa nikl afinitetnom hromatografijom. TEV proteaza je upotrebljena da se ukloni melitin-Hisf, tag i iseče PCSK.9 protein između katalitičkog domena i V domena. V domen was je dalje prečišćen sa jono izmenjivačkom hromatografijom i hromatografijom isključivanja veličine. 31A4 Fab fragment je eksprimiran uE, coli.Ovaj protein je prečišćen sa nikl afinitetnom hromatografijom, hromatografijom isključivanja veličine i jono izmenjivačkom hromatografijom.

[0654] Formiranje kompleksa i kristalizacija

[0655] PCSK9 V domen / 31A4 kompleks je napravljen mešanjem 1.5 molarnog viška od PCSK9 V domena sa 31A4 Fab. Kompleks je odvojen od viška PCSK9 V domena prečišćavanjem kolonskom hromatografijom isključivanja veličine. PCSK9 V domen / 3IA4 kompleks kristalizuje u 1.1 M sukcinskoj kiselini pH 7. 2% PEG MME 2000.

[0656] S akuplj anje podataka i određivanje strukture

[0657] Set podataka za PCSK9 V domen / 31A4 kristal je sakupljen na Rigaku FR-E x-zrak izvoru i obrađen sa denzo/scalepack (Otvvinovvski. Z.. Borek. D.. Majevvski. W. & Minor. W. Multiparametarsko skaliranjc difrakcionih intenziteta.Acta Crystallogr A59. 228-34 (2003)).

[0658] PCSK9 V domen / 31A4 kristali rastu u P212121 prostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a-74.6. b-131.1. c-197.9 A sa dva kompleksna molekula po asimetričnoj jedinici, i difrakciji na 2.2 A rezolucije. PCSK9 V domen / 31A4 strukture je razrešen sa molekulskom zamenom sa programom MOLREP (CCP4. CCP4 nastavak: programi za kristalografiju proteina.Acta CijstaUogr D Biol CijstaUogr50. 760-3 (1994)) koristeći V domen od PCSK9 strukture (Piper. D.E. i sar. Kristalna struktura PCSK9: regulator plazma LDL-holesterola.Structure15. 545-52 (2007)) kao polazni model za traženje. Držeći PCSK9 450-692 rastvor fiksiran, varijabilni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Nakon početnog usavršavanja, konstantni domeni antitela sun ručno podešeni. Kompletna struktura je poboljšana sa višestrukim rundama građenja modela sa Cmanta i usvršena sa cnx (Brunger, A.T. i sar. Kristalografija i NMR sistem: Novi sovtver nastavak za određivanje makromolekularne strukture.Acta CijstaUogr D Biol CijstaUogr54, 905-21 (1998)).

[0659] Interakcije jezgra međuveze amino kiselina su određene kao da su svi ostaci amino kiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 5 A od PCSK9 partner proteina. 5 A je odabrano kao granična distanca regiona jezgra da se omogući atomima u okviru van đer Waal-ovog radij us plus moguća vodom-posredovana vodonična veza. Granične interakcije međuveza amino kiselina su određene kao da su svi ostaci amino kiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 8 A od PCSK9 partner proteina ali koji nisu uključeni u interakcionu listu jezgra. Manje od ili jednako 8 A je odabrano kao granična distanca graničnog regiona da se omogući proširenje za dužinu amino kiseline arginina. Amino kiseline koje dostižu te kriterijume distance su izračunate sa programom PyMOL. (DeLano. W.L. PyMOL Molekularni grafički sistem. (Palo Alto, 2002)). Distance su izračunate koristeći V domen ,,A" i 31A4 ,,L1,H1" kompleks.

[0660] Kristalna struktura PCSK9 V domena vezana za Fab fragment od 31A4 je određena na 2.2 A rezoluciji. Prikazi kristalne strukture obezbedeni su na FIG. 21A-21D. FIGURAE 21A-21C pokazuju da se 31A4 Fab vezuje za PCSK9 V domen u regionu pod domena 1 i 2.

[0661] Napravljen je model pune dužine PCSK9 vezan za 31A4 Fab. Struktura pune dužine PCSK9 je položena na PCSK9 V domen iz kompleksa. Figura iz ovog modela je prikazana na

[0662] FIG. 21D. Mesto interakcije između EGFa domena LDLR i PCSK9jc istaknuto.

[0663] Analiza strukture pokazuje gde antitelo interreaguje sa PCSK9 i pokazuje da antitela koja se ne vezuju za LDLR površinu vezivanja od PCSK9 mogu još uvek inhibirati interakciju LDLR kojaje posredovana preko PCSK9 (kada se rezultati posmatraju u kombinaciji sa Primcrom 40 i 41 dole). U dodatku, analiza kristalne strukture omogućuje identifikaciju specifičnih amino kiselina uključenih u interakciju između PCSK9 i 31A4 antitela. Sem toga. takođe su određeni jezgro i granični regioni među veze na površini PCSK9. Specifično jezgro PCSK9 ostataka amino kiseline od interakcione među veze sa 31A4 su đefinisani kao PCSK9 ostaci koji su u okviru 5 A od 31A4 proteina. Ostaci jezgra su T468. R469. M470. A471. T472. R496. R499, E501. A502. Q503, R510, II512. F515. P540. P541. A542. E543. H565, W566. E567. V568. E569. R592. i E593. Granični PCSK9 ostaci amino kiseline od interakcione među veze sa 31A4 su đefinisani kao PCSK9 ostaci koji su 5-8 A od 31A4 proteina. Granični ostaci su sledeći: S465. G466, P467. A473, 1474. R476. G497, E498, M500, G504, K506. L507, V508. A511, N513, A5I4, G516. V536, T538, A539. A544, T548. D570. L571. H591, A594. S595. i H597. Ostaci amino kiselina koji su blizu ili su potpuno pokriveni u okviru PCSK9 proteina su istaknuti podvlačenjem. Kao što je ovde napomenuto, numerisanje označava pozicije amino kiselina u SEQ ID NO: 3 (doterano kao što je ovde napomenuto).

[0664] Specifični ostaci amino kiseline jezgra 31A4 interakcione meduveze sa PCSK9 su đefinisani kao 31A4 ostaci koji su u okviru 5 A od PCSK9 proteina. Ostaci jezgra za 31A4 antitelo su sledeći: teški lanac: G27. S28. F29. S30, A31. Y32. Y33, E50. N52. H53. R56. D58. K76, G98. 099. LI00, i V101; laki lanac: S31. N32, T33. Y50. S51. N52. N53. Q54. W92, i D94. Granični ostaci amino kiseline 31A4 interakcione među veze sa PCSK9 đefinisani su kao 31A4 ostaci koji su 5-8 A od PCSK9 proteina. Granični ostaci za 31A4 su sledeći: teški lanac: V2, G26, W34, N35, W47, 151, S54, T57, Y59, A96, R97, P102, F103, i D104; laki lanac: S26. S27, N28, G30, V34, N35, R55, P56, K67, V91, D93, S95. N97, G98, i W99.

[0665] Kristalna struktura takođe je pokazala prostorne zahteve tog AVP u njegovim interakcijama sa PCSK9. Kao što je pokazano u toj strukturi, na iznenađenje, antitela koja se vezuju na PCSK9 bez direktnog sprečavanja interakcije PCSK9 sa LDLR mogu još uvek inhibirati funkciju PCSK9.

[0666] U nekim ostvarenjima, bilo koji antigen vezujući protein koji se vezuje za, pokriva, ili sprečava 31A4 od interreagovanja sa bilo kojim od gornjih ostataka, može se upotrebiti da se veže ili neutralizuje PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje sa. ili interreaguje sa. najmanje jednim od sledećih PCSK9 (SEQ ID NO: 3) ostataka: T468. R469. M470. A471. T472. R496, R499. E501, A502. O503. R510. H512. E515. P540. P541, A542, E543, 11565. W566. E567. V568. E569. R592. i E593. U nekim ostvarenjima. AVP je u okviru 5 angstrema od jednog ili više gornjih ostataka. U nekim ostvarenjima. AVP vezuje sa. ili interreaguje sa. najmanje jednim od sledećih PCSK9 (SEO ID NO: 3) ostataka: S465. G466. P467. A473. 1474. R476. G497. [£498. M500. G504, K506. L507. V508. A511. N513. A514. G516. V536. T538. A539. A544. T548. D570. L571, H591. A594. S595. i H597. U nekim ostvarenjima, AVP je 5 do 8 angstrema od jednog ili više gornjih ostataka. U nekim ostvarenjima. AVP interreaguje. blokira, ili je u okviru 8 angstrema od 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9, 10. 11. 12. 13. 14. 15. 20, 25. 30.

[0667] 35. 40. 45. ili 50 od gornjih ostataka.

[0668] Koordinate kristalnih struktura koje su diskutovane u gornjim Primerima predstavljene su u Tabeli 35.1 (PCSK9 pune dužine i 31H4), Tabela 35.2 (PCSK.9 i EGEa). Tabela 35.3 (PCSK9, 31H4, i 21 BI2). i Tabela 35.4 (PCSK9 i 31A4). Takođe su posmatrani antigen vezujući proteini i molekuli koji interreaguju sa odgovarajućim područjima ili ostaci od strukture od PCSK9 (uključujući ona područja ili ostatke u oviru 15. 15-8. 8, 8-5, 5. ili manje angstrema odakle EGFa, ili antitela, interreaguju sa PCSK9) opisani u FIG. i/ili njihove odgovarajuće pozicije na strukturama od kordinati.

[0669] Antitela koja su opisana u koordinatama su odgajena uE. colii. prema tome, poseduju minorne razlike u amino kiselinama od potpuno humanih antitela. Prvi ostatak u varijabilnom regionu bio je glutaminska kiselina umesto glutamina za teške i lake lance 21 BI 2 i za lake lance za 31H4. U dodatku na razlike u sekvenci varijabilnog regiona, postojale su takođe neke razlike u konstantnom regionu antitela opisanog sa kordinatama (ponovo zahvaljući činjenici da je antitelo odgajeno uE. coli).FIG. 22 ističe (preko istaknutog senčenja. ili podebljavanja) razlike između konstantnih regiona 21B12. 31H4. i 31A4 Fabs (ođgajenih uE. coli)kada se porede sa SEQ ID NOs: 156, i 155. Za 21B12 31H4, i 31A4, laki lanac konstantne sekvence je sličan humanom lambda (SEQIDNO: 156). Podvučeni glicin ostatak je insercija između mesta gde se 21B12 i 31 H4 varijabilne sekvence zaustavljaju i započinje lambda sekvenca.

[0670] I za 21 BI2 i 31H4, konstatnta teškog lanca je slična humanom lgG4 (SEQ ID NO: 155). Razlike istaknute na FIG. 22 prikazane su u Tabeli 36.1:

[0671] Kada se razmatra 31A4. iako on takode ima iste razlike pobrojane gore. postoje još tri dodatne razlike. Kao što je prikazano na FIG. 22. postoje dve dodatne amino kiseline na početku, koje dolaze od nekompletnog procesovanja signalnog peptida u ekspresiji kodE. coli.Sem toga, postoji jedna dodatna supstitucija u teškom lancu konstantnog regiona 31A4 kada sc poredi sa SEQ ID NO: 155, koji je u susedstvu od L (u SEO ID NO: 155) do H. Konačno, 31A4 nema glutamin kao početnu amino kiselinu od Fab, pre nego što će imati ubacivanje glutaminske kiseline pornenuto gore za 21 BI2 i 31H4.

[0672] Za sva tri antitela. kraj teškog lanca (zaokružen tamno sivo) razlikuje se takodc. ali amino kiseline nisu poredane u strukturi tako da se pojave u kordinatama. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, his-tagovi nisu potrebni deo AVP i ne treba da sc smatraju kao deo sekvence AVP, ako to nije eksplicitno zahtevano na osnovu reference za specifični SEQ ID NO koji uključuje histidin tag i tvrdnju da sekvenca AVP ..uključuje hisliđin tag."

[0673] PRIMER 37

[0674] Mapiranje—bining epitopa

[0675] Alternativno postavljeni eksperiment bininga izveden je u dodatku na onaj postavljen u Primeru 10. Kao i u Primeru 10, AVPi koji su u kompeticiji jedan sa drugim mogu se smatrati kao vezujući na isto mesto na meti i uobičajeno se kaže da se „binuju" zajedno.

[0676] Upotrebljena je modifikacija Multiplexed Binning metoda opisana od strane Jia, i sar. (J. Immunological Methods, 288 (2004) 91-98). Pojedinačni kodovi perlica streptavidin obavijenih Luminex perlica su inkubirani u lOOul 0.5 ug/ml biotiniliranog monovalentnog miš-anti-humanog IgG zarobljenog antitela (BD Pharmingen, #555785) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi u mraku, zatim isprano 3x sa PBSA. slanim rastvorom fosfatnog pufera (PBS) plus 1% goveđi serum albumin (BSA). Svaka kod perlica je odvojeno inkubirana sa 100 ul 2 ug/ml anti-PCSK9 antitela (obavijajuće antitelo) tokom 1 časa a zatim isprana 3x sa PBSA. Perlice su sakupljene i zatim razdeljene u filter ploču sa 96-bunarČića (Millipore. #MSBVN1250). lOOul od 2 ug/ml prečišćenog PCSK9 proteina je dodano u polovinu bunarčića. Drugoj polovini je dodan pufer kao kontrola. Reakcija je inkubirana tokom 1 časa i zatim isprana. 100 ul od a 2 ug/ml anti-PCSK9 antitela (Detection Ab) je dodano u sve bunarčiće. inkubirano tokom 1 Časa i zatim isprano. Irelevantni humani-lgG (Jackson, #009-000-003) je pušten kao druga kontrola. 20ul PE-konjugovanog monovalentnog miš-anti-humanog IgG (BD Pharmingen. #555787) je dodano u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 Časa i zatim isprano. Perlice su resuspendovane u lOOul PBSA i minimum 100 događaja/kod perlice je sakupljeno na BioPlex instrumentu (BioRad).

[0677] Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) para antitela bez PCSK9 je oduzet od signala od odgovarajuće reakcije koja je sadržala PCSK.9. Da bi se par antitela smatrao istovremeno vezanim, i prema tome u različitim binovima, oduzeti signal mora biti više od 3 puta signal od antitela koje je u kompeticiji sa samim sobom i 3 puta signal antitela koje je u kompeticiji sa irelevantnim antitelom.

[0678] Gornji podaci su prikazani u FIG. 23A-23D. AVPi spadaju u pet binova. OsenČeni kvadrati naznačavaju AVPe koji se mogu vezati istovremeno za PCSK9. Ne osenčeni kvadrati naznačavaju one AVPe koji su u kompeticiji sa svakim drugim za vezivanje. Sažetak rezultata je prikazan u Tabeli 37.1.

[0679] Binovi 1 (u kompeticiji su sa AVP 21B12) i 3 (u kompeticiji su sa 31H4) su isključeni jedan od drugog; bin 2 u je kompeticiji sa binovima 1 i 3: i Bin 4 nije u kompeticiji sa binovima 1 i 3. Bin 5. u ovom primeru, je prisutan kao ..uhvati sve" bin da opiše AVPe koji se ne uklapaju u druge binove. Prema tome. gore identifikovani AVPi u svakom od binova su predstavnici različitih tipova lokacija epitopa na PCSK9. od kojih sc neki preklapaju jedan sa drugim.

[0680] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, ako pomenuti AVP sprečava vezivanje probe AVP onda se kaže da su antitela u istom binu. Rcdosled u kojem su AVPovi upotrebljeni može biti važan. Ako je AVP A upotrebljen kao pomenuti AVP i blokira vezivanje AVP B suprotno nije uvek tačno: AVP B upotrebljen kao pomenuti AVP neće neophodno blokirati AVP A. Postoji jedan broj faktora koji ovde imaju ulogu: vezivanje AVP može uzrokovati konformacione promene u meti što sprečava vezivanje drugog AVP. ili epitopa koji preklapaju ali ne pokalpaju potpuno jedan drugog što može omogućiti drugom AVP da još uvek ima dovoljno interakcija visokog afiniteta sa ciljem da se omogući vezivanje. AVPi sa mnogi višim afinitetom mogu imati mnogo veću sposobnost da uklone blokirajući AVP sa puta. Generalno, ako je zapažena kompeticija u bilo kom od redu AVPa kaže se da se oni binuju zajedno, a ako AVPi mogu blokirali jedan drugog onda je verovatno da će se epitopi poklapati mnogo kompletnije.

[0681] PRIMER 38

[0682] Mapiranje epitopa -western blot

[0683] Ovaj primer pokazuje da li epitopi jesu ili nisu bili linearni ili konformacioni za ispitane AVPe. Denaturišući redukovani i denaturišući ne redukovani vvestern blol-ovi su pušteni da se odredi koja antitela imaju konformacioni epitop. Antitela koja se vezuju za denaturišući redukovani vvestern blot imaju linearni epitop i nisu konformaciona. Rezultati su prikazani na FIG. 24A i FIG. 24B. Za blot. 0.5 ug/linija prečišćenog humanog PCSK9 pune dužine je puštena na 4-12% NuPAGE Bis-Tris gelu i MES SDS puferu ciklusa. I ug/ml anti-PCSK9 antitela. sem 0.5 ug/ml 31G11. je upolrebljeno za. probe blota. 1:5000 sekundarni magarac-anti-humani-1R700 jc upotrebljen i očitan na LiCOR instrumentu. Antitelo 13EI se vezuje za linearni epitop na pro-domen od PCSK9. Sva druga antitela pokazala su rezultate koji su bili konzistentni sa konformacionim epitopima. Ovi gelovi razdvajaju pro-domen od ostatka proteina, i pro domen startujc na oko 15kDa. Sem toga. pokazalo se da se 3C4 i 31A4 vezuju za konformacione epitopc koji su bili sačuvani pomoću disulfidnih veza, pošto se ta antitela vezuju za PCSK-9 pod denaturišućim uslovima gde su kojima su disulfiđne veze bile sačuvane (levo) ali redukujući tako uzorke (desno) eliminišući vezivanje.

[0684] PRIMER 39

[0685] Mapiranje epitopa - skeniranje arginin / glutaminska kiselina Reprezentativni AVPi iz svakog bina (na Primer 37) su odabrani iz dalje analize epitopa. Arginin/glutaminska kiselina-skaning strategija je izvedena radi mapiranja AVP vezivanja za PCSK9. Pomoću pozadine, ovaj metod determiniše da li je ostatak deo strukturnog epitopa, Što znači da ti ostaci u antigenu ili kontaktiraju ili su pokriveni od strane antitela. Arginin i glutaminska kiselina bočni lanci su naelektrisani i zamašni i mogu prekinuti vezivanje antitela čak i kada mutirani ostatak nije direktno uključen u vezivanje antitela.

[0686] Selekcija ostataka

[0687] Kristalna struktura PCSK9 je upotrebljena da se odaberu ostaci koji bi trebalo da se mutiraju radi mapiranja epitopa. Metod koji je upotrebljen da se odaberu ostaci koji će se mutirati uključio je oba mehanizma za izračunavanje i interaktivnu analizu strukture. PCSK9 struktura je sadržala gapove i nedostajuće ostatke i nedostajalo joj je 30 amino kiselina u N- (tj.. signalna sekvenca) i 10 amino kiselina u C-kraju. Unutrašnji nedostajući ostaci su modelirani na strukturu, ali N- i C-terminalni nedostajući ostaci nisu. Odnos izloženosti rastvarača za svaki ostatak je izračunat: područje površine svakog ostatka u kontekstu proteina (SA1) je podeljeno sa područjem površine ostatka u trimeru sa visećim glicinima (SA2) sa konzerviranom strukturom kičme. Ostaci sa odnosom izloženosti rastvarača više od 10% (R 10) su odabrani kao i 40 nedostajućih terminalnih ostataka. Od njih. prolini i glicini sa pozitivnim (D uglovima su isključeni da se redukuje mogućnost pogrešnog savijanja. Broj ostataka koji bi trebalo da se mutira u V domenu je redukovan koristeći odnos izlaganja rastvarača od 37% duž zajedno sa vizuelnom inspekcijom celog proteina da dovede do ukupnog broja mutacija od 285. Različite orijentacije površine PCSK.9 s tim različitim klasama iđentilikovanja su prikazane na FIG. 25A-25F. Na tim FIG.. najsvellije sivo označava područja koja nisu odabrana ili su dcselektovana. Tamno sivo označava one ostatke koji su odabrani).

[0688] Kloniranje i ekspresija

[0689] Onda kada su ostaci koji bi trebalo da sc promene identifikovani, izmenjcni su različiti ostaci. Humani PCSK9 je kloniran u pTT5 vektor sa C-terminal Flag-His tagom. Mutanti su napravljeni iz tog originalnog konstrukta pomoću mutageneze usmerenc na mesto koristeći QuikChange II kit od Stratagene. Sens i anti-sens oligonukleotidi koji su upotrebljeni za mutagenezu označeni su koristeći Amgen's MutaGenie softver. Svi PCSK9 konstrukti su eksprimirani u prolazno-transfcklovanim 293-6E ćelijama u pločama sa 24-bunarčića i ponovo raspoređeni u tri ploče sa 96-bunarČića sa ne-mutiranim PCSK9 kontrolama (divlji tip. WT) u svakoj ploči. Nivoi ekspresije i integritet rekombinantnih proteina u uslovnom medijumu su provereni sa Western blot-om. Od originalno odabranih 285 mutanata, kod 41 nije uspelo kloniranje ili ekspresija. 244 mutanata je upotrebljcno za mapiranje epitopa. Poklapanje roditcljeske sekvence PCSK9 i reprezentativne sekvence PCSK9 sa 244 imitirana ostatka je prokazano na FIG. 26. Napravljeni su odvojeni konstrukti koji su sadržali pojedinačnu mutaciju. Radi namene sekvenci epitopa i epitop zasnovanih pronalazaka uključujući promene u vezivanju, sekvence su obezbeđene u vezi sa SEQ ID NO: 1 i/ili SE;Q ID NO: 303. Sekvence na FIG. 26 su sekvence upotrebljene za ove studije vezivanja epitopa. Stručnjak će prihvatiti da su ovi rezultati primenjivi na druge PCSK9 varijante takođe otkrivene ovde (npr.. SEOIDNO: 1 i 3. kao i druge alelske varijante).

[0690] Pet antitela. reprezentativnih za svaki bin. je odabrano za fino mapiranje epitopa. Oni su bili 21B12. 31II4. 12H11, 31A4. 3C4. Sva konformaciona epitop antitela. Tri. 21 BI2, 31 H4, i 31A4 su takođe kristalizovana sa PCSK9. kao što je gore opisano.

[0691] Strukturni i funkcionalni epitopi

[0692] Epitopi se mogu dalje definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podset strukturnih epitopa i imaju takve ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcija (npr. vodonične veze, jonske interakcije). Strukturni epitopi mogu se smatrati delom mete koji je pretvoren od strane antitela.

[0693] Upotrebljena skaning mutageneza bila je skan arginina i glutaminske kiseline. Ta dva bočna lanca su odabrana zbog njihove velike sterične mase i njihovog naelektrisanja, koji omogućuju da mutacije koje se dešavaju u strukturnom epitopu imaju veći efekat na vezivanje antitela. Arginin je generalno upotrebljen sem kada je WT bio arginin, i u tim slučajevima ostatak je muiran u glutaminsku kiselinu da se promeni naelektrisanje.

[0694] Za svrhu mapiranja epitopa, multipleks ogled zasnovan na perlicama jc upotrebljen da se meri vezivanje antitela PCSK9 i PCSK9 mutanata istovremeno. Vezivanje antitela za mutante je poređeno za njegovo vezivanje za divlji tip u istom bunarčiću. Varijante su razdvojene u tri grupe: grupa 1: 81 varijanta + 2 wt kontrole + 1 negativna kontrola + 1 drugi PCSK9 supernatant; grupa 2: 81 varianta + 2 wt kontrole + 2 negativne kontrole: i grupa 3: 82 varujante + 2 wt kontrole + 1 negativna kontrola.

[0695] Ogled je tekao na sledeći način: 85 setova strepavidin-obavijenih LumAvidin perlica kodiranih bojom (Luminex) je vezano sa bioliniliranim anti-pentaHis antitelom (Qiagcn. #1019225) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi (RT) zatim isprano tri puta u PBS. 1% BSA. 0.1% Tween 20. Svaki set perlica kodiran bojom je zatim ostavljen da se veže za PCSK9 mutant, divlji tip. ili negativnu kontrolu u 150 ul supernatanta preko noći na 4 °C.

[0696] Bojom kodirani setovi perlica, svaki vezan sa specifičnim proteinom, isprani su i sakupljeni. U toj tački. bila su 3 skupa od po 85 setova perlica, jedan skup za svaku grupu mutanata i kontrole. Perlice iz svakog skupa su alikvotirane u 24 bunarčića (3 kolone) od filter ploča sa 96-bunarčića (Millipore, #MSBVN 1250). 100 ul anti-PCSK9 antitela u 4-puta razblaženjima je dodano u devet kolona za utrostručene tačke i inkubirano tokom 1 Časa na ST i isprano. lOOul od 1:200 razblaženja fikoeritrin (PE)-konjugovani anti-humani IgG Fc (Jackson Immunoresearch, #109-116-170) je dodano u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 Časa na ST i isprano.

[0697] Perlice su resuspendovane u 1% BSA u PBS. mućkane tokom 10 minuta i očitane na BioPlex instrumentu (Bio-Rad). Instrument identilikuje svaku perlicu prema njenom kodu boje identifikujući tako specifični protein vezan sa kodom boje. U isto vreme. on meri količinu antitela vezanog za perlice preko intenziteta fluorescencije PE boje. Antitelo koje se vezuje za svaki mutant može zatim biti direktno upoređeno prema svom vezivanju za divlji tip u istom skupu. JI.-17R himera F jc upotrebljena kao negativna kontrola. Sažetak svih ispitanih mutanata je prikazan u Tabeli 39.1 (sa pozivom na numerisanje sekvence upotrebljcno na FIG. 1A i 26).

[0698] Studija varijabilnosti perlice

[0699] Pre puštanja ogleda mapiranja vezivanja epitopa. izveden je eksperiment potvrđivanja da se proceni varijabilnost „region perlice" prema ..regionu perlice" (B-B). U eksperimentu potvrđivanja, sve perlice su bile konjugovanc sa istim divljim tipom kontrolnog proteina. Prema tome. razlika između regiona perlica bila je isključivo zbog čiste B-B varijanse i nije bila pomešana sa razlikom između divljeg tipa i mutantnih proteina. Titracija antitela jc obavljena u dvanaest ponavljanja u različitim bunarčićima.

[0700] Cilj ove statističke analize bio je da se proceni B-B varijabilnost procenjenihEC50od vezivanja krivi. Procenjcna B-B standardna devijacija (SD) je zatim upotrebljena da se naprave EC50 intervali pouzdanosti divljeg tipa i mutantnih proteina tokom poredenja krivih iz upoređnih eksperimenata.

[0701] Četvorostruko-parametarski logistički model je podešen za podatke vezivanja za svaki region perlice, Nastali laj], koji je sadžao rezultate krive kontrole kvaliteta (QC) i procenjene

[0702] parametre za vrh (maks), dno (min), Hillslope (nagib), i prirodni log od EC50 (x sred) od krivih, su upotrebljeni kao sirovi podaci za analizu. B-B varijabilnost za svaki parametar je zatim procenjena pomoću podešavanja modela pomešanog efekta koristeći SAS PROC MIXED proceduru. Samo krive sa „dobrim" QC statusom su uključene u analizu. Konačni model mešanog efekta uključio je samo ostatak (tj. pojedinačne regione perlica) kao slučajni efekt. Srednja vrednost najmanjeg kvadrata (LS-srednja vrednost) za svaki parametar je takođe procenjena sa modelom mešanog efekta. B-B SD je izračunata vađenjem kvadratnog korena B-B varijanse. Takođe je izračunata promena umnožaka između LS-srednjc vrednosti + 2SD i LS-sređnje vrednosti - 2SD. koja predstavlja približno gornji i donji 97.5 percentil populacije.

[0703] Rezultati su prikazani u Tabeli 39.2

[0704]

[0705] Identifikovanje ostataka u strukturnom epitopu

[0706] Ostatak je smatran delom strukturnog epitopa (..pogotka") kada mutiranje u arginin ili glutaminsku kiselinu, acid izmeni vezivanje antitela. To je viđeno kao pomak u EC50 ili redukcija maksimuma signala u poređenju sa vezivanjem antitela divljeg tipa. Statistčke analize krivih vezivanja antitela za divlji i mutant su upotrebljene da se identifikuju statistički značajni EC50 pomaci. Analiza uzima u obzir variranje u ogledu i krivu podešavanja.

[0707] Identifikacija pogotka zasnovana na poređenju E" C50

[0708] E;C50 i Bmax vrednosti su generisanc od Weighted 4-Paramcter Logistical modela podešenog za podatke vezivanja S-PLUS sa VarPovver softverom (Insightful Corporation. Seattle WA). LJporedeni su EC50-ovi od krivih vezivanja mutanta i krivih vezivanja divljeg tipa. Statistički značajne razlike su identifikovane kao pogodci radi daljeg razmatranja. Krive sa „ne podešenim" ili ..loše podešenim" obeležjima su isključene iz analize.

[0709] Varijacije u procenama EC50

[0710] Razmatrana su dva izvora variranja u poređenju procena EC50, variranje od podešavanja krive i variranje perlica-prema-perlici. Divlji tipovi i mutanti su vezani za razliličite perlice, prema tome, njihove razlike su pomešanc sa razlikom perlica-perlica (opisano gore). Variranje podešavanja krive je procenjeno sa standardnom greškom log EC50 procena. Variranje perlica-perlica je eksperimentalno određeno koristeći eksperiment u kojem su kontrole divljeg tipa bile vezane svaka za jednu perlicu (opisano gore). Variranje procena EC50 krive vezivanja divljeg tipa iz ovog eksperimenta je upotrebljeno da se proceni variranje perlica-perlica u aktuelnom eksperimentu mapiranja epitopa.

[0711] Testiranje za pomak EC50 između mutanta i divljeg tipa

[0712] Poređenje dva EC50 (u log skali) je izvedeno koristeći Studentov t-test. T-statistika je izračunata kao odnos između delta (apsolutne razlike između EC50 procena) i standardne devijacije delta. Varijansa delta je procenjena sabiranjem tri komponente, procene varijanse od EC50 za krive mutanta i divlji tip u nelinearnoj regresiji i dva puta varijansa perlica-perlica procenjena u odvojenom eksperimentu. Umnožak od dva za varijansu perlica-perlica je upotrebljen zbog pretpostavke da perlice i mutant i divlji tip imaju istu varijansu. Stepen slobode standardne devijacije delta je izračunat koristeći Sattcrthwaite-ovu (1946) aproksimaciju. Individualne p-vrednosti i intervali poverenja (95% i 99%) izvedeni su na osnovu Studentove<l>distribucije za svako poređenje. U slučaju višestrukih kontrola divljeg tipa. upotrebljen je konzervativni pristup odabiranjem kontrole divljeg tipa koja je bila najsličnija mutantu, tj.. odabiranjem onih sa najvećim p-vrednostima.

[0713] Doterivanja višestrukosti bila su važna da se kontroliše lažno pozitivna(c) dok se obavlja veliki broj testova istovremeno. Dva oblika doterivanja višestrukosti su implementirana za ovu analizu: kontrola porodične pametne greške (FWE) i kontrola lažne stope otkrića (FDR). FWE pristup kontroliše verovatnoću da jedan ili više pogodaka nisu realni; FDR pristup kontroliše verovatnoću očekivane proporcije lažno pozitivnih među odabranim pogodcima. Prvi pristup je konzervativniji i manje snažan nego onaj poslednji. Postoji mnogo dostupnih metoda za oba pristupa, za ovu analizu, odabrani su Hochberg-ov (1988) metod za FWE analizu i Benjamini-Ilochberg-ov (1995) FDR metod za FDR analizu. Izračunate su doterane p-vrednosti za oba pristupa.

[0714] Rezultati

[0715] Pomak EC50

[0716] Mutacije Čiji jc EC50 značajno različit od divljeg tipa. npr., ima False Discoverv Rate doteranu p-vrednost za ceo ogled od 0.01 ili manje, smatrane su delom strukturnog epitopa. Svi ovi pogode i takođe imaju porodično mudar tip I stope greške doteranu p-vrednost za svako antitelo manju od 0.01 sem ostatka R185E za antitelo 31H4 koje ima FWE doteranu p-vrednost po antitelu od 0.0109. Ostaci u strukturalnom epitopu različitih antitela određeni sa EC50 pomakom prikazani su u Tabeli 39.3 (tačkaste mutacije su sa pozivom na SEQ ID NO: 1 i 303).

[0717] Maksimum redukcije signala

[0718] Procenat maksimuma signala je izračunat koristeći maksimum signala iz podešavanja krive (Bmaks za WT) i tačku sirovog podatka (Sirovi Max za WT). Mutacije koje su redukovale maksimum signala vezivanja antitela za > 70% u poređenju sa signalom divljeg tipa iii koje su redukovale signal antitela u poređenju sa drugim antitelima za >50%i kada su sva druga antitela najmanje 40% divljeg tipa smatrane su pogotkom i delom epitopa. Tabela 39.4 pokazuje ostatke koji su u strukturalnom epitopu( kurziv)kao što je određeno redukcijom maksimuma signala.

[0719]

(tačkaste mutacije su u okviru poziva na SEQ ID NO: 1 i FIG. 26). Tabela 39.5 prikazuje sažetak svih pogodaka za različita antitela.

Da bi se dalje ispitalo kako ti ostaci formiraju deo ili cele odgovarajuće epitope, gore pomenute pozicije su mapirane na modele različite kristalne strukture, rezultati su prikazani na FIG. 27A do 27F. FIG. 27A prikazuje 21 B 12 epitop pogotke, kao što su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 21 BI2 antitelom. Struktura identifikuje PCSK.9 ostatke na sledeći način: svetio sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (Čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax Epitop pogodci su zasnovani na Bmax pomaku. Na ovoj figuri. 31114 jc iza 21 BI2. FIG. 27B prikazuje 31114 epitop pogotka, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21 Hl2 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetio sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bma<\>Epitop pogotka su zasnovani na Bmax pomaku. Epitop pogotka su zasnovani na EC50 pomaku. FIG. 27C prikazuje 31A4 epitop pogotka, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK.9 sa 31H4 i 21 BI2 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetio sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax Epitop pogotka su zasnovani na Bmax pomaku. Epitop pogodci su zasnovani na EC50 pomaku. Poznato je da se 31A4 antitelo vezuje za V-domen PCSK9. za koji se pokazuje da je konzislentan sa sa rezultatima predstavljenim na FIG. 27C. FIG. 27D prikazuje 121II1 epitop pogotka, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na siedeći način: svetio sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax Epitop pogotka su zasnovani na Bmax pomaku. 12H11 je u kompeticiji sa 21B12 i 31 H4 u ogledu vezivanja opisanom gore.

[0720] FIG. 27E prikazuje 3C4 epitop pogotke, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetio sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax Epitop pogodci su zasnovani na Bmax pomaku.

[0721] 3C4 nije u kompeticiji sa 21 BI2 i 31H4 u ogledu vezivanja. 3C4 se vezuje za V-domen u ogledu vezivanja domena (vidi rezultate iz Primera 40. FIG.. 28A i 28B).

[0722] I dok je bilo približno dvanaest mutanata za koje se očekivalo da mogu imati efekat na vezivanje (zasnovano na kristalnoj strukturi), ovaj eksperiment je pokazao da. na iznenađenje, oni nisu imali efekta. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati prikazani gore se dobro slažu sa kristalnim strukturama i vezivanjem PCSK-9 ovih antitela. To pokazuje da obezbedeni strukturni i odgovarajući funkcionalni podaci adekvatno identifikuju ključne ostatke i područja interakcije neutralizujućih AVPa i PCSK9. Prema tome. varijante AVPa koje poseduju sposobnost da se vezuju za gore pomenuta područja su adekvatno obezbeđena od strane predmetnog pronalaska.

[0723] Kao što će biti prihvaćeno od sirane stručnjaka, dok B-maks pad i EC50 pomak pogotka može da se smatra manifestacijom istog fenomena, striktno govoreći, sam B-max pad ne reflektuje gubitak afiniteta sam po sebi već. radije, destrukciju nekih procenata epitopa anlitela. I ako nema preklapanja u pogodcima određenim sa B-maks i EC50. mutacije sa jakim efektom na vezivanjene moraju omogućiti generisanje korisne krive vezivanja i. prema lome. EC50 se ne može odrediti za takve varijante.

[0724] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka. AVPi u istom binu (sa izuzetkom bina 5. koji je kao što je gore primećeno. hvata sve binove) se vezuju za preklapajuća mesta na ciljnom proteinu. Kao takvi, gornji epitopi i odgovarajući ostaci mogu se generalno proširiti na sve takve AVPe u istom binu.

[0725] Da bi se dalje ispitali gornji rezultati u odnosu na AVP 31H4. poziciju E181R. za koje je. prema gornjoj kristalnoj strukturi, bilo predviđeno da interreaguju sa R 185 da formiraju deo od površine koja interreaguje sa AVP. takođe je bio izmenjen (E181R). Rczullati, i ako nisu statistički značajni sami po sebi, bili su, kada su kombinovani sa kristalnom strukturom, dokazni za interakciju 31H4 sa E181R (podaci nisu prikazani). Prema tome, izgleda da pozicija 181 takođe formira deo epitopa za 31 H4 AVP.

[0726] Kao što je napomenuto gore, gornji podaci vezivanja i karaktcrizacije epitopa navode PCSK9 sekvencu (SEQ ID NO: 1) koja ne uključuje prvih 30 amino kiselina od PCSK9. Prema tome, sistem numerisanja ovog fragmenta proteina, i SEQ ID NO: koji navode taj fragment, su pomereni za 30 amino kiselina u poređenju sa podacima i eksperimentima koji koriste sistem numerisanja za PCSK9 pune dužine (kao što su oni podaci koji su upotrebljeni u studiji kristala opisani gore). Prema tome, da bi se uporedili ovi rezultati, mora se dodati 30 ekstra amino kiselina na pozicije u svakom od gornjih rezultata mapiranja epitopa. Na primer. pozicija 207 od SEO ID NO: 1 (ili SEQ ID NO: 303), je u korelaciji sa pozicijom 237 od SEQ ID NO: 3 (sekvenca pune dužine, i sistem numerisanja koji je upotrebljen kroz ostatak prijave). Tabela 39.6 ističe kako su gore pomenute pozicije, koje pominju SEO ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303) u korelaciji sa SEO ID NO: 3 (koji uključuje signalnu sekvencu).

[0727] Prema tome. ta ostvarenja opisana ovde u vezi sa SF,Q II) NO: 1 mogu se takođe opisati, sa njihovim gore pomenutim odgovarajućim pozicijama u vezi sa SEO ID NO: 3.

[0728] PRIMER 40

[0729] Ogled vezivanja domena PCSK9

[0730] Ovaj ogled je ispitao gde se na PCSK9 vezuju različiti AVPi.

[0731] Prozirne, ploče maksimalne apsopcije sa 96 bunarčića (Nunc) su obavijene preko noći sa 2 ug/ml različitih anti-PCSK9 antitela razblaženih u PBS. Ploče su snažno isprane sa PBS/.05% Tween-20 i zatim blokirane tokom dva časa sa 3% BSA/PBS. Nakon ispiranja, ploče su inkubirane tokom dva časa ili sa PCSK9 pune dužine (aa 31-692 SEQ ID NO: 3. prokal PCSK9 (aa 31-449 SEQ ID NO: 3) ili v-domen PCSK9 (aa 450-692 od SRQ ID NO: 3) razblaženim u razblaživaču za opšti ogled (Immunochemistrv Technologies. LLC). Ploče su isprane i zečje poliklonalno biotinilizirano anti-PCSK9 antitelo (D8774). koje prepoznaje prokat i v-domen kao i PCSK9 pune dužine, je dodano u 1 ug/ml (u 1 %BSA/PBS). Vezani pune dužine, prokat ili v-domen PCSK9 je detektovan pomoću inkubiranja sa neutravidin-HRP (Thermo Scientific) na 200 ng/ml (u 1% BSA/PBS) praćenim sa TMB substratom (KPL) i merenjem apsorbance na 650 nm. Rezultati, prikazani na FIG. 28A i 28B. pokazuju sposobnost različitih ABS da se vezuju za različite delove PCSK9. Kao što je prikazano na FIG. 28B. AVP 3 1A4 se vezuje za V domen od PCSK9.

[0732] PRIMER 41

[0733] Neutralizacija, ne-kompetitivnih antigen vezujućih proteina

[0734] Ovaj primer pokazuje kako da se identifikuje i okarakteriše antigen vezujući protein koji je ne-kompcptitivan sa LDLR za vezivanje sa PCSK9. ali je još uvek neutralizujući u odnosu na aktivnost PCSK9. Drugim recima, takav antigen vezujući protein neće blokirati PCSK9 da se vezuje za LDLR. ali će sprečiti ili redukovati PCSK9 posredovanu degradaciju LDLR.

[0735] Prozirne, ploče sa 384 bunarčića (Costar) obavijene su sa 2 ug/ml kozjeg anti-LDL receptor antitela (R&D Svstems) razblaženog u puferu A (100 mM natrijum kakodilat, pH 7.4). Ploče su snažno isprane sa puferom A i zatim blokirane tokom 2 časa sa puferom B (1% mleko u puferu A). Nakon ispiranja, ploče su inkubirane tokom 1.5 časa sa 0.4 ug/ml od LDL receptora (R&D Svstems) razblaženog u puferu C (pufer B snabdeven sa 10 mM CaCh). Konkurentno sa inkubacijom, 20 ng/ml biotiniliranog D374Y PCSK9 je inkubirano sa 100 ng/ml antitela razblaženog sa puferom A ili samim puferom A (kontrola). Ploče koje su sadržale LDL receptor su isprane i biotinilirane D374Y PCSK9/antitelo mešavina je preneta u njih i inkubirana tokom 1 čaasa na sobnoj temperaturi. Vezivanje biotiniliranog D374Y za LDL receptor je detektovano pomoću inkubacije sa streptavidin-IIRP (Biosource) na 500 ng/ml u puferu C praćeno sa TMB supstratom (KPL). Signal jc ugašen sa IN HCl i apsorbanca je očitana na 450 nm. Rezultati su predstavljeni na FIG. 28C. koja pokazuje da dok AVP 31114 inhibira LDLR vezivanje. AVP 31A4 ne inhibira LDLR vezivanje za PCSK9. U kombinaciji sa rezultatima iz Primera 40 i prikazanim na FIG. 28A i 28B. i jasno je da se 31A4 AVP vezuje za V domen od PCSK9 i ne blokira interakciju PCSK9 sa LDLR.

[0736] Dalje je sposobnost AVP 31A4 da posluži kao neutralizujući AVP bila potvrđena preko ogleda uzimanja LDL od strane ćelija (kao sto je opisano u primerima gore). Rezultati tog ogleda uzimanja LDL su predstavljeni na FIG. 28D. Kao što prikazano na FIG. 28D. AVP 31A4 pokazuje značajnu sposobnost neutralizacije PCSK9. Prema tome. u svetlu Primera 40 i ovih rezultata, jasno je da AVPi mogu da se vežu za PCSK9 bez blokiranja PCSK9 i LDLR interakcije vezivanja, dok su još uvek korisni kao neulralizatori PCSK9 AVPa.

[0737] Ovde citirane reference

[0738] U opsegu da bilo koja od definicija ili koji od pojmova iznetih u referencama ovde navedenim se razlikuje od pojmova i ovde iznete diskusije, ovde izneti pojmovi i definicije prevladavaju.

[0739] Ekvivalenti

[0740] Smatra se da je ovde iznet pisani opis dovoljan da omogući stručnjaku da reprodukuje pronalazak. Prethodni opis i primeri detaljno opisuju neka poželjna ostvarenja ovog pronalaska. Međutim, treba ceniti da bez obzira na to koliko prethodno izgleda detaljno u iznetom tekstu. ovaj pronalazak može biti reprodukovan na mnogo načina i pronalazak treba razmatrati u skladu sa priloženim patentnim zahtevima i bilo kojim njihovim ekvivalentima.

[0741]

Claims

1. Monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za humani PCSK9 i koje je neutralizujuće zato sto je višak poinenutog antitela ili njegovog fragmenta sposoban da redukuje količinu PCSK9 vezanu za LDLR u ogledu kompelitivnog vezivanjain vitro,gde su pomenuto monoklonalno antitelo ili njegov fragment u kompeticiji za vezivanje PCSK9 sa (a) antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanca sekvence amino kiseline u SLQ ID NO: 49; i varijabilni region lakog lanca sekvence amino kiseline u SEO ID NO: 23; ili (b) antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanca sekvence amino kiseline u SEQ ID NO: 67; i varijabilni region lakog lanca sekvence amino kiseline u SEQ IDNO: 12.

2. Antigen vezujući protein, u kojem se (A) pomenuti antigen vezujući protein specifično vezuje za humani PCSK9 i on je neutralizujući zato što je višak pomenutog antigen vezujućeg proteina sposoban da redukuje količinu PCSK.9 vezanu za LDLR u ogledu kompetitivnog vezivanjain vitro.gde pomenuti antigen vezujući protein obuhvata bilo: (i) (a) kombinaciju varijabilnog domena lakog lanca i varijabilnog domena teškog lanca odabranu iz grupe kombinacija koju čine: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 9 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90%> identična sa SEQ ID NO: 71; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 10 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90%> identična sa SEQ ID NO: 72: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 12 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 67; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 16 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90%> identična sa SEQ IDNO: 52; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 17 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90%> identična sa SEQ ID NO: 51; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 20 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID<N>O: 54; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja jc najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 21 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 55; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ JD NO: 22 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 56: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 23 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 49: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% idenlična sa SEO ID NO: 24 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja jc najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 57: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90%) idenlična sa SEO ID NO: 26 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 50: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 30 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 64; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 31 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 62; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 33 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 65; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 35 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 79; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 36 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 80: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu kojaje najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 37 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90%> identična sa SEO ID NO: 76: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 38 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% idenlična sa SEO ID NO: 77: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 39 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ IDNO: 78: varijabilni domen lakog lanea koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 40 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 83: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 461 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90%) identična sa SEQ ID NO: 459: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 465 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ IDNO: 463: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90%> identična sa SEO ID NO: 473 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90%> identična sa SEO ID NO: 471; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 477 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 475; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEO ID NO: 485 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ IDNO: 483; (ii) (a) CDRH 1 koji obuhvata SI£Q ID NO: 308. CDRH2 koji obuhvata SEQ ID NO: 175. i CD RH 3 koji obuhvata SEQ ID NO: 1 80 ili (b) CDRH1 koji obuhvata SEQ ID NO: 368, CDRH2 koji obuhvata SEQ ID NO: 175. i CDRI 13 koji obuhvata SEQ ID NO: 180 i CDRLI koji obuhvata SEQ ID NO: 158. CDRL2 koji obuhvata SEO ID NO: 162. i CDRL3 koji obuhvata SEO ID NO: 395 (iii) CDRH1 koji obuhvata SEO ID NO: 368, CDRH2 koji obuhvata SEO ID NO: 1 74, i CDRI 13 koji obuhvata SEQ ID NO: 180 i CDRLI koji obuhvata SEO ID NO: 158, CDRL2 koji obuhvata SEO ID NO: 162. i CDRL3 koji obuhvata SEO ID NO: 164: ili (iv) CDRH1 koji obuhvata GFTFSSYWMS. CDRH2 koji obuhvata SIKQDGSEKYYVDSVKG i CDRH3 koji obuhvata DLVLMVYDIDYYYYGMDV i CDRLI koji obuhvata RSSOSLLIISNGYNYLD. CDRL2 koji obuhvata LGSNRAS i CDRL3 koji obuhvata MQALQ TPLT: ili (B) pomenuti antigen vezujući protein obuhvata (a) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEO ID NO: 23. i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEO ID NO: 49: ili (b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 23, u kojem je prvi ostatak glutaminska kiselina umesto glutamina. i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEO ID NO: 49. u kojem je prvi ostatak glutaminska kiselina umesto glutamina.

3. Antigen vezujući protein iz zahteva 2(A)(i) koji obuhvata kombinaciju varijabilnog domena lakog lanca i varijabilnog domena teškog lanca, u kojoj su varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca odabrani iz grupe kombinacija koja obuhvata: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEO ID NO: 10 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEO ID NO: 72: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90%> identičnosti sa SEO ID NO: 12 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEO ID NO: 67: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 17 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 51; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 23 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90%> identičnosti sa SEQ ID NO: 49; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 35 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 79: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 461 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 459; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 465 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 463; i varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90%> identičnosti sa SEO ID NO: 485 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90%o identičnosti sa SEO !D NO: 483. pri čemu se antigen vezujući protein speci lično vezuje za FCSK9.

4. Antigen vezujući protein prema zahtevu 3, u kojem su varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca odabrani iz grupe kombinacija koju čine: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 10 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEO ID NO: 72: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 12 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 67: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEO ID NO: 1 7 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SI^O ID NO: 51; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 23 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 49; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 35 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 79: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEO ID NO: 461 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 459; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SE20 ID NO: 465 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 463; i varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEO ID NO: 485 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEO ID NO: 483, pri Čemu se antigen vezujući protein specifično vezuje za PCSK.9.

5. Antigen vezujući protein prema zahtevu 2(A){ii) koji obuhvata: (a) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEO ID NO: 23. varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEO ID NO: 49; ili (b) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 23. u kojem je prvi ostatak glutaminska kiselina umesto glutamina i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 49 u kojem je prvi ostatak glutaminska kiselina umesto glutamina.

6. Antigen vezujući protein prema zahtevu 2(B)(b) ili 5(b). koji dalje obuhvata ostatak glicina na C-terminalnom kraju pomenutog varijabilnog domena lakog lanca.

7. Antigen vezujući protein prema zahtevu 2(A)(iii) koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekv encu amino kiseline od SEO ID NO: 17. i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEO ID NO: 51.

8. Antigen vezujući protein prema zahtevu 2(A)(iv) koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEO ID NO: 461. i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEO ID NO: 459.

9. Antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 2 do 8. koji dalje obuhvata: (a) konstantnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 156; (b) konstantnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 1 57; (c) konstantnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 154; (d) konstantnu sekvencu teškog lanca od SEO ID NO: 155; (c) konstantnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 156 i konstantnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 154. (f) konstantnu sekvencu lakog lanca od SEO ID NO: 157 i konstantnu sekvencu teškog lanca od SEO IDNO: 154: (g) konstantnu sekvencu lakog lanca od SEO ID NO: 156 i konstantnu sekvencu teškog lanca od SEQ IDNO: 155: ili (h) konstantnu sekvencu lakog lanca od SEO ID NO: 157 i konstantnu sekvencu teškog lanca od SEO ID NO: 155.

10. Antitelo ili njegov fragment ili antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih zahleva, u kojem antitelo ili njegov fragment ili antigen vezujući protein ima najmanje jednu od sledećih karakteristika: (a) da se vezuje za PCSK9 varijantu koja ima D374Y tačkastu mutaciju; (b) daje odabrano iz grupe koju čine humano antitelo, humanizovano antitelo. himerično antitelo. monoklonalno antitelo. višestruko specifično antitelo. rekombinantno antitelo, anti gen-vezujući fragment antitela, antitelo sa pojedinačnim lancem, dijatelo. Fab fragment, F(ab)2 fragment. IgGl antitelo, IgG2 antitelo, IgG3 antitelo i IgG4 antitelo; (c) da se vezuje za PCSK.9 sa K<d>koji je manji od 1 nM. manji od 100 pM, manji od 10 pM. ili je manji od 5 pM: ili (d) da može blokirali vezivanje D374Y PCSK9 za LDLR sa IC50 manjim od 200 pM.

11. Antitelo ili njegov fragment ili antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih zahleva, koji kada se vezuje za PCSK9: (a) vezuje se za PCSK9 sa istim Kd kao referentno antitelo; (b) inhibira vezivanje PCSK9 za LDLR sa istim IC50 kao pomenulo referentno anlilelo: ili (c) u kompeticiji je za vezivanje sa pomenutim referentnim antitelom za PCSK9. pri čemu pomenuto referentno antitelo obuhvata kombinaciju varijabilnog domena lakog lanca i teškog lanca sekvenci odabranih iz grupe koja se sastoji od varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekv encu kao što je postavljena u SFQ ID NO: 10 i varijabilnog domena teškog lanca koji ima sekvencu kao što je postavljena u SLQ ID NO: 72; varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekvencu kao sto je postavljena u SLQ ID NO: 12 i varijabilnog domena teškog lanca koji ima sekvencu kao sto je postavljena u SEQ ID NO: 67: varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekvencu kao što je postavljena u SKQ ID NO: 1 7 i varijabilnog domena teškog lanca koji ima sekvencu kao sto je postavljena u SEO 11) NO: 51; varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekvencu kao što je postavljena u SEO ID NO: 23 i varijabilnog domena teškog lanca koji ima sekvencu kao što je postavljena u SEO ID NO: 49: varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekvencu kao sto je postavljena u SEQ ID NO: 35 i varijabilnog domena teškog lanca koji ima sekvencu kao što je postavljena u SEQ ID NO: 79; varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekvencu kao Što je postavljena u SEQ II) NO; 461 i varijabilnog domena teškog lanca koji ima sekvencu kao šio je postavljena u SEQ ID NO: 459; varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekvencu kao stoje postavljena u SEQ ID NO: 465 i varijabilnog domena teškog lanca koji ima sekvencu kao sto je postavljena u SEQ ID NO: 463: i varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekvencu kao sto je postavljena u SEQ ID NO: 485 i varijabilnog domena teškog lanca koji ima sekvencu kao što je postavljena u SEQ ID NO: 483.

12. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili njegov fragment ili antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih zahteva.

13. Rekombinantni ekspresioni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 12.

14. Ćelija domaćin koja obuhvata vektor prema zahtevu 13.

15. 1 5. Ilibridom sposoban da proizvede antitelo prema zahtevu 10 ili 11.

16. Postupak pravljenja antitela ili njegovog fragmenta ili antigen vezujućeg proteina prema bilo kom od zahteva 1-11. koji obuhvata fazu pripremanja pomenutog antitela ili njegovog fragmenta ili pomenutog antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina koja luči pomenuto antitelo ili njegov fragment ili pomenuti antigen vezujući protein.

17. Antitelo ili njegov fragment ili antigen vezujući protein proizveden putem ekspresije rekombinantne DNK u ćeliji domaćinu prema zahtevu 14 ili hibridomu prema zahtevu 15.

18. Postupak prema zahtevu 16 ili antitelo ili njegov fragment ili antigen vezujući protein prema zahtevu 17, gde je ćelija domaćin odabrana iz grupe koju čine ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO). IleLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK). ćelije bubrega majmuna (COS). ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma i humane 293 ćelije epitela bubrega.

19. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedno antitelo ili njegov fragment ili najmanje jedan antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1 do 11. 17 ili 1 8 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

20. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 19. gde se farmaceutska kompozicija daje pre. jednovremeno sa. ili nakon, davanja najmanje jednog terapeutskog agensa, gde je po potrebi drugi terapeutski agens statin.

21. Kit za tretiranje poremećaja vezanih za holesterol koji obuhvata kompoziciju prema zahtevima 19 ili 20.

22. Antitelo ili njegov fragment ili antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1 do 11,17 ili 18 za upotrebu u tretiranju ili prevenciji stanja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu kod subjekta.

23. Antitelo ili njegov fragment ili antigen vezujući protein za upotrebu prema zahtevu 22, gde je stanje odabrano između hiperholesterolemije, kardiovaskularne bolesti, metabličkog sindroma, dijabetesa, sloga i dislipidemije.