RS56538B1 - (tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il jedinjenja kao dvostruko delujućih h1 inverzni agonisti/5-ht2a antagonisti - Google Patents

Description

Opis

[0001] Histamin igra važnu ulogu u različitim fiziološkim procesima preko svoje interakcije sa najmanje četiri različita G-protein udvojena receptora, H1-H4 receptora. U CNS, H1 receptori igraju ključnu ulogu u regulaciji ciklusa spavanja a zna se da H1 antagonisti/inverzni agonisti indukuju pospanost

[0002] Isto tako, serotonin igra važne uloge u različitim fiziološkim procesima preko svoje interakcije sa najmanje četrnaest različitih G-protein udvojenih receptora. Modulacija 5-HT2Areceptora u CNS igra ključnu ulogu u regulaciji ciklusa spavanja a pokazano je da 5-HT2Aantagonisti poboljšavaju sporotalasno spavanje i održavanje sna kod pacijenata sa insomnijom [0003] Jedinjenja koja imaju aktivnost H1 ili 5-HT2Ainverznog agonista ili antagonista se koriste u tretmanu insomnije (na primer, doksetin i trazodon, tim redom) i ispoljavaju značajne farmakološke efekte u studijama spavanja životinja. Međutim, trenutno su na tržištu raspoloživi ne selektivni dvostruko delujući H1/5-HT2Ainverzni agonisti/antagonisti.

[0004] WO 2007/022068 opisuje neka supstituisana (tieno[2,3-b][1,5]benzodiazepin-4-il)piperazin-1-il i (tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il jedinjenja za lečenje poremećaja spavanja.

[0005] Ovaj pronalazak daje 3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatnu kiselinu i njene farmaceutski prihvatljive soli, koja ima visoku potenciju inverznog agonista za H1 receptor, visoku potenciju antagonista za 5-HT2Areceptor, i dobru selektivnost za ove receptore, posebno u odnosu na druge histamin receptore, serotonin receptore i druge fiziološki relevantne receptore, posebno u odnosu na 5-HT2Creceptor, GABAAreceptor, muskarinske receptore, dopaminergične receptore, adrenergične receptore i hERG kanal. Preko modela životinja ova jedinjenja takođe pokazuju da mogu da budu korisna za tretman poremećaja spavanja koje karakteriše održavanje lošeg sna. Kao takva, veruje se da jedinjenja mogu da budu korisna za tretman poremećaja spavanja koje karakteriše oskudna latencija spavanja ili oskudno održavanje sna ili oba, kao što je tretman insomnije, kao na primer hronične ili prolazne primarne insomnije, ili hronične ili prolazne sekundarne insomnije, ili oba. Primeri sekundarne insomnije uključuju, ali bez ograničenja na, insomniju povezanu sa depresivnim poremećajima (na primer, major depresivni poremećaj, distimija, i/ili ciklotimija), insomniju povezanu sa anksioznim poremećajima (na primer, opšti anksiozni poremećaj with anxiety disorders (e.g. opšti anksiozni poremećaj i/ili socijalna fobija), insomniju povezanu sa bolom (na primer, fibromijalgija, hronični bol kostiju ili zglobova, kao što je bol povezan sa inflamatornim artritisom ili osteoartritisom, ili dijabetični neuropatični bol), insomniju povezanu sa alergijskim reakcijama (na primer, alergijska astma, pruritis, rinitis, kongestija, itd), insomniju povezanu sa poremećajima pluća ili disajnih puteva (na primer, sa opstruktivnom apneom u snu, reaktivnom bolešću disajnih puteva, itd.), insomniju povezanu sa psihijatrijskim poremećajima, demencijom i/ili neurodegenerativnim bolestima i/ili insomnija povezana sa poremećajem cirkadijalnog ritma spavanja (na primer, poremećaj spavanja izazvan smenskim radom, jet lag poremećaj, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja i sindrom 24-časovnog poremećaja spavanja, itd.)

[0006] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. To jest, to je 3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatna kiselina ili njena farmaceutski prihvatljiva so.

[0007] U narednom aspektu pronalaska, data je farmaceutska kompozicija koja uključuje jedinjenje Formule I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijentom. Osim toga, ovaj aspekt pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za lečenje insomnije, kao što su, na primer, insomnija koju karakteriše produžena latencija spavanja ili oskudno održavanje sna ili oba, kao što su, na primer, primarna insomnija, jet lag, poremećaj spavanja izazvan smenskim radom, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja, i/ili poremećaj dnevno-noćnog ritma budnosti i spavanja, koja uključuje jedinjenje Formule I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinacji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, nosača ili razblaživača.

[0008] Naredno otelotvorenje ovog aspekta pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje u skladu sa Formulom I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, ekscipijentom ili razblaživačem i opciono sa drugim terapeutskim sredstvima.

[0009] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za lečenje insomnije, kao što je, na primer, insomnija koju karakteriše produžena latencija spavanja ili oskudno održavanje sna ili oba, kao što su, na primer, primarna insomnija, jet lag, poremećaj spavanja izazvan smenskim radom, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja, i/ili poremećaj dnevno-noćnog ritma budnosti i spavanja, kod sisara koji uključuje primenu na sisaru kome je potreban ovakav tretman efektivne količine jedinjenja Formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. U jednom posebnom otelotvorenju ovih postupaka tretmana, sisar je čovek.

[0010] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje Formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u terapiji. U okviru ovog aspekta, pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u tretmanu insomnije. U narednim otelotvorenjima, insomnija se karakteriše produženom latencijom spavanja ili oskudnim održavanjem sna ili oba, kao što su, na primer, primarna insomnija, jet lag, poremećaj spavanja izazvan smenskim radom, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja, i/ili poremećaj dnevno-noćnog ritma budnosti i spavanja. Jedno posebno otelotvorenje ovog aspekta pronalaska su upotrebe na sisarima, posebno ljudima..

[0011] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, u proizvodnji medikamenta za tretman insomnije, kao što je, na primer, primarna insomnija koju karakteriše produžena latencija spavanja ili oskudno održavanje sna ili oba, kao što su, na primer, primarna insomnija, jet lag, poremećaj spavanja izazvan smenskim radom, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja, i/ili poremećaj dnevno-noćnog ritma budnosti i spavanja.

[0012] Zbog jasnoće, u toku ove aplikacije se koristi naredno označavanje strukture tricikličnog prstena:

[0013] Jedinjenje iz ovog pronalaska ima bazne i kisele delove i u skladu sa tim reaguje sa brojnim organskim i neorganskim kiselinama i bazama da formira farmaceutski prihvatljive soli. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja iz ovog pronalaska se smatraju delom okvira ovog pronalaska. Kako se ovde koristi, naziv "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na bilo koju so jedinjenja iz pronalaska koja je potpuno ne-toksična za žive organizme. U ovakve soli spadaju one koje su navedene u Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977), koji je poznat stručnjaku sa iskustvom.

[0014] Skraćenice koje su ovde korišćene su definisane na sledeći način:

"Slani rastvor" označava zasićeni vodeni rastvor NaCl.

"DMEM" označava Dulbekov minimum Eagle-ove podloge.

"DMSO" označava dimetil sulfoksid.

"EDTA" označava etilendiamintetrasirćetnu kiselinu.

"Equiv" označava ekvivalent(e).

"FBS" označava serum fetusa govečeta.

"HEPES" označava 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonsku kiselinu.

"HPLC" označava visoko efikasnu tečnu hromatografiju.

"hr." označava označava sat ili sate.

"IC50" označava koncentraciju pri kojoj se postiže 50% maksimalne inhibicije.

"LC-MS" označava HPLC-masenu spektrografiju.

"MeOH" označava metanol.

"min." označava minut ili minute.

"MS" označava masenu spektroskopiju.

"MS (ES+)" označava masenu spektroskopiju uz korišćenje elektrosprem jonizacije. "NMR" označava nuklearnu magnetnu rezonancu.

"RO" označava zauzeti receptor.

"THF" označava tetrahidrofuran.

Opšta hemija

[0015] Jedinjenje iz ovog pronalaska može da se izradi u skladu sa narednim sintetičkim primerima.

Izrada 1.2,5-dihlortiofen-3-karbonil hlorid

[0016]

[0017] U suspenziju 2,5-dihlor-tiofen-3-karboksilne kiseline (49.7 g; 252.23 mmola; 1.00 equiv) u dihlormetanu (500 mL), se doda dimetilformamid (0.5 mL; 6.47 mmola) a nakon toga u toku 1.5 h se dodaje 2 M rastvor oksalil hlorida u dihlormetanu (138.73 mL; 277.45 mmola; 1.1 equiv) (ventilom se izdvaja gas kroz kaustični rastvor). Dobijeni bistar rastvor se meša 1 h na sobnoj temperaturi dok ne prestane izdvajanje gasa i dok se pomoću LCMS ne konstatuje da je reakcija završena (neutrališe se uzorak u smeši 7 M NH3/MeOH za praćenje reakcije). MS (m/z): = 195.9, 197.9 (M+H)<+>za odgovarajući primarini amid. Uparavanjem do sušenja se dobija naslovljeni međuproizvod kao braon ulje (55 g, 252 mmol, kvantitativno).

Izrada 2.2,5-dihlor-N-(2-hidroksi-4-metil-fenil)tiofen-3-karboksamid

[0018]

[0019] U rastvor 6-amino-m-krezola (34.14 g; 277.20 mmola; 1.1 equiv) u THF (450 mL) se doda piridin (40.76 mL; 504.00 mmola; 2 equiv), a nakon toga u toku 30 min rastvor 2,5-dihlortiofen-3-karbonil hlorida (54.30 g, 252 mmola, 1.00 equiv) u THF (250 mL), koristeći ledeno kupatilo za održavanje temperature između 15-20°C. Dobijena gusta smeša se meša 1 h na sobnoj temperaturi nakon čega se pomoću LCMS utvrdi da je aminofenol potpuno utrošen. Reakcija se sipa u smešu 2 M vodenog rastvora HCl (500 ml) i leda (250 ml), uz mućkanje. Dobijena bež čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem, dobro ispere sa vodom i suši na vazduhu. MS (m/z): = 301.84, 303.94 (M+H)<+>. Suši se u vakuumskoj pećnici na 40°C preko P2O5u toku noći da se dobije naslovljeni međuproizvod (84.5g, kvantitativni utrošak).

Izrada 3.2-hlor-8-metil-5H-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-on

[0020]

[0021] U dobro izmešanu suspenziju 2,5-dihlor-N-(2-hidroksi-4-metilfenil)tiofen-3-karboksamida (76.15 g; 252 mmola; 1.00 equiv) u dimetil sulfoksidu (450 mL) se doda kalijum karbonat (38.31 g; 277.20 mmola; 1.1 equiv) i smeša zagreva 4.5 h na 100-110°C da se pomoću LCMS potvrdi da je došlo do potpune konverzije. Smeša se ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu i polako se doda u dve odvojene posude koje sadrže 1 M vodeni rastvor hlorovodonične kiseline (500 ml), pri čemu se izdvaja gas. Meša se 0.5 h na sobnoj temperaturi a dobijena tamno siva čvrsta supstanca sakupi filtriranjem. Ispere se po redu sa vodom, zatim sa malom količinom etanola, pa sa malom količinom dietil etra. Suši se u vakuumskoj pećnici na 45°C u toku noći da se dobije naslovljeni međuproizvod (58.5g, 87%). MS (m/z): = 265.99 (M+H)<+>.

Izrada 4.2,4-dihlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin

[0022]

[0023] Boca sa okruglim dnom zapremine 1 L se napuni sa metoksibenzenom (225 mL, 5V), 2-hlor-8-metil-5H-tieno[2,3b][1,5]benzoksazepin-4-onom (45 g; 169.4 mmola; 1 equiv) i N,N-dimetilanilinom (47.2 g; 389.5 mmola; 2.3 equiv). Zagreje se na 60°C i u kapima se u toku 0.5 h dodaje fosforil hlorid (85.7 g; 558.9 mmola; 3.3 equiv). Zagreje se na 100°C i meša 2 h dok TLC analiza ne pokaže da je reakcija završena. Ohladi se na 40-60°C i upari da se dobije naslovljeni međuproizvod kao tamno braon čvrsta supstanca (123.1 g, 433.2 mmola, 256% prinos nekorigovan analizom). MS (m/z): 283.8 (M+H).

Izrada 5. Metil 3-[4-(2-hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoat

[0024]

[0025] Boca sa okruglim dnom zapremine 1L se napuni sa 2,4-dihlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepinom (121.1 g; 169.4 mmola; 1.0 equiv), zatim sa acetonitrilom (600 mL, 12.5V), a nakon toga sa kalijum karbonatom (119.4 g; 863.9 mmola) u jednoj porciji. Meša se 10-20 min a nakon toga se doda metil 2,2-dimetil-3-(piperazin-1-il)propanoat dihidrohlorid (55.54 g; 203.3 mmola; 1.2 equiv) u jednoj porciji. Zagreje se na 80°C i meša 30 h. Smeša se koncentruje do sušenja pod vakuumom, a nakon toga se u smešu dodaju etil acetat (1920 mL, 40V) i voda (1920 mL, 40V). Smeša se meša, filtrira a nakon toga vodena faza izdvoji i ekstrahuje sa etil acetatom (960 mL, 20V). Organske faze se kombinuju i isperu sa vodom (960 mL 32) i slanim rastvorom (200 mL, 4V). Koncentrisanjem i prečišćavanjem na koloni silika gela (petrol etar/etil acetat (0 to 10%)) dobija se naslovljeni međuproizvod kao žuta čvrsta supstanca (55.4 g, 123.7 mmola, 95.8% čistoće, 73.0% prinos nekorigovan analizom). MS (m/z): 448.2 (M+H).<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.03 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 3.67(s, 3H), 3.47 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 2.58-2.54 (q, 6H), 2.28 (s, 3H), 1.19 (s, 6H).

Izrada 6. Metil 3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetilpropanoat

[0026]

[0027] Smeša metil 3-[4-(2-hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoata (30.00 g, 66.97 mmol), ciklopropilborne kiseline (7.48 g, 87.06 mmol), tribaznog kalijum fosfat n-hidrata (49.75 g, 234.38 mmol), tricikloheksilfosfin tetrafluoroborata (2.47 g, 6.7 mmol), vode (13.39 mL, 13.39 g, 743.4 mmol) i toluena (267.87 mL, 233.36 g, 2.53 mol) se 10 min degasira sa azotom. Doda se paladijum (II) acetat (0.751 g, 3.35 mmol) i meša na 100°C u toku noći. Reaktivna smeša se ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu, doda se voda i reaktivna smeša ekstrahuje sa etil acetatom. Etil acetat ekstrakt se suši (Na2SO4), koncentruje i prečisti hromatografijom na silika gelu (ISCO) uz eluiranje sa gradijentom etil acetat / izoheksan (0%: 100% do 20%:80%). Frakcije koje sadrže produkt se sakupe i koncentruju. Koncentrat se prečisti hromatografijom koristeći superkritičnu tečnu (CO2) hromatografiju sa 25 % etanolom i 0.2% dimetilaminom. Frakcije koje sadrže produkt se sakupe, koncentruju i dobijena čvrsta supstanca suši 6 h pod vakuumom na 40°C da se dobija metil 3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]2,2-dimetil-propanoat (23.73 g, 82.93%) MS (m/z): 454.25 (M+H).<1>H NMR (300.11 MHz, CDCl3): 6.98 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 6.88 (dd, J= 1.4, 8.0 Hz, 1H), 6.81 (d, J= 1.5 Hz, 1H), 6.29 (d, J= 0.9 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.50-3.47 (m, 4H), 2.58-2.54 (m, 6H), 2.27 (s, 3H), 1.94-1.89 (m, 1H), 1.58 (s, 1H), 1.19 (s, 6H), 0.94-0.87 (m, 1H), 0.65-0.59 (m, 1H).

Primer 1.3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatna kiselina

[0028]

[0029] Natrijum hidroksid (9.27 g, 231.68 mmol) se doda u suspenziju metil 3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoata (35.03 g, 77.23 mmol) u vodi (210.18 mL,) i izopropil alkoholu (210.18 mL) i zagreva 45 min na 85 °C. Ohladi se na sobnu temperaturu i neutrališe sa 2M rastvorom hlorovodonične kiseline do pH 6-6.5. Smeša se koncentruje da se ukloni izopropil alkohol i dobijeni precipitat izdvoji filtriranjem i ispere na sinter levku. Izdvojena čvrsta supstanca se suši pod vakuumom na 40°C u toku noći da se dobije 3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatna kiselina (32.6 g, 95.12% prinos). MS (m/z): 440.1 (M+H).<1>H NMR (300.11 MHz, CDCl3): 7.03 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 6.92 (dd, J= 1.3, 8.1 Hz, 1H), 6.84 (d, J= 1.3 Hz, 1H), 6.32 (d, J= 0.9 Hz, H), 3.70 (s, 4H), 2.88 (t, J= 4.6 Hz, 4H), 2.62 (s, 2H), 2.30 (s, 3H), 1.97-1.91 (m, 1H), 1.28 (s, 6H), 0.98-0.91 (m, 2H), 0.67-0.62 (m, 2H).

Primer 2.3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatna kiselina dihidrohlorid

[0030]

1

[0031] 2 M rastvor hlorovodonične kiseline (0.119 mL, 0.24 mmol) se doda u suspenziju 3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetilpropanoatne kiseline (0.0497 g, 0.11 mmol) u acetonitrilu (1 mL) i vodi (1 mL) i liofilizira da se dobije 3-[4-(2-ciklopropil-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatna kiselina dihidrohlorid (0.058 g, 100%). MS (m/z): 440.2 (M+H).

[0032] Podaci iz litertature (Morairty SR, Hedley L, Flores J, Martin R, Kilduff TS. (2008) Selective 5-HT2A and 5-HT6 receptor antagonists promote sleep in rats. Sleep 31, 34-44.; i Barbier, A.J., and Bradbury, M.J., Histaminrgic Control of Sleep-Wake Cycles: Recent Therapeutic Advances for Sleep and Wake Dizorders, CNS & Neurological Dizorders Drug Targets, vol 6, pg. 31-43 (2007)) i podaci dobijeni u ne-kliničkim ispitivanjima na životinjama podržavaju ulogu dualne aktivnosti H1 inverznih agonista / 5-HT2Aantagonista u tretmanu insomnije i u simptomatičnom tretmanu insomnije povezane sa drugim poremećajima kao što su depresivni poremećaji, anksiozni poremećaji, bol, alergije, poremećaji pluća ili disajnih puteva, psihijatrijski poremećaji, demencija i/ili neurodegenerativne bolesti i/ili poremećaji cirkadijalnog ritma spavanja. Posebno je nađeno da su neki dvostruko delujući H1 inverzni agonisti / 5-HT2Aantagonisti efikasni u povećavanju ukupnog vremena spavanja praćenjem EEG kod glodara bez disproporcije ili klinički relevantne hiperaktivnosti, smanjenju u REM spavanju ili preterane pospanosti.

[0033] Za dalji prikaz karakteristika iz ovog pronalaska, jedinjenja mogu da se podvrgnu narednim in vitro i in vivo ispitivanjima:

In vitro ispitivanje vezivanja i aktivnosti:

Ispitivanje kompeticije vezivanja H1

[0034] Eksperimenti vezivanja [<3>H]-pirilamina se izvode u SPA (scintilacija bliskih analiza) u formatu sa 96 otvora. Membrane korišćene u ovim ispitivanjima su izrađene od HEK-293 ćelija u kojima se stabilno ekspresuje rekombinantni H1 receptor (humani). Inkubacija se započinje dodavanjem smeše WGA PVT SPA perlica (1mg/otvor, Perkin Elmer (MA, USA) RPNQ0001) i 3 µg membrana u pufer za analizu (67 mM Tris; pH 7.6) koji sadrži 3.5 nM [<3>H]-pirilamina i promenljive koncentracije test jedinjenja (krive odgovora sa 10 tačaka koncentracije). Ne-specifično vezivanje se određuje u prisustvu 10 µM Triprolidina. Uzorci se inkubiraju 4 h na sobnoj temperaturi (22° C) a nakon toga očitavaju u Microbeta Trilux.

Ispitivanje kompeticije vezivanja 5-HT2A

[0035] Eksperimenti vezivanja [<3>H]-ketanserina se izvode u SPA u formatu sa 96 otvora. Membrane korišćene u ovim ispitivanjima su izrađene od AV-12 ćelija u kojima se stabilno ekspresuje rekombinantni 5-HT2Areceptor (humani). Inkubacija se započinje dodavanjem smeše WGA YSi SPA perlica (1mg/otvor, Perkin Elmer (MA, USA) RPNQ0001) i 2 µg membrana u pufer za analizu (67 mM Tris; pH 7.6) koji sadrži 3.1 nM [<3>H]-ketanserina i promenljive koncentracije test jedinjenja (krive odgovora sa 10 tačaka koncentracije). Nespecifično vezivanje se određuje u prisustvu 20 µM 1-(1-naftil) piperazina. Uzorci se inkubiraju 4 h na sobnoj temperaturi (22° C) a nakon toga očitavaju u Microbeta Trilux.

Ispitivanje kompeticije vezivanja 5-HT2C

[0036] Eksperimenti vezivanja [<125>I]-(±)DOI se izvode u SPA u formatu sa 96 otvora.

Membrane korišćene u ovim ispitivanjima su izrađene od AV-12 ćelija u kojima se stabilno ekspresuje rekombinantni 5-HT2creceptor (humani). Inkubacija se započinje dodavanjem smeše WGA PVT SPA perlica (0.5 mg/otvor, Perkin Elmer (MA, USA) RPNQ0001) i 2.5 µg membrana u pufer za analizu (50 mM Tris-HCl; 10 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 10 µM pargilina, 0.1% askorbinske kiseline, pH 7.4) koji sadrži 0.2 nM [[<125>I]-(±)DOI i promenljive koncentracije test jedinjenja (krive odgovora sa 10 tačaka koncentracije). Ne-specifično vezivanje se određuje u prisustvu 20 µM 1-(1-naftil) piperazina. Uzorci se inkubiraju 4 h na sobnoj temperaturi (22° C) a nakon toga očitavaju u Microbeta Trilux.

Analiza rezultata vezivanja

[0037] Krive se procenjuju pomoću nelinearne logističke jednačine sa 4 parametra da se dobije koncentracija kompetitora koji dovodi do 50 % inhibicije vezivanja radioliganda (IC50). Ravnotežne konstante disocijacije (Ki) se izračunavaju prema jednačini Ki= IC50/(1+L/Kd), gde L predstavlja koncentraciju radioliganda korišćenog u eksperimentu a Kdpredstavlja uravnoteženu konstantu disocijacije radioliganda za receptor, određene iz analiza standardnog zasićenja ili eksperimenata homologne kompeticije. Zabeležene vrednosti za Ki, gde su naznačene n vrednosti, su pokazane kao geometrijska sredina ± standardna greška proseka (SEM), i broja ponovljenih određivanja označenim sa n. Geometrijski prosek se izračunava preko jednačine GeoMean = 10^(prosek (log Ki1 log Ki2 ...log Kin)/sqrt n).

GABAAantagonizam korišćenjem nativnih receptora u primarnim neuronalnim kulturama

[0038] Aktivnost jedinjenja na nativne GABAAreceptore se procenjuje praćenjem fluksa kalcijuma krišćenjem FLIPR® sistema formata sa 96 otvora (Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR®, Molecular Devices). Ukratko, kortikalni embrionični neuroni su izdvojeni iz embriona E18 pacova i preneti u optimalnoj gustini u FLIPR® ploče sa 96 otvora crnih zidova, providnog dna i obložene sa poli-D lizinom. Nakon stavljanja kalcijum osetljive boje u ćelije (Fluo4-AM, Molecular Devices), ćelije se potope u rastvor koji ima nizak sadržaj hlorida (hlorid zamenjen sa glukonatom). Pod ovim uslovima, aktivacija GABAAreceptora izaziva isticanje jona hlorida (u smeru hemijskog gradijenta), što dovodi do depolarizacije u membrani i shodno tome do aktivacime naponski zavisnih kalcijum kanala (VGCCs).

Oticanje kalcijuma kroz VGCCe se beleži i nezavisno analizira pomoću FLIPR® sistema. Za farmakološku validaciju analize, krive odgovora na koncentraciju (CRC) se izrađuju za standardni agonist (GABA) i standardni antagonist (Gabazin). Svi efekti se određuju u CRC modelu u odnosu na fiksnu koncentraciju agonista GABA od 10 µM (ekvivalent sa EC90GABA odgovora).

Metode:

[0039] Antagonistički efekti jedinjenja se kvantifikuju preko krivih odgovora sa 10 tačaka doze poređenjem pika fluorescentnih odgovora za agonist GABA u prisustvu i bez prisustva jedinjenja. Rezultat analize se definiše kao maksimalni odgovor dobijen za GABA pri

1

njegovoj prethodno određenoj EC90koncentraciji minus odgovor dobijen pri koncentraciji gabazina (50 µM) koji dovodi do potpune inhibicije. Antagonistički efekti se izračunavaju kao procenat rezultata analize. Sve vrednosti se izračunavaju kao relativne IC50vrednosti preko programa logaritamske krive sa četiri parametra (Prism Graphpad® 3.01).

Antagonistička potencija za sva jedinjenja se poredi sa gabazinom u tri replikata u svakoj analizi.

[0040] Isto tako, jedinjenja iz pronalaska mogu da se testiraju u analizama vezivanja i analizama funkcionalne aktivnosti dobro poznatim metodama za druge fiziološki važne receptore kao što su, ali bez ograničenja na, hERG kanal, drugi serotonin receptori (posebno 5-HT1B, 5-HT1Dreceptori, nedostatak aktivnosti agonista na 5-HT2Breceptorima, 5-HT2C, 5-HT5, 5-HT6i 5-HT7receptorima), dopaminergični receptori (posebno D1, D2 i D3), GABAAreceptori, adrenergični receptori i transporteri monoamina.

[0041] Jedinjenje iz primera 2 je u osnovi testirano kako je prethodno opisano i nađeno je da ima profile aktivnosti kako je pokazano u Tabeli 1.

Tabela 1. Rezultati selektivnosti

(nastavlja se)

[0042] Prema tome, očekuje se da fiziološki relevantne doze jedinjenja iz pronalaska obezbede značajnu inhibiciju H1 i 5-HT2Areceptora in vivo, dok istovremeno ne stupaju u interakciju sa drugim fiziološki relevantnim receptorima, i zbog toga se očekuje da obezbede potrebnu farmakologiju uz izbegavanje neželjenih efekata povezanih sa delovanjem izvan cilja. U ove neželjene efekte spadaju, ali bez ograničenja na: aktivnost 5-HT2Cantagonista povezana sa tretmanom naglog povećanja telesne težine, aktivnost 5-HT2Bagonista povezana sa valvulopatijom, modulacija hERG kanala povezana sa QT prolongiranjem i aktivnost GABAAantagonista povezana sa izazivanjem napada. Osim toga, izbegava se interferenca sa psihologijom spavanje/budno stanje selektivnošću u odnosu na dopamin receptore, druge serotonin receptore, adrenergične receptore i transportere monoamina.

[0043] Zauzimanje 5-HT2Areceptora: ispitivanje zauzetosti receptora (ZR) se vrši kako bi se pokazala aktivnost antagonista/inverznog agonista na 5-HT2Areceptor in vivo. Ukratko, mužjacima Sprague-Dawley pacova (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) težine približno 230-280 grama su voda i hrana dati po volji sve do 3h pre početka eksperimentalnog protokola. 1 mg/kg ketanserina (ne-selektivni 5-HT2Aantagonist) se koristi kao pozitivna kontrola za utvrđivanje validnosti ispitivanja. Test jedinjenja ili kontrola se primene oralnom gavažom u vehikulumu koji se sastoji od 20% hidroksipropil betaciklodekstrina. Kao uzorak se koristi MDL 100907 ((R)-(+)-α-(2,3-Dimetoksifenil)-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-4-piperidinmetanol), selektivni 5-HT2Aantagonist. MDL 100907 se suspenduje u vodi sa 5 µl razblažene mlečne kiseline (1 mg/ml), razblaži do 6 µg/ml sa fiziološkim rastvorom i primeni

1

intravenski preko lateralne repne vene u zapremini od 1 mL/kg da se dobije osnovna doza od 3 µg/kg. Na pacovima se primeni test jedinjenje, ketanserin ili vehikulum (N = 4), a 1 h kasnije se intravenski primeni 3 µg/kg osnovne doze MDL 100907. U vreme kada se primeni uzorak, tada počinje da se meri ZR. Petnaest minuta nakon primene uzorka, pacovi se usmrte presecanjem vrata. Uzimaju se uzorci plazme a izdvoje se uzorci frontalnog korteksa i cerebeluma. Nivo MDL 100907 uzorka se meri u svakom kortikalnom i cerebralnom uzorku. ZR se izračunava po dobro poznatom metodu odnosa koji obuhvata region sa velikim brojem receptora koji predstavlja ukupno vezivanje (frontalni korteks) uravnotežen sa oblašću bez ili sa veoma niskim vrednostima receptora (cerebelum). Ovaj region, označen kao nulti region, predstavlja nespecifično vezivanje probnog liganda. Osnovni odnos nivoa uzorka u korteksu u odnosu na cerebelum predstavlja zauzimanje od 0%. Odnos od 1 pretstavlja 100% zauzimanja i postiže se kada su sva specifična mesta vezivanja za 5-HT2Areceptor zauzeta od strane MDL 100907 uzoraka. Međusobni odnosi kortikalnog i cerebralnog uzorka test jedinjenja u pretretiranoj grupi su interpolirani linearno između odnosa nivoa uzorka u životinjama tretiranim vehikulumom (0% zauzeća) i nivoa od 1 (100% zauzeća) kako bi se odredio procenat 5-HT2AZR.

[0044] Analiza MDL 100907: Uzorci korteksa i cerebeluma se izmere i stave na led u konične centrifugalne kivete. U svaku kivetu se doda četiri zapremine (m/v) acetonitril koji sadrži 0.1% mravlje kiseline. Uzorci se nakon toga homogenizuju i centrifugiraju 16 min na 14,000 OPM (21,920 x g). Supernatant se razblaži dodavanjem 100 - 900 µL sterilne vode u HPLC injekcionim posudama za LC/MS/MS analize. Analiza MDL 100907 se izvodi pomoću Agilent modela 1200 HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) i API 4000 masenog spektrometra. Hromatografsko razdvajanje se odvija na 2.1 X 50 mm C18 koloni (Agilent serijski broj 971700-907) sa mobilnom fazom koja se sastoji od 60% acetonitrila u vodi sa ukupno 0.1% mravlje kiseline. Detekcija MDL 100907 se izvodi praćenjem prekursora za tranziciju jona produkta sa odnosom mase i naelektrisanja (m/z) od 374.2 do 123.0. Standardi se izrađuju dodavanjem poznatih količina analita za uzorke tkiva mozga od netretiranih pacova i procesuiraju kako je prethodno opisano.

[0045] Statistički metodi: krive za svaku studiju se stavljaju u logističku funkciju sa 4 parametra sa krajem fiksiranim na 0% korišćenjem JMP® verzije 8.0 (SAS Institute Inc, Cary NC) a apsolutna ED50se izračunava pomoću softvera. Vrednosti su date kao prosek, standardne greške i intervali 95% pouzdanosti. Jedinjenje iz Primera 2 je u osnovi testirano

1

kako je opisano i nađeno je da postiže visoko zauzimanje 5-HT2Areceptora sa ED50od 0.09 mg/kg.

[0046] Inhibicija DOI indukovanog drhtanja glave: antagonističko delovanje jedinjenja iz ovog pronalaska na 5-HT2Areceptor in vivo je dalje pokazano njegovom sposobnošću da blokira drhtanje glave indukovano 2,5-dimetoksi-4-jodamfetaminom (DOI), agonistom 5-HT2Areceptora (videti na primer Bartoszyk GD, van Amsterdam C, Böttcher H, Seyfried CA. EMD 281014, a new selective serotonin 5-HT2A receptor antagonist. Eur J Pharmacol.2003 473: 229-230.). Ukratko, mužjaci C57BL/6J miševa (20-25 g, Charles River) se čuvaju u standardnim uslovima čuvanja (32 u velikom IVC kavezu, 07.00 do 19.00 dnevna faza, konstantna temperatura (19-23°C) i vlažnost (50% /-10), uz slobodan pristup hrani i vodi). Miševi dobijaju ili vehikulum (0.25% metil celuloza), DOI (3 mg/kg u fiziološkom rastvoru) ili test jedinjenje u količini od 10mg/kg PO plus DOI (3 mg/kg u fiziološkom rastvoru). Test jedinjenja se pojedinačno procenjuju u grupama od po četiri po eksperimentu sa n=4 za svako jedinjenje, zajedno sa vehikulumom i DOI+vehikulum (n=8).60 minuta pre tretiranja test jedinjenjem, miševi prime ili vehikulum (fiziološki rastvor) ili 3 mg/kg DOI dozirano subkutano, a nakon toga se stave u providne izolovane komore za posmatranje. Pet minuta nakon primene DOI ili vehikuluma, 15 minuta se beleži broj vizuelno uočenih drhtanja glave kod svakog pojedinačnog miša. Rezultati se analiziraju pomoću ANOVA i post-hoc Dunnetovog testa. Jedinjenje iz primera 2 je u osnovi testirano kako je opisano i nađeno je da inhibira DOI indukovano drhtanje glave za 100% pri 10 mg/kg.

[0047] Praćenje spavanja i ponašanja kod pacova: Jedinjenje iz ovog pronalaska se testira na pacovima na sposobnost da poveća količinu sna ili smanji česta buđenja u toku spavanja ili oba, bez neželjenih efekata kao što su inhibicija REM spavanja, pogoršanje budnosti motorike i/ili povratne insomnije. Test životinje se kontinuirano prate preko elektroencefalograma (EEG), elektromiograma (EMG), i kretanja za merenje kumultivnog ne-REM spavanja, ukupnog kumulativnog sna, prosečnog trajanja dužine sna, trajanja najdužeg perioda sna, povratne insomnije, inhibicije REM spavanja i intenziteta lokomotorne aktivnosti u toku budnog stanja. Metode za ovakve studije su poznate u tehnici (videti, na primer, metode opisane u Edgar DM, Seidel WF. Modafinil induces wakefulness without intensifying motor activity or subsequent rebound hypersomnolence in the rat. J Pharmacology & Experimental Therapeutics 1997; 283: 757-769; van Gelder RN, Edgar DM, Dement WC. Real-time automated sleep scoring: validation of a microcomputer-based system for mice. Sleep 1991, 14: 48-55; and Gross BA, Walsh CM, Turakhia AA, Booth V, Mashour GA, Poe GR. Open-

1

source logic-based automated sleep scoring software using electrophysiological recordings in rats. J Neurosci Methods. 2009; 184(1):10-8.) Studije su izvedene na sledeći način:

Priprema životinja. Odraslim mužjacima Wistar pacova (približno 270-300 g u vreme operacije) su hirurški ugrađeni uređaji za stalno beleženje EEG, EMG i kretanja na sledeći način: pacovima je hirurški ugrađen kranijalni implant koji se sastoji od četiri vijka od nerđajućeg čelika za EEG beleženje (dva frontalno [3.9 mm ispred bregme i ±2.0 mm mediolateralno] i dva ocipitalno [6.4 mm iza bregme, ±5.5 mm mediolateralno]) i sa dve žice od nerđajućeg čelika obložene teflonom za beleženje EMG (pozicionirane ispod potiljačnog trapezoidnog mišića). Svi provodnici su zalemljeni za minijaturni konektor (Microtech, Boothwyn, PA) pre operacije. Konstrukcija implanta je fiksirana za lobanju kombinacijom vijaka od nerđajućeg čelika za beleženje EEG, cijanoakrilata nanetog između konektora implanta i lobanje i dentalnog akrila. Lokomotorna aktivnost je praćenena preko minijaturnog transmitera (Minimitter PDT4000G, Philips Respironics, Bend, OR) koji je hirurški smešten u abdomen. Životinje se ostave najmanje 3 nedelje da se oporave.

[0048] Sredina za beleženje. Svaki pacov je pojedinačno smešten u mikroizolatorni kavez modifikovan sa ubačenim stubom sa filterom od polikarbonata na vrhu da se obezbedi više vertikalnog prostora za glavu. Fleksibilni kabl koji minimalno ograničava pokrete je jednim krajem vezan za komutator smešten na vrhu kaveza a drugim krajem za kranijalni implant životinje. Svaki kavez je smešten u odvojene komore sa ventiliranim odeljcima od nerđajućeg čelika u kojima se beleži stanje spavanja i budnosti. Hrana i voda su raspoložive ad libitum a temperatura sredine se održava na približno 23±1°C.24-časnovni ciklus svetlo-tama (ST 12:12) je održavan u toku studije pomoću fluorescentnog svetla. Prosečna relativna vlažnost je približno 50%. Životinje nisu uznemiravane najmanje 30 sati pre i nakon svakog tretmana.

[0049] Izvođenje studije i doziranje. Vehikulum (placebo, metilceluloza 15 centipoaza 0.25% u vodi) ili jedna od doza test jedinjenja se primeni oralno u količini od 1 mL/kg pseudonasumično tako da ni jedan pacov ne primi isti tretman dva puta i ni jedan pacov ne primi više od 8 tretmana u bilo kojoj studiji. Svaki pacov se uzme iz svog kaveza u trajanju od približno minut da se izmeri i tretira. Ostavi se period "čišćenja" od najmanje 6 dana pre i nakon svakog tretmana.

[0050] Prikupljanje rezultata. Razlikovanje spavanja i budnog stanja može da bude automatizovano (na primer, Van Gelder i saradnici 1991 (kao gore); Edgar i saradnici 1997 (kao gore), Winrow i saradnici, 2010; Gross i saradnici, 2009 (kao gore)). EEG je pojačan i

1

filtriran (X10,000, propusni opseg 1-30 Hz), EMG je pojačan i integrisan (propusni opseg 10-100 Hz, RMS integracija) i istovremeno se prati ne-specifična lokomotorna aktivnost (LMA). Stanja pobuđenosti su klasifikovana u periodima od 10 sekundi kao ne-REM spavanje, REM spavanje, budnost ili teta-dominantna budnost. Lokomotorna aktivnost (LMA) se beleži kao broj po minutu i detektuje se komercijalno raspoloživim telemetrijskim prijemnicima (ER4000, Minimitter, Bend, OR).

[0051] Statistička analiza. Sve životinje koje su imale najmanje jedan rezultat su uključene u zbir rezultata (na primer, uključen je odgovarajući rezultat tretirane životinje za koju su rezulati telemetrije upotrebljivi ali rezultati EEG nisu). Period posmatranja nakon tretmana je podeljen u intervale posle doziranja koji odgovaraju svakom krajnjem rezultatu, pri čemu se vreme doziranja definiše kao početak u sat = 0, a rezultati su sumirani u periodu opservacije računanjem ili prosečno po satu ili kumulativnom vrednošću za svaki period (videti legendu u Tabeli 2 za preciznu definiciju svakog rezultata). Trajanje sna se analizira na log skali za stabilizaciju varijacije, a sve druge varijante se analiziraju na linearnoj skali. Svaki rezultat u svakom periodu se analizira analizama kovarijanse uzimajući kao faktore tretiranu grupu i rezultat tretmana a odgovarajući interval pre tretmana, 24 sata ranije, kao kovarijante. Načini podešavanja i promene nastale od vrste vehikuluma i njihove odgovarajuće standardne greške su sumirani za svaku tretiranu grupu. Rezultati analizirani na log skali se ponovo transformišu da se dobije geometrijska sredina i rezultati za prosečni odnos - vehikulum.

[0052] Jedinjenje iz Primera 2 je u osnovi testirano kako je opisano. Nađeno je da jedinjenje iz Primera 2 značajno povećava kumulativno vreme NREM spavanja i ukupno kumulativno vreme spavanja bez značajne povratne insomnije, ili inhibicije lokomotornog intenziteta (LMI) u količini od 3 mg/kg. Međutim, ovim rezultatima ne može da se isključi inhibicija REM spavanja. (Videti profil spavanja i intenzitet lokomotorne aktivnosti u Tabeli 2).

Tabela 2. Statistički rezultati: Skraćenice: N = veličina uzorka; Prilagođeni prosek = vrednost prilagođenog proseka grupe u odnosu na kontrole sa vehikulumom; SE = prosečna standardna greška; LCL = donja granica 95% pouzdanosti, NREM = ne-REM, to jest, sva spavanja različita od REM spavanja. Veličina uzorka za paralelne reference grupe sa vehikulumom je N=27.

1

Tabela 2. Jedinjenja iz Primera 2

Tabela 2. Jedinjenja iz Primera 2

2

Tabela 2. jedinjenja iz Primera 2

Tabela 2. Jedinjenje iz Primera 2

Definicije i jedinice - proseci su podešeni prema razlici od kontrola sa vehikulumom:

• Kumulativno spavanje: u toku prvih 6 h. nakon tretmana, u minutima (’ukupno spavanje’ predstavlja NREM spavanje REM spavanje).

• Prosečan period spavanja: prosek u satima izraženog prosečnog trajanja, u toku prvih 6 h. nakon tretmana, izraženo kao n-puta povećanje u odnosu na kontrole sa vehikulumom.

• Najduži period sna: najduži period sna u toku prvih 6 h. nakon tretmana, izražen kao n-puta povećanje u odnosu na kontrole sa vehikulumom.

• Povratna insomnija: kumulativni minuti NREM+REM spavanja u toku prvih 3 h u periodu svetla, to jest, 7<.>, 8. i 9. sat nakon tretmana.

• Inhibicija REM: kumulativni minuti REM spavanja u toku prvih 12 h nakon tretmana.

• Intenzitet lokomotorne aktivnosti (LMA): izražava se kao broj LMA po minutu EEG definisane budnosti, uprosečen u toku prvih 6 h nakon tretmana.

[0053] Određivanje efikasnosti. Prag efikasnosti za svaku od četiri promenljive efikasnosti se izračunava nanošenjem povećanja u svakoj promenljivoj u odnosu na kontrole sa vehikulumom u toku 6 h nakon tretmana prema log (doze). Prag efikasnosti za svaku promenljivu je ona doza, procenjena logaritamskom nelinearnom regresijom od 4 parametra, koja daje definisanu vrednost početne efikasnosti; 30 min dodatno akumuliranog ne-REM spavanja, 25 min dodatno akumuliranog ukupnog spavanja, 1.75x povećanje prosečnog trajanja perioda spavanja i 1.5x povećanje trajanja najdužeg perioda spavanja. Za jedinjenje iz Primera 2 je nađeno da ima doze sa pragom efikasnosti kako je pokazano u Tabeli 3.

Doza (mg/kg)

Povratna insomnija

[0054] Određivanje neželjenih efekata. Svaki ’neželjeni efkat’ kao rezultat promenljivih (videti legendu u Tabeli 2 za definicije) je nanet prema log (doze). Prag vrednosti za inhibiciju REM spavanja se definiše kao kumulativna redukcija REM spavanja od -10 min. Prag vrednosti za povratnu insomniju se definiše kao -20 min. Prag vrednosti za redukciju LMI se definiše kao -5 lokomotorne aktivnosti brojane po minutu EEG definisane budnosti.

2

Definiše se da se značajan neželjeni efekat dešava kada niži limit pouzdanosti ide ispod praga vrednosti bilo koje doze za ili ispod 10 puta prosečne efikasne doze a trend odgovora na dozu je evidentan za doze iznad praga efikasne doze. Za jedinjenje iz Primera 2, inhibicija REM spavanja prevazilazi prag vrednosti od 3 mg/kg, ali je ova doza više od 10 puta veća od najumerenije efikasne doze od 0.26 mg/kg (Tabela 3); jasno je da inhibicija REM spavanja u dozi od 0.25 mg/kg i 0.025 mg/kg nije deo doze koja predstavlja trend i nije statistički značajna pri ovim dozama, i stoga može da se tretira kao artefakt male veličine uzorka ovih doza; i pored toga, inhibicija REM spavanja ne može da se isključi ovim podacima. Zaključak je da nije uočeno neželjeno dešavanje u REM povratku insomnije, ili redukciji u LMI u dozi 10 puta većoj od najumerenije efikasne doze, ali ne može da se isključi inhibicija REM spavanja. Negativne vrednosti ukazuju na REM inhbiciju, povratnu insomniju i smanjenje LMI, tim redom.

[0055] Klirens plazme: za jedinjenje korisno u lečenju poremećaja sna kao što je insomnija, značajno je da bude adekvatno izlučeno iz organizma odgovarajućom brzinom klirensa kako bi se izbegli neželjeni efekti kao što su prolongirana pospanost izvan potrebnog perioda sna, dnevna pospanost, smanjena spoznaja nakon buđenja, itd. Ovaj pronalazak daje jedinjenja sa povećanom brzinom klirensa. Brzina klirensa može u osnovi da se ispita kako je niže opisano.

[0056] Mužjaci Sprague Dawley pacova (telesne težine u rasponu od 250-320 g) sa inplantiranom kanilom u femoralnoj arteriji su dobijeni od Charles River, Wilmington, MA 01887, USA. Test jedinjenje je primenjeno intravenski u obliku rastvora (1 mL/kg) u 20% Captizol® u 22.5 mM fosfatnog pufera, pH 2, pri finalnoj koncentraciji leka od 1.0 mg/mL (ekvivalenti slobodne baze). Nakon 24 h se uzimaju uzorci krvi preko implantirane kanile. Uzorci plazme su dobijeni centrifugiranjem i čuvaju se zamrznuti (-20°C) na suvom ledu, pre analize.

[0057] Mužjaci pasa bigl rase (telesne težine u rasponu od 10-12 kg) su dobijeni od Marshall Bioresources, USA. Test jedinjenje je primenjeno intravenski u obliku rastvora (1 mL/kg) u 20% Captizol<®>u 22.5 mM fosfatnog pufera, pH 2, pri finalnoj koncentraciji leka od 1.0 mg/mL (ekvivalenti slobodne baze). Uzorci krvi su dobijeni iz jugularne vene nakon 24 h. Uzorci plazme su dobijeni centrifugiranjem i čuvaju se zamrznuti (-20°C), pre analize.

[0058] Zamrznuti uzorci plazme se otope na sobnu temepraturu za bioanalize koncentracija test jedinjenja. Odgovarajuće jedinjenje, kao unutrašnji standard, u smeši acetonitril/metanol (1:1, v/v) se doda u sve uzorke plazme (1:1, v/v). Pre analize, uzorci se centrifugirju da se ukloni istaloženi protein. Supernatanti se analiziraju injektirnjem i brzom eluacijom grdijenta na Javelin Betasil C18 koloni (20 x 2.1 mm kertridž, mobilna faza A: voda/ 1M rastvor NH4HCO3, 2000:10 v/v, mobilna faza B: MeOH/ 1 M rastvor NH4HCO3, 2000:10 v/v). Eluirani analiti se detektuju LC-MS-MS analizama korišćenjem Sciex API 4000 trostrukog kvadropolnog masenog spektrometra. Koncentrcije jedinjenja se određuju iz pripremljenih standarda i ispituju pod identičnim uslovima. Klirens se izračunava korišćenjem nonkompartmental analiza u Watson 7.4, Thermo Fisher Scientific, Inc.

[0059] Jedinjenje iz Primera 2 je u osnovi ispitano kako je opisano i nađeno je da ima povoljan profil klirensa:

[0060] Mada je moguće da se jedinjenja primene direktno na način kako je to dato u postupcima iz ovog pronalaska bez bilo kakve formulacije, jedinjenja se uobičajeno primenjuju u obliku farmaceutskih kompozicija koje uključuju jedinjenje, ili njegovu farmaceutski prihvaltjivu so, kao aktivni sastojak i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač i/ili ekscipijent. Ove kompozicije mogu da se primene na različite načine, uključujući oralno, sublingvalno, nazalno, subkutano, intravenozno i intramuskularno.

Ovakve farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (University of the Sciences in Philadelphia, ed., 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins Co., 2005).

[0061] Kompozicije su preferirano formulisane kao jedinični dozni oblici, a svaka doza sadrži od približno 0.1 do približno 60 mg, mnogo češće približno 0.5 do približno 30 mg, kao na primer između približno 1 i približno 10 mg aktivnog sastojka. Naziv "jedinični dozni oblik" se odnosi na fizički odvojene jedinice pogodne za jednokratno doziranje na humanim subjektima i drugim sisarima, svaka jedinica sadrži prethodno odmerenu količinu aktivnog materijala izračunatu da dovede do traženog terapeutskog efekta, zajedno sa najmanje jednim pogodnim farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem i/ili ekscipijentom.

2

[0062] Jedinjenja Formule I su generalno efikasna u širokom opsegu doze. Na primer, dnevne doze su normalno u rasponu od približno 0.002 do približno 1.0 mg/kg, mnogo češće od približno 0.008 do 0.5 mg/kg, i kao što je, na primer, između 0.015 i 0.15 mg/kg telesne težinbe. U nekim slučajevima, vrednosti doze ispod najnižeg limita prethodno navedenog opsega mogu da budu više nego adekvatne, dok u drugim slučajevima čak i veće doze mogu da se koriste bez izazivanja bilo kog štetnog sporednog efekta, i stoga prethodno dati opseg doza ne treba da ograniči okvir pronalaska na bilo koji način. Razumljivo je da količinu jedinjenja koje se trenutno primenjuje određuje lekar, u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući stanje koje se tretira, izabrani način primene, određeno jedinjenje ili jedinjenja koja se primenjuju, godine starosti, telesnu težinu i odgovor pojedinačnog pacijenta i težinu simptoma kod pacijenta.

2

Claims (7)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje, naznačeno time što ima formulu

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to HCl so.
3. 3. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegovu farmceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijentom.
4. 4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
5. 5. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu insomnije.
6. 6. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 5, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što se insomnija karakteriše otežanim početkom sna ili održavanjem sna ili sa oba.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili 6, naznačeno time što je za upotrebu na ljudima. 2

   2