RS56009B1 - Humana antitela na humani protein 4 sličan angiopoetinu - Google Patents

Description

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak odnosi se na humana antitela i antigen-vezujuće fragmente humanih antitela koji specifično vezuju humani protein 4 sličan angiopoetinu (odnosno humani angiopetinu sličan protein 4 (hANGPTL4), i na antitela za upotrebu u terapeutskim metodama.

Stanje tehnike

Lipoprotein lipaza (LPL) ima centralnu ulogu u metabolizmu lipoproteina za održavanje normalnih niva lipoproteina u krvi i njihove aktivnosti kroz regulaciju specifičnu za tkivo, za određivanje kad i kojim tkivima su trigliceridi (TG) hidrolizovani. Objavljeno je da ANGPTL4 inhibira LPL i usporava katabolizam lipoproteina, kod ljudi i glodara. ANGPTL4 Nokaut (null) miševi ispoljavaju značajno smanjenje TG u serumu. Suprotno, injekcija ANGPTL4 mišu proizvodi brzo smanjenje lipida u krvi i to većom brzinom od injekcije proteina 3 sličnog angiopoetinu (ANGPTL3) (Yoshida et a/., 2002, J Lipid Res 43:1770-1772). N-terminalni region upredene zavojnice, ne C-terminalni domen sličan fibrinogenu, ANGPTL4 –a je prepoznat kao važan faktor u inhibiciji aktivnosti LPL i shodno tome, za indikaciju hipertrigliceridemije. Ova zapažanja ukazuju na to da inibicija ANGPTL4 može da bude od koristi u lečenju bolesti okarakterisanih povišenim nivoom lipida, uključujući primarnu dislipidemiju i hipertrigliceridemiju povezanu sa gojaznošću, metabolički sindrom, dijabetes tipa II i sl. ANGPTL4 takođe ima ulogu u angiogenezi i kanceru/karcinomu (Galaup et a/., 2006, PNAS 103(49):18721-18726; Kim eta/., 2000, Biochem J346:603-610; and Ito eta/., 2003, Cancer Res 63(20):6651-6657).

Sekvence nukleinskih kiselina i amino kiselina humanog ANGPTL4 prikazane su u SEQ 10 NOS: 475 i 476. Antitela na ANGPTL4 opisana su, na primer u WO 2006/074228 i WO 2007/109307.

Kratak opis pronalaska

Pronalazak obezbeđuje cela humana monoklonalna antitela (mAbs) i njihove antigenvezujuće fragmente koji specifično vezuju i neutrališu aktivnost humanog ANGPTL4 (hANGPTL4).

Anitela (Abs) mogu da budu cele dužine (na primer, antitelo IgG1 ili IgG4) ili mogu da sadrže samo deo za vezivanje antigena (na primer, Fab, F(ab'h ili scFv fragment), i mogu da budu modifikovani tako da utiču na funkcionalnost, npr., da eliminišu funkcije rezidualnog efektora (Reddy et a/.,2000, J. Immunol.164:1925-1933).

Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano humano anttelo ili njegov antigenvezujući fragment koji specifično vezuje humani protein 4 sličan angiopoetinu (hANGPTL4), koje sadrži:

(a) težak lanac hipervarijabilne sekvence 1 (HCDR1 )/HCDR2/HCDR3 sa kombinacijom amino kiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 28/30/32; i

(b) laki lanac hipervarijabilnog regiona 1 (LCDR1 )/LCDR2/LCDR3 sa kombinacijom amino kiselinskih sekvenci SEQ ID NO:36/38/40.

Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) odabran od SEQ ID NO: 487, 26, 42 i 46.

Pronalazak dalje obezbeđuje antitelo ili antigen-vezujući fragment koji sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) odabran od SEQ ID NO: 44, 34 i 48.

Pronalazak obezbeđuje i antitelo ili njegov fragment koji sadrži par sekvenci HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) odabranih od SEQ ID NO: 487/44, 26/34, 42/44 i 46/48.

Pronalazak takođe obuhvata antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela koji specifično vezuje hANGPTL4, pri čemu antitelo ili njegov fragment sadrži domene CDR teškog i lakog lanca koji su sastavni deo HCVR/LCVR para SEQ ID NO: 487/44,26/34,42/44 i 46/48. U tehnici su poznate metode i tehnike za identifikaciju CDRs unutar aminokiselinskih sekvenci HCVR i LCVR i mogu se primeniti za identifikaciju CDRs unutar ovde datih naznačnih amino kiselinskih sekvenci HCVR i/ili LCVR.

Uobičajene definicije koje se mogu primeniti za identifikaciju granica CDRs obuhvataju Kabat definiciju, Chothia definiciju i AbM definiciju. Opšte govoreći, Kabat definicija je bazirana na varijabilitetu sekvenci, Chothia definicija je bazirana na položaju strukturnih regiona petlje (zavoja) i AbM defincija koja obuhvata stanovište između Kabat i Chothia pristupa. Videti, npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 25 National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); AI-Lazikani et al., J. Mol. BioI.

273:927- 948 (1997); i Martin et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Baze podataka koje su dostupne javnosti takođe su dostupne za identifikaciju sekvenci CDR unutar antitela.

Pronalazak takođe obezbeđuje izolovane molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela na ANGPTL4 ili njihove fragmente kao što je prethodno opisano. Rekombinantni ekspresioni vektori sa nukleinskim kiselinama pronalaska i ćelije domaćini, npr., bakterijske ćelije, poput E. coli, ili ćelije sisara, kao što su CHO ćelije, u koje je su ubačeni vektori, takođe su obuhvaćene pronalaskom, kao i metode za proizvodnju antitela gajenjem ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju stvaranje antitela i regeneraciju dobijenih antitela.

Data su antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji se specifično vezuju za hANGPTL4 sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) od oko 1 nM ili manjom, mereno testom rezonance površinskih plazmona (na primer, BIACORETM). Antitela mogu da ispolje KD od oko 500 pM ili manje; oko 400 pM ili manje; oko 300 pM ili manje; oko 200 pM ili manje; oko 150 pM ili manje; oko 100 pM ili manje; ili oko 50 pM ili manje.

Obezbeđeno je antitelo na hANGPTL4 ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuje hANGPTL4 protein sa SEQ 10 NO:476, međutim ne reaguje unakrsno sa srodnim proteinom, kao što je humani protein 3 sličan angiopoetinu (hANGPTL3; SEQ 10 NO:485), kao što je određeno, na primer, sa ELISA, testom rezonance površinskih plazmona, ili LUMINEX® XMAP® Technology, kao što je ovde opisano. ANGPTL3 je sledeći protein za koji je poznato da smanjuje aktivnost LPL i da ima N-terminalni region u obliku upredene zavojnice i C-terminalni domen sličan fibrinogenu (Ono et a/., 2003, J Bioi Chern 43:41804-41809). Antitelo na hANGPTL4 ili njegov antigen vezujući fragment može da veže hANGPTL4 protein i unakrsno reaguje sa proteinom hANGPTL3. Afinitet vezivanja hANGPTL4 antitela ili njegovog fragmenta za protein hANGPTL3 može da iznosi oko 75% ili manje, ili oko 50% ili manje, afiniteta vezivanja antitela ili fragmenta za hANGPTL4 protein. Antitelo na hANGPTL4 ili njegov antigen vezujući fragment može da ne reaguje unakrsno sa mišjim ANGPTL4 (mANGPTL4: SEQ 10 NO:478) ali da unakrsno reaguje sa cinomolgus majmunom (Macaca fascicularis; aminokiselinska sekvenca N-terminalnih 1-148 ostataka i kodirajuće DNK sekvence su kao što je u SEQ 10 NOS:490 i 489) i/ili rezus majmunom (Macaca rnulatta; amino kiselinska sekvenca N-terminalih ostataka 1-148 i kodirajuće DNK sekvence su kao što je dato u SEQ 10 NOS:492 i 491) ANGPTL4.

Takođe su razmatrana i antitela na hANGPTL4 sa modifikovanim modelom glikozilacije. U nekim aplikacijama, može da bude korisna modifikacija uklanjanja neželjenih mesta glikozilacije, ili npr., uklanjanje ostatka fukoze radi povećanja funkcije ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (videti Shield et a/. (2002) JBC 277:26733). U ostalim primenama, uklanjanje mesta N-glikozilacije može da umanji neželjene imunske reakcije na terapeutska antitela ili da poveća afinitete antitela. U narednim primenama, može se izvesti modifikacija galaktozilacije komplement zavisne citotoksičnosti (CDC).

Pronalazak takođe prikazuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži rekombinantno humano antitelo ili njegov fragment predmetnog pronalaska

koje specifično vezuje hANGPTL4 i farmaceutski prohvatljiv nosač. Pronalazak dalje obezbeđuje kompoziciju koja predstavlja kombinaciju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta pronalaska i drugog terapeutskog agensa.

Drugi terapeutski agens može biti jedan ili više od sledećih: (1) inhbitora 3-hidroksi-3-metilglutaril-koenzim A (HMG-CoA) reduktaze, kao što su: cerivastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastatin, rosuvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, i sl.; (2) inhibitora resporpcije holesterola i/ili re-apsorpbcije žučne kiseline; (3) niacina, koji povećava katabolizam lipoproteina; (4) fibrata ili amfipatičnih karboksilnih kiselina, koji snižavaju nivo lipoproteina male gustine (LDL), poboljšavaju nivoe lipoproteina velike gustine (HDL) i TG, i smanjuju broj nefatalnih srčanih udara; i (5) aktivatora LXR faktora transkripcije koji imaju važnu ulogu u eliminaciji holesterola kao što je 22-hidroksiholesterol, ili fiksne kombinacije poput ezetimiba sa simvastatinom; statina sa adsorbensimai žučnih kiselina (npr., holestiramin, colestipol, colesevelam), i utvrđene kombinacije niacina sa statinom (npr., niacin sa lovastatinom); ili sa drugim agensom za sniženje nivoa lipida kao što su etil estri omega-3-masnih kiselina (na primer, omakor). Dalje, drugi terapeutski agens može da bude jedan ili više drugih inhibitora ANGPTL4 kao i inhibitori drugih molekula, poput ANGPTL3, ANGPTL5, ANGPTL6 i proprotein konvertaze subtilisin/keksin tip 9 (PCSK9), koji je uključen u metabolizam lipida, a posebno, homeostaze holesterola i/ili triglicerida. Inhibitori ovih molekula uključuju male molekule i antitela koja se specifično vezuju za ove molekule i blokiraju njihovu aktivnost.

Drugi terapeutski agens može da bude jedan ili više anti-karcinomskih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi, anti-angiogenici, agensi za inhbiciju rasta, citotoksični agensi, apoptotičk agensi i drugi agensi koji su poznati u tehnici za lečenje karcinoma ili drugih proliferativnih bolesti ili poremećaja, kao i drugih terapeutskih agenasa, kao što su analgetici, antiinflamatorni agensi, uključujući nesteroidne anti-inflamatorne lekove (NSAIDS), kao što su inhibitori Cox-2, za poboljšanje i/ili ublažavnje simptoma koji leće u osnovi karcinoma /tumora.

Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo na hANGPTL4 ili njegov fragment za upotrebu u metodi poboljšanja, ublažavanja, inhibicije ili prevencije bolesti ili poremećaja posredovanih ANGPTL4-om, pri čemu je bolest ili poremećaj posredovana ANGPTL4-om odabrana od hipertrigliceridemije, hiperholesterolemije, hilomikronemije, aterogena displipidemija, kardiovaskularne bolesti ili poremećaja, akutnog pankreatitisa, nealkoholičarski stetohepatitis (NASH), dijabetes i gojaznost. Primeri bolesti ili poremećaja koji se mogu tretirati primenom antitela koja su ovde opisana uključuju, ali ne isključivo, one koji uključuju poremećaj metabolizma lipida, kao što je hiperlipidemija, hiperlipoproteinemija i dislipidemija, uključujući aterogenu dislipidemiju, dijabetičku dislipidemiju, hipertrigliceridemiju, uključujući težak oblik hipertrigliceridemije sa TG >1000 mg/dL, hiperholesterolemiju, hilomikronemiju, kombinovanu dislipidemiju (gojaznost, metabolički sindrom, dijabetes, itd.), lipodistrofiju, lipoatrofiju i slične, koje su izazvane, na primer, smanjenjem LPL aktivnosti i/ili nedostatkom LPL, smanjenjem aktivnosti LDL receptora i/ili nedostatkom receptora LDL, izmenjenom ApoC2, nedostakom ApoE, povećanjem ApoB, povećanju produkciju i/ili umanjenu eliminaciju lipoproteina veoma niske gustine (VLDL), tretmana određenim lekovima (npr.,dislipidemije indukovane tretmanom glukokortikoidima), bilo kakve genetičke predispozicije, ishrana, životni stil. Antitela takođe mogu da spreče ili leče bolesti ili poremećaje povezane sa, ili koje nastaju usled hiperlipidemija, hiperlipoproteinemija, i(ili dislipidemija, uključujući, bez ograničenja, kardiovaskularne bolesti ili poremećaje, kao što su ateroskleroza, aneurzma, hipertenzija, angina, šlog, cerebrovaskularne bolesti, kongestivne srčane insuficijencije, koronarne arterijske bolesti, infarkt miokarda, periferne vaskularne bolesti; akutni pankreatitis; nealkoholičarski steatohepatitis (NASH); poremećaji nivoa šećera u krvi, kao što je dijabetes; gojaznosti.

Ostali primeri bolesti ili poremećaja koji se mogu tretirati antitelima uključuju karcinome/tumore kao i ne –neoplastične bolesti ili poremećaji povezani sa angiogenezom, uključujući okularne angiogene bolesti ili poremećaje, kao što je senilna makularna degeneracija, okluzija centralne veze mrežnjače ili okluzija ogranka retinalne vene , dijabetička retinopatija, retinopatija prematuriteta, inflamatorne bolesti ili poremećaji, kao što je artritis, reumatoidni artritis (RA), psorijaza.

Pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta pronalaska u proizvodnji leka za upotrebu za poboljšanje, ublažavanje, u inhibiciji ili prevecniji bolesti ili poremećaja posredovanih ANGPTL4-om, pri čemu su bolesti ili poremećaji posredovani ANGPTL4-om, odabrani od hipertrigliceridemije, hiperholesterolemije, hilomikronemije, aterogene dislipidemije, kardiovaskularne bolesti ili poremećaja, akutnog pankreatitisa, nealkoholičarskog steatohepatitisa (NASH), dijabetesa i gojaznosti.

Ostale realizacije će postati očigledne razmatranjem opisa koji sledi.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 pokazuje poravnavanje sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca (HCVR) antitela H1H268P, H1H284P, H1H291P AND H1H292P.

Slika 2 pokazuje poravnavanje sekvenci varijabilnih regiona lakog lanca (LCVR) antitela H1 H268P, H1 H284P, H1 H291 P AND H1 H292P.

Slike 3A i 3B pokazuju farmakokinetički klirens antitela na ANGPTL4 kod miševa divljeg tipa (Slika 3A) i transgenih miševa koji eksprimiraju humani ANGPTL4 [hAngptl4(+/+); ili "humanizovani ANGPTL4 miševi"] (Slika 3B). H4H268P2 (□); H4H284P (▲); i hlgG4 kontrola (●).

Slika 4 pokazuje efekat antitela na ANGPTL4, H4H268P2, na nivoe triglicerida (TG) u serumu kod humanizovanih ANGPTL4 miševa ukrštenih sa ApoE null mišem. Prikazan je procenat (%) promena nivoa TG u serumu dejstvom H4H268P2, u odnosu na kontrolno antitelo sa nerelavatnom specifičnošću. Kontrola Ab (○); i H4H268P2 (■).

Slika 5 pokazuje efekat na H4H268P2 i TG-redukujućeg leka fenofibrata anti-ANGPTL4 antitelo, samih ili u kombinaciji, na nivo TG u serumu u humanizovanom ANGPTL4 mišu.

Slika 6 pokazuje rezultat faze I pilot ispitivanja na efekat antitela na ANGPTL4 na nivoe TG u serumu kao kod izgladnjivanja, između ostalih lipida, kod gojaznih rezus majmuna (Macaca mulatta). Svi majmuni su primili nosač (10 mM histidin, pH 6) intravenskom (IV) infuzijom na Dan-5 i bilo H4H268P2 (n=3) (●) ili H4H284P (n=3) (□) u koncentraciji 10 mg/kg IV na Dan - 0. Uzorci seruma od osnovne linije do dana 35 posle doziranja. Prosečna osnovna linija za svaku životinju određena je na osnovu uzoraka uzetih u Dane-7, -5 i 0, i određen je procenat (%) promena nivoa TG u serumu od osnovne linije kao i prosek za svaku Ab grupu.

Slika 7 prikazuje rezultate faze II pilot ispitivanja na efekat anti-ANGPTL4 antitela H4H268P2 na nivoe TG u serumu kao kod izgladnjivanja kod gojaznih majmuna, kao što je opisano za Sliku 6, s tom razilikom što je izostavljana faza infuzije nosačem. Prosečna osnovna linija dobijena je za svakog majmuna na osnovu uzoraka uzetih u Dane-7, -3 i 0. Majmuni su podeljeni u grupe na osnovu osnovnih linija: A. TG<150 mg/dL (n=3; □); B.150 mg/dL<TG<500 mg/dL (n=4; ●); i C.

TG>1000 mg/dL (n=1; ∇ ). Procenti (%) promena TG nivoa, kao kod izgladnjivanja, od osnovne linije određeni su za svakog majmuna i određena je prosečna vrednost za svaku grupu.

Tolerancije za grešku na sviim graficima označavaju srednju vrednost ± sd.

Detaljan opis

Definicije

Izraz "humani protein 4 sličan angiopoetin (odnosno humani angiopoetinu sličan protein 4" ili "hANGPTL4", kao što je ovde korišćen, odnosi se na hANGPTL4 sa nukleinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO:475 i aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO:476, ili na njihov biološki aktivan fragment.

Izraz "antitelo ", kao što je ovde upotrebljen, upućuje na molekule imunoglobulina koji čine četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca povezani međusobno disulfidnim vezama. Svaki težak lanac ulazi u sastav varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) i konstantnog regiona teškog lanca (CH; sastoji se od domena CH1, CH2 i CH3). Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) i konstatnog regiona lakog lanca (CL). HCVR i LCVR mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR), između kojih su rasuti regioni koji su konzervisaniji, a koji se nazivaju okvirni regioni (FR). Svaki HCVR i LCVR sastoji se od tri CDRs i četiri FRs, poređanih od amino-kraja ka karboksi –kraju na sledeći način: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4.

Supstitucija jednog ili više ostataka CDR ili izostavljanje jednog ili više CDRs takođe je moguće. Antitela su opisana u naučnoj literaturi gde je jedan ili dva CDRs nisu neophodni za vezivanje. Padlan et al. (1995 FASEB J.9:133-139) analizirali su kontaktne regione između antitela i njihovih antigena, na osnovu objavljenih kristalnih struktura i zaključili da samo oko jedna petina do jedne trećine CDR ostataka u stvari stupa u kontakt sa antigenom. Padlan je takođe pronašao brojna antitela u kojima jedan ili dva CDRs nisu imala aminokiseline u kontaktu sa antigenom (videti takođe, Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320:415-428).

Sekvence CDR koji ne kontaktiraju antigen mogu se identifikovati na osnovu prethodnih ispitivanja (na primer, ostaci H60-H65 u CDRH2 često nisu neophodni), regiona Kabat CDRs koji leže ivan Chothia CDRs, molekularnim modelovanjem i/ili empirijski. Ako su izostavljeni CDR ili njegov ostatak (ostaci), onda su obično supstituisani aminokiselinom koja zauzima odgovarajuće mesto u drugoj sekvenci humanog antitela ili consenzusu ovih sekvenci. Položaji za supstituciju unutar CDRs i aminokiselina za supstituciju takođe se mogu empirijski odabrati. Empirijske supstitucije mogu da budu konzervativne i nekonzervativne supstitucije.

Izraz "humano antitelo", kao što je ovde korišćen, obuhvata antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji potiču od imunoglobulinskih sekvenci humanih germinativnih (embrionalnih) linija ćelija. Humani mAbs pronalaska mogu da sadrže aminokiselinske ostatke koje ne kodiraju imunoglobulinske sekvence humane germitivne linje ćelija (npr., mutacije uvedene nasumičnim mutagenezama ili mutagenezama specifičnim za mesto in vitro ili somatskim mutacijama in vivo), na primer u CDRs i u posebnom CDR3. Međutim, izraz "humano antitelo ", kako je ovde korišćen, ne obuhvata mAbs u kojima su sekvence CDR izvedene iz germitivne linije druge vrste sisara (npr., miša), bile kalmljene u humane sekvence FR.

Ovde opisana cela humana antitela na hANGPTL4 mogu da sadrže supstituciju jedne ili više aminokiselina, umetanje i/ili deleciju u okvirnim i/ili CDR regionima teškog i lakog lanca varijabilnih domena u odnosu na odgovarajuće germinativne sekvence. Ove mutacije mogu se lako utvrditi poređenjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisne sa sekvencama germinativnih ćelija odabranim, na primer, iz javno dostupnih baza podataka sekvenci antitela. Predmetni pronalazak obuhvata antitela i njihove antigenvezujuće fragmente, koji su izvedeni iz bilo koje od ovde opisanih aminokiselinskih sekvenci, pri čemuje je jedna ili više aminokiselina u jednom ili više okvirnih i/ili CDR regiona, mutirane u odgovarajuće ostatke geminativne sekvence iz koje potiče antitelo, ili u odgovarajuće ostatke druge humane germinativne sekvence ili u supstituciju konzervativnih aminokiselina odgovarajućih germinativnih ostataka (ove promene sekvenci ovde su zajednički nazvane kao "germinativne mutacije"). Prosečan stručnjak, polazeći od varijabilnih sekvenci teškog i lakog lanca koje su ovde opisane, može lako proizvesti brojna antitela i antigen-vezujuće fragmente koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih povratnih mutacija ili njihovih kombinacija. Svi ostaci okvirnih i/ili CDR regiona unutar VHi/ili VLdomena mogu se povratno mutrirati u ostake nađene u izvornoj germinativnoj sekvenci iz koje ie izvedeno anitelo. Alternativno, samo su određeni ostaci povratno mutirani u izvornu germinativnu sekvencu, npr., samo mutirani ostaci nađeni u prvih 8 amino kisalina u FR1 ili u prvih 8 amino kiselina u FR4, ili samo mutirani ostaci nađeni u CDR1, CDR2 ili CDR3. Jedan ili više ostatka okvirnih i/ili CDR ostatka može da mutira u odgovajuće ostatke različite germinativne sekvence (tj., germinativna sekvenca koja se razlikuje od germinaitivne sekvence od koje antitelo originalno potiče). Dalje, antitela predmetnog pronalaska mogu da sadrže bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija u okvirnim i/ili CDR regionima, npr., gde su određeni pojedini ostaci mutirani u odgovarajuće ostatke posebne germinativne sekvence dok određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence održavani ili mutirani u dogovarajuće ostatke različite germlinativne sekvence. Za dobijena, antitela i antigenvezujući fragmenti koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija može se lako ispitati željena osobina, kao što je poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšane ili pojačane antagonističke ili agonističke biološke karakteristike (zavisno od slučaja), smanjena imunogeničnost, itd. Antitela i antigen-vezujući fragmenti dobijeni na ovaj opšti način su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela na ANGPTL4 koja sadrže varijante jedne od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde date a koje sadrže jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni pronalazak obuhvata antitela na ANGPTL4 sa HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskim sekvencama sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, 2 ili 1, konzervativne aminokiselinske supstitucije u odnosu na bilo koju HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinske sekvence koje su ovde date. HCVR može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:487 sa 10 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. HCVR može da sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:487 sa 8 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. HCVR može da sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:487 sa 6 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. HCVR može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:487 sa 4 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. Takođe, HCVR može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:487 sa 2 ili 1 konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom. LCVR može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44 sa 10 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. LCVR može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44 sa 8 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. LCVR može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44 sa 6 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. LCVR može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44 sa 4 ili manje konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. LCVR može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:44 sa 2 ili 1 konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom.

Osim ako je drugačije posebno naznačeno, izraz "antitelo," kao što je ovde upotrebljen, treba shvatiti tako da obuhvata molekule antitela koja sadrže dva teška lanca imunoglobulina i sva laka lanca imunoglobulina (tj., "potpune molekule antitela") kao i njihove antigen-vezujuće fragmente. Izrazi "antigen-vezujući deo " antitela, "antigenvezujući fragment" antitela i sl., kao što je ovde uporebljeno, obuhvataju prirodne polipeptide, polipeptide koji se mogu enzimatski dobiti, sintetičke i polipeptide dobijene genetskim inženjeringom ili glikoprotein koji specifično vezuje antigen tako da obrazuje kompleks. Antigen-vezujući fragmenti antitela mogu se dobiti od, npr., potpunog molekula antitela primenom odgovarajućih standardnih tehnika kao što je proteolitička digestija ili tehnike rekombinantnog inženjeringa koji uključuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i (po izboru) konstante domene antitela. Ova DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz npr., komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući npr., biblioteke fagi antitela), ili se može sintetisati. DNK se može hemijski sekvencirati i manipulisati ili primenom tehnika molekularne biologije, na primer, za postavljanje jednog i/ili više varijablnih i/ili konstatnih domena u odgovarajuću konfiguraciju, ili za uvođenje kodona, stvaranje cisteinskih ostataka, modifikaciju, dodavanje il izostavljanje aminokiselina, itd.

Neograničavajući primeri antigen-vezujućih fragmenata su: (i) Fab fragmenti; (ii) F(ab')2fragmenti; (iii) Fd fragmenti; (iv) Fv fragmenti; (v) jednolančani Fv (scFv) molekuli; (vi) dAb fragmenti; i (vii) minimalne prepoznatljive jedinice koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji maskiraju hipervarijabilni region antitela (nr., izolovane hipervarijabilne sekvence (CDR)). Drugi molekuli dobijeni inženjeringom, kao što su diatela, triatela, tetratela i minitela, takođe su obuhvaćena izrazom "antigen-vezujući fragment," kao što je ovde upotrebljen.

Antigen-vezujući fragment antitela tipično sadrži barem jedan varijablni domen. Varijabilni domen može da bude bilo koje veličine ili aminokiselinskog sastava i generalno sadrži najmanje jednu CDR koja je susedna ili je u okviru sa jednom ili više okvirnih sekvenci. U antigen-vezujućim fragmentima sa VHdomenom povezanim sa VLdomainom, domeni VHi VLmogu se nalaziti jedan u odnosu na drugi u bilo kom odgovarajućem položaju. Na primer, varijabilni region može da bude dimeran i da sadrži dimere VH-VH, VH-VLili VL-VL. Alternativno, antigen-vezujući fragment antitela može da sadrži monomerni VHili VLdomen.

Antigen-vezujući fragment antitela može da sadrži najmanje jedan varijabilan domen kovalentno vezan za barem jedan konstantan domen. Neograničavajući ovde dati primeri konfiguracije varijablnih i konstantnih domena koji se mogu naći unutar antigen-vezujućeg fragmenta antitela predmetnog uključuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VLCH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijablnih i konstatnih domena, uključujući konfiguracije koje su prethodno date kao primeri, varijabilni i konstantni domeni mogu biti bilo direktno vezani jedan za drugi ili se mogu vezati za celu ili parcijalnu pregibnu ili linker sekvencu. Pregibna sekvenca može da se sastoji od najmanje 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje formiraju fleksibilnu ili polufleksibilnu vezu između susednih varijablnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Dalje, antigen-vezujui fragment antitela predmetnog pronalaska može da sadrži homodimer ili heterodimer (ili drugi multimer) bilo kog varijabilnog i konstantnog domena konfiguracije kao što je prethodno dato u nekovalentnoj asocijaciji sa jednim drugim i/ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (npr., disulfidnim vezama).

Kao potpuni molekuli antitela, antigen-vezujući fragmenti mogu da budu monospecifični ili multispecifični (npr., bispecifični). Multispecifični antigen-vezujući fragment antitela obično sadrži najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu svaki varijablni domen može da se specifično veže za odvojeni antigen ili za različit epitop istog antigena. Svaki format multispecifičnog antitela, uključujući ovde kao primer bispecifičan format antitela, može se prilagoditi za upotrebu u kontekstu antigen-vezujućeg fragmenta antitela predmetnog pronalaska primenjujući rutinske tehnike poznate u tehnici.

Antitela ili fragmenti antitela pronalaska mogu da se konjuguju za terapeutski ostatak ("imunokonjugat"), kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresant ili radioizotop.

Izraz "specifično vezuje" ili slično, označava antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obrazuje kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan pod fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može se okarakteristai konstantnom disocijacije (KD) od oko 1x10<-6>M ili manjom (tj., manja KDukazuje na jače vezivanje). Metode za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju poznata je u tehnici i obuhvata, na primer, ekvilibrijum dijalizu, površinsku plazmon rezonanciju i sl. Međutim, izolovano antitelo koje specifično vezuju hANGPTL4 može da ispolji unakrsnu reaktivnost ka drugim antigenima, kao što su ANGPTL4 molekuli iz drugih vrsta, na primer, ANGPTL4 i/ili hANGPTL3 cinomolgus majmuna sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:485. Dalje, multi-specifična antitela (npr., bispecifična) koja se vezuju za hANGPTL4 i jedan ili više dodatnih antigena se međutim smatraju antitelima koja "specifično vezuju" hANGPTL4, kao što je ovde upotrebljno.

Izraz "visoki afinitet" antitela odnosi se na ona antitela koja imaju afinitet vezivanja za hANGPTL4, izražen kao KD, od oko 1x10<-9>M ili manji, oko 0.5x10<-9>M ili manji, oko 0.25x10<-9>M ili manji, oko 1x10<-10>M ili manji, ili oko 0.5x10<-10>M ili manji, što je mereno površinskom plazmon rezonancom, npr., BIACORE™ ili afinitetnom ELISA u rastvoru.

Izraz "KD", kao što je ovde korišćen, odnosi se na ravnotežnu konstantnu disocijacie date interakcije antitelo-antigen.

Pod izrazom "konstanta brzije disocijacije", "Koff" ili "kd" podrazumeva se antitelo koje disosuje od hANGPTL4 konstantnom brzinom od 1 x 10<-3>s<-1>ili manje, poželjno 1 x 10<-4>s<-1>ili manje , kao što je određeno površinskom plazmon rezonancom, npr., BIACORE™.

Izraz "unutrašnja konstanta afiniteta" ili "ka" označava antitelo koje se vezuje sa hANGPTL4 pri konstantnoj brziji od oko 1 x 10<3>M<-1>s<-1>ili većoj, kao što je određeno površinskom plazmon rezonancom, npr., BIACORE™.

"Izolovano antitelo", kao što je ovde određeno, označava antitelo koje je u suštinti bez drugog mAbs sa različinim antigenskim karakteristikama (npr., izolovano antitelo koje specifično vezuje hANGPTL4 je u suštini bez mAbs koje specifično vezuje antigene osim hANGPTL4). Izolovano antitelo koje specifično vezuje hANGPTL4 može, međutim, da ispoljava unakrsnu reaktivnost za druge antigene, kao što su ANGPTL4 molekuli iz drugih vrsta, kao što je cynomolgus majmun i/ili drugi srodni proteini, kao što je humani ANGPTL3.

"Neutrališuće antitelo", kao što je ovde upotrebljeno ( ili "antitelo koje neutrališe aktivnost ANGPTL4 "), odnosi se na antitelo čije vezivanje za ANGPTL4 dovodi do inhbicije najmanje jedne biološke aktivnosti ANGPTL4. Ova inhibicija biološke aktivnosti ANGPTL4 može se odrediti merenjem jednog ili više indikatora ANGPTL4 biološke aktivnosti pomoću jednog ili više standardnih in vitro ili in vivo testova koji sui poznati u tehnici (takođe videti primere u daljem tekstu).

Izraz "površinska plazmon rezonanca ", kao što je vode dato, odnosi se na optički fenomen koji omogućava anlizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu detekcijom alteracija u koncentracijama proteina unutar biosenzor matrice, kao što je na primer, BIACORE™ sistem (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).

Izraz "epitop" je deo/region antigena za koji se vezuje antitelo. Epitopi se mogu definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podgrupa strukturnih epitopa i imaju takve ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcija. Epitopi takođe mogu da budu konformacioni, pri čemu se sastoje od nelinearnih aminokiselina. Epitopi mogu da sadrže determinante koje su hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil grupe, ili sulfonil grupe i u određenim slučajevima mogu da imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.

Izraz "suštinska istovetnost" ili "suštinski identičan," kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, označava da, kad je optimalno poravnana odgovarajućim insercijama ili delecijama nukleotida sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), tada posotji indentičnost nukleotidne sekvence od najmanje 90%, i još bolje od najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, mereno poznatim algoritmom za identite sekvence, kao što je FASTA, BLAST ili GAP, kao što je dato u daljem tekstu.

Kao što se odnosi na polipeptide, izraz "suštinska sličnost " ili "suštinski sličan" odnosi se na dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnane, kao recimo programima GAP ili BESTFIT koristeći zadate tzv. gap weights, a dele najmanje 90% istovetnosti sekvence, a još bolje, najmanje 95%, 98% ili 99% istovetnosti sekvence. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se po konzervativnim supstitucijama aminokiselina.

"Konzervativna supstitucija amino kiselina " je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanje ili hidrofobičnost). Generalno, konzervativna supstitucija amino kiselina neće suštinski promeniti funkcionalne karakteristike proteina. U slučajevima kada se dve ili više sekvenci amino kiselina razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat ili stepen identičnosti može da bude podešen naviše tako da koriguje konzervativnu prirodu supstitucije. Načini izvođenja ovih podešavanja poznati su posečnom stručnjaku. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331. Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sličnih hemijskih osobina su 1) alifatični bočni lanci: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatični – hidroksilni bočni lanci: serin i treonin; 3) bočni lanci sa amidom: asparagin i glutamin; 4) aromatični bočni lanci: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazni bočni lanci: lizin, arginin i histidin; 6) kiseli bočni lanci: aspartat i glutamat, i 7) bočni lanci sa sumporom: cistein i metionin. Poželjne amino kiselinske grupe za konzervativnu supstituciju su: valin-leucinizoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparaginglutamin. Alternativno, konzervativna zamena je svaka promena koja ima pozitivnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250 opisanoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345. "umereno konzervativna" zamena je svaka promena koja ima ne negatvinu vrednostu u matrici log-verovatnoće PAM250.

Sličnost polipeptida sekvenci obično je merena pomoću softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina sparuje slične sekvence merenjem sličnosti koje su pripisane različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativnu supstituciju amino kiselina. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su GAP i BESTFIT koji se mogu upotrebiti sa datim paramerima kako bi se odredila homoligija ili identitet sekvence između bliskih polipeptida, kao što su homologi polipeptidi iz organizama različitih vrsta ili između proteina divljeg tipe i njegovog muteina. Videti, npr., GCG verzija 6.1. Sekvenca polipeptida takođe se može porediti primenom FASTA sa zadatim ili preporučenim parametrima; program u GCG verzija 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) daje poravnanja i procenat identiteta sekvence regiona najboljeg preklapanja između ispitivanih i pretraženih sekvenci (Pearson (2000) supra). Sledeći algoritam kojem se daje prednost za poređenje sekvence pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, prmenom zadatih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.

215: 403410 and (1997) Nucleic Acids Res.25:3389402.

Pod izrazom "terapeutski delotvorna količina " označava se količina koja proizvodi željeni efekat za koji je administrirana. Tačna količina zavisiće od svrhe tretmana, starosti i veličine tretiranog subjekta, načina administracije i slično, i može je utvrditi prosečan stručnjak primenom poznatih tehnika (videti, na primer, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

Priprema humanih antitela

Metode dobijanja humanih antitela u transgenim miševima poznate su u tehnici. Bilo koja poznata metoda se može primeniti u kontekstu predmetnog pronalaska za dobijanje humanih antitel koja se specifično vezuju za ANGPTL4.

Primenom VELOCIMMUNE™ tehnologije ili druge poznate metode za dobijanje monoklonalnih antitela, himerna antitela visokog afiniteta za ANGPTL4 su prvobitno izolovana sa humanim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. Kao što je dato u eksperimentalnom delu, antitela su okarakterisana i odabrana po željenim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop i sl.

Generalno, antitela predmetnog pronalaska poseduju veoma visoke afinitete, obično imaju KDod oko 10<-12>M do oko 10<-9>M, kada je mereno vezivanjem za antigen bilo imobilizovan na čvrstoj fazi ili u rastvoru. Mišji konstantni regioni zamenjeni su željenim humanim konstantnim regionima, na primer, divljeg tipa IgG1 (SEQ ID NO:481) ili IgG4 (SEQ ID NO:482), ili modifikovanim IgG1 ili IgG4 (na primer, SEQ ID NO:483), za dobijanje celih humanih antitela pronalaska. Dok odabrani konstantni region može da varira prema specifičnoj upotrebi, visoko afinitetno vezivanje antigena i karakteristika ciljane specifičnosti antitela leže u varijabilnom regionu.

Mapiranje epitopa i povezane tehnologije

Za skrining antitela koja vezuju posebne epitope, može se izvesti rutinski test unakrsnog blokiranja kao što je onaj opisan u Antitela, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Ostale metode uključuju Ala skeniranje mutanata, peptidne blotove (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), ili analizu peptidnog otcepljivanja. Dodatno, mogu se primeniti metode, kao što je otsecanje epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).

Izraz"epitop" odnosi se na mesto na antigenu na koje odgovaraju B i/ili T ćelije. Epitopi B-ćelija mogu se formirati od dodirnih amino kiselina ili aminokiselina koje se ne dodiruju, a nalaze se jedna pored druge usled tercijarnog savijanja proteina. Epitopi formirani od dodirnih amino kiselina su obično zadržani prilikom izlaganja rastvaračima za denaturizaciju, pri čemu se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube tretiranjem rastvarača za denaturizaciju. Epitop obično sadrži najmanje 3, a češće najmanje 5 ili 8-10 amino kiselina u u jedinstvenoj prostornoj konfromaciji.

Matrica supstitucije PAM (engl. Modification-Assisted Profiling (MAP)), takođe poznata i kao Profilisanje antitela baziranog na strukturi antigena (engl. Antigen Structure-based Antitelo Profiling (ASAP)) je metoda kategorizacije velikog broja monoklonalnih antitela (mAbs) usmerenih na isti antigen prema sličnostima profila vezivanja svakog antitela za hemijski ili enzimski modifikovanu površinu enzima (US 2004/0101920). Svaka kategorija može da refektuje jedinstveni epitop bilo da je značajno različitog oblika ili da se delimično preklapa sa epitopom predstavljenim drugom kategorijom. Ova tehnologija omogućava brzo filtriranje genetski identičnih mAbs, tako da se karakterizacija može fokusirati na genetski različita mAbs. Kada se primeni na skrining hibridoma, MAP može da olakša identifikaciju retkih klonova hibridoma koji proizvode mAbs sa željenim karakteristikama.

MAP se može upotrebiti za sortiranje mAbs na ANGPTL4 pronalaska u grupe mAbs koja vezuju različite epitope.

ANGPTL4 sadrži amino-terminalni domen sa upredenom zavojnicom i karboksil-terminalni domen sličan fibrinogenu i ANGPTL4 protein cele dužine formira oligomer sa intermolekulskim disulfidnim vezama (Ge et al., 2004, J Bio Chem 279(3):2038-2045). Objavljeno je da N-terminalni domen sa upredenom zavojnicom posreduje u oligomerizaciji ANGPTL4's (Ge et al., supra) i takođe je važan u inhibiciji aktivnosti LPL (Ge et al., 2005, J Lipid Res 46:1484-1490; and Ono et al., 2003, J Biol Chem 278:41804-41809). Antitelo na hANGPTL4 ili antigen-vezujući fragment antitela vezuje epitop unutar N-terminalnog domena sa upredenom zavojnicom (ostaci 1-123) hANGPTL4 (SEQ ID NO:476). Antitelo na hANGPTL4 ili njegov fragment može da veže epitop unutar regiona od oko ostatka 1 do oko ostatka 25, od oko ostatka 25 do oko ostatka 50, od oko ostatka 50 do oko ostatka 75, od oko ostatka 75 do oko ostatka 100, od oko ostatka 100 do oko ostatka 125, od oko ostatka 125 do oko ostatka 150, hANGPTL4 (SEQ ID NO:476).

Antitelo ili fragment antitela može da veže epitop koji obuhvata jedan ili više nabrojanih epitopa unutar N-terminalnog domena sa upredenom zavojnicom hANGPTL4. hANGPTL4 antitela ili njihovi fragmenti mogu da vežu jedan ili više fragmenata hANGPTL4, na primer, fragment od ostatka 26 do 406, od ostatka 26 do 148, od ostatka 34 do 66 (antitela pronalaska), i/ili ostatka 165 do 406, SEQ ID NO:476.

Pojedinac može lako da odredi da li se antitelo vezuje za isti epitop kao, ili se takmiči za vezivanje sa, referentnim antitelom na hANGPTL4 pomoću rutinskih metoda poznatih u tehnici. Na primer, da bi se odredilo da li se testirano antitelo vezuje za isti epitop kao referentno antitelo na hANGPTL4 pronalska, referentno antitelo je ostavljeno da se veže za hANGPTL4 protein ili peptid pod uslovima zasićenja. Dalje, određena je sposobnost testiranog antitela da se veže za molekul hANGPTL4. Ako je testirano antitelo sposobno da se veže za hANGPTL4 nakon vezivanje pod uslovima zasićenja, sa referentnim antitelom na hANGPTL4, možemo zaključiti da se testirano antitelo vezuje za različit epitop nego referentno antitelo na hANGPTL4. Sa druge strane, ako testirano antitelo ne može da se veže za molekul hANGPTL4 nakon vezivanja pod uslovima zasićenja, sa referentnim antitelom na hANGPTL4, onda testirano antitelo može da se veže za isti epitop kao epitop vezan referetnim antitelom na hANGPTL4 pronalaska.

Da bi se odredilo da li se antitelo nadmeće za vezivanje sa referentnim antitelom na hANGPTL4, prethodno opisana tehnologija vezivanja izvedena je u dve varijante: u prvoj, referentno antitelo je ostavljeno da se vezuje za molekul hANGPTL4 pod uslovima zasićenja, nakon čega je izvršena procena vezivanja testiranog antitela za molekul hANGPTL4. U drugoj varijanti, testiranom antitelu omogućeno je da se veže za molekul hANGPTL4 pod uslovima zasićenja nakon čega je urađena procena vezivanja referentnog antitela za molekul ANGPTL4. Ako, u obe varijante, samo prvo (zasićenje) antitelo je sposobno da se veže za molekul ANGPTL4, onda možemo zaključiti da se testirano antitelo i referentno antitelo nadmeću za vezivanje za hANGPTL4. Prosečan stručnjak će uvažiti činjenicu, da antitelo koje se nadmeće za vezivanje sa referentnim antitelom ne mora da se veže za identičan epitop kao referentno antitelo, ali može sterno da blokira vezivanje referentnog antitela za preklapajući ili susedni epitop.

Dva antitela vezuju se za isti ili preklapajući epitop ako svako kompetitivno inhibira (blokira) vezivanje drugog za antigen. Tako, 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struki višak jednog antitela inhibira vezivanje drugog najmanje 50% bolje 75%, 90% ili čak 99% mereno u testu kompetitivnog vezivanja (videti, npr., Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502). Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ako u biti sve mutacija amino kiselina u antigenu koje umanjuju ili eliminušu vezivanje jednog antitela, smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Dva antitela imaju preklapajuće epitope ako neke mutacije amino kiselina koje umanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela, smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.

Mogu se sprovesti dodatni rutinski eksperimenti (npr., analize peptidne mutacije i vezivanja) kako bi se potvrdilo da li je zapažen nedostatak vezivanja testiranog antitela posledica vezivanja za isti epitop kao referentno antitelo ili je sterno blokiranje (ili drugi fenomen) odgovorno za nedostatak zapaženog vezivanja. Eksperimenti ovde vrste mogu se izvesti primenom ELISA, RIA, površinske plazmon rezonance, protočne citometrije ili druge kvantitativne ili kvalitativne analie vezivanja antitela poznate u tehnici.

Imunokonjugati

Razmatrana su humana monoklonalna antitela na ANGPTL4 konjugovana za terapeutski ostatak ("imunokonjugat"), kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresant ili radioizotop. Citotokinski agensi obihvataju onaj agens koji je štetan za ćeliju. Primeri odgovarajućih citotoksina i hemoterapeutskih agenasa za obrazovanje imunokonjugata su poznati u tehnici, videti na priemr, WO 05/103081.

Bispecifici

Antitela predmetnog pronalaska mogu da budu monospecifična, bispecifična, ili multispecifična. Multispecifična mAbs mogu da budu specifična za različite epitope jednog ciljanog polipeptida ili mogu da sadrže antigen-vezujuče domene specifične za više ciljanih polipeptida. Videti, npr., Tutt et al. (1991) J. Immunol.147:60-69. Humana mAbs na hANGPTL4 mogu da budu vezana za ili da se ko-eksprimiraju sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugi peptid ili protein. Na primer, antitelo ili njegov fragment može da bude funkcionalno povezan (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili drugačije) za jedan ili više od jednog molekulska entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela, za dobijanje bispecifičnog ili multispecifičnog antitela sa specifičnom drugom karakteristikom vezivanja.

Primeri formata bi-specifičnog antitela koje se može upotrebiti u kontekstu predmetnog pronalaska uključuje upotrebu prvog (Ig) CH3 domena imunoglobulina i drugog Ig CH3 domena, pri čemu se prvi i drugi Ig CH3 domeni razlikuju jedan od drugog po najmanje jednoj amino kiselini i pri čemu razlika u najmanje jednoj amino kiselini umanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u odnosu na bi-specifično antitelo bez razlike u amino kiselinama. U jednoj realizaciji, prvi Ig CH3 domen vezuje Protein A, a drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja umanjuje ili poništava vezivanje Proteina A kao što je H95R modifikacija (prema numeraciji IMGT egzona; H435R prema EU numeraciji). Drugi CH3 može dalje da sadrži i Y96F modifikaciju (prema IMGT; Y436F prema EU). Dalje modifikacije koje se mogu naći u drugom CH3 su: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (by IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I by EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I by EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I prema EU) u slučaju IgG4 antitela. Razmatrane su varijacije na prethodno opisanom formatu bi-specifičnog antitela.

Bioekvivalenti

Antitela na hANGPTL4 i fragmenti antitela predmetnog pronalaska uključuju proteine sa amino kiselinskim sekvencama koje variraju od onih u opisanim mAbs, ali koja zadržavaju sposobnost da vežu humani ANGPTL4. Ova varijanta mAbs i fragmenata antitela sadrže jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija amino kiselina u odnosu na roditeljsku sekvencu, ali ispoljava biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalenta onoj opisanoj za mAbs. Slično, hANGPTL4 antitelo-kodirajuće DNK sekvence predmetnog pronalaska obuhvataju sekvence koje sadrže jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija nukelotida u odnosu na ovde datu sekvencu, ali koje kodiraju antitelo na hANGPTL4 ili fragment antitela koji je u biti bioekvivalent antitelu na hANGPTL4 li fragmentu antitela pronalaska. Primeri ovih varijanti amino kiselinskih i DNK sekvenci su prethodno date.

Dva antigen-vezujuća proteina ili antitela, smatraju se bioekvivalentnima ako su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alterntative čije brzine i opseg apsropcije ne pokazuju značajne razlike kada se adminstriraju u istim molarnim dozama pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo kao jedna ili više doza. Neka antitela će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ako su ekvivalentni u pogledu njihove apsorpcije ali ne i po brzini apsorpcije i sem toga mogu se smatrati bioekvivalentima zbog toga što su razlike u brzini apsorpcije namerne i ogledaju se u označavanju, ali nisu bitne za postizanje delotvorne koncentracije leka u telu za, npr., hroničnu upotrebu i smatraju se medicinski neznačajnim za dati ispitivani lek.

U jednoj realizaciji, dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalenti ukoliko nema klinički značajnih razlika u njihovoj bezbednosti, čistoći i jačini.

Dva antigen-vezujuća proteina mogu da budu bioekvivalenti ukoliko pacijent može da se prebaci dva ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja od rizika od razvoja štetnih efekata, ukljućujući klinički značajnu promenu u imunogeničnosti ili umanjene efikasnosti, u odnosu na kontinuiranu terpaiju bez ovakvog prebacivanja.

Dva antigen-vezujuća proteina mogu da budu bioekvivalenti ukoliko oba deluju po zajedničkom mehanizmu ili mehanizmima dejstva za uslov ili uslove primene, u meri u kojoj su ovi mehanizmi poznati.

Bioekvivalentnost se može prikazati metodama in vivo i in vitro. Mere bioekvivalentnost i uključuju, npr., (a) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima, u kojem je koncentracija antitela ili njegovih metabolita merena u krvi, plazmi, serumu ili drugim biološkim tečnostima kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji sa i prilično je predvidiv za čoveka iz podataka in vivo bioraspoloživosti; (c) in vivo test na ljudima ili drugim životinjama u kojima je odgovarajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegovog cilja) meren ka funkciaj vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju kojim se utvrđuje bezbednost, efikasnost ili bioraspoloživost ili bioekvivalentnost antitela.

Bioekvivalentne varijante antitela na hANGPTL4 pronalaska mogu se konstruisati, na primer, pravljenjem različitih supstitucija aminokiselina ili sekvenci ili uklanjanjem krajnjih ili unutrašnjih aminokiselina ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, cistenski ostaci koji nisu bitni za biološku atkivnost mogu se izostaviti ili zameniti drugim amino kiselinima kako bi se sprečilo formranje nepotrebnnih ili pogrešnih intramolekulskih disulfidnih mostova nakon renaturacije.

Terapeutska administracija i formulacije

Pronalazak obezbeđuje terapeutske kompozicije koje sadrže antitela na hANGPTL4 ili njihove antigen-vezujuće fragmente predmetnog pronalaska i antitela za upotrebu u terapeutskim metodama. Administracija terapeutskih kompozicija u skladu sa pronalaskom sprovedena je sa odgovarajućim nosačima, ekscipijensima i drugim agensima koji su inkorporirani u formulacije kako bi se obezbedio poboljšan transfer, distribucija, tolerancija i sl. Veliki broj odgovarajućih formulacija može se naći u standardnom izdanju poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije obuhvataju, na primer, prahove, paste, meleme, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule (kao što je LIPOFECTIN™) koje sadrže lipid (katjonski ili anjonski), poput DNK konjugata, anhidrovanih apsorpcionih pasti, emulzija ulje-u-vodi i voda-u-ulju, emulzije carbowax-a (polietilen glikoli različitih moelkulskih težina), polu-čvrsti gelovi, i polu-čvrste smeše koje sadrže carbowax. Videti takođe Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

Doza može da varira zavisno od starosti i veličine subjekta koje se administra, ciljane bolesti, svrhe tretmana, stanja, načina administracije i sl. Kada je antitelo predmetnog pronalaska upotrebljeno za lečenje rasličitih stanja i bolesti direktno ili indirektno sa ANGPTL4, uključujući hiperholesterolemiju, bolesti povezane sa LDL i apolipoproteinom B i poremećaji metabolizma lipida i sl., kod odraslih pacijenata, prednost se daje intravenskoj ili subkutanoj administaciji antitela predmetnog pronalaska u jednoj dozi od oko 0.01 do oko 20 mg/kg telesne težine, a bolje oko 0.02 do oko 7, oko 0.03 do oko 5, ili oko 0.05 do okok 3 mg/kg telesne težine. Zavisno od ozbiljnosti stanja, može se podesiti frekvencija i trajanje tretmana. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment pronalaska može se administrirati u početnoj dozi od najmanje oko 0.1 mg do oko 800 mg, oko 1 do oko 500 mg, oko 5 do oko 300 mg, ili oko 10 do oko 200 mg, do oko 100 mg, ili do oko 50 mg. Nakon početne doze može se adminsitrirati druga ili veći broj naknadnih doza antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i količini koja približno može biti ista ili manja od poćetne doze, pri čemu su naknadne doze razdvojene od 1 do 3 dana; najmanje nedelju dana, najmanje 2 nedelje; najmanje 3 nedelje; najmanje 4 nedelje; najmanje 5 nedelja; najmanje 6 nedelja; najmanje 7 nedelja; najmanje 8 nedelja; najmanje 9 nedelja; najmanje 10 nedelja; najmanje 12 nedelja; ili najmanje 14 nedelja.

Poznati su različiti sistemi za distribuciju i mogu se primeniti za primenu faramceutske kompozicije pronalaska, npr., kapsuliranje u lipozomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije koje mogu da eksprimuju mutant viruse, endocitoza posredovana receptorom (videti, npr., Wu et al. (1987) J. Biol. Chem.262:4429-4432). Metode unošenja su, ali ne isključivo, intradermalni, intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, subkutani, intranazalni, epiduralni i oralni način. Kompozicija se može adminsitrirati na bilo koji uobičajeni način, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpicjom kroz epitelne i mukokutane slojeve (npr., oralna mukoza, rektalna i intestinalna mukoza, itd.) i može se administrirati sa drugim biološki aktivnim sastojcima. Administracija može da bude sistemska ili lokalna.

Farmaceutska kompozicija takođe može da bude distribuirana u nosaču, posebno lipozomu (videti Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp.317-327; see generally ibid.).

U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može se distribuirati sistemom kontrolisanog oslobađanja. Može se upotrebiti pumpa (videti Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201). Polimerni materijali se takođe mogu upotrebiti; videti, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). Sistem kontrolisanog oslobađanja može se postaviti u blizini cilja kojem je kompozicija namenjena, zahtevajući tako samo deo sistemske doze (videt, npr., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138, 1984).

Preparati za injektiranje mogu da budu dozni oblici za intravenske, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, drip infuzije, itd. Ovi preparati za injektiranje mogu se pripremiti prema postupcima koji su poznati javnosti. Na primer, preparati za injektiranje mogu se prirpemiti, npr., rastvaranjem, suspendovanjem i emulgacijom antitela ili njegove soli kao što je prethodno opisano u sterilnom vodenom medijumu ili u uljanom medijumu koji se obično koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, na raspolaganju su, na primer, fiziološki rastvor soli, izotoničan rastvor koji sadrži glukozu i druge pomoćne agense, itd., koji se mogu upotrebiti u kombinaciji sa odgovarajućim agensom za rastvaranje kao što je alkohol (npr., etanol), polialkohol (npr., propilen glikol, polietilen glikol), nejonska površinski aktivna sredstva [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukti hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum, koriste se, npr., susamovo ulje, sojino ulje, itd., koje se može upotrebiti u kombinaciji a agensom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Ovako dobijenim rastvorom za injekcije napunjene su ampule. Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se distribuirati subkutano ili intravenski pomoću standardne igle i šprica. Osim toga, u pogledu supkutane primene, uređaj u obliku penkala (pen injektor) ima primenu u isporuci farmaceutskih kompozicija predmentog pronalaska. Pen injektor može biti za višekratnu ili za jednokratnu upotrebu. Uređaj u obliku olovke za višekratnu upotrebu u opštem slučaju koristi zamenjivu patronu koja sarži farmaceutsku kompozciju. Kad je sva farmaceutska kompozicija u patroni utrošena i patrona je prazna, ova prazna patrona se lako može baciti i zamenti novom patronom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Pen injektor se tada može ponovo upotrebiti. U pen injektorima za jednokratnu upotrebi, nema patrone koja se može zameniti. Tačnije, pen injektor za jednokratnu upotrebu je prethodno napunjen farmaceutskim preparatom koji se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Kad je rezervoar ispražnjen, ceo uređaj se odstranjuje.

Mnogi pen injektori i autoinjektori za višekratnu upotrebu imaju primenu u supkutanoj primeni farmaceutsih kompozicija predmetnog pronalaska. Primeri uključuju, bez ograničenja AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II id III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, i OPTICLIK™ (sanofiaventis, Frankfurt, Germany), imenujući samo neke od njih. Primeri pen injektora za jednokratnu upotrebu koji imaju primenu u supkutanoj primeni farmaceutsih kompozicija predmetnog pronalaska uključuju, bez ograničenja SOLOSTAR™ pen (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), i KWIKPEN™ (Eli Lilly).

Poželjno, ovde opisane farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu su pripremljene u doznim oblicima jedinične doze podešene da odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takci dozni oblici jedinične doze uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina sadržanog ranije navedenog antitela je generalno oko 0.1 do oko 800 mg po doznom obliku u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, ranije navedeno antitelo se sadrži u količini od oko 1 do oko 500 mg, oko 5 do 300 mg, oko 8 do 200 mg, i oko 10 do oko 100 mg u drugim doznim oblicima.

Kombinovane terapije

Pronalazak dalje obezbeđuje antitela za upotrebu u terapijskim metodama za lečenje bolesti ili poremećaja, koji su direktno ili indirektno povezani sa hANGPTL4, primenom hANGPTL4 antitela ili njegovog fragmenta u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapijskih sredstava. Dodatno terapijsko sredstvo može biti jedno ili više bilo koga sredstva koje se pogodno kombinuje sa antitelom pronalaska ili njegovim fragmentom, uključujući inhibitore HMG-CoA reduktaze, kao što su cerovastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastin, ros uvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, i slični; niacin; razni fibrati, kao što je fenofibrat, bezafibrat, ciprofibrat, clofibrat, gemfibrozil, i slični; aktivatori LXR transkripcionog faktora, i slični. Osim toga, hANGPTL4 antitelo pronalaska ili njegov fragment može biti primenjeno zajedno sa drugim ANGPTL4 inhibitorima kao i sa inhibitorima drugih molekula, kao što su ANGPTL3, ANGPTL5, ANGPTL6 i proprotein konvertaza subtilisin/keksin tip 9 (PCSK9), koji su uključeni u metabolizam lipida, posebno u homeostazu holesterola i/ili triglicerida. Inhibitori ovih molekula uklljučuju male molekule i antitela koja se specifično vezuju za ove molekule i blokiraju njihovu aktivnost (videti, na primer, antitela na PCSK9 opisana u U.S.2010/0166768 A1).

Osim toga, dodatna terapijska sredstva mogu biti jedno ili više antikancernih sredstava, kao što su hemoterapijska sredstva, antiangiogena sredstva, sredstva za inhibiciju rasta, citotoksična sredstva, apoptotična sredstva, i druga sredstva dobro poznata u tehnici za lečenje kancera i drugih proliferativnih oboljenja ili poremećaja. Primeri antikancernih sredstava uključuju, bez ograničenja, antimitotičko sredstvo, kao što je docetaksel, paclitaksel, i slična; hemoterpijska jedinjenja na bazi platine, kao što su cisplatin, karboplatin, iproplatin, oksaliplatin, u slična; ili druga konvencionalna citotoksična sredstva, kao što su 5-fluorouracil, capecitabin, irinotecan, leucovorin, gemcitabin, i slični, i antingiogena sredstva, uključujući antagoniste vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF), kao što su antitela na VEGF, npr., bevacizumab (AVASTIN®, Genentech) i receptor-bazirani VEGF blokator, npr., "VEGF trap" opisan u US Patentu No.7,070,959, antagonosti delta-sličnog liganda 4 (DII4), kao što su antitela na DII4 opisana u U.S. Patentnoj prijavi No.2008/0181899, fuzioni protein koji sadrži ekstracelularni domen DII4, npr., DII4-Fc kao što je opisano u U.S. Patentnoj prijavi No.2008/0107648; inhibitori receptora tirozin kinaze i/ili angiogeneze, uključujući sorafenib (NEXAVAR®, Bayer Pharmaceuticals Corp.), sunitinib (SUTENT® , Pfizer), pazopanib (VOTRIENT™ , GlaxoSmithKline), toceranib (PALLADIA™, Pfizer), vandetanib (ZACTIMA™ ,AstraZeneca), cediranib (RECENTIN® , AstraZeneca), regorafenib (BAY 73-4506, Bayer), axitinib (AG013736, Pfizer), lestaurtinib (CEP-701, Cephalon), erlotinib (TARCEVA®, Genentech), gefitinib (IRESSA™, AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK™ , Boehringer Ingelheim), lapatinib (TYKERB® , GlaxoSmithKline), neratinib (HKI-272 , Wyeth/Pfizer), i slični, i farmacijski prihvatljive soli, kiseline li derivati bilo kojih gore navednih. Osim toga, druga terapijska sredstva, kao što su analgetici, antiinflamatorska sredstva, uključujući nesteroidne antiinflamatorne lekove (NSAIDS), kao što su Cox-2 inhibitori, i slični, mogu se takođe primenjivati zajedno sa hANGPTL4 antitelom pronalaska ili njegovim fragmentom da bi se ublažili i/ili smanjili simptomi koji prate osnovni kancer/tumor.

Antitelo hANGPTL4 pronalaska ili njegov fragment i dodatno tarapijsko sredstvo (sredstva) mogu se primenjivati zajedno ili odvojeno. Kad se upotrebljavaju posebni dozni oblici, antitelo pronalaska ili njegov fragment i dodatno sredstvo mogi se primenjivati istovremeno, ili odvojeno u određeno vreme, tj., uzastopno, odgovarajućim redom.

Diagnostička upotreba antitela

Antitela na ANGPTL4 predmetnog pronalaska mogu se takođe upotrebiti za detekciju i/ili određivanje ANGPTL4 u uzorku, npr., u dijagnostičke svrhe.. Na primer, Ab na ANGPTL4 ili njegov fragment, mogu se upotrebiti za dijagnozu stanja ili bolesti koje se karakterišu nenormalnom ekspresijom (npr., prekomerna ekspresija, smanjena ekspresija, nedostatak ekspresije, itd.) ANGPTL4. Reprezentativne dijagnostičke analize za ANGPTL4 mogu da sadrže, npr., dovođenje u kontakt uzorka dobijenog od pacijenta sa Ab na ANGPTL4 pronalaska, pri čemu je antitelo na ANGPTL4 obeleženo oznakom koja se može detektovati ili reporter molekulom ili upotrebiti da se selektivno imoblizuje (zarobi/zahvati) i izoluje ANGPTL4 protein iz uzoraka pacijenta. Alternativno, neobeleženo Ab na ANGPTL4 može se upotrebiti za dijagnostičke primene u kombinaciji sa sekundarnim antitelom obeleženim oznakom koja se može detektovati. Oznaka koja se može detektovati ili reporter molekul može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S,<131>I ili<125>I; fluorescentna ili hemiluminescentna grupa, kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, peroksidaza rena, ili luciferaza. Analize koje se mogu upotrebiti za detektovanje ili određivanje ANGPTL4 u uzorku uključuju enzimski imunovezujući test (ELISA), radioimunološki test (RIA), ćelijsko sortiranje aktivirano fluorescencijom (FACS), i slično.

PRIMERI

Uložen je trud da se osigura tačnost u pogledu brojeva , ali neke eksperomentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Ukoliko nije drugačije naznačeno, molekulska težina je srednja molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, i pritisak je na atmosferskom ili oko atmosferskog pritiska

Primer 1: Generisanje humanih antitela u humani ANGPTL4

VELOCIMMUNE™ miševi su imunizovani sa humanim ANGPTL4, i imuni odgovor antitela praćen antigen-specifičnim imunotestom upotrebom seruma dobijenog od ovih miševa. Pokazalo se da anti-hANGPTL4 eksprimirajuće B ćelije sakupljene iz slezine

imunizovanih miševa imanju povišene titre antitela na hANGPTL4 i fuzionisane su sa mišjim mijelomskim ćelijama da stvore hibridome. Hibridomi su skrinovani i izabrani za identifikaciju ćelijskih linija koje eksprimiraju hANGPTL4-specifična antitela koristeći testove opisane u tekstu koji sledi Testovi su identifikovali više ćelijskih linija koje su proizvele himerna antitela na hANGPTL4 označena kao H 1 M222, H 1 M223, H 1 M224, H 1 M225, H 1 M234 i H 1 M236.

Humana ANGPTL4-specifična antitela su takođe izolovana direktno iz antigenimunizovanih B ćelija bez fuzije sa mijelomnim ćelijama, kao što ie opisano u U.S.

2007/0280945 A1. Teški i laki lanci varijabilnih regiona su klonirani da bi se generisala potpuna/cela humana antitela na hANGPTL4 označena kao H1H257, H1H268, H1H283, H1H284, H1H285, H1H291, H1H292, H1 H295, H1 H624, H1 H637, H1 H638, H1 H644 i H1 H653. Ustanovljene su stabilne antitelo-eksprimirajuće CHO rekombinantne ćelijske linije

Primer 2. Analiza korišćenja varijabilnog gena

Da bi se analizirala struktura proizvedenih antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju varijablilne regione antitela su klonirane i sekvencirane. Iz sekvence nukleinske kiseline i predviđene sekvece aminokiseline antitela, identifikovano je korišćenje gena za svaki varijabilni region teškog lanca (HCVR) i varijabilni region lakog lanca (LCVR). Tabela 1 prikazuje korišćenje izabranih antitela u skladu sa pronalaskom.

Tabela 1

Tabela 2 prikazuje varijabilni region teškog i lakog lanca sekvence amino kiseline parova izabranih antitela na hANGPTL4 i njihovih odgovarajućih identifikatora antitela. Oznake N, P i L odnose se na antitela koja imaju teške i lake lance sa identičnim CDR sekvencama, ali sa varijacijama sekvence u regionima izvan CDR sekvenci (tj., u okvirnim regionima). Tako, N, P i L varijante posebnog antitela imaju identične CDR sekvence unutar svojih varijabilnih regiona teškiog i lakog lanca ali sadrže modifikacije u okvirnim regionima. Tabela 2

HCVR/LCVR SEQ HCVR/LCVR SEQ HCVR/LCVR SEQ Naziv Naziv Naziv

Primer 3. Određivanje afiniteta vezivanja hANGPTL4

Konstante ravnoteže disocijacije (KDvrednosti) za vezivanje antigena za odabrana antitela koja vezuju aminokiselinske ostatke 26-148 humanog ANGPTL4 fuzionisane u istom okviru čitanja sa mišjim IgG2a (hANGPTL4-mFc; SEQ ID NO:480) određene su kinetikom površine upotrebom testa biosenzorske rezonancije površinskih plazmona u realnom vremenu (BIACORE™ T100). hANGPTL4-mFc je imobilizovan kozjim anti-mišjim IgG poliklonalnim antitelom (GE Healthcare) koje je hemijski kuplovano za BIACORE™ čip preko slobodnih amino grupa. Različite koncentracije (u rasponu od 12.5 nM do 50 nM) antitela na ANGPTL4 su injektirane preko površine imobilizovanog antigena tokom 90 sekundi. Antigen-antitelo vezivanje i disocijacija su kontrolisani u realnom vremenu na 25°C i 37°C. Izvedena je kinetička analiza da bi se izračunali KDi poluživot disocijacije kompleksa antigen/antitelo. Rezultati su prikazani u Tabeli 3. Humano antitelo na EGFR je upotrebljeno kao negativna kontrola koja je pokazala da nema vezivanja za imobilizovan hANGPTL4-mFc.

Tabela 3

25°C 37°C Antitelo

D(pM/2(mi KD(pM)2(min)

H1H624P 1190 7 3710 3

H1H638P 193 85 299 48

H1H644P 111 144 3000 6

H1H653P 411 43 2130 6

Za H1 H268P and H1 H284P, Fab fragmenti su pripremljeni digestijom papaina i prečišćeni standardnim metodama prečišćavanja, i njihovi afiniteti vezivanja za hANGPTL4 su mereni na 25°C i pH 7.2 i pH 5.75 upotrebom BIACORE™ sistema, u suštini prema ranije opisanoj metodi. Ukratko, razne koncentracije (3.125 nM-100 nM) antitela na hANGPTL4 (tj., H1 H268 Fab, sav H1 H268 mAb, H1 H284 Fab, i sav H1 H284 mAb) su injektirani preko površine imobilizovanog anti-mFc hANGPTL4(26-148)-mFc (∼68 ± 4 RU) male gustine ili površine amino-kuplovanog hANGPTL4(26-406)-His (R&D Systems) (450 RU) ili amino-kuplovanog N-terminalnog/N-kranjeng regiona cynomolgus majmina (aminokiselinski ostaci 1-130 u SEQ ID NO:490) eksprimirani sa C-kraja heksahistidin tagom (MfANGPTL4(1-130)-His) (1,028 RU). Izvedena je kinetička analiza da bi se odredile vrednosti kai kd, i izračunate su KDvrednosti i poluživot disocijacije kompleksa antigen/antitelo. Rezultati su prikazani u Tabeli 4 (H1 H268P) i Tabeli 5 (H1 H284P). Tabela 4

Antitelo t Antigen1/2

H1H268P antigen (RU) 1 pM) (min) vezani Fab 1 ) (

50 mM k

Antitelo imobilizovana

k t Antigen pH mAb ili (M-1s-d(s- KD 1/2

H1H268P antigen (RU) 1 pM) (min) vezani Fab 1 ) (

Tabela 5

50 mM k Imobilizovana

- kd(s- K Antigen pH mAb ili (M-1sDt1/2

H1H284P antigen (RU) 1) (pM) (min) v z ni F 1

Oba fragmenta Fab mogu da se vezuju za sve oblike ANGPTL4, mada sa manjim afinitetom za cele molekule antitela.

Primer 4. Određivanje unakrsne reaktivnosti antitela na hANGPTL4

Moguća unakrsna aktivnost antitela na hANGPTL4 na srodne proteine, tj., hANGPTL3, humani protein 5 sličan angiopoetinu (hANGPTL5) i mišlji ANGPTL4 (mANGPTL4), testirana je za odabrana antitela, tj., H1 H268P i H1 H284P, upotrebom BIACORE™ sistema. Ukratko, antitela na hANGPTL4 kao i negativne kontrole, tj., dva monoklonalna antitela (kontrola a i kontrola b) koja se ne vezuju za bilo koje ANGPTL proteine, injektorana su sa 3.125 µg/mL-50 µg/mL preko površina amino kuplovanih čipova hANGPTL3-His (R&D Systems, cat # 3829-AN) na 5228 RU, hANGPTL4-His (R&D Systems, cat # 4487-AN) na 6247 RU, hANGPTL5-His (Abnova Corp., cat # H00253935-P01) na 5265 RU, odnosno mANGPTL4-His [R26-S410 mANGPTL4 (SEQ ID NO: 478) fuzionisan sa AS linkerom za C-terminalni 6-histidin tag] na 5233 RU, Poliklonalno antitelo specifično za hANGPTL3 (R&D System, cat # BAF3485) takođe je testirano. Određeno je vezivanje svakog antitela, izraženo kao specifična RU vrednost i rezultati su prikazani u Tabeli 6.

Tabela 6

Specifični RU

Injectirani m

hANGPTL3-His hANGPTL4-His hANGPTL PTL4-His

pufer -17 -23 -18 -7

H1H268P -17 768 -16 -7

H1H284P -6 1351 -13 18

kontrola a -16 -23 -18 -6

kontrola b -17 -23 -18 -6

Anti-hANGP 680 -1 -1 2319

H1 H268P i H1 H284P se vezuju samo specifično za hANGPTL4-His i nisu se vezali za bilo koje druge ANGPTL proteine.

Osim toga, afiniteti vezivanja H1 H268P i H1 H284P za razne ANGPTL3 i ANGPTL4 peptide takođe su određeni BIACORE™ sistemom. Ukratko, H1 H268P (1348 ± 11 RU) i H1 H284P (868 ± 13 RU) suimobilizovani (zarobljeni) preko površine anti-humanog Fc i injektirane su razne koncentracije (62.5 nM-500 nM) hANGPTL3 i hANGPTL4 peptida. Testirani peptidi bili su hANGPTL4 (R34-L66, SEQ ID NO:476), N-terminalno biotinilizovan hANGPTL4 (R34-L66, SEQ ID NO:476), hANGPTL3 (R36-I68, SEQ ID NO:485), i N-terminalno biotinilizovan hANGPTL3 (R36-I68, SEQ ID NO:485). Kinetička analiza je izvedena da bi se odredile vrednosti kai kd, i izračunate su KDvrednosti i poluživot disocijacije kompleksa antigen/antitelo. Rezultati su prikazani u Tabeli 7. NB: pod opisanim eksperimentalnim uslovima nema vezivanja.

Tabela 7

Nijedno od antitela nije se vezalo za bilo koji od hANGPTL3 peptida. Osim toga, H1 H284P se nije vezao ni za jedan od hANGPTL4 peptida čak ni na najvišoj testiranoj koncentraciji peptida (500 nM), dok je H1 H268P bio sposoban da se veže za oba hANGPTL4 peptida. Ovo nagoveštava da H1 H268P prepoznaje linearni epitop u 34-66 regionu. Nasuprot ovome, H1 H284P se ili vezuje izvan ovog regiona ili ne prepoznaje linearni epitop u ovom regionu.

Primer 5. Inhibicija hANGPTL4 antitelima na ANGPTL4

Lipoprotein lipaza (LPL) ima kritičnu ulogu u metabolizmu lipida kod ljudi. LPL katalizuje hidrolizu triglicerida i oslobađa masne kiseline da bi se metabolizovale. ANGPTL4 inhibira aktivnost LPL što dovodii do povećanog nivoa lipida (Oike et al., 2005, Trends in Molecular Medicine 11 (10):473-479). N-terminalni region u obliku upredene zavojnice ANGPTL4 prolazi kroz homo-multimerizaciju, i kad je izolovan , i kad je pripojen za C-terminalni region sličan fibrinogenu. N-terminalni region takođe inhibira LPL kad je eksprimiran bez C-terminalnog fibrinogen regiona. Razvijen je biološki bezćelijski test za određivanje sposobnosti odabranih antitela na hANGPTL4 da inhibiraju smanjenje aktivnosti LPL indukovano ANGPTL4.

Inhibicija delovanja hANGPTL4 odabranim antitelima na hANGPTL4 je određena korišćenjem kontinualne fluorometrijske analize lipaze CONFLUOLIP™ (Progen, Germany) upotrebom dva hANGPTL4 proteina: hANGPTL4 pune dužine (tj., aminokiselinski ostaci 26-406, SEQ ID NO:476) sa C-terminalnim heksa-histidin tagom (hANGPTL4-His; R&D Systems, MN) i hANGPTL4-mFc (SEQ ID NO:480) koji sadrži N-terminalni region u obliku upredene zavojinice.

Ukratko, 2 nM goveđeg LPL, 0.25 µM humanog ApoCII (kofaktor LPL-a), 2 mg/mL BSA i 1.6mM CaCl2, prethodno su pomešani u ploči sa 96-ležišta. Ili hANGPTL4-His, ili hANGPTL4-mFc protein je dodan u Apo/LPL m smešu do krajnje koncentracije od 10 nM, odnosno 2 nM. Apo/LPL/ANGPTL4 smeše proteina su zatim dodane zajedno sa serijski razblaženim antitelima na hANGPTL4, sa početnom koncentracijom od 300 nM (za inhibiciju hANGPTL4-His) ili 100 nM (za inhibiciju hANGPTL4-mFc) i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 30 minut (krajnja zapremina 50 µl). Posle inkubacije, 200 µl rekonstituisanog supstrata lipaze, 1-trinitrofenill-amino-dodecanoil-2-pirendecanoil-3-0-heksadecil-sn-glicerola (LS-A, Progen), dodano je smeši antitela i inkubirano na 37°C tokom dva sata. Fluorescencija je zatim merena na 342 nm/400 nm (ekscitacija/emisija) upotrebom FlexStation® 3 čitača mikroploče (Molecular Devices, CA). Fluorescencija je direktno proporcionalna aktivnosti LPL. Rezultati su prikazani u Tabel 8. Kontrola I: zečje poliklonalno antitelo specifično za hANGPTL4 (BioVendor). Kontrola II: irelevantno humano antitelo koje ne vezuje hANGPTL4. NT: nije testirano. Ukupna inhibicija (tj., 100% inhibicije) je određena iz relativne jedinice fluorescencije (RFU) analize sa 2 nM goveđeg LPL, 0.25 µM humanog ApoCII, 2 mg/mL BSA i 1.6mM CaCl2, u odsustvu antitela na ANGPTL4 i ANGPTL4 proteina.

Tabela 8

Antitela H1 H284P i H1 H268P su pokazala najveću inhibiciju delovanja ANGPTL4 prema LPL međi testiranim antitelima, uključujući kontrolu poliklonalno hANGPTL4 antitelo. Za antitela H1 H284P i H1 H268P, određeno je da koncentracije antitela potrebne za 50% maksimalne inhibicije (IC50) 2 nM hANGPTL4-mFc iznosi 0.8 nM, odnosno 1.2 nM. Osim toga, određeno je da koncentracije antitela potrebna za 50% maksimalne inhibicije 10 nM hANGPTL4-His iznose 0.5 nM, odnosno 0.2 nM.

Na sličan način proverena je sposobnost H1 H284P i H1 H268P da inhibiraju ortologe drugih vrsta LPL biološkim testom: cynomolgus mišji N-terminalni region (aminokiselinski ostaci 26-148) eksprimiran sa N-terminalnim heksa-histidin tagom (His-MfANGPTL4; SEQ ID NO:488) i mišji ortolog cele dužine (aminokiselinski ostaci 26-410 u SEQ ID NO:478) sa C-terminalnim heksa-histidin tagom (mANGPTL4-His). Cela kriva odgovora na dozu određena je prvo korišćenjem ANGPTL4 proteina u LPL testu da bi se prvo odredila vrednost ANGPTL4 EC50 za svaki eksperiment i zatim su izvedena određivanja IC50 za svako antitelo upotrebom konstantnih koncentracija ANGPTL4 proteina, kao što je prikazano u Tabeli 9. Koncentracije antitela su bile u rasponu od 0 do 100 nM. NB: bez blokiranja.

Tabela 9

Oba antitela inhibirala su aktivnost i humanog ANGPTL4 (cele dužine i N-terminalni) i majminskog ANGPTL4 (N-terminalni) proteina sa vrednostima IC50 od oko 0.3-0.5 nM; ali nijedno antitelo nije inhibiralo mišji ANGPTL4 (cele dužine) ni do najviših testiranih koncentracija antitela (tj., 100 nM).

Primer 6. Aktivnost ANGPTL4 na nivoe lipida u plazmi in vivo

hANGPTL4 je dat intravenozno C57BL/6 miševima da bi se odredio biološko aktivnostj hANGPTL4 na nivoe lipida u plazmi. Ukratko, C57BL/6 miševi su podeljeni u četiri grupe od pet životinja i svakoj grupi je data različita količina hANGPTL4-mFc proteina (SEQ ID NO:480): 25 µg, 50 µg, 100 µg i 300 µg, po mišu. Kontrolna grupa je dobila injekcije PBS. hANGPTL4-mFc protein i PBS su dati intravenoznom injekcijom (i.v.) kroz repnu venu. Miševima je uzeta krv na 15min, 30min, 60min i 120min posle davanja hANGPTL4-mFc ili PBS i nivoi lipida u plazmi su određeni sa ADVIA® 1650 Chemistry System (Siemens).

Izvršena su merenja triglicerida, ukupni holesterol, lipoprotein male gustine (LDL), neesterifikovane masne kiseline (NEFA-C) i lipoprotein velike gustine (HDL) za svaku grupu doze. Vrednosti ukupnog holesterola, LDL, NEFA-C i HDL nisu bila značajno različita u grupama doze za svaku vremensku tačku posle injekcije. Injekcija od 25 µg/miš hANGPTL4-mFc povećala je je trigliceride u cirkulaciji, više nego dvostruko u poređenju sa kontrolnim mišem (PBS) 30 minuta posle injekcije. Prema tome doza od 25 µg hANGPTL4-mFc je odabrana kao moguća minimalna doza za inihibiciju ANGPTL4-indukovanog povećanja nivoa triglicerida u serumu izabranim antitelima na hANGPTL4 kako je opisano u tekstu koji sledi.

Primer 7. In Vivo inhibicija ANGPTL4 antitelima na ANGPTL4

U drugom setu eksperimenata, testirana je sposobnost odabranih antitela na hANGPTL4 da inhibiraju hANGPTL4-indukovano povećanje nivoa triglicerida. Takođe su izvršena merenja ukupnog holesterola (ukupni-C), LDL, NEFA-C i HDL Ukratko, C57BU6 miševi su stavljeni u grupe od po pet miševa za svako testirano antitelo. Antitela su data sa dozom od 5 mg/kg supkutanom injekcijom. Kontrolnoj grupi I, tj., miševima koji nisu dobili ni antitela na hANGPTL4 niti hANGPTL4, dat je PBS. Dvadeset četiri sata posle injekcije antitela, hANGPTL4-mFc (SEQ ID NO:480) je dat (i.v.) sa dozom od 25 µg/miš svakoj grupi antitela. Miševima je uzeta krv 30 min posle hANGPTL4-mFc injekcije i nivoi lipida određeni sa ADVIA® 1650 Chemistry System (Siemens). Izračunate su srednje vrednosti za svako merenje triglicerida, ukupnog holesterola, LDL, NEFA-C i HDL za svaku grupu antitela ili kontrolnu grupu. Nivoi antitela na hANGPTL4 u ciruklaciji (serumska Ab) su takođe određeni upotrebom standardnog ELISA testa. Ukratko, ploče su obložene kozjim anti-humanim Fc antitelom (Sigma-Aldrich) da bi se imobilisala serumska Ab. Serum je zatim dodan na ploče i zahvaćena antitela na hANGPTL4 su detektovana hemiluminescencijom upotrebom peroksidaze rena (HRP) konjugovane sa kozjim antihumanim IgG antitelom (Sigma-Aldrich). Rezultati, izraženi kao (srednja vrednost ± sd) koncentracije lipida u serumu, prikazani suu Tabelama 10-12. Kontrola I: Miševi koji su dobili PBS, ali nisu antitela na hANGPTL4 niti hANGPTL4-mFc. Kontroal II: Miševi koji su dobili humano antitelo specifično za CD20 (tj., mAb koji ima sekvence 2F2 klona opisanog u US 2008/0260641) i hANGPTL4-mFc.

Tabela 10

Ab

5.60 ± 44.18 ±

Kontrola I 98.20 ± 5.49 89.80 ± 4.28 1.01 ± 0.04 -0.66 2.43

Kontrola 211.60 ± 58.29 93.40 ± 5.52 6.30 ± 1.33 ± 0.17 44.62 ± 12.76 ± 0.52

Posle injekcije hANGPTL4-mFc (25 µg), najveći deo testiranih antitela na hANGPTL4 (prikazanih u Tabelama 10-12) pokazao je značajno smanjene nivoe triglicerida u serumu u poređenju sa miševima koji su tretirani irelevantnim antitelom (kontrola II).

Primer 8. Priprema antitela na ANGPTL4 sa izotipom hlgG4.

Antitela H1 H268P id H1 H284P sa hlgG1 izotipom pretvorena su uhlgG4 izotip zamenom odgovarajućih konstantnuh regiona sa hlgG4 aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:483, koja sadrži S108P mutaciju u pregibnom regionu. Osim toga, supstitucija jednom aminokiselinom je uvedena u okvirni region 1 H1 H268P (SEQ ID NO:42) da bi se formirao H4H268P2 (SEQ ID NO:487) u IgG4 verziji. KD(pM) i t1/2vrednosti IgG4 antitela, označenih kao H4H268P2, odnosno H4H284P, za vezivanje hANGPTL4-mFc (SEQ ID NO:480) dobijene su sa Biacore na pH7.4 i 25°C, prema protokolu opisanom ranije u Primeru 3. Rezutultati su prikazani u Tabeli 13 koja sledi.

Tabela 13

H4H268P2 i H4H284P zajedno sa odgovarajućim IgG1 verzijama, H1 H268P, odnosno H1 H284P, testirani su u analizi inhibicije LPL, kao što je opisano ranije u Primeru 5, da bi se odredile vrednosti IC50. Rezultati su prikazani u Tabeli 14. NB: bez blokiranja.

Tabela 14

-148)-mFc U ovoj analizi, H1 H268P i H1 H284P imaju vrednosti IC50 u rasponu od oko 0.2-0.7 nM za pune dužine iN-terminalne hANGPTL4 proteine, dok H4H268P2 i H4H284P imaju IC50 vrednosti u rasponu od oko 1.0-2.0 nM.

Primer 9. Farmakokinetička ispitivanja antitela na ANGPTL4

Brzine farmakokinetičkog klirinsa anti-hANGPTL4 antitela H4H268P2 i H4H284P određene su kod miševa divljeg tipa i kod transgenih miševa koji eskprimiraju humani ANGPTL4 [hANGPTL4(+/+) miševi]. Poreklo soja i za miševe divljeg tipa i za transgene miševe bili su C57BL6 (75%) i 129Sv (25%). Odvojene kohorte koje sadrže po 5 miševa svaki divljeg tipa ili hANGPTL4(+/+) miševa dobile su supkutano (s.c.) 1 mg/kg H4H268P2, H4H284P ili kontrolu sa odgovarajućim izotipom (hIgG4) irelevantne specifičnosti. Uzorci krvi su sakupljeni na 0 sata, 6 sati, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 7 dana, 10 dana, i 15 dana, 22 dana, i 30 dana posle injekcije. Serumski nivoi humanih antitela su određeni sendvič ELISA testom. Ukratko, imobilizovano kozje poliklonalno antihumano IgG (Fc-specifično) antitelo (Jackson ImmunoResearch, PA) je obloženo u ploče sa 96 ležišta sa koncentracijom od 1 µg/mL i inkubirano preko noći na 4°C. Pošto su ploče blokirane sa BSA, uzorci seuma u šest razčitih razblaženja i referentni standardi odgovarajućeg antitela u dvanaest različitih razblaženju su dodani ploči i inkubirani tokom jednog sata na sobnoj temperature. Posle ispiranja pogodnim puferom za ispiranje, imobilizovana humana antitela su detektovana upotrebom istog kozjeg poliklonalnog antihumanog IgG (Fc-specifičnog) antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP) (Jackson ImmunoResearch, PA) i razvijeni standardnim kolorimetrijskim odgovorom upotrebom tetrametilbenzidin (TMB) supstrata, merenjem apsorbancije na 450 nm u čitaču ploče. Koncentracije humanih antitela u serumu su određene korišćenjem referentne standardne krive generisane za istu ploču uzorka. Rezltati su prikazani u Tabeli 15 i Slikama 3A i 3B.

Tabela 15

Antitelo Mišji genotip ax (µg/ (hr*µg/mL)

H4H268P2 Divljeg tipa 18.4 318

H4H284P Divljeg tipa 15.7 200

hIgG4 kontrol Divljeg tipa 14.2 199

H4H268P2 ANGPTL4(+/+ 13.3 37.0

H4H284P ANGPTL4(+/+ 5.86 7.60

hIgG4 kontrol ANGPTL4(+/+ 11.6 168

Kako je prikazano u Tabeli 15, oba antitela na hANGPTL4 su pokazala slične brzine klirensa kao kontrolno antitelo sa odgovarajućim izotipom kod miševa divljeg tipa, što je pokazano površinom ispod krive (AUC) izračunate tokom perioda od 30 dana koja iznosi oko 318, 200, odnosno 199 (h*µg/mL), za H4H268P2, H4H284P, i hIgG4 kontrolu (videti takođe Sl.3a). Kod transgenih miševa koji eksprimiraju samo humani ANGPTL4 [hANGPTL4(+/+)], brzine klirensa prikazane sa AUCs su brže za oba H4H268P2 (37.0 hr*µg/mL) i H4H284P (7.60 h*µg/mL) u poređenju sa brzinama klirensa kod miševa divljeg tipa (318, odnosno 200 h*µg/mL) i u poređenju sa brzinama klirensa kontrolnog antitela sa odgovarajućoim isotipom kod hANGPTL4(+/+) miševa (168 h*µg/mL) ili kod miševa divljeg tipa (199 h*µg/mL) (takođe videti Sl, 3B). Kod hANGPTL4(+/+) miševa, 30-dnevna AUC za H4H284P (7.60 h*µg/mL) je bila oko 5 puta manja nego ona za H4H268P2 (37.0 h*µg/mL). Zajedno,ovi rezultati ukazuju da oba antitela na hANGPTL4 pokazuju ciljem posredovan klirens kod miševa koji eksprimiraju humani ANGPTL4, H4H284P ispoljava suštinski brži klirens nego H4H268P2.

Primer 10. In Vivo aktivvnost IgG1 antitela na hANGPTL4 na nivoe TG u cirkulaciji kod humanizovanih ANGPTL4 miševa

Aktivnost anti-hANGPTL4 antitela H1 H268P i H1 H284P na nivoe TG u serumu određeno je kod miševa koji eksprimiraju ANGPTL4 protein koji sadrži humani N-terminalni region u obliku upredene zavojnice ("humanizovani ANGPTL4 miševi"). Humanizovani ANGPTL4 miševi su načinjeni zamenom prva tri eksona mišjeg Angptl4 gena (N terminalni region u obliku upredene zavojnice) odgovarajućim humanim N-terminalnim u obliku zavojnice ANGPLT4 sekvencama u C57BL6/129 (F1 H4) embrionskim matičnim ćelijama. Pošto je uspostavljeno prenošenje embrionalne linije, terminalnih heterozigotni miševi (ANGPTL4hum/+) da bi se dobili homozigotni miševi [ANGPTL4hum/hum ili hANGPTL4(+/+)] na osnovi C57BL6. Humanizovanim ANGPTL4 miševima je uzeta krv 7 dana (dan -7) pre ekspreimenta i stavljena u u grupe od šest miševa za svako testirano antitel. Antitela (H1 H268P, H1 H284P i kao kontrola sa odgovarajućim izotipom (hIgG1) bez poznate uankrsne reakcije na mišje antigene) su dati sa dozom od 10 mg/kg supkutanom injekcijom. Miševima je uzeta krv posle 4 sata izgladnjivanja na dane 1, 4, 7 i 11 posle injekcije antitela; i nivoi TG u sumu određeni su sa ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Srednji nivoi TG su izračunati sa svaku vremensku tačku, za svako antitelo. Rezultati izraženi kao (srednja vrednost ± sd) koncentracije TG, prikazani su u Tabeli 16.

Tabela 16

Nivoi antitela na hANGPTL4 ("serumska humana Ab") u crikulaciji su takođe određeni standardnim ELISA testom. Ukratko, ploče su obložene kozjim anti-humanim Fc antitelom (Sigma-Aldrich) da bi se imobilizovao serumski humani Ab. Serum je tada dodan u ploče i imobilizovana antitela na hANGPTL4 su detektovana hemiluminescencijom upotrebom peroksidazom rena (HRP)-konjugovanog kozjeg anti-humanog IgG antitela (Sigma-Aldrich). Rezultati izraženi kao (srednja vrednost ± sd) serumskog humanog AB prikazani su uTabeli 17.

Tabela 17

Primena H1 H268P kod humanizovanih ANGPTL4 miševa dovela je do smanjenja od ∼25-30% cirk TG u cirkulaciji, 4-11 dana posle davanja antitela, u poređenju sa miševima kojima kontrolno antitelo sa odgovarajućim izotipom. Smanjenje TG nastalo usled primene H1 H284P je bilo najdelotvornije na dan 4 posle injekcije atnitela (∼34% smanjenje TG), ali na dan 11 nivoi TG su se ponovo porasli na nivo kontrole, verovatno usled brzog klirensa antitela.

Primer 11. In Vivo aktivnost IgG4 antitela na hANGPTL4 na nivoe TG u cirkulaciji kod humanizovanih ANGPTL4 miševa

Aktivnost anti-hANGPTL4 antitela, H4H268P2 i H4H284P, na nivoe serumskog TG odeređeno je kod humanizovanih ANGPTL4 miševa. Humanizovanim ANGPTL4 miševima je prehtodno uzeta krv 7 dana pre eksperimenta i stavljena u grupe od po šest miševa za svako testirano antitelo. Antitela (H4H268P2, H4H284P i kontrola sa odgovarajućim izotipom (hIgG4) bez poznate unakrsne reakcije na mišje antigene dati su sa dozom od 10 mg/kg subkutanom injekcijom. Miševima je uzeta krv posle 4 sata 4 izgladnjivanja na dane 1, 4, 7 i 11 posle injekcije antitela; i nivoi TG su određeni u serumu sa ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Srednji nivoi TG su izračunati za svaku vremensku tačku, za svako antitelo. Rezultati izraženi kao (srednja vrednost ± sd) serumskog humanog AB prikazani su uTabeli 18.

Tabela 18

Primena H4H268P2 i H4H284P kod humanizovanih ANGPTL4 miševa dovela je do značajnoph smanjenja TG u cirkulaciji na dan 1 (H4H268P2) i dan 4 (H4H268P2 i H4H284P) posle davanja antitela, u poređenju sa miševima doziranim kontroniml antitelom sa odgovarajućim izotipom.

Aktivnost H4H268P2 na nivoe TG u cirkulaciji je dalje ispitivano kod humanizovanih ANGPTL4 miševima ukrštenih sa ApoE deficijentnim (null) miševima. Model ApoE deficijentnih miševa je poznat kao visoko aterogenični i hiperlipidemični model sa većinom holesterola i TG koji cirkulišu u VLDL česticama usled nedovoljnog klirensa ostatka VLDL. Humanizovanim ANGPTL4 x ApoE deficijentnim miševima uzeta je krv 7 dana pre eksperimenta i stavljena u 2 grupe po šest miševa. Antitela H4H268P2 i kontrola Ab su dati sa dozom od 10 mg/kg supkutanom injekcijom. Miševima je uzeta krv posle 4 sata 4 izgladnjivanja na dane 1, 4, 7 i 11 posle injekcije antitela; i nivoi TG su određeni u serumu sa ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Smanjenje prikazano na Slici.4 je izraženo kao procenat nivoa TG u poređenju sa kontrolom Ab.

Nivoi TG su znatno smanjeni za svih 17 dana (više od 42%) sa najvećim smanjenjem na dan 7 (∼50%) posle primene H4H268P2, u poređenju sa miševima doziranim sa kontrolom Ab.

Primer 12. In Vivo aktivnost antitela na hANGPTL4 u kombinaciji sa fenofibratom na nivoe serumskog TG

Aktivnost anti-ANGPTL4 antitela H4H268P2 i fenofibrata, leka koji smanjuje TG, svakog posebno, ili u kombinaciji, na nivoe serumskog TG određeno je kod humanizovanih ANGPTL4 miševa. Miševima uzeta je krv 7 dana pre eksperimenta posle 4 sata izgladnjivanje i stavljena u 4 grupe po šest miševa. Grupama 2 i 4 dat je H4H268P2 sa dozom od 10 mg/kg supkutanom injekcijom na dan 0 i grupe 1 (kontrolna grupa) i 2 su stavljene na regularnu dijetalnu ishranu. Grupe 3 i 4 dobijale su ishranu kojoj je dodano 0.05% (mas/mas) fenofibrata (nivo doze je određen eksperimentalno u pilot ispitivanju). Serum je sakupljen iz krajnjeng uzimanja krvi na dan 7 posle davanja H4H268P2 i/ili fenofibrata (posle 4 sata izgladnjivanja) i analiziran je sa ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Rezultati su prikazani na Slici.5.

Primena H4H268P2 samog ili u kombinaciji sa fenofibratom dovela je do značajnog smanjenja nivoa TG u cirkulaciji 7 dana posle primene. Nivoi TG su smanjeni za ∼40% (srednja vrednost) 7 dana posle primene samog H4H268P2, ∼25% posle primene samog fenofibrata, i ∼50% posle kombinovanog tretmana sa H4H268P2 i fenofibratom, u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom sa dijetalnom ishranom. H4H268P2 se pokazao efikasnijim od fenofibrata u smanjenju nivoa TG u cirkulaciji na mišjim modelima. Kombinaciono tretiranje je pokazalo sinergističku aktivnost H4H268P2 i fenofibrata na nivoe TG. Upadljivo, jetre sakupljene od miševa koji su trošili fenofibrat (grupe 3 i 4) tokom 7 dana bile su znatno uvećane (1.8 puta, masa jetre/telesna masa), u poređenju sa miševima sa kontrolnom dijetalnom ishranom (grupe 1 i 2) (podaci nisu prikazani).

Primer 13. Pilot ispitivanje farmakokinetike/farmakodinamike antitela na ANGPTL4 kod gojaznih rezus majmuna

Faza I: u pilot ne-GLP farmakokinetičkom/farmakodinamičkom (PK/PD) ispitivanju, H4H268P2 i H4H284P su dati kao jedna bolus intravenozna (IV) injekcija, gojaznim rezus majmunima (Macaca mulatta). Rezus majmuni su izabrani zato što je ova vrsta blisko srodna ljudima, kako filogenski, tako i fiziološki, i ova vrsta se obično upotrebljava za neklinička ispitivanja toksičnosti. Gojazni majmuni koji su bili na re\imu ishrane pri čemu su unosili velike količine mast, tokom više od 6 meseci su izabrani zato št oni obično pokazuju umereno povišene nivoe TG (tj., srednja vredost >100 mg/dL; hiper-TG). Osam mužjaka majmuna, za koje je utvrđeno da su zdravi, su aklimatizovani i određeni kao osnovna linija ocene tokom 7 dana pre doziranja. Sve životinje su dobile nosač (10 mM histidina, pH 6) IV infuzijom na dan -5, posle čega je četii od njih dobilo H4H268P2 i druga četiri H4H284P sa 10mg/kg IV na dan 0. Nije bilo reakcije na mestu injekcije, niti su primećeni drugi štetni efekti u bilo kojoj tački vremena posle infuzije.

Uzorci seruma su sakupljeni od bazne linije perioda do dana 35 posle doziranja i određeni su nivoi serumskog lipida sa ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Srednja bazna linija za svaku životinju je određena na osnovu uzoraka koji su uzeti na dane -7, -5 and 0. Preliminarna anliza uzorka uzetih posle primene nosača otkrila je da su 3 gojazne životinje iz svake grupe pokazale povišene nivoe TG kao kod izgladnjivanja (tj., TG > 100mg/dL) dok je jedna životinja iz svake grupe imala srednji nivo TG unutar normalnog raspona (tj., srednja vrednost nivoa TG kao kod izgladnjivanja od 42 mg/dL i 84 mg/dL). Tako su podaci analiza načinjeni sa 3 životinje u svakoj grupi. Procentne (%) promene nivoa serumskogTG od bazne linije su određene za svaku životinju i usrednjene za svaku Ab grupu. Rezultati su prikazani u Sl.6.

Primena H4H268P2 kod tri blago hiper-TG životinja pokazala je maksimalno smanjenje od 57% na dan 4 posle doziranja. Srednji nivoi seromskog TG za ove životinje posle tretiranja sa H4H268P2 ostalo su na ili ispod 100 mg/dL do približno dana 25. Umereni efekti su primećeni kod dodatnih lipida, kao što su LDL-holesterol (LDL-C) i HDL-C; međutim, ukupni C nije bio promenjen (podaci nisu prikazani). Primena H4H268P2 kod jedne gojazne životinje sa niskim nivoima TG nije dovela do značajnog delovanja na sniženje TG kao kod izgladnjivanja ili bilo kojih drugih parametara lipida (podaci nisu prikazani), ukazujući na nižu granicu smanjenja nivoa TG antitelom.

Faza II: U drugom farmakokinetičkom/farmakodinamićkom (PK/PD) ispitivanju koje nije uključivalo GLP, samo H4H268P2 je primenjen kod osam gojaznih rezus majmuna (Macaca mulatta) kao jedna bolus intravenozna (IV) injekcija. Korak prethodnog doziranja injekcijom nosača je izostavljen u ovom ispitivanju. Tri osnovne linije ocenjivanja su uzete na dane -7, -3 i 0 isšitivanje i svih osam majmuna je dobilo H4H268P2 sa 10 mg/kg i IV na dan 0. Uzorci seruma su sakupljeni od perioda bazne linije do dana 35 posle doziranja i nivoi lipida analizorani sa ADVIA® 1800 Chemistry System (Siemens). Životinje su grupisane za podatke analiza prema nivoima TG srednje osnovne linije TG, da bi se prospektivno predvideo efekat: A. TG < 150 mg/dL (n=3); B.150 mg/dL < TG < 500 mg/dL (n=4); i C. TG > 1000 mg/dL (n=1).

Sl. 7 prikazuje nivoe TG za tru grupe izražene kao procenat promene niova TG od srednje vrednosti 3 osnovne linije TG. Kako je očekivano na osnovu predkliničkih podataka, veće smanjenje nivoa TG kao kod izgladnjivanja, viđeno je kod životinja sa višim nivoima bazalnog serumskog TG. Naročito dramatični i brzi pad u nivoima Tg je primećen kod jedne životinje čiji je nivo osnovne linije TG bio > 1000 mg/dL. Znatno smanjenje nivoa TG (50-68%) je primećeno za životinje sa osnovnom linijom 150 mg/dL < TG < 500 mg/dL. U ovoj grupi gojaznih majmuna primena H4H268P2 povećala je HDL-C, ali nije delovala na LDL-C ili ukupni-C (podaci nisu prikazani). Životinje sa osnovnom linijom TG < 150 mg/dL (normalni nivoi TG) su u veliko meri nisu reagovale na H4H268P2.

LISTING SEKVENCI

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> HUAMN ANTIBODIES TO HUMAN ANGIOPOIETIN-LIKE PROTEIN 4 <130> 6250A-WO

<140> To be assigned

<141> Filed herewith

<150> 61/290,092

<151> 2009-12-24

<150> 61/306,359

<151> 2010-02-19

<150> 61/328,316

<151> 2010-04-27

<150> 61/349,273

<151> 2010-05-28

<150> 61/356,126

<151> 2010-06-18

<160> 492

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 3

ggattcactt tcagtagcta cgac 24

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 5

attggtactg ctggtgacac a 21

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 7

gcaagaggag acagtagaaa ctactacgtt ggggactact ttgactac 48 <210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 11

cagagtatta gtaggtgg 18 <210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 13

caggcgtcc 9

<210> 14

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 15

caacagtatg atagttattc tcgggcg 27 <210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 27

ggtggatcct tcagtattca tcac 24

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 29

atcaatcatc gtggaagcac c 21

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 30

<210> 31

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 31

gcgagaggct tacgattttt ggactggtta tcgtcctact ttgactac 48 <210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 32

<210> 33

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 35

cagggcatta gcgattat 18 <210> 36

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 37

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 37

gctgcgtcc 9

<210> 38

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 38

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 39

caaaattata acactgcccc gctcact 27 <210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 51

ggattcactt tcagtagcta cgac 24

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 53

attggtactg ctggtgacac a 21

<210> 54

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 54

<210> 55

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 55

gcaagaggag acagtagaaa ctactacgtt ggggactact ttgactac 48 <210> 56

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 56

<210> 57

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 59

cagagtatta gtaggtgg 18 <210> 60

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 61

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

aaggcgtct 9

<210> 62

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 63

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 63

caacagtata atagttattc tcggacg 27 <210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 64

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

ggattcacct tcagtagtta tggc 24

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 77

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 77

atatcatttg atggaggtaa taaa 24

<210> 78

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 79

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 79

gcgaaagagg gcgatagaag tggtcaccct tacttctact attacggttt ggacgtc 57 <210> 80

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 83

cagggcatta gcagttat 18 <210> 84

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 84

<210> 85

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 85

gctgcatcc 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 86

<210> 87

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 87

caacagcttc atagttaccc tctcact 27 <210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<211> 376

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 99

ggattcacct tcagtcggta cgac 24

<210> 100

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 100

<210> 101

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 101

attggtacag caggtgacac a 21

<210> 102

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 102

<210> 103

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 103

gcaagaggag atagtaagaa ctactacgtt ggggactact ttgactac 48 <210> 104

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 104

<210> 105

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 105

<210> 106

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 106

<210> 107

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 107

cacagtattg gtaattgg 18 <210> 108

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 108

<210> 109

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

gaggcgtct 9

<210> 110

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 110

<210> 111

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 111

caacaatatg atacttattt tcggacg 27 <210> 112

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 112

<210> 113

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 113

<210> 114

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 115

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 115

<210> 116

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 116

<210> 117

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 118

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 118

<210> 119

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 119

<210> 120

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 121

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 121

<210> 122

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 122

<210> 123

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 123

ggattcacct tcagtaccta cgac 24 <210> 124

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 124

<210> 125

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 125

attggttctg ctggtgacac a 21

<210> 126

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 126

<210> 127

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 127

gcaagaggag atagtcggaa ctacttcgtt ggggactact ttgactac 48 <210> 128

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 128

<210> 129

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 129

<210> 130

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 130

<210> 131

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 131

cagagtatta gtagttgg 18 <210> 132

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 132

<210> 133

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 133

aaggcgtct 9

<210> 134

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 134

<210> 135

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 135

caacagtata gtagttattc tcggacg 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 136

<210> 137

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 137

<210> 138

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 138

<210> 139

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 140

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 140

<210> 141

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 141

<210> 142

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 142

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 143

<210> 144

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 144

<210> 145

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 145

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 146

<210> 147

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 147

ggattcacct tcagtagtta cgac 24 <210> 148

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 148

<210> 149

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 149

attggtgttg ctggtgacac a 21 <210> 150

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 150

<210> 151

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 151

gcaagaggag acagtgggaa ctactacgat ggggactact ttgacttc 48 <210> 152

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 152

<210> 153

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 153

<210> 154

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 154

<210> 155

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 155

cagagtatta ataggtgg 18

<210> 156

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 156

<210> 157

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 157

aaggcgtct 9

<210> 158

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 158

<210> 159

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 159

caacagtatg atagttattt tcggacg 27 <210> 160

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 160

<210> 161

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 161

<210> 162

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 162

<210> 163

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 163

<210> 164

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 164

<210> 165

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic <400> 165

<210> 166

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 166

<210> 167

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 167

<210> 168

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 168

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 169

<210> 170

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 170

<210> 171

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 171

ggattcacct tcagtaccta cgac 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 172

<210> 173

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 173

attggttctg ctggtgacac a 21

<210> 174

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 174

<210> 175

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 175

gcaagaggag atagtcggaa ctacttcgtt ggggactact ttgactac 48 <210> 176

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 176

<210> 177

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 177

<210> 178

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 178

<210> 179

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 179

cagagtattg gtacctgg 18 <210> 180

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 180

<210> 181

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 181

aaggcgtct 9

<210> 182

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 182

<210> 183

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

caacagtata atagttttta tcggacg 27 <210> 184

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 184

<210> 185

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 185

<210> 186

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 186

<210> 187

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 188

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 188

<210> 189

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 189

<210> 190

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 190

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 191

<210> 192

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 192

<210> 193

<211> 378

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 194

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 194

<210> 195

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 195

gaattcattt ttagcagcta tgcc 24 <210> 196

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 196

<210> 197

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 197

attagtggta gtggtgatag caaa 24

<210> 198

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 198

<210> 199

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 199

gcgaaagatg ggaaggacag gtatggtttt tactacaact tctacggtat ggacgtc 57 <210> 200

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 200

<210> 201

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 201

<210> 202

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 203

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 203

cagggcataa gcagttat 18 <210> 204

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 204

<210> 205

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 205

gctgcatcc 9

<210> 206

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 206

<210> 207

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 207

caacagctta atagttaccc attcact 27 <210> 208

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 208

<210> 209

<211> 375

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 209

<210> 210

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 210

<210> 211

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 211

<210> 212

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 212

<210> 213

<211> 376

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 213

<210> 214

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 215

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 215

<210> 216

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 216

<210> 217

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 217

<210> 218

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 218

<210> 219

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 219

ggattcacct tcagttccta cgac 24 <210> 220

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 220

<210> 221

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 221

attggaactg ctggtgacac a 21

<210> 222

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 222

<210> 223

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 223

gcaagaggag atagtagaaa ctacttcgtt ggggactact ttgactac 48 <210> 224

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 224

<210> 225

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 225

<210> 226

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 227

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 227

cagagtatta gtaactgg 18 <210> 228

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 228

<210> 229

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 229

aaggcgtct 9

<210> 230

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 230

<210> 231

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 231

caacagtata atagttattc tcggacg 27 <210> 232

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 232

<210> 233

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 233

<210> 234

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 234

<210> 235

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic <400> 235

<210> 236

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 236

<210> 237

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 237

<210> 238

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 238

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 239

<210> 240

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 240

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 241

<210> 242

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 242

<210> 243

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 243

ggattcacct tcagtagcta cgac 24 <210> 244

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 244

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 245

attggtactg ctggtgacac a 21

<210> 246

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 246

<210> 247

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 247

gcaagaggag acagtagaaa ctactacgtt ggggactact ttgactac 48 <210> 248

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 248

<210> 249

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 249

<210> 250

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 250

<210> 251

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 251

cagagtatta gtaggtgg 18 <210> 252

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 252

<210> 253

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 253

aaggcgtct 9

<210> 254

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 254

<210> 255

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 255

caacagtata atagttattc tcggacg 27 <210> 256

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 256

<210> 257

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 257

<210> 258

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 258

<210> 259

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 259

<210> 260

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 260

<210> 261

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 261

<210> 262

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 263

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 263

<210> 264

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 264

<210> 265

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 266

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 266

<210> 267

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 267

ggattcacct tcagtagcta cgac 24 <210> 268

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 268

<210> 269

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

attggtactg ctggtgacac a 21

<210> 270

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 270

<210> 271

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 271

gcaagaggag acagtagaaa ctactacgtt ggggactact ttgactac 48 <210> 272

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 272

<210> 273

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 273

<210> 274

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 275

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 275

cagagtatta gtaggtgg 18 <210> 276

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 276

<210> 277

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 277

aaggcgtct 9

<210> 278

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 278

<210> 279

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 279

caacagtata atacttattc tcggacg 27 <210> 280

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 280

<210> 281

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 281

<210> 282

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 282

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 283

<210> 284

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 284

<210> 285

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 285

<210> 286

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 286

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 287

<210> 288

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 288

<210> 289

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 289

<210> 290

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 290

<210> 291

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 291

ggattcacct tcagcagcta tggc 24 <210> 292

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 292

<210> 293

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 293

atttggtatg atggaagtaa taag 24

<210> 294

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 294

<210> 295

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 295

gtgaaggcgg acgcccccct cctgatctat ggtgtggacg tc 42 <210> 296

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 296

<210> 297

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 297

<210> 298

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 299

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 299

cagggcatta gaaatgat 18 <210> 300

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 300

<210> 301

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 301

tttgcatcc 9

<210> 302

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 302

<210> 303

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 303

ctacagcata atagttaccc ttacact 27 <210> 304

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 304

<210> 305

<211> 360

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 305

<210> 306

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 306

<210> 307

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic <400> 307

<210> 308

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 308

<210> 309

<211> 361

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 309

<210> 310

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 311

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 311

<210> 312

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 312

<210> 313

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 314

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 314

<210> 315

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 315

ggattcacct tcaggagtta tggc 24 <210> 316

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 316

<210> 317

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

atattatatg atggaagtag tgag 24

<210> 318

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 318

<210> 319

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 319

gcgagagatt tattggcaat tggctggttc gaccgc 36 <210> 320

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 320

<210> 321

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 321

<210> 322

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 323

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 323

cagagtctta gtagttataa c 21 <210> 324

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 324

<210> 325

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 325

ggtacatcc 9

<210> 326

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 326

<210> 327

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 327

cagcaatatg gtagctcacc tctcact 27 <210> 328

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 328

<210> 329

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 329

<210> 330

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 330

<210> 331

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 331

<210> 332

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 332

<210> 333

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 333

<210> 334

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 335

<211> 325

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 335

<210> 336

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 336

<210> 337

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 337

<210> 338

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 338

<210> 339

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 339

ggattcacct tcagtaccta cgac 24 <210> 340

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 340

<210> 341

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

attgatactg ctggtgacac a 21

<210> 342

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 342

<210> 343

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 343

gcaagagggg gcgatttttg gagtggtcca gactac 36 <210> 344

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 344

<210> 345

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 345

<210> 346

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 347

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 347

caggacatta gcaattat 18 <210> 348

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 348

<210> 349

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 349

gctgcattc 9

<210> 350

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 350

<210> 351

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 351

caacagtata ttacttaccc attcact 27 <210> 352

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 352

<210> 353

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 353

<210> 354

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 354

<210> 355

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 356

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 356

<210> 357

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 357

<210> 358

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 359

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 359

<210> 360

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 360

<210> 361

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 361

<210> 362

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 362

<210> 363

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 363

ggattcacct ttgatgatta tgcc 24 <210> 364

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 364

<210> 365

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 365

attagttgga atagtggtag cata 24

<210> 366

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 366

<210> 367

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 367

gcaaaagatc actgggacta cgactttgaa tacttccacc ac 42 <210> 368

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 368

<210> 369

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 369

<210> 370

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 370

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 371

cagagtatta gtagctgg 18 <210> 372

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 372

<210> 373

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 373

aaggcgtct 9

<210> 374

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 374

<210> 375

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

caacagtata atagttatta cact 24 <210> 376

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 376

<210> 377

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 377

<210> 378

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 378

<210> 379

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 380

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 380

<210> 381

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 381

<210> 382

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 382

<211> 319

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 383

<210> 384

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 384

<210> 385

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 385

<210> 386

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 386

<210> 387

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 387

ggattcacct ttgatgatta tgcc 24 <210> 388

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 388

<210> 389

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

attagttgga atagtggtag cata 24

<210> 390

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 390

<210> 391

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 391

gcaaaagatg aaaacagctc gtcggggaac tggttcgacc cc 42 <210> 392

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 392

<210> 393

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 393

<210> 394

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 395

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 395

cagagtgtta gcagcaac 18 <210> 396

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 396

<210> 397

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 397

ggtgcatcc 9

<210> 398

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 398

<210> 399

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 399

caggaatata ataattggat cacc 24 <210> 400

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 400

<210> 401

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 401

<210> 402

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 402

<210> 403

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 404

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 404

<210> 405

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 405

<210> 406

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 407

<211> 319

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 407

<210> 408

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 408

<210> 409

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 409

<210> 410

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 410

<210> 411

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 411

ggattcactt tcagtaacgc ctgg 24 <210> 412

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 412

<210> 413

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic

<400> 413

attcaaagca aaactgatgg tgggacaaca 30 <210> 414

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 414

<210> 415

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 415

acaacagcag attacgattt ttggagtggg gttgactac 39 <210> 416

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 416

<210> 417

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 417

<210> 418

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 419

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 419

cagggtatta gcagctgg 18 <210> 420

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 420

<210> 421

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 421

gctgcatcc 9

<210> 422

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 422

<210> 423

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 423

caacaggcta acagtttccc attcact 27 <210> 424

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 424

<210> 425

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 425

<210> 426

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 426

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 427

<210> 428

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 428

<210> 429

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 429

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 430

<210> 431

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 431

<210> 432

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 432

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 433

<210> 434

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 434

<210> 435

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 435

ggattcactt tcagtaacgc ctgg 24

<210> 436

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 436

<210> 437

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 437

attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 30 <210> 438

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 438

<210> 439

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 439

atcacagcag attacgattt ttggagtggg gttgactac 39 <210> 440

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 440

<210> 441

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 441

<210> 442

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 442

<210> 443

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 443

cagggtatta gcagctgg 18 <210> 444

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 444

<210> 445

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

gctgcatcc 9

<210> 446

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 446

<210> 447

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 447

caacaggcta acagtttccc attcact 27 <210> 448

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 448

<210> 449

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 449

<210> 450

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<210> 451

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 451

<210> 452

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 452

<210> 453

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 453

<210> 454

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 454

<210> 455

<211> 322

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 455

<210> 456

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<223> Synthetic <400> 456

<210> 457

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 457

<210> 458

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 458

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 459

ggattcacct ttgatgatta tgcc 24 <210> 460

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 460

<210> 461

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 461

attagttgga atagtggtag cata 24 <210> 462

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<400> 462

<210> 463

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 463

gcaaaagatg aaagcagctc gtcggggaac tggttcgacc cc 42 <210> 464

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 464

<210> 465

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 465

<210> 466

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 466

<210> 467

<211> 363

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 467

<210> 468

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 468

<210> 469

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <220>

<221> VARIANT <222> (1)...(1)

<223> Xaa = Gly <220>

<221> VARIANT <222> (2)...(2)

<223> Xaa = Gly or Phe <220>

<221> VARIANT <222> (3)...(3)

<223> Xaa = Ser or Thr

<221> VARIANT

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = Phe

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)...(5)

<223> Xaa = Ser

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Ile, Ser, or Thr <220>

<221> VARIANT

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = His or Tyr

<220>

<221> VARIANT

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = His, Gly, or Asp <400> 469

<210> 470

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(1)

<223> Xaa = Ile

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)...(2)

<223> Xaa = Asn, Ser, or Gly <220>

<221> VARIANT

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = His, Phe, Ser, or Val <220>

<221> VARIANT

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = Arg, Asp, or Ala <220>

<221> VARIANT

<222> (5)...(5)

<223> Xaa = Gly

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Gly or absent

<221> VARIANT

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Ser, Asn, or Asp <220>

<221> VARIANT

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = Thr or Lys <400> 470

<210> 471

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(1)

<223> Xaa = Ala

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)...(2)

<223> Xaa = Arg or Lys <220>

<221> VARIANT

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = Gly or Glu <220>

<221> VARIANT

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = Gly, Asp, or absent <220>

<221> VARIANT

<222> (5)...(5)

<223> Xaa = Asp or absent <220>

<221> VARIANT

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Leu, Arg, or absent <220>

<221> VARIANT

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Arg or Ser <220>

<221> VARIANT

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = Phe, Gly, or Arg <220>

<221> VARIANT

<222> (9)...(9)

<223> Xaa = Leu, His, or Asn <220>

<221> VARIANT

<222> (10)...(10)

<223> Xaa = Asp, Pro, or Tyr <220>

<221> VARIANT

<222> (11)...(11)

<223> Xaa = Trp, Tyr, or Phe <220>

<221> VARIANT

<222> (12)...(12)

<223> Xaa = Leu, Phe, Val, or Asp <220>

<221> VARIANT

<222> (13)...(13)

<223> Xaa = Ser, Tyr, or Gly <220>

<221> VARIANT

<222> (14)...(14)

<223> Xaa = Ser, Tyr, or Asp <220>

<221> VARIANT

<222> (15)...(15)

<223> Xaa = Tyr

<220>

<221> VARIANT

<222> (16)...(16)

<223> Xaa = Phe or Gly

<220>

<221> VARIANT

<222> (17)...(17)

<223> Xaa = Leu or absent <220>

<221> VARIANT

<222> (18)...(18)

<223> Xaa = Asp

<220>

<221> VARIANT

<222> (19)...(19)

<223> Xaa = Tyr, Val, or Phe <220>

<221> VARIANT

<222> (20)...(20)

<223> Xaa = Trp

<400> 471

<210> 472

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(1)

<223> Xaa = Gln

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)...(2)

<223> Xaa = Gly or Ser <220>

<221> VARIANT

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = Ile

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = Ser or Asn <220>

<221> VARIANT

<222> (5)...(5)

<223> Xaa = Asp, Ser, or Arg <220>

<221> VARIANT

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Tyr or Trp <400> 472

<210> 473

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(1)

<223> Xaa = Ala or Lys <220>

<221> VARIANT

<222> (2)...(2)

<223> Xaa = Ala

<220>

<221> VARIANT

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = Ser

<400> 473

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(1)

<223> Xaa = Gln

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)...(2)

<223> Xaa = Asn or Gln <220>

<221> VARIANT

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = Tyr or Leu

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = Asn, His, Ser, or Asp <220>

<221> VARIANT

<222> (5)...(5)

<223> Xaa = Thr or Ser

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Ala or Tyr

<220>

<221> VARIANT

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Pro, Ser, or Phe <220>

<221> VARIANT

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = Leu or Arg <220>

<221> VARIANT

<222> (9)...(9)

<223> Xaa = Thr

<220>

<221> VARIANT

<222> (10)...(10)

<223> Xaa = Phe

<400> 474

<210> 475

<211> 1221

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 475

<210> 476

<211> 406

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 476

<211> 1233

<212> DNA <213> Mus muscular <400> 477

<210> 478

<211> 410

<212> PRT

<213> Mus muscular <400> 478

<211> 1110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 479

<210> 480

<211> 369

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 481

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 482

<211> 327

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 483

<211> 327

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic

<210> 484

<211> 455

<212> PRT

<213> Mus muscular

<211> 460

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 485

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 486

<210> 487

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 487

<210> 488

<211> 130

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic <400> 488

<211> 444

<212> DNA

<213> Macaca fascicularis <400> 489

<210> 490

<211> 148

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis <400> 490

<210> 491

<211> 444

<212> DNA

<213> Macaca mulatta <400> 491

<210> 492

<211> 148

<212> PRT

<213> Macaca mulatta <400> 492

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Izolovano humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje humani protein 4 sličan angiopoetinu, naznačen time, što sadrži:

(a) težak lanac hipervarijabilne sekvence 1/ težak lanac hipervarijabilne sekvence 2/ težak lanac hipervarijabilne sekvence 3 koji ima kombinaciju sekvenci amino kiselina SEQ ID NO: 28/30/32; i

(b) laki lanac hipervarijabilne sekvence 1/ laki lanac hipervarijabilne sekvence 2/ laki lanac hipervarijabilne sekvence 3 koji ima kombinaciju sekvenci amino kiselina SEQ ID NO:36/38/40.

2. Izolovano humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment iz zahteva 1, naznačen time, što sadrži varijabilni region teškog lanca odabran od SEQ ID NO: 487, 26, 42 i 46.

3. Izolovano humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema jednom od zahteva 1 ili 2, naznačeno time, što sadrži variajbilni region lakog lanca odabran od SEQ ID NO: 44, 34 i 48.

4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema jednom od zahteva 1 do 3, naznačen time, što sadrži par sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca/varijabilnog regiona lakog lanca odabran od SEQ ID NO:487/44, 26/34, 42/44 i 46/48.

5. Izolovano humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje humani protein 4 sličan angiopoetinu, naznačen time, što sadrži regione hipervarijabilne sekvence teškog i lakog lanca koje se nalaze unutar para sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca/varijabilnog regiona lakog lanca antitela ili antigen-vezujuće fragmenta iz zahteva 4.

6. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 4, naznačen time, što antitelo ili antigen-vezujući fragment unakrsno reaguje sa proteinom 4 sličnom angiopoetinu cinomolgus mamuna i sa proteinom 4 sličnom angiopoetinu rezus majmuna .

7. Izolovan molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili antigen-vezujući fragment prema jednom od prethodnih zahteva.

8. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 7, ili ćelija domaćin koja sadrži ovaj ekspresioni vektor.

9. Postupak dobijanja antitela na humani protein 4 sličan angiopoetinu ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji obuhvata gajenje ćelije domaćina iz zahteva 8 pod uslovima koji doouštaju proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta i rekuperaciju ovako dobijenog antitela ili njegovog fragmenta.

10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema jednom od zahteva 1 do 6 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10, naznačnena time, što sadrži:

(i) jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa odabranih od inhibitora HMG-CoA reduktaza; i inhibitora apsorpcije holesterola ili reapsorpcije žučne kiseline, ili oba; agensa koji povećavaju katabolizam lipoproteina; agensa koji umanjuj broj nefatalnih infarkta miokarda; i aktivatora transkripcionog faktora LXR; ili

(ii) jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa odabranih od statina, niacina, fibrata i antitela na PCSK9.

12. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema jednom od zahteva 1 do 6 za upotrebu u metodi poboljšanja, ublažavanja, inhibicije ili prevencije bolesti ili poremećaja posredovanih proteinom 4 sličnom angiopoetinu , pri čemu je bolest ili poremećaj posredovan proteinom 4 sličnom angiopoetinu odabran od hipertrigliceridemije, hiperholesterolemije, hilomikronemije, aterogene dislipidemije, kardiovaskularne bolesti ili poremećaja, akutnog pankreatitisa, nelakoholičarskog steatohepatitisa, dijabetesa i gojaznosti.

13. Upotreba antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta prema jednom od zahteva 1 do 6 za proizvodnju leka za upotrebu u poboljšanju, ublažavanju, inibiciji ili prevenciji bolesti ili poremećaja posredovanih proteinom 4 sličnom angiopoetinu, pri čemu su bolesti ili poremećaji posredovani proteinom 4 sličnom angiopoetinu odabrani od hipertrigliceridemije, hiperholesterolemije, hilomikronemije, aterogene dislipidemije, kardiovaskularne bolesti ili poremećaja, akutnog pankreatitisa, nelakoholičarskog steatohepatitisa, dijabetesa i gojaznosti.