RS56844B1 - Retrovirusni vektori sa modifikovanim polipurinskim nizom - Google Patents
Retrovirusni vektori sa modifikovanim polipurinskim nizomInfo
- Publication number
- RS56844B1 RS56844B1 RS20180107A RSP20180107A RS56844B1 RS 56844 B1 RS56844 B1 RS 56844B1 RS 20180107 A RS20180107 A RS 20180107A RS P20180107 A RSP20180107 A RS P20180107A RS 56844 B1 RS56844 B1 RS 56844B1
- Authority
- RS
- Serbia
- Prior art keywords
- vector
- integration
- sequence
- retroviral
- defective
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/24—Vectors characterised by the absence of particular element, e.g. selectable marker, viral origin of replication
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Artificial Filaments (AREA)
- Polyurethanes Or Polyureas (AREA)
Description
Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovde opisani predmet se odnosi na retrovirusne vektore defektne u integraciji i na retrovirusne vektore defektne u integraciji za upotrebu u postupcima za umetanje nukleotidne sekvence od interesa u genom ćelije-domaćina, kao u genskoj terapiji i u bazičnim biološkim istraživanjima.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Mogućnost da se određena strana ili nativna genska sekvenca uvede u ćeliju, i da se kontroliše ekspresija tog gena, važna je u oblastima medicine i bioloških istraživanja. Takva mogućnost ima veliki broj korisnih primena, uključujući, ali bez ograničenja, ispitivanje genske regulacije i dizajniranje terapeutske osnove za lečenje bolesti.
[0003] Uvođenje određenog stranog ili nativnog gena u ćeliju-domaćina može da se olakša uvođenjem genske sekvence u pogodan vektor na bazi nukleinske kiseline. Razvijeni su brojni postupci koji omogućavaju uvođenje takvog rekombinantnog vektora u željenu ćelijudomaćina. Upotreba virusnih vektora može da rezultuje u brzom uvođenju rekombinantnog molekula u veliki broj različitih ćelija-domaćina.
[0004] Retrovirusi su RNK virusi koji se repliciraju preko provirusnog DNK intermedijera koji je obično ugrađen u genom inficirane ćelije-domaćina. Svi poznati retrovirusi dele osobine replikativnog ciklusa, uključujući pakovanje virusne RNK u virione, ulazak u ciljne ćelije, reverznu transkripciju virusne RNK da bi se obrazovao DNK provirus, i stabilnu integraciju provirusa u genom ciljne ćelije. Replikativno kompetentni jednostavni provirusi tipično sadrže regulatorne duge terminalne ponovke (LTR) i gene gag, pro, pot i env koji kodiraju proteine jezgra (gag), proteazu (pro), reverznu transkriptazu (pol), RNKazu H (pol), integrazu (pol) i glikoproteine omotača (env). Kompleksni retrovirusi tipično sadrže i dodatne pomoćne gene.
[0005] Retrovirusni vektori su uobičajeno sredstvo za dostavu gena zbog toga što ih sposobnost retrovirusnih vektora da dostave nerearanžiranu, pojedinačnu gensku kopiju u širokom opsegu ćelija čini pogodnim za prenos gena u ćeliju. Dok rekombinantni retrovirusni vektori omogućavaju integraciju transgena u genom ćelije-domaćina, većina retrovirusa može da transducira samo ćelije koje se dele. Ovo može da ograniči njihovu upotrebu za in vivo prenos gena u neproliferativne ćelije kao što su hepatociti, mišićna vlakna, hematopoetske stem ćelije (HSC) i neuroni. Ćelije koje se ne dele su dominantni, dugoživeći ćelijski tip u telu, i smatraju se najpoželjnijim ciljnim mestima delovanja za prenos gena, uključujući jetru, mišiće i mozak.
[0006] Lentivirusi su podgrupa retrovirusa koja je sposobna da inficira ćelije koje se ne dele. Ovi virusi uključuju, ali nisu ograničeni na, HIV-1, HIV-2, SIV, EIAV i FIV. Lentivirusi imaju gag, pol, i env gene pored drugih dodatnih gena koji su oivičeni sa dve sekvence dugog terminalnog ponovka (LTR).
[0007] Ključni izazov u prenosu gena zasnovanom na upotrebi retrovirusnih vektora je postizanje stabilne ekspresije transgena uz smanjenje na najmanju meru insercione mutageneze i indukcije odgovora na oštećenje DNK zbog prisustva dvolančane DNK. Jedan pristup za izbegavanje insercione mutageneze je ciljna ugradnja transgena na specifičan položaj u genomu.
[0008] Jedan pristup za postizanje ekspresije transgena, uz smanjenje na najmanju meru insercione mutageneze, je proizvodnja lentiviralnih vektora koji se ne ugrađuju (NIL). NIL vektori su proizvedeni uvođenjem kombinacija mutacija napravljenih da onemoguće sam protein integrazu ili da izmene sekvence koje prepoznaje integraza (att) u virusnom LTR (videti npr., Yanez-Munoz et al. (2006) Nat Med 12(3):348-353; Nightingale et al. (2006) Mol Ther 13(6):1121-1132). Nedavna in vitro i in vivo ispitivanja su pokazala da NIL vektori mogu da posreduju u stabilnoj transdukciji i omoguće visoke nivoe ekspresije transgena (videt npr., Yanez-Munoz et al. (2006) Nat Med 12(3):348-353; Nightingale et al. (2006) Mol Ther 13(6):1121-1132). Prema tome, visoka efikasnost prenosa i ekspresije gena posredovana lentivirusima može da se iskoristi in vivo bez zahteva za integracijom vektora. Međutim, forme vektora proizvedene gore navedenim pristupima sadrže linearni, kao i tri tipa kružnih epizomalnih formi vektora. Prisustvo linearnih formi DNK, koje čine većinu epizomalnih formi, nosi potencijal za indukovanje odgovora na oštećenje DNK zbog prisustva slobodnih dvolančanih krajeva DNK.
[0009] Ma H. et al., Molecular Therapy, tom 10, br.1, str. 139 - 149, opisuje razvoj HIV-1 šatl vektora koji sadrži pojedinačni LTR. Plazmid pTK113 koji je tu opisan uključuje divlji tip 3’PPT, tj. element 3’PPT nije deletiran.
[0010] Miles et al., J. Virology, tom 79, br.11, str.6859 - 6867, opisuje dejstvo mutacija PPT na replikaciju HIV-1. Nađeno je da u odsustvu funkcionalnog PPT može da postoji izvestan nivo replikacije, posebno da promene na oba, i na 5’ kraju i na 3’ kraju mogu da smanje infektivnost HIV-1.
[0011] Ovde opisani predmet obezbeđuje poboljšane vektorske sisteme defektne u integraciji čiji je krajnji proizvod homogena populacija kružnih formi vektora koji sadrže 1-LTR, sposobnih da posreduju u prenosu gena u životinjske ćelije sa smanjenim rizikom od indukcije odgovora na oštećenje DNK. Činjenica da se stvaraju samo 1-LTR forme omogućava bolju kontrolu neintegrišućih vektora. Dodatno, novi vektorski sistem defektan u integraciji je značajno efikasniji od neintegrišućeg retrovirusnog sistema koji se trenutno koristi u kontekstu određenih primena, zasnovanog na kružnim formama vektora uključujući, ali bez ograničenja, integraciju vektora posredovanu sa FLIP i cre.
SAŽETAK PRONALASKA
[0012] Pronalazak na koji se predmetna specifikacija odnosi naveden je u patentnim zahtevima priloženim ovom opisu.
[0013] Predmetni pronalazak opisuje retrovirusni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži:
a) jedan ili dva retrovirusna duga terminalna ponovka (LTR),
b) signal za pakovanje,
c) responsivni element za rev,
d) eukariotski promotor, funkcionalno vezan za
e) heterologu nukleotidnu sekvencu, gde po izboru heterologa sekvenca sadrži jedan ili više marker gena, po potrebi odabranih od gena za 3-galaktozidazu, higromicinskog gena, blastocidinskog gena, MGMT gena, neomicinskog gena, puromicinskog gena, gena za citozin deaminazu, gena za sekretornu alkalnu fosfatazu, gena za fluorescentni protein, i njihovih kombinacija; terapeutskih gena; antivirusnih gena; antitumorskih gena; gena za citokine; gena koji kodiraju antigene; sekvenci koje mogu da se poveže sa hromatinom domaćina; sekvenci koje kodiraju protein koji može da se poveže sa DNK domaćina i hromatinom domaćina i nukleinskom kiselinom vektora; sekvenci koje kodiraju protein koji ima aktivnost metilacije DNK; i njihove kombinacije,
i izborno post-transkripcioni regulatorni element, gde retrovirusnom vektoru nedostaje 3’-PPT, izborno funkcionalni cPPT. U sledećem primeru izvođenja, opisana je retrovirusna vektorska kaseta za prenos defektna u integraciji kojoj nedostaje 3’-polipurinski niz (3’-PPT), gde retrovirusna vektorska kaseta za prenos defektna u integraciji izborno:
nema funkcionalni centralni polipurinski niz (cPPT), i/ili sadrži:
heterologu sekvencu,
pojedinačni LTR,
samoinaktivirajuću deleciju u U3 regionu LTR, u kojoj je deletirani deo U3 regiona izborno zamenjen sa inducibilnim promotorom, i/ili
mesto dirigovane rekombinacije, gde je mesto dirigovane rekombinacije izborno u U3 regionu LTR i/ili je loxP i FRT.
[0014] U još jednom primeru izvođenja, opisan je kit sa retrovirusnim vektorom koji sadrži:
(a) retrovirusnu vektorsku kasetu za prenos defektnu u integraciji kojoj nedostaje 3’-PPT; i
(b) ćelijsku liniju za pakovanje koja sadrži najmanje jedan konstrukt koji kodira jedan ili više proteina potrebnih za pakovanje retrovirusnog vektora.
[0015] Dalje, opisan je postupak za proizvodnju čestica vektora defektnog u integraciji, koji obuhvata transfekciju ćelijske linije za pakovanje retrovirusnom vektorskom kasetom za prenos defektnom u integraciji kojoj nedostaje 3’-PPT, gde ćelijska linija za pakovanje obezbeđuje proteine za pakovanje retrovirusnog vektora.
[0016] Ovde opisani predmet obezbeđuje retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji kojima nedostaje 3’ polipurinski niz (PPT). U nekim primerima izvođenja, retrovirusnim vektorskim kasetama za prenos nedostaje funkcionalni centralni polipurinski niz (cPPT). U nekim primerima izvođenja, retrovirusne vektorske kasete za prenos sadrže heterologu sekvencu.
[0017] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline koje sadrže heterologu nukleotidnu sekvencu, jedan ili dva retrovirusna duga terminalna ponovka (LTR), signal za pakovanje, responsivni element za rev i eukariotski promotor, gde nukleinskoj kiselini nedostaje 3’ PPT. U nekim aspektima, nukleinske kiseline sadrže virusno mesto početka replikacije ili sekvencu koja može direktno ili indirektno da posreduje u replikaciji nukleinske kiseline vektora od strane domaćina. U nekim aspektima, nukleinske kiseline sadrže bakterijsko mesto početka replikacije i bakterijski selekcioni marker smešten između dva LTR. U nekim aspektima, virusno mesto početka replikacije je odabrano iz grupe koja se sastoji od OriP Epštajn-Bar virusa i mesta početka replikacije SV40. U nekim aspektima, sekvenca koja može direktno ili indirektno da posreduje u replikaciji nukleinske kiseline vektora od strane ćelije-domaćina odabrana je iz grupe koja se sastoji od (a) sekvence koju prepoznaje replikativni aparat ćelije-domaćina; (b) sekvence koja kodira protein koji može da se poveže sa i/ili modulira replikativni aparat ćelije-domaćina; i (c) sekvence koja kodira protein koji može da se poveže sa proteinom iz dela (b) ili može da prepozna sekvencu vektora. U nekim aspektima, heterologa sekvenca je odabrana iz grupe koja se sastoji od jednog ili više marker gena, terapeutskih gena, antivirusnih gena, antitumorskih gena, gena za citokine, gena koji kodiraju antigene, sekvenci koje mogu da se povežu sa hromatinom domaćina, sekvenci koje kodiraju protein koji može da se poveže sa DNK domaćina i hromatinom domaćina i nukleinskom kiselinom vektora, sekvenci koje kodiraju protein koji ima aktivnost metlacije DNK, aktivnost demetilacije DNK, i/ili aktivnost deaminacije citidina, i njihovih kombinacija. U nekim aspektima, heterologa sekvenca je nukleotidna sekvenca iz gena povezanih sa dediferencijacijom i/ili uspostavljanjem indukovanih pluripotentnih stem ćelija (iPS) kao što su, ali bez ograničenja Oct4, Nanog, Klf4, Sox2, FGF-4, Ssea-1, Stat-3 i Myc. U nekim aspektima, marker geni su odabrani iz grupe koja se sastoji od gena za β-galaktozidazu, higromicinskog gena, blastocidinskog gena, MGMT gena, neomicinskog gena, puromicinskog gena, gena za citozin deaminazu, gena za sekretornu alkalnu fosfatazu, gena za fluorescentni protein, i njihovih kombinacija. U nekim aspektima, nukleinskim kiselinama nedostaje funkcionalni cPPT. U nekim aspektima, nukleinske kiseline sadrže post-transkripcioni regulatorni element (PRE). U nekim primerima izvođenja, PRE sadrži post-transkripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota.
[0018] U nekim aspektima, ovde opisane nukleinske kiseline su prisutne u vektoru. U nekim aspektima, vektor sadrži samo jedan LTR. U nekim aspektima, vektor sadrži samoinaktivirajuću deleciju u U3 regionu LTR. U nekim primerima izvođenja, deletirani deo U3 regiona je zamenjen inducibilnim promotorom. U nekim aspektima, ovde opisani vektori sadrže mesto dirigovane rekombinacije. U nekim aspektima, mesto dirigovane rekombinacije je u U3 regionu LTR. U nekim aspektima, mesto dirigovane rekombinacije je odabrano iz grupe koja se sastoji od IoxP i FRT. U nekim aspektima, ovde opisani vektori sadrže restrikciono mesto u U3 regionu LTR. U nekim aspektima, vektor sadrži sekvence iz najmanje dva različita retrovirusa. U nekim aspektima, najmanje dva različita retrovirusa uključuju lentivirus. U nekim aspektima, LTR vektora sadrži sekvence iz najmanje dva različita retrovirusa. U nekim aspektima, pojam najmanje dva retrovirusa uključuje lentivirus. U nekim aspektima, vektor sadrži sekvence iz najmanje dva različita retrovirusa i najmanje jedna od sekvenci kodira cis element koji obezbeđuje unakrsno pakovanje vektora u virusnu česticu. U nekim aspektima, cis element je odabran iz grupe koja se sastoji od RRE, fragmenta Env gena iz regiona koji oivičava RRE, i cPPT.
[0019] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje rekombinantne retrovirusne čestice koje sadrže ovde opisane vektore. U nekim aspektima, rekombinantna retrovirusna čestica je namenjena za upotrebu u genskoj terapiji.
[0020] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje retrovirusne proviruse proizvedene infekcijom ciljnih ćelija sa ovde opisanim rekombinantnim retrovirusnim česticama.
[0021] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje iRNK ili drugu RNK ovde opisanih retrovirusnih provirusa.
[0022] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje inducibilne ćelijske linije za pakovanje retrovirusnih vektora koje sadrže ovde opisane retrovirusne vektore i najmanje jedan konstrukt koji kodira jedan ili više proteina potrebnih za pakovanje retrovirusnog vektora.
[0023] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje kitove retrovirusnog vektora. U nekim aspektima, retrovirusni kitovi sadrže (a) retrovirusnu vektorsku kasetu za prenos defektnu u integraciji kojoj nedostaje 3’ PPT; i (b) ćelijsku liniju za pakovanje koja sadrži najmanje jedan konstrukt koji kodira jedan ili više proteina potrebnih za pakovanje retrovirusnog vektora.
[0024] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje postupke za proizvodnju čestica vektora defektnog u integraciji. U nekim aspektima, postupci obuhvataju transfekciju ćelijske linije za pakovanje retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji kojoj nedostaje 3’ PPT, gde ćelijska linija za pakovanje obezbeđuje proteine za pakovanje retrovirusnog vektora.
[0025] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje postupke za ekspresiju nukleotidne sekvence od interesa u životinjskoj ćeliji bez integracije nukleotidne sekvence u genom životinje. U nekim aspektima, postupci obuhvataju inficiranje jedne ili više ćelija sa ovde opisanim česticama retrovirusa defektnog u integraciji.
[0026] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje postupke za umetanje nukleotidne sekvence od interesa u genom ćelije-domaćina na mesto-specifičan način. U nekim aspektima, postupci obuhvataju (a) transdukciju kompatibilne ćelije-domaćina sa ovde opisanim vektorom defektnim u integraciji koji sadrži u funkcionalnoj kombinaciji nukleotidnu sekvencu od interesa i jednu ili više sekvenci za dirigovanu rekombinaciju; i (b) transfekciju ili transdukciju kompatibilne ćelije-domaćina sa nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu koja kodira nukleazu ili rekombinazu koja može da posreduje u mesto-specifičnoj integraciji u sekvenci za rekombinaciju, gde transfekcija ili transdukcija iz dela (b) može da se odvija odvojeno ili u istom koraku kao deo (a), gde je nukleotidna sekvenca od interesa ubačena na mesto-specifičan način u genom ćelije-domaćina. U nekim aspektima, rekombinaza sposobna za posredovanje u mesto-specifičnoj integraciji u rekombinacionoj sekvenci je Cre ili FLP. U nekim primerima izvođenja, transfekcija ili transdukcija iz dela (b) događa se u istom koraku kao deo (a) i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira nukleazu ili rekombinazu je vektor defektan u integraciji iz dela (a). U nekim aspektima, transfekcija ili transdukcija iz dela (b) događa se u istom koraku kao deo (a) i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira nukleazu ili rekombinazu je zaseban vektor, plazmid, ili molekul nukleinske kiseline u odnosu na vektor defektan u integraciji iz dela (a).
[0027] Ovde opisani predmet takođe obezbeđuje postupke za umetanje nukleotidne sekvence od interesa u genom ćelije-domaćina na nespecifičan način. U nekim aspektima, postupci obuhvataju (a) transdukciju ćelije-domaćina vektorom defektnim u integraciji, koji sadrži u funkcionalnoj kombinaciji, nukleotidnu sekvencu od interesa i jednu ili više transpozonskih sekvenci; i (b) transfekciju ili transdukciju ćelije-domaćina nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu koja kodira transpozazu koja može da posreduje u integraciji u genom domaćina, gde transfekcija ili transdukcija iz dela (b) može da se odvija odvojeno ili u istom koraku kao deo (a), gde je nukleotidna sekvenca od interesa ubačena u genom ćelijedomaćina. U nekim aspektima, transfekcija ili transdukcija iz dela (b) se događa u istom koraku kao deo (a) i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira transpozazu predstavlja vektor defektan u integraciji iz dela (a). U nekim aspektima, transfekcija ili transdukcija iz dela (b) se događa u istom koraku kao deo (a) i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira transpozazu je zaseban vektor, plazmid, ili molekul nukleinske kiseline u odnosu na vektor defektan u integraciji iz dela (a). U nekim aspektima, transpozon ili transpozaza je tipa mariner. U nekim aspektima, transpozon ili transpozaza je „Sleeping Beauty“.
[0028] Cilj ovde opisanog predmeta je da obezbedi retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji kojima nedostaju 3’ polipurinski nizovi.
[0029] Cilj ovde opisanog predmeta koji je naveden gore u tekstu, i koji je postignut u celini ili delimično ovde opisanim predmetom, ostali ciljevi će postati očigledni u nastavku opisa uzetom zajedno sa pratećim crtežima koji su najbolje opisani u nastavku teksta.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0030]
SL. 1 je šematski dijagram koji prikazuje ćelijske činioce koji utiču na obrazovanje epizoma. Skraćenice: LTR—dugi terminalni ponovak; RNK—virusna genomska RNK; 1-LTR—kružni oblik sa jednim LTR; 2-LTR— kružni oblik sa 2 LTR; HR— put popravke DNK zasnovan na homologoj rekombinaciji ćelije-domaćina; NHEJ— put nehomologog spajanja krajeva DNK (NHEJ) ćelije-domaćina.
SL. 2 je šematski dijagram koji prikazuje reprezentativne retrovirusne vektorske kasete za prenos prema ovde opisanom predmetu. Dodatne skraćenice: Amp— sekvenca koja kodira otpornost na ampicillin; pUC ori— mesto početka replikacije iz pUC serija vektora (Vieira & Messing (1982) Gene 19(3):259-268); CMV—glavni neposredni rani promotor citomegalovirusa; RRE—Rev responsivni element humanog virusa imunodeficijencije (HIV); cPPT—centralni polipurinski niz; GFP—sekvenca koja kodira zeleni fluorescentni protein; PRE—post-transkripcioni regulatorni element; ΔPPT—delecija PPT; U3Δ—LTR U3 region koji sadrži deleciju koja ga čini samoinaktivirajućim (SIN); R—LTR R region; U5—LTR U5 region.
SL. 3 je šematski dijagram koji prikazuje paralelno poređenje retrovirusne vektorske kasete za prenos prema ovde opisanom predmetu (npr., šatl vektor pTK459) i standardnog vektora (npr., pTK113).
SL. 4 je šematski dijagram koji prikazuje analizu odnosa različitih HIV-1 epizomalnih formi korišćenjem Hirt testa na bazi šatl vektora. Ciljne ćelije (npr., 293T ćelije) su transducirane česticama vektora korišćenjem standardnih tehnika, i Hirt ekstrakcija (Hirt (1967) J Mol Biol 26:365-369) je korišćena za izolaciju kružnih formi dvolančanih DNK izvedenih iz vektora. Ove kružne forme su transformisane u bakteriju korišćenjem standardnih tehnika, i bakterijski klonovi koji sadrže kružne vektorske forme su identifikovani. DNK je pripremljena iz identifikovanih bakterijskih klonova, obrađenih sa jednim ili više restrikcionih enzima koji seku kružne vektorske forme jednom svaku, i enzimski razložene linearne DNK su razdvojene na agaroznim gelovima. Prisustvo jednog LTR nasuprot dva LTR može da se utvrdi određivanjem veličina linearnih molekula.
SL. 5 je autoradiograf gela koji prikazuje test Southern blot koji pokazuje obrazovanje 1-LTR HIV-1 epizoma pomoću PPT- i PPT/cPPT-deletiranih vektora. 293T ćelije su transducirane ili sa uobičajenim HIV-1 vektorom vTK945 (trake 1, 4), PPT-deletiranim vektorom vTK1023 (trake 2, 5), ili PPT i cPPT-deletiranim vektorom, vTK1039 (trake 3, 6). DNK ekstrahovana iz transduciranih ćelija na ili 16 časova (trake 1-3), ili 5 pasaža (trake 4-6) nakon transdukcije podvrgnuta je testu Southern blot. Većina epizomalne vektorske DNK stvorene pomoću WT vektora, vTK945 bila je linearna (traka 1). Dalje, samo integrisani vTK945 genomi mogli su da budu detektovani nakon 5 ćelijskih pasaža u kulturi (traka 4). Nasuprot tome, samo 1-LTR forme vTK1023 i vTK1039 mogle su da se detektuju 24 časa nakon transdukcije. Činjenica da genom ovih vektora nije mogao da se detektuje nakon 5 pasaža nakon transdukcije (trake 5, 6) ukazuje na to da su PPT-deletirani vektori defektni u integraciji (kao što se očekuje zbog odsustva linearnih vektorskih formi).
SL. 6 je grafikon koji prikazuje rezultate testa sa šatl vektorom korišćenog za analizu relativne zastupljenosti 1-LTR, 2-LTR, i mutantnih kružnih epizoma. 293T ćelije su transducirane integrišućim ili neintegrišućim šatl vektorima sa (pTK1054; videti SL.
7) ili bez (TK1046; videti SL. 7) PPT sekvence, i epizomi su sakupljeni 16 časova nakon transdukcije. Svaka transdukcija je izvedena u triplikatu. Delecija PPT je vodila povećanju 2-LTR i mutantnih kružnih epizoma, sa istovremenim povećanjem 1-LTR kružnih epizoma koje se približava 100%.
SL. 7 je šematski dijagram šatl vektora pTK1054 i šatl vektora pTK1046. Kao što može da se vidi na slici, šatl vektor (pTK1054) uključuje PPT sekvencu, dok šatl
1
vektoru (pTK1046) nedostaje ova sekvenca. Dodatne skraćenice: WPRE—posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota.
DETALJAN OPIS
[0031] Sposobnost retrovirusnih vektora da dostave velike količine genetskog materijala u ćelije koje se ne dele otvara obećavajuće mogućnosti za uvođenje jedne ili više određenih sekvenci nukleinske kiseline u ćeliju. Međutim, ostvarivanje potpunog potencijala retrovirusnog vektorskog sistema u važeći modalitet isporuke trenutno je otežano potencijalom za insercionu mutagenezu indukovanu retrovirusnim vektorom. Prema tome, ovde opisani predmet obezbeđuje retrovirusne vektore defektne u integraciji, i postupke za pravljenje i korišćenje istih, koji se bave rizicima vezanim za insercionu mutagenezu posredovanu retrovirusnim vektorom, među ostalim problemima u ovoj oblasti.
[0032] Prethodni pristupi za proizvodnju neintegrišućih retrovirusnih vektora su zasnovani na inhibiciji koraka integracije u životnom ciklusu vektora tokom koga se linearna vektorska DNK ubacuje u genom domaćina. U ovim prethodno opisanim pristupima, neintegrišući retrovirusni vektori se proizvode ili korišćenjem sistema za pakovanje deficijentnog u integrazi, ili pomoću mutiranja att mesta u vektoru. Posledično, epizomalne vektorske forme proizvedene ovim pristupima sadrže ili linearnu ili različite kružne forme DNK uključujući 1-LTR, 2-LTR, i autointegracione proizvode (videti sliku 1).
[0033] Nasuprot tome, pristup koji je dat u ovde opisanom predmetu zasnovan je na proizvodnji neintegrišućih retrovirusnih vektora ciljnim delovanjem na proces reverzne transkripcije retrovirusa, koji prethodi integraciji. Pristup koji je ovde dat se zasniva na dramatičnom smanjenju proizvodnje vektorske linearne DNK tokom reverzne transkripcije i na stvaranju suštinski samo 1-LTR kružne DNK. Činjenica da se obrazuju suštinski samo 1-LTR forme omogućava bolju kontrolu neintegrišućih vektora. Jedna pogodnost je da dramatično smanjenje vektorske linearne DNK smanjuje rizik od indukcije odgovora u vidu popravke oštećene DNK. Pored toga, novi vektorski sistem sa defektom u integraciji je značajno efikasniji od trenutno korišćenog neintegrišućeg retrovirusnog sistema u kontekstu određenih primena, koji se zasniva na kružnim vektorskim formama uključujući, ali bez ograničenja, vektorsku integraciju posredovanu sa FLP i Cre. Osim toga, epizomalne 1-LTR forme prema ovde opisanom predmetu koje sadrže ili virusno mesto početka replikacije ili sekvencu koja može da posreduje u replikaciji vektorske nukleinske kiseline od strane domaćina može da se održava u ciljnim ćelijama koje se dele. Nasuprot tome, u primenama gde je samo prolazna ekspresija gena poželjna, epizomalne 1-LTR forme prema ovde opisanom predmetu koje ne sadrže mesto početka replikacije su korisne budući da se ne održavaju u ćelijama koje se dele.
I DEFINICIJE
[0034] Podrazumeva se da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja i nije namenjena da bude ograničavajuća. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ih uobičajeno shvata stručnjak u oblasti kojoj pripada ovde opisani predmet. Mada bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu da se koriste u praktikovanju ili ispitivanju ovde opisanog predmeta, reprezentativni postupci i materijali su ovde opisani. Prema dugogodišnjoj konvenciji o patentnom zakonu, termini “a”, “an”, i “the” odnose se na “jedan ili više” kada se koriste u ovoj prijavi, uključujući i patentne zahteve.
[0035] Osim ako nije drugačije naznačeno, sve brojeve koji označavaju količine sastojaka, uslove reakcija, i tako dalje, korišćene u specifikaciji i patentnim zahtevima treba razumeti kao modifikovane u svim slučajevima terminom “oko”. Prema tome, osim ako nije naznačeno suprotno, numerički parametri prikazani u predmetnoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima su približne vrednosti koje mogu da variraju u zavisnosti od željenih svojstava koja treba da se dobiju pomoću ovde opisanog predmeta.
[0036] Termin “oko”, kako se ovde koristi, kada se odnosi na merljivu vrednost kao što je težina, vreme, doza, itd., predviđeno je da obuhvata varijacije u nekim aspektima ±20%, u nekim aspektima ±10%, u nekim aspektima ±5%, u nekim aspektima ±1%, i u nekim aspektima ±0.1% od navedene vrednosti, budući da su takve varijacije pogodne za izvođenje opisanih postupaka i/ili upotrebu opisanih kompozicija.
[0037] Kako se ovde koristi, termin “cis-regulatorni element” ili “cis-element” ima isto značenje kako ga uobičajeno shvata stručnjak u ovoj oblasti; tj., predstavlja region DNK ili RNK koji reguliše ekspresiju gena lociranih na istom lancu DNK ili RNK.
[0038] Kako se ovde koristi, termin “kompatibilna ćelija-domaćin” označava ćeliju-domaćina koja ima jednu ili više sekvenci za dirigovanu rekombinaciju u svom genomu koje su kompatibilne sa rekombinacionim sekvencama na vektoru defektnom u integraciji prema ovde opisanom predmetu. Rekombinacione sekvence kompatibilne ćelije-domaćina su korisne u ovde opisanim postupcima za umetanje nukleotidne sekvence od interesa u genom domaćina na mesto-specifičan način.
[0039] Kako se ovde koristi, termin “konstrukt” može da se koristi u vezi sa molekulima nukleinske kiseline koji prenose DNK segment(e), RNK segment(e), ili njihove kombinacije iz jedne ćelije u drugu. Termin “vektor” može da se koristi međusobno zamenljivo sa “konstrukt”. Termin “konstrukt” može da obuhvata kružne konstrukte nukleinske kiseline uključujući, ali bez ograničenja, plazmidne konstrukte, fagmidne konstrukte, kozmidne vektore, kao i linearne konstrukte nukleinske kiseline uključujući, ali bez ograničenja, proizvode PCR reakcije.
[0040] Termin “genska terapija”, kako se ovde koristi, odnosi se na opšti postupak za lečenje patološkog stanja kod subjekta umetanjem egzogene nukleinske kiseline u odgovarajuću ćeliju(e) kod subjekta. Nukleinska kiselina se ubacuje u ćeliju na takav način da se održi njena funkcionalnost, npr., da se očuva sposobnost eksprimiranja određenog polipeptida. U određenim slučajevima, umetanje egzogene nukleinske kiseline rezultuje u ekspresiji terapeutski efikasne količine određenog polipeptida.
[0041] Termin “heterologo”, kada se ovde koristi u vezi sa nukleinskom kiselinom označava da nukleinska kiselina sadrži jednu ili više podsekvenci koje nisu nađene u istom odnosu jedna sa drugom u prirodi. Na primer, nukleinska kiselina može da se proizvodi rekombinantno, tako da ima dve ili više sekvenci iz nepovezanih gena uređene tako da čine novu funkcionalnu nukleinsku kiselinu. Na primer, u nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina ima promotor iz jednog gena uređen tako da upravlja ekspresijom kodirajuće sekvence iz drugog gena. Na taj način, u odnosu na kodirajuću sekvencu, promotor je heterolog. Termin “heterologo” može takođe da se koristi da označi nukleinsku kiselinu koja nije nativna za ćeliju-domaćina. U nekim aspektima u ovom tekstu, izraz “heterologa nukleotidna sekvenca” koristi se međusobno zamenljivo sa “nukleotidna sekvenca od interesa”.
[0042] “Izolovano”, kako se ovde koristi, označava da je prirodna sekvenca nukleinske kiseline, DNK fragment, DNK molekul, kodirajuća sekvenca, ili oligonukleotid uklonjen iz prirodnog okruženja, ili je sintetski molekul ili klonirani proizvod.
[0043] “LTR” je dugi terminalni ponovak. LTR su sekvence nađene u retrovirusima. LTR sekvenca je tipično najmanje nekoliko stotina baza duga, obično nosi invertovane ponovke na
1
svojim krajevima (često počinju sa TGAA i završavaju sa TTCA), i oivičena kratkim direktnim ponovcima dupliciranim unutar sekvenci ćelijske DNK koje oivičavaju mesto insercije. Kratki invertovani ponovci su uključeni u integraciju celokupne dužine virusne, retrotranspozonske, ili vektorske DNK u genom domaćina. Integraciona sekvenca se ponekad naziva att, prema skraćenici za vezivanje. Unutar LTR nalaze se tri različita podregiona: U3 (pojačivač i region promotora, transkribovan sa 5′-LTR), R (ponovljen na oba kraja RNK), i U5 (transkribovan sa 5′-LTR). LTR i njegove povezane oivičavajuće sekvence (mesta za vezivanje prajmera, mesta za splajsovanje, sekvence za dimerizaciono povezivanje i inkapsidaciju) sadrže sekvence sa cis aktivnošću retrovirusnog vektora. Izvori LTR sekvenci nukleinske kiseline, npr., fragmenti ili segmenti nukleinske kiseline, uključuju, ali nisu ograničeni na mišje retroviruse, mišje VL30 sekvence, retrotranspozone, majmunske retroviruse, ptičje retroviruse, mačje retroviruse, lentiviruse, ptičje retroviruse i goveđe retroviruse, „penaste“ viruse.
[0044] Predmetnim pronalaskom, obuhvaćeni su samo oni primeri izvođenja u kojima je 3’ PPT element deletiran. Zbog pogodnosti, međutim, ovde je definisan i termin "nefunkcionalni".
[0045] Kako se ovde koristi, termin “nefunkcionalni” odnosi se na element (npr., PPT) koji ne funkcioniše na način na koji normalno funkcioniše in vivo. Kao neograničavajući primer, izraz “nefunkcionalni PPT” može da se odnosi na PPT koji je odsutan, mutiran, ili drugačije modifikovan na taj način da ne može da obavlja funkcije koje PPT normalno obavlja u retrovirusu ili vektoru baziranom na retrovirusu. Alternativno ili dodatno, “nefunkcionalni PPT” može da se odnosi na PPT koji je prisutan u vektoru na položaju koji sprečava PPT da obavlja svoje normalne in vivo i/ili in vitro funkcije. Stoga, nefunkcionalni PPT je učinjen nefunkcionalnim pomoću delecije ili druge mutacije njegove nukleotidne sekvence, i u nekim aspektima nefunkcionalni PPT je učinjen nefunkcionalnim na taj način što je prisutan na položaju u nukleinskoj kiselini koji sprečava jednu ili više njegovih prirodnih bioloških aktivnosti.
[0046] Termini “neintegrišući” i “defektan u integraciji” ovde se koriste međusobno zamenljivo da opišu virusne vektore i virusne čestice prema ovde opisanom predmetu. Neintegrišućim i defektnim u integraciji virusnim vektorima/česticama prema ovde opisanom predmetu nedostaje funkcionalni PPT tako da transdukcija ovih vektora/čestica rezultuje u proizvodnji suštinski samo 1-LTR epizoma. Kao rezultat dramatičnog smanjenja proizvodnje linearne dvolančane DNK, tipičan kapacitet za umetanje sekvenci nukleinske kiseline u genom domaćina putem linearne dvolančane DNK forme je suštinski ukinut.
[0047] Termin “nukleinska kiselina” odnosi se na deoksiribonukleotidni ili ribonukleotidni polimer u jednolančanom ili dvolančanom obliku, i osim ako nije drugačije ograničen, obuhvata poznate analoge prirodnih nukleotida koji hibridizuju sa nukleinskim kiselinama na način sličan kao kod prirodnih nukleotida. Termini “nukleinska kiselina”, “nukleotidna sekvenca” i “polinukleotidna sekvenca” ovde se koriste međusobno zamenljivo.
[0048] Termin “funkcionalna kombinacija” odnosi se na funkcionalno uređenje dve ili više različitih sekvenci nukleinske kiseline gde njihova fizička bliskost jedne sa drugom rezultuje u tome da jedna ili više od različitih sekvenci nukleinske kiseline utiče na aktivnost i/ili ponašanje druge od različitih sekvenci nukleinske kiseline. U nekim aspektima, nukleotidna sekvenca od interesa je u funkcionalnoj kombinaciji sa jednom ili više sekvenci za dirigovanu rekombinaciju. U takvim aspektima, nukleotidna sekvenca od interesa može da se ugradi na željeni položaj u nukleinskoj kiselini delovanjem nukleaze ili rekombinaze na jednu ili više sekvenci za dirigovanu rekombinaciju.
[0049] Termin “funkcionalno vezan” odnosi se na funkcionalnu vezu između kontrolne sekvence za ekspresiju nukleinske kiseline (kao što je promotor, ili niz mesta vezivanja za transkripcioni faktor) i druge sekvence nukleinske kiseline, gde kontrolna sekvenca za ekspresiju usmerava transkripciju nukleinske kiseline koja odgovara drugoj sekvenci.
[0050] “Kaseta za pakovanje” kodira komponente neophodne za proizvodnju virusnih čestica od strane ćelije transducirane vektorom za pakovanje. Kaseta za pakovanje izborno uključuje sve komponente neophodne za proizvodnju virusnih čestica, ili izborno uključuje podset komponenti neophodnih za pakovanje virusa. Na primer, u nekim primerima izvođenja, ćelija koja služi za pakovanje transformisana je sa više od jedne kasete za pakovanje, od kojih svaka ima komplementarnu ulogu u proizvodnji virusne čestice.
[0051] Kako se ovde koristi, termin “polinukleotid” odnosi se na sve oblike DNK i RNK, bilo jednolančane, dvolančane, ili višeg reda. Polinukleotid može hemijski da se sintetizuje ili može da bude izdvojen iz ćelije-domaćina ili organizma. Određeni polinukleotid može da sadrži prirodne ostatke, kao i sintetske ostatke.
[0052] Kako se ovde koristi, termin “polipurinski niz” odnosi se na sekvencu od oko 15 nukleotida koja je prisutna u retrovirusnoj RNK (ili u RNK izvedenoj iz vektora na bazi
1
retrovirusa) koja može da služi kao mesto vezivanja prajmera za sintezu pozitivnog lanca DNK. Videti npr., Rausch & Le Grice (2004) Int J Biochem Cell Biol 36:1752-1766.
[0053] “Retrovirus” je jednolančani, diploidni RNK virus koji se replikuje preko reverzne transkriptaze i retrovirusni virion. Retrovirus može da bude replikativno kompetentan ili replikativno nekompetentan. Reprezentativni retrovirusi uključuju, ali nisu ograničeni na Moloney-ev virus mišje leukemije (MoMuLV), Harvey-ev virus mišjeg sarkoma (HaMuSV), virus mišjeg tumora mlečne žlezde (MuMTV), virus leukemije gibona (GaLV), virus leukemije mačke (FLV), Rausov virus sarkoma (RSV), HTLV-1 i HTLV-2, Mason-Pfizer virus majmuna, virus leukemije goveda, „penasti“ retrovirus šimpanze, humane viruse imunodeficiencije HIV-1 i HIV-2, virus imunodeficiencije majmuna (SIV), virus imunodeficiencije mačke (FIV) i virus infektivne anemije konja (EIAV) i „penaste“ viruse.
[0054] Kako se ovde koristi, termin “samoinaktivirajući” i njegove gramatičke varijante, odnose se na vektore i na taj način kodirane viruse, koji kada uđu u ćeliju proizvode ćelijsku formu koja ima LTR region(e) koji su transkripciono neaktivni u inficiranoj ćeliji. Uopšteno, ovo se postiže uvođenjem delecija ili drugih oslabljujućih mutacija u LTR regione vektora. Kao takva, “samoinaktivirajuća delecija” je delecija u virusnom vektoru (npr., retrovirusnom vektoru) kojoj posle reverzne transkripcije nedostaje promotorska funkcija u virusnom LTR regionu(ima). Primećeno je, međutim, da u nekim aspektima, samoinaktivirajući vektor sadrži promotor u telu vektora (npr., van pojedinačnog LTR ili između dva LTR) koji može da ostane kompetentan za upravljanje transkripcijom funkcionalno vezane nukleotidne sekvence.
[0055] Nekoliko termina u ovom tekstu mogu da se koriste međusobno zamenljivo. Tako, “virion”, “virus”, “virusna čestica”, “virusni vektor”, “virusni konstrukt”, “vektorska čestica”, “virusna vektorska kaseta za prenos” i “ šatl vektor” mogu da se odnose na virus i virusu-slične čestice koje su sposobne da uvedu nukleinske kiseline u ćeliju putem mehanizma sličnog ulaženju virusa. Takve vektorske čestice mogu, pod određenim okolnostima, da posreduju u prenosu gena u ćelije koje inficiraju. Takve ćelije su ovde označene kao “ciljne ćelije”. Retrovirusni vektori su korišćeni za prenos gena korišćenjem procesa virusne infekcije. Strani geni klonirani u retrovirusni genom mogu da se dostave u ćelije podložne infekciji ili transdukciji retrovirusom.
1
II REPREZENTATIVNI ASPEKTI I/ILI PRIMERI IZVOĐENJA
[0056] Ovde opisani predmet opisuje retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji iz kojih je parentalni retrovirusni polipurinski niz (PPT) deletiran ili kome na drugi način nedostaje funkcionalni PPT (reprezentativni primeri izvođenja prikazani su na slikama 2 i 3; videti takođe Ma & Kafri (2004) Mol Ther 10(1):139-149; Bayer et al. (2008) Mol Ther 16(12):1968-1976). Prema tome, u nekim aspektima prema ovde opisanom predmetu, obezbeđeni su postupci i kompozicije koji sadrže retrovirusne vektore defektne u integraciji uključujući, ali bez ograničenja, ove prikazane na slikama 2 i 3. Ovde opisani predmet takođe uključuje retrovirusne vektore defektne u integraciji kao što su oni predstavljeni na slikama 2 i 3, ali koji dodatno sadrže virusno mesto početka replikacije ili sekvencu koja može direktno ili indirektno da posreduje u replikaciji nukleinske kiseline vektora od strane domaćina. U nekim aspektima, virusno mesto početka replikacije uključuje, ali nije ograničeno na EBV-OriP i SV40 mesto početka replikacije. U nekim aspektima, virusno mesto početka replikacije smešteno je ushodno od promotora CMV. U kompozicijama retrovirusnog vektora koje su ovde opisane, proizvodnja vektorske linearne DNK tokom reverzne transkripcije je dramatično smanjena. U stvari, DNK retrovirusnog vektora, nastala iz ovde opisanih vektora u toku transdukcije vektora, u suštini predstavlja ravnomerne epizomalne dvolančane DNK krugove koji sadrže samo 1-LTR (videti slike 4-6).
[0057] Na primer, test šatl vektora bio je korišćen za analizu relativnih zastupljenosti 1-LTR, 2-LTR, i mutantnih kružnih epizoma. Ćelije 293T su transducirane integrišućim (IN+) ili neintegrišućim (IN−) šatl vektorima sa (pTK1054; videti SL.7) ili bez (TK1046; videti sliku 7) PPT sekvence, i epizomi su sakupljeni 16 časova nakon transdukcije. Svaka transdukcija je izvedena u triplikatu. Kao što je prikazano na slici 6, delecija PPT je vodila smanjenju 2-LTR i mutantnih kružnih epizoma, sa istovremenim povećanjem 1-LTR kružnih epizoma koje se približava 100%. Slika 7 je šematski dijagram šatl vektora pTK1054, koji uključuje PPT sekvencu, i šatl vektora pTK1046, kome nedostaje PPT sekvenca.
[0058] Jedan od mogućih mehanizama obrazovanja 1-LTR epizomalnog HIV-1 vektora prema postupcima i kompozicijama ovde opisanog predmeta je okarakterisan i reprezentativni podaci su prikazani na slikama 4 i 5. Na osnovu činjenice da nivo 1-LTR vektorskih formi nije redukovan u ćelijskim linijama defektnim u homologoj rekombinaciji, uloga reverzne transkripcije u obrazovanju 1-LTR vektorskih formi bila je u fokusu. Specifično, pokazano je da delecija polipurinskog niza (PPT) vektora dramatično smanjuje
1
obrazovanje linearnih dsDNK vektorskih formi i posledično čini vektor defektnim u integraciji (slika 5). Kao što je prikazano na slici 5, samo 1-LTR vektorske forme su mogle da se detektuju u ćelijama 293T transduciranim sa vektorom kome je deletiran PPT. Iako nije poželjno držati se neke posebne teorije o načinu funkcionisanja, smatra se da delecija PPT može da omogući sintezu pozitivnog lanca DNK sa kriptičnog RNK prajmera smeštenog ushodno od cPPT. Ovo može da spreči “drugi skok”, rezultujući u obrazovanju samo 1-LTR vektorskih formi. Alternativno ili dodatno, sinteza drugog lanca može da bude inicirana sa mesta vezivanja prajmera (PBS) i/ili kriptičnog mesta.
[0059] U nekim aspektima ovde opisanog predmeta, obezbeđene su kompozicije koje sadrže retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji kojima nedostaje 3’ polipurinski niz (PPT). U nekim aspektima, obezbeđene su izolovane nukleinske kiseline koje sadrže heterologu nukleotidnu sekvencu, jedan ili dva retrovirusna duga terminalna ponovka (LTR), signal za pakovanje, responsivni element za rev i eukariotski promotor, gde nukleinskoj kiselini nedostaje 3’ PPT. U nekim aspektima, izolovana nukleinska kiselina dodatno sadrži bakterijsko mesto početka replikacije smešteno između dva LTR. U nekim aspektima, izolovana nukleinska kiselina dalje sadrži bakterijski selekcioni marker (tj., bakterijsku kodirajuću sekvencu čija ekspresija omogućava rast ćelije u prisustvu jedinjenja koje bi inače sprečilo njen rast i/ili ubilo ćeliju). U nekim aspektima, izolovana nukleinska kiselina dalje sadrži virusno mesto početka replikacije ili sekvencu koja može direktno ili indirektno da posreduje u replikaciji nukleinske kiseline vektora od strane domaćina. U nekim primerima izvođenja, virusno mesto početka replikacije uključuje, ali nije ograničeno na OriP Epštajn-Bar virusa (EBV) i mesto početka replikacije SV40. U nekim aspektima, obezbeđeni su vektori koji sadrže nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, obezbeđene su rekombinantne retrovirusne čestice koje sadrže vektore.
[0060] U nekim aspektima, obezbeđene su inducibilne ćelijske linije za pakovanje retrovirusnog vektora koje sadrže vektore i najmanje jedan konstrukt koji kodira proteine potrebne za pakovanje retrovirusnog vektora.
[0061] U nekim aspektima, obezbeđeni su postupci za proizvodnju čestica vektora defektnog u integraciji, koji obuhvataju transfekciju ćelijske linije za pakovanje retrovirusnom vektorskom kasetom za prenos defektnom u integraciji kojoj nedostaje 3’ PPT, gde ćelijska linija za pakovanje obezbeđuje proteine za pakovanje retrovirusnog vektora.
1
[0062] U nekim aspektima, obezbeđeni su kitovi retrovirusnog vektora koji sadrže retrovirusnu vektorsku kasetu za prenos defektnu u integraciji kojoj nedostaje 3’ PPT; i ćelijsku liniju koja sadrži najmanje jedan konstrukt koji kodira proteine potrebne za pakovanje retrovirusnog vektora.
[0063] U nekim aspektima, obezbeđeni su postupci za postizanje genske ekspresije nukleotidne sekvence od interesa u ćelijama životinje suštinski bez integracije nukleotidne sekvence u genom životinje, koji obuhvataju infekciju ćelija retrovirusnom česticom defektnom u integraciji prema ovde opisanom predmetu koja sadrži nukleotidnu sekvencu od interesa. U nekim aspektima, retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji prema ovde opisanom predmetu koje sadrže ili virusno mesto početka replikacije ili sekvencu koja može da posreduje u replikaciji nukleinske kiseline vektora od strane ćelija-domaćina može da se održava u ciljnim ćelijama koje se dele. Nasuprot tome, u primenama gde je poželjna samo privremena genska ekspresija, korisne su retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji prema ovde opisanom predmetu koje ne sadrže mesto početka replikacije, budući da se ne održavaju u ćelijama koje se dele. Na primer, u nekim aspektima, retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji prema ovde opisanom predmetu kojima nedostaje mesto početka replikacije korisne su za dobijanje prolazne ekspresije gena od interesa u stem ćelijama. U nekim aspektima, gen od interesa je gen koji usmerava diferencijaciju stem ćelija. U nekom aspektima, stem ćelije su korisne za gensku terapiju.
[0064] U nekim aspektima, sekvenca koja može direktno ili indirektno da posreduje u replikaciji nukleinske kiseline vektora od strane ćelije-domaćina uključuje, ali nije ograničena na sekvencu koju prepoznaje replikativni aparat ćelije-domaćina; sekvencu koja kodira protein koji može da se poveže sa i/ili modulira replikativni aparat ćelije-domaćina; i sekvencu koja kodira protein koji može da se poveže sa proteinom koji može da se poveže sa i/ili modulira replikativni aparat ćelije-domaćina.
[0065] Prema tome, kompozicije i postupci sa neintegrišućim retrovirusnim vektorom prema ovde opisanom predmetu, mogu da se koriste za izbegavanje insercione mutageneze. U nekim aspektima, obezbeđeni su postupci za postizanje genske ekspresije nukleotidne sekvence od interesa u ćelijama životinje pomoću ciljne integracije nukleotidne sekvence u genom životinje. U nekim aspektima, kompozicije vektora defektnog u integraciji prema ovde opisanom predmetu su korisne budući da su značajno efikasnije od trenutno korišćenih
1
neintegrišućih retrovirusnih sistema u kontekstu primena zasnovanih na kružnim vektorskim formama, uključujući, ali bez ograničenja, integraciju vektora posredovanu sa FLP i Cre. Na primer, kompozicije i postupci sa neintegrišućim retrovirusnim vektorom prema ovde opisanom predmetu, mogu da se koriste za dobijanje ciljne integracije gena od interesa u genom domaćina kombinovanjem kompozicija i postupaka sa neintegrišućim retrovirusnim vektorom prema ovde opisanom predmetu, sa poznatim autonomnim replikativnim sistemima i sistemima za dirigovanu rekombinaciju. U nekim aspektima, retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji prema ovde opisanomu predmetu korisne su za dobijanje ekspresije gena od interesa u stem ćelijama. U nekim aspektima, stem ćelije su korisne za gensku terapiju.
[0066] U nekim aspektima ovde opisanog predmeta, obezbeđene su retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji kojima nedostaje 3’ polipurinski niz (PPT) koje sadrže heterologu sekvencu. U nekim aspektima, heterologa sekvenca uključuje, ali nije ograničena na jedan ili više marker gena, terapeutskih gena, antivirusnih gena, antitumorskih gena, gena za citokine, gena koji kodiraju antigene, sekvenci koje mogu da se povežu sa hromatinom domaćina, sekvenci koje kodiraju protein koji može da se poveže sa DNK domaćina i hromatinom domaćina i nukleinskom kiselinom vektora, sekvenci koje kodiraju protein koji ima aktivnost metilacije DNK, aktivnost demetilacije DNK, aktivnost citozin deaminaze, i njihove kombinacije. U nekim aspektima, sekvenca koja može da se poveže sa hromatinom domaćina je odabrana iz grupe koja se sastoji od regiona povezanog sa matricom (MAR) i nosača/regiona povezanog sa matricom (S/MAR). U nekim aspektima, marker geni uključuju, ali nisu ograničeni na gen za β-galaktozidazu, higromicinski gen, blastocidinski gen, MGMT gen, neomicinski gen, puromicinski gen, gen za citozin deaminazu, gen za sekretornu alkalnu fosfatazu, gene za fluorescentni protein, i njihove kombinacije.
[0067] U nekim aspektima, obezbeđeni su vektori koji sadrže nukleinske kiseline prema ovde opisanom predmetu. U nekim aspektima, vektori sadrže samo jedan LTR. U nekim primerima izvođenja, vektor sadrži sekvence iz najmanje dva različita retrovirusa. U nekim aspektima, najmanje dva različita retrovirusa uključuju lentivirus. U nekim aspektima, LTR vektora sadrži sekvence iz najmanje dva različita retrovirusa. U nekim aspektima, najmanje dva različita retrovirusa uključuju lentivirus. U nekim aspektima, vektor sadrži sekvence iz najmanje dva različita retrovirusa i najmanje jednu od sekvenci kodira cis element koji obezbeđuje unakrsno pakovanje vektora u virusnu česticu. U nekim aspektima, cis element uključuje, ali nije ograničena na RRE, fragment Env gena iz regiona koji oivičava RRE i
2
cPPT. U nekim aspektima, retrovirusne vektorske kasete za prenos defektne u integraciji kojima nedostaje 3’ PPT uključuju retrovirusne vektorske kasete za prenos koje sadrže sekvence iz najmanje dva različita retrovirusa.
[0068] U nekim aspektima, ovde opisani predmet obezbeđuje postupke za umetanje nukleotidne sekvence od interesa u genom domaćina na mesto-specifičan način, koji obuhvata transdukciju kompatibilne ćelije-domaćina vektorima defektnim u integraciji koji su ovde opisani, koji sadrže u funkcionalnoj kombinaciji nukleotidnu sekvencu od interesa i jednu ili više sekvenci za dirigovanu rekombinaciju; i transfekciju ili transdukciju kompatibilne ćelije-domaćina nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu koja kodira nukleazu ili rekombinazu koja može da posreduje u mesto-specifičnoj integraciji u sekvenci za rekombinaciju.
[0069] U nekim aspektima, nema drugog koraka transfekcije/transdukcije i transfekcija/transdukcija se odvijaju u istom koraku. U nekim primerima izvođenja, rekombinaza sposobna da posreduje u mesto-specifičnoj integraciji u sekvenci za rekombinaciju je Cre ili FLP. U nekim aspektima, nema drugog koraka transfekcije/transdukcije i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira nukleazu ili rekombinazu predstavlja vektor defektan u integraciji. U nekim aspektima, korak transfekcije/transdukcije se odvija u istom koraku i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira nukleazu ili rekombinazu je na odvojenom vektoru ili plazmidu ili molekulu nukleinske kiseline u odnosu na vektor defektan u integraciji. U nekim aspektima, sekvenca koju prepoznaju nukleaza ili rekombinaza koja može da posreduje u mesto-specifičnoj integraciji je IoxP mesto ili pseudo-IoxP mesto. U nekim aspektima, sekvence su mesta prepoznavanja za Cre ili varijante Cre. U nekim aspektima, gen koji treba da se umetne može da bude smešten u U3 regionu 3′ LTR sekvence. U nekim primerima izvođenja, vektor uključuje jedan ili više reporter gena.
[0070] U nekim aspektima, ovde opisani predmet obezbeđuje postupke za umetanje nukleotidne sekvence od interesa u genom ćelije-domaćina na nespecifičan način, koji obuhvata: transdukciju ćelije-domaćina vektorom defektnim u integraciji prema ovde opisanom predmetu koji sadrži u funkcionalnoj kombinaciji nukleotidnu sekvencu od interesa i jednu ili više transpozonskih sekvenci; i transfekciju ili transdukciju kompatibilne ćelijedomaćina nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu koja kodira transpozazu koja može da posreduje u integraciji u genom domaćina. U nekim aspektima, nema drugog koraka transfekcije/transdukcije i transfekcija/transdukcija se odvijaju u istom koraku. U nekim primerima izvođenja, korak transfekcije/transdukcije se odvija u istom koraku i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira transpozazu predstavlja vektor defektan u integraciji. U nekim primerima izvođenja, korak transfekcije/transdukcije se događa u istom koraku i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira transpozazu je na odvojenom vektoru ili plazmidu ili molekulu nukleinske kiseline u odnosu na vektor defektan u integraciji. U nekim aspektima, transpozon i transpozaza su tipa mariner kao što je „Sleeping Beauty“ (videti npr. SAD pat. br. 6,613,752; Robertson (1993) Nature 362:241-245; Ivics et al. (1997) Cell 91:501-510; Plasterk et al. (1999) Trends Genet 15:326-332; Zayed et al. (2003) Nuc. Acid Res 31(9):2313-2322; Arkhipova et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:11781-11786).
[0071] Ovde opisani predmet opisuje razvoj kompozicija i postupaka sa neintegrišućim retrovirusnim vektorom. Genomi retrovirusnog vektora nastali pomoću kompozicija i postupaka prema ovde opisanom predmetu tokom vektorske transdukcije, predstavljaju suštinski ujednačene epizomalne dvolančane kružne 1-LTR DNK forme. Činjenica da u suštini nastaju samo 1-LTR forme omogućava bolju kontrolu neintegrišućih vektora. Prema tome, kompozicije i postupci sa neintegrišućim retrovirusnim vektorom prema ovde opisanom predmetu imaju brojne upotrebe i prednosti za postizanje genske ekspresije nukleotidnih sekvenci od interesa u životinjskim ćelijama, uključujući smanjeni rizik od indukcije odgovora popravke oštećene DNK i značajno povećanje u efikasnosti kada se koriste u kombinaciji sa primenama zasnovanim na kružnim vektorskim formama uključujući, ali bez ograničenja, vektorsku integraciju posredovanu sa FLP i Cre.
Claims (15)
1. Retrovirusni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži:
a) jedan ili dva retrovirusna duga terminalna ponovka (LTR),
b) signal za pakovanje,
c) responsivni element za rev,
d) eukariotski promotor, funkcionalno vezan za
e) heterologu nukleotidnu sekvencu, gde izborno heterologa sekvenca sadrži jedan ili više marker gena, opciono izabranih između gena za 3-galaktozidazu, higromicinskog gena, blastocidinskog gena, MGMT gena, neomicinskog gena, puromicinskog gena, gena za citozin deaminazu, gena za sekretornu alkalnu fosfatazu, gena za fluorescentni protein, i njihovih kombinacija; terapeutskih gena; antivirusnih gena; antitumorskih gena; gena za citokine; gena koji kodiraju antigene; sekvenci koje mogu da se povežu sa hromatinom domaćina; sekvenci koje kodiraju protein koji može da se poveže sa DNK domaćina i hromatinom domaćina i nukleinskom kiselinom vektora; sekvenci koje kodiraju protein koji ima aktivnost metilacije DNK; i njihove kombinacije,
i izborno post-transkripcioni regulatorni element,
naznačen time što retrovirusnom vektoru nedostaje 3’-polipurinski niz (3’-PPT),
izborno funkcionalni cPPT.
2. Retrovirusni vektor prema patentnom zahtevu 1, koji dalje sadrži:
virusno mesto početka replikacije, izborno OriP Epštajn-Bar virusa ili mesto početka replikacije SV40 virusa,
sekvencu koja može direktno ili indirektno da posreduje u replikaciji nukleinske kiseline vektora od strane domaćina, izborno (a) sekvencu koju prepoznaje replikativni aparat ćelije-domaćina; (b) sekvencu koja kodira protein koji može da se poveže sa i/ili da modulira replikativni aparat ćelije-domaćina; ili (c) sekvencu koja kodira protein koji može da se poveže sa proteinom iz dela (b) ili može da prepozna sekvencu vektora,
bakterijsko mesto početka replikacije i bakterijski selekcioni marker smešten između dva LTR ponovka.
3. Retrovirusni vektor prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što vektor sadrži:
2
pojedinačni LTR, i/ili
samoinaktivirajuću deleciju u U3 regionu LTR, u kojoj je deletirani deo U3 regiona izborno zamenjen inducibilnim promotorom, i/ili
mesto dirigovane rekombinacije, gde je mesto dirigovane rekombinacije izborno u U3 regionu LTR i/ili je loxP ili FRT.
4. Retrovirusni vektor prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što vektor sadrži LTR koji sadrži restrikciono mesto u U3 regionu LTR.
5. Retrovirusni vektor prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačen time što vektor sadrži sekvence, izborno LTR sekvence, iz najmanje dva različita retrovirusa, i izborno gde dodatno najmanje dva različita retrovirusa uključuju lentivirus i/ili najmanje jednu od sekvenci koje kodiraju cis element koji obezbeđuje unakrsno pakovanje vektora u virusnu česticu, gde je izborno cis element odabran iz grupe koja se sastoji od RRE, fragmenta Env gena iz regiona koji oivičava RRE, i cPPT.
6. Retrovirusna vektorska kaseta za prenos defektna u integraciji kojoj nedostaje 3’-polipurinski niz (3’-PPT), naznačena time što retrovirusna vektorska kaseta za prenos defektna u integraciji izborno:
nema funkcionalni centralni polipurinski niz (cPPT), i/ili sadrži:
heterologu sekvencu,
pojedinačni LTR,
samoinaktivirajuću deleciju u U3 regionu LTR, u kojoj je deletirani deo U3 regiona izborno zamenjen inducibilnim promotorom, i/ili
mesto dirigovane rekombinacije, gde je mesto dirigovane rekombinacije izborno u U3 regionu LTR i/ili je loxP i FRT.
7. Rekombinantna retrovirusna čestica koja sadrži vektor prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što je vektor izborno za upotrebu u genskoj terapiji, ili retrovirusni provirus proizveden pomoću infekcije ciljnih ćelija rekombinantnom retrovirusnom česticom, ili RNK ili iRNK tako proizvedene retrovirusne čestice.
8. Inducibilna ćelijska linija za pakovanje retrovirusnog vektora koja sadrži retrovirusni vektor prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva i najmanje jedan konstrukt koji kodira jedan ili više proteina potrebnih za pakovanje retrovirusnog vektora.
9. Kit retrovirusnog vektora koji sadrži:
(a) retrovirusnu vektorsku kasetu za prenos defektnu u integraciji kojoj nedostaje 3’-PPT; i
(b) ćelijsku liniju za pakovanje koja sadrži najmanje jedan konstrukt koji kodira jedan ili više proteina potrebnih za pakovanje retrovirusnog vektora.
10. Postupak za proizvodnju čestica vektora defektnog u integraciji, koji obuhvata transfekciju ćelijske linije za pakovanje retrovirusnom vektorskom kasetom za prenos defektnom u integraciji kojoj nedostaje 3’-PPT, gde ćelijska linija za pakovanje obezbeđuje proteine za pakovanje retrovirusnog vektora.
11. Retrovirusna čestica defektna u integraciji prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu u postupku za ekspresiju nukleotidne sekvence od interesa u ćeliji životinje bez integracije nukleotidne sekvence u genom životinje, postupak obuhvata infekciju jedne ili više ćelija retrovirusnom česticom defektnom u integraciji prema patentnom zahtevu 7.
12. Vektor defektan u integraciji prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u postupku za umetanje nukleotidne sekvence od interesa u genom ćelije-domaćina na mesto-specifičan način, koji obuhvata:
(a) transdukciju kompatibilne ćelije-domaćina vektorom defektnim u integraciji prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva koji sadrži u funkcionalnoj kombinaciji nukleotidnu sekvencu od interesa i jednu ili više sekvenci za dirigovanu rekombinaciju;
i
(b) transfekciju ili transdukciju kompatibilne ćelije-domaćina nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu koja kodira nukleazu ili rekombinazu koja može da posreduje u mesto-specifičnoj integraciji u rekombinacionoj sekvenci, izborno Cre ili Flp, gde transfekcija ili transdukcija iz dela (b) može da se odvija odvojeno ili u istom koraku kao deo (a),
(c) gde je nukleotidna sekvenca od interesa ubačena na mesto-specifičan način u genom ćelije-domaćina.
13. Vektor defektan u integraciji za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što se transfekcija ili transdukcija iz dela (b) događa u istom koraku kao deo (a) i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira nukleazu ili rekombinazu predstavlja vektor defektan u integraciji iz dela (a), ili gde se transfekcija ili transdukcija iz
2
dela (b) događa u istom koraku kao deo (a) i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira nukleazu ili rekombinazu predstavlja zasebni vektor, plazmid, ili molekul nukleinske kiseline u odnosu na vektor defektan u integraciji iz dela (a).
14. Vektor defektan u integraciji prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u postupku za umetanje nukleotidne sekvence od interesa u genom ćelije-domaćina na nespecifičan način, koji obuhvata:
(a) transdukciju ćelije-domaćina vektorom defektnim u integraciji prema bilo kom od patentnih zahteva 4 - 6, koji sadrži u funkcionalnoj kombinaciji, nukleotidnu sekvencu od interesa i jednu ili više transpozonskih sekvenci; i
(b) transfekciju ili transdukciju ćelije-domaćina nukleinskom kiselinom koja sadrži sekvencu koja kodira transpozazu koja može da posreduje u integraciji u genom domaćina, gde transfekcija ili transdukcija iz dela (b) može da se odvija odvojeno ili u istom koraku kao deo (a),
(c) gde je nukleotidna sekvenca od interesa ubačena u genom ćelije-domaćina, i dodatno gde je transpozon ili transpozaza izborno tipa mariner, dodatno izborno predstavlja „Sleeping Beauty“.
15. Vektor defektan u integraciji za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 14, naznačen time što se transfekcija ili transdukcija iz dela (b) događa u istom koraku kao deo (a) i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koji kodira transpozazu predstavlja vektor defektan u integraciji iz dela (a), ili gde se transfekcija ili transdukcija iz dela (b) događa u istom koraku kao deo (a) i nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira transpozazu predstavlja zasebni vektor, plazmid ili molekul nukleinske kiseline u odnosu na vektor defektan u integraciji iz dela (a).
2
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US711807P | 2007-12-11 | 2007-12-11 | |
| EP08859393.4A EP2222861B1 (en) | 2007-12-11 | 2008-12-11 | Polypurine tract modified retroviral vectors |
| PCT/US2008/086409 WO2009076524A2 (en) | 2007-12-11 | 2008-12-11 | Polypurine tract modified retroviral vectors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RS56844B1 true RS56844B1 (sr) | 2018-04-30 |
Family
ID=40756119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RS20180107A RS56844B1 (sr) | 2007-12-11 | 2008-12-11 | Retrovirusni vektori sa modifikovanim polipurinskim nizom |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9796987B2 (sr) |
| EP (2) | EP3342872A1 (sr) |
| JP (2) | JP5749014B2 (sr) |
| CY (1) | CY1119905T1 (sr) |
| DK (1) | DK2222861T3 (sr) |
| ES (1) | ES2664988T3 (sr) |
| HR (1) | HRP20180184T1 (sr) |
| HU (1) | HUE036103T2 (sr) |
| LT (1) | LT2222861T (sr) |
| NO (1) | NO2222861T3 (sr) |
| PL (1) | PL2222861T3 (sr) |
| PT (1) | PT2222861T (sr) |
| RS (1) | RS56844B1 (sr) |
| SI (1) | SI2222861T1 (sr) |
| TR (1) | TR201802323T4 (sr) |
| WO (1) | WO2009076524A2 (sr) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1885186B1 (en) | 2005-06-01 | 2015-09-02 | California Institute Of Technology | Method of targeted gene delivery using viral vectors |
| US8329162B2 (en) | 2006-07-21 | 2012-12-11 | California Institute Of Technology | Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination |
| PL2222861T3 (pl) | 2007-12-11 | 2018-04-30 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Wektory retrowirusowe ze zmodyfikowanym odcinkiem polipurynowym |
| RS53257B2 (sr) * | 2009-07-24 | 2018-06-29 | Immune Design Corp | Lentiviralni vektori pseudotipizirani sa omotačem od glikobelančevine iz sindbis-virusa |
| WO2012112691A1 (en) | 2011-02-15 | 2012-08-23 | Immune Design Corp. | Methods for enhancing immunogen specific immune responses by vectored vaccines |
| EA027236B1 (ru) | 2011-04-08 | 2017-07-31 | Иммьюн Дизайн Корп. | Иммуногенные композиции и способы применения таких композиций для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа |
| WO2013149167A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Immune Design Corp. | Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing dc- sign |
| US9713635B2 (en) | 2012-03-30 | 2017-07-25 | Immune Design Corp. | Materials and methods for producing improved lentiviral vector particles |
| US8323662B1 (en) | 2012-03-30 | 2012-12-04 | Immune Design Corp. | Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein |
| HRP20181102T1 (hr) | 2012-05-16 | 2018-09-07 | Immune Design Corp | Cjepiva za hsv-2 |
| ES2738582T3 (es) | 2014-02-14 | 2020-01-23 | Immune Design Corp | Inmunoterapia del cáncer a través de combinación de inmunoestimulación local y sistémica |
| KR20170032373A (ko) | 2014-07-15 | 2017-03-22 | 이뮨 디자인 코포레이션 | Tlr4 작용제 보조제 및 렌티바이러스 벡터를 이용한 프라임-부스트 요법 |
| KR101607282B1 (ko) | 2014-12-18 | 2016-03-29 | 충남대학교산학협력단 | 유리형 산화환원조절단백-1 및 이를 함유하는 항염증 약학조성물 |
| WO2016118780A1 (en) | 2015-01-21 | 2016-07-28 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Point-of-care and/or portable platform for gene therapy |
| WO2017066570A1 (en) * | 2015-10-15 | 2017-04-20 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for integration-defective lentiviral vectors |
| EP3365453A2 (en) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics GmbH | Methods, kits, agents and apparatuses for transduction |
| WO2017083291A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | Immune Design Corp. | Compositions comprising lentiviral vectors expressing il-12 and methods of use thereof |
| AU2016354102B2 (en) | 2015-11-09 | 2022-05-12 | Immune Design Corp. | A retroviral vector for the administration and expression of replicon RNA expressing heterologous nucleic acids |
| JP2019509275A (ja) | 2016-02-23 | 2019-04-04 | イミューン デザイン コーポレイション | マルチゲノムレトロウイルスベクター調製物ならびにそれらを産生および使用するための方法およびシステム |
| WO2017181152A2 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof |
| MX2018012472A (es) | 2016-04-15 | 2019-08-12 | Alpine Immune Sciences Inc | Proteinas inmunomoduladoras variantes de ligando icos y sus usos. |
| US11471488B2 (en) | 2016-07-28 | 2022-10-18 | Alpine Immune Sciences, Inc. | CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof |
| WO2018022946A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-02-01 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof |
| WO2018022945A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-02-01 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Cd112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof |
| MA45783A (fr) | 2016-07-29 | 2019-06-05 | Juno Therapeutics Inc | Procédés d'évaluation de la présence ou de l'absence d'un virus compétent pour la réplication |
| KR20190098747A (ko) | 2016-12-05 | 2019-08-22 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 입양 세포 치료법을 위한 조작된 세포의 제조방법 |
| SG11201907769XA (en) | 2017-03-16 | 2019-09-27 | Alpine Immune Sciences Inc | Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof |
| KR20190141146A (ko) | 2017-03-16 | 2019-12-23 | 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 | Pd-l2 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도 |
| EP3596116B1 (en) | 2017-03-16 | 2023-09-06 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Pd-l1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof |
| SG11202000606TA (en) | 2017-07-29 | 2020-02-27 | Juno Therapeutics Inc | Reagents for expanding cells expressing recombinant receptors |
| KR20250016455A (ko) | 2017-08-09 | 2025-02-03 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 유전자 조작된 세포 조성물 및 관련 조성물의 제조 방법 |
| JP7749319B2 (ja) | 2017-10-10 | 2025-10-06 | アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド | Ｃｔｌａ－４変異型免疫調節タンパク質およびそれらの使用 |
| BR112020007542A2 (pt) | 2017-10-18 | 2020-12-01 | Alpine Immune Sciences, Inc. | proteínas imunomoduladoras ligantes de icos variantes e composições e métodos relacionados |
| EP3704229B1 (en) | 2017-11-01 | 2023-12-20 | Juno Therapeutics, Inc. | Process for producing a t cell composition |
| US12258580B2 (en) | 2017-11-01 | 2025-03-25 | Juno Therapeutics, Inc. | Process for generating therapeutic compositions of engineered cells |
| MX2020005907A (es) | 2017-12-08 | 2020-10-19 | Juno Therapeutics Inc | Formulacion de medio libre de suero para cultivar celulas y metodos de uso de la misma. |
| AU2019205273B2 (en) | 2018-01-03 | 2024-04-04 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof |
| JP2021511802A (ja) | 2018-01-31 | 2021-05-13 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 複製可能ウイルスの存在または非存在を評価するための方法および試薬 |
| WO2019241758A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof |
| EP3853247A2 (en) | 2018-09-19 | 2021-07-28 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Methods and uses of variant cd80 fusion proteins and related constructs |
| MA54078A (fr) | 2018-11-01 | 2021-09-15 | Juno Therapeutics Inc | Méthodes pour le traitement au moyen de récepteurs antigéniques chimériques spécifiques de l'antigene de maturation des lymphocytes b |
| IL283218B2 (en) | 2018-11-16 | 2025-11-01 | Juno Therapeutics Inc | Dosing methods of engineered T cells for the treatment of malignant B cells |
| CA3120868A1 (en) | 2018-11-30 | 2020-06-04 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof |
| PT3886875T (pt) | 2018-11-30 | 2024-06-27 | Juno Therapeutics Inc | Métodos para tratamento utilizando terapia celular adotiva |
| CN113692285A (zh) | 2018-11-30 | 2021-11-23 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 在过继细胞疗法中给药和治疗b细胞恶性肿瘤的方法 |
| MX2021012607A (es) | 2019-04-17 | 2022-03-11 | Alpine Immune Sciences Inc | Metodos y usos de proteinas de fusion de ligando icos (icosl) variante. |
| CN114207136A (zh) | 2019-06-07 | 2022-03-18 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 自动化t细胞培养 |
| KR20220034782A (ko) | 2019-06-12 | 2022-03-18 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 세포 매개 세포 독성 요법 및 친생존 ｂｃｌ2 패밀리 단백질 억제제의 병용 요법 |
| CN114555112A (zh) | 2019-08-22 | 2022-05-27 | 朱诺治疗学股份有限公司 | T细胞疗法和zeste增强子同源物2(ezh2)抑制剂的组合疗法及相关方法 |
| JP2022554348A (ja) | 2019-11-05 | 2022-12-28 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 治療用ｔ細胞組成物の属性を決定する方法 |
| MX2022006715A (es) | 2019-12-06 | 2022-09-23 | Juno Therapeutics Inc | Metodos relacionados con toxicidad y respuesta asociada con terapia celular para tratar neoplasias malignas de celulas b. |
| EP4093433A1 (en) | 2020-01-24 | 2022-11-30 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for dosing and treatment of follicular lymphoma and marginal zone lymphoma in adoptive cell therapy |
| JP2023512209A (ja) | 2020-01-28 | 2023-03-24 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | Ｔ細胞形質導入のための方法 |
| JP2023522857A (ja) | 2020-04-10 | 2023-06-01 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | Ｂ細胞成熟抗原を標的とするキメラ抗原受容体によって操作された細胞療法に関する方法および使用 |
| EP4146684A2 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | Alpine Immune Sciences, Inc. | April and baff inhibitory immunomodulatory proteins with and without a t cell inhibitory protein and methods of use thereof |
| KR20230024283A (ko) | 2020-05-13 | 2023-02-20 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 임상 반응과 관련된 특징을 식별하는 방법 및 이의 용도 |
| CA3197730A1 (en) | 2020-10-15 | 2022-04-21 | F. Hoffman-La Roche Ag | Nucleic acid constructs for va rna transcription |
| WO2022133030A1 (en) | 2020-12-16 | 2022-06-23 | Juno Therapeutics, Inc. | Combination therapy of a cell therapy and a bcl2 inhibitor |
| CN117321200A (zh) | 2021-03-22 | 2023-12-29 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 评估病毒载体颗粒效力的方法 |
| AU2022241654A1 (en) | 2021-03-22 | 2023-09-28 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods of determining potency of a therapeutic cell composition |
| CN117858719A (zh) | 2021-03-29 | 2024-04-09 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 使用检查点抑制剂疗法和car t细胞疗法的组合进行给药和治疗的方法 |
| US20240279310A1 (en) | 2021-05-07 | 2024-08-22 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Methods of dosing and treatment with a taci-fc fusion immunomodulatory protein |
| WO2023114949A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods and systems of particle production |
| KR20240137075A (ko) | 2022-01-28 | 2024-09-19 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 세포 조성물의 제조 방법 |
| WO2023172883A1 (en) | 2022-03-07 | 2023-09-14 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses |
| US20250345432A1 (en) | 2022-05-25 | 2025-11-13 | Celgene Corporation | Method for predicting response to a t cell therapy |
| EP4543923A1 (en) | 2022-06-22 | 2025-04-30 | Juno Therapeutics, Inc. | Treatment methods for second line therapy of cd19-targeted car t cells |
| KR20250099778A (ko) | 2022-10-04 | 2025-07-02 | 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 | 자가항체-매개 질환의 치료에 사용하기 위한 돌연변이된 taci-fc 융합 단백질 |
| WO2024220588A1 (en) | 2023-04-18 | 2024-10-24 | Juno Therapeutics, Inc. | Cytotoxicity assay for assessing potency of therapeutic cell compositions |
| WO2024226858A1 (en) | 2023-04-26 | 2024-10-31 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for viral vector manufacturing |
| KR20260026101A (ko) | 2023-05-23 | 2026-02-25 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | T 세포의 활성화 마커 및 t 세포 활성화를 평가하는 방법 |
| WO2024263991A2 (en) * | 2023-06-22 | 2024-12-26 | Arc Research Institute | Methods and compositions for integration deficient viral vectors |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5861161A (en) | 1994-09-07 | 1999-01-19 | Universite De Montreal | Chimeric proteins comprising a Vpr/Vpx virion incorporation domain for targeting into HIV-1 or HIV-2 virions |
| JP2000503527A (ja) * | 1995-11-28 | 2000-03-28 | ザ ジョンズ ホプキンズ ユニヴァーシティ スクール オヴ メディシン | 条件付き複製ウイルスベクターおよびその用途 |
| WO2001030965A2 (en) | 1999-10-28 | 2001-05-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of in vivo gene transfer using a sleeping beauty transposon system |
| US6673567B2 (en) | 2000-03-23 | 2004-01-06 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method of determination of gene function |
| US20030003565A1 (en) * | 2000-11-27 | 2003-01-02 | Dubensky Thomas W. | Functional lentiviral vector from an MLV-based backbone |
| EP1534847B1 (en) | 2002-09-03 | 2015-10-28 | Oxford Biomedica (UK) Limited | Retroviral vector and stable packaging cell lines |
| US7220578B2 (en) * | 2002-11-27 | 2007-05-22 | Tal Kafri | Single LTR lentivirus vector |
| EP2055316A1 (en) * | 2003-09-09 | 2009-05-06 | VIRxSYS Corporation | Lentivirus vector-based approaches for generating an immune response to HIV in humans |
| GB0325379D0 (en) * | 2003-10-30 | 2003-12-03 | Oxford Biomedica Ltd | Vectors |
| US20060019393A1 (en) * | 2003-12-04 | 2006-01-26 | Cannon Paula M | Minimal lentiviral vector system |
| US20070048285A1 (en) * | 2005-08-24 | 2007-03-01 | Christopher Baum | Self-inactivating retroviral vector |
| EP1757703A3 (en) | 2005-08-24 | 2007-12-05 | Medizinische Hochschule Hannover | Self-inactivating retroviral vector |
| PL2222861T3 (pl) | 2007-12-11 | 2018-04-30 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Wektory retrowirusowe ze zmodyfikowanym odcinkiem polipurynowym |
-
2008
- 2008-12-11 PL PL08859393T patent/PL2222861T3/pl unknown
- 2008-12-11 US US12/747,076 patent/US9796987B2/en active Active
- 2008-12-11 EP EP17204678.1A patent/EP3342872A1/en not_active Withdrawn
- 2008-12-11 JP JP2010538155A patent/JP5749014B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-12-11 TR TR2018/02323T patent/TR201802323T4/tr unknown
- 2008-12-11 WO PCT/US2008/086409 patent/WO2009076524A2/en not_active Ceased
- 2008-12-11 HU HUE08859393A patent/HUE036103T2/hu unknown
- 2008-12-11 SI SI200831929T patent/SI2222861T1/en unknown
- 2008-12-11 HR HRP20180184TT patent/HRP20180184T1/hr unknown
- 2008-12-11 DK DK08859393.4T patent/DK2222861T3/en active
- 2008-12-11 LT LTEP08859393.4T patent/LT2222861T/lt unknown
- 2008-12-11 RS RS20180107A patent/RS56844B1/sr unknown
- 2008-12-11 ES ES08859393.4T patent/ES2664988T3/es active Active
- 2008-12-11 PT PT88593934T patent/PT2222861T/pt unknown
- 2008-12-11 NO NO08859393A patent/NO2222861T3/no unknown
- 2008-12-11 EP EP08859393.4A patent/EP2222861B1/en active Active
-
2015
- 2015-01-28 JP JP2015013974A patent/JP6001702B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-10-23 US US15/790,530 patent/US10017785B2/en active Active
-
2018
- 2018-02-09 CY CY20181100167T patent/CY1119905T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6001702B2 (ja) | 2016-10-05 |
| WO2009076524A2 (en) | 2009-06-18 |
| US20180119170A1 (en) | 2018-05-03 |
| TR201802323T4 (tr) | 2018-03-21 |
| ES2664988T3 (es) | 2018-04-24 |
| CY1119905T1 (el) | 2018-06-27 |
| JP2015119715A (ja) | 2015-07-02 |
| US10017785B2 (en) | 2018-07-10 |
| US20100323403A1 (en) | 2010-12-23 |
| EP3342872A1 (en) | 2018-07-04 |
| LT2222861T (lt) | 2018-03-26 |
| HRP20180184T1 (hr) | 2018-04-06 |
| PL2222861T3 (pl) | 2018-04-30 |
| JP2011505835A (ja) | 2011-03-03 |
| HUE036103T2 (hu) | 2018-06-28 |
| NO2222861T3 (sr) | 2018-05-05 |
| EP2222861A2 (en) | 2010-09-01 |
| US9796987B2 (en) | 2017-10-24 |
| JP5749014B2 (ja) | 2015-07-15 |
| WO2009076524A3 (en) | 2009-09-11 |
| SI2222861T1 (en) | 2018-04-30 |
| PT2222861T (pt) | 2018-02-16 |
| EP2222861B1 (en) | 2017-12-06 |
| EP2222861A4 (en) | 2011-12-28 |
| DK2222861T3 (en) | 2018-02-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10017785B2 (en) | Polypurine tract modified retroviral vectors | |
| KR102091957B1 (ko) | 레트로바이러스 생산을 위한 안정한 세포주 | |
| Pluta et al. | Use of HIV as a gene transfer vector | |
| AU2016359838B2 (en) | Transient transfection method for retroviral production | |
| CN109415415B (zh) | 用于衣壳化基因组工程系统的颗粒 | |
| US20120115227A1 (en) | Gene transfer vectors comprising genetic insulator elements and methods to identify genetic insulator elements | |
| CN115667534A (zh) | 慢病毒载体 | |
| GB2538324A (en) | Packaging cell line for retroviral production | |
| GB2538321A (en) | Artificial chromosome for retroviral production | |
| Schambach et al. | Retroviral vectors for cell and gene therapy | |
| van Heuvel | Optimization of retroviral packaging cells for scale-up of vector production | |
| Durosa et al. | g-RETROVIRUS-AND LENTIVIRUS-DERIVED VECTORS FOR GENE TRANSFER AND THERAPY | |
| WO2025213067A2 (en) | Methods and compositions for increased expression of integration deficient viral vectors | |
| Binder et al. | Lentivirus vectors | |
| Duros et al. | γ-RETROVIRUS-AND LENTIVIRUS-DERIVED VECTORS FOR GENE TRANSFER AND THERAPY | |
| Heuvel | Optimization of retroviral packaging cells for scale-up of vector production | |
| GB2544891A (en) | Transient transfection method for retroviral production |