RS56604B1 - Agonisti vazopresinskog-2 receptora - Google Patents

Description

Opis

Oblast

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na nova jedinjenja sa aktivnošću agonista na vazopresinski-2 (V2) receptor, farmaceutske sastave koje se sastoje od njih, i na upotrebu jedinjenja u proizvodnji lekova za lečenje bolesti.

Pozadina

[0002] Postoje tri poznata podtipa vazopresinskih receptora, V1a, V1bi V2. V1breceptor je poznat i kao V3receptor, a V1areceptor je poznat i kao V1receptor. Svaki podtip ima poseban obrazac ekspresije u tkivima, pri čemu se V2prvenstveno nalazi u bubregu, gde posreduje antidiuretičkim aktivnostima endogenog ligandnog vazopresina (Favori i dr., 2009). V1bje široko rasprostranjen u mozgu (Hernando i dr., 2001). V1ase nalazi u različitim tkivima, uključujući glatke mišiće, jetru, bubrege, trombocite, slezinu i mozak (Zingg, 1996; Ostrovski i dr., 1994).

[0003] Agonisti V2receptora su klinički korisni. Dezmopresin je agonist V2receptora koji je odobren na nekim teritorijama za lečenje dijabetes insipidusa, primarne noćne enureze, nokturije i poremećaja koagulacije, uključujući hemofiliju A i von Vilebrandovu bolest. Dezmopresin se vezuje i aktivira receptore V2i V1b, sa slabijim aktivnostima na V1a.

[0004] Pokazano je da se dezmopresin delimično izlučuje preko bubrega (npr. Fjellestad-Paulsen i dr., 1993), a poluraspad dezmopresina povećava se kod pacijenata sa oštećenjem bubrega (Ruzicka i dr., 2003; Agersoe i dr., 2004 ). Agersoe i dr. sugerišu da povećani poluraspad može dovesti do produženih antidiuretskih efekata i povećati rizik od hiponatremije, pada nivoa natrijuma u serumu, koji mogu dovesti do neželjenih događaja kao što su napadi ili koma. Oni dalje navode da „iako izgleda da je dezmopresin siguran i dobro se toleriše od strane pacijenta sa oštećenom funkcijom bubrega, potrebno je obratiti pažnju kada se titrira prema efikasnom režimu doziranja, ako se pacijenti sa umerenom ili teškom bubrežnom funkcijom leče sa dezmopresinom.”

[0005] J. Med. Chem., vol 30, 1987, str.2245-2252 obelodanjuje „desglikinirane” analoge vazopresina.

[0006] Prema tome, postoji potreba za dodatnim agonistima receptora V2sa smanjenom aktivnošću na V1breceptoru. Dodatno, takođe mogu biti poželjni agonisti receptora V2koji se ne oslanjaju toliko na bubrege radi eliminacije.

Sažetak

[0007] U jednom otelotvorenju, dato je jedinjenje prema formuli I ili njegova farmaceutski prihvatljiva so,

gde R<2>je H, C1-C4alkil, halogen, -OH ili -O-C1-C4alkil;

R<3>je H ili -CH2-OH ili -C(O)-NR<5>R<6>;

R<4>je H ili -C(=NH)-NH2;

R<5>i R<6>su nezavisno H, C1-C6alkil, -CH2- ciklopropil, - ciklopropil ili arilalkil pod uslovom da R<5>i R<6>nisu oba H;

X i Y su nezavisno -CH2- ili -S- pod uslovom da X je -CH2-, Y nije -CH2-;

Z je -CHR<7>- ili S i R<7>je H ili C1-C4alkil, halogen, -OH ili -O-C1-C4alkil;

R<8>je H ili -CH3; i

Ar je heteroaril ili fenil opciono supstituisan sa jednim C1-C4alkilom, halogenom, -OH ili -O-C1-C4alkilom.

[0008] U nekim otelotvorenjima R<5>i R<6>su nezavisno H, C1-C6alkil, ili arilalkil.

[0009] U nekim otelotvorenjima R<5>i R<6>su nezavisno H, C1-C6alkil ili arilalkil.

[0010] U nekim otelotvorenjima R<5>i R<6>oba nisu H.

[0011] U nekim otelotvorenjima samo jedan od X i Y je -S-. U nekim otelotvorenjima X je -CH2-. U nekim otelotvorenjima X i Y su oba -S-.

[0012] U nekim otelotvorenjima Ar je tiofen.

[0013] U nekim otelotvorenjima R<8>je -CH3.

[0014] U nekim otelotvorenjima R<3>je -C(O)-NR<5>R<6>. U naročitim otelotvorenjima R<5>je H i R<6>je C1-C4alkil. U naročitim otelotvorenjima oba od R<5>i R<6>su -CH2CH3.

[0015] U nekim otelotvorenjima R<2>je halogen. U naročitim otelotvorenjima R<2>je -Cl. U nekim od naročitih otelotvorenja R<2>je -F.

[0016] Pronalazak takođe obuhvata farmaceutske sastave uključujući jedinjenja koja su ovde opisana za upotrebu pri lečenju dijabetesa insipidusa, primarne noćne enureze ili nokturije, zajedno sa upotrebom jedinjenja koja su ovde opisana u proizvodnji leka za lečenje dijabetesa insipidusa, primarne noćne enureze, ili nokturije.

[0017] Prema jednom otelotvorenju, jedinjenje formule I koristi se kod leka za upotrebu u lečenju dijabetesa insipidusa, primarne noćne enureze ili nokturije.

Detaljan opis

[0018] Ukoliko nije drugačije naznačeno, sledeći termini koji se koriste u ovoj prijavi patenta, uključujući opis i patentne zahteve, imaju definicije navedene ispod. Mora se napomenuti da, kako se koristi u opisu i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine forme (sa članovima) uključuju referente množine, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Definicija standardnih pojmova hemije može se naći u referentnim radovima, uključujući Carei and Sundberg (2007) Advanced Organic Chemistri 5. izdanje Vols. A and B, Plenum Press, Njujork. Praksa predmetnog pronalaska će, u okvirima struke, koristiti, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode sintetičke organske hemije, masene spektroskopije, preparativne i analitičke metode hromatografije, hemiju proteina, biohemije i farmakologije.

[0019] „Alkil” je C1-12alkil sa pravim ili razgranatim lancem. Razgranati alkil obuhvata izo-, sek-, i terc-konfiguracije.

[0020] „Aril” je mono- ili bi-ciklični aromatični karbociklični prstenasti sistem od 5-12 atoma ugljenika opciono supstituisan sa C1-C4alkilom, halogenom, -OH ili -O-C1-C4alkilom.

Primeri mono- i bi-cikličnih aromatičnih karbocikličnih prstenastih sistema obuhvataju opciono supstituisani fenil i opciono supstituisani naftil.

[0021] „Arilalkil” je alkil grupa koja ima kao supstituent aril ili heteroaril grupu.

[0022] „Heteroaril” je aromatični heterociklični peto- ili šesto-člani prstenasti sistem opciono supstituisan sa C1-C4alkilom, halogenom, -OH ili -O-C1-C4alkilom. Petočlani heteroaromatični prstenasti sistem je monociklični aromatični prstenasti sistem koji ima pet atoma u prstenu, pri čemu su 1, 2, 3 ili 4 atoma prstena nezavisno izabrani iz N, O i S. Primeri petočlanih heteroaromatičnih prstenastih sistema uključuju opciono supstituisani imidazolil, tiazolil, tienil, furil, pirazolil i triazolil. Šestočlani heteroaromatični prstenasti sistem je monociklični aromatični prstenasti sistem koji ima šest atoma u prstenu, pri čemu su 1, 2, 3 ili 4 atoma prstena nezavisno izabrani iz N, O i S. Primeri šestočlanih heteroaromatičnih prstenastih sistema uključuju opciono supstituisani piridil, pirimidil i pirazinil.

[0023] Jedno otelotvorenje pronalaska daje farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenja pronalaska. U prvom otelotvorenju, farmaceutski sastav dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ili nosača, a opciono i druge terapeutske i/ili profilaktičke sastojke. Takvi ekscipijensi su poznati stručnjacima. Jedinjenja iz ovog pronalaska uključuju, bez ograničenja, bazna jedinjenja kao što su slobodne baze. Detaljna rasprava o farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima i solima dostupna je u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje (Easton, Pennsilvania: Mack Publishing Compani, 1990).

[0024] Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju kisele adicione soli, npr. soli formirane reakcijom sa hidrohalogenskim kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina i mineralne kiseline, kao što su sumporna kiselina, fosforna kiselina i azotna kiselina, kao i alifatične, aliciklične, aromatične ili heterociklične sulfonske ili karboksilne kiseline kao što su mravlja kiselina, sirćetna kiselina, propionska kiselina, sukcinska kiselina, glikolna kiselina, mlečna kiselina, jabučna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzojska kiselina, askorbinska kiselina, maleinska kiselina, hidroksimaleinska kiselina, piruvinska kiselina, p-hidroksibenzojska kiselina, embonska kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, hidroksietansulfonska kiselina, halobenzensulfonska kiselina, trifluorosirćetna kiselina, trifluorometansulfonska kiselina, toluensulfonska kiselina i naftalensulfonska kiselina. (vidi npr., Berge i saradnici, J. Pharm. Sci., 66: 119, 1977. i Vermuth, CG i PH Stahl, eds., Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use. Zurich: Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002).

[0025] U zavisnosti od načina primene, farmaceutski sastavi mogu biti u obliku čvrstih, polu čvrstih ili tečnih oblika doziranja, kao što su, na primer, tablete, supozitorije, pilule, kapsule, praškovi, tečnosti, suspenzije, kreme, masti, losioni ili slično, poželjno u jediničnom obliku doziranja pogodnom za jednokratnu primenu precizne doze. Sastavi će obuhvatiti efektivnu količinu odabranog leka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i, pored toga, mogu uključivati i druge farmaceutske agense, adjuvanse, razblaživače, pufere itd.

[0026] Pronalazak uključuje farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje iz ovog pronalaska, uključujući izomere, racemske ili ne-racemske smeše izomera, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili solvate zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i opciono drugim terapeutskim i/ili profilaktičkim sastojcima.

[0027] Za čvrste sastave, konvencionalni netoksični čvrsti nosači uključuju, na primer, farmaceutske klase manitola, laktoze, skroba, magnezijum stearata, natrijum-saharina, talka, celuloze, glukoze, saharoze, magnezijum karbonata i slično.

[0028] Za oralnu primenu, sastav će generalno imati oblik tablete, kapsule, kapsule sa mekim gelom, rastvora koji nije na bazi vode, suspenzije ili sirupa. Tablete i kapsule su poželjni oralni oblici davanja. U nekim oblicima, tableta je pločasta, npr., brzo rastopljiva pločica. U nekim otelotvorenjima, način administracije pločica je sublingvalno. Tablete i kapsule za oralnu upotrebu će generalno obuhvatiti jedan ili više često korišćenih nosača kao što su laktoza i kukuruzni skrob. Uobičajeno se daju i lubrikanti kao što je magnezijum stearat. Kada se koriste tečne suspenzije, aktivni agens se može kombinovati sa emulgatorima i suspendujućim agensima. Ako je potrebno, mogu se dodati i agensi za aromatizaciju, bojenje i/ili zaslađivanje. Druge opcione komponente za inkorporaciju u oralni preparat ovde uključuju, ali nisu ograničene na, konzervanse, suspendujuće agense, zgušnjivače i slično.

[0029] Doze za terapiju zavise od apsorpcije, raspodele, metabolizma i izlučivanja komponenti kombinovane terapije, kao i drugih faktora poznatih u struci. Vrednosti doze takođe će se razlikovati od težine stanja koji treba ublažiti. Treba dalje razumeti da za posebnog pojedinca, specifični režimi doziranja i rasporedi mogu biti prilagođeni vremenu u skladu sa potrebama pojedinca i profesionalnom procenom osobe koja vrši ili nadgleda davanje terapije. U nekim otelotvorenjima intravenska doza je oko 100ng. U nekim otelotvorenjima oralna doza je od 1µg do 1mg. U nekim otelotvorenjima, nazalna doza je od 3 mg do 6 mg.

[0030] Skraćenice koje se koriste:

[0031] Osim ako nije drugačije naznačeno, korišćene su L-amino kiseline i korišćena je konvencionalna terminologija amino kiselina. Primeri amino kiselina koji nisu dvadeset konvencionalnih amino kiselina uključuju:

Jedinjenja

[0032] Jedinjenja iz ovog pronalaska imaju strukturu formule I:

i njene farmaceutski prihvatljive soli, gde:

R<2>je H, C1-C4alkil, halogen, -OH ili -O-C1-C4alkil;

R<3>je H ili -CH2-OH ili -C(O)-NR<5>R<6>;

R<4>je H ili -C(=NH)-NH2;

R<5>i R<6>su nezavisno H, C1-C6alkil, -CH2- ciklopropil, -ciklopropil ili arilalkil pod uslovom da R<5>i R<6>oba nisu H;

X i Y su nezavisno -CH2- ili -S- pod uslovom da X je -CH2-, Y nije -CH2-;

Z je -CHR<7>- ili S i R<7>je H ili C1-C4alkil, halogen, -OH ili -O-C1-C4alkil;

R<8>je H ili -CH3; i

Ar is je heteroaril ili fenil opciono supstituisan sa jednim C1-C4alkilom, halogenom, -OH ili -O-C1-C4alkilom.

Tabela 1. Primer jedinjenja pronalaska.

Strukture jedinjenja 1-41 (SEQ ID 1-41):

[0033]

Tabela 2: Fizikohemijske osobine jedinjenja 1-41 (SEK ID 1-41)

Tabela 3: Podaci in vitro testova za jedinjenja 1-41

Tabela 4: Ključ za nomenklaturu amino kiseline.

Primeri

Opšta sinteza

[0034] Derivati amino kiselina nabavljeni su od komercijalnih dobavljača (Aapptec, EMD Millipore i Peptides International). Smole su kupljene od komercijalnih dobavljača (PCAS BioMatrik Inc. i EMD Millipore). Svi dodatni reagensi, hemikalije i rastvarači su nabavljeni od Sigma-Aldrich i VVR.

[0035] Jedinjenja koja su ovde opisana sintetizovana su standardnim postupcima u hemiji peptida čvrste faze korišćenjem Fmoc metodologije. Peptidi su sastavljeni ili ručno, ili automatski, koristeći Tribute Peptide Sintetizer (Protein Technologies Inc., Tucson, Arizona), ili kombinacijom ručnih i automatskih sinteza.

[0036] Preparativna HPLC je izvršena na Waters Prep LC sistemu pomoću PrepPack patrone Delta-Pack C18, 300Å, 15 µm, 47 x 300 mm sa protokom od 100 ml/min i/ili na Phenomenex Luna C18 koloni, 100Å, 5 µm, 30 x 100 mm pri protoku od 40 ml/min. Analitička HPLC sa reverznom fazom izvedena je na tečnom hromatografu serije Agilent Technologies 1200rr korišćenjem kolone Agilent Zorbax C18, 1.8 µm, 4.6 x 110 mm sa protokom od 1.5 ml/min. Analize konačnih jedinjenja su izvedene na hromatografu serije Agilent Technologies 1200 pomoću HPLC sa reverznom fazom na koloni Phenomenex Gemini 110Å C18, 3 µm, 2 x 150 mm sa brzinom protoka od 0.3 ml/min. Maseni spektri zabeleženi su na MAT Finningan LCK elektrosprejskom masenom spektrometru. Ukoliko nije drugačije navedeno, sve reakcije su izvedene na sobnoj temperaturi. Sledeća standardna referentna literatura daje dalje smernice o opštim eksperimentalnim postavkama, kao i o dostupnosti traženog početnog materijala i reagensa: Kates, S.A., Albericio, F., Eds., Solid Phase Synthesis: A Practical Guide, Marcel Dekker, New York, Basel, 2000; Greene, T.W., Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley Sons Inc., 2nd Edition, 1991; Stewart, J.M., Young, J.D., Solid Phase Synthesis, Pierce Chemical Company, 1984; Bisello, i dr., J. Biol. Chem.1998, 273, 22498-22505; Merrifield, J. Am. Chem. Soc.1963, 85, 2149-2154; and Chang and White P.D., 'Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach', Oxford University Press, Oxford, 2000.

[0037] Sledeće zaštitne grupe korišćene su za zaštitu datih funkcionalnih grupa amino kiselinskih bočnih lanaca: Pbf (2,2,4,6,7-pentametilhidrobenzofuran-5-sulfonil) za Arg; tBu (t-butil) za Tyr i Trt (tritil) za Cys, Gln i Asn.

[0038] Spojevi Fmoc-zaštićenih amino kiselina na sintetizatoru Tribute posreduju sa HBTU/NMM u DMF-u, osim derivata cisteina koji su spojeni sa DIC/HOBt u DMF-u.

Tokom sinteze korišćeni su pojedinačni ciklusi od 30-60 minuta sa 5-puta više aktiviranih Fmoc-zaštićenih amino kiselina. Uklanjanje Fmoc zaštitne grupe praćeno je putem UV.

Izvršeno je više puta (do 10 puta, po potrebi) po dva minuta ispiranje peptidne smole sa 20% piperidina u DMF-u.

[0039] DIC/HOBt posredovani spojevi u DMF-u korišćeni su za sve amino kiseline u ručnom režimu. Tokom sinteze korišćeni su pojedinačni ciklusi od najmanje 2 sata sa trostruko više aktiviranih Fmoc-zaštićenih amino kiselina. Kompletnost veza je procenjena testom nihidrina (Kaiser). Uklanjanje Fmoc zaštitne grupe postignuto je sa samo jednim 30 min. ispiranjem peptidne smole sa 20% piperidina u DMF-u.

[0040] Po završetku sinteze peptida, peptidne smole su isprane sa DCM i osušene pod vakuumom. Smole su tretirane sa TFA/H2O/TIS 96:2:2 (v/v/v) tokom 2 časa da bi se uklonile zaštitne grupe sa bočnim lancem uz istovremeno cepanje peptida iz smole. Peptidi su filtrirani, precipitirani sa dietil etrom i dekantirani. Da bi se dobili peptidi sa disulfidnim mostovima, talog je rastvoren u čistom TFA i u rastvor je naknadno dodat u 10% acetonitril u vodi. U nekim slučajevima dodatna količina acetonitrila za rastvaranje supstrata je dodata. Linearni peptid je oksidisan sa 0.1M I2/MeOH. Rastvor oksidatora je dodan u kapima sve dok se nije dobila žuta boja. Višak joda je redukovan čvrstom askrobinskom kiselinom. pH je zatim podešena na oko 4 sa koncentrovanim amonijakom. Dobijeni rastvor je unet direktno u kolonu sa preparativnom HPLC i eluiran sa gradijentom komponente B (videti tabelu ispod).

[0041] Za ciklizaciju peptida putem formiranja amidnih veza, sirovi linearni peptidi su rastvoreni u DMF-u i takođe je pripremljen rastvor HBTU u DMF-u. Peptidni rastvor i rastvor aktivatora naizmenično su dodati do zapremine aktivno mešanog DMF koja sadrži DIPEA. pH je održavana na 9-10 uz dodatak čistog DIPEA. Reakcija je praćena pomoću HPLC i tipično nije pronađen nikakav vrh supstrata nakon što su dodati poslednji delovi aktivatora i peptidnih rastvora. Reakciona smeša je razblažena sa 0.1% AcOH i dobijeni rastvor je unet direktno u kolonu sa preparativnom HPLC i eluiran sa gradijentom komponente B.

[0042] Svaki sirovi peptid je prečišćen sistemom pufera T. Frakcije čistoće veće od 93%, utvrđene pomoću analitičke HPLC sa reverznom fazom, grupisane su i ponovo stavljene na kolonu i eluirane puferom T da bi se dobile trifluoroacetatne soli. U nekim slučajevima izvršeno je dodatno prečišćavanje sa sistemom pufera C. Da bi se dobile acetatne soli, frakcije iz tečaja sa puferom T ili C ponovo su stavljene na kolonu i kolona je isprana sa 5 zapremina 0.1 M amonijum acetata. Finalni proizvod se eluira puferom A. Frakcije su grupisane i liofilizovane.

Tabela. Sastavi pufera

[0043] Za pripremljena jedinjenja tipično je utvrđeno da imaju čistoću od bar oko 95%. Primer 1 - SEQ ID:21

[0044] Fragmenti 1-7 su ručno sklopljeni počevši od 7.8 g (6.9 mmol) H-Pro-2-hlorotritil AM smole (EMD Millipore, katalog broj 856057, 0.88 mmol/g). Koriste se DIC/HOBt posredovane veze u DMF-u. Tokom sinteze korišćeni su pojedinačni ciklusi od najmanje 2 sata sa trostruko više aktiviranih Fmoc-zaštićenih amino kiselina. Kompletnost spojeva je procenjena putem ninhidrin testa. Uklanjanje Fmoc zaštitne grupe postignuto je samo jednim 30 min. ispiranjem peptidne smole sa 20% piperidina u DMF-u. Dobijeni derivati amino kiselina korišćeni su za sastavljanje ostataka 1-7 peptida vezanog na smole: Fmoc-Cys((CH2)3C(O)OtBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thi-OH i Boc-Cpa-OH. Nakon sastavljanja fragmenta 1-7 peptida smola je temeljno isprana sa DCM i tretirana sa DCM/HFIP 7:3 (v/v) koktelom (2 x 1 čas, svaki po 30 mL). Tada se rastvarači evaporišu i ostatak se precipitira sa etil etrom, filtrira i osuši u vakuumu. Dobijeno je 5.79 g (4,63 mmol, 67%) sirovo zaštićenog linearnog peptida. (Ostatak ovog proizvoda je korišćen u sintezi drugih jedinjenja kao što je ovde opisano.)

[0045] H-D-Arg-NEt2 x 2TFA. 2.81 g (5.4 mmol) Boc-D-Arg(Pbf)-OH (Chem Impex, cat # 05282), 1.95 mL (11.2 mmol) HBTU su rastvoreni u 10 mL DMF. U rastvor je naknadno dodato 0.62 mL (6 mmol) dietilamina. Nijedan supstrat nije detektovan pomoću analitičke HPLC nakon 5 min. Reakciona smeša je sipana u 500 mL vode i talog je odvojen centrifugiranjem i osušen u vakuumu. Ostatak se tretira sa 20 mL TFA/TIS/H2O (96/2/2, v/v/v) tokom 1 časa, a rastvarači su evaporisani. Ostatak se tretira etil etrom i dekantira. Dobijeno je 1.65 g (3.6 mmol, 67%) polučvrstog derivata koji je korišćen u sledećem koraku bez prečišćavanja.

[0046] Spajanje sa H-D-Arg-NEt2. 2.3 g (približno, 1.86 mmol) linearnog zaštićenog peptida i 0.76 g (2 mmol) HBTU se rastvori u 10 mL DMF koji sadrži 0.73 mL (4.2 mmol) DIPEA. U reakcionu smešu je naknadno dodato 0.93 g (2.05 mmol) H-D-Arg(Pbf)-OH x 2TFA u 1 mL DMF. Nakon 5 min HPLC nije otkriven supstrat. Proizvod se precipitira sa 1 L vode, filtrira i osuši u vakuumu. Dobija se 2.6 g (1.78 mmol, 96%) sirovog zaštićenog linearnog peptida. Potpuno zaštićeni peptid je tretiran sa 20 mL TFA/TIS/H2O (96/2/2, v/v/v) tokom 1 časa i rastvarač je evaporiran. Nezaštićeni linearni peptid je precipitiran sa etil etrom i liofilizovan. Prinos 1.82 g (1.55 mmol, 83%).

[0047] Celokupna količina linearnog peptida rastvorena je u 50 mL DMF. Takođe je pripremljen rastvor od 0.59 g (približno, 1.55 mmol) HBTU u 10 mL DMF. Peptidni rastvor i rastvor aktivatora dodaju su naizmenično u 50 mL snažno mešanog DMF koji sadrži 200 µL DIPEA u 10 porcija od 5 mL i 1 mL. pH je održavana na 9-10 uz dodatak čistog DIPEA. Sa HPLC nije otkriven nikakav vrh supstrata nakon dodavanja poslednjih delova aktivatora i peptidnih rastvora. Reakciona smeša je razblažena sa 0.1% AcOH u 1 L. Dobijeni rastvor je stavljen direktno na kolonu sa preparativnom HPLC i prečišćen sa sistemom pufera T eluiran sa gradijentom komponente B (vidi tabelu iznad). Frakcije sa čistoćom većom od 93%, određene su pomoću analitičke HPLC sa reverznom fazom, skupljene su i stavljene na kolonu. Kolona je isprana sa 5 zapremina 0.1M AcONH4i jedinjenje je naknadno eluirano puferom C da bi se dobila acetatna so. Frakcije su grupisane i liofilizovane. Dobijeno je 703.1 mg belog peptidnog praha (0.60 mmol, ukupno 22% na bazi 89.6% sadržaja peptida). Čistoća proizvoda je određena pomoću analitičke HPLC kao 99.7% a posmatrani M+H je bilo 1045.6 (računato M+H=1045.5).

Primer 2 - SEQ ID NO:10

[0048] 2.32 g (oko 1.8 mmol) zaštićenog linearnog peptida pripremljenog u sintezi SEQ ID NO: 21 je rastvoreno u 7 mL DMF i dodato je 0.63 mL (3.6 mmol, 2 ekv.) NMM, a potom 0.76 g (2 mmol, 1.1 ek) HBTU. U zasebnoj bočici 0.64 g (2.8 mmol, 1.5 ekv) agmatin sulfata suspendovano je u 7 mL DMF koji sadrži 0.49 mL (2.8 mmol) DIPEA. N,O-Bis(trimetilsilil)acetamid (BTA, Sigma-Aldrich, kat # 128910) dodat je povremeno u mešanu/sonifikovanu suspenziju. Čist rastvor je dobijen nakon što je 4 ekvivalenta BTA dodato u suspenziju. Dva rastvora su kombinovana i nakon 5 min sa HPLC nije detektovan supstratni peptid. Proizvod se precipitira sa 1 L vode, filtrira i osuši u vakuumu. Dobijeni prah je tretiran sa 50 mL koktela TFA/TIS/H2O 96/2/2 (v/v/v) tokom 1.5 časa. Rastvarač je evaporisan i linearni peptid je precipitiran pomoću etil etra, rekonstituisan u vodi/acetonitrilu i liofilizovan.

[0049] Celokupna količina peptida (2.13 g, približno. 2 mmol) dobijena u prethodnom koraku rastvorena je u 50 mL DMF. Takođe je pripremljen rastvor od 0.76 g (2 mmol) HBTU u 10 mL DMF. Peptidni rastvor i rastvor aktivatora dodati su naizmenično u 50 mL snažno mešanog DMF koji sadrži 400 µL DIPEA u 10 porcija od 2.5 mL i 0.5 mL. pH je održavan na 9-10 uz dodatak čistog DIPEA. Nije pronađen nikakav vrh supstrata nakon dodavanja poslednjih delova aktivatora i peptidnih rastvora. Reakciona smeša je razblažena sa 0.1% AcOH do 1 L, a dobijeni rastvor je direktno stavljen na kolonu sa preparativnom HPLC i prečišćen sistemom pufera T te eluiran gradijentom komponente B (vidi tabelu iznad).

Frakcije čistoće veće od 93%, određene pomoću analitičke HPLC sa reverznom fazom, grupisane su i ponovo nanete na kolonu. Kolona je isprana sa 5 zapremina 0.1M AcONH4 i jedinjenje je naknadno eluirano puferom C da bi se dobila acetatna so. Frakcije su grupisane i liofilizovane. Dobijeno je 656.7 mg (0.62 mmol, ukupni prinos od 23% na bazi 89.5% sadržaja peptida) belog peptidnog praha. Čistoća proizvoda određena je pomoću analitičke HPLC kao 100,0%, a posmatrani M+H bio je 946.6 (računato M+H je bio 946.4).

Primer 3 - SEQ ID NO:5

[0050] 1 g (približno, 1 mmol) FMPB AM smole (EMD Millipore, kat # 855028) se ostavi da nabubri u 15 ml smeše DCE/TMOF 1:1. U smešu suspenzije izobutil amina (1.5 mL, 15 mmol) doda se 3.2 g čvrstog natrijum triacetoksiborohidrida. Suspenzija se mućka preko noći. Smola je isprana sa MeOH, DMF i DCM i zatim je acilovana sa Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH/DIC (4 ekv.) u DCM. Smola je isprana DMF-om i testirana za potpunu acilaciju sa testom hloranil (negativan). Smola je podeljena na tri jednaka dela i sinteza je nastavljena na skali od 0.33 mmol na Tribute Sintetizer. Upotrebljene su jednokratne veze posredovane sa HBTU/NMM u DMF-u ili sa DIC/HOBt (za Cis) sa 5-puta više Fmoc zaštićenim amino kiselinama. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena sa nekoliko uzastopnih ispiranja od 2 min. sa 20% piperidina u DMF-u. U automatskoj sintezi korišćeni su sledeći derivati amino kiselina: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys((CH2)3C(O)OtBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thi-OH i Boc-Cpa-OH. Posle kompletnog sastavljanja celokupne peptidne sekvence, peptid se odvaja u smoli sa 20 mL TFA/H2O/TIS 96:2:2 (v/v/v) tokom 2 časa. Linearni peptid je rastvoren u 40 mL DMF koji sadrži 200 µL DIPEA. Takođe je pripremljen rastvor od 152 mg (približno 0.4 mmol) HBTU u 5 mL DMF. Peptidni rastvor i rastvor aktivatora dodati su naizmenično u 40 mL snažno mešanog DMF u 10 porcija od 4 mL i 0.5 mL. pH je održavana na 9-10 uz dodatak čistog DIPEA. Nijedan vrh supstrata nije detektovan pomoću HPLC nakon što je dodat poslednji deo rastvora aktivatora. Reakciona smeša je razblažena sa 0.1% AcOH do 1 L. Dobijeni rastvor je natopljen direktno na HPLC preparat kolonu. Jedinjenje je prečišćeno tri puta uzastopno u puferu T.

[0051] Frakcije iznad 97% čistoće su sakupljene i liofilizovane. Dobijeno je 49.0 mg belog peptidnog praha (0.042 mmol, ukupno 12%, uz pretpostavljenih 90% sadržaja peptida).

Čistoća proizvoda određena je pomoću analitičke HPLC kao 99.5%, a posmatrani M+H bio je 1045.6 (računato M+H = 1045.5).

Primer 4 - SEQ ID NO:9

[0052] 0.37 g (približno 0.3 mmol) 1,4-diaminobutan-2-hlorotiltilne smole (EMD Millipore, kat # 856085) se ostavi da nabubri u 10 mL DMF i smola postavljena u reaktivni sud za automatsku sintezu. Sastavljanje peptida je izvedeno na Tribute Sintetizeru. Korišćene se jednokratne veze posredovane sa HBTU/ NMM u DMF-u ili sa DIC/HOBt (za Cis) sa 5-puta više Fmoc zaštićenih amino kiselina. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena putem nekoliko uzastopnih 2-minutnih ispiranja sa 20% piperidina u DMF-u. U automatskoj sintezi su korišćeni su sledeći derivati amino kiselina: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys((CH2)3C(O)OtBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thi-OH i Boc-Tyr(tBu)-OH. Nakon što je celokupna peptidna sekvenca postavljena, peptid se odvaja iz smole putem 30 mL HFIP/DCM 3:7 (v/v) tokom 2 časa. Smola je filtrirana i rastvarači su evaporisani. Linearni zaštićeni peptid je precipitiran anhidrovanim etil etrom. Talog je dekantovan i suspendovan u 20 mL acetonitrila. 111 mg (0.4 mmol) Z(2-Cl)-OSu i 0.136 mL (0.8 mmol) DIPEA su naknadno dodati suspenziji. Nakon što se supstrat rastvorio, rastvarač je evaporisan i ostatak je tretiran sa 20 mL koktela TFA/TIS/H2O 95/2.5/2.5 tokom 1.5 časa. TFA je zatim evaporisan i ostatak je precipitiran sa dietil etrom. Sirovi linearni peptid je rastvoren u 100 mL DMF koji sadrži 200 µL DIPEA. Rastvor od 120 mg (0.31 mmol) HBTU u 5 mL DMF je zatim dodat u reakcionu smešu koja je snažno mešana. Posle 30 min. reakciona smeša je razblažena sa 1 L 0.1% AcOH i dobijeni rastvor je postavljen na kolonu sa preparativnom HPLC. Ciklični peptid je brzo eluiran (oko 3% MeCN/min.) u sistemu pufera. Frakcije koje prelaze 97% čistoće pomoću analitičke HPLC su grupisane i liofilizovane. Liofilizat je tretiran sa 5 mL TMSBr/tioanizol/TFA koktelom (1/1/6,v/v/v) tokom 1 časa na 0 °C. TFA se evaporira i peptid se taloži etil eterom. Finalni proizvod je prečišćen jednim prolazom u puferu T.

[0053] Frakcije koje prelaze prečišćenost od 97% su sakupljene i liofilizovane. Dobijeno je 77.5 mg belog peptidnog praha (0.079 mmol, ukupno 26%, uz pretpostavku 90% sadržaja peptida). Čistoća proizvoda određena je pomoću analitičke HPLC kao 99.6%, a posmatran M+H je bio 886.4 (računato M+H = 886.4).

Primer 5 - SEQ ID NO:17

[0054] 0.43 g (približno 0,3 mmol) H-Arg(Pbf)-O-2-hlorotitilne smole (EMD Millipore, kat # 856067) se ostavi da nabubri u 10 mL DMF i smola se postavlja u reaktivni sud za automatsku sintezu. Sastavljanje peptida je izvedeno na Tribute Sintetizeru. Koriste se jednokratne veze posredovane sa HBTU/NMM u DMF-u ili sa DIC/HOBt (za Cis) sa 5-puta više Fmoc-zaštićenih amino kiselina. Fmoc zaštitna grupa je uklonjena sa nekoliko uzastopnih 2 minutnih ispiranja sa 20% piperidina u DMF-u. U automatskoj sintezi su korišćeni sledeći derivati amino kiselina: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys((CH2)3C(O)OtBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH i Fmoc-Thi-OH. Posle sastavljanja peptidne sekvence 3-8, Fmoc-Phe(4-Et)-OH ručno je spojen metodom DIC/HOBt sa dvostrukim viškom reagensa. Fmoc grupa je zatim zamenjena Boc grupom tretiranjem sa smolom sa 20% PIP/DMF tokom 30 min. i acilirana N-terminalne amino funkcije sa Boc2O u DMF-u. Linearni peptid se odvaja iz smole sa 30 mL HFIP/DCM 3:7 (v/v) tokom 2 časa. Smola je filtrirana i rastvarači su evaporisani. Linearni zaštićeni peptid je precipitiran anhidrovanim etil etrom. Talog je dekantiran i osušen u vakuumu. Dobijeno je 450 mg sirovog zaštićenog peptida. Celokupna količina peptida (oko 0.3 mmol) je rastvorena u 10 mL 1,2-dihloroetana koji sadrži 0.5 mL DMF i 61 µL (0.45 mmol) NMM. Rastvor je ohlađen na 0 °C u ledenom kupatilu i dodato je 61 µL (0.45 mmol) izobutil hloroformata. Reakciona smeša je magnetno mešana 10 min. na 0 °C. Rastvor 160 mg (4.5 mmol) natrijum borohidrida u 5 mL vode dodat je u jednoj porciji. Reakcija se razblaži sa 200 mL vode i proizvod se odvoji centrifugiranjem i osuši pod vakuumom. Tada je proizvod tretiran sa 20 mL koktela TFA/TIS/H2O 95/2.5/2.5 tokom 1.5 časa. TFA se zatim evaporiše i ostatak je istaložen s dietil eterom. Sirovi linearni peptid je rastvoren u 80 mL DMF koji sadrži 200 µL DIPEA. Rastvor 61 mg (0.15 mmol) HBTU u 5 mL DMF je zatim dodat u reakcionu smešu koja je snažno mešana. Posle 30 min. reakciona smeša je razblažena sa 1 L 0.1% AcOH i dobijeni rastvor je postavljen na kolonu sa preparativnom HPLC.

Ciklični peptid je prečišćen dva puta uzastopno u puferu T.

[0055] Frakcije koje prelaze 97% čistoće su sakupljene i liofilizovane. Dobijeno je 41.7 mg belog peptidnog praha 0.039 mmol, ukupno 13%, uz pretpostavku 90% sadržaja peptida). Čistoća proizvoda određena je pomoću analitičke HPLC kao 95.1% a posmatran M+H je bio 970.6 (računato M+H = 970.5).

Eksperimentalno (Biološka testiranja)

In vitro testovi receptora

Aktivnost V2 receptora

[0056] Aktivnost agonista jedinjenja na humanom receptoru V2(h V2R) određena je u testu transkripcijskog reporter gena sa tranzitnom transfekcijom ekspresije h V2receptora DNK u HEK-293 ćelijama (humane embrionalne bubrežne 293 ćelijske linije) u saglasnošću sa reporterom DNK koja sadrži intracelularni kalcijumske odzivne elemente promotera koji regulišu ekspresiju luciferaze svica. Videti Boss, V., Talpade, D.J., Murphi, T.J. J. Biol. Chem. 1996, 3. maj; 271 (18), 10429-10432 za dalja uputstva o ovom testu. Ćelije su bile izložene serijskim razblaživanjima jedinjenja razblaženih 10 puta po dozi tokom 5 časa, praćeno lizom ćelija, određivanjem aktivnosti luciferaze i određivanjem efikasnosti jedinjenja i EC50 vrednosti pomoću nelinearne regresije. Dezmopresin (dDAVP) je korišćen kao unutrašnja kontrola u svakom eksperimentu. Rezultati za testirana jedinjenja prikazani su u Tabeli 3.

Aktivnosti V1b receptora

[0057] Da bi se utvrdila selektivnost, jedinjenja su testirana putem genskih testova transkripcijskog izveštavanja baziranim na luciferazi, izražavajući humani receptor V1b(hV1bR). Aktivnost agonista jedinjenja na hV1bR je određena putem genskih testova transkripcijskog izveštavanja na Flp-In™ 293 ćelijskoj liniji (HEK-flpin) stabilno transfektovan radi ekspresije hV1bR.

Bubrežni klirens

[0058] Dezmopresin se prečišćava iz tela prvenstveno bubrezima (“bubrežni klirens”).

Jedinjenja prema pronalasku imaju veći stepen klirensa kroz ne-bubrežne mehanizme.

Farmakokinetski eksperimenti su izvedeni u nefrektomiranim i sham-operisanim pacovima. Ne-bubrežni klirens (CLnr) određen je kod nefrektomiranih pacova, a ukupni klirens je određen kod pacova sa sham-operacijom (CLsham). % ne-bubrežnog klirensa je izračunat prema (CLnr/CLsham) x 100.

[0059] Za farmakokinetska ispitivanja, odraslim mužjacima pacova Sprague Dawley je postavljen kateter preko jugularne vene (za primenu jedinjenja) i karotidne arterije (za sakupljanje krvi). Rastvor koji sadrži više jedinjenja (kasetno doziranje) ubrizgan je u jugularni venski kateter (0.1 mg FB/ml svakog jedinjenja, 0.3 ml/životinji, nominalna doza od 0.1 mg FB/kg/jedinjenju). Uzorci krvi su sakupljeni 2, 6, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 i 120 minuta nakon primene pomoću automatizovanog sistema za uzimanje krvi, Instech Laboratories Automated Blood Sampling Unit 2nd generation (ABS2). Plazma je pripremljena iz cele krvi pomoću K2EDTA kao antikoagulant. Sledeća bioanaliza uzoraka obuhvata ekstrakciju jedinjenja i koncentraciju plazme koristeći standardne LC/MS metode. Koncentracija analita izračunata je iz vršnih područja i krivih kalibracije. PK parametri su dobijeni najboljim podešavanjem koncentracije jedinjenja-vremenskog profila za svaku životinju metodom nekomercijalne analize koristeći softver WINNONLIN ™ v6.3 (Pharsight Corporation).

Antidiureza

[0060] Jedinjenja su testirana za antidiuretičku aktivnost na modelu pacova. Ukratko, euvolemijski Sprague Dawley pacovi sa postavljenim kateterom smešteni su u metaboličke kaveze. Svaki metabolički kavez je postavljen za kontinuirano merenje spontanog izlaza urina pomoću pretvarača sile postavljenih iznad bočica za sakupljanje urina za praćenje i beleženje vremenskog trajanja izlaza urina pomoću softvera NOTOCORD™. Pacovi su primili intravensku infuziju testiranog jedinjenja ili nosača tokom tri sata korišćenjem pumpe sa špricom pomoću swivel/tether metode. Podaci o izlučivanju urina sakupljeni su tokom primene jedinjenja (0-3 sata) i prikupljeni su tokom 5 sati nakon davanja. U nekim slučajevima je utvrđena i osmolalnost urina. Jedinjenja iz ovog pronalaska pokazala su antidiuretičku aktivnost.

Farmaceutski sastavi

[0061] Takođe je data upotreba jedinjenja formule (I), kao što je ovde definisano, kao lek. Dalje je obezbeđen farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje formule (I), kao što je ovde definisano, kao aktivni sastojak u vezi sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, razblaživačem ili nosačem.

[0062] Farmaceutski sastav se može prilagoditi različitim načinima primene, uključujući na primer, oralno i nazalno. Na taj način sastav može biti, na primer, u obliku tableta, kapsula, praha, mikročestica, granula, sirupa, suspenzija i rastvora.

[0063] Farmaceutski sastav može opciono da sadrži npr. najmanje jedan dodatni aditiv izabran iz disintegranta, veziva, lubrikanta, agensa za aromatizaciju, konzervansa, boje i bilo koje njihove mešavine. Primeri takvih i drugih aditiva nalaze se u 'Handbook of Pharmaceutical Excipients'; Ed. A.H. Kibbe, 3rd Ed., American Pharmaceutical Association, USA and Pharmaceutical Press UK, 2000.

Metode lečenja

[0064] U daljem aspektu ovaj pronalazak daje upotrebu jedinjenja kao što je gore opisano za proizvodnju leka za lečenje dijabetesa insipidusa, primarne noćne enureze i nokturije.

Nadalje, dati su načini lečenja dijabetesa insipidusa, primarne noćne enureze i nokturije. Kako se ovde koristi „lečenje” znači ublažavanje simptoma, odlaganje početka bolesti i/ili lečenje bolesti kada se jedinjenje pronalaska daje u odgovarajućoj dozi.

[0065] Tipična doza jedinjenja prema predmetnom pronalasku varira u širokom opsegu i zavisiće od različitih faktora kao što su individualne potrebe svakog pacijenta i način primene. Doziranje se može davati jednom dnevno ili češće nego jednom dnevno, npr. povremeno. Lekar uobičajene stručnosti moći će da optimizuje doziranje u zavisnosti od situacije.

Claims (16)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule I:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde: R<2>je H, C1-C4alkil, halogen, -OH ili -O-C1-C4alkil; R<3>je H ili -CH2-OH ili -C(O)-NR<5>R<6>; R<4>je H ili -C(=NH)-NH2; R<5>i R<6>su nezavisno H, C1-C6alkil, -CH2- ciklopropil, - ciklopropil ili arilalkil pod uslovom da R<5>i R<6>nisu oba H; X i Y su nezavisno -CH2- ili -S- pod uslovom da X je -CH2-, Y nije -CH2-; Z je -CHR<7>- ili S i R<7>je H ili C1-C4alkil, halogen, -OH ili -O-C1-C4alkil; R<8>je H ili -CH3; i Ar je heteroaril ili fenil opciono supstituisan sa jednim C1-C4alkilom, halogenom, -OH ili -O-C1-C4alkilom.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 gde su R5i R6nezavisno H, C1-C6alkil ili arilalkil.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 gde samo X ili samo Y su -S-.
4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 gde X je -CH2-.
5. 5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 gde su X i Y oba -S-.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 gde Ar je tiofen.
7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 gde R<8>je -CH3.
8. 8. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 gde R<3>je -C(O)-NR<5>R<6>.
9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 gde R<5>je H i R<6>je C1-C4alkil.
10. 10. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8 gde oba od R<5>i R<6>su -CH2CH3.
11. 11. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 gde R<2>je halogen.
12. 12. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 11 gde R<2>je -Cl.
13. 13. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 11 gde R<2>je -F.
14. 14. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 koje je: jedinjenje 5

    jedinjenje 10

    jedinjenje 13

    jedinjenje 14

    jedinjenje 21

    ili jedinjenje 33
15. 15. Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-14 za upotrebu pri lečenju dijabetesa insipidusa, primarne noćne enureze ili nokturije.
16. 16. Upotreba jedinjenja prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-14 u proizvodnji lekova za lečenje insipidusa dijabetesa, primarne noćne enureze ili nokturije.