RS56639B1 - Varijante humanog gdnf - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak je u oblasti medicine, naročito u oblasti terapeutskih proteina. Specifično, predmetni pronalazak se odnosi na nove varijante humanog neurotrofnog faktora poreklom iz glijalnih ćelija (GDNF). Nove varijante GDNF mogu biti korisne za lečenje Parkinson-ove bolesti.

[0002] GDNF je dobro poznati neurotrofni faktor za koji je objavljeno da daje trofičku potporu dopaminergičkim neuronima in vitro i in vivo. Pored toga, objavljeno je da GDNF daje funkcionalna poboljšanja i ima neuroprotektivne aktivnosti u modelima Parkinsonove bolesti glodara i primata. Divlji tip GDNF proteina iz E. coli je primenjen centralno na pacijente koji pate od Parkinsnove bolesti sa mešovitim rezultatima. U dve male otvorene studije, objavljeno je da divlji tip GDNF proizvodi dugotrajno poboljšanje u motornoj funkciji. Međutim, u randomizovanom, placebo-kontrolisanom ispitivanju faze IIa 34 pacijenata, intra-putamenalna primena GDNF nije pokazala simptomatsko poboljšanje na 6 meseci. Povećanje u signalu biomarkera je bilo samo očigledno u tkivu koje neposredno okružuje mesto infuzije. Jedan noviji rad tvrdi da GDNF može biti obećavajući molekul za spašavanje umirućih nerava; međutim, isporuka molekula u tačnu oblast mozga ostaje obeshrabrujući izazov. Nature, Vol 466:19 August 2010.

[0003] Skraćeni GDNF proteini su objaveljni u WO97/11964 (PCT/US96/14915); međutim, tu ostaje potreba za novim varijantama GDNF sa željenim farmakološkim osobinama, stabilnošću i osobinama bio-raspodele. Tu postoji potreba za varijantnim oblikom GDNF koji je stabilan u uređaju za isporuku, i olakšava željenu moždanu bio-raspodelu, uz demonstraciju željene potencije i prihvatljivih osobina imunogenosti. Varijante GDNF koje nude jednu ili više od ovih poželjnih osobina mogu biti nova farmaceutski korisna medicinska terapija, naročito za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti.

[0004] Predmetni pronalazak daje novu skraćenu varijantu GDNF zrelog humanog GDNF domena kome nedostaje prvih 31 aminokiselina na N-terminusu ("Δ31-N-terminus skraćeni GDNF"), sa određenim aminokiselinskim supstitucijama uvedenim da bi se obezbedile stabilne, pogodno potentne, varijante GDNF koje nude željene osobine bio-raspodele i farmaceutski prihvatljiv profil imunogenosti. Predmetni pronalazak daje određene varijante humanog GDNF koje daju jednu ili više prednosti u odnosu na zreli humani divlji tip GDNF uključujući varijante koje imaju poboljšanu farmaceutsku stabilnost, kao i poboljšanu bioraspodelu, smanjeno vezivanje heparina, smanjenu deamidaciju, smanjenu podložnost formiranju sukcinimida i smanjen imunogeni potencijal u poređenju sa humanim divljim tipom GDNF. Određene nove varijante GDNF mogu biti korisna nova opcija lečenja za pacijente sa Parkinsonovom bolešću.

[0005] Predmetni pronalazak daje varijantu humanog GDNF koja sadrži SEQ ID NO: 23 RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130C GCI (SEQ ID NO: 23),

gde:

i) Xaa84je K ili A;

ii) Xaa88je R ili K;

iii) Xaa90je R ili K;

iv) Xaa125je K ili E; i

v) Xaa130je R ili E.

[0006] Pronalazak daje varijantu humanog GDNF gde je navedena varijanta izabrana iz grupe koja se sastoji od

[0007] U jednom aspektu, pronalazak daje varijantu humanog GDNF koja sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 9:

[0008] Pronalazak dalje daje intermedijer, koristan za pripremu varijante zrelog humanog GDNF skraćenog na Δ31-N-terminusu. Intermedijer sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 23 RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa

130CGCI (SEQ ID NO: 23), koja je produžena na N-terminusu sa signalnim sekrecionim peptidom. Ovde mogu biti korišćeni određeni brojevi sekvenci signalnog sekrecionog peptida. Primeri sekvenci signalnog sekrecionog peptida obuhvataju mišji kapa vodeći signalni sekrecioni peptid koji ima sekvencu prema METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 25), i humani signalni sekrecioni peptid hormona rasta koji ima sekvencu prema MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 32).

[0009] Intermedijeri koji imaju ove signalne sekrecione peptide mogu da proizvedu varijante humanog GDNF za koje je tražena zaštita sa povećanim prinosom, u odnosu na skraćene konstrukte GDNF koji imaju druge vodeće sekvence. Opisani intermedijeri uključujući signalni sekrecioni peptid mogu na taj način da imaju aminokiselinsku sekvencu prema

ili

[0010] Pronalazak daje farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži varijantu humanog GDNF kao što je navedena u patentnim zahtevima predmetnog pronalaska i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača, nosača ili ekscipijenasa. Pronalazak daje varijantu humanog GDNF za upotrebu kao lek. Pronalazak dalje daje varijantu humanog GDNF za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti. Pronalazak daje varijantu GDNF za upotrebu kao terapija.

[0011] Poželjna je varijanta u kojoj Xaa84je A, Xaa88je K, i Xaa90je K.

[0012] Poželjna je varijanta u kojoj Xaa84je K, Xaa88je R i Xaa90je R.

[0013] Poželjna je varijanta u kojoj Xaa125je K i Xaa130je R.

[0014] Poželjna je varijanta u kojoj Xaa84je A, Xaa88je K, i Xaa90je K, Xaa125je E i Xaa130je E.

DETALJAN OPIS

[0015] Objavljeno je da se divlji tip GDNF vezuje za heparin i ekstracelularni matriks, verovatno preko pozitivnih naelektrisanja lociranih u N-terminalnim 1-31 aminokiselinskim ostacima, prema tome ograničavajući raspodelu GDNF posle primene u mozak (Lin et al., J Neurochem 63, 758-768, 1994; Rickard et al., Glycobiology 13, 419-426, 2003; Piltonen et al., Eksperimental Neurology 219, 499-506, 2009). Takođe je objavljeno da GDNF daje funkcionalna poboljšanja i ima neuroprotektivne aktivnosti u modelima Parkinsonove bolesti glodara i primata (Tomac et al, 1995; Gash et al., 1996). Divlji tip GDNF proteina iz E. coli je primenjen centralno na pacijente koji pate od Parkinsonove bolesti sa mešovitim rezultatima. U dve male otvorene studije, GDNF je proizveo dugotrajno poboljšanje u motornoj funkciji (Gill et al., 2003, Slevin et al., 2005). Pored toga, povećano izrastanje dopaminergičkog neurona bilo je očigledno kod jednog pacijenta koji je preminuo od nepovezanih uzroka – infarkta miokarda (Love et al 2005). Međutim, u randomizovanom, placebo-kontrolisanom, ispitivanju faze IIa 34 pacijenta izvedenom od strane Amgen-a, intra-putamenska primena GDNF (Liatermin) nije pokazala simptomatsko poboljšanje na 6 meseci (Lang et al., 2006). Varijante GDNF za koje je tražena zaštita ispoljavaju poboljšane osobine u poređenju sa prethodno testiranim divljim tipom GDNF proteina iz E. coli.

[0016] Konstrukt sekvenca cele dužine divljeg tipa GDNF (211aa) koja sadrži signalni peptid (prvih 19 aminokiselina, SEQ ID NO: 4), pro-domen (italik, SEQ ID NO: 5), i zreli peptid (podvučen, SEQ ID NO: 3) je označena kao SEQ ID NO: 1:

MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPE DYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMALPRRERNRQAAAANPENSRGKGRR GQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLS RNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI.

DNK sekvenca cele dužine divljeg tipa GDNF je označena kao SEQ ID NO: 2:

[0017] Aminokiselinski položaji varijanti prema predmetnom pronalasku su određeni iz polipeptida od 134 aminokiselina zrelog humanog divljeg tipa GDNF (SEQ ID NO: 3). Mutacije su označene originalnom aminokiselinom, nakon toga brojem aminokiselinskog položaja, nakon toga zamenskom aminokiselinom. Brojčana oznaka svake varijante je zasnovana na divljem tipu zrele sekvence ("zreli divlji tip GDNF") pre skraćenja. Na primer, supstitucija za Lys (K) na položaju 84 (tj. K84) sa Ala (A) je označena kao K84A. Na sličan način, višestruke supstitucije za Lys (K) na položaju 84 sa Ala (A), Arg (R) na položaju 88 sa Lys (K), Arg (R) na položaju 90 sa Lys (K) i Asp (D) na položaju 95 sa Glu (E) su označene kao K84A/R88K/R90K/D95E. Kao što je ovde korišćena skraćenica "KAKKE" označava K84A-R88K-R90K-D95E.

[0018] Kao što je ovde korišćen, "GDNF cele dužine" označava celu proteinsku sekvencu, uključujući signalni peptid, prodomen i zreli domen.

[0019] Kao što je ovde korišćen, "zreli GDNF" ili "zreli GDNF cele dužine" označava ceo GDNF zreli domen (sa signalnim peptidom i otcepljenim prodomenom).

[0020] Kao što je ovde korišćen, "Δ31-N-terminus skraćeni GDNF" označava zreli domen GDNF kome nedostaje prvih 31 aminokiselina na N-terminusu. Kao što je ovde korišćen, "Δ31-N-terminus skraćeni GDNF" i "varijanta humanog GDNF" (ili "GDNFv") su korišćeni naizmenično.

[0021] Konstrukti GDNF cele dužine kada su transficirani u HEK293 ćelije tokom 5 dana proizvode pretežno zreli GDNF cele dužine. Kada su konstrukti GDNF cele dužine transficirani u CHO ćelije tokom dužeg vremenskog perioda i u toku generisanja stabilne ćelijske linije, skraćeni oblici GDNF su predominantni oblici (Lin et al., Science 260, 11301132, 1993). Delta31 ("Δ31"), skraćeni varijantni oblik zrelog humanog GDNF u kome su aminokiselinski ostaci broj 1 do 31 deletirani na N-terminusu, ima SEQ ID NO: 8, i može biti prečišćen iz smeše.

[0022] Na N-terminusu skraćena Δ31 GDNF varijanta može biti proizvedena u sisarskom ili bakterijskom ekspresionom sistemu delecijom prodomen peptidne sekvence i prvih 31 aminokiselinskih ostataka zrelog GDNF peptida na DNK nivou, i upotrebom broja sekvence sekrecionog signalnog peptida, kao što je nativni GDNF sekrecioni signalni peptid (SEQ ID NO: 4: MKLWDVVAVCLVLLHTASA); mišji kapa vodeći sekrecioni signalni peptid (SEQ ID NO: 25: METDTLLLWVLLLWVPGSTG); i humani sekrecioni signalni peptid hormona rasta (SEQ ID NO: 32: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA). Ovi konstrukti mogu da proizvedu pojedinačne vrste homogenih GDNF varijanta skraćenih na Δ31-N-terminusu.

[0023] Stručnjak iz date oblasti tehnike će shvatiti da varijante GDNF za koje je tražena zaštita ne isključuju mogućnost glikozilacije. Varijante GDNF za koje je tražena zaštita mogu biti glikozilovane kako je odgovarajuće, u zavisnosti od korišćenog ekspresionog sistema. Na primer, sisarske eksprimirane varijante GDNF su glikozilovane na položaju N49 dok bakterijske eksprimirane varijante nisu.

[0024] Kada je korišćen konstrukt nativne sekvence (SEQ ID NO: 2) cele dužine u toku ekspresije, proizvedena je smeša GDNF vrsta sa različitim N-terminalnim skraćenjima kao i zreo oblik (neskraćen) sa ili bez prodomenskog regiona.

[0025] Sledeći primeri, izvedeni uglavnom kao što je opisano u daljem tekstu, mogu biti korišćeni za procenu određenih karakteristika varijanti humanog GDNF prema pronalasku.

Primer 1

Proteinska ekspresija, prečišćavanje i analiza imunogenosti

a. Sub-kloniranje, mutacija, ekspresija, raspakivanje, ponovno pakovanje i prečišćavanje E. coli-eksprimiranog GDNFv

[0026] Sub-kloniranje. E. coli soj BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL koji sadrži plazmid pET-30a(+)/rhGDNF je gajen na medijumu Luria-Bertani buljonu koji sadrži kanamicin u krajnjoj koncentraciji od 30 µg/ml preko noći na 37°C. Posle sakupljanja ćelija putem centrifugiranja plazmidni vektor je izolovan upotrebom QIAquick Spin Miniprep kompleta (Qiagen) praćenjem protokola proizvođača. Izolovana plazmidna DNK je zatim korišćena za reakciju produženja prajmera gena Δ31-GDNF i Δ31-N38Q-GDNF koji kodiraju Δ31-GDNF protein (31 ostatak isečen sa N-terminusa zrelog humanog GDNF) i Δ31-N38Q-GDNF protein (31 ostatak isečen sa N-terminusa zrelog humanog GDNF u kome je asparginski ostatak na položaju 38 supstituisan glutaminom), respektivno. Ovo se može postići upotrebom oligonukleotidnih prajmera Δ31-for, Δ31-rev, Δ31-N38Q-for, i Δ31-N38Q-rev (SEQ ID NOs:6, 7, 39, i 40, respektivno) koji sadrže mesta restrikcione endonukleaze NdeI i XhoI dizajnirana da se spajaju za 5’ i 3’ krajeve gena. NdeI i XhoI restrikciona mesta uvedena na 5’ krajevima sens i antisens prajmera omogućavaju kloniranje Δ31-GDNF i Δ31-N38Q-GDNF u odgovarajuća mesta vektora pET-30a(+). Reakcija produženja prajmera je izvedena 3 min na 94°C, nakon čega su usledila 16 ciklusa od tri koraka od 1 min na 94°C, 0.5 min na 55°C, i 1 min na 72°C, sa krajnjim 10 min korakom na 72°C, u ukupnoj zapremini od 100 µl upotrebom 80 ng obrasca DNK, „forward“ i reverznih prajmera i PCR Supermix (Invitrogen #10572-014). Rezultujući amplikoni su verifikovani elektroforezom na agaroznom gelu i očišćeni upotrebom QIAquick PCR kompleta za prečišćavanje (Qiagen) praćenjem protokola proizvođača.

[0027] Oba amplifikovana genа Δ31-GDNF ili Δ31-N38Q-GDNF i pET-30a(+) vektor su digestirani u trajanju od 2 časa na 37°C sa NdeI i XhoI, nakon čega je usledilo prečišćavanje DNK pomoću elektroforeze na agaroznom gelu upotrebom QIAquick Gel Extraction kompleta. Δ31-GDNF ili Δ31-N38Q-GDNF je zatim ligatiran u pET-30a(+) plazmid upotrebom T4 DNK ligaze i praćenjem protokola proizvođača. 2-5 µl ligacionih reakcionih smeša je korišćeno za transformaciju direktno 50-100 µl E. coli soja BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL hemijski kompetetnih ćelija praćenjem protokola proizvođača (Agilent #230280). Rezultujuće kolonije transformanta dobijene postavljanjem na ploču Luria-Bertani agaroznim pločama koji sadrži kanamicin u krajnjoj koncentraciji od 30 µg/ml su ispitivane u odnosu na prisustvo ispravnog konstrukta preko sekvenciranja ekstrahovanog plazmida u oba smera upotrebom standardnih T7 promotor i T7 terminator oligonukleotidnih prajmera.

[0028] Mutacije. Mutageneza usmerena na mesto je izvedena upotrebom QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kompleta (Stratagene, La Jolla, CA) da bi se pripremio Δ31-N38Q-D95E-GDNF i Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF. Postupak koristi Δ31-N38Q-GDNF, inseriran u pET-30a(+) kao obrazac, i Δ31-N38Q-D95E-for i Δ31-N38Q-D95Erev oligonukleotide (Tabela 1, SEQ ID NOs:41 i 42) kao „forward“ i reverzni prajmeri, respektivno. Zatim, uspešno mutirani Δ31-N38Q-D95E gen inseriran u pET-30a(+) je korišćen kao obrazac, i Δ31-N38Q-K84AR88K-R90K-D95E-for i Δ31-K84A-R88K-R90K-D95E-D95E-rev oligonukleotidi (Tabela 1, SEQ ID NOs:43 i 44) kao „forward“ i reverzni prajmeri, respektivno, da bi se proizveo Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF. DNK sekvenca je potvrđena i plazmid je transformisan u E. coli soj BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL hemijski kompetentnih ćelija.

[0029] Proteinska ekspresija. Trajno zamrznuti stokovi E. coli ćelija BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL koje sadrže plazmid pET-30a(+)/GDNFv su korišćeni za inokulaciju 50 ml medijuma 2xTY bujona koji sadrži kanamicin u krajnjim koncentracijama od 30 µg/ml, na 37°C. Posle 9 časova, 5 ml starter kulture je korišćeno za inokolulaciju 6 x 2 litra istog tečnog medijuma za kulturu na 37°C. Kada kultura dostigne optičku gustinu na 600 nm između 0.8 i 1.4, tipično posle 16 časova, IPTG je dodat do krajnje koncentracije od 1 mM i temperatura kulture je snižena između 27 i 30°C za 5 časova. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 10,000g u trajanju od 20 min na 4°C i čuvane na -80°C.

[0030] Solubilizacija-ponovno savijanje. Ćelijska pasta je suspendovana u 2-3 zapremine rastvora 0.2 mg/ml lizozima, 5mM MgCl2i 50 mM Tris-Cl na pH 8 i ostavljena da se inkubira uz mešanje u trajanju od 30 min na ledu. Dobijena suspenzija je ultrazvučno obrađena na ledu u trajanju od 10 min (pulsevi od 5 sek., interval od 2 sek., 30-40% amplituda). Zatim, GDNFv je obnovljen u obliku inkluzionih tela koja su izolovana iz ćelijskog lizata putem centrifugiranja na 20,000g u trajanju od 20 min i solubilizovana u 4M guanidinu, 90 mM cisteinu, 20 mM Tris-Cl, pH 8.5. Protein je ponovo savijen u aktivan oblik pomoću 10X razblaženja sa 0.2M guanidinom, 2M ureaom, 20 mM Tris-Cl, pH 8.75. Smeša za ponovno savijanje je držana na 4°C u trajanju od 2 dana.

[0031] Prečišćavanje. Ponovo savijeni GDNFv je prečišćen do homogenosti u 3-koraka hromatografije na koloni:

1. Katjonsko izmenjivačka hromatografija (CEX) na SP koloni

2. Hromatografija sa hidrofobnom interakcijom (HIC) na fenil koloni

3. Ekskluziona hromatografija (SEC) na Superdex-75 koloni.

[0032] Renaturisani protein je prvo nanet na SP Sepharose brzo protočnu kolonu ekvilibrisanu u 20 mM natrijum acetatu, pH 5. GDNFv je eluiran sa uzlaznim linearnim gradijentom soli od 0.3 do 1 M NaCl u 20 mM natrijum acetatu, pH 5. Pul glavne struje CEX je dopunjen sa NaCl do krajnje koncentracije od 2.5 M i zatim nanet na Phenyl Sepharose HP sa hidrofobnom interakcijom hromatografsku kolonu u 20 mM natrijum citratu, pH 5. HIC kolona je eluirana sa opadajućim linearnim gradijentom soli od 2.5 do 0 M NaCl u 20 mM natrijum citratu, pH 5. GDNFv se čvrsto vezuje za HIC kolonu. HIC glavni pul je zatim koncentrovan i konačno nanet na Superdex-75 kolonu i protein je eluiran sa PBS, pH 7.4. Krajnji pul je koncentrovan, filtriran kroz 0.22 mikronsku membranu i čuvan na -80°C.

b. Ekspresija i prečišćavanje GDNFv u sisarskim ćelijama

[0033] Geni koji kodiraju GDNF varijante mogu biti pripremljeni upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije ili pomoću genske sinteze u sisarskom ekspresionom vektoru vođenom CMV promotorom. Rekombinantni plazmidi su korišćeni za prolazno transficiranje humanih embrionalnih bubrežnih 293EBNA (HEK293) ćelija i medijum je sakupljen posle 5 dana. U sledećem postupku, stabilne ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO) su generisane tako da eksprimiraju GDNF varijante. Geni koji kodiraju varijantne proteine su subklonirani u osnove ekspresionog plazmida koji sadrži glutamin sintazu (GS) (plazmidi na bazi pEE12.4, Lonza Biologics, Slough, UK) u okviru sa nativnom GDNF signalnom sekvencom sa pro-domenom prema uputstvima proizvođača. Konstrukti GDNF cele dužine (SEQ ID NO: 2) u vektorima na bazi pEE12.4 su transficirani u CHO i proizvode skraćene oblike GDNF gde je Δ31 predominantan oblik i može biti prečišćen iz smeše. Kada su uklonjeni pro-domen i prvih 31 aminokiselina sa N-terminusa, tada je Δ31-N-terminus skraćena varijanta GDNF proizvedena efikasno i čisto u sisarskom ekspresionom sistemu bez potrebe za prečišćavanjem iz smeše proizvoda cele dužine i skraćenih proizvoda kao što su prethodno objavljeni. Nativni GDNF sekrecioni signalni peptid može takođe biti zamenjen sa brojnim sekrecionim signalnim peptidima, uključujući mišji kapa vodeći sekrecioni signalni peptid ili humani sekrecioni signalni peptid hormona rasta. Δ31-N-terminus skraćena GDNF varijanta se još uvek proizvodi efikasno i čisto sa svim opisanim sekrecionim signalnim peptidima, ali sa varijabilnim nivoima ekspresije. GDNF varijante koje sadrže željene mutacije su subklonirane u pogodne ekspresione vektore (kao što je pEMK-NF2, Lonza) u okviru sa mišjom kapa signalnom sekvencom.

[0034] Prečišćavanje. GDNFv je prečišćen do homogenosti preko hromatografije sa kuglicama od 4 koraka:

1. Katjonska izmenjivačka hromatografija (CEX) na SP koloni

2. Hromatografija sa hidrofobnom interakcijom (HIC) na fenil koloni

3. Katjonska izmenjivačka hromatografija (CEX) na multimodel Capto MMC koloni

4. Ekskluziona hromatografija (SEC) na Superdex-75 koloni.

[0035] Ukratko, sakupljeni medijum kulture koji sadrži GDNF varijante proteine je prvo nanet na SP Sepharose brzo protočnu kolonu ekvilibrisanu u 20 mM natrijum acetatu, pH 5. GDNFv je eluiran sa linearnim gradijentom soli od 0 do 1M NaCl u 20 mM natrijum acetatu, pH 5. CEX glavni pul je dopunjen sa NaCl do krajnje koncentracije od 2.5 M i zatim nanet na Phenyl Sepharose HP kolonu za hromatografiju sa hidrofobnom interakcijom u 20 mM natrijum acetatu, pH 5. HIC kolona je eluirana sa reverznim linearnim gradijentom soli od 2.5 do 0 M NaCl u 20 mM natrijum acetatu, pH 5. GDNFv se slabo vezuje za HIC kolonu. Pul protočnih i ranih eluirajućih frakcija je zatim nanet na multimodel smolu Capto MMC kolone na pH 5. Kolona je isprana sa 50 mM Tris-Cl, pH 8, i zatim je GDNFv eluiran sa linearnim gradijentom soli od 0 do 1 M NaCl u 50 mM Tris-Cl, pH 8. Capto MMC glavna struja je konačno naneta na Superdex-75 kolonu i protein je eluiran sa PBS, pH 7.4. Krajnji pul je filtriran kroz 0.22 mikronsku membranu i čuvan na 2-8°C.

Epivax analiza potencijala imunogenosti

[0036] Napravljene su izabrane varijante humanog GDNF sa smanjenom verovatnoćom vezivanja HLA-DR (SEQ ID NOs: 12 i 15) i upoređivane su sa divljim tipom GDNF u analizi vezivanja GFRα i heparina.

Primer 2

Stabilnost divljeg tipa GDNF i Δ31 GDNF varijante

[0037] Stabilnost zrelog GDNF divljeg tipa cele dužine i Δ31-N-terminus skraćenih GDNF varijanti može biti procenjena upotrebom određenog broja analitičkih tehnika kao što su RP-HPLC, SE-HPLC, katjonsko izmenjivačka HPLC i masena spektrometrija za identifikaciju svih mesta razlaganja u ovim molekuluma. Mutacije su zatim napravljene da bi se uklonila mesta hemijskog razlaganja da bi se poboljšala stabilnost varijante humanog GDNF.

[0038] Analitička reverzno-fazna hromatografija (RP-HPLC). Na Zorbax C8 SB-300Å, 3.5 mikrona, 4.6 x 50 mm kolona zagrevana na 60°C (Agilent Technologies # 865973-909). Pokretna faza je 0.1 % TFA u H2O. GDNFv se eluira kao jedan pik na 214 nm sa vremenom zadržavanja od 19-20 min pomoću linearnog gradijenta acetonitrila od 5 do 50% tokom 30 min na stopi protoka od 1 ml/min u trajanju od 35 min.

[0039] Analitička ekskluziona hromatografija (SEC-HPLC). Na TSK-G-2000-SW-XL, 5 mikrona, 7.8 x 300 mm kolona (TOSOH BIOSEP #08540). Pokretna faza: PBS 350 mM NaCl, pH 7.4, na stopi protoka od 0.5 ml/min u trajanju od 35 min. GDNFv se eluira kao jedan pik na 214 nm sa vremenom zadržavanja od ~16-17 min.

[0040] Analitička katrjonsko izmenjivačka hromatografija (CEX-HPLC). Na Dionex, Propac WCX-10, 4 x 250 mm koloni (Dionex #054993). Pokretna faza je 20 mM natrijum fosfat, 10% acetonitril, pH 7. GDNFv se eluira kao složeni pik sa vremenom zadržavanja od 25-30 min pomoću linearnog gradijenta soli od 0.15 do 0.6 M NaCl tokom 45 min sa stopom protoka od 1 ml/min u trajanju od 52 min.

Analiza hemijske stabilnosti (LC-MS) divljeg tipa (bakterijski GDNF cele dužine) naspram divljeg tipa CHO GDNFv (N-terminus Δ31 skraćeni GDNF).

[0041] Divlji tip (bakterijski GDNF cele dužine) naspram divljeg tipa CHO GDNFv (N-terminus Δ31 skraćeni GDNF) su stresirani na 37°C u trajanju od 4 nedelje da bi se identifikovale aminokiseline koje mogu biti povezane sa hemijskom nestabilnošću.

Uzorci

[0042]

1- Divlji tip E.coli GDNF cele dužine na 4°C u trajanju od 4 nedelje, 1.0 mg/mL

2- Divlji tip E.coli GDNF cele dužine na 37°C u trajanju od 4 nedelje, 1.0 mg/mL

3- Divlji tip CHO Δ31-GDNFv na 4°C u trajanju od 4 nedelje, 1.0 mg/mL

4- Divlji tip CHO Δ31-GDNFv na 37°C u trajanju od 4 nedelje, 1.0 mg/mL

[0043] Intaktna i delimično molekularna analiza. 10 µL alikvota svakog uzorka (rastvor je mešan sa 20 µL vode ili 10 µL alikvote svakog rastvora) je mešano sa 40 µL od 100 mM tris-HCl pufera, pH8, 1.0 µL od 50 mg/mL DTT na temperaturi sredine u trajanju od 30 min. Svaki uzorak je podvrgnut LC/MS analizi.

Lys-C razlaganje. 20 µL alikvota svakog rastvora uzorka je liofilizovana do sušenja pod brzim vakuumskim sistemom i materijal je zatim rekonstituisan u 0.5 µL od 50 mg/mL DTT i 4.5 µL od 6 M guanidin-HCl, 0.5 M tris-HCl pufera, pH 8. Smeša je inkubirana na 37°C u trajanju od 30 minuta i svaki rastvor je zatim razblažen sa 93 µL vode i tretiran sa 2 µL 0.2 mg/mL Lys-C (Wako) na 37°C u trajanju od 2 časa. Za CHO GDNFv, 30 µL tripsinksog digestata je tretirano sa 0.5 µL PNGaze F na 37°C u trajanju od 1 časa (da bi se procenio ugljenohidratni profil). Digestat je zakišeljen sa 2 µL 10% TFA u H2O pre LC/MS analize. LC/MS analiza. Rastvori uzorka su analizirani pomoću Waters SYNAPT masenog spektrometra spojenog sa Waters Acquity UPLC ili Water LCT premier masenog spektrometra spojenog sa Waters 2795 HPLC.

[0044] Top-Down analiza. Proizvodi cepanja/skraćenja za divlji tip GDNF su dobijeni pomoću LC-MS analize za delimično redukovani GDNF. Višestruki proizvodi cepanja/skraćenja su identifikovani i kvantitativni podaci za ova cepanja su prikazani u Tabeli 2. Nekoliko cepanja (cepanja između N15/R16, N22/P23, N25/S26 i N38/R39) imaju slične puteve razlaganja kao deamidacija preko formiranja sukcinimida. Za divlji tip CHO Δ31-GDNFv, prvih 31 aminokiselinskih ostataka su odcepljeni sa N-terminusa. Iako CHO GDNFv ima dva potencijalna N-glikozilaciona mesta po lancu, samo jedno mesto je N-glikozilovano. Glavni zabeleženi glikani su di- ili tri-antenarni oligosaharidi sa različitom galaktozilacijom. Zanimljivo, nisu detektovani značajno sialilovani glikani. (Tabela 3)

Bottom-Up analiza (Mapiranje peptida). UV hromatogrami Lys-C digestat uzoraka GDNF sa smanjenom stabilnošću pokazuju, sa izuzetkom GDNF peptida 126-129, da su detektovani svi očekivani peptidi. Za CHO materijal, N-terminalni peptidi (pre R32) nisu detektovani. Peptid 38-60 koji sadrži N49 je glikozilovan i više od 95% od Asn49 je zauzeto. Peptid 85-96 koji sadrži N85 nije glikozilovan. Ovi rezultati su u skladu sa LC/MS analizom za redukovane GDNF uzorke.

[0045] Ukupno, homo dimer za oba, divlji tip i CHO materijale je glavna komponenta. Manja komponenta, koja se rano eluira, je monomer. Prema analizi masene spektroskopije, GDNF Cys41 formira disulfidnu vezu sa slobodnim Cys ostatkom za monomer. Relativni procenat za pikove monomera je veoma nizak, i oni su <1% za CHO i <0.5% za divlji tip pomoću ultraljubičaste analize. Sadržaj monomera nije promenjen za stresirane materijale.

[0046] Razlaganja, kao što su oksidacija, deamidacija i izomerizacija, su takođe dobijeni iz mapiranja peptida. Rezultati su prikazani u Tabeli 4. Divlji tip GDNF cele dužine iz E. coli. Sadrži dva Met ostatka, M(-1) i M6, i oksidacija za ova mesta je relativno niska. GDNF ne sadrži nijedan Trp ostatak. GDNF ima osam Asp ostataka za monomer cele dužine. Glavna deamidaciona mesta su N25 i N38. S obzirom na to da se deamidacija javlja mnogo brže na višoj pH pufera, relativni procenat za ova mesta bi trebalo da je nizak kada je stresiran u pH 5 ili 6 puferu. Jedan izomerni peptid, 85-96, je identifikovan, ali nije jasan zbog izomerizacije Asp u Iso-Asp ili racemizacije aminokiselinskog ostatka. Dobro je poznato da je visoki pH stres generalno racemizacija i nizak pH stres je Asp izomerizacija. Za divljni tip GDNF cele dužine, nekoliko peptida pokazuju različite mase za oba, kontrolne (4°C) i stresirane (37°C) uzorke. Oni su najverovatnije pogrešna ugradnja u toku biosinteze E. coli..

[0047] Ovi podaci pokazuju da Δ31-N-terminus skraćena GDNF varijanta proizvedena u CHO ćelijama ima poboljšanu hemijsku stabilnost zahvaljujući deleciji prvih 31 aminokiselinskih ostataka koji obuhvataju značajne vruće tačke oksidacije i deamidacije, u poređenju sa divljim tipom zrelog humanog GDNF cele dužine proizvedenog iz E. Coli kada je stresiran u trajanju od 4 nedelje na 37°C. Pored toga, kao što je pokazano u Tabeli 5, značajno poboljšanje u biofizičkim i biohemijskim osobinama dve mutirane Δ31-N-terminus skraćene GDNF varijante (N38Q i D95E, respektivno) zabeleženo je posle mutacije u poređenju sa divljim tipom E. coli GDNF cele dužine ili Δ31-N-terminus skraćenom GDNF varijantom pre mutacije.

Primer 3

In vitro aktivnosti vezivanja

[0048] Sledeće anlaize pokazuju da određene varijante humanog GDNF smanjuju vezivanje heparina uz održavanje vezivanja GFRα1 receptora da bi se obezbedile različite karakteristike vezivanja za heparin i receptor.

• Kinetika vezivanja GDNFv sa GFRs na Biacore

[0049] GDNF varijante (GDNFv: N-terminus-Δ31-skraćeni) mogu se eksprimirati u E.coli (bakterijskim) ili ćelijama sisara (CHO ćelije ili HEK293 EBNA ćelije) i prečistiti kao što je opisano u Primeru 1. Primarne sekvence varijanti ostaju iste bez obzira koji je ekspresioni sistem korišćen.

[0050] Biacore® 2000 instrument je korišćen za merenje kinetike vezivanja GDNFv sa familijom GDNF receptora čoveka i pacova (GFRα1 i GFRα2). Merenja su izvedena na 25°C. Uzorci su rastvoreni u HBS-EP puferu (150 mM natrijum hlorid, 3 mM EDTA, 0.005% (tež./zapr.) surfaktant P-20, pH 7.4). Protein A, Staphylococcus aureus je imobilisan na protočnim ćelijama 1 do 4 CM4 senzor čipa (GE Healthcare #BR-1005-39) na nivou od ~200 jedinica odgovora (RUs) korišćenjem hemije kuplovanja amina da bi se zarobile GFR Fc himere (Rekombinantna humana GFRα-1/GDNF Rα-1 Fc himera; Rekombinantna humana GFRα-2/GDNF Rα-2 Fc himera; Rekombinantna GFRα-1/GDNF Rα-1 Fc himera pacova; Rekombinantna GFRα-2/GDNF Rα-2 Fc himera miša).

[0051] Vezivanje je procenjeno korišćenjem višestrukih ciklusa. Svaki ciklus se sastoji od sledećih koraka: 1) injekcije od oko 10 µL GFR na koncentraciji od ~1.0 µg/mL i stope protoka od 10 µL/min., ciljajući na zarobljavanje od 120-150 RUs; 2) injekcija od 250 µL GDNFv na stopi protoka od 50 µL/min., u opsegu finalne koncentracije između 10 nM i 0.04 nM praćeno sa 20 min. za disocijaciju; i 3) regeneracija korišćenjem oko 30 µL 10 mM glicin hidrohlorida, pH 1.5. Stope asocijacije i disocijacije za svaki ciklus su procenjene korišćenjem modela "1:1 (Langmuir) vezivanja" u BIAevaluation programu, verzija 4.1.

[0052] Rezultati su prikazani u Tabelama 6-8 u nastavku.

Tabela 8. Kinetika vezivanja i afinitet GDNFv za GFRα-1 pacova.

• Vezivanje humanih GDNF varijanti sa GFRα1 korišćenjem ELISA

[0053] GDNF divljeg tipa i varijante su testirani u ELISA testu, u kome je mereno vezivanje GDNF proteina sa receptorom (GFRα1) vezanim na ploči. Stanje "bez GDNF" i/ili stanje "irelevantni protein" korišćeni su za negativne kontrole.

[0054] Svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića (Greiner 655081 Immunobind ELISA plates) je obložen sa 70 µl humanog GFRα1 (rekombinantna humana GFRα1-Fc himera, bez nosača) na 1µg/ml u karbonatnom puferu, pH 9.6. Ukoliko je irelevantni receptor obložen, to je irelevantna Fc himera i obložena je na istoj koncentraciji kao GFRα1. Ploče su zapečaćene i inkubirane na 4°C preko noći. Bunarčići su aspirirani i isprani dva puta sa puferom za ispiranje (20 mM Tris (hidroksimetil) aminometan, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20), korišćenjem automatskog uređaja za ispiranje ploča. Ploče su blokirane sa 200 µl blokirajućeg pufera po bunarčiću (3% Carnation Instant milk u prethodno navedenom puferu za ispiranje) najmanje 1 čas na sobnoj temepraturi. Ploče su isprane dva puta sa puferom za ispiranje.

[0055] GDNF proteini su serijski razblaženi u blokirajućem puferu na odgovarajućem opsegu koncentracije, tipično počinjući od 5 µg/ml i serijski razblaživani 1:10. Korišćena je kontrola bez GDNF, koja se sastoji samo od blokirajućeg pufera.50 µl svakog rastvora GDNF dodato je GFRα1 obloženim bunarčićima u triplikatu. Ploče su inkubirane 1.5 čas na sobnoj temperaturi. Bunarčići su zatim isprani 3 puta sa puferom za ispiranje.

[0056] 50 µl alikvota biotinilovanog anti-humanog GDNF antitela (R&D Systems, biotinilovano kozje anti-humano GDNF poliklonsko antitelo, kataloški # BAF212) razblaženo do koncentracije od 1 µg/ml u blokirajućem pupferu, dodato je svakom bunarčiću i inkubirano 45 minuta na sobnoj temepraturi. Bunarčići su zatim isprani 3 puta sa puferom za ispiranje.

[0057] 50 µl alikvota streptavidina konjugovanog sa peroksidazom rena (Jackson ImmunoResearch, kataloški # 016-030-084), razblaženo 1:1000 u blokirajućem puferu, dodato je svakom bunarčiću i inkubirano 20-30 minuta na sobnoj temepraturi. Alternativno, može se koristiti razblaženje 1:2000, sa vremenom inkubacije od 30-90 minuta. Bunarčići su zatim isprani 3 puta sa puferom za ispiranje. 50 µl hromogenog supstrata (tj., OPD supstrata) dodato je svakom bunarčiću i dozvoljeno je da se razvija na sobnoj temperaturi 2-3 minuta. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 1N HCl svakom bunarčiću. Apsorbanca bunarčića je očitana na 490 nm na Molecular Devices SpectraMax250 čitaču ploča. Određena je prosečna apsorbanca za triplikate bunarčića za svaki uslov, i rezultujuće vrednosti su obrađene za izračunavanje EC50sa Graph Pad Prism softverom da bi se obezbedio 95% interval poverenja. Ovi opsezi su rezimirani u Tabeli 9 u nastavku.

• Vezivanje humanih GDNF varijanti za heparin korišćenjem ELISA

[0058] GDNF divlji tip i varijante testirani su u ELISA testu, u kojima je mereno vezivanje GDNF proteina za heparin vezan na ploči. Stanje "bez GDNF" korišćeno je kao negativna kontrola.

[0059] Svaki bunarčić ploče za vezivanje heparina sa 96-bunarčića (BD BioSciences Heparin Binding Plates, kataloški # 354676) obloženo je sa 70 µl heparina ((smeša molekulskih težina heparina od Sigma, natrijumova so heparina od Porcine Intestinal Mucosa, kataloški # H-3149) na 5 µg/ml u PBS. Ploče su zapečaćene i inkubirane na sobnoj temperaturi preko noći, zaštićene od svetlosti. Bunarčići su aspirirani i isprani tri puta sa puferom za ispiranje, korišćenjem automatskog uređaja za ispiranje ploča. Ploče su blokirane sa 200 µl blokirajućeg pufera po bunarčiću 90-120 minuta na 37°C (ploče su zapečaćene tokom ove inkubacije). Ploče su isprane dva puta sa puferom za ispiranje.

[0060] GDNF proteini su serijski razblaženi u blokirajućem puferu na odgovarajućem opsegu koncentracije, tipično počinjući od 5 µg/ml i serijski razblaženi 1:10. Korišćena je kontrola "bez GDNF", koja se sastoji samo od blokirajućeg pufera. 50 µl alikvota svakog GDNF rastvora je dodata bunarčićima obloženim sa heparinom u triplikatu. Ploče su inkubirane 1.5-2 časa na sobnoj temperaturi. Bunarčići su zatim isprani 3 puta sa puferom za ispiranje.

[0061] 50 μl alikvota biotinilovanog anti-humanog GDNF antitela, razblaženog do koncentracije od 1 μg/ml u blokirajućem puferu, dodato je svakom bunarčiću i inkubirano 45 minuta do 1 časa na sobnoj temperaturi. Bunarčići su zatim isprani 3 puta sa puferom za ispiranje.

[0062] 50 µl alikvota strepatividina konjugovanog sa peroksidazom rena, razblaženog 1:1000 u blokirajućem puferu, dodato je svakom bunarčiću i inkubirano 20-30 minuta na sobnoj temperaturi. Alternativno, može se koristiti razblaženje 1:2000, sa vremenom inkubacije od 30-90 minuta. Bunarčići su zatim isprani 3 puta sa puferom za ispiranje. 50 µl alikvota hromogenog supstrata (tj., OPD supstrat) je dodat svakom bunarčiću i dozvoljeno je da se razvija na sobnoj temperaturi 2-3 minuta. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 1N HCl svakom bunarčiću. Apsorbanca bunarčića očitana je na 490 nm na čitaču ploča. Određena je prosečna apsorbanca za triplikate bunarčića za svaki uslov, i rezultujuće vrednosti su obrađene za izračunavanje EC50sa Graph Pad Prism softverom da bi se obezbedio 95% interval poverenja. Ovi opsezi su rezimirani u Tabeli 9 u nastavku.

Tabela 9

[0063] Ovi podaci pokazuju da delecija 31 N-terminalne aminokiseline (varijanta nazvana "CHO Δ31 GDNF") iz divljeg tipa GDNF (nazvanog "WT E. coli GDNF") može značajno smanjiti vezivanje heparina (oko 10-puta) uz zadržavanje vezivanja GFRα1 receptora, i ovi podaci dalje ukazuju da se raznovrsne diferencijalne karakteristike vezivanja heparina i receptora mogu postići preko dodatnih varijanti humanog GDNF.

Primer 4

In vitro aktivnosti

• Test izrastanja neurita NS-1

[0064] GDNF aktivnost za neuronsku diferencijaciju je procenjena korišćenjem Neuroscreen-1 ćelija (PC12 subklon) pacova. Ćelije su održavane u F-12K bazalnom medijumu, 12.5% toplotno inaktiviranog konjskog seruma, 2.5% toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1X GlutaMAX™ (Invitrogen, Cat.# 35050061), i 1X Anti-anti (Invitrogen, Cat.#15240) na 37 °C, 95% vlažnosti u bocama obloženim kolagenom. Da bi se merilo izrastanje neurita, Neuroscreen-1 ćelije su zasejane u Collagen I ploče sa 96-bunarčića sa 2200 ćelija po bunarčiću u medijumu za rast korišćenjem samo unutrašnjih 60 bunarčića. Nakon 24 časa vezivanja ćelija, medijum je uklonjen i novi medijum za rast koji sadrži GFRα1-Fc na 1µg/ml plus GDNF razblažen u serijskim razblaženjima od 8 tačaka je dodat ploči ili u triplikatu bunarčića, ili šest bunarčića po koncentraciji. Medijum plus 1µg/ml GFRα1-Fc je uključen kao negativna kontrola, i medijum plus 25 ng/ml faktora rasta neurita uključeno je kao pozitivna kontrola za odgovor ćelija u testu. Ploče su inkubirane 96 časova na 37°C, 95% vlažnosti i zatim fiksirane dodavanjem 45 μl rastvora fiksativa svakom bunarčiću i inkubacijom na sobnoj temperaturi 1 čas. Ploče su isprane dva puta sa 1X puferom za ispiranje iz Neurite Outgrowth Hit Kit™(Cellomics, kat. #K07-0001-1) i zatim isprane dva puta sa 1X pufera iz kompleta. Ćelije su imuno-obojene sa reagensima za izrastanje neurita iz kompleta prema uputstvu proizvođača. Ploče su stavljene na Arrayscan Instrument i analizirane korišćenjem Arrayscan softvera i Neuronal Profiling algoritna od Cellomics. Podaci generisani algoritmom obrađeni su za izračunavanje EC50sa Graph Pad Prism softverom.

[0065] Testirane su višestruke varijante u odnosu na aktivnost neuronalne diferencijacije i uočenih EC50za svaku varijantu su navedene u Tabeli 10A.

Svi GDNF uzorci testirani ovde imaju aktivnost u testu izrastanja neurita, u različitom stepenu. Krive doze za Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E-R130E varijantu ne dostižu plato na maksimalnoj dozi u dva izvedena eksperimenta, tako da se nije mogla izračunati EC50. EC5095% intervali poverenja za druge četiri GDNF varijante preklapaju se u opsegu, pokazujući slične nivoe aktivnosti u ovom testu.

• Fosforilacija C-Ret receptora

[0066] Analiza fosforilacije c-Ret receptora može se koristiti za demonstraciju indukcije fosforilacije cRet receptora na položaju Y1016. GDNF aktivnost za fosforilaciju c-Ret receptora procenjena je u ćelijama iz ćelijske linije humanog neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC) koje su stabilno transficirane da prekomerno eksprimiraju humani c-Ret. Ćelije su održavane u Dulbecco’s modifikovanom Eagle medijumu (DMEM), 10% FBS, 3mg/ml Blasticidin. Za fosforilaciju c-Ret, ćelije su zasejane na 5 x 10<5>po bunarčiću u pločama od 24-bunarčića obloženim kolagenom u medijumu za rast bez Blasticidina i dozvoljeno je da se vežu preko noći. Medijum je promenjen u nisko glukozni DMEM 0.25% BSA (goveđi serum albumin) 24 časa. Medijum za izgladnjivanje je uklonjen, i ćelije su tretirane sa GDNF u DMEM bez glukoze, 0.25% BSA, mg/ml GFRα1-Fc 30 minuta na 37°C. Svaka GDNF varijanta je testirana u višestrukim koncentracijama. Medijum tretmana je uklonjen, i ćelije su sastrugane sa površine ploče u ledeno hladnom puferu za lizu M-Per Extraction reagent Protease Inhibitor cocktail, Phosphatase Inhibitor 1, Phosphatase Inhibitor cocktail 2, i Phosphphatase Inhibitor cocktail 3 (Sigma™). Suspenzije ćelija su vorteksovane za potpuno liziranje, centrifugirane na 14,000 x g da bi se istaložili ćelijski ostaci, i supernatant je kvanifikovan u odnosu na koncentraciju proteina korišćenjem reagenasa za analizu sa bicinhoninskom kiselinom (BCA). Za svaki GDNF lizat, 10 µg protein je izdvojen sa 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gels (Invitrogen, kat. # NP0322) i preneto u PVDF blotove. Tirozin 1016 fosfo-Ret je detektovan sa zečijim poliklonskim antitelom i kozjim-anti-zečijim-HRP antitelom; i c-Ret je detektovan sa monoklonskim antitelom miša i kozjim-anti-mišjim-HRP antitelom. Blotovi su razvijeni sa Supersignal West Pico™ (Thermo Scientific, kat. # 34081) reagensima i izloženi rentgenskom filmu. Pet GDNF varijanti (WT E.coli GDNF, CHO Δ31 GDNF, CHO 431-N38Q-D95E GDNF, CHO Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E GDNF, i CHO Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E-R130E GDNF) testirane su u DMEM bez glukoze, 0.25% BSA medijuma 1 μg/ml GFRα1-Fc za aktivnost fosforilacije c-Ret na četiri koncentracije od 0.8, 2.0, 4.0, 10, 20, 50 i 100 ng/ml. Samo medijum, medijum μg/ml GFRα1-Fc, i medijum 100 ng/ml CHO Δ31 GDNF su takođe testirani kao negativne kontrole. Svaka od pet GDNF varijanti indukuje fosforilaciju c-Ret sa EC50od 8-15ng/ml. Ovi podaci pokazuju da svih pet GDNF varijanti indukuje fosforilaciju c-Ret na Y1016 na dozno zavisni način.

[0067] Kao što je rezimirano u Tabeli 10B, inježeringom dobijene GDNF varijante sa skraćenim Δ31-N-terminusom koje su pokazivale značajno poboljšanje biofizičkih i biohemijskih osobina (Tabele 5, 6, 9, i 10A) zadržavale su optimizovane biološke osobine, npr., uporedivo vezivanje sa GFRα1 receptorom, smanjeno vezivanje heparina, i uporedivo izrastanje neurita, nakon 4 nedelje inkubacije na 37 °C.

Primer 5

Aktivnost GDNF varijante u testu obrta

[0068] Mužjaci Sprague-Dawley pacova anestezirani su sa izofluranom (3% u O2). Glava je obrijana i sterilizovana sa rastvorom joda pre nego što je životinja smeštena u stereotaksički okvir sa podlogom sa kontrolisanom temperaturom. Oči su zaštićene sa oftalmičkim gelom i anestezija je održavana korišćenjem izoflurana (1-2% u O2). Središnji rez je napravljen na glavi životinje, sklap i tkivo ispod njega su sklonjeni i lobanja je osušena da bi se uočila bregma. Koordinate za kaudalno jedro su merene od bregme i duralne površine za infuziju GDNF. Infuziona kanila veličine 28 je polako spuštena na ovu poziciju, i infuzija počinje 1 minut kasnije korišćenjem pumpe.2 ml bolus test GDNF je infuzijom uneto u levu hemisferu tokom 4 minuta na 0.5 µl/min, i kanila ostaje na mestu dodatna 3 minuta po završetku infuzije. Kad je kanila uklonjena mesto reza je zatvoreno, primenjena je post-operativna analgezija i dozvoljeno je da se životinja oporavi u kavezu sa kontrolisanom temperaturom pre prenošenja u njen kavez. Životinje su post-operativno proveravane u skladu sa lokalnim etičkim instrukcijama. U odgovarajućem intervalu nakon infuzije, životinja je žrtvovana, mozak je uklonjen i kaudalna jedra su precizno disekovana, izmerena i zamrznuta za HPLC analizu dopamina i metabolita. Dozvoljeno je da se smrznuto tkivo brzo odmrzne i homegenizovano je u 0.5 ml pufera za homogenizaciju (0.1 M perhlorne kiseline (PCA), 0.1 mM etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), 2.5 mg/L askorbinska kiselina) pre centrifugiranja na 20,000 g 15 minuta. Supernatant je uklonjen i filtriran kroz uređaj za filtriranje bez šprica. Analiza dopamina (DA), dihidroksifenilsirćetne kiseline (DOPAC) i homovanilinske kiseline (HVA) izvedena je korišćenjem HPLC kuplovanom sa elektrohemijskom detekcijom. 20 µl alikvote svakog uzorka je injektirano i kvantifikovano u odnosu na eksternu kalibracionu krivu (LC4C, BAS, USA). Mobilna faza se sastoji od 100 mM NaH2PO4, 100 mM H3PO4, 2 mM OSA, 1mM EDTA, 13% Metanola (MeOH), pH 2.8 korišćenjem Hypersil BDS (silika deaktivirana bazom) (Thermo Scientific, kat. # 28105) 150 x 3.0 mm kolone C18 sa 3µ česticama na 40°C. Podaci su sakupljeni korišćenjem Empower softvera za hromatografiju. 4-parametarsko logističko fitovanje je izvedeno na svim podacima pre ekspresije kao ng/g vlažne težine tkiva. Mera obrta dopamina izražena je kao (DOPAC+HVA)/DA i poređenja su izvedena sa levom hemisferom (tretiranom) nasuprot desne hemisfere (intaktna).

Tabela 11

[0069] Podaci pokazuju da svaka od GDNF varijanti sa nazivom iz Tabele 11 značajno povećava obrt dopamina u tretiranoj hemisferi, u poređenju sa intaktnom hemisferom.

Primer 6

In vivo testovi

• Model retrogradne lezije indukovane 6-hidroksi dopaminom (6-OHDA)

[0070] Mužjaci Sprague-Dawley pacova anestezirani su sa izofluranom (3% u O2). Glava je obrijana i sterilizovana sa rastvorom joda pre nego što je životinja smeštena u stereotaksički okvir sa podlogom sa kontrolisanom temperaturom. Oči su zaštićene sa oftalmičkim gelom i anestezija je održavana korišćenjem izoflurana (1-2% u O2). Središnji rez je napravljen na glavi životinje, sklap i tkivo ispod njega su sklonjeni i lobanja je osušena da bi se uočila bregma. Koordinate za kaudalno jedro su merene od bregme i duralne površine za infuziju10 ug 6-hidroksidopamina (6-OHDA). Infuziona kanila veličine 28 je polako spuštena na ovu poziciju, i infuzija počinje 1 minut kasnije. 2 ml bolus 6-OHDA je infuzijom unet u levu hemisferu tokom 4 minuta na 0.5 µl/min, i kanila ostaje na mestu dodatna 3 minuta po završetku infuzije.

[0071] 30 minuta nakon 6-OHDA infuzije test GDNF je unet infuzijom korišćenjem istog protokola. Koordinate za GDNF infuziju su ateriorno-posteriorno 1.0, LM -2.5, DV -4.5 mm od bregme i duralne površine kao pre. Kad je kanila uklonjena mesto reza je zatvoreno, primenjena je post-operativna analgezija i dozvoljeno je da se životinja oporavi u kavezu sa kontrolisanom temperaturom pre prenošenja u njen kavez. Životinje su post-operativno proveravane u skladu sa lokalnim etičkim instrukcijama. U odgovarajućem intervalu nakon infuzije, životinja je žrtvovana, mozak je uklonjen i kaudalna jedra i supstancija nigra su precizno disekovani, izmereni i zamrznuti za HPLC analizu dopamina i metabolita.

[0072] Dozvoljeno je da se smrznuto tkivo brzo odmrzne i homogenizovano je u 0.5ml pufera za homogenizaciju (0.1 M perhlorne kiseline (PCA), 0.1 mM etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), 2.5mg/L askorbinska kiselina) pre centrifugiranja na 20,000 g 15 minuta. Supernatant je uklonjen i filtriran kroz uređaj za filtriranje bez šprica. Analiza dopamina (DA), DOPAC i HVA izvedena je korišćenjem HPLC kuplovanom sa elektrohemijskom detekcijom. 20 µl alikvote svakog uzorka je injektirano i kvantifikovano u odnosu na eksternu kalibracionu krivu (LC4C, BAS, USA). Mobilna faza se sastoji od 100 mM NaH2PO4, 100 mM H3PO4, 2 mM OSA, 1mM EDTA, 13% MeOH, pH 2.8 korišćenjem BDS Hypersil 150 x 3.0 mm kolone C18 sa 3µ česticama na 40°C. Podaci su sakupljeni korišćenjem Empower softvera za hromatografiju.4-parametarsko logističko fitovanje je izvedeno na svim podacima pre ekspresije kao ng/g vlažne težine tkiva. Poređenja su izvedena sa levom hemisferom (tretiranom) nasuprot desne hemisfere (intaktna).

Tabela 12: Kaudalno jedro

Table 13: Supstancija nigra

[0073] Primena 6-OHDA u kaudalnom jedru rezultuje u značajnom smanjenju nivoa dopamina u tretiranoj strani u odnosu na intaktnu stranu (Tabela 12). Značajan deficit je takođe uočen u supstancija nigra (Tabela 13), što je sprečeno primenom GDNF. Sve ovde testirane varijante GDNF su značajno različite od vehikuluma, poredeći tretirane strane.

• Akutna biodistribucija u mozgu pacova

[0074] Mužjaci Sprague-Dawley pacova anestezirani su sa izofluranom (3% u O2). Glava je obrijana i sterilizovana sa rastvorom joda pre nego što je životinja smeštena u stereotaksički okvir sa podlogom sa kontrolisanom temperaturom. Oči su zaštićene sa oftalmičkim gelom i anestezija je održavana korišćenjem izoflurana (1-2% u O2).

[0075] Središnji rez je napravljen na glavi životinje, sklap i tkivo ispod njega su sklonjeni i lobanja je osušena da bi se uočila bregma. Koordinate za kaudalno jedro su merene od bregme i duralne površine za infuziju GDNF (anteriorno-posteriorno 0.5, lateralno medijalno -3.0, dorzalno ventralno -5.5 mm). Infuziona kanila veličine 30 je polako spuštena na ovu poziciju, i infuzija počinje 1 minut kasnije (korišćenjem pumpe). 2 ml bolus test GDNF je infuzijom unet u levu hemisferu tokom 4 minuta na 0.5 µl/min, i kanila ostaje na mestu dodatna 3 minuta po završetku infuzije. Kad je kanila uklonjena mesto reza je zatvoreno, primenjena je post-operativna analgezija, zatim je dozvoljeno da se životinja oporavi u kavezu sa kontrolisanom temperaturom. U odgovarajućem intervalu nakon infuzije, životinja je žrtvovana i mozak je uklonjen i zamrznut za kriopreseke za imunohistohemiju.

• GDNF imunohistohemija (IHC) u mozgu pacova

[0076] Biodistribucija GDNF unetog infuzijom je testirana u imunohistohemijskom testu, u kojem je mereno vezivanje sa antigenom unetim infuzijom (GDNF i GDNF varijante) u mozgovima pacova. Izotipsko antitelo kao kontrola je korišćeno kao negativna kontrola.

[0077] Pravljenje kriopreseka mozga pacova počinje sa trimovanjem cerebeluma unutar kriostata na -20 stepeni C, korišćenjem matriksa mozga pacova da bi se napravila ravna površina. Optimal Cutting Temperature™ (OCT, Sakura ili drugi slični dobavljači) je postavljen na ohlađeno postolje za uzorak kriostata. Kako OCT počinje da se mrzne, ravna kaudalna površina mozga pacova je postavljena na postolje za uzorak korišćenjem forcepsa ohlađenog na -20 stepeni C, tako da OCT namesti mozak na mesto sa najviše rostralnim mozgom usmerenim od postolja za uzorak. Postolje za uzorak je postavljeno u držač objekta i zategnuto. Nakon što je nož mikrotoma ubačen u držač noža, korišćena je funkcija trimovanja kriostata da se odbace olfaktorni bulbusi kao i cerebrum, rostralno od infuzione staze. 8 um debeli preseci uzeti su u intervalima od 300 µm i postavljeni na pozitivno naelektrisane staklene pločice. Dva ili tri susedna intervalna preseka su stavljena na svaku staklenu pločicu za svaki mozak pacova. Pločice su zatim stavljene u 4% paraformaldehhid na sobnoj temepraturi 20 minuta i isprane u tris-puferovanom fiziološkom rastvoru tween-20 (TBST) pufera za ispiranje. Korišćenjem rastvora za bojenje na soboj temperaturi, pločice su inkubirane 10 minuta sa Dual endogenim enzimskim blokom, isprane sa TBST puferom za ispiranje, inkubirane 15 minuta sa svakim od Avidin i Biotin bloka, isprane sa TBST puferom za ispiranje, blokirane sa Protein block 60 minuta i oduvane sa pločice korišćenjem vazdušnog noža. Biotinilovani anti-humani GDNF ili biotinilovani kozji IgG je razblažen u razblaživaču antitela sa sredstvima koja smanjuju osnovni nivo do 2 µg/ml i inkubiran na pločici 60 minuta, zatim ispran sa TBST puferom za ispiranje 3 puta. Pločice su inkubirane sa obeleženim streptavidin biotin 2 (LSAB2) (Dako, kat. # K0609) 10 minuta i isprane sa TBST puferom za ispiranje. Pločice su inkubirane sa DAB+ (2 kapi DAB u DAB razblaživaču 5 minuta, zatim isprane sa TBST puferom za ispiranje, nakon čega je sledilo ispiranje sa destilovanom vodom. Nakon toga pločice su uklonjene sa uređaja za automatsko bojenje, zatim su kontrastno obojene sa Hematoxylin™ i pokrivene sa Cytoseal XYL™ (Stephens Scientific, kat. # 8312-4). Dozvoljeno je da se pločice osuše i zatim su analizirane sa Aperio XT da bi se kvantifikovala biodistribucija.

• Kvantifikacija biodistribucije GDNF u mozgu pacova

[0078] Slike pločica su dobijene na uvećanju od 20X na Aperio ScanScope XT (sa v10.00.00.1805 softverom kontrolera). Meta podaci o slajdovima su uskladišteni u Aperio web-zasnovanom softveru, Spectrum (v10.0.1346.1806).

[0079] Svaki presek mozga je ručno iscrtan korišćenjem Aperio softvera za pregledanje slika, ImageScope (v10.0.36.1805). Za prvu studiju, presek celog mozga sa najmanjom količinom vidljivog artefakta sečenja je iscrtan. Za drugu studiju, presek celog mozga najbliži oznaci slajda je iscrtan. Svaki iscrtani region je analiziran korišćenjem Aperio "Positive Pixel Count" algoritma (v9) [sa svim parametrima na podrazumevanim podešavanjima, izuzev Image Zoom = .01 i Intensity Threshold WEAK (Upper Limit) = 235].

[0080] Površina GDNF distribucije u mm<2>za svakog pacova je izračunata sabiranjem pozitivnih i snažno pozitivnih površina iz algoritma pozitivnog piksela. Student-ov t-test za zavisne uzorke korišćen je za određivanje statističke značajnosti.

Tabela 14. GDNFv: distribucija u mozgu pacova

Prosečna površina GDNFv

distribucije (mm<2>)

7.05 6 2.92 Eksperiment 1 E.Coli-WT-GDNF (SEQ ID NO: 3)

9.16 6 4.19 Eksperiment 2

16.07 6 5.69* Eksperiment 1 CHO-Δ31-GDNF (SEQ ID NO: 8) 20.88 6 6.56** Eksperiment

2

CHO-Δ31-N38Q-D95E-GDNF (SEQ ID NO: 9) 17.91 6 1.47** Eksperiment

2

CHO-Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF 20.86 6 3.54** Eksperiment (SEQ ID NO:12) 2

Vehikulum (PBS, negativna kontrola) 0.41 6 0.25 Eksperiment 1

IgG (negativna kontrola) 0.01 60.03 Eksperiment 1

*Za Δ 31, p<0.003 u odnosu na vehikulum, IgG i E.coli-WT-GDNF,

**Statistički značajan u odnosu na E.coli WT-GDNF, p<0.05

[0081] ELISA podaci o vezivanju heparina (Tabela 9) pokazuju da modifikacije divljeg tipa GDNF mogu smanjiti vezivanje heparina u poređenju sa E.coli-WT GDNF. Ovi podaci, zajedno sa podacima za biodistribuciju prikazanim prethodno u Tabeli 14, potvrđuju da varijante koje smanjuju vezivanje heparina mogu rezultovati u povećanju biodistribucije u mozgu pacova. N38QD95E i N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E varijante navedene u prethodnoj tabeli imaju povećanu biodistribciju u poređenju sa E.coli-WT-GDNF.

[0082] Nove GDNF varijante predmetnog pronalaska su poželjno formulisane kao farmaceutske kompozicije primenjene raznovrsnim putevima. Najpoželjnije, takve GDNF varijante su za parenteralnu ili intrakranijalnu primenu. Takve farmaceutske kompozicije i procesi za pripremanje istih su dobro poznati u tehnici. Videti npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et. al., eds., 19th ed., Mack Publishing Co., 1995).

[0083] Terapeutski efikasna količina je količina nove GDNF varijante predmetnog pronalaska neophodna da dovede do terapeutskog benefita kod pacijenta. Podrazumeva se da će količina GDNF varijante koja je stvarno primenjena biti određena od strane lekara, u odnosu na relevantne okolnosti, uključujući stanje koje se tretira, izabranog puta primene, stvarnog aktivnog sredstva koje se primenjuje, starosti, težine, i odgovora individualnog pacijenta, i težine simptoma kod pacijenta.

LISTING SEKVENCI

[0084]

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. Varijanta humanog GDNF koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 23:
2. gde: i) Xaa84je K ili A; ii) Xaa88je R ili K; iii) Xaa90je R ili K; iv) Xaa125je K ili E; i v) Xaa130je R ili E. 2. Varijanta humanog GDNF prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što navedena varijanta je izabrana iz grupe koja se sastoji od
3. 3. Varijanta humanog GDNF prema patentnom zahtevu 2, naznačena time što navedena varijanta je
4. 4. Varijanta humanog GDNF prema patentnom zahtevu 2, naznačena time što navedena varijanta je
5. 5. Varijanta humanog GDNF prema patentnom zahtevu 2, naznačena time što navedena varijanta je
6. 6. Intermedijer za pripremu Δ31-N-terminus skraćene varijante GDNF koja sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od
7. 7. Intermedijer prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što aminokiselinska sekvenca je
8. 8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži varijantu humanog GDNF prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača, nosača ili ekscipijenasa.
9. 9. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8 za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti kod humanog pacijenta.
10. 10. Varijanta humanog GDNF prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu kao lek.
11. 11. Varijanta humanog GDNF prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti.