RS54831B1 - Ne-humane životinje koje ispoljavaju antitela koja imaju zajednički laki lanac - Google Patents

Abstract

Genetski modifikovan miš koji obuhvata B ćeliju koja ispoljava promenljivi domen lakog lanca (VL) čoveka izveden iz preraspoređene ljudske Vκ39/Jκ5 sekvence koja je prisutna u klicinoj liniji čelije miša, pri čemu miš nema nepreraspoređeni endogeni Vκ segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni Jκ segment gena imunoglobulina; i pri čemu se ljudski VL domen(i) dovode u vezu sa domenom promenljivog teškog lanca (VH) čoveka izvedenim iz preraspoređenog ljudskog VH/DH/JH regiona izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4.Prijava sadrži još 19 patentnih zahteva.

Description

[0001] Oblast pronalaska

[0002] Genetski modifikovan miš je obezbeđen koji ispoljava antitela koja imaju zajednički ljudski

[0003] promenljivi/mišji konstantni laki lanac povezan sa različitim ljudskim promenljivim/mišjim konstantnim teškim lancima. Daje se postupak za pravljenje ljudskog bispecifičnog antitela iz sekvenci gena ljudskog promenljivog regiona iz B ćelija miša.

[0004] STANJE TEHNIKE

[0005] Antitela obično sadrže homodimernu komponentu teškog ianca, pri Čemu svaki monomer

[0006] teškog lanca jeste povezan sa identičnim lakim lancem. Antitela sa heterodimernom komponentom teškog lanca (npr. bispecifičnim antitelima) su poželjna kao terapijska antitela. Ali pravljenje bispecifičnih antitela koja imaju pogodnu komponentu lakog lanca koja može zadovoljavajuće da se poveže sa svakim od teških lanaca bispecifičnog antiela se pokazalo problematičnim.

[0007] U jednom pristupu, laki lanac može da bude odabran pregledanjem statističkih podataka o

[0008] upotrebi za sve domene promenljivog lakog lanca, koji identiftkuju najčešće korišćen laki lanac kod antitela čoveka, i uparivanje tog lakog lancain vitrosa dva teška lanca različite specifičnosti.

[0009] Kod drugog pristupa, laki lanac može da bude izabran posmatranjem sekvenci lakog lanca u

[0010] biblioteci prikaza faga (npr., biblioteka prikaza faga obuhvata sekvence promenljivog regiona lakog lanca kod čoveka, npr. biblioteke ljudskog scFv fragmenta) i odabir najčešće korišćenog promenljivog regiona lakog lanca iz biblioteke. Laki lanac može zatim da se testira na dva različita teška lanca koji su predmet interesovanja.

[0011] Kod drugog pristupa, laki lanac može da se izabere analizom biblioteke prikaza faga

[0012] promenljivih sekvenci lakog lanca korišćenjem kao proba promenljive sekvence teškog lanca oba teška lanca koja su predmet interesovanja. Laki lanac koji povezuje promenljive sekvence oba teška ianca može da bude izabran kao laki lanac za teške lance.

[0013] U drugom pristupu, laki lanac kandidata može da se poravna sa poznatim lakim lancima teških

[0014] lanaca, i modifikacije se prave u lakom lancu da se bliže poklope karakteristike sekvence zajedničke poznatim lakim lancima oba teška lanca. Ako treba svesti na minimum šanse za imunogenost, modifikacije preporučljivo daju kao rezultat sekvence koje su prisutne kod poznatih sekvenci lakog lanca kod čoveka, tako da je neverovatno da proteolitska obrada generiše epitop T ćelije na osnovu parametara i postupaka poznatih u tehnici za procenu verovatnoće irnunogenosti (t./,in silicokao i za vlažne probe).

[0015] Svi gore pomenuti pristupi se oslanjaju na in vitro postupke koji uključuju jedan broj a priori

[0016] ograničenja, npr., identičnost sekvence, sposobnost da se poveže sa specifičnim prethodno odabranim teškim lancima, itd. U tehnici postoji potreba za jedinjenjima i postupcima koji se ne

[0017] oslanjaju na manipulisanje in vitro uslova, ali koji umesto toga koriste više biološki opipljive pristupe da se naprave ljudski proteini za vezivanje epitopa koji obuhvataju zajednički lak lanac.

[0018] KRATK OPIS PRONALASKA

[0019] Ovde su dati genetski modifikovani miševi koji ispoljavaju i promenljive domene teškog lanca imunoglobulina kod čoveka i promenljive domene lakog lanca imunoglobulina kod čoveka, pri čemu miševi imaju ograničen repertoar promenlivog lakog lanca. Preciznije, genetski modifikovan miš je dat koji obuhvata B ćeliju koja ispoljava promenljivi domen lakog lanca (V<L>) kod Čoveka izveden iz preraspoređene sekvence V<k>1-39/J<k>5 kod čoveka koja je prisutna u klicinoj liniji miša, pri čemu mišu nedostaje nepreraspoređeni endogeni V<k>segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni J<k>segment gena imunoglobulina; pri čemu se V<L>domeni čoveka povezuju sa promenljivim domenom teškog lanca (V|_|) kod čoveka izvedenog iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona kod čoveka izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4. Takođe je data upotreba takvog miša za pravljenje antitela koja obuhvata promenljivi domen teškog lanca (V<h>) kod čoveka izveden iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona kod Čoveka izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6. 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4. Obezbeđen je još i postupak proizvodnje antitela na antigenu od interesa koji obuhvata domen promenljivog teškog lanca kod čoveka izveden iz preraspoređenog ljudskog V<h>/D<h>/J<h>regiona izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4,3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4,3-30/3-3/4. 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6,1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4 koji obuhvata: (a) imunizaciju miša datog sa antigenom koji je predmet interesovanja; (b) dobijanje iz miša promenljivog domena teškog lanca kod čoveka iz preraspoređenog ljudskog V<h>/D<h>/J<h>regiona izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6. 1-69/6-6/5 or 1-69/6-13/4; i (c) korištenje sekvence promenijivog regiona imunoglobulina dobijene pod (b) za antitelo koje specifično vezuje antigen koji je predmet interesovanja.

[0020] [0009] Takođe je dat i genetski modifikovan miš koji obuhvata B ćeliju koja ispoljava promenljivi domen lakog lanca (V|_) kod čoveka izveden iz preraspoređene V<k>3-2Q/J<k>1 sekvence kod čoveka koja je prisutna u klicinoj liniji miša, pri čemu mišu nedostaje nepreraspoređeni endogeni Vk segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni J<k>: segment gena imunoglobulina; i pri čemu promenljiv domen lakog lanca (V{_) kod čoveka je povezan sa promenljivim domenom teškog lanca {V<h>) kod čoveka izvedenim iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona kod čoveka izabranim iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4. Još je obezbeđena upotreba takvog miša koji je dat za pravljenje antitela koje sadrži promenljivi domen teškog lanca (V<h>) čoveka izveden iz preraspoređenog Vh/Dh/Jh regiona Čoveka izabranog iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4. Još je obezbeđena upotreba takvog miša koji je dat za pravljenje antitela koje sadrži promenljivi domen teškog lanca (V<h>) čoveka izveden iz preraspoređenog V<h>/D(-|/J<h>regiona čoveka izabranog iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4. Obezbeđen je još i postupak proizvodnje antitela na antigenu od interesa koji obuhvata promenljivi domen teškog lanca čoveka izveden iz preraspoređenog ljudskog V<h>/Đ<h>/J<h>regiona izabranog iz 3-30/3-3/3. 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4 koji obuhvata: (a) imunizovanje miša koji je dat sa antigenom od interesa; (b) dobijanje iz miša promenljivog domena teškog lanca čoveka izvedenog iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona čoveka izabranog iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4; i (c) iskorišćavanje sekvence promenlivog regiona imunoglobulina dobijene pod (b) za antitelo koje specifično vezuje antigen od interesa.

[0021] Ovaj se pronalazak takođe odnosi i na biloški sistem za generisanje promenljivog domena lakog lanca čoveka koji se povezuje i ispoljava sa različitim afinitetno zrelim repertoarom promenljivih domena teškog lanca čoveka. Takođe se odnosi na postupke za pravljenje proteina koji se vezuju a obuhvataju promenljive regione imunoglobulina, koji obuhvataju imunizovanje miša koji ima ograničen repertoar lakog lanca imunoglobulina sa antigenom od interesa, i korišćenje sekvence promenljivog regiona gena imunoglobulina miša za vezivanje proteina koji specifično vezuje antigen od interesa. Postupci obuhvataju postupke za pravljenje promenljivih domena teškog lanca imunoglobulina čoveka pogodne za upotrebu višestruko specifičnih proteina koji vezuju antigen.

[0022] Ovde dati genetski projektovani miševi mogu da odaberu pogodne afinitetno zrele promenljive domene teškog lanca imunoglobulina čoveka izvedene iz repertoara nepreraspoređenih segmenata gena promenljivog regiona teškog lanca kod čoveka, pri čemu se afinitetno zreli promeljivt domeni teškog lanca čoveka povezuju i ispoljavaju sa jednim promenlivim domenom lakog lanca čoveka izvedenim iz jednog segmenta gena promenljivog regiona lakog lanca kod čoveka. Takođe, dati su genetski projektovani miševi koji predstavljaju izbor dva segmenta gena promenljivog regiona lakog lanca kod čoveka.

[0023] Dati su genetski projektovani miševi koji ispoljavaju ograničeni repertoar promenljivih domena lakog lanca kod čoveka, ili samo jedan promenljivi domen lakog lanca čoveka, iz ograničenog repertoara sekvenci promenljivog regiona lakog lanca čoveka. Miševi su genetski projektovani da obuhvate samo jednu V/J sekvencu lakog ianca čoveka (ili dve V/J sekvence) koje ispoljavaju promenljivi region samo jednog lakog lanca (ili koji ispoljavaju jedan od dva ili oba od dva promenljiva regiona). Preraspoređene sekvence su preraspoređena ljudska V<k>1-39/J<k>5 sekvenca, preraspoređena ljudska Vk3-20/Jk1 . ili obe. Laki lanac obuhvata promenijivu sekvencu koja je sposobna da se upari sa mnoštvom afinitetno zrelih teških lanaca čoveka klonaino izabranih pomoću miševa, pri čemu promenljivi regioni teškog ianca specifično vezuju različite epitope.

[0024] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji obuhvata samo jedan segment gena promenljivog regiona lakog lanca (VL) imunoglobulina Čoveka koji može da se prerasporedi sa J segmentom gena čoveka (odabranim iz jednog ili više JL segmenata) i kodira ljudski VL domen lakog lanca imunoglobulina. U drugom primem, miš obuhvata ne više od dva VL segmenta gena čoveka, od kojih svaki može da se prerasporedi sa ljudskim J segmentom gena (izabranim iz jednog ili više J<l>segmenata) i kodira ljudski V[_ domen lakog lanca imunoglobulina.

[0025] [0014] U jednom primem, jedanV\_segmentgena čoveka je operativno povezan na J|_ segment gena čoveka izabran iz Jtc1, J<k>2, J<k>3, J<k>4, i J<k>5, pri čemu taj jedan V[_ segment gena čoveka može da se prerasporedi da se formira kodirajuća sekvenca gena promenljivog regiona lakog ianca sa jednim ili više J|_ segmenata gena čoveka.

[0026] Takođe se pominju kao genetski modifikovan miš koji obuhvata lokus lakog lanca imunoglobulina koji ne obuhvata endogeni V<l>segment gena miša sposoban za preraspoređivanje za formiranje gena lakog lanca imunoglobulina, pri čemu V<j>_ lokus obuhvata jedan V|_ segment gena koji može da se prerasporedi da enkodira V<l>region gena lakog lanca. U specifičnom primeru, V|_ segment gena čoveka je V<k>1-39J<k>5 segment gena čoveka ili V<k>3-20J<k>1 segment gena čoveka. Takođe se odnose na genetski modifikovan miš koji obuhvata Vj_ lokus koji ne obuhvata endogeni V<l>segment gena miša koji je sposoban za preraspoređivanje da se formira gen lakog lanca imunoglobulina, pri čemu V<l>lokus obuhvata ne više od dva V<l>segmenta gena čoveka koja su sposobna za preraspoređivanje da se kodira V<l>region gena lakog ianca. U specifičnom primeru, ne više od 2 V<l>segmenta gena čoveka jesu V<k>1-39J<k>5 segment gena čoveka i V<k>3-20J<k>1 segment gena čoveka.

[0027] U jednom varijantnom rešenju, ovde dat genetski modifikovan miš obuhvata jedan preraspoređen (V/J) promenljivi region lakog lanca (V|_) imunoglobulina čoveka (t.j., V<l>/J<l>region) koji kodira V<l>domen lakog ianca imunoglobulina čoveka. U drugom varijantnom rešenju, miš obuhvata ne više od dva preraspoređena VL regiona čoveka koja mogu da kodiraju VL domen čoveka lakog lanca imunoglobulina. Preraspoređene sekvence su preraspoređena ljudska V<k>1-39/J<k>5 sekvenca, preraspoređena Ijudksa Vk3-20/Jk1, ili obe.

[0028] U specifičnom izvođenju, V<l>region je V<k>1-39J<k>5 sekvenca čoveka ili V<k>3-20J<k>1 sekvenca čoveka. U specifičnom izvođenju, miš ima i ljudsku V<k>1-39J<k>5 sekvencu i ljudsku V<k>3-20J<k>1 sekvencu.

[0029] U jednom izvođenju, V<l>segment gena čoveka je operativno povezan na ljudsku ili mišju vodeću sekvencu. U jednom izvođenju, vodeća sekvenca je mišja vodeća sekvenca. U specifičnom izvođenju, mišja vodeća sekvenca je mišja V<k>3-7 vodeća sekvenca. U specifičnom izvođenju, vodeća sekvenca je operativno povezana na preraspoređen u V<l>/J<l>sekvencu.

[0030] U jednom izvođenju, VL segment gena je operativno povezan na promoter sekvencu imunoglobulina. U jednom izvođenju, promoter sekvenca je ljudska promoter sekvenca. U specifičnom izvođenju, promoter imunoglobulina čoveka je ljudski V<k>3-15 promoter. U specifičnom izvođenju, promoter je operativno povezana na preraspoređen u ljudsku V<l>/J<l>sekvencu.

[0031] Takođe se odnosi na lokus lakog lanca koji obuhvata bočnu vodeću {sekvencu koja se pruža na bilo koju stranu specifične sekvence) 5' {smerom transkripcije Vl segmenta gena) sa promoterom imunoglobulina čoveka i bočnim 3' sa ljudskim V<l>segmentom gena koji se preraspoređuje sa ljudskim J segmentom gena i kodira V<l>domen reverznog himernog lakog lanca koji obuhvata endogeni konstantni region iakog lanca (CL) miša. U specifičnom izvođenju, VL segment gena je na V<k>lokusu miša, i mišji C<l>j<e>C<k>miša.

[0032] [0021] U jednom izvođenju, lokus lakog lanca obuhvata bočnu vodeću sekvencu 5" (u vezi sa transkripcionim smerom V<l>segmenta gena) sa promoterom imunoglobulina kod čoveka i bočnim 3' sa preraspoređenim ljudskim V<l>regionom (V<l>/J<l>sekvenca) i kodira V<l>domen reverznog himernog lakog lanca koji obuhvata endogeni konstantni region iakog lanca (CL) miša. U specifičnom izvođenju, preraspoređena ljudska V<l>/J<l>sekvenca je kapa (<k>) lokus miša, i C<l>miša jeste C<k>miša.

[0033] U jednom izvođenju, V<l>lokus modifikovanog miša jeklokus lakog lanca, i<k>lokus lakog lanca obuhvata mišji<k>intronski pojačivač,<k>

3' pojačivač miša, ili i intronski pojačivač i 3' pojačivač.

[0034] U jednom izvođenju, miš obuhvata nefunkcionalni lokus lambda lakog lanca( k)imunoglobulina. U specifičnom izvođenju,Xlokus lakog lanca obuhvata brisanje jedne ili više sekvenci lokusa, pri čemu jedna ili više delecija prikazuje nesposobnostXiokus iakog lanca za preraspoređivanje da se dobije gen lakog lanca. U drugom izvođenju, svi ili pretežno svi V<l>segmenti genaXlokusa lakog lanca se biršu.

[0035] U jednom izvođenju, miš pravi laki lanac koji obuhvata somatski mutiran VL domen izveden iz VL segmenta gena čoveka. U jednom izvođenju, laki lanac obuhvata somatski mutiran Vl domen izveden iz V<l>segmenta gena kod čoveka, i Ck region miša. U jednom izvođenju, miš ne ispoljavaXlaki lanac.

[0036] U jednom izvođenju, genetski modifikovan miš je pogodan za somatsko hi permutiranje sekvence V<l>regona čoveka.

[0037] U jednom izvođenju, miš obuhvata ćeliju koja ispoljava laki lanac koji obuhvata somatski mutiran V<l>domen čoveka povezan na mišji C<:>c, pri čemu se laki lanac povezuje sa teškim lancem koji obuhvata somatski mutiran Vj-j domen izveden iz ljudskog V(-| segmenta gena i pri čemu teški lanac obuhvata konstantni region teškog lanca (C<h>) rniša U specifičnom izvođenju, teški lanac obuhvata mišji C<h>1, zglob karakterističan za miša, mišji C<h>2, i mišji C<h>3. U specifičnom izvođenju, teški lanac obuvhata C<h>1 čoveka, zglob, C<h>2 miša, i C<h>3 miša.

[0038] U jednom izvođenju, miš obuhvata zamenu endogenih V<^>segmenata gena miša sa jednim ili više V|_j segmenata gena čoveka, pri čemu su V<f>_| segmenti gena čoveka su operativno povezani na C|_j region gena miša, tako da miš preraspoređuje V<^>segmente gena čoveka I ispoljava reverzni teški lanac himernog imunoglobulina koji obuhvata V(-| domen čoveka i C}-j miša. U jednom izvođenju, 90-100% nepreraspoređenih V<j>-( segmenata gena miša se zameni sa najmanje jednim nepreraspoređenim Vh segmentom gena čoveka. U specifičnom izvođenju, svi ili pretežno svi od endogenih Vh segmenata gena miša su zamenjeni najmanje jednim nepreraspoređenim V<h>segmentom gena čoveka. U jednom izvođenju, zamena je sa najmanje 19, najmanje 39, ili najmanje 80 ili 81 nepreraspoređenih V|_j segmenta gena čoveka. U jednom izvođenju, zamena je sa najmanje

[0039] 12 funkcionalnih nepreraspoređenih V(-<j>segmenata gena čoveka, najmanje 25 funkcionalnih V|_| segmenata gena čoveka, iii najmanje 43 funkcionalnih nepreraspoređenih V<h>segmenata gena čoveka. U jednom izvođenju, miš obuhvata zamenu svih D<h>i Jh segmenata miša najmanje jednim nepreraspoređenim Dh segmentom čoveka i najmanje jednim nepreraspoređenim Jh segmentom Čoveka. U jednom izvođenju, najmanje jedan nepreraspoređeni Dh segment čoveka je izabran iz 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3. 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, i njihove kombinacije. U jednom izvođenju, najmanje jedan nepreraspoređen Jh segment čoveka je odabran iz 1, 2, 3, 4, 5, 6, i njihove kombinacije. U specifičnom izvođenju, jedan ili više Vh segmenta gena čoveka se bira iz 1-2, 1- 8, 1-24, 1 - 69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, a 6-1 čoveka V<h>segmenta gena, i njihove kombinacije.

[0040] Genetski modifikovan miš se dobija koji sadrži B ćeliju koja ispoljava promenljivi domen lakog lanca čoveka (V|_) izveden iz preraspoređene V<k>1-33/J<k>5 sekvence čoveka koja je prisutna u klicinoj liniji miša, pri čemu kod miša nedostaje nepreraspoređen V<k>segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni J<k>segment gena imunoglobulina; i pri čemu V<[>_ domen(i) čoveka se povezuju sa promeljivim domenom teškog lanca (V<h>) čoveka izvedenog iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona čoveka izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-8/5, 3-23</>2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4. Takođe je dat genetski modifikovan miš koji obuhvata B ćeliju koja ispoljava V<l>domen kod čoveka izveden iz preraspoređene V<k>3-20/J<k>1 sekvence kod čoveka koja je prisutna u klicinoj liniji miša, pri čemu mišu nedostaje nepreraspoređeni endogeni V<k>segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni J<k>segment gena imunoglobulina; i pri čemu je Vl domen kod čoveka povezan sa Vh domenom čoveka izvedenim iz preraspoređenog V<h/dh/>^<H>regi°r>a čoveka izabran iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 or 3-53/1-1/4.

[0041] Takođe se odnosi na miša koji obuhvata B ćeliju koja ispoljava vezivanje proteina koji specifično vezuje antigen od interesa, pri čemu vezivanje proteina obuhvata laki Inac izveden iz preraspoređenja V<k>1-39/J<k>5 čoveka i preraspoređenja V<k>3-20/J<k>1 čoveka, i pri čemu ćelija obuhvata preraspoređen i gen teškog lanca imunoglobulina izveden iz preraspoređenja ljudskih V<h>segmenata gena odabranih iz 1-69, 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 4-59, i 5-51 segmenta gena. U jednom primeru, jedan ili više V<h>segmenata gena su preraspoređeni sa teškim lancem čoveka J<h>segmenta gena izabranog iz 1, 2, 3, 4, 5, i 6. U jednom primeru, jedan ili više V<h>i J<h>segmenata gena se preraspoređuje sa D<h>segmentom gena čoveka izabranom iz 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2- 15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, i 7-27. U specifičnom primeru, gen lakog lanca ima 1, 2, 3, 4, ili 5 ili više somatskih hipermutacija.

[0042] [0030] U jednom izvođenju, miš obuhvata B ćeliju koja obuhvata preraspoređen u sekvencu gena promenljivog regiona teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata V<h>/D<h>/J<h>region izabran iz 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1 -1/4, 3- 30/1-7/4, 3-30/3-3/3. 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3- 30/5-12/4, 3-30/6-6/1 , 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7- 27/5. 3-30/7-27/6, 3-33/1 -7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4,4-59/3-22/3, 5-51/3-16/6, 5-51/5-5/3, 5-51/6-13/5, 3-53/1-1/4, 1 - 69/6-6/5, i 1 -69/6-13/4- U specifičnom izvođenju, B ćelija ispoljava vezivanje proteina koji obuhvata promenljivi region teškog lanca imunoglobulina kod čoveka spojen sa konstantnim regionom teškog lanca miša, i promenljivi region iakog lanca imunoglobulina čoveka spojen na konstantni region lakog lanca miša. U jednom izvođenju, preraspoređeni Vl region čoveka je V<k>1-39J<k>5 sekvenca kod čoveka, i miš ispoljava reverzni himerni laki lanac koji obuhvata (i) V<l>domen je izveden iz V<l>/J<l>sekvence čoveka i (ii) C<l>miša; pri čemu se laki lanac povezuje sa reverznim himernim teškim lancem koji obuhvata (i) C<h>miša i (ii) somatski mutiran V<h>domen čoveka izveden iz V<h>segmenta gena čoveka izabranog iz 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33,

[0043] 3- 48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 ljudski V<h>segment gena, i njihovu kombinaciju. U jednom izvođenju, miš ispoljava laki lanac koji je somatski mutiran. U jednom izvođenju C|_ je mišji C<k>. U specifičnom izvođenju, V<h>segment gena čoveka je izabran iz 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 4-59, 5-51, i 1-69 segment gena. U specifičnom izvođenju, somatski mutiran V<h>domen čoveka obuhvata sekvencu izvedenu iz D<h>segmenta odabranog iz 1-1, 1-7, 2-8, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, i 7-27. U specifičnom izvođenju, somatski mutiran V<h>domen čoveka obuhvata sekvencu izvedenu iz J<h>segmenta izabranog iz 1, 2, 3, 4, 5, i 6. U specifičnom izvođenju, somatski mutiran ljudski Vh domen se kodira preraspoređenom V<h>/D<h>/J<h>sekvencom čoveka izabranom iz 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/5-5/3, I-69/6-5/5, i 1-69/6-13/4.

[0044] U jednom izvođenju, miš obuhvata B ćeliju koja ispoljava vezivanje proteina koji specifično vezuje antigen od interesa, pri čemu vezivanje proteina obuhvata laki lanac izveden iz preraspoređenja V<k>1-39/J<k>5 kod čoveka, i pri Čemu ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena promenljivog regiona teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata V<h>/D<h>/J<h>region izabran iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6,1-69/6-6/5 i 1-69/6-13/4., U specifičnom izvođenju, B ćelija ispoljava vezivanje proteina koje obuhvata promenljivi region teškog lanca imunoglobulina kod čoveka spojen sa konstantnim regionom teškog lanca miša, i promenljivi region lakog lanca imunoglobulina kod čoveka spojen sa konstantnim regionom lakog lanca miša.

[0045] U jednom izvođenju, preraspoređeni V<l>region čoveka je V<k>3-20J<k>1 sekvenca kod čoveka, i miš ispoljava reverzni htmerni laki lanac koji obuhvata (i) Vl domen izveden iz preraspoređene V<l>/J<l>sekvence kod čoveka, i (ii) Cl miša; pri čemu se laki lanac povezuje sa reverznim fiimernim teškim lancem koji obuhvata (i) C<h>miša, i (ii) somatski mutiran ljudski V<h>izveden iz ljudskog V<h>segmenta gena izabran iz 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9. 3-11,3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4- 31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 ljudski V<h>segment gena i njihove kombinacije. U jednom izvođenju, miš ispoljava laki lanac koji je somatski mutiran. U jednom izvođenju C<l>je mišji C<k>. U specifičnom izvođenju, V<h>segment gena čoveka je izabran iz 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, i 5-51 segmenta gena. U specifičnom izvođenju, somatski mutiran V<h>domen Čoveka obuhvata sekvencu izvedenu iz Dh segmenta izabranog iz 1-1, 1-7, 1-26, 2-15, 3-3, 3-16, i 6-13. U specifičnom izvođenju, somatski mutirani V<h>domen čoveka obuhvata sekvencu izvedenu iz J<h>segmenta izabranog iz 3, 4, 5, i 6. U specifičnom izvođenju, somatski mutiran V<h>domen čoveka se kodira preraspoređenom V<h>/D<h>/J<h>sekvencom čoveka izabranom iz 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 5-51/3-16/6, 5-51/6-13/5, i 3-53/1-1/4.

[0046] [0033] U jednom izvođenju, miš obuhvata B ćeliju koja ispoljava vezivanje proteina koji specifično vezuje antigen od interesa, pri čemu vezivanje proteina obuhvata iaki lanac izveden iz preraspoređenja V<k>3-20/J<k>1 kod čoveka, i pri čemu ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena promenljivog regiona teškog lanca imunoglobulina V<h>/D<h>/J<h>region izabran iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, i 3-53/1-1/4. U specifičnom izvođenju, ćelija B ispoljava vezivanje proteina koji sadrži promenljivi region teškog lanca imunoglobulina čoveka spojen na konstantni region teškog lanca miša, i promenljivi region lakog lanca imunoglobulina kod čoveka spojen sa konstantnim regionom lakog lanca miša. konstantni region.

[0047] U jednom izvođenju, miš obuhvata i preraspoređenu V<k>1-39J<k>5 sekvencu čoveka i preraspoređenu sekvencu V<k>3-20J<k>1 čoveka, i miš ispoljava reverzni himerni iaki lanac koji obuvhata (i) Vl domen izveden iz V<k>1-39J<k>5 sekvence čoveka ili V<k>3-20J<k>1 sekvence čoveka, i (ii) C<l>miša; pri čemu je laki lanac povezan sa reverznim himemim teškim lancem koji obuhvata (i) C<h>miša, i (ii) somatski mutiran V<h>čoveka izveden iz Vh segmenta gena čoveka izabran iz 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 V<h>segment gena čoveka, i neke njihove kombinacije. U jednom izvođenju, miš ispoljava laki lanac koji je somatski mutiran. U jednom izvođenju C<l>je mišji C<k>.

[0048] Kod različitih izvođenja, promenljivi region teškog lanca imunoglobulina kod čoveka je spojen sa konstantnim regionom teškog lanca miša i promenljivim regionom lakog lanca imunoglobulina čoveka sa konstantnim regionom lakog lanca miša ispoljenim B ćelijom su poznati kod miša. Kod različitih izvođenja, himerni laki lanac i himerni teški lanac koje je ispoljio miš su poznati kod miša.

[0049] U jednom izvođenju, 90-100% endogenih nepreraspoređenih V<h>segmenata gena miša se zameni sa najmanje jednim nepreraspoređenim V<H>segmentom gena čoveka. Kod specifičnog izvođenja, svi ili pretežno svi od endogenih nepreraspoređenih V<h>segmenata gena miša se zamene najmanje jednim nepreraspoređenim Vh segmentom gena čoveka. U jednom izvođenju, zamena je sa najmanje 18, najmanje 39, ili najmanje 80 ili 81 nepreraspoređenih segmenata Vh gena kod čoveka. U jednom izvođenju, zamena je sa najmanje 12 funkcionalnih nepreraspoređenih V<h>segmenata gena čoveka, najmanje 25 funkcionalnih nepreraspoređenih V<h>segmenata gena čoveka, ili najmanje 43 nepreraspoređenih Vh segmenata gena čoveka.

[0050] U jednom izvođenju, genetski modifikovan miš pripada soju C57BL, u specifičnom izvođenju izabranom iz C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/Q1a. U specifičnom izvođenju, genetski modifikovan miš je mešavina gore pomenutog soja 129 i gore pomenutog soja C57BL/6. U još jednom specifičnom izvođenju, miš je mešavina gore pomenutih sojeva 129, ili mešavina gorepomenutih sojeva BL/6. U specifičnom izvođenju, 129 soj mešavine soja 129S6 (129/SvEvTac).

[0051] U jednom izvođenju, miš ispoljava reverzno himerno antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata C? miša i somatski mutiran V<l>domen čoveka izveden iz preraspoređene V<k>1 -39J<k>5

[0052] sekvence čoveka ili preraspoređenu V<k>3-20J<k>1 sekvencu čoveka, i teški lanac koji obuhvata mišji Ch i somatski mutiran V<h>domen čoveka izveden iz ljudskog V<h>segmenta gena izabranog iz 1-2, 1-8,

[0053] 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5- 51, i 6-1 V(-| segment gena čoveka, pri čemu miš ne ispoljava potpuno mišje antitelo i ne ispoljava potpuno ljudsko antitelo, U jednom izvođenju miš obuhvata<k>lokus lakog lanca koji obuhvata zamenu endogenog<k>segmenata gena lakog lanca miša sa preraspoređenom V<k>1-39J<k>5 sekvencom čoveka ili preraspoređenom V<k>3-20J<k>1 sekvencom čoveka, i obuhvata zamenu svih ili pretežno svih endogenih V<h>segmenata gena miša sa potpunim ili pretežno potpunim repertoarom V<h>segmenata gena čoveka.

[0054] Takođe se odnosi na miša koji ispoljava laki lanac imunoglobulina iz preraspoređene sekvene lakog lanca imunoglobulina u klcinoj liniji miša, pri čemu laki lanac imunoglobulina obuhvata pramen ljivu sekvencu čoveka.

[0055] U jednom izvođenju, klicina linija miša nema funkcionalno nepreraspoređen V segment gena lakog lanca imunoglobulina. U jednom izvođenju, klicina linija miša nema funkcionalno nepreraspoređen J segment gena lakog lanca imunoglobulina.

[0056] U jednom izvođenju, klicina linija miša obuhvata ne više od jedne, ne više od dve, ili ne više od tri preraspoređene (V/J) sekvence lakog lanca.

[0057] k Sekvenca lakog lanca se bira iz V<k>1-39/J<k>1 sekvence čoveka. V<k>3-20/J<k>5 sekvence čoveka, i njihove kombinacije. U specifičnom izvođenju,<k>sekvenca lakog lanca je ljudska V<k>1 - 39/J<k>5 sekvenca. U specifičnom izvođenju,<k>sekvenca lakog lanca je ljudska V<k>3 -20/J<k>I sekvenca.

[0058] U jednom izvođenju, miš još obuhvata u svojoj klicinoj liniji sekvencu izabranu iz mišjeg<k>intronskog pojačivača 5' prema preraspoređenoj sekvenci lakog lanca imunoglobulina, mišjeg<k>3' pojačivača, i njihove kombinacije.

[0059] U jednom izvođenju, miš obuvhata nepreraspoređen: V<j>_<j>segment gena čoveka, nepreraspoređeni D<h>segment gena čoveka, i nepreraspoređeni J<h>segment gena čoveka, pri čemu su pomenuti V<h>, D<h>. i J<h>segmenti gena sposobni za preraspoređivanje da se formira sekvenca gena promenljivog teškog lanca imunoglobulina povezana na sekvencu gena konstantnog teškog lanca. Miš obuhvata više segmenata gena V<h>, D<h>i J<h>čoveka. U specifičnom izvođenju, V<h>, D<h>, i J<h>segmenti gena čoveka zamenjuju endogene V<h>, D<h>, i J<h>segmente gena miša na lokusu teškog lanca endogenog mišjeg imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, miš obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih V<h>, D<h>, i J<h>segmenata gena miša svim ili pretežno svim funkcionalnim V<h>, D<h>, i J<H>segmentima gena čoveka.

[0060] U jednom izvođenju, miš ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata konstantnu sekvencu miša. U jednom izvođenju, miš ispoljava iaki lanac imunoglobulina koji obuhvata konstantnu sekvencu čoveka..

[0061] U jednom izvođenju, miš ispoljava teški lanac imunoglobulina koji obuhvata sekvencu miša izabranu iz C<h>1 sekvence, sekvencu zgloba, C<h>2 sekvencu, C<h>3 sekvencu, i njihovu kombinaciju.

[0062] U jednom izvođenju, miš ispoljava teški lanac imunoglobulina koji obuhvata sekvencu čoveka izabranu iz C<h>1 sekvence, sekvencu zgloba, C<h>2 sekvence, C<h>3 sekvence, i njihovu kombinaciju.

[0063] [0048] U jednom izvođenju, preraspoređena sekvenca lakog lanca imunoglobulina u klicinoj liniji miša je endogeni lokus lakog lanca imunoglobulina mišjeg. U specifičnom izvođenju, preraspoređena sekvenca lakog lanca imunoglobulina u klicinoj liniji miša zamenjuje sve ili u većoj meri sve V i J sekvence lakog lanca miša na endogenom lokusu lakog lanca mišjeg imunoglobulina.

[0064] Takođe se odnosi na ćeliju miša koja je izolovana iz miša kako je ovde opisano. U jednom primeru, ćelija je ES ćelija. U jednom primeru, ćelija je limfocit. U jednom primeru, limfocit je B ćelija. U jednom primeru, B ćelija ispoijava himerni teški lanac koji obuhvata promenljivi domen izveden iz segmenta gena čoveka; i laki lanac izveden iz preraspoređene V<k>1-39/J<k>5 sekvence čoveka, preraspoređene V<k>3-20/J<k>1 sekvence čoveka, ili njene kombinacija; pri čemu se promenljivi domen teškog lanca spaja na konstantni region miša i promenljivi domen lakog lanca se spaja na konstantni region miša ili konstantni region čoveka.

[0065] Takođe se odnosi na B ćeliju miša koja se izoluje iz miša kako je ovde opisano, pri čemu B ćelija ispoljava himerni teški lanac izveden iz preraspoređene V<h>/D<h>/J<h>sekvence čoveka izabrane iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 i 1-69/6-13/4; i himerni laki lanac izveden iz preraspoređene V<k>1-39/J<k>5 sekvence čoveka; pri čemu se promenljivi domen spaja na konstantni region miša i promenljivi domen lakog lanca se spaja na konstantni region miša.

[0066] Takođe se odnosi na B ćeliju miša koja se izoluje iz miša kako je ovde opisano, pri čemu B ćelija ispoljava himerni teški lanac izveden iz preraspoređene Vh/Dh/Jh sekvence čoveka izabrane 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-1 5/4, i 3-53/1-1/4; i himernog lakog lanca izvedenog iz preraspoređene V<k>3-20/J<k>1 sekvence čoveka; pri čemu se promenljivi domen spaja na konstantni region miša i promenljivi domen lakog lanca se spaja na konstantni region miša.

[0067] U različitim primerima, himerni teški i laki lanci ispoljeni B ćelijom izolovani iz miša kako je ovde opisano su poznati kod miša.

[0068] Takođe se odnosi na hibridom, pri čemu se hibridom pravi sa B ćelijom miša kako je ovde opisano. U specifičnim primerima, B ćelija je iz miša kako je ovde opisano koji je imunizovan imunogenom koji obuhvata epitop koji je predmet interesa, i B ćelija ispoljava vezivanje proteina koji se vezuje na epitop od interesa, vezivanje proteina ima somatski mutiran Vh domen čoveka i Ch miša, i ima VL domen čoveka izveden iz preraspoređenog ljudskog V<k>1-39J<k>5 ili preraspoređenog ljudskog V<k>3-20J<k>1 i mišjeg C|_-

[0069] Takođe se odnosi na hibridom koj je napravljen sa B ćelijom miša kako je ovde opisano, pri čemu hibridom ispoljava himerni teški lanac izveden iz preraspoređene V<h>/D<h>/J<h>sekvence Čoveka izabrane iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 i /6-13/4; i himerni laki lanac izveden iz preraspoređene V<k>1-39/J<k>5 sekvence čoveka; pri čemu se promenljivi domen spaja na konstantni region miša i promenljivi domen lakog lanca se spaja na konstantni region miša.

[0070] Takođe se odnosi na hibridom koji je napravljen sa B ćelijom miša kako je ovde opisano, pri čemu hibridom ispoljava himerni teški lanac izveden iz preraspoređene V<h>/D<h>/J<h>sekvence čoveka izabrane iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, i 3-53/1-1/4; i himerni laki lanac izveden iz preraspoređene V<k>3-20/J<k>1 sekvence čoveka; pri čemu se promenljivi domen spaja na konsantni region miša i promenljivi domen lakog lanca se spaja na konstantni region miša.

[0071] [0056] U različitim primerima, himerni teški i laki<l>anci su ispoljeni putem hibridoma koji se prave sa B ćelijom miša kako je ovde opisano su poznati kod hibridoma. U različitim primerima, himerni teški i laki lanci ispoljeni pomoću hibridoma koji se prave sa B ćelijom miša kako je ovde opisano su poznati kod B ćelije miša.

[0072] Takođe se odnosi na embrion miša, pri čemu embrion obuhvata ES ćeliju đonora koji se izvodi iz miša kako je ovde opisano.

[0073] Takođe se odnosi na ciljni vektor, obuhvata, od 5' do 3' u transkripcionom smeru sa pozivom na sekvence 5' i 3' homologne krake miša vektora, 5' homologni krak miša, promoter imunoglobulina čoveka ili miša, vodeća sekvenca čoveka ili mišs, i V|_ region Čoveka izabran od preraspoređene ljudske V<k>1-39J<k>5 ili preraspoređen ljudski V<k>3-20J<k>1, i 3' homologni krak miša. U jednom primeru, 5' i 3' homologni krakovi ciljaju vektor za sekvencu 5' u vezi sa sekvencom pojačivačem koja je prisutna 5' i proksimalna mišjem C<k>genu. U jednom primeru, promoter je promoter segmenta gena promenljivog regiona imunoglobulina čoveka. U specifičnom primeru, promoter je promoter Vk3-15 čoveka. U jednom primeru, vodeća sekvenca je mišja vodeća sekvenca. U specifičnom primeru, mišja vodeća sekvenca je mišja VK3-7 vodeća sekvenca.

[0074] Takođe se odnosi na ciljni vektor kako je ovde opisano, ali umesto 5<*>homolognog kraka miša ljudski ili mišji promoter je bočni 5' sa mestom prepoznavanja rekombinaze specifičnim za mesto {SRRS}, i u mesto 3' mišji homologni krak VL region čoveka je bočni 3' sa SRRS.

[0075] Takođe se odnosi na reverzno himerno antitelo napravljeno pomoću miša kako je ovde opisano, pri čemu reverzno himerno antitelo obuhvata laki lanac koji obuvhata V<j>_ čoveka i C|_ miša i teški lanac obuhvata V<h>č<oveka>i C<h>miša.

[0076] Takođe je obezbeđen postupak proizvodnje antitela na antigenu od interesa koji obuhvata promenljivi domen teškog lanca čoveka izveden iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona čoveka izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4 obuhvata: (a) imunizovanje miša obezbeđeno sa antigenom od interesa; (b) dobijanje iz mišjeg ili ljudskog promenljivog domena teškog ianca iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona čoveka izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4. 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4. 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13</>4; i (c) korišćenje sekvence promenljivog regiona imunoglobulina dobijenog pod (b) za antitelo koje se specifično vezuje na antigen od interesa.

[0077] Dodatno obezbeđen je postupak proizvodnje antitela na antigen od interesa obuhvata promenljivi domen teškog lanca čoveka izveden iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona čoveka izabran iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4 obuhvata: (a) imunizovanje miša obezbeđenog sa antigenom od interesa; (b) dobijanje iz miša ljudskog promenljivog domena teškog ianca izvedenog iz preraspoređenog ljudskog V<h>/D<h>/J<h>regiona izabranog iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4; i (c) korišćenje sekvence promenljivog regiona imunoglobulina dobijenog u (b) u antitelu koje se

[0078] specifično vezuje na antigen od interesa.

[0079] Takođe se odnosi na postupak za pravljenje antitela, koji obuhvata ispoljavanje u jednoj ćeliji (a) prve V<h>sekvence gena imunizovanog miša kako je ovde opisan spojen sa C<h>sekvencom gena čoveka; (b) V[_ sekvenca gena imunizovanog miša kako je ovde opisano spojen sa C<l>sekvencom gena čoveka; i, (c) održavanje ćelije pod uslovima dovoljnim da se ispolji potpuno ljudsko antitelo, i izolovanje antitela. U jednom primeru, ćelija obuhvata drugu V<h>sekvencu gena drugog imunizovanog miša kako je opisano ovde spojenog sa C<h>sekvencom gena čoveka, prva V<h>sekvenca gena kodiira V<h>domen koji prepoznaje prvi epitop, i druga V<h>sekvenca gena kodira V<h>domen koji prepoznaje drugi epitop, pri čemu prvi epitop i drugi epitop nisu identični.

[0080] Takođe se odnosi na postupak za pravljenje proteina za vezivanje epitopa, obuhvata izlaganja miša kako je ovde opisan imunogenu koji obuhvata epitop od interesa, održavanje miša pod uslovima dovoljnim da miš generiše molekul imunoglobulina koji se specifično vezuje na epitop od interea, i izoluje molekul imunoglobulina koji se specifično vezuje na epitop od interesa, pri čemu protein za vezivanje epitopa obuhvata teški lanac koji obuhvata somatski mutiran ljudski V<h>i mišji C<h>, povezan sa lakim lancem koji obuhvata C<l>rniša i V<l>miša izveden iz preraspoređenog ljudskog V<k>1-39J<k>5 ili preraspoređenog ljudskog V<k>3-20J<k>1.

[0081] Takođe se odnosi na ćeliju koja ispoljava protein za vezivanje epitopa pri čemu ćelija obuhvata: (a) sekvencu nukleotida čoveka koja kodira V<l>domen čoveka koji je izveden iz preraspoređenog V<k>1-39J<k>5 čoveka ili preraspoređenog V<k>3-20J<k>1 čoveka, pri čemu se sekvenca nukleotida čoveka fuzioniše (direktno ili kroz linker) na konstantni komplementarnu (kDNK) sekvencu domena iakog lanca imunoglobulina čoveka (npr., DNK sekvenca<k>konstantnog domena čoveka); i, (b) prva V<h>sekvenca nukleotida čoveka koja kodira V<h>domen čoveka izveden iz prve V<h>sekvence nukleotida čoveka, pri čemu se prva V<h>sekvenca nukleotida čoveka spoji (direktno ili putem linkera) na kDNK (cDNA) sekvencu konstantnog domena teškog ianca imunoglobulina čoveka; pri čemu; protein za vezivanje epitopa prepoznaje prvi epitop. U jednom primeru, protein za vezivanje epitopa vezuje prvi epitop sa konstantnom disocijacije (razdvajanja) nižom od 10<~>6

M, nižom od 10-<8>jy nižom od 10<">9

M, nižom od<10">10 M, nižom od<10>-11 m, ili nižom od 1<0">12<M>.

[0082] U jednom primeru, ćelija obuhvata drugu sekvencu nukleotida čoveka koja kodira drugi V<h>domen čoveka, pri čemu se druga ljudska sekvenca spaja (direktno ili putem linkera) na kDNK sekvencu konstantnog domena teškog lanca imunoglobulina čoveka, i pri čemu drugi V<h>domen čoveka ne prepoznaje specifično prvi epitop (npr., prikazuje konstantu disocijacije od, npr., 10-<6>M, 10<">5

M, 10-<4>M. ili višu), i pri čemu protein za vezivanje epitopa prepoznaje prvi epitop i drugi epitop, i pri čemu se i prvi teški lanac i drugi teški lanac imunoglobulina povezuje sa identičnim lakim lancem (a).

[0083] U jednom primeru, drugi V<h>domen vezuje drugi epitop sa konstantnom disocijacije koja je niža od 10<">6

M, niža od 10<">7

M, niža od 10<">8

M, niža od 10<">9

M, niža od 10-<1>° M, niža od 10"H M, ili niža od 1<0>-12<M.>

[0084] U jednom primeru, protein za vezivanje epitopa obuhvata prvi teški lanac imunoglobulina i drugi teški lanac imunoglobulina, svaki se povezuje sa identičnm lakim lancem izvedenim iz raspoređenog ljudskog VL regiona izabranog iz ljudskog V<k>1-39J<k>5 ili ljudskog V<k>3-20J<k>1, pri čemu se prvi teški lanac imunoglobulina vezuje na prvi epitop sa konstantnom disocijacije u nanomolarnom do pikomolarnom opsegu, drugi teški lanac imunoglobulina vezuje drugi epitop sa konstantom disocijacije u opsegu od nanomolarne do pikomolarne vrednosti, prvi epitop i drugi epitop nisu identični, prvi teški lanac imunoglobulina ne vezuje drugi epitop ili vezuje drug! epitop sa konstantom disocijacije slabijom od rnikromolarnog opsega (npr., milimolarni opseg), drugi teški lanac imunoglobulina ne vezuje prvie pitop ili vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije slabijom od rnikromolarnog ospega (npr. milimolarni opseg), i jedan ili više VL, V|_] prvog teškog lanca imunoglobulina, i V<h>drugog teškog lanca imunoglobulina, su somatski mutirani.

[0085] U jednom primeru, prvi teški lanac imunogobulina obuhvata ostatak (rezidu) koji vezuje protein A i drugi teški lanac imunoglobulina nema ostatak koji vezuje protein A.

[0086] U jednom primeru, ova ćelija se bira iz CHO, COS, 293, HeLa, i ćelije mrežnjače koja ispoljava virusnu sekvencu nukleinske kiseline (npr., PERC.6™ ćelija).

[0087] Odnosi se i na reverzno himerno antitelo koje obuhvata V^ čoveka i konstantni domen teškog lanca miša, V<l>čoveka i konstantni domen lakog lanca miša, pri čemu se antitelo pravi postupkom koji obuhvata imunizovanje miša kako je ovde opisano sa imunogenom koji sadrži epitop, antitelo specifično vezuje epitop imunogena sa kojim se miš imunizuje. U jednom primeru, Vl domen se somatski mutira. U jednom primeru, V<[>_| domen se somatski mutira. U jednom primeru, i Vl i V|_|

[0088] domen su somatski mutirani. U jednom primeru, V<l>se povezuje na C<k>domen miša.

[0089] Kod jednog varijantnog rešenja, dat je miš, miš obuhvata Vj_| segmente gena čoveka koji zamenjuju sve ili pretežno sve V<h>segmente gena miša na endogenim lokusima teškog lanca miša; ne više od jednog ili dva preraspoređena laka lanca čoveka V<l>/J<l>sekvenci izabranih iz preraspoređene V<k>1-39/J<k>5 i preraspoređene V<k>3-20/J<k>1 ili njihove kombinacije, zamena svih segmenaa gena lakog lanca miša; pri čemu su segmenti gena promenljivog teškog lanca čoveka povezani na konstantni gen miša, i preraspoređene sekvence lakog lanca čoveka su povezane na konstantni gen čoveka ili miša.

[0090] Takođe se odnosi na ES ćeliju miša koja obuhvata zamenu svih ili pretežno svih segmenata gena promenljivog teškog lanca sa segmentima gena promenljivog teškog lanca čoveka, i ne više od jedne ili dve preraspoređene VL/JL sekvence lakog lanca čoveka, pri čemu se segmenti gena promenlivog iakog lanca čoveka povežu na konstantni gen teškog lanca imunoglobulina miša, i preraspoređene VL/JL sekvence lakog ianca čoveka se povežu na konstantni gen lakog ianca imunoglobulina čoveka. U specifičnom primeru, konstantni gen lakog lanca je konstantni gen miša.

[0091] Takođe se odnosi protein za vezivanje antigena napravljen pomoću miša kako je ovde opisano. U specifičnom primeru, antigen vezujući protein obuhvata promenljivi region teškog lanca imunoglobulina čoveka spojen na konstantni region miša, i promerilivi region iakog lanca imunoglobulina čoveka izveden iz V<k>1-39 segmenta gena ili V<k>3-20 segmenta gena, pri čemu konstantni region lakog lanca jeste konstantni region miša.

[0092] [0075] Takođe se odnosi na potpuno ljudski protein koji vezuje antigen napraljen od sekvence gena promenlivog regiona imunoglobulina iz miša kako je ovde opisano, pri čemu protein koji vezuje antigen obuhvata, potpuno ljudski teški lanac obuhvata promenljivi region čoveka izveden iz sekvence miša kako je opisano, i obuhvata potpuno ljudski iaki lanac V<k>1-39 ili V<k>3-20. U jednom primeru, laki lanac promenljivog regiona obuhvata jednu do pet somatskih mutacija. U jednom primeru, promenljivi region lakog ianca je poznati promenljivi region lakog lanca koji je uparen u B ćeliji miša sa promenljivim regionom teškog lanca.

[0093] U jednom primeru, potpuno ljudski protein koji vezuje antigen obuhvata prvi teški lanac i drugi teški lanac, pri čemu prvi teški lanac i drugi teški lanac obuhvata neidentićne promenljive regione nezavisno izvedene iz miša kako je ovde opisan, i pri čemu svaki od prvih i drugih teških lanaca ispoljava iz ćelije domaćina povezan sa ljudskim lakim lancem izvedenim iz V<k>1-39 segment gena ili V<k>3-20 segment gena. U jednom primeru, prvi teški lanac obuhvata prvi promenljivi region teškog lanca koj specifično vezuje prvi epitop prvog antigena, i drugi teški lanac obuhvata drugi promenljivi region teškog ianca koji specifično vezuje drugi epitop drugog antigena. U specifičnom primeru, prvi antigen i drugi antigen su različiti. U specifičnom primeru, prvi antigen i drugi antigen su isti, i prvi epitop i drugi epitop nisu identični; u specifičnom primeru, vezivanje prvog epitopa prvim molekulom proteina koji se vezuje ne blokira vezivanje drugog epitopa putem drugog molekula proteina koji vezuje.

[0094] U jednom primeru, potpuno ljudski protein za vezivanje je izveden iz ljudske sekvence imunoglobulina od miša kako je ovde opisano obuhvata prvi teški lanac imunoglobulina i drugi teški lanac imunoglbulina, pri čemu prvi teški lanac imunoglobulina obuhvata prvi promenljivi region koji nije identičan promenljivom regionu drugog teškog ianca imunoglobulina, i pri čemu prvi teški lanac imunoglobulina obuhvata determinant vezivanja proteina A divljeg tipa, a drugi teški lanac nema determinant vezivanja proteina A divljeg tipa. U jednom primeru, prvi teški lanac imunoglobulina vezuje protein A u uslovima izolacije, i drugi teški lanac imunoglobulina ne vezuje protein A ili vezuje protein A barem 10-struko, stostruko, ili hiljadustruko slabije nego što prvi teški lanac imunoglobulina vezuje protein A u uslovima izolacije. U specifičnom primeru, prvi i drugi teški lanci su lgG1 izotipovi, pri čemu drugi teški lanac obuhvata modifikaciju izabranu iz 95R (EU 435R}, 96F (EU 436F), i njihovu kombinaciju, i pri čemu prvi teški lanac nema takvu modifikaciju.

[0095] Takođe se odnosi na postupak za pravljenje bispecifičnog proteina koji vezuje antigen, obuhvata izlaganje prvog miša kako je ovde opisano prvom antigenu od interesa koji obuhvata prvi epitop, izlaganje drugog miša kako je opisano ovde drugom antigenu od interesa koji obuhvata drugi epitop, omogućava da i prvi i drugi miš postavi odgovore imunog sistema na antigene od interesa što identifikuje kod prvog miša prvi promenljivi region teškog lanca kod čoveka koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, identifikuje kod drugog miša drugi promenljivi region teškog ianca kod čoveka koji vezuje drugi epitop dugog antigena, čineći prvi potpuno ljudski gen teškog lanca koji kodira prvi teški lanac koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, čineći drugi potpuno ljudski gen teškog lanca koji kodira drugi teški lanac koji vezuje drugi epitop drugi antigen od interesa, ispoljavanje prvog teškog lanca i drugog teškog lanca u ćeliji koja ispoljava drugi iaki lanac čoveka izveden iz ljudskog V<k>1-39 ili ljudskog W3-20 segmenta gena da se formira bispecifični protein za vezivanje antigena, i izolovanje bispecifičnog proteina za vezivanje antigena.

[0096] U jednom primeru, prvi antigen i drugi antigen nisu identični.

[0097] U jednom primeru, prvi antigen i drugi antigen su identični, i prvi epitop i drugi epitop nisu identični. U jednom primeru, vezivanje prvog promenljivog regiona teškog lanca na prvi epitop ne blokira vezivanje drugog promenljivog regiona teškog lanca na drugi epitop.

[0098] U jednom izvođenju, prvi antigen je izabran iz rastvorijivog antigena i površinskog antigena ćelije (npr., antigena tumora), i drugi antigen obuhvata površinski receptor ćelije. U specifičnom primeru, površinski receptor ćelije je receptor imunoglobulina. U specifičnom primeru, receptor imunoglobulina je Fc receptor. U jednom primeru, prvi antigen i drugi antigen su isti površinski receptor ćelije, i vezivanje prvog teškog lanca na prvi epitop ne blokira vezivanje drugog teškog lanca na drugi epitop.

[0099] U jednom primeru, promenljivi domen lakog lanca tog lakog lanca obuhvata 2 do 5 somatskih mutacija. U jednom primeru, promenljivi domen lakog lanca je somatski mutiran poznati laki lanac ispoljen u 8 ćeliji prvog ili drugog imunizovanog miša sa bilo prvim ili drugim promenljivim domenom teškog lanca.

[0100] U jednom primeru, prvi potpuno ljudski teški lanac nosi modifikaciju amino kiseline koja smanjuje svoj afinitet prema proteinu A, i drugi potpuno ljudski teški lanac ne obuhvata modifikaciju koja smanjuje svoj afinitet prema proteinu A.

[0101] Takođe se pominje kao antitelo ili bispecifično antitelo koje obuhvata promenljivi domen teškog lanca čoveka napravljen u skladu sa ovim pronalaskom. U drugom varijantnom rešenju, obezbeđena je upotreba miša kako je ovde opisano da se napravi potpuno ljudsko antitelo ili potpuno ljudsko bispecifično antitelo. Dakle, takođe je obezbeđena upotreba miša koji je dat za pravljenje antitela koje sadrži promenljivi domen teškog lanca (V<h>) čoveka izveden iz preraspoređenog ljudskog V<h>/D<h>/J<h>regiona izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4. Još je obezbeđena upotreba miša koji je dobijen za pravljenje antitela koje obuhvata promenljivi domen teškog lanca (V<h>) čoveka izveden iz preraspoređenog Vh/Dh/h regiona čoveka izabranog iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4.

[0102] U jednom primeru, genetski modifikovan miš, embrion, ili ćelija opisani ovde obuhvataju lokus k iakog lanca koji zadržava endogene regulatorne ili kontrolne elemente, npr., mišji k intronski pojačivač, mišji<k>3' intronski pojačivač, ili i intronski pojačivač i 3' pojačivač, pri čemu regulatorni ili kontrolni elementi olakšavaju somatsku mutaciju i sazrevanje afiniteta ispoljene sekvence<k>lokusa lakog lanca.

[0103] Takođe obuhvata miša koji sadrži populaciju B ćelije naznačenu time što ima lake lance imunoglobulina izvedene iz ne više od jednog, ili ne više od dva, preraspoređena ili nepre rasporede na V i J segmenta gena lakog lanca imunoglobulina, pri čemu ispoljava<k>:X

odnos lakog lanca koji je otprilike isti kao i kod miša koji sadrži komplement divljeg tipa V i J segmenata gena lakog lanca imunoglobulina.

[0104] U jednom primeru, laki lanci imunoglobulina su izvedeni iz ne više od jednog, ili ne više od dva, preraspoređena V i J segmenta gena lakog lanca imunoglobulina. U specifičnom izvođenju, laki lanci su izvedeni iz ne više od jednog preraspoređenog V i J segmenta gena lakog lanca imunoglobulina.

[0105] [0088] U jednom primeru, miš ispoljavak:X odnosiakog lanca koji je oko od 55:1 do 75:1, 60:1 do 70:1,63:1 do 68: 1, ili oko od 65:1 do 67:1 u poređenju sa mišjim koji obuhvata kornplemente divljeg tipa V i J segmenata gena lakog lanca imunoglobulina. U specifičnom primeru, miš ispoljavak:Xodnos lakog lanca koji je 66:1 u poređenju sa mišjim koji obuhvata komplement divljeg tipa V i J segmenata gena lakog lanca imunoglobulina. U jednom primeru, laki lanac imunoglobulina izveden iz ne više od jednog, ili ne više od dva, preraspoređena ili nepreraspoređena V i J segmenta gena lakog lanca imunoglobulina obuhvata ljudske Vk i J segmente gena izabrane iz V<k>1-39 čoveka, V<k>3-20 čoveka, J<k>1 čoveka i J<k>5 čoveka. U specifičnom primeru, laki lanci imunoglobulina su izvedeni iz jedne sekvence iakog lanca čoveka koja obuhvata V<k>1-39 sekvencu čoveka.

[0106] U jednom primeru, miš ispoljavak:X odnoslakog<l>anca koji je oko od 18:1 do 23:1 ili oko od 19:1 do 22:1 u poređenju sa mišem koji sadržava komplement divljeg tipa V i J segmenta gena iakog lanca imunoglobulina. U jednom primeru, miš ispoljava<k>:A, odnos lakog lanca koji je oko od 18:1 do 23:1 ili oko od 19:1 do 22:1 u poređenju sa mišem koji sadržava komplement divljeg tipa V i J segmenta gena lakog lanca imunoglobulina. U jednom primeru, miš ispoljavak:X odnoslakog lanca koji je otprilike isti ili 20:1 u poređenju sa mišjim koji obuhvata komplement divljeg tipa V i J segmenata gena lakog ianca imunoglobulina. U jednom primeru, laki lanac imunoglobulina izveden iz ne više od jednog, ili ne više od dva, preraspoređena ili nepreraspoređena V i J segmenta gena lakog lanca imunoglobulina obuhvataju ljudske V<k>i Jk segmente gena izabrane iz V<k>1-39 čoveka, V<k>3-20 čoveka, J<k>1 čoveka i J<k>5 čoveka. U specifičnom primeru, laki lanci imunoglobulina su izvedeni iz jedne sekvence lakog lanca čoveka koja obuhvata V<k>3-20 sekvencu čoveka.

[0107] Takođe se odnosi na miša koji ispoljava laki lanac imunoglobulina izveden iz ne više od jedne, ili ne više od dve ljudske V<k>/J<k>sekvence, pri čemu miš sadrži zamenu svih ili pretežno svih endogenih mišjih segmenata gena regiona promenljivog teškog lanca sa jednim ili više segmenata gena regiona promenljivog teškog lanca , i miš ispoljava odnos (a) CD19<+>B ćelija koje ispoljavaju imunoglobulin koji ima Maki lanac prema (b) CD19<+>B ćelijama koje ispoljavaju imunoglobulin koji ima<k>

laki lanac, od oko 1 do oko 20.

[0108] U jednom primeru, miš ispoljava jedan<k>laki lanac izveden iz ljudske V<k>1-39J<k>5 sekvence, i odnos CD19<+>B ćelija koje ispoljavaju imunoglobulin koji imaXlaki lanac prema CD19<+>B ćelijama koje ispoljavaju imunoglobulin koji ima<k>iaki lanac je oko 1 do oko 20; u jednom primeru, odnos je oko 1 do najmanje oko 66; u specifičnom izvođenju, odnos je oko 1 do 66.

[0109] U jednom primeru, miš ispoljava jedan iaki lanac izveden iz ljudske V<k>3-20J<k>5 sekvence, i odnos CD19<+>B ćelija koje ispoljavaju imunoglobulin koji ima X laki lanac prema CD19<+>B ćelijama koje ispoljavaju imunoglobulin koji imaklaki lanac je oko 1 do oko 20; u jednom primeru, odnos je oko 1 do najmanje oko 21; u specifičnom izvođenju, odnos je oko 1 do 21, ili 1 do 21.

[0110] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji je dat i koji ispoljava jedan preraspoređeni<k>laki lanac, pri čemu miš obuhvata funkcionalni lokusX lakoglanca, i pri čemu miš ispoljava populaciju B ćelije, koja obuhvata lg<K>+ ćelije koje ispoljavaju<k>laki lanac izveden iz istog jednog preraspoređenog<k>lakog lanca. U jednom primeru, procenat \ gK+ lgX+ B ćelija u mišu je oko istog kao kod miša divljeg tipa. U specifičnom primeru, procenat lg<K>+

lg^<+>B ćelija u mišu je oko 2 do oko 6 procenata. U specifičnom primeru, procenat lg<K>+

lgX<+>B ćelija kod miša pri čemu jedan preraspoređeni<k>laki lanac izveden iz V<k>1-39J<k>5 sekvence je oko 2 do oko 3; u specifičnom primeru, oko 2,6. U specfiičnom izvođenju, procenat lg<K>+

lgA.<+>B ćelija kod miša pri čemu jedan preraspoređeni<k>laki lanac je izveden iz V<k>3-20J<k>1 sekvecne je oko 4 do oko 8; u specifičnom izvođenju, oko 6.

[0111] Takođe se odnosi na genetički modifikovanog miša, pri čemu miš ispoljava jedan preraspoređen<k>laki lanac izveden iz ljudskog V<k>i J<k>segmenta gena, pri čemu miš ispoljava popuplaciju B ćelije koja obuhvata jedan<k>laki lanac izveden iz jednog preraspoređenog<k>lakog lanca, pri čemu genetski modifikovan miš nije omogućio otpornost na sornatske hipermutacije. U jednom izvođenju, najmanje 90%<k>lakih lanac ispoijeno je na B ćeliji miša ispoljava najmanje jednu do oko pet somatskih mutacija.

[0112] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji se modifikuje da ispclji jedan<k>laki lanac izveden iz ne više od jedne, ili ne više od dve, preraspoređene sekvence<k>lakog lanca, pri čemu miš ispoljava upotrebu<k>lakog lanca koja je oko dvostruka ili veća, barem oko trostruko ili više, i barem oko četvorostruko ili više puta veća odupotrebe<k>iakog lanca ispoljene putem miša divljeg tipa, ili veća od upotrebe k lakog ianca ispoljene putem miša istog soja koji sadrži repertoar divljeg tipa<k>segmenata gena lakog lanca. U specifičnom primeru, miš ispoljava jedan<k>laki lanac od ne više od jedne preraspoređene<k>sekvence lakog lanca. U još specifičnijem pnrneru, preraspoređena<k>light chain sekvenca lakog lanca se bira iz V<k>1-39J<k>5 i V<k>3-20J<k>1 sekvence. U jednom primeru, preraspoređena<k>sekvenca lakog lanca je V<k>1-39J<k>5 sekvenca. U jednom primeru, preraspoređena<k>sekvenca lakog lanca je V<k>3-20J<k>1 sekvenca.

[0113] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji ispoljava jedan<k>

laki lanac izveden iz ne više od jedne, ili ne veiše od dve, preraspoređene<k>sekvence lakog ianca, pri čemu miš ispoljava<k>upotrebu lakog lanca koja je oko 100-struko ili više, barem oko 200-struko ili više, barem oko 300-struko ili više, barem oko 400-struko ili više, barem oko 500-struko ili više, barem oko 600-struko ili više, barem oko 700-struko ili više, barem oko 800-struko ili više, barem 900-sttruko ili više, barern oko 1000-struko ili više veća od iste upotrebe<k>lakog lanca od miša koji nosi potpuni ili pretežno popuno ljudski<k>iokus lakog lanca. U specifičnom primeru, miš koji nosi potpuni ili pretežno potpuno ljudski<k>lokus lakog lanca nema funkcionalno nepreraspoređenu mišju<k>sekvencu lakog lanca. U specifičnom primeru, miš ispoljava jedan<k>laki lanac od ne više od jedne preraspoređene<k>sekvence lakog lanca. U jednom primeru, miš obuhvata jedan primerak preraspoređene<k>sekvencu lakog lanca (npr., heterozigot). U jednom izvođenju, miš obuhvata dva primerka preraspoređene k sekvence lakog lanca (npr., homozigot). U još specifičnijem primeru, preraspoređena k sekvenca lakog lanca se bira iz V<k>1-39J<k>5 i V<k>3-20J<k>1 sekvence. U jednom primeru, preraspoređena k sekvenca lakog lanca je V<k>1-39J<k>5 sekvenca. U jednom primeru, preraspoređena k sekvenca lakog lanca je V<k>3-20J<k>1 sekvenca.

[0114] [0097] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji ispoljava jedan laki lanac izveden iz ne više od jedne, ili ne više od dve, preraspoređene sekvence lakog lanca, pri čemu laki lanac genetski modifikovanog miša ispoljava nivo ispoljavanja koji je najmanje 10-struko do oko 1.000-struko, 100-struko do oko 1.000-struko, 200-struko do oko 1.000-sfruko, 300-struko do oko 1.000-strukod, 400-struko do oko 1.000-struko, 500-struko do oko 1.000-struko, 600-struko do oko 1.000-struko, 700- struko do oko 1.000-stuko, SOO-struko do oko 1.000-struko, ili 900-struko do oko 1.000-struko ili više od ispoljenosti istog preraspoređenog iakog lanca ispoljenog putem rniša koji nosi potpuni ili pretežno potpuni lokus lakog lanca. U jednom primeru, laki lanac je sekvenca čoveka. U specifičnom primeru, sekvenca čoveka je<k>sekvenca. U jednom primeru, sekvenca čoveka jeXsekvenca. U jednom primeru, laki lanac je potpuno ljudski laki lanac.

[0115] U jednom primeru, nivo ekspresije je naznačen kvantifikovanjem iRNK (rnRNA) transkribovane sekvence lakog lanca, t poređenjem te sekvence sa transkribovanom sekvencom lakog lanca miša koja nosi potpuni ili ptetežno potpuni lokus lakog lanca.

[0116] Takođe odnosi se na genetski modifikovanog miša koji ispoljava jedan<k>laki lanac izveden iz ne više od jedne, ili ne više od dve preraspoređene<k>sekvence lakog ianca, pri čemu miš, posle imunizacije antigenom, ispoljava titar seruma koji je uporediv sa divljim tipom miša imunizovanim istim antigenom. U specifičnom primeru, miš ispoljava jedan<k>laki lanac od ne više od jedne preraspoređene<k>sekvence lakog lanca. U jednom primeru, titar seruma je naznačen kao totalan imunoglobulin. U specifičnom primeru, titar seruma je naznačen kao specifičan titar IgM. U specifičnom primeru, titar seruma je naznačen kao specifičan titar IgG. U još specifičnijem primeru, preraspoređena<k>sekvenca lakog lanca se bira iz V<k>1-39J<k>5 i V<k>3-20J<k>1 sekvence. U jednom primeru, preraspoređena<k>sekvenca lakog lanca je V<k>1-39J<k>5 sekvenca. U jednom primeru, preraspoređena<k>sekvenca lakog lanca je Vk3-20Jk1 sekvenca.

[0117] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji ispoljava više teških lanaca imunoglobulina povezanih sa jednim lakim lancem. U jednom primeru, teški lanac je sekvenca čoveka. U različitim primerima, ljudska sekvenca se bira iz promenljive sekvence, CHi, zgloba, CH<2>, CH<3>, i njihove kombinacije. U jednom primeru, jedan laki lanac sadrži sekvencu čoveka U različitim primerima, ijudska sekvenca se bira iz promenljive sekvence, konstantne sekvence, i njihove kombinacije. U jednom primeru, miš obuhvata onemogućeni endogeni lokus imunoglobulina i ispoljava tešku sekvencu i/ili laki lanac iz transgena ili ekstrahromozomnog epizoma. U jednom primeru, miš obuhvata zamenu na endogenom lokusu miša nekih ili svih endogenih segmenata gena teškog lanca miša (t.j., V, D, J), i/ili neke ili sve endogene konstantne sekvence teškog lanca miša (npr., CH-), zglob, CH<2>, CH<3>, ili njihovu kombinaciju), i/ili neke ili sve endogene sekvence lakog lanca miša (npr., V, J, konstantne, ili njihove kombinacije), sa jednom ili više sekvenci imunoglobulina čoveka.

[0118] Takođe se odnosi na miša pogodnog za pravljenje antitela koje ima isti laki lanac, pri čemu sva ili pretežno sva antitela napravljena u mišu jesu ispoljena sa istim lakim lancem. U jednom primeru, laki lanac se ispoljava iz endogenog lokusa iakog lanca.

[0119] Takođe se odnosi na postupak za pravljenje lakog lanca iz ljudskog antitela, koji obuhvata dobijanje iz miša kako je ovde opisano sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca, i korišćenje te sekvence lakog lanca i te sekvence teškog lanca za pravljenje ljudskog antitela. U jednom primeru, ljudsko antitelo je bispecifično antitelo.

[0120] Bilo koje od izvođenja i varijantnih rešenja opisanih ovde može da se koristi u vezi jednog sa drugim, osim ako nije drugačije navedeno ili očigledno iz ovog konteksta. Druga izvođenja će postati očigledna stručnjacima u ovoj oblasti iz pregleda opisa u nastavku.

[0121] KRATAK OPIS SLIKA

[0122] SL. 1 ilustruje ciljnu strategiju za zamenu endogenih segmenata gena promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina miša ljudskim V<k>1-39J<k>5 regionom gena.

[0123] SL. 2 ilustruje ciljnu strategiju za zamenu endogenih segmenata gena promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina miša ljudskim V<k>3-20J<k>1 regionom gena.

[0124] SL. 3 ilustruje ciljnu strategiju za zamenu endogenih segmenata gena promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina miša ljudskim VpreB/JA.5 regionom gena.

[0125] SL. 4 pokazuje procenat CD19<+>B ćelija (y-ose) iz periferne krvi za miševe divljeg tipa (WT), homozigotne miševe za projektovan ljudski preraspoređen V<k>1-39J<k>5 region lakog lanca (V<k>1-39J<k>5 HO) i miševe homozigotne za projektovan ljudski preraspoređeni V<k>3-20J<k>1 region lakog lanca (V<k>3-20J<k>1 HO).

[0126] SL. 5A pokazuje relativnu ekspresiju iRNK (y-osa) iz Vic1-39-izveđenog lakog lanca u kvantitativnom PCR ogledu korištenjem sondi specifičnih za spajanje projektovanog ljudskog preraspoređenog V<k>1-39J<k>5 regiona lakog lanca (V<k>1-39J<k>5 ogled spajanja) i ljudski V<k>1-39 segment gena (V<k>1-39 Probe) u homozigotu miša za zamenu endogenog V<k>i J<k>segmenata sa ljudskim V<k>i J<k>segmentima gena (H<k>), miš divljeg tipa (WT), i heterozigotni miš za projektovan ljudski preraspoređeni V<k>1-39J<k>5 region lakog lanca (Vk1 -39Jk5 HET). Signali se normalizuju da se ispolji mišji C<k>. N.D.: nije detektovano.

[0127] SL. 5B pokazuje relativno iRNK ispoljavanje (y-axis) iz V<K>l-39-izvedenog lakog lanca u kvantitativnoj PCR probi korišćenjem probi specifičnih za spajanja projektovanog ljudskog preraspoređenog V<k>1-39J<k>5 regiona lakog lanca (V<k>1-39J<k>5 ogled spajanja) i ljudskog V<k>1-39 segmenta gena (V<k>1<~>39 proba) u mišjim homozigotima za zamenu endogenih V<k>i J<k>segmenata gena sa ljudskim V<k>i J<k>segmentima gena (H<k>), miša divljeg tipa (WT), i mišji homozigotni za projektovani ljudski preraspoređeni V<k>1-39J<k>5 region lakog lanca (V<k>1-39J<k>5 HO). Signali se normalizuju da se ispolji mišji C<k>.

[0128] SL. 5C pokazuje relativno iRNK ispoljavanje (y-osa) iz V<K>3-20-izvedenog lakog lanca u kvantitativnoj PCR probi korišćenjem probi specifičnih za spajanja projektovanog ljudskog preraspoređenog V<k>3-20J<k>1 regiona lakog lanca (V<k>3-20J<k>1 ogled spajanja) i ljudskog V<k>3-20 segmenta gena (V<k>3-20 proba) u mišjim homozigotima za zamenu endogenih Vk i J<k>segmenata gena sa ljudskim Vk i J<k>segmentima gena (H<k>), miš divljeg tipa (WT), i miš heterozigotni (HET) i homozigotni (HO) za projektovani ljudski preraspoređeni V<k>3-20J<k>1 region lakog lanca. Signali se normalizuju da se ispolji mišji C<k>.

[0129] SL. 6A pokazuje IgM (levo) i IgG (desno) titar u divljem tipu (VVT; N=2) i mišji homozigotni za projektovani ljudski preraspoređeni V<k>1-39J<k>5 region lakog lanca (V<k>1-39J<k>5 HO; N=2) imunizovan p- galaktozidazom. FIG. 6B pokazuje totalni imunoglobulin (IgM, IgG, IgA) titar u divljem tipu (VVT; N=5) i mišji homozigotni za projektovani ljudski preraspoređeni V<k>3-20J<k>1 region lakog lanca (V<k>3-20J<k>1 HO; N=5) imunizovan {i- galaktozidazom.

[0130] DETALJAN OPIS

[0131] <[0105]>Ovaj pronalazak se ne ograničava na posebne postupke, i opisane eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i usiovi mogu da se razlikuju. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija samo za potrebe opisivanja određenih izvođenja, i nije namenjena da bude ograničenje, jer će obim ovog pronalaska biti ograničen samo na priložene patentne zahteve.

[0132] Osim ako nije drugačije definisano, svi pojmovi i fraze koji se ovde koriste obuhvataju značenje koje termini i fraze nose u tehnici, osima ako nije suprotno i jasno navedeno ili jasno očigledno iz konteksta u kom se koristi taj pojam ili fraza, lako postupci i materijali slični ili ekvivalentni postupcima i materijalima opisanim ovde mogu da se koriste u praksi ili testiranju ovog pronalaska, sada su opisani određeni postupci i materijali. Sve pomenute publikacije su ovde pomenute ili inkorporirane.

[0133] Pojam "antitelo", kako se ovde koristi, obuhvata molekule imunoglobulina koji obuhvataju četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva iaka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac obuhvata teški lanac promenljivog (V<^>) regiona i teški lanac konstantnog regiona (C<f>-|). Teški lanac konstantnog regiona obuhvata tri domena, C<h>1, C<h>2 i C<h>3. Svaki laki lanac obuhvata promenljivi region lakog lanca (V<l>) i konstantni region lakog lanca (C<l>)- V<h>i V<l>regioni mogu još da budu podpodeljeni u regione hiperraznovrsnosti, uslovne regione određivanja komplementarnosti (CDR), koji se preplićue sa region ima koji su više očuvani (konzervisani), regioni uslovnog okvira (FR). Svaki V<h>i V<l>obuhvata tri CDR i četiri FR, raspoređena iz amino terminusa na karboksi terminus sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (teški lanac CDR-ova može da bude skraćen kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3; iaki lanac CDR-ova može da bude skraćen kao LCDR1, LCDR2 i LCDR3. Pojam "visoko afinitetno" antitelo se odnosi na antitelo koje ima K<d>u vezi sa ciljnim epitopom o 10<">9

M iii nižem (npr., oko 1 x 10-<9>M, 1 x 10-<1>° M, 1 x 10-<11>fvt, j[j<O>Ko<1>x 10_<12>M). U jednom izvođenju, Kq se meri površinskom rezonancom plazmona, npr,. BIACORE™; u drugom izvođenju, I<<d>se meri pomoću ELISA.

[0134] [0108] Fraza "bispecifično antitelo" obuhvata antitelo koje je sposobno da selektivno vezuje dva ili više epitopa. Bispecifična antitela generalno obuhvataju dva neidentična teška lanca, sa svakim teškim lancem koji specifično vezuje različiti epitop bilo na dva različita molekula (npr. različiti epitopi na dva različita imunogena) ili na isti molekul (npr., različiti epitopi na istom imunogenu). Ako je bispecifično antitelo sposobno da selektivno vezuje dva različita epitopa (prvi epitop i drugi epitop), afinitet prvog teškog lanca za prvi epitop će generalno biti najmanje jedan do dva ili tri ili četiri ili više reda veličine niži od afiniteta prvog teškog lanca za drugi epitop, i vice versa. Epitopi specifično vezani bispecifičnim antitelom mogu da budu na istoj ili različitoj meti (npr., na istom ili različitom proteinu). Bispecifična antitela mogu da se naprave, na primer, kombinovanjem teških lanaca koji prepoznaju različite epitope istog imunogena. Na primer, sekvence nukleinske kiseline kodiraju promenljive sekvence teškog lanca koje prepoznaju različite epitope istog imunogena mogu da se spoje na sekvence nukleinske kiseline koje en kodiraj u iste ili različite konstantne regione teškog lanca, i takve sekvence mogu da se ispolje u ćeliji koja ispoljava laki lanac imunoglobulina. Tipično bispecifično antitelo ima dva teška lanca svaki ima tri teška ianca CĐR, posle kojih sledi (N-terminal do C-terminala) C<h>1 domen, zglob, C<h>2 domen, i C<h>3 domen, i laki lanac imunoglobulina koji ili ne daje spefičnost vezivanja epitopa ali može da se poveže sa svakim teškim lancem, ili koji može da se poveže sa svakim teškim lancem i koji može da veže jedan ili više epitopa vezanih regionima teškog lanca za vezivanje epitopa, ili koji može da poveže sa svakim teškim lancem i omogući vezivanje ili jednog ili oba teška lanca na jedan ili oba epitopa.

[0135] Pojam "ćelija" obuhvata bilo koju ćeliju koja je pogodna za Ispoljavanje rekornbinantne sekvence nukleinske kiseline. Ćelije obuhvataju one prokariote i eukailote (jedna ćelija ili više ćelija), bakterijske ćelije (npr., rodoveE. coii, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.},ćelije mikobakterija, gljivične ćelije, ćelije kvasca (npr., S.cerevisiae, S. pornbe, P. pastoris, P. methanolica,ere), ćelije biljaka, ćelije insekata (e.g., SF-9, SF-21 , bakulovirusom zaražene ćelije insekata,Trichoplusia ni, ere),ćelije čovekolikih životinja, ćelije čoveka, ili ćelije fuzije kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim primerima, ćelije je ćelija čoveka, majmuna, čovekolikog majmuna, pacova, ili miša. U nekim primerima, ćelija je eukariotska i bira se iz sledećih ćeiija: CHO (npr., CHO K1, DXB-1 1 CHO, Veggie-CHO), COS (npr., COS-7), ćelija mrežnjače, Vero, CV1, bubreg (npr., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, VVI38. MRC 5, Colo205, HB 8065, HL- 60, (npr., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalna), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, ćelija mijeloma, ćelija tumora, i linija ćelije izvedena iz gore pomenute ćelije. U nekim izvođenjima, ćelija obuhvata jedan ili više virusnih gena, npr., ćelija mrežnjače koja ispoljava virusni gen (npr., PER.C6™ ćelija).

[0136] Fraza "region određivanja komplementarnosti," ili pojam "CDR," obuhvata sekvencu amino kiseline enkodiranu sekvencom nukleinske kiseline gena imunoglobulina nekog organizma koji normalno (t.j. kod životinje divljeg tipa) se javlja između regiona dva okvira u održivom regionu lakog ili teškog lanca molekula imunoglobulina (npr., antitelo ili receptor T ćelije). CDR može da se enkodira pomoću, na primer, sekvence klicine linije ili preraspoređene ili nepreraspoređene sekvence, i, na primer, naivne ili zrele B ćelije ili T ćelije. CDR može da bude somatski mutiran (npr. da varira od sekvence enkodirane u klicinoj liniji životinje), humamzovana, i/ili modifikovana supstitucijama amino kiseline, dodavanjima, ili brisanjima. U nekim okolnostima (npr., za CDR3), CDR-ove je moguće enkodirati pomoću dva ili više sekvenci (npr., sekvenci klicine linije) koje nisu zarazne (npr., u nepreraspoređenoj sekvenci nukleinske kiseline) ali su dodirne u sekvenci nukleinske kiseline B ćelije, npr. kao rezultat spajanja ili izrezivanja ili povezivanja sekvenci (npr., V-D-J rekombinacija da se formira teški lanac CDR3).

[0137] [0111] Pojam "konzervativno," kada se koristi da se opiše supstitucija konzervativne amino kiseline, obuhvata ostatak amino kiseline pomoću drugog ostatka amino kiseline koji ima bočni lanac R grupe sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. punjenje ili hidrofobičnost). Generalno, supstitucija konzervativne amino kiseline neće u znatnoj meri promenitl funkcionalna svojstva koja su predmet interesovanja kod nekog proteina, na primer, sposobnost promenlivog regiona da se specifično veže na ciljni epitop sa željenim afinitetom. Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima obuhvataju afifatske bočne lance kao što je glicin, alanin, valin, leucin, i izoleucin; alifatični-hidroksii bočni lanci kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amid kao što je asparagin i glutamin; aromatične bočne lance kao što je fenilalanin, tirozin, i triptofan; osnovne bočne lance kao što je lizin, arginin, i histidin, kiseltnske bočne lance asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i, bočne lance koji sadrže sumpor kao što je cistein i metionin. Supstitucione grupe konzervativnih amino kiselina obuhvataju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutarnat/aspartat, i asparagin/gluiamin. Kod nekih izvođenja, supstitucija (zamena) konzervativne amino kiseline može da bude supstitucija bilo kog neprerađenog ostatka u proteinu sa alaninom, kako se koristi u, na primer, mutagenezi za skeniranje alanina. Kod nekih izvođenja, radi se konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost za PAM250 log-matrica verovatnoće koji su opisali Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. Kod nekih izvođenja, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima ne-negativnu vrednost za PAM250 log matricu verovatnoće.

[0138] Kod nekih primera, pozicije ostataka u lakom tancu ili teškom lancu imunoglobulina mogu da razlikuju jednu ili više supstitucija konzervativne amino kiseline. Kod nekih izvođenja, pozicije ostatka u lakom lancu imunoglobulina ili njegovom funkcionalnom fragmentu (npr., fragment koji dozvoljava ispoljavanje i izlučivanje iz, npr., B ćelije) nisu identični lakom lancu Čija je sekvenca amino kiseline ovde navedena, ali razlikuje jednu ili više supstitucija konzervativne amino kiseline.

[0139] Fraza "protein za vezivanje epitopa" obuhvata protein koji ima najmanje jedan CDR i koji je sposoban da selektivno prepoznaje epitop, npr. može da vezuje epitop sa Kq koji je oko jedan mikromolar ili manji (npr., Kp koji je oko 1 x 10-<6>M, 1 x 10-<7>M,<1>x 10<~>9

M , 1 x 10-<9>M, 1 x<1>0-<1>0 M, 1 x 10_<11>M, ili oko 1 x 10"12 M). Terapijski proteini za vezivanje epitopa (npr,, terapijska antitela) često zahtevaju Kq koji je u nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu.

[0140] Fraza "functional fragment" obuhvata fragmente proteina za vezivanje epitopa koji mogu biti ispoljeni, izlučeni, i specifično vezani na epitop sa Kq u mlkromolarnom, nanomolarnom, ili pikomolarnom opsegu. Specifično prepoznavanje obuhvata Kp koji je barem u mikromolarnom opsegu, nanomolarnom opsegu, ili pikomolarnom opsegu.

[0141] Pojam "klicina linija" obuhvata referencu na sekvencu nukleinske kiseline imunoglobulina u nesomatski mutiranoj ćeliji, npr., nesomatski mutraina B ćelija ili pre-B ćelija ii hematopoietična ćelija.

[0142] Fraza "teški lanac," ili "teški lanac imunoglobulina" obuhvata sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma. Promenljivi domeni teškog lanca obuhvataju tri regiona određivanja komplementarnosti teškog lanca (CDR) i četiri regiona okvira (FR), osim ako nije drugačije precizirano. Fragmenti teških lanaca obuhvataju CDR, CDR i FR, i njihove kombinacije. Tipičan teški lanac ima, sledeći promenljivi domen (iz N-terminala do C-terminala), C<^>1 domena, zglob, C<j>_|2 domen, i C<h>3 domen. Funkcionalni fragment teškog lanca obuhvata fragment koj ije sposoban da specifično prepoznaje epitop (npr., prepoznavanje epitopa sa Kq u mikromolarnom, nanomolarnom, ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban da ispoljava i izlučuje iz ćelije, i koji obuhvata najmanje jedan CDR.

[0143] [0117] Pojam "identitet" kada se koristi u vezi sa sekvencom obuhvata identitet kako je određen brojem različitih algoritama poznatih u ovoj oblasti tehnike koji može da se koristi da se meri identitet nukelotida i/ili sekvence amino kiseline. U nekim izvođenjima opisanim ovde, identiteti su utvrđeni korišćenjem ClustafW v.1.83 (spor) korišćenje poravnanja otvorenog kaznenog jaza od 10,0, produžen kazneni jaz od 0,1, i korišćenje Gonnet sličnost matrica (MACVECTOR ™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenici upoređena sa identitetom sekvenci će zavisiti od određenih sekvenci, ali u slučaju konstantnog domena lakog lanca, dužina treba da sadrži sekvencu dovoljne dužine da se presavije u konstantni domen lakog lanca koji je sposoban za samoudruživanje da se formira kanonski laki lanac konstantnog domena, npr., koji može da formira dve beta ploče koje obuhvataju beta lance i sposobne su da interreaguju sa barem jednim C<h>I domenom ljudskog ili mišjeg. U slučaju C[_| 1 domena, dužina sekvence treba da sadrži sekvencu dovoljne dužine da se presavije u C<h>1 domen koji je sposoban da formira dve beta ploče koje obuhvataju beta lance i mogu da reaguju sa barem jednim lakim lancem konstantnog domena miša ili čoveka.

[0144] Fraza "molekul imunoglobulina" obuhvata dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina. Teški lanci mogu da budu identični ili različiti, i laki lanci mogu da budu identični ili različiti.

[0145] Fraza "laki lanac" obuhvata sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i osim ako nije drugačije navedeno obuhvata ljudske<k>iXlake lance i VpreB, kao i lake lance dobijene putem surogata. Promenljivi domeni lakog lanca (V<[>_) najčešće obuhvataju tri CDR regiona lakog lanca i četiri regiona okvira (FR), osim ako nije drugračije precizirano. Generalno, laki lanac u punoj dužini obuhvata, od amino terminusa do karboksilnog terminusa, V(_ domen koji obuhvata FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, i konstantni domen lakog lanca. Laki lanac obuhvaa one, npr., koji ne vezuju selektivno bilo prvi ili drugi epitop selektivno vezan proteinom za vezivanje epitopa u kom se javljaju. Laki lanci takođe obuhvataju one koji vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu kod vezivanja i prepoznavanja, jednog ili više epitopa selektivno vezanih proteinom za vezivanje epitopa u kom se javljaju. Zajednički laki lanci su oni koji su izvedeni iz preraspoređene ljudske V<k>1-39J<k>5 sekvence ili preraspoređene ljudske V<k>3-20J<k>1 sekvence, i obuhvataju somatski mutirane (npr., afinitetno zrele) verzije.

[0146] Fraza "mikromolami opseg" je predviđena da znači 1-999 rnikromolarnog; fraza "nanomolarni opseg" treba da znači 1-999 nanomolarnog; fraza "pikomolami opseg" je predviđena da znači 1-999 pikomolarni.

[0147] [0121] Fraza "somatski rnutirano" obuhvata referencu na sekvencu nukleinske kiseline od B ćelije koja je prošla pramenu klase, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline promenljivog regiona imunoglobulina (npr., promenljivi domen teškog lanca ili obuhvata teški lanac CDR ili FR sekvencu) u promenjenoj klasi B ćelije nije identična sekvenci nukleinske kiseline u B ćeliji pre prelaska u klasu, kao što je, na primer, razlika u CDR ili okvirna sekvenca nukleinske kiseline između B ćelije koja nije prošla pramenu klase i B ćeliji koja je prošla promenu klase. "Somatski rnutirano" obuhvata referencu na sekvence nukleinske kiseline od afinitetno zrelih B ćelija koje nisu identične odgovarajućim sekvencama promenljivog regiona imunoglobulina u B ćelijama koje nisu afinitetno zrele (t.y., sekvence u genomu ćelija klicine ćelije). Fraza "somatski rnutirano" takođe obuhvata referencu na sekvencu nukleinske kiseline promenljivog regiona imunoglobulina iz B ćelije posle izlaganja B ćelije epitopu od interesa, pri čemu se sekvenca nukleinske kiseline razlikuje od odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline pre izlaganja B ćeije epitopu od interesa. Fraza "somatski rnutirano" se odnosi na sekvence iz antitela koje su generisane u nekoj životinji, npr., mišu koji ima ljudske sekvence nukleinske kiseline promenljivog regiona imunoglobulina, kao odgovor na izazov imunogena, i koji daju kao rezultat procese selekcije koji su inherentno operativni za takvu životinju.

[0148] Pojam "nepreraspoređeno," kada se odnosni na sekvencu nukleinske kiseline, obuhvata sekvence nukleinske kiseline koje postoje u klicinoj liniji ćelije životinja.

[0149] Fraza "promenljivi domen" obuhvata sekvencu amino kiseline lakog ili teškog lanca imunoglobulina (modifikovanog po želji) koja obuhvata sedeće regione amino kiseline, u sekvenci od N-terminala do C-terminala (osim ako nije drugačije navedeno): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0150] Zajedničko laki lanac

[0151] Prethodni pokušaji da se naprave višestruko specifični proteini za vezivanje epitopa, npr., bispecifična antitela, ovde su ometeni različitim problemima koji često dele zajedničku paradigmu,in vitroizbor ili manipulacija sekvencama da se racionalno projektuju, ili da se projektuju putem pokušaja i greške, pogodan format za uparivanje heterodimernog bispecifičnog ljudskog imunoglobulina. Nažalost, većina ako ne svi in vitro pristupi obezbeđuju uglavnom ad hoc rešenja koja su pogodna, ako ih uopšte obezbeđuju, za pojedinačne molekule. Sa druge strane, in vivo postupci za korišćenje kompleksnih organizama za biranje odgovarajućih parova koji mogu da dovedu do terapijskih sredstava za ljude nisu realizovani.

[0152] Generalno, neprerađene sekvence miša su često nedovoljno dobar izvor za ljudske terapijske sekvence. Zbog barem tog razloga, generisanje promenljivih regiona imunoglobulina teškog lanca miša koji se uklapaju kao par sa zajedničkim ljudskim lakim lancem ako ima ograničenu praktičnu primenu. Višein vitroprojektnih napora bi bilo potrošeno u postupku probe i greške da se proba da se humanizuju mišje sekvence promenljivog teškog ianca uz nadu da se zadrže specifičnost i afinitet epitopa a da se održi sposobnost da se spari zajednički ljudski laki lanac, sa netzvesnim ishodom. Na kraju takvog postupka, krajnji proizvod može da održi neke od specifičnosti i afiniteta, i da se udruži sa zajedničkim lakim lancem, ali na kraju imunogenost kod čoveka bi verovatno ostala dubok rizik.

[0153] Zbog toga, pogodan miš za pravljenje ljudskih lekova bi obuhvatio pogodno veliki repertoar ljudskih segmenata gena promenljivog regiona teškog ianca umesto endogenih mišjih segmenata gena promenljivog regiona teškog lanca. Ljudski segmenti gena promenljivog regiona teškog lanca treba da mogu da se prerasporede i rekombinuju sa endogenim mišjim konstantnim domenom teškog lanca da se formira reverzni himerni teški lanac (t.j. teški lanac obuhvata ljudski promenljivi domen i mišji konstantni region). Teški lanac treba bude u mogućnosti za promenu klase i somatsku hipermutaciju tako da se odgovarajuće veliki repertoar promenljivih domena teškog lanca čini dostupan za mišji da se odabere jedan koji može da poveže sa ograničenim repertoarom ljudskih promenljivih regiona lakog lanca.

[0154] [0127] Miš koji bira zajednički laki lanac za više teških lanaca ima praktičnu korisnost. U različitim izvođenjima, antitela koja se ispoljavaju u mišu koja mogu da ispolje samo zajednički laki lanac će imati teške lance koji mogu da povežu i ispolje sa identičnim ili pretežno identičnim lakim lancem. Ovo je posebno korisno za pravljenje bispecifičnih antitela. Na primer, takav miše može da se imunizuje sa prvim imunogenom da se generiše B ćelija koja ispoljava antitelo koje specifično vezuje prvi epitop. Miš (ili miš genetski isti) može da bude imunizovan sa drugim imunogenom da se generiše B ćelija koja ispoljava antitelo koje specifično vezuje drugi epitop. Promenljivi teški regioni mogu da se kloniraju iz B ćelija i ispolje sa istim konstantnim regionom teškog lanca, i isti laki lanac, i ispoljeni u ćeliji da se napravi bispecifično antitelo, pri čemu je komponenta iakog lanca na bispecifičnom antitelu izabrana pomoću miša da se udruži i ispolji sa komponentom lakog lanca.

[0155] Pronalazači su projektovali miš za generisanje lakih lanaca imunoglobulina koji će pogodno da se upare sa prilično raznovrsnom familijom teških lanaca, uključujući teške tance čiji primenljivi regioni se udaljavaju od sekvenci klicine linije, npr. afinitetno zreli iii somatski mutirani promenljivi regioni. U različitim izvođenjima, miš se napravi da spari ljudske promenljive domene lakog lanca sa ljudskim promenljivim domenima teškog lanca koji sadrže scmaske mutacije, koje omogućavaju rutu za visoko afinitetne proteine za vezivanje pogodne za upotrebu kao lekovi za ljude.

[0156] Genetski projektovan miš, putem dugog i složenog postupka selekcije antiela unutar nekog organizma, čini biološki pravilne izbore u sparivanju različite skupine ljudskih promenljivih domena teškog lanca sa ograničenim brojem opcija lakog lanca čoveka. Kako bi se ovo postiglo, miš se projektuje da bi predstavio ograničen broj opcija promenljivog domena iakog lanca čoveka u vezi sa veoma raznovrsnim opcijama promenljivog domena teškog lanca čoveka. Posle izazova sa imunogenom, miš maksimizuje broj rešenja u svom repertoaru da bi se razvilo antitelo na imunogenu, organičeno u velikoj meri ili isključivo brojem ili opcijama lakog lanca u svom repertoaru. U različitim izvođenjima, ovo obuhvata omogućavanje mišu da ostvari pogodne i kompatibilne somatske mutacije promenljivog domena lakog lanca koje će ništa manje biti kompatibilne sa relativno velikim brojem raznovrsnih promenljivih domena teškog lanca čoveka, uključujući posebno somatski mutirane promenljive domene teškog lanca čoveka.

[0157] Da bi se postigao ograničen repertoar opcija lakog lanca, miš je projektovan da da nefunkcionalnu ili pogodno nefunkcionalnu svoju sposobnost da napravi, iii prerasporedi, neprerađeni promenljivi domen lakog lanca miša. Ovo može da se ostvari npr., brisanjem mišjih segmenata gena promenljivog regiona lakog Inaca. Endogeni mišji lokus može zatim da se modfikuje eksogenim pogodnim ljudskim segmentom gena promenljivog regiona lakog lanca po izboru, operativno povezanim na endogeni mišji konstantni domen lakog ianca, tako da eksogeni ljudski segmenti gena promenljivog regiona mogu da se kombinuju sa endogenim mišjim genom konstantnog regiona lakog lanca i formiraju preraspoređeni reverzni gen himernog lakog lanca (ljudski promenljiv, mišji konstantan). U različitim izvođenjima, promenljivi region lakog lanca je sposoban da somatski mutira. Kod različitih izvođenja, da bi se maksimizovala sposobnost promenljivog regiona lakog lanca da usvoji somatske mutacije, odgovarajući pojačivači su zadržani u mišu. Na primer, kod modifikovanja mišjeg<k>lokusa lakog lanca da zameni endogene mišje<k>segmente gena takog ianca sa ljudskim<k>segmentima gena lakog lanca, mišji<k>intronski pojačivač i mišji 3' pojačivač se funkcionalno održavaju, ili su neprekinuti.

[0158] [0131] Genetski projektovan miš je dat koji ispoljava ograničeni reptertoar reverznih himernih (ljudskih promenljivih, mišjih konstantnih) lakih lanaca povezanih sa raznovrsnim reverznim himernim (ljudskim promenljivim, mišjim konstantnim) teškim lancima. Kod različitih izvođenja, endogeni mišji<k>segmenti gena lakog lanca se brišu i zamenjuju sa jednim (ili dva) preraspoređena regiona lakog lanca čoveka, operativo povezana na endogeni mišji C<k>gen. U ovim izvođenjima za dobijanje maksimalne somatske hipermutacije preraspoređenog regiona lakog lanca čoveka, mišji<k>intronski pojačivač i mišji<k>3' pojačivač se održavaju. U različitim izvođenjima, miš takođe obuhvata nefunkcionalniXlokus lakog lanca, ili njegovo brisanje ili brisanje koje daje kao rezultat da lokus ostane u nemogućnosti da napraviXlaki lanac.

[0159] Dakle, obezbeđuje se genetski modifikovan miš koji sadrži B ćeliju koja ispoljava promenljivi domen lakog lanca (V<l>) kod čoveka izveden iz preraspoređene ljudske V<k>1-39/J<k>5 sekvence koja je prisutna u klicinoj liniji ćelije miša, pri čemu miš nema nepreraspoređeni endogeni V<k>segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni imunoglobulin Jk segment gena; i pri čemu ljudski Vl domen(i) je povezan sa promenljivim domenom teškog (V<j>-<j>) lanca čoveka izvedenim iz prerapoređenog V<h>/D<h>-'J<h>regiona čoveka izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 or 1-69/6-13/4. Takođe je dat genetski modifikovan miš koji obuhvata B ćeliju koja ispoljava promenljivi domen iakog lanca (V<l>) kod čoveka izveden iz preraspoređene ljudske V<k>3-20/J<k>1 sekvence koja je prisutna u klicinoj liniji ćelije miša, pri Čemu miš nema nepreraspoređeni endogeni V<k>segment gena imunogloublina i nepreraspoređeni endogeni J<k>gene segment gena imunoglobulina; i pri čemu Vl domen(i) čoveka izveden povezani sa promenljvim domenom teškog lanca (V<h>) čoveka izvedenim iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona čoveka izabranom iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4.

[0160] Genetski projektovan miš je dat u različitim izvođenjima, obuhvata lokus promenljivog regiona lakog lanca kome nedostaju endogeni mišji V<l>i J<l>segmenti gena lakog lanca i obuhvata preraspoređeni promenljivi region lakog lanca čoveka, koji je preraspoređena ljudska V<k>1-39/J<k>5 sekvenca ili ljudska V<k>3-20/J<k>1 sekvenca, operativno povezana na mišji konstantni region, pri čemu lokus može da prođe somatsku hipermutaciju, i pri čemu lokus ispoljava laki lanac koji obuhvata ljudsku V<l>/J<l>sekvencu povezanu na mišji konstantni region. Zato, u različitim izvođenjima, lokus obuhvata mišji<k>3' pojačivač, koji je povezan sa normalnim ili diviljim tipom, nivoa somatske hipermutacije.

[0161] [0134] Genetski projektovan miš u različitim izvođenjima kada se imunizuje sa antigenom od interesa generiše B ćelije koje ispoljavaju raznovrsnost preraspoređivanje promenljivih regiona imunoglobulina čoveka koji ispoljavaju i funkcionišu sa jednim ili sa dva preraspoređena laka lanca, uključujući izvođenja gde jedan ili dva laka lanca obuhvataju promenljive regione lakog lanca čoveka koji obuhvata, npr., 1 do 5 somatskih mutacija. Kod različitih izvođenja, laki lanci čoveka tako ispoljeni su sposobni za udruživanje i ispoljavanje sa bilo kojim promenljivim regionom teškog lanca imunoglobulina čoveka ispoijenim u mišu. U jednom primeru, genetski modifikovan miš obuhvata B ćeliju koja ispoljava ljudski V<L>domen izveden iz preraspoređene ljudske V<k>1-39/J<k>5 sekvence koja je prisutna u klicinoj liniji miša, pri čemu miš nema neprerasoređeni endogeni V<k>segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni J<k>segment gena imunoglobulina; i pri čemu se promenlivi domen(i) lakog lanca (V<l>) Čoveka povezuje sa promenljivim domenom teškog lanca (V<h>) čoveka izvedenim iz preraspoređenog ljudskog Vh/Dh/Jh regiona izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6- 6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/5, 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4. U drugom primeru, genetski modifikovan miš koji obuhvata B ćeliju koja ispoljava promenljivi domen lakog lanca (V<l>) čoveka izveden iz preraspoređene ljudske V<k>3-20/J<k>1 sekvence koja je prisutna u klicinoj liniji ćelije miša, pri čemu miš nema nepreraspoređeni endogeni V<k>segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni J<k>segment gena imunoglobulina; i pri čemu Vl domen(i) čoveka se povezuju sa promenljivim domenom teškog lanca <V|_|) čoveka izvedenim iz preraspoređenog Vh<'D|-|/Jh regiona čoveka izabranim iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4.

[0162] Proteini za vezivanje epitopa koji vezuju više od jednog epitopa

[0163] Jedinjenja i postupci opisani ovde mogu da se koriste da se naprave proteini za vezivanje koji vežu više od jednog epitpopa sa visokim afinitetom, npr., bispecifična antitela. Prednosti ovog pronalaska obuhvataju sposobnost da se odaberu pogodni lanci imunoglobulina sa visokim vezivanjem teškog lanca od kojih će svaki da se poveže sa jednim lakim lancem.

[0164] Sinteza i ispoljavanje bispecifičnih proteina vezivanja je problematična, delimično zbog problema povezanih sa utvrđivanjem pogodnog lakog ianca koji može da se poveže i ispolji sa dva različita teška lanca, i delimično zbog problema sa izolacijom. Postupci i jedinjenja opisani ovde omogućavaju da se odabere za genetski modifikovanog miša, putem drugih prirodnih postupaka, pogodan laki lanac koji može da se poveže i ispolji sa više od jednog teškog lanca, uključujući teške lance koji se somatski mutiraju (npr., afinitetno zrele). Ljudske V<l>i V(-| sekvence iz pogodnih B ćelija imunizovanih miševa kako je ovde opisano koje ispoljavaju afinitetno zrela antitela koja imaju reverzne himerne teške lance (tj., ljudski promenijiv i mišji konstantan) mogu da budu identifikovane i klonirane u okviru u vektoru ekspresije sa pogodnom ljudskom sekvencom gena konstantnog regiona (npr., ljudski 1gG1). Dva takva konstrukta mogu da budu pripremljena, pri čemu svaki konstrukt kodira promenljivi domen teškog lanca čoveka koji vezuje različiti epitop. Jedno od ljudskih Vl (npr, ljudski V<k>1-39J<k>5 ili ljudski V<k>3-20J<k>1), u sekvenci klicine linije ili iz B ćelije pri čemu je ova sekvenca somatski mutirana, može da se spoji u okviru na pogodni gen konstantnog regiona čoveka (npr., ljudski<k>konstantni gen). Ova tri potpuno ljudska teška i laka konstrukta mogu da budu postavljena u pogodnu ćeliju za ispoljavanje. Ćelija će ispoljiti dve veće vrste: homodimerni teški lanac sa identičnim lakim lancem, i heterodimemi teški lanac sa identičnim lakim lancem. Da bi se omogućilo lako odvajanje ovih većih vrsta, jedan od dva ianca je modifikovan da izostavi determinant za vezivanje proteina A, to kao rezultat daje diferencijalni afinitet homodimernog proteina za vezivanje iz heterodimernog proteina za verzivanje. Jedinjenja i postupci koji se bave ovim problemom su opisani u USSN 12/832,838, podnetom 25. juna 2010., pod naslovom "ReadiSy Isoiated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format," objavljenom kao US 2010/0331527A1.

[0165] U jednom primeru, pronalazak se odnosi na protein za vezivanje epitopa kako je ovde opisano, pri čemu su ljudske V<l>i V<h>sekvence izvedene iz miša opisanog ovde koji je imimizovan sa antigenom koji obuhvata epitop od interesa.

[0166] [0138] Takođe se odnosi na protein za vezivanje epitopa koji sadrži prvi i drugi polipeptid, prvi polipeptid, od N-terminala do C- terminala, prvi region za vezivanje epitopa koji selektivno vezuje prvi epitop, posle kog sledi konstantni region koji obuhvata prvi C<h>3 region ljudskog IgG izabranog iz lgG1, lgG2, lgG4, i njihove kombinacije, i, drugi polipeptid koji obuhvata, od N-terminala do C-terminala, drugi region za vezivanje epitopa koji selektivno vezuje drugi epitop, posle kog sledi konstanti region koji obuhvata drugi C|-|3 region ljudskog IgG izabran iz lgG1, lgG2, lgG4, i njihova kombinacija, pri čemu drugi C(-|3 region obuhvata modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog C|_|3 domena na proteinu A.

[0167] U jednom primeru, drugi Cf-|3 region obuhvata H95R modifikaciju (putem IMGT numerisanja eksona; H435R putem EU numerisanja). U drugom izvođenju, drugi CH3 region još obuhvata Y96F modifikaciju (IMGT; Y436F putem EU).

[0168] U jednom primeru, drugi C<h>3 region je iz modifikovanog ljudskog !gG1, i još obuhvata modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I putem EU).

[0169] U jednom primeru, drugi C<h>3 region je iz modifikovanog ljudskog lgG2, i još obuhvata modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I putem EU).

[0170] U jednom primeru, drugi C<h>3 region je iz modifikovanog ljudskog lgG4, i dalje obuhvata modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79G, i V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V4221 putem EU).

[0171] [0143] Jedan postupak za pravljenje proteina za vezivanje epitopa koji vezuje više od jednog epitopa je da se imunizuje prvi miš u skladu sa ovim pronalaskom sa antigenom koji sadrži prvi epitop od interesa, pri čemu miš obuhvata endogeni lokus promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina koji ne sadrži endogeni mišji Vj_ koji je moguće prerasporediti i formirati laki lanac, pri čemu na endogenom mišjem lokusu promenljivog regiona lakog ianca imunoglobulina je jedan preraspoređeni ljudski V<[>_ region koji je operativno povezan na endogeni mišji konstantni region gena lakog lanca, i preraspoređeni V<[>_ region čoveka se bira iz ljudskog V<k>1-39J<k>5 i ljudskog V<k>3-20J<k>1, i endogenih mišjih V<h>segmenata gena je zamenjen u celini ili delimično ljudskim V<h>segmentima gena, kao što su teški lanci imunoglobulina napravljeni pomoću mišjih su isključivo ili pretežno teški lanci koji obuhvataju ljudske promenljive domene i mišje konstantne domene. Kada je imunizovan, takav miš će napraviti reverzno himerno antitelo, koje obuhvata samo jedan od dva promenijiva domena lakog lanca čoveka (npr., jedan od ljudskih V<k>1-39J<k>5 ili ljudski V<k>3-20J<k>). Pošto se identifikuje B ćelija koja kodira V<h>koji identifikuje epitop od interesa, sekvenca nukleotida V<h>(i, opciono, V[_) može da se otkrije (npr., putem PCR) i klonira u ispoljavanje konstrukta u okviru sa pogodnim konstantnim domenom imunoglobulina čoveka. Ovaj postupak može da se ponovi da se identifikuje drugi V<h>domen koji vezuje drugi epitop, i druga Vh sekvenca gena može da se otkrije i klonira u vektor ekspresije u okviru drugog pogodnog konstantnog domena imunoglobulina. Prvi i drugi konstantni domeni imunoglobulina mogu da imaju isti iii drugačiji izotip, i jedan od konstantnih domena imunoglobulina (ali ne i drugi) može da se modifikuje kako je ovde opisano ili u US 2010/0331527A1, i protein za vezivanje epitopa može da bude ispoljeno u pogodnoj ćeliji i izolovano na osnovu njegovog diferencijalnog afiniteta za Protein A u poređenju sa hornodimernim proteinom za vezivanje epitopa, npr, kako je opisano u US 2010/0331527A1.

[0172] Takođe se odnosi na postupak za pravljenje bispecifičnog proteina za vezivanje epitopa, koji obuhvata utvrđivanje prvu afinitetno zrelu (npr., koji sadrži jednu ili više somatskih hipermutacija) ljudsku V|-| sekvencu nukleotida (V<^>l) iz miša kako je ovde opisano, identifikovanje druge afinitetno zrele (npr., koji obuhvata jednu ili više somatskih hipermutacija) ljudske V<h>sekvence nukleotida (V<h>2) iz miša kako je ovde opisano, kloniranje V<h>1 u okviru sa ljudskim teškim lancem koji nema Protein A-determinantnu modifikaciju kako je opisano u US 2010/0331527A1 da se formira teški lanac 1 (HC1), kloniranje V<h>2 u okviru sa ljudskim teškim lancem obuhvata Protein A-determinant kako je opisano u US 2010/0331527A1 da se formira teški lanac 2 (HC2), koji uvodi vektor ekspresije koji obuhvata HC1 i isti ili drugačiji vektor ekspresije koji obuhvata HC2 u ćeliji, pri čemu ćelija takođe ispoljava iaki lanac imunoglobulina čoveka koji obuhvata ljudski Vsd-39/ljudski J<k>5 ili ljudski V<k>3-20/ljudski J<k>1 spojen na konstantni domen lakog ianca čoveka, što omogućava ćeliji da ispolji bispecifični protein za vezivanje epitopa koji obuhvata V<h>domen kodiran pomoću V<h>1 i V<h>domen kodiran pomoću V<h>2, i izolovanje bispecifičnog proteina za izolovanje epitopa na osnovu njegove sposobnosti diferenciranja da veže Protein A u poređenju sa rnonospecifičnim hornodimernim proteinom za vezivanje epitopa. U specifičnom primeru, HC1 je lgG1, i HC2 je lgG1 koji obuhvata modifikaciju H95R (IMGT; H435R by EU) i još obuhvata modifikaciju Y96F (IMGT; Y43SF pomoću EU). U jednom primeru, V<h>domen kodiran pomoću V<h>1, V<h>domen kodiran V<h>2, ili oba, su somatski mutirani.

[0173] Ljudski V<h>geni koji se ispoljavaju sa zajedničkim ljudskim V[_

[0174] Veliki broj ljudskih promenljivih regiona od afinitetno zrelih antitela podignutih protiv četiri različita antigena su ispoljeni sa bilo njihovim poznatim lakim lancem, ili najmanje jednim od ljudskog lakog lanca izabranog iz V<k>1-39J<k>5 čoveka, V<k>3-20J<k>1 čoveka, ili VpreBJ\5 čoveka (videti Primer 1). Za antitela na svakom od antigena, somatski mutirani visoko afinitetni, teški lanci iz različitih familija gena su upareni uspešno sa preraspoređenim klicinim linijama ćelije čoveka V<k>1-39J<k>5 i V<k>3-20J<k>1 regiona i izlučeni su iz ćelija koje ispoljavaju teške i lake lance. Za V<k>1-39J<k>5 i V<k>3-20J<k>1, V<h>domeni izvedeni iz sledećih Vh familija gena čoveka su ispoljeni pogodno: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, i 6-1. Zato, miš koji je projektovan da ispolji ograničeni repertoar V|_ domena čoveka iz jedne ili obe V<k>1-39J<k>5 i V<k>3-20J<k>1 generisaće raznovrsnu populaciju somatski mutiranih ljudskih V<h>domena iz V<h>lokusa modifikovanjh da zamene mišje Vh segmente gena sa ljudskim V<h>segmentima gena.

[0175] [0146] Genetski projektovani miševi da ispolje reverzni himerni (ljudski promenljive, mišji konstantne) teške lance imunoglobulina povezane sa jednim preraspoređenim lakim lancem (npr., W1-39/J ili V<k>3-20/J), kada su imunizovani sa antigenom od interesa, gnerisane B ćelije koje su obuhvatale raznovrsnost preraspoređivanja ljudskih Vh i ispoijiie su raznovrsnost visoko afinitetnih antitela specifičnih za antigen sa raznovrsnim svojstvima u vezi sa blokiranjem njihovih sposobnosti da blokiraju vezivanje antigena na njegov ligand, i u vezi sa njihovom sposobnošću da vežu varijante antigena (videti Primere 5 do 10).

[0176] Zato, ovde opisani miševi i postupci jesu korisni za pravljenje i selektovanje promenljivih domena teškog lanca imunoglobulina čoveka, uključujući somatski mutirane promenljive domene teškog lanca čoveka, koji kao rezultat daju raznovrsna preraspoređivanja, koji ispoljavaju široku raznovrsnost afiniteta {uključujući ispoljavanje Kq od oko nanomolarnog ili manje), veliku raznovrsnost specifičnosti (uključujući vezivanje na različite epitope istog antigena), i povezivanje i ispoljavanje sa istim ili pretežno istim promenljivim regionom lakog lanca imunoglobulina čoveka.

[0177] Siedeći primeri su dati tako da objasne prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti kako da naprave

[0178] i koriste postupke i jedinjenja prema ovom pronaiasku, i nisu predviđeni da ograničavaju obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Učinjeni su napori da se osigura preciznost u pogledu korišćenih brojeva (npr.. količine, temperature, itd.), ali neke eksperimentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije navedeno, delovi su delovi prema težini, molekularna težina je prosečna molekulama težina, temperatura je navedena u Celzijusima, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.

[0179] PRIMERI

[0180] Siedeći primeri su dati da se objasni kako napraviti i koristititi postupke i jedinjenja prema ovom pronalasku, i nisu predviđeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaksom. Osim ako nije drugačije navedeno, temperatura je navedena u Celzijusima, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.

[0181] Primer 1

[0182] Identifikacija ljudskih v<H>regiona koi se povezuju sa izabranim ljudskim V<l>regionima

[0183] In vitrosistem ekspresije je bio konstruisan da se odredi da ii jedan preraspoređeni ljudski laki lanac klicine linije može da ima koekspresiju sa ljudskim teškim lancima iz ljudskih antiela specifičnih za antigen.

[0184] [0151] Postupci za generisanje ljudskih antitela kod genetski rnodifikovanih miševa su poznati (videti npr, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuttcals, VELOCI MM U N E®). Ova VELOCIMMUNE® tehnologija obuhvata generisanje genetski modifikovanog miša koji ima genom koji obuhvata promenljive regione ljudskog teškog lanca i iakog lanca koji su operativno povezani na endogena mesta konstantnog regiona kod miša tako da miš proizvodi antitelo koje obuhvata ljudski promenljivi region i mišji konstantni region kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK kodiranje promenljivih regiona teškog lanca i lakog lanca antitela proizvedenih Iz VELOCIMMUNE® miša su potpuno ljudski. Inicijalno, izolovana su visoko afinitetna himerna antitela koja imaju promenljivi region čoveka i konstantni region miša. Kako je dole opisano, antitela su karakterizirana i selektovana prema poželjnim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni poželjnim ljudskim konstantnim regionima da se generiše potpuno ljudsko antitelo koje sadrži ne-lgM izotip, na primer, divlji tip ili modifikovani lgG1, lgG2, lgG3 ili lgG4. lako izabrani konstantni region može da varira prema specifičnoj upotrebi, visoko afinitetne antigen vezujuće i za cilj specifične karakteristike se nalaze u pramen ljivom regionu.

[0185] VELOCIMMUNE® miš je imunizovan sa faktorom rasta koji promoviše angiogenezu (Antigen C) i za antigen specifična ljudska antitela su izolovani i sekvenca za upotrebu V gena korišćenjem standardnih tehnika priznatih u ovoj oblasti. Izabrana antitela su klonirana na konstantne regione teškog i lakog lanca čoveka i 69 teških lanaca je izabrano za uparivanje sa jednim od tri ljudska laka lanca: (1) poznati k laki lanac povezan na ljudski k konstantni region, (2) preraspoređena ljudska klicina liniija V<k>1-39J<k>5 povezana na ljudski<k>konstantni region, ili (3) preraspoređenu klicinu liniju čoveka V<k>3-20J<k>1 povezanu na<k>konstantni region čoveka. Svaki par teškog lanca i lakog lanca su zajedno transfektovani u CHO-K1 ćelije korišćenjem standardnih tehnika. Prisustvo antitela u supernatantu je detektovano pomoću IgG-a koji jako reaguje sa antigenima čoveka u ELISA probi. Titar antitela (ng/ml) je određen za svaki par teškog lanca/lakog lanca i titrima sa različitim preraspoređenim lakim lancima klicine linije su upoređeni sa titrima dobijenim sa molekulom roditeljskog antitela (t.j. teški lanac uparen sa poznatim lakim lancem) i izračunat je procenat neprerađenog (Tabela 1). V<h>: Gen promenljivog teškog lanca. ND: nikakvo ispoljavanje nije detektovano pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.

[0186] U sličnom eksperimentu, VELOCIMMUNE® miševi su irnunizovani sa nekoliko različitih antigena i izabrani teški lanciantitela specifičnih za ljudski antigen su ispitani na njihovu sposobnost da se upare sa različitim preraspoređenim lakim lancima klicine linije čoveka (kao Što je gore opisano). Antigeni korišćeni u ovom eksperimentu su obuhvatali enzim uključen u homeostazu holesterola (Angtigen A), hormon seruma uključen u regulisanje homeostaze glukoze (Antigen B), faktor rasta koji pospešuje angiogenezu (Antigen C) i receptor na površini ćelije (Antigen D). Antitela specifična za antigen su izolovana iz miševa svake grupe i promenljivi regioni teškog lanca i lakog lanca su klonirani i sekvencionirani. Iz sekvence teškog lanca i lakog lanca, određena je upotreba V gena i odabrani teški lanci su upareni sa bilo njihovim poznatim lakim lancem ili preraspoređenim V<k>1-39J<k>5 regionom klicine linije čoveka. Svaki par teškog/lakog lanca je zajedno transfektovan u CHO-K1 ćelijama i prisustvo antitela u supernatantu je detektovano pomoću IgG-a koji jako reaguje sa antigenima čoveka u ELISA probi. Titar antitela (ug/ml) je određen za svaki upareni teški lanac/laki lanac i titri sa različitim preraspoređenim lakim lancima klicine linije čoveka su upoređeni sa titrima dobijenim sa molekulom roditeljskog antitela (t.j., teški lanac je uparen sa poznatim lakim lancem) i izračunat je procenat neprerađenog titra (Tabela 2). V<h>: Gen promenljivog teškog lanca. V<k>:<K>gen promenljivog lakog ianca. ND: nikakvo ispoljavanje nije detektovano pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.

[0187] Rezultati dobijeni iz ovih eksperimenata pokazuju da su somatski mutirani, visoko afinitetni teški lanci iz različitih familija gena sposobni da se upare sa preraspoređenim V<k>1-39J<k>5 čoveka i Vic 3-20J<k>1 regionima klicine linije čoveka i mogu da budu izlučeni iz ćelije kao molekul normalnog antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 1, titar antitela je povećan za oko 61 % (42 od 69} teških lanaca uparenih sa preraspoređenim V<k>1-39J<k>5 lakog lanca čoveka i oko 29% (20 od 69} teških lanaca kada se uporedi sa preraspoređenim V<k>3-20J<k>1 lakim lancem čoveka u poređenju sa poznatim lakim lancem roditeljskog antiela. Za oko 20% (14 of 69) teških lanaca, oba preraspoređena laka lanca klicine linije čoveka su dala povećanje ekspresije u poređenju sa poznatim lakim lancem rodtiteljskog antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 2, preraspoređeni V<k>1-39J<k>5 region klicine linije čoveka je dao povećanje u ispoljavanju nekoliko teških lanaca specifičnih za opseg različitih klasa antigena u poređenju sa poznatim lakim lancem za roditeljska antitela. Titar antitela je povećan za više od dvostruko za oko 35% (15/43) teških lanaca u poređenju sa poznatim lakim lancem roditeljskih antitela. Za dva teška lanca (315 i 316), povećanje je bilo veće od desetostrukog u poređenju sa roditeljskim antitelom. Unutar svih teških alanca koji su pokazali povećanje ispoljavanja u odnosu na poznati iaki lanac roditeljskog antitela, porodica tri (V<[>-<j>3) teška lanca je prekomerno zastupljena u poređenju sa drugim familijama gena promenljivog regiona teškog lanca. Ovo pokazuje povoljan odnos V|_|3 teških lanaca čoveka da se upare sa preraspoređenim W1-39Jk5 i V<k>3-20J<k>1 lakim lancima klicine linije čoveka.

[0188] Primer 2

[0189] Generisanje preraspoređenog lokusa lakog lanca klicine linije Čoveka

[0190] [0155} Različiti preraspoređeni vektori za ciljanje lakog lanca klicine linije čoveka su napravljeni korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., US Pat br. 6,586,251 i Valenzuelaef al.(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analvsis, Nature Biotech. 21(6):652-659)za modifikovanje genomskih klonova bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) 302g12 i 254m04 (Invitrogen). Korišćenje ova dva BAC klona, genomskih konstrukata je projektovano da sadrži jedan preraspoređeni region lakog ianca klicine linije čoveka i umetne ga u endogeni<k>lokus lakog lanca koji je prethodno modifikovan da isprazni endogene<k>promenljive i spojne segmente gena.

[0191] Konstrukcija preraspoređenih vektora za ciljanje lakog lanca klicine linije čoveka. Tri različita preraspoređena regiona lakog lanca klicine linije čoveka su napravljena korišćenjem standardnih tehnika priznatih u molekularnoj biologiji. Promenljivi segmenti gena čoveka korišćeni za konstruisanje ova tri regiona su obuhvatili preraspoređenu ljudsku V<k>1-39J<k>5 sekvencu, preraspoređenu ljudsku V<k>3-20J<k>1 sekvencu i preraspoređenu ljudsku VpreBJX5 sekvencu.

[0192] DNK segment koji sadrži ekson 1 (kodira vodeći peptid) i intron 1 miša V<k>3-7 gen je napravljen pomoću de novo DNK sinteze (Integrated DNA Technologies). Deo 5' neprevedenog regiona sve do mesta pojave Blpl restrikcionog enzima koji se prirodno javlja je obuhvaćen. Eksoni ljudskih V<k>1-39 i V<k>3-20 gena su bili pojačani PCR-om iz genomskih BAC biblioteka čoveka. Prajmeri prema napred su imali 5' produžetak koji sadrži mesto prijema spoja introna 1 mišjeg V<k>3-7 gena. Reverzni primer je korišćen za PCR W1-39 sekvencu čoveka obuhvaćenu produžetkom čovekove J<k>5 za kodiranje, pri čemu je reverzni primer korišćen za PCR čovekove Vic3-20 sekvence obuhvaćeni produžetak

[0193] čovekove J<k>1 za kodiranje. Ljudska VpreBJ^.5 sekvenca je napravljena pomoću de novo DNK sinteze (Integrated DNA Technologies), Deo ljudskog J<k>-C<k>introna obuhvata mesto donora spoja je PCR-om pojačano iz plazmida pBS-296- HA18-PIScei. Prajmer PCR prema napred je obuhvaćen produžetkom dela za kodiranje bilo koje od ljudskih J<k>5, J<k>1, ili J^5 sekvenci. Reverzni prajmer je obuhvatio Pl-Scel mesto, koja su bila prethodno projektovana u intron.

[0194] Mišji V<k>3-7 eksonl/intron 1, eksoni promenljivog lakog lanca čoveka, i Jk-Ck fragmenti introna čoveka su zašiveni zajedno produžetkom preklapanja PCR, prevareno sa Blpl i Pl-Scel, i povezani su u plazmid pBS-296-HA18-PIScel, koja je sadržala promoter iz V<k>3-15 segmenta promenljivog gena čoveka. Kaseta higromicina u tečnom kiseoniku unutar plazmida pBS-296-HA18-PIScel je zamenjena sa FRTed kasetom higromicina bočno postavljenom pomoću Noti i AscI mesta. Ova Notl/Pl-Scel fragment ovog plazmida je povezan u modifikovan mišji BAC 254m04, koji je sadržao deo mišjeg J<k>-C<k>introna, mišjeg C<k>eksona, i oko 75 kb genomske sekvence nizvodno od mišjeg<k>lokusa, koji je dao 3' homolognog kraka za homolognu rekombinaciju mišjih ES ćelija. Notl/AscI fragment ovog BAC je zatim povezano u modifikovani mišji BAC 302g12, koji su sadržali FRTed kasetu neomicina i oko 23 kb genomske skevence uzvodno od endogenog<k>lokusa za homolognu rekombinaciju u mišjim ES ćelijama.

[0195] Preraspoređeni V<k>1-39J<k>5 vektor za ciljanje klicine linije čoveka (SL. 1). Restrikciona mesta enzima su bila uvedena na 5' i 3' krajeve projektovanog lakog lanca umetnutog za kloniranje u ciljni vektor: AscI mesto na 5' kraju i Pl-Scel mestu na 3' kraju. Unutar 5' AscI mesta i 3' Pl-Scel mesta konstrukta za ciljanje od 5' do 3' obuhvatilo 5' homologni krak koji sadrži sekvencu 5' na endogenom lokusa mišjeg k lakog lanca dobijenog iz mišjeg BAC kiona 302g12, FRTed gena otpornog na neomicin, genomska sekvenca je uključivala ljudski V<k>3-15 promoter, vodeće sekvence mišjeg V<k>3-7 promenljivog segmenta gen, sekvenca introna mišjeg V<k>3-7 promenljivog segmenta gena, otvoreni okvir za učitavanje preraspoređenog V<k>1-39J<k>5 regiona klicine linije čoveka, genomska sekvenca sadrži deo J<k>-C<k>introna čoveka, i 3' homologni krak koji sadrži endogenu sekvencu 3' miša J<k>5 segment gena je dobijen iz mišeg BAC klona 254m04 (Slika 1, sredina). Geni i/ili sekvence uzvodno od endogenog mišjeg<k>

lokusa lakog lanca i nizvodno od većine 3' J<k>segmenta gena (npr., endogenih 3' pojačivač) su nemodifikovani konstrukti za ciljanje (videti Sliku 1). Sekvenca projektovanog ljudskog V<k>1-39J<k>5 lokusa je prikazana u iD BR SEK:1.

[0196] Ciljani umetak preraspoređenog V<k>1-39J<k>5 regiona klicine linije čoveka u BAC DNK je potvrđen putem lančane reakcije polimeraze (PCR) korišćenjem prajmera lociranih na sekvencama unutar preraspoređenog regiona iakog lanca klicine linije čoveka. Ukratko, intronska sekvenca 3' na mišjem V<k>3-7 vodeće sekvence je potvrđena sa prajmerima ULC-rn1F (AGGTGAGGGT

[0197] ACAGATAAGT GTTATGAG; ID BR SEK:2) i ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGAT- CA;

[0198] ID BR SEK:3). Otvoreni okvir za učitavanje preraspoređenog V<k>1-39J<k>5 regiona klicine linije čoveka je potvrđen sa prajmerima 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; ID BR SEK:4) i 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; ID BR SEK:5). Kaseta neomicina je potvrđena sa prajmerima

[0199] neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; ID BR SEK:6) i neoR (GAACACGGCG GCATCAG; ID BR

[0200] SEK.7). Ciljani BAC DNK je zatim korišćen za elektropermeabiiizaciju mišjih ES ćelija za kreiranje modifikovanih ES ćelija za generisanje himernih miševa koji ispoljavaju preraspoređeni V<k>1-39J<k>5 region klicine linije čoveka.

[0201] Pozitivni ES klonovi ćelije su potvrđeni putem TAO.MAN™ karakterisanja i kariotipovanja korišćenjem sondi specifičnih za projektovani V<k>1-39J<k>5 region lakog lanca umetnut u endogeni lokus. Ukratko, proba neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; ID BR SEK:8) koji se vezuje unutar gena markera neomicina, proba ULC-m1 P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; ID BR SEK:9) koji se vezuje unutar intronske sekvence 3' na mišju V<k>3-7 vodeću sekvencu, i probu 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; ID BR SEK:10) koja se vezuje unutar preraspoređene klicine linije čoveka W1-39Jk5 otvorenog okvira učitavanja. Pozitivni ES klonovi ćelije su zatim korišćeni za miševe ženskog implanta da se koriste za legio prokariotskih ubikvitinu sličnih proteina (pups) ispoljavanje V<k>1-39J<k>5 regiona lakog lanca klicine linije.

[0202] Alternativno, ES ćelije nose preraspoređeni V<k>1-39J<k>5 region lakog lanca klicine linije čoveka se transfektuju sa konstruktom koji ispoljava FLP kako bi se uklonio FRTed neomicin kaseta uvedena pomoću konstrukta za ciljanje. Opciono, kaseta neomicina je uklonjena oplemenjivanjem na miševima koji ispoljavaju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,273). Opciono, kaseta neomicina je zadržana kod miševa.

[0203] [0163] Preraspoređeni vektor za ciljanje V<k>3-20J<k>1 klicine linije čoveka (SL. 2). Na sličan način, projektovani lokus lakog lanca ispoljava preraspoređeni V<k>3-20J<k>1 region klicine linije je napravljen korišćenjem konstrukta za ciljanje uključujući, od 5' do 3', 5' homologni krak koji sadrži sekvencu 5' na endogenom<k>lokusu lakog lanca miša dobijenom iz BAC klona 302g12, FRTed gen otpornosti na neomicin, genomska sekvenca obuhvata ljudski V<k>3-15 promoter, vodeću sekvencu mišjeg V<k>3-7 promenljivog segmenta gena, intronska sekvenca mišjeg V<k>3-7 promenlivog segmenta gena, otvoreni okvir za učitavanje preraspoređenog V<k>3-20J<k>1 regiona klicine linije čoveka, genomska sekvenca koja sadrži deo J<k>-C<k>introna čoveka, i 3' homologni krak koji sadrži endogenu 3' sekvencu miša J<k>5 segment gena je dobijen iz mišjeg BAC kiona 254rn04 (Slika 2, sredina). Sekvenca projektovanog ljudskog V<k>3-20J<k>1 lokusa je prikazana u ID BR SEK:11.

[0204] Ciljani umetak preraspoređenog Vtc3-20J<k>1 regiona klicine linije čoveka u BAC DNK je potvrđen putem lančane reakcije polimeraze (PCR) korišćenjem prajmera postavljenih unutar preraspoređenog V<k>3-20J<k>1 regiona lakog lanca klicine linije čoveka. Ukratko, intronska sekvenca 3' na mišji V<k>3-7 vodeće sekvence je potvrđena sa prajmerima ULC-m1 F (ID BR SEK:2) i ULC-m1 R (ID BR SEK.3). Otvoreni okvir za čitanje preraspoređenog V<k>3-20J<k>1 regiona klicine linije čoveka je potvrđen sa prajmerima 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; ID BR SEK:12) i 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; ID BR SEK:13). Kaseta neomicina je potvrđena sa prajmerima neoF (ID BR SEK:6) i neoR (ID BR SEK:7). Ciljana BAC DNK je zatim korišćena da se elektroporizujuju mišje ES ćelije za kreiranje modifikovanih ES ćelija za generisanje himernih miševa koji ispoljavaju preraspoređeni V<k>3-20J<k>1 iaki lanac klicine linije čoveka.

[0205] Pozitivni ES klonovi ćelije su potvrđeni putem TAOMAN™ karakterisanja i kariotipovanja korišćenjem sondi specifičnih za projektovani V<k>3-20J<k>1 region lakog ianca umetnut u endogeni k lokus lakog lanca. Ukratko, proba neoP (ID BR SEK:8) koji se vezuje unutar marker gena neomicina, probe ULC-m1 P (ID BR SEK:9) koji vezuje unutar mišje V<k>3-7 vodeće sekvence, i proba 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; ID BR SEK:14) koji vezuje unutar ljudskog V<k>3-20J<k>1 otvorenog okvira za učitavanje. Pozitivni ES klonovi ćelija su zaiim korišćeni za implant ženskog miša. Leglo prokariotskih ubikvitinu sličnih proteina (pups) koji ispoljavaju Vsc3-20Jk1 region lakog lanca klicine linije čoveka.

[0206] Alternativno, ES ćelije koje nose V<k>3-20J<k>1 region lakog lanca klicine linije čoveka mogu da se transfektuju sa konstruktom koji ispoljava FLP kako bi se uklonila FRTed kaseta neomicina uvedena pomoću konstrukta za ciljanje. Opciono, kaseta neomicina može da bude uklonjena oplemenjivanjem na miševima koji ispoljavaju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279), Opciono, kaseta neomicina je zadržana kod miševa.

[0207] [0167] Preraspoređeni VpreBJX5 vektor za ciljanje klicine linije čoveka (SL. 3). Na siičan način, projektovani iokus lakog lanca koji ispoljava preraspoređeni VpreBJX5 region klicine linije čoveka je napravljen korišćenjem konstrukta za ciljanje uključujući, od 5' do 3', 5' homologni krak koji sadrži endogenu 5' sekvencu na endogenomklokusu lakog lanca miša dobijenom iz mišjeg BAC klona 302g12, FRTed gena za otpornost neomicina. genomska sekvenca uključujući ljudski V<k>3-15 promoter, vodeća sekvenca miša Vic3-7 promenljivog segmenta gena, intronska sekvenca mišjeg v<k>3-7 promenljivog segmenta gena. otvomeni okvir za učitavanje preraspoređenog VpreBJX5 regiona klicine linije čoveka, genomska sekvenca koja sadrži dec J<k>-C<k>introna čoveka, i 3' sekvenca koja obuhvata emdpgemo 3' homologni krak miša J<k>S segment gena dobijen iz mišjeg BAC kiona 2S4m04 (Slika 3, sredina). Sekvenca preraspoređenog ljudskog VpreBJX5 lokusa je prikazana na ID BR SEK:1S.

[0208] Ciljani umetak preraspoređenog VpreBJX5 regiona klicine linije čoveka u BAC DNK je potvrđen putem lančane reakcije polimeraze (PCR) korišćenjem prajmera smeštenih na sekvencama unutar preraspoređenog VpreBJX5 regiona lakog lanca klicine linije Čoveka. Ukratko, intronska sekvenca 3' na mišji Vtc3-7 vodeće sekvence je potvrđena sa prajmerima ULC-m1 F (ID BR SEK:2) i ULC-m1R (ID BR SEK:3). Otvoreni okvir za učitavanje preraspoređenog VpreBJX5 regiona klicine linije čoveka je potvrđen sa prajmerima 1616-MF (TGTCCTCGGC CCTTGGA; ID BR SEK:16) i 1616-MR (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; ID BR SEK:17). Kaseta neomicina je potvrđena sa prajmerima neoF (ID BR SEK:6) i neoR (ID BR SEK:7). Ciljana BAC DNK je zatim korišćena da se elektroporizujuju mišje ES ćelije za kreiranje modifikovanih ES ćelija za generisanje himernih miševa koji ispoljavaju preraspoređeni VpreBJIS laki lanac klicine linije čoveka.

[0209] Pozitivni ES klonovi ćelija su potvrđeni putem TAOMAN™ karakterisanja i kariotipovanja korišćenjem proba specifičnih za projektovani VpreBJA.5 region lakog lanca umetnut u endogeni<k>lokus lakog lanca. Ukratko, proba neoP (ID BR SEK:8) koja vezuje unutar gena markera neomicina, proba ULC-m1 P (ID BR SEK:9) koja vezuje unutar mišje !gVic3-7 vodeće sekvence, i proba 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; ID BR SEK:18) koji vezuje unutar ljudskog VpreBJ« otvorenog okvira za učitavanje. Pozitivni ES klonovi ćelija su zatim korišćeni za miševe ženskog implanta da se koriste da daju podsticaj za leglo prokariotskih ubikvitinu sličnih proteina (pups) za ispoljavanje regiona lakog lanca klicine linije.

[0210] Alternativno, ES ćelije koje nose preraspoređeni VpreBJ?.5 region lakog lanca klicine linije čoveka se transfektuje sa konstruktom koji ispoljava FLP kako bi se uklonila FRTed kaseta neomicina uvedena pomoću konstrukta za ciljanje. Opciono, kaseta neomicina je uklonjena oplemenjivanjem na miševima koji ispoljavaju FLP rekombinazu (npr, US 6,774,279). Opciono, kaseta neomicina je zadržana kod miševa.

[0211] Primer 3

[0212] Generisanje miševa koji ispoavaju jedan preraspoređeni laki lanac čoveka

[0213] Ciljane ES ćelije opisane gore u tekstu su korišćene kao donor ES ćelije i uvedene u embrion miša u staidujumu od 8-ćeiija pomoću VELOCIMOUSE® postupka (pogledati, npr., US Pat. br. 7,294,754 i Pouevmirou et al. (2007) FO generation mice that are essentiallv fully derived from the donor gene-targeteđ ES cells allovving immediate phenotvpic analvses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® nezavisno nosi projektovani V<k>1-39J<k>5 region lakog lanca klicine linije Čoveka, V<k>3-20J<k>1 region lakog lanca klicine linije čoveka ili VpreBJ^.5 region lakog lanca klicine linije čoveka korišćenjem modifikacije oglreda alela (Valenzuelaet al., supra)koji detektuje prisustvo jedinstvenog preraspoređenog regiona lakog lanca klicine linije čoveka..

[0214] [0172] Prokariott ubikvitinu sličnih proteina (pups) su genotipovani i heterozigotni ili homozigotni prokariotski ubikvitinu sličan protein (pup) za jedinstveni preraspoređeni region lakog lanca klicine linije čoveka se biraju za karakterizovanje ispoijavanja preraspoređenog regiona iakog lanca klicine linije čoveka.

[0215] Protočna citometrija Ispoljavanje preraspoređenog regiona lakog lanca čoveka u normalnom retertoaru antitela zajedničkog lakog lanca miša je potvrđeno analizom<k>iXispoijavanja imunoglobilina u splenocitima i perifernoj krvi zajedničkog lakog ianca miševa j Suspenzije ćelije iz ubranih siezina i periferne krvi divljeg tipa (n=5), V<k>1-39J<k>5 zajedničkog heterozigotnog lakog lanca (n=3), V<k>1-39J<k>5 zajedničkog homozigotnog lakog lanca (n=3), V<k>3-2Q<k>1 zajedničkog heterozigotnog lakog lanca (n=2), i V<k>3-20J<k>1 zajedničkog homozigotnog lakog lanca (n=2) miševa je napravljeno korišćenjem standardnih postupaka i postavljeno sa CD19<+>,\ gX+ \\ qk+korišćenjem antitela sa fluorescentnim nalepnicama (BD Pharmigen).

[0216] Ukratko, 1x10^ ćelije su inkubirane sa antttelima koja jako reaguju sa antigenima miša CD16/CD32 (klon 2.4G2, SD Pharmigen) na ledu tokom 10 minuta, posle čega je usledio koktel antitela tokom 30 minuta na ledu: APC konjugovano antitelo koje jako reaguje sa antigenom rniša CD19 (klon 1D3, BD Pharmigen), PerCP-Cy5.5 konjugovano antitelo koje jako reaguje sa antigenom miša CD3 (klon 17A2, BioLegend), FITC konjugovano antitelo koje jako reaguje sa antigenom miša Ig<K>(klon 187.1, BD Pharmigen), PE konjugovano antitelo koje jako reaguje sa antigenom miša lgX (klon RML-42, BioLegend). Posle bojenja, ćelije su oprane i fiksirane u 2% formaldehid. Izvedeno je usvajanje podataka na LSRII protočnoj citometriji i analizirano sa FlovvJo. Gating. zbir B ćelija (CD19+CD3-), lg<K>+

B ćelija (lg<K>+

lgX-CD19<+>CD3-),\ gX+B ćelija (lgK-|gA.<+>CD19<+>CD3-). Podaci prikupljeni iz uzoraka krvi i splenocita su pokazali slične rezultate. Tabela 3 iznosi procenat pozitivnih CD19<+>B ćelija iz periferne krvi jednog reprezentativnog miša iz svake grupe koja su\ gX+,\ qk+, ili\ gX+\ gK+.Procenat CD19<+>B ćelija u perifernoj krvi iz divljeg tipa (WT) i homozigotnih miševa za bilo koji od Vk1-39Jk5 ili V<k>3-20J<k>1 zajednički laki lanac su prikazane na SL. 4.

[0217] Ispoljavanje zajedničkog lakog lanca. Ispoljavanje svakog zajedničkog lakog lanca (V<k>1-39J<k>5 i V<k>3-20J<k>1) je analizirano kod heterozignih i homozignih miševa korišćenjem kvantitativnog PCR ogleda (npr. TAOMAN™).

[0218] [0176] Ukratko, CD19<+>B ćelije su pročišćene iz siezina divljeg tipa, miševa homozigotnih za zamenu mišjeg teškog lanca i<k>lokusa promenljivog regiona lakog ianca sa odgovarajućim teškim lancem čoveka i<k>lokusima promenljivog regiona lakog lanca (H<k>, kao i homozigotnih i heterozigotnih miševa za svaki preraspoređeni region lakog lanca čoveka (V<k>1-39J<k>5 ili V<k>3-20J<k>1) korišćenjem miševa CD19 Microbeads (Miltenyi Biotec) u skladu sa specifikacijama proizvođača. Ukupna RNK je prečišćena iz CD19<+>B ćelija korišćenjem RNeasy Mini pribora (Ojagen) u uskladu sa specifikacijama proizvođača i genomska RNK je uklonjena korišćenjem postupka obrade DNase na koloni bez RNase (OJagen). 200 ng iRNK je reverzno transkribovana u kDNK korišćenjem prvog lanca pribora za kDNK sintezu (Invitrogen) i to je kao rezultat dalo da je kDNK bila pojačana sa Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosvstems). Sve reakcije su izvedene korišćenjem sistema za detekciju sekvence ABI 7900 { Sequence Detection Svstem) (Applied Biosystems) korišćenjem prajmera i Taqman MGB proba raspona (1) V<k>-J<k>spajanje za oba laka lanca, (2) sam V<k>gen( t. j.V<k>1-39 i V<k>3-20), i (3) mišjeg C<k>regiona. Tabela 4 iznosi sekvence prajmera i proba korišćen ih za ovaj ogled. Relativno ispoljavanje je normalizovano na ispoljavanje mišjeg C<k>regiona. Rezultati su prikazani na SL. 5A, 5B i 5C

[0219] Antitela zajedničkog lakog lanca specifičnog za antigen. Zajednički laki lanac miševa koji su nosili bilo V<k>1-39J<k>5 ili V<k>3-20J<k>1 zajednički laki lanac na endogenom mišjem<k>lokusu lakog lanca su imunizovani sa p-galaktozidazom i titar antitela je izmeren.

[0220] [0178] Ukratko, p-galaktozidaza (Sigma) je emulzifikovana u ađuvansu Titermax (Sigma), u skladu sa smernicama koje je dao proizvođač. Divlji tip (n=7), V<K>1-39J<K>5 homozigoti zajedničkog lakog lanca (n=2) i V<K>3-20J<K>1 homozigoti zajedničkog lakog lanca (n=5) su imunizovani potkožnom injekcijom sa 100 ug p-galaktozidaze/Titermax. Miševi su pojačani potkožnom injekcijo dva puta, u razmaku od 3 nedelje, sa 50 ug p-galaktozidaze/Titermax. Posle drugog pojačavanja, krv je prikupljena od anesteziranih miševa korišćenjem retro-orbitalnog krvarenja u cevčicama za odvajanje seruma (BD Biosciences) u skladu sa smernicama proizvođača. Da bi se izmerio anti-p-galaktozidaze IgM ili IgG antitela, ELISA ploče (Nunc) su obložene sa 1 pg/mL p-galaktozidazom tokom noći na 4°C. Višak antigena je ispran pre blokiranja sa PBS sa 1 % BSA tokom jedan sat na sobnoj temperaturi. Serijska razblaženja seruma su dodata u ploče i inkubirana tokom jedan sat na sobnoj temperaturi pre pranja. Ploče su zatim inkubirane sa HRP sjedinjenim antitelom koje jako reaguje sa antigenom IgM (Southern Biotech) ili arttitelom koje jako reaguje sa antigenom IgG (Southern Biotech) tokom jedan sat na sobnoj temperaturi. Posle još jednog pranja, ploče su razvijene sa TMB supstratom (BD Biosciences). Reakcije su zaustavljene sa 1 N sumpornom kiselinom i OD<450>je očitam korišćenjem Victor X5 čitača ploče. (Perkin Elmer). Podaci su analizirani sa GraphPad Prism i signa! je izračunat kao razblaženje seruma koji je dva puta iznad pozadine.. Rezultati su prikazani na SL. 6A i 6B.

[0221] Kako je prikazano u ovom Primeru, odnosk! XB ćelija u siezinskim pierifernim pregradama V<k>1-39J<k>5 i V<k>3-20J<k>1 zajednički laki lanac miševa je pokazao skoro divlji tip uzorka (Tabela 3 i SL. 4). Međutim, VpreBJicS zajednički laki lanac miševa je pokazao manje perifernih B ćelija, od toga oko 1-2% ispoljava projektovani region lakog lanca čoveka (podaci nisu pokazani). Nivoi ispoijavanja W1-39J<k>5 i V<k>3-20J<k>1 preraspoređenih regiona lakog lanca čoveka iz endogenog<k>lokusa lakog lanca su podignuti u poređenju sa endogenim<k>lokusom lakog lanca koji je sadržao potpunu zamenu mišjih V<k>i J<k>segmenata gena u ljudskim V<k>i J<k>segmentima gena (SL. 5A, 5B i 5C). Nivoi ispoijavanja VpreBJ<K5>preraspoređenog regiona lakog lanca čoveka su pokazali slično visoko ispoljavanje iz endogenog<k>lokusa lakog lanca i kod heterozigotnih i kod homozigotnih miševa (podaci nisu prikazani). Ovo pokazuje da u direktnoj konkurenciji sa mišjimX,k

, ili oba endogena lokusa lakog lanca, jedna preraspoređena V|_/Jl sekvenca čoveka može dati bolji prinos od ispoijavanja nivoa divljeg tipa iz endogenog<k>lokusa lakog lanca i dati podsticaj normalnoj frekvenciji B ćelije jetre i krvi. Pored toga, prisustvo projektovanog<k>lokusa iakog lanca koje ima bilo ljudsku V<k>1-39J<k>5 ili ljudsku V<k>3-20J<k>1 sekvencu su miševi dobro podnosili toierisali i izgledalo je da funkciomše na način kao kod divljeg tipa predstavljanjem većeg dela repertoara lakog lanca u humorainoj komponenti odgovora imunog sistema (SL 6A i 6B).

[0222] Primer 4

[0223] Uzgajanje miševa koji ispoavaju jedan preraspoređeni laki lanac klicine linije čoveka

[0224] Ovaj primer opisuje nekoliko drugih genetski modifikovanih sojeva miša koji mogu da budu uzgajani na bilo kom od zajedničkih lakih lanaca miševa opisanih ovde da se kreira više genetski modifikovanih sojeva miša koji skrivaju više genetski modifikovanih lokusa imunoglobulina.

[0225] Endogeni lgXmutantni (KO). Za optimizovanje upotrebe projektovanog lokusa lakog lanca, miševi koji nose jedan od preraspoređenih regiona lakog lanca klicine linije čoveka su odgajani na drugom mišu koji sadrži deleciju u endogenomXlokusu lakog lanca. Na ovaj način, dobijeni progeni će ispoljiti, kao svoj jedini laki lanac, preraspoređeni region lakog lanca klicine linije čoveka kao što je opisano u Primeru 2. Uzgajanje je izvedeno standardnim tehnikama priznatim u tehnici i, alternativno, komercijalnim uzdgajivačem (npr., The Jackson Laboratorv). Mišji sojevi koji su nositi projektovani lokus lakog lanca i deleciju endogenogX lokusalakog lanca su skenirani na prisustvo jedinstvenog regiona lakog lanca i odsustvo endogenihXlakih lanaca miša.

[0226] [0182] Humanizovani endogeni lokus teškog ianca. Miševi koji su nosili projektovani lokus lakog lanca klicine linije čoveka su uzgajani sa miševima koji su sadržali zamenu endogenog lokusa promenljivog gena teškog lanca miša sa lokusom promeniivog gena teškog lanca čoveka (videti US 6,596,541; VELOCIMMUNE® miš, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). VELOCIMMUNE® miš obuhvata promenljive regione teškog lanca čoveka operativno povezane na endogene lokuse konstantnog regiona miša tako da miš proizvodi antitela koja obuhvataju promenljivi region teškog lanca čoveka i konstantni region teškog lanca miša kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK kodirajući promenljivi regioni teških lanaca antitela su izolovani i operativno povezani na DNK kodirajuće konstantne regione teškog lanca čoveka. DNK je zatim ispoljena u ćeliji koja iz antitela može da ispolji teški lanac koji je u potpunosti ljudski.

[0227] Dobijeni su miševi koji su nosili zamenu endogenog mišjeg V<h>lokusa sa Vh lokusom čoveka i jedan preraspoređeni V|_ region klicine linije čoveka na endogenom<k>lokusu lakog lanca. Reverzna himerna antitela koja sadrže somatski mutirane teške lance (ljudski V<h>i mišji CH) sa jednim lakim lancem čoveka (V<l>čoveka i Cl miša) su dobijeni posle imunizacije sa antigenom od interesa. V<h>i Vl skvence nukleotida B ćelija ispoljavaju antitela su iđentifikovana i potpuno ljudska antitela su napravljena spajanjem V<h>i V<l>sekvence nukleotida na Ch i C|_ sekvence nukleotida čoveka u pogodnom sistemu ispoijavanja.

[0228] Primer 5

[0229] Generisanje antitela iz miševa koji ispoljavaju teške lance čoveka i preraspoređeni region lakog lanca klicine linije čoveka

[0230] Posle uzgajanja miševa koji sadrže projektovani region lakog lanca čoveka na različitim željenim sojevima koji sadrže modifikacije i delecije drugih endogenih Ig lokusa (kako je opisano u Primeru 4), izabrani miševi mogu da biti imunizovani antigenom od interesa.

[0231] Generalno, VELOCIMMUNE® miševa koje sadrže jedan od jednostrukih preraspoređenih regiona lakog lanca klicine linije čoveka je izazvan sa antigenom, i limfne ćelije (kao što su B ćelije) su oporavljene iz seruma životinja. Limfne ćelije se spoje sa ćelijskom linijom mijeloma da se pripreme ćelijske linije besmrtnih hibridoma, i takve ćelijske linije hibridoma se skeniraju i biraju da se utvrde ćelijske linije hibridoma koje proizvode antitela koja sadrže promenljive teškog lanca čoveka i preraspoređenih lakih lanaca klicine linije čoveka koje su specifične za antigen korišćen za imunizaciju. DNK koja kodira promenljive regione teških lanaca i lakih lanaca su izolovane i povezane na poželjne izotipne konstantne regione teškog ianca i lakog lanca. Usied prisustva endogenih mišjih sekvenci i bilo kojih dodatnih elemenata koji imaju cis deiovanje u endogenom lokusu, jedan iaki lanac svakog antitela može da bude somatski mutiran. Ovo dodaje dodatnu raznovrsnost repertoaru specifičnom za antigen koji obuhvata jedan laki lanac i raznovrsne sekvence teškog lanca. Dobijene sekvence kloniranog antitela su naknadno ispoljene u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira himerna antitela specifična za antigen ili promenljive domene lakog i teškog lanca su identifikovane direktno iz limfocita specifičnih za antigen.

[0232] [0186] U početku, visokoafinitetna himerna antitela su izolovana tako da imaju promenljivi region čoveka i konstantni region miša. Kao što je gore opisano, karakteriziranje i odabir antitela prema poželjnim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim konstantnim regionom čoveka da se generiše potpuno ljudsko antitelo koje sadrži somatski mutiran teški lanac čoveka i jedan laki lanac izveden iz preraspoređenog regiona lakog lanca klicine linije čoveka prema ovom pronalasku. Pogodni konstantni regioni čoveka obuhvataju, na primer divlji tip ili modifikovan lgG1 ili lgG4.

[0233] Odvojene kohorte VELOCIMMUNE® miševa koji sadrže zamenu endogenih mišjih lokusa teškog lanca ljudskim V<h>, D<h>, i J<h>segmentima gena i zamenu endogenog<k>lokusa lakog lanca miša sa bilo projektovanom klicinom linijom V<k>1-39J<k>5 regiona lakog lanca čoveka ili projektovanom klicinom linijom V<k>3-20J<k>1 regiona lakog lanca čoveka (opisano iznad) su imunizovani proteinskim receptorom na površini ćelije čoveka (Antigen E). Antigen E se administrira direktno na zadnju stopicu miševa sa šest uzastopnih injekcija svaka 3-4 dana. Dva do tri mikroorganizma Antigena E su pomešana sa 10 ug CpG oligonukleotida (Cat # tlri-modn - ODN1826 oligonukleotid; InVivogen, San Diego, CA) i 25 ug Adju-Phos (aluminijum-fosfatni ađuvans, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark) pre ubrizgavanja. Ukupno šest injekcija je dato pre finalnog opoziva antigena, koji je dat 3-5 dana pre žrtvovanja. Prikupljanje krvi posle 4. i 6. injekcije je urađeno i imuni odgovor antitela se nadzire putem standardnog imunoogleda specifičnog za antigen.

[0234] Kada se željeni odgovor imunog sistema ostvari, splenociti se prikupljaju i spaja sa mišjim mijeloma ćelijama da sačuvaju njihovu održivost i formiraju ćelijske linije hibridoma. Ćelijske linije hibridoma su skenirane i odabrane da odrede ćelijske linije koje proizvode antitela zajedničkog lakog lanca specifična za Antigen E. Korišćenje tehnike nekoliko antitela zajedničkog lakog lanca specifičnog anti-Antigena E (antitelo koje jako reaguje sa antigenom E) (t.j, antitela koja imaju promenljive domene teškog lanca čoveka, isti promenljivi domen lakog ianca Čoveka, i konstantni domeni miša) se dobiju.

[0235] Alternativno, antitela zajedničkog lakog lanca anti-antigena E se izoluju direktno iz B ćelija pozitivnih za antigen bez spajanja na ćelije mijeloma, kako je opisano u U.S. 2007/0280945A1, ovde specifično ugrađen sa pozivom na isti u potpunosti. Korišćenje ovog postupka, dobijeno je nekoliko antitela zajedničkog lakog lanca anti-Antigena E čoveka (t.j. antitela poseduju promenljive domene teškog lanca čoveka, bilo projektovanog V<k>1-39J<k>5 lakog lanca čoveka ili projektovanog V<k>3-20J<k>1 regiona lakog lanca čoveka, i konstantnih domena čoveka).

[0236] Biološke osobine navedenih primera antitela zajedničkog iakog lanca anti-Antigena E generisanih u skladu sa postupcima ovog Primera su opisane detaljno u odeljcima iznetim dole.

[0237] Primer 6

[0238] Upotreba segmenta gena teškog lanca u za antigen specifičnim antitelima zajedničkog lakog ianca

[0239] [0191] Da bi se analizirala struktura proizvedenih antitela zajedničkog lakog lanca anti-Antigena E, nukleinske kiseline koje kodiraju promenljive regione antitela teškog lanca su klonirane i sekvencionirane. Iz sekvenci nukleinske kiseline i predviđene sekvence amino kiseline antitela, upotreba gena je utvrđena za promenljivi region teškog lanca (HCVR) izabranih antitela zajedničkog lakog lanca dobijenog iz imunizovanog VELOCIMMUNE® miševa koji sadrže projektovani V<k>1-39J<k>5 iaki lanac čoveka ili projektovan V<K>3-20J<K>1 region lakog lanca čoveka. Rezultati su prikazani u Tabelama 5 i 6, koje pokazuju da miševi u skladu sa ovim pronalaskom generišu antitela zajedničkog lakog lanca specifična za antigen iz raznovrsnih segmenata gena teškog lanca čoveka, usled raznovrsnih preraspođenja, kada se koriste bilo mišji koji ispoljavaju laki lanac iz samo Vid-39-izvedenog lakog lanca čoveka ili Vtc3-20~izvedenog lakog lanca čoveka. V|_| segmenti gena čoveka familija 2, 3, 4, i 5 preraspoređenih sa raznovrsnim D<h>segmentima čoveka i Jh segmentima čoveka da se dobije prinos antitela specifičnih za antigen.

[0240] Primer 7

[0241] Određivanje sposobnosti blokiranja antitela zajedničkog iakog lanca specifičnog za antigen putem LUMINEX™ probe

[0242] Devedeset osam antitela zajedničkog lakog lanca uvedenih protiv Antigena E je testirano na sposobnost da blokira vezivanje prirodnog liganda Antigena E {Ligand Y) na Antigen E u probi zasnovanoj na perlicama.

[0243] Vanćelijski domen (ECD) Antigena E je sjedinjeno sa dve myc oznake epitopa i 6X oznake histidina (Antigen E-mmH) i amin spojen na karboksilisane mikrosfere pri koncentraciji od 20 ug/mL u MES puferskom sredstvu. Mešavina je inkubirana tokom dva sata na sobnoj temperaturi posle čega je usledila deaktivacija perlica sa 1 M Tris pH 8,0 a posle toga je usledilo pranje u PBS sa 0,05% (v/v) Tween-20. Perlice su zatim blokirane sa PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji je sadržao 2%

[0244] (w/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). U ploči za filtriranje od 96 pregrada, supernatanti sa za Antigen A specifičnim antitelima zajedničkog lakog lanca su razblaženi u 1:15 u puferskom sredstvu. Negativna kontrola sadrži repliku supernatanta sa istim komponentama podloge jer je pripremljen supernatant antitela. Perlice sa Antigen E oznakom su dodate na supernatante i inkubirane tokom noći na 4°C Biotinilisani Ligand Y proteina je dodat u finalnu koncentraciju 0,06 nM i inkubirana tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Detekcija perlica označenih biotinilisanim Ligandom Y vezanim na Antigen E-myc-myc-6His je određena sa R-Fikoeritrinom spojenim na Streptavidin (Moss Ine, Pasadena, MD) posle čega je usledilo merenje u LUMINEX™ uređaju za analizu na bazi protočne citometrije. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) u pozadini uzorka bez Liganda Y je oduzet iz svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat podeiom oduzetog srednjeg

[0245] intenziteta fluorescencije (MF) u pozadini svakog uzorka podešavanjem negativne kontrolne vrednosti, pomnoženo za 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.

[0246] U sličnom eksperimentu, istih 98 antitela zajedničkog lakog lanca čoveka je uvedeno protiv Antigena E je ispitano na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje Antigena E na Ugandom Y označene perlice.

[0247] Ukratko, Ligand Y je amin spojen na karboksilisane mikrosfere pri koncentraciji od 20 ug/mL razblažen u MES puferu. Mešanje i inkubiranje dva sata na sobnoj temperaturi posle čega je usledila deaktivacija perlica sa 1 M Tris pH 8 je zatim opran u PBS sa 0,05% (v/v) Tween-20. Dve perlice su zatim blokirane sa PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji je sadržao 2% (w/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). U ploči za filtriranje od 96 pregrada, supernatanti sa za Antigen A specifičnim antitelima zajedničkog lakog ianca su razblaženi u 1:15 u puferskom sredstvu. Negativna kontrola sadrži repliku supernatanta sa istim komponentama podloge jer je pripremljen supernatant antitela. Biotinilisani Antigen E- mmH je dodat u finalnu koncentaciju 0,42 nM i inkubiran tokom noći na 4°C. Perlice sa oznakom Ligand Y su zatim dodate u mešavinu antitelo/Antigen E i inkubirane su tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Detekcija biotinilisanog Antigena E-mmH vezanog na Ligand Y perlice je određena sa R-Fikoeritrinom spojenim na Streptavidin (Moss Ine, Pasadena, MD} posle čega je usledilo merenje u LUMINEX™ uređaju za analizu na bazi protočne citometrije. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) u pozadini uzorka bez Antigena E je oduzet iz svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat podelom oduzetog srednjeg intenziteta fluorescencije (MF) u pozadini svakog uzorka podešavanjem negativne kontrolne vrednosti, pomnoženo za 100 i oduzimanjem dobijenih vrednosti od 100.

[0248] Tabele 7 i 8 pokazuju procenat blokianja za svih 98 anti-Antigen E antitela zajedničkog lakog lanca testiranih u oba LUMINEX™ ogleda. ND: nije detektovan pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.

[0249]

[0250] U prvom LUMINEX™ eksperimentu opisanom iznad, 80 antitela zajedničkog lakog lanca koji sadrže V<k>1-39J<k>5 projektovani laki lanac su ispitani na sposobnost da blokiraju vezivanje Liganda Y na Antigenom E-označene perlice. Od ovih 80 antitela zajedničkog lakog lanca, 68 je pokazalo blokiranje >50%, dok je 12 pokazalo blokiranje <<50%>{6 na 25-50% blokiranje i 6 na <2<5%>blokiranje). Za 18 antitela zajedničkog lakog lanca koji sadrže V<k>3-20J<k>1 projektovani laki lanac, 12 je pokazalo blokiranje >50% , dok je 6 pokazalo blokiranje <<50>% (3 pri blokiranju od 25-50% i 3 pri blokiranju <25%) Liganda Y koji se vezuje na Antigen E-označene perlice.

[0251] Kod drugog LUMINEX™ eksperimenta opisanog gore, istih 80 antitela zajedničkog lakog lanca sadrži V<K>1-39J<K>5 projektovan laki lanac je ispitano na njihovu sposobnost da blokira vezivanje Antigena E na Ligandom Y označene perlice. Od ovih 80 antitela zajedničkog lakog lanca, 38 je pokazalo blokiranje ><5>0%, dok je 44 pokazalo blokiranje <<5>0% {27 pri blokiranju 25-50% i 17 pri blokiranju <25%). Za 18 zajedničkih antitela lakog lanca antitela zajedničkog lakog lanca koja su sadržala V<k>3-20J<k>1 projektovani laki lanac, 1 prikazano je blokiranje >50%, dok je 17 pokazalo blokiranje <50% (5 pri blokiranju 25-50% i 12 pri blokiranju <25%) vezivanja Antigena E na Ligandom Y označene perlice.

[0252] Podaci iz Tabela 7 i 8 utvrđuju da su preraspoređivanja opisana u Tabelama 5 i 6 generisala Antitela zajedničkog lakog lanca specifična za anti-Antigen E- koja su blokirala vezivanje Liganda Y na njegov poznati receptor Antigena E sa različitim stepenima efikasnosti, što je dosledno sa antitelima zajedničkog lakog lanca anti-Antigena E prema Tabelama 5 i 6 pri čemu su obuhvaćena antitela sa specifičnošću koja se odnosi na preklapanje i nepreklapajući epitop u vezi sa Antigenom E.

[0253] Primer 8

[0254] Određivanje sposobnosti blokiranja za antigen specifičnih antitela zajedničkog lakog ianca_putem ELISA ogleda

[0255] Antitela zajedničkog lakog lanca čoveka uvedena protiv Antigena E su testirana na sposobnost da blokiraju vezivanje Antigena E na Ligandom Y obloženu površinu u ELISA ogledu.

[0256] [0201] Ligand Y je premazan kao obloga na ploče sa 96 pregrada u koncentraciji od 2 ug/mL razblažen u PBS i inkubiran tokom noći posle čega je usledilo pranje četiri puta u PBS-u sa 0,05% Tween-20. Ploča je zatim blokirana sa PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) gde je bilo 0,5% (w/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) tokom jedan sat na sobnoj temperaturi. U odovjenoj ploči, supernatanti koji sadrže antitela zajedničkog lakog lanca anti-Antigena E su razblaženi u odnosu od 1:10 u puferskom sredstvu. Replika supernatanta sa istim komponentama antitela je korišćena kao negativna kontrola Antigen E-mmH (opisan gore) je dodat u finalnu koncentraciju 0,150 nM i inkubiran tokom jedan sat na sobnoj temperaturi. Mešavina Antitelo/Antigen E-mmH je zatim dodata u ploču koja je sadržala Ligand Y i inkubirana tokom jedan sat na sobnoj temperaturi. Detekcija Antigena E-mmH vezanog na Ligand Y je određena sa peroksidazorn rena (HRP) spojenom na antitelo anti-Penta-His (OJagen, Valencia, CA) i razvijeno pomoću standardnog odgoovra na kolorimetrijsko ispitivanje korišćenjem tetrametil-benzidin (TMB) supstrata (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizovanog sumpornom kiselinom. Apsorbanca je očitana na OD450 tokom 0,1 sek. Apsorbovanje u pozadini uzorka bez Antigena E je oduzeto iz svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat podelom u pozadi ni-oduzetog srednjeg intenziteta fluorescencije (MF) svakog uzorka podešavanjem negativne kontrolne vrednosti, pomnoženo za 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.

[0257] Tabele 9 i 10 pokazuju procenat blokiranja za svih 98 antitela zajedničkog lakog lanca anti-Antigena E testiranih u oba ELISA ogleda. ND: nije detektovan đen pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.

[0258] Kao što je opisano u ovom primeru, od 80 antitela zajedničkog iakog ianca koja su sadržala V<k>1-39J<k>5 projektovan laki lanac testirani u pogledu njihove sposobnosti da bloiraju Antigen E za vezivanje na površinu obloženu Ligandom Y, 22 je pokazalo blokiranje >50%, dok je 58 pokazalo blokiranje <50% (20 sposobnost blokiranja na 25-50% i 38 sposobnost blokiranja na <2<5%>). Za 18 antitela zajedničkog lakog lanca koja su sadržala V<k>3-20J<k>1 projektovan laki lanac, jedno je demonstriralo blokiranje >50%, dok je 17 demonstriralo blokiranje <<50%>(5 pri blokiranju 25-50% i 12

[0259] pri bloiranju <<25%>) Antigena E vezivanje na površinu obloženu slojem Liganda Y.

[0260] Ovi rezultati su takođe dosledni sa spojem antitela zajedničkog lakog lanca specifičnog za Antigen E koje obuhvata antitela sa specifičnošću dodirnog i neđodirnog epitopa a s obzirom na

[0261] Antigen E.

[0262] Primer 9

[0263] BIACORE™ Određivanje afiniteta za antigen specifična antitela zajedničkog lakog lanca

[0264] Konstante ravnoteže rastavljanja (Ko) za supernatante izabranih antitela je bila određena pomoću SPR (Rezonance površinskog plazmona) korišćenjem BIACORE™ TI 00 instrumenta (GE Healthcare). Svi podaci su dobijeni korišćenjem HBS-EP (10 mM Hepes, 150rnM NaCI, 0,3 mM EDTA, 0,05% Surfactant P20, pH 7,4) kao puferskih sredstava korišćenih za pufersko sredstvo za podlogu .

[0265] (npr. za elektroforezu) i pufersko sredstvo uzeto kao uzorak, na 25°C. Antitela su uhvaćena iz sirovih uzoraka supernatanta na prethodno derivatizovanoj površini čipa CM5 sensora sa visokom gusitonom Fc antitela koja jako reaguju sa antigenima čoveka korišćenjem standardnih postupaka hemijskog spajanja amina. Tokom koraka hvatanja, supernatanti su ubrizgavani preko Fc površine antitela koja jako reaguju sa antigenima čoveka pri brzini protoka od 3 uL/min, za ukupno 3 minuta. Posle koraka hvatanja je usledila injekcija bilo tečnog puferskog sredstva ili analita pri koncentraciji od 100 nM tokom 2 minuta pri brzini protoka od 35 mL/min. Disasođjacija antigena iz uhvaćenog antitela je nadgledana tokom 6 minuta. Uhvaćeno antitelo je uklonjeno putem kratkog ubrizgavanja 10 mM glicina, pH 1,5. Svi senzogrami su dvostruko referencirani pomoću senzograma oduzimanja iz puferskih injekcija iz senzograma analita, čime je prouzrokovano uklanjanje artifakata rastavljanjem antitela od površine na kojoj je uhvaćen. Podaci o vezivanju za svako antitelo su stali u mode! vezivanja 1:1 sa masovnim transportom korišćenjem BlAcore T100 softvera za evaiuaciju v2.1. Rezultati su prikazani u Tabelama 11 i 12.

[0266]

[0267] Afiniteti vezivanja antitela zajedničkog lakog lanca koji su obuhvatali preraspoređivanja prikazana u Tabelama 5 i 6 se razlikuju, s tim da skoro svi ispoljavaju Kq u tom nanomolarnom opsegu. Podaci o afinitetu su dosledni sa antitelima zajedničkog iakog lanca koji daju kao rezultat kombinovano povezivanje preraspoređenih promenljivih domena opisanih u Tabelama 5 i 6 što je visok afinitet, klonalno odabrnaih, i somatski mutiranih. Spojeni sa prethodno pokazanim podacima, antitela zajedničkog lakog lanca opisana u Tabelama 5 i 6 obuhvataju prikupljanje raznovrsnih, visokoafinitetnih antitela koja ispoljavaju specifičnost za više od jednog epitopa na Antigenu E.

[0268] Primer 10

[0269] Određivanje specifičnosti vezivanja za antigen specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca putem LUMINEX™ ogleda

[0270] Odabrana antitela zajedničkog lakog lanca anti-Antigena E su ispitana na sposobnost da se vežu na ECD varijanate Antigena E i Antigena E ECD, uključujući bilo koju od dve ili više homolognih sekvenci gena makaki majmuna( MfAntigen E), koja se razlikuje od ljudskog proteina za približno 10% njegovih ostataka amino kiseline; mutant delecije Antigena E koji nema poslednjih 10 amino kiselina iz C-terminalnog kraja ECD (Antigen E-®CT); i dva mutanta koja sadrže zamenu alantna na pretpostavljenim lokacijama interakcije sa Ligandom Y (Antigen E-Aia1 i Antigen E-Ala2). Proteini Antigena E su proizvedeni u CHO ćelijama i svaki je sadržao myc-myc-His C oznaku terminalnog kraja.

[0271] Za studije vezivanja, Antigen E ECD protein ili varijanta proteina opisana iznad) iz 1 mL podloge kulture je uhvaćena inkubiranjem tokom 2 sata na sobnoj temperaturi sa 1 x 10^ mikrosferi (LUMINEX™) perlice su kovalentno obložene slojem sa antt-myc monoklonskim antitelom (MAb 9E10, ćelijske linije hibridoma CRL-1729™; ATCC, Manassas, VA). Perlice su zatim isprane sa PBS pre upotrebe. Supernatanti koji su sadržali antitela zajedničkog iakog lanca anti-Antigena E su razblaženi 1:4 u puferskom sredstvu i didati u ploče za filtriranje sa 96 pregrada. Supernatant-replika bez ikakvog antiela je korišćen kao negativna kontrola,. Perlice koje sadrže uhvaćene proteine Antigena E su zatim dodate u uzorke antitela (3000 perlica po pregradi) i inkubirane tokom noći na 4°C. Sledećeg dana, uzorci perlica su isprani i antitelo zajedničkog lakog lanca veze je detektovano sa R-fikoeritrinom konjugovanim IgG antitelom koje burno reaguje sa antigenima čoveka. Intenzitet fluorescencije perlica (približno 100 perlica je prebrajano za svaki uzorak vezivanja antitela na svakom proteinu Antigena E) je izmereno LUMINEX™ uređajem za anlizu na bazi protočne citometrije, i registrovan je srednji intenzitet fluorescencije (MFI) za barem 100 prebrojanih perlica po interakciji perlica/antitelo. Rezultati su prikazani u Tabelama 13 14.

[0272]

[0273] Supernatanti antitela zajedničkog lakog lanca anti-Antigena E su ispoljili visoku specifičnost vezivanja na perlice povezane na Antigenom E-ECD. Za ove perlice, negativna kontrolna replika supernatanta je kao rezultat dala zanemarljiv signal {<<1>0 MFI) kada je kombinovana sa uzorkom perlice Antigena E-ECD, pri čemu su supernatanti koji sadrže antitela zajedničkog lakog lanca anti-Antigena E ispoljili jak signal vezivanja {prosečan MFI 2627 za 98 supernatanta antitela; MFI > 500 for 91/98 uzorke antitela).

[0274] Kao mera sposobnosti odabranih antitela zajedničkog lakog ianca anti-Antigena E da prepoznaju različite epitope na ECD Antigena E, utvrđeno je relativno vezivanje antitela na ove varijante. Sve četiri varijante Antigena E su uhvaćene na anti-myc LUMINEX™ perlice kako je gore opisano za studije vezivanja neprerađenog Antigena E-ECD, i relativni odnosi vezivanja (MFIvarijantaMF<l>Antigen E- ECD) su određeni. Za 98 testiranih supernatanta antitela zajedničkog lakog lanca prikazanih u Tabelama 12 i 13, prosečni odnosi (MFIvarijanta</M>FlAntigen E-<ECD>) različiti za svaku varijantu, verovatno odražavaju različite količine hvatanja proteina na perlice (prosečni odnosi 0,61, 2,9, 2,0, i 1,0 za Antigen E-ACT, Antigen E-Ala1, Antigen E-Ala2, i Mf Antigen E, respektivno). Za svaku varijantu proteina, vezivanje za podskup od 98 testiranih antitela zajedničkog lakog lanca je pokazalo značajno smanjeno vezivanje, ukazujući na osetljivost na mutaciju koja je karakterisala datu varijantu. Na primer, 19 uzoraka antitela zajedničkog lakog lanca je vezano naMfAntigen E sa MFIvarijanta</M>^'Antigen E-ECD koji je<<>8%. Kako veliki broj u ovoj grupi obuhvata visoko ili umereno visoko afinitetna antitela (5 sa Kq < 5nM, 15 sa Kp < 50 nM), verovatno je da niži signal za ovu grupu daje kao razultat senzitivnost prema razlikama sekvence (epitopa) između neprerađenog Antigena E-ECD i date varijante pre nego od nižih afiniteta.

[0275] Ovi podaci utvrđuju da antitela zajedničkog lakog lanca opisana u Tabelama 5 i 6 predstavljaju raznovrsnu grupu antiela zajedničkog iakog lanca specifičnih za Antigen-E koja specifično prepoznaju više od jednog epitopa na Antigenu E.

[0276]

Claims (20)

1. 1.Genetski modifikovan miš koji obuhvata 8 ćeliju koja ispoljava promenljivi domen lakog lanca (V<l>) čoveka izveden iz preraspoređene ljudske V<k>39/J<k>5 sekvence koja je prisutna u klicinoj liniji ćelije miša, pri čemu miš nema nepreraspoređeni endogeni V<k>segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni J<k>segment gena imunoglobulina; i pri čemu se ljudski Vl domen(i) dovode u vezu sa domenom promenljivog teškog lanca (V<h>) čoveka izvedenim iz preraspoređenog ljudskog V<h>/D<h>/J<h>regiona izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4,3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 iii 1-69/6-13/4.

2. Miš prema patentnom zahtevu 1, gde je : (a) V<k>39/J<k>5 sekvenca čoveka operativno povezana na sekvencu C<k>regiona miša; (b) sekvenca koja kodira ljudski Vh domen je operativno povezana na sekvencu koja kodira sekvencu teškog lanca konstantnog (C<h>) regiona kod miša izabranu iz C<h>1, zglob, C<h>2, C<h>3, ili njihovu kombinaciju; ili (c) V<h>domen čoveka je ispoljen iz endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina.

3. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri Čemu svi ili pretežno svi V<k>i J<k>segmenti gena miša se zamene preaspoređenom V<k>1-39/J<k>5 sekvencom miša.

4. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu preraspoređena V<k>1-39/J<k>5 sekvenca kod čoveka je operativno povezana na sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina izabranu iz sekvence miša, pacova ili čoveka.

5. 5.Genetski modifikovan miš koji obuhvata B ćeliju koja ispoljava promenljivi domen lakog lanca (Vl) kod čoveka izveden iz preraspoređene ljudske V<k>3-20/J<k>1 sekvence koja je prisutna u klicinoj liniji čeiije miša, pri čemu miš nema nepreraspoređeni endogeni V<k>segment gena imunoglobulina i nepreraspoređeni endogeni J<k>segment gena imunoglobulina; i pri čemu se ljudski V<l>domen(i) dovodi u vezu sa domenom promenljivog teškog lanca (V<h>) čoveka izvedenim iz preraspoređenog ljudskog V<h>/D<h>/J<h>regiona izabranog iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 or 3-53/1-1/4.

6. Miš prema patentnom zahtevu 5, gde je : (a) V<k>-20/J<k>1 sekvenca čoveka operativno povezana na sekvencu C<k>regiona miša; (b) sekvenca koja kodira ljudski Vh domen je operativno povezana na sekvencu C<h>regiona miša izabranu iz C<h>1, zgloba, C<h>2, C<h>3, ili njihove kombinacije; ili (c) V<h>domen čoveka je ispoljen iz endogenog lokusa ili endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina.

7. Miš prema patentnom zahtevu 5, pri čemu svi ili pretežno svi V<k>i J<k>segmenti gena miša se zamene preaspoređenom V<k>3-20/J<k>1 sekvencom miša.

8. Miš prema patentnom zahtevu 5, pri čemu preraspoređena V<k>3-20/J<k>1 sekvenca kod čoveka je operativno povezana na sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina izabranu iz sekvence miša, pacova ili čoveka.

9. Miš prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu miš obuhvata nefunkcionalni lokus lambda lambda ( X) lakog lanca imunogiobuiina.

10. Upotreba miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 ili 9 za pravljenje antitela koje obuhvata promenljivi region teškog lanca (V<h>) kod čoveka izveden iz preraspoređenog ljudskog V<h>/D<h>/J<h>regiona izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4. 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4.

11. Upotreba prema patentnom zahtevu 10, pri čemu je antitelo bispecifično antitelo.

12. Upotreba miša prema bilo kom od patentnih zahteva 5-9 za pravljenje antitela koje obuhvata promenljivi region teškog lanca (V<h>) kod čoveka izveden iz preraspoređenog ljudskog V<h>/D<h>/J<h>regiona izabranog iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4.

13. Upotreba prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je antitelo bispecifično antitelo.

14. Upotreba jednog od patentnih zahteva 11 i 13, pri čemu je proizvodnja putem metoda koji obuhvata korake ispoijavanja domena promenljivog teškog ianca kod čoveka u jednoj ćeliji.

15. Upotreba jednog od patentnih zahteva 10-14, pri čemu su teški lanci antitela u potpunosti ljudski.

16. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 10, 11, 14, ili 15, pri čemu teški lanci obuhvataju par promenljivih domena teškog lanca čoveka sa lakirn lancem koji obuhvata ljudski V|_ domen izveden iz preraspoređene ljudske V<k>1-39/J<k>sekvence.

17. 17.Upotreba bilo kog od patentnih zahteva 12-15, pri čemu teški lanci obuhvataju par promenljivih domena teškog lanca čoveka sa lakim lancem koji obuhvata ljudski V<l>domen izveden iz preraspoređene ljudske V<k>3-20/J<k>sekvence.

18. Upotreba bilo kog od patentnih zahteva 10-17, pri čemu se promenljivi domeni teškog lanca kod čoveka biraju imunizacijom miša sa antigenom od interesa, koji određuje sekvence promenljivih domena teškog lanca čoveka ispoljene pomoću miša, i ispoljavanje ovih sekvenci u toj ćeliji.

19. Postupak proizvodnje antitela na antigenu od interesa obuhvata promenljivi domen teškog lanca čoveka izveden iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona čoveka izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/6, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 ili 1-69/6-13/4 koji obuhvata: (a) imunizaciju miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 sa antigenom od interesa; (b) dobijanje iz miša promenljivog domena teškog lanca čoveka iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona kod čoveka izabranog iz 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4. 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/5-6/5 ili 1-69/6-13/4; i (c) korišćenje sekvence promenljivog regiona imunoglobulina dobijenog pod (b) u antiteiu koje specifično vezuje antigen od interesa.

20. 20.Postupak proizvodnje antitela na antigenu od interesa koji obuhvata domen promenljivog teškog lanca kod čoveka izveden iz preraspoređenog V<h>/D<h>/J<h>regiona čoveka izabranog iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 iii 3-53/1-1/4 koji obuhvata: (a) imunizaciju miša prema bilo kom od patentnih zahteva 5-8 sa antigenom od interesa; (b) dobijanje iz miša domena promenljivog teškog lanca kod čoveka izvedenog iz preraspoređenog ljudskog V<h>/D<h>/J<h>regiona izabranog iz 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 ili 3-53/1-1/4; i (c) korišćenje sekvence promenljivog regiona imunoglobulina dobijenog pod (b) za antitelo koje specifično vezuje antigen od interesa.