RS56763B1

RS56763B1 - Metoda za razlikovanje plodnih i sterilnih biljnih linija detekcijom polimorfnih markera u dnk hloroplasta

Info

Publication number: RS56763B1
Application number: RS20171059A
Authority: RS
Inventors: Carlos Sala; Mariano Bulos; Emiliano Altieri; Maria Laura Ramos
Original assignee: Nidera Seeds Holding B V
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2018-04-30
Also published as: US9574237B2; US20130167270A1; HUE035056T2; HRP20171576T1; AR089008A1; WO2013080045A2; WO2013080045A3; EP2785867B1; PT2785867T; SI2785867T1; ES2644576T3; EP2785867A2

Description

Opis pronalaska

STANJE TEHNIKE/TEHNIČKI PROBLEM

[0001] Predmetna tehnologija se odnosi na metodu za razlikovanje plodnih i sterilnih biljnih linija na nivou DNK, detekcijom polimorfizama u hloroplasnoj DNK.

[0002] Hibridna snaga (heterozis) useva je dugo prepoznata kao široko rasprostranjeno i moćno sredstvo za povećanje prinosa poljoprivrednih kultura. Komercijalni hibridi se koriste u mnogim poljoprivrednim kulturama, uključujući kukuruz, sirak, šećernu repu, kanolu, pšenicu i suncokret.

[0003] Komercijalni hibridi su sa velikim potencijalom kod poljoprivrednih kultura kada postoji mogućnost pouzdane i ekonomične proizvodnje hibridnog semena. Za uspešnu proizvodnju hibridnog semena neophodno je da se zadovolje tri biološka zahteva: (a) prisustvo hibridne snage (heterozisa); (b) uklanjanje plodnog polena kod inbred linije koja će poslužiti kao ženski roditelj; i (c) obezbeđivanje odgovarajućeg oprašivanja od strane inbred linije koja će poslužiti kao muški roditelj. Ukoliko su navedeni biološki zahtevi zadovoljeni za određenu vrstu, moguće je razviti praktičan program proizvodnje semena u velikom obimu zarad proizvodnje hibrida koji se mogu upotrebljavati na poljoprivrednim dobrima.

[0004] Drugi od navedenih uslova – eliminacija plodnog polena kod linije koja će poslužiti kao ženski roditelj hibrida -naveo je naučnike da potpunije razumeju biološke mehanizme dobijanja muške sterilnosti kod hermafroditnih vrsta. Shodno tome, razvijeno je nekoliko procedura ili sistema za dobijanje muški-sterilnih biljaka, uključujući gensku mušku sterilnost, citoplazmatsku mušku sterilnost i nuklearno-citoplazmatsku mušku sterilnost. Prevashodno je nuklearno-citoplazmatska muška sterilnost u širokoj upotrebu za komercijalnu proizvodnju semena hibrida kod hemafroditnih vrsta useva (Wright, 1980).

[0005] Prilikom upotrebe citoplazmatsko-genskog sistema za proizvodnju hibrida moraju biti razvijena i održavana tri tipa inbred linija, a što se koristi kod hibridnog kukuruza, sirka, bisernog prosa, suncokreta i drugih vrsta. U ovakvom sistemu, ženski roditelj nosi faktore plodnosti u citoplazmi ćelija čime dolazi do muškog steriliteta u odsustvu odgovaraćih tzv. restorer gena (gena koji obnavljaju plodnost) u jedru. Citoplazma ženskog gameta, ali ne i muškog, se prenosi na potomstvo, čineći tako mogućom proizvodnju ženske populacije koja je oslobođena muški-plodnih jedinki (Forsberg i Smith, 1980).

[0006] U citoplazmatsko-genetskom sistemu, ženski roditelj mora imati dve različite, ali fenostipski identične forme. Jedna forma mora biti muški-sterilna, sa sterilnom citoplazmom (S) i sa nonrestorer genom fertilnosti (rfrf) u nukleusu. Druga forma mora biti muški-plodna jedinka, sa normalno-plodnom citoplazmom (N), ali takođe i sa nonrestorer genom u nukleusu (rfrf). Muški-sterilna verzija se označava kao muška citoplazmatski-sterilna linija (csm linija), linija A ili sterilna linija. Muška normalno-plodna verzija se označava kao linija za održavanje ili linija B. U principu, cms linija se razvija ukršanjem muški normalno-plodne linije kao muškog roditelja, sa muški-sterilnim ženskim roditeljem koji sadrži sterilnu citoplazmu i nonrestorer gen u nukleusu, nakon čega sledi ponovljeno povratno ukrštanje sa muški normalno-plodnom biljnom linijom. Nakon razvijanja cms linije, proizvode se semena cms linije zarad održavanja linije i to ukrštanjem sterilne cms linije (S, rfrf) sa muški normalno-plodnom linijom (N, rfrf). Svi potomci ukrštanja će biti muški sterilni. Muške normalno-plodne linije (ili linije održavanja ili B linije) se održavaju rutinski - kontrolisanom samooplodnjom, sib-oprašivanjem ili otvorenom polinacijom u izolaciji.

[0007] Treći tip inbred linije neophodan u citoplazmatski-genetskom sistemu označava muškog roditelja koji sadrži gen za ponovno uspostavljanje plodnosti – restorer gen. U principu, ovakav muški roditelj mora nositi homozigotni dominantni genotip za ponovno uspostavljanje feritlnosti (RfRf). Navedene restorer linije, ili R linije, se mogu dobiti ukrštanjem linije koja nosi restorer gen, a koja će poslužiti kao donorski roditelj, sa genotipom (linijom) za koju se želi da se upotrebi kao rekurentni roditelj u seriji povratnih ukrštanja. Veoma je pogodno ukoliko donorski roditelj takođe sadži sterilnu citoplazmu (S, RfRf) i upotrebljava se kao ženski roditelj, a zbog fenotipskog ispoljavanja prisutstva restorer alela u segregacionoj populaciji nakon svakog povratnog ukrštanja. Restorer muška roditeljska linija je plodna i održava se rutinski - kontrolisanom samooplodnjom, sib-oprašivanjem ili otvorenom polinacijom u izolaciji.

[0008] U proizvodnji hibridnih semena, redovi cms linija se sade u međunizovima sa redovima restorer linija, a u odnosu od 2:1 do 6:1. Hibridna semena iz ukrštanja cms x restorer se potom prikupljaju sa jedinki cms linije.

SAŽETAK PREDMETNE TEHNOLOGIJE

[0009] Predmetna prijava se odnosi na metodu za razlikovanje normalno-plodnih i sterilnih parnjaka inbred linije poljoprivredne kulture koje karakteriše citoplazmatski ili nuklearno-citoplazmatski sistem muške sterilnosti, a što obuhvata korake: (a) ekstrahovanje DNK hloroplasta; i (b) umnožavanja DNK hloroplasta s jednim ili sa više DNK markera, naznačenih time, što su navedeni markeri specifični za polimorfne razlike između normalno plodne biljke i biljke koju karakteriše citoplazmatska muška sterilnost. Jedan aspekt predmetnog pronalasak se odnosi na metodu za razlikovanje normalno-plodnih linija i njihovih sterilnih parnjaka kod inbred linija poljoprivrednih kultura koje karakteriše citoplazmatski ili nuklearno-citoplazmatski sistem muškog steriliteta, a koja obuhvata sledeće korake: (a) ekstrahovanje DNK hloroplasta; (b) umnožavanje DNK hloroplasta koja sadrži jedan ili više DNK markera izabranih iz grupe koju čine cpSSR-2 (od engl. chloroplast simple sequence repeats), cpSSR-7 i polimorfizmi u jednom nukleotidu (SNP, od engl. single nukleotide polymorphisms) u oviru introna rpoCl gena, a što omogućava razlikovanje plodnih i sterilnih citoplazmi kod suncokreta; i (c) analizu umnožene DNK hloroplasta koja sadrži jedan ili više DNK markera zarad razlikovanja normalno-plodnih linija i njihovih sterilnih parnjaka kod inbred linija poljoprivrednih kultura koje karakteriše citoplazmatski ili nuklearno-citoplazmatski sistem muškog steriliteta. Srodni aspekt predmetne tehnologije se odnosi na slučaj u kome se DNK hloroplasta ekstrahuje iz semena. U sledećem aspektu, DNK marker detektuje polimorfizam u dužini umnoženih fragmenata (AFLP, od engl. amplified fragment length polymorphism), polimorfizam PCR produkata u okviru mikrosatelitnih sekvenci (AMP-PCR, od engl. anchored microsatellite primed PCR), polimorfizam proizvoljno prajmovanih PCR produkata (AP-PCR, od engl. arbitrarily primed PCR), polimorfizam alelspecifične amplifikacije (ASA, od engl. allele-specific amplification), polimorfizam amplifikacije u oviru ponovka jednostavne sekvence (ASSR, od engl. anchored simple sequence repeat), polimorfizam sečenja umnoženih polimorfnih sekvenci (CAPS, od engl. cleaved amplified polymorphic sequence), polimorfizam DNK amplifikacionog fingerprintinga (DAF, od engl. DNA amplification fingerprint), polimorfizam direktne amplifikacije polimorfnih regiona po dužini (DALP, od engl. direct amplification of length polymorphism), polimorfizam direktne amplifikacije mikrosatelita DNK PCR-om (DAMD-PCR, od engl. direct amplification of microsatellite DNA by PCR), polimorfizam u dužini DNK fragmenata (DFLP, od engl. DNA fragment length polymorphism), RAMP sa digestijom (dRAMP, od engl. digested RAMP), polimorfizam intron-retrotranspozon amplifikovanih sekvenci (IFLP, od engl. intron-retrotransposon amplified polymorphism), polimorfizam inter-mikrosatelitnog PCR-a (IM-PCR, od engl. inter-microsatellite PCR), polimorfizam amplifikovanih sekvenci unutar retrotranspozona (IRAP, od engl. inter-retrotransposon amplified polymorphism), polimorfizam amplifikacije u okviru SSR (ISA, od engl. inter-SSR amplification), polimorfizam ponovaka sekvenci između uzorka (ISSR, od engl. inter-simple sequence repeats), polimorfizam multiplog profilisanja proizvoljnih amplikona (MAAP, od engl. multiple arbitrary amplicon profiling), polimorfizam PCR produkata u okviru mikrosatelita (MP-PCR, od engl. microsatellite-primed PCR), polimorfizam eseja ligacije oligonukleotida (OLA, od engl. oligonukleotide ligation assay), polimorfizam nasumično amlifikovanih hibridizovanih mikrosatelita (RAHM, od engl. randomly amplified hydbridizing microsatellites), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMPO, od engl. randomly amplified microsatellite polymorphism), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMP, od engl. randomly amplified microsatellites polymorphism), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMS, od engl. randomly amplified microsatellites), polimorfizam nasumično amplifikovane polimorfne DNK (RAPD, od engl. random amplified polymorphic DNA), polimorfizam zasnovan na insercijama u okviru retrotranspozona (RBIP, od engl. retrotransposon-based insertion polymorphism), polimorfizam proizvoda amplifikacije između retrotranspozona i mikrosatelita (REMAP, od engl. retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism), polimorfizаm u dužini restrikcionih frаgmenаtа (RFLP, od engl. restriction fragment length polymorphism), polimorfizam selektivno amplifikovanih mikrosatelitskih polimorfnih lokusa (SAMPLE, od engl. selective amplification of microsatellite polymorphic loci), polimorfizam amplifikovanih regiona okarakterisane sekvence (SCAR, od engl. sequence characterized amplified regions), polimorfizam pojedinačnih nukleotida ili tačkasti polimorfizam (SNP, od engl. single nukleotide polymorphism), polimorfizam ampkona dobijenih upotrebom pojedinačnih prajmera (SPAR, od engl. single primer amplification polymorphism), polimorfizam amplifikovanih srodnih sekvenci (SRAP, od engl. sequence related amplified polymorphism), polimorfizam sekvenca-specifične amplifikacije (S-SAP, od engl. sequence-specific amplification polymorphism), polimorfizam konformacije jednolančane DNK (SSCP, od engl. single strand conformation polymorphism), polimorfizam u dužini jednostavne sekvence (SSLP, od engl. simple sequence length polymorphism), polimorfizam mikrosatelitnih regiona označenih sekvencom (STAR, od engl. sequence tagged microsatellite region), polimorfizam pozicija mikrosatelita označenih sekvencom (STMS, od engl. sequence-tagged microsatellite site), polimorfizam kratkih tandemskih ponovaka (STR, od engl. short tandem repeat), polimorfizam mesta označenih sekvencom (STS, od engl. sequence-tagged-site), polimorfizam ciljanih regiona amplifikacije (TRAP, od engl. Target Region Amplification Polymorphism), varjabilnost broja tandemskih ponavljanja (VNTR, od engl. variable number of tandem repeats) ili ponovka jednostavne sekvence (SSR, od engl. simple sequence repeat). Dalji aspekt predmetne tehnologije podrazumeva da DNK marker označava cpSSR-2 ili cpSSR-7. Naredni aspekt predmetne tehnologije se odnosi na DNK marker koji detektuje SNP u okviru intronske sekvence rpoCl gena, a što omogućava razlikovanje plodne i sterilne citoplazme kod suncokreta. Srodni aspekt predmetne prijave se odnosi na DNK marker koji detektuje SNP u oviru intronske sekvence rpoC1 gena koji omogućava razlikovanje plodne i sterilne citoplazme kod suncokreta i naznačen je time, što su sekvence prajmera navedene kao sekvence sa identifikacionim brojevima (SEQ ID NO) od 3 do 12. U narednom aspektu, biljka označava lucerku (Medicago sativa), luk (Allium cepa), kukuruz (Zea mays), pšenicu (Triticum aestivum), pirinač (Oryza sativa), suncokret (Helianthus annuus), sirak (Sorghum bicolor), šargarepu (Daucus carota), petuniju (Petunia hybrida), kanolu (Brassica napus), šećernu repu (Beta vulgaris) ili duvan (Nicotiana tabacum). Još jedan aspekt predmetne tehnologije se odnosi na selekciju proizvedene serije semena na osnovu stepena kontaminacije semenom normalnih plodnih biljnih linija, a ispod praga koji je unapred određen. U srodnim aspektima, unapred određen prag iznosi bilo 1% ili manje ili 0,1% ili manje.

[0010] Predmetna prijava dalje obezbeđje metodu za detekciju kontaminacije biljnih semena koje karakteriše citoplazmatska muška sterilnost semenima biljnih linija koje karakteriše normalna plodnost kod inbred linije poljoprivredne kulture koja ispoljava citoplazmatski ili nuklearno-citoplazmatski sistem muškog steriliteta. Metoda obuhvata korake: (a) ektrakcije DNK hloroplasta iz velikog broja semena; i (b) umnožavanje DNK hloroplasta sa jednim ili sa više DNK markera, naznačenih time, što navedeni markeri specifično detektuju polimorfne razlike u DNK između normalno-plodne biljke i biljke koju karakteriše citoplazmatska muška sterilnost. Predmetni pronalazak se zapravo odnosi na metodu za detekciju kontaminacije biljnih semena koje karakteriše citoplazmatska muška sterilnost semenima biljnih linija koje karakteriše normalna plodnost kod inbred linije poljoprivredne kulture koja ispoljava citoplazmatski ili nuklearno-citoplazmatski sistem muškog steriliteta, metodu koja obuhvata korake: (a) ektrakcije DNK hloroplasta iz semena; i (b) umnožavanja DNK hloroplasta koja sadrži jedan ili više DNK markera izabranih iz grupe koju čine cpSSR-2, cpSSR-7 i SNP-ovi u okviru introna rpoCl gena, a što omogućava razlikovanje plodnih i sterilnih citoplazmi kod suncokreta; i (c) analizu umnožene DNK hloroplasta koja sadrži jedan ili više DNK markera za detekciju kontaminacije biljnih semena koje karakteriše citoplazmatska muška sterilnost semenima normalno-plodnih biljnih linija, a kod inbred linije poljoprivredne kulture koja ispoljava citoplazmatski ili nuklearno-citoplazmatski sistem muškog steriliteta. Srodni aspekt predmetne prijave se odnosi na DNK marker koji detektuje polimorfizam u dužini umnoženih fragmenata (AFLP, od engl. amplified fragment length polymorphism), polimorfizam PCR produkata u okviru mikrosatelitnih sekvenci (AMP-PCR, od engl. anchored microsatellite primed PCR), polimorfizam proizvoljno prajmovanih PCR produkata (AP-PCR, od engl. arbitrarily primed PCR), polimorfizam alel-specifične amplifikacije (ASA, od engl. allele-specific amplification), polimorfizam amplifikacije u oviru ponovka jednostavne sekvence (ASSR, od engl. anchored simple sequence repeat), polimorfizam sečenja umnoženih polimorfnih sekvenci (CAPS, od engl. cleaved amplified polymorphic sequence), polimorfizam DNK amplifikacionog fingerprintinga (DAF, od engl. DNA amplification fingerprint), polimorfizam direktne amplifikacije polimorfnih regiona po dužini (DALP, od engl. direct amplification of length polymorphism), polimorfizam direktne amplifikacije mikrosatelita DNK PCR-om (DAMD-PCR, od engl. direct amplification of microsatellite DNA by PCR), polimorfizam u dužini DNK fragmenata (DFLP, od engl. DNA fragment length polymorphism), RAMP sa digestijom (dRAMP, od engl. digested RAMP), polimorfizam intronretrotranspozon amplifikovanih sekvenci (IFLP, od engl. intron-retrotransposon amplified polymorphism), polimorfizam inter-mikrosatelitnog PCR-a (IM-PCR, od engl. inter-microsatellite PCR), polimorfizam amplifikovanih sekvenci unutar retrotranspozona (IRAP, od engl. inter-retrotransposon amplified polymorphism), polimorfizam amplifikacije u okviru SSR (ISA, od engl. inter-SSR amplification), polimorfizam ponovaka sekvenci između uzorka (ISSR, od engl. inter-simple sequence repeats), polimorfizam multiplog profilisanja proizvoljnih amplikona (MAAP, od engl. multiple arbitrary amplicon profiling), polimorfizam PCR produkata u okviru mikrosatelita (MP-PCR, od engl. microsatellite-primed PCR), polimorfizam eseja ligacije oligonukleotida (OLA, od engl. oligonukleotide ligation assay), polimorfizam nasumično amlifikovanih hibridizovanih mikrosatelita (RAHM, od engl. randomly amplified hydbridizing microsatellites), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMPO, od engl. randomly amplified microsatellite polymorphism), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMP, od engl. randomly amplified microsatellites polymorphism), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMS, od engl. randomly amplified microsatellites), polimorfizam nasumično amplifikovane polimorfne DNK (RAPD, od engl. random amplified polymorphic DNA), polimorfizam zasnovan na insercijama u okviru retrotranspozona (RBIP, od engl. retrotransposonbased insertion polymorphism), polimorfizam proizvoda amplifikacije između retrotranspozona i mikrosatelita (REMAP, od engl. retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism), polimorfizаm u dužini restrikcionih frаgmenаtа (RFLP, od engl. restriction fragment length polymorphism), polimorfizam selektivno amplifikovanih mikrosatelitskih polimorfnih lokusa (SAMPLE, od engl. selective amplification of microsatellite polymorphic loci), polimorfizam amplifikovanih regiona okarakterisane sekvence (SCAR, od engl. sequence characterized amplified regions), polimorfizam pojedinačnih nukleotida ili tačkasti polimorfizam (SNP, od engl. single nukleotide polymorphism), polimorfizam amplifikacije upotrebom pojedinačnih prajmera (SPAR, od engl. single primer amplification polymorphism), polimorfizam amplifikovanih srodnih sekvenci (SRAP, od engl. sequence related amplified polymorphism), polimorfizam sekvenca-specifične amplifikacije (S-SAP, od engl. sequence-specific amplification polymorphism), polimorfizam konformacije jednolančane DNK (SSCP, od engl. single strand conformation polymorphism), polimorfizam u dužini jednostavne sekvence (SSLP, od engl. simple sequence length polymorphism), polimorfizam mikrosatelitnih regiona označenih sekvencom (STAR, od engl. sequence tagged microsatellite region), polimorfizam pozicija mikrosatelita označenih sekvencom (STMS, od engl. sequence-tagged microsatellite site), polimorfizam kratkih tandemskih ponovaka (STR, od engl. short tandem repeat), polimorfizam mesta označenih sekvencom (STS, od engl. sequence-tagged-site), polimorfizam ciljanih regiona amplifikacije (TRAP, od engl. Target Region Amplification Polymorphism), varjabilnost broja tandemskih ponavljanja (VNTR, od engl. variable number of tandem repeats) ili ponovka jednostavne sekvence (SSR, od engl. simple sequence repeat). Sledeći aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na DNK marker amplifikovan i detektovan upotrebom PCR metodologije u relanom vremenu (Real Time PCR). U srodnom aspektu, marker DNK se umnožava upotrebom seta prajmera čije su sekvence u daljem tekstu navedene kao SEQ ID NO: 1 i 13. U srodnom aspektu, marker DNK se amplifikuje i detektuje upotrebom PCR metodologije u realnom vremenu i TaqMan eseja. Srodni aspekt se donosi na DNK marker amplifikovan upotrebom seta prajmera čije su sekvence navedene kao sekvence sa identifikacionim brojevim (SEQ ID NO:) 14 i 15, dok je amplikon obeležen fluorescentnom probom čija je sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 16. Još jedan srodan aspekt se odnosi na DNK marker koji označava cpSSR-2 ili cpSSR-7. U sledećem aspektu predmetne tehnologije, DNK marker označava cpSSR-2 ili cpSSR-7. Naredni aspekt predmetne tehnologije se odnosi na DNK marker koji detektuje SNP u okviru introna sekvence rpoCl gena što omogućava razlikovanje plodnih i sterilnih citoplazmi kod suncokreta. Dalji aspekt predmetne tehnologije podrazumeva da biljka označava lucerku (Medicago sativa), luk (Allium cepa), kukuruz (Zea mays, pšenicu (Triticum aestivum), pirinač (Oryza sativa), suncokret (Helianthus annuus), sirak (Sorghum bicolor), šargarepu (Daucus carota), petuniju (Petunia hybrida), kanolu (Brassica napus), šećernu repu (Beta vulgaris) ili duvan (Nicotiana tabacum). U drugom aspektu premetne tehnologije, proizvedena serija semena je izabrana na osnovu nivoa kontaminacije semenom normalne, plodne biljne linije ispod unapred određenog praga. U srodnim aspektima, unapred određeni prag iznosi bilo 1% ili manje ili 0,1% ili manje.

[0011] Drugi aspekt predmetne tehnologije se odnosi na metodu za ublažavanja stepena kontaminacije biljnim semenima normalno-plodnih biljnih linija u proizvedenoj seriji biljnih semena koje karakteriše citoplazmatska muška sterilnost kod inbred linije poljoprivredne kulture koja ispoljava citoplazmatski ili nuklearno-citoplazmatski sistem muškog steriliteta. Metoda obuhvata korake: a) ektrakcije DNK hloroplasta iz velikog broja semena; i (b) umnožavanja DNK hloroplasta sa jednim ili sa više DNK markera, naznačenih time, što su navedeni markeri specifični za polimorfne razlike u DNK između normalno-plodne biljke i biljke koju karakteriše citoplazmatska muška sterilnost; i (c) odabir proizvedene serije semena ukoliko je ista suštinski oslobođena kontaminacije normalno-plodnim biljnim linijama ili pak, uklanjanje proizvedene serije semena ukoliko je prisutna kontaminacija semenima normalno-plodnih biljnih linija. Srodni aspekt predmetne prijave se odnosi na DNK marker koji detektuje polimorfizam u dužini umnoženih fragmenata (AFLP, od engl. amplified fragment length polymorphism), polimorfizam PCR produkata u okviru mikrosatelitnih sekvenci (AMP-PCR, od engl. anchored microsatellite primed PCR), polimorfizam proizvoljno prajmovanih PCR produkata (AP-PCR, od engl. arbitrarily primed PCR), polimorfizam alel-specifične amplifikacije (ASA, od engl. allele-specific amplification), polimorfizam amplifikacije u oviru ponovka jednostavne sekvence (ASSR, od engl. anchored simple sequence repeat), polimorfizam sečenja umnoženih polimorfnih sekvenci (CAPS, od engl. cleaved amplified polymorphic sequence), polimorfizam DNK amplifikacionog fingerprintinga (DAF, od engl. DNA amplification fingerprint), polimorfizam direktne amplifikacije polimorfnih regiona po dužini (DALP, od engl. direct amplification of length polymorphism), polimorfizam direktne amplifikacije mikrosatelita DNK PCR-om (DAMD-PCR, od engl. direct amplification of microsatellite DNA by PCR), polimorfizam u dužini DNK fragmenata (DFLP, od engl. DNA fragment length polymorphism), RAMP sa digestijom (dRAMP, od engl. digested RAMP), polimorfizam intronretrotranspozon amplifikovanih sekvenci (IFLP, od engl. intron-retrotransposon amplified polymorphism), polimorfizam inter-mikrosatelitnog PCR-a (IM-PCR, od engl. inter-microsatellite PCR), polimorfizam amplifikovanih sekvenci unutar retrotranspozona (IRAP, od engl. inter-retrotransposon amplified polymorphism), polimorfizam amplifikacije u okviru SSR (ISA, od engl. inter-SSR amplification), polimorfizam ponovaka sekvenci između uzorka (ISSR, od engl. inter-simple sequence repeats), polimorfizam multiplog profilisanja proizvoljnih amplikona (MAAP, od engl. multiple arbitrary amplicon profiling), polimorfizam PCR produkata u okviru mikrosatelita (MP-PCR, od engl. microsatellite-primed PCR), polimorfizam eseja ligacije oligonukleotida (OLA, od engl. oligonukleotide ligation assay), polimorfizam nasumično amlifikovanih hibridizovanih mikrosatelita (RAHM, od engl. randomly amplified hydbridizing microsatellites), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMPO, od engl. randomly amplified microsatellite polymorphism), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMP, od engl. randomly amplified microsatellites polymorphism), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMS, od engl. randomly amplified microsatellites), polimorfizam nasumično amplifikovane polimorfne DNK (RAPD, od engl. random amplified polymorphic DNA), polimorfizam zasnovan na insercijama u okviru retrotranspozona (RBIP, od engl. retrotransposonbased insertion polymorphism), polimorfizam proizvoda amplifikacije između retrotranspozona i mikrosatelita (REMAP, od engl. retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism), polimorfizаm u dužini restrikcionih frаgmenаtа (RFLP, od engl. restriction fragment length polymorphism), polimorfizam selektivno amplifikovanih mikrosatelitskih polimorfnih lokusa (SAMPLE, od engl. selective amplification of microsatellite polymorphic loci), polimorfizam amplifikovanih regiona okarakterisane sekvence (SCAR, od engl. sequence characterized amplified regions), polimorfizam pojedinačnih nukleotida ili tačkasti polimorfizam (SNP, od engl. single nukleotide polymorphism), polimorfizam amplifikacije upotrebom pojedinačnih prajmera (SPAR, od engl. single primer amplification polymorphism), polimorfizam amplifikovanih srodnih sekvenci (SRAP, od engl. sequence related amplified polymorphism), polimorfizam sekvenca-specifične amplifikacije (S-SAP, od engl. sequence-specific amplification polymorphism), polimorfizam konformacije jednolančane DNK (SSCP, od engl. single strand conformation polymorphism), polimorfizam u dužini jednostavne sekvence (SSLP, od engl. simple sequence length polymorphism), polimorfizam mikrosatelitnih regiona označenih sekvencom (STAR, od engl. sequence tagged microsatellite region), polimorfizam pozicija mikrosatelita označenih sekvencom (STMS, od engl. sequence-tagged microsatellite site), polimorfizam kratkih tandemskih ponovaka (STR, od engl. short tandem repeat), polimorfizam mesta označenih sekvencom (STS, od engl. sequence-tagged-site), polimorfizam ciljanih regiona amplifikacije (TRAP, od engl. Target Region Amplification Polymorphism), varjabilnost broja tandemskih ponavljanja (VNTR, od engl. variable number of tandem repeats) ili ponovka jednostavne sekvence (SSR, od engl. simple sequence repeat). Srodni aspekt predmetne prijave se odnosi na DNK marker koji označava cpSSR-2 ili cpSSR-7. Jedan aspekt predmetne tehnologije se odnosi na DNK marker koji označava cpSSR-2 ili cpSSR-7. Drugi aspekt predmetne tehnologije se odnosi na marker DNK koji detektuje SNP u intronu sekvence rpoC1 gena, a što omogućava razlikovanje plodnih i sterilnih citoplazmi kod suncokreta. Sledeći aspekt predmetne tehnologije se odnosi na slučaj u kome biljka označava lucerku (Medicago sativa), luk (Allium cepa), kukuruz (Zea mays), pšenicu (Triticum aestivum), pirinač (Oryza sativa), suncokret (Suncokret), sirak (Sorghum bicolor), šargarepu (Daucus carota), petuniju (Petunia hybrida), kanolu (Brassica napus), šećernu repu (Beta vulgaris) ili duvan (Nicotiana tabacum).

[0012] Naredni aspekt predmetne tehnologije se odnosi na proizvodnu seriju biljnog semena dobijenu pocesom: (a) ekstrakcije DNK iz velikog broja semena; (b) umnožavanja DNK hloroplasta s jednim ili sa više DNK markera, naznačenih time, što su navedeni markeri specifični za polimorfne razlike u DNK između normalno plodne biljke i biljke koju karakteriše citoplazmatska muška sterilnost; i (c) odabir semena ukoliko je proizvodna serija suštinski oslobođena kontaminacije semenima normalno-plodnih biljnih linija ispod unapred određenog praga. Sledeći aspekt predmetnog pronalaska se odnosi DNK marker koji detektuje polimorfizam u dužini umnoženih fragmenata (AFLP, od engl. amplified fragment length polymorphism), polimorfizam PCR produkata u okviru mikrosatelitnih sekvenci (AMP-PCR, od engl. anchored microsatellite primed PCR), polimorfizam proizvoljno prajmovanih PCR produkata (AP-PCR, od engl. arbitrarily primed PCR), polimorfizam alel-specifične amplifikacije (ASA, od engl. allele-specific amplification), polimorfizam amplifikacije u oviru ponovka jednostavne sekvence (ASSR, od engl. anchored simple sequence repeat), polimorfizam sečenja umnoženih polimorfnih sekvenci (CAPS, od engl. cleaved amplified polymorphic sequence), polimorfizam DNK amplifikacionog fingerprintinga (DAF, od engl. DNA amplification fingerprint), polimorfizam direktne amplifikacije polimorfnih regiona po dužini (DALP, od engl. direct amplification of length polymorphism), polimorfizam direktne amplifikacije mikrosatelita DNK PCR-om (DAMD-PCR, od engl. direct amplification of microsatellite DNA by PCR), polimorfizam u dužini DNK fragmenata (DFLP, od engl. DNA fragment length polymorphism), RAMP sa digestijom (dRAMP, od engl. digested RAMP), polimorfizam intron-retrotranspozon amplifikovanih sekvenci (IFLP, od engl. intronretrotransposon amplified polymorphism), polimorfizam inter-mikrosatelitnog PCR-a (IM-PCR, od engl. intermicrosatellite PCR), polimorfizam amplifikovanih sekvenci unutar retrotranspozona (IRAP, od engl. interretrotransposon amplified polymorphism), polimorfizam amplifikacije u okviru SSR (ISA, od engl. inter-SSR amplification), polimorfizam ponovaka sekvenci između uzorka (ISSR, od engl. inter-simple sequence repeats), polimorfizam multiplog profilisanja proizvoljnih amplikona (MAAP, od engl. multiple arbitrary amplicon profiling), polimorfizam PCR produkata u okviru mikrosatelita (MP-PCR, od engl. microsatellite-primed PCR), polimorfizam eseja ligacije oligonukleotida (OLA, od engl. oligonukleotide ligation assay), polimorfizam nasumično amlifikovanih hibridizovanih mikrosatelita (RAHM, od engl. randomly amplified hydbridizing microsatellites), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMPO, od engl. randomly amplified microsatellite polymorphism), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMP, od engl. randomly amplified microsatellites polymorphism), polimorfizam nasumično amplifikovanih mikrosatelita (RAMS, od engl. randomly amplified microsatellites), polimorfizam nasumično amplifikovane polimorfne DNK (RAPD, od engl. random amplified polymorphic DNA), polimorfizam zasnovan na insercijama u okviru retrotranspozona (RBIP, od engl. retrotransposonbased insertion polymorphism), polimorfizam proizvoda amplifikacije između retrotranspozona i mikrosatelita (REMAP, od engl. retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism), polimorfizаm u dužini restrikcionih frаgmenаtа (RFLP, od engl. restriction fragment length polymorphism), polimorfizam selektivno amplifikovanih mikrosatelitskih polimorfnih lokusa (SAMPLE, od engl. selective amplification of microsatellite polymorphic loci), polimorfizam amplifikovanih regiona okarakterisane sekvence (SCAR, od engl. sequence characterized amplified regions), polimorfizam pojedinačnih nukleotida ili tačkasti polimorfizam (SNP, od engl. single nukleotide polymorphism), polimorfizam amplifikacije upotrebom pojedinačnih prajmera (SPAR, od engl. single primer amplification polymorphism), polimorfizam amplifikovanih srodnih sekvenci (SRAP, od engl. sequence related amplified polymorphism), polimorfizam sekvenca-specifične amplifikacije (S-SAP, od engl. sequence-specific amplification polymorphism), polimorfizam konformacije jednolančane DNK (SSCP, od engl. single strand conformation polymorphism), polimorfizam u dužini jednostavne sekvence (SSLP, od engl. simple sequence length polymorphism), polimorfizam mikrosatelitnih regiona označenih sekvencom (STAR, od engl. sequence tagged microsatellite region), polimorfizam pozicija mikrosatelita označenih sekvencom (STMS, od engl. sequence-tagged microsatellite site), polimorfizam kratkih tandemskih ponovaka (STR, od engl. short tandem repeat), polimorfizam mesta označenih sekvencom (STS, od engl. sequence-tagged-site), polimorfizam ciljanih regiona amplifikacije (TRAP, od engl. Target Region Amplification Polymorphism), varjabilnost broja tandemskih ponavljanja (VNTR, od engl. variable number of tandem repeats) ili ponovka jednostavne sekvence (SSR, od engl. simple sequence repeat). Srodni aspekt predmetne prijave se odnosi na DNK marker koji označava cpSSR-2 ili cpSSR-7. Naredni aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na DNK marker koji označava cpSSR-2 ili cpSSR-7. Prema sledećem aspektu, marker DNK detektuje SNP u intronu sekvence rpoCl gena, što omogućava razlikovanje plodnih i sterilnih citoplazmi suncokreta. Naredni aspekt predmetne tehnologije se odnosi na biljke: lucerku (Medicago sativa), luk (Allium cepa), kukuruz (Zea mays), pšenicu (Triticum aestivum), pirinač (Oryza sativa), suncokret (Suncokret), sirak (Sorghum bicolor), šargarepu (Daucus carota), petuniju (Petunia hybrida), kanolu (Brassica napus), šećernu repu (Beta vulgaris) ili duvan (Nicotiana tabacum). Ostali aspekti predmetne tehnologije se odnose na unapred određeni prag koji iznosi bilo 1% ili manje ili 0,1% ili manje.

DETALJNI OPIS PREDMETNE TEHNOLOGIJE

[0013] Jedan od praktičnih problema vezanih za sprovođenje navedenog sistema predmetne tehnologije kod bilo koje vrste poljoprivrednih kultura jeste što cms linije često mogu biti kontaminirane normalnim, muški-plodnim linijama. U ovakvim slučajevima, redovi cms linije sadrže i biljke muški normalno-plodnih linija u raznim procentima. Kako i cms i muški normalno-plodne linije predstavljaju verzije iste linije (gotovo identičnog jedarnog genotipa), one su fenotipski identične i ne mogu se razlikovati do cvetanja. Do tog vremena, suviše je kasno da se otkriju i uklone biljke normalne muško-plodne linije. U ovakvom slučaju, tokom cvetanja, postoje dva različita izvora polena: restorer muška parentalna linija i kontaminirajuća muški normalno-plodna linija. Posledično, moguća su dva tipa ukršanja: (a) legitimno ili željeno ukrstanje tipa cms x restorer; i (b) nelegitimno ili neželjeno ukrštanje tipa cms x muški normalnoplodna linija. Budući da se sva semena prikupljaju istovremeno sa jedinki cms linije, varjabilni procenat semena iz ukrštanja cms x muški normalno-plodna linija će kontaminirati hibridna semena ukrštanja cms x restorer linija. Kako nelegitimno ukrštanje dovodi do stvaranja nehibridnih cms semena, uzgajivači koji koriste ovakve nepoželjne tipove semena će dobiti smanjen prinos i to u koli

inama koje će zavisiti od stepena izvorne kontaminacije.

[0014] Napredak u načinima utvrđivanja stepena kontaminacije muški normalno-lodnih linija kod cms linija je od koristi zbog: (a) mogućnosti odbacivanja proizvodnih serija cms linije sa visokim stepenom kontaminacije muški normalno-plodnim linijama; (b) detekcije i uklanjanja kontaminirajućih biljaka muški normalno-plodne linije tokom proizvodnje hibridnog semena ili pak multiplikacije cms linije; i (c) mogućnosti sprovođenja kontrole kvaliteta hibridnog semena.

[0015] Citoplazmatska muška sterilnost je opisana kod više od 150 biljnih vrsta (Kaul, 1988), a u kombinaciji s pridruženim prisustvom restorer gena u jedru, cms sistem se široko upotrebljava za uzgoj i proizvodnju niza F1 hibridnih useva. Kod većine cms mutanata, antere se razvijaju normalno, dok se mikrosporogeneza zaustavlja tokom ili ubrzo nakon mejoze (Kaul, 1988). U principu, tapetum podleže ćelijskoj degradaciji tokom mejoze mejocita nakon čega brzo sledi smrt nezrelih mikrospora.

[0016] Kod cms biljaka, mitohondrijalni genom sadrži set gena identičan genima normalnih mitohondrija (Satoh i saradnici, 2004; Allen i saradnici, 2007). Napori da se identifikuju specifični mitohondrijalni geni doveo je do otkrića aberantnih okvira čitanja u oviru fragmenata mitohondrijalnih gena i/ili nepoznatih sekvenci koje uobičajno imaju i himernu strukturu. Dakle, cms je u vezi sa pojavom novih otvorenih okvira čitanja (ORF, od engl. open reading frames) u mitohondrijalnom genomu kod većine vrsta koje su do danas ispitivane (Schnable i Wise, 1998) ili je pak kod duvana u vezi sa delecijom mitohondrijalnih gena (Gutierres i saradnici, 1997). Smatra se da novi ORF dovode do aberantnih rekombinacionih događaja u biljnom mitohondrijalnom genomu. Sekvence DNK sa novim ORF često sadrže delimične sekvence drugih mitohondrijalnih gena i mogu se istovremeno prepisivati sa funkcionalnim mitohodrijalnim genima (de la Canal i saradnici, 2001; Balk i saradnici, 2001).

[0017] Do danas, prijavljeni su brojni aberantni ORF-vi od kojih svaki dovodi do sinteze jedinstvenog polipeptida koji je dalje povezan sa cms (Chase, 2007; Hanson i Bentolila, 2004). Aberantni ORF-ovi imaju malo toga zajedničkog, čak i kada je ispoljen fenotip vrlo sličan. Navedeno sugeriše da su cms-asocirani ORF-ovi nezavisno nastali tokom evolucije angiosperma (Kubo, 2007, 2008).

[0018] Predmetna tehnologija se zasniva na iznenađujućem otkriću metode razlikovanja cms biljke od njenog normalno-plodnog parnjaka, analizom genomom hloroplasta.

[0019] Genomom hloroplasta kod viših biljaka je visoko evolutivno očuvan (Wolfe i saradnici, 1987), a što ima neke od praktičnih implikacija u genetskim istraživanjim. Najvažnije je da visok stepen evolutivnog očuvanja sekvence omogućava upotrebu heterolognih hibridizacionih proba, kao i prajmera lančane reakcije polimeraze (PCR-a, od engl. polymerase chain reaction) kod nesrodnih vrsta čime se prevazilazi potreba za kloniranjem DNK hloroplasta (cpDNK) iz svake vrste (Olmstead i Palmer, 1994). Univerzalni parovi PCR prajmera su konstruisani na osnovu evolutivno očuvanih kodirajućih sekvenci cpDNK i upotrebljavaju da za amplifikaciju DNK smešene između mesta vezivanja prajmera (Taberlet i saradnici, 1991; Demesure i saradnici, 1995; Dumolin-Lapegue i saradnici, 1997). Sistem cpDNK markera je razvijen tako da se zasniva na detekciji određenih tzv. mikrosatelita u genom hloroplasta (Powell i saradnic, 1995). Mikrosateliti, takođe označeni i kao „jednostavni ponovci sekvence” ili „SSR” (od engl. simple sequence repats) predstavljaju visoko prisutne polimorfne elementne eukariotskih jedarnih genoma koji se sastoje od tandemskih ponovaka kratkih DNK motiva (Wang i saradnici, 1994; Field i Wills, 1996). Veličina varijacija SSR-ova je posledica varjabilnog broja ponavljanja kopija i može se vizualizovati amplifikacijom, na primer upotrebom PCR-a sa parovima prajmera koji se nalaze bočno u odnosu na ponovke, kao i potonjim elektroforetskim razdvajanem amplifikovanih produkata. Jedarni SSR-ovi su često multialelni, unutar i između populacija, i nasleđuju se na ko-dominanantan način zbog čega se mogu brzo i jednostavno tipizovati. Shodno tome, SSR-ovi čine sistem markera od izbora u genetičkom mapiranju, populacionoj genetici i DNK profilisanju kod biljaka (Powell i saradnici, 1996; Weising i saradnici, 1998).

[0020] Set od 10 konsenzus parova prajmera osmišljen je i opisan na osnovu višestrukog prisustva mononukleotidnih regiona koji okružuju ovakve ponovke kod nekoliko mono- i dikotilnih biljaka (Powell i saradnici, 1995; Bryan i saradnici, 1999; Weising i Gardner, 1999). Osam od 10 parova prajmera su ubikvitarno prisutni kod dikotiledonih angiospermi, a što ukazuje na intra- i interspecifične cpDNK polimorfizme unutar mnogih rodova angiospermi (Weising i Gardner, 1999; Weissing i saradnici, 2005; Borsch i Quandt, 2009). Do danas, identifikovani su dakle parovi prajmera sa evolutivno očuvanom sekvencom koji se vezuju bočno od cpSSR-a kod niza angiospermnih vrsta.

PRIMERI

Slike

[0021]

Slika 1 - Tabela koja prikazuje genotipove suncokreta upotrebljene u predmetnoj studiji.

Slika 2 prikazuje elektroforetski razdvojene produkte specifične amplifikacije polimorfnog markera cpSSR-7 u DNK hloroplasta koja je izolovana iz mladog lišća različitih cms i normalno-plodnih linija suncokreta i komercijalnih hibrida.

Slika 3 prikazuje elektroforetski razdvojene produkte specifične amplifikacije polimorfnog markera cpSSR-7 u DNK hloroplasta koja je izolovana iz semena različitih cms i normalno-plodnih linija suncokreta i komercijalnih hibrida.

Slika 4 prikazuje elektroforetski razdvojene produkte specifične amplifikacije polimorfnog markera cpSSR-7 u DNK hloroplasta koja je izolovana iz proizvedene serije semena suncokreta. Navedeno omogućava razlikovanje kontaminirajućih semena normalno-plodne linije u okviru poizvedene seriji semena sterilne linije.

Slika 5 prikazuje elektroforetski razdvojene produkte specifične amplifikacije polimorfnog markera cpSSR-2 u DNK hloroplasta koja je izolovana iz proizvedene serije semena kukuruza. Navedeno omogućava razlikovanje sterilnih i plodnih citoplazmi kod kukuruza.

Slika 6 prikazuje elektroforetski razdvojene produkte specifične amplifikacije polimorfnog markera cpSSR-2 u DNK hloroplasta koja je izolovana iz proizvedene serije semena pšenice koje karakteriše prisustvo Timopheevi citoplazme. Navedeno omogućava razlikovanje sterilnih i plodnih Timopheevi citoplazmi kod pšenice.

Slika 7 prikazuje elektroforetski razdvojene produkte specifične amplifikacije polimorfnog markera cpSSR-2 u DNK hloroplasta koja je izolovana iz proizvedene serije semena siraka. Navedeno omogućava razlikovanje sterilnih i plodnih citoplazmi kod siraka.

Slika 8 prikazuje parcijalno preklapanje nukleotidnih sekvenci introna rpoC1 gena kod sterilnih (SEQ ID NO: 3) i plodnih (SEQ ID NO: 4) linija suncokreta.

Slika 9 prikazuje parcijalno preklapanje nukleotidnih sekvenci introna rpoC1 gena kod linija suncokreta RIG (SEQ ID NO:5), PET1 (SEQ ID NO:3), HA89 (SEQ ID. 4), PET2 (SEQ ID NO:6), ANN2 (SEQ ID NO:7), GIG1 (SEQ ID NO:8), ANN3 (SEQ ID NO:9), MAX1 (SEQ ID NO:10), PEF1 (SEQ ID NO:11) i ANN4 (SEQ ID NO:12) sa različitim citoplazmama.

Slika 10 prikazuje rezultate detekcije SNP zarad razlikovanja plodnih od sterilnih citoplazmi upotrebom PCR-a u realnom vremenu i metodologije SYBR Green I. Na grafiku su prikazane jedinice relativne fluorescencije (RFU) u funkciji broja ciklusa amplifikacije uzoraka koje karakteriše prisustvo plodne i sterilne citoplazme. Upotrebom iste količine cpDNA u svakoj PCR reakciji, na osnovu ranih Ct vrednosti (Ct broj označava redni broj amplifikacionog ciklusa praga detekcije) se mogu specifično detektovati uzorci koje karakteriše prisustvo plodne citoplazme.

Slika 11 prikazuje rezultate detekcije SNP zarad razlikovanja plodnih semena koja kontaminiraju proizvedenu seriju sterilnih semena. Na grafiku su prikazane jedinice relativne fluorescencije (RFU) u funkciji broja ciklusa amplifikacije. Razlike u Ct vrednositma (Ct vrednost označava redni broj amplifikacionog ciklusa praga detekcije) ukazuju na različite nivoe kontaminacije semena sa semenima koja karakteriše prisustvo plodne citoplazme u uzorcima.

Slika 12 prikazuje rezultate TaqMan eseja za detekciju ferilne ili "normalne" citoplazme. Uzorak koji sadrži plodnu citoplazmu ima najnižu Ct vrijednost što ukazuje na specifičnu identifikaciju polimorfizma upotrebom probe. U međuvremenu, sterilna citoplazma uzorka ima najvišu Ct vrijednost što ukazuje da polimorfizam prisutan u ovim uzorcima nije detektovan.

Slika 13 prikazuje rezultate TaqMan eseja prilikom određivanje nivoa kontaminacije plodnom citoplazmom. Ct vrednosti se povećavaju kao funkcija stepena kontaminacije plodnom citoplazmom. Niža Ct vrednost ukazuje na viši nivo kontaminacije plodnom citoplazmom.

Primer 1

[0022] U navedenom primeru, DNK polimorfizmi u hloroplasnom genomu su omogućili identifikaciju sterilnih i plodnih verzija iste inbred linije suncokreta. Vrsta suncokreta koje je upotrebljena je PET1-CMS, vrsta koja je identifikovana kao međuvrsta nastala ukrštanjem Helianthus petiolaris i Helianthus annuus (Leclercq, 1969). Otkriveno je da PET1-CMS eksprimira nov mitohondrijalni gen, orf522, koji kodira peptid od 15kDa (Horn i saradnici, 1991; Laver i saradnici, 1991; Monéger i saradnici, 1994). Gen orf522 je nastao rekombinacionim događajem koji podrazumeva rearanžman tipa inverzije/insercije u gen atp1 (Köhler i saradnici, 1991; Laver i saradnici, 1991). Prvih 18 aminokiselina ORF522 je identično sekvenci ORFB, a što može predstavljati biljni homolog gena ATP8 kod kvasaca i sisara čiji produkt predstavlja subjedinicu F0F1-ATPaze (Gray i saradnici, 1998).

[0023] Za potrebe primera iskorišćeno je nekoliko parova sterilnih PET1-CMS i plodnih izolinija različitog porekla, zajedno sa mnoštvom restorer linija (CMSPET1 citoplazma) i sa 6 komercijalnih hibrida (PET1-CMS citoplazma). U Tabeli koja je prikazana kao Slika 1 okarakterisane su različite vrste biljnih linija koje su upotrebljene u ovom primeru i naveden je njihov genotip, status sterilnosti/plodnosti, kao i tip linije ili hibrida.

[0024] Genomska DNK je izolovana iz mladog lišća različitih CMS i plodnih linija suncokreta, kao i iz komercijalnih hibrida, upotrebom modifikovane cetil trimetilamonijum (CTAB) procedure (Weising i saradnici, 1995). Koncentracije DNK su zatim određene elektroforetski, upotrebom poznatih količina DNK u vidu standarda. Za PCR, uzorci DNK su podešeni do koncentracija od 20 ng/µl.

[0025] Marker cpSSR-7 je umnožen PCR-om iz DNK hloroplasta (cpDNA). PCR reakcija je urađena u finalnoj zapremini od 15 µl smeše koja je sadržavala 25 ng cpDNK, 0,5 U Taq Platinum DNK polimeraze (Invitrogen Carlsbad, CA) u 1xPCR puferu (Invitrogen), kao i po 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP i po 0,45 µM svakog od prajmera (uzvodni - cpSSR-7F: CAACATATACCACTGTCAAG i nizvodni - cpSSR-7R: ACATCATTATTGTATACTCTTTC). PCR program je bio sledeći : 95°C tokom 3 minuta; 10 ciklusa - 94°C / 30 sekundi, 58°C / 30 sekundi (-1°C/ciklus), 72°C / 45 sekundi. Nakon toga, nastavljeno je sa novih 30 ciklusa pod sledećim uslovima - 94°C / 30 sekundi, 48°C / 30 sekundi i 72°C / 45 sekundi, uz konačnu ekstenziju na 72°C u trajanju od 2 minuta. Reakcije su izvedene upotrebom PCR aparata PTC-200 (MJ Research, Waltham, MA).

[0026] Sav genetički materijal (linija ili hibrida) sa PET1-CMS citoplazmom koja uslovljava mušku sterilnost kod suncokreta se može razlikovati od onog koji je plodan ili sa "normalnom" citoplazmom, a pomoću mnogih markera koji ciljano amplifikuju SSR u genomu hloroplasta. Na primer, amplifikacija DNK markera cpSSR-7 sa parom prajmera označenim kao cpSSR-7F i cpSSR-7R rezultira dobijanjem PCR produkta od 125 bp kod genotipova sa PET1-CMS citoplazmom (sterilnom citoplazmom), dok se PCR produkt od 122 bp dobijaju amplifikacijom genetičkog materijala sa normalnom ili plodnom citoplazmom. Navedeni rezultati su prikazani na Slici 2 na kojoj se mogu uočiti elektroforetski razdvojeni specifični produkti amlifikacije polimorfnog cpSSR-7markera.

[0027] Sav materijal koji sadrži PET1-CMS citoplazmu se može razlikovati od materijala koji se nalazi u normalnoj ili plodnoj citoplazmi po veličini fragmenta koji su dobijeni umnožavanjem polimorfnog markera cpSSR-7. Ovo ukazuje da se polimorfizam u mitohondrijalnom genomu koji određuje sterilnost/plodnost kod suncokreta može proceniti na osnovu polimorfizma u genomu hloroplasta.

Primer 2

[0028] U ovom primeru, DNK polimorfizam od koristi za razlikovanje sterilnih i plodnih verzija iste linije se detektuje upotrebom DNK iz proplastida koji su prisutni u semenu. Metoda opisana u prethodnom Primeru je naime relevantna i upotrebljiva kao tehnološki pristup samo ukoliko se DNK može ekstrahovati iz semena određene vrste. Drugačije, metoda zahteva značajna ulaganja u prostor (uglavnom u staklenike ili klimatizovan komorni prostor), osvetljenje, vrijeme i rad, a da bi bilo moguće da se poseju semena i da se sačeka dovoljan vremenski period do uzorkovanja tkiva lista zarad ekstrakcije cpDNK iz njih.

[0029] U semenima poljoprivrednih kultura, plastidi se nalaze kao nediferencirani oblici poznati kao proplastidi (Wise, 2006). Nakon ekstrakcije DNK iz proplastida, PCR amplifikacija se sprovodi na isti način kao što je to prethodno opisano. Polimorfna traka kojom se lako mogu razlikovati sterilne i plodne linije, a koja se dobija upotrebom cpDNK koja je ekstrahovana iz semena, u potpunosti je ista kao i traka koja se dobija upotrebom cpDNK koja se ekstrahuje iz lišća. Navedeno je prikazano na slici 3 na kojoj su prikazani elektroforetski razdvojeni specifični produkti amlifikacije polimorfnog cpSSR-7 markera na cpDNK koja je izolovana iz proplastida semena. Ovo potvrđuje da se metoda koja je upotrebljena za razlikovanje plodnih i sterilnih citoplazmi i koja se zasniva na polimorfizmima genoma hloroplasta može upotrebiti ne samo korišćenjem DNK koja je izolovana iz listova, a kao što je to opisano u Primeru 1, već i upotrebom DNK izolovanom iz osušenih semena.

Primer 3

[0030] U ovom primeru, polimorfizmi DNK u genomu hloroplasta omogućavaju detekciju prisustva kontaminirajućih semena normalno-plodne linije u proizvedenoj seriji semenja sterilne linije. U ovom primeru, PCR reakcija je izvedena u finalnoj zapremini od 15 µl smeše koja je sadržavala 25 ng cpDNK, 0,5 U Taq Platinum DNK polimeraze (Invitrogen Carlsbad, CA) u 1xPCR puferu (Invitrogen), kao i po 0,45 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 0,40 mM dCTP i 0,75 mM Cy5.5-dCTP i po 0,45 µM svakog od uzvodnih i nizvodnih prajmera. Uporebljen je isti PCR program kao što je to opisano u prethodnim primerima.

[0031] Nakon PCR amplifikacije uzorak je prečišćen upotrebom NucleoFast 96 PCR aparata (Macherey-Nagel). Uzorci (0,25 µl) su zatim naneti na 6,5% poliakrilamidni gel u 1 x TBE i elektroforetski razdvojeni pod sledećim uslovima -1500 V, 40 mA, 30 W, na 45°C upotrebom LiCor 4300 DNK analizatora (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). Slike su vizuelno analizirane upotrebom kompjuterskog programa Adobe Photoshop (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA).

[0032] Dobijeni rezultati su prikazani na Slici 4 na kojoj se mogu uočiti elektroforetski razdvojeni produkti specifične amplifikacije cpSSR-7 polimorfnog markera u genomskoj DNK koja je izolovana iz proplastida velikog broja semena suncokreta. Navedeno omogućava detekciju kontaminirajućih semena normalno-plodnih linija u proizvedenoj seriji semena sterilne linije.

Primer 4

[0033] U ovom primeru, polimorfizmi DNK u genomu hloroplasta omogućavaju razlikovanje sterilnih i plodnih citoplazmi kod druge biljne vrste, kukuruza. Kod kukuruza je razvijeno nekoliko linija koje karakteriše sterilna citoplazma. A-citoplazma označava sterilnu citoplazmu koja je u širokoj upotrebi u produkciji sterilnih semena. Upotrebom metode koja je opisana u prethodnim Primerima, na Slici 5 je prikazano da se polimorfizam cpSSR-2 markera (amplifikovanog upotrebom uzvodnog prajmera cpSSR-2F: GATCCCGGACGTAATCCTG i nizvodnog prajmera cpSSR-2R: ATCGTACCGAGGGTTCGAAT) može iskoristiti za razlikovanje sterilne linije koja sadrži A citoplazmu, od njenog plodnog parnjaka (izolinije) koji sadrži normalnu ili plodnu citoplazmu.

Primer 5

[0034] U navedenom primeru, polimorfizmi DNK u genomu hloroplasta omogućavaju razlikovanje sterilnih i plodnih citoplazmi pšenice. Kod pšenice, jedna od najčešće korištenih citoplazmi za proizvodnju hibridnih semena označena je kao "Timopheevi-citoplazma". Primenom metode koja je opisana u prethodnim primerima dobijeni su rezultati koji su prikazani na Slici 6, a koji ukazuju da je moguće razlikovati sterilne linije sa Timopheevi citoplazmom od njihovih plodnih parnjaka sa normalnom ili plodnom citoplazmom i to upotrebom polimorfnog markera cpSSR-2.

Primer 6

[0035] Upotrebom metode opisane u prethodnim Primerima, dobijeni su rezultati koji su prikazani na Slici 7, a koji ukazuju da polimorfizmi DNK u genomu hloroplasta omogućava razlikovanje sterilnih i plodnih citoplazmi i kod siraka.

[0036] Iako je predmetna tehnologija prijavljena pozivajući se na određene aspekte i primere primene, za stručnjake je od značaja napomenuti da su moguće brojne modifikacije, izmene i promene opisanih aspekata bez odstupanja od predmeta i područja prijavljene tehnologije. Shodno navedenom, namera predmetne prijave je da predmetna tehnologija ne bude ograničena na opisane aspekte i primere primene opisane u tekstu, već da se tehnologija razmatra kao konzistentna u svim oblastima uključujući tu i ekvivalente određenih aspekata i primera primene koji su opisani u prijavi.

Primer 7

[0037] Prethodni primeri su se zasnivali na upotrebi polimorfizama u dužini fragmenata hloroplasnih SSR. U ovom primeru, upotrebom prajmera za nekodirajuće sekvence, PCR-om se amplifikuju intronske sekvence rpoCl gena iz DNK proplastida izolovanih zarad razlikovanja plodnih i sterilnih linija suncokreta.

[0038] PCR reakcija je urađena u finalnoj zapremini od 25 µl smeše koja je sadržavala 50 ng cpDNK, 0,5 U Taq Platinum DNK polimeraze (Invitrogen Carlsbad, CA) u 1xPCR puferu (Invitrogen), kao i 0,1 mM dNTP, 2,5 mM MgCl2, po 0,3 µM svakog prajmera (SEQ ID NO:1 - GAATTAGGGATGTATTCAAGACGC i SEQ ID NO:2 -GGAGTTCTCGCTTTCAGATTCTAG) i 4% DMSO-a, a po sledećem program PCR-a: 94°C tokom 5 minuta; 35 ciklusa -94°C / 1 minut, 55°C / 20 sekundi i 72°C / 30 sekundi. Reakcije su izvedene upotrebom PTC-200 aparata (MJ Research, Waltham, MA). PCR produkti su dalje sekvencirani.

[0039] Iznenađujuće, sav genetički materijali (linije ili hibrida) koji je sadržavao PET1-CMS citoplazmu koja određuje mušku sterilnost kod suncokreta je imao sekvencu koja je navedena kao sekvenca sa identifikacionim brojem 3 (SEQ ID NO:3), a koja se razlikuje od sekvence genetičkog materijala koji karakteriše plodnu ili "normalnu" citoplazmu (SEQ ID NO: 4) što je utvrđeno detekcijom SNP-ova u intronu rpoCl genske sekvence i koja je definisana kao polimorfizamm tipa "G506T" (Slika 8). Na poziciji SNP kod linije koje karakteriše prisustvo PET1-CMS citoplazme je prisutan T, dok se u intronu rpoC1 gena plodnih ili "normalnih" linija suncokreta na datoj poloziciji nalazi G. Shodno tome, polimorfizam na poziciji 506 intronske sekvence rpoC1 gena predstavlja polimorfizam koji omogućava diskriminaciju između plodnih i sterilnih linija.

Primer 8

[0040] U ovom primeru, amplifikovane su, sekvencirane i upoređene intronske sekvence hloroplasnog gena rpoC1 nekoliko različitih citoplazmi koji određuju mušku sterilnost kod suncokreta koje se označavaju kao RIG, PET2, ANN2, GIG1, ANN3, MAX1, PEF1 i ANN4, a da bi se detektovali polimorfizmi u jednom nukleotidu (SNP).

[0041] Dobijene sekvence su navedene kao sekvence sa identifikacionim brojevima od 5 do 12 (SEQ ID NO: 5-12) koje su dalje upoređene i uporedno prikazane na Slici 9. Shodno tome, Slika 9 prikazuje delimično preklapanje intronskih sekvenci u rpoC1 genu kod prethodno navedenih linija koje karakteriše sterilna citoplazma (SEQ ID NO: 3) i njihovih parnjaka koje karakteriše plodna ili "normalna" citoplazma (SEQ ID NO: 4). Iznenađujuće, sve ispitivane linije su vodile poreklom do različitih vrsta divljeg soja Helianthus, sa izuzetkom PET2 (SEQ ID NO: 6) koje je karakterisao isti polimorfizam u pogledu plodne ili "normalne" citoplazme, a kao što je opisano u Primeru 7. Dakle, neočekivani rezultati su pokazali da se SNP tipa G506T može koristiti za razlikovanje, detekciju ili identifikaciju sterilnih citoplazmi PET1, RIG, ANN2, GIG1, ANN3, MAX1, PEF1 i ANN4 citoplazmi na molekulskom nivou, a u odnosu na normalnu ili plodnu citoplazmu. S druge strane, PET2 citoplazma se takođe mogla razlikovati od plodne citoplazme na osnovu drugačijeg tipa SNP-a na istoj poziciji (506). Zapravo, na navedenoj poziciji je utvrđeno da se kod PET2 nalazi A, dok se kod linija sa plodnom ili "normalnom" citoplazmom nalazi G, a kao što je to pokazano u Primeru 7. Ovakav potonji SNP takođe može biti od koristi za identifikaciju PET2 sterilne citoplazme kod linija koje karakteriše plodna citoplazma. Navedeni SNP se označava kao G506A.

Primer 9

[0042] U ovom primeru, detekcija SNP-a prisutnog u intronu rpoC1 gena kod linija koje karakteriše plodna ili "normalna" citoplazma je sprovedena upotrebom proplastidne DNK kao početnog materijala i metodom PCR-a u realnom vremenu, kao i upotrebom alel-specifičnih prajmera i zelene fluorescentne boje SYBR Green I (Invitrogen).

[0043] PCR u realnom vremenu je urađen upotrebom iQCycler iQ4 aparata (Bio-Rad). PCR reakcija je izvedena u konačnoj zapremini od 25 µl smeše koja je sadržavala 50 ng cpDNK, 0,5 U Taq Platinum DNK polimeraze (Invitrogen Carlsbad, CA) u 1xPCR puferu (Invitrogen), 0,1 mM dNTP-a, 2,5 mM MgCl2, po 0,15 µM svakog prajmera ("G506-R", SEQ.ID NO. 13: ACGAGGTATAACTATAAATTCTTATGAAAG i "rpoC1-F", SEQ. ID NO. 1: GAATTAGGGATGTATTCAAGACGC), kao i 0,5x SYBR Green I boje i 4% DMSO-a. Program PCR-a je bio sledeći: 94°C tokom 5 minuta; 35 ciklusa - 94°C / 30 minuta, 58,5°C / 20 sekundi i 72°C / 30 sekundi. Sve PCR reakcije su urađene u triplikatu za svaki uzorak.

[0044] Real-time PCR metodologija bazirana na alel-specifičnim prajmerima je bila u stanju da identifikuje G na poziciji 506, a što je nedvosmisleno ukazalo na različitost plodne citoplazme u odnosu na sve druge sterilne citoplazme koje su ispitivane (Slika 10).

Primer 10

[0045] U ovom primeru, polimorfizmi DNK u hloroplasnom genomu omogućavaju detekciju kontaminirajućih semena normalno-plodne linije u proizvedenoj seriji semena sterilne linije. PCR reakcije su rađene upotrebom strategije PCR-a u realnom vremenu koja je detaljno opisana u Primeru 9. Obezbeđena je cpDNK iz četiri različita uzorka koja su karakterisala četiri različita nivoa kontaminacije (10, 5, 2 i 0,2% semena linije koju karakteriše plodna citoplazma u glavnini semena sterilne linije). Da bi se koristila ista količina početnog materijala u svim PCR reakcijama, cpDNK su normalizovane. Sve PCR reakcije su urađene u triplikatu za svaki uzorak.

[0046] Dakle, metodologija PCR-a u realnom vremenu je bila bazirana na upotrebi SYBR Green I boje koju karakteriše pouzdan stepen senzitivnosti, čime se dakle može detektovati prisustvo manje od jednog plodnog ili "normalnog" semena u količini od 499 semena sa sterilnom citoplazmom (kontaminacija 0.2%), a kao što je prikazano na Slici 11.

Primer 11

[0047] U ovom primeru, detekcija SNP-a prisutnog u intronu rpoC1 gena kod plodne ili "normalne" citoplazme je urađena upotrebom TaqMan eseja (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) koji se zasniva na vezivanjeu alel-specifične oligonukleotidne probe. Sekvence prajmera su sledeće: "PTQF-1", SEQ ID NO: 14, CTACAAAAGAAAAAGTCTTTTTTTACGAGGTATAACT i "PTQR-1" SEQ ID NO: 15: TGTATTCAAGACGCTCCCCAAAA, dok je sekvenca probe navedena kao "PBTQ1", SEQ ID NO: 16: (FAM)-ATCTATGGTCGCTTTCAT-(MGB). PCR reakcija u realnom vremenu je urađena upotrebom iQCycler iQ4 PCR aparata (Bio-Rad). PCR reakcija je izvedena u finalnoj zapremini smeše od 25 µl upotrebom 2xTaqMan SNP eseja za genotipizaciju (PE Applied Biosystems), 20xSNP eseja za genotipizaciju, 10 µl DNK koncentracije 10 ng/µl i sledećeg programa amplifikacije: 95°C / 10 minuta, 40 ciklusa -92°C / 15 sekundi i 60°C / 1 min. Sve PCR reakcije su urađene u triplikatu za svaki uzorak.

[0048] Slika 12 prikazuje rezultate detekcije koja je izvedena upotrebom FAM-obeležene probe specifične za plodnu citoplazmu, a čime je bilo moguće razlikovanje plodnih linija koje karakteriše plodna citoplazma u odnosu na njihove sterilne parnjake.

Primer 12

[0049] U ovom primeru, polimorfizmi DNK u hloroplasnom genomu omogućili su detekciju kontaminirajućih semena normalno-plodnih linija u proizvedenoj seriji semena sterilne linije. PCR reakcije su urađene primenom strategije PCR-a u realnom vremenu koja je detaljno opisana u prethodnim Primerima. Obezbeđena je cpDNK iz četiri različita uzorka koja su veštački bila kontaminirana tako da se dobiju četiri različita nivoa kontaminacije (prisutnost 10, 5, 2 i 0,2% semena linije koju karakteriše plodna citoplazma u glavnini semena sterilne linije). Da bi se koristila ista količina početnog materijala u svim PCR reakcijama, cpDNK su normalizovane. Sve PCR reakcije su urađene u triplikatu za svaki uzorak.

[0050] Dobijeni su impresivni rezultati koji su ukazali da metodologija PCR-a u realnom vremenu koja se zasniva na upotrebi TaqMan eseja predstavlja pouzanu metodu dovoljne senzitivnosti za detekciju niskog stepena kontaminacije tipa zastupljenosti tipa jednog plodnog ili "normalnog" semena u seriji od 999 sterilnih semena (tj 0,1%), kao što je prikazano na Slici 13, a što omogućava ranu detekciju tragova kontaminacije u proizvedenim serijama sterilnih semena.

Lista sekvenci

Claims

Patentni zahtevi

1. Metoda za razlikovanje normalno plodnih i sterilnih parnjaka inbred linije poljoprivredne kulture koje karakteriše citoplazmatski ili nuklearno-citoplazmatski sistem muške sterilnosti, obuhvatajući sledeće korake:

(a) ekstrakcije DNK hloroplasta;

(b) umnožavanja hloroplastne DNK koja sadrži jedan ili više DNK markera izabranih iz grupe koju čine cpSSR-2, cpSSR-7 i polimorfizmi pojedinačnih nukleotida (SNP, od engl. single nukleotide polymorphisms) u okviru introna rpoC1 gena što omogućava razlikovanje plodne i sterilne citoplazme kod suncokreta; i

(c) analize amlifikovane hloroplastne DNK koja sadrži jedan ili više DNK markera zarad razlikovanja normalno plodnih i sterilnih parnjaka inbred linije poljoprivredne kulture koje karakteriše citoplazmatski ili nuklearnocitoplazmatskim sistem muške sterilnosti.

2. Metoda prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je hloroplastna DNK ekstrahovana iz semena.

3. Metoda prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačena time, što biljka označava lucerku (Medicago sativa), luk (Allium cepa), kukuruz (Zea mays), pšenicu (Triticum aestivum), pirinač (Oryza sativa), suncokret (Helianthus annuus), sirak (Sorghum bicolor), šargarepu (Daucus carota), petuniju (Petunia hybrida), kanolu (Brassica napus), šećernu repu (Beta vulgaris) ili duvan (Nicotiana tabacum).

4. Metoda za detekciju kontaminacije biljnih semena koje karakteriše citoplazmatska muška sterilnost sa semenima biljnih linija koje karakteriše normalna plodnost kod inbred linije poljoprivredne kulture koju karakteriše citoplazmatski ili nuklearno-citoplazmatski sistem muškog steriliteta, obuhvatajući sledeće korake:

(a) ekstrakcije DNK hloroplasta iz semena; i

(b) umnožavanja hloroplastne DNK koja sadrži jedan ili više DNK markera izabranih iz grupe koju čine cpSSR-2, cpSSR-7 i SNP-ovi u okviru introna rpoC1 gena što omogućava razlikovanje plodne i sterilne citoplazme kod suncokreta; i

(c) analize umnožene hloroplastne DNK koja sadrži jedan ili više DNK markera zarad detekcije kontaminacije biljnih semena koje karakteriše citoplazmatska muška sterilnost sa semenima biljnih linija koje karakteriše normalna plodnost kod inbred linije poljoprivredne kulture koju karakteriše citoplazmatski ili nuklearnocitoplazmatski sistem muškog steriliteta.

5. Metoda prema patentnom zahtevu 4, naznačena time, što je DNK marker umnožen i detektovan upotrebom metodologije PCR-a u realnom vremenu (Real Time PCR).

6. Metoda prema patentnom zahtevu 5, naznačena time, što je DNK marker umnožen upotrebom prajmera navedenih pod identifikacionim brojevima sekvenci 1 i 13 (SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:13).

7. Metoda prema patentnom zahtevu 5, naznačena time, što je DNK marker umnožen i detektovan upotrebom metodologije PCR-a u realnom vremenu i TaqMan eseja.

8. Metodologija prema patentnom zahtevu 7, naznačena time, što je DNK marker umnožen upotrebom prajmera navedenih pod identifikacionim brojevima sekvenci 14 i 15 (SEQ ID NO:14 i SEQ ID NO:15) dok je amplikon obeležen probom sa fluoroforom - sekvenca probe je navedena pod identifikacionim brojem sekvence 16 (SEQ ID NO:16).

9. Metoda prema patentnom zahtevu 5, naznačena time, što biljka označava lucerku (Medicago sativa), luk (Allium cepa), kukuruz (Zea mays), pšenicu (Triticum aestivum), pirinač (Oryza sativa), suncokret (Helianthus annuus), sirak (Sorghum bicolor), šargarepu (Daucus carota), petuniju (Petunia hybrida), kanolu (Brassica napus), šećernu repu (Beta vulgaris) ili duvan (Nicotiana tabacum).

10. Metoda prema patentnom zahtevu 5, naznačena time, što metoda dalje obuhvata korak selekcije proizvedene serije biljnih semena ukoliko je suštinski odsutna kontaminacija semenima normalno plodnih biljnih linija ili odbacivanja proizvedene serije semena ukoliko je prisutna kontaminacija semenima normalno plodnih biljnih linija.

11. Metoda prema patentnom zahtevu 4 ili patentnom zahtevu 10, naznačena time, što je proizvodna serija semena izabrana na osnovu nivoa kontaminacije semenima normalno plodnih biljnih linija ispod unapred određenog praga.

12. Metoda prema patentnom zahtevu 11, naznačena time, što unapred određeni prag iznosi 1% ili manje.

13. Metoda prema patentnom zahtevu 11, naznačena time, što unapred određeni prag iznosi 0.1% ili manje.

14. Metoda prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je poljoprivredna kultura suncokret (Helianthus annuus).

15. Metoda prema patentnom zahtevu 14, naznačena time, što SNP u intronu rpoC1 gena jeste G506T ili G506A.

16. Metoda prema patentnom zahtevu 5, naznačena time, što poljoprivredna kultura jeste suncokret (Helianthus annuus).

17. Metoda prema patentnom zahtevu 16, naznačena time, što SNP u intronu rpoC1 gena jeste G506T ili G506A.