RS57192B1

RS57192B1 - Antagonističko antitelo specifično za peptid koji je u vezi sa genom za kalcitonin

Info

Publication number: RS57192B1
Application number: RS20180536A
Authority: RS
Inventors: Joerg Zeller; Kristian Todd Poulsen; Yasmina Noubia Adbiche; Jaume Pons; Arnon Rosenthal; Sierra Jones Collier
Original assignee: Teva Pharmaceuticals Int Gmbh
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2006-11-02
Publication date: 2018-07-31
Also published as: RS57194B1; CY1120267T1; CR9975A; US20160168244A1; NO20190202A1; NO344605B1; EP1957106A2; US9328168B2; LTPA2019015I1; EA015526B1; NL300997I1; NZ568237A; MA30136B1; PL2380592T3; US8597649B2; SI3045182T1; CY1120249T1; EP2380592A3; SI1957106T2; NO20081854L

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antagonistička anti-CGRP antitela.

Prethodno stanje tehnike

[0002] CGRP (peptid koji je u vezi sa genom za kalcitonin) je neuropeptid koji sadrži 37 aminokiselina, koji pripada familiji peptida koja uključuje kalcitonin, adrenomedulin i amilin. Kod ljudi, postoje dva oblika CGRP (α-CGRP i β-CGRP) koja imaju i slične aktivnosti. Razlikuju se do tri aminokiseline i različito su lokalizovani. Najmanje dva podtipa CGRP receptora mogu takođe da imaju različite aktivnosti. CGRP je neurotransmiter u centralnom nervnom sistemu, i pokazano je da deluje kao potentni vazodilatator na periferiji, gde se nalaze neuroni koji sadrže CGRP koji su blisko povezani sa krvnim sudovima. Vazodilatacija koja je u vezi sa CGRP je takođe povezana sa neurogenom inflamacijom, kao delom kaskadnih događaja koji dovode do ekstravazacije plazme i vazodilatacije mikrovaskulature koja je prisutna kod migrene. Tan et al, Clinical Science, 1995, Vol.

89, pp. 565-573 discloses the immunoblockade of CGRP in a skin vasodilatation model. CGRP has been noted for its possible connection to vasomotor symptoms (Wyon et al. Scand. J. Urol. Nephrol.

35: 92-96 (2001); Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000)). Vazomotorni simptomi (VMS), kao što su valunzi i nodna znojenja, predstavljaju najčešde prisutne simptome koji su u vezi sa menopauzom, koji pogađaju 60% do 80% svih žena koji dešavaju u prirodnoj ili hirurški indukovanoj menopauzi. Valunzi verovatno predstavljaju adaptivni odgovor centralnog nervnog sistema (CNS) na smanjenje koncentracije polnih steroida (Freedman Am. J. Human Biol. 13:453-464 (2001)). Do danas, najefektivnije terapije za valunge su tretmani sa hormonskom osnovom, uključujudi estrogene i/ili neke progestine. Hormonski tretmani mogu da budu efikasni za ublažavanje valunga, ali nisu odgovarajudi za sve žene. Smatra se da mogu da se uoče fiziološki i emocionalni simptomi, kao što su nervoza, umor, iritabilnost, nesanica, depresija, gubitak memorije, glavobolja, anksioznost, uzrujanost ili odsustvo koncentracije koji su prouzrokovani nedostatkom sna nakon čega slede valunzi i nodna znojenja (Kramer et al., In: Murphy et al., 3.sup.rd Int’l Symposium on Recent Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings, Paris, France: SCI: 3-7 (1992)).

[0003] Muškarci takođe imaju valunge nakon povlačenja steroidnog hormona (androgena). Ovo je zaista slučaj kod opadanja koncentracije androgena koje je u vezi sa starosnim dobom (Katovich, et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129-35) kao i u ekstremnim slučajevima deprivacije hormona koji su u vezi sa tretmanima za kancer prostate (Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47-54). Čak jedna tredina ovih pacijenata prolazi kroz trajne i česte simptome koji su dovoljno ozbiljni da prouzrokuju značajne neugonosti i neprijatnosti.

[0004] CGRP je potentni vazodilatator koji je uključen u patologiju drugih vazomotornih simptoma, kao što su svi drugi oblici vaskularne glavobolje, uključujudi migrene (sa ili bez aure) i grupisane glavobolje. Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1075, 2004. Tokom glavobolje koja je tipa migrene, kod pacijenata su povišeni nivoi CGRP-a u serumu spoljašnje jugularne vene. Goadsby et al., Ann. Neurol.28:183-7, 1990. Intravenozno davanje α-CGRP indukuje migrenu i glavobolju kod pacijenata koji pate od migrene bez aure, što ukazuje na to da je CGRP ima uzročnu ulogu u migrenama. Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002.

[0005] Mogude uključivanje CGRP u migreni je osnova razvoja i ispitivanja brojnih jedinjenja koja inhibiraju otpuštanje CGRP-a (npr., sumatriptan), antagonizuju na nivou receptora za CGRP (npr., dipeptidni derivat BIBN4096BS (Boerhringer Ingelheim); CGRP(8-37)), ili interaguju sa jednim ili više proteina koji se nalaze u vezi sa receptorima, kao što su, membranski protein receptorske aktivnosti (RAMP) ili proteinska komponenta receptora (RCP), oba koja pogađaju vezivanje CGRP za njegove receptore. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Podtipovi alfa-2 adrenoceptora i adenozin A1 receptora takođe kontrolišu (inhibiraju) oslobađanje CGRP i aktivaciju trigeminusa (Goadsby et al., Brain 125:1392-401, 2002). Pokazano je da agonist adenozin A1 receptora GR79236 (metrafadil), inhibira neurogenu vazodilataciju i trigeminalnu nocicepciju kod ljudi, može takođe da ima anti-migrenoznu aktivnost (Arulmani et al., Cephalalgia 25:1082-1090, 2005; Giffin et al., Cephalalgia 23:287-292, 2003.)

[0006] Zbunjujude u ovoj teoriji jeste opservacija da je lečenje sa jedinjenjima koji isključivo inhibiraju neurogenu inflamaciju (npr., tahikinin antagonisti NK1 receptora) ili trigeminalnu aktivaciju (npr., agonisti 5HT1D receptora) relativno nefikasno kao akutni tretman migrena, što dovodi do toga da neki istraživači razmatraju da li je inhibiranje otpuštanja CGRP primarni mehanizam delovanja efikasnih anti-migrenoznih tretmana. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol.500:315-330, 2004.

[0007] Migrena je kompleksno, opšte neurološko stanje koje se karakteriše ozbiljnim, epizodnim napadima glavobolje i povezanih karakteristika, u koje mogu da budu uključeni mučnina, povradanje, osetljivost na svetlost, zvuk ili kretanje. Kod nekih pacijenata, glavobolja prethodi ili je udružena sa aurom. Bol tom trajanja glavobolje može da bude ozbiljan i takođe kod nekih pacijenata može da bude unilateralan.

[0008] Napadi migrene ometaju svakodnevni život. U SAD-u i zapadnoj Evropi, sveukupna prevalenca ljudi koji pate od migrene je 11% u ukupnoj populaciji (6% muškaraca; 15-18% žena). Dalje, srednja učestalost napada kod individua 1,5/mesecu. Dok su brojni tretmani dostupni za ublažavanje ili smanjenje simptoma, preventivna terapija se preporučuje za one pacijente koji imaju više od 3-4 napada migrene po mesecu. Goadsby et al. New Engl. J. Med.346(4): 257-275, 2002.

[0009] Različite farmakološke intervencije koje se koriste za lečenje migrene i varijabilnost u odgovorima kod pacijenata su dokaz različite prirode ovog poremedaja. Prema tome, takvi relativno ne-selektivni lekovi kao što su ergot alkaloidi (npr., ergotamin, dihidroergotamin, metisergid), koji ispoljavaju serotonergičku, kao i adrenergičku, noradrenergičku i dopminergičku aktivnost, koriste se preko osam godina za lečenje migrene. Drugi tretmani uključuju opijate (npr., oksikodon) i βadrenergičke antagoniste (npr., propranolol). Neki pacijenti, obično oni koji imaju blaže simptome, mogu da kontrolišu svoje simptome sa lekovima koji se ne daju na recept kao što su jedan ili više nesteroidnih antiinflamatornih sredstava (NSAIDs), kao što je kombinacija aspirina, acetaminofena i kofeina (npr., Excedrin® Migraine).

[0010] Nedavno, neki pacijenti koji imaju migrenu su tretirani sa topiramatom, antikonvulzantom koji blokira natrijumove kanale koji su zavisni od napona i određene receptore glutamata (AMPA-kainat), potencira aktivnost GABA-A receptora, i blokira karbonsku anhidrazu. Relativno nedavni uspeh agonista serotonin 5HT-1B/1D i/ili 5HT-1a receptora, kao što je sumatriptan, kod nekih pacijenata je usmerio istraživače da predlože serotonergičku etiologiju poremedaja. Nažalost, dok neki pacijenti dobro reaguju na ovaj tretman, drugi ispoljavaju relativnu otpornost na njegove efekte.

[0011] Pretpostavljeno je da se u osnovi poremedaja nalazi disfunkcija jonskog kanala u aminergičkom jedru mozga, međutim, još uvek nije dovoljno jasna precizna patofiziologija migrene. Pokazano je da je jedan oblik migrene, porodična hemiplagična migrena, u vezi sa mutacijama koje imaju pogrešan smisao (eng. „missense“) u α1 subjednici naponom regulisanog kanala za kalcijum P/Q-tipa, i smatra da je verovatno da de kod drugih populacija pacijenata biti prisutne druge mutacije. Dok je širenje krvnih sudova u vezi sa migrenom i dovodi do egzarcerbacije simptoma bola kod migrene, sada se smatra da su takvi neurovaskularni događaji rezultati, pre nego sam uzrok, stanja. Sveukupno, smatra se da je disfunkcija moždanih puteva koji vrše modulaciju senzornog ulaza jedinstvena karakteristika migrene. Goadsby, P.J. et al., New Engl. J. Med.346(4): 257-275, 2002.

Kratka suština pronalaska

[0012] Pronalazak koji je ovde predstavljen razmatra anti-CGRP antagonisttička antitela.

[0013] U skladu sa predmetnim pronalaskom, obezbeđeno je anti-CGRP antagonističko antitelo koje sadrži VH domen koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 1 i VL domen koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 2.

[0014] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo prepoznaje humani CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje i za humani α-CGRP i β-CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo vezuje humani i CGRP od pacova. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo vezuje C-terminalni fragment koji sadrži aminokiseline 25-37 od CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo vezuje C-terminalni epitop koji se nalazi unutar aminokiselina 25-37 od CGRP.

[0015] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je antitelo G1 (kao što se ovde opisuje). Anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca koja je prikazana na slici 5 (SEQ ID NO: 1) i sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona lakog lanca koja je prikazana na Slici 5 (SEQ ID NO: 2).

[0016] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži modifikovani konstantni region, kao što je konstantni region koji je imunološki inertan (uključujudi delom imunološku inerciju), npr., ne pokrede lizu koja je posredovana delovanjem komplementa, ne stimuliše delijski posredovanu citotoksičnost koja je zavisna od antitela (ADCC), ne aktivira mikrogliju, ili ima smanjenu bilo koju od ovih aktivnosti. U nekim izvođenjima, konstantni region je modifikovan kao što se opisuje u Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; and WO 99/58572. U drugim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži konstantni region humanog teškog lanca IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanjem aminokiselina u odnosu na divlji tip IgG2 sekvence). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. U nekim izvođenjima, konstantni region teškog lanca anti-CGRP antagonističkog antitela je teški lanac humanog IgG1 sa bilo kojom od slededih mutacija: 1) A327A330P331 u G327S330S331; 2) E233L234L235G236 u P233V234A235 sa G236 delecijom; 3) E233L234L235 u P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 u P233V234A235G327S330S331 sa G236 delecijom; 5) E233L234L235A327A330P331 u P233V234A235G327S330S331; i 6) N297 do A297 ili bilo koja druga aminokiselina osim N. U nekim izvođenjima, konstantni region teškog lanca anti-CGRP antagonističkog antitela je humani teški lanac IgG4 sa bilo kojom od slededih mutacija: E233F234L235G236 do P233V234A235 sa G236 delecijom; E233F234L235 do P233V234A235; i S228L235 do P228E235.

[0017] U još drugim izvođenjima, konstantni region je aglikolizovan za N-vezanu glikozilaciju. U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikolizovan za N-vezanu glikozilaciju mutacijom ostatka za vezivanje oligosaharida (kao što je Asn297) i/ili ograničavanjem ostataka koji su deo sekvence za prepoznavanje N-glikozilacije u konstantnom regionu. U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikolizovan za N-vezanu glikozilaciju. Konstantni region može da bude aglikolizovan za N-vezanu glikozilaciju enzimski ili eksprimiranjem u deliji domadina koja je deficijentna za glikozilaciju.

[0018] Afinitet vezivanja (KD) anti-CGRP antagonističkog antitela za CGRP (kao što je humani α-CGRP kao što se meri površinskom plazmon rezonancijom na odgovarajudoj temperaturi, kao što je 25 ili 37 °C) može da bude oko 0,02 do oko 200 nM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je bilo koji od oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 pM, oko 20 pM, oko 15 pM, oko 10 pM, oko 5 pM, ili oko 2 pM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je manji od bilo kog od oko 250 nM, oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, ili oko 50 pM.

[0019] Anti-CGRP antagonističko antitelo može da se daje pre, tokom i/ili nakon glavobolje. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se daje se napada glavobolje (npr., migrene ili kluster, grupisane glavobolje). Davanje anti-CGRP antagonističkog antitela može da se izvede bilo kojim načinom koji je poznat iz oblasti tehnike, uključujudi: oralni, intravenozni, subkutani, intraarterijski, intramuskularni, intrakardijalni, intraspinalni, intratorakalni, intraperitonealni, intraventrikularni, sublingvalni, transdermalni, i/ili inhalacijom. Davanje može da bude sistemsko, npr. intravenozno, ili lokalno.

[0020] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo može da se daje zajedno sa drugim sredstvom, kao što je drugo sredstvo za lečenje glavobolje.

[0021] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje anti-CGRP antagonistička antitela koja su izvedena uz antitela G1. Antitelo G1 (naizmenično nazvano "G1") se proizvodi pomodu ekspresionih vektora koji imaju ATCC pristupne brojeve. PTA-6866 i PTA-6867. Sekvence aminokiselina varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca G1 su prikazane na Slici 5. Porcije regiona koji određuju komplementarnost (CDR) antitela G1 (uključujudi Chothia i Kabat CDR-e) su takođe prikazani na Slici 5. Razume se da referenca na bilo koji deo ili ukupan region G1 obuhvata sekvence koje se proizvode od ekpresionih vektora koji imaju ATCC pristupne brojeve PTA-6866 i PTA-6867, i/ili sekvence koje su predstavljene na Slici 5. Varijante antitela G1 sa sekvencama aminokiselina su predstavljene u Tabeli 6.

[0022] Pronalazak je antitelo koje sadrži VH domen koji je 100% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO: 1 i VL domen koji je 100% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO: 2.

[0023] U jednom izvođenju, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži fragment ili region antitela G1. Fragment sadrži varijabilne regione iz lakog i teškog lanca antitela G1. Fragment sadrži varijabilne regione iz lakog lanca i teškog lanca kao što je prikazano na Slici 5.

[0024] U nekim izvođenjima, CDR je Kabat CDR. U drugim izvođenjima, CDR je Chothia CDR. U drugim izvođenjima, CDR je kombinacija Kabat i Chothia CDR (takođe nazvani "kombinovani CDR" ili "prošireni CDR"). Drugim rečima, za bilo koje dato izvođenje koje sadrži više od jednog CDR, CDR-i mogu da budu bilo koji od Kabat, Chothia, i/ili kombinovano. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je izolovano. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je u osnovi čisto.

[0025] Teški lanac konstantnog regiona anti-CGRP antagonističkih antitela može da bude bilo koji od tipova konstantnog regiona, kao što su IgG, IgM, IgD, IgA, i IgE; i bilo koji izotipovi, kao što su IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4.

[0026] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži modifikovani konstantni region kao što se ovde opisuje.

[0027] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje polinukleotid (koji može da bude izolovan) koji sadrži polinukleotid koji kodira anti-CGRP antagonističko antitelo pronalaska. U jednom izvođenju, polinukleotid sadrži polinukleotid koji kodira fragment ili region antitela G1. Fragment sadrži varijabilne regione iz lakog lanca i teškog lanca antitela G1.

[0028] Polinukleotid (koji može da bude izolovan) može da sadrži polinukleotid koji kodira za antitelo G1. Polinukleotid sadrži ili oba polinukleotida koji su prikazani na SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10.

[0029] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje vektore (uključujudi ekspresione i vektore za kloniranje) i delije domadina koje sadrže bilo koji polinukleotid koji kodira anti-CGRP antitelo pronalaska. U nekim izvođenjima, vektor je pDb.CGRP.hFcGI koji ima ATCC br. PTA-6867. U drugim izvođenjima, vektor je pEb.CGRP.hKGI koji ima ATCC br. PTA-6866.

[0030] U drugom aspektu, pronalazak je delija domadina koja sadrži polinukleotid koji kodira anti-CGRP antagonističko antitelo pronalaska. U nekim izvođenjima, antitelo je antitelo G1.

[0031] U drugom aspektu, pronalazak je postupak za dobijanje antitela G1 koji obuhvata kulturu delija domadina ili njihovog potomstva pod uslovima koji omogudavaju proizvodnju G1, gde delija domadina sadrži ekpresioni vektor koji kodira antitelo G1; i, u nekim izvođenjima, prečišdavanje antitela G1. Ekspresioni vektor sadrži jednu ili obe polinukleotidne sekvence koje su prikazane na SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10. U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupke dobijanja anti-CGRP antagonističkog antitela pronalaska ekprimiranjem jednog ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo (koji može da bude odvojeno ekprimiran kao jedan laki ili teški lnc, ili oba i laki i teški lanac se eksprimiraju sa jednog vektora) u pogodnoj deliji, što generalno prati oporavak i/ili izolaciju antitela od interesa.

[0032] Anti-CGRP antagonističko antitelo, polinukleotidi koji kodiraju antitela predmetnog pronalaska mogu da se koriste za lečenje, prevenciju, ublažavanje, kontrolu, ili smanjenje pojavljivanja bolesti koje su povezane sa abnormalnom funkcijom CGRP, kao što je glavobolja (npr., migrena, kluster glavobolja, hronična glavobolja, i tenziona glavobolja) i druga stanja koja mogu da se leče ili da se vrši njihova prevencija antagonizujudi aktivnost CGRP.

Kratak opis slika

[0033]

Slika 1 je tabela koja pokazuje afinitete vezivanja 12 mišjih antitela za različite humane α-CGRP fragmente supstituisane alaninom. Afiniteti vezivanja se mere na 25°C upotrebom Biacore protokom Fab-a kroz CGRP-e na čipu. Vrednosti u boksovima predstavljaju gubitak u mutantima u odnosu na roditeljski fragment, 25-37 (italik), osim K35A, koji je izveden od 19-37 roditelja. "a" označava afinitete za 19-37 i 25-37 fragmente koji su srednja vrednost 6 standardnih devijacija dva nezavisna merenja na različitim senzor čipovima. "b" ukazuje na to da su ove interakcije odstupile od jednostavnog modela bimolekulske interakcije zbog bifazne brzine disocijacije, tako da se njihovi afiniteti određuju upotrebom modela konformacione promene. Greyscale ključ: bela (1,0) ukazuje na roditeljski afinitet; svetlo zelena (manje od 0,5) ukazuje navedi afinitet u odnosu na roditelja; tamno zelena (vede od 2) ukazuje na niži afinitet u odnosu na roditelja; i crna ukazuje na to da nije uočeno vezivanje.

Slike 2A i 2B pokazuju efekat davanja CGRP 8-37 (400 nmol/kg), antitela 4901 (25 mg/kg), i antitela 7D11 (25 mg/kg) na protok krvi u koži koji se meri fluksom krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom u trajanju od 30 sekundi. CGRP 8-37 se daje intravenozno (iv) 3-5 min pre stimulacije električnim pulsom. Antitela se daju intraperitonealno (IP) 72 časova pre stimulacije električnim pulsom. Svaka tačka u graficima predstavlja AUC jednog pacova koji se tretira pod uslovima koji su kao što je navedeno. Svaka linija u graficima predstavlja srednju vrednost AUC pacova koji se tretiraju pod uslovima kao što je navedeno. AUC (površina ispod krive) jednaka je Δfluksa x Δvremena. "Δfluksa" predstavlja promenu u jednicama fluksa posle stimulacije električnim pulsem; i "Δvremena" predstavlja vremenski period koji se uzima za nivo fluksa delija krvi da se vrati na nivo pre stimulacije električnim pulsom.

Slika 3 pokazuje efekat davanja različitih doza antitela 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg, ili 1 mg/kg) na protok krvi u koži mereno fluksom delija u koži nakon stimulacije električnim pulsom u trajanju od 30 sekundi. Antitela se daju intravenozno (IV) 24 časova pre stimulacije električnim pulsom. Svak tačka na grafiku predstavlja AUC jednog pacova koji se tretira pod uslovima kao što je navedeno. Linija u grafiku predstavlja srednju AUC pacova koji se tretiraju pod uslovima kao što je navedeno.

Slike 4A i 4B pokazuju efekat davanja antitela 4901 (1 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.), antitela 7E9 (10 mg/kg, i.v.), i antitela 8B6 (10 mg/kg, i.v.) na protok krvi u koži koji kao fluks krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom tokom 30 sekundi. Antitela se daju intravenozno (i.v.) nakon stimulacije elekričnim pulsom tokom 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela. Y osa predstavlja procenat AUC u poređenju sa nivoom AUC kada nije dato antitelo (vreme 0). X osa prestavlja vremenski (minuti) period između davanja antitela i stimulacije električnim pulsom. "*" ukazuje na P < 0,05, i "**" ukazuje na P< 0,01, u poređenju sa vremenom 0. Podaci se analiziraju jednosmernim ANOVA sa Dunnetovim testom višestrukog poređenja.

Slika 5 pokazuje sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca (SEQ ID NO:1) i varijabilnog regiona lakog lanca (SEQ ID NO:2) antitlea G1. Kabat CDR-e su napisane masnim slovima, i Chothia CDR-e su podvučene. Ostaci aminokiselina za varijabilni region teškog i lakog lanca su sekvencijalno obeleženi.

Slika 6 pokazuje mapiranje epitopa antitela G1 kompeticijom peptida upotrebom Biacore. N-biotinilovani humani α-CGRP se hvata na SA senzor čipu. G1 Fab (50 nM) u odsustvu peptida za kompeticiju ili prethodno inkubiranog 1 h sa 10 µM peptidom za kompeticiju se pušta preko čipa. Mereno je vezivanje G1 Fab-a za humani α-CGRP na čipu. Y osa predstavlja procenat vezivanja koje je blokirano prisustvom peptida kompeticije u poređenju sa vezivanjem u odsustvu peptida za kompeticiju.

Slika 7 pokazuje efekat davanja antitela G1 (1 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na krvotok kože mereno fluksom krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom u trajanju od 30 sekundi. Antitelo G1 ili nosač se daju intravenozno (i.v.) nakon čega sledi električna stimulacija nerva na 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davnaja antitela. Y osa predstavlja procenat AUC u poređenju sa nivoom AUC kada nema davanja antitela ili nosača (definisano kao 100%) (vreme 0). X osa predstavlja vremenski (minuti) period između davanja antitela i stimulacije električnimpulsom. "*" ukazuje na P < 0,05, i "**" ukazuje na P < 0,01, u poređenju sa nosačem. Podaci se analiziraju two-way ANOVA i Bonferroni post testom.

Slika 8A pokazuje efekat davanja antitela G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na krvotok kože mereno fluksom krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom tokom 30 sekundi 24 časova nakon doziranja. Antitelo G1 ili nosač se intravenozno daje (i.v.) 24 časova pre stimulacije nerva električnim pulsom. Y osa predstavlja ukupnu površinu ispod krive (promena u fluksu delija krvi koja je pomnožena sa vremenom od početka stimulacije dok se fluks ne vrati do osnovnog nivoa, AUC). X osa predstavlja varirajude doze antitela G1. "*" ukazuje na P < 0,05, i "**" ukazuje na P < 0,01, u poređenju sa nosačem. Podaci se analiziraju upotrebom jednosmernog ANOVA i Dunovim testom višestrukog poređenja.

Slika 8B pokazuje efekat davanja antitela G1 (0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na krvotok kože kao što se meri fluksom krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom 30 sekundi 7 dana nakon doziranja. Antitelo G1 ili nosač se daju intravenozno (i.v.) 7 dana pre nervne stimulacije električnim pulsom. Y osa predstavlja ukupni AUC. X osa prdstavlja varirajude doze G1. "**" ukazuje na P < 0,01, i "***" ukazuje na P < 0,001, u poređenju sa nosačem. Podaci se analizuraju upotrebom jednosmernog ANOVA i Dunovog testa višestrukog poređenja.

Slika 8C je analiza uklapanja podataka u krivu sa slika 8A i 8B. Antitelo G1 ili nosač se daju intravenozno (i.v.) ili 24 časova ili 7 dana pre nervne stimulacije električnim pulsom. Y osa predstavlja ukupni AUC. X osa predstavlja varirajude doze G1 u "mg/kg" na logaritamskoj skali za određivanje EC50.

Slika 9 pokazuje efekat antitela mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na promenu prečnika srednje meningealne arterije nakon stimulacije električnim poljem. Antitelo mu7E9, BIBN4096BS ili nosač se daju intravenozno (i.v.) u vremenskoj tački 0 minuta nakon uspostavljanja osnovnog odgovora na električnu stimulaciju. Y osa predstavlja promenu prečnika srednje meningealne arterije nakon stimulacije električnim poljem. Mirujudi prečnik odgovara 0%. X osa predstavlja vreme (minuti) stimulacije električnim pulsom. "*" ukazuje na P < 0,05, i "**" ukazuje na P < 0,01, u poređenju sa nosačem. Podaci se analizuraju upotrebom jednosmernog ANOVA i Dunetovim testom višestrukog poređenja.

Slika 10 pokazuje efekat varirajudih doza antitela G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na promenu prečnika srednje meningealne arterije nakon stimulacije električnim poljem. Antitelo G1 ili nosač se daju intravenozno (i.v.) 7 dana pre stimulacije električnim poljem. Y osa predstavlja promenu prečnika srednje meningealne arterije. Mirujudi prečnik odgovara 0%. X osa predstavlja voltažu stimulacije. "*" ukazuje na P < 0,05, "**" ukazuje na P < 0,01, i "***" ukazuje na P < 0,001, u poređenju sa nosačem. Podaci se analiziraju upotrebom dvosmernog ANOVA i Bonferroni posttestova.

Slika 11A pokazuje efekat antitela mu4901 (10mg/kg) ili nosača (PBS, 0.01% Tween 20), koji se daju intravenozno (i.v.) 24 časova pre, na smanjenje temperature u centru koja je indukovana subkutanom injekcijom naloksona (1 mg/kg) kod pacova koji su zavisnici od morfina. Y osa predstavlja razliku temperature u odnosu na osnovni nivo. X osa predstavlja vreme koje se meri od tačke injekcije naloksona.

Slika 11B pokazuje efekat antitela mu4901 (10mg/kg) ili nosač (PBS, 0,01% Tween 20), koji se daju intravenozno (i.v.) 24 časova pre, na povedanje u površinskoj temperaturi repa koja je indukovana subkutanom injekcijom naloksona (1 mg/kg) kod pacova koji su zavisnici od morfina. Y osa predstavlja razliku temperature u odnosu na osnovni nivo. X osa predstavlja vreme koje se meri od tačke injekcije naloksona.

Detaljni opis pronalaska

[0034] Pronalazak koji je ovde prikazan obezbeđuje anti-CGRP antagonistička antitela koja sadrže VH domen koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 1 i VL domen koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 2.Anti-CGRP antagonistička antitela mogu da budu izvedena od G1. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke dobijanja ovih anti-CGRP antagonističkih antitela.

Opšte tehnike

[0035] Praksa predmetnog pronalaska de koristiti, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke molekularne biologije (uključujudi tehnike rekombinacije), mikrobiologije, delijske biologije, biohemije i imunologije, koji su obuhvadeni tom oblasti tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi, kao što su, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989)Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definicije

[0036] "Antitelo" imunoglobulinski molekul koji može da se vezuje za cilj na specifičan način, kao što je ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, polipeptid, itd., kroz najmanje mesto za prepoznavanje antigena, koje se nalazi u varijabilom regionu imunoglobilinskog molekula. Kao što se ovde koristi, termin obuhvata ne samo intaktna poliklonska ili monoklonska antitela, ved takođe njihove fragmente (kao što su Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), jednolančani (ScFv), njihove mutirane oblike, kombinovane proteine koji sadrže porciju antitela (kao što je domen antitela), i bilo koju drugu modifikovanu modifikaciju molekula imunoglobulina koja sadrži mesto za prepoznavanje antigena. Antitelo uključuje antitelo bilo koje klase, kao što su IgG, IgA, ili IgM (ili njihove podklase), i antitelo ne mora da bude iz bilo koje posebne klase. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena teških lanaca antitela, imunoglobulini mogu biti dodeljeni različitim klasama. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i njih nekoliko mogu da budu podeljeni u subklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se zovu alfa, delta, epsilon, gama, i mu, redom. Dobro su poznate subjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina.

[0037] Kao što se ovde koristi, "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo koji se dobija iz populacije u osnovi homogenih antitela, tj., individualna antitela koja čine populaciju su identična osim mogudih mutacija koje se prirodno pojavljuju koje mogu u manjim količinama da budu prisutne. Monoklonska antitela su visoko specifična, koja su specifično usmerena prema jednom antigenskom mestu. Dalje, u suprotnosti sa preparatima koji sadrže poliklonska antitela, koji obično uključuju različita antitela koja su specifično usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo je usmereno prema jednoj determinanti na antigenu. Modifikator "monoklonsko" ukazuje na karakter antitela koje se dobija iz u osnovi homogene populacije antitela, i ne treba tumačiti kao neophodnu proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste prema predmetnom pronalasku mogu da se dobiju postupkom hibridoma koga su prvo opisali Kohler ai Milstein, 1975, Nature, 256:495, ili mogu da se dobiju postupcima rekombinantne DNK kao što se opisuje u U.S. Pat. No.4,816,567. Monoklonska antitela mogu takođe da se izoluju iz fagnih biblioteka koje se dobijaju upotrebom tehnika koje se opisuju u McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554, na primer.

[0038] Kao što se ovde koristi, "humanizovana" antitela se odnose na oblike ne-humanih (tj. mišjih) antitela koja su specifični himerni imunoglobulini, lanci imunoglobulina, ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2ili druge podsekvence antitela za vezivanje antigena) koje sadrže minimalnu sekvencu koja je izvedena iz ne-humog imunoglobulina. U vedini slučajeva, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (recipijentno antitelo) u kojima su ostaci od regiona koji određuje komplementarnost (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima od CDR ne-humanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov, ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i biološku aktivnost. U nekim slučajevima ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni sa odgovarajudim ostacima koji nisu poreklom od čoveka. Dalje, humanizovano antitelo može da sadrži

1

ostatke koji nisu prisutni ni kod recipijentnog antitela niti u uvednom CDR ili okvirnim sekvencama, ali su uključene kako bi dalje poboljšale i optimizirale performanse antitela Generalno, humanizovano antitelo u osnovi sadrži najmanje jedan, i obično dva, variabilna domena, u kojima svi ili u osnovi svi CDR regioni odgovaraju onima u ne-humanom imunoglobulinu i svi ili u osnovi svi od FR regiona su oni koji pripadaju konseznusnoj sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina ili domena (Fc), obično od humanog imunoglobilina. Antitela mogu da imaju Fc regione koji su modifikovani kao što se opisuje u WO 99/58572. Drugi oblici humanizovanih antitela imaju jedanili više CDRs (jedan, dva, tri, četiri, pet, šest) koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo, koji se takođe nazivaju jedan ili više CDRa "koji je izveden od" jednog ii više CDR-a iz originalnog antitela.

[0039] Kao što se ovde koristi, "humano antitelo" označava antitelo koje ima sekvencu aminokiselina koja odgovara antitelu koje je proizveo čovek i/ili je dobijeno upotrebom postupaka za dobijanje humanih antitela koji su poznati iz oblasti tehnike ili su ovde prikazani. Ova definicija humanog antitela uključuje antitela koja sadrža najmanje jedan polipeptid humanog teškog lanca ili najmanje jedan polipeptid humanog lakog lanca. Jedan takav primer je antitelo koje sadrži polipeptide mišjeg lakog lanca i humanog teškog lanca. Humana antitela mogu da se poizvedu upotrebom različitih postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike. U jednom izvođenju, humano antitelo se bira iz fagne biblioteke, gde bibiloteka faga eksprimira humana antitela (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Humana antitela takođe mogu da se dobiju uvođenjem lokusa humanog imunoglobulina u transgene životinje, tj., miševe kod koji su endogeni imunoglobulinski geni parcijalno ili kompletno inaktivirani. Ovaj pristup se opisuje u U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016. Alternativno, humano antitelo može da e dobije imortalizacijom humanih B limfocita koji proizvode antitelo koje je specifično za ciljani antigen (tako da B limfociti mogu da se dobiju od individue ili mogu da se in vitro imunizuju). Videti, npr., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; and U.S. Patent No.

5,750,373.

[0040] Kao što se ovde koristi, termin "peptid povezan sa genom za kalcitonin" i"CGRP" odnosi se na bilo koji oblik peptida koji je povezan sa genom za kalcitonin i njegovih varijanti koje najmanje delom zadržavaju aktivnost CGRP. Na priemr, CGRP može da bude α-CGRP ili β-CGRP. Kao što se ovde koristi, CGRP uključuje sve nativne sekvence CGRP sisarskih vrsta, npr., čoveka, psa, mačke, konja, i govečeta.

[0041] Kao što se ovde koristi, "anti-CGRP antagonističko antitelo" (naizmenično nazvano "anti-CGRP antitelo") se odnosi na antitelo koje može da se veže za CGRP i da inhibira biološku aktivnost CGRP i/ili nishodni put(eve) koji su posredovani signalizacijom CGRP. Anti-CGRP antagonističko antitelo obuvata antitela koja blokiraju, antagonizuju, suprimiraju ili redukuju (uključujudi značajnu) biološku aktivnost CGRP, uključujudi nishodne puteve koji su posredovani signalizacijom CGRP, kao što je vezivanje za receptor i/ili pokretanje delijskog odgovora na CGRP. Za svrhu predmetnog pronalaska, izričito treba razumeti da termin "anti-CGRP antagonističko antitelo" obuvata sve prethodno identifikovane termine, naslove, i funkcionalna stanja i karakterisitke gde CGRP sam, biološka aktivnost CGRP (uključujudi ali bez ograničenja na njegovu sposobnost da posreduje u bilo kom aspektu glavobolje), ili posledicama biološke aktivnosti, su u osnovi poništeni, smanjeni, ili neutralizovani u bilo kom značajnom stepenu. U nekom izvođenju, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za CGRP i sprečava vezivnaje CGRP za CGRP receptor. U drugim izvođenjima, anti-CGRP antitelo se vezuje za CGRP i sprečava aktivaciju CGRP receptora. Primeri anti-CGRP antagonističkih antitela su ovde obezbeđeni.

[0042] Kao što se ovde koristi, termini "G1" i "antitelo G1" se koriste naizmenično da označe proizvodnju antitela od strane ekspresionih vektora koji su deponovani pod brojevima ATCC PTA-6867 i ATCC PTA-6866. Sekvence aminokiselina varijabilnih regiona teškog i lakog lanca su prikazane na Slici 5. CDR porcije antitela G1 (uključujudi Chothia i Kabat CDRs) su predstavljene dijagramom na Slici 5. Polinukleotidi koji kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca su prikazani na SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10. Karakterizacija G1 je opisana u Primerima.

[0043] Termini "polipeptid", "oligopeptid", "peptid" i "protein" ovde se koriste naizmenično i odnose se na polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može da bude linearan ili razgranat, može da sadrži modifikovane aminokiseline, i može da bude prekinut sa ne-aminokiselima. Termini takođe obuhvataju polimer aminokiseline koji je modifikovan prirodno ili pomodu intervencije; na primer, obrazovanjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugovanje sa komponentom za obeležavanje. U definiciju su takođe uključeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uključujudi, na primer, aminokisleline koje nisu prirodne, itd.), kao i druge modifikacije koje su poznate u oblasti tehnike.

[0044] "Polinukleotid," ili "nukleinska kiselina," kao što se ovde naizmenično koristi, odnosi se na polimere nukleotida bilo koje dužine, i uključuje DNK i RNK. Nukleotidi mogu da budu deoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze, i/ili njihovi analozi, ili bilo koji supstrat koji može da bude inkorporiran u polimer delovanjem DNK ili RNK polimeraze. Polinukleotid može da sadrži modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. Ukoliko je prisutna, modifikacija strukture nukleotida može da se prenese pre ili nakon sklapanja polimera. Sekvenca nukleotida može da bude prekinuta komponentama koje nisu nukleotidi. Polinukleotid može dalje da bude modifikovan nakon polimerizacije, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. Drugi tipovi modifikacija uključuju, na primer, "kape", supstituciju jednog ili više nukleotida koji se pojavljuje u prirodi sa analogom, internukleotidnim modifikacijama kao što su, na primer, oni sa nezaštidenom vezom (npr., metil fosfonati, fosfotriestri, fosfoamidati, karbamati, itd.) i sa zaštidenim vezama (npr., fosforotioati, fosforoditioati, itd.), oni koji sadrže bočne grupe, kao što su, na primer, proteini (npr., nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, ply-L-lizin, itd.), oni sa interkalirajudim sredstvima (npr., akridin, psoralen, itd.), oni koji sadrže helatore (npr., metali, radioaktivni metali, boron, oksidni metali, itd.), oni koji sadrže sredstva za alkilovanje, oni sa modifikovanim vezama (npr., alfa anomerne nukleinske kiseline, itd.), kao i nemodifikovane oblike polinukleotid(a). Dalje, bilo koja od hidroksil grupa koja se uobičajeno nalazi u šederima može da bude zamenjena, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, koje su zaštidene standardnim grupama koje štite, ili koje su aktivirane dodatnim vezama sa dodatnim nukelotidima, ili mogu da budu konjugovane sa čvrstim podlogama.5’ i 3’ terminalna OH može da bude fosforilovana ili supstituisana sa aminima ili organskim grupama za dodavanje kape koje sadrže oko 1 do 20 ugljenikovih atoma. Drugi hidroksili mogu takođe da budu derivatizovani do standardnih grupa koje štite. Polinukleotidi mogu takođe da sadrže analogne oblike šedera riboze ili deoksiriboze koji su generalno poznati u oblasti tehike, uključujudi, na primer, 2’-O-metil-, 2’-O-alil, 2’-fluoro- ili 2’-azidoribozu, karbociklične analoge šedera, h-anomerne šedere, epimerne šedere kao što je arabinoza, ksiloze ili liksoze, piranozne sedere, furanozne šedere, sedoheptuloze, aciklične analoge i abazne nukleotidne analoge kao što je metilribozid. Jedna il više fosfodiestarskih veza može da bude zamenjena sa alternativnim grupama za vezivanje. Ove alternativne grupe za vezivnje uključuju, ali bez ograničenja, izvođenja u kojima se fosfat zamenjuje sa P(O)S("tioatom"), P(S)S ("ditioatom"), (O)NR2("amidatom"), P(O)R, P(O)OR’, CO ili CH2("formacetalom"), gde svaki R ili R’ je nezavisno H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (1-20 C) koji opciono sadrži etarsku (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Ne moraju sve veze u polinukleotidu da budu identične. Prethodni opis se odnosi na sve ovde navede polinukleotide, uključujudi RNK i DNK.

[0045] "Varijabilni region" antitela se odnosi na varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, ili zasebno ili u kombinaciji. Varijabilni regioniteškog i lakog lanca se svaki zasebno odnose na četiri okvirna regiona (FR) koja su povezana za tri regiona koja određuju komplementarnost (CDR-i) koji su takođe poznati pod imenom hipervarijabilni regioni. CDR-i u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomodu FRs i, sa CDRs iz drugog lanca, doprinose obrazovanju mesta za vezivanje antigena kod antitela. Postoje najmanje dve tehnike za određivnaje CDR-a: (1) pristup koji je zasnovan na varijabilnosti sekvenci unakrsnih vrsta (tj., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); i (2) pristup koji je zasnovan na kristalografskim ispitivanjima komleksa antigena i antitela (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol.273:927-948)). Kao što se ovde koristi, CDR mogu da se odnose na CDR-e koji se definišu bilo kojim pristupom ili kombinacijom oba pristupa.

[0046] "Konstantni region" antitela odnosi se na konstantni region lakog lanca antitela ili konstantni region teškog lanca antitela, ili zasebno ili u kombinaciji.

[0047] Epitop koji se "preferencijalno vezuje" ili "specifično vezuje" (ove se koristi naizmenično) za antitelo ili polipeptid je termin koji je dobro poznat iz oblasti tehnike, i postupci za određivanje takvog specfičnog ili preferencijalnog vezivanja su takođe dobro poznati iz oblasti tehnike. Kaže se da molekul ispoljava "specifično vezivanje" ili "preferencijalno vezivanje" ukoliko reaguje ili se povezuje češde, brže, sa vedim trajanjem i/ili sa vedim afinitetom sa određenom delijom ili supstancom nego što radi sa alternativnim delijama ili supstancama. Antitelo se ciljano "specifično vezuje" ili "preferencijalno vezuje" ukoliko se vezuje sa vedim afinitetom, aviditetom, brže, i/ili sa vedim trajanjem u odnosu na to kada se vezuje za druge supstance. Na primer, antitelo koje se specifično ili preferencijalno vezuje za CGRP epitop je antitelo koje se vezuje za ovaj epitop sa vedim afinitetom, aviditetom, brže, i/ili sa vedim trajanjem u odnosu na to kada se vezijuje za druge CGRP epitope ili epitope koji nisu CGRP. Čitanjem ove definicije takođe može da se razume da, na primer, antitelo (ili ostatak ili epitop) koje se specifično ili preferencijalno vezuje za prvi cilj može ili ne mora specifično ili preferencijalno da se vezuje za drugi cilj. Kao takvo, "specifično vezivanje" ili "preferencijalno vezivanje" nužno ne zahteva (iako može da uključi) ekskluzivno vezivanje. Generalno, ali ne nužno, referenca za vezivanje označava preferencijalno vezivanje.

1

[0048] Kao što se ovde koristi, "u osnovi čisto" se odnosi na matrijal koji je najmanje 50% čist (tj., oslobođen od kontaminacije), poželjnije najmanje 90 % čist, poželjnije najmanje 95% čist, poželjnie najmanje 98% čist, poželjnije najmanje 99% čist.

[0049] "Delija domadin" uključuje individualnu deliju ili kulturu delija koja može da bude ili jeste primalac vektor(a) za uključivanje polinukleotidnih inserata. Delije domadina uključuju potomstvo jedne delije domadina, i potomstvo ne mora u potpunosti da bude identično (u morfologiji ili u komplementu genomske DNK) sa originalnom roditeljskom delijom usled prirodne, slučajne, il namerno indukovane mutacije. Delija domadina uključuje delije u kojima je in vivo izvršena transfekcija sa polinukleotidom(a) ovog pronalaska.

[0050] Termin "Fc region" se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina. "Fc region" može da bude nativna sekvenca Fc regiona ili varijanta Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da se razlikuju, Fc region teškog lanca humanog IgG se obično definiše tako da se pruža od ostatka aminokiseline na položaju Cys226, ili od Pro230, do njegovog karboksi kraja. Obeležavanje ostataka u Fc regionu je prema EU indeksu kao u Kabatu. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Fc region imunogloblina generalno sadrži dva konstantna domena, CH2 i CH3.

[0051] Kao što se ovde koristi, "Fc receptor" i "FcR" opisuju receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je nativna sekvenca humanog FcR. Osim toga, poželjni FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcγRI, FcγRII, i FcγRIII podklasa, uključujudi varijante alela i alternativno splajsovane oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA ("aktivirajudi receptor") i FcγRIIB ("inhibirajudi receptor"), koji imaju slične sevence aminokiselina koje se prvenstveno razlikuju u njihovim citoplazmatskim domenima. Pregled FcR-a se nalazi u Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; and de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenošenje majčinih IgG-a u fetus (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

[0052] "Citotoksičnost koja je zavisna od komplementa" i "CDC" se odnose na ciljano liziranje u prisustvu komlementa. Put aktivacije komplementa je iniciran vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za molekul (npr. antitelo) u kompleksu sa srodnim antigenom. Za ispitivanje aktivacije komplementa, može da se izvede CDC test, npr. kao što se opisuje u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

[0053] "Funkcionalni Fc region" sadrži najmanje jednu efektorsku funkciju nativne sekvence Fc regiona. Primeri "efektorskih funkcija" uključuju vezivanje C1q ; citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; delijski posredovanu citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju receptora na delijskog površini (npr. B delijski receptor; BCR), itd. Takve efektorske funkcije generalno zahtevaju kombinovanje Fc regiona sa vezujudim domenom (npr. varijabilnim domenom antitela) i može da se ispita upotrebom različitih testova koji su u oblasti tehnike poznati za evaluaciju takvih efektorskih funkcija antitela.

[0054] "Nativna sekvenca Fc regiona" sadrži sekvencu aminokiselina koja je identična sa sekvencom aminokiselina Fc regiona koja može da se nađe u prirodi. "Varijanta Fc regiona" sadrži sekvencu aminokiselina koja se razlikuje u odnosu na nativnu sekvencu Fc regiona na osnovu najmanje jedne modifikacije aminokiseline, dok zadržava najmanje jednu efektorsku funkciju nativne sekvence Fc regiona. Poželjno, varijanta Fc regiona ima najmanje jednu supstituciju aminokiseline u poređenju sa nativnom sekvencom Fc regiona ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida, npr. od oko jedne do oko deset supstitucija aminokiselina, i poželjno od oko jedne do oko pet supstitucija aminokiselina u nativnoj sekvenci Fc regiona ili u Fc regionu roditeljskog polipeptida. Varijanta Fc regiona ovde poželjno ima najmanje oko 80% sličnosti sekvence sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida, i najpoželjnije najmanje oko 90% identičnosti sekvence sa njim, poželjnije najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa njim.

[0055] Kao što se ovde koristi "citotoksičnost posredovana delijama koja je zavisna od antitela" i "ADCC" se odnosi na reakciju koja je posredovna delijama u kojoj nespecifične citotksične delije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR-e) (npr. prirodne (NK) delije ubice, neutrofili, i makrofagi) prepoznaju antitelo koje je vezano za ciljanu deliju i nakon toga prouzrokuju liziranje ciljane delije. ADCC aktivnost molekula od interesa može da se ispita upotrebom ADCC testa, kao što je onaj koji se opisuje u U.S. Patent No.5,500,362 or 5,821,337. Korisne efektroske delije za takve testove uključuju mononuklearne delije iz periferne krvi (PBMC) i NK delije. Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može da se ispita in vivo, npr., u životinjskom modelu kao što je prikazano u Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

[0056] Kao što se ovde koristi, "tretman" je pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Za svrhe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali bez ograničenja, jednu ili više od slededih: poboljšanje u bilo kom aspektu glavobolje uključujudi slabljenje simptoma, ublažavanje intenziteta bola, i drugih povezanih simptoma, smanjenje učestalosti ponovnog pojavljivanja, povedanja kvaliteta života onih individua koje boluju od glavobolje, i smanjenja doze drugih lekova koji su neophodni za lečenje glavobolje. Za migrenu, drugi povezani simptomi uključuju, ali bez ogrnaičenja, mučninu, povradanje, i osetljivost na svetlost, zvuk, i/ili kretanje. Za klaster glavobolju, drugi povezani simptomi uključuju, ali bez ograničenja na oticanje ispod ili oko očiju, intenzivno suzenje očiju, crvenilo očiju, Rinoreju ili nazalnu kongenstiju, i crvenilo lica.

[0057] "Smanjenje učestalosti" glavobolje označava bilo koje od smanjenja ozbiljnosti simptoma (koje može da uključuje smanjenje potrebe za i/ili količine za (npr., izlaganja prema) drugim lekovima i/ili terapijama koje se generalno koriste za ovo stanje, uključujudi, na primer, ergotamin, dihidroergotamin, ili triptane za migrenu), trajanje, i/ili učestalost (uključujudi, na primer, odlaganje ili povedavanje vremena do sledede epizode napada kod individue). Kao što je jasno stručnjacima iz oblasti tehnike, pojedinici mogu da se razlikuju u pogledu njihovog odgovora na tretman, i, kao takvo, na primer, "postupak za smanjenje učestalosti glavobolje kod individue" odražava davanje anti-CGRP antagonista antitela koje se zasniva na razumnom očekivanju da takvo davanje može najverovatnije da prouzrokuje takvo smanjenje u učestalosti kod određene individue.

1

[0058] "Ublažavanje" glavobolje ili jednog ili više simptoma glavobolje označava slabljenje ili poboljšanje jednog ili više simptoma glavobolje u poređenju sa ne davanjem antagonističkog anti-CGRP antitela. "Ublažavanje" takođe uključuje skaradenje ili smanjenje trajanja simptoma.

[0059] Kao što se ovde koristi, "kontrolisanje glavobolje" se odnosi na održavanje ili smanjenje ozbiljnosti ili trajanja jednog ili više simptoma glavobolje ili učestalosti napada glavobolje kod individue (u poređenju sa nivoom pre tretmana). Na primer, trajanje ili ozbiljnost simptoma bola u glavi, ili učestalost napada je smanjena za najmanje od bilo kog oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, ili 70% kod individue u poređenju sa nivoom pre tretmana.

[0060] Kao što se ovde koristi, "odlaganje" razvijanja glavobolje znači odložiti, sprečiti, usporiti, odložiti, stabilizovati, i/ili odgoditi progresiju bolesti. Ovo odlaganje može da bude u različitim vremenskim trajanjima, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili individua koje se leče. Kao što je očigledno stručnjaku iz oblasti tehnike, dovoljna ili značajna količina odlaganja može, u stvari, da obuhvati prevenciju, u kojoj individua ne razvija glavobolju (npr., migrenu). Postupak koji "odlaže" razvijanje simptoma je postupak koji smanjuje verovatnodu razvijanja simptoma u datom vremenskom okviru i/ili smanjuje obim simptoma u datom vremenskom okviru, u poređenju sa tim kada se ovaj postupak ne koristi. Takva poređenja su obično zasnovana na kliničkim ispitivanjima, upotrebom statistički značajnog broja subjekata.

[0061] "Napredovanje" ili "progresija" glavobolje označava početne manifestacije i/ili naredna progresija poremedaja. Razvijanje glavobolje može da se otkrije i ispita upotrebom standardnih kliničkih postupaka koji su dobro poznati iz oblastih tehnike. Međutim, razvijanje se takođe odnosi na progresiju koja može da prođe neopaženo. Za svrhu ovog pronalaska, razvijanje ili progresija se odnosi na biološki tok simptoma. "Razvijanje" uključuje pojavljivanje, ponovno pojavljivanje, i početak. Kao što se ovde koristi "početak" ili "pojavljivanje" glavobolje uključuje inicijalni početak i/ili ponovno pojavljivanje.

[0062] Kao što se ovde koristi, "efikasna doza" ili "efikasna količina" leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije je količina koja je dovoljna da pokrene korisne ili željene rezultate. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što je eliminacija ili smanjenje rizika, smanjenje ozbiljnosti simptoma, ili odlaganje početka razvoja bolesti, uključujudi biohemijske, histološke i/ili bihevioralne simptome bolesti, komplikacije u vezi sa bolesti i intermedijerne patološke fenotipove koji su prisutni u toku razvoja bolesti. Za terapeutsku upotrebu, korisni iil željeni rezultati uključuju kliničke rezultate kao što su smanjenje intenziteta bola, trajanje, ili učestalost napada glavobolje, i smanjenje jednog ili više simptoma koji se razvijaju iz glavobolje (biohemijski, histološki i/ili biohevioralni), uključujudi njegove komplikacije i intermedijerne patološke fenotipove koji su prisutni u toku razvoja bolesti, povedanjem kvaliteta života onih individua koje imaju bolest, smanjenjem doze drugih lekova koi su neophodni za lečenje bolesti, pojačavanjem efekta drugih lekova, i/ili odlaganjem progresije bolesti kod pacijenta. Efikasna doza može da se daje u jednom ili više davanja. Za svrhu ovog pronalaska, efikasna doza leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije je dovoljna da se postigne profilaktički ili terapeutski tretman ili direktno ili indirektno. Kao što se razume i kliničkog konteksta, efikana doza leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije može ili ne mora da se postigne zajedno sa drugim lekom, jedinjenjem, ili farmaceutskom kompozicijom. Prema tome, "efikasna doza" može da se razmatra u kontekstu

1

davanja jednog ili više terapeutskih sredstava, i smatra se da jedno sredstvo može da se daje u efikasnoj količini ukoliko, zajedno sa jednim ili više drugih sredstava, može da se postigne ili jeste postignut željeni rezultat.

[0063] "Individua" ili "subjekat" je sisar, poželjnije čovek. Sisari takođe uključuju, ali bez ograničenja, domade životinje, sportske životinje, ljubimce, primate, konje, pse, mačke, miševe i pacove.

[0064] Kao što se ovde koristi, "vektor" označava konstrukt, pomodu koga mogu da se isporuče, i poželjno ekprimiraju, jedan ili više gen(a) ili sekvnenca(i) u deliji domadina. Primeri vektora uključuju, ali bez ograničenja, virusne vektore, čiste DNK ili RNK ekspresione vektore, plazmid, kozmid ilifagne vektore, DNK ili RNK ekspresione vektore koji su povezani sa katjonskim sredstvima za kondenzovanje, DNK ili RNK ekspresione vektore koji su inkapsulirani u lipozomima, i određene eukariotske delije, kao što su delije proizvođači.

[0065] Kao što se ovde koristi, "ekspresiona kontrolna sekvenca" označava sekvencu nukleinske kiseline koja usmerava transkripciju nukleinske kiseline. Ekspresiona kontrolna sekvenca može da bude promoter, kao što je konstitutivni ili inducibilni promoter, ili pojačivač. Ekspresiona kontrolna sekvenca je operativno vezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja treba da se transkribuje.

[0066] Kao što se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljivi nosač" ili "farmaceutski prihvatljivi ekscipijent" uključuje bilo koji materijal koji, kada se kombinuje sa aktivnim sastojkom, omogudava sastojku da zadrži biološku aktivnost i da ne interaguje sa imunskim sistemom domadina. Primeri uključuju, ali bez ograničenja, bilo koje standardne farmaceutske nosače kao što je rastvor fosfatnog pufer, vodu, emulzije kao što je emulzija ulja u vodi, i različiti tipovi sredstva za vlaženje. Poželjni rastvarači za davanje u obliku aerosoli ili parenteralno davanje su rastvor fosfatnog pufera normalnog (0,9 mas%) rastvora soli. Kompozicije koje sadrže takve nosače su formulisane dobro poznatim konvencionalnim postupcima (videti, na primer, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000).

[0067] Termin "kasoc.", kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na konstantu brzine za spajanje antitela sa antigenom.

[0068] Termin "kdis.", kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na konstantu brzine dioscijacije antitela iz kompleksa antitela/antigena.

[0069] Termin "KD", kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije interakcije antitela i antigena.

[0070] Kao što se ovde koristi, termin "vazomotorni simptom," je namenjen da se odnosi na stanja koja su povezana sa vazodilatacijom i uključuju, ali bez ograničenja, glavobolju (kao što je migrena, ...drugi), vrude crvenilo (ili vrudi valunzi), hladni valunzi, insomnija, poremedaji spavanja, poremedaji raspoloženja, razdražljivost, intenzivno znojenje, nodna znojenja, dnevna znojenja, umor, i slično, prouzrokovana, između ostalog, disfunkcijom u termoregulaciji.

1

[0071] Kao što se ovde koristi, termini "crvenilo", "vrude crvenilo" and "vrudi valung" su termini poznati iz oblasti tehnike koji se odnose na periodično narušavanje telesne temperature koje se obično sastoji od iznenadnog crvenila kože, koje je obično pradeno znojenjem kod subjekta.

B. Anti-CGRP antagonistička antitela

[0072] Anti-CGRP antagonističko antitelo se odnosi na bilo koji molekul antitela koji blokira, suprimira ili redukuje (uključujudi značajno) biološku aktivnost CGRP-a, uključujudi nishodne puteve koji su posredovani sa CGRP signalizacijom, kao što je vezivanje za receptor i/ili pokretanje delijskog odgovora na CGRP.

[0073] Anti-CGRP antagonistiko antitelo treba da ispoljava bilo koju od slededih karakteristika: (a) vezivanje za CGRP; (b) blokiranje vezivanja CGRP-a za njegov receptor(e); (c) blokiranje ii smanjenje aktivacije receptora za CGRP (uključujudi aktivaciju cAMP-a); (d) inhibiranje biološke aktivnosti CGRP-a ili nishodne puteve koji su posredovani sa signalnom funkcijom CGRP-a; (e) sprečavanje, ublažavanje, ili lečenje bilo kojeg aspekta glavobolje (npr., migrene); (f) povedanje čišdenja CGRP; i (g) inhibiranje (redukcija) sinteze CGRP, proizvodnje ili oslobađanja. U oblasti tehnike su poznata anti-CGRP antagonistička antitela. Videti, npr., Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89:565-73, 1995; Sigma (Missouri, US), broj proizvoda C7113 (klon #4901); Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993.

[0074] Anti-CGRP antagonističko antitelo predmetnog pronalaska reaguje sa CGRP na način koji inhibira CGRP i/ili nishodne puteve koji su posredovani sa signalnom funkcijom CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagoničko antitelo prepoznaje humani CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje i za humani α-CGRP i β-CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje i za humani i CGRP pacova. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za C-terminalni fragment koji ima aminokiseline 25-37 od CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za C-terminalni epitop koji se nalazi u okviru aminokiselina 25-37 od CGRP.

[0075] Anti-CGRP antagonistička antitela predmetnog pronalaska mogu da obuhvate fragmente antitela (npr., Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, itd.), jednolančani (ScFv), kombinovane proteine koji sadrže porciju antitela (npr., domen antitela), i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koja sadrži mesto prepoznavanja antigena pronalaska, uključujudi varijante glikozilacije antitela, varijante sekvenci aminokiselina antitela, i kovalentno modifikovana antitela. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je G1 antitelo (kao što se ovde opisuje). Anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca koja je prikazana na Slici 5 (SEQ ID NO:1) i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je prikazana na Slici 5 (SEQ ID NO:2).

[0076] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži modifikovani konstantni region, kao što je konstantni region koji je imunološki inertan koji se ovde opisuje. U nekim izvođenjima, konstantni region je modifikovan kao što se opisuje u Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; i WO 99/58572. U drugim izvođenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanje aminokiselina u odnosu na divlji tip sekvence IgG2). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži konstanti region IgG4

1

koji sadrži sledede mutacije: E233F234L235 u P233V234A235. U još drugim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju mutacijom ostatka za vezivanje oligosaharida (kao što je Asn297) i/ili ostacima koji okružuju koji su deo sekvence za prepoznavanje N-glikozilacije u konstantnom regionu. U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. Konstantni region može da bude aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju enzimski ili eksprimiranjem u domadinu koji je deficijentan za glikozilaciju.

[0077] Afinitet vezivanja (KD) anti-CGRP antagonističkog antitela za CGRP (kao što je humani α-CGRP) može da bude oko 0,02 do oko 200 nM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je bilo koji od oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 pM, oko 20 pM, oko 15 pM, oko 10 pM, oko 5 pM, ili oko 2 pM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je manji od bilo kog oko 250 nM, oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, ili oko 50 pM.

[0078] Jedan način određivanja afiniteta vezivanja antitela za CGRP je merenje afiniteta vezivanja monofunkcionalnih Fab fragmenata antitela. Za dobijanje monofunkcionalnih Fab fragmenata, antitelo (na primer, IgG) može da se iseče sa papinom ili rekombinantno eksprimira. Afinitet anti-CGRP Fab fragmenta antitela može da se odredi površinskom plazmon rezonancijom (Biacore3000TM surface plasmon resonance (SPR) system, Biacore, INC, Piscataway NJ) koja je opremljena sa prethodno imobilizovanim senzorskim čipovima koji sadrže streptavidin (SA) upotrebom HBS-EP pufera za pokretanje (0,01M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3mM EDTA, 0,005% v/v Surfaktant P20). Biotinilovani humani CGRP (ili bilo koji drugi CGRP) može da se rastvori u HBS-EP puferu do koncentracije koja je manja od 0,5 ug/mL i injektira kroz individualne kanale čipa upotrebom varijabilnog vremena kontakta, da se postignu dva opsega gustine antigena, ili 50-200 jedinica odgovora (RU) za detaljna kinetička ispitivanja 800-1,000 RU za skrining testove. Studije regeneracije su pokazale da 25mM NaOH u 25% v/v etanolu efikasno uklanja vezani Fab dok održava aktivnost CGRP-a na čipu preko 200 injekcija. Obično, serijska razblaženja (sa koncentracijama od 0,1-10x procenjenom KD) prečišdenih Fab uzoraka su injektirani 1 min na 100 mL/minutu i omogudeno je vreme disocijacije od 2 sata. Koncentracije Fab proteina se određuju upotrebom ELISA i/ili SDS-PAGE elektroforeze korišdenjem Fab-a poznate koncentracijie (kao što je određeno analizom aminokiselina) kao standardom. Kinetičke kostante asocijacije (kasoc.) i disocijacije (kdis.) se dobijaju istovremeno uklapanjem podataka globalno sa 1:1 Langmuirovim modelom vezivanja (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) upotrebom BIAevaluation programa. Vrednosti ravnoteže konstante disocijacije (KD) se računaju prema kdis./kasoc.. Ovaj protokol je pogodan za upotrebu u određivanju afiniteta vezivanja antitela za bilo koji CGRP, uključujudi humani CGRP, CGRP drugog sisara (kao što je mišji CGRP, CGRP pacova, CGRP primata ), kao i različiti oblici CGRP-a (kao što je α i β oblik). Afinitet vezivanja antitela se generalno meri na 25°C,ali takođe može da se meri na 37°C.

[0079] Antitela mogu da budu vezana za mnoge različite nosače. Nosači mogu da budu aktivni i/ili inertni. Primeri dobro poznatih nosača uključuju polipropilen, polistiren, polietilen, dekstran, najlon, amilaze, staklo, prirodnu ili modifikovanu celulozu, poliakrilamide, agaroze i magnetit. Nosač može da bude ili rastvorljiv ili nerastvorljiv. Stručnjaci iz oblasti tehnike znaju druge pogodne nosače za

1

vezivanje antitela, ili mogu da utvrde, upotrebom rutinskog eksperimenta. U nekim izvođenjima, nosač sadrži ostatak koji cilja miokard.

C. Antitelo G1 i povezana antitela, polinukleotidi, vektori i delije domadini

[0080] Ovaj pronalazak obuhvata G1 antitelo ; i polinukleotide koji sadrže sekvence koje kodiraju G1

[0081] Anti-CGRP antagonistička antitela pronalaska se karakterišu bilo kojom (jednom ili više) od slededih karakteristika: (a) vezivanje za CGRP; (b) blokiranje CGRP-a od vezivanja za njegov receptor(e); (c) blokiranje ili smanjenje aktivacije receptora za CGRP (uključujudi aktivaciju cAMP); (d) inhibiranje biološke aktivnosti CGRP-a ili nishodnih puteva koji su povezani sa signalnom funkcijom CGRP-a; (e) sprečavanje, ublažavanje, ili lečenje bilo kog aspekta glavobolje (npr., migrene); (f) povedanje čišdenja CGRP-a; i (g) inhibiranje (redukovanje) sinteze CGRP-a, proizvodnje ili oslobađanja.

[0082] Prema tome, anti-CGRP antagonist pronalaska može da sadrži bilo koje od slededih: (a) antitelo G1; (b) fragment ili region antitela G1 (c) laki lanac i teški lanac antitela G1; (d) varijabilni region iz lakog lanca i teškog lanca antitela G1.

[0083] CDR porcije antitela G1 (uključujudi Chothia i Kabat CDR-e) su predstavljene dijagramom na Slici 5. Određivanje svih CDR regiona je dobro poznato iz oblasti tehnike. Razume se da u nekim izvođenjima, CDR-i mogu da budu kombinacija Kabat i Chothia CDR (takođe nazvani "kombinovani CDR-i" ili "prošireni CDR-i"). U nekim izvođenjima, CDR-i su Kabat CDR-i. U drugim izvođenjima, CDR-i su Chothia CDR-i. Drugim rečima, u izvođenjima sa više od jednog CDR-a, CDR-i mogu da budu bilo koji od Kabat, Chothia, kombinovanih CDR-a, ili njihovih kombinacija.

[0084] Afinitet vezivanja (KD) anti-CGRP antagonističkog antitela za CGRP (kao što je humano α-CGRP) može da bude oko 0,06 do oko 200 nM. U nekin izvođenjima, afinitet vezivanja je bilo koji od 200 nM, 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 pM, oko 20 pM, oko 15 pM, oko 10 pM, oko 5 pM, ili oko 2 pM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je manji od bilo kog oko 250 nM, oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, ili oko 50 pM.

[0085] Pronalazak takođe obezbeđuje postupke dobijanja bilo kojih od anti-CGRP antagonističkih antitela pronalaska. Anti-CGRP antagonistička antitela ovog pronalaska mogu da se dobiju postupcima koji su poznati u oblasti tehnike. Polipeptidi antitela, posebno kradi polipeptidi do oko 50 aminokiselina, se pogodno prave hemijskom sintezom. Postupci hemijske sinteze su poznati iz oblasti tehnike i komercijalno su dostupni. Na primer, antitelo može da se proizvede automatskim sintetizatorom polipeptida korišdenjem postupka koji sadrži čvrstu fazu. Videti takođe, U.S. Patent Nos.5,807,715; 4,816,567; i 6,331,415.

[0086] U drugoj alternativi, antitela mogu da se dobiju kombinovanjem upotrebom postupaka koji su dobro poznati iz oblasti tehnike. U jednom izvođenju, polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira laki lanac i/ili varijabilne regione lakog lanca G1 antitela što je prikazano u SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10. U drugom izvođenju, polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:9 u SEQ ID

2

NO:10 je kloniran u jedan ili više vektora za ekspresiju ili propagaciju. Kodiranje sekvence za antitelo od interesa može da se održava u vektoru u deliji domadina i delija domadina zatim može da bude proširena i zamrznuta za bududu primenu. Ovde se dalje opisuju vektori (uključujudi eskpresione vektore) i delije domadina.

[0087] Pronalazak takođe obuhvata jednolančane fragmente varijabilnog regiona ("scFv") anti-CGRP antagonističkih antitela pronalaska, kao što je G1. Jednočlančani fragmenti varijabilnog regiona se dobijaju povezivanjem varijabilnih regiona lakog i/ili teškog lanca upotrebom kratkog peptida za povezivanje. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Primer peptida za povezivanje je (GGGGS)3 koji spaja približno 3,5 nm između karboksi kraja jednog varijabilnog regiona i amino kraja drugog varijabilnog regiona. Dizajniraen su i koriste se grupe za povezivanje drugih sekvenci. Bird et al. (1988). Grupe za povezivanje mogu da budu modifikovane za dodatne funkcije, kao što je vezivanje lekova ili vezivanje za čvrstu podlogu. Jednolančane varijante mogu da se proizvedu ili rekombinantno ili sintetički. Za sintetičko dobijanje scFv, može da se koristi automatski sintetizator. Za rekombinantnu proizvodnju scFv, pogodni plazmid koji sadrži polinukleotid koji kodira scFv može da se uvede u pogodnu deliju domadina, ili eukariotsku, kao što su delije kvasca, biljaka, insekata ili sisara, ili prokariotsku, kao što je E. coli. Polinukleotidi koji kodiraju scFv od interesa mogu da se dobiju rutinskim manipulacijama kao što je ligacija polinukleotida. Dobijeni scFv može da se izoluje upotrebom standardnih postupaka za prečišdevanje proteina koji su poznati iz oblasti tehnike.

[0088] U nekim izvođenjima pronalaska, anti-CGRP antagonističko antitelo može da sadrži modifikovani konstantni region, kao što je konstantni region koji je imunološki inertan ili delom inertan, npr., ne pokrede lizu koja je posredovana komplementom, ne stimuliše delijski posredovanu citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC), ili ne aktivira mikrogliju; ili ima smanjene aktivosti (u poređenju sa nemodifikovanim antitelom) u bilo kom jednom ili više od slededih: pokretanje lize koja je posredovana komplementom, stimulacije delijske citotoksičnosti koja je zavisna od antitela (ADCC), ili aktivacija mikroglije. Različite modifikacije konstantnog regiona mogu da se koriste za postizanje optimalnog nivoa i/ili kombinacije efektorskih funkcija. Videti, na primer, Morgan et al., Immunology 86:319-324 (1995); Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969 (1996); Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). U nekim izvođenjima, konstantni region je modifikovan kao što se opisuje u Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; PCT Application No. PCT/GB99/01441; i/ili UK Patent Application No. 9809951.8. U drugim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanje aminokiselina u odnosu na divlji tip IgG2 sekvence). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. U još drugim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikolzilovan za N-vezanu glikozilaciju mutacijom glikozilovanog ostatka aminokiseline ili ostacima koji okružuju koji su deo sekvence za prepoznavanje sekvence N-glikozilacije u konstantnom regionu. Na primer, mesto N-glikozilacije N297 može da bude mutirano u A, Q, K, ili H. Videti, Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). U nekim izvođenjima, konstantni region je glikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. Konstantni region može enzimski da bude aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju (kao što je uklanjanje ugljenog hidrata enzimom PNGazom), ili ekpresijom u deliji domadina koja je deficijentna za glikozilaciju.

[0089] Druge modifikacije antitela uključuju antitela koja su modifikovana kao što se opisuje u PCT objavi br. WO 99/58572, koja je objavljena 18 novembra, 1999. Ova antitela sadrže, zajedno sa vezujudim domenom koji je usmeren prema ciljanom molekulu, efektorski domen koji ima sekvencu aminokiselina koja je u osnovi homologa sa svim ili delom konstantnog domena teškog lanca humanog imunoglobulina. Ova antitela mogu da se vežu za ciljni molekul bez značajnog pokretanja lize koja je posredovana komplementom, ili delijski posredovanom destrukcijom cilja. U nekim izvođenjima, efektorski domen može specifično da se veže za FcRn i/ili FcγRIIb. Ovo je obično zasnovano na himernim domenima koji su izvedeni iz dva ili više CH2 domena teškog lanca humanog imunoglobulina. Antitela koja su modifikovana na ovakav način su delom pogodna za upotrebu u hroničnoj terapiji antitelom, da se izbegne inflamatorne i druge štetne reakcije konvencijalne terpije antitelom.

[0090] Kompozicije koje sadrže antitela koja se dobijaju od G1 mogu da budu konjugovana (na primer, povezana) sa sredtvom koje olakšava kuplovanje za čvrstu podlogu (kao što je biotin ili avidin). Radi jednostavnosti, referenca de generalno biti na G1 ili antitela sa razumevanjem da se ovi postupci primenjuju na bilo koje od izvođenja vezivanja CGRP koje se ovde opisuje. Konjugacija se generalno odnosi na povezivanje ovih komponenti kao što se ovde opisuje. Povezivanje (što je generalno postavljanje ovih komponenti neposredno udruženih barm za davanje) može da se postigne na različitim načinima. Na primer, direktna reakcija između sredstva i antitela je moguda kada svaki sadrži supstituent koji može da reaguej sa drugim. Na primer, nukleofilna grupa, kao što je amino ili sulfhidril grupa, na jednom može da reaguje sa grupom koja sadrži karbonil na drugom, kao što je anhidrih ili kiseli halid, ili sa alkil grupom koja sadrži dobru odlazedu grupu (npr., halid) na drugom.

[0091] Anti-CGRP antagonističko antitelo ovog pronalaska može da bude povezano sa sredstvom za obeležavanje (alternativno nazvano "obeleživač") kao što je fluorescentni molekul, radioaktivni molekul ili bilo koji drugi obeleživači koji su poznati iz oblasti tehnike. Obeleživači koji su poznati iz oblasti tehnike obično obezbeđuju (ili direktno ili indirektno) signal.

[0092] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju anti-CGRP antagonistička antitela pronalaska (uključujudi antitelo koje sadrži polipeptidne sekvence varijabilnih regiona lakog lanca i teškog lanca koji su prikazani na Slici 5), i vektore i delije domadina koji sadrže polinukleotid.

[0093] Prema tome, pronalazak obezbeđuje polinukleotide koji kodiraju anti-CGRP antagonistička antitela pronalaska koja sadrže polinukleotide koji kodiraju bilo koje od slededih: (a) antitelo G1; (b) fragment ili region antitela G1 (c) laki lanac i teški lanac antitela G1; (d) varijabilni region iz lakog lanca i teškog lanca G1 antitela. U nekim izvođenjima, polinukleotid sadrži i polinukleotid(e) koji su prikazani u SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10.

[0094] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje polinukleotide koji kodiraju bilo koje od anti-CGRP antagonističkih antitela pronalaska. Poli nukleotidi mogu da se dobiju postupcima koji su poznati iz oblasti tehnike.

[0095] Polinukleotidi koji su komplementarni sa bilo kojim takvim sekvencama su takođe obuhvadeni predmetnim pronalaskom. Polinukleotidi mogu da budu jednolančani (kodirajudi ili antisens) ili dvolančani, i mogu da budu DNK (genomska, cDNK ili sintetička) ili RNK molekuli. RNK molekuli uključuju HnRNK molekule, koji sadrže introne i ogovaraju DNK molekulu na način jedan prema jedan, i iRNK molekule, koji ne sadže introne. Dodatne kodirajude i nekodirajude sekvence mogu, ali ne moraju, da se nalaze u polinukleotidu predmetnog pronalaska, i polinukleotid može, ali ne mora, da bude povezan sa drugim molekulima i/ili dodatnim materijalima.

[0096] Pogodni vektori za kloniranje mogu da se dobiju u skladu sa standardni postupcima, ili mogu da se odaberu ood velikog broja vektora za kloniranje koji su dostupni u oblasti tehnike. Dok odabrani vektori za kloniranje mogu da se razlikuju u odnosu na deliju domadina koja se koristi, korisni vektori za kloniranje de generalno modi samostalno da se replikuju, mogu da sadrže jedan cilj za određenu restrikcionu endonukleazu, i/ili može da nosi marker gene koji mogu da budu korisni u selekciji klonova koji sadrže vektor. Pogodni primeri uključuju plazmide i bakterijske viruse, npr., pUC18, pUC19, Bluescript (npr., pBS SK+) i njegove derivate, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, fagne DNK, i trasfer vektore kao što su as pSA3 i pAT28. Ovi i mnogi drugi vektori za kloniranje su dostupni od komercijalnih dobavljača kao što su BioRad, Strategene, i Invitrogen.

[0097] Ekspresioni vektori su generalno polinukleotidni konstrukti koji mogu da se replikuju koji sadrže polinukleotid koji kodira anti-CGRP antagonističko antitelo prema pronalasku. Podrazumeva se da ekspresioni vektor mora da se replikuje u deliji domadina ili kao epizomi ili kao integralni deo hromozomske DNK. Pogodni ekspresioni vektori uključuju ali bez ograničenja plazmide, virusne vektore, uključujudi adenoviruse, adeno-povezane viruse, retroviruse, kozmide, i ekspresione vektor(e) koji su prikazani u PCT objavi br. WO 87/04462. Komponente vektora mogu generalno da uključe, ali bez ograničenja, jedan ili više od slededih: signalnu sekvencu; početak replikacije; jedan ili više marke gena; pogodne transkripcione kontrolne elemente (kao što su promoteri, pojačivači i terminator). Za ekspresiju (tj., translaciju), obično su neophodni jedan ili više translacionih kontrolnih elemenata, kao što su mesta za vezivanje ribozoma, mesta početka translacije, i stop kodoni.

[0098] Vektori koji sadrže polinukleotide koji kodiraju anti-CGRP antagonističko antitelo pronalaska mogu da budu uvedeni u deliju domadina brojim pogodnim načinima, uključujudi elektroporaciju, transfekciju korišdenjem kalcijum hlorida, rubidijum hlorida, kalcijum fosfata, DEAE-dekstrana, ili drugih supstanci; bombardovanjem mikroprojektilima; lipofekcijom; i infekcijom (npr., gde je vektro infektivni agens koa što je vaccinia virus). Izbor uvođenja vektora ili polinukleotida često zavisi od karakteristika delije domadina.

[0099] Pronalazak takođe obezbeđuje delije domadina koje sadrže bilo koje od polinukleotida koji kodiraju anti-CGRP antagonističko antitelo pronalaska. Bilo koje delije domadina koje su sposobne za prekomerne ekspresije heterolognih DNK mogu da se koriste za svrhu izolovanja gena koji kodiraju antitelo od interesa. Primeri delija domadina sisara koji ne ograničavaju uključuju ali bez ograničenja, COS, HeLa, i CHO delije. Videti takođe PCT objavu br. WO 87/04462. Pogodne delije domadina koji nisu sisari uključuju prokariote (kao što su E. coli ili B. subtillis) i kvasac (kao što je S. cerevisae, S. pombe; ili K. lactis). Poželjno, delije domadina eksprimiraju cDNK na nivou koji je oko 5 puta vedi, poželjnije 10 puta vedi, još više poželjno 20 puta vedi u odnosu na odgovarajude endogeno antitelo ili protein od interesa, u koliko je prisutan, u delijama domadina. Skrining delija domadina za specifično

2

vezivanje za A 1-40 se vrši imunotestom ili FACS analizom. Mogu da se identifikuju delije koje prekomerno eksprimiraju anti-CGRP antagonističko antitelo od interesa.

Primeri

Primer 1: Dobijanje i karakterizacija monoklonskih antitela specifičnih za CGRP

[0100] Dobijanje anti-CGRP antitela. Da bi se dobila anti-CGRP antitela koja imaju ukrštenu reaktivnost prema CGRP koji je poreklom iz pacova i čoveka, miševi se imunizuju sa 25-100 µg humanim α-CGRP ili β-CGRP konjugovanim sa KLH u adjuvansu (50 µl po šapici, 100 µl ukupno po mišu) u različitim intervalima. Imunizacija se generalno izvodi kao što se opisuje u Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol.. Methods 121:157-166; and Wicher K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl, Immunol.89:128-135. Miševi se prvo imunizuju sa 50 µg humanog α-CGRP ili β-CGRP konjugovanog sa KLH u CFA (kompletnom Frojndovom adjuvansu). Nakon 21 dana, miševi se sekundarno imunizuju sa 25 µg humanog β-CGRP (za miševe koji su prvo imunizovani sa α-CGRP) ili α-CGRP (za miševe koji su prvo imunizovani sa β-CGRP)) konjugovanim sa KLH u IFA (nekompletnom Frojndovom adjuvansu). Dvadeset tri dana kasnije nakon druge imunizacije, treda imunizacija se izvodi sa 25 µg α-CGRP poreklom iz pacova konjugovanim sa KLH u IFA. Deset dana kasnije, ispituju se titri antitiela upotrebom ELISA. Četvrta imunizacija se izvodi sa 25 µg peptida (α-CGRP-KLH pacova) u IFA 34 dana nakon trede imunizacije. Konačni „booster“ se izvodi sa 100 µg rastvorljivog peptida (α-CGRP pacova) 32 dana nakon četvrte imunizacije.

[0101] Splenociti se dobijaju iz imunizovanog miša i fuzionišu sa NSO delijama mijeloma u odnosu 10:1, sa polietilen glikolom 1500. Hibridi se zasejavaju na ploče sa 96 bunarida u DMEM koji sadrži 20% serum konja i počinje selekcija sa 2-oksaloacetat/piruvat/insulinom (Sigma), i hipoksantin/aminopterin/timidinom. Tokom dana 8, u sve bunaride se dodaje 100 µl DMEM koji sadrži 20% serum konja. Supernatanti hibrida se pretražuju upotrebom imunotesta hvatanjem antitela. Određivanje klase antitela se izvodi sekundarnim antitelima koji su specifni za klasu.

[0102] Panel delijskih linija koje proizvode monoklonska antitela se bira na osnovu njihovog vezivanja za CGRP čoveka i pacova za dalju karakterizaciju. Ova antitela i karakteristike su prikazane u tekstu ispod u Tabelama 2 i 3.

[0103] Prečišdavanje i dobijanje Fab fragmenta. Monoklonska antitela koja se biraju za dalju karakterizaciju su prečišdena iz supernatanta kultura hibridoma upotrebom afinitetne hromatografije koja sadrži protein A. Supernatanti su ekvilibrisani do pH 8. Supernatanti su zatim napunjeni u MabSelect kolonu koja sadrži protein A (Amersham Biosciences # 17-5199-02) ekvilibrisani sa PBS do pH 8. Kolona se ispira sa PBS, vrednosti 5 zapremina kolone, pH 8. Antitela se ispiraju sa 50 mM citratno-fosfatnim puferom, pH 3. Isprana antitela se neutralizuju sa 1M fosfatnim puferom, pH 8. Prečišdena antitela se dijaliziraju sa PBS, pH 7,4. Koncentracije antitela se određuju upotrebom SDS-PAGE, korišdenjem standardne krive mišjeg monoklonskog antitela.

[0104] Fab-i were se dobijaju proteolizom ukupnih antitela papainom, korišdenjem Immunopure Fab kita (Pierce # 44885) i prečišdavanjem protokom kroz hromatografiju koja sadrži protein A prema uputstvima proizvođača. Koncentracije se određuju upotrebom ELISA i/ili SDS-PAGE elektroforeze upotrebom Fab standarda poznate koncentracije (određeno analizom aminokiselina), i pomodu A280 upotrebom 10D=0,6 mg/ml (ili teorijski evivalent na osnovu sekvence aminokiseline).

[0105] Određivanje afiniteta Fab-a. Afiniteti anti-CGRP monoklonskih antitela se određuju na ili 25°C ili 37°C upotrebom sistema Biacore3000™ površinske plazmon rezonancije (SPR) (Biacore, INC, Piscataway NJ) sa puferom koji se odbija od samog proizvođača, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v polisorbat P20). Afinitet se određuje hvatanjem N-terminalno biotinilovanih CGRP peptida (po narudžbini od Gen-Script Corporation, New Jersey ili Global Peptide Services, Colorado) pomodu prethodno imobilizovanog streptavidina na SA čipu i merenjem kinetike vezivanja Fab antitela koje se titrira kroz površinu CGRP. Biotinilovani CGRP se rastvara u HBSEP i injektira u čip na koncentraciji manjoj od 0,001 mg/ml. Upotrebom varijabilnog vremena protoka kroz individualne kanale čipa, postižu se dva opsega gustine antitela: <50 jedinica odgovora (RU) za detaljna ispitivanja kinetike i oko 800 RU za ispitivanja koncentracije i skrining. Dvostruka ili trostruka serijska razblaženja obično na koncentracijama od 1 µM - 0.1 nM (ciljano na 0,1-10x procenjeno KD) ili prečišdenih Fab fragmenta se injektiraju 1 minut na 100 µL/min i omogudava se vreme disocijacije u trajanju od 10 minuta. Nakon svakog ciklusa vezivanja, površine su regenerisane sa 25 mM NaOH u 25% v/v etanolu, koji se toleriše tokom stotina ciklusa. Kinetička konstanta vezivanja (kasoc.) i brzina disocijacije (kdis.) se dobijaju istovremeno uklapanjem podataka 1:1 Langmuir modela vezivanja (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6.99-110) upotrebom BIA programa za evaluciju. Globalne ravnotežne konstante disocijacije (KD) ili "afiniteti" se računaju iz odnosa KD = kdis./kasoc.. Afiniteti mišjih Fab fragmenta su prikazani u Tabelama 2 i 3.

[0106] Mapiranje epitopa mišjih anti-CGRP antitela. Da bi se odredio epitop za kog se anti-CGRP antitela vezuju na humanom α-CGRP, afiniteti vezivanja Fab fragmenta za različite CGRP fragmente se mere kao što se opisuje u tekstu iznad hvatanjem N-terminalno biotinilovanih CGRP fragmenata aminokiselina 19-37 i aminokiselina 25-37 na SA senzor čipu. Slika 1 pokazuje njihove afinitete vezivanja koji se mere na 25°C. Kao što je prikazano na Slici 1, sva antitela, izuzev antitela 4901, se vezuju za humane fragmente α-CGRP 19-37 i 25-37 sa afinitetom koji je sličan sa njihovim afinitetom vezivanja za humani α-CGRP pune dužine (1-37). Antitelo 4901 se vezuje za humani α-CGRP fragment 25-37 sa šest puta nižim afinitetom nego što je vezivanje za humani α-CGRP fragment pune dužine, uglavnom zbog gubitka u „dis.“-brzini. Podaci ukazuju na to da se ova anti-CGRP antitela generalno vezuju za C-terminalni kraj CGRP.

[0107] Pretraživanje prisustva alanina se izvodi za dalju karakterizaciju aminokiselina kod humanog α-CGRP koji je uključen u vezivanju anti-CGRP antitela. Različite varijante humanog α-CGRP sa jednom supstitucijom alanina se dobijanju sintezom peptida. Njihove sekvence aminokiselina su prikazane u Tabeli 4 zajedno sa svim drugim peptidima koji se koriste u Biacore analizi. Afiniteti Fab fragmenata anti-CGRP antitela prema ovim varijantama se određuju upotrebom Biacore kao što se opisuje u tekstu iznad. Kao što je prikazano na Slici 1, svih 12 antitela ciljaju C-terminalni epitop, pri čemu je aminokiselina F37 najvažniji ostatak. Mutacija F37 u alanin zančajno smanjuje afinitet ili čak kompletno onemogudava vezivanje anti-CGRP antitela za peptid. Slededi najvažniji ostatak aminokiselina je G33, međutim, samo su antitela viskog afiniteta (7E9, 8B6, 10A8, i 7D11) pogođena zamenom alanina na ovom položaju. Ostatak aminokiseline S34 takođe ima značajnu, ali manju, ulogu u vezivanju ovih četiri visokoafinitetnih antitela.

2

Tabela 2. Karakteristike vezivanja anti-CGRP monoklonskih antitela za humani α-CGRP i njihova aktivnost antagonista

Tabela 3. Karakteristike vezivanja anti-CGRP monoklonskih antitela za α-CGRP pacova i aktivnost antagonista

2

Tabela 4. Sekvence aminokiselina humanih α-CGRP fragmenata (SEQ ID NOS:15-40) i peptida koji su u vezi sa njima (SEQ ID NOS:41-47). Svi peptidi su C-terminalno amidovani izuzev SEQ ID NOS:36-40.

Ostaci naznačeni tamnim slovima ukazuju na tačkaste mutacije.

Primer 2: Skrining anti-CGRP antagonista antitela korišdenjem in vitro testova.

[0108] Mišja anti-CGRP antitela se dalje pretražuju za aktivnost antagonista in vitro upotrebom delijski zasnovanog testa aktivacije cAMP-a i testa vezivanja.

[0109] Aktivnost antagonista merena cAMP testom. Pet mikrolitara humanog ili α-CGRP pacova (finalne koncentracije 50 nM) u prisustvu ili odsustvu anti-CGRP antitela (finalna koncentracija 1-3000 nM), ili α-CGRP pacova ili α-CGRP čoveka (finalna koncentracija 0,1 nM-10 mM; kao pozitivna

2

kontrola za aktivaciju c-AMP-a) se sipa u ploču koja sadrži 384 bunarida (Nunc, Cat. No. 264657). Deset mikrolitara delija (humanih SK-N-MC ukoliko se koristi humani α-CGRP, L6 pacova od ATCC ukoliko se koristi α-CGRP pacova) u puferu za stimulaciju (20 mM HEPES, pH 7,4, 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, i 500 µM 3-lsobutil-1-metilksantin (IBMX)) se dodaju u bunaride ploče. Ploča se inkubira na sobnoj temperaturi 30 min.

[0110] Nakon inkubacije, cAMP aktivacija se izvodi upotrebom HitHunter™ Enzyme Fragment Complementation testa (Applied Biosystems) prema uputstvima proizvođača. Test se zasniva na genetski modifikovanom enzimu β-galaktosidazi koji se sastoji iz dva fragmenta –koji se zovu akceptor enzima (EA) i donor enzima (ED). Kada su dva fragmenta razdvojena, enzim je inaktivan. Kada su fragmenti zajedno oni mogu spontano da se rekombinuju da obrazuju aktivni enzim pomodu postupka komplementacije. Platforma EFC testa koristi konjugat ED-cAMP peptida gde je cAMP prepoznat od anti-cAMP. Ovaj ED fragment može ponovo da sespoji sa EA da se obrazuje aktivni enzim. U testu, anti-cAMP antitelo se optimalno titrira za vezivanje za ED-cAMP konjugat i inhibiranje obrazovanja enzima. Nivoi cAMP-a u uzorcima delijskog lizata se nalaze u kompeticiji sa ED-cAMP konjugatom za vezivanje za anti-cAMP antitelo. Količina slobodnog ED konjugata u testu je proporcionalna koncentraciji cAMP-a. Prema tome, cAMP se meri obrazovanjem aktivnog enzima koje se kvantifikuje prometom luminiscentnog supstrata β-galaktozidaze. Test aktivacije cAMP-a se izvodi dodavanjem 10 µl pufera za lizu i anti-cAMP antitela (u razmeri 1:1) nakon čega sledi inkubacija na sobnoj temperaturi u trajanju od 60 min. Zatim se u svaki bunarid dodaje 10 µl ED-cAMP reagensa i inkubira se 60 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, u svaki bunarid se dodaje 20 µl EA reagensa i CL smeša (koja sadrži supstrat) (u razmeri 1:1) i inkubira 1-3 sati preko nodi na sobnoj temperaturi. Ploča se čita 1 sekundu/bunaridu na PMT instrumentu ili 30 sekundi/mestu na laseru. Identifikovana su antitela koja inhibiraju aktivaciju cAMP pomodu α-CGRP (naznačeno sa "da") u Tabelama 2 i 3 gore. Podaci u Tabelama 2 i 3 ukazuju na to da antitela koja pokazuju aktivnost antagonista u testu imaju generalno visok afinitet. Na primer, antitela koja imaju KD(određeno na 25°C) oko 80 nM ili manje za humani α-CGRP ili koja imaju KD(određeno na 37°C) oko 47 nM ili manje za α-CGRP pacova u ovom testu pokazuju aktivnost antagonista.

[0111] Test vezivanja radioliganda. Test za ispitivanje vezivanja se izvodi merenjem IC50anti-CGRP antitela u blokiranju CGRP od vezivanja za receptor kao što se prethodno opisuje. Zimmermann et al., Peptides 16:421-4, 1995; Mallee et al., J. Biol. Chem. 277:14294-8, 2002. Membrane (25 µg) iz SK-N-MC delija se inkubiraju 90 min na sobnoj temperaturi u puferu za inkubaciju (50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 5 mM MgCL2, 0,1% BSA) koji sadrži 10 pM<125>I-(humanog α-CGRP u ukupnoj zapremini od 1 mL. Da bi se odredile koncentracije inhibicije (IC50), antitela ili neobeleženi CGRP (kao kontrola), od oko 100 puta vedim rastvorom štoka su rastvoreni u puferu za inkubaciju i istovremeno inkubirani sa membranama i 10 pM<125>I-(humanim α-CGRP. Inkubacija se završava ceđenjem kroz stakleni filter koji sadrži mikrocevčice (GF/B, 1µm) koji je blokiran sa 0,5% polietilemiminom. Predstavljene su krive doznog odgovora su i Kivrednosti su određene korišdenjem jednačine: Ki= IC50/(1 ([ligand]/KD); gde je ravnotežna konstanta disocijacije KD= 8 pM za humani α-CGRP prema CGRP1 receptoru kao što se nalazi kod SK-N-MC delija, i Bmax= 0,025 pmol/mg proteinu. Prijavljena IC50vrednost (u terminima IgG molekula) se konvertuje za mesta vezivanja (množenjem sa 2) tako da može da se poredi sa afinitetima (KD) koji su određeni upotrebom Biacore (vidi Tabelu 2).

2

[0112] Tabela 2 pokazuje IC50mišjih antitela 7E9, 8B6, 6H2 i 4901. Podaci ukazuju na to da se afinitet antitela generalno nalazi u korelaciji sa IC50: antitela koja imaju vedi afinitet (niže KDvrednosti) imaju niži IC50u testu vezivanja radioliganda.

Primer 3: Efekat anti-CGRP antagonista antitela na vazodilataciju kože koja je indukovana stimulacijom nerva safenusa pacova

[0113] Za testiranje aktivnosti antagonista anti-CGRP antitela, ispituje se efekat antitela na vazodilataciju stimulacijom nerva safenusa pacova korišdenjem modela pacova kao što se prethodno opisuje. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1993. Uovom modelu pacova, elekrična stimulacija nerva safenusa indukuje oslobađanjem CGRP sa krajeva nerva, što dovodi do povedanja u prokrvljenosti kože. Prokrvljenost u koži stopala kod Sprague Dwaley pacova muškog pola (170-300 g, od Charles River Hollister) se meri nakon stimulacije nerva safenusa. Pacovi se drže pod anestezijom koja sadrži 2% izofluran. Bretilijum tosilat (30 mg/kg, dato i.v.) se daje na početku eksperimnta da se minimizuje vazokonstrikciija usled istovremene stimulacije simpatičkih vlakana nerva safenusa. Telesna temperatura se održava na 37°C korišdenjem rektalne probe koja je termostatski povezana sa grejnom pločom koja je kontrolisana temperaturom. Jedinjenja uključujudi antitela, pozitivnu kontrolu (CGRP 8-37), i nosač (PBS, 0,01% Tween 20) se daju intravenozno kroz desnu femoralnu venu, osim za eksperiment koji je prikazan na Slici 3, jedinjenje koje se ispituje i kontrola se daju injekcijom kroz repnu venu, i za eksperimente koji su prikazani na Slikama 2A i 2B, antitela 4901 i 7D11 se daju injekcijom intraperiotnealno (IP). Jedinjenja pozitivne kontrole CGRP 8-37 (antagonist vazodilatacije), usled njegovog kratkog polu-života, se daje 3-5 min pre stimulacije nerva na 400 nmol/kg (200 µl). Tan et al., Clin. Sci, 89:656-73, 1995. Antitela se daju u različitim dozama (1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, i 25 mg/kg).

[0114] Za ekperimente koji su prikazani na Slikama 2A i 2B, antitelo 4901 (25 mg/kg), antitelo 7D11 (25 mg/kg), ili kontrola koja sadrži nosač (PBS sa 0,01% Tween 20) se daje intraperitonealno (IP) 72 časova pre stimulacije električnim pulsiranjem. Za eksperiment koji je prikazan na Slici 3, antitelo 4901 (1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, ili 25 mg/kg) ili kontrola koja sadrži nosač (PBS sa 0,01% Tween 20) se daje intravenozno 24 časova pre stimulacije električnim pulsiranjem. Nakon davanja antitela ili kontrole koja sadrži nosač, nerv safenus desnog zadnjeg ekstremiteta se izlaže hirurški, seče proksimalno i pokriva plastičnim omotom da se spreči isušivanje. Laserska Doppler proba se postavlja preko medio-dorzalne strane kože šapice, koji je region inervisan sa nervom safenusom. Prokrvljenost kože, koja se meri kao fluks krvnih delija, se prati laserskim Doppler meračem protoka. Kada je stabilan protok osnovne linije (sa varijacijom koja je manja od 5%) uspostavlja se najmanje 5 min, nerv se postavlja preko bipolarnih elektroda od platine i električno stimulišu sa 60 pulseva (2 Hz, 10 V, 1 ms, tokom 30 sec) i zatim ponovo 20 minuta kasnije. Kumulativna promena u prokrvljenosti kože se procenjuje površinom ispod krive protoka u vremenu (AUC, koja je jednala sa promenom u fluksu koja je pomnožena sa promenom u vremenu) za svaki odgovor fluksa na stimulaciju električnim pulsiranjem. Uzima se srednja vrednost odgovora protoka krvi na dve simulacije. Životinje se drže pod anestezijom u periodu od jednog do tri časa.

[0115] Kao što je prikazano na Slici 2A i Slici 2B, povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom električnih pulseva na nerv safenus je inhibiranan prisustvom CGRP 8-37 (400 nmol/kg, dato i.v.), antibody 4901 (25 mg/kg, dato ip), ili antitelom 7D11 (25 mg/kg, dato ip) u poređenju sa kontrolom.

2

CGRP 8-37 se daje 3-5 min pre stimulacije nerva safenusa; i antitela se daju 72 časova pre stimulacije nerva safenusa. Kao što je prikazano na Slici 3, povedanje protoka krvi stimulisano primenom električnih pulseva na nerv safenus je inhibirano prisustvom antitela 4901 u različitim dozama (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, i 25 mg/kg) koje se daju intravenozno 24 h pre stimulacije nerva safenusa.

[0116] Za eksperimente koji su prikazani na Slikama 4A i 4B, nerv safenus se hirurški izloži pre davanja antitela. Nerv safenus desnog zadenjeg ekstemiteta se izlaže hirurški, seče proksimalno i pokriva sa plastičnim omotom da bi se sprečilo isušivanje. Laserska Doppler proba se postavlja preko medio-dorzalne strane kože šapice, što predstavlja region koji je inervisan nervom safenusom. Protok krvi u koži, koji se meri kao fluks krvnih delija, se prati laserskim Doppler meračme protoka. Trideset do četrdeset pet minuta nakon injekcije bretilijum tozilata, da se uspostavi stabilni fluks osnovnog nivoa (sa varijacijom koja je manja od 5%) u toku najmanje 5 min, nerv se postavlja preko bipoarnih elektroda od platine i električno stimuliše (2Hz, 10V, 1 ms, za 30 sec) i ponovo 20 minuta kasnije. Srednja vrednost odgovora fluksa protoka krvi na ove dve stimulacije se koriti za uspostavljanje odgovora osnovnog nivoa (vreme 0) za električnu stimulaciju. Antitelo 4901 (1 mg/kg ili 10 mg/kg), antitelo 7E9 (10 mg/kg), antitelo 8B6 (10 mg/kg), ili nosač (PBS sa 0,01% Tween 20) se zatim daju intravenozno (i.v.). Nerv se naknadno stimuliše (2Hz, 10V, 1 ms, tokom 30 sec) na 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja atitelea ili nosača. Životinje se drže pod anestezijom tokom perioda od približno tri sata. Kumultivna promena u protoku krvi u koži se procenjuje površinom ispod krive prokotka krvi i vremenu (AUC, koja je jednaka sa promenom u fluksu koja je pomnožena sa promenom u vremenu) za svaki odgovor fluksa na stimulacije električnim pulsevima.

[0117] Kao što je prikazano na Slici 4A, povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom elektronskih pulseva na nerv safenus je značajno inhibirano prisustvom antitela 49011 mg/kg koje se daje i.v., kada se stimulacija elektronskim pulsevima primeni na 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela, i povedanje protoka krvi stimuliše primenom elektronskih pulseva na nerv safenus je značajno inhibirana prisustvom antitela 4901 10 mg/kg koje se daje i.v., kada se stimulacija elektronskim pulsem primeni na 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela. Slika 4B pokazuje da povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom elektronskih pulseva na nerv safenus je značajno inhibirano prisutvom antitela 7E9 (10 mg/kg, dato i.v.) kada se stimulacija elektronskim pulsem primenjuje 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela, i prisustom antitela 8B6 (10 mg/kg, dato i.v.) kada se stimulacija elektronskim pulsem primenjuje 30 min nakon davanja antitela.

[0118] Ovi podaci ukazuju na to da su antitela 4901, 7E9, 7D11, i 8B6 efikasna u blokiranju CGRP aktivnosti kao što se meri vazodilatacijom kože koja je indukovana stimulacijom nerva safenusa pacova.

Primer 4. Karakterizacija anti-CGRP antitela G1 i njegovih varijanti

[0119] Sekvence aminokiselina za varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca anti-CGRP antitela G1 su prikazane na Slici 5. Slededi postupci se koriste za ekspresiju i karakterizaciju antitela G1 i njegovih varijanti.

[0120] Ekspresioni vektor koji se koristi. Ekspresija Fab fragmenta antitela je pod kontrolom IPTG inducibilnog lacZ promotera koji je sličan onom koji se opisuje u Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector pComb3X), međutim, modifikacije uključuju dodavanje i ekspresiju slededih dodatnih domena: konstantnog domena humanog Kapa lakog lanca i CH1 konstantnog domena humanog imunoglobilina klase IgG2, C regiona lanca Ig gama-2, pristupni broj proteina P01859; kapa lakog lanca imunoglobulina (homosapiens), pristupni broj proteina CAA09181.

[0121] Dobijanje Fab-a u maloj razmeri. Iz transformisane E. Coli (ili korišdenjem TG1 delija kompetentnih za elektroporaciju ili hemijski kompetentnih Top 10 delija) sa Fab bibliotekom, pojedinačne kolonije se koriste za inokulaciju i master ploče (agar LB karbenicilin (50 µg/mL) 2% glukoza) i radne ploče (2 mL/bunaridu, 96-bunarida/ploči) gde svaki bunarid sadrži 1,5mL LB karbenicilin (50 µg/mL) 2% glukozu. Adhezivni zatvarač koji je propustljiv za gas (ABgene, Surrey, UK) se postavlja na ploču. Obe ploče se inkubiraju na 30°C 12-16h; radna ploča se intenzivno meša. Master ploča se čuva na 4°C do ponovne upotrebe, dok se delije iz glavne ploče transformišu u pelete (4000 oum, 4°C, 20 minuta) i resuspenduju u 1,0 mL LB karbenicilin (50 µg/mL) 0,5 mM IPTG da bi se indukovala ekpresija Fab-a intenzivnim mešanjem 5h na 30°C. Indukovane delije se centrifugiraju na 4000 oum, 4°C tokom 20 minuta i resuspenduju u 0,6 mL Biacore HBSEP puferu (10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v P20). Liza HB-SEP resuspendovanih delija se postiže zamrzavanjem (-80°C) i zatim otapanjem na 37°C. Delijski lizati se centrifugiraju na 4000 oum, 4°C tokom 1 h da bi se debris odvojio od supenatanta koji sadrže Fab, koji se zatim cede (0,2 µm) upotrebom Millipore MultiScreen test sistema sa pločom za ceđenje koja sadrži 96 bunarida i vakuumski kolektor. Biacore se koriti za analizu supernatanta koji se dobijaju nakon ceđenja koji se injektiraju preko CGRPs na senzor čipu. Klonovi koji ekprimiraju Fab-e koji su odabrani afinitetnom selekcijom su preuzeti sa master ploče, koji obezbeđuju DNK za PCR, sekvenciranje, i dobijanje plazmida.

[0122] Dobijanje Fab-a u velikoj razmeri. Da bi se dobili kinetički parametri, Fab-i se ekprimiraju u velikoj razmeri prema slededem. Erlenmajer baloni koji sadrže 150 mL LB karbenicilin (50 ug/mL) 2% glukozu su inokulirani sa 1 mL "početne" prekonodne kulture iz afnitetno odabranog klona E. coli koji eksprimira Fab . Ostatak početne kulture (∼3 mL) se koristi za dobijanje plazmidne DNK (QIAprep mini-prep, Qiagen kit) za sekvenciranje i dalju manipulaciju. Velika kultura se inkubira na 30°C uz intenzivno mešanje do postizanja OD600nmod 1,0 (obično 12-16 h). Delije se peletuju centrifugiranjem na 4000 oum, 4°C tokom 20 minuta, i resuspenduju u 150 mL LB karbenicilin (50 µg/mL) 0,5 mM IPTG. Nakon 5 h ekspresije 30°C, delije se peletuju centrifugiranjem na 4000 oum, 4°C tokom 20 minuta, resuspenduju u 10 mL Biacore HBS-EP pufera, i liziraju upotrebom jednog ciklusa zamrzavanja (-80°C)/ (37°C) otapanja. Delijski lizati se peletuju centrifugiranjem na 4000 oum, 4°C tokom 1 h, i supernatant se skuplja i cedi (0,2 µm). Supernatanti koji ostaju nakon ceđenja se pune na Ni-NTA superflow kolone sefaroze (Qiagen, Valencia. CA) koje se ekvilibrišu sa PBS, pH 8, zatim ispiraju sa 5 PBS zapremina kolone, pH 8. Individualni Fab-i koji se ispiraju u različitim delovima sa PBS (pH 8) 300 mM Imidazolom. Delovi koji sadrže Fab-i se sakupljaju i dijaliziraju u PBS-u, zatim se kvantifikuju upotrebom ELISA testa pre karakterizacije afiniteta.

[0123] Dobijanje celih antitela. Za ekspresiju celih antitela, varijabilni regioni teškog i lakog lanca se kloniraju u sisarske ekpresione vektore i transfekcija se vrši upotrebom lipofektamina u HEK 293

1

delijama za prolaznu ekpresiju. Antitela se prečišdavaju korišdenjem proteina A upotrebom standardnih postupaka.

[0124] Vektor pDb.CGRP.hFcGI je ekpresioni vektor koji sadrži teški lanac G1 antitela, i pogodan je za prolaznu ili stabilnu ekspresiju teškog lanca. Vektor pDb.CGRP.hFcGI ima nukleotidne sekvence koje odgovaraju slededim regionima: regionu promotora mišjeg citomegalovirusa (nukleotidi 7-612); sintetički intron (nukleotidi 613-1679); DHFR kodirajudi region (nukleotidi 688-1253); signalni peptid humanog hormona rasta (nukleotidi 1899-1976); varijabilni region teškog lanca G1 (nukleotidi 1977-2621); teški lanac konstantnog regiona humanog IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanje aminokiselina u odnosu na divlji tip IgG2 sekvence; vidi Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). Vektor pDb.CGRP.hFcGI je deponovan na ATCC 15 jula, 2005, i dodeljen mu je ATCC pristupni br. PTA-6867.

[0125] Vektor pEb.CGRP.hKGI je ekpresioni vektor koji sadrži laki lanac G1 antitela, i pogodan je za prolaznu ekspresiju lakog lanca. Vektor pEb.CGRP.hKGI ima nukleotidne sekvence koji odgovaraju slededim regionima: region promotora mišjeg citomegalovirusa (nukleotidi 2-613); humanom EF-1 intronu (nukleotidi 614-1149); signalnom peptidu humanog hormona rasta (nukleotidi 1160-1237); varijabilni region lakog lanac antitela G1 (nukleotidi 1238-1558); konstantni region humanog kapa lanca (nukleotidi 1559-1882). Vektor pEb.CGRP.hKGI je deponovan na ATCC 15 jula, 2005, i dodeljen mu je ATCC pristupni br. PTA-6866.

[0126] Biacore test za određivanje afiniteta. Afiniteti G1 monoklonskog antitela i njegovih varijanti se određuju na ili 25°C ili 37°C upotrebom Biacore3000™ sistema površinske plazmon rezonancije (SPR) (Biacore, INC, Piscataway NJ). Afinitet se određuje hvatanjem N-terminalno biotinilovanog CGRP ili fragmenata pomodu prethodno imobilizovanog strepatavidina (SA sensor čip) i merenjem kinetike vezivanja Fab fragmenata G1 antitela ili varijanti koje se titriraju kroz CGRP ili fragment na čipu. Svi Biacore testovi se izvode u HBS-EP puferu (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v polisorbat P20). CGRP površine se pripremaju rastvaranjem N-biotiniloovanog CGRP do koncentracije koja je manja od 0,001 mg/mL u HBS-EP bufer i injektiranjem kroz SA sensor čip upotrebom vremena za kontakt koje se razlikuju. Površine niskog kapaciteta, koje odgovaraju nivoima hvatanja <50 jedinica odgovora (RU) se koriste za kinetička ispitivanja visoke rezolucije, gde površine visokog kapaciteta (oko 800 RU uhvadenog CGRP) se koriste za ispitivanja koncentracije, pretraživanja, i određivanja afiniteta rastvora. Kinetički podaci se dobijaju serijskim rastvaranjem Fab G1 u dvostruka ili trostruka povedanja koncentracija koje imaju opseg 1µM-0.1nM (ciljano na 0,1-10x procenjenu KD). Uzorci su obično ubrizgani 1 minut na 100 µL/min i omogudena su vremena disocijacije od najmanje 10 minuta. Nakon svakog ciklusa vezivanja, povšine su regenerisane sa 25mM NaOH u 25% v/v etanolu, koji se toleriše preko stotina ciklusa. Ukupne serije titracije (obično dobijene u duplikatu) se globalno uklapaju u 1:1 Langmuir model vezivanja upotrebom BIAevaluation programa. Ovo je dovelo do jedinstvenog para konstanti kinetičke brzine asocijacije i disocijacije (redom, kasoc.i kdis.) za svaku interakciju vezivanja, čiji odnos daje ravnotežnu konstantu disocijacije (KD= kdis/kasoc.). Afiniteti (KDvrednosti) koje su određene na ovaj način su navedene u Tabelama 6 i 7.

[0127] Analiza interakcije vezivanja visoke rezolucije sa ekstremno sporim dis.-brzinama. Za interakcije sa ekstremno sporim dis.-brzinama (posebno, vezivanje Fab antitela G1 za humani h-CGRP na čipu na 25°C), afiniteti se dobijaju u eksperimentu koji se sastoji iz dva dela. Protokol koji se

2

opisuje u tekstu iznad se koristi sa slededim modifikacijama. Konstanta brzine asocijacije (kasoc.) se određuje injektiranjem 2-strukih serija titracija (u duplikatu) koji imaju opseg 550 nM-1 nM za 30 sec na 100 µL/min i omogudavanjem faze disocijacije u trajanju od samo 30 sekundi. Brzina konstante disocijacije (kdis.) se određuje injektiranjem tri koncentracije (visoke, srednje, i niske) istih serija titracije u duplikatu za 30sek i omoudavanjem faze disocijacije u trajanju od 2-sata. Afinitet (KD) svake interakcije se dobija kombinovanjem kasoc.i kdis.vrednosti koje se dobijaju u oba tipa eksperimenta, kao što je prikazano u Tabeli 5.

[0128] Određivanje afiniteta rastvora pomodu Biacore. Afinitet rastvora koji sadrži G1 antitelo za α-CGRP pacova i F37A (19-37) čoveka α-CGRP se meri pomodu Biacore na 37°C. Koristi se CGRP površina čipa sa visokim kapacitetom (humani α-CGRP sa visokim afinitetom se koristi za svrhe detekcije) i HBS-EP pufer se pušta na 5 µL/min. Fab fragment G1 antitela na konstantnoj koncentraciji od 5 nM (sa ciljem da bude na ili ispod očekivane KDinterakcije zasnovane na rastvoru) prethodno se inkubira sa kompetitivnim peptidom, ili α-CGRP pacova ili F37A (19-37) čoveka α-CGRP, na finalnoj koncentraciji koja ima opseg od 1 nM do 1 µM u 3-strukim serijskim razblaženjima. Rastvori Fab antitela G1 u odsustvu ili prisustvu peptida kompeticije koji je zasnovan na rastvoru, se injektiraju preko CGRP koji se nalazi na čipu i prati se deplecija odgovora vezivanja koji se uočava na povrišni čipa kao rezultat kompeticije rastvora. Ovi odgovori vezivanja se konvertuju u "slobodne Fab koncentracije" korišdenjem kalibracione krive, koja se dobija samo titracijom Fab G1 antitela (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 i 0 nM) preko CGRP na čipu. "Slobodne Fab koncentracije" se predstavljaju u odnosu na koncentraciju peptida za kompeticiju u rastvoru koji se koristi za dobijanje svake tačke podatka i za uklapanje u model afiniteta rastvora upotrebom BIAevaluation softvera. Afiniteti rastvora koji su određeni na ovaj način (indirektno) su prikazani u Tabelama 5 i 7 i koriste se za određivanje afiniteta koji se dobijaju kada se Fab-ovi injekiraju direktno kroz N-biotinilovane CGRP-e na SA čipu. Blisko slaganje između afiniteta koje se određuje pomodu ova dva postupka potvrđuje da vezivanje N-biotinilovane verzije CGRP-a za čip ne menja njegovu prirodnu sposobnost vezivanja u rastvoru.

[0129] Tabela 5 ispod pokazuje afinitete vezivanja G1 antitela za humani α-CGRP, humani β-CGRP, α-CGRP pacova, β-CGRP pacova određeno od Biacore, protokom Fab fragmenara kroz N-biotinilovane CGRP-e koji se nalaze na SA čipu. Za bolje određivanje afiniteta kroz interakcije vezivanja sa ekstremno niskim dis.-brzinama, afiniteti se takođe određuju u ekperimentu iz dva dela u cilju dopune orijentacije ovog testa, rastvor interakcije afiniteta α-CGRP pacova se takođe određuje (kao što se opisuje u tekstu iznad). Blisko slaganje afiniteta koji se mere u obe orijentacije afiniteta potvrđuje da se afinitet vezivanja prirodnog α-CGRP pacova u rastvoru ne menja kada je on N-biotinilovan i vezan za SA čip.

Tabela 5. Afiniteti vezivanja Fab-ova G1 antitela koji su titrirani kroz CGRP-e na čipu

[0130] Tabela 6 ispod pokazuje antitela koja imaju varijaciju sekvence aminokiselina u poređenju sa antitelom G1 i njihove afinitete za α-CGRP pacova i α-CGRP čoveka. Sve supstituicije aminokiselina u varijantama koje su prikazane u Tabeli 6 su opisane u odnosu na sekvencu G1. Afiniteti vezivanja Fab fragmenata su određeni upotrebom Biacore njihovim prelaskom preko CGRP-e na SA čipu.

4

Tabela 6. Sekvence aminokiselina i podaci afiniteta vezivanja za varijante antitela G1 koji su određeni na 37°C uporebom Biacore.

Svi CDR-i uključujudi i Kabat i Chothia CDR-e. Ostaci aminokiselina su sekvencijalno numerisani (videti Sliku 5). Svi kolonovi imaju L3+H1+H3 sekvence koje su identične sa G1.

KD= kdis./kasoc.. Sve kdis.vrednosti se određuju u skrining režimu osim onih koji su podvučeni, koji se dobijaju globalnom analizom serija Fab koncentracija (G1 se analizira u režimu visoke rezolucije). Podvučene KDvrednsoti se prema tome eksperimentalno određuju merenjem ken. Procenjuje se da su druge konvrednsoti iste kao M25. n.d. = nije determinisano

[0131] Za određivanje epitopa na humanom α-CGRP koje prepoznaje antitelo G1, koriste se Biacore testovi koji se opisuju u tekstu iznad. Humani α-CGRP se kupuje kao N-biotinilovana verzija da se omogudi njegovo visoko-afiniteno hvatanje pomodu SA senzorskog čipa. Određuje se vezivanje Fab fragmenta G1 za humani α-CGRP na čipu u odsustvu ili prisustvu CGRP peptida. Obično, 2000:1 mol peptida/rastvoru Fab (npr., 10 µM peptida u 50nM G1 Fab) se injektira kroz humani α-CGRP na čipu. Slika 6 pokazuje procenat vezivanja koje je blokirano kompetitorskim peptidom. Podaci koji su prikazani na Slici 6 ukazuju na to da peptidi koji blokiraju 100% vezivanje Fab-a G1 za humani α-CGRP su 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37), i K35M (19-37) humanog α-CGRP; 1-37 of β-CGRP (WT); 1-37 α-CGRP pacova (WT); i 1-37 β-CORP pacova (WT). Svi ovi peptidi su amidovani na C-kraju. Peptidi F37A (19-37) i 19-37 (zadnji nije amidovan na C-kraju) humanog α-CGRP takođe blokiraju oko 80% do 90% vezivanja G1 Fab-a za humani α-CGRP. Peptid 1-36 (nije amidovan na C-kraju) humanog α-CGRP blokiraju oko 40% vezivanja G1 Fab-a za humani α-CGRP. Peptidni fragment 19-36 (amidovan na C-kraju) humanog α-CGRP; peptidni fragmenti 1-13 i 1-19 humanog α-CGRP (od kojih nijedan nije amidovan na C-kraju); i humani amilin, kalcitonin, i adrenomedulin (svi su amidovani na C-kraju) nisu u kompeticiji sa vezivanjem G1 Fa-a za humani α-CGRP na čipu. Ovi podaci pokazuju da G1 cilja C-terminalni epitop CGRP-a i da su oba identiteta terminalnog ostatka (F37) i njegova amindacija važni za vezivanje.

[0132] Takođe se određuju afiniteti vezivanja G1 Fab-a za varijante humanog α-CGRP (na 37°C). Tabela 7 ispod pokazuje afinitete kao što se meri direktno titriranjem G1 Fab-a preko N-biotinilovanog humanog α-CGRP i varijanti na čipu. Podaci uTabeli 7 ukazuju na to da se antitelo G1 vezuje za C-terminalni epitope sa F37 i G33 koji su najvažniji ostaci. G1 se ne vezuje za CGRP kada se dodatni ostatak aminokiseline (alanin) dodaje na C-terminalni kraj (koji je amidovan).

Tabela 7. Afiniteti vezivanja G1 Fab-a za humani α-CGRP i varijante koji su mereni na 37°C (videti Tabelu 4 za njihove sekvence aminokiselina)

4

[0133] Gornji podaci ukazuju na to da se epitop za koji se G1 vezuje nalazi na C-terminalnom kraju huamnog α-CGRP, i amiinokiseline 33 i 37 humanog α-CGRP su važne za vezivanje antitela G1. Takođe, amidacija ostatka F37 je važna za vezivanje.

Primer 5: Efekat anti-CGRP antagonističkog antitela G1 na vazodilataciju kože koja je indukovana stimulacijom nerva safenusa pacova

[0134] Da bi se ispitala antagonistička aktivnost anti-CGRP antitela G1, ispituje se efekat antitela na vazodilataciju kože stimulacijom nerva safenusa pacovaupotrebom odela pacova koji se opisuje u Primeru 3. Ukratka, pacovi se drže u anesteziji u 2% izofluranom. Bretilijum tozilat (30 mg/kg, dato i.v.) se daje na početku eksperimenta da se minimizuje vazokonstrikcija zbog pratede stimulacije simpatičkih vlakana nerva safenusa. Temperatura tela se održava na 37°C korišdenjem rektalne probe koja je termostatički povezana sa grajnim pokrivačem koji se temperaturno kontroliše. Nerv safenus desnog zadnjeg ekstremiteta se hirurški izlaže, seče proksimalno i pokriva plastičnim omotačem da bi se sprečilo isušivanje. Laserska Doppler proba se postavlja preko medio-dorzalne strane kože šape, koji predstavlja region koji je inervisan safenoznim nervom. Protok krvi u koži, koji se meri kao fluks krvnih delija, se prati sa laserskim Doppler metrom protoka. U eksperimentima za određivanja efekata antitela u okviru dva sata od injekcije trideset do četrdeset i pet minuta nakon injekcije bretilijum tozilata, kada je stabilan osnovni fluks (manje od 5% varijacije) uspostavljen za najmanje 5 min, nerv se postavlja preko bipolarnih elektroda od platine i električno stimuliše (2Hz, 10V, 1 ms, za 30 sec) i ponovo 20 minuta kasnije. Srednja vrednsot odgovora fluksa protoka krvi za ove dve stimulacije se koristi za upostavljanje odgovora osnovnog nivoa (vreme 0) na električnu stimulaciju. Antitelo G1 (1 mg/kg ili 10 mg/kg) ili nosač (PBS sa 0,01% Tween 20 jednake zapremine sa 10 mg/kg G1) se zatim daju intravenozno (i.v.). Nerv se zatim stimuliše (2Hz, 10V, 1 ms, 30 sek) na 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela. Životinje se drže pod anestezijom u periodu od približno tri sata. Ukupna promena protoka krvi u koži se procenjuje površinom koja se nalazi ispod krive fluksa u vremenu (AUC, koji je jednak promeni u fluksu pomnoženoj sa promenom u vremenu) za svaki odgovor fluksa na stimulacij električnim pulsem.

[0135] Kao što je prikazano n Slici 7, povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom električnih pulseva na safenozni nerv je značajno inhibirano prisustvom antitela G1 na 1 mg/kg (dato i.v.) u poređenju sa nosačem, kada je safenozni nerv električno stimulisan na 90 min nakon davanja antitela. Povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom električnih pulseva na safenozni nerv je značajno inhibirano prisustvom antitela G1 na 10 mg/kg (dato i.v.) u poređenju sa nosačem, kada je safenozni nerv električno stimulisan na 90 minuta i 120 minut nakon davanja antitela.

[0136] U eksperimentima za određivanje efekata antitela u dužim vremenskim tačkama safenoznog testa, pacovima je data injekcija i.v. sa naznačenim dozama antitela 24 časova ili 7 dana pre pripreme životinje za stimulaciju safenoznog nerva kao što se opisuje u tekstu ispod. U ovim eksperimentima je mogude uspostaviti odnovni odgovor kod individualnih pacova na stimulaciju električnim pulsiranjem pre doziranja, tako da se tretirane grupe porede sa životinjama koje su dozirane nosačem (PBS, 0,01% Tween 20) 24 časova ili 7 dana.

[0137] Kao što je prikazano na Slikama 8A i 8B protok krvi koji je povedan u dorzomedijalnoj koži šape koji je porenut stimulacijom safenoznog nerva je značajno inhibiran u grupama koje su dozirane sa ili 10 mg/kg ili 3 mg/kg G1 na ili 24 časova ili 7 dana pre stimulacije u pređenju sa grupama koje sadrže nosač koje su dozirane u istim vremenskim tačkama.

[0138] Slika 8C predstavlja analizu uklapanja krive koja se primenjuje na podatke doznog odgovora koji su predstavljeni na Slikama 8A i 8B za definisanje doze koja je neophodna za 50% maksimalni efekat (EC50). EC50na 24 časova je 1,3 mg/kg i EC50na 7 dana je nešto niži (0,8mg/kg).

Primer 6: Akutni efekat anti-CGRP antagonističkog G1 antitela u testu duralne arterije (zatvorenom kranijanlnom prozoru)

[0139] Model zatvorenog kranijalnog prozora: Svrha ovog eksperimenta je da se odredi akutni efekat anti-CGRP antagonističkih antitela i da se poredi sa akutinim efektom antagonista CGRP receptora BIBN4096BS. Eksperimenti se izvode kao što se prethodno opisuje (Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518-24 (1997)) sa modifikacijama koje slede. Sprague Dawley pacovi (300-400g) su anestezirani 70mg/kg i.p. sa pentobarbitalom. Anesteziija se održava sa 20mg/kg/hr i.v. pentobarbitalom. Izvršena je kanulizacija pacova kroz jugularnu venu za isporuku svih lekova. Krvni pritisak se prati upotrebom probe (mikro-tip katetera, Millar Instrumenti) sa navojem kroz femoralnu arteriju u abdominalnu aortu. Pacovi su traheotomizovani i brzina disanja se održava na 75 udisaja po minuti u zapremini od 3,5 mL. Nakon fiksiranja glave u stereotaktičkom instrumentu i uklanjanja skalpa, prozor 2x6mm u parietalnoj površini koja je lateralna u odnosu na sagitalni nabor se dobija proređivanjem kosti sa zubnom bušilicom. Upotrebom mikromanipulatora, bipolarna eletroda od platine se postavlja na površinu i pokriva se sa teškim mineralnim uljem. Lateralno u odnosu na prozor elektrode kreira se drugi prozor veličine 5x6 mm i puni se sateškim mineralnim uljem kroz koji se kontinuirano prati dijametar grane srednje meningealne arterije (MMA) pomodu CCD kamere i video analizira dijametar (Living Systems). Pacovi odmaraju ne manje od 45 minuta nakon dobijanja. Uspostavlja se osnovni odgovor na to električnu stimulaciju (15 V, 10 hz, 0,5 ms pulseva, 30 sekundi) i zatim se pacovi doziraju i.v. sa ekperimentalnim jedinjenjem (10mg/kg mu7E9, 300mg/kg BIBN4096BS ili PBS 0,01%Tween 20). Dodatne električne stimulacije se izvode na 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 i 120 minuta nakon doziranja. Svi podaci se snimaju upotrebom čart softvera (ADInstruments).

[0140] Kao što je prikazano na Slici 9 mu7E9 na 10mg/kg značajno blokira MMA dilataciju koja j epobuđena stimulacijom električnog polja tokom 60 minuta nakon doziranja i održava efeakt kroz trajanje testa (120 minuta). Za poređenje BIBN4096BS blokira MMA dilataciju tokom 5 minuta doziranja ali efekat u potpunosti neastaje nakon 90 minuta. Veličina blokiranja može da se poredi između BIBN4096BS i mu7E9.

Primer 7: Hroničan efekat anti-CGRP antagonisitčkog G1 antitela u testu duralne arterije (zatvorenom kranijalnom prozoru)

[0141] Svrha ovog eksperimenta je da se odredi da li anti CGRP antitelo još uvek može da blokira elekrično stimulisanu MMA dilataciju 7 dana nakon doziranja. Priprema pacova je identična sa gore opisanim aktunim eksperimentom (Primer 6) uz izuzetke koji slede. Pacovima je data i.v. injekcija (10mg/kg, 3mg/kg ili 1mg/kg G1) 7 dana pre kreiranja zatvorenog kranijalnog prozora i stimulacije. Nije bilo mogude uspostaviti osnovni nivo odgovora dilatacije na električnu stimulaciju pre doziranja kao kod akutnog eksperimenta tako da se grupe antitela porede sa dilatacijom MMA u nosaču (PBS, 0,01% Tween 20) doziranoj kontrolnoj grupi. Nakon što je pacovima omogudeno da se odmore ne manje od 45 minuta dura je elekrično stimulisana u vremenskim intervalima od 30 minuta. Stimulacije su izvedene na 2,5V, 5V, 10V, 15V i 20V, sve na 10hz, 0.5 ms pulseva tokom 30 sekundi.

[0142] Kao što je prikazano na Slici 10 G1 na 10 mg/kg i 3 mg/kg značajno blokira MMA dilataciju koja je pobuđena elekričnom stimulacijom u opsegu od 10 do 20 volti. Ovi podaci pokazuju da G1 može da blokira električno stimulisanu MMA dilataciju do 7 dana nakon doziranja.

Primer 8: Model valunga odvikavanjam sa morfina

[0143] Model odvikavanja sa morfina kod pacova je upostavljeni model glodara za ispitivanje mehanizama koji obuhvataju vrude valunge u koji se javljaju u menopauzi (Sipe et al., Brain Res.

1028(2):191-202 (2004); Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998); Katovich et al., Brain Res. 494:85-94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). U osnovi, pacovi postaju zavisni od morfina implantacijom peleta koji sadrže morfin ispod kože. Nakon uspostavljanja zavisnosti životinjama se injekcijom daje nalokson (antagonist opioida) koji ih šalje u trenutno odvikavanje. Ovo odvikavanje je povezano sa povedanjem temperature u koži, smanjenjem telesne temperature, povedanjem brzine srčanog rada i povedanjem koncentracije luteinizirajudeg hormona u serumu. Sve promene su slične po veličini i vremenu sa onim što se događa u humnim vrudim valunzima (Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Dalje, ukoliko se pacovi tretiraju sa estradiolom pre indukovanja odvikavanja, simptomi vrudih valunga se smanjuju (Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998)). Zbog to se veruje da model odvikaavanja sa morfina imitira kliničke simptome vrudih valunga.

[0144] Ovariektomizirani pacovi su naručeni od Charles River Laboratories. Ne manje od 7 dana nakon ovarijektomije kreira se zavisnost od morfina subkutanom implantacijom peleta koji sadrže morfin (osnova morfina od 75 mg). Dva dana kasnije implantira se još 2 pelete. Slededeg dana pacovima je data intravenska injekcija sa ili 10 mg/kg 4901 [**] ili nosačem (PBS, 0,01% tween). Dva nakon drugog davanja peleta pacovi se anesteziraju upotrebom ketamina (90 mg/kg) i blago zadrže. Površinska temperatura termoelementa se postavlja na osnovu repa i rekatalni termoelement se koristi za merenje temperature jezgra. Podaci se snimaju upotrebom Chart software (ADInstruments). Nakon snimanja stabilne osnovne temperature 15 minuta, subkutano se injkecijom daje nalokson (1 mg/kg). Temperatura se u kontinuitetu snima slededih 60 minuta. Rezultati su prikazani na Slikama 11A i 11B.

Depozit biološkog materijala

[0145] Slededi materijali su deponovani kod American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA (ATCC):

Materijal Antitelo Br. ATCC Pristupni br Datum depozita pDb.CGRP.hFcGI G1 teški lanac PTA-6867 Jul 15, 2005 pEb.CGRP.hKGI G1 laki lanac PTA-6866 Jul 15, 2005

4

[0146] Vektor pEb.CGRP.hKGI je polinukleotid koji kodira varijabilni region G1 lakog lanca i kapa konstantni lanac lakog lanca; i vektor pDb.CGRP.hFcGI je polinukleotid koji kodira varijabilni region G1 teškog lanca i konstantni region teškog lanca IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanje amino sekvence u odnosu na divlji tip IgG2 sekvence; videti Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624).

[0147] Ovi depoziti se dobijaju u skaldu sa odredbama Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder (Budapest Treaty). Ovo osigurava održavanje vijabilne kulture depozita 30 godina od datuma deponovanja. Depozit de biti dostupan od ATCC pod uslovima Budapest Treaty, i predmet dogovra između Rinat Neuroscience Corp. i ATCC, što osigurava permanentnu i neogrančenu dostupnost potomstva kulture depozita javnosti nakon izdavanja odgovarajudeg U.S. patenta ili javnom otvaranju za bilo koju U.S. ili stanu prijavu patenta, koja god dolazi prvo, i osigurava dostupnost potomstva onom koji je određen od U.S. Commissioner of Patents and Trademarks da imaju pravo na osnovu 35 USC Section 122 and the Commissioner’s rules pursuant (uključujudi 37 CFR Section 1.14 sa posebnom referencom na 886 OG 638).

[0148] Prijavilac ove prijave pristaje da ukoliko kultura materijala depozita umre ili se izgubi ili se uništi nakon gajenja u kulturi pod stabilnim uslovima, materijali mogu da budu blagovremeno zamenjeni sa drugim ili istim. Dostupnost deponovanog materijala ne treba tumačiti kao dozvolu za primenu pronalaska koja je u suprotnosti sa pravima odobrenih u nadležnosti bilo koje vlade u skladu sa njenim zakonima o patentu.

Sekvence antitela

[0149]

sekvenca aminokiselina varijabilnog regiona G1 teškog lanca (SEQ ID NO:1)

sekvenca aminokiselina varijabilnog regiona G1 lakog lanca (SEQ ID NO:2)

G1 CDR H1 (produžen CDR) (SEQ ID NO:3)

GFTFSNYWIS

G1 CDR H2 (produžen CDR) (SEQ ID NO:4)

EIRSESDASATHYAEAVKG

G1 CDR H3 (SEQ ID NO:5)

YFDYGLAIQNY

G1 CDR L1 (SEQ ID NO:6)

KASKRVTTYVS

G1 CDR L2 (SEQ ID NO:7)

GASNRYL

G1 CDR L3 (SEQ ID NO:8)

SQSYNYPYT

nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona G1 teškog lanca (SEQ ID NO:9)

nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona G1 lakog lanca (SEQ ID NO:10)

4

puna sekvenca aminokiselina G1 teškog lanca antitela (uključujudi modifikovani IgG2 kao što se ovde opisuje) (SEQ ID NO:11)

puna sekvenca aminokiselina G1 lakog lanca antitela (SEQ ID NO:12)

Puna nukleotidna sekvenca G1 teškog lanca antitela (uključujudi modifikovani IgG2 kao što se ovde opisuje) (SEQ ID NO:13)

4

puna nukleotidna sekvenca antitela G1 lakog lanca (SEQ ID NO:14)

[0150] Poređenja sekvence aminokiselina CGRP čoveka i pacova (humani α-CGRP (SEQ ID NO:15); humani β-CGRP (SEQ ID NO:43); α-CGRP pacova (SEQ ID NO:41); i β-CGRP pacova (SEQ ID NO:44)):

NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGWKNNFVPTNVGSKAF-CONH2(humani α-CGRP) NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2(humani β-CGRP) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-CONH2(α-CGRP pacova) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-CONH2(β-CORP pacova)

LISTA SEKVENCI

[0151]

4

1

�

4

1

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Anti-CGRP antagonističko antitelo koje sadrži VH domen koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 1 i VL domen koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 2.

2. Antitelo prema zahtevu 1, koje sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 11 i laki lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 12.

3. Polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac i teški lanac antitela prema zahtevu 1 ili 2.

4. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 3, koji sadrži (i) SEQ ID NOs: 9 i 10 ili (ii) SEQ ID NOs:

13 i 14.

5. Vektor koji sadrži polinukleotid prema bilo kom od zahteva 3 do 4.

6. Vektor prema zahtevu 5, gde je vektor deponovan kao ATCC Br. PTA-6867 ili ATCC Br. PTA-6866.

7. Delija domadina koja sadrži polinukleotid prema bilo kom od zahteva 3 do 4 ili vektor prema bilo kojim od zahteva 5 ili 6.

8. Postupak dobijanja antitela prema bilo kom prethodnom zahtevu, koji sadrži korake eksprimiranja polinukleotida prema bilo kom od zahteva 3 do 4 ili vektora prema bilo kojim od zahteva 5 ili 6 u deliji domadina i (b) i po potrebi regeneraciju i/ili izolovanje antitela ili njegovog fragmenta.

4