RS56159B1 - Bakterijski soj domaćina sa ekspresijom rekombinantne dsbc i imajući smanjenu aktivnost tsp - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na rekombinantni bakterijski soj domaćina, naročito E. koli. Pronalazak se takođe odnosi na metod za proizvodnju proteina od interesa u takvoj ćeliji.

Pozadina pronalaska

[0002] Bakterijske ćelije, kao što je E. koli, se obično koriste za proizvodnju rekombinantnih proteina. Postoje mnoge prednosti u korišćenju bakterijskih ćelija, kao što je E. koli, za proizvodnju rekombinantnih proteina, naročito zbog svestrane prirode bakterijskih ćelija kao ćelija domaćina koje dozvoljavaju umetanje gena putem plazmida. E. koli je korišćena za proizvodnju mnogih rekombinantnih proteina uključujući ljudski insulin.

[0003] Uprkos mnogim prednostima u korišćenju bakterijskih ćelija za produkciju rekombinantnih proteina, još uvijek postoje značajna ograničenja uključujući teškoće produkcije proteina osetljivih na proteaze. Proteaze igraju važnu ulogu u preusmeravanju starih, oštećenih ili pogrešno savijenih proteina u periplazmi i citoplazmi E. koli. Bakterijske proteaze deluju da degradiraju rekombinantni protein od interesa, čime se često značajno smanjuje prinos aktivnog proteina.

[0004] Identifikovane su brojne bakterijske proteaze. U E. koli proteazama, uključujući Proteaze III (ptr), identifikovane su DegP, OmpT, Tsp, prlC, ptrA, ptrB, pepA-T, tsh, espc, eatA, clpP i lon.

[0005] Tsp (takođe poznata kao Prc) je 60 kDa periplazmatska proteaza. Prvi poznati supstrat Tsp je bio protein-3 koji vezuje penicilin (PBP3) (Određivanje mesta cepanja uključenog u C-terminalnu obradu proteina 3 koji vezuje penicilin u Ešerihiji koli; Nagasawa H, Sakagami Y, Suzuki A, Suzuki H, Hara H, Hirota Y. J Bacteriol. 1989 Nov;171(11):5890-3 i kloniranje, mapiranje i karakterizacija Tsp gena u Ešerihiji koli koji je uključen u C-terminalnu obradu proteina 3 koji vezuje penicilin; Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacteriol. 1991 Aug;173 (15):4799-813) ali kasnije je otkriveno da je Tsp takođe u stanju da cepa zadnji fag proteina i, zbog toga, je preimenovana kao Terminalna specifična proteza (Tsp) (Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)). Silber et al. (Brisanje gena prc (tsp) obezbeđuje dokaze za dodatnu terminalnu- specifičnu proteolitičku aktivnost u Ešerihiji koli K-12; Silber, K.R., Sauer, R.T.; Mol Gen Genet 1994242:237-240) opisuje prc brisanje soja (KS1000) pri čemu je mutacija stvorena zamenom segmenta prc gena sa fragmentom koji sadrži Kan<r>marker.

[0006] Smanjenje aktivnosti Tsp (prc) je poželjno da se smanji proteoliza proteina od interesa. Međutim, ustanovljeno je da ćelije bez proteaze prc pokazuju termosenzitivni rast pri niskoj osmolarnosti. Hara i saradnici su izolovali termorezistentne revertante koji sadrže mutacije ekstragenskog supresora (spr) (Hara et al. Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)). Spr je 18kDa za membranu vezana periplazmatska proteaza i supstrati spr su Tsp i peptidoglikani u spoljnoj membrani uključeni u hidrolizu ćelijskog zida tokom ćelijske deobe. Spr gen je označen kao UniProtKB/Swiss- Prot POAFV4 (SPR_ECOLI).

[0007] Opisani su poboljšani sojevi sa manjkom proteaze sadržavajući mutirani spr gen. Chen et al (Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechnol Bioeng.

2004 Mar 5;85(5):463-74) opisuje građu sojeva E. koli koji nose različite kombinacije mutacija u prc (Tsp) i drugoj proteazi, DegP, stvorenu pojačavanjem uzvodnih i nizvodnih regija gena i povezivanjem ovih zajedno na vektoru koji sadrži selekcione markere i mutaciju sprW174R ( Akumulacija na visokom nivou rekombinantnog fragmenta antitela u periplazmi Ešerihije koli zahteva trostruko mutirani (ΔDegP Δprc sprW174R) soj domaćina. Kombinacija mutacija ΔDegP, Δprc i sprW174R je pronađena da obezbedi najviše nivoe lakog lanca antitela, teškog lanca antitela i F(ab')2-LZ. EP1341899 otkriva soj E. koli koji je deficijentan u hromozomskoj DegP i prc kodirajući proteaze DegP i Prc, respektivno, i sadrži mutirani SPR gen koji kodira protein koji suprimira rast fenotipova koje pokazuju sojeve skrivajući prc mutante.

[0008] Protein disulfid izomeraza je enzim koji katalizuje formiranje i razbijanje disulfidnih veza između cisteinskih ostataka unutar proteina kao što su oni savijeni. Poznato je da međusobno sarađuju proteini koji katalizuju formaciju disulfidnih veza da bi poboljšali ekspresiju proteina u ćeliji domaćina. WO98/56930 otkriva metod za produkciju heterolognih polipeptida koji sadrže disulfidnu vezu u bakterijskim ćelijama pri čemu je prokariotska disulfidna izomeraza, kao što je DsbC ili DsbG zajednički izražena sa eukariotskim polipeptidom. US6673569 otkriva veštački operon koji sadrži polinukleotide koji kodiraju svaki od DsbA, DsbB, DsbC i DsbD za uporebu u proizvodnji stranog proteina. EPO786009 otkriva proces za proizvodnju heterolognog polipeptida u bakterijama gde je ekspresija nukleinske kiseline kodirajući DsbA ili DsbC indukovana pre indukcije ekspresije nukleinske kiseline kodirajući heterologni polipeptid.

[0009] DsbC je prokariotski protein pronađen u periplazmi E. koli koji katalizuje formiranje disulfidnih veza u E. koli. DsbC ima dužinu aminokiselinske sekvence od 236 (uključujući signalni peptid) i molekulsku težinu 25.6 KDa (UniProt No.POAEG6). DsbC je prvi put identifikovana 1994 (Missiakas et al. The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation, The EMBO Journal vol 13, no 8, p2013-2020, 1994 and Shevchik et al. Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli with disulfide isomerase activity, The EMBO Jounral vol 13, no 8, p2007-2012, 1994).

[0010] Neočekivano je pronađeno da prekomerna ekspresija DsbC iz rekombinantne DsbC u gram-negativnoj bakterijskoj ćeliji poboljšava ćelijsku lizu fenotipa ćelija bez proteaze Tsp. Prema tome, ovi pronalazači su obezbedili novi soj koji ima povoljna svojstva za produkciju proteina od interesa.

Rezime pronalaska

[0011] Predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantnu gram-negativnu bakterijsku ćeliju, naznačenu time da ćelija:

a) obuhvata ekspresioni vektor obuhvatajući rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC;

b) ima mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein imajući smanjenu aktivnost proteaze u poređenju sa ćelijom prirodnog tipa,

c) obuhvata mutirani spr gen koji kodira mutirani spr protein sposoban za suzbijanje fenotipa ćelije obuhvatajući mutirani Tsp gen, i

d) ima genom koji je izogen sa divljim-tipom soja E. koli W3110, osim mutiranog Tsp gena i mutiranog spr gena.

[0012] Gram-negativna bakterijska ćelija imajući iznad specifičnu kombinaciju genetskih modifikacija pokazuje povoljan rast i fenotipove produkcije proteina.

[0013] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod za produkciju proteina od interesa obuhvatajući ekspresiju proteina od interesa u rekombinantnoj gram-negativnoj bakterijskoj ćeliji kao što je definisano iznad. Metod obuhvata kultivisanje rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije kao što je definisano iznad u medijumu za kulturu pod efikasnim uslovima za ekspresiju proteina od interesa i rekombinantnog polinukleotida koji kodira DsbC; i obnavljanje proteina od interesa iz periplazme rekombinantne gramnegativne bakterijske ćelije i/ili medijuma za kulturu.

Kratak opis crteža

[0014] Slika 1 prikazuje profil rasta anti-TNF Fab' izražavajući sojeve MXE001 MXE008 i anti-TNFα Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući sojeve MXE001 i MXE008.

Slika 2 prikazuje anti-TNF Fab' prinos iz periplazme (osenčeni simboli) i supernatanta (otvoreni neosenčeni simboli) iz anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući sojeve E. koli MXE001, MXE008 i MXE009.

Slika 3 prikazuje anti-TNF Fab' prinos iz periplazme (osenčeni simboli) i supernatanta (otvoreni neosenčeni simboli) iz anti-TNF Fab’ izražavajući sojeve E. koli MXE001 i MXE008 i iz anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući sojeve E. koli MXE001 i MXE008.

Slika 4 prikazuje anti-TNF Fab' prinos iz periplazme iz Fab A i Fab B izražavajući soj E. koli W3110 i iz Fab A i rekombinantne DsbC ili Fab B i rekombinantne DsbC izražavajući soj E. koli MXE008.

Slika 5a prikazuje 5' kraj divljeg tipa ptr (proteaza III) i nokaut mutirani ptr (proteaza III) protein i sekvence gena.

Slika 5b prikazuje 5' kraj divljeg tipa Tsp i nokaut mutirani Tsp protein i sekvence gena.

Slika 5c prikazuje regiju divljeg tipa DegP i mutirani DegP protein i sekvence gena.

Slika 6 prikazuje građu vektora za upotrebu u produkciji ćelije prema izvođenju predmetnog pronalaska. Slika 7 prikazuje komparativne profile rasta 5L i 200L fermentacija anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući soj E. koli MXE008.

Slika 8 prikazuje komparativne Fab' titracije 5L i 200L fermentacija anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući soj E. koli MXE008.

Slika 9 prikazuje komparativne profile rasta fermentacija anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući sojeve E. koli MXE008 i MXE009.

Slika 10 prikazuje komparativne Fab' titracije fermentacija anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući sojeve E. koli MXE008 i MXE009.

Kratak opis sekvenci

[0015]

SEK ID BR: 1 je DNA sekvenca divljeg-tipa Tsp gena uključujući 6 nukleotida ATGAAC uzvodno od početnog kodona.

SEK ID BR: 2 je aminokiselinska sekvenca divljeg-tipa Tsp proteina.

SEK ID BR:3 je DNA sekvenca mutiranog nokaut Tsp gena uključujući 6 nukleotida ATGAAT uzvodno od početnog kodona.

SEK ID BR:4 je DNA sekvenca divljeg-tipa Proteaze III gena.

SEK ID BR:5 je sekvenca amino kiseline divljeg-tipa Proteaze III proteina.

SEK ID BR:6 je DNA sekvenca mutirane nokaut Proteaze III gena.

SEK ID BR:7 je DNA sekvenca divljeg-tipa DegP gena.

SEK ID BR:8 je sekvenca amino kiseline prirodnog tipa DegP proteina.

SEK ID BR:9 je DNA sekvenca mutiranog DegP gena.

SEK ID BR: 10 je sekvenca amino kiseline mutiranog DegP gena.

SEK ID BR: 11 je sekvenca amino kiseline varijabilne regije lakog lanca anti-TNF antitela.

SEK ID BR:12 je sekvenca amino kiseline varijabilne regije teškog lanca anti-TNF antitela.

SEK ID BR: 13 je sekvenca amino kiseline lakog lanca anti-TNF antitela.

SEK ID BR:14 je sekvenca amino kiseline teškog lanca anti-TNF antitela.

SEK ID BR: 15 je sekvenca 3' oligonukleotidnog prajmera za regiju mutiranog Tsp gena obuhvatajući Ase l restrikciono mesto.

SEK ID BR: 16 je sekvenca 5' oligonukleotidnog prajmera za regiju mutiranog Tsp gena obuhvatajući Ase I restrikciono mesto.

SEK ID BR: 17 je sekvenca 3' oligonukleotidnog prajmera za regiju mutirane Proteaze III gena obuhvatajući Ase l restrikciono mesto.

SEK ID BR: 18 je sekvenca 5' oligonukleotidnog prajmera za regiju mutirane Proteaze III gena obuhvatajući Ase l restrikciono mesto.

SEK ID BR: 19 je sekvenca 5' oligonukleotidnog prajmera za regiju mutiranog DegP gena obuhvatajući Ase I restrikciono mesto.

SEK ID BR:20 je sekvenca 3' oligonukleotidnog prajmera za regiju mutiranog DegP gena obuhvatajući Ase I restrikciono mesto.

SEK ID BR: 21 je sekvenca divljeg-tipa spr gena, uključujući signalnu sekvencu koja je prvi 26 aminokiselinski ostatak.

SEK ID BR:22 je sekvenca divljeg-tipa spr gena, bez signalne sekvence.

SEK ID BR: 23 je nukleotidna sekvenca mutirane OmpT sekvence obuhvatajući mutacije D210A i H212A SEK ID BR: 24 je sekvenca aminokiseline mutirane OmpT sekvence obuhvatajući mutacije D210A i H212A. SEK ID BR: 25 je nukleotidna sekvenca mutirane nokaut OmpT sekvence.

SEK ID BR: 26 je nukleotidna sekvenca his obeležene DsbC.

SEK ID BR: 27 je sekvenca amino kiseline his obeležene DsbC.

SEK ID BR: 28 prikazuje sekvencu amino kiseline CDRH1 od hTNF40.

SEK ID BR: 29 prikazuje sekvencu amino kiseline CDRH2 od hTNF40 koja je hibridni CDR pri čemu su C-terminalnih šest aminokiselina iz H2 CDR sekvence čoveka podgrupe 3 embrionskog antitela i promene amino kiseline u sekvenci rezultirajući iz ove hibridizacije su naglašene kao što sledi: WINTYIGEPI YADSVKG.

SEK ID BR: 30 prikazuje sekvencu amino kiseline CDRH3 od hTNF40.

SEK ID BR: 31 prikazuje sekvencu amino kiseline CDRL1 od hTNF40.

SEK ID BR: 32 prikazuje sekvencu amino kiseline CDRL2 of hTNF40.

SEK ID BR: 33 prikazuje sekvencu amino kiseline CDRL3 of hTNF40.

SEK ID BR: 34 prikazuje sekvencu amino kiseline CDRH2 od hTNF40.

SEK ID BR: 35 prikazuje sekvencu oligonukleotidnog adaptera OmpA.

SEK ID BR: 36 prikazuje oligonukleotidnu kasetu kodirajući intergenske sekvence 1 (IGS1) za E. koli Fab ekspresiju.

SEK ID BR: 37 prikazuje oligonukleotidnu kasetu kodirajući intergenske sekvence 2 (IGS2) za E. koli Fab ekspresiju.

SEK ID BR: 38 prikazuje oligonukleotidnu kasetu kodirajući intergenske sekvence 3 (IGS3) za E. koli Fab ekspresiju.

SEK ID BR: 39 prikazuje oligonukleotidnu kasetu kodirajući intergenske sekvence 4 (IGS4) za E. koli Fab ekspresiju.

Detaljan opis poželjnih izvođenja pronalaska

[0016] Predmetni pronalazak će sada biti opisan detaljnije.

[0017] Termini "protein" i "polipeptid" se ovde koriste naizmenično, osim ako kontekst ukazuje drugačije. "Peptid" je namenjen da se odnosi na 10 ili manje aminokiselina.

[0018] Termini "polinukleotid" uključuju gen, DNA, cDNA, RNA, mRNA i sl., osim ako kontekst ukazuje drugačije.

[0019] Kao što se ovje koristi, termin "obuhvatajući" u kontekstu ove specifikacije treba tumačiti kao "uključujući".

[0020] Ne-mutirana ćelija ili kontrolna ćelija u kontekstu predmetnog pronalaska označava ćeliju istog tipa kao što je rekombinantna gram-negativna ćelija predmetnog pronalaska, pri čemu ćelija nije modifikovana da bi se smanjila aktivnost Tsp proteina i da nosi rekombinantnu DsbC sekvencu i opciono mutantni spr gen. Na primer, ne-mutirana ćelija može biti divlji-tip ćelije i može biti izvedena iz iste populacije ćelija domaćina kao i ćelije iz pronalaska pre modifikacije da se uvede bilo koja mutacija.

[0021] Izrazi "ćelija", "ćelijska linija", "ćelijska kultura" i "soj" su korišćeni naizmenično.

[0022] Izraz "fenotip ćelije koji sadrži mutirani Tsp gen" u kontekstu predmetnog pronalaska označava fenotip koji pokazuje ćeliju koja nosi mutirani Tsp gen. Tipično, ćelije sadržavajući mutirani Tsp gen mogu lizirati, naročito pri visokim gustinama ćelije. Liza ovih ćelija uzrokuje da bilo koji rekombinantni protein prolazi u supernatant. Ćelije koje nose mutirani Tsp gen takođe mogu pokazivati termosenzitini rast pri niskoj osmolarnosti. Na primer, ćelije ne pokazuju smanjenu stopu rasta ili ćelije umiru u hipotoničnom medijumu pri visokoj temperaturi, kao što je na 40°C ili više.

[0023] Termin "izogen" u kontekstu predmetnog pronalaska označava da ćelijski genom sadrži istu ili suštinski istu sekvencu (e) nukleinske kiseline u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa iz koje je izvedena ćelija, osim modifikacije potrebne za smanjenje aktivnosti Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa i opciono mutiranim spr genom. U ovom izvođenju genom ćelije ne sadrži dalje nikakve mutacije koje se ne javljaju prirodno ili genetski modifikovane. U jednom izvođenju, genom ćelije predmetnog pronalaska ima suštinski istu ili istu genomsku sekvencu u poređenju sa divljim-tipom ćelije, osim za modifikaciju koja je potrebna da se smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa divljim -tipom ćelije i opciono mutiranim spr genom. U jednom izvođenju, ćelija prema predmetnom pronalasku može imati suštinski istu genomsku sekvencu u poređenju sa divljim-tipom ćelije osim za modifikaciju koja je potrebna da se smanji aktivnosti Tsp proteina u poređenju sa divljim-tipom ćelije i opciono mutiranim spr genom uzimajući u obzir bilo koje prirodno nastale mutacije koje se mogu pojaviti. U jednom izvođenju, ćelija prema predmetnom pronalasku može imati tačno istu genomsku sekvencu u poređenju sa divljim-tipom ćelije osim za modifikaciju koja je potrebna da se smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa divljim-tipom ćelije i opciono mutiranim spr genom.

[0024] Rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC može biti prisutan na pogodnom ekspresionom vektoru transformisanom u ćeliju i/ili integrisanom u genom ćelije domaćina. U izvođenju gde je polinukleotid kodirajući DsbC umetnut u genom domaćina, genom ćelije će se takođe razlikovati od divljeg-tipa ćelije zbog umetnute polinukleotidne sekvence koja kodira DsbC. Poželjno, polinukleotid kodirajući DsbC je u ekspresionom vektoru u ćeliji, tako uzrokujući minimalni poremećaj genoma ćelije domaćina.

[0025] U jednom izvođenju, ćelija predmetnog pronalaska sadrži polinukleotid koji kodira protein od interesa. U ovom izvođenju, polinukleotid kodirajući protein od interesa može biti sadržan unutar pogodnog ekspresionog vektora transformisan u ćeliju i/ili integrisan u genom ćelije domaćina. U izvođenju gde je polinukleotid kodirajući protein od interesa umetnut u genom domaćina, genom će se takođe razlikovati od divljeg-tipa ćelije zbog umetnute polinukleotidne sekvence kodirajući protein od interesa. Poželjno, polinukleotid kodirajući protein od interesa je u ekspresionom vektoru u ćeliji prouzrokujući tako minimalni poremećaj ćelijskog genoma domaćina.

[0026] Termin "divlji-tip" u kontekstu predmetnog pronalaska označava soj gram-negativne bakterijske ćelije kao što se može pojaviti u prirodi ili može biti izolovan iz okoline, koja ne nosi nikakve genetski modifikovane mutacije. Primer divljeg-tipa soja E. koli je W3110, kao što je W3110 K-12 soj.

[0027] Pronalazači su obezbedili rekombinantnu gram-negativnu bakterijsku ćeliju pogodnu za ekspresiju proteina od interesa koji ima smanjenu aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa i sadrži rekombinantni polinukleotid kodirajući DsbC.

[0028] Ćelije prema predmetnom pronalasku sadrže rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC. Kao što se ovde koristi, "rekombinantni polipeptid" se odnosi na protein koji je građen ili proizveden korišćenjem rekombinantne DNA tehnologije. Polinukleotidna sekvenca kodirajući DsbC može biti identična endogenoj sekvenci koja kodira DsbC pronađenu u bakterijskim ćelijama. Alternativno, rekombinantna polinukleotidna sekvenca kodirajući DsbC je mutirana verzija divljeg-tipa DsbC sekvence, na primer imajući uklonjena restrikciona mesta, kao što je EcoRI mesto i/ili sekvencu koja kodira his-tag. Primer modififikovane DsbC nukleotidne sekvence za upotrebu u predmetnom pronalasku prikazan je u SEK ID BR: 26, koji kodira hisobeleženu DsbC sekvencu amino kiseline prikazanu u SEK ID BR: 27.

[0029] Našli smo da specifična kombinacija ekspresije rekombinantnog polinukleotida kodirajući DsbC u bakterijskoj ćeliji koja ima smanjenu aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa i u poželjnom izvođenju dodatno mutiranim spr genom, bezbeđuje poboljšanog domaćina za ekspresiju proteina od interesa. Specifična kombinacija iznad navedenih genetskih mutacija obezbeđuje nove sojeve koji imaju poboljšano zdravlje ćelija i rast fenotipa u poređenju sa ćelijama koje nose nokaut mutirani Tsp gen. Ćelije noseći mutirani Tsp gen mogu imati dobru stopu rasta ćelije, ali jedno ograničenje ovih ćelija je njihova sklonost lizi, posebno pri visokim gustinama ćelija. Prema tome, fenotip ćelije sadržavajući mutirani TSp gen je sklonost liziranju, posebno pri visokim gustinama ćelija. Međutim, ekspresija DsbC u ćelijama predmetnog pronalaska, potiskuje smanjeni Tsp fenotip i zbog toga ćelija pokazuje smanjenu lizu.

[0030] Ćelije prema predmetnom pronalasku pokazuju poboljšani prinos produkcije proteina u poređenju sa ćelijama koje nose nokaut mutirani Tsp gen. Poboljšani prinos proteina može biti brzina produkcije proteina i/ili trajanje produkcije proteina iz ćelije. Poboljšani prinos proteina može biti prinos periplazmatskog proteina i/ili prinos supernatanta proteina. U jednom izvođenju, ćelije predmetnog pronalaska pokazuju poboljšani prinos periplazmatskog proteina u poređenju sa ćelijom koja nosi mutirani Tsp gen zbog smanjenog propuštanja iz ćelije. Rekombinantne bakterijske ćelije mogu biti sposobne bržoj stopi produkcije proteina od interesa, i zbog toga ista količina proteina od interesa može biti proizvedena u kraćem vremenu u poređenju sa ćelijom koja sadrži mutirani Tsp gen. Brža stopa produkcije proteina od interesa može biti posebno značajna tokom početnog perioda rasta ćelije, na primer tokom prvih 5, 10, 20 ili 30 sati nakon indukcije ekspresije proteina.

[0031] Ćelije prema predmetnom pronalasku poželjno izražavaju maksimalni prinos u periplazmi i/ili medijumu od približno 1.0g/L, 1.5g/L, 1.8g/L, 2.0g/L, 2.4g/L, 2.5g/L, 3.0g/L, 3.5g/L ili 4.0g/L g/L proteina od interesa.

[0032] Ćelije obezbeđene predmetnim pronalaskom imaju smanjenu aktivnost proteaze u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa, što može smanjiti proteolizu rekombinantnog proteina od interesa, naročito proteina od interesa koji su proteolitički osetljivi na Tsp proteazu. Zbog toga, ćelije koje su obezbeđene predmetnim pronalaskom obezbeđuju veći prinos intaktnih proteina, poželjno proteina od interesa i niži prinos, ili poželjno bez proteolitičkih fragmenata proteina, poželjno od proteina od interesa, u poređenju sa bakterijskom ćelijom divljeg-tipa.

[0033] Stručna osoba bi mogla lako testirati klon ćelije kandidata da vidi ima li željeni prinos proteina od interesa korišćenjem metoda dobro poznatih u tehnici, uključujući metodu fermentacije, ELIZA i protein G HPLC. Pogodne metode fermentacije su opisane u Humphreys D P, et al. (1997). Formacija dimernih Fabova u E. koli: efekat zglobne veličine i izotipa, prisustvo međulančane disulfidne veze, nivoi Fab' ekspresije, krajnji deo sekvenci i uslovi rasta. J. IMMUNOL. METH. 209: 193-202; Backlund E. Reeks D. Markland K. Weir N. Bowering L. Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov’t Journal of Biotechnology. 135(4):358-65, 2008 Jul 31; Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott D. Similarity of the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes. [Journal Article] Proteomics. 1(9):1133-48, 2001 Sep; and Horn U. Strittmatter W. Krebber A. Knupfer U. Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S. Pluckthun A. Riesenberg D. Visoki volumetrijski prinosi funkcionalnih dimernih miniantitela u Ešerihiji koli, koristeći optimizirani ekspresioni vektor i fermentaciju ćelija visoke gustoće u ne-ograničenim uslovima rasta Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov’t Applied Microbiology & Biotechnology. 46(5-6):524-32, 1996 Dec. Stručnjak bi takođe lako mogao testirati izlučene proteine da bi proverio je li protein ispravno savijen korišćenjem metoda dobro poznatih u struci, kao što je protein G HPLC, cirkularni dihroizam, NMR, rendgenska kristalografija i metode merenja afiniteta epitopa.

[0034] U jednom izvođenju, ćelija prema pronalasku takođe izražava jedan ili više dodatnih proteina kao što sledi:

• jedan ili više proteina sposobnih da olakšavaju savijanje proteina, kao što su FkpA, Skp, SurA, PPiA i PPiD; i/ili

• jedan ili više proteina sposobnih da olakšavaju sekreciju proteina ili translokaciju, kao što su SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY i Lep; i/ili

• jedan ili više proteina sposobnih da olakšavaju formiranje disulfidne veze, kao što su DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

[0035] Jedan od više iznad navedenih proteina mogu biti integrisati u genom ćelije i/ili umetnuti u ekspresioni vektor.

[0036] U jednom izvođenju, ćelija prema predmetnom pronalasku ne sadrži rekombinantni polinukleotid kodirajući jedan ili više od sledećih dodatnih proteina:

• jedan ili više proteina sposobnih da olakšavaju savijanje proteina, kao što FkpA, Skp, SurA, PPiA i PPiD; • jedan ili više proteina sposobnih da olakšavaju sekreciju proteina ili translokaciju, kao što su SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY i Lep; i

• jedan ili više proteina sposobnih da olakšavaju formiranje disulfidne veze, kao što su DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

[0037] U izvođenjima predmetnog pronalaska ćelija dalje sadrži mutirani spr gen. Protein spr je periplazmatska proteaza vezana za membranu E. koli.

[0038] Divlji-tip sekvence amino kiseline spr proteina je prikazan u SEK ID BR: 21 sa signalnom sekvencom na N-terminusu i u SEK ID BR: 22 bez signalne sekvence 26 amino kiselina (prema UniProt Accession Number P0AFV4). Numerisanje sekvence amino kiseline spr proteina u predmetnom pronalasku uključuje signalnu sekvencu. Prema tome, amino kiselina 1 spr proteina je prva amino kiselina (Met) prikazana u SEK ID BR: 21.

[0039] U izvođenjima pri čemu ćelija prema predmetnom pronalasku sadrži mutirani spr gen, mutirani spr gen je poželjno ćelijski hromozomski spr gen. Mutirani spr gen kodira spr protein sposoban suzbijanju fenotipa ćelije sadržavajući mutirani Tsp gen. Ćelije noseći mutirani Tsp gen mogu imati dobru stopu rasta ćelije, ali jedno ograničenje ovih ćelija je njihova sklonost ka lizi, posebno pri visokim gustinama ćelija. Prema tome, fenotip ćelije sadržavajući mutirani Tsp gen je sklon lizi, posebno pri visokim gustinama ćelije. Ćelije noseći mutirani TSp gen takođe pokazuju termosenzitivni rast pri niskoj osmolarnosti. Međutim, izvedene su spr mutacije od strane ćelija predmetnog pronalaska, kada se unesu u ćeliju koja ima smanjenu aktivnost Tsp, suzbijaju smanjeni Tsp fenotip, i zbog toga, ćelija pokazuje smanjenu lizu, naročito pri visokoj gustini ćelije. Fenotip rasta ćelije može lako biti izmeren od strane stručnjaka u ovom područlu tehnike za vreme tehnike fermentacije ćelije visoke gustoće u protresenoj boci. Suzbijanje lize fenotipa ćelije se može videti iz poboljšane stope rasta i/ili produkcije rekombinantnog proteina, naročito u periplazmi, koju pokazuje ćelija koja nosi mutirani spr i ima smanjenu aktivnost Tsp u poređenju sa ćelijom koja nosi mutirani Tsp i divlji-tip spr.

[0040] Ćelije prema predmetnom pronalasku poželjno sadrže mutirani spr gen koji kodira spr protein imajući mutaciju na jednoj ili više aminokiselina izabranih od N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147, H157 i W174, poželjnije na jednoj ili više amino kiselina izabranih od C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157 i W174. Poželjno mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju na jednoj ili više amino kiselina izabranih od N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 i H157, poželjnije na jednoj ili više amino kiselina izabranih od C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 i H157. U ovom izvođenju, spr protein poželjno nema nikakvih daljih mutacija. Poželjno, mutirani spr gen

kodira spr protein koji ima mutaciju na jednoj ili više amino kiselina izabranih od N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 i G147, još poželjnije na jednoj ili više amino kiselina izabranih od S95, V98, Y115, D133, V135 i G147. U ovom izvođenju, spr protein poželjno nema nikakve dalje mutacije.

[0041] Predmetni pronalazači su identifikovali spr-mutacije koje su sposobne suzbijanju rasta fenotipa ćelije koji sadrži mutirani Tsp gen.

[0042] Pronalazači su takođe, iznenađujuće našli da ćelije noseći rekombinantni DsbC gen, novi mutirani spr gen i imajući smanjenu aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa pokazuju povećanu stopu rasta ćelije i povećanu trajnost preživljavanja ćelije u poređenju sa ćelijom koja sadrži mutirani Tsp gen. Specifično, ćelije noseći rekombinantni DsbC gen, spr mutaciju i imajući smanjenu aktivnost Tsp proteina pokazuju smanjenu ćelijsku lizu fenotipa u poređenju sa ćelijama koje nose mutirani Tsp gen.

[0043] Mutacija jedne ili više iznad navedenih spr amino kiselina može biti bilo koja pogodna genetska mutacija na jednom, dva ili tri nukleotida koji kodiraju aminokiselinu. Mutacija menja ostatak amino kiseline na bilo kojoj pogodnoj aminokiselini koja rezultira mutiranim spr proteinom sposobnom suzbijanju ćelije fenotipa koja sadrži mutirani Tsp gen. Genetska mutacija može promeniti amino kiselinu na jednoj koja je različite veličine i/ili ima različita hemijska svojstva u poređenju sa aminokiselinom divljeg-tipa.

[0044] U jednom izvođenju mutacija je na jednoj, dve ili tri katalitičke trijade aminokiselinskih ostataka C94, H145, i H157 (Solution NMR Structure of the NlpC/P60 Domain of Lipoprotein Spr from Escherichia coli Structural Evidence for a Novel Cysteine Peptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717).

[0045] Prema tome, mutirani spr gen može sadržavati:

• mutaciju na C94; ili

• mutaciju na H145; ili

• mutaciju na H157; ili

• mutaciju na C94 i H145; ili

• mutaciju na C94 i H157; ili

• mutaciju na H145 i H157; ili

• mutaciju na C94, H145 i H157.

[0046] U ovom izvođenju, spr protein poželjno nema nikakve dalje mutacije.

[0047] Jedan, dva ili tri od C94, H145 i H157 mogu biti mutirani u bilo kojoj pogodnoj amino kiselini koja rezultira u spr proteinu sposobnom suzbijanju fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen. Na primer, jedan, dva ili tri od C94, H145 i H157 mogu biti mutirani na maloj amino kiselini kao što je Gly ili Ala. Prema tome, spr protein može imati jednu, dve ili tri mutacije C94A, H145A i H157A. Poželjno, spr gen sadrži genetsku mutaciju H145A, za koju je nađeno da produkuje spr protein sposoban suzbijanju fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen.

[0048] Oznaka za supstituciju mutanta se ovde sastoji od slova praćenim brojem, praćenim slovom. Prvo slovo označava aminokiselinu u proteinu divljeg-tipa. Broj se odnosi na poziciju amino kiseline gde je izvršena supstitucija amino kiseline, i drugo slovo označava amino kiselinu koja je korišćena da zameni amino kiselinu divljeg-tipa.

[0049] U poželjnom izvođenju mutirani spr protein sadrži mutaciju na jednoj ili više aminokiselina izabranih od N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 i G147, poželjno mutaciju na jednoj ili više amino kiselina izabranih od S95, V98, Y115, D133, V135 i G147.

U ovom izvođenju, spr protein poželjno nema nikakve dalje mutacije. Prema tome, mutirani spr gen može sadržavati:

• mutaciju na N31; ili

• mutaciju na R62; ili

• mutaciju na I70; ili

• mutaciju na Q73; ili

• mutaciju na S95; ili

• mutaciju na V98; ili

• mutaciju na Q99; ili

• mutaciju na R100; ili

• mutaciju na L108; ili

• mutaciju na Y115; ili

• mutaciju na D133; ili

• mutaciju na V135; ili

• mutaciju na L136; ili

• mutaciju na G140; ili

• mutaciju na R144; ili

• mutaciju na G147.

[0050] U jednom izvođenju mutirani spr protein sadrži višestruke mutacije na amino kiselinama:

• S95 i Y115; ili

• N31, Q73, R100 i G140 ; ili

• Q73, R100 i G140; ili

• R100 i G140; ili

• Q73 i G140; ili

• Q73 i R100; ili

• R62, Q99 i R144 ;ili

• Q99 i R144.

[0051] Jedna ili više aminokiselina N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 i G147 može biti mutirana u bilo koju pogodnu aminokiselinu koja rezultira u spr proteinu sposobnom suzbijanju fenotipa ćelije sadržiavajući mutirani Tsp gen. Na primer, jedna ili više od

N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 i R144 može biti mutirana u malu amino kiselinu kao što je Gly ili Ala.

[0052] U poželjnom izvođenju spr protein sadrži jednu ili više od sedećih mutacija: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D ili V135G, L136P, G140C, R144C i G147C. Poželjno, spr protein sadrži jednu ili više od sledećih mutacija: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D ili V135G i G147C. U ovom izvođenju, spr protein poželjno nema nikakve dalje mutacije.

[0053] U jednom izvođenju spr protein ima jednu mutaciju izabranu od N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D or V135G, L136P, G140C, R144C i G147C. U ovom izvođenju, spr protein poželjno nema nikakve dalje mutacije.

[0054] U daljem izvođenju spr protein ima višestruke mutacije izabrane od:

• S95F i Y115F

• N31Y, Q73R, R100G i G140C ;

• Q73R, R100G i G140C;

• R100G i G140C;

• Q73R i G140C ;

• Q73R i R100G ;

• R62C, Q99P i R144C; ili

• Q99P i R144C.

[0055] Poželjno, mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju izabranu od C94A, D133A, H145A i H157A.

[0056] U daljem izvođenju mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju W174R. U alternativnom izvođenju spr protein nema mutaciju W174R.

[0057] Ćelija prema predmetnom pronalasku ima smanjenu aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa. Izraz "smanjena aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg-tipa" znači da je Tsp aktivnost ćelija smanjena u poređenju sa aktivnošću Tsp ćelije divljeg-tipa. Ćelija može biti modifikovana bilo kojim pogodnim načinom za smanjenje aktivnosti Tsp.

[0058] U jednom izvođenju smanjena aktivnost Tsp je iz modifikacije endogenog polinukleotida kodirajući Tsp i/ili pridruženene sekvence regulatorne ekspresije. Modifikacija može smanjiti ili zaustaviti transkripciju Tsp gena i translaciju ili može obezbediti izraženi Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze u poređenju sa Tsp proteinom divljeg-tipa.

[0059] U jednom izvođenju, pridružena sekvenca regulatorne ekspresije je modifikovana da bi se smanjila ekspresija Tsp. Na primer, promotor za Tsp gen može biti mutiran da bi se sprečila ekspresija gena.

[0060] U poželjnom izvođenju, ćelija prema predmetnom pronalasku nosi mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili nokaut mutirani Tsp gen. Poželjno hromozomski Tsp gen je mutiran.

[0061] Kao što se ovde koristi, "Tsp gen" označava gen koji kodira Tsp proteazu (takođe poznautu kao Prc) koja je periplazmatska proteaza sposobna delovanju na Penicilin-vezujući protein-3 (PBP3) i fag krajnje proteine. Sekvenca divljeg-tipa Tsp gena je prikazana u SEK ID BR: 1, i sekvenca divljeg-tipa Tsp proteina je prikazana u SEK ID BR: 2.

[0062] Pozivanje na mutirani Tsp gen ili mutirani Tsp gen koji kodira Tsp, se odnosi i na mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein imajući smanjenu aktivnost proteaze ili nokaut mutirani Tsp gen, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0063] Izraz "mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein imajući smanjenu aktivnost proteaze" u kontekstu predmetnog pronalska znači da mutirani Tsp gen nema punu aktivnost proteaze u poređenju na divlji-tip nemutiranog Tsp gena.

[0064] Poželjno, mutirani Tsp gen kodira Tsp protein koji ima 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje ili 5% ili manje aktivnosti proteaze divljeg tipa ne-mutiranog Tsp proteina. Poželjnije, mutirani Tsp gen kodira Tsp protein koji nema aktivnost proteaze. U ovom izvođenju ćelija nema manjak u hromozomskom Tsp, tj. Tsp genska sekvenca nije izbrisana ili mutirana da bi se sprečila ekspresija bilo kojeg oblika Tsp proteina.

[0065] Bilo koja pogodna mutacija može biti uvedena u Tsp gen da bi se proizveo protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze. Aktivnost proteaze od Tsp proteina izražena iz gram-negativne bakterije može lako biti testirana od strane stručnjaka sa ovog područja tehnike bilo kojim pogodnom metodom u tehnici, kao što je metoda opisana u Keiler et al

(Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease* THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.270, No. 48, Issue of December 1, pp. 28864-28868, 1995 Kenneth C. Keiler and Robert T. Sauer) pri čemu je testirana aktivnost Tsp proteaze.

[0066] Tsp je oobjavljen u Keiler et al (iznad) kao da ima aktivno mesto sadržavajući ostatke S430, D441 i K455, a ostaci G375, G376, E433 i T452 su važni za održavanje strukture Tsp. Keiler et al (iznad) dostavlja izveštaje da mutirani Tsp geni S430A, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A i T452A nisu imali prepoznatljivu aktivnost proteaze. Dalje je objavljeno da mutirani Tsp gen S430C prikazuje oko 5-10% aktivnosti divljeg-tipa. Prema tome, mutacija Tsp da proizvede protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze može sadržavati mutaciju, kao što je genetska mutacija na jednom ili više ostataka S430, D441, K455, G375, G376, E433 i T452. Poželjno mutacija Tsp da proizvede protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze može sadržavati mutaciju, kao što je genetska mutacija na jednom, dva ili sva tri aktivna mesta ostataka S430, D441 i K455.

[0067] Prema tome, mutirani Tsp gen može sadržavati:

• mutaciju na S430; ili

• mutaciju na D441; ili

• mutaciju na K455; ili

• mutaciju na S430 i D441; ili

• mutaciju na S430 i K455; ili

• mutaciju na D441 i K455; ili

• mutaciju na S430, D441 i K455.

[0068] Jedan ili više S430, D441, K455, G375, G376, E433 i T452 mogu biti mutirani u bilo koju pogodnu aminokiselinu koja rezultira u proteinu imajući smanjenu aktivnost proteaze. Primeri pogodnih mutacija su S430A, S430C, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A i T452A. Mutirani Tsp gen može sadržavati jednu, dve ili tri mutacije na ostacima aktivnog mesta, na primer gen može sadržavati:

• S430A ili S430C; i/ili

• D441A; i/ili

• K455A ili K455H ili K455R.

[0069] Poželjno, Tsp gen ima tačkastu mutaciju S430A ili S430C.

[0070] Izraz "nokaut mutirani Tsp gen" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da Tsp gen obuhvata jednu ili više mutacija koje sprečavaju ekspresiju Tsp proteina kodiranog od strane gena divljeg-tipa da se obezbedi ćelijski deficijent u Tsp proteinu. Nokaut gen može biti delimično ili potpuno transkribovan, ali nije preveden u kodiran protein. Nokaut mutirani Tsp gen može biti mutiran na bilo koji pogodan način, na primer sa jednim ili više brisanja, umetanja, tačkaste, genetske, besmislene i mutacija pomeranja okvira čitanja, da se ne uzrokuje ekspresija proteina. Na primer, gen može biti nokautiran umetanjem sekvence strane DNA, kao što je marker rezistentan na antibiotik, u sekvencu kodirajućeg gena.

[0071] U poželjnom izvođenju, Tsp gen nije mutiran umetanjem sekvence strane DNA, kao što je marker rezistentan na antibiotike, u genom kodirajuću sekvencu. U jednom izvođenju Tsp gen obuhvata mutaciju na start kodonu gena i/ili jednom ili više stop kodona pozicioniranih nizvodno od start kodona gena i uzvodno od stop kodona gena, time sprečavajući ekspresiju Tsp proteina. Mutacija na start kodonu može biti genetska mutacija jednog, dva ili sva tri nukleotida start kodona. Alternativno ili dodatno start kodon može biti mutiran pomoću umetanja ili brisanja mutacije pomeranja okvira čitanja. Tsp gen obuhvata dva ATG kodona na kraju 5' kodirajuće sekvence, jedan ili oba od ATG kodona mogu biti mutirana pomoću genetske mutacije. Tsp gen može biti mutiran na drugom ATG kodonu (kodon 3) TCG, kao što je prikazano na Slici 5b. Tsp gen može alternativno ili dodatno sadržavati jedan ili više stop kodona pozicioniranih nizvodno od start kodona gena i uzvodno od stop kodona gena. Poželjno, nokaut mutirani Tsp gen obuhvata i genetsku mutaciju na start kodonu i jednom ili više umetnutih stop kodona. U poželjnom izvođenju Tsp gen je mutiran da izbriše "T" iz petog kodona, time uzrokujući pomeranje okvira čitanja, rezultirajući u stop kodonu i kodonima 11 i 16, kao što je prikazano na Slici 5b. U poželjnom izvođenju Tsp gen je mutiran da ubaci Ase I restrikciono mesto da bi stvorio u okviru treći stop kodon na kodonu 21, kao što je prikazano na Slici 5b.

[0072] U poželjnom izvođenju nokaut mutirani Tsp gen ima DNA sekvencu SEK ID br:3, koja uključuje 6 nukleotida ATGAAT uzvodno od start kodona. Mutacije koje su napravljene u nokaut mutiranoj Tsp sekvenci od SEK ID BR:3 su prikazane na Slici 5b. U jednom izvođenju mutirani Tsp gen ima DNA sekvencu nukleotida 7 do 2048 od SEK ID BR: 3.

[0073] U poželjnom izvođenju predmetnog pronalaska rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija dalje sadrži mutirani DegP gen koji kodira DegP protein imajući aktivnost šaperona i smanjenu aktivnost proteaze i/ili mutirani ptr gen, pri čemu mutirani ptr gen kodira Proteazu III protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani ptr gen i/ili mutirani OmpT gen, pri čemu mutirani OmpT gen kodira OmpT protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani OmpT gen.

[0074] U jednom izvođenju predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantnu gram-negativnu bakterijsku ćeliju koja sadrži:

a. rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC;

b. mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili nokaut mutirani Tsp gen; c. Mutirani DegP gen koji kodira DegP protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu aktivnost proteaze i/ili mutirani OmpT, pri črmu mutirani OmpT gen kodira OmpT protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani OmpT gen; i

d. opciono mutirani spr gen.

[0075] Poželjno u ovom izvođenju genom ćelije je izogen u odnosu na bakterijsku ćeliju divljeg-tipa, osim iznad navedenih mutacija b, c i d.

[0076] U jednom izvođenju predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantnu gram-negativnu bakterijsku ćeliju koja sadrži:

a. rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC;

b. mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili nokaut mutirani Tsp gen; c. mutirani ptr gen, pri čemu mutirani ptr gen kodira Proteazu III protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani ptr gen i/ili mutirani OmpT pri čemu mutirani OmpT gen kodira OmpT protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani OmpT gen; i

d. opciono mutirani spr gen.

[0077] Poželjno u ovom izvođenju genom ćelije je izogen u odnosu na bakterijsku ćeliju divljeg-tipa, osim iznad navedenih mutacija b, c i d.

[0078] U jednom izvođenju predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži

a. rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC;

b. mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili nokaut mutirani Tsp gen; c. mutirani DegP gen koji kodira DegP protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu aktivnost proteaze; d. mutirani ptr gen, pri čemu mutirani ptr gen kodira Proteazu III protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani ptr gen; i

e. opciono mutirani OmpT pri čemu mutirani OmpT gen kodira OmpT protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani OmpT gen; i

f. opciono mutirani spr gen.

[0079] Poželjno u ovom izveđenju genom ćelije je izogen u odnosu na bakterijsku ćeliju divljeg-tipa osim iznad navedenih mutacija b, c, d, e i f.

[0080] U izvođenjima predmetnog pronalaska ćelija sadrži mutirani DegP gen. Kao što se ovde koristi, "DegP" označava gen koji kodira DegP protein (takođe poznat kao HtrA), koji ima dvojnu funkciju kao šaperon i proteaza (Families of serine peptidases; Rawlings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994;244:19-61). Sekvenca nemutiranog DegP gena je prikazana u SEK ID BR:7, i sekvenca ne- mutiranog DegP proteina je prikazana u SEK ID BR: 8.

[0081] Na niskim temperaturama, DegP funkcioniše kao šaperin i pri visokim temperaturama, DegP ima prednost da funkcioniše kao proteaza (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97 , Issue 3 , Pages 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) and The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658).

[0082] U izvođenjima gde ćelija sadrži DegP mutaciju, DegP mutacija u ćeliji obezbeđuje mutirani DegP gen koji kodira DegP protein koji ima aktivnost šaperona, ali ne punu aktivnost proteaze.

[0083] Izraz "imajući šaperon aktivnost" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da mutirani DegP protein ima istu ili suštinski istu aktivnost šaperona u poređenju sa divljim-tipom ne-mutiranog DegP proteina. Poželjno, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji ima 50% ili više, 60% ili više, 70% ili više, 80% ili više, 90% ili više ili 95% ili više šaperon aktivnosti divljeg-tipa ne-mutiranog DegP proteina. Poželjnije, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji ima istu aktivnost šaperona u poređenju sa divljim- tipom DegP.

[0084] Izraz "imajući smanjenu aktivnost proteaze" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da mutirani DegP protein nema punu aktivnost proteaze u poređenju sa divljim-tipom ne-mutiranog DegP proteina. Poželjno, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji ima 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje ili 5% ili manje aktivnosti proteaze divljeg tipa ne-mutiranog DegP proteina. Poželjnije, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji nema aktivnost proteaze. Ćelija nije deficijentna u hromozomskom DegP-u, tj. sekvence DegP gena nisu bile izbrisane ili mutirane da bi se sprečila ekspresija bilo kojeg oblika DegP proteina.

[0085] Bilo koja pogodna mutacija može biti uvedena u DegP gen kako bi se proizveo protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu aktivnost proteaze. Proteazna i šaperon aktivnost proteina DegP izražena iz gram-negativne bakterije može biti lako testirana od strane stručnjaka sa ovog područja tehnike bilo kojom pogodnom metodom kao što je metoda opisana u Spiess et al, pri čemu su proteazne i šaperon aktivnosti DegP testirane na MalS, prirodnom supstratu DegP (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock

Protein. Cell, Volume 97 , Issue 3 , Pages 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) kao i metodom opisanom u The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658.

[0086] DegP je serinska proteaza i ima aktivni centar koji se sastoji od katalitičke trijade aminokiselinskih ostataka His105, Asp135 i Ser210 ( (Families of serine peptidases, Methods Enzymol., 1994, 244:19-61 Rawlings N and Barrett A). DegP mutacija da proizvede protein koji ima šaperon aktivnost i smanjenu aktivnost proteaze može sadržavati mutaciju, kao što je genetska mutacija na jednom, dva ili tri His105, Asp135 i Ser210.

[0087] Prema tome, mutirani DegP gen može sadržavati:

• mutaciju na His 105; ili

• mutaciju na Asp 135; ili

• mutaciju na Ser210; ili

• mutaciju na His105 i Asp 135; ili

• mutaciju na His105 i Ser210; ili

• mutaciju na Asp135 i Ser210; ili

• mutaciju na His105, Asp135 i Ser210.

[0088] Jedan, dva ili tri His105, Asp135 i Ser210 mogu biti mutirani na bilo kojoj pogodnoj amino kiselini koja rezultira u protein imajući šaperon aktivnost i smanjenu aktivnost proteaze. Na primer, jedan, dva ili tri His105, Asp135 i Ser210 mogu biti mutirani na maloj aminokiselini kao što je Gly ili Ala. Dalja pogodna mutacija je da se promeni jedan, dva ili tri His105, Asp135 i Ser210 na amino kiselini imajući suprotna svojstva kao što je Asp135 muturan u Lys ili Arg, polarni His105 je mutiran u ne-polarnu aminokiselinu kao što je Gly, Ala, Val ili Leu i mala hidrofilna Ser210 je mutirana u veliki ili hidrofobni ostatak kao što su Val, Leu , Phe ili Tyr. Poželjno, DegP gen obuhvata tačkastu mutaciju S210A, kao što je prikazano na Slici 5c, koja je nađena da proizvodi protein koji ima aktivnost šaperona, ali ne i aktivnost proteaze (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97 , Issue 3 , Pages 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).

[0089] DegP ima dva PDZ domena, PDZ1 (ostaci 260-358) i PDZ2 (ostaci 359-448), koji posreduju proteinprotein interakciju (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97 , Issue 3 , Pages 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M). U jednom izviđenju predmetng pronalaska DegP gen je mutiran da bi se izbrisao PDZl domen i/ili PDZ2 domen. Brisanje PDZl i PDZ2 dovodi do potpunog gubitka aktivnosti proteaze od DegP proteina i smanjene šaperon aktivnosti u poređenju sa divljim-tipom DegP proteina dok brisanje PDZ1 ili PDZ2 rezultira aktivnošću proteaze od 5% i sličnom šaperon aktivnošću u poređenju sa divljim-tipom DegP proteina (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3 , Pages 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).

[0090] Mutirani DegP gen može takođe sadržavati javljanje tihog ne-prirodnog restrikcionog mesta, kao što je Ase I, kako bi se pomoglo u identifikaciji i skrining metodama, na primer kao što je prikazano na Slici 5c.

[0091] Poželjna sekvenca mutiranog DegP gena obuhvatajući tačkastu mutaciju S210A i Ase I restrikciono marker mesto je obezbeđeno u SEK ID BR: 9, i kodirana sekvenca proteina je prikazana u SEK ID BR:10. Mutacije koje su napravljene u mutiranj sekvenci DegP od SEK ID BR:9 su prikazane na Slici 5c.

[0092] U izvođenjima predmetnog pronalaska, pri čemu ćelija sadrži mutirani DegP gen koji kodira DegP protein imajući šaperon aktivnost i smanjenu aktivnost proteaze, jedna ili više ćelija obezbeđenih predmetnim pronalaskom mogu obezbediti poboljšani prinos pravilno savijenih proteina iz ćelije u odnosu na mutirane ćelije u kojima je DegP gen mutiran do nokaut DegP sprečavajući ekspresiju DegP, kao što je hromozomski deficijent DegP. U ćeliji koja sadrži nokaut mutirani DegP gen sprečavajući ekspresiju DegP-a, šaperon aktivnost od DegP je u potpunosti izgubljena, dok je u ćeliji prema predmetnom pronalasku aktivnost DegP zadržana dok je puna aktivnost proteaze izgubljena. U ovim izvođenjima, jedna ili više ćelija prema predmetnom pronalasku imaju nižu aktivnost proteaze da bi se sprečila proteoliza proteina uz održavanje šaperon aktivnosti da bi se omogućilo ispravno savijanje i transport proteina u ćeliji domaćina.

[0093] Stručnjak će lako moći testirati izlučene proteine da bi proverio je li protein ispravno savijen pomoću metoda dobro poznatih u tehnici, kao što je protein G HPLC, cirkularni dihroizam, NMR, rendgenska kristalografija i metode merenja afiniteta epitopa.

[0094] U ovim izvođenjima, jedna ili više ćelija prema predmetnom pronalasku mogu imati poboljšani rast ćelija u poređenju sa ćelijama koje nose mutirani nokaut DegP gen sprečavajući ekspresiju DegP. Bez želje da se vežemo za teoriju, poboljšani rast ćelije je možda izložen zbog DegP proteaze zadržavajući šaperon aktivnost, koja može povećati kapacitet ćelije da obrađuje sve proteine koji zahtevaju šaperon aktivnost. Prema tome, produkcija pravilno savijenih proteina neophodnih za ćelijski rast i reprodukciju može biti povećana u jednoj ili više ćelija iz predmetnog pronalaska u poređenju sa ćelijama koje nose DegP nokaut mutaciju, time poboljšavajući ćelijske puteve koji regulišu rast. Dalje, poznati sojevi sa nedostatkom DegP proteaze su generalno osetljivi na temperaturu i obično ne rastu na temperaturama višim od oko 28°C. Međutim, ćelije prema predmetnom pronalasku nisu temperaturno senzitivne i mogu biti uzgajane na temperaturama od 28°C ili više, uključujući temperature od približno 30°C do približno 37°C, koje se tipično koriste za produkcija u industrijskim razmerama proteina iz bakterije.

[0095] U izvođenjima predmetnog pronalaska ćelija sadrži mutirani ptr gen. Kao što se ovde koristi, "ptr gen" označava gen koji kodira Proteazu III protein koja degradira proteine velike molekulske težine. Sekvenca nemutiranog ptr gena prikazana u SEK ID BR:4, i sekvenca ne-mutirane Proteaze III proteina je prikazana u SEK ID BR: 5.

[0096] Referenca na mutirani ptr gen ili mutirani ptr gen koji kodira Proteazu III, se odnosi na mutirani ptr gen koji kodira Proteazu III protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze ili nokaut mutirani ptr gen, ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0097] Izraz " mutirani ptr gen kodirajući Proteazu III protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da mutirani gen ptr nema punu aktivnost proteaze u poređenju sa divljim-tipom ne-mutiranog ptr gena.

[0098] Poželjno, mutirani ptr gen kodira Proteazu III imajući 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje ili 5% ili manje aktivnosti proteaze divljeg-tipa ne-mutirane Proteaze III proteina. Poželjnije, mutirani ptr gen kodira Proteazu III protein koji nema aktivnost proteaze. U ovom izvođenju ćelija nema deficijent u hromozomskom ptr, tj. sekvenca ptr gena nije izbrisana ili mutirana da se spreči ekspresija bilo kojeg oblika Proteaze III proteina.

[0099] Bilo koja pogodna mutacija može biti uvedena u ptr gen da bi se proizveo Proteaza III protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze. Aktivnost proteaze od Proteaze III proteina izražena iz gram-negativne bakterije može biti lako ispitana od strane stručnjaka u ovom području tehnike bilo kojim pogodnom metodom u tehnici.

[0100] Izraz "nokaut mutirani ptr gen" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da gen sadrži jednu ili više mutacija i time ne uzrokuje ekspresiju proteina kodiranog od strane gena da obezbedi ćelijski deficijent u proteinu kodiranom od strane nokaut mutiranog gena. Nokaut gen može biti delimično ili potpuno transkribovan, ali nije preveden u kodiran protein. Nokaut mutirani ptr gen može biti mutiran na bilo koji pogodan način, na primer sa jednim ili više brisanja, umetanja, tačkaste, genetske, besmislene i mutacija pomeranja okvira čitanja, da se ne uzrokuje ekspresiju proteina. Na primer, gen može biti nokautiran umetanjem sekvence strane DNA, kao što je marker rezistentan na antibiotik, u sekvencu kodirajućeg gena.

[0101] U poželjnom izvođenju gen nije mutiran umetanjem sekvence strane DNA, kao što je marker rezistentan na antibiotik u sekvencu kodirajućeg gena. Poželjno Proteazaa III gen sadrži mutaciju na start kodonu gena i/ili jednom ili više stop kodona pozicioniranih nizvodno od start kodona gena i uzvodno od stop kodona gena time sprečavajući ekspresiju Proteaze III proteina.

[0102] Mutacija na meti start kodona nokaut gena uzrokuje gubitak funkcije start kodona i time osigurava da ciljani gen ne sadrži pogodni start kodon na početku kodirajuće sekvence. Mutacija na start kodonu može biti genetska mutacija jednog, dva ili sva tri nukleotida start kodona. Alternativno ili dodatno start kodon može biti mutiran umetanjem ili brisanjem mutacije pomeranja okvira čitanja.

[0103] U poželjnom izvođenju ptr gen je mutiran da promeni ATG start kodon u ATT, kao što je prikazano na Slici 5a.

[0104] Nokaut mutirani ptr gen može alternativno ili dodatno sadržavati jedan ili više stop kodona pozicioniranih nizvodno od start kodona gena i uzvodno od stop kodona gena. Poželjno, nokaut mutirani ptr gen obuhvata i genetsku mutaciju na start kodonu i jednom ili više umetnutih stop kodona.

[0105] Jedan ili više umetnutih stop kodona su poželjno u okviru stop kodona. Međutim, jedan ili više ubačenih stop kodona mogu alternativno ili dodatno biti izvan okvira stop kodona. Za zaustavljanje translacije mogu biti potrebni jedan ili više stop kodona izvan okvira, gde se izvan okvira start kodon promenio u okviru start kodona pomoću umetanja ili brisanja mutacije pomeranja okvira čitanja. Jedan ili više stop kodona mogu biti uvedeni bilo kojom pogodnom mutacijom uključujući besmislenu tačkastu mutaciju i mutaciju pomeranja okvira čitanja. Jedan ili više stop kodona su poželjno uvedeni mutacijom pomeranja okvira čitanja i/ili mutacijom umetanja, poželjno zamenom segmenta genske sekvence sa sekvencom koja sadrži stop kodon. Na primer, Ase I restrikciono mesto može biti umetnuto, što uobuhvata stop kodon TAA.

[0106] U poželjnom izvođenju ptr gen je mutiran da umetne u okviru stop kodona umetanjem Ase I restrikcionog mesta, kao što je prikazano na Slici 5a. U poželjnom izvođenju nokaut mutirani ptr gen ima DNA sekvencu od SEK ID BR: 6. Mutacije koje su napravljene u nokaut mutiranoj sekvenci ptr gena od SEK ID BR: 6 su prikazane na Slici 5a.

[0107] Iznad opisane nokaut mutacije su korisne jer uzrokuju minimalan ili nikakav poremećaj na hromozomskoj DNA uzvodno ili nizvodno od ciljanog mesta nokaut gena i ne zahtevaju umetanje i zadržavanje strane DNA, kao što su markeri rezistentni na antibiotik, koji mogu uticati na ćelijsku pogodnost za ekspresiju proteina od interesa, naročito terapijskih proteina. Prema tome, jedna ili više ćelija prema predmetnom pronalasku mogu pokazivati poboljšane karakteristike rasta i/ili ekspresiju proteina u poređenju sa ćelijama pri čemu je gen proteaze uklonjen umetanjem strane DNA u sekvencu kodirajućeg gena.

[0108] U izvođenjima predmetnog pronalaska ćelija nosi mutirani OmpT gen. Kao što se ovde koristi, "OmpT gen" označava gen koji kodira proteazu OmpT (spoljašnju membransku proteazu T) koja je spoljašnja membrana proteaze. Sekvenca divljeg -tipa ne-mutiranog OmpT gena je SWISS-PROT P09169.

[0109] Referenca za mutirani OmpT gen ili mutirani OmpT gen koji kodira OmpT, se odnosi i na mutirani OmpT gen koji kodira OmpT protein imajući smanjenu aktivnost proteaze ili nokaut mutirani OmpT gen, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0110] Izraz "mutirani OmpT gen koji kodira OmpT protein imajući smanjenu aktivnost proteaze" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da mutirani OmpT gen nema punu aktivnost proteaze u poređenju sa divljim-tipom nemutiranog OmpT gena. Mutirani OmpT gen može kodirati OmpT protein imajući 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje ili 5% ili manje aktivnosti proteaze divljeg-tipa ne-mutiranog OmpT proteina. Mutirani OmpT gen može kodirati OmpT protein koji nema aktivnost proteaze. U ovom izvođenju ćelija nema deficijent u hromozomskom OmpT tj. sekvenca OmpT gena nije izbrisana ili mutirana da bi se sprečila ekspresija bilo kojeg oblika OmpT proteina.

[0111] Svaka pogodna mutacija može biti uvedena u OmpT gen da bi se proizveo protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze. Stručnjak sa ovog područja tehnike može lako testirati aktivnost proteaze od OmpT proteina izraženu iz gram-negativne bakterije bilo kojom pogodnom metodom u ovom području tehnike, kao što je metoda opisana u Kramer et al (Identification of essential acidic residues of outer membrane protease OmpT supports a novel active site, FEBS Letters 505 (2001) 426-430) and Dekker et al (Substrate Specitificity of the Integral Membrane Protease OmpT Determined by Spatially Addressed Peptide Libraries, Biochemistry 2001, 40, 1694-1701).

[0112] OmpT objavljen u Kramer et al (Identification of active site serine and histidine residues in Escherichia coli outer membrane protease OmpT FEBS Letters 2000468, 220-224) otkriva da supstitucija serina, histidina i kiselih ostataka od alanina rezultira u ~ 10 puta smanjenom aktivnošću za Glu27, Asp97, Asp208 ili His101, ~ 500 puta smanjenu aktivnost za Ser99 i ~ 10000 puta smanjenu aktivnost za Asp83, Asp85, Asp210 ili His212. Vandeputte-Rutten et al (Crystal Structure of the Outer Membrane Protease OmpT from Escherichia coli predlaže novo katalitičko mesto, The EMBO Journal 2001, Vol 20 No 185033-5039) kao da ima aktivno mesto sadržavajući Asp83-Asp85 par i His212-Asp210 par. Dalje Further Kramer et al (Lipopolysaccharide regions involved in the activation of Escherichia coli outer membrane protease OmpT, Eur. J. Biochem. FEBS 2002, 269, 1746-1752) otkriva da mutacije D208A, D210A, H212A, H212N, H212Q, G216K/K217G, K217T i R218L u petlji L4 sve rezultiraju delimičnim ili praktično potpunim gubitkom enzimske aktivnosti.

[0113] Prema tome, mutacija OmpT da proizvode protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze može sadržavati mutaciju, kao što je genetska mutacija na jedom ili više ostataka E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 i E250.

[0114] Jedan ili više od E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 i E250 može biti mutiran u bilo koju pogodnu amino kiselinu koja rezultira u protein imajući smanjenu aktivnost proteaze. Na primer, jedan od više od E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 i E250 može biti mutiran u alanin. Primeri pogodnih mutacija su E27A, D43A, D83A, D85A, D97A, S99A, H101A E111A, E136A, E193A, D206A, D208A, D210A, H212A, H212N, H212Q, G216K, K217G, K217T, R218L i E250A. U jednom izvođenju mutirani OmpT gen obuhvata mutacije D210A i H212A. Pogodna mutirana sekvenca OmpT obuhvatajući mutacije D210A i H212A je prikazana u SEK ID BR: 23.

[0115] Izraz "nokaut mutirani OmpT gen" u kontekstu predmetnog pronalaska znači da gen sadrži jednu ili više mutacija i time ne uzrokuje ekspresiju proteina kodiranog od strane gena da bi obezbedio ćelijski deficijent u proteinu kodiranim nokaut mutiranim genom. Nokaut gen može biti delmično ili potpuno transkribovan, ali ne i preveden u kodirani protein. Nokaut mutirani OmpT gen može biti mutiran na bilo koji pogodan način, na primer sa sa jednim ili više brisanja, umetanja, tačkaste, genetske, besmislene i mutacija pomeranja okvira čitanja, da se ne uzrokuje ekspresija proteina. Na primer, gen može biti nokautiran umetanjem sekvence strane DNA, kao što je marker rezistentan na antibiotik, u sekvencu kodirajućeg gena.

[0116] U jednom izvođenju, OmpT gen obuhvata mutaciju na start kodonu gena i/ili jednom ili više stop kodona pozicioniranih nizvodno od start kodona gena i uzvodno od stop kodona gena time sprečavajući ekspresiju OmpT proteina. Mutacija na start kodonu može biti genetska mutacija jednog, dva ili sva tri nukleotida start kodona. Alternativno ili dodatno start kodon može biti mutiran pomoću umetanja ili brisanja mutacije pomeranja okvira čitanja.

[0117] Pogdna mutirana nokaut OmpT sekvenca je prikazana u SEK ID BR: 24.

[0118] U jednom izvođenju, gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku ne nosi nokaut mutirani OmpT gen, kao što je deficijentan u hromozomskom OmpT.

[0119] U jednom izvođenju gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku ne nosi nokaut mutirani DegP gen, kao što je deficijentan u hromozomskom DegP. U jednom izvođenju gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku ne nosi mutirani DegP gen.

[0120] U jednom izvođenju gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku ne nosi nokaut mutirani ptr gen, kao što je deficijentan u hromozomskom ptr.

[0121] Mnoge genetski modifikovane mutacije uključujući nokaut mutacije uključuju upotrebu markera rezistentnih na antibiotike koji dozvoljavaju izbor i identifikaciju uspešno mutiranih ćelija. Međutim, kao što je gore diskutiovano, postoji niz nedostataka u korišćenju markera rezistentnih na antibiotike.

[0122] Dalje izvođenje predmetnog pronalaska prevazilazi iznad navedene nedostatke korišćenja markera rezistentnih na antibiotike pri čemu su mutirani Tsp gen, opciono mutirani spr, opciono mutirani DegP gen i/ili mutirani ptr gen i/ili mutirani OmpT gen, mutirani da obuhvate jedno ili više restrikcionih mesta markera. Restrikcina mesta su genetski modifikovana u genu i nisu prirodno prisutna. Restrikciona mesta markera su korisna jer omogućavaju skrining i identifikaciju ispravno modifikovanih ćelija koje sadrže tražene hromozomske mutacije. Ćelije koje su modifikovane da nose jedan ili više mutiranih gena proteaze mogu biti analizirane pomoću PCR genomske DNA iz ćelijskih lizata korišćenjem parova oligonukleotida dizajniranih da pojačaju područje genomske DNA koja sadrži restrikciono marker mesto koje nije prirodno prisutno. Pojačana DNA može zatim biti analizirana pomoću elektroforeze na agaroza gelu pre i posle inkubacije sa pogodnim restrikciionom enzimom sposobnim za digestiranju DNA na mestu restrikcionog markera koje nije prirodno prisutno. Prisustvo DNA fragmenata posle inkubacije sa restrikcionim enzimom potvrđuje da su ćelije uspešno modifikovane da nose jedan ili više mutiranih gena.

[0123] U izvođenju pri čemu ćelija nosi nokaut mutirani ptr gen imajući DNA sekvencu od SEK ID BR: 6, oligonukleotidni prajmer sekvenci prikazan u SEK ID BR: 17 i SEK ID BR: 18 može biti upotrebljen da pojača područje DNA obuhvatajući Ase I restrikciono mesto koje nije prirodno prisutno iz genomske DNA transformisanih ćelija. Pojačana genomska DNA može zatim biti inkubirana sa Ase l restrikcionim enzimom i analizirana pomoću gel elektroforeze da se potvrdi prisustvo mutiranog ptr gena u genomskoj DNA.

[0124] U izvođenju pri čemu ćelija obuhvata nokaut mutirani Tsp gen imajući DNA sekvencu od SEK ID BR: 3 ili nukleotide 7 do 2048 od SEK ID BR:3, oligonukleotidni prajmer sekvenci prikazan u SEK ID NO: 15 i SEK ID BR:16 može biti upotrebljen da pojača područje DNA obuhvatajući Ase l restrikciono mesto, koje nije prirodno prisutno, iz genomske DNA transformisanih ćelija. Pojačana genomska DNA može zatim biti inkubirana sa Ase l restrikcionim enzimom i analizirana pomoću gel elektroforeze da se potvrdi prisustvo mutiranog Tsp gena u genomskoj DNA.

[0125] U izvođenju pri čemu ćelija obuhvata mutirani DegP gen imajući DNA sekvencu od SEK ID BR: 9, oligonukleotidni prajmer sekvenci prikazan u SEK ID BR: 19 i SEK ID BR:20 može biti upotrebljen da pojača područje DNA obuhvatajući Ase l restrikciono mesto, koje nije prirodno prisutno, iz genomske DNA transformisanih ćelija. Pojačana genomska DNA može zatim biti inkubirana sa Ase l restrikcionim enzimom i analizirana pomoću gel elektroforeze da se potvrdi prisustvo mutiranog DegP gena u genomskoj DNA.

[0126] Jedno ili više restrikcionih mesta može biti uvedeno bilo kojom pogodnom mutacijom uključujući jedno ili više brisanja, umetanja, tačkastih, genetskih, besmislenih i mutacija pomeranja okvira čitanja. Restrikcino mesto može biti uvedeno i pomoću mutacije start kodona i/ili mutacije da bi se uveo jedan ili više stop kodona, kao što je opisano iznad. Ova izvođenje je povoljno jer je restrikciono marker mesto direktno i jedinstveni marker uvedenih nokaut mutacija.

[0127] Restrikciono marker mesto, može biti umetnuto koje sadrži u –okviru stop kodon, kao što je Ase l restrikciono mesto. Ovo je naročito korisno jer umetnuto restrikciono mesto služi i kao restrikciono marker mesto i stop kodon da spreči punu transkripciju gen kodirajuće sekvence. Na primer, u izvođenju pri čemu je stop kodon uveden u ptr gen uvođenjem Ase l mesta, ovo takođe stvara restrikciono mesto, kao što je prikazano na Slici 5a. Na primer, u izvođenju pri čemu je stop kodon uveden u Tsp gen na kodon 21 uvođenjem Ase l mesta, ovo takođe stvara restrikciono mesto, kao što je prikazano na Slici 5b.

[0128] Restrikciono marker mesto može biti umetnuto mutacijom na start kodonu i opciono jednom ili više daljih tačkastih mutacija. U ovom izvođenju restrikciono marker mesto je poželjno EcoR l restrikciono mesto. Ovo je naročito korisno jer mutacija na start kodonu takođe stvara restrikciono marker mesto. Na primer, u izvođenju pri čemu je start kodon ptr gena promenjen u ATT, ovaj stvara EcoR l marker mesto, kao što je prikazano na Slici 5a. Na primer, u izvođenju pri čemu je start kodon (kodon 3) Tsp gena promenjen iz ATG u TCG, kao što je prikazano na Slici 1b, dalja tačkasta mutacija kodona 2 iz AAC u AAT i mutacija kodona 3ATG u TCG 3 stvara EcoR l restrikciono marker mesto, kao što je prikazano na Slici 5b.

[0129] U izvođenju predmetnog pronalaska pri čemu ćelija nosi mutirani OmpT gen, jedno ili više restrikcionih mesta može biti uvedeno bilo kojom pogodnom mutacijom uključujući jednu ili više mutacija brisanja, umetanja, tačkastih, genetskih, besmislenih i pomeranja okvira čitanja. Na primer, u izvođenju pri čemu OmpT gen obuhvata mutacije D210A i H212A, ove mutacije uvode tiho Hind III restrikciono mesto koje se može biti korišćeno kao selekcioni marker.

[0130] U DegP genu ili spr genu, restrikciono marker mesto može biti uvedeno korišćenjem tihih promena kodona. Na primer, Ase l mesto može biti korišćeno kao tiho restrikciono marker mesto, pri čemu je TAA stop kodon izvan-okvira, kao što je prikazano na slici 5c za mutirani DegP gen.

[0131] U izvođenju predmetnog pronalaska, pri čemu su ptr gen i/ili Tsp gen mutirani da kodiraju Proteazu III ili Tsp imajući smanjenu aktivnost proteaze, jedno ili više restrikciono marker mesto može biti uvedeno korišćenjem tihih promena kodona.

[0132] Bilo koja pogodna gram-negativna bakterija može biti korišćena kao roditeljska ćelija za produkciju rekombinantne ćelije predmetnog pronalaska. Pogodna gram-negativna bakterija uključuje Salmonelu tifimurium, Pseudomonas fluorescens, Ervinia carotovoru, Šigelu, Klebsielu pneumonie, Legionela pneumofilu, Pseudomonas aeruginozu, Acinetobakter baumani i E. koli. Poželjno roditeljska ćelija je E. coli. Bilo koji pogodni soj E. koli može biti korišćen u predmetnom pronalasku, ali poželjno je da se koristi divlji-tip soja W3110, kao što je K-12 W3110.

[0133] Nedostatak povezan sa deficijentnim proteaznim bakterijskim sojevima predhodno stvorenim i korišćenim za ekspresiju rekombinantnih proteina je taj da sadrže dodatne mutacije na genima uključenim u metabolizam ćelije i replikaciju DNA kao što je na primer phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi i pro i pro u sojevima E. koli. Ove mutacije mogu imati mnoge štetne efekte na ćeliju domaćina uključujući efekte na ćelijski rast, stabilnost, prinos rekombinantne ekspresije proteina i toksičnost. Sojevi koji imaju jednu ili više od ovih genomskih mutacija, naročito sojevi koji imaju veliki broj ovih mutacija, mogu pokazati gubitak sposobnosti koja smanjuje bakterijski rast do nivoa koji nije pogodan za industrijsku proizvodnju proteina. Dalje, bilo koja od iznad navedenih genomskih mutacija može uticati na druge gene u cis i/ili trans u nepredvidljivim štetnim načinima, time menjajući soj fenotipa, sposobnost i profil proteina. Dalje, upotreba jako mutiranih ćelija nije generalno pogodna za proizvodnju rekombinantnih proteina za komercijalnu upotrebu, naročito terapeutika, jer takvi sojevi generalno imaju defektne metaboličke puteve, i samim tim mogu slabo rasti ili uopšte ne u minimalnom ili hemijski definisanom medijumu.

[0134] U poželjnom izvođenju, ćelije nose samo minimalne mutacije da uvedu rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC; modifikacija je potrebna da smanji aktivnost Tsp proteina i opciono mutirani spr gen. Samo minimalne mutacije su napravljene na genomu ćelije da uvedu rekombinantni polinukleotid i mutacije. Ćelije ne nose nikakve druge mutacije koje mogu imati štetne efekte na rast ćelije i/ili sposobnost da izraze protein od interesa. Prema tome, jedna ili više rekombinantnih ćelija domaćina predmetnog pronalaska mogu pokazati poboljšanu ekspresiju proteina i/ili poboljšane karakteristike rasta u poređenju sa ćelijama koje sadrže dalje genetski modifkovane mutacije u sekvenci genoma. Ćelije obezbeđene predmetnim pronalaskom su takođe pogodnije za upotrebu u produkciji terapijskih proteina u poređenju sa ćelijama koje obuhvataju dalje poremećaje u genomu ćelije.

[0135] Prema tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje gram-negativnu bakterijsku ćeliju koji ima genom izogen u odnosu na divlji-tip bakterijske ćelije osim za rekombinantne modifikacije potrebne da se smanji aktivnost Tsp proteina i opciono mutirani spr gen. Ćelija dalje nosi rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i opciono polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa.

[0136] U poželjnom izvođenju, ćelija je izogena u odnosu na divlji tip ćelije E. coli, kao što je soj W3110, osim modifikacije koja je potrebna da se smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg- tipa i opciono mutiranim spr genom. Ćelija dalje nosi rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i opciono polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa.

[0137] Ćelija prema predmetnom pronalasku može dalje sadržavati polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa. Polinukleotidna sekvenca koja kodira protein od interesa može biti egzogena ili endogena. Polinukleotidna sekvenca koja kodira protein od interesa može biti integrisana u hromozomu domaćina ili može biti neintegrisana u vektoru, tipično plazmidu. Poželjno, polinukleotid je u ekspresionom vektoru u ćeliji, time uzrokujući minimalni poremećaj na genomu ćelije domaćina.

[0138] "Protein od interesa" u kontekstu ove specifikacije je namenjen da se odnosi na polipeptid za ekspresiju, obično rekombinantni polipeptid. Međutim, protein od interesa može biti endogeni protein eksprimiran iz endogenog gena u ćeliji domaćina.

[0139] Kao što se ovde koristi, "rekombinantni polipeptid" se odnosi na protein koji je izgrađen ili proizveden korišćenjem rekombinantne tehnologije DNA. Protein od interesa može biti egzogena sekvenca identična endogenom proteinu ili njegovoj mutiranoj verziji, na primer sa oslabljenom biološkom aktivnošću, ili njegovom fragmentu, izraženom iz egzogenog vektora. Alternativno, protein od interesa može biti heterologni protein, normalno ne izražen u ćeliji domaćina.

[0140] Protein od interesa može biti bilo koji pogodni protein uključujući terapijski, profilaktički ili dijagnostički protein.

[0141] U jednom izvođenju, protein od interesa je koristan u lečenju bolesti ili poremećaja uključujući inflamatorne bolesti i poremećaje, imunu bolest i poremećaje, fibrozne poremećaje i kancere.

[0142] Termin "inflamatorna bolest" ili "poremećaj" i "imuna bolest ili poremećaj" uključuje reumatoidni artritis, psorijazni artritis, još uvek je bolest, tzv. "Muckle Wells" bolest, psorijazu, Kronovu bolest, ulcerozni kolitis, SLE (sistemski eritemski lupus), astmu, alergijski rinitis, atopijski dermatitis, multiplu sklerozu, vaskulitis, dijabetes melitus tip I, transplantaciju i graft-versus-host bolest.

[0143] Termin "fibrozni poremećaj" uključuje idiopatsku plućnu fibrozu (IPF), sistemsku sklerozu (ili sklerodermu), fibrozu bubrega, dijabetičku nefropatiju, IgA nefropatiju, hipertenziju, -poslednji stadijum bolesti bubrega, , peritonealnu fibrozu (kontinuiranu ambulantnu peritonealnu dijalizu), cirozu jetre, (ARMD), retinopatiju, kardijalnu reaktivnu fibrozu, ožiljke, keloide, opekotine, kožne ulkuse, angioplastiku, koronarnu bajpas operaciju, artroplastiku i operaciju katarakte.

[0144] Termin "kancer" uključuje maligni novi rast koji nastaje iz epitela, pronađen u koži ili, češće, oblažući organe tela, na primer: dojke, jajnika, prostate, pluća, bubrega, pankreasa, želuca, bešike ili creva. Kanceri imaju tendenciju da infiltriraju u susedno tkivo i prošire se (metastaziraju) do udaljenih organa, na primer: kosti, jetre, pluća ili mozga.

[0145] Protein može biti proteolitički-senzitivan polipeptid, tj. proteini koji su podložni da budu cepani, osetljivi na cepanje ili cepani sa jednim ili više gram-negativnih bakterija, kao što je E. coli, proteaza, bilo u prirodnom stanju ili tokom sekrecije. U jednom izvođenju, protein od interesa je proteolitički -senzitivan na proteazu izabranu od DegP, Proteaze III i Tsp. U jednom izvođenju, protein od interesa je proteolitički senzitivan na proteazu Tsp. U jednom izvođenju, protein od interesa je proteolitički senzitivan na proteaze DegP i Proteasu III. U jednom izvođenju protein od interesa je proteolitički senzitivan na proteaze DegP i Tsp. U jednom izvođenju, protein od interesa je proteolitički senzitivan na proteaze Tsp i Proteazu III. U jednom izvođenju protein od interesa je proteolitički senzitivan na proteaze DegP, Proteazu III i Tsp.

[0146] Poželjno, protein je eukariotski polipeptid.

[0147] Protein od interesa izražen od strane ćelija prema pronalasku može, na primer, biti imunogen, fuzioni protein sadržavajući dva heterologna proteina ili antitelo. Antitela za upotrebu kao proteina od interesa uključuju monoklonalna, multi-valentna, multi-specifična, humanizovana, potpuno ljudska ili himerna antitela. Antitelo može biti iz bilo kojih vrsta, ali je poželjno izveden iz monoklonalnog antitela, ljudskog antitela ili humanizovanog fragmenta. Antitelo može biti izvedeno iz bilo koje klase (npr. IgG, IgE, IgM, IgD ili IgA) ili podklasa molekula imunoglobulina i može se dobiti iz bilo kojih vrsta uključujući, na primer, miša, pacova, ajkulu, kunića, svinju, hrčka, kamilu, lamu, kozu ili čoveka. Delovi fragmenta antitela mogu biti dobijeni iz više od jedne vrste, na primer, fragmenti antitela mogu biti himerni. U jednom primeru konstantne regije su iz jednih vrsta i varijabilnih regija iz drugih.

[0148] Antitelo može biti kompletan molekul antitela imajući teške i lake lance pune dužine ili fragmente od njih, na pr. VH, VL, VHH, Fab, modifikovani Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv fragment, Fab-Fv, ili dvostruko specifično antitelo, kao šro je Fab-dAb, kao što je opisano u PCT/GB2008/003331.

[0149] Antitelo može biti specifično za bilo koji ciljani antigen. Antigen može biti protein povezan sa ćelijom, na primer membranski protein na ćelijama kao što su bakterijske ćelije, ćelije kvasca, T-ćelije, endotelne ćelije ili tumorske ćelije, ili to može biti rastvorljivi protein. Antigeni od interesa takođe mogu biti bilo koji medicinski relevantni protein kao što su oni proteini koji su ushodno regulisani za vreme bolesti ili infekcije, na primer receptori i/ili njihovi odgovarajući ligandi. Posebni primeri membranskih ćelijskih proteina uključuju adhezione molekule, na primer integrine kao što su ß1 integrini, npr. VLA-4, E-selektin, P-selektin ili L-selektin, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 or CSF1-Receptor, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nektin-kao2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, karcinoembrionalni antigen (CEA), ljudski globulin mlečne masti (HMFG1 i 2), MHC Klasa I and MHC Klasa II antigena, KDR i VEGF, i gde odgovara, receptori od njih.

[0150] Rastvorljivi antigeni uključuju interleukine kao što je IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 ili IL-17, kao što je IL17A i/ili IL17F, virusne antigene, na primer respiratorni sincitijalnii virus ili citomegalovirusne antigene, imunoglobuline, kao što je IgE, interferone kao interferon α, interferonβ ili interferon γ, faktor nekroze tumora TNF (ranije poznat kao faktor-α nekroze tumora), faktor-β nekroze tumora, faktore stimulisanja kolonija kao što su G-CSF ili GMCSF, i faktori rasta izvedeni iz trombocita kao što su PDGF-α i PDGF-β i, gde to odgovara, receptore od njih. Drugi antigeni uključuju antigene bakterijske ćelijske membrane, bakterijske toksine, viruse kao što je virus gripa, EBV, HepA, B i C, agense bioterorizma, radioizotope i teške metale, i venome od zmije i pauka i toksine.

[0151] U jednom izvođenju, antitelo može biti korišćeno za funkcionalnu izmenu aktivnosti antigena od interesa. Na primer, antitelo može neutralizovati, antagonizirati ili agonizirati aktivnost navedenog antigena, direktno ili indirektno.

[0152] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje rekombinantnu gram-negativnu bakterijsku ćeliju obuhvatajući rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC, mutirani Tsp gen, pri čemu mutirani Tsp gen kodira Tsp protein imajući smanjenu aktivnost proteaze ili je nokaut mutirani Tsp gen, i polinukleotidna sekvenca kodirajući antitelo ili njegov antigen vezujući fragment specifičan za TNF. U poželjnom izvođenju ćelija dalje obuhvata mutirani spr gen koji kodira mutirani spr protein.

[0153] U poželjnom izvođenju, protein od interesa izražen od strane ćelija prema predmetnom pronalasku je anti-TNF antitelo, poželjnije anti-TNF Fab ', kao što je opisano u WO01/094585.

[0154] U jednom izvođenju, antitelo imajući specifičnost za ljudski TNFa, obuhvata teški lanac, pri čemu varijabilni domen obuhvata CDR imajući sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 28 za CDRH1, sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 29 ili SEK ID BR: 34 za CDRH2 ili sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 30 za CDRH3.

[0155] U jednom izvođenju, antitelo obuhvata laki lanac, pri čemu varijabilni domen obuhvata CDR imajući sekvencu prikazanu u SEK ID BR:31 za CDRL1, sekvencu prikazanu u SEK ID BR:32 za CDRL2 ili sekvencu prikazanu u SEK ID BR: za CDRL3.

[0156] CDR-ovi dati u SEK IDS BR: 28 i 30 do 34 koji se odnose na navedene iznad, su izvedeni iz mišjeg monoklonalnog antitela hTNF40. Međutim, SEK ID BR: 29 se sastoji od hibridnog CDR. Hibridni CDR obuhvata deo CDR2 teškog lanca iz mišjeg monoklonalnog antitela hTNF40 (SEK ID BR: 34) i deo CDR2 teškog lanca iz sekvence V embrionalne regije ljudske grupe 3.

[0157] U jednom izvođenju, antitelo obuhvata teški lanac, pri čemu varijabilni domen obuhvata CDR imajući sekvencu prikazanu u SEK ID BR :28 za CDRH1, sekvencu prikazanu u SEK ID BR:29 ili SEK ID BR:34 za CDRH2 ili sekvencu prikazanu u SEK ID BR:30 za CDRH3 i laki lanac, pri čemu varijabilni domen obuhvata CDR imajući sekvencu prikazanu u SEK ID BR:31 za CDRL1, sekvencu prikazanu u SEK ID BR:32 za CDRL2 ili sekvencu prikazanu u SEK ID BR:33 za CDRL3.

[0158] U jednom izvođenju, antitelo obuhvata SEK ID BR:28 za CDRH1, SEK ID BR: 29 ili SEK ID BR:34 za CDRH2, SEK ID BR:30 za CDRH3, SEK ID BR:31 za CDRL1, SEK ID BR:32 za CDRL2 i SEK ID BR:33 za CDRL3. Poželjno, antitelo obuhvata SEK ID BR:29 za CDRH2.

[0159] Anti-TNF antitelo je poželjno CDR-presađen molekul antitela. U poželjnom izvođenju varijabilni domen obuhvata ljudske akceptorske okvirne regione i CDR-ove koji nisu ljudski donatori.

[0160] Poželjno molekul antitela ima specifičnost za ljudski TNF (prethodno poznat kao TNFα), pri čemu laki lanac obuhvata varijabilnu regiju lakog lanca od SEK ID BR: 11, i teški lanac obuhvata varijabilnu regiju teškog lanca od SEK ID BR: 12.

[0161] Anti-TNF antitelo je poželjno Fab ili Fab’ fragment.

[0162] Poželjno molekul antitela imajući specifičnost za humani TNF je Fab' i ima sekvencu lakog lanca obuhvatajući ili se sastojeći od SEK ID BR: 13 i sekvencu teškog lanca obuhvatajući ili se sastojeći od SEK ID BR: 14.

[0163] Posle ekspresije, fragmenti antitela mogu dalje biti obrađeni, na primer konjugacijom u drugom entitetu kao što je efektorski molekul.

[0164] Termin efektorski molekul, kao što se ovde koristi, uključuje, na primer, antineoplastične agense, lekove, toksine (kao što su enzimski aktivni toksini bakterijskog ili biljnog porekla i fragmenti od njih, npr. ricin i njegovi fragmenti) biološki aktivne proteine, na primer enzime, drugo antitelo ili fragmente antitela, sintetičke ili prirodne polimere, nukleinske kiseline i fragmente od njih, npr DNA, RNA i fragmente od njih, radionukleotide, naročito radiojodid, radioizotope, helirane metale, nanočestice i reporterske grupe kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja mogu biti otkrivena pomoću NMR ili ESR spektroskopije. Molekulski efektor može biti pripojen na antitelo ili njegov fragment pomoću bilo koje pogodne metode, na primer, fragment antitela može biti modifikovan da se pripoji sa najmanje jednim efektorskim molekulom, kao što je opisano u WO05/003171 ili WO05/003170. WO05/003171 ili WO05/003170 takođe opisuje pogodne efektorske molekule.

[0165] U jednom izvođenju, antitelo ili njegov fragment, kao što je Fab, je PEGilirano da se generiše produkt sa traženim svojstvima, na primer sličan celim antitelima, ako je potrebno. Na primer, antitelo može biti PEGilirani anti-TNF-α Fab', kao što je opisano u WO01/094585, poželjno imajući pripajanje na jednom od cisteinskih ostataka na C-terminalnom kraju teškog lanca iz lizil-maleimid izvedene grupe, pri čemu je svaka od dve amino grupe lizil ostatka kovalentno vezana na njemu metoksipoli(etilenglikol) ostatkom imajući molekularnu težinu od oko 20.000 Da, tako da ukupna prosečna molekularna težina ostataka metoksipoli(etilenglikola) iznosi oko 40.000 Da, poželjnija izvedena grupa iz lizil-maleimida je [1-[[[2-[[3-(2,5-diokso-1-pirolidinil)-1-oksopropi1]amino]etil]amino]-karbonil]-1,5-pentandiil]bis(iminokarbonil).

[0166] Ćelija može takođe dalje sadržavati polinukleotidne sekvence koje kodiraju jedan ili više dodatnih proteina od interesa.

[0167] U jednom izvođenju, jedan ili više proteina domaćina E. koli koji su u divljem tipu poznati da koprečišćavaju sa rekombinantnim proteinom od interesa za vreme prečišćavanja, su izabrani za genetsku modifikaciju kao što je opisano u Humphreys et al. "Engineering of Escherichia coli to improve the purification of periplasmic Fab’ fragments: changing the pI of the chromosomally encoded PhoS/PstS protein", Protein Expression and Purification 37 (2004) 109-118 and WO04/035792). Upotreba takvih modifikovanih proteina domaćina poboljšava proces prečišćavanja za proteine od interesa, naročito antitela, proizvedenih u E. koli menjanjem fizičkih svojstava izabranih proteina E. koli tako da više ne ko-prečišćavaju sa rekombinantnim antitelom. Poželjno, protein E.koli koji je promenjen je odabran između jednog ili više Fosfat-vezujućeg proteina (PhoS/PstS), Dipeptid-vezujućeg proteina (DppA), Maltoza vezujućeg proteina (MBP) i Tioredoksina.

[0168] U jednom izvođenju, fizičko svojstvo kontaminiranog proteina domaćina je promenjeno dodavanjem amino kiselinske oznake na C-terminusu ili N-terminusu. U poželjnom izvođenju fizička svojstva koja su promenjena su izoelektrična tačka i amino kiselinska oznaka je oznaka poli-asparaginske kiseline pripojene na C-kraj. U jednom izvođenju proteini E. koli izmenjeni dodavanjem navedene oznake su Dpeptid vezujući protein (DppA), Maltoza vezujući protein (MBP), Tioredoksin i Fosfat vezujući protein (PhoS/PstS). U jednom specifičnom izvođenju pl od E. koli Fosfat vezujućeg proteina (PhoS/PstS) je smanjen sa 7.2 do 5.1 dodavanjem poli-asparaginske kiseline (poliD), koja sadrži 6 ostataka asparaginske kiseline na C-terminusu.

[0169] Takođe, poželjna je modifikacija specifičnih ostataka kontaminiranog proteina E. koli da menja svoja fizička svojstva, bilo samostalno ili u kombinaciji sa dodatkom N ili C terminalnih oznaka. Takve promene mogu uključiti umetanja ili brisanja da promene veličinu proteina ili supstitucija aminokiseline da promene pl ili hidrofobnost. U jednom izvođenju, ovi ostaci se nalaze na površini proteina. U poželjnom izvođenju površinski ostaci PhoS proteina su izmenjeni da bi se smanjio pl proteina. Poželjno ostaci koji su uključeni da su važni u vezivanju fosfata (Bass, US 5,304,472) se izbegavaju, da bi se održao funkcionalni PhoS protein. Poželjno su ciljani ostaci lizina koje projektuju daleko izvan površine proteina ili se nalaze u ili u blizini velikih grupa osnovnih ostataka. U jednom izvođenju, PhoS protein ima oznaku heksa-poli-asparaginske kiselinu pričvršćene na C-terminus dok su površinski ostaci na suprotnom kraju molekula ciljani za supstituciju. Poželjno, odabrani ostaci lizina su supstituisani za glutaminsku kiselinu ili asparaginsku kiselinu da bi dobili veću potencijalnu promenu pl nego kod menjanja neutralnih ostataka na kisele. Oznaka za supstitucioni mutant se ovde sastoji od slova praćenim brojem, praćenim slovom. Prvo slovo označava amino kiselinu u divljem-tipu proteina. Broj se odnosi na poziciju amino kiselinu gde je izvršena supstitucija amino kiseline, a drugo slovo označava amino kiselinu koja se koristi za zamenu amino kiseline divljeg-tipa. U poželjnim mutacijama PhoS-a u predmetnom pronalasku, ostaci lizina (K) 275, 107, 109, 110, 262, 265, 266, 309, 313 su supstituisani za glutaminsku kiselinu (E) ili glutamin (Q) kao pojedinačne ili kombinovane mutacije, dodatno lizin (K) 318 može biti supstituisan za asparaginsku kiselinu (D) kao pojedinačna ili kombinovana mutacija. Poželjno pojedinačne mutacije su K262E, K265E i K266E. Poželjno kombinovane mutacije su K265/266E i K110/265/266E. Poželjnije, sve mutacije su kombinovane sa oznakom poliaksparaginske kiseline (poliD) pripojenom na C-kraju i opciono takođe sa K318D supstitucijom. U poželjnom izvođenju mutacije dovode do smanjenja pi od najmanje 2 jedinice. Poželjno, mutacije predmetnog pronalaska smanjuju pi od PhoS od 72 do između oko 4 do oko 5.5. U jednom izvođenju predmetnog pronalaska pl PhoS protein od E. koli je smanjen sa 7.2 na oko 4.9, oko 4.8 i oko 4.5 koristeći mutacije poliD K318D, poliD K265/266E i poliD K110/265/266E respektivno.

[0170] Rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku može biti proizvedena bilo kojim pogodnim načinima.

[0171] U izvođenjima predmetnog pronalaska pri čemu je hromozomski Tsp gen mutiran i opciono jedan ili više hromozomskog spr gena, DegP gena, ptr gena i OmpT gena su mutirani, stručna osoba zna pogodne tehnike koje mogu biti korišćene za zamenu hromozomske genske sekvence sa mutiranom sekvencom gena. Mogu se koristiti pogodni vektori koji omogućuju integraciju u hromozomu domaćina homolognom rekombinacijom. U izvođenju, pri čemu ćelija sadrži dva ili tri gore navedena mutirana gena, mutirani geni mogu biti uvedeni u gram-negativnu bakteriju na istim ili različitim vektorima.

[0172] Pogodne metode zamene gena su, na primer, opisane u Hamilton et al (New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli, Hamilton C. M. et al., Journal of Bacteriology Sept.

1989, Vol. 171, No. 9 p 4617-4622), Skorupski et al (Positive selection vectors for allelic exchange, Skorupski K and Taylor R. K., Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel et al (A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation, Kiel J.A.K.W. et al, Mol Gen Genet 1987, 207:294-301), Blomfield et al (Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature sensitive pSC101 replicon, Blomfield I. C. et al., Molecular Microbiology 1991, 5(6), 1447-1457) and Ried et al. (An nptI-sacB-sacR cartridge for constructingdirected, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis, Ried J. L. and Collmer A., Gene 57 (1987) 239-246). Pogodni plazmid koji omogućava homolognu rekombinaciju/zamenu je pKO3 plazmid (Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237).

[0173] Stručnjak zna pogodne tehnike koje mogu biti korišćene za umetanje rekombinantnog polinukleotida koji kodira DsbC. Rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC može biti integrisan u ćelijski genom korišćenjem pogodnog vektora kao što je pKO3 plazmid.

[0174] Alternativno ili dodatno, rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC može biti ne-integrisan u rekombinantnoj ekspresionoj kaseti. U jednom izvođenju, ekspresiona kaseta je upotrebljena u predmetrnom pronalasku da nosi polinukleotid koji kodira DsbC koji tipično sadrži protein kodirajuće sekvence koja kodira DsbC i jednu ili više regulatornih sekvenci ekspresije. Jedna ili više regulatornih ekspresionih sekvenci mogu uključivati promoter. Jedna ili više regulatornih ekspresionih sekvenci mogu takođe uključiti 3' netranslirani region kao što je terminalna sekvenca. Pogodni promoteri su detaljnije razmatrani u nastavku.

[0175] U jednom izvođenju, ekspresiona kaseta je upotrebljena u predmetnom pronalasku da nosi polinukleotid koji kodira protein od interesa i/ili rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC koji tipično sadrži jednu ili više sekvenci regulatorne ekspresije, jednu ili više kodirajućih sekvenci koje kodiraju jedan ili više proteina od interesa i/ili kodirajuće sekvence koja kodira DsbC. Jedna ili više sekvenci regulatorne ekspresije mogu uključivati promoter. Jedna ili više sekvenci regulatorne ekspresije mogu takođe uključiti 3' netransliranu regiju kao što je terminalna sekvenca. Pogodnidni promoteri su detaljnije razmatrani u nastavku.

[0176] U jednom izvođenju, ćelija prema predmetnom pronalasku sadrži jedan ili više vektora, kao što je plazmid. Vektor poželjno sadrži jednu ili više ekspresionih kaseta kao što je definisano iznad. U jednom izveđenju polinukleotidna sekvenca kodirajući protein od interesa i polinukleotid kodirajući DsbC su umetnuti u jedan vektor. Alternativno, polinukleotidna sekvenca kodirajući protein od interesa i polinukleotid kodirajući DsbC su umetnuti u odvojenim vektorima.

[0177] U izvođenju gde je protein od interesa antitelo koje sadrži teške i lake lance, ćelijska linija može biti transfektovana sa dva vektora, prvi vektor koji kodira polipeptid lakog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid teškog lanca. Alternativno, može biti upotrebljen jedan vektor, vektor uključujući sekvence koje kodiraju polipeptide lakog lanca i teškog lanca. Alternativno, polinukleotidna sekvenca kodirajući antitelo i polinukleotid koji kodira DsbC su umetnuti u jedan vektor. Poželjno, vektor obuhvata sekvence koje kodiraju polipeptide lakog i teškog lanca antitela.

[0178] U izvođenju gde ćelija takođe izražava jedan ili više dodatnih proteina kao što sledi:

• jedan ili više proteina sposobnih olakšavanju savijanju proteina, kao što su FkpA, Skp, SurA, PPiA i PPiD; i/ili • jedan ili više proteina sposobnih olakšavanju sekrecije proteina ili translokacije, kao što su SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY i Lep; i/ili

• jedan ili više proteina sposobnih olakšavanju formiranja disulfidne veze, kao što su DsbA, DsbB, DsbD, DsbG;

jedan ili više dodatnih proteina mogu biti izraženi iz jednog ili više polinukleotida umetnutih u isti vektor kao polinukleotid kodirajući DsbC i/ili polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa. Alternativno, jedan ili više polinukleotida mogu biti umetnuti u odvojene vektore.

[0179] Vektor za upotrebu u predmetnom pronalasku može biti proizveden umetanjem jedne ili više ekspresionih kaseta kao što je definisano iznad u pogodnom vektoru. Alternativno, sekvence regulatorne ekspresije za usmeravanje ekspresije polinukleotidne sekvence mogu biti sadržane u vektoru i tako samo kodirajući region polinukleotida može biti potreban za završetak vektora.

[0180] Polinukleotid koji kodira DsbC i/ili polinukleotid koji kodira protein od interesa je pogodno umetnut u replicirani vektor, tipično autonomno replicirajući vektor, za ekspresiju u ćeliji pod kontrolom odgovarajućeg promotera za ćeliju. Mnogi vektori su poznati u tehnici za tu svrhu i selekcija odgovarajućeg vektora može zavisiti od veličine nukleinske kiseline i određenog tipa ćelije.

[0181] Primeri vektora koji mogu biti upotrebljeni za transformisanje ćelije domaćina sa polinukleotidom prema predmetnom pronalasku uključuju:

• plazmid, kao što je pBR322 ili pACYC184, i/ili

• virusni vektor kao što je bakterijski fag

• prenosivi genetički element kao što je transpozon

[0182] Takvi vektori obično obuhvataju plazmidno poreklo replikacije DNA, antibiotik selektivni marker, promoter i transkripcioni terminator izdvojen mestom za više kloniranja (ekspresiona kaseta) i DNA sekvencu koja kodira mesto vezivanja ribozoma.

[0183] Promoteri upotrebljeni u predmetnom pronalasku mogu biti direktno povezani sa relevantnim polinukleotidom ili alternativno biti smešteni na odgovarajućoj poziciji, na primer u vektoru tako da kada je relevantni polipeptid umetnut, relevantni promoter može delovati na isti način. U jednom izvođenju promoter se nalazi pre dela za kodiranje polinukleotida na kojem deluje, na primer relevantni promoter pre svakog kodirajućeg dela polinukleotida. "Pre", kao što je ovde korišćen, podrazumeva da je promoter smešten na 5-om glavnom kraju u odnosu na kodirajući polinukleotidni deo.

[0184] Promoteri mogu biti endogeni ili egzogeni za ćelije domaćina. Pogodni promoteri uključuju Lac, tac, trp, PhoA, lpp, Arab, Tet i T7.

[0185] Jedan ili više promotera koji se upotrebljavaju mogu biti induktibilni promoteri.

[0186] U izvođenju pri čemu polinukleotid koji kodira DsbC i polinukleotid koji kodira protein od interesa su umetnuti u jedan vektor, nukleotidne sekvence koje kodiraju DsbC i protein od interesa mogu biti pod kontrolom pojedinačnog promotera ili odvojenih promotera. U izvođenju pri čemu su nukleotidne sekvence koje kodiraju DsbC i protein od interesa pod kontrolom odvojenih promotera, promoter može biti nezavisno induktibilni promoter.

[0187] Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe generalno sadrže tzv. "Shine-Dalgamo (S.D.)" sekvencu operativno povezanu za DNA kodirajući polipeptid od interesa. Promoter može biti uklonjen iz DNA bakterijskog izvora digestijom restrikcionog enzima i umetnuti u vektor koji sadrži željenu DNA.

[0188] U izvođenjima predmetnog pronalaska, pri čemu polinukleotidna sekvenca sadrži dve ili više kodirajućih sekvenci za dva ili više proteina od interesa, na primer laki lanac antitela i teški lanac antitela, polinukleotidna sekvenca može sadržavati jedan ili više unutrašnjih mesta ulaska ribozoma (IRES) sekvenci koje omogućuju inicijaciju translacije usred mRNA. IRES sekvencija može biti poizicionirana između kodirajućih polinukleotidnih sekvenci da bi se pojačala odvojena translacija mRNA da bi se proizvele kodirane polipeptidne sekvence.

[0189] Ekspresioni vektor poželjno takođe sadrži dicistronsku poruku za produkciju antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen kao što je opisano u WO 03/048208 ili WO2007/039714. Poželjno, uzvodno cistron sadrži DNA kodirajući za laki lanac antitelo, i nizvodni cistron sadrži DNA kodirajući za odgovarajući teški lanac, i dicistronska intergenska sekvenca (IGS) poželjno sadrži sekvencu izabranu od IGS1 (SEK ID BR: 36), IGS2 (SEK ID BR: 37), IGS3 (SEK ID BR: 38) I IGS4 (SEK ID BR: 39).

[0190] Terminatori mogu biti endogeni ili egzogeni za ćelije domaćina. Pogodan terminator je rrnB.

[0191] Daljnji pogodni regulatori transkripcije uključujući promotere i terminatore i metode ciljanja proteina mogu biti nađeni u "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in "Escherichia coli" Sawas C. Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996, p 512-538.

[0192] DsbC polinukleotid umetnut u ekspresioni vektor poželjno sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira DsbC signalnu sekvencu i DsbC kodirajuću sekvencu. Vektor poželjno sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja omogućuje da vektor replicira u jednoj ili više izabranih ćelija domaćina, poželjno da se replicira nezavisno hromozom domaćina. Takve sekvence dobro su poznate za različite bakterije.

[0193] U jednom izvođenju, DsbC i/ili protein od interesa sadrži histidin oznaku na N-terminusu i/ili C-terminusu.

[0194] Molekul antitela može biti izlučen iz ćelije ili ciljan na periplazmu pogodnim signalnim sekvencama. Alternativno, molekuli antitela se mogu akumulirati unutar ćelijske citoplazme. Poželjno je molekul antitela ciljan na periplazmi.

[0195] Polinukleotid koji kodira protein od interesa može biti izražen kao fuzija sa drugim polipeptidom, poželjno signalnom sekvencom ili drugim polipeptidom koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog polipeptida. Odabrana heterologna signalna sekvenca trebala bi biti ona koja je prepoznata i obrađena od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i obrađuju nativnu ili eukariotsku polipeptidnu signalnu sekvencu, signalna sekvenca je supstituisana sa prokariotskom signalnom sekvencom. Pogodne signalne sekvence uključuju OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA i DsbC.

[0196] Izgradja pogodnih vektora koji sadrže jednu ili više iznad navedenih komponenti koristi standarde tehnike vezivanja. Izolovani plazmidi ili fragmenti DNA su cepani, prilagođeni i ponovo-vezani u željenom obliku da generišu tražene plazmide.

[0197] U poželjnom izvođenju predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak obezbeđuje multi-cistronski vektor koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira DsbC i polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa. Multicistronski vektor može biti proizveden pomoću povoljne metode kloniranja koja dozvoljava ponovljeno sekvencionalno kloniranje polinukleotidnih sekvenci u vektor. Metoda koristi kompatibilne kohezivne krajeve od para restrikcionih mesta, kao što su "AT" krajevi od Ase I i Nde I restrikcionih mesta. Polinukleotidna sekvenca koja sadrži kodirajuću sekvencu i koja ima kompatibilne kohezivne krajeve, kao što je AseI-NdeI fragment, može biti klonirana u restrikciono mesto u vektoru, kao što je Nde I. Umetanje polinukleotidne sekvence uništava 5' restrikciono mesto, ali stvara novo 3’ restrikciono mesto, kao što je NdeI, koje zatim može biti upotrebljeno za umetanje dalje polinukleotidne sekvence obuhvatajući kompatibilne kohezivne krajeve. Proces zatim može biti ponovljen za umetanje daljih sekvenci. Svaka polinukleotidna sekvenca umetnuta u vektor sadrži nekodirajuću sekvencu 3' do stop kodona koji može sadržavati Ssp I mesto za skrining, tzv. "Shine Dalgarno" ribozom vezujuću sekvencu, bogati razmak i NdeI mesto kodirajući start kodon.

[0198] Prikazuje se dijagramski prikaz stvaranja vektora sadržavajući polinukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela (LC), teški lanac antitela (HC), i DsbC polinukleotidnu sekvencu i dalja polinukleotidna sekvenca je prikazanu na Slici 6.

[0199] Uspešno mutirani sojevi mogu biti identifikovani korišćenjem dobro poznatih metoda, uključujući sekvenciranje kolonije PCR DNA i mapiranje restrikcionih enzima kolonije PCR.

[0200] Izvođenja pronalaska opisana ovde sa referencom na polinukleotidu primenjuju se jednako na alternativnim izvođenjima pronalaska, na primer vektorima, ekspresionim kasetama i/ili ćelijama domaćina obuhvatajući komponente upotrebljene u njemu u onoj meri u kojoj se relevantni aspekt može primeniti na isti.

[0201] Prema trećem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđena je metoda za proizvodnju rekombinantnog proteina od interesa obuhvatajući ekspresiju rekombinantnog proteina od interesa u rekombinantnoj gramnegativnoj bakterijskoj ćeliji kao što je opisano iznad u prvom ili drugom aspektu predmetnog pronalaska. Metoda za produkciju rekombinantnog proteina od interesa koja obuhvata:

a. kultivisanje rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije kao je definisano iznad u medijumu za kulturu pod uslovima koji su efikasni za ekspresiju rekombinantnog proteina od interesa i rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC; i

b. oporavljanje rekombinantnog proteina od interesa iz periplazme rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije i/ili medijuma za kulturu.

[0202] Gram negativne bakterijska ćelija i protein od interesa poželjno upotrebljeni u metodi ovog predmetnog pronalaska su opisani detaljno iznad.

[0203] Kada je polinukleotid koji kodira protein od interesa egzogeni polinukleotid, može biti inkorporisan u ćeliju domaćina korišćenjem bilo kojeg pogodnog sredstva poznatog u tehnici. Kao što je razmatrano iznad, tipično je polinukleotid inkorporisan kao deo ekspresionog vektora koji je transformisan u ćeliju. Prema tome, u jednom aspektu ćelija prema predmetnom pronalasku sadrži ekspresionu kasetu obuhvatajući polinukleotid koji kodira protein od interesa i ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotid koji kodira DsbC.

[0204] Polinukleotidna sekvenca koja kodira protein od interesa i polinukleotidna sekvenca koja kodira DsbC može biti transformisana u ćeliju korišćenjem standardnih tehnika, na primer primenom rubidijum hlorida, PEG ili elektroporacije.

[0205] Metoda prema predmetnom pronalasku može takođe primeniti sistem selekcije da se olakša selekcija stabilnih ćelija koje su uspešno transformisane sa polinukleotidom kodirajući protein od interesa. Sistem selekcije tipično koristi ko-transformaciju polinukleotidne sekvence kodirajući selekcioni marker. U jednom izvođenju, svaki polinukleotid transformisan u ćeliju dalje sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više selekcionih markera. Prema tome, transformacija polinukleotida koji kodiraju DsbC i protein od interesa i jedan ili više polinukleotida koji kodiraju marker pojavljuju se zajedno i sistem selekcije se može koristiti da se izaberu one ćelije koje produkuju željene proteine.

[0206] Ćelije sposobne da izraze jedan ili više markera su sposobne da prežive/rastu/se množe pod određenim veštačkim nametnutim uslovima, na primer dodavanjem toksina ili antibiotika, zbog obogaćenih svojstava koje daje polipeptid/gen ili polipeptidna komponenta selekcionog sistema inkorporisana u njih (npr. rezistencija na antibiotike). One ćelije koje ne mogu izraziti jedan ili više markera ne mogu da prežive/rastu/se množe u veštačko nametnutim uslovima. Artificijelno nametnuti uslovi mogu biti izabrani da budu manje ili više snažni, po potrebi.

[0207] Bilo koji pogodni selekcioni sistem može biti primenjen u predmetnom pronalasku. Tipično selekcioni sistem može biti zasnovan na uključivanju vektora u jedan ili više gena koji obezbeđuju rezistenciju na poznati antibiotik, na primer tetraciklin, hloramfenikol, kanamicin ili ampicilin rezistentan gen. Ćelije koje rastu u prisustvu relevantnog antibiotika mogu biti izabrane jer eksprimiraju i gen koji daje rezistenciju na antibiotik i željeni protein.

[0208] U jednom izvođenju, metoda prema predmetnom pronalasku dalje obuhvata korak kultivisanja transformisane ćelije u medijumu da se time eksprimira protein od interesa.

[0209] U predmetnom pronalasku može biti upotrebljen induktibilni ekspresionii sistem ili konstitutivni promoter za ekspresiju proteina od interesa i/ili DsbC. Pogodni induktibilni ekspresionii sistemi i konstitutivni promoteri su dobro poznati u tehnici.

[0210] U jednom izvođenju pri čemu polinukleotid kodirajući DsbC i polinukleotid kodirajući protein od interesa pod kontrolom istih ili odvojenih induktibilnih promotera, ekspresija polinukleotidne sekvence koja kodira protein od interesa i rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC je indukovana dodavanjem induktora u medijum za kulturu.

[0211] Bilo koji pogodni medijum može biti upotrebljen za kulturu transformisane ćelije. Medijum može biti prilagođen za specifični selekcioni sistem, na primer medijum može sadržavati antibiotik, da dozvoli samo onim ćelijama koje su uspešno transformisane da rastu u medijumu.

[0212] Ćelije dobijene iz medijuma mogu biti podvrgnute daljem skriningu i/ili prečišćavanju po potrebi. Metoda može dalje sadržavati jedan ili više koraka za ekstrakciju i prečišćavanje proteina od interesa po potrebi.

[0213] Polipeptid može biti obnovljen iz soja, uključujući iz citoplazme, periplazme ili supernatanta.

[0214] Specifična metoda (metode) korišćena za prečišćavanje proteina zavisi od tipa proteina. Pogodne metode uključuju frakcionisanje na kolonama sa imuno-afinitetom ili jonskom izmenom; taloženje etanola; reverznu-fazu HPLC; hidrofobnu interaktivnu hromatografiju; hromatografiju na silika gelu; -hromatografiju na jono-izmenjivačkoj smoli kao što je S-SEPHA-ROSE i DEAE; hromatofokusiranje; precipitaciju amonijumsulfata; i gel filtraciju.

[0215] U jednom izvođenju metod dalje obuhvata odvajanje rekombinantnog proteina od interesa iz DsbC.

[0216] Antitela mogu biti pogodno odvojena od medijuma za kulturu i/ili ekstrakta citoplazme i/ili ekstrakta periplazme konvencionalnim procedurama prečišćavanja antitela kao što je, na primer, protein A-Sefaroza, protein G hromatografija, hromatografija proteina L, tiofilni, mešani oblik smola, His-tag, FLAGTag, hidroksilapatit hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza, afinitetna hromatografija, Amonijum sulfat, etanol ili PEG frakcionisanje/precipitacija, jono izmenjivačka membrana, apsorpciona hromatografija ekspandiranog sloja (EBA) ili simulirana hromatografija pokretnog sloja.

[0217] Metoda može takođe uključiti i dalji korak merenja količine ekspresije proteina od interesa i selekcije ćelija imajući visoke nivoe ekspresije proteina od interesa.

[0218] Metoda može takođe uključivati jedan ili više daljih nizvodnih koraka obrade kao što je PEGilacija proteina od interesa, kao što je antitelo ili fragment antitela.

[0219] Jedan ili više koraka metode opisani ovde mogu biti izvedeni u kombinaciji u pogodnom spremniku kao što je bioreaktor.

Primeri

Ćelijske linije

[0220] Za sve eksperimente, E. koli ćelijska linija W3110 je korišćena kao roditeljska ćelijska linija divljegtipa.

[0221] Stvorene su ćelijske linije noseći sledeće mutacije:

a. mutirani Tsp gen;

b. mutirani Tsp gen i nošenje rekombinantne DsbC;

c. mutirani Tsp gen i mutirani spr gen;

d. mutirani Tsp gen i mutirani spr gen i nošenje rekombinantne DsbC.

Primer 1: Stvaranje ćelijske linije koja nosi mutirani TSp gen MXE001 (ΔTsp)

[0222] Soj MXE001 je generisan kao što sledi:

Tsp kaseta je premeštena kao Sal I, Not I restrikcioni fragmenti u slično ograničenim pKO3 plazmidima. PKO3 plazmid koristi temperaturno senzitivni mutant pSC101 porekla replikacije (RepA) zajedno sa markerom hloramfenikola da se forsira i odabere za hromozomska integraciona dešavanja. sacB gen koji kodira za levansaharozu je letalan za E. koli gajenu na saharozi i zbog toga (uporedo sa hloramfenikol markerom i pSC101 poreklom) je koršćena da forsira i odabere za deintegraciju i događaje plazmid lečenja. Ova je metodologija prethodno opisana (Hamilton et al., 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 and Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). PKO3 sistem uklanja sve selektivne markere iz genoma domaćina, osim umetnutog gena.

[0223] Izgrađeni su sledeći plazmidi.

pMXE191 sadržavajući nokaut mutirani Tsp gen kao što je prikazano u SEK ID BR: 3 koji sadrži EcoR I i Ase I restrikcione markere.

[0224] Plazmid je zatim transformisan u elektro-kompetentnim ćelijama E. koli W3110 pripremljenim korišćenjem metode pronađene u Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli lectrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995).

Dan 140µl ćelije E. koli su pomešane sa (10pg) 1µl od pKO3 DNA u ohlađenoj BioRad 0.2cm elektroporacijskoj kiveti pre elektroporacije na 2500V, 25µF i Ω 200Ω.1000 µl od 2xPY je odmah dodato, ćelije su oporavljene mućkanjem na 250 rpm u inkubatoru na 30°C tokom 1 sata. Ćelije su serijski 1/10 razblažene u 2xPY pre nego što je 100 µl alikvota stavljeno na 2xPY agar ploče koje sadrže hloramfenikol na 20 µg/ml prethodno zagrejane do 30°C i 43°C. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C i 43°C.

Dan 2 Broj kolonija gajenih na 30°C je dao procenu efikasnosti elektroporacije, dok kolonije da prežive rast na 43°C predstavljaju potencijalne integracione događaje. Pojedinačne kolonije sa ploče od 43°C su sakupljene i resuspendovane u 10 ml 2xPY. 100 µl od toga je stavljeno na 2xPY agar ploče koje sadrže 5% (w/v) saharoze prethodno zagrejane na 30°C da bi se dobile pojedinačne kolonije. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C. Dan 3 Kolonije ovde predstavljaju potencijalne istovremene de-integracije i događaje plazmid lečenja. Ako se događaji de-integracije i stvrdnjavanja dogode rano u rastu, tada će najveći deo kolonije biti klonski. Pojedinačne kolonije su sakupljene i replika je naneta na 2xPY agar koji sadrži i hloramfenikol na 20 mµ/ml ili 5% (w/v) saharoze. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C.

Dan 4 Kolonije koje obe rastu na saharozi i umiru na hloramfenikolu predstavljaju potencijalno hromozomsku zamenu i događaje plazmid lečenja. One su sakupljene i ispitivane pomoću PCR sa mutacionim specifičnim oligonukleotidom. Kolonije koje su stvorile pozitivnu PCR traku pravilne veličine bile su izbačene da bi se dobile pojedinačne kolonije na 2xPY agaru sadržavajući 5% (w/v) saharoze i ploče su inkubirane preko noći na 30°C.

Dan 5 Pojedinačne kolonije PCR pozitivne, hloramfenikol-senzitivne i saharoza rezistentne E. koli su korišćene za stvaranje glicerol zaliha, hemijski kompetentnih ćelija i deluju kao PCR templejti za PCR reakciju sa 5' i 3' bočnim oligonukleotidima da se generiše PCR produkt za direktno sekvencioniranje DNA korišćenjem Taq polimeraze.

[0225] Soj ćelije MXE001 je testiran da bi se potvrdila uspešna modifikacija genomske DNA koja nosi mutirani TSp gen pomoću PCR amplifikacije regije Tsp gena i sadržavajući restrikciono mesto Ase I koje se ne javlja prirodno, kao što je prikazano na Slikama 1a, 1b i 1c, korišćenjem prajmera oligonukleotida. Pojačane regije DNA su zatim analizirane gel elektroforezom pre i posle inkubacije sa Ase I restrikcionim enzimom da bi se potvrdilo prisustvo ne-prirodnog pojavljivanja Ase I restrikcionog mesta koji se ne javlja prirodno u mutiranim genima. Ova metoda je izvedena kao što sledi:

[0226] Sljedeći oligonukleotidi su korišćeni su za amplifikaciju, korišćenjem PCR, genomske DNA iz pripremljenih lizata E. koli iz MXE001 i W3110:

6284 Tsp 3’ 5’-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3’ (SEK ID BR: 15) 6283 Tsp 5’ 5’-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3’ (SEK ID BR: 16)

[0227] Lizati su pripremljeni gejanjem pojedinačne kolonije ćelija tokom 10 minuta na 95°C u 20 ul od 1x PCR pufera. Smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, zatim centrifugirana na 13.200 rpm tokom 10 minuta. Supernatant je uklonjen i obelžen kao ’ćelijski lizat’.

[0228] Svaki je soj amplificiran upotrebom para Tsp oligonukleotida.

[0229] DNA je amplificirana upotrebom standardne PCR procedure.

5ul Pufer x10 (Roche)

1ul dNTP miks (Roche, 10mM miks)

1.5ul 5’ oligo (5 pmol)

1.52ul 3’ oligo (5 pmol)

2ul Ćeijskil lizat

0.5ul Taq DNA polimeraza (Roche 5U/ul)

38.5ul H2O

[0230] PCR ciklus

94 °C 1 minuta

94 °C 1 minuta)

55 °C 1 minuta) ponovljeno za 30 ciklusa

72 °C 1 minuta)

72 °C 10 minuta

[0231] Jednom kada su reakcije završene, 25ul je uklonjeno u novu mikrofugnu cev za digestiju sa Ase I. U 25ul od PCR reakcije 19ul H2O, 5 ul pufera 3 (NEB), 1ul Ase I (NEB) je dodato, mešano i inkubirano na 37°C tokom 2 sata.

[0232] U preostalu PCR reakciju je dodato 5 ul pufera za punjenje (x6) i 20 ul je napunjeno u 0.8% TAE 200 ml agarozni gel (Invitrogen) plus Etidijum Bromid (5 ul od10 mg/ml zaliha) i pokrenuto na 100 volti tokom 1 sata. 10ul veličine markera (Perfekt DNA marker 0.1-12Kb, Novagen) je napunjeno u konačnu traku.

[0233] Nakon potpune digestaje Ase I, dodato je 10 ul pufera za punjenje (x6) i 20 ul je stavljeno u 0.8% TAE agarozni gel (Invitrogen) plus Etidijum Bromid (5 ul od 10 mg/ml zaliha) i pokrenuto na 100 volti tokom 1 sata.

10ul veličine markera (Perfekt DNA marker 0.1-12Kb, Novagen) je napunjeno u konačnu traku. Oba gela su vizualizirana pomoću UV transluminanatora.

[0234] Amplificirani genomski fragment je pokazao ispravnu veličinu od 2.8 Kb za Tsp. Nakon digestije sa Ase I ovo je potvrdilo prisustvo uvedenih Ase I mesta u Tsp deficijentnom soju MXE001, ali ne u kontrolnom W3110.

MXE001: genomska DNA amplificirana korišćenjem Tsp prajmer seta i dobijena DNA digestirana sa Ase I da proizvede 2.2 i 0.6 Kbps bands- traka-bendova.

W3110 PCR amplificirana DNA nije digestirana pomoću Ase I restrikcionog enzima.

Primer 2: Generisanje ćelijskih linija koje nose mutirani spr gen i ćelijskih linija koji nose mutirani Tsp gen i mutirani spr gen

[0235] spr mutacije su generirane i izabrane za korišćenje analize komplementacije.

[0236] Spr gen je mutiran korišćenjem Clontech<®>slučajne raznolikosti mutageneze PCR pribora koji je uveo 1 do 2 mutacije po 1000 bp. Mutirana spr PCR DNA je klonirana u induktibilni ekspresioni vektor [pTTO CDP870] koji eksprimira CDP870 Fab' zajedno sa spr mutantom. Ova ligacija je zatim elektro-transformisana u E. koli soj MXE001 (ΔTsp) pripremljen primenom metode pronađena u Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995). Sledeći protokol je upotrijebljen, 40 ul elektro kompetentnog MXE001, 2.5 ul ligacije (100 pg od DNA) je dodato u elektroporacionu kivetu od 0.2 cm, elektro-transformacija je izvedena korišćenjem kao tzv. "BioRad Genepulser Xcell" sa sledećim uslovima, 2500V, 25µF i 200Ω. Posle elektrotransformacije dodat je 1 ml od SOC (Invitrogen) (prethodno zagrejan na 37°C) i ćelije su ostavljene da se obnove na 37°C tokom 1 sata sa blagim mešanjem.

[0237] Ćelije su stavljene u hipotonični agar (ekstrakt kvasca od 5 g/L, 2.5 g/L Triptona, 15 g/L agar (sve Difco)) i inkubirane na 40°C. Ćelije koje su oblikovale kolonije ponovo su stavljene u HLB na 43°C da se potvrdi restauracija sposobnosti da raste pod niskim osmotskim uslovima na visokoj temperaturi do soja MXE001. Plazmidna DNA je pripremljena iz odabranih klonova i sekvencionirana da bi se identifikovale mutacije spr.

[0238] Koristeći ovu metodu izolovano je osam pojedinačnih, jedna dvostruka mutacija i dve višestruke mutacije u spr proteinu koji su dopunili fenotip ΔTsp kao što sledi:

1. V98E

2. D133A

3. V135D

4. V135G

5. G147C

6. S95F i Y115F

7. I70T

8. N31T, Q73R, R100G, G140C

9. R62C, Q99P, R144C

10.L108S

11. L136P

[0239] Pojedinačne mutacije 1 do 5 identifikovane iznad i tri mutacije katalitičke trijade spr (C94A, H145A, H157A) i W174R su korišćene da generišu nove sojeve korišćenjem i soj E. koli divljeg-tipa W3110 (genotip: F-LAM- IN (rrnD-rrnE)1 rph1 (ATCC br. 27325)) da stvore spr mutirane sojeve ili MXE001 soj iz Primera 1 da bi se stvorili kombinovani ΔTsp/mutirani spr sojevi.

[0240] Sledeći mutirani sojevi ćelije E. koli su generisani korišćenjem sistema vektora zamene gena korišćenjem pKO3homologne rekombinacije/zamenski plazmid (Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237), kao što je opisano u Primeru 1 za generisanje MXE001.

Tabela 1

[0241] Mutirane spr integracione kasete su premeštene kao Sal I, Not I restrikcioni fragmenti u slično restrikcionim pKO3 plazmidima.

[0242] Plazmid koristi temperaturno senzitivni mutant pSC101 porekla replikacije (RepA) zajedno sa hloramfenikol markerom da forsira i izabere za hromozomske integracione događaje. sacB gen koji kodira za levansaharozu je letalan za E. koli gajenu na saharozi i zbog toga (uz hloramfenikol marker i pSC101 poreklo)se koristi da forsira i izabere za deintegraciju i događaje plazmid lečenja. Ova je metodologija prethodno opisana (Hamilton et al., 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 and Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). PKO3 sistem uklanja sve selektivne markere iz genoma domaćina, osim umetnutog gena.

[0243] PK03 vektori navedeni ispod su konstruisani, sadržavajući mutirane spr gene, uključujući tihu mutaciju unutar spr sekvence koja uklanja Sall restrikciono mesto za identifikaciju klona.

pMXE336, pK03 spr S95F (-Sall)

pMXE337, pK03 spr Y115F (-Sall)

pMXE338, pK03 spr G147C (-Sall)

pMXE339, pK03 spr D133A (-Sall)

pMXE340, pK03 spr V135D (-Sall)

pMXE341, pK03 spr V135G (-Sall)

pMXE342, pK03 spr V98E (-Sall)

pMXE343, pK03 spr C94A (-Sall)

pMXE344, pK03 spr H145A (-Sall)

pMXE345, pK03 spr H157A (-Sall)

pMXE346, pK03 spr W174R (-Sall)

[0244] Ovi plazmidi su zatim transformisani u hemijski kompetentnim ćelijama E.koli W3110 pripremljenim korišćenjem metode pronađene u Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995) ili u soju MXE001 iz Primera 1 da bi se napravili kombinovani ΔTsp/mutirani spr sojevi, kao što je prikazano u Tabeli 1.

Dan 1 40µl elektro-kompetentne ćelije E.koli ili MXE001 ćelije su pomešane sa (10 p.g) 1 µl pKO3 DNA u rashlađenoj BioRad 0.2 cm elektroporacijskoj kiveti pre elektroporacije na 2500V, 25µF i Ω 200Ω. 1000 µl od 2xPY je odmah dodato, ćelije su oporavljene mućkanjem na 250 rpm u inkubatoru na 30°C tokom 1 sata. Ćelije su serijski 1/10 razblažene u 2xPY pre nego što je 100 µl alikvota stavljeno na 2xPY agar ploče koje sadrže hloramfenikol na 20 µg/ml prethodno zagrejane na 30°C i 43°C. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C i 43°C.

Dan 2 Broj kolonija gajenih na 30°C je dao procenu efikasnosti elektroporacije, dok kolonije da prežive rast na 43°C predstavljaju potencijalne integracione događaje. Pojedinačne kolonije sa ploče od 43°C su sakupljene i resuspendovane u 10 ml 2xPY. 100 µl od toga je stavljeno na 2xPY agar ploče koje sadrže 5% (w/v) saharoze prethodno zagrejane do 30°C da bi se dobile pojedinačne kolonije. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C. Dan 3 Kolonije ovde predstavljaju potencijalne istovremene de-integracione i događaje plazmid lečenja. Ako se događaji de-integracije i stvrdnjavanja dogode rano u rastu, tada će najveći deo kolonije biti klonski. Pojedinačne kolonije su sakupljene i replika je naneta na 2xPY agar koji sadrži i hloramfenikol na 20 mµ/ml ili 5% (w/v) saharoze. Ploče su inkubirane preko noći na 30°C.

Dan 4 Kolonije koje obe rastu na saharozi i umiru na hloramfenikolu predstavljaju potencijalno hromozomsku zamenu i događaje plazmid lečenja. Ove su sakupljene i ispitivane pomoću PCR plus restrikcinog razlaganja za gubitak Sall mesta. Kolonije koje su stvorile pozitivnu PCR traku pravilne veličine i rezistenciju na razlaganje putem Sall su izbačene bi se dobile pojedinačne kolonije na 2xPY agaru sadržavajući 5% (w/v) saharoze i ploče su inkubirane preko noći na 30°C.

Dan 5 Pojedinačne kolonije PCR pozitivne, hloramfenikol-senzitivne i saharoza rezistentne E. koli korišćene za stvaranje glicerol zaliha, hemijski kompetentnih ćelija i deluju kao PCR templejti za PCR reakciju sa 5' i 3' bočnim oligonukleotidima da se generiše PCR produkt za direktno sekvencioniranje DNA korišćenjem Taq polimeraze za potvrdu ispravne mutacije.

Primer 3 - Generiranje plazmida za Fab' i DsbC ekspresiju

[0245] Konstruisan je plazmid koji sadrži isekvence i teških i lakih lanaca anti-TNF Fab' i sekvencu koja kodira DsbC.

[0246] Dicitronska poruka je stvorena od anti-TNF-α Fab' fragmenta (odnosi se na CDP870) opisanog u WO01/94585. Uzvodni cistron je kodirao laki lanac antitela (SEK ID BR: 13), dok je nizvodni cistron kodirao teški lanac antitela (SEK ID BR: 14). DNA sekvenca kodirajući OmpA signalni peptid je fuzionisana na 5' kraju DNA kodirajući za svaki od lakog lanca i teškog lanca da bi se omogućila efikasna sekrecija prema periplazmi. Intergenska sekvenca (IGS) 2 je korišćena kao što je prikazano u SEK ID BR: 37.

[0247] Plazmid pDPH358 (pTTO 40.4 CDP870 IGS2), ekspresioni vektor za CDP870 Fab' (anti-TNF Fab') i DsbC (periplazmatski polipeptid) je konstruisan korišćenjem konvencionalnih metodologija restrikcionog kloniranja koji se mogu naći u Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y. Plazmid pDPH358 je sadržavao sledeće karakteristiike; jak tac promoter i lac operator sekvencu. Kao što je prikazano na Slici 6, plazmid je sadržavao jedinstveno EcoRl restrikciono mesto posle kodirajuće regije Fab’-ovog teškog lanca, nakon čega sledi nekodirajuća sekvenca, i zatim jedinstveno Ndel restrikciono mesto. DsbC gen je PCR kloniran korišćenjem W3110 sirove hromozomske DNA kao templejt tako da PCR produkt kodiran za 5' EcoRI mesto praćeno snažnim vezivanjem ribozoma, nakon čega sledi nativni start kodon, signalna sekvenca i zrela sekvenca DsbC, završavajući u C-terminalnoj His oznaci i konačno nekodirajući Ndel mesto. EcoRl-Ndel PCR fragment je ograničen i vezan u ekspresioni vektor tako da su sva tri polipeptida: Fab 'laki lanac, Fab' teški lanac i DsbC kodirani na jednoj policistronskoj mRNA.

[0248] Fab lakog lanca, geni teškog lanca i DcbC gen su transkribovani kao jedna policistronska poruka. DNA kodirajući signalni peptid iz E. coli OmpA proteina je bila fuzionisana na 5' kraju oba lakog i teškog lanca genskih sekvenci, koji su usmeravali translokaciju polipeptida na periplazmu E. koli. Transkripcija je prekinuta upotrebom dvojnog transkripcijskog terminatora rrnB t1t2. laclq gen kodira konstitutivno izražen Lac l represor proteina. Ova potisnuta transkripcija od tac promotera do de-represije je indukovana prisustvom alolaktoze ili lPTG. Poreklo korišćene replikacije je p15A, što je zadržalo mali broj kopija. Plazmid je sadržavao tetraciklin rezistentan gen za selekciju antibiotika.

Primer 4 - Ekspresija anti-TNF Fab' i DsbC u mutiranim ćelijskim linijama

Ekspresija anti-TNF Fab' i DsbC

[0249] Soj MXE001 obezbeđen u Primeru 1 i mutirani sojevi, MXE008 i MXE009, obezbeđeni u Primeru 2, su transformisani sa plazmidom generisanim u Primeru 3.

[0250] Transformacija sojeva je izvedena korišćenjem metode pronađene u Chung C.T et al Transformacija i skladištenje bakterijskih ćelija u istom rastvoru. PNAS 86:2172-2175 (1989).

Ekspresija anti-TNF Fab’

[0251] Sojovi MXE001, MXE008 i MXE009 su transformirani sa plazmidom pMXE117 (pTTO CDP870 ili 40.4 IGS2), ekspresionim vektorom za CDP870 Fab' (anti-TNF Fab' imajući sekvencu lakog lanca prikazanog u SEK ID BR: 13 i sekvencu teškog lanca prikazanu u SEK ID BR: 14), kao što je opisano u Primeru 3, koji je konstruisan korišćenjem uobičajenih metodologija restrikcionog kloniranja koje se mogu naći u Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y. Plazmid pMXE117 (pTTO CDP870 ili 40.4 IGS2) je sadržavao su sledeće karakteristike; snažan tac promoter i lac operater sekvence. Geni Fab lakog i teškog lanca su transkribiovni kao pojedinačna dicistronska poruka. DNA kodirajući signalni peptid iz E. koli OmpA proteina bila je fuzionisana na 5' kraju genskih sekvenci oba, lakog i teškog lanca, koji su usmeravali translokaciju polipeptida na periplazmu E. coli. Transkripcija je prekinuta upotrebom dvojnog transkripcijskog terminatora rrnB t1t2. laclq gen kodira konstitutivno izražen Lac l represor proteina. Ova potisnuta transkripcija od tac promotera do de-represije je indukovana prisustvom alolaktoze ili lPTG. Poreklo korišćene replikacije je p15A, što je zadržalo mali broj kopija. Plazmid je sadržavao tetraciklin rezistentan gen za selekciju antibiotika.

[0252] Transformacija sojeva je izvedena korišćenjem metode pronađene u Chung C.T et al Transformacija i skladištenje bakterijskih ćelija u istom rastvoru. PNAS 86:2172-2175 (1989).

Primer 5 - Rast mutiranih sojeva E. koli i ekspresija anti-TNF Fab' u mutiranim sojevima E. koli korišćenjem fermentacija visoke gustoće.

[0253] Sledeći sojevi proizvedeni u Primeru 4 su ispitani u eksperimentima fermentacije upoređujući rast i ekspresiju anti-TNFα Fab’:

MXE001 izražavajući anti-TNF Fab’

MXE008 izražavajući anti-TNF Fab’

MXE009 izražavajući anti-TNF Fab’

MXE001 izražavajući anti-TNF Fab’ i DsbC

MXE008 izražavajući anti-TNF Fab’ i DsbC

MXE009 izražavajući anti-TNF Fab’ i DsbC

Medijum za rast

[0254] Medijum za rast fermentacije je baziran na SM6E medijumu (opisano u Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320) sa 3.86 g/l NaH2PO4.H2O i 112 g/l glicerola.

[0255] Inokulum. Kultura inokuluma je gajena u istom medijumu obogaćenom 10 µg/ml tetraciklina. Kulture su inkubirane na 30°C uz mućkanje približno 22 sata.

[0256] Fermentacija. Posude za fermentaciju (ukupna zapremina od 2.5 litara) su zasađene sa kulturom inokuluma na 0.3-0.5 OD600. Temperatura je održavana na 30°C tokom faze rasta i redukovana na 25°C pre indukcije. Koncentracija rastvorenog kiseonika je održavana iznad 30% zasićenja vazduha promenjivim mešanjem i protokom vazduha. pH kulture je kontrolisana na 7.0 automatskom titracijom sa 15% (v/v) NH4OH i 10% (v/v) konc. H2SO4. Penušanje je kontrolisano dodatkom 10% (v/v) Struktol J673 rastvora (Schill i Seilacher). Broj dodataka je napravljen u različitim fazama fermentacije. Kada je koncentracija biomase dostigla približno 40 OD600, dodate su magnezijumove soli i NaH2PO4.H2O. Dalje dodavanje NaH2PO4H2O je napravljeno pre i za vreme faze indukcije da se fosfat održava u višku. Kada je glicerol prisutan na početku fermentacije, potrošen (približno 75 OD600), primenjena je kontinuirana hrana od 80% (w/w) glicerola. Na istoj tački u fermentaciji primenjena je iPTG hrana na 170 µM. Početak hranjenja lPTG-om je uzet kao početak indukcije. Fermentacije se tipično izvode 64 do 120 sati pri brzini glicerol hrane (u rasponu od 0.5 do 2.5 ml/h).

[0257] Merenje koncentracije biomase i stope rasta. Koncentracija biomase je određena merenjem optičke gustoće kultura na 600 nm.

[0258] Periplazmatska ekstrakcija. Ćelije su sakupljene iz uzoraka kulture centrifugiranjem. Supernatantna frakcija je zadržana (na -20°C) za dalju analizu. Frakcija ćelijskog peleta je resuspendovana do početne zapremine kulture u ekstrakcionom puferu (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA; pH 7.4). Posle inkubacije na 60°C tokom približno 16 sati ekstrakt je prečišćen centrifugiranjem i supernatantna frakcija je zadržana (na -20°C) za analizu.

[0259] Fab 'kvantifikacija. Fab 'koncentracije u periplasmatskim ekstraktima i kulturi supernatanta određene su Fab' skupnom ELIZOM kao što je opisano u Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320 i upotreboom Protein G hplc. Kolona HiTrap Protein-G HP 1 ml (GE-Healthcare ili ekvivalent) je napunjena sa analitom (otprilike neutralna pH, 30°C, 0.2 um filtriran) pri 2 ml/min, kolona je isprana sa 20 mM fosfatom, 50 mM NaCl pH 7.4 i onda je Fab'eluiran upotrebom injekcije od 50 mM Glicin/HCl pH 2.7. Eluiran Fab' je meren sa A280 na Agilent 1100 ili 1200 HPLC sistemu i kvantifikovan referencom na standardnoj krivi prečišćenog Fab' proteina poznate koncentracije.

[0260] Slika 1 prikazuje profil rasta anti-TNF Fab' izraženih sojeva MXE001 i MXE008 i profil rasta anti-TNFα Fab' i rekombinantnih DsbC izraženih sojeva MXE001 i MXE008. Može se videti da sojevi koji izražavaju DsbC pokazuju poboljšani rast u poređenju sa odgovarajućim sojevima ćelije koji ne izražavaju rekombinantni DsbC. Takođe se može videti da prisustvo spr mutacije u sojevima poboljšava rast ćelija.

[0261] Slika 2 prikazuje prinos Fab iz periplazme (osenčeni simboli) i supernatanta (otvoreni neosenčeni i simboli) iz anti-TNF Fab' i rekombinantnih DsbC izražavajući sojeve E. koli MXE001, MXE008 i MXE009. Na grafikonu se može videti da su sva tri soja dovela do visokog prinosa anti-TNF-α-Fa b' sa sojevima MXE008 i MXE009 proizvodeći više od 2.2 g/L periplazmatskog anti-TNF α Fab' u 40 sati. Takođe se može videti da su sojevi MXE008 i MXE009 noseći gen mutiranog spr gena pokazali smanjenu lizu u poređenju sa MXE001 što se može smatrati kao manje supernatantnim anti-TNF α Fab’ (otvoreni simboli).

[0262] Slika 3 prikazuje prinos Fab iz periplazme (osenčeni simboli) i supernatanta (otvoreni neosenčeni simboli) iz anti-TNFα Fab’ izražavajući sojeve E. koli MXE001 i MXE008 i od anti-TNFα Fab’ i rekombinantnog DsbC izražavajući sojeve E. koli MXE001 i MXE008. Na grafikonu se može videti da sojevi izražavajući rekombinantnu DsbC proizvode visoki prinos anti-TNF-α Fab' sa sojem MXE008 koji proizvodi 2.4 g/L periplazmatskog anti-TNF α Fab’ u 40 sati. Takođe se može videti da sojevi MXE008 noseći mutirani spr gen pokazuju smanjenu lizu u poređenju sa MXE001 sojevima što se može smatrati manjim supematantom anti-TNF α Fab’ (otvoreni simboli).

Primjer 6 - Rast mutiranih sojeva E. koli i ekspresija Fab A i Fab B u mutiranim sojevima E. koli korišćenjem fermentacija visoke gustoće

[0263] Uticaj na prinos produkcije proteina iz ćelije predmetnog pronalaska je takođe izveden za dva dodatna Fab proteina, Fab A koji ima specifičnost za antigen A i Fab B koji ima specifičnost za antigen B, koristeći isti metod opisan iznad u Primeru 5 i u odnosu na W3110 sojeve izražavajući Fab A i Fab B.

[0264] Slika 4 prikazuje ukupni prinos Fab iz periplazme iz Fab A i Fab B koji izražavaju soj E. koli W3110 i iz Fab A i rekombinantne DsbC ili Fab B i rekombinantne DsbC koji izražavaju soj E. koli MXE008. Na grafikonu se može videti da sojevi koji izražavaju rekombinantne DsbC proizvode znatno veći prinos Fab A i Fab B u MXE008 u poređenju sa W3110.

Primer 7 - Rast sojeva E. koli koji izražavaju anti-TNF Fab' i DsbC korišćenjem fermentacija velikih razmera

[0265] Sledeći soj, proizveden u primeru 4, je testiran u eksperimentima fermentacije upoređujući rast soja i ekspresiju anti-TNF-α Fab ':

MXE008 izražavajući anti-TNF Fab' i DsbC

[0266] Fermentacije su izvedene kao što sledi:

MXE008 eksprimirajući anti-TNF Fab i DsbC ćelije su gajane prvobitno korišćenjem kompleksnog medijuma ekstrakta kvasca i peptona u kulturi u mućkalici. Ćelije su zatim prenesene fermentor u stadijumu semena korišćenjem hemijski definisanog medijuma. Ćelije su gajene pod ne-ograničavajućim uslovima do definisane tačke prenosa. Ćelije su zatim prenesene u 5L ili 250L produkcioni fermenter korišćenjem hemijski sličnog definisanog medijuma sa konačnom zapreminom od približno 3.3 L ili 230 L respektivno. Kultura je prvobitno gajena u serijskom načinu rada sve do osiromašenja izvora ugljenika. Posle iscrpljivanja izvora ugljenika, ograničavajući izvor ugljenika je unet pri eksponencijalno ubrzanom stopom. Nakon dodatka definisane količine izvora ugljenika, smanjena je stopa dodatka rastvora hrane i dodata je lPTG da se indukuje ekspresija Fab'. Fermentacija je zatim nastavljena i Fab' je akumulisan u periplazmi. U određenom periodu posle indukcije, kultura je prikupljena centrifugiranjem i Fab' je ekstrahovan iz ćelija resuspendovanjem prikupljenih ćelija u Tris i EDTA puferu i zagrevanjem do 59°C.

[0267] Profili rasta fermentacije su bili određeni merenjem optičke gustoće kulture na 600 nm.

[0268] Fab' titri su određeni pomoću Protein G HPLC, kao što je opisano u Primeru 5, osim što su za vreme periplazmatske ekstrakcije korišćene sveže ćelije i dodat je 1 mL ekstrakcionog pufera u ćelijsku kulturu. Supernatant i periplazmatski Fab' su izmereni kao što je opisano u Primeru 5. Slika 8 prikazuje periplazmatski titar Fab'.

[0269] Slika 7 prikazuje komparativne profile rasta od 5L i 200L fermentacija anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući E. koli soj MXE008.

[0270] Slika 8 prikazuje komparativne Fab' titre od 5L i 200L fermentacija anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući E. koli soj MXE008.

Primer 8 - Rast sojeva E. koli koji izražavaju anti-TNF Fab' i DsbC koroišćenjem fermentacija velikih razmera

[0271] Sledeći sojevi, proizvedeni u primeru 4, su testirani u fermentacionim eksperimentima upoređujući rast soja i ekspresiju anti-TNFα Fab':

MXE008 izražavajući anti-TNF Fab’ i DsbC

MXE009 izražavajući anti-TNF Fab’ i DsbC

[0272] Fermentacije su izvedene kao što je opisano iznad u Primeru 7 korišćenjem 20L produkcionog fermentera.

[0273] Profili rasta fermentacije su određeni merenjem optičke gustoće kulture na 600 nm.

[0274] Fab 'titri su određeni pomoću Protein G HPLC kao što je opisano u Primeru 7 iznad.

[0275] Slika 9 prikazuje komparativne profile rasta fermentacija anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući E. koli sojeve MXE008 i MXE009.

[0276] Slika 10 prikazuje komparativne periplazmatske Fab' titre fermentacija anti-TNF Fab' i rekombinantne DsbC izražavajući E. koli sojeve MXE008 i MXE009.

LISTA SEKVENCI

[0277]

<110> UCB PHARMA S.A.

<120> BAKTERISKI SOJ DOMAĆINA <130> G0109-WO

<150> GB1000591.6

<151> 2010-01-14

<160> 39

<170> PatentIn verzija 3.5 <210> 1

<211> 2049

<212> DNK

<213> E. coli

<210> 2

<211> 682

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 2

<210> 3

<211> 2048 <212> DNK <213> E. coli

<400> 3

<210> 4

<211> 2889

<212> DNK

<213> E. coli

<400> 4

<210> 5

<211> 962

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 5

<210> 6

<211> 2915

<212> DNK

<213> E. coli

<400> 6

<210> 7

<211> 1425

<212> DNK

<213> E. coli

<400> 7

<210> 8

<211> 474

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 8

<210> 9

<211> 1425

<212> DNK

<213> E. coli

<400> 9

<210> 10

<211> 474

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 10

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> hTNF40-gL1 <400> 11

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> gh3h TNF40.4 <400> 12

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Grafted Light Chain

<400> 13

<210> 14

<211> 229

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Cepljen teški lanac <400> 14

<210> 15

<211> 24

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Oligonucleotidni prajmer <400> 15

gcatcataat tttcttttta cctc 24 <210> 16

<211> 24

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Oligonukleotidni prajmer <400> 16

gggaaatgaa cctgagcaaa acgc 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Oligonukleotidni prajmer <400> 17

gtgccaggag atgcagcagc ttgc 24 <210> 18

<211> 21

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Oligonukleotidni prajmer <400> 18

tttgcagcca gtcagaaagt g 21

<210> 19

<211> 24

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Oligonukleotidni prajmer <400> 19

ctgcctgcga ttttcgccgg aacg 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Oligonukleotidni prajmer <400> 20

cgcatggtac gtgccacgat atcc 24

<210> 21

<211> 188

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 21

<210> 22

<211> 162

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 22

<210> 23

<211> 951

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Mutirana OmpT sekvenca

<400> 23

<210> 24

<211> 317

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Mutirana OmpT sekvenca

<400> 24

<210> 25

<211> 954

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Mutirana OmpT sekvenca

<400> 25

<210> 26

<211> 729

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Mutirana DsbC sekvenca <400> 26

<210> 27

<211> 242

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> Mutirana DsbC sekvenca <400> 27

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Opis veštačke sekvence:hTNF40 CDRH1

<400> 28

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Opis veštačke sekvence a: hTNF40 Human hybrid CDRH2 <400> 29

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Opis veštačke sekvence: hTNF40 CDRH3

<400> 30

<210> 31

<211> 11

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Opis veštačke sekvence: hTNF40 CDRL1 <400> 31

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Opis veštačke sekvence: hTNF40 CDRL2 <400> 32

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Opis veštačke sekvence:hTNF40 CDRL3 <400> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Opis veštačke sekvence: hTNF40 CDRH2 <400> 34

<210> 35

<211> 84

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> OmpA oligonukleotidni adaptor <400> 35

<210> 36

<211> 67

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> IGS kaseta-1

<400> 36

<210> 37

<211> 69

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> IGS kaseta-2 <400> 37

<210> 38

<211> 81

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> IGS kaseta-3 <400> 38

<210> 39

<211> 81

<212> DNK

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> IGS kaseta-4 <400> 39

Claims (21)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija je naznačena time, da ćelija:

a)obuhvata ekspresioni vektor sadržavajući rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC;

b) ima mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu aktivnost proteaze u poređenju sa divljimtipom ćelije,

c) obuhvata mutirani spr gen koji kodira mutirani spr protein sposoban suzbijanju fenotipa ćelije obuhvatajući mutirani Tsp gen, i

d) ima genom koji je izogen za divlji- tip E.koli soja W3110 osim za mutirani Tsp gen i mutirani spr gen.

2. Ćelija prema patentnim zahtevu 1, pri čemu mutirani spr gen kodira spr protein, kao što je definisano u SEK ID BR: 21, imajući mutaciju u jednoj ili više aminokiselina izabranih od N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 i H157.

3. Ćelija prema patentnim zahtevu 2, pri čemu mutirani spr gen kodira spr protein, imajući jednu ili više mutacija izabranih od N31Y, R62C, I70T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D, V135G, L136P, G140C, R144C, H145A, G147C i H157A.

4. Ćelija prema patentnim zahtevu 3, pri čemu mutirani spr gen kodira spr protein, imajući mutaciju C94A.

5. Ćelija prema patentnim zahtevu 3, pri čemu mutirani spr gen kodira spr protein, imajući mutaciju H145A.

6. Ćelija prema patentnim zahtevu 3, pri čemu mutirani spr gen kodira spr protein, imajući mutacije S95F i Y115F.

7. Ćelija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu ćelija ima nokaut mutirani Tsp gen koji obuhvata mutaciju na genu start kodona i/ili obuhvata jedan ili više stop kodona pozicioniranih nizvodno od start kodona gena i uzvodno od stop kodona gena.

8. Ćelija prema patentnim zahtevu 7, pri čemu nokaut mutirani Tsp gen obuhvata mesto restrikcionog markera nastao pomoću genetske mutacije na start kodonu gena i opciono jednu ili više daljih tačkastih mutacija.

9. Ćelija prema patentnim zahtevu 8, pri čemu nokaut mutirani Tsp gen obuhvata SEK ID BR:3.

10. Ćelija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu ćelija obuhvata polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa.

11. Ćelija prema patentnim zahtevu 10, pri čemu ćelija obuhvata vektor obuhvatajući rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa.

12. Ćelija prema patentnim zahtevu 11, pri čemu vektor sadrži promoter koji kontroliše ekspresiju rekombinantnog polinukleotida kodirajući DsbC i polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa.

13. Ćelija prema bilo kojem od patentnih zahteva 10 do 12, pri čemu je protein od interesa antitelo ili njegov antigen vezujući fragment.

14. Ćelija prema patentnim zahtevu 13, pri čemu antitelo ili njegov antigen vezujući fragment je Fab, modifikovani Fab ili Fab’.

15. Ćelija prema patentnim zahtevu 13 ili 14, pri čemu je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment specifičan za TNF.

16. Ćelija prema patentnim zahtevu 15, pri čemu antitelo ili antigen vezujući fragment obuhvata

a) teški lanac pri čemu varijabilni domen obuhvata sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 28 za CDRH1, sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 29 ili SEK ID BR: 34 za CDRH2 i sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 30 za CDRH3 i b) laki lanac pri čemu varijabilni domen sadrži sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 31 za CDRL1, sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 32 za CDRL2 i sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 33 za CDRL3.

17. Ćelija prema patentnim zahtevu 15, pri čemu antitelo ili antigen vezujući fragment je Fab’ i ima sekvencu lakog lanca obuhvatajući ili se sastojeći od SEK ID BR: 13 i sekvencu teškog lanca obuhvatajući ili se sastojeći od SEK ID BR: 14.

18. Metoda za proizvodnju proteina od interesa obuhvatajući:

a) kultivisanje rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije kao što je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 17 u medijumu za kulturu pod uslovima efikasnim da izraze rekombinantni protein od interesa i rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC; i

b) obnavljanje proteina od interesa iz periplazme rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije i/ili medijuma za kulturu.

19. Metoda prema patentnom zahtevu 18, pri čemu ekspresija polinukleotidne sekvence koja kodira protein od interesa i rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC je indukovan dodavanjem induktora u medijum za kulturu.

20. Metoda prema patentnim zahtevima 18 ili 19, pri čemu metoda dalje obuhvata odvajanje proteina od interesa iz DsbC.

21. Metoda prema bilo kom od patentnh zahteva 18 do 20, koji nizvodno dalje obuhvata korak obrade PEGilacije proteina od interesa.