RS57080B1 - Identifikacija antigena povezanih sa tumorom za dijagnostiku i terapiju - Google Patents

Description

Opis pronalaska

[0001] Uprkos interdisciplinarnim pristupima i širokoj primeni klasičnih terapeutskih procedura, kanceri se još uvek nalaze među vodećim uzrocima smrti. Noviji terapeutski koncepti ciljaju na uključivanje pacijentovog imunog sistema u sveukupni terapeutski koncept putem korišćenja rekombinantnih tumorskih vakcina i drugih specifičnih mera, kao što je terapija antitelima. Preduslov za uspeh takve strategije je prepoznavanje antigena koji su specifični za tumor ili su povezani sa tumorom ili epitopa od strane pacijentovog imunog sistema čije efektorske funkcije treba da se pojačaju intervencijom. Tumorske ćelije se biološki suštinski razlikuju od nemalignih ćelija od kojih potiču. Ove razlike potiču od genetskih promena nastalih tokom razvoja tumora i rezultuju, između ostalog, i formiranjem kvalitativno ili kvantitativno promenjenih molekulskih struktura u ćelijama kancera. Strukture ove vrste povezane sa tumorima koje prepoznaje specifični imuni sistem domaćina koji ima tumor se nazivaju antigenima povezanim sa tumorom. Specifično prepoznavanje antigena povezanih sa tumorom obuhvata celularne i humoralne mehanizme, koji su dve funkcionalno međusobno povezane jedinice: CD4<+>i CD8<+>T limfociti prepoznaju procesuirane antigene prezentovane na MHC (glavni kompleks histokompatibilnosti, engl. major histocompatibility complex) molekulima klasa II i I, respektivno, dok B limfociti stvaraju molekule cirkulišućih antitela koji se vezuju direktno za neprocesuirane antigene. Potencijalni kliničko-terapeutski značaj antigena povezanih sa tumorom potiče od činjenice da prepoznavanje antigena na neoplastičnim ćelijama od strane imunog sistema dovodi do inicijacije citotoksičnih efektorskih mehanizama i, u prisustvu T pomoćnih ćelija, može izazvati eliminaciju ćelija kancera (Pardoll, Nat. Med.4:525-31, 1998). Shodno tome, centralni cilj tumorske imunologije je da se molekulski definišu ove strukture. Molekulska priroda ovih antigena je bila zagonetna tokom dužeg perioda. Tek posle razvoja odgovarajućih tehnika kloniranja postalo je moguće da se sistemski pretražuju kDNK ekspresione biblioteke (engl. cDNA) tumora u potrazi za antigenima povezanim sa tumorom analiziranjem ciljnih struktura citotoksičnih T limfocita (CTL) (van der Bruggen et al., Science 254:1643-7, 1991) ili korišćenjem cirkulišućih autoantitela (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol.

9:709-16, 1997) kao proba. Za te svrhe su od svežeg tumorskog tkiva bile pripremljene kDNK ekspresione biblioteke, pa su zatim rekombinantno izražene kao proteini u podesnim sistemima. Za kloniranje odgovarajućih antigena su korišćeni imunoefektori izolovani od pacijenata, odnosno CTL klonovi sa procesima lize specifičnim za tumor, ili cirkulišuća autoantitela.

[0002] Ovim pristupima je tokom prethodnih godina bilo definisano mnoštvo antigena u različitim neoplazijama.

[0003] Međutim, probe koje su korišćene za identifikaciju antigena u klasičnim metodima su imunoefektori (cirkulišuća autoantitela ili CTL klonovi) pacijenata koji obično imaju već uznapredovali kancer. Brojni podaci ukazuju da tumori mogu dovesti, na primer, do tolerizacije i anergizacije T ćelija i da se u toku bolesti iz imunoefektorskog repertoara naročito gube one specifičnosti koje bi mogle izazvati efektivno imuno prepoznavanje. Aktuelne studije na pacijentima još uvek nisu dale bilo kakav čvrst dokaz o stvarnom dejstvu prethodno otkrivenih i korišćenih antigena povezanih sa tumorom. Shodno tome, ne može biti isključeno da su proteini koji pobuđuju spontane imune reakcije pogrešne ciljne strukture.

[0004] Cilj predmetnog pronalaska je da se realizuju ciljne strukture za dijagnostiku i terapiju kancera.

[0005] Ovaj cilj je ostvaren predmetom patentnih zahteva.

[0006] Prema predmetnom otkrivanju su identifikovani geni koji su selektivno ili nenormalno izraženi u tumorskim ćelijama, na osnovu toga su realizovani antigeni povezani sa tumorom. Ovi geni i/ili njihovi genetski proizvodi i/ili njihovi derivati i/ili fragmenti su korisni kao ciljne strukture za terapeutske i dijagnostičke pristupe.

[0007] Antigeni povezani sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju imaju aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleinskom kiselinom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od (a) nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline sa SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62, i 64-67 iz liste sekvenci, njenog dela ili derivata, (b) nukleinske kiseline koja se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom pod (a) pod specifičnim uslovima, (c) nukleinske kiseline koja se degeneriše u odnosu na nukleinsku kiselinu pod (a) ili (b), i (d) nukleinske kiseline koja je komplementarna sa nukleinskom kiselinom pod (a), (b) ili (c). U poželjnom primeru izvođenja, antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ima aminokiselinsku sekvencu kodiranu nukleinskom kiselinom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62, i 64-67 iz liste sekvenci. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema predmetnom otkrivanju sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68, i 69 iz liste sekvenci, njenog dela ili derivata.

[0008] Predmetno otkrivanje se generalno odnosi na primenu antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju ili njihovih delova ili derivata, nukleinske kiseline koje kodiraju antigene povezane sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju ili njihove delove ili derivate ili nukleinske kiseline koje su usmerene protiv pomenutih nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene povezane sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju ili njihove delove ili derivate i/ili ćelije domaćine koje izražavaju antigene povezane sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju ili njihove delove ili derivate za terapiju, profilaksu, dijagnostiku i/ili praćenje neoplastičnih bolesti. Ovo takođe može obuhvatati primenu kombinacije dva ili više ovih antigena, nukleinskih kiselina, antitela, T ćelija i/ili ćelija domaćina, u jednom primeru izvođenja takođe u kombinaciji sa antigenima povezanim sa tumorom drugačijim od onih koji su identifikovani prema otkrivanju, nukleinskim kiselinama koje ih kodiraju ili nukleinskim kiselinama koje su usmerene protiv pomenutih kodirajućih nukleinskih kiselina, antitela ili T ćelija usmerenih protiv pomenutih antigena povezanih sa tumorom i/ili ćelija domaćina koje izražavaju pomenute antigene povezane sa tumorom.

[0009] U onim primerima izvođenja otkrivanja koji se odnose na primenu antitela usmerenih protiv antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju ili njihovih delova ili derivata takođe se mogu primeniti T ćelijski receptori koji su usmereni protiv antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju ili njihovih delova ili derivata, opciono u kompleksu sa MHC molekulima.

[0010] Posebno podesan za terapiju, profilaksu, dijagnostiku i/ili praćenje je deo antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju, koji odgovara netransmembranskom delu, a naročito ekstracelularni deo antigena povezanih sa tumorom ili koji ga sadrži. Zbog toga je prema otkrivanju deo antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju, koji odgovara netransmembranskom delu, a naročito ekstracelularnom delu antigena povezanih sa tumorom ili ga sadrži, ili odgovarajućem delu nukleinske kiseline koja kodira antigene povezane sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju poželjan za terapiju, profilaksu, dijagnostiku i/ili praćenje. Slično tome, poželjna je primena antitela koja su usmerena protiv dela antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju, koji odgovara netransmembranskom delu, a naročito ekstracelularnog dela antigena povezanih sa tumorom ili ga sadrži.

[0011] Poželjne bolesti za terapiju, profilaksu i/ili dijagnostiku su one kod kojih su jedan ili više antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju selektivno izraženi ili abnormalno izraženi.

[0012] Pored toga, predmetno otkrivanje se odnosi na nukleinske kiseline i proteine ili peptide, koji nastaju usled promenjenog splajsovanja (splajsne varijante) poznatih gena ili promenjene translacije uz korišćenje alternativnih otvorenih okvira za čitanje.

[0013] Promenjeno splajsovanje gena može rezultovati promenjenom transkripcionom sekvencom (splajsna varijanta). Translacija splajsne varijante u regionu njene promenjene sekvence rezultuje promenjenim proteinom koji može biti izrazito različit po strukturi i funkciji od originalnog proteina. Splajsne varijante povezane sa tumorom mogu stvarati transkripte povezane sa tumorom i proteine/antigene povezane sa tumorom. One se mogu upotrebiti kao molekulski markeri i za detekciju tumorskih ćelija, i za terapeutsko ciljanje na tumore. Detekcija tumorskih ćelija u uzorku dobijenom od pacijenta može se izvesti prema otkrivanju, na primer, posle ekstrakcije nukleinskih kiselina PCR amplifikacijom sa oligonukleotidima specifičnim za splajsne varijante.

[0014] Prema predmetnom otkrivanju, svi sistemi za detekciju zavisni od sekvenci su podesni za detekciju. To su, osim PCR, na primer, sistemi sa genskim čipom/mikrorasterom (engl. „microarray“), Nordern blot, testovi zaštite od ribonukleaza (engl. RNAse protection assays, skr. RDA) i drugi. Svi sistemi za detekciju imaju zajedničko to što se detekcija bazira na specifičnoj hibridizaciji sa najmanje jednom sekvencom nukleinske kiseline specifične za splajsnu varijantu. Međutim, prema otkrivanju tumorske ćelije takođe mogu detektovati antitela koja prepoznaju specifični epitop kodiran splajsnom varijantom. Pomenuta antitela se mogu dobiti korišćenjem peptida koji su specifični za pomenutu splajsnu varijantu za imunizaciju. Za imunizaciju su posebno podesne aminokiselinske sekvence koje su izrazito različite od varijante, odnosno varijanti genskog proizvoda, koja, odnosno koje se prvenstveno stvaraju u zdravim ćelijama. Detekcija tumorskih ćelija sa antitelima se ovde može izvršiti na uzorku izolovanom od pacijenta ili snimanjem sa intravenski datim antitelima.

[0015] Pored dijagnostičke primenljivosti, splajsne varijante koje imaju nove ili promenjene epitope su atraktivni ciljevi za imunoterapiju, pošto se ovi epitopi mogu koristiti za usmeravanje antitela ili T limfocita kao što je ovde opisano. Kod pasivne imunoterapije, antitela ili T limfociti koji prepoznaju epitope specifične za splajsne varijante se ovde adoptivno prenose. Kao i u slučaju drugih antigena, antitela se takođe mogu generisati primenom standardnih tehnologija putem korišćenja polipeptida koji sadrže ove epitope. Alternativno tome, za imunizaciju je moguće primeniti nukleinske kiseline koje kodiraju peptide koji sadrže pomenute epitope. Za in vitro ili in vivo generisanje T limfocita specifičnih za epitope su poznate i detaljno su opisane različite tehnike (na primer, Kessler JH, et al.2001, Sahin et al., 1997) i slično navedenom su bazirane na korišćenju peptida koji sadrže epitope specifične za splajsne varijante ili nukleinske kiseline koje kodiraju pomenute peptide. Peptidi koji sadrže epitope specifične za splajsne varijante ili nukleinske kiseline koje kodiraju pomenute peptide takođe se mogu primeniti kao farmaceutski aktivne supstance u aktivnoj imunoterapiji (npr. vakcinaciji, terapiji vakcinama).

[0016] Prema jednom aspektu, ovde opisano otkrivanje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži agens koji prepoznaje antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen povezan sa tumorom i koji je prvenstveno selektivan za ćelije koje imaju ekspresiju ili abnormalnu ekspresiju antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju. Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži agens koji (I) inhibira ekspresiju ili aktivnost antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju, i/ili (II) ima tumorsko-inhibirajuću ili tumorskouništavajuću aktivnosti i selektivan je za ćelije koje izražavaju ili abnormalno izražavaju antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju, i/ili (III) kada se daje, selektivno povećava količinu kompleksa između MHC molekula i antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegovog dela, kao što je peptidni epitop. U posebnim primerima izvođenja pomenuti agens može izazvati indukciju smrti ćelija, smanjenje rasta ćelija, oštećenje ćelijske membrane ili izlučivanje citokina, a prvenstveno ima tumorsko-inhibirajuću aktivnost. U jednom primeru izvođenja, agens je antisens nukleinska kiselina koja se selektivno hibridizuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira antigen povezan sa tumorom. U sledećem primeru izvođenja, agens je siRNK koja prvenstveno sadrži sens lanac RNK i antisens lanac RNK, pri čemu sens i antisens lanci RNK formiraju RNK dupleks, i pri čemu sens lanac RNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je u suštini identična sa ciljnom sekvencom od oko 19 do oko 25 susednih nukleotida u nukleinskoj kiselini koja kodira antigen povezan sa tumorom, a prvenstveno iRNK koja kodira antigen povezan sa tumorom. U sledećem primeru izvođenja, agens je antitelo koje se selektivno vezuje za antigen povezan sa tumorom, a naročito komplementom aktivirano ili sa toksinom konjugovano antitelo koje se selektivno vezuje za antigen povezan sa tumorom. U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje se vezuje selektivno za antigen povezan sa tumorom je kuplovano sa terapeutski korisnom supstancom i/ili angažuje prirodne ili veštačke efektorske mehanizme za pomenuto izražavanje ćelija ili abnormalno izražavanje pomenutog antigena povezanog sa tumorom. U sledećem primeru izvođenja, agens je citotoksični T limfocit koji prepoznaje antigen povezan sa tumorom ili njegov deo koji je vezan MHC molekulom na ćeliji i lizira ćelije koje su označene na ovaj način. U sledećem primeru izvođenja, agens je T pomoćni limfocit koji pojačava efektorske funkcije drugih ćelija koje specifično prepoznaju pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov deo.

[0017] U sledećem primeru izvođenja, agens sadrži dva ili više agenasa, od kojih svaki prepoznaje različite antigene povezane sa tumorom i/ili inhibira ekspresiju ili aktivnost različitih antigena povezanih sa tumorom, i/ili ima tumorsko-inhibirajuću ili tumorsko-uništavajuću aktivnost i koji su selektivni za ćelije koje izražavaju ili abnormalno izražavaju različite antigene povezane sa tumorom, i/ili kada se daju, onda selektivno povećavaju količinu kompleksa između MHC molekula i različitih antigena povezanih sa tumorom ili njihovih delova, pri čemu je najmanje jedan od pomenutih različitih antigena povezanih sa tumorom antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema predmetnom otkrivanju. Prvenstveno, antigen povezan sa tumorom koji selektivno ograničava tumore služi kao marker za angažovanje efektorskih mehanizama za ovu specifičnu lokaciju. Otkrivanje obuhvata primere izvođenja kod kojih sam agens nema sposobnost da inhibira aktivnost antigena povezanog sa tumorom ili tumorsko-inhibirajuću ili tumorsko-uništavajuću aktivnost, ali posreduje kod takvog efekta, a naročito angažovanjem efektorskih mehanizama, a naročito onih koji imaju potencijal za uništavanje ćelija, na specifičnoj lokaciji, a naročito tumora ili tumorskih ćelija.

[0018] Aktivnost antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju može biti bilo koja proteinska ili peptidna aktivnost. U jednom primeru izvođenja ova aktivnost je enzimska aktivnost.

[0019] Prema ovde opisanom otkrivanju, izraz "inhibira ekspresiju ili aktivnost" obuhvata kompletnu ili u suštini kompletnu inhibiciju ekspresije ili aktivnosti i smanjenje ekspresije ili aktivnosti.

[0020] Agens koji, kada se daje, selektivno povećava količinu kompleksa između MHC molekula i antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema predmetnom otkrivanju ili njegovog dela, sadrži jednu ili više komponenata izabranih iz grupe koja se sastoji od (i) antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, (ii) nukleinske kiseline koja kodira pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, (iii) ćelije domaćina koja izražava pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, i (iv) izolovanih kompleksa između peptidnih epitopa pomenutog antigena povezanog sa tumorom i MHC molekula.

[0021] Otkrivanje se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jednu ili više komponenata izabranih iz grupe koja se sastoji od: (i) antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegovog dela, (ii) nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov deo, i (iii) antitela koje se vezuje za antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov deo, (iv) antisens nukleinske kiseline koja se specifično hibridizuje sa nukleinskom kiselinom koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju, (vi) ćelije domaćina koja izražava antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov deo, i (vii) izolovanih kompleksa između antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegovog dela i MHC molekula.

[0022] U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov deo je prisutna u farmaceutskoj kompoziciji u ekspresionom vektoru i funkcionalno je vezana za promotor. U sledećem primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov deo je prisutna u farmaceutskoj kompoziciji u virusu, kao što je dalje opisano u nastavku.

[0023] U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin koja je prisutna u farmaceutskoj kompoziciji prema otkrivanju može izlučivati antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, izražavati ga na površini i prvenstveno dodatno izražavati MHC molekul koji se vezuje za pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov pomenuti deo. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin može izražavati MHC molekul endogeno. Alternativno tome, ćelija domaćin može izražavati MHC molekul i/ili antigen povezan sa tumorom ili njegov deo na rekombinantan način. Ćelija domaćin je prvenstveno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija domaćin može biti ćelija koja prezentuje antigen, a naročito dendritska ćelija, monocit ili makrofag.

[0024] U sledećem primeru izvođenja, antitelo koje je prisutno u ovde opisanoj farmaceutskoj kompoziciji može biti monoklonsko antitelo. U sledećim primerima izvođenja, antitelo može biti himerično ili humanizovano antitelo, fragment prirodnog antitela ili sintetičkog antitela. Antitelo može biti kuplovano sa terapeutski ili dijagnostički korisnim agensom koji se ovde takođe naziva terapeutskim ili dijagnostičkim agensom.

[0025] Antisens nukleinska kiselina koja je prisutna u farmaceutskoj kompoziciji može sadržati sekvencu od 6-50, a naročito od 10-30, 15-30 i 20-30, susednih nukleotida nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju.

[0026] U sledećim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, realizovani farmaceutskom kompozicijom prema otkrivanju se, bilo direktno ili putem ekspresije nukleinske kiseline, mogu vezivati za MHC molekule na površini ćelija, pri čemu pomenuto vezivanje prvenstveno izaziva citolitičku reakciju i/ili indukuje oslobađanje citokina.

[0027] U posebnim primerima izvođenja nukleinske kiseline prema SEQ ID NO: 1 koja cilja siRNK, sens lanac RNK ima sekvencu SEQ ID NO: 70 a antisens lanac RNK ima sekvencu SEQ ID NO: 71, ili sens lanac RNK ima sekvencu SEQ ID NO: 72, a antisens lanac RNK ima sekvencu SEQ ID NO: 73.

[0028] Farmaceutska kompozicija može sadržati farmaceutski kompatibilni nosač i/ili adjuvans.

[0029] Farmaceutska kompozicija se prvenstveno primenjuje za lečenje ili prevenciju bolesti karakterisane selektivnom ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom. U poželjnom primeru izvođenja, bolest je neoplastična bolest, a prvenstveno kancer.

[0030] U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija prema otkrivanju može biti u obliku vakcine koja se može primeniti terapeutski ili profilaktički. Takva vakcina prvenstveno sadrži antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov deo, i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov deo. U posebnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je prisutna u virusu ili u ćeliji domaćinu.

[0031] Predmetno otkrivanje se dalje odnosi na metode lečenja, prevencije, dijagnostike ili praćenja, tj. utvrđivanja regresije, progresije, toka i/ili pojave bolesti karakterisane ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom jednog ili više antigena povezanih sa tumorom koji su identifikovani prema otkrivanju, a prvenstveno neoplastične bolesti, a naročito kancera. Prema jednom primeru izvođenja, lečenje ili prevencija mogu sadržati davanje farmaceutske kompozicije prema otkrivanju.

[0032] Pomenuti metodi dijagnostike i/ili metodi praćenja generalno se odnose na detekciju i/ili određivanje kvantiteta jednog ili više parametara izabranih iz grupe koja se sastoji od (i) nukleinske kiseline, koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju, ili njegov deo, (ii) antigena povezanog sa tumorom, ili njegovog dela (iii) antitela protiv antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegovog dela, i (iv) T limfocita, a prvenstveno citotoksičnih ili T pomoćnih limfocita, koji su specifični za antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov deo i/ili kompleks između antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela i MHC molekula, u biološkom uzorku izolovanom od pacijenta, a prvenstveno od pacijenta koji ima pomenutu bolest, za koga se sumnja da ima ili dobija ili da će dobiti ili da je sa pomenutom bolesti ili da ima potencijal za pomenutu bolest. Sredstva za ostvarivanje pomenute detekcije i/ili određivanja količine su ovde opisana i biće jasna stručnjaku iz odgovarajuće oblasti.

[0033] Prvenstveno, prisustvo pomenute nukleinske kiseline, pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog pomenutog dela, pomenutog antitela i/ili pomenutih T limfocita i/ili količine pomenute nukleinske kiseline, pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog pomenutog dela, pomenutog antitela i/ili pomenutih T limfocita koje je povećano u poređenju sa pacijentom bez pomenute bolesti je indikacija prisustva pomenute bolesti ili potencijala za razvoj pomenute bolesti.

[0034] Metodi dijagnostike i/ili praćenja koji su ovde opisani takođe obuhvataju primere izvođenja kod kojih je detekcijom ili određivanjem količine pomenute nukleinske kiseline, pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog pomenutog dela, pomenutog antitela i/ili pomenutih T limfocita moguće oceniti i/ili prognozirati metastatičko ponašanje pomenute bolesti, pri čemu je prvenstveno prisustvo pomenute nukleinske kiseline, pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog pomenutog dela, pomenutog antitela i/ili pomenutih T limfocita i/ili količina pomenute nukleinske kiseline, pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog pomenutog dela, pomenutog antitela i/ili pomenutih T limfocita koja je povećana u poređenju sa pacijentom bez pomenute bolesti ili bez metastaza pomenute bolesti indikacija za metastatičko ponašanje pomenute bolesti ili potencijala za metastatičko ponašanje pomenute bolesti.

[0035] U posebnim primerima izvođenja, pomenuta detekcija ili određivanje količine sadrži (i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa agensom koji se specifično vezuje za pomenutu nukleinsku kiselinu koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov pomenuti deo, sa pomenutim antigenom povezanim sa tumorom ili njegovim pomenutim delom, sa pomenutim antitelom ili njegovim pomenutim delom ili sa pomenutim T limfocitima, i (ii) detektovanje formiranja ili određivanje količine kompleksa između agensa i nukleinske kiseline ili njenog dela, antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, antitela ili njegovog dela, ili T limfocita. U jednom primeru izvođenja, bolest je karakterisana ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom dva ili više različitih antigena povezanih sa tumorom, a detekcija ili određivanje količine sadrže detekciju ili određivanje količine dve ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju dva ili više različitih antigena povezanih sa tumorom ili njegovih delova, dva ili više različitih antigena povezanih sa tumorom ili njegovih delova, dva ili više antitela koja se vezuju za pomenuta dva ili više različitih antigena povezanih sa tumorom ili sa njihovim delovima i/ili dva ili više T limfocita specifičnih za pomenuta dva ili više različitih antigena povezanih sa tumorom ili njihovih delova, ili njihovih kompleksa sa MHC molekulima. U sledećem primeru izvođenja, biološki uzorak koji je izolovan iz pacijenta se poredi sa uporedivim normalnim biološkim uzorkom.

[0036] Metodi praćenja prema predmetnom otkrivanju prvenstveno obuhvataju detekciju i/ili određivanje količine jednog ili više parametara koji su gore pomenuti u prvom uzorku u prvom vremenskom trenutku i u sledećem uzorku u drugom vremenskom trenutku, pri čemu se tok bolesti određuje upoređivanjem ova dva uzorka.

[0037] Prema predmetnom otkrivanju, detekcija nukleinske kiseline ili njenog dela ili određivanje količine nukleinske kiseline ili njenog dela može se izvršiti korišćenjem oligo- ili polinukleotidne probe koja se specifično hibridizuje sa pomenutom nukleinskom kiselinom ili njenim pomenutim delom ili se može izvesti selektivnom amplifikacijom pomenute nukleinske kiseline ili njenog pomenutog dela, npr. PCR amplifikacijom. U jednom primeru izvođenja, oligo- ili polinukleotidna proba sadrži sekvencu od 6-50, a naročito od 10-30, 15-30 i 20-30, susednih nukleotida pomenute nukleinske kiseline.

[0038] U posebnim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom ili njegov deo koji se detektuju ili čija količina treba da se odredi u metodama prema otkrivanju je prisutan intracelularno, na površini ćelije ili u kompleksu sa MHC molekulom. Prema otkrivanju, detekcija antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela ili određivanje količine antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela može se izvršiti korišćenjem antitela koje se specifično vezuje za pomenuti antigen povezan sa tumorom ili za njegov pomenuti deo.

[0039] Prema predmetnom otkrivanju, detekcija antitela ili određivanje količine antitela može se izvršiti korišćenjem proteina ili peptida koji se specifično vezuje za pomenuto antitelo.

[0040] Prema predmetnom otkrivanju, detekcija ili određivanje količine T limfocita koji su specifični za antigen povezan sa tumorom ili njegov deo i/ili njegov kompleks sa MHC molekulom može se izvršiti korišćenjem kompleksa koji prezentuje ćeliju između pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog pomenutog dela i MHC molekula. T limfociti mogu biti dodatno detektovani detektovanjem njihove proliferacije, njihove produkcije citokina, i njihove citotoksične aktivnosti aktivirane specifičnom stimulacijom sa kompleksom MHC molekula i antigenom povezanim sa tumorom ili njegovim delom. T limfociti se takođe mogu detektovati uz pomoć rekombinantnog MHC molekula ili kompleksa dva ili više MHC molekula snabdevenih sa imunogenim fragmentima jednog ili više antigena povezanih sa tumorom.

[0041] Agens koji se primenjuje za detekciju ili određivanje količine u metodima prema otkrivanju, kao što su oligo- ili polinukleotidne probe, antitelo, protein ili peptid ili ćelija se prvenstveno obeležava na detektabilni način, a naročito detektabilnim markerom, kao što je radioaktivni marker ili enzimski marker.

[0042] Prema posebnom aspektu, otkrivanje se odnosi na metod lečenja, prevencije, dijagnostike ili praćenja bolesti karakterisane ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju, pri čemu taj metod sadrži davanje antitela koje se vezuje za pomenuti antigen povezan sa tumorom ili za njegov deo i koje je kuplovano sa terapeutskim ili dijagnostičkim agensom. Antitelo može biti monoklonsko antitelo. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je himerično ili humanizovano antitelo ili fragment prirodnog antitela.

[0043] U izvesnim primerima izvođenja, metodi dijagnostike ili praćenja bolesti karakterisane ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju mogu se izvoditi na biološkom uzorku koji sadrži ili se sumnja da sadrži diseminirajuće tumorske ćelije ili metastatičke tumorske ćelije. Takvi biološki uzorci obuhvataju, na primer, krv, serum, koštanu srž, ispljuvak, bronhijalni aspirat, i/ili bronhijalnu lavažu.

[0044] Prema jednom poželjnom aspektu, predmetno otkrivanje se odnosi na metod lečenja pacijenta koji ima bolest karakterisanu ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju, pri čemu taj metod sadrži (i) pribavljanje uzorka koji sadrži imunoreaktivne ćelije, bilo da je dobijen od pomenutog pacijenta ili od druge jedinke iste vrste, a naročito zdrave jedinke, ili jedinke neke druge vrste, (ii) dovođenje u kontakt pomenutog uzorka sa ćelijom domaćinom koja izražava pomenuti antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, pod uslovima koji stimulišu stvaranje citolitičkih T ćelija protiv pomenutog antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, i (iii) uvođenje citolitičkih T ćelija u pacijenta u količini koja je podesna za liziranje ćelija koje izražavaju antigen povezan sa tumorom ili njegov deo. U jednom primeru izvođenja, metod sadrži kloniranje T ćelijskog receptora citolitičkih T ćelija koje su dobijene i prenose nukleinsku kiselinu koja kodira T ćelijski receptor T ćelija, bilo da je dobijen od pomenutog pacijenta ili od druge jedinke iste vrste, a naročito zdrave jedinke, ili jedinke neke druge vrste, pri čemu na ovaj način T ćelije dobijaju željenu specifičnost i, kao pod (iii), mogu biti uvedene u pacijenta.

[0045] U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin endogeno izražava MHC molekul. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin rekombinantno izražava MHC molekul i/ili antigen povezan sa tumorom ili njegov deo. Prvenstveno, ćelija domaćin prezentuje antigen povezan sa tumorom ili njegov deo pomoću MHC molekula na njenoj površini. Ćelija domaćin je prvenstveno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija domaćin je ćelija koja prezentuje antigen, a naročito dendritska ćelija, monocit ili makrofag.

[0046] Predmetno otkrivanje se takođe odnosi na metod lečenja bolesti karakterisane ekspresijom ili abnormalnom ekspresijom antigena povezanog sa tumorom identifikovanog prema otkrivanju, pri čemu taj metod sadrži (i) identifikaciju ćelija kod pacijenta koje izražavaju abnormalne količine antigena povezanog sa tumorom, (ii) izolaciju uzorka pomenutih ćelija, (iii) kultivisanje pomenutih ćelija, i (iv) uvođenje pomenutih ćelija u pacijenta u količini koja je podesna za aktiviranje imune reakcije na te ćelije.

[0047] Predmetno otkrivanje se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od (a) nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62, i 64-67, njenog dela ili derivata, (b) nukleinske kiseline koja se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom pod (a) pod specifičnim uslovima, (c) nukleinske kiseline koja se degeneriše u odnosu na nukleinsku kiselinu pod (a) ili (b), i (d) nukleinske kiseline koja je komplementarna sa nukleinskom kiselinom pod (a), (b) ili (c). Otkrivanje se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu, koja kodira protein ili polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68, i 69, njenog dela ili derivata.

[0048] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na molekul rekombinantne nukleinske kiseline, a naročito DNK ili RNK molekul, koji sadrži ovde opisanu nukleinsku kiselinu.

[0049] Otkrivanje se takođe odnosi na ćelije domaćine koje sadrže nukleinsku kiselinu ili molekul rekombinantne nukleinske kiseline prema otkrivanju.

[0050] Ćelija domaćin takođe može sadržati nukleinsku kiselinu koja kodira MHC molekul. U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin endogeno izražava MHC molekul. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin rekombinantno izražava MHC molekul i/ili nukleinsku kiselinu ili molekul rekombinantne nukleinske kiseline prema otkrivanju ili njegov deo. Prvenstveno, ćelija domaćin nije proliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija domaćin je ćelija koja prezentuje antigen, a naročito dendritska ćelija, monocit ili makrofag.

[0051] U sledećem primeru izvođenja, predmetno otkrivanje se odnosi na oligonukleotide koji se hibridizuju sa nukleinskom kiselinom prema otkrivanju i koji se mogu primeniti kao genetske probe ili kao "antisens" molekuli.

[0052] Molekuli nukleinskih kiselina u obliku oligonukleotidnih prajmera ili kompetentnih proba, koji se hibridizuju sa nukleinskom kiselinom identifikovanom prema predmetnom otkrivanju ili njenim delovima, mogu se upotrebiti za pronalaženje nukleinskih kiselina koje su homologe sa pomenutim nukleinskim kiselinama prema otkrivanju, npr. PCR amplifikacijom, Soudern i Nordern hibridizacijom. Hibridizacija se može izvršiti pod malo stringentnim uslovima, još poželjnije pod srednje specifičnim uslovima i najpoželjnije pod visoko specifičnim uslovima.

[0053] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na protein ili peptid koji je kodiran nukleinskom kiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od (a) nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62, i 64-67, njenog dela ili derivata, (b) nukleinske kiseline koje se hibridizuje sa nukleinskom kiselinom pod (a) pod stringentnim uslovima, (c) nukleinske kiseline koja je degenerisana u odnosu na nukleinsku kiselinu pod (a) ili (b), i (d) nukleinske kiseline koja je komplementarna sa nukleinskom kiselinom pod (a), (b) ili (c). U poželjnom primeru izvođenja, otkrivanje se odnosi na protein ili peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68, i 69, njen deo ili derivat.

[0054] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na imunogeni fragment antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju. Pomenuti fragment prvenstveno se vezuje za MHC molekul ili antitelo, a prvenstveno za humani HLA receptor ili humano antitelo. Prema predmetnom otkrivanju, fragment prvenstveno sadrži sekvencu od najmanje 6, a naročito najmanje 8, najmanje 10, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30 ili najmanje 50, aminokiselina.

[0055] Prema ovom aspektu otkrivanje se naročito odnosi na peptid koji ima ili sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 51-60, 68 i 69 iz liste sekvenci, njen deo ili derivat.

[0056] Prema sledećem aspektu, predmetno otkrivanje se odnosi na agens koji se vezuje za antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili za njegov deo. U poželjnom primeru izvođenja, agens je protein ili peptid, a naročito antitelo, T ćelijski receptor ili MHC molekul. U sledećim primerima izvođenja, antitelo je monoklonsko, himerično, ili humanizovano antitelo, antitelo proizvedeno kombinatornim tehnikama, ili fragment antitela. U jednom primeru izvođenja, predmetno otkrivanje se odnosi na antitelo koje se selektivno vezuje za kompleks (i) antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegovog dela i (ii) MHC molekul za koji se vezuje pomenuti antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov pomenuti deo, sa pomenutim antitelom koje se ne vezuje samo za (i) ili (ii).

[0057] Otkrivanje se naročito odnosi na takav agens, a naročito na antitelo, koje se specifično vezuje za peptid koji ima ili sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 51-60, 68, i 69 iz liste sekvenci, njen deo ili derivat.

[0058] Prema otkrivanju, izraz "vezivanje" se prvenstveno odnosi na specifično vezivanje. "Specifično vezivanje" označava agens, kao što je antitelo, koji se jače vezuje za cilj, kao što je epitop, koji je specifičan u poređenju sa vezivanjem za drugi cilj. Agens se vezuje jače za prvi cilj u poređenju sa drugim ciljem, ako se vezuje za prvi cilj sa konstantom disocijacije (KD) koja je manja od konstante disocijacije za drugi cilj. Prvenstveno je konstanta disocijacije (KD) za cilj za koji se agens specifično vezuje više od 10-struko, a prvenstveno više od 20-struko, još poželjnije više od 50-struko, čak još više od 100-struko, 200-struko, 500-struko ili 1000-struko manja od konstante disocijacije (KD) za cilj za koji se agens ne vezuje specifično.

[0059] Takva specifična antitela mogu se, na primer, dobiti imunizacijom korišćenjem napred navedenih peptida.

[0060] Predmetno otkrivanje se dalje odnosi na konjugat između agensa prema otkrivanju koji se vezuje za antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju ili njegov deo ili antitelo prema otkrivanju i terapeutski ili dijagnostički agens. U jednom primeru izvođenja, terapeutski ili dijagnostički agens je toksin.

[0061] Prema sledećem aspektu, otkrivanje se odnosi na kit, odnosno komplet za detekciju ekspresije ili abnormalne ekspresije antigena povezanog sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju, pri čemu taj komplet sadrži agense za detekciju ili određivanje količine (i) nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, (ii) antigena povezanog sa tumorom ili njegovog dela, (iii) antitela koja se vezuju za antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, i/ili (iv) T ćelija koja su specifična za antigen povezan sa tumorom ili njegov deo ili njegov kompleks sa MHC molekulom. U jednom primeru izvođenja, agensi za detekciju nukleinske kiseline ili njenog dela su molekuli nukleinske kiseline za selektivnu amplifikaciju pomenute nukleinske kiseline, koji sadrže naročito sekvencu od 6-50, a naročito 10-30, 15-30 i 20-30, susednih nukleotida pomenute nukleinske kiseline.

Detaljni opis pronalaska

[0062] Kada se ovde koristi, "referentni", kao što je referentni uzorak ili referentni organizam se može koristiti za dovođenje u vezu i upoređivanje rezultata dobijenih u metodama prema otkrivanju opisane od testiranog uzorka ili testiranog organizma, tj. pacijenta. Obično je referentni organizam zdravi organizam, a naročito organizam koji ne boluje od kancera.

[0063] "Referentna vrednost" može biti određena na osnovu reference empirijski merenjem dovoljno velikog broja referenci. Referentna vrednost se prvenstveno određuje merenjem najmanje 2, a prvenstveno najmanje 3, prvenstveno najmanje 5, prvenstveno najmanje 8, prvenstveno najmanje 12, prvenstveno najmanje 20, prvenstveno najmanje 30, prvenstveno najmanje 50, ili prvenstveno najmanje 100 referenci.

[0064] "Derivat" nukleinske kiseline prema otkrivanju znači da su u pomenutoj nukleinskoj kiselini prisutne pojedinačne ili višestruke, kao što su najmanje 2, najmanje 4, ili najmanje 6 i prvenstveno do 3, do 4, do 5, do 6, do 10, do 15, ili do 20 nukleotidnih supstitucija, delecija i/ili adicija. Pored toga, izraz "derivat" takođe obuhvata hemijsku derivatizaciju nukleinske kiseline na nukleotidnoj bazi, na šećeru ili na fosfatu. Izraz "derivat" takođe obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže nukleotide i nukleotidne analoge koji se ne javljaju u prirodi.

[0065] Kada se ovde koristi, nukleinska kiselina je prvenstveno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK). Nukleinske kiseline prema otkrivanju obuhvataju genomsku DNK, kDNK, iRNK, rekombinantno dobijene i hemijski sintetisane molekule. prema otkrivanju, nukleinska kiselina može biti prisutna kao jednolančani ili kao dvolančani i kao linearni ili kovalentno cirkularno, odnosno kružno zatvoreni molekul.

[0066] Kada se ovde koristi, izraz "RNK" označava molekul koji sadrži najmanje jedan ribonukleotidni ostatak. Pod "ribonukleotid" se podrazumeva nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2’-poziciji beta-D-ribo-furanozne grupe. Ovaj izraz obuhvata dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK, kao što je delimično prečišćena RNK, u suštini čistu RNK, sintetičku RNK, rekombinantno dobijenu RNK, kao i promenjenu RNK koja se razlikuje od prirodne RNK po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili promeni jednog ili više nukleotida. Takve promene mogu obuhvatati adiciju nenukleotidnog materijala, kao što je na kraju, odnosno krajevima RNK ili internu, na primer, na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u RNK molekulima mogu takođe obuhvatati nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove promenjene RNK se mogu nazvati analozima ili analozima prirodnih RNK.

[0067] Nukleinske kiseline koje su opisane prema otkrivanju su prvenstveno izolovane. Izraz "izolovana nukleinska kiselina" znači da je nukleinska kiselina bila (i) amplifikovana in vitro, na primer, lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno dobijena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, sečenjem i gelelektroforetičkim frakcionisanjem, ili (iv) sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju tehnikama rekombinantne DNK.

[0068] Nukleinska kiselina je "komplementarna" sa drugom nukleinskom kiselinom ako su dve sekvence sposobne da se međusobno hibridizuju i formiraju stabilni dupleks, pri čemu se hibridizacija prvenstveno izvodi pod uslovima koji omogućavaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida (visoko specifični uslovi). Visoko specifični uslovi su opisani, na primer, u Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., urednici, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Njujork, 1989 ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., urednici, John Wiley & Sons, Inc., Njujork i odnose se, na primer, na hibridizaciju na 65°C u hibridizacionom puferu (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirolidon, 0,02% goveđi serumski albumin, 2,5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0,5% SDS, 2 mM EDTA). SSC je 0,15 M natrijum hlorid/0,15 M natrijum citrat, pH 7. Posle hibridizacije, membrana na koju je preneta DNK se ispira, na primer, u 2 X SSC na sobnoj temperaturi, pa onda u 0,1-0,5 X SSC/0,1 X SDS na temperaturama do 68°C.

[0069] Prema otkrivanju, komplementarne nukleinske kiseline imaju najmanje 40%, a naročito najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i prvenstveno najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%, identičnih nukleotida.

[0070] Izraz "procenat identičnosti" treba da označi procenat nukleotida ili aminokiselinskih ostataka koji su identični između dve sekvence koje se upoređuju, dobijen posle najboljeg poravnanja, ovaj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence su distribuirane prema slučajnosti i preko cele dužine. Poređenja sekvenci između dva nukleotida ili aminokiselinske sekvence se obično izvode poređenjem ovih sekvenci posle njihovog optimalnog poravnanja, pri čemu se poređenje ovih sekvenci vrši pomoću segmenta ili "prozora poređenja" da bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti sekvenci. Optimalno poravnanje sekvenci radi poređenja može se izvesti, osim ručno, i pomoću algoritma lokalne homologije autora Smith i Waterman, 1981, Ads App. Math.2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije autora Neddleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48, 443, pomoću metoda pretraživanja prema sličnosti autora Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0071] Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja identičnih pozicija između dve sekvence koje se upoređuju, deljenjem ovog broja sa brojem pozicija koje se upoređuju i množenjem dobijenog rezultata sa 100, tako da se dobije procenat identičnosti između ove dve sekvence.

[0072] Prema predmetnom otkrivanju, nukleinske kiseline koje kodiraju antigene povezane sa tumorom mogu biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, a naročito heterologim nukleinskim kiselinama. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno vezana za ekspresione kontrolne sekvence ili regulatorne sekvence koje mogu biti homologe ili heterologe u odnosu na pomenutu nukleinsku kiselinu. Kodirajuća sekvenca i regulatorna sekvenca su međusobno "funkcionalno" povezane, ako su međusobno kovalentno vezane tako da je ekspresija ili transkripcija pomenute kodirajuće sekvence pod kontrolom ili pod uticajem pomenute regulatorne sekvence. Ako se kodirajuća sekvenca translira u funkcionalni protein, onda, sa regulatornom sekvencom funkcionalno povezanom sa pomenutom kodirajućom sekvencom, indukcija pomenute regulatorne sekvence rezultuje transkripcijom pomenute kodirajuće sekvence, bez uzrokovanja promene okvira u kodirajućoj sekvenci ili pomenuta kodirajuća sekvenca ne može da se translira u željeni protein ili peptid.

[0073] Izraz "ekspresiona kontrolna sekvenca" ili "regulatorna sekvenca" prema otkrivanju sadrži promotore, pojačavače i druge kontrolne elemente koji regulišu ekspresiju gena. U posebnim primerima izvođenja prema otkrivanju, može biti regulisana ekspresija kontrolnih sekvenci. Tačna struktura regulatornih sekvenci može varirati kao funkcija vrste ili tipa ćelija, ali generalno sadrži 5’netranskribovane i 5’netranslirane sekvence koje su uključene u započinjanje transkripcije i translacije, respektivno, kao što su TATA „box“ (kutija), pokrovna sekvenca, CAAT sekvenca. Preciznije, 5’netranskribovane regulatorne sekvence sadrže promotorski region koji obuhvata promotorsku sekvencu za transkripcionu kontrolu funkcionalno povezanog gena. Regulatorne sekvence mogu takođe sadržati pojačavačke sekvence ili ushodne aktivatorske sekvence.

[0074] Prema predmetnom otkrivanju, nukleinska kiselina dalje može biti prisutna u kombinaciji sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira peptid koji kontroliše izlučivanje proteina ili peptida kodiranog pomenutom nukleinskom kiselinom iz ćelije domaćina. Nukleinska kiselina takođe može biti prisutna u kombinaciji sa drugom nukleinskom kiselinom koja kodira peptid koji izaziva da se kodirani protein ili peptid zakači na ćelijskoj membrani ćelije domaćina ili kompartmentalizuje u posebnim organelama pomenute ćelije. Slično tome, moguća je kombinacija sa nukleinskom kiselinom koja predstavlja reporter gen ili bilo koji "tag".

[0075] U poželjnom primeru izvođenja, molekul rekombinantne nukleinske kiseline prema otkrivanju je, na primer, vektor, ako je podesno sa promotorom, koji kontroliše ekspresiju nukleinske kiseline, na primer, nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju. Izraz "vektor" se ovde upotrebljava u svom najopštijem značenju i obuhvata bilo koji intermedijerni nosač za nukleinsku kiselinu koji omogućava da pomenuta nukleinska kiselina, na primer, bude uvedena u prokariotske i/ili eukariotske ćelije i, ako je podesno, da bude integrisana u genom. Vektori ove vrste se prvenstveno repliciraju i/ili izražavaju u ćelijama. Intermedijerni nosač može biti adaptiran, na primer, za primenu u elektroporaciji, u bombardovanju sa mikroprojektilima, lipozomalnoj primeni, u transferu pomoću agrobakterija ili u inserciji pomoću DNK ili RNK virusa. Vektori obuhvataju plazmide, fagemide, bakteriofage ili virusne genome.

[0076] Nukleinske kiseline koje kodiraju antigen povezan sa tumorom koji je identifikovan prema otkrivanju se mogu upotrebljavati za transfekciju ćelija domaćina. Nukleinske kiseline ovde označavaju i rekombinantnu DNK i RNK. Rekombinantna RNK se može dobiti pomoću in-vitro transkripcije DNK obrasca. Dalje, ona se može modifikovati stabilizovanjem sekvenci, pokrivanjem i poliadenilacijom pre primene.

[0077] Kada se ovde koristi, izraz "ćelija domaćin" se odnosi na bilo koju ćeliju koja se može transformisati ili transfektovati sa egzogenom nukleinskom kiselinom. Izraz "ćelije domaćini" prema otkrivanju obuhvata prokariotske (npr. E. coli) ili eukariotske ćelije (npr. dendritske ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, ćelije kvasca i ćelije insekata). Posebna prednost se daje sisarskim ćelijama, kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza, primata. Ćelije mogu poticati od velikog broja tipova tkiva i obuhvataju primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri obuhvataju keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije koštane srži i embrionalne matične ćelije. U sledećim primerima izvođenja, ćelija domaćin je ćelija koja prezentuje antigen, a naročito dentritska ćelija, monocit ili makrofag. Nukleinska kiselina može biti prisutna u ćeliji domaćinu u obliku samo jedne kopije ili dve ili više kopija i, u jednom primeru izvođenja, je izražena u ćeliji domaćinu.

[0078] Kada se ovde koristi, izraz "ekspresija" se upotrebljava u svom najopštijem značenju i obuhvata dobijanje RNK ili RNK i proteina. On takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinske kiseline. Dalje, ekspresija se može izvršiti prolazno ili stabilno. Poželjni ekspresioni sistemi u sisarskim ćelijama obuhvataju pcDNK3.1 i pRc/CMV (Invitrogen, Karlsbad, CA), koji sadrže selektabilni marker, kao što je gen koji prenosi otpornost na G418 (i na taj način omogućava da budu selekcionisane stabilno transfektovane ćelijske linije) i pojačavačko-promotorske sekvence citomegalovirusa (CMV).

[0079] U onim slučajevima otkrivanja u kojima MHC molekul prezentuje antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, ekspresioni vektor takođe može sadržati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti MHC molekul. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira MHC molekul može biti prisutna na istom ekspresionom vektoru kao nukleinska kiselina koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov deo, ili obe nukleinske kiseline mogu biti prisutne u različitim ekspresionim vektorima. U zadnje pomenutom slučaju, dva ekspresiona vektora mogu biti kotransfektovana u ćeliji. Ako ćelija domaćin ne izražava antigen povezan sa tumorom, ni njegov deo, niti MHC molekul, onda nukleinske kiseline koje ih kodiraju mogu biti transfektovane u ćeliju bilo na istom ekspresionom vektoru ili na različitim ekspresionim vektorima. Ako ćelija već izražava MHC molekul, onda u ćeliju može biti transfektovana samo sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom ili njegov deo.

[0080] Predmetno otkrivanje se takođe odnosi na komplete za amplifikaciju nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom. Takvi kompleti sadrže, na primer, par amplifikacionih prajmera koji se hibridizuju sa nukleinskom kiselinom koja kodira antigen povezan sa tumorom. Prajmeri prvenstveno sadrže sekvencu od 6-50, a naročito od 10-30, 15-30 i 20-30 susednih nukleotida nukleinske kiseline i oni se ne preklapaju da bi se izbeglo formiranje dimera prajmera. Jedan od prajmera će se hibridizovati sa jednim lancem nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom, a drugi prajmer će se hibridizovati sa komplementarnim lancem u rasporedu koji omogućava amplifikaciju nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom.

[0081] "Antisens molekuli" ili "antisens nukleinske kiseline" se mogu koristiti za regulisanje, a naročito smanjenje ekspresije nukleinske kiseline. Izraz "antisens molekul" ili "antisens nukleinska kiselina" prema otkrivanju se odnosi na oligonukleotid koji je oligoribonukleotid, oligodezoksiribonukleotid, modifikovani oligoribonukleotid ili modifikovani oligodezoksiribonukleotid i koji se hibridizuje pod fiziološkim uslovima sa DNK koja sadrži određen gen ili iRNK pomenutog gena, čime se inhibira transkripcija pomenutog gena i/ili translacija pomenute iRNK. Prema otkrivanju "antisens molekul" takođe sadrži konstrukt koji sadrži nukleinsku kiselinu ili njen deo u obrnutoj, odnosno reverznoj orijentaciji u odnosu na njegov prirodni promotor. Antisens transkript nukleinske kiseline ili njenog dela može formirati dupleks sa prirodnom iRNK koji određuje enzim i na taj način sprečava akumulaciju ili translaciju iRNK u aktivni enzim. Sledeća mogućnost je upotreba ribozima za inaktivaciju nukleinske kiseline. Antisens oligonukleotidi koji su poželjni prema otkrivanju imaju sekvencu od 6-50, a naročito od 10-30, 15-30 i 20-30, susednih nukleotida ciljne nukleinske kiseline i prvenstveno su potpuno komplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselinom ili njenim delom.

[0082] U poželjnim primerima izvođenja, antisens oligonukleotid se hibridizuje sa N-terminalnim ili 5’ ushodnim mestom, kao što je mesto početka translacije, mesto početka transkripcije ili promotorsko mesto. U sledećim primerima izvođenja, antisens oligonukleotid se hibridizuje sa 3’netransliranim regionom ili iRNK splajsnim mestom.

[0083] U jednom primeru izvođenja, oligonukleotid prema predmetnom otkrivanju se može sastojati od ribonukleotida, dezoksiribonukleotida ili njihove kombinacije, pri čemu su 5’ kraj jednog nukleotida i 3’ kraj drugog nukleotida međusobno povezani fosfodiestarskom vezom. Ovi oligonukleotidi se mogu sintetizovati na uobičajeni način ili dobiti rekombinantno.

[0084] U poželjnim primerima izvođenja, oligonukleotid prema otkrivanju je "modifikovani" oligonukleotid. Ovde, oligonukleotid može biti modifikovan na veoma različite načine, bez smanjivanja njegove sposobnosti da se veže za svoje ciljno mesto, sa ciljem da se poveća, na primer, njegova stabilnost ili terapeutska efikasnost. Prema otkrivanju, izraz "modifikovani oligonukleotid" označava oligonukleotid u kome su (i) najmanje dva od njegovih nukleotida međusobno povezani sintetičkom internukleozidnom vezom (tj. internukleozidnom vezom koja fosfodiestarska veza) i/ili (ii) hemijska grupa koja se obično ne nalazi u nukleinskim kiselinama je kovalentno vezana za oligonukleotid. Poželjne sintetičke internukleozidne veze su fosforotioati, alkil fosfonati, fosforoditioati, fosfatni estri, alkil fosfonotioati, fosforamidati, karbamati, karbonati, fosfatni triestri, acetamidati, karboksimetil estri i peptidi.

[0085] Izraz "modifikovani oligonukleotid" takođe sadrži oligonukleotide koji imaju kovalentno modifikovanu bazu i/ili šećer. "Modifikovani oligonukleotidi" obuhvataju, na primer, oligonukleotide sa šećernim ostacima koji su kovalentno vezani za organske grupe male molekulske težine različite od hidroksilne grupe na 3’ poziciji i fosfatnu grupu na 5’ poziciji. Modifikovani oligonukleotidi mogu sadržati, na primer, 2’-O-alkilovani ostatak riboze ili drugi šećer umesto riboze, kao što je arabinoza.

[0086] Podrazumeva se da se svi primeri izvođenja koji su gore opisani u vezi oligonukleotida takođe mogu odnositi na polinukleotide.

[0087] Pod "sitnom interferentnom RNK" ili "siRNK" kada se ovde koristi se podrazumeva izolovani RNK molekul, a prvenstveno veći od 10 nukleotida po dužini, još poželjnije veći od 15 nukleotida po dužini, i najpoželjnije 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 nukleotida po dužini koji se upotrebljava za identifikaciju ciljnog gena ili iRNK koja treba da bude razložena. Opseg od 19-25 nukleotida je najpoželjnija veličina za siRNK.

[0088] siRNK prema otkrivanju može obuhvatati delimično prečišćenu RNK, u suštini čistu RNK, sintetičku RNK, ili rekombinantno dobijenu RNK, kao i promenjenu RNK koja se razlikuje od prirodne RNK po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili promeni jednog ili više nukleotida. Takve promene mogu obuhvatati dodavanje nenukleotidnog materijala, kao što je na kraju, odnosno na krajevima siRNK ili na jednom ili više internih nukleotida siRNK; modifikacije koje čine siRNK otpornim na razlaganje nukleazom (npr. korišćenjem 2’-supstituisanih ribonukleotida ili modifikacijom na šećerno-fosfatnom osnovnom lancu, odnosno skeletu); ili supstituciju jednog ili više nukleotida u siRNK sa dezoksiribonukleotidima. Dalje, siRNK se može modifikovati tako da se poveća njena stabilnost, kao što je gore opisano za modifikovane oligonukleotide, a naročito uvođenjem jedne ili više fosforotioatnih veza.

[0089] Jedan ili oba lanca siRNK mogu takođe sadržati 3’-izbočinu. Kada se ovde koristi, "3’-izbočina" označava najmanje jedan neupareni nukleotid koji se pruža sa 3’-kraja RNK lanca. Na taj način u jednom primeru izvođenja, siRNK sadrži najmanje jednu 3’-izbočinu od 1 do oko 6 nukleotida (koji sadrži ribonukleotide ili dezoksinukleotide) po dužini, a prvenstveno od 1 do oko 5 nukleotida po dužini, još poželjnije od 1 do oko 4 nukleotida po dužini, i posebno poželjno od oko 2 do oko 4 nukleotida po dužini. U primeru izvođenja u kome oba lanca molekula siRNK sadrže 3’-izbočinu, dužina izbočine može biti ista ili različita za svaki lanac. U najpoželjnijem primeru izvođenja, 3’-izbočina je prisutna na oba lanca siRNK, i ima dužinu od 2 nukleotida. Na primer, svaki lanac siRNK prema otkrivanju može sadržati 3’-izbočine od dideoksitimidilne kiseline ("TT") ili diuridilne kiseline ("uu").

[0090] Da bi se povećala stabilnost siRNK, 3’-izbočine se mogu takođe stabilizovati protiv razlaganja. U jednom primeru izvođenja, izbočine su stabilizovane uključivanjem purinskih nukleotida, kao što su adenozin ili gvanozin nukleotidi.

Alternativno tome, supstitucija pirimidinskih nukleotida sa modifikovanim analozima, npr. supstitucija uridinskih nukleotida u 3’-izbočinama sa 2’-deoksitimidinom, se toleriše i ne utiče na efikasnost razgradnje RNKi. Naročito odsustvo 2’-hidroksila u 2’-deoksitimidinu značajno povećava otpornost 3’-izbočina na nukleazu u medijumu za kultivaciju tkiva.

[0091] Sens i antisens lanci siRNK mogu sadržati dva komplementarna, jednolančana RNK molekula ili mogu sadržati samo jedan molekul u kome dva komplementarna dela imaju uparene baze i kovalentno su vezana sa jednolančanom oblasti "ukosnice". To znači da sens region i antisens region mogu biti kovalentno povezani pomoću linker molekula. Linker molekul može biti polinukleotidni ili nenukleotidni linker. Bez želje da budemo vezani za bilo koju teoriju, veruje se da se oblast ukosnice zadnje pomenutog tipa siRNK molekula otkida intracelularno pomoću "Dicer" proteina (ili njegovog ekvivalenta) da bi se formirala siRNK od dva posebna RNK molekula sa uparenim bazama.

[0092] Kada se ovde koristi, "ciljna iRNK" se odnosi na molekul RNK koji je ciljno mesto za nishodnu regulaciju.

[0093] siRNK može biti izražena iz pol III ekspresionog vektora bez promene ciljnog mesta, pošto se smatra da je ekspresija RNK iz pol III promotora efikasna samo onda kada je prvi transkribovani nukleotid purin.

[0094] siRNK prema otkrivanju može biti usmerena na bilo koji lanac dužine od približno 19-25 susednih nukleotida u bilo kojoj ciljnoj iRNK sekvenci ("ciljna sekvenca"). Tehnike za selekciju ciljnih sekvenci za siRNK su date, na primer, u Tuschl T. et al., "The siRNA User Guide", revidiran 11. okt.2002. "The siRNA User Guide" je dostupan sa interneta sa vebsajta koji održava Dr. Thomas Tuschl, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, Njujork, USA, i može se naći pristupanjem vebsajtu Rockefeller University i pretraživanjem po ključnoj reči "siRNA". Na taj način, sens lanac aktuelne siRNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je u suštini identična sa bilo kojim susednim lancem dužine od oko 19 do oko 25 nukleotida u ciljnoj iRNK.

[0095] Generalno, ciljna sekvenca na ciljnoj iRNK može biti selekcionisana iz date kDNK sekvence koja odgovara ciljnoj iRNK, a koja prvenstveno potiče od 50 do 100 nt nishodno (tj. u 3’-smeru) od start kodona. Međutim, ciljna sekvenca može biti locirana u 5’- ili 3’-netransliranim regionima, ili u regionu pored start kodona.

[0096] siRNK se može dobiti korišćenjem više tehnika koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Na primer, siRNK se može hemijski sintetizovati ili rekombinantno dobiti korišćenjem metoda koji su poznati iz odgovarajuće oblasti, kao što je Drosophila in vitro sistem koji je opisan u US objavljenoj prijavi 2002/0086356 od Tuschl et al.

[0097] Prvenstveno se siRNK hemijski sintetiše korišćenjem odgovarajuće zaštićenih ribonukleozidnih fosforamidita i uobičajenog uređaja za sintezu DNK/RNK. siRNK se može sintetizovati kao dva posebna, komplementarna RNK molekula, ili kao jedan RNK molekul sa dva komplementarna regiona.

[0098] Alternativno tome, siRNK može takođe biti izražen od rekombinantnih cirkularnih ili linearnih DNK plazmida korišćenjem bilo kog podesnog promotora. Takvi primeri izvođenja su obuhvaćeni onda kada se ovde navodi primena siRNK ili uključivanje siRNK u farmaceutske kompozicije. Podesni promotori za izražavanje siRNK prema otkrivanju iz plazmida obuhvataju, na primer, U6 ili H1 RNK pol III promotorske sekvence i citomegalovirusni promotor.

[0099] Izbor drugih podesnih promotora je u okviru znanja iz odgovarajuće oblasti. Ovde opisani rekombinantni plazmidi prema otkrivanju mogu takođe obuhvatati induktibilne ili promotore koji se mogu regulisati za ekspresiju siRNK u određenom tkivu ili u određenoj intracelularnoj sredini.

[0100] siRNK izražena iz rekombinantnih plazmida može biti izolovana iz sistema za ekspresiju kultivisanih ćelija standardnim tehnikama, ili može biti izražena intracelularno. Upotreba rekombinantnih plazmida za uvođenje siRNK u ćelije in vivo je razmotrena detaljnije u nastavku. siRNK može biti izražena iz rekombinantnog plazmida bilo kao dva posebna, komplementarna RNK molekula, ili kao jedan RNK molekul sa dva komplementarna regiona.

[0101] Izbor plazmida koji su podesni za izražavanje siRNK, metodi za insertovanje sekvenci nukleinske kiseline radi izražavanja siRNK u plazmid, i metodi za uvođenje rekombinantnog plazmida u ćelije od interesa su u okviru znanja iz odgovarajuće oblasti.

[0102] siRNK takođe može biti izražena iz rekombinantnih virusnih vektora intracelularno in vivo. Rekombinantni virusni vektori sadrže sekvence koje kodiraju siRNK i bilo koji podesni promotor za izražavanje sekvenci siRNK. Rekombinantni virusni vektori takođe mogu sadržati induktibilne ili promotore koji se mogu regulisati za ekspresiju siRNK u određenom tkivu ili određenoj intracelularnoj sredini. siRNK može biti izražena iz rekombinantnog virusnog vektora bilo kao dva posebna, komplementarna RNK molekula, ili kao jedan RNK molekul sa dva komplementarna regiona.

[0103] Izraz "peptid" sadrži oligo- i polipeptide i odnosi se na supstance koje sadrže dva ili više, a prvenstveno 3 ili više, prvenstveno 4 ili više, prvenstveno 6 ili više, prvenstveno 8 ili više, prvenstveno 10 ili više, prvenstveno 13 ili još poželjnije 16 ili više, prvenstveno 21 ili više i prvenstveno do 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, a naročito 100 aminokiselina koje su kovalentno povezane peptidnim vezama. Izraz "protein" se odnosi na velike peptide, a prvenstveno na peptide sa više od 100 aminokiselinskih ostataka, ali generalno izrazi "peptidi" i "proteini" su sinonimi i ovde se upotrebljavaju jedan umesto drugog.

[0104] Proteini i peptidi koji su opisani prema otkrivanju su prvenstveno izolovani. Izraz "izolovani protein" ili "izolovani peptid" znači da je protein ili peptid bio izolovan iz svoje prirodne sredine. Izolovani protein ili peptid može da bude u suštini u prečišćenom stanju. Izraz "u suštini prečišćen" znači da je protein ili peptid u suštini bez drugih supstanci sa kojima se nalazi u prirodi ili in vivo.

[0105] Takvi proteini i peptidi mogu se koristiti, na primer, za dobijanje antitela i u imunološkom ili dijagnostičkom testu ili kao lekovi. Proteini i peptidi koji su opisani prema otkrivanju mogu biti izolovani iz bioloških uzoraka, kao što su homogenati tkiva ili ćelija i takođe mogu biti izraženi rekombinantno u velikom broju pro- ili eukariotskih sistema za ekspresiju.

[0106] Kada se koriste u smislu ovog opisa, "derivati" proteina ili peptida ili aminokiselinske sekvence obuhvataju varijante aminokiselinskih insercija, varijante aminokiselinskih delecija i/ili varijante aminokiselinskih supstitucija.

[0107] Varijante aminokiselinskih insercija obuhvataju amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije, a takođe i insercije jedne ili više aminokiselina, a naročito aminokiselinske sekvence. U slučaju varijanti aminokiselinske sekvence koje imaju inserciju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka je insertovan u određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, mada je takođe moguća i slučajna insercija sa odgovarajućim skriningom rezultujućeg proizvoda. Varijante aminokiselinskih delecija su karakterisane odstranjivanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence. Varijante aminokiselinskih supstitucija su karakterisane sa odstranjivanjem najmanje jednog ostatka u sekvenci i insertovanjem drugog ostatka na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama na pozicijama u aminokiselinskoj sekvenci koje nisu konzervativne između homologih proteina ili peptida i/ili zameni aminokiselina sa drugima koje imaju slična svojstva kao što su hidrofobnost, hidrofilnost, elektronegativnost, zapremina bočnog lanca i slično (konzervativna supstitucija). Konzervativne supstitucije se odnose, na primer, na zamenu jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom između dole navedenih iz iste grupe u kojoj se nalazi aminokiselina koja treba da bude supstituisana:

1. mali alifatični, nepolarni ili blago polarni ostaci: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)

2. negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi: Asn, Asp, Glu, Gln

3. pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg, Lys

4. veliki alifatični, nepolarni ostaci: Met, Leu, Ile, Val (Cys)

5. veliki aromatični ostaci: Phe, Tyr, Trp.

[0108] Zbog njihove posebne uloge u arhitekturi proteina, tri ostatka su prikazana u zagradama. Gly je jedini ostatak bez bočnog lanca i zato obezbeđuje fleksibilnost lanca. Pro ima neuobičajenu geometriju koja znatno ograničava lanac. Cys može obrazovati disulfidni most.

[0109] Varijante aminokiselina koje su gore opisane mogu se lako dobiti uz pomoć poznatih tehnika sinteze peptida, kao što su, na primer, sinteza čvrste faze (Merrifield, 1964) i slični metodi ili manipulacijom rekombinantne DNK. Manipulacija DNK sekvencama radi dobijanja proteina i peptida koji imaju supstitucije, insercije ili delecije je detaljno opisana, na primer, u Sambrook et al. (1989).

[0110] Prema otkrivanju, "derivati" proteina i peptida takođe obuhvataju pojedinačne ili višestruke supstitucije, delecije i/ili adicije bilo kojih molekula povezanih sa proteinom ili peptidom, kao što su ugljeni hidrati, lipidi i/ili proteini ili peptidi. Izraz "derivat" se takođe proteže na sve funkcionalne hemijske ekvivalente pomenutih proteina i peptida.

[0111] Prema predmetnom otkrivanju, deo ili fragment antigena povezanog sa tumorom prvenstveno ima funkcionalno svojstvo proteina ili peptida od koga potiče. Takva funkcionalna svojstva obuhvataju interakciju sa antitelima, interakciju sa drugim peptidima ili proteinima, selektivno vezivanje nukleinskih kiselina i enzimsku aktivnost. Posebno svojstvo je sposobnost da obrazuju kompleks sa MHC molekulima i, ako je podesno, da generišu imunu reakciju, a prvenstveno stimulisanjem citotoksičnih ili T pomoćnih ćelija. Deo ili fragment antigena povezanog sa tumorom prema otkrivanju prvenstveno sadrži sekvencu od najmanje 6, a naročito najmanje 8, najmanje 10, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30 ili najmanje 50, uzastopnih aminokiselina antigena povezanog sa tumorom. Deo ili fragment antigena povezanog sa tumorom prvenstveno sadrži sekvencu do 8, a naročito do 10, do 12, do 15, do 20, do 30 ili do 55, uzastopnih aminokiselina antigena povezanog sa tumorom. Deo ili fragment antigena povezanog sa tumorom je prvenstveno deo antigena povezanog sa tumorom koji odgovara netransmembranskom delu, a naročito ekstracelularni deo antigena, ili se sastoji od njega.

[0112] Poželjni delovi ili fragmenti antigena povezanog sa tumorom prema otkrivanju su naročito podesni za stimulaciju citotoksičnih T-limfocita in vivo, ali takođe i za dobijanje ekspandovanih i stimulisanih T-limfocita za terapeutski adoptivan prenos ex vivo.

[0113] Deo ili fragment nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom se odnosi prema otkrivanju na deo nukleinske kiseline, koji kodira bar antigen povezan sa tumorom i/ili deo ili fragment pomenutog antigena povezanog sa tumorom, kao što je gore definisano. Deo ili fragment nukleinske kiseline koji kodira antigen povezan sa tumorom je prvenstveno deo nukleinske kiseline koji odgovara otvorenom okviru čitanja.

[0114] Prema predmetnom otkrivanju, specifični primeri izvođenja bi trebali da obuhvataju realizaciju "dominantno negativnih" proteina ili peptida poreklom od antigena povezanih sa tumorom. Dominantno negativni protein ili peptid je neaktivna varijanta proteina ili peptida koja, putem interakcije sa celularnom mašinerijom, uklanja aktivni protein ili peptid iz njegove interakcije sa celularnom mašinerijom ili koji se takmiči sa aktivnim proteinom ili peptidom, čime smanjuje efekat pomenutog aktivnog proteina.

[0115] Antiserumi koji sadrže specifična antitela koja se specifično vezuju za ciljni protein mogu se dobiti različitim standardnim procesima; vidi, na primer, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" autora Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" autora Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 i "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" autora Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. Na taj način je takođe moguće da se generišu afinitetna i specifična antitela koja prepoznaju složene membranske proteine u njihovom prirodnom obliku (Azorsa et al., J.

Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol.143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Ovo je naročito važno za dobijanje antitela koja treba da se primene terapeutski, ali takođe za mnoge dijagnostičke primene. U tom pogledu, moguće je vršiti imunizaciju sa celim proteinom, sa ekstracelularnim delimičnim sekvencama, kao i sa ćelijama koje izražavaju ciljni molekul u fiziološki savijenom obliku.

[0116] Monoklonska antitela se tradicionalno dobijaju korišćenjem tehnologije hibridoma (za tehničke detalje vidi: "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" autora Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" autora Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" autora Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).

[0117] Poznato je da je samo mali deo molekula antitela, paratop, uključen u vezivanje antitela za njegov epitop (upor. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Njujork; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7. izdanje, Blackwell Scientific Publications, Oxford). pFc’ i Fc regioni su, na primer, efektori kaskade komplementa, ali nisu uključeni u vezivanje antigena. Antitelo iz koga je enzimski odstranjen pFc’ region ili koje je dobijeno bez pFc’ regiona, koje se naziva F(ab’)2 fragment, nosi oba mesta za vezivanje antigena kompletnog antitela. Slično tome, antitelo iz koga je enzimski odstranjen Fc region ili koje je dobijeno bez pomenutog Fc regiona, koje se naziva Fab fragment, nosi jedno mesto za vezivanje antigena molekula intaktnog antitela. Dalje, Fab fragmenti se sastoje od kovalentno vezanog lakog lanca antitela i dela teškog lanca pomenutog antitela, koji se naziva Fd. Fd fragmenti su glavne determinante specifičnosti antitela (samo jedan Fd fragment može biti povezan sa do deset različitih lakih lanaca, bez promene specifičnosti antitela) i Fd fragmenti, kada se izoluju, zadržavaju sposobnost da se vezuju za epitop.

[0118] Unutar dela antitela za vezivanje antigena su lokalizovani regioni koji određuju komplementarnost (engl. complementary-determining regions, skr. CDRs), koji sadejstvuju direktno sa epitopom antigena i okvirnim regionima (engl. framework regions, skr. FRs), koji zadržavaju tercijarnu strukturu paratopa. Fd fragment teškog lanca i laki lanac IgG imunoglobulina sadrže četiri okvirna regiona (FR1 do FR4) koji su uvek razdvojeni sa tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3). CDRs, a naročito CDR3 regioni, te posebno CDR3 region teškog lanca su u velikoj meri odgovorni za specifičnost antitela.

[0119] Poznato je da ne-CDR regioni sisarskog antitela mogu da se zamene sličnim regionima antitela sa istom ili različitom specifičnosti, uz zadržavanje specifičnosti za epitop originalnog antitela. Ovo je omogućilo razvoj "humanizovanih" antitela, kod kojih su nehumani CDRs kovalentno vezani za humane FR i/ili Fc/pFc’ regione da bi se dobilo funkcionalno antitelo.

[0120] Kao sledeći primer, u WO 92/04381 je opisano dobijanje i primena humanizovanih mišijih RSV antitela, kod kojih je bar deo mišijih FR regiona bio zamenjen sa FR regionima humanog porekla. Antitela ove vrste, uključujući fragmente intaktnih antitela sa sposobnošću vezivanja antigena, se često nazivaju "himerična" antitela.

[0121] Kada se ovde koristi, izraz "antitelo" takođe obuhvata F(ab’)2, Fab, Fv, i Fd fragmente antitela, himerična antitela, kod kojih su Fc i/ili FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 regioni lakog lanca bili zamenjeni sa homologim humanim ili nehumanim sekvencama, antitela himeričnog F(ab’)2-fragmenta u kojima su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 regioni lakog lanca bili zamenjeni sa homologim humanim ili nehumanim sekvencama, himerični Fab fragment antitela kod koga su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 regioni lakog lanca bili zamenjeni sa homologim humanim ili nehumanim sekvencama, i antitela himeričnog Fd-fragmenta kod kojih su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 regioni bili zamenjeni sa homologim humanim ili nehumanim sekvencama. Izraz "antitelo" takođe obuhvata "jednolančana" antitela.

[0122] Predmetno otkrivanje se takođe odnosi na proteine i peptide koji se specifično vezuju za antigene povezane sa tumorom. Vezivanje supstanci ove vrste može biti ostvareno, na primer, pomoću biblioteka degenerisanih peptida koje se mogu jednostavno pripremiti u rastvoru u imobilizovanom obliku ili kao biblioteke za prikazivanje faga. Isto tako je moguće da se dobiju kombinatorne biblioteke peptida sa jednom ili više aminokiselina. Takođe se mogu pripremiti biblioteke peptoida i nepeptidnih sintetičkih ostataka.

[0123] Antitela takođe mogu biti spojena, odnosno kuplovana sa specifičnim dijagnostičkim supstancama radi prikazivanja ćelija i tkiva koja izražavaju antigene povezane sa tumorom. Ona takođe mogu biti kuplovana sa terapeutski korisnim supstancama.

[0124] Dijagnostičke supstance obuhvataju bilo koji marker koji funkcioniše tako da: (i) obezbedi detektabilni signal; (ii) sadejstvuje sa drugim markerom da bi se modifikovao detektabilni signal koji je obezbeđen prvim ili drugim markerom, npr. FRET (fluorescentni rezonantni prenos energije, engl. Fluorescence Resonance Energy Transfer); (iii) utiče na pokretljivost, npr. elektroforetsku pokretljivost, naelektrisanje, hidrofobnost, oblik ili druge fizičke parametre, ili (iv) obezbeđuje hvatanje grupa, npr. afinitetno, antitela/antigena ili stvaranje kompleksa jona.

Podesni markeri su strukture, kao što su fluorescentni markeri, luminiscentni markeri, hromoforni markeri, radioizotopski markeri, izotopski markeri, a prvenstveno stabilni izotopski markeri, izobarski markeri, enzimski markeri, čestični markeri, a naročito metalni čestični markeri, magnetni čestični markeri, polimerni čestični markeri, mali organski molekuli kao što je biotin, ligandi receptora ili vezujući molekuli, kao što su ćelijski adhezioni proteini ili lektini, markerske sekvence koje sadrže nukleinske kiseline i/ili aminokiselinske ostatke koji se mogu detektovati upotrebom vezujućih agenasa, itd. Dijagnostičke supstance obuhvataju, na neograničavajući način, barijum sulfat, jocetaminsku kiselinu, jopansku kiselinu, kalcijum ipodat, natrijum diatrizoat, meglumin diatrizoat, metrizamid, natrijum tiropanoat i radio dijagnostike, uključujući emitere pozitrona kao što je fluor-18 i ugljenik-11, gama emitere kao što su jod-123, tehnecijum-99m, jod-131 i indijum-111, nuklide za nuklearnu magnetnu rezonancu, kao što su fluor i gadolinijum.

[0125] Kada se ovde koristi, izraz "terapeutski korisna supstanca" označava bilo koji molekul koji može imati terapeutski efekat. Prema predmetnom otkrivanju, terapeutski korisna supstanca se prvenstveno selektivno dovodi do ćelije koja izražava jedan ili više antigena povezanih sa tumorom i obuhvata antikancerske agense, jedinjenja obeležena radioaktivnim jodom, toksine, citostatike ili citolitičke lekove itd. Antikancerski agensi obuhvataju, na primer, aminoglutetimid, azatioprin, bleomicin sulfat, busulfan, karmustin, hlorambucil, cisplatin, ciklofosfamid, ciklosporin, citarabidin, dakarbazin, daktinomicin, daunorubin, doksorubicin, taksol, etopozid, fluorouracil, interferon-α, lomustin, merkaptopurin, metotreksat, mitotan, prokarbazin HCl, tiogvanin, vinblastin sulfat i vinkristin sulfat. Drugi antikancerski agensi su opisani, na primer, u Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8. izdanje, 1990, McGraw-Hill, Inc., a naročito u Poglavlju 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner). Toksini mogu biti proteini kao što je antivirusni protein iz vinobojke (lat. Phytolacca americana), toksin kolere, toksin velikog kašlja, ricin, gelonin, abrin, egzotoksin difterije ili egzotoksin Pseudomonasa. Ostaci toksina takođe mogu biti radionuklidi koji emituju visoku energiju, kao što je kobalt-60.

[0126] Izraz "glavni kompleks histokompatibilnosti" ili "MHC" se odnosi na kompleks gena koji je prisutan kod svih kičmenjaka. MHC proteini ili molekuli su uključeni u prenos signala između limfocita i ćelija koje prezentuju antigen u normalnim imunim reakcijama preko vezujućih peptida i njihovim prezentovanjem radi prepoznavanja od strane T ćelijskih receptora (engl. T cell receptors, skr. TCR). MHC molekuli vezuju peptide unutar odeljka za intracelularnu obradu i prezentuju ove peptide na površini ćelija koje prezentuju antigen radi prepoznavanja od strane T ćelija. Humani MHC region, koji je takođe označen sa HLA, lociran je na hromozomu 6 i obuhvata region klase I i klase II. U jednom poželjnom primeru izvođenja svih ovde opisanih aspekata MHC molekul je HLA molekul.

[0127] Kada se ovde upotrebljava, "smanjivanje" ili "inhibiranje" označava sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, a prvenstveno 20% ili veće, još poželjnije 50% ili veće, i najpoželjnije 75% ili veće nivoa, npr. nivoa proteina ili iRNK u poređenju sa referentnim uzorkom (npr. uzorkom koji nije tretiran sa siRNK). Ovo smanjenje ili inhibicija ekspresije RNK ili proteina može se izvršiti ciljanim sečenjem ili razlaganjem iRNK. Testovi za ekspresiju proteina ili ekspresiju nukleinskih kiselina su poznati iz odgovarajuće oblasti i to su, na primer, ELISA, vestern blot analiza ekspresije proteina, i „nordern bloting“ ili testovi zaštite RNK od RNaze.

[0128] Izraz "pacijent" prema otkrivanju označava ljudsko biće, nehumanog primata ili drugu životinju, a naročito sisara, kao što je krava, konj, svinja, ovca, koza, pas, mačka ili glodar, kao što su miš i pacov. U posebno poželjnom primeru izvođenja, pacijent je ljudsko biće.

[0129] "Abnormalna ekspresija" prema otkrivanju znači da je ekspresija promenjena, a prvenstveno povećana u poređenju sa stanjem kod zdrave jedinke.

[0130] Prema otkrivanju izraz "povećan" ili " povećana količina" prvenstveno znači povećanje od najmanje 10%, a naročito najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%. Količina supstance je takođe povećana u testiranom uzorku, kao što je biološki uzorak, u poređenju sa referentnim uzorkom, ako je detektabilna u testiranom uzorku, ali nije prisutna ili nije detektabilna u referentnom uzorku.

[0131] Kada se ovde koristi, izraz "bolest" se odnosi na bilo koje patološko stanje kod koga su antigeni povezani sa tumorom izraženi ili abnormalno izraženi. "Abnormalna ekspresija" prema otkrivanju znači da je ekspresija promenjena, a prvenstveno je povećana u poređenju sa stanjem kod zdrave jedinke. Povećanje ekspresije znači povećanje od najmanje 10%, a naročito najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%. U jednom primeru izvođenja, antigen povezan sa tumorom je izražen samo u tkivu bolesne jedinke, dok je kod zdrave jedinke ekspresija suzbijena. Jedan primer takve bolesti je kancer, pri čemu izraz "kancer" prema otkrivanju obuhvata leukemije, seminome, melanome, teratome, limfome, neuroblastome, gliome, kancer rektuma, kancer endometrijuma, kancer bubrega, kancer nadbubrežnih žlezda, kancer štitne žlezde, kancer krvi, kancer kože, kancer mozga, kancer grlića materice, intestinalni kancer, kancer jetre, kancer kolona, kancer želuca, kancer creva, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer limfnih čvorova, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uha, grla i nosa (engl. ear, nose and throat, skr. ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, kancer jajnika i kancer pluća i njihove metastaze. Njihovi primeri su karcinomi pluća, karcinomi mlečnih žlezda, karcinomi prostate, karcinomi kolona, karcinomi bubrežnih ćelija, karcinomi grlića materice, ili metastaze tipova kancera ili tumora koji su gore opisani. Izraz kancer prema otkrivanju takođe sadrži metastaze kancera.

[0132] Pod "tumorom" se podrazumeva abnormalna grupa ćelija ili tkivo koje raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste i pošto stimulansi koji su inicirali novi rast nestanu. Tumori ispoljavaju delimičan ili kompletan nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom i obično formiraju posebnu masu tkiva, koja može biti benigna ili maligna.

[0133] Pod izrazom "metastaza" se podrazumeva širenje ćelija kancera sa njegovog originalnog mesta na drugi deo tela. Formiranje metastaze je veoma kompleksan proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija sa primarnog tumora, invazije ekstracelularne matrice, penetracije kroz endotelijalne bazalne membrane radi ulaska u telesne šupljine i sudove, a onda, posle transportovanja putem krvi, od infiltracije u ciljnim organima. Konačno, rast novog tumora na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaza tumora se često pojavljuje čak i posle odstranjivanja primarnog tumora, jer tumorske ćelije ili komponente mogu da ostanu i razviju metastatički potencijal. U jednom primeru izvođenja, izraz "metastaza" prema otkrivanju se odnosi na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnih čvorova.

[0134] Prema predmetnom otkrivanju, biološki uzorak može biti uzorak tkiva, uključujući i telesne tečnosti, i/ili uzorak ćelija i može se dobiti na uobičajeni način, kao što je biopsijom tkiva, uključujući probojnu biopsiju, i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, ispljuvka, urina, fecesa ili drugih telesnih tečnosti. Kada se ovde koristi, izraz "biološki uzorak" takođe obuhvata i frakcije bioloških uzoraka.

[0135] Kada se ovde koristi, izraz "imunoreaktivna ćelija" označava ćeliju koja može da sazri u imunu ćeliju (kao što je B ćelija, T pomoćna ćelija, ili citolitička T ćelija) uz pogodnu stimulaciju. Imunoreaktivne ćelije obuhvataju CD34<+>hematopoetske matične ćelije, nezrele i zrele T ćelije i nezrele i zrele B ćelije. Ako je poželjna proizvodnja citolitičkih ili T pomoćnih ćelija koje prepoznaju antigen povezan sa tumorom, onda se imunoreaktivna ćelija dovodi u kontakt sa ćelijom koja izražava antigen povezan sa tumorom pod uslovima koji stimulišu stvaranje, diferencijaciju i/ili selekciju citolitičkih T ćelija i T pomoćnih ćelija. Diferencijacija prekursora T ćelija u citolitičke T ćelije, kada su izloženi antigenu, je slična klonskoj selekciji imunog sistema.

[0136] Izrazi "T ćelija" i "T limfocit" se ovde upotrebljavaju jedan umesto drugog i obuhvataju T pomoćne ćelije i citotoksične T ćelije koje sadrže citolitičke T ćelije.

[0137] Neki terapeutski metodi su bazirani na reakciji imunog sistema pacijenta, koja rezultuje lizom ćelija koje prezentuju antigen, kao što su ćelije kancera, koje prezentuju jedan ili više antigena povezanih sa tumorom. U vezi toga, na primer, autologni citotoksični T limfociti specifični za kompleks antigena povezanog sa tumorom i MHC molekula se daju pacijentu koji ima celularnu abnormalnost. Poznata je proizvodnja takvih citotoksičnih T limfocita in vitro. Jedan primer metoda diferencijacije T ćelija se može naći u WO-A-9633265. Generalno, uzorak koji sadrži ćelije, kao što su ćelije krvi, se uzima od pacijenta i ćelije se dovode u kontakt sa ćelijom koja prezentuje kompleks i koja može izazvati propagaciju citotoksičnih T limfocita (npr. dendritskih ćelija). Ciljna ćelija može biti transfektovana ćelija, kao što je COS ćelija. Ove transfektovane ćelije prezentuju željeni kompleks na svojoj površini i, kada se dovedu u kontakt sa citotoksičnim T limfocitima, stimulišu propagaciju zadnje pomenutih. Onda se pacijentu daju klonski ekspandovani autologni citotoksični T limfociti.

[0138] U sledećem metodu selekcije citotoksičnih T limfocita specifičnih za antigen, fluorogeni tetrameri MHC molekulskih/peptidnih kompleksa klase I se upotrebljavaju za dobijanje specifičnih klonova citotoksičnih T limfocita (Altman et al., Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol.8:413-416, 1998).

[0139] Predmetno otkrivanje takođe obuhvata terapeutske metode koju su poznate kao adoptivni transfer (Greenberg, J. Immunol.136(5):1917, 1986; Riddel et al., Science 257:238, 1992; Lynch et al., Eur. J. Immunol.21:1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59:603-614, 1989), pri čemu se ćelije koje prezentuju željeni kompleks (npr. dendritske ćelije) kombinuju sa citotoksičnim T limfocitima pacijenta koji treba da se leči, što rezultuje propagacijom specifičnih citotoksičnih T limfocita. Onda se pacijentu koji ima celularnu anomaliju koja je naročito karakterisana abnormalnim ćelijama koje prezentuju specifični kompleks daju propagirani citotoksični T limfociti. Zatim citotoksični T limfociti liziraju abnormalne ćelije, čime se ostvaruje željeni terapeutski efekat.

[0140] Dalje, ćelije koje prezentuju željeni kompleks (npr. dendritske ćelije) mogu biti kombinovane sa citotoksičnim T limfocitima zdravih jedinki ili drugih vrsta (npr. miša), što može rezultovati propagacijom specifičnih citotoksičnih T limfocita sa visokim afinitetom. Visoko-afinitetni T ćelijski receptor ovih propagiranih specifičnih T limfocita može biti kloniran i opciono humanizovan do različite mere, a T ćelijski receptori dobijeni na ovaj način zatim mogu biti transdukovani putem transfera gena, na primer, korišćenjem retrovirusnih vektora, u T ćelije pacijenata. Onda može biti izvršen adoptivni transfer ovih genetski promenjenih T limfocita (Stanislawski et al., Nat Immunol.2:962-70, 2001; Kessels et al., Nat Immunol.2:957-61, 2001).

[0141] Adoptivni transfer nije jedini oblik terapije koji se može primeniti prema otkrivanju. Takođe se mogu generisati citotoksični T limfociti in vivo na način koji je poznat kao takav. Prema jednom metodu se upotrebljavaju neproliferativne ćelije koje izražavaju kompleks. Ćelije koje se ovde upotrebljavaju će biti one koje obično izražavaju kompleks, kao što su ozračene ćelije tumora ili ćelije transfektovane sa jednim ili oba gena neophodna za prezentaciju kompleksa (tj. antigenog peptida i prezentujućeg MHC molekula). Sledeći poželjni oblik je uvođenje antigena povezanog sa tumorom u obliku rekombinantne RNK koja se može uvesti u ćelije, na primer, putem lipozomalnog transfera ili elektroporacije. Rezultujuće ćelije prezentuju kompleks od interesa i njih prepoznaju autologni citotoksični T limfociti, koji se onda propagiraju.

[0142] Sličan efekat se može ostvariti kombinovanjem antigena povezanog sa tumorom ili njegovog fragmenta sa adjuvansom da bi se omogućilo ugrađivanje u ćelije koje prezentuju antigen in vivo. Antigen povezan sa tumorom ili njegov fragment može biti prezentovan kao protein, DNK (npr. unutar vektora) ili RNK.

Antigen povezan sa tumorom se obrađuje tako da proizvede peptidni partner za MHC molekul, dok njegov fragment može biti prezentovan bez potrebe za daljom obradom. Zadnje pomenuto važi naročito, ako ovi mogu da se vezuju za MHC molekule.

Prednost se daje oblicima za primenu u kojima se kompletan antigen obrađuje in vivo pomoću dendritskih ćelija, pošto se time takođe mogu ostvariti reakcije T pomoćnih ćelija koje su potrebne za efektivnu imunu reakciju (Ossendorp et al., Immunol Lett.

74:75-9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med.187:693-702, 1998). Generalno, moguće je davati efektivnu količinu antigena povezanog sa tumorom pacijentu, na primer, intradermalnom injekcijom. Međutim, injekcija se može takođe dati intranodalno u limfni čvor (Maloy et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303, 2001).

[0143] Ovde opisane farmaceutske kompozicije i metodi lečenja takođe se mogu primeniti za imunizaciju ili vakcinaciju radi terapeutskog lečenja ili sprečavanja ovde opisane bolesti. Prema otkrivanju, izrazi "imunizacija" ili "vakcinacija" se prvenstveno odnose na povećanje ili aktivaciju imune reakcije na antigen. Za testiranje imunizujućeg efekta na kancer korišćenjem antigena povezanog sa tumorom ili nukleinske kiseline koja ga kodira je moguće primeniti životinjske modele. Na primer, humane ćelije kancera se mogu uvesti u miša da bi se generisao tumor, i može im se dati jedna ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene povezane sa tumorom. Efekat na ćelije kancera (na primer, smanjenje veličine tumora) se može izmeriti kao mera efektivnosti imunizacije nukleinskom kiselinom.

[0144] Kao deo kompozicije za imunizaciju ili vakcinaciju, prvenstveno se jedan ili više antigena povezanih sa tumorom ili njihovih stimulišućih fragmenata daju zajedno sa jednim ili više adjuvanasa radi indukovanja imune reakcije ili radi pojačanja imune reakcije. Adjuvans je supstanca koja je ugrađena u antigen ili se daje zajedno za zadnje pomenutim i koja pojačava imunu reakciju. Adjuvansi mogu pojačati imunu reakciju obezbeđivanjem rezervoara antigena (ekstracelularno ili u makrofagima), aktiviranjem makrofaga i/ili stimulisanjem posebnih limfocita. Adjuvansi su poznati i na neograničavajući način obuhvataju monofosforil lipid A (MPL, SmithKline Beecham), saponine, kao što su QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 i QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997), nekompletni Frojndov adjuvans, kompletni Frojndov adjuvans, vitamin E, montanid, stipsu, CpG oligonukleotide (upor. Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995) i različite emulzije voda-u-ulju pripremljene od biološki razgradivih ulja, kao što su skvalen i/ili tokoferol. Peptidi se prvenstveno daju u smeši sa DQS21/MPL. Odnos DQS21 prema MPL je obično oko 1:10 do 10:1, a prvenstveno oko 1:5 do 5:1 i a naročito oko 1:1. Za davanje ljudima, formulacija vakcine obično sadrži DQS21 i MPL u opsegu od oko 1 μg do oko 100 μg.

[0145] Takođe se mogu davati druge supstance koje stimulišu imunu reakciju kod pacijenta. Moguće je, na primer, koristiti citokine za vakcinaciju, zahvaljujući njihovim regulatornim svojstvima za limfocite. Takvi citokini obuhvataju, na primer, interleukin-12 (IL-12), za koji je pokazano da pojačava zaštitna dejstva vakcina (upor. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF i IL-18.

[0146] Postoji više jedinjenja koja pojačavaju imunu reakciju i koja se zato mogu koristiti za vakcinaciju. Pomenuta jedinjenja sadrže kostimulišuće molekule, koji imaju oblik proteina ili nukleinskih kiselina, kao što su B7-1 i B7-2 (CD80 i CD86, respektivno).

[0147] Otkrivanjem je takođe realizovano davanje nukleinskih kiselina, proteina ili peptida. Proteini i peptidi se mogu davati na način koji je poznat kao takav. U jednom primeru izvođenja, nukleinske kiseline se daju ex vivo metodama, tj. uzimanjem ćelija od pacijenta, genetskom modifikacijom pomenutih ćelija da bi se ugradio antigen povezan sa tumorom i ponovnim uvođenjem promenjenih ćelija u pacijenta. Ovo generalno obuhvata uvođenje funkcionalne kopije gena u ćelije pacijenta in vitro i ponovno uvođenje genetski promenjenih ćelija u pacijenta. Funkcionalna kopija gena je pod funkcionalnom kontrolom regulatornih elemenata koji omogućavaju da gen bude izražen u genetski promenjenim ćelijama. Metodi transfekcije i transdukcije su poznati stručnjaku iz odgovarajuće oblasti. Pronalaskom je takođe realizovano davanje nukleinskih kiselina in vivo korišćenjem vektora, kao što su virusi i ciljno kontrolisani lipozomi. Ako se prema otkrivanju vrši poziv na davanje ili ugrađivanje nukleinskih kiselina u farmaceutske kompozicije, onda ovo obuhvata primere izvođenja kod kojih je nukleinska kiselina prisutna u takvim vektorima.

[0148] U poželjnom primeru izvođenja, virus ili virusni vektor za davanje nukleinske kiseline koja kodira antigen povezan sa tumorom je izabran iz grupe koja se sastoji od adenovirusa, virusa povezanih sa adenovirusima, virusa boginja, uključujući vakcinija virus i oslabljene viruse boginja, Semliki Forest virus, retroviruse, Sindbis virus i čestice slične Ty virusu. Posebna prednost se daje adenovirusima i retrovirusima. Retrovirusi su obično deficijentni u pogledu replikacije (tj. oni ne mogu da generišu infektivne čestice).

[0149] Metodi uvođenja nukleinskih kiselina u ćelije in vitro ili in vivo obuhvataju transfekciju nukleinske kiseline kalcijum fosfatnim talozima, transfekciju nukleinskih kiselina povezanu sa DEAE, transfekciju ili infekciju sa gore navedenim virusima koji nose nukleinske kiseline od interesa, lipozomima posredovanu transfekciju i slično. U posebnim primerima izvođenja daje se prednost usmeravanju nukleinske kiseline u posebne ćelije. U takvim primerima izvođenja, nosač koji se upotrebljava za davanje nukleinske kiseline ćeliji (npr. retrovirus ili lipozom) može imati vezani ciljni kontrolni molekul. Na primer, molekul kao što je antitelo specifično za protein na površini membrane na ciljnoj ćeliji ili ligand za receptor na ciljnoj ćeliji, može biti ugrađen u nosač nukleinske kiseline ili vezan na njega. Poželjna antitela sadrže antitela koja selektivno vezuju antigen povezan sa tumorom. Ako je poželjno davanje nukleinske kiseline putem lipozoma, onda proteini koji se vezuju za protein na površini membrane povezan sa endocitozom mogu biti ugrađeni u formulaciju lipozoma da bi se omogućila ciljna kontrola i/ili apsorpcija. Takvi proteini sadrže kapsidne proteine ili njihove fragmente koji su specifični za određen tip ćelije, antitela za proteine koji se internalizuju, proteine koji su usmereni na intracelularno mesto i slično.

[0150] Terapeutske kompozicije prema otkrivanju se mogu davati u farmaceutski kompatibilnim preparatima. Takvi preparati mogu obično sadržati farmaceutski kompatibilne koncentracije soli, puferskih supstanci, konzervanasa, nosača, suplementirajućih supstanci koje pojačavaju imunitet, kao što su adjuvansi, npr. CpG oligonukleotidi, citokini, hemokini, saponin, GM-CSF i/ili RNK i, ako je podesno, druga terapeutski aktivna jedinjenja.

[0151] Terapeutski aktivna jedinjenja prema otkrivanju se mogu davati bilo kojim uobičajenim putem, uključujući injekciju ili infuziju. Davanje se može vršiti, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano ili transdermalno. Prvenstveno se antitela terapeutski daju u obliku aerosola za pluća. Antisens nukleinske kiseline se prvenstveno daju sporom intravenskom primenom.

[0152] Kompozicije prema otkrivanju se daju u efektivnim količinama. "Efektivna količina" se odnosi na količinu koja ostvaruje željenu reakciju ili željeni efekat sama ili zajedno da dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja karakterisanog ekspresijom jednog ili više antigena povezanih sa tumorom, željena reakcija se prvenstveno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo sadrži usporavanje napredovanja bolesti i, naročito, prekid ili preusmeravanje napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja takođe može biti odlaganje pojave ili prevencija pojave pomenute bolesti ili pomenutog stanja. Prema otkrivanju, dijagnostika ili lečenje kancera takođe mogu obuhvatati dijagnostiku ili lečenje metastaza kancera koje su se već formirale ili će se formirati. Prema otkrivanju, izraz "lečenje" sadrži terapeutsko i profilaktičko lečenje, tj. prevenciju.

[0153] Efektivna količina kompozicije prema otkrivanju će zavisiti od stanja koje treba da se leči, od ozbiljnosti bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, visinu i težinu, trajanje lečenja, tip prateće terapije (ako postoji), specifični način primene i slične faktore.

[0154] Farmaceutske kompozicije prema otkrivanju su prvenstveno sterilne i sadrže efektivnu količinu terapeutski aktivne supstance radi generisanja željene reakcije ili željenog efekta.

[0155] Doze kompozicija prema otkrivanju koje se daju mogu zavisiti od različitih parametara, kao što je tip primene, stanje pacijenta, željeni period primene itd. U slučaju da je reakcija pacijenta na početnu dozu nedovoljna, mogu se primeniti veće doze (ili efektivno veće doze koje se ostvaruju drugačijim, lokalizovanijim načinom primene).

[0156] Generalno se formulišu i primenjuju radi lečenja ili radi generisanja ili pojačanja imune reakcije doze antigena povezanog sa tumorom od 1 ng do 1 mg, a prvenstveno od 10 ng do 100 μg. Ako je poželjna primena nukleinskih kiselina (DNK i RNK) koje kodiraju antigene povezane sa tumorom, onda se formulišu i primenjuju doze od 1 ng do 0,1 mg.

[0157] Farmaceutske kompozicije prema otkrivanju se generalno daju u farmaceutski kompatibilnim količinama i u farmaceutski kompatibilnim kompozicijama. Izraz "farmaceutski kompatibilan" se odnosi na netoksični materijal koji ne utiče na dejstvo aktivne komponente farmaceutske kompozicije. Preparati ove vrste mogu obično sadržati soli, puferske supstance, konzervanse, nosače i, ako je podesno, druga terapeutski aktivna jedinjenja. Kada se upotrebljavaju u medicini, onda bi soli trebale da budu farmaceutski kompatibilne. Međutim, soli koje nisu farmaceutski kompatibilne se mogu primeniti za dobijanje farmaceutski kompatibilnih soli i obuhvaćene su pronalaskom. Farmakološki i farmaceutski kompatibilne soli ove vrste obuhvataju, na neograničavajući način, one koje su dobijene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, ćilibarne kiseline. Farmaceutski kompatibilne soli se mogu takođe pripremiti kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su natrijumove soli, kalijumove soli ili kalcijumove soli.

[0158] Farmaceutska kompozicija prema otkrivanju može sadržati farmaceutski kompatibilni nosač. Kada se ovde koristi, izraz "farmaceutski kompatibilan nosač" se odnosi na jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razređivača ili inkapsulirajućih supstanci, koje su podesne za davanje ljudima. Izraz "nosač" se odnosi na organsku ili neorgansku komponentu, prirodnog ili sintetičkog porekla, u kojoj je kombinovana aktivna komponenta da bi se olakšala primena. Komponente farmaceutske kompozicije prema otkrivanju su obično takve da ne dolazi ni do kakve interakcije koja u suštini smanjuje željenu farmaceutsku efikasnost.

[0159] Farmaceutske kompozicije prema otkrivanju mogu sadržati podesne puferske supstance, kao što su sirćetna kiselina u soli, limunska kiselina u soli, borna kiselina u soli i fosforna kiselina u soli.

[0160] Farmaceutske kompozicije takođe mogu, ako je podesno, sadržati podesne konzervanse, kao što su benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.

[0161] Farmaceutske kompozicije su obično pripremljene u obliku ujednačene doze i mogu se pripremiti na način koji je poznat kao takav. Farmaceutske kompozicije prema otkrivanju mogu biti, na primer, u obliku kapsula, tableta, lozengi, rastvora, suspenzija, sirupa, eliksira ili u obliku emulzije.

[0162] Kompozicije koje su podesne za parenteralno davanje obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je prvenstveno izotoničan u krvi primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, obično se upotrebljavaju sterilna, fiksirana ulja kao medijum za rastvaranje ili suspendovanje.

[0163] Predmetni pronalazak je detaljno opisan na osnovu slika i primera u nastavku, koji su upotrebljeni isključivo radi ilustracije i ne treba ih smatrati ograničavajućim. Na osnovu opisa i primera, stručnjaku iz odgovarajuće oblasti su dostupni drugi primeri izvođenja, koji su isto tako obuhvaćeni pronalaskom.

Slike nacrta:

[0164]

Sl. 1. Ekspresija ISC-468 iRNK

A. RT-PCR ispitivanja sa ISC-468-specifičnim prajmerima nisu pokazala značajnu ekspresiju u svim testiranim normalnim tkivima osim placente. B. ekspresija ISC-468 iRNK u karcinomima glave i vrata, jetre, bubrega i kolona.

C. ekspresija ISC-468 iRNK u karcinomima dojke, jajnika i želuca.

Sl. 2. Kvantitativna PCR analiza ekspresije ISC-468 iRNK u normalnim kontrolnim tkivima i kancerima dojke

PCR ispitivanja u realnom vremenu sa ISC-468-specifičnim prajmerima su pokazala selektivnu ekspresiju iRNK u normalnom testisu, placenti, želucu i PBMC, i u svim biopsijama karcinoma dojke.

Sl. 3. Ekspresija ISC-468 iRNK

(A) RT-PCR i B) PCR ispitivanje u realnom vremenu sa ISC-468-specifičnim prajmerima je pokazalo selektivnu ekspresiju iRNK u normalnom testisu, placenti, i kod 80% biopsija karcinoma dojke.

Sl. 4. Imunofluorescentna analiza ekspresije ISC-468

(A) Specifičnost anti-ISC-468 antitela je potvrđena bojenjem ISC-468-eGFP transfektovanih ćelija. (B) Bojenje ćelija fiksiranih sa MeOH, bilo transfektovanih sa ISC-468-specifičnim RNKi dupleksima, ili neutišavajućim kontrolnim dupleksima. (C) Bojenje nefiksiranih ćelija, bilo transfektovanih sa ISC-468-specifičnim RNKi dupleksima, ili neutišavajućim kontrolnim dupleksima.

Sl. 5. Imunohistohemijska analiza ekspresije ISC-468

Ekspresija nije bila detektabilna u normalnom tkivu dojke (A) 100x, (B) 200x. Nasuprot tome, bilo je uočeno jako i homogeno bojenje membrana u uzorcima karcinoma dojke (C) 100x, (D) 200x.

Sl. 6. Nok-daun ekspresije ISC-468 iRNK koji je indukovan sa RNKi Transfekcija ćelija sa ISC-468-specifičnim siRNK dupleksima je rezultovala karakterističnom „nok-daun“ ekspresijom ISC-468 iRNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama.

Sl. 7. Analiza ćelijske proliferacije

Transfekcija ćelija sa ISC-468-specifičnim siRNK dupleksima je rezultovala karakterističnim smanjenjem ćelijske proliferacije u poređenju sa kontrolnim ćelijama.

Sl. 8. Analiza ćelijskog ciklusa

Transfekcija ćelija sa ISC-468-specifičnim siRNK dupleksima rezultovala je G1/S blokadom kod (A) MCF-7 i (B) BT-549 ćelija karcinoma dojke u poređenju sa kontrolnim ćelijama.

Sl. 9. AKT fosforilacija

Transfekcija ćelija sa ISC-468-specifičnim siRNK dupleksima je rezultovala karakterističnim smanjenjem AKT fosforilacije u poređenju sa kontrolnim ćelijama.

Sl. 10. Inhibicija proliferacije posredovana antitelom

Inkubacija ćelija karcinoma dojke MCF-7 sa ISC-468 specifičnim antitelima je rezultovala smanjenom proliferacijom u poređenju sa ćelijama inkubiranim sa irelevantnim kontrolnim antitelom.

Sl. 11. Analiza ćelijske proliferacije

Transfekcija ćelija sa ISC-468-specifičnim siRNK dupleksima je rezultovala sa karakterističnim smanjenjem (A) hemotaksije, (B) hemokineze i (C) invazije u poređenju sa kontrolnim ćelijama.

Sl. 12. Korelacija sa receptorom estrogena

Nivoi ekspresije ISC-468 iRNK kod uzoraka karcinoma dojke su u korelaciji sa stanjem receptora estrogena. Prikazani su medijana, 10 i 90 procenata sa opsezima greške.

Sl. 13. Tretman sa 17ß-estradiolom

Ekspresija ISC-468 iRNK je bila indukovana tretmanom MCF-7 ćelijske linije karcinoma dojke koja je pozitivna na receptore estrogena sa 100nM 17ßestradiola. Kod MDA-MB-231 ćelijske linije koja je negativna na receptore estrogena nije uočena nikakva indukcija.

Sl. 14. Sekvence

Prikazane su sekvence koje se ovde navode.

Primeri:

Materijal i metode

[0165] Tehnike i metode koje su ovde pomenute su izvedene na način koji je poznat kao takav i opisane su, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Sve metode, uključujući primenu kompleta i reagenasa, su izvedene prema informacijama proizvođača.

Ekstrakcija RNK, pripremanje poli-d(T) prajmirane kDNK i uobičajena RT-PCR analiza

[0166] Ukupna RNK je ekstrahovana iz materijala prirodnog tkiva korišćenjem gvanidijum izotiocijanata kao haotropnog agensa (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem.162:156-9, 1987). Posle ekstrakcije sa kiselim fenolom i taloženjem sa izopropanolom, pomenuta RNK je bila rastvorena u vodi tretiranoj sa DEPC.

Sinteza prvog lanca kDNK od 4 μg ukupne RNK je bila izvedena u 20 μl reakcione smeše pomoću Superscripta II (Invitrogen), prema informacijama proizvođača.

Upotrebljeni prajmer je bio dT(18) oligonukleotid. Integritet i kvalitet kDNK su provereni amplifikacijom p53 u 30 ciklusa PCR ((SEQ ID NO:33,34)), temperatura hibridizacije 67°C).

Arhiva prvog lanca kDNK je bila pripremljena od određenog broja normalnih tkiva i tumorskih entiteta. Za studije ekspresije je bilo amplifikovano 0,5 μl ovih kDNK u 30 μl reakcione smeše, korišćenjem GOI-specifičnih prajmera (vidi dole) i 1 U HotStarTaq DNK polimeraze (Qiagen). Svaka reakciona smeša je sadržala 150 μM dNTPs, 0,3 μM svakog prajmera i 3 μl 10 x reakcionog pufera. Prajmeri su izabrani tako da budu locirani na dva različita egzona, a eliminacija interference kontaminirajuće genomske DNK kao razlog za lažne pozitivne rezultate je potvrđena testiranjem nereverzno-transkribovane DNK kao obrasca. Posle 15 minuta na 95°C da bi se aktivirala HotStarTaq DNK polimeraza, izvedeno je 35 ciklusa PCR (0,5 min na 94°C, 0,5 min na konkretnoj temperaturi hibridizacije, 0,5 min na 72°C i finalno izduživanje na 72°C tokom 6 min).20 μl ove reakcione smeše je frakcionisano i analizirano je na etidijum bromidom obojenom agaroznom gelu.

Priprema kDNK prajmirane slučajnim heksamerom i kvantitativna PCR u realnom vremenu

[0167] Ekspresija nekoliko gena je kvantifikovana pomoću PCR u realnom vremenu. PCR proizvodi su detektovani korišćenjem SYBR Green kao interkalirajuće reporter boje. Reporter fluorescencija SYBR Green je suprimirana u rastvoru, a boja je bila aktivna tek posle vezivanja dvolančanih fragmenata DNK. Povećanje SYBR Green fluorescencije kao rezultat specifične amplifikacije uz korišćenje GOI-specifičnih prajmera posle svakog ciklusa PCR je primenjeno za kvantifikaciju. Ekspresija ciljnog gena je kvantifikovana apsolutno ili relativno u odnosu na ekspresiju kontrolnog gena, sa konstantnom ekspresijom u ispitivanim tkivima. Ekspresija je izmerena posle standardizacije uzoraka protiv 18s RNK kao takozvanog pripremnog gena korišćenjem ΔΔ-Ct metoda (PE Biosystems, USA). Reakcije su izvršene u dva ponavljanja, a određene su u tri ponavljanja. QuantiTect SYBR Green PCR komplet (Qiagen, Hilden) je upotrebljen prema instrukcijama proizvođača. kDNK je bila sintetisana sa slučajnim prajmerima (Invitrogen) uz korišćenje gore opisanog protokola. Svaka porcija razređene kDNK od 5 μl je upotrebljena u ukupnoj zapremini od 30 μl za PCR: sens prajmer 300 nM, antisens prajmer 300 nM; početna denaturacija 95°C u trajanju od 15 min; 95°C u trajanju od 30 sec; spajanje u trajanju od sec; 72°C u trajanju od 30 sec; 40 ciklusa. Sekvence upotrebljenih prajmera su navedene u odgovarajućim primerima.

Kloniranje i sekvencijalna analiza

[0168] Kloniranje celih gena i fragmenata gena je izvedeno uobičajenim metodama. Da bi se odredila sekvenca, odgovarajući antigeni su bili amplifikovani korišćenjem ispravljačke polimeraze pfu (Stratagene). Posle završetka PCR, adenozin je vezan pomoću HotStarTaq DNK polimeraze za krajeve amplikona radi kloniranja fragmenata prema instrukcijama proizvođača u TOPO-TA vektor. Sekvenciranje je izvršeno komercijalnim putem. Sekvence su bile analizirane korišćenjem uobičajenih programa za predviđanje i algoritama.

Analiza ćelijske proliferacije

[0169] 24 h posle transfekcije sa siRNK dupleksima 1x10<4>ćelija je kultivisano u medijumu dopunjenom sa različitim koncentracijama FCS u trajanju od 48 h.

Proliferacija je bila analizirana merenjem ugradnje BrdU u novo sintetisane lance DNK korišćenjem DELFIA kompleta za proliferaciju ćelija (Perkin Elmer) prema instrukcijama proizvođača na Wallac Victor2 multi-label brojaču (Perkin Elmer).

Analiza ćelijskog ciklusa i apoptoze

[0170] Ćelije su bile kultivisane u medijumu dopunjenom sa FCS u različitim koncentracijama, pa su sakupljene posle 48 h i obojene su propidijumjodidom pre analize sadržaja DNK protočnom citometrijom. Apoptotičke ćelije i ćelije u S/G2/M fazama ćelijskog ciklusa su kvantifikovane korišćenjem CellQuest-Software (Becton Dickinson).

Ćelijska migracija

[0171] Testovi ćelijske migracije su izvedeni u „transwell“ komoricama sa membranama sa veličinom pora od 8,0 μm (BD Biosciences) sa ćelijama kultivisanim u medijumu bez seruma u trajanju od 12h pre eksperimenata. Za eksperimente na siRNK ćelije su prenete u uslove bez seruma 24 h posle transfekcije sa siRNK dupleksima kao što je gore opisano.4x10<4>ćelija u 400 μl medijuma za kultivaciju bez seruma je bilo dodato u gornju komoricu. Donje komorice koje su sadržale 800 μl medijuma za kultivaciju dopunjenog bilo sa FCS, PDGF-BB (Sigma-Aldrich) ili SDF-1α/CXCL12 (R&D Systems) kao hemoatraktantima. Posle 24 sata ćelije koje su migrirale do donje strane membrane su fiksirane u ledeno hladnom metanolu; membrane su isečene, pa su stavljene na mikroskopske pločice i postavljene su na Hoechst (Dako) za fluorescentnu mikroskopiju. Za svaku membranu su izbrojane ćelije u pet slučajno izabranih vidljivih polja (100x uvećanje). Svi eksperimenti su bili urađeni u tri ponavljanja. Efekti na hemokinezu ćelija su analizirani istom eksperimentalnom postavkom (i) bez dodavanja hemoatraktanta u gornju i donju komoricu i (ii) sa hemoatraktantom dodatim i u gornju i u donju komoricu.

In vitro test invazije

[0172] In vivo testovi invazije su bili izvedeni u „transwell“ komoricama sa membranama sa veličinom pora od 8,0 μm (BD Biosciences) sa ćelijama koje su kultivisane u medijumu bez seruma u trajanju od 12h pre eksperimenata. Gornje komorice su bile pripremljene sa 100 μl Matrigela (BD Biosciences) razređenog do 1 mg/ml u medijumu bez seruma. Komorice su inkubirane na 37°C u trajanju od 5h radi geliranja. Za eksperimente na siRNK ćelije su prenete u uslove bez seruma 24 h posle transfekcije sa siRNK dupleksima kao što je gore opisano.1x10<5>ćelija u 400 μl medijuma za kultivaciju bez seruma je dodato u gornju komoricu. Donje komorice su sadržale 800 μl medijuma za kultivaciju dopunjenog sa FCS kao hemoatraktantom. Posle 24 časa invadirane ćelije na donjoj strani membrane su fiksirane u ledeno hladnom metanolu; membrane su isečene, pa su stavljene na mikroskopske pločice i postavljene su na Hoechst (Dako) za fluorescentnu mikroskopiju. Za svaku membranu su prebrojane ćelije u pet različitih slučajno izabranih vidljivih polja (100x uvećanje). Svi eksperimenti su izvršeni u tri ponavljanja.

Primer 1: Identifikacija ISC-468 kao terapeutskog i dijagnostičkog ciljnog mesta za kancer

[0173] ISC-468 (SEQ ID NO:1) kodira protein od 212 aminokiselina (SEQ ID NO:2) sa molekulskom težinom od 23,6 kDa. On je prethodno opisan kao antigen specifičan za tkiva (Cocchia et al., Genomics 68:305-312, 2000) i kao protein specifičan za placentu koji je izražen u toku trudnoće (Fant et al., Mol Reprod Dev.63:430-6, 2002). Stanje tehnike sugeriše upotrebu antigena koji su specifični za tkiva za vakcinaciju protiv kancera (Pardoll Nature Medicine Vaccine Supplement 4: 525-531, 1998).

[0174] Predviđeno je da ovaj protein ima odvojivi signalni peptid od aa 1-23, koji je praćen kratkim pretpostavljenim transmembranskim domenom (aa 25-47), kao što je analizirano bioinformatičkim alatima (TMpred, SOUSI). Predviđeno je da je ostatak proteina ekstracelularan i da se zato može primeniti prema otkrivanju kao ciljna struktura za monoklonska antitela.

[0175] Prema otkrivanju, genski specifičan prajmerski par (SEQ ID NO:3, 4) za ISC-468 je upotrebljen u RT-PCR analizama za amplifikaciju kDNK koja potiče od kombinovanog panela normalnih i tumorskih tkiva. Kao što je očekivano, potvrđeno je da je placenta jedino zdravo tkivo koje izražava ovaj gen (Sl.1). Međutim, nije bila detektovana značajna ekspresija ni u jednom drugom normalnom organskom tkivu. Kao najviše iznenađujuće, kada su ispitivani uzorci kancera, otkrili smo visoke i značajne nivoe ekspresije u određenom broju različitih tipova tumora uključujući karcinome kolona, pankreasa, jednjaka, želuca, pluća, dojke, jajnika, glave & vrata, bubrega, prostate i jetre (Sl.1 i 2, kao i Tab.1). Kvantitativna RT-PCR analiza ekspresije ISC-468 u realnom vremenu u 60 uzoraka karcinoma dojke je otkrila da je 80% svih uzoraka izražavalo značajne nivoe ISC-468 (Sl.3A,B).

Tab.1: ISC-468 ekspresija u normalnim i tumorskim tkivima

[0176] Selektivna i visoka ekspresija ISC-468 transkripata u tumorima nije bila prethodno poznata i može se primeniti prema otkrivanju za molekulske dijagnostičke metode, kao što je RT-PCR, za detekciju diseminirajućih tumorskih ćelija u serumu i koštanoj srži i za detekciju metastaza u drugim tkivima. Ovaj molekul se može dalje koristiti kao specifično ciljno mesto za terapeutske pristupe.

[0177] Sledeći peptidi, između ostalog, su bili izabrani za dobijanje ISC-468 specifičnih antitela prema otkrivanju: SEQ ID NO: 58, 59, 60, 68, 69, 2. Specifičnost antitela je potvrđena imunofluorescentnim analizama ćelija transfektovanih sa ISC-468-eGFP (Sl.4A).

[0178] Subcelularna lokalizacija ISC-468 u endogeno izraženim ćelijskim linijama karcinoma dojke MCF-7 i BT- 549 je analizirana imunofluorescentnim analizama. Bojenje ćelija bilo fiksiranih sa MeOH (Sl.4B) ili nefiksiranih (Sl.4C) ćelija otkrilo je da je ISC-468 lokalizovan na ćelijskim membranama izražavajućih ćelija. Specifičnost bojenja je potvrđena „nok-daun“ ekspresijom ISC-468 indukovanom sa RNKi, što je rezultovalo prestankom bojenja ćelijske membrane.

[0179] Pored toga, ISC-468 specifična antitela su bila korišćena za imunohistohemijske analize ekspresije ISC-468 u kliničkim uzorcima normalne dojke i karcinoma dojke. Ekspresija ISC-468 nije bila detektabilna u uzorcima normalne dojke (Sl.5A,B). Nasuprot tome, uzorci karcinoma dojke su pokazali jaku i homogenu ekspresiju ISC- 468 (Sl.5C,D). Signali su bili jači na ćelijskoj membrani izražavajućih ćelija kancera, što potvrđuje da je ISC- 468 membranski protein koji je selektivno izražen u ćelijama kancera.

[0180] Ekstracelularni domeni ISC-468 se mogu koristiti prema otkrivanju kao ciljna struktura za imunodijagnostiku i terapiju sa monoklonskim antitelima. Pored toga, ISC-468 se može prema otkrivanju koristiti kao vakcina (RNK, DNK, proteinska, peptidna) za indukovanje imunih reakcija specifičnih za tumor (imune reakcije posredstvom T i B ćelija).

[0181] „Nok-daun“ ekspresija ISC-468 indukovana sa RNKi je ostvarena transfekcijom ćelija sa siRNK dupleksima koji su specifično ciljali na ISC-468 iRNK (SEQ ID NO: 70-73). Transfekcija endogeno izražavajućih ćelijskih linija karcinoma dojke MCF-7 i BT-549 rezultovala je stabilnim i specifičnim smanjenjem ekspresije ISC-468 iRNK (Sl.6).

[0182] Da bi se dobio uvid u fiziološku ulogu ekspresije ISC-468 izvedeno je nekoliko in vitro ćelijskih testova na bazi RNKi. Transfekcija ćelijskih linija karcinoma dojke MCF-7 i BT-549 sa siRNK dupleksima rezultovala je očiglednim smanjenjem proliferacije ćelija u poređenju sa odgovarajućim kontrolama, kao što je analizirano u testu proliferacije na bazi BrdU (Sl.7). Analiza ćelijskog ciklusa bazirana na FACS-u je pokazala da je prestanak proliferacije ćelija nastao kao rezultat G1/S blokade (Sl.8A,B). Pored toga, moglo je biti pokazano da je nok-daun ISC-468 indukovan sa RNKi značajno uticao na AKT proces prenosa signala u endogeno izražavajućim ćelijama kancera putem inhibiranja AKT fosforilacije (Sl.9). Dalje, proliferacija MCF-7 ćelija je oslabila kada su te ćelije bile inkubirane sa ISC-468 specifičnim antitelima generisanim protiv ISC-468 specifičnih peptida (SEQ ID NO:68, 69) u poređenju sa irelevantnim kontrolnim antitelom (Sl.10). Ovi rezultati ukazuju da je ISC-468 kritični faktor za proliferaciju ćelija kancera verovatno posredstvom aktivacije AKT procesa prenosa signala indukovanog faktorom rasta i drugim. Sam ISC-468 bi mogao da predstavlja receptor, ko-receptor ili za membranu vezani šaperon za faktore rasta, hemokine ili druge supstance.

[0183] Dalje je analiziran uticaj ekspresije ISC-468 na migratornu sposobnost ćelija kancera. „Nok-daun“ ekspresija ISC-468 indukovana sa RNKi u MCF-7 i BT-549 ćelijskim linijama karcinoma dojke je rezultovala očiglednim pogoršanjem hemotaksije, hemokineze i invazije ćelija, što je utvrđeno „transwell“ testovima migracije (Sl.11 A,B,C). Hemotaksija, hemokineza i invazija su kritični faktori za metastazu ćelija kancera u druge organe. Zbog toga bi ekspresija ISC-468 u ćelijama kancera mogla biti pozitivan faktor za metastazu ćelija kancera.

[0184] Kod karcinoma dojke moglo se pokazati da je ekspresija ISC-468 u korelaciji sa stanjem receptora estrogena tumora. Kvantitativna RT-PCR analiza ekspresije ISC-468 u realnom vremenu u 60 uzoraka karcinoma dojke je otkrila da su karcinomi dojke pozitivni na receptor estrogena imali znatno više nivoe ekspresije ISC-468 od tumora negativnih na receptor (Sl.12). Shodno tome, ekspresija ISC-468 se može indukovati u ćelijskoj liniji karcinoma dojke pozitivnoj na receptor estrogena MCF-7 tretiranoj sa 17ß-estradiolom (Sl.13).

LISTA SEKVENCI

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija za primenu u metodu lečenja, koja sadrži antitelo koje se vezuje za ekstracelularni deo antigena koji je povezan sa tumorom, pri čemu pomenuti antigen koji je povezan sa tumorom ima sekvencu kodiranu nukleinskom kiselinom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od:

(a) nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 1, i

(b) nukleinske kiseline koja je najmanje 95% identična sa nukleinskom kiselinom (a).

2. Farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 1, pri čemu je metod terapije metod lečenja ili prevencije kancera, naznačena ekspresijom antigena koji je povezan sa tumorom prema zahtevu 1, pri čemu je kancer prvenstveno tumor jednjaka, tumor jajnika, tumor glave-vrata, tumor bubrega, tumor jetre, tumor pluća, tumor dojke, tumor prostate, tumor debelog creva, tumor želuca, kancer želuca, tumor pankreasa, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom debelog creva ili karcinom mlečnih žlezda.

3. Farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu antigen povezan sa tumorom ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 58, 59, 60, 68 i 69.

4. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je antitelo monoklonsko, himerično ili humanizovano antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za antigen.

5. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je antitelo kuplovano sa terapeutskim agensom.

6. Farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, koja je u obliku vakcine.