RS55726B1 - Varijanta aktivin receptorskih polipeptida i njihove upotrebe - Google Patents

Description

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

[0001]Tehnička oblast ovog pronalaska sc odnosi na članove familije transformišućeg faktora rasta-fl (TGF-P) i rastvorljive TGF-P receptore, kao i na modulaciju aktivnosti TGF-P članova familije za lečenje različitih poremećaja.

STANJE TEHNIKE

[0002]Familija proteina transformišućeg faktora rasta P (TGF-P) uključuje transformišuće faktore rasta-P (TGF-P), aktivine, koštane morfogene proteine (BMP), faktore rasta nerava (NGFs), neurotrofni moždani faktor (BDNF), i faktore rasta/diferencijacije (GDFs). Ovi članovi familije su uključeni u regulaciju širokog spektra bioloških procesa, uključujući ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju i druge funkcije.

[0003]Faktor rasta/diferencijacije 8 (GDF-8), takođe označen kao miostatin, je jedan član TGF-P familije eksprimiran najvećim delom u ćelijama u razvoju i tkivu odraslih skeletnih mišića. Miostatin izgleda da igra važnu ulogu u negativnoj kontroli rasta skeletnih mišića (McPherron et al., Nature (London) 387, 83-90 (1997)). Antagonizovanje aktivnosti miostatina je dokazano da povećava mišićnu masu kod životinja (McFerron et al., supra, Zimmers et al., Science 296:1486 (2002)).

[0004]Drugi član TGF-P familije proteina je srodni faktor rasta/diferencijacije, GDF-11. GDF-11 ima oko 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom miostatina. GDF-11 ima ulogu u aksijalnom modelu kod životinja u razvoju (Oh et al, Genes Dev 11:1812-26 (1997)), a takođe izgleda da igra ulogu u razvoju i rastu skeletnih mišića.

[0005]Aktivini A, B i AB su homodimeri i heterodimer respektivno od dva polipeptidna lanca, PA i PB (Vale et al. Nature 321, 776-779 (1986), Ling et al., Nature 321, 779-782 (1986)). Aktivini su prvobitno otkriveni kao gonadni peptidi uključeni u regulaciju sinteze folikulo-stimulišućeg hormona, a sada se veruje da su uključeni u regulaciju brojnih bioloških aktivnosti. Aktivin A je dominantan oblik aktivina.

[0006]Aktivin, miostatin, GDF-11 i drugi članovi TGF-P superfamilije vezuju i signaliziraju putem kombinacije aktivinskih receptora tipa II i tipa IIB, od kojih su oba transmembranske serin/treonin kinaze (Harrison et al., J. Biol. Chem. 279, 28036-28044 (2004)). Studijama unakrsnog vezivanja utvrđeno je da je miostatin sposoban da veže aktivinske receptore tipa II ActRIIA i ActRIIBin vitro(Lee et al, PNAS USA 98:9306-11 (2001)). Takođe postoji dokaz da se GDF-11 vezuje za oba ActRIIA i ActRIIB (Oh et al, Genes Dev 16:2749-54 (2002)).

[0007]Poznato je da je ekspresija proteina TGF-P povezana sa različitim bolestima i poremećajima. Stoga, terapeutski molekuli sposobni da antagonizuju nekoliko proteina TGF-P istovremeno mogu biti posebno efikasni za ove bolesti i poremećaje.

[0008]Pored toga, proizvodnja terapeutika na bazi proteina može biti komplikovana usled problema koji se dešavaju tokom ekspresije i prečišćavanja proteina. Jedan problem je agregacija proteina tokom ekspresije ili prečišćavanja. Nagomilavanje visokih nivoa proteina u uslovima ćelijske kulture može dovesti do agregacije. Procesi prečišćavanja mogu izložiti proteine dodatnim faktorima koji promovišu dalju agregaciju (Cromwell, M.E.M. et al., The AAPS Journal 8:E572-E579, 2006). Pokušaji mogu biti načinjeni da ublaže faktore koji uzrokuju agregaciju, međutim, postoji potreba za proteinima dizajniranim tako da imaju smanjenu tendenciju ka stvaranju agregata. Predmetni pronalazak ispunjava potrebu za terapeutskim molekulima koji se vezuju za više liganada i imaju smanjenu agregaciju i stoga poboljšanu produktivnost, kako bi sc efikasno proizveli proteini korisni za lečenje TGF-P povezanih stanja bolesti.

SUŠTTNA PRONALASKA

[0009]Kako se ovde koristi izraz vActRIIB polipeptid se odnosi na oba, humane vActRIIB polipeptide i humane vActRIIB5 polipeptide.

[0010]Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani protein koji sadrži varijantu polipeptida aktivinskih IIB receptora (vActRIIB) pri čemu je navedeni polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od: (a) polipeptida koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u SEKID BR: 18, osim pojedinačne aminokiselinske supstitucije na položaju 28, pri čemu je supstitucija odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E;

(b) polipeptida koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u aminokiselinama 19 do 134

iz SEK ID BR:18, osim pojedinačne aminokiselinske supstitucije na položaju 28, pri čemu je supstitucija odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E;

(c) polipeptida koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u aminokiselinama 23 do 134

iz SEK ID BR:18, osim pojedinačne aminokiselinske supstitucije na položaju 28, pri čemu je supstitucija odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E;

(d) polipeptida koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u aminokiselinama 25 do 134

iz SEK ID BR:18, osim pojedinačne aminokiselinske supstitucije na položaju 28, pri čemu je supstitucija odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E;

(e) polipeptida koji ima najmanje 90 % identičnosti sa bilo kojim od (a) preko (d),

pri čemu je supstitucija na položaju 28 odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E, a pri čemu je polipeptid sposoban da veže miostatin, aktivin A, ili GDF-11.

[0011]U jednom aspektu otkrivenosti pronalaska, protein sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 2 ili 18 u kojoj su aminokiseline na jednom ili drugom položaju E28 ili R40, ili su oba položaja E28 i R40 supstituisana sa drugom neprirodnom aminokiselinom i gde je polipeptid sposoban da veže miostatin, aktivin A, ili GDF-11. U jednom aspektu otkrivenosti pronalaska, protein sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 2 ili 18 u kojoj su aminokiseline na položajima E28 ili R40, ili su oba položaja E28 i R40 supstituisana sa neprirodnom aminokiselinom, a pri čemu je signalni peptid uklonjen, pri čemu je polipeptid sposoban da veže miostatin, aktivin A, ili GDF-11. U jednom aspektu otkrivenosti pronalaska, protein sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 2 ili 18 u kojoj su aminokiseline na položajima E28 ili R40, ili su oba položaja E28 i R40 supstituisana sa drugom aminokiselinom, gde je signalna sekvenca uklonjena, a N-završetak zrelog polipeptida je odsečen, i pri čemu je polipeptid sposoban da veže miostatin, aktivin A, ili GDF-11. U jednom aspektu otkrića N-terminalnom zrelom presečenom vActRIIB polipeptidu nedostaju N-terminalne četiri aminokiseline ili N-terminalne šest aminokiseline zrele sekvence, pri čemu je polipeptid sposoban da veže miostatin, aktivin A, ili GDF-11. U jednoj realizaciji, supstitucija na položaju E28 je odabrana iz grupe koju čine W, Y i A. U daljoj realizaciji, supstitucija na položaju E28 je odabrana iz grupe aminokiselina koju čine A, F, Q, V, I, L, M, K, H, V i Y. U daljem ostvarenju polipeptid dalje sadrži heterologni protein. U jednom izvođenju, heterologni protein je humani Fc domen. U daljem ostvarenju, humani Fc domen je humani IgG Fc domen.

[0012]U jednoj realizaciji, protein obuhvata polipeptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEK TD BR: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40,42, 87, ili 88.

[0013]U drugoj realizaciji, protein sadrži polipeptid kodiran pomoću polinukleotida koji ima sekvencu navedenu u SEK ID BR: 19, 23, 25, 27, 33, 37, 39, 41, 59, 61, 63, 92, 94, 96 ili njegov komplement.

[0014]U drugom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotid koji kodira varijantu polipeptida vActRIIB iz pronalaska. U jednoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji ima sekvencu nukleinske kiseline, navedenu u SEK ID BR: 19, 23, 25, 27, 33, 37, 39,41, 59, 61, 63, 92, 94, 96 ili njegov komplement.

[0015]U drugoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u grupi koju čine SEK ID BR: 20, 24 , 26, 28, 34, 38, 40, 42, 60, 62, 64, 87, 88, 91, 93, 95 i 97. U daljem ostvarenju, molekul nukleinske kiseline dalje obuhvata transkripcionu ili translacionu regulatornu sekvencu. U drugom aspektu obezbeđen je rekombinantni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline vActRIIB. U drugom aspektu, obezbeđene su ćelije domaćina koje sadrže rekombinantne vektore kao i metode za proizvodnju vActRIIB polipeptida.

[0016]Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje preparat koji sadrži najmanje jedan vActRIIB polipeptid ili protein iz sadašnjeg pronalaska. U jednoj realizaciji, kompozicija je farmaceutska kompozicija koja sadrži vActRIIB polipeptid ili protein u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0017]U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje protein ili kompoziciju pronalaska za upotrebu: (i) za inhibiciju aktivnosti miostatina ili povećanje mišićne mase ili povećanje odnosa mišićne mase prema masnoj masi kod subjekta kome je potreban takav tretman; (ii) za lečenje bolesti gubitka mišićne mase ili metaboličkog poremećaja kod subjekta kome je potreban takav tretman; ili (iii) za lečenje bolesti u kojima je aktivin prekomerno eksprimiran kod subjekta kome je potreban takav tretman. Bolest gubitka mišićne mase uključuje ili rezultira od, ali nije ograničena na, sledeća stanja: tumorsku kaheksiju, mišićnu distrofiju, amiotrofičnu lateralnu sklerozu, kongestivnu opstruktivnu plućnu bolest, hroničnu srčanu insuficijenciju, hemijsku kaheksiju, kaheksiju usled HIV/AIDS-a, bubrežnu insuficijenciju, uremiju, reumatoidni artritis, starosnu sarkopeniju, starosnu slabost, atrofiju organa, sindrom karpalnog tunela, androgenu deprivaciju i gubitak mišićne mase usled neaktivnosti zbog produženog ležanja u krevetu, povrede kičmene moždine, šloga, frakture kostiju, i starenja. Gubitak mišićne mase može takođe da rezultira iz bestežinskog stanja usled svemirskog leta, insulinske rezistencije, gubitka mišićne mase usled opekotina, androgene deprivacije i drugih poremećaja. U jednoj realizaciji, bolest u kojoj je aktivin prekomerno eksprimiran je kancer. Metabolički poremećaj može biti odabran od gubitka kostiju, dijabetesa, gojaznosti, smanjene tolerancije glukoze, hiperglikemije, androgene deprivacije i metaboličkog sindroma. Sadašnji pronalazak obezbeđuje upotrebu terapeutske kompozicije u pripremi leka za lečenje navedenih poremećaja. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor koji

kodira vActRIIB polipeptid ili protein iz sadašnjeg pronalaska za upotrebu u lečenju poremećaja gubitka mišićne mase ili metaboličkog poremećaja kod subjekta kome je potreban takav tretman, gde je vektor je sposoban da reguliše ekspresiju vActRIIB polipeptida kod subjekta.

KRATAK OPIS SLIKA

[0018]Slika 1. Slika 1 prikazuje aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa rastvorljivog ActRIIB-humanog IgGIFc (SEK ID BR: 98). Signalna peptidna sekvenca je u boldu, praćena sa zrelim ActRIIB ekstracelularnim domenom, a humani IgGl Fc je u kurzivu, uključujući delimični spojni region. Aminokiseline E28 i R40 su podvučene. Linker sekvenca GGGGS (SEK ID BR: 75) je u kurzivu i podvučena.

Slika 2. Slika 2 prikazuje aminokiselinsku sekvencu rastvorljivog ActRIIB5-humanog IgGIFc (SEK ID BR: 99). Signalna sekvenca peptida je u boldu, sledi zreli ActRIIB5 rastvorljivog domena, i humani IgGl Fc, uključujući delimičan spojni region, je u kurzivu. E28 i R40 su podvučeni. Linker sekvenca (GGGGS) (SEK ID BR: 75) je u kurzivu i podvučena.

Slika 3. Slika 3 prikazuje efekat tretmana sa rastvorljivim vActRIIB-Fc E28W na masu testisa (Slika 3A) i jajnika (Slika 3B) kod inhibin-a nokaut miševa.

Slika 4. Slika 4 prikazuje efekat tretmana rastvorljivim vActRIIB-Fc E28W na stopu preživljavanja kod mužjaka (Slika 4A) i ženki (Slika 4B) inhibin-a nokaut miševa.

Slika 5. Slika 5 prikazuje efekat tretmana rastvorljivim vActRIIB-Fc E28W na telesnu težinu kod kolon 26 tumor noscćih miševa.

Slika 6. Slika 6 prikazuje efekat tretmana rastvorljivim vActRIIB-Fc E28W na preživljavanje kod kolon

26 tumor nosećih miševa.

DETALJAN OPIS

[0019]Opisani su proteini koji sadrže varijantu polipeptida humanih aktivinskih IIB receptora (vActRIIB). Ovi proteini i polipeptidi se odlikuju njihovom sposobnošću vezivanja za najmanje jedan od tri TGF-P proteina, miostatin (GDF-8), aktivin A, i GDF-11, kao i time što inhibiraju aktivnosti ovih proteina. Ovi proteini i polipeptidi takođe ispoljavaju smanjenu tendenciju za agregaciju u odnosu na polipeptide koji ne sadrže modifikacije ovde opisane. Modifikacije se sastoje od aminokiselinske supstitucije na položajima 28, 40, ili oba položaja 28 i 40 sa referencom na divlji tip ActRIIB pristupnog broja NP 001097 (SEK ID BR: 47), i ekstracelularni domen ActRIIB (SEK ID BR: 18) ili ActRIIBS (SEK ID BR: 2).

[0020]Kako je ovde korišćen izraz "TGF-P članovi familije" ili "TGF-P proteini" se odnosi na strukturno povezane faktore rasta iz familije transformišućeg faktora rasta uključujući aktivine, proteine faktora rasta i diferencijacije (GDF) (Kingslev et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherron et al. Growth factors and cvtokines in health and disease, Vol. 1B, D. LeRoith i C.Bondv. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, SAD: str 357-393).

[0021]GDF-8, takođe označen kao miostatin, je negativni regulator skeletno-mišićnog tkiva

(McPherron et al. PNAS USA 94: 12457-12461 (1997)). Miostatin se sintetiše kao neaktivni proteinski kompleks dužine oko 375 aminokiselina, koji ima GenBank pristupni br: AAB86694 (SEK ID BR: 49) za čoveka. Proteinski prekursor se aktivira proteolitičkim cepanjem na tetrabazičnom mestu obrade da proizvede N-terminalni neaktivni prodomain i C-tcrminalni protein približno 109 aminokiselina koji dimerizuje da formira homodimer od oko 25 kDa. Ovaj homodimer je zreo, biološki aktivan protein (Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002)).

[0022]Kako se ovde koristi, izraz "prodomain" ili "propeptid" se odnosi na neaktivni N- terminalni protein koji se čepa da oslobodi aktivni C-terminalni protein. Kako se ovde koristi izraz "miostatin" ili "zreo miostatin" se odnosi na zreo, biološki aktivan C-terminalni polipeptid u obliku monomera, dimera ili drugom obliku, kao i biološki aktivne fragmente ili srodne polipeptide uključujući alelne varijante, spojne varijante i fiizioni peptide i polipeptide. Prijavljeno je da zreo miostatin ima 100% identičnosti sekvence između mnogih vrsta, uključujući čoveka, miša, pile, svinju, ćurku i pacova (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)).[0023]Kako se ovde koristi GDF-11 se odnosi na BMP (koštani morfogeni protein) koji ima Svvissprot pristupni broj 095390 (SEK ID BR: 50), kao i njihove varijante i homologne vrste tog proteina. GDF-11 ima oko 90% identičnosti prema miostatinu na aminokiselinskom nivou. GDF-11 je uključen u regulaciju prednjeg/zadnjeg šablona aksijalnog skeleta (McPherron et al, Nature Genet. 22 (93): 260-264 (1999); Gamer et al, Dev. Biol. 208 (1), 222-232 (1999)), ali su postnatalne funkcije nepoznate.

[0024]Aktivin A je homodimer polipeptidnih lanaca p"A. Kako je ovde korišćen izraz "aktivin A" se odnosi na aktivin protein koji ima GenBank pristupni broj: NM 002192 (SEK ID BR: 48), kao i njihove varijante i homologne vrste tog proteina.

Aktivinski receptori

[0025]Kako je ovde korišćen, izraz aktivinski tip IIB receptora (ActRIIB) se odnosi na humane aktivinske receptore koji imaju pristupni broj NP 001097 (SEK ID BR: 47). Izraz rastvorljivi ActRIIB obuhvata ekstracelularni domen ActRIIB (SEK ID BR: 18), ActRIIB5 (SEK ID BR: 2) i ove sekvence gde je arginin na položaju 64 supstituisan alaninom.

Varijanta rastvorljivih ActRIIB polipeptida

[0026]Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovane proteine koji sadrže varijantu humanih rastvorljivih ActIIB receptorskih polipeptida (ovde označen kao vActRIIB polipeptidi, ili varijanta polipeptida). Kako je ovde korišćen izraz "vActRIIB protein" se odnosi na protein koji sadrži vActRIIB polipeptid. Kako je ovde korišćen izraz "izolovan" se odnosi na molekul proteina ili polipeptida prečišćen do izvesnog stepena od endogenog materijala. Ovi polipeptidi i proteini su okarakterisani da imaju sposobnost da vežu i inhibiraju aktivnost bilo kog od aktivina A, miostatina ili GDF-11. U nekim aspektima, afinitet vezivanja varijantnih polipeptida za aktivin A, miostatin ili GDF-11 je poboljšan u poređenju sa divljim tipom polipeptida.

[0027]U jednom aspektu, vActRIIB polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 2 ili 18 u kojima se aminokiseline bilo na položaju E28 ili R40, ili su oba položaja E28 i R40 supstituisana sa drugom neprirodnom aminokiselinom, i pri čemu je polipeptid sposoban da veže miostatin, aktivin A, ili GDF-11. U sledećoj realizaciji, vActRIIB polipeptidi su zrele verzije ili su skraćene zrele verzije ovih sekvenci. Kako se ovde koristi izraz "zreli vActRIIB polipeptid" se odnosi na polipeptid koji ima uklonjenu aminokiselinsku signalnu sekvencu. U jednom aspektu, zrele sekvence su, na primer, aminokiseline 19 do 160 iz SEK ID BR: 2, i aminokiseline 19 do 134 iz SEK ID BR: 18, gde su jedna ili obe aminokiseline na položajima 28 i 40 supstituisane sa drugom neprirodnom aminokiselinom i polipeptidi zadržavaju sposobnost da se vežu za aktivin A, miostatin ili GDF-11. Kako se ovde koristi izraz skraćeni zreo vActRIIB polipeptid se odnosi na polipeptid koji ima signalnu sekvencu i u dodatku uklonjene aminokiseline sa N-završetka zrelog polipeptida. U jednom aspektu, uklonjene su zrele N-terminalne 4 aminokiseline ili N-terminalne 6 aminokiseline zrelog polipeptida. U ovom aspektu, skraćene zrele sekvence su, na primer, aminokiseline 23 do 160 iz SEK TD BR: 2, ili aminokiseline 25 do 160 iz SEK TD BR: 2; i aminokiseline 23 do 134 iz SEK ID BR: 18, ili aminokiseline 25 do 134 iz SEK ID BR: 18 gde su jedna ili obe aminokiseline na položajima 28 i 40 supstituisane sa ne-divljim tipom aminokiselina koje zadržavaju sposobnost da se vezuju za aktivin A, miostatin ili GDF-11. Kako se ovde koristi, izraz "položaj 28" i "položaj 40" (to je, E28 i R40) se odnosi na položaj aminokiseline u odnosu na sekvence SEK ID BR: 2 i 18 koje uključuju 18 aminokiselina signalne sekvence. Radi doslednosti, ako zreli vActRIIB polipeptidi imaju supstitucije na položaju 10 i/ili položaju 22, ili skraćeni zreli polipeptidi imaju supstitucije na položaju 6 i/ili položaju 18, ili supstitucije na položaju 4 i/ili položaju 16 u odnosu na zrele ili skraćene zrele sekvence, ove varijante će i dalje biti upućene na u pogledu pune dužine SEK ID BR: 2 i 18, ili kao što je prikazano na slici 1 ili 2, odnosno, aminokiselinsku supstituciju na položaju E28 i/ili R40. Takvi zreli aspekti ili N-terminalni skraćeni aspekti su objašnjeni primerima u nastavku.

[0028] U jednom aspektu, supstitucija na položaju E28 je odabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od W, Y i A. U jednom aspektu, supstitucija na položaju 28 je W. U daljem aspektu supstitucija na položaju 28 je odabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y. U daljem aspektu, supstitucija na položaju 40 je odabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od G, Q, M, H, K i N. U daljem aspektu supstitucija na položaju 28 je odabrana iz grupe aminokiselina koju čine A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y i supstitucija na položaju 40 je odabrana iz grupe aminokiselina koju čine A, G, Q, M, H, K i N. U jednom aspektu, protein sadrži polipeptide koji imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, i 97. U drugom aspektu, protein sadrži polipeptid kodiran polinukleotidom koji ima sekvencu navedenu u grupi koja se sastoji od SEKID BR: 3,5,7, 9, 11, 13, 15, 19,21,23,25,27, 29,31,33,35,37, 39,41,43, 45,51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, 96 ili njegov komplement.

[0029] U jednom aspektu, signalne sekvence se uklanjaju iz vActRIIB polipeptida, ostavljajući zrele varijante polipeptida. Različiti signalni peptidi se mogu koristiti u pripremi polipeptida instant primene. Signalni peptidi mogu imati sekvencu prikazanu na Slikama 1 i 2 (SEK ID BR: 73), ili alternativne signalne sekvence kao što su SEK ID BR: 74, signalne sekvence za SEK ID BR: 2 i 18. Mogu se koristiti bilo koji drugi signalni peptidi korisni za ekspresiju vActRIIB ili vActRIIB5 polipeptida.

[0030] U drugom aspektu, vActRIIB polipeptidi imaju sekvence koje su suštinski slične sa SEK ID BR: 2 i 18. Kako se ovde koristi izraz "suštinski sličan" se odnosi na polipeptide koji imaju najmanje oko 80% identičnosti, najmanje oko 85% identičnosti, najmanje oko 90% identičnosti, najmanje oko 95% identičnosti, najmanje oko 98%o identičnosti, ili najmanje oko 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEK ID BR: 2 i 18, i gde su jedna ili obe aminokiseline na položajima 28 i/ili 40 supstituisane sa tipom aminokiselina koji nije divlji, pri čemu polipeptid zadržava aktivnost polipeptida iz SEK ID BR: 2 i 18, to je sposobnost da se veže i inhibira miostatin, aktivin A ili GDF-11. Pored toga, izraz vActRIIB polipeptid obuhvata fragmente iz SEK ID BR: 2 ili 18 kao što su N i C terminalna skraćenja koja sadrže supstitucije na položaju 28 i/ ili 40 ovde opisane, pri čemu je polipeptid sposoban da veže i inhibira miostatin, aktivin A ili GDF- 11.

[0031]Kako je ovde korišćen izraz "derivat" od vActRIIB i vActRIIB5 polipeptida se odnosi na dodatak najmanje jedne dodatne hemijske grupe, ili najmanje jednog dodatnog polipeptida da formiraju kovalentne ili agregatne konjugate kao što glikozil grupe, lipidi, acetil grupe, ili C-terminalni ili N-terminalni fuzioni polipeptidi, konjugacija sa PEG molekulima, i druge modifikacije koje su opisane potpunije u nastavku. Varijanta polipeptida ActRITB receptora (vActRIIB) može takođe da uključuje dodatne modifikacije i derivate, uključujući modifikacije završetaka C i N koje proističu iz prerade usled ekspresije u različitim tipovima ćelija kao što su ćelije sisara, E. coli, kvasaca i drugim rekombinantnim ćelijama domaćina. Dalje su obuhvaćeni vActRIIB polipeptidni fragmenti i polipeptidi koji sadrže inaktivirano N-mesto(a) glikozilacije, inaktivirano mesto(a) obrade proteaze ili konzervativnu supstituciju(e) aminokiselina, od polipeptidnih sekvenci navedenih u SEK ID BR: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, i 97.

[0032]Kako se ovde koristi, izraz jedna "vActRIIB ili vActRIIB5 polipeptidna aktivnost" ili "biološka aktivnost rastvorljivog ActRIIB ili ActRIIB5 polipeptida" se odnosi na jednu ili višein vitroiliin vivoaktivnosti vActRIIB i vActRIIB5 polipeptida, uključujući ali ne ograničavajući se na one prikazane u primeru ispod. Aktivnosti vActRIIB polipeptida uključuju, ali nisu ograničene na, sposobnost da se vežu za miostatin ili aktivin A ili GDF-11, kao i sposobnost da redukuju ili neutrališu aktivnost miostatina ili aktivina A ili GDF-11. Kako se ovde koristi, izraz "sposoban da se veže" za miostatin, aktivin A, ili GDF- 11 se odnosi na vezivanje koje je izmereno postupcima poznatim u struci, kao što je Biacore metod opisan u Primeru 2 ispod. Takođe, u Primeru 2, pMARE C2C12 ćelijski-baziranom testu meri se aktivnost neutralisanja aktivina A, aktivnost neutralisanja miostatina, i aktivnost neutralisanja GDF-11.In vivoaktivnosti uključuju, ali nisu ograničene na povećanje telesne mase, povećanje posne mišićne mase, povećanje skeletne mišićne mase, smanjenje masne mase kao što je pokazano na životinjskim modelima ispod i kao što je poznato u tehnici. Biološke aktivnosti dalje uključuju smanjenje ili sprečavanje kaheksije izazvane određenim tipovima tumora, sprečavanje rasta određenih vrsta tumora i povećanje preživljavanja pojedinih životinjskih modela. Dalja diskusija polipeptidnih aktivnosti vActRIIB je prikazana ispod.

[0033]Polipeptidi prema predmetnom pronalasku dalje obuhvataju heterologne polipeptide pričvršćene za vActRIIB polipeptid bilo direktno ili preko sekvence linkera da se formira fuzioni protein. Kako je ovde korišćen izraz "fuzioni protein" označava protein koji ima heterologni polipeptid vezan putem rekombinantnih DNK tehnika. Heterologni polipeptidi obuhvataju, ali nisu ograničeni na Fc polipeptide, njegove oznake i leucin domene zatvarača da promovišu oligomerizaciju i stabilizaciju varijante ActRIIB polipeptida kao što je opisano, u na primer, WO 00/29581. U jednom aspektu, heterologni polipeptid je Fc polipeptid ili domen. U jednom aspektu, Fc domen je odabran od humanog IgGl, IgG2 i IgG4 Fc domena. Oni su obezbeđeni u SEK ID BR: 80, 82 i 84. vActRIIB može dalje da sadrži sve ili deo zglobnih sekvenci iz IgGl, IgG2 ili IgG4 susedan njegovom odgovarajućem IgG Fc regionu. Pune zglobne sekvence za IgGl, IgG2 i IgG4 su obezbeđene u SEK ID BR: 76, 77, i 78 respektivno.

[0034]vActRIIB polipeptid može izborno dodatno da sadrži "linker" sekvencu. Linkeri služe prvenstveno kao odstojnici između polipeptida i drugog heterolognog polipeptida ili druge vrste fuzije ili između dve ili više varijanti ActRIIB polipeptida. U jednoj varijanti, linker je sačinjen od aminokiselina povezanih peptidnim vezama, poželjno od 1 do 20 aminokiselina povezanih peptidnim vezama, gde su aminokiseline odabrane od 20 prirodnih aminokiselina. Jedna ili više ovih aminokiselina može biti glikozilirana, kao što je shvaćeno od strane stručnjaka u tehnici. U jednoj realizaciji, 1 do 20 aminokiselina je odabrano od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, i lizina. Poželjno, linker je sačinjen od većine amino kiselina koje su prostorno neometane, kao što su glicin i alanin. Primcri linkcra su poliglicini (posebno (Gli)5, (Gli)s, poli (Gli-Ala) i polialanini. Jedan primer pogodnog linkera kao što je prikazano u Primerima u nastavku je (Gli)4Ser (SEK ID BR: 75). U sledećoj realizaciji, vActRIIB može sadržati zglobni linker, to su linker sekvence koje su obezbeđene neposredno sa zglobnim regionom, kako je prikazano primerom u SEK TD BR: 79.

[0035]Linkeri su takođe nepeptidni linkeri. Na primer, mogu biti korišćeni alkil linkeri kao što su -NH- (CH2) S-C (O) -, gde je s = 2 - 20. Ovi alkil linkeri mogu dalje biti supstituisani sa bilo kojom neprostorno ometajućom grupom kao što je niži alkil (npr, CrC6) niži acil, halogen (npr, Cl, Br), CN, NH2, fenil, itd.

[0036]U jednom aspektu vActRIIB polipeptidi mogu biti vezani za Fc polipeptid, direktno ili preko linkera ili preko zglobnog linkera. U jednom aspektu, Fc je humani IgG Fc. vActRIIB vezan za Fc uključuje na primer, vActRIIB-IgGIFc, E28A (SEK ID BR: 60); vActRIIB-IgGIFc, E28W (SEK ID BR: 62), vActRIIB-IgGIFc, E28Y (SEK ID BR: 64), vActRIIB-IgG Fc, R40G (SEK ID BR: 66), vActRIIB5-IgGlFc, E28A (SEK ID BR: 70), i vActRIIB5-IgGlFc E28W (SEK ID BR: 72), kao što je prikazano u Tabelama 1 i 2, a opisano ovde u Primerima. Daljnji aspekti uključuju vActRIIB- IgG2 Fc, E28W (SEK ID BR: 91), vActRIIB-IgG2 Fc, E28Y (SEK ID BR: 93), i vActRIIB-IgG2 Fc (SEK ID BR: 95). Za varijante je pokazano da proizvode manje agregacije u poređenju sa divljim tipom ActRIIB-IgG2 IgG2, kao što je pokazano u niže datim Primerima.

[0037]vActRIIB polipeptidi ovde opisani takođe mogu biti vezani za molekul koji nije polipeptid radi obezbeđivanja željenih svojstava kao što je smanjenje degradacije i/ili povećanje poluživota, smanjenje toksičnosti, smanjenje imunogenosti i/ili povećanje biološke aktivnosti ActRIIB polipeptida. Primeri molekula uključuju, ali nisu ograničeni na linearne polimerc kao što su polietilen glikol (PEG), polilizin, dekstran; lipid; holesterol grupa (kao što je steroid); ugljeni hidrat, ili molekul oligosaharida.

[0038]U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline, koji sadrže polinukleotide koji kodiraju vActRIIB polipeptide iz predmetnog pronalaska. Kako je ovde korišćen izraz "izolovane" se odnosi na molekule nukleinske kiseline prečišćene do izvesnog stepena od endogenog materijala. U jednom aspektu, molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska sadrži polinukleotid koji kodira polipeptide iz SEK ID BR: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44,46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, i 97. Zbog poznate degeneracije genetskog koda, gde više od jednog kodona može kodirati istu aminokiselinu, DNK sekvenca može odstupati od prikazane u SEK ID BR: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 , 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, i 96 ili komplementarnim lancem SEK ID BR: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, i 96, i još kodiraju polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, i 97. Takve varijante DNK sekvenci mogu rezultirati usled tihih mutacija koje se javljaju tokom proizvodnje, ili mogu biti proizvod namerne mutageneze ovih sekvenci.

[0039]U drugom aspektu molekul nukleinske kiseline iz sadašnjeg pronalaska sadrži polinukleotid koji ima polinukleotidnu sekvencu navedenu u SEK ID BR: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, i 96 ili komplementarni lanac od SEK ID BR: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, i 96. U drugom aspektu, sadašnji pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji hibridizuju pod strogim ili umerenim uslovima sa polipeptid-kodirajućim regionima od SEK ID BR: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, i 96 pri čemu kodirani polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID BR: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, i 97 i gde kodirani polipeptid održava aktivnost vActRIIB polipeptida.

[0040]Molekuli nukleinske kiseline iz pronalaska uključuju DNK i u jednolančanom i dvolančanom obliku, kao i njegove RNK komplemente. DNK uključuje, na primer, cDNK, genomsku DNK, sintetičku DNK, DNK amplifikovanu sa PCR-om, i njihove kombinacije. Genomska DNK može biti izolovana konvencionalnim tehnikama, kao što je pomoću DNK iz SEK ID BR: 1 ili 17, ili pogodno fragmenta, kao probe. Genomska DNK koja kodira polipeptide ActRIIB-a se dobija iz genomskih biblioteka koje su na raspolaganju za više vrsta. Sintetička DNK je dostupna putem hemijske sinteze preklapanja oligonukleotidnih fragmenata praćene udruživanjem fragmenata da se ponovo uspostavi deo ili svi regioni kodiranja i bočne sekvence. RNK mogu biti dobijene iz prokariotskih vektora ekspresije koji upravljaju sintezom iRNK na visokom nivou, kao što su vektori korišćenjem T7 promotera i RNK polimeraze. cDNK se dobija iz biblioteka dobijenih iz iRNK izolovane iz različitih tkiva koja eksprimiraju ActRIIB. DNK molekuli iz pronalaska uključuju gene pune dužine kao i polinukleotide i njihove fragmente. Gen pune dužine može takođe da uključuje sekvence koje kodiraju N-terminalnu signalnu sekvencu.

[0041]U drugom aspektu sadašnjeg pronalaska, ekspresioni vektori koji sadrže sekvence nukleinskih kiselina su takođe obezbeđeni, a ćelije domaćina su transformisane sa takvim vektorima i metode proizvodnje vActRIIB polipeptida su takođe obezbeđene. Izraz "ekspresioni vektor" se odnosi na jedan plazmid, fag, virus ili vektor za ekspresiju jednog polipeptida iz jedne polinukleotidne sekvence. Vektori za ekspresiju vActRIIB polipeptida sadrže minimum sekvenci neophodnih za prenošenje vektora i za ekspresiju kloniranog umetka. Izvcsni ekspresioni vektor sadrži transkripcionu jedinicu koja sadrži skup (1) genetičkog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u genskoj ekspresiji, na primer, promoteri ili pojačivači, (2) sekvencu koja kodira vActRIIB polipeptide koji će biti transkribovani u iRNK i prevedeni u protein, i (3) odgovarajuće transkripcije početka i završetka sekvenci. Ove sekvence mogu dalje da sadrže selekcioni marker. Vektori pogodni za ekspresiju u ćelijama domaćina su lako dostupni i molekule nukleinske kiseline su ubačene u vektore korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK. Takvi vektori mogu da sadrže promotere koji fimkcionišu u specifičnim tkivima i virusne vektore za ekspresiju vActRIIB u ciljnim ljudskim ili životinjskim ćelijama. Primer ekspresionog vektora pogodnog za ekspresiju vActRIIB je pDSRa, (opisan u WO 90/14363) i njegovi derivati, koji sadrže vActRIIB polinukleotide, kao i bilo koje dodatne odgovarajuće vektore poznate u stanju tehnike ili opisane u nastavku.

[0042]Primena dalje obezbeđuje postupke izrade vActRIIB polipeptida. Mnoštvo drugih sistema ekspresije/domaćina može biti korišćeno. Ovi sistemi uključuju, ali nisu ograničeni na mikroorganizme kao što su bakterije transformisane rekombinantnim bakteriofagom, plazmidski ili kozmidski DNK ekspresioni vektori; kvasac transformisan sa ekspresionim vektorima kvasca; sistemi ćelija insekata inficirani sa virusnim ekspresionim vektorima (npr, bakulovirus); sistemi biljnih ćelija transfektovani sa virusnim ekspresionim vektorima (npr, mozaični virus karfiola, CaMV; mozaični virus duvana, TMV) ili transformisani sa bakterijskim ekspresionim vektorima (npr, Ti ili pBR322 plazmid); ili sistemi životinjskih ćelija. Ćelije sisara korisne u produkciji rekombinantnog proteina uključuju, ali nisu ograničene na, VERO ćelije, HeLa ćelije, ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili njihove derivate poput Veggie CHO i srodne ćelijske linije koje rastu u medijumu bez seruma (videti Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) ili CHO soj DX-B11, koji je deficijentan u DHFR-u (videti Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20) COS ćelije poput COS-7 linije ćelija bubrega majmuna (ATCC CRL 1651) (vidi Gluzman et al, 1981, Cell 23:175), W138, BHK, HepG2, 3T3 (ATCC CCL 163), RIN, MDCK, A549, PC12, K562, L ćelije, C127 ćelije, BHK (ATCC CRL 10) ćelijske linije, CV1/EBNA ćclijska linija izvedena iz ćelijske linije bubrega afričkog zelenog majmuna CV1

(ATCC CCL 70)

(videti McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), humane embrionske bubrežne ćelije poput 293, 293 EBNA ili MSR 293, humane epidermalne A431 ćelije, humane Colo205 ćelije, ostale transformisane ćelijske linije primata, normalne diploidne ćelije, ćelijske sojevi izvedeni izin vitrokulture primarnog tkiva, primarnih eksplantata, HL-60, U937, HaK ili Jurkat ćelija. Sisarska ekspresija omogućava proizvodnju sekretovanih ili rastvorljivih polipeptida koji mogu biti regenerisani iz medijuma za rast.

[0043]Korišćenjem odgovarajućeg sistema domaćin-vektor, vActRIIB polipeptidi se rekombinantno proizvode gajenjem ćelija domaćina transformisanih sa ekspresionim vektorom koji sadrži molekule nukleinske kiseline iz sadašnjeg pronalaska pod uslovima koji omogućavaju proizvodnju. Transformisane ćelije mogu da se koriste za dugoročnu, proizvodnju polipeptida u visokom prinosu. Kada se jednom takve ćelije transformišu vektorima koji sadrže selektivne markere kao i željenu ekspresionu kasetu, ćelijama može biti omogućeno da rastu tokom 1-2 dana u obogaćenom medijumu pre nego što se prebace u selektivni medijum. Selektivni marker je dizajniran da omogući rast i oporavak ćelija koje uspešno eksprimiraju uvedene sekvence. Rezistentne grupe stabilno transformisanih ćelija mogu da proliferišu korišćenjem tehnika kulture tkiva koje odgovaraju angažovanoj ćelijskoj liniji. Pregled ekspresije rekombinantnih proteina se nalazi u Metodama Enzimologije, v. 185, Goeddell D.V. ed., Academic Press (1990).

[0044]U nekim slučajevima, kao u ekspresiji korišćenjem prokariotskih sistema, eksprimirani polipeptidi ovog pronalaska mogu biti potrebno "uvijeni" i oksidovani u odgovarajuću tercijarnu strukturu i generisanjem disulfidnih veza kako bi bili biološki aktivni. Presavijanje se može postići korišćenjem brojnih postupaka koji su dobro poznati u tehnici. Takvi postupci uključuju, na primer, izlaganje rastvorenog polipeptida na pH obično iznad 7 u prisustvu haotropnog agensa. Izbor haotropa je sličan izborima korišćenim za uključivanje solubilizacionog tela, međutim, haotrop se obično koristi pri nižoj koncentraciji. Primeri haotropnih sredstava su gvanidin i urea. U većini slučajeva, uvijeni/oksidovani rastvor će takođe sadržati redukcioni agens plus njegov oksidovani oblik u specifičnom odnosu da generišu poseban redoks potencijal koji omogućava disulfidno menjanje položaja za formiranje cisteinskih mostova. Neki uobičajeno korišćeni redoks parovi uključuju cistein/ cistamin, glutation/ditiobisGSH, bakar hlorid, ditiotreitol DTT/ditian DTT i 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-bME. U mnogim slučajevima, može se koristiti korastvarač za povećanje efikasnosti ponovnog uvijanja. Uobičajeno korišćeni korastvarači uključuju glicerol, polietilen glikol različitih molekulskih težina i arginin.

[0045]Pored toga, ovi polipeptidi mogu da se sintetišu u rastvoru ili na čvrstoj podlozi, u skladu sa konvencionalnim tehnikama. Različiti automatski sintesajzeri su komercijalno dostupni i mogu se koristiti u skladu sa poznatim protokolima. Videti, na primer, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Svnthesis, 2d. Ed, Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J Am Chem Soc, 105: 6442, (1983); Merrifield, Science 232: 341-347

(1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30: 705-739 (1987).

[0046]Polipeptidi i proteini prema predmetnom pronalasku se mogu prečišćavati prema tehnikama prečišćavanja proteina dobro poznatim onima koji su verzirani u stanje tehnike. Ove tehnike uključuju, na jednom nivou, sirovo frakcionisanje proteinskih i ne-proteinskih frakcija. Pošto su odvojeni peptidni polipeptidi iz drugih proteina, peptid ili polipeptid od interesa može biti dalje prečišćen korišćenjem hromatografskih i elektroforetskih tehnika da se postigne potpuno ili delimično prečišćavanje (ili prečišćavanje do homogenosti). Izraz "izolovani polipeptid" ili "prečišćeni polipeptid" kako se ovde koristi, treba da označi kompoziciju, izdvojenu od drugih komponenata, pri čemu je polipeptid prečišćen do bilo kog stepena u odnosu na njegovo prirodno-dobijeno stanje. Prečišćeni polipeptid se stoga takođe odnosi na polipeptid koji je izolovan iz okruženja u kome se može prirodno naći. Generalno, izraz "prečišćen" odnosiće se na kompoziciju polipeptida koja je podvrgnuta frakcionisanju da bi se uklonile različite druge komponente i da takva kompozicija suštinski zadržava svoju izraženu biološku aktivnost. Gde se koristi izraz "suštinski prečišćen", ovaj izraz se odnosi na kompoziciju peptida ili polipeptida u kojoj polipeptid ili peptid formira glavnu komponentu kompozicije, tako što sačinjava oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%o, oko 85%, ili oko 90% ili više proteina u kompoziciji.

[0047]Različite tehnike pogodne za prečišćavanje će biti dobro poznate stručnjacima u tehnici. One uključuju, na primer, taloženje amonijum sulfatom, PEG-om, antitelima (imunoprecipitacija) i slično ili toplotnu denaturaciju praćenu centrifugiranjem; hromatografiju kao što je afinitetna hromatografija (Protein-A kolone), razmenu jona, gel filtraciju, reverznu fazu, hidroksilapatit, hromatografiju hidrofobnih interakcija; izoelektrično fokusiranje; gel elektroforezu; i kombinacije ovih tehnika. Kao što je opšte poznato u tehnici, veruje se da se redosled izvođenja različitih koraka prečišćavanja može menjati, ili da izvesni koraci mogu biti izostavljeni, i dalje rezultira u pogodnom postupku za dobijanje suštinski prečišćenog polipeptida. Primeri koraka u prečišćavanju su dati u Primerima ispod.

[0048]Različiti postupci za kvantifikovanje stepena prečišćavanja polipeptida biće poznati stručnjaku u svetlu predmetnog otkrića. Oni uključuju, na primer, određivanje specifične aktivnosti vezivanja aktivne frakcije ili procenu količine peptida ili polipeptida unutar frakcije pomoću SDS/PAGE analize. Poželjan postupak za procenu čistoće frakcije polipeptida je izračunavanje aktivnosti vezivanja frakcije, koja se poredi sa aktivnošću vezivanja početnog ekstrakta, i na taj način izračuna stepen prečišćavanja, ovde ocenjen pomoću "fold (koliko puta) broja prečišćavanja." Stvarne jedinice koje se koriste za predstavljanje iznosa aktivnosti vezivanja, će naravno, zavisiti od konkretnog testa tehnike odabranog da sledi prečišćavanje i da li ili ne polipeptid ili peptid ispoljava merljivu aktivnost vezivanja.

[0049]Varijanta aktivinskih tipa IIB polipeptida vezuje se za ligande koji aktiviraju kaskade mišićne degradacije. vActRIIB polipeptidi sposobni da se vežu i inhibiraju aktivnost liganada aktivina A, miostatina, i/ili GDF-11, imaju terapeutski potencijal protiv bolesti koje uključuju mišićnu atrofiju, kao i lečenje određenih kancera i drugih bolesti kao što je prikazano u primerima niže.

[0050]Međutim, do agregacije može doći kada se eksprimira ili prečišćava divlji tip ActRIIB ili ActRIIB5 polipeptida. Ova agregacija uključuje strukturirano formiranje oligomera tokom ekspresije i nestrukturirano generisanje agregata oba tokom ekspresije i nakon prečišćavanja polipeptida.

[0051]Kombinovani pristupi strukturne analize, molekularnog modeliranja, i masena spektrometrija su pokazali da multimerizacija može nastati u ActRIIB polipeptidima putem formiranja intermolekularne disulfidne veze uz pomoć elektrostatičkih interakcija i interakcijama vezivanja vodonika između neglikoziliranih ActRIIB polipeptida. Značajne vodonične veze postoje na međupovršini dva ActRIIB molekula; između E28 bočnog lanca u jednom ActRIIB i R40 bočnog lanca u drugom ActRIIB, na primer. Pored toga, kritične elektrostatičke interakcije postoje između E28 u jednom ActRIIB-u i R40 u drugom ActRIIB-u.

[0052]Ove elektrostatičke interakcije mogu značajno da doprinesu u povećanju populacije privremenih ActRIIB dimera, rezultirajući u potpomaganju formiranja nekovalentnih i/ili kovalentnih veza između ActRIIB jedinica. Interakcija između ostataka 28 i 40 je najkritičnija među ovim interakcijama pošto su ova dva ostatka uključena u dvostrukim vodoničnim vezama i jakoj elektrostatičkoj interakciji. Ostaci 28 i 40 su uključeni u interakcijama ActRIIB:ActRIIB a ne u ActRIIB:ligand interakcijama. Tako, ostaci 28 i 40 mogu biti supstituisani sa aminokiselina koje nisu nativne prema pronalasku, da bi se poboljšala rastvori)ivost i smanjila agregacija polipeptida receptora. Stoga, E28 i R40 su supstituisani respektivno sa drugim mogućim prirodnim aminokiselinama, izraženim i testiranim pomoću Biacore kao što je prikazano ispod. Biacore određena vezivanja su prikazana u Tabelama 1A i 1B u primeru 2 ispod. Osim toga, procentne agregacije vActRTTB polipeptida su određene u nastavku.

[0053]Rezultati u niže datim primerima pokazuju smanjenu agregaciju vActRIIB polipeptida i proteina koji imaju aminokiselinske supstitucije ovde opisane, zadržavajući sposobnost da se vežu i neutrališu miostatin, aktivin A, ili GDF-11.

Antitela

[0054]Predmetni pronalazak dalje uključuje antitela koja se vezuju za varijantu ActRIIB polipeptida, uključujući i one koji se specifično vezuju za vActRIIB polipeptide prema predmetnom pronalasku. Kako je ovde korišćen izraz "specifično vezuje" se odnosi na antitela koja imaju afinitet vezivanja (Ka) za vActRIIB polipeptide od 10<6>M"<1>ili veći. Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" se odnosi na čitava antitela uključujući poliklonska antitela (videti, na primer Antibodies: A Laboratorv Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Press, (1988)), i monoklonska antitela (videti, na primer, US Patent br. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439, i 4,411,993, i monoklonska antitela: Nova dimenzija u biološkoj analizi, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.)

(1980)). Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" se takođe odnosi na fragmente antitela kao što su F (ab), F (ab'), F (ab')2, Fv, Fc, i jednolančana antitela koja se proizvode rekombinantnim DNK tehnikama ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela. Izraz "antitelo" se takođe odnosi na bispecifična ili bifunkcionalna antitela, koja su veštačka hibridna antitela koja poseduju dva različita para teških/lakih lanaca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela mogu biti proizvedena različitim metodama uključujući fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. (Videti Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelnv et al., J. Immunol.148: 1547- 1553 (1992)).

[0055]Kako se ovde koristi izraz "antitelo" se takođe odnosi na himerna antitela, odnosno, antitela koja imaju humani konstantni imunoglobinski domen antitela povezan sa jednim ili više nehumanih varijabilnih imunoglobinskih domena antitela, ili njegovim fragmentima (videti, na primer, U.S. Patent Br. 5,595,898 i U.S. Patent Br. 5,693,493). Antitela se takođe odnose na "humanizovana" antitela (videti, na primer, U.S. Pat. Br. 4,816,567 i WO 94/10332), minitela (WO 94/09817), maksitela, i antitela proizvedena pomoću transgenih životinja, u kojoj transgena životinja sadrži deo humanih gena koji proizvode antitela, ali nedovoljna u proizvodnji endogenih antitela su sposobna da proizvode humana antitela (videti, na primer, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), i U.S. Patent Br. 6,300,129). Izraz "antitela" takođe uključuje multimerna antitela ili veći kompleks reda proteina poput heterdimernih antitela i anti-idiotipskih antitela. "Antitela" takođe uključuju anti-idiotipska antitela. Antitela protiv vActRIIB mogu biti korišćena, na primer, za identifikaciju i kvantifikaciju vActRIIBin vitroiin vivo.

[0056]Takođe su uključena poliklonska antitela bilo kog sisara, na primer antitela miša i pacova, i zečija antitela, koja se vezuju specifično za vActRIIB polipeptide koji su ovde opisani, uključujući SEK ID BR: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, i 97.

[0057]Takva antitela nalaze primenu kao alati u istraživanju i u kvantitativnom testovima za otkrivanje i testiranje polipeptida ovde opisanih. Takva antitela se prave korišćenjem metoda gore opisanih i kao što je poznato u tehnici.

Farmaceutske kompozicije

[0058]Farmaceutske kompozicije koje sadrže vActRIIB proteine i polipeptide iz sadašnjeg pronalaska su takođe obezbeđene. Takve kompozicije sadrže izvesnu terapeutsku ili profilaktički efikasnu količinu polipeptida ili proteina u smeši sa farmaceutski prihvatljivim materijalima i fiziološki prihvatljivim materijalima formulacije. Farmaceutska kompozicija može sadržati formulacione materijale za modifikovanje, održavanje ili očuvanje, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, apsorpcije ili penetracije preparata. Pogodni formulacioni materijali uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobna sredstva; antioksidanse (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen sulfit); pufere (kao što boratni, bikarbonatni, Tris-HCl, citratni, fosfatni, drugih organskih kiselina); punioce (kao što su manitol ili glicin), helatne agense (kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); kompleksirajuće agense (kao što su kafein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); sredstva za dopunjavanje; monosaharidi; disaharidi i drugi ugljeni hidrati (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini); sredstva za bojenje; arome i sredstva za razblaživanje; sredstva za emulgovanje; hidrofilne polimerc (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide male molekulske mase; suprotne jonc za formiranje soli (kao što je natrijum); konzervanse (kao što su benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilenglikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što su manitol ili sorbitol); sredstva za suspendovanje; surfaktante ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agense za pospešivanje stabilnosti (saharoza ili sorbitol); sredstva za povećanje elastičnosti (kao što su halidi alkalnih metala (poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol, sorbitol); nosače za isporuku; razblaživače; ekscipijense i /ili farmaceutske adjuvanse. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Companv, 1990).

[0059]Optimalna farmaceutska kompozicija bice određena od strane stručnjaka u tehnici u zavisnosti od, na primer, nameravanog puta primene, oblika za isporuku i željene doze. Videti na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Takve kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost,in vivobrzinu oslobađanja iin vivobrzinu klirensa polipeptida. Na primer, pogodne kompozicije mogu biti voda za injekcije, fiziološki rastvor za parenteralnu primenu.

[0060]Primarni vehikulum ili nosač u farmaceutskom preparatu po svojoj prirodi može biti bilo koji vodeni ili nevodeni vehikulum. Na primer, pogodan vehikulum ili nosač može biti voda za injekcije, fiziološki slani rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, eventualno dopunjeni sa drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu primenu. Neutralni pufer ili fiziološki rastvor pomešan sa serumskim albuminom su dalji primeri nosača. Drugi primeri farmaceutskih kompozicija sadrže Tris pufer sa vrednošću pH oko 7,0-8,5, ili acetatni pufer pH od oko 4,0-5,5, koji dalje mogu da sadrže sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U jednoj realizaciji ovog pronalaska, kompozicije mogu biti pripremljene za skladištenje mešanjem izabranog preparata koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim sredstvima za formulaciju (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) u obliku liofdizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, terapcutska kompozicija može biti formulisana u obliku liofdizata korišćenjem pogodnih ekscipijenasa kao što je saharoza.

[0061]Formulacije mogu biti isporučene u različitim postupcima, na primer, inhalacionom terapijom, oralno ili injekcijom. Kada je razmatrana parenteralna primena, terapeutski preparati za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti u obliku apirogenog, parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji sadrži željeni polipeptid u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Posebno pogodan vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je polipeptid formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, pravilno očuvan. Još jedan preparat može da obuhvati formulaciju željenog molekula sa sredstvima, kao što su injektabilne mikrosfere, biodegradabilne čestice, polimerna jedinjenja (polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji obezbeđuje kontrolisano ili odloženo oslobađanje proizvoda koji se zatim može isporučiti putem depo injekcije. Hijaluronska kiselina se takođe može koristiti, a to može imati efekat potpomaganja produženog trajanja u cirkulaciji. Druga pogodna sredstva za uvođenje željenog molekula uključuju implantablne uređaje za isporuku leka.

[0062]U drugom aspektu, farmaceutske formulacije pogodne za injektabilnu primenu mogu biti formulisane u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima kao što je Hanksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki pufer. Vodene injekcione suspenzije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Dodatno, suspenzije aktivnih jedinjenja mogu biti pripremljene kao odgovarajuće uljane injekcione suspenzije. Pogodni lipofdni rastvarači ili nosači uključuju masna ulja, kao što je susamovo ulje, ili sintetske estre masnih kiselina, kao što su etil oleat, trigliceridi, ili lipozomi. Nclipidni polikatjonski amino polimeri mogu takođe da se koriste za isporuku. Opciono, suspenzija može takođe da sadrži pogodne stabilizatore ili agense za povećanje rastvori)ivosti jedinjenja koji omogućavaju dobijanje visoko koncentrovanih rastvora. U drugom aspektu, farmaceutska kompozicija može biti formulisana za inhalaciju. Inhalacioni rastvori se takođe mogu formulisati sa propelentom za isporuku u obliku aerosola. U još jednom aspektu, rastvori mogu biti nebulizovani. Pulmonarna primena je dalje opisana u PCT prijavi br. PCT/US94/001875, koja opisuje pulmonamu isporuku hemijski modifikovanih proteina.

[0063]Takođe je razmatrano da izvesne formulacije mogu biti primenjene oralno. U jednoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, molekuli koji se primenjuju na ovaj način mogu biti formulisani sa ili bez onih nosača koji se obično koriste u kombinovanim preparatima čvrstih doziranih oblika kao što su tablete i kapsule. Na primer, kapsula može biti dizajnirana da oslobodi aktivni deo formulacije na mestu u gastrointestinalnom traktu kada je bioraspoloživost maksimalna i presistemska degradacija smanjena. Dodatni agensi mogu biti uključeni da olakšaju apsorpciju terapeutskog molekula. Takođe se mogu koristiti razblaživači, arome, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, lubrikansi, agensi za suspendovanje, agensi za dezintegraciju tableta i sredstva za vezivanje. Farmaceutske kompozicije za oralnu primenu mogu takođe biti formulisane korišćenjem farmaceutski prihvatljivih nosača koji su dobro poznati u struci, u dozama pogodnim za oralnu primenu. Takvi nosači omogućavaju da farmaceutske smeše budu formulisane u obliku tableta, pilula, dražeja, kapsula, tečnosti, gelova, sirupa, pasti, suspenzija i slično, za primenu od strane pacijenta.

[0064]Farmaceutski preparati za oralnu upotrebu se mogu dobiti kombinovanjem aktivnih jedinjenja sa čvrstim ekscipijensom i obradom dobijene mešavine granula (opciono posle mlevenja) da se dobiju tablete ili jezgra dražeja. Mogu se dodavati pogodna pomoćna sredstva ako je poželjno. Pogodni ekscipijensi uključuju ugljenohidratne ili proteinske punioce, kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol i sorbitol; škrob od kukuruza, pšenice, pirinča, krompira ili drugih biljaka; celulozu, kao što je metilceluloza, hidrokipropilmetil-celuloza, ili natrijum karboksimetilcelulozu; gume, uključujući arapsku gumu i tragakantu; i proteine, kao što su žclatin i kolagcn. Kada jc poželjno, mogu se dodati sredstva za dezintegraciju ili sredstva za solubilizaciju, kao što su unakrsno vezani polivinil pirolidon, agar i alginska kiselina ili njene soli, kao što je natrijum alginat.

[0065]Jezgra dražeja mogu da se koriste u kombinaciji sa pogodnim sredstvima za oblaganje kao što su koncentrovani rastvori šećera, koji takođe mogu da sadrže arapsku gumu, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilen glikol i/ili titan dioksid, rastvore laka i pogodne organske rastvarače ili smeše rastvarača. Boje ili pigmenti se mogu dodavati oblogama tableta ili dražeja za identifikaciju proizvoda ili da okarakterišu količinu aktivnog jedinjenja, tj, dozu.[0066]Farmaceutski preparati koji mogu da se koriste oralno uključuju dvodelne kapsule izrađene od želatina, kao i meke, zatvorene želatinske kapsule i omotača kao što je glicerol ili sorbitol. Dvodelne kapsule mogu da sadrže aktivne sastojke pomešane sa puniocima ili vezivnim sredstvima, kao što su laktoza ili škrobovi, lubrikansi, kao što su talk ili magnezijum stearat, i opciono, stabilizatorima. U mekim kapsulama, aktivna jedinjenja mogu biti rastvorena ili suspendovana u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja, tečnosti ili tečni polietilenglikol sa ili bez stabilizatora.

[0067]Dodatni farmaceutski preparati će biti očigledni za stručnjake u ovoj oblasti, uključujući formulacije koje uključuju polipeptide u formulacijama za odloženu ili kontrolisanu isporuku. Tehnike u formulisanju sa različitim drugim odloženim ili kontrolisanim sredstvima za oslobađanje, kao što su lipozomski nosači, biodegradabilne mikročestice ili porozna zrnca i depo injekcije, takođe su poznate onima koji su verzirani u stanje tehnike. Videti na primer, PCT/US93/00829 koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih preparata. Dodatni primeri preparata za odloženo oslobađanje uključuju polupropustljive polimerne matriksc u obliku oblikovanih proizvoda, npr filmova ili mikrokapsula. Matriksi sa odloženim oslobađanjem mogu da uključuju poliestre, hidrogelove, poliaktide (U.S: 3,773,919, EP 58,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman et al., Biopolvmers, 22:547-556 (1983), poli (2-hidroksietil- metakrilat)

(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277, (1981); Langer et al., Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer et al., supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (EP 133,988). Preparati za odloženo oslobađanje takođe uključuju lipozome, koji se mogu pripremiti bilo kojom od nekoliko metoda poznatih u struci. Videti npr Eppstein et al., PNAS (USA), 82: 3688 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.

[0068]Farmaceutska kompozicija koja se koristi zain vivoprimenu tipično mora biti sterilna. Ovo se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Gde je kompozicija liofilizovana, sterilizacija korišćenjem ove metode se može vršiti ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicija za parenteralnu primenu se može čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Pored toga, parenteralne kompozicije se generalno postavljaju u kontejner koji poseduje sterilni pristupni deo, na primer, kesu za intravenski rastvor ili bočicu koja ima zapušač koji se može probušiti potkožnom injekcionom iglom.

[0069]Jednom kada je farmaceutski preparat formulisan, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca ili dehidriran ili liofilizovan prašak. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr, liofdizovanom) koji zahteva rekonstituciju pre primene.

[0070]U jednom specifičnom aspektu, sadašnji pronalazak je usmeren na komplete za proizvodnju pojedinačne dozne jedinice za primenu. Svaki od kompleta može da sadrži oba prvi kontejner sa suvim proteinom i drugi kontejner sa vodenom formulacijom. Takođe uključeni unutar obima ovog pronalaska su kompleti koji sadrže pojedinačne i više komorske prethodno napunjene špriceve (npr tečni špricevi i liošpricevi).

[0071]Efikasna količina farmaceutske kompozicije koja se koristi u terapiji zavisiće, na primer, od terapijskog konteksta i ciljeva. Stručnjak u ovoj oblasti će ceniti da će odgovarajući dozni nivoi u lečenju varirati u zavisnosti, delimično, od isporučenog molekula, indikacije za koju se koristi polipeptid, načina primene i veličine (telesne težine, površine tcla ili veličine organa) i stanja (starosti i opštcg zdravlja) pacijenta. Shodno tome, lekar može da podešava dozu i modifikuje put primene za dobijanje optimalnog terapeutskog efekta. Tipična doza može biti u rasponu od oko 0,1 mg/kg do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Polipeptidne kompozicije mogu biti poželjno injektovane ili primenjene intravenski. Dugodelujuće farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati svaka tri do četiri dana, svake nedelje, ili dvonedeljno u zavisnosti od poluživota i brzine klirensa određene formulacije. Učestalost doziranja zavisiće od farmakokinetičkih parametara polipeptida korišćenih u formulaciji. Tipično, kompozicija se primenjuje sve dok se ne dostigne doza koja postiže željeno dejstvo. Kompozicija može stoga biti primenjena kao pojedinačna doza, ili kao višestruke doze (u istim ili različitim koncentracijama/dozama) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija. Dalja podešavanja odgovarajuće doze se čine rutinski. Odgovarajuće doze se mogu utvrditi korišćenjem odgovarajućih podataka doza-odgovor.

[0072] Način primene farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim metodama, npr oralno, injekcijom intravenski, intraperitonealno, intracerebralno (intraparenhimalno), intracerebroventrikularno, intramuskularno, intraokularno, intraarterijski, intraportalno, intralezionalnim putevima, intramedularno, intratekalno, intraventrikularno, transdermalno, subkutano, intraperitonealno ili; kao i intranazalnim, enteralnim, topikalnim, sublingvalnim, uretralnim, vaginalnim ili rektalnim sredstvima, sistemima za odloženo oslobađanje ili pomoću implantacijskih uređaja. Gde je poželjno, kompozicije se mogu primeniti bolus injekcijom ili kontinuirano infuzijom ili pomoću implantacijskog uređaja. Alternativno ili dodatno, kompozicija može biti primenjena lokalno implantacijom membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji je željeni molekul apsorbovan ili inkapsuliran. Kada se koristi implantacijski uređaj, uređaj može biti implantiran u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a isporuka željenog molekula može biti putem difuzije, vremenskog-oslobađanja bolusa ili kontinuiranom primenom.

[0073] U nekim slučajevima, vActRIIB polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu biti isporučeni implantacijom određenih ćelija koje su nastale genetskim inženjeringom, korišćenjem postupaka kao što su oni ovde opisani, za ekspresiju i sekreciju polipeptida. Takve ćelije mogu biti životinjske ili humane ćelije i mogu biti autologne, heterologne ili ksenogene. Opciono, ćelije mogu biti besmrtne. Da bi se smanjila mogućnost pojave imunološkog odgovora, ćelije mogu biti inkapsulirane da bi se izbegla infiltracija okolnih tkiva. Materijali za inkapsulaciju su tipično biokompatibilni, polu-propustljivi polimerni omotači ili membrane koji dozvoljavaju oslobađanje proizvoda polipeptida, ali sprečavaju destrukciju ćelija od strane imunog sistema pacijenta ili drugih štetnih faktora iz okolnih tkiva.

[0074] vActRIIB genska terapijain vivoje takođe predviđena kada se molekul nukleinske kiseline koji kodira vActRIIB, ili derivat vActRIIB uvodi direktno u subjekat. Na primer, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vActRIIB se uvodi u ciljne ćelije putem lokalne injekcije konstrukta nukleinske kiseline sa ili bez odgovarajućeg vektora isporuke, kao što je adeno-povezani virusni vektor. Alternativni virusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, retroviruse, adenoviruse, herpes simpleks, virusne i papiloma virusne vektore. Fizički prenos virusnih vektora se može postićiin vivolokalnom injekcijom željenog konstrukta nukleinske kiseline ili drugog odgovarajućeg vektora isporuke koji sadrži željenu sekvencu nukleinske kiseline, lipozomima-posredovan transfer, direktnim ubrizgavanjem (gole DNK), ili mikročestično bombardovanje (genski pištolj).

Upotrebe vActRIIB kompozicija

[0075]Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke i farmaceutske kompozicije za smanjenje ili neutralizaciju količine ili aktivnosti miostatina, aktivina A, ili GDF-11in vivoiin vitrodovođenjem u kontakt polipeptida sa vActRIIB polipeptidom. vActRIIB polipeptidi imaju visok afinitet za miostatin, aktivin A, i GDF-11, i sposobni su da smanje i inhibiraju biološke aktivnosti najmanje jednog od miostatina, aktivina A i GDF-11. U nekim aspektima, vActRTTB polipeptidi ispoljavaju poboljšanu aktivnost u poređenju sa polipeptidima ActRITB divljeg tipa. Ovo je prikazano u niže datim Primerima.

[0076]U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke i reagense za lečenje miostatin povezanih i/ili aktivin A povezanih poremećaja kod subjekta kome je potreban takav tretman primenom efektivne doze jedne vActRIIB kompozicije na subjektu. Kako je ovde korišćen izraz "subjekt" se odnosi na bilo koju životinju, kao što su sisari uključujući ljude.

[0077]Kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti korišćene za povećanje mišićne mase kao procenat telesne težine i smanjenje mase masti kao procenat telesne težine.

[0078]Poremećaji koji se mogu tretirati pomoću vActRIIB kompozicije uključuju ali nisu ograničeni na razne oblike gubitka mišićne mase, kao i metaboličke poremećaje kao što su dijabetes i srodni poremećaji, i degenerativna oboljenja kostiju kao što je osteoporoza. Kompozicije vActRIIB su se pokazale efikasnim u lečenju poremećaja gubljenja mišićne mase u različitim modelima bolesti utvrđenih u Primeru 3 u nastavku. Ovo je pokazano u tretmanu gubljenja mišićne mase kod inhibin-a knockout miševa, lečenju gubitka mišićne mase kod 26-kolon modela kaheksije sa kancerom debelog creva, prevenciji mišićne atrofije kod suspenzionog modela zadnjih ekstremiteta, lečenje OXV ženki pokazuje povećanje posne mišićne mase, smanjenje masnog tkiva i povećanje mineralnog sadržaja kostiju.

[0079]Poremećaji gubitka mišićne mase obuhvataju distrofije kao što su Duchennova mišićna distrofija, progresivna mišićna distrofija, Bekerov tip mišićne distrofije, Dejerine- Landouzijeve mišićne distrofije, Erbove mišićne distrofije, i dečije neuroaksonalne mišićne distrofije. Dodatni poremećaji gubitka mišićne mase nastaju usled hroničnih bolesti ili poremećaja kao što su amiotrofična lateralna skleroza, kongestivna opstruktivna bolest pluća, kancer, AIDS, bubrežna insuficijencija, atrofija organa, androgena deprivacija i reumatoidni artritis.

[0080]Prekomerna ekspresija miostatina i/ili aktivina može doprineti kaheksiji, ozbiljnom sindromu gubljenja mišića i masti. Efikasnost vActRIIB polipeptida u lečenju kaheksija na životinjskim modelima je prikazana u Primeru 3 ispod. Kaheksija takođe nastaje usled reumatoidnog artritisa, dijabetične nefropatije, insuficijencije bubrega, hemoterapije, povrede usled opekotina, kao i drugih uzroka. U drugom primeru, nađeno je da su serumske i intramuskularne koncentracije miostatin-imunoreaktivnog proteina povećane kod muškaraca koji pokazuju gubitak mišićne mase povezan sa AIDS-om i bio je inverzno povezan sa bezmasnom masom (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS USA 95:14938-14943 (1998)). Nivoi miostatina su takođe pokazali da se povećava u odgovoru na povrede od opekotina, rezultirajući u kataboličkom mišićnom efektu (Lang et al, FASEB J 15, 1807-1809 (2001)). Dodatni uslovi koji dovode do gubitka mišićne mase mogu nastati usled neaktivnosti zbog invaliditeta, kao što su čuvanje u kolicima, produženi odmor u krevetu zbog moždanog udara, bolesti, povreda kičmenog stuba, preloma kostiju ili traume, i mišićne atrofije u mikrogravitacionom okruženju (kosmički let). Na primer, miostatin imunoreaktivni protein plazme je pronađen da se povećava posle dužeg odmora u krevetu (Zachvvieja et al. J Gravit Phvsiol. 6(2): 11 (1999). Takođe je utvrđeno da mišići pacova izloženi mikrogravitacionom okruženju tokom leta svemirskom letelicom izražavaju povećanu količinu miostatina u poređenju sa mišićima pacova koji nisu bili izloženi istom (Lalani et al., J.Endocrin 167 (3):417-28 (2000)).

[0081]Pored toga, povećanja u mastima u odnosu na mišiće povezana za starosnim dobom i mišićne atrofije povezane sa starenjem izgleda da su vezane za miostatin. Na primer, prosečni serumski miostatin-imunorcaktivni protein se povećava sa godinama u grupama mladih (19-35 god starosti), srednjih godina (36-75 god starosti), i starijih (76-92 god starosti) muškaraca i žena, dok prosečna mišićna masa i bezmasna masa opadaju sa godinama u ovim grupama (Yarasheski et al..T Nutr Aging 6 (5):343-8 (2002)). Pored toga, sada je nađeno da se miostatin izražava u niskim nivoima u srčanom mišiću i ekspresija je ushodno regulisana u kardiomiocitima nakon infarkta (Sharma et al., J Cell Phvsiol. 180 (l):l-9 (1999)). Stoga smanjenje nivoa miostatina u srčanom mišiću može poboljšati oporavak srčanog mišića nakon infarkta.

[0082]Izgleda da miostatin takođe utiče na metaboličke poremećaje, uključujući tip 2 dijabetesa, insulinski nezavisan diabetes mellitus, hiperglikemiju i gojaznost. Na primer, nedostatak miostatina je pokazano da poboljšava gojazne i dijabetične fenotipove dva mišja modela (Yen et al. FASEB J. 8:479 (1994). Pokazano je u U.S. prijavi serijskog br: 11/ 590,962, U.S. objavljenoj prijavi br: 2007/0117130, AAV-ActRIIB5 vektori povećavaju odnos mišića u odnosu na masti kod životinja, posebno kod gojaznih životinjskih modela. Polipeptidi vActRIIB-a prema predstavljenom opisu, kao što su SEK ID BR: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 su pogodni za takve svrhe. Stoga, će smanjenje sastava masti primenom kompozicija prema predmetnom pronalasku poboljšati dijabetes, gojaznost i hiperglikemijske uslove kod životinja. Pored toga, kompozicije koje sadrže vActRIIB polipeptide mogu smanjiti unos hrane kod gojaznih osoba, kao što je pokazano u U.S. prijavi serijskog br: 11/ 590,962, U.S. objavljenoj prijavi br: 2007/0117130 za ActRIIB5 polipeptide.

[0083]Primena ActRIIB polipeptida iz sadašnjeg pronalaska može poboljšati jačinu kostiju i smanjiti osteoporozu i druge degenerativne bolesti kostiju. Ovo je pokazano na OVX modelu miša opisanom u daljem tekstu. Takođe je nađeno, na primer, da miostatin-deficitarni miševi pokazuju povećan sadržaj minerala i gustinu humerusa miša i povećani sadržaj minerala u obe trabekularnoj i kortikalnoj kosti u regionima gde vezuju mišić, kao i povećanu masu mišića (Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71 (l):63-8 (2002)). Pored toga, vActRIIB kompozicije predmetnog pronalaska mogu se koristiti za lečenje efekata androgene deprivacije poput androgen supresione terapije korišćene u lečenju kancera prostate.

[0084]Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje postupke i preparate za povećanje mišićne mase u hrani životinja primenom efektivne doze vActRIIB proteina na životinjama. Pošto je zreli C-terminalni miostatinski polipeptid identičan kod svih ispitivanih vrsta, vActRIIB polipeptidi se očekuju da budu efikasni u povećanju mišićne mase i smanjenju masti kod bilo kojih poljoprivredno značajnih vrsta, uključujući goveda, piliće, ćurke i svinje.

[0085]Polipeptidi vActRIIB-a i kompozicije predmetnog pronalaska takođe antagonizuju aktivnost aktivina A. Poznato je da se aktivin A izražava u određenim tipovima kancera, posebno tumorima gonada kao što su karcinomi jajnika, i da uzrokuje ozbiljnu kaheksiju. (Ciprano et al. Endocrinol 141 (7): 2319-27 (2000), Shou et al., Endocrinol 138 (ll):5000-5 (1997); Coerver et al, Mol Endocrinol 10 (5): 534-43 (1996); Ito et al, British J Cancer 82 (8):1415-20 (2000), Lambert-Messerlian et al, Gvnecologic Oncology 74: 93-7 (1999). U Primeru 3 ispod, vActRIIB polipeptidi prema predmetnom pronalasku su pokazali efikasnost u lečenju teške kaheksije, smanjenju veličine tumora i produžavanju preživljavanja na modelima inhibin-a nokaut miševa i 26-kolon mišjih modela kancerske kaheksije. Prema tome, kompozicije prema predstavljenom pronalasku se mogu koristiti u lečenju stanja vezanih za aktivin A prekomernu ekspresiju, kao i ekspresiju miostatina, kao što je kaheksija usled određenih kancera i tretman određenih tipova gonadnih tumora.

[0086]Kompozicije iz sadašnjeg opisa mogu biti korišćene same ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima za poboljšanje njihovih terapcutskih efekata ili smanjenje mogućih neželjenih efekata. Ove osobine uključuju povećanu aktivnost, povećanu rastvorljivost, smanjenu degradaciju, povećan poluživot, smanjenu toksičnost, i smanjenu imunogenost. Tako su kompozicije iz prikazanog opisa korisne za proširene režime tretmana. Pored toga, svojstva hidrofilnosti i hidrofobnosti jedinjenja prema pronalasku su dobro izbalansirana, čime se povećava njihova korisnost i zain vitroi naročitoin vivoupotrebe. Specifično, jedinjenja iz opisa imaju odgovarajući stepen rastvorljivosti u vodenom medijumu koji omogućava apsorpciju i bioraspoloživost u telu, dok takođe imaju određeni stepen rastvorljivosti u lipidima koji omogućava jedinjenjma da prolaze kroz ćelijsku membranu do navodnog mesta dejstva, kao što je specifična mišićna masa.

[0087]Pored toga, vActRIIB polipeptidi prema predmetnom pronalasku su korisni za detekciju i kvantifikaciju miostatina, aktivina A, ili GDF-11 u neograničenom broju testova. Uopšteno, ActRIIB polipeptidi prema predmetnom pronalasku su korisni kao hvatajući agensi za vezivanje i imobilizaciju miostatina, aktivina A, ili GDF-11 u različitim testovima, slični onima koji su opisani, na primer, u Asai, ed., Methods in Cell Biologv, 37, Antibodies in Cell Biologv, Academic Press, Inc., New York (1993). Polipeptidi mogu biti obeleženi na neki način ili mogu reagovati sa trećom molekulom, kao što je izvesno antitelo koje je obeleženo da omogući detekciju i kvantifikovanje miostatina. Na primer, polipeptid ili treći molekul može biti modifikovan sa detektabilnom grupom, kao što je biotin, koji zatim može biti vezan četvrtom molekulom, kao što je enzimski obeležen streptavidin, ili drugim proteinima. (Akerstrom, J Immunol 135: 2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10: 585

(1997)).

[0088]Postoje pronalazak opisan, sledeći primeri su dati kao ilustracija, a ne ograničenje.

Primer 1

Ekspresija i prečišćavanje vActRIIB polipeptida

[0089]Sledeće metode su korišćene za ekspresiju i prečišćavanje varijante ActRIIB polipeptida.

[0090]cDNK humanog aktivinskog tipa IIB receptora je izolovana iz cDNK biblioteke porekla humanog testisa (Clontech, Inc.) i klonirana kao što je opisano u U.S. prijavi serijskog br: 11/590,962, U.S. objavi prijave br: 2007/0117130.

Određivanje aminokiselinske supstitucije

[0091]Kombinovani pristupi strukturnih analiza, molekulskog modeliranja i masene spektrometrije pokazuju da agregacija (oligomerizacija) može nastati u ActRIIB-u preko formiranja intermolekularne disulfidne veze izazvane elektrostatičkim i H-vezujućim interakcijama između neglikoziliranih molekula ActRIIB-a. Ostaci 28 i 40 su bili određeni da budu uključeni u ActRIIB:ActRIIB interakcijama, a ne u ActRIIB interakcijama sa njegovim ligandima.

[0092]Početno, E28 i R40 na ActRIIB-Fc su bili supstituisani sa A na svakom položaju. Analize rasipanja svetlosti i masene spektrometrije su potvrdile da frakcija potpuno glikoziliranog vActRIIB-IgGIFc, E28A, i vActRIIB-IgGIFc R40A je bila značajno povećana u odnosu na divlji tip proteina. E28A i R40A vActRJIB-IgGlFc su bili inkubirani na 37°C tokom 6 dana, rezultirajući sa malo ili bez agregacije u poređenju sa divljim tipom. Aminokiselinske supstitucije na položajima 28 i 40 (u vezi sa SEK ID BR: 2 i 18 sa signalnom sekvencom) su načinjene radi ublažavanja ili sprečavanja agregacije koja se može desiti tokom ekspresije ili prečišćavanja divljeg tipa ActRIIB (SEK ID BR: 2 i 18). Ova agregacija je bila identifikovana kao strukturirano formiranje oligomera tokom ekspresije i nestrukturirana generacija agregata obe nastale tokom ekspresije i nakon prečišćavanja proteina.

[0093] Agregacija u različitim fazama procesa proizvodnje i prečišćavanja je određivana korišćenjem ekskluzione hromatografije prema postupku ispod.

[0094] Sledeći primer metode je korišćen za proizvodnju polipeptidne varijante ActRIIB

(vActRIIB i vActRIIB5). Polinukleotidi koji kodiraju vActRIIB, E28W (SEK ID BR: 23) su fuzionisani sa polinukleotidima koji kodiraju humani IgGl Fc domen (SEK ID BR: 82) ili polinukleotidima koji kodiraju humani IgG2 Fc (SEK ID BR: 84), preko spojne sekvence linkera (nukleotidi koji kodiraju SEK ID BR: 79) korišćenjem PCR preklapajućeg nastavka korišćenjem prajmera koji sadrže mutaciju rezultirajući u E28W. Puna polinukleotidna sekvenca je SEK ID BR: 61. Dvostruko lančani DNK fragmenti su subklonirani u pTT5 (Biotechnologv Research Institute, National Research Council Canada (NRCC), 6100 Avenue Rovalmount, Montreal (Kvebek) Kanada H4P 2R2), pDSRa (opisan u WO/9014363) i/ili derivati pDSRa. U drugim izvođenjima, polinukleotidi koji kodiraju vActRIIB polipeptide su vezani za polinukleotide koji kodiraju linker GGGGS (SEK ID BR: 75) ili njegove multimere, i ili spojni linkeri (poput SEK ID BR: 79).

[0095] Prolazna ekspresija konstruisanog vActRIIB-Fc i vActRIIB5-Fc je izvedena kao što sledi.

[0096] Konstruisane varijante gornjih dveju molekula su prolazno eksprimirane u serumu bez suspenzije prilagođenih 293-6E ćelija (Nacionalni savet istraživanja Kanade, Otava, Kanada) održane u FrccStvlc™ medijumu (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) dopunjenom sa 250 u.g/ml geneticina (Invitrogen) i 0,1% Pluronic F68 (Invitrogen). Transfekcije su izvršene kao 1L kulture. Ukratko, ćelijski inokulum je narastao na 1,1 x IO<6>ćelija/ml u 4L fernbach boci za trešenje (Corning, Ine). Kultura boce za trešenje je održavana na Innova 2150 šejker platformi (News Brunswick Scientific, Edison, NJ) na 65 RPM koji je postavljen u vlažnom inkubatoru koji je održavan na 37°C i 5% C02. U vreme transfekcije, 293-6E ćelije su razblažene do 1,0 x IO<6>ćelija/ml.

[0097] Kompleksi transfekcije su formirani u 100 ml FreeStvle medijumu. 1 mg DNK plazmida je prvo dodat medijumu praćeno sa 3 ml Fugene HD transfekcionog reagensa (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Kompleks transfekcije je inkubiran na sobnoj temperaturi približno 15 minuta, a zatim dodat ćelijama u posudi za trešenje. Dvadeset četiri sati nakon transfekcije, 20% (m/v) peptona TN1 (OrganoTechnie S.A., TeknieScience, QC, Kanada) je dodato da se postigne finalna koncentracija od 0,5%> (m/v). Transfekcija/ ekspresija je izvršena za 4-7 dana, nakon čega je kondicionirani medijum sakupljen centrifugiranjem na 4,000 RPM tokom 60 minuta na 4°C.

[0098] Stabilna transfekcija i ekspresija su izvedene kao što sledi. vActRIIB-humane (hu) IgG2-Fc ćelijske linije su stvorene putem transfekcije stabilnih CHO ćelija domaćina sa ekspresionim plazmidima pDC323-vActRIIB (E28W)-huIgG2 Fc i pDC324-vActRIIB (E28W)-huIgG2 FC (prema Bianchi, et al, Biotech and Bioengineering, 84 (4): 439-444 (2003)) korišćenjem standardne procedure elektroporacije. Nakon transfekcije ćelijske linije domaćina sa ekspresionim plazmidima, ćelije su gajene u serumski-slobodnom odabranom medijumu bez GHT-a tokom 2-3 nedelje da bi se omogućio izbor plazmida i oporavak ćelija. Ćelije su odabrane dok nisu postigle više od 85% održivosti. Ovaj bazen transfektovanih ćelija je zatim kultivisan u medijumu koji sadrži 150 nM metotreksata.

Kloniranje ćelijske linije

[0099]Ćelija banka je napravljena od odabranih klonova prema sledećoj proceduri. Amplifikovani bazen stabilnih transfektovanih ćelija je zasejan u 96-bazenčića, a klonovi kandidata su procenjeni na rast i učinak produktivnosti u studijama malih razmera. Pre-master ćelija banke (PMCB) od približno 60 bočica su bile pripremljene od odabranog klona. Svi PMCBs su testirani na sterilnost, mikoplazme i viruse.

[0100]VActPJIB-Fc koji eksprimira ćelijska linija je povećan u razmeri korišćenjem tipičnog procesa šarže sa napajanjem. Ćelije su inokulisane u Wave bioreaktoru (Wave Biotech LLC). Kultura je hranjena tri puta sa bolus hranom. 10L je sakupljeno u 10-om danu, ostatak je sakupljen 11-og dana; oba sakupljanja su podvrgnuta dubinskoj filtraciji praćenoj sterilnom filtracijom. Kondicionirana podloga je filtrirana kroz 0,45/0,2 mikronski predfilter od 10 inča, praćeno filtracijom kroz 0,2 mikronski filter od 6 inča.

Prečišćavanje proteina

[0101]Oko 5 L kondicioniranog medijuma koji sadrži ActRllB-Fc (oba IgGl i lgG2), ActRIIB5-Fc (oba IgGl i IgG2), i njihove varijante su koncentrovane korišćenjem 5 ft<2>10K membranskog tangencijalnog protočnog filtera (Pali). Koncentrovani materijal je primenjen na 5 mL Protein A High Performance Column™ (GE Healthcare) koja je uravnotežena sa PBS-om (Dulbecco bez magnezijum hlorida ili kalcijum hlorida). Nakon ispiranja kolone sa ckvilibracionim pufcrom dok apsorpcija na 280 nm (OD28o) jc bila manja od 0,1, vezani protein je cluiran sa 0,1 M glicin-HCl, pH 2,7, i odmah neutralizovan sa 1 M Tris-HCl, pH 8,5. Neutralizovan eluirani bazen je koncentrovan do zapremine od 1 ml i primenjen na 320ml Sephacryl-200 koloni (GE Healthcare) koja je uravnoteženu u PBS-u (Dulbecco bez magnezijum hlorida ili kalcijum hlorida). 4-20% SDS PAGE gelova (Invitrogen) je propušteno da se utvrde frakcije do bazena. Ovi polipeptidi su testirani na aktivnost i stepen agregacije, kao što je prikazano ispod.

[0102]Opciono, ovi polipeptidi mogu dalje biti prečišćeni, na primer, korišćenjem Shp-Sefaroze kolone. Koncentracija se određuje korišćenjem OD280.

Primer 2

TestoviIn vitroaktivnosti

[0103]Prečišćeni uzorci vActRIIB polipeptida kao što je gore opisano su razblaženi sa fosfatnim puferom (PBS: 2,67 mM kalijum hlorida, 138 mM natrijum hlorida, 1,47 mM kalijum monobaznog fosfata, 8,1 mM dibaznog natrijum fosfata, pH 7.4) do 0,2 mg/mL, inkubirani na 37°C tokom 6 dana, zatim naneseni na MALDI-MS (matriks uz prisustvo lasera desorpciono/jonizaciona masena spektrometrija), SEC i / ili SEC-LS analize. Agregacija divljeg tipa i varijante polipeptida nakon koraka prečišćavanja proteina A utvrđeni su korišćenjem SEC ili SEC-LS, a molekulska težina molekula je potvrđena korišćenjem postupka MALDI-MS opisanog u nastavku. Ekskluziona hromatografija ( SEC). Eksperimenti su izvedeni na Agilent 1100 HPLC sistemu sa dve kolone (TOSOHAAS G3000swxl, 7,8 x 300 mm) u tandemu. 2x PBS je korišćen kao mobilna faza pri 0,5 ml/minuti. Ekskluziona hromatografija - svetlosno rasejavanje ( SEC- LS). Eksperimenti su izvedeni na Agilent 1100 HPLC sistemu sa Supcrdcx-200 gel filtracionom kolonom (Amcrsham Pharmacia, Waukcsha, WI). Uzorci su zatim propušteni kroz Wyatt miniDavvn LS laserski detektor rasejavanja svetlosti i Wyatt Optilab DSP refraktometar (Wyatt Technology Co., Santa Barbara, CA) da se utvrdi molekulska masa. PBS je korišćen kao mobilna faza pri 0,4 ml/minuti. Matriks uz prisustvo lasera Desorpciono/ jonizacione masene spektrometrije. Uzorci su pomešani (1:1) sa sinapinskom kiselinom i naneseni na MALDI-MS (Applied Biosystems Voyager System 2009). Ovaj postupak je korišćen za proveru molekulske težine molekula.

[0104]Određivanje afiniteta vezivanja i IC50vrednosti za aktivin i miostatin je dobijeno kako je niže opisano. Kvalitativni BIAcore<®>esej. E28 i R40 su supstituisani respektivno sa drugim prirodnim aminokiselinama u fuzijama sa IgGl Fc kao što je iznad opisano. Oni su generisani sa ili bez linkera, kao što je prikazano u donjim tabelama. Svaki uzorak vActRIIB-IgGIFc iz kondicioniranog medijima je uhvaćen u kozjem anti-humanom IgGl Fc antitelu (Jackson Immuno Research, cat # 109-005-098, lot 63550) obložene CM5 površine. 20 nM aktivina A je ubrizgano preko zarobljenih površina uzoraka u BIACore2000 (Biacore Life Sciences, Piscataway, New Jersey). Dobijeni senzorgrami su normalizovani prema uhvaćenom RL (500 RU) od vActRIIB-IgGIFc varijanti. Normalizovani vezujući odgovor (RU) za neke varijante je prikazan u Tabeli 2, i dodatno je opisan u nastavku. Relativni afinitet vezivanja za aktivin je takođe određen Biacore merenjima, korišćenjem kondicioniranog medijuma dobijenog ekspresijom iz ćelija sisara. Aktivin A (20 nM) je korišćen za hvatanje rastvorljivog receptorskog polipeptida u kondicioniranom medijumu i izmereni SPR signali su normalizovani. Normalizovan SPR od +++++: > 60, ++++: 40 - 60, +++: 20 - 40, ++ 10 - 20 +: 5 - 10, - :<5.

[0105]Tabela 1A i tabela 1B sumiraju rezultate podataka relativnog vezivanja. Donja tabela pokazuje da su izvesni aspekti vActRIIB-IgGIFc posebno vezani za aktivin A sa većim afinitetom nego divlji tip, ili zadržavaju uporedivi afinitet sa divljim tipom.

Ispitivanje C2C12 ćelijski bazirane aktivnosti

[0106]vActRIIB5-IgGIFc i vActRIIB-IgGIFc varijante su generisane kao što je prethodno opisano. Sposobnost ovih varijanti da inhibiraju vezivanje aktivina A ili miostatina za aktivinski IIB receptor testirano je korišćenjem ispitivanja na bazi aktivnosti ćelija kako je niže opisano.

[0107]Miostatin/aktivin/GDF-11-odgovarajuća reporter ćelijska linija je generisana transfekcijom C2C12 ćelija mioblasta (ATCC br: CRL- 1772) sa pMARE-luc konstruktom. pMARE-luc konstrukt je izrađen kloniranjem dvanaest ponavljanja CAGA sekvence, koje predstavljaju elemente miostatin/aktivin odgovora (Dennler et al. EMBO 17: 3091-3100 (1998)) u pLuc-MCS reporter vektor (Stratagene kat # 219087 ushodno od TATA kutije. C2C12 ćelije prirodno izražavaju aktivinske receptore tipa IIB na njihovoj ćelijskoj površini. Kada miostatin/aktivinA/GDF-11 vezuje ćelijske receptore, Smad put je aktiviran i fosforilisani Smad se vezuje za element odgovora (Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996)), što dovodi do ekspresije gena luciferaze. Aktivnost luciferaze je zatim merena korišćenjem komercijalnih luciferaza reporter test kompleta (kat # E4550, Promega, Madison, WI) u skladu sa protokolom proizvođača. Stabilna linija C2C12 ćelija koje su transfektovane sa pMARE-luc (C2C12/pMARE) je korišćena za merenje aktivnosti u skladu sa sledećom procedurom. Reporter ćelije su nanete u 96 bazenčića kultura. Skrining uz korišćenje razblaženja divljeg tipa i varijanti ActRIIB-IgGl Fc fuzija konstruisanih kao što je gore opisano je izveden sa koncentracijom fiksiranom na 4 nM aktivina. Aktivin A je prethodno inkubiran sa receptorima pri nekoliko koncentracija. Aktivnost aktivina je merena određivanjem aktivnosti luciferaze u tretiranim kulturama. IC50vrednosti su određene za svaki polipeptid. Ove su prikazane u Tabeli 2. Isti postupak je praćen za ActRIIB-huIgG2 Fc fuzije proizvedene kao što je gore opisano za određivanje miostatina. Protein A prečišćeni wt i varijante su korišćeni u određivanju IC50vrednosti za miostatin korišćenjem iste metodologije. Za ovo određivanje, polipeptidi su prethodno inkubirani sa 4 nM miostatina. Pored toga, stepen agregacije je određivan korišćenjem gore navedenih postupaka. Ove vrednosti su date u Tabeli 3 u nastavku.

[0108]Od seta ActRIIB5-IgGl Fc varijanti koje su navedene u tabeli 1 A, nekoliko ActRIIB-IgGl Fc varijanti i tri ActRIIB5-IgGl Fc varijante zajedno sa polipeptidima divljeg tipa su dalje prečišćene i analizirane pomoću SPR (površinske plazmonske rezonance) pri 20 nM aktivina A. Tabela 2 prikazuje SPR afinitet vezivanja odabranih vActRIIB-IgGl Fc polipeptida za aktivin. Aktivin A (20 nM) je korišćen za hvatanje vActRIIB polipeptida u uzorcima i izmereni SPR signali su bili normalizovani. IC50vrednosti su dobijene na ćelijski-baziranoj inhibiciji aktivina ispitivanjima gore opisanim. Standardne greške su manje od 10% za sve rezultate.

[0109]Kao što je prikazano iznad u Tabeli 2, IC50vrednost vActRIIB-IgGIFc (E28W) za blokiranje aktivina je 2,07 nM i IC50 vrednost vActRIIB-IgGIFc (E28Y) je 2,1 nM u poređenju sa divljim tipom. Osim toga, E28W i E28Y varijante vActRIIB-IgGIFc su bile stabilne i ne agregiraju kada su jednom prečišćene.

[0110]IC5ovrednost u ćelijski baziranom testu blokiranja miostatina određena je isto tako za dodatne varijante polipeptida. Ove varijante su zreli skraćeni vActRIIB polipeptidi kojima nedostaje signalna sekvenca i prvih šest amino kiselina N-terminala. Ove sekvence su prikazane u Tabeli 3. Tabela 3 prikazuje procenat agregacije proteina nakon prečišćavanja proteina A, i IC50vrednost u odnosu na miostatin. Može se videti da je procenat agregacije mnogo manji za varijante polipeptida u poređenju sa divljim tipom. Slični rezultati su dobijeni za zrele skraćene vActRIIB polipeptide bez signalne sekvence i četiri N-terminalne aminokiseline, i sa identičnim supstitucijama kao što je prikazano niže.

[0111]Tabela 4 identifikuje sekvence koje odgovaraju SEK ID BR: 1-99 u listingu sekvenci.

Primer 3

In vivo tretmani upotrebom vActRIIB

[0112]Sva sledeća ispitivanja na životinjama su izvedena upotrebom zrelog skraćenog vActRIIB-IgG2 Fc (E28W) polipeptida, (SEK ID BR: 91), u skladu sa postupcima opisanim u daljem tekstu.

Lečenje gubitka mišićne mase kod miševa sa manjkom Inhibina- ct

[0113]Inhibin-a je prirodni inhibitor aktivina A. Miševi kojima nedostaje inhibin-a pokazuju značajno povišene nivoe aktivina A u cirkulaciji i pate od smrtonosnog sindroma atrofije koji je povezan sa spontanim formiranjem tumora kao što su ovarijalni, kanceri testisa i adrenalni kanceri (Matzuk et al., PNAS 91 (19):8817-21 (1994), Cipriano et al. Endocrinology 121 (7): 2319-27 (2000), Matzuk et al., Nature 360 (6402):313-9 (1992)). Za sledeće eksperimente, inhibin-a nokaut miševi (C57BL/6J) dobij eni su od Charles River Laboratories. Efekti vActRIIB-IgG2 Fc E28W (SEK ID BR: 91) (u daljem tekstu E28W ili E28W polipeptid, ili rastvorljivi receptor E28W) na telesnu masu i mišićnu masu su ispitani na inhibin-a nokaut miševima. Izvršena je 14-dnevna studija pojedinačnog injektiranja kod 8 nedelja starih mužjaka inhibin-a nokaut miševa. U 8 nedelji starosti, mužjak inhibin-a nokaut miš je izgubio više od 25% telesne težine u poređenju sa kontrolnim miševima divljeg tipa istog uzrasta. 5 nokaut miševa je primilo jednu potkožnu injekciju E28W (30 mg/kg), dok je 5 nokaut miševa subkutano primilo jednaku zapreminu PBS-a (nosača) u 0 danu. Kao osnovna kontrola, 5 starosno uparenih miševa divljeg tipa je primilo jednu subkutanu injekciju nosača u 0 danu. Miševi su izmereni u 0 danu, 7 danu i 14 danu. Na kraju 14-og dana, svi miševi su žrtvovani, a njihove težine trupa izmercne i mišićne mase lisnog mišića su analizirane putem autopsije. Tokom perioda studije od 14 dana, prosečna telesna masa nokaut miševa tretiranih nosačem je smanjena za oko 1,1 g od 22,5 g u 0 danu do 21,4 g u 14 danu. Nasuprot tome, prosečna telesna težina E28W-tretiranih nokaut miševa je pokazala dramatičan dobitak od 11 g od 22,1 g u 0 danu do 33,1 g u 14-om danu. Završna analiza autopsije je pokazala da je E28W polipeptid praktično udvostručio mišićnu masu trupa i masu lisnog mišića uda kod inhibin-a nokaut miševa, kao što je prikazano u nastavku. Prosečna težina trupa kod E28W-tretiranih nokaut miševa je bila otprilike 14,9 g u poređenju sa približno 8,0 g kod nokaut miševa tretiranih nosačem, i približno 12,1 g za kontrolne miševe divljeg tipa tretirane nosačem. Prosečna mišićna težina lisnog mišića (oba uda) kod E28W-tretiranih nokaut miševa je bila otprilike 426 mg u poređenju sa približno 209 mg kod nokaut miševa tretiranih nosačem, i približno 324 mg za kontrolne miševe divljeg tipa tretirane nosačem. Ovi rezultati pokazuju efikasnost E28W polipeptida za lečenje bolesnih stanja gubitka težine i mišićne mase i sumirane su u sledećoj tabeli.

[0114]Efekti primene E28W polipeptida na stopu formiranja tumora testisa i jajnika su ispitani kod mužjaka i ženki inhibin-a KO miševa, respektivno. U ovoj studiji, 11 inhibin-a knockout miševa, uključujući 8-nedelja stare mužjake (n = 5) i 9 nedelja stare ženke (n = 6), tretirano je sa jednom subkutanom injekcijom E28W (30 mg/kg), dok je drugih 11 inhibin-a nokaut miševa, uključujući mužjake starosno-uparene (n = 5) i ženke (n = 6) dobilo jednu injekciju jednake zapremine PBS-a (nosača). Pored toga, 11 miševa divljeg tipa kontrolnih potomaka, uključujući mužjake starosno-uparene (n = 5) i ženke (n = 6) je dobilo jednu injekciju nosača. Dve nedelje nakon tretmana, miševi su žrtvovani i podvrgnuti autopsiji da se ispita stopa formiranja vizuelno prepoznatljivih tumora testisa i jajnika. Primećeno je da je 10 od 11 nokaut miševa tretiranih sa nosačem razvilo prepoznatljive tumore. Specifično, tumorske formacije na testisima i jajnicima su pronađene u pregledanim 5 od 5 mužjaka i 5 od 6 ženki, respektivno. Nađeno je da su veličine ovih tumora 2-3 puta veće od odgovarajućeg normalnog testisa ili jajnika kod kontrolnih miševa divljeg tipa. Ovo je prikazano na slici 3. Samo 10% (1 od 11) od E28W-tretiranih inhibin-a knockout miševa je pokazalo vidljivu formaciju tumora. Specifično, kod ženki, 1 od 6 od E28W-tretiranih nokaut miševa je razvio prepoznatljiv tumor jajnika, dok 5 od 6 netretiranih nokaut ženki je imalo malu ili nikakvu promenu u veličini ili celini, morfologije jajnika u poređenju sa kontrolnim divljim tipom starosno uparenim. 5 od 5 od E28W-tretiranih mužjaka nokaut miševa nije pokazalo vidljive tumore sa malo ili bez promene veličine ili celine, morfologije testisa u odnosu na kontrolni divlji tip starosno-upareni. Ovi rezultati pokazuju da je primena E28W bila efikasna u smanjenju formiranja tumora testisa i jajnika kod inhibin-a KO miševa, sugerišući kliničku korisnost za terapiju rastvorljivim receptorom u lečenju kancera.

[0115]Efikasnost E28W polipeptida u lečenju anoreksije je ispitivana kod mužjaka inhibin-a nokaut miševa. U ovoj studiji, konzumacija hrane kod inhibin-a nokaut miševa (n = 5) je značajno smanjena u poređenju sa miševima divljeg tipa starosno-uparenih (n = 10). Primećeno je da je unos hrane kod E28W tretiranih inhibin-a nokaut miševa značajno povećan tokom ispitanog perioda od 3 nedelje. Prosečan nedeljni unos hrane kod nokaut miševa E28W-tretiranih je porastao na nivo neznatno više nego kod kontrolnih miševa divljeg tipa starosno-uparenih, i bio je oko 50% veći nego prosečan nedeljni unos hrane nokaut miševa tretiranih sa nosačem. Prema tome, podaci pokazuju da je lečenje sa E28W bilo veoma efikasno u ublažavanju anoreksije kod inhibin-a KO miševa.

[0116]Efekat tretmana E28W na preživljavanje je ispitivan kod mužjaka i ženki inhibin-a KO miševa, respektivno. Kod mužjaka, 25 inhibin-a KO miševa oko 50 dana starosti primenjuje se E28W polipeptid (10 mg/kg/ned, SC), dok je 26 starosno-uparenih inhibin-a KO miševa primilo nosač (PBS). 19 starosno-uparenih miševa mužjaka divljeg tipa je primilo nosač i korišćeni su kao osnovna kontrola. Nokaut miševi tretirani nosačem su počeli da umiru u 15-om danu studije (oko 65 starosnih dana). U 34-om danu eksperimenta (oko 84 dana starosti), 50% od nokaut miševa tretiranih nosačem je uginulo, a u 78-om danu (oko 128 dana starosti), 100% od njih je umro. Nasuprot tome, nijedan od 25 nokaut miševa tretiranih sa E28 W polipeptidom, ili 19 kontrolnih miševa divljeg tipa tretiranih nosačem, nije uginulo pre 78-og dana studije (oko 128 dana starosti). Kod E28W-tretiranih nokaut miševa, 1 od 25 je uginuo u 78-om danu studije (oko 128 dana starosti) i 24 od 25 je preživelo iza 100-og dana (oko 150 dana starosti). Nema uginulih miševa divljeg tipa tretiranih sa nosačem tokom 100 dana studijskog perioda. Slični rezultati preživljavanja dobijeni su kod ženki inhibin-a KO miševa. 22 ženke inhibin-a KO miševa približno 50 dana starosti su tretirane sa E28W (10 mg/kg/ned, SC), dok 23 ženke inhibin-a KO miševa iste starosti su tretirane sa PBS-om (nosačem). U međuvremenu, 17 ženki kontrolnih miševa divljeg tipa je tretirano sa nosačem. Ženke knockout miševa tretirane nosačem su počele uginuće u 40-om danu studije (oko 90 dana starosti). U 58-om danu eksperimenta (oko 108 dana starosti), 50% ženki nokaut miševa tretiranih nosačem je uginulo, a u 86-om danu studije (oko 136 dana starosti) 100% njih je uginulo. Suprotno, samo oko 5% (1 od 22) od E28W-tretiranih ženki nokaut miševa je uginulo dok je oko 90% (20 od 22) preživelo preko 120 dana studije (oko 170 dana starosti). Nema uginulih miševa divljeg tipa tretiranih nosačem tokom 120 dana studijskog perioda. Prema tome, podaci pokazuju da je terapija sa E28W polipeptidom efikasna u dramatičnom produžavanju stope preživljenja i mužjaka i ženki inhibin-a nokaut miševa.

Lečenje gubitka mišićne mase kod kolon- 26 tumor nosećih miševa

[0117]Kolon-26 tumor noseći miševi su široko korišćeni preklinički životinjski model za proučavanje kaheksije usled kancera (Fujita et al., Int J Cancer 68 (5): 637-43 (1996), Kwak et al., Cancer Research 64 (22): 8193-8

(2004)). Uticaj E28W polipeptida na promenu telesne težine, mišićne mase i stopu preživljavanja ispitivani su na miševima sa tumorom. Kolon-26 (C-26) tumorske ćelije su subkutano implantirane kod 40, 10 nedelja starih, mužjaka CDF miševa pri 0,5 x 10<6>ćelija po mišu. Tumorska implantacija je izvedena u danu 0. Počevši u 5-om danu nakon implantacije tumora, dvadeset C-26 miševa je tretirano nedeljno sa potkožnom injekcijom od 10 mg/kg vActRIIB IgG2 Fc E28W (SEK ID BR: 91), dok je dvadeset C-26 miševa tretirano sa nosačem (PBS-om). U isto vreme 10 starosno i težinski uparenih normalnih miševa je tretirano samo sa nosačem (PBS). Telesna težina i unos hrane su određivani 3 puta nedeljno. Miševi sa tumorom su pregledani dva puta dnevno na preživljavanje. Veličine tumora su merene korišćenjem kalibarskog šestara (Ultra-Cal IV IP65 elektronski šestar, Fred V Fowler Co. Boston, MA) povezanog sa PC računarom i vrednosti su automatski snimane u radnoj listi u datoteci Microsoft Excel-a. Kao što je prikazano na Slici 5, dve nedelje nakon implantacije tumora, miševi sa C-26 tumorima su razvili tešku kaheksiju i dramatičan gubitak telesne težine. E28W lečenje efikasno umanjuje gubitak telesne težine kod miševa sa tumorom. Prosečna telesna masa tumorskih miševa tretiranih sa E28W je bila značajno veća nego kod tumorskih miševa tretiranih sa nosačem (p <0,001, od 7 dana do 33 dana nakon tumorske-inokulacije. Nesparen t test, Graph Pad Softvvare Inc. San Diego CA).

[0118]Nije bilo razlike u veličini tumora između grupa tretiranih sa E28W polipeptidom i nosačem što ukazuju da tretman nije imao efekta na rast tumora C-26. Terminalna autopsijska analiza je pokazala da je prosečna masa trupa i težina lisnog mišića uda kod E28W-tretiranih C-26 tumor-nosećih miševa bila značajno veća u odnosu na miševe sa tumorom koji su bili tretirani sa nosačem (p <0,001 za posnu masu trupa i lisnog mišića uda). Efekat E28W na preživljavanje miševa sa tumorom C-26 je prikazan na slici 6. Miševi tretirani nosačem su imali početak uginuća oko 14-og dana nakon implantacije tumora. U 35-om danu post implantacije tumora, svih 20 tretiranih sa nosačem C-26-tumor-nosećih miševa je uginulo; međutim, preživelo je 17 od 20, C-26 tumor-nosećih miševa koji su bili tretirani sa E28W. Stoga, tretman sa E28W je doveo do značajnog produženja stope preživljavanja C-26 tumor- nosećih miševa (p <0,0001, ki-kvadrat test). Stoga, E28W polipeptid nije samo efikasan u održavanju telesne težine i mišićne mase, već i u produžavanju stope preživljavanja miševa sa tumorom C-26.

Tretman miševa sa zaustavljanjem zadnjih udova

[0119]Mišji model suspenzije zadnjih udova je korišćen da se ispita efekat vActRIIB-IgG2 Fc E28W (SEK ID BR: 91) na mišićnu masu u stanju nckorišćcnja. Postupak suspenzije zadnjih udova je suštinski isti kao što je ranije izvestio Carlson CJ et Al (Carlson CJ, Booth FW i Gordon SE: Am J Phvsiol Regul Integr Comp Phvsiol. 277: R601-RR606, 1999). Devet nedelja starosti ženke C57BL/6 miševa su korišćene za studiju. Ukupno 60 miševa je podeljeno u tri grupe kao sledeće: 1. Nesuspendovanu osnovnu kontrolnu grupu (20 miševa) tretiranih sa nosačem (PBS), 2. Grupa miševa sa suspenzijom zadnjih udova (20 miševa) tretiranih sa nosačem, i 3. Grupa miševa sa suspenzijom zadnjih udova (20 miševa) tretiranih sa vActRIIB-IgG2 Fc, E28W. Specifično, jedna SC injekcija ili 30 mg/kg vActRIIB-IgG 2 Fc E28W ili nosača je data gore opisanim grupama respektivno, u vreme uvođenja suspenzije zadnjih ekstremiteta. Promena telesne mase je merena longitudinalno 2-3 puta nedeljno. 5 miševa iz svake grupe je žrtvovano u sledeće 4 različite vremenske tačke: 1. dana, 3. dana, 7. dana i 14. dana. Težina trupnih mišića je određena preko autopsije.

[0120]Kao što je prikazano u donjoj tabeli, suspenzija zadnjih udova je dovela do značajnog gubitka telesne težine do 10%. Tretman zadnjih udova suspendovanih miševa sa vActRIIB-IgG2 Fc E28W je doveo do značajnog povećanja u telesnoj masi do nivoa koji je bio viši bilo od suspendovane grupe zadnjih udova tretiranih sa nosačem ili bazne kontrolne nesuspendovane grupe analiziranih pomoću ANO VA merenja. Tokom perioda studije od dve nedelje, prosečan dobitak telesne mase u tretiranoj grupi sa vActRIIB-IgG2 Fc E28W (SEK ID BR: 91) je bio 12,6% u poređenju sa padom od 0,2% u suspenzionoj grupi tretiranoj sa nosačem i 4,8% u dobitku telesne mase u nesuspendovanoj baznoj kontrolnoj grupi, respektivno. Rezultati autopsije tokom vremena su pokazali da se mišićna masa zadnjih udova promenila paralelno sa telesnom težinom. Tretman suspendovanih miševa sa vActRIIB-IgG2 Fc (E28W) u potpunosti ublažava gubitak mišićne mase. Stoga, rezultati ovog eksperimenta pokazuju da je E28W efikasan u lečenju mišićne atrofije povezane sa nekorišćenjem mišića.

Lečenje OVX miševa

[0121]Ovarijektomisane ženke C57B16 miševa (OVX) se smatraju modelom za ženski hipogonadizam i osteoporozu. 24 ženki C57B16 miševa su ovarijektomisane u starosti od 3 meseca i dozvoljeno je da se oporave tokom 3 meseca. 24 OVX miševa, starosti od 6 meseci, kao i 24 starosno-uparenih lažno operisanih kontrolnih C57B16 miševa je mereno na longitudinalne promene u telesnoj težini, mišićima i masi masti pomoću NMR-a i koštane mase (PIXImus - GE LUNAR Corporation) više od 3 meseca perioda tretmana. Na kraju perioda, životinje su žrtvovane, a koštano tkivo sakupljeno tokom terminalne autopsije i podvrgnuto Faxitron X-ray i microCT (Faxitron X-ray Corporation i GE Medical system) analizama. Pokazano je da je E28W varijanta receptora (SEK ID BR: 91) bila efikasna u povećanju telesne težine, specifično posne skeletne mišićne mase i koštane mase, smanjujući sadržaj masti kod miševa do nivoa koji se vidi kod ne-ovarijektomisanih miševa. Specifično, tokom perioda od 12 nedelja, posna masa mišića je povećana sa 20 g do 27,0 g kod OVX miševa tretiranih sa E28W, u poređenju sa 20 g do 27,5 g za lažno operisane miševe tretirane sa E28W, poređene sa skoro bez povećanja posne mišićne mase za OVX plus nosač ili lažne plus nosač (oko 19 grama za OVX plus nosač i oko 20 g za divlji tip plus nosač). U istoj studiji, OVX miševi tretirani sa E28W pokazuju smanjenu masu masti od 8 g prosečno po životinji do oko 4 g prosečno po životinji, poredbenu sa lažno operisanim životinjama, krajem 12 nedelje studije. OVX miševi tretirani sa nosačem, nasuprot tome, nisu izgubili masu masti u bilo kom trenutku tokom studije. Konačno, koštana masa je povećana kod OVX miševa tretiranih sa E28W u poređenju sa OVX miševima tretiranim sa nosačem. Analiza butne kosti /tibije BMC (mineralni sadržaj kostiju) disecirane kosti sakupljene tokom terminaine autopsije je određena pomoću pQCT analize (periferne kvantitativne kompjuterizovane tomografije). OVX miševi tretirani sa E28W povećavaju BMC od oko 0,045 g/cm do oko 0,055 g/cm na kraju 12 nedelje studije, što je uporedivo sa krajnjim BMC-om lažno operisanih životinja tretiranih sa nosačem. OVX miševi tretirani sa nosačem pokazuju otprilike isti BMC od 0,045 g/cm na kraju 12 nedelje studije. E28W tretirani divlji tip miševa je pokazao porast BMC-a od oko 0,054 g/cm do oko 0,065 g/cm na kraju 12 nedelje studije. Ove studije pokazuju efikasnost E28W polipeptida kao potencijalnih tretmana kod slabosti, osteoporoze i gojaznosti u starenju.

Claims (18)

1. Izolovani protein koji sadrži jednu varijantu aktivin IIB reeeptorskog polipeptida (vActRIEB) pri čemu jc navedeni polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od: (a) polipeptida koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u SEK ID BR: 18, osim pojedinačne aminokiselinske supstitucije na položaju 28, pri čemu je supstitucija odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E; (b) polipeptida koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u aminokiselinama 19 do 134 iz SEK ID BR:18, osim pojedinačne aminokiselinske supstitucije na položaju 28, pri čemu je supstitucija odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E; (c) polipeptida koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u aminokiselinama 23 do 134 iz SEK ID BR:18, osim pojedinačne aminokiselinske supstitucije na položaju 28, pri čemu je supstitucija odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E; (d) polipeptida koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u aminokiselinama 25 do 134 iz SEK ID BR:18, osim pojedinačne aminokiselinske supstitucije na položaju 28, pri čemu je supstitucija odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E; (e) polipeptida koji ima najmanje 90 % identičnosti sa bilo kojim od (a) do (d), pri čemu je supstitucija na položaju 28 odabrana od bilo koje od A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W i Y za E, i pri čemu je polipeptid sposoban da veže miostatin, aktivin A, ili GDF-11.

2. Izolovani protein prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što (i) supstitucija na položaju 28 je odabrana od A, W ili Y za E; ili (ii) polipeptid prema patentnom zahtevu l(e) dalje obuhvata supstituciju A za R na položaju 64.

3. Izolovani protein prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što je supstitucija na položaju 28 izabrana od A,WiliYzaE.

4. Izolovani protein prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što je supstitucija na položaju 28 W za E.

5. Izolovani protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što polipeptid ima sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 20, 24,26, 28, 34, 38,40,42, 87, ili 88.

6. Izolovani protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time da (i) polipeptid je fuzionisan sa najmanje jednim heterolognim polipeptidom; (ii) polipeptid je fuzionisan sa najmanje jednim heterolognim polipeptidom, pri čemu je heterologni polipeptid humani Fc domen; ili (iii) polipeptid je fuzionisan sa najmanje jednim heterolognim polipeptidom, pri čemu je heterologni polipeptid humani Fc domen i pri čemu protein dalje sadrži linker.

7. Izolovani protein prema patentnom zahtevu 6, naznačen time da (a) polipeptid ima najmanje 99% identičnosti sa polipeptidom prema patentnom zahtevu 4 i ima supstituciju W za E na položaju 28; i (b) polipeptid je fuzionisan sa najmanje jednim heterolognim polipeptidom, pri čemu je heterologni polipeptid humani IgG2 Fc domen koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u SEK TD BR: 80 i pri čemu protein dalje sadrži zglobni linker koji ima polipeptidnu sekvencu navedenu u SEK ID BR: 79.

8. Izolovani protein prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što protein ima sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 60, 62, 64, 87, 88, 91, 93, 95, i 97.

9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži efikasnu količinu proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

10. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8.

11. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10, koji sadrži polinukleotid izabran iz grupe koju čine: (a) polinukleotid koji ima sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEK ID BR: 19, 23, 25,27, 33, 37, 39, 41, 59, 61, 63, 92, 94 i 96 ili njegov komplement; ili (b) polinukleotid koji kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEK ID BR: 20, 24 , 26, 28, 34, 38, 40, 42, 60, 62, 64, 87, 88, 91, 93, 95 i 97.

12. Rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 10 ili 11.

13. Ćelija domaćina koja sadrži rekombinantni vektor prema patentnom zahtevu 12.

14. Postupak za proizvodnju proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 koji obuhvata kultivisanje ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 13, na taj način eksprimirajući protein.

15. Protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 ili kompozicija prema patentnom zahtevu 9 za upotrebu (i) za inhibiranje aktivnosti miostatina ili povećanje posne mišićne mase ili povećanje odnosa posne mišićne mase prema masi masti kod subjekta kome je potreban takav tretman; (ii) za lečenje bolesti gubitka mišićne mase ili metaboličkog poremećaja kod subjekta kome je potreban takav tretman; ili (iii) za lečenje bolesti u kojima je aktivin prekomerno eksprimiran kod subjekta kome je potreban takav tretman.

16.Protein ili kompozicija za upotrebu kao u patentnom zahtevu 15, pri čemu je bolest gubitka mišićne mase ili metabolički poremećaj odabran od: mišićne distrofije, amiotrofične lateralne skleroze, kongestivne opstruktivne plućne bolesti, hronične srčane insuficijencije, kancerske kaheksije, kaheksija usled HIV/AIDS-a, kaheksije usled bubrežne insuficijencije, uremije, kaheksije usled reumatoidnog artritisa, starosno povezane sarkopenije, atrofije organa, sindroma karpalnog tunela, androgene deprivacije, kaheksije usled opekotina, dijabetične nefropatije i gubitka mišićne mase usled produženog ležanja u krevetu, povrede kičmene moždine, šloga, frakture kostiju, starenja, izlaganja mikrogravitaciji, dijabetesa, hiperglikemije i gubitka kostiju.

17.Protein ili kompozicija za upotrebu kao u patentnom zahtevu 15, pri čemu je bolest u kojoj je aktivin prekomerno eksprimiran kancer.

18.Protein ili kompozicija za upotrebu kao u patentnom zahtevu 17, pri čemu je kancer kancer jajnika.