RS55410B1 - Bispecifična antitela protiv cd3-epsilon i bcma - Google Patents

Description

[0001]Predmetni pronalazak odnosi se na nova bispecifična antitela protiv CD3s i BCMA, njihovu spravljanje i upotrebu.

Osnov pronalaska

[0002]Antigen maturacije humanih B-ćelija, poznat i kao BCMA; TR17HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), član je superfamilije receptora za faktor nekroze tumora, i preferencijalno se eksprimira u diferenciranim plazmocitima (Laabiet al.1992; Madryet al.1998). BCMA je neglikozilovani transmembranski protein tipa 111 uključen u sazrevanje, rast i preživljavanje B-ćelija. BCMA je receptor za dva Uganda iz superfamilije TNF: APRIL (a proliferation-inducing ligand, ligand koji indukuje proliferaciju), visokoafinitetni ligand za BCMA, i faktor aktivacije B-ćelija BAFF, niskoafinitetni ligand za BCMA (THANK, BlyS, stimulator B-limfocita, TALL-1 i zTNF4). APRIL i BAFF pokazuju strukturnu sličnost i preklapajuću, mada i dalje različitu specifičnost vezivanja za receptor. Negativni regulator TACI takođe se vezuje i za BAFF i za APRIL. Koordinisano vezivanje APRIL i BAFF za BCMA i/ili TACI aktivira transkripcioni faktor NF-kB i povećava ekspresiju pro-preživljavajućih članova familije Bcl-2 (npr. Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Al) i negativnu regulaciju pro-apoptotskih faktora (npr. Bid, Bad, Bik, Bim, itd.), inhibirajući na taj način apoptozu i omogućavajući preživljavanje. Ovo kombinovano dejstvo pokreće diferencijaciju, proliferaciju, preživljavanje B-ćelija i proizvodnju antitela u njima (kao što je pregledno dato u Rickert RCet al,Immunol Rev (2011) 244 (1): 115-133).

[0003]TCR/CD3 kompleks T-limfocita sastoji se od TCR alfa (<x)/beta (p) ili TCR gama (y)/delta (5) heterodimera, koji se na površini ćelije eksprimira sa invarijantnim subjedinicama CD3 obeleženim kao gama (y), delta (8) epsilon (s), zeta (Q i eta (n). Humani CD3s opisan je pod UniProt P07766 (CD3EHUMAN). Anti-CD3s antitelo opisano u stanju tehnike je SP34 (Yang SI, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34 reaguje sa CD3 primata i čoveka. SP34 se može nabaviti od PharMingen. Još jedno anti-CD3 antitelo opisano u stanju tehnike je UCHT-1 (vidi WO2000041474). Još jedno anti-CD3 antitelo opisano u stanju tehnike je BC-3 (Fred Hutchinson Cancer Research Institute; korišćeno u Fazi I/II ispitivanja GvHD, Anasettiet al,Transplantation 54: 844 (1992)).

[0004]U bliskoj prošlosti razvijeni su veoma raznovrsni formati rekombinantnih bispecifičnih antitela, npr., fuzijom, npr. antitela IgG formata i jednolančanih domena (vidi Kontermann RE, mAbs 4:2, (2012) 1-16). Bispecifična antitela u kojima su varijabilni domeni VL i VH ili konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim opisani su u WO2009080251 i WO2009080252.

[0005]Pristup za prevazilaženje problema pogrešno sparenih sporednih proizvoda, poznat kao "knobs-into-holes" ("izbočine u udubljenjima"), ima za cilj forsirano sparivanje dva različita teška lanca antitela uvođenjem mutacija u CH3 domene kako bi se modifikovala kontaktna površina. Na jednom lancu, glomazne amino-kiseline zamenjuju se amino-kiselinama sa kratkim bočnim lancima da bi se napravilo "udubljenje". Nasuprot tome, amino-kiseline sa velikim bočnim lancima uvode se u drugi CH3 domen, da bi se napravila "izbočina". Koeksprimiranjem ova dva teška lanca (i dva identična laka lanca koja moraju biti odgovarajuća za oba teška lanca), zapaženi su visoki prinosi formiranih heterodimera ("knob-hole") u odnosu na formirane homodimere ("hole-hole" ili "knob-knob") (Ridgway JB, Presta LG, Čarter P; Protein Eng. 9, 617-621 (1996); i WO1996027011). Procenat heterodimera mogao bi dodatno da se poveća remodeliranjem interakcionih površina dva CH3 domena korišćenjem pristupa prikazivanja na fagima i uvođenjem disulfidnog mosta za stabilisanje heterodimera (Merchant A.M,et al,Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Axwell S, Ridgway JB, Wells JA, Čarter P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35). Novi pristupi tehnologije "knobs-into-holes" opisani su npr. u EP 1870459A1. Iako ovaj format izgleda veoma privlačan, trenutno nema podataka koji govore o napretku ka kliničkoj upotrebi. Jedno važno ograničenje ove strategije je to što laki lanci dva roditeljska antitela treba da budu identični da bi se sprečilo pogrešno sparivanje i formiranje neaktivnih molekula. Prema tome, ova tehnika nije pogodna za lako razvijanje rekombinantnih bispecifičnih antitela protiv dva cilja počevši od dva antitela protiv prvog i drugog cilja, jer teški lanci ovih antitela i/ili identični laki lanci treba da budu optimizovani. Xie, Z.,et al,J Immunol Methods 286 (2005) 95-101 odnosi se na format bispecifičnog antitela koje koristi scFv u kombinaciji "sa "knobs-into-holes' tehnologijom za FC deo. WO2012116927 i WO2010145792 pominju razmenu CH1 i CL domena. WO2009080254 pominje "knob in hole" konstrukte za proizvodnju bispecifičnih antitela. WO 2006093794 odnosi se na heterodimerne proteinske vezujuće smeše. W0199937791 opisuje višenamenske derivate antitela. Morrison, S.L.,et al,J. Immunol. 160 (1998) 2802-2808 odnosi se na uticaj razmene domena varijabilnog regiona na funkcionalne osobine IgG.

[0006]WO 201302362 odnosi se na heterodimerizovane polipeptide. WO201312733 odnosi se na polipeptide koji sadrže heterodimerne Fc regione. WO2012131555 odnosi se na inženjerisane heterodimerne imunoglobuline. EP 2647707 odnosi se na inženjerisane heterodimerne imunoglobuline. WO2009080251, WO 2009080252, WO 2009080253, WO 2009080254 i Schaefer, W.et al,PNAS, 108 (2011) 11187-1191 odnose se na bivalentna, bispecifična IgG antitela sa domenskim "crossover"-om (unakrsna razmena). Kod multispecifičnih antitela sa VH/VL zamenom/razmenom u jednom vezujućem domenu, kako bi se sprečilo pogrešno sparivanje lakih lanaca (Cross-MabVH-VL), koja su opisana u WO2009080252 (vidi i Schaefer, W.et al,PNAS, 108 (2011) 11187-1191), jasno su redukovani sporedni proizvodi koji nastaju kao rezultat greške u sparivanju lakog lanca protiv prvog antitega sa pogrešnim teškim lancem protiv drugog antigena (u poređenju sa pristupom bez takve razmene domena). Međutim, njihova priprema ne podrazumeva potpuno odsustvo sporednih proizvoda. Glavni sporedni proizvod zasniva se na interakcijama Bence-Jones-ovog tipa (Schaefer,W. et al, PNAS,108 (2011) 11187-1191).

[0007]Antitela protiv BCMA opisana su npr. u Gras M-P.et al.Int Immunol. 7 (1995) 1093-1106, WO200124811, WO200124812, WO2010104949 i WO2012163805. Antitela protiv BCMA i njihova upotreba u lečenju limfoma i multiplog mijeloma pominju se npr. u WO2002066516 i WO2010104949. WO2013154760 odnosi se na himerne antigenske receptore (chimeric antigen receptors, CAR) koji sadrže BCMA-prepoznavajuću komponentu i T-ćelijsku aktivacionu komponentu.

[0008]Ryan, MCet al,Mol. Cancer Ther. 6 (2007) 3009-3018 odnosi se na ciljanje BCMA u malignim oboljenjima plazmocita. Antitelo SG1 sa ligand-blokirajućom aktivnošću, u vidu ogoljenog antitela ili u vidu konjugata antitelo-lek (antibody-drug conjugates, ADC), može da pokrene citotoksičnost ćelijskih linija multiplog mijeloma

(multiple mveloma, MM). SG1, inhibitorno BCMA-antitelo, blokira APRIL-zavisnu aktivaciju nukleusnog faktora-KB na dozno-zavisan način,in vitro.Citotoksičnost SG1 kao ogoljenog antitela procenjivana je posle himerizacije sa i bez Fc mutacija koje pojačavaju FcyRIIIA vezivanje. Ryan takođe pominje antitelo SG2 koje ne inhibira značajno vezivanje APRIL za BCMA. Međutim, SG2 pokazuje 20 puta višu IC5ovrednost nego SG1, mereno kao citotoksična aktivnost konjugata leka protiv BCMA-pozitivnih ćelijskih linija mijeloma. Ryan zaključuje da BCMA-antitela mogu da deluju na ćelijske linije mijeloma višestrukim mehanizmima koji uključuju inhibiciju APRIL-zavisne aktivacije NF-kB, pokretanje lize tumorskih ćelija putem ADCC aktivnosti posredovane ćelijama prirodnim ubicama i indukciju citotoksičnosti putem ADC.

[0009]Bispecifična antitela protiv CD3 i BCMA pomenuta su u WO2007117600, WO2009132058, WO2012066058, WO2012143498 i WO2013072415. WO2014122143 i WO2014122144 opisuju antitela protiv BCMA i bispecifična antitela protiv CD3 i BCMA, koja uključuju određene CDR i varijabilne domene objavljene i u predmetnom pronalasku.

[0010]Prema tome, postoji potreba za bispecifičnim antitelima protiv CD3s i BCMA sa VH/VL razmenom, koja mogu da se proizvedu sa visokim prinosom i da se lako prečiste.

Kratak opis pronalaska

[0011]Pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za dva cilja koja su vanćelijski domeni humanog BCMA (dalje označen i kao "BCMA") i humanog CD3s (dalje označen i kao "CD3"), karakterisano time što sadrži a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za

CD3, i gde su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom

teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim i

c) gde je u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom

(H) (numerisanje po Kabat-u), i gde su u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213

supstituisane nezavisno glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numerisanje po Kabat-u) (vidi npr. Slike 1A, 2A, 2C, 3A, 3C).

[0012]Poželjno, pomenuto bispecifično antitelo opisano u poslednjem prethodnom paragrafu dalje se karakteriše time što pomenuto bispecifično antitelo dodatno sadrži Fab fragment pomenutog prvog antitela (dalje označen i kao "BCMA-Fab") i u konstantnom domenu CL pomenutog BCMA-Fab amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana je nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numerisanje po Kabat-u), i pri čemu su u konstantnom domenu CH1 pomenutog BCMA-Fab amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabat-u) (vidi npr. Slike 2A, 2C).

[0013]Pronalazak se dalje odnosi na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za dva cilja koja su vanćelijski domeni humanog BCMA (dalje označen i kao "BCMA") i humanog CD3s (dalje označen i kao "CD3"), karakterisano time što sadrži a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za

CD3, i gde su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom

teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim; i

c) gde je u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom

(H) (numerisanje po Kabat-u), i gde su u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213

supstituisane nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numerisanje po Kabat-u) (vidi npr. Slike 1B, 2B, 2D, 3B, 3D).

[0014]Poželjno, pomenuto bispecifično antitelo opisano u poslednjem prethodnom paragrafu karakteriše se i time što pomenuto bispecifično antitelo dodatno sadrži drugi Fab fragment pomenutog prvog antitela ("BCMA-Fab") (vidi npr. Sliku 2B, 2D).

[0015]Numerisanje amino-kiselina je prema Kabat-u (vidi dole).

[0016]Poželjno, pored zamene amino-kiseline na poziciji 124 u konstantnom domenu CL prvog ili drugog lakog lanca, amino-kiselina na poziciji 123 supstituisana je nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H).

[0017]Poželjno, u konstantnom domenu CL, amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana je lizinom (K), u konstantnom domenu CH1 amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane su glutaminskom kiselinom (E). Poželjno, pored toga, u konstantnom domenu CL amino-kiselina na poziciji 123 supstituisana je argininom (R).

[0018]U poželjnoj formi pronalaska, antitelo prema pronalasku sastoji se od jednog Fab fragmenta antitela koje se specifično vezuje za CD3 (dalje označeno i kao "CD3-Fab") i jednog Fab fragmenta antitela koje se specifično vezuje za BCMA (dalje označeno i kao "BCMA-Fab") i Fc dela, pri čemu su CD3-Fab i BCMA-Fab povezani preko svojih C-terminusa sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela. CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrži aa (amino acid, aminokiselinsku) supstituciju i CD3-Fab sadrži "crossover" (Slike 1A i 1B).

[0019]U poželjnoj formi pronalaska, antitelo prema pronalasku sastoji se od jednog CD3-Fab i jednog BCMA-Fab i Fc dela, pri čemu su CD3-Fab i BCMA-Fab povezani preko svojih C-terminusa sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i drugog BCMA-Fab koji je svojim C-terminusom vezan za N-terminus CD3-Fab. CD3-Fab sadrži "crossover" i CD3-Fab ili oba BCMA-Fab sadrže aa supstituciju (Slike 2A i 2B). Posebno je poželjno bispecifično antitelo koje sadrži BCMA-Fab-Fc-CD3-Fab-BCMA-Fab, pri čemu oba BCMA-Fab sadrže aa supstituciju i CD3-Fab sadrži VL/VH "crossover" (Slika 2A). Posebno je poželjno bispecifično antitelo koje se sastoji od BCMA-Fab-Fc-CD3-Fab-BCMA-Fab, pri čemu oba BCMA-Fab sadrže aa supstituciju Q124K, E123R, K147E i K213E i CD3-Fab sadrži VL/VH "crossover". Posebno je poželjno da oba BCMA-Fab kao CDR sadrže CDR antitela 83A10, ili, kao VH/VL da sadrže VH/VL 83A10. Poželjno je i da oba BCMA-Fab kao CDR sadrže CDR antitela 17A5, ili, kao VH/VL da sadrže VH/VL 17A5. Poželjno je i da oba BCMA-Fab kao CDR sadrže CDR antitela 13A4, ili, kao VH/VL da sadrže VH/VL 13A4.

[0020]U poželjnoj formi pronalaska, antitelo prema pronalasku sastoji se od dva BCMA-Fab i Fc dela, pri čemu su BCMA-Fab povezani preko svojih C-terminusa sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i CD3-Fab koji je povezan svojim C-terminusom sa N-terminusom jednog BCMA-Fab. CD3-Fab sadrži "crossover" i CD3-Fab ili oba BCMA-Fab sadrže aa supstituciju (Slike 2C i 2D).

[0021]U poželjnoj formi pronalaska, antitelo prema pronalasku sastoji se od jednog CD3-Fab, koji je preko svog C-terminusa povezan sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela i BCMA-Fab, koji je povezan svojim C-terminusom sa N-terminusom CD3-Fab. CD3-Fab sadrži "crossover" i CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrži aa supstituciju (Slike 3A i 3B).

[0022]U poželjnoj formi pronalaska, antitelo prema pronalasku sastoji se od jednog BCMA-Fab koji je povezan preko svog C-terminusa sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i CD3-Fab koji je povezan svojim C-terminusom sa N-terminusom BCMA-Fab. CD3-Fab sadrži "crossover" i CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrži aa supstituciju (Slike 3C i 3D).

[0023]Fab fragmenti su hemijski spojeni upotrebom odgovarajućeg linkera u skladu sa stanjem tehnike. Poželjno, koristi se (Gly4-Serl)3 linker (Desplancq DKet al,Protein Eng. 1994 Aug;7(8): 1027-33 i MackM.et al,PNAS July 18, 1995 vol. 92 no. 15 7021-7025). Spoj između dva Fab fragmenta uspostavlja se između teških lanaca. Dakle, C-terminus CH1 prvog Fab fragmenta povezan je sa N-terminusom VH drugog Fab fragmenta (nema "crossover"-a) ili za VL ("crossover"). Spoj između Fab fragmenta i Fc dela uspostavlja se pema pronalasku kao veza između CH1 i CH2.

[0024]Prvi i drugi Fab fragment antitela koje se specifično vezuje za BCMA poželjno su izvedeni iz istog antitela i poželjno su identični po CDR sekvencama, sekvencama varijabilnih domena VH i VL i/ili sekvencama konstantnih domena CH1 i CL. Poželjno, aminokiselinske sekvence prvog i drugog Fab fragmenta antitela koje se specifično vezuje za BCMA su identične. Poželjno, BCMA antitelo je antitelo koje sadrži CDR sekvence antitela 83A10, 17A5 ili 13A4, antitelo koje sadrži VH i VL sekvence antitela 83A10, 17A5 ili 13A4, ili antitelo koje sadrži VH, VL, CH1 i CL sekvence antitela 83A10, 17A5 ili 13A4.

[0025]Poželjno bispecifično antitelo sadrži, kao Fab fragmente i Fc deo, ne više od jednog Fab fragmenta anti-CD3 antitela, ne više od dva Fab fragmenta anti-BCMA antitela i ne više od jednog Fc dela, poželjno humanog Fc dela. Poželjno, drugi Fab fragment anti-BCMA antitela vezan je preko svog C-terminusa za N-terminus Fab fragmenta anti-CD3 antitela ili za zglobni region Fc dela. Poželjno, veza se uspostavlja između CH1 BCMA-Fab i VL CD3-Fab (VLNH "crossover").

[0026]Poželjno, antitelo prema pronalasku se karakteriše i time što se specifično vezuje za BCMA cinomolgusa. Takvo poželjno antitelo prema pronalsku je antitelo koje se karakteriše time što uključuje teško- i lakolančani set polipeptida SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 i SEQ ID NO:46 (set 1).

[0027]Poželjno, deo antitela koji se specifično vezuje za humani CD3, poželjno Fab fragment, karakteriše se time što sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolančane CDR SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao respektivne teškolančane CDR1, CDR2 i CDR3, i varijabilni domen VL koji uključuje lakolančane CDR SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao respektivne lakolančane CDR1, CDR2 i CDR3 anti-CD3s antitela (CDR MAB CD3). Poželjno, deo antitela koji se specifično vezuje za humani CD3 karakteriše se time što su varijabilni domeni SEQ ID NO:7 i 8 (VHVL MAB CD3).

[0028]Poželjno, deo antitela, poželjno Fab fragment, koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše se time što sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolančane CDR CDR IH SEQ ID NO:21, CDR2H SEQ ID NO:24, CDR3H SEQ ID NO: 27 i sadrži varijabilni domen VL koji uključuje lakolančane CDR CDR1L SEQ ID NO:30, CDR2L SEQ ID NO:33, CDR3L SEQ ID NO: 36 (CDR MAB 83A10). Poželjno, deo antitela, poželjno Fab fragment, koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše se time što sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolančane CDR CDR IH SEQ ID NO:22, CDR2H SEQ ID NO:25, CDR3H SEQ ID NO: 28 i varijabilni domen VL koji uključuje lakolančane CDR1L SEQ ID NO:31, CDR2L SEQ ID NO:34, CDR3L SEQ ID NO: 37 (CDR MAB 17A5). Poželjno deo antitela, poželjno Fab fragment, koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše se time što sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolančane CDR CDR IH SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:26, CDR3H SEQ ID NO: 29 i varijabilni domen VL koji uključuje lakolančane CDR1L SEQ ID NO:32, CDR2L SEQ ID NO:35, CDR3L SEQ ID NO: 38 (CDR MAB 13A4).

[0029]Poželjno, deo antitela, poželjno Fab fragment, koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše se time što sadrži varijabilni domen VH SEQ ID NO: 15 i VL SEQ ID NO: 18 (VHVL MAB 83A10). Poželjno, deo antitela, poželjno Fab fragment, koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše se time što sadrži VH SEQ ID NO: 16 i VL SEQ ID NO: 19 (VHVL MAB 17A5). Poželjno, deo antitela, poželjno Fab fragment, koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše se time što sadrži VH SEQ ID NO: 17 i VL SEQ ID NO: 20 (VHVL MAB 13A4).

[0030]Pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za vanćelijski domen humanog BCMA i za humani CD3s, koje se karakteriše time što sadrži teško- i lakolančani set odabran iz grupe koja se sastoji od polipeptida

i) SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, i SEQ ID NO:46 (set 1),

ii) SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, i SEQ ID NO:49 (set 2), i iii) SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, i SEQ ID NO:52 (set 3).

[0031]Poželjno, antitelo prema pronalasku uključuje, kao anti-BCMA antitelo, antitelo odabrano iz grupe varijanti BCMA antitela 13A4 i 83A10. Poželjno, antitelo pronalaska koje sadrži sekvence 13A4, sadrži aminokiselinsku zamenu na respektivnoj poziciji 95 (N95) ili 96 (G96) unutar CDR3H SEQ ID NO:29, i to jednu aminokiselinsku zamenu na poziciji 95, koja je N95S, N95T, N95E, N95Q, N95A, ili N95G, ili jednu aminokiselinsku zamenu na poziciji 96, koja je G96A, G96E, ili G96Q.

[0032]Poželjno, antitelo prema pronalasku, koje sadrži sekvence 13A4, sadrži aminokiselinsku zamenu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih zamena na respektivnim pozicijama 27 (N27f) i 28 (G28) unutar CDR1L SEQ ID NO:32 i to jednu aminokiselinsku zamenu na poziciji 27, koja je N27fS, N27fT, N27fE, N27fQ, N27fA ili N27fG, ili jednu aminokiselinsku zamenu na poziciji 28, koja je G28A, G28E, ili G28Q.

[0033]Poželjno, antitelo prema pronalasku, koje sadrži sekvence 13A4, sadrži aminokiselinsku zamenu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih zamena na respektivnim pozicijama 54 (D54) i 55 (S55) unutar CDR2H SEQ ID NO:26 i to jednu aminokiselinsku zamenu na poziciji 54, koja je D54S, D54T, D54E, D54Q, D54A ili D54G, ili jednu aminokiselinsku zamenu na poziciji 55, koja je S55A, S55E ili S55Q.

[0034]Poželjno, antitelo prema pronalasku, koje sadrži sekvence 13A4, sadrži aminokiselinsku zamenu odabranu iz grupe koja se sastoji od zamene amino-kiseline W na poziciji 33 (W33) unutar CDR1H SEQ ID NO:23, koja je W33F, W33Y, W33V, W33I, W33L ili W33A.

[0035]Poželjno, antitelo prema pronalasku, koje sadrži sekvence 13A4, sadrži do dve aminokiselinske zamene na N95 i/ili W33 ili do dve aminokiselinske zamene na G96 i/ili W33. Poželjno, antitelo prema pronalasku, koje sadrži sekvence 13A4, sadrži jednu aminokiselinsku zamenu na N95 ili G96.

[0036]Poželjno, antitelo prema pronalasku, koje sadrži sekvence 13A4, sadrži do četiri aminokiselinske zamene na N95 i/ili W33 i/ili N27 ili G28 i/ili D54 ili S55 ili do četiri aminokiselinske zamene na G96 i/ili W33 i/ili N27 ili G28 i/ili D54 ili S55. Poželjno antitelo prema pronalasku, koje sadrži sekvence 13A4, sadrži jednu aminokiselinsku zamenu na N95 ili G96.

[0037] Poželjno, antitelo prema pronalasku sadrži prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA, pri čemu pomenuti laki lanac sadrži, kao CDR, CDR2L SEQ ID NO:35, CDR3L SEQ ID NO: 38 i CDR1L odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 32, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 i 87, i pomenuti teški lanac sadrži, kao teškolančane CDR, CDR1H odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:23, 107, 109, 111, 113, 115 i 117, CDR2H odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:26, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 i 105 i CDR3H odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:29, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67 i 69.

[0038] Poželjno, antitelo prema pronalasku sadrži, unutar prvog lakog lanca prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA, varijabilni lakolančani domen VL odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, 72, 74,76, 78, 80, 82, 84, 86 i 88, i unutar prvog teškog lanca prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA, varijabilni teškolančani domen VH odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 i 118.

[0039]Poželjno, antitelo prema pronalasku, koje sadrži sekvence 83A10, sadrži aminokiselinsku zamenu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih zamena na poziciji 98 (W98) unutar CDR3H SEQ ID NO:27, koja je W98F, W98Y, W98V, W98I, W98L ili W98A.

[0040]Poželjno, antitelo prema pronalasku sadrži prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA, pri čemu pomenuti laki lanac sadrži, kao CDR, CDR1L SEQ ID NO:30, CDR2L SEQ ID NO:33, CDR3L SEQ ID NO: 36 i pomenuti teški lanac sadrži, kao teškolančane CDR, CDR IH SEQ ID NO:21, CDR2H SEQ ID NO:24 i CDR3H odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 27, 119, 121, 123, 125, 127 i 129.

[0041]Poželjno, antitelo prema pronalasku sadrži, unutar prvog lakog lanca prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA, varijabilni lakolančani domen VL SEQ ID NO: 18 i unutar prvog teškog lanca prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA, varijabilni teškolančani domen VH odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, 120, 122, 124, 126, 128 i 130.

[0042]Pronalazak se odnosi i na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za vanćelijski domen BCMA i za CD3s, koje se karakteriše time što sadrži, kao teške i lake lance, polipeptide SEQ ID NO: 45, 50, 51 i 52, pri čemu su jedan ili više CDR zamenjeni respektivnim CDR "varijanti BCMA-antitela". Pronalazak se odnosi i na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za vanćelijski domen BCMA i za CD3e, koje se karakteriše time što sadrži, kao teške i lake lance, polipeptide SEQ ID NO: 45, 50, 51 i 52, pri čemu su jedan ili više VH i/ili VL zamenjeni respektivnim VH i/ili VL "varijanti BCMA-antitela". Pronalazak se odnosi i na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za vanćelijski domen BCMA i za CD3s, koje se karakteriše time što sadrži, kao teške i lake lance, polipeptide SEQ ID NO: 43, 44, 45, i 46, pri čemu su jedan ili više CDR zamenjeni respektivnim CDR "varijanti BCMA-antitela". Pronalazak se odnosi i na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za vanćelijski domen BCMA i za CD3s, koje se karakteriše time što sadrži, kao teške i lake lance, polipeptide SEQ ID NO: 43, 44, 45, i 46, pri čemu su jedan ili više VH i/ili VL zamenjeni respektivnim VH i/ili VL "varijanti BCMA-antitela". Poželjno, antitelo prema pronalasku pokazuje visoki afinitet prema BCMA i nisku agregaciju.

[0043]Pronalazak se odnosi i na set nukleinskih kiselina koje kodiraju respektivni set teških i lakih lanaca.

[0044]Poželjno, bispecifično antitelo prema pronalasku, koje uključuje konstantne teškolančane regione CH2/CH3 IgGl subklase, karakteriše se time što sadrži mutacije L234A, L235A i P239G (numerisanje po Kabat—u) da bi se izbeglo vezivanje FcR i Clq i na najmanju meru svela ADCC/CDC. Prednost je što takvo antitelo pronalaska ostvaruje svoj efekat u ubijanju tumorskih ćelija isključivo snažnim mehanizmom preusmeravanja/aktivacije T-ćelija. Izbegnuti su dodatni mehanizmi delovanja kao što su efekti na sistem komplementa i efektorske ćelije koje eksprimiraju FcR i smanjenje rizik od sporednih efekata.

[0045]Pronalazak poželjno uključuje teški lanac antitela prema pronalasku, koji se sastoji od (od N- ka C-terminusu) VH(BCMA)-CH1(BCMA)-VL(CD3)-CH1(CD3)-CH2-CH3 SEQ ID NO: 43, 47, ili 50, kao i respektivne kodirajuće nukleinske kiseline. Ovi polipeptidi i respektivne nukleinske kiseline korisni su za proizvodnju bispecifičnog antitela prema pronalasku.

[0046]Izmene amino-kiselina (aa) izvan CDR bispecifičnih antitela prema pronalasku obezbeđuju znatno poboljšanje proizvodnje/prečišćavanja, bez promene bioloških svojstava kao što je vezivanje za BCMA. Uvođenjem aa izmena prema pronalasku pogrešno sparivanje lakog lanca (light chain, LC) i formiranje sporednih proizvoda u procesu proizvodnje značajno je smanjeno i tako je prečišćavanje olakšano.

[0047]Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što pokazuje inhibiciju rasta tumora za više od 70%, poželjno više od 85%, poželjno blizu 100%, u ksenograftskom modelu multiplog mijeloma (npr. ksenograft sa NCI-H929 ćelijama ili RPMI8226 ćelijama ili U266B1 ćelijama ili L-363 ćelijama), u dozi od 1 mg/kg telesne težine (body weight, BW) datoj intravenski( i. v.)ili subkutano( s. c.)ili intraperitonealno( i. p.),dva puta nedeljno ili jednom nedeljno, poželjno u dozi od 0.5 mg/kg BW datoji. v.ilii. p.ilis. c.dva puta nedeljno ili jednom nedeljno, poželjno u dozi od 0.1 mg/kg BW datoj/.v.ilii. p.ilis. c.dva puta nedeljno ili jednom nedeljno, poželjno u dozi od 0.05 mg/kg BW datoji. v.ilii. p.ilis. c.dva puta nedeljno ili jednom nedeljno, poželjno u dozi od 0.01 mg/kg BW datoji. v.ilii. p.ilis. cdva puta nedeljno ili jednom nedeljno, poželjno u dozi od 5 ug/kg BW datoji. v.ilii. p.ilis. c.dva puta nedeljno ili jednom nedeljno.

[0048]Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što ima poluvreme eliminacije u miševima, poželjno cinomolgus majmunu, duže od 24 sata, poželjno 3 dana ili duže, poželjno, poluživot se meri za doze koje su efikasne u ksenograftskom modelu i pri primeni dva puta ili jednom nedeljno.

[0049]Bispecifična antitela koja se vezuju za cilj na tumorskim ćelijama i za CD3 i imaju molekulski format (scFv)2, imaju veoma kratko poluvreme eliminacije od 1 do 4 sata. U kliničkim ispitivanjima sa (scFv)2-bispecifičnim CD19xCD3 antitelom blinatumomabom, ovo jedinjenje moralo je da se daje pomoću pumpe koju bi pacijenti nosili nedeljama i mesecima (Toppet al.J Clin Oncol 2011; 29(18): 2493-8). U poređenju sa primenom dva puta ili jednom nedeljno iv ili sc, tretman pomoću pumpe je mnogo manje pogodan za pacijenta, a takođe je i mnogo rizičniji (npr. otkazivanje pumpe, problemi sa kateterom).

[0050]Poželjno antitelo prema pronalasku karakteriše se time što pokazuje EC50 vrednost za vezivanje za NCIH929 ćelije (ATCC<®>CRL-9068™) od 30 nM ili nižu, poželjno EC50 vrednost od 15 nM i nižu.

[0051]Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se sposobnošću da indukuje preusmereno ubijanje NCI-H929 tumorskih ćelija u prisustvu humanih T-ćelija, uz EC50 nižom od 0.1 nM, poželjno 0.05 nM, poželjno 0.02 nM, poželjno 0.002 nM i nižom.

[0052]Poželjno, moć ubijanja tumorskih ćelija bispecifičnim antitelom prema pronalasku ne redukuje se, ili se redukuje samo minimalno, klinički relevantnim koncentracijama APRIL; specifično, bispecifično antitelo pronalaska karakteriše se time što dodavanje 100 ng/ml APRIL menja EC50 za preusmereno ubijanje tumorskih ćelija T-ćelijama za faktor manji od 4, poželjno faktor manji od 2, poželjno faktor manji od 1.5. U jednoj poželjnoj formi, bispecifično antitelo pronalaska karakteriše se time što dodavanje 1000 ng/ml APRIL menja EC50 za ubijanje tumorskih ćelija za faktor manji od 6.5, poželjno faktor manji od 5, poželjno faktor manji od 4, poželjno faktor manji od 3, poželjno faktor manji od 2.

[0053]Pokazano je da su APRIL i BAFF značajni u patogenezi multiplog mijeloma. Pacijenti oboleli od multiplog mijeloma imaju visoko varijabilne koncentracije APRIL i BAFF u plazmi. Kod zdravih subjekata, koncentracije APRIL u plazmi obično su 10 ng/ml ili manje. Kod obolelih od mijeloma, koncentracije APRIL i/ili BAFF u plazmi u opsegu su od 10 ng/ml do 100 ng/ml, a kod malog procenta pacijenata čak i do 300 ng/ml i više (Moreauxet al.2004; Blood 103(8): 3148-3157). Što je još važnije, APRIL se konstitutivno eksprimira u mikrosredini kostne srži i važan je faktor preživljavanja ćelija malignog mijeloma, a proizvode ga i sekretuju uglavnom mijeloidne prekursorske ćelije kostne srži (Mattheset al.Blood 2011; 118 (7): 1838-1844). Prema tome, koncentracije APRIL u kostnoj srži obolelih od mijeloma, za koje se očekuje da budu povišene, do 1000 ng/ml ili čak i više, visoko su relevantne u ovom kontekstu. Ukoliko se koncentracije za preusmereno T-ćelijsko ubijanje tumorskih ćelija pomoću BCMAxCD3 bispecifičnog antitela npr. pomere koncentracijama APRIL od 100 ng/ml i/ili 1000 ng/ml ka značajno višim koncentracijama (tj. ako su potrebne više koncentracije BCMAxCD3 bispecifičnog antitela da bi se postigla ista vrednost lize tumora (%) tokom definisanog vremena inkubacije), pri datoj kliničkoj dozi/koncentraciji bispecifičnog antitela pacijenti sa niskim nivoima APRIL u krvi i/ili kostnoj srži mogu imati terapijski efekat, ali pacijenti sa npr. 100 ng/ml APRIL u krvi i/ili 1000 ng/ml APRIL u kostnoj srži mogu odgovoriti mnogo nižim terapijskim efektom ili čak efekat može izostati kada se leče bispecifičnim antitelom. Alternativno, mogle bi se koristiti znatno više terapijske doze, ali u tom slučaju bi značajno porastao rizik od sporednih efekata (T-ćelijska bispecifična antitela mogu biti udružena sa dozno-zavisnim sporednim efektima kako je npr.saopšteno za blinatumomab u fazi 1 i 2 kliničkih ispitivanja). Verovatnije je da će takvo pomeranje prema višim efikasnim koncentacijama BCMAxCD3 antitela visokim nivoima APRIL biti prouzrokovano ako BCMAxCD3 antitelo i APRIL ligand kompetiraju za ista vezujuća mesta na BCMA receptom. U tom slučaju, okupiranost BCMA receptora biće smanjena kompetirajućim APRIL. Manja okupiranost receptora BCMAxCD3 bispecifičnim antitelom znači nižu efikasnost. BAFF takođe može da dovede do ovakvog pomeranja, ali s obzirom na mnogo niži afinitet vezivanja BAFF za BCMA nego APRIL za BCMA (tj. do 1000 puta niži afinitet), koncentracije APRIL u plazmi su u ovom kontekstu relevantnije nego koncentracije BAFF u plazmi.

[0054]Poželjno, antitelo prema pronalasku ne kompetira sa vezivanjem prirodnog liganda za BCMA, poželjno, ne kompetira sa APRIL.

[0055]Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što se vezivanje pomenutog antitela, u koncentraciji od 1000 nM, za humani BCMA redukuje u prisustvu 140 ng/ml (6.25 nM) mišjeg A APRIL za ne više od 10%, mereno ELISA testom kao OD na 450 nm, u poređenju sa vezivanjem pomenutog vezivača/antitela za humani BCMA u odsustvu APRIL.

[0056]Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što se vezivanje pomenutog antitela, u koncentraciji od 500 nM, za humani BCMA redukuje u prisustvu 1120 ng/ml (50 nM) AAPRIL za ne više od 35%, poželjno za ne više od 15%, mereno ELISA testom kao OD na 450 nm, u poređenju sa vezivanjem pomenutog vezivača/antitela za humani BCMA u odsustvu APRIL. Poželjno antitelo prema pronalasku karakteriše se time što se vezivanje pomenutog vezivača/antitela u koncentraciji od 1000 nM redukuje u prisustvu 1120 ng/ml (50 nM) AAPRIL za ne više od 35%, poželjno ne više od 15%, mereno ELISA testom kao OD na 450 nm, u poređenju sa vezivanjem pomenutog vezivača/antitela za humani BCMA u odsustvu

APRIL.

[0057]Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što se vezivanje pomenutog antitela za BCMA na ćelijama ćelijske linije multiplog mijeloma NCI-H929 redukuje APRIL-om za ne više od 25%, poželjno ne više od 20%, poželjno ne više od 10%, mereno kao vezivanje pomenutog vezivača/antitela u koncentraciji od 200 nM, poželjno 100 nM, poželjno 50 nM i poželjno 5 nM za NCI-H929 ćelije (ATCC<®>CRL-9068™) u prisustvu APRIL u koncentraciji od 2.5 ug/ml, u poređenju sa vezivanjem pomenutog antitela za NCI-H929 ćelije u odsustvu APRIL.

[0058]Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što pomenuto antitelo menja (indukuje ili redukuje) APRIL-indukovanu (koncentracija APRIL 1000 ng/ml) aktivaciju NF-kB, u koncentraciji od 1 nM, poželjno 100 nM, poželjno 400 nM, za ne više od 30%o, poželjno za ne više od 20%>, poželjno za ne više od 10%, u poređenju sa APRIL samim, i/ili pomenuto antitelo indukuje aktivaciju NF-kB u odsustvu APRIL, u koncentraciji od 1 nM, poželjno 100 nM, poželjno 400 nM za ne više od 20%, poželjno za ne više od 10%, poželjno za ne više od 5%, u poređenju sa stanjem u odsustvu pomenutog antitela.

[0059]Na stabilnost bispecifičnih antitela može da se utiče u praktičnim uslovima i prilikom kliničke primene. Uprkos nedavnim poboljšanjima u inženjerisanju antitela, neki rekombinantni proteini i molekulski formati (npr. scFVs fragmenti) pod stresnim uslovima teže da se, lakše nego drugi, denaturišu i formiraju agregate (Worn and Pluckthun. J Mol Biol 2001; 305, 989-1010). Poželjno, antitelo prema ovom pronalasku karakteriše se time što pomenuto antitelo uskladišteno u standardnom formulacionom puferu, na 37 °C, poželjno na 40 °C, 10 dana, poželjno do 2 nedelje, poželjno do 4 nedelje, ne daje više od 10% promena (A), poželjno ne više od 5%> promena (A), u sadržaju vrsta visoke molekulske težine (high molecular weight, HMW) i/ili vrsta niske molekulske težine (low molecular weight, LMW) i/ili monomera u poređenju sa pomenutim antitelom uskladištenim u istom formulacionom puferu na -80 °C tokom istog perioda skladištenja. Poželjno, bispecifično antitelo prema ovom pronalasku karakteriše se sposobnošću da indukuje preusmereno ubijanje primarnih ćelija mijeloma pcijenta obolelog od multiplog mijeloma, u prisustvu humanih T-ćelija. Poželjno, bispecifično antitelo prema ovom pronalasku karakteriše se time što se CH3 domen jednog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca susreću na kontaktnoj površini koja sadrži originalnu kontaktnu površinu između CH3 domena antitela; pri tome je pomenuta kontaktna površina izmenjena tako da pokrene formiranje bispecifičnog antitela, pri čemu se promena karakteriše time što je: a) CH3 domen jednog teškog lanca izmenjen, tako da se unutar originalne kontaktne površine CH3 domena jednog teškog lanca koja se susreće sa originalnom kontaktnom površinom CH3 domena drugog teškog lanca u bispecifičnom antitelu, aminokiselinska rezidua zamenjuje aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem veće zapremine, čime se unutar kontaktne provršine CH3 domena jednog teškog lanca stvara izbočina koja može da se smesti u udubljenje u kontaktnoj površini CH3 domena drugog teškog lanca i

b) CH3 domen drugog teškog lanca je izmenjen, tako da se unutar originalne kontaktne provršine drugog CH3 domena koja se susreće sa originalnom

kontaktnom površinom prvog CH3 domena u bispecifičnom antitelu, aminokiselinska rezidua zamenjuje aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem manje zapremine, čime se stvara udubljenje unutar kontaktne površine

drugog CH3 domena u koje može da se smesti ispupčenje u kontaktnoj površini prvog CH3 domena.

[00601 Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što se pomenuta aminokiselinska rezidua sa bočnim lancem veće zapremine bira iz grupe koja sadrži arginin (R), fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W). Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što se pomenuta aminokiselinska rezidua sa bočnim lancem manje zapremine bira iz grupe koja sadrži alanin (A), serin (S), treonin (T), valin (V). Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što su oba CH3 domena izmenjena još i uvođenjem cisteina (C) kao amino-kiseline na korespondirajućim pozicijama svakog od CH3 domena. Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što se jedan od konstantnih teškolančanih domena CH3 iz dva teška lanca zamenjuje konstantnim teškolančanim domenom CH1; i drugi konstantni teškolančani domen CH3 zamenjuje se konstantnim lakolančanim domenom

CL.

[0061] Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se i time što se specifično vezuje i za BCMA cinomolgusa.

[0062] Sledeću formu pronalaska predstavlja jedna ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju aminokiselinske sekvence antitela prema pronalasku.

[0063] Sledeće forme pronalaska predstavljaju ekspresioni vektori koji sadrže nukleinske kiseline prema pronalasku, sposobni da eksprimiraju pomenute nukleinske kiseline u ćeliji-domaćinu.

[0064] Sledeću formu pronalaska predstavlja metod pripremanja bispecifičnog antitela prema pronalasku koji uključuje korake a) transformisanja ćelije-domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju lake lance i teške lance antitela prema ovom pronalasku b) kultivisanje ćelije-domaćina pod uslovima koji omogućavaju sintezu molekula pomenutog antitela i

c) sakupljanje molekula pomenutog antitela iz pomenute kulture.

[0065]Sledeću formu pronalaska predstavlja ćelija-domaćin koja sadrži vektore koji sadrže nukleinskokiselinske

[0066]molekule koji kodiraju lake lance i teške lance antitela prema pronalasku.

[00671Sledeću poželjnu formu pronalaska predstavlja farmaceutska smeša koja sadrži antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.

[0068]Sledeću formu pronalaska predstavlja dijagnostička smeša koja sadrži antitelo prema pronalasku.

[0069]Objavljuje se metod lečenja pacijenta kojem je lečenje potrebno, koji se karakteriše time što se pacijentu daje terapijski efikasna količina bispecifičnog antitela prema pronalasku.

[0070]Sledeću poželjnu formu pronalaska predstavlja farmaceutska smeša koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu u vidu leka. Sledeću poželjnu formu pronalaska predstavlja farmaceutska smeša koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu u vidu leka za lečenje poremećaja plazmocita. Sledeću poželjnu formu pronalaska predstavlja farmaceutska smeša koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu u vidu leka za lečenje multiplog mijeloma. Sledeću formu pronalaska predstavlja antitelo prema pronalasku za lečenje poremećaja plazmocita, kao što su multipli mijelom ili drugi poremećaji B-ćelija u kojima se eksprimira BCMA. Multipli mijelom je maligno oboljenje B-limfocita, koje se karakteriše monoklonskom ekspanzijom i akumulacijom abnormalnih plazmocita u kompartmentu kostne srži. Multipli mijelom obuhvata i cirkulišuće klonske B-ćelije sa istim IgG genskim rearanžmanom i somatskom hipermutacijom. Multipli mijelom nastaje od asimptomatskog, premalignog stanja nazvanog monoklonska gamopatija nepoznatog značaja (monoclonal gammopathv of unknovra significance, MGUS), koje se karakteriše niskim nivoima plazmocita i monoklonskog proteina u kostnoj srži. Stopa proliferacije ćelija multiplog mijeloma je niska. Multipli mijelom je rezultat progresivnog nastanka većeg broja strukturnih hromozomskih promena (npr. nebalansirane translokacije). Multipli mijelom uključuje uzajamne interakcije malignih plazmocita i mikrosredine kostne srži (npr. normalnih ćelija strome kostne srži). Klinički znaci aktivnog multiplog mijeloma uključuju nagli porast (spike) monoklonskog antitela, prenaseljenost kostne srži plazocitima, litičke lezije i destrukciju kosti kao rezultat preterane stimulacije osteoklasta (Dimopulos & Terpos, Ann Oncol 2010; 21 suppl 7: viil43-150). Drugi poremećaj B-ćelija vezan za plazmocite tj. ekspresiju BCMA je sistemski eritemski lupus (svstemic lupus ervthematosus, SLE), poznat i kao lupus. SLE je sistemsko autoimuno oboljenje koje može da zahvati bilo koji deo tela, a predstavljen je imunim sistemom koji napada ćelije i tkiva sopstvenog tela, što za rezultat ima hroničnu inflamaciju i oštećenje tkiva. To je reakcija preosetljivosti tipa III u kojoj imunski kompleksi antitela precipitiraju i dovode do daljeg imunskog odgovora (Inaki & Lee, Nat Rev Rheumatol 2010; 6: 326-337). Objavljuje se i farmaceutska smeša koja uključuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u vidu leka za lečenje sistemskog eritemskog lupusa.

Opis slika

[0071]Slika 1. Bispecifična bivalentna antitela koja sadrže samo Fab fragmente (specifične za CD3 i BCMA) i Fc deo, kako je navedeno: (A) Fab BCMA(RK/EE)-Fc-Fab CD3; (B) Fab BCMA-Fc-Fab CD3(RK/EE). aa supstitucije RK/EE uvedene u CL-CH1 za smanjenje LC pogrešnog sparivanja/sporednih proizvoda pri proizvodnji. Fab CD3 uključuje VL-VH "crossover" za smanjenje LC pogrešnog sparivanja i sporednih proizvoda.

Slika 2. Poželjna bispecifična trivalentna antitela sadrže samo Fab fragmente

(specifične za CD3 i BCMA) i Fc deo kako je navedeno: (A) Fab BCMA(RK/EE)- Fc-Fab CD3-Fab BCMA(RK/EE); (B) Fab BCMA-Fc-Fab CD3(RK/EE)-Fab BCMA; (C) Fab BCMA(RK/EE)-Fc-Fab BCMA(RK/EE)-Fab CD3; (D) Fab BCMA-Fc-Fab BCMA-Fab CD3(RK/EE). aa supstitucije RK/EE uvedene u CL-CH1 za smanjenje LC pogrešnog sparivanja/sporednih proizvoda pri proizvodnji. Poželjno, Fab CD3 uključuje VL-VH "crossover" za smanjenje LC pogrešnog sparivanja i sporednih proizvoda. Poželjno, Fab CD3 i Fab BCMA povezani su jedan sa drugim fleksibilnim linkerima.

Slika 3. Bispecifična bivalentna antitela koja sadrže samo Fab fragmente (specifične za CD3 i BCMA) i Fc deo kako je navedeno: (A) Fc-Fab CD3-Fab

BCMA(RK/EE); (B) Fc-Fab CD3(RK/EE)-Fab BCMA; (C) Fc-Fab BCMA(RK/EE)-Fab CD3; (D) Fc-Fab BCMA-Fab CD3(RK/EE). Poželjno, Fab CD3 uključuju VL-VH "crossover" za smanjenje LC pogrešnog sparivanja i sporednih proizvoda. Fab CD3 i Fab BCMA povezani su jedan sa drugim fleksibilnim linkerima.

Slika 4. Vezivanje anti-BCMA antitela na BCMA-pozitivnim ćelijama multiplog mijeloma. Srednji intenzitet fluorescencije za anti-BCMA IgG klonove nanosi se na dijagram u funkciji koncentracija anti-BCMA antitela (od 0.2 do 40 ug/ml);

(A) klonovi 17A5 i 83A10 na H929 ćelijama, (B) klonovi 17A5, 83A10 na MKN45 ćelijama, (C) klonovi 13A4 na H929 ćelijama (D) klonovi 13A4 na

MKN45 ćelijama (vidi Primer 4).

Slika 5. Kompetitivni ELISA. Prikazani su ELISA rezultati, za odabrane anti-BCMA Fab klonove (17A5, 83A10, i 13A4), pri zasićujućim koncentracijama od 500 ili 1000 nM, vezivanja za imobilisani humani BCMA u prisustvu opsega koncentracija mišjeg APRIL (od 1.56 do 100 nM). U slučaju nekompeticije, signali ostaju konstantni unutar varijabilnosti testa duž koncentracionog opsega,

a signali u prisustvu mišjeg APRIL uporedivi su sa onima iz kontrolnih bunarčića u koje nije dodavan mišji APRIL. U slučaju kompeticije izmerena je koncentraciono-zavisna redukcija signala (vidi Primer 5a).

Slika 6. Kompeticija u vezivanju, uz korišćenje FACS, na H929 ćelijama. Kompeticija mišjeg A-APRIL sa anti-BCMA antitelima detektovana je protočnom citometrijom. Relativna medijana intenziteta fluorescencije A-APRIL

(FITC signal) korišćenog u koncentraciji od 1000 ng/ml detektovana je u funkciji koncentracija (osnov 16 ug/ml) anti-BCMA antitela, klonovi 83A10, 17A5, i 13A4, na H929 ćelijama. Medijana intenziteta fluorescencije posle vezivanja A- APRIL u prisustvu izotipske kontrole podešena je na jedan; drugi signali su normalizovani u odnosu na to. Detekcija vezivanja APRIL za BCMA-pozitivne H929 ćelije u prisustvu anti-BCMA antitela merena je anti-HA fluorohrom-konjugovanim antitelom (vidi Primer 5b).

Slika 7. Kompeticija u vezivanju, uz korišćenje FACS, na RPMI-8226 ćelijama. Kompeticija anti-BCMA antitela sa A-APRIL detektovana je protočnom citometrijom. Relativna medijana intenziteta fluorescencije anti-BCMA antitela

(Alexa.Fluor 647 signal) korišćenog u koncentraciji od 40 |ig/m1, za klonove anti- BCMA antitela 13A4, 17A5, 83A10 na RPMI-8226 ćelijama, detektovana je u odsustvu ili prisustvu A-APRIL, 1000 ng/ml. Medijana intenziteta fluorescencije posle vezivanja anti-BCMA antitela u odsustvu A-APRIL podešena je na jedan;

drugi signali koji se odnose na anti-BCMA antitelo u prisustvu A-APRIL normalizovani su u odnosu na to. Detekcija vezivanja anti-BCMA antitela za BCMA-pozitivne RPMI-8226 ćelije u prisustvu A-APRIL merena je anti-humanim Fc fluorohrom-konjugovanim antitelom (vidi Primer 5c).

Slika 8. Kompetitcija anti-BCMA antitela sa A-APRIL na H929 ćelijama posle simultane inkubacije, detektovana protočnom citometrijom. (A) Medijana intenziteta fluorescencije i relativni fluorescentni signal (Alexa.Fluor 647 signal) anti-BCMA antitela, klonovi 13A4, 17A5, 83A10 pri koncentraciji od 20 ug/ml, u prisustvu ili odsustvu 2.5 ug/ml A-APRIL ili (B) Mereni su prosečni intenzitet fluorescencije i relativni fluorescentni signal A-APRIL (FITC signal) pri

koncentraciji od 2.5 ug/ml A-APRIL i anti-BCMA antitela, klon 83A10 (20 ug/m) (Alexa.Fluor 647 signal). Detekcija anti-BCMA antitela u prisusutvu A-APRIL,

FITC-konjugovanim anti-humanim Fc antitelom normalizovana je u odnosu na signal klona anti-BCMA antitela u odsustvu A-APRIL. Detekcija A-APRIL u prisustvu klona anti-BCMA antitela, Alexa.Fluor 647-konjugovanim anti-HA antitelom normalizovana je prema A-APRIL signalu u prisustvu izotipske kontrole (vidi Primer 5d).

Slika 9. Efekat anti-BCMA antitela, posle vezivanja za H929 ćelije, na aktivaciju NF-kB u odsustvu APRIL, detektovan testom hemiluminiscencije na bazi ELISA. Detekcija aktivacije NF-kB posle vezivanja anti-BCMA antitela (17A5, 83A10) i izotipskih kontrolnih antitela za BCMA-eksprimirajuće H929 ćelije, merenje vršeno testom hemiluminiscencije na bazi ELISA (vidi Primer 6).

Slika 10. Proizvodnja i prečišćavanje 83A10-TCB bez varijante naelektrisanjavs.83A10-TCBcv sa varijantom naelektrisanja. CE-SDS (neredukujući uslovi)

grafikoni finalnih proteinskih preparata posle različitih metoda prečišćavanja, za 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela. Koraci prečišćavanja afinitetnom hromatografijom na proteinu A (PA) i ekskluzionom hromatografijom zasnovanom na veličini (siže exclusion chromatographv, SEC) primenjeni na antitelo 83A10-TCB (A). (B) Dodatni koraci prečišćavanja: katjonsko-izmenjivačka hromatografija (cation exchange chromatography, cIEX) i finalna

ekskluziona hromatografija zasnovana na veličini (re-SEC), primenjeni na finalne proteinske preparate u (A). (C) 83A10-TCBcv antitelo posle koraka prečišćavanja PA + cIEX + SEC. 83A10-TCB i 83A10-TCBcv molekuli su molekulskog formata opisanog na Slici 2a (vidi Primer 8).

Slika 11. Studija direktnog poređenja (head-to-head comparison): Proizvodnja 83A10-TCB bez naelektrisanja vs. 83A10-TCBcv sa varijantom naelektrisanja. Osobine (npr. čistoća, prinos, sadržaj monomera) 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela merene su paralelno i upoređivane posle svakog koraka prečišćavanje 1)

samo PA afinitetna hromatografija (A, B), 2) PA afinitetna hromatografija, zatim SEC (C, D) i 3) PA afinitetna hromatografija, zatim SEC zatim cIEX i re-SEC (E, F). CE-SDS (neredukujući uslovi) grafikoni finalnih proteinskih rastvora posle respektivnih metoda prečišćavanja, za 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela. (A) korak prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom primenjen na 83A10-TCB antitelo. (B) Korak prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom primenjen na 83A10-TCBcv antitelo. (C) Koraci prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom + SEC primenjeni na 83A10-TCB antitelo. (D) Koraci prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom + SEC primenjeni na 83 A10-TCBcv antitelo. (E) Koraci prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom +/-SEC + cIEX + SEC primenjeni na 83A10-TCB antitelo. (F) koraci prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom +/- SEC + cIEX + SEC primenjeni na 83 A10-TCBcv antitelo. Mereni su čistoća, prinos, sadržaj monomera. Procenat

korektnih molekula detektovan je tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC- MS) (vidi Primer 8).

Slika 12. Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3-TCB antitela za mišje BCMA-eksprimirajuće HEK ćelije (A) BCMA-eksprimirajuće HEK ćelije majmuna cinomolgusa (B), detektovano protočnom citometrijom (vidi Primer 10).

Slika 13. Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3-TCBcv antitela za BCMA-poztivne H929 ćelije, uz korišćenje protočne citometrije. Srednji intenzitet fluorescencije anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela nanet je na dijagram u funkciji koncentracija antitela; (A) 83A10-TCBcv na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama, (B) 17A5-TCBcv na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama (vidi Primer 11).

Slika 14. Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3-TCBcv antitela za CD3-pozitivne Jurkat T ćelije mereno protočnom citometrijom. Medijana intenziteta fluorescencije za vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (83A10-TCBcv

(A); 17A5-TCBcv (B)) za Jurkat T ćelije nanosi se u funkciji koncentracija antitela. Nema vezivanja za BCMA-negativne i CD3-negativne MKN45 ćelije

(vidi Primer 12).

Slika 15. Efekat anti-BCMA/anti-CD3-TCBcv antitela na APRIL-indukovanu aktivaciju NF-kB, kako je detektovano fosfoprotočnom citometrijom. (A) Efekat

APRIL- nekompetirajućeg 83A10-TCBcv u poređenju sa APRIL-kompetirajućim J6M0-TCB na APRIL-(1000 ng/ml)-posredovanu aktivaciju NF-kB u H929 ćelijama. (B) Efekat APRIL-nekompetirajućeg 83A10-TCBcv u poređenju sa APRIL-kompetirajućim J6M0-TCB na APRIL-(zasićujuća koncentracija od 5000 ng/ml)-posredovanu aktivaciju NF-kB u H929 ćelijama. Detekcija unutarćelijskog fosforilisanog NF-kB vršena je fosfoprotočnom citometrijom (vidi Primer 13).

Slika 16. Efekat anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela na NF-kB aktivaciju H929 ćelija u odsustvu APRIL, kako je detektovano fosfoprotočnom citometrijom. (A)

Efekat APRIL nekompetirajućeg 83A10-TCBcv na NF-kB aktivaciju u H929

ćelijama u odsustvu APRIL (eksperiment 1). (B) Efekat APRIL nekompetirajućeg 83A10-TCB na NF-kB aktivaciju u H929 ćelijama u odsustvu APRIL (eksperiment 2). Detekcija unutarćelijskog fosforilisanog NF-kB fosfoprotočnom citometrijom (vidi Primer 14).

Slika 17. Aktivacija T-ćelija posredovana anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitelima u prisustvu H929 ćelija, detektovana protočnom citometrijom. Nivo ekspresije ranog markera aktivacije CD69 (C, D) i kasnog markera aktivacije

CD25 (A, B) na CD4<+>i CD8<+>T-ćelijama, posle 48 sati inkubacije. 83A10-TCBcv antitelo indukovalo je pozitivnu regulaciju CD69 i CD25 markera aktivacije na koncentraciono-zavisan i specifičan način, u prisustvu BCMA-pozitivnih ciljnih ćelija. Korišćen je odnos E:T 10 PBMC:1 H929 ćelija; ćelije su inkubirane 48 h pre merenja pozitivne regulacije CD69 i CD25. Reprezentativni rezultati dva nezavisna eksperimenta (vidi Primer 15).

Slika 18. Anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela indukuju T-ćelijsko preusmereno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 mijeloma ćelija, detektovano kolorimetrijskim testom oslobađanja LDH. Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ((A) 83A10- TCBcv, (B) 17A5-TCBcv) indukovala su koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 mijeloma ćelija, mereno preko oslobađanja LDH. Korišćen je odnos E:T 10 PBMC:1 H929 ćelija; ćelije su inkubirane 24 h pre merenja oslobađanja LDH (vidi Primer 18).

Slika 18-1. Preusmerena T-ćelijska liza H929 MM ćelija indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena preko oslobađanja LDH. Krive koncentracionog odgovora za lizu H929 MM ćelija indukovanu 83A10-TCBcv (prazan krug, tačkasta linija). Sa 83A10-TCBcv antitelom

zapaženo je koncentraciono-zavisno ubijanje H929 ćelija, dok sa kontrolnim-TCB nije zapaženo ubijanje. Eksperimenti su obavljeni sa PBMC donora 1 (A), donora 3 (B), donora 4 (C), donora 5 (D), uz korišćenje odnosa efektorskih ćelija

prema tumorskim ciljnim ćelijama (E:T) od 10 PBMC prema 1 MM ćeliji (vidi Primer 18).

Slika 18-2. Preusmerena T-ćelijska liza L363 MM ćelija indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena preko oslobađanja LDH. Krive koncentracionog odgovora za lizu L363 MM ćelija indukovanu 83A10-TCBcv (prazan krug, tačkasta linija). Sa 83A10-TCBcv antitelom

zapaženo je koncentraciono-zavisno ubijanje L363 ćelija, dok sa kontrolnim-TCB nije zapaženo ubijanje. Eksperimenti su obavljeni sa PBMC donora 1 (A), donora 2 (B), donora 3 (C), donora 4 (D), donora 5 (E), uz korišćenje odnosa E:T od 10 PBMC prema 1 MM ćeliji (vidi Primer 19).

Slika 18-3. Preusmerena T-ćelijska liza RPMI-8226 MM ćelija indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena preko oslobađanja LDH. Krive koncentracionog odgovora za lizu RPMI-8226 MM ćelija indukovanu 83A10-TCBcv (prazan krug, tačkasta linija). Sa 83A10-TCB

antitelom zapaženo je koncentraciono-zavisno ubijanje RPMI-8226 ćelija, dok sa kontrolnim-TCB nije zapaženo ubijanje. Eksperimenti su izvedeni sa PBMC

donora 2 (A), donora 3 (B), donora 4 (C), donora 5 (D), uz korišćenje E:T odnosa 10 PBMC prema 1 MM ćeliji (vidi Primer 19A).

Slika 18-4. Preusmerena T-ćelijska liza JJN-3 MM ćelija indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena protočnom citometrijom. Koncentraciono-zavisno ubijanje JJN-3 MM ćelija u prisustvu

83A10-TCBcv (prazan krug, tačkasta linija). Procenat aneksin-V-pozitivnih JJN- 3 ćelija (A, C) i liza tumorskih ćelija (B, D) određuju se i unose na dijagram.

Procenat lize JJN-3 ćelija indukovane specifičnom koncentracijom anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela određen je na sledeći način: apsolutni broj aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija za daru koncentraciju TCB oduzima se od apsolutnog broja aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija bez TCB;

podeljeno sa apsolutnim brojem aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija bez TCB. Eksperimenti su izvedeni sa PBMC uzetim od 2 donora: donora 1 (A, B) i

donora 2 (C, D), uz korišćenje odnosa E:T 10 PBMC prema 1 MM ćeliji (vidi Primer 19B).

Slika 19. Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela indukuju T-ćelijsko preusmereno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 mijeloma ćelija u prisustvu APRIL, kako je detektovano kolorimetrijskim testom oslobađanja LDH. (A) APRIL-neblokirajuće/nekompetirajuće 83A10-TCBcv u odsustvu egzogenog APRIL i u prisustvu 100 ng/ml ili 1000 ng/ml egzogenog APRIL. (B) APRIL-blokirajuće/kompetirajuće J6M0-TCB u odsustvu egzogenog APRIL i u prisustvu 100 ng/ml ili 1000 ng/ml egzogenog APRIL. Korišćenje odnos E:T 10 PBMC:1 H929 ćelija; ćelije su inkubirane 24 h pre merenja oslobađanja LDH (vidi Primer 20).

Slika 20. Poređenje uticaja 83A10-TCB bez varijante naelektrisanja i 83A10-TCBcv sa varijantom naelektrisanja, na biološka svojstva. (A) Metod direktnog poređenja: vezivanje 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela za H929 ćelije, kako

je detektovano protočnom citometrijom (eksperiment 1); (B) Direktno poređenje: vezivanje 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela za H929 ćelije i MKN45 ćelije kako je detektovano protočnom citometrijom (eksperiment 2); (C-F) Poređenje 83A10-TCB antitela (C, D) i 83A10-TCBcv antitela (E, F) u indukovanju T-ćelijskog preusmerenog ubijanja BCMA-pozitivnih H929 mijeloma ćelija. Korišćen odnos E:T 10 PBMC:1 H929 ćelija; ćelije su inkubirane 24 h pre merenja oslobađanja LDH (vidi Primer 21).

Slika 21. Preusmerena T-ćelijska liza mijeloma-plazmocita iz kostne srži pacijenata obolelih od multiplog mijeloma, u prisustvu autologih T-ćelija koje infiltriraju kostnu srž (aspirati cele kostne srži pacijenta), indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena multiparametarskom protočnom citometrijom. Određen je procenat aneksin-V-pozitivnih mijeloma-plazmocita i nanesen na dijagram u odnosu na koncentracije TCB. Koncentraciono-zavisna i specifična liza pacijentovih mijeloma-plazmocita zapaža se sa 83A10-TCBcv, dok liza T-ćelija, B-ćelija i NK-ćelija nije zapažena, bazirano na 8-kolornom multiparametarskom panelu. Nije bilo indukcije ćelijske smrti mijeloma-plazmocita sa kontrolnim-TCB, pri najvišoj testiranoj koncentraciji TCB antitela (vidi Primer 23).

Slika 22. Preusmerena T-ćelijska liza mijeloma-plazmocita iz kostne srži pacijenata obolelih od multiplog mijeloma u prisustvu autologih T-ćelija koje infiltriraju kostnu srž, indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena protočnom citometrijom. Procenat vijabilnih mijeloma-plazmocita određivan je selektovanjem aneksin-V-negativne ćelijske populacije i nanošenjem na dijagram u odnosu na koncentraciju 83A10-TCBcv anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela za Pacijenta 001 (A), Pacijenta 002 (B) i Pacijenta 003 (c). 83A 10-TCBcv-indukovana liza mijeloma-plazmocita u uzorcima aspirata kostne srži obolelih od multiplog mijeloma. Koncentraciono-zavisna redukcija vijabilnih mijeloma ćelija zapažena je kod 3/3 uzorka dobijena od pacijenata, tretiran sa 83A10-TCBcv. Poređenje 83A10-TCBcv sa J6M0-TCBcv (antitelo za koje je saopšteno da kompetira sa APRIL u vezivanju za BCMA (Tai et at., Blood 2014)): Kod 3/3 uzorka dobijena od

pacijenata, 83A10-TCBcv je indukovao više lize mijeloma-plazmocita iz aspirata kostne srži obolelih nego J6M0-TCB pri ekvimolarnoj maksimalnoj dozi od 30 nM (vidi Primer 23).

Slika 23. Preusmerena T-ćelijska liza mijeloma-plazmocita iz kostne srži pacijenata obolelih od multiplog mijeloma, u prisustvu autologih T-ćelija koje infiltriraju kostnu srž, indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena protočnom citometrijom. Određen je procenat propidijum-jodid-negativnih mjeloma-plazmocita, i procenat vijabilnih plazmocita kostne srži u odnosu na kontrolni medijum (medium control, MC) nanet je na dijagram u odnosu na koncentracije TCB. Koncentraciono-zavisna i specifična liza mijeloma-plazmocita obolelih zapažena je sa 83A 10-TCBcv (A-G), dok liza mikrosredine kostne srž (bone marrow microenvironment, BMME)

nije zapažena (H). Nije zapažena indukcija ćelijske smrti mijeloma-plazmocita sa kontrolnim-TCB ni pri najvišoj testiranoj koncentraciji TCB antitela. 83A10-

TCBcv indukuje potentno ubijanje mijeloma-plazmocita kostne srži obolelih što se reflektuje koncentraciono-zavisnom redukcijom vijabilnih (propidijum-jodid-negativnih) mijeloma-plazmocita. Efekat se smatra za statistički značajan ako P-vrednost odgovarajućeg statističkog testa iznosi <5% (<*>), < 1% (<**>) ili <0.1%

(<***>). Eksperimenti su izvedeni korišćenjem uzoraka aspirata kostne srži dobijenih od pacijenta 1 (A), pacijenta 2 (B), pacijenta 3 (C), pacijenta 4 (D), pacijenta 5 (E), pacijenta 6 (F) i pacijenta 7 (G, H) (vidi Primer 23).

Slika 24. Aktivacija T-ćelija kostne srži pacijenata obolelih od mijeloma u prisustvu plazmocita kostne srži (aspirati cele kostne srži obolelih) indukovana 83A10-TCBcv anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelom, merena multiparametarskom protočnom citometrijom (8-kolorni panel za bojenje). Aktivacija CD4 T-ćelija (gore) i aktivacija CD8 T-ćelija (dole) (vidi Primer 23 A).

Slika 25. Koncentracije 83A10-TCBcv merene u uzorcima seruma imunodeficijentnih NOD/Shi-scid IL2rgamma(null) (NOG) miševa, posle jedne intravenske (IV) injekcije 83A10-TCBcv u dozi od 0.0082, 0.082 i 0.82 mg/kg.

Sakupljanje uzoraka seruma obavljeno je pre doziranja i 0.25, 0.5, 1, 3, 7, 24, 48, 96, 168, 240 h posle doziranja (vidi Primer 24).

Slika 26. Koncentracije 83A10-TCBcv merene u uzorcima seruma (ispunjeni simboli i pune linije) i uzorcima kostne srži (prazni simboli i tačkaste linije) majmuna cinomolgusa posle jedne intravenske (IV) injekcije 83A10-TCBcv, u dozi od 0.003, 0.03 i 0.1 mg/kg. Sakupljanje uzoraka seruma obavljeno je pre

doziranja i 30, 90, 180 min, 7, 24, 48, 96, 168, 336, 504 h posle doziranja. Uzorci kostne srži uzimani su pre doziranja i 96 i 336 h posle doziranja (vidi Primer 24A).

Slika 27. Redistribucija perifernih T-ćelija zapažena kod majmuna cinomolgusa

posle jedne IV injekcije 83A10-TCBcv (0.003, 0.03 i 0.3 mg/kg). Životinje A i B, C i D i E i F, respektivno, primile su IV injekciju 83A10-TCBcv u dozi od

0.003, 0.03 i 0.3 mg/kg. Apsolutne vrednosti broja T-ćelija u krvi (CD2<+>ćelije poul

krvi) nanete su na dijagram u odnosu na vreme posle tretmana (vidi Primer 24A).

Slika 28. Redukcija broja plazmocita u krvi zapažena kod majmuna cinomolgusa posle jedne IV injekcije 83A10-TCBcv (0.3 mg/kg), kako je izmereno multiparametarskom protočnom citometrijom. Plazmociti (plasma cells, PC) su identifikovani na osnovu 6-kolornog panela za bojenje i procenat PC prema limfocitima određen je i unet u konturne dijagrame (A). Prikazana je kinetika

deplecije krvnih plazmocita posle tretmana sa 83A10-TCBcv u dozi od 0.3 mg/kg, kod majmuna cinomolgusa (B) (vidi Primer 24A).

Slika 29. Antitumorska aktivnost indukovana 83A10-TCBcv anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelom u ksenograftskom modelu H929 humanog mijeloma uz korišćenje PBMC-humanizovanih NOG miševa. Imunodeficijentni NOD/Shi-scid IL2rgamma(null) (NOG) primili su, na dan 0 (dO), H929 ćelije humanog multiplog mijeloma, u vidu subkutane (SC) injekcije u desnu polovinu dorzalnog regiona. Na dan 15 (dl5), NOG miševi primili su jednu intraperitonealnu (IP) injekciju humanih PBMC. Miševi su zatim pažljivo

nasumično raspoređeni u različite grupe tretmana i kontrole (n=9/grupi) i obavljen je statistički test za utvrđivanje homogenosti između grupa. Eksperimentalne grupe bile su kontrolna netretirana grupa, kontrolna-TCB tretirana grupa, grupa tretirana sa 2.6 nM/kg 83A10-TCBcv i grupa tretirana sa 2.6 nM/kg BCMA50- BiTE<®>(BCMAxCD3 (scFv)2). Tretman antitelima injektiranjem u repnu venu, počeo je na dan 19 (dl9), tj. 19 dana posle SC injekcije H929 tumorskih ćelija. Raspored tretmana TCB antitelom podrazumevao je intravensku primenu jednom nedeljno, tokom 3 nedelje (tj. ukupno 3 injekcije TCB antitela). Zapremina tumora (tumor volume, TV) merena je tokom studije nonijusom i pnapredakje procenjivan poređenjem TV između grupa. TV (mm<3>) naneta je na dijagram u odnosu na dane posle injektiranja tumora. Na dl9, prvog dana tretmana, srednja zapremina tumora dostigla je 300 ± 161 mm<3>za kontrolnu grupu tretiranu prenosnikom (A), 315 ± 148 mm<3>za grupu tretiranu kontrolnim-TCB,

2.6 nM/kg (A), 293 ± 135 mm<3>za grupu tretiranu sa 2.6 nM/kg 83A10-TCBcv (B) i 307 ± 138 mm3 za grupu tretiranu sa 2.6 nM/kg BCMA50-BiTE<®>(C). TV svakog pojedinačnog miša po eksperimentalnoj grupi nanet je na dijagram u odnosu na dan posle injektiranja tumora: (A) kontrolne grupe, uključujući kontrolu sa prenosnikom (puna linija) i kontrolno-TCB (tačkasta linija), (B) 83A 10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupa, i (C) BCMA50-BiTE<®>(2.6 nM/kg). Crna strelica pokazuje

kada je TCB treteman dat IV injekcijom. U grupi 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg), kod 6 od 9 miševa (67%) došlo je do regresije tumora, čak do TV zabeležene na dl9

tj. na dan prvog TCB-tretmana i regresija tumora se održala do kraja studije. Kod 3 miša u grupi tretiranoj sa 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) kod kojih nije došlo do regresije tumora, TV na dl9 iznosila je 376, 402 odnosno 522 mm<3>. Nasuprot

tome, ni kod jednog od 9 miševa (0%>) tretiranih ekvimolarnom dozom BCMA50- BiTE<®>(2.6 nM/kg) po režimu jednom nedeljno, tokom 3 nedelje, nije došlo do regresije tumora, ni u jednoj tački vremena (vidi Primer 25).

Slika 30. Procenat rasta tumora (tumor growth, TG) izračunat za dl9 do d43 i poređenje između 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupe i BCMA50-BiTE<®>(2.6

nM/kg). Procenat rasta tumora definisan kao TG (%>) određen je izračunavanjem: TG (%) = 100 x (medijana TV analizirane grupe)/(medijana TV kontrolne grupe tretirane prenosnikom). Iz etičkih razloga, miševi su eutanazirani kada je TV dostigla 2000 mm<3>. TG (%) bio je konzistentno i značajno redukovan kod83A10- TCBcv (2.6 nM/kg) grupe, a takođe je i TG (%) bio uvek niži u poređenju sa BCMA50-BiTE<®>(2.6 nM/kg) (vidi Primer 25).

Detaljan opis pronalaska

[0072]Pronalazači su našli da bispecifična antitela protiv CD3s i BCMA, sa VH/VL razmenom, mogu da se proizvedu sa visokim prinosom i da se lako prečiste ako je u CL lakog lanca, ili u delu antitela protiv CD3s ili u delu antitela protiv BCMA, amino-kiselina na poziciji 124 nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numerisanje po Kabat-u), i u respektivnom konstantnom domenu CH1 amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 su nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D)

(numerisanje po Kabat-u).

[0073]Poželjno, VH/VL razmena je u CD3-vezujućem delu. Poželjno, bispecifično antitelo je monovalentno za vezivanje sa CD3. Gore opisane aminokiselinske supstitucije mogu biti ili u BCMA-vezujućem delu ili u CD3-vezjućem delu. Dakle, u određenoj formi pronalaska, CD3-vezujući deo može da sadrži VH/VL razmenu i aminokiselinske supstitucije. U tom slučaju BCMA-vezujući deo ne sadrži VH/VL razmenu ili aminokiselinske supstitucije na mestima 124, 147, 213, ili 123. Poželjno, bispecifično antitelo je monovalentno za vezivanje sa CD3 i bivalentno za vezivanje sa BCMA. Kako je opisano, bispecifično antitelo može dakle sadržati drugi BCMA-vezujući deo koji je identičan sa prvim. Prema tome, ako prvi BCMA-vezujući deo sadrži aminokiselinske supstitucije, drugi BCMA-vezujući deo sadrži iste supstitucije i ako prvi BCMA-vezujući deo ne sadrži aminokiselinske supstitucije, drugi BCMA-vezujući deo takođe ne sadrži supstitucije. Poželjno, amino-kiselina 124 je K, amino-kiselina 147 je E, amino-kiselina 213 je E, i amino-kiselina 123 je R. Poželjno, CD3-vezujući deo i BCMA-vezujući deo (ili oba BCMA-vezujuća dela ako je takav slučaj) su Fab fragmenti, pri čemu, kada su prisutna dva BCMA-vezujuća dela, jedan BCMA deo je hemijski vezan za CD3-vezujući deo preko CH1/VL (C-terminus BCMA-vezjućeg dela (CH1) za N-terminus "crossover" CD3-vezujućeg dela (VL)) ili CH1/VH (C-terminus "crossover" CD3-vezujućeg dela (CH1) za N-terminus BCMA-vezujućeg dela (VH)). Bispecifično antitelo može da sadrži ili da ne sadrži Fc deo.

[0074]Izraz "cilj", kako se koristi u ovom tekstu, označava BCMA ili CD3. Izraz "prvi cilj i drugi cilj" označava CD3 kao prvi cilj i BCMA kao drugi cilj ili označava BCMA kao prvi cilj i CD3 kao drugi cilj.

[0075]Izraz "BCMA", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antigen maturacije humanih B-ćelija, poznat i kao BCMA; TR17 HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), koji je član superfamilije receptora za faktor nekroze tumora i koji se preferencijalno eksprimira na diferenciranim plazmocitima. Vanćelijski domen BCMA sastoji se, prema UniProt, od amino-kiselina 1-54 (ili 5-51). Izraz "antitelo protiv BCMA, anti-BCMA antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antitelo koje se specifično vezuje za BCMA.

[0076]Izraz "CD3s ili CD3", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na humani CD3s opisan pod UniProt P07766 (CD3E HUMAN). Izraz "antitelo protiv CD3, anti CD3 antitelo" odnosi se na antitelo koje se vezuje za CD3s. Poželjno antitelo sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolančane CDR SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao respektivne teškolančane CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni domen VL koji uključuje lakolančane CDR SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao respektivne lakolančane CDR1, CDR2 i CDR3. Poželjno, antitelo sadrži varijabilne domene SEQ ID NO:7 (VH) i SEQ ID NO:8 (VL). Izraz "antitelo protiv CD3, anti-CD3 antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antitelo koje se specifično vezuje za CD3.

[0077]"Specifično vezivanje za CD3 ili BCMA" odnosi se na antitelo koje je sposobno da se veže za CD3 ili BCMA (ciljevi) sa dovoljnim afinitetom tako da antitelo bude korisno kao terapijsko sredstvo u ciljanju CD3 ili BCMA. U nekim formama, stepen vezivanja anti-CD3 ili BCMA antitela za nesrodni, ne-CD3 ili ne-BCMA protein je oko 10 puta, poželjno >100 puta, manji nego vezivanje antitela za CD3 ili BCMA, kada se meri, npr., rezonancijom površinskog plazmona (surface plasmon resonance, SPR), npr. Biacore<®>, enzimskim imunotestom (ELISA) ili protočnom citometrijom (FACS). Poželjno, antitelo koje se vezuje za CD3 ili BCMA ima konstantu disocijacije (dissociation constant, Kd) od IO"<8>M ili manju, poželjno od 10"<8>M do 10"<13>M, poželjno od IO"<9>M do IO"<13>M. Poželjno, anti-CD3 i/ili anti-BCMA antitelo vezuje se za epitop CD3 i/ili BCMA koji je konzerviran među CD3 i/ili BCMA iz različitih vrsta, poželjno između čoveka i cinomolgusa. "Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za CD3 i BCMA" ili "antitelo prema pronalasku" ili "bispecifično antitelo protiv CD3 i BCMA" odnosi se na odgovarajuću definiciju za vezivanje za oba cilja. Antitelo koje se specifično vezuje za BCMA (ili BCMA i CD3) ne vezuje se za druge humane antigene. Prema tome, u ELISA, OD vrednosti za takve nesrodne ciljeve biće jednake ili niže od limita detekcije specifičnog testa, poželjno > 0.3 ng/ml, ili jedanke ili niže od OD vrednosti kontrolnih uzoraka bez za ploču vezanog BCMA ili sa netransfektovanim HEK293 ćelijama.

[0078]Izraz "varijanta BCMA antitela", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na anti-BCMA antitelo koje sadrži sekvence antitela 13A4 sa aminokiselinskom izmenom odabranom iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih izmena na respektivnoj poziciji 95 (N95) ili 96 (G96) unutar CDR3H SEQ ID NO:29, i to zamena jedne amino-kiseline na poziciji 95, koja može biti N95S, N95T, N95E, N95Q, N95A ili N95G, ili zamena jedne amino-kiseline na poziciji 96, koja može biti G96A, G96E ili G96Q. Isto tako, odnosi se na antitelo pronalaska koje sadrži sekvence antitela 13A4 sa aminokiselinskom izmenom odabranom iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih izmena na respektivnim pozicijama 27 (N27f) i 28 (G28) unutar CDR1L SEQ ID NO:32, i to zamena jedne amino-kiseline na poziciji 27, koja može biti N27fS, N27fT, N27fE, N27fQ, N27fA, ili N27fG ili zamena jedne amino-kiseline na poziciji 28, koja može biti G28A, G28E ili G28Q. Odnosi se i na antitelo pronalaska, koje sadrži sekvence antitela 13A4 sa aminokiselinskom zamenom odabranom iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih zamena na respektivnim pozicijama 54 (D54) i 55 (S55) unutar CDR2H SEQ ID NO:26, i to zamena jedne amino-kiseline na poziciji 54, koja može biti D54S, D54T, D54E, D54Q, D54A ili D54G ili zamena jedne amino-kiseline na poziciji 55, koja može biti S55A, S55E ili S55Q. Odnosi se i na antitelo pronalaska, koje sadrži sekvence antitela 13A4 sa aminokiselinskom izmenom odabranom iz grupe koja se sastoji od izmena amino-kiseline W na poziciji 33 (W33) unutar CDR1H SEQ ID NO:23, koje mogu biti W33F, W33Y, W33V, W33I, W33L ili W33A.

[0079]Izraz "varijanta BCMA antitela", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antitelo pronalaska koje sadrži sekvence antitela 83A10, sa aminokiselinskom izmenom odabranom iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih izmena na poziciji 98 (W98) unutar CDR3H SEQ ID NO:27, koje mogu biti W98F, W98Y, W98V, W98I, W98L ili W98A.

[0080]Izraz "APRIL", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na rekombinantni, skraćeni mišji APRIL (A-APRIL) (amino-kiseline 106-241; NP 076006). APRIL može da se proizvede kako je opisano u Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18), a takođe je i komercijalno dostupno (R&D Systems Europe).

[0081]Anti-BCMA antitela analizirana su pomoću ELISA u pogledu vezivanja za humani BCMA uz korišćenje za ploču vezanog BCMA, u prisustvu i odsustvu APRIL. Za ovaj test koristi se poželjna količina za ploču vezanog BCMA od 1.5 ug/ml i poželjna koncentracija(e) anti-BCMA antitela u opsegu od 1 pM do 200 nM. BCMA-antitelo čije vezivanje za BCMA nije inhibirano prema pronalasku je anti-BCMA antitelo "koje ne inhibira vezivanje APRIL za humani BCMA u ELISA testu".

[0082]Izraz "NF-kB", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na rekombinantni NF-kB p50 (pristupni broj (P19838).

[0083] Aktivnost NF-kB meri se DNK-vezujućim ELISA testom ekstrakta NCI-H929 MM ćelija (CRL-9068™). NCIH929 MM ćelije, netretirane ili tretirane sa 0.1 pM do 200 nM izotipske kontrole ili sa 0.1 pM do 200 nM anti-BCMA antitela, inkubirane su 20 min u odsustvu APRIL. Aktivnost NF-kB testira se korišćenjem funkcionalnog ELISA koji detektuje hemiluminiscentni signal sa p65 vezanog za NF-kB konsenzusnu sekvencu (US6150090).

[0084]Poželjno, aktivnost NF-kB meri se fosfoprotočnim citometrijskim merenjem unutarćelijskog fosforilisanog NF-kB p65 (pS529) u NCI-H929 MM ćelijama (CRL-9068™). NCI-H929 MM ćelije, netretirane ili tretirane sa 1000 ng/ml, poželjno 3000 ng/ml, poželjno 5000 ng/ml APRIL, 1 min do 30 min, poželjno 15 min, i prethodno inkubirane sa 0.1 pM do 200 nM anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ili izotipskih kontrolnih antitela, 20 min u odsustvu APRIL ili u isto vreme u prisustvu APRIL. NF-kB aktivnost se testira korišćenjem funkcionalnog fosfoprotočnog testa koji detektuje unutarćelijski signal fosforilisanog S529 na p65 vezanom za NF-kB konsenzusnu sekvencu (US6150090).

[0085] Isto tako, ako se antitelo prema pronalasku koristi u velikom višku, poželjno do 500 nM ili 1000 nM, vezivanje pomenuog antitela za BCMA redukuje se u prisustvu 140 ng/ml APRIL za ne više od 10%, poželjno ne više od 6%, poželjno ne više od 1%.

[0086] Poželjno, ako se antitelo prema pronalasku koristi u velikom višku, poželjno do 107 nM, vezivanje 1000 ng/ml APRIL za NCI-H929 ćelije (CRL-9068™) redukuje se za ne više od 10%, poželjno ne više od 5%, poželjno ne više od 1% u prisustvu pomenutog antitela.

[0087] Poželjno, ako se antitelo prema pronalasku koristi u velikom višku, poželjno do 267 nM, vezivanje pomenutog antitela za RPMI8226 (CCL-155™) redukuje se u prisustvu 1000 ng/ml APRIL za ne više od 10%>, poželjno ne više od 5%, poželjno ne više od 1%.

[0088]U poželjnoj formi, ako se antitelo prema pronalasku koristi u velikom višku, poželjno do 133 nM, vezivanje pomenutog antitela za NCI-H929 ćelije (CRL-9068™) redukuje se u prisustvu 2500 ng/ml APRIL za ne više od 25%, poželjno ne više od 20%, poželjno ne više od 10%.

[0089]Poželjno, ako se antitelo prema pronalasku koristi u velikom višku, poželjno do 400 nM, pomenuto antitelo menja APRIL-indukovanu aktivaciju NF-kB u NCI-H929 ćelijama (CRL-9068™) za ne više od 30%, u prisustvu 1000 ng/ml, poželjno 3000 ng/ml, poželjno 5000 ng/ml APRIL.

[0090]U jednoj poželjnoj formi, ako se antitelo prema pronalasku koristi u velikom višku, poželjno do 400 nM, pomenuto antitelo indukuje aktivaciju NF-kB u NCI-H929 ćelijama (CRL-9068™) za ne više od 5%, u odsustvu APRIL.

[0091]Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se time što pokazuje EC50 vrednost za vezivanje za NCIH929 ćelije (ATCC<®>CRL-9068™) od 30 nM ili nižu, poželjno EC50 vrednost od 15 nM i nižu.

[0092]Poželjno, antitelo prema ovom pronalasku karakteriše se sposobnošću vezivanja za RPMI8226 (CCL-155™) ćelije.

[0093]U jednoj poželjnoj formi, antitelo prema pronalasku karakteriše se sposobnošću vezivanja za humane T-ćelije. Izraz "TCB", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za BCMA i CD3.

[0094]Poželjno, antitelo prema ovom pronalasku karakteriše se sposobnošću vezivanja za BCMA majmuna cinomolgusa, koji se prolazno eksprimira na HEK-ćelijama.

[0095]U poželjnoj formi, antitelo prema ovom pronalasku karakteriše se sposobnošću indukovanja aktivacije CD4<+>i CD8<+>T-ćelija u prisustvu tumorskih ćelija koje eksprimiraju BCMA.

[0096]Poželjno, antitelo prema pronalasku karakteriše se sposobnošću indukovanja preusmerenog ubijanja NCI-H929 tumorskih ćelija u prisustvu humanih T-ćelija, sa EC50 nižom od 0.1 nM, poželjno 0.05 nM, poželjno 0.02 nM, poželjno 0.002 nM i nižom.

[0097]Poželjno, moć (npr. EC50) antitela prema pronalasku da indukuje preusmereno T-ćelijsko ubijanje NCI-H929 ćelija, definiše se time što je nesmanjena ili je samo minimalno smanjena klinički relevantnim koncentracijama APRIL; karakteriše se time što dodavanje 100 ng/ml APRIL menja EC50 za ubijanje NCI-H929 ćelija za faktor manji od 4, poželjno faktor manji od 2, poželjno faktor manji od 1.5; poželjnije, time što dodavanje 1000 ng/ml APRIL menja EC50 za ubijanje NCI-H929 ćelija za faktor manji od 6.5, poželjno faktor manji od 5, poželjno faktor manji od 4, poželjno faktor manji od 3, poželjno faktor manji od 2, poželjno faktor manji od 1.5.

[0098]Izraz "antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na monoklonsko antitelo. Antitelo se sastoji od dva para, svaki od "lakog lanca" (light chain, LC) i "teškog lanca" (heavy chain, HC) (takvi parovi laki lanac (LC)/teški lanac ovde su skraćeno označeni kao LC/HC). Laki lanci i teški lanci takvih antitela su polipeptidi koji se sastoje od nekoliko domena. Svaki teški lanac sadrži teškolančani varijabilni region (ovde skraćeno HCVR ili VH) i teškolančani konstantni region. Konstantni region teškog lanca sadrži teškolančane konstantne domene CH1, CH2 i CH3 (klase antitela IgA, IgD, i IgG) i opciono teškolančani konstantni domen CH4 (klase antitela IgE i IgM). Svaki laki lanac sadrži lakolančani varijabilni domen VL i lakolančani konstantni domen CL. Varijabilni domeni VH i VL mogu dodatno da se podele u regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (complementarity determining regions, CDR), ispresecane konzervativnijim regionima, označenim kao regioni okvira (framework regions, FR). Svaki VH i VL sastoji se od tri CDR i četiri FR, postavljena od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. "Konstantni domeni" teškog lanca i lakog lanca nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za cilj, ali pokazuju različite efektorske funkcije.

[0099]"Laki lanac antitela", kako se koristi u ovom tekstu, je polipeptid koji sadrži, u smeru od N-terminusa ka C-terminusu, lakolančani varijabilni domen (VL) i lakolančani konstantni domen (CL), skraćeno VL-CL. "Crossover laki lanac (VH-CL)", kako se koristi u ovom tekstu, je laki lanac u kojem je VL domen zamenjen respektivnim VH domenom. "Teški lanac antitela", kako se koristi u ovom tekstu, je polipeptid koji uključuje, u smeru od N-terminusa ka C-terminusu, teškolančani varijabilni domen (VH) i konstantni teškolančani domen 1 (CH1). "Crossover teški lanac (VL-CH1)", kako se koristi u ovom tekstu, je teški lanac u kojem je VH domen zamenjen respektivnim VL domenom. [01001Postoji nekoliko pristupa za modifikacije CH3 da bi se podstakla heterodimerizacija, koji su dobro opisani npr. u WO96/27011, WO98/050431, EP1870459, WO2007/l 10205, WO2007/147901, WO2009/089004, WO2010/129304, WO2011/90754, WO2011/143545, WO2012058768, WO2013157954, WO2013096291. Tipično, u svim tim pristupima prvi CH3 domen i drugi CH3 domen su inženjerisani na komplementaran način tako da svaki CH3 domen (ili teški lanac koji ga sadrži) ne mogu više da se homodimerizuju sami sa sobom nego su prisiljeni da se heterodimerizuju sa drugim komplementarno inženjerisanim CH3 domenom (tako da se prvi i drugi CH3 domen heterodimerizuju, a ne formiraju se homodimeri dva prva ili dva druga CH3 domena). Ovi različiti pristupi za poboljšanje heterodimerizacije teških lanaca razmatraju se kao različite alternative u kombinaciji sa modifikacijama teškoglanca-lakog lanca (VH i VL razmena/zamena u jednoj vezujućoj ručici i uvođenje supstitucija naelektrisanih amino-kiselina sa suprotnim naelektrisanjima u CH1/CL interfejsu) u antitelima prema pronalasku, što redukuje pogrešno sparivanje lakog lanca, npr. sporedne proizvode Bence-Jones-ovog tipa.

[0101]U jednoj poželjnoj formi pronalaska (u slučaju da antitelo prema pronalasku sadrži CH3 domene u teškim lancima) CH3 domeni pomenutog multispecifičnog antitela prema pronaalsku mogu biti izmenjeni tehnologijom "izbočine u udubljenjima", koja je detaljno opisana, uz nekoliko primera, npr. u WO 96/027011, Ridgway, J.B.,et al,Protein Eng. 9 (1996) 617-621; i Merchant, A.M.,et al,Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681; WO98/050431. U ovom metodu, površine međudejstva dva CH3 domena izmenjene su tako da se poveća heterodimerizacija oba teška lanca koja sadrže ova dva CH3 domena. Svaki od dva CH3 domena (iz dva teška lanca) može biti "izbočina", dok je drugi "udubljenje".

[0102]Prema tome, u jednoj formi pronalaska, pomenuto antitelo prema pronalasku (sadrži CH3 domen u svakom teškom lancu i) karakteriše se i time što se prvi CH3 domen prvog teškog lanca antitela pod a) i drugi CH3 domen drugog teškog lanca antitela pod b) susreću na kontaktnoj površini koja sadrži originalnu kontaktnu površinu između CH3 domena antitela, pri čemu je pomenuta kontaktna površina izmenjena tako da pokrene formiranje antitela prema pronalasku, pri čemu se promena karakteriše time što je: i) CH3 domen jednog teškog lanca izmenjen, tako da je unutar originalne kontaktne površine CH3 domena jednog teškog lanca, koja se susreće sa originalnom kontaktnom površinom CH3 domena drugog teškog lanca unutar

antitela prema pronalasku, aminokiselinska rezidua zamenjena aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem veće zapremine, čime se stvara

izbočina unutar kontaktne površine CH3 domena jednog teškog lanca, koja može da se smesti u udubljenje unutar kontaktne površine CH3 domena drugog teškog lanca i

ii) CH3 domen drugog teškog lanca je izmenjen, tako da je unutar originalne kontaktne površine drugog CH3 domena koja se susreće sa originalnom kontaktnom površinom prvog CH3 domena unutar antitela prema pronalasku, aminokiselinska rezidua zamenjena aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem manje zapremine, čime se stvara udubljenje unutar kontaktne površine drugog CH3 domena u koje može da se smesti izbočina u kontaktnoj površini prvog CH3 domena.

[0103]Poželjno, pomenuta aminokiselinska rezidua sa bočnim lancem veće zapremine bira se iz grupe koja sadrži arginin (R), fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W).

[0104]U jednom aspektu pronalaska, oba CH3 domena su dodatno izmenjena uvođenjem cisteina (C) kao amino-kiseline na korespondirajućim pozicijama svakog CH3 domena tako da može da se formira disulfidni most između CH3 domena.

[0105]Druge tehnike modifikovanja CH3 za podsticanje heterodimerizacije razmatraju se kao alternative pronalaska i opisane su npr. u WO96/27011, WO98/050431, EP1870459, WO2007/l 10205, WO2007/147901, WO2009/089004, WO2010/129304, WO2011/90754, WO2011/143545, WO2012/058768, WO2013/157954, WO2013/157953, WO2013/096291.

[0106]U jednoj formi, antitelo prema pronalasku je IgG2 izotipa i alternativno može da se koristi pristup za heterodimerizaciju opisan u WO2010/129304.

[0107]Izraz "antitelo" uključuje npr. mišja antitela, humana antitela, himerna antitela, humanizovana antitela i genetički inženjerisana antitela (variantna ilir mutantna antitela), dokle god zadržavaju svoja karakteristična svojstva. Posebno su poželjna humana ili humanizovana antitela, posebno kao rekombinantna humana ili humanizovana antitela. Izrazi "monoklonsko antitelo" ili "smeša monoklonskog antitela", kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na preparat molekula antitela istog aminokiselinskog sastava.

[0108]Izrazi "bispecifično antitelo" i "antitelo prema pronalasku", kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na antitelo u kojem se jedan od dva para teškog i lakog lanca

(HC/LC) specifično vezuje za BCMA, a drugi se specifično vezuje za CD3 ili, poželjno, za CD3 i BCMA. Izraz "valentan", kako se koristi u ovoj prijavi, označava prisustvo specifikovanog broja vezujućih mesta u molekulu antitela. Bivalentno antitelo prema ovom pronalasku ima dva vezujuća mesta, jedno za CD3 i drugo za BCMA. Prema tome, izraz "trivalentno", označava prisustvo tri vezujuća mesta u antitelu prema pronalasku, od kojih su dva vezujuća mesta za BCMA i jedno vezujuće mesto za CD3.

[0109]Postoji pet tipova teških lanaca sisarskih antitela, koji su označeni grčkim slovima: a, 5, s,yi\ x(Janeway CA, Jret al(2001). Immunobiology. 5<th>ed., Garland Publishing). Tip prisutnog teškog lanca definiše klasu antitela; ovi lanci nalaze se u IgA, IgD, IgE, IgG i IgM antitelima, respektivno (Rhoades RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology, 4<th>ed., Thomson Learning). Distinktni teški lanci razlikuju se u veličini i sastavu; a iysadrže približno 450 amino-kiselina, dok\ ii s imaju približno 550 amino-kiselina. Svaki teški lanac ima dva regiona, konstantni region i varijabilni region. Konstantni region je identičan u svim antitelima istog izotipa, ali se razlikuje u antitelima različitog izotipa. Teški lanciy, ai 8 imaju konstantni region sastavljen od tri konstantna domena CH1, CH2, i CH3 (u nizu), i zglobni region za dodatnu fleksibilnost (Woof J, Burton D Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99); teški lanci \ i i8imaju konstantni region sastavljen od četiri konstantna domena CH1, CH2, CH3 i CH4 (Janeway CA, Jret al(2001). Immunobiology. 5<th>ed., Garland Publishing). Varijabilni region teškog lanca različit je u antitelima proizvedenim u različitim B-ćelijama, ali je isti za sva antitela proizvedena u jednoj B-ćeliji ili klonu B-ćelija. Varijabilni region svakog teškog lanca dug je približno 110 amino-kiselina i sačinjen je od jednog domena antitela

[0110]Kod sisara postoje dva tipa lakog lanca koji se nazivaju lambda( X)i kapa (k). Laki lanac ima dva sukcesivna domena: jedan konstantni domen CL i jedan varijabilni domen VL. Približna dužina lakog lanca je 211 do 217 amino-kiselina. Poželjno, laki lanac je kapa (k) laki lanac i konstantni domen CL je poželjno izveden iz kapa (K) lakog lanca (konstantni domen CK). Poželjno konstantni domeni teških i lakih lanaca antitela prema pronalasku su humani domeni.

[0111]"Antitela" prema pronalasku mogu biti bilo koje klase (npr. IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, poželjno IgG ili IgE), ili subklase (npr., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl i IgA2, poželjno IgGl), pri čemu oba antitela od kojih je izvedeno bivalentno bispecifično antitelo prema pronalasku, imaju Fc deo iste subklase (npr. IgGl, IgG4 i slično, poželjno IgGl), poželjno istog alotipa (npr. kavkazoidnog).

[0112]"Fab fragment antitela", kako se koristi u ovom tekstu, je fragment antitela koji se vezuje za antigene. Fab fragment antitela sastoji se od dva para domena. U antitelu divljeg tipa sastoji se od jednog konstantnog i jednog varijabilnog domena teškog lanca (CH1 i VH) i jednog konstantnog i jednog varijabilnog domena lakog lanca (CL and VL). Prema pronalasku takvi domenski parovi mogu biti, zbog "crossover"-a, i VH-CL i VL-CH1. U antitelu divljeg tipa i prema pronalasku domeni parova domena teškog i lakog lanca Fab fragmenta nisu hemijski povezani i dakle nisu scFv (jednolančani varijabilni fragmenti). "Crossover" prema pronalasku označava da su, poželjno, u jednom Fab, domeni VL i VH zamenjeni jedan drugim.

[0113]Izraz "aa supstitucija ili varijanta naelektrisanja", kako se koristi u ovom tekstu, označava aminokiselinsku supstituciju prema pronalasku u kojoj u konstantnom domenu CL amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numerisanje po Kabat-u), i pri čemu su u respektivnom konstantnom domenu CH1 amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D), i poželjno pored toga u konstantnom domenu CL amino-kiselina na poziciji 123 supstituisana je nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H), i poželjno argininom (R).

[0114]Poželjna kombinacija aa supstitucije je Q124K, E123R, K147E i K213E (na primer: E123R znači da je glutaminska kiselina (E) na poziciji 123 zamenjena argininom (R)).

[0115]"Fc deo antitela" je izraz koji je dobro poznat iskusnom stručnjaku i definisanje na osnovu sečenja antitela papainom. Antitela prema pronalasku kao Fc deo sadrže poželjno, Fc deo humanog porekla i poželjno sve druge delove humanih konstantnih regiona. Fc deo antitela direktno je uključen u aktivaciju komplementa, Clq vezivanje, aktivaciju C3 i vezivanje za Fc receptor. Iako uticaj antitela na sistem komplementa zavisi od određenih uslova, vezivanje za Clq prouzrokovano je definisanim vezujućim mestima u Fc delu. Takva mesta vezivanja poznata su u stanju tehnike i opisana su npr. u Lukas, TJ.,et al,J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R.,et al,Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E.,et al,Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E.,et ah,J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M.,et al,J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A.,et al,Immunology 86 (1995) 319-324; i EP 0 307 434. Takva mesta vezivanja su npr. L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 i P329 (numerisanje po EU indeksu Kabat-a, vidi dole). Antitela subklase IgGl, IgG2 i TgG3 obično pokazuju aktivaciju komplementa, vezivanje za Clq i aktivaciju C3, dok IgG4 ne aktivira sistem komplementa, ne vezuje se za Clq i ne aktivira C3. Poželjno, Fc deo je humani Fc deo. Poželjno, Fc deo je humani IgGIFc deo. Poželjno, antitelo prema pronalasku sadrži u humanom IgGIFc delu supstituciju amino-kiseline Pro329 glicinom ili argininom i/ili supstitucije L234A i L235A, poželjno supstituciju Pro329 glicinom i supstitucije L234A i L235A.

[0116]Poželjno, antitelo prema pronalasku kao Fc deo sadrži Fc varijantu humanog IgG- Fc regiona divljeg tipa, pomenuta Fc varijanta sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji Pro329 i najmanje još jednu aminokiselinsku supstituciju, pri čemu su rezidue numerisane prema Kabat-ovom EU indeksu, i pri čemu pomenuto antitelo ispoljava smanjeni afinitet prema humanim FcyRIIIA i/ili FcyPvIIA i/ili FcyRI, u poređenju sa antitelom koje sadrži IgG-Fc region divljeg tipa, i pri čemu je ADCC indukovana pomenutim antitelom redukovana bar na 20% od ADCC indukovane antitelom koje sadrži humani IgG-Fc region divljeg tipa. U specifičnoj formi, Pro329 humanog Fc regiona divljeg tipa u antitelu prema pronalasku, supstituisan je glicinom ili argininom ili aminokiselinskom reziduom koja je dovoljno velika da naruši prolinski sendvič unutar površine kontakta Fc/Fcy receptor, koji se formira između prolina 329 Fc i triptofanskih rezidua Trp 87 i Tip 110 FcyRIII (Sondermannet al:Nature 406, 267-273 (20 July 2000)). U sledećem aspektu pronalaska, najmanje još jedna aminokiselinska supstitucija u Fc varijanti je S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S i u još jednoj formi pomenuta najmanje jedna dodatna aminokiselinska supstitucija je L234A (označava da je leucin 234 supstituisan alaninom) i L235A humanog IgGl-Fc regiona ili S228P i L235E humanog IgG4-Fc regiona. Takve Fc varijante opisane su detaljno u WO2012130831.

[0117]Izraz "himemo antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži varijabilni region tj. vezujući region iz jednog izvora ili vrste i najmanje deo konstantnog regiona izveden iz različitog izvora ili vrste, obično pripremljeno tehnikama rekombinantne DNK. Poželjna su himerna antitela koja sadrže mišji varijabilni region i humani konstantni region. Druge poželjne forme "himernih antitela" obuhvaćene predmetnim pronalaskom su one u kojima je konstantni region modifikovan ili izmenjen u odnosu na onaj kod originalnog antitela da bi se generisale osobine prema pronalasku, posebno u vezi sa vezivanjem za Clq i/ili za Fc receptor (FcR). Takva himerna antitela označena su i kao "klasno-prekopčana antitela" ("class-switched antibodies"). Himerna antitela proizvodi su ekspresije imunoglobulinskih gena koji uključuju DNK segmente koji kodiraju varijabilne regione imunoglobulina i DNK segmenata koji kodiraju konstantne regione imunoglobulina. Metodi prozvodnje himernih antitela uključuju konvencionalne tehnike rekombinantne DNK i tehnike transfekcije gena, dobro poznate u struci. Vidi, npr., Morrison, S.L.,et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US Patent No. 5,202,238 i 5,204,244.

[0118]Izraz "humanizovano antitelo" odnosi se na antitela u kojima su regioni okvira ili "regioni koji određuju komplementarnost" (CDR) modifikovani tako da sadrže CDR imunoglobulina različite specifičnosti u poređenju sa onom roditeljskog imunoglobulina. U poželjnoj formi, mišji CDR graftovan je u okvirni region humanog antitela da bi se pripremilo "humanizovano antitelo". Vidi, npr., Riechmann, L.,et al,Nature 332 (1988) 323-327; i Neuberger, M.S.,et al,Nature 314 (1985) 268-270. Posebno poželjni CDR odgovaraju onima koji predstavljaju sekvence koje prepoznaju ciljeve navedene gore za himerna antitela. Drugi oblici "humanizovanih antitela" obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region dodatno modifikovan ili izmenjen u odnosu na originalno antitelo, tako da se generišu osobine prema pronalasku, posebno u vezi sa vezivanjem za Clq i/ili za Fc receptor (FcR).

[0119]Izraz "humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, treba da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije (germline). Humana antitela dobro su poznata u stanju tehnike (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Humana antitela mogu da se proizvedu i u transgenim životinjama (npr., miševima) sposobnim da, posle imunizacije, proizvode pun repertoar ili odabrana humana antitela, uz izostanak proizvodnje endogenih imunoglobulina. Transfer humanih germline imunoglobulinskih genskih čipova u takve germline-mutantne miševe rezultovaće proizvodnjom humanih antitela posle izazivanja ciljem (vidi, npr., Jakobovits, A.,et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A.,et al,Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M.,et al,Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Humana antitela mogu da se proizvedu i u bibliotekama prikazivanja na fagima (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D.,et al,J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Tehnike Coleet aland Boerneret altakođe su na raspolaganju za pripremanje humanih monoklonskih antitela (Coleet al,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapv, Alan R. Liss, p. 77 (1985); i Boerner, P.,et al,J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Kao što je već pomenuto za himerna i humanizovana antitela prema pronalasku, izraz "humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, obuhvata i antitela koja su modifikovana u konstantnom regionu da bi se generisale osobine prema pronalasku, posebno u vezi sa vezivanjem za Clq i/ili za FcR, npr., "klasnim prekopčavanjem" tj. pramenom ili mutacijom Fc delova (npr. iz IgGl u IgG4 i/ili IgGl/IgG4 mutacija).

[0120] Izraz "rekombinantno humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, treba da uključi sva humana antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, kreiraju ili izoluju rekombinantnim načinom, kao što su antitela izolovana iz ćelije-domaćina, npr. NSO ili CHO ćelije, ili iz životinje (npr. miša) koja je transgena za humane imunoglobulinske gene ili antitela eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju-domaćina. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione u rearanžiranom obliku. Rekombinantna humana antitela prema pronalasku podvrgnuta suin vivosomatskoj hipermutaciji. Tako, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako izvedene i srodne sa humanim germline VH i VL sekvencama, ne moraju prirodno postojati u humanom germline repertoaru antitelain vivo.

[0121] "Varijabilni domen" (varijabilni domen lakog lanca (VL), varijabilni region teškog lanca (VH)), kako se ovde koristi, označava svaki od parova lakog i teškog lanca direktno uključen u vezivanje antitela za cilj. Domeni varijabilnih humanih lakih i teških lanaca imaju istu opštu strukturu i svaki domen sadrži četiri regiona okvira (FR) čije su sekvence široko konzervirane, povezane preko tri "hipervarijabilna regiona" (ili regiona koji određuju komplementarnost, CDR). Regioni okvira zauzimaju konformaciju p-ploče, a CDR mogu formirati petlje koje povezuju strukturu p-ploče. CDR u svakom lancu održavaju se u svojoj trodimenzionalnoj strukturi pomoću regiona okvira i zajedno sa CDR iz drugog lanca formiraju mesto za vezivanje sa ciljem. CDR3 regioni teškog i lakog lanca antitela imaju posebno važnu ulogu u specifičnosti/afinitetu vezivanja antitela prema pronalasku i tako predstavljaju sledeći predmet pronalaska.

[0122]Izrazi "hipervarijabilni region" ili "deo antitela koji se specifično vezuje sa ciljem", kada se koristi u ovom tekstu, odnosi se na aminokiselinske rezidue antitela koje su odgovorne za vezivanje sa ciljem. Hipervarijabilni region obuhvata aminokiselinske rezidue iz "regiona koji određuju komplementarnost" ili "CDR". "Okvirni" ili "FR" regioni su oni regioni varijabilnog domena koji su različiti od rezidua hipervarijabilnog regiona, kako je ovde definisano. Prema tome, laki i teški lanci antitela sadrže od N- do C-terminusa domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. CDR na svakom lancu razdvojeni su amino-kiselinama regiona okvira. Posebno, CDR3 teškog lanca je region koji najviše doprinosi vezivanju za cilj. CDR i FR regioni određeni su prema standardnoj definiciji iz Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5<th>ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991).

[0123]Izraz "epitop" uključuje svaku polipeptidnu determinantu sposobnu da se specifično veže sa antitelom. U određenim formama, epitopska determinanta uključuje hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su amino-kiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil i, u određenim formama, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region cilja za koji se vezuje antitelo.

[0124]Za pripremanje bispecifičnog antitela prema pronalasku mogu se koristiti zasebni vektori koji kodiraju svaki laki i teški lanac, ili se može koristiti druga odgovarajuća količina vektora. Takvi vektori mogu da se koriste za transformisanje ćelije-domaćina.

[0125]Izraz "nukleinska kiselina ili molekul nukleinske kiseline ", kako se koristi u ovom tekstu, treba da obuhvati molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančani ili dvolančani, ali poželjan je dvolančani DNK molekul.

[0126]Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "ćelija", "ćelijska linija" i "kultura ćelija" koriste se naizmenično i sve takve oznake uključuju i potomstvo. Tako, reči "transformanti" i "transformisane ćelije" uključuju primarnu subjekatsku ćeliju i iz nje izvedene kulture, bez obzira na broj transfera. Podrazumeva se takođe da, zbog namernih ili slučajnih mutacija, ne mora svo potomstvo biti precizno identično po sadržaju DNK. Uključene su i varijante potomstva koje imaju istu funkciju ili biološku aktivnost prema kojima je vršen skrining originalno transformisanih ćelija. Iz konteksta će biti jasno kada se koriste distinktne oznake.

[0127]Izraz "transformacija", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na proces transfera vektora/nukleinske kiseline u ćeliju-domaćina. Ako se ćelije bez bitnog ćelijskog zida koriste kao ćelije-domaćini, transfekcija se obavlja npr. metodom precipitacije kalcijum-fosfatom, kako su opisali Graham and Van der Eh, Virologv. 52

(1978) 546ff. Međutim, mogu se koristiti i drugi metodi introdukovanja DNK u ćelije-domaćine kao što su injektiranje u nukleus ili fuzija protoplasta. Ako se koriste prokariotske ćelije ili ćelije koje imaju značajan ćelijski zid, jedan metod transfekcije je npr. tretman kalcijumom uz korišćenje kalcijum-hlorida, kako su opisali Cohen SN,et al,PNAS 1972, 69 (8): 2110-2114.

[0128]Rekombinantna proizvodnja antitela uz korišćenje transformacije dobro je poznata u stanju tehnike i opisana je, na primer, u revijskim člancima Makrides, S. C, Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S.,et al,ProteinExpr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, RJ., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G.,et al,Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880 kao i u US6331415 i US4816567.

[0129]Kako se ovde koristi, "ekspresija" se odnosi na proces kojim se nukleinska kiselina transkribuje u iRNK i/ili proces kojim se transkribovana iRNK (označena i kao transkript) posle toga translatuje u peptide, polipeptide ili proteine. Transkripti i kodirani polipeptidi zajedno se označavaju kao genski proizvod. Ako je polinukleotid poreklom iz genomske DNK, ekspresija u eukariotskoj ćeliji može uključivati splajsovanje iRNK.

[0130]"Vektor" je molekul nukleinske kiseline, posebno samoreplicirajući, koji prenosi insertovani molekul nukleinske kiseline u i/ili između ćelija-domaćina. Izraz obuhvata vektore čija je primarna funkcija insertovanje DNK ili RNK u ćeliju (npr., hromozomska integracija), replicirajuće vektore koji funkcionišu prvenstveno za replikaciju DNK ili RNK, i ekspresione vektore koji imaju funkciju u transkripciji i/ili translaciji DNK ili RNK. Obuhvaćeni su i vektori koji obezbeđuju više od jedne opisane funkcije.

[0131]"Ekspresioni vektor" je polinukleotid koji, kada se introdukuje u odgovarajuću ćeliju-domaćina, može da se transkribuje ili translatuje u polipeptid. "Ekspresioni sistem" obično se odnosi na pogodnu ćeliju-domaćina koja sadrži ekspresioni vektor, čijim funcionisanjem se dobija željeni ekspresioni proizvod.

[0132]Bispecifična antitela prema pronalasku se poželjno proizvode rekombinantno. Takvi metodi su opšte poznati u stanju tehnike i sastoje se od ekspresije proteina u prokariotskoj i eukariotskoj ćeliji, praćene izolacijom polipetida antitela i obično prečišćavanjem do farmaceutski prihvatljive čistoće. Za ekspresiju proteina, nukleinske kiseline koje kodiraju lake i teške lance ili njihove fragmente, insertuju se u ekspresione vektore standardnim metodima. Ekspresija se obavlja u odgovarajućim prokariotskim ili eukariotskim ćelijama-domaćinima kao što su CHO ćelije, NSO ćelije, SP2/0 ćelije, HEK293 ćelije, COS ćelije, ćelije kvasca iliE. colii antitelo se sakuplja iz ćelija (supernatanta ili ćelija posle lize). Bispecifična antitela mogu biti prisutna u celim ćelijama, u lizatu ćelija ili u delimično prečišćenoj ili suštinski čistoj formi. Prečišćavanje se obavlja da bi se eliminisale druge ćelijske komponente ili drugi kontaminanti, npr. druge ćelijske nukleinske kiseline ili proteini, standardnim tehnikama uključujući tretman baza/SDS, hromatografiju na koloni i druge dobro poznate u struci. Vidi Ausubel, F.,et al,ed., Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

[0133]Ekspresija u NSO ćelijama opisana je npr. u Barnes, L.M.,et al,Cytotechnology 32 (2000) 109-123; i Barnes, L.M.,et al,Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Prolazna ekspresija opisana je npr. u Durocher, Y.,et al,Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Kloniranje varijabilnih domena opisano je u Orlandi, R.,et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Čarter, P.,et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; i Norderhaug, L.,et al,J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Poželjan sistem za prolaznu ekspresiju (HEK293) opisali su Schlaeger, E.- J., i Christensen, K., u Cytotechnology 30 (1999) 71-83 i Schlaeger, E.-J., u J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

[0134]Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, opciono operatorsku sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske sekvence koriste promotore, enhensere i poliadenilacione signale.

[0135]Nukleinska kiselina je "operabilno povezana" kada se nalazi u funkcionalnom odnosu sa sekvencom druge nukleinske kiseline. Na primer, DNK za presekvencu ili sekretorni lider operabilno je povezana sa DNK za polipeptid ako se eksprimira u vidu preproteina koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili enhenser operabilno su povezani sa kodirajućom sekvencom ako utiču na transkripciju te sekvence; ili mesto vezivanja ribozoma operabilno je povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšva translaciju. Uopšteno, "operabilno povezano" znači

[0136]da su povezane DNK sekvence u kontinuitetu, a u slučaju sekretornog lidera da su u kontinuitetu i u istom ramu čitanja. Međutim, enhenseri ne moraju biti u kontinuitetu. Povezivanje je ostvareno ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetski oligonukleotidni adapteri ili linkeri, u skladu sa uobičajenom praksom.

[0137]Bispecifična antitela pogodno se izdvajaju iz kultivacionog medijuma uobičajenim postupcima prečišćavanja imunoglobulina kao što su, na primer, prečišćavanje pomoću proteina A-sefaroze, hromatografija na hidroksiapatitu, gel-elektroforeza, dijaliza, ili afinitetna hromatografija. DNK ili RNK koje kodiraju monoklonska antitela lako se izoluju i sekvenciraju korišćenjem konvencionalnih postupaka. Kao izvor takve DNK i RNK mogu da služe ćelije hibridoma. Jednom izolovana, DNK može da se insertuje u ekspresione vektore koji se zatim transfektuju u ćelije-domaćine kao što su HEK293 ćelije, CHO ćelije ili ćelije mijeloma, koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, da bi došlo do sinteze rekombinantnih monoklonskih antitela u ćelijama-domaćinima.

[0138]Varijante aminokiselinskih sekvenci (ili mutanti) bispecifičnog antitela pripremaju se uvođenjem pogodnih nukleotidnih promena u DNK antitela, ili sintezom nukleotida. Međutim, takve modifikacije mogu da se obave samo u veoma ograničenom opsegu, npr. kako je gore opisano. Na primer, modifikacije ne menjaju karakteristike gore pomenutog antitela kao što su IgG izotip i vezivanje za cilj, ali mogu poboljšati prinos rekombinantne proizvodnje, stabilnost proteina ili olakšati prečišćavanje.

[0139]T-ćelijski bispecifični (T cell bispecific, TCB) vezivači imaju veoma visoku moć ubijanja ćelija zavisnu od koncetracije/okupiranja receptora na tumorskoj ćeliji (npr. EC50 u testovima ubijanja ćelijain vitroje u sub- ili niskom pikomolarnom opsegu; Dreieret al.Int J Cancer 2002), T-ćelijski bispecifični vezivači (TCB) dati su u mnogo nižim dozama nego konvencionalna monospecifična antitela. Na primer, blinatumomab (CD19xCD3) se daje u obliku kontinuirane intravenske dozi od 5 do 15 ug/m<2>/dan (tj. samo 0.035 do 0.105 mg/m<2>/nedeljno) za lečenje akutne limfocitne leukemije, ili 60 ug/m<2>/dan za lečenje ne-Hodgkin-ovog limfoma, a koncentracije u serumu pri ovim dozama su u opsegu od 0.5 do 4 ng/ml (Klingeret al.,Blood 2012; Toppet ah,J Clin Oncol 2011; Goebeleret al.Ann Oncol 2011). Zbog toga što niske doze TCB mogu kod pacijenata ispoljiti visoku efikasnost, smatra se da antitelo pronalaska može da se primeni subkutano i da je ovakva primena poželjna u kliničkim postavkama (poželjno u opsegu doze od 0.25 do 2.5 mg/m<2>/nedeljno). Čak i pri ovim niskim koncentracijama/dozama/okupiranju receptora, TCB može da dovede do značajnih neželjenih efekata (Klingeret ah,Blood 2012). Stoga je od kritične važnosti kontrolisati okupiranost/pokrivenost tumorske ćelije. Kod pacijenata sa visokim i varijabilnim nivoima APRIL i BAFF u serumu (npr. obole li od multiplog mijeloma, Moreauxet al.2004; Blood 103(8): 3148-3157), broj TCB vezanih za tumorske ćelije odn. okupiranost tumorskih ćelija, može znatno zavisiti od APRIL (visokoafinitetni ligand koji se vezuje za humani BCMA sa 1000 puta višim afinitetom nego BAFF). Ali, pri korišćenju pomenutog antitela ovog pronalaska, u vezi sa okupiranošću tumorske ćelije prema efikasnosti/bezbednosti, ne mora biti potrebno povećanje doze antitela prema pronalasku jer na pomenuto antitelo ne mora uticati kompeticija sa APRIL ligandom. Druga prednost antitela prema pronalasku zasnovana je na uključivanju Fc dela koji produžava poluvreme eliminacije na do~12 dana ili čak i više i nudi mogućnost primene jednom ili dva puta nedeljno, u poređenju sa TCB bez Fc dela (npr. blinatumomab) koje treba davati intravenski i u kontinuitetu pomoću pumpe koju pacijent nosi.

[0140]Kod pacijenata sa povratnom/refraktornom akutnom limfocitnom leukemijom (acute lymphocytic leukemia, ALL), sa CD19xCD3 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelom blinatumomabom pokazana stopa odgovora iznosila je do 80%. Kao i ALL, multipli mijelom i druge bolesti plazmocita još uvek postavljaju visoke medicinske zahteve. Uprkos svim danas raspoloživim načinima lečenja, pet godina od postavljanja dijagnoze približno 60% obolelih od multiplog mijeloma umre. Još uvek postoji potreba za efikasnim lečenjem pacijenata sa multiplim mijelomom.

[0141]Antitela prema pronalasku imaju jedinstvene osobine i prednosti u odnosu na npr. blinatumomab i publikovana BCMAxCD3 TCB antitela:

dugo poluvreme eliminacije (dani umesto sati)

pogodna primena dva puta ili jednom nedeljno (umesto primene pomoću

pumpe koja mora da se nosi nedeljama/mesecima)

minimalni uticaj koncentracija APRIL prisutnog u krvi i kostnoj srži, koji je prirodni ligand BCMA, na BCMA-TCB-indukovano ubijanje tumorskih ćelija (pacijenti sa multiplim mijelomom pokazuju ogromnu varijabilnost koncentracija APRIL, pacijenti sa visokim nivoima APRIL mogu iskusiti redukovanu efikasnost ili čak odsustvo efikasnosti leka ukoliko njegova efikasnost izrazito zavisi od nivoa APRIL)

molekulski format i stuktura koji obezbeđuju visoku stabilnost i nisko

agregiranje BCMAxCD3 TCB antitela

optimizacija molekulskih struktura, da bi se omogućio visok kvalitet izrade i olakšalo prečišćavanje, primenom sledećih mera: aa supstitucije u CL i CH1 da bi se smanjilo pogrešno sparivanje lakog lanca

VL-VH "crossover" da bi se smanjilo pogrešno sparivanje lakog lanca

Poželjno, tehnologija "izbočina u udubljenju" da bi se poboljšalo ispravno sparivanje teških lanaca

Poželjno, Pro 329 i L234A i L235A aminokiselinske supstitucije u CH3

Fc, da bi se izbegli potencijalni sporedni efekti usled interakcije sa sistemom komplementa i/ili efektorskim ćelijama koje nose FcR.

[0142]Da bi se napravila sledeća (2+1) Fc-sadržavajuća anti-BCMA/anti-CD3 TCB, potrebni su odgovarajući "gradivni blokovi'Vsekvencioni ID, kako je pomenuto u Tabeli 2, gore:

83A10-TCB: 39, 40, 41, 42 (komparacija)

83A10-TCBcv: 43, 44, 45, 46 (Slika 2A)

17A5-TCBcv: 45, 47, 48,49 (Slika 2A)

13A4-TCBcv: 45, 50, 51, 52 (Slika 2A)

[0143]U sledećim navedenim specifičnim formama objave: 1. Bispecifično bi- ili trivalentno antitelo koje se specifično vezuje za dva cilja

koji su vanćelijski domeni humanog BCMA (dalje označen i kao "BCMA") i humanog CD3s (dalje označen i kao "CD3"), pri čemu su varijabilni domeni VL i VH u lakom lancu i respektivnom teškom lancu zamenjeni jedan drugim, karakteriše se time što sadrži konstantni domen CL u kojem je amino-kiselina na

poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom

(H) (numerisanje po Kabat-u), a u respektivnom konstantnom domenu CH1 amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane su

nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D)

(numerisanje po Kabat-u).

2. Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za dva cilja koji su vanćelijski domeni humanog BCMA i humanog CD3e, karakteriše se time što sadrži

a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za CD3, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim; i pri čemu c) u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana je nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numerisanje po Kabat-u), i pri čemu u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane su nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numerisanje po Kabat-u). 3. Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za dva cilja koji su vanćelijski domeni humanog BCMA i humanog CD3, karakteriše se time što sadrži a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično

vezuje za CD3 i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH u drugom

lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim; i pri čemu

c) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana je nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili

histidinom (H) (numerisanje po Kabat-u), i pri čemu u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane su nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numerisanje po Kabat-u).

4. Bispecifično antitelo prema formi 2 gore, karakteriše se time što pomenuto bispecifično antitelo sadrži dodatno i Fab fragment pomenutog prvog antitela (dalje označen i kao "BCMA-Fab"), i u konstantnom domenu CL

pomenutog BCMA-Fab amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana je nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numerisanje po Kabat-u), i pri čemu u konstantnom domenu CH1 pomenutog BCMA-Fab amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane su nezavisno glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numerisanje po Kabat-u).

5. Bispecifično antitelo prema formi 3 gore, karakteriše se time što

pomenuto bispecifično antitelo sadrži dodatno i drugi Fab fragment pomenutog prvog antitela ("BCMA-Fab").

6. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj formi 1, karakteriše se time što se sastoji od jednog Fab fragmenta antitela koje se specifično vezuje za CD3 (dalje označen i kao "CD3-Fab"), i jednog Fab fragmenta antitela koje se specifično vezuje za BCMA (dalje označen i kao "BCMA-Fab") i Fc dela, pri čemu su CD3-Fab i BCMA-Fab povezani preko svojih C-terminusa sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela i pri čemu CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrži aa supstituciju i CD3-Fab sadrži "crossover". 7. Bispecifično antitelo prema formi 6, karakteriše se time što se sastoji od jednog CD3-Fab, i jednog BCMAFab i Fc dela, pri čemu su CD3-Fab i BCMA-Fab povezani preko svojih C-terminusa sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i drugog BCMA-Fab koji je povezan svojim C-terminusom sa N-terminusom CD3-Fab i pri čemu CD3-Fab sadrži "crossover" i CD3-Fab ili oba BCMA-Fab sadrže aa supstituciju (Slike 2A i 2B). 8. Bispecifično antitelo prema formi 7, karakteriše se time što se sastoji od

BCMA-Fab-Fc-CD3-Fab-BCMAFab, pri čemu oba BCMA-Fab sadrže aa supstituciju i CD3-Fab sadrži VL/VH "crossover".

9. Bispecifično antitelo prema formi 1, karakteriše se time što se sastoji od dva

BCMA-Fab i Fc dela, pri čemu su BCMA-Fab povezani preko svojih C-terminusa sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i CD3-Fab koji je povezan svojim C- terminusom sa N-terminusom jednog BCMA-Fab, i CD3-Fab sadrži "crossover" i CD3-Fab ili oba BCMA-Fab sadrže aa supstituciju (Slike 2C i 2D). 10. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 5, karakteriše se time što se sastoji od jednog CD3-Fab koji je povezan preko svog C-terminusa sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i BCMA-Fab koji je povezan svojim C-terminusom sa N-terminusom CD3-Fab, i CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrže aa supstituciju (Slike 3A i 3B). 11. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što se sastoji od jednog BCMA-Fab koji je povezan preko svog C-terminusa sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i CD3-Fab koji je povezan svojim C-terminusom sa N-terminusom BCMA-Fab, i CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrže aa supstituciju (Slike 3C i 3D). 12. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što sadrži CDR sekvence anti-BCMA antitela 83A10, 17A5 ili 13A4. 13. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što sadrži VH i VL sekvence anti-BCMA antitela 83A10, 17A5 ili 13A4, ili antitelo sadrži VH, VL, CH1 i CL sekvence anti-BCMA antitela 83A10, 17A5 ili 13A4. 14. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što se deo antitela koje se specifično vezuje za humani CD3, poželjno Fab fragment, karakteriše time što sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolančane CDR SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao respektivne teškolančane CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni domen VL koji uključuje lakolančane CDR SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao respektivne lakolančane CDR1, CDR2 i CDR3 anti-CD3s antitela (CDR MAB CD3). 15. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što se deo antitela koje se specifično vezuje za humani CD3 karakteriše time što su mu varijabilni domeni SEQ ID NO:7 i 8 (VHVL MAB CD3). 16. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što se Fab fragment koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše time što sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolančane CDR CDR1H SEQ ID NO:21, CDR2H SEQ ID NO:24, CDR3H SEQ ID NO: 27 i sadrži varijabilni

domen VL koji uključuje lakolančane CDR CDR1L SEQ ID NO:30, CDR2L SEQ ID NO:33, CDR3L SEQ ID NO: 36 (CDR MAB 83A10).

17. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što se Fab fragment koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše time što sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolančane CDR CDR1H SEQ ID

NO:22, CDR2H SEQ ID NO:25, CDR3H SEQ ID NO: 28 i varijabilni domen VL koji uključuje lakolančane CDR1L SEQ ID NO:31, CDR2L SEQ ID NO:34,

CDR3L SEQ ID NO: 37 (CDR MAB 17A5).

18. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što se Fab fragment koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše time što sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolančane CDR CDR1H SEQ ID

NO:23, CDR2H SEQ ID NO:26, CDR3H SEQ ID NO: 29 i varijabilni domen VL koji uključuje lakolančane CDR1L SEQ ID NO:32, CDR2L SEQ ID NO:35,

CDR3L SEQ ID NO: 38 (CDR MAB 13A4).

19. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što se Fab fragment koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše time što sadrži VH SEQ ID NO: 15 i VL SEQ ID NO: 18 (VHVL MAB 83A10). 20. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što se Fab fragment koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše time što sadrži VH SEQ ID NO: 16 i VL SEQ ID NO: 19 (VHVL MAB 17A5). 21. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 6, karakteriše se time što se Fab fragment koji se specifično vezuje za humani BCMA karakteriše time što sadrži VH SEQ ID NO: 17 i VL SEQ ID NO: 20 (VHVL MAB 13A4). 22. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 21, karakteriše se time

što je, pored aminokiselinske zamene na poziciji 124 u konstantnom domenu CL, amino-kiselina na poziciji 123 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H).

23. Bispecifično antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 22, karakteriše se time

što je amino-kiselina 124 K, amino-kiselina 147 je E, amino-kiselina 213 je E i amino-kiselina 123 je R.

24. Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za vanćelijski domen humanog BCMA i za humani CD3s, karakteriše se time što sadrži teškolančani i lakolančani set odabran iz grupe koja se sastoji od polipeptida

i) SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 i SEQ ID NO:46 (set 1) ,

ii) SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 i SEQ ID NO:49 (set

2) , i

ih) SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 i SEQ ID NO:52 (set 3).

25. Antitelo prema formi 24, karakteriše se time što je u delu antitela koji se specifično vezuje za humani CD3s varijabilni domen VH zamenjen varijabilnim

domenom VH koji sadrži teškolančane CDR SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao respektivne teškolančane CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni domen VL je zamenjen

varijabilnim domenom VL koji sadrži lakolančane CDR SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao respektivne lakolančane CDR1, CDR2 i CDR3 anti-CD3s antitela.

26. Antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 25, karakteriše se time što se CH3

domen jednog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca susreću na kontaktnoj površini koja sadrži originalnu kontaktnu površinu između CH3 domena antitela; pri čemu je pomenuta kontaktna površina izmenjena tako da

pokrene formiranje bispecifičnog antitela prema pronalasku, pri čemu se promena karakteriše time što je: a) CH3 domen jednog teškog lanca izmenjen, tako da je unutar originalne kontaktne površine CH3 domena jednog teškog lanca, koja se

susreće sa originalnom kontaktnom površinom CH3 domena drugog teškog lanca unutar bispecifičnog antitela, aminokiselinska rezidua zamenjena aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem veće zapremine, čime se stvara izbočina unutar kontaktne površine CH3 domena jednog teškog

lanca, koja može da se smesti u udubljenje unutar kontaktne površine CH3 domena drugog teškog lanca i

b) CH3 domen drugog teškog lanca je izmenjen, tako da je unutar originalne kontaktne površine drugog CH3 domena, koja se susreće sa

originalnom kontaktnom površinom prvog CH3 domena unutar bispecifičnog antitela, aminokiselinska rezidua zamenjena aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem manje zapremine, čime se stvara udubljenje unutar kontaktne površine drugog CH3 domena u koje može da se smesti izbočina u kontaktnoj površini prvog CH3 domena.

27. Metod pripremanja bispecifičnog antitela prema bilo kojoj od formi 1 do 26 sadrži korake

a) transformisanja ćelije-domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju laki lanac i teški lanac antitela prema

bilo kojoj od formi 1 do 26,

b) kultivisanja ćelije-domaćina pod uslovima koji dopuštaju sintezu molekula pomenutog antitela; i

c) sakupljanja molekula pomenutog antitela iz pomenute kulture.

28. Celija-domaćin sadrži vektore koji sadrže molekule nukleinskih kiselina koje

kodiraju lake lance i teške lance antitela prema bilo kojoj od formi 1 do 26

29. Farmaceutska smeša uključuje antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 26 i farmaceutski prihvatljivi ekscipijent. 30. Antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 26 ili farmaceutska smeša iz forme

29 za upotrebu u vidu leka.

31. Antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 26 ili farmaceutska smeša iz forme

29 za upotrebu u vidu leka za lečenje poremećaja plazmocita.

32. Antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 26 ili farmaceutska smeša iz forme

29 za upotrebu u vidu leka za lečenje multiplog mijeloma.

33. Antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 26 ili farmaceutska smeša iz forme 29 za lečenje poremećaja plazmocita kao što su multipli mijelom ili drugi poremećaji B-ćelija u kojima se eksprimira BCMA. 34. Antitelo prema bilo kojoj od formi 1 do 25, karakteriše se time što sadrži u

humanom IgGl-Fc delu aminokiselinsku supstituciju Pro329 glicinom ili argininom i/ili supstitucije L234A i L235A.

[0144]Sledeći primeri, lista sekvenci i slike dati su da bi pomogli u razumevanju predmetnog pronalaska čiji je istinski okvir naveden u pridruženim zahtevima.

Materijali i opšti metodi

Tehnike rekombinantne DNK

[0145]Za obradu DNK korišćeni su standardni metodi opisani u Sambrook, J.et ah,Molecular cloning: A laboratorv manual; Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Molekularno-biološki reagensi korišćeni su prema uputstvima proizvođača. Opšte informacije u vezi sa nukleotidnim sekvencama lakih i teških lanaca humanih imunoglobulina date su u: Kabat, E.A.et ah,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5<th>ed., NIH Publication No. 91-3242. Amino-kiseline lanaca antitela numerisane su i označene prema Kabat, E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5<th>ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991).

Sinteza gena

[0146]

a) Željeni genski segmenti pripremaju se od oligonukleotida napravljenih hemijskom sintezom. 600-1800 bp dugi genski segmenti, bočno ograničeni

pojedinačnim mestima sečenja restrikcionim endonukleazama, asambliraju se topljenjem i povezivanjem oligonukleotida, uz PCR amplifikaciju, i potom kloniraju preko navedenih restrikcionih mesta npr. Kpnl/ Sad ili Ascl/Pacl u pPCRScript (Stratagene)-bazirani pGA4 klonirajući vektor. DNK sekvence

subkloniranih genskih fragmenata potvrđene su sekvenciranjem DNK. Fragmenti iz genske sinteze uređuju se prema datim specifikacijama, u Geneart (Regensburg, Germanv).

b) Željeni genski segmenti se po potrebi generišu pomoću PCR, uz korišćenje odgovarajućih templata ili se sintetišu u Geneart AG (Regensburg, Germanv) od

sintetskih oligonukleotida i PCR proizvoda automatizovanom sintezom gena. Genski segmenti bočno ograničeni pojedinačnim mestima sečenja restrikcionim endonukleazama kloniraju se u standardne ekspresione vektore ili u sekvencirajuće vektore, za dalju analizu. Plazmidna DNK se prečisti iz transformisanih bakterija korišćenjem komercijalno dostupnih kitova za prečišćavanje plazmida. Koncentracija plazmida određuje se UV spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranih genskih fragmenata potvrđuje se

DNK sekvenciranjem. Genski segmenti su dizajnirani sa pogodnim restrikcionim mestima, kako bi se omogućilo subkloniranje u respektivne ekspresione vektore. Po potrebi, geni koji kodiraju proteine dizajnirani su sa 5'-kraj-sekvencom koja kodira liderski peptid koji u eukariotskim ćelijama upućuje proteine na sekreciju.

Određivanje sekvence DNK

[0147]DNK sekvence određuju se sekvenciranjem dvostrukog lanca.

Analiza sekvence DNK i proteina i obrada podataka sekvenciranja

[0148]Softverski paket Clone Manager (Scientific & Educational Software) version 9.2 koristi se za mapiranje sekvence, analizu, napomene i ilustraciju.

Ekspresioni vektori

[01491

a) Fuzioni geni koji sadrže lance opisanih antitela, kako je dole opisano, generišu se pomoću PCR i/ili genske sinteze i asambliraju poznatim

rekombinantnim metodima i tehnikama, spajanjem odgovarajućih segmenata nukleinske kiseline, npr. korišćenjem jedinstvenih restrikcionih mesta u respektivnim

vektorima. Subklonirane sekvence nukleinske kiseline proveravaju se sekvenciranjem DNK. Za prolazne transfekcije, veće količine plazmida pripremaju se iz kulturaE. coli(Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

b) Za generisanje ekspresionih vektora za anti-BCMA antitelo, DNK sekvence

varijabilnih regiona lakog i teškog lanca subkloniraju se u okvir sa humanim

IgGl konstantnim teškim lancem ili hum IgGi konstantnim lakim lancem preinsertovanim u respektivni generički recipijentni ekspresioni vektor optimizovan za ekspresiju u sisarskim ćelijskim linijama. Ekspresija antitela vođena je himernim MPSV promotorom koji sadrži CMV enhenser i MPSV promotor praćen sa 5' UTR, intronom i Ig kapa MAR elementom. Transkripcija

se okončava sintetskom polyA signalnom sekvencom na 3' kraju CDS. Svi vektori nose na 5'-kraju DNK sekvencu koja kodira liderski peptid koji upućuje proteine na sekreciju iz eukariotiskih ćelija. Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu za epizomsku replikaciju plazmida u EBV EBNA eksprimirajućim ćelijama.

c) Za generisanje vektora za BCMAxCD3 bispecifično antitelo, bispecifični molekuli izvedeni iz IgGl sadrže najmanje dve antigen-vezujuće komponente

sposobne da se specifično vežu za dve različite antigenske determinante CD3 i BCMA. Antigen-vezujuće komponente su Fab fragmenti sastavljeni od teškog lanca i lakog lanca, svaki sadrži varijabilni i konstantni region. Najmanje jedan

od Fab fragmenata je "Crossfab" fragment, gde su VH i VL razmenjeni. Razmena VH i VL unutar Fab fragmenta osigurava da Fab fragmenti različite specifičnosti nemaju identične domenske aranžmane. Dizajn bispecifičnog molekula je monovalentan za CD3 i bivalentan za BCMA kada je jedan Fab fragment fuzionisan za N-terminus unutrašnjeg CrossFab (2+1). Bispecifični molekul sadrži Fc deo, kako bi poluživot molekula bio dug. Sematski prikaz konstrukata

dat je na Slici 2; poželjne sekvence konstrukata prikazane su u SEQ ID NO 39 do 52. Molekuli su proizvedeni kotransfektovanjem HEK293 EBNA ćelija raslih u suspenziji sisarskim ekspresionim vektorima, uz korišćenje transfekcije na bazi polimera. Za pripremanje 2+1 CrossFab-IgG konstrukata, ćelije se transfektuju

odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 ("vektor Fc(izbočina)" : "vektor laki lanac" : "vektor laki lanac CrossFab" : "vektor teški lanac-CrossFab").

Tehnike kulture ćelija

[0150]Standardne tehnike kulture ćelija korišćene su kako je opisano u Current Protocols in Cell Biologv (2000), Bonifacino, J. S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.

Prolazna ekspresija u HEK293 ćelijama ( HEK293- EBNA sistem)

[0151]Bispecifična antitela eksprimiraju se prolaznom kotransfekcijom respektivnih sisarskih ekspresionih vektora u HEK293-EBNA ćelije gajene u suspenziji, korišćenjem transfekcije na bazi polimera. Jedan dan pre transfekcije, HEK293-EBNA ćelije zaseju se u količini od 1.5 Mio vijabilnih ćelija/ml u Ex-Cell medijumu, dopunjenom 6 mM L-glutaminom. Za svaki ml zapremine finalnog proizvoda, 2.0 Mio vijabilnih ćelija je centrifugirana (5 minuta na 210 x g). Supernatant se aspirira i ćelije se resuspenduju u 100 ul CD CHO medijuma. DNK za svaki ml zapremine finalnog proizvoda priprema se mešanjem 1 ug DNK (odnos teški lanac : modifikovani teški lanac : laki lanac : modifikovani laki lanac = 1:1:2:1) u 100 ul CD CHO medijuma. Posle dodavanja 0.27 rastvora na bazi polimera (1 mg/ml) mešavina se vorteksuje 15 sekundi i ostavi na sobnoj temperaturi 10 minuta. Posle 10 minuta, resuspendovane ćelije i mešavna DNK/rastvor na bazi polimera se spoje i prenesu u odgovarajući kontejner koji se stavi na uređaj za protresanje (37°C, 5% CO2) Posle 3 sata inkubacije, za svaki mL zapremine finalnog proizvoda doda se 800 ul Ex-Cell Medium, dopunjenog 6 mM L-glutaminom, 1.25 mM valproinskom kiselinom i 12.5% Pepsoy (50 g/l). Posle 24 sata, 70 ul Feed rastvora doda se na svaki ml zapremine finalnog proizvoda. Posle 7 dana ili kada vijabilnost ćelija bude jednaka ili niža od 70%, ćelije se odvoje od supernatanta centrifugiranjem i sterilnom filtracijom. Antitela se prečiste koričenjem afinitetnog koraka i jednog ili dva koraka poliranja, koji su katjonsko-izmenjivačka hromatografija i ekskluziona hromatografija zasnovana na veličini. Po potrebi, koristi se dodatni korak poliranja. Rekombinantno anti-BCMA humano antitelo i bispecifična antitela proizvode se u suspenziji kotransfektovanjem HEK293-EBNA ćelija sisarskim ekspresionim vektorima, uz koiršćenje transfekcije na bazi polimera. Ćelije se transfektuju sa dva ili četiri vektora, zavisno od formata. Za humani IgGl jedan plazmid kodira teški lanac, a drugi plazmid kodira laki lanac. Za bispecifična antitela kotransfektuju se četiri plazmida. Dva od njih kodiraju dva različita teška lanca, a druga dva kodiraju dva različita laka lanca. Jedan dan pre transfekcije HEK293-EBNA ćelije se zaseju u količini od 1.5 Mio vijabilnih ćelija/ml, u F17 medijumu, dopunjenom 6 mM L-glutaminom.

Određivanje proteina

[0152]Određivanje koncentracije antitela obavlja se merenjem apsorpcije na 280 nm, uz korišćenje teorijske vrednosti apsorpcije 0.1% rastvora antitela. Ova vrednost bazira se na aminokiselinskoj sekvenci i izračunava pomoću GPMAW softvera (Lighthouse data).

SDS- PAGE

[0153]NuPAGE<®>Pre-Cast gel sistem (Invitrogen) koristi se prema uputstvima proizvođača. Tačnije, koriste se 10% ili 4-12% NuPAGE<®>Novex<®>Bis-TRIS Pre-Cast gelovi (pH 6.4) i puferi za razdvajanje NuPAGE<®>MES (redukovani gelovi, sa NuPAGE<®>Antioxidant aditivom za pufer za razdvajanje) ili MOPS (neredukovani gelovi).

Prečišćavanje proteina

Afinitetnom hromatografijom proteina

[0154]Za afinitetni korak, supernatant se nanese na protein A-kolonu (HiTrap Protein A FF, 5 ml, GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 6 CV 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata, pH 7.5. Posle koraka ispiranja istim puferom, antitelo se eluira sa kolone korakom eluiranja sa 20 mM natrijum-fosfatom, 100 mM natrijum-hloridom, 100 mM glicinom, pH 3.0. Frakcije sa željenim antitelom se odmah neutrališu 0.5 M natrijum-fosfatom, pH 8.0 (1:10), sakupe i koncentruju centrifugiranjem. Koncentrat se sterilno filtrira i dalje obrađuje katjonsko-izmenjivačkom hromatografijom i/ili ekskluzionom hromatografijom na osnovu veličine.

[0155]Katjonsko- izmenjivačkom hromatografijom.

[0156]Za korak katjonsko-izmenjivačke hromatografije, koncentrovani protein se razblaži u razmeri 1:10 puferom za eluiranje korišćenim za afinitetni korak i nanese na katjonsko-izmenjivačku kolonu (Poros 50 HS, Applied Biosvstems). Posle dva koraka ispiranja ekvilibrirajućim puferom odnosno puferom za ispiranje, 20 mM natrijum-fosfat, 20 mM natrijum-citrat, 20 mM TRIS, pH 5.0 i 20 mM natrijum-fosfat, 20 mM natrijum-citrat, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum-hlorid, pH 5.0, protein se eluira gradijentom uz korišćenje 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum-hlorida, pH 8.5. Frakcije sa željenim antitelom se sakupe, koncentruju centrifugiranjem, sterilno filtriraju i sprovode korakom ekskluzione hromatografije zasnovane na veličini.

Analitičkom ekskluzionom hromatografijom baziranom na veličini

[0157]Za korak ekskluzione hromatografije bazirane na veličini, koncentrovani protein se injektira na XK16/60 HiLoad Superdex 200 kolonu (GE Healthcare), i 20 mM histidin, 140 mM natrijum-hlorid, pH 6.0 sa ili bez Tween20 kao formulacioni pufer. Frakcije koje sadrže monomere se sakupe, koncentruju centrifugiranjem i sterilno filtriraju u sterilne fiole.

Merenje čistoće i sadržaja monomera

[0158]Čistoća i sadržaj monomera finalnog proteinskog preparata određuju se CE-SDS (Caliper LabChip GXII sistemom (Caliper Life Sciences)) resp. HPLC (TSKgel G3000 SW XL analitičkom kolonom za ekskluzionu hromatografiju baziranu na veličini (Tosoh)) u 25 mM kalijum-fosfatu, 125 mM natrijum-hloridu, 200 mM L-arginin-monohidrohloridu, 0.02% (w/v) natrijum-azidu kao puferu, pH 6.7.

Potvrđivanje molekulske težine LC- MS analizama

Deglikozilacija

[0159]Da bi se potvrdilo da su pripremljeni molekuli homogeni, finalni proteinski rastvor se analizira LC-MS analizama. Da bi se uklonila heterogenost uvedena ugljenim hidratima, konstrukti se tretiraju sa PNGaseF (ProZvme). pH proteinskog rastvora podesi se na 7.0 dodavanjem 2 jal 2 M Tris u 20 ug proteina u koncentraciji od 0.5 mg/ml. Doda se 0.8 ug PNGaseF i inkubira 12 h na 37 °C.

LC- MS analiza - On Une detekcija

[0160]LC-MS metod izvodi se na Agilent HPLC 1200 sistemu povezanom sa TOF 6441 masenim spektrometrom (Agilent). Hromatografska separacija se vrši na Macherev Nagel Polvsterene koloni; RP1000-8.(8 um veličina čestica, 4.6 x 250 mm; kat. br. 719510). Eluent A je 5% acetonitril i 0.05% (v/v) mravlja kiselina u vodi, eluent B je 95% acetonitril, 5% voda i 0.05% mravlja kiselina. Stopa protoka je 1 ml/min, separacija se vrši na 40 °C i 6 ug (15 ul) proteinskog uzorka dobijenog tretmanom kako je ranije opisano.

[0161]Tokom prva 4 minuta eluat se usmerava u otpad da bi se maseni spektrometar zaštitio od kontaminacije solju. ESI-izvor se pušta, uz protok sušećeg gasa od 12 l/min, temperaturu od 350 °C i nebulizerski pritisak od 60 psi. MS spektri se dobijaju korišćenjem fragmentorske voltaže od 380 V i masenog opsega 700 do 3200 m/z, uz korišćenje pozitivnog jonskog moda. MS podaci se sakupljaju softverom instrumenta, od 4. do 17. minuta.

Izolacija humanih primarnih pan T- ćelija iz PBMC

[0162]Mononuklearne ćelije periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) pripremaju se centrifugiranjem na Histopaque gustinskom gradijentu, iz preparata obogaćenih limfocitima ("buffy coats", interfaza), dobijenih iz lokalnih banaka krvi ili iz sveže krvi zdravih humanih donora. Ukratko, krv se razblaži sterilnim PBS i pažljivo nanese na Histopaque gradijent (Sigma, H8889). Posle 30 min centrifugiranja na 450 x g na sobnoj temperaturi (isključen "brake"), deo plazme iznad PBMC, koji sadrži interfazu se odlije. PBMC se prebace u nove 50 ml-ske Falcon epruvete i epruvete se dopune PBS do ukupne zapremine od 50 ml. Mešavina se centrifugira na sobnoj temperaturi, 10 minuta na 400 x g (uključen "brake"). Supernatant se odlije i pelet od PBMC ispere dva puta sterilnim PBS (koraci centrifugiranja na 4 °C, 10 minuta na 350 x g). Dobijena populacija PBMC se broji automatski (ViCell) i skladišti u RPMI1640 medijumu, koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamin (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u inkubatoru do početka testa.

[0163]Preuzimanje T-ćelija iz PBMC obavlja se korišćenjem Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenvi Biotec #130-091-156), prema uputstvima proizvođača. Ukratko, ćelijski peleti se razblaže u 40 ul hladnog pufera na 10 miliona ćelija (PBS sa 0.5%> BSA, 2 mM EDTA, sterilno filtriran) i inkubiraju sa 10 ul Biotin-Antibodv Cocktail na 10 miliona ćelija, 10 min na 4 °C. Doda se 30 ul hladnog pufera i 20 jal Anti-Biotin magnetnih perlica na 10 miliona ćelija i mešavina se inkubira još 15 min na 4 °C. Ćelije se isperu dodavanjem 10-20 x postojeće zapremine i zatim korakom centrifugiranja na 300 x g 10 min. Do 100 miliona ćelija resuspenduje se u 500 ul pufera. Magnetna separacija neobeleženih humanih pan T-ćelija obavlja se korišćenjem LS kolona (Miltenvi Biotec #130-042-401) prema uputstvima proizvođača. Dobijena populacija T-ćelija broji se automatski (ViCell) i skladišti u AIM-V medijumu na 37 °C, 5% CO2u inkubatoru do početka testa (ne duže od 24 h).

Izolacija primarnih humanih naive T- ćelija iz PBMC

[0164] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremaju se centrifugiranjem na Histopaque gustinskom gradijentu od preparata obogaćenih limfocitima ("buffy coats") dobijenih iz lokalnih banaka krvi ili iz sveže krvi zdravih humanih donora. Preuzimanje T-ćelija iz PBMC obavlja se korišćenjemNaiveCD8<+>T cell isolation Kit, Miltenyi Biotec (#130-093-244), prema uputstvima proizvođača, uz izostavljanje poslednjeg koraka izolacije CD8<+>T-ćelija (vidi i opis izolacije primarnih humanih pan-T-ćelija).

Izolacija primarnih PBMC cinomolgusa iz heparinizovane krvi

[0165] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremaju se centrifugiranjem na gustinskom gradijentu iz sveže krvi zdravih donora cinomolgusa na sledeći način: Heparinizovana krv se razblaži u razmeri 1:3 sterilnim PBS, i Lymphoprep medij um (Axon Lab #1114545) se razblaži do 90% sterilnim PBS. Dve zapremine razblažene krvi nanesu se na jednu zapreminu razblaženog gustinskog gradijenta i PBMC frakcija se izdvoji centrifugiranjem 30 min na 520 x g, bez "brake", na sobnoj temperaturi. PBMC traka se prenese u svežu 50 ml-sku Falcon epruvetu i ispere sterilnim PBS, centrifugiranjem 10 min na 400 x g na 4 °C. Obavi se jedno centrifugiranje na maloj brzini da bi se uklonile pločice (15 min na 150 xg, 4 °C) i dobijena populacija PBMC se automatski broji i odmah koristi za sledeće testove.

Primeri

Primer 1: Stvaranje anti-BCMA antitela

Primer 1.1: Proizvodnja antigena i pomoćnih reagenasa

Primer 1.1.1: Rekombinanti, solubilni, vanćelijski domen humanog BCMA

[0166]Vanćelijski domeni humanog, cinomolgusovog i mišjeg BCMA, koji se koriste kao antigeni za selekcije prikazivanjem na fagima, prolazno se eksprimiraju kao N-terminalna monomerna Fc-fuzija u HEK EBNA ćelijama iin vivomesno-specifično biotinizuju putem koekspresije BirA biotin-ligaze, na avi-tag prepoznavajućoj sekvenci lociranoj na C-terminusu Fc dela koji nosi receptorski lanac (Fc-izbočina lanac). Vanćelijski domeni humanog, cinomolgusovog i mišjeg BCMA sadrže metionin 4 do asparagin 53, metionin 4 do asparagin 52 i alanin 2 do treonin 49, respektivno. Oni su N-terminalno fuzionisani sa zglobom humanog IgGl, omogućavajući heterodimerizaciju sa nefuzionisanm humanim IgGl Fc delom (udubljenje lanac) tehnologijom "izbočina u udubljenju".

[0167]Za sakupljanje vanćelijskog domena BCMA korišćeni su sledeći prajmeri:

Primer1.1.2: Rekombinantni, skraćeni mišji APRIL

[0168] Rekombinantni, skraćeni mišji APRIL koji se koristi kao sredstvo (kompetitor) za selektovanja prikazivanjem na fagima i ELISA, prolazno se eksprimira kao N-terminalna monomerna Fc-fuzija u HEK EBNA ćelijama. Mišji APRIL sadrži histidin 106 do leucin 241. On je N-terminalno fuzionisan za zglob humanog IgGl što omogućava heterodimerizaciju sa nefuzionisanim humanim IgGl-Fc delom (udubljenje lanac) tehnologijom "knobs-into-holes".

Primer 1.2: BCMA-eksprimirajuće ćelije kao sredstva

Primer 1.2.1: Rekombinantne ćelije koje na svojoj površini eksprimiraju humani, cinomolgusov ili mišji BCMA

[0169]

a) Proizvodnja HEK293-EBNA ćelija koje prolazno eksprimiraju BCMA pune dužine

HEK293-EBNA ćelije koje prolazno eksprimiraju BCMA proizvode se u suspenziji transfektovanjem HEK293-EBNA ćelija sisarskim ekspresionim vektorima, korišćenjem transfekcije na bazi polimera. Ćelije se transfektuju

vektorima koji sadrže gen koji kodira humani, mišji ili cinomolgusov BCMA pune dužine. Jedan dan pre transfekcije HEK293-EBNA ćelije se zaseju, u količini od

1.5 Mio vijabilnih ćelija/ml, u Ex-cell<®>GTM-3 medijumu, dopunjenom 6 mM L- glutaminom.

Na svaki ml zapremine finalnog proizvoda, 2.0 Mio vijabilnih ćelija se centrifugira (5 minuta na 210 x g). Supernatant se aspirira i ćelije resuspenduju u 100 ul CD CHO medijuma. DNK za svaki ml zapremine finalnog proizvoda priprema se mešanjem 1 ug DNK u 100 jal CD CHO medijuma. Posle dodavanja 0.27 jal rastvora na bazi polimera (1 mg/ml) mešavina se vorteksuje 15 sekundi i ostavi na ST 10 minuta. Posle 10 minuta resuspendovane ćelije i mešavina DNK/rastvor na bazi polimera se spoje. Ovo se prenese u odgovarajući kontejner koji se stavi u uređaj za pretresanje (37°C, 5% CO2). Posle 3 sata inkubacije, 800 (al F17 medijuma, dopunjenog 6 mM L-glutaminom, 1.25 mM valproinskom kiselinom i 12.5% Pepsov (50 g/l), doda se na svaki ml zapremine finalnog proizvoda.

Posle 2 dana inkubacije, prolazno transfektovane HEK293-EBNA ćelije se sakupe centrifugiranjem (200 x g; 10 min.). Posle aspiracije supernatanta, ćelijski pelet se nežno resuspenduje sa Ex-cell<®>GTM-3 medijumom pri potrebnoj gustini (30 Mio ćelija/ml). Ćelije se prenesu u krio-fiole (1 ml/fioli), stave u kutiju za krio- prezervaciju, koja se prethodno hladi na četiri stepena Celzijusova najmanje 12 sati, i uskladište na -80 °C. Posle72 sata na - 80 °C ćelije se prenesu u tečni azot.

b) Stvaranje CHO ćelijske linije koja eksprimira BCMA

Ćelijske linije koje u višku eksprimiraju humani, mišji ili cinomolgusov BCMA

generišu se transdukovanjem sa virusu sličnim partikulama (virus-like particles, VLP). Na lentivirusu bazirane virusu slične partikule proizvode se kotransfekcijom HEK293T (ATCC CRL11268) ćelija ViraSafe™ Lentiviral Packaging plazmidima (Cell Biolabs, USA) i lentivirusnim ekspresionim vektorima koji kodiraju humani, mišji ili cinomolgusov BCMA. Transfekcije plazmida u HEK293T ćelije obavljaju se pomoću Lipofectamine LTX (Life

Technologies, USA), prema uputstvima proizvođača. Transfekcije se obavljaju na pločama sa 6 bunarčića, koje su zasejane sa 6 x IO<5>ćelija/bunarčiću dan pre transfekcije, sa 2.5 |ag plazmidne DNK. Svaka transfekcija sadržala je 0.4 ug pRSV-Rev pakujućeg vektora, 0.4 ug pCgpV pakujućeg vektora, 0.4 ug pCMV-VSV-G omotačkog vektora, i 1.3 ug humanog (pETR14305), mišjeg (pETR14304) ili cinomolgusovog (pETR14306) BCMA-ekspresionog vektora.

VLP-sadržavajući supernatant sakupi se posle 48 h i filtrira kroz polietersulfonsku membranu sa veličinom pora 0.45 um. Za generisanje stabilnih ćelijskih linija koje eksprimiraju BCMA, CHO ćelije se zaseju pri 1.0 x IO<6>ćelija/bunarčiću na ploče sa 6 bunarčića i prekriju sa 2 ml VLP-sadržavajućeg supernatanta. Transdukcije se obavljaju spinokulacijom na 800 x g i na 32 °C, 30 min u Epperidorf centrifuge 5810 table-top centrifugi (Eppendorf, Germanv). Virusni supernatant se zameni svežim medij umom 12 h posle spinokulacije. Tri dana posle transdukcije, puromicin se doda u količini 6 ug/ml i ćelije se kultivišu kroz nekoliko pasaža. BCMA-pozitivni pulovi ćelija dobijaju se FACS sortiranjem (FACS ARIA, Becton, Dickinson and Companv, USA) uz korišćenje unakrsno reaktivnog Alexa Fluor 448-obeleženog anti-BCMA antitela.

c) Rekombinantne ćelije koje stabilno eksprimiraju cinomolgusov BCMA na svojoj površini

i. Generisanje HEK293T ćelijske linije koja stabilno eksprimira BCMA

[0170] HEK293T (ATCC CRL11268) ćelijske linije koje preterano eksprimiraju humani ili cinomolgusov BCMA generišu se transdukcijom sa virusu sličnim partikulama (VLP). Na lentivirusu bazirane virusu slične partikule proizvode se kotransfekcijom HEK293T ćelija ViraSafe™ Lentiviral Packaging plazmidima (Cell Biolabs, USA) i lentivirusnim ekspresionim vektorima koji kodiraju humani ili cinomolgusov BCMA. Transfekcije plazmida u HEK293T ćelije obavljaju se pomoću Lipofectamine LTX (Life Technologies), prema uputstvima proizvođača. Transfekcije se obavljaju na pločama sa 6 bunarčića koje su zasejane sa 6 x IO<5>ćelija/bunarčiću dan pre transfekcije, sa 2.5 ug plazmidne DNK. Svaka transfekcija sadržala je 0.4 ug pRSV-Rev pakujućeg vektora, 0.4 ug pCgpV pakujućeg vektora, 0.4 ug pCMV-VSV-G obmotavajućeg vektora i 1.3 ug humanog (pETR14305) ili cinomolgusovog (pETR14306) BCMA-ekspresionog vektora. VLP-sadržavajući supernatant sakupi se posle 48 h i filtrira kroz polietersulfonsku membranu sa veličinom pora 0.45 um. Za generisanje stabilnih ćelijskih linija koje eksprimiraju BCMA, HEK293T ćelije se zaseju pri 1.0 x IO<6>ćelija/bunarčiću na ploče sa 6 bunarčića i prekriju sa 1 ml VLP-sadržavajućeg supernatanta. Transdukcije se obavljaju spinokulacijom na 800 x g i na 32 °C, 30 min u Epperidorf centrifuge 5810 table-top centrifugi (Eppendorf). Virusni supernatant se zameni svežim medijumom 12 h posle spinokulacije. Tri dana posle transdukcije, puromicin se doda u količini 1 ug/ml i ćelije se kultivišu kroz nekoliko pasaža. BCMA-pozitivni ćelijski klon dobij a se FACS sortiranjem (FACS ARIA, Becton, Dickinson and Companv) uz korišćenje čovek/cinomolgus unakrsno reaktivnog anti-BCMA antitela (MAB 83A10), i FITC-konjugovanog Fc gama-specifičnog kozjeg antihumanog IgG (Jackson ImmunoResearch, #109-095-098) kao sekundarnog antitela.

ii. Normalizacija ekspresije humanog i cinomolgusovog BCMA

[0171]Analiza protočnom citometrijom uz koiršćenje anti-FLAG M2 antitela (Sigma-Aldrich, #F3165) koristi se za potvrđivanje komparativnih nivoa ekspresije FLAG-markiranih cinomolgusovih i humanih BCMA u transdukovanim HEK293T ćelijama. Unutarćelijski FLAG-marker fuzioniše se sa C-terminusom humanog i cinomolgusovog BCMA. Za unutarćelijsko bojenje, 10<6>ćelija se ispere, fiksira paraformaldehidom, permeabilizuje uz korišćenje 1% saponina u PBS, i zatim inkubira sa anti-FLAG M2 antitelom 30 min na 4°C. Ćelije se isperu sa PBS i inkubiraju 30 min sa RPE-konjugovanim kozjim anti-mišjim antitelom (AbD Serotec, # 103001), isperu tri puta sa PBS i resuspenduju u 1 ml PBS/5% FCS, za protočno-citometrijsku analizu.

Primer 1.2.2: Ćelijska linija humanog mijeloma čije ćelije na svojoj površini

eksprimiraju BCMA

[0172]Ekspresija BCMA procenjuje se na pet ćelijskih linija humanog nijeloma (NCI-H929, RPMI-8226, U266B1, L-363 i JJN-3), korišćenjem protočne citometrije. NCI-H929 ćelije ((H929) ATCC® CRL-9068™) kultivišu se u 80-90% RPMI 1640, sa 10-20% toplotom inaktiviranim FCS, i koji može sadržati 2 mM L-glutamin, 1 mM natrijum-piruvat i 50 mM merkaptoetanol. RPMI-8226 ćelije ((RPMI) ATCC® CCL-155™) kultivišu se u u medijumu koji sadrži 90% RPMI 1640 i 10%> toplotom inaktivirani FCS. U266B1 ((U266) ATCC® TIB-196™) ćelije kultivišu se u RPMI-1640 medijumu modifikovanom da sadrži 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natrijum-piruvat, 4500 mg/l glukoze i 1500 mg/l natrijum-bikarbonata, i 15% toplotom inaktivirani FCS. L-363 ćelijska linija (Leibniz Institute DSMZ - German kolekcija mikroorganizama i ćelijskih kultura; DSMZ No. ACC 49) kultiviše se u 85% RPMI 1640 i 15%o toplotom inaktiviranom FCS. JJN-3 ćelijska linija (DSMZ No. ACC 541) kultiviše se u 40% Dulbecco-ov MEM + 40% Iscove-ov MDM + 20% toplotom inaktivirani FBS. Ukratko, ćelije se sakupe, isperu, broje na vijabilnost, resuspenduju do 50 000 ćelija/bunarčiću na pločama sa 96-bunarčića sa okruglim dnom i inkubiraju sa antihumanim BCMA- antitelom (Abcam, #ab54834, mišji IgGl) pri 10 ug/ml, 30 min na 4°C (da se spreči internalizacija). Mišji IgGl koristi se kao izotipska kontrola (BD Biosciences, #554121). Ćelije se zatim centrifugiraju (5 min na 350 x g), isperu dva puta i inkubiraju sa FITC-konjugovanim antimišjim sekundarnim antitelom, 30 min na 4°C. Na kraju perioda inkubacije, ćelije se centrifugiraju (5 min na 350 x g), isperu dva puta sa FACS puferom, resuspenduju u 100 jal FACS pufera i analiziraju na CantoII uređaju sa FACS Diva softverom. Relativna kvantifikacija broja BCMA receptora na površini membrane H929, RPMI-8226 i U266B ćelijskih linija mijeloma procenjuje se QIFIKIT analizom (Dako, #K0078, prema uputstvima proizvođača). H929 ćelije eksprimiraju humani BCMA sa najvećom gustinom koja je do 5-6 puta veća nego kod drugih ćelijskih linija mijeloma. H929 se smatra za ćelijsku liniju koja u visokoj meri eksprimira BCMA u poređenju sa RPMI-8226, U266 i L363, koje su ćelije mijeloma sa niskom ekspresijom BCMA. Tabele 4 i 4A zbirno prikazuju relativan broj BCMA receptora na površini ćelija ćelijskih linija humanog mijeloma.

Primere 1.3: Dobijanje BCMA vezivača iz in vitro, rekombinantne biblioteke

Primer 1.3.1: konstruisanje generičkih Fab-biblioteka

[0173]Biblioteke generičkih antitela u Fab-formatu konstruišu se na bazi humanih germline gena korišćenjem sledećih sparivanja V-domena: Vk3-20 kapa laki lanac sa VH3-23 teškim lancem za DP47-3 biblioteku i Vkl-17 kapa laki lanac sa VH1-69 teškim lancem za DP88-3 biblioteku. Obe biblioteke su randomizovane u CDR3 lakog lanca (L3) i CDR3 teškog lanca (H3) i asamblirane od 3 fragmenta po biblioteci, putem splajsovanja prekrivajućim oligonukleotidima (splicing by overlapping extension, SOE)-PCR. Fragment 1 sadrži 5'-kraj gena za antitelo uključujući randomizovani L3, fragment 2 je centralni konstantni fragment koji se pruža od L3 do H3, dok fragment 3 sadrži randomizovani H3 i 3'-deo gena za antitelo. Sledeće kombinacije prajmera koriste se za generisanje bibliotečkih fragmenata za DP47-3 biblioteku: fragment 1 (LMB3-LibLlb_new), fragment 2 (MS63-MS64), fragment 3 (Lib2H-fdseqlong). Vidi Tabelu 1 u WO2012020038. Sledeće kombinacije prajmera koriste se za generisanje bibliotečkih fragmenata za DP88-3 biblioteku: fragment 1 (LMB3-RJH LIB3), fragment 2 (RJH31-RJH32) i fragment 3 (LIB88-2-fdseqlong). Vidi Tabele 3 i 4 u WO2012020038.

[0174]PCR protokol za proizvodnju bibliotečkih fragmenata uključuje: 5 min inicijalne denaturacije na 94°C; 25 ciklusa od 1 min na 94 °C, 1 min na 58 °C i 1 min na 72 °C; i terminalnu elongaciju, 10 min na 72 °C. Za sklapajući PCR, ekvimolarni odnosi 3 fragmenta koriste se kao templat. Protokol za sklapajući PCR uključuje: 3 min inicijalne denaturacije na 94 °C; i 5 ciklusa od 30 sekundi na 94 °C, 1 min na 58 °C i 2 min na 72 °C. Na ovom stupnju, dodaju se prajmeri komplementarni sekvenci izvan fragmenata 1-3 i obavlja se dodatnih 20 ciklusa, pre terminalne elongacije, 10 min na 72 °C. Posle sklapanja dovoljnih količina randomizovanih Fab konstrukata pune dužine, Fab konstrukti se digestiraju sa Ncol/NotI za DP47-3 biblioteku i sa Ncol/Nhel za DP88-3 biblioteku, zajedno sa slično tretiranim akceptorskim fagemidnim vektorom. Za DP47-3 biblioteku, 22.8 ug Fab biblioteke se poveže sa 16.2 ug fagemidnog vektora. Za DP88-3 biblioteku, 30.6 ug Fab biblioteke se poveže sa 30.6 ug fagemidnog vektora.

[0175]Prečišćeni proizvodi ligacije koriste se za 68 transformacija za DP47-3 biblioteku odnosno 64 transformacije za DP88-3 biblioteku, da se dobiju finalne DP47-3 i DP88-3 biblioteke. Fagemidne čestice koje prikazuju Fab biblioteke izdvoje se i prečiste PEG/NaCl prečišćavanjem, da bi se koristile za selekciju anti-BCMA Fab klonova.

Primer 1.3.2: Selekcija anti-BCMA Fab klonova

[0176]Anti-BCMA Fab uspostavljaju se prikazivanjem na fagima iz sintetskih Fab biblioteka koje se sastoje od VL i VH parova poreklom od različitih V-domenskih familija. Klonovi 17A5 i 83A10 generišu se od Vk3 20 / VH3 23 sub-biblioteke i klon 13A4 od Vk2D_28 / VH51 sub-biblioteke, respektivno (Tabela 5). Ove biblioteke baziraju se na potpuno humanim okvirima sa sekvencionim diverzitetom u CDR3 VL (3 različite dužine) i VH domenima (6 različitih dužina).

[0177]Ciklusi selekcije ("biopanning") obavljaju se u rastvoru po sledećem obrascu: 1) pre-pročišćavanje~10<12>fagemidnih partikula po bibliotečkom pulu u imunoepruvetama obloženim sa 10 ug/ml nesrodnog humanog IgG da se biblioteke oslobode antitela koja prepoznaju Fc-deo antigena; 2) inkubacija ne-Fc-vezujućih fagemidnih partikula sa 100 nM biotinisanog BCMA, 0.5 h u prisustvu 100 nM nesrodnog nebiotinisanog Fc "knobs-into-holes" konstrukta za dalju depleciju Fc-vezivača, u ukupnoj zapremini od 2 ml; 3) zadržavanje biotinisanog BCMA i specifično vezivanje faga rastavljanjem i prenošenjem "panning" reakcije u 16 bunarčića na neutravidinom ili streptavidinom prethodno obložene mikrotitarske ploče, 20 min na šejkeru; 4) ispiranje respektivnih bunarčića 10-30x sa PBS/Tween20 i 10-30x sa PBS, uz korišćenje uređaja za ispiranje ploča; 5) opciono korak kompetitivnog ispiranja dodavanjem 230 nM mišjeg APRIL, za izmeštanje Fab klonova koji prepoznaju mesto vezivanja prirodnog liganda i time selektovanje za APRIL-nekompetirajuća fagna antitela; 6) eluiranje fagnih partikula dodavanjem 125 ul 100 mM TEA (trietilamin) po bunarčiću, 5-10 min, i neutralizacija dodavanjem jednake zapremine 1 M Tris/HCl pH 7.4; 7) reinfekcija log-fazeE. coliTG1 ćelija eluiranim fagnim česticama, infekcija helperfagom VCSM13, inkubacija na šejkeru na 30 °C preko noći i zatim PEG/NaCl precipitacija fagemidnih čestica koje će se koristiti u sledećem krugu selekcije.

[0178]Selekcija se obavlja u 3 do 5 rundi, uz korišćenje konstantnih koncentracija antigena od 100 nM. Pored selektovanja u kojima se samo humani BCMA koristi kao antigen, obavljaju se dodatne selekcije tokom kojih se cinomolgusov ili mišji BCMA koriste na alternirajući način sa humanim BCMA, da bi se izvršila selekcija unakrsno reaktivnih antitela. Štaviše, kao alternativa zadržavanju baziranom na pločama obloženim streptavidinom, zadržavanje kompleksa antigen : fag obavlja se dodavanjem 5.4 x IO<7>streptavidinom obloženih magnetnih perlica za "panning" reakciju, praćeno koracima ispiranja uz korišćenje respektivnih magneta, pod gore opisanim uslovima.

[0179]Specifični vezivači identifikuju se skriningom rezonancijom površinskog plazmona supernatanta Fab-sadržavajuće bakterijske kulture uz korišćenje BioRad ProteOn XPR36 biosenzora. Ukratko, posle infekcije log-faznihE. coliTG1 ćelija eluuiranim fagnim partikulama, pojedinačne jedinice koje formiraju koloniju (colony forming units, cfu) zaseju se i odaberu za inokulaciju 1 ml ekspresionih kultura na pločama sa 96 bunarčića. Fab se preuzimaju iz supernatanta na ProteOn GLM čip koji se derivatizuje sa 8.000-10.000 RU kozjeg antihumanog IgG, F(ab')2fragment-specifičnog poliklonskog antitela (Jackson ImmunoResearch, #109-005-006) u vertikalnoj orijentaciji. Posle toga, humani, cinomolgusov i mišji BCMA kao i nesrodni Fc "knobs-into-holes" konstrukt, injektiraju se kao analiti u horizontalnoj orijentaciji. Klonovi koji ispoljavaju značajan odgovor vezivanja za BCMA i ne vezuju se za Fc-deo antigena, bakterijski se eksprimiraju u zapremini od 0.5 litara kulture, afinitetno prečišćavaju i kinetički katakterišu SPR-analizom uz korišćenje "one-shot-kinetics" protokola, na BioRad ProteOn XPR36 biosenzoru.

Primer 2: Testovi vezivanja BCMA: rezonancija površinskog plazmona

[0180] a) Afiniteti (KD) anti-BCMA Fab klonova mere se rezonancijom površinskog plazmona uz korišćenje ProteOn XPR36 instrumenta (Biorad) na 25 °C sa biotinisanim humanim, cinomolgusovim i mišjim BCMA, imobilisanim na NLC čipovima pomoću zadržavanja neutravidinom (Tabela 6). Nesrodni biotinisani Fc "knobs-into-holes" konstrukt imobiliše se na sličan način kao negativna kontrola. Imobilizacija antigena (ligand): Rekombinantni antigeni se razblaže sa PBST (10 mM fosfat, 150 mM natrijum-hlorid, pH 7.4, 0.005% Tween 20) do 10 ug/ml, zatim injektiraju pri 40 (jl/minutu, 300 s u vertikalnoj orijentaciji. Injektiranje analita: Za merenje "one-shot" kinetike, smer injektiranja se menja u horizontalnu orijentaciju, serije dvostrukih razblaženja prečišćenog Fab (različiti koncentracioni opsezi) injektiraju se istovremeno pri 40 ul/min duž kanala 1-5, uz vreme asocijacije 200 ili 300 s, i vreme disocijacije 300 s. Pufer (PBST) se injektira duž šestog kanala da se obezbedi "in-line" šlepa kontrola za referencu. Konstante asocijacije (kon) i konstantne disocijacije (koff) izračunavaju se korišćenjem jednostavnog jedan-na-jedan Langmuir-ovog modela vezivanja, u ProteOn Manager v3.1 softveru, istovremenim podešavanjem asocijacionog i disocijacionog senzograma. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunava se kao odnos k^t/k™. Regeneracija se obavlja u horizontalnoj orijentaciji uz korišćenje 10 mM glicina-HCl, pH 1.5, pri stopi protoka od 100 jal/min, za vreme kontakta od 18 s.

b) Procena vezivanja anti-BCMA antitela za rekombinantni BCMA rezonancijom površinskog plazmona (SPR) vrši se na sledeći način. Svi SPR eksperimenti obavljaju

se na Biacore T200, na 25 °C sa HBS-EP kao puferom za razdvajanje (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Germanv). Određuje se aviditet interakcije između anti-BCMA antitela i rekombinantnog BCMA Fc(kih) (humani, cinomolgusov i mišji). Biotinisani rekombinantni humani, cinomolgusov i mišji BCMA Fc(kih) direktno se kupluju na SA čip prema uputstvima (Biacore, Freiburg/Germanv). Nivo imobilizacije bio je od 200 do 700 RU. Anti-BCMA antitela propuštana su u opsegu dvostrukih koncentracija (1.95 do 500 nM) uz protok od 30^l/minutu kroz ćelijski tok, u trajanju od 120 sekundi. Disocijacija je praćena 180 sekundi. Velike razlike refraktornog indeksa korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnom toku ćelija. Tu su anti-BCMA antitela propuštana preko prazne površine prethodno aktivirane i deaktivirane kako je opisano u kitu za standardno kuplovanje amina. Prividne kinetičke konstante izvedene su korišćenjem Biacore T200 Evaluation softvera (vAA, Biacore AB, Uppsala/Sweden), da bi se jednačine za stopu 1:1 Langmuir-ovog vezivanja podesile numeričkom integracijom, uprkos bivalenciji interakcije, u svrhu poređenja.

[0181]Određivanje i afinitet interakcije između anti-BCMA antitela i rekombinantnog humanog BCMA Fc(kih). Antihumano Fab antitelo (GE Healthcare) direktno se kupluje na CM5 čip pri pH 5.0 uz korišćenje kita za standardno kuplovanje amina (Biacore, Freiburg/Germanv). Nivo imobilizacije bio je oko 6500 RU. Anti-BCMA antitelo zadržava se tokom 90 sekundi, pri 25 nM. Rekombinantni humani BCMA Fc(kih) propuštan je pri opsegu 4-strukih koncentracija (1.95 do 500 nM), uz protok od 30 (al/minutu, kroz tok ćelija, tokom 120 sekundi. Disocijacija je praćena 120 sekundi. Velike razlike refraktornog indeksa korigovane su oduzimanjem odgovora dobij enog na referentnom toku ćelija. Tu je rekombinantni BCMA tekao preko površine sa imobilisanim antihumanim Fab antitelom, ali na koju je HBS-EP injektiran umesto anti-BCMA antitela. Kinetičke konstante izvedene su korišćenjem Biacore TI00 Evaluation Software (vAA, Biacore AB, Uppsala/Svveden, da bi se jednačine za stopu 1:1 Langmuir-ovog vezivanja podesile numeričkom integracijom (Tabela 7). Mereno je i vezivanje 83A10 anti-BCMA antitela za rekombinantni cinomolgusov BCMA Fc(kih) i mišji BCMA Fc(kih) (Tabela 8).

Primer3: Testspecifičnosti anti-BCMA IgG antitela na huTACI-R i huBAFF-R

[0182]Kao članovi TNF-TNF-R superfamilije, TACI i BAFF receptori srodni su sa BCMA receptorom sa respektivnom homologijom od 22% i 18.5% u vanćelijskom domenu. Prema tome, rezonancijom površinskog plazmona (SPR) obavljeni su eksperimenti vezivanja da bi se ispitala specifičnost anti-BCMA IgG antitela. Svi SPR eksperimenti obavljeni su na Biacore T200 (GE Healthcare), na 25 °C sa HBS-EP kao puferom za razdvajanje (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfaktant P20). Fc fuzionisani huBCMA, huBAFF-R i huTACI-R hemijski su imobilisani sa visokim nivoom imobilizacije (~5000 RU) na različitim kanalima za protok na Biacore CM5 senzorskom čipu, pri pH 5.0, uz korišćenje standardnog kita za kuplovanje amina (GE Healthcare). Inicijalno visokokoncentrovani rastvori (1.5 uM, rastvoreno u HBS-EP) anti-BCMA IgG 83A10, kao i a-huTACI-R IgG i a-huBAFF-R IgG kao pozitivne kontrole injektiraju se (vreme asocijacije: 80 s, vreme disocijacije: 600 s, protok: 30 ul/min) da se proveri da li dolazi do vezivanja. Pozitivan događaj vezivanja a-huTACI-R IgG za huTACI-R, kao i a-huBAFF-R IgG za huBAFF-R i anti-BCMA IgG antitela za huBCMA, ukazuju da se svi receptori i dalje prepoznaju posle imobilisanja. Za anti-BCMA IgG antitela koja se sa brzim kinetičkim konstantama vezuju za huBAFF-R i/ili huTACI-R, izvedeno je pažljivo ispitivanje kinetičkih parametara sa niskim nivoima imobilizacije (300 RU) na novom CM5 senzornom čipu. Razblaženja anti-BCMA IgG antitela pri koncentracijama od 700, 350, 175, 87.5, 43.75, 21.88 nM (razblaženo u HBS-EP) se injektiraju (vreme asocijacije: 80 s, vreme disocijacije: 300 s, protok: 30 jal/min), i uzorak(ci) se testiraju u duplikatu. Regeneracija se takođe vrši kada je moguće tj. kada nema brze i potpune disocijacije. Kinetička evaluacija interakcije između anti-BCMA IgG antitela i huBAFF-R ili huTACI-R izvodi se globalnim podešavanjem podataka sa modelom interakcije 1:1, koji uključuje izraz za maseni transport (Biacore evaluation Version 2.0). Obavlja se i analiza ravnotežnog stanja sa višim koncentracijama anti-BCMA IgG antitela.

Primer 4: Vezivanje BCMA antitela za BCMA-pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma (protočna citometrija)

[0183] Anti-BCMA IgG antitela (klonovi 17A5, 83A10, 13A4) analiziraju se protočnom citometrijom u pogledu vezivanja za humani BCMA na BCMA-eksprimirajućim H929 ćelijama. MKN45 (ćelijska linija humanog želudačnog adenokarcinoma, koja ne eksprimira BCMA) korišćena je kao negativna kontrola. Ukratko, kultivisane ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se podese na 2 x IO<6>ćelija po ml u BSA-sadržavajućem FACS Stain Buffer (BD Biosciences). 100 (al ove ćelijske suspenzije po bunarčiću alikvotira se na ploče sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubira sa 30 (al anti-BCMA antitela ili odgovarajućeg kontrolnog IgG, 30 min na 4 °C. Sva anti-BCMA antitela (i izotipska kontrola) titruju se i analiziraju u finalnoj koncentraciji u opsegu od 0.1-40 ug/ml. Ćelije se zatim centrifuguraju (5 min, 350 x g), isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS Stain Buffer (BD Biosciences), resuspenduju i inkubiraju dodatnih 30 min na 4 °C sa fluorohrom-konjugovanim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab'^-fragment kozjim anti-humanim IgG, Fc-fragment specifičnim antitelom (Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170). Ćelije se zatim isperu dva puta sa Stain Buffer (BD Biosciences), fiksiraju korišćenjem 100(alBD Fixation buffer (#BD Biosciences, 554655) po bunarčiću, na 4 °C 20 min, resuspenduju u 120ulFACS pufera i analiziraju korišćenjem BD FACS CantoII. Slika 4 pokazuje srednji intenzitet fluorescencije za anti-BCMA IgG klonove, nanet na dijagram u funkciji koncentracije anti-BCMA antitela; (A) klonovi 17A5, 83A10 na H929 ćelijama, (B) klonovi 17A5, 83A10 na MKN45 ćelijama, (C) klon 13A4 na H929 ćelijama (D) klon 13A4 na MKN45 ćelijama. EC50 vrednosti (označava koncentraciju antitela potrebnu za 50% maksimalnog vezivanja) za vezivanje klonova 17A5, 83A10 za H929 ćelije sumirane su u Tabeli 9.

Primer5: 100 ng/ml, poželjno 1000 ng/ml APRIL ne menja vezivanje BCMA antitela za humani BCMA (protočna citometrija i ELISA)

[0184]

a) Identifikacija ne-APRIL-kompetirajućih anti-BCMA Fab ili antitela pomoću ELISA. Vezivanje Fab za imobilisani humani BCMA procenjuje se u prisustvu rastućih

koncentracija mišjeg APRIL. 25 nM biotinisani humani BCMA (100 ul/bunarčiću) nanese se na neutravidinsku ploču i inkubira na šejkeru, 1 h na sobnoj temperaturi.

Doda se 500 nM ili 1000 nM prečišćeno Fab da se zasiti obloga humanog BCMA, 1 h na sobnoj temperaturi. Ploča se ispere 3 puta sa PBS i doda se mišji APRIL u osam različitih koncentracija, uz korišćenje serije dvostrukih razblaženja u PBS puferu, od 0 do 100 nM, i vrši inkubiranje na šejkeru, 30 min. Ploča se ispere 3 puta sa PBS i doda se anti-FLAG-HRP sekundarno antitelo (1:4000), 1 h. Ponovo se ploča ispere 3 puta sa PBS i razvije dodavanjem 100 ul/bunarčiću BM Blue POD (Roche). Reakcija se zaustavlja dodavanjem 50 (al/bunarčiću 1 M H2SO4 i OD se očitava na 450 nm (referenca na 650 nm), za finalno očitavanje OD450.65o- Rezultati za odabrane Fab prikazani su na Slici 5. Redukcija (%) OD vrednosti izmerenih za anti-BCMA klonove u odsustvuvs.prisustvu 50 nM (1200 ng/ml) ili 6.25 nM (140 ng/ml) muAPRIL (mišji A-APRIL) sumirana je u Tabeli 10.

b) Kompeticija A-APRIL sa anti-BCMA antitelima detektovana je protočnom citometrijom. Procena eventualne kompeticije između A-APRIL i anti-BCMA antitela

vršena je na H929 ćelijama kvantifikovanjem vezivanja A-APRIL u prisustvu rastućih koncentracija anti-BCMA antitela (klonovi 17A5, 83A10, 13A4). Ukratko, kultivisane ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se podese na 1 x IO<6>ćelija po ml u BSA-sadržavajućem FACS Stain Buffer (BD Biosciences). 100 ul po bunarčiću ove ćelijske suspenzije alikvotira se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubira sa 30 ul anti-BCMA antitela ili odgovarajućeg kontrolnog IgG, 30 min na 4 °C. Sva anti-BCMA antitela (i izotipska kontrola) titruju se i analiziraju u finalnoj koncentraciji od 1, 16 i 40 ug/ml. Ćelije se zatim centrifuguraju (5 min, 350 x g), isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS Stain Buffer (BD Biosciences), resuspenduju i inkubiraju sa 1 ug/ml rekombinantnog mišjeg A-APRIL markiranog hemaglutininom (HA) (R&D Systems Europe, #7907-AP-010), dodatnih 30 min na 4

°C. Ćelije se zatim isperu jednom sa 120 ul/bunarčiću FACS pufera i inkubiraju sa FITC-konjugovanim anti-HA antitelom (Sigma Aldrich, #H7411) 30 min na 4 °C. Na kraju inkubacije, ćelije se isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS pufera, fiksiraju korišćenjem 100 ul BD Fixation buffer (#BD Biosciences, 554655) po bunarčiću na 4 °C, 20 min, resuspenduju u 80 ul FACS pufera i analiziraju korišćenjem BD FACS Fortessa. Slika 6 pokazuje relativnu medijanu detektovanog intenziteta fluorescencije A-APRIL (FITC signal) u funkciji rastućih koncentracija anti-BCMA antitela, klonovi 13A4, na H929 ćelijama. Medijana intenziteta fluorescencije po vezivanju A-APRIL u prisustvu izotipske kontrole podešena je na jedan; drugi signali su normalizovani u odnosu na to.

c) Kompeticija anti-BCMA antitela sa A-APRIL detektovana je protočnom citometrijom. Procena eventualne kompeticije između A-APRIL i anti-BCMA antitela

vršena je na RPMI ćelijama kvantifikovanjem vezivanja anti-BCMA antitela (klonovi 13A4, 17A5, 83A10) u prisustvu ili odsustvu A-APRIL. Ukratko, kultivisane ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se podese na 1 x IO<6>ćelija po ml u BSA-sadržavajućem FACS Stain Buffer (BD Biosciences). 100 ul ove ćelijske suspenzije po bunarčiću alikvotira se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubira sa 30 ul anti-BCMA antitela ili odgovarajućeg kontrolnog IgG, 20 min na 4 °C. Sva anti-BCMA antitela i izotipska kontrola analiziraju se u finalnoj koncentraciji od 40 ug/ml. Ćelije se zatim centrifuguraju (5 min, 350 x g), isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS Stain Buffer (BD Biosciences), resuspenduju i inkubiraju sa 1 ug/ml rekombinantnog mišjeg A-APRIL markiranog hemaglutininom (HA) (R&D Systems Europe, #7907-AP-010), dodatnih 40 min na 4 °C. Ćelije se zatim isperu jednom sa 120 ul/bunarčiću FACS puffera i inkubiraju sa Alexa.Fluor 647-konjugovanim anti-humanim Fc antitelom (Jackson Immuno Research Lab, #109-606-008), 30 min na 4 °C. Na kraju inkubacije, ćelije se isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS pufera, fiksiraju korišćenjem 100 ul BD Fixation buffer (#BD Biosciences, 554655) po bunarčiću, na 4 °C za 20 min, resuspenduju u 80 jal FACS pufera i analiziraju korišćenjem BD FACS Fortessa. Slika 7 pokazuje relativnu medijanu intenziteta fluorescencije anti-BCMA antitela (Alexa.Fluor 647 signal), klonovi 13A4, 17A5, 83A10 na RPM18226 ćelijama, detektovanog u odsustvu ili prisustvu 1000 ng/ml A-APRIL. Medijana intenziteta fluorescencije po vezivanju anti-BCMA antitela u

odsustvu A-APRIL podesi se na jedan; drugi signali respektivni prema anti-BCMA antitelu u prisustvu A-APRIL normalizuju se u odnosu na to. d) Kompeticija anti-BCMA antitela sa A-APRIL posle istovremene inkubacije detektovana je protočnom citometrijom. Procena eventualne kompeticije između A-APRIL i anti-BCMA antitela vrši se na H929 ćelijama (NCI-H929, ATCC<®>CRL-9068™), kvantifikovanjem vezivanja anti-BCMA antitela (klonovi 13A4, 17A5, 83A10) u prisustvu ili odsustvu A-APRIL. Ukratko, kultivisane ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se podese na 1 x IO<6>ćelija po ml u BSA-sadržavajućem FACS Stain Buffer (BD Biosciences). 100 (al ove ćelijske suspenzije po bunarčiću alikvotira se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubira sa 30 (al anti-BCMA antitela ili odgovarajućeg kontrolnog IgG i 30 (al A-APRIL markiranog hemaglutininom (HA) (R&D Svstems Europe, #7907-AP-010), 40 min na 4 °C. Sva anti-BCMA antitela i izotipska kontrola analiziraju se u finalnoj koncentraciji od 20 (ag/ml; A-APRIL u finalnoj koncentraciji 2.5 ug/ml. Ćelije se zatim centrifuguraju (5 min, 350 x g), isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS Stain Buffer (BD Biosciences). Posle toga, ćelije se inkubiraju sa Alexa.Fluor 647-konjugovanim anti-humanim Fc antitelom (Jackson Immuno Research Lab, #109-606-008) i FITC-konjugovanim anti-HA antitelom (Sigma Aldrich, #H7411), 30 min na 4 °C. Na kraju inkubacije, ćelije se isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS pufera, fiksiraju korišćenjem 100 ul BD Fixation buffer (#BD Biosciences, 554655), po bunarčiću, na 4 °C za 20 min, resuspenduju u 80 ul FACS pufera i analiziraju korišćenjem BD FACS CantoII. Slika 8A pokazuje srednji intenzitet fluorescencije i relativni fluorescentni signal klona anti-BCMA antitela (Alexa.Fluor 647 signal) i Slika 8B pokazuje srednji intenzitet fluorescencije i relativni fluorescentni signal A-APRIL (FITC signal) i klona anti-BCMA antitela (Alexa.Fluor 647 signal). Detekcija anti-BCMA antitela u prisustvu A-APRIL sa FITC-konjugovanim anti-humanim Fc antitelom normalizovana je u odnosu na signal klona anti-BCMA antitela u odsustvu A-APRIL. Detekcija A-APRIL u prisustvu klona anti-BCMA antitela sa Alexa.Fluor 647-konjugovanim anti-HA antitelom normalizovana je u odnosu na A-APRIL signal u prisustvu izotipske kontrole. Redukcija vezivanja anti-BCMA antitela (20 ug/ml), klonovi 13A4, 17A5 i 83A10 u prisustvu A-APRIL (2.5 (ag/ml) detektovana fluorohrom-konjugovanim anti-human Fc antitelom sumirana je u Tabeli 11.

Primer6: Anti-BCMA antitela sama ne indukuju aktivaciju NF-kB (test luminiscencije)

[0185] Procenjivano je da li vezivanje anti-BCMA antitela za BCMA-eksprimirajuće H929 ćelije indukuje aktivaciju NF-kB, poznatog signalnog puta nishodno od BCMA. Ukratko, H929 ćelije su gladovale u RPMI1640 sa 0.25% FCS, 24 h na 37 °C, u ćelijskom inkubatoru. Na kraju vremena gladovanja, ćelije se sakupe, broje i vijabilnost ćelija se procenjuje korišćenjem ViCell. Vijabilne ćelije se podese na 4 x 10<6>ćelija po ml u BSA-sadržavajućem FACS Stain Buffer (BD Biosciences). 30 (al ove ćelijske suspenzije po bunarčiću alikvotira se na ploči sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubira sa 30 ul anti-BCMA antitela pri 100 ili 350 nM (14 ili 50 |ag/ml), 20 min na 37 °C. Kao negativne kontrole, ćelije su ili ostavljene netretirane ili su inkubirane sa odgovarajućom IgG izotipskim kontrolnim antitelima, 100 nM (14 (ag/ml), 20 min na 37 °C. Kao pozitivne kontrole, ćelije su inkubirane sa 1 ug/ml rekombinantnog mišjeg A-APRIL markiranog hemaglutininom (HA) (R&D Systems Europe, #7907-AP-010), 20 min na 37 °C. Na kraju perioda inkubacije, ćelije se sakupe, isperu, liziraju i obrade prema protokolu proizvođača Nuclear Extract Kit (Active Motif, # 40410). Proteinski ekstrakti se analiziraju na NF-kB aktivnost korišćenjem TransAm<®>NF-kB p65 Chemi Assay kita (Active Motif, #40097) po uputstvima proizvođača. Luminiscentni signal se očitava korišćenjem Spectra Max M5 luminometra (Molecular Devices). Kako je prikazano na Slici 9, 4.2-struki porast luminiscentnog signala dostiže se kada se H929 ćelije izlože APRIL 1 ug/ml u poređenju sa samim H929 ćelijama. Minimalni pozadinski luminiscentni signali zapaženi su sa samim H929 ćelijama ili u prisustvu izotipskih kontrolnih antitela i on se može objasniti bazalnom aktivacijom NF-kB zapaženom u ćelijskim linijama multiplog mijeloma, kako je ranije saopšteno (Demchenkoet al,Blood 2010; 115 (17):3541-3552). Dodavanje samog anti-BCMA antitela (17A5, 83A10) nije dodatno indukovalo NF-kB aktivaciju u poređenju sa respektivnim izotipskim kontrolnim antitelima. Rezultat sugeriše da anti-BCMA antitela ne indukuju aktivaciju NF-kB posle vezivanja za BCMA-pozitivne ćelije.

Primer 7: Generisanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela Primer 7.1: Anti-CD3 antitela

[0186] Izraz "CD3s ili CD3", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na humani CD3s opisan pod UniProt P07766 (CD3E HUMAN). Izraz "antitelo protiv CD3, anti CD3 antitelo" odnosi se na antitelo koje se vezuje za CD3e. Poželjno antitelo sadrži varijabilni domen VH koji uključuje teškolačane CDR SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao respektivne teškolančane CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni domen VL koji uključuje lakolančane CDR SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao respektivne lakolančane CDR1, CDR2 i CDR3. Poželjno, antitelo sadrži varijabilne domene SEQ ID NO:7 (VH) i SEQ ID NO:8

(VL).

[0187] Anti-CD3 antitelo kao što je gore opisano koristi se za generisanje T-ćelijskih bispecifičnih antitela koja se koriste u sledećim primerima.

Primer 7.2: Generisanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela Fc-sadržavajućeg 2+1 formata

[0188] cDNK koje kodiraju cele teške i lake lance odgovarajućih anti-BCMA IgGl antitela, kao i anti-CD3 VH i VL cDNK, upotrebljavaju se kao polazni materijali. Za svako bispecifično antitelo, uključena su četiri proteinska lanca koja sadrže teške i lake lance odgovarajućeg anti-BCMA antitela i teške i lake lance anti-CD3 antitela opisanog gore, respektivno. Da bi se minimiziralo formiranje sporednih proizvoda sa pogrešno sparenim teškim lancima, na primer sporednih proizvoda sa dva teška lanca anti-CD3 antitela, koriste se mutirani heterodimerni Fc regioni koji nose mutacije "knobs-into-holes" i inženjerisanu disulfidnu vezu, kako je opisano u WO2009080251 i u WO2009080252. Da bi se minimiziralo formiranje sporednih proizvoda sa pogrešno sparenim lakim lancima, na primer sporednih proizvoda sa dva laka lanca anti-BCMA antitela, CH1 x konstantni kapa "crossover" primenjuje se na teške i lake lance anti-CD3 antitela, uz korišćenje metodologije opisane u WO2009080251 i u WO2009080252.

a) Anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijsko bispecifično antitelo sa formatom 2+1 tj. bispecifično (Fab)2x (Fab) antitelo koje je bivalentno za BCMA i monovalentno

za CD3 imalo bi prednost u snazi, prediktabilnosti efikasnosti i u bezbednosti jer se preferentno vezuje za tumorski cilj BCMA uz izbegavanje "odlivanja" antitela na CD3, čime se povećava verovatnoća da će se lek fokusirati na tumor.

Proizveden je anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijski bispecifik 2+1 formata, tj.

bispecifično (Fab)2x (Fab) antitelo bivalentno za BCMA i monovalentno za CD3, sa Fc, za prethodno odabrana humana BCMA antitela. cDNK koje kodiraju cele Fab (teškolačane VH i CH1 domene plus lakolančane VL i CL domene) odgovarajućih anti-BCMA IgGl antitela, kao i anti-CD3 VH i VL cDNK, korišćene su kao polazni materijali. Za svako bispecifično antitelo, uključena su četiri proteinska lanca koja sadrže teške i lake lance odgovarajućeg anti-BCMA antitela i teške i lake lance anti-CD3 antitela opisanih gore, respektivno, sa Fc regionima.

Ukratko, svako bispecifično antitelo proizvodi se simultanom kotransfekcijom četiri sisarska ekspresiona vektora koji kodiraju, respektivno a) celu lakolančanu cDNK odgovarajućeg BCMA antitela, b) fuzionu cDNK generisanu standardnim molekularno-biološkim metodima, kao što je splajsovanje prekrivajućim nukleotidima-PCR, koja kodira fuzioni protein sačinjen od (redom od N- do C-terminusa) sekretorne liderske sekvence, Fab (domeni VH praćen CH1) odgovarajućeg anti-BCMA antitela opisanog gore, fleksibilnog glicin(Gly)-serin(Ser) linkera sa sekvencom Gly-Gly- Gly- Gly-Ser-Gly-Gly- Gly- Gly-Ser, Fab (VH domen praćen CH1 domenom) odgovarajućeg anti-BCMA antitela

opisanog gore, fleksibilnog glicin(Gly)-serin(Ser) linkera sa sekvencom Gly-Gly- Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, VH anti-CD3 antitela opisanog gore i

konstantnog kapa domena humanog lakog lanca, c) fuzionu cDNK generisanu standardnim molekularno-biološkim metodima, kao što je splajsovanje

prekrivajućim nukleotidima-PCR, koja kodira fuzioni protein sačinjen od (redom od N- do C-terminusa) sekretorne liderske sekvence, VL anti-CD3 antitela opisanog gore, konstantnog CH1 domena humanog IgGl. Kotransfekcija sisarskih ćelija i proizvodnja i prečišćavanje antitela koriste gore opisane metode proizvodnje humanih ili humanizovanih IgGl antitela sa jednom modifikacijom: za prečišćavanje antitela, prvi korak zadržavanja ne obavlja se korišćenjem proteina A, nego korišćenjem kolone za afinitetnu hromatografiju pakovane smolom koja se vezuje za humani kapa lakolančani konstantni region, npr. KappaSelect (GE Healthcare Life Sciences). Pored toga, može se uključiti za

povećanje stabilnosti i prinosa, kao i dodatne rezidue koje formiraju jonske ostove i pojačavaju heterodimerizacioni prinos (EP 1870459A1).

b) Za generisanje vektora za BCMAxCD3 bispecifično antitelo, bispecifični molekuli izvedeni iz IgGl sastoje se od najmanje dve antigen-vezujuće

komponente koje mogu da se specifično vezuju za dve različite antigenske determinante, CD3 i BCMA. Antigen-vezujuće komponente su Fab fragmenti sastavljeni od teškog lanca i lakog lanca, svaki sadrži varijabilni i konstantni region. Najmanje jedan od Fab fragmenata je "Crossfab" fragment, pri čemu su konstantni domeni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni. Razmena konstantnih domena teškog i lakog lanca unutar Fab fragmenta osigurava da Fab fragmenti različite specifičnosti nemaju identične domenske aranžmane i prema tome ne razmenjuju lake lance. Dizajn bispecifičnog molekula bio je monovalentan za CD3 i bivalentna za BCMA, gde je jedan Fab fragment fuzionisan sa N-terminusom unutrašnjeg CrossFab (2+1). Bispecifični molekul sadržao je Fc deo

da bi imao duži poluživot. Sematski prikaz konstrukata dat je na Slici 2; sekvence poželjnih konstrukata prikazane su u SEQ ID NO 41 i 43 do 52. Molekuli su proizvedeni kotransfektovanjem HEK293 EBNA ćelija gajenih u suspenziji, sisarskim ekspresionim vektorima uz korišćenje transfekcije na bazi polimera. Za pripremanje 2+1 CrossFab-IgG konstrukata, ćelije se transfektuju odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 ("vektor Fc(izbočina)" : "vektor laki lanac" : "vektor laki lanac CrossFab" : "vektor teški lanac-CrossFab").

Primer7.3: Generisanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za komparaciju

[0189] Generisanje APRIL- i BAFF-blokirajućih J6M0-TCBcv i BCMA50-sc(Fv)2(poznat i kao BCMA50- BiTE<®>) anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela i upotrebljenih aminokiselinskih sekvenci obavljeno je prema WO2012163805 odnosno WO2013072406/WO2013072415.

Primer 8: Proizvodnja i prečišćavanje anti-BCMA/anti-CD3 Fc-sadržavajućih (2+1) T-ćelijskih bispecifičnih antitela sa ili bez varijanti naelektrisanja

[0190] Za proizvodnju bispecifičnih antitela, bispecifična antitela se eksprimiraju prolaznom kotransfekcijom respektivnih sisarskih ekspresionih vektora u HEK293-EBNA ćelije koje se kultivišu u suspenziji, korišćenjem transfekcije na bazi polimera. Jedan dan pre transfekcije, HEK293-EBNA ćelije se zaseju u količini od 1.5 Mio vijabilnih ćelija/ml u Ex-Cell medijumu dopunjenom sa 6 mM L-glutaminom. Za svaki ml zapremine finalnog proizvoda centrifugira se zapremina od 2.0 Mio vijabilnih ćelija (5 minuta na 210 x g). Supernatant se aspirira i ćelije resuspenduju u 100 (al CD CHO medijuma. DNK za svaki ml finalne proizvodne zapremine priprema se mešanjem 1 ug DNK (odnos teški lanac:modifikovan teški lanac:laki lanac:modifikovani laki lanac = 1:1:2:1) u 100 ul CD CHO medijuma. Posle dodavanja 0.27 (al rastvora na bazi polimera (1 mg/ml) mešavina se vorteksuje 15 sekundi i ostavi na sobnoj temperaturi 10 minuta. Posle 10 minuta, resuspendovane ćelije i mešavna DNK/rastvor na bazi polimera se spoje i zatim prenesu u odgovarajući kontejner koji se stavi na uređaj za protresanje (37°C, 5% C02). Posle 3 sata inkubacije 800 ul Ex-Cell Medium, dopunjenog sa 6 mM L-glutaminom, 1.25 mM valproinskom kiselinom i 12.5% Pepsoy (50 g/l), doda se za svaki ml zapremine finalnog proizvoda. Posle 24 sata, na svaki ml zapremine finalnog proizvoda doda se 70 (al Feed rastvora. Posle 7 dana ili kada vijabilnost ćelija bude jednaka ili niža od 70%, ćelije se odvoje od supernatanta centrifugiranjem i sterilnom filtracijom. Antitela se prečiste afinitetnim korakom i jednim ili dva koraka poliranja, koji su katjonsko-izmenjivačka hromatografija i ekskluziona hromatografija zasnovana na veličini. Po potrebi, koristi se dodatni korak poliranja.

[0191]Za afinitetni korak supernatant se nanese na kolonu sa proteinom A (HiTrap Protein A FF, 5 ml, GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 6 CV 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata, pH 7.5. Posle koraka ispiranja istim puferom, antitelo se eluira sa kolone korakom eluiranja sa 20 mM natrijum-fosfatom, 100 mM natrijum-hloridom, 100 mM glicinom, pH 3.0. Frakcije sa željenim antitelom se odmah neutrališu 0.5 M natrijum-fosfatom, pH 8.0 (1:10), sakupe i koncentruju centrifugiranjem. Koncentrat se sterilno filtrira i dalje obrađuje katjonsko-izmenjivačkom hromatografijom i/ili ekskluzionom hromatografijom zasnovanom na veličini.

[0192]Za korak katjonsko-izmenjivačke hromatografije, koncentrovani protein se razblaži u odnosu 1:10 puferom za eluiranje korišćenim za afinitetni korak i nanese na katjonsko-izmenjivačku kolonu (Poros 50 HS, Applied Biosvstems). Posle dva koraka ispiranja ekvilibrišućim puferom i ispirajućim puferom, respektivno, 20 mM natrijum-fosfat, 20 mM natrijum-citrat, 20 mM TRIS, pH 5.0 i 20 mM natrijum-fosfat, 20 mM natrijum-citrat, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum-hlorid pH 5.0, protein se eluira gradijentom uz korišćenje 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum-hlorida, pH 8.5. Frakcije sa željenim antitelom se sakupe, koncentruju centrifugiranjem, sterilno filtriraju i dalje sprovode korakom ekskluzione hromatografije zasnovane na veličini.

[0193]Za korak ekskluzione hromatografije zasnovane na veličini, koncentrovani protein se injektira na XK16/60 HiLoad Superdex 200 kolonu (GE Healthcare), uz 20 mM histidin, 140 mM natrijum-hlorid, pH 6.0 sa ili bez Tween20 kao formulacionog pufera. Frakcije koje sadrže monomere se sakupe, koncentruju centrifugiranjem i sterilno filtriraju u sterilne fiole.

[0194]Određivanje koncentracije antitela obavlja se merenjem apsorpcije na 280 nm, korišćenjem teorijske vrednosti apsorpcije 0.1% rastvora antitela. Ova vrednost bazirana je na aminokiselinskoj sekvenci i izračunata pomoću GPMAW softvera (Lighthouse data).

[0195]Čistoća i sadržaj monomera finalnog proteinskog preparata određuju se CE-SDS (Caliper LabChip GXI1 sistemom (Caliper Life Sciences)) resp. HPLC (TSKgel G3000 SW XL analitičkom kolonom za ekskluzionu hromatografiju (Tosoh)) u puferu koji se sastoji od 25 mM kalijum-fosfata, 125 mM natrijum-hlorida, 200 mM L-arginin-monohidrohlorida, 0.02% (w/v) natrijum-azida, pH 6.7.

[0196] Da bi se proverila težina finalnih proteinskih preparata i potvrdila homogena priprema molekula finalnog proteinskog rastvora, koristi se metod tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Prvo se izvrši korak deglikozilacije. Da bi se uklonila heterogenost uvedena ugljenim hidratima, konstrukti se tretiraju sa PNGaseF (ProZvme). Dakle, pH proteinskog rastvora podesi se na pH 7.0 dodavanjem 2 (al 2 M Tris u 20 ug proteina sa koncentracijom od 0.5 mg/ml. Doda se 0.8 ug PNGaseF i inkubira 12 h na 37 °C. Zatim se vrši LC-MS online detekcija. LC-MS metod se izvodi na Agilent HPLC 1200 sistemu povezanom sa TOF 6441 masenim spektrometrom (Agilent). Hromatografska separacija se obavlja na Macherev Nagel Polystyrene koloni; RP1000-8 (8 um veličina čestica, 4.6 x 250 mm; kat. br. 719510). Eluent A je 5% acetonitril i 0.05% (v/v) mravlja kiselina u vodi, eluent B je 95% acetonitril, 5% voda i 0.05% mravlja kiselina. Stopa protoka je 1 ml/min, separacija se obavlja na 40 °C i 6 ug (15 ul) proteinskog uzorka, dobij enog tretmanom kako je ranije opisano.

[0197]Tokom prva 4 minuta eluat se usmerava u otpad da bi se maseni spektrometar zaštitio od kontaminacije solju. ESI-izvor se pušta, uz protok sušećeg gasa od 12 l/min, temperaturu od 350 °C i nebulizerski pritisak 60 psi. MS spektri se dobijaju korišćenjem fragmentorske voltaže od 380 V i masenog opsega 700 do 3200 m/z uz korišćenje pozitivnog jonskog moda. MS podaci se sakupljaju softverom instrumenta, od 4. do 17. minuta.

[0198]Slika 10 prikazuje CE-SDS (neredukujući uslovi) grafikone finalnih proteinskih preparata posle različitih metoda prečišćavanja, za 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela. Koraci prečišćavanja protein A (PA)-afinitetnom hromatografijom i hromatografijom baziranom na veličini (SEC), primenjeni na 83A10-TCB antitelo rezultovali su čistoćom od <30% i sadržajem monomera 82.8% (A). Kada se na finalne proteinske preparate u (A) primene dodatni koraci prečišćavanja, uključujući katjonsko-izmenjivačku hromatografrju (cIEX) i finalnu ekskluzionu hromatografiju zasnovanu na veličini (re-SEC), čistoća se poveća do 93.4%, ali sadržaj monomera ostaje isti i prinos se značajno smanjuje do 0.42 mg/l.

[0199]Međutim kada se naprave specifične modifikacije naelektrisanja kod 83A10 anti-BCMA Fab CL-CH1, tj. 83A10-TCBcv antitela, zapaža se superiorni profil proizvodnje/prečišćavanja TCB molekula, što se manifestuje čistoćom od 95.3%, sadržajem monomera od 100% i prinosom do 3.3 mg/l, čak i kada se primenjuju PA + cIEX + SEC koraci preččišćavanja (C), u poređenju sa (B) sa profilom proizvodnje/prečišćavanja koji pokazuje 7.9 puta niži prinos i 17.2% niži sadržaj monomera uprkos tome što se uključuje dodatni korak prečišćavanja re-SEC.

[0200]Zatim se vrši uporedna proizvodnja da bi se direktno uporedili profili proizvodnje/prečišćavanja 83A10-TCB i dodatno evaluirale prednosti CL-CH1 uvođenja modifikacija naelektrisanja antitela. 83A10-TCB i 83A10-TCBcv molekuli su, oba, u molekularnom formatu opisanom na Slici 2a. Kako je prikazano na Slici 11, osobine 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela merene su paralelno i upoređivane posle svakog koraka prečišćavanja 1) samo PA afinitetna hromatografija (A, B), 2) PA afinitetna hromatografija, zatim SEC (C, D) i 3) PA afinitetna hromatografija, zatim SEC, zatim cIEX i re-SEC (E, F). CE-SDS (neredukujući uslovi) grafikoni finalnih proteinskih rastvora posle respektivnih metoda prečišćavanja za 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela pokazani su na Slici 11. Kao što je pokazano na Slikama 11A i 11B, poboljšanja sa primenom varijanti naelektrisanja kod TCB antitela zapažena su već posle prečišćavanja samo PA afinitetnom hromatografijom. U ovoj uporednoj studiji, korak prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom primenjen na 83A10-TCB antitelo za rezultat je imao čistoću od 61.3%, prinos od 26.2 mg/l i sadržaj monomera 63.7%

(11A). U poređenju sa tim, kada je 83A10-TCBcv antitelo prečišćavano PA afinitetnom hromatografijom sve osobine su poboljšane, uz bolju čistoću od 81.0%, bolji prinos od 51.5 mg/l i sadržaj monomera 68.2%> (11B). Kada se primeni dodatni korak prečišćavanja SEC na finalne proteinske preparate, kako se vidi na Slikama 12A i 12B, 83A10-TCB dostiže čistoću od 69.5%, prinos 14.1 mg/l i sadržaj monomera 74.7% (C) u poređenju sa 83A10-TCBcv sa poboljšanom čistoćom i sadržajem monomera za do 91.0% odnosno 83.9%) i prinosom od 10.3 mg/l (D). Čak i uz malo manji prinos (tj. 27% manji) za 83A10-TCBcv nego za 83A10-TCB u ovom posebnom eksperimentu, procenat ispravnih molekula je mnogo bolji za 83A10-TCBcv nego za 83A10- TCB, respektivno 90%>vs.40-60%>, mereno LC-MS. U trećem direktnom poređenju, 83A10-TCB i 3A10-TCBcv finalni proteinski preparati sa Slika 11C i 11D pulovani su sa približno 1 1 (ekvivolumen) respektivnih finalnih proteinskih preparata iz druge serije prečišćavanja (ista proizvodnja) posle koraka samo PA afinitetne hormatografije. Pulovani proteinski preparati su zatim prečišćavani cIEX i SEC metodima prečišćavanja. Kao što je pokazano na Slikama 11E i 11F, poboljšanje profila proizvodnje/prečišćavanja TCB antitela sa varijantama naelektrisanja zapaža se konzistentno, u poređenju sa TCB antitelom bez varijante naelektrisanja. Posle nekoliko koraka metoda prečišćavanja (tj. PA +/- SEC + cIEX + SEC) upotrebljenih za prečišćavanje 83A10-TCB antitela, postignuta je čistoća od samo samo 43.1%, i može se dostići sadržaja monomera 98.3%, ali uz smanjeni prinos koji je iznosio 0.43 mg/l. Procenat ispravnih molekula izmeren LC-MS i dalje je bio mali, 60-70%. Na kraju, kvalitet finalnog proteinskog preparata nije bio prihvatljiv zain vitroupotrebu. U oštroj suprotnosti sa tim, kada su isti višestruki koraci prečišćavanja, sa istom hronologijom, primenjeni na 83A10-TCBcv antitelo, dostiže se čistoća od 96.2%> i sadržaj monomera 98.9%o, kao i 95%> ispravnih molekula, mereno LC-MS. Prinos je međutim takođe veoma redukovan, na 0.64 mg/l posle cIEX koraka prečišćavanja. Rezultati pokazuju da bolja čistoća, veći sadržaj monomera, veći procenat ispravnih molekula i bolji prinos mogu da se postignu sa 83A10-TCBcv antitelom posle samo dva standardna koraka prečišćavanja tj. PA afinitetne hromatografije i SEC (Slika UD), dok takve osobine ne mogu da se dostignu sa 83A10-TCB čak ni kada se primene dodatni koraci prečišćavanja (Slika 11E).

[0201] Tabela 12 sumira osobine 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv posle PA koraka prečišćavanja. Tabela 13 sumira osobine 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv posle PA i SEC koraka prečišćavanja. Tabela 14 sumira osobine 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv posle PA i SEC plus samo PA, zatim cIEX i re-SEC koraka prečišćavanja. Za Tabele 12 do 14, zamašćene vrednosti naglašavaju superirona svojstva pri poređenju 83A10-TCBvs.83A10-TCVcv. Sa jednim izuzetkom (tj. respektivne vrednosti prinosa, vidi Tabelu 13) koji ne mora biti reprezentativan, svi parametri i vrednosti proizvodnje/prečišćavanja koji su rezultat 3 eksperimenta direktnog poređenja superiorni su za 83A10-TCBcv u odnosu na 83A10-TCB. Ukupni rezultati jasno pokazuju da prednosti u osobinama proizvodnje/prečišćavanja mogu da se postignu ako se CL-CH1 modifikacija naelektrisanja primene na TCB antitela i da su samo dva koraka prečišćavanja (tj PA afinitetna hromatografija i SEC) potrebna za dobijanje visokokvalitetnih proteinskih preparata sa veoma dobrim osobinama koje omogućavaju dalji razvoj.

Primer 9: Stabilnost (agregacija/fragmentacija) anti-BCMA/anti-CD3 TCB

antitela u formulacionom puferu

[0202]Da bi se anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela procenila i uporedila sa BCMAxCD3 (scFV)2formatom bispecifičnih antitela u pogledu stabilnosti prema agregacij i/fragmentaciji, uzorci se inkubiraju 10 dana, poželjno 2 do 4 nedelje na 37-40 °C u standardnom formulacionom puferu (npr. 20 mM citrat, 180 mM saharoza, 20 mM arginin, 0.02% polisorbat 20 ili npr. 20 mM histidin, 140 mM NaCl, 0.01% Tween20, pH 6.0) pri koncentraciji proteina od približno 1 mg/ml. Respektivni kontrolni uzorak uskladišti se 2-4 nedelje na -80 °C.

[0203]Ekskluziona hromatografija zasnovana na veličini, za kvantifikovanje agregata i vrsta niske molekulske težine (low-molecular weight, LMW), obavlja se pomoću HPLC. Količina od 25 ug proteina nanese se na Tosoh TSKgel G3000SWXL kolonu u 5 mM K2HP04, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin-monohidrohloridu, 0.02% (w/v) NaN3, pH 6.7, na Agilent 1200 HPLC sistemu (Agilent). Eluirani protein se kvantifikuje UV apsorpcijom na 280 nm.

Primer 10: Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za rekombinantne ćelije koje na svojoj površini eksprimiraju humani, cinomolgusov ili mišji BCMA (protočna citometrija)

[0204]

a) Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela pokazano je na HEK ćelijama koje prolazno eksprimiraju mišji BCMA (muBCMA-HEK) ili cinomolgusov

BCMA (cyBCMA-HEK), protočnom citometrijom. Ukratko, BCMA-eksprimirajuće HEK ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz

korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se zatim podese na 2 x IO<6>ćelija po ml u BSA- sadržavajućem FACS Stain Buffer (BD Biosciences). 100 ul ove ćelijske suspenzije po bunarčiću alikvotira se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubira sa 30 ul anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ili odgovarajućeg

kontrolnog TCB antitela, 30 min na 4 °C. Sva anti-BCMA7anti-CD3 TCB antitela titruju se i analiziraju u finalnoj koncentraciji u opsegu od 2-300 nM. Ćelije se zatim centrifuguraju (5 min, 350 x g), isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS Stain Buffer (BD Biosciences), resuspenduju i inkubiraju dodatnih 30 min na 4 °C sa fluorohrom-konjugovanim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab')2-fragment kozjim anti-humanim IgG, Fc-fragment specifičnim antitelom (Jackson Immuno

Research Lab; 109-116-170). Ćelije se zatim isperu dva puta sa Stain Buffer (BD Biosciences), fiksiraju korišćenjem 100 ul BD Fixation buffer (#BD Biosciences, 554655) po bunarčiću, na 4 °C 20 min, resuspenduju u 120 ul FACS pufera i analiziraju korišćenjem BD FACS Cantoll. Kako je pokazano na Slici 12, 83A10- TCB vezuje se za HEK ćelije koje prolazno eksprimiraju mišji BCMA

(A) i BCMA majmuna cinomolgusa (B), na specifičan i koncentraciono zavisan način, kako je izmereno povećanjem medijane intenziteta fluorescencije. Kao

negativno kontrolno TCB antitelo, DP47-TCB ne vezuje se za muBCMA-HEK ćelije i cyBCMA-HEK ćelije. Iste vezujuće osobine kao što su zapažene kod 83A10-TCB očekuju se i za 83A10-TCBcv jer su VL i VH CDR identični kod ova dva molekula (vidi Primer 19). b) Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela pokazano je i na CHO ćelijama koje stabilno eksprimiraju mišji BCMA, cinomolgusov BCMA ili BCMA,

protočnom citometrijom. Ukratko, BCMA-eksprimirajuće HEK ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se zatim podese na 2 x IO<6>ćelija po ml u BSA-sadržavajućem FACS Stain Buffer (BD Biosciences). 100 ul ove ćelijske suspenzije po bunarčiću alikvotira se na ploči sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubira sa 30 (al anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ili odgovarajućeg TCB kontrolnog antitela, 30 min na 4 °C. Sva anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i TCB kontrolno antitelo titruju se i analiziraju u finalnoj koncentraciji u opsegu od 2-300 nM. Ćelije se zatim centrifuguraju (5 min, 350 x g), isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS Stain Buffer (BD Biosciences), resuspenduju i inkubiraju dodatnih 30 min na 4 °C sa fluorohrom-konjugovanim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab')2-fragment kozjim anti-humanim IgG, Fc-fragment specifičnim antitelom (Jackson Immuno

Research Lab; 109-116-170). Ćelije se zatim isperu dva puta sa Stain Buffer (BD Biosciences), fiksiraju korišćenjem 100 ul BD Fixation buffer (#BD Biosciences, 554655) po bunarčiću, na 4 °C 20 min, resuspenduju u 120 (al FACS pufera i analiziraju korišćenjem BD FACS CantoII.

c) Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za rekombinantne ćelije koje stabilno eksprimiraju humani BCMA ili BCMA

majmuna cinomolgusa na svojoj površini, mereno protočnom citometrijom.

Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela pokazano je na HEK293T ćelijskoj liniji koja stabilno eksprimira humani BCMA (huBCMA-HEK293T) ili cinomolgusov BCMA (cynoBCMA-HEK293T), protočnom citometrijom. Nivoi ekspresije humanog BCMA i cinomolgusovog BCMA na površini ćelije bili su slični što je potvrđeno unutarćelijskom ekspresijom FLAG. Ukratko, BCMA-eksprimirajuće HEK293T ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se zatim podese na 2 x IO<6>ćelija po ml u BSA-sadržavajućem FACS Stain Buffer (BD Biosciences). 100 ul ove ćelijske

suspenzije po bunarčiću alikvotira se na ploče sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubira sa 30 ul anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ili odgovarajućeg TCB

kontrolnog anitiela, 30 min na 4 °C. Sva anti-BCMA/ anti-CD3 TCB antitela i

TCB kontrolno antitelo titruju se i analiziraju u finalnoj koncentraciji u opsegu od 2-300 nM. Ćelije se zatim centrifuguraju (5 min, 350 x g), isperu sa 120

ul/bunarčiću FACS Stain Buffer (BD Biosciences), resuspenduju i inkubiraju dodatnih 30 min na 4 °C sa fluorohrom-konjugovanim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab'^-fragment kozjim anti-humanim IgG, Fc-fragment specifičnim antitelom (Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170). Ćelije se zatim isperu dva puta sa Stain Buffer (BD Biosciences), fiksiraju korišćenjem 100 ul BD Fixation buffer (#BD Biosciences, 554655) po bunarčiću, na 4 °C 20 min,

resuspenduju u 120 ul FACS pufera i analiziraju korišćenjem BD FACS CantoII. Meri se EC50 vrednost vezivanja 83A10-TCBcv za huBCMA-HEK293T ćelije i cynoBCMA-HEK293T ćelije (Tabela 14A).

Primer 11:Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za BCMA-pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma (protočna citometrija)

[0205] Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (13A4-TCBcv, 17A5-TCBcv, 83A10-TCBcv) analizirana su protočnom citometrijom u pogledu vezivanja za humani BCMA na BCMA-eksprimirajućim H929 i L363 ćelijama. MKN45 (ćelijska linija humanog želudačnog adenokarcinoma koja ne eksprimira BCMA) korišćena je kao negativna kontrola. Ukratko, kultivisane ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se podese na 2 x IO<6>ćelija po ml u BSA-sadržavajućem FACS Stain Buffer (BD Biosciences). 100 ul ove ćelijske suspenzije po bunarčiću alikvotira se na ploči sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubira sa 30 ul anti-BCMA antitela ili odgovarajućeg kontrolnog IgG, 30 min na 4 °C. Sva anti-BCMA/anti-CD3 TCB antibodies (i TCB kontrole) titruju se i analiziraju u finalnoj koncentraciji u opsegu od 1-300 nM. Ćelije se zatim centrifuguraju (5 min, 350 x g), isperu sa 120 ul/bunarčiću FACS Stain Buffer (BD Biosciences), resuspenduju i inkubiraju dodatnih 30 min na 4 °C sa fluorohrom-konjugovanim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab'^-fragment kozjim anti-humanim IgG, Fc-fragment specifičnim antitelom (Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170). Ćelije se zatim isperu dva puta sa Stain Buffer (BD Biosciences), fiksiraju korišćenjem 100 jal BD Fixation buffer (#BD Biosciences, 554655) po bunarčiću, na 4 °C 20 min, resuspenduju u 120 ul FACS pufera i analiziraju korišćenjem BD FACS CantoII. Kako se vidi na Slici 13, srednji intenzitet fluorescencije anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela nanet je na dijagram u funkciji koncentracija antitela; (A) 83A10-TCBcv na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama,

(B) 17A5-TCBcv na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama, (C) 13A4-TCBcv na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama. Kada je moguće, EC50 se izračunava korišćenjem Prism

GraphPad (LaJolla, CA, USA) i EC50 vrednosti koje označavaju koncentraciju antitela potrebnu da se postigne 50% maksimalnog vezivanja anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela za H929 ćelije sumirane su u Tabeli 15. Tabela 15A prikazuje EC50 vrednosti za vezivanje 83A10-TCBcv za L363 MM ćelije.

Primer 12:Vezivanjeanti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitelaza

CD3-pozitivnu Jurkat T-ćelijsku liniju (protočna citometrija)

[0206]Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (13A4-TCBcv, 17A5-TCBcv, 83A10-TCBcv) analizirana su protočnom citometrijom u pogledu svoje sposobnosti da se vezuju za humani CD3 eksprimiran na humanim leukemijskim T-ćelijama Jurkat (ATCC TIB-152). Jurkat T-ćelije se kultivišu u RPMI koji je dopunjen 10% toplotom inaktiviranim FCS. Ukratko, kultivisane ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se podese na 2 x IO<6>ćelija po ml u FACS Stain Buffer (BD Biosciences) koji sadrži 0.1% BSA. 100 ul ove ćelijske suspenzije po bunarčiću alikvotira se na ploči sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom. 30 jal anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ili odgovarajućeg kontrolnog IgG doda se u bunarčiće koji sadrže ćelije da se dobije finalne koncentracije od 3 nM do 500 nM ili 0.1 pM do 200 nM. Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i kontrolno IgG koriste se u istom molaritetu. Posle inkubacije 30 min na 4 °C, ćelije se centrifuguraju (5 min, 350 x g), isperu dva puta sa 150 ul/bunarčiću BSA-sadržavajućeg FACS Stain Buffer (BD Biosciences), zatim se ćelije fiksiraju korišćenjem 100 ul BD Fixation buffer (#BD Biosciences, 554655) po bunarčiću, na 4°C 20 min, resuspenduju u 120 ul FACS pufera i analiziraju korišćenjem BD FACS Cantoll. Evaluira se vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela za T-ćelije i medijana intenziteta fluorescencije se određuje odabirom CD3-eksprimirajućih Jurkat T ćelija i nanošenjem na histograme ili tačkaste dijagrame. Slika 14 pokazuje medijanu intenziteta fluorescencije za vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (83A10-TCBcv (A); 17A5-TCBcv (B)) za Jurkat T-ćelije prikazano u funkciji koncentracije antitela. EC50 vrednosti i maksimalno vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela za CD3-pozitivne Jurkat T-ćelije se ne dostižu. Izotipsko kontrolno antitelo ne vezuje se za Jurkat T-ćelije, i BCMA/anti-CD3 TCB antitela ((A), 83A10-TCBcv); (B) 17A5-TCBcv) ne vezuju se za BCMA-negativne i CD3-negativne MKN45 ćelije.

Primer 13: Anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijska bispecifična antitela ne blokiraju APRIL-zavisnu aktivaciju NF-kB, kako je detektovano unutarćelijskim fosforilisanim NF-kB (protočna citometrija)

[0207] Da bi se testiralo da li anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela blokiraju ili dodatno indukuju APRIL-zavisnu aktivacijut NF-kB, detekcija unutarćelijskog fosforilisanog NF-kB merena je protočnom citometrijom, kako je opisano u Lafargeet al.BMC Molecular Biol 2007; 8:64. Metod fosfoprotočne citometrije je alternativa detektovanju aktivacije NF-kB pomoću testa luminiscencije baziranog na ELISA, koji može da bude nedovoljno osetljiv i sadrži zahtevne korake (Perez and Nolan. Nat Biotechnol 2002; 20(2): 155-62). Procenjivano je da li vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela za BCMA-pozitivne H929 ćelije mijeloma blokira ili dodatno indukuje APRIL-zavisnu aktivaciju NF-kB, poznatog nukleusnog faktora u signalnim putevima nishodno od BCMA receptora. Ukratko, H929 ćelije se izgladnjuju u RPMI1640 bez FCS, 24 h, na 37°C u ćelijskom inkubatoru. Na kraju perioda izgladnjivanja, ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se podese na 1 x IO<6>ćelija po ml u FACS Stain Buffer (BD Biosciences) koji sadrži BSA. Po 100 jal ove ćelijske suspenzije se alikvotira u bunarčiće na ploči sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i vrši se inkubacija sa 25 (al anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ili izotipskih kontrolnih antitela pri zasićujućoj koncentraciji od 400 nM (77 (ag/ml), 20 min na 37°C, praćeno direktnom inkubacijom 100 ng/ml ili 1 (ag/ml rekombinantnog mišjeg A-APRIL (R&D Svstems Europe) dodatnih 15 min na 37 °C. Kao negativne kontrole, ćelije se ili ostave netretirane ili inkubiraju sa odgovarajućim IgG izotipskim kontrolnim antitelima, 400 nM (77 ug/ml), ukupno 45 min na 37°C. Kao pozitivne kontrole, ćelije se inkubiraju sa 100 ng/ml ili 1 (ag/ml samo rekombinantnog mišjeg A-APRIL (R&D Svstems Europe), 15 min na 37°C. Na kraju stimulacije, ćelije se centrifugiraju (360 x g, 4 min), ćelijski pelet se odmah fiksira u prethodno zagrejanom Cytofix Buffer (BD Biosciences, #554655) i inkubiraju na 37°C, 10 minuta. Ćelije se zatim centrifugiraju, supernatant se ukloni i ćelijski pelet se razbije vorteksom. Ćelije se zatim permeabilizuju u ledeno hladnom Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences, #558050), 30 min na ledu. Ćelije se zatim centrifugiraju, supernatant se ukloni i ćelijski pelet se razbije vorteksom. Ćelije se resuspenduju u 100 ul Phosflow Perm Buffer III i permeabilizovane ćelije se boje anti-NF-KB p65 (pS529) antitelom (BD Biosciences, #558423) ili izotipskim kontrolnim antitelom (mišji IgG2b,k, BD Biosciences #555058), 60 min na sobnoj temperaturi, zaštićeno od svetlosti. Posle perioda bojenja, ćelije se isperu PBS + 0.1% BSA u PBS + 0.1% BSA pre analize protočnom citometrijom. Određuje se relativna medijana intenziteta fluorescencije dobijenog sa H929 ćelija tretiranih kako je gore opisano. Signal medijane intenziteta fluorescencije (median fluorescence intensity, MFI) dobijen posle vezivanja A-APRIL u prisustvu izotipske kontrole podesi se na jedan; drugi signali se normalizuju u odnosu na to. Kao što je prikazano na Slici 15, efekat anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela sa APRIL-nekompetirajućom BCMA-vezujućom ručicom (83A10-TCBcv) u poređenju sa APRTL-kompetirajućom BCMA-vezujućom ručicom (J6M0-TCB) testiran je na 1000 ng/ml APRIL-posredovanoj aktivaciji NF-kB u H929 ćelijama (A). U poređenju sa H929 ćelijama u prisustvu 1000 ng/ml APRIL, APRIL-nekompetirajući 83A10-TCBcv redukuje za 29.9%> signal APRIL-indukovane aktivacije NF-kB (A). S obzirom na to da može postojati približno 20%> eksperimentalne varijabilnosti, 83A10-TCBcv pokazuje minimalnu redukciju NF-kB fosforilacije posredovane APRIL. Nasuprot tome, kada se APRIL-kompetirajuća BCMA-vezujuća ručica J6M0-TCB uporedi sa H929 ćelijama u prisustvu 1000 ng/ml APRIL, javlja se najmanje 79.3% smanjenja NF-kB aktivacionog signala, izmereno fosfoprotočnom citometrijom. Bilo je saopšteno je da J6M0 anti-BCMA antitelo (WO2012163805) blokira APRIL-indukovanu aktivaciju NF-kB. J6M0-TCB se generiše korišćenjem potpuno istog TCB formata kao 83A10-TCBcv.

[0208]U drugom setu eksperimenata, efekat APRIL-nekompetirajućeg 83A10-TCBcv i APPJL-kompetirajućeg J6M0-TCB proverava se u prisustvu zasićujuće koncentracije APRIL tj. 5000 ng/ml, koja indukuje jači signal za aktivaciju NF-kB u H929 ćelijama i da bi se potvrdila prva zapažanja, korišćenjem tehnike fosfoprotočne citometrije. U poređenju sa H929 ćelijama u prisustvu 5000 ng/ml APRIL, porast od 30% u aktivaciji NF-kB zapaža se sa APRIL-nekompetirajućim 83A 10-TCBcv (Slika 15B). Međutim, imajući u vidu da je 20-30% i dalje u okviru varijabilnosti testa, ne može se zaključiti postojanje ni porasta ni smanjenja aktivacionog signala za 83A10-TCBcv. Sa druge strane, kada se APRIL-kompetirajuće J6M0-TCB uporedi sa H929 ćelijama u prisustvu 5000 ng/ml APRIL, javlja se 69% smanjenja aktivacionog signala NF-kB, izmereno fosfoprotočnom citometrijom, čak i kada se ima u vidu varijabilnost testa, ovo predstavlja redukciju aktivacionog signala.

[0209]Ukupni rezultati u saglasnosti su sa setom podataka dobij enih APRIL-kompeticionim studijama za vezivanje za BCMA i BCMA-pozitivne ćelije (Slike 5-8) i potvrđuju da 83A10 anti-BCMA IgG antitelo i 83A10-TCBcv minimalno kompetiraju sa APRIL i ne blokiraju ili minimalno blokiraju vezivanje APRIL za BCMA na ćelijama kao i da samo minimalno utiču na NF-kB nishodnu signalizaciju/transdukciju signala posle vezivanja APRIL za BCMA na ćelijama. Sadašnji rezultati takođe potvrđuju da je J6M0 anti-BCMA antitelo koje kompetira sa APRIL u vezivanju sa BCMA i koje blokira nishodnu APRIL signalizaciju.

Primer 14: Anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijska bispecifična antitela ne indukuju

direktno aktivacijuNF-kBuodsustvu egzogenog APRIL,mereno fosforilisanim

NF-kB (protočna citometrija)

[0210]Procenjivano je da li vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela za BCMA-pozitivne H929 mijeloma ćelije indukuje aktivaciju NF-kB, poznatog nukleusnog faktora signalnog puta nishodno od BCMA receptora. Ukratko, H929 ćelije se izgladnjuju u RPMI1640 bez FCS, 24 h, na 37°C u ćelijskom inkubatoru. Na kraju perioda izgladnjivanja, ćelije se sakupe, broje i ćelijska vijabilnost se evaluira uz korišćenje ViCell. Vijabilne ćelije se podese na 1 x IO<6>ćelija po ml u FACS Stain Buffer (BD Biosciences) koji sadrži BSA. 100 (al ove ćelijske suspenzije po bunarčiću se alikvotira na ploči sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i vrši se inkubacija sa 25 (al anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ili izotipskih kontrolnih antitela pri zasićujućoj koncentraciji od 400 nM (77 |ag/ml), 20 min na 37°C, praćeno direktnom inkubacijom sa 100 ng/ml ili 1 (ag/ml ili zasićujućim koncentracijama od 3 (ag/ml do 5 (ag/ml rekombinantnog mišjeg A-APRIL (R&D Svstems Europe), dodatnih 15 min na 37 °C. Kao negativne kontrole, ćelije se ili ostave netretirane ili inkubiraju sa odgovarajućim IgG izotipskim kontrolnim antitelima 400 nM (77 |ag/ml) ukupno 45 min na 37°C. Kao pozitivne kontrole, ćelije su inkubirane sa 100 ng/ml ili 1 (ag/ml rekombinantnog mišjeg A-APRIL samo (R&D Svstems Europe), 15 min na 37 °C da se pokaže daje pozitivan signal detektabilan i da izostanak minimalnog signala nije usled tehničke grešeke. Na kraju stimulacije, ćelije se centrifugiraju (360 x g, 4 min), ćelijski pelet se odmah fiksira u prethodno zagrejanom Cytofix Buffer (BD Biosciences, #554655) i inkubiraju na 37 °C, 10 minuta. Ćelije se zatim centrifugiraju, supernatant se ukloni i ćelijski pelet se razbije vorteksom. Ćelije se zatim permeabilizuju u ledeno hladnom Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences, #558050), 30 min na ledu. Ćelije se zatim centrifugiraju, supernatant se ukloni i ćelijski pelet se razbije vorteksom. Ćelije se resuspenduju u 100 (al Phosflow Perm Buffer III i permeabilizovane ćelije se boje anti-NF-KB p65 (pS529) antitelom (BD Biosciences, #558423) ili izotipskim kontrolnim antitelom (mišji IgG2b,k, BD Biosciences #555058), 60 min na sobnoj temperaturi, zaštićeno od svetlosti. Posle perioda bojenja, ćelije se isperu PBS + 0.1% BSA u PBS + 0.1 %> BSA pre analize protočnom citometrijom. Određuje se relativni srednji intenzitet fluorescencije dobijen sa H929 ćelijama tretiranim kako je gore opisano meri se. Signal medijane intenziteta fluorescencije dobijen posle vezivanja A-APRIL u prisustvu izotipske kontrole podesi se na jedan; drugi signali se normalizuju u odnosu na to. Efekat anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (83A10-TCBcv) na NF-kB signalizaciju posle vezivanja za H929 ćelije u odsustvu egzogenog APRIL prikazan je na Slici 16. Slika 16A pokazuje da vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 83A10-TCBcv za H929 ćelije ne dovodi do porasta aktivacije NF-kB u odsustvu APRIL, ali zapaža se blago, 18.1%, smanjenje bazalnog signala, koje je unutar varijabilnosti eksperimenta, u poređenju sa samim H929 ćelijama i kako je mereno detekcijom unutarćelijskog NF-kB p65 (pS529) fosfoprotočnom citometrijom. Ovo zapažanje je potvrđeno u drugom eksperimentu koji pokazuje da anti-BCMA/anti-CD3 83A10-TCBcv ne inhibira ili ne indukuje aktivaciju NF-kB vezivanjem za BCMA-pozitivne H929 ćelije (Slika 16B). Kako je saopšteno u ranijim publikacijama, H929 ćelije mijeloma pokazuju bazalni nivo aktivacije u NF-kB putu, što je poznata patološka osobina ćelijskih linija multiplog mijeloma (Demchenkoet al,Blood 2010; 115 (17): 3541-3552). Izostanak aktivacije NF-kB puta posle vezivanja anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela za BCMA-pozitivne ćelije može biti povoljno, posebno što je zbog višeg afiniteta vezivanja anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela za BCMA tumorski ciljvs.za CD3 na T-ćelijama, poželjno da se NF-kB put ne aktivira dodatno i da preživljavanje mijeloma ćelija bude povećano kada se anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela privremeno vežu za BCMA-pozitivne mijeloma ćelije još uvek bez vezivanja za T-ćelije.

Primer 15: Aktivacija humanih T-ćelija posle vezivanja anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za CD3-pozitivne T-ćelije i BCMA-pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma (protočna citometrija)

[0211] Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analizirana su protočnom citometrijom u pogledu svoje sposobnosti da indukuju aktivaciju T-ćelija, evaluacijom površinske ekspresije ranog aktivacionog markera CD69, ili kasnog aktivacionog markera CD25 na CD4<+>i CD8<+>T-ćelijama, u prisustvu ili odsustvu humanih BCMA-eksprimirajućih MM ćelija. Ukratko, BCMA-pozitivne H929 ćelije se sakupe pomoću Cell Dissociation buffer, broje i proverava im se vijabilnost. Ćelije se podese na 0.3 x IO<6>(vijabilnih) ćelija po ml, u modifikovanom RPMI-1640 medijumu. Po 100 ul ove ćelijske suspenzije se pipetira u bunarčiće na ploči sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom (kako je navedeno). 50 ul (razblaženih) anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela doda se u bunarčiće koji sadrže ćelije da se dobije finalna koncentracija od 0.3 pM-30 nM. Humane PBMC efektorske ćelije se izoluju iz sveže krvi zdravog donora i podese na 6 x IO<6>(vijabilnih) ćelija po ml u modifikovanom RPMI-1640 medijumu. Po 50 ul ove ćelijske suspenzije doda se u svaki bunarčić ploče za test da se dobije konačni odnos E:T, PBMC prema tumorskim ćelijama mijeloma od 10:1. Da bi se analiziralo da li su anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela sposobna da aktiviraju T-ćelije specifično u prisustvu ciljnih ćelija koje eksprimiraju humani BCMA, uključeni su i bunarčići koji su sadržali 3 nM respektivnih anti-BCMA/anti-CD3 TCB molekula, kao i PBMC, ali ne i ciljne ćelije. Posle inkubacije od 15-28 h (CD69), ili 24-48 h (CD25) na 37°C, 5% C02, ćelije se centrifugiraju (5 min, 350 x g) i isperu dva puta sa 150 ul/bunarčiću PBS koji sadrži 0.1% BSA. Površinsko bojenje za CD4 (mišji IgGl, K; klon RPA-T4), CD8 (mišji IgGl, K; klon HIT8a; BD #555635), CD69 (mišji IgGl; klon L78; BD #340560) i CD25 (mišji IgGl, K; klon M-A251; BD #555434) obavlja se na 4 °C, 30 min, prema uputstvima proizvođača. Ćelije se isperu dva puta sa 150 ul/bunarčiću PBS koji sadrži 0.1% BSA i fiksiraju 15 min na 4 °C, uz korišćenje 100 ul/bunarčići fiksacionog pufera (BD #554655). Posle centrifugiranja, uzorci se resuspenduju u 200 ul/bunarčiću PBS sa 0.1% BSA i analiziraju korišćenjem FACS CantoII mašine (Software FACS Diva). Slika 17 prikazuje nivo ekspresije ranog markera aktivacije CD69 (C, D), i kasnog markera aktivacije CD25 (A, B) na CD4<+>i CD8<+>T-ćelijama posle 48 sati inkubacije (reprezentativni rezultati iz dva nezavisna eksperimetna). 83A10-TCBcv antitelo indukuje pozitivnu regulaciju CD69 i CD25 aktivacionih markera na koncentraciono-zavisan i specifičan način u prisustvu BCMA-pozitivnih ciljnih ćelija. Nije zapažena aktivacija CD4<+>i CD8<+>T-ćelija kada se humane PBMC tretiraju DP47-TCB kontrolnim antitelom, što ukazuje na to da uprkos vezivanju za CD3 na T-ćelijama, ne dolazi do aktivacije T-ćelija kada se TCB antitelo ne veže za BCMA-pozitivne ciljne ćelije (podaci nisu prikazani).

Primer 16: Proizvodnja citokina u aktiviranim T-ćelijama posle vezivanja anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za CD3-pozitivne T-ćelije i BCMA-pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma (test oslobađanja citokina, CBA analiza)

[0212] Anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijska bispecifična antitela analiziraju se u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijama posredovanu proizvodnju citokinade novo,u prisustvu ili odsustvu humanih BCMA-eksprimirajućih MM ćelija. Ukratko, humane PBMC se izoluju iz interfaze ("buffy coat") i 0.3 miliona ćelija po bunarčiću se zaseje na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom. Alternativno, 280 ul cele krvi uzete od zdravog donora zaseje se u svaki bunarčić ploče sa 96 dubokih bunarčića. Dodaju se tumorske ciljne ćelije (npr. H929, RPMI-8226, U266, ili L363 mijeloma ćelije) da se dobije finalni E:T-odnos 10:1. Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i kontrole dodaju se do finalne koncentracije od 0.3 pM-30 nM. Posle inkubacije koja je trajala do 24 h, na 37°C, 5% CO2, testna ploča se centrifugira 5 min na 350 x g i supernatant se prenese na novu ploču sa 96 dubokih bubarčića za sledeće analize. CBA analiza se obavlja na FACS CantoII prema uputstvima proizvođača, uz korišćenje Human Thl/Th2 Cvtokine Kit II (BD #551809) ili kombinacije sledećih CBA Flex setova: humani granzim B (BD #560304), humani TFN-y Flex set (BD #558269), humani TNF Flex set (BD #558273), humani IL-10 Flex set (BD #558274), humani IL- 6 Flex set (BD #558276), humani IL-4 Flex set (BD #558272), humani IL-2 Flex set (BD #558270). Tabele 15C i 15D pokazuju EC50 vrednosti i količinu sekretovanih citokina/proteaza u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela kada se H929 ćelije i RPMI-8226 ćelije koriste kao tumorske ciljne ćelije, respektivno. Primer17: Preusmerena T-ćelijska citotoksičnost cinomolgusovih BCMA-transfektovanih ćelija indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (test oslobađanja LDH)

[0213]

a) Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analiziraju se u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijama posredovanu apoptozu u BCMA-eksprimirajućim CHO ćelijama majmuna cinomolgusa, posle umrežavanja sa TCB konstruktom, vezivanjem antigen-vezujućih komponenti za BCMA na ćelijama. Ukratko, BCMA-eksprimirajuće CHO ciljne ćelije sakupe se pomoću Cell Dissociation Buffer, isperu i resuspenduju u RPMI dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčiću zaseje se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i respektivna razblaženja konstrukta se dodaju za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, svi TCB konstrukti i kontrole podese se na isti molaritet. PBMC majmuna cinomolgusa koriste se kao efektorske ćelije, finalni E:T odnos je 10:1. Negativne kontrolne grupe predstavljene su samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Kao pozitivna kontrola za aktivaciju T-ćelija majmuna cinomolgusa, koristi se 1 ug/ml PHAM

(Sigma #L8902). Za normalizaciju, maksimalna liza CHO ciljnih ćelija majmuna cinomolgusa (= 100%) određuje se inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1%> Triton X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%>) predstavljena je ciljnim ćelijama koinkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. Posle 20-24 h inkubacije na 37°C, 5% CO2, oslobađenje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih BCMA-eksprimirajućih CHO ciljnih ćelija majmuna cinomolgusa u supernatantu meri se pomoću LDH detekcionog kita (Roche Applied Science), prema uputstvima

proizvođača. Procenat LDH oslobađanja nanosi se na dijagram u odnosu na

koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela u vidu koncentraciono-zavisnih krivih. EC50 vrednosti mere se korišćenjem Prism software (GraphPad) i

određuju kao koncentracija TCB antitela koja daje 50% maksimalnog oslobađanja LDH. b) Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analiziraju se u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijama posredovanu apoptozu u BCMA-eksprimirajućim HEK293T ćelijama majmuna cinomolgusa posle umrežavanja sa TCB konstruktom, vezivanjem antigen-vezujućih komponenti za BCMA na ćelijama.

Ukratko, BCMA-eksprimirajuće HEK293T ciljne ćelije sakupe se pomoću Cell Dissociation Buffer, isperu i resuspenduju u RPMI 1640 medijumu dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen).

[0214]Približno 30000 ćelija po bunarčiću zaseje se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i respektivno razblaženje konstrukta doda se za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, svi TCB konstrukti i kontrole podese se na isti molaritet. PBMC majmuna cinomolgusa koriste se kao efektorske ćelije, finalni E:T odnos je 10:1. Negativne kontrolne grupe predstavljene su samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Za normalizaciju, maksimalna liza HEK ciljnih ćelija majmuna cinomolgusa (= 100%) određuje se inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Triton X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%o) predstavljena je ciljnim ćelijama koinkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. Posle 20-24 h inkubacije na 37°C, 5% CO2, oslobađenje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih BCMA-eksprimirajućih HEK ciljnih ćelija majmuna cinomolgusa u supernatantu meri se pomoću LDH detekcionog kita (Roche Applied Science), prema uputstvima proizvođača. Procenat LDH oslobađanja nanosi se na dijagram u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela u vidu koncentraciono-zavisnih krivih. EC50 vrednosti mere se korišćenjem Prism softvvare (GraphPad) i određuju kao koncentracija TCB antitela koja daje 50%> maksimalnog oslobađanja LDH. Tabela 15E prikazuje EC50 vrednosti za lizu ciljnih ćelija cynoBCMA-HEK ćelija pomoću 83A10-TCBcv.

Tabela15E. EC50 vrednosti moći anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela da indukuju lizu cvnoBCMAHEK ćelija

EC50 (pM)

Ciljne ćelije Efektorske ćelije

83A10-TCBcv

CynoBCMA- HEK Cyno PBMCs donor 1 3,5

CynoBCMA- HEK Cyno PBMCs donor 2 2/7

Srednja EC50 = [ 3.1 ± 0.57

Primer 18: PreusmerenaT-ćelijskacitotoksičnost BCMA-visokoeksprimirajućih

H929 ćelija mijeloma indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim

antitelima (kolorimetrijski test oslobađanja LDH)

[0215]Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analiziraju se u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijama posredovanu apoptozu u BCMA-visokoeksprimirajućim MM ćelijama posle umrežavanja sa konstruktom, vezivanjem antigen-vezujućih komponenti za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane BCMA-eksprimirajuće H929 ciljne ćelije multiplog mijeloma sakupe se pomoću Cell Dissociation Buffer, isperu i resuspenduju u RPMI dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčiću zaseje se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i respektivno razblaženje konstrukta doda se za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, svi TCB konstrukti i kontrole podese se na isti molaritet. Humane ukupne T-ćelije (efektorske) dodaju se u bunarčiće da se dobije finalni E:T odnos od 5:1. Kada se humane PBMC ćelije koriste kao efektorske ćelije koristi se finalni E:T odnos 10:1. Negativne kontrolne grupe su predstavljene samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Kao pozitivna kontrola za aktivaciju humanih pan T-ćelija koristi se 1 ug/ml PHA-M (Sigma #L8902). Za normalizaciju, maksimalna liza H929 MM ciljnih ćelija (= 100%) određuje se inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Triton X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%>) predstavljena je ciljnim ćelijama koinkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. Posle 20-24h ili 48 h inkubacije na 37 °C, 5% C02, oslobađanje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih MM ciljnih ćelija u supernatant meri se pomoću LDH detekcionog kita (Roche Applied Science), prema uputstvima proizvođača. Procenat LDH oslobađanja nanosi se na dijagram u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela u vidu koncentraciono-zavisnih krivih. EC50 vrednosti mere se korišćenjem Prism software (GraphPad) i određuju kao koncentracija TCB antitela koja daje 50% maksimalnog oslobađanja LDH. Kao što je pokazano na Slici 18, anti-BCMA7anti-CD3 TCB antitela ((A) 83A10-TCBcv, (B) 17A5-TCBcv) indukuju koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 ćelija mijeloma, mereno oslobađanjem LDH. Ubijanje H929 ćelija je specifično jer DP47-TCB kontrolno antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije ne indukuje oslobađanje LDH, ni pri najvišim testiranim koncentracijama (podaci nisu prikazani). Tabele 16 i 16A sumiraju EC50 vrednosti za preusmereno T-ćelijsko ubijnaje BCMA-pozitivnih H929 ćelija indukovano BCMA/anti-CD3 TCB antitelima. U jednom eksperimentu, 83A10-TCBcv upoređeno je sa APRJL/BAFF ligand-kompetirajućim J6M0-TCB u indukovanju ubijanja H929 ćelija (Tabela 16A). Slika 18-1 pokazuje da 83A10-TCBcv indukuje koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 mijeloma ćelija, kako je izmereno oslobađanjem LDH. Liza H929 ćelija je specfifična jer kontrolno-TCB antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije nego samo za CD3 na T-ćelijama ne indukuje oslobađanje LDH ni pri najvišim testiranim koncentracij ama. Primer 19:PreusmerenaT-ćelijska citotoksičnost BCMA-niskoeksprimirajućih U266BI i/iliL363ćelija mijeloma indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima(testoslobađanja LDH)

[0216]Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analiziraju se u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijama posredovanu apoptozu u BCMA-niskoeksprimirajućim MM ćelijama posle umrežavanja sa konstruktom, vezivanjem antigen-vezujućih komponenti za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane BCMA-niskoeksprimirajuće U266BI i/ili L363 ciljne ćelije multiplog mijeloma sakupe se pomoću Cell Dissociation Buffer, isperu i resuspenduju u RPMI dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčiću zaseje se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i respektivno razblaženje konstrukta doda se za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, svi TCB konstrukti i kontrole podese se na isti molaritet. Humane ukupne T-ćelije (efektorske) dodaju se u bunarčiće da se dobije finalni E:T odnos od 5:1.Kada se humane PBMC ćelije koriste kao efektorske ćelije, finalni E:T odnos je 10:1. Negativne kontrolne grupe predstavljene su samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Kao pozitivna kontrola za aktivaciju humanih T-ćelija koristi se 1 (ag/ml PHA-M (Sigma #L8902). Za normalizaciju, maksimalna liza MM ciljnih ćelija (= 100%) određuje se inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Triton X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%>) predstavljena je ciljnim ćelijama koinkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. Posle 20-24 h inkubacije na 37 °C, 5%> C02, oslobađanje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih MM ciljnih ćelija u supernatant meri se pomoću LDH detekcionog kita (Roche Applied Science), prema uputstvima proizvođača. Procenat LDH oslobađanja nanosi se na dijagram u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela u vidu koncentraciono-zavisnih krivih. EC50 vrednosti mere se korišćenjem Prism software (GraphPad) i određuju kao koncentracija TCB antitela koja daje 50% maksimalnog oslobađanja LDH. Kao što je pokazano na Slici 18-2, 83A10-TCBcv anti-BCMA/anti- CD3 TCB antitelo indukuje koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih L363 ćelija mijeloma, mereno oslobađanjem LDH. Liza L363 ćelija je specfična jer kontrolno TCB antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije nego samo za CD3 na T-ćelijama ne indukuje oslobađanje LDH ni pri najvišim testiranim koncentracijama. Tabela 16B zbirno prikazuje EC50 vrednosti za preusmereno T-ćelijsko ubijanje BCMA-srednje/niskoeksprimirajućih L363 ćelija indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima.

Primer 19 A: Preusmerena T-ćelijska citotoksičnost BCMA-srednje-/niskoeksprimirajućih RPMI-8226 ćelija mijeloma indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (test oslobađanja LDH) [02171Anti-BCMA7anti-CD3 TCB antitela analiziraju se u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijama posredovanu apoptozu u BCMA-srednje-/niskoeksprimirajućim MM ćelijama posle umrežavanja sa konstruktom, vezivanjem antigen-vezujućih komponenti za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane BCMA-srednje-/niskoeksprimirajuće L363 ciljne ćelije multiplog mijeloma sakupe se pomoću Cell Dissociation Buffer, isperu i resuspenduju u RPMI dopunjenom 10%> fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčiću zaseje se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i respektivno razblaženje konstrukta se doda za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, svi TCB konstrukti i kontrole podese se na isti molaritet. Humane PBMC (efektorske ćelije) dodaju se u bunarčiće da se dobije finalni E:T odnos od 10:1, što odgovara E:T odnosu od približno 3 do 5 T-ćelija na jednu ciljnu tumorsku ćeliju. Negativne kontrolne grupe su predstavljene samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Za normalizaciju, maksimalna liza MM ciljnih ćelija (= 100%) određuje se inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Triton X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%) predstavljena je ciljnim ćelijama koinkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. Posle 20-24 h inkubacije na 37 °C, 5% C02, oslobađanje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih MM ciljnih ćelija u supernatant meri se pomoću LDH detekcionog kita (Roche Applied Science), prema uputstvima proizvođača. Procenat LDH oslobađanja nanosi se na dijagram u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela u vidu koncentraciono-zavisnih krivih. EC50 vrednosti mere se korišćenjem Prism softvvare (GraphPad) i određuju kao koncentracija TCB antitela koja daje 50%> maksimalnog oslobađanja LDH. Kao što je pokazano na Slici 18-3, 83 A 10-TCBcv anti-BCMA/anti- CD3 TCB antitelo indukuje koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih RPMI-8226 ćelija mijeloma, mereno oslobađanjem LDH. Liza RPMI-8226 ćelija je specfična jer kontrolno-TCB antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije nego samo za CD3 na T-ćelijama ne indukuje oslobađanje LDH ni pri najvišim testiranim koncentracijama. Tabela 16C zbirno prikazuje EC50 vrednosti za preusmereno T-ćelijsko ubijanje BCMA srednje/niskoeksprimirajućih RPMI-8226 ćelija indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima.

Primer19B: Preusmerena T-ćelijska citotoksičnost BCMA-niskoeksprimirajućih JJN-3 ćelija mijeloma indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (protočna citometrija i oslobađanje LDH)

[0218] Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analiziraju se u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijama posredovanu apoptozu u BCMA-niskoeksprimirajućim MM ćelijama posle umrežavanja sa konstruktom, vezivanjem antigen-vezujućih komponenti za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane BCMA-niskoeksprimirajuće JJN-3 ciljne ćelije multiplog mijeloma sakupe se pomoću Cell Dissociation Buffer, isperu i resuspenduju u RPMI dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčiću zaseje se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i doda se respektivno razblaženje konstrukta za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, svi TCB konstrukti i kontrole podese se na isti molaritet. Humane PBMC (efektorske ćelije) dodaju se u bunarčiće da se dobije finalni E:T odnos od 10:1, što odgovara E:T odnosu od približno 3 do 5 T-ćelija na jednu ciljnu tumorsku ćeliju. Negativne kontrolne grupe su predstavljene samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Za normalizaciju, maksimalna liza MM ciljnih ćelija (= 100%) određuje se inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Triton X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%) predstavljena je ciljnim ćelijama koinkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. i) Posle 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kultivisane mijeloma ćelije se sakupe, isperu i boje fluorohrom-konjugovanim antitelima i aneksinom-V, za određivanje apoptoze ćelija mijeloma. Panel za bojenje sadržao je CD138-APCC750/CD38-FITC/CD5-BV510/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450/ Annexin-V-PerCP-Cy5.5. Upotrebljena fluorohromom obeležena antitela nabavljena su od BD Biosciences (San Jose, CA) i Caltag Laboratories (San Francisco CA). Podaci se dobijaju korišćenjem multikolornog protočnog citometra i instaliranog softvera (npr. CantoII aparat sa FACS Diva softverom ili FACSCalibur protočni citometar, uz korišćenje CellQUEST softvera). Paint-A-Gate PRO program (BD Biosciences) koristi se za analizu podataka. Meri se Aneksin-V na JJN-3 ćelijama i procenat aneksin-V-pozitivnih JJN-3 ćelija nanosi se na dijagram u odnosu na koncentraciju anti-BCMA7anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela. Procenat lize JJN-3 ćelija indukovane specifičnom koncentracijom anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela takođe se određuje, merenjem apsolutnog broja aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija pri datoj koncentraciji TCB i oduzimanjem te vrednosti od apsolutnog broja aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija bez TCB; podeljeno apsolutnim brojem aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija bez TCB. Slika 18-4 pokazuje da 83A 10-TCBcv anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelo indukuje koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-niskoeksprimirajućih JJN-3 mijeloma ćelija, kako je mereno protočnom citometrijom. Liza JJN-3 ćelija je specifična jer kontrolno TCB antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije nego samo za CD3 na T-ćelijama ne indukuje porast aneksin-V-pozitivnih JJN-3 ćelija ili JJN-3 ćelijsku lizu čak ni pri najvišim testiranim koncentracijama. Tabele 16D i 16E sumiraju respektivno procente aneksin-V-pozitivnih JJN-3 ćelija i procente lize JJN-3 ćelija indukovane anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima. Primer20: Poređenje uticaja anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela koja uključuju APRIL-neblokirajuće/nekompetirajuće anti-BCMA antitelo vs. APRIL-blokirajuće/kompetirajuće anti-BCMA antitelo na preusmereno T-ćelijsko ubijanje BCMA-pozitivnih ćelijskih linija multiplog mijeloma u prisustvu visokih koncentracija Uganda

[0219] U određenim hematološkim malignitetima kao što je multipli mijelom, nivo cirkulišućih BCMA-liganda APRIL i BAFF može biti povišen (Moreauxet al.2004; Blood 103(8): 3148-3157). Prema tome, pronalazači prepoznaju da visoki nivoi liganda u serumu mogu da interferiraju sa vezivanjem anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela za BCMA receptor na tumorskim ćelijama. U poređenju sa zdravim donorima, nivoi cirkulišućeg APRIL (visokoafinitetni ligand za BCMA) u krvi obolelih od multiplog mijeloma su~100 ng/ml vs.~10 ng/ml. Za BAFF (niskoafinitetni ligand za BCMA), nivoi mogu da fluktuiraju od 1-1000 ng/ml u poređenju sa~3 ng/ml kod zdravih donora. U blizini tumorskih ćelija, tj. u mikrosredini kostne srži obolelih od multiplog mijeloma (kostna srž je organ koji je konstitutivno bogat APRIL-om), APRIL/BAFF koncentracije mogu biti znatno više nego nivoi izmereni u serumu. Što je još važnije, APRIL se konstitutivno eksprimira u mikrosredini kostne srži i važan je faktor preživljavanja ćelija malignog mijeloma i uglavnom ga proizvode i sekretuju mijeloidne prekursorske ćelije kostne srži (Mattheset al.Blood 2011; 118 (7): 1838-1844). Tako, koncentracije APRIL u kostnoj srži obolelih od mijeloma za koje se očekuje da su visoke, do 1000 ng/ml ili čak i više od toga, od velikog su značaja u ovom kontekstu. U određenim autoimunskim boletima kao što je sistemski eritemski lupus, nivoi cirkulišućeg APRIL takođe su povišeni, sa~85 ng/ml (Kovamaet al.2005; Ann RheumDis 64: 1065-1067).

[0220]Da bi se proverilo da li bi APPJL-neblokirajuća/nekompetirajuća anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela bila pogodnija u odnosu na APRIL-blokirajuća/kompetirajuća anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela, APRIL neblokirajuća/nekompetirajuća anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analizirana su u pogledu svog potencijala da indukuju T-ćelijama posredovano ubijanje BCMA-eksprimirajućih ćelija mijeloma posle umrežavanja sa konstruktom, putem vezivanja antigen-vezujućih komponenti za BCMA na ćelijama, u prisustvu povišenih koncentracija APRIL nađenim kod obolelih od multiplog mijeloma (tj.. 100 ng/ml do 1000 ng/ml). Pošto se APRIL vezuje za humani BCMA sa do 1000 puta višim afinitetom nego što se BAFF vezuje za receptor, visoke koncentracije APRIL relevantnije su u ovom kontekstu nego koncentracije BAFF. Visoki nivoi APRIL bi najverovatnije uticali na efikasnost TCB antitela, posebno kada se terapeutik daje pacijentu u vrlo niskim dozama (Bargouet al.Science 2008; 321 (5891); 974-7). Prema tome, sledeći eksperimenti su obavljeni u prisustvu APRIL.

[0221]Ukratko, humane BCMA- pozitivne H929 ciljne ćelije multiplog mijeloma sakupe se pomoću Cell Dissociation Buffer, isperu i resuspenduju u RPMI dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčiću zaseje se na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i respektivno razblaženje TCB konstrukata se doda za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 TCB su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM, u prisustvu ili odsustvu APRIL u finalnoj koncentraciji odlOO ng/ml ililOOO ng/ml. Za odgovarajuće poređenje, svi TCB konstrukti i kontrole podese se na isti molaritet. Humane PBMC (efektor) dodaju se u bunarčiće da se dobije finalni E:T odnos od 10:1. Negativne kontrolne grupe su predstavljene samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Kao pozitivna kontrola za aktivaciju humanih pan T-ćelija, koristi se 1 ug/ml PHA (Sigma #L8902). Za normalizaciju, maksimalna liza H929 MM ciljnih ćelija (= 100%) određuje se inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Triton X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%>) predstavljena je ciljnim ćelijama koinkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. Posle 24 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, oslobađanje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih H929 mijeloma ciljnih ćelija u supernatant meri se LDH detekcionim kitom (Roche Applied Science), prema uputstvima proizvođača. Procenat oslobađanja LDH nanese se na dijagram u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela u vidu koncentraciono-zavisni krivih. EC50 vrednosti se mere korišćenjem Prism softvera (GraphPad) i određuju kao koncentracija TCB antitela koja za rezultat ima 50% maksimalnog oslobađanja LDH. Kako je pokazano na Slici 19, anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela indukuju ubijanje BCMA-pozitivnih H929 mijeloma ćelija u prisustvu ili odsustvu egzogenog APRIL. Kako je pokazano na Slici 19A, APRIL- neblokirajuće/nekompetirajuće 83 A 10-TCBcv indukuje koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 mijeloma ćelija sa niskom pikomolarnom snagom (EC50aprilo= 1.5 pM) u odsustvu egzogenog APRIL. Kada se doda 100 ng/ml APRIL u kulturu, što je koncentracija APRIL koja bi mogla da se nađe u krvi obolelih od multiplog mijeloma, takva koncentracija liganda samo minimalno utiče na snagu ubijanja posredovanu 83A10-TCBcv što se reflektuje 2.9-strukim porastom EC50 (EC50A<p>rilioo= 4.3 pM). Kada se 10 puta veća koncentracija APRIL (tj. 1000 ng/ml), koja bi mogla da se nađe u kostnoj srži obolelih od multiplog mijeloma, doda u kulturu moć ubijanja posredovanog 83A10-TCBcv blago se redukuje, što se reflektuje 6-strukim porastom EC50 (EC50APRILiooo= 9.0 pM). Uprkos ovoj maloj redukciji snage ubijanja u prisustvu 1000 ng/ml APRIL, APRIL- neblokirajuće/nekompetirajuće 83A10-TCBcv i dalje efikasno ubija BCMA-pozitivne H929 ćelije mijeloma sa, potencijalom u niskopikomolarnom opsegu. Tabela 17 sumira EC50 vrednosti APRIL neblokirajućeg/nekompetirajućeg 83A10-TCBcv u odsustvu i prisustvu egzogenog

APRIL.

[0222]Kako je pokazano na Slici 19B, APRIL-blokirajuće/kompetirajuće J6M0-TCB indukuje koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 ćelija mijeloma sa niskom pikomolarnom snagom (EC50Aprilo= 5.8 pM) u odsustvu egzogenog APRIL. Kada se u kulturu doda 100 ng/ml APRIL, takva koncentracija liganda samo minimalno utiče na moć ubijanja J6M0-TCB, što je pokazano 2.4-strukim porastom EC50 (EC50A<p>rilioo= 14.2 pM). Međutim, kada se 1000 ng/ml APRIL doda u kulturu moć ubijanja posredovana J6M0-TCB se u velikoj meri redukuje što se odražava porastom EC50 od 84.3 puta (EC50APriliooo=488.9 pM). Tabela 18 sumira EC50 vrednosti APRIL- blokirajućeg/kompetirajućeg J6M0-TCB u odsustvu i prisustvu egzogenog

APRIL.

[0223]Ukupni rezultati upućuju na to da APRIL-neblokirajuća/nekompetirajuća anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela mogu imati jasnu prednost nad APRIL-blokirajućim/kompetirajućim anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima jer na njih ne utiču ili malo utiču visoke koncentracije APRIL koje u značajnoj meri mogu biti prisutne u mikrosredini kostne srži kod obolelih od multiplog mijeloma. Uprkos ovom malom smanjenju u moći ubijanja u prisustvu 1000 ng/m APRIL, APRIL-neblokirajuće/nekompetirajuće 83A10-TCBcv i dalje može efikasno da ubija BCMA-pozitivne H929 ćelije mijeloma sa potencijom u niskom pikomolarnom opsegu. Kada se ova zapažanja prenesu u kliničku situaciju, to znači da pri datim niskim terapijskim dozama TCB kao 83A10-TCBcv, kod pacijenata sa visokim nivoima APRIL u kostnoj srži, ćelije mijeloma i dalje mogu da budu ubijene. Situacija može biti drugačija ako se koristi TCB kao J6M0-TCB; antitumorski efekat kod pacijenata sa visokim nivoima APRIL mogao bi biti u značajnoj meri izgubljen. Alternativa je korišćenje znatno viših terapijskih doza, ali to povećava rizik od sporednih efekata (za TCB blinatumomab, saopšteni su dozno-zavisni sporedni efekti).

Primer 21: 83A10-TCB bez varijante naelektrisanja i 83A10-TCBcv sa varijantom

naelektrisanja pokazuju slične biološke osobine

[0224]Očekuje se da se TCB antitelo sa modifikacijama naelektrisanja u CL-CH1 ponaša slično u testovima baziranim na ćelijama kao njegov TCB parnjak divljeg tipa bez modifikacija naelektrisanja jer VL i VH CDR ostaju identični u oba molekula.

[0225]Jedna od najvažnijih bioloških osobina za upoređivanje TCB sa varijantom naelektrisanjavs.TCB bez varijante naelektrisanja bio bi kapacitet TCB antitela da se vezuju za ćelije. Slika 20A prikazuje da se 83A10-TCB i 83A10-TCBcv vezuju za BCMA-pozitivne H929 ćelije na koncentraciono-zavisan način i sličnom snagom, respektivno EC50 = 9.8 nMvs.EC50 = 14.5 nM. DP47-TCB kontrolno antitelo se ne vezuje za BCMA-pozitivne H929 mijeloma ćelije, kako je izmereno izostankom porasta medijane intenziteta fluorescencije. U drugom eksperimentu direktnog poređenja, 83A10-TCB i 83A 10-TCBcv evaluirana su u pogledu vezivanja za BCMA-pozitivne H929 ćelije i izostanka vezivanja za BCMA/CD3-negativne MKN45 ćelije. Kako je pokazano na Slici 20B, 83A10-TCB i 83A10-TCBcv vezuju se za BCMA-pozitivne H929 ćelije na koncentraciono-zavisan način i sličnom snagom, respektivne vrednosti EC50 =16.9 nM i EC50 =14.5 nM. EC50 za vezivanje 83A10-TCB i 83A10-TCBcv za H929 ćelije za oba eksperimenta zbirno su prikazane u Tabeli 19.

[0226]Druga biološka osobina relevantna za poređenje TCB antitela sa varijantom naelektrisanjavs.TCB antitelima bez varijante naelektrisanja bio bi njihov kapacitet da indukuju preusmereno T-ćelijsko ubijanje ciljnih ćelija. Kao što je pokazano na Slici 20C-F, anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ((C, D) 83A10-TCB, (E, F) 83A10-TCBcv) indukuju koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 mijeloma ćelija što je izmereno oslobađanjem LDH. Ubijanje H929 ćelija je specifično jer DP47-TCB kontrolno antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije ne indukuje oslobađanje LDH, ni pri najvišoj koncentraciji od 1 nM (C). Čak i ako EC50 vrednosti za 83A10-TCB (C, D) i 83A10-TCBcv (E, Eksperiment 1) nisu bile merljive Prism (GraphPad) statističkim softverom, magnituda EC50 vrednosti može približno da se proceni na nisku pikomolarnu jačinu, i za nenaelektrisane i za naelektrisane TCB molekule. U drugom eksperimentu, efekat 83A10-TCBcv evaluiran je u testu preusmerenog T-ćelijskog ubijanja i EC50 vrednost je mogla da se izmeri na 1.5 pM

(F). Autori ne isključuju da blago niža EC50 vrednost (blago bolja moć) može biti prourokovana varijabilnošću davalaca krvi. Međutim, magnituda snage za ubijanje

H929 ćelija definitivno je u pikomolarnom opsegu. Ukupni rezultati ukazuju na to da 83A10-TCB (bez varijante naelektrisanja) vs. 83A10-TCBcv (sa varijantom naelektrisanja) pokazuje slične biološke osobine u testovima baziranim na ćelijama. EC50 vrednosti za preusmereno T-ćelijsko ubijanje H929 ćelija indukovano 83A10-TCB i 83A10-TCBcv zbirno su prikazane u Tabeli 20.

Primer22: Ekspresija BCMA na mijeloma-ćelijama kostne srži obolelih od multiplog mijeloma

[0227] Humane ćelijske linije koje eksprimiraju tumorske ciljeve od interesa veoma su korisna i praktična sredstva za merenje moći TCB antitela da indukuju citotoksičnost tumorskih ćelija u prisustvu T-ćelija i određivanje EC50 vrednosti, kao i za rangiranje TCB molekula. Međutim, uprkos tome što su lako dostupne i praktične, humane ćelijske linije mijeloma imaju manu da ne reprezentuju heterogenost multiplog mijeloma, veoma kompleksne bolesti koja se odlikuje značajnom heterogenošću na molekulskom nivou. Pored toga, ćelijske linije mijeloma ne eksprimiraju BCMA receptor sa istim intenzitetom i gustinom jer neke ćelije eksprimiraju BCMA snažnije nego druge (npr. H929 ćelijevs.U266 ili RPMI-8226 ćelije), što sugeriše da takva heterogenost na ćelijskom nivou može postojati i među različitim pacijentima. Kroz akademsku saradnju sa vodećim stručnjacima za multipli mijelom, izučavaju se određivanje ekspresije i gustine BCMA u uzorcima pacijenata i evaluiacija anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela na kliničkim uzorcima uzetim od pacijenata. Krv i aspirati kostne srži uzimaju se od obolelih od multiplog mijeloma posle davanja informacija i pristanka pacijenta, u skladu sa uputstvima lokalnog etičkog komiteta i Helsinškom deklaracijom.

a) Ekspresija BCMA detektovana protočnom citometrijom (medijana intenziteta fluorescencije)

[0228] Da bi se odredila ekspresija BCMA receptora na mijeloma ćelijama kostne srži, imunofenotipske analize se obavljaju korišćenjem sveže izolovanih aspirata kostne srži. Uzorci cele kostne srži sa liziranim eritrocitima i antikoagulantom K3-EDTA (etilendiaminetetrasirćetna kiselina) koriste se za imunofenotipske analize. Ćelije, ukupno 2 x IO<6>po epruveti, boje se, liziraju i ispiraju korišćenjem tehnike direktne imunofluorescencije i multikolornog bojenja kojom se specifično identifikuju i imunofenotipski karakterišu maligni plazmociti identifikovani kao CD138<+>CD38<+>CD45<+>CD19"CD56<+>. Ćelije se zatim boje korišćenjem panela fluorohrom-konjugovanih antitela uključujući bar CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450/BCMA-APC. Korišćena fluorohromom obeležena antitela nabavljaju se od BD Biosciences (San Jose, CA) i Caltag Laboratories (San Francisco CA). U kući napravljeno APC-konjugovano anti-humano BCMA-antitelo koristi se u imunofenotipskim analizama. Podaci se dobijaju korišćenjem multikolornog protočnog citometra i instaliranog softvera (npr. CantoII uređaj sa FACS Diva softverom ili FACSCalibur protočni citometar koji koristi CellOUEST softver). Paint-A-Gate PRO program (BD Biosciences) koristi se za analizu podataka. BCMA ekspresija se meri selekcijom populacije malignih plazmocita, i vrednosti medijane intenziteta flurescencije se određuju i porede među obolelima od mijeloma.

b)Određivanje broja kopija BCMA antigena (kvantitativna protočno-citometrijska analiza)

[0229]

(i) Qifikit (Dako) metod koristi se za kvantifikovanje broja kopija BCMA antigena na površini H929 ćelija. H929 ćelije se jednom isperu FACS puferom (100 ul/bunarčiću; 350 x g 5 min) i podese na 1 Mio ćelija/ml. 50 jal (= 0.5 Mio ćelija) ćelijske suspenzije prenese se u svaki od bunarčića ploće sa 96 bunarčića

sa zaobljenim dnom kako je navedeno. Zatim se doda 50 jal mišjeg antihumanog BCMA IgG (BioLegend #357502) ili mišjeg izotipskog kontrolnog IgG2a (BioLegend # 401501), razblaženih u FACS puferu (PBS, 0.1% BSA) do finalne koncentracije od 25 (ag/ml (ili pri koncentracijama zasićenja) i obavi se bojenje, 30 min na 4 °C, u mraku. Zatim se 100(alSet-up ili Calibration Beads doda u

zasebne bunarčiće i ćelije, kao i perlice, isperu se dva puta FACS puferom. Ćelije i perlice se resuspenduju u 25 (al FACS pufera koji sadrži fluorescein-konjugovano antimišje sekundarno antitelo (u zasićujućim koncentracijama), obzbeđeno od Qifikit. Ćelije i perlice se boje 45 min na 4 °C, u mraku. Ćelije se jednom isperu i svi uzorci se resuspenduju u 100 (al FACS pufera. Uzorci se analiziraju na multikolornom protočnom citometru i instaliranom softveru (npr. CantoII uređaj sa FACS Diva softverom ili FACSCalibur protočni citometar sa CellQUEST softverom). Alternativno, u nekim studijama umesto komercijalnog mišjeg antihumanog BCMA IgG kao primarnog antitela, koriste se u kući pripremljena antihumana BCMA IgG antitela (npr. 83A10 IgG, 17A5-IgG ili 13A4 IgG) sa optimalnim osobinama vezivanja, posle čega sledi dodatni korak inkubiranja sa komercijalnim nekonjugovanim prvim sekundarnim antitelom

protiv humanog IgG-Fc (Abcam, kat. br. ABM121), pre nego što se kalibracione perlice inkubiraju sa ćelijama u prisustvu FACS pufera koji sadrži fluorescein-konjugovano antimišje drugo sekundarno antitelo. Kada se primarna i sekundarna antitela koriste u zasićujućim koncentracijama, broj vezanih molekula primarnog antitela odgovara broju antigenskih mesta na površini ćelije i fluorescencija odgovaraju broju vezanih molekula primarnog antitela na ćelijama i perlicama.

(ii) Qifikit (Dako) metod koristi se za kvantifikovanje BCMA specifičnog antigen-vezujućeg kapaciteta (specific antigen binding capacitv, SABC) na ćelijskoj površini plazmocita kostne srži obolelih od mijeloma. Plazmociti mijeloma izolovani iz aspirata cele kostne srži boje se sa 50 ul mišjeg antihumanog BCMA IgG (BioLegend #357502) ili mišjeg izotipskog kontrolnog IgG2a (BioLegend #401501), razblaženih u FACS puferu (PBS, 0.1% BSA) do finalne koncentracije od 25 ug/ml (ili pri zasićujućim koncentracijama) i bojenje se vrši 30 min na 4 °C u mraku. Posle toga, 100 ul Set-up ili Calibration perlica doda se u zasebne bunarčiće i ćelije, kao i perlice, isperu se dva puta FACS puferom. Ćelije i perlice se resuspenduju u 25 ul FACS pufera koji sadrži fluorescein-konjugovano antimišje sekundarno antitelo (u zasićujućim koncentracijama), obezbeđenih od Qifikit. Ćelije i perlice se boje 45 min na 4 °C u mraku. Ćelije se jednom isperu i svi uzorci se resuspenduju u 100 (al FACS pufera. Uzorci se odmah analiziraju na multikolornom protočnom citometru i instaliranom softveru (npr. CantoII uređaj sa FACS Diva softverom ili FACSCalibur protočni citometar sa CellQUEST softverom).

Primer23: Preusmerena T-ćelijska citotoksičnost mijeloma-ćelija iz kostne srži obolelih indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima

(protočna citometrija)

[0230]

a) jedna od najznačajnijih i kritičnihin vitrokarakterizacija tokom prekiliničke evaluacije kandidatskih TCB antitela za multipli mijelom je da li TCB molekul može da

aktivira pacijentove T-ćelije i indukuje preusmereno T-ćelijsko ubijanje primarnih ćelija mijeloma iz kostne srži obolelih. Radi evaluacije efekta anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela da indukuju preusmereno T-ćelijsko ubijanje ćelija mijeloma iz kostne srži, autologe T-ćelije iz krvi, izolovane iz cele krvi i uzoraka cele kostne srži sa liziranim

eritrocitima, sakupe se i pripreme. U prvoj eksperimentalnoj postavci, autologe T-ćelije koje infiltriraju kostnu srž koriste se kao efektorske ćelije i TCB antitela se uvedu direktno u uzorke cele kostne srži sa liziranim eritrocitima. Odnos efektroskih ćelija prema tumorskim ćelijama (E:T odnos) prisutan u uzorcima cele kostne srži određen je merenjem protočnom citometrijom. Poželjno, koristi se E:T odnos 1-3 CD3<+>ćelije na jednu ćeliju mijeloma. U drugoj eksperimentalnoj postavci, autologe T-ćelije izolovane iz cele krvi pacijenta dodaju se uzorcima cele kostne srži da se dobije E:T odnos od 1-3 CD3<+>ćelije na jednu ćeliju mijeloma. Ukratko, 200 (al pripremljenih uzoraka cele kostne srži sa liziranim eritrocitima prenese se na ploče sa 96 dubokih bunarčića. Razblaženja anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i kontrolnog antitela pripreme se u sterilnom PBS i 10 ul preparata se doda u respektivne bunarčiće do finalnih koncentracija u opsegu od 0.1 pM do 100 nM. Suspenzije cela kostna srž-antitelo meša se blagim pretresanjem i zatim inkubira na 37 °C, 5% C0224 h do 48 h, pokriveno parafinskim filmom. Posle inkubacionog perioda, na ploče sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom dodaje se 20 (al odgovarajućeg FACS-rastvora antitela pripremljenog na osnovu panela antitela uključujući CD138-APCC750/CD38-FITC/CD5-BV510/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/ CD45-V450/BCMA-APC/Annexin-V-PerCP-Cy5.5. Koriste se fluorohromom-markirana antitela komercijalno nabavljena od BD Biosciences (San Jose, CA) i Caltag Laboratories (San Francisco CA) i u kući napravljeno APC-konjugovano antihumano BCMA antitelo. Uzorci se onda inkubiraju 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi, i podaci se dobijaju i analiziraju korišćenjem multikolornog protočnog citometra. Ćelijska smrt ćelija mijeloma određuje se evaluiranjem selektovane aneksin-V-pozitivne ekspresije na populacijama ćelija mijeloma CD138<+>CD38<+>CD45<+>CD19"i CD138<+>CD38<+>CD45<+>CD19"BCMA<+>. Zatim se određuju procenti smrti mijeloma ćelija. Da bi se procenilo da li anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela indukuju aktivaciju CD4<+>i CD8<+>T-ćelija obolelih od mijeloma (npr. T-ćelije koje infiltriraju kostnu srž (MIL) i krvne T-ćelije), uzorci dobijeni od tretirane, netretirane odnosno kontrolne grupe takođe se boje FACS rastvorom antitela pripremljenim na osnovu panela antitela uključujući CD8-APCH7/CD69-FITC/CD107-BV510/CD16-PE/CD25-PerCP-Cy7/CD4-PacB/HLD-DR-APC/CD3-PerCP-Cy5.5. Uzorci se zatim inkubiraju 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi i podaci se dobijaju i analiziraju multikolornim protočnim citometrom.

Aktivacija T-ćelija određuje se procenom CD25 i/ili CD69 pozitivne ekspresije selektovane na CD4<+>i CD8<+>T-ćelijskim populacijama. Zatim se mere procenti aktivacije T-ćelija.

b) Da bi se procenio efekat anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela da indukuju preusmereno T-ćelijsko ubijanje mijeloma-plazmocita kostne srži, aspirati cele kostne

srži se sakupe od obolelih od multiploog mijeloma u EDTA-obložene epruvete i odmah koriste za testove kulture ćelija. Odnos efektorskih ćelija prema tumorskim ćelijama (E:T odnos) u uzorcima cele kostne srži određuje se i meri protočnom citometrijom. Ukratko, 200 ul uzoraka cele kostne srži prenese se na ploče sa 96 dubokih bunarčića. Razblaženja anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i kontrolnog antitela pripreme se u sterilnom medijumu i 10 ul preparata se doda u respektivne bunarčiće do finalnih koncentracija u opsegu od 0.1 pM do 30 nM. Suspenzije kostna srž-antitelo meša se blagim pretresanjem i zatim inkubira na 37 °C, 5% C0248 h, pokriveno parafinskim filmom.Posle inkubacionog perioda, 20 (al odgovarajućeg FACS-rastvora antitela pripremljenog na osnovu panela antitela uključujući CD138-APCC750/CD38-FITC/CD5-BV510/CD56-PE/CD19-PerCPCy7/CD45-V450/BCMA-APC/Annexin-V-PerCP-Cy5.5 dodaje se na ploče sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom. Koriste se fluorohromom-markirana antitela komercijalno nabavljena od BD Biosciences (San Jose, CA) i Caltag Laboratories (San Francisco CA) i u kući napravljeno APC-konjugovano antihumano BCMA antitelo. Uzorci se zatim inkubiraju 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi i podaci se dobijaju i analiziraju korišćenjem multikolornog protočnog citometra. Ćelijska smrt ćelija mijeloma određuje se evaluiranjem selektovane aneksin-V-pozitivne ekspresije na populacijama ćelija mijeloma CD138<+>CD38<+>CD45<+>CD19"CD56<+>. Zatim se određuje procenat smrti ćelija mijeloma. Procenat lize mijeloma-plazmocita iz kostne srži obolelih, indukovane specifičnom koncentracijom anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelom određuje se i merenjem apsolutnog broja aneksin-V-negativnih mijeloma-plazmocita pri datoj koncentraciji TCB i oduzimanjem tog broja od aneksin-V-negativnih mijeloma-plazmocita bez TCB; podeljeno apsolutnim brojem aneksin-V-negativnih mijeloma plazmocita bez TCB. Da bi se proverila specifičnost anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela, ekspresija aneksina-V se meri i u drugim tipovima ćelija kostne srži, npr. T-ćelijama, B-ćelijama i NK-ćelijama. Kako je pokazano na Slici 21, postoji

koncentraciono-zavisna i specifična liza mijeloma-plazmocita obolelih, dok liza T-ćelija, B-ćelija i NK-ćelija nije zapažena. Pored toga kontrolno TCB koje se vezuje samo za CD3 ali ne i za BCMA ne indukuje ćelijsku smrt mijeloma-plazmocita ni pri najvišim koncentracijama TCB antitela. Kako je pokazano u Tabeli 23, procenat aneksin-V- pozitivnih mijeloma-ćelija iz kostne srži pacijenata pri najvišoj koncentraciji (30 nM) dostiže 29.31% 83A10-TCBcv, što ukazuje na to da je 83A10-TCBcv sposobno da indukuje ubijanje mijeloma-plazmocita iz kostne srži obolelih.

c) U sledećoj studiji, u aspiratima kostne srži uzetim od 3 MM pacijenta procenat vijabilnih mijeloma plazmocita određivan je selektovanjem aneksin-V-negativne

populacije ćelija i nanošenjem na dijagram te vrednosti u odnosu na koncentraciju anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela. EC50 vrednosti se mere i određuju kao koncentracija TCB antitela koja za rezultat daje 50%> maksimalnog broja vijabilnih plazmocita mijeloma. EMAX (%) se određuje kao maksimum vijabilnih mijeloma-plazmocita u prisustvu respektivnog anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela. 83A10-TCBcv je potentan u indukovanju lize mijeloma-plazmocita u uzorcima aspirata kostne srži obolelih od mijeloma (Tabela 24; Slika 22). Koncentraciono-zavisna redukcija vijabilnih ćelija mijeloma zapaža se kod 3/3 uzorka pacijenata tretiranih sa 83A10-TCBcv. Slika 22 i Tabela 24 pokazuju i poređenje 83A10-TCBcv sa J6M0-TCBcv (J6M0 je antitelo za koje je saopšteno da kompetira sa APRIL u vezivanju za BCMA (Taiet al,Blood 2014) u pogledu EC50 i EMAX (%) vrednosti, obavljeno u studiji koja je usledila. Kod 3/3 uzorka pacijenata, 83A10-TCBcv indukuje više lize mijeloma-plazmocita iz aspirata kostne srži obolelih nego J6M0-TCBcv pri ekvimolarnoj maksimalnoj dozi od 30 nM što se reflektuje EMAX vrednostima koje predstavljaju procenat vijabilnih mijeloma-plazmocita (što je niži ovaj procenat, veći je

procenat liziranih ćelija). EC50 vrednosti takođe pokazuju daje 3A10-TCBcv takođe potentnije nego J6M0-TCBcv kod 2/3 uzorka uzetih od obolelih.

d) U sledećim ispitivanjima u kojima su nova anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijska bispecifična antitela ovog pronalaska upoređivana sa 83A10-TCBcv, sedam sveže

uzetih uzoraka/aspirata cele kostne srži obolelih boj eno je CD 138 magnetnim mikroperlicama (Miltenvi Biotec, Bergisch Gladbach, Germanv), propušteno kroz autoMACS kolonu za separaciju ćelija i sakupljene frakcije sa dovoljnim brojem preostalih MM plazmocita, obično >4% mijeloma-plazmocita, korišćene su za dalje eksperimente. Na pločama sa 24 bunarčića, inkubira se 500000 ćelija/bunarčiću i kultiviše 48 sati. Rastvori anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i kontrolnog antitela dodaju se u respektivne bunarčiće do finalne koncentracije TCB od 0.1. pM do 10 nM. Svaka dozna tačka se uradi u triplikatima. Vijabilnost plazmocita i ćelija mikrosredine kostne srži ispituje se dvostrukim bojenjem propidijum-jodidom/CD138-FITC, uz korišćenje protočne citometrije (FACSCalibur; Becton Dickinson). Analiza podataka vrši se korišćenjem FACSDiva softvera (Becton Dickinson). Kako je pokazano na Slici 23, stubići histograma pokazuju srednje vrednosti normalizovane u odnosu na srednju vrednost triplikata respektivne medijumske kontrole (medium control, MC). Za statističku analizu, koristi se jednosmerni/-test. Maksimalna inhibicija rasta MM plazmocita pri koncentraciji od 10 nM (IMAX10) i inhibicija merena na 1 nM (IMAX1), respektivno, date su u procentu u odnosu na kontrolu sa medijumom. Maksimalna inhibicija kontrolnog TCB antitela (10 nM) u poređenju sa kontrolom sa medijumom takođe je prikazana. Izračunavanja su obavljena korišćenjem R 3.1.19, i Bioconductor 2.1310, osim za izračunavanje IMAX vrednosti (Microsoft Excel<®>;

Microsoft Office Professional 2013). Efekat je smatran za statistički značajan ako je P-vrednost odgovarajućeg statističkog testa iznosila <5% (<*>), < 1% (<**>) ili <0.1% (<***>). Kako se vidi na Slikama 23A-23G, rezultati jasno pokazuju daje sa 83A10-TCBcv bilo manje vijabilnih mijeloma plazmocita kostne srži (tj. više lize mijeloma palzmocita iz kostne srži) kod 7/7 uzoraka uzetih od obolelih, u poređenju sa kontrolom sa medijumom. Tabela 25 prikazuje procenat vijabilnih mijeloma-plazmocita iz aspirata kostne srži obolelih indukovane anti- BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, u odnosu na kontrolu sa medijumom. Tabela 26 pokazuje IMAX10 i IMAX1 vrednosti. Rezultati pokazuju da je 83A10-TCBcv moćan u indukovanju ubijanja mijeloma- plazmocita iz kostne srži obolelih. Uprkos specifičnoj lizi plazmocita kostne srži (bone marrow plasma cells, BMPC) indukovanoj anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima i zapaženoj u svim uzorcima kostne srži obolelih, nije bilo uticaja na mikrosredinu kostne srži (bone marrovv microenvironment, BMME) respektivnih uzoraka (Slika 23H, reprezentativni od 7 uzoraka obolelih).

Primer23A: Aktivacija T-ćelija iz kostne srži obolelih indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (multiparametarska protočna citometrija) [0231] Da bi se procenilo da li anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela indukuju aktivaciju CD4<+>i CD8<+>T-ćelija obolelih od mijeloma (tj. T-ćelija koje infiltriraju kostnu srž (MIL)), uzorci iz respektivnih tretiranih, netretiranih i kontrolnih grupa posle 48 h inkubacije bojeni su FACS rastvorom antitela pripremljenim na osnovu panela antitela uključujući osam markera: CD8/CD69/TIM-3/CD16/CD25/CD4/HLA-DR7PD-1. Uzorci su zatim inkubirani 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi i podaci su dobijeni i analizirani uz korišćenje multikolornog protočnog citometra. Aktivacija T-ćelija određivana je evaluacijom CD25, CD69 i/ili HLA-DR pozitivne ekspresije selektovane na CD4<+>i CD8<+>populacijama T-ćelija. Zatim su mereni procenti aktivacije T-ćelija. Slika 24 pokazuje koncentraciono-zavisnu pozitivnu regulaciju CD69 i CD25 na CD4<+>i CD8<+>T-ćelijama koje infiltriraju kostnu srž obolelih od multiplog mijeloma. Tabela 26A sumira porast CD69 i CD25 ekspresije na CD4<+>i CD8<+>T-ćelijama indukovan anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima; podaci za jednog pacijenta.

Primer24: Farmakokinetička studija na miševima

[0232J Jasna prednost koju bi anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitelo moglo da ima nad drugim bispecifičnim antitelima kao (scFV)2(npr. BCMAxCD3 bispecifični T-ćelijski "engager" (antitelo koje angažuje T-ćelije), BiTE, kako je opisano u WO2013/072415 i WO2013/072406) je mnogo duže poluvreme eliminacije/niži klirensin vivo,što bi omogućilo primenu dva puta ili jednom nedeljnoi. v.ilis. c.u poređenju sa veoma kratkim poluvremenom eliminacije (scFV)2(npr. 1 do 4 sata) što zahteva da se lečenje primenjuje pomoću pumpe koju pacijent nosi nedeljama ili mesecima (Toppet al.J Clin Oncol 2011; 29(18): 2493-8). Primena dva puta ili jednom nedeljno mnogo je pogodnija za pacijente i nosi mnogo manje rizika (npr. otkazivanje pumpe, problemi sa kateterom).

[0233] Da bi se proverilo poluvreme eliminacije/klirens anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitelain vivo,imunodeficijentni mužjaci i/ili ženke miševa (npr. NOD/SCID ili NOD/Shi-scid iL2rgamma(null) (NOG) miševi, stari 6-10 nedelja i teški 18-25 g dobijeni su od poznatih dobavljača kao što su Charles River, The Jackson Laboratorv i/ili Taconic i ostavljeni da se aklimatizuju pod odgovarajućim uslovima, najmanje nedelju dana. Tokom perioda aklimatizacije i eksperimentalnog perioda, životinje su imale pristup standardnoj peletiranoj hrani i vodiađ libitum.Držanje životinja i sve postupke sprovodili su iskusne CRO i/ili autorizovane laboratorije u skladu sa federalnim uputstvima, uz poštovanje propisa o dobrobiti životinja.

a) Da bi se sprovele farmakokinetičke studije, životinje su nasumično raspoređene u grupe od n = 1 do n = 6, poželjno n = 2 do n = 4, određene za odabrane tretmane i/ili doze i/ili vremenske tačke za sakupljanje krvi. Grupe su držane u zasebnim kavezima i pojedinačne životinje su obeležene odgovarajućim metodima.

Životinjama je data jednai. v.doza anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela, doze su iznosile od 1 ug/kg do 20 mg/kg, poželjno 5 ug/kg do 0.5 mg/kg. Date zapremine iznosile su od 5 do 10 ml/kg. U jednoj grupi miševi su mogli primiti, zbog upoređivanja,i. v.doze BCMAxCD3 (scFV)2. Uzimanje krvi organizovano je prema eksperimentalnom protokolu/protokolima u više vremenskih tačaka pre i posle davanja, od 10 min do 14 dana poslei. v.injekcije testnog artikla, poželjno od 15 min do 168 sati. Uzorci krvi od oko 200 (al sakupljani su, korišćenjem hematokritskih kapilara, u microvette<®>punktiranjem retrobulbalnog venskog pleksus ili, u vreme eutanazije, punktiranjem srca. Uzorci krvi uskladišteni su odmah na 4 °C i centrifugirani 2-5 min na do 9000 x g. Supernatanti seruma ili plazme od najmanje 80 (al izdvoje se i uskladište na -20 °C do -80 °C do analiziranja. Koncentracije ispitivanih antitela u serumu ili plazmi merene su korišćenjem standardnog ELISA testa da bi se detektovala humana IgG (abcam;

kat. # abl000547). Iz koncentracija u serumu i/ili plazmi, izračunavaju se farmakokinetički parametri, npr. maksimalna koncentracija u serumu/plazmi, volumen distribucije, oblast ispod koncentraciono-vremenske krive, klirens, srednje vreme zadržavanja i/ili vreme poluživota. Za detektovanje serumskih koncentracija BCMAxCD3 (scFV)2bez humanog IgG-Fc, korišćen je biološki

test za kvantifikovanje sub-ng/ml koncentracija BCMAxCD3 (scFV)2u uzorcima seruma tretiranih miševa. Osnov biološkog testa je zapažanje da BCMAxCD3 (scFV)2indukuje pozitivnu regulaciju T-ćelijskih površinskih aktivacionih makera (CD69 i/ili CD25) na koncentraciono-zavisan način, kako je ranije saopšteno (Schlerethet al.Cancer Immunol Immunother 2006; 55:503-514).

Koncentracije BCMAxCD3 (scFV)2u opsegu od 3 ng/ml do 200 pg/ml korišćene su za generisanje standardnih krivih za merenje imunoloških odgovora CD3- pozitivnih T-ćelija u prisustvu BCMAxCD3 (scFV)2vezanog za BCMA-pozitivne H929 ćelije. Ćelije se inkubiraju uz E:T odnos od 10:1, na 37°C, 5%

CO2, preko noći. Prazne ("blank") probe (bez BCMAxCD3 (scFV)2) koriste se za merenje pozadinske ekspresije markera. Testni uzorci se sprovode čisti ili razblaženi 1:2 i 1:4 u humanom pulovanom serumskom ekvivalentu, za postupak standardizacije. Nivoi ekspresije imunoloških površinskih markera određuju se FACS analizom uz korišćenje anti-CD25 i/ili anti-CD69 FITC- ili PE-markiranih detekcionih antitela (BD biosciences). Koncentracije BCMAxCD3 (scFV)2nepoznatih testnih uzoraka određuju se nanošenjem na dijagram količine respektivnog markera iz standardnih krivih u odnosu na poznate koncentracije BCMAxCD3 (scFV)2korišćenjem funkcije "interpolirane X vrednosti" Prism softvera (Graph-Pad). Potom može da usledi farmakokinetička studija na miševima, uz subkutanu primenu, jer subkutana primena može na kraju biti poželjni klinički put primene.

b) U farmakokinetičkoj studiji jedne doze, životinje se nasumično rasporede u 3 grupe tretmana od n = 9 miševa po grupi, i dalje odrede za uzimanje krvi u

određenim vremenskim tačkama (n = 3 za vremensku tačku, po grupi tretmana). Životinjama se daje po jedna IV doza anti-BCMA7anti-CD3 83A 10-TCBcv antitela, doze iznose od 0.0082 mg/kg do 0.82 mg/kg. Primenjene zapremine iznose 5 ml/kg. Prema eksperimentalnom protokolu, krv je uzimana u više vremenskih tačaka: 0.25, 0.5, 1, 3, 7, 24, 48, 96, 168, 240 h poslei. v.injekcije testnog artikla 83A 10-TCBcv. Uzorci krvi od oko 100 ul po životinji sakupljani su, korišćenjem hematokritskih kapilara, u microvette<®>punktiranjem retrobulbalnog venskog pleksusa (za pojedinačnog miša krv iz retrobulbalnog pleksusa uzimana je u 2 ili najviše 3 vremenske tačke posle injektiranja) ili, u vreme eutanazije, punktiranjem srca. Uzorci krvi držani su na sobnoj temperaturi da bi došlo do koagulacije, približno 60 min, do centrifugiranja 2.5 min na 9300 g. Serumski supernatanti od najmanje 50 ul sakupljeni su, preneti u čiste 200 ul-ske Eppendorf epruvete i čuvani na -85 °C do -70 °C, do analize. Serumske koncentracije ispitivanog 83A10-TCBcv merene su korišćenjem standardnih biohemijskih testova za detektovanje humanog Fc ili CHl/kapa, kako je opisano u Stubenrauchet alJ Pharm Biomed Anal 2009 i Stubenrauchet al.J Pharm

Biomed Anal 2013. Serumske koncentracije date u Tabeli 27 i na Slici 25 merene su korišćenjem ELISA za detekciju humanog Fc. Tabela 27 i Slika 25 pokazuju serumske koncentracije merene ELISA za 3 doze. Slika 25 sugeriše doznu linearnost u ispitivanom doznom opsegu. Koncentraciono-vremenska kriva izgleda da pokazuje u prvih nekoliko časova posle injektiranja relativno brži pad nego što je pad koncentracija zapažen u periodu između 24 sata i 240 sati posle injektiranja. Pri srednjoj dozi (0.082 mg/kg) pad između 24 i 240 sati odražava

prilično linearno ponašanje i poluvreme eliminacije od približno 6 do 7 dana može da se izvede iz nagiba linearnog pada. Pad koncentraciono-vremenske krive pri visokoj dozi (0.82 mg/kg) izgleda daje još sporiji, tj. eliminacioni poluživotje najmanje 6 do 7 dana mada može biti i duži. Poluvreme eliminacije između 24 i

240 sati pri niskoj dozi (0.0082 mg/kg) ne može u potpunosti da se proceni jer su serumski nivoi na 240 sati ispod detekcionog limita. Međutim, Slika 25 sugeriše

da poluvreme eliminacije između 24 sata i 96 sati može biti kraće od 6 do 7 dana, moguće bliži 3 do 5 dana. Koncentraciono-vremenske krive dobij ene za 83A 10-TCBcv podržavaju pogodnost leka za primenu jednom ili dva puta nedeljno.

Primer24A: Farmakokinetička/farmakodinamička (PK/PD) studija na majmunima cinomolgusima

[0234] Jednodozne farmakokinetičke (pharmacokinetic, PK)/farmakodinamičke (pharmacodynamic,(PD) studije sa anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (83A10-TCBcv) sprovedene su pri iskusnim AAALAC-akreditovanim CRO. Biološkinaiveadultni cinomolgus majmuni, stari oko dve godine i teški približno 3 kg, aklimatizovani su najmanje 40 dana i odabrani na osnovu telesne težine, kliničkih opservacija i kliničko-patoloških ispitivanja. Životinje su obeležene individualnom tetovažom i karticama za kavez sa kolornim kodom. Svi postupci sa životinjama (uključujući držanje, praćenje zdravstvenog stanja, obuzdavanje, doziranje, itd) i etička revizija obavljaju se u skladu sa trenutnim državnim zakonodavstvom uz sprovođenje Smernica o zaštiti životinja koje se koriste u biomedicinskim istraživanjima. Životinje se nasumično rasporede po grupama tretmana na osnovu poslednjeg merenja težine pre eksperimenta. Posle isključivanja životinja sa neprihvatljivim nalazima pre testa, kompjuterski program uključen u Pristima<®>system dizajniran za postavljanje ravnoteže u pogledu pretestnih telesnih težina upotrebljen je da se isključe životinje sa ekstremnim telesnim težinama na oba ekstrema i preostale životinje se nasumično rasporede u grupe za tretmane. Životinje su određene za tri grupe tretmana sa 83A10-TCBcv (n = 2 životinje tj. 1 ženka i 1 mužjak po grupi), pri 0.003; 0.03; i 0.3 mg/kg. Životinje primaju jednui. v.injekciju 83A10-TCBcv i najmanje uzorci krvi od najmanje 0.8 ml po vremenskoj tački uzimaju se preko periferne vene za evaluaciju PK prema sledećem rasporedu sakupljanja i postupcima: Pre doziranja, 30, 90, 180 min, 7, 24, 48, 96, 168, 336, 504 h posle doziranja. Uzorci krvi se ostave da se koagulišu u epruvetama za izdvajanje seruma, 60 min na sobnoj temperaturi. Koagulum se obori centrifugiranjem (najmanje 10 min., 1200 g, +4 °C). Dobijeni serum (oko 300 ul) direktno se skladišti na

-80 °C do dalje analize. Uzimaju se i uzorci kostne srži za PK evaluacije, iz femura, pod anestetskim/analgetskim tretmanom, po sledećem rasporedu: Pre doziranja, 96 i 336 h posle doziranja. Uzorci kostne srži ostave se da se koagulišu u epruveti za izdvajanje seruma, 60 min na sobnoj temperatuie. Koagulum se obori centrifugiranjem (najmanje 10 min., 1200 g, +4 °C). Dobijena kostna srž (oko 1 ml) direktno se skladišti na -80 °C do dalje analize. Obavlja se analiza PK podataka i evaluacija. Standardna

nekompartmentalna analiza obavlja se korišćenjem Watson paketa (v 7.4, Thermo Fisher Scientific Waltman, MA, USA) ili Phoenix WinNonlin sistema (v. 6.3, Certara Company, USA). Kako je pokazano na Slici 26, Tabeli 28, serumske koncentracije 83A 10-TCBcv merene su pomoću ELISA. Tabela 29 pokazuje koncentracije 83A 10-TCBcv u kostnoj srži merene pomoću ELISA, za svaku grupu tretmana (BLQ, znači ispod nivoa kvantifikacije).

[0235]Nekoliko informacija relevantnih za potencijalnu kliničku upotrebu 83A10-TCBcv mogu da se vide iz Slike 26, Tabele 28 Tabele 29: U aspiratima kostne srži MM pacijenata koncentracije od 1 nM ili 10 nM 83A10- TCBcv indukuju značajno ili čak potpuno ubijanje MM plazmocita; u dozi od 0.03 mg/kg u intervalu od injekcije do 168 sati (7 dana) dostižu se koncentracije u plazmi između pribl. 1 nM i 4 nM što pokazuje da terapija jednom nedeljno dozom od približno 0.03 mg/kg može biti izvodljiva (200 ng/ml odgovara pribl: 1 nM)

Slika 26 pokazuje daje u ispitivanom doznom opsegu PK u velikoj meri dozno-linearna; to znači da su koncentracije proporcionalne dozi, stoje korisna osobina

za kliničku terapiju

MM je bolest uglavnom locirana u kostnoj srži; koncentracije 83A10-TCBcv detektovane u kostnoj srži bliske su koncentracijama u serumu (Tabela 29), npr.

na 96 h posle injekcije izmerene su koncentracije u kostnoj srži od pribl. 1 i 2 nM; ovo su koncentracije TCB ovog pronalaska pri kojima se zapaža značajno ubijanje MM plazmocita u aspiratima kostne srži neposredno uzetim od MM pacijenata; (vidi Tabele 25 i 26), što ponovo pokazuje mogućnost za doziranje u pogodnim intervalima, npr. jednom nedeljno

Između 24 i 504 sata posle injekcije eliminacija je uglavnom prvog reda sa

poluvremenom eliminacije od pribl. 6 do 8 dana, što ponovo potvrđuje mogućnost doziranja npr. jednom nedeljno

[0236]Farmakodinamička (PD) merenja: Uzorci krvi (vremenske tačke: pre doziranja, 24, 48, 96, 168, 336, 504 h posle doziranja) i uzorci kostne srži (vremenske tačke: pre doziranja, 96 i 336 h posle doziranja) sakupe se u epruvete koje sadrže 7.5% K3 EDTA, za evaluaciju PD protočnom citometrijom, da bi se odredio efekat 83A10-TCBcv datogi. v.u jednoj dozi, na plazmocite, B-ćelije i T-ćelije krvi i kostne srži. Primenjuje se direktan metod imunofluorescentnog bojenja površinskih markera "liza i ispiranje". Ukratko, 100 (al krvi ili kostne srži inkubira se sa mešavinama dva antitela koje uključuju CD45/CD2/CD16/CD20/CD27/CD38 ili CD45/CD2/CD16/CD4/CD25/CD8, u mraku 30 min na +4 °C. Da bi se lizirale crvene krvne ćelije, uzorku se doda 2 ml rastvora lizirajućeg pufera i inkubira 15 min na sobnoj temperaturi u mraku. Ćelije se sakupe centrifugiranjem i isperu puferom za bojenje (PBS 2% fetalni goveđi serum). Obojeni uzorci se drže u frižideru, zaštićeni od svetlosti do analiziranja na citometru istog dana. Prikupljanje podataka FACS obavlja se na Becton Dickinson protočnom citometru opremljenom laserskim snopovima od 488 i 635, BD FACS Canto II. BD FACSDiva softver koristi se za prikupljanje podataka i analizu. Apsolutni broj ćelija dobija se pomoću dvostruke platforme na bazi broja WBC dobijenog hematološkim analizatorom (ADVIATM 120, Siemens). Kako je pokazano na Slici 27, redistribucija perifernih T-ćelija zapažena je kod svih životinja koje su primile jednu dozu IV tretmana 83A10-TCBcv, što je pokazano smanjenjem broja T-ćelija u cirkulaciji. Kako je pokazano na Slici 28A, već 24 sata posle tretmana sa 83A10-TCBcv 0.3 mg/kg, kod tretiranih životinja zapaža se smanjenje plazmocita u krvi (BCMA-pozitivne ćelije), dok nema smanjenja ukupnog broja B-ćelija (BCMA-negativne ćelije). Slika 28B pokazuje kinetiku smanjenja broja plazmocita u krvi posle tretmana sa 83A10-TCBcv 0.3 mg/kg, kod majmuna cinomolgusa.

[0237] Uzorci krvi sprovode se i za analizu plazme, za analizu citokina (IL-lb, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-a i IFN-y), u skladu sa sledećim rasporedom sakupljanja: Pre doziranja, 30, 90, 180 min, 7, 24, 48, 96, 168 h posle doziranja. Uzorci krvi se stave u plastične epruvete koje se drže u ledenom vodenom kupatilu, zatim centrifugiraju (najmanje 10 min., 1200g, +4 °C). Dobijena plazma se direktno skladišti na -80°C do analize. Analiza citokina obavlja se Multiplex citokinskim imunotestom baziranim na perlicama (Luminex Technologv). Podaci se analiziraju Bio-Plex Manager 4.1 softverom (BioRad): koristi se petoparametarski logistički regresioni model (5PL).

Primer 25: Terapijska efikasnost anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela u mišjim ksenograftskim modelima humanog mijeloma

[0238]

a)In vivoefekat anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela evaluira se u ksenograftskom modelu humanog mijeloma kod miša. Ukratko, na dan 0 (dO)

studije, 5x10<6>do 100xl0<6>ćelija ćelijske linije humanog mijeloma NCI-H929

(NCIH929, ATCC<®>CRL-9068™) subkutano se injektiraju u desnu polovinu leđa imunodeficijentnih NOD/Shiscid IL2rgamma(null) (NOG) odraslih miševa (The

Jackson Laboratorv i/ili Taconic) i ostave da se kaleme 7 do 21 dan ili dok veličina tumora ne dostigne 50-300 cm<3>, poželjno 100-200 cm<3>. Transplantirani miševi se nasumično rasporede u različite grupe tretmana (n = 5 do 12). NOG miševi su jedan od najpovoljnijih sojeva za humanizovane mišje modele jer se odlikuju kompletnim odsustvom imunskih ćelija uključujući populaciju rezidentnih NK- ćelija, koja može da se zapazi kod neozračivanih SCID ili RAG imunodeficijentnh miševa i koja može da utiče na graftovanje tumora humanih ksenogenih ćelija (Ito kada tumorski graft dostigne zapreminu od približno 50-300 cm<3>, poželjno 100- 200 cm<3>, 5 x 10<6>do 100 x IO<6>humanih PBMC izolovanih iz interfaza, injektiraju se u peritonealnu duplju miševa-domaćina. Miševi iz kontrolnih grupa ne primaju humane PBMC i koriste se kao netransplantirani kontrolni miševi za upoređivanje sa kontrolnim miševima tretiranim prenosnikom, koji su primili humane PBMC, za praćenje uticaja T-ćelija na rast tumora. Režim tretmana TCB baziran je na prethodno dobijenim farmakokinetičkim podacima i sastoji se od primene jednom nedeljnoi. v., s. c.ilii. p.do 3-6 injekcija anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela. Dva dana posle rekonstituicije recipijenata humanim PBMC (d9 do d23), prva doza anti-BCMA/anti-CD3 2TCBcv antitela, u opsegu od 1 ug/kg do 20 mg/kg,

poželjno 5 ug/kg do 0.5 mg/kg, daje se injekcijom preko repne vene ilis. c.ilii. p.injekcijom. Kod nekih miševa iz satelitskih grupa, krv se uzima 5 min, 1 h, 8 h i 24 h posle injekcije anti-BCMA/anti-CD3 2+1 Fc-sadržavajućeg TCB antitela za

farmakokinetičke analize. Tri do sedam dana posle prvog tretmana TCB miševi

primaoci se tretiraju drugom dozom anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela. Jedan sat pre druge TCB injekcije, krv se sakuplja da bi se dobili najniži nivoi antitela tokom tretmana. Tri do sedam dana posle drugog tretmana TCB miševi primaoci

se tretiraju trećom dozom anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela, itd. Planirano je da tretman traje 3 nedelje, tj. 6 doza po režimu dva puta nedeljno, odnosno 3 doze po režimu jednom nedeljno. Jedan sat pre druge (po režimu doziranja jednom nedeljno) odnosno četvrte injekcije TCB, krv se sakuplja za farmakokinetičke analize. Između druge i treće odnosno četvrte i pete injekcije TCB neki miševi iz satelitskih grupa se eutanaziraju i koriste za prikazivanje farmakodinamičkih

efekata i merenje sekundarnih završnih tačaka kao što su aktivacija T-ćelija i funkcija T-ćelija kod tretiranih miševa. Primarna završna tačka meri se preko veličine tumora. Tumori se tokom studije mere nonijusom, a napredovanje se procenjuje međugrupnim poređenjem zapremine tumora (tumor volume, TV).

Inhibicija rasta tumora T/C (%) određuje se izračunavanjem TC kao T/C% = 100 x (srednja TV analizirane grupe)/(srednja TV kontrolne grupe tretirane prenosnikom). U nekim stuudijama, preživljavanje miševa-domaćina koristi se

kao primarna ili sekundarna završna tačka. Alternativno H929 ćelijskoj liniji, kao ksenograft mogu da se koriste humane mijeloma ćelijske linije RPMI-8226

(ATCC<®>CCL-155™), U266B1 (ATCC<®>TIB-196™) ili L-363 ćelijska linija

(Leibniz Institute DSMZ - nemačka kolekcija mikroorganizama i ćelijskih kultura (German collection of microorganisms and cell cultures); DSMZ No. ACC 49). U nekim studijama, NOD-Ragl (null)-y lanac (nulla) (NRG) adultni miševi (The Jackson Laboratorv) mogu da se koriste kao primaoci transplanta. U nekim studijama, miševi primaoci tretiraju se komparativnim dozama BCMAxCD3

(scFV)2(npr. BCMAxCD3 bispecifičnim T-ćelijskim "engager" BiTE kako je opisano u WO2013/072415 i WO2013/072406) po rasporedu tretiranja dva puta i/ili jednom nedeljno.

b) Antitumorska aktivnost indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelom u ksenograftskom modelu H929 humanog mijeloma u

PBMC-humanizovanim NOG miševima. Sa dugim poluživotom eliminacije, Fc-sadržavajuća anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela mogu da budu efikasnija od (scFv)2-baziranih bispecifičnih antitela kao BCMA50-BiTE<®>, datih u

ekvimolarnim dozama, po režimu jednom nedeljno.In vivoefekat 83A 10-TCBcv i BCMA50-BiTE<®>(kako je opisano u WO2013072415 i WO2013072406) upoređuje se i evaluira u ksenograftskom modelu H929 humanog mijeloma u PBMC-humanizovanim NOG miševima. NOG miševi su pogodni za humanizovane mišje modele jer se odlikuju kompletnim odsustvom imunskih ćelija uključujući populaciju rezidentnih NK-ćelija i tako su permisivniji za graftovanje tumora humanih ksenogenih ćelija (Itoet al.Curr Top Microbiol Immunol 2008; 324: 53-76). Ukratko, na dan 0 (dO) studije, 5xl0<6>do 100xl0<6>

ćelija ćelijske linije humanog mijeloma NCI-H929 (NCI-H929, ATCC<®>CRL-9068™) u 100 ul RPMI 1640 medijuma koji sadrži 50:50 matrigel (BD Biosciences, France) subkutano (SC) se injektiraju u desnu polovinu leđa

imunodeficijentnih NOD/Shi-scid IL2rgamma(null) (KOG) ženki miševa starosti 8-10 nedelja (Taconic, Ry, Danemark). Dvadeset četiri do 72 časa pre SC implantacije H929 tumorskih ćelija, svi miševi su dobili ozračivanje celog tela h- izvorom (1.44 Gy, 60Co, BioMep, Bretenieres, France). Na dan 15 (dl 5), NOG

miševi primili su jednu intraperitonealnu (IP) injekciju 2 x IO<7>humanih PBMC (u 500 ul PBS IX pH 7.4). Karakterizacija humanih PBMC obavljena je imunofenotipizacijom (protočna citometrija). Miševi se zatim pažljivo randomizuju u različite grupe tretmana i kontrolne grupe (n = 9/grupi) uz

korišćenje Vivo manager<®>softvera (Biosystemes, Couternon, France) i statistički testovi se obave (analiza varijanse) da bi se testirala homogenost između grupa. Tretman antitelima počinje na dan 19 (dl9), tj. 19 dana posle SC injekcije H929

tumorskih ćelija, kada zapremina tumora kod svih miševa dostigne najmanje 100- 150 mm<3>, sa srednjom zapreminom tumora od 300 ± 161 mm<3>za kontrolnu grupu tretiranu prenosnikom, 315 ± 148 mm<3>za grupu tretiranu 2.6 nM/kg kontrolnim TCB, 293 ± 135 mm<3>za grupu tretiranu 2.6 nM/kg 83A10-TCBcv i 307 ± 138 mm<3>za grupu tretiranusa 2.6 nM/kg BCMA50-(scFv)2(BCMA50-BiTE<®>). Raspored tretiranja TCB antitelom zasniva se na farmakokinetičkim rezultatima ranije dobijenim za 83A10-TCBcv i sastoji se od IV primene jednom nedeljno, u trajanju do 3 nedelje (tj. ukupno 3 injekcije TCB antitela). Četiri dana posle rekonstitucije miševa-domaćina humanim PBMC (dl9), daje se prva doza anti-BCMA/anti-CD3 83A10-TCBcv antitela (2.6 nM/kg respektivno 0.5 mg/kg), injekcijom preko repne vene. Uzorci krvi uzimaju se punkcijom

jugularne/mandibularne vene (pod anestezijom), 1 h pre svakog tretmana, 2 h pre drugog tretmana i na kraju eksperimenta od miševa iz svih grupa tretiranih sa 83 A 10-TCBcv i kontrolnim TCBcv. Uzorci krvi se odmah prenesu u epruvete sa

aktivatorom koagulacije (T MG epruvete, tamnocrveni vrh, Capiject<®>, Terumo<®>). Epruvete se ostave na sobnoj temperaturi 30 min da dođe do koagulacije. Epruvete se zatim centrifugiraju na 1 300 g 5 min da se koagulum odvoji od seruma. Pripreme se alikvoti seruma, brzo zamrznu u tečnom azotu i skladište na

-80 °C do dalje analize. Zapremina tumora (TV) meri se nonijusom tokom studije i napredovanje se evaluira međugrupnim poređenjem TV. Procenat rasta tumora definisan kao TG (%) određuje se izračunavanjem TG (%) = 100 x (srednja TV

analizirane grupe)/(srednja TV kontrolne grupe tretirane prenosnikom). Iz etičkih razloga, miševi se eutanaziraju kada TV dostigne 2000 mm<3>.

[0239]Slika 29 pokazuje TV svakog pojedinačnog miša po eksperimentalnoj grupi: (A) kontrolne grupe uključujući kontrolu sa prenosnikom (puna linija) i kontrolno -TCB (tačkasta linija), (B) 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupa, i (C) BCMA50-BiTE<®>(2.6 nM/kg). U grupi 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg), 6 od 9 miševa (67%) imalo je regresiju tumora čak ispod TV zabeležene na dl9, tj. na dan prvog tretmana TCB i regresija tumora se održala do kraja studije. Tri miša u 83A10- TCBcv (2.6 nM/kg) tretiranoj grupi koja nisu pokazala regresiju tumora imala su TV 376, 402 i 522 mm<3>na dl9. Nasuprot tome, nijedan od 9 miševa (0%) tretiranih ekvimolarnom dozom BCMA50-BiTE<®>(2.6 nM/kg) po režimu jednom nedeljno tokom 3 nedelje nije imao regresiju tumora ni u jednoj vremenskoj tački. Tabela 30 pokazuje progresiju zapremina tumora tokom vremena u svim eksperimentalnim grupama. Procenat rasta tumora izračunavan je za dl9 do d43 i

upoređivan između 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupe i BCMA50-BiTE<®>(2.6 nM/kg)

(Slika 30). Rezultati pokazuju da je TG (%) konzistentno i značajno redukovan u 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupi kao i da je TG (%) uvek niži kada se upoređuje sa BCMA50-BiTE<®>(2.6 nM/kg). Tabela 31 pokazuje srednju zapreminu tumora (TV) i procenat rasta tumora (TG (%>)) na dane 19 do 43. Ukupni rezultati jasno pokazuju daje 83A10-TCBcv superiorno u odnosu na BCMA50-BiTE<®>u indukovanju antitumorske aktivnostiin vivokada se tretman daje u ekvimolarnoj dozi po režimu jednom nedeljno tokom 3 nedelje.

Claims (14)

1. Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za dva cilja koja su vanćelijski domen antigena maturacije humanih B-ćelija (dalje označen i kao "BCMA") i humanog CD3s (dalje označen i kao "CD3"),naznačeno time,što sadrži a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za CD3, i gde su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim i c) gde je u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numerisanje po Kabat-u), i gde su u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numerisanje po Kabat-u).

2. Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za dva cilja koja su vanćelijski domen humanog BCMA i humanog CD3,naznačeno time,što sadrži a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za CD3, i gde su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim; i c) gde je u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numerisanje po Kabat-u), i gde su u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numerisanje po Kabat-u).

3. Bispecifično antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time, što pomenuto bispecifično antitelo sadrži dodatno Fab fragment pomenutog prvog antitela (dalje označen i kao "BCMA-Fab") i u konstantnom domenu CL pomenutog BCMA- Fab amino-kiselina na poziciji 124 supstituisana je nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numerisanje po Kabat-u), i pri čemu su u konstantnom domenu CH1 pomenutog BCMA-Fab amino-kiselina na poziciji 147 i amino-kiselina na poziciji 213 supstituisane nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numerisanje po Kabat-u).

4. Bispecifično antitelo prema zahtevu 2, naznačeno time, što pomenuto bispecifično antitelo sadrži dodatno drugi Fab fragment pomenutog prvog antitela ("BCMA-Fab").

5. Bispecifično antitelo prema bilo kojem od zahteva 1 do 4, naznačeno time, što je pored zamene amino-kiseline na poziciji 124 u konstantnom domenu CL amino- kiselina na poziciji 123 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H).

6. Bispecifično antitelo prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, naznačeno time, što je amino-kiselina 124 K, amino-kiselina 147 je E, amino-kiselina 213 je E i amino-kiselina 123 je R.

7. Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za vanćelijski domen humanog BCMA i za humani CD3, naznačeno time, što sadrži set teških i lakih lanaca odabran iz grupe koja se sastoji od polipeptida i) SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 i SEQ ID NO:46 (set 1) , ii) SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 i SEQ ID NO:49 (set 2) , i iii) SEQ TD NO:45, SEQ TD NO:50, SEQ TD N0:51 i SEQ TD NO:52 (set 3).

8. Antitelo prema bilo kojem od zahteva 7,naznačeno time,što je u delu antitela koje se specifično vezuje za humani CD3 varijabilni domen VH zamenjen varijabilnim domenom VH koji sadrži teškolančane CDR SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao respektivne teškolančane CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni domen VL je zamenjen varijabilnim domenom VL koji sadrži lakolančane CDR SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao respektivne lakolančane CDR1, CDR2 i CDR3 anti-CD3e antitela.

9. Antitelo prema bilo kojem od zahteva 1 do 6,naznačeno time,što se CH3 domen jednog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca susreću na kontaktnoj površini koja sadrži originalnu kontaktnu površinu između CH3 domena antitela; pri čemu je pomenuta kontaktna površina promenjena tako da se podstakne formiranje bispecifičnog antitela, pri čemu se promena karakteriše time što je: a) CH3 domen jednog teškog lanca izmenjen, tako da je unutar originalne kontaktne površine CH3 domena jednog teškog lanca, koja se susreće sa originalnom kontaktnom površinom CH3 domena drugog teškog lanca unutar bispecifičnog antitela, aminokiselinska rezidua zamenjena aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem veće zapremine, čime se stvara izbočina unutar kontaktne površine CH3 domena jednog teškog lanca, koja može da se smesti u udubljenje unutar kontaktne površine CH3 domena drugog teškog lanca i b) CH3 domen drugog teškog lanca je izmenjen, tako da je unutar originalne kontaktne površine drugog CH3 domena koja se susreće sa originalnom kontaktnom površinom prvog CH3 domena unutar bispecifičnog antitela, aminokiselinska rezidua zamenjena aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem manje zapremine, čime se stvara udubljenje unutar kontaktne površine drugog CH3 domena u koje može da se smesti izbočina u kontaktnoj površini prvog CH3 domena.

10. Metod pripremanja bispecifičnog antitela prema bilo kojem od zahteva 1 do 9,naznačen time,što uključuje korake a) transformisanja ćelije-domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju laki lanac i teški lanac antitela prema bilo kojem od zahteva 1 do 9, b) kultivisanja ćelije-domaćina pod uslovima koji dopuštaju sintezu molekula pomenutog antitela; i c) sakupljanja molekula pomenutog antitela iz pomenute kulture.

11. Ćelija-domaćin, naznačenatime,što sadrži vektore koji sadrže molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju lake lance i teške lance antitela prema bilo kojem od zahteva 1 do 9.

12. Farmaceutska smeša, naznačena time, što sadrži antitelo prema bilo kojem od zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.

13. Antitelo prema bilo kojem od zahteva 1 do 9 ili farmaceutska smeša prema zahtevu 12,naznačeni time,što se koriste kao lek.

14. Antitelo prema bilo kojem od zahteva 1 do 9 ili farmaceutska smeša prema zahtevu 12, naznačeni time, što se koriste kao lek za lečenje poremećaja plazmocita kao što je multipli mijelom.