Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS55727B1 - Metode za proizvodnju glikoproteina u sisarskim ćelijskim kulturama upotrebom glukokortikoida - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS55727B1 - Metode za proizvodnju glikoproteina u sisarskim ćelijskim kulturama upotrebom glukokortikoida - Google Patents

Metode za proizvodnju glikoproteina u sisarskim ćelijskim kulturama upotrebom glukokortikoida

Info

Publication number
RS55727B1
RS55727B1 RS20170199A RSP20170199A RS55727B1 RS 55727 B1 RS55727 B1 RS 55727B1 RS 20170199 A RS20170199 A RS 20170199A RS P20170199 A RSP20170199 A RS P20170199A RS 55727 B1 RS55727 B1 RS 55727B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
cells
culture
ctla4
glucocorticoid
Prior art date
Application number
RS20170199A
Other languages
English (en)
Inventor
Ying Jing
Zhengjian Li
Yueming Qian
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43823459&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55727(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of RS55727B1 publication Critical patent/RS55727B1/sr
Publication of RS55727B2 publication Critical patent/RS55727B2/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

[0001] OBLAST PRONALASKA
[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na nove procese za kultivisanje CHO ćelija koje sintetišu solubilni molekul CTLA4. Performanse procesa kultivacije ćelija rezultuju visokim vijabilitetom ćelija i mogu takođe da rezultuju visokim kvalitetom i produkcijom proizvoda, produžavanjem faze rasta i smanjenjem stepena smrti u fazi umiranja.
[0003] STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0004] Za ekspresiju rekombinantno dobijenih glikoziliranih proteina u cilju terapijskih i/ili profilaktičkih primena preporučeno je korišćenje kultura životinjskih ćelija, poželjno kultura ćelija sisara. Obrasci glukozilacije rekombinantnih glikoproteina su važni, zato što oligosaharidni bočni lanci glikoproteina utičuu na funkciju protina, kao i na unutarmolekulske interakcije između različitih regiona proteina. Takve unutarmolekulske interakcije su uključene u konformaciju proteina i tercijarne strukture glikoproteina. (Videti, npr., A. Wittwer et al., 1990, Biochemistrv, 29:4175-4180; Hart, 1992, Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023; Goochee et al, 1991, Bio/Technol., 9:1347-1355; and R.B. Parekh, 1991, Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754). Pored toga, oligosaharidi mogu da služe da se cilja određeni polipeptid na određenim strukturama zasnovano na specifičnim ćelijskim ugljeno hidratnim receptorima. (M.P. Bevilacqua et al., 1993, J. Clin. Invest, 91:379-387; R.M. Nelson et al., 1993, J. Clin. Invest, 91:1157-1166; K.E. Norgard et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1068-1072; and Y. Imai et al., 1993, Nature, 361-555-557).
[0005] [0003] Poznato je da sijalinska kiselina kao terminalna komponenta oligosaharidnog bočnog lanca glikoproteina ima efekat na brojne aspekte i osobine glikoproteina, uključujući apsorpciju, rastvorljivost, toplotnu stabilnost, polu-život u serumu, uklanjanje iz seruma, kao i na njegovu fizičku i hemijsku strukturu/ponašanje i njegovu imunogenost. (A. Varki, 1993, Glycobiology, 3:97-100; R.B. Parekh,Id.,Goochee et al.,Id.,J. Paulson et al., 1989, TIBS, 14:272-276; and A. Kobata, 1992, Eur. J. Biochem., 209:483-501; E.Q. Lawson et al., 1983, Arch. Biochem. Biophvs., 220:572-575; i E. Tsuda et al., 1990, Eur. J. Biochem., 188:405-411).
[0006] Na količinu sijalinske kiseline u glikoproteinima utiču dva suprotna procesa: unutarćelijsko dodavanje sijalinske kiseline delovanjem sijaliltransferaze u vanćelijsko uklanjanje sijalinske kiseline cepanjem pod dejstvom sijalidaze.
[0007] Unutarćelijsko dodavanje sijalinske kiseline je poslednji stadijum u procesu glikozilacije koji se odvija u trans-Goldži mreži. Ovo uključuje enzimski prenos sijalinske kiseline sa prekursora nukleotidnog šećera, CMP-sijalinske kiseline na raspoloživu galaktozu na nastajućoj glikanskoj strukturi koja je vezana za novo sintetisani protein. Moguća ograničenja ovog procesa koja mogu da dovedu do nepotpune sijalilacije uključuju dostupnost CMP-sijalinske kiseline, aktivnost enzima sijaliltransferazu, količinu galaktoze na nastajućoj glikanskoj strukturi i aktivnost enzima galaktoziltransferaze. Mnoga istraživanja su bila usmerena na postizanje maksimalne sijalilacije posredstvom prekomerne ekspresije gena i pojačavanja aktivnosti enzima sijaliltransferaze i glikoziltransferaze. Zhang et al. (Biochim Biophvs Acta 1425(3): 1998, 441-52) su pokazalu da ekspresija humane a2,6-sijaliltransferaze u CHO ćelijama koje sintetišu tkivni aktivator plazminogena (tPA) pospešuje a2,6-sijalilaciju tPA. Weikert et al (Nat Biotechnol 17(11): 1999, 1116-21) su objavili da koekspresija a2,3-sijaliltransferaze i (31,4-galaktoziltransferaze dovodi do sijalilacije TNK-tPA i TNFR-IgG veće od 90%. Takođe, dodavanje odgovarajuće količine mangana (Mn<2+>), kofaktora pi,4-galaktoziltransferaze, značajno je smanjilo količinu rHuEPO u manje sijalilovanoj frakciji, povećalo prisustvo ugljenih hidrata na mestu i suzilo grananje ugljenih hidrata (Zhang et al. 1998) na dvo-granske strukture o u ovim manje sijalilovanim vrstama (Crowell et al. Biotechnol Bioeng 96(3):538-49,2007).
[0008] Na količinu sijalinske kiseline u glikoproteinima takođe utiče vanćelijsko uklanjanje sijalinske kiseline cepanjem pod dejstvom sijalidaze. Gramer i Goochee (Biotechnol Prog 9(4):366-73,1993) su pokazali daje porast laktat dehidrogenaze (LDH), koja je pokazatelj porasta ćelijske lize, bio u korelaciji sa porastom aktivnosti vanćeljske sijalidaze u CHO perfuzione kulture. Gu et al (Biotechnol Bioeng 55(2):390-8, 1997) takođe ilustruju vredan pažnje gubitak terminalnih sijalinskih kiselina interferona-y (IFN-y) zajedno sa padom u vijabilitetu CHO ćelija i sledstvenim porastom broja mrtvih ćelija dugoročnom "batch"
[0009] (šaržnom) kultivacijom.
[0010] Stoga, od suštinske važnosti je da se odloži početak ćelijske smrti i poboljša vijabilitert ćelija da bi se smanjio ili izbegao ovaj efekat razgradnje.
[0011] Uopšteno, nivoi ekspresije proteina u sistemima zasnovanim na kulturama ćelija sisara su značajni niži nego u sistemima ekpresijeu mikroorganizmima, na primer, sistemima ekspresije u bakterijama ili gljivama. Ipak, ćelije bakterija i gljiva imaju ograničenu sposobnost optimalne ekspresije proteinskih proizvoda visoke molekulske mase, da se u njima ispravno savije protein koji ima složenu strukturu u prostoru, i/ili da obezbede neophodne post-translacione modifikacije radi sazrevanja eksprimiranog glikoproteina, tako utičući na imunogenost i brzinu uklanjanja proizvoda.
[0012] Kao posledica ograničenja kultivisanja životinjskih ili sisarskih ćelija, posebno životinjskih ili sisarskih ćelija koje sintetišu rekombinantne proizvode, istraživana je mogućnost manipulacije niza parametara, uključujući primenu sudova za kultuvaciju velike zapremine; menjanje osnovnih uslova kultivacije, kao što su temperatura inkubacije, koncentracija rastvorenog kiseonika, pH, i slično; korišćenje različitih tipova medij uma i dodataka medijumima; i povećanje gustine kultivisanih ćelija. Uz to, razvijanje procesa za kulturu ćelija sisara bi imao koristi iz napretka u sposobnosti da se produže trajanja serija da bi se povećala koncentracija finalnog proizvoda uz očuvanje visokog kvaliteta proizvoda. Značajan pokazatelj kvaliteta proizvoda je stepen i kompletnost strukture glikozilacije polipeptidnog proizvoda, pri čemu se količina sijalinske kiseline uobičajeno koristi kao pokazatelj kvaliteta glikoproteina.
[0013] [0010] Trajanje serija kultivacije ćelija, posebno diskontinuiranih procesa, obično je ograničeno preostalim vijabilitetom ćelija, koji tipično opada tokom trajanja serija. Zato je poželjno maksimalno moguće produžavanje visokog stepena vijabiliteta ćelija. Briga za kvalitet proizvoda takođe pruža motivaciju za minimizovanje smanjenje u gustini živih ćelija i održavanja visokog stepena vijabiliteta ćelija, pošto ćelijska smrt može da dovede do oslobađanja sijalidaza u supernatant kulture ćelija, što može da smanji količinu sijalinske kiseline eksprimiranih proteina. Briga o prečišćavanju proteina pruža dodatnu motivaciju za minimizovanje smanjenja u gustini živih ćelija i održavanja visokog stepena vijabiliteta ćelija. Prisustvo ćelijsoh debrisa i količinaa mrtvih ćelija u kulturi može da ima negativan uticaj na sposobnost da se izoluje i/ili prečisti proteinski proizvod po završetku serija kultivacije. Održavanjem ćelija vijasbilnim tokom dužeg vremenskog perioda u kulturi, dolazi do istovremene redukcije u kontaminaciji medijuma kulture ćelijskim proteinima i enzimima, npr., ćelijskim proteazama i sijalidazama koje mogu da uzrokuju razgradnju i sledstveno smanjenje kvaliteta željenog glikoproteina koji se sintetiše u ćelijama.
[0014] Ispitivani su različiti parametri u cilju postizanja visokog stepena vijabiliteta ćelija u kulturama ćelija. Jedan ispitivani parametar je jednokratno snižavanje temperature kulture nakon početne kultivacije na 37°C (na primer, Roessler et al, 1996, Enzvme and Microbial Technologv, 18:423-427; Američki patenti br. 5,705,364 i 5,721,121 od T. Etcheverrv et al., 1998; Američki patent br. 5,976,833 od K. Furukawa et al., 1999; Američki patent br. 5,851,800 od L. Adamson et al.; WO 99/61650 i WO 00/65070 od Genentech, Inc.; WO 00/36092 od Biogen, Inc.; i Američki patent br. 4,357,422 od Girard et al).
[0015] Drugi ispitivani parametri su uključivali dodavanje komponenata u kulturu. Pokazano je da inhibitor faktora rasta suramin sprečava apoptozu tijin eksponencijalnog rasta ćelija CHO Kl:CycE (Zhangi et al., Biotechnol. Prog. 2000, 16, 319-325). Međutim, suramin nije štitio od apoptoze tokom faze umiranja. Kao rezultat, suramin je mogao da obezbedi visok stepen vijabiliteta tokom faze rasta, ali nije dozvoljavao produžavanje dugovečnosti kulture. Isti autori su objavili da za ćelijsku liniju CHO 111-10PF, dekstran sulfat i polivinil sulfat mogu da, slično suraminu, povećaju gustinu živih ćelija i vijabilitet 3. dana, u poređenju sa kontrolnom kulturom. Međutim, nema podataka o efektu dekstran sulfata ili polivinil sulfata itokom faze umiranja. Takođe je pokazano da su suramin, dekstran sulfat i polivinil sulfat u prevenciji agregacije ćelija.
[0016] M. Xia et al. (1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences, 55:1649-1656) su pronašli da deksametazon pospešuje ekspresiju CTLA4 tokom aktivacije T ćelija u kulturama ćelija slezine miša.
[0017] CM. Coughlan et al. (1997, FEBS Letters, 413:389-393) su ispitivali biohemijske posledice deksametazonom izazvane indukcije sijaliltransferaza na ekspresiju sijaloglikoproteina u ćelijskoj liniji hepatoma pacova H41 le.
[0018] V. Vandamme et al. (1993, Eur. J. Biochem., 211:135-140) opisuju transcripcionu indukciju (3-galaktozid a-2,6-sijaliltransferaza deksametazonom u fibroblastima pacova.
[0019] M.L. Lipscomb et al. (2004, Biotechnol. Prog., 20:1402-1407) opisuju prekomemu ekspresiju glikoproteina, t.j. sekretovane alkalne fosfataze, SEAP, sa glukokortokoidnim inducibilnim promotorom u rekombinantnim jajnim ćelijama kineskog hrčka (CHO) kultivisanim u bioreaktorskim perfuzionim sistemima velike ćelijske gustine.
[0020] Efekti suplementiranja medijuma za ćelijske kulture insekata sa deksametazonom ili N-acetilmanosarninom na složenu glikozilaciju proteina, uključujući dodavanje terminalnih ostataka sijalinske kiseline na N-vezane oligosaharide, pripremljeme preko baculovirusnog vektor sistema ekspresije (BEVS) stavljen je na uvid javnosti u američkom patentu br. 6,472,175 od Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. (Ithaca, NY), 2002.
[0021] AU 2004 201 287 Al se odnosi na solubilni molekul CTLA4 i metodu za dobijanje ovog proteina koja obihvata vektor sistem domaćina sa eukariotsko ćelijom domaćina.
[0022] P.S. Linsley et al. (1992, Science, 257:792-795) opisuju da je postignuta imunosupresija in vivo tretmanom sa CTLA4Ig. CTLA4Ig je dobijen iz stabilno transfekovanih ćelija CHO i opisan je kao solubilni oblik vanćelijskog domena CTLA4.
[0023] 0020] Proteinski terapeutici su inherentno heterogeni zahvaljujući njihovoj veličini, složenosti strukture, i prirodi biološkog procesa njihovog dobijanja (Chirino i Mire-Sluis, Nat Biotechnol. 2004; 22:1383-1391). Čak i u "čistom" rastvoru proteina, biće prisutni u određenom procentu fragmenti niske molekulske mase, vrste visoke molekulske mase, i različiti stepeni hemijske modifikacije. Nastajanje vrste visoke molekulske mase je obično posledica agregacije proteina, što je uobičajen problem koji se sreće tokom dobijanja biološlih preparata. Tipično, prisustvo agregata se smatra nepoželjnim zbog bojazni da agregati mogu da dovedu do imunogene reakcije ili mogu da uzrokuju neželjene događaje pri primeni (Croirrvvell et al, AAPS J. 2006; 8:E572-579). Iako neki tipovi agregata bioloških preparata mogu da imaju normalnu funkciju, i dalje je važno da se održava konzistentnost u kvalitetu proizvoda pošto je konzistentost proizvoda neophodni preduslov za odobrenje regulatornog tela.
[0024] [0021] Do nastanka agregata proteina može doći usled nekoliko mehanizama i može se desiti u bilo kojoj fazi tokom procesa dobijanja proteina. U kulturi ćelije, sekretovani proteini mogu da budu izloženi uslovima koji su nepovoljni po stabilnost proteina; ali češće, nakupljanje velikih količina proteina može da dovede do unutarćelijske agregacije zahvaljujući interakcijama neuvijenih molekula proteina ili neefikasnom prepoznavanju nascentnih peptidnih lanaca od strane molekularnih šaperona odgovornih za korektno uvijanje proteina (Cromwell et al, AAPS J. 2006; 8:E572-579). U endoplazminom retikulumu (ER) ćelija, disulfidne veze novosintetisanih proteina se formiraju u oksidativnom okruženju. Pod normalnim uslovima, sulfhidrilne grupe proteina se reverzibilno oksiduju u proteinske disulfide i sulfonske kiseline, ali više oksidovana stanja kao što su sulfinski i sulfonski kiseli oblici cisteina u proteinu su ireverzibilna (Thomas and Mallis, Exp Gerontol. 2001; 36:1519-1526). Hiper-oksidovani proteini mogu da sadrže nepravilne disulfidne veze ili da imaju mešovite disulfidne veze da drugim proteinima u lumenu ER; u svakom slučaju to vodi ka netačom uvijanju proteina i agregaciji. Zato je ključno da se održava propismo kontrolisamo oksidativno okruženje u ER. U tom smislu, Cuozzo and Kaiser (Nat Cell Biol. 1999; 1:130-135) su inicijalno pokazali da je kod kvasnica glutation imao pufersku ulogu protiv hiperoksidacije ER i kasnije su Chakravarthi i Bulleid (J Biol Chem. 2004; 279:39872-39879) potvrdili daje u ćelijama sisara glutation takođe potreban radi regulisanja nastajanja nativnih disulfidnih veza unutar proteina koji ulaze u sekretorni put.
[0025] Sa porastom koncentracija proizuvoda u kulturi, u procesima u ćelijskoj kulturi može da se uoči da se kvalitet proizvoda smanjuje, što se određuje merenjem sadržaja sijalinske kiseline oligosaharidne glikostrukture. Uobičajeno, postoji donja granica za prihvatljiv sadržaj sijalinske kiseline kao što je pokazano u studije klirensa leka. Visoka zastupljenost proteina koji su sintetisale ćelije u kulturi optimalno je praćen visokim kvalitetom proteina koji se na kraju izdvoje za predviđenu primenu.
[0026] Proteinski proizvodi dobijeni rekombinantnom tehnologijom koji su ispravno glikozilirani postaju sve značajniji u medicinskom i kliničkom smislu za primenu kao terapeutici, tretmani i profilaktici. Zbog toga, razvoj pouzdanih procesa ćelijske kulture koji ekonomično i efikasno postižu povećanu koncentraciju finalnog proteinskog proizvoda, u spoju sa visokim nivoom kvaliteta proizvoda, koji se određuje količinom sijalinske kiseline, ispunjava kako željeni tako i potreban cilj u oblasti.
[0027] SAŽETAK PRONALASKA
[0028] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove postupke za sintezu solubilnih molekula CTLA4, preporučeno rekombinantnih solubilnih molekula CTLA4, u ćelijama CHO ćelijske kulture. Ovi novi postupci postižu povećanu gustinu živih ćelija u kasnoj fazi, ćelijski vijabilitet, produkciju i količinu sijalinske kiseline i smanjenu agregaciju proteina.
[0029] [0025] Shodno predmetnom pronalasku, u medijume se dodaju netoksični nivoi glukokortikoida. Postupci kultivacije ćelije ovog pronalaska mogu da povoljno postignu poboljšanje specifične produkcije, npr., solubilnog molekula CTLA4, kao i za sijalinske kiseline solubilnog molekula CTLA4 sintetisanog u kultivisanim ćelijama. Specifično, u saglasnosti sa predmetnim pronalaskom, dodavanje glukokortikoida tokom perioda kultivacije ćelija održava visok vijabilitet ćelija u kulturi i može da obezbedi visok kvantitet i kvalitet sintetianog poizvoda tokom cekolupnog trajanja serije kultuvacije. Dodavanje glukokortikoida procesima kultivacije može da povoljno dozvoli produžavanje sintetske faze kultivacije. Tokom produžene sintezske faze, titar željenog proizvoda je povećan; kvalitet proizvoda, koji karakteriše količina sijalinske kiselina, se održava na visokom nivou; nivo agegacije proteina se održava na nižem nivou i vijabilitet ćelija se takođe održava na visokom nivou. Pored toga, produžena sintetska faza udružena sa procesima kultivacije predmetnog pronalaska uzima u obzir sintezu proizvoda preko onoga što se sintetiše rokom standardne faze sinteze.
[0030] Predmetni pronalazak obezbeđuje proces (ili metodu) u kojoj je povećana specifična produkcija, nivo agregacije proteina je bio snižen i količina sijalinske kiseline sintetisanog molekula CTLA4 je viši, dodavanjem glukokortikoida. Preporučljivo je da glukokortikoid bude deksametazon. U skladu sa ovim specifičnim aspektom, dodavanje glukokortikoida održava visok ćelijski vijabilitet kulture, omogućavajući time produženu fazu produkcije tokom koje je titar proizvoda, preporučljivo rekombinantnog proizvoda, povećan i kvalitet proizvoda, koji je okarakterisan sadržajem sijalinske kiseline, se održava na visokom nivou. Dodavanje glukokortikoida može da minimizuje rasprostranjen kompromis između titra proteina i sadržaja sijalinske kiseline u dobijanju proizvoda tokom procesa kultivacije ćelija. Na taj način, dodavanje glukokortikoida obezbeđuje pozitivan efekat pojačavajući važan parametar performanse procesa kultivacije, t.j., matematički proizvod "krajnjeg (t.j., finalnog) titra" x "krajnje (t.j., finalne) sijalinska kiselina" X "količina monomera "("krajnji titar x krajnja sijalinska kiselina"x "krajnja količina monomera).
[0031] U jednom aspektu predmetnog pronalaska, kulturi se dodaje glukokortikoidno jedinjenje u vreme inokulacije ili u vreme posle inokulacije koje je pre početka inicijalne faze ćelijske smrti, ili je tokom inicijalne faze rasta, ili je tokom druge polovine inicijalne faze rasta, ili je na završetku ili oko završetka inicijalne faze rasta. U skladu sa ovim aspektom predmetnog pronalaska, faza rastaje produžena i/ili početak faze umiranja je odložen za neki period vremena, kao što je nekoliko dana.
[0032] [0028] U narednom preporučenom aspektu predmetnog pronalaska i kao što je detaljnije opisano u ovom tekstu, novorazvijeni postupci kultivacije ćelija koji uključuju dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja, posebno su pogodni za produkciju solubilnih molekula CTLA4 i solubilnih mutiranih molekula CTLA4, kao što su CTLA4Ig i L104EA29YIg, od strane CHO ćelija koje su genetski modifikovane da eksprimiraju i sintetišu ove proteine. Preporučeni tipični primeri predmetnog pronalaska obuhvataju kultivaciju ćelija koje sintetišu CTLA4Ig i L104EA29YIg koja uključuje dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja tokom serije kultivacije da bi se ostvarile velike količine visokokvalitetnih CTLA4Ig i L104EA29YIg kao proizvoda, što se potvrđuje određivanjem sijalinske kiseline i/ili niskom agregacijom proteina finalnih proizvoda.
[0033] Dalji aspekti, karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska će biti shvaćeni nakon čitanja detaljnog opisa pronalaska u razmatranja crteža /slika.
[0034] OPISI NACRTA/SLIKA
[0035] Slika 1 pokazuje da se ekspresija (31,4-galaktoziltransferaze (1A) i a2,3-sijaliltransferaze (1 B) uopšteno povećava sa prastom koncentracije deksametazona (DEKS) u CHO ćelijama tretiranim deksametazonom kao što je opisano u Primeru 1. DEKS je dodat kulturama 2. dana po inokulaciji u koncentracijama od 0.1 do 10 uM. Petog dana posle inokulacije, prikupljeni su uzorci ćelija i pripremljeni ćelijski lizati, razdvojeni na gradijentom gelu 4-15% i primenom odgovarajućih antitela je ispitano prosustvo svake glikoziltransferase. Na blot je zatim stavljeno antitelo na beta-aktin da bi se procenilo da li je nanošenje uzoraka bilo podjednako.
[0036] Slika 2 pokazuje protektivni efekat DEKS na ćelije koji rezultira smanjenjem aktivnosti sijalidaze u supernatantu ćelijskih kultura kao što je opisano u Primeru 1. Vijabilitet ćelija (2A) i profili promene apsorbance testa aktivnosti sijalidaze u supernatantu (2B) tokom perioda kultivacije između kultura tretriranih DEKS i netretiranih kultura. Tretmani DEKS-om u koncentracijama od 1 uM su započeti 2. dana. Vrednosti prikazuju srednju vrednost i standardnu devijaciju podataka iz pet eksperimenata.
[0037] Slika 3 prikazuje poboljšanja u sijalilaciji glikoproteina u kulturama tretitanim glukokortikoidnim analozima, hidrokortizonom (HIK) i prednizolonom (PRD) kao što je opisano u Primeru 1. Normalizovane vrednosti ukupne količine sijalinske kiseline (3A) i normalizovane vrednosti N-vezane frakcije sijalilovanih vrsta (3B) kultura tretiranih DEKS, HIK i PRD, redom kako su navedene. Tretman je započet drugog dana po inokulaciji u koncentraciji od 0.1, 1 i 10 uM u medijumu za svako jedinjenje. Vrednosti svakog parametra su prikazane kao srednja vrednost ± razlika/2 (n=2)
[0038] Slika 4 prikazuje poboljšanje sijalilacije delovanjem DEKS koje je blokirano antagonistom glukokortikoida RU-486 kao što je opisano u Primeru 1. Normalizovane vrednosti ukupne količine sijalinske kiseline (4A) i normalizovane vrednosti N-vezane frakcije sijalilovanih vrsta (4B) u prisustvu i odsustvu RU-486. RU-486, pri 0 ili 1 uM, dodat je u suspenziju ćelijske kulture 48 sati nakon inokulacije. Zatim je u kulturu 24 sata kasnije dodato 0.1, 1 i 10 uM DEKS. Vrednosti svakog parametra su prikazane kao srednja vrednost ± razlika/2 (n=2).
[0039] Slika 5 pokazuje da je u serijama prihranjivane šaržne kultivacije CHO ćelija tretiranih DEKS u 5-L bioreaktorima je došlo do povećanja količine sijalinske kiseline i frakcija sijalilovanih vrsta kao što je opisano u Primeru 1. Normalizovane vrednosti ukupne količine sijalinske kiseline (5A) i normalizovane vrednosti N- vezane frakcije sijalilovanih vrsta (5B) netretiranih i treiranih kultura tokom kultivacije. Vrednosti svakog parametra su prikazane kao srednjavrednost ± standardna devijacija (n=3). Normalizovana vrednost je realna vrednost podeljena arbitrarnom vrednošću.
[0040] Slika 6 prokazuje sposobnost DEKS da poboljša sijalilaciju glikoproteina na bioreaktorima skale (veličine) 7, 10, i 20-L kao što je opisano u Primeru 1. Zbirno su prikazani normalizovani finalni ukupni molarni odnos ukupne sijalinske kiseline naspram normalizovane sijalilovane frakcije DEKS tretiranih i netretiranih kultura iz različitih serija. Normalizovana vrednost je realna vrednost podeljena arbitrarnom vrednošću.
[0041] Slika 7 prikazuje smanjenje procenta vrsta visoke molekulske mase (VMM) u IgG-fuzionim proteinima koje sintetišu CHO ćelije tretirane deksametazonom (DEKS) kao što je opisano u Primeru 2. 7A, sve ćelije su inicijalno kultuvisane zajedno tokom dva dana u istom flasku koji se meša, i zatim su podeljene u dve grupe, pri čemu je polovina dobila jednokratnu dozu DEKS u finalnoj koncentraciji od 1 uM u bazalnom medijumu. SEC-HPLC analizi da bi se odredio procenat VMM vrsta je prethodilo sakupljanje supernatanta 10. dana i prečišćavanje. Tačkasto prikazane vrednosti su srednje vrednosti (± S.D.) rezultata iz 5 mešajućih flaskova u pojedinačnom eksperimentu.* P <0.01 u poređenju sa kontrolom (KON).1B,kulturana CHO ćelija je dodat DEKS u različitim koncentracijama 2. dana i supernatanti su sakupljeni 10. dana. Tačkasto prikazane vrednosti su srednje vrednosti dobijene iz flaskova u duplikatu. 7C, sve kulture su započete u istom trenutku, ali je 1 uM DEKS dodavano različitog dana, dajući različita vremena inkubacije kao što je naznačeno, kada su ćelije prikupljene u isto vreme, 10. dana. Tačkasto prikazane vrednosti su srednje vrednosti dobij ene iz flaskova u duplikatu.;[0042] Slika 8 prikazuje povećanje ekspresije glutation reduktaze u CHO ćelijama tretiranim deksametazonom (DEKS) kao što je opisano u Primeru 2. DEKS je dodavan kulturama ćelija u različitim koncentracijama na dan inokulacije i uzorci ćelija su prikupljeni 5. dana. Lizati ćelija su razdvojeni na 4-15% gradijentnom gelu. Nakon detekcije glutatione reduktaze, isti blot je korišćen da se detektuje P-actin radi poređenja nalivanja uzoraka.;[0043] Slika 9 prikazuje snižen procenat HMW vrsta u IgG-fuzionim proteinima inkubiranim sa GSHin vitrokao što je opisano u Primeru 2. Rastvoru prečišćenih IgG-fuzionih proteina u Tris-acetatnom puferu (pH 7.5) dodat je redukovani glutation (GSH) u finalnim koncentracijama od 0, 1 i 3 mM, i smeša GSH i proteina je inkubirana na 37°C tokom 1 h pre SEC-HPLC analize. Tačkasto prikazane vrednosti su srednje vrednosti (± S.D.) četiri određivanja iz dva eksperimenta.* P <0.05 u poređenju sa kontrolom (0 mM GSH).
[0044] Slika 10 pokazuje ublažene efekte deksametazona (DEKS) u prisustvu antagoniste glukokortikoidnog receptora RU-486 kao što je opisano u Primeru 2.10A,napravljeni su ćelijski lizati netetiranih ćelija HepG-2 i CHO i razdvojeni su na 4-15% gradijentnom gelu. Uzorak HepG-2 je uzet kao kontrola humanog porekla u svrhu validacije primarnog antitela.10B,RU-486 je dodat u kulturu u koncentraciji 1 uM jedan dan po inokulaciji (1. dan) i CHO ćelije pretretirane RU-486-su 2. dana podeljene, pri čemu je polovina dobila jednokratnu dozu DEKS u finalnoj koncentraciji od 0,1 uM u bazalnom medijumu. Uzorci ćelija su sakupljeni 10. dana; i sve ostale procedure su bile iste kao one na Slici 2.10C,RU-486 je dodat u kulturu u koncentraciji 1 uM 1. dana i zatim je 2. dana dodat DEKS u kulture pretretirane RU-486 u finalnoj koncentraciji od bilo 0,1 uM ili 1 uM. Supernatanti su sakupljeni 10. dana. Tačkasto prikazane vrednosti su srednje vrednosti dobijene iz flaskova u duplikatu.
[0045] Slika 11 prikazuje da DEKS inhibira ćelijsku smrt u kulturama CHO ćelija u medijumu bez seruma cells kao što je opisano u Primeru 3. Kriva odnosa doze DEKS i efekta na gustinu živih ćelija (11A) i vijabilitet (11 B) sa tretmanima započetim drugog dana. Krive zavisnosti efekta DEKS u vremenu na gustinu živih ćelija (11 C) i vijabilitet (11 D) pri koncentraciji tretmana od 1 uM. Svaka vrednost je srednja vrednost podataka dobijenih iz eksperimenata urađenih u duplikatu.
[0046] Slika 12 prikazuje da je pod uticajem DEKS specifična brzina rasta CHO ćelija smanjena dok je specifična produktivnost ćelija povećana kao što je opisano u Primeru 3. Efekat DEKS na specifičnu brzinu rasta CHO ćelija (12A), normalizovanu volumetrijsku produkciju (12B) i normalizovanu ćelijski specifičnu produkciju (12B). Tretmani DEKS su započeti 2. dana. Vrednosti odražavaju srednje vrednosti i standardne devijacije podataka iz pet eksperimenata. Normalizovana vrednost je realna vrednost podeljena arbitrarnom vrednošću.
[0047] Slika 13 prikazuje ushodnu regulaciju anti-apoptotskog gena GILZ u ćelijama CHO tretiranim DEKS je potvrđena primenom qRT-PCR i imunoblot analizom, kao što je opisano u Primeru 3. (13A) DEKS je 2. dana po inokulaciji dodat u kulture u triplikatu u finalnoj koncentraciji od 0 odnosno 1 uM. Uzorci iRNK su izolovani 5<'>i 8. dana posle inokulacije. Vrednosti svakog parametra su prikazane kao srednja vrednost ± standardna devijacija (n=3).
[0048] (13B) DEKS je 2. dana po inokulaciji dodat u kulture u triplikatu u finalnoj koncentraciji od 0 odnosno 1 uM. 5. i 8. dana posle inokulaciji su sakupljeni uzorci ćelija su i pripremljeni ćelijski lizati.
[0049] Slika 14 prikazuje da efekat deksametazona na supresiju ćelijske smrti uk<l>jučuje GILZ i glukokortikoidni receptor, kao što je opisano u Primeru 3 Procenat povećanja (u poređenju sa tretmanom bez DEKS) finalnog vijabiliteta (14A), stepen promene (porast) povećanja ekspresije gena GILZ (14B) i ekspresije proteina GILZ protein indukovana DEKS-om (14C) u prisustvu i odsustvu RU-486. RU-486, je dodat u ćelijsku kulturu u suspenziji, i to 0 ili 1 uM, 48 sati posle inokulacije, a 0, 0.1 i 1 uM of DEKS je zatim dodato u kulturu 24 časa je kasnije. Ćelije su sakupljene za analizu vijabiliteta, qRT-PCR i imunoblota. Svaka prikazana prednost u panelu A sis srednja vrednost eksperimenata urađenih u duplikatu. Svaka vrednosti u paneluBje srednja vrednost i standardna devijacija podataka dobijenih iz eksperimenata urađenih u triplikatu.
[0050] Slika 15 prikazuje da je u serijama prihranjivanih šaržnih kultivacija CHO ćelija tretiranih DEKS u 10-L bioreaktorima kao rezultat dobijeno poboljšanje GŽĆ, vijabiliteta, titra i molarnog odnosa sijalinske kiseline kao što je opisano u Primeru 3. Profili gustine živih ćelija (15A), vijabiliteta (15B) i normalizovanog titra (15C) netretiranih kultura i kultura tretiranih DEKS gde je tretman započet 2. dana i 7. dana. Normalizovana vrednost je realna vrednost podeljena arbitrarnom vrednošću.
[0051] Slika 16 prikazuje efekat DEKS na rast ćelija CHO ćelijske kulture sa CTLA4Ig sekrecijom. Kriva odnosa doze DEKS i efekta na vijabilitet živih ćelija (16A) i vijabilitet (16B) ćelija tretiranih DEKS u finalnoj koncentraciji od, 0, 0.001, 0.01, 0.1,1 i 10 uM, redom. Tretman je započet drugog dana posle inokulacije i svaka vrednost je srednja vrednost podataka dobij enih u eksperimentima urađenim u duplikatu.
[0052] Slika 17 prikazuje efekat DEKS na molarni odnos sijalinske kiseline i VMM nivo CTLA4Ig. Slika prikazuje finalni molarni odnos ukupne sijalinske kiseline (17A) i vrsta VMM (17B) kultura tretiranih DEKS u finalnoj koncentraciji od 0, 0.001, 0.01, 0.1,1 i 10 uM, redom. Tretman je započet drugog dana posle inokulacije i svaka vrednost je srednja vrednost podataka dobij enih u eksperimentima urađenim u duplikatu. Vrednosti prikazane u panelu A su normalizovane vrednosti, koje su realne vrednosti podeljene arbitrarnom vrednošću.
[0053] Slika 18 prokazuje izvodljivost uključivanja DEKS u dobijanje velikih količina rekombinantog glikoproteina, kao što je opisano u Primeru 5. Slika pokazuje gustinu živih ćelija (18A), vijabilitet (18B), normalizovani titar (18C) i normalizovana količina sijalinske kiseline (18D) rekombinantnog glikoproteina dobijenog u opsegu zapremine od 7-L (n=16) i 500-L (n=6) i 5000-L (n=3) skale, redom. Vrednosti odražavaju srednju vrednost i standardnu devijaciju podataka iz više eksperimenata u svakom od navedenih opsega. Normalizovana vrednost je realna vrednost podeljena arbitrarnom vrednošću. Isti delilac je korišćen za normalizaciju za sve skale.
[0054] Slika 19 opisuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:l) i kodiranu sekvencu amino kiselina (SEQ ID NO:2) CTLA4Ig koja ima signalni peptid, nemutiranu (wild type) sekvencu amino kiselina vanćelijskog domena CTLA4 koja počinje metioninom u položaju +1 do asparaginske kiseline u položaju +124, ili počinje alaninom u položaju -1 do asparaginske kiseline u položaju +124, i Ig region. FIG.20 opisuje sekvencu nukleotida (SEQ ID NO:3) i kodiranu sekvencu amino kiselina (SEQ ID NO:4) mutiranog molekula CTLA4 (L104EA29YIg) koji sadrži signalni peptid, mutirani vanćelijski domen CTLA4 koji počinje metioninom u položaju +1 i završava asparaginskom kiselinom u položaju +124, ili počinje alaninom u položaju -1 i završava asparaginskom kiselinom u položaju +124, i Ig region. FIG. 21 opisuje sekvencu nukleinskih kiselina (SEQ ID NO:5) i kodiranu kompletnu sekvencu amino kiselina (SEQ ID NO:6) humanog receptora za CTLA4 (u ovom tektu označen kao nemutiran "wild type" CTLA4) spojenu sa signalnim peptidom onkostatina M (položaj -26 do -2). (američki patenti br. 5,434,131 i 5,844,095).
[0055] DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0056] Predmetni pronalazak opisuje nove postupke za produkciju specifičnih glikoproteina, naime solubilnih molekula CTLA4, preporučljivo solubilnih molekula CTLA4, u ćelijskoj kulturi CHO. Ovi procesi ostvaruju povećanu gustinu živih ćelija, vijabilitet ćelije, nivo produkcije i količinu sijalinske kiseline i smanjenu agregaciju proteina.
[0057] Predmetni pronalazak je usmeren na proces kultivacije ćelija kao što je definisano u patentnim zahtevima. Takođe je ovde stavljen na uvid javnosti proces kultivacije ćelija koji obuhvata: kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja kulturi ćelija.
[0058] Prema predmetnom pronalasku, glukokortikoidna jedinjenja obuhvataju, ali ne isključivo, hidrokortizon (dostupan od Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), prednizon (dostupan od Sigma-Aldrich), prednizolon (dostupan od Sigma-Aldrich), metilprednizolon (dostupan od Sigma-Aldrich), deksametazon (dostupan od Sigma-Aldrich), betametazon (dostupan od Sigma-Aldrich), triamcinolon (dostupan od Sigma-Aldrich), fludrokortizon acetat (dostupan od Sigma-Aldrich). Jedinjenja su lako dostupna od navednih izvora, ii se lako mogu nabaviti načinima poznatim prosečnom poznavaocu oblasti.
[0059] Preporučena glukokortikoidna jedinjenja obihvataju, alli ne isključivo hidrokortizon, prednizolon, betametazon i deksametazon. Posebno je preporučen deksametazon.
[0060] U jednom tipičnom prikazu predmetnog pronalaska, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje pri inokulaciji ili može da bude komponenta bazalnog medijuma. Inokulacija se dešava 0. dana.
[0061] U jednom prikazu predmetnog pronalaska, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje u vremenu posle inokulacije, t.j. ne nalazi se u bazalnom medijumu i nije prisutno pri inokulaciji. Preporučeno je da se glukokortikoidno jedinjenje dodaje 1. dana od kultivacije ili kasnije.
[0062] [0037] U saglasnosti sa predmetnim pronalaskom, glukokortikoidno jedinjenje može da se doda ćelijskoj kulturi jednom, dva puta, tri puta, ili bilo koji broj puta tokom definisanog vremenskog perioda. Može se istovremeno primeniti jedno ili više glukokortikoidnih jedinjenja. To znači da, bilo koje pojedinačno dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja može da uključi dodavanje jednog ili više drugih glukokortikoidnih jedinjenja. Slično tome, ukoliko postoji više od jednog dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja, mogu se pri različitim dodavanjima dodati različita glukokortikoidna jedinjenja. Dodatna jedinjenja i supstance, uključujući glukokortikoidna jedinjenja, se mogu dodavati kulturi pre, zajedno sa ili posle dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja - bilo tokom ili izvan preciziranog vremenskog perioda. U preporučenom tipičnom primeru, u pitanju je jednokratno, t.j. u jednom navratu, dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja. U preporučenom tipičnom primeru, dodaje se jedno glukokortikoidno jedinjenje.
[0063] U saglasnosti sa predmetnim pronalaskom, glukokortikoidno jedinjenje se može dodati ćelijskoj kulturi bilo kojim načinom. Načini dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja obuhvataju, ali ne isključivo, rastvorene u DMSO, rastvorene u organskom rastvaraču, rastvorene u vodi, rastvorene u medijumu za kulture, rastvorene u hranljivom medijumu, rastvorene u pogodnom medijumu, u obliku u kom je nabavljeno ili u bilo kojoj njihovoj kombinaciji.
[0064] Preporučljivo, u rastvor se dodaje DEKS pri čemu je DEKS rastvoren u etanolu koji je zatim razblažen vodom za dalju upotrebu (t.j. kao što je dodavanje DEKS u hranljivi medij um).
[0065] U saglasnosti sa predmetnim pronalaskom, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje da bi se u kulturi postigla koncentracija odgovarajućeg nivoa. Kao neograničavajući primeri, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje do koncentracije od lnM - 1 mM. Preporučljivo glukokortikoidno jedinjenje se dodaje do koncentracije od lnM - 0.1 uM ili 0.1 uM - lOuM; još više preporučeno oko 5nM - 15nM ili 0.5uM - 5uM; posebno preporučeno oko lOnM ili 1 uM ciljnih količina.
[0066] U saglasnosti sa predmetnim pronalaskom, trajanje kulture može da bude bilo koje vreme nakon dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja. Prosečan poznavalac oblasti može da odredi vreme trajanja kulture, na osnovu relevantnih faktora kao što su kvantitet i kvalitet proteina koji se mogu izdvojiti, i nivoa kontaminirajućih ćelijskih elemenata (npr. proteini i DNK) u supernatantnu koji se dobija posle lize ćelije, što će zakomplikovati izdvajanje proteina od interesa.
[0067] [0042] U specifičnim tipičnim primerima procesa kultivacije ćelija i metoda za povećanje vijabiliteta ćelija predmetnog pronalaska, glukokortikoidno jedinjenje je dodaje u vreme nakon inokulacije koje je posle otpočinjanja inicijalne faze umiranja. Preporučeno, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje u vreme nakon inokulacije koje je tokom tokom inicijalne faze rasta. Preporučljivi]e, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje tokom druge faze inicijalne faze rasta. Posebno preporučenp, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje na završetku ili oko završetka inicijalne faze rasta.
[0068] Inicijalna faza rasta se odnosi na fazu rasta koja se uočava u odsustvu navedenog dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja. Inicijalna faza umiranja se odnosi na fazu umiranja koja se uočava u odsustvu navedenog dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja.
[0069] Inicijalna faza rasta se može završiti kada otpočne inicijalna faza umiranja, ili može da postoji stacionarna faza bilo koje dužine između inicijalne faze rasta i inicijalne faze umiranja.
[0070] Na primer, u kulturi ćelija kod koje je inicijalna faza rasta od 0. dana do 6. dana i inicijalna faza umiranja počine 7. dana, u posebnom tipičnom primeru glukokortikoidno jedinjenje se dodaje u vreme nakon inokulacije i pre 7. dana. U specifičnom tipičnom primeru, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje posle inokulacije i do 6. dana. U specifičnom tipičnom primeru, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje između 1. i 6. dana. U drugom specifičnom tipičnom primeru, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje sa hranljivim medijumom u periodu 3-6 dana. U drugim specifičnim tipičnim primerima, glukokortikoidno jedinjenje se dodaje oko 2. dana, ili 2. dana.
[0071] Pokazano je (videti Primer 3) da kada se sprovodi predmetni pronalazak, vijabilitet kulture ćelija je produžen. Stanje, kao što je dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja, uzrokuje produžen vijabilitet ćelija ukoliko je vijabilitet ćelija u kulturi viši tokom perioda vremena u prisustvu ovog stanja nego u odsustvu ovog stanja.
[0072] Takođe su ovde na ovaj način stavljeni na uvid javnosti (1) proces kultivacije ćelija, i (2) metoda produžavanja vijabiliteta ćelija u kulturi koja obuhvata: kultivaciju ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja ćelijskoj kulturi; pri čemu je vijabilitet ćelija ćelijske kulture produžen.
[0073] Pokazano je (videti Primer 3), da kada se glukokortikoidno jedinjenje doda u vreme posle inokulacije i pre početka inicijalne faze umiranja, stepen umiranja u fazi umiranja može da bude snižena, manje od one u fazi umiranja uočene u odsustvu dodavanja glukokortikoidnog j edinj enj a.
[0074] Takođe su ovde na ovaj način stavljeni na uvid javnosti (1) proces kultivacije ćelija, i (2) postupak za smanjenje stepena smrti u fazi umiranja kulture ćelija koji obuhvata: kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja ćelijskoj kulturi u vreme po inokulaciji koje je pre otpočinjanja inicijalne u fazi umiranja; pri čemu je stepen smrti u fazi umiranja snižen. Preciznije, predmetna objava je usmerena na (1) proces kultivacije ćelija, i (2) proces snižavanja stepena smrti u fazi umiranja kulture ćelija koji obuhvata: kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja ćelijskoj kulturi u vreme po inokulaciji koje je tokom inicijalne faze rasta; pri čemu je stepen smrti u fazi umiranja odloženo. Preciznije, predmetna objava je usmerena na (1) proces kultivacije ćelija, i (2) proces snižavanja stepena smrti u fazi umiranja kulture ćelija koji obuhvata: kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja ćelijskoj kulturi tokom druge polovine inicijalne faze rasta; pri čemu je stepen smrti u fazi umiranja smanjeno. U drugim posebnim tipičnim primerima predmetna objava je usmerena na proces za snižavanje stepena smrti u fazi umiranja kulture ćelija koji obuhvata: kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanja glukokortikoidnog jedinjenja ćelijskoj kulturi na završetku ili oko završetka inicijalne faze rasta; pri čemu je stepen smrti u fazi umiranja odložen.
[0075] Primer 3 takođe dokazuje da hidrokortizon (HIK), prednizolon (PRD) i deksametazon (DEKS) svi pokazuju dozno-zavisni protektivni efekat na ćelije u tretiranim kulturama ćelija u poređenju sa netretiranim kulturama ćelija. Međutim, bile su potrebne više koncentracije HIK i and PRD da bi se postigao isti stepen protektivnog efekta na ćelija, što je konzistentno sa njihovom razlikom u potentnosti (t.j. HIK i PRD imaju samo 5% i 20% potentnosti DEKS)
[0076] Trajanje serija procesa kultivacije ćelije, posebno diskontinuiranih procesa, obično je ograničeno preostalom gustinom živih ćelija, koja se smanjuje tokom faze umiranja. Duže vreme trajanja serija može da omogući postizanje višeg titra proizvoda. Briga za kvalitet proizvoda takođe pruža motivaciju za snižavanje stepena smrti, jer smrt ćelija može da uzrokuje oslobađanje sijalidaza u supernatant kultura, što može da smanji sadržaj sijalinske kiseline u eksprimiranim proteinima. Briga za prečišćavanje proteina pruža dodatnu za odlaganje ili zaustavljanje faze umiranja. Prisustvo ćelijskog debrisa i sadržaja mrtvih ćelija u kulturi može negativno da utiče na sposobnost da se izoluje i/ili prečisti proteinski proizvod na kraju serije kultivacije.
[0077] Pokazano je (videti Primer 2), da dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja kulturi ćelija smanjuje agregaciju proteina od interesa.
[0078] Na taj način, predmetna objava je takođe usmerena na (1) proces kultivacije ćelija, i (2) proces za smanjenje procenta agregacije proteina koji obuhvata: kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja ćelijskoj kulturi; pri čemu je procenat vrsta visoke molekulske mase snižen.
[0079] Pokazano je (videti Primer 1), da dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja kulturi ćelija poboljšava sijalilaciju proteina od interesa povećavanjem ukupnog sadržaja sijalinske kiseline i povećanjem procenta sijalilovanih vrsta.
[0080] Primer 1 takođe dokazuje da hidrokortizon (HIK), prednizolon (PRD) i deksametazon (DEKS) svi pokazuju dozno-zavisni poboljšanje sijalilacije u tretiranim kulturama ćelija u poređenju sa netretiranim kulturama ćelija. Međutim, bile su potrebne više koncentracije HIK i PRD da bi se postigao isti stepen poboljšanja, što je konzistentno sa njihovom razlikom u potentnosti.
[0081] Na taj način, predmetna objava je takođe usmerena na (1) proces kultivacije ćelija, i (2) proces za povećanje procenta sijalilovanih vrsta koji obuvata: kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja ćelijskoj kulturi; pri čemu je procenat sijalilovanih vrsta povećan.
[0082] Tako, predmetna objava je takođe usmerena na (1) proces kultivacije ćelija, i (2) proces za povećanje ukupne količine sijalinske kiseline koji obuhvata: kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja ćelijskoj kulturi; pri čemu je ukupna količina sijalinske kiseline povećana.
[0083] Prema tome, predmetna objava je takođe usmerena na (1) proces kultivacije ćelija, i (2) proces za smanjenje stepena de-sijalilacije glikoproteina u kulturi ćelija koji obuhvata: kultivisanje ćelija domaćina koje eksprimiraju protein od interesa; i dodavanje glukokortikoidnog jedinjenja ćelijskoj kulturi; pri čemu je stepena de-sijalilacije smanjen.
[0084] Tehnike i postupci koji se odnose na prečišćavanje i analizu glikoproteina
[0085] [0059] U metodama kultivacije obuhvaćenin predmetnim pronalaskom, protein koji sintetišu ćelije je tipično sakupljen, obnovljen, izolovan, i/ili prečišćen, ili suštinski prečišćen, prema želji, na kraju celokupnog perioda kultivacije ćelija korišćenjem metoda izolacije i prečišćavanja kao što su poznati i primenjivani u oblasti. Preporučeno, protein koji se sekretuje iz ćelija u kulturi se izoluje iz medijuma kulture ili supernatanta; međutim, protein se takođe može bude izdvojen iz ćelija domaćina, npr., ćelijskh lizata, korišćenjem metoda koje su poznate i primenjivane u oblasti, i kao što je dodatno opisano u daljem tekstu.
[0086] Složeni ugljeni hidrat koji sadrži CTLA4 molekul dobijen procesima predmetnog pronalaska se može rutinski analizirati, prema želji, konvencionalnim tehnikama analize ugljenih hidrata. Na primer, tehnike kao što su prenos lektina, dobro poznate u oblasti, otkrivaju razmere terminalne manoze, ili drugih šećera kao što je galaktoza. Završavanje oligosaharida sa jednom dve, tri ili četiri grane sijalinskim kiselinaama mora da bude potvrđeno oslobađanjem šećera sa proteina primenom bezvodnog hidrazina ili enzimskih metoda i frakcionacije oligosaharida jono-izmenjivačkom hromatografijom, ekskluzionom hromatografijom, ili drugim metodama koje su dobro poznate u oblasti.
[0087] pi molekula CTLA4 se takođe može izmeriti, pre i posle tretmana neuraminidazom, da bi se uklonila sijalinske kiseline. Porast u pi nakon tretmana neuraminidazom ukazuju na prisustvo sijalinskih kiselina na molekulu CTLA4. Ugljeno hidratne strukture se tipično javljaji na eksprimiranom proteinu kao N-vezani ili O-vezani ugljeni hidrati. N-vezani i O-vezani ugljeni hidrati se pre svega razlikuju u svojim centralnim strukturama. N-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje ugljeni hidratnog ostatka preko GlcNAc za asparaginski ostatak u peptidnom lancu. N-vezani ugljeni hidrati svi sadrže zajedničku Manl-6(Manl-3)Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcP-R centralne strukture, gde R u ovoj centralnoj strukturi predstavlja asparaginski ostatak. Peptidna sekvenca sintetisanog proteina će sadržati asparagin-X-serin, asparagin-X-treonin, i asparagin-X-cistein, gde je X bilo koja amino kiselina izuzev prolina.
[0088] Nasuprot tome, O-vezane ugljene hidrate karakteriše zajednička centralna struktura, gde je GalNAc vezana za hidroksilnu grupu treonina ili serina. Od svih N-vezanih i O-vezanih ugljenih hidrata, najvažniji u složeni N- i O-vezai ugljeni hidrati. Takvi složeni ugljeni hidrati sadrže nekoliko razgranatih struktura. Mono-, bi-, tri,-, i tetra-, i spoljašnje strukture su važne za dodavanje terminalnih sijalinskih kiselina. Takve spoljašnje lančane strukture obezbeđuju dodatna mesta za veze sa specifičnim šećerima i veze koje obuhvataju ugljene hidrate proteinskih proizvoda.
[0089] [0063] Dobijeni ugljeni hidrati mogu biti analizirani bilo kojom metodom poznatom u oblasti. Nekoliko metoda je poznato u oblasti za analizu glikozilacije i korisne su u kontekstu predmetnog pronalaska. Ove metode obezbeđuju informaciju u smislu identiteta i kompozicije ugljenog hidrata koji je vezan za proizvedeni peptid. Metode za analizu ugljenih hidrata korisne u vezi sa predmetnim pronalaskom uključuju, ali nisu ograničene na, lektin hromatografija; HPAEC-PAD, koja koristi anjon izmenjivačku hromatografiju sa visokim pH da razdvoji oligosaharide na osnovu naelektrisanja; NMR; masena spektrometrija; HPLC; GPC; analiza sastava monosaharida; i sekvencijalna enzimska digestija.
[0090] Uz to, metode za oslobađanje oligosaharida su poznate i primenjivane u oblasti. Ove metode obihvataju 1) enzimske metode, koje se uobičajeno izvode primenom peptid-N-glikozidaze F/endo-P-galaktozidaze; 2) metode P eliminacije, korišćenjem veoma alkalne sredine da bi se oslobodile prevashodno O-vezane strukture; i 3) hemijske metode primenom bezvodnog hidrazina da bi se oslobodili i N- i O-vezani oligosaharidi. Analiza može da se uradi primenom sledećih koraka: 1. Dijaliza uzoraka nasuprot dejonizovane vode da bi se uklonile sve soli pufera, nakon čega sledi liofilizacija. 2. Oslobađanje intaktnih oligosaharidnih lanaca bezvodnim hidrazinom. 3. Delovanje na intaktne oligosaharidne lance bezvodnom metanolskom HC1 da bi se oslobodili pojedinačni monosaharidi kao O-metil derivati. 4. N-acetilacija primarnih amino grupa. 5. Derivatizacija kako bi se dobili per-O-trimetilsilil metil glikozidi. 6. Razdvajanje ovih derivata kapilarnom gas-tečnom hromatografijom (GLC) na CP-SIL8 coloni. 7. Identifikacija pojedinačnih glikozidnih derivata preko retencionog vremena sa GLC i masene spektroskopije, u poređenju sa poznatim standardima. 8. Kvantifikacija pojedinačnih derivata pomoću FID sa unutrašnjim standardom (13-O-metil-D-glukoza).
[0091] Neutralni i amino šećeri mogu da budu određeni anjonsko izmenjivačkom hromatografijom visoke performense, kombinovanom sa pulsnom amperometrijskom detekcijom (HPAE-PAD Carbo Hvdrate Svstem; Dionex Corp.). Na primer, šećeri mogu da bidi oslobođeni hidrolizom u 20% (v/v) trifluorosirćetnom kiselinom na 100°C tokom 6 sati. Hidrolizati su zatim osušeni liofilizacijom ili pomoću Speed-Vac (Savant Instruments). Ostaci su zatim ratsvoreni u 1% rastvoru natrijum acetat trihidrati analizirani na HPLC-AS6 koloni (kao što je opisano u Anumula et al., 1991, Anal. Biochem., 195:269-280).
[0092] [0066] Alternativno, može se uraditi imunoblot analiza ugljenih hidrata. U ovoj proceduri ugljeni hidrati vezani za proteine se detektuju korišćenjem komercijalnog sistema za detekciju glikana (Boehringer), koji je zasnovan na proceduri oksidativnog imunoblota koji su opisali Haselbeck et al. (1993, Glvcoconjugate J., 7:63). Primenjen je protokol za bojenje koji preporučuje proizvođač izuzev što je transfer proteina izvršen na membranu od poliviniliden difluorida umesto na nitroceluloznu membranu i puferi za blokiranje sadrže 5% goveđeg serumskog albumina u 10 mM Tris puferu, pH 7.4, sa 0.9% natrijum hlorida. Detekcije je urađena pomoćun anti-digoksigenin antitelima vezanim za konjugat alkalnog fosfata (Boehringer), 1:1000 razblaženje u Tris-puferovanom fiziološkom rastvoru korišćenjem supstrata za fosfatazu, 4-nitroplavi tetrazolijum hlorid, 0.03% (w/v) i 5-bromo-4 hloro-3-indoil-fosfata 0.03% (w/v) u 100 mM Tris puferu, pH 9.5, koji sadrži 100 mM natrijum hlorida i 50 mM magnezijum hlorida. Proteinske take koje sadrže ugljeni hidrat se obično vizuelizuju posle oko 10 do 15 minuta.
[0093] Ugljeni hidrat udružen sa proteinom se može takođe analizitati digestijom pomoću peptid-N-glikozidaze F. Prema ovoj proceduri, ostatak se suspenduje u 14 uL pufera koji sadrži 0.18% SDS, 18 mM beta-merkaptoetanola, 90 mM fosfata, 3.6 mM EDTA, na pH 8.6, i zagreva na 100°C tokom 3 minuta. Poštp se ohladi do sobne temperature, uzorak je podeljen na dva jednaka dela. Jedan deo, koji nije dalje tretiran, služi kao kontrola. Drugi deo je podešen do oko 1 % NP-40 deterdženta nakon čega su dodate 0.2 jedinice peptid-N-glikozidaze F (Boehringer). Oba uzorka su zagrejana na 37°C tokom 2 sata i zatim analizirana denaturišućom SDS elektroforezom na gelu od poliakrilamida.
[0094] Uz do, sadržaj sijalinske kiseline solubilnog CTLA4 proizvoda je procenjen konvencionalnim metodama. Na primer, sijalinska kiselina može posebno da bude određena direktnom kolorimetrijskom metodom (Yao et al., 1989, Anal. Biochem., 179:332-335), preporučljivo korišćenjem uzoraka u triplikatu. Drugi metod određivanja sijalinske kiseline podrazumeva primenu tiobarbaturne kiseline (TBA), kao što si opisali Warren et al.(1959, J. Biol. Chem., 234:1971-1975). Joše jedna metoda uključuje hromatografiju visoke performanse, kao što su opisali H.K. Ogawa et al. (1993, J. Hromatografija, 612:145-149).
[0095] [0069] Ilustrativno, za izdvajanje molekula CTLA4, izolaciju i/ili prečišćavanje, medijum ćelijske kulture ili ćelijski lizat su centrifugirani da bi se uklonile pojedinačne ćelije i ćelijski debris. Željeni polipeptidni proizvod je izolovan i odgovarajućim tehnikama prečišćavanja prečišćen od kontaminirajućih solubilnih proteina i polipeptida. Naredne procedure obezbeđuju metode prečišćavanja za proteine koje predstavljaju primer, ali nisu ograničavajuće: razdvajanje ili frakcionacija na imunoafinittnim ili jono izmenjivačkim kolonama; taloženje etanolom; HPLC na reverznoj fazi; hromatografija na smoli, kao što je silika, ili kandjonsko izmenjivačkoj smoli, npr., DEAE; hromatofokusiranje; SDS-PAGE; taloženje amonijum sulfatom;
[0096] gel filtracija korišćenjem, npr., SephaDEKS G-75, Sepharose; hromatografija na protein A sefarozi za uklanjanje imunoglobulinskih kontaminanata; i slično. Drugi aditivi, kao što su inhibitori proteaza (npr., PMSF ili proteinaza K) mogu da se koriste da inhibiraju proteolitičku razgradnju tokom prečišćavanja. Iskusan praktičar će podrazumevati da metode prečišćavanje za dati polipeptid od interesa mogu da zahtevaju modifikacije koje dozovoljavaju promene u polipeptidu koji je rekombinantno eksprimitan u kulturi ćelija. One procedure prečišćavanja koje mogu da omoguće da se izdvoje ugljeni hidrati i obogati sijalinska kiselina su posebno poželjne, npr., jono-izmenjivačka hromatografija na mekom gelu, ili HPLC korišćenjem katjonsko- ili anjonsko-izmenjivačkih smola, u kojima se prikupljahu) kiselije frakcija/frakcije.
[0097] Ćelije, proteini i ćelijske kulture
[0098] U procesima ili metodama kultivacije ćelija predmetnog pronalaska, ćelije se mogu održavati u nizu različitih medijuma za kulturu ćelija, t.j., bazalnih medijuma za kultivaciju, kao što je konvencionalno označeno u oblasti. Na primer, metode su primenljive za primenu kod ćelijskih zapremina održavanih u medijumu za ćelijske kulture, koji može da bude obogaćen hranljivim materijama i sličnim. Tipično, "medijum za kultivaciju ćelija " (takođe označen kao "medijum za kulturu ") je izraz dobro poznat onim koji se ovom oblašću bave i poznato je da se odnosi na rastvor hranljivih materija u kojima se ćelije, preporučeno životinjske ili ćelije sisara, uzgajaju i koji uopšteno obezbeđuje najmanje jednu ili više komponenata od sledećih: izvor energije (obično i obliku ugljenog hidrata kao što je glukoza); sve esencijalne amino kiseline, i uopšteno dvadeset osnovnih amino kiselina, plus cistein; vitamine i/ili druga organska jedinjenja koja su tipišno neophodna u niskim koncentracijama; lipide ili slobodne masne kiseline, npr., linoleinsku kiselinu; i elemente u tragovima, npr., neorganska jedinjenja ili prirodne elemente koji su tipično potrebni u veoma niskim koncentracijama, obično u mikromolarnom opsegu. Medijum za kultivaciju ćelija može takođe da bude obogaćen da sadrži niz komponenata po izboru, kao što su hormoni i drugi fatori rasta, npr., insulin, transferin, epidermalni faktor rasta, serum, i slično; soli, npr., kalcijum, magnezijum i fosfat, i puferi, npr., HEPES; nukleozidi i baze, npr., adenozin, timidin, hipoksantin; i proteinski i tkivni hidrolizati, npr., hidrolizovani životinjski protein
[0099] (pepton ili peptonske smeše, koje mogu da se dobiju od životinjskih nusproizvoda, prečišćenog želatina ili biljnog materijala); antibiotici, npr., gentamicin; i zaštitni agensi za ćelije, npr., Pluronic poliol (Pluronic F68). Preporučen je hranljivi medijum za ćelije koji ne sadrži serum kao ni proizvode niti sastojke životinjskog porekla.
[0100] Kao što je poznato praktičaru, životinjske ili ćelije sisara se kultivišu u a medijumu koji je odgovarajući za specifične ćelije koje se kultivišu i koji stručnjak u oblasti može da odredi bez neopravdanih eksperimenata. Mogu se koristiti komercijalno dosupni medijumi i uključuju, na primer, Minimal Essential Medium (MEM, Sigma, St. Louis, MO); Ham's F10 Medium (Sigma); Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma); RPMI-1640 Medium (Sigma); HIKlone cell culture medium (HIKlone, Logan, UT); i hemijski definisane (CD) medijume, koji su formulisani za specifične tipove ćelije, npr., CD-CHO Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ovim gore pomenutim medijumima navedenim kao primer mogu da se dodaju gore opisane dodatne komponente ili sastojci, uključujući komponente po izvoru, u odgovarajućim koncentracijama ili količinama, kao što je neophodno ili poželjno, i to će oni koji se rutinski bave ovom oblašću znati i primenjivati.
[0101] Uz to, uslovi ćelijske kulture odgovarajući za metode predmetnog pronalska su one koje se tipično primenjuju i poznate su za "batch" kultivaciju, prihranjivanu "batch" kultivaciju, ili kontinuiranu kultivaciju ćelija, pri posebna pažnja treba da se obrato na pH, npr., oko 6.5 do oko 7.5; rastvoren kiseonik (O<2>), npr., između 5-90% zasićenja vazduha i ugljen dioksid (CO<2>), mešanje i vlažnost, uz dodatak temperature. Kao ilustracija, iako nije ograničavajući, primer, odgovarajući medijum za kultivaciju ćelija za procese "batch" kultivacije predmetnog pronalaska sadrži modifikovani CD-CHO Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA). Može se primeniti i hranljivi medijum, kao što je modifikovani eRDF medijum (Invitrogen, Carlsbad, CA). Preporučen je hranljivi medijum koji takođe sadrži glukokortikoid, npr. deksametazon.
[0102] [0073] Životinjske ćelije, ćelije sisara, kultivisane ćelije, životinjske ili sisarske ćelije domaćina, rekombinantne ćelije, rekombinantne ćelije domaćina, i slično, i tipično ćelijske linije dobijene ili izvedene od sisara i mogu da rastu i prežive kada su stavljene bilo u kulturu u jednom sloju ili kulturu u suspenziji u medijumu koji sadrži odgovarajuće hranljive materije i/ili faktore rasta. Faktore rasta i hranljive materije koje su neophodne za rast i održavanje specifičnih kultura ćelija lako mogu empirijski da odrede oni koji stručni u ovoj značajnoj oblasti, kao što su opisali, na primer, Barnes i Sato, (1980, Cell, 22:649); u Mammalian Cell Culture, Ed. J.P. Mather, Plenum Press, NY, 1984; i u Američkom patentu br. 5,721,121.
[0103] CHO ćelije se kultivišu prema metodama predmetnog pronalaska. Dalje su stavljene na uvid javnosti ćelije koje su tipično životinjske ili ćelije sisara koje mogu da eksprimiraju ili sekretuju, ili one koje mogu da budu molekularno modifikovane da eksprimiraju i sekretuju, velike količine specifičnog proteina, specifičnije, glikoproteina od interesa, u medijum kulture. Podrazumeva se da glikoprotein koji proizvode ćelije domaćina može da bude endogeni ili homolog ćeliji domaćina. Glikoprotein moće da bude heterolog, t.j., strani, ćeliji domaćina, na primer, humani glikoprotein koji proizvodi i sekretuje jajna ćelija kineskog hrčka (Chinese hamster ovary - CHO) kao ćelija domaćina. Glikoproteini sisara, t.j., oni koji su izvorno dobijeni ili potiču iz organizma sisara, dobijaju se metodama predmetne objave i poželjno je da ih ćelije sekretuju u medijum kulture.
[0104] [0075] Primeri glikoproteina sisara koji mogu da budu pogodno proizvedeni metodama predmetne objave obuhvataju, ali ne isključivo, citokine, citokinske receptore, faktore rasta (npr., EGF, HER-2, FGF-a, FGF-(3, TGF-a, TGF-p, PDGF. IGF-1, IGF-2, NGF, NGF-p); receptore za faktore rasta, uključujući fuzione ili himerne proteine. Drugi neograničavajući primeri obihvataju hormone rasta (npr., humani hormon rasta, goveđi hormon rasta); insulin (npr., A insulina i B lanac insulina), proinsulin; eritropoetin (EPO); faktori stimulacije kolonija (npr., G-CSF, GM-CSF, M-CSF); interleukini (npr., IL-1 preko IL-12); vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) i njegov receptor (VEGF-R); interferoni (npr., IFN-a, P, iliy) ;faktor nekroze tumora (npr., TNF-a i TNF-P) i njihovi receptori, TNFR-1 i TNFR-2; trombopoetin (TPO); trombin; moždani natriuretski peptid (BNP); faktori koagulacije (npr., Faktor VIII, Faktor IX, fon Vilebrandov faktor, i slični); anti-koagulacioni faktori; tkivni aktivator plazminogena (TPA), npr., urokinaza ili humani TPA urokinaznog ili tkivnof tipa; folikulostimulirajući hormon (FSH); luteinizirajući hormon (LH); kalcitonin; CD proteini (npr., CD3, CD4, CD8, CD28, CD19, itd.); CTLA proteini (npr., CTLA4); receptorski proteini T-ćelija i B-ćelija; koštani morfogeni proteini (BNPs, npr., BMP-1, BMP-2, BMP-3, itd.); neurotrofični faktori, npr., neurotrofični faktor izveden iz kosti (BDNF); neurotrofini, npr., 3-6; renin; reumatoidni faktor; RANTES; albumin; relaksin; makrofagni inhibitorni protein (npr., MIP-1, MIP-2); virusni proteini ili antigeni; površinski proteini membrane; proteni jonskih kanala; enzimi; regulatorni proteini; antitela; imunomodulatorni proteini, (npr., HLA, MHC, B7 familija); receptori za privlačenje; transportni proteini; superoksid dismutaza (SOD); proteini receptora vezanog za G-protein (GPCRs); neuromodulatorni proteini; proteini i peptidi udruženi sa Alchajmerovom bolešću, (npr., A-beta), i ostali kao što je poznato u oblasti. Fuzioni proteini i polipeptidi, himerni proteini i polipeptidi, kao i fragmenti ili delovi, ili mutirani proteini, varijante, ili analozi bilo kog od napred navedenih proteina i polipeptida su takođe uklljučeni među odgovarajuće proteine, polipeptide i peptide koji mogu da budu dobijeni metodama predmetnog pronalaska.
[0105] Neograničavajući primeri životinjskih ili sisarskih ćelija domaćina pogodnih za gajenje, eksprimiranje i produkciju proteina za sledstvenu izolaciju i/ili prečišćavanje uključuju jajne ćekije kineskog hrčka (Chinese hamster ovary cells - CHO) kao što su kultivisane u procesu kultivacije ćelija datom u predmetnoj objavi, kao što su CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; i Kolkekar et al, 1997, Biochemistrv, 36:10901-10909), CHO-K1 Tet-On ćelijska linija (Clontech), CHO označene ECACC 85050302 (CAMR, Salisburv, Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO klon B (GEJJVIG, Genova, IT), CHO-K1/SF označene ECACC 93061607 (CAMR, Salisburv, Wiltshire, UK), RR-CHOK1 označene ECACC 92052129 (CAMR, Salisburv, Wiltshire, UK), CHO ćelije negativne na dihidrofolat reduktazu (CHO/-DHFR, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), i dpl2.CHO ćelije (Američki patent br. 5,721,121). Primeri takvih ćelija domaćina takođe uključuju ćelije koje nisu obuhvaćene CHO ćelijama kultivisanim u procesu kultivacije ćelija iz predmetnih objava, npr., ćelija bubrega majmuna CV1 cells transformisane pomoću SV40 (COS cells, COS-7, ATCC CRL-1651); ćelije humanog embrionalnog bubrega (npr., 293 ćelije, ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi u suspenziji, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL-10); ćelije bubrega majmuna (CV1, ATCC CCL-70); ćelije bubrega afričkog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); sertoli ćelije miša (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); ćelije humanog cervikalnom karcinoma (HELA, ATCC CCL-2); ćelije bubrega psa (MDCK, ATCC CCL-34); humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL-75); humane ćelije hepatoma (HEP-G2, HB 8065); ćelije tumora dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL-51); bufalo ćelije jetre pacova (BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI ćelije (Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68); MCR 5 ćelije; FS4 ćelije. CHO ćelije su kultivisane u procesu kultivacije ćelija predmetne objave, naročito, CHO/-DHFR ćelije.
[0106] [0077] Ćelije pogodne za kultivaciju u metodama i procesima predmetnog pronalaska mogu da sadrže ubačene, npr., putem transformacije, transfekcije, infekcije, ili injekcije, ekspresione vektore (konstrukte), kao što su plazmidi i slični, koji sadrže kodirajuće sekvence, ili njihove delove, koje kodiraju proteine koji treba da se eksprimiraju i proizvedu u procesu kultivacije. Takvi ekspresioni vektori sadrže neophodne elemente za transkripciju i translaciju ubačene kodirajuće sekvence. Metode koje stručnjaci u oblasti dobro poznaju i primenjuju mogu da se koriste za kreiranje ekspresionih vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju produkovane proteine i polipeptide, kao i odgovarajuće transkripcione i translacione kontrolne elemente. Ove metode uključujuin vitrorekombinantne DNK tehnike, sintetske tehnike i,in vivogenetičku rekombinaciju. Takve tehnike su opisane u J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. and in F.M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, New York, N.Y.
[0107] Kontrolni elementi, ili regulatorne sekvence, su oni netranslacioni regioni vektora, npr., pojačivači, promotori, 5' i 3' ne-translirani regioni, koji ulaze u interakciju sa proteinima ćelije domaćina da bi izvršili transkripciju i translaciju. Takvi elementi mogu da budu različite jačine i specifičnosti. Zavisno od korišćenog vektorskog sistema i ćelije domaćina, može se koristiti bilo koji broj pogodnih transkripcionih i translacionih elemenata, uključujući konstitutivne i inducibilne promotore. U ćelijskim sistemima sisara, preporučuju se promotori od sisarskih gena ili od sisarskih virusa. Konstrukti za primenu u sistemima za ekspresiju proteina su osmišljeni da sadrže najmanje jedan promotor, pojačivačku sekvencu (po izboru, za ekspresione sisteme sisara), i druge sekvence kao što je potrebno ili traženo za pravilnu transkripciju i regulaciju genske ekspresije (npr., sekvence za inicijaciju i terminaciju transkripcije, poreklo mesta replikacije, sekvence poliadenilacije, npr., poli A sekvenca goveđeg hormona rasta (BGH)).
[0108] [0079] Kao što će stručnjaci u oblasti shvatiti, odabir odgovarajućeg vektora, npr., plazmida, komponenata za korektnu transkripciju, ekspresiju, i izolaciju proteina sintetisanih u eukariotskim (npr., sisarskim) ekspresionim sistemima je poznat i rutinski određen i primenjuju ga stručnjaci u oblasti. Ekspresija proteina u kultivisanim ćelijama u saglasnosti sa metodama predmetnog pronalaska može da bude pod kontrolom promotora kao što su virusni promotori, npr., citomegalovirusni (CMV), Raus sarkoma virusni (RSV), fosfoglicerol kinazni (PGK), timidin kinazni (TK), ili a-aktinski promotor. Uz to, regulisani promotori obezbeđuju inducibilnost posredstvom specifičnih jedinjenja ili molekula, npr., element glukokortikoidnog odgovora (glucocorticoid response element - GRE) virusa tumora dojke miša (MMTV) je indukovan glukokortikoidima (V. Chandler et al., 1983, Cell, 33:489- 499). Takođe, mogu se koristiti tkivno-specifični promotori ili regulatorni elementi (G. Swift et al., 1984, Cell, 38:639-646), ukoliko je neophodno ili poželjno.
[0109] Ekspresioni konstrukti mogu da budu ubačeni u ćelije različitim metodama za transfer gena poznatim stručnjacima u oblasti, na primer, konvencionalnim metodama transfekcije gena, kao što su ko-precipitacija sa kalcijum fosfatom, lipozomalna transfekcija, mikroinjekcija, elektroporacija, i infekcija ili virusna transdukcija. Odabir metoda je u okviru nadležnosti iskusnog praktičara u oblasti. Prosečnim poznavaocima oblasti će biti jasno da jedan ili više konstrukata koji nose sekvencu DNK za ekspresiju u ćelijama mogu da budu transfektovani u ćelije tako da zatim proizvodi ekspresije budu sintetisani i/ili dobijeni iz ćelija.
[0110] U naročitom aspektu, preporučuju se sisarski sistemi za ekspresiju koji sadrže odgovarajuće kontrolne i regulatorne sekvence za primenu u sisarskim ćelijama predmetnog pronalaska koje eksprimiraju proteine. Uobičajeno korišćene eukariotske kontrolne sekvence za primenu u sisarskim ekspresionim vektorima uključuju promotore i kontrolne sekvence kompatibiln sa ćelijama sisara kao što su, na primer, citomegalovirusni (CMV) promotor (CDM8 vektor) i ptičji sarkoma virus (ASV), (<71>LN). Drugi uobičajeno korišćeni promotori uključuju rane i kasne promotore Simian Virusa 40 (SV40) (Fiers et al., 1973, Nature, 273:113), ili druge virusne promotore kao što su oni izvedeni iz poli oma, Adenovirusa 2, i goveđeg papiloma virusa. Može se koristiti i inducibilni promotor, kao što je hMTII (Karin et al., 1982, Nature, 299:797-802).
[0111] Primeri ekspresionih vektora odgovarajućih za eukariotske ćelije domaćina obuhvataju, ali ne isključivo, vektore za sisarske ćelije domaćina (npr., BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); pVPakc Vektore, pCMV vektore, pSG5 vektore (Stratagene), retrovirusne vektore (npr., pFB vektori (Stratagene)), pcDNA-3 (Invitrogen), adenovirusni vektori; vektore udružene sa adeno-virusima, baculovirusne vektore, vektore kvasnica (npr., pESC vektori (Stratagene)), ili modifikovane oblike bilo kog od prethodno navedenih. Vektori mogu takođe da sadrže pojačivačke sekvence ushodno ili nishodno od sekvence promotornog regiona radi optimizovanja genske ekspresije.
[0112] [0083] U rekombinantnom vektoru (npr., plazmidu) može da postoji i marker selekcije koji nosi rezistenciju ćelijama koje su primile (preporučljivo, imaju stabilno integrisani) vektor koji omogućava njihovu selekciju u odgovarajućem medijumu za selekciju. Može se koristiti više različitih sistema za selekciju, uključujući ali ne isključivo, gene za timidin kinazu Herpes Simpleks Virusa (HSV TK), (Wigler et al, 1977, Cell, 11:223), hipoksantin-guanin fosforiboziltransferazu (HGPRT), (Szvbalska and Szvbalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202), i adenin fosforiboziltransferazu (Lowy et al., 1980, Cell, 22:817), koji mogu da se primene u tk-, hgprt-, ili aprt- ćelijama (APRT), redom kako su navedeni.
[0113] Kao osnova za selekciju može da se koristi i rezistencija na anti-metabolite za sledeće neograničavajuće primere gena za markere: dhfr, koji nosi rezistenciju na metotreksat (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357; i O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527); gpt, koji nosi rezistenciju na mikofenolnu kiselinu (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072); neo, koji nosi rezistenciju na aminoglikozid G418 (Clinical Pharmacy, 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann, Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191-21; May, 1993, TIB TECH, 11(5): 155-215; i higro, koji nosi rezistenciju na higromicin (Santerre et al., 1984, Gene, 30:147). Za selekciju željenih rekombinantnih ćelijskih klonova mogu rutinski da se koriste metode uobičajeno poznate u oblasti rekombinantne DNK tehnologije, i takve metode su opisane, na primer, u Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; u Poglavljima 12 i 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al, 1981. J. Mol. Biol, 150:1.
[0114] Uz to, nivo ekspresije eksprimiranog molekula proteina se može povećati amplifikacijom vektora (za pregled, videti Bebbington i Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, New York, 1987). Kada se marker u vektorskom sistemu koji eksprimira protein može amplifikovati, porast u nivou inhibitora prisutnog u kulturi ćelija domaćina će povećati broj kopija gena markera. Pošto je amplifikovani region udružen sa regionom koji kodira protein, produkcija proteina će istovremeno da poraste (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3:257).
[0115] [0086] Vektori koji nose nukleinsku kiselinu koja kodira glutamin sintazu (GS) ili dihidrofolat reduktazu (DHFR) kao markere selektivnosti mogu da budu amplifikovani u prisustvu lekova metionin sulfoksimina odnosno metotreksata. Prednost vektora zasnovanih na glutamin sintazi je dostupnost ćelijskih linija (npr., ćelijska linija mijeloma miša, NSO) koje su glutamin sintaza negativne. Sistem ekspresije glutamin sintaze mogu takođe da deluju u ćelijama koje eksprimiraju glutamin sintazu (npr., CHO ćelije) ukoliko je prisutan dodatni inhibitor koji sprečava funkcionisanje endogenog gena.
[0116] Vektori koji eksprimiraju DHFR kao marker za selekciju obuhvataju, ali ne isključivo, plazmid pSV2-dhfr (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854 (1981). Vektori koji eksprimiraju glutamin sintazu kao marker za selekciju obuhvataju, ali ne isključivo, pEE6 vektor ekspresije koji su opisali Stephens i Cockett, 1989, Nucl. Acids. Res., 17:7110. Ekspresioni sistem glutamin sintaze i njegove komponente su detaljno iznete u PCT publikacijama: WO87/04462; WO86/05807; WO8910103B; WO89/10404; i WO91/06657. Uz to, ekspresioni vektori glutamin sintaze koji mogu da se koriste u saglasnosti sa predmetnim pronalaskom su komercijalno dostupni od dobavljača, uključujući, na primer, Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH).
[0117] U posebnom tipičnom primeru, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira solubilni molekul CTLA4 ili solubilni mutirani CTLA4 molekul može da bude ubačena u vektor osmišljen za eksprimiranje stranih sekvenci u eukariotskom domaćinu. Regulatorni elementi vektora mogu da se razlikuju u skladu sa specfičnom CHO ćelijom. Vektori koji eksprimiraju solubilni CTLA4 ili solubilni mutirani CTLA4 u CHO ćelijama mogu da sadrže sekvence pojačivača za optimizovanje ekspresije proteina.
[0118] Tipovi ćelijskih kultura
[0119] Radi boljeg razumevanja, ali bez ograničenja, iskusnom praktičaru će biti jasno da kulture ćelije i serije kultivacija za produkciju proteina mogu da uključe tri opšta tipa; naime, kontinuiranu kulturu, „batch" kultivaciju i prihranjivanu "batch" kultivaciju. U kontinuiranoj kulturi, na primer, svež suplement medijuma za kultuvaciju (t.j., hranljivi medijum) se obezbeđuje ćelijama tokom peroda kultivacije, dok se stari medijum za kultivaciju uklanja dnevno i proizvod se sakuplja, na primer, dnevno ili kontinuitano. U kontinuiranoj kulturi, hranljivi medijum može da se dodaje dnevno i može da se dodaju kontinuirano, t.j., kapalicom ili infuzijum. Za kontinuiranu kultivaciju, ćelije mogu da ostanu u kulturi sve dokle ćelije ostaju žive i održavau se uslovi okoline i uslovi za kultivaciju.
[0120] [0090] U "batch" (šaržnoj) kultivaciji, ćelije se najpre kultivišu u medijumu i taj medijum se ne uklanja, ne zamenjuje niti suplementira, t.j., ćelije nisu "hranjene" novim medijumom, tokom ili pre zavšetka serije kultivacije. Željeni proizvod se prikuplja na kraju serije kultivacije.
[0121] Za pohranjivanu "batch" kultivaciju, vreme serije kultivacije se produžava suplementiranjem medijuma za kultivaciju jednom ili više puta dnevno (ili kontinuirano) svežim medijumom tokom serije kultivacije, t.j., ćelije su "hranjene" novim medijumom ("hranljivi medijum") tokom perioda kutivacije. Prihranjivana "batch" kultivacija može da obuhvata različite režime i vremena hranjenja, na primer, dnevno, svakog drugog dana, svaka dva dana, itd., više od jednom dnevno, ili manje od jednom dnevno, i tako dalje. Dalje, kod prihranjivanr "batch" kultivacija mogu biti hranjene kontinuirano hranljivim medijumom.
[0122] Željeni proizvod se zatim skuplja na kraju serije kultivacije/produkcije. Predmetni pronalazak preporučljivo prihvata prihranjivane "batch" kultivacije u kojima se glukokortikoidno jedinjenje dodaje u vreme nakon inokulacije.
[0123] Prema predmetnom pronalasku, gajenje CHO ćelijske kulture može biti izvedeno, i produkcija solubilnih molekula CTLA4 u ćelijama se može izvesti, pod uslovima za produkciju proteina u maloj količini ili u velikim količinama, korišćenjem sudova za kultivaciju ćelija i/ili aparatura za kultivaciju koji se konvencionalno koriste za kulturu životinjskih ili sisarskih ćelija. Kao što se podrazumeva stručnjacima u oblasti, posude za kulturu ćelija, T-flaskovi i flaskovi sa mešanjem se tipično koriste na laboratorijskom nivou. Za kultivacije u većim razmerama (skalama), (npr., 500 L, 5000 L, i slični, na primer, kao što je opisano u uobičajeno odobreom Američkom patentu br. 7,541,164, Američkom patentu br. 7,332,303, američkoj prijavi serijski br. 12/086786, podnetoj 19. decembra, 2006) procedure uključuju, ali bez ograničenja, bioreaktor fluidizovane osnove, bioreaktor šupljeg vlakna, kulturu kotrljajućeg suda, ili bioreaktorski sistem sa mešanjem u sudu koji mogu da se koriste. Sa kulturom kotrljajućeg suda ili bioreaktorskim sistemom sa mešanjem u sudu mogu ili ne moraju da se koriste mikronosači. Sistemi mogu da rade u "batch", kontinuiranom ili prihranjivanom "batch" režimu. Uz to oprema ili sistem za kultivaciju može ii ne mora da bude opremljena separatorom ćelija koji koristi filtere, zemljinu težu, centrifugalnu silu i slično.
[0124] Faze kultivacije ćelija i pridruženi parametri
[0125] Pojam term "inokulacija" se odnosi na dodavanje ćelija početnom medijumu kako bi se započela kultura.
[0126] "Faza rasta" kulture je faza tokom koje je gustina živih ćelija u bilo kojoj vremenskoj tački veća nego u bilo kojoj prethodnoj vremenskoj tački.
[0127] "Stacionarna faza" kulture je faza tokom koj je gustina živih ćelija približno konstantna (t.j. unutar greške merenja) tokom vremenskog perioda bilo koje dužine.
[0128] "Faza umiranja" kulture je faza koja dolazi posle faze rasta ili posle faze rasta i stacionarne faze, i tokom koje je gustina živih ćelija u bilo kojoj vremenskoj tački manja nego u bilo kojoj prethodnoj vremenskoj tački tokom te faze.
[0129] U procesu kultivacije "udruženom s rastom", kao što su slučajevi kada glukokortikoidno jedinjenje uzrokuje produženu fazu rasta, faza produkcije može da započne tokom produžene faze rasta.
[0130] U procesu kultivacije udruženom sa fazom "bez rasta", faza produkcije može da bude stacionarna faza.
[0131] Preporučeno, medijum za kultivaciju je suplementiran ("hranjen") tokom faze produkcije kako bi se podržala kontinuirana produkcija proteina, posebno u produženoj fazi produkcije, i da bi se dobile velike količine solubilnog CTLA4 proizvoda visokog kvaliteta (tako kao primer i/ili određeno visokim nivoom sadržaja terminalne sijalinske kiseline nakon izdvajanja proteina). Hranjenje se može odvijati na dnevnoj bazi, ili prema drugim rasporedima radi podrške ćelijskom vijabilitetu i produkciji proteina.
[0132] Proces kultivacije prema predmetnom pronalasku može da rezultira u većem preživljavanju živih ćelija sve do kraja perioda kultivacije. Shodno tome, u nekim tipičnim primerima, što više ćelija preživljava, više ćelija sintetiše željeni proizvod. To, zauzvrat, rezultita većom količinom akumuliranog proizvoda na kraju procesa kultivacije, pri čemu stopa produkcije proteina u pojedinačnim ćelijama, t.j., specifična ćelijska produkcija, ostaje nepromenjena. Celijka specifična produkcija ili specifična ćelijska stopa, kao što je poznato u oblasti, tipično se odnosi na specifičnu ekspresiju proizvoda sintetisanog po ćeliji, ili po jedinici ćelijske mase ili ćelijske zapremine. Ćelijska specifična produkcija se meri u gramima proteina produkovanim po danu, na primer, i može se meriti prema integralnoj metodi koja uključuju sledeću formulu:
[0133] Gde je qp ćelijska specifična konstanta produktivnosti; X je broj ćelija ili zapremina ćelija, ili ekvivalent ćelijske mase; i dP/dt je mera produkcije proteina. Tako, qp se može dobidi iz krive koncentracije proizvoda versus vremenskog integrala ivih ćelija (jo<1>Xdt "dani živih ćelija"). Prema ovoj formuli, kada se količina sintetisanog solubilnog CTLA4 proizvoda stavi na grafik u odnosu na dane vijabilnih ćelija, kriva je ekvivalentna ćeliskoj specifičnoj brzini. Vijabiln ćelije se mogu odrediti korišćenjem nekoliko mera, na primer, biomasa, stepen potrošnje O<2>, laktat dehidrogenaza (LDH), zapremima zgusnutih ćelija ili turbiditet.
[0134] (npr., Američki patent br. 5,705,364 to T. Etcheverrv et al.)
[0135] Produkcija solubilnih molekula CTLA4 i solubilnih mutantnih molekula CTLA4
[0136] metodama kultivacije predmetnog pronalaska
[0137] Metode kultivacije ćelija predmetnog pronalaska su korišćene da bi se dobio solubilni molekul CTLA4 ili solubilni mutantni molekul CTLA4, kao što je opisamo u daljem tesktu. Solubilni molekul CTLA4 je preporučeno CTLA4 fuzioni protein, poželjno CTLA4Ig. Posebno poželjno je da bude CTLA4Ig koji sadrži amino kiseline od -1 do 357 ili +1 do 357 kao što je prikazano sa Slici 19. Solubilni mutirani molekul CTLA4 je preporučeno L104EA29YIg koji sadrži amino kiseline -1 do 357 ili +1 to 357 kao što je prikazano na Slici 20. Metode kultivacije ćelija koje uključuju produžene faze produkcije za proteinski proizvod su posebno pogodne za dobijanje velikih količina solubilnihog molekula CTLA4 visokog kvaliteta i solubilnih mutiranih molekula CTLA4, u njihovim ćelijama domaćina u kulturi.
[0138] U preporučenom tehničkom rešenju, CTLA4Ig produkuju rekombinantno izmenjene ćelije domaćina. CTLA41g fuzioni protein može da bude rekombinantno dobijen u CHO ćelijama transfektovanim vektorom koji sadrži DNK sekvencu koja kodira CTLA4Ig. (videti, američki patent br. 5,844,095 od P.S. Linslev et al). CTLA4Ig fuzioni protein se sintetiše u velikoj količini i odgovarajuće je sijalilovan kada se kultiviše u saglasnosti sa procesima predmetnog pronalaska. Pronalazak omogućava produkciju visokih nivoa proteinskog proizvoda koji se može izdvojiti, npr., sijalilovanog CTLA4Ig proteinskog proizvoda. U narednom preporučenom tehničkom rešenju, solubilni mutirani molekul CTLA4 L104EA29YIg koji sadrži amino kiseline -1 do 357 ili+1 to 357 kao stoje pokazano sa Slici 20 se sintetiše metodama kultivacije ćelija predmetnog pronalaska.
[0139] [0104] Ligand za CTLA4 je molekul B7. Kao što je ovde korišćeno, "ligand" se odnosi na molekul koji specifično prepoznaje i vezuje se za drugi molekul. Interakcije molekula i njegovog Uganda mogu da budu regulisane proizvodoma procesa kultivacije predmetnog pronalaska. Na primer, interakcija CTLA4 sa njegovim Ugandom B7 može da bude blokirana primenom molekula CTLA4Ig. Kao drugi primeri, interakcija faktora nekroze tumora (TNF) sa svojim Ugandom, TNF receptorom (TNFR), može da bude blokirana primenom etanercepta ili drugih molekula koji blokiraju TNF/TNFR.
[0140] "Wild type" CTLA4 ili "ne-mutirani CTLA4" ima sekvencu amino kiselina prirodnog CTLA4, u punoj dužojo kao što je prikazano na Slici 20 (i takođe opisano u Američkom patentu br. 5,434,131, 5,844,095, i 5,851,795), ili njegov bilo koji deo koji prepoznaje i vezuje se za B7, ili ulazi u interakciju sa molekulom B7, tako da je blokirano vezivanje za CD28 i/ili CTLA4 (npr., endogeni CD28 i/ili CTLA4). Nemutirani CTLA4 sadrži specifične delove, uključujući, na primer, vanćelijski domen nemutiranog CTLA4 koji počinje metioninom u položaju +1 i završava asparaginskom kiselinom u položaju +124, ili vanćelijski domen nemuritanog CTLA4 koji počinje alaninom u položaju +1 i završava asparaginskom kiselinom u položaju +124, kao što je prikazano na Slici 21.
[0141] Nemutirani CTLA4 koji se javlja u prirodi je protein na površini ćelije koji ima N-terminalni vanćelijski domen, transmembranski domen, i C-terminalni citoplazmatski domen. Vanćelijski domen se vezuje za ciljni molekul, kao što je molekul B7. U ćeliji, prirodni, nemutirani CTLA4 protein translacijom daje nezreli polipeptid, koji sadrži signalni peptid na amino, ili N-terminalnom, kraju. Nezreli polipeptid podleže post-translacionoj obradi, koja uključuje cepanje i uklanjanje signalnog peptida da bi se dobio proizvod cepanja CTLA4 koji ima novo nastali N-terminalni kraj koji se razlikuje od N-terminalnog kraja nezrelog oblika. Stručnjak u oblasti će razumeti da može doći do dodatne post-translacione obrade, koja uklanja jednu ili više amino kisleina sa novo nastalog N-terminalnog kraja proizvoda cepanja CTLA4. Zreli CTLA4 protein može da počne metioninom u položaju +1 ili alaninom u položaju -1. Zreli oblik CTLA4 molekula uključuje vanćelijski domen ili bilo koji njegov deo, koji se vezuje za B7.
[0142] [0107] Mutirani molekul CTLA4, kako je ovde korišćen, odnosi se na molekul koji sadrži nemutirani CTLA4 kao što je prikazan na Slici 21, ili bilo koji njegov deo ili derivat koji ima mutaciju, ili višestruke mutacije, u sekvenci nemutiranog CTLA4, preporučeno u vanćelijskom domenu nemutiranog CTLA4, i vezuje B7. Mutirani molekul CTLA4 sadrži sekvencu koja je slična, ali nije identična, sekvenci nemutiranog CTLA4 molekula, ali još uvek verzuje B7. Mutacije mogu da uključe jedan ili više amino kiselinskih ostataka supstituisanih amino kiselinom koja ima konzervativnu (npr., leucin zamenjen izoleucinom) ili ne-konzervativnu (npr., glicin zamenjen triptofanom) strukturu ili hemijske osobine, delecije amino kiselina, adicije, pomeranje okvira čitanja, ili sečenja.
[0143] Mutirani CTLA4 molekuli mogu u svom sastavu da sadrže ne-CTLA4 molekul ili da on za njega bude vezan, t.j., CTLA4 mutirani fuzioni proteini. Mutirani molekuli su solubilni (t.j., cirkulišući). Mutirani CTLA4 molekuli uključuju L104EA29YIg i one opisane američkim prijavama serijskih brojeva 60/214,065 and 60/287,576; u WO 01/92337 A2; u američkim patentima broj 6,090,914, 5,844,095, 7,094,874 i 5,773,253; i kao što je opisano u RJ. Peach et al, 1994, J Exp Med, 180:2049-2058.) Nezavisno od specifičnog domena u procesima patentnog zahteva, dalje je ovde stavljeno na uvid javnosti da mutirani molekuli CTLA4 mogu da budu dobijeni sintetski ili rekombinantno proizvedeni.
[0144] CTLA4Ig je solubilni fuzioni protein koji sadrži vanćelijski domen nemutiranog CTLA4, ili njegov deo koji vezuje B7, vezan za molekul imunoglobulina (Ig), ili njegov deo. Vanćelijski domen CTLA4 ili njegovog dela je vezan za Ig ostatak koji sadrži ceo ili deo molekula imunoglobulina, preporučeno ceo ili deo konstantnog regiona imunoglobulina kao što je ceo ili deo IgCyl (IgCgamal), IgCy2 (IgCgama2), IgCy3 (IgCgama3), IgCy4 (IgCgama4), IgCu, (IgCmu), IgCal (IgCalfal), IgCa2 (IgCalfa2), IgC8 (IgCdelta) ili IgCs (IgCepsilon), čineći da fuzioni molekul bude solubilan. Ig deo može da uključi varijabilne, CH2 i CH3 domene, ili CH1, varijabilne, CH2 i CH3 domene, prethodno pomenutih konstantnih regiona ili drugih konstantnih regiona. Preporučeno, Ig deo je humani ili majmunski i sadrži varijabilne, CH2 i CH3 domene. Posebno preporučeno Ig deo sadrži varijabilne, CH2 i CH3 domene humanog IgCyl, ili se sastoji od varijabilnih, CH2 i CH3 domena humanog IgCyl. Ig deo CTLA4Ig, Ig konstantni region ili njegov deo može da bude mutiran, što ima za posledicu smanjenje njegovih efektorskih funkcija (videti, npr., Američki patent br. 5,637,481, 5,844,095 i 5,434,131). Kao što je ovde korišćeno, izrazi Ig deo, Ig konstantni region, Ig C(konstantni) domen, IgCyl (IgCgamal), IgCy2 (IgCgama2), IgCy3 (IgCgama3), IgCy4 (IgCgama4), IgCu (IgCmi), IgCal (IgCalfal), IgCa2 (IgCalfa2), IgC8 (IgCdelta) ili IgCs (IgCepsilon), obihvataju i nativne sekvence i sekvence koje su mutirane, kao što su, na primer, sekvence koje imaju mutacije u konstantnom regionu koje snižavaju efektorsku funkciju.
[0145] [0110] Poseban prikaz koji se odnosi na CTLA4 sadrži vanćelijski domen nemutiranog CTLA4 koji počinje metioninom u položaju +1 i završava asparaginskom kisleinom u položaju +124, ili počinje alaninom u položaju -1 do asparaginskom kisleinom u položaju +124; vezni amino kiselinski ostatak glutamina u položaju +125; i immunoglobulinski deo koji obuhvata glutaminsku kuselinu u položaju +126 preko lizina u položaju +357, kao što je prikazano na Slici 19. DNK koja kodita ovaj CTLA4Ig je deponovana 31. Maja, 1991, u Američkoj kolekciji kultura ćelija (American Type Culture Collection - ATCC), 10801 Universitv Blvd., Manassas, VA 20110-2209, u skladu sa odredbama sporazuma iz Budimpešte, i priznat mu je ATCC broj unosa ATCC 68629; P. Linslev et al., 1994, Immunitv 1:793-80. CHO ćelijska linija koja eksprimira CTLA4Ig je deponovana 39. maja, 1991 u ATCC pod identifikacionim brojem CRL-10762. Solubilni molekuli CTLA41g dobijeni prema ovde opisanim metodama mogu ili ne moraju da uključuju signalnu (vodeću) peptidnu sekvencu. Slke 19 i 20 ukjučuju ilustraciju signalne (vodeće) peptidne sekvence. Tipično, molekuli ne uključuju signalnu peptidnu sekvencu.
[0146] [0111] L104EA29YIg je fuzioni protein koji je solubilni mutirani molekul CTLA4 koji sadrži vanćelijski domen nemutiranog CTLA4 sa izmenom amino kiselina A29Y (amino kiselinski ostatak tirozina koji zamenjuje alanin u položaju 29) i L104E (amino kiselinski ostatak glutaminske kiseline koji zamenjuje leucin u položaju +104) vezan za Ig rep. Slika 20 ilustruje L104EA29YIg. Sekvenca amino kiselina L104EA29YIg sadrži alanin u položaju amino kiseline -1 do lizina u položaju amino kiseline +357 kao što je pokazano na Slici 20. Alternativno, sekvenca amino kiselina L104EA29YIg sadrži metionin +1 do lizina u položaju amino kiseline +357 kao što je pokazano na Slici 20. L104EA29YIg sadrži vezni aminokiselinski ostatak glutamina u položaju +125 i Ig deo koji obihvata glutaminsku kuselinu u položaju +126 preko lizina u položaju +357. DNK koja kodira L104EA29YIg je deponovana 20. juna 2000, u u Američkoj kolekciji kultura ćelija (ATCC), u skladu sa odredbama sporazuma iz Budimpešte, i priznat mu je ATCC broj unosa PTA-2104. 104EA29Y-Ig je opisan u nerešenim američkim prijavama sa serijskim brojevima 09/579,927, 60/287,576 i 60/214,065, i u WO/01/923337 A2. Solubilni L104EA29YIg molekuli sintetisani metodama kultivacije ovog pronalaska mogu ili ne moraju da sadrže signalnu (vodeću) peptidnu sekvencu. Tipično, molekuli dobijeni prema ovom pronalasku ne uključuju signalnu peptidnu sekvencu.
[0147] [0112] Kako je ovde korišćen, izraz "solubilni" se odnosi na bilo koji molekul, ili njegov fragment, koji nije vezan ili pričvršćen za ćeliki cell, t.j., cirkulišući. Na primer, CTLA4, može da postane solubilan dodavanjem Ig grupe na vanćelijski domen CTLA4. Alternativno, molekul kao što je CTLA4 može biti učinjen solubilnim uklanjanjem njegovog transmembranskog domena. Tipično, solubilni molekuli sintetisani shodno predmetnom pronalasku ne uključuju signalnu (vodeću) sekvencu.
[0148] Solubilni molekul CTLA4 se odnosi na molekul koji nije vezan za površinu ćelije (t.j., cirkulišući) molekul koji sadrži nemutiran CTLA4, ili bilo koji njegov deo ili derivat koji vezuje B7, uključujući, ali ne isključivo, solubilni CTLA4 fuzioni proteini; solubilni CTLA4 fuzioni proteini kao što su CTLA4Ig fuzioni proteini (npr., ATCC 68629), kod kojih je vanćelijski domen CTLA4 spojen sa Ig ostatkom koji je kompletan ili deo Ig molekula, preporučeno kompletan ili deo Ig konstantnog regiona, koa što je kompletan ili deo IgCyl (IgCgamal), IgCy2 (IgCgama2), IgCy3 (IgCgama3), IgCy4 (IgCgamm4), IgCrx (IgCmi), IgCal (IgCalfal), IgCa2 (IgCalfa2), IgC8 (IgCdelta) ili IgCe (IgCepsilon), čineći fuzioni molekul solubilnim; solubilni CTLA4 fuzioni protein u kojima je vanćelijski domen spokjen ili pridružen sa delom biološki aktivnog ili hemijski aktivnog proteina kao što je proizvod E7 gena papilomavirusa (CTLA4-E7), antigen p97 udružen sa melanomom (CTLA4-p97) ili env protein HIV-a(CTLA4-env gpl20), kao što je opisano u Američkom patentu br. 5,844,095; hibridni (himerični) fuzioni proteini kao što je CD28/CTLA4Ig kao što je opisano u Američkom patentu br. 5,434,131; Molekuli CTLA4 sa uklonjenim transmembranskim domenom da bi se protein učinio solubilnim (videti, npr., M.K. Oaks et al., 2000, Cellular Immunologv, 201:144-153); solubilni mutirani molekul CTLA4 L104EA29YIg.
[0149] Solubilni molekul CTLA4 može takođe da bude solubilni mutirani molekul CTLA4. Solubilni molekul CTLA4s dobijen prema predmetnom pronalasku može ili ne mora da uključi signalnu (vodeću) peptidnu sekvencu. Signalni peptid može da bude bilo koja sekvenca koja će dozvoliti sekreciju molekula, uključujući signalni peptid iz onkostatina M (Malik et al., 1989, Molec. Cell. Biol., 9:2847-2853), ili CD5 (N.H. Jones et al., 1986, Nature, 323:346-349), ili signalni peptid iz bilo kog vanćelijskog proteina. Solubilni molekul CTLA4 dobijen procesima kultivacije predmetnog pronalaska može da obuhvati signalni peptid onkostatina M koji je vezan na N-terminalnom kraju vanćelijskog domena CTLA4. Tipično, u predmetnom pronalasku molekuli ne uključuju signalnu peptidnu sekvencu.
[0150] [0115] "CTLA4 fuzioni protein" kako je ovde korišćen odnosi se na molekul koji sadrži vanćelijski domen nemutiranog CTLA4, ili njegov deo koji se vezuje za B7, spojen sa ne-CTLA4 ostatkom koji čini CTLA4 molekul solubilnim, kao što je Ig deo. Na primer, CTLA4 fuzioni protein može da uključi vanćelijski domen CTLA4 spojen sa kompletnim konstantnim regionom Ig ili njegovim delom. Primeri Ig konstantnih domena (ili njihovih delova) koji mogu da budu spojeni sa CTLA4 uključuju sve, ali nisu ograničeni na sve gore pobrojane. CTLA4 fuzioni protein može takođe da bude mutirani molekul CTLA4.
[0151] Kako je ovde korišćen, "ne-CTLA4 ostatak " se odnosi na molekul ili njegov deo koji ne vezuje CD80 i/ili CD86 i ne interferira sa vezivanjem CTLA4 za njegov ligand. Primeri uključuju, ali bez ograničenja, Ig ostatak koji je kompletan ili deo Ig molekula, deo biološki aktivnog ili hemijski aktivnog proteina kao što su proizvod E7 gena papilomavirusa (CTLA4-E7), antigen p97 udružen sa melanomom (CTLA4-p97) ili env protein HIV-a(CTLA4-env gpl20) (kao što je opisano u američkom serijski broj 5,844,095,). Primeri Ig ostataka uključuju kompletan ili delove konstantnog domena imunoglobulina, kao što su IgCyl (IgCgamal), IgCy2 (IgCgama2), IgCy3 (IgCgama3), IgCy4 IgCgama4), IgC<^>i (IgCmi), IgCal (IgCalfal), IgCa2 (IgCalfa2), IgCS (IgCdelta) ili IgCs (IgCepsilon). Ig ostatak može da uključi varijabilni, CH2 i CH3 domene, ili CH1, varijabilni, CH2 i CH3 domene gore navedenih konstantnih regiona ili drugih konstantnih regiona. Preporučeno, Ig ostatak je humani ili majmunski i obuhvata varijabilne, CH2 i CH3 domene. Najviše preporučeno Ig ostatak obuhvata varijabilne, CH2 i CH3 domene humanog IgCyl, ili je varijabilni, CH2 i CH3 domen humanog IgCyl. U Ig ostatku, konstantni region Ig ili njegov deo može da bude mutiran tako da smanji njegove efektorske funkcije (videti, npr., Američki patent br. 5,637,481, 5,844,095 i 5,434,131).
[0152] Vanćelijski domen CTLA4 se odnosi na bilo koji deo nemutiranog CTLA4 koji prepoznaje i vezuje B7. Na primer, vanćelijski domen CTLA4 sadrži metionin na položaju +1 do asparaginske kiseline na položaju +124 (FIG. 21). Na primer, vanćelijski domen CTLA4 sadrži alanin na položaju -1 do asparaginske kiseline na položaju +124 (FIG.21).
[0153] [0118] Kao što je ovde korišćen, izraz "mutacija" se odnosi na promenu u nukleotidnoj ili sekvenci amino kiselina nemutiranog molekula, na primer, promenu u DNK i/ili sekvenci amino kiselina nemutiranog CTLA4 vanćelijskog domena. Mutacija u DNK može da promeni kodon što dovodi do promene u kodiranoj sekvenci amino kiselina. Promena DNK može da uključi supstitucije, delecije, insercije, alternativno isecanje, ili skraćenja. Promema amino kiselina može da uključi supstitucije, delecije, insercije, adicije, skraćenja, ili greške u obradi ili isecanju proteina. Alternativno, mutacije u nukleotidnoj sekvenci mogu da dovedu do silent mutacije u sekvenci amino kiselina, što je dobro poznato u oblasti. Jer je takođe poznato da pojedini nukleotidni kodoni kodiraju istu amino kiselinu. Primeri uključuju nukleotidne kodone CGU, CGG, CGC, i CGA koji kodiraju amino kiselinu, arginin (R); ili kodone GAU, i GAC koji kodiraju amino kiselinu, asparaginsku kiselinu (D).
[0154] Na taj način, protein može da bude kodiran jednim ili više molekula nukleinskih kiselina koji se razlikuju u njihovim specifičnim nukleotidnim sekvencama, ali i dalje kodiraju molekule proteina koji sadrže identične sekvence. Mutirani molekul može da sadržu jednu, ili više od jedne mutacije. Za orijentaciju, kodirajuća sekvenca amino kiselina je kao što sledi:
[0155] Kao što je ovde korišćeno, "fragment ili deo" je bilo koji deo ili segment molekula. Za CTLA4 ili CD28, fragment ili deo je poželjno vanćelijski domen CTLA4 ili CD28, ili njihov deo ili segment, koji prepoznaje i vezuje B7 ili interferira sa B7 tako da blokira vezivanje za CD28 i/ili CTLA4. Takođe, kao što je ovde korišćeno, "odgovarajući" znači koji dele iste sekvence.
[0156] Kao što je ovde korišćeno, "derivat" je molekul koji deli sličnost sekvence i aktivnost sa svojim ishodnim molekulom. Na primer, derivat CTLA4
[0157] uključuje solubilni molekul CTLA4 koji ima sekvencu amino kiselina najmanje 70% sličnu vanćelijskom domenu nemutiranog CTLA4, i koji prepoznaje i vezuje B7 npr. CTLA4Ig ili solubilni mutirani molekul CTLA4 L104EA29YIg. Derivat znači bilo koji promenu u sekvenci amino kiselina i/ili hemijskih osobina amino kiselina npr., amino acid analozi.
[0158] [0122] Kao što je ovde korišćeno, da "reguliše imunski odgovor " je da aktivira, stimuliše, ushodno reguliše, inhibira, blokira, smanji, ublaži, nishodno reguliše ili modifikuje imunski odgovor. Niz bolesti, npr., autoimunske bolesti, može da se leči regulacijom imunskog odgovora, npr., regulacijom funkcionalnih CTLA4- i/ili CD28- pozitivnih ćelijskih interakcija sa B7-pozitivnim ćelijama. Na primer, metoda regulacije imunskog odgovora sadrži dovođenje u kontakt B7-pozitivnih ćelija sa solubilnim molekulom CTLA4, kao što su oni dobijeni prema predmetnom pronalasku, formiranje solubilnih CTLA4/B7 kompleksa, gde solubilni molekul CTLA4 interferira sa reakcijom endogenog CTLA4 i/ili CD28 molekula sa molekulom B7. "Blokirati" ili "inhibirati" receptor, signal ili molekul, kako je ovde navedeno, znači interferirati sa aktivacijom receptora, signala ili molekula, kao što je detektovamo testom priznatom u oblasti. Blokada ili inhibicija može da bude delimična ili totalna.
[0159] Kao što je ovde korišćeno, "blokiranje B7 interakcija" odnosi se na interferiranje sa vezivanjem B7 za njegove ligande, kao što su CD28 i/ili CTLA4, time sprečavajući T-ćelijski i B7-pozitivne ćelijske interakcije. Primeri agenasa koji blokiraju B7 interakcije obihvataju, ali ne isključivo, molekule kao što su antitelo (ili njegov deo) koje prepoznaje i vezuje se za bilo koji od CTLA4, CD28 ili B7 molekula (npr., B7-1, B7-2); solubilni oblik (ili njegov deo) molekula kao što su solubilni CTLA4; peptidni fragment ili drugi mali molekul osmišljen da interferira sa ćelijskim signalom preko CTLA4/CD28/B7-posredovanih interakcija. Blokirajući agens može da bude solubilni molekul CTLA4, kao što su CTLA41g (ATCC 68629) ili L104EA29YIg (ATCC PTA-2104); solubilni CD28 molekul, kao što je CD28Ig (ATCC 68628); solubilni B7 molekul, kao što je B7-Ig (ATCC 68627); anti-B7 monoklonsko antitelo (npr., ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 i monoklonska antitela kao što su opisana u Američki patent br. 6,113,898 ili u Yokochi et al., 1982, J. Immunol., 128(2):823-827); anti-CTLA4 monoklonsko antitelo (npr., ATCC HB-304, monoklonska antitela kao što su opisana u referencama 82-83); i/ili anti-CD28 monoklonsko antitelo (npr. ATCC HB 11944 i MAb 9.3, kao što je opisano u Hansen et al., 1980, Immunogenetics, 10: 247-260, ili Martin et al, 1984, J. Clin. Immunol., 4(1):18-22). Blokiranje B7 interakcija se može detektovati testovima prepoznatim u oblasti kao što su određivanje smanjenja simptoma udruženih sa imunskom bolešću (npr., reumatskom bolešću), određivanjem smanjenja u T-ćelijskim/B7-ćelijskim interakcijama, ili određivanjem smanjenja u interakciji B7 sa CTLA4/CD28. Blokada može da bude delimična ili potpuna.
[0160] [0124] Kao što je ovde korišćeno, delotvorna količina molekula se odnosi na količinu koja blokira interakciju molekula sa svojim Ugandom. Na primer, delotvorna količina molekula koja blokira interakciju B7 sa CTLA4 i/ili CD28 je količina molekula koja, kada je vezana za molekule B7 na B7-pozitivnim ćelijama, inhibira vezivanje molekula B7 za endogene ligande kao što su CTLA4 i CD28. Alternativno, delotvorna količina molekula koja blokira interakciju B7 sa CTLA4 i/ili CD28 je količina molekula koja, kada je vezana za CTLA4 i/ili CD28 molekule na T ćelijama, inhibira vezivanje molekula B7 za endogene ligande kao što su CTLA4 i CD28. Inhibicija blokade može da bude delimična ili potpuna.
[0161] Za kliničke protokole, preporučeno je da Ig ostatak fuzionog proteina, kao što su CTLA4Ig ili mutirani CTLA4Tg, ne ispoljava štetan imunski odgovor kod subjekta. Preporučeni ostatak je kompletan ili deo konstantnog regiona Ig, uključujući humane ili ne-humane (od primata) Ig konstantne regione. Primeri pogodnih Ig regiona obihvataki IgCyl (IgCgamal), IgCy2 (IgCgama2), IgCy3 (IgCgama3), IgCy4 IgCgama4), IgCri (IgCmi), IgCal (IgCalfal), IgCa2 (IgCalfa2), IgC8 (IgCdelta) ili IgCe (IgCepsilon), uključujući varijabilne, CH2 i CH3 domene, ili CH1, varijabilne, CH2 i CH3 domene, koji su uključeni u efektorske funkcije kao što su vezivanje za Fc receptore, komplement-zavisna citotoksičnost (engl.complement- depenđent cytotoxicity -CDC), ili ćelijski-posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (engl.antibody- dependent cell- mediated cytotoxicity- ADCC). U Ig ostatku može da bude prisutna jedna ili više mutacija, (npr., u CH2 domenu da bi se smanjile efektorske funkcije kao što su CDC ili ADCC) gde mutacije modulišu sposobnost Ig da se veže za svoj ligand povećavanjem ili smanjenjem sposobnosti Ig da se veže za Fc receptore. Na primer, mutacije u Ig ostatku mogu da uključe promene u bilo kom ili svim od njegovih cisteinskih ostataka unutar varijabilnog domena. Na primer, cisteini u položajima +130, +136, i +139 su supstituisani serinom. Ig ostatak može takođe može da uključi prolin u položaju +148 supstituisan serinom. Dodatno, mutacije u Ig ostatku mogu da uključe leucin u položaju +144 zamenjen fenilalaninom; leucin u položaju +145 supstituisan glutaminskom kiselinom; ili glicin na položaju +147 zamenjen alaninom.
[0162] PRIMERI
[0163] Primeri koji slede pokazuju specifične aspekte predmetnog pronalaska da ilustruju pronalazak i obezbeđuju opis predmetnih metoda za stručnjake u oblasti. Primere ne treba shvatati kao ograničavajuće za pronalazak, pošto Primeri samo daju specifičnu metodologiju i putem primera daju razjašnjenja koja su koreisna u razumevanju i primeni pronalaska i njegovih različitih aspekata.
[0164] Primeri 1-5 kao što su napred izloženi opisuju eksperimente koji se odnose na procese kultivacije ćelija koji uključuju dodavanje glukokortikoida tokom serije kultivacije.
[0165] PRIMER 1
[0166] U ovoj studiji, ispitivani su unutarćelijski efekti deksametazona (DEKS) na proces glikozilacije CHO ćelije, i vanćelijski efekti usled aktivnosti sijalidaze. Ovde je po porvi put pokazano da je DEKS bio sposoban da poboljša sijalilaciju rekombinantnog fuzionog glikoproteina koji je sintetisan u CHO. Neto efekat DEKS u pospešivanju povećane sijalilacije ispitane u kulturama u flaskovima sa mešanjem je zatim uspešno potvrđen u kontrolisanim bioreaktorima, i rezultovao je u povećanom sadržaju sijalinske kiseline kao i u smanjenom stepenu de-sijalilacije u prihranjivanim "batch" kulturama.
[0167] Ćelijska linija i medijum
[0168] Ćelijska linija CHO koiršćena u ovoj studiji je inicijalno subkloniran od DG44 parentalnih ćelija i kultivisana je u sopstvenom medijumu za rast koji ne sadrži proteine.
[0169] Eksperimenti u flaskovima koji se mešaju
[0170] Eksperimenti su urađeni u 250-mL flaskovima za mešanje (VWR international) sa početnim zapreminama od 100 mL i inicijalnim gustinama ćelija od 6 x 10<5>ćelija/mL. Kulture su stavljene na platformu koja se meša (VWR international) na 150 rpm i održavane su na 37°C i 6% CO<2>tokom deset dana. Uzorak iz kultura je uziman svakog dana i pH je korigovan po potrebi korišćenjem 1 M natrijum karbonata i ćelije su hranjene glukozom i glutaminom svaka dva dana kako bi se održale na odgovarajućim nivoima. Ćelijska gustina i vijabilitet su mereni van kulture korišćenjem CeDEKS automatizovanog brojača ćelija (Innovatis AG, Bielefeld, Germanv). pH vrednost kulture i koncentracije za glukozu i glutamin su merene van kulture korišćenjem Bioprofile Analvzer 400 (Nova Biomedical Corporation, Waltham, MA).
[0171] Rad Bioreaktora
[0172] [0131] Eksperimenti u bioreaktoru su urađeni u 5-L bioreaktorima (Sartorius AG, Goettingen, Germanv) sa početnom radnom zapreminom od 1.5 L. Održavani kontrolisani uslovi su značili mešanje na 150 rpm, pH na 7.05, i rastvoreni kiseonik 50% zasićenja vazduha. Kontrola temperature je inicijalno održavana na 37°C, ali je pomerena na nižu temperaturu tokom kultivacije da bi se produžio vijabilitet kulture. Bioreactori su radili u režimu prihranjivane "batch" kultivacije i dnevno s pohranjivani počevši od 3. dana sopstvenim hranljivim medijumom da bi se održale odgovarajuće koncentracije glukoze i drugih nutritijenata. Tokom procesa kultivacije su uzimani uzorci i u njima je analizirana gustina ćelija, ćelijski vijabilitet, supstrati i metaboliti.
[0173] Western blot analiza a2,3-sijaliltransferaze (a2,3-ST) i pi,4-galaktoziltransferaze
[0174] (P1.4-GT)
[0175] Približno IO<7>CHO ćelija je oprano IX puferovanim fiziološkim rastvorom (PBS), lizirano pomoću 1 mL Lemli pufera za uzorke (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), zatim denaturisano na 90°C tokom 5 minuta. Ćelijski lizati su razdvojeni na 4-15% SDS-poliakrilamidnom gelu, preneti na 0.45 um nitrocelulozne membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), i inkubiran sa primarnim i sekundarnim antitelima. Primarna antitela su bila anti-humana a2,3-ST zečija poliklonska antitela i anti-humana pi,4-GT zečija poliklonska antitela (Santa Cruz Biotechnologv, Santa Cruz, CA). Sekundarno antitelo je bilo anti-zečije antitelo konjugovano peroksidazom iz rena (horseradish peroxidase - HRP) (Santa Cruz Biotechnologv, Santa Cruz, CA). Membrane su stripovane i ponovo inkubirane sa antitelom na P-aktin (Santa Cruz Biotechnologv, Santa Cruz, CA) i HRP-konjugovano anti-mišje sekundarno antitelo. Immunodetekcija je urađena primenom sistema za detekciju Western blota na bazi pojačane hemiluminescence (GE Healthcare) i vizuelizovano pomoću VersaDoc Imaging Svstem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
[0176] Merenje aktivnosti sijalidaze u supernatantu
[0177] [0133] Aktivnost sijalidaze je analizirana korišćenjem Amplex Red Neuraminidase (Sialidase) Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ukratko, neuraminidaza iz uzorka se koristi da ukloni sijalinsku kiselinu sa fetuina. Ovaj test koristi Amplex Red da se detektuje H<2>O<2>koji nastake oksidacijom desijalilovanih galaktozih ostataka na fetuinu delovanjem galaktozo oksidaze. H<2>O<2>, u prisustvu HRP, stehiometrijski reaguje sa Amplex Red reagensom pri čemu nastaje fluorescentno crveni proizvod oksidacije, resornim 5, koji se zatim analizira bilo fluorometrijski ili spektrofotometrijski. U ovom testu, 50 uL radnog rastvora (100 uM Amplex Red, 0.2 U/mL HRP, 4 U/mL galaktozo oksidaze i 500 ug/mL fetuina) se dodaje u svaki bunar mikrotitarske ploče koji sadrži 50 uE razblaženog supernatanta ćelijske kulture. Posle 30 minuta inkubacije na 37°C, apsorbanca uzoraka je analizirana na 560 nm korišćenjem čitača za mikrotitarske ploče.
[0178] Test sijalinske kiseline
[0179] Molarni odnos sijalinske kiseline naspram rekombinantnog proteina je izračunat određivanjem koncentracija sijalinske kiseline i rekombinantnog proteina. Sijalinska kiselina (SK), uključujući N-acetilneuraminsku (Neu5Ac) i N-glikolilneuraminsku kiselina (Neu5Gc), su oslobođene delimičnom kiselom hidrolizom. Derivati su zatim razdvojene HPLC reverznih faza da bi se odredila količina sijalinske kiseline. Koncentracije proteina je određena UV apsorbancom na 280 nm. Količina sijalinske kiseline je izražena kao molarni odnos, koji je ukupni broj mola Neu5Ac i Neu5Gc po molu rekombinantnog glikoproteina. Količina sijalinske kiseline je prikazana kao normalizovane vrednosti, što su realne vrednosti podeljene arbitrarnom vrednošću. Isti delilac je korišćen radi normalizacije svih podataka o količini sijalinske kiseline u ovde prikazanim studijama.
[0180] Merenje N-vezanih oligosaharida
[0181] Za dobijanje profila N-vezanih oligosaharida korišćena je anjonsko-izmenjivačka hromatografija visokog pH sa pulsnom amperometrijskom detekcijom (HPAEC-PAD) (Basa and Spellman 1990; Townsend i Hardy 1991) da bi se dobile informacije o N-vezanoj glikozilaciji specifičnoj za mesto. N N-vezani oligosaharidi su odvojeni od proteina i razdvojeni na HPAEC-PAD u četiri domena na osnovu količine prisutne sijalinske kiseline. Domen I predstavlja asijalo vrste. Domeni II, III, i IV su sijalilovane vrste i predstavljaju, redom monosijalilovane, disijalilovane, i tri- i tetrasijalilovane vrste. N-vezane frakcije sijalilovanih vrsta su prikazane kao procenat N-linked sijalilovanih vrsta unutar ukupnih N-vezanih oligosaharidnih vrsta, koje uključuju i asijalo i sijalilovane vrste. N-vezane frakcije sijalilovanih vrsta su prikazane kao normalizovane vrednosti, koje su realne vrednosti podeljene arbitrarnom vrednošću. Isti delilac je korišćen radi normalizacije svih podataka N-vezanih frakcija sijalilovanih vrsta u ovde prikazanim studijama.
[0182] Merenje O-vezanih oligosaharida
[0183] [0136] O-vezanu glikozilaciju karakteriše analiza intaktne mase referentnog standarda i uzoraka fuzionog proteina prečišćenih pomoću Proteina-A (Reference). Uzorci su razblaženi u 100 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.6 i inkubirani sa PNGase F preko noći da bi se enzimski uklonili svi N-vezani oligosaharidi. Uzorci su zatim injektovani za analizu intaktne mase nakon mešanja sa internim standardom insulina. Sadržaj O-vezane sijalinske kiseline je izražen kao molarni odnos, koji je broj molova O-vezane sijalinske kiseline po molu rekombinantnog glikoproteina.
[0184] Rezultati
[0185] Deksametazon povećava sadržaj sijalinske kiseline i procenat sijalilovanih vrsta u N-vezanim oligosaharidima
[0186] Ćelijska linija CHO DG44 koja eksprimira fuzioni glikoprotein tretirana je različitim nivoima DEKS da bi se procenilo da li DEKS utiče na sadržaj sijalinske kiseline i procente različitih sijalilovanih vrsta. Studija je urađena u duplikatu u flaskovima od 250-mL koji se mešaju korišćenjem uslova kultivacije kao što su napred opisani. Drugog dana posle inokulacije, DEKS je dodat CHO ćelijskim kulturama u finalnim koncentracijama u opsegu od 0.01 do 10 uM DEKS. Kulture su sakupljene 10. dana, i fuzioni protein je prečišćen korišćenjem protein A kolone i analiziran je ukupan sadržaj sijalinske kiseline, sadržaj O-vezane sijalinske kiseline i N-vezani profil. U kulturama tretiranim DEKS došlo je do dozno-zavisnog porasta sijalilacije (Table 1).
[0187] Koncentracije DEKS od 0.01 uM do 10 uM su dovele do porasta od 9.3% do 20.4% u sadržaju sijalinske kiseline, sa maksimalnim efektom na 10 uM. U poređenju sa kontrolom, hromatografije N-vezanih oligosaharida za kulture sa tretmanom DEKS su pokazale povećanje monosijalilovanih, disijalilovanih i tri-plus tetra sijalilovanih frakcija, redom, od 4.3% do 7.3%o, 13.9 % do 24.3% i 4.5% do 20.5%. Saglasno tome, došlo je do smanjenja u 8.5% do 15.6% u poređenju se kontrolom u asijalo frakcijama u rasporedu oligosaharida za DEKS-suplementirane kulture. Hromatogrami N-vezanih frakcija su pokazali maksimalan efekat na 10 uM DEKS. Ovi rezultati ukazuju na povećanje sijalilacije u kulturama tretiranim DEKS. Međutim, nisu uočene značajne promene u molarnim odnosima O-vezane sijalinske kiseline iz uzoraka tretiranih DEKS.
[0188] DEKS povećava ekspresiju pi,4-galaktoziltransferaze (pi,4-GT) i a2,3-sijaliltransferaze (a2,3-ST)
[0189] Kako bi se rasvetlili potencijalni mehanizmi delovanja DEKS na sijalilaciju primenjen je Western blot za ispitivanje ekspresije dva enzima, pi,4-GT i a2,3-ST, koji su uključeni u puteva dodavanja sijalinske kiseline. U ovom eksperimentu, DEKS je dodat kulturama drugog dana posle inokulacije u koncentracijama od 0.1 uM do 10 uM i ćelije su sakupljene za Western blot analizu nakon tri dana. Za poređenje nanošenja uzoraka korišćen je konstitutivni protein P-aktin. Kao što je prikazano na Slikama 1A i 1B, nivoi ekspresije pi,4-GT i a2,3-ST su bitno povećani u kulturama tretiranim DEKS u poređenju sa kulturama bez DEKS tretmana. Intenzitet ekspresije za oba enzima se obično povećavao sa porastom koncentracije DEKS. Ovi rezultati su pokazali da je DEKS mogao da stimuliše ekspresiju sijaliltransferaza pi,4-GT i a2,3-ST u CHO ćelijama.
[0190] Protektivni efekat DEKS na ćelije dovodi do snižene aktivnosti sijalidaze u supernatantu kultura
[0191] [0140] U Primeru 3, pokazano je da DEKS tretman povećava ekspresiju anti-apoptotskog proteina GILZ što rezultira povećanjem vijabiliteta kultura CHO ćelija. Da bi se utvrdilo da li poboljšanje u ćelijskom vijabilitetu usled DEKS može da smanji razgradni efekat sijalidaza na rekombinantni fuzioni protein, otpočeta je studija u flasku sa mešanjem da bi se uporedio ćelijski vijabilitet i profili aktivnosti sijalidaze u supernatantu iz kultura sa i bez 1 uM DEKS. Kao što je prikazano na Slici 2A i Slici 2B, povećana aktivnost sijalidaze je bila udružena sa smanjenim vijabilitetima ćelija i u DEKS-tretiranim i netretiranim kulturama. Ćelijski vijabilitet se smanjivao od 98.0 ± 0.1% 4. dana do 85.0 ± 2. 7% 10. dana u DEKS tretiranim kulturama u poređenju sa vijabilitetom 10. dana od 70.2 ± 4.6% za kontrolu. Merenja apsorbance aktivnosti sijalidaze su se povećavala od 0.006 ± 0.002 4. dana 4 do 0.024 ± 0.003 10. dana u DEKS tretiranim kulturama u poređenju sa vrednošću 10. dana od 0.047 ± 0.004 u kontroli. Prema tome, brzina kojom je u kulturama doalzilo do pada u ćeliskom vijabilitetu kao i do porasta u aktivnosti sijalidaza je bila značajno manja u kulturama tretiranim DEKS. Ovi rezultati ukazuju daje DEKS mogo da inhibira oslobađanje sijalidaza preko svog protektivnog efekta na ćelije.
[0192] Poređenje deksametazona sa dva druga glukokortikoida, hidrokortizonom i prednizolonom
[0193] Dodatna glukokortikoidna jedinjenja, hidrokortizon (HIK) i prednizolon (PRD) su takođe ispitivana, da bi se utvrdilo da li efekat DEKS na povećanje sijalilacije u CHO ćelija može da se odnosi i na druga glukokortikoidna jedinjenja. DEKS, HIK i PRD su dodarti u medijum ćelijske kulture drugog dana posle inokulacije u finalnim koncentracijama od 0, 0.1, 1 i 10 uM. Slika 3A i Slika 3B prikazuju normalizovani ukupni sadržaj sijalinske kiseline i normalizovane N-vezane frakcije sijalilovanih vrsta posle 10-dnevne kultivacije za različite glukokortikoidne uslove. Ukupni sadržaj sijalinske kiseline pri koncentracijama glukokortikoida između 0.1 do 10 M je bio 12.4±0.4 do 14.0±0.5 za DEKS, 11.2±0.1 do 13.0±0.2 za HIK, i 11.8±0.2 do 13.4±0.8 za PRD, u poređenju sa 10.2±0.2 za kontrolu. N-vezane frakcije sijalilovanih vrsta pri koncentracijama glukokortikoida između 0.1 do 10 M su bile 85.6±1.6 do 88.8±0.9 za DEKS, 79.8±1.6 do 89.6±0.1 za HIK, i 83.7±0.1 do 89.0±0.2 za PRD u poređenju sa 77.1±0.7 za kontrolu. Na taj način, slično DEKS, i HIK i PRD su takođe pokazali poraste u sijalilaciji i maksimalni efekat je uočen pri 10 uM za sva tri glukokortikoidna jedinjenja unutat ispitivanog opsega koncentracija. Međutim, bile su potrebne više koncentracije HIK i PRD da bi se postihgao isti nivo povećanja sijalilacije kao
[0194] DEKS.
[0195] Mehanizam povećanja sijalilacije deksametazonom uključuje glukokortikoidni receptor.
[0196] Da bi se utvrdilo da li je poboljšanje sijalilacije usled dodavanja DEKS posredovano preko glukokortikoidnog receptora (GR), medijumu ćelijske kulture je pre tretmana DEKS dodat antagonist GR mifepriston (RU-486). Specifično, 1 uM RU-486 je dodat 48 sati posle inokulacije i DEKS, u koncentracijama od 0.1, 1 i 10 uM, dodat je 24 sata kasnije. DEKS je takođe dodat kulturama bez RU-48 kao kontrolama. Za uslove sa i bez RU-486, normalizovane vrednpsti ukupnog sadržaja sijalinske kiseline i normalizovane vrednosti N-vezane frakcije sijalilovanih vrsta indukovane DEKS su prikazane, redom, na Slici 4A odnosno Slici 4B. Sposobnost DEKS da poveća sijalilaciju proizvoda je značajno smanjena u prisustvu 1 uM of RU-486 i bila je najuočljivija za uslove 0.1 uM DEKS. Ukupni sadržaj sijalinske kiseline i N-vezane frakcije sijalilovanih vrsta za uslove 0.1 uM DEKS se smanjio od 15.1 ±0.1 i 92.2±2.0 (bez RU-486) na 12.7±0.1, odnosno 81.5±0.8 (sa 1 uM RU-486), redom. Ovi rezultati ukazuju da je mehanizam preko kog DEKS povećava sijalilaciju GR-zavistan, pošto RU-486 konkuriše DEKS za ligand-vezujući domen GR (Raux-Demay et al. 1990).
[0197] Primena DEKS u "batch" kultivacije u bioreaktoru
[0198] Efekat DEKS na povećanje sijalilacije fuzionog proteina pokazan u flaskovima sa mešanjem je zatim ispitan u uslovima pohranjivane "batch" kultivacije korišćenjem kontrolisanih 5-L bioreaktora. Rad bioreaktora je opisan u odeljki metoda. U kulturama sa dodatkom 1 uM DEKS u bolusu je uočen viši ukupni sadržaj sijalinske kiseline (Slika 5A) i N-vezanih frakcija sijalilovanih vrsta (Slika 5B). Ukupno sadržaj sijalinske kiseline sa DEKS je bio 16.5±0.1 u poređenju sa 14.2=1=0.1 za kontrolu (16.2% porast). Slično tome, N-vezane frakcije sijalilovanih vrsta sa DEKS su bile 90.2±1.3 u poređenju sa 77.9±1.6 za kontrolu (15.8% porast). U skladu sa opažanjima u flaskovima sa mešanjem ispitivanja aktivnosti sijalidaze (Slike 3A i 3B), ukupni sijalinski sadržaj se smanjivao između 8. i 14. dana od 17.9±0.1 do 16.5±0.1 (-7.8%) sa DEKS u poređenju sa 16.3±0.1 to 14.2±0.1 (-12.9%) za kontrolu. Slično tome, procenat sijalilovanih frakcija između 8. i 14. dana se smanjio od 97.7±0.9 do 90.2±1.3 (-7.7%) sa DEKS u poređenju sa 91.3 ±0.9 to 77.9±1.6 (-14.7%) za kontrolu.
[0199] [0144] Porast sijalilaciji glikoproteina delovanjem DEKS je dodatno potvrđen u bioreaktorima različitih veličina (skala). Normalizovani finalni sadržaj sijalinske kiseline, i normalizovani procenat sijalilovanih frakcija iz različitih serija su zbirno prikazani na Slici 6. Unutar ovih serija, uslovi sa DEKS su obuhvatali serije sa DEKS dodatim u vidu bolusa ili uključenim u hranljivi medijum. Kao što je naznačemo na Slici 6, DEKS ja pokazao značajno poboljšanje sijalilacije sa povećanim finalnim sadržajem sijalinske kiseline (p vrednost < 0.001 pomoću t -testa) i finalne frakcije sijalilovanih vrsta (p vrednost < 0.001 pomoću t-testa).
[0200] Zaključak
[0201] Dodavanje deksametazona kulturi CHO koja produkuje rekombinantni fuzioni glikoprotein je dovelo do poboljšanja sijalilacije. Ova studija je prva koja je pokazala da deksametazon može da poveća ekspresiju glikoziltransferaza a2,3-ST i pi,4-GT i daje taj efekat deksametazona posredovan preko glukokortikoidnih receptora. Sveukupni efekat deksametazona na poboljšanje sijalilacije je obuhvatio i unutarćelijske efekte posredstom glikoziltransferaza kao i vanćelijske efekte preko produžavanja vijabiliteta kulture koji je smanjio prisustvo sijalidaza oslobođenih supernatant kulture usled ćelijske lize. Deksametazon se pokazao kao pogodan metod za poboljšanje sijalilacije.
[0202] Primer 2
[0203] Ćelijska linija i medijum
[0204] Ćelijska linija CHO koiršćena u ovoj studiji je originalno subklonirana od DG44 parentalnih ćelija i kultivisana je u sopstvenom medijumu za rast koji ne sadrži proteine. Ćelije domaćina su bile genetski modifikovane da sekretuju IgG-fuzioni protein pod kontrolom CMV promotora.
[0205] Eksperimenti u flaskovima koji se mešaju
[0206] [0147] Eksperimenti su urađeni u flaskovima od 250-mL koji se mešaju (VWR international) sa početnim zapreminama od 100 mL i inicijalnim gustinama ćelija od 6 x IO<5>ćelija/mL. Kulture su stavljene na platformu koja se meša (VWR international) na brzinu rotacije od 150 rpm. Ćelije su kultivisane pod standardnim uslovima održavanja vlažnosti na 37°C i 6% C02, u trajanju od deset dana uz dnevno doterivanje pH korišćenjem 1 M natrijum karbonata i ćelije su hranjene glukozom i glutaminom svaka dva dana kako bi se održale na odgovarajućem nivou. Ćelijska gustina, vijabilitet ćelija i supstrati/metaboliti su analizirani van kulture korišćenjem CeDEKS automatizovanog brojača ćelija (Innovatis AG, FJielefeld, Germanv) i Bioprofile Analyzer 400 (Nova Biomedical Corporation, Waltham, MA). Supernatanti iz svakog sakupljanja kulture su prikupljeni za SEC analizu.
[0207] Ekskluziona Hromatografija (SEC)
[0208] SEC analiza je urađena prema prthodno objavljenoj metodi (Perico et al., 2008) sa određenim modifikacijama. Ukratko, uzorci prečišćeni pomoću Proteina-A su analizirani na Agilent 1100 HPLC sistemu (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) na Tosoh Bioscience TSK-Gel G3000 SWxI koloni (7.8 ID x 30 cm, 5 um čestice). Mobilna faza je sadržala 1 x puferovani fiziološki rastvor (PBS) na pH 7.4. Brzina protoka je bila 0.5 mL/min, a temperatura kolone je kontrolisana na 25°C. Signal je praćen apsorpcijom na talasnoj dužini od 280 nm.
[0209] Western blot analiza glutation reduktaze i glukokortikoidnog receptora
[0210] [0149] Nakon što su oprane 1 x PBS, približno IO<7>CHO ćelija je lizirano pomoću 1 mL Lemli pufera za uzorke (Bio-Rad Laboratories) i denaturisano na 90 °C tokom 5 minuta. Lizati ćelija su razdvojeni na 4-15% SDS-poliakrilamidnom gelu, preneti na 0.45 um nitrocelulozne membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), i inkubiran sa primarnim i sekundarnim antitelom. Primarna antitela za detekciju glutation reduktaze su bila monoklonska antitela na amino kiseline 391-510 koje mapiraju deo blizu C-kraja glutation reduktaze humanog porekla (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Iako proizvođač nije naveo materijal porekla kineskog hrčka za detekciju glutation reduktaze korišćenjem ovog antitela, preliminarni eksperiment je pokazao daje bila detektovana samo jedna traka u lizatima CHO ćelija i HL60 ćelija humanog porekla sa identičnom približnom molekulskom veličinom na blotu. Primarno antitelo korišćeno za detekciju glukokortikoidnog receptora je bilo anti-humano monoklonsko antitelo (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Sekundarno antitelo je bilo anti-mišje antitelo konjugovano peroksidazom iz rena (horseradish peroxidase - HRP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Membrane su stripovane i ponovo inkubirane sa antitelom na P-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i HRP-konjugovanim sekundarnim antitelom. Imunodetekcija je urađena primenom sistema za detekciju Western blota na bazi pojačane hemiluminescence (GE Healthcare) i vizuelizovano pomoću VersaDoc Imaging Svstem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
[0211] Rezultati
[0212] Deksametazon (DEKS) smanjuje agregaciju IgG-fuzionih protein sintetisanih u CHO u širokom opsegu koncentracija
[0213] Slika 7A prikazuje značajno snižen procenat vrsta visoke molekulske mase (VMM) u IgG-fuzionom proteinu nakon što su CHO ćelije tretirane DEKS u finalnoj koncentraciji od 1 uM u medijumu za kulture. Najvažnije komponente vrsta VMM su bili dimeri i trimeri nagrađeni kovalentno ili ne-kovalentno i kategorično smatrani i nedvosmisleno smatrani proteinskim agregatima. Uzimajući u obzir da je pod uslovima kultivacije koji su već bili optimizovani postignuto smanjenje agregacije proteina od 15%, poboljšanje je bilo od praktičnog značaja u procesu proizvodnje. Da bi se napravila kriva zavisnosti efekta od doze i vremenske zavisnosti za efekte DEKS na agregaciju proteina, ćelije su kultivisane bilo sa različitim koncentracijama DEKS ili pri istoj koncentraciji (1 uM) ali sa različitim vremenima inkubacije. Kao što je prikazano na Slici 7C, DEKS je vremenski-zavisno smanjivao stepen agregacije proteina, što je bilo konzistentno sa prethodno uočenom vremenskom zavisnošću DEKS na poboljšanje ćelijskog vijabiliteta i profile glikozilacije proteina (Tabela 1 i Slika 11). Međutim, zavisnost smanjenje nivoa agregacije proteina od koncentracije DEKS na nije bila očigledna (Slika 7B), što ukazuje da anti-agregacioni efekat nije jednostavno bio usled pobiljšanja vijabiliteta ćelija pošto su naši prethodni rezultati demonstrirali da se vijabilitet CHO ćelija povećavao sa koncentracijom DEKS u medijumu od 0.01 uMdo 10 uM.
[0214] Deksametazon ushodno reguliše ekspresiju glutation reduktaze u CHO ćelijama
[0215] Urađen je Western Blot radi detekcije ekspresije glutation reduktaze u lizatima pripremljenim od CHO ćelija tretiranih različitim koncentracijama DEKS. Kao što je prikazano na Slici 8, DEKS je povećao ekspresiju glutation reduktaze, što se moglo zapaziti čak i kada je lek bio na 1 nM. Detekcija P-aktina je korišćena za poređenje nanošenja uzoraka kako bi se eliminisala mogućnost daje do pojačavanja trake glutation reduktaze došlo usled slučajno povećane količine nanetog uzorka.
[0216] GSH smanjuje agregaciju prečišćenog IgG-fuzionog proteina in vitro
[0217] Da bi se utvrdilo da li GSH sam po sebi može da utiče na agregaciju proteina usled direktne interakcije sa proteinima, uradili smoin vitrostudiju dodavanjem GSH Protein-A prečišćenom IgG-fuzionim proteinima koji su rekonstituisani u Tris-acetatnom puferu, i analizirali SEC profile. Kao što je prikazano na Slici 9, procenat vrsta visoke molekulske mase je bio značajno snižen, sa stepenom snižavanja koji je bio 15.3% i 27.3% u prisustvu 1 odnosno 3 mM GSH. Podaci su jasno pokazali da GSH može da direktno inhibira agregaciju IgG-fuzionog proteina.
[0218] Efekti deksametazona se ostvaruju preko glukokortikoidnih receptora
[0219] DEKS je moćan glukokortikoid sa širokim spektrom farmakoloških delovanja. Da bi se utvrdilo da li je inhibitorni efekat DEKS na agregaciju IgG-fuzionog proteina specifično posredovan preko aktivacije glukokortikoidnih receptora, najpre je potvrđeno da u korišćenoj ćelijskoj liniji postoji endogena ekspresija glukokortikoidnih receptora (GR), što je predstavljeno na Slici 10A. Pošto je antitelo korišćeno za Western Blot specifično za konzervirane regione humanog GR, uzorak ćelijskog lizata HepG-2 ćelija je takođe nanet kao uzorak humanog porekla za potrebe validacije antitela. Iako je antitelo moglo da detektuje i GRa i GRp\ ova analiza je pokazala samo jednu traku. Ovo je možda zato što su molekulske mase ove dve izoforme (95 kDa prema 90 kDa) suviše bliske da bi mogle da se razdvoje na 5-15%o gradijentnom gelu ili verovatnije zato što je u uzorku bila prisutna samo jedna izoforma.
[0220] Pošto je pokazano da DEKS ushodno reguliše ekspresiju glutation reduktaze u CHO ćelijama (videti Sliku 8), urađena je dodatna procena da bise utvrdilo da li je ovaj efekat indukovan aktivacijom GR receptora. RU-486 je antagonist GR i često se koristi kao sredstvo u mnogim studijama koje su povezane sa GR. Naši preliminarni eksperimenti su pokazali da RU-486 nije uticao na vijabilitet CHO ćelija i metaboličke parametre ukoliko koncentracije nisu bile veće od 1 uM; sa 10 uM, uočeno je značajno smanjenje u ćelijskom vijabilitetu i brzini rasta ćelija. U narednim eksperimentima, RU-486 je zato korišćen u koncentracijama od 1 uM ili nižoj i dodavanje u kulturu kao pre-tretman CHO ćelija jedan dan pre dodavanja DEKS. Slika 10B prikazuje da u prisustvu 1 uM RU-486, efekat DEKS na ushodnu regulaciju ekspresije glutation reduktaze je bio snižen, potvrđujući učešće GR.
[0221] Konačno, ispitani su procenti vrsta VMM u IgG-fuzionim proteinima sintetisanim u CHO ćelijama tretiranim 0.1 uM DEKS i njegovim kombinacijama sa različitim koncentracijama RU-486. Konzistentno sa rezultatom na Slici Fig 7B, procenat vrsta VMM je smanjen za približno 17% kada je kultura tretirana samo sa 0.1 uM DEKS, i taj efekat se postepeno smanjivao sa porastom koncentracija RU-486 (Slika 10C). Pod uslovima kada su korišćene jednake koncentracije DEKS i RU-486, stepen inhibicije vrsta VMM je bio oko polovina stepena dobijenog primenom samo DEKS, ukazujući da su DEKS kao agonist i RU-486 kao antagonist imali slične afinitete da konkurišu jedan drugom za GR u CHO ćelijama. Tako, uzimajući zajedno sve tri grupe podataka na Slici 9, rezultati jasno prikzuju da je inhibicija agregacije IgG-fuzionog proteina posredovana preko GR.
[0222] Zaključak
[0223] Kao potentan glukokortikoid koji nije skup i sa svojom delotvornom trijadom, poboljšavajući ćelijski vijabilitet kao što je opisano u Primeru 3 i glikozilaciju kao što je opisano u Primeru 1 i inhibirajući agregaciju proteina kao što je ovde opisano, deksametazon može da obezbedi jednostavan, isplativ i efikasan način da se sveukupno poboljša proces kultivacije ćelija,
[0224] Primer 3
[0225] U ovoj studiji je, po prvi put, pokazano da deksametazon može da spreči apoptozu CHO ćelija u uslovima bez seruma na dozno- i vremenski-zavisan način. DEKS u CHO ćeliji indukuje ekspresiju gena GILZ (glukokortikoidima-indukovan leucinski ziper). DEKS je uspešni primenjen u 10-L bioreaktoru kuture CHO da bi se poboljšao ćelijski vijabilitet i produkcija Fc-fuzionog proteina i sadržaj sijalinske kiseline. Studija prikazuje primenu DEKS u industrijskoj ćečlijskoj kulturi da bi se poboljšala produkcija rekombinantnog proteina i glikozilacija.
[0226] Ćelijska linika i medijum
[0227] Ćelijska linija CHO koiršćena u ovoj studiji je subklonirana od DG44 parentalnih ćelija i kultivisana je u sopstvenom hemijski definisanom medijumu za rast.
[0228] Eksperimenti u flaskovima koji se mešaju
[0229] Eksperimenti su urađeni u flaskovima od 250 mL koji se mešaju (VWR international) sa početnim zapreminama od 100 mL i inicijalnim gustinama ćelija od 6 x IO<5>ćelija/mL. Kulture su stavljene na platformu koja se meša (VWR international) na brzinu rotacije od 150 rpm i održavane na 37°C i 6% CO<2>tokom deset dana. Uzorak iz kultura je uziman svakog dana i pH je korigovan po potrebi korišćenjem 1 M natrijum karbonata i ćelije su hranjene glukozom i glutaminom svaka dva dana kako bi se održale na odgovarajućim nivoima. Ćelijska gustina i vijabilitet su mereni van mreže ("off-line") korišćenjem Bioprofile Analvzer 400 (Nova Biomedical Corporation, Waltham, MA).
[0230] Rad bioreaktora
[0231] Eksperimenti u bioreaktoru su izvedeni u bioreaktorima od 10-L (Sartorius Stedim Biotech, France) sa početnim radnim zapreminama od 5 L. Održavani kontrolisani uslovi su značili mešanje na 150 rpm, pH na 7.05, i rastvoreni kiseonik 50% zasićenja vazduha. Kontrola temperature je inicijalno održavana na 37°C, ali je pomerena na nižu temperaturu tokom kultivacije da bi se produžio vijabilitet kulture. Bioreaktori su radili u režimu prihranjivane "batch" kultivacije i prihranjivani su dnevno počevši od 3. dana sopstvenim hranljivim medijumom da bi se održale odgovarajuće koncentracije glukoze i drugih hranljivih materija. Tokom procesa kultivacije su uzimani uzorci i u njima je analizirana gustina ćelija, ćelijski vijabilitet, supstrati i metaboliti.
[0232] qRT-PCR analiza
[0233] [0161] Urađena je TaqMan® 5'-nukleaza kvantitativna RT-PCR analiza u realnom vremenu da bi se potvrdila ushodna regulacija GILZ delovanjem DEKS. Ukupna RNK je prečišćena iz svake kulture u triplikatu sa i bez 1 uM DEKS korišćenjem RNeasv® midi kita kao što je napred opisano. Na prečišćenu RNA je delovano DNA-zomI koje ne sadrži RNK (Qiagen) i zatim korišćena kao matrica za sintezu prvog lanca cDNK korišćenjem RT<2>First Strand Kit (SA Biosciences, Frederick, MD). Ekspresija GILZ je određena kvantitativno korišćenjem GILZ specifične TaqMan MGB probe (6-FAM-AGAGGACTTCACGTGT) i prajmera (prednji: 5-CCTCCCTCATCTGTCCACTGA-3 i reverzni: 5-TGGTGGGTTTGGCATTCAA-3). 20 ng cDNK je amplifikovamo korišćenjem 900 nM prajmera i 250 nM probe u !><TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosvstems, Carlsbad, CA). Reakcije su urađene u triplikatu na sistemu Applied Biosvstems 7500 Fast Real-Time PCR Svstem korišćenjem univerzalnih parametera ciklusa (20 s 95°C, 40 ciklusa od 3 s 95 °C, 30 s 60°C). Na istoj ploči su postavljene paralelne reakcije za analizu P-aktina u svakom uzorku kao endogene kontrole. Ciklus kada se pređe prag ("threshold cycle") za svaki od gena je normalizovan na osnovu praga ciklusa konstitutivnog "housekeeping" gen P-aktina. Normalizovane promene u genskoj ekspresiji u odnosu na kontrolu su izračunate primenom delta-delta metod praga ciklusa (Livak and Schmittgen, 2001).
[0234] Western blot analza GILZ
[0235] Približno IO<7>CHO ćelija je oprano IX puferovanim fiziološkim rastvorom (PBS), lizirano pomoću 1 mL Lemli pufera za uzorke (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), zatim denaturisano na 90°C tokom 5 minuta. Ćelijski lizati su razdvojeni na 4-15% SDS-poliakrilamidnom gelu, preneti na 0.45 um nitrocelulozne membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), i inkubiran sa primarnim mišjim monoklonsim antitelom usmerenim na GILZ (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), a nakon toga anti-mišjim antitelom konjugovanim peroksidazom iz rena (horseradish peroxidase - HRP) (Santa Cruz Biotechnology). Membrane su stripovane i ponovo inkubirane sa antitelom na P-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i HRP-konjugovanim anti-mišime sekundarnim antitelom. Imunodetekcija je urađena primenom sistema za detekciju Western blota na bazi pojačane hemiluminescence (GE Healthcare) i vizuelizovano pomoću sistema VersaDoc Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
[0236] Test titra
[0237] Titar je određen afinitetnom hromatografijom korišćenjem HPLC pumpe i UV detekcije (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i kolona Applied Biosystems Poros A/20 Protein A (100 x 4.6 mm). Eluirani protein je kvantifikovan korišćenjem standardne krive sa 10 nivoa.
[0238] Rezultati
[0239] Efekat deksametazona na rast CHO ćelija
[0240] U kulturu u flaskovima sa mešanjem dodat je glukokortikoid deksametazon (DEKS) u finalnoj koncentraciji između 0.01 i 10 uM dva dana nakon inokulacije da bi se procenili efekti glukokortikoida na vijabilitet CHO ćelija i potencijal da se produži trajanje kulture ćelija. Profil gustine živih ćelija (GŽC) u studiji zavisnosti odgovora od doze (Fig. 11 A) pokazuje rastuću inhibiciju ćelijskog rasta koja se javlja jedan dan nakon DEKS tretmana na dozno-zavisan način. Najveća GŽC je dostigla 8.5 x IO<6>ćelija /ml u netretiranoj kontrolnoj kulturo, dok je vrh GŽC u kulturama tretiranim sa lOuM DEKS bio 6.5 x IO<6>ćelija/mL. Vijabilitet ćelija je rapidno opadao nakon 6. dana (Slika 11 B) i procenat vijabiliteta 10. dana je bio samo 42.1%. Nasuprot tome, finalni vijabiliteti ćelija sa 0.01 uM, i 10 uM DEKS su bili 53.1%) odnosno 64. 0%. Pad vijabiliteta koji je počinjao 6. dana se poboljšavao na dozno-zavistan način u kulturama tretiranim DEKS, sa maksimalnim efektom na lOuM (Slike 11A i 11B).
[0241] Zatim je urađena studija vremenske zavisnosti dodavanja DEKS u kulturama u flaskovima koji se mešaju u kojima je DEKS dodat do finalne koncentracije DEKS od 1 uM i dodavan je između dana inokulacije sve do šestog dana posle inokulacije. Kao što je prikazano na Slici 11C i 11D, finalna GŽC i ćelijski vijabilitet su bili povećani u svim kulturama tretiranim DEKS, i GŽC i ćelijski vijabilitet su se poboljšali na vremenski zavisan nalin sa ranijim trenucima dodavanja DEKS. Vijabilitet netretiranih CHO ćelija u kulturi se smanjio do 50% 10. dana, dok je u kulturama kojima je DEKS dodat 0., 2., 4. i 6. dana bio 63, 68, 72 i 74%, redom.
[0242] DEKS snižava specifičnu brzinu rasta ali povećava ćelijsku specifičnu produkciju
[0243] [0166] Specifična brzina rasta, normalizovana volumetrijska produkcija, i normalizovana ćelijska specifična produkcija su kvantifikovane i uporiđivane između DEKS-tretiranih i netretiranih ćelija. Podaci koji porede specifičnu brzinu rasta i normalizovanu produkciju sa i bez luM DEKS su prikazani na Slici 12A i 12B (n=5). DEKS je dodvan 2. dana, dovodeći do približno 30% redukcije u brzinama rasta ćelija sa DEKS u poređenju sa kotrolom dan nakon dodavanja DEKS. Međutim, ovaj efekat na inhibiciju rastaje opadao sa dužinom kultivacije. Na kraju perioda kultivacije, brzine umiranja ćelija su bila sporije u kulturama sa ćelijama tretiranim DEKS. Dodatno, rana inhibicija ćelijskog rasta indukovana DEKS nije uticala na volumetrijsku produkciju (6.5 za sve kulture); međutim, kulture sa tretmanom DEKS su imale višu specifičnu produkciju nego netretirane ćelije, sa maksimumom specifične produkcije od (7.0 ± 0.6)xl0<">9
.
[0244] Ushodna regulacija GILZ pomoću DEKS je potvrđena qRT-PCR i western blot analizom
[0245] GILZ je analiziran korišćenjem qRT-PCR da bi se validirali profili genske ekspresije dobijeni mikroerej (microarrav) analizom. Uzorci RNK od 5. do 8. dana za triplikate kultura tretiranih sa DEKS i netretiranih kultura su korišćeni za TaqMan® qPCR kvantifikaciju. Paralelne reakcije su postavljene na istu ploču radi analize P-Aktina u svakom uzorku kao endogena kontrola. Kao što je prikazano na Slici 13A, normalizovane promene profila ekspresije GILZ dobijeni pomoću qRT-PCR u uzorcima od 5. dana i 8. dana su bile 7.66±1.08 odnosno 10.48±2.16.
[0246] Ćelijski lizati kultura 5. dana sa i bez 1 uM DEKS tretmana su analizirani Western blotom da bi se ispitalo da li postoji povećana ekspresija GILZ u kulturama tretiranim DEKS. Blot je takođe ponovo analiziran antitelom na beta-aktin kao kontrola da se proceni ekvivalentno nanošenje uzoraka na gel. Kao što je prikazamo na Slici 13B, ekspresija proteina GILZ je bila značajno povećana u uzorcima tretiranim DEKS u poređenju sa netretiranim uzorcima. Uz to, relativna promena GILZ uzrokovana DEKS je nešto viša u uzorcima uzetim 8. dana nego u uzorcima od 5. dana, što se slaže sa rezultatima qRT-PCR.
[0247] Poređenja deksametazona sa druga dva glukokortikoida, hidrokortizonom i prednizolonom
[0248] Experimentima u flaskovima koji se mešaju je zatim ispitivano da li je protektivni efekat DEKS na vijabilitet CHO ćelija ograničen na DEKS ili se može proširiti na druga glukokortikoidna jedinjenja, kao što su hidrokortizon (HIK) i prednizolon (PRD). DEKS, HIK i PRD (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) su dodavani dva dana posle inokulacije u finalnim koncentracijama od 0, 0.1, 1 i 10 uM za svako do pva tri jedinjenja. Vršna GŽĆ, finalna GŽĆ i finalni vijabiliteti kultivisanih ćelija su prikazani u Tabeli 2.
[0249] Slično DEKS, HIK (60.1-75.5% finalni vijabilitet) i PRD (69.4-75.5% finalni vijabilitet) su takođe pokazali protektivni efakat na ćelije koji je bio dozno-zavisan. Vijabilitet 10. dana je bio 56.6% za kontrole u poređenju sa vijabilitetima 10. dana sa koncetracijama DEKS od 0.1 i and lOuM koji su bili 72.3% odnosno 82.3%; za HIK 60.1 % odnosno 75.5%; i PRD 69. 4% odnosno 77.5%. Tako su sva tri glukokortikoidna jedinjenja pobo<l>jšala vijabilitet kultira sa maksimalnim efektima pri lOuM za sva tri glukokortikoidna jedinjenja.
[0250] Delovanje deksametazona na supresiju smrti uk<l>jučuje GILZ i glukokortikoidni receptor
[0251] Da bi se odredilo da lije poboljšanje vijabiliteta usled dodavanja DEKS posredovano preko GILZ i glukokortikoidnog receptora (GR), u medijum ćelijskih kultura je dodat antagonist GR mifepriston (RU-486) pre tretmana DEKS. Za uslove sa i bez RU-486, procenat porasta finalnog ćelijskog vijabiliteta indukovan DEKS je prikazan na Slici 14A. Sposobnost DEKS da poboljša ćelijski vijabilitet je bio značajno snižen u prisustvu 1 uM RU-486. Procenat porasta ćelijskog vijabiliteta indukovanog sa 0.1 i 1 uM DEKS je snižem od 30.5% odnosno 32.6% (bez RU-486) do 4.7% odnosno 5.7% (sa 1 uM RU-486). U međuvremenu, qRT-PCR analiza (Slika 14B) pokazuje da u prisustvu 1 uM RU-486, efekat DEKS na ushodnu regulaciju ekspresije GILZ je bio značajno ublažen. Stepen promene indukovane sa 0.1 i 1 uM DEKS se smanjio sa 9.0±1.9 odnosno 11.3±3.0 puta (bez RU-486) na 1.8±0.9 odnosno 2.3±1.0 puta (sa 1 uM RU-486). Western Blot analiza (Slika 14C) je dodatno potvrdila da je prekomerna ekspresija GILZ proteina bila značajno smanjena u prisustvu 1 uM RU-486. Ovi rezultati ukazuju da mehanizam kojim DEKS povećava vijabilitet uključuje GILZ i daje bio GR-zavisan, pošto RU-486 konkuriše DEKS za ligand-vezujuči domen GR.
[0252] Primena deksametazona u prihranjivanim "batch" kulturama u bioreaktoru od 10-L
[0253] Prihranjivana "batch" kultivacija u bioreaktorima od 10-L su izvođene da bi se utvrdilo da li će se efekat DEKS uočen u flaskovima koji se mešaju preneti i u uslovima bioreaktora. Sveukupno cilj DEKS je da suprimira ćelijsku smrt, provećavajući dugovečnost kulture i sledstveno poveća produkciju glikoproteina za proces u bioreaktorima. U ovoj studiji, tri bioreaktora su pokrenuta korišćenjem istih napred opisanih uslova; sa 1 uM DEKS koji je dodat u dva bioreaktora 2. dana ili 7. dana. Različito od serija u flaskovima sa mešanjem, serije u bioreaktorima su produžene na 14 dana, temperatura kulture je pomerena na nižu temperaturu tokom kasne eksponencijalne faze kulture, i korišćen je sopstveni hranljivi medijum umesto dodavanja samo glukoze i glutamina.
[0254] [0173] Bioreaktori sa DEKS dodatim bilo 2. dana ili 7. dana su dostigli maksimalne gustine ćelija od približno 8.3 x IO<6>ćelija/mL 8. dana, u poređenju sa 7.8 x IO<6>ćelija /mL bez DEKS (Slika 15A). Dodavanje DEKS je smanjilo stepen ćelijske smrti u bioreaktorima. Ćelijski vijabilitet je bio 94% vijabiliteta za sve uslove 6. dana (Slika 15B). Do 14. dana, procenat vijabiliteta se smanjio do 29% bez DEKS, u poređenju sa 55% odnosno 39% sa DEKS dodatim 2. dana ili 7. dana. Finalna GŽĆ 14. dana sa DEKS dodatim 2. dana ili 7. dana je bila 4.1 odnosno 3.5 x IO<6>ćelija/mL, u poređenju sa 2.8 x IO<6>ćeloija/mL bez dodavanja DEKS. Normalizovani titri proteina su bili približno 5.5 7. dana pre maksimuma GŽĆ (Slika 15C). Posle toga, produkcija proteina tokom stacionarne i faze umiranja kultura je bila viša u bioreaktorima sa dodavanjem DEKS. Normalizovani titri sakupljeni 14. dana su bili 12.5 u oba bioreaktora sa DEKS, u poređenju sa 10.5 bez dodavanja DEKS, porast od 20%.
[0255] Zaključak
[0256] Naš napor u optimizaciji medijuma je doveo do neočekivanog otkrića da glukokortikoidi mogu da značajno ublaže pad ćelijskog vijabiliteta u prihranjivanoj "batch" kultivaciji CHO ćelija. U studiji mehanizma ovog fenomena, qRT-PCR i Western blot analizom je identifikovano da je uključena ushodna regulacija anti-apoptotskog gena GILZ. Isptivanjem efekat analoga i antagonista DEKS na rast CHO ćelija, odrešena je uloga GILZ i glukokortikoidnog receptora u ispoljavanju delovanja DEKS. Eksperimeni prihranjivane "batch" kultivacije u bioreaktorima pokazuju da su glukokortikoidni analozi delotvorne, pogodne i isplative hemikalije za ublažavanje pada vijabiliteta u kulturi ćelija.
[0257] Primer 4
[0258] U ovoj studiji, ispitivani su efekti deksametazona (DEKS) na rast CHO ćelija, sijalilaciju i agregaciju proteina u drugoj CHO ćelijskoj liniji sa sekrecijom različitog glikoproteina (CTLA4Ig).
[0259] Ćelijska linija i medijum
[0260] Ćelijska linija CHO korišćena u ovoj studiji je inicijalno subkloniran od DG44 parentalnih ćelija i kultivisana je u sopstvenom hemijski definisanom medijumu za rast.
[0261] Eksperimenti u flaskovima koji se mešaju
[0262] [0177] Eksperimenti su urađeni u flaskovima od 250-mL koji se mešaju (VWR international) sa početnim zapreminama od 100 mL i inicijalnim gustinama ćelija od 6 x 10<5>ćelija/mL. Kulture su stavljene na platformu koja se meša (VWR international) na 150 rpm i održavane su na 37°C i 6%> CO<2>tokom deset dana. Uzorak iz kultura je uziman svakog dana i pH je korigovan po potrebi korišćenjem 1 M natrijum karbonata i ćelije su hranjene glukozom i glutaminom svaka dva dana kako bi se održale na odgovarajućim nivoima. Glukokortikoid deksametazon (DEKS) je dodat u finalnim koncentracijama između 0.001 - 10
[0263] M na 2. dan. Ćelijska gustina i vijabilitet su mereni van kulture korišćenjem CeDEKS automatizovanog brojača ćelija (Innovatis AG, Bielefeld, Germanv). pH vrednost kulture i koncentracije za glukozu i glutamin su merene van kulture korišćenjem Bioprofile Analvzer 400 (Nova Biomedical Corporation, Waltham, MA). Supernatanti iz prikupljenih kultura su sakupljeni za analizu sadržaja sijalinske kiseline i nivoa VMM.
[0264] Test određivanja sadrćaja sijalinske kiseline i VMM
[0265] Analiza sadržaj sijalinske kiseline i VMM je urađeno kao što je opisano u prethodnim primerima.
[0266] Rezultati
[0267] Efekti deksametazona rast CHO ćelija
[0268] U kulturu u flaskovima sa mešanjem dodat je glukokortikoid deksametazon (DEKS) u finalnoj koncentraciji između 0.001 i 10 uM dva dana nakon inokulacije da bi se procenili efekti glukokortikoida na vijabilitet CHO ćelija i potencijal da se produži trajanje kulture ćelija. Profil gustine živih ćelija (GŽĆ) u studiji zavisnosti odgovora od doze (Fig. 11 A) pokazuje rastuću inhibiciju ćelijskog rasta koja se javlja nakon DEKS tretmana, iako dozna zavisnost nije bila očigledna u ispitivanom opsegu. Najveća GŽĆ je dostigla 13.9<x>IO<6>ćelija /ml u netretiranoj kontrolnoj kulturi, dok se vršna GŽĆ kretala od 10.6 x IO<6>to 12.7 x IO<6>ćelija/mL u kulturama tretiranim sa 0.001 do lOuM DEKS. Vijabilitet ćelija u netretiranim kulturama je rapidno opadao nakon 6. dana (Slika 16 B) i procenat vijabiliteta 10. dana je bio samo 64.5%. Nasuprot tome, finalni vijabiliteti ćelija sa 0.001 uM, i 10 uM DEKS su bili 75.5% odnosno 82.3%.
[0269] Deksametazon (DEKS) povećava sijalilaciju i smanjuje nivo vrsta VMM glikoproteina CTLA4Ig
[0270] [0181] Osim ćelijskog rasta, procenjivani su efekti DEKS na sadržaj sijalinske kiseline i nivo vrsta VMM. Poređenje sa netretiranim kulturama, procenat porasta sadržaja sijalinske kiseline (Slika 17A) i procenat smanjenja vrsta VMM (Slika 17B) indukovana različitim koncentracijama DEKS su prikazani na Slici Fig. 17. Očigledno je da DEKS može da poveća sijalilaciju i da smanji vrste VMM glikoproteina, ukazujući na poboljšanje kvaliteta proteina, čak i u koncentraciji od 0.001 uM. Dozna zavosnost DEKS na sadržaj sijalinske kiseline i vrste VMM nije očigledna jer je koncentracija DEKS iznad 0.01 uM.
[0271] Ovi rezultati su pokazali da delovanje DEKS na poboljšanje ćelijskog vijabiliteta, pobo<l>jšanje sijalilacije glikoproteina i smanjenje agregacije nije ograničeno na jedan ćelijski klon niti na jednu formulaciju medijuma.
[0272] Primer 5
[0273] U ovoj studiji, pokazana je izvodljivost primene DEKS u medijumu za ćelijske kulture za proizvodnju rekombinantnog glikoproteina bioreaktorima opsega (skale) 500-L i 5000-L.
[0274] Ćelijska linija i medijum
[0275] Ćelijska linija CHO korišćena u ovoj studiji je inicijalno subklonirana od DG44 parentalnih ćelija i kultivisana je u sopstvenom hemijski definisanom medijumu za rast.
[0276] Rad bioreaktora
[0277] Eksperimenti u bioreaktorima su urađeni u 7-L, 500-L i 5000-L bioreaktorima sa početnim zapreminama oko 3 L, 300 L i 3000 L, redom. Sve serije u bioreaktorima su započete na 37 °C, ali su pomerene na nižu temperaturu kada su ćelije ušle u fazu produkcije da bi se produžio vijabilitet kulture. pH je održavan na 7.05, i rastvoreni kiseonikje održavan na 50% zasićenja vazduha. Brzine mešanja za 7-L, 500-L i 5000-L veličine su bile, redom. 180, 75 i 60 rpm. Svi eksperimeni u bioreaktoru su urađenu u načlinu prihranjivane "batch" kultivacije sa dnevnim prihranjivanjem medijumom bez proteina kako bi se glukoza i druge hranljive materije održali na odgovarajućem nivou. Deksametazon je dodat u hranljivi medijum na svim proizvodnim opsezima u cilju povećanja ćelijskog vijabiliteta i sijalilacije proteina. Tokom procesa kultivacije su uzimani uzorci i u njima je analizirana gustina ćelija, ćelijski vijabilitet, supstrati i metaboliti.
[0278] Određivanja titra, sadržaja sijalinske kiseline i vrsta VMM su izvršena kako je opisano u prethodnim primerima.
[0279] Rezultati
[0280] Slike 18A i 18B prikazuju performanse bioreaktora u odnosu na ćelijski rast i vijabilitet. Uočeno je da ćelijski rast kroz opseg od 7-L do 5000-L ima slične najviše vrednosti gustine živih ćelija između 12 do 13 x IO<6>ćelija/mL sa prikazima grešaka koje predstavljaju standardnu devijaciju serija na odgovarajućoj skali koje se preklapaju u svakoj ispitivanoj vremenskoj tački. Ćelijske gustine su dostizale najvišu vrednost 7. dana na 5000-L opseg i 8. dana 7-L i 500-L opsega. 14. dana prosečni vijabiliteti kultura su bili 88%, 84%, i 91%o na 7-L, 500-L, i 5000-L bioreaktorskoj skali, redom. Slike 18C i 18D predstavljaju produkciju i profile sijalinske kiseline iz 7-L, 500-L i 5000-L bioreaktorskih skala. 14. dana titri (prikazano kao normalizovane vrednosti) su bili 13.2, 11.6, i 13.6 na 7, 500, i 5000-L skali, redom. Najviši nivoi sijalinske kiseline (prikazani kao normalizovana vrednost) su bile 16.0, 18.0 i 19.0 na rastućim skalama. Sijalinska kiselina je pala za oko 2.6 jedinice do kraja serija za sve skale.
[0281] Zaključak
[0282] Sveukupno, sa deksametazonom uključenim u medijum za prehranu izvedenim dobro na svim skalama, ukazano je na izvodljivost korišćenja deksametazona kao aditiva za medij ume za industrijsku proizvodnju skala.
[0283]

Claims (19)

1. Proces kultivacije ćelija za proizvodnju solubilnog molekula CTLA4, koji sadrži: a) kultivaciju ćelija CHO koje proizvode solubilni molekul CTLA4 u kulturi ćelija pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju proteina; i b) dodavanje netoksičnih nivoa glukokortikoida.
2. Proces kultivacije ćelija iz patentnog zahteva 1, u kom je sijalilacija solubilnog molekula CTLA4 povećana u poređenju sa sijalilacijom u kulturi bez dodavanja glukokortikoida.
3. Proces kultivacije ćelija iz patentnog zahteva 1, u kom je ćelijska smrt suprimirana u poređenju sa apoptozom ćelija u kulturi bez dodavanja glukokortikoida.
4. Proces kultivacije ćelija iz patentnog zahteva 1, u kom je vijabilnost ćelija povećana u poređenju sa vijabilnošću ćelija u kulturi bez dodavanja glukokortikoida.
5. Proces kultivacije ćelija iz patentnog zahteva 1, u kom je titar CTLA4 povećan u poređenju sa titrom CTLA4 u kulturi bez dodavanja glukokortikoida.
6. Proces kultivacije ćelija iz patentnog zahteva 1, u kom je agregacija molekula CTLA4 smanjena u poređenju sa agregacijom molekula CTLA4 u kulturi bez dodavanja glukokortikoida.
7. Proces kultivacije ćelija iz patentnih zahteva 1-6, gde je glukokortikoid odabran iz grupe koja se sastoji od deksametazona, betametazona, fludrokortizon acetata, hidrokortizona, metilprednizolona, prednizolona, prednizona i triamcinolona.
8. Proces kultivacije ćelija iz patentnih zahteva 1-6, gde se nivo glukokortikoida u kulturi ćelija održava u koncentraciji od 1 nM do lmM.
9. Proces kultivacije ćelija iz patentnih zahteva 1-6, gde se glukokortikoid dodaje u osnovni medijum, hranljivi medijum ili kao bolus u bilo kom trenutku tokom procesa kultivacije.
10. Proces prema patentnim zahtevima 1-6 gde se glukokortikoid dodaje u periodu nakon inokulacije što je pre početka inicijalne faze umiranja.
11. Proces prema patentnom zahtevu 10 gde se glukokortikoid dodaje u periodu nakon inokulacije što je tokom inicijalne faze rasta.
12. Proces prema patentnom zahtevu 11, gde se glukokortikoid dodaje na završetku ili oko završetka inicijalne faze rasta.
13. Proces kultivacije ćelija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, u kom solubilni molekul CTLA4 je solubilni mutantni molekul CTLA4 koji sadrži sekvencu amino kiselina koja počinje metioninom u položaju +1 ili alaninom u položaju -1 i završava asparaginskom kiselinom u položaju 124 kao što je pokazano u SEQ ID NO: 3 koja je vezana za imunoglobulinski ostatak koji sadrži zglobni region, CH2 i CH3 domene, gde je glukokortikoid deksametazon i deksametazon se održava ili uspostavlja u kulturi ćelija u koncentraciji od O.luM do 10 uM, i gde je zapremina kulture ćelija najmanje 500 litara.
14. Proces kultivacije ćelija iz patentnog zahteva 13, u kom solubilni molekul CTLA4 je solubilni mutantni molekul CTLA4 koji sadrži sekvencu amino kiselina koja počinje metioninom u položaju +1 ili alaninom u položaju -1 i završava asparaginskom kiselinom u položaju 124 kao što je pokazano u SEQ ID NO: 3 koja je vezana za imunoglobulinski ostatak koji sadrži zglobni region, CH2 i CH3 domene, gde su ćelije hranjene hranljivim medijumom koji sadrži glukokortikoid deksametazon, i gde je zapremina kulture ćelija najmanje 500 litara.
15. Proces kultivacije ćelija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, u kom solubilni molekul CTLA4 sadrži sekvencu amino kiselina koja počinje metioninom u položaju +1 ili alaninom u položaju -1 i završava asparaginskom kiselinom u položaju 124 kao što je pokazano u SEQ ID NO: 1 koja je vezana za imunoglobulinski ostatak koji sadrži zglobni region, CH2 i CH3 domene, gde je glukokortikoid deksametazon i deksametazon se održava ili uspostavlja u kulturi ćelija u koncentraciji od lnM do 0.1 uM, i gde je zapremina kulture ćelija najmanje 500 litara.
16. Proces kultivacije ćelija bilo kog od patentnih zahteva 1-12, u kom solubilni molekul CTLA4 sadrži sekvencu amino kiselina koja počinje metioninom u položaju +1 ili alaninom u položaju -1 i završava asparaginskom kiselinom u položaju 124 kao što je pokazano u SEQ ID NO: 1 koja je vezana za imunoglobulinski ostatak koji sadrži zglobni region, CH2 i CH3 domene, gde su ćelije hranjene hranljivim medijumom koji sadrži glukokortikoid deksametazon, i gde je zapremina kulture ćelija najmanje 500 litara.
17. Proces kultivacije ćelija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, 15 i 16 u kom solubilni molekul CTLA4 sadrži sekvencu amino kiselina koja počinje metioninom u položaju +1 ili alaninom u položaju -1 i završava lizinom u položaju +357 kao što je pokazano u SEQ ID NO: 1.
18. Proces kultivacije ćelija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, 13 i 14, u kom solubilni mutantni molekul CTLA4 sadrži sekvencu amino kiselina koja počinje metioninom u položaju +1 ili alaninom u položaju -1 i završava lizinom u položaju +357 kao što je pokazano u SEQ ID NO: 3.
19. Proces kultivacije ćelija iz patentnog zahteva 9, u kom glukokortikoid je deksametazon i deksametazon je dodat u hranljivi medijum.
RS20170199A 2009-10-06 2010-10-06 Metode za proizvodnju glikoproteina u sisarskim ćelijskim kulturama upotrebom glukokortikoida RS55727B2 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27834309P 2009-10-06 2009-10-06
US12/897,857 US9540426B2 (en) 2009-10-06 2010-10-05 Mammalian cell culture processes for protein production
EP10765714.0A EP2486048B2 (en) 2009-10-06 2010-10-06 Methods of production of glycoproteins in mammalian cell cultures using glucocorticoids
PCT/US2010/051552 WO2011044180A1 (en) 2009-10-06 2010-10-06 Methods of production of glycoproteins in mammalian cell cultures using glucocorticoids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS55727B1 true RS55727B1 (sr) 2017-07-31
RS55727B2 RS55727B2 (sr) 2020-09-30

Family

ID=43823459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170199A RS55727B2 (sr) 2009-10-06 2010-10-06 Metode za proizvodnju glikoproteina u sisarskim ćelijskim kulturama upotrebom glukokortikoida

Country Status (26)

Country Link
US (3) US9540426B2 (sr)
EP (1) EP2486048B2 (sr)
JP (1) JP2013506436A (sr)
KR (1) KR20120100973A (sr)
CN (1) CN102753572A (sr)
AR (1) AR078544A1 (sr)
AU (1) AU2010303590B2 (sr)
BR (1) BR112012007854A2 (sr)
CA (1) CA2777050C (sr)
CO (1) CO6531436A2 (sr)
CY (1) CY1118734T1 (sr)
DK (1) DK2486048T4 (sr)
EA (2) EA025604B1 (sr)
ES (1) ES2613269T5 (sr)
HR (1) HRP20170269T4 (sr)
HU (1) HUE031867T2 (sr)
IL (1) IL219124A (sr)
LT (1) LT2486048T (sr)
MX (1) MX2012003654A (sr)
PL (1) PL2486048T5 (sr)
PT (1) PT2486048T (sr)
RS (1) RS55727B2 (sr)
SI (2) SI2486048T1 (sr)
SM (2) SMT201700116T1 (sr)
TW (1) TW201118176A (sr)
WO (1) WO2011044180A1 (sr)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007294731B2 (en) 2006-09-13 2014-04-17 Abbvie Inc. Cell culture improvements
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
BRPI0920572A8 (pt) 2008-10-20 2015-10-27 Abbott Lab Inativação viral durante a purificação dos anticorpos
NZ592095A (en) 2008-10-20 2013-01-25 Abbott Lab Isolation and purification of il-12 and tnf-alpha antibodies using protein a affinity chromatography
US9540426B2 (en) * 2009-10-06 2017-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
US9062106B2 (en) 2011-04-27 2015-06-23 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
DK2729482T3 (en) 2011-07-08 2018-05-07 Merck Sharp & Dohme PROCEDURE FOR CLEANING FC-FUSION PROTEIN
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US20130281355A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-24 Genentech, Inc. Cell culture compositions and methods for polypeptide production
JP6473079B2 (ja) 2012-05-02 2019-02-20 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 高密度増殖およびトランスフェクション培地並びに発現増強物質の固有の組み合わせを用いる、哺乳類細胞における高収率一過性発現
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
US9926365B2 (en) * 2012-06-29 2018-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Methods for reducing glycoprotein aggregation
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
HK1211981A1 (en) 2012-09-02 2016-06-03 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
EP2943563A1 (en) * 2013-01-10 2015-11-18 Biogen MA Inc. Medium supplements for improved process performance
HK1207960A1 (en) 2013-03-12 2016-02-19 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
SG10201802023RA (en) * 2013-03-26 2018-05-30 Coherus Biosciences Inc Protein production method
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
MX362923B (es) * 2014-01-30 2019-02-25 Coherus Biosciences Inc Medios de perfusión.
US11124760B2 (en) * 2014-03-24 2021-09-21 Biogen Ma Inc. Methods for overcoming glutamine deprivation during mammalian cell culture
CN105296433B (zh) 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
PL3209767T3 (pl) * 2014-10-21 2021-01-11 Gennova Biopharmaceuticals Ltd. Nowy sposób oczyszczania do izolacji i komercyjnej produkcji zrekombinowanego tnk-tpa (tenekteplazy)
CN121159719A (zh) 2015-04-17 2025-12-19 高山免疫科学股份有限公司 具有可调的亲和力的免疫调节蛋白
CN106318998B (zh) * 2015-07-08 2019-08-20 浙江海正博锐生物制药有限公司 用于提高重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物
KR102669726B1 (ko) * 2015-07-13 2024-05-29 라이프 테크놀로지스 코포레이션 Cho 세포에서의 개선된 일시적 단백질 발현을 위한 시스템 및 방법
WO2017083224A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods to manipulate quality attributes of polypeptides produced in cho cells
WO2018035710A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Akeso Biopharma, Inc. Anti-ctla4 antibodies
JP7749319B2 (ja) 2017-10-10 2025-10-06 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｔｌａ－４変異型免疫調節タンパク質およびそれらの使用
AU2019205273B2 (en) 2018-01-03 2024-04-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
CN108659095A (zh) * 2018-05-18 2018-10-16 上海药明生物技术有限公司 一种使唾液酸含量稳定的方法
EP4146684A2 (en) 2020-05-08 2023-03-15 Alpine Immune Sciences, Inc. April and baff inhibitory immunomodulatory proteins with and without a t cell inhibitory protein and methods of use thereof
CN114592005B (zh) * 2022-04-12 2023-12-19 厦门大学 一种糖皮质激素的检测方法
WO2024129594A1 (en) * 2022-12-12 2024-06-20 Genentech, Inc. Optimizing polypeptide sialic acid content
CN116003633B (zh) * 2022-12-15 2026-04-17 景泽生物医药(合肥)股份有限公司 一种重组人抗vegf抗体融合蛋白的制备方法

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4357422A (en) 1980-08-14 1982-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Method of enhancing interferon production
AU580145B2 (en) * 1985-02-13 1989-01-05 Scios Nova Inc. Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US5264550A (en) * 1985-04-15 1993-11-23 Scios Nova Inc. Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5171739A (en) * 1989-02-14 1992-12-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Treatment of endotoxin-associated shock and preventation thereof using a BPI protein
GB8924021D0 (en) 1989-10-25 1989-12-13 Celltech Ltd Recombinant dna method and vectors for the use therein
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US6090914A (en) 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
CA2580812A1 (en) 1991-06-27 1993-01-07 Bristol-Myers Squibb Company Ctla4 receptor, fusion proteins containing it and uses thereof
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
JPH08308561A (ja) * 1995-05-16 1996-11-26 Sumitomo Electric Ind Ltd 動物細胞培養用無血清培地
US5705364A (en) 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
US5721121A (en) 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
JP4306813B2 (ja) 1995-09-19 2009-08-05 アスビオファーマ株式会社 動物細胞の新規培養方法
US5851800A (en) 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
AU1003001A (en) 1997-01-31 2001-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
DE69929198T2 (de) 1998-05-29 2006-08-10 Genentech, Inc., South San Francisco Zellkulturverfahren für die produktion von glycoproteinen
TR200504220T2 (tr) 1998-12-17 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem.
US6506598B1 (en) 1999-04-26 2003-01-14 Genentech, Inc. Cell culture process
US6261805B1 (en) 1999-07-15 2001-07-17 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system
JP4443714B2 (ja) 2000-03-28 2010-03-31 明治乳業株式会社 細胞培養におけるｂ型肝炎ウイルス表面抗原の高収率生産方法
US7094874B2 (en) * 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
CN101255192A (zh) * 2000-05-26 2008-09-03 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 可溶性ctla4突变体分子及其应用
MXPA05006523A (es) 2002-12-23 2005-08-26 Squibb Bristol Myers Co Procesos de cultivo de celulas de mamiferos para la produccion de proteinas.
MXPA05006522A (es) 2002-12-23 2006-02-17 Bristol Myers Squibb Co Mejora en la calidad de producto en procesos de cultivo en celulas de mamiferos para la produccion de proteina.
DK1969007T3 (da) 2005-12-20 2013-11-25 Bristol Myers Squibb Co Sammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af en sammensætning
US9540426B2 (en) * 2009-10-06 2017-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
US8678606B2 (en) 2010-06-14 2014-03-25 Aja Berger Carrying container with at least two light sources

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011044180A1 (en) 2011-04-14
KR20120100973A (ko) 2012-09-12
EP2486048A1 (en) 2012-08-15
SI2486048T1 (sl) 2017-02-28
AR078544A1 (es) 2011-11-16
PT2486048T (pt) 2017-02-06
US9540426B2 (en) 2017-01-10
PL2486048T3 (pl) 2017-07-31
SMT201700116T1 (it) 2017-03-08
SI2486048T2 (sl) 2020-04-30
DK2486048T4 (da) 2020-03-30
US20110081679A1 (en) 2011-04-07
AU2010303590A1 (en) 2012-05-03
US10030064B2 (en) 2018-07-24
EA201490631A1 (ru) 2016-05-31
LT2486048T (lt) 2017-02-10
US20170129937A1 (en) 2017-05-11
IL219124A0 (en) 2012-06-28
DK2486048T3 (en) 2017-02-27
MX2012003654A (es) 2012-04-30
EP2486048B2 (en) 2019-12-25
EA028491B1 (ru) 2017-11-30
JP2013506436A (ja) 2013-02-28
CO6531436A2 (es) 2012-09-28
RS55727B2 (sr) 2020-09-30
US20170129936A1 (en) 2017-05-11
BR112012007854A2 (pt) 2016-11-22
AU2010303590B2 (en) 2016-07-07
EP2486048B1 (en) 2016-11-23
CA2777050C (en) 2016-12-20
CN102753572A (zh) 2012-10-24
HUE031867T2 (en) 2017-09-28
CY1118734T1 (el) 2017-07-12
EA201270469A1 (ru) 2012-10-30
HRP20170269T1 (hr) 2017-04-07
ES2613269T5 (es) 2020-08-03
SMT201700116B (it) 2017-03-08
HRP20170269T4 (hr) 2020-04-03
CA2777050A1 (en) 2011-04-14
TW201118176A (en) 2011-06-01
US10059754B2 (en) 2018-08-28
IL219124A (en) 2017-10-31
ES2613269T3 (es) 2017-05-23
PL2486048T5 (pl) 2020-07-13
EA025604B1 (ru) 2017-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10059754B2 (en) Mammalian cell culture processes for protein production
JP4496086B2 (ja) タンパク質製造のための哺乳類細胞培養方法を用いる生成物品質の増大
JP4541157B2 (ja) タンパク質を製造するための哺乳類細胞培養法
HK1169125A (en) Methods of production of glycoproteins in mammalian cell cultures using glucocorticoids
HK1169125B (en) Methods of production of glycoproteins in mammalian cell cultures using glucocorticoids
HK1075474B (en) Product quality enhancement in mammalian cell culture processes for protein production