RS54854B1 - Hondroitin sulfat nalik onom kod ajkula i proces za njegovo dobijanje - Google Patents

Abstract

Hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule, naznačen time što ne sadrži tri-, tetra- i 2,4-disulfonovane disaharide, a koji se sastoji od 60-99% 6-sulfata, 0,5-30% 2,6-disulfata, 0,1-5% 4,6-disulfata, 0,1-5% nesulfonovanog hondroitina i 0,1-1% 4-sulfata, gde su svi procenti izraženi u odnosu na ukupan sadržaj disaharida navedenog hondroitin sulfata nalik onom kod ajkule, pri čemu on pokazuje srednju brojnu molarnu masu (Mn) od 40-85 kDa i srednju masenu molarnu masu (Mw) od 50-95 kDa.Prijava sadrži još 19 patentnih zahteva.

Description

HONDROITIN SULFAT NALIK

ONOM KOD AJKULA I PROCES ZA

NJEGOVO DOBIJANJE

Opis pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na hondroitin sulfat nalik onome kod ajkula i na proces za njegovo dobijanje. Konkretnije, predmetni pronalazak se odnosi na hondroitin sulfat nalik onome kod ajkula, koji pokazuje veoma nizak sadržaj 4-sulfata, veliku gustinu naelektrisanja i biološku aktivnost uporedivu onoj kod prirodnih hondroitin sulfata; predmetni pronalazak se takođe odnosi na proces za dobijanje navedenog hondroitin sulfata nalik onom kod ajkula.

Hondroitin sulfat (u daljem tekstu CS), koji pripada klasi prirodnih kompleksnih polisaharida nazvanih glikozaminoglikani (GAG) sastoji se od naizmeničnih disaharidnih sekvenci različito sulfonovanih ostataka D-glukuronske kiseline (G!cA) i N-acetil-D-galaktozamina (GalNAc) povezanih beta (l->3) vezama.

U zavisnosti od prirode navedenih disaharida, poznati su CS sa različitim ugljenohidratnim kičmama (osovinama). Zapravo, čak iako su i prirodni i sintetski CS koji su do danas poznati uglavnom sastavljeni od različitih procenata dve vrste disaharidnih jedinica, tj. GalNAc sulfonovanih u položajima 4 ili 6, u polisaharidnim lancima se mogu naći disaharidi sa različitim brojem i položajem sulfatnih grupa, u različitim procentima. Na primer, nesulfonovani disaharid je prisutan, generalno u malim količinama, u osovini CS, dok disulfonovani disaharidi sa dve sulfatne grupe vezane preko O-veze u različitim položajima, kao što su 2 u GIcA i 6 u GalNAc (disaharid D), ili u položaju 4 i 6 GalNAc (disaharid E) mogu da budu prisutni u osovini CS u različitim procentima u zavisnosti od specifičnog životinjskog izvora [Volpi N., J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009. Volpi N., J Pharm Sci 96, 3168, 2007].

CS pokazuje ponovke disaharidne jedinice koja ima sledeću strukturnu formulu:

gde su R<2>, R<4>i R<6>, nezavisno ili H ili SO>.

Značenje nekih od najčešće ponavljanih skraćenica, koji se koriste u predmetnoj prijavi kako bi se ukratko označili različito sulfonovani ostaci naizmeničnih disaharidnih sekvenci koje sačinjavaju CS, navedene su u tekstu koji sledi.

Di-OS (R2=H; R4=H; RĆ=H)

Di-6S (C) (Ri=H; R4=H; R6=SO>)

Di-4S (A) (R2=H; R4= SO3-; Ro=H)

Di-4,6diS (C) (R2=H; R4=SOj-; R6=SO3-)

Di-2,6diS (D) (R2=SO3-; R4=H; R6=SO3-)

Di-2,4diS (B) (R2=SO3-; R4= SO3-; R6=H)

Di-2,4,6triS (R2=SO>; R4= SO3-; R&=SO3-).

Uzorci i prirodnih i sintetskih CS mogu da se okarakterišu i identifikuju na osnovu osetljivih, specifičnih, proverenih i objavljenih analitičkih pristupa, koji mogu da daju strukturnu karakterizaciju i parametre za CS (na primer, specifične sulfonovane grupe, gustina naelektrisanja, molekulska masa i čistoća), kao i njihovu biološku aktivnost.

Uzorci CS iz prirodnih ekstrakata mogu da se okarakterišu kako bi im se odredila struktura i osobine [Volpi N., J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009; Volpi N., J Pharm Sci 96. 3168, 2007; Mućci A. et a!., Carbohvdr Polvmers 41, 37, 2000; Volpi N., Analvt Biochem 277. 19. 2000].

Kada je reč o tri- i tetra-sulfonovanim oblicima CS ("tri S" i "tetraS", redom), treba imati u vidu da se oni retko detektuju u uzorcima CS iz prirodnih ekstrakata, dok su tipična karakteristika sintetskih CS; Di-2,4,6triS se uzima kao standard za ocenu prisustva triS CS u sintetskim CS proizvodima kao drugih teoretski mogućih triS oblika koji nisu prisutni u proizvodima dobijenim iz prirode.

Tabela 1 koja sledi ilustruje glavne disaharide identifikovane u prirodnim uzorcima CS estrahovanim i prečišćenim iz različitih organa i tkiva, uglavnom iz hrskavice.

Tabela 1 ilustruje glavne strukturne parametre za karakterizaciju glavnih uzoraka prirodnih CS prečišćenih iz nekoliko izvora.

Konkretnije, parametri molekularne mase veoma su slični za uzorke kopnenih CS (goveđi, svinjski i kokošji uzorak) ali veoma različiti za vodene uzorke (uzorci iz ajkule, raže i lignje), pri čemu ovi drugi imaju veće vrednosti za molekulsku masu nego oni prvi.

Uz to, uzorci vodenih CS imaju veoma neobičan opseg gustine naelektrisanja, koji je veći od oko 1,0, usled prisustva disulfonovanih disaharida, za razliku od kopnenih uzoraka koji imaju vrednosti gustine naelektrisanja niže od oko 1,0, usled odsustva disulfonovanih disaharida.

Dalja neobična karakteristika svih prirodnih CS je, kada se razgrade pomoću honđroitinaze ABC, hidrolitičkog enzima specifičnog bilo za 4S ili 6S sulfonovane disaharide, kao i za nesulfonovane disaharide, polisaharidni lanac se u potpunosti hidrolizuje na disaharidne jedinice. Ovo može lako da se uoči pomoću FACE analize{ Fluophore- Assisted Carbohydra! e Electrophoresis,elektroforeza ugljenih hidrata potpomognuta fluoroforom). Potpuna hidroliza prirodnog CS je poslcdica odsustva tri- i tetra-sulfonovanih struktura u polisaharidnom lancu. Tri-i tetra-sulfonovane disaharide, ukoliko su prisutni, ne prepoznaje hondroitinaza ABC, što ne dozvoljava potpunu hidrolizu polisaharida i dovodi do nastanka delimično nehidroiizovanih oligosaharidnih lanaca koji se Iako određuju FACE analizom.

Konačno, zbog biosintetskih puteva, svi poznati prirodni CS pokazuju istovremeno prisustvo disaharida monosulfonovanih u položajima 4 i 6 na GalNAc (pri Čemu 4-sulfonovani disaharidi nikada ne čine ispod 30%), iako se njihov međusobni odnos menja u zavisnosti od izvora.

Kao što je prethodno ilustrovano, CS je veoma kompleksan heterogeni makromolekul koji ima varijabilnu strukturu i osobine, u zavisnosti od izvora iz kog je dobijen. Dalje, kao posledica biosintetskih procesa u specifičnim tkivima i vrstama, može da se biosintetiše CS sa različitim stepenima polimerizacije, čime se dobijaju makromolekuli sa različitim molekulskim masama i polidisperzitetom. Usled ovih strukturnih varijacija, i uz moguće prisustvo specifičnih oligosaharidnih sekvenci i usled Čistoće preparata za terapeutske primene ili primene u nutriceutskim preparatima, CS može da ima različite osobine i kapacitete.

Zapravo, objavljene su različite i neobične aktivnosti u zavisnosti od strukture CS [ Volpi N., Biomaterials 23, 3015, 2002; Volpi N. et al., Biochimie 81, 955, 1999; Volpi N., Biomaterials 20, 1359, 1999; Suzuki S. et ah, J Biol Chem 243, 7. 1968].

Evropska liga protiv reume (EULAR,Eitropean League Agaimt Rheumalism)trenutno preporučuje CS iz prirodnih ekstrakata kao simptomatski lek sa sporim dejstvom za osteoartrilis (SYSADOA) u Evropi za tretman OA kolena [Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003J, kuka [Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003] i šake [Zhang W. et al., Ann Rheum Dis 66, 377, 2007] na osnovu dokaza iz istraživanja i metaanaliza brojnih kliničkih studija.

Dalje, CS sam ili u kombinaciji sa drugim sastojcima se uveliko koristi kao nutriceutski preparat, najčešće u Evropi i Sjedinjenim Američkim Državama [McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000. Volpi N. et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008. Volpi N. et al., Separation Sc I. 22, 2009].

Delotvornost CS strogo je povezana sa njegovom protivzapaljenskom aktivnošću, kao što je njegova sposobnost da inhibira aktivnost degradirajućih enzima kao što su humana leukocitna elastaza (HLE) [Ronca F. et al., Osteoarthritis Cartilage 6 dodatak A, 14. 1998. Egea J. et al., Osteoarthritis Cartilage 18 dodatak I, S24, 2010].

CS koji se koristi širom sveta u farmaceutskim ili nutriceutskim primenama dobija se ekstrakcijom iz tkiva nekoliko životinja, kao što su goveda i svinje [Fuentes EP et al., Acta Farm Bonaerense 17, 135, 1998], ptice [Luo XM et al., Poult Sci 81. 1086-1089, 2002], ribe sa hrskavicama [Sugahara K. et al., Eur J Biochem 239, 871, 1996. Lignot B et al., J Biotechnol 103, 281,2003], itd.

Ipak, životinjsko poreklo ovih proizvoda predstavlja potencijalan problem sa stanovišta bezbednosti potrošača, usled mogućeg prisustva infektivnih činilaca koje je moguće preneti, kao što su oni koji izazivaju spongiformne encefalopatije kod goveda, ili usled ograničenja zbog religijskih razloga.

Uz to, priroda ovih proizvoda - činjenica da se dobijaju ekstrakcijom - čini snabdevanje ovim proizvodima potencijalno nepouzdanim u svetlu sve veće potražnje i povećanja tržišta.

Sve prethodno navedeno inspirisaloje potragu za alternativnim, pouzdanijim izvorima CS, kao što je, na primer, biotehnološka poizvodnja iz K.4 kapsularnog polisaharidaE. coli,što je opisano u naučnoj i patentnoj literaturi.

U ovom kontekstu, izraz biotehnološka proizvodnja odnosi se na postupak proizvodnje u kojem značajan deo konačnog proizvoda zapravo proizvodi mikroorganizam, ili izolovane ćelije viših organizama, u sistemu za veštačko gajenje u kulturi, koji se u kolokvijalnom jeziku i dosta nespecifično naziva fermentacijom.

Suštinski, u struci su do sada korišćena tri glavna pristupa.

Prvi može da se identifikuje kao proizvodnja jedinjenja nalik na CS, gde se kao polazna supstanca koristi K4 kapsularni polisaharidE. coli05:K4:H4, koji se potom podvrgava hemijskoj transformaciji, dok drugi pristup može da se posmatra kao direktna biosinteza jedinjenja nalik na CS od strane mikroorganizama, a treći je prepoznat kao biosintetska proizvodnja nesulfonovanog hondroitina koju prati hemijsko ili biohemijsko sulfonovanje.

EP-A-1304338, koji pripada prvom pristupu koji je prethodno opisan, opisuje proizvodnju CS počev od K4 polisaharida proizvedenog u tečnim kulturama, koji se potom estrahuje i prečišćava, nakon čega se ponovo rastvara i podvrgava kiseloj hidrolizi, čiji jc glavni efekat uklanjanje ostataka nalik fruktozi koji su vezani za ostatke GIcA prisutne u linearnom polimeru. Sekundarni efekat je delimična hidroliza polisaharidnog lanca, koja dovodi do proizvoda manje molekulske mase. Nakon toga, de-fruktozilovani polimer koji je identičan nesulfonovanom hondroitinu na različite načine se sulfonuje u C-4 ili C-6 položajima GalNAc ostataka hemijskim putem, uz upotrebu odgovarajućih zaštitnih grupa u položajima 4 ili 6. Na istom mestu je opisan i CS, kod kojeg se najmanje 70% sadržaja sastoji od mono- i(li) disulfonovanih galaktozaminskih ostataka, sulfonovanih u položajima 4 i 6, pri čemu je položaj 2 u glukuronskom ostatku nesulfonovan, a koji ima Mw od 6-25 kDa i odnos karboksilnih/sulfatnih grupa (tj. gustinu naelektrisanja) od 0,7-2,0.

WO 2009/149155, kao primer drugog prethodno opisanog pristupa, opisuje direktnu proizvodnju jedinjenja nalik CS-u od strane nekoliko mikroorganizama, kako bakterija tako i gljiva. Jedinjenje CS nalik kopnenom CS takođe je opisano u istom radu, u kojem su i položaj 4 i položaj 6 u galaktozaminu sulfonovani; objavljeno je da ovo jedinjenje pokazuje molarnu masu (Mw) od oko 300 Da do 35 kDa i odnos 4S/6S sulfata od manje od 1 do više od I.

Treći od prethodno pomenutih postupaka podrazumeva nekoliko različitih strategija za proizvodnju nesulfonovanog hondroitina, od kojih je glavna enzimatska sinteza u polimernim sistemima bez ćelija, kao što su, na primer, oni opisani u EP-A-1950308 i EP-A-1964924, i biosinteza u rekombinantnim ćelijama dobijenim eksprimiranjem gena kfoA i kfoC estrahovanih izE. coliK4 u ćelije domaćine koje su u stanju da proizvedu iz UDP-GlcA, kao što je opisano, na primer, u WO 2008/133350.

Još jedan primer biosintetske proizvodnje nesulfonovanog hondroitina opisan je u Italijanskoj patentnoj prijavi br. M12010A001300 koja se, između ostalog, odnosi na postupak za biotehnološku proizvodnju hondroitina koja podrazumeva gajenje, u kulturi na odgovarajućoj podlozi, rekombinantnog mikroorganizma, poželjno je da to budeEscherichia coliDSM23644, izolovanje i prečišćavanje nesulfonovanog hondroitina prisutnog u mikrobiološkoj kulturi, a zatim i hemijsko sulfonovanje ovog molekula. Zajednička odlika procesa za proizvodnju CS koji su do sada opisani je značajno smanjenje molekulske mase polazne supstance i tokom uklanjanja ostataka fruktoze katalizovanog kiselinom i tokom koraka hemijske sinteze koji je potreban za sulfonovanje GalNAc ostataka.

Kao primer, EP-A-1304338 opisuje CS sa molekulskom masom od 6-25 kDa, dok je navedeno daje molarna masa K4 polisaharida, koja se koristi kao polazna supstanca, 150-400 kDa.

Kenji Uchimura et al.: "Mouse ehondroitin 6-sulfotransferase: molecular cloning, eharacterization and chromosomal mapping". Glvcobiologv, 1. 1, 1998, str. 489-496 opisuje karakterizaciju 6-sulfotransferaze koja je potencijalno u stan ju da proizvede hondroitin 6-su!fat na specifičan način, pri čemu on nije okarakterisan u smislu svoje primarne strukture, tj. disaharidnog sastava i fizičko-hemijskih osobina, tj. gustine naelektrisanja i parametara molekulske mase. U ch im ura et al. takođe opisuju hemijski desulfonovan hondroitin određen nespecifičnim testom i ne prave razliku između hondroitina i oligomera sa niskom molekulskom masom i bez biološke aktivnosti.

H. Kitagavva: "Molecular cloning and expression of a novel chondroitin 6-0-sulfotransferase", J. of Biol. Chem, tom 275 br. 28,25.4. 2000., str. 21075-21080 opisuje upotrebu hemijski desulfonovanog hondroitina, koji se potom resulfonuje enzimskim procesom, opet bez navođenja da li je takvo desulfonovanje potpuno ili nakon nega ipak preostaje određeni stepen sulfonovanja u položaju 6 (ili drugim položajima). Osim toga, ne pominju se niti se procenjuju nesulfonovani disaharidi, jer se sastav disaharida ocenjuje razdvajanjem samo sulfonovanih disaharida.

Tsutsumi et al.: "Functional expression and genomic structure of human chondroitin 6-sulfotransferase", Febs Letters, Elsevier, Amsterdam. NL, tom. 441. br. 2, 18. 12. 1998., str. 235-241 i Fukuta et al.: "Molecular cloning and expression of chick chondrocvte chondroitin 6-sulfotransferase", J. of Biol. Chem., The American Societv Of Biologica! Chemists, Inc., US, tom 270, br. 31, 4. 8. 1995., str. 18575-18580, opisuju karakterizaciju humane 6-sulfotransferaze koja je u stanju da proizvede hondroitin 6-sulfat (i druge derivate hondroitina) na specifičan način, ali opet bez bilo kakve karakterizacije hondroitin sulfata.

WO 2010/136435 opisuje proizvodnju visokih koncentracija nesulfonovanog hondroitina putem rekombinantnih bakterija, koje su genetski mutirane insercijom specifičnih genetskih sekvenci; primer br. 10 i I] opisuju proizvodnju natrijumove soli hondroitina. Proces dalje ilustruju i razmatraju Chiara Schiraldi et al. "Purification of chondroitin precursor from Escherichia coli K4 fermentation broth using membrane processing", Bbtechnologv Journal, tom 6, br. 4, 7.3. 2011., str. 410-419.

WO 98/34958 opisuje proces za proizvodnju O-sulfonovanog K4, K5 i K.40 polisaharida, koji je koristan za tretman tumorskih, HIV-I i patologija koagulacije kao i u kozmetičkim preparatima.

Chiara Schiraldi et al., "Production of chondroitin sulphate and chondroitin", Applied Microbiologv and Biotechnologv, tom 87, br. 4, 3. 6. 2010. str. 1209-1220 opisuje pregled različitih primena i procesa za hondroitin, sa ciljem da obezbedi hondroitin sulfat koji predstavlja alternativu proizvodima estrahovanim iz prirodnih izvora.

Prvo rešenje predmetnog pronalaska je hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule. koji ne sadrži tri-, tetra- i 2,4-disulfonovane disaharide, a koji se sastoji od 60-99% 6-sulfata, 0,5-30% 2,6-disulfata, 0.1-5% 4,6-disulfata, 0,1-5% nesulfonovanog hondroitina i 0,1-1% 4-sulfata, gde su svi ti procenti izraženi u odnosu na ukupan sadržaj disaharida navedenog hondroitin sulfata nalik onom kod ajkule, pri čemu on pokazuje srednju brojnu molarnu masu (Mn) od 40-85 kDa i srednju masenu molarnu masu (Mw) od 50-95 kDa.

Poželjno je da se hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule sastoji od 70-90% 6-sulfata, 8,5-20% 2,6-disulfata, 0,1-5% 4.6-disulfata, 0,1-5% nesulfonovanog hondroitina i 0,1-1% 4-sulfata, gde su svi ti procenti izraženi u odnosu na ukupan sadržaj disaharida navedenog hondroitin sulfata nalik onom kod ajkule, pri čemu on pokazuje srednju brojnu molarnu masu (Mn) od 40-65 kDa i srednju masenu molarnu masu (Mvv) od 50-70 kDa.

CS na koji se odnosi predmetni pronalazak odlikuje se visokom molekulskom masom i neobičnim sulfonovanim grupama, koje se nalaze uglavnom u položaju 6. kao i veoma malom količinom 4-sulfonovanog disaharida.

Ispitivanjem odlika CS prema predmetnom pronalasku i njihovim poređenjem sa onima koji su opisani u prethodnoj tabeli 1 koja se odnosi na prirodne uzorke CS dobijene ekstrakcijom, može se uočiti da CS prema predmetnom pronalasku približno liči na CS ajkule.

Takođe, CS koji je cilj predmetnog pronalaska ne pokazuje prisustvo bilo kakvih polisulfonovanih disaharida, a posebno ne pokazuje prisustvo tri- ili tetrasulfonovanih disaharida koji su tipična odlika CS dobijenog sintetskim postupcima koji su opisani u stanju tehnike i koji takođe mogu da se detektuju, nakon digestije hondroitinazom ABC, kao proizvodi koji se nisu razgradili.

Dalje, CS prema predmetnom pronalasku je veoma prečišćen (na osnovu količine nerazgrađenog proizvoda nakon digestije hondroitinazom ABC) i jasno se razlikuje od CS opisanog u EP-A-1304338 koji ima molarnu masu od 6-25 kDa i veći sadržaj nesulfonovanog hondroitina (>10%) i Širok spektar gustine naelektrisanja (0,7-2), dok su gustine naelektrisanja CS prema predmetnom pronalasku uže i poželjno je da se kreću u opsegu od 1,05-1,30.

I Mn i Mvv mogu da se izračunaj u uobičajenim postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti; na primer, pomoću hromatografije sa ekskluzijom na osnovu veličine visokih performansi (HPSEC); poželjno je da se Mn i Mvv odrede pomoću HPSEC. opremljene integrisanim specijalizovanim softverom za gel-permeacionu hromatografiju (GPC).

Poželjno je da zbir 2,6-disulfata i 4,6-sulfata u CS prema predmetnom pronalasku dostiže 10-25% ukupnog sadržaja disaharida.

Prema još jednom rešenju predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak se odnosi na preparat koji sadrži hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule prema predmetnom pronalasku i farmaceutski ili nutriceutski prihvaltjiv nosilac kao što su. na primer, mikrokristalna celuloza, dekstrin, maltodekstrin, ciklodekstrin, sulfobutiletar beta-ciklodekstrin, sojin lecitin, palmitoleinska kiselina, lipozomi, šećerni estri i slične supstance.

Kao što će stručnjak u ovoj oblasti imati u vidu na osnovu uobičajenog osnovnog znanja iz ove oblasti, preparat prema predmetnom pronalasku može da se formuliše u različite oblike, bilo čvrste (npr. tablete, tvrde kapsule, meke gel kapsule) ili tečne (npr. rastvore ili praskaste mcšavine za pripremu napitaka), poželjno je da to bude u obliku preparata za parenteralnu i(li) farmaceutsku oralnu i(li) nutriceutsku primenu, pri čemu navedeni preparat može dalje da sadrži druge neaktivne ili aktivne sastojke.

Među takvim daljim sastojcima, poželjno je da preparat prema predmetnom pronalasku takođe sadrži najmanje jednu od sledećih supstanci: glukozamin hidrohlorid, glukozamin sulfat, N-acetil glukozamin, hijaluronsku kiselinu, heparin, keratin, dermatin, metilsulfonilmetan, folate ili redukovane folate, vitamine B grupe, S-adenozilmetionin (SAM), askorbinsku kiselinu ili mangan askorbat. a može da se primeni u delotvornoj količini kod pacijenta kojem je to potrebno, u zavisnosti od potreba i okolnosti konkretnog slučaja. Isključivo kao primer, CS nalik onom kod ajkule i(li) preparat prema predmetnom pronalasku mogu da se primenjuju u količini od 100-3000 mg/dan, poželjno je da to bude količina od 1000 - 2000 mg/dan, još poželjnijeje da to bude količina od 1200 - 1800 mg/dan, obično podeljena u dve-tri doze dnevno.

Premajošjednom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule ili preparat prema predmetnom pronalasku za upotrebu u prevenciji ili tretmanu osteoartritisa, ili za održavanje mišićno-skeletnog zdravlja, na primer, kao aktivni sastojak, bilo u leku ili u dodatku ishrani ili u aditivu za hranu.

Isključivo kao primer, CS nalik onom kod ajkule ili preparat prema predmetnom pronalasku, kao što je prethodno definisano, može da se koristi za dobijanje leka, aditiva za hranu ili dodatka ishrani, za prevenciju i(Ii) lečenje osteoartritisa (OA) kuka, šake i kolena. glavnih simptoma ovih oboljenja kao što su bol, oticanje zglobova, zapaljenje, Alchajmerova bolest. mikrobiološke infekcije, arterioskleroza, osteoporoza, kao i dodatak u terapiji kancera i za regeneraciju tkiva, uključujući regeneraciju nervnih tkiva.

Prema još jednom daljem rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na proces za dobijanje prethodno definisanog hondroitina nalik onom kod ajkule, koji podrazumeva: a) salifikaciju nesulfonovanog hondroitina, u obliku slobodne kiseline, koja je prethodno rastvorena u vodenoj sredini, pomoću soli izabrane iz grupe koja se sastoji od tetrametil-, tetraetil-i tetrabutil amonijuma ili piridinijuma; b) sušenja salifikovanog nesulfonovanog hondroitina dobijenog u koraku a) do sadržaja vode od 5-15%; c) sušenja salifikovanog nesulfonovanog hondroitina dobijenog u koraku b) na temperaturi od 100°C - 170°C do sadržaja vode od 0,1 -3%; d) selektivno sulfonovanje, u položaju 6, salifikovanog nesulfonovanog hondroitina dobijenog u koraku c), rastvorenog u N-metil pirolidonu ili dimetilformamidu, na temperaturi od 0°C - 30°C, dodatkom 1-2 ekvivalenta kompleksa sumpor trioksid - piridin ili kompleksa sumpor trioksid - dimetilformamid, u vremenskim intervalima od 1 -3 časa, dok ne bude dodato ukupno 2-15 ekvivalenata kompleksa sumpor trioksid - piridin ili sumpor trioksid - dimetilformamid; ostavljanje dobijenog rastvora da se meša 2-24 h; e) gašenje reakcije izvršava se u koraku d) pomoću vodenog rastvora natrijum bikarbonata ili karbonata, zatim filtracijom i koncentrovanjem do suva kako bi se dobila suva čvrsta supstanca; f) rastvaranje osušene čvrste supstance u vodenom rastvoru natrijum hlorida, ultrafiltracija i dijaliza dobijenog rastvora; g) izdvajanje proizvoda iz rastvora dobijenog iz koraka f); h) prečišćavanje proizvoda dobijenog iz koraka g) i dobijanje ovog drugog bilo u obliku

kiseline ili u obliku natrijumove soli takve kiseline;

i) prečišćavanje proizvoda dobijenog u koraku h).

Poželjno je da se salifikacija nesulfonovanog hondroitina u koraku a) izvodi sa solju izabranom iz grupe koja se sastoji od tetrametil-, tetraetil- i tetrabutilamonijuma, najpoželjnije je da to bude tetrabutil amonijum, dok sušenje nesulfonovanog hondroitina u koraku b) može da se izvede liofilizacijom ili sušenjem prskanjem.

Poželjno je da se sušenje soli nesulfonovanog hondroitina u koraku c) izvodi sve do sadržaja vode od 0.5 - 2%, dok je poželjno da se rastvaranje soli nesulfonovanog hondroitina dobijene u tom koraku izvodi u dimetilformamidu.

Poželjno je da se selektivno sulfonovanje u koraku d) izvodi dodatkom ukupno 6-12, još poželjnije je 6-9 ekvivaienata kompleksa sumpor trioksid-piridin. Alternativno, kada se selektivno sulfonovanje u koraku d) izvodi kompleksom sumpor trioksid-dimetiiformamid, dodaje se 1-9, poželjno je da to bude 2-4, ekvivalenta.

Dalje, poželjno je da se selektivno sulfonovanje u koraku d) izvodi na temepraturi 10°C-20°C i poželjno je da se. na kraju koraka d), dobijeni rastvor ostavlja da se mesa 2-6h.

Prema još jednom poželjnom rešen ju procesa prema predmetnom pronalasku, proizvod koji se dobija iz koraka f) se izoluje liofilizacijom, sušenjem prskanjem ili taloženjem u alkoholnoj sredini.

Proces prema predmetnom pronalasku omogućava održavanje nepromenjene molekulske mase nativnog polisaharida.

Ono što predstavlja iznenađenje je da proces prema predmetnom pronalasku omogućava izbegavanje bilo kog koraka usmerenog ka zaštiti sekundarnih hidroksilnih grupa, verovatno zbog toga što reaktivnost primarnih hidroksilnih grupa u položaju 6 GalNAc garantuje selektivnost navedene reakcije.

Osim toga, proces prema predmetnom pronalasku omogućava značaj no veću produktivnost i bolju reproducibilnost kvaliteta proizvoda u poredenju sa stanjem tehnike; na primer, u odnosu na EP-A-1304388, u kojem korak sulfonovanja dovodi do šireg opsega odnosa karboksilnih i sulfatnih grupa, koji ide čak i od 0,7 - 2,0.

Takođe, proces prema predmetnom pronalasku omogućava dobijanje proizvoda koji pokazuje veoma nizak sadržaj 4-sulfonovanih disaharida i koji suštinski ne sadrži polisulfonovane disaharide; konkretnije, on omogućava dobijanje proizvoda koji ne sadrži ni triS ni tetraS saharide.

U tipičnoj situaciji, proces prema predmetnom pronalasku može da se izvede rastvaranjem nesulfonovanog hondroitina, u obliku slobodne kiseline ili natrijumove soli, dobijenog na primer defruktozilacijom K4 kapsularnog polimera dobijenog fermentacijom, kao što je opisano u Manzoni (Biotechnologv Letters 18, 383-6, 1996) i Rodriguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1988), u vodenoj sredini.

U slučaju da je nesulfonovani hondroitin u obliku svoje natrijumove soli, nakon potpunog rastvaranja, dobijeni rastvor se eluira, obično je to na temperaturi od 0°C - 30°C sa kolone koja sadrži katjonsku jonoizmenjivačku smolu (kao što je, na primer, Amberjet 1200 H, Rohm & Haas i slične), pri Čemu je zgodno da se sakupljaju eluirane porcije na pH 1,5-4.0, poželjno je da to bude 1,5-3,0, te se odatle dobijaju porcije vodenog rastvora kiseline.

Alternativno, ovaj korak može da se izvede u baču: nakon rastvaranja soli nesulfonovanog hondroitina u vodi, pri čemu je poželjno da se navedeni rastvor dobije mešanjem 20-60 min na 0°C-30°C, doda se katjonska smola (Amberjet 1200 H, Rohm & Haas i slične) u rastvor, pri čemu pH rastvora nakon dodatka smole treba da bude između 1,5 i 3,0. Rastvor se potom cedi a dobijeni kiseli filtrat se sakuplja.

Kiselom rastvoru nesulfonovanog hondroitina, koji se dobija bilo direktnim rastvaranjem navedenog nesulfonovanog hondroitina u obliku slobodne kiseline ili prečišćavanjem njegove natrijumove soli kao što je prethodno definisano, bilo u kontinuitetu ili u baču, potom se dodaje vodeni rastvor jona izabranog iz grupe koja se sastoji od tetrametil-, tetraetil- i tetrabutil amonijuma ili piridinijuma, poželjno je do postizanja pH 6,0-8,0, a još poželjnije 6,-7,0; rastvor se uparava do suva, na primer liofilizactjom ili sušenjem prskanjem, sve do postizanja sadržaja vode od 5-15%, kako bi se dobila odgovarajuća so hondroitina.

Dobijena so hondroitina potom se podvrgava drugom koraku sušenja na temperaturi od 100 °C - 170 °C, do sadržaja vode od 0,1 - 3%, tako da se konačno dobije odgovarajuća nesulfonovana so hondroitina.

Odgovarajuća nesulfonovana so hondroitina, dobijena kao što je prethodno opisano, se potom selektivno sulfonuje u položaju 6, bez potrebe da se zaštiti bilo koji funkcionalni ostatak, uz rastvaranje u rastvaraču izabranom iz grupe koja se sastoji od N-metil pirolidona ili dimetilformamida, na temperaturi od 0°C-30°C, poželjno je da to bude 10°C-20°C, uz pogodnu eluciju potpuno rastvorene nesulfonovane soli hondroitina sa kolone koja sadrži kajonsku jonoizmenjivačku so (kao, na primer, Amberjet 1200 H, Rohm & Haas i si.), dodatkom 1-2 ekvivalenta kompleksa sumpor trioksid - piridin ili kompleksa sumpor trioksid - dimetilformamid, u vremenskim intervalima od 1-3 Časa, sve dok se ne doda ukupno 2-15 ekvivalenata kompleksa piridin ili dimetilformamid - sumpor trioksid, nakon čega se dobijeni rastvor ostavi da se meša 2-24 časa, poželjno je 2-6 časova.

Dobijena reakciona masa se zatim gasi u rastvoru vodenog natrijum bikarbonata ili karbonata a zatim izoluje, na primer, tretmanom natrijum bikarbonatom i filtracijom dobijenih nerastvorljivih soli, uparavanjem do suva i ponovnim rastvaranjem u vodenom rastvoru natrijum hlorida, izolovanjem i konačnim tretmanom, na primer, uItrafiltracijom i dijalizom, kako bi se uklonile zaostale soli i nečistoće male molekulske mase i konačno izolovao proizvod, na primer. liofilizacijom, sušenjem prskanjem ili precipitacijom u alkoholnoj sredini.

Navedeni hondroitin 6-sulfat koji je dobtjen kao što je prethodno opisano se potom prečišćava, na primer. jonoizmenjivaČkom hromatografijom u koloni sa katjonskom jonoizmenjivačkom smolom, kako bi se dobilo jedinjenje u obliku kiseline i - što predstavlja mogućnost - nakon toga dobila njegova natrijumova so dodatkom, na primer. natrijum hidroksida.

Navedeni hondroitin 6-sulfat koji je dobijen na taj način se konačno izoluje, na primer sušenjem u pećnici, pod vakuumom, na temperaturi od 50°C-70°C ili se prečišćava hromatografski, pri čemu se dobija hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule, koji ne sadrži tri-, tetra- i 2,4-disulfonovane disaharide i pokazuje Mn od 85 kDa a Mvv od 50-95 kDa.

Primeri koji slede ilustracija su predmetnog pronalaska.

Primer I

Salifikacija

20 g soli hondroitin sulfata, dobijene defruktozilacijom K4 kapsularnog polimera dobijenog fermentacijom, kao što je opisano u Manzoni (Biotechnologv Letters 18, 383-6, 1996) i Rodriguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1998) rastvoreno je u demineralizovanoj vodi (500 ml). Nakon potpunog rastvaranja, dobijeni rastvor je eluiran na 5°C sa kolone koja sadrži katjonsku jonoizmenjivačku smolu (160 ml Amberjet 1200 H, Rohm & Haas), koja je prethodno hidratisana i pripremljena u kiselom obliku. Eluirane porcije se sakupljaju na pH 1,9. te se nakon sakupljanja vodenih kiselih porcija u njih dodaje 16% vodeni rastvor tetrabutil amonijuma do pH 7,0; rastvor se zatim uparava do suva liofilizacijom kako bi se dobilo 20,8 g hondroitina u obliku tetrabutil amonijum soli.

Dobijena so se potom podvrgava drugom termičkom tretmanu u statičkoj sušilici na 105°C u toku 4h, pod vakuumom, do preostale vlažnosti koja je manja od 0.2%. Na ovaj način dobijeno je 18,5 g hondroitina u obliku tetrabutil amonijum soli.

Primer 2

Salifikacija

12 g nesulfonovanog hondroitina, dobijenog defruktozilacijom K4 kapsularnog polimera dobijenog fermentacijom, kao što je opisano u Manzoni (Biotechnologv Letters 18, 383-6, 1996) i Rodriguez (Eur. J. of Biochem 177, 117-24, 1998) rastvoreno je u 20 ml demineralizovane vode te je, nakon što je rastvor zakišeljen do pH 2,5 dodatkom IM HCl, ovom rastvoru dodato 80 ml etanola, nakon Čega je nesulfonovani hondroitin precipitirao u obliku slobodne kiseline.

Nakon filtracije i ispiranja etanolom, dobijeno je 10,3 g proizvoda u obliku bele čvrste supstance koja, nakon stoje osušena u vakuumu na 50°C. pokazuje kiseli titar od 90% izračunat na sam proizvod, i sadrži 8% preostale vode. Dobijena čvrsta supstanca suspendovana je u 20 ml vode te joj je dodat 40% (m/m) vodeni rastvor tetrabutil amonijum hidroksida do pH 8. Dobijeni rastvor je zatim Hofilizovan do sadržaja preostale vode od 2,5%, kako bi se dobilo 15,9 g čvrstog hondroitina u obliku tetrabutil amonijum soli.

Dobijena so se potom podvrgava drugom termičkom tretmanu u statičkoj sušilici na 105<H>C u toku 4h, pod vakuumom, do preostale vlažnosti koja je manja od 0,2%. Na ovaj način dobijeno je 15,4 g tetrabutil hondroitina.

Primer 3

Sulfonovanje

1,4 g tetrabutil hondroitina dobijenog kao što je opisano u primeru 1 i 84 ml DMF-a usuti su u četvorogrli balon od 250 ml koji je držan u inertnoj atmosferi (Ni), opremljen mehaničkom mešalicom i sistemom za hlađenje sa barbotiranjem, kalcijum hloridnom zamkom i termometrom.

Dobijena suspenzija ostavljena je da se meša do potpunog rastvaranja, nakon čega je temperatura podešena na 23°C.

Kada je temperatura podešena, u rastvor je dodat kompleks sumpor trioksid - piridin u porcijama (1,07 g, 3 ekv.), uz mešanje reakcione smeše još 1 čas, nakon čega je usled io dodatak dalje količine kompleksa sumpor trioksid - piridin (1,07 g; 3 ekv). Nakon još 1 čas mešanja na istoj temperaturi, reakciona smeša je prebačena u erlenmajer od 500 ml, koji je sadržao zasićeni rastvor natrijum hidrogen karbonata, te je smeša ohlađena na 10°C.

Nakon što je smeša ostavljena da se temperatura poveća do 20°C, proceđena je na Bihnerovom levku, filtrat je sakupljen i uparen do suva pod vakuumom.

Dobijena osušena čvrsta supstanca (2,3 g) je fino samlevena i ponovo rastvorena u 0,3 M rastvoru NaCI (130 ml), te je rastvor podvrgnut ultrafiltraciji pomoću membrane sa pragom od 3 kDa i uz održavanje pH sačuvanog rastvora na 7,0. Ultrafiltrirani rastvor je potom dijalizo van kako bi se uklonila so, čime je dobijen proizvod za liofilizaciju.

Dobijeni proizvod je konačno osušen na 50°C i 10 mbar, čime je dobijeno 1 g supstance koja pokazuje titar (izračunat određivanjem glukuronske kiseline pomoću pulsirajuće amperometrijske detekcije, PAD( Pulsed Amperometric Detectiori))od 95%, Mn od 60 kDa i Mvv od 67,3 kDa, određenu gel hromatografijom sa ekskluzijom na osnovu veličine visokih performansi (HPSEC,High- Performance Size- Exclusion Chromatography)opremeljenom specijalizovanim softverom za GPC.

Primer 4

Sulfonovanje

1,21 g hondroitina u obliku tetrabutil amonijum soli, dobijenog kao stoje opisano u primeru 1 i 72 ml DMF-a usuti su u četvorogrli balon od 250 ml koji je držan u inertnoj atmosferi (N2), opremljen mehaničkom mešalicom i sistemom za hlađenje sa barbotiranjem, kalcijum hloridnom zamkom i termometrom.

Dobijena suspenzija ostavljena je da se meša do potpunog rastvaranja, nakon čega je temperatura podešena na 10°C.

Kada je temperatura podešena, u rastvor je dodat čvrsti kompleks sumpor trioksid - DMF (0,88 g, 3 ekv.) te je reakciona smeša mešana 1 čas. Dodat je natrijum hidrogenkarbonat (0,97 g, 6 ekv) uz održavanje temperature na istom nivou, te je mešanje nastavljeno 1 čas, pri čemu je dozvoljeno da se temperatura poveća do 20°C. Dobijena suspenzija je filtrirana na Bihnerovom levku, te je dobijeni filtrat uparen do suva u vakuumu.

Dobijena osušena čvrsta supstanca (2,05 g) je fino samlevena i ponovo rastvorena u 0,3 M rastvoru NaCI (130 ml), te je rastvor podvrgnut ultrafiltraciji pomoću membrane sa pragom od 3 kDa i uz održavanje pH sačuvanog rastvora na 7,0. Ultrafiltrirani rastvor je potom dijalizovan kako bi se uklonila so, čime je dobijen proizvod za liofilizaciju.

Dobijeni proizvod je konačno osušen na 50°C i ! 0 mbar, čime je dobijeno 0.95 g supstance koja pokazuje titar (izračunat određivanjem glukuronske kiseline pomoću PAD) od 94%, Mn od 62 kDa i Mvv od 68,3 kDa, određenu gel hromatografijom sa ekskluzijom na osnovu veličine visokih performansi (HPSEC) opremeljenom specijalizovanim softverom za GPC.

Primer 5

Analiza hondroitin 6-sulfata

Sastav CS dobijenog u primerima 3 i 4 ispitan je pomoću HPLC proizvoda digestije, koja je sprovedena tretmanom CS dobijenog kao što je prethodno opisano hondroitinazom ABC u skladu sa postupkom koji su opisali Joon-Soo Sim et al. (J. Chromatographv B, 2005 tom 818, str. 133-139).

Analizaje izvršena sa kolonom HPLC-SAX, 250 x 4,6 mm 10 u.m, uz eluciju gradijentom počev od 3,5 m M HCI (pH= 3,5) (100%) u početnoj fazi do koncentracije koja je jednaka 1 M NaCI u HCI 3,5 mM (pH= 3,5) (100%). Dali proizvodi koji potiču od digestije hondroitinazom ABC analizirani su pomoću FACE analize( Fluorophore- Assisted Carbohydrate Electrophoresis,elektroforeza ugljenih hidrata potpomognuta fluoroforom), kako bi se istaklo prisustvo polisaharida koji nije podlegao digestiji. Rezultati pokazuju stopu digestije od preko 95%. Visoka stopa digestije ukazuje na značajno odsustvo tri- i(li) tetra-sulfatnih disaharida u strukturi dobijenog CS.

Tabela 2 koja sledi prikazuje glavne disaharide koji su iđentifikovani u proizvodima dobijenim u primerima 3 i 4.

Upoređivanjem ove tabele sa tabelom 1, može se uočiti da sastav CS dobijenog prema predmentom pronalasku pokazuje blisku srodnost sa CS ajkule, budući da pokazuje jako male količine Di-4S i uglavnom se sastoji od Di-6S, dok su Di-OS, Di-2.6diS i Di-4,6diS dobijeni u količinama koje se veoma dobro preklapaju sa vrednostima navedenim za CS ajkule; dalje, CS prema predmetnom pronalasku pokazuje gustinu naelektrisanja veću od 1,0. Uz to, proizvodi koji su dobijeni izvođenjem primera 3 i primera 4 nisu pokazali ni prisustvo triS ni prisustvo tetraS oblika CS.

Takođe, CS prema predmetnom pronalasku pokazuje veoma neobičan sastav sulfata u poređenju sa nekim od proizvoda koji su opisani u stanju tehnike, stoje ilustrovano sledećom tabelom 3.

Primer 6

Kako je delotvornost CS strogo vezana za njegovu protivzapaljensku aktivnost, kao što je njegova sposobnost da inhibira aktivnost degradativnih enzima kao što su humana leukocitna elastaza (HLE), CS prema predmetnom pronalasku testiran jein vitrokako bi se odredila njegova sposobnost da inhibira takvu aktivnost HLE u poređenju sa goveđim CS (prvi standard Evropske farmakopeje za CS) i CS izolovanim iz uzoraka hrskavice ajkule.

Rezultati poređenja prikazani su na slici 1.

Uzorak CS nalik onom kod ajkule prema predmetnom pronalasku, koji je dobijen prema proceduri opisanoj u primeru 3, upoređen je sa goveđim CS (prvi standard Evropske farmakopeje za CS) koji prodaje Bioiberica i sa CS dobijenim ekstrakcijom iz hrskavica ajkule.

Aktivnost elastaze određena je spektrofotometrijskim određivanjem pomoću hromogenog veštačkog supstrata (N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid) specifičnog za HLE. Nakon perioda prethodne inkubacije enzima sa sve većim količinama CS, određivana je aktivnost enzima inkubacijom sa hromogenim supstratom (N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidom). Nakon stoje reakcija zaustavljena, dobijeni proizvod određen je kvantitativno pomoću spektrofotometrijskog određivanja.

Na slici 1 prikazani su podaci navedeni u tabeli 4, koji pokazuju daje CS nalik onom kod ajkule prema predmetnom pronalasku u stanju da suštinski inhibira aktivnost humane leukocitne elastaze na delotvoran način, i u meri koja je uporediva sa onom koju pokazuju prirodni uzorci CS.

Biološka aktivnost i protivzapaljenska svojstva koja CS prema predmetnom pronalasku pokazujein vitro,čine ga uporedivim sa prirodnim proizvodima i time potencijalno korisnim u obliku leka u farmaceutskim preparatima i nutriceutskim preparatima.

Claims (20)

1. Hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule, naznačen time što ne sadrži tri-, tetra- i 2,4-disulfonovane disaharide, a koji se sastoji od 60-99% 6-sulfata, 0.5-30% 2,6-disulfata, 0,1-5% 4,6-disulfata, 0,1-5% nesulfonovanog hondroitina i 0,1-1% 4-sulfata, gde su svi procenti izraženi u odnosu na ukupan sadržaj disaharida navedenog hondroitin sulfata nalik onom kod ajkule, pri čemu on pokazuje srednju brojnu molarnu masu (Mn) od 40-85 kDa i srednju masenu molarnu masu (Mvv) od 50-95 kDa.

2. Hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule prema patentnom zahtevu I. naznačen time što se sastoji od 70-90% 6-sulfata, 8,5-20% 2,6-disulfata, 0,1-5% 4,6-disulfata, 0,1-5% nesulfonovanog hondroitina i 0,1-1% 4-sulfata, gde su svi procenti izraženi u odnosu na ukupan sadržaj disaharida navedenog hondroitin sulfata nalik onom kod ajkule, pri čemu on pokazuje srednju brojnu molarnu masu (Mn) od 40-65 kDa i srednju masenu molarnu masu (Mvv) od 50-70 kDa.

3. Hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule prema patentnim zahtevima 1 ili 2, naznačen time što zbir 2,6-disulfata i 4,6-disulfata dostiže 10-25% ukupnog sadržaja disaharida.

4. Hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu osteoartritisa ili za održavanje mišićno-skeletnog zdravlja.

5. Preparat naznačen time što sadrži hondroitin sulfat nalik onom kod ajkule iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3 i farmaceutski ili nutriceutski prihvatljiv nosilac.

6. Preparat prema prethodnom patentnom zahtevu za upotrebu u prevenciji ili tretmanu osteoartritisa ili za održavanje mišićno-skeletnog zdravlja.

7. Proces za dobijanje hondroitina nalik onom kod ajkuie iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što podrazumeva: a) salifikaciju nesulfonovanog hondroitina, dobijenog defruktozilacijom K4 kapsularnog polimera£.colidobijenog fermentacijom, u obliku slobodne kiseline, koja je prethodno rastvorena u vodenoj sredini, pomoću soli izabrane iz grupe koja se sastoji od tetrametil-, tetraetil- i tetrabutil amonijuma ili piridinijuma; b) sušenja salifikovanog nesulfonovanog hondroitina u obliku slobodne kiseline i(li) natrijumove soli dobijenog u koraku a) do sadržaja vode od 5-15%; c) sušenja salifikovanog nesulfonovanog hondroitina dobijenog u koraku b) na temperaturi od 100°C - 170°C do sadržaja vode od 0,1-3%; d) selektivno sulfonovanje, u položaju 6, salifikovanog nesulfonovanog hondroitina dobijenog u koraku c), rastvorenog u N-metii pirolidonu ili đimetilformamidu, na temperaturi od 0°C - 30°C, dodatkom 1 -2 ekvivalenta kompleksa sumpor trioksid - piridin ili kompleksa sumpor trioksid - dimetilformamid, u vremenskim intervalima od 1-3 časa, dok ne bude dodato ukupno 2-15 ekvivalenata kompleksa sumpor trioksid - piridin ili sumpor trioksid - dimetilformamid; ostavljanje dobijenog rastvora da se meša 2-24 h; e) gašenje reakcije izvršene u koraku d) pomoću vodenog rastvora natrijum bikarbonata ili karbonata, zatim filtracija i koncentrovanje do suva kako bi se dobila osušena čvrsta supstanca; f) rastvaranje osušene čvrste supstance u vodenom rastvoru natrijum hlorida, ultrafiltracija i dijaliza dobijenog rastvora; g) izdvajanje proizvoda iz rastvora dobijenog iz koraka f); h) prečišćavanje proizvoda dobijenog iz koraka g) i dobijanje ovog drugog bilo u obliku kiseline ili u obliku natrijumove soli takve kiseline; i) dobijanje proizvoda koji je rezultat koraka h) a koji pokazuje srednju brojnu molarnu masu (Mn) od 40-85 kDa i srednju masenu molarnu masu (Mvv) od 50-95 kDa.

8. Proces prema prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što se salifikacija nesulfonovanog hondroitina u koraku a) izvodi pomoću soli izabrane iz grupe koja se sastoji od tetrametil-, tetraetil- i tetrabutil-amonijuma.

9. Proces prema patentnim zahtevima 7 ili 8, naznačen time što se salifikacija nesulfonovanog hondroitina u koraku a) izvodi pomoću tetrabutil amonijuma.

10. Proces prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 9, naznačen time što se sušenje nesulfonovanog hondroitina u koraku b) izvodi liofilizacijom ili sušenjem prskanjem.

11. Proces prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 10, naznačen time što se sušenje soli nesulfonovanog hondroitina u koraku c) izvodi do 0,5-2% vode.

12. Proces prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do II. naznačen time što se rastvaranje soli nesulfonovanog hondroitina dobijene u koraku c) izvodi u dimetilformamidu.

13. Proces prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 12, naznačen time što se proces selektivnog sulfonovanja u koraku d) izvodi uz dodatak ukupno 6-12 ekvivalenata kompleksa sumpor trioksid - pridin.

14. Proces prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 13, naznačen time što se proces selektivnog sulfonovanja u koraku d) izvodi uz dodatak ukupno 6-9 ekvivalenata kompleksa sumpor trioksid - pridin.

15. Proces prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 12, naznačen time što se proces selektivnog sulfonovanja u koraku d) izvodi uz dodatak ukupno 1-9 ekvivalenata kompleksa sumpor trioksid - dimetilformamid.

16. Proces prema prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što se proces selektivnog sulfonovanja u koraku d) izvodi uz dodatak ukupno 2-4 ekvivalenata kompleksa sumpor trioksid - dimetilformamid.

17. Proces prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se selektivno sulfonovanje u koraku d) izvodi na temperaturi od I0°C - 20°C.

18. Proces prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se na kraju koraka d), dobijeni rastvor ostavlja da se meša 2-6 časova.

19. Proces prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se u koraku g) proizvod dobija liofilizacijom, sušenjem prskanjem ili precipitacijom u alkoholnoj sredini.

20. CS ili preparat iz patentnih zahteva 1 do 3 i 5 za upotrebu u postupku tretmana ili prevencije osteoartritisa ili za održavanje mišićno-skeletnog zdravlja, naznačen time što podrazumeva primenu, kod pacijenta kome je to potrebno, terapcutski delotvorne količine CS ili preparata prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 i 5.