RS55161B1 - Anti-il-23 antitela - Google Patents

Description

ANTI-IL-23 ANTITELA

Tehnička oblast ovog pronalaska

[0001]Ovaj pronalazak uopšteno se odnosi na anti-IL-23pl9 antitela za dijagnostičku i terapeutsku upotrebu. Preciznije, opisana su humanizovana anti-IL-23pl9 antitela i postupci koji se koriste u tretiranju različitih bolesti ili poremećaja. Takođe su opisane farmaceutske kompozicije i kitovi koji obuhvataju takva jedinjenja.

Pozadina pronalaska

[0002]Više eukariote razvile su zamršen odgovor na patogene koji je iniciran urođenim imunim odgovorom i zatim adaptivnim imunim odgovorom. Zajedno ova dva mehanizma ne samo da iskorene patogene koji inficiraju organizam već i uspostavljaju dugoročni imunološki odgovor na buduća izlaganja. Nedostaci u ovim odgovorima mogu da rezultiraju povećanjem osetljivosti na infekcije i/ili alteracije adaptivnog imunog odgovora što dovodi do hroničnog zapaljenja i autoimuniteta. IL-12, heterodimerski citokin koji se sastoji od p40 i p35 subjedinice proteina, dugo je smatran za oznaku citokina urođenog imunog odgovora sa velikim uticajem na adaptivni imunitet. Međutim, podaci iz ispitivanja biološke uloge ovog citokina doveli su do zbunjujućih rezultata. Na primer, dok su p40-deficitarni miševi bili rezistentni na Kolagen Indukovani Artritis (CIA) i Eksperimentalni Autoimuni Encefalomijelitis (EAE), p35-deficitarni miševi bili su osetljivi na oba i čak su pokazali pogoršanje bolesti. Takve zagonetke počele su da se rešavaju u kasnijim 1990-im sa otkrićem novog člana familije IL-12 citokina sa posebnom ulogom u imunom odgovoru - IL-23.

[0003]IL-23 se sastoji od zajedničke subjedinice (p40) sa IL-12 i jedinstvene pl9 subjedinice. Uprkos ovoj zajedničkoj p40 subjedinici, uloge za IL-23 i IL-12 su sasvim drugačije. IL-12 je važan za Thl odgovore preko promocije Thl ćelijske diferencijacije, proliferacije i aktivacije. Nasuprot tome, IL-23 podržava razvoj i održava skoro definisani set CD4+ T pomoćnih ćelija koje su nazvane Thl7 ćelije zbog njihove sposobnosti da proizvode IL-17 i srodne citokine. Sve je više dokaza da je IL-23 uključen u hronično autoimuno zapaljenje, a modulacija aktivnosti IL-23 može da obezbedi obećavajuće terapije protiv autoimunih bolesti.

[0004]Stoga, postoji potreba za antagonističkim molekulima protiv IL-23 sa blagotvornim farmakološkim svojstvima, koja mogu da se koriste kao terapeutski agensi za tretiranje bolesti, u određenim imunološkim i autoimunim bolestima kod ljudi. Prema tome, jedan cilj ovog pronalaska je da obezbedi anti-IL-23 antagonističke molekule, posebno anti-IL-23 antagonističke molekule koji imaju visok afinitet vezivanja za IL-23.

[0005]Sledeći cilj ovog pronalaska je da obezbedi anti-IL-23 antagonističke molekule, koji imaju visoku specifičnost za IL-23.

[0006]Sledeći cilj ovog pronalaska je da obezbedi anti-IL-23 antagoniste, koji imaju visoku aktivnost blokiranja za asocijaciju IL-23 i njegovog receptora.

[0007]Sledeći cilj ovog pronalaska je da obezbedi anti-IL-23 antagoniste, koji imaju snažnu ćelijsku aktivnost.

[0008]Sledeći cilj ovog pronalaska je da obezbedi anti-IL-23 antagoniste, koji imaju povoljnu bioraspoloživost.

[0009]Sledeći cilj ovog pronalaska je da obezbedi anti-IL-23 antagoniste, koji imaju povoljna biofizička svojstva.

[0010]Dalji ciljevi ovog pronalaska uključuju kombinacije bilo kojih ciljeva navedenih gore.

[0011]Antitela protiv IL-23pl9 poznata su, na primer, iz WO 2007/024846.

Sažetak pronalaska

[0012]Ovaj pronalazak odnosi se na gore navedene potrebe i obezbeđuje antitela koja se vezuju za pl9 subjedinicu IL-23 proteina. Ovaj pronalazak je kao stoje navedeno u patentnim zahtevima. U jednom aspektu, antitelo ovog otkrića vezuje se za humani IL-23 sa visokim afinitetom. U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića inhibira IL-23 stimulisanu proizvodnju IL-17 iz mišjih splenocita. U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića ne vezuje se za, niti antagonistički deluje na, IL-12, koji je blisko srodan član familije IL-23.

[0013]U jednom ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitela koja su izvedena iz mišjih hibridoma, na primer monoklonska antitela. U jednom ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje celu dužinu anti-IL-23pl9 antitela. U drugom ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 humanizovana antitela, na primer humanizovana monoklonska anti-IL-23pl9 antitela, na primer celu dužinu humanizovanih monoklonskih anti-IL-23pl9 antitela. U jednom aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića vezuje se za humani IL-23 sa visokim afinitetom. U drugom aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića takođe se vezuje za cinomolgusni IL-23 sa visokim afinitetom. U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića inhibira IL-23-indukovanu STAT3 fosforilaciju u DB ćelijama. U drugom aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića antagonistički deluje na akciju IL-23 vezivanjem za pl9 subjedinicu IL-23 proteina, na primer mereno inhibicijom citokina kao što su IL-17 i IL-22, čija je proizvodnja stimulisana od strane IL-23. U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića ima povoljan farmakokinetički (PK) profil. U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog pronalaska ima povoljna biofizička svojstva, kao što su kvalitet, stabilnost ili rastvorljivost, na primer kao što je određeno procentom antitela u monomernom obliku.

[0014]Dalja ostvarenja obuhvataju DNK molekule koji kodiraju antitela ovog pronalaska ekspresione vektore i ćelije domaćina koje obuhvataju takve DNK molekule, i postupke stvaranja antitela ovog pronalaska. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje terapeutske primene antitela ovog pronalaska, naročito protiv imunoloških i autoimunih bolesti.

[0015]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje anti-IL=23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata CDR1 (L-CDR1) sekvencu lakog lanca iz SEQID NO:l, 4, 6, 7, 8,11,15, 18,19, 22, 27 ili 30; CDR2 (L-CDR2) sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO:2, 5, 9,12,16,20, 23, 25, 28 ili 31; CDR3 (L-CDR3) sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO:3, 10, 13,14,17, 21, 24, 26, 29, ili 32; CDR1 (H-CDR1) sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO:33, 36, 38, 40, 43, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 67, 68, 69, 77 ili 80; CDR2 (H-CDR2) sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO:34, 39, 41, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 70, 72, 73, 75, 78 ili 81; i CDR3 (H-CDR3) sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO:35, 37, 42,44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 71, 74, 76, 79 ili 82. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata gore naveden L-CDR1, gore naveden L-CDR2 i gore naveden L-CDR3, i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata gore naveden H-CDR1, gore naveden H-CDR2 i gore naveden H-CDR3.

[0016]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:l, 2, 3, 33, 34, i 35, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:4, 5, 3, 36, 34 i 37, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:l, 2, 3, 38, 39 i 35, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:6, 2, 3, 40, 41 i 42, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu SEQ ID NO:7, 2, 3, 43, 41 i 44, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:8, 9, 10, 45, 46 i 47, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:8, 9,10, 48, 49 i 50, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:ll, 12,13, 51, 52 i 53, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:7, 2, 14, 54, 55 i 56, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:15, 16,17, 57, 58 i 59, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:18, 16, 17, 60, 61 i 62, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:19, 20, 21, 63, 66, 67 ili 68, 64 i 65, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:22, 23, 24, 69, 70 i 71, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:22, 25, 26, 55, 72 i 71, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:8, 9, 10, 45, 73 i 74, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:27, 28, 29, 45, 75 i 76, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:8, 9, 10, 77, 78 i 79, respektivno; ili L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvencu od SEQ ID NO:30, 31, 32, 80, 81 i 82, respektivno. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3 kombinaciju gore navedenog, i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 kombinaciju gore navedenog.

[0017]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:84 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:121; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:86 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:123; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:88 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:125; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:90 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:127; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:91 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:128; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:93 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEOJD NO:130; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:95 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:132; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:97 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:134; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:99 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEOJD NO:136; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:101 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:138; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:103 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:140; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:105 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:142; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:107 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:144; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:109 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:146; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:lll i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:148; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:113 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:150; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:115 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:152; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:117 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:154; ili varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:119 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:156.

[0018]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:158, 160,162 i 164 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:166,168 170 i 172.

[0019]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima KDza IL-23 manje od 40pM, ili KDza IL-23 manje od 20pM, ili KDza IL-23 manje od lOpM ili KDza IL-23 manje od lpM.

[0020]U daljem ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za humani IL-23pl9 na epitopu koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka 108 do 126 i aminokiselinskih ostataka 137 do 151 iz SEQ ID NO: 181.

[0021]U daljem ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se kompetitivno vezuje za humani IL-23pl9 sa antitelom ovog otkrića. U jednom ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se kompetitivno vezuje za humani IL-23pl9 sa humanizovanim monoklonskim anti-IL-23pl9 antitelom koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176. U jednom ostvarenju ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se kompetitivno vezuje za humani IL-23pl9 sa humanizovanim monoklonskim anti-IL-23pl9 antitelom koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:178. U jednom ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se kompetitivno vezuje za humani IL-23pl9 sa humanizovanim monoklonskim anti-IL-23pl9 antitelom koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:180 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176. U jednom ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se kompetitivno vezuje za humani IL-23pl9 sa humanizovanim monoklonskim anti-IL-23pl9 antitelom koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 180 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 178.

[0022]U ovom pronalasku, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano antitelo. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je monoklonsko antitelo. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je antitelo cele dužine. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo, na primer humanizovano monoklonsko antitelo cele dužine. U jednom ostvarenju antigen-vezujući fragment je Fab, F(ab')2, ili Fv fragment jedinstvenog lanca. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca i varijabilnu regiju teškog lanca.

[0023]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata sekvencu aminokiseline SEO, ID NO:19( CDR1- L) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20( CDR2- L) ;sekvencu aminokiseline (SEQ ID NO:21( CDR3- L) :sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO:63, 66, 67 ili 68( CDR1- H) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:64( CDR2- H) ;i sekvencu aminokiseline SEQ I D NO:65( CDR3- H).

[0024]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19( CDR1- L) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20( CDR2- L) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:21( CDR3- L) :sekvencu aminokiseline SEQ ID. NO:66( CDR1- H) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:64( CDR2- H) ;i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:65( CDR3- H).

[0025]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19( CDR1- L) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20( CDR2- L) ;i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:21( GDR3- L) ;i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEQ ID NO:63, 66, 67 ili 68( CDR1- H) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:64( CDR2- H) ;i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:65( CDR3- H).

[0026]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju

lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19( CDR1- L) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20( CDR2- L) ;i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:21( CDR3- L) ;i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:66( CDR1- H) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:64( CDR2-H) ;i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:65( CDR3- H).

[0027]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO:158,160,162 ili 164; i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO:166,168, 170 ili 172.

[0028]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:160 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:166.

[0029]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:160 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:168.

[0030]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:166.

[0031]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:168.

[0032]U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano antitelo. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je monoklonsko antitelo. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je antitelo cele dužine. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo, na primer humanizovano monoklonsko antitelo cele dužine. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući fragment je Fab, F(ab')2, ili Fv fragment jedinstvenog lanca. U jednom ostvarenju, antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca i varijabilnu regiju teškog lanca.

[0033]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje antitelo koje obuhvata sekvencu aminokiseline SEO, ID NO:166 ili 168 povezanu sa humanom IgGl, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA ili IgE konstantnom regijom teškog lanca. Antitelo koje obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 166 ili 168 povezanu sa humanom IgGl konstantnom regijom teškog lanca. Antitelo koje obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158 ili 160 povezanu sa humanom kapa ili lambda konstantnom regijom lakog lanca. Antitelo koje obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158 ili 160 povezanu sa humanom kapa konstantnom regijom lakog lanca.

[0034]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje antitelo koje obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:166 ili 168 povezanu sa humanom IgGl konstantnom regijom teškog lanca; i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158 ili 160 povezanu sa humanom kapa konstantnom regijom lakog lanca.

[0035]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od bilo koje od SEQ ID NO:158,160,162 i 164 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od bilo koje od SEQ ID NO:166,168, 170 i 172.

[0036]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:160 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:166.

[0037]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:160 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:168.

[0038]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:166.

[0039]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:168.

[0040]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 ili 180 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176 ili 178.

[0041]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176.

[0042]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano monoklonski anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:178.

[0043]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:180 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176.

[0044]U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 180 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 178.

[0045]U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak odnosi se na anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR-ove SEQ ID NO:160 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena lakog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:160 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR-ove SEO, ID NO:166 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena teškog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:166. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo, na primer humanizovano monoklonsko antitelo cele dužine.

[0046]U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak odnosi se na anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata humanizovano varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR-ove SEQ ID NO:160 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena lakog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:160 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR-ove SEQ ID NO:168 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena teškog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:168. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo, na primer humanizovano monoklonsko antitelo cele dužine.

[0047]U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak odnosi se na anti-tL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR-ove SEQ ID NO:158 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena lakog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:158 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR-ove SEQ ID NO:166 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena teškog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:166. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo, na primer humanizovano monoklonsko antitelo cele dužine.

[0048]U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak odnosi se na anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR-ove SEQ ID NO:158 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena lakog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:158 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR-ove SEQ ID NO:168 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena teškog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:168. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo, na primer humanizovano monoklonsko antitelo cele dužine.

[0049]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može da bude dalje okarakterisan sa KDkoji je za humani IL-23 jednak ili manji od 1 pM. U jednom aspektu, nema pomeranja u brzini napredovanja vezivanja u 50% humanom serumu.

[0050]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše time što blokira vezivanje IL-23 za humani IL-23R/Fc in vitro.

[0051]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše time što se ne vezuje za humani IL-12.

[0052]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše time što inhibira humanim IL-23 indukovanu IL-17 proizvodnju u mišjim splenocitima sa IC50jednako ili manje od 20 pM.

[0053]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše time što inhibira humanim IL-23 indukovanu STAT3 fosforilaciju u humanim DB ćelijama sa IC50 jednako ili manje od 40 pM.

[0054]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše time što nema predviđenu aktivnost u ADCC/CDC.

[0055]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše time što ima KD jednako ili manje od_l pM za IL-23 cinomolgus majmuna.

[0056]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše time što nema unakrsnu reaktivnost za mišji ili pacovski IL-23.

[0057]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše time što inhibira humanim IL-23 indukovanu proizvodnju IL-17 i IL-22 u mišjem uvetu sa 80% ili većom inhibicijom oba citokina pri 1 mg/kg.

[0058]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše temperaturom topljenja od 83°C kao što je određeno diferencijalno skenirajućom kalorimetrijom.

[0059]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića može dalje da se karakteriše sa rastvorljivošću koja je jednaka ili veća od 100 mg/ml, merena UV spektroskopijom i praćena zamućenjem.

[0060]U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog pronalaska može dalje da se karakteriše time što je prisutno u najmanje 90% monomernom obliku, ili u najmanje 92% monomernom obliku, ili u najmanje 95% monomernom obliku u puferu.

[0061]U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog pronalaska može dalje da se karakteriše time što ostaje u najmanje 90% monomernom obliku, ili u najmanje 92% monomernom obliku, ili u najmanje 95% monomernom obliku u puferu za jedan mesec ili za četiri meseca.

[0062]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo, na primer humanizovano monoklonsko antitelo cele dužine.

[0063]Dalja ostvarenja obuhvataju DNK molekul koji kodira varijabilnu regiju lakog lanca gore, DNK molekul koji kodira varijabilnu regiju teškog lanca gore, DNK molekul koji kodira regiju lakog lanca gore, ili DNK molekul koji kodira regiju teškog lanca gore.

[0064]Dalja ostvarenja obuhvataju ekspresioni vektor koji sadrži DNK molekul gore. U jednom ostvarenju, ekspresioni vektor obuhvata DNK molekul koji kodira konstantan težak lanac i/ili konstantan laki lanac, respektivno, povezan sa DNK molekulom koji kodira varijabilni težak lanac i/ili varijabilni laki lanac, respektivno. Dalja ostvarenja obuhvataju ćeliju domaćina koja nosi jedan ili više ekspresionih vektora gore. U jednom ostvarenju, domaćin je ćelija sisara.

[0065]Dalja ostvarenja obuhvataju postupak za proizvodnju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta gore koji obuhvata transfekciju ćelija domaćina sisara sa jednim ili više vektora gore, kultivisanje ćelije domaćina i izolovanje i prečišćavanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0066]Dalja ostvarenja obuhvataju postupak za proizvodnju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta gore koje obuhvata dobijanje ćelije domaćina sisara koja obuhvata jedan ili više vektora gore, i kultivisanje ćelije domaćina. U jednom ostvarenju, postupak dalje obuhvata izolovanje i prečišćavanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0067]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment gore za upotrebu u medicini. U jednom ostvarenju, koristi se u tretiranju zapaljenske bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja ili kancera. U jednom ostvarenju, koristi se za tretiranje psorijaze, zapaljenske bolesti creva (Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa), psorijaznog artritisa, multipla skleroze, reumatoidnog artritisa ili ankilozirajućeg spondilitisa. U jednom ostvarenju, koristi se za tretiranje psorijaze. U jednom ostvarenju, koristi se za tretiranje zapaljenske bolesti creva.

[0068]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata molekul antitela ili antigen-vezujući fragment gore i farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0069]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje postupak za tretiranje zapaljenske bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja ili kancera koji obuhvata davanje subjektu kojem je to potrebno, na primer pacijentu, efektivne količine anti-IL-23pl9 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta gore, ili farmaceutske kompozicije koja obuhvata antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. U jednom ostvarenju, antitelo ili antigen-vezujući fragment se daje parenteralnim putem primene; ili se daje intravenozno ili subkutano. U jednom ostvarenju, antitelo ili antigen-vezujući fragment se daje subkutano. U jednom ostvarenju, bolest je psorijaza, zapaljenska bolest creva (Kronova bolest, ulcerozni kolitis), psorijazni artritis, multipla skleroza, reumatoidni artritis, ili ankilozirajući spondilitis. U jednom ostvarenju, bolest je psorijaza. U jednom ostvarenju, bolest je zapaljenska bolest creva.

[0070]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje postupak za inhibiranje vezivanja IL-23 za IL-23 receptor na ćeliji sisara, koji obuhvata davanje ćeliji molekul antitela ili antigen-vezujući fragment gore, pri čemu je inhibirana signalizacija posredovana IL-23 receptorom.

[0071]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje postupak za tretiranje subjekta koji ima IL-23-povezan poremećaj, koji obuhvata davanje subjektu antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta gore, pri čemu se antitelo ili antigen-vezujući fragment vezuje se za humani IL-23.

[0072]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje postupak za detekciju i/ili kvantifikaciju IL-23 nivoa u biološkom uzorku dovođenjem uzorka u kontakt sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom gore i detekciju vezivanja antitela ili njegovog fragmenta sa IL-23pl9. Ova informacija može da se koristi za dijagnozu IL-23-povezanog poremećaja. Na ovaj način, obezbeđeni su postupci za dijagnozu IL-23-povezanog poremećaja ili za određivanje da li subjekat ima povećan rizik od razvoja IL-23-povezanog poremećaja, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt biološkog uzorka uzetog sa subjekta sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom gore i detekciju vezivanja antitela ili antigen vezujućeg fragmenta za IL-23pl9 radi određivanje ekspresije ili koncentracije IL-23.

[0073]U jednom ostvarenju, ovo otkriće dalje obezbeđuje postupak za inhibiranje vezivanja IL-23 za IL-23 receptor na ćeliji, koji obuhvata davanje ćeliji ili ćelijskom okruženju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta gore, pri čemu je inhibirana signalizacija posredovana IL-23 receptorom.

Kratak opis crteža

[0074]

Fig. 1: Poravnanje mišjih i humanizovanih varijabilnih regija. Fig. 1 a: Anti-IL-23pl9 6B8 konstruisane Vk regije. Fig. lb: Anti-IL-23pl9 6B8 konstruisane VH regije.

Numerisanje aminokiselina je po standardnoj Kabat šemi za numerisanje. Obični font = Humani; italik/podvučeni font = Mišji; osenčen font = sintetički; bold/italik/podvučen = CDR.

Fig. 2: Ogled kompetitivnog vezivanja humanog IL-23 vezivanje za IL-23R/Fc.

Detaljni opis

[0075]pl9 subjedinica iz IL-23 (ovde takođe označena kao "IL-23pl9" i "pl9 subjedinica") je 189 aminokiselinski polipeptid koji sadrži 21 aa vodeću sekvencu (Oppmann et al. Immunitv 13:715 (2000), SEQ ID NO: 181). Biološka aktivnost molekula samo se detektuje kada je udružena sa IL-12p40 subjedinicom za formiranje IL-23. IL-23 je pretežno eksprimiran aktiviranjem dendričnih ćelija (DC) i fagocitnih ćelija. Receptor za IL-23 utvrđeno je da se sastoji od IL-12R01 subjedinice od IL-12 receptora združenog sa jedinstvenom subjedinicom koja se naziva IL-23R (Parham et al. J. Immunol. 168:5699

(2002)). Ekspresija receptora detektovana pre svega na memorijskim T ćelijama i NK ćelijama. Ovako,

ekspresija ovog citokin:receptor para izgleda daje ograničena za specifičnu populaciju imunih ćelija. Dok se prvo mislilo da IL-12 i IL-23 dele mnoge funkcije, podaci su pokazali da je slika drugačija. S obzirom da IL-12 ima pretežnu ulogu u proizvodnji Thl ćelija, IL-23 utvrđeno je da je kritički uključen u proizvodnju i održavanje skoro prepoznatog Th ćelijskog podseta nazvanog Thl7 (Kiklv et al. Curr. Opin. Immunol.

18:670 (2006), Kastelein et al. Ann. Rev. Immunol. 25:221 (2007)). Ove ćelije proizvode IL-17A, IL-17F, IL-22 i druge pro-inflamatorne citokine poput IL-6 i TNF-a. Kao što je opisano dole, ispitivanja životinjskih modela na ulogu ovih Thl7 ćelija pokazuje njihov značaj kao pogonske sile kod hroničnih zapaljenja i autoimuniteta.

[0076]Ovo otkriće obezbeđuje antitela koja se vezuju za pl9 subjedinicu iz IL-23, naročito za humani IL-23pl9. Ovo otkriće takođe se odnosi na humanizovana antitela koja prepoznaju pl9 subjedinicu iz IL-23. U posebnim ostvarenjima, sekvenca ovih humanizovanih antitela identifikovana je na osnovu sekvenci određenih vodećih mišjih antitela.

[0077]Vodeća mišja antitela ovog otkrića izvedena su iz mišjih hibridoma. Imunizacija miševa izvodi se korišćenjem različitih postupaka. Na primer, antitela koja su specifična za humane IL-23pl9 proteine ili njihove fragmente mogu da se podignu protivno imunogenskom antigenu poput izolovanog IL-23pl9 proteina, izolovanog IL-23 proteina, izolovanog hibridnog IL-23 proteina, i/ili dela bilo kojeg od prethodnih (uključujući sintetičke peptide). Na primer, hibridni IL-23 protein koji obuhvata miš IL-23p40 subjedinicu i humanu IL-23pl9 subjedinicu korišćen je za imunizaciju miševa. Pripremanje imunogenih antigena i proizvodnja monoklonskog antitela može se izvesti korišćenjem bilo kog pogodnog postupka poznatog stručnjaku.

[0078]Vodeća mišja antitela izabrana su na osnovu njihovog visok afiniteta za humani IL-23. Prema tome, u jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani IL-23 sa visokim afinitetom. Izabrana mišja antitela humanizovana su radi dobijanja humanizovanih antitela. Humanizovana antitela ovog pronalaska vezuju se za humani IL-23 sa visokim afinitetom. Prema tome, u drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje humanizovano antitelo koje se vezuje za humani IL-23 sa visokim afinitetom. Prema tome, u jednom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo koje ima KDmanje od 40pM. U daljem ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo koje ima KDmanje od 20pM. U daljem ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo koje ima KDmanje od lOpM. U daljem ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo koje ima KDmanje od lpM.

[0079]U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića vezuje se za IL-23pl9 sa visokim afinitetom u odsustvu humanog seruma ili u prisustvu od 50% humanog seruma. U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića takođe se vezuje za IL-23 cinomolgus majmuna sa visokim afinitetom.

[0080]U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića vezuje se za IL-23, ali se ne vezuje za IL-12. U daljem aspektu, antitelo ovog pronalaska ne utiče na biološku aktivnost IL-12, koji je je blizak član famije sa IL-23.

[0081]U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića inhibira IL-23 stimulisana proizvodnja IL-17 iz mišjih splenocita.

[0082]U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića inhibira IL-23-indukovanu STAT3 fosforilaciju u DB ćelijama.

[0083]U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića antagonistički deluje na akciju IL-23 vezivanjem za pl9 subjedinicu iz IL-23, što je mereno inhibicijom citokina poput IL-17 i IL-22, čija proizvodnja je stimulisana od strane IL-23, i detektovano redukcijom u nivoima u citokina.

[0084]U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića ima povoljan farmakokinetički profil (PK) profil, kako je prikazano putem in vivo poluživota u cinomolgus majmunima.

[0085]U daljem aspektu, humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima povoljna biofizička svojstva, na primer kvalitet, stabilnost, ili rastvorljivost.

[0086]U jednom aspektu, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano antitelo. U jednom aspektu, anti-IL-23pl9 antitelo je monoklonsko antitelo. U jednom aspektu, anti-IL-23pl9 antitelo je antitelo cele dužine. U jednom aspektu, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo, na primer humanizovano monoklonsko antitelo cele dužine.

[0087]Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovog otkrića prepoznaje specifičan "IL-23pl9 antigen epitop" ili "IL-23pl9 epitop". Kao što su ovde korišćeni ovi termini se odnose na molekul (npr., peptid) ili fragment molekula koji ima sposobnost imunoreaktivnosti sa anti-IL-23pl9 antitelom i, na primer, uključuje IL-23pl9 antigenu determinantu prepoznatu od strane bilo kojih antitela koja imaju kombinaciju sekvence lakog lanca/teškog lanca od SEQ ID NO:84/121, 86/123, 88/125, 90/127, 91/128, 93/130, 95/132, 97/134, 99/136, 101/138,103/140,105/142,107/144,109/146, 111/148, 113/150, 115/152,117/154,119/156,160/166,160/168,158/166 ili 158/168. IL-23pl9 antigen epitopi mogu da budu uključeni u proteinima, fragmentima proteina, peptidima ili sličnom. Epitopi su najjednostavniji proteini, kratki oligopeptidi, imitatori oligopeptida (tj., organska jedinjenja koja oponašaju antitelo vezujuća svojstva IL-23pl9 antigena), ili njihovim kombinacijama. Minimalna veličina peptida ili polipeptidnog epitopa za antitelo smatra se da bude oko četiri do pet aminokiselina. Peptid ili polipeptidni epitopi sadrže na primer najmanje sedam aminokiselina ili na primer najmanje devet aminokiselina ili na primer između oko 15 do oko 20 aminokiselina. S obzirom da antitelo može da prepozna antigeni peptid ili polipeptid u njegovom tercijarnom obliku, aminokiseline koje obuhvataju epitop ne moraju biti susedne, a u nekim slučajevima, mogu čak da ne budu na istom peptidom lancu. Epitopi mogu da se odrede različitim postupcima koji su poznati stručnjaku, kao što su Rendgenska krisatalografija, Vodonik/Deuterijum Razmena Masena Spektrometrija (HRMS), usmerena mutageneza, mutageneza za alanin skeniranje, i postupci za skrining peptida.

[0088]Opšta struktura antitela ili imunoglobulina dobro je poznata stručnjacima iz oblasti. Ovi molekuli su heterotetramerni glikoproteini, obično oko 150,000 daltona, sastavljena od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca i obično se odnosi na kao antitela cele dužine. Svaki laki lanac je kovalentno povezan sa teškim lancem jedno disulfidnom vezom formirajući heterodimer, a heterotetramerni molekul formiran je kovalentnim disulfidnim vezama između dva identična teška lanaca heterodimera. lako su laki i teški lanaci povezani zajedno jednom disulfidnom vezom, broj disulfidnih veza između dva teška lanaca varira u zavisnosti od izotipa imunoglobulina. Svaki težak i laki lanac takođe ima pravilno raspoređene disulfidne mostove u lancu. Svaki težak lanac ima na amino terminusu varijabilni domen (VH), praćen sa tri ili četiri konstantna domena (CHi, CH2, CH3, i CH4), kao i zglobna regija između CHii CH2- Svaki laki lanac ima dva domena, amino-terminalni varijabilni domen (VL) i karboksi-terminalni konstantni domen (CL). VLdomen vezan je nekovalentno sa VHdomenom, pri čemu je CLdomen obično kovalentno povezan sa Cm domenom preko disulfidnee veze. Posebni aminokiselinski ostaci veruje se da formiraju povezivanje između varijabilnih domena lakog i teškog lanca (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663). Varijabilni domeni takođe se ovde odnose kao varijabilne regije.

[0089]Određeni domeni u sklopu varijabilnih domena znatno se razlikuju među različitim antitelima tj., oni su "hipervarijabilni." Ovi hipervarijabilni domeni sadrže ostatke koji su direktno uključeni u vezivanje i specifičnost svakog posebnog antitela za njegovu specifičnu antigenu determinantu. Hipervarijabilnost, i u varijabilnim domenima lakog lanca i teškog lanca, je koncentrisana u tri segmenta poznata kao regije koje determinišu komplementarnost (CDR) ili hipervarijabilne petlje (HVL). CDR određeni su poređenjem sekvenci u Kabat et al., 1991, U: Sequences of Proteins of immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., pri ćemu su HVL (takođe se ovde odnose kao CDR) strukturno određeni prema trodimenzionalnoj strukturi varijabilnog domena, kao što je opisano od strane Chothia i Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Ova dva postupka rezultiraju blago različitim identifikacijama CDR. Kao što je odredio Kabat, CDR-L1 pozicioniran je na oko ostacima 24-34, CDR-L2, na oko ostacima 50-56, i CDR-L3, na oko ostacima 89-97 u varijabilnom domenu lakog lanca; CDR-H1 pozicioniran je na oko ostacima 31-35, CDR-H2 na oko ostacima 50-65, i CDR-H3 na oko ostacima 95-102 u varijabilnom domenu teškog lanca. Tačan broj ostataka koji obuhvazaju poseban CDR variraće u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručnjaci iz oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci obuhvataju poseban CDR dajući sekvencu aminokiseline varijabilnog regijaa antitela. CDR1, CDR2, CDR3 teških i lakih lanaca stoga određuje jedinstvena i funkcionalna svojstva specifična za dato antitelo.

[0090]Tri CDR-a unutar svakog teškog i lakog lanca odvojeni su okvirnim regijama (FR), koje sadrže sekvence koje imaju tendenciju da su manje varijabilne. Od amino terminusa do karboksi terminusa varijabilnih domena tečkog i lakog lanca, FR-ovi i CDR-ovi raspoređeni su u redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. U velikoj meri konfiguracija B-ravni FR-ova donosi CDR-ove unutar svakog lanca u neposrednoj blizini jedan do drugog kao i do CDR-ova iz drugog lanca. Rezultirajuća konformacija doprinosi vezivanju antigena(videti Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, strane 647-669), iako nisu svi CDR ostaci nužno direktno uključeni u vezivanje antigena.

[0091]FR ostaci i Ig konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali doprinose vezivanju antigena i/ili posreduju u efektorskoj funkciji antitela. Neki FR ostaci smatra se da imaju značajan efekat na vezivanje antigena na najmanje tri načina: nekovalentnim vezivanjem direktno za epitop, interakcijom sa jednim ili više CDR ostataka, i tako što utiču na povezivanje između teških i lakih lanaca. Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena ali posreduju različite Ig efektorske funkcije, kao što su učestvovanje antitela u antitelo zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC); komplement zavisnu citotoksičnost (CDC) i antitelo zavisnu ćelijsku fagocitozu (ADCP).

[0092]Lakim lancima imunoglobulina kičmenjaka dodeljena je jedna od dve jasno različite klase, kapa (k) i lambda (\), koje su zasnovane na sekvenci aminokiseline konstantnog domena. Poređenja radi, teškim lancima imunoglobulina sisara dodeljena je jedna od pet glavnih klasa, prema sekvenci konstantnih domena: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. IgG i IgA su dalje podeljeni u subklase (izotipovi), npr., IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgAii lgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se a, 6, e, v i V-, respektivno. Strukture subjedinica i trodimenzionalne konfiguracije klasa prirodnih imunoglobulina su dobro poznate.

[0093]Pojmovi, "antitelo", "anti-IL-23pl9 antitelo", "humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo", "humanizovani anti-IL-23pl9 epitop antitela" i "varijanta humanizovanog anti-IL-23pl9 epitopa antitela" posebno obuhvataju monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela cele dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), i fragmente antitela kao što su varijabilni domeni i drugi delovi antitela koji pokazuju željenu biološku aktivnost, npr., IL-23pl9 vezivanje. Pojam "monoklonsko antitelo" (mAb) odnosi se na antitelo koje je visoko specifično, usmereno protiv jedne antigene determinante, za "epitop". Prema tome, modifikator "monoklonski" ukazuje na antitela koja su usmerena na identični epitop i ne bi trebalo da se tumači kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Podrazumeva se da monoklonska antitela mogu da se proizvedu bilo kojim postupkom ili metodologijom koji su poznati stručnjaku; uključujući npr., hibridoma postupak (Kohler et al., 1975, Nature 256:495), ili postupke rekombinantne DNK koji su poznati stručnjaku (videti, npr., U.S. Pat. Br. 4,816,567), ili postupke izolacije monoklonski rekombinantno proizvedenih korišćenjem biblioteka faga antitela, korišćenjem postupaka Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597.

[0094]Pojam "monomer" odnosi se na homogeni oblik antitela. Na primer, za antitelo cele dužine, monomer znači monomerno antitelo koje ima dva identična teška lanca i dva identična laka lanca.

[0095]Himerna antitela sastoje se od varijabilnih regija teškog i lakog lanca antitela iz jedne vrste (npr., sisara koji nije čovek kao što je miš) i konstantnih regija teškog i lakog lanca druge vrste (npr., čovek) antitela i može se dobiti vezivanjem DNK sekvenci koje kodiraju varijabilne regije antitela friz prve vrste (npr., miša) za DNK sekvence za konstantne regije antitela iz druge (npr. čovek) vrste i transformisanjem domaćina sa ekspresionim vektorom koji sadrži povezane sekvence da bi se omogućilo da proizvede himerno antitelo. Alternativno, himerno antitelo takođe može da bude jedno u kojem jedna ili više regija ili domena teškog i/ili lakog lanca su identična sa, homologna sa, ili varijantom odgovarajuće sekvence u monoklonskom antitelu iz druge klase ili izotipa imunoglobulina, ili iz konsenzus sekvence ili sekvence germinativne linije. Himerna antitela mogu da uključuju fragmente takvih antitela, obezbeđujući da fragment antitela ispoljava željenu biološku aktivnost svog matičnog antitela, na primer vezivanje za isti epitop (videti, npr., U.S. Pat. Br. 4,816,567; i Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

[0096]Pojmovi," fragment antitela", "anti-IL-23pl9 fragment antitela", "anti-IL-23pl9 epitop fragmenta antitela", "humanizovani anti-IL-23pl9 fragment antitela", "humanizovani anti-IL-23pl9 epitop fragmenta antitela", "varijanta humanizovanog anti-IL-23pl9 epitopa fragmenta antitela" odnosi se na deo anti-IL-23pl9 antitela cele dužine, u kojoj je zadržana varijabilna regija ili funkcionalna sposobnost, na primer, specifično vezivanje IL-23pl9 epitopa. Primeri fragmenta antitela uključuju, ali ne ograničavaju se na, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv i scFv-Fc fragment, dijatelo, linearno antitelo, jedno-lančano antitelo, minitelo, dijatelo formirano od fragmenata antitela, i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0097]Antitela cele dužine mogu da se tretiraju sa enzimima kao što je papain ili pepsin da stvaraju korisne fragmente antitela. Digestija papaina koristi se za proizvodnju dva identična fragmenta antigen-vezujućeg antitela koji se nazivaju "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigen-vezujućim mestom, i peostalog "Fc" fragmenta. Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i CHidomen teškog lanca. Tretiranje pepsinom daje F(ab')2 fragment koji ima dva antigen-vezujuća mesta i dalje je sposoban za antigen unakrsno-povezivanje.

[0098]Fab' fragmenti razlikuju se od Fab fragmenata zbog prisustva additional ostataka uključujući jedan ili više cisteina iz zglobne regije antitela na C-terminusu Cm domena. F(ab')2fragmenti antitela su parovi Fab' fragmenata povezani sa ostacima cisteina u zglobnoj regiji. Takođe su poznata druga hemijska vezivanja fragmenata antitela.

[0099]"Fv" fragment sadrži mesto potpunog antigen-prepoznavanja i vezivanja koje se sastoji od dimera varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji, tri CDR-a svakog varijabilnog domena intereaguju da odrede antigen-vezujuće mesto na površini VH-VLdimera. Zajedno, šest CDR-ova prenose antigen-vezivanje specifičnost za antitelo.

[0100]"Jedno-lančani Fv" ili "scFv" fragment antitela je jedno-lančana Fv varijanta koja obuhvata VHi VLdomene antitela gde su domeni prisutni u jedinstvenom polipeptidnom lancu. Jedno-lančani Fv je sposoban da prepozna i veže antigen. scFv polipeptid može opciono takođe da sadrži polipeptidni veznik pozicioniran između VHi VLdomenima kako bi se olakšalo formiranje željene trodimenzionalne strukture za vezivanje antigena od strane scFv (videti, npr., Pluckthun, 1994, In The Pharmacologv of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg i Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315).

[0101]"Dijatelo" odnosi se na male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, čiji fragmenti obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (V.sub.H) povezan za varijabilni domen lakog lanca (V.sub.L) u istom polipeptidnom lancu (V.sub.H-V.sub.L ili V.sub.L-V.sub.H). Dijatela su detaljnije opisana u, npr., Holligeret al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.

[0102]Drugi prepoznati fragmenti antitela uključuju one koji obuhvataju partandemskih Fd segmenata (VH-CHi-VH-CHi) za formiranje para antigen vezujućih regija. Ova "linearna antitela" mogu da budu bispecifična ili monospecifična kao što je opisano u, na primer, Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062.

[0103]"Humanizovano antitelo" ili" fragment humanizovanog antitela" je specifičan tip himernog antitela koji uključuje imunoglobulinsku varijantu sekvence aminokiseline, ili njen fragment, koji je sposoban da se vezuje za predodređeni antigen a koji, obuhvata jedan ili više FR-ova koji imaju supstancijalnu sekvencu aminokiseline humanog imunoglobulina ijedan ili više CDR-ova koji imaju supstancijalnu sekvencu aminokiseline ne-humanog Imunoglobulina. Ova ne-humana sekvenca aminokiseline koja se često odnosi kao "važna" sekvenca je obično uzeta iz "važnog" domena antitela, naročito varijabilnog domena. Uopšteno, humanizovano antitelo uključuje najmanje CDR-ove ili HVL-ove ne-humanog antitela, umetnute između FR-ova humanog varijabilnog domena teškog ili lakog lanca. Ovaj pronalazak opisuje specifična humanizovana anti-IL-23pl9 antitela koja sadrže CDR-ove dobijene iz mišjih monoklonskih antitela ili humanizovanih CDR-ova koji su prikazani u Tabelama 3 i 4 umetnutih između FR-ova humane sekvence germinativne linije varijabilnih domena teškog i lakog lanca. Razume se da određeni mišji FR ostaci mogu da budu važni za funkcionisanje humanizovanih antitela i stoga određeni od ostataka humane sekvence germinativne linije varijabilnih domena teškog i lakog lanca modifikovani su tako da su isti kao oni odgovarajuće mišje sekvence.

[0104]U drugom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo obuhvata supstancijalno sve od najmanje jednog, a obično dva, varijabilna domena (kao što su sadržana, na primer, u Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, i Fv fragmentima) u kojima su svi, ili supstancijalno svi, od CDR-ova vezi sa onima ne-humanog imunoglobulina, a posebno ovde, svi CDR-ovi su mišje ili humanizovane sekvence kao što je dato u Tabelama 1 do 4 ovde dole a svi, ili supstancijalno svi, od FR-ova su oni od humane Imunoglobulinske konsenzus sekvence ili sekvence germinativne linije. U drugom aspektu, humanizovano anti- IL-23pl9 antitelo takođe uključuje najmanje deo Fc regije imunoglobulina, obično one od humanog imunoglobulina. Obično, antitelo će da sadrži i laki lanac kao i najmanje varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može da uključuje jednu ili više CH1, zglobnih, CH2, CH3, i/ili CH4regija teškog lanac, po potrebi.

[0105]Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo može da se izabere iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa, uključujući Igd, lgG2, lgG3, lgG4, IgAii lgA2. Na primer, konstantni domen može da bude dopuna pričvršćivanju konstantnog domena gde je poželjno da humanizovano antitelo ispolji citotoksičnu aktivnost, i izotip je tipično IgGi. Gde je citotoksična aktivnost poželjna, konstantni domen može da bude na drugom izotipu, npr., lgG2. Alternativno humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo može da obuhvata sekvence iz višeod jedne klase imunoglobulina ili izotipa, i odabir određenih konstantnih domena za optimiziranje željenih efektorskih funkcija je poznato stručnjaku. U određenim ostvarenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja su IgGiantitela i određenije, koja su IgGl antitela u kojima postoji knock-out efektorskih funkcija.

[0106]FR-ovi i CDR-ovi, ili HVL-ovi, humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela ne moraju precizno da odgovaraju matičnim sekvencama. Na primer, jedan ili više ostataka u unosu CDR, ili HVL, ili konsenzus ili sekvenca germinativne linije FR može da bude izmenjena (npr., mutirana) supstitucijom, insercijom ili delecijom tako da rezultujući ostatak aminokiseline nije više identičan originalnom ostatku na odgovarajućoj poziciji u bilo kojoj matičnoj sekvenci, ali antitelo ipak zadržava funkciju vezivanja za IL-23pl9. Takva promena obično neće biti ekstenzivna i biće konzervativne alteracije. Obično, najmanje 75% ostataka humanizovanog antitela biće u vezi sa onim matičnim konsenzus ili sekvence germinativne linije FR i unete CDR, češće najmanje 90%, i najčešće više od 95%, ili više od 98% ili više od 99%.

[0107]Ostaci imunoglobulina koji utiču na povezivanje između varijabilnih regija teškog i lakog lanca ("VL-VHpovezivanje") su oni koji utiču na blizinu ili orjentaciju dva lanca u odnosu jedan prema drugom. Određeni ostaci koji modu da budu uključeni u interlančane interakcije uključuju VLostatke 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, i 98 i VHostatke 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95,100, i 103 (koristeći sistem numerisanja koji je naveden u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). U.S. Pat. Br. 6,407,213 takođe opisuje da ostaci kao što su VLostaci 43 i 85, i VHostaci 43 i 60 takođe mogu da budu uključeni u ovu interakciju. Dok su ovi ostaci naznačeni za humani IgG samo, primenljivi su za razne vrste. Važni ostaci antitela za koje se sa razlogom očekuje da su uključeni u unutarlančane interakcije izabrani su za supstituciju u konsenzus sekvenci.

[0108]Pojmovi "konsenzus sekvenca" i "konsenzus antitelo" odnose se na sekvencu aminokiseline koja obuhvata aminokiselinski ostatak koji se najčešće javlja na svakoj lokaciji u svim imunoglobulinima bilo koje posebne klase, izotipa, ili subjedinične strukture, npr., varijabilni domen humanog imunoglobulina. Konsenzus sekvenca može da se zasniva na imunoglobulinima posebne vrste ili mnogih vrsta. "Konsenzus" sekvenca, struktura ili antitelo razume se da obuhvata konsenzus humanu sekvencu kao što je opisano u određenim ostvarenjima, i da se odnosi na sekvencu aminokiseline koja obuhvata aminokiselinske ostatke koji se najčešće javljaju na svakoj lokaciji u svim humanim imunoglobulinima bilo koje posebne klase, izotipa, ili subjedinične strukture. Na ovaj način, konsenzus sekvenca sadrži sekvencu aminokiseline koja ima na svakom položaju aminokiselinu koja je prisutna u jednom ili više poznatih imunoglobulina, ali koja ne mora baš da duplira celu sekvencu aminokiseline bilo kog jedinstvenog imunoglobulina. Konsenzus sekvenca varijabilne regije ne dobija se iz nekog prirodno proizvedenog antitela ili imunoglobulina. Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., and variants thereof. FR-ovi konsenzus sekvenci teškog i lakog lanca, i njihove varijante, obezbeđuju korisne sekvence za pripremanje humanizovanih anti-IL-23pl9 antitela. Videti, na primer, U.S. Pat. Br. 6,037,454 i 6,054,297.

[0109]Humane sekvence germinativne linije pronađene su prirodno u humanoj populaciji. Kombinacija tih gena germinativne linije stvara raznovrsnost antitela. Sekvence germinativne linije antitela za laki lanac antitela potiču od čuvane humane germinativne linije, kapa ili lambda v-gena i j-gena. Slično sekvence teškog lanca potiču od v-, d- i j-gena germinativne linije (LeFranc, M-P, i LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).

[0110]Kako što se ovde koriste, "varijanta", "anti- IL-23pl9 varijanta", "humanizovana anti-IL-23pl9 varijanta", ili "varijanta humanizovanog anti- IL-23pl9" odnosi se svako na humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo koje ima najmanje varijabilni mišji CDR lakog lanca od bilo koje od sekvenci koje su prikazane u Tabeli 1 ili mišju CDR sekvencu teškog lanca izvedenu iz mišjeg monoklonskog antitela kao što je prikazano u Tabeli 2. Varijante uključuju one koje imaju jednu ili više izmena aminokiseline u varijabilnim domenima jednog ili oba lakog i teškog lanca, obezbeđujući da izmena aminokiseline supstancijalno ne pogorša supstancijalno vezivanje antitela za IL-23pl9. Primerna humanizovana antitela proizvedena ovde uključuju one konstruisane kao Antitelo A, Antitelo B, Antitelo C i Antitelo D, i različite lake lance i teške lance istih prikazani u SEQ ID No:174 i 180, i SEQ ID No:176 i 178, respektivno.

[0111]"Izolovano" antitelo je jedno koje je identifikovano i izdvojeno i/ili izolovano iz komponente njegovog prirodnog okruženja . Kontaminirajuće komponente prirodnog okruženja antitela su oni materijali koji mogu da smetaju pri dijagnostičkim ili terapeutskim upotrebama antitela, i mogu da budu enzimi, hormoni, ili druge proteinske ili neproteinske rastvorne supstance. U jednom aspektu, antitelo biće prečišćeno do najmanje više od 95 mas.% izolacije antitela.

[0112]Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija u kojima se proizvodi, budući da najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično međutim, izolovano antitelo biće pripremljeno u najmanje jednoj fazi prečišćavanja u kojoj se uklanja rekombinantni ćelijski materijal.

[0113]Pojam "performansa antitela" odnosi se na faktore koji doprinose da antitelo prepozna antigen ili efektivnosti antitela in vivo. Izmene u sekvenci aminokiseline antitela mogu da utiču na svojstva antitela kao što je slaganje, i može da utiče na fizičke faktore kao što je početna brzina vezivanja antitela za antigen (ka), konstanta disocijacije antitela od antigena (kd), konstanta afiniteta antitela za antigen (Kd), konformacija antitela, stabilnost proteina, i poluživot antitela.

[0114]Pojam "označen epitop" kada se ovde koristi, odnosi se na anti-IL-23pl9 antitelo spojeno sa "oznaka epitopa". "oznaka epitopa" je polipeptid koji ima dovoljan broj aminokiselina da obezbedi epitop za proizvodnju antitela, ipak je dizajniran tako da ne utiče na željenu aktivnost humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela. Oznaka epitopa je obično prilično jedinstven tako da antitelo dobijeno prema tagu epitopa supstancijalno ne reaguje unakrsno sa drugim epitopima. Pogodni oznaka polipeptida uopšteno sadrži najmanje 6 aminokiselinskih ostataka i obično sadrži oko 8 do 50 aminokiselinskih ostataka, ili oko 9 do 30 ostataka. Primeri oznaka epitopa i antitela koji vezuje epitop uključuju influencu HA oznaka.polipeptida i njegovo antitelo 12CA5 (Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165; c-myc oznaka i 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 njegova antitela (Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616; i Herpes simplex virusna oznaka glikoproteina D (gD) i njegova antitela (Paborskv et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). U određenim ostvarenjima, oznaka epitopa je "popravljanje receptora vezivanjem epitopa". Kao što se ovde koristi, pojam "popravljanje receptora vezivanjem epitopa" odnosi se na epitop Fc regije IgG molekula (kao što su IgGi, lgG2, lgG3ili lgG4) koji je odgovoran za povećanje in vivo poluživota IgG molekula u serumu.

[0115]U nekim ostvarenjima, antitela ovog pronalaska mogu biti konjugovani sa citotoksičnim agensom. To je bilo koja supstanca koja inhibira ili sprečava funkciju ćelije i/ili uzrokuje destrukciju ćelija. Pojam je namenjen da uključi radioaktivne izotope (kao što su I<131>,1<125>, Y<90>i Re<186>), hemoterapeutske agense, i toksine kao što su enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, i njihove fragmente. Takvi citotoksični agensi mogu da budu spojeni sa humanizovanim antitelima ovog pronalaska korišćenjem standardnih postupaka, i korišćenjem, na primer, za tretiranje pacijenta kome je određena terapija sa antitelom.

[0116]"Hemoterapeutski agens" je hemijsko jedinjenje korisno u tretiranju kancera. Postoje brojni primeri hemoterapeutskih agensa koji mogu da se konjuguju sa terapeutskim antitelima ovog pronalaska. Primeri takvih hemoterapeutskih agensa uključuju alkilirajuće agense kao što su tiotepa i ciklofosfamid; alkilsulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbohion, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analogni topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući svoj adozelesin, carzelesin i bizelesin sintetičke analoge); kriptoficine (naročito" kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin, auristatine, (uključujući analogni monometil-auristatin E i monometil-auristatin F); duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktiin; spongistatin; azotni iperiti kao što su hlorambucil, hlomafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin; trofosfamid, uramustin; nitrosuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su enediin antibiotici (npr., kaliheamicin, naročito kalihemicin gamall i kaliheamicin phill, videti na primer, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186; dinemicin, uključujući dinemicin A; bisfosfonate, poput klodronat; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodni hromoprotein enediin antibiotik hromomofor), aklacinomizin, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, cactinomicin, carabicin, caminomicin, carzinofilin, hromomicine, dactinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (Adriamvcin™) (uključujući morfolino-doksorubicin, cianomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubucin, ezorubicin, idarubicin, markelomicin, mitomicine kao što su mitomicin C, mikofenolne kiseline, nogalamicin, olivomicin, peplomicin, potfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što su calusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenaline kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavlječe folne kiseline kao što je frolinilna kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsacrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; democolcin; diazihion; elfomitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; maitansinoide kao što su maitansin i ansamitocini; mitoguazon, mitoksantron; mopidamol; nitracrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK<®>; razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazihion; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; trihotecene (naročito T-2 toksin, veracurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitabronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoide, npr., paklitaksel (TAXOL<®>, Bristol-Myers Squibb Oncologv, Princeton, NJ.) i doksetaksel (TAXOTERE<®>, Rhone-Poulenc Rorer, Antonv, France); hlorambucil; gemcitabin (Gemzar™); 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platine kao što su cisplatin i carboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin Navelbine™); novantron; teniposid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitortopoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinoinska kiselina; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline, ili derivate bilo čega gore. U ovu definiciju takođe su uključeni anti-hormonalni agensi čije je uloga da regulišu ili inhibiraju hormonsku akciju na tumore kao što su anti-estrogeni i selektivni modulatori estrogenih receptora (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući Nolvadex™), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen; keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (Fareston™); inhibitore aromataza koji inhibiraju enzim aromatazu, koja reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, megestrol acetat (Megace™), eksemestan, formestan, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™) i anastrozol (Arimidex™); i anti-androgene kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kojih gore. Bilo jedan ili više ovih agenasa mogu da se konjuguju sa humanizovanim antitelima ovog pronalaska da bi obezbedili koristan terapeutski agens za tretiranje raznih poremećaja.

[0117]Antitela takođe mogu da budu konjugovani sa conjugated sa prolekovima. "Prolek" je prekursorni ili derivatni oblik farmaceutski aktivne supstance koja je manje citotoksična za tumorne ćelije u poređenju sa matičnim lekom i može biti enzimski aktiviran ili konvertovan u aktivniji oblik. Videti, na primer, Wilman, 1986," Prodrugs in Cancer Chemotherapv", In Biochemical Societv Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella et al., 1985,"Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Deliverv, In: "Directed Drug Deliverv, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press. Korisni prolekovi uključuju, ali ne ograničavaju se na, prolekove koji sadrže fosfat, prolekovi koji sadrže tiofosfat, prolekove koji sadrže sulfat prolekove koji sadrže peptide, D-aminokiselinski-modifikovane prolekove, glikozilovane prolekove, p-laktam-sadržavajuće prolekove, opciono supstituisane fenoksiacetamid-sadržavajuće prolekove, i opciono supstituisane fenilacetamid-sadržavajuće prolekove, 5-fluorocitozin i druge 5-fluorouridin prolekove koji mogu da se konvertuju u aktivniji citotoksični slobodni lek. Primeri citotoksičnih lekova koji se mogu derivatizovati u obliku proleka uključuju, ali ne ograničavaju se na, one hemoterapeutske agense koji su prethodno opisani.

[0118]Za dijagnostičke kao i za terapeutske svrhe kontrolisanja, antitela ovog pronalaska takođe mogu da se konjuguju sa oznakom, ili sa samom oznakom ili sa oznakom i dodatnim drugim agensom (prolek, hemoterapeutski agens i slično). Oznaka, za razliku od ostalih drugih agensa odnosi se na agens koji je detektabilno jedinjenje ili kompozicija i može da se konjuguje direktno ili indirektno za humanizovano antitelo ovog pronalaska. Oznaka može sama da bude detektabilna (npr., radioizotopne oznake ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimske oznake, može da katalizuje hemijsku alternaciju jedinjenja supstrata ili kompozicije koja je detektabilna. Označeno humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo može da se pripremi i koristi u različitim aplikacijama uključujući in vitro i in vivo dijagnostiku.

[0119]Antitela ovog pronalaska mogu da se formulišu kao deo lipozomalnog preparata koji utiču na njegovu dostavu in vivo. "Lipozom" je mali nosač koji se sastoji od različitih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanata. Lipozomi su korisni za dostavu jedinjenja ili formulacije u sisare, kao što je humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo opisano ovde, opciono, spojeno ili u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski aktivnih agensima i/ili oznakama. Komponente lipozoma su obično raspoređene u dvoslojne formacije, slično lipidnom rasporedu kod biloloških membrana.

[0120]Određeni aspekti ovog pronalaska odnose se na izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više domena humanizovanih antitela ovog pronalaska. "Izolovani" molekul nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i izdvojen iz najmanje jednog kontaminanta molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično asociran u prirodnom izvoru nukleinske kiseline antitela. Izolovani molekul nukleinske kiseline razlikuje se od molekula nukleinske kiseline kao koji postoji u prirodnim ćelijama.

[0121]U različitim aspektima ovog otkrića jedan ili više domena humanizovanih antitela biće rekombinantno eksprimirana. Takva rekombinantna ekspresija može da uposli jednu ili više kontrolnih sekvenci, tj., polinukleotidnih sekvenci koje su potrebne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina. Kontrolne sekvence pogodne za upotrebu u prokariotskim ćelijama uključuju, na primer, sekvence promotera, operatora i vezujućeg mesta ribozoma. Eukariotske kontrolne sekvence uključuju, ali ne ograničavaju se na, promotere, poliadenilacione signale i pojačivače. Ove kontrolne sekvence mogu se koristiti za ekspresiju i proizvodnju humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela u prokariotskim i eukariotskim ćelijama domaćina.

[0122]Sekvenca nukleinske kiselie je "operativno vezana" kada je stavljena u funkcionalnu vezu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, presekvenca nukleinske kiseline ili sekretorni lider je operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid ako je eksprimiran kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili vezujuće mesto ribozoma je operativno povezno sa kodirajućom sekvencom ako je postavljen tako da olakšava translaciju. Uopšteno, "operativno vezana" znači da su DNK sekvence vezane susedno, i, u slučaju sekretornog lidera, susedno i u čitajućem okviru. Međutim, pojačivači su opciono susedni. Vezivanje može da se postigne ligacijom na prikladnim restrikcionim mestima. Ukoliko takva mesta ne postoje, mogu da se koriste sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri.

[0123]Kao što se ovde koristi, izrazi "ćelija", "ćelijska linija" i "ćelijska kultura" koriste se naizmenično i sve te oznake uključuju njihovo potomstvo. Ovako, "transformanti" i "taransformisane ćelije" uključuju primarnu ćeliju subjekta i kulture izvedene iz toga bez obzira na broj transfera.

[0124]Pojam "sisar" za svrhe tretiranja odnosi se na bilo koju životinju klasifikovanu kao sisar, uključujući i ljude, domaće i seoske životinje, i životinje iz zološkog vrta, za sport ili kućni ljubimci, kao što su psi, konji, mačke, krave i slično. Poželjno, sisar je čovek.

[0125]"Poremećaj", koji se ovde koristi, je bilo koje stanje koje će da ima koristi od tretiranja sa humanizovanim anti-IL-23pl9 antitelom opisanim ovde. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara do poremećaja koji je u pitanju. Ne-limitirajući primeri ili poremećaji koji se tretiraju ovde uključuju inflamatorne, angiogenske, autoimune i imunološke poremećaje, respiratorne poremećaje, kancer, hematološke malignitete, benigne i maligne tumore, leukemije i limfoidne malignitete.

[0126]Pojmovi "kancer" i "kancerogen" odnose se na ili opisuju fizioločko stanje sisara koje je obično okarakterisano neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri kancera uključuju, ali ne ograničavaju se na, karcinome, limfome, blastom, sarkom i leukemiju.

[0127]Kako se ovde koristi, pojam "IL-23-povezani poremećaj" ili "IL-23-povezana bolest" odnosi se na stanje u kojem IL-23 aktivnost doprinosi bolesti i obično gde je IL-23 abnormalno eksprimiran. IL-23-povezani poremećaj uključuje bolesti i poremećaje imunog sistema, kao što su autoimuni poremećaji i inflamatorni poremećaji. Takva stanja uključuju, ali ne ograničavaju se na, reumatoidni artritis (RA), sistemski eritemski lupus (SLE), sklerodermu, Sjogrenov sindrom, multipla sklerozu, psorijazu, psorijazni artritis, zapaljensku bolest creva (npr., ulcerozni kolitis i Kronova bolest), zapaljenje pluća, astmu, idiopatsku trombocitopeničnu pururu (ITP) i ankilozirajući spondilitis;

[0128]Pojam "intravenozna infuzija" odnosi se na uvođenje agensa u venu životinjskog ili humanog pacijenta tokom određenog vremenskog perioda koji je veći od približno 15 minuta, uopšteno između oko 30 do 90 minuta.

[0129]Pojam "intravenozni bolus" ili "intravenozni pritisak" odnosi se na davanje leka u venu životinje ili čoveka tako da telo primi lek za oko 15 minuta ili kraće, uopšteno za 5 minuta ili kraće.

[0130]Pojam "subkutana primena" odnosi se na uvođenje agensa pod kožu životinjskog ili humanog pacijenta, poželjno u džep između kože i potkožnog tkiva, relativno sporim, kontinuiranim dostavljanjem iz posude sa lekom. Džep može da se napravi štipanjem ili povlačenjem kože gore i od potkožnog tkiva.

[0131]Pojam "subkutana infuzija" odnosi se na unošenje leka pod kožu životinjskog ili humanog pacijenta, poželjno u džep između kože i potkožnog tkiva, relativno sporim, kontinuiranim dostavljanjem iz posude sa lekom tokom vremenskog perioda koji uključuje, ali ne ograničavajući se na, 30 minuta ili kraće, ili 90 minuta ili kraće. Opciono, infuzija može da se obavi subkutanom implantacijom pumpe za dostavljenje leka koja se implantira ispod kože životinjskog ili humanog pacijenta, pri čemu pumpa dostavlja predodređenu količinu leka za unupred određen vremenski period, kao što je 30 minuta, 90 minuta, ili vremenski period koji ovuhvata dužinu režima tretiranja.

[0132]Pojam "subkutani bolus" odnosi se na davanje leka ispod kože životinjskog ili humanog pacijenta, gde je dostava leka iz bolusa kraća od oko 15 minuta; U drugom aspektu, kraća od 5 minuta, i u još jednom aspektu, kraća od 60 sekundi. U još jednom drugom aspektu, daje se u džep između kože i potkožnog tkiva, pri čemu se džep može napraviti štipanjem ili povlačenjem kože gore i od potkožnog tkiva.

[0133]Pojam "terapeutski efektivna količina" koristi se za određivanje količine sktivnog agensa koji olakšava ili ublažava jedan ili više simptoma poremećaja koji se tretiraju. U drugom aspektu, terapeutski efektivna količina odnosi se na ciljani koncentraciju seruma koja se pokazala da je efektivna u, na primer, usporavanju progresije bolesti. Efikasnost može da se meri na konvencionalne načine, u zavisnosti od stanja koje treba da se tretira.

[0134]Pojmovi "tretiranje" i "terapija" i slično, koji se koriste ovde, znače da uključuju terapeutske kao i profilaktičke ili supresivne mere za bolest ili poremećaj koji vodi do bilo kog kliničkog, poželjnog ili delotvornog efekta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ublažavanje, ili oslobađanje jednog ili više simptoma, regresiju, usporavanje ili prestanak progresije bolesti ili poremećaja. Ovako, na primer, pojam tretiranje uključuje davanje agensa pre ili nakon pojave simptoma bolesti ili poremećaja i time sprečavajući ili uklanjajući jedan ili više znakova bolesti ili poremećaja. Kao drugi primer, pojam uključuje davanje agensa nakon kliničke manifestacije bolesti za borbu protiv simptoma bolesti. Dalje, davanje agensa nakon pojave i nakon razvoja kliničkih simptoma gde davanje utiče na kliničke parametere bolesti ili poremećaja, tako da stepen oštećenja tkiva ili količina ili razmera metastaze, bez obzira da li tretiranje vodi do ublažavanja bolesti, obuhvata "tretiranje" ili "terapiju" koje se ovde koriste. Štaviše, sve dok kompozicije ovog pronalaska bilo same ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom olakšavaju ili ublažavaju najmanje jedan simptom poremećaja koji se tretira u odnosu na simptom u odsustvu upotrebe kompozicije humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela, rezultat treba posmatrati kao efektivno tretiranje predmetnog poremećaja uprkos tome da li su svi simptomi poremećaja olakšani ili ne.

[0135]Pojam "uputstvo" koristi se da označi instrukcije koje su obično uključene u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenja koja se tiču upotrebe takvih terapeutskih proizvoda.

Antitela

[0136]U jednom aspektu, opisana i otkrivena ovde su anti-IL-23 antitela, naročito humanizovana anti-IL-23pl9 antitela, i kompozicije i proizvodni artikli koji obuhvataju jedno ili više anti-IL-23 antitela, naročito jedno ili više humanizovano anti-IL-23pl9 antitela ovog pronalaska. Takođe opisani su vezujući agensi koji uključuju antigen-vezujući fragment anti-IL-23 antitela, naročito humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo. Humanizovana anti-IL-23pl9 antitela i vezujući agensi mogu da inhibiraju proizvodnju Thl7 povezanih citokina, koji dovode do hroničnih autoimunih i zapaljenskih bolesti. Humanizovana anti-IL-23pl9 antitela i vezujući agensi mogu se tako upotrebiti u tretiranju različitih bolesti ili poremećaja, Svako humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo i IL-23pl9 vezujući agens uključuje najmanje deo koji posebno prepoznaje IL-23pl9 epitop (tj., antigen-vezujući fragment).

[0137]U inicijalnoj karakterizaciji, mišja antitela izabrana su na osnovu karakterizacije IL-23pl9 vezivanja.

[0138]Dakle u jednom aspektu, antitelo ovog otkrića ima KDza IL-23, naročito humani IL-23, manji od lOOpM. U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića ima KDmanji od 40pM. U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića ima KDmanji od 20pM. U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića ima KDmanji od lOpm. U drugom aspektu, monoklonsko antitelo ovog otkrića ima KDmanji od lpM.

[0139]Izabrana mišja antitela imaju sledeće varijabilne regije lakog lanca i varijabilne regije teškog lanca kao što je prikazano u Tabeli 1 i 2:

[0140]Humane okvirne sekvence izabrane su za svaka vodeća mišja na osnovu homologije okvira, strukture CDR, očuvanih kanoničnih ostataka, očuvanih interfejs upakovanih ostataka i drugih parametera.

[0141]Mišji CDR-ovi lakog lanca i teškog lanca različitih mišjih antitela prikazani su u Tabeli 3 i Tabeli 4, respektivno. Tabela 4 takođe prikazuje tri CDR-a teškog lanca izvedena iz mišjeg antitela 6B8 u postupku humanizacije.

[0142]CDR-ovi gore navedeni u Tabelama 3 i 4 određeni su korišćenjem Chothia glomaznog sistema (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948).

[0143]Fab-ovi koji su pokazali bolje ili jednako vezivanje u odnosu na himerni matični Fab izabrani su za konverziju u IgG. 6B8 konvertovan je u IgGIKO format. IgGIKO (knock-out efektornih funkcija) ima dve mutacije u Fc regiji, Leu234Ala i Leu235Ala, koji smanjuje efektornu funkciju kao što je FcyR i vezivanje komplementa. IgG format opisan je u literaturi (videti na primer Hezareh et al. (2001) Journal of Virology 75:12161-12168). Primer 1 opisuje postupak humanizacije dalje detaljno. Rezultati takve humanizacije rezultiraju u sekvencama humanizovanog-antitela. Reprezentativan broj humanizovanih varijabilnih regija lakog lanac i teškog lanca izvedenih iz mišjeg antitela 6B8 obezbeđen je i prikazan u Tabelama 5 i 6. Usklađivanje između humanizovanih varijabilnih regija lakog lanca i teškog lanca izvedenih iz mišjeg antitela 6B8 i lanca i teškog lanca, varijabilne regije iz mišjeg antitela 6B8 prikazano je na Fig. 1.

[0144]Izabrana kombinacija humanizovanih varijabilnih regija lakog lanca i teškog lanca izvedenih iz mišjeg antitela 6B8 rezultira u Antitelima A, B, C i D: Antitelo A: 6B8-lgGlKO-2 sa lgK-66 (varijabilna regija teškog lanca 6B8CVH-02 i varijabilna regija lakog lanca 6B8CVK-66); Antitelo B: 6B8-lgGlKO-5 sa lgK-66 (varijabilna regija teškog lanca 6B8CVH-05 i varijabilna regija lakog lanca 6B8CVK-66); Antitelo C: 6B8-lgGlKO-2 sa lgK-65 (varijabilna regija teškog lanca 6B8CVH-02 i varijabilna regija lakog lanca 6B8CVK-65); Antitelo D: 6B8-lgGlKO-5 sa lgK-65 (varijabilna regija teškog lanca 6B8CVH-05 i varijabilna regija lakog lanca 6B8CVK-65).

[0145]Antitela A, B, C i D imaju sekvence teškog i lakog lanca prikazane u Tabeli 7.

[0146]Varijabilne regije lakog lanca i teškog lanca Antitela A, B, C, i D date su u Tabeli 7 gore.

[0147]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima najmanje jedno od svojstva dole. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima bilo koju kombinaciju od najmanje dva, ili najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, ili 11 svojstva dole. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima sva svojstva dole. • KDza humani IL-23 < 1 pM (nema pomeranja u brzini napredovanja vezivanja u 50% humanom serumu)

• Blokira IL-23 vezivanje za humani IL-23R/Fc in vitro

• Nema vezivanja za humani IL-12

• Inhibira humanim IL-23 indukovanu IL-17 proizvodnju u mišjim splenocitima sa IC50s < 20 pM

• Inhibira humanim IL-23 indukovanu STAT3 fosforilaciju u humanim DB ćelijama sa IC50's < 40 pM

• Nepredviđena aktivnost u ADCC/CDC

• KD <1 pM za IL-23 cinomolgus majmuna

• Nema unakrsne reaktivnosti za IL-23 miša ili pacova

• Inhibira humanim IL-23 indukovanu IL-17 i IL-22 proizvodnju u mišjem uvetu (>80% inhibicije oba citokina pri 1 mg/kg) • Stabilnost 83°C (temperatura topljenja 83°C kako je određeno diferencijalno skenirajućom kalorimetrijom)

• Rastvorljivost > 100 mg/ml (mereno UV spektroskopijom i praćeno zamućenjem)

• Subkutana primena 1,0 mg/kg u tri cinomolgus majmuna pokazuje kontinuirano > 10 nM izlaganje za oko 28 dana sa bioraspoloživošću od oko 70%.

[0148]Pod nepredviđenom aktivnošću u ADCC/DC, ovde se smatra da humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog pronalaska ima smanjeni afinitet za Fc receptor i stoga je predviđeno da nema aktivnost u

ADCC/CDC.

[0149]U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima najmanje jedno od svojstva dole. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima bilo koju kombinaciju od najmanje dva, ili najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 svojstva dole. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima sva svojstva dole. • KDza humani IL-23 < 1 pM (nema pomeranja u brzini napredovanja vezivanja u 50% humanom serumu)

• Blokira IL-23 vezivanje za humani IL-23R/Fc in vitro

• Nema vezivanja za humani IL-12

• Inhibira humanim IL-23 indukovanu IL-17 proizvodnju u mišjim splenocitima sa IC50's < 20 pM

• Inhibira humanim IL-23 indukovanu STAT3 fosforilaciju u humanim DB ćelijima sa IC50's < 40 pM

• Nepredviđena aktivnost u ADCC/CDC

• KD <1 pM za IL-23 cinomolgus majmuna

• Nema unakrsne reaktivnosti IL-23 miša ili pacova

• Inhibira humanim IL-23 indukovanu IL-17 i IL-22 proizvodnju u mišjem uvetu (>80% inhibicije oba citokina pri 1 mg/kg) • Stabilnost 83°C (temperatura topljenja 83°C kako je određeno diferencijalno skenirajućom kalorimetrijom)

• Rastvorljivost > 100 mg/ml (mereno UV spektroskopijom i praćeno zamućenjem).

[0150]U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića ima najmanje jedno od sledećih vezujućih svojstva (svojstva A). U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima bilo koju kombinaciju od najmanje dva, ili najmanje 3, svojstva dole. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima sva svojstva dole. • KDza humani IL-23 < 1 pM (nema pomeranja u brzini napredovanja vezivanja u 50% humanom serumu)

• Nema vezivanja za humani IL-12

• KD < 1 pM za IL-23 cinomolgus majmuna

• Nema unakrsne reaktivnosti za IL-23 miša ili pacova.

[0151]Naročito, humanizovano antitelo ovog otkrića ima KDza humani IL-23 < 1 pM (nema pomeranja u brzini napredovanja vezivanja u 50% humanom serumu) i nema vezivanja za humani IL-12.

[0152]U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića ima najmanje jedno od sledećih funkcionalnih svojstva (svojstva B). U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima bilo koju kombinaciju od najmanje dva, ili najmanje 3, svojstva dole. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima sva svojstva dole.

• Blokira IL-23 vezivanje za humani IL-23R/Fc in vitro

• Inhibira humanim IL-23 indukovanu IL-17 proizvodnju u mišjim splenocitima sa IC50's < 20 pM

• Inhibira humanim IL-23 indukovanu STAT3 fosforilaciju u humanim DB ćelijama sa IC56's < 40 pM • Inhibira humanim IL-23 indukovanu IL-17 i IL-22 proizvodnju u mišjem uvetu (>80% inhibicije oba citokina pri 1 mg/kg).

[0153]U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića ima najmanje jedno od sledećih svojstva (svojstva C). U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima bilo koju kombinaciju od najmanje dva, ili najmanje 3, svojstva dole. U daljem aspektu, humanizovano Anti-IL-23019 antitelo ovog pronalaska ima sva svojstva dole.

• Nepredviđena aktivnost u ADCC/CDC

• Stabilnost 83°C (temperatura topljenja 83°C kako je određeno diferencijalno skenirajućom kalorimetrijom)

• Rastvorljivost > 100 mg/ml (mereno UV spektroskopijom i praćeno zamućenjem)

• Subkutana primena 1,0 mg/kg u tri cinomolgus majmuna pokazuje kontinuirano > 10 nM izlaganje za oko 28 dana sa bioraspoloživošću od oko 70%.

[0154]U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića ima najmanje jedno od sledećih svojstva (svojstva C). U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog otkrića ima bilo koju kombinaciju od najmanje dva svojstva dole. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog pronalaska ima sva svojstva dole.

• Nepredviđena aktivnost u ADCC/CDC

• Stabilnost 83°C (temperatura topljenja 83°C kako je određeno diferencijalno skenirajućom kalorimetrijom)

• Rastvorljivost > 100 mg/ml (mereno UV spektroskopijom i praćeno zamućenjem).

[0155]U daljem aspektu, humanizovano antitelo ovog otkrića ima najmanje jedno svojstvo A, najmanje jedno svojstvo B i najmanje jedno svojstvo C. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog pronalaska ima bilo koju kombinaciju od najmanje dva, ili najmanje 3, svojstva A, B i C.

[0156]U nekim aspektima, humanizovano antitelo pokazuje blokiranje aktivnosti, čime smanjuje vezivanje IL-23 za IL-23 receptor za najmanje 45%, za najmanje 50%; za najmanje 55%, za najmanje 60%, za najmanje 65%, za najmanje 70%, za najmanje 75%, za najmanje 80%, za najmanje 85%, za najmanje 90%, ili za najmanje 95%. Sposobnost antitela da blokira vezivanje IL-23 za IL-23 receptor može da se meri korišćenjem sklopova kompetitivnog vezivanja koji su poznati stručnjaku. Alternativno, blokiranje aktivnosti antitela može da se meri ocenjivanjem bioloških efekata IL-23, kao što je proizvodnja IL-17 i IL-22 da bi se utvrdilo da li je inhibirana signalizacija koja je posredovana IL-23 receptorom.

[0157]U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo kojee ima povoljna biofizička svojstva. U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog pronalaska prisutno je u najmanje 90% monomernom obliku, ili u najmanje 92% monomernom obliku, ili u najmanje 95% monomernom obliku u puferu. U daljem aspektu, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ovog pronalaska ostaje u najmanje 90% monomernom obliku, ili u najmanje 92% monomernom obliku, ili u najmanje 95% monomernom obliku u puferu jedan mesec ili četiri meseca.

[0158]U jednom aspektu, humanizovano antitelo ovog pronalaska je Antitelo A, Antitelo B, Antitelo C ili Antitelo D. Prema tome, u jednom ostvarenju, humanizovano antitelo ovog pronalaska obuhvata laki lanac sekvence SEQ ID NO:174 i težak lanac sekvence SEQ ID NO:176 (Antitelo A). U drugom ostvarenju, humanizovano antitelo ovog pronalaska obuhvata laki lanac sekvence SEQ ID NO:174 i težak lanac sekvence SEQ ID NO:178 (Antitelo B). U drugom ostvarenju, humanizovano antitelo ovog pronalaska obuhvata laki lanac sekvence SEQ ID NO:180 i težak lanac sekvence SEQ ID NO:176 (Antitelo C). U drugom ostvarenju, humanizovano antitelo ovog pronalaska obuhvata laki lanac sekvence SEQ ID NO:180 i težak lanac sekvence SEQ ID NO:178 (Antitelo D).

[0159]U daljem ostvarenju, humanizovano antitelo ovog pronalaska sastoji se od lakog lanca sekvence SEQ ID NO:174 i teškog lanca sekvence SEQ ID NO:176 (Antitelo A). U daljem ostvarenju, humanizovano antitelo ovog pronalaska sastoji se od lakog lanca sekvence SEQ ID NO:174 i teškog lanca sekvence SEQ ID NO:178 (Antitelo B). U daljem ostvarenju, humanizovano antitelo ovog pronalaska sastoji se od lakog lanca sekvence SEQ ID NO:180 i teškog lanca sekvence SEQ ID NO:176 (Antitelo C). U daljem ostvarenju, humanizovano antitelo ovog pronalaska sastoji se od lakog lanca sekvence SEQ ID NO:180 i teškog lanca sekvence SEQ ID NO:178 (Antitelo D).

[0160]U nekim ostvarenjima, humanizovano anti-IL-23pl9 antitela, uključujući njegov antigen-vezujući fragmenti, kao što su varijabilne regije teškog i lakog lanca, obuhvata sekvencu aminokiseline ostataka izvedenih iz Antitela A (sekvenca lakog lanca = SEQ ID NO:174; sekvenca teškog lanca = SEQ ID NO:176), Antitela B (sekvenca lakog lanca = SEQ ID NO:174; sekvenca teškog lanca = SEQ ID N0:178), Antitela C (sekvenca lakog lanca = SEQ ID NO:180; sekvenca teškog lanca = (SEQ ID NO:176) ili Antitela D (sekvenca lakog lanca = SEQ ID NO:180; sekvenca teškog lanca = SEQ ID NO:178).

[0161]U daljem ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za humani IL-23pl9 na epitopu koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka 108 do 126 i aminokiselinskih ostataka 137 do 151 od SEQ ID NO: 181.

[0162]U daljem ostvarenju, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se kompetitivno vezuje za humani IL-23pl9 sa antitelom ovog pronalaska, na primer Antitelo A, Antitelo B, Antitelo C ili Antitelo D koji su ovde opisani. Sposobnost antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta da se kompetitivno vežu za IL-23pl9 može da se izmeri korišćenjem sklopova kompetitivnog vezivanja koji su poznati stručnjaku.

[0163]Humanizovana anti-IL-23pl9 antitela opciono uključuju specifične supstitucije aminokiselina u konsenzusnim ili germlinijskim okvirnim regijama. Specifična supstitucija aminokiselinskih ostataka u ovim okvirnim pozicijama može da poboljša različite aspekte performanse antitela uključujući afinitet i/ili stabilnost vezivanja, što je pokazano u humanizovanim antitelima koja su formirana "direktnom razmenom" CDR-ova ili HVL-ova u humanim germlinijskim okvirnim regijjama.

[0164]U nekim ostvarenjima, ovo otkriće opisuje druga monoklonska antitela sa varijabilnom regijom lakog lanca koja ima sekvencu aminokiseline navedenu u SEQ ID NO: 84, 86,88,90, 91, 93, 95, 97, 99, 101,103,105,107,109,111,113,115,117 ili 119. U nekim ostvarenjima, ovaj pronalazak opisuje druga monoklonska antitela sa varijabilnom regijom teškog lanca koji ima sekvencu aminokiseline navedenu u SEQ ID NO: 121, 123,125,127, 128,130, 132, 134,136, 138, 140, 142, 144,146,148,150,152, 154 ili 156 (videti Tabele 1 i 2 gore). CDR sekvenca ovih mišjih antitela prikazane su u Tabelama 3 i 4. Stavljajući takve CDR-ove u FR-ove humanih konsenzusnih varijabilnih domena teškog i lakog lanca dobiđe se korisna humanizovana antitela ovog pronalaska.

[0165]Naročito, ovo otkriće obezbeđuje monoklonska antitela sa kombinacijama varijabilnih regija lakog lanca i varijabilnih regija teškog lanca od SEQ ID NO:84/121, 86/123, 88/125, 90/127, 91/128, 93/130, 95/132, 97/134, 99/136, 101/138,103/140,105/142, 107/144,109/146, 111/148, 113/150, 115/152,117/154 ili 119/156. Takve varijabilne regije mogu da se kombinuju sa humanim konstantnim regijama.

[0166]U nekim ostvarenjima, ovo otkriće opisuje druga humanizovana antitela sa sekvencama varijabilne regije lakog lanca koja ima sekvencu aminokiseline navedenu u SEQ ID NO:158,160,162 ili 164. U nekim ostvarenjima, ovo otkriće opisuje druga humanizovana antitela sa sekvencama varijabilne regije teškog lanca koja ima sekvencu aminokiseline navedenu u SEQ ID NO:166,168,170 ili 172 (videti Tabele 5 i 6 gore). CDR sekvence ovih antitela prikazane su u Tabelama 3 i 4. Naročito, ovaj pronalazak obezbeđuje monoklonska antitela sa kombinacijama varijabilnih regija lakog lanca i teškog lanca od SEQ ID NO: 160/166,160/168,158/166 ili 158/168. Takve varijabilne regije mogu da se kombinuju sa humanim konstantnim regijama.

[0167]U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak odnosi se na anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR-ove od SEQ ID NO:160 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena lakog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:160 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR-ove od SEQ ID NO:166 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena teškog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:166. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo.

[0168]U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak odnosi se na anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata humanizovano varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR-ove od SEQ ID NO:160 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena lakog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:160 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR-ove od SEQ ID NO:168 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena teškog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:168. U jednom ostvarenju, anti-LL=23pl9antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo.

[0169]U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak odnosi se na anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR-ove od SEQ ID NO:158 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena lakog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:158 i humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR-ove od SEQ ID NO:166 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena teškog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:166. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo.

[0170]U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak odnosi se na anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata humanizovano varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR-ove od SEQ ID NO:158 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena lakog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:158 i humanizovano varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR-ove od SEQ ID NO:168 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu, najmanje 93% identičnu ili najmanje 95% identičnu sekvenci aminokiseline okvirnih regija varijabilnog domena teškog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:168. U jednom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo.

[0171]U nekim posebnim ostvarenjima, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo opisano ovde obuhvata najmanje varijabilni domen teškog ili lakog lanca koji obuhvata CDR-ove ili HVL-ove mišjih monoklonskih antitela ili humanizovana antitela kao što je prethodno prikazano u Tabelama 1 do 6 i FR-ove humanih varijabilnih domena teškog i lakog lanca germinativne linije.

[0172]CDR-ovi ovih sekvenci prikazani su u Tabelama 3 i 4. Prema tome, u jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata laki lanac CDR1 (L-CDR1) sekvence SEQ ID NO:l, 4, 6, 7, 8,11,15,18,19, 22, 27 ili 30; laki lanac CDR2 (L-CDR2) sekvence SEQ ID NO:2, 5, 9,12,16, 20, 23, 25, 28 ili 31; laki lanac CDR3 (L-CDR3) sekvence SEQ ID NO:3,10,13,14, 17, 21, 24, 26, 29, ili 32; težak lanac CDR1 (H-CDR1) sekvence SEQ ID NO:33, 36, 38, 40, 43, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 67, 68, 69, 77 ili 80; težak lanac CDR2 (H-CDR2) sekvence SEQJD NO:34, 39, 41, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 70, 72, 73, 75, 78 ili 81; i težak lanac CDR3 (H-CDR3) sekvence SEQ ID NO:35, 37, 42, 44,47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 71, 74, 76, 79 ili 82. U jednom aspektu, ahti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata gore navedeno L-CDR1, gore navedeno L-CDR2 i gore navedeno L-CDR3, i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata gore navedeno H-CDR1, gore navedeno H-CDR2 i gore navedeno H-CDR3.

[0173]U daljem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata: a) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:l, 2, 3, 33, 34, i 35, respektivno; ili b) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:4, 5, 3, 36, 34 i 37, respektivno; ili c) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:l, 2, 3, 38, 39 i 35, respektivno; ili d) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:6, 2, 3, 40, 41 i 42, respektivno; ili e) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:7, 2, 3, 43, 41 i 44, respektivno; ili f) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:8, 9, 10, 45, 46 i 47, respektivno; ili g) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:8, 9,10, 48, 49 i 50, respektivno; ili, h) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:ll,12,13, 51, 52 i 53, respektivno; ili

i) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:7, 2,14, 54, 55 i 56, respektivno; ili

j) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:15,16,17, 57, 58 i 59, respektivno; ili

k) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:18, 16, 17, 60, 61 i 62, respektivno; ili

I) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID N0:19, 20, 21, 63, 66, 67 ili 68, 64 i 65, respektivno;

ili

m) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:22, 23, 24, 69, 70 i 71, respektivno; ili

n) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:22, 25, 26, 55, 72 i 71, respektivno; ili

o) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:8, 9, 10, 45, 73 i 74, respektivno; ili

p) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:27, 28, 29, 45, 75 i 76, respektivno; ili

q) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:8, 9, 10, 77, 78 i 79, respektivno; ili

r) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO:30, 31, 32, 80, 81 i 82, respektivno.

[0174]U jednom aspektu, anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata kombinaciju L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3 gore navedenih, i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata kombinaciju H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 gore navedenih.

[0175]U posebnim ostvarenjima, smatra se da himerna antitela sa uključenim CDR regijama (tj., na primer uključivanje jednog ili dva CDR-ova jednog od mišjih antitela ili humanizovanog antitela izvedenog otuda sa analognim CDR iz drugog mišjeg antitela ili humanizovanog antitela izvedenog otuda) između ovih primernih imunoglobulina mogu da daju korisna antitela.

[0176]U određenim ostvarenjima, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo je fragment antitela. Različiti fragmenti antitela uopšteno su opisani gore i postoje postupci koji su razvijeni za proizvodnju fragmenata antitela. Fragmenti mogu da se izvedu preko proteolitičke digestije netaknutog antitela (videti, npr., Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophvsical Methods 24:107-117; i Brennan et al., 1985, Science 229:81). Alternativno, fragmenti mogu direktno da se proizvedu u rekombinantnim ćelijama domaćina. Na primer, Fab'-SH fragmenti mogu da se direktno izoluju iz E. coli i hemijski spoje radi formiranja F(ab')2fragmenata (videti, npr., Čarter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167). Drugim pristupom, F(ab')2fragmenti mogu direktno da se izoluju iz rekombinantne ćelijske kulture domaćina. Drugi postupci za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledni stručnjaku. Prema tome, u jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje fragmente antitela koji obuhvataju CDR-ove opisane ovde, naročito jednu od kombinacija L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 opisanih ovde. U daljem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje fragmente antitela koja obuhvataju varijabilne regije opisane ovde, na primer jedna od kombinacija varijabilnih regija lakog lanca i varijabilnih regija teškog lanca opisanih ovde.

[0177]Određena ostvarenja uključuju F(ab')2 fragment humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela obuhvatajući sekvencu lakog lanca bilo koju od SEQ ID NO: 174 ili 180 u kombinaciji sa sekvencom teškog lanca SEQ ID NO: 176 ili 178. Takva ostvarenja mogu da uključuju netaknuto antitelo koje obuhvata takvo F(ab')2.

[0178]U nekim ostvarenjima, antitelo ili fragment antitela uključuje konstantnu regiju koja posreduje efektornu funkciju. Konstantna regija može da obezbedi ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP) i/ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) odgovore na IL-23 eksprimirajuću ciljnu ćeliju. Efektorni domen(i) mogu da budu, na primer, Fc regija Ig molekula.

[0179]Efektorni domen antitela može da bude iz bilo kojih pogodnih životinjskih vrsta i izotipova kičmenjaka. Izotipovi iz različitih životinjskih vrsta razlikuju se u sposobnostima da posreduju efektorne funkcije. Na primer, sposobnost humanog imunoglobulina da posreduje CDC i ADCC/ADCP je uopšteno prema redosledu od lgM=lgGi=lgG3>lgG2>lgG4 i lgG1=lgG3>lgG2/lgM/lgG4, respektivno. Mišji imunoglobulini posreduju CDC i ADCC/ADCP uopšteno prema redosledu od mišjih IGM=lgG3»lgG2b>lgG2a»lgGi i lgG2b>lgG2a>lgGi»lgG3, respektivno. U drugom primeru, mišji lgG2aposreduje ADCC dok oba mišja lgG2ai IgM posreduju CDC.

Modifikacije antitela

[0180]Humanizovana anti-IL-23pl9 antitela i agensi mogu da uključuju modifikacije humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Na primer, može da bude poželjno da se modifikuje antitelo u odnosu na efektornu funkciju, tako da se poboljša efektivnost antitela u tretiranju kancera. Takva jedna modifikacija je uvod ostatka(a) cisteina u Fc regiju, time omogućavajući interlančano disulfidno vezanu formaciju u ovoj regiji. Homodimerno antitelo tako generisano može da ima poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećano ćelijsko ubijanje posredovano komplementom i/ili ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Videti, na primer, Caron et al., 1992, J. Exp Med.

176:1191-1195; i Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922. Homodimerna antitela koja imaju pojačanu anti-tumornu aktivnost mogu takođe da se pripreme korišćenjem heterobifunkcionalnih kroslinkera kao što je opisano u Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565. Alternativno, antitelo može da bude konstruisano tako da sadrži dualne Fc regije, pojačanu lizu komplementa i ADCC sposobnosti antitela. Videti Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Lek Design 3: 219-230.

[0181]Antitela sa poboljšanom sposobnošću da podrže ADCC generisana su modifikacijom obrazca glikolizacije njihove Fc regije. Ovo je moguće, budući daje glikolizacija antitela na ostatku asparagina, N297, u CH2domenu uključena u interakciju između IgG i Fcv receptora koji su preduslov za ADCC. Ćelijske linije domaćina konstruisane su da izraze antitela sa izmenjenom glikolizacijom, kao što je povećano račvanje N-acetilglukozamina ili smanjena fukoza. Redukcija fukoze obezbeđuje veće poboljšanje ADCC aktivnosti nego što obezbeđuje porast prisustva račvanja N-acetilglukozamina. Osim toga, poboljšanje ADCC sporom fukozom antitela je nezavisno od FcvRMla V/F polimorfizama.

[0182]Modifikacija sekvence aminokiseline Fc regije antitela alternativno je za konstrukciju glikolizacije radi poboljšanja ADCC. Mesto vezivanja na humanom IgGiza Fcv receptore određeno je ekstenzivnom analizom mutacije. Ovo je dovelo do generisanja humanizovanih IgGiantitela sa Fc mutacijama koji povećavaju afinitet vezivanja za FcvRMla i poboljšavaju ADCC in vitro. Dodatno, Fc varijante dobijaju se sa mnogo različitim permutacijama svojstva vezivanja, npr., poboljšano vezivanje za specifične FcyR receptore sa nepromenjenim ili smanjenim vezivanjem za druge FcvR receptore.

[0183]Drugi aspekt uključuje imunokonjugate koji obuhvataju humanizovano antitelo ili njegove fragmente konjugovane sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapeutski agens, toksin (npr., enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njegove fragmente), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat).

[0184]Hemoterapeutski agensi koji su korisni u generisanju takvih imunokonjugata opisani su gore.

Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji mogu da se koriste za formiranje korisnih imunokonjugata uključuju difterija A lanac, nevezujuće aktivne fragmente ili toksin difterije, egzotoksin A lanac (iz Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modekcin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, diantin proteine, Phvtolaca americana proteine (PAPI, PAPU, i PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcin, krotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, trikotecene, i slično. Raznovrsnost radionuklida dostupna je za proizvodnju radiokonjugovanih humanizovanih anti-IL-23pl9 antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<131>l,131ln,<90>Y i<186>Re.

[0185]Konjugati humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela i citotoksični ili hemoterapeutski agens mogu se dobiti poznatim postupcima, korišćenjem različitih agenasa bifunkcionalnog spajanja proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivativi imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksanediamin), bis-diazonijum derivativi (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilenediamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može da se pripremi kao što je opisano u Vitetta et al., 1987, Science 238:1098. Ugljenik-14-označen l-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina(MX-DTPA) je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Konjugati takođe mogu da se formiraju sa cepivim linkerom.

[0186]Humanizovana anti-IL-23pl9 antitela opisana ovde mogu takođe da budu formulisana kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo pripremaju se postupcima poznatim stručnjaku, kao što je opisano u Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; i U.S. Pat. Br. 4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi koji imaju povećano vreme cirkulacije opisani su, na primer, u U.S. Pat. Br. 5,013,556.

[0187]Naročito korisni lipozomi mogu da se generišu postupkom reversnog faznog isparavanja sa lipidnom kompozicijom koja obuhvata fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi ekstrudiraju se kroz filtere definisane veličine pora radi dobijanja lipozoma sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti antitela opisani ovde mogu da budu konjugovani sa lipozomima kao što je opisano u Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288 preko disulfidne reakcije izmene. Hemoterapeutski agens (kao što je doksorubicin) je opciono sadržan unutar lipozoma. Videti, npr., Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst. 81 (19):1484.

[0188]Antitela opisana i obelodanjena ovde mogu takođe da se koriste u ADEPT (Antitelom-upravljana Enzim Prolek Terapija) postupcima konjugacijom antitela sa enzimom aktiviranim prolekom koji konvertuje prolek (npr., peptidil hemoterapeutski agens), do aktivnog anti-kancer leka. Videti, na primer, WO 81/01145, WO 88/07378, i U.S. Pat. Br. 4,975,278. Enzimska komponenta imunokonjugata korisnog za ADEPT je enzimski sposoban za delovanje na prolek na takav način tako da ga konvertuje u njegov aktivniji, citotoksični oblik. Specifični enzimi koji su korisni u ADEPT uključuju, ali ne ograničavaju se na, alkalnu fosfatazu za konvertovanje prolekova koji sadrže fosfat u slobodnim lekovima; arilsulfatazu za konvertovanje sulfat-sadržavajućih prolekova u slobodnim lekovima; citozin deaminazu za konvertovanje ne-toksičnog 5-fluorocitozina u anti-kancer leku, 5-fluorouracil; proteaze, kao što je serratia proteazu, termolizin, subtilizin, karboksipeptidaze, i katepsine (kao što su katepsini B i L), za konvertovanje peptid-sadržavajućih prolekova u slobodnim lekovima; D-alanilkarboksipeptidaze, za konvertovanje prolekovia koji sadrže D-aminokiselinske supstituente; enzime za cepanje ugljenih hidrata kao što su p-galaktozidaza i neuraminidaa za konvertovanje glikolizovanih prolekova u slobodne lekove; P-laktamaza za konvertovanje lekova derivatizovanih sa p-laktamima u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što je penicilin V amidaza ili penicilin G amidaza, za konvertovanje lekova derivatizovanih na njihovim atomima azota iz amina sa fenoksiacetil ili fenilacetil grupama, respektivno, u slobodnim drogama. Alternativno, antitela koja imaju enzimsku aktivnost ("abzimi") mogu da se koriste za konvertovanje prolekova u slobodne aktivne lekove (videti, na primer, Massev, 1987, Nature 328: 457-458). Antitelo-abzim konjugati mogu da se pripreme poznatim postupcima za dostavu abzima do ćelijske populacije tumora, na primer, kovalentnim vezivanjem enzima za humanizovano anti-IL-23pl9antitelo/heterobifunkcionalne umrežavajuće reagense opisane gore. Alternativno, fuzija proteina koja obuhvata najmanje antigen vezujuću regiju antitela opisanu ovde povezanu sa najmanje funkcionalno aktivnim delom enzima kao što je opisano ovde može da se konstruiše korišćenjem postupaka sa rekombinantnom DNK (videti, npr., Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608).

[0189]U određenim ostvarenjima, može da bude poželjno da se koristi fragment humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela, pre nego netaknuto antitelo, radi povećanja penetracije tkiva, na primer. Može biti poželjno da se modifikuje fragment antitela da bi se produžio poluživot negovog seruma. Ovo može da se postigne, na primer, inkorporacijom popravljanjog receptora vezivanjem epitopa u fragment antitela. U jednom postupku, odgovarajuća regija fragmenta antitela može biti izmenjena (npr., mutirana), ili epitop može da bude inkorporiran u peptidnu oznaku koji je onda spojen sa fragmentom antitela bilo na kraju ili u sredini, na primer, sintezom DNK ili peptida. Videti, npr., WO 96/32478.

[0190]U drugim ostvarenjima, takođe su uključene kovalentne modifikacije humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela. Kovalentne modifikacije uključuju modifikaciju cisteinil ostataka, histidil ostataka, lizinil i amino-terminalnih ostataka, arginil ostataka, tirozil ostataka, karboksilnih bočnih grupa (aspartil ili glutamil), glutaminil i asparaginil ostataka, ili seril, ili treonil ostataka. Druga vrsta kovalentne modifikacije uključuje hemijsko ili enzimsko spajanje glikozida sa antitelom. Takve modifikacije mogu se izvesti hemijskom sintezom ili enzimskim ili hemijskim cepanjem antitela, ako je primenjljivo. Druge vrste kovalentnih modifikacija antitela mogu se uvesti u molekul reagovanjem označenih aminokiselinskih ostataka antitela sa organskim derivatizirajućim agensom koji je sposoban da reaguje sa izabranim bočnim lancima ili amino- ili karboksi-terminalnim ostacima.

[0191]Uklanjanje bilo kojih ugljenohidratnih grupa prisutnih na antitelu može da se postigne hemijski ili enzimski. Hemijska deglikolizacija opisana je od strane Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophvs. 259:52 i od strane Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131. Enzimsko cepanje ugljenohidratnih grupa na antitelima može da se postigne korišćenjem različitih endo- i egzo-glikozidaza opisanih od strane Thotakura etal., 1987, Meth. Enzvmol 138:350.

[0192]Druga vrsta korisne kovalentne modifikacije obuhvata povezivanje antitela sa jednim od različitih neproteinskih polimera, npr., polietilen glikol, polipropilen glikol, ili polioksialkileni, na način koji je dat u jednom ili u više patentnih prijava U.S. Pat. Br. 4,640,835, U.S. Pat. Br. 4,496,689, U.S. Pat. Br. 4,301,144, U.S. Pat. Br. 4,670,417, U.S. Pat. Br. 4,791,192 i U.S. Pat. Br. 4,179,337.

Humanizacija i Varijante sekvence aminokiseline

[0193]Varijante sekvence aminokiseline anti-IL-23pl9 antitela mogu da se pripreme uvođenjem odgovarajućeg izmene nukleotida u DNK anti-IL-23pl9 antitela, ili sintezom peptida. Takve varijante uključuju, na primer, delecije iz, i/ili umetanja u i/ili supstitucije, ostataka u sekvencama aminokiseline anti-IL-23pl9 antitela iz primera ovde. Bilo koja kombinacija delecija, umetanja i supstitucija izvedena je da dođe do finalne konstrukcije, obezbeđujući da finalna konstrukcija poseduje željene karakteristike. Aminokiselinske izmene takođe mogu da izmene post-translacione postupke humanizovanog ili varijante anti-IL-23pl9 antitela, kao što je izmena broja ili pozicije mesta glikolizacije.

[0194]Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regija anti-IL-23pl9 antitela koje su poželjne lokacije za mutagenezu koja se naziva "alanin skenirajuća mutageneza," kao što je opisano od strane Cunningham i Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). Ovde, ostatak ili grupa ciljanih ostataka su identifikovani (npr., naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zamenjeni neutralno ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (obično alaninom) da utiču na interakciju aminokiselina sa IL-23pl9 antigenom. Ove aminokiselinske lokacije koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije onda su prečišćene uvođenjem daljih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Ovako, dok je mesto za uvođenje varijante sekvence aminokiseline predodređeno, priroda mutacije per se ne treba da je predodređena. Na primer, za analiziranje performanse mutacije na datom mestu, alanin skeniranje ili nasumična mutageneza vođena je na ciljanom kodonu ili regiji i eksprimirane varijante anti-IL-23pl9 antitela pregledane su za željenu aktivnost.

[0195]Umetanja sekvence aminokiseline uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije rangirane po dužini od jednog ostatka do hiljadu ili više ostataka koji sadrže polipeptide, kao i intrasekvencijalna umetanja pojedinačnih ili multipliciranih aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih umetanja uključuju anti-IL-23pl9 antitelo koje je spojeno sa oznakom epitopa. Druge varijante umetanja molekul anti-IL-23pl9 antitela uključuju fuziju sa N- ili C-terminusom anti-IL-23pl9 antitela enzima ili polipeptida koja povećava poluživot seruma antitela.

[0196]Druga vrsta varijante je varijanta aminokiselinske supstitucije. Ove varijante imaju uklonjen najmanje jedan aminokiselini ostatak u molekulu anti-IL-23pl9 antitela i drugačiji ostatak umetnut na njegovo mesto. Mesta najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regije, ali takođe su razmatrane FR alteracije. Konzervativne supstitucije prikazane su Tabeli 5 pod naslovom "poželjne supstitucije". Ako takve supstitucije rezultiraju promenom u biološkoj aktivnosti, onda značajnije promene, iskazane kao "primeri supstitucije", ili kako je dalje opisano dole pozivajući se na klase aminokiselina, mogu se uvesti a proizvodi prikazati.

[0197]U herniji proteina, opšte je prihvaćeno da biološka svojstva antitela mogu da se postignu biranjem supstitucija koje se razlikuju značajno po njihovom efektu na održavanje (a) strukture polipeptidne kičme u oblasti supstitucije, na primer, kao ravna ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljanom mestu, ili (c) mase bočnog lanca. Ostaci koj se javljaju u prirodi podeljeni su u grupe na osnovu njihovih zajedničkih svojstva bočnog lanca: (1) hidrofobna: norleucine, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralno hidrofilna: cvs, ser, thr; (3) kisela: asp, glu; (4) bazna: asn, gln, his, lys, arg;

(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i

(6) aromatična: trp, tyr, phe.

[0198]Nekonzervativne supstitucije obuhvataće izmenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.

[0199]Bilo koji ostatak cisteina koji nije uključen u održavanje prave konformacije humanizovanog ili varijante anti-IL-23pl9 antitela takođe može da se supstituiše, uopšteno sa serinom, da bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula, sprečilo neprirodno umrežavanje, ili da obezbedi za utvrđivanje tačke konjugacije za citotoksično ili citostatičko jedinjenje. Nasuprot tome, cistein veza(e) mogu se dodati antitelu da bi se poboljšalja njegova stabilnost (naročito gde je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).

[0200]Vrsta supstitucione varijante uključuje, supstituisanje jednog ili više ostataka hipervarijabilne regije matičnog antitela (npr., humanizovano ili humano antitelo). Uopšteno, rezultirajuća varijanta(e) izabrana za dalji razvoj imaće poboljšana biološka svojstva u odnosu na matično antitelo iz kojeg su generisane. Povoljan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti je afinitetno sazrevanje korišćenjem postupka prikazivanja na fagima. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilne regije (npr., 6-7 mesta) mutirana su radi generisanja svih mogućih amino supstitucija na svakom mestu. Varijante antitela ovako generisane prikazane su na monovalentni način od čestica filamentoznogfaga kao fuzija sa genom III proizvoda M13 spakovanog unutar svake čestice. Varijante koje prikazuju fag onda su prikazane za njihovu biološku aktivnost (npr., afinitet vezivanja). U cilju identifikacije mesta hipervarijabilne regije kandidata za modifikaciju, alanin skenirajuća mutageneza može da se izvede radi identifikacije ostataka hipervarijabilne regijeznačajno doprinoseći vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno da se analizira cristalna struktura kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale tačke kontakta između antitela i humanog IL-23pl9. Takvi ostaci koji su u kontaktu i susedni ostaci su kandidati za supstituciju prema postupcima razrađenim ovde. Neke takve varijante su generisane, panel varijanti je predmet skrininga kao što je opisano ovde i antitela sa superiornim svojstvima u jednoj ili više bitnih analiza mogu da se izaberu za dalji razvoj.

[0201]Druga vrsta varijante aminokiseline antitela menja originalni obrazac glikolizacije antitela. Pod "menjanjem" podrazumeva se brisanje jedne ili više ugljovodoničnih grupa koji su pronađeni u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikolizacije koja su goruće prisutna u antitelu.

[0202]U nekim ostvarenjima, može biti poželjna modifikacija antitela ovog pronalaska radi dodavanja mesta glikolizacije. Glikolizacija antitela je obično ili N-povezana ili O-povezana. N- povezana odnosi se na povezanost ugljovodonične grupe za bočni lanac ostataka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, u kojima je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su prepoznatljive sekvence za enzimsko povezivanje ugljovodonične grupe za bočni lanac asparagina. Ovako, prisustvo neke od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikolizacije. O-povezana glikolizacija odnosi se na vezivanje jednog od šećera N-aceilgalaktozamin, galaktoze, ili ksiloze za oksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, ali i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin mogu takođe da se koriste. Ovako, da bi glikozilat dati protein, npr., antitelo, sekvenca aminokiseline proteina konstruisana je da sadrži jednu ili više gore-opisane tripeptidne sekvence (za N-povezana mesta glikolizacije). Promena takođe može da se izvede dodavanjem, ili supstitucijom, jednog ili više ostataka serina ili treonina sekvenci originalnog antitela (za O-povezana mesta glikolizacije).

[0203]Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju varijante sekvence aminokiseline anti-IL-23pl9 antitela pripremaju se različitim postupcima koji su poznati stručnjaku. Ovi postupci uključuju, ali ne ograničavaju se na, izolovanje iz prirodnog izvora (u slučaju varijanti sekvence aminokiseline koje se javljaju u prirodi) ili pripremanje oligonukleotidno-posredovanom (ili usmerenom) mutagenezom, PCR mutagenezom i kasetnom mutagenezom ranije pripremljene varijantne ili ne-varijantne verzije anti-IL-23pl9 antitela.

Polinukleotidi, Vektori, Ćelije domaćina, i Rekombinantni Postupci

[0204]Druga ostvarenja obuhvataju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvencu koja kodira humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo, vektore, i ćelije domaćina koje obuhvataju polinukleotide, i rekombinantne postupke za proizvodnju humanizovanog antitela. Izolovani polinukleotidi mogu da kodiraju bilo koji željeni oblik anti-IL-23pl9 antitela uključujući, na primer, monoklonska antitela cele dužine, Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente, dijatela, linearna antitela, jedno-lančane molekule antitela, i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0205]Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvence koje kodiraju varijabilnu regiju lakog lanca antitela ili fragmenta antitela koja ima sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO: SEQ ID NO:84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,107,109,111,113,115, 117 ili 119. Primer polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju takve sekvence aminokiselina su SEQ ID NO:83, 85, 87, 89, 92, 94, 96, 98,100,102,104,106,108,110,112,114,116 i 118. Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvence koje kodiraju varijabilnu regiju teškog lanca antitela ili fragmenta antitela koja ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:121, 123, 125, 127,128,130,132, 134, 136,138,140,142,144, 146, 148,150, 152, 154 ili 156. Primer polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju takve sekvence aminokiselina su SEQ ID NO: 120, 122,124,126, 129, 131, 133,135, 137,139, 141, 143, 145,147, 149,151, 153 ili 155.

[0206]Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvence koje kodiraju varijabilnu regiju lakog lanca antitela ili fragmenta antitela koja ima sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO:158,160, 162 ili 164. Primer polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju takve sekvence

aminokiselina su SEQID NO:157,159,161 ili 163. Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvence koje kodiraju varijabilnu regiju teškog lanca antitela ili fragmenta antitela koja ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 166,168,170 ili 172. Primer polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju takve sekvence aminokiselina su SEQ ID NO: 165,167,169 ili 171.

[0207]Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvence koje kodiraju laki lanac antitela koji ima sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO:174 ili 180. Primer polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju takve sekvence aminokiselina su SEQ ID NO:173 ili 179. Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji obuhvataju sekvence koje kodiraju težak lanac antitela koji ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176 ili 178. Primer polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju takve sekvence aminokiselina su SEQ ID NO:175 ili 177.

[0208]U jednom aspektu, izolovana polinukleotidna sekvenca(e) kodira antitelo ili fragment antitela koji ima varijabilnu regiju lakog lanca i teškog lanca koja obuhvata sekvence aminokiseline SEQ ID NO:174 i SEQ ID NO:176, respektivno; SEQ ID NO:174 i SEQ ID NO:178, respektivno; SEQ ID NO:180 i SEQ ID NO:176, respektivno; SEQ ID NO:180 i SEQ ID NO:178, respektivno. Primer polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju takve sekvence aminokiselina su SEQ ID NO: 173 i 175, respektivno, SEQ ID NO: 173 i 177, respektivno, SEQ ID NO: 179 i 175, respektivno, SEQ ID NO: 179 i 177, respektivno.

[0209]Polinukleotid(i) koji obuhvata sekvencu koja kodira humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov fragment ili lanac može da se spoji sa jednom ili više regulatornom ili kontrolnom sekvencom, kao što je poznato stručnjaku iz oblasti, i može biti sadržan u pogodnim ekspresionim vektorima ili ćeliji domaćina kao što je poznato stručnjaku. Svaki od molekula polinukleotida koji kodira varijabilne domene teškog ili lakog lanca može nezavisno da bude spojen sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira konstantni domen, kao što je humani konstantni domen, pri čemu omogućava proizvodnju netaknutih antitela. Alternativno, polinukleotidi, ili njihovi delovi, mogu se zajedno spojiti, obezbeđujući templat za proizvodnju jednolančanog antitela.

[0210]Za rekombinantnu proizvodnju, polinukleotid koji kodira antitelo umetnut je u replikabilni vektor za kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. Mnogi pogodni vektori za ekspresiju rekombinantnog antitela su dostupni. Komponente vektora uopšteno uključuju, ali ne ograničavaju se na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu, oridžin replikacije, jedan ili više markergena, pojačivač element, promoter, i završetak transkripcije sekvence.

[0211]Humanizovana anti-IL-23pl9 antitela takođe mogu da se proizvedu spajanjem polipeptida, u kojima je antitelo spojeno sa heterolognim polipeptidom, kao što je signalna sekvenca ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na amino terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Izabrana heterologna signalna sekvenca je obično jedna koja je prepoznata i obrađena (tj., otcepljena pomoću signalne peptidaze) od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i obrađuju signalnu sekvencu humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela, signalna sekvenca može da se supstituiše pomoću prokariotske signalne sekvence. Signalna sekvenca može da bude, na primer, alkalna fosfataza, penicilinaza, lipoprotein, enterotoksin II lideri stabilni na toplotu, i slično. Za sekreciju kvasca, prirodna signalna sekvenca može da se supstituiše, na primer, sa vodećom sekvencom dobijenom iz alfa-faktor invertaze kvasca (uključujući Saccharomvces i Kluvveromvces a-faktor lidere), kisela fosfataza, C. albicans glukoamilaza, ili signal opisan u VVO90/13646. U ćelijama sisara, mogu da se koriste signal sekvence sisara kao i virusni sekretorni lideri, na primer, herpes simpleks gD signal. DNK za takvu prekursornu regiju vezuje se u okvir čitanja za DNK kodiranje humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela.

[0212]Ekspresioni i vektori za kloniranje sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava vektoru da se replikuje u jednoj ili više izabranih ćelija domaćina. Uopšteno, u vektorima za kloniranje ova sekvenca je jedna koja omogućava vektoru da se replikuje nezavisno od hromozomalne DNK domaćina, i uključuje oridžin replikacije ili autonomno replikujuće sekvence. Takve sekvence dobro su poznate za razne bakterije, kvasce i viruse. Oridžin replikacije od plazmida pBR322 je pogodno za većinu Gram-negativnih bakterija, 2-u. Plazmidni oridžin je pogodan za kvasac, a razni virusni oridžini (SV40, polioma, adenovirus, VSV i BPV) korisni su za vektore za kloniranje u ćelijama sisara. Uopšteno, oridžin replikacione komponente nije potreban za ekspresione vektore sisara (SV40 oridžin može obično da se koristi samo zato što sadrži gornji promoter).

[0213]Ekspresioni i vektori za kloniranje mogu da sadrže gen koji kodira selektivan marker da bi se olakšala identifikacija ekspresije. Tipični selektivni marker geni kodiraju proteine koji prenose rezistenciju na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, ili alternativno, su komplement auksotrofni nedostaci, ili u drugim alternativama snabdevaju specifičnim nutrientima koji nisu prisutni u kompleksnom medijumu, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacile.

[0214]Jedan primer selekcione šeme koristi lek za sprečavanje rasta ćelije domaćina. Te ćelije koje su uspešno transformisane sa heterolognim genom proizvode protein koji daje rezistenciju na lek i ovako preživljavaju režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin. Zajednički selektivni markeri za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih da preuzmu nukleinsku kiselinu koja kodira humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo, kao što je DHFR (dihidrofolat reduktaza), timidin kinaza, metalotionein-l i -II (kao štosu metalotionein geni primata), adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza i slično. Ćelije transformisane sa DHFR selekcijom gena prve su koje su identifikovane kultivisanjem svih transformanata u medijumu za kultivisanje koji sadrži metotreksat (Mtx), kompetitivni antagonist od DHFR. Odgovarajuća ćelija domaćina kada je divlji tip DHFR uposlen je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) deficitarna u DHFR aktivnosti (npr., DG44).

[0215]Alternativno, ćelije domaćina (naročito divljeg tipa domaćina koja sadrži endogeni DHFR) transformisane ili ko-transformisane sa DNK sekvencama koje kodiraju anti-IL-23pl9 antitelo, divlji tip DHFR proteina, i drugi selektivni marker kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH), mogu da se odaberu ćelijskim rastom u medijumu koji sadrži agens za selekciju za selektivni marker kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin ili G418. Videti, npr., U.S. Pat. Br. 4,965,199.

[0216]Kada se rekombinantna proizvodnja izvodi u ćeliji kvasca kao ćeliji domaćina, TRPI gen prisutan u plazmidu YRp7 kvasca (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39) može da se koristi kao selektivni marker. TRPI gen obezbeđuje selektivni marker za soj mutanta kvasca kome nedostaje sposobnost da raste u triptofanu, na primer, ATCC Br. 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Prisustvo trpi lezije u ćelijskom genomu kvasca domaćina onda obezbeđuje efektivno okruženje za detekciju transformacije rastom u odsustvu triptofana. Slično, Leu2p-deficitarni sojevi kvasca kao što su ATCC 20,622 i 38,626 su komplementarni poznatim plazmidima koji nose LEU2 gen.

[0217]Dodatno, vektori izvedeni iz 1,6 um kružnog plazmida pKDl mogu da se koriste za transformaciju kvasaca Kluvveromvces. Alternativno, ekspresioni sistem za masovnu proizvodnju rekombinantnog cimozina mladunčeta objavljeno je za K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technologv 8:135). Stabilni multi-kopirajući ekspresioni vektori za sekreciju zrelog rekombinantnog humanog seruma albumina od strane industrijskih sojeva Kluvveromvces takođe su opisani u (Fleer et al., 1991, Bio/Technologv 9:968-975).

[0218]Ekspresioni i vektori za kloniranje obično sadrže promoter koji je prepoznat od strane organizma domaćina i operativno je povezan sa molekulom nukleinske kiseline koja kodira anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov polipeptidni lanac. Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promoter, B-laktamazu i sisteme laktoza promotera , alkalnu fosfatazu, sistem triptofan (trp) promotera, i hibridne promotere kao što je tac promoter. Drugi poznati bakterijski promoteri su takođe pogodni. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe će da sadrže Shine-Dalgarno (S.D.) sekvencu operativno povezanu sa DNK koji kodira humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo.

[0219]Mnoge eukariotske sekvence promotera su poznate. Praktično svi eukariotski geni imaju AT-bogatu regiju koja je smeštenu na oko 25 do 30 baza uzvodno od mesta gde se inicira transkripcija. Druga sekvenca koja se nalazi 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT regija gde N može da bude bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može da bude signal za dodavanje poli A kraja 3' kraju kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su pogodno umetnute u eukariotske ekspresione vektore.

[0220]Primeri pogodnih promotivnih sekvenci za upotrebu sa domaćinima kvasca uključuju promotere za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutat, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza, i glukokinaza.

[0221]Inducibilni promoteri imaju dodatne prednosti transkripcije kontrolisane uslovima rasta. Ovi uključuju regije promotera kvasca za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu, derivativne enzime povezane sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za iskorišćenje maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promoteri za upotrebu u ekspresiji kod kvasca su dalje opisani u EP 73,657. Pojačivači kod kvasca takođe se povoljno koriste sa promoterima kvasca.

[0222]Transkripcija humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela od vektora u ćelijama domaćina sisara je kontrolisana, na primer, promoterima koji su dobijeni od genoma virusa kao što su polioma virus, virus boginja pernate živine, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičji sarkom virus, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus i Simian Virus 40 (SV40), iz heterolognih promotera sisara, npr., aktinski promoter ili imunoglobulinski promoter, ili iz promotera toplotnog šoka, obezbeđuje takve promotere koji su kompatibilni sa ćelijskim sistemima domaćina.

[0223]Gornji i donji promoteri SV40 virusa konvencionalno se dobijaju kao SV40 restrikcioni fragment koji takođe sadrži SV40 virusni oridžin replikacije. Neposredni gornji promoter humanog citomegalovirusa je konvencionalno dobijen kao Hindlll E restrikcioni fragment. Sistem za ekspresiju DNK u domaćinima sisara korišćenjem goveđeg papiloma virusa kao vektora opisan je u U.S. Pat. Br. 4,419,446. Modifikacija ovog sistema opisana je u U.S. Pat. Br. 4,601,978. Videti takođe Reves et al., 1982, Nature 297:598-601, koji opisuje ekspresiju humanog p-interferona cDNK u mišjim ćelijama pod kontrolom promotera timidin kinaze iz herpes simpleks virusa. Alternativno, dugo terminalno ponavljanje Rous sarkom virusa može da se koristi kao promoter.

[0224]Drugi korisni element koji može da se koristi u rekombinantnom ekspresionom vektoru je sekvenca pojačivača, koja se koristi da poveća transkripciju DNK koji kodira humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo višim eukariotama. Mnoge sekvence pojačivača sada su poznate iz gena sisara (npr., globin, elastaza, albumin, a-fetoprotein i insulin). Obično, međutim, koristi se pojačivač iz eukariotskog ćelijskog virusa. Primeri uključuju SV40 pojačivač na donjoj strani oridžina replikacije (bp 100-270), citomegalovirus donjeg promotera pojačivača, polioma pojačivač na donjoj strani oridžina replikacije, i adenovirusne pojačivače. Videti takođe Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 za opis pojačivačkih elemenata za aktivaciju eukariotskih promotera. Pojačivač može biti vezan u vektor na poziciji 5' ili 3' za humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo-enkodirajuću sekvencu, ali poželjno je smešten na mesto 5' od promotera.

[0225]Ekspresioni vektori korišćeni u eukariotskim ćelijama domaćina (kvasca, gljiva, insekata, biljaka, životinja, ljudi, ili nukleotidnih ćelija iz drugih višećelijskih organizama) mogu takođe da sadrže sekvence potrebne za završetak transkripcije i za stabilizaciju mRNA. Takve sekvence su često dostupne iz 5' i, povremeno 3', neprevedenih regija eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ove regije sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilacionirani fragmenti u neprevedenom delu mRNA koja kodira anti-IL-23pl9 antitelo. Jedna korisna transkripciona terminaciona komponenta je poliadenilaciona regija hormona rasta goveda. Videti WO94/11026 i ekspresioni vektor opisan tu. U nekim ostvarenjima, humanizovana anti-IL-23pl9 antitela mogu da se eksprimiraju korišćenjem CHEF sistema. (Videti, npr., U.S. Pat. Br. 5,888,809).

[0226]Pogodne ćelije domaćina za DNK za kloniranje ili ekspresiju u vektorima ovde su prokariotske ćelije, ćelije kvasca ili ćelije viših eukariota opisane gore. Pogodne prokariote za ovu svrhu uključuju eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što je Escherichia, npr., E. coli, Enterobacter, Ervvinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr., Salmonella tvphimurium, Serratia, npr., Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bacilli kao što su B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis 41 P opisan u DD 266,710 izdatom 12.Aprila 1989.), Pseudomonas kao što je P. aeruginosa, i Streptomvces. Jedan poželjan E. coli klonirajući domaćin je E. coli 294 (ATCC 31,446), iako drugi sojevi kao što su E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), i E. coli VV31110 (ATCC 27,325) su pogodni. Ovi primeri su pre ilustrativni nego ograničavajući.

[0227]Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao poput filamentoznih gljiva ili kvasca su pogodni domaćini kloniranja ili ekspresije za humanizovanog anti-IL-23pl9antitela-kodirajuće vektore. Saccharomvces cerevisiae, ili običan pekarski kvasac, je najčešće korišćen među donjim eukariotskim domaćinima mikroorganizama. Međutim, brojne drugi rodovi, vrste, i sojevi su često dostupni i korisni ovde, kao što je Schizosaccharomvces pombe; Kluvveromvces domaćini kao što su, npr., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. vvickeramii (ATCC 24,178), K. vvaltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, i K. marxianus; varrovvia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schvvanniomvces poput Schvvanniomvces occidentalism i flamentozne gljive poput, npr., Neurospora, Penicillium, Tolvpocladium, i Aspergillus domaćini poput A. nidulans i A. niger.

[0228]Pogodne ćelije domaćina za ekspresiju glikozilovanog humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela su izvedene iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija bezkičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata, uključujući, npr., brojne bakulovirusne sojeve i varijante i odgovarajuće permisivne ćelije domaćina insekta iz domaćina poput Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegvpti mosquito), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna mušica), i Bombyx mori (svilena buba). Raznovrsnost virusnih sojeva za transfekciju su dostupni javnosti, npr., L-l varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj od Bombyx mori NPV, i takvi virusi mogu da se koriste, naročito za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija.

[0229]Biljne ćejiske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza i duvana mogu takođe da se koriste kao domaćini.

[0230]U drugom aspektu, ekspresija humanizovanog anti-IL-23pl9 obavljena je u ćelijama kičmenjaka. Propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postao je rutinska procedura i postupci su lako dostupni. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana od strane SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), humana embrionska linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10), ćelije janika kineskog hrčka/-DHFRl (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; npr., DG44), mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, 1980, Biol, Reprod. 23:243-251), ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587), ćelije humanog cervikalnog karcinoma (HELA, ATCC CCL 2), ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34), ćelije jetre bivoljeg pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442), ćelije humanih pluća (W138, ATCC CCL 75), ćelije humane jetre (Hep G2, HB 8065), tumor dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL51), TRI ćelije (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), MRC 5 ćelije, FS4 ćelije, i humana hepatoma linija (Hep G2).

[0231]Ćelije domaćina transformisane su sa gore opisanim ekspresionim i vektorima za kloniranje za proizvdnju humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela i kultivisane u konvencionalnom nutritivnom medijumu koji je modifikovan kao odgovarajući za indukciju promotera, odabir transformanata, ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence.

[0232]Ćelije domaćina korišćene za proizvodnju humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela opisane ovde mogu da se kultivišu u raznovrsnim medijumima. Komercijalno dostupni medijum poput Ham-ovog F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), minimalnog esencijalnog medijuma ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) i Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma-Aldrich. Co.) su pogodni za kultivisanje ćelija domaćina. Dodatno, bilo koji medjum opisan u jednom ili više Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, U.S. Pat. Br. 4,767,704, U.S. Pat. Br. 4,657,866; U.S. Pat. Br. 4,927,762, U.S. Pat. Br. 4,560,655, U.S. Pat. Br. 5,122,469, WO 90/103430, i WO 87/00195 može da se koristi kao medijum za kultivisanje za ćelije domaćina. Bilo koji od ovih medijuma može se dopuniti ako je potrebno sa hormonima i/ili drugim faktorima rasta (poput insulina, transferina, ili epidermalnog faktora rasta), solima (poput natrijum hlorida, kalcijuma, magnezijuma, i fosfata), puferima (poput HEPES), nukleotidima (poput adenozina i timidina), antibiotika (poput gentamicina), elementima u tragovima (definisana kao neofganska jedinjenja obično prisutna u krajnjoj kincentraciji u mikromolarnom opsegu), i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Drugi suplementi mogu takođe da budu uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje su poznate stručnjacima iz oblasti. Uslovi kultivisanja, poput temperature, pH, i slično, su oni prethodno korišćeni sa ćelijom domaćina izabranom za ekspresiju, i biće očigledni prosečnom stručnjaku.

[0233]Kada se koriste rekombinantni postupci, antitelo može se proizvesti intracelularno, u periplazmatskom prostoru, ili se direktno luče u medijumu. Ako je antitelo proizvedeno intracelularno, ćelije mogu da budu prekinute u oslobađanju proteina kao prvog koraka. Ostaci čestica, ili ćelije domaćina ili liziranih fragmenata, mogu da se uklone, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Čarter et al., 1992, Bio/Technologv 10:163-167 opisuje postupak za izolaciju antitela koja su izlučena u periplazmatski prostor od E. coli. Ukratko, ćelijska pasta je odmrznuta u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA, i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) preko oko 30 minuta. Ostaci čestica mogu da se uklone centrifugiranjem. Gde je antitelo izlučeno u medijum, supernatanti iz takvih sistema ekspresije su uopšteno prvo koncentrovani korišćenjem komercijalno dostupnog filtera za koncentrisanje proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltraciona jedinica. Inhibitor proteaze poput PMSF može da bude uključen u bilo koje navedene faze radi inhibiranja proteolize i antibiotici mogu da budu uključeni da spreče rast sporednih kontaminenata. Razni postupci mogu da se koriste za izolaciju antitela iz ćelija domaćina.

[0234]Kompozicija antitela pripremljena iz ćelija može da se prečisti korišćenjem, na primer, hidroksilapatit hromatografije, gel elektroforeze, dijalize, i afinitetne hromatografije, sa tim da je afinitetna hromatografija tipični postupak prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrsta i izotipa bilo kog imunoglobulinskog Fc domena koji je prisutan u antitelu. Protein A može da se koristi za prečišćavanje antitela koji se zasnivaju na humanim gammal, gamma2, ili gamma4 teškim lancima (videti, npr., Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). Protein G preporučen je za sve mišje izotipove i za humani gamma3 (videti, npr., Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). Matrica za koju je afinitetni ligand pričvršćen je najčešće agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice poput kontrolisano poroznog stakla ili poli(stirendivinil)benzena dozvoljavaju veće brzine protoka i kraća vremena postupka nego što mogu da se postignu sa agarozom. Gde antitelo obuhvata CH3domen, Bakerbond ABX™ smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) korisna je za prečišćavanje. Drugi postupci za prečišćavanje proteina poput frakcionisanja na jonskoizmenjivačkoj koloni, taloženja pomoću etanola, reversnog faznog HPLC, hromatografije na silicijumu, hromatografije na heparinu SEPHAROSE™ hromatografije na smoli anjonske ili katjonske izmene (poput kolone poliaspartne kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i amonijum sulfat taloženje su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koja će se obnoviti.

[0235]Nakon bilo koje preliminarne faze(a) prečišćavanja, mešavina koja obuhvata antitelo od interesa i kontaminente može da se podvrgne hromatografiji niske pH hidrofobne interakcije korišćenjem pufera za eluiranje na pH između oko 2,5-4,5, obično izvedeno pri malim koncentracijama soli (npr., od oko 0-0,25Msoli).

[0236]Takođe su uključene nukleinske kiseline koje hibridizuju pod malim, umerenim, i velikim strogim uslovima, kao što je određeno ovde, sve ili deo (npr., deo koji kodira varijabilnu regiju) nukleotidne sekvence predstavljene od strane izolovane polinukleotidne sekvence(i) koja kodira antitelo ili fragment antitela ovog pronalaska. Hibridizovani deo hibridizovane nukleinske kiseline je obično dužine najmanje 15 (npr., 20, 25, 30 ili 50) nukleotida. Hibridizovani deo hibridizovane nukleinske kiseline je najmanje 80%, npr., najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%, identičan sekvenci dela ili celoj nukleinskoj kiselini koja kodira anti-IL-23pl9 polipeptid (npr., varijabilnu regiju teškog lanca ili lakog lanca), ili njegov komplement. Hibridizovane nukleinske kiseline tipa opisanog gore mogu da se koriste, na primer, kao proba za kloniranje, prajmer, npr., PCR prajmer, ili dijagnostička proba.

[0237]Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO: 84,86,88, 90, 91, 93, 95, 97; 99,101,103,105,107,109,111,113,115,117 ili 119, i ona je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična polinukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO:83, 85, 87, 89, 92, 94, 96, 98,100, 102, 104, 106,108,110,112, 114, 116 ili 118.

[0238]Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO: 158,160,162 ili 164, i ona je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična polinukleotidnoj sekvenci od SEQ ID NO:157,159,161 ili 163.

[0239]Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO: 121,123,125,127,128, 130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150,152,154 ili 156, i ona je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična polinukleotidnoj sekvenci od SEQ ID NO: 120,122, 124, 126, 129, 131,133,135,137, 139, 141, 143,145,147, 149,151,153 ili 155.

[0240]Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO: 166,168,170 ili 172, i ona je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična polinukleotidnoj sekvenci od SEQ ID NO: 165,167,169 ili 171.

[0241]Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline varijabilne regije lakog lanca koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična polinukleotidnoj sekvenci bilo kojoj od SEQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99,101, 103,105,107,109, 111,113, 115,117 ili 119. Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline varijabilne regije lakog lanca koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiseline bilo kojoj od SEQ ID NO:158; 160,162 ili 164. Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline varijabilne regije teškog lanca koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiseline bilo kojoj od SEQ ID NO:121,123,125,127,128,130,132,134,136, 138,140,142,144,146,148,150,152,154 ili 156. Neka ostvarenja uključuju izolovane polinukleotide koji uključuju sekvence koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline varijabilne regije teškog lanca koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiseline bilo kojoj od SEQ ID NO:166, 168, 170 ili 172. Kako se ovde koriste, pojmovi "identičan" ili "procenat identičnosti," u kontekstu dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, odnose se na dve ili više sekvenci ili subsekvenci koje su iste ili imaju određen procenat nukleotida ili aminokiselinskih ostataka koji su isti, kada se uporede i usklade za maksimalno podudaranje. Radi određivanja procenta identičnosti, sekvence su poravnate za optimalne svrhe poređenja (npr., međuprostori mogu da se uvedu u sekvencu prve aminokiseline ili sekvencu nukleinske kiseline za optimalno poravnanje sa drugom sekvencom aminokiseline ili sekvencom nukleinske kiseline). Aminokiselinski ostatci ili nukleotidi na odgovarajućim aminokiselinskim pozicijama ili nukleotidnim pozicijama se potom porede. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istim aminokiselinskim ostatkom ili nukleotidom kao što je odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija deljenih sekvencama (tj., % identičnost=# identičnih pozicija/ukupno # pozicija (npr., preklapajuće pozicije)xlOO). U nekim ostvarenjima, dve sekvence koje se porede su iste dužine nakon što se međuprostori uvedu unutar sekvenci, kao odgovarajuće (npr., isključivanjem dodatne sekvence koja se prostire izvan sekvenci koje se porede). Na primer, kada se porede sekvence varijabilne regije, vodeće i/ili konstantne sekvence domena ne uzimaju se u obzir. Za poređenja sekvenci između dve sekvence, "odgovarajući" CDR odnosi se na CDR na istoj lokaciji u obe sekvence (npr., CDR-H1 svake sekvence).

[0242]Određivanje procenta identičnosti ili procenta sličnosti između dve sekvence može da se postigne korišćenjem matematičkog algoritma. Poželjno, neograničavajući primer matematičkog algoritma korišćen za poređenje dve sekvence je algoritam od Karlin i Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modifikovan kao u Karlin i Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Takav algoritam je inkorporiran u NBLAST i XBLAST programe od Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST nukleotidne pretrage mogu se izvesti NBLAST programom, rezultat=100, dužina reči=12, da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne nukleinskoj kiselini koja kodira protein od interesa. BLAST protein pretrage mogu se izvesti XBLAST programom, rezultat=50, dužina reči=3, da bi se dobile sekvence aminokiseline homologne proteinu od interesa. Radi dobijanja Gapped poravnanja u svrhe poređenja. Gapped BLAST može da bude korišćen kao što je opisano u Altschul et al.,1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativno, PSI-Blast može da se koristi za izvođenje ponovne pretrage koja detektuje udaljene odnose između molekula (ld.). Kada korišćeni BLAST, Gapped BLAST, i PSI-Blast programi, zadati parametri odgovarajućih programa (npr., XBLAST i NBLAST) mogu da se koriste. Drugi poželjni, nelimitirajući primer matematičkog algoritma korišćen za poređenje sekvenci je algoritam od Mvers i Miller, CABIOS (1989). Takav algoritam je inkorporiran u ALIGN program (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa GCG poravnavanje sekvenci. Kada se koristi ALIGN program za poređenje sekvenci aminokiseline, PAM120 tablica težinskog ostatka, penali dužine međuprostora od 12, i penali međuprostora od 4 mogu da se koriste. Dodatni algoritam za analizu sekvence poznati su stručnjaku i uključuju ADVANCE i ADAM kao što je opisano u Torellis i Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; i FASTA opisano u Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8. Unutar FASTA, ktup je kontrolna opcija koja određuje osetljivost i brzinu pretrage. Ako ktup=2, slične regije u dve sekvence koje se porede nalaze se gledanjem parova poravnatih ostataka; ako ktup=l, pojedinačno poravnate aminokiseline se ispituju, ktup može da se podesi na 2 ili 1 za sekvence proteina, ili od 1 do 6 za DNK sekvence. Podrazumeva se ako ktup nije naznašen onda je 2 za proteine i 6 za DNK. Alternativno, poravnanjesekvence proteina može se izcesti korišćenjem CLUSTAL W algoritma, kao što je opisano od strane Higgins et al., 1996, Methods Enzvmol. 266:383-402.

Neterapeutske upotrebe

[0243]Antitela opisana ovde korisna su kao agensi afinitetnog prečišćavanja . U ovom postupku, antitela se imobilišu na čvrstu fazu poput Protein A smole, korišćenjem postupaka poznatim stručnjaku. Imobilisano antitelo je u kontaktu sa uzorkom koji sadrži IL-23pl9 protein (ili njegov fragment) koji se prečišćava, i posle toga podrška je oprana sa pogodnim rastvaračem koji će ukloniti supstancijalno sav materijal u uzorku osim IL-2319 proteina, koji se graniči sa imobilizovanim antitelom. Konačno, podrška je isprana sa drugim pogodnom rastvaračem koji oslobađa IL-23pl9 protein iz antitela.

[0244]Anti-IL-23pl9 antitela, na primer humanizovana anti-IL-23pl9 antitela, takođe su korisna u dijagnostičkim sklopovima za detektovanje i/ili kvantifikovanje IL-23 proteina, na primer, detektovana IL-23 ekspresija u specifičnim ćelijama, tkivima, ili serumu. Anti-IL-23pl9 antitela mogu da se koriste dijagnostički za, na primer, kontrolu razvoja ili progresije bolesti kao deo kliničkog postupka ispitivanja za,npr.,određivanje efikasnosti datog tretmana i/ili režima prevencije. Detekcija može da se olakša spajanjem anti-IL-23pl9 antitela. Primeri detektabilnih supstanci uključuju razne enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale, radioaktivne materijale, metale koji emituju pozitron korišćenjem raznih pozitron emitujućih tomografija, i neradioaktivne paramagnetne metalne jone. Videti, na primer, U.S. Patent Br. 4,741,900 za metalne jone koji mogu da se konjuguju sa antitelima radi upotrebe kao dijagnostika prema ovom pronalasku.

[0245]Anti-IL-23pl9 antitela mogu da se koriste u postupcima za dijagnozu IL-23-povezanog poremećaja (npr., poremećaj karakterisan abnormalnom ekspresijom IL-23) ili za određivanje da li subjekt ima rastući rizik od razvoja IL-23-povezanog poremećaja. Takvi postupci uključuju stavljanje u kontakt biološkog uzorka iz subjekta sa IL-23pl9 antitelom i detektovanje vezivanja antitela za IL-23pl9. Pod "biološkim uzorkom" podrazumeva se bilo koji biološki uzorak dobijen iz pojedinca, ćelijske linije, tkivne kulture, ili drugog izvora ćelija koji potencijalno eksprimiraju IL-23. Postupci za dobijanje biopsija tkiva i telesnih fluida iz sisara poznati su stručnjaku.

[0246]U nekim ostvarenjima, postupak može dalje da obuhvata poređenje nivoa IL-23 u uzorku pacijenta radi kontrolisanja uzorka (npr., subjekta koji nema IL-23-povezani poremećaj) radi određivanja da li pacijent ima IL-23-povezan poremećaj ili ima rizik od razvoja IL-23-povezanog poremećja.

[0247]Prednost u nekim ostvarenjima biće, na primer, dijagnostičke svrhe za označavanje antitela sa detektabilnom grupom. Brojni detektabilne oznake su dostupne, uključujući radioizotope, fluorescentne oznake, enzim supstrat oznake i slično. Onaka može da se direktno konjuguje sa antitelom korišćenjem raznih poznatih postupaka.

[0248]Na primer, antitelo može da bude konjugovano sa biotinom i bilo kojom od tri široke kategorije oznaka pomenutih gore može da bude konjugovano sa avidinom, ili obrnuto. Biotin se vezuje selektivno za avidin i ovako, oznaka može da bude konjugovano sa antitelom na indirektan način. Alternativno, radi postizanja indirektne konjugacije oznake sa antitelom, antitelo može da bude konjugovano sa malim haptenom (poput digoksina) a jedan od različitih tipova oznaka pomenutih gore je konjugovana sa anti-hapten antitelom (npr., anti-digoksin antitelom). Ovako, može da se postigne indirektna konjugacija oznake sa antitelom.

[0249]Primeri oznaka radioizotopa uključuju35S,14C,12<5>l,<3>H, i<131>l. Antitelo može da bude označeno sa radioizotopom, korišćenjem postupaka opisanih u, na primer, Current Protocols in Immunologv, Volumes 1 i 2,1991, Coligen et al., Ed. Wiley-lnterscience, New York, N.Y., Pubs. Radioaktivnost može da se meri, na primer, scintilacionim brojanjem.

[0250]Primeri fluorescentnih oznaka uključuju oznake izvedene iz retkih zemljanih helata (europijum helati) ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, danzil, Lisamin, fikoeritrin, i Texas Red su dostupni. Fluorescentne oznake mogu da budu konjugovane sa antitelom poznatim postupcima, poput onih opisanih u Current Protocols in Immunologv, na primer. Fluorescencija može se kvantif i kovati korišćenjem fluorimetra.

[0251]Postoje različite, dobro okarakterisane enzim-supstrat oznake poznate stručnjaku (videti, npr., U.S. Pat. Br. 4,275,149 za pregled). Enzim uopšteno katalizuje hemijske promene hromogenskog supstrata koje mogu da se mere korišćenjem raznih postupaka. Na primer, promene mogu da izazovu promenu boje u supstratu koja se može meriti spektrofotometrijski. Alternativno, enzim može da promeni fluorescenciju ili hemiluminescenciju supstrata. Postupci za kvantifikovanje promene u fluorescenciji opisani su gore. Hemiluminescentni supstrat postaje elektronski pobuđen hemijskom reakcijom i može da emituje svetlost koja može da se meri, korišćenjem hemiluminometra, na primer, ili donira energiju fluorescentnom akceptoru.

[0252]Primeri enzimskih oznaka uključuju luciferaze poput luciferaze svica i bakterijske luciferaze (U.S. Pat. Br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazinedione, malat dehidrogenazu, ureazu, peroksidazu poput peroksidaze rena (HRPO), alkalnu fosfatazu, (3-galaktozidazu, glukoamilazu, lizozim, saharid oksidaze (poput glukoza oksidaze, galaktoza oksidaze, i glukoza-6-fosfat dehidrogenaze), heterociklične oksidaze (poput urikaze i ksantin oksidaze), laktoperoksidazu, mikroperoksidazu, i slično. Postupci za konjugaciju enzima sa antitelima opisana je, na primer, u O'SuIlivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzvme-Antibodv Conjugates for use in Enzvme immunoassav, in Methods in Enzvm. (J. Langone &. H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73:147-166.

[0253]Primeri enzim-supstrat kombinacija uključuju, na primer: peroksidazu rena (HRPO) sa vodonik peroksidazom kao supstratom, pri čemu vodonik peroksidaza oksiduje bojeni prekursor poput ortofenilen diamina (OPD) ili 3,3',5,5'-tetrametil benzidin hidrohlorida (TMB); alkalnu fosfatazu (AP) sa para-Nitrofenil fosfatom kao hromogenskim supstratom; i B-D-galaktozidazu (B-D-Gal) sa hromogenskim supstratom poput p-nitrofenil-p-D-galatozidaze ili fluorogen supstrat 4-metilumbeliferil-P-D-galaktozidaze.

[0254]Brojne deuge enzim-supstrat kombinacije dostupne su stručnjacima iz oblasti. Za opšti pregled ovoga, videti U.S. Pat. Br. 4,275,149 i U.S. Pat. Br. 4,318,980.

[0255]U drugom ostvarenju, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo koristi se neoznačeno i detektuje se sa označenim antitelom koje vezuje humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo.

[0256]Antitela opisana ovde mogu da se koriste u bilo kom poznatom oglednom postupku, poput ogleda kompetitivnog vezivanja, direktni ili indirektni umetnuti ogledi, i ogledi imunoprecipitacije. Videti, npr., Zola, Monoklonski Antitela: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

[0257]Anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može da se koristi za inhibiciju vezivanja IL-23 za IL-23 receptor. Takvi postupci obuhvataju davanje anti-IL-23pl9 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragment za ćeliju (npr., ćelija sisara) ili ćelijsku okolinu, pri čemu je inhibirana signalizacija posredovana IL-23 receptorom. Ovi postupci mogu se izvestiin vitroiliin vivo.Pod "ćelijskom okolinom" smatra se tkivo, medjium, ili ekstracelularna matrica koja okružuje ćeliju. Anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment daje se ćelijskoj okolini ćelije na takav način da je antitelo ili fragment sosoban da se veže za IL-23 molekule spolja i oko ćelije, stoga, sprečavajući vezivanje IL-23 za svoj receptor.

Dijagnostički Kitovi

[0258]Anti-IL-23pl9, antitelo može da se koristi u dijagnostičkom kitu, tj., upakovanoj kombinaciji reagenasa u predodređenim količinama sa instrukcijama za izvođenje dijagnostičkog ogleda. Kada je antitelo označeno sa enzimom, kit može da uključuje supstrate i kofaktore potrebne od strane enzima poput supstrat prekursora koji obezbeđuje detektabilni hromofor ili fluorofor. Dodatno, drugi aditivi mogu da budu uključeni poput stabilizatora, pufera (na primer blokirajući pufer ili pufer lize), i slično. Relativne količine različitih reagensa mogu da veoma variraju da bi obezbedeli za koncentracije u rastvoru reagenasa koje supstancijalno optimizuju osetljivost ogleda. Reagensi mogu da budu obezbećeni kao suvi praškovi, obično liofilizovani, uključujući ekscipijente koji će na rastvaranje da obezbede rastvor reagensa koji ima odgovarajuću koncentraciju.

Terapeutske upotrebe

[0259]U drugom ostvarenju, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo opisano ovde korisno je u tretiranju različitih poremećaja povezanih sa ekspresijom IL-23pl9 kao što je opisano ovde. Postupci za tretiranje IL-23 povezanog poremećaja obuhvataju davanje terapeutski efektivne količine humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela subjektu kojem je to potrebno.

[0260]Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili agens daje sa na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralno, subkutano, intraperitonealno, intrapulmonarno, i intranazalno, i, ako je poželjno lokalno imunosupresivno tretiranje, intralezionalno davanje (uključujući prelivanjem ili na drugi način povezati graft sa antitelom pre transplatacije). Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili agens može da se primeni, na primer, kao infuzija ili kao bolus. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravenoznu, intraarterialnu, intraperitonealnu, ili subkutanu primenu. Dodatno, humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo je povoljno primenjeno pulsnom infuzijom, naročito sa opadajućim dozama antitela. U jednom aspektu, doza se daje injekcijom, najpoželjnije intravenoznom ili subkutanom injekcijom, zavisno delimično od toga da lije davanje kratko ili hronično.

[0261]Za prevenciju ili tretiranje bolesti, odgovarajuća doza antitela zavisiće od raznih faktora poput vrste bolesti koja se tretira, kao što je definisano gore, ozbiljnosti i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, pacijentove kliničke istorije i odgovora na antitelo, i diskrecije prisutnog lekara. Antitelo je pogodno dato pacijentu jedanput ili tokom serije tretmana.

[0262]U zavisnosti od vrste i ozbiljnosti bolesti, oko 1 u.g/kg do 20 mg/kg (npr., 0,1-15 mg/kg) antitela

je je inicijalni dozni kandidat za primenu na pacijenta, ili, na primer, jednom ili više odvojenih primena, ili kontinuiranom infuzijom. Tipična dnevna doza može da ima opseg od oko 1 u.g/kg do 100 mg/kg ili viši, u zavisnosti od faktora pomenutih gore. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretiranje se održava dok se željena supresija simptoma bolesti ne primeti. Međutim, mogu da budu korisni drugi dozni režimi. Napredak ove terapije lako se prati konvencionalnim postupcima i ogledima. Primer doznog režima opisan je u WO 94/04188.

[0263]Pojam "supresija" koji se ovde koristi u istom kontekstu kao "poboljšanje" i "olakšanje" znači smanjivanje jedne ili više karakteristika bolesti.

[0264]Kompozicija antitela biće formulisana, dozirana, i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju određen poremećaj koji se tretira, određenog sisara koji se tretira, kliničko stanje posebnog pacijenta, uzrok poremećaja, tmesto dostavljanja agensa, postupak primene, raspored primene, i druge faktore poznate lekarima. "Terapeutski efektivna količina" antitela koje se primenjuje biće regulisana takvim razmatranjima, i predstavlja minimalnu količinu potrebnu da spreči, poboljša, ili tretira poremećaj povezan sa IL-23 ekspresijom.

[0265]Antitelo ne mora da bude, ali je opciono, formulisano sa jednim ili više agensa koji se trenutno koriste za prevenciju ili tretiranje poremećaja koji je u pitanju. Efektivna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili tretiranja, i drugih faktora opisanih gore. Oni se uopšteno koriste u istim dozama i na načine primene koji se koriste ovde ranije ili oko od 1 do 99% ranije primenjenih doza.

IL-23-Povezani poremećaji

[0266]Anti-IL-23pl9 antitela ili agensi korisni su za tretiranje ili prikazivanje imunološkog, poremećaja koji se karakteriše abnormalnom ekspresijom IL-23, npr., neodgovarajućom aktivacijom imunih ćelija (npr., limfocita ili dendričnih ćelija). Takva abnormalna ekspresija IL-23 može da bude usled, na primer, povećanih nivoa IL-23 proteina. Anti-IL-23pl9 antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti takođe nalaze primenu u tretiranju ili prevenciji respiratornih poremećaja, metaboličkih poremećaja, na primer šećerne bolesti, i određenih kancera. Tretiranje ili prevencija imunoloških poremećaja, respiratornih poremećaja, metaboličkih poremećaja ili kancera, prema postupcima opisanim ovde, postiže se davanja anti-IL-23pl9 antitela ili agensa subjektu kojem je potreban takav tretman ili prevencija, pri čemu antitelo smanjuje aktivnost IL-23 povezanu sa stanjem bolesti.

[0267]Imunološke bolesti koje se karakterišu odgovarajućom aktivacijom imunih ćelija i koje mogu da se tretiraju ili spreče postupcima opisanim ovde mogu da se klasifikuju, na primer, vrstom(a) reakcije(a) hipersenzitivnosti na kojima se zasniva poremećaj. Ove reakcije obično se klasifikuju u četiri vrste: anafilaktičke reakcije, citotoksične (citolitičke) reakcije, imuno kompleksne reakcije, ili ćelijski posredovane imunosti (CMI) reakcije (takođe se odnose kao odložena vrsta reakcija hipersenzitivnosti

(DTH)). (Videti, npr., Fundamental lmmunology (VVilliam E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3rd ed. 1993).) Imunološke bolesti uključuju zapaljenske bolesti i autoimune bolesti.

[0268]Određeni primeri takvih imunoloških bolesti uključuju sledeće: reumatoidni artritis, autoimune demijelinizirajuće bolesti (npr., multipla sklerozu, alergijski encefalomijelitis), endokrinu oftalmopatiju, uveoretinitis, sistemski eritemski lupus, miasteniju gravis, Grejvsovu bolest, glomerulonefritis, autoimuni hepatološki poremećaj, zapaljensku bolest creva (npr., Kronova bolest ili ulcerozni kolitis), anafilaksis, alergijsku reakciju, Sjogrenov sindrom, šećernu bolest tipa I, primarnu bilijarnu cirozu, VVegenerov granulomatozis, fibromialgiju, polimiozitis, dermatomiozitis, inflamatorni miozitis, multipla endokrini poremećaj, Šmitov sindrom, autoimuni uveitis, Adisonovu bolest, adrehalitis, tiroiditis, Hašimotov tiroiditis, autoimunu tiroidnu bolest, pernicioznu anemiju, gastričnu atrofiju, hronični hepatitis, lupoidni hepatitis, aterosklerozu, subakutni kutani eritemski lupus, hipoparatiroidizam, Dreslerovsindrom, autoimunu trombocitopenija, idiopatsku trombocitopeničnu purpuru, hemolitičnu anemiju, pemfigus vulgaris, pemfigus, dermatitis herpetiformis, alopecija arcata, pemfigoid, sklerodermu, progresivnu sistemsku sklerozu, CREST sindrom (kalcinoza, Rejnoov fenomen, dismotilitet jednjaka, sklerodaktilija), i teleangiektazija), mušku i žensku autoimunu neplodnost, ankilozni spondilitis, ulcerozni kolitis, mešovitu bolest vezivnog tkiva, poliarteritis nedozu, sistemski nekrotizirajući vaskulitis, atopijski dermatitis, atopijski rinitis, Goodpastureov sindrom, Chagasovu bolest, sarkoidozu, reumatsku groznicu, astmu, rekurentni pobačaj, anti-fosfolipidni sindrom, pluća farmera, eritema multiforme, post kardiotomijski sindrom, Cushingov sindrom, autoimuni hronični aktivni hepatitis, pluća odgajivača ptica, toksičnu epidermalnu nekrolzu, Alportov sindrom, alveolitis, alergijski alveolitis, fibrozu, alveolitis, intersticijalnu plućnu bolest, eritema nodozum, pioderma gangrenozum, transfuzionu reakciju, Takavasuov arteritis, polimialgija reumatika, temporalni arteritis, šistozomijazu, arteritis džinovskih ćelija, askarijazu, aspergilozu, Sampterov sindrom, ekcem, limfomatoidnu granulomatozu, Behcetovu bolest, Kaplanov sindrom, Kavvasaki bolest, dengu, encefalomijelitis, endokarditis, endomiokardialnu fibrozu, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, psorijazu, psorijazni artritis, fetalnu eritroblastozu, eozinofilni fascitis, Šulmanov sindrom, Feltijev sindrom, filarijazu, ciklitis, hronični ciklitis, heterohronični ciklitis, Fuchov ciklitis, IgA nefropatiju, Henoch-Schonlein purpuru, bolest kalem protiv domaćina, odbacivanje transplanta, kardiomiopatiju, Eaton-Lambert sindrom, povratni polihondritis, krioglobulinemiju, Waldenstromovu makroglobulemiju Evansov sindrom, akutni respiratorni distres sindrom, zapaljenje pluća, osteoporozu, odloženi tip hipersenzitivnosti i autoimuni poremećaj gonade.

[0269]U nekim ostvarenjima, imunološki poremećaj je T ćelijski-posredovan imunološki poremećaj i prema tome, anti-IL-23pl9 antitela i agensi su, kao što je opisano ovde, takođe korisni za tretiranje ili prevenciju Tćelijski posredovanih imunoloških poremećaja.

[0270]U jednom aspektu, anti-IL-23pl9 antitela ili agensi korisni su za tretiranje ili prevenciju respiratorniog poremećaja u kojem je IL-23 abnormalno eksprimiran. Tretiranje ili prevencija respiratornog poremećaja, prema postupcima opisanim ovde, postiže se davanjem efektivne količine anti-IL-23pl9 antitele ili agensa subjektu kojem je potreban takav tretman ili prevencija, pri čemu antitelo smanjuje aktivnost IL-23 povezanu sa stanjem bolest. Ovo uključuje, ali ne ograničava se na: respiratorne bolesti, opstruktivne bolesti pluća različitog porekla, emfizem pluća različitog porekla, restriktivne bolesti pluća, intersticijumske pulmonarne bolesti, intersticijumsku bolest pluća, cističnu fibrozu, bronhitis različitog porekla, bronhiektazije, RSDO (respiratorni distres sindrom odreslih) i sve oblike, edema pluća; opstruktivne bolesti pluća izabrane od između HOBP (hronične opstruktivne bolesti pluća), astme, bronhialne astme, pedijatrijske astme, ozbiljne astme, akutnih napada astme i hroničnog bronhitisa; emfizem pluća čije je poreklo u HOBP (hronična opstruktivna bolest pluća) ili nedostatak inhibitora al-proteinaze; restriktivne bolesti pluća izabrane od između alergijskog alveolitisa, restriktivnih bolesti pluća aktiviranih vezano za rad štetnih supstanci, poput azbestoze ili silikoze, i ograničenja prouzrokovanih tumorima pluća, poput karcinomske limfagioze, bronhoalveolarnog karcinoma i limfoma; pneumonije prouzrokovane infekcijijama, poput na primer infekcije virusima, bakterijama, gljivicama, protozoama, helmintima ili drugim patogenima, pneumonitis prouzrokovan različitim faktorima, poput na primer aspiracije i insufincijencije leve strane srca, radijacijom-indukovani pneumonitis ili fibrozu, kolagenozu, poput na primer eritemskog lupusa, sistemske skleroderme ili sarkoidoze, granulomatozu, poput na primer Boeckove bolesti, idiopatsku intersticijalnu pneumoniju ili idiopatsku plućnu fibrozu (IPF); mukoviscidozu, bronhitis uzrokovan bakterijskom ili virusnom infekcijom, alergijski bronhitis i toksični bronhitis; bronhiektazije; edem pluća, na primer, toksični edem pluća nakon aspiracije ili inhalacije toksične supstance i stranih supstanci; rinitis, artritis i povezane artropatije, psorijazu, mijeloidnu leukemiju, multipla sklerozu, Alchajmerovu bolest, glomerulonefritis, i hronični atopijski dermatitis.

[0271]U drugom aspektu, anti-IL-23pl9 antitela i agensi su, kao što je opisano ovde, takođe korisni za tretiranje kancera, u kojima IL-23 je abnormalno ispoljen.

[0272]IL-23-eksprimirajući kanceri koji se mogu tretirati postupcima opisanim ovde uključuju, na primer, leukemiju, poput akutne leukemije, akutne limfocitne leukemije, akutne mijelocitne leukemije

(npr., mijeloblastne, promijelocitne, mijelomonocitne, monocitne, ili eritroleukemije), hronične leukemije, hronične mijelocitne (granulocitne) leukemije, ili hronične limfocitne leukemije; Policitemija vera; Limfoma (npr., Hodžkinova bolest ili Ne-Hodžkinova bolest); multipla mijeloma, VValdenstromova makroglobulinomiju; bolest teškog lanca; čvrste tumore poput sarkoma i karcinoma (npr., fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteogenetski sarkom, osteosarkom, hordoma, angiosarkom, endoteliosarkom, limfangiosarkom, limfangioendoteliosarkom, sinovioma, mezotelioma, Evvingov tumor, lejomiosarkom, rabdomijosarkom, karcinom kolona, karcinom debelog creva, kancer pankreasa, kancer dojke, kancer jajnika, kancer prostate, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom, karcinom znojnih žlezda, karcinom lojnih žlezda, papilarni karcinom, papilarni adenokarcinome, cistadenokarcinom, medularni karcinom, bronhogenetski karcinom, karcinom renalnih ćelija, hepatom, karcinom žučnog kanala, horiokarcinom, seminom, embrionalni karcinom, Wilmsov tumor, cervikalni kancer, kancer materice, tumor testisa, karcinom pluća, mikrocelularni karcinom pluća, nemikrocelularni karcinom pluća, karcinom bešike, epitelialni, karcinom, gliom, astrocitom, meduloblastom, kraniofaringeom, ependimom, pinealom, hemangioblastom, akustični neurom, oligodendrogliom, menangiom, melanom, neuroblastom, retinoblastom, nazofaringealni karcinom, ili ezofagealni karcinom).

Farmaceutske kompozicije i njihova primena

[0273]Kompozicija koja obuhvata IL-23pl9 vezujući agens (npr., anti-IL-23pl9 antitelo) može da se primeni na subjekta koji ima ili je pod rizikom da oboli od imunološkog poremećaja, respiratornog poremećaja ili kancera. Opis dalje obezbeđuje za upotrebu IL-23pl9 vezujućeg agensa (npr., anti-IL-23pl9 antitela) u proizvodnji leka za prevenciju ili tretiranje kancera, respiratornog poremećaja ili imunološkog poremećaja. Pojam "subjekt" koji se ovde koristi predstavlja bilo kog sisara kao pacijenta kom se daje IL-23pl9 vezujući agens, uključujući, npr., ljude i druge sisare, poput primata, glodara i pasa. Subjekti posebno namenjeni za tretiranje korišćenjem postupaka opisanih ovde uključuju ljude. Antitela ili agensi mogu da se primene ili samostalno ili u kombinaciji sa drugim kompozicijama u prevenciji ili tretiranju imunoloških poremećaja, respiratornih poremećaja ili kancera. Takve kompozicije koje se mogu primeniti u kombinaciji sa antitelima ili agensima uključuju metotreksat (MTX) i imunomodulatore, npr. antitela ili male molekule.

[0274]Primeri antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su oni koji obuhvataju humanizovano antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline varijabilne regije lakog lanca bilo koju od SEQ I D NO: 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99,101,103,105,107,109,111,113,115, 117 ili 119. Primeri antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su takođe ona koja obuhvataju humanizovano antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline varijabilne regije teškog lanca bilo koju od SEQ ID NO: 121,123,125,127,128,130,132,134,136,138,140,142, 144,146, 148, 150,152, 154 ili 156.

[0275]Sledeći primeri antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su takođe oni koji obuhvataju humanizovano antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline varijabilne regije lakog lanca bilo koju od SEQ ID NO:158,160,162 ili 164. Poželjna antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su takođe ona koja obuhvataju humanizovano antitelo ili fragment antitela koji ima sekvencu aminokiseline varijabilne regije teškog lanca bilo koju od SEQ ID NO:166,168, 170 ili 172.

[0276]Sledeći primeri antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su takođe oni koji obuhvataju humanizovano antitelo ili fragment antitela koji ima varijabilnu regiju lakog lanca i varijabilnu regiju teškog lanca bilo koju od SEQ ID NO: 160 i 166, SEQ ID NO: 160 i 168, SEQ ID NO: 158 i 166 ili SEQID NO: 158 i 168.

[0277]Sledeći primeri antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su takođe oni koji obuhvataju humanizovano antitelo koje ima sekvencu aminokiseline regije lakog lanca bilo koju od SEQ ID NO:174 ili 180. Poželjna antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su takođe ona koja obuhvataju humanizovano antitelo koje ima sekvencu aminokiseline varijabilne regije teškog lanca bilo koju od SEQ ID NO:176 ili 178.

[0278]Sledeći primeri antitela za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su takođe oni koji obuhvataju Antitelo A, Antitelo B, Antitelo C ili Antitelo D.

[0279]Poznati su različiti sistemi za dostavu i mogu da se koriste za davanje IL-23pl9 vezujućeg agensa. Postupci uvođenja uključuju, ali ne ograničavaju se na, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenozne, subkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve. IL-23pl9 vezujući agens može da se daje, na primer infuzijom, bolusom ili injekcijom, i može da se primeni zajedno sa drugim bioločki aktivnim agensima poput hemoterapeutskih agensa. Primena može da bude sistemska ili lokalna. U poželjnim ostvarenjima, primenjuje se subkutanim injektiranjem. Formulacije za takvo injektiranja mogu se pripremiti, na primer, prethodnim punjenjem šprica i mogu se dati jedanput svake druge nedelje.

[0280]U posebnim ostvarenjima, kompozicija IL-23pl9 vezujućeg agensa primenjuje se injektiranjem, pomoću katetra, pomoću supozitorija, ili pomoću implanta, pri čemu je implant porozan, neporozan ili želatinozan materijal, uključujući membranu, poput sialastične membrane ili vlakna. Obično, kada se daje kompozicija, koriste se materijali na kojima se anti-IL-23pl9 antitelo ili agens ne apsorbuje.

[0281]U drugim ostvarenjima, anti-IL-23pl9 antitelo ili agens dostavlja se u sistem kontrolisanog oslobađanja. U jednom ostvarenju, može da se koristi pumpa (videti, npr., Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. End. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). U drugom ostvarenju, mogu da se koriste polimerni materijali. (Videti, npr., Medical Applications of Controlled Release (Langer i Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailabilitv, Drug Product Design and Performance (Smolen i Bali ends., Wiley, New York, 1984); Rangeri Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Videti takođe Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Hovvard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105.) Drugi sistemi kontrolisanog oslobađanja opisani su, na primer, u Langer, gore.

[0282]IL-23pl9 vezujući agens (npr., anti-IL-23pl9 antitelo) može da se primeni kao farmaceutske kompozicije koje obuhvataju terapeutski efektivnu količinu vezujućeg agensa i jednog ili više farmaceutski kompatabilnih sastojaka.

[0283]U tipičnim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija formulisana je u skladu sa rutinskim postupcima kao farmaceutska kompozicija adaptirana za intravenoznu ili subkutanu primenu na ljude. Obično, kompozicije za primenu injektiranjem su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Gde je potrebno, farmaceutski preparat može takođe da uključuje agens za rastvaranje i lokalni anestetik poput lignokain za ublažavanje bola na mestu injektiranja. Uopšteno, sastojci se dostavljaju ili zasebno ili umešani zajedno u jediničnom doznom obliku, na primer, kao suvi lifilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenom kontejneru poput ampule ili kesice naznačene količine aktivnog agensa. Kada se farmaceutski preparat primenjuje preko infuzije, može se dati preko boce za infuziju koja sadrži sterilnu vodu ili slani rastvor farmaceutskog kvaliteta. Gde se farmaceutski preparat daje injektiranjem, ampula sa sterilnom vodom za injekciju ili slanim rastvorom može da se obezbedi tako što se sastojci umešaju pre primene.

[0284]Dalje, farmaceutska kompozicija može da se obezbedi kao farmaceutski kit koji obuhvata (a) kontejner koji sadrži IL-23pl9 vezujući agens (npr., anti-IL-23pl9 antitelo) u liofilizovanom obliku i (b) drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv razblaživač (npr., sterilnu vodu) za injekciju. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač može da se koristi za rekonstituciju ili razblaživanje liofilizovanog anti-IL-23pl9 antitela ili agensa. Opciono povezano sa takvim kontejnerom(ima) može da bude obaveštenje u obliku koji propisuje vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih preparata ili bioloških proizvoda, koje obaveštava o odobrenju od strane agencije koje se odnosi na proizvodnju, upotrebu ili prodaju za ljudsku primenu.

[0285]Količina IL-23pl9 vezujućeg agensa (npr., anti-IL-23pl9 antitela) koja je efektivna u tretiranju ili prevenciji imunološkog poremećaja ili kancera može da se odredi standardnim kliničkim postupcima. Dodatno, in vitro ogledi mogu opciono da budu uključeni da bi pomogli u identifikaciji optimalnih doznih opsega. Precizna doza koja se koristi u formulaciji takođe će da zavisi od načina primene i stupnja imunološkog poremećaja ili kancera, i treba da se donese odluka prema mišljenju lekara i stanja svakog pacijenta. Efektivne doze mogu se dobiti ekstrapolacijom iz krivih odgovora na dozu koje se izvode iz testiranih sistema in vitro ili životinjskog modela.

[0286]Uopšteno, doza anti-IL-23pl9 antitela ili IL-23pl9 vezujućeg agensa datog pacijentu sa imunološkim poremećajem ili IL-23pl9-eksprimiranim kancerom je obično oko 0,1 mg/kg do oko 100 mg/kg telesne mase subjekta. Doza data pacijentu je oko 0,1 mg/kg do oko 50 mg/kg, oko mg/kg do oko 30 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 15 mg/kg, ili oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg telesne mase subjekta.

[0287]Primeri doza uključuju, ali ne ograničavaju se na, od 1 ng/kg do 100 mg/kg. U nekim ostvarenjima, doza je oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg ili oko 16 mg/kg. Doza može da se primeni, na primer, dnevno, jedanput u nedelji (nedeljno), dvaput u nedelji; triput u nedelji, četri puta u nedelji, pet puta u nedelji, šest puta u nedelji, dvonedeljno ili mesečno, svaka dva meseca, ili svaka tri meseca. U posebnim ostvarenjima, doza je oko 0,5 mg/kg/nedelja, oko 1 mg/kg/nedelja, oko 2 mg/kg/nedelja, oko 3 mg/kg/nedelja, oko 4 mg/kg/nedelja, oko 5 mg/kg/nedelja, oko 6 mg/kg/nedelja, oko 7 mg/kg/nedelja, oko 8 mg/kg/nedelja, oko 9 mg/kg/nedelja, oko 10 mg/kg/nedelja, oko 11 mg/kg/nedelja, oko 12 mg/kg/nedelja, oko 13 mg/kg/nedelja, oko 14 mg/kg/nedelja, oko 15 mg/kg/nedelja ili oko 16 mg/kg/nedelja. U nekim ostvarenjima, opseg doze je od oko 1 mg/kg/nedelja do oko 15 mg/kg/nedelja.

[0288]U nekim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije koje obuhvataju IL-23pl9 vezujući agens mogu dalje da obuhvataju terapeutski agens, ili konjugovan ili nekonjugovan sa vezujućim agensom. Anti-IL-23pl9 antitelo ili IL-23pl9 vezujući agens može da se istovremeno primeni u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih agensa za tretiranje ili prevenciju imunoloških poremećaja ili kancera.

[0289]Takva kombinovana primena terapije može da ima aditiv ili sinergijski efekat na parametre bolesti (npr., ozbiljnost simptoma, broj simptoma ili učestalost recidiva).

[0290]U pogledu terapeutskih režima za kombinovanu primenu, u određenom ostvarenju, anti-IL-23pl9 antitelo ili IL-23pl9 vezujući agens daje se istovremeno sa terapeutskim agensom. U drugom određenom ostvarenju, terapeutski agens daje se pre ili nakon primene anti-IL-23pl9 antitela ili IL-23pl9 vezujućeg agensa, najmanje sat i do nekoliko meseci, na primer najmanje jedan sat, pet sati, 12 sati, dan, nedelja, mesec, ili tri meseca, pre ili nakon primene anti-IL-23pl9 antitela ili IL-23pl9 vezujućeg agensa.

Proizvedeni artikli

[0291]U drugom aspektu, uključen je proizvedeni artikal koji sadrži materijale korisne za tretiranje poremećaja opisanih gore. Proizvedeni artikal obuhvata kontejner i oznaku. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, bočice, fiolice, špriceve i epruvete za testiranje. Kontejneri mogu da se izrade od različitih materijala poput stakla ili plastike. Kontejner sadrži kompoziciju koja je efektivna za tretiranje stanja i može da ima sterilni pristupni otvor. Na primer, kontejner može da bude kesa sa rastvorom za intravenozno davanje ili fiolica koja ima čep koj može da se probuši iglom za potkožno injektiranje. Aktivni agens u kompoziciji je humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo. Oznaka na ili povezana sa kontejnernom označava da se kompozicija koristi za tretiranje stanja prema izboru. Proizvedeni artikal može dalje da obuhvata drugi kontejner koji obuhvata farmaceutski-prihvatljiv pufer, poput fosfat-puferovanog slanog rastvora, Ringerovog rastvora i rastvora dekstroze. Može dalje dalje da uključuje druge materijale koji su komercijalno poželjni i sa stanovišta korisnika, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i uputstva sa unstrukcijama za upotrebu.

[0292]Ovaj pronalazak je dalje opisan u primerima koji slede, koji ne ograničavaju obim ovog pronalaska.

Primeri

Primer 1: Proizvodnja Humanizovanih Anti-IL-23pl9 Antitela

[0293]Mišje vodeće antitelo 6B8 konvertovano je u himerno antitelo koje se sastoji od mišjeg varijabilnog domena 6B8 i humanog konstantnog IgGIKO domena. Miješ antitelo 6B8 prethodno je prikazano ovde u Tabelama 1 i 2. IgGIKO (knock out) ima dve mutacije zamene (Leu234Ala i Leu235Ala) koje eliminišu ADCC i CDC aktivnost smanjenjem efektorne funkcije poput FcvR i komplementarnog vezivanja. Varijabilni domeni mišjih i himernih antitela su identični. Himerna antitela generisana su radi potvrđivanja funkcije antitela i radi osiguravanja dobijanja ispravne sekvence. Varijabilna regija antitela je potom humanizovana putem dizajna i postupka skrininga. Biblioteka je napravljena tako da humani i mišji ostaci variraju na takav način da u bilo kom datom položaju može da bude ili humani ili mišji ostatak. Takva biblioteka izrađena je za one aminokiseline koje se razlikuju između humanog antitela germinativne linije i mišjeg antitela. Izabrani su samo klonovi koji zadržavaju funkciju matičnog mišjeg antitela. Reprezentativne humanizovane varijabilne regije za antitelo 6B8 prikazane su u Tabelama 5 i 6.

[0294]Na ovaj način, Antitelo A, Antitelo B, Antitelo C i Antitelo D bila su humanizovana antitela dobijena od mišjeg antitela 6B8 (koloniran u humanom IgGl-KO (KO=knock-out)/kapa iz kičme. Antitela A, B, C i D prikazana su u Tabeli 7.

Primer 2: Vezivanje antitela za rekombinantni IL-23 protein

[0295]

A) Kinetike i afinitet vezivanja mišjih anti-IL-23pl9 antitela za rekombinantni humani IL-23 prikazani su dole (Tabela 9). Kinetike i afiniteti vezivanja mereni su korišćenjem Fortebio Octet (Fortebio, Menlo Park, CA) upotrebom materijala generisanih iz hibridome praćeno pojedinačnim kolonskim

prečišćavanje. Budući da Octet nije tehnologija zasnovana na fluidu, ovaj postupak ne obezbeđuje precizno određivanje brzine povratne reakcije. U nekim slučajevima, samo procenjuje afinitet koji se može dobiti. B) Afiniteti su mereni za humanizovana antitela dobijena od mišjeg antitela 6B8. Podaci kinetike vezivanja, koji su mereni korišćenjem ProteON XPR36 (Biorad, Hercules, CA) i globalno podešeni za 1:1 model vezivanja, pokazali su interakcije sa rekombinantnim IL-23 bilo sa ili bez 21 aminokiselinskog linkera koji kovalentno spaja pl9 i p40 subjedinice radi visokog afiniteta, u opsegu od 1 pM ~ 100 pM (Tabela 10). Takođe su testirana Antitelo 6H12 (opisano u WO 2007/027714), antitelo QF20 (opisano u WO 2007/024846) i antitelo C1273 (opisano u WO 2007/005955). C) Podaci afiniteta i kinetike za vezivanje anti-IL-23pl9 antitela za cinomologusni IL-23 mereni su na ProteON XPR36, i globalno podešeni za 1:1 model vezivanja (Tabela 11). Takođe su testirani Antitelo 6H12 (opisano u WO 2007/027714), antitelo QF20 (opisano u WO 2007/024846) i antitelo C1273 (opisano u WO 2007/005955).

D) Molekularna selektivnost na humani IL-12

Anti-IL-23pl9 antitela takođe injektirana na površini humanog IL-12 u koncentraciji od 100 nM. Signal vezivanja za ova antitela meren korišćenjem Fortebio Octet je nula, što ukazuje da se ova antitela selektivno vezuju za humani IL-23. Vezivanje anti-IL-23pl9 antitela za IL-23 takođe je analizirano u prisustvu 50% humanog seruma i nije primećen nikakav značajan efekat seruma na brzinu napredovanja vezivanja demonstrirajući visoku specifičnost.

Primer 3: Ogled kompetitivnog vezivanja humanog IL-23 kojisevezuje za humani IL-23R/Fc

[0296]Humani IL-23R-Fc uhvaćen je na površini biosenzora i injektirano je 10 nM humanog IL-23. Senzorgram ukazuje na specifično vezivanje IL-23 i IL-23 receptora (Fig. 2, gornji zapis). Antitela su potom istovremeno injektirana sa 10 nM humanim IL-23 da bi se procenilo da li vezivanje antitela sa IL-23 može da inhibira interakciju između IL-23 i IL-23 receptora. U ovom primeru, ako se antitelo vezuje za humani IL-23 i ako je sposobno da inhibira interakciju onda će doći do smanjenja ili neće ni doći do vezivanja (Fig. 2, donji zapis). U primeru prikazan je ekvivalentna molarna koncentracija Antitela A koje je istovremeno injektirano sa 10 nM rekombinantnog humanog IL-23.

Primer 4: Funkcionalni ćelijski ogledi, inhibicija IL-17 proizvodnje iz IL-23 stimulisanih mišjih splenocita

[0297]U jednom funkcionalnom ćelijskom ogledu anti-IL-23pl9 antitela meri se njihova sposobnost da IL-23 stimuliše IL-17 proizvodnju iz mononuklearnih ćelija izolovanih iz mišjih slezina. Humani

rekombinantni IL-23 protein može da stimuliše IL-17 oslobađanje iz mišjih splenocita. Dodatno, prirodni izvor humani IL-23 koji se nalazi u supernatantu aktiviranih humanih monocitičnih THP-1 ćelija može da se koristi za stimulisanje IL-17 proizvodnje iz mišjih mononuklearnih ćelija.

[0298]Humani rekombinantni IL-23 ili prirodni humani IL-23 iz aktiviranih THP-1 ćelija je prethodno inkubiran sa titriranim anti-IL-23pl9 antitelima. Kombinacije IL-23/antitela potom su dodate sveže izolovanim mišjim splenocitima. Rekombinantna IL-23 samostalno je korišćena kao pozitivna kontrola. Nakon dva dana u kulturi, ćelijski supernatanti su prikupljeni i ispitivani za IL-17 pomoću ELISA (R&D Sistems, Minneapolis, MN). Dole su prikazane reprezentativne količine IC50 za anti-IL-23pl9 antitela. Testirana antitela su mišja antitela izvedena iz hibridoma (redovi 1-19, videti Tabele 1 i 2), himernih antitela (redovi 20-23) i iz Antitela A do D. Takođe su testirana Antitelo 6H12 (opisano u WO 2007/027714), antitelo QF20 (opisano u WO 2007/024846) i antitelo C1273 (opisano u WO 2007/005955).

Primer 5: Testiranje funkcionalne specifičnosti za IL-12 u ogledu sa humanim aktiviranim T ćelijama

[0299]Anti-IL-23pl9 antitela testirana su za funkcionalnu inhibiciju IL-12 u ogledu sa humanim aktiviranim T ćelijama. Humani rekombinantni IL-12 (1 ng/ml) je prethodno inkubiran sa 5 u.g/ml anti-IL-23pl9 antitela. Kombinacije IL-12/antitela potom su dodate humanim PHA-izvedenim Tćelijskim blastima. Rekombinantni IL-12 samostalno je korišćen kao pozitivna kontrola. Anti-IL-12p70 antitelo (Bender MedSistems, Vienna, Austria) korišćeno je kao kontrolno inhibitorno antitelo. Nakon dva dana u kulturi, ćelijski supernatanti prikupljeni su i testirani za IFN-y pomoću ELISA (R&D Sistemi). Uzorci su testirani u triplikatu i određenje prosečna pg/ml od IFN-y. Rezultati (sa standardnim devijacijama) prikazani su u tabeli dole.

Primer 6: Inhibicija IL-23 indukovane STAT3 fosforilacije u humanoj ćelijskoj liniji DB

[0300]Humana ćelijska linija DB (ATCC, Manassas, VA) odgovara na IL-23 stimulaciju preko endogenog IL-23R kompleksa (IL-23R i IL-12R01) i fosforiliše STAT3 na način koji zavisi od doze IL-23. Razvijen je ogled za ispitivanje inhibicije IL-23 indukovane STAT3 fosforilacije od strane anti-IL-23pl9 antitela. DB ćelije postavljene su sa Ixl0e6 ćelija/bazenčić u 96 ploča sa bazenčićima. Antitela koja su testirana su serijski razblažena i prethodno inkubirana sa rekombinantnim humanim IL-23 (10 ng/ml) za 1 sat na sobnoj temperaturi. Antitelo/IL-23 mešavina potom je dodavana ćelijama 30 minuta na 37°C. Ćelije su prikupljene centrifugiranjem na 4°C za 10 minuta i potom lizirane u ledeno hladnom puferu (Cell SignalingTechnologv, Beverlv, MA). Deo lizata uleteo je u fosfo-STAT3 ELISA (Invitrogen). Vrednosti IC50antitela izračunate su kao procenat inhibicije STAT3 fosforilacije u odnosu na kontrolne bazenčiće bez antitela. Representativne vrednosti IC50prikazane su u tabeli dole.

Primer 7: In vivo model IL-23 indukovane proizvodnje citokina u mišjem uvetu

[0301]Korišćen je in vivo model u mišu. Rekombinantni humani IL-23 injektiran je u mišje uvo 4 uzastopna dana dajući epidermalno zadebljanje i regulaciju povećanja količine IL-17 i IL-22 proteina. Anti-IL-23pl9 antitela procenjena su u ovom modelu. Pojedinačno intraperitonealno injektiranje 1 mg/kg ili 5 mg/kg antitela primenjeno je 1 sat pre inicijalnog IL-23 injektiranja u kožu. Rekombinantni humani IL-23 (sa linkerom) injektiran je jednom dnevno tokom 3 dodatna dana i prikupljeno je tkivo za ocenjivanje citokina. Inhibicija proizvodnje citokina demonstrirana je za antitela. Rezultati tri eksperimenta prikazana su u tabeli dole 1: redovi 1-7, eksperiment 2: redovi 8-10, eksperiment 3: redovi 11-14).

Primer 8: Farmakokinetička ispitivanja u Cinomolgus majmunu

[0302]Humanizovana anti-IL-23pl9 antitela davana su deset minuta intravenoznom infuzijom u dozi od 1,0 mg/kg u tri cinomolgus majmuna. Uzorci seruma sakupljani su tokom vremenskog perioda od 6 nedelja i koncentracije slobodnog antitela merene su korišćenjem specifičnog ELISA. Serumski profili koncentracija-vreme za antitela i odgovarajući farmakokinetički parameteri sumirani su u Tabeli 16 dole.

Primer 9: Ekspresija u NSO ćelijama i biofizički podaci

[0303]Transfekcija NSO ćelija i generisanje stabilnih pulova;

NSO ćelije uzgajane su u prisustvu 1% FBS pre transfekcije. 40xl0e6 ćelije prikupljene su i resuspendovane u 0,8ml u medijumu koji sadrži 2% FBS sa 20ug linearizovanog DNK (ekspresioni vektori teškog lanca i lakog lanca) i potom su ćelije inkubirane na ledu za oko 15 min pre elektroporacije ćelija pri 750V/25uF (Bio-Rad Gene Pulser Xcell). Ćelije su izolovane sa 2% FBS za oko 48 sati na 37°C i 5% C02 potom postavljene na 96 ploča sa bazenčićima sa 2xl0e5 ćelije/ml sadržavajućim G418 i mikofenolnom kiselinom u toku 14-21 dana do formiranja kolonija.

[0304]Supernatant iz 96 ploča sa bazenčićima sa kolonijama ispitivani su pomoću ELISA. ELISA ploče obložene su sa lug/ml kozjeg anti-kapa (Southern Biotech, Birmingham, AL) u PBS i razblaženi supernatant inkubiran je i potom detektovan sa kozjim anti-humanim IgG Fc-HRP (izJackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Positivne kolonije spojene su za povećanje opsega. Titeri za proizvodnju antitela određeni su pomoću ForteBio korišćenjem protein A nastavaka prema upustvu proizvođača. Titeri za Antitelo A i Antitelo D bili su između 250-350 mg/L, sa više od 80% izolovanog prečišćavanjem proteina, i više od 94% monomera. Proteini resuspendovani su u finalnom puferu koji sadrži 20mM Natrijum Citrata i 115mM NaCI, pH 6,0 i stabilni su na 4°C najmanje 4 meseca i sa rastvorljivošću do 100 mg/ml u ovom pufer.

[0305]AUC: Analitičko Ultracentrifugiranje mereno sedimentacijom u Velocitv postupku sa koncentracijom od 0,5 -1 mg/ml; SEC: Ekskluziona hromatografija; %M: procenat monomera.

Primer 10: Mapiranje epitopa

[0306]Masena spektrometrija sa izmenom Vodonik/Deuterijum (HXMS) izvodi se radi mapiranja epitopa vezivanja Antitelo A za humani IL-23pl9. Ovaj postupak određuje osetljivost atoma amidnog vodonika iz kišme od IL-23pl9 na zamenu sa D20. Eksperiment je upravljan sa IL-23 samostalno i sa IL-23 sa dodatkom Antitela A. Tako su identifikovane regije IL-23pl9 sekvence koje pokazuju značajnu zaštitu od izmene usled vezivanja Antitela A. Rezolucija postupka određena je peptidima proizvedenih digestijom sa pepsinom ili Proteazom XVIII. Ovi IL-23pl9 izvedeni peptidi identifikovani su dodatnim kontrolnim eksperimentima sa neizmenjenim uzorcima korišćenjem standardnih tačnih masenih i HPLC MS/MS tehnologija.

[0307]Korišćen je rekombinantni humani IL-23. Za protein + antitelo uzorak, 50ul od IL-23 (0,8mg/ml) inkubirano je sa lOul Antitela A (12,7mg/ml) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Finalni molarni odnos Antitela A/IL-23 je bio 1,2:1.

[0308]Za izmenu 5ul od IL-23 proteina dodato je 50ul deuterisanom puferu (50mM PBS u D20) i inkubirano tokom 100 sekundi na sobnoj temperaturi. 50ul od 2M Urea/0,5M TCEP dodato je i inkubirano tokom 60 sekundi na sobnoj temperaturi. 5ul pepsina ili Proteaze XVIII (4mg/ml u 0,1% mravlje kiseline) dodato je i uzorak je odmah ohlađen do 4°C.

[0309]Nakon 5 minuta 50ul uzorka injektirano je na Shimadzu HPLC sistem (SCL10A kontrolor i dve LC10AD pumpe) pod sledećim uslovima:

Pokretna faza A = 99/1/0,1 (voda/acetonitril/ mravlja kiselina).

Pokretna faza B = 95/5/0,1 (acetonitril/voda/ mravlja kiselina).

Brzina protoka = lOOul/min.

Kolona = Phenomenex Jupiter C5, 5u, 50xl,0mm.

Linije pokretne faze, kolona, eza za injektiranje su u ledenom kupatilu.

Gradijent = Vreme 0(3%B), Vreme 2,2(3%B), Vreme 10,1(90%B), Vreme 12,0(90%B), Vreme 12,1(3%B).

[0310]Masena spektrometrija izvedena je kao što sledi:

Mas. Spek. = Thermo Orbitrap Velos (0900865).

Postupci:

A. Fragmentacija (do ID peptida): vreme akvizicije 12 minuta (3 minuta kašnjenje početka), potpuno-skeniranje FTMS na 30,000 rezoluciji, skeniranja zavisna od podataka sedam jonskih trapova (CID).

B. MS Runs: vreme akvizicije 12 minuta (3 minuta kašnjenje početka), potpuno-skeniranje FTMS na 60,000 rezoluciji.

[0311]Peptidi pepsina i Proteaze XVIII identifikovani su korišćenjem podataka fragmentacije i programa Proteome Discoverer (Thermoscientific, VValtham, MA). Identifikovani peptidi vizuelno su poređeni (samostalan protein vs. protein sa prisutnim antitelom) korišćenjem Xcalibur softvera (Thermoscientific). Nisu primećena nikakva značajna pomeranja u izmeni za samostalni IL-23 vs. IL-23 sa Antitelom A izvan IL-23pl9 regije. Za pl9 deo proteina, podaci su analizirani korišćenjem programa PepMap (Thermoscientific). Ovaj program izračunava prosečnu masu za razmenu peptida. PepMap rezultati su provereni i ti peptidi koji nisu dali verifikovane rezultate izračunati su uz pomoć Microsoft Excel.

[0312]Regije IL-23 sekvence koje su pokazale značajnu zaštitu od izmene usled vezivanja Antitela A identifikovane su kao aminokiselinski ostaci 108 do 126 iz SEQ ID NO:181 i aminokiselinski ostatci 137 do 151 iz SEQ ID NO:181.

LISTA SEKVENCI

[0313]

<110> Barrett, Rachel Rebecca

Canada, Keith

Catron, Katrina Mary

Copenhaver, Robert

Frego, Lee Edvvard

Ravmond, Ernest Lee

Singh, Sanjava

Zhu, Xiangyang

<120> Anti-IL-23 Antitela

<130> 09-0561

Claims (26)

1. Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata: a) varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19( CDR1- L) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:20( CDR2- L) ;i sekvencu aminokiseline SEOJD NO:21( CDR3- L) ;i b) varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 66 ili 67( CDR1- H) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:64( CDR2- H) ;i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:65( CDR3- H).

2. Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata: a) varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19( CDR1- L) ;sekvencu aminokiseline SEQ IDNO:20 ( CDR2- L) ; i sekvencuaminokiseline SEQ IDNO:21 ( CDR3- L) ; ib) varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:66( CDR1- H) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:64( CDR2- H) ;i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:65( CDR3- H).

3. Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata: a) varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:19( CDR1- L) ;sekvencu aminokiseline SEQ IDNO:20 ( CDR2- L) ; i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:21 ( CDR3- L) ; ib) varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:67( CDR1- H) ;sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:64( CDR2- H) ;i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:65( CDR3- H).

4. Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO:158,160,162 ili 164; i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline bilo koju od SEQ ID NO:166 ili 168.

5. Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 4, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:160 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:166.

6. Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 4, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:160 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:168.

7. Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 4, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158 i varijabilnu regiju teškog lanca koja obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:166.

8. Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 4, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:166 ili 168 vezanu za humanu IgGl konstantnu regiju teškog lanca; i sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158 ili 160 vezanu za humanu kapa konstantnu regiju lakog lanca.

9. Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata: a) humanizovani varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata CDR-ove SEQ ID NO:158 ili 160 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirne regije varijabilnog domena lakog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:158 ili 160; i b) humanizovani varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata CDR-ove SEQ ID NO:166 ili 168 i okvirne regije koje imaju sekvencu aminokiseline koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiseline okvirne regije varijabilnog domena teškog lanca sekvence aminokiseline SEQ ID NO:166 ili 168.

10.Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu je pomenuto antitelo monoklonsko antitelo.

11.Humanizovano anti-IL-23pl9 antitelo prema zahtevu 1, pri čemu je antitelo humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 ili 180 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176 ili 178.

12.Humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo prema zahtevu 11, pri čemu pomenuto antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176.

13.Humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo prema zahtevu 11, pri čemu pomenuto antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:178.

14.Humanizovano monoklonsko anti-IL-23pl9 antitelo prema zahtevu 11, pri čemu pomenuto antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:180 i težak lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176.

15.Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 14 za upotrebu u medicini.

16.Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 15, pri čemu se koristi za tretiranje zapaljenske bolesti, autoimune bolesti, respiratorne bolesti, metaboličkog poremećaja ili kancera.

17.Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 16, pri čemu se koristi za tretiranje psorijaze, zapaljenske bolesti creva, psorijaznog artritisa, multipla skleroze, reumatoidnog artritisa, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa ili ankilozirajućeg spondilitisa.

18.Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 16, pri čemu se koristi za tretiranje astme ili HOBP (hronične opstruktivne bolesti pluća).

19.Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 14 i farmaceutski prihvatljivi nosač.

20.Izolovani polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilnu regiju lakog lanca antitela ili fragmenta antitela koja ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158,160, 162 ili 164, i koja kodira varijabilnu regiju teškog lanca antitela ili fragmenta antitela koja ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 166 ili 168.

21.Izolovani polinukleotid prema zahtevu 20, pri čemu pomenuti polinukleotid obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac antitela koji ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 ili 180, i koja kodira težak lanac antitela koji ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176 ili 178.

22.Ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid prema zahtevu 20 ili 21.

23.Ćelija domaćina koja obuhvata: a) izolovani polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilnu regiju lakog lanca antitela ili fragmenta antitela koja ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:158,160,162 ili 164; i b) izolovani polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira varijabilnu regiju teškog lanca antitela ili fragmenta antitela koja ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 166 ili 168.

24.Ćelija domaćina koja obuhvata: a) izolovani polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac antitela koji ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:174 ili 180; i b) izolovani polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira težak lanac antitela koji ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:176 ili 178.

25.Postupak proizvodnje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta koji obuhvata: a) dobijanje ćelije domaćina prema zahtevu 23 ili 24; i b) kultivisanje ćelije domaćina.

26. Postupak prema zahtevu 25, koji dalje obuhvata izolovanje i prečišćavanje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta.