RS56496B1 - Kompozicije hemoglobina - Google Patents

Description

Opis pronalaska

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetni pronalazak pripada oblasti zamena za krv i resuscitacionih fluida, koji sadrže protein modifikovan polimerom, npr. hemoglobin, čije formulacije mogu da dopreme kiseonik ili ugljen monoksid do tkiva.

STANJE TEHNIKE

[0002] Trauma je jedan od vodećih uzroka smrti u Sjedinjenim Državama. Primarni razlog za visoku stopu mortaliteta je nemogućnost održavanja oksigenacije tkiva kod pacijenta u periodu između trenutka povrede i trenutka hirurške intervencije u medicinskoj ustanovi. Nedostatak oksigenacije rezutuje oštećenjem tkiva, otkazivanjem organa i smrću. Zbog toga je glavni fokus u lečenju traumatskog šoka davanje lekova koji obezbeđuju unutrašnjim tkivima i organima pacijenata što je više moguće kiseonika.

[0003] Očigledan pristup za održavanje oksigenacije je transfuzija krvi. Međutim, postoje značajni praktični problemi pri korišćenju krvi na mestima ukazivanja pomoći sa stanovišta medicinskog tretmana koji rutinsko korišćenje uskladištene ljudske krvi za upotrebu izvan medicinske ustanove čine nepraktičnim iz brojnih razloga. Standardni pristupi za lečenje traume prvenstveno obuhvataju održavanje intravaskularne zapremine cirkulišuće krvi davanjem izotiničnih, hipertoničnih ili hiperonkotičnih rastvora. Ovakvi tretmani ne mogu ravnomerno povećati oksigenaciju unutrašnjih tkiva i organa tako da to bude dovoljno za efikasno sprečavanje ishemije i otkazivanja organa.

[0004] Kao posledica ovoga došlo je do velikih napora da se razviju nosači kiseonika na bazi hemoglobina (engl. hemoglobin based oxygen carriers, skr. HBOCs) koji mogu da ponovo uspostave sposobnost nošenja kiseonika kod pacijenata sa traumom. HBOCs imaju više prednosti u odnosu na uskladištenu ljudsku krv, uključujući smanjenu šansu za prenošenje bolesti, nedostatak imune reaktivnosti, nepostojanja potrebe za određivanjem krvne grupe i, kao najvažnije, poboljšanu raspoloživost uz smanjenje potrebe za skladištenjem. Više grupa je razvilo HBOCs, a nekoliko kompanija je sprovelo klinička ispitivanja da bi razvilo svoje proizvode na bazi hemoglobina kao zamene za krv. Hemoglobin (HGB) izolovan iz ljudske ili životinjske krvi, ili sintetički proizveden nosač kiseonika, kao što je perfluorougljenik, su dva tipa zamena za krv koja su bila na kliničkim ispitivanjima. Takođe su razvijene neke zamene za crvena krvna zrnca i karakterizovane su za primenu kod pacijenata. (Vidi, na primer, Red Blood Cell Substitutes, 1998, (ured.) A. S. Rudolph, R. Rabinovici, i G. Z. Feuerstein, Dekker, Njujork, N.Y.). Takve zamene za crvena krvna zrnca se mogu koristiti u kombinaciji sa standardnim medicinskim terapijama, kao što su transfuzija krvi ili proizvoda od krvi. Kao specifičan primer, Enzon, Inc. (Piscataway, N.J.), je razvio goveđi hemoglobin modifikovan polietilen glikolom (PEG), skraćeno PEG-HGB. PEG-HGB se proizvodi pomoću procesa u kome se lanci PEG umrežavaju na površinama HGB molekula, na primer, kao što je opisano u US pat. br.5,386,014 i 5,234,903 nosalaca Nho et al.). Neki specifični primeri obuhvataju Hemopure™ i Oxyglobin (Biopure, Kembridž, Mass.). Međutim, ni za jedan od ovih proizvoda nije utvrđeno da dovodi do značajnog povećanja oksigenacije tkiva i nijedan nije dobio odobrenje FDA, bilo zato što nisu efikasni, ili zato što izazivaju značajnu toksičnost.

[0005] Nedostatak podesnih HBOCs je u velikoj meri sprečio bazično istraživanje fiziologije oksigenacije tkiva i naše razumevanje kritičnih mehanizama uključenih u šok i njegovo izazivanje oštećenja tkiva. Što se tiče HBOCs koji su bili podvrgnuti kliničkim ispitivanjima i koji su izazvali značajnu toksičnost, na raspolaganju se nalazi mali broj informacija u vezi uzroka ovih toksičnosti.

[0006] Shodno tome, postupci za lečenje traumom indukovane hemoragije su trenutno nedovoljni. Transfuzija cele krvi može dopremiti kiseonik do tkiva i dopuniti izgubljenu zapreminu cirkulišuće krvi, ali korišćenje krvi kao sredstva za lečenje hemoragije izvan medicinskih ustanova dovodi do značajnih praktičnih problema. Pre svega tu su generalno ograničene količine krvi na raspolaganju, a za svaku tretiranu osobu je neophodno određivanje krvne grupe da bi se sprečila smrt pacijenta usled imune reakcije. Međutim, najvažniji problem pri korišćenju krvi za lečenje pacijenata sa traumom izvan medicinskih ustanova predstavljaju ograničenja vezana za skladištenje i pakovanje koja su inherentna pri upotrebi ovog tkiva. Shodno tome, transfuzije krvi se normalno ne koriste u svrhe lečenja kod pacijenata sa traumom.

[0007] U stvari, standardni pristupi za lečenje traume prvenstveno obuhvataju održavanje intravaskularne zapremine cirkulišuće krvi davanjem bilo izotoničnih, hipertoničnih ili hiperonkoničnih rastvora. Ovi pristupi su namenjeni za obezbeđivanje kratkoročnog dopunjavanja zapremine cirkulišuće krvi i takođe mogu povećati protok krvi, a time i dopremanje kiseonika do tkiva. Međutim, kada je hemoragija ozbiljna, onda ovakvi tretmani ne mogu ravnomerno povećati oksigenaciju unutrašnjih tkiva i organa dovoljno da bi se efikasno sprečila ishemija i otkazivanje organa. Kao posledicu ovoga imamo visoku stopu mortaliteta kod onih pojedinaca koji su izloženi ozbiljnoj traumi.

[0008] US2004/0072729 opisuje rastvore koji sadrže konjugate polietilen glikola (SP-PEG) i hemoglobina koji imaju P50između 6 i 14 mmHg (Tabela 3: 10 mmHg). US2004/0072729 takođe opisuje da kao stabilizator može biti dodat cistein.

[0009] Godinama su vršeni pokušaji da se razviju nosači kiseonika na bazi hemoglobina (HBOCs) koji mogu snabdeti kiseonikom pacijente sa traumom. HBOCs imaju više prednosti u odnosu na uskladištenu ljudsku krv, a ne izazivaju mnoge probleme koji su povezani sa upotrebom ljudske krvi za lečenje traume. Ove prednosti obuhvataju smanjenu šansu za prenošenje bolesti, nepostojanje imune reakcije, nedostatak potrebe za određivanjem krvne grupe i, kao najvažnije, poboljšanu raspoloživost uz smanjenu potrebu za skladištenjem. Bilo bi idealno da HBOCs mogu da vezuju kiseonik i da ga predaju tkivima kojima je to potrebno. To bi trebalo da bude rastvor spreman za upotrebu, u obliku koji je mesecima stabilan pod većinom uslova okruženja, a naročito onim uslovima koji se obično sreću na mestima ukazivanja pomoći na kojima se nalaze pacijenti sa traumom kojima je potrebno lečenje.

[0010] Tokom godina je bilo učinjeno više pokušaja da se razviju HBOCs kao kiseonični terapeutici, bilo uz korišćenje prirodno, ili rekombinantnog humanog hemoglobina, modifikovanih oblika humanog hemoglobina ili modifikovanih oblika hemoglobina drugih vrsta. Nemodifikovani hemoglobin se može koristiti kao kiseonični terapeutik, međutim, on vezuje NOx i izaziva ozbiljnu vazokonstrikciju i hipertenziju. Zbog svoje molekulske težine, hemoglobin može izazvati značajne toksičnosti, a naročito u bubrezima, gde izaziva začepljenje glomerularnog aparata. Zbog toga je većina hemoglobina koji su bili testirani na ljudima modifikovana da bi se produžio njihov rok trajanja i da bi se smanjila njihova toksičnost.

[0011] Cilj pronalaska je da se realizuju novi molekuli za nošenje i predavanje kiseonika i ugljen monoksida koji mogu služiti kao zamene za krv i/ili imaju terapeutsku aktivnost, kao i procesi za dobijanje ovih molekula.

[0012] Sledeći cilj ovog pronalaska je da se realizuju stabilizovani i virusno neaktivni hemoglobin i konjugati hemoglobina sa vodorastvornim polimerima koji su korisni kao terapeutici u transfuzionoj medicini, pri čemu zbog virusne deaktivacije prirodni hemoglobin i rezultujuće formulacije hemoglobina u suštini ne sadrže infektivne agense koji se mogu preneti. Konjugati su sposobni za predavanje kiseonika ili ugljen monoksida vezanih za hemoglobin tkivima.

SUŠTINA PRONALASKA

[0013] Između svojih mnogih primera izvođenja, predmetnim pronalaskom je realizovan molekul PEG-hemoglobin ("PEG-Hb"), koji u sisarskoj vaskulaturi može i da nosi, i da predaje kiseonik ili ugljen monoksid (CO) tkivima u kontaktu sa vaskulaturom i/ili u kontaktu sa hemoglobinom. Kompozicije prema pronalasku sadrže vodorastvorni, funkcionalni, prirodni hemoglobin. Kompozicija sadrži vodorastvornu frakciju hemoglobina, koja sadrži grupu funkcionalnih, prirodnih molekula hemoglobina. Svaki član ove grupe molekula hemoglobina je kovalentno konjugovan sa najmanje jednim molekulom pomenutog poli(etilen glikola) preko jedne amino grupe aminokiselinskog ostatka (npr. ε-amino grupe lizinskog ostatka), u suštini ne sadrži hemijske agense za umrežavanje i ima P50od 9 mm Hg do 14 mm Hg. Kompozicija takođe sadrži frakciju vodorastvornog stabilizatora. Frakcija stabilizatora obezbeđuje grupi molekula hemoglobina rezistenciju protiv oksidacije. Frakcija stabilizatora sadrži stabilizator koji sadrži strukturni element koji je reaktivniji sa kiseonikom (ili reaktivne vrste kiseonika, engl. reactive oxygen vrste, skr. ROS) nego molekul hemoglobina. Kompozicija sadrži frakciju razređivača, generalno vodenu frakciju razređivača. Frakcija razređivača sadrži farmaceutski prihvatljivi razređivač u kome je rastvorljiva frakcija hemoglobina, opciono u kome je takođe rastvorljiva i frakcija stabilizatora.

Kompozicija sadrži manje od 5% metemoglobina. Jedinjenje je virusno deaktivirano, čime je dobijena kompozicija u kojoj nema virusne aktivnosti. Kompozicija se dobija postupkom koji sadrži:

i. podvrgavanje rastvora deoksigenovanog hemoglobina i stabilizatora procesu termičke deaktivacije virusa koji sadrži, izlaganje pomenutog rastvora temperaturi koja je dovoljno povišena da deaktivira celokupnu virusnu aktivnost u pomenutom rastvoru (npr.60 °C), pri čemu je pomenuto izlaganje vremenski dovoljno dugo da se ostvari pomenuta deaktivacija celokupne virusne aktivnosti u pomenutom rastvoru (npr.10 sati),

pomenuti stabilizator sadrži strukturni element koji je reaktivniji sa kiseonikom nego pomenuti deoksigenovani hemoglobin u pomenutom rastvoru, čime se minimizira vezivanje kiseonika za pomenuti deoksigenovani hemoglobin, pri čemu pomenuti rastvor sadrži količinu pomenutog stabilizatora koja je dovoljna za sprečavanje formiranja više od 5% metemoglobina u pomenutom procesu termičke deaktivacije virusa; i onda reoksigenaciju pomenutog deoksigenovanog hemoglobina da bi se formirao virusno deaktivirani reoksigenovani rastvor hemoglobina; i

ii. dovođenje u kontakt pomenutog virusno deaktiviranog reoksigenovanog rastvora hemoglobina iz koraka (i) sa aktiviranim molekulom poli(etilen glikola) sa reaktivnosti komplementarnom sa aminokiselinskim ostatkom pomenutog hemoglobina, čime se formira kovalentni konjugat između poli(etilen glikola) i molekula hemoglobina u pomenutom rastvoru.

[0014] U ilustrativnim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovan konjugat hemoglobina koji može da prenosi kiseonik ili ugljen monoksid iz molekula hemoglobina do tkiva in vivo (npr. do tkiva).

Kompozicija sadrži kovalentni konjugat između funkcionalnog, opciono deoksigenovanog, prirodnog molekula hemoglobina i najmanje jednog molekula poli(etilen glikola). Hemoglobin je konjugovan sa najmanje jednim molekulom poli(etilen glikola) (PEGilovan), jer ova modifikacija produžava poluživot prirodnog hemoglobina. Ovime se prevazilazi glavni problem kratkog in vivo poluživota samog prirodnog hemoglobina, kao i nekih od prethodno razvijenih HBOCs. Dalje, produžavanjem poluživota hemoglobina, putem vezivanja takvih polimera se povećava fizička veličina molekula. U ilustrativnim primerima izvođenja, konjugacija dovodi do manjeg formiranja proizvoda razlaganja, čime se smanjuje verovatnoća bubrežne toksičnosti koja je otkrivene kod prirodnog hemoglobina, kao i kod nekih manje stabilnih HBOCs. PEGilacija smanjuje imuno prepoznavanje hemoglobina. Shodno tome, u kompozicijama i postupcima prema pronalasku se može upotrebiti hemoglobin nehumanih vrsta. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, hemoglobin je goveđi hemoglobin. Kompozicija je kompozicija virusno deaktiviranog konjugata hemoglobina.

[0015] Kompozicija sadrži vodorastvornu frakciju hemoglobina koja sadrži grupu molekula hemoglobina. Grupa molekula hemoglobina je opciono deoksigenovana i kovalentno je konjugovana sa najmanje jednim molekulom poli(etilen glikola) preko jedne amino grupe aminokiselinskog ostatka (npr. s-amino grupe lizinskog ostatka). Konjugat hemoglobina u frakciji hemoglobina ne sadrži hemijske agense za umrežavanje; i ima P50od 9 mm Hg do 14 mm Hg, opciono do oko 12 mm Hg. Ilustrativne kompozicije takođe sadrže vodorastvornu frakciju stabilizatora koja obezbeđuje grupi molekula hemoglobina rezistenciju protiv oksidacije. Frakcija stabilizatora sadrži stabilizator. Stabilizatori sadrže strukturni element koji sprečava reoksigenaciju deoksigenovanog hemoglobina. Stabilizator je reaktivniji sa kiseonikom nego članovi grupe molekula hemoglobina. Kompozicija takođe sadrži frakciju razređivača. Frakcije razređivača su farmaceutski prihvatljivi razređivač u kome je rastvorljiva frakcija hemoglobina. Kompozicija je u suštini virusno deaktivirana i sadrži manje od 5% metemoglobina.

[0016] Pronalaskom je realizovana virusno deaktivirana kompozicija hemoglobina koja sadrži vodorastvorni, funkcionalni, opciono deoksigenovani, prirodni hemoglobin. Kompozicija se dobija postupkom koji sadrži, podvrgavanje rastvora deoksigenovanog hemoglobina i stabilizatora procesu termičke deaktivacije virusa. Proces termičke deaktivacije virusa sadrži izlaganje rastvora temperaturi koja je dovoljno povišena da u suštini deaktivira celokupnu virusnu aktivnost u pomenutom rastvoru (npr.60 °C). Tretman povišenom temperaturom je vremenski dovoljno dug da se ostvari deaktivacija u suštini celokupne virusne aktivnosti u rastvoru. Stabilizator sadrži strukturni element koji sprečava reoksigenaciju deoksigenovanog hemoglobina. Ovaj strukturni element se bira tako da je reaktivniji sa kiseonikom ili ROS nego sa deoksigenovanim hemoglobinom. Stabilizator ima funkciju minimizacije vezivanja kiseonika od strane deoksigenovanog hemoglobina. U različitim primerima izvođenja, rastvor sadrži količinu stabilizatora koja je dovoljna za sprečavanje formiranja više od 5% metemoglobina u toku procesa termičke deaktivacije virusa.

[0017] U ilustrativnim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovana kompozicija hemoglobina koja sadrži vodorastvorni, funkcionalni, deoksigenovani, prirodni hemoglobin. Ova kompozicija sadrži manje od 5% metemoglobina. Kada je kompozicija virusno deaktivirana, onda se opciono priprema postupkom koji sadrži zagrevanje rastvora prekursora hemoglobina do oko 60 °C do oko 12 sati (npr. od oko 1 do oko 4 sata). Rastvor prekursora sadrži stabilizator. Stabilizator sadrži strukturni element koji sprečava reoksigenaciju deoksigenovanog hemoglobina. Ovaj strukturni element se bira tako da je reaktivniji sa kiseonikom nego sa deoksigenovanim hemoglobinom. Stabilizator ima funkciju minimizacije vezivanja kiseonika od strane deoksigenovanog hemoglobina.

[0018] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovan postupak za dobijanje kompozicije hemoglobina prema pronalasku. Kompozicija sadrži vodorastvorni, funkcionalni, opciono deoksigenovani, prirodni hemoglobin. Kompozicija sadrži vodorastvornu frakciju hemoglobina koja sadrži grupu funkcionalnih, prirodnih molekula hemoglobina, pri čemu je svaki član grupe molekula hemoglobina u opciono deoksigenovanom stanju; u suštini ne sadrži hemijske agense za umrežavanje; i ima P50od 9 mm Hg do 14 mm Hg. Kompozicija sadrži vodorastvornu frakciju stabilizatora, koja sadrži stabilizator. Stabilizator sadrži strukturni element koji sprečava reoksigenaciju deoksigenovanog hemoglobina. Ovaj strukturni element je izabran tako da je reaktivniji sa kiseonikom nego sa deoksigenovanim hemoglobinom. Stabilizator služi funkciji minimizacije vezivanja kiseonika od strane deoksigenovang hemoglobina, čime se molekuli hemoglobina održavaju u deoksigenovanom stanju. Kompozicija sadrži frakciju razređivača. Frakcija razređivača sadrži farmaceutski prihvatljivi razređivač u kome je rastvorljiva frakcija hemoglobina. U kompozicijama u suštini nema virusne aktivnosti, i one sadrže manje od 5% metemoglobina. Kompozicija je virusno deaktivirana. Postupak za dobijanje virusno deaktivirane kompozicije sadrži podvrgavanje smeše koja sadrži frakciju hemoglobina i frakciju stabilizatora procesu termičke deaktivacije virusa. Proces termičke deaktivacije virusa sadrži izlaganje smeše temperaturi koja je dovoljno povišena da deaktivira u suštini celokupnu virusnu aktivnost u smeši. Vremenski period tokom koga je smeša na povišenoj temperaturi je dovoljan za ostvarivanje pomenute deaktivacije u suštini celokupne virusne aktivnosti u pomenutoj smeši.

[0019] U svakoj od gore navedenih kompozicija, hemoglobin je reoksigenovan. U jednom primeru izvođenja, hemoglobin se reoksigenuje posle deaktivacije virusa. Alternativno tome, hemoglobin se vezuje za ugljen monoksid. Vezivanje za ugljen monoksid se može izvršiti u suštini u bilo kom momentu tokom pripreme kompozicije ili posle pripreme kompozicije. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, u deoksigenovanoj kompoziciji, Fe(II) iz hemoglobina je vezano za ugljen monoksid.

[0020] Predmetnim pronalaskom su takođe realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupcima lečenja traume, šoka, ishemije i nekih bolesti koje se mogu ublažiti povećanjem sadržaja kiseonika ili ugljen dioksida u tkivima ili organima. Kompozicije prema pronalasku brzo ponovo uspostavljaju oksigenaciju tkiva i u potpunosti nadoknađuju deficit kiseonika u životinjskim modelima ozbiljnog traumatskog šoka kod koga najmanje 50% subjekata normalno umire od hemoragičnog šoka. Korišćenjem ilustrativne formulacije, jedna doza kompozicije prema pronalasku nadoknađuje deficit kiseonika u svim glavnim organima, otvara mikrovaskulaturu i ponovo uspostavlja srednju vrednost arterijskog pritiska. Različite kompozicije prema pronalasku su efikasnije i brže u preokretanju deficita kiseonika od upakovanih crvenih krvnih zrnaca. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, formulacija prema pronalasku nadoknađuje najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 100% deficita kiseonika kod subjekta u roku od oko 60 minuta do oko 160 minuta posle administracije formulacije subjektu. Alternativno tome, kompozicije prema pronalasku povećavaju koncentraciju ugljen monoksida u tkivu. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, formulacija koje nadoknađuje deficit kiseonika, ili povećava sadržaj ugljen monoksida u tkivu, sadrži PEGilovani konjugat hemoglobina prema pronalasku.

[0021] Shodno tome, u jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku dopremanja kiseonika ili ugljen monoksida do dela izabranog između tkiva i organa kome je potrebno takvo dopremanje. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine bilo koje kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za ostvarivanje dopremanja kiseonika ili ugljen monoksida jednom ili više tkiva i/ili organa.

[0022] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku preokretanja deficita kiseonika u delu izabranom između tkiva i organa subjekta koji pati od hemoragičnog šoka. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine bilo koje kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za preokretanje deficita kiseonika. Takođe su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku za povećanje sadržaja ugljen monoksida u tkivu, bilo kao reakcija na gubitak sadržaja ugljen monoksida zbog bolesti, povrede, itd., ili kao sredstvo za ostvarivanje terapeutske koristi usled povećanja sadržaja ugljen monoksida u tkivu preko nivoa koji se normalno nalaze u tkivu u zdravom ili bolesnom stanju.

[0023] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku indukcije angiogeneze u tkivima subjekta davanjem subjektu količine kompozicije prema pronalasku koja je efektivna za indukciju angiogeneze. U ilustrativnim primerima izvođenja, angiogeneza se indukuje u tkivima koja pate od deficita kiseonika. U sledećim ilustrativnim primerima izvođenja, tkiva ili organi u kojima se indukuje angiogeneza su tkiva ili organi subjekta koji pati od deficita kiseonika. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine bilo koje kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za preokretanje deficita kiseonika.

[0024] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku povećanja protoka krvi do tkiva koja pate od deficita kiseonika. Taj postupak se sastoji od davanja subjektu količine kompozicije prema pronalasku koja je efektivna za povećanje protoka krvi tkivima koja pate od deficita kiseonika. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, tkivo ili organ su tkivo ili organ subjekta koji pati od slabog protoka krvi. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine bilo koje kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za preokretanje slabog protoka krvi.

[0025] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku smanjenja neurološkog oštećenja i/ili infarktnog tkiva u tkivima koja pate od deficita kiseonika. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za smanjenje neurološkog oštećenja i/ili infarkta u tkivu koje pati od deficita kiseonika. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine bilo koje kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za preokretanje količine infarktnog i ili neurološki oštećenog tkiva.

[0026] U svakom od gore navedenih primera izvođenja, hemoglobin u formulaciji može biti vezan za kiseonik, ugljen monoksid ili ni za jedan od njih. Pored toga, formulacije u kojima je inkorporiran konjugat hemoglobina mogu biti hipotonične, izotonične ili hipertonične u pogledu toničnosti subjektove krvi.

[0027] Neki primeri izvođenja, ciljevi i prednosti pronalaska će postati očigledni na osnovu detaljnog opisa koji sledi.

KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0028]

FIG.1 je algoritam proizvodnje ilustrativnog PEG-Hb.

FIG.2 je grafičko poređenje PEG-Hb/HS i nekih tretmana za preokretanje deficita kiseonika u životinjskom modelu traumatskog šoka.

FIG.3 prikazuje arterijski krvni pritisak (A) i laser-doplerski protok, izmerene preko bočnog parietalnog korteksa i izražene kao procenat osnovne vrednosti (B), tokom 2 h od okluzije srednje cerebralne arterije (engl. middle cerebral artery occlusion, skr. MCAO) i prvih 30 min reperfuzije u grupama pacova koji nisu bili podvrgnuti transfuziji ili su bili podvrgnuti transfuziji 10 ml/kg PEG-albumina ili PEG-COHb tokom 20 min od MCAO (srednja vrednost ± SO; n = 10 po grupi).

FIG.4 prikazuje skor neurološkog deficita na skali od 0-4 (0 = nema deficita) tokom 1 ili 24 h od reperfuzije posle 2 h od MCAO u grupama bez transfuzije ili sa transfuzijom PEG-albumina ili PEG-COHb tokom 20 min od MCAO (srednja vrednost ± SO; n = 10). * P < 0.05 između PEG-COHb grupa u odnosu na grupe bez transfuzije i sa transfuzijom PEG-albumina. ;;FIG.5 je grafički prikaz volumena infarkta u svakoj od 7 koronarnih sekcija cerebralnog korteksa (A) i strijatuma (B), i ukupni volumen infarkta izračunat na osnovu 7 sekcija cerebralnog korteksa i strijatuma (C). Vrednosti su izražene kao procenat kontralateralne celokupne strukture (srednje vrednosti ± SO; n = 10). * P < 0.05 između PEG-COHb grupe u odnosu na grupe bez transfuzije i sa transfuzijom PEG-albumina.

FIG.6 prikazuje da je količina vijabilnog moždanog tkiva (obojeno tamnije) veća kod pacova sa transfuzijom sa PEG-COHb (desna slika) prema pronalasku, nego kod kontrolnog pacova koji nije dobio infuziju sa PEG-COHb prema pronalasku (leva slika).

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Uvod

[0029] Postoji potreba za agensom za prenos kiseonika za lečenje ili prevenciju hipoksije koja nastaje usled bolesti, povreda i napada, na primer, gubitka krvi (npr. usled akutne hemoragije ili tokom hirurških operacija), koja nastaje zbog anemije (npr. perniciozne anemije ili anemije srpastih ćelija), ili koji nastaje zbog šoka (npr. šoka usled smanjene zapremine, anafilaktičkog šoka, septičnog šoka ili alergijskog šoka). Upotreba cele krvi ili frakcija krvi u ovim slučajevima je skopčana sa nedostacima. Na primer, primena cele krvi je često praćena rizikom od prenošenja većeg broja virusa, uključujući i viruse koji prouzrokuju hepatitis, i viruse koji prouzrokuju AIDS, što može dovesti do komplikacija pri oporavku pacijenta ili može biti fatalno za pacijenta. Pored toga, upotreba cele krvi zahteva određivanje krvne grupe i međusobnu podudarnost da bi se izbegli imunohematološki problemi i nekompatibilnost sa donorom.

[0030] Takođe postoji potreba za terapeutskim agensima koji mogu da dopremaju kiseonik ili ugljen monoksid do tkiva subjekta. Terapeutski agens se primenjuje za lečenje, inter alia, stanja povezanih sa gubitkom krvi i ishemijom.

[0031] Predmetni pronalazak zadovoljava obe ove potrebe realizacijom PEG-hemoglobinskih formulacija u kojima je hemoglobin vezan za kiseonik, vezan za ugljen monoksid ili nije vezan ni za jedan od njih. Konjugat hemoglobina se formuliše u medijumu koji je hipotoničan, izotoničan ili hipertoničan u odnosu na toničnost krvi subjekta kome se daje formulacija.

[0032] Humani hemoglobin, kao agens za snabdevanje kiseonikom, agens za snabdevanje CO i/ili zamena za krv, poseduje osmotsku aktivnost i sposonost da transportuje i prenosi kiseonik, ali ima nedostatak što se brzo eliminiše iz cirkulacije putem bubrega i preko vaskularnih zidova, što rezultuje oštećenjem organa i veoma kratkim, a zato i nezadovoljavajućim poluživotom. Dalje, humani hemoglobin je takođe često kontaminiran toksičnim nivoima endotoksina, bakterija i/ili virusa.

[0033] Nehumani hemoglobin ima iste nedostatke kao i humani hemoglobin. Pored toga, hemoglobin iz nehumanih izvora ima potencijal za izazivanje reakcije imunog sistema kod primaoca.

[0034] Predmetnim pronalaskom su realizovani formulacija hemoglobina i ovde opisane formulacije za primenu u lečenju i ublažavanju hipoksije zbog bolesti, povrede i napada, ili za snabdevanje tkiva CO u ovim stanjima. Formulacija je virusno deaktivirana i hemoglobin je konjugovan sa najmanje jednim molekulom poli(etilen glikola) (PEGilovan). Formulacija hemoglobina prema pronalasku sadrži molekule hemoglobina sa P50od 9 mm Hg do 14 mm Hg što je različito od onog kod prirodnog humanog hemoglobina. Formulacija hemoglobina prema pronalasku preokreće deficit kiseonika kod traume, kao što je pokazano na životinjskom modelu ozbiljne traume, što ukazuje da ona ima superioran kapacitet prenošenja kiseonika in vivo u poređenju sa nekim proizvodima. Ilustrativna formulacija prema pronalasku može da brzo ponovo uspostavi oksigenaciju tkiva i da potpuno eliminiše deficit kiseonika kod traume, kao što je pokazano na životinjskom modelu ozbiljnog traumatskog šoka u kome je najmanje 50% subjekata normalno umrlo od hemoragičnog šoka. Jedna doza ilustrativne formulacije prema pronalasku nadoknađuje deficit kiseonika svim glavnim organima, otvara mikrovaskulaturu i ponovo uspostavlja srednju vrednost arterijskog pritiska. Ilustrativne formulacije takođe obezbeđuju superiornu stabilnost i sposobnost skladištenja u odnosu na bilo koju drugu HBOC. Jedna ilustrativna formulacija je dovoljno stabilna da ostane potpuno efikasna u životinjskom modelu posle skladištenja od najmanje 4 nedelje na 45°C (113 °F), ekstremnom stanju okruženja, što potvrđuje da su ilustrativne formulacije prema pronalasku korisne za potrebe na mestima ukazivanja pomoći u situacijama hitnih intervencija.

[0035] Različite formulacije prema pronalasku za kliničku upotrebu sadrže PEGilovani hemoglobin, npr. goveđi hemoglobin, i izotonični ili hipertonični slani rastvor (PEG-Hb/HS) i PEGilovani hemoglobin u CO obliku (PEG-Hb-CO) sa ili bez visokih koncentracija soli (tj. izotonični ili hipertonični). Ilustrativne formulacije prema ovim primerima izvođenja povećavaju kapacitet krvi da prenosi kiseonik zahvaljujući svom sadržaju hemoglobina i povećavaju isporuku kiseonika tkivima dilatacijom vaskulature (zahvaljujući svojim hipertoničnim dejstvima ili efektu CO) i delovanjem kao agensa za prenošenje kiseonika između crvenog krvnog zrnca i tkiva. Ilustrativne formulacije prema pronalasku su takođe korisne za lečenje anemije srpastih ćelija, moždanog udara ili periferne ishemije izazvane dijabetesom. Jedna ilustrativna formulacija sadrži PEG-Hb-CO, i veoma je stabilna i ima poželjna farmakološka svojstva. U različitim primerima izvođenja, PEG-Hb-CO ima vazodilatorna svojstva. U različitim primerima izvođenja, PEG-Hb-CO ima antioksidantna svojstva. U različitim primerima izvođenja, PEG-Hb formulacije prema pronalasku ne uzrokuju pojavu reaktivnih vrsta kiseonika u količini koja je dovoljna da izazove oštećenje tkiva. Ova formulacija se može primeniti za lečenje bilo koje od bolesti, napada ili povreda koje su ovde razmotrene. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, ovde opisana formulacija je predviđena za primenu u lečenju ishemije. Ilustrativni tipovi ishemije koji se mogu lečiti ovom kompozicijom obuhvataju cerebralnu ishemiju i dijabetičnu ishemiju. Shodno tome, pronalaskom su realizovane ovde opisane formulacije za primenu u postupcima lečenja, ublažavanja i prevencije nizvodnih oštećenja usled ishemijskih pojava. Jedan ilustrativni tip ishemije koji se može lečiti kompozicijama prema pronalasku je periferna ishemija, na primer, periferna dijabetična ishemija.

Definicije

[0036] "CO" se odnosi na ugljen monoksid.

[0037] "HS" se odnosi na veoma slanu, hipertoničnu formulaciju.

[0038] "Sanguinate™", kada se ovde koristi, se odnosi na PEG-HbCO kompoziciju prema pronalasku.

[0039] Izrazi "zamena za krv", "resuscitacioni fluid," "PEG-Hb," PEG-CO-Hb," "nosač kiseonika na bazi hemoglobina" (engl. hemoglobin-based oxygen carrier, skr. HBOC) i "PEG-Hb/HS" se odnose na PEGilovane Hb kompozicije prema pronalasku i formulacije koje sadrže ove kompozicije. Ti izrazi takođe ukazuju na opis ilustrativne primene kompozicije i njene formulacije. Na primer, "zamena za krv" se primenjuje za zamenu krvi u kontekstu, npr. traume, moždanog udara, ishemijske/reperfuzione povrede, hirurgije, anemije ili drugih povreda, napada i bolesti kod kojih bi mogla biti indikovana transfuzija krvi. Ovi izrazi, kada se ovde koriste, se takođe odnose na Hb formulacije koje mogu da predaju tkivu kiseonik ili ugljen monoksid. Ove formulacije se primenjuju kod povreda, napada i bolesti karakterisanih time što subjekt ima adekvatnu zapreminu krvi, ali ta krv ima neadekvatnu sposobnost nošenja i/ili predavanja kiseonika ili ugljen monoksida tkivima. Derivati PEG-hemoglobina su formulisani u hipotonične, izotonične ili hipertonične slane rastvore. Shodno tome, ilustrativna kompozicija deoksigenovanog PEG-Hb u kojoj Fe(II) nije vezan ili je vezan za CO može biti formulisana u izotonični ili hipertonični rastvor. Slično tome, ilustrativni oksigenovani PEG-Hb može biti formulisan u izotoničnim ili hipertoničnim nosačima.

[0040] Izraz "aminokiselina" se odnosi na prirodne aminokiseline, npr. cistein, i sintetičke aminokiseline, kao što su analozi aminokiselina i mimetici aminokiselina, koji funkcionišu na sličan način kao prirodne aminokiseline. Prirodne aminokiseline su one koje su kodirane genetskim kodom, kao i one aminokiseline koje su modifikovane kasnije, kao što su npr. hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, i O-fosfoserin. Analozi aminokiselina se odnose na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao i prirodne aminokiseline, tj. α-ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu, i R grupu, npr. homoserin, norleucin, metionin sulfoksiid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (npr. norleucin) ili modifikovane peptidne skelete, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina. Mimetici aminokiselina se odnose na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu koja je drugačija od opšte hemijske strukture aminokiseline, ali im je funkcija slična prirodnim aminokiselinama.

[0041] "Peptid" i "polipeptid" se odnose na polimer u kome su monomeri aminokiseline, koje su međusobno povezane pomoću amidnih veza, alternativno tome se naziva polipeptid. Pored toga, takođe su obuhvaćene neprirodne aminokiseline, na primer, β-alanin, fenilglicin i homoarginin.

Aminokiseline koje nisu kodirane genima se takođe mogu koristiti u predmetnom pronalasku. Dalje, aminokiseline koje su modifikovane tako da sadrže reaktivne grupe, mesta glikozilacije, polimere, terapeutske grupe, biomolekule i slično se takođe mogu koristiti u pronalasku. Sve aminokiseline koje se koriste u predmetnom pronalasku mogu biti D - ili L - izomer. Generalno je poželjan L - izomer. Pored toga, neki peptidomimetici su takođe korisni u predmetnom pronalasku. Kada se ovde koristi, izraz "peptid" se odnosi i na glikozilovane, i na neglikozilovane peptide. Takođe su obuhvaćeni peptidi koji su nekompletno glikozilovani sistemom koji izražava peptid. Za opšti pregled, vidi, Spatola, A. F., u CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINOACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, ured., Marcel Dekker, Njujork, str.267 (1983). Ilustrativni peptid je hemoglobin.

[0042] Izrazi "peptidni konjugat," i "konjugat hemoglobina" se odnose na vrste prema pronalasku u kojima je polipeptid hemoglobina konjugovan sa vodorastvornim polimerom, kao što je npr. poli(etilen glikol) (PEG), kao što je već gore navedeno.

[0043] "Hemoglobin", kada se ovde koristi, se odnosi na aktivni polipeptid koji vezuje kiseonik (ili vezuje CO), koji nije hemijski umrežen tretiranjem sa hemijskim agensima za umrežavanje, npr. dialdehidima, itd. Jedan ilustrativni hemoglobin je prirodni protein bez modifikacija drugačijih od konjugacije sa jednom ili više PEG (npr. m-PEG) grupa. Kada se ovde koristi, "u suštini ne sadrži hemijske agense za umrežavanje," se odnosi na molekule hemoglobina koji nisu ciljano umreženi hemijskim agensima za umrežavanje. Ovi preparati hemoglobina sadrže manje od 5%, manje od 3% ili manje od 1% umreženog hemoglobina.

[0044] Izraz "vodorastvorna" se odnosi na grupe koje imaju izvesni detektabilni stepen rastvorljivosti u vodi. Postupci za detekciju i/ili kvantifikaciju rastvorljivosti u vodi su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti. Ilustrativni vodorastvorni polimeri obuhvataju peptide, saharide, poli(etre), poli(amine), poli(karboksilne kiseline) i slično. Peptidi mogu imati mešovite sekvence sastavljene od samo jedne aminokiseline, kao što je npr. poli(lizin). Jedan ilustrativni polisaharid je poli(sijalinska kiselina). Jedan ilustrativni poli(etar) je poli(etilen glikol). Poli(etilen imin) je jedan ilustrativni poliamin, i poli(akrilna) kiselina je reprezentativna poli(karboksilna kiselina). Izraz "vodorastvorni", kao u "vodorastvorni polimer", je polimer koji je rastvorljiv u vodi na sobnoj temperaturi. Obično će rastvor vodorastvornog polimera preneti najmanje oko 75%, još poželjnije najmanje oko 95% svetlosti, koju prenese isti rastvor posle filtriranja. Na bazi težine, vodorastvorni polimer ili njegov segment će prvenstveno biti najmanje oko 35% (po težini) rastvorljiv u vodi, još poželjnije najmanje oko 50% (po težini) rastvorljiv u vodi, čak još poželjnije oko 70% (po težini) rastvorljiv u vodi, i čak još poželjnije oko 85% (po težini) rastvorljiv u vodi. Međutim, najpoželjnije je da vodorastvorni polimer ili segment bude oko 95% (po težini) rastvorljiv u vodi ili potpuno rastvorljiv u vodi.

[0045] Kada se ovde koristi, izraz "vodorastvorni polimer" obuhvata one vodorastvorne polimere koji su biokompatibilni i neimunogeni i naročito sadrži bilo koje segmente vodorastvornog polimera koji nisu biokompatibilni i neimunogeni. U pogledu biokompatibilnosti, supstanca se smatra biokompatibilnom ako su korisni efekti povezani sa upotrebom same supstance ili neke supstance (npr. aktivnog agensa) u vezi živih tkiva (npr. administracije pacijentu) važniji od bilo kakvih štetnih efekata, na osnovu procene kliničkog lekara, npr. specijaliste. U pogledu neimunogenosti, supstanca se smatra neimunogenom ako namenjeno korišćenje supstance in vivo ne dovodi do neželjene imune reakcije (npr. formiranja antitela) ili, ako dođe do pojave imune reakcije takve da se ta reakcija ne smatra klinički značajnom ili važnom, na osnovu procene kliničkog lekara. Posebno je poželjno da ovde opisani segmenti vodorastvornog polimera, kao i konjugati budu biokompatibilni i neimunogeni.

[0046] Polimerni skelet vodorastvornog polimera može biti poli(etilen glikol) (tj. PEG). Međutim, podrazumeva se da su neki srodni polimeri takođe podesni za primenu ovog pronalaska u praksi i da korišćenje izraza PEG ili poli(etilen glikol) treba da bude uključujuće, a ne isključujuće u ovom pogledu. Izraz PEG obuhvata poli(etilen glikol) u bilo kom od njegovih oblika, uključujući alkoksi PEG, difunkcionalni PEG, višekraki PEG, račvasti PEG, razgranati PEG, viseći PEG (tj. PEG ili srodni polimeri koji imaju jednu ili više funkcionalnih grupa koje vise sa polimernog skeleta), ili PEG sa degradabilnim vezama u sebi.

[0047] Polimerni skelet može biti linearni ili razgranati. Razgranati polimerni skeleti su generalno poznati u odgovarajućoj oblasti. Obično razgranati polimer ima centralnu granajuću grupu jezgra i grupu linearnih polimernih lanaca vezanih za centralno granajuće jezgro. PEG se obično koristi u razgranatim oblicima koji se mogu dobiti adicijom etilen oksida različitim poliolima, kao što su glicerol, pentaeritritol i sorbitol. Centralna granajuća grupa se takođe može dobiti od nekoliko aminokiselina, kao što je lizin. Razgranati poli(etilen glikol) može biti predstavljen u generalnom obliku kao R(-PEG-OH)mu kome R predstavlja grupu jezgra, kao što su glicerol ili pentaeritritol, i m predstavlja broj krakova. Višekraki PEG molekuli, kao što su oni koji su opisani u US pat. br.5,932,462, se takođe mogu upotrebiti kao polimerni skelet.

[0048] Mnogi drugi polimeri su takođe podesni za pronalazak. Polimerni skeleti koji su nepeptidni i vodorastvorni, od 2 do oko 300 terminusa, odn. krajeva, su posebno korisni u pronalasku. Primeri podesnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na neke poli(alkilen glikole), kao što je poli(propilen glikol) ("PPG"), kopolimere etilen glikola i propilen glikola i slično, poli(oksietilovani poliol), poli(olefinski alkohol), poli(vinilpirolidon), poli(hidroksipropilmetakrilamid), poli(α-hidroksilna kiselina), poli(vinil alkohol), polifosfazen, polioksazolin, poli(N-akriloilmorfolin), kao što je opisano u US pat. br.5,629,384, i kopolimere, terpolimere, i njihove smeše. Mada molekulska težina svakog lanca polimernog skeleta može varirati, ona je obično u opsegu od oko 100 Da do oko 100,000 Da, često od oko 6,000 Da do oko 80,000 Da.

[0049] Mada molekulska težina vodorastvornog polimera (kao i polimernog reagensa koji se upotrebljava za formiranje konjugata) može varirati, molekulska težina će zadovoljiti jednu ili više od sledećih vrednosti: veća od 100 Daltona; veća od 200 Daltona; veća od 400 Daltona; veća od 500 Daltona, veća od 750 Daltona; veća od 900 Daltona; veća od 1,000 Daltona, veća od 1,400 Daltona; veća od 1,500 Daltona, veća od 1,900 Daltona; veća od 2,000 Daltona; veća od 2,200 Daltona; veća od 2,500 Daltona; veća od 3,000 Daltona; veća od 4,000 Daltona; veća od 4,900 Daltona; veća od 5,000 Daltona; veća od 6,000 Daltona; veća od 7,000 Daltona; veća od 7,500 Daltona, veća od 9,000 Daltona; veća od 10,000 Daltona; veća od 11,000 Daltona; veća od 14,000 Daltona, veća od 15,000 Daltona; veća od 16,000 Daltona; veća od 19,000 Daltona; veća od 20,000 Daltona; veća od 21,000 Daltona; veća od 22,000 Daltona, veća od 25,000 Daltona; i veća od 30,000 Daltona. Podrazumeva se da je maksimalna granica molekulske težine za bilo koji dati segment vodorastvornih polimera koji se ovde mogu primeniti oko 300,000 Daltona.

[0050] Molekulska težina vodorastvornog polimera (kao i celog polimernog reagensa koji se upotrebljava za formiranje konjugata) se takođe može izraziti kao vrednost unutar opsega molekulskih težina. Ilustrativni opsezi obuhvataju: od oko 100 Daltona do oko 100,000 Daltona; od oko 500 Daltona do oko 80,000 Daltona; od oko 1,000 Daltona do oko 60,000 Daltona; od oko 2,000 Daltona do oko 50,000 Daltona; i od oko 5,000 Daltona do oko 40,000 Daltona.

[0051] Ilustrativne molekulske težine za bilo koji dati vodorastvorni polimer (kao i za celi polimerni reagens) u okviru polimernog reagensa obuhvataju oko 100 Daltona, oko 200 Daltona, oko 300 Daltona, oko 400 Daltona, oko 500 Daltona, oko 600 Daltona, oko 700 Daltona, oko 750 Daltona, oko 800 Daltona, oko 900 Daltona, oko 1,000 Daltona, oko 2,000 Daltona, oko 2,200 Daltona, oko 2,500 Daltona, oko 3,000 Daltona, oko 4,000 Daltona, oko 4,400 Daltona, oko 5,000 Daltona, oko 6,000 Daltona, oko 7,000 Daltona, oko 7,500 Daltona, oko 8,000 Daltona, oko 9,000 Daltona, oko 10,000 Daltona, oko 11,000 Daltona, oko 12,000 Daltona, oko 13,000 Daltona, oko 14,000 Daltona, oko 15,000 Daltona, oko 20,000 Daltona, oko 22,500 Daltona, oko 25,000 Daltona, oko 30,000 Daltona, oko 40,000 Daltona, oko 50,000 Daltona, oko 60,000 Daltona, oko 75,000 Daltona, i oko 80,000 Daltona.

[0052] Prosečni stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da gore navedena diskusija, koja se u suštini odnosi na vodorastvorni polimer, ni u kom slučaju nije isključiva i da je samo ilustrativna i da se razmatraju svi polimerni materijali koji imaju gore opisane kvalitete. Kada se ovde koristi, izraz "polimerni reagens" se generalno odnosi na ceo molekul, koji može sadržati vodorastvorni polimer i funkcionalnu grupu. Izraz "vodorastvorni polimer" je generalno rezervisan za korišćenje u razmatranju jednog dela veće molekulske strukture, kao što je polimerni reagens, prekursorski molekul, konjugat, i tako dalje.

[0053] Svaki deo (npr. funkcionalna grupa, aktivni agens, vodorastvorni polimer, i tako dalje) polimernog reagensa i nekih ovde opisanih struktura može biti direktno pričvršćen jedan za drugi preko direktne kovalentne veze. Međutim, uobičajenije je da svaki deo bude pričvršćen pomoću spejser grupe koja sadrži jedan ili više atoma koji služe da međusobno povežu svaki deo u jedinstvenu celinu.

[0054] Poželjne spejser grupe pomoću kojih različiti delovi polimernih reagenasa i nekih ovde opisanih struktura sadrže lanac atoma koji je sačinjen od atoma ugljenika, azota, kiseonika i/ili sumpora. Za ovaj lanac atoma mogu biti pričvršćeni i jedan ili više nekih atoma kao što su ugljenik, azot, kiseonik, sumpor i vodonik. Lanac može biti kratak i sadržati nekoliko atoma, kao što lanac od dva do pet atoma. Takođe su razmotreni duži lanci, kao što je, na primer, lanac od deset, petnaest ili više atoma po dužini. Pored toga, spejser grupa sadržati prsten od atoma koji može biti zasićen, nezasićen, kao i aromatičan. Kada je prisutna, spejser grupa prvenstveno sadrži sekvencu od oko 1-20 atoma isključujući granajuće atome. Prvenstveno atomi koji sačinjavaju spejser grupu (uključujući opcione granajuće atome) sadrže neku kombinaciju atoma kiseonika, ugljenika, azota, sumpora i vodonika. Spejser grupe mogu imati bilo koji korisni format.

[0055] Izrazi "poluživot" ili "t1⁄2", kada se ovde koriste u kontekstu davanja leka pacijentu, su definisani kao vreme potrebno da se koncentracija leka u plazmi kod pacijenta smanji za jednu polovinu. Dalje objašnjenje "poluživota" se nalazi u Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, ured., Harwood Publishers, Amsterdam, str.101 - 120). U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, poluživot PEG konjugata prema pronalasku je između oko 12 i oko 22 sati, što je znatno duže nego za ne-PEGilovani hemoglobin.

[0056] Kada se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljivi nosač" obuhvata bilo koji materijal, koji kada se kombinuje sa konjugatom zadržava aktivnost konjugata i nije reaktivan sa imunim sistemima subjekta. Primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, kao što su fosfatni puferovani slani rastvor, voda, emulzije, kao što je emulzija ulje/voda, i različiti tipovi okvašivača. Drugi nosači takođe mogu obuhvatati sterilne rastvore, tablete, uključujući obložene tablete i kapsule. Obično takvi nosači sadrže ekscipijense kao što su skrob, mleko, šećer, izvesni tipovi gline, želatin, stearinska kiselina ili njene soli, magnezijum ili kalcijum stearat, talk, biljne masti ili ulja, gume, glikoli, ili drugi poznati ekscipijensi. Takvi nosači takođe mogu obuhvatati arome i boje ili druge sastojke. Kompozicije koje sadrže takvi nosači se formulišu dobro poznatim uobičajenim postupcima. Ilustrativni nosači su hipertonični natrijum hlorid i izotonični natrijum hlorid (npr. fosfatni puferovani slani rastvor). Hipertonični i izotonični nosači se koriste za formulisanje deoksigenovanog PEGilovanog hemoglobina prema pronalasku (npr. gvožđa vezanog za ugljen monoksid, i nevezanog gvožđa) i PEGilovanog hemoglobina prema pronalasku u kome je atom gvožđa vezan za kiseonik.

[0057] Kada se ovde koristi, "administracija" označava intravensku, intraperitonealnu, intramuskularnu, intralezionu, ili subkutanu administraciju. Parenteralna administracija obuhvata, npr. intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intradermalnu, subkutanu, intraperitonealnu, intraventrikularnu, i intrakranijalnu.

[0058] Izrazi "ublažavanje" ili "ublažiti" se odnosi na bilo koju indikaciju uspeha u lečenju patologije ili stanja, uključujući bilo koji objektivni ili subjektivni parametar kao što su slabljenje, remisija ili smanjenje simptoma ili poboljšanje pacijentovog fizičkog ili mentalnog stanja. Ublažavanje simptoma može biti bazirano na objektivnim ili subjektivnim parametrima; uključujući rezultate fizičkog ispitivanja i/ili psihijatrijsku evaluaciju.

[0059] Izraz "terapija" se odnosi na "tretiranje" ili "lečenje" bolesti ili stanja koje obuhvata obezbeđivanje olakšanja simptoma ili neželjenih efekata bolesti (uključujući palijativno lečenje), i ublažavanje bolesti (izazivanje regresije bolesti). Ovi izrazi se takođe odnose na lečenje povreda, uključujući hemoragični šok, moždani udar, ishemijsku/reperfuzionu povredu, traumu i slično. U različitim primerima izvođenja, ovi izrazi se takođe odnose na sprečavanje da se bolest ili stanje pojave kod subjekta koji može imati predispozicije za bolest, ali još uvek nije osetio ili ispoljio simptome bolesti (profilaktičko lečenje), inhibiciju bolesti (usporavanje ili zaustavljanje njenog razvoja).

[0060] Izrazi "efektivna količina" ili "količina efektivna za" ili "terapeutski efektivna količina" ili bilo koji gramatički ekvivalentni izraz označava količinu koja, kada se daje subjektu radi lečenja bolesti, stanja ili povrede, je dovoljna za ostvarivanje lečenja te bolesti. U ilustrativnim primerima izvođenja, ovaj izraz se odnosi na bilo koju količinu konjugata prema pronalasku (ili formulacije koja sadrži konjugat prema pronalasku) dovoljnu da se nadoknadi najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili do oko 100% deficita kiseonika u tkivu ili organu koji se može pripisati bolesti, napadu ili povredi. Kada se koristi u kontekstu predaje CO tkivu, ovaj izraz se odnosi na datu količinu koja je dovoljna da izazove detektabilni terapeutski efekat predavanja CO tkivu.

[0061] Ilustrativna kompozicija hemoglobina prema pronalasku se označava kao "sposobna za prenošenje dela izabranog između kiseonika i ugljen monoksida koji je vezan za nju do tkiva." Ova fraza se odnosi na kompoziciju hemoglobina koja ima sposobnost da prenosi kiseonik ili ugljen monoksid koji je vezan za atom gvožđa u hemoglobinu do tkiva. U ilustrativnim kompozicijama, prenošenje se može meriti promenom parametara tkiva (npr. vazodilatacije, oksigenacije tkiva) ili detektabilnom promenom klinički relevantnog ishoda (kao što su npr. završetak nekrotičnog procesa, smanjenje ishemijske/reperfuzione povrede). U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, prenošenje ugljen monoksida ili kiseonika do tkiva se meri količinom "nadoknađenog" deficita kiseonika davanjem izabrane zapremine kompozicije prema pronalasku subjektu (ili tkivu) sa deficitom kiseonika. U sledećem ilustrativnom primeru izvođenja, količina kiseonika ili ugljen monoksida predata tkivu se meri masom kiseonika ili CO prenetog unapred izabranoj masi tkiva (npr. jednom gramu) davanjem unapred izabrane doze kompozicije prema pronalasku. Sposobnost da se prenese kiseonik ili CO do tkiva se takođe može izmeriti funkcionalno in vivo, i poređenjem sa poznatim zamenama za krv na bazi hemoglobina. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, hemoglobin je u "kontaktu" ili "operativnom kontaktu" sa tkivom kome predaje kiseonik ili ugljen monoksid. Pod operativnim kontaktom se podrazumeva da je hemoglobin dovoljno blizu tkiva tako da se kiseonik ili ugljen monoksid može preneti direktno, pomoću intermedijernog nosača ili pomoću difuzije u tkivo.

[0062] Kada se ovde koristi, "prirodni hemoglobin" se odnosi na hemoglobin koji nije namerno hemijski umrežen ili konjugovan sa drugim vrstama. Prirodni hemoglobin sadrži molekule hemoglobina u kojima atom gvožđa nije vezan, vezan je za kiseonik ili je vezan za ugljen monoksid. Prema predmetnom pronalasku, prirodni hemoglobin može formirati hemoglobinsko jezgro PEG-Hb konjugata prema pronalasku.

[0063] "Deoksigenovani" se odnosi na hemoglobin u kome je Fe(II) atom vezan za drugačije vrste od kiseonika (npr. ugljen monoksid) ili nije vezan za kiseonik, ni za jednu drugu vrstu.

[0064] Izraz "izolovan" se odnosi na materijal koji ne sadrži ili u suštini ne sadrži komponente koje prirodno prate taj materijal, koje se koriste za proizvodnju tog materijala ili su nusproizvodi ili proizvodi degradacije pri proizvodnji materijala. Za peptidne konjugate prema pronalasku, izraz "izolovan" se odnosi na materijal koji ne sadrži ili u suštini ne sadrži komponente koje normalno prate taj materijal u smeši koja se koristi za dobijanje peptidnog konjugata. "Izolovan" i "čist" se upotrebljavaju jedan umesto drugog. Obično izolovani peptidni konjugati prema pronalasku imaju nivo čistoće koji se prvenstveno izražava kao opseg. Donji kraj opsega čistoće za peptidne konjugate je oko 60%, oko 70% ili oko 80%, a gornji kraj opsega čistoće je oko 70%, oko 80%, oko 90% ili više od oko 90%.

Kompozicije hemoglobina prema pronalasku koje su virusno deaktivirane toplotom generalno se izoluju pre konjugacije sa vodorastvornim polimerom. U ilustrativnim primerima izvođenja, hemoglobin koji se upotrebljava za pravljenje konjugata je izolovan. U različitim primerima izvođenja, konjugat hemoglobin-PEG je izolovan. U ilustrativnim primerima izvođenja, hemoglobin ili konjugat PEG-hemoglobin su izolovani, sa izuzetkom prisustva stabilizatora ili drugih ekscipijenasa. U različitim primerima izvođenja, hemoglobin ili konjugat PEG-hemoglobin su izolovani od drugih proteina, a naročito proteina izabranih između dimera ili oligomera hemoglobina i drugih proteina koji nose kiseonik.

[0065] Kada su peptidni konjugati čisti više od oko 90%, onda se njihove čistoće takođe prvenstveno izražavaju kao opseg. Donji kraj opsega čistoće je oko 90%, oko 92%, oko 94%, oko 96% ili oko 98%. Gornji kraj opsega čistoće je oko 92%, oko 94%, oko 96%, oko 98% ili oko 100% čistoća. Za svrhe ovog pronalaska "čisti" konjugat ili rastvor čistog konjugata može sadržati stabilizator.

[0066] Čistoća se određije bilo kojim postupkom analize koji je priznat u odgovarajućoj oblasti (npr. intenzitet trake na gelu obojenom srebrom, elektroforeza na poliakrilaminom gelu, HPLC, ili sličnim sredstvima).

[0067] Izrazi "reaktivni" ili "aktivirani", kada se koriste u vezi sa posebnom funkcionalnom grupom, se odnose na reaktivnu funkcionalnu grupu koja lako reaguje sa elektrofilom ili nukleofilom na drugom molekulu. Ovo je suprotnost u odnosu na one grupe koje zahtevaju jake katalizatore ili veoma nepraktične reakcione uslove da bi reagovale (tj. "nereaktivna" ili "inertna" grupa).

[0068] Izraz "svaki član grupe" se koristi za označavanje članova jedne subpopulacije u formulaciji prema pronalasku koja ima posebnu karakteristiku. Shodno tome, pozivanje na svaki član grupe molekula hemoglobina u frakciji formulacije prema pronalasku ne znači nužno da svaki molekul hemoglobina u formulaciji ima pomenutu karakteristiku, već se odnosi na grupu (subpopulaciju) molekula hemoglobina u formulaciji koji imaju pomenutu karakteristiku.

[0069] Izraz "stabilizator" se odnosi na vrste koje sprečavaju ili usporavaju reoksigenaciju deoksigenovanog hemoglobina. Jedan ilustrativni stabilizator je jedinjenje koje sadrži amin koji je podesno, ali ne isključivo, aminokiselina. Bilo koje jedinjenje koje sadrži amin može služiti kao stabilizator u formulacijama prema pronalasku. Dodatni ilustrativni stabilizator ima jedan ili više strukturnih elemenata koji reaguju sa kiseonikom, a prvenstveno hemoglobin koji reaguje sa kiseonikom. Jedan ilustrativni strukturni element koji se nalazi na stabilizatorima prema pronalasku je tiol grupa. Ilustrativna sulfhidril jedinjenja za primenu kao stabilizatori obuhvataju, ali nisu ograničena na N-acetil-L-cistein (NAC) D,L-cistein, γ-glutamil-cistein, glutation, 2,3-dimerkapto-1-propanol, 1,4-butanditiol, i druga biološki kompatibilna sulfhidril jedinjenja. Generalno je poželjno kada je stabilizator biokompatibilan i netoksičan u količinama u kojima je uključen u kompozicije i formulacije prema pronalasku. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, sam PEG je reagens za stabilizaciju. Shodno tome, u različitim primerima izvođenja, PEG koji je konjugovan za Hb otklanja potrebu za posebnim stabilizatorom ili za posebnom vodorastvornom stabilizacionom frakcijom. Shodno tome, pronalaskom su realizovane formulacije koje su ekvivalentne onima koje su ovde navedene, uključujući vodorastvornu stabilizujuću frakciju, koja u stvari, ne sadrži ovu frakciju. [0070] Kada se ovde koriste, izrazi kao što su "subjekt", "pacijent" i "sisar" se upotrebljavaju jedan umesto drugog, i njihov primer predstavlja čovek.

[0071] Kada se ovde koristi "donor azotnog oksida" ili "NO donor" se odnosi na jedinjenja koja doniraju, oslobađaju i/ili direktno ili indirektno prenose vrste azot monoksida, i/ili stimulišu endogenu proizvodnju azotnog oksida ili endotelnog derivacionog relaksirajućeg faktora (engl. endotel-derived relaxing factor, skr. EDRF) in vivo i/ili podižu endogene nivoe azotnog oksida ili EDRF in vivo i/ili su oksidirani da bi proizveli azotni oksid i/ili su supstrati za azotni oksid sintazu i/ili citohrom P450. "NO donor" takođe obuhvata jedinjenja koja su prekursori L-arginina, inhibitori enzima arginaze i medijatori azotnog oksida.

[0072] Izraz "azotni oksid" obuhvata nenaelektrisani azotni oksid (NO) i naelektrisane vrste azot monoksida, a prvenstveno naelektrisane vrste azot monoksida, kao što su nitrozonijum jon (NO<+>) i nitroksil jon (NO-). Reaktivni oblik azotnog oksida se može obezbediti pomoću gasovitog azotnog oksida. Jedinjenja koja oslobađaju, predaju ili prenose azot monoksid imaju strukturu F-NO, pri čemu je F grupa koja oslobađa, predaje ili prenosi azot monoksid, i obuhvata bilo koje i sva takva jedinjenja koja isporučuju azot monoksid na mesto njegovog željenog dejstva u aktivnom obliku za njegovu ciljnu namenu.

[0073] Izrazi "NO adukti, "NO prekursor," i "agens za oslobađanje NO" se upotrebljavaju jedan umesto drugog.

[0074] U ilustrativnim primerima izvođenja, izraz "hipertoničan" se odnosi na PEGilovani Hb rastvor koji ima od oko 3% do oko 7% soli.

Primeri izvođenja

[0075] Diskusija koja je data u nastavku se odnosi na primere izvođenja koji su dati u nastavku, kao i na one koji su opisani gore i u priloženim patentnim zahtevima. Elementi primera izvođenja mogu biti kombinovani na bilo koji način, a ovde prezentovana diskusija je ilustracija kombinacija koje su date kao primeri i nije ograničavajuća.

[0076] Pronalaskom je realizovana kompozicija koja sadrži vodorastvorni, funkcionalni, opciono deoksigenovani, prirodni hemoglobin. Kompozicije su virusno deaktivirane. Kompozicija sadrži vodorastvornu frakciju hemoglobina, koja sadrži grupu funkcionalnih, prirodnih molekula hemoglobina. Svaki član ove grupe molekula hemoglobina je generalno u deoksigenovanom stanju, on ne sadrži hemijske agense za umrežavanje, i ima P50od 9 mm Hg do 14 mm Hg. Alternativno tome, u različitim primerima izvođenja, P50hemoglobina je od oko 9 mm Hg do oko 12 mm Hg. Kompozicija takođe sadrži vodorastvornu frakciju stabilizatora. Frakcija stabilizatora pomaže da se grupa molekula hemoglobina zadrži u deoksigenovanom stanju. Frakcija stabilizatora sadrži stabilizator. Stabilizatori imaju strukturni element koji je reaktivniji sa kiseonikom nego molekul hemoglobina. Takođe je u kompoziciju uključena frakcija razređivača, i to generalno vodena frakcija razređivača. Frakcija razređivača sadrži farmaceutski prihvatljivi razređivač u kome je frakcija hemoglobina rastvorljiva, a podesna frakcija stabilizatora je takođe rastvorljiva. U kompoziciji u suštini nema virusne aktivnosti. Kompozicija sadrži manje od 5% metemoglobina.

[0077] Fe (II) deoksigenovanog hemoglobina bilo koje vrste prema pronalasku može biti vezan za CO ili ne mora biti u suštini vezan ni za kiseonik, ni za CO. U različitim primerima izvođenja, Fe (II) deoksigenovanih molekula hemoglobina nije vezan ni za kiseonik, ni za ugljen monoksid. U različitim primerima izvođenja, molekul hemoglobina je član populacije molekula hemoglobina. U ovom primeru izvođenja, ilustrativna populacija molekula hemoglobina sadrži manje od 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili manje od 1% molekula hemoglobina u oksigenovanom stanju.

[0078] Frakcija stabilizatora u kompoziciji sadrži agens koji sprečava ili usporava oksidaciju deoksigenovanog hemoglobina. Može se upotrebiti bilo koji podesan i efikasan stabilizator. U različitim primerima izvođenja, stabilizator se dobro toleriše u biološkim sistemima i može se bezbedno davati sisarima. Jedan ilustrativni stabilizator u frakciji stabilizatora je amin, kao što je aminokiselina, ili tiol jedinjenje. Jedan ilustrativni stabilizator je aminokiselina koja sadrži tiol, analog aminokiseline ili mimetik aminokiseline. U različitim primerima izvođenja, aminokiselina je izabrana između prirodnih i neprirodnih aminokiselina, kao što je npr. cistein.

[0079] Kompozicija sadrži frakciju farmaceutski prihvatljivog razređivača koja može sadržati so. So može biti izabrana u suštini između bilo koje soli, mada su trenutno poželjne one soli koje su farmaceutski prihvatljive soli za davanje sisaru. U različitim primerima izvođenja, kompozicija sadrži natrijum hlorid. Kompozicije prema pronalasku su izotonične, hipertonične ili hipotonične. U različitim primerima izvođenja, kompozicija je hipertonična. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, kompozicija sadrži dovoljno natrijuma hlorid koji joj obezbeđuje hipertoničnost. U drugim primerima izvođenja, razređivač je tonični fosfatni puferovani slani rastvor.

[0080] U ilustrativnim primerima izvođenja, predmetnim pronalaskom su realizovane frakcije hemoglobina u suštini bez sintetičkih grupa za umrežavanje koje kovalentno povezuju dva ili više molekula hemoglobina. Mada se mali procenat umrežavanja između molekula hemoglobina može formirati tokom proizvodnje ili skladištenja kompozicija prema pronalasku, ove umrežene vrste predstavljaju mali procenat ukupnog hemoglobina i nisu namerno pripremljene ili izolovane tokom prečišćavanja. Shodno tome, ilustrativne kompozicije prema pronalasku obično sadrže populaciju molekula hemoglobina u kojoj je manje od 10%, manje od 5%, manje od 4%, manje od 3%, manje od 2% ili manje od 1% ukupnog sadržaja hemoglobina u obliku dva ili više molekula hemoglobina u umreženom stanju.

[0081] Hemoglobin za korišćenje u predmetnom pronalasku potiče u suštini iz bilo kog sisarskog izvora. Ilustrativni izvori hemoglobina obuhvataju uobičajene domaće životinje, npr. krave, svinje, ovce i slično. Pronalazak nije ograničen izvorom hemoglobina. U različitim primerima izvođenja, hemoglobin je goveđi hemoglobin.

[0082] Kompozicije hemoglobina prema pronalasku sadrže minimalne količine metemoglobina, manje od 5%. U različitim kompozicijama, količina metemoglobina je manja od 4%, manja od 3%, manja od 2% ili manja od 1%.

[0083] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, hemoglobin je izolovan pre sjedinjavanja sa frakcijom stabilizatora.

[0084] Pronalaskom su realizovani kovalentni konjugati između funkcionalnog, prirodnog molekula hemoglobina i najmanje jednog molekula poli(etilen glikola). Mnogi vodorastvorni polimeri su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti i korisni su za izvođenje predmetnog pronalaska u praksi. Izraz vodorastvorni polimer obuhvata vrste kao što su saharidi (npr. dekstran, amiloza, hijaluronska kiselina, poli(sijalinska kiselina), heparani, heparini, itd.); poli (aminokiseline), kao što je npr. poli(asparaginska kiselina) i poli(glutaminska kiselina); nukleinske kiseline; sintetičke polimere (kao što je npr. poli(akrilna kiselina), poli(etri), npr. poli(etilen glikol)); peptide, proteine i slično.

[0085] Pronalaskom je realizovana virusno deaktivirana kompozicija hemoglobina, koja sadrži kovalentni konjugat između funkcionalnog, opciono deoksigenovanog, prirodnog molekula hemoglobina i najmanje jednog molekula poli(etilen glikola). Kompozicija sadrži vodorastvornu frakciju hemoglobina koja sadrži grupu molekula hemoglobina. Opciono, svaki član grupe molekula hemoglobina je deoksigenovan. Poli(etilen glikol) je kovalentno konjugovan sa hemoglobinom preko amino grupe aminokiselinskog ostatka. Hemoglobin u suštini ne sadrži uvedene hemijske agense za umrežavanje. Hemoglobin ima P50od 9 mm Hg do 14 mm Hg. U različitim primerima izvođenja, P50je od oko 9 mm Hg do oko 12 mm Hg. Kompozicija takođe sadrži vodorastvornu frakciju stabilizatora koja omogućava da grupa molekula hemoglobina bude otporna na oksidaciju. Frakcija stabilizatora sadrži stabilizator. Stabilizatori sadrže najmanje jedan strukturni element, koji je reaktivniji sa kiseonikom nego grupa molekula hemoglobina. Formulacije takođe sadrže frakciju razređivača koja sadrži farmaceutski prihvatljivi razređivač u kome je frakcija hemoglobina rastvorljiva. U formulacijama u suštini nema virusne aktivnosti, i one sadrže manje od 5% metemoglobina.

[0086] Postupci za aktiviranje polimera se takođe mogu naći u WO 94/17039, US pat. br.5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, US pat. br.5,219,564, US pat. br.5,122,614, WO 90/13540, US pat. br.

5,281,698, i još u WO 93/15189, i za konjugaciju između aktiviranih polimera i peptida, npr. faktora koagulacije VIII (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molekula koji nosi kiseonik (US pat. br.

4,412,989), ribonukleaze i superoksid dismutaze (Veronese at al., App. Biochem. Biotech.11: 141-45 (1985)).

[0087] Molekulska težina u kontekstu vodorastvornog polimera koji se upotrebljava u kompozicijama prema pronalasku, kao što je PEG, može biti izražena bilo kao brojčana prosečna molekulska težina ili kao težinska prosečna molekulska težina. Osim ako nije drugačije naznačeno, ovde se svako pozivanje na molekulsku težinu odnosi na težinsku prosečnu molekulsku težinu. Obe determinacije molekulske težine, brojna prosečna i težinska prosečna, se mogu meriti gel hromatografijom ili drugim tehnikama tečne hromatografije. Takođe se mogu koristiti drugi postupci za merenje vrednosti molekulske težine, kao što su analiza krajnih-grupa ili merenje koligativnih svojstava (npr. snižavanje tačke zamrzavanja, porast tačke ključanja, ili osmotskog pritiska) da bi se odredila brojčana prosečna molekulska težina ili korišćenje tehnika rasejavanja svetlosti, ultracentrifugiranja ili viskozimetrije za određivanje težinske prosečne molekulske težine. Polimerni reagensi prema pronalasku su obično polidisperzni (tj. brojčana prosečna molekulska težina i težinska prosečna molekulska težina polimera nisu jednake), a poseduju niske vrednosti polidisperzivnosti, koje su prvenstveno manje od oko 1.2, poželjnije manje od oko 1.15, još poželjnije manje od oko 1.10, čak još više poželjno manje od oko 1.05, i najpoželjnije manje od oko 1.03. Ilustrativni vodorastvorni polimeri su oni u kojima većina polimernih molekula u uzorku polimera približno ima približno istu molekulsku težinu; takvi polimeri su "homodisperzni".

[0088] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sa pozivom na poli(etilen glikol) konjugat. Na raspolaganju se nalazi nekoliko pregleda i monografija o funkcionalizaciji i konjugaciji PEG. Vidi, na primer, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Processes in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol.14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem.6: 150-165 (1995); i Bhadra, et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002). Putevi za dobijanje reaktivnih PEG molekula i formiranje konjugata uz korišćenje reaktivnih molekula su poznati iz odgovarajuće oblasti. Na primer, u US patentu br.5,672,662 je opisan vodorastvorni konjugat aktivnog estra polimerne kiseline izabrane između linearnih ili razgranatih poli(alkilen oksida), poli(oksietilovanih poliola), poli(olefinskih alkohola), i poli(akrilomorfolina) koji se može izolovati.

[0089] US patent br.6,376,604 opisuje postupak za dobijanje vodorastvornog 1-benzotriazolilkarbonatnog estra vodorastvornog i nepeptidnog polimera reakcijom sa terminalnim hidroksilom polimera sa di(1-benzotriazoil)karbonatom u organskom rastvaraču. Aktivni estar se koristi za formiranje konjugata sa biološki aktivnim agensom kao što je protein ili peptid.

[0090] WO 99/45964 opisuje konjugat koji sadrži biološki aktivni agens i aktivirani vodorastvorni polimer koji sadrži polimerni skelet koji ima najmanje jedan kraj koji je vezan za polimerni skelet pomoću stabilne veze, pri čemu najmanje jedan kraj sadrži razgranatu grupu koja ima najbliže reaktivne grupe vezane za razgranatu grupu, u kojoj je biološki aktivni agens vezan za najmanje jednu od najbližih reaktivnih grupa. Drugi razgranati poli(etilen glikoli) su opisani u WO 96/21469, dok US patent br. 5,932,462 opisuje konjugat formiran sa razgranatim PEG molekulom koji sadrži razgranati kraj koji sadrži reaktivne funkcionalne grupe. Na raspolaganju su slobodne reaktivne grupe koje mogu da reaguju sa biološki aktivnim vrstama, kao što su protein ili peptid, formirajući konjugate između poli(etilen glikola) i biološki aktivnih vrsta. US patent br.5,446,090 opisuje bifunkcionalni PEG linker i njegovu primenu u formiranju konjugata koji imaju peptid na svakom od krajeva PEG linkera.

[0091] Konjugati koji sadrže degradabilne PEG veze su opisani u WO 99/34833; i WO 99/14259, kao i u US patentu br.6,348,558. Takve degradabilne veze se mogu primeniti u predmetnom pronalasku.

[0092] Postupci aktivacije polimera poznati iz odgovarajuće oblasti koji su gore navedeni se upotrebljavaju u kontekstu predmetnog pronalaska pri formiranju razgranatih polimera koji su ovde navedeni, a takođe i za konjugaciju ovih razgranatih polimera sa drugim vrstama, npr. šećerima, nukleotidnim šećerima i sličnim.

[0093] Kompozicija prema predmetnom pronalasku sadrži kovalentni konjugat između funkcionalnog, prirodnog molekula hemoglobina i najmanje jednog molekula poli(etilen glikola), npr. metoksi-poli(etilen glikola). Poli(etilen glikol) koji se upotrebljava u predmetnom pronalasku nije ograničen na neki poseban oblik ili opseg molekulskih težina. Za linearne molekule poli(etilen glikola) molekulska težina je prvenstveno između 500 i 100,000. Prvenstveno se upotrebljava molekulska težina od 2000-60,000, a prvenstveno od oko 5,000 do oko 40,000. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, upotrebljeni PEG je metoksi-PEG, sa prosečnom molekulskom težinom od oko 5,000.

[0094] U sledećem primeru izvođenja poli(etilen glikol) je razgranati PEG koji ima pričvršćene više od jedne PEG grupe. Primeri razgranatih PEGs su opisani u US pat. br.5,932,462; US pat. br.5,342,940; US pat. br.5,643,575; US pat. br.5,919,455; US pat. br.6,113,906; US pat. br.5,183,660; WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); i Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998. U poželjnom primeru izvođenja molekulska težina svakog poli(etilen glikola) razgranatog PEG je manja od ili jednaka 40,000 Daltona.

[0095] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovan konjugat hemoglobina koji ima jednu ili više PEG grupa koje su vezane za njega. PEG-hemoglobin je u CO obliku. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, ovaj konjugat je formulisan u fosfatnom puferovanom slanom rastvoru.

[0096] Pronalaskom je realizovan konjugat hemoglobina koji ima jednu ili više PEG grupa vezanih za sebe. U različitim primerima izvođenja, PEG-hemoglobin je deoksigenovan i nije u CO obliku. U drugim primerima izvođenja, PEG-hemoglobin je u CO obliku. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, ovaj konjugat, bilo da li je PEG-Hb u oksigenovanom, CO ili nevezanom obliku, je formulisan u hipertoničnom slanom rastvoru (visoka sadržina soli). Ilustrativne koncentracije soli (npr. NaCl) za primenu u ovim hipertoničnim formulacijama su od oko 4% do oko 8%, od oko 4.5% do oko 7.5% ili od oko 5% do oko 7%. Ilustrativni formulacije sadrže oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7% ili oko 8% soli. U jednoj formulaciji koncentracija soli je 7.5%. U različitim primerima izvođenja, so je NaCl. U ilustrativnim primerima izvođenja, osmolalnost formulacije je od oko 300-400, ili od oko 325-375, ili od oko 340-360 mOsmol. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja so je NaCl.

[0097] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovan resuscitacioni fluid na bazi PEG-Hb koji ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% najmanje 95% ili oko 100% efikasnosti jednakoj onoj koju ima sveže zamrznuta plazma za korekciju koagulopatije.

Ilustrativne formulacije prema ovom primeru izvođenja dalje sadrže faktore koagulacije, trombocite ili druge supstance za koje je poznato da pomažu pri ublažavanju koagulopatije.

[0098] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovan PEG-Hb resuscitacioni fluid koji ima ukupnu zapreminu fluida od oko 450 mL, i koji ima kapacitet nošenja kiseonika i/ili difuzioni kapacitet kiseonika ekvivalentan jednoj jedinici upakovanih crvenih krvnih zrnaca, a prvenstveno humanih crvenih krvnih zrnaca.

[0099] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovana PEG-Hb formulacija (npr. resuscitacioni fluid) koji može da nosi CO i izvrši njegovu difuziju u tkivima. Jedna ilustrativna formulacija ima ukupnu zapreminu fluida od oko 450 mL, i koji ima kapacitet nošenja CO i/ili kapacitet difuzije CO dovoljan za prenošenje terapeutski relevantne količine CO do tkiva.

[0100] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovan PEG-Hb resuscitacioni fluid koji ima prisutne faktore koagulacije. U različitim primerima izvođenja, faktori koagulacije su prisutni u količini koja nije manja od 60%, nije manja od 70%, nije manja od 80% ili nije manja od 90% sveže zamrznute plazme.

[0101] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, resuscitacioni fluid sadrži trombocite. Generalno je poželjno da resuscitacioni fluidi prema pronalasku koji sadrže trombocite imaju aktivnost koja nije manja od 60%, nije manja od 70%, nije manja od 80%, nije manja od 90% ili je približno jednaka onoj pojedinačne aferezne jedinice.

[0102] Stabilnost skladištenja je važan cilj predmetnog pronalaska. U različitim primerima izvođenja, predmetnim pronalaskom je realizovan PEG-Hb resuscitacioni fluid koji je stabilan na ambijentalnoj temperaturi (~25 °C) tokom najmanje 4 meseca, najmanje šest meseci, najmanje 9 meseci ili najmanje 12 meseci.

[0103] Predmetnim pronalaskom je takođe realizovan, u različitim primerima izvođenja, PEG-Hb resuscitacioni fluid koji nije imunogeniji od aktuelnih uskladištenih krvnih proizvoda. Takođe je realizovan PEG-Hb resuscitacioni fluid koji nije trombogeniji od aktuelnih krvnih proizvoda koji se skladište.

[0104] Ilustrativne formulacije prema pronalasku sadrže jednu ili više ovih karakteristika u bilo kojoj kombinaciji: oko 4.0-4.6 tež.% Hb, oko 1.0-5.0 tež.% Met, oko 0.0-5.0% HbO2, oko 95.0-100.0% HbCO, pH od oko 8.10-8.20, osmolalnost od oko 325-370 mOsmol, P50(mm Hg) od oko 10.00-14.00, i optički spektar sa glavnim pikovima na 538 nm i 568 nm sa apsorbansom od oko 1.4 i 1.9, respektivno, i odnos pikova na 568 nm/500nm od 2.5-3.0. U drugim ilustrativnim formulacijama, formulacija ima optički spektar sa glavnim pikovima na 541 i 576 nm.

[0105] Još specifičnije, ilustrativne formulacije prema pronalasku sadrže jednu ili više ovih karakteristika u bilo kojoj kombinaciji: oko 4.5 tež.% Hb, oko 1.1 tež.% Met, oko 1.2% HbO2, oko 99.4% HbCO, pH od oko 8.14, osmolalnost od oko 356 mOsmol, a P50(mm Hg) od oko 12.2, i optički spektar sa glavnim pikovima na 538 nm i 568 nm sa apsorbansom od oko 1,493 i oko 1,465, respektivno, i odnos pikova na 568 nm/500nm od oko 2.6.

Dobijanje konjugata

Dobijanje virusno deaktiviranog hemoglobina

[0106] Prekursor hemoglobina za upotrebu u dobijanju konjugata prema pronalasku može biti izolovan iz crvenih krvnih zrnaca (engl. red blood cells, skr. RBC). Podesni izvori RBC sadrže humanu krv, goveđu krv, ovčiju krv, svinjsku krv, krv drugih subjekata i transgenski proizvedeni hemoglobin, kao što je transgenski Hb koji je opisan u BIO/TECHNOLOGY, 12: 55-59 (1994).

[0107] Krv može biti uzeta od živih ili sveže zaklanih donora. Jedan postupak za uzimanje goveđe cele krvi je opisan u US pat. br.5,084,558 i 5,296,465, nosilaca Rausch et al. Poželjno je da se krv uzme na higijenski način.

[0108] Iz odgovarajuće oblasti su poznati mnogi postupci za izolaciju i prečišćavanje hemoglobina; ovi postupci se generalno mogu primeniti na kompozicije prema aktuelnom pronalasku. Diskusija koja ovde sledi je ilustrativna i nije ograničavajuća.

[0109] U različitim primerima izvođenja, pri uzimanju ili posle njega, krv se opciono meša sa najmanje jednim antikoagulantom da bi se sprečilo značajno zgrušavanje krvi. Podesni antikoagulanti za krv su kao klasični poznati iz odgovarajuće oblasti i obuhvataju, na primer, natrijum citrat, etilendiamintetrasirćetnu kiselinu i heparin. Kada se meša sa krvi, antikoagulant može biti u čvrstom obliku, kao što je prašak, ili u vodenom rastvoru.

[0110] Rastvor krvi može biti proceđen pre ili tokom koraka antikoagulacije, na primer, pomoću cediljke, da bi se odstranili veliki agregati i čestice. Sito od 600 meša je primer podesne cediljke.

[0111] RBCs u rastvoru krv se onda opciono ispira podesnim sredstvima, kao što je dijafiltracija ili kombinacijom koraka diskretnog razređivanja i koncentrisanja sa najmanje jednim rastvorom, kao što je izotonični rastvor, da bi se RBCs odvojila od ekstracelularnih proteina plazme, kao što su serumski albumini ili antitela (npr. imunoglobulini (IgG)). Podrazumeva se da se RBCs mogu isprati šaržno ili u režimu kontinualnog dopremanja.

[0112] Prihvatljivi izotonični rastvori su takođe poznati iz odgovarajuće oblasti i generalno su korisni za dobijanje formulacija prema pronalasku. Jedan ilustrativni izotonični rastvor ima neutralni pH i osmolarnost između oko 285-315 mOsm. Neograničavajući primeri izotoničnih rastvora obuhvataju rastvore, kao što su citratni/slani rastvor, koji ima pH i osmolarnost koja je kida ćelijske membrana RBCs i istiskuje deo plazme cele krvi. Jedan ilustrativni izotonični rastvor se sastoji od vodenog rastvora natrijum citrat dihidrata (6.0 g/L) i natrijum hlorida (8.0 g/L).

[0113] Voda koja je korisna za postupak prema pronalasku obuhvata destilovanu vodu, dejonizovanu vodu, vodu-za-injekcije (WFI) i/ili nisko pirogenu vodu (engl. low pyrogen water, skr. LPW). WFI, koja je poželjna, je dejonizovana, destilovana voda koja ispunjava US farmakološke specifikacije za vodu-zainjekcije. WFI je dalje opisana u Pharmaceutical Engineering, 11, 15-23 (1991). LPW, koja je poželjna, je dejonizovana voda koja sarži manje od 0.002 EU/ml.

[0114] RBCs u rastvoru krvi mogu biti isprana dijafiltracijom. Podesni dijafilteri obuhvataju mikroporozne membrane sa veličinom pora koje će odvojiti RBCs u suštini od manjih komponenata rastvora krvi, kao što su filter od 0.1 mm do 0.5 mm (npr. filter od 0.2 mm). Istovremeno, isfiltrirani izotonični rastvor se dodaje kontinualno (ili u šaržama) kao dopuna brzinom koja je jednaka brzini (ili zapremini) filtrata izgubljenog na dijafilteru. U toku ispiranja RBC, komponente rastvora krvi koje su znatno manje po prečniku od RBCs, ili fluidi, kao što je plazma, prolaze kroz zidove dijafiltera u filtrat. RBCs, trombociti i veća tela razređenog rastvora krvi, kao što su bela krvna zrnca, se zadržavaju i mešaju sa izotoničnim rastvorom, koji se dodaje kontinualno ili u šaržama da bi se formirao dijalizovani rastvor krvi.

[0115] RBCs takođe mogu biti isprana pomoću niza koraka sekvencijalnih (ili reverzno sekvencijalnih) razređivanja i koncentrovanja, pri čemu se rastvor krvi razređuje dodavanjem najmanje jednog izotoničnog rastvora, a koncentruje se proticanjem kroz filter, čime se formira dijalizovani rastvor krvi.

[0116] Ispiranje RBC je gotovo kada se nivo proteina plazme koji kontaminiraju RBCs u suštini smanji (obično najmanje oko 90%). Dodatno ispiranje RBC može dalje odvojiti ekstracelularne proteine plazme od RBCs. Na primer dijafiltracijom sa 6 zapremina izotoničnog rastvora se može odstraniti oko 99% IgG iz rastvora krvi.

[0117] Dijalizovani rastvor krvi se onda opciono izlaže sredstvima za izdvajanje RBCs u dijalizovanom rastvoru krvi od belih krvnih zrnaca i trombocita, kao što je centrifugiranje.

[0118] Podrazumeva se da se mogu upotrebiti i drugi postupci koji su generalno poznati iz odgovarajuće oblasti za razdvajanje RBCs od drugih komponenata krvi. Na primer, sedimentacija, pri čemu postupak razdvajanja ne kida ćelijske membrane značajne količine RBCs, kao što je manje od oko 30% RBCs, pre razdvajanja RBC od drugih komponenata krvi.

[0119] Posle izdvajanja RBCs, hemoglobin se ekstrahuje iz RBCs da bi se formirao rastvor koji sadrži hemoglobin. Ekstrakcija se može izvršiti različitim postupcima, uključujući lizu i hipoosmotsko bubrenje RBCs. Liza znači da se mogu primeniti različiti postupci lize, kao što su mehanička liza, hemijska liza, hipotonična liza ili drugi poznati postupci lize kojima se oslobađa hemoglobin bez značajnog oštećivanja sposobnosti Hb da transportuje i oslobađa kiseonik.

[0120] Alternativno tome, umesto RBCs u postupku prema pronalasku se može preraditi rekombinantno proizvedeni hemoglobin, kao što je rekombinantno proizvedeni hemoglobin koji je opisan u Nature, 356: 258-260 (1992),. Bakterijske ćelije koje sadrže hemoglobin se ispiraju i odvajaju od kontaminanata kao što je gore opisano. Ove bakterijske ćelije se onda mehanički kidaju sredstvima koja su poznata iz odgovarajuće oblasti, kao što je kuglični mlin, da bi se oslobodio iz ćelija hemoglobin i da bi se formirala faza liziranih ćelija. Ova faza liziranih ćelija se onda prerađuje kao i faza liziranih RBC.

[0121] Posle lize, faza liziranih RBC se zatim opciono ultrafiltrira da bi se odstranio krupniji ćelijski otpad, kao što su proteini sa molekulskom težinom iznad oko 100,000 Daltona. Generalno ćelijski otpad sadrži sve cele i fragmentirane ćelijske komponente, uz izuzetak Hb, manjih ćelijskih proteina, elektrolita, koenzima i organskih metaboličkih međuproizvoda. Prihvatljivi ultrafilteri obuhvataju, na primer, filtere od 100,000 Daltona.

[0122] Mogu se koristiti i drugi postupci za razdvajanje Hb od faze liziranih RBC, uključujući sedimentaciju, centrifugiranje ili mikrofiltraciju. Hb filtrat se onda može ultrafiltrirati da bi se odstranio manji ćelijski otpad, elektroliti, koenzimi, metabolički međuproizvodi i proteini manji od oko 30,000 Daltona molekulske težine, i voda iz Hb ultrafiltrata. Podesni ultrafilteri obuhvataju ultrafilter od 30,000 Daltona.

[0123] Koncentrovani Hb rastvor se onda može usmeriti u jednu ili više paralelnih hromatografskih kolona radi daljeg izdvajanja hemoglobina tečnom hromatografijom visokih performansi od drugih kontaminanata, kao što su antitela, endotoksini, fosfolipidi i enzimi i virusi. Primeri podesnih medijuma obuhvataju anjonsko izmenjivačke medijume, katjonsko izmenjivačke medijume, hidrofobno interaktivtivne medijume i afinitetne medijume. U jednom primeru izvođenja, hromatografske kolone sadrže anjonsko izmenjivački medijum koji je podesan za razdvajanje Hb od nehemoglobinskih proteina. Podesni anjonsko izmenjivački medijumi obuhvataju, na primer, silicijum dioksid, aluminijum oksid, titanijum gel, umreženi dekstran, agarozu ili derivatizovanu grupu, kao što su poliakrilamid, polihidroksietilmetakrilat ili stiren divinilbenzen, koja je derivatizovana sa katjonskom hemijskom funkcionalnošću, kao što je dietilaminoetil ili kvaternarna aminoetil grupa. Podesni anjonsko izmenjivački medijum i odgovarajuće eluante za selektivnu apsorpciju i desorpciju Hb u poređenju sa drugim proteinima i kontaminantima, koji se verovatno biti u fazi liziranih RBC, lako može odrediti stručnjak sa prosečnim znanjem iz odgovarajuće oblasti.

[0124] Hb rastvor je opciono deoksigenovan da bi se formirao deoksigenovani Hb rastvor (u nastavku deoksi-Hb) sredstvima koja u suštini deoksigenuju Hb bez značajnog smanjenja sposobnosti Hb u Hb eluatu da transportuje i oslobađa kiseonik, kao što bi se desilo formiranjem oksidiranog hemoglobina (metHb) usled denaturacije.

[0125] Hb eluat može biti deoksigenovan putem gasnog transfera inertnog gasa kroz faznu membranu. Takvi inertni gasovi obuhvataju, na primer, azot, argon i helijum. Podrazumeva se da se mogu koristiti i druga sredstva za deoksigenaciju rastvora hemoglobina, koja su poznata iz odgovarajuće oblasti, deoksigenacije Hb eluata. Takva druga sredstva mogu obuhvatati, na primer, raspršivanje azota na Hb eluat, hemijsko hvatanje agensima za redukciju, kao što su N-acetil-L-cistein (NAC), cistein, natrijum ditionit ili askorbat, ili fotoliza svetlošću. Deoksigenovani hemoglobin se može prevesti u CO oblik.

[0126] Deoksigenacija se nastavlja sve dok se pO2Hb rastvora ne smanji do željenog nivoa, na primer, kada sadržaj oksigenovanog Hb (oksihemoglobina ili HbO2) u Hb rastvoru bude oko 20% ili manje, 10% ili manje, 5% ili manje 3% ili manje ili 1% ili manje.

[0127] Tokom deoksigenacije, temperatura Hb rastvora se obično održava na nivou koji uravnotežava brzinu deoksigenacije u odnosu na brzinu formiranja metemoglobina. Temperatura se održava da bi se sadržaj metemoglobina ograničio na manje od 20%. Optimalna temperatura će rezultovati sa manje od oko 5% sadržaja metemoglobina, a prvenstveno sa manje od oko 2.5% sadržaja metemoglobina, još uvek uz deoksigenaciju Hb rastvora. Obično se tokom deoksigenacije temperatura Hb rastvora održava na između oko 15 °C i oko 35 °C. Tokom deoksigenacije, i posle toga u toku preostalih koraka postupka prema pronalasku Hb se održava u okruženju sa malo kiseonika da bi se minimizirala apsorpcija kiseonika od strane Hb.

[0128] Deoksigenovani-Hb je opciono uravnotežen sa skladišnim puferom sa niskim sadržajem kiseonika, koji sadrži stabilizator, npr. sulfhidril jedinjenje, da bi se formirao oksidaciono stabilizovani deoksi-Hb. Podesna sulfhidril jedinjenja obuhvataju netoksični agens, kao što su N-acetil-L-cistein (NAC), D,L-cistein, y-glutamil-cistein, glutation, 2,3-dimerkapto-1-propanol, 1,4-butanditiol, i druga biološki kompatibilna sulfhidril jedinjenja. Dodaje se količina sulfhidril jedinjenja da bi se uspostavila koncentracija sulfhidrila koja će hvatati kiseonik da bi se održao sadržaj metemoglobina manji od oko 15%, manji od oko 10%, ili manji od oko 5% tokom perioda skladištenja. Obično je količina sulfhidril jedinjenja koja se dodaje količina koja je dovoljna za uspostavljanje koncentracije sulfhidrila između oko 0.05% i oko 0.2% po težini.

[0129] Pronalaskom je u različitim primerima izvođenja realizovana virusno deaktivirana kompozicija hemoglobina koja sadrži vodorastvorni, funkcionalni, opciono deoksigenovani, prirodni hemoglobin. Kompozicija je dobija postupkom koji sadrži podvrgavanje rastvora deoksigenovanog hemoglobina i stabilizatora procesu termičke deaktivacije virusa. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, proces termičke deaktivacije virusa sadrži izlaganje rastvora temperaturi koja je dovoljno povišena da deaktivira u suštini celokupnu virusnu aktivnost u pomenutom rastvoru; temperatura se povećava tokom vremenskog perioda dovoljnog da se ostvari u suštini deaktivacija celokupne virusne aktivnosti u rastvoru. Stabilizator sadrži strukturni element koji je reaktivniji sa kiseonikom nego deoksigenovani hemoglobin u rastvoru, čime se minimizira vezivanje kiseonika od strane deoksigenovanog hemoglobina. Rastvor sadrži količinu stabilizatora koja je dovoljna da spreči formiranje više od 5%, 4% ili 2% metemoglobina u procesu termičke deaktivacije virusa. Stabilizator se bira i prisutan je u količini koja je dovoljna za održavanje koncentracije metemoglobina na oko 5% ili manjoj.

[0130] U različitim primerima izvođenja, kompozicija sadrži kovalentni konjugat između hemoglobina i najmanje najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, ili najmanje oko 10 vodorastvornih polimernih grupa vezanih za hemoglobin, gde kovalentni konjugat sadrži najmanje jedan molekul poli(etilen glikola). Svaki član pomenute grupe molekula hemoglobina je kovalentno konjugovan sa najmanje jednim molekulom pomenutog poli(etilen glikola) preko amino grupe aminokiselinskog ostatka. Vodorastvorni polimeri su vezani za bilo koji odgovarajući ostatak na hemoglobinu. U jednom ilustrativnom konjugatu prema pronalasku, jedna ili više vodorastvornih polimernih grupa su vezane za aminokiselinski bočni lanac, npr. ε-amino grupu lizinskog ostatka. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovan PEG-Hb konjugat, kao što je gore navedeno, u kome je svaki Hb molekul konjugovan sa 7, 8, 9 ili 10 PEG grupa. U različitim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovana populacija PEG-Hb konjugata u kojoj je prosečni broj PEG grupa po Hb molekulu od oko 7 do oko 10, ili oko 8 i oko 9. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, PEG grupa je PEG 5000 grupa.

Sinteza konjugata

[0131] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovani konjugati između jednog ili više molekula poli(etilen glikola) i hemoglobinskog polipeptida. Prekursor hemoglobina je virusno deaktivirana kompozicija hemoglobina koja sadrži vodorastvorni, funkcionalni, opciono deoksigenovani, prirodni hemoglobin. Kompozicija se dobija postupkom koji sadrži podvrgavanje rastvora deoksigenovanog hemoglobina i stabilizatora procesu termičke deaktivacije virusa. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, proces termičke deaktivacije virusa sadrži izlaganje rastvora temperaturi koja je dovoljno povišena da u suštini deaktivira celokupnu virusnu aktivnost u pomenutom rastvoru; temperatura se povećava tokom vremenskog perioda koji je dovoljan za ostvarivanje deaktivacije u suštini celokupne virusne aktivnosti u rastvoru. Stabilizator sadrži strukturni element koji je reaktivniji sa kiseonikom nego deoksigenovani hemoglobin u rastvoru, čime se minimizira vezivanje kiseonika od strane deoksigenovanog hemoglobina. Rastvor sadrži količinu stabilizatora koja je dovoljna za sprečavanje formiranja više od 5%, 4% ili 2% metemoglobina u procesu termičke deaktivacije virusa. Stabilizator se bira i prisutan je u količini koja je dovoljna za održavanje koncentracije metemoglobina od oko 5% ili manje.

[0132] U različitim primerima izvođenja, prekursor hemoglobinsksog polipeptida je virusno deaktivirana kompozicija hemoglobina koja sadrži vodorastvorni, funkcionalni, deoksigenovani, prirodni hemoglobin. Kompozicija sadrži manje od 5% metemoglobina i dobija se postupkom koji sadrži zagrevanje rastvora prekursora hemoglobina do oko 60 °C tokom do oko 12 sati, na primer, od oko 1 sat do oko 4 sata. Rastvor prekursora sadrži stabilizator. Stabilizator sadrži strukturu koja lakše reaguje sa kiseonikom ili reaktivnim vrstama kiseonika nego molekuli hemoglobina u rastvoru, čime se minimizira vezivanje kiseonika od strane deoksigenovanog hemoglobina, i time se formira pomenuta kompozicija.

[0133] Konjugati između vodorastvornih polimera i virusno deaktiviranog hemoglobinskog peptida se mogu formirati reakcijom aktiviranog derivata vodorastvornog polimera i hemoglobina pod podesnim uslovima. U različitim primerima izvođenja, vodorastvorni polimer je konjugovan sa hemoglobinom preko bočnog lanca aminokiselinskog ostatka, na primer, ε-amino grupe lizinskog ostatka. Ilustrativni konjugati prema pronalasku sadrže najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10 vodorastvornih polimernih grupa vezanih za hemoglobin.

[0134] U postupku formiranja konjugata prema pronalasku, kompozicija virusno deaktiviranog prekursora hemoglobina se oksigenuje i oksigenovani hemoglobin se dovodi u kontakt sa aktiviranim molekulom poli(etilen glikola) čija reaktivnost je komplementarna sa aminokiselinskim ostatkom hemoglobina, čime se formira kovalentni konjugat između poli(etilen glikola) i oksigenovanih molekula hemoglobina u rastvoru oksigenovanog hemoglobina. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, hemoglobin u kovalentnom konjugatu je deoksigenovan ili je vezan za CO. Deoksigenacija može biti mehanička ili hemijska, čime se dobija molekul hemoglobina u kome je gvožđe nevezano ili je vezano za CO.

[0135] Generalno, PEG grupa i polipeptid su međusobno povezani korišćenjem reaktivnih grupa, koje se obično transformišu procesom vezivanja u novu organsku funkcionalnu grupu ili vrstu koja nije reaktivna pod fiziološki relevantnim uslovima. Reaktivna, odnosno reaktivne funkcionalne grupe su locirane na bilo kojoj poziciji na peptidu i PEG. Reaktivne grupe i klase reakcije koje su korisne za izvođenje predmetnog pronalaska u praksi su generalno dobro poznate stručnjacima iz oblasti hemije biokonjugata. Trenutno poželjne klase reakcija raspoloživih za reaktivne aminokiselinske grupe su one koje se izvode pod relativno blagim uslovima. One obuhvataju, ali nisu ograničene na nukleofilne supstitucije (npr. reakcije amina i alkohola sa acil halidima, aktivnim estrima), elektrofilne supstitucije (npr. enaminske reakcije) i adicije višestrukih veza ugljenik-ugljenik i ugljenik-heteroatom (npr. Majklova reakcija, Diels-Alderova adicija). Ove i druge korisne reakcije su razmotrene, na primer, u March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3. izd., John Wiley & Sons, Njujork, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUE, Academic Press, San Dijego, 1996; i Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, tom 198, American Chemical Society, Vašington D.C., 1982.

[0136] Korisne reaktivne funkcionalne grupe koje vise sa hemoglobinskog polipeptida ili PEG obuhvataju, ali nisu ograničene na sledeće:

(a) karboksilne grupe i njihovi različiti derivati obuhvataju, ali nisu ograničeni na, N-hidroksisukcinimidne estre, N-hidroksibenztriazolske estre, kisele halide, acil imidazole, tioestre, pnitrofenil estre, alkil, alkenil, alkinil i aromatične estre;

(b) hidroksilne grupe, koje se mogu prevesti, npr. u estre, etre, aldehide, itd.

(c) haloalkil grupe, pri čemu halid može kasnije biti zamenjen nukleofilnom grupom kao što je, na primer, amin, karboksilatni anjon, tiol anjon, karbanjon, ili alkoksidni jon, što rezultuje kovalentnim pričvršćivanjem nove grupe na funkcionalnu grupu halogenog atoma;

(d) dienofilne grupe, koje mogu da učestvuju u Diels-Alderovim reakcijama, kao što su, na primer, maleimido grupe;

(e) aldehidne ili ketonske grupe, kao što je moguća sledstvena derivatizacija formiranjem karbonil derivata, kao što su, na primer, imini, hidrazoni, semikarbazoni ili oksimi, ili pomoću takvih mehanizama, kao što su Grinjarova adicija ili alkillitijumska adicija;

(f) sulfonil halidne grupe za sledstvenu reakciju sa aminima, na primer, radi formiranja sulfonamida;

(g) tiol grupe, koje mogu biti prevedene, na primer, u disulfide ili reagovati sa acil halidima, ili mogu biti prevedene u tioetre, npr. reakcijom sa maleimidima;

(h) amino ili sulfhidril grupe, koje mogu biti, na primer, acilovane, alkilovane ili oksidirane;

(i) alkeni, koji mogu biti podvrgnuti, na primer, cikloadicijama, acilaciji, Majklovoj adiciji, itd.;

(j) epoksidi, koji mogu reagovati, na primer, sa aminima i hidroksilnim jedinjenjima; i

(k) maleimidi, koji mogu reagovati, na primer, sa aminima i sulfhidrilima.

[0137] Reaktivne funkcionalne grupe mogu biti izabrane tako da ne učestvuju ili da ne remete reakcije koje su neophodne za spajanje reaktivne polimerne modifikujuće grupe (PEG). Alternativno tome, reaktivna funkcionalna grupa može biti zaštićena od učešća u reakciji prisustvom zaštitne grupe.

Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će shvatiti kako da zaštite specifičnu funkcionalnu grupu tako da ne remeti izabrani skup reakcionih uslova. Za primere korisnih zaštitnih grupa, vidi, na primer, Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, Njujork, 1991.

[0138] Podesni uslovi za konjugaciju su oni uslovi vremena, temperature, pH, koncentracije reagensa, funkcionalne grupe, odnosno grupa reagensa, funkcionalne grupe na aktivnom agensu koja je raspoloživa reagensu, rastvarača, i sličnog koji su dovoljni da se ostvari konjugacija polimernog reagensa i aktivnog agensa. Kao što je poznato iz odgovarajuće oblasti, specifični uslovi zavise, između ostalog, od aktivnog agensa, željenog tipa konjugacije, prisustva drugih materijala u reakcionoj smeši, i tako dalje. Dovoljne uslove za ostvarivanje konjugacije u bilo kom specifičnom slučaju može odrediti prosečan stručnjak izodgovarajuće oblasti na osnovu čitanja ovog opisa, referenci u relevantnoj literaturi, i/ili rutinskim eksperimentisanjem.

[0139] Na primer, kada polimerni reagens sadrži N-hidroksisukcinimidni aktivni estar (npr. sukcinimidil sukcinat, sukcinimidil karbonat, sukcinimidil propionat, i sukcinimidil butanoat), i aktivni agens sadrži amino grupu (npr. terminalnu amino grupu na polipeptidu i/ili epsilon amin polipeptida koji sadrži lizin), konjugacija se može izvršiti na pH od od oko 7.5 do oko 9.5 na sobnoj temperaturi. Pored toga, kada polimerni reagens sadrži vinilsulfonsku reaktivnu grupu ili maleimidnu grupu i farmakološki aktivni agens sadrži sulfhidril grupu (npr. sulfhidril grupu polipeptida koji sadrži cistein ili polipeptida koji sadrži metionin), konjugacija se može izvršiti na pH od oko 7 do oko 8.5 na sobnoj temperaturi. Pored toga, kada je reaktivna grupa koja je povezana sa polimernim reagensom aldehid ili keton i farmakološki aktivni agens sadrži primarni amin, onda se konjugacija može izvršiti redukcionom aminacijom, pri čemu primarni amin farmakološkog aktivnog agensa reaguje sa aldehidom ili ketonom polimera. Ako se vrši na pH od oko 6 do oko 9.5, onda redukciona aminacija inicijalno rezultuje konjugatom gde su farmakološki aktivni agens i polimer povezani preko imino veze. Sledstvenim tretmanom konjugata koji sadrži imin sa podesnim agensom za redukciju, kao što je NaCNBH3, se imin redukuje u sekundarni amin.

[0140] Ilustrativni uslovi konjugacije obuhvataju izvođenje reakcije konjugacije na pH od oko 4 do oko 10, i, na primer, na pH od oko 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, ili 10.0. Pušta se da se reakcija nastavi od oko 5 minuta do oko 72 sata, na primer, od oko 30 minuta do oko 48 sati, na primer, od oko 4 sata do oko 24 sata. Temperatura pod kojom se može izvršiti konjugacija je obično, mada ne i nužno, u opsegu od oko 0 °C do oko 40 °C, i često na sobnoj temperaturi ili manjoj. Reakcije konjugacije se često izvode uz korišćenje fosfatnog puferovanog rastvora, natrijum acetata, ili sličnog sistema.

[0141] Što se tiče koncentracija reagensa, višak polimernog reagensa se obično sjedinjava sa hemoglobinom. Ilustrativni odnosi polimernih reagenasa i hemoglobina obuhvataju molske odnose od oko 1:1 (polimerni reagens:hemoglobin), 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1 ili 30:1. U različitim primerima izvođenja, pušta se da se reakcija konjugacije nastavi sve dok dalja konjugacija u suštini ne prestane, što se generalno može odrediti praćenjem napredovanja reakcije tokom vremena.

[0142] Napredovanje reakcije se može pratiti izvlačenjem alikvota reakcione smeše u različitim vremenskim trenucima i analiziranjem reakcione smeše pomoću SDS-PAGE ili MALDI-TOF masene spektrometrije ili bilo kog drugog podesnog analitičkog postupka. Kada se jednom dostigne plato za količinu formiranog konjugata ili količinu preostalog nekonjugovanog polimernog reagensa, pretpostavlja se da je reakcija okončana. Obično se reakcija konjugacije odvija između nekoliko minuta i nekoliko sati (npr. od 5 minuta do 24 sata ili više). Rezultujuća smeša proizvoda se prvenstveno, ali ne i nužno prečišćava da bi se izdvojio višak polimernog reagensa, nekonjugovanih reaktanata (npr. aktivnog agensa), i nepoželjne multi-konjugovane vrste. Rezultujući konjugati se onda mogu dalje karakterisati korišćenjem analitičkih postupaka, kao što su MALDI, kapilarna elektroforeza, gel elektroforeza, i/ili hromatografija.

[0143] Konjugati polimera-hemoglobina se mogu prestiti da bi se dobile/izolovane različite konjugovane vrste. Alternativno tome, i poželjnije za manje molekulske težine (npr. manje od oko 20,000 Daltona, prvenstveno manje od oko 10,000 Daltona) polimernih reagenasa koji se upotrebljavaju za formiranje konjugata, smeša proizvoda se može prečistiti da bi se dobila raspodela segmenata vodorastvornog polimera po aktivnom agensu. Na primer, smeša proizvoda se može prečistiti da bi se dobio željeni prosečni broj pričvršćivanja polimernog reagensa po Hb molekulu, obično prosečno od oko 7, 8, 9 ili 10 pričvršćivanja po Hb molekulu. Strategija za prečišćavanje finalne smeše konjugata će zavisiti od više faktora, uključujući, na primer, molekulsku težinu upotrebljenog polimernog reagensa, specifičnu Hb formulaciju, željeni režim doziranja, i rezidualnu aktivnost i in vivo svojstva pojedinačnog, odnosno pojedinačnih konjugata).

[0144] Ako je poželjno, konjugati koji imaju različite molekulske težine se mogu izolovati korišćenjem gel filtracione hromatografije. To znači da se gel filtraciona hromatografija koristi za frakcionisanje različito numetisanih odnosa reagens-prema-aktivnom agensu (npr.1-mer, 2-mer, 3-mer, i tako dalje, pri čemu "1-mer" ukazuje na 1 polimerni reagens prema aktivnom agensu, "2-mer" ukazuje na dva polimerna reagensa prema aktivnom agensu, i tako dalje) na bazi njihovih različitih molekulskih težina (gde razlika u suštini odgovara prosečnoj molekulskoj težini segmenata vodorastvornog polimera). Na primer, u jednoj ilustrativnoj reakciji gde je protein od 100,000 Daltona slučajno konjugovan sa razgranatim PEG koji ima ukupnu molekulsku težinu od oko 20,000 Daltona (pri čemu svaki polimerni "krak" razgranatog PEG ima molekulsku težinu od oko 10,000 Daltona), rezultujuća reakciona smeša može sadržati nemodifikovani protein (koji ima molekulsku težinu od oko 100,000 Daltona), monoPEGilovani protein (koji ima molekulsku težinu od oko 120,000 Daltona), diPEGilovani protein (koji ima molekulsku težinu od oko 140,000 Daltona), i tako dalje.

[0145] Dok se ovaj pristup može upotrebiti za odvajanje PEG i drugih konjugata polimer-aktivni agens koji imaju različite molekulske težine, ovaj pristup je generalno neefikasan za razdvajanje pozicionih izomera koji imaju različita mesta pričvršćivanja polimera unutar proteina. Na primer, gel filtrirajuća hromatografija se može upotrebiti za međusobno razvajanje smeša PEG 1-mera, 2-mera, 3-mera, i tako dalje, mada svaka od rekuperisanih kompozicija PEG-mera može sadržati PEGs koji su pričvršćeni za različite reaktivne amino grupe (npr. lizinske ostatke) unutar aktivnog agensa.

[0146] Kolone za gel filtraciju koje su podesne za izvođenje ovog tipa razdvajanja obuhvataju Superdex™ i Sephadex™ kolone koje se mogu nabaviti od Amersham Biosciences (Piscataway, N.J.). Izbor odgovarajuće kolone će zavisiti od željenog opsega frakcinacije. Eluiranje se generalno izvodi uz korišćenje podesnog pufera, kao što je fosfat, acetat, ili slično. Izdvojene frakcije se mogu analizirati pomoću više postupaka, kao što su, na primer, (i) optičkom gustinom (OD) na 280 nm radi određivanja sadržaja proteina, (ii) analizom proteina sa goveđim serumskim albuminom (BSA), (iii) testiranjem jodom za sadržaj PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), i (iv) gel elektroforezom na dodecil sulfat poliakrilamidnom gelu (SDS PAGE), praćenim bojenjem barijum jodidom.

[0147] Vodorastvorni polimer je PEG i u različitim primerima izvođenja on ima molekulsku težinu od približno 1 kD, 5 kD, 10 kD, 15 kD, 20 kD, 30 kD ili 40 kD. PEG grupe su linearne ili razgranate PEG vrste. Kraj PEG grupe, koji nije pričvršćen za polipeptid (ili za linker koji je pričvršćen za polipeptid), može biti OH ili druga grupa, npr. sa O-(C1-C4) supstituisana ili nesupstituisana alkil grupa. Sada je poželjan OMe (gde je Me metil grupa).

[0148] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, vodorastvorni polimer je linearan ili razgranati PEG. U različitim primerima izvođenja, konjugati sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 PEG grupa po peptidu. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, vodorastvorni polimer je linearni PEG i konjugat sadrži približno 6, 7, 8, 9 ili 10 PEG grupa po molekulu peptida. U sledećem ilustrativnom primeru izvođenja, vodorastvorni polimer je razgranati PEG i konjugat sadrži približno 1, 2, 3, 4 ili 5 PEG grupa po molekulu peptida.

[0149] U ilustrativnim primerima izvođenja, u kojima je PEG linearna vrsta, PEG grupa ima molekulsku težinu koja je od oko 200 D do oko 20 kD. U različitim primerima izvođenja u kojima je PEG grupa linearna PEG grupa, molekulska težina linearnog PEG je najmanje oko 200 D, najmanje oko 500 D, najmanje oko 1 kD, najmanje oko 2 kD, najmanje oko 5 kD, najmanje oko 10 kD, najmanje oko 20 kD, najmanje oko 30 kD ili najmanje oko 40 kD.

[0150] Ilustrativna PEG vrsta za upotrebu u pronalasku je razgranati PEG koji ima dva ili više PEG krakova. Ovaj ilustrativni primer izvođenja je baziran na aminokiselini sa bočnim lancem, npr. serinu, cisteinu ili lizinu i di-, tri- i tetrapeptidima formiranim od ovih aminokiselina pojedinačno ili u kombinaciji.

[0151] U drugim ilustrativnim primerima izvođenja u kojima su PEG vrste razgranate, razgranati PEG sadrži od 2 do 6 linearnih PEG krakova. Ilustrativni PEG krakovi imaju molekulsku težinu od oko 200 D do oko 30 kD. U različitim primerima izvođenja, svaki krak ima individualno izabranu molekulsku težinu koja je najmanje oko 2 kD, najmanje oko 5 kD, najmanje oko 10 kD, najmanje oko 15 kD, najmanje oko 20 kD, najmanje oko 30 kD ili najmanje oko 40 kD.

[0152] U predmetnom pronalasku, najmanje jedna poli(etilen glikol) grupa je kovalentno konjugovana preko amino grupe aminokiselinskog ostatka molekula hemoglobina. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselinski ostatak je lizinski ostatak i najmanje jedna poli(etilen glikol) grupa je kovalentno konjugovana sa ε-amino grupom lizinskog ostatka. Ilustrativni motivi konjugacije se završavaju vezom koja je član izabran između amida i uretana.

Stabilnost konjugata

[0153] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovani konjugati PEG- hemoglobin koji su veoma stabilni, mereno njihovom rezistencijom na formiranje metemoglobina. U jednom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovan konjugat koji sadrži manje od 5%, 4% ili 3% metemoglobina posle skladištenja na 45 °C tokom najmanje oko 4 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 6 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 8 dana, najmanje oko 9 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 11 dana, najmanje oko 12 dana, najmanje oko 13 dana, najmanje oko 14 dana, ili najmanje oko 15 dana.

[0154] U drugačijem primeru izvođenja, pronalaskom su realizovani konjugati PEG- hemoglobin koji su veoma stabilni, mereno njihovom rezistencijom na formiranje metemoglobina. U jednom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovan konjugat koji sadrži manje od oko 5%, 4% ili 3% metemoglobina posle skladištenja na 4 °C tokom najmanje oko 5 nedelja, najmanje oko 6 nedelja, najmanje oko 7 nedelja, najmanje oko 8 nedelja, najmanje oko 9 nedelja, najmanje oko 10 nedelja, najmanje oko 11 nedelja, najmanje oko 12 nedelja, najmanje oko 13 nedelja, najmanje oko 14 nedelja, najmanje oko 15 nedelja, ili najmanje oko 16 nedelja.

[0155] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovan ugljen monoksidni (CO) oblik konjugata PEG-hemoglobin. Ovaj oblik izgleda posebno stabilan u pogledu održavanja formiranja malog %MET-Hb, kao što je prikazano u Tabeli 3. Na primer, CO oblik je ispoljio samo 4.0% %MET-Hb posle skladištenja na 37° C tokom 16 nedelja. Ovo je stabilnije nego mehanički deoksigenovani oblik.

[0156] Jedan ilustrativni konjugat prema pronalasku je potpuno efikasan u životinjskom modelu hipovolemijskog šoka posle skladištenja na 45 °C tokom najmanje oko 3 nedelja, najmanje oko 4 nedelja ili najmanje oko 5 nedelja.

[0157] U jednoj ilustrativnoj formulaciji prema svakom od gornjih opisa, konjugat hemoglobina je u CO obliku. U različitim primerima izvođenja, pronalaskom je realizovan PEG-Hb-CO konjugat koji je stabilan na 4 °C tokom najmanje oko 3 meseca, najmanje oko 6 meseci, najmanje oko 9 meseci ili najmanje oko 12 meseci.

Kombinovane formulacije

[0158] U različitim ilustrativnim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovane kombinovane formulacije koje sadrže jedan ili više PEG-Hb konjugata ili formulaciju prema pronalasku u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom ili agensom koji potencira, komplementira ili povećava aktivnost PEG-Hb konjugata u formulaciji. Ilustrativni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na koagulante ili prekursore koagulanata, antioksidantne enzime, i agense koji obezbeđuju profilaksu ili lečenje ishemijskih/reperfuzionih povreda. Ilustrativne vrste u skladu sa ovim primerima su navedene u nastavku.

[0159] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovana formulacija koja sadrži jednu ili više PEG-Hb kompozicija prema pronalasku u kombinaciji sa trombocitima.

[0160] Trombociti su krvne ćelije bez jedra koje potiču iz koštane srži i štite povređene sisare od gubitka krvi lepljenjem na mesta vaskularne povrede i podsticanjem formiranja ugrušaka od fibrina iz plazme. Ljudi kojima nedostaju cirkulišući trombociti zbog otkaza koštane srži doživotno pate od spontanog krvarenja koje im ugrožava život, a manje komplikovani manjak trombocita doprinosi komplikacijama usled krvarenja posle traume ili hirurgije.

[0161] Dosta toga je poznato u vezi humanih trombocita kao ćelija. Opšte publikacije koje opisuju tehnike, materijale, i postupke za skladištenje trombocita su opisane u Murphy et al., Blood 60(1):194-200 (1982); Murphy in "The Preparation and Storage of Platelets for Transfusion", Mammon, Barnhart, Lusher, i Walsh, PJD Publications, Ltd., Westbury, N.Y. (1980); Murphy u "Platelet Transfusion ", Progress in Hemostasis and Thrombosis, tom Ill, izd. autora T. Spaet, Grune i Stratton, Inc. (1976); Murphy et al., Blood 46(2):209-218 (1975); Kilkson et al., Blood 64(2):406-414 (1984); Murphy u "Platelet Storage for Transfusion ", Seminars in Hematology 22(3): 165-177 (1985); Simon et al., Transfusion 23:207-212 (1983); Cesar et al., Transfusion 27(5):434-437 (1987).

[0162] Smanjenje broja cirkulišućih trombocita na manje od -70,000 po gelu navodno rezultuje produžavanjem vremena krvarenja u standardizovanom kutanom testu, i produžava intervale krvarenja, ekstrapolacijom bliskom beskonačnosti kada broj trombocita pada na nulu. Za pacijente sa brojem trombocita manjim od 20,000 po gelu se smatra da su veoma podložni spontanoj hemoragiji iz mukoznih površina.

[0163] Formulacije trombocita PEG-Hb prema pronalasku se koriste za lečenje subjekata koji boluju od otkaza koštane srži, npr. aplastične anemije, akutne i hronične leukemije, metastatičkog kancera, ali naročito onih koje nastaju usled lečenja kancera jonizujućim zračenjem i hemoterapijom. Pored toga, formulacije se koriste za lečenje i ublažavanje trombocitopenije povezane sa velikim operacijama, povredama (npr. traumom) i sepsom.

[0164] Trombociti i PEG-Hb formulacija se mogu kombinovati na bilo koji praktičan i efikasan način. Shodno tome, u jednom ilustrativnom primeru izvođenja, trombociti i PEG-Hb se kombinuju neposredno pre davanja rezultujuće kompozicije subjektu. U drugim ilustrativnim primerima izvođenja, formulacija trombociti-PEG-Hb se priprema i skladišti tokom predviđenog vremenskog perioda.

[0165] U različitim primerima izvođenja, trombociti, bilo sami ili u kombinaciji sa PEG-Hb formulacijom su stabilizovani pomoću stabilizatora. Ilustrativni stabilizatori za primenu u predmetnom pronalasku su poznati iz odgovarajuće oblasti. Vidi, na primer, US. pat. br.7,241,282 i 5,466,573. Izvor trombocita je takođe opciono kompozicija krvi obogaćena trombocitima i fibrinogenom, kao što je ona koja je opisana u US pat. br.6,649,072.

[0166] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovan kit u kome su prisutne dve (ili više) komponenata i one su uskladištene odvojeno pre svog kombinovanja. Na primer, u različitim primerima izvođenja pronalaskom je realizovan uređaj za sjedinjavanje trombocita i PEG-Hb formulacije. Uređaj sadrži prvi kontejner za sakupljanje ili skladištenje faktora; i najmanje jedan satelitski kontejner u fluidnoj komunikaciji sa prvim kontejnerom u kome je uskladištena PEG-Hb formulacija. Pri upotrebi je lomljiva zaštitna barijera postavljena između prvog i satelitskog kontejnera tako da posle probijanja zaštite, dve komponente formulacije mogu da se pomešaju, a zatim da se daju subjektu kome je to potrebno. Kao što će stručnjak iz odgovarajuće oblasti shvatiti, raspoloživi su i ekvivalenti opisanog uređaja i oni spadaju u okvir i obim ovog otkrivanja. Na primer, kit može sadržati dve ili više ampula, pri čemu svaka sadrži jedan element kombinovane formulacije prema pronalasku u tečnom ili suvom obliku. Sadržaji ampula se mogu pomešati u podesnom vremenskom trenutku i na odgovarajući način pre administracije kombinovane formulacije subjektu kome je to potrebno.

[0167] U sledećem ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovana formulacija u kojoj je PEG-Hb formulacija prema pronalasku kombinovana sa jednim ili više faktora koagulacija. Takve formulacije se koriste u lečenju izvesnih poremećaja koagulacije (npr. naslednog ili stečenog deficita koagulacije krvi), akutne hemoragije, i pred-hirurške profilakse krvarenja između ostalog.

[0168] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovana kombinovana formulacija koja sadrži PEG-Hb formulaciju prema pronalasku i faktor koagulacije koji je član izabran između Faktora II, V, VII, VIII, IX, X, XI, i XII i njihve kombinacije. U različitim ilustrativnim primerima izvođenja, faktor je izabran između Faktora VII, Faktora VIII i Faktora IX ili njihove kombinacije.

[0169] Koagulacija krvi je kompleksan proces koji zahteva sukcesivnu interakciju velikog broja komponenata, od kojih su skoro sve proteini. Ove komponente obuhvataju fibrinogen i Faktore II, V, VII, VIII, IX, X, XI, i XII. Nedostatak bilo koje od ovih komponenata, ili nefunkcionalna komponenta može dovesti do nemogućnosti zgrušavanja krvi kada je to potrebno, što će rezultovati prekomernim gubitkom krvi koji ugrožava život kod pacijenta.

[0170] Stanje tehnike je dopuna sa ustanovljenim postupcima za dobijanje koncentrata faktora koagulacije različitim sorbentima. Na primer, prečišćavanje kompleksa Faktora VIII je rezultovalo preparatima VIII koji imaju nivo čistoće od oko 90% ili veći, i koji su dovoljno stabilni za skladištenje tokom dužih vremenskih perioda u liofilizovanom obliku. Vidi, na primer, US pat. br.4,650,858; i US pat. br. 5,399,670. Formulacije Faktora VIII su takođe na raspolaganju. One sadrže humani faktor VIII (sličan aktivnim principima kod Humate™, Monoclate™, lmmunate™, i Hemofil™), rekombinantni humani faktor VIII (sličan r-VIII SQ koji je opisan u PCT prijavi patenta WO 91/09122 (aktivni princip kod ReFacto™) ili aktivne principe kod Kogenate™ ili Recombinate™), svinjski faktor VIII (koji je aktivni princip kod proizvoda Hyate:C™) koji prodaje Ipsen, Inc., USA) ili rekombinantni svinjski faktor VIII (npr. modifikovani oblik svinjskog faktora VIII bez domena B, kao što je onaj koji je opisan u prijavi patenta WO 01/68109 i identifikovan je kao "POL1212".

[0171] Formulacije dodatnog Faktora VIII koje se koriste u predmetnom pronalasku obuhvataju one koje su opisane u US pat. br.5,565,427, US pat. br.5,605,884, US pat. br.5,763,401 US pat. br.

5,874,408, US pat. br.5,962,650, US pat. br.5,972,885, WO 89/09784, i WO 94/07510.

[0172] Drugi faktori imaju sličnu raspoloživost i primenljivost u predmetnom pronalasku. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, Faktor VII ke inkorporiran u PEG-Hb formulaciju prema pronalasku. Faktor VII je jednolančani glikoprotein (mol. tež.50,000) od 406 aminokiselina koji se izlučuje u krv, gde cirkuliše u zimogenom obliku. In vitro se FVII može aktivirati proteolitički u aktivirani Faktor FVII, ili FVIIa, desjtvom aktiviranih faktora koagulacije Faktor X (FXa), Faktor IX (FIXa), Faktor XII (FXIIa) ili Faktor II (FIIa). Sam FVIIa ne podstiče koagulaciju, ali može formirati kompleks sa tkivnim faktorom (TF) izloženim na mestu povrede. FVIIa/TF kompleks može prevesti FX u FXa, čime se indukuje lokalna hemostaza na mestu povrede. Aktivacija FVII u FVIIa obuhvata proteolitičko kidanje jedne jedine peptidne veze između Arg-152 i Ile-153, što rezultuje dvolančanim molekulom koji se sastoji od lakog lanca od 152 aminokiselinskih ostataka i teškog lanca od 254 aminokiselinskih ostataka koji se drže zajedno pomoću jedne jedine disulfidne veze.

[0173] Postupci dobijanja i prečišćavanja Faktora VII su poznati iz odgovarajuće oblasti. Vidi, na primer, US pat. br.6,329,176. Opisane su neke proteinske varijante FVII dobijene genetskim inženjeringom. Vidi, npr. Dickinson et al., J. Bio. Chem.272:19875-19879 (1997), Kemball-Cook et al., J. Biol. Chem.

273:8516-8521 (1998), Bharadwaj et al., J. Biol. Chem.271:30685-30691 (1996), Ruf et al., Biochemistry, 38:1957-1966 (1999); WO 99/20767; WO 00/11416; WO 02/22776; WO 02/38162; WO 01/83725; WO 01/58935; i US pat. br.5,580,560. FVII je izražen u BHK i drugim sisarskim ćelijama (WO 92/15686, WO 91/11514 i WO 88/10295) i ko-ekspresijom FVII i kex2 endoproteaze u eukariotskim ćelijama (WO 00/28065). Komercijalni preparati sa humanim rekombinantnim FVIIa se prodaju kao NovoSeven™. NovoSeven™ je indikovan za lečenje epizoda krvarenja kod pacijenata sa hemofilijom A ili B.

[0174] Hemofilija B je izazvana deficitom proteina iz krvne plazme koji se zove Faktor IX i utiče na svojstvo zgrušavanja krvi. Poremećaj je izazvan nasleđenom osobinom povezanom sa X hromozomom, pri čemu je defektni gen lociran na X hromozomu. Shodno tome, poremećaj se prvenstveno pojavljuje kod muškaraca. Humani faktor IX je zimogen zavisan od vitamina K, koji igra važnu ulogu u koagulaciji krvi. Faktor IX cirkuliše kao pojedinačni zimogen sa jednim lancem od 415-aminokiselina i molekulskom masom od 55,000 Daltona i u normalnoj plazmi je prisutan sa približno 5 mg/ml.

[0175] Na raspolaganju se nalazi nekoliko komercijalnih oblika koncentrata Faktora IX za obezbeđivanje zamenske terapije za pacijente koji pate od hemofilije B. Na primer, proizvodi sa kompleksom Faktora IX dobijeni iz krvi (koji sadrže druge faktore) se prodaju pod komercijalnim nazivima Bebulin VH™ (Baxter Healthcare, Beč, Austrija), konyne 80™ (Bayer Corporation, Elkhart Ind.), Profilnine SD™ (Alpha Therapeutic Corporation, Los Anđeles Kalif.), i Proplex™ (Baxter Healthcare, Glendejl Kalif.). Nešto više prečišćeni oblici proizvoda sa Faktorom IX se prodaju pod komercijalnim nazivima Alphanine SD™ (Alpha Therapeutic Corporation, Los Anđeles Kalif.) i Mononine™ (Aventis Behring, Kankaki Ill.). Što se tiče rekombinantno dobijenih koncentrata Faktora IX, trenutno se može nabaviti jedan proizvod, Benefix™ (Wyeth/Genetics Institute, Kembridž Mass.).

[0176] Rekombinantna sinteza i prečišćavanje drugih faktora koagulacije i inkorporiranje ovih faktora u formulaciju prema pronalasku je u okviru sposobnosti onih koji su stručnjaci iz odgovarajuće oblasti.

[0177] Faktor, odnosno faktori i PEG-Hb formulacija se mogu kombinovati na bilo koji praktičan i efikasan način. Shodno tome, u jednom ilustrativnom primeru izvođenja, faktor, odnosno faktori i PEG-Hb se kombinuju neposredno pre nego što se rezultujuća kompozicija da subjektu. U drugim ilustrativnim primerima izvođenja, Formulacija faktora-PEG-Hb se priprema i čuva tokom odgovarajućeg vremenskog perioda.

[0178] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovan kit u kome su prisutne dve (ili više) komponenata i one se skladište odvojeno pre njihovog sjedinjavanja. Na primer, u različitim primerima izvođenja pronalaskom je realizovan uređaj za sjedinjavanje faktora i PEG-Hb formulacija. Uređaj sadrži prvi kontejner za sakupljanje ili skladištenje faktora; i najmanje jedan satelitski kontejner u fluidnoj komunikaciji sa prvim kontejnerom u kome je uskladištena PEG-Hb formulacija. Pri upotrebi je lomljiva zaštitna barijera postavljena između prvog i satelitskog kontejnera tako da posle probijanja zaštite, dve komponente formulacije mogu da se pomešaju, a zatim da se daju subjektu kome je to potrebno. Kao što će stručnjak iz odgovarajuće oblasti shvatiti, raspoloživi su i ekvivalenti opisanog uređaja i oni spadaju u okvir i obim ovog otkrivanja. Na primer, kit može sadržati dve ili više ampula, pri čemu svaka sadrži jedan element kombinovane formulacije prema pronalasku u tečnom ili suvom obliku. Sadržaji ampula se mogu pomešati u podesnom vremenskom trenutku i na odgovarajući način pre administracije kombinovane formulacije subjektu kome je to potrebno.

[0179] U sledećem ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovana kombinovana formulacija između izvora NO i PEG-Hb formulacije prema pronalasku. Ovaj primer izvođenja pronalaska je ilustrovan sa pozivom na različite molekule NO donore, međutim, stručnjak iz odgovarajuće oblasti će lako shvatiti da izvor NO nije ograničen na ove ilustrativne primere i da se u kombinovanu formulaciju prema pronalasku mogu inkorporirati drugi izvori NO.

[0180] Azotni oksid (NO) je važan intracelularni i intercelularni mesendžer molekul koji igra važnu fiziološku ulogu u anti-trombocitnoj agregaciji i anti-trombocitnoj aktivaciji, vaskularnoj relaksaciji, neurotransmisiji, i imunoj reakciji. NO (azotni oksid) je biološki "mesendžer molekul" koji, pored ostalih funkcija, smanjuje krvni pritisak i inhibira funkciju trombocita,. NO slobodno difunduje iz endotela u vaskularni glatki mišić i trombocit i preko neuronskih sinapsi da bi pobudio biološke reakcije.

[0181] Tkiva koja su lišena krvi i kiseonika su podvrgnuta ishemijskoj nekrozi ili infarktu sa mogućim nepovratnim oštećenjem organa. Kada se ponovo uspostavi protok/dotok krvi i kiseonika do organa ili tkiva (reperfuzija), organ se ne vraća odmah u normalno pre-ishemično stanje. Post-ishemična disfunkcija može biti uzrokovana mnoštvom faktora. Ulogu mogu imati kiseonični slobodni radikali, pošto je dokazano generisanje slobodnih radikala u zahvaćenom miokardu i pokazano je da hvatači slobodnih radikala slabe kontraktilnu disfunkciju. Pogoršano intracelularno postupanje sa kalcijumom i prekomerno opterećenje kalcijumom tokom rane reperfuzije može doprineti post-ishemijskoj disfunkciji.

[0182] Dobro je utvrđeno da prekomerni oksidativni stres zbog slobodnih radikala može povrediti biološka tkiva. Prirodne odbrane ćelija i tkiva su bazirane na antioksidansnim mehanizmima koji su se razvili da bi zaštitili ćelije i tkiva od visokih nivoa oksidativnog stresa. U našoj atmosferi bogatoj kiseonikom prisustvo kiseonika u izvesnim trenucima stresa može biti štetno; ovo se naziva kiseoničnim paradoksom i odnosi se na ulogu kiseonika u generisanju i učestvovanju u procesima sa slobodnim radikalima. U izvesnim bolesnim stanjima koja su povezana sa periodima ograničenog protoka krvi to tkiva, kao što su srčani infarkt, moždani udar i ograničeni protok prema ekstremitetima, povremene epizode bez protoka koje su praćene ponovnim protokom krvi predstavljaju ishemijski/reperfuzioni (I/R) oksidativni stres.

[0183] Kada se ovde koristi izraz NO donor, on obuhvata bilo koje od jedinjenja koje oslobađa, predaje ili prenosi azot, uključujući, na primer, S-nitrozotiole, nitrite, nitrate, S-nitrotiole, sidnonimine, 2-hidroksi-2-nitrozohidrazine, (NONOate), (E)-alkil-2-((E)-hidroksiimino)-5-nitro-3-heksenamid (FK-409), (E)-alil-2-((E)-hidroksiimino)-5-nitro-3-hekseneamine, N-((2Z, 3E)-4-etil-2-(hidroksiimino)-6-metil-5-nitro-3-heptenil)-3-piridinekarboksamid (FR 146801), N-nitrozoamine, N-hidroksil nitrozamine, nitrozimine, diazetin diokside, oksatriazol 5-imine, oksime, hidroksilamine, N-hidroksigvanidine, hidroksiuree, benzofuroksane, furoksane kao i supstrate za endogene enzime koji sintetizuju azotni oksid.

[0184] Podesni NONOati obuhvataju, ali nisu ograničeni na (Z)-1-(N-metil-N-(6-(N-metilamonioheksil)amino))diazen-1-ijum-1,2-diolat ("MAHMA/NO"), (Z)-1-(N-(3-amoniopropil)-N-(npropil)amino)diazen-1-ijum-1,2-diolat ("PAPA/NO"), (Z)-1-(N-(3-aminopropil)-N-(4-(3-aminopropilammonio)butil)-amino) diazen-1-ijum-1,2-diolat (spermin NONOat ili "SPER/NO") i natrijum(Z)-1-(N,N-dietilamino)diazenijum-1,2-diolat (dietilamin NONOat ili "DEA/NO") i njihove derivate. NONOati su takođe opisani u US pat. br.6,232,336, 5,910,316 i 5,650,447. "NO adukti" mogu biti mono-nitrozilovani, poli-nitrozilovani, mono-nitrozovani i/ili poli-nitrozovani na mnoštvu prirodno podložnih ili veštački obezbeđenih mesta vezivanja za biološki aktivne oblike azot monoksida.

[0185] Podesni furoksani obuhvataju, ali nisu ograničeni na CAS 1609, C93-4759, C92-4678, S35b, CHF 2206, CHF 2363, i slično.

[0186] Podesni sidnonimini obuhvataju, ali nisu ograničeni na molsidomin (N-etoksikarbonil-3-morfolinosidnonimin), SIN-1 (3-morfolinosidnonimin) CAS 936 (3-(cis-2,6-dimetilpiperidino)-N-(4-metoksibenzoil)-sidnonimin, pirsidomin), C87-3754 (3-(cis-2,6-dimetilpiperidino)sidnonimin, linsidomin, C4144 (3-(3,3-dimetil-1,4-tiazan-4-il)sidnonimin hidrohlorid), C89-4095 (3-(3,3-dimetil-1,1-diokso-1,4-tiazan-4-il)sidnonimin hidrohlorid, i slično.

[0187] Podesni oksimi obuhvataju, ali nisu ograničeni na NOR-1, NOR-3, NOR-4, i slično.

[0188] Jedna grupa NO adukata su S-nitrozotioli, koji su jedinjenja koja sadrže najmanje jednu SNO grupu. Ova jedinjenja obuhvataju S-nitrozo-polipeptide (izraz "polipeptid" obuhvata proteine i poliaminokiseline koje ne poseduju utvrđenu biološku funkciju, i njihove derivate); S-nitrozilovane aminokiseline (uključujući prirodne i sintetičke aminokiseline i njihove stereoizomere i racemske smeše i njihove derivate); S-nitrozilovane šećere; S-nitrozilovane, modifikovane i nemodifikovane oligonukleotide (prvenstveno od najmanje 5, i još poželjnije od 5-200 nukleotida); linearne ili razgranate, zasićene ili nezasićene, alifatične ili aromatične, supstituisane ili nesupstuisane S-nitrozilovane ugljovodonike; i S-nitrozo heterociklična jedinjenja. S-nitrozotioli i postupci za njihovo dobijanje su opisani u US pat. br.5,380,758 i 5,703,073; WO 97/27749; WO 98/19672; i Oae et al, Org. Peep. Proc. Int., 15(3):165-198 (1983).

[0189] Sledeća klasa podesnih NO donora su S-nitrozo aminokiseline kod kojih je nitrozo grupa vezana za sumpornu grupu aminokiseline koja sadrži sumpor ili njen derivat. Takva jedinjenja obuhvataju, na primer, S-nitrozo-N-acetilcistein, S-nitrozo-kaptopril, S-nitrozo-N-acetilpenicilamin, S-nitrozohomocistein, S-nitrozo-cistein, S-nitrozo-glutation, S-nitrozo-cisteinil-glicin, i slično.

[0190] Podesni S-nitrozilovani proteini obuhvataju proteine koji sadrže tiol (gde je NO grupa pričvršćena za jednu ili više sumpornih grupa na aminokiselini ili njenom aminokiselinskom derivatu) iz različitih funkcionalnih klasa uključujući enzime, kao što su tkivni tip plazminogenskog aktivatora (TPA) i katepsin B; transportne proteine, kao što su lipoproteini; hemo proteine, kao što su hemoglobin i serumski albumin; i biološke zaštitne proteine, kao što su imunoglobulini, antitela i citokini. Takvi nitrozilovani proteini su opisani u WO 93/09806. Primeri obuhvataju polinitrozilovani albumin, gde su modifikovani jedan ili više tiola ili drugih nukleofilnih centara u proteinu.

[0191] Sledeća grupa NO adukata za upotrebu u pronalasku, gde je NO adukt jedinjenje koje donira, prenosi ili oslobađa azotni oksid, obuhvata jedinjenja koja sadrže najmanje jednu ONO ili ONN grupu. Jedinjenja koja sadrže najmanje jednu ONO- ili ONN grupu su prvenstveno ONO ili ONN-polipeptidi (izraz "polipeptid" obuhvata proteine i poliaminokiseline koje ne poseduju utvrđenu biološku funkciju i njihove derivate); ONO ili ONN-aminokiseline (uključujući prirodne i sintetičke aminokiseline i njihove stereoizomere i racemske smeše); ONO ili ONN-šećeri; ONO ili ONN modifikovani ili nemodifikovani oligonukleotidi (koji sadrže najmanje 5 nukleotida, a prvenstveno 5-200 nukleotida); ONO ili ON linearni ili razgranati, zasićeni ili nezasićeni, alifatični ili aromatični, supstituisani ili nesupstituisani ugljovodonici; i ONO, ONN ili ONC-heterociklična jedinjenja. Poželjni primeri jedinjenja koja sadrže najmanje jednu ON-O ili ON-N grupu obuhvataju butil nitrit, izobutil nitrit, terc.-butil nitrit, amil nitrit, izoamil nitrit, N-nitrozamine, N-nitrozamide, N-nitrozoureu, N-nitrozogvanidine, N-nitrozokarbamate, N-acil-N-nitrozo jedinjenja (kao što je N-metil-N-nitrozourea); N-hidroksi-N-nitrozamine, kupferon, alanozin, dopastin, 1,3-disupstituisane nitroziminobenzimidazole, 1,3,4-tiadiazol-2-nitrozimine, benzotiazol-2(3H)-nitrozimine, tiazol-2-nitrozimine, oligonitrozo sidnonimine, 3-alkil-N-nitrozo-sidnonimine, 2H-1,3,4-tiadiazin nitrozimine.

[0192] Sledeća grupa NO adukata za upotrebu u pronalasku obuhvata nitrate koji doniraju, prenose ili oslobađaju azotni oksid, kao što su jedinjenja koja sadrže najmanje jednu O2NO, O2NN ili O2N-S grupu. Među ovim jedinjenjima su poželjni O2NO, O2NN- ili O2NS polipeptidi (izraz "polipeptid" obuhvata proteine i takođe poliaminokiseline koje ne poseduju utvrđenu biološku funkciju i njihove derivate); O2NO, O2NN ili O2NS aminokiseline (uključujući prirodne i sintetičke aminokiseline i njihove stereoizomere i racemske smeše); ONO, O2NN ili O2NS šećeri; O2NO-, O2NN ili O2NS modifikovani i nemodifikovani oligonukleotidi (koji sadrži najmanje 5 nukleotida, a prvenstveno od 5-200 nukleotida); O2NO, O2NN ili O2NS linearni ili razgranati, zasićeni ili nezasićeni, alifatični ili aromatični, supstituisani ili nesupstituisani ugljovodonici; i O-2NO, O2NN ili O2NS heterociklična jedinjenja. Poželjni primeri jedinjenja koja sadrže najmanje jednu O2NO, O2NN ili O2NS grupu obuhvataju izosorbid dinitrat, izosorbid mononitrat, klonitrat, eritritil tetranitrat, manitol heksanitrat, nitroglicerin, pentaeritrtoltetranitrat, pentrinitrol, propatilnitrat i organske nitrate sa aminokiselinom koja sadrži sulfhidril kao što su, na primer, SPM 3672, SPM 5185, SPM 5186 i oni koji su opisani u US pat. br.5,284,872, 5,428,061, 5,661,129, 5,807,847 i 5,883,122 i u WO 97/46521, WO 00/54756 i u WO 03/013432.

[0193] Sledeća grupa NO adukata su N-okso-N-nitrozoamini koji doniraju, prenose ili oslobađaju azotni oksid i predstavljeni su formulom: R<1">R<2">NN(OM+)NO, gde su R<1">i R<2">svaki nezavisno polipeptid, aminokiselina, šećer, modifikovani ili nemodifikovani oligonukleotid, linearni ili razgranati, zasićeni ili nezasićeni, alifatični ili aromatični, supstituisani ili nesupstituisani ugljovodonik, ili heterociklična grupa, i gde je M<+>organski ili neorganski katjon, kao što su, na primer, alkilom supstituisani amonijumski katjon ili katjon metala iz grupe I.

[0194] U kombinaciji sa NO donorom, subjektu može biti davana terapeutski efektivna količina drugog jedinjenja koje potencira terapeutski efekat NO. Drugo jedinjenje može biti, na primer, inhibitor fosfodiesteraze (npr.2-o-propoksifenil-8-azapurin-6-on [Zaprinast™], dipiridamol, teofilin, sildenafil [Viagra™], ili 1,3-dimetil-6-[2-propoksi-5-metansulfonilamidofenil]-pirazolo[3,4-D]pirimidin-4-[5H]-on) ili superoksid dismutaze. Alternativno tome, drugo jedinjenje može biti antitrombotički agens, kao što su tiklopidin, streptokinaza, urokinaza, t-PA ili njegov analog (npr. met-t-PA, Retevase™, ili FE1X), heparin, hirudin ili njegov analog (npr. Hurulog.TM.), nesteroidni anti-inflamatorni agens (npr. indometacin ili aspirin), glukokortikoid (npr. prednizon), ili citotoksični agens (npr. metotreksat); ili antileukocitni agens, kao što je anti-leukocitno antitelo.

[0195] Administracija azotnog oksida je koristi za profilaksu i lečenje ishemijske/reperfuzione povrede. Vidi, na primer, US pat. br.6,656,452 i reference citirane u njemu. Shodno tome, sledeći cilj ovog pronalaska je da se realizuju formulacije zamena za krv na bazi hemoglobina koje sadrže izvor NO za lečenje ishemijskih/reperfuzionih povreda. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, zamena za krv prema pronalasku se kombinuje sa molekulom NO-donorom. Kombinacija može biti u trenutku proizvodnje zamene za krv ili u bilo kom trenutku posle inicijalne proizvodnje. Na primer, pronalaskom je realizovan uređaj sa dva odeljka ili dva odvojena kontejnera. U jednom odeljku ili kontejneru je uskladištena zamena za krv, a u drugom odeljku ili kontejneru se nalazi molekul NO-donor. Pre administracije subjektu kome je to potrebno, sadržaji dva odeljka ili kontejnera se mešaju, a rezultujuća formulacija se daje subjektu.

[0196] U različitim primerima izvođenja, formulacija prema pronalasku dalje sadrži superoksid dismutaze ili katalaze. Sami ovi proteini su opciono konjugovani sa vodorastvornim polimerom, kao što je npr. PEG.

[0197] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovana formulacija za primenu u lečenju, ublažavanju, sprečavanju ili smanjenju ishemijske/reperfuzione povrede i/ili oksidativnog stresa u jednom ili više tkiva subjekta kome se formulacija daje.

[0198] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom je realizovan kit u kome su prisutne dve (ili više) komponenata i one su uskladištene odvojeno pre svog kombinovanja. Na primer, u različitim primerima izvođenja pronalaskom je realizovan uređaj za sjedinjavanje NO donora i PEG-Hb formulacije. Uređaj sadrži prvi kontejner za sakupljanje ili skladištenje NO donora; i najmanje jedan satelitski kontejner u fluidnoj komunikaciji sa prvim kontejnerom u kome je uskladištena PEG-Hb formulacija. Pri upotrebi je lomljiva zaštitna barijera postavljena između prvog i satelitskog kontejnera tako da posle probijanja zaštite, dve komponente formulacije mogu da se pomešaju, a zatim da se daju subjektu kome je to potrebno. Kao što će stručnjak iz odgovarajuće oblasti shvatiti, raspoloživi su i ekvivalenti opisanog uređaja i oni spadaju u okvir i obim ovog otkrivanja. Na primer, kit može sadržati dve ili više ampula, pri čemu svaka sadrži jedan element kombinovane formulacije prema pronalasku u tečnom ili suvom obliku. Sadržaji ampula se mogu pomešati u podesnom vremenskom trenutku i na odgovarajući način pre administracije kombinovane formulacije subjektu kome je to potrebno.

[0199] U svakoj od gore navedenih kombinovanih formulacija, PEG-Hb može biti vezan za kiseonik, ugljen monoksid ili ni za jedan od njih. Sam PEG-Hb ili cela formulacija može biti formulisana tako da bude hipotonična, izotonična ili hipertonična u odnosu na toničnost subjektove krvi.

Postupci primene

[0200] Postoji potreba za agensima za prenošenje kiseonika za lečenje ili prevenciju hipoksije usled gubitka krvi (npr. zbog akutne hemoragije ili tokom hirurških operacija), usled anemije (npr. perniciozne anemije ili anemije srpastih ćelija), ili usled šoka (npr. šoka deficita zapremine, anafilaktičkog šoka, septičnog šoka ili alergijskog šoka), infarkta miokarda, moždanog udara ili traumatske povrede mozga. Dodatno tome, postoji potreba za hiperoksigenacijom tumora da bi se poboljšao terapeutski efekat zračne terapije ili hemoterapije. Predmetnim pronalaskom su realizovana jedinjenja i postupci, kao što je gore opisano, koji su korisni za lečenje i prevenciju ovih i drugih stanja koja su povezana sa gubitkom krvi, na primer, ishemijom ili hipoksijom.

[0201] Svaka od ovde opisanih formulacija se primenjuje u mnoštvu postupaka za lečenje i profilaksu stanja povezanih sa šokom, hemoragijom, anemijom ili drugim disfunkcijama funkcije krvi da nosi kiseonik. Kompozicije i formulacije koje su ovde opisane se mogu primeniti u lečenju ili prevenciju ishemijsko-reperfuzionih povreda, uključujući one koje su izazvane hirurgijom (npr. transplantacionom hirurgijom (posebno transplantacionom hirurgijom bubrega ili srca) ili hirurgijom srčanog bajpasa), trombolizom, moždanim udarom, privremenom hipotenzijom indukovanom traumom, ili procedurom vaskularne intervencije, kao što su aterektomija ili angioplastika, uključujući upotrebu lasera, balona, ili stenta. Kompozicije i formulacije koje su ovde opisane se mogu koristiti za lečenje ili prevenciju ishemijsko-reperfuzionih povreda posle perkutane transluminalne koronarne angioplastike. Lečena ili sprečena povreda se može pojaviti u bilo kom nepulmonarnom tkivu, uključujući bubrege, srce ili mozak.

[0202] Hipovolemijski šok je posebni oblik šoka kod koga srce nije u stanju da dovoljno snabdeva telo krvlju zbog gubitka krvi ili neadekvatne zapremine krvi. Gubitak od približno jedne petine ili više od normalne zapremine krvi dovodi do hipovolemijskog šoka. Gubitak može imati bilo koji uzrok, uključujući spoljašnje krvarenje (od posekotina ili povreda), krvarenje iz gastrointestinalnog trakta, druga unutrašnja krvarenja, ili usled smanjene zapremine krvi koja nastaje usle prekomernog gubitka drugih telesnih fluida (kao što se može desiti kod dijareje, povraćanja, opekotina, i tako dalje).

Generalno, veći i brzi gubici zapremine krvi rezultuju ozbiljnijim simptomima šoka. Generalno, pacijenti sa blažim stepenima šoka će se osećati bolje od onih sa ozbiljnim šokom. Međutim, u slučajevima ozbiljnog hipovolemijskog šoka, smrt je moguća čak i uz brzu medicinsku pomoć. Starije osobe imaju povećan rizik od nepovoljnog ishoda šoka.

[0203] Tokom ratova, meci i šrapneli od eksplozivne municije često izazivaju hemoragiju koja ugrožava život. The Life Science Research Office procenjuje da je hemoragija koja dovodi do iskrvavljenja predstavlja mehanizam smrti za do 50% ranjenih vojnika umrlih u prošlim konfliktima, i smatra se da je glavni uzrok smrti kod poginulih na bojnom polju koji bi mogli biti spaseni. Samo hemoragija iz povređenih udova se smatra uzrokom skoro desetine svih smrti na bojnom polju, a to je udeo za koji se smatra da može sprečiti i za koji bi bilo moguće predviđeti odgovarajuću predbolničku negu.

[0204] Anemija je opšti izraz za bilo koje stanje koje se razvija kada u krvi nedostaju crvena krvna zrnca. Alternativno tome, može biti dovoljno crvenih krvnih zrnaca, ali ona mogu imati deficit hemoglobina. Anemija je najčešće stanje krvi koje u SAD pogađa oko 3.5 milliona Amerikanaca. Žene i ljudi sa hroničnim bolestima imaju povećani rizik od ovog stanja. Postoji više od 400 tipova anemije, koje se grubo mogu klasifikovati u tri kategorije: 1) anemija izazvana gubitkom krvi, 2) anemija izazvana smanjenom ili defektnom proizvodnjom crvenih krvnih zrnaca, ili 3) anemija izazvana razaranjem crvenih krvnih zrnaca.

[0205] Bez obzira na uzrok, postoji značajan broj pojedinaca koji pate od nekog oblika kliničke insucifijencije kiseonika koja može biti ublažena primenom PEG-Hb formulacije. Potrebe za takvim proizvodom i komercijalne mogućnosti su skoro neograničene. Na primer, anemija srpastih ćelija je najučestaliji nasledni poremećaj krvi u Sjedinjenim Državama, koji pogađa oko 72,000 Amerikanaca. Ona je posebno bolna i onesposobljavajuća tokom kriza. Moguće je osmisliti lečenje ovih pacijenata na mesečnoj bazi sa jednom dozom PEG-Hb da bi se sprečila kriza i da bi se oksigenovala tkiva. Ovo bi zahtevalo 864,000 jedinica PEG-Hb samo za ovu indikaciju.

[0206] Kada kapilari ili veće arterije become postanu začepljene, kao što je usled suženja krvnog suda ili čvrstih ugrušaka koji blokiraju ili delimično blokiraju krvne sudove, snabdevanje kiseonikom postaje takvo da ugrožava tkiva koja zavise od tih krvnih sudova u pogledu snabdevanja kiseonikom. Hipoksija tkiva nastaje usled prestanka transporta dovoljne količine kiseonika, a često usled neadekvatnog protoka krvi tj. ishemije. Hipoksija može nastati usled interne hemoragije (npr. intracerebralne hemoragije koja dovodi do cerebralne hipoksije), anemije ili traume. Ishemija je deficit snabdevanja tkiva kiseonikom zbog funkcionalnog suženja ili aktuelne opstrukcije krvnog suda. Na primer, miokardijalna ishemija je deficit snabdevanja kiseonikom srčanog mišića zbog opstrukcije ili suženja koronarnih arterija. Ako se ishemija nastavi tokom duže od nekoliko sekundi, može doći do oštećenja tkiva koje nastaje usled kompleksnog niza biohemijskih događaja koji su povezani sa hipoksijom tkiva indukovanom ishemijom.

[0207] Hipoksioni ili ishemijski uslovi koje stvaraju embolusi mogu dovesti do oštećenja tkiva koje je posebno onesposobljavajuće ako je oštećeno srčano tkivo ili nervno tkivo centralnog nervnog sistema (CNS). Dve najozbiljnije posledice embolusa su srčani udar (akutni infarkt miokarda ili AMI), koji nastaje usled ishemije srčanog mišića, i moždani udar, koji nastaje usled ishemije mozdanog tkiva. Ishemija koja ne dovede do AMI ili moždanog udara ipak može izazvati ozbiljne simptome, kao što su bol u grudima (angina pektoris), delimična paraliza, konfuzija, dezorijentacija i/ili gubitak memorije.

[0208] Pojedinci sa vaskularnom bolesti, a naročito ateroskerozom se posebno nalaze pod rizikom da razviju emboluse koji mogu rezultovati sa AMI ili moždanim udarom. Ishemijska bolest srca pogađa milione ljudi širom sveta, često dovodeći do iznenadne smrti od AMI. Ishemija može nastati kada se stvore čvrsti embolusi od delova plaka koji se otkačinju i pomeraju kroz cirkulatorni sistem u kapilar ili se pričvrste za drugi depozit plakova u krvnom sudu, čime potpuno ili delimično začepe sud ili kapilar. Ateromatozne čestice plaka se takođe mogu generisati tokom procedura vaskularne i kardijačne hirurgije (npr. kanulacija, klemovanje) kojima se manipuliše ili remeti bilo koji od aterosklerotičnih krvnih sudova (npr. karotide, koronarni krvni sudovi, aorta, femoralni ili poplitealni krvni sudovi).

[0209] Shodno tome, predmetnim pronalaskom su realizovane kompozicije koje su ovde opisane za primenu u postupku dopremanja kiseonika do dela izabranog između tkiva i organa subjekta kome je potrebno takvo dopremanje. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine bilo koje kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za ostvarivanje dopremanja kiseonika do jednog ili više tkiva i/ili organa. U ilustrativnim primerima izvođenja, postupak se primenjuje za lečenje stanja kao što su hipoksija, ishemija, anemija i anemija srpastih ćelija.

[0210] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku preokretanja deficita kiseonika u delu izabranom između tkiva i organa subjekta koji boluje od hemoragičnog šoka. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine bilo koje kompozicije prema pronalasku dovoljne za preokretanje deficita kiseonika.

[0211] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku indukcije angiogeneze u tkivima subjekta davanjem subjektu količine kompozicije prema pronalasku koja je efektivna za indukciju angiogeneze. U ilustrativnim primerima izvođenja, angiogeneza se indukuje u tkivima koja pate od deficita kiseonika. U sledećim ilustrativnim primerima izvođenja, tkiva ili organi u kojima se indukuje angiogeneza su tkiva ili organi subjekta koji pati zbog deficita kiseonika. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu one količine bilo koje kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za preokretanje deficita kiseonika.

[0212] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku povećanja protoka krvi u tkivima koja pate zbog deficita kiseonika. Postupak se sastoji od davanja subjektu količine kompozicije prema pronalasku koja je efektivna za povećanje protoka krvi u tkivima koja pate zbog deficita kiseonika. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, tkivo ili organ je tkivo ili organ subjekta koji pati od slabog protoka krvi. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količinu bilo koje kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna da preokrene slab protok krvi.

[0213] U različitim primerima izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u postupku smanjenja neurološkog oštećenja i/ili infarktnog tkiva u tkivima koja pate od deficita kiseonika. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za smanjenje neurološkog oštećenja i/ili infarkta u tkivu koje pati od deficita kiseonika. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, postupak sadrži davanje subjektu količine bilo koje kompozicije prema pronalasku koja je dovoljna za preokretanje količine infarktnog i ili neurološki oštećenog tkiva.

[0214] Subjekti koji mogu da prime agense za prenošenje kiseonika formirane postupcima prema pronalasku obuhvataju sisare, kao što su čovek, nehumani primat, pas, mačka, pacov, konj ili ovca. Dalje, subjekti koji mogu da prime agens koji sadrži kiseonik obuhvataju fetuse (prenatalne subjekte), post-natalne subjekte, ili subjekte u trenutku rođenja.

[0215] Kompozicija prema predmetnom pronalasku se može davati u cirkulatorni sistem injektiranjem kompozicije direktno i/ili indirektno u cirkulatorni sistem subjekta, jednim ili više postupaka injektiranja. Primeri direktnih postupaka injektiranja obuhvataju intravaskularne injekcije, kao što su intravenske i intraarterijske injekcije, i intrakardijačne injekcije. Primeri indirektnih postupaka injektiranja obuhvataju intraperitonealne injekcije, subkutane injekcije, tako da se agens za prenošenje kiseonika transportuje limfnim sistemom u cirkulatorni sistem ili injekcijom u koštanu srž pomoću trokara ili katetera. Agens za prenošenje kiseonika se prvenstveno daje intravenski.

[0216] Subjekt koji se tretira može biti normovolemičan, hipervolemičan ili hipovolemičan pre, tokom, i/ili posle infuzije kompozicije prema pronalasku. Kompozicija se može usmeriti u cirkulatorni sistem postupcima kao što su davanje inicijalne veće doze ili zamenskim postupcima.

[0217] Kompozicija prema pronalasku se može davati terapeutski, da bi se lečilo hipoksično tkivo u subjektu koje je nastalo zbog mnogih različitih uzroka, uključujući smanjeni protok RBC u delu ili u celom cirkulatornom sistemu, anemiju i šok. Dalje, agensi za prenošenje kiseonika se mogu davati profilaktički da bi se sprečio nedostatak kiseonika u tkivu subjekta, što bi moglo rezultovati mogućim ili očekivanim smanjenjem protoka RBC do tkiva ili u celom cirkulatornom sistemu subjekta. Kompozicije prema pronalasku se primenjuju terapeutski ili profilaktički za lečenje hipoksije.

[0218] U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u lečenju bolesti, povreda ili napada davanjem subjektu količine formulacije prema pronalasku koja je dovoljna za ostvarivanje lečenja. Hemoglobin je u CO obliku. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, ovaj konjugat je formulisan u fosfatnom puferovanom slanom rastvoru.

[0219] U različitim primerima izvođenja realizovana je PEG-Hb-CO formulacija prema pronalasku za primenu u lečenju ishemije. Ilustrativni tip ishemije koji se može lečiti ovom formulacijom je periferna ishemija, kao što je periferna dijatetička ishemija, i nizvodni efekti ishemije. Kao što se shvatiti stručnjaci iz odgovarajuće oblasti, kompozicije prema pronalasku su korisne i u lečenju drugih oblika ishemije.

[0220] U različitim primerima izvođenja pronalaskom su realizovane ovde opisane kompozicije za primenu u lečenju bolesti, povreda ili napada davanjem subjektu količine formulacije prema pronalasku koja je dovoljna za ostvarivanje lečenja. Hemoglobin je deoksigenovan ili može biti u CO obliku i formulisan je u hipertonični slani rastvor. Ilustrativne koncentracije soli za primenu u ovim formulacijama su od oko 4% do oko 8%, od oko 4.5% do oko 7.5% ili od oko 5% do oko 7%. Ilustrativne formulacije sadrže oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7% ili oko 8% soli. U jednoj formulaciji koncentracija soli je 7.5%. U različitim primerima izvođenja, so je NaCl. U različitim primerima izvođenja, ova formulacija se primenjuje za lečenje anemije srpastih ćelija, moždanog udara, infarkta miokarda ili traumatske povrede mozga.

[0221] U ilustrativnim primerima izvođenja, PEG-Hb-CO prema pronalasku se koriste za povećanje angiogeneze, povećanje vazodilatacije, zaštitu srca i bubrega od ishemije, aktiviranje mitohondrijalnih KATP kanala, smanjenje endotelne adhezije i infiltracije leukocita, smanjenje aktiviranja makrofaga i mikroglija, i/ili zaštitu cerebrovaskularne vaskularne reaktivnosti od disfunkcije indukovane napadom. Shodno tome, pronalaskom su realizovani postupci primene kompozicija prema pronalasku za ostvarivanje takvih rezultata.

[0222] Obično je podesna doza ili kombinacija doza agensa za prenošenje kiseonika prema pronalasku, ona količina koja kada se nađe u krvnoj plazmi rezultuje ukupnom koncentracijom hemoglobina u krvnoj plazmi subjekta između oko 0.1 do oko 10 grama Hb/dl, ili od oko 1 do oko 4 grama Hb/dl ili više, ako je potrebno za nadoknađivanje gubitaka većih zapremina krvi.

[0223] Kompozicija prema pronalasku se može davati subjektu na bilo koji korisni način. Na primer, u jednom primeru izvođenja, kompozicija se daje kao kontinualna infuzija unapred određenom brzinom tokom unapred određenog vremenskog perioda. U jednom ilustrativnom primeru izvođenja, inicijalna veća doza kompozicije prema pronalasku se daje tokom kratkog perioda kada je to prihvatljivo. Ova inicijalna "udarna doza" je praćena administracijom druge količine formulacije tokom najmanje oko 6 sati, najmanje oko 12 sati, najmanje oko 18 sati ili najmanje oko 24 sata. U različitim primerima izvođenja, druga količina je najmanje oko 60%, najmanje oko 80%, najmanje oko 100% ili najmanje oko 120% inicijalne "udarne doze."

[0224] Ilustrativne kompozicije prema pronalasku sadrže PEG-Hb konjugat u količini od oko 3% do oko 6%. Jedna ilustrativna kompozicija sadrži PEG-Hb konjugat u količini od oko 4%.

[0225] U širem smislu predmetnim pronalaskom je takođe realizovana primena sintetičkog agensa za prenošenje kiseonika na bazi konjugata hemoglobin-PEG za proizvodnju leka za reoksigenaciju hipoksičnog tkiva. Hipoksija može nastati usled bilo kakvog napada, povrede ili bolesti, uključujući, ali bez ograničavanja na hirurgiju, traumu, ishemiju, anemiju, infarkt miokarda, moždani udar, šok, dijabetes, i traumatsku povredu mozga, pri čemu se lek koji nosi kiseonik daje sistemski pojedincu koji ima ili se sumnja da ima jedno ili više tkiva sa deficitom kiseonika.

[0226] U svakom od gore navedenih postupaka, PEG-Hb može biti vezan za kiseonik, ugljen monoksid ili ni za jedan od njih. Sam PEG-Hb ili cela formulacija mogu biti formulisani tako da budu hipotonični, izotonični ili hipertonični u odnosu na toničnost subjektove krvi.

[0227] Sledeći primeri su predviđeni za ilustraciju izabranih primera izvođenja prema pronalasku i ne treba ih smatrati ograničavajućim za njegov obim.

PRIMERI

PRIMER 1

Prečišćavanje hemoglobina

[0228] Ovaj prvi korak je obuhvatao ispiranje krvnih ćelija odvojenih od plazme. U laboratorijskim razmerama ovo je bilo izvršeno ponovljenim ispiranjem, centrifugiranjem i odlivanjem. Ispostavilo se da je ovaj proces efikasniji nego vertikalna kontinualna protočna centrifuga.

[0229] Crvena zrnca su isprana 4x sa puferom (1.2% NaCl sa 10mM fosfata, pH 7.8). Crvena zrnca su onda lizirana (hemoglobin je ekstrahovan bez prave lize ćelija) sporim dodavanjem 1.5 zapremina WFI tokom perioda od 2 sata. Status lize (ponovo, ekstrakcija hemoglobina) je praćen uzorkovanjem provodnosti sve dok nije bila u opsegu od 5.50 - 7.00 μS. %Hb je određen korišćenjem Radiometar OSM3 Hemoksiimetra. Osmolalnost je takođe testirana i bila je u opsegu od 130 - 150 mOsmol. Kada je ekstrakcija hemoglobina bila završena, tada je sadržaj pod pritiskom bio isfiltriran kroz filter na bazi celuloze debljine 1μm, što je bilo praćeno sa sterilnim filterom na bazi polisulfona od 0.45/0.2μm u drugom rezervoaru koji je služio kao rezervoar za sledeći korak. Rastvor hemoglobina je onda pumpan kroz ultrafilter od 300Kd u izolovani rezervoar na 10 °C, što je služilo kao inicijalni korak za odstranjivanje virusa i odstranjivanje proteina visoke molekulske težine.

[0230] Hemoglobin je koncentrovan uz korišćenje 10KD MWCO sistema, a onda je deoksigenovan recirculacijom kroz kontaktnu membranu od šupljih vlakana sve dok rastvor hemoglobina nije imao manje od 10% HbO2. Stabilizator, cistein, je bio dodat pri kraju faze odstranjivanja kiseonika do finalne koncentracije od 5 mM. Stabilizator je potpomogao održavanje nivoa kiseonika na manje od 10% i takođe je delovao tako što je zaštitio hemoglobin tokom faze deaktivacije toplotom.

Razvoj koraka deaktivacije/ odstranjivanja virusa tokom proizvodnje hemoglobina

[0231] Pre nego što se goveđi hemoglobin može upotrebiti u proizvodu za ljude, potrebne su procedure za deaktivaciju bilo kog virusnog kontaminanta, uz održavanje funkcionalnosti aktivnog proteina biološkom. FDA zahteva virusnu deaktivaciju proteina koji potiču iz životinjskih proizvoda. Ovo se ostvaruje izlaganjem na 60° C sve dok nije izvršena virusna deaktivacija, u ovom slučaju tokom 4 sata. Rastvor je onda bio ohlađen i isfiltriran je kroz 0.45/ 0.2μ u rezervoar za držanje. Ovo je prečišćeni hemoglobin. Proizvod se podvrgava QC analizi sa FPLC (jedan jedini pik), vidljivoj spektralnoj analizi (pikovi na 540 nm i 577nm), SDS gel elektroforezi, %Hb, %HbO2, %MetHb, pH, osmolalnost, endotoksiin, lipidi, i slobodno gvožđe.

[0232] Kao što je prikazano na FIG.1 mehanički deoksigenovani hemoglobin je bio virusno deaktiviran toplotom, a ovaj goveđi hemoglobin deaktiviran toplotom je bio čist. Proces deaktivacije toplotom mehanički deoksigenovanog hemoglobina sa dodatim agensom za redukciju je održao niski nivo MET-Hb (manje od 10%), pri čemu je zadržan svoj integritet, što pokazuje donja tabela (Tabela 1). Izlaganje na 60° C tokom 10 sati nije imalo efekta na proizvod u deoksigenovanom (deoksi) obliku (sa dodatih 5 mM cisteina), u pogledu %tHb i %METHb. Ovo nije bio slučaj za goveđi hemoglobin u deoksigenovanom obliku bez cisteina, gde je približno 40% proteina bilo izgubljeno.

Tabela 1: Deoksigenacija hemoglobina stabilizuje proizvod pri deaktivaciji toplotom

PEGilacija hemoglobina

[0233] Pufer za razređivanje (25 mM natrijum fosfat, 120 mM natrijum bikarbonat i 4.5% NaCl, pH 8.0) je dodat da bi se rastvor hemoglobina doveo do koncentracije od 4-5%. Hemoglobin je PEGilovan uz korišćenje molskog odnosa od 17:1 PEG prema hemoglobinu. Reakcija je održavana na pH 7.6 - 7.8, pa je ostavljeno da se reakcija nastavi tokom jednog sata. Od ove tačke mogao se primeniti jedan od dva procesa.

Proces A

[0234] Dodato je 15mM cisteina da bi se reakcija zaustavila. Posle čuvanja rastvora preko noći na 4° C, rastvor je bio dijaliziran sa 20 zapremina pufera (5.0 mM natrijum bikarbonata, 1.0 mM natrijum fosfata, 150 mM natrijum hlorida, 4.7 mM kalijum hlorida, 2.5 mM magnezijum sulfata, 0.5 mM kalcijum hlorida, pH 8.1) uz korišćenje membrane sa razdelnom tačkom od 50Kd. PEG-Hb je onda bio razređen do 4%Hb, pa su mu dodati dekstroza (5mg/ mL) i cistein (5 mM), i rastvor je onda cirkulisao kroz kontaktnu membranu od šupljih vlakana sve dok %HbO2nije bio ispod 10%. Rastvor je onda aseptično isfiltriran u kese za krv. Proizvod se podvrgava QC analizi sa FPLC (jedan jedini pik), vidljivoj spektralnoj analizi (pikovi na 540 nm i 577nm), SDS gel elektroforezi, %Hb, %HbO2, %MetHb, pH, osmolalnost, endotoksiin, lipidi, i slobodno gvožđe.

Proces B

[0235] Dodato je 15mM cisteina da se zaustavi reakcija. Posle čuvanja preko noći na 4° C, rastvor je dijalizovan sa 20 zapremina pufera (5.0 mM natrijum bikarbonata, 1.0 mM natrijum fosfata, 150 mM natrijum hlorida, 4.7 mM kalijum hlorida, 2.5 mM magnezijum sulfata, 0.5mM kalcijum hlorida, pH 8.1) uz korišćenje membrane sa razdelnom tačkom od 50Kd. PEG-Hb je onda razređen do 4%Hb, pa su mu dodati dekstroza (5mg/ mL) i L-cistein (5 mM), i rastvor je stavljen u ugljen monoksidni oblik sporim barbotiranjem ugljen monoksida kroz rastvor uz konstantno mešanje sve dok %kiseonika nije bio manji od ’0’, a ugljen monoksida (CO) 95% ili više. Rastvor je onda aseptično isfiltriran u kese za krv.

Proizvod se podvrgava QC analizi sa FPLC (jedan jedini pik), vidljivoj spektralnoj analizi (pikovi na 540 nm i 577nm), SDS gel elektroforezi, %Hb, %HbO2, %MetHb, pH, osmolalnost, endotoksiin, lipidi, i slobodno gvožđe.

[0236] Dalje, toplotom deaktivirani hemoglobin je bio PEGilovan, a rezultujući PEG-Hb je bio čist i aktivan.

Fig.1: stabilnost PEG-Hb na 37°C

[0237] Tokom perioda od 120 dana nije bilo promene u % ukupnom Hb, % MET-Hb, %HbCO, i %HbO2u uzorku uskladištenom na 37C (Fig.1).

Razvoj ugljen monoksidnog oblika PEG-Hb

[0238] Cilj ovih studija je bio da se razvije ugljen monoksidni (CO) oblik PEG-hemoglobina. Izgleda da je ovaj oblik posebno stabilan u pogledu održavanja %MET-Hb formiranja na niskom nivou, kao što je prikazano na Fig.1. On je stabilniji od mehanički deoksigenovanog oblika.

[0239] Dalje, CO oblik PEG-Hb je bio uskladišten na 4° C i samo 1.0% se konvertovao u MET-Hb posle 8 nedelja skladištenja. Ova ista šarža PEG-Hb u CO obliku je imala 1.3% MET-Hb posle 12 nedelja na 4° C. Dalje, utvrđeno je da je CO oblik PEG-Hb koji je bio uskladišten na 18° C tokom 6 nedelja sadržao 7.9% MET-Hb, što je poraslo na 16.7% MET-Hb po isteku 10 nedelja na 18° C.

Efikasnost PEG-Hb/HS u preokretanju deficita kiseonika

[0240] U preliminarnim studijama za testiranje aktivnosti našeg PEG-Hb/HS u oksigenovanim tkivima, testirana je njegova sposobnost da poveća dopremanje kiseonika do tkiva i da preokrene deficit kiseonika u svinjskom modelu ozbiljnog traumatskog šoka.

[0241] Deficit kiseonika je mera koliko je potrošnja kiseonika u celom telu ispod nivoa potrebnog za održavanje aerobnog metabolizma. To je jedna fiziološka promenljiva za koju je pokazano da je u korelaciji i da predviđa preživljavanje, i komplikacije otkaza organa posle traumom indukovanog hemoragičnog šoka. U modelu su životinje krvarile do unapred određenog deficita kiseonika da bi se smanjila varijabilnost između životinja, tako da efekti ne zavise od količine gubitka krvi ili endogenog hemoglobina. Model omogućava kontinualno merenje potrošnje kiseonika (VO2), proizvodnje ugljen dioksida (VCO2), zasićenja venskog hemoglobina kiseonikom (SvO2), zasićenja arterijskog hemoglobina kiseonikom (SaO2) stepena ekstrakcije kiseonika (OER), deficita kiseonika, pulsa, krvnog pritiska, zasićenja hemoglobina u cerebralnom tkivu kiseonikom (StO2mozga), zasićenja hemoglobina tkiva skeletnog mišića ramena kiseonikom (StO2ramena), kardijačnog izlaza (CO), kao i merenje PO2u skeletnom mišiću, jetri, intestinalnoj mukozi, oralnoj mukozi, i bubrezima.

[0242] U modelu je hemoragija bila praćena bilateralnom povredom skeletnih mišića zadnjih udova i frakturom femura da bi se stvorila povreda tkiva koja odgovara povredi tkiva u borbi. Pokazalo se da je ovaj tip povreda tkiva nezavisno uticao na dopremanje kiseonika tkivu i da je rezultovao većim smanjenjem protoka krvi u utrobi u poređenju sa samom hemoragijom. Posle povreda skeletnih mišića i femura korišćenjem pištolja za omamljivanje, životinje su krvarile do unapred određenog deficita kiseonika od 80 mL/kg. Hemoragija do ujednačenog deficita kiseonika obezbeđuje da sve životinje imaju ograničenu varijabilnost svojih finalnih povreda pre tretmana i da znatno smanjuje varijabilnost odstranjene zapremine u odnosu na hemoragije izazvane pritiskom. Kod ovih životinja je deficit kiseonika praćen kontinualno i kumulativno. Deficit kiseonika je baziran na odstupanjima VO2ispod veličine osnovnih vrednosti uzetih pre povrede skeletnih mišića i meren je svakih 10 sekundi.

[0243] Posle povrede deficit kiseonika kod životinja je porastao tokom hemoragije. U trenutku kada je bilo dostignuto 100% ciljnog deficita kiseonika (80 mL/kg) kod povređenih životinja, životinja je primila infuziju od 500 cc PEG-Hb (PEG-Hb koncentracije od 4% i hipertonični slani rastvor od 5-7.5%) tokom vremenskog perioda od 15 min (period resuscitacije). Posle administracije PEG-Hb, deficit kiseonika se brzo preokrenuo (prosečni rezultati za 4 povređene životinje). Povećanje oksigenacije tkiva tokom perioda resuscitacije bilo je paralelno promenama u deficitu kiseonika, a onda se stabilizovalo tokom tročasovnog perioda.

[0244] Za razliku od PEG-Hb, tretiranje 2 životinje sa 500 mL hetaskroba (Hespan), standardnog tretmana pacijenata sa traumom, nije dovelo do preokretanja deficita kiseonika, kao ni Oxyglobin, HBOC proizvod koji je razvio Biopure kao zamenu za krv. Ovi nalazi su važni, jer oni, kao prvo, pokazuju da je tretman koji se sada koristi za traumu neefikasan u oksigenovanom tkivu i zbog toga je verovatno da će proizvesti ograničen efekat kod pacijenata pogođenih hemoragičnom šoku. Kao drugo, oni pokazuju da jedan od proizvoda koji su opsežno testirani kod ljudi i koji nije prošao klinička ispitivanja, Oxyglobin, nije uspeo da oksigenuje tkivo. Činjenica da je kompozicija prema pronalasku preokrenula deficit kiseonika jasno ukazuje da su kompozicija prema pronalasku i kompozicija firme Biopure veoma različite i da potencijal PEG-Hb/HS za lečenje trauma ne bi trebalo prosuđivati na osnovu neuspeha drugih HBOC’s.

[0245] Dalje, dve povređene životinje tretirane sa 500cc upakovanih crvenih krvnih zrnaca su imale smanjenje deficita kiseonika koje je bilo očekivano. Međutim, red veličine, odn. magnituda preokreta izgleda nije bila tako velika kao ona koju je indukovao PEG-Hb. Važno je da, čak i ako tretman sa upakovanim crvenim krvnim zrncima proizvodi isti efekat kao PEG-Hb, bi ovi rezultati podržali primenu PEG-Hb kao zamene za krv, pošto je cilj HBOC da bude efektivan kao transfuzija krvi.

[0246] Pored testiranja promena deficita kiseonika i dopremanja kiseonika do tkiva, takođe smo izmerili sublingvalnu mikrocirkulaciju kod životinja sa hemoragijom kao meru reperfuzije tkiva posle hemoragije.

Funkcionalna gustina kapilara je takođe bila kvantitativno izmerena kao ukupna dužina svih sudova na posmatranoj površini kao mera perfuzije tkiva. Kao što je uočeno tokom hemoragije, gustina kapilara se dramatično smanjila. Nasuprot tome, PEG-Hb tretman je doveo gustinu blizu osnovne vrednosti normalnih nivoa na kraju studije. Ovo se desilo uprkos krajnjem padu nivoa hemoglobina sa osnovne vrednosti od 12.3 g/dl na 7.1 g/dl. Kao što je uočeno, PEG-Hb infuzija je povećala funkcionalnu gustinu kapilara do većeg stepena nego Hetaskrob ili upakovana crvena zrnca.

PRIMER 2

[0247] Obrazloženje: U mišijem modelu ishemije zadnjih udova indukovane ligacijom femoralne arterije, miševi sa dijabetesom su ispoljili značajno pogoršano ponovno uspostavljanje protoka krvi i reakcije angiogeneze u poređenju sa nedijabetičnim životinjama. U ovoj studiji, mi smo testirali hipotezu da bi administracija Sangvinata olakšala ponovno uspostavljanje protoka krvi i angiogeneze.

[0248] Postupak i rezultati: C57BL/6 miševima starosti od 6 nedelja je bio izazvan dijabetes sa streptozotocinom (stz), a u starosti od 12 nedelja su bili podvrgnuti FA ligaciji praćenoj administracijom Sangvinata (20ml/kg/dnevno) intraperitonealnom (i.p.) injekcijom dnevno tokom 4 nedelje. Nosačem tretirani dijabetični miševi su primili i.p. injekciju sa jednakim zapreminama 1xPBS dnevno. Dijabetični miševi tretirani Sangvinatom su ispoljili znatno poboljšane odnose protoka krvi (ishemija/bez ishemije) laser-doplerskom analizom 28. dana posle FA ligacije u poređenju sa grupom tretiranom nosačem (63.36 ± 5.83 prema 44.39 ± 4.13 BFR (%), n≥9, p=0.019). Imunohistohemijsko bojenje sa CD31 na mišićnom tkivu je pokazalo znatno povećanu gustinu mikrosudova kod dijabetičnih miševa tretiranih sa Sangvinatom (Sanguinate™).28. dana posle FA ligacije u poređenju sa grupom tretiranom sa nosačem (663.86 ± 57.78 prema 461.44 ± 36.19 kapilara/mm<2>, p<0.0001). Posmatrani zajedno, ovi podaci otkrivaju značajne terapeutske efekte Sangvinata kod ishemije dijabetičnih udova u mišijem modelu i može obezbediti osnovu za upotrebu ovog agensa kao komplementarne vaskularno-spasavajuće terapije kod dugotrajnog dijabetesa.

[0249] Protokol: C57BL/6 miševima je izazvan dijabetes tipa 1 sa streptozotocinom (više injekcija sa niskim dozama). Jedan mesec posle indukcije dijabetesa, miševima je izazvana jednostrana ishemija zadnjih udova. U ovoj studiji su bili praćeni protok krvi i angiogeneza.

[0250] Procedura: Napravljena je incizija kože na gornjem delu butine miša. Leva noga je bila podvrgnuta hirurškoj proceduri, dok je desna noga bila podvrgnuta identičnoj proceduri osim što nije bila izvršena ligacija femoralne arterije. Ingvinalni ligament i gornja polovina femoralne arterije su bili izloženi. Vaskularni snop je bio ligatiran sa dve sterilne 8/0 neapsorbujuće svilene suture ispod ingvinalnog ligamenta proksimalno i neposredno iznad bifurkacije u superficijelnu i duboku femoralnu arteriju distalno. Svi arterijski i venski ogranci povezani sa izolovanim segmentom femoralnih sudova su bili podvezani sa 8/0 neapsorbujućim suturama. Konačno, vena i arterija su bile presečene između proksimalne i distalne ligature. Incizija kože je bila zatvorena sa sterilnom 5/0 najlonskom suturom.

[0251] Miševi #s i grupe: Na bazi naših preliminarnih studija, počeli smo sa >15 miševa po grupi da bi bili sigurni da imamo dovoljno miševa na kraju studije i da imamo dovoljno tkiva za analizu.

[0252] Eksperimenti su bili naizmenično raspoređeni da bi se pripremili dodatni miševi tretirani nosačem.

Grupa #1 - Dijabetični WT miševi 20 ml/kg/dnevno Sangvinata (IP) počevši neposredno posle ligacije femoralne arterije

Grupa #2 - Dijabetični WT miševi PBS (20 ml/kg/dnevno IP)

Ishodi

[0253] Laser-doplersko snimanje protoka krvi (28. dan) Naglašava se da je protok krvi ispitivan u levoj (povređenoj) i desnoj nozi (nepovređenoj) i da je onda naveden kao odnos leva/desna. Navedena je srednja vrednost za Dijabetes/Sangvinat i Dijabetes/PBS.

- Kvantitativna ocena angiogeneze korišćenjem bojenja sa CD31 i program kvantitativnog snimanja (28. dan) (leva noga)

Podaci

Ishod #1: kvantitativna ocena angiogeneze

[0254] 28. dana miševi su bili usmrćeni i uzeti su skeletni mišići zadnjih udova u distribuciji ligacije femoralne arterije, pa su podvrgnuti imunohistohemiji korišćenjem anti-cD31 IgG. Napravljeni su serijski snimci i izvršena je analiza snimaka da bi se odredili efekti Sangvinata na angiogenezu:

Ishod #2: Ponovno uspostavljanje protoka krvi

[0255] % ponovnog uspostavljanja protoka krvi pri poređenju uda sa ligatiranom femoralnom arterijom/kontralateralnog (nepovređenog) uda je bio određen korišćenjem laser-doplerskog snimanja. U ovim studijama, naveden je odnos između povređene noge i njene kontralateralne (naspramne) nepovređene noge tako što je u obzir uzeta bazalna vaskularna disfunkcija. Podaci su kao što sledi:

Zaključak

[0256] Administracija Sangvinata dijabetičnim miševima podvrgnutim ishemiji zadnjeg uda, indukovana ligacijom femoralne arterije, rezultovala je značajnim poboljšanjem kvantifikacije angiogeneze kada je upoređena sa nalazima kada je upotrebljen nosač. Administracija Sangvinata dijabetičnim miševima podvrgnutim ishemiji zadnjeg uda, indukovanoj ligacijom femoralne arterije, znatno je poboljšala ponovno uspostavljanje protoka krvi, što je bilo izmereno laser-doplerskim snimanjem, kada je upoređeno sa tretmanom sa nosačem (PBS).

PRIMER 3

[0257] Efekat transfuzije PEGilovanog CO-hemoglobina (PEG-COHb) je bio određen na anesteziranim pacovima koji su 2 sata bili podvrgnuti fokalnoj cerebralnoj ishemiji i 1 danu reperfuzije. PEG-Hb je bio uskladišten u karboksi stanju (PEGCOHb) da bi se obezbedio izvor CO i smanjila autooksidacija i povećao rok trajanja. Transfuzija 10 ml/kg PEGCOHb posle 20 minuta od ishemije nije izmenila arterijski krvni pritisak ili povećala protok crvenih zrnaca u ishemijskom jezgru. Hemoglobin u plazmi se povećao samo do 0.6 g/dL, ali se infarktna zapremina znatno smanjila i neurološki deficiti su bili poboljšani. Rana transfuzija PEG-COHb sa inicijalnom većom dozom zaštitila je mozak od ishemijskog moždanog udara.

Hirurška priprema

[0258] Sve procedure su bile odobrene od strane the Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. Anestezija je bila indukovana kod mužjaka Wistar pacova (250-350 g) sa 5% izoflurana i održavana je sa približno 2% izoflurana pomoću nosnog konusa sa spontanom ventilacijom tokom hirurgije. Koncentracija izoflurana je bila smanjena na približno 1.5% posle hirurgije. Udahnuti O2je bio približno 25-30%. Kateteri za transfuziju su bili umetnuti u femoralnu venu i u femoralnu arteriju za merenje arterijskog krvnog pritiska i uzimanje uzoraka arterijske krvi. Grejna lampa je bila upotrebljena za održavanje rektalne temperature tokom ishemije i rane reperfuzije. Bila je napravljena mala incizija u skalpu, a neravni mali otvor je bio pravljen u bočnoj parietalnoj kosti sve dok nije ostala samo mala debljina kosti. Sonda sa optičkim vlaknom od 1 mm je bila pričvršćena na stanjenu kost. Sonda je bila povezana sa laser-doplerskim meračem protoka koji je emitovao i primao svetlost blisku infracrvenoj i izračunavao promene protoka crvenih krvnih zrnaca. Signal laser-doplerskog protoka je bio upotrebljen za određivanje adekvatnosti vaskularne okluzije tokom ishemijskog perioda.

[0259] Prolazna fokalna cerebralna ishemija je bila indukovana intraluminalnom filamentnom tehnikom da bi se zaustavio protok krvi u srednju cerebralnu arteriju. Desna zajednička karotidna arterija je bila izložena kroz bočnu inciziju i onda je zatvorena. Zadnja spoljašnja karotidna arterija je bila disektovana i ligatirana, a okcipitalni arterijski ogranak spoljašnje karotidne arterije je bio izolovan i koagulisan.

Proksimalni pterigopalatinski arterijski ogranak desne unutrašnje karotidne arterije je bio ligatiran, i 4-0 monofilamentna najlonska sutura (sa zaobljenim vrhom) je pomerena napred približno 2 cm u unutrašnju karotidnu arteriju. Položaj filamenta je bio podešen tako da je stvorio najmanje 60% smanjenje signala laser-doplerskog protoka. Posle dva sata okluzije, počela je reperfuzija izvlačenjem intraluminalne suture. Posle praćenja tokom prvih 30 min reperfuzije, kateteri su bili odstranjeni, incizije su bile zatvorene sa suturama, i anestezija je prekinuta.

Dizajn eksperimenta

[0260] PEG-albumin i PEG-COHb su bili sintetizovani kod Prolong Pharmaceuticals (South Plainfield, New Jersey). Površinski lizinski ostaci na prečišćenom goveđem Hb su bili konjugovani sa PEG molekulske težine 5000. PEG-Hb rastvor je bio barbotiran sa CO da bi se konvertovalo >80% PEG-Hb u PEG-COHb pre skladištenja. Rastvori koji su sadržali 4-6% proteina su bili uskladišteni na 2-10°C u sterilnim kesama za krv. Bile su proučene tri grupe od 10 pacova: 1) bez transfuzije, 2) transfuzija sa goveđim PEGalbuminom, i 3) transfuzija sa goveđim PEG-COHb. Na dan eksperimenta, jedan alikvot rastvora je bio zagrejan i dat je kao transfuzija sa inicijalnom većom dozom ekvivalentnom 10 ml/kg telesne težine. Transfuzija je počela 20 min od MCAO. Brzina intravenske transfuzije je bila 0.5ml/min i trajala je približno 5-7 min. Srednja vrednost arterijskog pritiska i procenat promene laser-doplerskog protoka su bili snimani u 15-minutnim intervalima tokom 2 h od MCAO i 30 min od reperfuzije. Rektalna temperatura je bila praćena tokom 1 h od reperfuzije dok su se životinje oporavljale od anestezije u toplom okruženju. Arterijska krv (~0.7 ml) je bila uzorkovana kao osnovna vrednost, 1 h od MCAO, i 30 min od reperfuzije. pH, PCO2, PO2, i elektroliti u arterijskoj krvi su bili izmereni na radiometarskom gasnom analizatoru za krv (ABL80). Arterijska koncentracija Hb, O2zasićenje, MetHb, i COHb su bili izmereni na radiometarskom hemoksimetru (OSM3). Bila je analizirana koncentracija Hb u plazmi iz uzoraka. Neurološki deficiti pacova su bili ocenjeni 1 i 24 h od reperfuzije na skali 0-4 (0 = bez deficita, 1 = nemogućnost pružanja prednjeg uda tokom postavljanja, 2 = kretanje u krug, 3= slabost sa jedne strane, i 4 = bez spontane motorne aktivnosti). Posle 24 h, mozak je izvađen da bi se izmerila infarktna zapremina. Mozak je bio podeljen na 7 koronarnih sekcija (debljine 2 mm). Sekcije su bile obojene sa 1% rastvorom trifeniltetrazolijum hlorida, koji vijabilne regione boji crveno. Blede, nevijabilne oblasti cerebralnog korteksa i strijatuma su bile izmerene na anteriornim i posteriornim površinama svake sekcije. Infarktna zapremina svake sekcije je bila izračunata iz proizvoda debljine sekcije i prosečne infarktne oblasti na anteriornoj i posteriornoj površini. Ukupna infarktna zapremina za korteks i strijatum je bila dobijena sabiranjem zapremina svake sekcije. Vrednosti su bile izražene kao procenat cele strukture. Merenja između 3 grupe su bila upoređena sa ANOVA i Njuman-Keulsovim testom sa više opsega sa nivoom značajnosti od 0.05. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SO.

Rezultati

[0261] Arterijski pH, PCO2, i PO2su ostali stabilni i u fiziološkom opsegu tokom MCAO i rane reperfuzije u svim grupama pacova (Tabela 1). Nije bilo značajnih razlika između grupa sa transfuzijom 20 min od MCAO. Koncentracije elektrolita su ostale slične između grupa posle transfuzije (Tabela 2). Kao što je očekivano za transfuziju proteina u inicijalnoj većoj dozi, došlo je do malih smanjenja hematokrita (Tabela 3).

Tabela 1. Arterijski pH i gasovi u krvi u toku i posle 2 h od okluzije srednje cerebralne arterije (MCAO) u grupama bez transfuzije ili sa transfuzijom 20 min od MCAO (srednja vrednost ± SO; n = 10)

Tabela 2. Elektroliti u arterijskoj krvi u toku i posle 2 h od MCAO u grupama sa bez transfuzija ili sa transfuzijom 20 min od MCAO (srednja vrednost ± SO; n = 10)

Tabela 3. Analiza hemoglobina u celoj krvi u toku i posle 2 h od MCAO u grupama bez transfuzije ili sa transfuzijom 20 min od MCAO (srednja vrednost ± SO; n = 10)

[0262] Međutim, ne postoje značajne razlike u hematokritu ili Hb koncentraciji u celoj krvi kod PEGCOHb-transfuzione grupe u poređenju sa PEG-albumin-transfuzionom grupom. Procenti MetHb i COHb u celoj krvi su bili blago povećani posle transfuzije PEG-COHb (Tabela 3). Analiza Hb u plazmi za 60 min od MCAO (oko 35 min posle završetka PEG-COHb transfuzije) je pokazala koncentracije od 0.6 ± 0.1 g/dL (6SO), a nivo je ostao relativno nepromenjen tokom 30 min od reperfuzije. Procenat COHb u Hb u plazmi je bio 11 ± 4% za 60 min od MCAO i 6 ± 1% za 30 min od reperfuzije. Veličine srednje vrednosti arterijskog krvnog pritiska su prikazane na FIG.3A. Mada je postojala tendencija da se pritisak blago poveća tokom produženog MCAO u PEG-COHb grupi, vrednosti nisu bile značajno različite između grupa u bilo kom vremenskom trenutku. Laser-doplerski protok je bio praćen preko bočnog korteksa gde je ishemija najjača. Vrednosti su prikazane na FIG.3B. U svim grupama, protok se inicijalno smanjio na približno 25% od osnovne vrednosti, a tokom vremena se blago povećao na približno 30% od osnovne vrednosti. Sa reperfuzijom, protok je bio uspostavljen na približno 80% od osnovne vrednosti u svim grupama. Nije bilo značajnijih razlika između grupa u bilo kom vremenskom trenutku. Rektalna temperatura je bila održavana u opsegu od 36.5-37.0°C tokom ishemije i 1 h od reperfuzije pošto su se pacovi probudili iz anestezije. Pored toga, kod pacova se nije pojavila groznica tokom 24 h. Posle buđenja iz anestezije, skorovi neurološkog deficita su bili slični između grupa (FIG.

4). Međutim, posle ponovnog testiranja za 24 h, skorovi neurološkog deficita su se selektivno poboljšali kod PEG-COHb grupe. Vrednosti za infarktnu zapreminu na svakom koronarnom nivou i ukupne infarktne zapremine su prikazani na FIG.5. Infarktna zapremina je bila slična kod grupe bez transfuzije i kod PEGalbuminske grupe. Infarktna zapremina je bila znatno smanjena u grupi sa transfuzijom PEGCOHb u poređenju bilo sa grupom bez transfuzije ili grupom sa transfuzijom PEG-albumina. U PEG-COHb grupi, infarktna zapremina je bila smanjena za 82% u korteksu i 56% u strijatumu u odnosu na PEG-albuminsku grupu (FIG.6). Smanjenje infarktne zapremine je bilo prisutno u svakoj od 5 najanteriornijih sekcija, što je ukazalo da je spasavanje tkiva bilo rašireno na celoj oblasti distribucije srednje cerebralne arterije.

Diskusija

[0263] Stepen spasavanja tkiva sa PEG-COHb transfuzijom sa inicijalnom većom dozom tokom prolazne fokalne cerebralne ishemije je u suštini veći od onog koji je opisan za hipervolemijsku zamensku transfuziju sa αα-umreženim Hb kod pacova ili polimernim Hb kod miševa. Ovaj nalaz je značajan zbog toga što je koncentracija Hb u plazmi koja je održana sa inicijalnom većom dozom od 10 ml/kg bila 0.6 g/dL, što je znatno manje od 2-2.5 g/dL koliko se obično održava sa 30-40% zamenske transfuzije fluida koja sadrži 6 g/dL Hb. Pored toga, povećanje koncentracija αα-umreženog Hb u plazmi daljim povećanjem koncentracije Hb u transfuzionom fluidu od 10 g/dL do 20 g/dL dovodi do dodatnih smanjenja infarktne zapremine. Ova poređenja sugerišu da PEG-COHb može biti superioran po molu hema u poređenju sa αα-umreženim Hb i polimernim Hb za spasavanje mozga od moždanog udara. Rezultati ukazuju da nisu potrebne velike koncentracije PEGilovanog COHb u plazmi za spasavanje mozga. Teorijska prednost zamenske transfuzije je ta što se viskoznost cele krvi može smanjiti smanjenjem hematokrita, a time i stimulacijom kolateralnog protoka krvi. Prednost transfuzije sa inicijalnom većom dozom u odnosu na zamensku transfuziju je ta što bi ovaj protokol bilo lakše primeniti kod kliničkog moždanog udara i što se 10 ml/kg zapremine lako toleriše bez izazivanja značajnije hipervolemijski indukovane hipertenzije. U aktuelnog studiji nije bila uočena značajna hipertenzija. Spasavanje pomoću PEG-COHb izgleda nije povezano sa povećanjem protoka krvi u ishemijsko jezgro korteksa, kao što je utvrđeno laser-doplerskom protokometrijom na jednom mestu. Međutim, moguće je da je kolateralni protok krvi u ishemičnom graničnom regionu bio dovoljno poboljšan da bi spasao tkivo. Viskoznost PEGilovanog Hb rastvora je bliža onoj kod cele krvi u poređenju sa rastvorima umreženog i polimernog Hb i shodno tome može bolje održati endotelno smicajno naprezanje i sa njime povezano stvaranje NO, što bi moglo pomoći pri održavanju dilatacije kolateralnih arterija.

[0264] Transfuzija od 10-ml/kg sa inicijalnom većom dozom PEG-albumina i PEG-COHb dovela je do smanjenja hematokrita približno od 8-10%. Ovo relativno malo smanjenje hematokrita će imati samo mali efekat na viskoznost krvi i nije verovatno da poboljšava perfuziju dovoljno da bi smanjilo povredu mozga smanjenjem viskoznosti krvi. Nedostatak razlike između infarktnih zapremina grupe sa transfuzijom PEG-albumina i grupe bez transfuzije u ovoj studiji i u prethodnoj studiji sa većim hemorazređivanjem podržava ovu premisu. Pored toga, povećanje [Hb] u plazmi na 0.6 g/dL posle PEG-COHb u inicijalnoj većoj dozi je bilo neadekvatno da neutrališe smanjenje hematokrita. Shodno tome, [Hb] cele krvi i arterijski O2sadržaj nisu bili povećani PEG-COHb transfuzijom. Međutim, čak i u odsustvu povećanja arterijskog O2sadržaja ili protoka krvi, O2nosač u plazmi može da bude u stanju da poveća predaju O2ishemičnom tkivu iz nekoliko razloga. Kao prvo, rastvorljivost kiseonika u plazmi je niska i predstavlja glavno mesto otpora difuziji O2među crvenim zrncima i mitohondrijama u tkivu. Donošenjem velike količine O2u plazmu je olakšan transport O2iz membrane crvenih zrnaca do endotela. U ovom pogledu, efikasnost transfuzije Hb polimera tokom MCAO se gubi kada rastvor primarno sadrži polimere molekulske težine veće od 14 MDa. Izgleda da aktuelni goveđi PEG-Hb sa približno 8-10 bočnih lanaca PEG molekulske težine od 5000 predstavlja dobar balans između toga da su dovoljno mali da imaju visoku mobilnost radi olakšanja transporta O2u plazmi, ali i da su dovoljno veliki da ograniče ekstravazaciju. Kao drugo, protok crvenih zrnaca kroz pojedinačne mikrosudove je heterogen, a ova heterogenost se amplifikuje pod uslovima niskog perfuzionog pritiska tokom nepotpune ishemije. Zahvaljujući dopremanju O2putem protoka plazme u kapilarima koji su lišeni crvenih zrnaca, dopremanje O2između kapilara može postati homogenije. Kao treće, crvena zrnca su čestice, a njihova površina ne pokriva celu površinu kapilarnog endotela u bilo kom trenutku. O2nosač u plazmi povećava efektivnu površinu za difuziju O2. Zato bi infuzija HB bez ćelija u inicijalnoj većoj dozi mogla da uključi nekoliko mehanizama dopremanja O2nezavisnih od glavnog arterijskog O2sadržaja i makroskopskog protoka krvi.

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja sadrži kovalentni konjugat između funkcionalnog, prirodnog molekula hemoglobina i najmanje jednog molekula poli(etilen glikola), pomenuta kompozicija sadrži:

a. vodorastvornu frakciju hemoglobina koja sadrži grupu molekula hemoglobina, pri čemu je svaki element pomenute grupe molekula hemoglobina;

i. kovalentno konjugovan sa najmanje jednim molekulom pomenutog poli(etilen glikola) preko amino grupe aminokiselinskog ostatka (npr. ε-amino grupe lizinskog ostatka); ii. ne sadrži hemijske agense za umrežavanje; i

iii. ima P50od 9 mm Hg do 14 mm Hg; i

b. vodorastvornu frakciju stabilizatora koja daje pomenutoj grupi molekula hemoglobina otpornost protiv oksidacije, a pomenuta frakcija sadrži stabilizator koji sadrži strukturni element koji je reaktivniji sa kiseonikom nego pomenuta grupa molekula hemoglobina; i c. frakciju razređivača koja sadrži farmaceutski prihvatljivi razređivač u kome je rastvorljiva pomenuta frakcija hemoglobina,

u pomenutoi kompoziciji nema virusne aktivnosti, i stabilno sadrži manje od 5% metemoglobina;

pomenuta kompozicija se dobija postupkom koji sadrži:

i. podvrgavanje rastvora deoksigenovanog hemoglobina i stabilizatora procesu termičke deaktivacije virusa koji sadrži, izlaganje pomenutog rastvora temperaturi koja je dovoljno povišena da deaktivira celokupnu virusnu aktivnost u pomenutom rastvoru (npr.60 °C), pri čemu je pomenuto izlaganje vremenski dovoljno dugo da se ostvari pomenuta deaktivacija celokupne virusne aktivnosti u pomenutom rastvoru (npr.10 sati), a pomenuti stabilizator sadrži strukturni element koji je reaktivniji sa kiseonikom nego pomenuti deoksigenovani hemoglobin u pomenutom rastvoru, čime se minimizira vezivanje kiseonika za pomenuti deoksigenovani hemoglobin, pri čemu pomenuti rastvor sadrži količinu pomenutog stabilizatora koja je dovoljna za sprečavanje formiranja više od 5% metemoglobina u pomenutom procesu termičke deaktivacije virusa; i onda reoksigenaciju pomenutog deoksigenovanog hemoglobina da bi se formirao virusno deaktivirani reoksigenovani rastvor hemoglobina; i

ii. dovođenje u kontakt pomenutog virusno deaktiviranog reoksigenovanog rastvora hemoglobina iz koraka (i) sa aktiviranim molekulom poli(etilen glikola) sa reaktivnosti komplementarnom sa aminokiselinskim ostatkom pomenutog hemoglobina, čime se formira kovalentni konjugat između poli(etilen glikola) i molekula hemoglobina u pomenutom rastvoru.

2. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu je svaki element pomenute grupe molekula hemoglobina kovalentno konjugovan sa pet ili više pomenutih poli(etilen glikol) grupa preko pomenute amino grupe od pet ili više pomenutih aminokiselinskih ostataka.

3. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je pomenuti molekul hemoglobina vezan za element izabran između kiseonika i ugljen monoksida.

4. Kompozicija prema zahtevu 3, pri čemu pomenuti molekul hemoglobina može da prenese element izabran između pomenutog vezanog kiseonika i pomenutog vezanog ugljen monoksida do tkiva sa kojim je pomenuti hemoglobin u kontaktu.

5. Kompozicija prema zahtevu 1, koja je dobijena pomenutim postupkom, a koja dalje sadrži jedan ili više od sledećih: (iii), pre koraka (i), deoksigenaciju rastvora oksigenovanog hemoglobina, čime se formira pomenuti rastvor pomenutog deoksigenovanog hemoglobina; i (iv), pre koraka (i), formiranje pomenutog rastvora pomenutog deoksigenovanog hemoglobina sa pomenutim stabilizatorom.

6. Kompozicija prema zahtevu 5, pomenuta deoksigenacija stvara deoksigenovani molekul hemoglobina, koji (i) nije vezan ni za kiseonik, ni za ugljen monoksid; ili (ii) je vezan za ugljen monoksid.

7. Kompozicija prema zahtevu 5, pri čemu je pomenuti molekul hemoglobina vezan za element izabran između kiseonika i ugljen monoksida.

8. Kompozicija prema zahtevu 7, pri čemu pomenuti molekul hemoglobina može da prenosi element izabran između pomenutog vezanog kiseonika i pomenutog vezanog ugljen monoksida do tkiva.

9. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu je hemoglobin vezan za CO.

10. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu hemoglobin nije vezan za CO.

11. Kompozicija prema zahtevima 9 i 10, pri čemu

a. kada je hemoglobin vezan za CO, onda frakcija razređivača sadrži fosfatni puferovani slani rastvor; i

b. kada hemoglobin nije vezan za CO, onda frakcija razređivača sadrži hipertonični slani razređivač.

12. Kompozicija prema zahtevu 11 pri čemu pomenuti hipertonični slani razređivač sadrži NaCl u koncentraciji od 3% do 7%.

13. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 12 za primenu u:

(i) snabdevanju tkiva kiseonikom ili ugljen monoksidom;

(ii) lečenju: traume, hemoragičnog šoka, ishemije, reperfuzine povrede ili anemije srpastih ćelija, u svakom slučaju uz održavanje dilatacije kolateralnih arterija;

(iii) indukciji angiogeneze ili povećanju protoka krvi u tkivima;

(iv) lečenju ili precenciji hipoksije nastale usled gubitka krvi, anemije, šoka, infarkta miokarda, moždanog udara ili traumatske povrede mozga; ili

(v) hiperoksigenaciji tumora radi poboljšanja terapeutskog efekta zračne terapije ili hemoterapije.

14. Kompozicija prema zahtevu 1, dobijena pomenutim postupkom u kome je pomenuta temperatura oko 60 °C.

15. Kompozicija prema zahtevu 1, dobijena pomenutim postupkom u kome je pomenuto vreme od oko 1 do oko 12 sati.

16. Kompozicija prema zahtevu 1, dobijena pomenutim postupkom, pri čemu je pomenuti stabilizator aminokiselina.

17. Kompozicija prema zahtevu 16, pri čemu je pomenuti stabilizator cistein.