RS57013B1 - Korektno savijeni etanercept sa visokom čistoćom i odličnim prinosom - Google Patents

Description

Opis pronalaska

Oblast tehnike

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na primenu mešovite hromatografije za prečišćavanje etanercepta koji može sadržati nepoželjne količine nekorektno savijenog i/ili agregiranog proteina zajedno sa korektno savijenim proteinom. Mešoviti hromatografski postupak prema pronalasku je posebno koristan za razdvajanje korektno savijenog etanercepta od nekorektno savijenog etanercepta (kao što je ovde definisano).

Stanje tehnike

[0002] Etanercept (Enbrel®, proizvodi ga firma Immunex Corporation) je dimerni fuzioni polipeptid koji se sastoji od ekstracelularnog ligand-vezujućeg dela humanog receptora faktora nekroze tumora (engl. tumor necrosis factor receptor, skr. "TNFR") od 75 kilodaltona (p75) vezanog za Fc receptorski [fragment koji se može kristalizovati, engl. fragment, crystallizable] region humanog imunoglobulina G ("IgG1"). Etanercept se sastoji od 934 aminokiselina i ima očiglednu molekulsku težinu od približno 150 kilodaltona (Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company, Inc.). Fc komponenta etanercepta sadrži konstantni teški 2 (CH2) domen, konstantni teški 3 (CH3) domen i region zgloba, ali ne i konstantni teški 1 (CH1) domen humanog IgG 1. Fc domen može sadržati jedan ili sve od gore opisanih domena.

[0003] Ljudi koji boluju od nekih tipova zapaljenskih bolesti, kao što su reumatoidni artritis, plak psorijaza, psorijatični artritis, juvenilni idiopatski artritis i ankilozirajući spondilitis, imaju imuni sistem koji prekomerno proizvodi faktor nekroze tumora (engl. tumor necrosis factor, skr. "TNF"). Utvrđeno je da je administracija etanercepta efektivna za lečenje nekih zapaljenskih bolesti, jer može da smanji nivoe aktivnog oblika TNF kod subjekta vezivanjem za TNF kao “mamac” receptor.

[0004] Etanercept se može proizvoditi na poznat način rekombinantnom DNK tehnologijom u sisarskom sistemu za ekspresiju u jajnim ćelijama kineskog hrčka (engl. Chinese hamster ovary, skr. "CHO"). Nažalost, proizvod koji proizvedu CHO ćelije sadrži veliku količinu nekorektno ili pogrešno savijenog i/ili agregiranog etanercepta. Za farmaceutsku primenu je poželjno dobiti etanercept koji je relativno čist, bez nekorektno savijenog i agregiranog proteina, jer nekorektno savijeni/agregirani protein neće imati isti terapeutski efekat kao korektno savijeni protein i u stvari može biti škodljiv za pacijenta.

[0005] Pogrešno savijanje i agregacija se često pojavljuju tokom proizvodnje rekombinantnih proteina i zato se moraju rešavati pomoću nizvodnih procesa kojima se može razdvojiti korektno savijeni protein od proteina koji je pogrešno savijen ili agregiran. Pogrešno savijanje smanjuje ili eliminiše terapeutski efekat proteina. Agregacija, za koju se generalno smatra da obuhvata nekovalentnu asocijaciju dva ili više homodimera etanercepta kojom se obrazuju vrste veoma velike molekulske težine, dovodi do sličnog gubitka terapeutskog efekta i dešava se kada se proteini, uključujući pogrešno savijene proteine, akumuliraju i međusobno zgrudvavaju. Kao što je gore navedeno, takvi pogrešno savijeni proteini i proteinski agregati ne samo što nisu terapeutski efektivni, već takođe mogu biti škodljivi za pacijenta. Shodno tome, sposobnost da se prečisti proizvod ekspresije koji sadrži etanercept tako da se ispravno savijeni etanercept razdvoji od pogrešno savijenog i/ili agregiranog etanercepta je važna za dobijanje etanercepta koji ima najviši mogući stepen farmaceutske prihvatljivosti.

[0006] Proizvodnja pogrešno savijenih i agregiranih proteina nije problem specifičan za etanercept. Postoje mnogi drugi terapeutski proteini za koje pogrešno savijanje može biti problem. Na primer, pogrešno savijanje proteina koji sadrže disulfide tokom ponovnog savijanja rekombinantnih proteina iz inkluzionih tela Escherichia coli je teško izbeći, ali se mogu efikasno izdvojiti reverzno-faznom hromatografijom visoke rezolucije. Upotreba niskog pH i organskog rastvarača u reverzno-faznoj hromatografiji, međutim, može denaturisati proteine i može izazvati agregaciju prečišćenog proteina tokom hromatografije.

[0007] Čak i kada se smatra da je pogrešno savijanje tokom proizvodnje farmaceutskih proteina neznatno, npr. u slučaju sisarske sekretorne ekspresije, još uvek može doći do agregacije i izvesnog pogrešnog savijanja (vidi npr. Chi, E. Y., Krishna, S., Randolph, T. W. i Carpenter, J. F., Physical Stability of Proteins in Aqueous Solution: Mechanism and Driving Forces in Nonnative Protein Aggregation, Pharm. Res., 20, 1325-1336 (2003); Kiese, S., Pappenberger, A., Friess, W., i Mahler, H. C., Shaken, Not Stirred: Mechanical Stress Tasting of an IgG 1 Antibody, J. Pharm. Sci., 97, 4347-4366 (2008)). Istraživači su uspešno izdvojili ne-nativne, pogrešno savijene proteine pod nedenaturišućim uslovima korišćenjem vodene hromatografije uz upotrebu izmene jona ("IEC") (vidi npr. Gagnon, P. J., Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Polyethylene Glycol, Immunol. Methods, 336, 222-228 (2008); Gagnon, P., Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems, Tucson, AZ, 57-87 (1996); Shukla, A. A., i Yigzaw, Y., Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry, Shukla, A., Etzel, M., i Gadam, S., eds., 179-227, CRC Press, Boca Raton (2007); Staby, A., Jacobsen, J. H., Hansen, R. G., Bruus, U. K., Jensen, I. H., Comparison of Chromatographic Ion-exchange Resins. V. Strong and Weak Cation-Exchange Resigns, J.Chroma-togr. A, 1118, 168-179 (2006); Shukla, A. A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S., Low, D. J., Downstream Processing of Monoclonal Antibodies-Application of Platform Approaches, Chromatogr. B, 848, 28-39 (2007); Shihara, T., Kadoya, T. J., Accelerate Purification Process Development of Monoclonal Antibodies for Shortening Time to Clinic: Design and Case Study of Chromatography Processes, Chromatogr. A, 1176, 149-156 (2007); Fahmer, R. L., Knudsen, H. L., Basey, C. D., Galan, W., Feuerhelm, D., Vanderlaan, M., Blank, G. S., Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies: Development, Operation, and Validation of Chromatography Processes, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 18, 301-27 (2001); i Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A. i Vedantham, G., Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates, Curr. Pharm. Biotech., 10, 421-426 (2009)), hidrofobne interakcije ("HIC") (vidi npr. Chen, J., Tetrault, J., Ley, A., Comparison of Standard and New Generation Hydrophobic Interaction Chromatography. Resins in the Monoclonal Antibody Purification Process, J. Chromatogr. A., 1177, 272-81 (2008); Gagnon, P., i Grund, E., Large Scale Process Development for Hydrophobic Interaction Chromatography, Part 4: Controlling Selectivity, BioPharm, 9, 54-64 (1996); i Lu, Y., Williamson, B., i Gillespie, R., Recent Advancement in Application of Hydrophobic Interaction Chromatography for Aggregate Removal in Industrial Purification Process, Curr. Pharm. Biotech., 10, 427-33 (2009)) i hidroksiapatidne ("HA") hromatografije (vidi npr. Aoyama, K., Chiba, J., Reparation of Molecular Forms of Mousse IgG and IgM Monoclonal Antibodies in High Performance Liquid Chromatography on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Immunol. Methods, 162, 201-210 (1993); Luellau, E., Marison, W., von Stockar, U., Ceramic Hydroxapatite: A New Tool for Separation and Analysis of IgA Monocolonal Antibodies, in Animal Cell Technology, Carondo, M., ed., Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 265-269 (1997); Luellau, E., von Stockar, U., Vogt, S., Freitag, R., Development of a Downstream Process for the Isolation and Separation of Monoclonal Immunoglobulin A Monomer, Dimers, and Polymers from Cell Culture Supernatant, J. Chomatogr. A., 796, 165-175 (1998); Yamakawa, Y., Chiba, J., High Performance Liquid Chromatography of Mouse Monoclonal Antibodies on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Liquid. Chromatogr., 11, 665-681 (1998); Coppola, G., Underwood, J., Cartwright, G., Hearn, M. T., High-performance Liquid Chromatography of Amino Acids, Peptides and Proteins: XCIII. Comparison of Methods for the Purification of Mouse Monoclonal Immunoglobulin M Autoantibodies, J.

Chromatogr. A., 476, 269-290 (1989); Josics, D., Loster, K., Kuhl, R., Noll, F., Reusch, J., Purification of Monoclonal Antibodies by Hydroxylapatite HPLC and Size Exclusion HPLC, Biol. Chem. Hoppe-Seylars, 372, 149-156 (1991); Gagnon, P., i Beam, K., Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography, Curr. Pharm. Biotech. (2008)).

[0008] WO2011/015926 se odnosi na upotrebu fermentacije i hromatografskih procedura odvojeno i zajedno za proizvodnju rekombinantnog rastvorljivog alfa receptora faktora nekroze tumora (TNFR) -Humanog IgG Fc fuzionog proteina, u biološki aktivnom obliku, iz fluida.

[0009] Prethodna otkrivanja, kao što su ona na koja se vrši poziv gore, nisu se pokazala uspešnim za primenu za razdvajanje korektno savijenog etanercepta od nekorektno savijenog etanercepta zato što nisu obezbedila kvalitativno i/ili kvantitativno adekvatne uzorke. Shodno tome, postoji potreba u odgovarajućoj oblasti za efektivnom i efikasnom tehnikom razdvajanja za upotrebu sa etanerceptom proizvedenim CHO ćelijama koja može obezbediti preparate etanercepta veoma visoke čistoće (tj. u kojima nekorektno savijeni etanercept nije prisutan ili je prisutan u veoma malim nivoima) i sa komercijalno atraktivnim prinosima proizvodnje.

[0010] Predmetni pronalazak primenjuje takozvanu "mešovitu" hromatografiju. Hromatografski postupak za prečišćavanje rekombinantno izraženih proteina se generalno može nazvati "mešovitim" kada on koristi najmanje dve različite sile za vezivanje proteina i za razdvajanje željenog proteinskog proizvoda od nepoželjnih materijala koji mogu biti prisutni u relativno nečistom proizvodu ekspresije koji sadrži željeni protein zajedno sa nepoželjnim nečistoćama. Ove sile mogu obuhvatati, na primer, elektrostatičke sile i hidrofobne sile.

[0011] Mešovita hromatografija funkcioniše slično tradicionalnijim hromatografskim tehnikama po tome što postoje stacionarna faza i mobilna faza. Stacionarna faza je normalno nerastvorljiva smola ili gel, koja se obično naziva hromatografska smola, koja obezbeđuje osnovu za razdvajanje. Smola je smeštena u koloni koja omogućava da tečnosti prolaze kroz nju i dolaze u kontakt sa smolom.

Svojstvo hromatografske smole da razdvaja željeni materijal od nepoželjnog materijala je omogućeno prisustvom izabranih hemijskih grupa ili radikala, koji su konjugovani sa smolom. Ove konjugovane grupe, koje se obično nazivaju ligandi, obezbeđuju smoli neophodna afinitetna svojstva (tj. svojstva elektrostatičkog privlačenja koja nastaju zbog jonoizmenjivačkih radikala koji su prisutni u ligandima, i svojstva hidrofobnog privlačenja koja nastaju zbog hidrofobnih radikala koji su prisutni u ligandima), čime se omogućava vezivanje nekih od proteinskih materijala u nečistom uzorku, ali ne i drugih, kada se pusti da rastvor koji sadrži nečisti uzorak teče kroz hromatografsku kolonu u kontaktu sa smolom.

[0012] Stacionarna faza hromatografske kolone koja sadrži smolu sa ovim afinitetnim grupama je spakovana unutar hromatografske kolone koja je obično kruti cilindrični sud u koji se na jednom kraju može uvesti fluid, doći u kontakt sa smolom, a onda izaći iz kolone na suprotnom kraju. Rastvor koji sadrži protein koji treba da se prečisti se može uvesti u (i na taj način mu se omogućava da struji kroz) kolonu stavljanjem proteinskog proizvoda u odgovarajući rastvor i omogućavanjem da se rastvor, takozvana mobilna faza, kreće kroz kolonu. Kada je proteinski proizvod koji treba da bude prečišćen (koji se naziva analit) prisutan u koloni u mobilnoj fazi, on dostiže stanje ravnoteže između kolone i mobilne faze, što znači da će se neki od materijala u rastvoru proteina pričvrstiti, vezati ili se fiksirati za ili biti uhvaćen od strane afinitetnih grupa na smoli kolone, dok se preostali materijal u proizvodu neće pričvrstiti za kolonu, već će umesto toga proteći kroz i isteći iz kolone, gde se može sakupiti radi analize, dalje prerade ili se može odbaciti.

[0013] Kada se proteinski analit veže za kolonu na gore opisani način, onda se upotrebljava korak ispiranja - koji se obično naziva korak eluiranja - za eluiranje ili oslobađanje vezanog analita iz kolone. U zavisnosti od tipa afinitetnih liganada (npr. radikala baziranih na naelektrisanju ili hidrofobnih radikala ili njihove kombinacije itd.) koji su prisutni na smoli radi vezivanja analita za kolonu, rastvor koji se upotrebljava za eluiranje ili oslobađanje analita iz kolone mora imati afinitet ili privlačnost za analit i/ili ligand (na primer, svojstva naelektrisanja, svojstva hidrofobnosti, pH svojstva, koncentracija soli, itd.) koja mogu prevladati afinitet analita ili privlačnost za smolu, što dovodi do oslobađanja analita od smole (stacionarne faze koja je gore pomenuta) i u medijum za eluiranje (mobilna faza). Kada se jednom oslobodi ili eluira u mobilnu fazu, analit onda može da proteče kroz i isteče iz hromatografske kolone radi eventualnog sakupljanja, analize itd, ili prenošenja u dalje postupke prečišćavanja ili korake filtriranja. Može se podrazumevati da bilo koje svojstvo privlačenja ili afiniteta može izazvati vezivanje analita za hromatografsku smolu (npr. svojstva naelektrisanja ili svojstva hidrofobnosti), te da rastvor kao mobilna faza koja se sledstveno upotrebljava za eluiranje ili oslobađanje analita mora imati kompetitivni skup svojstava tako da analit onda "preferira" da bude u medijumu za eluiranje umesto da ostane vezan za smolu kolone.

[0014] U poređenju sa drugim jednostrukim hromatografskim tehnikama, takozvana mešovita hromatografija je jedinstvena po tome što različiti faktori vezivanja i eluiranja mogu biti međuzavisni i mogu delovati suprotno jedan drugom. Na primer, povećanje jonske jačine mobilne faze u tradicionalnoj jednostrukoj jonoizmenjivačkoj hromatografiji može pokrenuti eluiranje ili oslobađanje analita vezanog za smolu kada karakteristike naelektrisanja analita imaju jaču privlačnost (preferenciju) za medijum za eluiranje u odnosu na sile privlačenja smole kolone. Međutim, u mešovitom hromatografskom postupku gde hromatografska smola koristi i elektrostatičko privlačenje, kao i hidrofobno privlačenje za vezivanje analita, povećanje jonske jačine mobilne (eluirajuće) faze može pokrenuti oslobađanje materijala uzorka od kolone bazirane na svojstvima naelektrisanja tog materijala, dok u isto vreme pokreće ili pojačava vezivanje hidrofobnih materijala u analitu, jer takvi hidrofobni proteinski materijali - u prisustvu medijuma za eluiranje na bazi naelektrisanja - će onda težiti da imaju jače privlačenje ili preferenciju za vezivanje za hidrofobne ligande kolone u odnosu na naelektrisano okruženje medijuma za eluiranje. Shodno tome, dok povećanje koncentracije soli može zaista dovesti do tendencije pomeranja naelektrisanih proteinskih materijala iz stacionarne faze kada se naelektrisani joni u mobilnoj fazi nadmeću sa proteinom za mesta vezivanja na stacionarnoj fazi -oni delovi smeše proizvoda kao analita koji mogu ispoljiti veći stepen hidrofobnog karaktera mogu imati pojačanu tendenciju da ostanu vezani za hidrofobne radikale mešovite hromatografske kolone. Sposobnost da se iskoriste ovi fenomeni u bilo kom datom kontekstu razdvajanja proteina se teško mogu smatrati predvidivim.

[0015] Dva primera mešovitih smola su Capto<TM>MMC i Capto<TM>Adhere (mogu se nabaviti od GE Healthcare). Capto<TM>MMC koristi ligand pričvršćen za čvrstu noseću matricu koja može sadejstvovati sa analitom katjonskom izmenom (sa svojom karboksilnom grupom), vodoničnim vezama i hidrofobnim interakcijama. Capto<TM>MMC's ligand je prikazan dole:

[0016] Capto<TM>Adhere je sličan sa Capto<TM>MMC po tome što takođe upotrebljava ligand koji je pričvršćen za čvrstu noseću matricu. Ligand, N-benzil-N-metil etanol amin, takođe sadejstvuje sa analitom anjonskom izmenom, vodoničnim vezama i hidrofobnim interakcijama. Ligand Capto<TM>Adhere je prikazan dole:

[0017] Kod oba liganda se očekuje da hidrofobna interakcija bude slaba. Shodno tome, ako ovi ligandi imaju samo hidrofobne radikale (bez naelektrisanja), oni bi najverovatnije zahtevali uslove odsoljavanja (taloženja proteina) za vezivanje proteina. Međutim, postojanje elektrostatičke interakcije može učiniti takvu slabu hidrofobnu interakciju dovoljnom za obezbeđivanje dodatne sile vezivanja.

Suština pronalaska

[0018] Predmetni pronalazak je zasnovan na otkriću da se mešovita hromatografija, na primer, uz korišćenje Capto<TM>MMC i Capto<TM>Adhere kao mešovite hromatografske smole, može upotrebiti za prečišćavanje analita koji sadrži korektno savijeni i nekorektno savijeni etanercept, čime se korektno savijeni etanercept može efikasno razdvojiti od nekorektno ili pogrešno savijenog etanercepta na veoma efikasan način i sa odličnim prinosom proizvodnje da bi se dobio proteinski preparat koji je veoma obogaćen željenim, korektno savijenim etanerceptom. Pored toga, pronalaskom je obuhvaćena sposobnost da se izvede mešovito hromatografsko razdvajanje koje je ovde opisano tako da se dobije proizvod eluiranja hromatografskim razdvajanjem koji može biti, ako je poželjno, bez ili u suštini bez nekorektno savijenog proizvoda, mada se može podrazumevati za svrhe balansa prinosa i čistoće, da bude prihvatljivo da sadrži veoma male nivoe nekorektno savijenog proizvoda (npr. manje od 5 tež. %, a prvenstveno manje od 3 tež. %) da bi se maksimizirali prinosi u željenoj meri.

Shodno tome u prvom primeru izvođenja predmetni pronalazak je mešoviti hromatografski postupak za razdvajanje korektno savijenog etanercepta od nekorektno savijenog etanercepta, koji sadrži korake: (a) vezivanja prve smeše proteina koja sadrži etanercept, a koja sadrži i korektno savijenu, i nekorektno savijenu konformaciju etanercepta za mešovitu hromatografsku smolu koja ima i jonoizmenjivačke radikale, i hidrofobne radikale; (b) eluiranje korektno savijenog etanercepta iz mešovite smole da bi se dobila druga smeša proteina koja sadrži etanercept, a koja sadrži veći udeo korektno savijenog etanercepta od prve smeše koja sadrži etanercept. Izraz "veći udeo" znači da je odnos korektno prema nekorektno savijenom etanercepta u eluatu iz koraka (b) bar veći od 1:1, ali je najpoželjnije veći od oko 8:2 a prvenstveno je veći od oko 9:1. Druga smeša proteina najpoželjnije sadrži korektno savijeni etanercept u količini koja sačinjava najmanje oko 95 tež. % druge smeše proteina.

[0019] Gore opisani primeri izvođenja postupka daju smešu proteina koja sadrži korektno savijeni etanercept u količini koja sačinjava više od oko 90 tež. % smeše proteina; i koja sadrži nekorektno savijeni etanercept u količini koja sačinjava manje od oko 5 tež. % smeše proteina; i pri čemu smeša proteina ima kombinovanu količinu korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta koja sačinjava najmanje oko 95, a prvenstveno najmanje oko 98 tež. % smeše proteina koja sadrži etanercept. Količine korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta se mogu odrediti korišćenjem hidrofobne interaktivne hromatografije (jednostruke). Kombinovane količine korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta se mogu odrediti korišćenjem gel hromatografije ("SEC"). Kada se ovde koriste, izraze "smeša proteina baziranih na etanerceptu" ili "smeša proteina koja sadrži etanercept" ili "preparat etanercepta" ili "materijal na bazi etanercepta" bi trebalo smatrati sinomimima i oni treba da označavaju smešu proteina u kojoj veću komponentu sačinjava korektno savijeni etanercept, manje komponente mogu sadržati skraćeni etanercept, nekorektno savijeni etanercept, agregirani etanercept (takvi agregati sadrže korektno i/ili nekorektno savijeni etanercept), ili fragmente etanercepta. Predmetni pronalazak obezbeđuje mogućnost proizvodnje smeše proteina baziranih na etanerceptu (ili preparata etanercepta) za primenu kao aktivnog sastojka u farmaceutskim formulacijama u kojima je poželjno maksimizirati količinu korektno savijenog etanercepta, uz minimiziranje količine nekorektno savijenog (uključujući agregirani) etanercept, do veće mere nego što je to do sada bilo ostvareno.

[0020] Etanercept sa visokom čistoćom dobijen postupkom prema pronalasku može se koristiti u farmaceutski prihvatljivoj formulaciji koja je podesna za administraciju subjektu kome je potrebno lečenje stanja posredovanog sa TNF, pri čemu pomenuta formulacija sadrži smešu proteina koja sadrži veću količinu korektno savijenog etanercepta i manju količinu nekorektno savijenog etanercepta, pri čemu: (i) nekorektno savijeni etanercept sačinjava manje od oko 10 tež. %, a prvenstveno manje od oko 8 tež. % i najpoželjnije manje od oko 5 tež. % smeše proteina;

(ii) korektno savijeni etanercept sačinjava više od 90 tež. %, a prvenstveno više od oko 92 tež. % i najpoželjnije više od oko 95 tež. % smeše proteina; i (iii) ukupna količina korektno savijenog etanercepta i nekorektno savijenog etanercepta (ali bez njihovih agregata) sačinjava najmanje 95 tež. % a prvenstveno najmanje 98 tež. % smeše proteina; pri čemu formulacija dalje sadrži farmaceutski prihvatljive neaktivne sastojke, ekscipijense ili nosače koji čine formulaciju podesnom za administraciju subjektu.

[0021] U sledećem primeru izvođenja pronalazak je postupak za proizvodnju smeše proteina koja sadrži etanercept koji ima visoku čistoću u pogledu količine korektno savijenog u odnosu na nekorektno savijeni etanercept koji su prisutni u njoj, pri čemu pomenuti postupak sadrži korake: (1) izražavanja etanercepta u sisarskom sistemu za ekspresiju da bi se dobio fluid sakupljenih ćelijskih kultura koji sadrži smešu proteina koja sadrži etanercept koji sadrži i korektno savijeni, i nekorektno savijeni etanercept; (2) podvrgavanje fluida sakupljenih ćelijskih kultura dobijenog u koraku 1 procesu prečišćavanja, čime se dobija smeša proteina koja sadrži etanercept sa smanjenom količinom, ili u suštini bez nepoželjnih nečistoća (tj. proteina koji nisu bazirani na etanerceptu) prisutnih u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura proizvedenom u koraku (1); (3) dovođenje u kontakt smeše proteina koja sadrži etanercept dobijene u koraku (2) jednom ili više puta sa mešovitom hromatografskom smolom koja ima i jonoizmenjivačke radikale, i hidrofobne interaktivne radikale da bi se proteini sadržani u smeši vezali za smolu; i (4) dovođenje u kontakt mešovite smole koja na sebi ima vezan protein iz koraka 3 sa rastvorom koji može da eluira korektno savijeni etanercept iz mešovite smole da bi se dobio eluat koji sadrži smešu proteina koja sadrži etanercept, a koja ima veći udeo korektno savijenog etanercepta u odnosu na nekorektno savijeni etanercept od smeše koja sadrži etanercept uvedenoj u smolu u koraku 3; i pri čemu je (i) količina proteina prisutnog u smeši proteina koja sadrži etanercept dobijenoj prečišćavanjem u koraku 2 najmanje oko 80 tež. % i najpoželjnije najmanje oko 85 tež. % količine smeše proteina baziranih na etanerceptu prisutne u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura dobijenom u koraku 1; (ii) kombinovana količina korektno i nekorektno savijenog proteina etanercepta prisutnog u smeši proteina eluiranoj u koraku 4 je najmanje oko 60 tež. % njene količine prisutne u smeši proteina dobijenoj u koraku 2; (iii) količina korektno savijenog etanercepta prisutnog u eluatu iz koraka 4 je najmanje oko 30 tež. %, a prvenstveno najmanje oko 34 tež. % količine smeše proteina koja sadrži etanercept prisutne u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura dobijenom u koraku 1; i (iv) pomenuti korektno savijeni etanercept sačinjava najmanje oko 90 tež. %, a prvenstveno najmanje oko 95 tež. % eluata dobijenog u koraku 4.

[0022] Takođe je opisan postupak za razdvajanje korektno savijenog etanercepta od nekorektno savijenog etanercepta, pri čemu se upotrebljavaju hromatografska sredstva za izvođenje pomenutog razdvajanja, i pri čemu se hromatografska sredstva sastoje isključivo od mešovite hromatografije u kojoj se smeša koja sadrži korektno savijeni i nekorektno savijeni etanercept dovodi u kontakt sa mešovitom hromatografskom smolom koja ima i jonoizmenjivačke, i hidrofobne radikale, i onda se eluira iz nje da bi se dobio eluat koji sadrži najmanje oko 85, a prvenstveno najmanje oko 90, i najpoželjnije najmanje oko 95 tež. % korektno savijenog etanercepta. Što se tiče ovog postupka, kada se ovde navodi da se "hromatografska sredstva sastoje isključivo od mešovite hromatografije", podrazumeva se da takva terminologija ne isključuje opcionu upotrebu različitih hromatografskih sredstava (npr. HIC, SEC, itd.) kada se koriste isključivo za analitičke svrhe. Ovaj postupak je podesan zato što ne zahteva upotrebu drugih metodologija razdvajanja radi razdvajanja korektno od nekorektno savijenog proteina osim ovde opisane mešovite metodologije.

[0023] Prema sledećem aspektu, gore opisani postupci kada se primenjuju na etanercept se mogu izvesti dva ili više puta da bi se dobio preparat etanercepta sa visokom čistoćom na sledeći način: izvođenjem prve separacije u mešovitom modu (separacija #1) izvođenjem koraka (a) i (b) kao što je opisano, npr. u primerima izvođenja 1 i 2 gore; praćenim izvođenjem druge separacije u mešovitom modu (separacija #2) izvođenjem koraka (a) i (b) ponovo; gde se onda eluat dobijen u koraku (b) separacije #1 upotrebljava kao analit (tj. rastvor koji sadrži smešu proteina) za korak (a) separacije #2. Mešovite smole koje se upotrebljavaju u separaciji #1 i separaciji #2 mogu biti iste ili različite. U posebno poželjnoj praksi ovog aspekta, separacija #1 se izvodi sa CAPTO MMC mešovitom smolom i separacija #2 se izvodi sa CAPTO ADHERE mešovitom smolom.

[0024] Opciono, preparati etanercepta koji se dobijaju postupkom prema pronalasku mogu, ako je poželjno, biti bez ili u suštini bez nekorektno savijenog etanercepta, mada se može podrazumevati da sposobnost da se ovde realizuju preparati etanercepta koji imaju znatno niže nivoe nekorektno savijenog etanercept, a prvenstveno manje od oko 10 tež. % i najpoželjnije manje od oko 5 tež. % ukupne količine smeše proteina baziranih na etanerceptu prisutnom u formulaciji leka, predstavlja značajan napredak u odnosu na farmaceutske formulacije koje su trenutno na raspolaganju za komercijalnu prodaju koje sadrže smeše na bazi etanercepta, pri čemu količina nekorektno savijenog etanercepta u takvim smešama, na bazi HIC analize, može biti veća od oko 10% proteina na bazi etanercepta koji se nalazi u takvim formulacijama.

[0025] Poželjne mešovite smole za upotrebu u pronalasku su CAPTO MMC i CAPTO ADHERE; međutim, podrazumeva se da bilo koja mešovita smola koja je funkcionalizovana i sa jonoizmenjivačkim radikalima, i sa hidrofobnim radikalima može da se razmotri za upotrebu u predmetnom pronalasku.

[0026] Bez želje za vezivanjem za bilo koju posebnu teoriju, smatra se mogućim, ako ne i potpuno predvidivim, da bi mogla da se iskoristi međuzavisnost i suprotstavljena dejstva između karakteristika naelektrisanja i karakteristika hidrofobnosti u mešovitoj hromatografiji u kojoj se upotrebljavaju ova dva tipa afiniteta, da bi se razvilo razdvajanje visoke efikasnosti pravilno savijenih vrsta proteina od vrsta koje su nekorektno savijene i/ili agregirane. Kao iznenađujuće, mešoviti postupak prema pronalasku ne treba da se kombinuje ili dopunjava sa bilo kojom od drugih strategija razdvajanja da bi se razdvojio korektno savijeni od nekorektno savijenog proteina sa odličnim prinosom i visokom čistoćom. Na primer, nije neophodno koristiti dodatni HIC korak da bi se dalje ostvarilo takvo razdvajanje korektno savijenog od nekorektno savijenog proteina.

[0027] Kada se primeni na etanercept, mešoviti hromatografski postupak prema predmetnom pronalasku obuhvata pojavu sledećeg opšteg niza fenomena: prvo, posle uvođenja nečistog uzorka koji sadrži etanercept u mešovitu smolu (tj. uzorka koja sadrži korektno savijeni, nekorektno savijeni i druge nečistoće) kakav je dobijen, npr. CHO ekspresijom etanercepta, postupak prema pronalasku omogućava da se etanercept (i korektno, i nekorektno savijen) veže za mešovitu smolu. Kao drugo, tokom sledstvenog koraka eluiranja ili ispiranja (npr. korišćenjem gradijenta soli koji se prvenstveno primenjuje u gradijentu sa povećanjem koncentracije), predmetni pronalazak omogućava oslobađanje (tj. eluiranje) iz smole smeše na bazi etanercepta, pri čemu je tamo sadržani etanercept dominantno savijen pravilno, dok u suštini omogućava da etanercept koji je nekorektno savijen ostane vezan ili uhvaćen na mešovitoj smoli; čime je u materijalu eluiranom iz smole veoma visoki udeo pravilno savijenog etanercepta (u poređenju sa nižim udelom koji je prisutan u uzorku proteina koji sadrži etanercept, inicijalno uvedenom u i vezanom za smolu). U pogledu fizičkog izvođenja mešovite hromatografije prema predmetnom pronalasku, mešovita smola može biti smeštena (tj. spakovana) u kruto sredstvo za držanje u vidu kolone ili sud koji može sadržati smolu, i koji ima ulazno i izlazno sredstvo za omogućavanje da fluidni rastvori uđu na jednom kraju kolone, teku u kontakt sa smolom, a onda izađu na suprotnom kraju suda da bi bili sakupljeni radi dalje analize ili prerade ili radi odbacivanja.

[0028] Rastvor koji sadrži smešu proteina korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta upotrebljen u koraku (a) gore opisanog postupka se može dobiti na poznat način ekspresijom proteina etanercepta u sisarskoj ćelijskoj kulturi, na primer, CHO ćelijama. Pre mešovitog hromatografskog prečišćavanja u predmetnom pronalasku, sakupljeni protein od sisarske ekspresije (fluid sakupljenih ćelijskih kultura) može biti podvrgnut inicijalnom koraku prečišćavanja, kao što je afinitetno prečišćavanje Proteinom A da bi se odstranile nečistoće. Dok takav korak može biti poželjan za odstranjivanje nečistoća koje nisu bazirane na etanerceptu, ovo prečišćavanje generalno neće rezultovati značajnijim razdvajanjem (tj. separacijom) korektno savijenog etanercepta od nekorektno savijenog etanercepta. Shodno tome, onda se pul Proteina A podvrgava mešovitoj metodologiji predmetnog pronalaska da bi se izvršilo takvo razdvajanje.

[0029] Postupak prema predmetnom pronalasku daje komercijalno korisne proizvode (prinose) korektno savijenog etanercepta. Na primer, u slučajevima u kojima se rastvor proteina na bazi etanercepta korektno i nekorektno savijenog etanercepta upotrebljava u koraku (a) predmetnog pronalaska prvenstveno je predviđen u obliku izlaza hromatografije sa Proteinom A dobijenim prečišćavanjem etanercepta kao sisarskog proizvoda ekspresije u koloni sa Proteinom A, količina materijala dobijenog u koraku prečišćavanja sa Proteinom A je prvenstveno najmanje oko 80 tež. %, a prvenstveno najmanje oko 85 tež. % proizvoda ekspresije na bazi etanercepta koji su prisutni u sakupljenoj ćelijskoj kulturi koja se uvodi u kolonu sa Proteinom A (gde se količina proteina na bazi etanercepta prisutnih u sakupljenoj ćelijskoj kulturi može odrediti pomoću Fc Elise, a količina proteina na bazi etanercepta dobijenih u eluiranjem pula Proteina A se može odrediti pomoću UV apsorbanse na A280 nm). Sledstveno, kada se mešovita hromatografija prema predmetnom pronalasku izvodi upotrebom gore navedenog materijala prečišćenog Proteinom A, količina materijala proteina na bazi etanercepta dobijena u koraku eluiranja (b) predmetnog pronalaska je prvenstveno najmanje oko 60 tež. %, a prvenstveno najmanje oko 70 tež. % količine materijala na bazi etanercepta uvedenog u mešovitu smolu u koraku (a) pronalaska.

[0030] Shodno tome, ukupni prinos smeše etanercepta visoke čistoće u mešovitom eluatu iz koraka (b) je ovde znatno obogaćen korektno savijenim etanerceptom (tj. ne sadrži više od 10 tež. %, a prvenstveno ne više od oko 5 tež. % pogrešno savijenog materijala od težine eluata) može biti negde od oko 30 do oko 50 tež. % smeše na bazi etanercepta koja je originalno prisutna u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura pre njenog prečišćavanja (npr. prečišćavanja Proteinom A).

[0031] Prečišćavanje fluida sakupljenih ćelijskih kultura se takođe može izvršiti drugim hromatografskim sredstvima, kao što su mešovita hromatografija uz korišćenje hromatografskih smola koje imaju i jonoizmenjivačke, i hidrofobne interaktivne radikale.

[0032] Pri izvođenju postupka prema predmetnom pronalasku mogu biti izvedeni dodatni koraci filtriranja (npr. filtriranje virusa i filtriranje tangencijalnim strujanjem) na poznat način na drugim procesnim eluatima proizvedenim u koraku (b) gore opisanog mešovitog hromatografskog postupka.

[0033] Predmetni pronalazak obezbeđuje znatno poboljšani postupak razdvajanja za razdvajanje korektno savijene od nekorektno savijene konformacije (uključujući agregate) datog proteina, a naročito razdvajanje pravilno savijenog etanercepta od pogrešno savijenog (i agregiranog) etanercepta dobijenog od sakupljene kulture sisarskih ćelija koja sadrži veoma heterogenu smešu vrsta na bazi etanercepta.

Kratki opis slika nacrta

[0034]

FIG 1 prikazuje hemijsku strukturu Capto-MMC i Capto-Adhere mešovite smole.

FIG 2A (profil eluiranja za Protein A) prikazuje profil eluiranja za Protein-A sakupljene CHO kulture koja sadrži i korektno savijeni i pogrešno savijeni protein etanercepta korišćenjem eluiranja sa 0.1 M citrata za naznačeni pH koji sadrži 1 M arginina. Puna kriva je UV abso apsorbansa; isprekidana kriva je provodnost (isto kao na narednim slikama).

FIG 2B (profil eluiranja za Protein A) prikazuje rezultate Native-PAGE za uzorke eluirane iz Proteina-A, pri čemu je traka-1 standard (komercijalni Enbrel); traka-2 je opterećenje; traka-3 je FT (protočna, engl. flow-through); traka-4, pH 6.0; traka-5, pH 4.2; traka-6, pH 3.7; traka-7, pH 3.0.

FIG.3A (profil eluiranja pula Proteina A za Capto MMC) prikazuje CAPTO MMC hromatogram eluiranja sa NaCl ili argininom u 10 mM fosfata, pH 7.5.

FIG.3B (profil eluiranja pula Proteina A za Capto MMC) SDS-PAGE i native-PAGE eluiranih uzoraka), pri čemu je traka-0, standard; traka-1, opterećenje; traka-2, FT; traka-3, 0.15 M NaCl; traka-4, 0.3 M NaCl; traka-5, 1 M arginina.

FIG.4A (profil eluiranja pula Proteina A za Capto MMC) prikazuje hromatograf eluiranja sa 0-0.5 M NaCl gradijentom za pH 7.5. Kolona je bila uravnotežena sa 10 mM fosfata, pH 7.5 pre gradijentnog eluiranja.

FIG.4B (profil eluiranja pula Proteina A za Capto MMC) prikazuje native-PAGE eluiranih uzoraka, pri čemu je: traka-0, standard; traka-1, opterećenje; traka-2 do traka-8, eluirane frakcije; traka-9, 1 M arginina.

FIG.4C (profil eluiranja pula Proteina A za Capto MMC) prikazuje SDS-PATE i native-PAGE eluiranog uzorka za različiti pul Proteina A, pri čemu je: traka-0, standard; traka-1, opterećenje, traka-2, FT; traka-3 do traka-8, eluirane frakcije; traka-9, 1 M arginina.

FIG.5A (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-MMC) hromatogram eluiranja sa 0-0.4 M Na2SO4gradijentom za pH 7.5. Kolona je bila uravnotežena sa 10 mM fosfata, pH 7.5 pre gradijentnog eluiranja.

FIG 5B. (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-MMC) SDS-PAGE i native-PAGE eluiranih uzoraka, pri čemu je: traka-1, opterećenje; traka-2, FT; traka-3, pufersko ispiranje; traka-4 do traka-9, eluirane frakcije; traka-10, 1 M arginina.

FIG.6 prikazuje HIC analizu Capto-MMC eluiranih frakcija.

FIG.7A (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-MMC) prikazuje hromatogram eluiranja sa pH i gradijentom soli.

FIG.7B (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-MMC) prikazuje SDS-PAGE i native-PAGE eluiranih uzoraka, pri čemu je traka-0, standard; traka-1, opterećenje; traka-2 i 3, FT; traka-4 do traka-8, eluirane frakcije; traka-9, 1 M arginina.

FIG.8A (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-MMC) prikazuje hromatogram eluiranja sa pH i Na2SO4gradijentom.

FIG.8B (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-MMC) prikazuje SDS-PAGE i native-PAGE eluiranih uzoraka, pri čemu je traka-0, standard; traka-1, opterećenje; traka-2, FT; traka-3 do traka-5, eluirane frakcije; traka-6, 1 M arginina.

FIG.9 prikazuje Native-PAGE pula Proteina A za Capto-Adhere, pri čemu je traka-0, standard; traka-1, opterećenje; traka-2, 5 mM citrata (pH 4,5); traka-3 i 4, 0.1 M arginina (pH 4.5); traka-5, 0.5 M arginina. Uočene vrste male molekulske težine su zaokružene.

FIG.10A (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-Adhere) prikazuje hromatogram eluiranja sa pH i gradijentom arginina.

FIG.10B (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-Adhere) prikazuje SDS-PAGE i native-PAGE eluiranih uzoraka, pri čemu je: traka-0, standard; traka-1, opterećenje; traka-2 do traka-4, FT; traka-5 do traka-7, eluirane frakcije; traka-8, 0.5 M arginina.

FIG.11A (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-Adhere) prikazuje hromatogram eluiranja sa pH i gradijentom arginina.

FIG.11B (profil eluiranja pula Proteina A za Capto-Adhere) prikazuje native-PAGE eluiranih uzoraka, pri čemu je traka-0, standard; traka-1, opterećenje; traka-2, FT; traka-3 do traka-5, eluirane frakcije; traka-6, 1 M arginina.

FIG.12 je šematski prikaz HIC (hidrofobne interaktivne hromatografske) analize eluiranih frakcija Capto-Adhere mešovite smole dobijenih u koraku 3B primera 12, pri čemu je uzorak sa opterećenjem materijal dobijen u koraku 3A primera 12. Procenat korektno savijenog etanercepta je naznačen na vertikalnoj osi, a primena gradijenta soli u toku vremena je prikazana na horizontalnoj osi. Eluirana frakcija dobijena rano u gradijentu sadrži 100% korektno savijenog etanercepta.

FIG.13 (profil eluiranja pula Capto-MMC za Capto-Adhere) prikazuje SDS i Native-PAGE eluiranih uzoraka. Eluiranje je bilo izvršeno sa gradijentom arginina za pH 7.5, pri čemu je: traka-0, standard; traka-1, opterećenje; traka-2 i 3, FT; traka-4 do traka-7, eluirane frakcije; traka-8, 1 M arginina.

FIG.14 je hromatogram eluiranja pula Capto-MMC za Capto-Adhere. Eluiranje je bilo izvršeno sa NaCl gradijentom za pH 7.5.

FIG.15A (profil eluiranja pula Capto-MMC za Capto-Adhere) prikazuje hromatogram eluiranja sa gradijentom soli/arginina za pH 7.5.

FIG.15B. (profil eluiranja pula Capto-MMC za Capto-Adhere) SDS-PAGE i native-PAGE eluiranih uzoraka, pri čemu je: traka-0, standard; traka-1, opterećenje; traka-2, FT; traka-3 do traka-6, eluirane frakcije; traka-7, 1 M arginina.

FIG.16 je HIC hromatogram koji odgovara materijalu etanercepta proizvedenom u primeru 12, na kome grafik koji u suštini ne prikazuje drugi manji pik (pogrešno savijeni materijal) odgovara materijalu proizvedenom prema predmetnom pronalasku (primer 12); i pri čemu se vidi da dodatna kriva na slici koja odgovara komercijalno raspoloživom etanerceptu, pribavljenom za svrhe poređenja, ima drugi manji pik koji predstavlja pogrešno savijeni i/ili agregirani material.

Detaljni opis pronalaska

[0035] Pronalazak je baziran na otkriću da se mešovite smole koje koriste i principe izmene jona i hidrofobnog privlačenja, kao što su, na primer Capto<TM>MMC i Capto<TM>Adhere, mogu upotrebiti za vezivanje, a onda preferencijalno (tj. selektivno) eluiranje korektno savijene u odnosu na nekorektno savijenu konformaciju etanercepta. Obe gore pomenute mešovite smole sadrže ligande sa radikalima (tj. hemijskim grupama) koje obezbeđuju dva različita načina za privlačenje i vezivanje etanercepta, odnosno privlačenje izmenom jona i hidrofobnu interakciju.

Definicije

[0036] Izrazi upotrebljeni u ovom opisu generalno imaju svoja uobičajena značenja iz odgovarajuće oblasti, u kontekstu pronalaska, i u specifičnom kontekstu gde se svaki izraz upotrebljava. Izvesni izrazi koji se upotrebljavaju za opisivanje pronalaska su razmotreni u nastavku ili na drugim mestima u opisu da bi se obezbedile dodatne smernice praktičaru u pogledu opisa pronalaska. Predviđeni su sinonimi za izvesne izraze. Navođenje jednog ili više sinonima ne isključuje upotrebu drugih sinonima. Korišćenje primera bilo gde u ovom opisu uključujući primere bilo kojih ovde razmotrenih izraza je isključivo ilustrativno.

[0037] Osim ako nije drugačije definisano, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni izrazi imaju isto značenje koje bi im obično dao prosečan stručnjak iz odgovarajuće oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. U slučaju konflikta, aktuelni dokument, uključujući definicije će biti kontrola.

[0038] "Okvirno", "oko" ili "približno" generalno znači u okviru 20 procenata, u okviru 10 procenata, u okviru 5, 4, 3, 2 ili 1 procenta date vrednosti ili opsega. Numeričke vrednosti su približne, što znači da se izraz "okvirno", "oko" ili "približno" može podrazumevati, ako nije eksplicitno naveden.

[0039] Izraz "etanercept" kada se ovde koristi označava aktivni sastojak koji je sadržan u komercijalnoj formulaciji Enbrel®, odnosno homodimeru fuzionog polipeptida koji se sastoji od ekstracelularnog ligand-vezujućeg dela humanog receptora faktora nekroze tumora (engl. tumor necrosis factor receptor, skr. "TNFR") od 75 kilodaltona (p75) vezanog za Fc deo [fragment koji se može kristalizovati, engl. fragment, crystallizable] humanog imunoglobulina G ("IgG1"). Etanercept je homodimer u kome su dva lanca od 75 kilodaltona TNFR:Fc molekula kao što je gore opisano povezana pomoću disulfidne veza u regionu zgloba Fc dela. Etanercept se sastoji od 934 aminokiselina i ima očiglednu molekulsku težinu od približno 150 kilodaltona, a njegova Fc komponenta sadrži konstantni teški 2 (CH2) domen, konstantni teški 3 (CH3) domen i region zgloba, ali ne i konstantni teški 1 (CH1) domen humanog IgG 1. Za svrhe predmetne prijave, izraz "etanercept" može takođe obuhvatati etanercept sa malim modifikacijama aminokiselinske strukture (uključujući delecije, adicije i/ili supstitucije aminokiselina) koje ne utiču znatno na funkciju polipeptida koji je opisan gore. Takođe bi trebalo podrazumevati da izraz etanercept obuhvata proteine koji su namenjeni ili se smatra da su takozvane bio-slične ili bio-bolje varijante etanercepta.

[0040] Izraz "korektno savijeni etanercept" kada se ovde upotrebljava treba da označi konformaciju savijanja homodimera etanercepta (kao što je definisano gore) koja ima biološku aktivnost za inhibiciju TNF i konformaciju koja je ista ili u suštini ista kao konformacija i biološka aktivnost aktivnog sastojka u Enbrelu®.

[0041] Izraz "nekorektno savijeni etanercept" kada se ovde upotrebljava treba da obuhvati: (i) homodimerni protein koji ima istu ili u suštini istu aminokiselinsku sekvencu kao etanercept (kao što je definisano gore), ali ima različitu konformaciju od tog korektno savijenog etanercepta, pri čemu pomenuta različita konformacija dovodi do toga da proteinu nedostaje ili u suštini nedostaje biološka aktivnost kao TNF inhibitora; i/ili (ii) agregat u kome su dva ili više korektno i/ili nekorektno savijenih homodimera etanercepta postali povezani (tj. agregirani ili zgrudvani) tako da obrazuju vrste koje imaju veću molekulsku težinu od korektno savijenog etanercepta; i/ili (iii) smešu (i) i (ii); i/ili (iv) kompozicija agregiranih tj. zgrudvanih proteina koja sadrži iste ili u suštini iste sekvence ili njihove delove kao korektno savijeni etanercept, ali koja ispoljava smanjenu poziciju eluiranja (zbog veće hidrofobnosti) na HIC koloni u poređenju sa korektno savijenim etanerceptom.

[0042] Izraz "lečenje" se odnosi na bilo koju administraciju ili aplikaciju lekova za bolesti kod sisara i obuhvata inhibiciju bolesti, zaustavljenje njenog razvoja, ublažavanje bolesti (na primer, izazivanjem regresije ili ponovnim uspostavljanjem ili popravljanjem izgubljene, nedostajuće ili defektne funkcije) ili stimulacijom neefikasnog procesa. Izraz obuhvata dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta i pokriva bilo kakvo lečenje patološkog stanja ili poremećaja kod sisara. Efekat može biti profilaktički u smislu potpunog ili delimičnog sprečavanja poremećaja ili njegovog simptoma i/ili može biti terapeutski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja poremećaja i/ili neželjenog uticaja koji se može pripisati poremećaju. On obuhvata (1) sprečavanje pojave ili vraćanja poremećaja kod subjekta koji može biti predisponiran prema poremećaju, ali još uvek nema simptome, (2) inhibiciju poremećaja, kao što je zaustavljanje njegovog razvoja, (3) zaustavljanje ili okončanje poremećaja ili bar simptoma povezanih sa njim, tako da domaćin više ne boluje od poremećaja ili njegovih simptoma, kao što je izazivanje regresije poremećaja ili njegovih simptoma, na primer, ponovnim uspostavljanjem ili popravljanjem izgubljene, nedostajuće ili defektne funkcije), ili stimulacije neefikasnog procesa, ili (4) slabljenje, olakšanje ili ublažavanje poremećaja ili simptoma povezanih sa njim, pri čemu se ublažavanje upotrebljava u širem smislu tako da se odnosi bar na smanjenje reda veličine parametra, kao što je zapaljenje, bol i/ili veličina tumora.

[0043] Izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač" se odnosi na netoksični čvrsti, polučvrsti ili tečni punilac, razređivač, materijal za kapsuliranje, pomoćnu materiju za formulacije ili ekscipijens bilo kog uobičajenog tipa. Farmaceutski prihvatljivi nosač je netoksičan za primaoce u dozama i koncentracijama koje se primenjuju i kompatibilan je sa drugim sastojcima formulacije.

[0044] Izraz "kompozicija" ili "formulacija" se odnosi na smešu koja obično sadrži nosač, kao što je farmaceutski prihvatljivi nosač ili ekscipijens koji je uobičajen u odgovarajućoj oblasti i koji je podesan za administraciju subjektu za terapeutske, dijagnostičke ili profilaktičke svrhe. On može obuhvatati ćelijsku kulturu u kojoj je polipeptid ili polinukleotid prisutan u ćelijama ili u medijumu za kultivaciju. Na primer, kompozicije za oralnu administraciju mogu formirati rastvore, suspenzije, tablete, pilule, kapsule, formulacije sa produženim oslobađanjem, oralna ispiranja ili praškove.

[0045] Predmetni pronalazak je podesan za razdvajanje korektno savijene od nekorektno savijene konformacije etanercepta.

[0046] Etanercept koji je podesan za prečišćavanje u skladu sa mešovitim hromatografskim postupkom prema predmetnom pronalasku se može proizvesti pomoću živih ćelija domaćina koje izražavaju etanercept, kao što su hibridomi u slučaju antitela, ili ćelije domaćini koje su izmenjene genetskim inženjeringom da bi proizvele polipeptid u slučaju fuzionih polipeptida ili antitela. Metode izmene ćelija genetskim inženjeringom da bi one proizvodile polipeptide su dobro poznate u odgovarajućoj oblasti. Vidi, npr. Ausubel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Takve metode obuhvataju uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju i omogućavaju ekspresiju polipeptida u živim ćelijama domaćinima. Ove ćelije domaćini mogu biti bakterijske ćelije, ćelije gljiva ili prvenstveno životinjske ćelije koje se gaje u kulturi. Bakterijske ćelije domaćini obuhvataju, ali nisu ograničene na Escherichia coli ćelije. Primeri podesnih sojeva E. coli obuhvataju: HB101, DH5.alfa, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, i bilo koji soj E. coli koji ne može da kida stranu DNK. Ćelije domaćini gljiva koje se mogu upotrebiti obuhvataju, ali nisu ograničene na Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris i Aspergillus ćelije. Nekoliko primera životinjskih ćelijskih linija koje se mogu upotrebiti su CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, i W138. Nove životinjske ćelijske linije se mogu uspostaviti korišćenjem metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti (npr. transformacijom, virusnom infekcijom i/ili selekcijom).

Opciono, ćelije domaćini mogu izlučivati etanercept u medijum.

[0047] Pre mešovitog hromatografskog razdvajanja korektno savijenog od pogrešno savijenog etanercepta, prečišćavanje izraženog etanercepta se može izvesti bilo kojim standardnim metodom. Kada se etanercept proizvodi intracelularno, onda se čestični ostaci odstranjuju, na primer, centrifiranjem ili ultrafiltriranjem. Kada se etanercept izluči u medijum, onda se supernatanti iz takvih sistema za ekspresiju mogu prvo koncentrovati uz korišćenje standardnih filtera za koncentrovanje polipeptida. Takođe mogu biti dodati inhibitori proteaze da bi se inhibirala proteoliza, a antibiotici mogu biti uključeni da bi se sprečio razvoj mikroorganizama.

Etanercept se može prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksiapatitne hromatografije, gel elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije i bilo koje kombinacije poznatih tehnika prečišćavanja ili onih koje tek treba da budu otkrivene, uključujući, ali bez ograničavanja na Protein A hromatografiju, frakcinaciju na jonoizmenjivačkoj koloni, etanolsko taloženje, reverzno faznu HPLC, hromatografiju na siliki, hromatografiju na heparinu SEPHAROSET®, hromatografiju na anjonsko ili katjonsko izmenjivačkim smolama (kao što je kolona sa poliasparaginskom kiselinom), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i amonijum sulfatno taloženje.

[0048] U veoma opštem smislu, kada se primeni na etanercept, pronalaskom je realizovan postupak razdvajanja proteina koji sadrži korake (a) uvođenja rastvora koji sadrži smešu proteina baziranih na etanerceptu koja ima i korektno savijeni, i nekorektno savijeni etanercept u mešovitu hromatografsku smolu funkcionalizovanu sa jonoizmenjivačkim radikalima, kao i hidrofobne interaktivne radikale, pod uslovima koji mogu da obezbede da se korektno i nekorektno savijeni etanercept vežu za smolu; a onda (b) ispiranje smole sa medijumima za eluiranje koji mogu da eluiraju korektno savijeni etanercept iz smole tako da rezultujući eluat ima veći udeo korektno savijenog etanercepta od rastvora proteina uvedenog u koraku (a).

[0049] Opciono, postupak može dalje obuhvatati preliminarne korake izražavanja etanercepta u sisarskoj ćelijskoj kulturi, kao što je CHO ćelijska kultura, a zatim prečišćavanje proizvoda ekspresije korišćenjem, na primer, Protein A hromatografije, posle čega i izlazni proizvod proteina A postaje rastvor proteina koji se upotrebljava u koraku (a) predmetnog pronalaska. Podrazumeva se da se postupak prema pronalasku može izvoditi na takav način da koraci sisarske ekspresije i proteina A, koji dovode do polaznog rastvora za upotrebu u koraku (a) predmetnog pronalaska, mogu da budu izvršeni od strane prvog entiteta na datom mestu proizvodnje, dok bi se postupak mešovitog razdvajanja prema predmetnom pronalasku mogao izvesti od strane istog ili različitog entiteta na istom ili različitom mestu proizvodnje.

[0050] Uslovi za korak (a)-vezivanje za CAPTO MMC mešovitu smolu. U koraku (a) pronalaska, rastvor proteina koji sadrži korektno savijeni i nekorektno savijeni etanercept bi trebalo da bude uveden u CAPTO MMC mešovitu smolu radi vezivanja za nju na pH od oko 4 do oko 8, a prvenstveno na pH od oko 4 do oko 6. Alternativno tome, kada se upotrebljava CAPTO ADHERE mešovita smola, rastvor proteina u koraku (a) koji sadrži korektno savijeni i nekorektno savijeni etanercept bi trebalo da bude uveden u CAPTO ADHERE mešovitu smolu radi vezivanja za nju na pH od oko 6 do oko 8.5, a prvenstveno na pH od oko 7 do oko 8.

[0051] Uslovi za korak (b)-eluiranje iz mešovite smole. U koraku (b) medijum za eluiranje sadrži so u unapred određenoj koncentraciji, i aplicira se na kolonu na unapred određeni način koji je efektivan za preferencijalno eluiranje korektno savijenog etanercepta kao proteina u odnosu na nekorektno savijeni etanercept. Pošto bi, generalno govoreći, eluat trebalo da sadrži veći udeo korektno savijenog u odnosu na nekorektno savijeni etanercept, slani rastvor i način njegove aplikacije na smolu se prvenstveno biraju tako da količina korektno savijenog etanercepta znatno prevazilazi količinu nekorektno savijenog etanercepta u eluatu iz koraka (b). Rano eluirane frakcije mogu sadržati u suštini 100% korektno savijenog proteina. Korak eluiranja slanim rastvorom se može izvesti promenom (povećanjem) molske koncentracije slanog rastvora, kao što je sa gradijentom. Gradijent se može menjati stepenasto, ali je poželjno da bude kontinualan i linearan. U poželjnom primeru izvođenja, slani rastvor sadrži natrijum hlorid ("NaCl"). Linearni gradijent NaCl može biti od oko 0 do oko 1 M.

[0052] U alternativnom primeru izvođenja, slani rastvor može sadržati natrijum sulfat ("Na2SO4"). Rastvor Na2SO4može biti apliciran stepenasto ili sa linearnim gradijentom, a prvenstveno linearno i najpoželjnije od gradijenta koncentracije od oko 0 do oko 1 molar.

[0053] Etanercept se može dobiti kultivacijom u CHO ćelijama.

[0054] U poželjnom primeru izvođenja, slani rastvor sadrži NaCl.

[0055] Sledeće procedure su bile praćene za ekspresiju, prečišćavanje proizvoda ekspresije i analizu eluata koji su sadržali etanercept dobijen mešovitim hromatografskim postupkom prema predmetnom pronalasku:

[0056] Ekspresija etanercepta. Etanercept se izražava u kondicioniranom medijumu ("CM") rekombinantnih CHO ćelija transfektovanih sa genom koji kodira humani TNFR ekstracelularni domen fuzionisan sa humanim Fc na C-terminusu. Primeri u stanju tehnike za sisarsku ekspresiju etanercepta se mogu naći u sledećim US patentima: RE 36755; US patent br.5,605,690; EP 464,533; EP 417,563; US patent br.8.063,182; i US patent br.7,2,94,481.

[0057] Protein A hromatografija. Gore dobijeni CM se prerađuje korišćenjem Protein A kolone sa 1 ml HiTrap rProtein A kolone (može se nabaviti od GE Healthcare) i uravnotežava se sa 10 mM fosfata, 0.1 M NaCl, pH 7.0 rastvorom. Posle ispiranja kolone sa 1 M arginin-hidrohlorida ("arginin"), 0.1 M citrata, pH 6.0 rastvorom, vezani proteini se eluiraju stepenasto sa pH 4.2, 3.7 i 3.0 koji sadrži 1 M arginina i 0.1 M citrata. Alternativno tome, kolona se može prerađivati bez arginina sa opadajućim pH sa 0.1 M citrata. U odsustvu arginina, veći deo etanercepta je eluiran za pH od 3.85 da bi se dobio eluat koji sadrži kontaminante, kao i nekorektno savijeni etanercept, fragmente etanercepta, agregate etanercepta itd. eluiranjem ispod ovog pH. Protein A eluat se onda podvrgava Capto<TM>MMC ili Capto<TM>Adhere u HiTrap koloni (može se nabaviti od GE Healthcare) kao što je opisano dole u primerima.

[0058] Analiza eluata Proteina A. Analiza gore dobijenog eluata Proteina A je prikazana na Fig.2A i 2B. Fig.2A prikazuje profil eluiranja iz Proteina-A sa puferima sa niskim pH koji sadrže 1 M arginina. Veliki pik UV apsorbanse je bio uočen za pH 6.0 (pik je označen kao 6.0) i nije sadržao traku (Fig.2B, traka-4) koja bi odgovarala komercijalnom Etanerceptu, što je ispitano pomoću native-PAGE (traka-1): treba uočiti da etanercept nije proticao kroz Protein-A kolonu (uporedi trake-2 i 3). Mada nisu bile uočene trake proteina za pH 6.0 (traka-4), uočena velika UV apsorbansa ukazuje na eluiranje pigmenata. Posle dostizanja osnovne linije apsorbanse (Fig.2A), kolona je onda bila eluirana sa 0.1 M arginina, 0.1 M citrata, pH 4.2, što je rezultovalo oštrim vrhom eluiranja (Fig.2A, označen sa 4.2). Native-PAGE analiza ovog pika je pokazala intenzivnu traku etanercepta, zajedno sa razlivanjem traka male mobilnosti (traka-5). HIC analiza eluiranog proteina je pokazala 2 pika, pri čemu prvi pik odgovara glavnom piku komercijalnog etanercepta, dok drugi pik odgovara manjim vrstama koje su takođe prisutne u komercijalnom etanerceptu. Mada priroda drugog pika nije jasna, izgleda da su pogrešno savijene vrste etanercepta vezane za Protein-A i zato bi trebale da sadrže Fc domen.

Preostali vezani proteini su bili eluirani sa pH 3.7, a zatim sa 3.0, pri čemu su oba sadržala 1 M arginina. Ovi rastvarači sa niskim pH su rezultovali eluiranjem malih pikova, kao što je prikazano na Fig.2A (3.7 i 3.0). pH 3.7 pik je sadržao malu količinu etanercepta (traka-6), dok je pH 3.0 pik sadržao uglavnom vrste male mobilnosti, koje su odgovarale pogrešno savijenim vrstama, kao i vrstama koje takođe mogu biti agregirane (traka-7). Slična šema eluiranja je bila uočena u odsustvu arginina. Niži pH, npr. pH 3.85, je bio potreban za eluiranje etanercepta, a dalje smanjenje pH je rezultovalo eluiranjem vrsta male mobilnosti. Činjenica da su ove vrste male mobilnosti vezane za Protein-A znači da su one bile takođe Fc-fuzioni proteini. Pošto su ove vrste bile eluirane na nižim pH od etanercepta, one se bile čvršće vezane za Protein-A. Ove analize potvrđuju da ekspresija etanercepta u rekombinantnim CHO ćelijama dovodi i do prirodnog (korektno savijenog) etanercepta, što odgovara korektno savijenim vrstama, i vrstama male mobilnosti, što odgovara nekorektno, pogrešno savijenim vrstama, kao što je analizirano analitičkom HIC. Pošto se pogrešno savijene vrste eluiraju kasnije u HIC, trebalo bi da budu hidrofobnije od prirodnog etanercepta. U zavisnosti od CHO klonova i uslova fermentacije, količina korektno savijenih vrsta varira od 40 do 60 tež.% eluata proteina A. U primerima dole je određena sposobnost mešovite hromatografije da razdvaja savijene vrste od pogrešno savijenih vrsta.

Analitičke metode.

[0059] Eluirane frakcije iz kompozicija Proteina A, Capto<TM>MMC i Capto<TM>Adhere mogu biti analizirane korišćenjem mnoštva tehnika koje su dobro poznate u odgovarajućoj oblasti, kao što su gel hromatografija (SEC), denaturisana SEC (dSEC), hidrofobna interaktivna hromatografija (HIC), elektroforeza na natrijum dodecilsulfat poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) i native-PAGE. Na primer, tehnike gel hromatografije su opisane u Hawe et al, Pharm. Res.2011, 28: 2302 i/ili van Marrschalkerweerd et al., Eur. J. Pharm. Biopharm.2011, 78: 213.

[0060] SDS-PAGE. Na primer, eluirane frakcije iz Proteina A, Capto<TM>MMC i Capto<TM>Adhere mogu biti analizirane pomoću elektroforeze na natrijum dodecilsulfatnom ili prirodnom poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE ili native-PAGE, respektivno). I SDS-PAGE, i native-PAGE su bile izvedene korišćenjem 6 % tris-glicin gela (može se nabaviti od Life Technology). SDS-PAGE se može izvesti pod neredukujućim uslovima, tako da se mogu uočiti disulfidno vezani agregati.

[0061] Gel hromatografija. Frakcije eluata dobijene korišćenjem mešovitih hromatografskih postupaka prema predmetnom pronalasku mogu biti analizirane korišćenjem dobro poznate tehnike gel hromatografije (SEC), metoda tečne hromatografije visokih performansi ("HPLC") u kome se analiti razdvajaju po veličini (vidi Rogner, M. (2000). Size Exclusion Chromatography. Protein Liquid Chromatography. M. Kastner. Amsterdam, Elsevier.61: 89-145.). Na primer, i bez ograničavanja, može se pripremiti pufer mobilne faze tako da sadrži 50 mM natrijum fosfat monobaznog monohidrata i 150 mM arginina. pH se podešava na 6.5 uz korišćenje 1 M HCl. Razdvajanja se mogi izvršiti uz korišćenje Tosoh TSK-Gel SWxl 6 mm x 4 cm zaštitne kolone (kat. br.8543) pričvršćene linearno za Tosoh TSK-Gel G4000 SWxl 7.8 mm x 30 cm (kat. br.8542). Da bi se izvršilo razdvajanje, kolone se dovode na sobnu temperaturu (23C) i uravnotežavaju sa mobilnom fazom sa protokom od 0.5 mL/min.

5 mikrolitara 50 mg/mL rastvora koji sadrži etanercept se ubrizgava u kolonu uz korišćenje autosemplera. Razdvajanje se može vršiti tokom oko 30 minuta pri protoku od oko 0.5 mL/minuta. Eluent kolone je bio praćen na talasnoj dužini od 280 nm u toku ovog perioda. Integracija može biti izvršena uz korišćenje Chromeleon softvera (Dionex). Pre integracije, SEC hromatogram za pufer koji ne sadrži etanercept se oduzima od svih hromatograma. Celokupna integracija se može izvršiti između vremena retencije od 12 minuta i 26 minuta. Upotrebljava se nekoliko parametara da bi se definisao pik. Minimalna površina za detektovani pik je postavljena na 0.05 mAu * min.

Dvodimenzionalna osetljivost za detekciju pika je postavljena na 0.01 mAu i 75 sekundi. Ivice pika su bile dodate ručno uz korišćenje ručnog integracionog alata. Svi detektovani pikovi su podešeni ručno u dva koraka. Kao prvo, osnove pikova (donja granica pika) su bile podešene na horizontalu. Kao drugo, vertikalne pozicije osnova pikova su bile podešene prema osnovnoj liniji hromatograma. Vrednost osnovne linije hromatograma je definisana kao odsustvo signala analita. Signal u odsustvu analita je definisan kao apsorbansa u mAu za vreme retencije od 12 minuta.

[0062] Hidrofobna interaktivna hromatografija (HIC). Analiza hidrofobnom interaktivnom hromatografijom (HIC) može biti izvršena na butil-sefarozi uz korišćenje gradijenta amonijum sulfata od 1.8 do 0 M. HIC hromatografija se takođe može izvesti na način koji je opisan u US patentu 7,294,481 (vidi kolonu 19, redove 49-55). Takođe se vrši poziv na US patent br 7,157,557; Chew.J, Tetrault J, Ley A. (2008) J Chromatogr A.1177, 272-81; Gagnon P. i Grund E.(1996) BioPharm, 9, 54-64; i Lu, Y., Williamson, B., i Gillespie, R. Recent advancement in application of hydrophobic interaction chromatography for aggregate removal in industrial purification process. Curr. Pharm. Biotech.

[0063] Što se tiče HIC analize preparata etanercepta proizvedenih u skladu sa mešovitim hromatografskim postupkom prema predmetnom pronalasku, naglašava se da Fig.4 u US patentu 7,294,481 sadrži HIC hromatogram preparata etanercepta u kome postoje tri pika, od kojih je za najveći (identifikovan kao "pik 2" u '481 patentu) navedeno da predstavlja pravilno savijeni etanercept fuzioni protein; dok je za manji pik (identifikovan kao "pik 3" u 481 patentu) od strane nosioca patenta postulirano da sadrži "ispremeštani" (tj. u aktuelnoj diskusiji se smatra da je to sinonim za nekorektno savijeni) etanercept, kao i agregirani etanercept (vidi US patent 7,294,481 kolona 22, redovi 13-66, i Fig.5 tamo). Značajna prednost prema predmetnom pronalasku je sposobnost da se obezbedi preparat koji sadrži etanercept sa izuzetno visokom čistoćom sa komercijalno atraktivnim prinosima, kod koga "pik 3" HIC hromatograma, koji je prikazan na Fig.4 i Fig.5 iz 481 patenta i ovde se smatra da sadrži nekorektno savijeni etanercept, može biti bitno smanjen ili u suštini eliminisan.

[0064] Etanercept sa visokom čistoćom dobijen korišćenjem postupaka prema predmetnom pronalasku se može primeniti u farmaceutskim formulacijama. Formulacije takođe mogu sadržati pufere, modifikatore toničnosti, ekscipijense, farmaceutski prihvatljive nosače i druge neaktivne sastojke farmaceutskih kompozicija koji se obično koriste. Radi jednostavnosti, oni će biti razmotreni detaljnije dalje u prijavi.

[0065] Puferi održavaju pH u željenom opsegu. Podesni puferi obuhvataju histidin, kalijum fosfat, natrijum ili kalijum citrat, maleinsku kiselinu, amonijum acetat, tris-(hidroksimetil)-aminometan (tris), različite oblike acetata i dietanolamina. Koncentracija pufera u formulaciji je prvenstveno između oko 1 mM do oko 1M, i još poželjnije od oko 10 mM do oko 200 mM. Puferi su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti i proizvode se poznatim metodama i mogu se nabaviti od komercijalnih dobavljača.

[0066] Primeri podesnih pufera su fosfat, histidin, citrat, maleat, tartrat, sukcinat, acetat, tris-(hidroksimetil)-aminometan (tris), bikarbonat.

[0067] Poželjni pufer je natrijum fosfat.

[0068] Poželjno je da pH farmaceutske kompozicije bude na ili blizu fizioloških nivoa. Shodno tome, pH realizovanih kompozicija je prvenstveno između oko 5.8 i oko 8.4; i čak još poželjnije, između oko 6.2 i oko 7.4. Osoba koja je prosečan stručnjak iz odgovarajuće oblasti če shvatiti da se pH može podesiti koliko je potrebno da bi se maksimizirala stabilnost i rastvorljivost etanercepta u specifičnoj formulaciji. Shodno tome, takođe su opisane formulacije etanercepta sa pH izvan fizioloških opsega, ali koje pacijent još uvek može tolerisati.

[0069] Modifikator toničnosti je molekul koji doprinosi osmolalnosti rastvora. Osmolalnost farmaceutske kompozicije se prvenstveno podešava tako da se maksimizira stabilnost aktivnog sastojka i/ili da se minimiziraju neugodnosti za pacijenta posle administracije. Generalno je poželjno da farmaceutska kompozicija bude izotonična sa serumom, tj. da ima istu ili sličnu osmolalnost, što se ostvaruje dodavanjem modifikatora toničnosti.

[0070] Poželjno je da osmolalnost realizovanih formulacija bude od oko 180 do oko 420 mOsM. Međutim, podrazumeva se da osmolalnost može biti viša ili niža u zavisnosti od zahtevanih specifičnih uslova.

[0071] Primeri modifikatora toničnosti koji su podesni za modifikaciju osmolalnosti obuhvataju, ali nisu ograničeni na aminokiseline (ne uključujući arginin) (npr. cistein, histidin i glicin), soli (npr. natrijum hlorid, kalijum hlorid i natrijum citrat) i/ili saharide/poliole (npr. saharoza, glukoza i manitol).

[0072] Poželjni modifikatori toničnosti su glicin, alanin, natrijum hlorid, kalijum hlorid, i natrijum sulfat.

[0073] Koncentracija modifikatora toničnosti u formulaciji je prvenstveno između oko 1 mM i oko 1 M, još poželjnije od oko 10 mM do oko 200 mM. Modifikatori toničnosti su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti i proizvode se poznatim metodima i mogu se nabaviti od komercijalnih dobavljača.

[0074] Ekscipijensi, koji se takođe nazivaju hemijskim aditivima, ko-solventima, ili ko-rastvaračima, koji stabilizuju polipeptid dok je u rastvoru (takođe u osušenom ili zamrznutom obliku) takođe mogu biti dodati farmaceutskoj kompoziciji. Ekscipijensi su dobro poznati u odgovarajućoj oblasti i proizvode se poznatim postupcima, a mogu se nabaviti od komercijalnih isporučilaca.

[0075] Primeri podesnih ekscipijenasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na šećere/poliole kao što su: saharoza, laktoza, glicerol, ksilitol, sorbitol, manitol, maltoza, inozitol, trehaloza, glukoza; polimere kao što su: serumski albumin (goveđi serumski albumin (BSA), humani SA ili rekombinantni HA), dekstran, poli(vinil alkohol) PVA, hidroksipropil metilceluloza (HPMC), poli-etilenimin, želatin, polivinilpirolidon (PVP), hidroksietilceluloza (HEC); nevodene rastvarače kao što su: PEG, i glicerol i dimetilformamid (DMF); aminokiseline kao što su: prolin, L-serin, natrijum glutaminska kiselina, alanin, glicin, lizin hidrohlorid, sarkozin i gama-aminobuterna kiselina; surfaktante kao što su: Tween-80® (polisorbat 80), Tween-20 ® (polisorbat 20), SDS, polisorbat, poloksameri; i različite ekscipijense kao što su: kalijum fosfat, natrijum acetat, amonijum sulfat, magnezijum sulfat, natrijum sulfat, trimetilamin N-oksid, betain, joni metala (npr. cinka, kalcijuma, i magnezijuma), CHAPS, monolaurat, 2-O-beta-manoglicerat ili bilo koja kombinacija gore navedenih.

[0076] Poželjni ekscipijensi su saharoza, laktoza, glicerol, ksilitol, sorbitol, manitol, maltoza, inozitol, trehaloza, glukoza, goveđi serumski albumin (BSA), humani serumski albumin (HSA), rekombinantni albumin, dekstran, PVA, hidroksipropil metilceluloza (HPMC), polietilenimin, želatin, polivinilpirolidon (PVP), hidroksietilceluloza (HEC), PEG, etilen glikol, glicerol, alanin, glicin, lizin hidrohlorid, sarkozin, SDS, polisorbat 20, polisorbat 80, poloksamer 188, trimetilamin N-oksid, betain, joni cinka, joni kalcijuma, joni magnezijuma, CHAPS, saharoza monolaurat, i 2-O-beta-manoglicerat.

[0077] Koncentracija jednog ili više ekscipijenasa u formulaciji prema pronalasku je prvenstveno između od oko 0.001 do 5 težinskih procenata, još poželjnije od oko 0.1 do 2 težinskih procenata.

[0078] Ako je poželjno, preparat etanercepta pripremljen prema predmetnom pronalasku se može upotrebiti u istoj formulaciji u kojoj se sada isporučuje komercijalni Enbrel, a takva formulacija sadrži od oko 25 do oko 75 mg/ml) formulacije, i dalje koja sadrži saharozu, natrijum hlorid, L-arginin hidrohlorid, i natrijum fosfat.

[0079] Alternativno tome, preparati etanercepta dobijeni prema predmetnom pronalasku mogu biti isporučeni u farmaceutskoj formulaciji koja ne sadrži arginin; na primer, bilo kojoj od neargininskih formulacija koje su opisane u Manning et al. provizornim prijavama USSN 61/548,518 i 61/669480 podnetim 18. oktobra 2011. i 9. jula 2012., respektivno.

[0080] Takođe je opisan postupak lečenja sisara koji sadrži davanje terapeutski efektivne količine ovde opisanih farmaceutskih kompozicija sisaru, pri čemu sisar ima bolest ili poremećaj za koji je korisno da se leči etanerceptom.

[0081] Poželjno je da etanercept potiče od iste vrste sisara kao što je onaj koji treba da bude lečen kompozicijom.

[0082] Prvenstveno, sisar je čovek.

[0083] Bolesti ili poremećaji koji se mogu lečiti kompozicijama obuhvataju, ali nisu ograničene na reumatoidnu artritis, psorijatički artritis, ankilozirajući spondilitis, Vegenerovu bolest (granulomatozu), Kronovu bolest (ili zapaljensku bolest creva), hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), hepatitis C, endometriozu, astmu, kaheksiju, psorijazu, i atopijski dermatitis. Dodatne bolesti ili poremećaji koji se mogu lečiti kompozicijama prema predmetnom pronalasku obuhvataju one koje su opisane u WO 00/62790, WO 01/62272, US prijavi patenta br.2001/0021380, i US pat.7,648,702 B2.

[0084] Farmaceutske kompozicije se mogu davati subjektu kome je potrebno lečenje injekcijom sistemski, kao što je intravenskom injekcijom; ili injekcijom ili primenom na relevantnom mestu, kao što je direktnom injekcijom ili direktnom aplikacijom na mesto, kada je to mesto izloženo hirurškom intervencijom; ili topičkom primenom.

[0085] Postupak lečenja i/ili prevencije reumatoidnog artritisa sadrži davanje sisaru kome je to potrebno terapeutski efektivne količine jedne od realizovanih kompozicija etanercepta.

[0086] Terapeutski efektivna količina etanercepta u kompozicijama će zavisiti od stanja koje se leči, ozbiljnosti stanja, prethodne terapije i pacijentove kliničke istorije i reakcije na terapeutik.

Odgovarajuća doza se može podesiti na osnovu rasuđivanja nadležnog lekara, tako da se pacijentu može dati odjednom ili nizom administacija.

[0087] Efektivna količina etanercepta po dozi za odrasle je od oko 1-500 mg/m<2>, ili od oko 1-200 mg/m<2>, ili od oko 1-40 mg/m<2>ili oko 5-25 mg/m<2>.

[0088] Alternativno tome, može se davati ista doza, čija količina se može nalaziti u opsegu od 2-500 mg/dozi, od 2-100 mg/dozi ili od oko 10-80 mg/dozi.

[0089] Ako je doza koja treba da se daje više od jednom nedeljno, primer opsega doza je isti kao što su gore opisani opsezi doza ili niži, a prvenstveno se daje dva ili više puta nedeljno sa dozom u opsegu od 25-100 mg/dozi.

[0090] Prihvatljiva doza za administraciju injekcijom sadrži 80-100 mg/dozi, ili alternativno tome, sadrži 80 mg po dozi.

[0091] Doza se može davati nedeljno, dvonedeljno ili odvojeno za nekoliko nedelja (na primer, od 2 do 8).

[0092] Može se davati 25 to 75 mg/ml etanercepta pojedinačnom subkutanom (SC) injekcijom.

[0093] U nekim slučajevima poboljšanje pacijentovog stanja će biti ostvareno davanjem doze do oko 100 mg farmaceutske kompozicije jednom do tri puta nedeljno tokom perioda od najmanje tri nedelje. Lečenje tokom dužih perioda može biti neophodno radi indukcije željenog stepena poboljšanja. Za neizlečiva hronična stanja režim može biti neograničeno produžen. Za pedijatrijske pacijente (starosti od 4-17), podesan režim može obuhvatati davanje doze od 0.4 mg/kg do 5 mg/kg etanercepta, jednom ili više puta nedeljno.

[0094] Ovde opisane farmaceutske formulacije se mogu pripremiti u vidu koncentrovane formulacije, i kao takve komponente farmaceutske kompozicije se podešavaju tako da ih ima više nego što bi bilo potrebno za administraciju i razređuju se na odgovarajući način pre administracije.

[0095] Farmaceutske kompozicije se mogu davati kao jedini terapeutik ili u kombinaciji sa dodatnim terapijama, ako je potrebno. Shodno tome, metode lečenja i/ili prevencije se primenjuju u kombinaciji sa davanjem terapeutski efektivne količine drugog aktivnog agensa. Drugi aktivni agens se može davati pre, u toku ili posle davanja farmaceutskih kompozicija prema predmetnom pronalasku. Drugi aktivni agens se može davati bilo kao deo pripremljene kompozicije, ili alternativno tome, kao posebna formulacija.

[0096] Administracija realizovanih farmaceutskih kompozicija se može ostvarivati na različite načine, uključujući parenteralnu, oralnu, bukalnu, nazalnu, rektalnu, intraperitonealnu, intradermalnu, transdermalnu, subkutanu, intravensku, intraarterijsku, intrakardijalnu, intraventrikularnu, intrakranijalnu, intratrahealnu, intratekalnu administraciju, intramuskularnu injekciju, intravitralnu injekciju i topičku aplikaciju.

Farmaceutske kompozicije su posebno korisne za parenteralnu administraciju, tj. subkutanu, intramuskularnu, intravensku, intraperitonealnu, intracerebrospinalnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu i/ili intratekalnu. Parenteralna administracija može biti bolus injekcijom ili kontinualnom infuzijom. Farmaceutske kompozicije za injekciju mogu biti prisutne u obliku pojedinačnih doza, npr. u ampulama ili u kontejnerima za više doza sa dodatim konzervansom. Pored toga, razvijeno je više novih pristupa davanju lekova, a farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku su podesne za administraciju primenom ovih novih metoda, kao što su npr. Inject-ease ®, Genject ®, injekcionog pena, ka što je GenPen ®, i uređaji bez igala, kao što su MediJector ® i BioJector ®. Farmaceutska kompozicija takođe može biti prilagođena za načine primene koji tek treba da budu otkriveni. Vidi takođe Langer, 1990, Science, 249:1527-1533.

[0097] Farmaceutske kompozicije takođe mogu biti formulisane kao depo preparat. Takve formulacije sa dugim dejstvom se mogu davati implantacijom (na primer, subkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Shodno tome, na primer, formulacije mogu biti modifikovane podesnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačkim smolama, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so.

[0098] Farmaceutske kompozicije mogu, ako je poželjno, biti prisutne u bočici, pakovanju ili uređaju za izdavanje koji mogu sadržati jedan ili više doziranih oblika koji sadrže aktivni sastojak. Uređaj za izdavanje može sadržati špric koji ima pojedinačnu dozu tečne formulacije spremne za injekciju. Špric može biti praćen uputstvima za administraciju.

[0099] Takođe je opisan kit ili kontejner, koji sadrži vodenu farmaceutsku kompoziciju dobijenu u skladu sa pronalaskom. Koncentracija polipeptida u vodenoj farmaceutskoj kompoziciji može varirati u širokom opsegu, ali je generalno u opsegu od oko 0.05 do oko 20,000 mikrograma po mililitru (μg/ml) vodene formulacije. Kit takođe može biti praćen uputstvima za upotrebu.

[0100] Predmetni pronalazak je detaljnije opisan na osnovu sledećih primera koji su namenjeni samo za ilustraciju, pošto su mnoge modifikacije i varijacije u njima očigledne stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

Primeri 1

Capto<TM>MMC mešovito prečišćavanje upotrebom NaCI eluiranja

[0101] U ovom primeru, eluat Proteina A dobijen kao što je gore opisano je podvrgnut Capto<TM>MMC hromatografiji. Capto<TM>MMC kolona je uravnotežena sa 5 mM citrata, pH 4.5 rastvorom.

Odgovarajuće razređivanje eluata Proteina A (npr.3- do 6-struko razređivanje u zavisnosti od pufera za eluiranje u koraku sa Proteinom A) sa 5 mM citrata rezultuje potpunim vezivanjem za kolonu. Kao što je bilo pokazano u SDS-PAGE analizama, opterećeni uzorak (pH 4.2, eluat Proteina A) je veoma heterogen i nikakav protein ne protiče kroz Capto<TM>MMC kolonu. Vezani proteini se onda eluiraju sa 0.15 M NaCl u 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom koji dovodi do istovremene promene pH (od 4.5 do 7.5) i NaCl koncentracije (od 0 do 0.15 M). Oštri p k eluiranja koji sadrži korektno savijeni etanercept je uočen pri analizi eluata. Međutim, rekuperacija je bila oko 40-50 %. Praćenjem koraka eluiranja kao što je upravo opisano, smola koja sadrži materijal preostalog vezanog proteina se dovodi u kontakt sa 0.3 M NaCl i 1 M arginina u 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom, što rezultuje eluiranjima koja sadrže uglavnom pogrešno savijene vrste, kao i agregate povezane disulfidnim vezama. Ovaj primer pokazuje da je Capto<TM>MMC efektivan za razdvajanje pogrešno savijenih vrsta od korektno savijenih vrsta. Činjenica da se pogrešno savijene vrste eluiraju za veće koncentracije soli (0.3 M prema 0.1 M) znači da one imaju jaču elektrostatičku interakciju sa kolonom. Pored toga, 1 M arginina dalje povećava eluiranje pogrešno savijenih, kao i agregiranih proteina, što ukazuje da su ovi proteini vezani za Capto<TM>MMC ne samo zahvaljujući elektrostatičkoj interakciji, već takođe i zahvaljujući hidrofobnoj interakciji i tome što arginin povećava remećenje i elektrostatičkih, i hidrofobnih interakcija. Analiza frakcija eluata dobijenih u ovom primeru je prikazana na Fig.3A i 3B.

Primer 2

Canto<TM>MMC mešovito prečišćavanje upotrebom NaCl smole uravnotežene na pH 7.5

[0102] U prethodnom primeru rastvor proteina koji sadrži korektno savijeni i nekorektno savijeni etanercept je inicijalno bio doveden u kontakt sa CAPTO<TM>MMC smolom na pH 4.5. U ovom primeru je uočeno slično eluiranje kao ono koje je bilo uočeno u Primeru 1 kada je Capto<TM>MMC kolona bila prvo uravnotežena sa 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom, a zatim je eluirana sa NaCl, što je bilo praćeno argininom. Specifično, etanercept nije bio eluiran tokom ovog uravnotežavanja pH. Ovaj rezultat je neočekivan, jer je etanercept negativno naelektrisan za pH 7.5; pI etanercepta se nalazi u opsezima od 4.9 to 5.4 zbog teške glikozilacije. Shodno tome, na ili ispod pH 4.5, etanercept je pozitivno naelektrisan i zato bi trebao da se vezuje za negativno naelektrisane Capto<TM>MMC ligande, mada hidrofobna interakcija može doprineti vezivanju. Na pH 7.5, negativno naelektrisani etanercept bi trebalo da se odvoji od negativno naelektrisanog Capto<TM>MMC, ali je utvrđeno da se ovo ne događa. Ovo se može objasniti hidrofobnom interakcijom između etanercepta i Capto<TM>MMC koja prevladava elektrostatičko odbijanje između negativno naelektrisane kolone i etanercepta. Alternativno tome, Capto<TM>MMC može držati vezani protein vezivanjem za lokalna pozitivna naelektrisanja na proteinskom radikalu (pI proteinskog radikala je -8.1).

Primer 3

Capto<TM>MMC mešovito prečišćavanje upotrebom NaCl gradijenta za eluiranje

[0103] U ovom primeru, uspešno eluiranje je ostvareno upotrebom gradijenta koncentracije NaCl. Specifično, posle ispiranja kolone sa 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom, vezani proteini su bili eluirani sa linearnim gradijentom soli od 0 do 0.5 M. Opterećeni uzorak (pH 4.2 eluat Proteina A) je ekstremno heterogen (sadrži i korektno savijeni, i nekorektno savijeni etanercept) kao u prethodnom slučaju, a vezani proteini su eluirani sa povećanjem jonske jačine NaCl gradijenta. Posle 180 min, gradijent je okončan, pa je koncentracija soli onda dovedena do 0.5 M, što je izazvalo blago povećanje eluiranja proteina. Kao što je utvrđeno sledstvenim analizama, frakcije sa malo soli sadrže više korektno savijenog etanercepta, a frakcije sa više soli su bile obogaćene sa vrstama male mobilnosti (pogrešno savijenim i agregiranim). Konačno, preostali proteini su eluirani sa 1 M arginina, 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom. Ova frakcija ne sadrži etanercept, već samo vrste male mobilnosti (pogrešno savijene/agregirane). Upotreba eluiranja Capto<TM>MMC sa NaCl gradijentom na različitim eluatima Proteina A, kombinovana sa preliminarnom ravnotežom smole rezultuje čistijim eluatom u pogledu korektno savijenog etanercepta. Za niske koncentracije NaCl u medijumu za eluiranje, eluirani uzorci su obogaćeni sa savijenim etanerceptom. Pogrešno savijene vrste se postepeno povećavaju u eluatu kada se gore opisani gradijent soli primeni na smolu. Pošto se gradijent soli okonča, smola se dovodi u kontakt sa rastvorom od 1 M arginina, a za frakciju eluata koja rezultuje iz toga je utvrđeno da sadrži pogrešno savijene vrste (koje obuhvataju ne samo pogrešno savijene, već takođe i agregirane vrste), kao što je evidentno u sledstvenoj SDS-PAGE analizi. Smatra se da su neke vrste male mobilnosti nekorektno savijeni (ali ni i agregirani) etanercept na SDS-PAGE, što ukazuje da deo pogrešno savijenih vrsta migrira kao pogrešno savijeni homodimer etanercepta sa sporijom mobilnosti na native-PAGE od korektno savijenog homodimera etanercepta. Analiza frakcija eluata dobijenih u ovom primeru je prikazana na Fig.4A, 4B i 4C.

Primer 4

Capto<TM>MMC mešovito prečišćavanje upotrebom gradijenta Na2-SO4za eluiranje

[0104] U ovom primeru je bio upotrebljen Na2SO4gradijent umesto NaCl kao gradijent soli za eluiranje korektno savijenog etanercepta iz mešovite smole. Dok se NaCl generalno isključivo upotrebljava za eluiranje proteina u IEC, generalno je poznato da različite soli imaju različite stepene efekta isoljavanja (taloženja proteina). NaCl je intermedijer između soli za usoljavanje, kao što je MgCl2, i soli za isoljavanje, kao što je Na2SO4. NaCl može biti efektivan za slabljenje elektrostatičke interakcije između etanercepta i Capto<TM>MMC, ali može biti neutralan za slabljenje hidrofobne interakcije. Ovde se smatra da bi Na2SO4trebao takođe da bude efektivan za slabljenje elektrostatičke interakcije, ali da bi trebao da poveća hidrofobnu interakciju, jer je poznat kao jaka so za isoljavanje. Shodno tome, ako su vrste male mobilnosti vezane za kolonu hidrofobnom interakcijom kao što je navedeno gore, njihovo eluiranje se može sprečiti pomoću Na2SO4. Ovo je testirano eluiranjem rastvora proteina koji sadrži korektno savijeni i nekorektno savijeni etanercept sa gradijentom Na2SO4od 0 do 0.4 M, posle pH uravnotežavanja kolone sa CAPTO<TM>MMC smolom sa 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom. Pošto se eluiranje proteina sa gradijentom Na2SO4okonča, kolona se ispira sa 1 M arginina, pH 7.5 rastvorom. Fig.5A prikazuje hromatogram eluiranja, dok Fig.5B prikazuje SDS-PAGE i native-PAGE eluiranih frakcija. Relativno oštra traka korektno savijenog etanercepta je uočena u frakcijama sa malo Na2SO4(trake 6 i 7 Fig.5B), a čistoća ovih frakcija je veća nego opterećenje (traka 1). Veće koncentracije Na2SO4rezultuju eluiranjem vrsta male mobilnosti na native-PAGE (trake 8 i 9 Fig.5B). Finalno eluiranje sa 1 M arginina za pH 7.5 rezultuje eluiranjem vrsta male mobilnosti (pogrešno savijenih/agregiranih). Izgleda da ima nešto etanercepta u ovoj frakciji (traka 10 Fig.5B), što ukazuje da Na2SO4takođe može da spreči eluiranje prirodnog etanercepta. Može se zaključiti da je Na2SO4podjednako, ako ne i više, efektivan za razdvajanje savijenih vrsta od pogrešno savijenih vrsta, mada može izazvati retenciju prirodnog etanercepta (traka 10).

Primer 5

Capto<TM>MMC mešovito prečišćavanje upotrebom eluiranja sa gradijentima NaCl i pH

[0105] U prethodnim primerima nije bilo uočeno da se proteini eluiraju tokom koraka uravnotežavanja pH, tj. promene pH od 4.5 (5 mM citrata) do 7.5 (10 mM fosfata). Kada se količina proteinskog opterećenja povećala na preko 10 mg po 1 ml

kolone, međutim, ovo više nije bio slučaj. Povećano eluiranje proteina tokom promene pH se događa pri većem opterećenju, mada razlog za ovu opservaciju nije jasan. Čistoća ovog eluiranog uzorka je veća nego opterećenih uzoraka, ali je znatno manja nego frakcija sa malo soli. Na primer, kada opterećeni uzorak (eluat Proteina A) sadrži samo 51 % vrsta korektno savijenog etanercepta, eluiranje koje se dešava tokom uravnotežavanja pH je samo 65 % čisto, više nego opterećenje, ali daleko ispod frakcija sa malo soli, dok eluiranja sa soli u gornjim primerima mogu da daju 96 % čistoće na početku gradijenta soli, što je određeno analitičkom HIC (FIG.6). Kao što je grafički prikazano na Fig.6, čistoća eluiranih frakcija se postepeno smanjuje od 96 % do 20 % sa povećanjem koncentracija soli, konzistentno sa rezultatom native-PAGE za Capto<TM>MMC (FIGS 3B, 4B, 5B). Čistoća frakcije sa 1 M arginina (u pogledu korektno savijenog etanercepta) je bila niska (samo 11 %), što je konzistentno sa native-PAGE analizom (vidi FIG.4B, traka 9 i FIG.5B, traka 10). U svetlosti prethodnih opservacija, postulirano je u vezi da ovde otelotvorenim otkrićima da može biti korisno da se kombinuje gradijent pH sa gradijentom soli da bi se suprotstavilo potencijalnom gubitku bilo koje korektno savijene vrste u toku uravnotežavanja pH kolone za veća proteinska opterećenja. Shodno tome, u ovom primeru 5 dole je gradijent pH kombinovan sa gradijentom soli kada se izvodi gore definisani korak (b) predmetnog postupka. U ovom primeru mogućnost da male količine pravilno savijenog etanercepta mogu da budu nepoželjno eluirane u toku inicijalnog uravnotežavanja pH kolona sa mešovitom smolom se suprotstavlja kombinovanjem promene pH sa gradijentom soli. Specifično, vezani protein se eluira sa istovremenim gradijentom i pH, i koncentracije NaCl, tj. kolona se razvija od 5 mM citrata, pH 4.5 rastvorom do 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom, koji sadrži NaCl. Ovo rezultuje istovremenim promenama i pH, i koncentracije soli, koje izazivaju eluiranje vezanih proteina. Ovo je slično profilu eluiranja sa soli posle uravnotežavanja pH, kada je bilo uočeno da su vrste male mobilnosti eluirane u kasnijim frakcijama (tj. za veći pH i koncentraciju soli) i u finalnom ispiranju sa 1 M arginina, pH 7.5. Na primer, eluat Proteina A (24 mg) se vezuje za kolonu za pH 4.5 i eluira se sa gradijentom sa 5 mM citrata, pH 4.5 do 10 mM fosfata, pH 7.5 koji sadrži 0.5 M NaCl. Postulirano je da bi ovo veliko opterećenje sa uravnotežavanjem pH moglo da dovede do eluiranja vezanih proteina tokom promene pH. Profil eluiranja u toku gradijenta pH i soli zaista pokazuje mali pik na početku gradijenta i veći pik (željeni korektno savijeni etanercept) na sredini gradijenta. Uočeni mali pik može odgovarati eluiranju koje bi bilo uočeno ako bi uravnotežavanje pH bilo inicijalni izvršeno bez gradijenta pH/soli. Pošto se eluiranje sa gradijentom NaCl/pH okonča, kolona se onda podvrgava daljem eluiranju sa rastvorom sa 1 M arginina, što rezultuje finalnim oštrim pikom koji odgovara vrstama male mobilnosti. Ranim eluiranjem sa malo soli i niskim pH frakcije se obogaćuju sa etanerceptom, dok za mnogo soli i visoki pH frakcije ispoljavaju eluiranje vrsta male mobilnosti; pH se postepeno povećava od 4.5 do 7.5, npr. pH od 4.1-5.1 u intermedijernim koncentracijama soli i pH 6.6 na kraju gradijenta. Finalno ispiranje sa 1 M arginina, pH 7.5 rastvorom, prikazuje mutna traka na native-PAGE i višestruke trake na SDS-PAGE, u suštini identično sa eluiranjem koje rezultuje posle inicijalnog uravnotežavanja kolone koje izaziva promenu pH sa 10 mM fosfata, pH 7.5 ispiranjem. Rekuperacija pravilno savijenog etanercepta u pulu je bila ∼70 %. Sličan rezultat je bio dobijen kada je eluiranje izvršeno sa istim gradijentom pH/so do 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom, ali sa završetkom za manje soli koji je sadržao 0.25 M NaCl. Ovaj gradijent sa upotrebom niže koncentracije soli rezultuje nekompletnim eluiranjem etanercepta sa prinosom od ∼50 %. Kao u prethodnim primerima, veliki pik je bio uočen za ispiranje sa 1 M arginina, što odgovara vrstama etanercepta male mobilnosti (pogrešno savijenog/agregiranog). Analiza eluata dobijenih u ovom primeru je prikazana na FIG.7A i 7B.

Primer 6

Capto<TM>MMC mešovito prečišćavanje upotrebom Na2SO4/pH gradijenta za eluiranje

[0106] Slično procedurama upotrebljenim u primeru 5 gore, eluiranje sa gradijentom pH/soli je takođe bilo izvedeno uz upotrebu rastvora sa 0.5 M Na2SO4kao finalnog rastvarača, za koji se smatra da poboljšava separaciju savijenih vrsta od pogrešno savijenih vrsta. Rekuperacija etanercepta u pulu je ∼50 %, a smatra se da je rekuperacija mala zbog povećane hidrofobne interakcije za 0.5 M Na2SO4, što dovodi do retencije ne samo pogrešno savijenih vrsta, koje se uglavno eluiraju u ispiranju sa 1 M arginina, već takođe i etanercepta, koji se takođe pojavio u ispiranju sa 1 M arginina. Shodno tome, upotreba Na2SO4može povećati razdvajanje (tj. separaciju) pogrešno savijenih od korektno savijenih vrsta, ali takođe smanjuje rekuperaciju etanercepta. Za analizu eluata u ovom primeru, može se izvršiti poziv na FIG.8A i 8B.

Primer 7

Capto<TM>Adhere; eluiranje sa NaCl za pH 7.5 i pH 4.5

[0107] U ovom primeru, eluat Proteina A koji sadrži i korektno, i nekorektno savijene vrste etanercepta se podvrgava mešovitoj hromatografiji upotrebom Capto<TM>Adhere kao mešovite smole. Vezivanje rastvora proteina koji sadrži korektno savijene i nekorektno savijene vrste etanercepta je bilo izvršeno za pH 7.5, za koji je etanercept negativno naelektrisan i zato bi trebalo da se vezuje za pozitivno naelektrisane Capto<TM>Adhere ligande. Kada je pH 4.2 eluat Proteina A dijalizovan protiv 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom, vezivanje proteina je potpuno, ali je utvrđeno da je eluiranje samo sa soli (za pH 7.5) neefektivno, što sugeriše da je Capto<TM>Adhere veoma hidrofoban. Zato se smatra pošto je pI etanercepta 4.9-5.4, da bi eluiranje sa manjim pH od možda pH 4.5 vrste etanercepta bile pozitivno naelektrisane i zato odbijene od pozitivno naelektrisane Capto<TM>Adhere smole za pH 4.5. Ova mogućnost je ispitana izvođenjem eluiranja vrsta etanercepta iz Capto<TM>Adhere za pH 4.5. pH 4.2 eluat Proteina A (koji je bio dijalizovan do pH 7.5) vezan za Capto<TM>Adhere uravnotežen sa 10 mM fosfata, pH 7.5 rastvorom. Posle proteinskog opterećenja, kolona je isprana sa 0 i 0.2 M NaCl u istom puferu, bez eluiranja proteina u ovim ispiranjima.

Primeri 8

Capto<TM>Adhere; eluiranje sa/bez arginina za pH 4.5

[0108] U svetlosti rezultata iz primera 7, vezani protein je onda eluiran sa 5 mM citrata, pH 4.5 rastvorom sa i bez arginina. Arginin, umesto NaCl, je upotrebljen u ovom primeru da bi se ispitao način na koji bi hidrofobnije vrste (arginin) mogle uticati na eluiranje u svetlosti hidrofobne prirode Capto<TM>Adhere liganada. Otkriveno je da se vrste male mobilnosti (pogrešno savijene/agregirane) zajedno sa korektno savijenim etanerceptom eluiraju sa 5 mM citrata, pH 4.5 rastvorom za ispiranje (koji ne sadrži arginin). Eluiranje vrsta male mobilnosti u ovoj frakciji može biti zbog iznenadne promene pH, pošto je izmereni pH ove frakcije bilo 3.0. Kada je ovaj korak ponovljen sa 0.1 i 0.2 M arginina u 5 mM citrata, pH 4.5 rastvorom, uočene su samo marginalne količine korektno savijenog etanercepta. Potpuno eluiranje korektno savijenog etanercepta je zahtevalo 0.5 M arginina, međutim eluat je sadržao nepoželjnu količinu vrsta male mobilnosti. Shodno tome, otkriveno je da je čak za pH 4.5, arginin neefektivan u malim koncentracijama, a veće koncentracije arginina su rezultovale slabim razdvajanjem savijenih i pogrešno savijenih vrsta. Vidi FIG 9. za analizu eluata dobijenih u ovom primeru.

Primer 9

Capto<TM>Adhere; eluiranje sa dva gradijenta arginina i gradijentom pH od 7.5 do 4.5

[0109] Onda je postulirano da bi kombinovani gradijent pH/arginin mogao rezultovati boljom separacijom pravilno savijenih i pogrešno savijenih vrsta. Kao u prethodnim primerima za CAPTO MMC, pad pH u toku uravnotežavanja pH od 7.5 do 4.5 uz korišćenje 5 mM citrata se može sprečiti istovremenom primenom gradijenta pH koja se onda može kuplovati sa gradijentom koncentracija arginina (na primer, gradijent od 10 mM fosfata, pH 7.5 do 5 mM citrata, pH 4.5 sadrži arginin). Bila su ispitana dva gradijenta arginina sa ovim pH gradijentom. U slučaju gradijenta arginina do 0.25 M arginina, (Fig.10A i 10B) otkriveno je da je finalno ispiranje sa 0.5 M arginina rezultovalo eluiranjem obe vrste, i male mobilnosti i etanercepta, što ukazuje da bi upotreba gradijenta koncentracije arginina od samo 0.25 M arginina bila nedovoljna za potpuno eluiranje korektno savijenog etanercepta.

Shodno tome, bio je ispitan gradijent arginina od 0-0.5 M (kuplovan sa gornjim gradijentom pH od 7.5 do 4.5) (Fig.11A i 11B). Na osnovu sledstvene native-PAGE analize je evidentno da je relativna visina pika bila manja za finalno ispiranje sa 1 M arginina sa većim gradijentom arginina od prethodnog gradijenta arginina od 0.25 M. Nije uočen drugi pik, što sugeriše da je separacija mogla biti kompromitovana. Gradijent pH je takav da su se frakcije eluirane sa pH postepeno smanjivale od 7.5 do 6.0, 5.7, 5.2 i konačno do 4.5. Što se tiče 0.5 M arginina i gradijenta pH, dve frakcije u glavnom piku eluiranja su bile obogaćene sa korektno savijenim etanerceptom uz rekuperaciju proteina od ∼65 %. Poslednji deo gradijenta je pokazao mutnu traku koja je sadržala etanercept. Shodno tome, mada je gradijent arginina od 0.5 M zajedno sa gradijentom pH povećao eluiranje vezanog etanercepta, korektno savijeni etanercept je koeluirao sa pogrešno savijenim vrstama u poslednjem delu gradijenta arginin/pH. Finalno ispiranje sa 1 M arginina je pokazalo samo mutnu traku.

Primer 10

Canto<TM>Adhere; eluiranje sa gradijentom arginina i gradijentom pH od 7.5 do 4.5

[0110] Eluiranja sa gradijentom arginina su takođe izvedena za pH 7.5 uz upotrebu Capto<TM>MMC pulova. Vezani proteini su bili eluirani sa gradijentom od 10 mM fosfata, pH 7.5 do 0.6 M arginina, 10 mM fosfata, pH 7.5. SDS-PAGE i native-PAGE profili pokazuju eluiranje korektno savijenog etanercepta u srednjim frakcijama (0.2-0.4 M arginina) (Fig.13). Vrste male mobilnosti, kao što se vidi u oba gela su uočene u poslednjoj frakciji i finalnom ispiranju sa 1 M arginina pH 7.0. Radi poređenja, kada je 0.6 M arginina zamenjeno sa 0.5 M NaCl u gradijentnom eluiranju za pH 7.5, eluiranje etanercepta se znatno smanjilo. Fig.14 prikazuje profil eluiranja za pH 7.5 u toku gradijenta soli do 0.5 M NaCl. Bila su uočena dva pika u toku gradijenta, koja su uglavnom sadržala etanercept, ali sa malim prinosom. Velika količina etanercepta je bila eluirana u finalnom ispiranju sa 1 M arginina, što ukazuje da koncentracija soli od 0.5 M NaCl kuplovana sa pH 7.5 nije bila optimalna za razdvajanje korektno savijenog etanercepta od nepravilno savijenog/agregiranog materijala. Kao što je navedeno gore, 1 M arginina je bilo visoko efektivno za eluiranje korektno savijenog etanercepta, mada uz prisustvo vrsta male mobilnosti. Uočeno je da modifikacija gradijenta soli za eluiranje za primenu gradijenta od oko 0 do oko 1M NaCl i izvođenje eluiranja za pH 8 rezultuje odličnom separacijom korektno savijenog etanercepta u odnosu na vrste male mobilnosti (nepravilno savijene/agregirane) u ranim proizvodima eluiranja sa takvim gradijentom, kao što je prikazano u primeru 12. Izgleda da je doprinos hidrofobnosti vezivanju etanercepta za Capto Adhere smanjena za pH 8.0, što rezultuje efektivnim eluiranjem korektno savijenog etanercepta sa samim NaCl.

Primer 11

Capto<TM>Adhere; eluiranje sa gradijentima arginina/NaCl za pH 7.5

[0111] U ovom primeru je ispitivan kombinovani gradijent NaCl/arginina za pH 7.5. Bila su ispitivana dva takva gradijenta: prvi gradijent koji je ispitivan za medijum za eluiranje je onaj u kome su finalne koncentracije NaCl i arginina bile 0.4 i 0.2, respektivno. Drugi gradijent koji je onda ispitivan je onaj u kome su finalne koncentracije NaCl i arginina bile 0.25 M NaCl i 0.5 M arginina, respektivno. U oba slučaja su gradijenti bili primenjeni u 10 mM fosfata, sa pH 7.5 rastvorom. Prvi gradijent je još uvek bio suviše slab da bi smanjio hidrofobne interakcije, a time i eluirao etanercept. Drugi gradijent je bio efektivnih, kao što pokazuje manji pik u finalnom ispiranju sa 1 M arginina. Naročito, kao što je potvrđeno sa SDS-PAGE, eluiranje etanercepta se dešava u toku drugog testiranog gradijenta do 0.25 M NaCl, 0.5 M arginina bez vrsta (male mobilnosti/nepravilno savijenih/agregiranih) velike molekulske težine. Ove vrste velike molekulske težine su bile onda eluirane u finalnom ispiranju sa 1 M arginina. Na native-PAGE, pokazano je da se veći deo prirodno korektno savijenog etanercepta eluira u srednjoj frakciji. Mutna traka je bila uočena za ispiranje sa 1 M arginina. Zbog toga je evidentno da kombinacija arginina i NaCl može dovesti do eluiranja etanercepta i razdvajanja vrsta male mobilnosti i velike molekulske težine, što odgovara pogrešno savijenim vrstama. HIC analiza Capto<TM>Adhere frakcije za Capto<TM>MMC pulove (60-80 % čistoća) pokazuje da eluirane frakcije u toku gradijenta (izuzev poslednjih frakcija) normalno daju čistoću veću od 95 %. Analize eluata dobijenih u ovom primeru su prikazane na Fig.15A i 15B.

Primer 12 - Capto<TM>Adhere i Capto<TM>MMC

[0112] U ovom primeru, eluat Proteina A koji sadrži korektno savijeni i pogrešno savijeni etanercept je bio dobijen postupkom sličnim gore opisanom proteinskom postupku. Eluat je bio sukcesivno apliciran na Capto<TM>MMCe kolonu, a pul proizvoda je onda apliciran na Capto<TM>ADHERE kolonu da bi se dobio superiorni proizvod etanercepta, i kvantitativno, i kvalitativno.

[0113] KORAK 1. Ekspanzija ćelija. Na način koji je poznat u odgovarajućoj oblasti, ekspanzija ćelija koja je neophodna za generisanje dovoljnog broja ćelija za inokulaciju proizvodnog bioreaktora se vrši upotrebom klona CHO ćelija koje izražavaju etanercept fuzioni protein. Proizvod ovog procesa ekspresije (fluid sakupljenih ćelijskih kultura) rezultuje smešom korektno savijenog etanercepta, kao i nekorektno savijenog i/ili agregiranog etanercepta, zajedno sa dodatnim nečistoćama. Fluid sakupljenih ćelijskih kultura koji sadrži takvu smešu proteina se podvrgava inaktivaciji virusa deterdžentom.

[0114] KORAK 2. Afinitetna hromatografija. Afinitetna hromatografija je izvedena na sakupljenoj ćelijskoj kulturi dobijenoj u koraku 1 gore uz korišćenje uobičajene afinitetne kolone za Protein A na dobro poznat način. Rekuperacija proizvoda je približno 85%. Dobijeni proizvod je kompleksna smeša proteina koja sadrži korektno savijeni etanercept, nekorektno savijeni etanercept, i/ili agregate korektno i/ili nekorektno savijenog etanercepta, ili fragmente proteina. Proizvodu dobijenom iz ove afinitetne kolone za Protein A u koraku prečišćavanja se podešava pH 3.5, a onda se podvrgava koraku inaktivacije virusa. Posle inaktivacije virusa proizvodu se podešava pH 5.5, a onda se dalje izbistrava na poznat način uz korišćenje komercijalno nabavljenog kapsulnog filtera.

[0115] KORAK 3A. Mešovita katjonsko izmenjivačka hromatografija. Hromatografska kolona od 31.8 L (45 cm prečnik X 20 cm visina sloja) sa pakovanim slojem GE Healthcare Capto MMC je bila upotrebljena za prečišćavanje proizvoda dobijenog u koraku 2 gore. Pre upotrebe, kolona je uravnotežena sa 2 CV od 25 mM acetata pH 5.5 i sanitizovana sa 2 CV od 0.1 N NaOH, 1M NaCl i neutralizovana je sa 2 CV od 25 mM acetata, 0.7 M NaCl, pH 5.5. Kolona je onda uravnotežavana sa 8-10 CV od 25 mM acetata pH 5.5 sve do efluenta sa pH 5.5 i 3.5 mS/cm. Pul Proteina A iz koraka 2 gore je razređen na < 6 mS/cm sa WFI i apliciran je na kolonu opterećenu sa do 15 g/L medijuma za svaki ciklus. Kolona je radila sa linearnom brzinom od 200 cm/h da bi se dobilo vreme zadržavanja od 6 minuta. Posle opterećenja, kolona je isprana sa 2 CV od 25 mM acetata pH 5.5. Proizvod je onda eluiran sa 8.5 CV, gradijent od 15% do 85% 25 mM acetata pH 5.5 do 25 mM acetata, 0.7 M NaCl, pH 5.5. Sakupljanje proizvoda počinje na 0.15 OD (A280, 1.0 cm dužina putanje), a sakupljanje se završava na 50% maksimuma pika. Zapremina eluata je približno 5 CV. Rezidualni proizvod i kontaminanti su izvučeni iz kolone sa 2 CV od 10 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0, pa su odbačeni.

Proizvod dobijen iz mešovite kolone je isfiltriran uz korišćenje Millipore Opticap XL10, 0.22 mm Durapore kapsulnog filtera, (0.69 m<2>). Proizvod dobijen iz ovog koraka predstavlja rekuperaciju od oko 70% materijala Proteina A dobijenog u koraku 2.

[0116] KORAK 3B. Mešovita anjonsko izmenjivačka hromatografija. Hromatografska kolona od 27.0 L (45 cm prečnik X 17 cm visina sloja) sa pakovanim slojem od GE Healthcare Capto Adhere je upotrebljena za dalje prečišćavanje proizvoda dobijenog u gornjem koraku 3A. Pre upotrebe, kolona je uravnotežena sa 2 CV od 25 mM Tris, pH 8.0 i sanitizovana je sa 2 CV od 0.1 N NaOH, 1M NaCl i neutralizovana je i uravnotežena sa 2 CV od 25 mM Tris, pH 8.0. Pre opterećenja proizvodom, kolona je uravnotežena sa 3 CV od 10 mM Tris, pH 8.0. Capto MMC pulu iz koraka 3A gore je podešen pH 8.1 sa ∼0.045 kg 1 M Tris, pH 8.3 po kg pula. Proizvod iz koraka 3A gore je bio razređen in-lajn 1:3.8 sa WFI da bi se podesila provodnost na 12.0 mS/cm i pH 8.0. Rezultujući materijal je onda apliciran na kolonu opterećenu sa do 15 g/L medijuma. Kolona je radila sa linearnom brzinom od 170 cm/h da bi se dobilo vreme zadržavanja od 6 minuta. Posle opterećenja, kolona je isprana sa 2 CV od 25 mM Tris, pH 8.0. Proizvod je onda eluiran sa gradijentom od 10 CV (20% do 90%) od 25 mM Tris, pH 8.0 do 10 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0. Sakupljanje proizvoda je započelo za 0.15 OD (A280, 1.0 cm dužina putanje), a sakupljanje je završeno za 25% maksimuma pika. Zapremina eluata je 4-6 CV. Eluirani proizvod je isfiltriran uz korišćenje komercijalno raspoloživog kapsulnog filtera, a onda je na poznat način podvrgnut koracima filtriranja virusa i filtriranja tangencijalnim strujanjem. Ukupna rekuperacija proizvoda iz koraka 3B (uključujući finalne korake filtriranja virusa i filtriranja tangencijalnim strujanjem) je približno 68%. Rekuperacija proizvoda izmerena pre koraka filtriranja je bila oko 75%. Šematski prikaz HIC podataka dobijen na eluiranim frakcijama iz ovog koraka je dat na Fig.12.

[0117] Analiza: Utvrđeno je da je finalni isfiltrirani proizvod dobijen u ovom primeru imao više od oko 90 tež. % korektno savijenog etanercepta, kao što je bilo određeno pomoću HIC; manje od 5 tež. % nekorektno savijenih vrsta etanercepta, kao što je bilo određeno pomoću HIC; manje od oko 3 tež. % skraćenog materijala pomoću HIC analize (veruje se da su to fragmenti etanercepta kod kojih je njihov TNFR deo bio skraćen) i količinu kombinovanog korektno i nekorektno savijenog etanercepta veću od 95 tež. %, kao što je bilo određeno pomoću gel hromatografije.

[0118] Činjenica da se vezivanje proteina dogodilo u prisustvu uslova za isoljavanje sugeriše mogućnost da hidrofobna interakcija nije uključena u vezivanje etanercepta za Capto<TM>MMC i Capto<TM>Adhere, imajući u vidu da hidrofobno vezivanje proteina za HIC normalno zahteva jako isoljavanje. Međutim, hidrofobna interakcija može biti olakšana u prisustvu elektrostatične interakcije između proteina i ovih mešovitih smola. Shodno tome, bez želje za vezivanjem za bilo koju posebnu teoriju, vezivanje etanercepta za mešovitu smolu može biti posredovano modovima i elektrostatičke, i hidrofobne interakcije, čak i u odsustvu uslova za isoljavanje. Analitička HIC jasno ukazuje da su pogrešno savijene vrste, koje se eluiraju pri manjoj koncentraciji amonijum sulfata, hidrofobnije od savijenih vrsta. Pretpostavljajući da i savijene, i pogrešno savijene vrste imaju identična elektrostatička svojstva i da se podjednako dobro vezuju za naelektrisanu grupu Capto<TM>MMC ili Capto<TM>Adhere liganada, moguće je da jača hidrofobnost pogrešno savijenih vrsta izaziva da se one jače vezuju za mešovite smole, pa su, shodno tome, potrebni uslovi jačeg eluiranja za pogrešno savijene vrste, kao što je uočeno u prethodnim primerima. Za Capto<TM>MMC se ovo može ostvariti pri većoj koncentraciji soli, koja ne mora biti dovoljna za povećanje hidrofobne interakcije, ali može biti dovoljna za kidanje dodatne elektrostatičke interakcije između Capto<TM>MMC i korektno, i nekorektno savijenih vrsta. Nasuprot tome, izgleda da je Capto<TM>Adhere hidrofobniji od Capto<TM>MMC, zbog čega zahteva arginin, ili alternativno tome, veću koncentraciju soli sa većim pH da bi se eluirale korektno savijene vrste. Veća koncentracija arginina ili oštriji uslovi su potrebni za eluiranje pogrešno savijene vrste.

[0119] Dok se u predmetnom pronalasku izrazi "nepravilno savijeni" ili "nekorektno savijeni" ili "pogrešno savijeni" upotrebljavaju jedan umesto drugog, takođe bi trebalo razumeti da ovi izrazi takođe treba da obuhvate agregirane vrste, zato što je takođe utvrđeno da su mešovite smole efektivne za odstranjivanje agregiranih vrsta u istim eluiranim frakcijama za koje je utvrđeno da sadrže pogrešno savijene vrste. U stvari, etanercept formira oligomere povezane disulfidom, kao što je viđeno u SDS-PAGE. Takvi oligomeri se eluiraju uglavnom ispiranjem sa 1 M arginina, što ukazuje na njihovu jaču hidrofobnu interakciju sa smolama. Shodno tome, za etanercept izgleda da i Capto<TM>MMC, i Capto<TM>Adhere mogu dovesti do istovremenog odstranjivanja pogrešno savijenih i agregiranih vrsta. Odstranjivanje pogrešno savijenog materijala i agregata, bilo da je kovalentan ili nekovalentan, je veoma poželjno da bi se obezbedili bezbedniji biofarmaceutici zbog potencijalne imunogenosti agregiranog materijala (bilo da je korektno ili nekorektno savijen).

[0120] Što se tiče efekata arginina u prethodnim primerima, evidentno je da arginin (arginin hidrohlorid) služi ne samo kao so, već da takođe slabi hidrofobnu interakciju. U odgovarajućoj oblasti je poznato da arginin sprečava agregaciju proteina i površinsku adsorpciju. Pored toga, arginin sadejstvuje sa aromatičnim grupama i time remeti aromatično-aromatičnu ili aromatično-katjonsku interakciju između proteina ili između proteina i površine. I Capto<TM>MMC, i Capto<TM>Adhere poseduju aromatičnu grupu koja može doprineti vezivanju proteina. Nije moglo biti predviđeno da bi takav mod vezivanja bio efektivno prekinut argininom, a ne sa NaCl. Arginin takođe slabi interakciju između masnih kiselina, što sugeriše da on može prekinuti hidrofobnu interakciju, koja nije posredovana aromatičnim grupama. Hidrofobna priroda arginina, mada nije jasno mehanicistički razjašnjena, shodno tome, može igrati važnu ulogu u modulaciji interakcije protein-protein i površinske adsorpcije, a zato i u eluiranju proteina iz mešovite smole. Međutim, kao što je pokazano u primeru 12 gore, nije neophodno koristiti arginin da bi se izveo predmetni pronalazak radi dobijanja preparata etanercepta sa ekstremno visokom čistoćom. Ovo je možda usled slabog hidrofobnog doprinosa Capto MMC i Capto Adhere smola vezivanju proteina. Ipak, upotreba arginina u kombinaciji sa NaCl može poboljšati rekuperaciju i separaciju mešovite hromatografije za proteine.

DODATAK A

NAREDNI PRIMERI IZVOĐENJA OTKRIVANJA

[0121]

A. Mešoviti hromatografski postupak za razdvajanje korektno savijenog proteina od nekorektno savijenog proteina, koji sadrži korake:

(a) vezivanje prve smeše proteina koja sadrži i korektno savijenu i nekorektno savijenu konformaciju datog proteina za mešovitu hromatografsku smolu koja ima i jonoizmenjivačke radikale, i hidrofobne radikale;

(b) eluiranje korektno savijenog proteina iz mešovite smole da bi se dobila druga smeša proteina koja sadrži veći udeo korektno savijenog proteina od prve smeše proteina.

B. Postupak prema primeru izvođenja A, pri čemu je mešovita hromatografska smola Capto<TM>MMC mešovita hromatografska smola.

C. Postupak prema primeru izvođenja A pri čemu je mešovita hromatografska smola Capto<TM>Adhere mešovita hromatografska smola.

D. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A-C, pri čemu korektno i nekorektno savijene konformacije proteina sadrže korektno savijeni i nekorektno savijeni etanercept.

E. Postupak prema primeru izvođenja D, pri čemu nekorektno savijeni etanercept sačinjava manje od oko 10 tež. %, a prvenstveno manje od oko 5 tež. % eluata dobijenog u koraku (b); korektno savijeni etanercept sačinjava više od oko 90 tež. % a prvenstveno više od oko 95 tež. % eluata dobijenog u koraku (b); i kombinovana količina korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta sačinjava najmanje oko 95 tež. procenata, a prvenstveno najmanje oko 98 tež. % eluata dobijenog u koraku (b).

F. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A do E, pri čemu je mešovita smola Capto<TM>MMC, a koraci (a) i (b) postupka se izvode pri pH između oko 4.5 i oko 7.5; a korak eluiranja (b) se izvodi dovođenjem mešovite smole u kontakt sa slanim rastvorom.

G. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A do E, pri čemu je mešovita smola Capto<TM>Adhere, a koraci (a) i (b) se izvode pri pH od oko 4.5 do oko 8.5; i korak eluiranja (b) se izvodi dovođenjem mešovite smole u kontakt sa slanim rastvorom, pri čemu pomenuti rastvor opciono dalje sadrži arginin.

H. Postupak prema primerima izvođenja F ili G, pri čemu se slani rastvor primenjuje u koraku (b) sa gradijentom, pri čemu se koncentracija soli postepeno povećava.

I. Postupak prema primeru izvođenja H pri čemu gradijent koncentracije soli iz koraka (b) izaziva povećanje koncentracije soli od oko 0 do oko 1 M.

J. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja F do I pri čemu je so izabrana između natrijum hlorida i natrijum sulfata.

K. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A do J, pri čemu se tokom koraka (b) postepeno menja pH rastvora dovođenjem u kontakt sa smolom u koraku (b).

L. Postupak prema primeru izvođenja K, pri čemu se pH postepeno povećava.

M. Postupak prema primeru izvođenja K, pri čemu se pH postepeno smanjuje.

N. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A do M, pri čemu je količina korektno savijenog proteina dobijenog u eluatu iz koraka (b) najmanje oko 60 tež. % količine proteina prisutnog u smeši proteina uvedenoj u smolu u koraku (a).

O. Postupak prema primeru izvođenja N, pri čemu je količina korektno savijenog proteina najmanje oko 70 tež. % količine proteina prisutnog u smeši proteina uvedenoj u smolu u koraku (a).

P. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A-O, u kome se smeša proteina koja sadrži najmanje 90 tež. % korektno savijenog etanercepta, a prvenstveno manje od oko 5 tež. % nekorektno savijenog etanercepta dobija bez izvođenja ili bez potrebe za izvođenjem bilo kog od koraka hromatografskog razdvajanja ili prečišćavanja da bi se korektno savijeni razdvojio od nekorektno savijenog etanercepta, osim sledećih:

(1) jedan ili više koraka prečišćavanja, a prvenstveno koji sadrži korak hromatografskog prečišćavanja proteina A, gde se takav korak, odn. koraci koriste za prečišćavanje fluida sakupljenih ćelijskih kultura koji sadrži proteine bazirane na etanerceptu, i gde takav korak prečišćavanja ne dovodi do bilo kakvog značajnijeg razdvajanja korektno od nekorektno savijenog etanercepta.

(2) mešovitih hromatografskih koraka (a) i (b) navedenih u primeru izvođenja 1; i

(3) SEC, HIC ili drugih analitičkih hromatografskih koraka koji se izvode isključivo za svrhe analize.

Q. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A do P, pri čemu se količina proteina prisutna u eluatu iz koraka (b) određuje pomoću UV apsorbanse na A 280; količina korektno savijenog etanercepta u eluatu iz koraka B se određuje hidrofobnom interaktivnom hromatografijom; a kombinovana količina korektno i nekorektno savijenog etanercepta prisutnog u eluatu iz koraka (b) se određuje gel hromatografijom.

R. Mešoviti hromatografski postupak za prečišćavanje smeše proteina da bi se razdvojio korektno savijeni etanercept od nekorektno savijenog etanercepta prisutnih u pomenutoj smeši, pri čemu postupak sadrži korake:

(a) dovođenja u kontakt mešovite hromatografske smole koja ima hidrofobne radikale i jonoizmenjivačke radikale sa rastvorom koji sadrži smešu proteina koja sadrži korektno savijeni etanercept i nekorektno savijeni etanercept, tako da se i korektno i nekorektno savijeni etanercept fiksiraju, vezuju ili hvataju za mešovitu hromatografsku smolu; i

(b) dovođenje u kontakt mešovite smole sa rastvorom koji može da eluira proteine etanercepta iz mešovite hromatografske smole da bi se dobio eluat u kome je odnos količine korektno savijenog etanercepta prema nekorektno savijenom etanerceptu veći od onog u smeši proteina uvedenoj u smolu u koraku (a).

S. Postupak prema primeru izvođenja R, pri čemu je mešovita hromatografska smola Capto<TM>MMC mešovita hromatografska smola.

T. Postupak prema primeru izvođenja R, pri čemu je mešovita hromatografska smola Capto<TM>Adhere mešovita hromatografska smola.

U. Postupak prema primerima izvođenja A-T, pri čemu

(A) nekorektno savijeni etanercept sačinjava manje od oko 5 tež. procenata eluata dobijenog u koraku (b); korektno savijeni etanercept sačinjava više od oko 90 tež. % eluata dobijenog u koraku (b); i kombinovana količina korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta sačinjava najmanje oko 95 tež. procenata eluata dobijenog u koraku (b); ili

(B) eluat, ili njegov deo, dobijen u koraku (b) sadrži korektno savijeni etanercept i ne sadrži ili u suštini ne sadrži nekorektno savijeni etanercept.

V. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A do U, pri čemu je mešovita smola Capto<TM>MMC, a koraci (a) i (b) postupka se izvode pri pH između oko 4.5 i oko 7.5; i korak eluiranja (b) se izvodi dovođenjem mešovite smole u kontakt sa slanim rastvorom.

W. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja R do V, pri čemu je mešovita smola Capto<TM>Adhere, a koraci (a) i (b) se izvode pri pH od oko 4.5 do oko 8.5; i korak eluiranja (b) se izvodi dovođenjem mešovite smole u kontakt sa slanim rastvorom, pri čemu pomenuti rastvor opciono dalje sadrži arginin.

X. Postupak prema primerima izvođenja V ili W, pri čemu se slani rastvor primenjuje u koraku (b) sa gradijentom tako da se koncentracija soli postepeno povećava.

Y. Postupak prema primeru izvođenja X, pri čemu gradijent koncentracije soli iz koraka (b) izaziva povećanje koncentracije soli od oko 0 do oko 1 M.

Z. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja V do Y, pri čemu je so izabrana između natrijum hlorida i natrijum sulfata.

AA. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja R do Z, pri čemu se tokom koraka (b) pH rastvora dovođenjem u kontakt sa smolom iz koraka (b) postepeno povećava ili postepeno smanjuje.

BB. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja R do AA, pri čemu je količina korektno savijenog proteina dobijenog u eluatu iz koraka (b) najmanje oko 60 tež. %, a prvenstveno najmanje oko 70 tež. % količine proteina prisutne u smeši proteina uvedenoj u smolu u koraku (a).

CC. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A do BB, pri čemu se postupak izvodi dva ili više puta na sledeći način:

izvođenje prve separacije u mešovitom modu (separacija #1) izvođenjem koraka (a) i (b); što je praćeno

izvođenjem druge separacije u mešovitom modu (separacija #2): izvođenjem koraka (a) i (b) ponovo;

pri čemu se eluat dobijen u koraku (b) separacije #1 upotrebljava kao rastvor koji sadrži smešu proteina u koraku (a) separacije #2.

DD. Postupak prema primeru izvođenja CC, pri čemu je mešovita smola koja se upotrebljava u separaciji #1 ista ili različita od mešovite smole koja se upotrebljava u separaciji #2.

EE. Postupak prema primeru izvođenja DD, pri čemu se separacija #1 i separacija #2 izvode na način koji je izabran između sledećih kombinacija:

Separacija # 1 upotrebljava CAPTO MMC kao mešovitu hromatografsku smolu i Separacija # 2 upotrebljava CAPTO ADHERE kao mešovitu hromatografsku smolu;

--------

Separacija # 1 upotrebljava CAPTO ADHERE kao mešovitu hromatografsku smolu i Separacija # 2 upotrebljava CAPTO MMC kao mešovitu hromatografsku smolu;

--------

Separacija # 1 upotrebljava CAPTO MMC kao mešovitu hromatografsku smolu i Separacija # 2 upotrebljava CAPTO MMC kao mešovitu hromatografsku smolu; ili

--------

Separacija # 1 upotrebljava CAPTO ADHERE kao mešovitu hromatografsku smolu i Separacija # 2 upotrebljava CAPTO ADHERE kao mešovitu hromatografsku smolu.

FF. Postupak prema primeru izvođenja EE, pri čemu se separacija #1 i separacija #2 izvode na sledeći način: Separacija # 1 upotrebljava CAPTO<TM>MMC kao mešovitu hromatografsku smolu; i Separacija # 2 upotrebljava CAPTO<TM>ADHERE kao mešovitu hromatografsku smolu.

GG. Smeša proteina koja sadrži etanercept, ili farmaceutski prihvatljiva formulacija koja sadrži pomenutu smešu, dobijenu postupkom prema bilo kom od primera izvođenja A do FF i pri čemu pomenuta smeša proteina sadrži korektno savijeni etanercept u količini koja sačinjava više od oko 90 tež. % smeše proteina; i koja sadrži nekorektno savijeni etanercept u količini koja sačinjava manje od oko 5 tež. % smeše proteina; i pri čemu smeša proteina ima kombinovanu količinu korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta koja sačinjava najmanje oko 95, a prvenstveno najmanje oko 98 tež. % smeše proteina koja sadrži etanercept.

HH. Farmaceutski prihvatljiva formulacija koja sadrži etanercept visoke čistoće podesna za administraciju subjektu kome je potrebno lečenje za stanje posredovano sa TNF alfa, pri čemu pomenuta formulacija sadrži smešu proteina koja sadrži veću količinu korektno savijenog etanercepta i manju količinu nekorektno savijenog etanercepta, pri čemu:

(i) nekorektno savijeni etanercept sačinjava manje od oko 10 tež. %, a prvenstveno manje od oko 8 tež. % i najpoželjnije manje od oko 5 tež. % smeše proteina;

(ii) korektno savijeni etanercept sačinjava više od 90 tež. %, a prvenstveno više od oko 92 tež. % a prvenstveno više od oko 95 tež. % smeše proteina; i

(iii) ukupna količina korektno savijenog etanercepta i nekorektno savijenog etanercepta (ali bez njihovih agregata) sačinjava najmanje 95, a prvenstveno najmanje 98 tež.% smeše proteina;

pri čemu formulacija dalje sadrži farmaceutski prihvatljive neaktivne sastojke, ekscipijense ili nosače koji čine formulaciju podesnom za administraciju subjektu.

II. Formulacija prema primeru izvođenja HH, pri čemu preparat etanercepta sačinjava od oko 25 do oko 75 mg/ml formulacije, i formulacija dalje sadrži saharozu, natrijum hlorid, L-arginin hidrohlorid i natrijum fosfat.

JJ. Postupak za proizvodnju smeše proteina koja sadrži etanercept koji ima visoku čistoću u pogledu količine korektno savijenog prema nekorektno savijenom etanerceptu prisutnom u njoj, pri čemu pomenuti postupak sadrži korake:

(1) izražavanja etanercepta u sisarskom ekspresionom sistemu da bi se dobio fluid sakupljenih ćelijskih kultura koji sadrži smešu proteina koja sadrži etanercept, a koja sadrži i korektno savijeni, i nekorektno savijeni etanercept;

(2) podvrgavanja fluida sakupljenih ćelijskih kultura dobijenog u koraku 1 procesu prečišćavanja, čime se dobija smeša proteina koja sadrži etanercept sa smanjenom količinom ili u suštini bez nepoželjnih nečistoća prisutnih u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura proizvedenom u koraku (1);

(3) dovođenja u kontakt smeše proteina dobijene u koraku (2) koja sadrži etanercept jednom ili više puta sa mešovitom hromatografskom smolom koja ima i jonoizmenjivačke radikale, i hidrofobno interaktivne radikale da bi se proteini sadržani u smeši vezali za smolu; i

4) dovođenja u kontakt smole koja na sebi ima vezan protein iz koraka 3 sa rastvorom za eluiranje korektno savijenog etanercepta iz mešovite smole da bi se dobio eluat koji sadrži smešu proteina koja sadrži etanercept koja ima veći udeo korektno savijenog etanercepta u odnosu na nekorektno savijeni etanercept od smeše koja sadrži etanercept uvedene u smolu u koraku 3;

pri čemu:

(i) količina proteina prisutnog u smeši proteina koja sadrži etanercept dobijenoj prečišćavanjem u koraku 2 je najmanje oko 80 tež. % količine smeše proteina baziranih na etanerceptu prisutnog u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura dobijenom u koraku 1.

(ii) kombinovana količina korektno i nekorektno savijenog proteina etanercepta prisutnog u smeši proteina eluiranog u koraku 4 je najmanje oko 60 tež. % njegove količine prisutne u smeši proteina dobijenoj u koraku 2;

(iii) količina korektno savijenog etanercepta prisutnog u eluatu iz koraka 4 je najmanje oko 30 tež. %, a prvenstveno najmanje oko 35 tež. % količine smeše proteina koja sadrži etanercept prisutne u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura dobijenom u koraku 1; i

(iv) pomenuti korektno savijeni etanercept sačinjava najmanje oko 90 tež. % eluata dobijenog u koraku 4, a prvenstveno najmanje oko 95 tež. % eluata dobijenog u koraku 4.

KK. Postupak prema primeru izvođenja JJ, pri čemu je mešovita smola izabrana iz grupe koja se sastoji od CAPTO MMC i CAPTO ADHERE.

LL. Postupak prema primerima izvođenja JJ ili KK koji sadrži sledeće dodatne korake:

Korak (5): dovođenje u kontakt smeše proteina dobijene u eluatu iz koraka 4 sa mešovitom hromatografskom smolom koja ima i jonoizmenjivačke radikale, i hidrofobno interaktivne radikale da bi se proteini sadržani u smeši vezali za smolu, a zatim;

korak (6) dovođenja u kontakt smole sa rastvorom da bi se eluirao korektno savijeni etanercept iz nje da bi se dobio eluat koji sadrži smešu proteina koja ima veći udeo korektno savijenog u odnosu na nekorektno savijeni etanercept;

pri čemu je mešovita smola koja se upotrebljava u pomenutim dodatnim koracima 5 i 6 ista ili različita od mešovite smole upotrebljene u koracima 3 i 4

MM. Postupak prema primeru izvođenja LL, pri čemu je mešovita smola koja se upotrebljava u koraku (3) i (4) CAPTO MMC i smola koja se upotrebljava u koracima (5) i (6) je CAPTO ADHERE.

NN. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja JJ do MM, pri čemu se korak 4 (i/ili korak 6 u slučaju prema primeru izvođenja LL) izvodi dovođenjem u kontakt mešovite smole sa slanim rastvorom da bi se eluirao korektno savijeni etanercept iz mešovite smole, i opciono (i), pri čemu se koncentracija slanog rastvora postepeno povećava u koracima (4) ili (6) tokom pomenutog dovođenja u kontakt rastvora sa smolom; i opciono (ii) pH eluiranog rastvora se postepeno povećava ili smanjuje u koracima (4) i/ili (6) tokom pomenutog dovođenja u kontakt rastvora sa smolom.

OO. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja JJ do NN, pri čemu se proizvod dobijen u jednom ili više koraka postupka podvrgava filtriranju, kao što je filtriranje virusa i/ili filtriranje tangencijalnim strujanjem.

PP. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja JJ do OO, pri čemu se korak 2 izvodi upotrebom kolone za hromatografiju sa proteinom A.

QQ. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja JJ do OO, pri čemu se korak 2 izvodi korišćenjem mešovite smole koja ima hidrofobne i jonoizmenjivačke radikale.

RR. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A-PP u kome se smeša proteina koja sadrži najmanje 90 tež. % korektno savijenog etanercepta, a prvenstveno manje od oko 5 tež. % nekorektno savijenog etanercepta dobija bez izvođenja bilo kakvog koraka hromatografskog razdvajanja ili prečišćavanja da bi se razdvojio korektno savijeni od nekorektno savijenog etanercepta, različitih od jednog ili više sledećih koraka:

(1) opciono, jednog ili više koraka prečišćavanja, a prvenstveno koji sadrže korak prečišćavanja hromatografijom sa proteinom A, pri čemu se takav korak, odn. koraci upotrebljava za prečišćavanje fluida sakupljenih ćelijskih kultura koji sadrži proteine bazirane na etanerceptu, pri čemu korak prečišćavanja ne razdvaja korektno od nekorektno savijenog etanercepta;

(2) pomenuto jedno ili više izvođenja mešovitih hromatografskih koraka (3) i (4) navedenih u primeru izvođenja A (ili koraka 3, 4, 5 i 6 kao u primeru izvođenja LL); i

(3) opciono, jedan ili više SEC, HIC ili drugih analitičkih hromatografskih koraka koji se izvode isključivo za svrhe analize.

SS. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja A do RR, koji isključuju upotrebu jednostruke hidrofobne interaktivne hromatografije kao sredstva za razdvajanje korektno savijenog etanercepta od nekorektno savijenog etanercepta, osim kada se izvodi isključivo za svrhe analize.

TT. Postupak za lečenje subjekta koji boluje od bolesti posredovane sa TNF, koja sadrži korake davanja takvom pojedincu farmaceutske formulacije koja sadrži smešu proteina koja sadrži korektno savijeni etanercept i nekorektno savijeni etanercept, pri čemu je pomenuta smeša dobijena postupkom prema bilo kom od primera izvođenja A do SS, pri čemu je količina nekorektno savijenog etanercepta u smeši proteina manja od oko 5 tež. % pomenute smeše.

UU. Postupak prema primeru izvođenja TT, pri čemu je količina nekorektno savijenog etanercepta u smeši proteina manja od oko 3 tež. % pomenute smeše i količina korektno savijenog etanercepta u smeši je veća od oko 95 tež. % pomenute smeše.

VV. Postupak za lečenje subjekta koji boluje od bolesti posredovane sa TNF, koji sadrži korake davanja takvom pojedincu farmaceutske formulacije koja sadrži smešu proteina koja sadrži korektno savijeni etanercept i nekorektno savijeni etanercept, pri čemu je količina nekorektno savijenog etanercepta u smeši proteina manja od oko 5 tež. % pomenute smeše.

WW. Postupak prema primerima izvođenja TT-VV, pri čemu je količina nekorektno savijenog etanercepta u smeši proteina manja od oko 3 tež. % pomenute smeše i količina korektno savijenog etanercepta u smeši je veća od oko 95 tež. % smeše.

XX. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja TT-VV, pri čemu je kombinovana količina korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta (isključujući njihove agregate) najmanje oko 95 tež. % pomenute smeše.

YY. Postupak prema primeru izvođenja XX, pri čemu je kombinovana količina korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta (isključujući njihove agregate) najmanje oko 98 tež. % pomenute smeše.

ZZ. Postupci ili kompozicije prema bilo kom od primera izvođenja A do YY, pri čemu se podrazumeva da izraz "nekorektno savijeni etanercept", ukoliko nije drugačije naglašeno, obuhvata agregate koji sadrže korektno savijeni i/ili nekorektno savijeni etanercept.

AAA. Postupak prema primerima izvođenja JJ do QQ, pri čemu se količina proteina na bazi etanercepta sadržanog u sakupljenoj ćelijskoj kulturi iz koraka 1 određuje pomoću Fc elise.

BBB. Postupak prema bilo kom od primera izvođenja JJ-QQ, pri čemu se količina proteina baziranih na etanerceptu prisutnih u eluatima dobijenim od mešovite smole u koraku 4 (ili kao u slučaju prema primeru izvođenja LL, koraci 4 i 6) određuje pomoću UV apsorbanse na A280.

CCC. Postupak prema primeru izvođenja BBB, pri čemu se količina proteina baziranih na etanerceptu u proizvodu dobijenom iz procesa prečišćavanja u koraku 2 određuje pomoću UV apsorbanse na A280 ili pomoću Fc elise.

DDD. Postupak za razdvajanje korektno savijenog etanercepta od nekorektno savijenog etanercepta, pri čemu se upotrebljavaju hromatografska sredstva za realizaciju tog razdvajanja, i pri čemu se hromatografska sredstva sastoje isključivo ili suštinski od mešovite hromatografije u kojoj se smeša koja sadrži korektno savijeni i nekorektno savijeni etanercept dovodi u kontakt sa mešovitom hromatografskom smolom koja ima jonoizmenjivačke i hidrofobne radikale, a zatim se eluira iz nje da bi se dobio eluat koji sadrži najmanje oko 85, a prvenstveno najmanje oko 90, i najpoželjnije najmanje oko 95 tež. % korektno savijenog etanercepta.

EEE. Postupak prema primeru izvođenja DDD, pri čemu je mešovita smola izabrana između CAPTO MMC i CAPTO ADHERE; eluiranje se izvodi sa slanim rastvorom, opciono primenjenim uz upotrebu rastućeg gradijenta koncentracije soli; pH slanog rastvora je u opsegu od oko 4 do oko 8.5, primenjuje se opciono u gradijentu u kome se pH postepeno povećava ili smanjuje; i pri čemu se eluat dobija od smole tokom vremenskog perioda, a eluat koji se sakuplja rano u toku pomenutog perioda ne sadrži ili u suštini ne sadrži nekorektno savijeni etanercept.

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Mešoviti hromatografski postupak za razdvajanje korektno savijenog etanercepta od nekorektno savijenog etanercepta, koji sadrži korake:

(a) vezivanje prve smeše proteina koja sadrži etanercept i to i korektno savijenu i nekorektno savijenu konformaciju etanercepta za mešovitu hromatografsku smolu koja ima i jonoizmenjivačke radikale, i hidrofobne radikale;

(b) eluiranje korektno savijenog etanercepta iz mešovite smole dovođenjem mešovite smole u kontakt sa slanim rastvorom da bi se dobila druga smeša proteina koja sadrži etanercept, a koja sadrži veći udeo korektno savijenog etanercepta od prve smeše etanercepta.

2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je mešovita hromatografska smola Capto<TM>MMC mešovita hromatografska smola ili Capto<TM>Adhere mešovita hromatografska smola.

3. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu nekorektno savijeni etanercept sačinjava manje od oko 10 tež. % eluata dobijenog u koraku (b); korektno savijeni etanercept sačinjava više od oko 90 tež. % eluata dobijenog u koraku (b); i kombinovana količina korektno savijenog i nekorektno savijenog etanercepta sačinjava najmanje oko 95 tež. % eluata dobijenog u koraku (b).

4. Postupak prema zahtevu 3, pri čemu je mešovita smola Capto<TM>Adhere i koraci (a) i (b) se izvode na pH od oko 4.5 do oko 8.5; pomenuti slani rastvor opciono dalje sadrži arginin.

5. Postupak prema zahtevu 3, pri čemu se slani rastvor primenjuje u koraku (b) sa gradijentom, pri čemu se koncentracija soli postepeno povećava.

6. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu se tokom koraka (b) pH slanog rastvora koji se dovodi u kontakt sa smolom u koraku (b) postepeno menja.

7. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je količina korektno savijenog proteina najmanje oko 70 tež.

% količine proteina prisutnih u smeši proteina uvedenoj u smolu u koraku (a).

8. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu se smeša proteina koja sadrži najmanje 90 tež. % korektno savijenog etanercepta dobija bez izvođenja, ili bez potrebe za izvođenjem bilo kakvih koraka hromatografske separacije ili prečišćavanja da bi se razdvojio korektno savijeni od nekorektno savijenog etanercepta, osim sledećih:

(1) jednog ili više koraka prečišćavanja, gde se takav korak, odn. koraci koriste isključivo za odstranjivanje nečistoća koje nisu bazirane na etanerceptu;

(2) mešovitih hromatografskih koraka (a) i (b) navedenih u zahtevu 1; i

(3) SEC, HIC ili drugih analitičkih hromatografskih koraka koji se izvode isključivo za svrhe analize.

9. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu se postupak izvodi dva ili više puta na sledeći način:

izvođenjem prve separacije u mešovitom modu (separacija #1) izvođenjem koraka (a) i (b); praćenim izvođenjem druge separacije u mešovitom modu (separacija #2): izvođenjem koraka (a) i (b) ponovo;

pri čemu se eluat dobijen u koraku (b) separacije #1 upotrebljava kao rastvor koji sadrži smešu proteina u koraku (a) separacije #2.

10. Postupak prema zahtevu 9, pri čemu se separacija #1 i separacija #2 izvode na način koji je izabran između sledećih kombinacija:

Separacija # 1 upotrebljava CAPTO MMC kao mešovitu hromatografsku smolu i Separacija # 2 upotrebljava CAPTO ADHERE kao mešovitu hromatografsku smolu;

Separacija # 1 upotrebljava CAPTO ADHERE kao mešovitu hromatografsku smolu i Separacija # 2 upotrebljava CAPTO MMC kao mešovitu hromatografsku smolu;

Separacija # 1 upotrebljava CAPTO MMC kao mešovitu hromatografsku smolu i Separacija # 2 upotrebljava CAPTO MMC kao mešovitu hromatografsku smolu; ili Separacija # 1 upotrebljava CAPTO ADHERE kao mešovitu hromatografsku smolu i Separacija # 2 upotrebljava CAPTO ADHERE kao mešovitu hromatografsku smolu.

11. Postupak za proizvodnju smeše proteina koja sadrži etanercept i ima visoku čistoću u pogledu količine korektno savijenog prema nekorektno savijenom etanerceptu prisutnu u njoj, pri čemu pomenuti postupak sadrži korake:

(1) izražavanja etanercepta u sisarskom ekspresionom sistemu da bi se dobio fluid sakupljenih ćelijskih kultura koji sadrži smešu proteina koja sadrži etanercept, a koja sadrži i korektno savijeni, i nekorektno savijeni etanercept;

(2) podvrgavanja fluida sakupljenih ćelijskih kultura dobijenog u koraku 1 procesu prečišćavanja, čime se dobija smeša proteina koja sadrži etanercept sa smanjenom količinom ili u suštini bez nepoželjnih nečistoća prisutnih u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura proizvedenom u koraku (1);

(3) dovođenja u kontakt smeše proteina dobijene u koraku (2) koja sadrži etanercept jednom ili više puta sa mešovitom hromatografskom smolom koja ima i jonoizmenjivačke radikale, i hidrofobno interaktivne radikale da bi se proteini sadržani u smeši vezali za smolu; i

4) dovođenja u kontakt smole koja na sebi ima vezan protein iz koraka 3 sa rastvorom za eluiranje korektno savijenog etanercepta iz mešovite smole da bi se dobio eluat koji sadrži smešu proteina koja sadrži etanercept koja ima veći udeo korektno savijenog etanercepta u odnosu na nekorektno savijeni etanercept od smeše koja sadrži etanercept uvedene u smolu u koraku 3;

pri čemu:

(i) količina proteina prisutnog u smeši proteina koja sadrži etanercept dobijenoj prečišćavanjem u koraku 2 je najmanje oko 80 tež. % količine smeše proteina baziranih na etanerceptu prisutnog u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura dobijenom u koraku 1.

(ii) kombinovana količina korektno i nekorektno savijenog proteina etanercepta prisutnog u smeši proteina eluiranog u koraku 4 je najmanje oko 60 tež. % njegove količine prisutne u smeši proteina dobijenoj u koraku 2;

(iii) količina korektno savijenog etanercepta prisutnog u eluatu iz koraka 4 je najmanje oko 30 tež. % količine smeše proteina koja sadrži etanercept prisutne u fluidu sakupljenih ćelijskih kultura dobijenom u koraku 1; i

(iv) pomenuti korektno savijeni etanercept sačinjava najmanje oko 90 tež. % eluata dobijenog u koraku 4.

12. Postupak prema zahtevu 11, pri čemu je mešovita smola izabrana iz grupe koja se sastoji od CAPTO MMC i CAPTO ADHERE.

13. Postupak prema zahtevu 12, koji sadrži sledeće dodatne korake:

Korak (5): dovođenje u kontakt smeše proteina dobijene u eluatu iz koraka 4 sa mešovitom hromatografskom smolom koja ima i jonoizmenjivačke radikale, i hidrofobno interaktivne radikale da bi se proteini sadržani u smeši vezali za smolu, a zatim;

korak (6) dovođenja u kontakt smole sa rastvorom da bi se eluirao korektno savijeni etanercept iz nje da bi se dobio eluat koji sadrži smešu proteina koja ima veći udeo korektno savijenog u odnosu na nekorektno savijeni etanercept;

pri čemu je mešovita smola koja se upotrebljava u pomenutim dodatnim koracima 5 i 6 ista ili različita od mešovite smole upotrebljene u koracima 3 i 4.

14. Postupak prema zahtevu 1, koji isključuje upotrebu jednostruke hidrofobne interakcione hromatografije kao sredstva za razdvajanje korektno savijenog etanercepta od nekorektno savijenog etanercepta, izuzev kada se izvodi isključivo za svrhe analize.