RS54900B1 - Interspecijski specifično psmaxcd3 bispecifično jednolančano antitelo - Google Patents

Abstract

Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadži prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za cpitop humanog i Callithrix jacchus, Saguinus oedipus ili Saimiri sciureus CD3ε (epsilon) lanac, gde je pomenuti epitop deo aminokiselinske sekvence sadržane u grupi koja se sastoji od SEQ ID NOs. 2, 4, 6, ili 8, i sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Glv-Asn-Glu, i drugi vezujući domen koji se vezuje za antigen specifičan za membranu prostate (PSMA).Prijava sadrži još 17 patentnih zahteva.

Description

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na molekul bispecificnog jednolančanog antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za epitop humanog i Callithrix jacchus, Saguinus oedipus ili Saimiri sciureus CD3 epsilon lanca, gde je pomenuti epitop deo aminokiselinske sekvence sadržan u grupi koja se sastoji od SEQ ID NOs. 2, 4, 6, i 8, i drugog vezujućeg domena koji se vezuje za membranski antigen (PSMA) specifičan za prostatu. Pronalazak takođe obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju pomenuti molekul bispecificnog jednolančanog antitela kao i vektore i ćelije domaćine i postupak za njihovu proizvodnju. Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenuti molekul bispecificnog jednolančanog antitela i medicinske upotrebe pomenutog molekula bispecifičnog jednolančanog antitela.

[0002] T ćelijsko prepoznavanje je posredovano klonotipično distribuiranim alfa beta i gama delta T ćelijskim receptorima (TcR) koji interaguju sa peptid-napunjenim molekulima peptid-MHC (pMHC) (Daviš & Bjorkman, Nature 334 (1988), 395-402). Antigen specifični lanci TcR ne poseduju signalne domene, već su umeslo toga povezani sa konzervativnim signalnim aparatom CD3 sastavljenim iz više subjedinica (Call, Cell 111 (2002), 967-979, Alarcon, Immunol. Rev. 191 (2003), 38-46, Malissen Immunol. Rev. 191 (2003), 7-27). Mehanizmi preko kojih je TcR vezivanje direktno dojavljeno signalnom aparatu ostaje fundamentalno pitanje u bilogiji T ćelija (Alarcon, loc. cit.; Daviš, Cell 110 (2002), 285-287). Deluje jasno da produženi Tćelijski odgovori uključuju angažovanje ko-receptora, TcR oligomertzaciju, i aranžman višeg reda TcR-pMHC kompleksa u imunološkoj sinapsi (Daviš & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289-R291, Daviš, Nat. Immunol. 4 (2003), 217-224). Međutim, veoma rana TcR signalizacija dešava se u odsustvu ovih događaja i može uključivati ligand-indukovanu konformacionu promenu u CD3 epsilon (Alarcon, loc. cit.. Daviš (2002), loc. cit., Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174-11179, Gil, Cell 109 (2002), 901-912). Epsilon, gama, delta i zeta podjedinica signalnog kompleksa međusobno se vezuju da bi formirale CD3 epsilon-gama heterodimer, CD3 epsiion-dclta heterodimer, i CD3 zcta-zeta homodimer (Call, loc. cit.).

[0003] Različite studije su otkrile da su CD3 molekuli važni za pravilnu ekspresiju alfa beta TcR na površini ćelije i normalni razvoj T ćelija (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536, Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375-1380. Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995). 441-447). Rcšcnje za strukturu fragmenata ektodomena mišjeg CD3 epsilon gama heterodimera pokazalo je da su obe epsilon gama podjedinice C2-set ig domeni koji međusobno interaguju da bi formirali neobičnu "side-to-side'1 dimer konfiguraciju (Sun, Cell 105 (2001), 913-923). Iako izgleda da drška bogata cisternom ima važnu ulogu u izvođenju CD3 dimerizacije (Su, loc. cit., Borrolo, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807-12816), interakcija preko ekstracelulamih domena CD3 epsilon i CD3 gama je dovoljna za sastavljanje ovih proteina sa TcR beta (Manolios, Eur. J. Immunol. 24

(1994), 84-92, Manolios & Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532-536). Iako je i dalje kontraverzna, dominantna stehiometrijaTcR najverovatnije sadrži jedan alfa beta TcR, jedan CD3 epsilon gama heterodimer, jedan CD3 epsilon delta heterodimer i jedan CD3 zeta zeta homodimer (Call, loc. cit.). Uzimajući u obzir centralnu ulogu humanog CD3 epsilon gama heterodimera u imunom odgovoru, nedavno je razjašnjena kristalna struktura ovog kompleksa vezanog za terapeutsko antitelo OKT3 (Kjer-Nielsen, PNAS 101. (2004), 7675-7680).

[0004] Brojne terapeutske strategije moduliraju T ćelijski imunitet ciljanjem TcR signalizacije, naročito antihumana CD3 monoklonska antitela (mAbs) koja su u širokoj kliničkoj upotrebi u imunosupresivnim režimima. CD3-specifični mišji mAb OK.T3 bilo je prvo mAb licencirano za upotrebu kod ljudi (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29) i u širokoj je kliničkoj upotrebi kao imunosupresivni agens kod transplantacije (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422-430, Chatenoud, Nal. Rev. Immunol. 3 (2003), 123-132, Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351-1352), tip 1 dijabetesa (Chatenoud (2003), loc. cit.), i psorijaze (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913). Dodatno, anti-CD3 mAbs mogu indukovati delimičnu T ćelijsku signalizaciju i klonsku anergiju (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422). OKT3 je opisan u literaturi kao potentni T ćelijski mitogen (Van Wauvc, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) kao i potentni ubica T ćelija (Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9). OKT3 pokazuje obe ove aktivnosti na vremeski zavisan način; nakon rane aktivacije T ćelija što vodi oslobađanju citokina, nakon dalje primene OKT3 kasnije blokira sve poznate funkcije T ćelija. Usled poslednje pomenutog blokiranja funkcije T ćelija, 0KT3 je našao tako široku primenu kao imunosuporesiv u terapijskim režimima za smanjenje ili čak odsustvo odbacivanja alografta tkiva.

[0005] OKT3 sprečava odbacivanje alografta tkiva najverovatnije blokiranjem funkcije svih T ćelija. Što ima glavnu ulogu u akutnom odbacivanju. OKT3 reaguje sa i blokira funkciju CD3 kompleksa u membrani humanih T ćelija, što jc povezano sa strukturom koja prepoznaje antigen T ćelija (TCR) i esencijalno je za prenos signala. Predmet više studija bilo je koja pod jedinica TCR/CD3 je vezana sa OKT3. Iako su neki dokazi ukazali na specifičnost OK.T3 za epsilon-pođjedinicu TCR/CD3 kompleksa (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 10i, (2004), 7675-7680) dodatni dokazi su pokazali da OKT3 vezivanje TCR/CD3 kompleksa zahteva da budu prisutne druge podjedinice ovog kompleksa (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52).

[0006] Druga dobro poznata antitela specifina za CD3 molekule navedena su u Tunnacliffe, Int. Immunol. I (1989), 546-50. Kao što je prethodno naznačeno, takva CD3 specifična antitela sposobna su da izazovu različite T ćelijske odgovore kao što je proizvodnja limfokina (Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol 128 (1982), 337), proliferacija (Van VVauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) i indukcija supresorskih-T ćelija (Kunicka, in "Lymphocyte Typing II" I (1986), 223). Odnosno, u zavisnosti od eksperimentalnih uslova, CD3 specifično monoklonsko antitelo može ili inhibirati ili indukovati citotoksienost (Leevvenberg, J. Immunol. 134(1985), 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) i 579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135

(1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu (2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221).

[0007] lako je objavljeno da mnoga CD3 antitela opisana u tehnici prepoznaju CD3 epsilon podjedinicu CD3 kompleksa, većina njih ustvari se vezuje za konformacione epitope i, stoga, prepoznaju samo CD3 epsilon u nativnom kontekstu TCR. Konformacioni epitopi su karakterisani prisustvom dva ili više posebnih aminokiselinskih ostataka koji su razdvojeni u primarnoj sekvenci, ali su postavljeni zajedno na površini molekula kada se polipeptid savije u nativni protein/antigen (Sela, (1969) Science 166, 1365 i Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Konformacioni epitop vezan sa CD3 epsilon antitelima opisan u tehnici može se razdvojiti u dve grupe. U glavnoj grupi, pomenuti epitopi se formiraju od dve CD3 podjedinice, npr. CD3 epsilon lanac i CD3 gama ili CD3 delta lanac. Na primer, pronađeno jc u nekoliko studija da se najviše korišćena CD3 epsilon monoklonska antitela OKT3. WT31, UCHT1, 7D6 i Leu-4 nisu vezivala za ćelije transficirane samo sa CD3-epsilon lancem. Međutim, ova antitela su bojila ćelije dvostruko transficirane sa kombinacijom CD3 epsilon plus ili CD3 gama ili CD3 delta (Tunnacliffe. loc. cit.; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991). 1703-9). U drugoj manjoj grupi, konformacioni epitop se formira unutar same CD3 epsilon podjedinice. Član ove grupe je na primer mAb APA 1/1 koji je izazvan sa denaturisanim CD3 epsilon (Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). Uzeta zajedno, većina CD3 epsilon antitela opisana u tehnici prepoznaju konformacionc epitope smeštenc na dve ili više podjedinica CD3. Posebni aminokiselinski ostaci koji formiraju trodimenzionalnu strukturu ovih epilopa mogu ovde biti smešteni bilo na samoj CD3 epsilon podjedinici ili na CD3 epsilon podjedinici i drugim CD3 podjedinicama kao što su CD3 gama ili CD3 delta.

[0008] Još jedan problem u odnosu na CD3 antitela je daje pronađeno da su mnoga CD3 antitela specifična za vrstu. Anti-CD3 monoklonska antitela - što je generalno tačno za bilo koja druga monoklonska antitela - funkcionišu preko visoko specifičnog prepoznavanja njihovih ciljnih molekula. Ona prepoznaju samo pojedinačno mesto, ili epitop, na njihovom ciljnom CD3 molekulu. Na primer, jedno od najšire korišćenih i najbolje okarakterisanih monoklonskih antitela specifičnih za CD3 kompleks je OKT-3. Ovo antitelo reaguje sa CD3 šimpanze, ali ne sa CD3 homologom primata, kao što su makaki, ili sa CD3 psa (Sanduskv et al., J. Med. Primatol. 15

(1986), 441-451). Slično tome, WO2005/l 18635 ili V/O2007/033230 opisuju humana monoklonska CD3 epsilon antitela koja reaguju sa humanim CD3 epsilon, ali ne sa CD3 epsilon miša, pacova, zeca ili primata osim šimpanzi kao što je rezus majmun, makaki majmun ili babun. Anti-CD3 monoklonsko antitelo UCHT-1 je takođe reaktivno sa CD3 iz Šimpanze, ali ne sa CD3 iz makaka (sopstveni podaci). Sa druge strane, takode postoje primeri monoklonskih antitela, koja prepoznaju antigene makaka, ali ne njihove humane partnere. Jedan primer ove grupe je monoklonsko antitelo FN-18 usmereno protiv CD3 iz makaka (Uda et al., i. Med. Primatol. 30

(2001), 141-147). Zanimljivo je da je pronađeno da periferni limfociti iz oko 12% makaki majmuna ne reaguju sa anti-rezus majmun CD3 monoklonskim antitelom (FN-18) usled polimorfizma CD3 antigen kod makaka. Uda et al. opisali su supstituciju dve aminokiseline u CD3 sekvenci makaki majmuna, koja nisu reaktivna sa FN-18 antitelima, u poređenju sa CD3 izvedenim iz životinja, koji reaguju sa FN-18 antitelima (Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J Med Primatol. 33 (2004). 34-7). WO 2007/042261 opisuje bispecifična jednolančana antitela usmercna protiv CD3 i antigen na površini ćelije, koji pokazuje interspecijsku specifičnost.

[0009] Diskriminatorna sposobnost, tj. specifičnost za vrstu, inherentna ne samo za CD3 monoklonska antitela (i njihove fragmente), već za monoklonska antitela generalno, značajna je prepreka njihovom razvoju kao terapeutskih agenasa za tretman bolesti kod ljudi. Da bi se dobilo tržišno odobrenje bilo koji novi medikament kandidat mora proći rigorozno testiranje. Ovo testiranje se može podeliti u prekliničke i kliničke faze: Dok je poslednje pomenuta - dalje podeljena u generalno poznate kliničke faze i, II i III - izvedena kod humanih pacijenata, prethodno pomenuta je izvedena na životinjama. Cilj prekliničkog testiranja je dokazivanje da lek kadidat ima željenu aktivnost i najvažnije daje bezbedan. Tek kada je bezbednost kod životinja i moguća efikasnost leka kandidata ustanovljena u prekiiničkim ispitivanjima ovaj lek kandidat biće odobren za kliničko testiranje kod ljudi od strane odgovarajuće regulatorne institucije. Lekovi kandidati mogu se testirati u odnosu na bezbednost kod životinja na sledeća tri načina, (i) kod relevantnih vrsta, tj. vrsta gde lekovi kandidati mogu prepoznati ortologne antigene, (it) kod transgene životinje koja sadrži humane antigene i (iii) upotrebom surogata za lek kandidat koji se može vezati za ortologne antigene prisutne u životinji. Ograničenja transgenih životinja su da je ova tehnologija tipično ograničena na glodare. Između glodara i čoveka postoje značajne raziike u fiziologiji i rezultati u odnosu na bezbednost ne mogu se tačno primeniti na ljude. Ograničenja surogata za lek kandidata su različit sastav materije u poređenju sa stvarnim lekom kandidatom i životinje koje se često koriste su glodari sa prethodno razmatranim ograničenjem. Stoga, preklinički podaci dobijeni kod glodara su ograničene prediktivne snage u odnosu na lek kandidat. Izborni pristup za testiranje bezbednosti je upotreba relevantne vrste, poželjno nižeg primata. Sadašnje ograničenje monoklonskih antitela pogodnih za terapeutsku intervenciju kod čoveka opisana u tehnici je da su relevantne vrste viši primati, naročito šimpanze. Šimpanze se smatraju ugroženom vrstom i usled njihove čovekolike prirode, korišćenje takvih životinja za testiranje bezbednosti leka zabranjeno je u Evropi i na drugim mestimaje strogo zabranjeno. CD3 je takode uspešno korišćen kao ciljna struktura za bispecifična jednolančana antitela da bi se preusmerile citotoksične T ćelije na patološke ćelije, što rezultuje u pražnjenju bolesnih ćelija iz respektivnog organizma (WO 99/54440; WO 04/106380). Na primer, Bargou et al. (Science 321 (2008):974-7) su u skorije vreme objavili podatke o kliničkoj aktivnosti konstrukta CD19xCD3 bispecifičnog antitela nazvan blinatumomab, koji ima potencijal da angažuje sve citotoksične T ćelije kod humanih pacijenata za lizu ćelija kancera. Niske doze kao 0.005 miligrama po kvadratnom metru po danu kod pacijenata sa ne-Hodgkin-ovim limfomom dovelo je do eliminacije ciljnih ćelija u krvi. Delimična i kompletna regresija tumora prvo su uočene na nivou doze od 0.015 miligrama, i svih sedam pacijenata tretiranih na doznom nivou od 0.06 miligrama imalo je regresiju tumora. Blinatumomab takođe je doveo do klirensa ćelija tumora iz kostne srži i jetre. Iako je ova studija ustanovila klinički dokaz koncepta za terapeulsku potenciju formata bispecifičnog jednolančanog antitela u tretiranju kancera poreklom iz ćelije krvi, i dalje postoji potreba za uspešne koncepte za terapije drugih tipova kancera. [0010| Procenjuje se da će u 2008, 186,320 muškaraca biti novo dijagnostifikovano sa kancerom prostate u Sjedinjenim državama i oko 28,660 muškaraca će umreti od bolesti. Najnoviji dostupan izveštaj o mortalitetu od kancera pokazuje da jc, u 2004, ukupna stopa smrtnosti od kancera prostate kod muškaraca u Americi 25 na 100,000. U kasnim 1980-tim, široka prihvaćenost testa sa antigenom specifičnim za prostatu (PSA) predstavljala je glavno poboljšanje u odnosu prema kanceru prostate. Ovaj test meri količinu PSA proteina u krvi, koji je često povišen koda pacijenata sa kancerom prostate. U.S. Food and Drug Adminislration je 1986 odobrila upotrebu PSA testa za praćenje pacijenata sa kancerom prostate i, 1994. dodatno odobrila njegovo korišćenje kao skrining test za ovu bolest. Usled široke upotrebe PSA testiranja u Sjedinjenim državama, oko 90 procenata svih kancera prostate su trenutno dijagnostifikovani u ranom stadij umu, i, kao posledica toga, muškarci preživljavaju duže nakon dijagnoze. Međutim, rezultati dve tekuće studije, NCI-sponzorisane skrining studije prostate, pluća, kolorektalnog dela i jajnika (PLCO) i Evropske studije skrininga kancera prostate (ERSPC) biće potrebni da se odredi da li PSA skrining zaista spašava živote. Tekuće kliničke studije tokom proteklih 25 godina istraživale su efikasnost prirodnih i sintetičkih jedinjenja u prevenciji kancera prostate. Na primer. Studija za prevenciju kancera prostate (PCPT), u kojoj je učestvovalo skoro 19,000 zdravih muškaraca, pronašla je da finasterid, lek odobren za tretman benigne hiperplazije prostate (BPH), koja jc nekancerozno uvećanje prostate, smanjila je rizik od razvoja kancera prostate za 25 procenata. Sledeća studija, Studija prevencije kancera sa selenom i vitaminom E (SELECT), proučava više od 35,000 muškaraca da bi se odredilo da li dnevni suplement selena i vitamina E može smanjiti incidencu kancera prostate kod zdravih muškaraca. Druge studije prevencije kancera prostate trenutno procenjuju zaštitni potencijal multivilamina, vitamina C i D, soje, zelenog Čaja, i likopena, prirodnog jedinjenja koje se nalazi u paradjzu. Jedna studija, objavljena 2005, pokazala je da su specifični geni fuzionisani u 60 do 80 procenata analiziranih tumora prostate. Ova studija predstavlja prvu opservaciju neslučajnih rearanžmana gena kod kancera prostate. Ova genetička izmena može biti eventualno korišćena kao biomarker, kao pomoć u dijagnozi i moguće u tretmanu ove bolesti. Druge studije su pokazale da genetičke varijacije u specifičnom regionu hromozoma 8 mogu povećali rizik kod muškarca za razvoj kancera prostate. Ove genetičke varijacije čine oko 25 procenata kancera prostate koji se javljaju kod muškaraca belaca. To su prve provercne genetičke varijante koje povećavaju rizik razvoja kancera prostate i mogu pomoći naučnicima da bolje razumeju genetičke uzroke ove bolesti. Postoji takođe i tekuće istraživanje koje istražuje kako se proteini koji cirkulišu u krvi pacijenta mogu koristiti da bi se poboljšala dijagnoza kancera prostate i drugih kancera. U 2005. naučnici su identifikovali grupu specifičnih proteina koje proizvodi imuni sistem pacijenta kao odgovor na tumore prostate. Ovi proteini, tipa autoanitela, mogli su da detektuju prisustvo ćelija kancera prostate u krvi sa više od 90 procenata tačnosti. Kada se koriste u kombinaciji sa PSA, ovi i drugi proteini u krvi mogu se eventualno koristiti da bi se smanjio broj lažno pozitivnih rezultata dobijenih samo sa PSA testiranjem i, stoga, smanjiti veliki broj nepotrebnih biopsija prostate koje sc izvode svake godine usled lažno pozitivnih rezultata PSA testa.

[0011] Osim PSA, identifikovano je nekoliko drugih markera za kancer prostate, uključujući npr. šestodomenski transmenbranski epitelni antigen prostate (STEAP) (Hubcrt et al., PNAS 96 (1999), 14523-14528), antigen matične ćelije prostate (PSCA) (Rciter et ai., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 1735-1740, 1998) i mebranski antigen specifičan za prostatu (PSMA; PSM) (Israeli et al., Cancer Res. 53 (1993). PSMA je originalno definisan sa monoklonskim antitelom (MAb) 7E11 izvedenim pri imunizaciji sa delimično prečišćenim preparatom membrane iz ćelijske linije limfnog čvora adenokarcinoma prostate (LNCaP) (Horoszevvicz et al., Anticancer Res. 7 (1987), 927-35). cDNK fragment od 2.65-kb koji kodira PSMA protein kloniran je i zatim mapiran na hromozomu 11 pli.2 (Israeli et al., loc. cit.: O'Keefe et al., Biochem. Biophvs. Acta 1443 (1998), 113-127). Inicijalna analiza PSMA pokazala je široku ekspresiju unutar ćelija sekretornog epitela prostate. Imunohistohemijsko bojenje pokazalo je da je PSMA bio odsutan do umereno eksprimiran u hiperplastičnim i benignim tkivima, dok su sc maligna tkiva bojila sa najvećim intenzitetom (Horoszevvicz et al., loc. cit.). Naknadna istraživanja rekapitulirala su ove rezultate i označila PSMA ekspresiju kao univerzalnu karkateristiku kod praktično svakog do sada ispitivanog tkiva prostate. Ovi izveštaji dalje demonstriraju da sc ekspresija PSMA naglo povećava proporcionalno agresivnosti tumora (Burger et al., Int. J. Cancer 100 (2002), 228-237; Chang et al., Cancer Res.

59 (1999), 3192-98; Chang et al., Urology 57 (2001). 1179-83), Kavvakami i Nakavama, Cancer Res. 57 (1997), 2321-24; Liuet al., Cancer Res. 57 (1997). 3629-34; fopcs et al., Cancer Res. 50

(1990), 6423-29: Silver et al., Clin. Cancer Res. 9 (2003), 6357-62; Svveat et al., Urology 52

(1998), 637-40; Troyer et al., Int. J. Cancer 62 (1995), 552-558; VVright et al., Urology 48 (1996), 326-334). Konzistentno sa korelacijom između PSMA ekspresije i stadijuma tumora, povećani nivoi PSMA povezani su sa androgen-nezavisnim kancerom prostate (PCa). Analiza uzoraka tkiva od pacijenata sa kancerom prostate pokazala je povećane PSMA nivoe nakon fizičke kastracije ili terapije za androgenu deprivaciju. Za razliku od ekspresije antigena specifičnog za prostatu, koji je nishodno regulisan nakon androgene ablacije, PSMA ekspresija je značajno povećana i u primarnim i metastaziranim primercima tumora (Kavvakami et al., Wright et al., loc. cit.). Konzistentno sa povećanom ekspresijom kod androgen-nezavisnoh tumora, takođe je poznato da je PSMA transkripcija nishodno regulisana steroidima, i primena testosterona posreduju u dramatičnom smanjenju nivoa PSMA proteina i iRNK (Israeli etal., Cancer Res. 54(1994), 1807-11; Wright et al., loc. cit.). PSMA je takođe visoko eksprimiran kod sekundarnih tumora prostate i okultne metastazirajuće bolesti. Imunohistohemijska analiza otkrila je relativno intenzivnu i homogenu ekspresiju PSMA unutar metastazi ran ih lezija lokalizovanih u limfnim čvorovima, kosti, mekom tkivu, i plućima u poređenju sa benignim tkivima prostate (Chang et ai. (2001), loc. cit.; Murphy et al., Cancer 78 (1996), 809-818; Svveat et al., loc. cit.). Neki izveštaji su takođe ukazali na ograničenu PSMA ekspresiju u tkivima izvan prostate, uključujući podskup od rcnalnih proksimalnih tubula, nekih ćelija intestinalne membrane mikrovilima, i retkih ćelija u kriptama debelog creva (Chang et al. (1999), Iloroszevvicz et al., Israeli et ai. (1994), Lopes et ai., Troyer et al., loc. cit.). Međutim, nivoi PSMA u ovim tkivima su generalno dva do tri reda veličine manji od onih uočenih kod prostate (Sokoloff et al.. Prostate 43 (2000), 150-157). PSMA je takođe eksprimiran u neovaskulaluri povezanoj sa tumorom kod većine ispitivanih solidnih kancera ali je odsutan u normalnom vaskularnom endotelu (Chang et al. (1999). Liu et al., Silver et ai., loc. cit.). iako jc značaj PSMA ekspresije unutar vaskulalure nepoznat, specifičnost za tumor-povezani endotel čini PSMA potencijalnim ciljem za tretman mnogih oblika malignilela.

[0012] WO 2006/089230 obezbeđuje izolovana humana monoklonska antitela koja se specifično vezuju za PSMA sa visokim afinitetom i njihovu upotrebu za tretiranje kancera. WO 2006/125481 opisuje izolovana diatela usmerena na PSMA i njihovu upotrebu u tretmanu kancera. Biihler et al.

(2007), Cancer Immunologv, lmmunotherapv, Springer Berlin, Vol. 57, No. I, pp. 43-52, odnosi se na bispecifično diatelo usmereno na PSMA i CD3, koje indukuje T-ćelijski posredovanu ližu ćelija kancera prostate.

[0013] lako je uloženo mnogo truda u identifikovanje novih ciljeva za terapeutskc pristupe kanceru, kancer je i dalje jedna od najčešće dijagnostifikovanih bolesti. U svetlu ovoga, i dalje postoji potreba za efikasnim tretmanima kancera.

[0014]Ovaj pronalazak obezbeđuje molekul bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za epitop humanog i Cal lithrix jacchus, Saguinus oedipus ili Saimiri sciureus CD3e (epsilon) lanca, gdc je pomenuti epitop deo aminokiselinske sekvence sadržane u grupi koja se sastoji od SEQ ID NO. 2, 4, 6, i 8 i sadrži najmanje aminokiselinske sekvence Gln-Asp-Gly-Asn-Giu; i drugi vezujući domen koji se vezuje za membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA).

[0015]Iako bispecifična jednolančana antitela kojaangažuju T ćelije opisana u tehnici imaju veliki terapeutski potencijal za tretman malignih bolesti, većina ovih bispecifičnih molekula su ograničeni u tome da su specifični za vrstu i prepoznaju samo humani antigen, i - usled genetičke sličnosti - verovatno partnera iz šimpanze. Prednost ovog pronalaska je obezbeđivanje bispecifičnog jednolančanog antitela koje sadrži vezujući domen koji pokazuje interspecijsku specifičnost sa CD3 epsilon lancem kod ljudi i i primata osim šimpanzi. U ovom pronalasku, N-terminalni 1-27 aminokiselinski ostatak polipeptidnog fragmenta ekstracelularnog domena CD3 epsilon je iznenađujuće identifikovan da - za razliku od svih ostalih poznatih CD3 epsilon epitopa opisanih u tehnici - zadržava svoj trodimenzionalni strukturni integritet kada se izdvoji iz svoje nativne sredine u CD3 kompleksu (i izborno fuzioniše sa heterolognom aminokiselinskom sekvencom kao što je EpCAM ili Fc deo imunoglobulina). Ovaj pronalazak, stoga, obezbeđuje molekul bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadrži prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za epitop N-terminalnog 1-27 aminokiselinskog ostatka polipeptidnog fragmenta ekstracelularnog domena CD3 epsilon (gde CD3 epsilon jc, na primer, izdvojen iz svoje nativne sredine i/ili sadržan u (prikazan na površini) humanom CD3 epsilon lancu T-ćelije kod ljudi i Callithrix jacchus, Saguinus oedipus iii Saimiri sciureus, gde je pomenuti epitop deo aminokiselinske sekvence sadržane u grupi koja se sastoji od SEQ ID NO. 2, 4, 6, i 8 i sadrži najmanje aminokiseiinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu; i drugi vezujući domen koji se vezuje za membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA). Poželjni primati osim šimpanze ovde su pomenuti na drugim mestima. Najmanje jedan (ili izabrani ili svi) primat(i) izabrani od Callithrix jacchus; Saguinus oedipus, Saimiri sciureus, i Macaca fascicularis (bilo SEQ ID XY ili YZ ili oba), je(su) opisani ovde. Macaca mulatta, takođe poznat kao rezus majmun takođe jc opisan kao sledeći poželjni primat. Sloga je predviđeno da se antitela pronalaska vezuju za (sposobna da se vežu za) kontekstno nezavisni epitop N-terminalnog 1-27 aminokiselinskog ostatka polipeptidnog fragmenta ekstracelularnog domena CD3 epsilon ljudi i Callithrix jacchus, Saguinus oedipus, Saimiri sciureus, i Macaca fascicularis (bilo SEQ ID XY ili YZ ili oba), i izborno takođe za Macaca mulatta. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži prvi vezujući domen kao što je ovde definisano može se dobiti (moguće je dobiti) ili se može proizvesti u skladu sa protokolom postavljenim u priključenim Primerima (naročito Primer 2). U tom smislu, predviđeno je da se (a) imunizuju miševi sa N-termina! 1-27 aminokiselinskim ostatkom polipeptidnog fragmenta ekstracelularnog domena CD3 epsilon ljudi i/ili Saimiri sciureus; (b) stvaranje scFv biblioteke imunog mišjeg antitela; (c) identifikacija CD3 epsilon specifičnih vezujućih sredstava testiranjem sposobnosti da vežu najmanje SEQ ID NO. 2, 4, 6, i 8. 10016] Kontekstna nezavisnost CD3 epitopa obezbeđena u ovom pronalasku odgovara prvim 27 N-terminainim aminokiselinama CD3 epsilon ili funkcionalnim fragmentima ovog dela od 27 aminokiselina. Fraza "kontekstno nezavisan," kao stoje ovde korišćeno u odnosu na CD3 epitop znači da vezivanje ovde opisanih molekula/molekula antitela pronalaska ne dovodi do promene ili modifikacije konformacije, sekvence, ili strukture koja okružuje antigenu determinantu ili epitop. Za razliku od toga, CD3 epitop prepoznat sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekulom (npr. kao što je opisano u WO 99/54440 ili WO 04/106380) lokalizovan je na CD3 epsilon lancu C-terminalno od N-terminalnih 1-27 aminokiselina kontekstno nezavisnog epitopa, pri čemu je potrebna samo tačna konformacija ukoliko se nalazi u okviru ostatka epsilon lanca i održava se u ispravnoj sleričkoj poziciji helerodimerizacijom epsilon ianca biio sa CD3 gama ili delta lancem. Anti-CD3 vezujući domeni kao deo PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog molekula kao što je ovde obezbeđeno i stvoreno (i usmereno) protiv kontekstno nezavisnog CD3 epitopa obezbeđuje iznenađujuće kliničko poboljšanje u odnosu na redistribuciju T ćelija i, stoga, poželjniji bezbednosni profil. Bez vezivanja za teoriju, kako je CD3 epitop kontekstno nezavisan, obrazovanje autonomnog samodovoljnog podomena bez većeg uticaja na ostatak CD3 kompleksa, CD3 vezujući domen PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog molekula obezbeđenog ovde indukuje manje alosteričkih promena u CD3 konformaciji od konvencionalnih CD3 vezujućih molekula (kao što su molekuli obezbeđeni u WO 99/54440 ili WO 04/106380), koji prepoznaju kontekstno zavisne CD3 epilope.

[0017] Kontekstna nezavisnost CD3 epitopa koja je prepoznala od strane CD3 vezujućeg domena PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska povezana je sa malom iii nedostajućom redistribucijom T ćelija (redistribucija T ćelija izjednačava se sa incijalnom epizodom pada i naknadnog vraćanja u normalu apsolutnog broja T ćelija) tokom početne faze tretmana sa pomenutim PSMAxCD3 bispecifičnim jednolančanhn antilelom pronalaska. Ovo rezultuje u boljem bezbednosnom profilu PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska u poređenju sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekuiima poznatim u tehnici, koji prepoznaju kontekstno-zavisne CD3 epitope. Naročito, usled toga što je redistribucija T ćelija tokom početne faze tretmana sa CD3 vezujućim molekuiima glavni faktor rizika za Štetne efekte, kao što su CNS štetni efekti, PSMAxCD3 bispecifično jednolančano antitelo pronalaska preko prepoznavanja kontekstno-nezavisnog pre nego kontekstno-zavisnog CD3 epitopa ima značajnu bezbednosnu prednost nad CD3 vezujućim molekuiima poznatim u tehnici. Pacijenti sa takvim CNS štetnim efektima povezanim sa redistribucijom T ćelija tokom početne faze tretmana sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekuiima obično pate od konfuzije i dezorijentacije, u nekim slučajevima takođe od urinarne inkontinencije. Konfuzija je pramena u mentalnom statusu kod koje pacijent nije sposoban da misli sa njegovim ili njenom uobičajenim nivoom jasnoće. Pacijent obično ima teškoće da se koncentriše i mišljenje nije samo mutno i nejasno već često značajno usporeno. Pacijenti sa CNS štetnim događajima vezanim za redistribuciju T ćelija tokom početne faze tretmana sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekuiima mogu takođe patiti od gubitka pamćenja. Cesto, konfuzija vodi do gubitka sposobnosti da se prepoznaju ljudi, mesla. vreme ili datum. Osećaj dezorijentisanosti je uobičajen kod konfuzije, i smanjena je mogućnost donošenja odluka. CNS štetni događaji vezani za redistribuciju T ćelija tokom početne faze tretmana sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekuiima mogu dalje obuhvalati nejasan govor i/ili teškoću pronalaženja reči. Poremećaj može smanjiti oba, izražavanje i razumevanje jezika kao i čitanje i pisanje. Pored urinarne inkontinencije, vrtoglavica i ošamućenost mogu takođe pratiti CNS štetne događaje vezane za redistribuciju T ćelija tokom početne faze tretmana sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekuiima kod nekih pacijenata. Održavanje trodimenzionalne strukture unutar pomenutih 27 aminokiselina N-tcrminalnog polipeptidnog fragmenta CD3 epsilon mogu se koristiti za stvaranje, poželjno humanih, vezujućih domena koji su sposobni da se vezuju za N-tcrminalni CD3 epsilon polipeptidni fragmentinviiroi za nativni (CD3 epsilon podjcdinicu) CD3 kompleks na T ćelijamain vivosa istim afinitetom vezivanja. Ovi podaci snažno ukazuju da N-terminalni fragment kao što je ovde opisan obrazuje tercijarnu konformaciju, koja je slična njegovoj strukturi koja normalno postojiin vivo.Izveden je veoma osetljiv test za važnost strukturnog integriteta aminokiselina 1-27 N-terminalnog polipeptidnog fragmenta CD3 epsilon. Individualne aminokiseline od aminokiselina 1-27 N-terminalnog polipeptidnog fragmenta CD3 epsilon promenjene su u alanin (alanin skening) da bi se testirala osetljivost aminokiselina 1-27 N-terminalnog polipeptidnog fragmenta CD3 epsilon na manje disrupcije. CD3 specifični vezujući domeni kao deo PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska korišćeni su za testiranje vezivanja za alanin-mutante aminokiselina 1-27 N-terminalnog polipeptidnog fragmenta CD3 epsilon (videti priključeni Primer 5). Pojedinačne zamene prvih pet aminokiselinskih ostataka na samom N-terminalnom kraju fragmenta i dve od aminokiselina na pozicijama 23 i 25 od aminokiselina 1-27 N-terminalnog polipeptidnog fragmenta CD3 epsilon bile su kritične za vezivanje molekula antitela. Supstitucija aminokiselinskih ostataka u regionu pozicije 1-5 koji sadrži ostatke Q (Glutamin na poziciji 1), D (Asparaginska kiselina na poziciji 2), G (Glicin na poziciji 3), N (Asparagin na poziciji 4), i E (Glutaminska kiselina na poziciji 5) u vezivanju bez alanina. poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska za pomenuti fragment. Dok, za najmanje neka od, poželjno humana, PSMAxCD3 bispecifična jednolančana antitcia pronalaska, dva aminokisclinska ostatka na C-terminusu pomenutog fragmenta T (Treonin na poziciji 23) i I (Izoieucin na poziciji 25) su smanjila energiju vezivanja za, poželjno humano, PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska.

[0018] Neočekivano, pronađeno je da tako izolovano, poželjno humano, PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska ne samo da prepoznaje humani N-terminalni fragment CD3 epsilon, već takode odgovarajuće homologe fragmente CD3 epsilon različitih primata, uključujući majmune novog Sveta (marmozet, Callithrix jacchus; Saguinus oedipus; Saimiri sciureus) i majmune Starog Sveta (Macaca fascicularis, poznat takode mamaki rakojed; ili Macaca mulatta, takođe poznat kao rezus majmun). Stoga, deleklovana je multi-primatna specifičnost PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska. Sledeće analize sekvenci potvrdile su da ljudi i primati dele visoko homoiogi deo sekvence na N-terminusu ekstracelularnog domena CD3 epsilon. Aminokiselinska sekvenca N-terminalnih fragmenata CD3 epsilon prikazana je na S£Q ID No. 2 (čovek), SEQ ID No. 4 (Callithrix jacchus); SF.Q ID No. 6 (Saguinus oedipus); SEQ ID No. 8 (Saimiri sciureus); SEQ ID No. 1047QDGNEEMGSJTQTPYQVS1SGTTJLTCili SEQ ID No. 1048QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILT(Macacafascicularis, takođe poznat kao makaki rakojed), i SEQ ID No. 1049ODGNEEMGSITOTPYHVSISGTTVILT (Macacamulatta, takode poznat kao rezus majmun).

[0019]Drugi vezujući domen PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska vezuje se za membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA). Poželjno, drugi vezujući domen PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska vezuje se za humani PSMA ili PSMA primata osim šimpanze; poželjnije vezuje se za humani PSMA i PSMA primata osim šimpanze i stoga je interspecijski specifičan; još poželjnije za humani PSMA i makaki PSMA (i stoga je takođe interspecijski specifičan). Naročito poželjno, makaki PSMA jc PSMA makaki rakojeda i/ili PSMA rezus majmuna. Međutim, nije isključeno iz obima ovog pronalaska, da drugi vezujući domen može takođe da se vezuje za PSMA homologe drugih vrsta, kao što je za PSMA homolog kod glodara.

[0020]Kancer prostate je drugi po učestalosti kancer kod muškaraca. Za 2008, procenjeno je da će 1 86,320 muškaraca biti novo dijagnostifikovanih sa kancerom prostate u Sjedinjenim državama i oko 28,660 muškaraca će umreti od boiesti. Rizik od kancera prostate je snažno povezan sa starošću: veoma malo slučajeva je registrovano kod muškaraca ispod 50 i tri četvrtine slučajeva se dešava kod muškaraca preko 65 godina. Najveći broj slučajeva je dijagnostifikovan kod onih starosti 70-74. Trenutno, stopa rasta starije populacije je značajno veća od ukupne populacije. Do 2025-2030, projekcije ukazuju da će populacija preko 60 rasti 3.5 puta brže od ukupne populacije. Proporcija starijih osoba je projektovana na više od dvostruko širom sveta tokom sledećih pola veka, što znači da treba očekivati dalji porast incidence dijagnostifikovanog kancera prostate u budućnosti. Visoko restriktivna ekspresija PSMA i njegova ushodna regulacija u uznapredovalim stadijumima i metastaziranoj bolesti kancera prostate kao i njegova uloga kao neoantigena na vaskuiaturi tumora mnogih različitih tipova drugih solidnih tumora kvaliilkuje PSMA kao atraktivni ciljni antigen za terapiju kancera zasnovanu na antitelima. Kao što je prikazano u sledećim primerima, PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska obezbeđuje napredno sredstvo za ubijanje PSMA-eksprimirajućih humanih ćelija kancera, kao što je dato primerom ćelijske linije humanog kancera prostate LNCaP. Dodatno, citotoksična aktivnost PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska je veća od citotoksične aktivnosti antitela opisanih u tehnici. Kako poželjno oba CD3 i PSMA vezujući domen PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska su interspecijski specifični, tj. reaktivni sa humanim i antigenima primata osim šimpanze, mogu sc koristiti za prckliničku cvaluaciju bezbednosti, aktivnosti i/ili farmakokinetičkog profila ovih vezujućih domena kod primata i - u identičnom obliku - kao lekovi kod ljudi. 100211 Povoljno, ovaj pronalazak takode obezbeđuje PSMAxCD3 bispecifična jednolančana antitela koja sadrže drugi vezujući domen koji se vezuje i za humani PSMA i za makaki PSMA homolog, tj. homolog primata osim šimpanze. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, bispecifično jednoiančano antitelo stoga sadrži drugi vezujući domen koji pokazuje interspecijsku specifičnost sa humanim i PSMA primata osim šimpanze. U ovom slučaju, identični molekul bispecifičnog jednolančanog antitela može se koristiti i za prekliničku procenu bezbednosti, aktivnosti i/ili farmakokinetički profil ovih vezujućih domena primata i kao ickkod ljudi. Drugim rečima, isti molekul se može koristili u prekliničkim studijama na životinjama kao i u kliničkim studijama na ljudima. Ovo vodi do visoko uporedivih rezultata i veoma povećanoj prediktivnoj snazi studija na životinjama u poređenju sa surogat molekuiima specifičnim za vrstu. Kako su i CD3 i PSMA vezujući domen PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska interspecijski specifični, tj. reaktivni sa humanim i antigenima primata osim Šimpanze, mogu se korisiti za prekliničku evaluaciju bezbednosti, aktivnosti i/ili farmakokinetičkog profila ovih vezujućih domena kod primata i — u identičnom obliku - kao lek kod ljudi. Podrazumeva se da u poželjnom primeru izvođenja pronalaska, interspecijska specifičnost prvog i drugog vezujućeg domena antitela pronalaska je identična.

[0022] U ovom pronalasku jc nađeno da jc moguće stvoriti, poželjno humano, PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo gde sc identični molekul može koristiti u prekliničkom testiranju na životinjama, kao i u kliničkim studijama i čak u terapiji ljudi. Ovo je usled neočekivane identifikacije, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela, koje, kao dodatak vezivanja humanog CD3 epsilon i PSMA, respektivno, (i usled genetičke sličnosti verovatno i za partnera kod šimpanze), takođe vezuje homologe pomenutih antigena primata osim šimpanze, uključujući majmune Novog Sveta i majmune Starog Svela. Kao Što je prikazano u sledećim Primerima, pomenuto poželjno humano, PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska može se koristiti kao terapeutski agens protiv različitih bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kancer. PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo je naročito povoljno za terapiju kancera, poželjno solidnih tumora, poželjnije karcinoma i kancera prostate. U odnosu na prethodno navedeno, nestaje potreba da se konstruišc surogat PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska za testiranje kod filogenetski udaljenih (od ljudi) vrsta. Kao rezultat toga, identični molekul se može koristiti kod prekliničkog testiranja na životinjama kao što jc nameravano da se primeni na ljude u kliničkom tretiranju kao i prateće odobrenje za tržište i terapeutska primena leka. Mogućnost da se koristi isti molekul za prekliničko testiranje na životinjama kao i u kasnijoj primeni na ljude praktično eliminišc, ili najmanje u velikom stepenu smanjuje, opasnost da podaci dobijeni u prekliničkom testiranju na životinjama imaju ograničenu primenljivost u slučaju ljudi. Ukratko, dobijanje prekliničkih podataka o bezbednosti kod životinja korišćenjem istog molekula kao što će stvarno biti primenjeno na ljude čini mnogo da se osigura primenjivost podataka na scenario relevantan za ljude. Suprotno tome, u konvencionalnim pristupima korišćenjem surogat molekula, pomenuti surogat molekuli moraju biti molekularno prilagođeni na životinjski test sistem korišćen za prekliničku procenu bezbednosti. Stoga, molekul koji će se koristiti u terapiji ljudi se ustvari razlikuju u sekvenci i takođe verovatno u strukturi od surogat molekula korišćenog u prekliničkom testiranju u farmakokinetičkim parametrima i/ili biološkoj aktivnosti, sa posledicom da podaci dobijeni u prekliničkom testiranju na životinjama imaju ograničenu primenu/prenosivost u slučaju ljudi. Korišćenje surogat molekula zahteva konstrukciju, proizvodnju, prečišćavanje i karakterizaciju kompletno novog konstrukta. Ovo vodi do dodatnih troškova razvoja i vremena neophodnih da bi se dobio taj molekul. Sumarno, surogati sc moraju zasebno razvijati dodatno stvarnom leku koji će se koristili u terapiji ljudi, tako moraju da se izvedu dve linije razvoja za dva molekula. Stoga, glavna prednost, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska koje pokazuju interspecijsku specifičnost koja je ovde opisana je da se identičan molekul može koristiti kao terapeutski agens kod ljudi i u prekliničkom testiranju na životinjama.

[0023] Poželjno je da je najmanje jedan od pomenutih prvih ili drugih vezujućih domena bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska CDR-graftovan, humanizovan ili humani, kao što je detaljnije dato u daljem tekstu. Poželjno, i prvi i drugi vezujući domeni bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska su CDR-graftovan i. humanizovani ili humani. Za poželjno humano, PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska, stvaranje imune reakcije protiv pomenutog vezujućeg molekula je isključena u najvećem mogućem stepenu nakon primene molekula na humane pacijente.

[0024] Sledeća glavna prednost, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska je njegova primenjivosl u prekliničkom testiranju kod različitih primata. Ponašanje leka kandidata kod životinja u idelanom slučaju treba da bude indikativno za očekivano ponašanje ovog leka kandidata pri primeni na ljude. Kao rezultat, podaci dobijeni iz takvih prekliničkih testiranja stoga generalno imaju visoku prediktivnu snagu u slučaju ljudi. Međutim, kao što je naučeno iz tragičnog rezultata skore Faze I kliničke studije sa TGN1412 (CD28 monoklonsko antitelo), lek kandidat se može ponašati drugačije kod vrsta primata nego kod ljudi: dok u prekliničkom testiranju pomenutih antitela nije uočen nijedan ili samo ograničeni štetni efekti u studijama na životinjama izvedenim sa makaki majmunima, šest ljudi pacijenata razvilo je višestruko otkazivanje organa pri primeni pomenutog antitcia (Lancet 368 (2006), 2206-7). Rezultati ovih dramatičnih, neželjenih negativnih događaja sugerišu da nije dovoljno ograničiti prekliničko testiranje na samo jednu vrstu (primata osim šimpanze). Činjenica da sc PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska vezuje za niz majmuna Novog i Starog sveta može pomoći da se prevaziđu problemi koji postoje u prethodno pomenutom slučaju. Shodno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje sredstva i postupke za minimizovanjc razlika između vrsta u efektima kada se lekovi za humanu terapiju razvijaju i testiraju.

[0025] Sa, poželjno humanim, interspecijski specifičnim PSMAxCD3 bispecifiČnim jednolančanim anlitelom pronalaska takođe nije više potrebno priiagođavati test životinju na lek kandidat namenjen za primenu na ljudima, kao sto je npr. stvaranje transgenih životinja. Poželjno humano, PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska koje pokazuje interspecijsku specifičnost prema upotrebama i postupcima pronalaska može se direktno koristiti za prekliničko testiranje kod primata osim šimpanzi, bez bilo kakve genetičke manipulacije životinja. Kao što je dobro poznato stručnjacima, pristupi u kojima su test životinje prilagođene na lek kandidat uvek nose rizik da su rezultati dobijeni u prekliničkom testiranju bezbednosti manje reprezentativni i prediktivni za ljude usled modifikacije životinje. Na primer, kod transgenih životinja, proteini kodirani transgenima su često visoko prekomerno eksprimirani. Stoga, podaci dobijeni za biološku aktivnost antitela na proteinski antigen mogu biti ograničeni u njihovoj pređiktivnoj vrednosti za ljude kod kojih je protein eksprimiran na mnogo nižim, više fiziološkim nivoima. [0026J Dodatna prednost upotreba poželjno humanog PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska koje pokazuje interspecijski specifičnost je činjenica da su Šimpanze kao ugrožena vrsta izbegnuta u testiranju na životinjama. Šimpanze su najbliži srodnici ljudima i skoro su grupisani u familiju hominida na osnovu podataka sekvenciranja genoma (Vv'ildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Stoga, podaci dobijeni na šimpanzi sc generalno smatraju visoko prediktivnim za ljude. Međutim, usled njihovog statusa ugrožene vrste, broj šimpanzi, koji sc mogu koristili za medicinske eksperimente, veoma je ograničen. Kao stoje prethodno navedeno, održavanje šimpanzi za testiranja na životinjama je stoga i skupo i etički problematično. Upotreba, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska izbegava etičke primedbe i finansijski teret tokom prekliničkog testiranja bez predrasuda o kvalitetu, tj. primenljivosti, podataka dobijenih testiranjem na životinjama. U svetlu ovoga, upotreba, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska obezbeđuju racionalnu alterantivu za studije na šimpanzama.

[0027]Dodatna prednost, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska je sposobnost ekstrakcije višestrukih uzoraka krvi kada sc koriste kao deo prekliničkog testiranja na životinjama, na primer tokom farmakokinetičkih studija na životinjama. Višestruke ekstrakcije krvi mogu se mnogo lakše dobiti sa primatom osim šimpanze nego sa nižim životinjama, npr. mišem. Ekstrakcija višestrukih uzoraka krvi omogućava testiranje parametara krvi za određivanje bioloških efekata indukovanih sa, poželjno humanim, PSMAxCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom pronalaska. Dodatno, ekstrakcija višestrukih uzoraka krvi omogućava istraživaču da proceni farmakokinetički profil, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska kao sto je ovde đefinisano. Dodatno, potencijalni sporedni efekti, koji se mogu indukovati pomenutim, poželjno humanim, PSMAxCD3 bispecifičnim jednolančanim antitelom pronalaska što se odražava na parametre krvi, mogu se meriti u različitim uzorcima krvi ekstrahovanim tokom primene pomenutog antitela. [0028)Ovo omogućava određivanje potencijalno toksičnog profila, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska kao Što je ovde đefinisano.

[0029]Prednosti, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska koje kao što je ovde đefinisano pokazuje interspecijskiu specifičnost može se kratko rezimirati kao što sledi: Prvo, poželjno humano, PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska kao Što je ovde đefinisano korišćeno u prekliničkom testiranju istoje kao ono korišćeno u humanoj terapiji. Stoga, više nije neophodno razvijati dva nezavisna molekula, koji se mogu razlikovati u njihovim farmakokinetičkim karakteristikama i biološkoj aktivnosti. Ovo jc veoma povoljno po tome npr. što se farmakokinetički rezultati mogu direklnije preneti i primenjiviji su na ljude od npr. konvencionalnih surogat pristupa. Drugo, upotrebe, poželjno humanog, PSMAxCD3 bispecificnog jednolančanog antitela pronalaska kao što jc ovde đefinisano za pripremu terapeutika kod ljudi su jefitinije i zahtevaju manje rada od surogat pristupa. Treće, poželjno humano, PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska kao što jc ovde đefinisano može se koristiti za prekliničko testiranje ne samo na jednoj vrsti primata, već u nizu različitih vrsta primata, čime se smanjuje rizik potencijalnih razlika između vrsta između primata i čoveka. Četvrto, ukoliko je poželjno mogu se izbeći šimpanze kao ugrožena vrsta za testiranje na Životinjama. Peto, višestruki uzorci krvi mogu se ekstrahovati za ekstenzivne farmakokinetičke studije. Šesto, usled ljudskog porekla, poželjno humanih, vezujućih molekula prema poželjnom primeru izvođenja pronalaska, stvaranje imune reakcije protiv pomenutih vezujućih molekula je minimizovano pri primeni naa ljudske pacijente. Isključena je indukcija imunog odgovora sa antitelima specifičnim za lek kandidat izveden iz ne-humanih vrsta kao stoje npr. miš koja dovodi do razvoja humanih-anti-mišjih antitela (HAMAs) protiv terapeutskih molekula mišjeg porekla. Poslednjc, ali ne najmanje važno, terapeutska upotreba PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska obezbeđuje novi i inventivni terapeutski pristup za kancer, poželjno soiidnih tumora, poželjnije karcinoma i kancera prostate. Kao što je prikazano u sledećim primerima. PSMAxCD3 bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska obezbeđuje povoljno oruđe da bi se ubile PSMA-eksprimirajuće humane ćelije kancera prostate. Dodatno, citotoksiČna aktivnost PSMAxCD3 bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska je veća od aktivnosti antitela opisanih u tehnici.

[0030] Kao što je ovde naznačeno prethodno, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptide, tj. bispecifična jednolančana antitela pronalaska, koja sadrže prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za epitop humanog i Cal!ithrix jacchus, Saguinus oedipus ili Saimiri sciureus primata osim šimpanze CD3e lanca i drugi vezujući domen koji vezuje PSMA. Drugi vezujući domen poželjno se vezuje za humani PSMA i PSMA primala osim šimpanze. Prednost molekula bispecifičnog jednolančanog antitela kao lekova kandidata koji ispunjavaju zahteve za poželjno bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska je upotreba takvih molekula u prekliničkim testiranjima na životinjama kao i u kliničkim studijama i čak za terapiju ljudi. U poželjnom primeru izvođenja interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska drugi vezujući domen koji se vezuje za PSMA je humani. U interspecijski specifičnom bispecifiČnom molekulu prema pronalasku vezujući domen koji sc vezuje za epitop čoveka i primata osim šimpanze CD3 epsilon lanca nalazi sc redom u VH-VL ili VL-VH na N-terminusu ili C-terminusu bispecifičnog molekula. Primeri za interspecijski specifične bispcciflčne molekule prema pronalasku u različitim rasporedima VH- i VL-lanca u prvom i drugom vezujućem domenu opisani su u priključenim primerima.

[0031] Kao što je ovde korišćeno, " bispecifično jednoiančano antitelo pronalaska" označava jedan polipeptidni lanac koji sadrži dva vezujuća domena. Svaki vezujući domen sadrži jedan varijabilni region iz teškog lanca antitela ("VH region"), gde se VH region prvog vezujućeg domena specifično vezuje CD3e molekul, i VH region drugog vezujućeg domena specifično se vezuje za PSMA. Dva vezujuća domena su izborno međusobno povezana preko kratkog polipeptidnog spejsera. Neograničavajući primer za polipeptidni spejser je Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-G-S) i njegovi ponovci. Svaki vezujući domen može dodatno sadržati jedan verijabilni region iz lakog lanca antitela ("VL region"), VH region i VL region unutar svakog od prvih i drugih vezujućih domena međusobo je povezan preko polipeptidnog linkera, na primer tipa koji je opisan i za koji jc tražena zaštita u EP 623679 BI, ali u svakom slučaju dovoljno dugačak da bi omogućio da se VH region i VL region prvog vezujućeg domena i VH region i VL region drugog vezujućeg domena međusobno upare tako da su zajedno sposobni da se specifično vezuju za respektivne prve i druge vezujućc domene.

[0032] Termin "protein" je dobro poznat u tehnici i opisuje biološka jedinjenja. Proteini sadrže jedan ili više aminokiselinskih lanaca (polipeptida), gde su aminokiselinc međusobno vezane peptidnom vezom. Termin "polipeptid" kao što je ovde korišćen označava grupu moiekula, koja se sastoji od više od 30 aminokiselina. U skladu sa pronalaskom, grupa polipeptida čini "proteine" dok se god proteini sastoje od jednog polipeptidnog lanca. Takođe u skladu sa definicijom termin "polipeptid" opisuje fragmente proteina sve dok se ovi fragmenti sastoje od više od 30 aminokiselina. Polipeptidi mogu dalje obrazovati multimere kao što su dimeri, trimeri i viši oligomeri, tj. koji se sastoje od više od jednog polipeptidnog molekula. Polipeptidni molekuli koji formiraju takve dimere, trimere, itd.. mogu biti identični ili ne-identični. Odgovarajuće strukture višeg reda takvih multimera su, konsekventno, označeni kao homo- ili heterodimeri, homo- ili heterotrimeri itd. Primer heteromultimera je molekul antitela, koje se, u obliku u kom se prirodno javlja, sastoji od dva identična laka polipeptidna lanca i dva identična teška polipeptiđna lanca. Termini "polipeptid" i "protein" takođe se odnose na prirodno modifikovane polipeptide/proteine gde je modifikacija izvedena npr. sa post-translacionim modifikacijama kao što je giikozilacija. acetilacija, fosforilacija i slično. Takve modifikacije su dobro poznate u tehnici.

[0033] Termin "vezujući domen" karakteriše se u vezi sa ovim pronalaskom kao polipeptidni domen koji se specifično vezuje za/interaguje sadatom ciljnom strukturom /antigenom/epitopom. Sloga, vezujući domen je "mesto interakcije sa antigenom". Termin "mesto interakcije sa antigenom" definiše, u skladu sa ovim pronalaskom, polipeptidni motiv, koji je sposoban da specifično interagujc sa specifičnim antigenom ili specifičnom grupom antigena, npr. identičan antigen kod različitih vrsta. Podrazumeva se da pomenuto vezivanje/interakcija takode definiše "specifično prepoznavanje". Termin "specifično prepoznaje" označava u skladu sa ovim pronalaskom daje molekul antitela sposoban da specifično interaguje sa i/i I i vezuje sc sa najmanje dva, poželjno najmanje tri, poželjnije najmanje četiri aminokiseline antigena, na primer humanog CD3 antigena kao što je ovde đefinisano. Primer takvog vezivanja može biti specifičnost "principa ključa i brave". Stoga, specifični motivi u aminokiselinskoj sekvenci vezujućeg domena i antigen vezuju se međusobno kao rezultat njihove primarne, sekundarne ili tercijarne strukture, takođe i kao rezultat sekundarnih modifikacija pomenute strukture. Specifična interakcija mesta interakcije sa antigenom sa njegovim specifičnim antigenom može rezultovati takođe u prostom vezivanju pomenutog mesta za antigen. Dodatno, specifična interakcija vezujućeg đomena/mesta interakcije sa antigenom sa njegovim specifičnim antigenom može alternativno rezultovati u inicijaciji signala, npr, usled indukcije promene konformacije antigena, oligomerizacije antigena, itd. Poželjan primer vezujućeg domena u skladu sa ovim pronalaskom je antitelo. Vezujući domen može biti monoklonsko ili poliklonsko antitelo ili izveden iz monoklonskog ili poiiklonskog antitela. Termin "antiteio" sadrži derivate ili njegove funkcionalne fragmente koji i dalje zadržavaju specifičnost vezivanja. Tehnike za proizvodnju antitela su dobro poznate u tehnici i opisane, npr. u Harlovv i Lane "Antibodies, Laboratorv Manual", Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1988 i llarlovv i Lane "Using Antibodies: Laboratorv Manual" Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1999. Termin "antitelo" takode obuhvata imunogiobuline (Ig) različitih klasa (tj. IgA, 3gG, IgM, IgD i IgE) i potklasa (kao što su IgGI, IgG2 itd.). Definicija termina "antitelo" takođe uključuje primere izvođenja kao što su himerna. jednolančana i humanizovana antitela, kao i fragmenti antitela, kao Što su, između ostalih, Fab fragmenti. Fragmenti ili derivati antitela dalje sadrže F(ab<*>)2, Fv, scFv fragmente ili antitla sa jednim domenom, antitela sa jednim varijabilinim domenom ili jedan varijabilni region imunoglobulina koji sadrži samo jedan varijabilni domen. koji može biti VII ili VL. koji se specifično vezuje za antigen ili epitop nezavisno za V regione iii domame; videti, na primer, Harlovv i Lane (1988) i (1999), loc. cit. Takvi imunoglobulini sa jednim varijabilnim regionom obuhvataju ne samo jedan varijabilni polipeptidni domen i/olovan iz antitela, već takođe i veće polipeptide koji sadrže jedan ili više monomera polipeptidne sekvence jednog varijabilnog domena antitela. ;[0034]Poznate su različite procedure u tehnici i mogu se koristiti za proizvodnju takvih antitela i/ili fragmenata. Stoga, derivati (antitela) mogu se takođe proizvesti peptidomimelicima. Dalje, tehnike opisane za proizvodnju jednolančanih antitela (videti, između ostalog, US Patent 4,946,778) mogu sc prilagoditi da se proizvedu jednolančana antitela specifična za izabrani polipeptid(e). Takođe, mogu se koristiti transgene životinje da bi sc eksprimirala humanizovana ili humana antitela specifična za polipeptide i fuzione proteine pronalaska. Za pripremu monoklonskih antitela može se koristiti bilo koja tehnika, koja obezbeđuje antitela proizvedena od kontinuiranih linija ćelijskih kultura. Primcri takvih tehnika uključuju tehniku hibridoma (Kohler i Milstein "Nature 256 (1975), 495-497), trioma tehniku, tehniku humanog B-ćelijskog hibridoma (Kozbor, Immunologv Today 4 (1983), 72) i tehniku EBV-hibridoma da bi se proizvela humana monoklonska antitela (Cole et al., Monoclonal Antibodies i Cancer Therapv, Alan R. Liss, Inc. ;(1985), 77-96). Može se koristiti površinska plazmon rezonanca kao što je iskorišćena u BIAcore sistemu da bi se povećala efikasnost antitela na fage koje se vezuje za epitop ciljnog polipeptida, kao što je CD3 epsilon ili PSMA (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Maimborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). U kontekstu ovog pronalaska takođe je predviđeno da termin "antitelo" sadrži konstrukte antitela, koji mogu biti eksprimirani u domaćinu kao što je ovde dalje opisano, npr. konstrukti antitela koji mogu biti transficirani i/ili preneti preko, između ostalog, virusa ili plazmidnih vektora. ;[0035]Termin "specifična interakcija" kao Što je korišćena u skladu sa ovim pronalaskom označava da vezujući domen ne reaguje unakrsno iii ne reaguje značajno unakrsno sa polipeptidima koji imaju sličnu strukturu kao oni koje vezuje vezujući domen. i koji mogu biti eksprimirani od strane istih ćelija kao i polipeptid od interesa. Unakrsna reaktivnost panela vezujućih domena koji se ispituju može se testirali, na primer, procenom vezivanja pomenutog panela vezujućih domena pod konvencionalnim uslovima (vidrti, npr., HarIow i Lane, Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 i Using Antibodies: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Primeri specifične intereakcije vezujućeg domena sa specifičnim domenom sadrže specifičnost Uganda za njegov receptor. Pomenuta definicija naročito sadrži interakciju liganada, koji indukuju signal kada se vežu za njihov specifični receptor. Primeri pomenule interakcije, kojaje takode sadržana pomenutom definicijom, je interakcija antigene determinante (epitopa) sa vezujućim domenom (vezujuće mesto antigena) antitela. ;[0036] Termin "specifičnost za različite vrste" ili "interspecijska specifičnost" kao što je ovde korišćeno označava vezivanje vezujućeg domena koji je ovde opisan sa istim ciljnim molekulom kod ljudi i primata osim šimpanze. Stoga, "specifičnost za različite vrste" ili "interspecijska specifičnost" treba shvatiti kao interspecijsku reaklivnost na isti molekui "X" eksprimiran kod različitih vrsta, ali ne na molekul različit od "X". Interspecijska specifičnost monoklonskog antitela koje prepoznaje npr. humani CD3 epsilon, za CD3 epsilon primata osim šimpanze, npr. CD3 epsilon makakija, može se odrediti, na primer, FACS analizom. FACS analiza je izvedena na takav način da je respektivno monoklonsko antitelo testirano u odnosu na vezivanje humane i ćelije primata osim šimpanze, npr. ćelije makakija, koji eksprimiraju pomenute CD3 epsilon antigene ljudi i primata osim šimpanze, respektivno. Odgovarajuća analiza je prikazana u sledećim primerima. Prethodno pomenuti predmet primenjuje se mutatis mutandis za PSMA antigen: Interspecijska specifičnost monoklonskog antitela koje prepoznaje npr. humani PSMA, za PSMA primata osim šimpanze, npr. PSMA makakija, može sc odrediti, na primer, FACS analizom. FACS analiza je izvedena na takav način da je respektivno monoklonsko antitelo testirano u odnosu na vezivanje humane i ćelije primata osim šimpanze, npr. ćelije makakija, koji eksprimiraju pomenute PSMA antigene ljudi i primata osim šimpanze, respektivno. ;[0037] Kao što je ovde korišćeno, CD3 epsilon označava molekul eksprimiran kao deo T ćelijskog receptora i ima značenje kao što mu je tipično dodeljeno u prethodnoj tehnici. Kod čoveka, on obuhvata u pojedinačnom ili nezavisno kombinovanom obliku sve poznate CD3 podjedinice, na primer CD3 epsilon, CD3 delta, CD3 gama, CD3 zeta. CD3 alfa i CD3 beta. Ne-humani CD3 antigeni primata osim šimpanzi kao što se ovde pominju su, na primer,Macaca fascicularisCD3 iMacaca mulattaCD3. KodMacaca fascicularis,on obuhvata CD3 epsilon FN-18 negativni i CD3 epsilon FN-18 pozitivni, CD3 gama i CD3 delta. KodMacaca mulatta,on obuhvata CD3 epsilon, CD3 gama i CD3 delta. Poželjno, pomenuti CD3 kao stoje ovde korišćeno je CD3 epsilon. Humani CD3 epsilon je označen u GenBank Accession No.NM_000733 i obuhvata SEQ ID NO. ;1. Humani CD3 gama je označen u GenBank Accession NO. NM 000073. Humani CD3 delta je označen u GenBank Accession No. NM_000732, CD3 epsilon "FN-18 negativan"Macaca fascicularis(tj. CD3 epsilon koji ne prepoznaje monoklonsko antitelo FN-18 usled polimorfizma kao što je prethodno dato) je označen u GenBank Accession No. AB073994. CD3 epsilon "FN-18 pozitivni"Macaca fascicularis(tj. CD3 epsilon prepoznat sa monoklonskim antitelom FN-18) označeno je u GenBank Accession No. AB073993. CD3 gamaMacaca fascicularisje označen u GenBank Accession No. AB073992. CD3 deltaMacaca fascicularis jeoznačen u GenBank Accession No. AB073991. Sekvence nukleinskih i aminokiselina respektivnih CD3 epsilon, gama i delta homoiogaMacaca mulattamogu se identifikovati i izolovati rekombinantnim tehnikama opisanim u tehnici (Sambrook et al. Molecular Cloning: Laboratorv Manual; Cold Spring Harbor Laboratorv Press. 3rd edition 2001). Ovo sc odnosi mutatis mutandis na CD3 epsilon, gama i delta homologe drugih primata osim šimpanzi kao što je ovde đefinisano. Identifikacija aminokiselinske sekvence Callithrix jacchus, Saimiri sciureus i Saguinus oedipus opisana je u priključenim primerima. Aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena CD3 epsilonCallithrix jacchusprikazana je u SEQ ID NO: 3, ona odSaguinus oedipusprikazana je u SLQ ID NO: 5 i ona odSaimiri sciureus jeprikazana u SEQ ID NO: 7. ;[0038] Humani PSMA je označen u GenBank Accession No. "AY101595'. Kloniranje PSMA homoioga makakija je pokazana u sledećim primerima, odgovarajuće cDNK i aminokiselinske sekvence su prikazane u SEQ ID NOs. 385 i 386, respektivno. U skladu sa prethodno navedenim, termin "epitop" definiše antigenu determinantu, koja je specifično vezana/identifikovana sa vezujućim domenom kao što je ovde đefinisano. Vezujući domen može specifično da se vezuje/interaguje sa konformacionim ili kontinuiranim epitopima, koji su jedinstveni za ciijnu strukturu, npr. CD3 epsilon lanac čoveka ili primata osim Šimpanze ili PSMA Čoveka ili šimpanze. Konformacioni ili diskontinuirani epitop jc karakterisan za polipeptidne antigene prisustvom dva ili više odvojena aminokiselinska ostatka koji su odvojeni u primarnoj sekvenci, ali su zajedno na površini molekula kada se polipeptid savije u nativni protein/antigen (Sela. (1969) Science 166, 1365 i Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Dva ili više odvojenih aminokiselinskih ostataka koji doprinose epitopu prisutni su na zasebnim delovima jednog ili više polipeptidnog lanca(lanaca). Ovi ostaci se pojavljuju zajedno na površini molekula kada se polipeptidni lanac(Ianci) savije(saviju) u trodimenzionalnu strukturu da bi sačinili epitop. Nasuprot tome, kontinuirani ili linearni epitop se sastoji od dva ili više odvojenih aminokiselinskih ostataka, koji su prisutni u jednom linearnom segmentu polipeptidnog lanca. Unutar ovog pronalaska, "kontekstno zavisni" CD3 epitop odnosi se na konformaciju pomenutog epitopa. Takav kontekstno zavisni epitop. smešten na epsilon lancu CD3, može razviti svoju korektnu konformaciju samo ukoliko je utsnut unutar ostatka epsilon lanca i držan u ispravnom položaju preko heterodimerizacije epsilon lanca ili sa CD3 gama ili delta lancem. Nasuprot tome. kontekstno nezavisni CD3 epitop kao što jc ovde obezbeđen odnosi se na N-terminalni 1-27 aminokiselinski ostatak polipeptida ili njegov funkcionalni fragment CD3 epsilon. Ovaj N-terminalni 1-27 aminokiselinski ostatak polipeptida ili njegov funkcionalni fragment zadržava svoj trodimenzionalni strukturni integritet i korektnu konformaciju kada je izvađen iz njegove nativne sredine u CD3 kompleksu. Kontekstno nezavisni N-lerminalni 1-27 aminokiselinski ostatak polipeptida ili njegov funkcionalni fragment, koji je deo ekstracelularnog domena CD3 epsilon, predstavlja, stoga, epitop koji je potpuno različit od epitopa CD3 epsilon opisanih u vezi sa postupkom za pripremu humanih vezujućih molekula u WO 2004/106380. Pomenuti korišćeni postupak koristi jedino eksprimirani rekombinanti CD3 epsilon. Konformacija ovog samog eksprimiranog rekombinantnog CD3 epsilon razlikuje se od onog prilagođenog za njegov prirodni oblik, odnosno, oblik u kom CD3 epsilon podjedinica TCR/CD3 kompleksa postoji kao deo nekovaientnog kompleksa ili sa CD3 delta ili CD3-gama podjedinicom TCR/CD3 kompleksa. Kada se takav jedino eksprimirani rekombinantni CD3 epsilon protein koristi kao antigen za selekciju antitela iz biblioteke antitela, antitela specifična za ovaj antigen su identiftkovana iz biblioteke iako takva biblioteka ne sadrži antitela sa specifičnošću za sopstvene antigene/autoantigene. Ovo je usled činjenice da jedino eksprimirani rekombinantni CD3 epsilon protein ne postoji in vivo; to nije autoanligen. Posledično, subpopulacije B ćelija koje eksprimiraju antitela specifična za ovaj protein nisu depletirane in vivo; biblioteka antitela konslruisana od takvih B ćelija sadržala bi genetički materijal za antitela specifična za jedino eksprimirani rekombinantni CD3 epsilon protein. ;[0039] Međutim, kako je konteksno nezavisni N-terminalni 1-27 aminokiselinski ostatak polipeptida ili njegov funkcionalni fragment epitop, koji se savija u svom nativnom obliku, vezujući domeni u skladu sa ovim pronalaskom ne mogu se identifikovati postupcima na osnovu pristupa opisanih u WO 2004/106380. Stoga, može sc proveriti testovima da vezujući molekuli kao što su opisani u WO 2004/106380 nisu sposobni da se vezuju za N-terminalni 1-27 aminokiselinski ostatak CD3 epsilon lanca. Stoga, konvencionalni anti-CD3 vezujući molekuli ili molekuli anti-CD3 antitela (npr. kao što su opisani u WO 99/54440) vezuju CD3 epsilon lanac na poziciji koja je postavljena više C-terminalno od kontekstno nezavisnog N-tcrminalnog 1-27 aminokiselinskog ostatka polipeptida ili funkcionalnog fragmenta obezbeđenog ovde. Molekuli antitela OKT3 i UCHT-I iz prethodne tehnike takođe imaju specifičnost za epsiion podjedinicu TCR/CD3 kompleksa između aminokiselinskih ostataka 35 do 85 i. shodno tome, epitop ovih antitela je takode više C-terminalno postavljen. Dodatno, UCHT-1 se vezuje za CD3 epsilon lanac u regionu između aminokiselinskih ostataka 43 do 77 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989). 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52). Stoga. anti-CD3 molekuli iz prethodne tehnike ne vezuju se za i nisu usmereni protiv ovde definisanog kontekstno nezavisnog epitopa od N-terminalnog 1-27 aminokiselinskog ostatka (ili njegovog funkcionalnog fragmenta). Naročito, stanje tehnike ne obezbeđuje anti-CD3 molekule koji specifično vezuju kontekstno nezavisni epitop od N-terminalnog 1-27 aminokiselinskog ostatka i koji su interspecijski specifični, tj. vezuju se za CD3 epsilon čoveka i primata osim šimpanze. ;[0040]Za stvaranje, poželjno humanog, vezujućeg domena sadržanog u molekulu bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, mogu se koristiti npr. monoklonska antitela koja se vezuju i za humani i za CD3 epsilon primata osim šimpanze (npr. makaki CD3 epsilon) ili monoklonska antiteia koja se vezuju i za humani i za PSMA primata osim šimpanze. ;[0041]Kao što je ovde korišćeno, "humani" i "čovek" odnosi se na vrstuHomo sapiens.Sto se tiče medicinske upotrebe ovde opisanih konstrukata, humane pacijente treba tretirati sa istim molekulom. ;[0042]Poželjno je da najmanje jedan od pomenutih prvih ili drugih vezujućih domena bispecifičnog jednolančanog antiela pronalaska jc CDR-graftovan, humanizovan ili humani. Poželjno, i prvi i drugi vezujući domen bispecifičnog jednolančanog antiela pronalaska su CDR-graftovani, humanizovani ili humani. Podrazumeva se da termin "humano" antitelo kao što se ovde koristi znači da bispecifično jednoiančano antitelo kao Što je ovde đefinisano, sadrži (jednu) aminokiselinsku sekvencu(sekvence) sadržane u repertoaru antitela humane klicine linije. U svrhu definicije ovde, pomenuto bispecifično jednoiančano antitelo može se stoga smatrati humanim ukoliko se sastoji od takve (a) aminokiselinske sekvence(sekvenci) humane klicine linije, tj. ukoliko je aminokiselinska sekvenca(sekvence) bispecifičnog jednolančanog antitela koje je u pitanju identična sa eksprimiranom aminokiselinskom sekvencom(sekvencama) humane klicine linije. Bispecifično jednoiančano antitelo kao što je ovde đefinisano može se takođe smatrali humanim ukoliko sc sastoji od (a) sekvence(sekvenci) koja odstupa(odstupaju) od njenog(njihovih) najbliže sekvence{sekvenci) humane klicine linije ne više nego šio bi bilo očekivano usled ugrađivanja somalske hipermutacije. Dodatno, antitela mnogih ne-humanih si sara, na primer glodara kao Što su miševi i pacovi, sadrže VII CDR3 aminokiselinske sekvence za koje se takođe očekuje da postoje u repertoaru eksprimiranih humanih antitela. Bilo koja takva sekvenca(sekvence) humanog ili ne-humanog porekla za koje se može očekivati da postoje u eksprimiranom humanom repertoaru takođe bi se smatrale "humanim" u smislu ovog pronalaska. |0043] Kao što je ovde korišćeno, termin "humanizovano", "humanizacija", "slično humanom" ili njihove gramatički srodne varijante koriŠćene su naizmenično da bi se označilo bispecifično jednoiančano antitelo koje sadrži u najmanje jednom od svojih vezujućih domena najmanje jedan region koji određuje komplementarnost ("CDR") iz ne-humanog antitela ili njegovog fragmenta. Pristupi humanizacije su opisani na primeru WO 91/09968 i US 6,407,213. Kao neograničavajući primer, termin obuhvata slučaj u kom varijabilni region najmanje jednog vezujućeg domena sadrži jedan CDR region, na primer treći CDR region VH (CDRH3), iz druge ne-humane životinje, na primer glodara, kao i slučaj u kome jedan ili svaki od oba varijabilna regiona na svojim respektivnim prvim, drugim i trećim CDRs, sadrže CDRs iz pomenute ne-humane životinje. U slučaju kada su svi CDRs vezujućeg domena bispecifičnog jednolančanog antitela zamenjeni sa njihovim ekvivalentima iz, na primer, glodara, govori se o "CDR-graftingu", i podrazumeva se da je ovaj termin obuhvaćen terminom "humanizovano" ili njihovim gramatički srodnim varijantama kao što je ovde korišćeno. Termin "humanizovano" ili njegove gramatički srodne varijante takođe obuhvataju slučajeve koji, kao dodatak zameni jednog ili više CDR regiona unutar VH i/ili VL prvog i/ili drugog vezujućeg domena sa doadatnom mutacijom/mutacijama (npr. supstitucije) najmanje jednog aminokiselinskog ostatka/ostataka unutar okvirnih ("FR") regiona između CDRs. je/su pogođeni tako što aminokiseline na tom/tim položajima odgovara/odgovaraju atninokiselini/aminokiselinama na toj/tim položaju/položajima kod životinje iz koje su izvedeni CDR regioni korišćeni za zamenu. Kao što je poznato u tehnici, takve pojedinačne mutacije su često napravljene u okvirnim regionima nakon CDR-graftinga da bi se povratio originalni afinitet vezivanja ne-humanog antitela korišćenog kao CDR-donor za njegov ciljni moiekul. Termin "humanizovano" može dalje obuhvatati (jednu) aminokiselinsku suspstituciju (supstitucije) u CDR regionima iz ne-humane životinje u aminokiselinu(aminokiseline) odgovarajućeg CDR regiona iz humanog antitela, kao dodatak aminokiselinskim supstitucijama u okvirnim regionima kao što je prethodno opisano. ;[0044] Kao što je ovde korišćeno, termin "homolog" ili "homologija" podrazumeva kao Što sledi: Homologija između proteina i DNK se često izvodi na osnovu sličnosti sekvence. naročito u bioinformatici. Na primer. generalno, ukoliko dva ili više gena imaju veoma slične sekvence DNK. verovatno su homologi. Ali sličnost sekvence može biti porcklom od različitih predaka: kratke sekvence mogu biti slične po principu slučajnosti, i sekvence mogu biti slične jer su obe izabrane da vezuju određeni protein, kao što je transkripcioni faktor. Takve sekvencu su slične aii nisu homologe. Regioni sekvence koji su homologi takođe se nazivaju konzervativni. Ovo ne treba pomešati sa konzervativnošću aminokiselinskih sekvenci kod kojih je aminokiselina na specifičnom položaju promenjena ali su fizičko-hemijske karakteristike aminokiseline nepromenjene. Postoje dva tipa homologih sekvenci: ortologne i paralogne. Homologe sekvence su ortologne ukoliko su razdvojene specijacionim događajem: kada vrsta divergira u dve posebne vrste, divergentne kopije pojedinačnog gena nazivaju se ortolognim. Ortologi, ili ortoiogni geni, su geni kod različitih vrsta koji su međusobno slični jer su nastali od zajedničkog pretka. Najjači dokaz da su dva slična gena ortologna je rezultat filogenetske analize genske linije. Geni koji sc nalaze unutar jedne klade su ortoiogni, poreklom od zajedničkog pretka. Ortologi često, ali ne uvek, imaju istu funkciju. Ortologne sekvence obezbeđuju korisne informacije u studijama taksonomske klasifikacije organizama. Obrazac genetičke divergencije se može koristiti da bi se utvrdila srodnost organizama. Dva organizma koja su veoma srodna verovatno imaju veoma slične sekvence DNK između dva ortologa. Nasuprot tome, organizam koji je cvoiutivno dalje od drugog organizma verovatno ima veću divergenciju u sekvenci ortologa koji se proučavaju. Homologe sekvence su paralogne ukoliko su razdvojene događajem duplikacije gena: ukoliko je gen u organizmu dupliran tako da zauzima dva različita položaja u istom genomu, onda su dve kopije paralogne. Set sekvenci koje su paralogne nazivaju se međusobni paralogi. Paraiogi tipično imaju istu ili sličnu funkciju, ali nekada i ne: usled nedostatka originalnog selekcionog pritiska na jednu kopiju dupliranog gena, ova kopija može slobodno mutirati i dobijati nove funkcije. Primer se može pronaći kod glodara kao što su pacovi i miševi. Glodari imaju par paralognih gena za insulin, iako je nejasno da li sc odigrala bilo kakva divergencija u funkciji. Paralogni geni Često pripadaju istoj vrsti, ali ovo nije obavezno: na primer, gen za hemoglobin kod ljudi i gen za mioglobin šimpanze su paralogi. Ovo je čest problem u bioinformatici: kada se sekvenciraju genomi različitih vrsta i nađu homologi geni, nc može se neposredno zaključiti da ovi geni imaju sličnu ili istu funkciju, jer mogu biti paralogi čija je funkcija divergirala. ;[0045] Kao što je ovde korišćeno, "primat osim šimpanze" ili "primat koji nije šimpanza" ili njihove gramatičke varijante odnose sc na bilo koju životinju primata (tj. ne čoveka) osim šimpanze, tj. različitu od životinje koja pripada roduPan,i uključujući vrstePari paniscusiPan troglodytes,takođe poznat kaoAnlhropopilhecns troglodytesiliSimia satyrus.Podrazumeva se, međutim, daje moguće da se antitela pronalaska mogu takode vezivati sa svojim prvim i/ili drugim vezujućim domenom za respektivne epitope/fragmente itd. pomenutih šimpanzi. Namera je da se samo izbegnu testovi na životinjama koji se izvode sa šimpanzama, ukoliko se želi. Stoga je takođe predviđeno da se u sledećem primeru izvođenja antitela ovog pronalaska takođe vezuju sa svojim prvim i/ili drugim vezujućim domenom za respektivne epitope šimpanzi. "Primat", "vrsta primata", "primati" ili njihove gramatičke varijante označavaju red sisara euterija podcljcn u dva podreda prosimija i antropoida i koji sadrže čovekolike majmune, majmune i lemure. Specifično, "primati" kao Što je ovde korišćeno obuhvataju podredStrepsirrhini(ne-tarzijus prosimije), uključujući infraredLemuriformes(koji uključuje superfamilijeCheirogaleoideaiLemuroidea).infraredChiromyiformes(koji uključuje familijuDaubentoniidae)i infraredLohsiformes(koji uključuje familijeLorisidaeiGalagidae)."Primati" kao što je ovde korišćeno takođe obuhvata podredHaplarrhini,koji uključuje infraredTarsiiformes(koji uključuje familijuTarsiidae),infraredSimiiformes(koji uključujePlaiyrrhini,ili majmune Novog Sveta, iCatarrhhii.koji uključujeCercopithecidea,ili majmune Starog Sveta). ;[0046] Vrste primata osim šimpanze u smislu ovog pronalaska mogu biti lemur, tarzijer, gibon, marmozet (koj ipripda majmunima Novog Sveta iz familijeCebidae)ili majmun Starog Sveta (koji pripada superfamilijiCercopilhecoidea).;[0047] Kao što je ovde korišćeno, "majmun Starog Sveta" obuhvata majmune koji spadaju u superfamiiijuCercopithecoidea,koja je podeljena na familije:Cercopithecinae,koji su uglavnom afrički ali uključuju raznovrsni rod makaka koji su azijski i severno afrički; iColohirtae,koji uključuju većinu azijskih rodova ali takođe i kolobus majmune. Specifično, unutar potfamilijcCercopithecinae,poželjni primat osim šimpanze može biti iz tribusaCercopithecini,unutar rodaAllenopithecus(Allen-ov močvarni majmun,Allenopithecus nigroviridis) ;unutar rodaMiopithecus(Angolski talapoin,Miopithecus talapoin;Gabonski talapoin,Miopithecus ogouensis) ;unutar rodaEiythrocebus(Palas majmun,Eijthrocebus paias) ;unutar rodaChlorocebus(zeleni zamorac,Chlorocebus sabaceus;grivet,Chlorocebus aethiops;džam džam,Chlorocebus djamdjamensis;tantal us,Chlorocebus ( antalus:vervel,Chlorocebus pygerythrus;Malbrouck,Chlorocebus cynosuros) ;ili unutar rodaCercopithecus(Drijas iii salongo zamorac,Cercopithecus chyas;Diana zamorac,Cercopilhecus dlana;Rolovvav zamorac,Cercopithecus roknvav;veliki ravnonosni zamorac,Cercopilhecus nictilans;plavi zamorac.Cercopilhecus miliš;srebrni zamorac,Cercopithecus doggeiti;zlatni zamorac.Cercopithecus kandti:Sykes-ov zamorac,Cercopilhecus albogularis;Mona zamorac.Cercopithecus mana;Campbell-ov zamorac,Cercopithecus campbelli;Lovve-ov zamorac,Cercopithecus hnvei:krestasti mona Monkey,Cercopithecus pogonias;Wolfov mona zamorac,Cercopithecus wolfi;Dent-ov mona zamorac,Cercopithecus denti;mali ravnonosni zamorac,Cercopithecus petaurista;belogrli zamorac,Cercopithecus eiythrogaster;Sclater-ov zamorac,Cercopithecus selateri;crvenouhi zamorac,Cercopithecus erythrotis;brkati zamorac,Cercopithecus cephus;crvenorepi zamorac,Cercopithecus ascanius;L'Hoest-ov zamorac,Cercopithecus Ihoesti;Preuss-ov zamorac,Cercopithecus preussi;suneorepi zamorac,Cercopithecus solatus;Hamlyn-ov zamorac,Cercopithecus hamlyni;Dc Brazza zamorac,Cercopilhecus negleetus).Altermativno, poželjni primat osim šimpanze, takođe unutar potporodiceCercopithecinaeali unutar tribusaPapionini,može biti iz rodaMacaca(berberski makaki,Macaca sy! vanus;lavorepi makaki,Macaca silemis;južni svinjorepi makaki ili beruk,Macaca nemestrina:severni svinjorepi makaki.Macaca leonina;Pagai ostrvski makaki ili bokoi,Macaca pagensis;siberut makaki,Macaca siberu;mavarski makaki,Macaca maura;čizmasti makaki,Macaca oehreata;tonkeanski makaki,Macaca tonkeana;Heck-ov makaki,Macaca hecki;Gorontalo makaki,Macaca nigriscens;Celebeski krestasti makaki ili cni majmun,Macaca nigra;makaki rakojed ili dugorepi makaki ili kera,Macaca fascicularis;patrljkorepi makaki ili medvedolikimakaki, Macaca aretoides;rezus makaki,Macaca mulatta;Formozski kamenski makaki,Macaca cyclopis;Japanski makaki,Macaca fuscata;toko,Macaca sinica:Bonnet-ov makaki,Macaca radiata;berberski makaki,Macaca syIvanmus;asamski makaki,Macaca assamensis;tibetanski makaki ili Milne-Edvvards-ov makaki,Macaca thibefana;arunača makaki ili munzala,Macaca munzala) ;unutar rodaLophocebus(siviobrazni mangabi,Lophocebus albigena; Lophocebus albigena albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni:crnoobrazni mangabi,Lophocebus aterrimus;Opdenbosch-ov mangabi,Lophocebus opdenhoschi;kipunji,Lophocebus kipunji) ;unutar rodaPapio(Hamedrijas,Papio hamadijas;Gvinejski pavijan,Papio papio;Maskinasti pavijan,Papio anubis;žuti pavijan,Papio cynocephalus;medveđi pavijan,Papio ursimts) ;unutar rodaTheropithecus(Gelada pavijan,Theropithecus gelada) ;unutar rodaCercocebus(garavi mangabcj,Cercocebus atys\Cercocebus atys atys; Cercocebus alys hmulalus:Collared Mangabey,Cercocebus torguatus;Agila mangabej,Cercocebus agilis;zlatnotrbi mangabej,Cercocebus chrysogaster;mangabej sa reke Tana,Cercocebus galerilus;Sanje magabej,Cercocebus sanjei) ;ili unutar rodaMandrillus(mandril,Mandrillus sphinx;dril.Mandril/ us leucophaeus).Najpoželjniji jeMacaca fascicularis(takođe poznat kao mamaki rakojed i, stoga u Primerima nazvan "makaki rakojed") iMacaca mulatta(rezus makaki, nazvan "rezus"). Unutar potfamilijeColobinae,poželjni primat osim šimpanze može biti iz afričke grupe, unutar rodaColobus(crni kolobus,Colobus satanas:Angolski kolobus.Colobvs angolensis;kraljevski kolobus,Colobus polykomos;međveđi kolobus,Colobus vellerosus;severno crno-beli gvereza,Colobus guereza) ;unutar rodaPiliocolobus(zapadni crveni kolobus,Piliocolobus badius;;Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae;;Pennant-ov kolobus,Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri;Preuss-ov creveni kolobus,Piliocolobus preussi;Thollon-ov crveni kolobus,Piliocolobus tholloni;centralnoafrički crveni kolobus, ;Piliocolobus foai; Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai ellioti; Piliocolobus foai oustaleti;;Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum;Ugandski crveni kolobus,Piliocolobus tephrosceles:Uzyngwa crveni kolobus.Piliocolobus gordonorum;Zanzibarski crveni kolobus,Piliocolobus kirkii:kolobus sa reke Tana,Piliocolobus rufbmitratus) ;ili unutar rodaProcolobus(maskinasti kolobus,Procolobus verus).Unutar potfamilijeColobinae,požeijni primat osim šimpanze može alternativno biti iz Langur (lišćarski majmun) grupe, iz rodaSemnopithecus(Ncpalski sivi langur,Semnopiihecus sehistaceus;Kašmirski sivi langur,Semnopithecus ajax;Tarai sivi langur,Semnopithecus heetor.severni mzijski sivi langur,Semnopithecus entellus;crnonogi sivi langur,Semnopithecus hvpoleucos;južni nizijski sivi langur,Semnopithecus dussumieri;ćubasti sivilangur, Semnopithecus priam) ;uT. vetulusgrupi ili roduTrachypithecus(rumenoobrazni langur,Trachvpithecus vetulus;Nilgiri langur,Trachypithecusjohnii) ;uT. crisiatusgrupi rodaTrachvpithecus(Javanski lutung,Trachypilhecus auratus;srebrni lišćarski majmun ili srebrni lutung,Trachypithecus cristatus;indokineski lutung,Trachypithecus germaini;Tenasserim lutung,Trachypithecus barbe i) ; u T. obscurusgrupi rodaTrachvpithecus(sumračni lišćarski majmun,Trachypithecus obscurus;Phayre-ov lišćarski majmun,Trachypilhecus phayrei) ;uT. pilealusgrupi rodaTrachypithecus(kapasti langur,Trachypithecus pileatus;Shortridge-ov iangur,Trachypithecus shorlridgei;Gee-ov zlatni langur,Trachypithecus geei) ;uT. francoisigrupi rodaTrachypiihecus(Francois-ov langur,Trachypithecus francoisi;Hatinh langur.Trachvpithecus hatinhensis\beloglavi langur,Trachypilhecus poliocephalus;Laoski langur.Trachvpithecus laoiimr,Delacour-ov langur.Trachypithecus delacouri;indokineski crni langur.Trachvpithecus ebenus) ;ili iz rodaPresbytis(Sumatranski suri,Presbytis melalophos;trakasti suri I i,Presbvtis femoralis;Saravvak surili,Presbytis chrvsomelas;belobutni surili,Presbvtis siamensis;beloglavi surili,Presbytis frontata;Javanski surili,Presbvtis comaia;Thomas-ov langur,Presbvtis thomasi;Hose-ov langur.Preshyiis hosei;kestenjasti lišćarski majmun,Presbytis rubicunda;Mentavvai langur ili joja,Presbytispo/ enziani;surili sa Natuna ostrva.Presbvtis natunae).Unutar potfamilijeColobinae,poželjni primat osim šimpanze može biti alternativno iz grupe majmuna sa specifičnim noscvima, iz rodaPygathrix(crveni douk,Pygathrix nemaeus;crni douk,Pygathrix nigripes;sivi douk,Pygathrix cinerea) ;unutar rodaRhinopithecus(zlatni kratkonosi majmun,Rhinopithecus roxellana;crni kratkonosi majmun,Rhinopithecus bieti;sivi kratkonosi majmun,Rhinopithecus breliehi;Tonkin kratkonosi langur,Rhinopithecus avuncuhts) ;unutar rodaNašališ(surlasti majmun,Našališ laiyatus) ;ili iz rodaSimias(svinjorepi langur,Simias concolor).;[0048] Kao što je ovde korišćeno, termin "marmozel" označava bilo kog majmuna Novog Sveta iz rodaCallithrix,koji na primer pripada atlantskim marmozetima iz podrodaCalliihrix(sic!) ;(obični marmozet,Callithrix ( Callithrix) jacchus;crnouhi marmozet,Callithrix ( Calli( hrix) penicillata;Wied-ov marmozet,Callithrix ( Callithrix) kuhlii;bciogiavi marmozet,Callithrix ( Callifhrix) ge<q>ffroyi;gloglavi marmozet,Callithrix ( Callilhrix) flaviceps;belouhi marmozet,Callithrix ( Callithrix) aurita) ;koji pripada amazonskim marmozetima iz podrodaMico(akarijski marmozet,Callilhrix ( Mico) acariensis;Mani ćore marmozet,Callithrix ( Mico) manicorensis;srebrnasti marmozel,Callithrix ( Mico) argentala;beli marmozet.Callithrix ( Mico) leucippe;Emilia's Marmoset,C. allithrix ( Mico) emiliae;crnoglavi marmozel,Callithrix ( Mico) nigriceps;Marca marmozet,Callithrix ( Mico) marcai;crnorepi marmozet,Callithrix ( Mico) melanura;Santarem marmozet,Cal! ithrix ( Mico) humeralifera;Maues marmozet,Callithrix ( Mico) mauesi;zlalnobeli marmozet,Callithrix ( Mico) chiysoleuca;1 lershkovilz marmozet,Callithrix ( Mico) intermedia;Satere marmozet,Callithrix ( Mico) saterei) :Roosmalens patuljasti marmozet koji pripada podrodu Callibella( Callithrix ( Callibella) humilis) ;iii pigmej marmozetkoji pripada podrodu Cebuella{ Callithrix ( Cebuella) pygmaea).Drugi rodovi majmuna Novog Sveta obuhvataju tamarine rodaSaguinus(koji obuhvataS. oedipus- grupu,S.midasgrupu,S. nigricollis;grupu,5. mystaxgrupu.S. bicolorgrupu i S.inustusgrupu) i vcveričji majmuni rodaSamiri(npr. ;Saimiri sciureus, Saimiri oerstedii, Saimiri ustus. Saimiri boliviensis, Saimiri vanzolini).;[0049] U poželjnom primeru izvođenja molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, primat osim šimpanze je majmun Starog Sveta. U poželjnijem primeru izvođenja molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, majmun Starog Sveta je majmun iz Papio roda Macaca roda. Najpoželjnije, majmun roda Macaca jc asamski makaki( Macaca assamensis),berberski makaki{ Macaca sylvamis),Bonnet-ov makaki( Macaca radiata),čizmasti ili Sulavvesi-čizmasti makaki{ Macaca oehreata),Sulavvesi-krestasti makaki( Macaca uigra),Formozski kamenski makaki( Macaca cyc! opsis).Japanski snežni majmun ili Japanski majmun( Macaca fuscata),makaki rakojed ili dugorepi makaki ili Javanski makaki{ Macacafascicularis),lavorepi makaki( Macaca silenus),svinjiorepi makaki{ Macaca nemestrina).rezus makaki{ Macaca mulatta),Tibetanski makaki{ Macaca thibetana),Tonkeanski makaki{ Macaca tonkeana),Cejlonski makaki( Macaca sinica),medvedoliki majmun( Macaca aretoides),ili Moor-ov makaki( Macaca maurus).Najpoželjnije, majmun roda Papio jeHamadryas Baboon, Papio hamadryas;;Guinea Baboon, Papio papio; Olive Baboon, Papio amtbis; Yello\ v Baboon, Papio cynocephahts:;Chacma Baboon, Papio ursinus.;[0050] U alternativno poželjnom primeru izvođenja molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, primat osim šimpanze jc majmun Novog Sveta. U poželjnijem primeru izvođenja polipeptida, majmun Novog Sveta je majmun iz roda Ca!lithrix (marmozet), roda Saguinus ili roda Samiri. Najpoželjnije, majmun roda Callithrix jeCallithrix jacchus,majmun roda Saguinus jeSaguinus oedipusmajmun roda Samiri jeSaimiri sciureus.;[0051] Termin "antigen ćelijske površine" kao što je ovde koriŠćen označava molekul, koji je prikazan na površini ćelije. U većini slučajeva, ovaj moiekui će se nalaziti u ili na plazma membrani ćelija tako da najmanje jedan deo ovog molekula ostaje dostupan sa spoljne strane ćelije u tercijarnom obliku. NeograniČavajući primer molekula ćelijske površine, koji je smešten u plazma membrani je transmembranski protein koji sadrži, u svojoj tercijarnoj konformaciji, regione hidrofllnosti i hidrofobnosti. Ovde, najmanje jedan hidrofobni region omogućava molekulu ćelijske površine da bude utisnut, ili ubačen u hidrofobnu plazma membranu ćelije dok se hidrofilni regioni pružaju na bilo kojoj strani plazma membrane u citoplazmu i ekstracelularni prostor, respektivno. NeograniČavajući primeri molekula ćelijske površine koji su smešteni na plazma membrani su proteini koji su modifikovani na cisteinskom ostatku da bi nosili palmitoii grupu, proteini modifikovani na C-terminalnom cisteinskom ostatku da bi nosili farnezil grupu ili proteini koji su modifikovani na C-terminusu da bi nosili glikozil fosfatidil inozitol ("GPI") sidro. Ove grupe omogućavaju kovalentno vezivanje proteina za spoljnu površinu plazma membrane, gde ostaju dostupni za prepoznavanje od strane ekstracclularnih molekula kao što su antitela. Primcri antigena ćelijske površine su CD3 epsilon i PSMA. Kao što je ovde prethodno opisano, PSMA je antigen na površini ćelije koji je ciljno mesto za terapiju kancera, uključujući, ali ne ograničavajući se na solidne tumore, poželjno karcinome i kancer prostate. ;[0052] U svetlu ovoga, PSMA se takođe može okaraktertsati kao antigen tumora. Termin "antigen tumora" kao što je ovde korišćen podrazumeva one antigene koji su prikazani na ćelijama tumora. Ovi antigeni mogu biti prikazani na ćelijskoj površini sa ekstracelularnim delom, koji se Često kombinuje sa transmembranskim i citoplazmatičnim delom molekula. Ovi antigeni nekada mogu biti prikazani samo od strane tumorskih ćelija i nikada od strane normalnih. Antigeni tumora mogu biti isključivo eksprimirani na ćelijama tumora ili mogu predstavljati tumor specifičnu mutaciju u poređenju sa normalnim ćelijama. U ovom slučaju, nazivaju se tumor-specifični antigeni. Češći su antigeni koji su prikazani od strane ćelija tumora i normalnih ćelija, i oni sc nazivaju tumor-povezani antigeni. Ovi tumor-povezani antigeni mogu biti prekomerno eksprimirani u poređenju sa normalnim ćelijama ili su dostupni za vezivanje antitela u tumorskim ćelijama usled manje kompaktne strukture tkiva tumora u poređenju sa normalnim tkivom. Primer antigena tumora u skladu sa ovim pronalaskom je PSMA. [0053} Kao što je ovde prethodno opisano moiekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska specifično se vezuje prvim vezujućim domenom za epitop humanog i CD3c (epsilon) lanac Callithrix jacchus, Saguinus oedipus ili Saimiri sciureus, gde je pomenuti epitop deo aminokiselinske sekvence sadržane u grupi koja se sastoji od 27 aminokiselinskih ostataka kao što je prikazano na SEQ ID NOs. 2, 4, 6, i 8 i sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E). U skladu sa ovim pronalaskom poželjno je za inoiekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska daje pomenuti epitop deo aminokiselinske sekvence koja sadrži 26,25, 24,23, 22, 21, 20, 19. 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11. 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiselina. Kao što je ovde spomenuto, epitop sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E). U okviru ovog pronalaska, funkcionalni fragment N-terminalnih 1-27 aminokiselinskih ostataka znači da je pomenuti funkcionalni fragment još uvek kontekstno nezavisni epitop koji održava integritet njegove trodimenzionalne strukture kada je uzet iz njegove nativne sredine u CD3 kompleksu (i fuzionisan sa heterotognom aminokiselinskom skvencom kao stoje EpCAM ili Fc deo imunoglobulina, npr. kao stoje prikazano u Primeru 3.1). Održavanje trodimenzionalne strukture unutar 27 aminokiselina N-terminalnog polipeptida ili njegovog funkcionalnog fragmenta CD3 epsilon može se koristiti za stvaranje vezujućih domena koji se vezuju za N-terminalni CD3 epsilon polipeptidni fragmentin vilroi za nativni (CD3 epsilon podjedinicu) CD3 kompleksa na T ćelijamain vivosa istim afinitetom vezivanja. U okviru ovog pronalaska, funkcionalni fragment N-terminalnih 1-27 aminokiselinskih ostataka znaci da se ovde obezbeđeni CD3 vezujući domeni još uvek mogu vezati za takve funkcionalne fragmente na kontekstno nezavisan način. Stručnjaku su poznati postupci za mapiranje epitopa da bi se odredilo koji aminokiselinski ostaci epitopa su prepoznati sa takvim anti-CD3 vezujućim domenima (npr. alanin skeninig; videti priključene primere). ;[0054] U okviru ovog pronalaska je dalje poželjno da se drugi vezujući domen vezuje za humani PSMA antigen na ćelijskoj površini i/ili PSMA primata osim šimpanze. Naročito je poželjno, da se drugi vezujući domen vezuje za humani PSMA PSMA primata osim šimpanze, poželjno PSMA makakija. Podrazumeva se da se drugi vezujući domen vezuje za najmanje jedan PSMA primata koji nije šimpanza, međutim, on se takođe može vezivati za dva, tri ili više, PSMA homoioga primata osim šimpanze. Na primer, drugi vezujući domen se može vezivati za PSMA makaki rakojeda i PSMA rezus majmuna. ;[0055] Za stvaranje drugog vezujućeg domena molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, npr. bispecifična jednolančana antitela kao što je ovde đefinisano, mogu se koristiti monoklonska antitela koja se vezuju i za respektivni humani i/ili primatski osim šimpanze antigen ćelijske površine kao što je PSMA. Odgovarajući vezujući domeni za bispecifične polipeptide kao što je ovde đefinisano npr. mogu se izvesti iz interspecijski specifičnih monokionskih antitela rekombinantnim postupcima opisanim u tehnici. Monoklonsko antitelo koje se vezuje za antigen ćelijske površine i za homolog pomenutog antigena ćelijske površine kod primata osim šimpanze može se testirati sa FACS analizom kao što je dato prethodno. Stručnjacima je očigledno da se interspecijski specifična antitela mogu takođe stvoriti tehnikama hibridoma opisanim u literaturi (Milstein i Kohler, Nature 256 (1975), 495-7). Na primer, miševi mogu biti alternativno imunizovati sa humanim i primatskim osim šimpanze antigenom ćelijske površine, kao što je PSMA, Od ovih miševa, interspecijski specifične hibridoma ćelije koje stvaraju antitela su izolovane tehnologijom hibridoma i analizirani sa FACS kao što je prethodno dato. Stvaranje i analiza bispecifčnih polipeptida kao što su bispecifična jednolančana antitela koja pokazuju interspecijsku specifičnost kao stoje ovde opisano prikazano je u sledećim primerima. Prednosti bispecifičnih jednolančanih antitela koja pokazuju interspecijsku specifičnost uključuju ovde nabrojane stavke. ;[0056J Naročito je poželjno za molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska da prvi vezujući domen sadrži VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabran od: ;(a) CDR-L1 kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 27. CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 28 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 29; (b) CDR-L1 kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 117, CDR-L2 kao što jc prikazano u SEQ ID NO. 118 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ iD NO. 119; i (c) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 153, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 154 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 155. ;[0057] U tehnici se podrazumeva da varijabilni regioni. tj. varijabilni laki lanac ("L" ili "VL") i varijabilni teški lanac ("H" ili "VH") obezbeđuju vezujući domen antitela. Ovi varijabilni regioni obuhvataju regione koji određuju komplementarnost. U tehnici je dobro poznato da termin "region koji određuje komplementarnost" (CDR) diktira antigen specifičnost antitela. Termin "CDR-L" ili "L CDR" ili "LCDR" odnosi se na CDRs u VL, dok se termin "CDR-H" ili "H CDR" ili HCDR" odnosi na CDRs u VH. ;[0058] U alternativno poželjnom primeru izvođenja molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska prvi vezujući domen obuhvata VH region koji sadrži CDR-H 1, CDR-H2 i CDR-H3 izabran od: (a) CDR-H 1 kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 12, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 13 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 14; (b) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 30, CDR-II2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 31 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 32; (c) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 48, CDR-II2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 49 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 50; (d) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 66, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 67 i CDR-I I3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 68; (e) CDR-H i kao što je prikazano u SEQ ID NO. 84, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 85 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 86; (0 CDR-H 1 kao Stoje prikazano u SEQ IDNO. 102. CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ I DNO. 103 i CDR-H3 kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 104; (g) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 120, CDR-H2 kao što jc prikazano u SEQ ID NO. 121 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ iD NO. 122; (h) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 138, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 139 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 140; ;(i) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ IDNO. 156.CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 157 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 158; i ;0) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 174, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 175 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 176. ;Dodatno je poželjno da vezujući domen sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO. 35, 39, 125, 129, 161 ili 165. Alternativno je poželjno da prvi vezujući domen sadrži VII region izabran iz grupe koja se sastoji od VH region kao što je prikazano u SEQ IDNO. 15, 19,33,37,51,55,69, 73, 87,91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ili 181. ;[0059J Još poželjnije, molekul bispecifičnog jednolančanog antitela iz opisa okarakterisan je prvim vezujućim domenom, koji sadrži VL region i VH region izabran iz grupe koja se sastoji od: ;(a) VL regiona kao sto je prikazano u SEQ ID NO. 17 ili 21 i VH regiona kao što je prikazano u SEQ IDNO. 15 ili 19; (b) VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO. 35 ili 39 i VH regiona kao što je prikazano u SEQ IDNO. 33 ili 37; (c) VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO. 53 ili 57 i VH regiona kao što je prikazano u SEQ IDNO. 51 ili 55; (d) VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO. 71 ili 75 i VII regiona kao što je prikazano u SEQ IDNO. 69 ili 73; (e) VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO. 89 ili 93 i VH region kao što jc prikazano u SEQ IDNO. 87 ili 91; (f) VL region kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 107 iii 111 i VH region kao što je prikazano u SEQ IDNO. 105 ili 109; (g) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO. 125 ili 129 i VH region kao što je prikazano u SEQ IDNO. 123 ili 127; (h) VL regiona kao što je prikazano u SFQ ID NO. 143 ili 147 i VH regiona kao što je prikazano u SLQ iD NO. 141 ili 145; ;(i) VL regiona kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 161 ili 165 i VH regiona kao Što je prikazano uSEQ IDNO. 159 ili 163; i ;(j) VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO. 179 ili 183 i VH regiona kao što je prikazano u SEQ IDNO. 177 ili 181. ;Parovi VH-rcgiona i VL-regiona u prvom vezujućem domenu koji se vezuju za CD3 epsilon molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska su u obliku jednolančanog anititela (scFv). VH i VL region su raspoređeni u redosledu VH-VL ili VL-VH. Poželjno je da se VH-region nalazi N-terminalno u odnosu na linker sekvencu. VL-region se nalazi C-terminalno od linker sekvence. Drugim rečima, raspored domena u CD3 vezujućem domenu molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska je poželjno VH-VL, sa pomenutim CD3 vezujućim regionom smeštenim C-tcrminalno u odnosu na drugi (antigen ćelijske površine, kao što je PSMA) vezujući domen. Poželjno VH-VL sadrži ili je SEQ ID NO. 185. Poželjan primer izvođenja prethodno opisanog molekula bispecifičnog jednolančanog antiteia iz opisa okarakterisan je prvim vezujućim domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 23, 25,41,43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 1 13, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187. ;[0060] Pronalazak se dalje odnosi na prethodno opisano bispecifično jednoiančano antitelo, gde se drugi vezujući domen vezuje za PSMA antigen ćelijske površine. Prema poželjnom primeru izvođenja pronalaska prethodno okarakterisani molekul bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži grupu sledećih sekvenci kao što su CDR Hi, CDR H2, CDR H3, CDR LI, CDR L2 i CDR L3 u drugom vezujućem domenu izabranom iz grupe koja se sastoji od: a) CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 394 - 396 i CDR LI-3 od SEQ ID NO: 389-391; b) CDR H1 -3 od SEQ ID NO: 408 - 410 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 403-405; c) CDR H1 -3 od SEQ ID NO: 422 - 424 i CDR L1 -3 od SEQ ID NO: 417-419; d) CDR Hi -3 od SEQ ID NO: 436 - 438 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 43 1 -433; e) CDR Hl-3 od SEQ (DNO: 445 - 447 i CDR Li-3 od SEQ ID NO: 450-452; f) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 464 - 466 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 459-461; g) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 478 - 480 i CDR LI-3 od SEQ ID NO: 473-475; h) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 492 - 494 i CDR LI-3 od SEQ ID NO: 487-489; i) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 506 - 508 i CDR Ll-3 od SEQ IDNO: 501-503; j) CDR Hl-3 od SEQ iD NO: 520 - 522 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 515-517; k) CDR Hl-3 od SEQ ID NO; 534 - 536 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 529-531; 1) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 548 - 550 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 543-545; m) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 562 - 564 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 557-559; n) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 576 - 578 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 571-573; o) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 590 - 592 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 585-587; ;p) CDR H1 -3 od SEQ ID NO: 604 - 606 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 599-601; ;q) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 618 -620 i CDR LI-3 od SEQ ID NO: 613-615; ;r) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 632 - 634 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 627-629; s) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 646 - 648 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 641-643; t) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 660 - 662 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 655-657; ;u) CDR H1 -3 od SEQ ID NO: 674 - 676 i CDR L1 -3 od SEQ ID NO: 669-671; ;v) CDR H1 -3 od SEQ ID NO: 688 - 690 i CDR L1 -3 od SEQ IDNO: 683-685; ;vv) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 702 - 704 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 697-699; ;x) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 716 - 718 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 711-713; and y) CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 729- 731 i CDR Ll-3 od SEQ IDNO: 724-726. ;[0061] Sekvence odgovarajućih VL- i VH-regiona drugog vezujućeg domena molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska kao i od respektivnih scFvs prikazane su u popisu sekvenci. U molekulu bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska vezujući domeni su raspoređeni u redosiedu VL-VHVH-VL, VL-VH-VL-VH, VH-VL-VH-VL ili VH-VL-VL-VH, kao što jc prikazano u priključenim primerima. Poželjno, vezujući domeni su raspoređeni u redosiedu VH PSMA-VL PSMA-VH CD3-VL CD3 ili VL PSMA-VH PSMA-VH CD3-VL CD3. ;[0062] Naročito je poželjan primer izvođenja pronalaska koji se odnosi na prethodno okarakterisani molekul bispecifičnog jednolančanog antitela, gde moiekui bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži sekvence izabrane od: (a) aminokiselinske sekvence kao što jc prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 399, 413, 427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721, 734, 799, 817, 863, 849, 835, 785, 899, 935. 1017, 1031, 917, 1003, 953, 971 ili 989; (b) aminokisleinske sekvence kodirane nukleinskom kisleinom kao stoje prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 400, 414, 428, 442, 456, 470, 484. 498, 512. 526, 540, 554, 568, 582, 596, 610, 624, 638, 652, 666, 680, 694, 708, 736 735, 800, 818. 864. 850. 836, 786, 882. 900. 936, 1018, 1032, 918, 1004, 954, 972, 990, 804, 822, 868, 886, 904, 940, 922, 958 ili 976; (c) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90 % identična, poželjnije najmanje 95 % identična, najpoželjnije najmanje 96 % identična sa aminokiselinskom sekvencom (a) iii (b). ;[0063] Pronalazak se odnosi na molekul bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao stoje prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 399, 413,427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721, 734, 799, 817, 863, 849, 835, 785, 899, 935, 1017, 1031, 917, 1003, 953, 971 ili 989, kao i na aminokiselinske sekvence najmanje 90 %, poželjnije najmanje 95 % identične, najpoželjnije najmanje 96, 97, 98, ili 99 % identične sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NOs: 399, 413, 427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553. 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721, 734, 799, 817, 863, 849, 835, 785, 899, 935, 1017, 1031, 917. 1003, 953, 971 ili 989. Pronalazak se takođe odnosi na odrgovarajuće sekvence nukleinske kiseiine kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 400, 414, 428, 442, 456, 470, 484, 498. 512, 526, 540, 554, 568, 582, 596, 610, 624, 638, 652, 666. 680, 694. 708, 736 735, 800, 818, 864, 850, 836, 786, 882, 900, 936, 1018, 1032, 918, 1004, 954, 972, 990. 804. 822, 868, 886, 904, 940, 922, 958 ili 976. ;[0064]Podrazumeva se da je identičnost sekvence određena duž cele nukleotidne ili aminokiselinske sekvence. Za poravnanje sekvenci mogu se koristiti, na primer, programi Gap ili BestFit (Needleman i Wunsch J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453; Sinith i Waterman, Adv. Appi. Math 2 (1981), 482-489), koji se nalazi u GCG softverskom paketu (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, VVisconsin, USA 53711 (1991). Za stručnjaka je rutinski postupak da odrede ili identifikuju nukleotidnu ili aminokiselinsku sekvencu koja ima npr. 85% (90%. 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa nukleotidnom ili aminokiselinskom sekvencom bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska korišćenjem npr. jednog od prethodno pomenutih programa. Na primer, prema Crick-VVobble hipotezi, 5' baza na antikodonu nije prostorno zatvorena kao druge dve baze, i stoga može imati nestandardna bazna sparivanja. Drugim rečima: treći položaj u tripletu kodona može varirati tako da dva tripleta koji se razlikuju u ovom trećem položaju mogu kodirati isti aminokiselinski ostatak. Pomenuta hipoteza je dobro poznata stručnjacima (videti npr. http://en.wikipedia.org/vviki/Wobble_Hypothesis; Crick, J Mol Biol 19 ;(1966): 548-55). ;[0065] Poželjni rasporedi domena u konstruktima PSMAxCD3 biaspecifčnog jednolančanog antitela pronalska prikazani su u primerima koji slede. ;[0066] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, bispecifična jednolančana antitela su interspecijski specifična za CD3 epsilon i za humani PSMA antigen ćelijske površine i PSMA antigen ćelijske površine primata osim šimpanze, koji sc prepoznaje njihovim drugim vezujućim domenom. ;[0067] Ovaj pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prethodno opisani molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska. Mnogi pogodni vektori su poznati stručnjacima molekularnim biolozima, čiji izbor će zavisiti od željene funkcije i uključuje plazmide, kozmide, viruse, bakteriofage i druge vektore konvencionalno korišćenc u genetičkom inženjeringu. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima mogu se koristiti za konstrukciju različitih plazmida i vektora; videti, na primer, tehnike opisane u Sambrook et al. (loc cit.) i Ausubel, Current Protocols in Molecular Biologv, Green Publishing Associates i Wilcy Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativno, polinukleotidi i vektori pronalaska mogu se rekonstituisati u lipozomima za dopremanje do ciljnih ćelija. Kao što je dalje detaljnije diskutovano, vektor za kloniranje korišćen je za izolaciju pojedinačnih sekvenci DNK. Relevantne sekvence se mogu preneti u ekspresione vektore gde je neophodna ekspresija određenog polipeptida. Tipični vektori za kloniranje uključuju pBluescript SK. pGEM, pUC9, pBR322 i pGBT9. Tipični ekspresioni vektori uključuju pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT. ;[0068] Poželjno pomenuti vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja jc regulatorna sekvenca operativno vezana za pomenutu sekvencu nukleinske kiseline definisanu ovde. Termin "regulatorna sekvenca" odnosi se na DNK sekvence, koje su neophodne da se postigne ekspresija kodirajućih sekvenci za koje su vezane. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina. Kod prokariota, kontrolne sekvence generalno uključuju promotor, mesto vezivanja ribozoma, i terminatore. Kod eukariota kontrolne sekvence uključuju promotore, terminatore i, u nekim slučajevima, pojačivače, transaktivatore iii transkripcione faktore. Namera je da termin "kontrolna sekvenca" uključuje, minimalno, sve komponente čije je prisustvo neophodno za ekspresiju, i može takođe uključivati dodatne pogodne komponente. Termin "operativno vezan" odnosi se na susedni položaj gde su opisane komponente u vezi koja im omogućava da funkcionišu na njhov nameravani način. Kontrolna sekvenca "operativno povezana" sa kodirajućom sekvencom je vezana na takav način da je ekspresija kodirajuće sekvence postignuta pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama. U slučaju da je kontrolna sekvenca promotor, stručnjaku je očigledno da se poželjno koristi dvolančana nukleinska kiselina. Stoga, navedeni vektor je poželjno ekspresioni vektor. "Ekspresioni vektor" je konstrukt koji se može koristiti da se transformiše odabrani domaćin i obezbeđuje ekspresiju kodirajuće sekvence u odabranom domaćinu. Ekspresioni vektori mogu na primer biti vektori za kloniranje, binarni vektori ili integrativni vektori. Ekspresija obuhvata transkripciju molekula nukleinske kiseline poželjno u iRNK koja se može prevesti. ;[0069] Regulatorni elementi koji osiguravaju ekspresiju kod prokariotskih i/ili cukariotskih ćelija dobro su poznati stručnjacima. U slučaju eukariotskih ćelija oni normalno sadrže promotore koji osiguravaju početak transkripcije i izborno poii-A signali koji osiguravaju terminaciju transkripcije i stabilizaciju transkripta. Mogući regulatorni elementi koji omogućavaju ekspresiju kod prokariotskih ćelija domaćina sadrže, npr., PL,lac, trp ili tacpromotor uE. coli,i primeri regulatoru ih elemenata koji omogućavaju ekspresiju kod eukariotskih ćelija domaćina suAOXIiliGAL]promotor kod kvasca ili CMV-, SV40-, RSV-promotor (Rous sarkom virus), CMV-enhanser, SV40-enhanser ili globin intron kod sisara i drugih životinjskih ćelija. Pored elemenata koji su odgovorni za početak transkripcije takvi regulatorni elementi mogu takođe sadržati signale za terminaciju transkripcije, kao što je SV40-poli-A mesto ili tk-poli-A mesto, nishodno od polinukleotida. Dodatno, u zavisnosti od korišćenog ekspresionog sistema, lider sekvence sposobne da usmeravaju polipeptid do ćelijskog odeljka ili ga izlučuju u medijum mogu se dodati kodirajućoj sekvenci pomenute sekvence nukleinske kiseline i dobro su poznate u tehnici; videti takođe priključene Primere. Lider sekvenca(e) jc (su) sklopljena u odgovarajućoj fazi sa translacionim, inicijacionim i terminacionim sekvencama, i poželjno, lider sekvencom koja je sposobna da usmerava sekreciju translatiranog proteina, ili njegovog dela, u periplazmatični prostor ili ekstracelularni medijum. Izborno, helerologna sekvenca može kodirati fuzioni protein uključujući N-terminalni identifikacioni peptid koji donosi željene karakteristike, npr., stabilizaciju ili pojednostavljeno prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proizvoda; videti prethodno. U ovom kontekstu, pogodni ekspresioni vektori su poznati u tehnici kao što su Okayama-Berg cDNK ekspresioni vektor pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNl, pcDNA3 (In-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA ili pEF-neo (Mack et ai. PNAS (1995) 92, 7021-7025 i Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) ili pSPORTl (GIBCO BRL). Poželjno, sekvence za kontrolu ekspresije biće eukariotski promotor sistemi u vektorima sposobnim đa transformišu transficirane eukariotske ćelije domaćine, ali se mogu takode koristiti kontrolne sekvence za prokariotske domaćine. Kada je vektor inkorporisan u odgovarajućeg domaćina, domaćin se održava pod uslovima pogodnim za ekspresiju nukleolidnih sekvenci visokog nivoa, i ukoliko je poželjno, može uslediti sakupljanje i prečišćavanje molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska; videti, npr., priključene primere. ;[0070] Alternativni ekspresioni sistem koji se može koristiti da sc eksprimira protein koji interaguje sa ćelijskim ciklusom je insekatski sistem. U jednom takvom sistemu,Autographa californica jedarnipolihedrozis virus (AcNPV) korišćen jc kao vektor da eksprimira strane gene uSpodoptera frugiperdaćelijama ili uTrichoplusialarvi. Kodirajuća sekvenca pomenutog molekula nukleinske kiseline može se klonirati u ne-esencijalni region virusa, kao Što je polihedrin gen, i stavljen pod kontrolu polihedrin promotora. Uspešna insercija pomenute kodirajuće sekvence učiniće polihedrin gen neaktivnim i proizveŠće rekombinantni virus bez proteinskog omotača. Rekombinantni virusi su zatim korišćeni za infekcijuS. frugiperdaćelija iliTrichoplusialarve u kojimaje eksprimiran protein pronalaska (Smith, J. Virol. 46 (1983). 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227). Dodatni regulatorni elementi mogu uključivati transkripcione kao i translacione enhansere. Pogodno, prethodno opisani vektori pronalaska sadrže selektabilni i/ili marker koji se može oceniti. Selektabilni marker geni korisni za selekciju transformisanih ćelija i, npr., biljnog tkiva i biljaka dobro su poznati stručnjacima i sadrže, na primer, rezistenciju na antimetabolite kao osnovu za selekciju dhfr, koji daje rezistenciju na metotreksat (Reiss, Plant Phvsiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, koji daje rezistenciju na aminogiikozide neomicin, kaitamicin i paromicin (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) i hygro, koji daje rezistenciju na higromicin (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Dodatni selektabilni geni su opisani, odnosno trpB, koji omogućava ćelijama da koriste indol umesto triptofana: hisD, koji omogućava ćelijama da koriste histinol umesto histidina (Ilartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manoza-6-fosfat izomeraza koji omogućava ćelijama da koriste manozu (WO 94/20627) i ODC (ornitin karboksilaza) koji daje rezistenciju na ornitin dekarboksilaza inhibitor, 2-(difluorometil)-DL-ornitin, DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Moiecular BioIogy, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) ili deaminaza iz Aspergillus terreus koja daje rezistenciju na Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. ;59 (1995), 2336-2338). Pogodni markeri koji se mogu oceniti su takođe poznati stručnjacima i komercijalno su dostupni. Pogodno, pomenuti marker je gen koji kodira luciferazu (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996). 121), zeleni fluorescentni protein (Gerdcs, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) ili B-glukuronidaza (Jcffcrson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Ovaj primer izvođenja je naročito koristan za jednostavan i brz skrining ćelija, tkiva i organizama koji sadrže pomenuti vektor. Kao što je prethodno opisano, pomenuti molekul nukleinske kiseline može se koristi zasebno ili kao deo vektora da eksprimira molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska u ćelijama, za, npr., prečišćavanje ali takođe i za svrhu genske terapije. Molekuli nukelinske kiseline ili vektori koji sadrže DNK sekvencu(e) koja kodira jedan od prethodno opisanih molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska su uvedeni u ćeliju koje zauzvrat proizvode polipeptid od interesa. Genska terapija, koja je zasnovana na introdukciji terapeutskih gena u ćeliji preko ex-vivo ili in-vivo tehnika je jedna od najvažnijih primena transfera gena. Pogodni vektori, postupci ili sistemi za dopremanje gena za in-vitro ili in-vivo gensku terapiju opisani su u literaturi i poznati su stručnjacima; videti, npr., Giordano, Nature Medicine 2 ;(1996), 534-539: Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Eancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 ;(1995), 1077-1086: Onodera, Biood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998). 692-699; Nabei, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Vcrzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; VVang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,589,466; ili Schaper, Current Opinion in Biotechnologv 7 (1996), 635-640; dos Santos Coura i Nardi Virol J. (2007), 4:99. Navedeni molekuli nukleinske kiseline i vektori mogu se dizajnirali za direktnu introdukciju ili za introdukciju preko lipozoma, ili virusnih vektora (npr., adenovirusnih, retorvirusnih) u ćeliju. ;[0071] Pronalazak takođe obezbeđuje ćelije domaćine transformisane ili transficirane sa vektorom pronalaska kao što je ovde đefinisano. Pomenuta ćelija domaćin može se proizvesti introdukcijom prethodno opisanog vektora pronalaska ili prethodno opisanog molekula nukleinske kiseline pronalaska u domaćina. Prisustvo najmanje jednog vektora ili najmanje jednog molekula nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu može posredovati u ekspresiji gena koji kodiraju prethodno opisane konstrukte jednolančanog antitela. ;[0072] Opisani molekul nukleinske kiseline ili vektor pronalaska, koji je introdukovan u ćeliju domaćina može ili biti integrisan u genom domaćina ili se može održavati ekstrahromozomski. Ćelija domaćin može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija. Namera je da termin "prokariot" uključuje sve bakterije, koje se mogu transformisati ili transficirati sa molekuiima DNK ili RNK za ekspresiju proteina pronalaska. Prokariotski domaćini mogu uključivati gram negativne kao i gram pozitivne bakterije kao što su. na primer, 0. coli, S. tvphimurium, Serratia marcescens i Bacillus subtilis. Namera je da termin "eukariotski" uključuje kvasac, ćelije kvasca, viših biljaka, insekata i poželjno sisara. U zavisnosti od domaćina upotebljenog u proceduri rekombinantne proizvodnje, protein kodiran sa polinukleotidom ovog pronalaska može se glikozilovati ili može biti neglikozilovan. Naročito je poželjna upotreba plazmida ili virusa koji sadrži kodirajući) sekvencu molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska i sa njima genetički fuzionisanog Nterminalnog FLAG-taga i/ili C-terminalnog His-taga. Poželjno, dužina pomenutog FLAG-taga je oko 4 do 8 aminokiselina, najpoželjnije 8 aminokiselina. Prethodno opisan polinukleotid može se koristiti za transformaciju ili transficiranje domaćina korišćenjem bilo kog poznatog postupka uobičajeno poznatog prosečnom stručnjaku. Dodatno, postupci za pripremu fuzionisanih, opeartivno povezanih gena i njihova ekspresija u, npr., sisarskim ćelijama i bakterijama dobro su poznati u tehnici (Sambrook, loc cit.). Poželjno, pomenuta ćelija domaćina je ćelija bakterije ili insekta, gljive, biljke ili životinje. Naročito je predviđeno da navedena ćelija domaćin može biti sisarska ćelija. Naročito poželjna ćelija domaćin obuhvata CHO ćelije, COS ćelije, linije ćelija mijeloma kao što su SP2/0 ili NS/O. Kao što je ilustrovano u priključenim primerima, naročito su poželjne CHO-ćelije kao domaćini. Poželjnije pomenute ćeiije domaćini su humana ćelija ili humana ćelijska linija, npr. per,c6 (Kroos, Biotechnol. Prog, 2003, 19:163-168). ;[0073] Ovaj pronalazak se stoga odnosi na postupak za proizvodnju molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, gde pomenuti postupak obuhvata kultivisanje ćeiije domaćina pronalaska kao što je ovde đefinisano pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska kao što je ovde đefinisano i rekuperovanje proizvedenog polipeptida iz kulture. [0074} Transformisani domaćini mogu se uzgajati u fermentorima i kultivisani u skladu sa postupcima poznatim u tehnici da bi sc postigao optimalan rast ćelija. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska zatim može biti izolovan iz medija za uzgajanje, ćelijskih lizata, ili frakcija ćelijske membrane. Izolacija i prečišćavanje, npr., mikrobijalno eksprimiranog molekula bispecifičnog jednolančanog antitela može biti preko bilo kojih konvencionalih načina kao što su, na primer, preparativne hromatografske separacije i imunološe separacije kao što su one koje uključuju upotrebu monoklonskih ili poliklonskih antitela usmerenih, npr., protiv taga molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska ili kao stoje opisano u priključenim primerima. Uslovi za kultivisanje domaćina, koji omogućavaju ekspresiju poznati su u tehnici i zavise od sistema domaćina i ekspresionog sistema/vektora korišćenog u takvom postupku. Parametri koji se modifikuju da bi se postigli uslovi koji omogućavaju ekspresiju rekombinantnog polipeptida poznati su u tehnici. Stoga, pogodni usiovi se mogu odrediti od strane stručnjaka u odsustvu dodatnog inventivnog doprinosa. Po ekspresiji, molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska može se prečistiti prema standardnim tehnikama, uključujući precipitaciju sa amonijum sulfatom, afinitetnim kolonama, hromatografijom na koloni, elektroforezu na gelu i slično; videti, Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982). U značajnoj meri čisti poiipeptidi ili najmanje oko 90 do 95% homogenosti je poželjno, i 98 do 99% iii više homogenosti je najpoželjnije, za farmaceutske upotrebe. Po prečišćavanju, delimično ili do homogenosti po želji, molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska može se zatim koristiti terapeutski (uključujući vantelesno) ili u razvoju i izvođenju test procedura. Dodatno, primeri za postupke za rekuperaciju molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska iz kulture su detaljno opisani u priključenim primerima. Rekuperacija se takođe može postići postupkom za izolaciju molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska sposobnog za vezivanje sa epilopom humanog i primata osim šimpanze CD3 epsilon (CD3 , postupak koji sadrži korake: (a) dovođenje u kontakt polipeptidafjednog ili više) sa N-terminalnim fragmentom ekstracelularnog domena CD3cod maksimalno 27 aminokiselina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 341) ili Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO. 342), fiksiranu preko njegovog C-tcrminusa u čvrstu fazu; (b) eluiranje vezanog polipeptida(jednog ili više) iz pomenutog fragmenta; i (c) izolovanje polipeptida(jednog ili više) iz ciuata iz (b). Poželjno je da polipeptid (jedan ili više) izolovan preko prethodnog postupka pronalaska je humanog porekla. Ovaj postupak ili izolacija molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska podrazumeva se kao postupak za izolaciju jednog ili više različitih polipeptida sa istom specifiČnošću za fragment ekstracelularnog domena CD3e koji sadrži na svom N-terminusu aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Giu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 341) ili Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO. 342) iz mnoštva kandidata polipeptida kao i postupak za prečišćavanje polipeptida iz rastvora. NeograniČavajući primer za poslednje pomenuti postupak za prečišćavanje molekula bispecifičnog jednolančanog antitela iz rastvora je npr. prečišćavanje rekombinantno cksprimiranog molekula bispecifičnog jednolančanog antitela iz supernatanta kulture ili priprema iz takve kulture. Kao što je prethodno navedeno fragment korišćen u ovom postupku je N-terminalni fragment ekstracelularnog domena CD3e molekula primata. Aminokiselinske sekvence ekstracelularnog domena CD3c molekula različitih vrsta prikazane su u SEQ ID NOs: 1, 3, 5 i 7. Dva oblika N-terminalnog oktamera prikazani su u SEQ ID NOs: 341 i 342. Poželjno je da je ovaj N-terminus slobodno dostupan za vezivanje polipeptida koje treba identifikovati postupkom pronalaska. Termin "slobodno dostupan" podrazumeva u kontekstu pronalaska kao oslobođen od dodatnih motiva kao što je His-tag. Interferencija takvog His-taga sa vezujućim molekulom identifikovanim sa postupkom pronalaska opisan je u priključenim Primerima 6 i 20. Prema ovom postupku pomenuti fragment je fiksiran preko svog C-terminusa za čvrstu fazu. Stručnjak će lako i bez bilo kakve inventivne aktivnosti izabrati pogodnu podlogu čvrste faze iz korišćenog primera izvođenja postupka pronalaska. Primeri za čvrstu podlogu obuhvataju, ali nisu ograničeni na matrikse kao Što su kuglice (npr. agarozne kuglice, sefaroza kuglice, polistirol kuglice, dekstran kuglice), ploče (ploče za kulturu ili MultiWell ploče) kao i čipovi poznati npr. od Biacore®. Izbor načina i postupaka za fiksaciju/imobilizaciju fragmenta za pomenutu čvrstu podlogu zavisi od izbora Čvrste podloge. Uobičajeno korišćeni postupak za fiksaciju/imobilizaciju je kuplovanje preko N-hidroksisukcinimid (NHS) estra. Hernija u osnovi ovog kuplovanja kao i alternativni postupci za fiksaciju/imobilizaciju poznati su stručnjaku, npr. od Hermanson "Bioconjugate Techniques", Academic Press, Inc. (1996). Za fiksaciju za/imobilizaciju na hromatografskim podlogama sledeća sredstva su uobičajeno korišćena: NHS-aktivirana sefaroza (npr. HiTrap-NHS od GE Life Science-Amersham), CnBr-aktivirana sefaroza (npr. GE Life Science-Amersham), NHS-aktivirane dekstran kuglice (Sigma) ili aktivirani polimetakrilat. Ovi reagensi se takođe mogu koristiti za serijski pristup. Dodatno, dekstran kuglice koje sadrže gvožđe oksid (npr. dostupne od Miltenvi) mogu sc korisiti u serijskom pristupu. Ove kuglice se mogu koristiti u kombinaciji sa magnetom za razdvajanje kuglica od rastvora. Polipeptidi mogu biti imobilisani na Biacore čipu (npr. CM5 čipovi) upotrebom NHS aktiviranog karboksimetildekstrana. Dodatni primeri za odgovarajuću čvrstu podlogu su amin reaktivne MulliWeli ploče (npr. Nunc Immobilizer™ ploče). Prema ovom postupku pomenuti fragment ekstracelularnog domena CD3 epsilon može biti direktno kuplovan sa čvrstom podlogom ili preko niza aminokiselina, koji može biti linker ili druga proteinska/polipeplidna grupa. Alternativno, ckslracelularni domen CD3 epsilon može biti indirektno kuplovan preko jednog ili više molekula adaptera. Načini i postupci za eluiranje peptida ili polipeptida vezanog za imobilizovani epitop su dobro poznate u tehnici. Isto važi za postupke za izolaciju idcntifkovanog polipeptida (ili više njih) iz eluata. Postupak za izolaciju jednog ili više različitih molekula bispecifičnog jednolančanog antitela(ili više njih) sa istom specifičnošću za fragment ekstracelularnog domena CD3c koji sadrži na svom N-terminusu aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly (gde je X Met ili lle) iz mnoštva polipeptidnih kandidata mogu sadržati jedan ili više koraka sledećih postupaka za selekciju antigen-specifičnih entiteta: CD3e specifični vezujući domeni mogu se izabrati iz repertoara izvedenih iz antitela. Može se konstruisati biblioteka fagnog prikaza na osnovu standardnih procedura, kao što jc na primer opisano u "Phage Display: Laboralory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Format fragmenata u biblioteci antitela može biti scFv, ali može generalno biti takođe Fab fragment ili čak fragment antitela sa jednim domenom. Za izolaciju fragmenata antitela mogu se koristiti biblioteke fragmenata naivnog antitela. Za selekciju potencijalno nisko imunogenih vezujućih entiteta za kasniju terapeutsku upotrebu, biblioteke fragmenta humanog antitela mogu biti povoljnije za direktnu selekciju fragmenata humanog antitela. U nekim slučajevima one mogu formirati osnovu za sintetičke biblioteke antitela (Knappik et al. J Mol. Biol. 2000, 296:57 ff). Odgovarajući format može biti Fab, scFv (kao stoje dalje opisano) ili domen antitela (dAbs, kao stoje prikazano u Hoit ct al., Trends Biotechnol. 2003, 21:484 ff). U tehnici je takođe poznato da u mnogim slučajevima ne postoji dostupan izvor imunog humanog antitela protiv ciljnog antitela. Stoga su životinje imunizovane sa ciljnim antigenom i biblioteke respektivnog antitela su izolovane iz životinjskog tkiva kao što je npr. slezina ili PBMC. N-terminalni fragment se može biotinilovati ili se kovalentno vezati za proteine kao što su KLH ili goveđi serum albumin (BSA). Prema uobičajenim pristupima glodari su korišćeni za imun izaći ju. Neki repertoari imunog antitela ne-humanog porekla mogu biti naročito pogodni iz drugih razloga, npr. za prisustvo antitela sa jednim domenom (VHH) izvedenih iz vrsta kamila (kao što je opisano u Muyldermans, J Biotechnol. 74:277; De Genst et al. Dev Como Immunol. 2006, 30:187 ff). Stoga odgovarajući format biblioteke antitela može biti Fab, scFv (kao što je dalje opisano) ili antitela sa jednim domenom (VHH). U jednom mogućem pristupu deset nedelja stari Fl miševi iz baib/c x C57black ukrštanja mogu se imunizovani sa celim ćelijama npr. koje eksprimiraju transmembranski EpCAM N-terminalno prikazan kao translaciona fuzija N-terminalnih aminokiselina 1 do 27 zrelog CD3c lanca. Alternativno, miševi se mogu imunizovati sa 1-27 CD3 epsilon-Fc fuzionim proteinom ;(odgovarajući pristup je opisan u priključenom Primeru 2). Nakon bustcr imunizacije(a), mogu se uzeti uzorci krvi i titri antitela u serumu na CD3-pozitivne T ćelije mogu se testirati npr. u FACS analizi. Obično, serumski titri su značajno viši kod imunizovanih nego kod ne-imunizovanih životinja. Imunizovane životinje mogu formirati osnovu za konstrukciju biblioteka imunih antitela. Primeri takvih biblioteka obuhvataju biblioteke fagnog prikaza. Takve biblioteke mogu se generalno konstruisati na osnovu standardnih procedura, kao što je na primer opisano u "Phage Displav: Laboratorv Manual"; Ed. Barbas, Burton. Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 2001. Ne-humana antitela mogu se takođe humanizovati preko fagnog prikaza usled stvaranja biblioteka varijabilnijih antitela koje se naknadno mogu obogatiti sa vezujućim sredstvima tokom selekcije. ;[0075] U pristupu prikaza faga bilo koji pul faga koji prikazuje biblioteke antitela čini osnovu za selekciju vezujućih entiteta korišćenjem respektivnog antigena kao ciljnog molekula. Centralni korak u kome su antigen specifični, antigen vezani fagi izolovani označen je kao paning. Usled prikaza fragmenata antitela na površini faga, ovaj generalni postupak se naziva fagni prikaz. Jedan poželjan postupak selekcije je upotreba malih proteina kao što je N2 domen filamentoznog faga translaciono fuzionisan sa N-terminusom scFv koji je prikazan od strane faga. Drugi postupak prikaza poznat u tehnici, koji se može koristiti za izolovanje vezujućih entiteta je postupak ribozomskog prikaza (opisan u Groves & Osbourn, Expert Opin Biol Ther. 2005, 5:125 ff; Lipovsek & Pluckthun, J Immunol Methods 2004, 290:52 ff). Da bi se pokazalo vezivanje scFv čestica faga za fagnu biblioteku 1-27 CD3c-Fc fuzionog proteina koji nosi klonirani scFv-repertoar može se prikupiti iz supernatanta respektivne kulture sa PEG (polietilenglikol). ScFv čestice faga mogu se inkubirati sa imobilisanim CD3e Fc fuzionim proteinom. Imobilisani CD3s Fc fuzioni protein se može obložiti sa čvrstom fazom. Vezujući entiteti se mogu cluirati i eluat se može koristiti za infekciju svežih neinficiranih bakterija domaćina. Bakterijski domaćini koji su uspešno transdukovani sa kopijom fagemida, koji kodiraju humani scFv-fragment, mogu se ponovo selektovati u odnosu na rezistenciju na karbenicilin i naknadno inficirati sa npr. VCMS 13 helper fagom da bi se započela druga runda prikaza antitela i in vitro selekcija. Ukupno od 4 do 5 rundi selekcije jc noramlno izvedeno. Vezivanje izolovanih vezujućih entiteta može se testirati na CD3 epsilon pozitivnim Jurkat ćelijama. HPBall ćelijama, PBMC ili transficiranim eukariotskim ćelijama koje nose N-terminalnu CD3c sekvencu fuzionisanu sa površinski prikazanim EpCAM korišćenjem testa protočne citometrije (videti priključeni Primer 4). Poželjno, prethodni postupak može biti postupak, gde se fragment ekstracelularnog domena CD3e sastoji od jednog ili više fragmentata polipeptida sa bilo kojom aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID NOs. 2,4, 6 ili 8. Poželjnije, pomenuti fragment je dužine 8, 9, 10, I 1, 12, 13, 14, 15, 16. 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 aminokiselinskih ostataka. Ovaj postupak identifikacije molekula bispecifičnog jednolančanog antitela može biti postupak skrininga mnoštva molekula bispecifičnog jednolančanog antitela koja sadrže interspecijski specifični vezujući domen koji se vezuje za epitop humanog i primata osim šimpanze CD3e. Alternativno, postupak identifikacije je postupak prečišćavanja/izolacije molekula bispecifičnog jednolančanog antitela koje sadrži interspecijes specifični vezujući domen koji se vezuje za epitop humanog i primata osim šimpanze CD3c. ;[0076] Dodatno, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska iii bispecifično jednoiančano antitelo kao što je proizvedeno postupkom kao što je ovde đefinisano. ;[0077] Pronalazak takođe obezbeđuje molekul bispecifičnog jednolančanog antitela kao Što je ovde đefinisano, ili proizveden prema postupku kao što je ovde đefinisano, gde pomenuti molekul bispecifičnog jednolančanog antitela je za upotrebu u prevenciji, tretmanu ili ublažavanju kancera. Poželjno, pomenuti kancer je solidni tumor, poželjnije karcinom ili kancer prostate. Poželjno je da bispecifična jednolančana struktura dalje sadrži pogodne formulacije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenta. Dodatno, poželjno je da je pomenuti molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pogodan za primenu u kombinaciji sa dodatnim lekom. Pomenuti lek može biti ne-proteinsko jedinjenje ili proteinsko jedinjenje i može se primeniti istovremeno ili ne-isotvremeno sa molekulom bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde đefinisano. ;[0078] U skladu sa pronalaskom, termin "farmaceutska kompozicija" odnosi se na kompoziciju za primenu na pacijenta, poželjno humanog pacijenta. Određena poželjna farmaceutska kompozicija ovog pronalaska sadrži bispecifična jednolančana antitela usmerena protiv i stvorena protiv kontekstno nezavisnih CD3 epitopa. Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži pogodne formulacije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenata. U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži kompoziciju za parenteralnu, transdcrmalnu, intraluminalu, intraarterijalnu, intratekalnu i/ili intranazalnu primernu ili putem direktne injekcije u tkivo. Naročito je predviđeno da se pomenuta kompozicija primenjujc na pacijenta preko infuzije ili injekcije. Primena pogodnih kompozicija može se izvesti različitim načinima, npr., intravenskom, intrapcritoncalnom. polkožnom, intramuskularnom, topikalnom ili intradermalnom primenom. Naročito, ovaj pronalazak obezbeđuje neprekidnu primenu pogodne kompozicije. Kao neograničavajući primer, neprekidna, tj. kontinuirana primena može se realizovati sistemom male pumpe koju nosi pacijent za merenjc influksa terapeutskog agensa u telo pacijenta. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifična jednolančana antitela usmerena protiv i stvorena protiv kontekstno nezavisnih CD3 epitopa pronalaska može se primeniti korišćenjem pomenutih sisitema pumpi. Takvi sistemi pumpi su generalno poznati u tehnici, i uobičajeno se oslanjaju na periodičnu zametni kertridža koji sadrže terapeutski agens za infuziju. Pri zameni kertridža u takvom sistemu pumpe može doći do privremenog prekida inače neprekidnog protoka terapeutskog agensa u telo pacijenta. U takvom slučaju, faza primene pre zamene kertridža i faza primene nakon zamene kertridža i dalje će se smatrati unutar značenja farmaceutskih načina i postupaka pronalaska i zajedno će stvarati jednu "neprekinutu primenu" takvog terapeutskog agensa. Kontinuirana ili neprekinuta primena ovih bispecifičnih jednolančanih antitela usmerenih protiv i stvorenih protiv kontekstno nezavisnih CD3 epitopa ovog pronalaska može biti intravenska ili potkožna putem uređaja za dopremanje tečnosti ili sistema male pumpe uključujući mehanizam za protok tečnosti i mehanizam za protok tečnosti za protok tečnosti iz rezervoara i aktuatorski mehanizam za aktuaciju mehanizma za protok. Sistemi pumpe za potkožnu primenu mogu uključivati iglu ili kanilu za probijanje kože pacijenta i dopremanje pogodne kompozicije u telo pacijenta. Pomenuti sistemi pumpe mogu biti direktno fiksirani ili pričvršćeni za kožu pacijenta nezavisno od vene, arterije, ili krvnog suda, čime se omogućava direktni kontakt između sistema pumpe i kože pacijenta. Sistem pumpe može biti pričvršćen za kožu pacijenta od 24 časa do nekoliko dana. Sistem pumpe može biti male veličine sa rezervoarom za male zapremine. Kao neograničavajući primer, zapremina rezervoara za pogodnu farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje može biti između 0.1 i 50 ml. Kontinuirana primena može biti transdermalna putem flastera koji se nosi na koži i zamenjuje u određenim intervalima. Stručnjak je upoznat sa sistemima flastera za dopremanje leka pogodnih za ovu svrhu. Treba napomenuti daje transdermalna primena naročito pogodna za neprekidnu primenu, jer zamena prvog istrošenog flastera može se pogodno postići istovremeno sa postavljanjem novog, drugog flastera, na primer na površini kože u neposrednoj okolini prvog istrošenog flastera i neposredno pre uklanjanja prvog istrošenog flastera. Problemi prekida protoka ili otkazivanje baterije se ne dešavaju. J0079] Kompozicija ovog pronalaska, koja naročito sadrži bispecifična jednolančana antitela usmerena protiv i stvorena protiv kontekstno nezavisnih CD3 epitopa može dalje sadržali farmaceutski prihvatljivi nosač. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača dobro su poznati u tehnici i uključuju rastvore, npr. fosfatno puferovan slani rastvor, vodu. emulzije, kao što su ulje/voda emulzije, različiti tipovi ovlaživača, sterilni rastvori, lipozomi, itd. Kompozicije koje sadrže takve nosače mogu se formulisati dobro poznatim konvencionalnim postupcima. Formulacije mogu sadržati ugljene hidrate, rastvore pufera, aminokiseline i/ili površinski aktivna sredstva. Ugljeni hidrati mogu biti neredukujući šećeri, poželjno trehaloza, saharoza, oktasulfat, sorbitol ili ksilitol. Takve formulacije mogu se koristiti za kontinuiranu primenu koja može biti intravenska ili potkožna sa i/ili bez sistema pumpe. Aminokiseline mogu biti naelektrisane aminokiseline, poželjno lizin, lizin acetat, arginin, glutamat i/ili histidin. Surfaktanti mogu biti deterdženti, poželjno sa molekulskom težinom od > 1.2 KD i/ili polietar, poželjno sa molekulskom težinom >3 KD. Neograničavajući primeri za poželjne deterdžente su Tween 20, Tween 40, Tvveen 60, Tween 80 ili<T>vveen 85. Neograničavajući primeri za poželjne polietre su PEG 3000. PEG 3350, PEG 4000 ili PEG 5000. Puferski sistemi korišćeni u ovom pronalasku mogu imati poželjnu pH od 5-9 i mogu sadržati citrat, sukcinat, fosfat, histidin i acetat, Kompozicije ovog pronalaska mogu se primeniti na subjekta u pogodnoj dozi koja se može odrediti npr. studijama povećanja doze primenom rastućih doza molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska koje pokazuje interspecijsku specifičnost opisanu za primate osim šimpanze, na primer makaki. Kao stoje dato prethodno, molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska koji pokazuje ovde opisanu interspecijsku specifičnost može se pogodno koristiti u identičnom obliku u prekliničkom testiranju na primatima osim šimpanze i kao lek kod ljudi. Ove kompozicije se takođe mogu primeniti u kombinaciji sa drugim proteinskim i neproteinskim iekovima. Ovi lekovi se mogu primeniti istovremeno sa kompozicijom koja sadrži molekui bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska kao što je ovde đefinisano ili zasebno pre ili posle primene pomenutog polipeptida u vremenski definisanim intervalima i dozama. Dozni režim će odrediti zaduženi lekar i klinički faktori. Kao stoje dobro poznato u medicini, doze za bilo kog pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, određenog jedi nj enj a koje se primenjuje, pola, vremena i načina primene, opšteg zdravstvenog stanja, i drugih Jekova koji se istovremeno primenjuju. Pripreme za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili ne-vodene rastvore, suspenzije, i emulzije. Primeri ne-vodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao maslinovo ulje, i injektabilni organski estri kao sto je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući slani rastvor i puferisani medijum. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringer-ovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, Ringerov rastvor sa laktatima, ili neisparljiva ulja. Intravenski nosači uključuju sredstva za obnavljanje tečnosti i nutrijenata, sredstva za obnavljanje elektrolita (kao što su oni zasnovani na Ringer-ovoj dekstrozi), i slično. Mogu takođe biti prisutni konzervansi i drugi aditivi kao što su, na primer, antimikrobna sredstva, anti-oksidansi, helirajući agensi, inertni gasovi i slično. Dodatno, kompozicija ovog pronalaska može sadržati proteinske nosače, kao Što su, npr., serum albumin ili imunoglobulin, poželjno humanog porekla. Predviđeno je da kompozicija pronalaska može sadržati, kao dodatak molekulu bispecifičnog jednolančanog antitela definisanog ovde, dodatne biološki aktivne agense, zavisno od nameravane upotrebe kompozicije. Takvi agensi mogu biti lekovi koji deluju na gastro-inlestinalni sistem, lekovi koji deluju kao citostatici, lekovi koji sprečavaju hiperurikemiju, lekovi koji inhibiraju imunološke reakcije (npr. kortikosteroidi), lekovi koji moduliraju inflamatorni odgovor, lekovi koji deluju na cirkulatorni sistem i/ili agensi kao što su citokini poznati u tehnici. Biološka aktivnost farmaceutske kompozicije definisane ovde može se odrediti na primer testovima citotoksičnosti, kao što je opisano u sledećim primerima, u WO 99/54440 ili od strane Schlcrcth ct al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12). "Efikasnost" ili "in vivo efikasnost" kao što je ovde korišćeno odnosi se na odgovorna terapiju od strane farmaceutske kompozicije pronalaska, korišćenjem npr. standard i zo van ih kriterijuma NCI odgovora. Uspeh iliin vivoefikasnost terapije korišćenjem farmaceutske kompozicije pronalaska odnosi se na efikasnost kompozicije za njenu nameravanu upotrebu, tj. sposobnost kompozicije da izazove svoj željeni efekat, tj. depleciju patoloških ćelija, npr. ćelija tumora.In vivoefikasnost može se pratiti ustanovljenim standardnim postupcima za respektivne bolesti uključujući, ali se ne ograničavajući na broj leukocita, diferencijalnu analizu krvi, postupak sortiranja fluorescentno aktiviranih ćelija, aspiraciju kostne srži. Dodatno, mogu se koristiti različiti parametri kliničke hernije specifični za bolest i drugi ustanovljeni standardni postupci. Dodatno, mogu se koristiti kompjuterskalomografija, rentgen, nuklearna magnetna rezonanca (npr. za National Cancer Institute-criteria based response assessment [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher Rl, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiđdemann W, Castellino R, Harris NL, Armitagc JO, Čarter W. Hoppe R, Canellos GP. Reporlof an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's Ivmphomas. NCI Sponsorcd International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;l7(4): 1244]). pozitron emisiono tomografsko skeniranje, broj leukocita, diferencijalna analiza krvi, postupak sortiranja fluorescentno aktiviranih ćelija, aspiracija kostne srži, biopsija/histologija limfnogčvora, i različiti kancer specifični parametri kliničke hernije (npr. laktat dehidrogenaza) i drugi ustanovljeni postupci. ;[0080] Sledeći glavni izazov u razvoju lekova kao što su farmaceutske kompozeije pronalaska je prediktabilna modulacija farmakokinetičkih osobina. U tu svrhu, uspostavlja se farmakokinetički profil leka kandidata, tj. profil farmakokinetičkih parametara koji utiču na sposobnost određenog leka da leči dato stanje. Farmakokinetički parametri leka koji utiču na sposobnost leka da tretira određenu bolest uključuju, ali nisu ograničeni na: polu-život, zapreminu distribucije, metabolizam prvog prolaza u jetri i stepen vezivanja krvnog seruma. Na efikasnost određenog agensa leka može uticati svaki od prethodno pomenutih parametara. "Polu-život" označava vreme kada je 50% primenjenog leka eliminisano biološkim procesima, npr. metabolizmom, ekskrecijom, itd. Pod "meatabolizmom prvog prolaza u jetri" podrazumeva se sklonost leka da se metabolizuje pri prvom kontaktu u jetri, tj. tokom prvog prolaska kroz jetru. "Zaprcrnina distribucije" označava stepen zadržavanja leka kroz različite delove tela, kao što su npr. intracelularni i ekstracelularni prostori, tkiva i organi, itd. i distribucija leka unutar ovih delova. "Stepen vezivanja krvnog seruma" označava sklonost leka da interaguje sa i da se vezuje za proteine krvnog seruma, kao što je albumin, što dovodi do redukcije ili gubitka biološke aktivnosti leka. ;[0081] Farmakokinetički parametri takođe uključuju bioraspoloživost, latentni period (Tlag), Tmax, stope apsorpcije, vreme početka i/ili Cmax za određenu količinu primenjenog leka. "Bioraspoloživost" označava količinu leka u krvi. "Latentni period" označava vremensko kašnjenje između primene leka i njegove detekcije i merljivosti u krvi ili plazmi. "Tmax" je vreme nakon koga je postignuta maksimalna koncentracija leka u krvi, i "Cmax" je koncentracija u krvi maksimalno dobijena sa određenim lekom. Na vreme do postizanja koncentracije leka u krvi ili tkivu koja je neophodna za njegov biološki efekat utiču svi parametri. Farmakokinetički parametri bispecifičnih jednolančanih antitela koja pokazuju interspecijsku specifičnost, koja se može odredili u prekliničkom testiranju na životinjama kod primata osim šimpanzi kao što je prethodno dalo takođe su dali npr. u objavi od sirane Schlereth ei al. (Cancer Immunol. immunother. 20 ;(2005), 1-12). ;[0082] Termin "toksičnost" kao što je ovde korišćeno odnosi se na toksične efekte leka koji se manifestuju u štetnim događajima ili teškim štetnim događajima. Ovi sporedni događaji mogu se odnositi na izostanak tolerancije na lek generalno i/ili izostanak lokalne tolerancije nakon primene. Toksičnost takođe može uključivati teratogene ili karcinogene efekte izazvane lekom. ;[0083] Termin "bezbednost", "in vivo bezbednost" ili "tolerbilnost" kao što su ovde korišćeni definišu primenu leka bez uključivanja teških štetnih događaja neposredno nakon primene (lokalna tolerancija) i tokom dužeg perioda primene leka. "Bezbednost", "in vivo bezbednost" ili "tolerabilnost" može se proceniti npr. u pravilnim intervalima tokom tretmana i perioda nakon toga. Merenja uključuju kliničku evaluaciju, npr. manifestacije u organima, i skrining laboratorijskih abnormalnosti. Klinička evaluacija se može izvesti i odstupanje od normalnih nalaza se može zabeležiti/kodirati prema NCICTC i/ili MedDRA standardima. Manifestacije na organima mogu uključiti kriterijume kao što su alergija/imunologija, krv/kostna srž, srčana aritmija, koagulacija i slično, kao što je dato u npr. Common Terminologv Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE). Laboratorijski parametri koji se mogu testirati uključuju na primer hematologiju, kliničku herniju, koagulacioni profil i analizu urina i ispitivanje drugih teiesnih tečnosti kao što su serum, plazma, limfna ili spinalna tcčnost, likvor i slično. Bezbednost se stoga može proceniti npr. fizičkim pregledom, tehnikama viueliuzacije (tj. ultrazvuk, rentgen, CT sken, Magnetic Resonance Imaging (MRI), druga merenja sa tehničkim uređajima (tj. elektrokardiogram), vitalnim znacima, merenjem laboratorijskih parametara i beleženjem štetnih događaja. Na primer, štetni događaji kod primala osim šimpanze u upotrebama i postupcima prema opisu mogu se ispitati histopatološkim i/ili histohemijskim postupcima. Termin "efektivna i ne-toksična doza" kao što je ovde korišćeno odnosi se na tolerabilnu dozu bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je ovde đefinisano koja je dovoljno velika da izazove deleciju patogenih ćelija, eliminaciju tumora, smanjivanje tumora ili stabilizaciju bolesti bez ili suštinski bez velikih toksičnih efekata. Takve efektivne i ne-loksične doze mogu se odrediti npr. studijama povećanja doze opisanim u tehnici i treba da budu ispod doze koja indukuje teške sporedne efekte (toksičnost koja limitira dozu, DLT). Prethodni termini su takođe pomenuti u npr. Preclinical safetv evaluation of biotechnology-dcrivcd pharmaccuticals S6; IC1I Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997. Dodatno, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži molekul bispecifičnog jednolančanog antitela ovog pronalaska ili proizvedenu prema postupku prema pronalasku za prevenciju, tretman ili ublažavanje kancera. Poželjno, pomeuti kancer je solidni tumor, poželjno karcinom ili kancer prostate. Poželjno, pomenuta farmaceutska kompozicija dalje sadrži pogodne formulacije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenata. Sledeći aspekt pronalaska odnosi se na upotrebu molekula bispecifičnog jednolančanog antitela/polipeptida kao što je ovde prethodno đefinisano ili proizvedeno prema postupku deflnišanom prethodno ovde, za pripremu farmaceutske kompozicije za prevenciju, tretman ili ublažavanje bolesti. Poželjno, pomenuta bolest je kancer. Poželjnije, pomenuti kancer je solidni tumor, poželjno karcinom ili kancer prostate. U sledećem poželjnom primeru izvođenja za upotrebu molekula bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska pomenuta farmaceutska kompozicijaje pogodna za primenu u kombinaciji sa dodatnim lekom, tj. kao deo ko-lerapije. U pomenutoj ko-terapiji, aktivni agens može biti izborno uključen u istu farmaceutsku kompoziciju kao i molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, ili može biti uključen u zasebnoj farmaceutskoj kompoziciji. U poslednje pomenutom slučaju, pomenuta zasebna farmaceutska kompozicijaje pogodna za primenu pre, istovremeno ili nakon primene pomenute farmaceutske kompozije koja sadrži molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska. Dodatni lek ili farmaceutska kompozicija može biti ne-proteinsko jedinjenje ili proteinsko jedinjenje. U slučaju da je dodatni lek proteinsko jedinjenje, pogodno je da je proteinsko jedinjenje sposobno da obezbedi aktivacioni signal za imune efektorske ćelije. Poželjno, pomenuto proteinsko jedinjenje ili nc-protcinsko jedinjenje može biti primenjeno istovremeno ili ne-istovremeno sa molekulom bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, molekulom nukleinske kiseline kao što je ovde prethodno đefinisano, vektorom definisanom kao stoje ovde prethodno đefinisano, ili domaćinom definisanim kao što je ovde prethodno đefinisano. ;[0084] Sledeći aspekt pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupku za prevenciju, tretman ili ublažavanje bolesti kod subjekta kome je to potrebno. Poželjno, pomenuta bolest je kancer. Poželjno, pomenuti kancer jc solidni tumor, poželjno karcinom ili kancer prostate. ;[0085] U sledećem poželjnom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije za upotrebu kao što je prethodno opisano, pomenuta farmaceutska kompozicija je pogodna za primenu u kombinaciji sa dodatnim lekom, tj. kao deo ko-terapije. U pomenutoj ko-terapiji, aktivni agens može biti izborno uključen u istoj farmaceutskoj kompoziciji kao molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, ili može biti uključen u zasebnu farmaceutsku kompoziciju. U ovom poslednje pomenutom slučaju, pomenuta zasebna farmaceutska kompozicijaje pogodna za primenu pre, istovremeno ili nakon primene pomenute farmaceutske kompozicije koja sadrži molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska. Dodatni lek ili farmaceutska kompozicija može biti neproteinsko jedinjenje ili proteinsko jedinjenje. U slučaju da je dodatni lek proteinsko jedinjenje, pogodno je da je proteinsko jedinjenje sposobno da obezbedi aktivacioni signal za imune efektorske ćelije. Poželjno, pomenuto proteinsko jedinjenje ili nc-proteinsko jedinjenje može se primeniti istovremeno ili nc-istovremeno sa molekulom bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, molekulom nukleinske kiseline kao što je ovde prethodno đefinisano, vektorom definisanim kao što jc ovde prethodno đefinisano, ili domaćinom definisanim kao Što je ovde prethodno đefinisano. ;[0086] Poželjno je za prethodno opisanu farmaceutsku kompoziciju za upotrebu kao što je prethodno opisano daje pomenuti subjekat čovek. ;[0087] U sledećem aspektu, pronalazak sc odnosi na komplet koji sadrži molekul bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, molekul nukleinske kiseline pronalaska, vektor pronalaska, ili ćeliju domaćina pronalaska. ;[0088] Ovi i drugi primeri izvođen ja su opisani i obuhvaćeni opisom i Primerima ovog pronalaska. Rekombinantne tehnike i postupci u imuologiji su opisani npr. u Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual; Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 3rd edition 2001; Lefkovits: Immunologv Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Acadcmic Press, 1997; Golemis; Protein-Protcin Intcractions: Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratorv Press, 2002. Dodatna literatura koja se odnosi na bilo koja antitela, postupke, upotrebe i jedinjenja koja se primenjuju u skladu sa ovim pronalaskom mogu se naći u javnim bibliotekama i bazama podataka, korišćenjem na primer elektronskih uređaja. Na primer, javna baza podataka "Medline", dostupna na internetu, može se koristiti, na primer na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.iitml. Dodatne baze podataka i adrese kao stoje http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ili navedena na početnoj strani CMBL-servisa na http://www.embl.de/services/index.html poznati su stručnjacima i mogu se takođe dobiti korišćenjem, npr., http://www.google.com. ;[0089] Slike prikazuju: ;Slika 1 ;Fuzija N-terminalnih aminokiselina 1-27 CD3 epsilon primata sa heterolognim rastvorljivim proteinom. ;Slika 2 ;Slika prikazuje prosečne vrednosti apsorpcije uzoraka u četiri ponavljanja merenih u ELISA testu koji detektuje prisustvo konstrukta koji se sastoji od N-terminalnih aminokiselina 1-27 zrelog humanog CD3 epsilon lanca fuzionisanog sa zglobnim i Te gama delom humanog IgGI i C-terminalnog 6 Histidin taga u supernatantu prolazno transficiranih 293 ćelija. Prva kolona obeležena sa "27 aa huCD3E" prikazuje prosečnu vrednost apsorpcije za konstrukt, druga kolona obeležena sa "irel, SN" prikazuje prosečnu vrednost za supernatant od 293 ćelije transficirane sa irelevantnim konstruktom kao negativnom kontrolom. Poređenje vrednosti dobijenih za konstrukt sa vrednostima dobijenim za negativnu kontrolu jasno pokazuju prisustvo rekombinantnog konstrukta. ;Slika 3 ;Slika prikazuje prosečne vrednosti apsorpcije uzoraka u četiri ponavljanja merenih u ELISA testu koji detektuje vezivanje interspecijski specifičnih anti-CD3 vezujućih molekula u obliku sirovih preparata periplazmatski eksprimiranih jednolančanih antitela u odnosu na konstrukt koji sadrži N-terminaine 1-27 aminokiseline zrelog humanog CD3 epsilon lanca fuzionisanog sa zglobnim i Fc gama delom humanog IgGI i C-terminalnim His6 tagom. Kolone prikazuju s leva na desno prosečne vrednosti apsorpcije za specifične delove obeležene kao A2J HLP, I2C HLP E2M HLP, F70 HLP, G4H HLP, II2C IILP, El L HLP, F12Q HLP, F6A HLP i Hl E HLP. Krajnja desna kolona obeležena sa "neg. kontr." Prikazuje prosečnu vrednost apsorpcije za jednolančani preparat mišjeg anti-humanog CD3 antitela kao negativne kontrole. Poređenje vrednosti dobijene za anti-CD3 specifične delove sa vrednostima dobijenim za negativnu kontrolu jasno pokazuje jako vezivanje anti-CD3 specifičnih delova za Nterminalne 1-27 aminokiseline zrelog humanog CD3 epsilon lanca. ;Slika 4 ;Fuzija N-terminalnih aminokiselina 1-27 CD3 epsilon primata sa heterolognim membranski vezanim proteinom. ;Slika 5 ;Histogramski prikaz različitih transfektanata testiranih u FACS analizu koja detektuje prisustvo rckombinantnih transmembranskih fuzionih proteina koji se sastoje od EpCAM makaki rakojeda i N-terminalnih 1-27 aminokiselina CD3 epsilon lanca čoveka, marmozeta, tamarina, veveričjeg majmuna i domaće svinje respektivno. Histogramski prikazi s leva na desno i od vrha do dole prikazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju konstrukte koji sadrže humani 27-mer, 27-mer marmozeta, 27-mer tamarina, 27-mer veveričjeg majmuna i 27-mer svinje respektivno. U pojedinačnim prikazima tanka linija predstavlja uzorak inkubiran sa PBS sa 2% FCS umesto anti-Flag M2 antitela kao negativne kontrole i podebljana linija prikazuje uzorak inkubiran sa anti-Flag M2 antitelom. Za svaki konstrukt histogramski prikaz prikazuje vezivanje anti-Flag M2 antitela za transfektante, što jasno pokazuje ekspresiju rekombinantnih konstrukata u transfektantima. ;Slika 6 ;Histogramski prikazi različitih transfektanata testiranih u FACS analizi koja detektuje vezivanje interspecijski specifičnih anti-CD3 vezujućih molekula u obliku sirovih preparata periplazmatki eksprimiranih jednolančanih antitela u odnosu na N-terminalne aminokiseline 1-27 CD3 epsilon lanca čoveka. marmozeta, tamarina i veveričjeg majmuna respektivno fuzionisanog sa EpCAM makaki rakojeda. ;Slika 6A: ;Histogramski prikazi s leva na desno i od vrha do dole prikazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju 1-27 CD3-EpCAM koji sadrži humani 27-mer testiran sa CD3 specifičnim vezujućim molekuiima označeni kao H2C HLP, F12Q HLP. E2M HLP i G4H HLP respektivno. ;Slika 6B: ;Histogramski prikazi s leva na desno i od vrha do dole prikazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju humani 1-27 CD3-EpCAM koji sadrži 27-mer marmozeta testiran sa CD3 specifičnim vezujućim molekuiima označenim kao H2C HLP, FI2Q HLP, E2M HLP i G4H HLP respektivno. ;Slika 6C: ;Histogramski prikazi s leva na desno i od vrha do dole prikazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju humani 1-27 CD3-EpCAM koji sadrži 27-mer tamarina testiran sa CD3 specifičnim vezujućim molekuiima označenim kao H2C IILP, F12Q HLP, E2M HLP i G4H HLP respektivno. Slika 6D: Histogramski prikazi s leva na desno i od vrha do dole prikazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju humani 1-27 CD3-EpCAM koji sadrži 27-mer veveričjeg majmuna testiran sa CD3 specifičnim vezujućim molekuiima označenim kao H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP i G4H HLP respektivno. ;Slika 6E: ;Histogramski prikazi s leva na desno i od vrha do dole prikazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju humani i- 21 CD3-EpCAM koji sadrži 27-mer svinje testiran sa CD3 specifičnim vezujućim molekuiima označenim kao H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP i G4H HLP respektivno. U pojedinačnim prikazima tanka linija predstavlja uzorak inkubiran sa jednolančanim preparatom mišjeg anti-humanog CD3-antitela kao negstivne kontrole i podebljana linija prikazuje uzorak inkubiran sa respektivnim naznačenim anli-CD3 vezujućim molekuiima. Uzimajući u obzir izostanak vezivanja za transfektante 27-mer svinje i ekspresione nivoe konslrukata prikazanih na Slici 5 prikazi histograma pokazuju specifično i jako vezivanje testiranih anti-CD3 specifičnih delova potpuno interspecijski specifičnih humanih bispecifičnih jednolančanih antitela za ćelije koje eksprimiraju rekombinantne transmembranske fuzione proteine koji sadrže N-terminalne aminokiseline 1-27 CD3 epsilon lanca čoveka, marmozeta, tamarina i veveričjeg majmuna respektivno fuzionisanih sa EpCAM makaki rakojeda i stoga pokazuju multi primat intersepcijsku specifičnost anti-CD3 vezujućih molekula. ;Slika 7 ;FACS analiza za detekciju humanog CD3 epsilon na transficiranim mišjim EL4 T ćelijama. Grafička analiza pokazuje prikaz histograma. Podebljala linija prikazuje transficirane ćelije inkubirane sa anti-humanim CD3 antitelom UCHT-1. Tanka linija predstavlja ćelije inkubirane sa mišjim IgGI izotipom kao kontrolom. Vezivanje anti CD3 antitela UCHT1 jasno pokazuje ekspresiju humanog CD3 epsilon lanca na ćelijskoj površini transficiranih mišjih EL4 T ćelija. ;Slika 8 ;Vezivanje interspecijski specifičnih anti CD3 antitela za alanin-mutante u alanin skening eksperimentu. Na pojedinačnim Slikama kolone prikazuju s leva na desno izračunate vrednosti vezivanja u arbitrarnim jedinicama na iogaritamskoj skali za transfektante divljeg tipa (WT) i za sve alanin-mutante od položaja 1 do 27. Vrednosti vezivanja su izračunate korišćenjem sledeće formule: ;U ovoj formulivređnosiJJzorakoznačava vrednost u arbitrarnim jedinicama vezivanja koji prikazuje stepen vezivanja specifičnog anti-CD3 atitela sa specifičnim alanin-mutantom kao što je prikazano na Slici,Uzorakoznačava geometrijsku sredinu vrednosti fluorescencije dobijene za specifično anti-CD3 antitelo testirano na specifičnom alanin-skening transfektantu,neg Kontr.označava geometrijsku sredinu vrednosti fluorescencije dobijene za negativnu kontrolu analiziranu na specifičnom alanin-mutantu,UCIJT- 1označava geometrijsku sredinu vrednosti fluorescencije dobijenu za UCHT-1 antitelo analizarano na specifičnom alanin-mutantu,WToznačava geometrijsku sredinu vrednosti fluorescencije dobijenu za anti-CD3 antitelo analizirano na transfektantu divljeg tipa, x označava respektivni transfektant, y označava respektivno anti-CD3 antitelo i\ vtoznačava daje respektivni transfektant divljeg tipa. Pojedinačni alanin-mulant položaji obeleženi su sa kodom od jednog slova aminokiseline divljeg tipa i brojem položaja. ;Slika 8A: ;Slika prikazuje rezultate za interspecijski specifično anti CD3 antitelo A2J HLP eksprimirano kao himerni IgG molekul. Smanjena aktivnost vezivanja uočena je za mutacije u alanin na položaju 4 (asparagin), na položaju 23 (treonin) i na položaju 25 (izoleucin). Kompletan gubitak vezivanja uočen je za mutacije u alanin na položaju I (glutamin), na položaju 2 (aspartat), na položaju 3 (glicin) i na položaju 5 (glutamat). ;Slika 8B: ;Slika prikazuje rezultate za interspecijski specifično anti CD3 antitelo F2M HLP, eksprimirano kao himerni IgG molekul. Smanjena aktivnost vezivanja uočena je za mutacije u alanin na položaju 4 (asparagin), na položaju 23 (treonin) i na položaju 25 (izoleucin). Kompletan gubitak vezivanja uočen je za mutacije u alanin na položaju 1 (glutamin), na položaju 2 (aspartat), na položaju 3 (glicin) i na položaju 5 (glutamat). ;Slika 8C: ;Slika prikazuje rezultate za interspecijski specifično anti CD3 antitelo H2C HLP, eksprimirano kao himerni IgG molekul. Smanjena aktivnost vezivanja uočena je za mutacije u alanin na položaju 4 (asparagin). Kompletan gubitak vezivanja uočen je za mutacije u alanin na položaju 1 (glutamin), na položaju 2 (aspartat), na položaju 3 (glicin) i na položaju 5 (glutamat). ;Slika 8D: ;Slika prikazuje rezultate za interspecijski specifično anti CD3 antitelo FI2Q HLP, testirano kao periplazmatično eksprimirano jednoiančano antitelo. Kompletan gubitak vezivanja uočen je za mutacije u alanin na položaju 1 (glutamin), na položaju 2 (aspartat), na položaju 3 (glicin) i na položaju 5 (glutamat). ;Slika 9 ;FACS analiza koja detektuje vezivanje interspecijski specifičnog anti-CD3 vezujućeg molekula H2C HLP za humani CD3 sa i bez N-terminalnog His6 taga. Histogramski prikazi su izvedeni na EL4 ćeiijskoj liniji transficiranoj sa humanim CD3 epsilon lancem divljeg tipa (levi histogram) ili humanim CD3 epsilon lancem sa N-terminalnim His6 tagom (desni histogram) testiranim u FACS analizi koja detektuje vezivanje interspecijski specifičnog vezujućeg molekula H2C HLP. Uzorci su inkubirani sa odgovarajućim izotipom kao kontrolom kao negativnom kontrolom (tanka linija), anti-humanim CD3 antitelom UCHT-1 kao pozitivnom kontrolom (tačkasta linija) i interspecijski specifičnim anti-CD3 antitelom 112C HLP u obliku himernog IgG molekula (podebljana linija). Histogramski prikazi prikazuju uporedivo vezivanje UCHT-1 antitela za oba transfektanta u poređenju sa izotipom kao kontrolom što pokazuje ekspresiju oba rekombinantna konstrukta. Histogramski prikazu takođe prikazuju vezivanje anti-CD3 vezujućeg molekula H2C HLP samo za humani CD3 epsilon lanac divljeg tipa ali ne za IIis6-humani CD3 epsilon lanac. Ovi rezutlati pokazuju daje slobodni N-terminus esencijalan za vezivenje interspecijski specifičnog anti-CD3 vezujućeg molekula H2C HLP. ;Slika 10 ;FACS analiza vezivanja naznačenih interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata za CHO ćelije transficirane as humanim MCSP D3, humanom CD3+ T ćelijskom linijom HPB-ALL, CHO ćelije transficirane sa MCSP D3 makaki rakojeda i makaki T ćelijskom linijom 4119 LnPx. FACS bojenje je izvedeno kao stoje opisano u Primeru 10. Podebljana linija predstavlja ćelije inkubirane sa 2 mg/mi prečišćenog proteina koji su naknadno inkubirani sa anti-his antitelom i PE obeleženim antitelom za detekciju. Tanka linija na histogranu označava negativnu kontrolu: ćelije inkubirane samo sa anti-his antitelom i antitelom za detekcijom. ;Slika 11;FACS analiza vezivanja naznačenih interspecijskispecifičnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata sa CHO ćelijama transficiranim sa humanim MCSP D3, humanom CD3+ T ćelijskom linijom HPB-ALL, CHO ćelijama transficiranim sa MCSP D3 makaki rakojeda i makaki T ćelijskom linijom 4119 LnPx. FACS bojenje je izvedeno kao što je opisano u Primeru 10. Podebljana linija predstavlja ćelije inkubirane sa 2 ug/ml prečišćenog proteina koji su naknadno inkubirani sa anti-his antitelom i PE obeleženim antitelom za detekciju. Tanka linija na histogranu označava negativnu kontrolu: ćelije inkubirane samo sa anti-his antitelom i antitelom za detekcijom. ;Slika 12 ;FACS analiza vezivanja naznačenih interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata sa CHO ćelijama transficiranim sa humanim MCSP D3, humanom CD3+ T ćelijskom linijom HPB-ALL, CHO ćelijama transficiranim sa MCSP D3 makaki rakojeda i makaki T ćelijskom linijom 4119 LnPx. FACS bojenje je izvedeno kao što je opisano u Primeru 10. Podebljana linija predstavlja ćelije inkubirane sa 2 ug/ml prečišćenog proteina koji su naknadno inkubirani sa anti-his antitelom i PE obeleženim antitelom za detekciju. Tanka linija na histogranu označava negativnu kontrolu: ćelije inkubirane samo sa anti-his antitelom i antitelom za detekcijom. ;Slika 13 ;Citotoksična aktivnost indukovana sa naznačenim interspecijski specifičnim MCSP specifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. A) Stimuiisane CD4-/CD56- humane PBMC su korišćene kao efektorske ćelije, CHO ćelije transficirane sa humanim MCSP D3 kao ciljne ćelije. B) Makaki T ćelijske linije 4119 LnPx su korišćene kao efektorske ćelije, CHO ćelije transficirane sa MCSP D3 makaki rakojeda kao ciljnim ćelijama. Anal iza je izvedena kao stoje opisano u Primeru 1 1. ;Slika14;Citotoksična aktivnost indukovana sa naznačenim interspecijski specifičnim MCSP specifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. A) i B) Makaki T ćelijske linije 4119 LnPx su korišćene kao efektorske ćelije, CHO cells transficirane sa MCSP D3 makaki rakojeda kao ciljnim ćelijama. Analiza je izvedena kao što je opisano u Primeru i 1. ;Slika 15 ;Citotoksična aktivnost indukovana sa naznačenim interspecijski specifičnim MCSP specifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. A) i B) Stimuiisane CD4-/CD56- humane PBMC su korišćene kao efektorske ćelije, CHO ćelije transficirane sa humanim MCSP D3 kao ciljnim ćelijama. Analiza je izvedena kao što je opisano u Primeru 11. ;Slika 16 ;Citotoksična aktivnost indukovana sa naznačenim interspecijski specifičnim MCSP specifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. A) Stimuiisane ;CD4-/CD56- humane PBMC su korišćene kao efektorske ćelije. CHO ćelije transficirane sa humanim MCSP D3 kao ciljnim ćelijama. B) Makaki T ćelijske linije 4119 LnPx su korišćene kao efektorske ćelije. CHO cells transficirane sa MCSP D3 makaki rakojeda kao ciljnim ćelijama. Anal iza jc izvedena kao što je opisano u Primeru 11. ;Slika 17 ;Citotoksična aktivnost indukovana sa naznačenim interspecijski specifičnim MCSP specifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. A) Stimuiisane CD4-/CD56- humane PBMC su korišćene kao efektorske ćelije, CHO ćelije transficirane sa humanim MCSP D3 kao ciljnim ćelijama. B) Makaki T ćelijske linije 4119 LnPx su korišćene kao efektorske ćelije, CHO cells transficirane sa MCSP D3 makaki rakojeda kao ciljnim ćelijama. Analiza je izvedena kao što je opisano u Primeru I 1. ;Slika 18 ;Stabilnost MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela u plazmi testirana merenjem citotoksične aktivnosti indukovane sa uzorcima naznačenih jednolančanih konstrukata inkubirana sa 50% humane plazme na 37°C i 4°C 24 časa respektivno ili sa dodatkom 50% humane plazme neposredno pre testiranja citotoksičnosti ili bez dodavanja plazme. CHO ćelije transficirane sa humanim MCSP korišćene su kao ciljna ćelijska linija i stimuiisane CD4-/CD56- humane PBMC su korišćene kao efektorske ćelije. Analiza je izvedena kao što je opisano u Primeru 12, ;Slika 19 ;Inicijalni pad i oporavak (tj. redistribucija) apsolutnog broja T ćelija (prazni kvadrati), u perifernoj krvi B-NHL pacijenata (pacijenti broj 1, 7,23, 30, 31, i 33 iz Tabele 4), koji esencijalno nisu imali cirkulišućc CD19-pozitivne ciljne B ćelije (puni trouglovi), tokom početne faze intravenske infuzije sa CD3 vezujućim molekulom CDI9xCD3 koji prepoznaje konvencionalni kontekstno zavisili CD3 epitop. Apsolutni broj ćelija dat je u 1000 ćelija po mikrofilm krvi. Prvi podatak prikazuje osnovni broj neposredno pre početka infuzije. CDI9xCD3 doza je data u zagradama pored broja pacijenta. ;Slika 20 ;(A) Ponovljena redistribucija T ćelija (prazni kvadrati) kod B-NHL pacijenta #19 (Tabela 4) koji nije imao cirkulišuće CD19-pozitivne ciljne B ćelije (puni trouglovi) i razvio je CNS simptome ;pod neprekidnom intravenskom infuzijom sa CD19xCD3 na početnoj dozi od 5 ug/m<2>/24č za ;jedan dan praćeno iznenadnim povećanjem doze do 15ug/m2/24č. Apsolutni broj ćelija dat jc u 1000 ćelija po mikrolitru krvi. Prvi podatak pokazuje osnovni broj neposredno pre početka infuzije. Nakon oporavka cirkulišućih T ćelija od prve epizode redistribucije inicirane sa početkom tretmana na 5u,g/m<2>/24č postepeno povećanje doze od 5 do I5ug/m<2>/24č iniciralo jc drugu epizodu redistribucije 7" ćelija koja je povezana sa razvojem CNS simptoma sa dominirajućom konfuzijom i dezorijentacijom. ;(B) Ponovljena redistribucija T ćelija kod B-NHL pacijenta, koji je razvio CNS simptome pod ponovljenom intravenskom bolus infuzijom sa CD19xCD3 pri 1.5pg/m<2>. Apsolutni broj ćelija dat ;je u 1000 ćelija po mikrolitru krvi. Vreme infuzije za svaku bolus primenu bilo je 2 do 4 Časa. Vertikalne strelice označavaju početak bolus infuzija. Podaci na početku svake bolus primene pokazuju broj T ćelija neposredno pre početka bolus infuzije. Svaka bolus infuzija pokrenula je epizodu redistribucije T ćelije koja je praćena oporavkom broja T ćelija pre sledeće bolus infuzije. Konačno treća epizoda redistribucije T ćelija povezana je sa razvojem CNS simptoma kod ovog pacijenta. ;Slika 21 ;Kompleksna šema redistribucije T ćelija (prazni kvadrati) kod B-NHL pacijenta #20 (Tabela 4) bez cirkulišućih CD 19-pozitivnih ciljnih B ćelija (pni trouglovi), tokom postepene inicijacije CD19xCD3 infuzije tj. jedankog postepenog povećanja stope protoka od skoro nula do 15 u.g/m<2>/24č tokom prva 24 časa tretmana. Apsolutni broj ćelija dalje u 1000 ćelija po mikrolitru krvi. Prvi podatak pokazuje osnovni broj neposredno pre početka infuzije. CDI9xCD3 doza je data u zagradama pored broja pacijenta. T ćelije koje sc ponovo pojavljuju u cirkulišućoj krvi nakon početne redistribucije započete sa prvim izlaganjem CD19xCD3 su delimično indukovane da ponovo nestanu iz cirkulišuće krvi sa i daljim povećanjem nivoa CD19xCD3 tokom faze postepenog povećavanja. ;Slika 22 ;Broj T i B ćelija tokom tretmana sa CD19xCD3 B-NHL pacijenta #13 (Tabela 4) koji je imao značajan broj cirkulišućih CD 19-pozitivnih ciljnih B (limfom) ćelija (puni trouglovi). Apsolutni broj ćelija dat je u 1000 ćelija po mikrolitru krvi. Prvi podatak pokazuje osnovni broj neposredno pre početka infuzije. CDI9xCD3 doza je data u zagradama pored broja pacijenta. T ćelije (prazni kvadrati) potpuno nestaju iz cirkulacije po početku CD19xCD3 infuzije i ne pojavljuju se ponovo dok cirkulišuće CD19-pozilivne B (limfom) ćelije (puni trouglovi) nisu depletirane iz periferne krvi. ;Slika 23;Ponovljena redistribucija T ćelija (prazni kvadrati) kod B-NHL pacijenta #24 (Tabela 4), koji suštinski nije imao cirkulišuće CD 19-pozitivne ciljne B ćelije (puni trouglovi) i razvio je CNS simptome po početku CD19xCD3 infuzije bez dodatnog HSA što jc potrbno za stabilizaciju leka (gornji panel). Nakon prvog oporavka cirkulišućih T ćelija od početne redistribucije nejednaki protok leka usled nedostatka slabilizujućih HSA inicirao je drugu epizodu redistribucije T ćelija koja jc bila povezana sa razvojem CNS simptoma sa dominirajućom konfuzijom i dezorijentacijom. Kada je isti pacijent korektno restartovan sa CD19xCD3 rastvorom koji sadrži dodatni HSA za stabilizaciju leka, nije uočena ponovljena redistribucija T ćelija (donji panel) i pacijent nije ponovo razvio bilo kakve CNS simptome. Apsolutni broj ćelija dat je u 1000 ćelija po mikrolitru krvi. Prvi podatak pokazuje osnovni broj neposredno pre početka infuzije. CD19xCD3 doza je data u zagradama pored broja pacijenta. ;Slika 24;Model adhezije T ćelija za endotelne ćelije indukovane monovalentnim vezivanjem za kontekstno zavisne CD3 epitope. Monovalentna interakcija konvencionalnog CD3 vezujućeg molekula za njegov konteksno zavisni epitop na CD3 epsilon može dovesti do alosteriČke promene u konformaciji CD3 praćene sa regrutovanjem Nck2 za citoplazmatski domen CD3 epsilon (Gil et al. (2002) Cell 109: 901). Kako je Nck2 direktno vezan za integrine preko PINCH i 1LK (Legate et al. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7: 20), regrutovanje Nck2 za citoplazmatski domen CD3 epsilon nakon alosteričke promene u konformaciji CD3 preko vezivanja konvencionalnog CD3 vezujućeg molekula (kao što je CD19xCD3 iz primera 13) za njegov kontekstno zavisni epitop na CD3 epsilon, može povećati adhezivnost T ćelija za endotelne ćelije putem prolazne promene integrina na površini T ćelije u njihovu adhezivniju izoformu preko unutra-spolja signalizacije. ;Slika 25;Citottoksična aktivnost CD33-AF5 VH-VL x 12C VH-VL test materijala korišćenog za in vivo studiju kod majmuna rakojeda kao što je opisano u Primeru 14. Specifična liza CD33-pozitivnih ciljnih ćelija određena je u standardnom testu oslobađanja<5i>hroma sa rastućim koncentracijama CD33-AF5 VH-VL x 12C VH-VL. Trajanje analize bilo je 18 časova. Makaki T ćelijska linija 4119 LnPx korišćena je kao izvor efektorskih ćelija. CHO ćelije transficirane sa CD33 makaki rakojeda služile su kao ciljne ćelije. Odnos efektorskih i ciljnih ćelija (E:T-odnos) bio jc 10:1. Koncentracija CD33-AF5 VH-VL x 12C VH-VL ncopodna za polu-maksimalnu lizu ciljnih ćelija (EC50) izračunata je iz krive odgovora na dozu sa vrednošću od 2.7 ng/ml. ;Slika 26 ;(A) Dozno- i vremenski-zavisna deplecija CD33-pozitivnih monocita iz periferne krvi makaki rakojeda preko intravenske neprekidne infuzije CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL kao što je ;opisano u Primeru 14. Procenat u odnosu na osnovnu vrednost (tj. 100%) apsolutnog broja cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita nakon trajanja tremana kao Što je naznačeno iznad kolona prikazano je za svakog od dva makaki rakojeda po nivou doze. Nivo doze (tj. stopa protoka infuzije) naznačena je ispod kolona. Nije uočena deplecija cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita kod životinja 1 i 2 tretiranih 7 dana na dozi od 30 pg/m<2>/24č. Kod životinja 3 i 4 tretiranih 7 dana na dozi od 60 u,g/m<2>/24č broj cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita smanjenje na 68% i 40% od osnovne vrednosti, respektivno. Na 240 pg/m<2>/24Č cirkulišuće CD33-pozitivne monocite skoro potpuno su depletirane iz periferne krvi nakon 3 dana tretmana (životinje 5 i 6). Na 1000 ug/m<2>/24č deplecija cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita iz periferne krvi završena je već nakon I dana tretmana (životinje 7 i 8). ;(B) Tok brojnosti T ćelija i CD33-monocita u perifernoj krvi dva makaki rakojeda tokom neprekidne infuzije CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL u toku 14 dana na 120 ug/m<2>/24č. Apsolutni ;broj ćelija dat jc u 1000 ćelija po mikrolitru krvi. Prvi podatak pokazuje osnovni broj neposredno pre početka infuzije. Nakon inicijalne mobilizacije CD33-monocita tokom prvih 12 časova po početku infuzije CD33-monociti iz periferne krvi (puni trouglovi) su depletirani za dve trećine (životinja 10) i 50% (životinja 9) u odnosu na respektivni osnovni broj tokom daljeg toka infuzije. Broj cirkulišućih T ćelija (prazni kvadrati) pokazao je ograničeni inicijalni pad praćen oporavkom još tokom prisustva cirkulišućih CD33-pozitivnih monocitnih ciljnih ćelija. ;Slika 27 ;Citotoksična aktivnost MCSP-G4 VF1-VL x I2C VH-VL test materijala korišćenog za in vivo studiju kod makaki rakojeda kao što je opisano u Primeru 15. Specifična liza MCSP-pozitivnih ciljnih ćelija određena je u standardnom testu oslobađanja 5lhroma sa rastućim koncentracijama MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL. Trajanje analize bilo jc 18 časova. Makaki I ćelijska linija 4119 LnPx korišćena je kao izvor efektorskih ćelija. CHO ćelije transficirane sa MCSP makaki rakojeda služile su kao ciljne ćelije. Odnos efektorskih i ciljnih ćelija (E:T-odnos) bio jc 10:1. Koncentracija MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL neopodna za polu-maksimalnu [izu ciljnih ćelija (EC50) izračunata je iz krive odgovora na dozu sa vrednošću od 1.9 ng/ml. ;Slika 28 ;Izostanak inicijalnih epizida pada i naknadnog oporavka broja T ćelija (tj. redistribucija) u perifernoj krvi makaki rakojeda tokom početne faze intravenske infuzije sa CD3 vezujućim molekulom MCSP-G4 VH-VL x 12C VH-VL koji prepoznaje suštinski kontekstno nezavisni CD3 epitop. Apsolutni broj ćelija jc dat u 1000 ćelija po mikrolitru krvi. Prvi podatak pokazuje osnovni broj neposredno pre početka infuzije. MCSP-G4 VH-VL x 12C VH-VL doza jc data u zagradama pored broja životinje. U poznatom izostanku MCSP-pozitivnih ciljnih ćelija iz cirkulišuće krvi makaki rakojeda nema indukcije redistribucije T ćelija (tj. inicijalna epizoda pada i naknadnog oporavka apsolutnog broja T ćelija) preko unakrsnog vezivanja CD3 posredovanog ciljnim ćelijama. Dodatno, indukcija redistribucije T ćelija (tj. inicijalna epizoda pada i naknadnog oporavka apsolutnog broja T ćelija) preko signala, koji T ćelije mogu primiti preko isključive interakcije samo sa CD3 vezujućim mestom, može sc izbeći korišćenjem CD3 vezujućih molekula kao što je MCSP-G4 VHVL x 12C VH-VL koji prepoznaje suštinski kontestno nezavisni CD3 epitop. ;Slika 29 ;FACS analiza vezivanja naznačenih interspecijski specifičnih bispecifičnih konstrukata sa CHO ćelijama transficiranim sa humanim CD33, humanom CD3+ T ćelijskom linijom HPB-ALL, CHO ćelijama transficiranim sa makaki CD33 i makaki PBMC respektivno. FACS bojenje je izvedeno kao što je opisano u Primeru 16.4. Podebljane linije predstavljaju ćelije inkubirane sa 5 pg/mi prečišćenog bispecifičnog jednolančanog konstrukta ili supematantom ćelijske kulture transficiranih ćelija koje eksprimiraju interspecijski specifične konstrukte bispecifičnog antitela. Puni histogram! označavaju negativne kontrole. Supernatant netransficiranih CHO ćelija je korišćen kao negativna kontrola. Za svaki interspecijski specifični bispecifični jednolančani konstrukt prikaz histograma pokazuje specifično vezivanje konstrukta za humani i makaki CD33 i humani i makaki CD3. ;Slika 30 ;Dijagrami prikazuju rezultate testa sa oslobađanjem hroma koji meri citotoksičnu aktivnost indukovanu sa naznačenim interspecijski specifičnim CD33 specifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. Efektorske ćelije su takode korišćene kao Što je naznačeno. Testovi su izvedeni kao stoje prikazano u Primeru 16.5. Dijagrami jasno pokazuju za svaki konstrukt potentno regrutovanje citotoksične aktivnosti humanih i makaki efektorskih ćelija protiv CHO ćelija transficiranih sa humanim i makaki CD33, respektivno. ;Slika 31 ;SDS PAGE gel i Western blot monitoring prečišćavanja interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula označenog kao E292F3 HL x I2C HL. Uzorci iz eluata, supernatant ćelijske kulture (SN) i protok kroz kolonu (FT) analizirani su kao što je naznačeno. Primenjen je proteinski marker (M) kao referenca za veličinu. Snažna proteinska traka sa molekulskom težinom između 50 i 60 kDa u SDS PAGE gelu pokazuje efikasno prečišćavanje interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula do veoma velikog stepena čistoće sa postupkom prečišćavanja u jednom koraku opisanom u Primeru 17.2. Western blot koji detektuje histidinć tag potvrđuje identitet proteinske trake u eluatu kao interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula. Slabi signal za protok kroz uzorak u ovom senzitivnom postupku za detekciju dodatno pokazuje skoro potpuno zarobljavanje bispecifičnih jednolančanih molekula sa postupkom prečišćavanja. ;Slika 32 ;SDS PAGE gel i VVestern blot monitoring prečišćavanja interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula označenog kao V207CI2 HL x F12C HL. Uzorci iz eluata, supernatant ćelijske kulture (SN) i protok kroz kolonu (FT) analizirani su kao što je naznačeno. Primenjen je proteinski marker (M) kao referenca za veličinu. Snažna proteinska traka sa molekulskom težinom između 50 i 60 kDa u SDS PAGE gelu pokazuje efikasno prečišćavanje interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula do veoma velikog stepena Čistoće sa postupkom prečišćavanja u jednom koraku opisanom u Primeru 17.2. Western blot koji detektuje histidinćtag potvrđuje identitet proteinske trake u eluatu kao interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula. Slabi signal za protok kroz uzorak u ovom senzitivnom postupku za detekciju dodatno pokazuje skoro potpuno zarobljavanje bispecifičnih jednolančanih molekula sa postupkom prečišćavanja. ;Slika 33 ;SDS PAGE gel i VVestern blot monitoring prečišćavanja interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula označenog kao AFSHLxF12QHL. Uzorci iz eluata, supernatant ćelijske kulture (SN) i protok kroz kolonu (FT) analizirani su kao što je naznačeno. Primenjen je proteinski marker (M) kao referenca za veličinu. Snažna proteinska traka sa molekulskom težinom između 50 i 60 kDa u SDS PAGE gelu pokazuje efikasno prečišćavanje interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula đo veoma velikog stepena čistoće sa postupkom prečišćavanja u jednom koraku opisanom u Primeru 17.2. VVestern blot koji detektuje histidin6 tag potvrđuje identitet proteinske trake u eluatu kao interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula. Signal u protoku kroz uzorak u ovom osetljivom postupku detekcije objašnjenje zasićenjem afinitetne kolone usled visokih koncentracija bispecifičnih jednolančanih molekula u supernatantu. ;Slika 34 ;Standardna kriva AF5HLxI2CHL u 50% serumu makaki majmuna. Gornji dijagram prikazuje standardnu krivu stvorenu za test kao što je opisan u Primeru 18.2. Donji dijagram prikazuje rezultate za kontrolu kvaliteta uzoraka AF5HLxl2CHL kod 50% seruma makaki majmuna. Stope oporavka su iznad 90% za visoku i srednju QC uzorka i iznad 80% za nisku QC uzorka. Stoga test omogućava detekciju AF5FILxI2CHL u uzorcima seruma u opsegu od 10 ng/ml đo 200 ng/ml (prc razređivanja). ;Slika 35 ;Standardna kriva MCSP-G4 HL x I2C HL u 50% serumu makaki majmuna. Gornji dijagram prikazuje standardnu krivu stvorenu za test kao Što je opisan u Primeru 18.2. Donji dijagram prikazuje rezultate za kontrolu kvaliteta uzoraka MCSP-G4 HL x I2C HL kod 50% seruma makaki majmuna. Stope oporavka su iznad 98% za visoku i srednju QC uzorka i iznad 85% za nisku QC uzorka. Stoga test omogućava detekciju MCSP-G4 HL x I2C HL u uzorcima seruma u opsegu od 10 ng/ml do 200 ng/ml (pre razređivanja). ;Slika 36 ;FACS analiza vezivanja anti-Flag antitela za CHO ćelije transficirane sa 1-27 N-terminalnim aminokiselinama CD3 epsilon naznačenih vrsta fuzionisanih sa EpCAM makaki rakojeda. FACS bojenje je izvedeno kao Što je opisano u Primeru 19.1. Podebljana linija predstavlja ćelije inkubirane sa anti-Flag antitelom. Puni histogram! odslikavaju negativne kontrole. PBS as 2 % FCSje korišćen kao negativna kontrola. Histogrami pokazuju jako i uporedivo vezivanje anti-Flag antitela za sve transfektante ukazujući na jaku i jednaku ekspresiju transficiranih konstrukata. ;Slika 37 ;FACS analiza vezivanja I2C IgGI konstrukta sa CHO ćelijama koje eksprimiraju 1-27 N-terminalne aminokiseline CD3 epsilon naznačenih vrsta fusionisanih sa EpCAM makaki rakojeda. FACS bojenje je izvedeno kao što je opisao u Primeru 19.3. Podebljane linije predstavljaju ćelije inkubirane sa 50 ml supernatanta ćelijske kulture ćelija koje eksprimiraju I2C IgG 1 konstrukt. Puni histogrami odslikavaju negativnu kontrolu. Ćelije koje eksprimiraju 1-27 N-terminalne aminokiseline CD3 epsilon svinje fuzionisane sa EpCAM makaki rakojeda korišćene su kao negativna kontrola. U poređenju sa negativnom kontrolom histogrami jasno pokazuju vezivanje I2C IgG 1 konstrukta za 1-27 N-terminalne aminokiseline CD3 epsilon čoveka, marmozeta, tamarina i veveričjeg majmuna. ;Slika 38 ;FACS analiza vezivanja I2C IgGI konstrukta kao stoje opisano u Primeru 19.2 za humani CD3 sa i bez Nterminalnog His6 taga kao što je opisano u Primerima 6.1 i 5.1 respektivno. Podebljane linije predstavljaju ćelije inkubirane sa anti-humanim CD3 antitelom UCHT-1, penla-His antitelom (Qiagen) i supernatantom ćelijske kulture ćelija koje eksprimiraju I2C IgGI konstrukt respektivno kao što je naznačeno. Puni histogrami odslikavaju ćelije inkubirane sa irelevantnim mišjim IgGI antitelom kao negativnom kontrolom. Dva gornja histogramska prikaza prikazuju uporedivo vezivanje UCHT-1 antitela za oba transfektanta u poređenju sa izotipskom kontrolom što pokazuje ekspresiju oba rekombinantna konstrukta. Centralni histogramski prikaz pokazuje vezivanje penta his antitela za ćelije koje eksprimiraju His6-humani CD3 epsilon lanac (His6-CD3) ali ne za ćelije koje eksprimiraju divlji tip CD3 epsilon lanca (WT-CD3). Donji histogramski prikazi pokazuju vezivanje I2C IgGI konstrukta sa divljim tipom humanog CD3 epsilon lanca ali nc za His6-humani CD3 epsilon lanac. Ovi rezultati pokazuju da je slobodni N-terminus esencijalan za vezivanje interspecijski specifičnog anti-CD3 vezujućeg molekula I2C za CD3 epsilon lanac. ;Slika 39 ;FACS analiza vezivanja naznačenih interspecijski specifičnih bispecifičnih konstrukata sa CHO ćelijama transficiranim sa humanim MCSP D3, humanom CD3+ T ćelijskom linijom HPB-ALL, CHO ćelijama transficiranim sa makaki MCSP D3 i makaki T ćelijskom linijom 4119 LnPx respektivno. FACS bojenje je izvedeno kao što je opisano u Primeru 10. Podebljane linije predstavljaju ćelije inkubirane sa 2 pg/ml prečišćenog bispecifičnog jednolančanog konstrukta ili supernatantom ćelija koji sadrži bispecifiČne jednolančane konstrukte. Puni histogrami označavaju negativne kontrole. Supernatant net ran slici ran ih CHO ćelijaje korišćen kao negativna kontrola za vezivanje sa T ćelijskim linijama. Jednolančani konstrukt sa irelevantnom ciljnom specifičnošću korišćen je kao negativna kontrola za vezivanje MCSP D3 transficiranih CHO ćelija. Za svaki interspecijski specifični bispecifični jednolančani konstrukt histogramski prikaz pokazuje specifično vezivanje konstrukta za humani i makaki MCSP D3 i humani i makaki CD3. ;Slika 40 ;Citotoksična aktivnost indukovana sa naznačenim interspecijski specifičnim MCSP D3 specifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. Efektorske ćelije i odnos efektorskih i ciljnih ćelija korišćen je takođe kako je naznačeno. Analiza je izvedena kao što je opisano u Primeru 11. Dijagrami jasno pokazuju potentnu interspecijski specifičnu regrutaciju citotoksične aktivnosti svakog konstrukta. ;Slika41;FACS analiza vezivanja naznačenih interspecijski specifičnih bispecifičnih konstrukata sa CHO ćelijama transficiranim sa humanim CD33, humanom CD3+ T ćelijskom linijom HPB-ALE, CHO ćelijama transficiranim sa makaki CD33i makaki PBMC respektivno. FACS bojenje je izvedeno kao što je opisano u Primeru 21.2. Podebljane linije predstavljaju ćelije inkubirane sa supernatantom ćelijske kulture transficiranih ćelija koje eksprimiraju interspecijski specifične konstrukte bispecifičnih antitela. Puni histogrami označavaju negativne kontrole. Supernatant netransficiranih CHO ćelijaje korišćen kao negativna kontrola. Za svaki interspecijski specifični bispecifični jednolančani konstrukt histogramski prikaz pokazuje specifično vezivanje konstrukta za humani i makaki CD33 i humani i makaki CD3. ;Slika 42 ;Dijagrami prikazuju rezultate testa sa oslobađanjem hroma koji meri citotoksičnu aktivnost indukovanu sa naznačenim interspecijski specifičnim CD33 specifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. Efektorske ćelije su takođe korišćene kao što je naznačeno. Testovi su izvedeni kao stoje prikazano u Primeru 21.3. Dijagrami jasno pokazuju za svaki konstrukt potentno regrutovanje citotoksične aktivnosti humanih i makaki efektorskih ćelija protiv CHO ćelija transficiranih sa humanim i makaki CD33, respektivno. ;Slika 43 ;Redistribucija T ćelija kod šimpanze pod nedeljnom intravenskom bolus infuzijom sa PBS/5% HSA i PBS/5% HSA plus konstrukt jednolančanog EpCAM/CD3-bispecifičnog antitela sa dozama ođ 1.6,2.0, 3.0 i 4.5 pg/kg. Vreme infuzije za svaku bolus primenu bilo je 2 Časa. Verikalne strelice označavaju početak bolus infuzija. Podaci na početku svake bolus primene pokazuju broj T ćelija neposredno pre početka bolus infuzije. Svaka bolus infuzija konstrukta jednolačanog EpCAM/CD3-bispecifičnog antitela, koji prepoznaje konvencionalni kontektno zavisni CD3 epitop, inicirala je epizodu redistribucije T ćelija praćenu sa oporavkom T ćelija na osnovne vrednosti pre sledeće bolus infuzije. ;Slika 44 ;CD3 specifična ELISA analiza periplazmatskih preparata koji sadrže Flag tagovane scFv protein fragmente iz izabranih klonova. Periplazmatski preparati rastvorljivih scFv protein fragmenata dodati su komoricama ELISA ploče, koja jc obložena sa rastvorljivim humanim CD3 epsilon (ak 1 -27)- Fc fuzionim proteinom i i koja je dodatno blokirana sa PBS 3% BSA. Detekcija je izvedena sa monoklonskim anti Flag-Biotin-obeleženim antitelom praćenim sa peroksidaza-konjugovanim Strcptavidinom. ELISA je razvijena sa rastvorom ABTS supstrata. OD vrednosti (y osa) merene su na 405 nm sa ELISA čitačem. Imena klonova su predstavljena na x osi. ;Slika 45;ELISA analiza periplazmatskih preparata koji sadrže Flag tagovane fragmente scFv proteina iz izabranih klonova. Isti periplazmatski preparati rastvorljivih fragmenata scFv proteina kao na Slici 44 dodati su komoricama ELISA ploče koja nije obložena sa humanim CD3 epsilon (ak 1-27)- Fc fuzionim proteinom već sa huigGl (Sigma) i blokirana sa 3% BSA u PBS. Detekcija je izvedena sa monoklonskim anti Flag-Biotin-obeleženim antitelom praćenim sa peroksidaza-konjugovanim Streptavidinom. ELISA je razvijena sa rastvorom ABTS supstrata. OD vrednosti (y osa) merene su na 405 nm sa ELISA čitačem. Imena klonova su predstavljena na x osi. ;Slika 46;FACS analiza vezivanja naznačenih interspecijski specifičnih bispecifičnih konstrukata sa CHO ćelijama transficiranim sa humanim PSMA, humanom CD3+ T ćelijskom linijom IIPB-ALL, CHO ćelijama transficiranim sa makaki PSMA i makaki T ćelijskom linijom 4119 LnPx respektivno. FACS bojenje jc izvedeno kao što je opisano u Primeru 24.4. Podebljane linije predstavljaju ćelije inkubirane sa supernatantom ćelija koje su naknadno inkubirane sa anti-his antitelom i PE obeleženim antitelom za detekciju. Tanka linija histograma odslikava negativnu kontrolu: ćelije inkubirane sa anti-his antitelom i antitelom za detekciju. ;Slika 47;Citotoksična aktivnost indukovana sa naznačenim interspecijski specifičnim bispecifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. A) i B) Stimuiisane CD4-/CD56- humane PBMC su korišćene kao efektorske ćelije, CHO ćelije transficirane sa humanim PSMA kao ciljnim ćelijama. Analiza je izvedena kao stoje opisano u Primeru 24.5. ;Slika 48 ;Citotoksična aktivnost indukovana sa naznačenim interspecijski specifičnim bispecifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. A) i B) Makaki T ćelijska linija 4119 LnPx je korišćena kao efektorske ćelije, CHO ćelije transficirane sa makaki PSMA kao ciljnim ćelijama. Analiza je izvedena kao što je opisano u Primeru 24.5. ;Slika 49 ;FACS analiza vezivanja naznačenih interspecijski specifičnih bispecifičnih konstrukata sa humanom PSMA pozitivnom ćelijskom linijom kancera prostate LNCaP, humanom CD3+ T ćelijskom linijom HPB-ALL, CHO ćelijama transficiranim sa makaki PSMA i makaki T ćelijskom linijom 4119 LnPx respektivno. FACS bojenje je izvedeno kao što jc opisano u Primeru 24.7. Podebljane linije predstavljaju ćelije inkubirane sa supernatantom transficiranih ćelija koje eksprimiraju interspecijski specifične konstrukte bispecifičnog antitela. Puni histogrami označavaju negativne kontrole. Medijum kulture ćelija je korišćen kao negativna kontrola. 2a svaki interspecijski specifični bispecifični jednolančani konstrukt histogramski prikaz pokazuje vezivanje konstrukta za humani PSMA i humani i makaki CD3. ;Slika 50 ;Dijagrami prikazuju rezultate testa sa oslobađanjem hroma koji meri citotoksičnu aktivnost indukovanu sa naznačenim interspecijski specifičnim bispecifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. Efektorske ćelije su takođe korišćene kao što je naznačeno. Testovi su izvedeni kao Što je prikazano u Primeru 24.8. Dijagrami jasno pokazuju za prikazane konstrukte potentno regrutovanje citotoksične aktivnosti humanih i makaki efektorskih T ćelija protiv PSMA pozitivnih ćelija kancera putem primera sa humanom ćelijskom linijom kancera prostate LNCaP ili makaki ćelijske linije 41 19LnPx. ;Slika 51 ;FACS analiza vezivanja naznačenih interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata sa PSMA pozitivnim ćelijama, FACS bojenje je izvedeno kao što je opisano u Primeru 24.7. Za svaki prikazani interspecijski specifični bispecifični jednolančani konstrukt histogramski prikaz pokazuje vezivanje konstrukta sa humanim PSMA i humanim i makaki CD3. ;Slika 52 ;Dijagrami prikazuju rezultate testa sa oslobađanjem hroma koji mcri citotoksičnu aktivnost indukovanu sa naznačenim interspecijski specifičnim bispecifičnim jednolančanim konstruktima preusmerenim na naznačene ciljne ćelijske linije. Efektorske ćelije su takođe korišćene kao što je naznačeno. Testovi su izvedeni kao što je prikazano u Primeru 24.8. Dijagrami jasno pokazuju za prikazane konstrukte potentno regrutovanje citotoksične aktivnosti humanih ili makaki efektorskih T ćelija protiv PSMA-pozitivnih ćelija. ;Slika 53 ;FACS analiza vezivanja naznačenih bispecifičnih jednolančanih konstrukata sa CHO ćelijama koje eksprimiraju naznačene humani/pacov PSMA himerc kao što jc opisano u Primeru 25.1. FACS bojenje je izvedeno kao što je opisano u Primeru 25.2. Podebljane linije predstavljaju ćelije inkubirane sa supernatantom ćelijske kulture transficiranih ćelija koje eksprimiraju konstrukte bispecifičnog antitela. Puni histogrami označavaju negativne kontrole. Supernatant netransficiranih CHO ćelijaje korišćen kao negativna kontrola. Za svaki bispecifični jednolančani konstrukt histogramski prikaz pokazuje specifično vezivanje konstrukta za sa himernim konstruktima huPSMArat!40-169, huPSMAratl9I-258, huPSMArat281-284, huPSMArat683-690 i huPSMArat716-750. Poredeći sa signalima dobijenim sa drugim bispecifičnim jednolančanim konstruktom postoji jasan izostanak vezivanja za konstrukte bispecifičnog jednolančanog antitela PM84-D7 x I2C, PM29-G1 x I2C i PM49-B9 x I2C za himerni konstrukt huPSMArat300-344. Dodatno poredeći sa signalima dobijenim sa drugim bispecifičnim jednolančanim konstruktom postoji jasan izostanak vezivanja za konstrukte bispecifičnog jednolančanog antitela PM34-C7 x 12C sa konstruktom huPSMArat598-61 7. ;Slika 54 ;Vezivanje scFv MP9076-A9, PSMA ciljne srukture za vezivanje PSMA BiTE antitela PM 76-A9 x I2C za 15-merne peptide koji se prostiru kroz ekstracelularni domen humanog PSMA i preklapaju se sa njihovim susednim peptidima sa 14 aminokiselina. Brojevi peptida dati su na X-osi. ELISA signali korišćenjem Hts detekcije dati su na Y-osi. ;Slika 55 ;Vezivanje scFv MP9076-B10, PSMA ciljne strukture za vezivanje PSMA Bi TE antitela PM 76-B10 x I2C za 15-merne peplide koji se prostiru kroz ckstracelularni domen humanog PSMA i preklapaju se sa njihovim susednim peptidima sa 14 aminokiselina. Brojevi peptida dati su na X-osi. ELISA signali korišćenjem His detekcije dati su na Y-osi. ;Slika 56 ;Vezivanje scFv F1-A10, PSMA ciljne strukture za vezivanje PSMA Bi'FE antitela PM F1-A10 x I2C za 15-merne peptide koji se prostiru kroz ekstracelularni domen humanog PSMA i preklapaju se sa njihovim susednim peptidima sa 14 aminokiselina. Brojevi peptida dati su na X-osi. ELISA signali korišćenjem His detekcije dati su na Y-osi. ;Slika 57 ;Potencijalni dominantni epitopi scFvs MP 9076-A9, MP 9076-B10 i F1-A10. Potencijalne vezujuće aminokiseline jezgra u trodimenzionalnoj strukturi humanog PSMA zaokružene su taČkastom linijom. Obojeni kodovi prikazuju scFvs i respektivne epitope. Kristalna struktura humanog PSMA objavljena je od strane Daviš et al. 2005 (PNAS, 102: 5981-6). ;f0090j Ovaj pronalazak je dodatno opisan putem sledećih ilustrativnih neograničavajućih primera koji omogućavaju bolje razumevanje ovog pronalaska i njegovih mnogih prednosti. ;PRIMERI ;1. Identifikacija CDSepsilon sekvenci iz uzoraka krvi ne~humanih primata ;[0091] Uzorci krvi sledećih ne-humanih primata korišćeni su za CD3epsilon-identifikaciju:Callithrixjacchus, Saguinus oedipus i Saimiris ciureus.Sveži uzorci cele krvi tretirane heparinom pripremljeni su za izolovanje ukupne ćelijske RNK prema protokolu proizvođača (QlAamp RNK Blood Mini Kit, OJagen). Ekstrahovana iRNK je transkribovana u cDNK prema objavljenim protokolima. Ukratko, 10 pl istaložene RNK inkubirano je sa 1.2 u.1 10x heksanukleotidne smeše (Roche) na 70 °C 10 minuta i uskladišteno na ledu. Dodataje reakciona smeša koja se sastoji od 4 ul 5x superscript II pufera, 0.2 ul 0.1 M ditiotreitola, 0.8 ul superscript II (Invitrogen), 1.2 pl dezoksiribonukleozid trifosfata (25 uM), 0.8 u.1 RNase Inhibitor (Roche) i 1.8 pl DNase i vode oslobođene od RNKaze (Roth). Reakciona smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 10 minuta praćeno sa inkubacijom na 42 °C 50 minuta i na 90 °C 5 minuta. Reakcija je ohlađena na ledu pre dodavanja 0.8 u.1 RNaseH (1 U/ul, Roche) i inkubirana 20 minuta na 37 °C. ;[0092]Prvi lanac cDNK od svake vrste podvrgnut jc zasebnom lančanim reakcijama polimeraze od 35-ciklusa korišćenjem Taq DNK polymerase (Sigma) i sledeće kombinacije prajmera dizajniranih na osnovu istraživanja baze podataka: forvvard prajmer 5'-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3<*>(SEQ ID NO: 253); reverse prajmer 5'-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3'(SEQ ID NO: 254);. Amplifikovanc trake od 550 bp prečišćene su na gelu (Gel Extraction Kit. Qiagen) i sekvencirane (Sequiscrve, Vaterstetten/Germany, videti popis sekvenci).

CD3epsilonCallithrix jacchus

Nukleotidi

[0093]

[0094]

CD3epsilonSaguimts oedipus

Nukleotidi

[0095]

[0096]

CD3epsilonSaimiris ciureus

Nukleotidi

[0097] [0098|

2. Stvaranje fragmenata interspecijski specifičnihjednolančanihantitela (scFv) koja sc vezuju za N-terminalne aminokiseline 1-27 CD3epsilon čoveka irazličitihprimata osim šimpanze

2.1. Imunizacija korišćenjem N-terminusa CD3epsilon odvojenog od svog nativnog CD3-konteksta sa fuzijom za heterologni rastvorljivi protein

[0099] Deset nedelja stari F1 miševi iz balb/c x C57black ukrštanja imunizovani su sa CD3epsilon-Fc fuzionim proteinom koji nosi najviše N-terminaine aminokiseline 1-27 zrelog CD3epsilon lanca (1-27 CD3-Fc) čoveka i/ili Saimiris ciureus. U tu svrhu 40 pg 1-27 CD3-Fc fuzionog proteina sa 10 nmoi tioat-modifikovanog CpG-oligonukleotida (5'-tccatgacgttcctgatgct-3') (SEQ ID No. 343) u 300 ul PBS injektovano je intraperilonealno po mišu. Miševi primaju buster imunizacije nakon 21, 42 i izborno 63 dana na isti način. Deset dana nakon prve buster imunizacije, uzeti su uzorci krvi i serumski titar antitela na i-27 CD3-Fc fuzioni protein testiran je sa ELISA. Dodatno, titar protiv CD3-pozitivne humane T ćelijske linije HPBall testiranje u protočnoj citometriji prema standardnim protokolima. Serumski titri su bili značajno viši kod imunizovanih nego kod neimunizovanih životinja.

2.2. Stvaranje bibliotekeimunihmišjih scFv antitela: Konstrukcija kombinatorne bibliotekeantitela i fagniprikaz

[0100]Tri dana nakon poseldnje injekcije sakupljene su ćelije mišje slezine za pripremu ukupne RNK prema standardnim protokolima.

[0101]Biblioteka DNK-fragmenata varijabilnog regiona (VK) lakog lanca (kapa) mišjeg imunoglobulina (Ig) i varijabilnog regiona teškog lanca (VH) Ig konslurisana je preko RT-PCR na RNK mišje slezine korišćenjem VK-i VH specifičnog prajmera. cDNK je sintetisana prema standardnim protokolima.

[0102] Prajmeri su dizajnirani tako da stvore 5,-Xhol i 3'-BstEll mesto prepoznavanja za amplifikovanc V-fragmentc teškog lanca i 5'-Sacl i 3'-Spel mesta prepoznavanja za amplifikovane VK DNK fragmente.

[0103] Za PCR-ampiifikaciju VH DNK-fragmenata svaki od osam različitih prajmera specifičnih za 5'-VH-familiju (MVHl(GC)AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT (SEQ ID No. 344); MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT (SEQ ID No. 345); MVH3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT (SEQ ID No. 346); MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA (SEQ ID No. 347): MVH5 GA(AG) GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA (SEQ ID No. 348); MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT

(SEQ ID No. 349); MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA (SEQ ID No. 350); MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT (SEQ lDNo. 351)) je kombinovan sa jednim 3'-VH prajmerom (3'MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt cee ttg gcc cea g (SEQ ID No. 352)); za PCR amplifikaciju fragmenata VK-lanca svaki od sedam različitih prajmera specifičnih za S'-VK-familiju (MUVKi CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT

CT (SEQ ID No. 353); MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC (SEQ ID No. 354); MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA (SEQ ID No. 355); MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA (SEQ ID No.

356); MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA (SEQ ID No. 357);

MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA (SEQ ID No. 358); MUVK7

CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA (SEQ ID No. 359)) kombinovan je sa jednim 3'-VK prajmerom (3'MuVkHindIII/BsiVVl tgg tgc act agt cgt acg ttt gat ete aag ctt ggt cee (SEQ ID No. 360)).

[0104] Sledeći PCR program je korišćen za amplifikaciju: denaturacija na 94°C 20 sek; aniling prajmera na 52°C 50 sek i ekstenzija prajmera na 72°C 60 sek i 40 ciklusa, praćeno sa 10 min finalne ekstenzije na 72°C.

[0105] 450 ng fragmenata kapa lakog lanca (Sacl-Spel digestovanih) vezani su sa 1400 ng fagemida pComb3II5Bhis (Sacl-Spel digestovan; veliki fragment). Rezultujuća kombinatorna biblioteka antitela je zatim transformisana u 300 ul elcktrokompetentne Escherichia coli XLI Blue ćelije preko elektro po racije (2.5 kV, 0.2 cm gap kiveta, 25 uFD, 200 Om, Biorad gene-pulser) što je rczultovalo u veličini biblioteke većoj od IO7 nezavisnih klonova. Nakon jednog časa fenotipske ekspresije, pozitivni transformanti su izabrani u odnosu na karbenicilin rezistenciju kodiranu sa pComb3H5BIIis vektorom u 100 ml tečne super buljon (SB)-kulture preko noći. Ćelije su zatim sakupljene centrifugiranjem i priprema plazmidaje izvedena korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta za pripremu plazmida (Qiagen).

[0106] 2800 ng ove plazmidne-DNK koja sadrži VK-bib!ioteku (XhoI-BstEII digestovana; veliki fragment) vezano je sa 900 ng V-fagmenata teškog lanca (XhoI-BstEII digestovanih) i ponovo transformisano u dve 300 ul alikvote elektrokompetentne E. coli XL1 Blue ćelije elektroporacijom (2.5 kV, 0.2 cm gap kiveta, 25 uFD, 200 Om) što rezuituje u ukupnoj VH-VK scFv (jednolančani varijabilni fragment) veličini biblioteke većoj od IO<7>nezavisnih klonova.

[0107] Nakon fenotipske ekspresije i spore adaptacije na karbenicilin, ćelije E. coli koje sadrže biblioteku antitela prenete su u SB-Carbenicillin (50 ug/mE) selekcioni medijum. E. coli ćelije koje sadrže biblioteku antitela su zatim inficirane sa infektivnom dozom od IO<12>čestica helper faga VCSM13 Što rezuituje u proizvodnji i sekreciji filamentoznog M13 faga, gde čestica faga sadrži jednolančanu pComb3H5BHis-DNK koja kodira mišji scFv-fragmcnt i koja je prikazivala odgovarajući scFv-protein kao translacionu fuziju sa proteinom III omotača faga. Ovaj pul faga koji prikazuje biblioteku antitela kasnije je korišćen za selekciju entiteta koji vezuju antigen.

2.3. Selekcija CD3-specifičnih vezujućih sredstava zasnovana na fagnom prikazu

[0108] Biblioteka faga koja nosi klonirani scFv-rcpcrtoar sakupljena je iz respektivnog supernatanta kulture sa PEG8000/NaCI precipitacijom i centrifugiranjem. Oko 10" do 10<12>scFv čestica faga resuspendovano je u 0.4 mi PBS/0.1% BSA i inkubirano sa \ 0i to IO<7>Jurkat ćelija (CD3-pozitivna humana T-ćelijska linija) 1 čas na ledu uz sporu agitaciju. Ove Jurkat ćelije su uzgajane prethodno u RPMI medijumu obogaćenom sa fetalnim goveđim serumom (10 %), glutaminom i penicilinom/slreptomicinom, sakupljene centri fugiranj em, isprane u PBS i resuspendovane u PBS/1 % FCS (koji sadrži Na Azid). scFv fagi koji se ne vezuju specifično sa Jurkat ćelijama eliminisani su sa do pet koraka ispiranja sa PBS/1 % FCS (koji sadrži Na azid). Nakon ispiranja, vezujući entiteti su eluirani iz ćelija resuspendovanjem ćelija u HCl-glicinu pH 2.2 (10 min inkubacije sa naknadnim vorteksovanjem) i nakon neutralizacije sa 2 M Tris pH 12, eluat je korišćen za infekciju sveže neinficirane E. coli XL1 Blue kuiture (OD600 > 0.5). E. coli kultura koja sadrži ćelije E. coli koje su uspešno transdukovanc sa kopijom fagemida. koji kodira humani scFv-fragment, ponovo su selekcionisane u odnosu na rezistenciju na karbenicilin i naknadno inficirane sa VCMS 13 helperfagom da bi se započela druga runda prikaza antitela i in vitro selekcija. Obično je izvršeno ukupno 4 do 5 rundi selekcije.

2.4. Skrining za CD3-specifično vezivanje

[0109] Plazmidna DNK koja odgovara 4 i 5 rundi paninga izolovana je iz E. coli kultura nakon selekcije. Za proizvodnju rastvorljivog scFv-protein. VH-VL-DNA fragmenti su isečeni iz plazmida (Xhol-Spel). Ovi fragmenti su klonirani preko istih restrikcionih mesta u plazmidu pComb3H5BFlag/His koji se od originalnog pComb3H5BHis razlikuje po tome što ekspresioni konstrukt (npr. scFv) uključuje Flag-tag (TGD YKDDDDK) između scFv i Fiis6-taga i dodatni proteini faga su uklonjeni. Nakon vezivanja, svaki pul (različite runde paninga) plazmidne DNK je transformisan u 100 ml za toplotni šok kompetentne E. coliTGl ili XL1 blue i stavljen na ploču sa karbenicilin LB-agar. Pojedinačne kolonije su uzete u 100 ul LB carb (50 ug/ml).

[0110] E. coli transformisana sa pComb3H5BHis koji sadrži VL-i VH-segment proizvodi ratsvorljivi scFv u dovoljnim količinama nakon isecanja fragmenta gena III i indukcije sa I mM IPTG. Usled pogodne signalne sekvence, scFv-lanac je eksportovan u periplazmu gde se savija u fukcionalnu konformaciju.

[0111] Pojedinačne E. coli TG1 bakterijske kolonije iz transformacionih ploča uzete su iz periplazmatskih preparata u malom obimu i uzgajane u SB-medijumu (npr. 10 ml) sa dodatkom 20 mM MgCb i karbenicilina 50 ug/ml (i ponovo rastvorene u PBS (npr. 1 ml) nakon sakupljanja. Sa četiri runde zamrzavanja na -70°C i odmrzavanja na 37°C, temperaturnim šokom je uništena spoljna membrana bakterija i rastvorljivi periplazmatski proteini uključujući scFvs oslobođeni su u supernatant.

[0112] Nakon eliminacije intaktnih ćelija i ostataka ćelija sa centrifugiranjem, supernatant koji sadrži humane antihumane CD3-scFvs sakupljen je i korišćen za dalje ispitivanje.

2.5. Identifikacija CD3-specifičnog vezivanja

[0113] Vezivanje izolovanih scFvs testirano je protočnom citometrijom na eukariotskim ćelijama, koje na svojoj površini eksprimiraju heterologni protein koji na svon N-lerminusu prikazuje prvih 27 N-terminalnih aminokiselina CD3epsilona.

[0114] Kao što je opisano u Primeru 4, prve aminokiseline 1-27 N-terminalne sekvence zrelog CD3 epsilon lanca humanog kompleksa T ćelijskog receptora (aminokiselinska sekvenca: QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTV1LT SEQ ID NO: 2) fuzionisane su sa N-terminusom Iran smemb ran skog proteina EpCAM tako daje N-terminus lociran na spoljašnjoj površini ćelije. Dodatno, FLAG epitop je ubačen između N-tcrminalne 1-27 CD3epsilon sekvence i EpCAM sekvence. Ovaj fuzioni proizvod je eksprimiran u ćelijama humanog embrionalnog bubrega (MEK) i ovarijuma kineskog hrčka (CHO).

[0115] Eukariotskc ćelije koje prikazuju 27 N- najterminalnijih aminokiselina zrelog CD3epsilon drugih vrsta primata pripremljene su na isti način za Saimiri ciurcus (veveričji majmun) (CD3 epsilon N-terminalna aminokiselinska sekvenca: QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID NO: 8), za Cal!ithrix jacchus (CD3 epsilon N-terminalna aminokiselinska sekvenca: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID NO: 4) i za Saguinus oedipus (CD3 epsilon N-terminalna aminokiselinska sekvenca: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID NO: 6).

[0116] Za protočnu citometriju 2,5xl0<:>>ćelijaje inkubirano sa 50 u! supernatanta ili sa 5 pg/ml prečišćenih konstrukata u 50 pl PBS sa 2% FCS. Vezivanje konstrukata je detektovano sa anti-His antitelom (Penta-His Anlibodv, BSA free, Qiagen GmbH, Hilden, FRG) na 2 pg/ml in 50 pl PBS sa 2% FCS. Kao sledeći korak korišćen je reagens kozji anti-mišji IgG R-fikoentrin konjugovani afinitetno prečišćeni F(ab')2 fragment (Fc-gama fragment specifičan), rastvoren 1:100 u 50 pl PBS sa 2% FCS (Dianova, Hamburg, FRG). Uzorci su mereni na FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG).

[0117] Vezivanje je uvek potvrđeno sa protočnom citometrijom kao što je opisano u prethodnom paragrafu o primarnim T ćelijama čoveka i različitih primata (npr. saimiris ciureus, callithrix jacchus, saguinus oedipus).

2.6. Stvaranje humanih/humanizovanih ekvivalenata nc-humanih CD3epsilon specifičnih scFvs

[0118] VH region mišjeg anti-CD3 scFv poravnat je sa aminokiselinskim sekvencama antitela humane klicine linije. Izabrana je VH sekvenca antitela humane klicine linije koja je imala najbližu homologiju sa nc-humanim VII i izvedeno jc direktno poravnanje dve aminokiselinske sekvence. Postojao je određeni broj okvirnih ostataka ne-humanog VH koji se razlikuje od humanih VH okvirnih regiona ("različite okvirne pozicije"). Neki od ovih ostatka mogu doprineti vezivanju i aktivnosti antitela u odnosu na njegovu ciljnu strukturu.

[0119] Da bi sc konstruisala biblioteka koja sadrži mišje CDRs i na svakoj okvirnoj poziciji koja sc razlikuje od izabrne humane VH sekvence obe mogućnosti (humani i majčinski mišji aminokiselinski ostatak), sintetisani su degenerisani oligonukleotidi. Ovi oligonukleotidi uključuju humani ostatak na različitim pozicijama sa verovatnoćom od 75 % i mišji ostatak sa verovatnoćom od 25 %.

[0120] Za jedan humani VH npr. moralo se sintetisati šest od ovih oligonukleotida koji se preklapaju u terminalnom delu od oko 20 nukleotida. U tu svrhu svaki drugi prajmer bio je antisens prajmer. Restrikciona mesta potrebna za kasnije kloniranje unutar oligonukleotida su uklonjena.

[0121] Ovi prajmeri su dužine 60 do 90 nukleotida, u zavisnosti od broja prajmera koji su potrebni da obuhvate celu V sekvencu.

[0122] Ovih npr. šest prajmera je pomešano u jednakim količinama (npr. 1 ul svakog prajmera (primer stok 20 do 100 uM) za 20 pl PCR reakciju) i dodati su PCR smeši koja sadrži PCR pufer, nukleolide i Taq polimerazu. Ova smeša je mešana na 94 °C 3 minuta, 65 °C 1 minut, 62°C 1 minut, 59 °C 1 minut, 56 °C 1 minut, 52 °C 1 minut, 50 °C 1 minut i na 72°C 10 minuta u PCR aparatu. Posle toga je proizvod pušten na elektroforezu na agaroznom gelu i proizvod veličine od 200 do 400 je izolovan iz gela prema standardnim postupcima.

[0123] Ovaj PCR proizvod je zatim korišćen kao šablon za standardnu PCR reakciju korišćenjem prajmera koji uključuju Nterminalna i C-terminalna pogodna klonirajuća restrikciona mesta.

[0124] DNK fragment odgovarajuće veličine (za VH oko 350 nukleotida) izolovan je clcktroforezom na agaroznom gelu prema standardnim postupcima. Na ovaj način amplifikovano je dovoljno VH DNK fragmenata. Ovaj VH fragment je sada postao pul VH fragmenata gde svaki ima različitu količinu humanih i mišjih ostataka na respektivnim okvirnim pozicijama koje se razlikuju (pul humanizovanih VH). Ista procedura je izvedena za VL region mišjeg anti-CD3 scFv (pul humanizovanih VL).

[0125] Pul humanizovanih VH jc zatim kombinovan sa pulom humanizovanih VL vektora pComb3H5Bhis za fagni prikaz da bi se stvorila biblioteka funkcionalnih scFvs od kojih su - nakon prikaza na filamentoznom fagu - anti-CD3 scFv izabrani, podvrgnuti skriningu, identifikovani i potvrđeni kao što je opisano prethodno za roditeljske ne-humane (mišje). Pojedinačni klonovi su zatim analizirani u odnosu na poželjne osobine i aminokiselinsku sekvencu. Poželjni su oni scFvs koji su bili najbliži po homologiji aminokiselinske sekvence sa V-segmentima humane klicine linije, naročito oni gde najmanje jedan CDR od CDR I i II od VH i CDR I i II od VLkapa ili CDR i i II od VLlambda pokazuje više od 80% identičnosti aminokiselinske sekvence sa najbližim respektivnim CDR od svih V-segmenata humane klicine linije. Anti-CD3 scFvs su konvertovani u rekombinantna bispecifična jednolančana antileia kao što je opisano u slcdećim Primerima 9, 16, i 24. 3. Stvaranje rckombinatnog fuzionog proteina N-terminalnih aminokiselina 1-27 humanog CD3 epsilon lanca fuzionisanih sa Fc-delom IgGI (1-27 CD3-Fc).

3.1. Kloniranje i ekspresija 1-27 CD3-Fc

[0126] Kodirajuća sekvenca 1-27 N-tcrminalnih aminokiselina humanog CD3 epsilon lanca fuzionisana sa zglobnim i Fc gama regionom humanog imunoglobulina IgGI kao i 6 Histidin tagom dobijeni su genskom sintezom prema standardnim protokolima (cDNK sekvenca i aminokiselinska sekvenca rekombinantnog fuzionog proteina navedeni su pod SEQ ID NOs 230 i 229). Fragment dobijen genskom sintezom je dizajniran tako sa sadrži prvo Kozak site za eukariotsku ekspresiju konstrukta, praćen sa lider peptidom imunoglobulina od 19 aminokiselina, praćen u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom prvih 27 aminokiselina ekstracelulranog dela epitopa zrelog humanog CD3 epsilon lanca, praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom zglobnog regiona i Fc gama delom humanog IgGI, praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom 6 Histidine taga i stop kodonom (Slika I). Fragment dobijen genskom sintezom je takođe dizajniran tako da uvede restrikciona mesta na početku i na kraju cDNK koja kodira fuzioni protein. Uvedena restrikciona mesta, EcoRI na 5' kraju i Sali na 3' kraju, korišćena su u narednim procedurama kloniranja. Fragment dobijen genskom sintezom kloniran je preko EcoRI i Sali u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisanu Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025 i Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) praćenjem standardnih protokola. Plazmid sa proverenom sekvencom je korišćen za transfekciju u FreeStyle 293 Exprcssion System (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) prema protokolu proizvođača. Nakon 3 dana supernatanti ćelijske kulture transfektanata su sakupljeni i testirani za prisustvo rekombinantnog konstrukta u ELISA testu. Kozji anti-human i IgG, Fc-gama fragment specifično antitelo (dobijeno od Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK) razblaženo je u PBS do 5 pg/ml i obloženo sa 100 pl po komorici na MaxiSorp 96-komornoj ELISA ploči (Nunc GmbH & Co. KG, VViesbađen, Germany) preko noći na 4 °C. Komorice su isprane sa PBS sa 0,05 % Tvveen 20 (PBS/Tvveen i blokirane sa 3 % BSA u PBS (goveđi albumin, frakcija V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) 60 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Posle toga, komorice su ponovo isprane sa PBS/Tvveen i zatim inkubirane sa supernatantima ćelijske kulture 60 minuta na RT. Nakon ispiranja komorice su inkubirane sa peroksidaza konjugovanim anti-His6 anttielom (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheitn, Germanv) razblažene sa 1:500 u PBS sa I % BSA 60 minuta na RT. Posle toga. komorice su isprane sa 200 pl PBS/Tvveen i dodato je 100 ul S1GMAFAST OPD (SiGMAFAST OPD [o-fenilendiamin dihidrohlorid] rastvor supstrata (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) prema protokolu proizvođača. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100<p>l 1 M H2SO4. Boja reakcije je merena na PowcrWaveX microplate speclrophotometer (BioTek Instruments, Inc., VVinooski, Vermont, USA) na 490 nm i oduzimenjem bazne apsorpcije na 620 nm. Kao što je prikazano na Slici 2 prisustvo konstrukta u poređenju sa irelevantnim supernatantom lažno-transficiranih HEK 293 ćelija korišćenih kao negativna kontrola moglo se jasno detektovati.

3.2, Test vezivanja interspecijski specifičnih jednolančanih antitela sa 1-27 CD3-Fc.

[0127] Vezivanje sirovih preparata periplazmatski eksprimiranih interspecijski specifičnih jednolančanih antitela specifičnih za CD3 epsilon za 1-27 CD3-Fc testirano je u FXISA testu. Kozji anti-humani IgG, Fc-gama fragment specifično antitelo (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK) razblaženo je u PBS do 5 ug/ml i obloženo sa 100 pl po komorici na MaxiSorp 96-komornoj ELISA ploči (Nunc GmbH & Co. KG, VVtesbaden, Germanv) preko noći na 4 °C. Komorice su isprane sa PBS sa 0,05 % Tvveen 20 (PBS/Tvveen i blokirane sa 3 % BSA u PBS (goveđi albumin, frakcija V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) 60 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Posle toga, komorice su isprane sa PBS/Tvveen i zatim inkubirane sa supernatantima ćelija koje eksprimiraju 1-27 CD3-Fc konstrukt 60 minuta na RT. Komorice su isprane sa PBS/Tvveen i inkubirane sa sirovim preparatima periplazmatski eksprimiranim interspecijski specifičnim jednolančanim antitelima kao što je prethodno opisano 60 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa PBS/Tvveen komorice su inkubirane sa peroksidaza konjugovanim anti-Flag M2 anttielom (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) razblažene 1:10000 u PBS sa 1 % BSA 60 minuta na RT. Komorice su isprane sa PBS/Tvveen i inkubirane sa 100 pl SIGMAFAST OPD (SIGMAFAST OPD [o-fenilendiamin dihidrohlorid] rastvor supstrata (Sigma-Aiđrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) prema protokolu proizvođača. Bojena reakcija je zaustavljena sa 100 pl I M H2SO4i merena na PowerWaveX microplate speetrophotometer (BioTek Instruments, Inc., VVinooski, Vermont, USA) na 490 nm i oduzirnenjem osnovne apsorpcije na 620 nm. Uočeno je snažno vezivanje interspecijski specifičnih humanih jednolančanih antitela specifičnih za CD3 epsilon sa 1-27 CD3-Fc konstruktom u poređenju sa mišjim anti CD3 jednolančanim antitelom (Slika 3). 4. Stvaranje rekombinantnih transmembranskih proteina N-terminalnih aminokiselina 1-27 CD3 epsilon od različitih primata osim šimpanze fuzionisanih sa EpCAM od makaki rakojeda (1-27 CD3-EpCAM).

4.1. Kloniranje i ekspresija 1-27 CD3-EpCAM

[0128] CD3 epsilon je izolovan iz različitih primata osim šimpanze (marmozet. tamarin, vevričji majmun) i svinje. Kodirajuće sekvence 1-27 N-tcrminalnih aminokiselina CD3 epsilon lanca zrelog humanog, običnog marmozeta( Callithrix jacchus),pinča tamarina( Saguinus oedipus),običnog veveričjeg majmuna( Saimiri sciureus)i domaće svinje(Sus scrofa:koriŠćena kao negativna kontrola) fuzionisanih sa N-terminusom Flag tagovanog EpCAM makaki rakojeda dobijene su genskom sintezom prema standardnim protokolima. cDNK sekvenca i aminokiselinska sekvenca rekombinatnih fuzionih proteina dati su pod SEQ ID NOs 231 to 240). Fragmenti dobijeni genskom sintezom dizajnirani su da sarže prvo BsrGI mesto da bi se omogućila fuzija u korektnom okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom imunoglobulinskog lider peptida od 19 aminokiselina koji jc već prisutan u ciljnom ekspresionom vektoru, koji je praćen u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom N-terminalnih 1-27 aminokiselina ekstracelularnog dela zrelih CD3 epsilon lanaca, što jc praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom Flag taga i praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom zrelog EpCAM transmembranskog proteina makaki rakojeda (Slika 4). Fragmenti dobijeni genskom sintezom takođe su dizajnirani da uvedu restrikciono mesto na kraju cDNK koja kodira fuzioni protein. Uvedena restrikciona mesta BsrGI na 5' kraju i Sali na 3' kraju, korišćena su u narednim procedurama kloniranja. Fragmenti dobijeni genskom sintezom su zatim klonirani preko BsrGI i Sali u derivat plazmida označen kao pEF DHFR (pEF-DHFR je opisan u Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), koji je već sadržao kodirajuću sekvencu imunoglobulinskog lider peptida od 19 aminokiselina praćenjem standardnih protokola. {0129] Plazmidi sa verifikovanom sekvencom korišćeni su da prolazno transficiraju 293-HEK ćelije korišćenjem MATra-A Reagent (IBA GmbH, Gottingen, Germanv) i 12 pg DNK plazmida za odgovarajuće 293-HEK ćelije u posudama od 175 ml za ćelijsku kulturu prema protokolu proizvođača. Nakon 3 dana kultivisanja ćelija transfektanti su testirani u odnosu na ekspresiju rekombinantnog transmcmbranskog proteina na ćelijskoj površini preko FACS analize prema standardnim protokolima. U tu svrhu 2,5x105 cells inkubiran je sa anti-Flag M2 antitelom (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) sa 5 pg/ml u PBS sa 2% FCS. Vezano antitelo je detektovano sa kozjim anti-mišjim IgG R-fikoertirin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD bioscicnccs, Heidclberg, Germanv). Ekspresija Flag tagovanih rekombinantih transmembraniskih proteina koji se sastoje od EpCAM makaki rakojeda i 1-27 N-terminalnih aminokiselina humanog, marmozeta. tamarina, veveričjeg majmuna i svinjskog CD3 epsilon lanca respektivno na trasficiranim ćelijama mogao se jasno detektovati (Slika 5).

4.2. Vezivanje interspecijski specifičnih anti-CD3 jednolančanih antitela sa 1-27 CD3-EpCAM

[0130] Vezivanje sirovih preparata periplazmatski eksprimiranih interspecijski specifičnih anti CD3 jednolančanih antitela sa 1-27 N-terminalnim aminokiselinama humanog, marmozeta, tamarina i veveričjeg majmuna CD3 epsilon lanaca respektivno fuzionisanih sa Ep-CAM makaki rakojeda testirano je u FACS analizi prema standardnim protokolima.

[0131] U tu svrhu 2,5x10<5>ćelija inkubirano je sa sirovim preparatima periplazmatski eksprimiranih interspecijski specifičnih anti CD3 jednolančanih antitela (priprema je izvedena kao što je prethodno opisano prema standardnim protokolima) i jednolančanim mišjim anti-humanim CD3 antitelom kao negativnom kontrolom. Kao sekundarno antitelo korišćeno je Penta-His antitelo (Ojagen GmbH, Hildesheim, Germanv) sa 5 pg/ml u 50 pl PBS sa 2% FCS. Vezivanje antitela je detektovano sa kozjim anti-mišjim IgG R-fikoertirin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim, razblaženog 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germanv). Kao što je prikazano na Slikama 6 (A do E) uočeno je vezivanje jednolančanih antiteia za transfektante koji eksprimiraju rekombinantne transmembranske fuzione proteine koji se sastoje od 1-27 N-terminalnih aminokiselina CD3 epsilon čoveka, marmozeta, tamarina ili veveričjeg majmuna fuzionisanim sa EpCAM makaki rakojeda. Nije uočeno vezivanje interspecijski specifičnih jednolančanih antitela sa fuzionim proteinom koji se sastoji od 1-27 N-terminalnih CD3 epsilon svinje fuzionisanog sa EpCAM makaki rakojeda koriŠćenim kao negativna kontrola. Pokazana je multi-primat interspecijska specifičnost anti-CD3 jednolančanih antitela. Signali dobijeni sa anti Flag M2 antitelom i interspecijski specifičnim jednolačanim antitelima bili su uporedivi, ukazujući na snažnu vezujuću aktivnost interspecijski specifičnih jednolančanih antitela za Nterminalne aminokiseline 1-27 CD3 epsilon. 5. Analiza vezivanja interspecijski specifičnih anti-CD3 jednolančanih antitela preko alanin-skeninga mišjih ćelija transficiranih sa humanim CD3 epsilon lancem i njegovi alanin mutanti

5.1. Kloniranje i ekspresija humanog divljeg tipa CD3 epsilon

[0132] Kodirajuća sekvenca humanog CD3 epsilon lanca dobijena je genskom sintezom prema standardnim protokolima (cDNK sekvenca i aminokiselinska sekvenca humanog CD3 epsilon lanca date su pod SEQ ID Nos 242 i 241). Fragment dobijen genskom sintezom dizajniranje tako da sadrži Kozak site za eukariotsku ekspresiju konstrukta i restrikciona mesta na početku i kraju cDNK koja kodira humani CD3 epsilon. Uvedena restrikciona mesta EcoRI na 5' kraju i Sali na 3' kraju, korišćena su u sledećim procedurama kloniranja. Fragment dobijen genskom sintezom jc zatim kloniran preko EcoRI i Sali u plazmid označen kao pEF NEO prateći standardne protokole. pEFNEOje izveden iz pEF DHFR (Mack et al. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92(1995) 7021-7025) zamenom cDNK iz DHFR sa cDNK sa neomicin rezistencijom konvencionalnim molekularnim kloniranjem. Plazmid sa verifikovan sekvencom korišćen je za transfekciju mišje T ćelijske linije EL4 (ATCC No. TIB-39) kultivisane u RPM1 sa stabilizovanim L-glutaminom sa dodatkom 10 % FCS, 1% penicilm/streptomicin, 1% HEPES, 1% piruval, 1% ne esencijalne aminokiseline (sve Biochrom AG Berlin, Germanv) na 37 °C, 95 % vlažnosti i 7 % CO2. Transfekcija je izvedena sa SuperFect Transfection Reagent (Qiagen GmbH, Hilden, Germanv) i 2 pg DNK plazmida prema protokolu proizvođača. Nakon 24 časa ćelije su isprane sa PBS i ponovo kultivisane u prethodno pomenutom medij umu za kulturu ćelija sa 600 pg/ml G418 za selekciju (PA A Laboratories GmbH, Pasching, Austria). 16 do 20 dana nakon transfekcije uočen je rast rezistentnih ćelija. Nakon dodatnih 7 do 14 dana ćelije su testirane u odnosu na ekspresiju humanog CD3 epsilon FACS analizom prema standardnim protokolima. 2,5xl0<5>ćelijaje inkubirano sa anti-humanim CD3 antitelom UCHT-1 (BD biosciences, Heidelberg, Germanv) sa 5 pg/ml u PBS sa 2% FCS. Vezivanje antitela detektovano je sa kozjim anti-mišjim IgG R-fikoertirin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim, razređenim 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket. Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACSCalibur (BD bioscienccs, Heiđelberg, Germany). Ekspresija humanog divljeg tipa CD3 na transficiranim EL4 ćeli jama prikazana je na Slici 7.

5.2. Kloniranje i ekspresija interspecijski specifičnih anti-CD3 jednolančanih antitela kao IgGI antitela

[0133] Da bi se obezbedila poboljšana sredstva za detekciju vezivanja interspecijski specifičnih jednolančanih anti-CD3 antitela H2C HLP, A2J HLP i E2M HLP su konvertovani u IgGI antitela sa mišjim IgGI i humanim lambda konstantnim regionima. cDNK sekvence koje kodiraju teške i lake lance respektivnih IgG antitela dobijene su genskom sintezom prema standardnim protokolima. Fragmenti dobijeni genskom sintezom za svaku specifičnost označeni su tako da sadrže prvo Kozak mesto da bi se omogućila eukariotska ekspresija konstukta, koja je praćena sa lider peptidom imunoglobulina od 19 aminokiselina (SEQ ID NOs 244 i 243), koja je praćena u okviru čitanja kodirajućom sekvencom respektivnog varijabilnog regiona teškog lanca ili respektivnog varijabilnog regiona lakog lanca, praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca mišjeg IgGI (SEQ ID NOs 246 i 245) ili kodirajućom sekvencom konstantnog regiona humanog lambda lakog lanca (SE,Q ID NO 248 i 247), respektivno. Restrikciona mesta su uvedena na početak i na kraj cDNK koja kodira fuzioni protein. Restrikciona mesta EcoRI na 5' kraju i Sali na 3' kraju korišćena su za sledeće procedure kloniranja. Fragmenti dobijeni genskom sintezom klonirani su preko EcoRI i Sali u plazmid označen kao pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) za konstrukte teškog lanca i pEF ADA (pEF ADA je opisan u Raum et al., Cancer Immunol lmmunothcr., 50(3), (2001), 141-50) za konstrukte lakog lanca) prema standardnim protokolima. Plazmid i sa verifikovanom sekvencom korišćeni su za ko-transfekciju respektivnih konstrukata lakog i teškog lanca u FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) prema protokolu proizvođača.

[0134] Nakon 3 dana supernatanti ćelijske kulture transfektanata su sakupljeni i korišćeni za alanin-skening eksperiment.

5.3. Kloniranje i ekspresija alanin mutanata humanog CD3 epsilon za alanin-skening

[0135] 27 cDNK fragmenata koji kodiraju humani CD3 epsilon lanac sa zamenom jednog kodona sekvence divljeg tipa humanog CD3 epsilon u kodon koji kodira alanin (GCC) za svaku aminokiselinu od aminokiselina 1 -27 ekstracelularnog domena zrelog humanog CD3 epsilon lanca respektivno dobijeni su genskom sintezom. J0136] Osim zamenjenog kodona cDNK fragmenti bili su identični sa prethodno pomenutim cDNK fragmentom humanog divljeg tipa CD3. Samo jedan kodon je zamenjen u svakom konstruktu u poređenju sa prethodno opisanim cDNK fragmentom humanog divljeg tipa CD3. Restrikciona mesta EcoRI i Sali uvedena su u cDNK fragmente na identičnim pozicijama u poređenju sa konstruktom divljeg tipa. Svi alanin-skening konstrukti su klonirani u pEF NEO i i plazmidi sa vcrifikovanom sekvencom transficirani su u EL4 ćelije. Transfekcija i selekcija transfektanata izvedena je kao Što je prethodno opisano. Kao rezultat dobijen je panel eksprimiranih konstrukata u kojim je prva aminokiselina humanog CD3 epsilon lanca, glutamin (Q, Gln) na poziciji 1 zamenjena sa alaninom. Poslednja aminokiselina zamenjena sa alaninom bila je treonin (T, Thr) na poziciji 27 zrelog humanog divljeg tipa CD3 epsilon. Za svaku aminokiselinu između glutamina 1 i treonina 27 stvoreni su respektivni transfektanti sa zamenom aminokiseline divljeg tipa u alanin.

5.4. Alanin-skening eksperiment

[0137] Himerna IgG antitela kao stoje opisano u 5.2 i interspecijski specifična jednolančana antitela specifična za CD3 epsilon testirana su u alanin-skening eksperimentu.

[0138] Vezivanje antitela sa EL4 ćelijskim linijama transficiranim sa konstruktima alanin-mutanata humanog CD3 epsilon kao što je opisano u 5.3 testirano je FACS analizom prema standardnim protokolima. 2,5xl0<5>ćelija respektivnih transfektanata inkubirano je sa 50 pl supernatanta ćelijske kulture koja sadrži himerna IgG antitela iii sa 50 pl sirovih preparata periplazmatično eksprimiranih jednolančanih antitela. Za uzorke inkubirane sa sirovim preparatima periplazmatski eksprimiranih jednolančanih antitela korišćeno je anti-Flag M2 antitelo (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) kao sekundarno antitelo sa 5 pg/ml u 50 pl PBS sa 2% FCS. Za uzorke inkubirane sa himernim IgG antitelima nije bilo potrebno sekundarno antitelo. Za sve uzorke vezivanje molekula antitela detektovano je sa kozjim anti-mišjim IgG R-fikoertirin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim, razređenim 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK).

[0139] Uzorci su mereni na FACSCalibur (BD bioscienccs, Ileidelberg, Germanv).

[0140] Detektovano je diferencijalno vezivanje himernih IgG molekula ili interspecijski specifičnih jednolančanih antitela sa EL4 ćelijskim linijama transficiranim sa aianin-mutantima humanog CD3 epsilon. Kao negativna kontrola korišćenajc ili izotipska kontrola ili sirovi preparat periplazmatski eksprimiranog jednolančanog antitela irelevantne specifičnosti, respektivno. UCHT-1 antitelo je korišćeno kao pozitivna kontrola za ekspresioni nivo alanin-mutanata humanog CD3 epsilon. EL4 ćelije transficirane sa alanin-mutantima za aminokiseline tirozin na poziciji 15, valin na poziciji 17, izoleucin na poziciji 19, valin na poziciji 24 ili leucin na poziciji 26 zrelog CD3 epsilon lanca nisu procenjivane usled veoma niskih ekspresionih nivoa (podaci nisu prikazani). Vezivanje interspecijski specifičnih jednolančanih antitela i jednolančanih antitela u himernom IgG formatu sa EL4 ćelijskim linijama transficiranim sa alanin mutantima humanog CD3 epsilon prikazano je na Slici 8 (A-D) kao relativno vezivanje u arbitrarnim jedinicama sa geometrijskom sredinom vrednosti fluorescencije respektivnih negatinih kontrola oduzetih od respektivnih geometrijskih sredina vrednosti fluorescencije uzorka. Da bi se kompenzovali ekspresioni nivoi sve vrednosti uzorka za određeni transfektant su zatim podeljeni sa geometrijskom sredinom vrednosti fluorescencije za UCHT-1 antitelo za ovaj respektivni transfektant. Za poređenje vrednosti specifičnosti za uzorak divljeg tipa sve vrednosti uzorka respektivnih specifičnosti konačno su podeljeni sa vrednošću za uzorak divljeg tipa, čime se postavlja vrednost za uzorak divljeg tipa na 1 arbitrarnu jedinicu vezivanja.

[0141]Korišćena izračinavanja detaljno su prikazana u sledećoj formuli:

[0142]U ovoj formulivrednost Uzorakoznačava vrednost u arbitrarnim jedinicama vezivanja koji prikazuje stepen vezivanja specifičnog anti-CD3 antitela sa specifičnim alanin-mutantom kao što je prikazano na Slici 8 (A-D),Uzorakoznačava geometrijsku sredinu vrednosti fluorescencije dobijene za specifično anti-CD3 antitelo testirano na specifičnom alanin-skening transfektantu,neg Kontr.Označava geometrijsku sredinu vrednosti fluorescencije dobijene za negativnu kontrolu analiziranu na specifičnom alanin-mutantu,UCHT- 1označava geometrijsku sredinu vrednosti fluorescencije dobijenu za UCHT-1 antitelo analizarano na specifičnom alanin-mutantu,WToznačava geometrijsku sredinu vrednosti fluorescencije dobijenu za anti-CD3 antitelo analizirano na transfektantu divljeg tipa, x označava respektivni transfektant, y označava respektivno anti-CD3 antitelo iwtoznačava daje respektivni transfektant divljeg tipa.

[0143]Kao što se može videti sa Slike 8 (A-D) IgG antitelo A2J HLP pokazalo je izražen gubitak vezivanja za aminokiseline asparagin na poziciji 4, treonin na poziciji 23 i izoleucin na poziciji 25 zrelog CD3 epsilon lanca. Kompletan gubitak vezivanja IgG antitela A2J HLP uočen je za aminokiseline glutamin na poziciji 1, aspartat na poziciji 2, glicin na poziciji 3 i glutamat na poziciji 5 zrelog CD3 epsilon lanca. IgG antitelo E2M HLP pokazalo je izražen gubitak vezivanja za aminokiseline asparagin na poziciji 4. treonin na poziciji 23 i izoleucin na poziciji 25 zrelog CD3 epsilon lanac IgG telo E2M HLP pokazalo je kompletan gubitak vezivanja za aminokiseline glutamin na poziciji l, aspartat na poziciji 2, glicin na poziciji 3 i glutamat na poziciji 5 zrelog CD3 epsilon lanca. IgG antitelo H2C 11 LP pokazalo je umeren gubitak vezivanja za aminokiseline asparagin na poziciji 4 zrelog CD3 epsilon lanca i pokazalo je kompletan gubitak vezivanja za aminokiseline glutamin na poziciji 1, aspartat na poziciji 2, glicin na poziciji 3 i glutamat na poziciji 5 zrelog CD3 epsilon lanca. Jednoiančano antitelo F12Q HLP pokazalo je suštinski kompletan gubitak vezivanja za aminokiseline glutamin na poziciji 1, aspartat na poziciji 2, glicin na poziciji 3 zrelog CD3 epsilon lanca i glutamat na poziciji 5 zrelog CD3 epsilon lanca. 6. Analiza vezivanja interspecijski specifičnih anti-CD3 vezujućih molekula H2C HLP za humani CD3 epsilon lanac sa i bez N-terminalnog His6 taga transficiranog u mišju T ćelijsku liniju EL4

6.1. Kloniranje i ekspresija humanog CD3 epsilon lanca sa N-terminalnim šest histidin tagom

(His6 tag)

[0144] cDNK fragment koji kodira humani CD3 epsilon lanac sa N-terminalnim His6 tagom dobijen je genskom sintezom. Fragment dobijen genskom sintezom dizajniranje tako da sadrži prvo Kozak mesto za eukariotsku ekspresiju konstrukta, koji je praćen u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom imunoglobulinskog lider peptida od 19 aminokiselina, koji je praćen u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom His6 taga koja je praćena u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom zrelog humanog CD3 epsilon lanca (sekvence cDNK i aminokiselina date su kao SEQ ID NOs 256 i 255).

[0145] Fragment dobijen genskom sintezom je takođe dizajniran tako da sadrži restrikciona mesta na početku i na kraju cDNK. Uvedena restrikciona mesta EcoRI na 5' kraju i Sail na 3' kraju, korišćena su u sledećim procedurama kloniranja. Fragment dobijen genskom sintezom je zatim kloniran preko EcoRI i Sail u plazmid označen kao pEF-NEO (kao što je prethodno opisano) prateći standardne protokole. Plazmid sa verifikovanom sekvencom korišćen je za transfekciju mišje T ćelijske linije EL4. Transfekcija i selekcija transfektanata izvedene su kao što je prethodno opisano. Nakon 34 dana ćelijske kulture transfektanti su korišćeni za test opisan u nastavku.

6.2. Vezivanje interspecijski specifičnog anti-CD3 vezujućeg molekula H2C HLP sa humanim CD3 epsilon lancem sa i bez N-terminalnog His6 taga

[0146] Himerno IgG antitelo sa vezujućom specifičnošću H2C HLP specifično za CD3 epsilon testirano je za vezivanje za humani CD3 epsilon sa i bez N-terminalnog His6 taga.

[0147] Vezivanje antitela sa EL4 ćelijskim linijama transficiranim sa His6-humanim CD3 epsilon i divljim tipom humanog CD3 epsilon respektivno testirano je u FACS analizi prema standardnim protokolima. 2,5xl0<3>ćelija transfektanata je inkubirano sa 50 pl supernatanta ćelijske kulture koja sadrži himerno IgG antitelo iii 50 pl respektivnih kontrolnih antitela sa 5pg/ml u PBS sa 2% FCS. Kao negativna kontrola odgovarajuća izotipska kontrola i kao pozivna kontrola za ekspresiju konstrukata CD3 specifično antitelo UCIIT-1 korišćeni su respektivno. Vezivanje antitela detektovano je sa kozjim anti-mišjim IgG R-fikoertirin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim, razblažcnog 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germanv). U poređenju sa EL4 ćelijskom linijom transfi ci ranom sa divljim tipom humanog CD3 epsilon detektovan jc jasan gubitak vezivanja himernog IgG sa vezujućom specifičnošću H2C HLP za humani-CD3 epsilon sa N-terminalnim His6 tagom. Ovi rezultati su pokazali da je slobodni N-terminus CD3 epsilon esencijalan za vezivanje interspecijski specifičnog anti-CD3 vezujućeg specificiteta H2C HLP za humani CD3 epsilon lanac (Slika 9).

7. Kloniranje i ekspresija C-terminalnih, transmembranskih i skraćenih ekstracelularnih domena humanog MCSP

[0148] Kodirajuća sekvenca C-terminalnih, transmembranskih i skraćenih ekstracelularnih domena humanog MCSP (aminokiseline 1538 - 2322) dobijena je genskom sintezom prema standardnim protokolima (cDNK i aminokiselinske sekvence rekombinantnog konstrukta za ekspresiju C-terminalnog, transmembranskog i skraćenog ekstracelularnog domena humanog MCSP (označenog kao humani D3) dati su pod SEQ ID NOs 250 i 249). Fragment dobijen genskom sintezom dizajniran je da sadrži prvo Kozak mesto da omogući eukariotsku ekspresiju konstrukta što je praćeno sa kodirajućom sekvencom imunoglobulinskog lider peptida od 19 aminokiselina praćenog sa FLAG tagom, praćeno u okviru čitanja sa sekvencom koja sadrži nekoliko restrikcionih mesta za potrebe kloniranja i koja kodira veštački linker od 9 aminokiselina (SRTRSGSOL), praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom C-tenninalnog, iransmembranskog i skraćenog ekstracelularnog domena humanog MCSP i stop kodonom. Restrikciona mesta su uvedena na početku i na kraju DNK fragmenta. Restrikciona mesta EcoRI na 5' kraju i Sail na 3" kraju korišćena su u sledećim procedurama kloniranja. Fragment je digestovan sa EcoRI i Sali i kloniran u pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) prateći standardne protokole. Plazmid sa verifikovanom sekvencom korišćen je za transfekciju CHO/dhfr- ćelija (ATCC No. CRE 9096). Ćelije su kultivisane u RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom, sa dodatkom 10% FCS, 1 % penicilin/streptomicin (svi dobijeni od Biochrom AG Berlin, Germanv) i nukleozida iz stok rastvora graduisanih reagnesa ćelijske kulture (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) do finalne koncentracije od 10 pg/ml adenozina, 10 pg/ml dezoksiadenozina i 10 pg/ml timidina, u inkubatoru na 37 °C, 95% vlažnosti i 7% CO2. Transfekcija je izvedena korišćenjem PolvFect Transfection Reagent (Qiagen GmbH, Hilden, Germanv) i 5 pg plazmidne DNK prema protokolu proizvođača. Nakon kultivacije od 24 časa ćelije su isprane jednom sa PBS i kultivisane ponovo u RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom i 1% penicilin/streptomicin. Stoga medijum ćelijske kulture nije sadržao nukelozide i stoga je selekcija primenjena na transficirane ćelije.

[0149] Oko 14 dana nakon transfekcije uočen je rast rezistentnih ćelija. Nakon dodatnih 7 do 14 dana transfektant! su testirani u odnosu na ekspresiju konstrukta sa FACS analizom. 2,5x10<5>ćelija je inkubirano sa 50 pl anti-Flag-M2 antitela (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) razblaženo sa 5 pg/ml u PBS sa 2% FCS. Vezivanje antitela je detektovano sa kozjim anti-mišjim IgG R-fikoertirin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim, razblaženog 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germanv).

8. Kloniranje i ekspresija C-terminalnih, transmembranskih i skraćenih ekstracelularnih domena makaki MCSP

[0150] cDNK sekvenca C-terminalnih, transmembranskih i skraćenih ekstracelukiarnih domena makaki MCSP (označeni kao D3) dobijena jc sa setom od tri PCR na cDNK kože makakija (Cat No. Cl53421 8-Cy-BC; BioCat GmbH, Heidelberg, Germany) korišćenjem sledećih reakcionih uslova: 1 ciklus na 94°C, 3 min., 40 ciklusa sa 94°C 0,5 min., 52°C 0,5 min. i 72°C 1,75 min., tcrminalni ciklus 72°C 3 min. Sledeći prajmeri su korišćeni:

[0151] Onalri preklapajuća fragmenta (A: 1-1329, B: 1229-2428, C: 1782-2547) stvorena sa PCR koja su izolovana i sekvencirana prema standardnim protokolima korišćenjem PCR prajmera i time su dali deo od 2547 bp cDNK sekvence makaki MCSP (cDNK i aminkiseiinska sekvenca ovog dcla makaki MCSP su dati pod SEQ ID NOs 252 i 251) od 74 bp ushodno od kodirajuće sekvence C-terminalnog domena do 121 bp nishodno od stop kodona. Drugi PCR korišćenjem sledećih reakcionih uslova: 1 ciklus na 94°C 3 min, 10 ciklusa sa 94°C 1 min, 52°C 1 min i 72°C 2,5 min, terminalni ciklus 72°C 3 min korišćen je za fuziju PCR proizvoda prethodno pomenutih reakcija A i B. Korišćeni su sledeći prajmeri:

reverse prajmer: 5'-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3' (SEQ ID No. 368)

[0152]Prajmeri za ovaj PCR su dizjanirani tako da uvedu restrikciona mesta na početku i na kraju cDNK fragmenta koji kodira C-terminalne, transmembranske i skraćene ekstracelularne domene makaki MCSP. Uvedena restrikciona mesta Mfel na 5' kraju i Sali na 3<!>kraju, korišćena su u sledećim procedurama kloniranja. PCR fragment jc zatim kloniran preko Mfel i Sali u Bluescript plazmid koji sadrži FxoRl/MfeI fragment prethodno pomenutog plazmida pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunolher 50 (2001) 141-150) zamenom C-terminalnih, transmembranskih i skraćenih ekstracelularnih domena humanog MCSP. Fragment dobijen genskom sintezom sadržao je kodirajuće sekvence imunoglobinskog lider peptida i Flag taga kao i veŠtaČki linker (SRTRSGSQL) u okviru čitanja u odnosu na 5' kraj cDNK fragment koji kodira C-terminalne, transmembranske i skraćene ekstracelularne domene makaki MCSP. Ovaj vektor je korišćen da transficira CHO/dhfr- ćelije ATCC No. CRL 9096).

[0153]Ćelije su kultivisane u RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom sa dodatkom 10% FCS, 1% penicilin/streptomicin (svi od Biochrom AG Berlin, Germanv) i nukleozida iz stok rastvora graduisanih reagensa ćelijske kulture (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) do finalne koncentracije od 10 ug/ml adenozina, 10 pg/ml dezoksiadenozina i 10 ug/ml timidina, u inkubatoru na 37 °C, 95% vlažnosti i 7% CO2. Transfekcija je izvedena sa PolyFect Transfection Reagent (Qiagen GmbH. Hilden, Gcrmany) i 5 ug plazmidne DNK prema protokolu proizvođača. Nakon kultivacije 24 časa ćelije su isprane jednom sa PBS i ponovo kultivisane sa RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom i 1% penicilin/streptomicin. Stoga medijum kulture ćelija nije sadržao nukleozide i stoga je selekcija primenjena na transficirane ćelije.

[0154] Oko 14 dana nakon transfekcije uočen jc rast rezistentnih ćelija. Nakon dodatnih 7 do 14 dana transfektanti su testirani u odnosu na ekspresiju rekombinantnog konstrukta preko FACS. 2,5x 105 ćelijaje inkubirano sa 50 pl of an anti-Flag-M2 antibody (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Gcrmany) razblaženo do 5 pg/ml u PBS sa 2% FCS. Vezano antitelo je detektovano sa kozjim anti-mišjim IgG, R-fikoertirin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim, razblaženog 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany).

9. Svaranje i karakterizacija MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula

[0155] Molekul bispecifičnih jednolančanih antitela gde svaki sadrži vezujući domen interspecijski specifičnog za humani i primata osim šimpanze CD3 epsilon kao i vezujući domen interspecijski specifičan za humani i primata osim šimpanze MCSP. dizajnirani su kao što je dato u sledećoj Tabeli 1:

[0156]Prethodno pomenuti konstrukti koji sadrže domene varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) interspecijski specifičnog za humani i makaki MCSP D3 i VH i VL domene interspecijski specifične za humani i makaki CD3 dobijeni su genskom sintezom. Fragmenti dobijeni genskom sintezom dizajnirani su tako da sadrže prvo Kozak mesto za cukariotsku ekspresiju konstrukta, praćenu sa imunoglobulinskim lider peptidom od 19 aminokiselina, praćenim u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom respektivnog molekula bispecifičnog jednolančanog antitela, praćenog u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom histidin6-taga i stop kodonom. Fragment dobijen genskom sintezom takođe je dizajniran tako da uvede pogodna N- i C-terminalna restrikciona mesta. Fragment dobijen genskom sisntezom kloniran je preko ovih restrikcionih mesta u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR jc opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; Laboratorv Manual, 3rd edilion, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, Nevv York (2001)). Konstrukti su transficirani stabilno ili prolazno u DHFR-deficijentne CHO-ćelijc (ATCC No. CRL 9096) elektroporacijom ili alternativno u HEK 293 (humane embrionalne ćelije bubrega, ATCC Numbcr: CRL-1573) na prolazni način prema standardnim protokolima.

[0157] Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR dcficijcntnim CHO ćelijama (ATCC No. CRL 9096) izvedena je kao stoje opisano od strane Kaufmann RJ. (1990) Methods Enzvmol. 185, 537-566. Genska amplifikacija konstrukata je indukovana dodavanjem rastućih koncentracija metotreksata (MTX) do finalnih koncentracija od 20 nM MTX. Nakon dva pasaža kulture ćelije su uzgajane u roler bocama HyQ PF CHO tečnim medijumom soje oslobođenim nukleozida (sa 4.0 mM L-Glutamina sa 0.1% Pluronic F - 68; HyClone) 7 dana pre sakupljanja. Ćelije su uklonjene centri fugiranj em i supernatant koji sadrži eksprimirani protein je uskladišten na -20<C>C.

[0158] Akta® Explorer System (GE Health Systems) i Unicorn® Softvvarc korišćeni su za hromatografiju. Imobilisana metalna afinitetna hromatografija ("IMAC") izvedena je korišćenjem Fractogcl EMD chelate® (Merck) koji je napunjen sa ZnCb prema protokolu obezbeđenom od strane proizvođača. Kolona je ekvilibrisana sa puferom A (20 mM natrijum fosfat pufer pH 7.2, 0.1 M NaCI) i supernatant ćelijske kulture (500 ml) primenjen je na kolonu (10 ml) sa stopom protoka 3 ml/min.

[0159] Kolona jc isprana sa puferom da bi se uklonio nevezani uzorak. Vezani protein je eluiran korišćenjem gradijenta pufera B iz dva koraka (20 mM natrijum fosfat pufer pH 7.2, 0.1 M NaCI, 0.5 M Imidazol) prema sledećem:

Korak 1: 20% pufera B u 6 zapremina kolone

Korak 2: 100% pufer B u 6 zapremina kolone

[0160] Eluirane frakcije proteina iz koraka 2 pulovane su za dalje prečišćavanje. Sve hemikalije su istraživačkog stepena i kupljene od Sigma (Deisenhofen) ili Merck (Darmstadt).

[0161] Gel filtraciona hromatografija izvedena je na HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade koloni (GE/Amersham) ekvilibrisanoj sa Equi-buffer (25 mM citrat, 200 mM lizin, 5% glicerol, pH 7.2). Eluirani uzorci proteina (stopa protoka 1 ml/min) podvrgnuti su standardnim SDS-PAGE i Western Blot za detekciju. Pre prečišćavanja, kolona je kali brisana za određivanje molekulske težine (marker kit za molekulsku težinu, Sigma MW GF-200). Koncentracije proteina su određene korišćenjem OD280 nm.

[0162] Prečišćeni protein bispecifičnog jednolančanog antitela analiziranje u SDS PAGE pod redukujućim uslovima izvedenim sa pre-cast 4-12% Bis Tris gelovima (Invitrogen). Priprema uzorka i primena su izvedene prema protokolu obezbeđenom od strane proizvođača. Molekulska težina je određena sa MultiMark proteinskim standardom (Invitrogen). Gel je obojen sa koloidnim Coomassie (Invitrogen protocol). Čistoća izolovanog proteina je >95% kao što je određena sa

SDS-PAGE.

[0163] Bispecifično jednoiančano antitelo ima molekulsku težinu od oko 52 kDa pod nativnim uslovima kao stoje određeno gel filtracijom u fosfatno puferisanom slanom rastvoru (PBS). Svi konstrukti su prečišćeni prema ovom postupku.

[0164] Weslern Blot je izveden upotrebom Optitran® BA-S83 membrane i Invitrogen Blot Module prema protokolu proizvođača. Za detekciju bispecifičnih jednolančanih antitela proteinskih antitela korišćeno je anti-Ilis Tag antitelo (Penta His, Qiagen). Kozje-anti-mišje Ig antitelo obeleženo sa alkalnom fosfatazom (AP) (Sigma) korišćeno je kao sekundarno antitelo i BCIP/NBT (Sigma) kao supstrat. Jedna traka jc dctcktovana na 52 kD koja odgovara prečišćenom bispecifičnom jednolanČanom antitelu.

[0165] Alternativno, konstrukti su prolazno eksprimirani u DHFR deficijcntnim CHO ćelijama. Ukratko, 4 x IO<5>ćelija po konstruktu je kultivisano u 3 ml RPMI 1640 ali mcdijuma sa stabilizovanim glutaminom sa dodatkom 10% fetalnog govejeg seruma, 1% penicilin/streptomicin i nukleozida iz stok rastvora graduisanih reagensa ćelijske kulture (Sigma-AldrichChemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) do finalne koncentracije od 10 pg/mi adenozina, 10 pg/ml dezoksiadenozina i 10 pg/ml timidina, u inkubatoru na 37 °C, 95% vlažnosti i 7% CO2 jedan dan pre transfekcije. Transfekcija je izvedena sa Fugenc 6 Transfection Reagent (Roche, # 11815091001) prema protokolu proizvođača. 94 pl OptiMEM medijuma (Invitrogen) i 6 pl Fugene 6 pomešani su i inkubirani 5 minuta na sobnoj temperaturi. Posle toga, dodato je 1.5 ug DNK. po konstruktu, pomešano i inkubirano 15 minuta na sobnoj temperaturi. U međuvremenu, DHFR deficijentne CHO ćelije su isprane sa ix PBS i resuspendovane u 1.5 mi RPMI 1640 ali medijuma.

[0166] Transfekciona smeša je razblažena sa 600 pl RPMI 1640 ali medijuma, dodatna ćelijama i inkubirana preko noći na 37 °C, 95% vlažnosti i 7% CO2. Dan nakon transfekcije inkubaciona zapremina svakog pristupaje povećana do 5 ml RPMI 1640 ali medijuma. Supernatant je sakupljen nakon 3 dana inkubacije.

10. Protočno citometrijska analiza vezivanja MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela

[0167] Da bi se testirala funkcionalnost konstrukata inerspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela u odnosu na sposobnost da se vežu za humani i makaki MCSP D3 i CD3, respektivno, izvedena je FACS analiza. U tu svrhu CHO ćelije transficirane sa humanim MCSP D3 (kao što je prikazano u Primeru 7) i humana CD3 pozitivna T ćelijska linija leukemije HPB-ALL (DSMZ, Braunschvveig, ACC483) korišćene su za testiranje vezivanja humanih antigena. Reaktivnost vezivanja za makaki antigene testirana je korišćenjem stvorenog makaki MCSP D3 transfektanta (opisanog u Primeru 8) i makaki T ćelijske linije 4119LnPx (ljubazno obezbeđene od strane Prof. Fickenscher, Hvgienc Institute, Virologv, Hrlangen-Nuernberg; publikovano u Knappe A, et al., i Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). 200.000 ćelija respektivnih ćelijskih linija inkubirano je 30 min na ledu sa 50 pl prečišćenog proteina konstrukata interspecijski specifičnog bispecifičnog antitela (2 pg/ml) ili supernalanta ćelijske kulture koji eksprimiraju konstrukte interspecijski specifičnog bispecifičnog antitela. Ćelije su dva puta isprane u PBS sa 2% FCS i vezivanje konstrukta je detektovano sa mišjim anti-His antitelom (Penta His antibodv; Ojagen; razblaženo 1:20 u 50 pl PBS sa 2% FCS). Nakon ispiranja, vezana anti-His antitela su detektovana sa Fc gama-specifičnim antitelom (Dianova) konjugovanim sa fikoeritrinom, razblaženom 1:100 u PBS sa 2% FCS. Supernatant netransficiranih CHO ćelija je korišćen kao negativna kontrola za vezivanje za T ćelijske linije. Jednolančani konstrukt sa irelevantnom ciljnom specifičnošću korišćen jc kao negativna kontrola za vezivanje sa MCSP-D3 transficiranim CHO ćelijama.

[0168] Protočna citometrijaje izvedena na FACS-Calibur aparatu; korišćen je CellQucst program da bi se dobili i analizirali podaci (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS bojenje i merenje intenziteta fluorescencije izvedeno je kao što je opisano u Current Protocols in Immunologv (Coligan, Kruisbeek, Margulies. Shevach i Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[0169] Bispecifično vezivanje prethodno navedenih jednolančanih molekula, koji su interspecijski specifični za MCSP D3 i interspecijes specifični za humani i makaki CD3 bilo jc jasno detektabilano kao što je prkazano na Slikama 10, 11, 12 i 39. U FACS analizi svi konstrukti su pokazali vezivanje za CD3 i MCSP D3 u poređenju sa respektivnim negativnim kontrolama. Pokazana je interspecijska specifičnost bispecifičnih antitela za humani i makaki CD3 i MCSP D3 antigen.

11.Bioaktivnost MCSP i CD3 interspecijska specifičnost bispecifičnih jednolančanih antitela

[0170] Bioaktivnost stvorenih bispecifičnih jednolančanih antitela analizirana je sa in vitro citotočksičnim analizama oslobađanja Hroma 51 (<5l>Cr) korišćenjem MCSP D3 pozitivnih ćelijskih linija opisanih u Primerima 7 i 8. Kao efektorske ćelije korišćene su humane PBMC dcplctiranc od CD4/CD56, stimuiisane humane PBMC ili makaki T ćelijska linija 4119LnPx kao stoje spccifikovano na respektivnim slikama.

[0171] Stvaranje stimulisanih PBMC depletiranih od CD4/CD56 izvedeno je kao što sledi: Oblaganje Petri šolje (145 mm preČnik, Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) izvedeno je sa komercijalno dostupnim anti-CD3 specifičnim antitelom (npr. OKT3, Othoclone) u finalnoj koncentraciji od 1 pg/ml 1 čas na 37°C. Nevezani protein je uklonjen sa jednim korakom ispiranja sa PBS. Sveži PBMC su izolovane iz periferne krvi (30 - 50 ml humane krvi) sa Ficoll gradijentom centrifugiranja prema standardnim protokolima. 3 - 5 x IO<7>PBMC dodate su u prethodno obloženu petri šolju u 120 ml RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom/10% FCS/IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron) i stimuiisane 2 dana. Trećeg dana ćelije su sakupljene i jednom isprane sa RPMI i 640. IL-2 je dodat do finalne koncentracije 20 U/ml i ćelije su ponovo kultivisane jedan dan u istom medijumu za kulturu ćelija kao prethodno.

[0172] Deplecijom CD4+ T ćelija i CD56+ NK ćelija prema standardnim protokolima obogaćeni su CD8+ citotoksični T timfociti (CTLs).

[0173]Ciljne ćelije su isprane dva puta sa PBS i obeležene sa ILI MBq 51Cr u finalnoj zapremini od 100 pl RPMI sa 50% FCS 45 minuta na 37°C. Posle toga obeležene ciljne ćelije su isprane 3 puta sa 5 ml RPMI i zatim korišćene u citotoksičnoj analizi. Analiza je izvedena u 96 komornoj ploči u totalnoj zapremini od 250ml sa dodatkom RPMI (kao prethodno) sa E:T odnosom 10:1. 1 pg/ml interspecijski specifičnih molekula bispecifičnih jednolančanih antitela i primenjeno je njhovih 20 trostrukih razblaženja. Ukoliko se koristi supernatant koji sadrži molekule interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela, 21 dvo- i 20 trostrukih njihovih razređenja je primenjeno za humanu i makaki analizu citotoksičnosti, respektivno. Vreme analize je bilo 18 časova i citotoksičnost je merena kao relativne vrednosti oslobođenog hroma u supernatantu u odnosu na razliku maksimalne lize (dodatak Triton-X) i spontane lize (bez efektorskih ćelija). Sva merenja su vršena u četiri kopije. Merenje aktivnosti hroma u supernatantima izvedena je sa Wizard 3" gama brojačem (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Germanv). Analiza eksperimentalnih podataka završena je sa Prism 4 za Windows (verzija 4.02, GraphPad Sofhvare Inc., San Dicgo, California, USA). Sigmoidalne krive odgovora na dozu tipično imaju R2 vrednosti >0.90 kao što je određeno softverom. FC50vrednosti izračunate sa programom za analizu korišćene su za poređenje bioaktivnost!.

[0174] Kao što je prikazano na Slikama 13 do 17 i 40, svi generisani konstruktnt interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog antitela pokazuju ciloloksičnu aktivnost protiv humanih MCSP D3 pozitivnih ciljnih ćelija izazvani sa stimulisanim humanim PBMC sa depletiranim CD4/CD56 ili stimulisanim PBMC i protv makaki MCSP D3 pozitivnih ciljnih ćelija izazvanih sa makaki T ćelijskom linijom 4119LnPx.

12. StabilnostMCSP iCD3interspecijskispecifičnihbispecifičnihjednolančanihantitelau

plazmi

[0175]Stabilnost stvorenih bispecifičnih jednolančanih antitela u humanoj plazmi je analizirana inkubacijom bispecifičnih jednolančanih antitela u 50% humanoj plazmi na 37°C i 4°C 24 časa i posle toga testiranjem bioaktivnosti.

[0176] Bioaktivnost je proučavana u in vitro citotočksiČnim analizama oslobađanja Hroma 51 (5lCr) korišćenjem MCSP pozitivne CHO ćelijske linije (koja eksprimira MCSP kao što je kloniran prema primeru 14 ili 15) kao ciljnih i stimuMsanih humanih CD8 pozitivnih T ćelija kao efektorskih ćelija.

[0177] EC50vrednosti izračunate sa programom za analizu kao što je prethodno opisano korišćene su za poređenje bioaktivnosti bispecifičnih jednolančanih antitela inkubiranih sa 50% humanom plazmom 24 časa na 37°C i 4°C respektivno sa bispecifičnim jednolančanim antitelima bez dodatka plazme ili mešana sa istom količinom plazme neposredno pre testa.

[0178]Kao stoje prikazano na Slici 18 i Tabeli 2 bioaktivnost G4 H-L x I2C H-L, G4 H-L x H2C H-L i G4 H-L x F12Q H-L bispecifičnih antitela nije značajno smanjena u poređenju sa kontrolama bez dodavanja plazme ili sa dodavanjem plazme neposredno pre testiranja bioaktivnosti. 13. Redistribucija cirkulišućih T ćelija u odsustvu cirkulišućih ciljnih ćelija prvo izlaganjem CD3 vezujućim molekuiima usmerenim na kovencionalne tj. kontekstno zavisne CD3 epitope je glavni faktor rizika za štetne događaje vezane sa započinjanjem tretmana T ćelijskom redistribucijom kod pacijenata sa B-ćelijskim ne-Hodgkin-limfomom (B-NHL) nakon započinjanja tretmana sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekulom

[0179] Konvencionalni CD19xCD3 vezujući molekul je CD3 vezujući molekul bispecifičnog tandem scFv formata (Loffler (2000, Blood. Volume 95, Number 6) ili WO 99/54440). Sastoji se od dva različita vezujuća dela usmerena na (i) CD 19 na površini normalnih i malignih humanih B ćelija i (ii) CD3 na humanim T ćelijama. Unakrsnim vezivanjem CD3 na T ćelijama sa CD 19 na B ćelijama, ovaj konstrukt okida preusmerenu li/.u normalnih i malignih B ćelija sa citotoksiČnom aktivnošću T ćelija.

[0180] CD3 epitop prepoznat takvim konvencionalnim CD3 vezujućim molekulom jc lokalizovan na CD3 epsilon lancu, gde zauzima korektnu konformaciju jedino ukoliko je utisnut unutar ostatka epsilon lanca i održavan u ispravnoj poziciji preko heterodimerizacije epsilon lanca bilo sa CD3 gama ili delta lancem.

[0181] Interakcija ovog visoko kontekstno zavisnog epitopa sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekulom (videti npr. Loffler (2000, Blood, Volume 95, Number 6) ili WO 99/54440) - Čak i kada se odigrava na čisto monovalentni način i bez bilo kakvog unakrsnog vezivanja - može indukovati alosteričku promenu u konformaciji CD3 što vodi izlaganju inače sakrivenog regiona bogatog prolinom unutar citoplazmatskog domena CD3 epsilon. Po izlaganju, region bogat prolinom može regrutovati molekul Nck2 za prenos signala, koji je sposoban da ukida dalje intracelularne signale. Iako ovo nije dovoljno za punu T ćelijsku aktivaciju, koja definitivno zahteva unakrsno vezivanje nekoliko CD3 molekula na T ćelijskoj površini, npr. unakrsnim vezivanjem nekoliko anti-CD3 molekula vezanih za nekoliko CD3 molekula na T ćeliji sa nekoliko CD 19 molekula na površini B ćelije, čista monovalentna interakcija konvencionalnih CD3 vezujućih molekula sa njihovim kontekstno zavisnim epitopom na CD3 epsilon i dalje nije inertna za T ćelije u smislu signalizacije. Bez vezivanja za teoriju, monovalentni konvencionalni CD3 vezujući molekuli (poznati u tehnici) mogu indukovati neke T ćelijske reakcije po infuziji u čoveka čak i u onim slučajevima gde nisu dostupne cirkulišuće ćelije za CD3 unakrsno vezivanje. Važna T ćelijska reakcija na intravensku infuziju monovalentnog konvencionalnog CDI9xCD3 vezujućeg molekula u B-NHL pacijente koji suštinski nemaju cirkulišuće CD 19-pozitivne B ćelije je redistribucija T ćelija nakon početka tretmana. Nađeno je u fazi I kliničke studije da se ova T ćelijska reakcija dešava tokom početne faze intravenske infuzije CD1 9xCD3 vezujućeg molekula kod svih pojedinaca bez cirkulišućih CD 19-pozitivnih ciljnih B ćelija suštinski nezavisno od doze CD19xCD3 vezujućeg molekula (Fig. 19). Međutim, nađeno je da iznenadno povećanje izlaganja CDI9xCD3 vezujućem molekulu okida suštinski istu redistribucionu Tćelijsku reakciju kod ovih pacijenata kao inicijalno izlaganje T ćelija CD19xCD3 vezujućem molekulu na početku tretmana (SI. 20 A) i čak postepeno povećanje izlaganja CD19xCD3 vezujućem molekulu još uvek može imati redistribucione efekte na cirkulišuće T ćelije (SI. 21). Dodatno, nađeno je da ova suštinski dozno nezavisna rcdistribuciona'F ćelijska reakcija u odsustvu cirkulišućih ciljnih ćelija kao što je inicirana sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekuiima kao što je CD19xCD3 vezujući molekul (npr. opisan u WO 99/54440) kod 100% svih tretiranih pojedinaca je glavni faktor rizika za štetne efekte povezane sa početkom tretmana.

[0182]Prema protokolu studije, pacijenti sa relapsnim histološki potvrđenim indolentnim B-ćelijskim ne-Hodgkin-limfomom (B-NHL) uključujući limfom mantle ćelija regrutovani su u fazi I interpacijent studiji otvorenog tipa iz više centara sa povećanjem doze.

[0183]Protokol studije je odobren od strane nezavisnih etičkih komiteta svih centara učesnika i poslat kao obaveštenje odgovornom regulatornom telu.

[0184]Merljiva bolest (najmanje jedna lezija > 1.5 cm) kao što jc dokumentovano CT skenom bila je neophodna za uključivanje u studiju. Pacijenti su primili konvencionalni CD19xCD3 vezujući molekul neprekidnom intravenskom infuzijom sa portabilnim sistemom mini pumpe tokom četiri nedelje sa konstantnom stopom protoka (tj. doznim nivoom). Pacijenti su hospitalizovani tokom prve dve nedelje tretmana pre otpuštanja iz bolnice i nastavili su tretman kod kuće. Pacijentima bez dokaza o progresiji bolesti nakon četiri nedelje ponuđeno je nastavljanje tretmana za dodatne četiri nedelje. Do sada je šest različitih nivoa doza testirano bez postizanja maksimalno tolerantne doze (MTD): 0.5, 1.5, 5, 15, 30 i 60 ug/m<2>/24Č. Svaka kohorta se sastojala od tri pacijenta ukoliko nisu uočeni Štetni događaji definisani protokolom studije kao DLT (doza koja ograničava toksičnost). U slučaju jednog DLT između prva tri pacijenta kohortaje proširena na šest pacijenata, kojima je — u odsustvu druge DLT - dozvoljeno dalje povećanje doze. Shodno tome, dozni nivoi bez DLT u kohortama sa 3 pacijenta iii sa jednim DLT u kohortama sa 6 pacijenata smatrani su kao bezbedni. Tretman studije je prekinut kod svih pacijenata koji su razvili DLT. Na 15 i 30 pg/m2/24č različiti načini početka tretmana tokom prvih 24č testirani su u nekoliko dodatnih kohorti: (i) Postupno povećanje nakon 5 pg/m2/24č za prvih 24č do 15 ug/m<2>/24č doze za održavanje (kohorta pacijenta 15-postepeno), (ii) jednako neprekidno povećanje stope protoka od skoro nula do 15 ili 30 pg/m<2>/24č (kohorte pacijenta 15-postepcno povećanje i 30-postepeno povećanje) i (iii) početak sa dozom za održavanje od samog početka (kohorte pacijenta 15-ista doza, 30-ista doza i 60-ista doza). Sve kohorte pacijenata na doznim nivoima 0.5, 1.5 i 5 pg/m2/24č započete su sa dozom za održavanje od samog početka (tj. ravna inicijacija),

[0185]Vremenski tok apsolutnog broja B- i T-ćelija u perifernoj krvi određeni su sa četiri FACS kolorimetrijske analize kao Što sledi:

Prikupljanje uzoraka krvi i rutinska analiza

[0186]U kohortama pacijenata 15-postepeno povećanje, 15-ista doza, 30-postepeno povećanje, 30-ista doza i 60-ista doza uzorci krvi (6 ml) su dobijeni prc i 0.75, 2, 6, 12, 24, 30, 48 časova nakon početka infuzije CD19xCD3 vezujućeg molekula (kao što je opisano u WO 99/54440) kao i na dane tretmana 8, 15, 17, 22, 24, 29, 36, 43, 50. 57 i 4 nedelje nakon kraja infuzije sa konvencionalnim CD19xCD3 vezujućim molekulom korišćenjem Vacutainer™ epruveta sa CDTA (Becton Dickinson) koje su isporučene za analizu na 4°C. U 15-postepeno povećanje kohortama pacijenata uzorci krvi (6 ml) dobijeni su pre i 6, 24, 30, 48 časova nakon početka infuzije CD 19xCD3 vezujućim molekulom kao i na dane tretmana 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57 i 4 nedelje nakon kraja infuzije sa CD19xCD3 vezujućim molekulom. Na doznim nivoima 0.5, 1.5 i 5 ug/m<2>/24č uzorci krvi (6 ml) dobijeni su pre i 6, 24, 48 časova nakon početka infuzije CDl9xCD3 vezujućeg molekula kao i na dane tretmana 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50,57 i 4 nedelje nakon kraja infuzije CD19xCD3 vezujućeg molekula. U nekim slučajevima desile su se blage varijacije vremenskih tačaka iz operativnih razloga. FACS analiza subpopulacija limfocita je izvedena unutar 24 - 48 časa nakon uzimanja uzoraka krvi. Apsolutni broj subpopulacija leukocita u uzorcima krvi određenje preko diferencijalne analize krvi na CoulterCounler™ (Coulter).

Izolacija PBMC iz uzoraka krvi

[0187]PBMC (mononuklcarnc ćelije periferne krvi) izolacija izvedena je prilagođenim protokolom Ficoll™ gradijent separacije. Krv je prcneta na sobnu temperaturu u 10 ml Leucosep™ epruvete (Grcincr) prethodno napunjene sa 3 ml Biocoll™ rastvora (Biochrom).

[0188]Centrifugiranjc jc izvedeno u swing-out rotorom 15 min na 1700xg i 22°C bez usporavanja. PBMC iznad Biocoll™ sloja su izolovane, isprane jednom sa FACS puferom (PBS / 2% FBS [Foetal Bovinc Serum; Biochrom]), centrifuirane i resuspendovane u FACS puferu. Centrifugiranje lokom svih koraka ispiranja izvedeno jc u swing-out rotoru 4 min na 800xg i 4°C. Ukoliko je ncophdno, I iza eritrocita je izvedena inkubiranjein izolovanih PBMC u 3 ml pufera za lizu eritrocita (8.29 g NHUC1, 1.00 g KHCO3, 0.037 g EDTA, ad 1.0 1 H20bidest, pH 7.5) 5 min na sobnoj temperaturi praćena korakom ispiranja sa FACS puferom.

Bojenje PBMC sa fluorescentno obeleženimantitelimanamolekulećelijske površine

{0189] Monoklonska antitela su dobijena iz Invitrogen (ICat. No. MHCD1301, 2Cat. No. MHCDI401), Dako (5Cat. No. C7224) ili Becton Dickinson (3Cat. No. 555516. 4Cat. No. 345766) korišćena prema preporuci proizvođača. 5xlO<5->Ixl0<6>ćelija je obojeno sa sledećom kombinacijom antitela: anti-CD 131/ anti-CD 142 (F1TC) x anti-CD563 (PE) x anti-CD34 (PerCP) x anti-CD 195 (APC). Ćelije su peletirane u 96 komornim multititarskim pločama V-oblika (Greiner) i supernatant je uklonjen. Pelet ćelijaje resuspendovan u ukupnoj zapremini od 100 ml koja sadrži specifična antitela razredena u FACS puferu. Inkubacija je izvedena u mraku 30 min na 4°C. Nakon toga, uzorci su dva puta isprani sa FACS puferom i peleti ćelija su resuspendovani u FACS puferu za protočnocitometrijsku analizu.

Protočnocitomctrijska detekcija obojenih limfocita sa FACS

[0190]Prikupljanje podataka je izvedeno sa 4 bojnim BD FACSCalibur™ (Becton Dickinson). Za svako merenje uzeto je 1 x 104 ćelija od definisanih subpopulacija limfocita. Statistička analiza je izvedena sa programom CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) da bi se dobili procenti subpopulacije limfocita i da se klasifikuje intenzitet ekspresije molekula ćelijske površine. Nakon toga, procenti subsetova pojedinačnih limfocita u odnosu na ukupne limfocite (tj. B plus T plus NK ćelije isključujući bilo koje mijeloidne ćelije preko CD13/14-bojenja) kao što je određeno FACS korelisani su sa brojem limfocita iz diferencijalne analize krvi da bi se izračunao apsolutni broj T ćelija (CD3+, CD56-, CD 13/14-) i B ćelija (CD 19+. CD 13/14-).

[0191]Redistribucija T ćelija tokom početne faze tretiranja konvencionalnim CD19xCD3 vezujućim molekulom (npr. opisano u WO 99/54440) kod svih onih pacijenata koji suštinski nisu imali cirkulišuće CD19-pozitivne B ćelije na početku tretmana prikazana je na (SI. 19). Za poređenje, reprezentativni primer redistribucije T ćelija lokom početne faze tretmana sa CD19xCD3 vezujućim molekulom kod pacijenta sa značajnim brojem cirkulišućih CD 19-pozitivnih B ćelijaje prikazana na SI. 22.

[0192]U oba slučaja (tj. suštinski bez ili mnogo cirkulišućih B ćelija) broj cirkulišućih T ćelija rapidno sc smanjuje nakon početka tretmana. Međutim, u odsustvu cirkulišućih B ćelija T ćelije imaju tendenciju da se veoma rano vrate u cirkulišuću krv, dok je povratak T ćelija u cirkulišuću krv onih pacijenata koji imaju značajan broj cirkulišućih B ćelija na početku tretmana obično odložen dok ove cirkulišuće B ćelije nisu dcplctiranc. Stoga, obrasci redistribucije T ćelija uglavnom se razlikuju u kinetici ponovnog pojavljivanja T ćelija u cirkulišućoj krvi. (0193]Procenat efikasnosti zasnovan na CT skenu izveden jc centralnom referentnom radiologijom nakon 4 nedelje tretmana i kod pacijenata koji primaju dodatne 4 nedelje takode nakon 8 nedelja tretmana plus u svim slučajevima četiri nedelje nakon kraja tretmana.

[0194]Nestanak i/ili veličine svih poznatih lezija (uključujući uvećanu slezinu) plus klirens kostne srži iz ćelija limfoma u slučajevima infiltracije kostne srži računalo je kao kompletan odgovor (CR). Redukcija od najmanje 50% od osnovne vrednosti zbira proizvoda dva najveća prečnika (SPD) za svaku predefinisanu cil jnu leziju đefinisano jc kao delimični odgovor (PR); redukcija od najmanje 25% smatrana je kao minimalni odgovor (MR). Progresivna bolest (PD) definisana je kao > 50% povećanje SPD od osnovne vrednosti. SPD devijacije od osnovne vrednosti između +50% i -25% smatrale su se stabilnom bolešću (SD). [0195[Demografija pacijenta, primljena doza i klinički ishod kod 34 pacijenta rezimirano je u Tabeli 3. Klinička anti-tumorska aktivnost CD19xCD3 vezujućeg molekula bila je jasno dozno zavisna: Konzistentna deplecija cirkulišućih CD19-pozitivnh B (limfom) ćelija iz periferne krvi uočeno je od 5 pg/m2/24č nadalje. Na 15 ug/m2/24č i 30 pg/m<2>/24Č prvi objektivni klinički odgovori (PRs i CRs) su zabeleženi kao i slučajevi delimične i kompletne eliminacije ćelija B limfoma iz infiltrirane kostne srži. Konačno, na 60 ug/m<2>/24č stopa odgovora se povećala do 100%

(PRs i CRs) i klirens kostne srži iz ćelija B limfoma bio jc kompletan u svim procenjivim slučajevima.

[0196]CD19xCD3 vezujući molekul je bio dobro tolerisan od strane većine pacijenata. Najčešći štetni događaji stepena 1-4 kod 34 pacijenta, nezavisno od žrtava rezimirano je u Tabeli 4. Štetni događaji povezani sa CD19xCD3 vezujućim molekulom obično su bili prolazni i potpuno reverzibilni. Naročito, bila su 2 pacijenta (pacijenti # 19 i # 24 u Tabeli 3) suštinski bez cirkulišućih CD19-pozitivnih B ćelija čiji je tretman rano zautavljen zbog CNS štetnih efekata (glavni simptomi: konfuzija i dezorijentacija) povezana sa ponovljenom redistribucijom T ćelija tokom početne faze infuzije CD19xCD3 vezujućeg molekula.

(0197]Jedan od ovih pacijenata (#19) bio je u kohorti 15-postepeno. Primio je 5 pg/m<2>/24č CD 19xCD3 vezujućeg molekula za prva 24č praćeno sa iznenadnim povećanjem do 15 pg/m<2>/24Č

dozom za održavanje. Odgovarajući obrazac redistribucije T ćelija pokazuje da se broj cirkulišućih T ćelija rapidno smanjuje nakon početka infuzije sa 5 pg/m<2>/24č praćeno sa ranim ponovnim javljanjem T ćelija u cirkulišućoj krvi suštinski bez cirkulišućih CD 19-pozitivnih B ćelija. Kao posledica, broj perifernih T ćelija se potpuno oporavio kada je doza CD19xCD3 vezujućeg molekula povećana nakon 24č od 5 do 15 pg/m<2>/24č. Stoga korak doze mogao je inicirati drugu epizodu redistribucije T ćelija kao što je prikazano na Fig. 20A. Ova ponovljena redistribucija T ćelija bila jc povezana sa CNS sporednim efektima (glavni simptomi: konfuzija i dezori jentacija) kod ovog pacijenta, što je dovelo do prekida infuzije. Veza između ponovljene redistribucije T ćelija i takvih CNS štetnih događaja takođe je uočena u prethodnim faza I kliničkim studijama kod B-NHL pacijenata koji su primali CD19xCD3 vezujući molekul (npr. opisan u WO 99/54440) kao ponovljena bolus infuzija 2 do 4 časa svaka obično praćena sa 2 dana intervala bez tretmmana (SI. 20 B). Svaka pojedinačna bolus infuzija inicirala jc jednu epizodu redistribucije T ćelija koja se sastojala od brzog smanjenja broja cirkulišućih T ćelija i oporavka T ćelija pre sledeće bolus infuzije. Ukupno, CNS štetni efekti povezani sa ponovljenom redistribucijom T ćelija uočeni su kod 5 od 21 pacijenta. SI. 20B prikazuje reprezentativni primer jednog pacijenta iz studije sa bolus infuzijom, koji je razvio CNS simptome nakon treće epizode redistribucije T ćelija. Tipično, pacijenti sa CNS štetnim događajima u studijama sa bolus infuzijom takođe su imali nizak broj cirkulišućih B ćelija.

[0198JDrugi pacijent (#24) iz studije sa neprekidnom infuzijom, čije je tretman rano prekinut zbog CNS štetnih događaja (glavni simptomi: konfuzija i dezorijentacija) povezanih sa ponovljenom redistribucijom T ćelija tokom početne faze infuzije CD19xCD3 vezujućeg molekula, bio je u kohorti 15-ista doza. Greškom, ovaj pacijent je primio infuziju CDI9xCD3 vezujućeg molekula bez dodatnog HSA potrebnog za stabilizaciju leka. Rezultujući nejadnaki protok leka inicirao je ponovljene epizode redistribucije T ćelija umesto samo jedne (SI. 23A) sa posledicom da je infuzija morala da se zaustavi zbog razvoja CNS simptoma. Ipak, kada je isti pacijent korektno ponovo tretiran sa rastvorom CD19xCD3 vezujućeg molekula koji sadrži dodatni HSA za stabilizaciju leka (npr. opisano u WO 99/54440), nije uočena ponovljena ređsitribucija T ćelija i pacijent nije ponovo razvio bilo kakve CNS simptome (SI. 23B). Obzirom da pacijent takođe suštinski nije imao cirkulišuće B ćelije, cirkulišuće T ćelije mogle su da reaguju sa brzom kinetikom redistribucije čak i na suptilne promene u izlaganju leka kao što jc uočeno. CNS štetni događaji povezani sa redistribucijom T ćelija kod pacijenata koji suštinski nisu imali cirkulišuće

ciljne ćelije može se objasniti prelaznim povećanjem adhczivnosti T ćelija za endotelne ćelije praćeno sa masivnom simultanom adhezijom cirkulišućih T ćelija za zidove krvnih sudova sa posledičnim smanjenjem broja T ćelija u cuirkul išućoj krvi kao što je uočeno. Masivno simultano vezivanje T ćelija za zidove krvnih sudova može izazvati povećanje u endotelnoj permeabilnosti i aktivaciji cndotelnih ćelija. Poslcdice povećane endotelne propustljivosti su pomeranja tečnosti iz intravaskuiarnog odeljka u intersticijalne tkivne odeljke uključujući CNS intersticijum. Aktivacija endotelnih ćelija od strane vezanih T ćelija može imati prokoagulatorne efekte (Monaco et al. J Leukoc Biol 71 (2002) 659-668) sa mogućim poremećajima u protoku krvi (uključujući protok krvi u mozgu) naročito u odnosu na kapilarnu mikrocirkulaciju. Stoga, CNS štetni događaji povezani sa redistribucijom T ćelija kod pacijenata suštinski bez cirkulišućih ciljnih ćelija mogu biti posledica kapilarnog curenja i/ili poremećaja u kapilarnoj mikrocirkulaciji preko adhezije T ćelija za endotelne ćelije. Endotclni stres izazvan sa jednom epizodom redistribucije T ćelija je tolerisan kod većine pacijenata, dok pojačani endotelni stres izazavan ponovljenom redistribucijom T ćelija često izaziva CNS štetne događaje. Više od jedne epizode redistribucije T ćelija može biti manje rizično samo kod pacijenata koji imaju nisku osnovnu vrednost broja cirkulišućih T ćelija. Međutim, takođe ograničeni endotelni stres izazvan jednom epizodom redistribucije T ćelija može izazvati CNS štetne događaje u retkim slučajevima povećane osetljivosti na takve događaje kao što je uočeno kod 1 od 21 pacijenta u studijama sa bolus infuzijom CD19xCD3 vezujućeg molekula.

|0199] Bez vezivanja za teoriju, prolazno povećanje adhezivnosti T ćelija za endotelne ćelije kod pacijenata koji suštinski nisu imali cirkulišuće ciljne ćelije može se objasniti kao reakcija T ćelija na monovalentnu interakciju konvencionalnog CD3 vezujućeg molekula, kao Što je CD19xCD3 vezujući molekul (npr. WO 99/54440), za njegov kontekstno zavisni epitop na CD3 epsilon što rezuituje u alosteričkoj promeni konformacije CD3 praćene sa regrutovanjem Nck2 za citoplazmatski domen CD3 epsilon kao što je prethodno opisano. Kako je Nck2 direktno vezan za integrine preko PINCH i ILK (SI. 28), regrutovanje Nck2 za citoplazmatski domen CD3 epsilon nakon alosteričke promene konformacije CD3 preko vezivanja sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekulom, kao što je CDl9xCD3 vezujući molekul, za njegov kontekstno zavisni epitop na CD3 epsilon, može povećati adhezivnost T ćelija na endotelne ćelije preko prolazne zamene integrina na površini T ćelije u njihovu adhezivniju izoformu preko unutra-spo Ija-signalizacije.

[0200]Korišćene skraćenice su: AE, štetni događaj; AP, alkalna fosfataza; LDH, laktat dehidrogenaza; CRP, C-reaktivni protein; ALT, alanin transaminaza; AST, aspartat transaminaza; GGT, gama-glutamil transferaza; AK podaci iz dodatnog ciklusa tretmana pacijenta 34 nisu još uključeni.

[0201]Kao što je prethodno objašnjeno, konvencionalni CD3 vezujući molekuli (npr. opisani u WO 99/54440) sposobni da se vezuju za kontekstno zavisni epitop, iako funkcionalni, dovode do neželjenog efekta redistribucije T ćelija kod pacijenata izazivajući CNS štetne događaje. Nasuprot tome, vezujući molekuli ovog pronalaska, vezujući kontekstno nezavisne Nterminalne 1-27 aminokiseline CD3 epsilon lanca, ne dovode do takvih efekata redistribucije T ćelija. Kao posledica, CD3 vezujući molekuli pronalaska su povezani sa boljim bezbednosnim profilom u poređenju sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekuiima. 14. Bispecifični Cl)3 vezujući molekuli opisa i nd u kuj u T ćelijski posredovanu ćelijsku ližu prepoznavanjem površinskog ciljnog antigena deplctiraju ćelije pozitivne na ciljni antigen in vivo

Bispecifični CD3 vezujući molekul iz opisa prepoznajući CD33 kao ciljni antigen depletira CD33-pozitivne cirkulišuće monocite iz periferne krvi makaki rakojeda

|0202] CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL (aminokiselinska sekvenca: SEQ ID N0.267) proizvedena je ekspresijom u CI IO ćelijama korišćenjem kodirajuće nukleotidne sekvence SEQ ID NO. 268. Kodirajuće sekvence od (i) N-terminalnog lidera teškog lanca imunoglobulina koji sadrži start kodon utisnut unutar Kozak konsenzus sekvence i (ii) C-terminalni His6-tag praćen sa stop kodonom su obe vezane u okviru čitanja sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO 268 prc umetanja rezultujućeg DNK-fragmenta kao što je dobijen genskom sintezom u višestruko klonirajuće mesto ekspresionog vektora pEFDI 1FR (Raum et al. Cancer Immunol Immunothcr 50

(2001) 141-150). Stabilna trransfekcija DHFR-deficijentnih CHO ćelija, selekcija za DHFR-pozitivne transfektante koji izlučuju CD3 vezujući molekul CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL u supernatant kulture i amplifikacija gena sa metotreksatom za povećanje nivoa ekspresije izvedene su kao što je opisano (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Analitički SEC-profil CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL za korišćenje kod makaki rakojeda otkrio je da se test materijal skoro isključivo sastojao od monomera. Potencija test materijala je merena u testu citotoksičnosti kao što je opisano u primeru 16.5 korišćenjem CHO ćelija transficiranih sa CD33 makaki rakojeda kao ciljnih ćelija i makaki T ćelijske linije 4119LnPx kao izvora efektorskih ćelija (SL. 25). Koncentracija CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL neophodna za polu-maksimalnu lizu ciljnih ćelija sa efektorskim T ćelijama (EC50) bila je 2.7 ng/ml.

[0203] Mladi (oko 3 godine starosti) adultni makaki rakojedi (Macaca fascicularis) tretirani su kontinuiranom intravenskom infuzijom CD3 vezujućeg molekula CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL na različitim stopama protoka (tj. doznim nivoima) da bi se proučavala deplecija cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita iz periferne krvi. Ova situacija ekvivalentna je tretmanu sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekulom CD19xCD3 (specifičnim za CD19 na B ćelijama i CD3 na T ćelijama) onih B-NHL pacijenata, koji imaju CD19-pozitivne ciljne B ćelije (videti npr. WO99/54440). Deplecija cirkulišućih CD 19-pozitivnih ciljnih B ćelija iz periferne krvi pokazala se kao validan surogat za opštu kliničku efikasnost konvencionalnog CD3 vezujućeg molekula (CD19xCD3 kao što je dat u WO99/54440) kod pacijenata sa CD 19-pozitivnim B ćelijskim malignomima kao što je B-NHL. Slično tome, deplecija cirkulišućih CD33-pozilivnih monocita iz periferne krvi smatra se validnim surogatom opšte kliničke efikasnosti CD33-usmerenih bispecifičnih CD3 vezujućih molekula iz opisa kao što jc CD33-AF5 VII-VL x I2C VI l-VL kod pacijenata sa CD33-pozitivnim mijeloidnim malignomima kao što je AML (akutna mijcloidna leukemija).

[0204] Neprekidna infuzija je izvedena prema Svvivel postupku kao što sledi: Majmuni su kateterizovani preko femoralne vene u venu cava caudalis korišćenjem venskog katetera. Kateter je tunelovan potkožno u dorzaini region ramena i izveden spolja na kaudalnom delu lopatice. Cevčica je zatim sprovedena kroz prsluk i zaštitnu oprugu. Prsluk je pričvršćen oko životinje i katetera, i preko cevi je spojen sa infuzionom pumpom.

[0205] Rastvor za primenu (1.25 M lizin, 0.1 % tvveen 80, pH 7) bez test materijala neprekidno jc primenjivan infuzijom sa 48 ml/24č 7 dana pre početka tretmana da bi se omogućila aklimatizacija životinja na uslove infuzije. Tretman je započet dodavanjem CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL test materijala u rastvor za primenu u količini potrebnoj za svaki pojedinačni nivo doze za testiranje (tj. stopu protoka CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL). lnfuzioni rezervoar je menjan svaki dan tokom ceie faze aklimatizacije i tretmana. Planirano trajanje tretmana bilo je 7 dana osim za 120 pg/m2/24č nivo doze, gde su životinje tretirane 14 dana.

[0206] Vremenski tokovi apsolutnog broja cirkulišućih T ćelija i CD33-pozitivnih monocita određeni su 4- 3-bojnom FACS analizom, respektivno:

Prikupljanje uzoraka krvi i rutinska analiza

[0207] Uzorci krvi (l ml) dobijeni su pre i 0.75, 2, 6. 12, 24, 30, 48, 72 časova nakon početka neprekidne infuzije sa MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL kao i i nakon 7 i 14 dana (i nakon 9 dana na 120 pg/m<2>/24č nivou doze) tretmana korišćenjem Vacutainer™ epruveta sa EDTA (Becton Dickinson) koje su isporučene za analizu na 4°C. U nekim slučajevima desile su se blage varijacije ovih vremenskih tačaka iz opreativnih razloga. FACS analiza subpopulacija limfocita izvedena je unutar 24 - 48 Č nakon prikupljanja uzoraka krvi. Apsolutni broj subpopulacija limfocita u uzorcima krvi određenje preko diferencijalne analize krvi u rutinskoj veterinarskoj laboratoriji.

Izolacija PBMC iz uzoraka krvi

[0208] PBMC (mononuklearne ćelije periferne krvi) izolovani su analogno protokolu opisanom u primeru 13, prethodno, sa prilagođavanjem korišćenih zapremina.

Bojenje PBMC sa fluorescentno obeleženim antitelima protiv molekula na ćelijskoj površini

[0209]Monoklonska antitela reaktivna sa antigenima makaki rakojeda dobijena su od Becton Dickinson (1 Cal. No. 345784, 2Cat. No. 556647, 3Cat. No. 552851, 6Cat. No. 557710). Bcckman Coulter (4Cat. No. IM2470) i Miltenvi (5Cat. No. 130-091-732) i korišćena prema preporukama proizvođača. 5xlOMxl06 ćelija bojeno je sa sledećim kombinacijama antitelima: anti-CD141 (FITC) x anti-CD562 (PE) x anti-CD33 (PerCP)x anti-CD 194 (APC) i anti-CD 141 (FITC) x anti-CD335 (PE) x anti-CD 166 (Alexa Fluor 647™). Dodatni koraci su izvedeni kao što je opisano u primeru 13, prethodno.

Protočno citometrijska detekcija obojenih limfocita sa FACS

[0210] Prikupljanje podataka je izvedeno sa 4 bojnim BD FACSCalibur™ (Becton Dickinson). Za svako merenje uzelo jc lxl0<4>ćelija definisanih subpopulacija limfocita. Statistička analiza je urađena sa programom CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) da bi se dobili procenti subpopulacijc limfocita i da bi sc klasifikovao intenzitet ekspresije molekula na ćelijskoj površini. Nakon toga, procenti subsetova pojedinačnih limfocita su stavljeni u odnos sa ukupnim limfocitima (tj. B plus T plus NK ćelije isključujući mijeloidne ćelije preko CDl4-bojenja) kao što je određeno FACS analizom korelisani su sa brojem limfocita iz diferencijalne analize krvi da bi se izračunao apsolutni broj T ćelija (CD3+, CD56-, CD 14-). Apsolutni brojevi CD33-pozitivnih monocita izračunati su množenjem broja monocita iz diferencijalne analize krvi sa odgovarajućim odnosima CD33-pozitivnih monocita (CD33+, CD 14+) prema svim monocitima (CD 14+) kao što je određeno sa FACS.

[0211] Procenat u poređenju sa osnovnom vrednošću (tj. 100%) apsolutnog broja cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita na kraju tretmana sa CD33-AF5 VH-VE x 12C VH-VL u 4 kohorte od 2 makaki rakojeda sa inter-kohortnim povećanjem doze od 30 preko 60 i 240 do 1000 ug/m<2>/24č prikazan je na SL 26A.

[0212] Kao što je prikazano na SL 26A, kontinuirana intravenska infuzija CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL indukuje depleciju cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita na način zavisan od doze. Iako i dalje nije bilo detektabilne deplecije cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita na 30 pg/m<2>/24č, prvi trend ka smanjenju broja CD33-pozitivnih monocita postao je vidljiv sa 60 pg/m<2>/24č nakon 7 dana tretmana.

[0213] Na 240 pg/m<2>/24č cirkulišući CD33-pozitivni monociti bili su skoro potpuno depletirani iz periferne krvi nakon 3 dana tretmana. Ovo je još brže dostignuto na 1000 ug/m<2>/24č, gde je deplecija cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita iz periferne krvi već završena nakon 1 dana tretmana.

[0214] Ovaj nalaz je potvrđen rezultatima prikazanim na Slici 26B koja pokazuje depleciju cirkulišućih CD33-pozitivnih monocita za dve trećine i 50% u poređenju sa respektivnom osnovnom vrednošću kod dva makaki rakojeda tretirana neprekidnom infuzijom sa CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL na 120 pg/m2/24č 14 dana. [0215J Ovaj ishod je jasan signal kliničke efikasnosti CD3 vezujućih molekula iz opisa generalno i bispecifičnih CD33-usmcrcnih CD3 vezujućih molekula iz opisa za tretman CD33-pozitivnih malignoma kao što je naročito AML.

[0216] Dodatno, redistribucija T ćelija tokom početne faze tretmana sa CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL u prisustvu cirkulišućih ciljnih ćelija (tj. CD33-pozitivnih monocita) izgleda daje manje izražena nego redistribucija T ćelija tokom početne faze tretmana sa konvencionalnim CD19xCD3 konstruktima, kao što je opisano u WO99/54440 kod B-NHL pacijenata sa značajnim brojem cirkulišućih ciljnih ćelija (tj. CD 19-pozitivnih B ćelija) kao Što je prikazano na SI. 22. Dok T ćelije nestaju u potpunosti iz cirkulacije nakon početka infuzije sa CD 19xCD3 i ne pojavljuju sc ponovo do depletiranja cirkulišućih CD19-pozitivnih ciljnih B ćelija iz periferne krvi (SI. 22), inicijalni nestanak cirkulišućih T ćelija nije kompletan po početku infuzije sa CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL i broj T ćelija se oporavlja još tokom prisustva cirkulišućih CD33-pozilivnih ciljnih ćelija (SI. 26B). Ovo potvrđuje da CD3 vezujući molekuli iz opisa (usmereni protiv i stvoreni protiv epitopa humanog i primata osim šimpanze CD3£(epsilon) lanca i koji su deo ili fragment iii puna dužina aminokiselinske sekvence kao što je obezbeđeno u SEQ ID Nos. 2, 4, 6, ili 8) preko prepoznavanja kontekstno nezavisnog CD3 epitopa pokazuju povoljniju

[0217] redistribuciju T ćelija od konvencionalnih CD3 vezujućih molekula koji prepoznaju kontekstno zavisni CD3 epitop, kao što su vezujući molekuli obezbedeni u WO99/54440,

15. CD3 vezujući molekuli iz opisa usmereni na suštinski kontekstno nezavisne CD3 epitope preko izazivanja manje redistribucije cirkulišućih T ćelija u odsustvu cirkulišućih ciljnih ćelija smanjuju rizik od štetnih događaja povezanih sa početkom tretmana Smanjena redistribucija T ćelija kod makaki rakojeda nakon početka tretmana sa reprezentativnim interspecijski specifičnim CD3 vezujućim molekulom iz opisa

[0218] MCSP-G4 VH-VL x 12C VH-VL (aminokiselinska sekvenca: SEQ ID NO. 193) proizveden je ekspresijom u CHO ćelijama korišćenjem kodirajuće nukleotidne sekvence SEQ ID NO. 194. Kodirajuće sekvence od (i) N-terminalnog lidera teškog lanca imunoglobulina koja sadrži start kodon utisnut unutar Kozak konsenzus sekvence i (ii) C-terminalni His6-tag praćen sa stop kodonom, su obe vezane u okivru čitanja sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO. 194 pre ubacivanja rczultujućeg DNK-fragmenta kao što je dobijen genskom sintezom u višestruko klonirajuće mesto ekspresionog vektora pEFDIIFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50

(2001) 141-150). Stabilna transfekcija DHFR-deficijentnih CHO ćelija, selekcija za DHFR-pozitivne transfektante koji luče CD3 vezujući molekul MCSP-G4 VH-VL x 12C VH-VL u supernatant kulture i amplifikacija gena sa melotreksatom za povećanje ekspresionih nivoa izvedena je kao Što je opisano (Macket al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Test materijal za tretman makaki rakojeda proizveden je u 200-litarskom fermentoru. Prečišćavanje sakupljenih proteina bilo je zasnovano na IMAC afinitetnoj hromatografiji koja je ciljala C-terminalni His6-tag MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL praćen sa preparativnom ekskluzionom hromatografijom (SEC). Totalni prinos finalnog test materijala bez endotoksina bio je 40 mg. Test materijal se sastojao od 70 % monomera, 30% dimera i male kontaminacije viših multimera. Potencija test materijala merena je u citotoksičnorn testu kao Što je opisano u primeru 11 korišćenjem CHO ćelija transficiranih sa MCSP makaki rakojeda kao ciljnim ćelijama i makaki T ćelijske linije 41 19LnPx kao izvora efektorskih ćelija (SI. 27). Koncentracija MCSP-G4 VF1-VL x I2C VH-VL neophodna za polu-maksimalnu lizu ciljnih ćelija od sirane efektorskih T ćelija (EC50) bila je 1.9 ng/ml. |02I9JMladi (oko 3 godine starosti) adultni makaki rakojedi (Macaca fascicularis) tretirani su kontinuiranom intravenskom infuzijom CD3 vezujućeg molekula MCSP-G4 VH-VL x 12C VH-VL na različitim stopama protoka (tj. doznim nivoima) da bi se proučavala redistribucija cirkulišućih T ćelija nakon početka tretmana u odsustvu cirkulišućih ciljnih ćelija, lako CD3 vezujući molekul MCSP-G4 VH-VL x 12C VH-VL može prepoznati i MCSP makaki rakojeda i CD3 makaki rakojeda, nema cirkulišućih ćelija koje eksprimiraju MCSP. Stoga, jedina moguća interakcija u cirkulišućoj krvi je vezivanje CD3specifične ručice MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL za CD3 na T ćelijama. Ova situacija je ekvivalentna tretmanu sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekulom (CDI9xCD3 vezujući molekul specifičan za CD19 na B ćelijama i CD3 na T ćelijama) onih B-NHL pacijenata, koji nemaju cirkulišuće CD19-pozttivne ciljne B ćelije kao što je opisano u primeru 13.

[0220]Neprekidna infuzija izvedena je prema Svvivel postupku kao što sledi: Majmuni su kateterizovani preko femoralne vene u venu cava caudaiis korišćenjem venskog katetera. Kateter jc tunelovan potkožno u dorzalni region ramena i izveden spolja na kauđalnom delu lopatice, Ccvčica je zatim sprovedena kroz prsluk i zaštitnu oprugu. Prsluk je pričvršćen oko životinje i katetera, i preko cevi je spojen sa infuzionom pumpom.

[0221] Rastvor za primenu (1.25 M lizin, 0.1 % tvveen 80, pH 7) bez test materi jala neprekidno jc primenjivan infuzijom sa 48 ml/24č 7 dana pre početka tretmana da bi se omogućila aklimatizacija životinja na uslove infuzije. Tretman je započet dodavanjem MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL test materijala u rastvor za primenu u količini potrebnoj za svaki pojedinačni nivo doze za testiranje (tj. stopu protoka MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL). Infuzioni rezervoar jc menjan svaki dan tokom cele faze aklimatizacije i tretmana. Trajanje tretmana bilo je 7 dana.

[0222] Vremenski tokovi apsolutnog broja cirkulišućih T ćelija određeni črtvorobojnom FACS analizom kao što sledi:

Prikupljanje uzoraka krvi i rutinska analiza

[0223] Uzorci krvi (1 ml) dobijeni su pre i 0.75, 2, 6, 12, 24, 30, 48, 72 Časova nakon početka neprekidne infuzije sa MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL kao i i nakon 7 dana tretmana korišćenjem Vacutainer™ epruveta sa EDTA (Becton Dickinson) koje su isporučene za analizu na 4°C. U nekim slučajevima desile su se blage varijacije ovih vremenskih tačaka iz opreativnih razloga. FACS analiza subpopulacija limfocita izvedena je unutar 24 - 48 č nakon prikupljanja uzoraka krvi.

[0224] Apsolutni broj subpopulacija limfocita u uzorcima krvi određen je preko diferencijalne analize krvi u rutinskoj veterinarskoj laboratoriji.

Izolacija PBMC iz uzoraka krvi

[0225] PBMC (mononuklearne ćelije periferne krvi) izolovani su analogno protokolu opisanom u primeru 13, prethodno, sa prilagođavanjem korišćenih zapremina.

Bojenje PBMC sa fluorescentno obeleženim antitelima protiv molekula na ćelijskoj površini

[0226] Monoklonska antitela reaktivna sa antigenima makaki rakojeda dobijena su od Becton Dickinson (ICat. No. 345784, 2Cat. No. 556647, 3Cat. No. 552851) i Beckman Coultcr (4Cat. No. 1M2470) i korišćena prema preporukama proizvođača. 5xl05 - lxl0<6>ćelija bojen je sa sledećim kombinacijama antitelima: anti-CD 141 (FITC) x anti-CD562 (PE) x anti-CD33 (PerCP) x anti-CD 194 (APC). Dodatni koraci su izvedeni kao što je opisano u primeru 13, prethodno.

Protočno citometrijska detekcija obojenih limfocita sa FACS

{0227] Prikupljanje podatakaje izvedeno sa 4 bojnim BD FACSCalibur™ (Becton Dickinson). Za svako merenje uzeto je lxl0<4>ćelija definisanih subpopulacija limfocita. Statistička analiza je urađena sa programom CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) da bi se dobili procenti subpopulacije limfocita i da bi sc klasifikovao intenzitet ekspresije molekula na ćelijskoj površini. Nakon toga, procenti subselova pojedinačnih limfocita su stavljeni u odnos sa ukupnim limfocitima (tj. B plus T plus NK ćelije isključujući mijeloidne ćelije preko CD14-bojenja) kao što je određeno FACS analizom korelisani su sa brojem limfocita iz diferencijalne analize krvi da bi se izračunao apsolutni broj T ćelija (CD3+, CD56-, CD14-)

[0228] Redistribucija T ćelija tokom početne faze tretmana sa MCSP-G4 VH-VF x I2C VH-VL kod makaki rakojeda na nivou doze od 60, 240 i 1000 ug/m<2>/24č prikazana je na SI. 28. Ove životinje nisu pokazivale nikakve znake redistribucije T ćelija tokom početne faze tretmana, tj. broj T ćelija se pre povećao nego smanjio na početku tretmana. Uzimajući u obzir da je redistribucija T ćelija konzistentno uočavana kod 100% svih pacijenata bez cirkulišućih ciljnih ćelija, po početku tretmana sa konvencionalnim CD3 vezujućim molekulom (npr. CD19xCD3 konstruktom kao što je opisano u WO 99/54440) protiv kontekstno zavisnog CD3 epitopa, pokazano je da se suštinski manja redistribucija T ćeli ja u odsustvu cirkulišućih ciljnih ćelija po početku tretmana može uočiti sa CD3 vezujućim molekulom iz opisa usmerenim i stvorenim protiv epitopa humanog i primata osim šimpanze CD3 epsilon lanca kao što je đefinisano aminokiselinskom sekvencom bilo koje od SEQ ID NOs: 2,4, 6, ili 8 ili njihovog fragmenta. Ovo je jasan kontrast sa CD3-vezujućim molekuiima usmerenim protiv kontekstno zavisnog CD3 epitopa, kao što su konstrukti opisani u WO 99/54440. Vezujući molekuli protiv kontekstno nezavisnih CD3 epitopa, kao (između ostalog) što su obezbeđeni u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 2, 4, 6, ili 8 (ili fragmenti ovih sekvenci) obezbeđuju ovu suštinski manju (štetnu i neželjenu) redisribuciju T ćelija. Kako je redistribucija T ćelija tokom početne faze tretmana sa CD3 vezujućim molekuiima glavni faktor rizika za CNS štetne događaje, ovde obezbeđeni CD3 vezujući molekuli i koji su sposobni da prepoznaju kontekstno nezavisni CD3 epitop imaju značajnu prednost u odnosu na CD3 vezujućc molekule poznate u tehnici i usmerene protiv kontekstno zavisnih CD3 epitopa. Zaista, nijedan od makaki rakojeda tretiran sa MCSP-G4 VHVL x I2C VH-VL nije pokazao bilo kakve znake CNS simptoma.

[0229] Kontekstna nezavisnost CD3 epitopa obezbeđena je u ovom pronalasku i odgovara prvim 27 Ntcrminalnim aminokiselinama CD3 epsilon) ili fragmentima ovog 27 aminokiselinskog niza. Ovaj kontekstno nezavisni epitop je uzet iz svog nativnog okruženja unutar CD3 kompleksa i fuzionisan sa heterolognim aminokiselinskim sekvencama bez gubitka svog strukturnog integriteta. Anti-CD3 vezujući molekuli kao što su obezbeđeni ovde i stvoreni (i usmereni) protiv kontekstno nezavisnog CD3 epitopa obezbeđuju iznenađujuće kliničko poboljšanje u odnosu na redistribuciju T ćelija i stoga, povoljniji bezbednosni profil. Bez vezivanja za teoriju, kako je njihov CD3 epitop kontekstno nezavisan, formira autonomni samodovoljni subdomen bez mnogo uticaja na ostatak CD3 kompleksa, ovde obezbeđeni CD3 vezujući molekuli indukuju manje alosteričkih promena u CD3 konformaciji od konvencionalnih CD3 vezujućih molekula (kao što su molekuli obezbeđeni u WO 99/54440), koji prepoznaju kontekstno zavisne CD3 epitope kao što su molekuli u WO 99/54440. Kao posledica toga (opet bez vezivanja za teoriju), indukcija intracelularnog NcK2 regrutovanja od strane ovde obezbedenih CD3 vezujućih molekula je takođe smanjena što rezuituje u manjoj promeni izoformi T ćelijskih integrina i manjoj adheziji T ćelija sa endotelnim ćelijama. Poželjno je da se preparati CD3 vezujućih molekula iz opisa (usmereni protiv i stvoreni protiv kontekstno nezavisnog epitopa kao što je ovde đefinisano) suštinski sastoje od monomernih molekula.

[0230] Ovi monomerni molekuli su još više efikasni (od dimernih ili multimernih molekula) u izbegavanju redistribucije T ćelija i stoga rizika od CNS štetnih događaja tokom početne faze tretmana.

16. Stvaranje i karakterizacija CD33 i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula

16.1. Stvaranje CHO ćelija koje eksprimiraju humani CD33

[0231] Kodirajuća sekvenca humanog CD33 kao što je objavljena u GenBank (Accession number NM_001772) dobijena je genskom sintezom prema standardnim protokolima. Fragment dobijen genskom sintezom dizjaniran je da sadrži prvo Kozak mesto za eukariotsku ekspresiju konstrukta, praćeno sa lider peptidom imunoglobulina od 19 aminokiselina, praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom zrelog humanog CD33 proteina, praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom serin glicin dipeptida, histiđinć-tagom i stop kodonom (cDNK i aminoksielinska sekvenca konstrukta je data pod SEQ ID Nos 305 i 306). Fragment dobijen genskom sintezom takođe je dizajniran da uvede restrikciona mesta na početku i na kraju fragmenta. Uvedena rcstirkciona mesta. EcoRI na 5' kraju i Sali na 3' kraju, korišćena su u sledećim procedurama kloniranja. Fragment dobijen genskom sintezom kloniranje preko EcoRI i Sali u plazmid označen pEF-DHFR (pEF-DHFRje opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) praćenjem standardnih protokola. Prethodno pomenute procedure izvedene su prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Klon sa proverenom nukleotidnom sekvencom je transficiran u DHFR deficijentne CHO ćelije za eukariotsku ekspresiju konstrukta. Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijentnim CHO ćelijama (ATCC No. CRL 9096) izvedena je kao što je opisano u Kaufmann RJ. (1990) Methods Enzvmol. 185, 537-566. Amplifikacija gena konstrukta indukovana jc rastućim koncentracijama metotreksata (MTX) do finalne koncentracije od do 20 nM M l X.

16.2. Stvaranje CHO ćelija koje eksprimiraju ekstracelularni domen makaki CD33

[0232] Sekvenca cDNK makaki CD33 dobijena je nizom od 3 PCR na cDNK od kostne srži makaki majmuna pripremljene po standardnim protokolima. Sledeći reakcioni uslovi: 1 ciklus na 94°C 3 minuta praćen sa 35 ciklusa sa 94°C 1 minut, 53°C 1 minut i 72°C 2 minuta praćeno salerminalnim ciklusom od 72°C 3 minuta i korišćeni su sledeći prajmeri:

(0233]Ovi PCR stvaraju tri preklapajuća fragmenta, koji su izolovani i sekvencirani prema standardnim protokolima korišćenjem PCR prajmera, i time su obezbedili deo cDNK sekvence makaki CD33 od drugog nukleotida od kodon +2 do trećeg kodona od kodon +340 zrelog proteina.

[0234]Da bi se stvorio konstrukt za ekspresiju makaki CD33 cDNK. fragment je dobijen genskom sintezom prema standardnim protokolima (cDNK i aminokiselinska sekvenca konstrukta data je pod SEQ ID Nos 307 i 308). U ovom konstruktu kodirajuća sekvenca makaki CD33 od aminokiseline +3 do +340 zrelog CD33 proteina fuzionisano je u kodirajuću sekvencu humanog CD33 zamenjujući humanu kodirajuću sekvencu aminokiseline +3 do +340. Fragment dobijen genskom sintezom takođe je dizajniran tako da sadrži Kozak mesto za eukariotksu ekspresiju konstrukta i restrikciona mesta na početku i na kraju fragmenta koji sadrži cDNK koja suštinski kodira ceo ekstracelularni domen makaki CD33, makaki CD33 transmembranski domen i makaki-humani himerni intraceluiarni CD33 domen. Uvedena restrikciona mesta Xbal na 5' kraju i Sali na 3' kraju, korišćena su u sledećim procedurama kloniranja, fragment dobijen genskom sintezom je zatim kloniran preko Xbal i Sali u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Jmmunoi Immunother 50 (2001) 141-150). Klon ovog plazmida sa verifikovanom sekvencom korišćen je za transficiranje CHO/dhfr- ćelija kao Što je prethodno opisano.

16.3. Stvaranje CD33 i CD3 molekula interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela Kloniranje interspecijski specifičnih vezujućih molekula

[0235] Generalno, molekuli bispecifičnih antitela, gde svaki sadrži domen sa vezujućom specifičnošću interspecijski specifičnom za humani i primata osim šimpanzi CD3 epsilon kao i domena sa vezujućom specifičnošću interspecijski specifičnom za humani i primata osim šimpanze CD33, dizajnirani su kao stoje dato u sledećoj Tabeli 5:

[0236] Prethodno pomenuti konstrukti koji sadrže varbijalne domene lakog lanca (L) i varijabilne domene teškog lanca (U) interspecijski specifične za humani i makaki CD33 i CD3 specifične VH i VL kombinacije interspecijski specifične za humani i makaki CD3 dobijeni su genskom sintezom. Fragmenti dobijeni genskom sintezom su dizajnirani i ekspresija eukariotskog proteina je izvedena slično kao što jc opisano u primeru 9 za MCSP i CD3 interspecijski speifične jednolančane molekule.

[0237] Isto važi za ekspresiju i prečišćavanje CD33 i CD3 interspecijski specifičnih jednolančanih molekula.

[0238] U VVestern Blot detektovana je jedna traka na 52 kD koja odgovara prečišćenom bispecifičnom antitelu.

J6.4. Protočno citometrijska analiza vezivanja CD33 i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela

[0239] Da bi se testirala funkcionalnost konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u odnosu na sposobnost da sc vezuju za humane i makaki CD33 i CD3. respektivno, izvedena je FACS analiza slična analizi opisanoj za analizu MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u primeru 10 korišćenjem CHO ćelija koje eksprimiraju humane ili makaki CD33 ekstracelularne domene (videti primere 16.1 i 16.2).

[0240] Specifično vezivanje humanih i primata osim Šimpanze CD3 od CD3 vezujućih molekula iz opisa bila je jasno detektabilna kao stoje prikazano na Slici 29. U FACS analizi svi konstrukti su pokazali vezivanje za CD3 i CD33 u poređenju sa respektivnim negativnim kontrolama. Pokazana je interspecijska specifičnost bispecifičnih antitela za humane i makaki CD3 i CD33 antigene.

16.5.Bioaktivnost CD33 i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela

[0241] Bioaktivnost stvorenih bispecifičnih antitela analizirana je sa in vitro acilotoksičnim testom sa oslobađanjem hroma 51 C'Cr) korišćenjem CD33 pozitivnih ćelijskih linija opisanih u Primerima 16.1 i 16.2. Kao efektorske ćelije korišćene su stimuiisane humane CD4/CD56 depletirane PBMC ili makaki T ćelijska linija 41 !9LnPx kao što je specifikovano u respektivnim slikama. Citotoksični testovi su izvedeni slično postavkama opisanim za analizu bioaktivnosti MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u primeru 11 korišćenjem CHO ćelija koje eksprimiraju humane ili makaki CD33 ekstracelularne domene (videti primer 16.1 i 16.2) kao ciljnih ćelija.

[0242] Kao štoje prikazano na Slici 30, svi stvoreni interspecijski specifični bispecifični konstrukti demonstriraju citotoksičnu aktivnost protiv humanih CD33 pozitivnih ciljnih ćelija izazvanih stimulisanim humanim CD4/CD56 depletiranim PBMC i protiv makaki CD33 pozitivnih ciljnih ćelija izazvanih sa makaki T ćelijskom linijom 4119LnPx. 17. Prečišćavanje interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula preko afinitetne procedure zasnovane na kontekstno nezavisnom CD3 epsilon epitopu koji odgovara N-terminalnim aminokiselinama 1-27

17.1 Stvaranje afinitetne kolone koja prikazuje izolovane kontekstno nezavisne humane CD3 epsilon epitope koji odgovaraju N-terminalnim aminokiselinama 1-27

[0243] Plazmid za ekspresiju konstrukta 1-27 CD3-Fc koji se sastoji od 1-27 N-terminalnih aminokiselina humanog CD3 epsilon lanca fuzionisanog sa zglobnim regionom i Fc gama regionom humanog imunoglobulina IgGI prethodno opisanog (Prirner3; cDNK sekvenca i aminokiselinska sekvenca rekombinantnog fuzionog proteina dati su pod SEQ ID Nos 230 i 229) transficiran je u DHFR deficijentne CHO ćelije za eukariotsku ekspresiju konstrukta. Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijentnim CHO ćelijama izvedena je kao što je opisano od strane Kaufmann RJ. (1990) Methods Enzvmol. 185, 537-566. Amplifikacija gena konstrukta indukovana jc rastućim koncentracijama metotreksata (MTX) do finalne koncentracije od do 20 nM MTX. Nakon dvas pasaža stacionarne kulture ćelije su uzgajane u roler bocama sa HyQ PF CHO tečnim soja medijumom bez nukleozida (sa 4.0 mM L-Glutamin sa 0.1% Pluronic F - 68; FIyClone) 7 dana pre sakupljanja. Ćelije su uklonjene centri fugiranj em i supernatant koji sadrži eksprimirani protein je uskladišten na -20°C. Za izolaciju fuzionog proteina kozji anti-humani fc afinitetna kolona jc pripremljena prema standardnim protokolima korišćenjem komercijalno dostupnih afinitetno prečišćenih kozjih anti-humanih IgG fc fragment specifičnih antitela sa minimalnom unakrsnom reacijom sa goveđim, konjskimi mišjim serum proteinima (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Korišćenjem ove afinitetne kolone fuzioni protein je izolovan iz supernatant ćelijske kulture na Akta Explorer Svstem (GE Amersham) i cluiran limunskom kiselinom. Elual je neulralisan i koncentrovan. Nakon dijalize preko kuplujućeg pufera bezamina prečišćeni fuzioni protein je kuplovan sa N-hidroksi-sukcinimid NHS aktiviranom 1 ml HiTrap kolonom (GE Amersham).

[0244] Nakon kuplovanja preostale NHS grupe su blokirane i kolona je isprana i uskladištena na 5°C u puferu za skladištenje koji sadrži 0.1% natrijum azid.

17.2 Prečišćavanje interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula korišćenjem afinitetne kolone sa humanim CD3 peptidom

[0245] 200 ml supernatanta ćelijske kulture ćelija koje eksprimiraju interspecijski specifične bispecifične jednolančane molekule 0.2 pm sterilno je filtriran i primenjen na CD3 peptid afinitctnnu kolonu korišćenjem Akta Explorer sistema (GE Amersham).

[0246] Kolona je zatim isprana sa fosfatno puferovanim slanim rastvorom PBS pl 1 7.4 bi se isprao nevezani uzorak. Eluiranje jc izvedeno sa kiselim puferom pH 3.0 koji sadrži 20 mM limunske kiseline i 1 M natrijum hlorida. Eluirani protein je odmah neutralisan sa 1 M Trishidroksimetilamin TRIS pH 8.3 sadržanom u kolektorskim epruvetama frakcionog kolektora.

[0247] Analiza proteina urađena jc sa SDS PAGE i Western Blot.

[0248] Za SDS PAGE korišćen je BisTris Gels 4-12% (Invitrogen). Tekući pufer bio je 1 x MES-SDS-Puffer (Invitrogen). Kao proteinski standard primenjeno je 15 pl prethodno obojenog Sharp Protein Standard (Invitrogen). Elektroforcza je izvedena 60 minuta na 200 volti 120 mA maks. Gelovi su isprani u demineralizovanoj vodi i obojeni sa Coomassie jedan čas. Gelovi su odbojeni u demineralizovanoj vodi 3 časa. Slikano je sa Svngene Gel documentation svstem.

[0249] Za Western Blot napravljen je dupli SDS PAGE gel i proteini su elektroblotovani na nitroceluloznoj membrani. Membrana je blokirana sa 2% albumina iz goveđeg seruma u PBS i inkubirano sa biotinilovanim mišjim Penta His antitelom (Qiagen). Kao sekundarni reagens korišćen je streptavidin alkalna fosfataza konjugat (DAKO). Blotovi su razvijeni sa BCIP/NBT rastvorom supstrata (Pierce). J0250] Kao što je pokazano na Slikama 31, 32 i 33 korišćenje CD3 peptid afinitetne kolone kao što je prethodno opisano omogućava visoko efikasno prečišćavanje bispecifičnih jednolančanih molekula iz supernatanta ćelijske kulture. Interspecijski specifična anti-CD3 jednolančana antitela sadržana u bispecifičnim jednolančanim molekuiima stoga omogućavaju preko njihovih osobina specifičnog vezivanja efikasan generički postupak iz jednog koraka za prečišćavanje interspecijski specifične bispecifične jednolančane molekule, bez potrebe za bilo kakvim tagovima koij su vezani samo za potrebe prečišćavanja.

18. Generički farmakokinetički test za interspecijski specifične bispecifične jednolančane molekule

18.1 Proizvodnja 1-27 CD3-Fc za upotrebu u farmakokinetičkom testu

[0251] Kodirajuća sekvenca 1-27 N-terminalnih aminokiselina humanog CD3 epsilon lanca fuzionisanog sa zglobnim i Fc gama regionom humanog imunoglobulina IgGI dobijena je genskom sintezom prema standardnim prtokolima (cDNK sekvenca i aminokiselinska sekvenca rekombinatnog fuzionog proteina je data pod SEQ ID NOs 309 i 310). Fragment dobijen genskom sintezom dizajniran je tako da sadrži prvo Kozak mesto za cukariotsku ekspresiju konstrukta, praćeno sa lider peptidom imunoglobulina od 19 aminokiselina, praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom prvih 27 aminokiselina ekstracelularnog dela zrelog humanog CD3 epsilon lanca, praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom zgiobnog regiona i Fc gama delom humanog IgGI i stop kodonom. Fragment dobijen genskom sintezom takode je dizajniran i kloniran kao što je opisano u primeru 3.1, supra. Kion sa verifikovanom nukleotidnom sekvencom transficiran je u DHFR deficijentne Cl IO ćelije za eukariotsku ekspresiju konstrukta. Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijentnim CHO ćelijama izvedena je kao Što je opisano u primeru 9, prethodno. Za izolaciju fuzionog proteina pripremljena je kozji anti-humani fc afinilelna kolona pripremljena prema standardnim protokolima korišćenjem komerejalno dostupnog afinitetno prečišćenog kozjeg anti-humanog IgG fc fragment specifičnog antitela sa minimalnom unakrsnom reaktivnošću sa goveđim, konjskim, i mišjim serum proteinima (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Korišćenjem ove afinitetne kolone fuzioni proein je izolovan iz supernatanta ćelijske kulture na Akta Explorer Svstem (GE Amersham) i eluiran sa limunskom kiselinom. Eluat je neutralizovan i koncentrovan.

18.2 Farmakokinetički test za interspecijski specifične bispecifične jednolančane molekule

[0252] Test je zasnovan na ECL-EL1SA tehnologiji korišćenjem rutenijum obeležene detekcije na pločama od ugljeničnih vlakana mereno na Sektor Imager device (MSD). U prvom koraku, ploče od ugljeničnih vlakana (MSD High Bind Plate 96 ploča Cat: L15xB-3) su obložene sa 5 pl/komorici sa 50 ng/ml prečišćenog 1-27 CD3-Fc opisanog u Primeru 18.1. Ploča je zatim preko noći osušena na 25°C. Nakon toga ploče su blokirane sa 5% BSA (Paesel&Lorci #100568) u PBS sa 150 pl/komorici 1 č na 25°C u inkubatoru uz šejkiranje (700 rpm). U sledećem koraku ploče su isprane tri puta sa 0.05% Tvveen u PBS. Standardna kriva u 50% makaki serumu u PBS stvorena je erijskim 1:4 razblaženjima počinjući sa 100 ng/ml respektivnog interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula koji treba detektovati u testu. Uzorci za kontrolu kvaliteta (QC) pripremljeni su u 50% makaki seruma u PBS u opsegu od 1 ng/ml do 50 ng/ml respektivnog interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog molekula zavisnog od očekivane koncentracije uzorka u serumu. Standardni, QC ili nepoznati uzorci su preneti na ploče od ugljeničnih vlakana sa 10 pl/komorici i inkubirane 90 min na25°C u inkubatoru uz šejkiranje (700 rpm). Nakon toga ploče su isprane tri puta sa 0.05% Tvveen u PBS. Za detekciju dodato je 25 pl/komorici penta-His-Biotin antitela (Qiagen, 200 pg/ml u 0.05% Tvveen u PBS) i inkubirano 1 č na 25°C u inkubatoru uz šejkiranje (700 rpm). U drugom koraku detekcije dodato je 25 ul/vveli Streptavidin-SulfoTag rastvora (MSD; Cat: R32AD-1; Lot: W0010903) i inkubirano 1 č na 25°C u inkubatoru uz šejkiranje (700 rpm). Nakon toga ploče su isprane tri puta sa 0.05% Tvveen u PBS. Konačno, dodato je 150 pl/komorici MSD Rcading Buffer (MSD, Cat: R9ZC-l)i ploče su očitane u Sektor Imager device.

[0253] Slike 34 i 35 pokazuju izvodljivost detekcije interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula u uzorcima seruma makaki majmuna za interspecijski specifične bispecifične jednolančane molekule. Interspecijski specifična anti-CD3 jednolančana antitela sadržana u bispecifičnim jednolančanim molekuiima stoga omogućuje preko njihovih osobina specifičnog vezivanja visoko senzitivni generički test za detekciju interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula. Prethodno dati test može se koristiti u kontekstu formalnih toksikoloških studija koje su potrebne za razvoj leka i mogu se lako prilagoditi za merenja uzoraka pacijenata u vezi sa kliničkom primenom interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula. 19. Stvaranje rekombinantnih transmembranskih fuzionih proteina N-tcrminalnih aminokiselina 1-27 CD3 epsilon iz različitih primata osim šimpanze fuzionisanih sa EpCAM makaki rakojeda (1-27 CD3-EpCAM).

19.1 Kloniranje i ekspresija 1-27 CD3-EpCAM

[0254] CD3 epsilon je izolovan iz različitih primala osim šimpanze (marmozet, tamarin, vcveričji majmun) i svinje. Kodirajuće sekvence 1-27 N-terminalnih aminokiselina CD3 epsilon lanca zrelog humanog, običnog marmozeta( Cal/ ithrix jacchus),pinča tamarina( S<a>guinus oedipus),običnog veveričjeg majmuna( Saimiri sciureus)i domaće svinje( Sus scrofa;korišćena kao negativna kontrola) fuzionisane sa N-terminusom Flag tagovanog EpCAM makaki rakojeda dobijene su genskom sintezom prema standardnim protokolima (cDNK sekvenca i aminokiselinska sekvenca rekombinantnih fuzionih proteina dati su pod SEQ ID NOs 231 do 240). Fragmenti dobijeni genskom sintezom dizajnirani su da sadrže prvo BsrGI mesto da bi se omogućila fuzija u ispravnom okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom lider peptida imunoglobulina od 19 aminokiselina koja je već prisutna u ciljnom ekspresionom vektoru, koja je praćena u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom N-terminalnih 1-27 aminokiselina ekstracelularnog dela zrelih CD3 epsilon lanaca, što je praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom Flag taga i praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom zrelog EpCAM transmembranskog proteina makaki rakojeda. Fragmenti dobijeni genskom sintezom takođe su dizajnirani da uvedu restrikciono mesto na kraju cDNK koja kodira fuzioni protein. Uvedena restrikciona mesta BsrGI na 5' kraju i Sali na 3' kraju, korišćena su u sledećim procedurama kloniranja. Fragmenti dobijeni genskom sintezom su zatim klonirani preko BsrGI i Sali u derivat plazmida označenog kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150), koji već sadrži kodirajuću sekvencu lider peptida imunoglobulina od 19 aminokiselina praćenjem standardnih protokola. Plazmidi sa verifikovanom sekvencom korišćeni su za transfekciju DHFR deficijentnih CHO ćelija za eukariotsku ekspresiju konstrukta. Ekspresija eukariotskog proteina u Dl IFR deficijentnim CHO ćelijama izvedenaje kao što je opisano u Kaufmann RJ. (1990) Methods Enzvmol. 185, 537-566. Amplifikacija gena konstrukta je indukovana rastućim koncentracijama metotreksata (MTX) do finalne koncentracije od do 20 nM MTX.

[0255] Transfektanti su testirani za ekspresiju rekombinantnog transmembranskog proteina na ćelijskoj površini preko FACS analize prema standardnim protokolima. U tu svrhu 2.5xl0<5>ćelija je inkubirano sa 50 pl anti-Flag M2 antitela (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) sa 5 pg/ml u PBS sa 2% FCS. Vezano antitelo je detektovano kozjim anti-mišjim IgG R-fikocritrin konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK), Protočna citometrija je izvedena na FACS-Calibur aparatu, CellQuest program je korišćen za prikupljanje i analiziranje podataka (Becton Dickinson bioscienccs, I lcidelberg). FACS bojenje i merenje intenziteta fluorescencije izvedeno je kao što je opisano u Current Protocols in Immunologv (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach i Strobcr, Wilcy-Interscience, 2002).

[0256] Ekspresija Flag tagovanih rekombinantnih transmembranskih fuzionih proteina koji se sastoji od EpCAM makaki rakojeda i 1-27 N-terminalnih aminokiselina humanog, marmozeta, tamarina, veveričjeg i svinjskog CD3 epsilon lanca respektivno na transficiranim ćelijama je jasno detektabilno (Slika 36).

19.2 Kloniranje i ekspresija interspecijski specifičnih anti-CD3 jednolančanih antitela I2C HL u obliku IgGI antitela

[0257] Da bi se obezbedili poboljšani načini za detekciju vezivanja interspecijski specifičnih jednolančanih anti-CD3 antitela, I2C VHVL specifičnost je konvertovana u IgGI antitelo sa mišjim IgGI i mišjim kapa konstantnim regionima. cDNK sekvence koje kodiraju teški lanac IgG antitela dobijene su genskom sintezom prema standardnim protokolima. Fragmenti obijeni genskom sintezom dizajnirani su da sadrže prvo Kozak mesto da omoguće eukariotsku ekspresiju konstrukta, koji je praćen sa lider peptidom imunoglobulina od 19 aminokiselina, koji je praćen u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom varijabilnog regiona teškog lanca ili varijabilnog regiona lakog lanca, praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca mišjeg IgGI kao što je objavljeno u GenBank (Accession number AB097849) ili kodirajućom sekvencom konstantnog regiona mišjeg kappa lakog kao sto je objavljeno u GenBank (Accession number Dl4630), respektivno.

[0258] Restrikciona mesta su uvedena na početak i na kraj cDNK koja kodira fuzioni protein. Restrikciona mesta EcoRI na 5' kraju i Sali na 3' kraju korišćena su u sledećim procedurama kloniranja. Fragmenti dobijeni genskom sintezom klonirani preko EcoRI i Sali u plazmid obeležen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opsan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) za konstrukt teškog lanca i pEFADA (pEFADA jc opisan u Raum et al. loc cit.) za konstrukt lakog lanca prema standardnim protokolima. Plazmidi sa verifikovanom sekvencom korišćeni su za ko-transfekciju respektivnih konstrukata lakog i teškog lanca u DHFR deficijentne CHO ćelije za eukariotsku ekspresiju konstrukta. Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijentnim CHO ćelijama izvedena je kao što je opisano od strane Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Amplifikacija gena konstrukata indukovana je rastućim koncentracijama metotreksala (MTX) do finalne koncentracije od do 20 nM MTX i đezoksikoformicina (dCF) do finalne koncentracije od do 300 nM dCF. Nakon dva pasaža stacionarne kulture ćelija supernatant ćelijske kulture je sakupljen i korišćen u narednom eksperimentu.

19.3 Vezivanje interspecijski specifičnog anti-CD3 jednolančanog antitela I2C HL u obliku IgGI antitela za 1-27 CD3-EpCAM

[0259] Vezivanje stvorenog I2C IgGI konstrukta sa 1-27 N-terminalnim aminokiselinama humane, marmozet, tamarin i veveričjeg majmuna CD3 epsilon lance respektivno fuzionisane sa Ep-CAM makaki rakojeda kao što je opisano u Primeru 19. testirano je u FACS analizi prema standardnim protokolima. U tu svrhu 2.5xl0<:i>ćelija je inkubirano sa 50 pl supernatanta ćelijske kulture koji sadrži I2C IgGI konstrukt ako što jc opisano u Primeru 19.2. Vezivanje antitela detektovano je sa kozjim anti-mišjim IgG R-fikoertirin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Protočna citometrija je izvedena na FACScalibur aparatu, CellQuest program je korišćen za prikupljanje i analizu podataka (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS bojenje i merenje intenziteta fluorescencije izvedeno je kao što je opisano u Current Protocols in Immunologv (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach i Strobcr, Wiley-Interscience, 2002).

[0260] Kao što je prikazano na Slici 37 uočeno je vezivanje I2C IgGI konstrukta sa transfektantima koji eksprimiraju rekombinantne transmembranske fuzione proteine koji se sastoje od 1-27 N-terminalnih aminokiselina CD3 epsilon humanog, marmozet, tamarin, ili veveričjeg majmuna fuzionisanog sa EpCAM makaki rakojeda u poređenju sa negativnom kontrolom koja se sastoji od 1-27 Nterminalnih aminokiselina CD3 epsilon svinje fuzionisanog sa EpCAM makaki rakojeda. Stoga je pokazana multi-primatna interspecijska specifičnost I2C. Signali dobijeni sa anti Flag M2 antitelom i 12C IgGI konstruktom bili su uporedivi, ukazujući na snažnu aktivnost vezivanja interspecijski specifičnih I2C na N-terminalne aminokiseline 1-27 CD3 epsilon.

20. Vezivanje interspecijski specifičnog anti-CD3 vezjućeg molekula I2C sa humanim CD3 epsilon lancem sa i bez N-terminal His6 taga

[0261] Himerno IgGI antitelo sa vezujućom specifičnošću 12C kao što jc opisano u Primeru 19.2 specifično za CD3 epsilon testirano je za vezivanje za humani CD3 epsilon sa i bez N-terminalnog His6 taga. Vezivanje antitela sa EL4 ćelijskim linijama transficiranim sa His6-humanim CD3 epsilon kao što je opisano u Primeru 6.1 i divlji tip humanog CD3 epsilon kao što je opisano u Primeru 5.1 respektivno testirano je FACS analizom prema standardnim protokolima. 2.5xl0<5>ćelija transfektanata inkubirano je sa 50 pl of supernatanta ćelijske kulture koji sadrži 12C IgGI konstrukt ili 50 pl respektivnih kontrolnih antitela sa 5ug/ml u PBS sa 2% FCS. Kao negativna kontrola korišćena je odgovarajuća izotipska kontrola i kao pozitivna kontrola za ekspresiju konstrukata CD3 specifičnog antitela UCHT-1, respektivno. Detekcija His6 taga izvedena je sa penta His antitelom (Ojagen). Vezivanje antitela je detektovano sa kozjim anti-mišjim IgG R-fikoertirin-konjugovanim afinitetno prečišćenim F(ab')2 fragmentom, Fc-gama fragment specifičnim 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germanv). Protočna citometrija je izvedena na FACScalibur aparatu, CellQuest program je korišćen za prikupljanje i analizu podataka (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS bojenje i merenje intenziteta fluorescencije izvedeno je kao što je opisano u Current Protocols in Immunologv (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach i Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[0262] Uporedivo vezivanje anti-humanog CD3 antitela UCHT-1 za oba transfektanta demonstrira približno iste nivoe ekspresije konstrukata. Vezivanje penta His antitela potvrdilo je prisustvo His6 taga na His6-humanom CD3 konstruktu ali ne na konstruktu divljeg tipa. [0263j U poređenju sa EL4 ćelijskom linijom transficiranom sa divljim tipom humanog CD3 epsilon detektovan je jasan gubitak vezivanja I2C IgGI konstrukta za humani-CD3 epsilon sa N-lerminalnim His6 tagom. Ovi rezutlati pokazuju daje slobodni Nterminus CD3 epsilon esencijalan za vezivanje interspecijski specifinih anti-CD3 vezujućih specifičnosti 12C sa humanim CD3 epsilon lancem (Slika 28).

21. StvaranjeCD33 i CD3 interspecijskispecifičnihbispecifičnih jednolančanih molekula 21.1Stvaranje CD33 iCD3 interspecijskispecifičnih bispecifičnihjednolančanih molekula

[0264]Generalno, molekul bispecifičnih jednolančanih antitela, gde svaki sadrži domen sa vezujućom specifičnošću interspecijski specifičnom za humani i makaki CD3 epsilon kao i domen sa vezujućom specifičnošću interspecijski specifičnom za humani i makaki CD33, dizajnirani su kao što je dato u sledećoj Tabeli 6:

[0265] Prethodno pomenuti konstrukti koji sadrže varijabilne domene lakog lanca (L) i varijabilen domene teškog lanca (H) interspecijski specifični za humani i makaki CD33 i CD3 specifične VII i VL kombinacije interspecijski specifične za humani i makaki CD3 dobijeni su genskom sintezom. Fragmenti dobijeni genskom sintezom dizjanirani su po analogiji sa procedurom opisanom u primeru 9 za MCSP i CD3 interspecijski specifične jednolančane molekule. Klon sa verifikovanom nukleotidnom sekvencom transflciran je u DHFR deficijentne CHO ćelije za eukariotsku ekspresiju konstrukta. Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijentnim CHO ćelijama je izvedena kao što je takođe opisano u primeru 9 za MCSP i CD3 interspecijski specifične jednolančane molekule i korišćena u narednim eksperimentima.

21.2 Protočno citometrijska analiza CD33 i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela

[0266] Da bi se testirala funkcionalnost konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u odnosu na sposobnost da vezuju humani i makaki CD33 i CD3, respektivno, FACS analiza je izvršena slično analizi opisanoj za analizu MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u primeru 10 korišćenjem CHO ćelija koje eksprimiraju humane ili makaki CD33 ekstracelularne domene (videti primere 16.1 i 16.2).

[0267] Bispecifično vezivanje prethodno navedenih jednolančanih molekula, koji su bili interspecijski specifični za CD33 i interspecijski specifični za humani i primata osim šimpanze CD3 jasno se mogla detektovati kao što je prikazano na Slici 41. U FACS analizi svi konstrukti su pokazivali vezivanje za CD3 i CD33 u poređenju sa respektivnim negativnim kontrolama. Pokazana je interspecijska specifičnost bispecifičnih antitela za humane i makaki CD3 i CD33 antigene.

21.3. Bioaktivnost CD33 i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela

[0268] Bioaktivnost stvorenih bispecifičnih jednolančanih antitela analizirana je in vitro citotoksičnim testovima oslobađanja hroma 51 (<sl>Cr) korišćenjem CD33 pozitivnih ćelijskih linija opisanih u Primerima 16.1 i 16.2. Kao efektorske ćelije stimuiisane humane CD4/CD56 dcpletirane PBMC ili makaki T ćelijska linija 41 !9LnPx u korišćeni kao što je naznačeno na respektivnim slikama. Citotoksični testovi su izvedeni slično proceduri opisanoj za analizu bioaktivnosti MCSP i CD3 interspecijski specifična bispecifična antitela u primeru 11 korišćenjem CHO ćelija koje eksprimiraju humane ili makaki CD33 ekstracelularne domene (videti primer 16.1 i 16.2) kao ciljnih ćelija.

[0269] Kao što je prikazano na Slici 42, svi stvoreni konstrukti interspecijeski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela pokazuju citotoksičnu aktivnost protiv humanih CD33 pozitivnih ciljnih ćelija izazvanih sa stimulisanim humanim CD4/CD56 depletiranim PBMC i protiv makaki CD33 pozitivnih ciljnih ćelija izazvanih sa makaki T ćelijskom linijom 41 !9LnPx.

22. Redistribucija cirkulišućih T ćelija šimpanze po izlaganju konvencionalnom bispecifičnom CD3 vezujućem molekulu usmerenom na ciljni molekul koji je odsutan iz cirkulišućih krvnih ćelija

[0270] Jedan mužjak šimpanze podvrgnut je povećanju doze sa intravenskim jednolančanim konstruktom EpCAM/CD3-bispecifičnog antitela (Schlereth (2005) Cancer Res 65: 2882). Kao i kod konvencionalnog jednolančanog konstrukta CD 19/CD3-bispecifiČnog antitela (Loffler (2000, Blood, Volume 95, Number 6) ili WO 99/54440), CD3 ručica pomenutog EpCAM/CD3-konstrukta je takode usmerena protiv konvencionalnog kontekstno zavisnog epitopa CD3 čoveka i šimpanze. Na dan 0, životinja je primila 50ml PBS/5% HSA bez test materijala, praćeno sa 50ml PBS/5% HSA plus jednolančani konstrukt EpCAM/CD3-bispecifiČnog antitela sa 1.6, 2.0, 3.0 i 4.5 mg/kg na dane 7, 14, 21 i 28, respektivno. Period infuzije je bio 2 časa po primeni. 2a svaku nedeljnu infuziju šimpanza jc sedatirana sa 2-3 mg/kg Telazol intramuskularno, intubirana i stavljena na izofluran/Oz anesteziju sa stabilnom srednjom vrednošću krvnog pritiska. Drugi intravenski kateter slavljenje u suprotni ud da bi se sakupili (heparinizovani) uzorci cele krvi u vremenskim tačkama naznačenim na Slici 43 za FACS analizu cirkulišućih krvnih ćelija. Nakon standardne lize eritrocita, T ćelije su obojene sa FFFC-obeleženim antitelom koje reaguje sa CD2 šimpanze (Becton Dickinson) i procenat T ćelija u odnosu na ukupne limfocite je određen protočnom citometrijom. Kao što je prikazano na Slici 43, svaka primena konstrukta jednolančanog Ep-CAM/CD3-bispecifičnog antitela indukovala jc brzo opadanje cirkulišućih T ćelija kao što je uočeno sa konstruktom jednolančanog CD19/CD3-bispecifičnog antitela kod B-NHL pacijenata, koji suštinski nisu imali cirkulišuće B (limfom) ćelije. Kako nema EpCAM-pozitivnih ciljnih ćelija u cirkulišućoj krvi ljudi i šimpanzi, pad cirkulišućih T ćelija po izlaganju konstruktu jednolančanog EpCAM/CD3-bispecifičnog antitela može se isključivo pripisati signalu, koji T ćelije primaju čistom interakcijom CD3 ručice konstrukta sa konvencionalnim kontekstno zavisnim CD3 epitopom u odsustvu unakrsnog veziivanja posredovanog bilo kojim ciljnim ćelijama. Kao i redistribucija T ćelija indukovati njihovim izlaganjem konstruktu jednolančanog CD19/CD3-bispecifičnog antitela kod B-NHL pacijenata, koji suštinski nisu imali cirkulišuće ciljne B (limfom) ćelije, redistribucija T ćelija kod šimpanze po izlaganju konstruktu jednolančanog Hp-CAM/CD3-bispecifičnog antitela može se objasnili konformacionom promenom CD3 nakon događaja vezivanja za kontekstno zavisni CD3 epitop što dalje rezuituje u prolaznom povećanju adhezivnosti T ćelija za endotel krvnog suda (videti Primer 13). Ovaj nalaz potvrđuje, da konvencionalni CD3 vezujući molekuli usmereni na kontekstno zavisne CD3 epitope - isključivo preko ove reakcije - mogu dovesti do obrasca redistribucije T ćelija periferne krvi, koja je povezana sa rizikom od CNS štetnih događaja kod ljudi kao stoje opisano u Primeru 13.

23. Specifično vezivanje scFv klonova za N-terminus humanog CD3 epsilon 23.1 Bakterijska ekspresija scFv konstrukata u E. coli XL1 Blue

[0271] Kao što je prethodno pomenuto,E. coliXLI Blue transformisan sa pComb3H5Bhis/Fiag koji sadrži VL- i VH segment proizvodi rastvorijivi scFv u dovoljnim količinama nakon ekscizije fragmenta gena III i indukcije sa 1 mM IPTG. scFv-lanac je eksporlovan u periplazmu gde se savija u funkcionalnu konformaciju.

|0272] Sledeći scFv klonovi su izabrani za ovaj eksperiment:

i) ScFvs 4-10, 3-106, 3-114, 3-148, 4-48, 3-190 i 3-271 kao stoje opisano u WO 2004/106380. ii) ScFvs iz humanih anti-CD3epsilon vezujućih klonova H2C, F12Q i I2C kao Što je opisano ovde.

[0273] Za periplazmatske preparate, bakterijske ćelije transformisane sa respektivnim scFv koji sadrže plazmide koji omogućavaju periplazmatsku ekspresiju uzgajne su u SB-medijumu sa dodatkom 20 mM MgCb i karbenicilina 50 pg/ml i ponovo rastvoreni u PBS nakon sakupljanja. Sa četiri runde zamrzavanja na -70°C i odmrzavanja 37°C, spoljna membrana bakterija je uništena osmotskim šokom i rastvorijivi periplazmatski proteini uključujući scFvs oslobođeni su u supernatant. Nakon eliminacije intaktnih ćelija i ćelijskih ostataka centrifugiranjem, supernatant koji sadrži humane anti-humane CD3-scFvs sakupljen je i korišćen za dalja istraživanja.

[0274] Ovi sirovi supernatanti koji sadrže scFv biće nadalje označeni kao periplazmatski preparati

(PPP).

23.2 Vezivanje scFvs za humani CD3 epsilon (ak I-27)-Fc fuzioni protein J0275] ELISA eksperimenti su izvedeni oblaganjem humanog CD3 epsilon (ak 1-27)- Fc fuzionog proteina u komoricama 96 komornih plastičnih ploča (Nunc, maxisorb) tipično na 4° C preko noći.

Rastvor za oblaganje antigena je zatim uklonjen, komorice su jednom isprane sa PBS/0.05 % Tvveen 20 i nakon toga blokirane sa PBS/3 % BSA najmanje jedan čas. Nakon uklanjanja blokirajućeg rastvora, PPPs i kontrolni rastvori su dodati komoricama i inkubirani tipično jedan čas na sobnoj temperaturi. Komorice su zatim isprane tri puta sa PBS/0.05 % Tvveen 20. Detekcija scFvs vezanih za imobilisani antigen izvedena je korišćenjem Biotin-obclcžcnog anti FLAG-tag antiela (M2 anti Flag-Bio, Sigma, tipično u Finalnoj koncentraciji od 1 pg/ml PBS) i detektovani sa peroksidaza-obeleženim streplavidinom (Dianova, 1 pg/ml PBS). Signal je razvijen dodavanjem rastvora ABTS supstrata i meren na talasnoj dužini od 405 nm. Nespecifično vezivanje test-uzoraka sa blokirajućim agensom i/ili deo humanog IgGI humanog CD3 epsilon (akl-27)-Fc fuzionog proteina ispitivano je izvođenjem identičnog testa sa identičnim reagensima i identičnim lajmingom na ELISA pločama koje su obložene sa humanim IgGI (Sigma). PBS je korišćen kao negativna kontrola.

[0276] Kao što je prikazano na Slici 44, scFvs H2C, F12Q i I2C pokazuju snažne signale vezivanja sa humanim CD3 epsilon (ak 1-27)- Fc fuzionim proteinom. Humani scFvs 3-106, 3-114. 3-148, 3-190,3-271,4-10 i 4-48 (kao što su opisani u WO 2004/106380) ne prikazuju bilo kakvo značajno vezivanje iznad nivoa negativne kontrole.

[0277]Da bi se isključila mogućnost da pozitivno vezivanje scFvs H2C, F12Q i I2C sa komoricama obloženim sa humanim CD3 epsilon (ak 1-27)- Fc fuzionim proteinom može biti usled vezivanja za BSA (korišćenog kao blokirajući agens) i/ili humanog IgGI Fc-gama-dcla humanog CD3 epsilon (ak 1-27)- Fc fuzionog proteina, paralelno je izveden drugi ELISA eksperiment. U drugom ELISA eksperimentu, svi parametri su bili identični onima u prvom ELISA eksperimentu, osim što jc u drugom ELISA eksperimentu humani IgGI (Sigma) bio obložen umesto humanog CD3 epsilon (ak l-27)-Fc fuzionog proteina. Kao što je prikazano na Slici 45, nijedan od testiranih scFvs nije pokazao bilo kakvo značajno vezivanje sa BSA i/ili humanim IgGI iznad osnovnog nivoa.J0278]Uzeti zajedno, ovi rezultati dozvoljavaju zaključak da konvencionalni CD3 vezujući molekuli koji prepoznaju kontekstno zavisni epitop CD3 epsilon (npr, kao što je opisano u VVO 2004/106380) ne vezuju se speefično za humani CD3 epsilon (ak l-27)-region, dok scFvs H2C, F12Q i I2C vezivanje kontekstno nezavisnog epitopa CD3 epsilon jasno pokazuje specifično vezivanje sa N-terminalnih 27 aminokiselina humanog CD3 epsilon.

24. Stvaranje i karkaterizacija PSMA i CD3 molekula interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela

24.1 Kloniranje i ekspresija humanog PSMA antigena na CHO ćelijama

[0279] Sekvenca humanog PSMA antigena ('AY101595'. Homo sapiens iRNK prostata-specifični antigen membrane, kompletni cds, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) korišćen je da se dobiju sintetički molekuli sintezom gena prema standardnim protokolima, fragment dobijen genskom sintezom takođe je dizajniran da sadrži Kozak mesto za eukariotsku ekspresiju konstrukta i restrikciona mesta na početku i na kraju DNK. Introdukovana restrikciona mesta Xbal na 5' kraju i Sali na 3' kraju korišćena su tokom koraka kloniranja u ekspresioni plazmid označen kao pEFDHFR kao što je opisano u Mack et al.

(Mack M et al., Proc Natl Acad Sci U S 1995;92:7021-5. i Raum et al. Cancer Immunol Immunolher (2001) 50(3)). Nakon verifikacije sekvence plazmid jc korišćen za transfekciju CHO/dhfr-ćelija kao što sledi. Plazmid sa verifikovanom sekvencom korišćen je za transfekciju CHO/dhfr ćelija (ATCC No. CRL 9096; kultivisane u RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom dobijenim od Biochrom AG Berlin, Germany, sa dodatkom 10% FCS, 1% penicilin/streptomicin sve dobijeno od Biochrom AG Berlin, Germany i nukleozidi iz stok rastvora graduisanih reagenasa ćelijske kulture dobijeni od Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany, do finalne koncentracije od 10 pg/ml adenozina, 10 pg/ml dezoksiadenozina i 10 pg/ml timidina, u inkubatoru na 37 °C, 95% vlažnosti i 7% CO2). Transfekcija je izvedena korišćenjem PolyFect Transfection Reagent (OJagen GmbH, Hilden, Germany) i 5 pg plazmidne DNK prema protokolu proizvođača. Nakon kultivacije od 24 časa ćelije su jednom isprane sa PBS i ponovo kultivisane u prethodno pomenutom medijumu ćelijske kulture osim što medijumu nisu dodati nukleozidi i korišćen je dijalizirani FCS (dobijen od Biochrom AG Berlin, Germany). Stoga medijum kulture ćelija nije sadržao nukleozide i stoga je selekcija primenjena na transficirane ćelije. Oko 14 dana nakon transfekcije uočen je rast rezistentnih ćelija. Nako dodatnih 7 do 14 dana transfektanti su bili pozitivni u odnosu na ekspresiju konstrukta sa FACS. Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijentnim CHO ćelijama je izvedena kao što je opisano od strane Kaufmann RJ. (1990) Mcthods Enzymol. 185, 537-566. Amplifikacija gena konstrukta indukovan je rastućim koncentracijama metolreksata (MTX) do finalne koncentracije od do 20 nM MTX

24.2 Kloniranje i ekspresija makaki PSMA antigena na CHO ćelijama

[0280]cDNK sekvenca makaki PSMA (makaki rakojed) dobijena je setom od pet PCR na cDNK iz prostate makaki majmuna pripremljene po standardnim protokolima. Sledeći reakcioni uslovi: 1 ciklus na 94° C 2 minuta praćen sa 40 ciklusa sa 94°C 1 minut, 52°C 1 minut i 72°C 1.5 minuta praćenosa terminalnim ciklusom na 72°C 3 minuta i korišćeni su sledeći prajmeri:

|0281]Ovih pet preklapajućih fragmenata dobijenih sa PCR, koji su izolovani i sekvenci on i ran i prema standardnim protokolima korišćenjem PCR prajmera, i time obezbeđuju deo cDNK sekvence koja kodira makaki PSMA od kodona 3 do poslednjeg kodona zrelog proteina. Da bi se stvorio konstrukt za ekspresiju makaki PSMA cDNK fragment je dobijen genskom sintezom prema standardnim protokolima (cDNK i aminokiselinska sekvenca konstrukta je data pod SEQ ID 385 i 386). U ovom konstruktu kodirajuća sekvenca makaki PSMA od aminokiseline 3 do poslednje aminokiseline zrelog PSMA proteina praćena sa stop kodonom fuzionisana je u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom prve dve aminokiseline humanog PSMA proteina. Fragment dobijen genskom sintezom je takođe dizajniran da sadrži Kozak mesto za eukariotsku ekspresiju konstrukta i restrikciona mesta na početku i na kraju fragmenta koji sadrži cDNK. Introdukovana restrikciona mesta, Xbal na 5' kraju i Sali na 3' kraju, korišćena su u sledećim procedurama kloniranja. Fragment dobijen genskom sintezom kloniranje preko Xbal i Sali u plazmid označen kao pEF-DHFR prateći standardne protokole. Prethodno pomenute procedure izvedene su prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, Nevv York (2001)). Klon sa verifikovanom nukleotidnom sekvencom transtlciran jc u DHFR deficijentne CHO ćeiije za eukariotsku ekspresiju konstrukta. Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijenlnim CHO

ćelijama izvedena je kao što je opisano u Kaufmann R.J. (1990) Mcthods Hnzvmol. 185, 537-566. Amplifikacija gena konstrukta indukovana je rastućim koncentracijama metotreksata (MTX) do finalne koncentracije od do 20 nM MTX.

24.3 Stvaranje PSMA i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula

[0282]Generalno, molekul bispecifičnih jednolančanih antitela. gde svaki sadrži domen sa vezujućom specifičnošću za humani i makaki CD3 antigen kao i domen sa vezujućom specifičnošću za humani i makaki PSMA antigen, dizajnirani su kao Što je dato u sledećoj Tabeli 7:

[0283]Prethodno pomenuti konstrukti koji sadrže varijabilne domene lakog lanca (L) i varijabilne domene teškog lanca (H) interspecijski specifična za humane i makaki PSMA i CD3 specifične VH i VL kombinacije interspecijski specifična za humani i makaki CD3 dobijeni su genskom sintezom. Dizjanirani su fragmenti dobijeni genskom sintezom i izvedena je ekspresija eukariotskog proteina po analogiji sa procedurom opisanom u primeru 9 za MCSP i CD3 interspecijski specifične jednolančane molekule. Alternativno, konstrukti mogu biti transficirani u DHFR deficijentne CHO-ćelije na prolazni način prema standardnim protokolima.

24.4 Protočno citometrijska analiza vezivanja PSMA i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela

[0284] Da bi sc testirala funkcionalnost konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u odnosu na sposobnost vezivanja za humani i makaki PSMA i za humani i makaki CD3, izvedena jc FACS analiza. U tu svrhu CHO ćelije transficirane sa humanim PSMA kao što je opisano u Primeru 24.1 i korišćene su humane CD3 pozitivne T ćelije leukemije ćelijske linije HPB-ALL (DSMZ, Braunschvveig, ACC483) da bi se proverilo vezivanje za humane antigene. Reaktivnost vezivanja za makaki antigene je testirana korišćenjem stvorenog makaki PSMA transfektanta opisanog u Primeru 24.2 i makaki T ćelijske linije 4119LnPx (ljubazno obezbedene od strane Prof Fickenscher, Hvgiene Institute, Virologv, Erlangen-Nuernberg; published in Knappe A, et al., i Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Protočno citometrijska analiza je izvedena po analogiji sa procedurom opisanom u primeru 10.

[0285] Vezujuća sposobnost svih PSMA zasnovanih bispecifičnih jednolančanih molekula mogla se jasno detektovati kao što je prikazano na Slici 46. U FACS analizi, svi konstrukti su pokazali vezivanje sa CD3 i PSMA u poređenju sa negativnom kontrolom korišćenjem medijuma kulture i 1. i 2. Antitela za detekciju. Sumarno, jasno se mogla pokazati interspecijska specifičnost bispecifičnog antitela na humani i makaki CD3 i na humani i makaki PSMA.

24.5 Bioaktivnost PSMA i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela

[0286] Bioaktivnost stvorenih bispecifičnih jednolančanih antitela anlaizirana je in vitro citotoksičnim testovima sa oslobađanjemm hrom 51 korišćenjem PSMA pozitivnih ćelijskih linija opisanih u primerima 24.1 i 24.2. Kao efektorske ćelije korišćene su stimuiisane humane CD8 pozitine T ćelije ili makaki T ćelijske linije 4119LnPx. Citotksični testovi su izvedeni slično proceduri koja jc opisana za analizu bioaktivnosti MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u primeru 11.

[0287] Kao što je prikazno na Slikama 47 i 48, svi prikazanni konstrukti interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela imali su citotoksičnu aktivnost protiv humanih PSMA pozitivnih ciljnih ćelija izazavanih sa humanim CD8+ ćelijama i protiv makaki PSMA pozitivnih ciljnih ćelija izazavanih sa makaki T ćelijskom linijom 41 19LnPx. Kao negativna kontrola korišćeno je irelevantno bispecifično jednoiančano antitelo.

24.6 Stvaranje PSMA i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula

[0288]Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela, gde svaki sadrži domen koji se vezuje za humani i za makaki CD3 antigen kao i domen koji se vezuje za humani PSMA antigen, dizajnirani su kao Što je dato u sledećoj Tabeli 8;

[0289] Prethodno pomenuti konstrukti gde se svaki sastoji od kombinacije varijabilnog domena lakog lanca (L) i varijabilnog domena teškog lanca (H) koji se vezuju za humani i za makaki CD3 antigen kao i kombinacija varijabilnog domena lakog lanca (L) i varijabilnog domena teškog lanca

(H) koji se vezuju za humani PSMA antigen dobijeni su genskom sintezom. Svaka kombinacija varijabilnog domena lakog lanca (L) i varijabilnog regiona teškog lanca (H) koja se vezuje za

humani PSMA antigen dobijena je preko fagnog prikaza iz scFv-library paningom PSMA-pozitivne ćelijske linije kancera humane prostate LNCaP (ATCC No. CRL-1740) praćeno sa FACS-asnovanim skriningom za pozitivne klonove korišćenjem iste ćelijske linije. Dizajnirani su fragmenti dobijeni genskom sintezom prethodno datog molekula bispecifičnih jednolančanih antitela i ekspresija eukariotskog proteina je izvedena po analogiji sa procedurom opisanom u primeru 24.3, prethodno, respektivno za MCSP i CD3 interspecijski specifične jednolančane molekule u primeru 9. Isto važi za ekspresiju i prečišćavanje PSMA i CD3 molekula bispecifičnih jednolančanih antitela.

24.7 Protočno citometrijskaanalizavezivanja PSMA i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnihantitela

[0290] Da bi se testirala funkcionalnost konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u odnosu na sposobnost da vezuje PSMA i CD3 FACS izvedena je analiza. U tu svrhu PSMA-pozitivne ćelije su korišćene za testiranje vezivanja za humane antigene. Vezujuća reaktivnost na makaki CD3 testirana je korišćenjem makaki T ćelijske linije 4119LnPx (ljubazno obezbeđena od strane Prof Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Lrlangen-<N>uernberg; objavljeno u Knappe A, et al., and Fickenscher FL, Blood 2000, 95, 3256-61). Protočno citometrijska analiza izvedena je po analogiji sa procedurom opisanom u primeru 10.

[0291]Bispecifično vezivanje stvorenih jednolančanih molekula prikazanih na Slici 49 i Slici 51, za humani PSMA i za humani i primata osim Šimpanze CD3 jasno se mogla detektovati. U FACS analizi svi prikazani konstrukti su pokazivali vezivanje za CD3 i PSMA u poređenju sa negativnom kontrolom.

24.8 Bioaktivnost PSMA iCD3interspecijskispecifičnihbispecifičnihjednolančanih antitela

[0292]Bioaktivnost stvorenih bispecifičnih jednolančanih antitela analizirana je in vitro citotksičnim testovima sa oslobađanjem hroma 51 (51Cr) korišćenjem PSMA pozitivnih ćelijskih linija. Kao efektorske ćelije korišćene su stimuiisane humane CD4/CD56 depletirane PBMC ili makaki T ćelijska linija 4119LnPx. Citotoksični testovi su izvedeni slično proceduri opisanoj za analizu bioaktivnosti MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u primeru 11.

[0293] Stvoreni konstrukti interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela prikazanih na Slici 50 i 52 demonstrirali su citotoksičnu aktivnost protiv PSMA pozitivnih ciljnih ćelija.

24.9. StvaranjedodatnihPSMAi CD3molekula interspecijski specifičnih bispecifičnih

jednolančanih antitela

[0294] VH sekvenca VH3 3-11 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) antitela humane klicine linije je izabrana kao okvirni kontekst za CDRH1 (SKQ ID NO. 394, CDRH2 (SEQ ID NO. 395) i CDRH3 (SEQ ID NO. 396). Slično tome, VH sekvenca VH1 1-02 (http://vbase.mrc-cpc.cam.ac.uk/) antitela humane klicine linije izabrana je kao okvirni kontekst za CDRH1 (SEQ ID NO. 408). CDRII2 (SEQ ID NO. 409) i CDRH3 (SEQ ID NO. 410) kao i VH sekvenca VH1 1-03 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) antitela humane klicine linije kao okvirni kontekst za CDRH1 (SEQ ID NO. 445), CDRH2 (SEQ ID NO. 446) i CDRH3 (SEQ ID NO. 447). Za svaki humani VH nekoliko degenerisanih oligonukleotida je moralo biti sintetisano koji se preklapaju u terminalnom nizu od oko 15-20 nukleotida. U tom smislu svaki drugi prajmer je antisens prajmer. Za VH3 3-11 sledeći set nukleotida jc korišćen:

Za VH1 1-02 oligonukleotidi su kao što sledi:

[0295] Svaki od ovih setova prajmera pokriva ćelu odgovarajuću VH sekvencu. Unutar svakog seta prajmeri su pomešani u jednakim količinama (npr. 1 pl svakog prajmera (slokovi prajmera 20 do i 00 pM) za 20 pl PCR reakciju) i dodati PCR smeši koja se sastoji od PCR pufera, nukleotida i Taq polimeraze. Ova smeša je inkubirana na 94 °C 3 minuta, 65 °C I minut, 62°C I minut, 59 °C 1 minut, 56 °C 1 minut, 52 °C 1 minut, 50 °C 1 minut i na 72°C 10 minuta u PCR aparatu. Nakon toga proizvod jc pušten na elektroforezu na agaroznom gelu i proizvod veličine od 200 do 400 izolovan je iz gela prema standardnim postupcima.

[0296] Svaki VH PCR proizvod je zatim korišćen kao Šablon za standardnu PCR reakciju korišćenjem prajmera koji uključuju N-terminalna i C-terminala pogodna klonirajuća restrikciona mesta. DNK fragment ispravne veličine (za VH oko 350 nukleotida) je izolovan elektroforezom na agaroznom gelu prema standardnim postupcima. Na ovaj način dovoljno VH DNK fragmenta je amplifikovano.

[0297] Vf sekvenca Vkl LI (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) antitela humane klicine linije je izabran kao okvirni kontekst za CDRL1 (SEQ ID NO. 389). CDRL2 (SEQ ID NO. 390) i CDRL3 (SEQ ID NO. 391). Slično tome VL sekvenca Vkll A17 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) antitela humane klicine linije je izabrana kao okvirni kontekst za CDRL1 (SEQ ID NO. 403), CDRL2 (SEQ ID NO. 404) i CDRL3 (SEQ ID NO. 405) kao i VL sekvenca Vkll Al (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) antitela humane klicine linije kao okvirni kontekst za CDRL1 (SEQ ID NO. 450), CDRL2 (SEQ ID NO. 451) i CDRL3 (SEQ ID NO. 452). Za svaki humani VL nekoliko degenerisanih oligonukleotida je moralo biti sintetisano koji se preklapaju u terminalnom nizu od oko 15-20 nukleotida. U tom smislu svaki drugi prajmer je antisens prajmer. Restrikciona mesta potrebna za kasnije kloniranje unutar oligonukleotida su deletirana. Za Vkl LI sledeći oligonukleotidi su korišćeni:

[0298]Za Vkll A17 oligonukleotidi su kao što sledi:

[0299]Za Vkll AI sledeći oligonukleotidi su korišćeni:

[0300]Svaki od ovih setova prajmera pokriva celu odgovarajuću VL sekvencu. Unutar svakog seta prajmeri su pomešani u jednakim količinama (npr. 1 u! svakog prajmera (stokovi prajmera 20 do 100 u.M) za 20 pl PCR reakciju) i dodati PCR smeŠi koja sc sastoji od PCR pufera, nukleotida i Taq polimeraze. Ova smeša je inkubirana na 94 °C 3 minuta, 65 °C 1 minut, 62°C 1 minut, 59 °C 1 minut, 56 °C 1 minut, 52 °C I minut, 50 °C 1 minut i na 72°C 10 minuta u PCR aparatu. Nakon toga proizvod je pušten u elektroforezi na agaroznom gelu i proizvod veličine od 200 do 400 izolovan je iz gela prema standardnim postupcima. [0301) Svaki VL PCR proizvod je zatim korišćen kao Šablon za standardnu PCR reakciju korišćenjem prajmera koji uključuju N-terminalna i C-terminala pogodna klonirajuća restrikciona mesta. DNK fragment ispravne veličine (za VL oko 330 nukleotida) je izolovan elektroforezom na agaroznom gelu prema standardnim postupcima. Na ovaj način dovoljno VL DNK fragmenta je amplifikovano.

[0302] Finalni VH3 3-1 1-zasnovani VH PCR proizvod (tj. repertoar humanih/humanizovanih VH) je zatim kombinovan sa finalnim Vkl LI-zasnovanim VL PCR proizvodom (tj. repertoar humanih/humanizovanih VL), finalni VH1 1-02 -zasnovani VH PCR proizvod (tj. repertoar humanih/humanizovanih VH) jc kombinovan sa finalnim Vkll A17-zasnovasnim VL PCR proizvodom (tj. repertoar humanih/humanizovanih VL) i finalni VHI 1-03-zasnovani VFI PCR proizvod (tj. repertoar humanih/humanizovanih VH) je kombinovan sa finalnim Vkll Al-zasnovanim VL PCR proizvodom (tj. repertoar humanih/humanizovanih VL) vektoru pComb3H5Bhis za fagni prikaz, respektivno. Ove tri VH-VL kombinacije iz tri različite biblioteke funkcionalnih scFvs iz kojih — nakon prikaza na filamentoznom fagu - anti-PSMA vezujući su selektovani, podvrgnuti sriningu, identifikovani i potvrđeni kao što je opisano u sledećem: 450 ng fragmenta lakog lanca (Sacl-Spel digestovanog) vezano jc sa 1400 ng fagemida pComb3FI5Bhis (Sacl-Spel digestovanog; veliki fragment). Rezultujuća kombinatorna biblioteka antitela je zatim transformisana u 300 ul elektrokompetentne Escherichia coli XL1 Blue ćeli je elektroporacijom (2.5 kV, 0.2 cm gap kiveta, 25 uFD, 200 Om, Biorad gene-pulser) što je rezultovalo u veličini biblioteke od više od 107 nezavisnih klonova. Nakon jednog časa fenotipske ekspresije, pozitivni transformanti su selektovani u odnosu na rezistenciju na karbenicilin kodiranu od strane pComb3H5BHis vektora u 100 ml tečne super buljon (SB)-kulture preko noći. Ćelije su zatim prikupljene centrifugiranjem i priprema plazmida je izvedena korišćenjem, komercijalno dostupnog kompleta za pripremu plazmida (Qiagen). 2800 ng ove plazmid-DNK koja sadrži VL-biblioteku (Xhol-BstEll digestovano; veliki fragment) vezano je sa 900 ng V-fragmenata teškog lanca (Xhol-BstEll digestovanog) i ponovo transformisano u dve 300 ul alikvote elektrokompetentnih E. coli XL1 Blue ćelija elektroporacijom (2.5 kV, 0.2 cm gap kiveta, 25 uFD, 200 Om) što rezuituje u ukupnom VH-VL scFv (jednolančani varijabilni fragment) biblioteci veličine od više od 107 nezavisnih klonova.

[0303] Nakon fenotipske ekspresije i spore adptacije na karbenicilin, E. coli ćelije koje sadrže biblioteku antitela prcnele su u SB-karbenicilin (SB sa 50 ug/mL karbenicilina) selekcioni medijum. E. coli ćelije koje sadrže biblioteku antitela su zatim inficirane sa infektivnom dozom 10<12>čestica helper faga VCSM13 što rezuituje u proizvodnji i sekreciji filamantoznog M 13 faga, gde čestice faga sadrže jednolančanu pComb3H5BHis-DNK koja kodira scFv-fragment i koja je prikazala odgovorajući scFv-protein kao translacionu fuziju sa proteinom III omotača faga. Ovaj pul faga koji prikazuje biblioteku antitela korišćen je za selekciju antigen vezujućih entiteta.

[0304] U tu svrhu fagna biblioteka koja nosi kloniranu scFv-rcpertoar prikupljena je iz supernatanta respektivne kulture sa PEG8000/NaC! taloženjem i centri fugiranj em. Oko IO<11>do IO<12>scFv fagnih čestica resuspendovano je u 0.4 ml PBS/0.I % BSA i inkubirana sa IO<5>do IO<7>PSMA-pozitivnih humane ćelijske linije kancera prostate LNCaP (ATCC No. CRL-I740) 1 čas na ledu uz sporu agitaciju. Ove LNCaP ćeiije su prikupljene prethodno sa centrifugiranjem, isprane u PBS i resuspendovane u PBS/1 % FCS (koji sadrži 0.05% Na azid). scFv fagi koji se ne vezuju specifično za LNCaP ćelije su eliminisani sa pet koraka ispiranja sa PBS/1 % FCS (koji sadrži 0.05% Na azid). Nakon ispiranja, vezujući entiteti su cluirani od ćelija resuspendovanjem ćelija u HCI-glicinu pFI 2.2 (10 min inkubacija koju prati vorteksovanje) i nakon neutralizacije sa 2 M Tris pH 12, eluat je korišćen za infekciju svežih neinficiranih E. coli XL1 Blue kulture (OD600 > 0.5). E. coli kultura koja sadrži E. coli ćelije uspešno transdukovane sa kopijom fagemida, koja kodira humani/humanizovani scFv-fragment, su ponovo selektovane u odnosu na rezistenciju na karbenicilin i nakon toga inficirane sa VCMS 13 helper fagom da bi se pokrenula druga runda prikaza antitela i in vitro selekcija. Ukupno 4 do 5 rundi selekcije je u normalnom slučaju izvedeno.

[0305] Da bi se izvršio skrining PSMA specifičnih vezujućih plazmidna DNK koja odgovara 4 i 5 rundi paninga izolovana je iz E. coli kultura nakon selekcije. Za proizvodnju rastvorIjivog scFv-proteina, VH-VL-DNK fragmenti su isečeni iz plazmida (Xhol-Spel). Ovi fragmenti su klonirani preko istih restrikcionih mesta u plazmid pComb3H5BFIag/His koji sc od originalnog pComb3H5BHis razlikuje po tome što ekspresioni konstrukt (npr. scFv) uključuje Flag-tag (DYKDDDDK) između scFv i His6-taga i dodatni proteini faga su deletirani. Nakon vezivanja, svaki pul (različite runde paninga) plazmidne DNK je transformisan u 100 pl E. coli TG1 ili XLI blue kompetentnih za toplotni Šok i postavljeni na ploče sa karbenicilin LB-agarom. Pojedinačne kolonije su uzete u 100 pl LB carb (50 ug/ml karbenicilin).

[0306] E. coli transformisana sa pComb3H5BFIag/Ilis koji sadrži VL-i VTI-scgment proizvodi rastvorijivi scFv u dovoljnoj količini nakon indukcije sa 1 mM IPTG. Usled pogodne signalne sekvence, scFv-lanac je eksportovan u periplazmu gde se savija u funkcionalnu konformaciju.

[0307] Pojedinačne E. coli 'FG1 bakterijske kolonije iz transformacionih ploča uzete su za periplazmatske pripreme u malom obimu i i uzgajane u SB-medijumu (npr. 10 ml) sa dodatkom 20 mM MgCb i karbenicilina 50 pg/ml (i ponovo rastvorene u PBS (npr. 1 ml) nakon prikupljanja. Sa četiri runde zamrzavanja na -70°C i odmrzavanja na 37°C, spoljašnja membrana bakterija je uništena temperaturnim šokom i rastvorijivi periplazmatski proteini uključujući scFvs oslobođeni su u supernatant. Nakon eliminacije intaktnih ćelija i ćelijskih ostataka centrifugiranjem, supernatant koji sadrži anti-PSMA scFvs je sakupljen i korišćen za identifikaciju PSMA specifičnih vezivača kao što sledi: Vezivanje scFvs za PSMA je testirano protočnom citometrijom na PSMA-pozitivnim humanim ćelijskim linijama kancera prostate LNCaP (ATCC No. CRL-1740). Periplazmatska priprema u malom obimu kao što je prethodno opisano bez uzgojenih bakterija korišćena je kao negativna kontrola.

[0308] Za protočnu citometriju 2.5xl0<5>ćelijaje inkubirano sa 50 ul scFv periplazmatske pripreme ili sa 5 pg/ml prečišćenog scFv u 50 pl PBS sa 2% FCS. Vezivanje scFv je detektovano sa anti-His antitelom (Penta-His Antibodv, BSA frce, Qiagen GmbH, Hilden, FRG) sa 2 pg/ml u 50 pl PBS sa 2% FCS. Kao reagens drugog koraka korišćen je kozji anti-mišji IgG R-fikoertirin-konjugovani afinitetno prečišćeni F(ab')2 fragment (Fc-gama fragment specifičan) razblaženim 1:100 u 50 pl PBS sa 2% FCS (Dianova, Hamburg, FRG). Uzorci su mereni na FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG).

[0309] Pojedinačni klonovi su zatim analizirani za povoljne osobine i aminokiselinsku sekvencu. PSMA specifični scFvs su konvertovani u rekombinantna bispecifična jednolančana antitela njihovim spajanjem preko Gly4Sen-Iinkera sa CD3 specifičnim scFv I2C (SEQ ID 185) ili bilo kojim drugim CD3 specifičnim scFv pronalaska da bi rezultovalo u konstruktima sa aranžmanom domena VH<p>sma - (Gly4Sen)3-VL<p>sma- Gly4Sen-VHcD3- (Gly4Sen)3- VLcra ili VLpsma -

(Gly4Sen)3-VH<p>sma- Gly4Sen-VHcD3- (Gly4Sen)3- VLcm ili alternativnim aranžmanima domena. Za ekspresiju u CHO ćelijama kodirajuće sekvence od (i) N-terminalnog teškog lanca lider imunoglobulina koji sadrži start kodon utisnut unutar Kozak konsenzus sekvence i (ii) C-

terminalni His6-tag praćen sa stop kođonom su oba vezana u ovim čitanja za nukleotidnu sekvencu koja kodira bispecifična jednolančana antitela pre ubacivanja rezultujućeg DNK-fragmenta kao stoje dobijen genskom sintezom u višestruko klonirajuće mesto ekspresionog vektora pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Transfekcija stvorenih ekspresionih plazmida, ekspresija proteina i prečišćavanje konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela izvedeni su kao što je opisano u poglavljima 24.6 i 24.7 ovog primera. Sve druge procedure iz tehnike izvedene su prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring I Iarbour, New York (2001)).

[0310] Identifikacija funkcionalnih konstrukata bispecifičnih jednolančanih antitela izvedena je protočno citomclrijskom analizom vezivanja supernatanta kulture trensficiranih ćelija koje eksprimiraju konstrukte interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela. Protočno citometrijska analiza izvedena je na humanoj PSMA pozitivnoj ćelijskoj liniji kancera prostate LNCaP (ATCC No. CRL-I740) kao što je opisano u poglavlju 24.7 ovog primera. Samo oni konstrukti koji pokazuju bispecifično vezivanje za humani i makaki CD3 kao i za PSMA izabrani su za dalju upotrebu.

[0311] Citotoksična aktivnost generisanih konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela protiv PSMA pozitivnih ciljnih ćelija izazvanih sa efektorskim T ćelijama analizirana je kao stoje opisano u poglavlju 24.8 ovog primera. I lumana PSMA pozitivna ćelijska linija kancera prostate LNCaP (ATCC No. CRL-1740) korišćena je kao izvor ciljnih ćelija. Samo oni konstrukti koji su pokazivali potentno regrutovanje citotoksične aktivnosti efektorskih T ćelija protiv ciljnih ćelija pozitivniih za PSMA izabrani su za dalju upotrebu.

25. Mapiranje epitopa PSMA i CD3 molekula interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela

25.1 Stvaranje CHO ćelija koje eksprimiraju čovek/pacov PSMA himere 10312] Za mapiranje vezujućih epitopa PSMA molekula interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela, himerni PSMA proteini su generisani sa PSMA iz dve različite vrste. Ovaj pristup zahteva da je samo PSMA protein iz jedne vrste prepoznat sa antitelom. Ovde, PSMA rattus norvegicus, koji nije vezan testiranim PSMA molekulom interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela, korišćen jc za stvaranje himera sa humanim PSMA. Stoga, stvaranje himera u regionu koji sadrži vezujući epitop PSMA molekula interspecijski specifičnog

bispecifičnog jednolančanog antitela dovodi do gubitka vezivanja pomenutog jednolančanog antitela za respektivni PSMA konstrukt.

[0313]Kodirajuća sekvenca humanog PSMA kao stoje objavljena u GenBank (Accession number NM_004476) i kodirajuća sekvenca PSMA pacova (NM_057185, Rattus norvegicus folat hidroiaza (Folhl), iRNK, National Center for Biotechnologv Information. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrcz) korišćeni su za stvaranje himernih konstrukata.

[0314]Set od 7 himernih cDNK konstrukata dizajniran je i stvoren genskom sintezom prema standardnim protokolima. U konstruktima segmenti kodirajućih sekvenci za aminokiseline 140 do 169, 191 do 258, 281 do 284, 300 do 344, 589 do 617, 683 do 690 i 716 do 750, respektivno. zamenjene su sa homologim sekvencama PSMA pacova.

[0315]Himerni PSMA konstrukti su generisani kao stoje prethodno opisano i dizajnirani kao što je dato u sledećoj Tabeli 9:

[0316]Fragmenti dobijeni genskom sintezom dizajnirani su tako da sadrže prvo Kozak mesto za eukariotsku ekspresiju konstrukta praćenu sa kodirajućom sekvencom himernih PSMA proteina, praćeno u okviru čitanja sa kodirajućom sekvencom FLAG-taga i stop kodonom. Fragmenti dobijeni genskom sintezom su takođe dizajnirani tako da uvedu restirkciona mesta na početku i na kraju fragmenata. Uvedena restrikciona mesta, EcoRI na 5' kraju i Sali na 3' kraju, korišćena su u sledećim procedurama kloniranja. Neželjena unutrašnja restrikciona mesta uklonjena su tihom mutacijom kodirajuće sekvence u fragmentima dobijenim genskom sintezom. Fragmenti dobijeni genskom sintezom klonirani su preko EcoRI i Sali u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol lmmunother 50 (2001) 141-150) praćenjem standardnih protokola. Prethodno pomenute procedure izvedene su prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Klon sa verifikovaniom nukleotidnom sekvencom transficiran je u DHFR deficijentne CHO ćelije za eukariotsku ekspresiju konstrukta. Ekspresija eukariotskog proteina u DHFR deficijentnim CHO ćelijama izvedena je kao stoje opisano od strane Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzvmol. 185, 537-566. Amplifikacija gena konstrukta indukovana je rastućim koncentracijama metotreksata (MTX) do finalne koncentracije od do 20 nM MTX.

25.2 Protočno citometrijska analiza vezivanja za mapiranje epitopa PSMA i CD3 molekula

interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela korišćenjem PSMA proteina

[0317]Da bi se odredio vezujući epitop PSMA konstrukti interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog antitela izvedena je FACS analiza. U ovu svrhu korišćene su CHO ćelije transficirane sa čovek/pacov himernim PSMA molekuiima kao što je opisano u Primeru 25.1. FACS analiza sa supernatantom CHO ćelija koje eksprimiraju konstrukte bispecifičnog jednolančanog antitela izvedeno je kao što je ovde opisano. Detekcija vezivanja PSMA konstrukata interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog antitela izvedena je korišćenjem mišjeg Penta His antitela i kao reagens drugog koraka Fc gama-pecifično antitelo konjugovano sa fikoeritrinom. Supernatant netransficiranih ćelija je korišćen kao negativna kontrola.

[0318]Kao Što je prikazano na Slici 53 svi testirani konstrukti PSMA interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog antitela pokazali su vezivanje za himerne konstrukte huPSMArat 140-169, huPSMArat 191-258, huPSMArat281-284, huPSMArat683-690 i huPSMArat716-750. Kao što je dalje pokazano na Slici 53 izostaje vezivanje sa PSMA konstruktima interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog antitela PM84-D 7 x I2C, PM29-G1 x I2C i PM49-B9 x I2C sa konstruktom huPSMArat300-344, Što pokazuje prisustvo glavnog vezujućeg epitopa za ove konstrukte u regionu aminokiselina 300 do 344 humanog PSMA. Kao stoje takođe prikazano na Slici 53 izostaje vezivanje PSMA konstrukta interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog antitela PM34-C7 x 12C sa konstruktom huPSMArat598-617, što pokazuje prisustvo glavnog vezujućeg epitopa za ovaj konstrukt u rcgionu aminokiselina 598 do 617 humanog PSMA.

26 Mapiranje epitopa korišćenjem postupka skeninga peptida

|0319] Dva PSMA BiTE antitela PM 76-B10 x I2C i PM 76-A9 x I2C bila su unakrsno reaktivna sa PSMA pacova, što ih je isključilo iz mapiranja korišćenjem čovek-pacov PSMA himera. Slično tome, vezujući signali PSMA BiTE antitela PM Fl -A 10 x I2C za čovek-pacov PSMA himere bili su preslabi za pouzdano mapiranje epitopa. Ova tri PSMA BiTE antitela su podvrgnuta alternativnom pristupu mapiranja epitopa zasnovanom na skeningu peptida (Pepscan). Pepscan koristi preklapajuće peptidc datog proteina i analizira vezivanje antitela sa imobilisaniom peptidima preko enzimskih imunih testova (ELISAs). Eksperimenti sa mapiranjem epitopa sa PSMA BiTE antitelima izvedeni su u kompaniji Pepscan (Lelvstad, The Nelherlands). Detaljan opis ovog postupka se nalazi na drugim mestima (Bernard et al. 2004, J. Biol. Chem., 279: 24313 -22; Teelinget al. 2006, J Immunol., 177: 362-71). Ukratko, sintetisano je 693 različitih I5-mernih peptida koji se prostiru ćelom aminokiselinskom sekvencom humanog PSMA i preklapaju se sa svakim susednim 15-mernim peptidom sa 14 aminokiselina. Ovi peptidi su obloženi na ELISA komorice u formatu 384-komorne ploče. Za ovaj niz eksperimenata, anti-PSMA scFvs respektivnih kandidata BiTE antitela (scFv MP 9076-A9 za BiTE antitela PM 76-A9 x I2C; scFv MP 9076-B10 za BiTE antitelo PM 76-B10 x I2C; scFv FI-A10 za BiTE antitelo PM F1-A10 x 12C) proizverdeni su u E. coli i korišćeni za ELISA kao sirovi periplazmatski ekstrakti. U tu svrhu 7 ml sirovih periplazmatskih ekstrakata ispuručeni su na suvom led u Pepscan (Holandija). Korišćenje scFv partnera u ovom testu minimizovalo je rizik da se pokupe signali iz drugog ne-PSMA specifičnog vezivanja BiTE antitela, što može vodili pogrešnom tumačenju PSMA vezujućih epitopa ciljnih vezujućih struktura. scFvs su inkubirani sa peptidima i specifično vezivanje jc detektovano korišćenjem anti-His antitela. Vezujući signali su mereni na 384-komornom ELISA čitaču. Rezultati su prikazani na Slikama 54, 55 i 56.

|0320] Od tri anti-PSMA scFv antitela korišćena za stvaranje PSMA BiTE antitela (scFv MP 9076-A9 za BiTE antitelo PM 76-A9 x 12C; scFv MP 9076-B10 za BiTE antitelo PM 76-BI0 x I2C; scFv Fl-A 10 za BiTE antitelo PM FI-A10 x I2C) dva su se očigledno (MP 9076-A9 i MP 9076-B10) vezivala za sličan dominantni epitop humanog PSMA. Ovaj nalaz je podržan bliskom homologijom dva scFv antitela i identiteta sekvence u njihovih šest CDRs. Signali vezivanja peptida ukazuju na jezgro epitopa između Thr334 do Thr339. Ova sekvenca je smeštena u

izloženoj petlji apikalnog domena humanog PSMA kao što je prikazano na Slici 57. Za scPv Fl-A10, dominantni epitop se mogao detektovati unutar sekvence LFFPPPPGYBNVS (aminokiseline 143-155 humanog PSMA), koja je takođe smeštena u apikalnom domenu. Snažno vezivanje tri fragmenta antitela MP 9076-A9. MP9076-B10 i F1-A10 za diskretne peptide ukazuje na prepoznavanje epitop linearnog proteina pre nego ugljenohidratnc grupe.

Claims (18)

1. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadži prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za epitop humanog i Callithrix jacchus, Saguinus oedipus ili Saimiri sciureus CD3e (epsilon) lanac, gde je pomenuti epitop deo aminokiselinske sekvence sadržane u grupi koja sc sastoji od SEQ ID NOs. 2, 4, 6, ili 8, i sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-G!y-Asn-Giu, i drugi vezujući domen koji se vezuje za antigen specifičan za membranu prostate (PSMA).

2. Molekkul bispecifičnog jednolančanog antitela prema patentnom zahtevu 1, gde prvi vezujući domen sadrži VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabran od: (a) CDR-L1 kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 27, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.

28 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 29; (b) CDR-Ll kao što je prikazano u SEQ ID NO. 1 17, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.

118 i CDR-L3 kao stoje prikazano u in SEQ IDNO. 119; i (c) CDR-Ll kao što je prikazano u SEQ ID NO. 153, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.

154 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 155.

3. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde prvi vezujući domen sadrži VH region koji sadrži CDR-H 1, CDR-H2 i CDR-H3 izabran od: (a) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 12, CDR-H2 kao stoje prikazano u SEQ ID NO.

13 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 14; (b) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 30, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.

31 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 32; (c) CDR-H I kao što je prikazano u SEQ IDNO. 48, CDR-I12 kao što je prikazano u SEQ IDNO.

49 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 50; (d) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 66, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.

67 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 68; (e) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 84, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.

85 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 86; (f) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 102, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.

103 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 104; (g) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 120, CDR-H2 kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 121 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ IDNO. 122; (h) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 138, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 139 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 140; (i) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 156, CDR-112 kao stoje prikazano u SEQ ID NO.

157 i CDR-H3 kao stoje prikazano u SEQ ID NO. 158; i

0) CDR-H 1 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 174, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO.

175 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO. 176.

4. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde je drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za humani PSMA i/ili PSMA ne-humanog primata.

5. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela prema patentnom zahtevu 4, gde molekul bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži grupu sledećih sekvenci kao CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR LI, CDR L2 i CDR L3 u drugom vezujućem domenu izabrane od: a) CDR 111-3 od SEQ ID NO: 394 - 396 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 389 - 391; b) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 408 - 410 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 403 - 405; c) CDR H1 -3 od SEQ ID NO: 422 - 424 i CDR L1 -3 od SEQ ID NO: 417-419; d) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 436 -438 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 431 - 433; e) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 445 - 447 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 450-452; f) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 464 - 466 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 459-461: g) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 478 - 480 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 473 - 475; h) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 492 - 494 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 487 - 489;

1) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 506 - 508 i CDR LI-3 od SEQ ID NO: 501 - 503; j) CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 520 - 522 i CDR Ll-3 od SEQ IDNO: 515-517; k) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 534 - 536 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 529 - 531; I) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 548 - 550 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 543 - 545; m) CDR H1-3 od SEQ ID NO: 562 - 564 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 557 - 559; n) CDR 111-3 od SEQ ID NO: 576 - 578 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 571 - 573; o) CDR Hi-3 od SEQ ID NO: 590 - 592 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 585 - 587; p) CDR H1 -3 od SEQ ID NO: 604 - 606 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 599 - 601; q) CDR H1 -3 od SEQ ID NO: 618 - 620 i CDR LI-3 od SEQ ID NO: 613 - 615; r) CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 632 - 634 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 627 - 629; s) CDR H 1 -3 od SEQ ID NO: 646 - 648 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 641 - 643: t) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 660 - 662 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 655 - 657; u) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 674 - 676 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 669 - 671: v) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 688 - 690 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 683 - 685; w) CDR H1-3 od SEQ ID NO: 702 - 704 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 697 - 699; x) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 716 - 718 i CDR Ll-3 od SEQ IDNO: 711-713; y) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 729 - 731 i CDR LI-3 od SEQ ID NO: 724 - 726; z) CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 788 - 790 i CDR Ll-3 od SEQ IDNO: 793 - 795; aa) CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 806 - 808 i CDR Ll-3 od SEQ IDNO: 81 1-813; ab) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 852 - 854 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 857 - 859; ac) CDR HI-3 od SEQ ID NO: 838 - 840 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 843 - 845; ad) CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 824-826 i CDR Ll-3 od SEQ IDNO: 829- 831; ae) CDR Hi-3 od SEQ ID NO: 774 - 776 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 779 - 781; af) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 688 - 690 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 683 - 685; ag) CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 870 - 872 i CDR Ll-3 od SEQ IDNO: 875 - 877; ah) CDR H1 -3 od SEQ ID NO: 888 - 890 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 893 - 895; ai) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 924-926 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 929 - 931; aj) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 1019- 1021 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 1025 - 1027; ak)CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 1006- 1008 i CDR Ll-3 od SEQ IDNO: 1011 - 1013; al) CDR Hl-3 od SEQ ID NO: 906 - 908 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 911 - 913: am) CDR Hl-3 od SEQ IDNO: 992 -994 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 997 - 999; ari) CDR 111-3 od SEQ ID NO: 942 - 944 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 947 - 949; ao) CDR HI -3 od SEQ ID NO: 960 - 962 i CDR L1 -3 od SEQ ID NO: 965 - 967; and ap) CDR Hl-3 od SEQ ID NO:978 -980 i CDR Ll-3 od SEQ ID NO: 983 - 985.

6. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela iz patelnog zahteva 5, gde su vezujući domeni raspoređeni u redosiedu VH PSMA-VL PSMA-VH CD3-VL CD3 ili VL PSMA-VH PSMA-VH CD3-VL CD3.

7. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela prema patentnom zahtevu 6, gde molekul bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži sekvencu izabranu od: (a) aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ IDNOs: 399, 413. 427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567. 581, 595, 609, 623. 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721,734, 799,817, 863.849, 835, 785,899,935, 101 7, 1031, 917. 1003,953,971 ili 989; (b) aminokiselinske sekvence kodirane sa sekvencom nukleinske kiseline kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 400, 414. 428, 442, 456. 470, 484, 498, 512. 526, 540, 554, 568, 582,

596, 610, 624, 638, 652, 666, 680, 694, 708, 736 735, 800. 818, 864, 850, 836. 786, 882, 900, 936, 1018, 1032, 918, 1004, 954, 972, 990, 804, 822, 868, 886, 904, 940, 922, 958 ili 976; i (c) aminokiselinske sekvence najmanje 90 % identične, poželjnije najmanje 95 % identične, najpoželjnije najmanje 96 % identične sa aminokiselinskom sekvencom iz (a) ili (b).

8. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira molekul bispecifičnog jednolančanog antitela kao što je đefinisano u bilo kom od patentnih zahteva I do 7.

9. Vektor, koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline kao što je đefinisano u patentnom zahtevu 8.

10. Ćelija domaćin transformisana ili transficirana sa vektorom definisanom u bilo kom od patentnih zahteva 6 do 9.

11.Postupak za proizvodnju molekula bispecifičnog jednolančanog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 to 7, gde pomenuti postupak sadrži kultivisanje ćelije domaćina definisane u patentnom zahtevu 10 pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju molekula bispecifičnog jednolančanog antitela kao stoje đefinisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 i rekuperacije proizvedenog polipeptida iz kulture.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži molekul bispecifičnog jednolančanog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili proizvedena prema postupku iz patentnog zahteva 11.

13. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili proizveden prema postupku iz patentnog zahteva 11, za upotrebu u prevenciji, tretmanu ili ublažavanju kancera.

14. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela prema patentnom zahtevu 13, gde je pomenuti kancer solidni tumor, poželjno karcinom ili kancer prostate.

15. Komplet koji sadrži molekul bispecifičnog jednolančanog antitela kao šio je đefinisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, molkeul nukleinske kiseline kao što je definisan u patentnom zahtevu 8, vektor kao što je definiasn u patentnom zahtevu 9, ili ćelija domaćin kao što jc definisan u patentnom zahtevu 10.

16. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela iz patentnog zahteva 1, gde se pomenuti prvi vezujući domen vezuje za N-terminalni CD3 epsilon polipeptidni fragment in vitro i za nativnu CD3 epsilon podjedinicu CD3 kompleksa na T ćelijama in vivo sa istim afinitetom vezivanja.

17. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela prema patentnom zahtevu 1, gde je pomenuti epitop deo aminokiselinske sekvence koja sadrži 26, 25, 24, 23, 22, 21 , 20, 19, 18, i 7, 16, 15, 14, 13, 12, 1 1 , 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiseline.

18. Molekul bispecifičnog jednolančanog antitela prema patentnom zahtevu 1, gde je homogenost molekula bispecifičnog jednolančanog antitela najmanje 90%, 95% ili 98%.