RS55788B1 - Inženjerisana anti-il-23 antitela - Google Patents

Description

[0001]Predmetni pronalazak odnosi se uopšteno na antitela specifična za pl9 humanog interleukina-23 (humani IL-23pl9), kako je definisano u zahtevima. Tačnije, pronalazak se odnosi na humanizovana antitela koja prepoznaju humani IL-23pl9 i modulišu njegovu aktivnost, posebno u zapaljenskim, autoimunskim i proliferativnim poremećajima.

[0002]Funkcija imunskog sistema je zaštita individua od infektivnih agenasa, npr., bakterija, višećelijskih organizama i virusa, kao i od kancera. Ovaj sistem uključuje nekoliko tipova limfoidnih i mijeloidnih ćelija kao što su monociti, makrofagi, dcndritskc ćelije (dcndritic cclls, DC), cozinofili, T ćelije, B ćelije i neutrofili. Ove limfoidne i mijeloidne ćelije često proizvode signalne proteine poznate kao citokini. Imunski odgovor uključuje zapaljenje, tj., akumulaciju imunskih ćelija, sistemsku ili na određenom mestu u telu. U odgovoru na infektivni agens ili stranu supstancu, imunske ćelije sekretuju citokine koji zatim modulišu proliferaciju imunskih ćelija, njihov razvoj, diferencijaciju ili migraciju. Imunski odgovor može da proizvede patološke posledice, npr., kada u okviru njega dođe do preteranog zapaljenja, kao u autoimunskim poremećajima (vidi npr., Abbas, et al. (eds.) (2000) Cellular and Molecular Immunologv, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppenheim and Feldmann (eds.)

(2001) Cvtokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian and Mackav

(2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson and Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350).

[0003]Interleukin-12 (IL-12) je heterodimerni molekul sastavljen od podjedinica p35 i p40. Studije su ukazale na to da IL-12 igra kritičnu ulogu u diferencijaciji naivnih( nal' ve)T ćelija u T-pomagače tip 1 CD4<+>limfocite koji sekretuju IFNy. Pokazano je takođe da je IL-12 od suštinskog značaja zain vivoimunski odgovor i zapaljenski odgovor, koji zavise od T ćelija. (Vidi, npr., Cua, et al. (2003) Nature 421:744-748. Receptor za IL-12 je sastavljen od podjedinica 1L-I2betal i IL-12beta2.

[0004]lnterleukin-23 (IL-23) je heterodimerni citokin koji se sastoji od dve podjedinice, pl9 koja se nalazi samo u IL-23, i p40 koja je zajednička sa IL-12. Podjedinica pl9 je strukturno povezana sa IL-6, faktorom stimulacije kolonija granulocita (granulocyte-colony stimulating factor, GCSF) i podjedinicom p35 IL-12. IL-23 posreduje u prenosu signala vezujući se za heterodimerni receptor koji se sastoji od IL-23R, i IL-12J31 koji je zajednički sa podjedinicom receptora za IL-12. Brojne rane studije pokazale su da su posledice genetičke detlcijencije p40 (p40 nokaut miševi; p40KO miševi) jače nego one koje su nađene kod p35KO miševa. Neki od ovih rezultata na kraju su objašnjeni otkrićem IL-23, i činjenicom da p40KO prevenira ekspresiju IL-12, ali i IL-23 (vidi, npr., Oppmami, et al. (2000) Immunitv 13:715-725; Wiekowski, et al. (2001) J. Immunol. 166:7563-7570; Parham, et al. (2002) j Immunol 168:5699-708; Frucht (2002) Sci STKE 2002, E1-E3; Elkins, et al. (2002) Infection Immunity 70:1936-1948).

[0005]Nedavne studije, izvedene uz korišćenje p40 KO miševa, pokazale su da blokada IL-23 i IL-12 predstavlja efikasan tretman za različite zapaljenske i autoimunske poremećaje. Međutim, izgleda da blokada IL-12 preko p40 ima različite sistemske posledice kao što su povećana podložnost oportunističkim infekcijama izazvanim mikroorganizmima.

[0006]Najznačajnije ograničenje u korišćenju antitela kao terapijskih sredstavain vivoje imunogenost antitela. Kako je većina monoklonskih antitela poreklom od glodara, njihova ponovljena upotreba kod ljudi za rezultat ima pokretanje imunskog odgovora na terapijsko antitelo. Rezultat takvog imunskog odgovora u najboljem slučaju je gubitak terapijske efikasnosti, dok u najgorem slučaju dolazi do potencijalno fatalnog anafilaktičkog odgovora. Početni napori za smanjenje imunogenosti glodarskih antitela uključivali su proizvodnju himernih antitela u kojima su varijabilni regioni miša fuzionisani sa konstantnim regionima čoveka. Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43. Međutim, miševi kojima su injektirani hibridi humanih varijabilnih regiona i mišjih konstantnih regiona razvijaju jak odgovor na antitela, usmeren protiv humanog varijabilnog regiona, što sugeriše da zadržavanje celog Fv regiona glodara u takvim himernim antitelima ipak kod pacijenata može rezultovati neželjenom imunogenošću.

[0007]Prema opštem uverenju, petlje regiona koji određuje komplementarnost (complementaritv determining region, CDR), varijabilnih domena, uključuju mesto vezivanja molekula antitela. Prema tome, pokušano je kalemljenje CDR petlji glodara u humane okvirne regione (tj., humanizacija), da bi se dodatno smanjilo prisustvo sekvenci glodara. Jones et al. (1986) Nature 321:522; Verhoeven et al. (1988) Science 239:1534. Međutim, razmene CDR petlji i dalje nemaju, kao uniforman rezultat, antitelo sa istim osobinama vezivanja kakve ima antitelo od kojeg potiče. Da bi se očuvao afinitet za vezivanje sa antigenom, u humanizovanim antitelima potrebne su i promene u reziduama okvira (framework residues, FR), reziduama koje učestvuju u pružanju potpore CDR petljama. Kabat et al. (1991) J. Immunol. 147:1709. Iako je za brojne humanizovane konstrukte antitela saopšteno korišćenje kalemljenja CDR uz očuvanje rezidua okvira, teško je predvideti da li će određena sekvenca za rezultat imati antitelo sa željenim vezivanjem i, ponekad biološkim osobinama. Vidi, npr., Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029, Gorman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181 i Hodgson (1991) Biotechnology (NY) 9:421-5. Štaviše, većina ranijih studija u kojima su različite humane sekvence korišćene kao varijabilne sekvence životinjskih lakih i teških lanaca, dovodi u pitanje predviđajuću prirodu takvih studija. Korišćene su sekvence poznatih antitela ili, tipičnije, onih antitela sa strukturom poznatom na osnovu analize X-zracima, antitela NEW i KOL. Vidi, npr., Jones et al., gore; Verhoeven et al., gore; and Gorman et al., gore. Tačne informacije o sekvenci saopštene su za mali broj humanizovanih konstrukata. Predmetni pronalazak obezbeđuje inženjerisana antitela za IL-23pl9 i njihove upotrebe u tretmanu zapaljenskih, autoimunskih i proliferativnih poremećaja. WO 2004/081190 opisuje upotrebe agonista i antagonista IL-23 i srodnih reagenasa. US 6495667 opisuje IL B30 antitela. Sehv et al., FASEB Journal Vol. 19 (4), Suppl. S, Part 1, strane A945-A946, opisuju nedvosmislenu detekciju IL-23 (pl9/p40) proteina u nativnim uzorcima korišćenjem novog enzimskog imunoadsorpcionog testa. WO 2005/052157 opisuje IL-23 i njegov receptor, i reagense i metode u vezi sa tim. Rudikoff et al., PNAS USA, March 1982, Vol. 79, strane 1979-1983, opisuju jednu aminokiselinsku supstituciju koja menja antigen-vezujuću specifičnost. Chen et al, J. Clin. Investigation, Vol. 116(5), May 2006, strane 1317-1326, saopštavaju da terapija sa anti-IL-23 inhibira višestruke zapaljenske puteve i ublažava autoimunski encefalomijelitis.

KRATAK OPIS CRTEŽA

|00OS]

Slike 1A-1C prikazuju poređenja sekvenci varijabilnog domena teškog lanca klona mišjeg antihumanog IL-23pl9 antitela. Naznačeni su CDR, kao i CDR

konsenzusne sekvence, za klonove 7G10, 6H12, 13F11, 13B5, 7E2, 13G1, 11C10, 1E10, 30F11, 34E4, 5B12, 6H4, 9C9, UBIO, 30E1, 33D2, 20A9, 22E9, 29D5, 21A10, 33B12, 10H11, 19E9, 10G8, 3D7, 39G2, 35F12, 49A10, 34F9 i 7D7.

Slike 2A-2C prikazuju poređenja sekvenci varijabilnog domena lakog lanca klona mišjeg antihumanog IL-23pl9 antitela. Naznačeni su CDR za klonove 7G10,

6H12, 13F11, 13B5, 7E2, 13G1, 11C10, 1E10, 30F11, 34E4, 5B12, 6H4, 9C9, UBIO, 33D2, 20A9, 22E9, 29D5, 21A10, 33B12, 10H11, 19E9, 10G8, 3D7,

39G2, 35F12, 49A10, 34F9 i 7D7. Nije data sekvenca varijabilnog domena lakog lanca za klon 30E1. Konsenzusne sekvence su date za svaku od tri potporodice CDR sekvenci lakog lanca, ovde označene kao potporodice lakog lanca (a), (b) i (c). Ove potporodice sekvenci prikazane su od vrha ka dnu na SL. 2A-2C.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0009]Predmetni pronalazak (kako je definisano u zahtevima) zasniva se na zapažanju da blokiranje IL-23 inhibira zapaljenje, autoimunost i nenormalnu proliferaciju.

[0010]Predmetna objava obuhvata vezujuće jedinjenje, kao što je antitelo ili njegov fragment, uključujući humanizovana ili himeraa rekombinantna antitela, koji se vezuje za humani IL-23pl9, koji sadrži najmanje jedan varijabilni region lakog lanca antitela, ili njegovog vezujućeg fragmenta, sa najmanje jednim, dva ili tri CDR odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 81-89. Vezujuće jedinjenje definisano u ovom tekstu može sadržati varijabilni domen lakog lanca koji uključuje najmanje jedan CDRL1 odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 81-83 i najmanje jedan CDRL2 odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 84-86 i najmanje jedan CDRL3 odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 87-89.

[0011]Vezujuće jedinjenje može sadržati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca antitela, ili njegovog vezujućeg fragmenta, sa najmanje jednim, dva ili tri CDR odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 78-80.

[0012]Vezujuće jedinjenje može sadržati region okvira u kojem je aminokiselinska sekvenca regiona okvira u potpunosti ili suštinski u potpunosti aminokiselinska sekvenca humanog imunoglobulina.

[0013]Vezujuće jedinjenje definisano u ovom tekstu može sadržati najmanje jedan, dva ili tri CDR lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 81-89 ili opciono njenom varijantom. Vezujuće jedinjenje može sadržati najmanje jedan, dva ili tri CDR teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 78-80 ili opciono njenom varijantom. Varijanta može sadržati do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više konzervativno modifikovanih aminokiselinskih rezidua, u odnosu na sekvencu respektivnih SEQ ID NO. Konzervativne aminokiselinske supstitucije date su u Tabeli 1.

[0014]Vezujuće jedinjenje može sadržati najmanje jedan varijabilni region lakog lanca antitela, ili njegovog vezujućeg fragmenta, sa najmanje jednim, dva ili tri CDR odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 69-77. Vezujuće jedinjenje definisano u ovom tekstu može uključivati varijabilni domen lakog lanca koji uključuje najmanje jedan CDRL1 odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 69-71 i najmanje jedan CDRL2 odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 72-74 i najmanje jedan CDRL3 odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 75-77. Vezujuće jedinjenje može sadržati najmanje jedan varijabilni region teškog lanca antitela, ili njegovog vezujućeg fragmenta, sa najmanje jednim, dva ili tri CDR odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 66-68.

[0015]Vezujuće jedinjenje definisano u ovom tekstu može sadržati najmanje jedan, dva ili tri CDR lakog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 69-77 ili njenom varijantom. Vezujuće jedinjenje definisano u ovom tekstu može sadržati varijabilni domen lakog lanca koji uključuje najmanje jedan CDRL1 odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 69-71 ili njene varijante, i najmanje jedan CDRL2 odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 72-74 ili njene varijante, i najmanje jedan CDRL3 odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 75-77 ili njene varijante. Vezujuće jedinjenje definisano u ovom tekstu može sadržati najmanje jedan, dva ili tri CDR teškog lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 66-68 ili njenom varijantom. Varijanta može uključivati do 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više konzervativno modifikovanih aminokislinskih rezidua, u odnosu na sekvencu respektivnih SEQ ID NO.

[0016]U jednoj formi, pronalazak obezbeđuje antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, kako je definisano u zahtevima, pri čemu antitelo predmetnog pronalaska sadrži CDRL1, CDRL2 i CDRL3 koji se sastoje od rezidua 43-53, 69-75, odnosno 108-116 SEQ ID NO: 4; i CDRH1, CDRH2 i CDRH3 koji se sastoje od rezidua 45-54, 69-85, odnosno 118-123 SEQ ID NO: 3.

[0017]U jednoj formi pronalaska, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako je definisano u zahtevima, sadrži varijabilni domen lakog lanca antitela, ili njegovog vezujućeg fragmenta, koji sadrži sekvencu rezidua 20-129 SEQ ID NO: 4, ili njenu varijantu; i varijabilni domen teškog lanca antitela, ili njegovog vezujućeg fragmenta, koji sadrži sekvencu rezidua 20-134 SEQ ID NO: 3, ili njenu varijantu; gde varijanta uključuje do 20 konzervativno modifikovanih aminokiselinskih supstitucija. U različitim formama varijanta uključuje do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ili 20 konzervativno modifikovanih aminokiselinskih rezidua, u odnosu na sekvencu respektivnih SEQ ID NO.

[0018]Vezujuće jedinjenje može uključivati laki lanac antitela, koji sadrži, ili se suštinski sastoji od sekvence zrelog oblika (rezidue 20-233) SEQ ID NO: 2 ili 4. Vezujuće jedinjenje može uključivati teški lanac antitela koji sadrži, ili se suštinski sastoji od sekvence zrelog oblika (rezidue 20-464) SEQ ID NO: 1 ili 3.

[0019]Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment predmetnog pronalaska, vezuje se za humani IL-23pl9 (SEQ ID NO: 29) na epitopu koji sadrži rezidue 82-95 i rezidue 133-140. U jednoj formi, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment pronalaska, vezuje se za epitop koji sadrži rezidue E82, G86, S87, D88, T91, G92, E93, P94, S95, H106, P133, S134, Q135, P136, W137, R139 i L140 SEQ ID NO: 20. Epitop opciono uključuje rezidue K83, F90 i LI 10. Epitop za antitelo od interesa može da se odredi dobijanjem strukture kompleksa antitelo:antigen pomoću kristalografije X-zracima, i određivanjem koje se rezidue IL-23pl9 nalaze unutar specifikovane udaljenosti rezidua na antitelu od interesa, pri čemu specifikovano odstojanje iznosi, npr., 4 A ili 5 A. Epitop može da bude definisan kao niz od 8 ili više kontinuiranih aminokiselinskih rezidua duž sekvence IL-23pl9, u kojem se najmanje 50%, 70% ili 85% rezidua nalazi unutar specifikovanog odstojanja od antitela.

[0020]Objava obezbeđuje vezujuće jedinjenje koje se vezuje za humani IL-23 i ima varijabilni domen lakog lanca (VL) sa najmanje 95%, 90%. 85%, 80%, 75% ili 50% sekvencione homologije sa reziduama 20-129 SEQ ID NO: 2 ili 4. Objava obezbeđuje vezujuće jedinjenje koje se vezuje za humani IL-23 i ima varijabilni domen teškog lanca (VH) sa najmanje 95%., 90%.. 85%, 80%, 75% ili 50% sekvencione homologije sa reziduama 20-134 SEQ ID NO: 1 ili 3.

[0021]Vezujuće jedinjenje može sadržati ili suštinski se sastojati od antitela koje ima laki lanac sa sekvencom zrelog oblika (tj. rezidue 20-233) SEQ ID NO: 2 ili 4. Vezujuće jedinjenje može sadržati ili suštinski se sastojati od antitela koje ima teški lanac sa sekvencom zrelog oblika (tj. rezidue 20-464) SEQ ID NO: 1 ili 3.

[0022]Objava se odnosi na antitela koja su sposobna da blokiraju vezivanje vezujućeg jedinjenja predmetnog pronalaska za humani IL-23 u testu unakrsnog blokiranja. U jednoj formi, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment pronalaska, blokira IL-23-posredovanu aktivnost, kao što su aktivnosti koje uključuju, ali se ne ograničavaju na vezivanje za njegov receptor ili pokretanje proliferacije ili preživljavanja Th17 ćelija.

[0023]U nekim formama predmetnog pronalaska, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment predmetnog pronalaska, sadrži još i konstantni region yl ili y4 humanog teškog lanca. Objava takođe obezbeđuje konstantni region humanog y2 ili y3 teškog lanca ili njegovu varijantu. Konstantni region lakog lanca može sadržati konstantni region humanog lambda ili kapa lakog lanca.

[0024]Vezujuća jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu biti poliklonska, monoklonska, himerna, humanizovana ili potpuno humana antitela ili njihovi fragmenti. Predmetni pronalazak razmatra da se fragmenti antitela biraju iz grupe koja se sastoji od Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2i dijatela.

[0025]Predmetna objava obuhvata metod suprimiranja imunskog odgovora kod humanog subjekta, koji uključuje primenu, kod subjekta kojem je to potrebno, antitela (ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta) specifičnog za IL-23, u količini efikasnoj za blokiranje biološke aktivnosti IL-23. Antitelo specifično za IL-23 može biti humanizovano ili himerno antitelo. Imunski odgovor može biti zapaljenski odgovor koji uključuje artritis, psorijazu i zapaljensku bolest creva. Imunski odgovor može biti autoimunski odgovor koji uključuje multiplu sklerozu, uveitis, sistemski eritemski lupus i dijabetes. Imunski odgovor može biti odgovor na kancer.

[0026]Predmetna objava takođe razmatra primenu dodatnog imunosupresivnog ili antizapaljenskog sredstva. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment predmetnog pronalaska mogu se nalaziti u smeši koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem. U sledećoj formi, smeša sadrži još i imunosupresivno ili antizapaljensko sredstvo.

[0027] Predmetni pronalazak uključuje izolovanu nukleinsku kiselinu, kako je definisano u zahtevima, koja kodira polipeptidnu sekvencu antitela predmetnog pronalaska. Nukleinska kiselina može biti u ekspresionom vektoru operabilno povezana sa kontrolnim sekvencama koje prepoznaje ćelija-domaćin transfektovana vektorom. Uključena je i ćelija-domaćin koja sadrži vektor, kao i metod proizvodnje polipeptida, koji se sastoji od kultvisanja ćelije-domaćina pod uslovima pod kojima se eksprimira sekvenca nukleinske kiseline, čime se proizvodi polipeptid, i preuzimanja tog polipeptida iz ćelije-domaćina ili medijuma.

[0028] U različitim formama, objava se odnosi na medikamente koji sadrže vezujuća jedinjenja predmetnog pronalaska.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0029] Kako se koriste u ovom tekstu, uključujući priložene zahteve, oblici reči u jednini podrazume vaju i njihove odgovarajuće oblike u množini, ukoliko kontekst jasno ne upućuje na drugačije. Tabela 7, dole, daje spisak skraćenih oznaka sekvenci, upotrebljenih u ovoj prijavi.

I. Definicije

[0030] "Aktivacija", "stimulacija" i "tretman", kada se odnose na ćelije ili receptore, mogu imati isto značenje npr., aktivacija, stimulacija ili tretman ćelije ili receptora Ugandom, ukoliko kontekstom ili eksplicitno nije naznačeno drugačije. "Ligand" obuhvata prirodne i sintetske Ugande, npr., citokine, varijante citokina, analoge, muteine, i vezujuće smeše izvedene iz antitela. "Ligand" takođe obuhvata male molekule, npr., peptidne mimetike citokina i peptidne mimetike antitela. "Aktivacija" može da se odnosi na aktivaciju ćelije kada je ona regulisana unutrašnjim mehanizmima, kao i kada je regulisana spoljašnjim ili sredinskim faktorima. "Odgovor", npr., ćelije, tkiva, organa ili organizma, obuhvata promenu biohemijskog ili fiziološkog ponašanja, npr., koncentracije, gustine, adhezije ili migracije unutar biološkog kompartmenta, stopu ekspresije gena, ili stanje diferencijacije, pri čemu je promena u korelaciji sa aktivacijom, stimulacijom ili tretmanom, ili sa unutrašnjim mehanizmima kao što je genetičko programiranje.

[0031]"Aktivnost" molekula može opisivati ili se odnositi na vezivanje molekula sa Ugandom ili receptorom, na katalitičku aktivnost; na sposobnost stimulisanja genske ekspresije ili ćelijske signalizacije, diferencijacije ili maturacije; na antigensku aktivnost, na modulaciju aktivnosti drugih molekula, i slično. "Aktivnost" molekula može da se odnosi i na aktivnost u modulisanju ili održavanju interakcija između ćelija, npr., adhezije, ili aktivnost u održavanju strukture ćelije, npr., ćelijskih membrana ili citoskeleta. "Aktivnost" može da označava i specifičnu aktivnost, npr., [katalitička aktivnost]/[mg proteina], ili [imunološka aktivnost]/[mg proteina], koncentraciju u biološkom kompartmentu ili slično. "Proliferativna aktivnost" obuhvata aktivnost koja pokreće, koja je neophodna ili koja je specifično udružena sa npr., normalnom ćelijskom deobom, kao i sa kancerom, tumorima, displazijom, transformacijom ćelije, metastazom i angiogenezom.

[0032]"Primena" i "tretman", kada se odnose na životinju, čoveka, eksperimentalni subjekt, ćeliju, tkivo, organ ili biološku tečnost, odnose se na kontakt egzogenog farmaceutskog, terapijskog, dijagnostičkog sredstva, ili smeše kod životinje, čoveka, subjekta, ćelije, tkiva, organa ili biološke tečnosti. "Primena" i "tretman" mogu da se odnose, npr., na terapijske, farmakokinetičke, dijagnostičke, istraživačke i eksperimentalne metode. Tretman ćelije obuhvata kontakt reagensa sa ćelijom kao i kontakt reagensa sa tečnošću, pri čemu je tečnost u kontaktu sa ćelijom. "Primena" i "tretman" takođe označavaju tretmanein vitroiex vivo,npr., ćelije, reagensom, dijagnostičkim sredstvom, vezujućom smešom ili drugom ćelijom. "Tretman", kada se odnosi na humani, veterinarski ili istraživački subjekt, odnosi se na terapijski tretman, profilaktičke ili preventivne mere, na primenu u istraživanju ili dijagnostici. "Tretman" kada se primenjuje na humani, veterinarski ili istraživački subjekt, ili ćeliju, tkivo ili organ, obuhvata kontakt IL-23 agonista ili IL-23 antagonista sa humanim ili životinjskim subjektom, ćelijom, tkivom, fiziološkim kompartmentom ili fiziološkom tečnošću. "Tretman ćelije" takođe obuhvata situacije u kojima IL-23 agonist ili IL-23 antagonist stupa u kontakt sa IL-23 receptorom (IL-23R/IL-12Rbetal heterodimer), npr., u tečnoj fazi ili koloidnoj fazi, ali i situacije u kojima agonist ili antagonist ne stupa u kontakt sa ćelijom ili receptorom.

[0033] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "antitelo" odnosi se na svaki oblik antitela ili njegovog fragmenta, koji pokazuje željenu biološku aktivnost. Prema tome, koristi se u najširem smislu i specifično pokriva monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god ispoljavaju željenu biološku aktivnost.

[0034] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "IL-23pl9 vezujući fragment" ili "njegov vezujući fragment" obuhvata fragment ili derivat antitela koji i dalje suštinski zadržava svoju biološku aktivnost u inhibiranju IL-23pl9 aktivnosti. Prema tome, izraz "fragment antitela" ili IL-23pl9 vezujući fragment odnosi se na deo antitela pune dužine, obično njegov antigen-vezujući ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela, npr., sc-Fv; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Tipično, vezujući fragment ili derivat zadržava najmanje 10% svoje IL-23pl9 inhibitorne aktivnosti. Poželjno, vezujući fragment ili derivat zadržava najmanje 25%, 50%, 60%, 70%., 80%, 90%», 95%, 99% ili 100% (ili više) svoje IL-23pl9 inhibitorne aktivnosti, iako će koristan biti svaki fragment sa afinitetom dovoljnim za ispoljavanje željenog biološkog efekta. Namera je takođe da IL-23pl9 vezujući fragment može uključivati konzervativne aminokiselinske supstitucije koje suštinski ne menjaju njegovu biološku aktivnost.

[0035] Izraz "monoklonsko antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju identična su osim po mogućim prirodnim mutacijama koje mogu biti prisutne u minimalnim količinama. Monoklonska antitela su visokospecifična, usmerena protiv jednog antigenskog epitopa. Nasuprot tome, konvencionalni preparati antitela (poliklonski) tipično uključuju veliki broj antitela usmerenih prema različitim epitopima (ili specifičnih za različite epitope). Modifikator "monoklonsko" označava karakter antitela kao antitela dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao zahtev da antitela budu proizvedena nekim određenim metodom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti prema predmetnom pronalasku mogu da se naprave metodom hibridoma koji je prvi put opisan u Kohler et al., (1975) Nature 256: 495, ili mogu da se naprave metodima rekombinantne DNK (vidi, npr., U.S. Pat. No. 4,816,567). "Monoklonska antitela" mogu takođe da budu izolovana iz fagnih biblioteka antitela korišćenjem tehnika opisanih u Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628 i Marks et al, (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, na primer.

[0036]Monoklonska antitela ovde specifično uključuju "himerna" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela poreklom iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca/lanaca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela poreklom iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, dokle god pokazuju željenu biološku aktivnost (U.S. Pat. No. 4,816,567; i Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 6851-6855).

[0037]"Domensko antitelo" je imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više Vhregiona kovalentno su spojena peptidnim linkerom da bi nastalo bivalentno domensko antitelo. Dva Vhregiona bivalentnog domenskog antitela mogu ciljati iste ili različite antigene.

[0038]"Bivalentno antitelo" sadrži dva antigen-vezujuća mesta. U nekim slučajevima, dva vezujuća mesta imaju istu antigensku specifičnost. Međutim, bivalentna antitela mogu biti bispecifična (vidi kasnije).

[0039]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "jednolančano Fv" ili "scFv" antitelo, odnosi se na fragmente antitela koji sadrže Vhi VLdomene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid sadrži još i polipeptidni linker između Vhi Vldomena, koji omogućava da sFv formira željenu strukturu za vezivanje sa antigenom. Za pregled sFv, vidi Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315.

[0040]Monoklonska antitela u ovom tekstu uključuju i kamelizovana jednodomenska antitela.. Vidi, npr., Muvldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; U.S. Pat. No. 6,005,079). U jednoj formi, predmetna objava obezbeđuje jednodomenska antitela koja sadrže dva Vh domena sa modifikacijama, tako da se formiraju jednodomenska antitela.

[0041]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "dijatela" odnosi se na male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (Vh) spojen sa varijabilnim domenom lakog lanca (Vl) u istom polipeptidnom lancu (Vh-Vlili Vl-Vh). Korišćenjem linkera koji je suviše kratak da bi dopustio sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prinuđeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i da stvaraju dva antigen-vezujuća mesta. Dijatela su potpunije opisana u npr., EP 404,097; WO 93/11161; i Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Za pregled inženjerisanih varijanti antitela uopšteno, vidi Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

[0042]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "humanizovano antitelo" odnosi se na oblike antitela koja sadrže sekvence iz nehumanih antitela (npr., mišjih), kao i humanih antitela. Takva antitela sadrže minimalnu sekvencu poreklom iz nehumanog imunoglobulina. Uopšteno, humanizovana antitela uključivaće suštinski sve od najmanje jednog, i tipično dva varijabilna domena, u kojima cele ili suštinski cele hipervarijabilne petlje odgovaraju onima iz nehumanih imunoglobulina, i celi ili suštinski celi FR regioni su iz humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo će opciono sadržati i najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc) tipično onog iz humanog imunoglobulina. Prefiks "hum" dodaje se oznakama za klon antitela onda kada je potrebno razlikovati humanizovana antitela (npr., hum6H12) od roditeljskih antitela glodara (npr. mišje 6H12, ili "m6H12"). Humanizovani oblici antitela glodara obično će sadržati iste CDR sekvence roditeljskih glodarskih antitela, iako neke aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu kako bi se povećao afinitet ili poboljšala stabilnost humanizovanog antitela.

[0043]Antitela objavljena u ovom tekstu uključuju i antitela sa modiflkovanim (ili blokiranim) Fc regionima da bi se obezbedile izmenjene efektorske funkcije. Vidi, npr., U.S. Pat. No. 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; Presta

(2006) Adv. Drug Deliverv Rev. 58:640-656. Takva modifikacija može da se koristi za pojačavanje ili supresiju različitih reakcija imunskog sistema, uz moguće korisne efekte u dijagnozi i terapiji. Izmene Fc regiona uključuju promene amino-kiselina (supstitucije, delecije i insercije), glikozilaciju ili deglikozilaciju i dodavanje više Fc. Promene u Fc mogu takođe da promene poluživot terapijskih antitela, a duži poluživot rezultovaće manje čestim doziranjem, uz posledični porast udobnosti i smanjeni utrošak materijala. Vidi Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 na 734-35.

[0044]Izraz "potpuno humano antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži proteinske sekvence samo humanog imunoglobulina. Ako je proizvedeno u ćeliji miša ili u hibridomu izvedenom iz ćelije miša, potpuno humano antitelo može sadržati ugljenohidratne lance miša. Slično tome, "mišje antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži samo mišje imunoglobulinske sekvence.

[0045]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "hipervarijabilni region" odnosi se na aminokiselinske rezidue antitela odgovorne za vezivanje sa antigenom. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske rezidue iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR" (npr., rezidue 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) i 89-97 (CDRL3) u varijabilnom domenu lakog lanca i rezidue 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) i 95-102 (CDRH3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5<th>Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) i/ili one rezidue iz "hipervarijabilne petlje" (tj. rezidue 26-32 (LI), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (Hl), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "okvirne" ili "FR" rezidue odnosi se na one rezidue varijabilnog domena koje nisu rezidue hipervarijabilnog regiona, ovde definisane kao CDR rezidue. Gornje numerisanje rezidua odnosi se na Kabat-ov sistem numerisanja i ne odgovara obavezno u detaljima numerisanju sekvenci u pridruženoj Listi sekvenci. Vidi Tabele 2 i 3 u kojima je numerisanje sekvenci prema Listi sekvenci.

[0046]"Vezujuće jedinjenje" odnosi se na molekul, mali molekul, makromolekul, polipeptid, antitelo ili njegov fragment ili analog, ili solubilni receptor, sposoban za vezivanje sa svojim ciljem. "Vezujuće jedinjenje" takođe može da se odnosi na kompleks molekula, npr., nekovalentni kompleks, na jonizovani molekul i na kovalentno ili nekovalentno modifikovani molekul, npr., modifikovan fosforilacijom, acilacijom, unakrsnim povezivanjem, ciklizacijom, ili ograničenim sečenjem, sposoban da se veže za cilj. Kada se koristi u vezi sa antitelima, izraz "vezujuće jedinjenje" odnosi se i na antitela i na njihove vezujuće fragmente. "Vezivanje" se odnosi na udruživanje vezujuće smeše sa ciljem, pri čemu udruživanje za rezultat ima smanjenje normalnog Brown-ovog kretanja vezujuće smeše, u slučajevima kada vezujuća smeša može da se rastvori ili suspenduje u rastvoru. "Vezujuća smeša" odnosi se na molekul, npr., vezujućeg jedinjenja u kombinaciji sa stabilizerom, ekscipijentom, solju, puferom, rastvaračem ili aditivom, koji je sposoban da se vezuje sa ciljem.

[0047] "Konzervativno modifikovane varijante" ili "konzervativna supstitucija" odnosi se na supstitucije amino-kiselina koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti i koje se mogu napraviti obično bez izmene biološke aktivnosti rezultujućeg molekula. Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznaće da, uopšteno, pojedinačne aminokiselinske supstitucije u neesencijalnim regionima polipeptida neće bitno izmeniti biološku aktivnost (vidi, npr., Watson, et al., Molecular Biologv of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4<th>Edition 1987)). Primeri takvih supstitucija poželjno se prave u skladu sa onima koje su navedene u Tabeli 1 koja sledi:

[0048]Izrazi "sastoji se suštinski od" ili varijacije kao "sastoje se suštinski od" ili "koji se sastoji suštinski od", kako se koriste u ovoj specifikaciji i zahtevima, ukazuju na uključenost svih navedenih elemenata ili grupe elemenata i, opciono, uključenost drugih elemenata slične ili različite prirode u odnosu na navedene elemente, koji materijalno ne menjaju bazične ili nove osobine specifikovanog doznog režima, metoda ili smeše. Kao neograničavajući primer, vezujuće jedinjenje koje se sastoji suštinski od navedene aminokiselinske sekvence može uključivati i jednu ili više amino-kiselina, uključujući supstitucije jedne ili više aminokiselinskih rezidua, koje materijalno ne utiču na osobine vezujuć eg j edinj enj a.

[0049]"Efikasna količina" podrazumeva količinu dovoljnu za poboljšanje ili prevenciju simptoma ili znakova medicinskog stanja. Efikasna količina takođe označava količinu dovoljnu da omogući ili olakša postavljanje dijagnoze. Efikasna količina za određenog pacijenta ili za veterinarski subjekt može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stanje koje se tretira, opšte stanje zdravlja pacijenta, metod, put i doza primene i jačina sporednih efekata (vidi, npr., U.S. Pat. No. 5,888,530 za Netti, et al.). Efikasna količina može biti maksimalna doza ili dozirajući protokol, koji ne dovode do značajnih sporednih efekata ili toksičnih efekata. Efekat će za rezultat imati poboljšanje dijagnostičke mere ili parametra za najmanje 5%, obično za najmanje 10%, češće za najmanje 20%, najčešće za najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, najpoželjnije za najmanje 60%, idealno za najmanje 70%, idealnije za najmanje 80% i najidealnije za najmanje 90%, pri čemu se 100% defmiše kao dijagnostički parametar koji pokazuje normalni subjekt (vidi, npr., Mavnard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, lnterpharm Press, Boca Raton, FL; Dent

(2001) Good Laboratorv and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK).

[0050]"Egzogeno" odnosi se na supstance koje se proizvode izvan organizma, ćelije, ili čovečjeg tela, zavisno od konteksta. "Endogeno" odnosi se na supstance koje se proizvode unutar ćelije, organizma ili čovečjeg tela, zavisno od konteksta.

[0051]"Imunsko stanje" ili "imunski poremećaj" obuhvata, npr., patološko zapaljenje, zapaljenski poremećaj i autoimunski poremećaj ili oboljenje. "Imunsko stanje" odnosi se i na infekcije, perzistentne infekcije i proliferativna stanja kao što su kancer, tumori i angiogeneza, uključujući infekcije, tumore i kancere koji su otporni na eradikaciju imunskim sistemom. "Kancerozno stanje" uključuje npr., kancer, kancerske ćelije, tumore, angiogenezu i prekancerozna stanja kao što je displazija.

[0052]"Zapaljenski poremećaj" označava poremećaj ili patološko stanje u kojem je patologija u potpunosti ili delom rezultat npr., promene u broju, promene u stopi migracije ili promene u aktivaciji ćelija imunskog sistema. Ćelije imunskog sistema uključuju, npr., T ćelije, B ćelije, monocite ili makrofage, antigen-prezentujuće ćelije (antigen presenting cells, APC), dendritske ćelije, mikroglijske ćelije, NK ćelije, NKT ćelije, neutrofile, eozinofile, mastocite, ili bilo koji drugi tip ćelija specifično udruženih sa imunologijom, na primer, endotelske ili epitelne ćelije koje proizvode citokine.

[0053]"IL-17-produkujuća ćelija" označava T ćeliju koja nije klasična T ćelija TH1-tipa ili klasična T ćelija TH2-tipa, označenu kao Th17 ćelija. O Tnl7 ćelijama više se govori u Cua and Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato and O'Shea (2006) Nature 441:166-168; hvakura and Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222. "IL-17-produkujuća ćelija" označava i T ćeliju koja eksprimira gen ili polipeptid iz Tabele 10B iz U.S. Patent Application Publication No. 2004/0219150 (npr., P-protein koji odgovara na mitogen; hemokinski ligand 2; interleukin-17 (IL-17); transkripcioni faktor RAR srodan; i/ili supresor signalizacije citokinima 3), gde je ekspresija uz tretman IL-23 agonistom veća nego uz tretman IL-12 agonistom, pri čemu se "veća od" definiše na sledeći način. Ekspresija uz IL-23 agonist je obično najmanje 5-struko veća, tipično najmanje 10-struko veća, tipičnije najmanje 15-struko veća, najtipičnije najmanje 20-struko veća, poželjno najmanje 25-struko veća, i najpoželjnije najmanje 30-struko veća, nego uz tretman IL-12. Ekspresija može da se meri, npr., tretiranjem populacije suštinski čistih IL-17-produkujućih ćelija.

[0054]Pored toga, "IL-17-produkujuća ćelija" uključuje progenitorsku ili prekursorsku ćeliju koja je opredeljena, na putu razvoja ćelije ili ćelijske diferencijacije, da se diferencira u IL-17-produkujuću ćeliju, kako je definisano gore. Progenitorska ili prekursorska ćelija za IL-17 produkujuću ćeliju može da se nađe u drenažnom limfnom čvoru (draining lymph node, DLN). Pored toga, "IL-17-produkujuća ćelija" obuhvata IL-17-produkujuću ćeliju, kako je gore definisno, koja je bila, npr., aktivirana, npr., forbol estrom, jonoforom i/ili karcinogenom, dodatno diferencirana, uskladištena, zamrznuta, osušena, inaktivirana, delimično razgrađena, npr., apoptozom, proteolizom ili oksidacijom lipida, ili modifikovana, npr., rekombinantnom tehnologijom.

[0055]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "izolovani molekul nukleinske kiseline" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminirajućeg molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično udružen u prirodnom izvoru nukleinske kiseline za antitelo. Izolovani molekul nukleinske kiseline nije u obliku ili postavci u kojoj se nalazi u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline se dakle razlikuju od molekula kakav postoji u prirodnim ćelijama. Međutim, izolovani molekul nukleinske kiseline uključuje molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje uobičajeno eksprimiraju antitelo, gde se, na primer, molekul nalazi na mestu na hromozomu, različitom od onoga u prirodnim ćelijama.

[0056] Ekspresione "kontrolne sekvence" odnosi se na sekvence DNK neophodne za ekspresiju operabilno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu-domaćinu. Kontrolne sekvence pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, opciono operatorsku sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Za eukariotske ćelije se zna da koriste promotore, poliadenilacione signale i enhensere.

[0057] Nukleinska kiselina je "operabilno povezana" kada se nalazi u funkcionalnom odnosu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za presekvencu ili sekretorni lider operabilno je povezana sa DNK za polipeptid ako se eksprimira kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili enhenser operabilno su povezani sa kodirajućom sekvencom ako utiču na transkripciju sekvence; ili mesto vezivanja ribozoma operabilno je povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da olakšava translaciju. Uopšteno, "operabilno povezan" označava da su spojene DNK sekvence kontinuirane i, u slučaju sekretornog lidera, kontinuirane i u fazi čitanja. Međutim, enhenseri ne moraju da budu u kontinuitetu. Povezivanje se ostvaruje ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takvih mesta nema, koriste se sintetski oligonukleotidni adapteri i linkeri, u skladu sa uobičajenom praksom.

[0058] Kada se koriste u ovom tekstu, izrazi "ćelija", "ćelijska linija" i "kultura ćelija" koriste se naizmenično i sva takva imenovanja uključuju i potomstvo. Tako, reči "transformanti" i "transformisane ćelije" uključuju primarnu subjekatsku ćeliju i kulture izvedene iz nje, bez obzira na broj transfera. Podrazumeva se da ne mora svo potomstvo biti precizno identično po sadržaju DNK, zbog namernih ili nenamernih mutacija. Uključeno je mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što su one prema kojima je vršeno pretraživanje originalno transformisane ćelije. Kada je namera da imenovanje ima drugačije značenje, to će biti jasno iz konteksta.

[0059]Kako se koristi u ovom tekstu, "lančana reakcija polimeraze" ili "PCR" odnosi se na postupak ili tehniku u kojoj se mala količina specifičnog dela nukleinske kiseline, RNK i/ili DNK, amplifikuje kako je opisano u, npr., U.S. Pat. No. 4,683,195. Uopšteno, potrebno je da na raspolaganju bude informacija o sekvenci sa krajeva regiona od interesa ili i dalje od toga, tako da mogu da se dizajniraju oligonukleotidni prajmeri; ovi prajmeri biće identični ili slični po sekvenci sa suprotnim stranama templata koji će se amplifikovati. 5'-terminalni nukleotidi dva prajmera mogu da se podudaraju sa krajevima amplifikovanog materijala. PCR može da se koristi za amplifikovanje specifičnih RNK sekvenci, specifičnih DNK sekvenci iz ukupne genomske DNK, i cDNK prepisane sa ukupne ćelijske RNK, bakteriofagnih ili plazmidnih sekvenci, itd. Vidi, uopšteno, Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263: Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). Kako se koristi u ovom tekstu, smatra se da je PCR jedan, ali ne i jedini primer metoda polimerazne reakcije nukleinske kiseline za amplifikovanje testnog uzorka nukleinske kiseline, koji uključuje korišćenje poznate nukleinske kiseline kao prajmera i polimeraze nukleinske kiseline za amplifikovanje ili stvaranje specifičnog dela nukleinske kiseline.

[0060]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "sekvenca geraiinativne linije" odnosi se na sekvencu nerearanžiranih imunoglobulinskih DNK sekvenci. Može se koristiti svaki pogodan izvor nerearanžiranih imunoglobulina.

[0061]"Inhibitori" i "antagonisti" ili "aktivatori" i "agonisti" odnosi se na inhibitorne ili aktivirajuće molekule respektivno, npr., za aktivaciju, npr., Uganda, receptora, kofaktora, gena, ćelije, tkiva ili organa. Modulator, npr., gena, receptora, liganda, ili ćelije je molekul koji menja aktivnost gena, receptora, liganda, ili ćelije, pri čemu aktivnost može biti podstaknuta, inhibirana, ili izmenjena, u pogledu svojih regulatornih osobina. Modulator može delovati sam ili može koristiti kofaktor, npr., protein, jon metala ili mali molekul. Inhibitori su jedinjenja koja smanjuju, blokiraju, preveniraju, odlažu aktivaciju, inaktiviraju, desenzitizuju ili nishodno regulišu npr., gen, protein, ligand, receptor, ili ćeliju. Aktivatori su jedinjenja koja povećavaju, aktiviraju, olakšavaju, pojačavaju aktivaciju, senzitizuju ili pozitivno regulišu, npr., gen, protein, ligand, receptor, ili ćeliju. Inhibitor može da se definiše i kao smeša koja smanjuje, blokira ili inaktivira konstitutivnu aktivnost. "Agonist" je jedinjenje koje interaguje sa ciljem da bi prouzrokovalo ili pokrenulo porast aktivacije cilja. "Antagonist" je jedinjenje koje se suprotstavlja dejstvima agonista. Antagonist prevenira, smanjuje, inhibira, ili neutrališe aktivnost agonista. Antagonist može takođe da prevenira, inhibira ili smanjuje konstitutivnu aktivnost cilja, npr., ciljnog receptora, čak i kada nema identifikovanog agonista.

[0062]Da bi se ispitao obim inhibicije, na primer, uzorci ili testovi koji sadrže dati, npr., protein, gen, ćeliju ili organizam, tretiraju se potencijalnim aktivirajućim ili inhibirajućim sredstvom i upoređuju se sa kontrolnim uzorcima koji nisu tretirani sredstvom. Kontrolnim uzorcima, tj., onima koji nisu tretirani sredstvom, pripisuje se relativna vrednost aktivnosti od 100%. Inhibicija se postiže kada vrednost aktivnosti u odnosu na kontrolu iznosi oko 90%> ili manje, tipično 85% ili manje, tipičnije 80%) ili manje, najtipičnije 75% ili manje, uopšteno 70% ili manje, uopštenije 65% ili manje, najuopštenije 60%> ili manje, tipično 55% ili manje, obično 50% ili manje, češće 45%) ili manje, najčešće 40% ili manje, poželjno 35% ili manje, poželjnije 30% ili manje, još poželjnije 25% ili manje, i najpoželjnije manje od 25%. Aktivacija se postiže kada je vrednost aktivnosti u odnosu na kontrolu oko 110%, uopšteno najmanje 120%, uopštenije najmanje 140%, najuopštenije najmanje 160%, često najmanje 180%, češće najmanje 2-struko, najčešće najmanje 2.5-struko, obično najmanje 5-struko, češće najmanje 10-struko, poželjno najmanje 20-struko, poželjnije najmanje 40-struko, i najpoželjnije preko 40-struko veća.

[0063]Ishodi aktivacije ili inhibicije mogu da se prate na sledeći način. Aktivacija, inhibicija ili odgovor na tretman, npr., ćelije, fiziološke tečnosti, tkiva, organa i životinjskog ili humanog subjekta mogu da se prate preko ishoda. Ishod može biti unapred određena količina ili procenat npr., indicije zapaljenja, onkogenosti ili ćelijske degranulacije ili sekrecije, kao što je oslobađanje citokina, toksičnog kiseonika ili proteaze. Ishod može uključivati, npr., unapred određenu količinu jonskog fluksa ili transporta; migraciju ćelija; adheziju ćelija; proliferaciju ćelija; potencijal za metastaziranje; diferencijaciju ćelije; i promenu fenotipa, npr., promenu ekspresije gena vezanih za zapaljenje, apoptozu, transformaciju, ćelijski ciklus ili metastazu (vidi, npr., Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood and Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins and Itzkovvitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady and Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).

[0064]Ishod inhibicije iznosi uopšteno 75% kontrole ili manje, poželjno 50% kontrole ili manje, poželjnije 25% kontrole ili manje, i najpoželjnije 10%) kontrole ili manje. Generalno, ishod aktivacije je najmanje 150% kontrole, poželjno najmanje dvostruka vrednost kontrole, poželjnije najmanje četvorostruka vrednost kontrole, i najpoželjnije najmanje 10-struka vrednost kontrole.

[0065]"Ligand" se odnosi, npr., na mali molekul, peptid, polipeptid i molekul udružen ili vezan za membranu, ili kompleks istog, koji može delovati kao agonist ili antagonist receptora. "Ligand" takođe obuhvata sredstvo koje nije agonist ili antagonist, ali koje može da se vezuje za receptor. Pored toga, "ligand" uključuje ligand vezan za membranu, koji je izmenjen, npr., hemijskim ili rekombinantnim metodima, u solubilnu verziju liganda vezanog za membranu. Prema dogovoru, kada je ligand vezan za membranu jedne ćelije, receptor se obično nalazi na dnigoj ćeliji. Draga ćelija može biti imati isti ili različiti identitet u odnosu na prvu ćeliju. Ligand ili receptor mogu biti u potpunosti unutar ćelije, to jest, mogu se nalaziti u citosolu, nukleusu ili nekom drugom unutarćelijskom kompartmentu. Ligand ili receptor mogu menjati svoju lokaciju, npr., mogu prelaziti iz unutarćelijskog kompartmenta na spoljašnju površinu ćelijske membrane. Kompleks liganda i receptora naziva se "kompleks ligand-receptor". Kada su ligand i receptor uključeni u signalne puteve, ligand se nalazi na ushodnoj poziciji i receptor se nalazi na nishodnoj poziciji signalnog puta.

[0066]"Mali molekuli" obezbeđeni su za tretman fiziologije i poremećaja dlakinog folikula. "Mali molekul" se definiše kao molekul sa molekulskom težinom manjom od 10 kD, tipično manjom od 2 kD, i poželjno manjom od 1 kD. Mali molekuli uključuju, ali se ne ograničavaju na neorganske molekule, organske molekule, organske molekule koji sadrže neorgansku komponentu, molekule koji sadrže radioaktivni atom, sintetske molekule, peptidne mimetike i mimetike antitela. Kao terapijsko sredstvo, mali molekul može lakše ulaziti u ćelije, biti manje podložan razlaganju i manje sklon izazivanju imunskog odgovora nego veći molekuli. Opisani su mali molekuli kao što su peptidni mimetici antitela i citokina, kao i mali molekuli toksina (vidi, npr., Casset, et al. (2003) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 307:198-205; Muvldermans (2001) J. Biotechnol.

74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos, et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini, et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues, et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato and Sone (2003) Biochem. J. 371:603-608; U.S. Patent No. 6,326,482 za Stewart, et al).

[0067]"Specifično" ili "selektivno" vezuje, kada se odnosi na ligand/receptor, antitelo/antigen, ili drugi vezujući par, označava reakciju vezivanja koja je determinativna za prisustvo proteina u heterogenoj populaciji proteina i drugih bioloških materija. Prema tome, pod određenim uslovima, specifikovani ligand vezuje se za određeni receptor i ne vezuje se u značajnoj količini za druge proteine prisutne u uzorku.

[0068]Antitelo ili vezujuća smeša izvedena iz antigen-vezujućeg mesta antitela razmatranog metoda, vezuje se za svoj antigen sa afinitetom koji je najmanje dva puta veći, poželjno najmanje deset puta veći, poželjnije najmanje 20 puta veći, i najpoželjnije najmanje 100 puta veći od afiniteta za nesrodne antigene. U poželjnoj formi, antitelo će imati afinitet koji je veći od oko IO<9>litara/mol, određeno, npr., Scatchard-ovom analizom (Munsen, et al. (1980) Analvt. Biochem. 107:220-239).

[0069]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "imunomodulatorno sredstvo" odnosi se na prirodna ili sintetska sredstva koja suprimiraju ili modulišu imunski odgovor. Imunski odgovor može biti humoralni ili ćelijski odgovor. Imunomodulatorna sredstva obuhvataju imunosupresivna ili antizapaljenska sredstva.

[0070]"Imunosupresivna sredstva", "imunosupresivni lekovi" ili "imunosupresivi", kako se koristi u ovom tekstu, predstavljaju terapijska sredstva koja se koriste u imunosupresivnoj terapiji za inhibiranje ili prevenciju aktivnosti imunskog sistema. Klinički, koriste se za prevenciju odbacivanja transplantiranih organs i tkiva (npr. kostna srž, srce, bubreg, jetra), i/ili za lečenje autoimunskih oboljenja ili oboljenja koja su najverovatnije autoimunskog porekla (npr. reumatoidni artritis, mijastenija gravis, sistemski eritemski lupus, ulcerativni kolitis, multipla skleroza). Imunosupresivni lekovi mogu da se svrstaju u četiri grupe: glukokortikoidi, citostatici; antitela (uključujući modifikatore biološkog odgovora ili DMARD); lekovi koji deluju na imunofiline; drugi lekovi uključujući poznata hemioterapijska sredstva koja se koriste za tretman proliferativnih poremećaja. Za multiplu sklerozu, posebno, antitela predmetnog pronalaska mogu da se primene zajedno sa novom klasom terapijskih sredstava sličnih proteinima, koja se vezuju za mijelin, poznatih kao kopaksoni.

[0071]"Antizapaljenska sredstva" ili "antizapaljenski lekovi", koristi se za predstavljanje steroidnih i nesteroidnih terapeutika. Steroidi, poznati i kao kortikosteroidi, su lekovi slični kortizolu, hormonu koji se prirodno proizvodi u nadbubrežnim žlezdama. Steroidi se koriste kao glavni tretman u određenim zapaljenskim stanjima kao što su: sistemski vaskulitis (zapaljenje krvnih sudova); i miozitis (zapaljenje mišića). Steroidi mogu da se koriste i selektivno za tretiranje zapaljenskih stanja kao što su: reumatoidni artritis (hronični zapaljenski artritis koji se javlja na zglobovima na obe strane tela); sistemski eritemski lupus (generalizovano oboljenje prouzrokovano nenormalnom funkcijom imunskog sistema); Sjogren-ov sindrom (hronični poremećaj koji prouzrokuje suvoću očiju i suvoću usta).

[0072]Nesteroidni antizapaljenski lekovi, obično skraćeno NSAID (non-steroidal anti-inflammatorv drugs) su lekovi sa analgetičkim, antipiretičkim i antizapaljenskim efektima - smanjuju bol, groznicu i zapaljenje. Izraz "nesteroidni" koristi se da bi se napravila razlika između ovih lekova i steroida koji (pored širokog spektra drugih efekata) imaju slično eikozanoid-snižavajuće, antizapaljensko dejstvo. NSAID su obično indikovani za ublažavanje simptoma u sledećim stanjima: reumatoidni artritis; osteoartritis; zapaljenske artropatije (npr. ankilozni spondilitis, psorijatički artritis, Reiter-ov sindrom); akutni giht; dismenoreja; metastatski bol u kostima; glavobolja i migrena; postoperativni bol; blagi do umereni bol usled zapaljenja i povrede tkiva; pireksija; i bubrežne kolike. NSAID uključuju salicilate, arilalkanoinske kiseline, 2-arilpropionske kiseline (profeni), N-arilantranilne kiseline (fenaminske kiseline), oksikame, koksibe i sulfonanilide.

II. Opšte

[0073]Predmetni pronalazak obezbeđuje inženjerisana anti-IL-23 antitela i njihove upotrebe za lečenje zapaljenskih, autoimunskih i proliferativnih poremećaja.

[0074]Brojni citokini imaju ulogu u patologiji ili repariranju neuroloških poremećaja.

IL-6, IL-17, interferon-gama (IFNgama) i faktor stimulacije kolonije granulocita (granulocvte colonv-stimulating factor, GM-CSF) udruženi su sa multiplom sklerozom (Matusevicius, et al. (1999) Multiple Sclerosis 5:101-104; Lock, et al. (2002) Nature Med. 8:500-508). IL-lalfa, IL-lbeta, i transformišući faktor rasta-beta 1 (transforming growth factor-beta 1, TGF-betal) imaju ulogu u ALS, Parkinson-ovoj bolesti i Alzheimer-ovoj bolesti (Hoozemans, et al. (2001) Exp. Gerontol. 36:559-570; Griflin and Mrak (2002) J. Leukocvte Biol. 72:233-238; Ilzecka, et al. (2002) Cytokine 20:239-243). Izgleda da TNF-alfa, IL-lbeta, IL-6, IL-8, interferon-gama (IFNgama) i IL-17 modulišu odgovor na ishemiju mozga (vidi, npr., Kostulas, et al. (1999) Stroke 30:2174-2179; Li, et al. (2001) J. Neuroimmunol. 116:5-14). Faktor rasta vaskularnih enđotelskih ćelija (vascular endothelial celi growth factor, VEGF) udružen je sa ALS (Cleveland and Rothstein (2001) Nature 2:806-819).

[0075]Zapaljenski poremećaji creva, npr., Crohn-ova bolest, ulcerativni kolitis, celijakija i sindrom iritabilnog kolona, posredovani su ćelijama imunskog sistema i citokinima. Na primer, Crohn-o va bolest je udružena sa povišenjem IL-12 i IFNy, dok je ulcerativni kolitis udružen sa povišenjem IL-5, IL-13 i transformišućeg faktora rasta-beta (TGFbeta). Ekspresija IL-17 takođe može da se poveća u Crohn-ovoj bolesti i ulcerativnom kolitisu (vidi, npr., Podolsky (2002) New Engl..1. Med. 347:417-429; Bouma and Strober (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:521-533; Bhan, et al. (1999) Immunol. Rev. 169:195-207; Hanauer (1996) New Engl. J. Med. 334:841-848; Green

(2003) The Lancet 362:383-391; McManus (2003) New Engl. J. Med. 348:2573-2574; Honvitz and Fisher (2001) Nevv Engl. J. Med. 344:1846-1850; Andoh, et al. (2002) Int. J. Mol. Med. 10:631-634; Nielsen, et al. (2003) Scand. J. Gastroenterol. 38:180-185; Fujino, et al. (2003) Gut 52:65-70).

[0076]Zapaljenska oboljenja kože, zglobova, CNS, kao i proliferativni poremećaji izazivaju slične imunske odgovore, tako da bi blokada IL-23 mogla da obezbedi inhibiciju ovih imunski posredovanih zapaljenskih poremećaja, bez ugrožavanja sposobnosti domaćina da se bori sa sistemskim infekcijama. Antagonizovanje IL-23 trebalo bi da ublaži zapaljenje udruženo sa zapaljenskom bolešću creva, Crohn-ovom bolešću, ulcerativnim kolitisom, reumatoidnim artritisom, psorijatičnim artritisom, psorijazom i atopijskim dermatitisom. Upotreba inhibitora IL-23 takođe će obezbediti inhibiciju proliferativnih poremećaja, npr., kancera i autoimunskih poremećaja npr., multiple skleroze, dijabetesa tipa I, i SLE. Opisi IL-23 u ovim različitim poremećajima mogli se naći u sledećim objavljenim PCT patentnim prijavama: WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; i WO 01/18051.

[0077]Podjedinica pl9 IL-23 član je porodice hematopoetskih citokina 'dugog lanca'

(Oppmannet al.(2000) gore) i sadrži 4 spakovane a-zavojnice označene kao A, B, C i D, sa topologijom gore-gore-dole-dole. Četiri zavojnice spojene su preko 3 polipeptidne petlje. Petlje A-B i C-D modelovane su tako da budu relativno duge jer povezuju paralalne zavojnice. Kratka B-C petlja povezuje antiparalelne B i C zavojnice. Podjedinica pl9 IL-23 je član IL-6 porodice zavojičastih citokina. Ova porodica citokina vezuje se za svoje poznate receptore preko tri konzervirana epitopa (mesto I, II i III; Bravo and Heath (2000) EMBO J. 19:2399-2411). Podjedinica pl9 interaguje sa tri podjedinice citokinskog receptora formirajući kompetentni signalni kompleks. Kada se eksprimira u ćeliji, podjedinica pl9 prvo formira kompleks sa podjedinicom p40 koja je zajednička sa IL-12. Kako je gore pomenuto, pl9p40 kompleks se sekretuje iz ćelije kao heterodimerni protein i naziva se IL-23 (vidi, npr., Oppmann et al., gore). Celijski receptorski kompleks potreban za transdukciju IL-23 signala sastoji se od dva člana dugih signalnih receptorskih podjedinica IL-6/IL-12 porodice citokina, IL-23-specifičnog IL-23R (vidi, npr., Parham et al. gore) i IL-12Rbl, koji deli sa IL-12.

[0078]Uvid u strukturnu osnovu prepoznavanja između citokina 'dugog lanca' i receptora, pokazao je da, iako su velike oblasti površine proteina "zaklonjene" pri formiranju kompleksa citokin-receptor, afinitet interakcije kontroliše nekoliko, obično blisko združenih aminokiselinskih rezidua koje formiraju energetsku 'vruću tačku' u centru vezujuće međupovršine. Identitet rezidua koje kontrolišu energiju vezivanja velike protein-protein međupovršine označen je kao 'funkcionalni epitop'. Afinitet interakcije (a time i biološka specifičnost) posledično je definisan stnikturnom komplementarnošću funkcionalnih epitopa liganda i receptora. Detaljne studije mutageneze pokazale su da su najznačajnije rezidue koje čine funkcionalne epitope citokina i receptora hidrofobni kontakti koji uključuju nepolarne bočne lance npr., triptofan, alifatične komponente nepolarnih bočnih lanaca ili polipeptidnu osovinu. Nepolarna 'srž' okružena je haloom polarnih rezidua manje značajnih za energiju vezivanja. Kinetičke studije ukazuju na to da je primarna uloga funkcionalnih epitopa da stabilizuju interakciju protein-protein, smanjivanjem stope disocijacije kompleksa. Sugerisano je da je inicijalni kontakt između citokina i receptora kontrolisan nasumičnom difuzijom ili 'kotrljanjem' proteinskih površina, što proizvodi mnogo nestabilnih kontakata. Kompleks se zatim stabiliše kada se uključe funkcionalni epitopi receptora i liganda (vidi, npr., Bravo and Heath, gore).

III. Stvaranje IL-23 specifičnih antitela

[0079] Može se koristiti svaki pogodan metod stvaranja monoklonskih antitela. Na primer, primalac može da se imunizuje sa spojenim ili nespojenim (npr., prirodnim) oblikom IL-23 heterodimera, ili njegovim fragmentom. Može se koristiti svaki pogodan metod imunizacije. Takvi metodi mogu uključivati adjuvanse, druge imunostimulanse, ponavljanu pojačavajuću imunizaciju ("booster") i korišćenje jednog ili više puteva imunizacije.

[0080] Svaki pogodan izvor IL-23 može se koristiti kao imunogen za stvaranje nehumanog antitela, specifičnog za pl9 podjedinicu, smeša i metoda objavljenih u ovom tekstu. Takvi oblici uključuju, ali se ne ograničavaju na celi protein, uključujući spojene i prirodne heterodimere, peptid(e) i epitope, stvorene rekombinantnim, sintetskim, hemijskim ili enzimsko-degradacionim načinima, poznatim u struci.

[0081] Za stvaranje antitela može se koristiti svaki oblik antigena koji je dovoljan za stvaranje biološki aktivnog antitela. Tako, izazivajući antigen može biti jedan epitop, više epitopa, ili čitav protein sam ili u kombinaciji sa jednim ili više sredstava za pojačavanje imunogensti, poznatih u struci. Izazivajući antigen može biti izolovani protein pune dužine, ćelijski površinski protein (npr., imunizovanje ćelijama koje su transfektovane bar delom antigena), ili solubilni protein (npr., imunizovanje samo sa vanćelijskim domenskim delom proteina). Antigen može da se proizvede u genetski modifikovanoj ćeliji. DNK koja kodira antigen može biti genomska ili negenomska (npr., cDNK) i kodira najmanje deo vanćelijskog domena. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "deo" odnosi se na minimalni broj amino-kiselina ili nukleinskih kiselina, kako je pogodno, da bi se konstituisao imunogeni epitop antigena od interesa. Može se upotrebiti svaki genski vektor pogodan za transformaciju ćelija od interesa, uključujući, ali ne ograničavajući se na adenovirusne vektore, plazmide i nevirusne vektore kao što su katjonski lipidi.

[0082]Za izazivanje antitela sa željenim biološkim osobinama inhibiranja IL-23, može se koristiti svaki pogodan metod. Poželjno je pripremiti monoklonska antitela (mAb) iz različitih sisarskih domaćina, kao što su miševi, glodari, primati, ljudi, itd. Opis tehnika pripremanja takvih monoklonskih antitela može se naći u npr., Stites, et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL MMUNOLOGY (4<th>ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, i tamo navedenim referencama; Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRTNCIPLES AND PRACTICE (2<nd>ed.) Academic Press, New York, NY. Prema tome, monoklonska antitela mogu se dobiti različitim tehnikama poznatim istraživačima stručnim u oblasti. Tipično, ćelije slezine životinje koja je imunizovana željenim antigenom se imortalizuju, obično fuzijom sa ćelijom mijeloma. Vidi Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Alternativni metodi imortalizacije uključuju transformaciju Epstein-Barr virusom, onkogenima ili retrovirusima, ili drugim metodima poznatim u struci. Vidi, npr., Doyle, et al. (eds. 1994 i perodične dopune) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wilev and Sons, New York, NY. Kolonije nastale od pojedinačnih imortalizovanih ćelija pretražuju se na proizvodnju antitela željene specifičnosti i afiniteta za antigen, a prinos monoklonskih antitela proizvedenih takvim ćelijama može da se poveća različitim tehnikama, uključujući injektiranje u peritonealnu šupljinu vertebratskog domaćina. Alternativno, DNK sekvence koje kodiraju monoklonsko antitelo ili njegov vezujući fragment mogu se izolovati pretraživanjem biblioteke DNK iz humanih B ćelija prema, npr., opšem protokolu koji su naveli Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281.

[0083]Druge pogodne tehnike uključuju selekciju biblioteka antitela u fagu ili sličnim vektorima. Vidi, npr., Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); i Ward et al., Nature 341:544-546 (1989). Polipeptidi i antitela predmetnog pronalaska mogu da se koriste sa modifikacijama ili bez njih, uključujući himerna ili humanizovana antitela. Cesto, polipeptidi i antitela obeležiće se kovalentnim ili nekovalentnim spajanjem sa supstancama koje daju detektabilni signal. Poznat je veliki broj različitih obeleživača i tehnika konjugacije i u naučnoj i patentnoj literaturi postoje obimna saopštenja o njima. Pogodni obeleživači uključuju radionuklide, enzime, supstrate, kofaktore, inhibitore, fluorescentne komponente, hemiluminiscentne komponente, magnetne čestice i slično.

Patenti u kojima su data uputstva o upotrebi takvih obeleživača uključuju U.S. Patent

No. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; i 4,366,241. Isto tako, mogu se proizvesti rekombinantni imunoglobulini, vidi Cabillv U.S. Patent No. 4,816,567; i Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; ili se napravitti u transgenim miševima, vidi Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; takođe vidi tehnologije Abgenix i Medarex.

[0084]Antitela ili vezujuće smeše protiv predetenninisanih fragmenata IL-23, mogu da se naprave tako što se životinje imunizuju konjugatima polipeptida, fragmenata, peptida ili epitopa sa nosačkim proteinima. Monoklonska antitela pripremaju se korišćenjem ćelija koje sekretuju željeno antitelo. Ova antitela mogu da se pretražuju da bi se ustanovilo da li se vezuju za normalni ili defektni IL-23. Ova monoklonska antitela obično će se vezivati sa Kdkoja iznosi najmanje oko 1 uM, češće najmanje oko 300 nM, tipično najmanje oko 30 nM, poželjno najmanje oko 10 nM, poželjnije najmanje oko 3 nM ili bolje od toga, što se obično određuje pomoću ELISA. Pogodna nehumana antitela mogu da se identifikuju korišćenjem bioloških testova opisanih u Primeru 6, dole.

IV. Humanizacija IL-23 specifičnih antitela

[0085]Svako pogodno nehumano antitelo može da se koristi kao izvor hipervarijabilnog regiona. Izvori nehumanih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na miša, lagomorfe (uključujući zečeve), goveda i primate. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (recipijentno antitelo) u kojima su rezidue hipervarijabilnog regiona recipijenta zamenjene reziduama hipervarijabilnog regiona nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec ili nehumani primat, sa željenom specifičnošću, afinitetom i kapacitetom. U nekim slučajevima, rezidue okvirnog regiona (FR) Fv humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim nehumanim reziduama. Pored toga, humanizovana antitela mogu sadržati rezidue koje se ne nalaze u recipijentnom antitelu ili u donorskom antitelu. Ove modifikacije se prave da bi se dodatno poboljšale karakteristike željene biološke aktivnosti. Za dodatne pojedinosti vidi Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Reichmann et al. (1988) Nature 332:323-329; i Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

[0086]Metodi rekombinantnog inženjerisanja antitela opisani su npr., u Boss et al.

(U.S. Pat. No. 4,816,397), Cabilly et al. (U.S. Pat. No. 4,816,567), Law et al. (European

Patent Application Publication No. 438 310) i Winter (European Patent Application PublicationNo. 239400).

[0087]Varijante aminokiselinske sekvence humanizovanog anti-IL-23 antitela pripremaju se uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih zamena u DNK za humanizovano anti-IL-23 antitelo, ili peptidnom sintezom. Takve varijante uključuju, na primer, delecije i/ili insercije i/ili supstitucije rezidua unutar aminokiselinskih sekvenci pokazanih za humanizovano anti-IL-23 F(ab) (npr., kao u SEQ ID NO: 1 i 2). Svaka kombinacija delecije, insercije i supstitucije pravi se da bi se našla u konačnom konstruktu, uz uslov da finalni konstrukt poseduje željene karakteristike. Promene amino-kiselina mogu izmeniti i posttranslacione procese na humanizovanom anti-IL-23 antitelu, na primer izmeniti broj ili položaje mesta glikozilacije.

[0088]Metod koristan za identifikovanje određenih rezidua ili regiona polipeptida humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela, koji predstavljaju poželjna mesta mutageneze naziva se "alanin-skenirajuća mutageneza", kako je opisano u Cunningham and Wells

(1989) Science 244: 1081-1085. Ovde, izvrši se identifikovanje rezidue ili grupe ciljnih rezidua (npr., naelektrisane rezidue kao Arg, Asp, His, Lys, i Glu) i one se zamene neutralnim ili negativno naelektrisanim amino-kiselinama (najpoželjnije alanin ili polialanin), da bi se uticalo na interakciju amino-kiselina sa IL-23 antigenom. Zatim se aminokiselinske rezidue koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije finije određuju uvođenjem dodatnih ili drugih varijanti na mestima supstitucije. Prema tome, dok je mesto uvođenja varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, priroda mutacijeper sene mora biti unapred određena. Na primer, da bi se analizirala karakteristika mutacije na datom mestu, na ciljnom kodonu ili regionu sprovodi se Ala skeniranje ili nasumična mutageneza i eksprimirane varijante humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela se pretražuju u pogledu željene aktivnosti.

[0089]Insercije u aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije koje se kreću od jedne rezidue do polipeptida koji sadrži sto ili više rezidua, kao i unutarsekvencione insercije jedne ili većeg broja aminokiselinskih rezidua. Primeri terminalnih insercija uključuju humanizovano anti-IL-23 antitelo sa N-terminalnom metionil reziduom ili antitelo fuzionisano sa epitopskim markeom. Druge insercione varijante molekula humanizovanog anti-IL-23 antitela uključuju fuziju, za N- ili C-terminus humanizovanog anti-IL-23 antitela, enzima ili polipeptida koji povećava poluživot antitela u serumu.

[0090]Drugi tip varijante je aminokiselinska supstituciona varijanta. Kod ovih varijanti, najmanje jedna aminokiselinska rezidua u molekulu humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela je uklonjenu i na njeno mesto je insertovana različita rezidua. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne petlje, ali razmatraju se i FR alteracije. Rezidue hipervarijabilnog regiona ili FR rezidue uključene uvezivanje sa antigenom obično se supstituišu na relativno konzervativan način.

[0091]Sledeći tip aminokiselinske varijante antitela menjaju originalni obrazac glikozilacije antitela. Pod menjanjem misli se na uklanjanje jedne ili više ugljenohidratnih komponenti koje se nalaze na antitelu i/ili dodavanje jednog ili više glikozilacionih mesta koja nisu prisutna na antitelu. Glikozilacija antitela se tipično obavlja ili preko N ili preko O. N-glikozilacija odnosi se na prikačinjanje ugljenohidratne komponente za bočni lanac asparaginske rezidue. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja amino-kiselina izuzev prolina, su prepoznavajuće sekvence za enzimsko prikačinjanje ugljenohidratne komponente za bočni lanac asparagina. Prema tome, prisustvo jedne od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-glikozilacija odnosi se na prikačinjanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze za hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, mada mogu da se koriste i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0092]Dodavanje glikozilacionih mesta na antitelu se pogodno obavlja izmenom aminokiselinske sekvence tako da ona sadrži jednu ili više od gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-glikozilaciona mesta). Promene mogu da se naprave i dodavanjem ili supstitucijom jedne ili više serinskih ili treoninskih rezidua u sekvenci originalnog antitela (za O-glikozilaciona mesta).

[0093]Još jedan tip aminokiselinske varijante je supstitucija rezidua da bi se obezbedila veća hemijska stabilnost finalnog humanizovanog antitela. Na primer, može se zameniti asparaginska (N) rezidua da bi se smanjio potencijal za formiranje izoaspartata, na bilo kojoj od NG sekvenci unutar CDR glodara. U jednoj formi, asparagin se menja u glutamin (Q). Formiranje izoaspartata može negativno da utiče ili da potpuno onemogući vezivanje antitela za njegov ciljni antigen. Presta (2005) J. Allergv Clin. Immunol. 116:731 na 734. Pored toga, mogu se zameniti metioninske rezidue u CDR glodara, da bi se smanjila mogućnost da se sumpor metionina oksidiše, što može da smanji afinitet vezivanja sa antigenom, kao i da doprinese molekularnoj heterogenosti u finalnom preparatu antitela. Gore navedeni izvor. U jednoj formi, metionin se zamenjuje alaninom (A). Antitela sa takvim supstitucijama se zatim pretražuju da bi se osiguralo da supstitucije ne smanjuju afinitet vezivanja za IL-23pl9 do neprihvatljivih nivoa.

[0094]Molekuli nukleinskih kiselina, koji kodiraju varijante aminokiselinskih sekvenci humanizovanog IL-23-specifičnog antitela pripremaju se različitim metodima poznatim u struci. Ovi metodi uključuju, ali se ne ograničavaju na izolovanje iz prirodnih izvora (u slučaju prirodnih varijanti aminokiselinskih sekvenci) ili pripremanje putem oligonukleotidima posredovane (ili usmerene) mutageneze, PCR mutageneze i kasetne mutageneze ranije pripremljene varijantne ili nevarijantne verzije humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela.

[0095]Uobičajeno, varijante aminokiselinske sekvence humanizovanog anti-IL-23 antitela imaće sekvencu amino-kiselina sa najmanje 75% identičnosti aminokiselinske sekvence u odnosu na originalne aminokiselinske sekvence teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%>, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95%. Identičnost ili homologija u odnosu na ovu sekvencu, ovde se definiše kao procenat aminokiselinskih rezidua u kandidatskoj sekvenci, koje su identične sa humanizovanim anti-IL-23 reziduama, posle poravnavanja sekvenci i uvođenja procepa, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalan procenat sekvencione identičnosti i konzervativne supstitucije se ne razmatraju kao deo sekvencione identičnosti. Nijednu od N-terminalnih, C-terminalnih, ili unutrašnjih ekstenzija, delecija ili insercija u sekvenci antitela ne treba tumačiti kao da utiču na sekvencionu identičnost ili homologiju.

[0096]Humanizovano antitelo može da se bira iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA, i IgE. Poželjno, antitelo je IgG antitelo. Može se koristiti svaki izotip IgG, uključujući IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4. Varijante IgG izotipova takođe se razmatraju. Humanizovano antitelo može sadržati sekvence iz više od jedne klase ili izotipa. Optimizacija neophodnih sekvenci konstantnog domena, da bi se ostvarila željena biološka aktivnost, lako se postiže pretraživanjem antitela u dole opisanim biološkim testovima.

[0097]Slično tome, u smešama i metodima ovog teksta može da se koristi bilo koja od klasa lakog lanca. Specifično, za predmetne smeše i metode korisne su kapa, lambda, ili njihove varijante.

[0098]Može se koristiti svaki pogodan deo CDR sekvenci iz nehumanog antitela. CDR sekvence mogu da se mutagenizuju supstitucijom, insercijom ili delecijom najmanje jedne rezidue, tako da CDR sekvenca bude različita od upotrebljene sekvence humanog i nehumanog antitela. Smatra se da bi takve mutacije trebalo da budu minimalne. Tipično, najmanje 75% rezidua humanizovanog antitela odgovaraće onima iz nehumanih CDR rezidua, češće 90%, i najpoželjnije više od 95%.

[0099]Može se koristiti svaki pogodan deo FR sekvenci iz humanog antitela. FR sekvence mogu da se mutagenizuju supstitucijom, insercijom ili delecijom najmanje jedne rezidue tako da FR sekvenca bude različita od upotrebljene sekvence humanog i nehumanog antitela. Smatra se da bi takve mutacije trebalo da budu minimalne. Tipično, najmanje 75% rezidua humanizovanog antitela odgovaraće onima iz humanih FR rezidua, češće 90%), i najpoželjnije više od 95%.

[0100]CDR i FR rezidue određuju se prema standardnoj Kabat-ovoj definiciji sekvence. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987). SEQ ID NO: 5-16 i 31-48 prikazuju sekvence varijabilnog domena teškog lanca različitih mišjih anti-humanih IL-23pl9 antitela, a SEQ ID NO: 17-28 i 49-65 prikazuju sekvence varijabilnog domena lakog lanca. SEQ ID NO: 66-68 su konsenzusne sekvence teškolančanih CDR (CDRH1, CDRH2 i CDRH3), i sastoje se od najčešćih aminokiselinskih rezidua na svakoj poziciji teškolančanih CDR, za porodicu antitela koja se sastoji od 7G10, 6H12, 13F11, 13B5, 7E2, 13G1, 11C10, 1E10, 30F11, 34E4, 5B12, 6H4, 9C9, UBIO, 30E1, 33D2, 20A9, 22E9, 29D5, 21A10 i 33B12. SL, 1A-1C prikazuju sastav sekvenci teških lanaca različitih antitela predmetnog pronalaska.

[0101]Kao što je pokazano na SL. 2A-2C, CDR lakog lanca antitela predmetnog pronalaska objavljenog u ovom tekstu grupisani su u tri potporodice, označene kao (a), (b) i (c). Potporodica lakih lanaca (a) sastoji se od antitela 7G10, 6H12, 13F11, 13B5, 7E2, 13G1, 11C10, 30F11, 34E4, 6H4, 33D2 i 33B12. Potporodica lakih lanaca (b) sastoji se od antitela 1E10, 20A9, 22E9, 29D5, 5B12, 9C9 i UBIO. Potporodica lakih lanaca (c) sastoji se od antitela 10H11, 19E9, 10G8, 39G2, 35F12, 49A10, 34F9 i 7D7. Ove potporodice lakih lanaca upotrebljene su za izvođenje konsenzusnih CDR sekvenci CDRLl(a), CDRLl(b) i CDRLl(c) (SEQ ID NO: 69-71) i odgovarajućih konsenzusnih sekvenci CDRL2 (SEQ ID NO: 72-74) i CDRL3 (SEQ ID NO: 75-77), za svaku potporodicu. Konsenzusne sekvence za CDR lakog lanca sastoje se od najčešćih aminokiselinskih rezidua na svakoj poziciji lakolančanih CDR, za svaku potporodicu antitela.

[0102]Tabele 2 i 3 definišu različite domene humanizovanih anti-IL-23pl9 antitela 6H12, 7G10, 10H11 i 22E9, kao i varijabilne domene lakog i teškog lanca nekoliko mišjih antitela predmetnog pronalaska. Rezidue 1-19 SEQ ID NO: 1-4 predstavljaju signalne sekvence za teške i lake lance hum6H12 i hum7G10. Konstantni domeni lakog lanca hum6H12 i hum7G10 su na reziduama 130-233 SEQ ID NO: 2 i 4, respektivno. Konstantni domeni teškog lanca hum6H12 i hum 7G10 su na reziduama 135-464 SEQ ID NO: 1 i 3, respektivno, sa CH1 na reziduama 135-242, CH2+zglob na reziduama 243-357 i CH3 na reziduama 358-464. Sva druga antitela predstavljena su kao varijabilni regioni lakog i teškog lanca (Vli Vh), i prema tome nemaju signalne sekvence i konstantne domene.

[0103] U jednoj formi, antitela predmetne objave ili njihovi vezujući fragmenti sadrže CDR koji uključuju jednu od nekoliko varijabilnih amino-kiselina na određenim pozicijama. U jednoj formi antitela predmetne objave ili njihovi vezujući fragmenti, sadrže "CDR varijabilne" domene navedne kao SEQ ID NO: 78-89. Ove "CDR varijabilne" sekvence uključuju konsenzusnu sekvencu svake porodice srodnih antitela kao i varijabilne pozicije koje obuhvataju sve zapažene sekvencione varijante unutar te porodice. Takve sekvencione varijante prikazane su na SL. 1A-1C i 2A-2C.

[0104] Varijabilne amino-kiseline u potencijalnim CDR mogu da se biraju između onih amino-kiselina koje se pojavljuju dva ili više puta u ovde pomenutim porodicama. Ova antitela su podgrupa gore opisanih "CDR varijabilnih" antitela u kojima amino-kiseline koje se pojavljuju samo jednom na datoj poziciji u CDR u datoj porodici sekvenci, nisu uključene u pul potencijalnih CDR. Ove aminokiselinske supstitucije "koje se jednom sreću" lako se određuju i tako isključuju iz "CDR varijabilnih" sekvenci, jednostavnim pregledanjem SL. 1A-1C i 2A-2C. Ovaj suženi opseg potencijalnih CDR sekvenci označen je ovde kao "varijabilni CDR sa višestrukim pojavljivanjem". Ovakva nomenklatura upotrebljena je u ovom tekstu zbog jednostavnijeg označavanja ove podgrupe "CDR varijabilnih" sekvenci.

[0105] Alternativno, potencijalni CDR nisu ograničeni na "CDR varijabilne" sekvence opisane gore, nego uključuju i konzervativno mođifikovane varijante svake zapažene amino-kiseline, kako je određeno korišćenjem podataka iz Tabele 1.

[0106]Potencijalni CDR mogu uključivati varijante svake pojedinačne CDR sekvence objavljene u ovom tekstu, uključujući konsenzusne sekvence SEQ ID NO: 66-77, u kojima varijante sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na objavljenu sekvencu, kako je određeno korišćenjem podataka iz Tabele 1.

[0107]Razmatraju se i himerna antitela. Kako je gore napomenuto, tipična himema antitela sadrže deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela izvedenih iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca/lanaca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz dnige vrste ili koje pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (U.S. Pat. No. 4,816,567; i Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

[0108]Bispecifična antitela takođe su korisna u predmetnim metodima i smešama. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "bispecifično antitelo" odnosi se na antitelo, tipično monoklonsko antitelo, sa specifičnostima vezivanja za najmanje dva različita antigenska epitopa, npr., IL-23pl9 i IL-23p40. U jednoj formi, epitopi su sa istog antigena. U drugoj formi, epitopi su sa dva različita antigena. Metodi spravljanja bispecifičnih antitela poznati su u struci. Na primer, bispecifična antitela mogu da se proizvedu rekombinantno korišćenjem koekspresije dva imunoglobulinska para teški lanac/laki lanac. Vidi, npr., Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39. Alternativno, bispecifična antitela mogu da se pripreme korišćenjem hemijskog povezivanja. Vidi, npr., Brennan, et al. (1985) Science 229: 81. Bispecifična antitela uključuju fragmente bispecifičnih antitela. Vidi, npr., Hollinger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48, Gruber,et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

[0109]U još jednoj formi, različiti konstantni domeni mogu da se dodaju ovde datim humanizovanim Vli Vh regionima. Na primer, ako određena nameravana upotreba antitela (ili fragmenta) predmetnog pronalaska zahteva promenu efektorskih funkcija, može se koristiti konstantni domen teškog lanca različitog od IgGl. Iako IgGl antitela obezbeđuju dug poluživot i efektorske funkcije, kao što su aktivacija komplementa i ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela, takve aktivnosti ne moraju biti poželjne u svim upotrebama antitela. U takvim slučajevima može se koristiti konstantni domen IgG4, na primer.

V. Biološka aktivnost humanizovanog anti-IL-23

[0110]Antitela sa karakteristikama koje su ovde navedene kao poželjne za humanizovano anti-IL-23 antitelo, mogu da se pretražuju u pogledu svoje inhibitorne biološke aktivnostiin vitroili pogodnog afiniteta vezivanja. Da bi se pronašla antitela koja se vezuju za epitop na humanom IL-23 (tj. podjedinici pl9) vezanom sa antitelom od interesa (npr., ono koje blokira da se citokin veže za svoj receptor), može se obaviti rutinski test unakrsnog blokiranja kao što je onaj opisan u ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratorv, Ed Harlovv and David Lane (1988). U takvim testovima, antitela koja se vezuju za isti epitop verovatno će izvršiti unakrsno blokiranje, ali neće sva unakrsno blokirajuća antitela obavezno da se vežu za potpuno isti epitop jer unakrsno blokiranje može biti rezultat steričkog ometanja vezivanja antitela antitelima koja su se vezala za obližnje, ako ne i preklapajuće epitope.

[0111]Alternativno, može da se obavi mapiranje epitopa npr., kako je opisano u Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, da bi se odredilo da li se antitelo vezuje za epitop od interesa. "Alanin-skenirajuća mutageneza", kako je opisano u Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085, ili neki drigi vid tačkaste mutageneze aminokiselinskih rezidua na humanom IL-23 takođe se mogu koristiti da bi se odredio funkcionalni epitop za anti-IL-23 antitelo predmetnog pronalaska. Studije mutageneze, međutim, mogu takođe da otkriju aminokiselinske rezidue koje su ključne za ukupnu trodimenzionalnu strukturu IL-23, ali koje nisu direktno uključene u kontakte antitela i antigena, pa tako mogu biti potrebni drugi metodi da bi se potvrdio funkcionalni epitop određen ovim metodom.

[0112]Epitop za koji se vezuje specifično antitelo može da se odredi i procenom vezivanja antitela za peptide koji sadrže fragmente humanog IL-23pl9 (SEQ ID NO: 39). Može se sintetisati niz preklapajućih peptida kojima je obuhvaćena sekvenca IL-23pl9 i vršiti njihovo pretraživanje u pogledu vezivanja, npr., direktnim ELISA, kompetitivnim ELISA (gde se procenjuje sposobnost peptida da spreči vezivanje antitela za IL-23pl9 vezan za bunarčić mikrotitarske ploče), ili na čipu. Može se pokazati da takvi metodi nisu dovoljni za otkrivanje nekih diskontinuiranih funkcionalnih epitopa, tj. funkcionalnih epitopa koji uključuju aminokiselinske rezidue koje se ne pružaju u kontinuitetu duž primarne sekvence IL-23pl9 polipeptidnog lanca.

[0113]Epitop za koji se vezuju antitela predmetnog pronalaska može da se odredi i strukturnim metodima kao što su određivanje kristalne strukture pomoću X-zraka (npr., WO2005/044853), molekularno modeliranje i nuklearna magnetno-rezonantna (nuclear magnetic resonance, NMR) spektroskopija, uključujući NMR određivanje H-D stopa razmene labilnih amidnih vodonika u IL-23 kada je slobodan i kada je vezan u kompleksu sa antitelom od interesa (Zinn-Justin et al.(1992) Biochemistrv 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistrv 32, 6884-6891).

[0114]U vezi sa kristalografijom X-zracima, kristalizacija može da se obavi korišćenjem bilo kojeg metoda poznatog u struci (npr. Giege et al. (1994) Acta Crvstallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23), uključujući mikroserijsku kristalizaciju (npr. Chaven (1997) Structure 5:1269-1274), difuziju pare uz korišćenje viseće kapi (npr. McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300 -6303), zasejavanje i dijalizu. Poželjno je koristiti proteinski preparat čija koncentracija iznosi najmanje oko 1 mg/ml i poželjno oko 10 mg</>ml do oko 20 mg/ml. Kristalizacija se postiže najbolje u precipitantnom rastvoru koji sadrži polietilenglikol 1 000-20 000 (PEG; prosečna molekulska težina u opsegu od oko 1 000 do oko 20 000 Da), poželjno oko 5 000 do oko 7 000 Da, poželjnije oko 6 000 Da, sa koncentracijama u opsegu od oko 10% do oko 30%) (tež/zapr., w/v). Može biti poželjno i uključivanje sredstva za stabilisanje proteina, npr., glicerola, u koncentraciji u opsegu od oko 0.5% do oko 20%. U precipitantnom rastvoru može biti poželjno i prisustvo pogodne soli, kao što su natrijum hlorid, litijum hlorid ili natrijum citrat, poželjno u koncentraciji u opsegu od oko 1 mM do oko 1000 mM. Precipitant je poželjno puferisan na pH od oko 3.0 do oko 5.0, poželjno oko 4.0. Specifični puferi korisni za precipitantni rastvor mogu varirati i dobro su poznati u struci (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York). Primeri korisnih pufera ukjučuju, ali se ne ograničavaju na HEPES, Tris, MES i acetatni pufer. Kristali mogu rasti na temperaturama u širokom opsegu, uključujući 2 °C, 4 °C, 8 °C i 26 °C.

[0115]Kristali antitelo:antigen mogu da se izučavaju pomoću dobro poznatih tehnika difrakcije X-zraka, potpomognutih korišćenjem kompjuterskog softvera kao što je X-PLOR (Yale Universitv, 1992, distributer Molecular Simulations, Inc.; vidi, npr. Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzvmol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; U.S. Patent Application Publication No. 2004/0014194), i BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzvmol. 276A:361-423, Čarter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323).

[0116]Dodatna antitela koja se vezuju za isti epitop kao antitelo predmetnog pronalaska mogu se dobiti, na primer, pretraživanjem antitela proizvedenih u odgovoru na IL-23 u odnosu na vezivanje za epitop, ili imunizovanjem životinje peptidom koji sadrži fragment humanog IL-23 sa epitopskom sekvencom. Može se očekivati da antitela koja se vezuju za isti funkcionalni epitop ispoljavaju slične biološke aktivnosti, kao što je blokiranje vezivanja za receptor, i takve aktivnosti mogu biti potvrđene funkcionalnim testovima antitela.

[0117]Afiniteti antitela (npr., prema humanom IL-23) mogu se odrediti korišćenjem standardne analize. Poželjna humanizovana antitela su ona koja se vezuju za humani IL-23pl9 sa vrednošću KD ne većom od oko lxl0"<7>; poželjno ne većom od oko lxl0"<s>; poželjnije ne većom od oko 1x10"<9>; i najpoželjnije ne većom od oko 2x10"<10>.

[0118]Antitela i njihovi fragmenti korisni u predmetnim smešama i metodima su biološki aktivna antitela i fragmenti. Kako se koristi u ovom tekstu, "biološki aktivan" odnosi se na antitelo ili fragment antitela, sposoban da se veže sa željenim antigenskim epitopom i direktno ili indirektno ostvari biološki efekat. Tipično, ovi efekti su rezultat nemogućnosti da se IL-23 veže za svoj receptor. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "specifično" odnosi se na selektivno vezivanje antitela za ciljni antigenski epitop. Specifičnost vezivanja antitela može da se testira upoređivanjem vezivanja za IL-23 sa vezivanjem za irelevantni antigen ili mešavinu antigena, pod datim uslovima. Ako se antitelo vezuje za IL-23 najmanje 10, a poželjno 50 puta više nego za irelevantni antigen ili mešavinu antigena, onda se smatra da je ono specifično. Antitelo koje se "specifično vezuje" za IL-23 ne vezuje se sa proteinima koji ne sadrže sekvence poreklom iz IL-23, tj., "specifičnost", kako se ovde koristi, odnosi se na specifičnost prema IL-23 i ni prema jednoj drugoj sekvenci koja može biti prisutna u proteinu o kojem je reč. Na primer, kako se ovde koristi, antitelo koje se "specifično vezuje" za IL-23 tipično će se vezivati za FLAG-hIL-23 koji je fuzioni protein koji sadrži IL-23 i FLAG'<8>' peptidni marker, ali se neće vezivati za sam FLAG<®>peptidni marker ili kada je on fuzionisan sa proteinom različitim od IL-23.

[0119]Jedinjenja predmetne objave koja se specifično vezuju za IL-23, kao što su inhibitorna IL-23pl9-specifična antitela pronalaska, mogu da inhibiraju njegovu biološku aktivnost na bilo koji način uključujući, ali ne ograničavajući se na proizvodnju IL-ip i TNF peritonealnim makrofagima i IL-17 TH17 T ćelijama (vidi Langrish et al. (2004) Immunol. Rev. 202:96-105). Anti-IL-23pl9 antitela biće sposobna i da inhibiraju gensku ekspresiju IL-17A, IL-17F, CCL7, CCL17, CCL20, CCL22, CCR1 i GM-CSF (vidi Langrish et al. (2005) .1. Exp. Med. 201:233-240). Jedinjenja predmetne objave koja se specifično vezuju za IL-23, kao anti-IL-23pl9 antitela pronalaska, blokiraće i sposobnost IL-23 da pojača proliferaciju ili preživaliavanje Th17 ćelija. Cua and Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559. Inhibitorna aktivnost inženjerisanog anti-IL-23pl9 biće korisna u lečenju zapaljenskih, autoimunskih i proliferativnih poremećaja. Takvi poremećaji opisani su u objavljenim PCT patentnim prijavama WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; i WO 01/18051.

VI. Farmaceutske smeše

[0120]Za pripremanje farmaceutskih ili sterilnih smeša koje sadrže agonist ili antagonist IL-23, citokinskog analoga ili muteina, odgovarajuće antitelo ili njegova nukleinska kiselina pomešaju se sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijentom, vidi, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formularv, Mack Publishing Companv, Easton, PA (1984).

[0121]Formulacije terapijskih ili dijagnostičkih sredstava mogu da se pripreme mešanjem sa fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijentima, ili stabilizerima, u vidu npr., liofilizovanih praškova, gustih suspenzija, vodenih rastvora ili suspenzija (vidi, npr., Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacv, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Svstems, Marcel Dekker, NY; VVeiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).

[0122]Toksičnost i farmaceutska efikasnost smeša antitela, primenjenih samih ili u kombinaciji sa imunosupresivnim sredstvom, mogu se odrediti standardnim farmaceutskim postupcima, uz korišćenje ćelijskih kultura ili eksperimentalnih životinja, npr., za određivanje LD50(doze koja je letalna za 50% populacije) i ED50(doze koja je terapijski efikasna za 50% populacije). Odnos doze sa toksičnim i doze sa terapijskim efektom je terapijski indeks i može se izraziti kao odnos između LD5oi ED5o. Poželjna su antitela koja pokazuju visoke terapijske indekse. Podaci dobijeni iz ovih testova na kulturama ćelija i studija na životinjama mogu da se koriste za formulisanje opsega doza koje će se koristiti kod ljudi. Doziranje takvih jedinjenja biće poželjno u opsegu koncentracija u cirkulaciji koje uključuju ED50, uz malo ili nimalo toksičnosti. Doza može varirati unutar ovog opsega, zavisno od upotrebljne dozne forme i puta primene.

[0123]Način primene nije od posebne važnosti. Pogodni putevi primene mogu, na primer, uključivati oralnu, rektalnu, transmukoznu ili intestinalnu primenu; parenteralnu dostavu, uključujući intramuskularno, subkutano, intramedularno injektiranje kao i intratekalne, direktne intraventrikularne, intravenske, intraperitonealne, intranazalne ili intraokularne injekcije. Primena antitela upotrebljenih u farmaceutskoj smeši ili u izvođenju metoda predmetnog pronalaska može da se obavi različitim konvencionalnim načinima, kao što su oralna ingestija, inhalacija, površinsko nanošenje ili kutana, subkutana, intraperitonealna, parenteralna, intraarterijska ili intravenska injekcija. Poželjna je intravenska primena kod pacijenta.

[0124]Alternativno, umesto sistemskim putem, antitelo se može primeniti lokalno, na primer injektiranjem antitela direktno u zglob zahvaćen artritisom ili u leziju indukovanu patogenom, koja se odlikuje imunopatologijom, često u vidu depoa ili formulacije sa produženim oslobađanjem. Pored toga, antitelo se može primeniti u okviru sistema sa ciljanom dostavom, na primer, u vidu lipozoma obloženog tkivno-specifičnim antitelom, koje cilja, na primer, zglob zahvaćen artritisom ili leziju indukovanu patogenom, koja se odlikuje imunopatologijom. Lipozomi će biti usmereni ka obolelom tkivu i selektivno preuzeti u njemu.

[0125]Izbor režima primene terapijskog sredstva zavisi od nekoliko faktora, uključujući stopu razgradnje entiteta u serumu ili tkivu, nivo simptoma, imunogenost entiteta i mogućnost pristupa ciljnim ćelijama u biološkom matriksu. Poželjno, režim primene podrazumeva maksimalnu količinu terapijskog sredstva dostavljenog pacijentu spojivu sa prihvatljivim nivoom sporednih efekata. Prema tome, količina dostavljenog biološkog sredstva zavisi delom od određenog entiteta i jačine stanja koje se leči. Na raspolaganju su uputstva o izboru doza antitela, citokina i malih molekula (vidi, npr., Wawrzynczak (1996) Antibodv Therapv, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodi.es, Cvtokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapv in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipskv, et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).

[0126]Pogodnu dozu određuje kliničar, npr., koristeći parametre ili faktore za koje se u struci zna ili veruje da utiču na lečenje, ili za koje se pretpostavlja da utiču na lečenje. Uopšteno, početna doza predstavljena je količinom nešto manjom od optimalne, koja se zatim povećava u malim koracima, do dostizanja željenog efekta, optimalnog u odnosu na bilo kakve negativne sporedne efekte. Važne dijagnostičke mere uključuju one koje su vezane za simptome, npr., zapaljenje ili nivo proizvedenih zapaljenskih citokina. Poželjno, biološko sredstvo koje će se koristiti izvedeno je iz iste vrste kojoj pripada životinja koja se leči, čime se na najmanju moguću meru svodi zapaljenski, autoimunski ili proliferativni odgovor na reagens.

[0127]Antitela, fragmenti antitela i citokini mogu da se daju kontinuiranom infuzijom, ili doziranjem u intervalima od, npr., jednog dana, jedne nedelje, ili 1-7 puta nedeljno. Doze mogu da se daju intravenski, subkutano, površinski, oralno, nazalno, rektalno, intramuskulamo, intracerebralno, intraspinalno ili inhalacijom. Poželjni dozni protokol je onaj koji uključuje maksimalnu dozu ili učestalost doziranja, kojima se izbegavaju značajni neželjeni sporedni efekti. Ukupna nedeljna doza uopšteno iznosi najmanje 0.05 ug/kg telesne težine, uopštenije najmanje 0.2 ug/kg, najuopštenije najmanje 0.5 ug/kg, tipično najmanje 1 ug/kg, tipičnije najmanje 10 ug/kg, najtipičnije najmanje 100 ug/kg, poželjno najmanje 0.2 mg/kg, poželjnije najmanje 1.0 mg/kg, najpoželjnije najmanje 2.0 mg/kg, optimalno najmanje 10 mg/kg, optimalnije najmanje 25 mg/kg i najoptimalnije najmanje 50 mg/kg (vidi, npr., Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144). Željena doza terapeutika sa malim molekulima npr., peptidnih mimetika, prirodnih proizvoda ili organskih hemijskih sredstava, otprilike je ista kao doza antitela ili polipeptida, na bazi molova/kg.

[0128]Kako se koriste u ovom tekstu, "inhibira" ili "tretira" ili "tretman", uključuju odlaganje razvoja simptoma udruženih sa autoimunskom bolešću ili imunopatologijom indukovanom patogenom i/ili smanjenje jačine takvih simptoma koji će se razviti ili za koje se očekuje da će se razviti. Izrazi uključuju još i ublažavanje postojećih nekontrolisanih ili neželjenih, sa autoimunošću povezanih ili patogenom indukovanih, imunopatoloških simptoma, preveniranje dodatnih simptoma i ublažavanje ili preveniranje uzroka koji su u osnovi tih simptoma. Prema tome, izrazi označavaju da se korisni efekti postižu kod vertebratskog subjekta koji ima autoimunsko ili patogenom indukovano imunopatološko oboljenje ili simptom, ili kod kojeg postoji potencijal za razvijanje takve bolesti ili simptoma.

[0129]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "terapijski efikasna količina" ili "efikasna količina" označava količinu jedinjenja koje se specifično vezuje za IL-23pl9, npr., antitela koje, kada se primeni samo ili u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvom, na ćeliju ili tkivo ili kod subjekta, bude efikasno u preveniranju ili ublažavanju autoimunske bolesti ili bolesti ili stanja udruženih sa imunopatologijom indukovanom patogenom, ili progresije bolesti. Terapijski efikasna doza odnosi se i na količinu jedinjenja dovoljnu da ublaži simptome, npr., leči, zaceli, spreči ili ublaži relevantno medicinsko stanje ili poveća stopu lečenja, zaceljivanja, prevencije ili ublažavanja takvih stanja. Kada se kod pojedinca primeni aktivni sastojak sam, terapijski efikasna doza odnosi se samo na taj sastojak. Kada se primenjuje u kombinaciji, terapijski efikasna doza odnosi se na kombinovane količine aktivnih sastojaka, koje za rezultat imaju terapijski efekat, bilo da se u kombinaciji primenjuju serijski ili istovremeno. Efikasna količina terapijskog sredstva smanjiće simptome tipično za najmanje 10%; obično najmanje 20%; poželjno najmanje oko 30%; poželjnije najmanje 40% i najpoželjnije najmanje 50%.

[0130]Metodi istovremene primene ili lečenja sa drugim terapijskim sredstvom, npr., citokinom, steroidom, hemioterapijskim sredstvom, antibiotikom ili zračenjem, dobro su poznati u struci, vidi, npr., Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10<*>ed., McGraw-Hill, Nevv York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) ;(2001) Cancer Chemotherapv and Biotherapv, Lippincott, VVilliams & VVilkins, Phila., PA. Farmaceutska smeša pronalaska može da sadrži i dmga imunosupresivna ili imunomodulišuća sredstva. Može se koristiti svako pogodno imunosupresivno sredstvo uključujući, ali ne ograničavajući se na antizapaljenska sredstva, kortikosteroide, ciklosporin, takrolimus (tj., FK-506), sirolimus, interferone, solubilne citokinske receptore (npr., sTNRF i sIL-lR), sredstva koja neutrališu aktivnost citokina (npr., infliksimab, etanercept), mikofenolat mofetil, 15-deoksispergualin, talidomid, glatiramer, azatioprin, leflunomid, ciklofosfamid, metotreksat, i slično. Farmaceutska smeša može takođe da se upotrebi sa drugim terapijskim modalitetima kao što su fototerapija i zračenje. ;[0131]Tipični veterinarski, eksperimentalni ili istraživački subjekti uključuju majmune, pse, mačke, pacove, miševe, zečeve, zamorce, konje i ljude. ;VII. Proizvodnja antitela ;[0132]Za rekombinantnu proizvodnju antitela predmetnog pronalaska, nukleinske kiseline koje kodiraju dva lanca izoluju se i insertuju u jedan ili više replikabilnih vektora za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. DNK koja kodira monoklonsko antitelo lako se izoluje i sekvencionira korišćenjem uobičajenih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih proba sposobnih da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Na raspolaganju su mnogi vektori. Vektorske komponente obično uključuju, ali se ne ograničavaju na jednu ili više od sledećih: signalna sekvenca, početak replikacije, jedan ili više markerskih gena, enhenserski element, promotor i sekvenca za tenninaciju transkripcije. U jednoj formi, laki i teški lanci humanizovanog anti-IL-23pl9 antitela predmetnog pronalaska eksprimiraju se u istom vektoru, npr. plazmidnom ili adenovirusnom vektoru. ;[0133]Antitela predmetnog pronalaska mogu da se proizvedu bilo kojim metodom poznatim u struci. Antitela mogu da se eksprimiraju u sisarskim ili insekatskim ćelijama u kulturi, kao što su ćelije ovarijuma kineskog hrćka (chinese hamster ovary, CHO), humane embrionske bubrežne (human embrvonic kidney, HEK) 293 ćelije, ćelije mišjeg mijeloma NSO, ćelije bubrega mladog hrčka (babv hamster kidney, BHK), ćelije ovarijumaSpodoptera rfugiperda(Sf9). Antitela sekretovana iz CHO ćelija mogu da se sakupe i prečiste standardnim hromatografskim metodima, kao što su hromatografija na proteinu A, katjonska izmenjivačka hromatografija, anjonska izmenjivačka hromatografija, hromatografija hidrofobnih interakcija i hidroksiapatitna hromatografija. Rezultujuća antitela se koncentruju i skladište u 20 mM natrijum acetatu, pH 5.5. ;[0134]Antitela predmetnog pronalaska mogu da se proizvedu u kvascu, prema metodima opisanim u WO2005/040395. Ukratko, vektori koji kodiraju pojedinačne lake ili teške lance antitela od interesa uvedu se u različite haploidne ćelije kvasca, npr. ćelije različitih sparujućih tipova kvascaPichia pastoris,koje predstavljaju haplodne ćelije kvasca opcione komplementarni auksotrofe. Transformisane haploidne ćelije kvasca mogu da se spare ili fuzionišu da bi dale diploidne ćelije kvasca sposobne da proizvode i teške i lake lance. Diploidni soj je tada sposoban da sekretuje celo sklopljeno i biološki aktivno antitelo. Relativni nivoi ekspresije dva lanca mogu da se optimizuju na primer, korišćenjem vektora sa različitim brojem kopija, korišćnjem promotora transkripcije različite jačine, ili indukovanjem ekspresije sa inducibilnih promotora koji vode transkripciju gena kodirajućih za jedan ili oba lanca. ;[0135]Respektivni teški i laki lanci velikog broja različitih anti-IL-23pl9 antitela ("originalna" antitela) mogu da se uvedu u haploidne ćelije kvasca da bi se kreirala biblioteka haploidnih sojeva kvasca jednog tipa sparivanja, koji eksprimiraju veliki broj lakih lanaca i biblioteka haploidnih sojeva kvasca različitog tipa sparivanja, koji eksprimiraju veliki broj teških lanaca. Ove biblioteke haploidnih sojeva mogu da se sparuju (ili fuzionišu kao sferoplasti) da bi se proizveo niz diploidnih ćelija kvasca koje eksprimiraju kombinovanu biblioteku antitela koja se sastoji od raznih mogućih permutacija lakih i teških lanaca. Kombinovane biblioteke antitela mogu zatim da se pretražuju da bi se odredilo da li neko od antitela ima osobine koje su superiorne (npr., veći afinitet za IL-23) u poređenju sa osobinama originalnih antitela. Vidi, npr., WO2005/040395. ;[0136]U sledećoj formi, antitela predmetne objave su humana domenska antitela u kojima su delovi varijabilnog domena antitela povezani u polipeptid molekulske težine približno 13 kDa. Vidi, npr., U.S. Pat. Publication No. 2004/0110941. Takva jednodomenska sredstva male molekulske težine obezbeđuju brojne prednosti u pogledu jednostavne sinteze, stabilnosti i puta primene. ;VIII. Upotrebe ;[0137]Predmetna objava obezbeđuje metode korišćenja inženjerisanog anti-IL-23 za lečenje i dijagnostikovanje zapaljenskih poremećaja i stanja, npr., centralnog nervnog sistema, perifernog nervnog sistema i gastrointestinalnog trakta, kao i autoimunskih i proliferativnih poremećaja. ;[0138]Obezbeđeni su metodi lečenja, npr., multiple skleroze (MS), uključujući MS sa poboljšanjima i pogoršanjima (relapsno-remitentna) i primarnu progresivnu MS, Alzheimer-ove bolesti, amiotrofične lateralne skleroze (poznata i kao ALS; Lou Gehrig-ova bolest), ishemične povrede mozga, prionske bolesti i demencije udružene sa HTV-om. Obezbeđeni su i metodi lečenja neuropatskog bola, posttraumatskih neuropatija, Guillain-Barre sindroma (GBS), periferne polineuropatije i regeneracije nerava. ;[0139]Obezbeđeni su metodi lečenja ili ublažavanja jednog ili više od sledećih odlika, simptoma, aspekata, manifestacija ili znakova multiple skleroze ili drugih zapaljenskih poremećaja ili stanja nervnog sistema: moždane lezije, lezije mijelina, demijelinizacija, demijelinzovane plake, poremećaj vida, gubitak ravnoteže ili koordinacije, spastičnost, poremećaj prijema čulnih nadražaja, inkontinencija, bol, slabost, umor, paraliza, kognitivna ometenost, bradifrenija, diplopija, optički neuritis, parestezija, ataksija prilikom hodanja, zamor, Uhtoff-ov simptom, neuralgija, afazija, apraksija, napadi, gubitak vidnog polja, demencija, ekstrapiramidalni fenomen, depresija, osećaj blagostanja ili drugi emocionalni simptomi, hronična progresivna mijelopatija i simptomi koji se detektuju dobijanjem slike pomoću magnetne rezonance (magnetic resonance imaging, MRI), uključujući lezije koje se pojačavaju gadolinijumom, registrovanjem pobuđenog potencijala ili ispitivanjem cerebrospinalne tečnosti (vidi, npr., Kenealv et al. (2003) J. Neuroimmunol. 143:7-12; Noseworthy et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:938-952; Miller et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:15-23; Chang et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:165-173; Bruck and Stadelmann (2003) Neurol. Sci. 24 Suppl. 5:S265-S267). ;[0140]Pored toga, predmetna objava obezbeđuje metode lečenja i dijagnostikovanja zapaljenskih poremećaja creva, npr., Crohn-ove bolesti, ulcerativnog kolitisa, celijakije, i sindroma iritabilnog kolona. Obezbeđeni su metodi lečenja ili ublažavanja jednog ili više od sledećih simptoma, aspekata, manifestacija ili znakova zapaljenskog poremećaja creva: loša apsorpcija hrane, izmenjen motilitet creva, infekcija, groznica, bol u stomaku, dijareja, krvarenje iz rektuma, gubitak težine, znaci pothranjenosti, perianalna bolest, masa u stomaku i prestanak rasta, kao i crevne komplikacije kao što su strikture, fistule, toksični megakolon, perforacija i kancer, i uključujući endoskopske nalaze kao što su krtost, aftozni i linearni ulceri, kaldrmasti izgled, pseudopolipi i promene na rektumu, i, pored toga, antitela na kvasce (vidi, npr., Podolskv, gore; Hanauer, gore; Honvitz and Fisher, gore). ;[0141]Razmatra se i lečenje zapaljenskih poremećaja kao što su psorijaza, atopijski dermatitis, artritis, uključujući reumatoidni artritis, osteoartritis i psorijatični artritis, autoimunskih poremećaja kao što su sistemski eritemski lupus i dijabetes tipa 1, i proliferativnih poremećaja kao što je kancer (vidi, npr., PCT patentne prijave WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; i WO 01/18051). ;[0142]IL-23pl9 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti predmetnog pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više antagonista drugih citokina (npr. antitelima), uključujući, ali ne ograničavajuće se na IL-17A, IL-ip, IL-6 i TGF-p\ Vidi, npr., Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat. Rev. Immunol. 6(4):329-333. IL-23pl9-vezujuće jedinjenje pronalaska može da se primeni pre, istovremeno ili posle primene drugog/drugih antagonista, kao što je anti-IL-17A antitelo. IL-17A-vezujuće jedinjenje može da se koristi za lečenje akutne rane faze neželjenog imunskog odgovora (npr. MS, Crohn-ova bolest) sam, ili u kombinaciji sa IL-23-antagonističkim antitelom predmetnog pronalaska. U ovom drugom slučaju, IL-17A-vezujuće jedinjenje može postepeno da se smanjuje i da se lečenje nastavi samo sa antagonistom IL-23 da bi se supresija neželjenog odgovora održala. Alternativno, antagonisti na IL-lp, IL-6 i/ili TGF-0 mogu da se primene istovremeno, pre ili posle IL-23pl9 antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska. Vidi Cua and Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato and O'Shea (2006) Nature 441:166-168; Ivvakura and Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222. ;[0143]Pronalazak je defmisan zahtevima i najbolje se razume uz upućivanje na primere koji slede, čija svrha nije ograničavanje pronalaska na specifične forme. ;[0144]Specifične forme opisane u ovom tekstu ponuđene su samo kao primeri i pronalazak treba da bude ograničen priloženim zahtevima; i pronalazak ne treba da bude ograničen specifičnim formama koje su ovde predstavljene kroz primere. ;PRIMERI ;Primer 1 ;Opšti metodi ;[0145]Opisani su standardni metodi u molekularnoj biologiji (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3<rd>ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Standardni metodi se takođe pojavljuju u Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology,Vols.l-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, gde se opisuju kloniranje u bakterijskoj ćeliji i DNK mutageneza (Vol. 1), kloniranje u sisarskim ćelijama i kvascima (Vol. 2), glikokonjugati i ekspresija proteina (Vol . 3) i bioinfonnatika ( Vol. 4). ;[0146]Metodi prečišćavanja proteina, koji uključuju imunoprecipitaciju, hromatografiju, elektroforezu, centrifugiranje i kristalizaciju opisani su (Coligan et al. ;(2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Opisane su hemijska analiza, hemijska modifikacija, posttranslaciona modifikacija, proizvodnja fuzionih proteina, glikozilacija proteina (vidi, npr., Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Proizvodnja, prečišćavanje i fragmentacija poliklonskih i monoklonskih antitela opisani su u (Coligan et al. (2001) Current Protcols in Immunologv, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, gore). Na raspolaganju su standardne tehnike karakterisanja interakcija ligand/receptor (vidi, npr., Coligan et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York). ;[0147]Na raspolaganju su metodi protočne citometrije, uključujući fluorescencijom aktivirano ćelijsko sortiranje (fluorescence activated celi sorting, FACS) (vidi, npr., Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2<nd>ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Na raspolaganju su fluorescentni reagensi pogodni za modifikovanje nukleinskih kiselina, uključujući nukleinskokiselinske prajmere i probe, polipeptida i antitela, za upotrebu npr., kao dijagnostičkih sredstava, (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO). ;[0148]Opisani su standardni metodi histologije imunskog sistema (vidi, npr., Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thvmus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histologv, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McCn-aw-Hill, New York, NY). ;[0149]Na raspolaganju su softverski paketi i baze podataka za određivanje npr., antigenskih fragmenata, liderskih sekvenci, nabiranja proteina, funkcionalnih domena, mesta glikozilacije i poravnavanje sekvenci, (vidi, npr., GenBank, Vector NTI<*>Suite (Infonnax, Ine, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypner<®>(TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

Primer 2

Humanizacija antihumanih IL-23pl9 antitela

[0150]Humanizacija mišjih antihumanih IL-23pl9 antitela 6H12 i 7G10, obavlja se suštinski kao što je opisano u objavljenim PCT patentnim prijavama WO 2005/047324 i WO 2005/047326.

[0151]Varijabilni domeni lakog i teškog lanca odabranih anti-IL-23 monoklonskih antitela (6H12 i 7G10) kloniraju se i fuzionišu sa humanim kapa lakim lancem (Cldomen) i humanim IgGl teškim lancem (CHl-zglob-CH2-CH3), respektivno.

[0152]Aminokiselinska sekvenca nehumanog Vhdomena upoređivana je sa grupom od pet humanih Vhaminokiselinskih sekvenci germinativne linije; jednim predstavnikom iz podgrupa IGHV1 i 1GHV4 i tri predstavnika iz podgrupe IGHV3. Vhpodgrupe navedene su u M.-P. Lefranc, "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavv (IGH) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:100-116, 2001. 6H12 i 7G10 antitela imala su najviši skor prema sekvenci germinativne linije humanog teškog lanca DP-14 u podgrupi VH1.

[0153]Za sva nehumana antitela, VLsekvence bile su iz kapa potklase Vl. Aminokiselinska sekvenca nehumanog Vldomena upoređivana je sa grupom od četiri humane Vlkapa aminokiselinske sekvence germinativne linije. Četvoročlana grupa sastojala se od jednog predstavnika iz svake od četiri uspostavljene podgrupe humanih Vl, navedene u V. Barbie & M.-P. Lefranc, "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments", Experimental and Clinical Immunogenetics, 15:171-183, 1998 i M.-P. Lefranc, "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:161-174, 2001. Četiri podgrupe takođe korespondiraju sa četiri podgrupe navedene u Kabat et al. "Sequences of Proteins of lmmunological Interest", U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242, 5<th>Ed., 1991, pp. 103-130. 6H12 i 7G10 antitela imala su najviši skor prema sekvenci genninativne linije humanog lakog lanca Z-012 u podgrupi VLkl.

[0154]Kada se odrede aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca, naprave se plazmidi koji kodiraju humanizovano antitelo pune dužine. Polazeći od plazmida koji kodira humanizovano anti-IL-10 antitelo sa VH3 DP-46 i VLkl Z-012 okvirnim regionima genninativne linije, plazmidi se menjaju korišćenjem Kunkel-ove mutageneze (vidi, npr., Kunkel T A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:488-492) da bi se DNK sekvenca promenila u ciljne humanizovane 6H12 ili 7G10 sekvence. Istovremeno, optimizacija kodona se inkorporiše u promene da bi se obezbedio potencijal za optimalnu ekspresiju. Dobijene humanizovane sekvence lakog i teškog lanca, uključujući signalne sekvence, date su u SEQ ID NO: 1 i 2 (antitelo 6H12) i SEQ ID NO: 3 i 4 (za antitelo 7G10), respektivno.

[0155]Analogni postupak obavlja se da bi se odredili ispravni okvirni regioni za humanizaciju antitela 10H11 i 22E9. Antitelo 10H11 imalo je najviši skor u odnosu na humani teški lanac antitela germinativne linije DP-46 u podgrupi VH3 i laki lanac genninativne linije Z-A27 u podgrupi VLklll. Antitelo 22E9 imalo je najviši skor u odnosu na teški lanac humanog antitela genninativne linije DP-14 u podgrupi VH1 i laki lanac germinativne linije Z-B3 u podgrupi VLklV. Rezultujuće sekvence varijabilnog domena lakog i teškog lanca date su u SEQ ID NO: 90 i 91 (antitelo 10H11) i SEQ ID NO: 92 i 93 (za antitelo 22E9), respektivno.

Primer 3

Određivanje ravnotežne konstante disocijacije (KD) za humanizovano antihumano IL-23 antitelo, korišćenjem KinEx A tehnologije

[0156]Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) za antihumana IL-23 antitela određivana je korišćenjem KinExA 3000 instrumenta (Sapidvne Instmments Inc., www.sapidyne.com). KinExA koristi princip metoda kinetičkog testa isključivanja, koji se zasniva na merenju koncentracije nekompleksovanog antitela u mešavini antitela, antigena i kompleksa antitelo-antigen. Koncentracija slobodnog antitela meri se tako što se mešavina izlaže antigenu koji je imobilisan na čvrstoj fazi, tokom veoma kratkog perioda vremena. U praksi, ovo se obavlja propuštanjem mešavine antigen-antitelo u fazi rastvora, preko antigenskih čestica "zarobljenih" u komori za protok. Podaci generisani instrumentom analiziraju se korišćenjem uobičajenog softvera. Ravnotežne konstante se izračunavaju korišćenjem matematičke teorije zasnovane na sledećim pretpostavkama:

[0157]

1. Vezivanje se odvija prema jednačini reverzibilnog vezivanja za ravnotežno stanje:

2. Antitelo i antigen vezuju se u odnosu 1:1 i ukupno antitelo jednako je

kompleksu antigen-antitelo plus slobodno antitelo.

3. Signal instrumenta je u linearnom odnosu sa koncentracijom slobodnog antitela.

[0158]PMMA čestice od 98 mikrona (Sapidvne, Cat No. 440198) oblože se biotinisanim rhIL-23 prema Sapidvne "Protocol for coating PIVIMA particles with biotinvlated ligands having short or nonexistent linker arms". Za biotinisanje rhIL-23, koristi se EZ-link TFP PEO-biotin (Pierce, Cat. No. 21219), prema preporukama proizvođača (Pierce bulletin 0874). Svi eksperimentalni postupci obavljaju se prema KinExA 3000 priručniku.

[0159]Koriste se tri oblika heterodimernog IL-23 proteina. Nativni ili nevezani humani IL-23 sastoji se od dva lanca, pl9 i p40, koji su kovalentno povezani disulfidnom vezom. "Nevezani" IL-23 sastoji se od humanog p40 koeksprimiranog u 293T ćelijama sa humanim pl9:FLAG-markerskim peptidom i prečišćava se na anti-FLAG peptid-afinitetnoj koloni. Neredukujućom SDS-PAGE, prečišćeni nevezani IL-23 pokazuje prisustvo multimernih IL-23 oblika, na molekulskim težinama koje odgovaraju dimerima, trimerima, itd.

[0160]"Elastikine" IL-23 je jednolančani peptid koji se sastoji od FLAG-marker peptid:GLU-marker peptid:humani p40:elastilinker:humani pl9. Elasti-linker peptidna sekvenca izvedena je iz komercijalnog oblika IL-23, R&D Svstems. Elastikine je eksprimiran u 293T ćlijama i prečišćen preko anti-FLAG peptid-afinitetne kolone. Neredukujućom SDS-PAGE, prečišćeni elastikine IL-23 pokazuje prisustvo multimernih IL-23 oblika, na molekulskim težinama koje odgovaraju dimerima, trimerima, itd.

[0161]Nemarkirani, nevezani oblik nativnog humanog IL-23pl9/p40 koeksprimiran u SF9 ćelijama kupljenje od eBioscience (kat. br. 34-8239). Neredukujućom SDS-PAGE, prečišćeni eBioscience humani IL-23 nije pokazao prisustvo multimernih oblika IL-23.

[0162]Svi testovi rađeni su duplikatu pod sledećim uslovima: zapremina uzorka: 1.5 ml; stopa protoka uzorka: 0.25 ml/min; zapremina obeleživača: 0.5 ml; stopa protoka obeleživača: 0.25 ml/min; mAb konc: 0.1 nM; najviša Ag (hIL-23) konc: 4.0 nM; najniža Ag (hIL-23) konc: 3.91 pM. Pripremaju se dvostruka serijska razblaženja antigena i mešaju se sa antitelom u konstantnoj koncentraciji. Mešavina se inkubira 2 h na sobnoj temperaturi, da bi se uravnotežila.

[0163]Tabela 4 prikazuje rezultate KinExA analize.

Određivanje ravnotežne konstante disocijacije (KD) za humanizovana antihumana IL-23 pl9 antitela, korišćenjem BIAcore tehnologije

[0164]Svi ligandi (anti-IL-23 mAb) imobilišu se na BIAcore CM5 senzoraom čipu korišćenjem standardnog postupka kuplovanja amina. Svi eksperimenti se obavljaju na 25 °C i pri stopi protoka od 10 ul/min u PBS. Svi oblici IL-23 razblaženi su u PBS da bi se dobile različite koncentracije. Kinetičke konstante za različite interakcije određene su korišćenjem BIAevaluation softvera 3.1. KDse određuje korišćenjem izračunatih konstantni brzine otpuštanja i brzine vezivanja. Proteini se koriste u sledećim koncentracijama: anti-IL-23 mAb hu7G10 u PBS pri 0,33 mg/ml; anti-IL-23 mAb hu6H12 u PBS pri 0.2 mg/ml; bac-wt humani IL-23 u PBS pri 0.30 mg/ml; eBioscience humani IL-23 u PBS pri 0.10 mg/ml; N222Q humani IL-23 u PBS pri 0.33 mg/ml.

[0165]Pored gore navedenih proteina koriste se i drugi oblici. "Bac-wt" humani IL-23 je po sekvenci identičan sa "elastikine" humanim IL-23. Ovaj IL-23 se eksprimira u SF9 ćelijama i prečišćava preko anti-FLAG peptid-aifnitetne kolone. Neredukujućom SDS-PAGE, prečišćeni IL-23 ne pokazuje prisustvo multimernih oblika IL-23. "N222Q" humani IL-23 je po sekvenci identičan sa "elastikine" humanim IL-23, osim promene Asn222 u Gln u p40 podjedinici (GenBank Accession No. P29460). Ovaj IL-23 eksprimiran je u SF9 ćelijama i prečišćen na anti-FLAG peptid-aifnitetnoj koloni. Neredukujućom SDS-PAGE, prečišćeni N222Q IL-23 ne pokazuje prisustvo multimernih oblika IL-23.

[0166]Za sve eksperimente korišćeni su sledeći uslovi imobilizacije i regeneracije: stopa protoka: 5^1/min; NHS/EDC: 10 ul; protein: 5 ug-inl u 10 mM Na-acetatu, pH 5.0: 10 ul; etanolamin: 40 ul; regeneracija: 5 ul 50 mM NaOH.

[0167]Tabela 5 prikazuje Kdvrednosti određene korišćenjem BIAcore.

Primer 5

Biotestovi proliferacije za procenu neutrališućih anti-IL-23 antitela

[0168]Sposobnost monoklonskog antitela da biološki neutrališe IL-23 procenjivana je primenom kratkotrajnih proliferacionih biotestova u kojima se koriste ćelije koje eksprimiraju rekombinantne IL-23 receptore. Transfektantske Ba/F3-2.21o ćelije proliferišu u odgovoru na humani IL-23, a odgovor može da se inhibira neutrališućim anti-IL-23 antitelom. Antitelo se titruje prema koncentraciji IL-23 odabranoj unutar linearnog regiona dozno-zavisne krive, blizu platoa i iznad EC50. Proliferacija, ili njeno odsustvo, mere se kolorimetrijski korišćenjem Alamar Blue boje indikatora rasta koja se bazira na detekciji metaboličke aktivnosti. Sposobnost antitela da neutrališe IL-23 procenjuje se preko njegove IC50vrednosti ili koncentracije antitela koja indukuje polovinu maksimalne inhibicije IL-23-zavisne prolifercije.

[0169]IL- 23R transfektantska ćelijska linija i kultura ćelija

[0170]Ba/F3 transfektanti se održavaju u RPMI-1640 medijumu, sa 10% fetalnim telećim serumom, 50 uM 2-merkaptoetanolom, 2 mM L-glutaminom, 50 ug/ml penicilina-streptomicina i 10 ng/ml mišjeg 1L-3. "Cinomolg" se odnosi na IL-23 majmuna cinomolgusa.

Medijum za biotestproliferacije

[0171]Ba/F3 biotestovi proliferacije obavljaju se u RPMI-1640 medijumu, sa 10% fetalnim telećim serumom, 50 uM 2-merkaptoetanolom, 2 mM L-glutaminom, i 50 ug/ml penicilina-streptomicina.

Postupak

[0172]Testovi se obavljaju na pločama sa 96 bunarčića sa ravnim dnom (Falcon 3072 ili slično). Za sva pripremanja reagenasa i ćelijskih suspenzija koristi se odgovarajući medijum za biotest. Zapremina testa je 150 ul po bunarčiću. Titracije anti-IL-23 antitela se preinkubiraju sa IL-23, 30-60 min na sobnoj temperaturi, tokom kog vremena se pripremaju ćelije. Ćelije se dodaju na ploče posle inkubacije antitelo-citokin. Ploče za biotestove se inkubiraju u humidifikovanoj komori za kulturu (37 °C, 5% CO2) 40-48 h. Na kraju vremena kultivisanja, Alamar Blue (Biosource Cat #DAL1100) se doda u koncentraciji od 16.5 ul/bunarčiću i ostavi se da se razvija 5-12 sati. Apsorbanca se zatim očitava na 570 nm i 600 nm (VERSAmax Microplate Reader, Molecular Probes), i dobija se OD570-600. Za svaki uzorak rade se duplikati.

Pripremanje ćelija

[0173]Ćelije se koriste u stanju zdravog rasta, obično pri gustinama od of 3-8 x l OVml. Ćelije se broje, peletiraju, dva puta isperu medijumom za biotest i suspenduju u odgovarajućoj gustini za zascjavanjc.

IL- 23 dozni odgovor

[0174]IL-23 se pripremi u radnoj koncentraciji (3 ng/ml) i doda u prvi bunarčić u količini od 75 ul. Serijska razblaženja od 1:3 naprave se titrovanjem 25:50 ul u medijumu za biotest, u bunarčićima, ostavljajući 50 ul/bunarčiću. Ćelije se suspenduju u odgovarajućoj gustini za zasejavanje u količini od 100 ul po bunarčiću.

Dozni odgovor neutrališućeg antitela

[0175]Antitelo se priprema u radnoj koncentraciji (30 mg/ml) i doda u prvi bunarčić u količini od 75 ul. Serijska razblaženja od 1:3 naprave se titrovanjem 25:50 ul u medijumu za biotest, u bunarčićima, ostavljajući 50 ul/bunarčiću. IL-23 u odgovarajućoj koncentraciji doda se u količini od 50 ul po bunarčiću, u bunarčiće koji sadrže titrovano antitelo. Ćelije se suspenduju u odgovarajućoj gustini za zasejavanje u količini od 50 ul po bunarčiću, i dodaju posle preinkubacije antitelo-citokin.

Određivanje IC50

[0176] Korišćenjem GraphPad Prism 3.0 softvera, apsorbanca se ucrtava u odnosu na koncentraciju citokina ili antitela i IC50vrednosti se određuju korišćenjem nelinearne regresije (podešavanje krive) sigmoidnog doznog odgovora.

[0177]Tabela 6 prikazuje IC50vrednosti za blokiranje proliferacije Ba/F3 ćelija anti-IL-23pl9 antitelima.

Primer 6

Epitop za anti-IL-23pl9 antitelo 7G10

[0178]Epitop za vezivanje antitela 7G10 za humani IL-23pl9 (SEQ ID NO: 29) određen je kristalografijom X-zracima. Koordinate su određene za kompleks Fab fragmenta himeraog oblika antitela 7G10 i nevezanog humanog IL-23, koji sadrži pl9 i p40 podjedinice. Sekvenca humanog IL-23pl9 nalazi se kao SEQ ID NO: 29, a zrelog oblika humanog IL-12/IL-23 p40 nalazi se na reziduama 23-328, GcnBank pristupni br. P29460. Himerni oblik antitela 7G10 obuhvata i) teški lanac koji sadrži Vhdomen mišjeg 7G10 (SEQ ID NO: 6) fuzionisan sa konstantnim regionom humanog teškog lanca (rezidue 135-464 SEQ ID NO: 3), i ii) laki lanac koji sadrži VLdomen mišjeg 7G10 (SEQ ID NO: 18) fuzionisan sa konstantnim regionom humanog lakog lanca (rezidue 130-233 SEQ ID NO: 4).

[0179]Aminokiselinske rezidue IL-23 koje su unutar 4.0 A od rezidua na antitelu 7G10 uključuju E82, G86, S87, D88, T91, G92, E93, P94, S95, H106, P133, S134, Q135, P136, W137, R139, L140. Dodatne rezidue K83, F90 i LI 10 bile su unutar 5.0 A. Smatra se da su aminokiselinske rezidue na IL-23pl9 unutar date distance od antitela (npr. 4.0 A ili 5.0 A) ako su kordinate svakog atoma rezidue unutar date distance od koordinata svakog atoma antitela.

[0180]Većina ovih kontaktnih rezidua spada u dva glavna klastera duž primame strukture IL-23pl9, sa prvim klasterom koji sadrži rezidue 82-95 (od kojih je 11 od 14 rezidua unutar 5.0 A od antitela i 9 od 14 je unutar 4.0 A) i drugim klasterom koji sadrži rezidue 133-140 (od kojih je 7 od 8 rezidua unutar 4.0 A od antitela). Ovi klasteri definišu epitope koji sadrže nizove od 8 ili više kontinuiranih aminokiselinskih rezidua IL-23pl9 u kojima je 50%, 70% i 85% ili više rezidua unutar 5.0 A od antitela.

[0181]Očekuje se da će antitela koja se vezuju za jedan ili oba ova klastera blokirati vezivanje antitela 7G10. Imajući u vidu jaku sekvencionu homologiju između svih šest CDR sekvenci (vidi SL. 1A-1C i 2A-2C), verovatno je da će se druga antitela koja sadrže "(a) potporodicu lakog lanca" (6H12, 33B12, 13F11, 13B5, 13G1, 11C10, 7E2, 30F11, 34E4, 6H4, 33D2) takođe vezivati za isti epitop u IL-23pl9 kao antitelo 7G10. Konsenzusne CDR sekvence za antitela varijabilne domenske sekvence "(a) potporodice lakog lanca", date su kao SEQ ID NO: 69, 72 i 75. Odgovarajuće konsenzusne sekvence varijabilnog domena teškog lanca date su kao SEQ ID NO: 66-68. Očekuje se da će antitela koja se vezuju za isti epitop kao antitelo 7G10 pokazati slične biološke aktivnosti, kao što je blokiranje proliferacije Ba/F3 ćelija u testu opisanom u Primeru 5 i Tabeli 6, mada sa moguće unekoliko varijabilnim afinitetima i IC50.

[0182]Tabela 7 prikazuje kratak opis sekvenci u listi sekvenci.

Claims (17)

1. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment,naznačen time,što se vezuje za humani IL-23pl9 na epitopu koji sadrži rezidue 82-95 i rezidue 133-140 SEQ ID NO: 29.

2. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz zahteva 1,naznačen time,što se vezuje za epitop koji sadrži rezidue E82, G86, S87, D88, T91, G92, E93, P94, S95, H106, P133, S134, Q135, P136, W137, R139 i L140 SEQ ID NO: 29.

3. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz zahteva 1,naznačen time,što antitelo sadrži: CDRL1 koji se sastoji od rezidua 43-53 SEQ ID NO: 4; CDRL2 koji se sastoji od rezidua 69-75 SEQ ID NO: 4; CDRL3 koji se sastoji od rezidua 108-116 SEQ ID NO: 4; CDRH1 koji se sastoji od rezidua 45-54 SEQ ID NO: 3; CDRH2 koji se sastoji od rezidua 69-85 SEQ ID NO: 3; i CD RIO koji se sastoji od rezidua 118-123 SEQ ID NO: 3.

4. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz zahteva 3,naznačen time,što: varijabilni region lakog lanca antitela, ili njegovog vezujućeg fragmenta, sadrži sekvencu rezidua 20-129 SEQ I D NO: 4, ili njenu varijantu; i varijabilni region teškog lanca antitela, ili njegovog vezujućeg fragmenta, sadrži sekvencu rezidua 20-134 SEO ID NO: 3, ili njenu varijantu; pri čemu varijanta sadrži do 20 konzervativno modifikovanih aminokiselinskih supstitucija.

5. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz zahteva 4,naznačen time,što je vezujuće jedinjenje antitelo, ili njegov vezujući fragment, koji uključuje: varijabilni region lakog lanca koji sadrži rezidue 20-129 SEQ ID NO: 4; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži rezidue 20-134 SEQ ID NO: 3.

6. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment iz zahteva 3, naznačen time, što blokira aktivnost posredovanu IL-23.

7. Izolovana nukleinska kiselina, naznačena time, što kodira varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca antitela, ili njegovog antigen-vczujućcg fragmenta, iz zahteva 4.

8. Ekspresioni vektor, naznačen time, što sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 7 operabilno povezanu sa kontrolnim sekvencama koje prepoznaje ćelija-domaćin, kada se ćelija-domaćin transfektuje vektorom.

9. Ćelija-domaćin, naznačena time, što sadrži ekspresioni vektor iz zahteva 8.

10. Metod proizvodnje polipeptida, naznačen time, što uključuje: kultivisanje ćelije-domaćina iz zahteva 9 u kultivacionom medijumu pod uslovima pod kojima se eksprimira sekvenca nukleinske kiseline, čime se proizvode polipeptidi koji sadrže varijabilne regione lakog i teškog lanca; i sakupljanje polipeptida iz ćelije-domaćina ili kultivacionog medijuma.

11. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz zahteva 2, naznačen time, što sadrži konstantni region humanog yl teškog lanca.

12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment iz zahteva 2, naznačen time, što sadrži konstantni region humanog y4 teškog lanca.

13. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz zahteva 1, naznačen time, što se fragment antitela bira iz grupe koja se sastoji od Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2i dijatela.

14. Smeša, naznačena time, što sadrži antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, iz zahteva 4 u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem.

15. Smeša iz zahteva 14, naznačena time, što sadrži još i imunosupresivno ili antizapaljensko sredstvo,

16. Ćelija-domaćin, naznačena time, što sadrži: (a) ekspresioni vektor koji uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira laki lanac antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, iz zahteva 4; i (b) ekspresioni vektor koji uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, iz zahteva 4.

17. Metod proizvodnje vezujućeg jedinjenja naznačen time, što uključuje: kultivisanje ćelije-domaćina iz zahteva 16 u kultivacionom medijumu pod uslovima u kojima se eksprimiraju sekvence nukleinske kiseline, čime se proizvode polipeptidi koji sadrže lake i teške lance antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta; i sakupljanje antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta iz ćelije-domaćina ili kultivacionog medijuma.