RS57207B1 - Jedinjenja (tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-ila kao dvostruko delujući h1 inverzni agonisti/5-ht2a antagonisti - Google Patents

Description

Opis

[0001] Histamin igra važnu ulogu u različitim fiziološkim procesima svojom interakcijom sa najmanje četiri različita G-protein udvojena receptora, H1-H4 receptora. U CNS, H1 receptori igraju ključnu ulogu u regulaciji ciklusa spavanja a poznato je da H1 antagonisti/inverzni agonisti indukuju pospanost.

[0002] Isto tako, serotonin igra važnu ulogu u različitim fiziološkim procesima interakcijom sa najmanje četrnaest različitih G-protein udvojenih receptora. Modulacija 5-HT2Areceptora u CNS igra ključnu ulogu u regulaciji ciklusa spavanja a pokazano je da 5-HT2Aantagonisti poboljšavaju najdublji deo sna i održavaju tok spavanja kod pacijenata sa nesanicom.

[0003] Jedinjenja koja imaju aktivnost H1 ili 5-HT2Ainverznog agonista ili antagonista su korišćena u tretmanu nesanice (na primer doksepin i trazodon, tim redom) i ispoljavali su značajne farmakološke efekte u studijama sna kod životinja. Međutim, sada na tržištu nisu raspoloživi dvostruko delujući H1/5-HT2Ainverzni agonisti/antagonisti.

[0004] WO 2007/022068 opisuje neka supstituisana (tieno[2,3-b][1,5]benzodiazepin-4-il)piperazin-1-il i (tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il jedinjenja za lečenje poremećaja spavanja.

[0005] Ovaj pronalazak obezbeđuje 3-[4-(2-hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatnu kiselinu i njene farmaceutski prihvatljive soli, koja ima potenciju inverznog agonista za H1 receptor, visoku potenciju antagonista za 5-HT2Areceptor i dobru selektivnost za ove receptore, posebno u odnosu na druge histamin receptore, serotonin receptore i druge fiziološki relevantne receptore, posebno u odnosu na 5-HT2Creceptor, GABAAreceptor, muskarinske receptore, dopaminergične receptore, adrenergične receptore i hERG kanal. Ova jedinjenja preko životinjskih modela takođe pokazuju da mogu da budu korisna za tretman poremećaja spavanja koje karakteriše slabo održavanje sna. Kao takva, veruje se da su jedinjenja korisna za tretman poremećaja spavanja koje karakteriše latencija spavanja ili slabo održavanje sna ili oba, kao što je tretman nesanice, kao na primer, hronične ili prolazne primarne nesanice, ili hronične ili prolazne sekundarne nesanice, ili obe. U primere sekundarne nesanice spadaju, ali se ne ograničavaju samo na, nesanica povezana sa depresivnim poremećajima (na primer, major depresivni poremećaj, distimija i/ili ciklotimija), nesanica povezana sa anksioznim poremećajima (na primer generalizovani anksiozni poremećaj i/ili socijalna fobija), nesanica povezana sa bolom (na primer fibromialgija, hronični bol kostiju ili zglobova, kao što je bol povezan sa inflamatornim artritisom ili osteoartritisom ili dijabetični neuropatični bol), nesanica povezana sa alergijskim reakcijama (na primer alergijska astma, pruritis, rinitis, kongestija, itd.), nesanica povezana sa poremećajima pluća ili disajnih puteva (na primer sa opstruktivnom spavačkom apneom, reaktivnom bolešću disajnih puteva, itd.), nesanica povezana sa psihijatrijskim poremećajima, demencijom, i/ili neurodegenerativnim bolestima, i/ili nesanica povezana sa poremećajem cirkadijalnog ritma spavanja (na primer poremećaj spavanja zbog rada u smenama, jet lag poremećajem, poremećajem odložene faze spavanja, poremećajem rane faze spavanja i sindroma poremećaja dnevno-noćnog ritma budnosti i sna, itd.).

[0006] Isto tako, jedinjenja iz ovog pronalaska pokazuju potenciju efekta na fazu sna bez brzog kretanja očiju (NREM san) kada se primene zajedno sa selektivnim inhibitorima ponovnog preuzimanja serotonina.

[0007] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. To jest da kažemo 3-[4-(2-hlor-8-metiltieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetilpropanoatnu kiselinu ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

[0008] U narednom aspektu pronalaska ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja uključuje jedinjenje Formule I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijentom. Osim toga, ovaj aspekt pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za lečenje nesanice, kao na primer nesanice koju karakteriše produžena latencija sna ili slabo održavanje sna ili oba, kao na primer primarna nesanica, jet lag, poremećaj spavanja zbog smenskog rada, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja i/ili poremećaj dnevno-noćnog ritma budnosti i sna, uključujući jedinjenje Formule I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljih eksicipijenata, nosača ili razblaživača.

[0009] Naredno otelotvorenje ovog aspekta pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje u skladu sa Formulom I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, ekscipijentom ili razblaživačem i opciono drugim terapeutskim sastojcima. U još jednom otelotvorenju ovog aspekta pronalaska, farmaceutska kompozicija dalje uključuje drugo terapeutsko sredstvo koje je inhibitor ponovnog preuzimanja serotonina, kao što su, na primer, citalopram, paroksetin, fluoksetin i/ili fluvokestin.

[0010] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje za upotrebu u postupku lečenja nesanice, kao što je na primer nesanica koju karakteriše produžena latencija sna ili slabo održavanje sna ili oba, kao na primer primarna nesanica, jet lag, poremećaj spavanja zbog smenskog rada, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja i/ili poremećaj dnevno-noćnog ritma budnosti i sna kod sisara koji uključuje primenu na sisaru kome je potreban ovakav tretman efektivne količine jedinjenja Formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. U narednom otelotvorenju ovog aspekta pronalaska, jedinjenje se koristi u postupku koji dalje uključuje primenu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji, drugog terapeutskog sredstva koje je inhibitor ponovnog preuzimanja serotonina, kao što su na primer, citalopram, paroksetin, fluoksetin i/ili fluvokestin. U jednom određenom otelotvorenju ovih jedinjenja za upotrebu u tretmanu, sisar je čovek.

[0011] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje Formule I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u terapiji. U okviru ovog aspekta, pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u tretmanu nesanice. U narednim otelotvorenjima, nesanica se karakteriše produženom latencijom sna ili slabim održavanjem sna ili oba, kao na primer primarna nesanica, jet lag, poremećaj spavanja zbog smenskog rada, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja i/ili poremećaj dnevno-noćnog ritma budnosti i sna. U narednom otelotvorenju ovog aspekta, pronalazak obezbeđuje jedinjenje u skladu sa Formulom I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu kombinaciji sa inhibitorom ponovnog preuzimanja serotonina, kao što su na primer citalopram, paroksetin, fluoksetin i/ili fluvokestin, u tretmanu nesanice. Jedno posebno otelotvorenje ovog aspekta pronalaska je upotreba na sisarima, posebno ljudima.

[0012] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, u proizvodnji medikamenta za tretman nesanice, kao što je na primer, primarna nesanica koju karakteriše produžena latencija sna ili slabo održavanje sna ili oba, kao na primer primarna nesanica, jet lag, poremećaj spavanja zbog smenskog rada, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja i/ili poremećaj dnevnonoćnog ritma budnosti i sna. Naredno otelotvorenje ovog aspekta pronalaska obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i drugog terapeutskog sredstva koje je inhibitor ponovnog preuzimanja serotonina, kao što su na primer, citalopram, paroksetin, fluoksetin i/ili fluvokestin, u proizvodnji medikamenta za tretman nesanice, kao što je na primer, nesanica koju karakteriše produžena latencija sna ili slabo održavanje sna ili oba, kao na primer primarna nesanica, jet lag, poremećaj spavanja zbog smenskog rada, poremećaj odložene faze spavanja, poremećaj rane faze spavanja i/ili poremećaj dnevno-noćnog ritma budnosti i sna.

[0013] Da bude jasnije, u celoj prijavi je korišćeno sledeće obeležavanje strukture tricikličnog prstena:

[0014] Jedinjenje iz ovog pronalaska ima bazne i kisele delove i u skladu sa tim reaguje sa brojnim organskim i neorganskim kiselinama i bazama da se formiraju farmaceutski prihvatljive soli. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja iz ovog pronalaska su obuhvaćene okvirom ove prijave. Kako se ovde koristi, naziv "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na bilo koju so jedinjenja iz pronalaska koja je potpuno ne-toksična za žive organizme. U ovakve soli spadaju soli navedene u Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977), što je poznato stručnjaku sa iskustvom u praksi.

[0015] Ovde korišćene skraćenice se definišu kako sledi:

"DMEM" označava Dulbekov minimum Eagle-ove podloge.

"DMSO" označava dimetil sulfoksid.

"EDTA" označava etilendiamintetrasirćetnu kiselinu.

"FBS" označava serum fetusa govečeta.

"HEPES" označava 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonsku kiselinu.

"HPLC" označava visoko efikasnu tečnu hromatografiju.

"h." označava sat.

"IC50" označava koncentraciju pri kojoj se dostiže 50% maksimalne inhibicije.

"LC-MS" označava HPLC-masenu spektrografiju.

"MeOH" označava metanol.

"min." označava minut.

"MS" označava masenu spektroskopiju.

"MS (ES+)" označava masenu spektroskopiju pomoću elektrosprej jonizacije.

"NMR" označava nuklearnu magnetnu rezonancu.

"THF" označava tetrahidrofuran.

Opšta hemija

[0016] Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se izarade u skladu sa narednim primerima sinteze.

Izrada 1. 2,5-dihlortiofen-3-karbonil hlorid

[0017]

[0018] U suspenziju 2,5-dihlor-tiofen-3-karboksilne kiseline (49.7 g; 252.23 mmola; 1.00 equiv) u dihlormetanu (500 mL) se doda dimetilformamid (0.5 mL; 6.47 mmola) a nakon toga 2 M rastvor oksalil hlorida u dihlormetanu (138.73 mL; 277.45 mmola; 1.1 equiv) u toku 1.5 h. (oslobođeni gas se propušta kroz kaustični rastvor). Dobijeni bistar rastvor se meša 1 h na sobnoj temperaturi sve dok ne prestane izdvajanje gasa i dok se pomoću LCMS ne utvrdi da je reakcija završena (uzorak se neutrališe u smeši 7 M NH3/MeOH za preaćenje reakcije) MS (m/z): = 195.9, 197.9 (M+H)<+>za odgovarajući primarni amid. Uparavanjem do sušenja dobija se naslovljeni međuproizvod kao braon ulje (55g, 252 mmol, kvantitativno).

Izrada 2. 2,5-dihlor-N-(2-hidroksi-4-metil-fenil)tiofen-3-karboksamid

[0019]

[0020] U rastvor 6-amino-m-krezola (34.14 g; 277.20 mmola; 1.1 equiv) u THF (450 mL) se doda piridin (40.76 mL; 504.00 mmola; 2 equiv), a nakon toga rastvor 2,5-dihlortiofen-3-karbonil hlorida (54.30 g, 252 mmola, 1.00 equiv) u THF (250 mL) u toku 30 min koristeći ledeno kupatilo da se temperatura održi na 15-20°C. Dobijena gusta smeša se meša 1 h na sobnoj temperaturi da se pomoću LC-MS utvrdi da je aminofenol u potpunosti utrošen. Sipa se u smešu 2 M vodenog rastvora HCl (500 ml) i leda (250 ml) uz mešanje. Dobijena bež čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem, dobro ispere sa vodom i suši na vazduhu. MS (m/z): = 301.84, 303.94 (M+H)<+>. Suši se u vakuumskoj pećnici na 40°C preko P2O5u toku noći da se dobije naslovljeni međuproizvod (84.5g, procenjeno kvantitativno).

Izrada 3. 2-hlor-8-metil-5H-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-on

[0021]

[0022] U dobro izmešanu suspenziju 2,5-dihlor-N-(2-hidroksi-4-metilfenil)tiofen-3-karboksamida (76.15 g; 252 mmola; 1.00 equiv) u dimetil sulfoksidu (450 mL) se doda kalijum karbonat (38.31 g; 277.20 mmola; 1.1 equiv) i smeša zagreva 4.5 h na 100-110°C i pomoću LCMS se utvrdi da je konverzija završena. Ostavi se da se ohladi na sobnu temperaturu i polako se doda u dve odvojene posude koje sadrže 1 M vodeni rastvor hlorovodonične kiseline (500 ml) uz uočavanje izdvajanja gasa. Meša se 0.5 h na sobnoj temperaturi i dobijena tamno siva čvrsta supstanca sakupi filtriranjem. Ispere se po redu sa vodom, nakon toga sa malom količinom etanola, a nakon toga sa malom količinom dietil etra. Suši se u vakuumskoj pećnici na 45°C u toku noći da se dobije naslovljeni međuproizvod (58.5g, 87%). MS (m/z): = 265.99 (M+H)<+>.

Izrada 4. 2,4-dihlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin

[0023]

[0024] Boca sa okruglim dnom zapremine 1 L se napuni sa metoksibenzenom (225 mL, 5V), 2-hlor-8-metil-5H-tieno[2,3b][1,5]benzoksazepin-4-onom (45 g; 169.4 mmola; 1 equiv) i N,N-dimetilanilinom (47.2 g; 389.5 mmola; 2.3 equiv). Zagreje se na 60°C i u kapima se u toku 0.5 h dodaje fosforil hlorid (85.7 g; 558.9 mmola; 3.3 equiv). Zagreje se na 100°C i meša 2 h dok se TLC analizom ne utvrdi da je reakcija završena. Ohladi se na 40-60°C i upari da se dobije naslovljeni međuproizvod kao tamno braon čvrsta supstanca (123.1 g, 433.2 mmola, 256% prinos nekorigovan ispitivanjem). MS (m/z): 283.8 (M+H).

Izrada 5. Metil 3-[4-(2-hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetilpropanoat

[0025]

[0026] Boca sa okruglim dnom zapremine 1 L se napuni sa 2,4-dihlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepinom (121.1 g; 169.4 mmola; 1.0 equiv), nakon toga acetonitrilom (600 mL, 12.5V), a nakon toga kalijum karbonatom (119.4 g; 863.9 mmola) u jednoj porciji. Meša se 10-20 min i nakon toga se doda metil 2,2-dimetil-3-(piperazin-1-il)propanoat dihidrohlorid (55.54 g; 203.3 mmola; 1.2 equiv) u jednoj porciji. Zagreje se na 80°C i meša 30 h. Smeša se koncentruje do sušenja pod vakuumom, nakon toga se u smešu dodaju etil acetat (1920 mL, 40V) i voda (1920 mL, 40V). Smeša se meša, filtrira i nakon toga izdvoji vodena faza i ekstrahuje sa etil acetatom (960 mL, 20V). Organske faze se kombinuju i isperu sa vodom (960 mL 32) i slanim rastvorom (200 mL, 4V). Koncentruju se i prečiste na koloni silika gela (petrol etar/etil acetat (0 to 10%)) da se dobije naslovljeni međuproizvod kao žuta čvrsta supstanca (55.4 g, 123.7 mmola, 95.8% čistoće, 73.0% prinos nekorigovan ispitivanjem). MS (m/z): 448.2 (M+H).<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.03 (m, 1H), 6.91 (m, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 3.67(s, 3H), 3.47 (m, 4H), 2.58-2.54 (m, 6H), 2.28 (s, 3H), 1.19 (s, 6H).

Primer 1. 3-[4-(2-Hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatna kiselina

[0027]

[0028] Boca sa okruglim dnom zapremine 2 L se napuni sa metil 3-[4-(2-hlor-8-metiltieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatom (70.3 g; 156.9 mmola; 1.0 equiv), izopropil alkoholom (469 mL; 6.67V) i vodom (469 mL; 6.67V). Nakon toga se doda natrijum hidroksid (18.83g; 470.8 mmola; 3.0 equiv) i smeša zagreva na 80°C uz 3 h mešanja. Ohladi se na 20°C i neutrališe do pH 7 sa 5 M vodenim rastvorom HCl. Najveći deo izopropil alkohola se upari a nakon toga pH podesi na 6-7 sa 5 M vodenim rastvorom HCl i koncentruje da se uklone rastvarači. Dodaju se etil acetat (2800 mL, 40V) i voda (2800 mL, 40V), nakon toga se meša 30 min a zatim filtrira da se dobije sirovi produkt. Vodena faza se izdvoji i ekstrahuje sa etil acetatom (700 mL, 10V). Etil acetat slojevi se kombinuju i upare da se dobije sirovi produkt. Sirovi produkt i izopropil alkohol (500 mL, 7V) se sipaju u bocu zapremine 1 L sa okruglim dnom. Zagreje se na 80°C i meša 1 h a nakon toga polako ohladi na 20°C. Pogača se filtrira i ispere sa izopropil alkoholom (70 mL, 1 V) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (60.4 g; 138.6 mmola; 99.3% čistoće, 88.3% prinos korigovan ispitivanjem). MS (m/z): 434.0 (M+H).<1>H NMR (400MHz, CDCl3): δ 7.01 (m, 1H), 6.94 (m, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 3.64 (brs, 4H), 2.86 (brs, 4H), 2.60 (s, 2H), 2.29 (s, 3H), 1.26 (s, 6H).13C NMR (400MHz, CDCl3): δ 178.57, 161.10, 154.37, 152.00, 136.63, 135.64, 127.95, 127.14, 121.88, 121.20, 120.14, 118.58, 65.70, 54.46, 46.45, 41.54, 25.34, 20.70.

Primer 2. 3-[4-(2-hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatna kiselina

[0029]

1

[0030] U suspenziju metil 3-[4-(2-hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoata (22.5 g; 50.23 mmola; 1.00 equiv) u smeši izopropil alkohola (150 mL; 1.96 mola) i vode (150 mL) se doda natrijum hidroksid (6.03 g; 150.68 mmola; 3 equiv) i smeša zagreva 2.5 h na 80°C (uljano kupatilo) da se pomoću LC-MS registruje završetak konverzije. Ostavi se da se ohladi i neutrališe do pH 7 sa 5 M vodenim rastvorom HCl. Najveći deo izopropil alkohola se upari da se dobije fini precipitat. pH se ponovo podesi na pH 7 sa 5 M vodenim rastvorom HCl. Boca se ostavi 0.5 h u frižideru a bledo žuta čvrsta supstanca se nakon toga sakupi filtriranjem i ispere sa vodom. Suši se u vakuumskoj pećnici na 45°C preko P2O5u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje (20.6g, 95%). MS (m/z): = 434.1 (M+H)<+>.

Primer 3. 3-[4-(2-hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatna kiselina dihidrohlorid

[0031]

[0032] 3-[4-(2-hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetilpropanoatna kiselina (5.8 g; 13.3 mmol) se prevede u žitku masu u maloj količini acetonitrila, a nakon toga se doda 4 M rastvor vodonik hlorida u dioksanu (14.06 g; 53.57 mmola; 4 equiv) i dobijeni rastvor upari do sušenja. Triturira se sa malom količinom dietil etra, sakupi filtriranjem i suši u vakuumskoj pećnici da se dobije naslovljeno jedinjenje (4.74g, 70%); MS (m/z): = 434.1 (M+H)<+>.

Dodatno prečišćavanje dihidrohloridne soli

[0033] Uzme se 3-[4-(2-hlor-8-metil-tieno[2,3-b][1,5]benzoksazepin-4-il)piperazin-1-il]-2,2-dimetil-propanoatna kiselina dihidrohlorid (7.5 g; 14.80 mmola; 1.00 equiv) i zagreva u etanolu (150 ml) uz sonikaciju dok se ne dobije kompletna smeša. Upari se do sušenja.

Triturira se sa malom količinom dietil etra i bež čvrsta supstanca sakupi filtriranjem. Samelje se do finog praha i suši u vakuumskoj pećnici 2 noći na 50°C da se dobije naslovljeno jedinjenje (7.14g, 95%). MS (m/z): = 434.1 (M+H)<+>.

[0034] Rezultati iz literature (Morairty SR, Hedley L, Flores J, Martin R, Kilduff TS. (2008) Selective 5-HT2A i 5-HT6 receptor antagonists promote sleep in rats. Sleep 31, 34-44.; i Barbier, A.J., i Bradbury, M.J., Histaminrgic Control of Sleep-Wake Cycles: Recent Therapeutic Advances for Sleep i Wake Dizorders, CNS & Neurological Dizorders Drug Targets, vol 6, pg. 31-43 (2007)) i rezulati dobijeni u ne-kliničkim studijama na životinjama podržavaju ulogu za dvostruku aktivnost H1 inverznih agonista/5-HT2Aantagonista u tretmanu nesanice i u simptomatičnom tretmanu nesanice povezane sa drugim poremećajima kao što su depresivni poremećaji, anksiozni poremećaji, bol, alergije, poremećaji pluća ili disajnih puteva, psihijatrijski poremećaji, demencija i/ili neurodegenerativne bolesti i/ili poremećaji cirkadijalnog ritma spavanja. Posebno, nađeno je da su neke dvostruke aktivnost H1 inverznih agonista / 5-HT2Aantagonista efikasne u povećanju ukupnog vremena spavanja praćenjem EEG glodara bez disproporcionalne ili klinički relevantne hipoaktivnosti, smanjenju REM sna ili hiperpospanosti.

[0035] Kako bi dalje pokazali karakteristike jedinjenja iz ovog pronalaska, mogu da se izvrše naredna in vitro i in vivo ispitivanja:

In vitro ispitivanja vezivanja i aktivnosti:

Analiza H1 kompetitivnog vezivanja

[0036] Eksperimenti vezivanja [3H]-Pirilamina se izvode u SPA (scintilatna proksimatna analiza) u formatu sa 96 otvora. Membrane korišćene u ovoj analizi su izrađene od HEK-293 ćelija u kojima se stabilno ekspresuje rekombinantni H1 receptor (humani). Inkubacija se započinje dodavanjem smeše WGA PVT SPA perlica (1mg/otvor, Perkin Elmer (MA, USA) RPNQ0001) i 3 µg membrana u puferu za analizu (67 mM Tris; pH 7.6) koji sadrži 3.5 nM [<3>H]-Pirilamina i različite koncentracije test jedinjenja (krive odgovora sa 10 tačaka koncentracije). Ne-specifično vezivanje je određeno u prisustvu 10 µM Triprolidina. Uzorci se inkubiraju 4 h na sobnoj temperaturi (22° C) i nakon toga očitavaju u Microbeta Trilux.

Analiza 5-HT2Akompetitivnog vezivanja

[0037] Eksperimenti vezivanja [3H]-Ketanserina se izvode u SPA u formatu sa 96 otvora. Korišćene membrane u ovoj analizi su izrađene od AV-12 ćelija u kojima se stabilno ekspresuje rekombinantni 5-HT2Areceptor (humani). Inkubacija se započinje dodavanjem smeše WGA YSi SPA perlica (1mg/otvor, Perkin Elmer (MA, USA), RPNQ0011) i 2 µg membrana u pufer za analizu (67 mM Tris, 0.5 mM EDTA; pH 7.6) koji sadrži 3.1 nM [3H]-Ketanserina i različite koncentracije test jedinjenja (krive odgovora sa 10 tačaka koncentracije). Ne-specifično vezivanje je određeno u prisustvu 20 µM 1-(1-Naftil) piperazina. Uzorci se inkubiraju 4 h na sobnoj temperaturi (22° C) i nakon toga očitavaju na Microbeta Trilux.

Analiza 5-HT2Ckompetitivnog vezivanja

[0038] Eksperimenti vezivanja [<125>I]-(6)DOI se izvode u SPA u formatu sa 96 otvora.

Korišćene membrane u ovoj analizi su izrađene od AV-12 ćelija u kojima se stabilno ekspresuje rekombinantni 5-HT2Creceptor (humani). Inkubacija se započinje dodavanjem smeše WGA PVT SPA perlica (0.5 mg/otvor, Perkin Elmer (MA, USA), RPNQ0001) i 2.5 µg membrana u pufer za analizu (50 mM Tris-HCl, 10 µM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 10 mM pargilin, 0.1% askorbinska kiselina, pH7.4) koji sadrži 0.2 nM [[<125>I]-(6)DOI i različite koncentracije test jedinjenja (krive odgovora sa 10 tačaka koncentracije). Ne-specifično vezivanje je određeno u prisustvu 20 µM 1-(1-Naftil) piperazina. Uzorci se inkubiraju 4 h na sobnoj temperaturi (22° C) i nakon toga očitavaju na Microbeta Trilux.

Analiza rezultata vezivanja

[0039] Krive se procenjuju pomoću ne-linearne logaritamske jednačine sa 4 parametra da se dobije koncentracija kompetitora koji dovodi do 50% inhibicije vezivanja radioliganda (IC50).

1

Konstante ravnotežne disocijacije (Ki) se izračunavaju po jednačini Ki= IC50/(1+L/Kd), gde L predstavlja koncentraciju radioliganda korišćenog u eksperimentu a Kdpredstavlja konstantu ravnotežne disocijacije radioliganda za receptor, određene iz standardnih analiza zasićenja ili eksperimenata kompeticije homologa. Objavljene vrednosti za Ki, kada su navedene n vrednosti, su pokazane kao geometrijska sredina ± prosečna standardna greška (SEM), sa brojem ponovljenih određivanja označenih sa n. Geometrijske sredine se izračunavaju po jednačini Geoprosek = 10^(prosek (log Ki1 log Ki2 ...log Kin)/kvadratni koren n).

GABAAantagonizam korišćenjem nativnih receptora u primarnim neuronalnim kulturama

[0040] Aktivnost jedinjenja na nativne GABAAreceptore je procenjena praćenjem kalcijum fluksa korišćenjem FLIPR® sistema u formatu 96 otvora (čitač ploča fluorometrijskih slika (FLIPR®, Molecular Devices). Ukratko, kortikalni embrionični neuroni su odvojeni od embriona E18 pacova i u optimalnoj gustini preneti u FLIPR® ploče sa 96 otvora crnih zidova, providnog dna, obloženih poli-D-lizinom. Nakon stavljanja kalcijum osetljive boje (Fluo4-AM, Molecular Devices) u ćelije, ćelije se potope u rastvor sa niskim sadržajem hlorida (hlorid zamenjen sa glukonatom). Pod ovim uslovima, aktivacija GABAAreceptora dovodi do isticanja jona hlorida (u pravcu hemijskog gradijenta) što za rezultat ima depolarizaciju membrane i samim tim aktivaciju naponski zavisnih kalcijumovih kanala (VGCCa). Beleži se ulaz kalcijuma kroz VGCCe i analizira offline korišćenjem FLIPR® sistema. Za farmakološku validaciju analize, beleže se krive odgovora na koncentraciju (CRC) za standardni agonist (GABA) i standardni antagonist (Gabazin). Određuju se svi efekti u CRC modalitetu u odnosu na fiksnu koncentraciju agonista GABA od 10 µM (ekvialent sa EC90GABA odgovora).

Postupci:

[0041] Efekti jedinjenja kao antagonista se kvantifikuju pomoću krive odgovora na dozu od 10 tačaka poređenjem pika fluorescentnih odgovora sa agonistom GABA u prisustvu i bez prisustva jedinjenja. Rezultat analize je definisan kao maksimalni odgovor dobijen sa GABA pri njegovoj prethodno određenoj EC90koncentraciji minus odgovor dobijen od koncentracije potpune inhibicije gabazina (50 µM). Efekti antagonista se izračunavaju kao procenat rezultata analize. Svi rezultati se izračunavaju kao relativne IC50vrednosti koristeći odgovarajući program sa logaritamskom krivom od četiri parametra (Prism Graphpad® 3.01). Antagonistički potencijal za sva jedinjenja se poredi sa gabazinom u tri ponavljanja za svaku seriju ispitivanja.

[0042] Pored toga, jedinjenja iz pronalaska mogu da se testiraju u analizi vezivanja i analizama funkcionalne aktivnosti dobro poznatim postupcima za druge fiziološki važne receptore, kao što su, ali bez ograničenja na, hERG kanal, drugi serotonin receptori (posebno 5-HT1B, 5-HT1Dreceptori, bez aktivnosti agonista na 5-HT2Breceptore, 5-HT2C, 5-HT5, 5-HT6i 5-HT7receptore), dopaminergični receptori (posebno D1, D2, i D3), GABAAreceptori, adrenergični receptori i transporteri monoamina.

[0043] Jedinjenja iz primera 1 i 13 su u osnovi testirana kako je prethodno opisano i nađeno je da imaju profil aktivnost kako je pokazano u Tabeli 1.

Tabela 1. Rezultati selektivnosti

1

(nastavlja se)

[0044] Prema tome, očekuje se da fiziološki relevantne doze jedinjenja iz pronalaska u suštini obezbede inhibiciju H1 i 5-HT2Areceptora in vivo, dok u suštini ne stupaju u interakciju sa drugim fiziološki relevantnim receptorima i zbog toga se očekuje da obezbede željenu farmakologiju uz izbegavanje neželjenih efekata povezanih sa aktivnošću koja nije cilj. U ovakve neželjene efekte spadaju, ali bez ograničenja na sledeće: aktivnost 5-HT2Cantagonista povezana sa tretmanom brzog porasta težine, aktivnost agonista 5-HT2Bpovezane sa valvulopatijom, modulacija hERG kanala povezana sa QT prolongiranjem i aktivnost antagonista GABAApovezana sa napadom padavice. Osim toga, interferencija sa fizologijom spavanje/budno stanje se izbegava selektivnošću u odnosu na dopamin receptore, druge serotonin receptore, adrenergične receptore i transportere monoamina.

[0045] Zauzimanje 5-HT2Areceptora: Zauzimanje receptora se ispituje da se pokaže aktivnost antagonista/inverznog agonista na 5-HT2Areceptor in vivo. Ukratko, mužjacima Sprague-Dawley pacova (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) težine približno 230-280 grama je omogućen neograničen pristup hrani i vodi sve do početka eksperimentalnog protokola u trajanju od 3-h.1 mg/kg ketanserina (ne-selektivni 5-HT2Aantagonist) se koristi kao pozitivna kontrola da se utvrdi validnost ispitivanja. Test jedinjenja ili kontrola se primenjuju oralnom gavažom u vehikulumu koji sadrži 20% hidroksipropil betaciklodekstrin. MDL 100907 ((R)-(+)-α-(2,3-Dimetoksifenil)-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-4-piperidinmetanol), selektivni 5-HT2Aantagonist, se koristi kao indikator. MDL 100907 se suspenduje u vodi sa 5 µl razblažene mlečne kiseline (1 mg/ml), razblaži do 6 µg/ml sa fiziološkim rastvorom i

1

primeni intravenski u zapremini od 1 mL/kg preko lateralne vene repa da se dobije indikator od 3 µg/kg. Na pacovima se primenjuje test jedinjenje, ketaserin ili vehikulum (N = 4), a nakon 1 h se intravenski primeni 3µg/kg doze indikatora MDL 100907. Smatra se da u vreme primene doze indikatora treba da se meri zauzetost receptora (RO). Petnaest minuta nakon primene doze indikatora, pacovi se žrtvuju cervikalnom dislokacijom. Uzimaju se uzorci plazme a uklone se uzorci frontalnog korteksa i cerebeluma. Nivo MDL 100907 indikatora se meri u svakom kortikalnom i cerebralnom uzorku. RO se izračunava postupkom jasno utvrđenog odnosa koji koristi region velike gustine receptora koji predstavlja ukupno vezivanje (frontalni korteks) uravnotežen sa oblašću bez ili sa veoma malim nivoom receptora (cerebelum). Ovaj region označen kao nulti region predstavlja ne-specifično vezivanje liganda probe. Nivo indikatora u odnosu na vehikulum u korteksu u odnosu na cerebelum predstavlja 0% zauzetosti. Odnos od 1 predstavlja 100% zauzetosti i postiže se kada su sva specifična vezivanja MDL 100907 indikatora za 5-HT2Areceptor blokirana. Srednji odnosi kortikalnog i cerebralnog indikatora za test jedinjenje prethodno tretirane grupe se linearno interpoliraju između odnosa nivoa indikatora kod životinja tretiranih vehikulumom (0% zauzetosti) i odnosa od 1 (100% zauzetosti) kako bi se odredio procenat 5-HT2ARO.

[0046] Analiza MDL 100907: Uzorci korteksa i cerebeluma se izmere i stave u konične centrifugalne kivete na led. U svaku kivetu se dodaju četiri zapremine (m/v) acetonitrila koji sadrži 0.1% mravlje kiseline. Uzorci se nakon toga homogenizuju i centrifugiraju 16 minuta na 14,000 OPM (21,920 x g). Supernatant se razblaži dodavanjem 100 - 900 µL sterilne vode u posudama na injektovanje HPLC za LC/MS/MS analize. Analiza MDL 100907 se izvodi pomoću Agilent modela 1200 HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) i na API 4000 masenom spektrometru. Hromatografsko razdvajanje je na 2.1 X 50 mm C18 koloni (Agilent oznaka dela 971700-907) sa mobilnom fazom koja se sastoji od 60% acetonitrila u vodi sa ukupnim sadržajem od 0.1% mravlje kiseline. Detekcija MDL 100907 se izvodi praćenjem prekursora da se dobije tranzicija jona sa masom do odnosa punjenja (m/z) od 374.2 do 123.0. Standardi se izrađuju dodavanjem poznatih količina analita u uzorke tkiva mozga od netretiranih pacova i postupanjem kako je prethodno opisano.

[0047] Statistički postupci: Krive za svaku studiju su dobijene prema logaritamskoj funkciji od 4 parametra sa početkom fiksiranim na 0% koristeći JMP® verziju 8.0 (SAS Institute Inc, Cary NC) a apsolutna ED50je izračunata pomoću softvera. Vrednosti su date kao srednje vrednosti, standardne greške i intervali 95% pouzdanosti. Jedinjenje iz Primera 3 je u osnovi

1

testirano kako je opisano i nađeno je da dostiže visoku zauzetost 5-HT2Areceptora sa ED50od 0.09 mg/kg.

[0048] H1 Inverzni agonizam: Za određivanje prirode inverznog agoniste jedinjenja iz ovog pronalaska, mere se njihovi efekti na nivoe Myo-Inositol 1 fosfata (IP1) u HEK293 ćelijama transfektovanih sa humanim rekombinantnim H1 receptorom (HEK293/hm H1 klon R-40). Ukratko, HEK293/hm H1 ćelije (klon R-40) se uzgajaju do ∼90% ispunjenosti (3:1 DMEM/F12, 5% FBS, 20 mM HEPES, G418500 µg/ml, 1% Pen/Strep/Glutamin) i sakupe na dan ispitivanja koristeći 1x tripsin/EDTA (PAA Pasching, Austria L11-003).35 µl ćelija (300K) se zaseje u polovinu ploča sa 96 otvora belog čvrstog dna (Corning, UK 3688) u puferu za stimulaciju (NaCl 146 mM, CaCl21 mM, KCl 4.2 mM, MgCl20.5 mM, glukoza 5.5 mM, HEPES 10 mM i LiCl 50 mM). Test jedinjenja se inicijalno rastvore u 100% DMSO pri 100x finalne koncentracije. Ovo se dalje razblaži do x2 finalne koncentracije za analizu u puferu za stimulaciju i u ćelije u ploči za analizu se nakon toga doda 35 µl ovog rastvora. Ćelije plus jedinjenje se inkubiraju 1.5 h na 37°C / 5% CO2a nakon toga se doda 15 µl svakog od reagensa kita za HTRF IP1 detekciju (CisBio 62P1APEC). Ploče sa ćelijama se inkubiraju još jedan sat na sobnoj temperaturi a nakon toga se meri akumulacija IP 1 (Envision plate reader, Perkin Elmer). Akumulacija IP1 (nM) se izračunava ekstrapolacijom sa standardne IP1 krive dobijene na dan ispitivanja. Vrednosti negativne efikasnosti su izražene u odnosu na pozitivnu kontrolu Tripelenamina (10 µM, Sigma, UK P5514).

Jedinjenje 3 je u osnovi testirano kako je opisano i nađeno je da potpuno zaustavlja konstitutivnu aktivnost (105% pri 1 µM i 85% pri 10 mM (n=2)).

[0049] Inhibicija aktivnosti drhtanja glave indukovane DOI: Aktivnost jedinjenja iz ovog pronalaska kao antagonista 5-HT2Areceptora in vivo je dalje pokazana njegovom sposobnošću da blokira aktivnost drhtanja glave indukovane 2,5-dimetoksi-4-jodamfetaminom, agonistom (DOI) 5-HT2Areceptora. (Videti na primer Bartoszyk GD, van Amsterdam C, Böttcher H, Seyfried CA. EMD 281014, novi selektivni antagonist serotonin 5-HT2A receptora. Eur J Pharmacol. 2003 473: 229-230.) Ukratko, mužjaci C57BL/6J miševa (20-25 g, Charles River) su smešteni u standardnim uslovima smeštaja (32 miša u velikom IVC kavezu, 07.00 do 19.00 faza svetlosti, konstantna temperatura (19-23°C) i vlažnost (50% /-10), hrana i voda po želji). Miševi su dobijali ili vehikulum (0.25% Metil celuloza), DOI (3 mg/kg u fiziološkom rastvoru) ili test jedinjenje u količini od 10mg/kg PO plus DOI (3 mg/kg u fiziološkom rastvoru). Test jedinjenja su pojedinačno procenjivana u grupama od četiri po eksperimentu sa n=4 za svako jedinjenje, zajedno sa vehikuklumom i DOI+vehikulum (n=8). U pripremnom

1

vremenu od 60 minuta, nakon test jedinjenja, miševi su primali ili vehikulum (fiziološki rastvor) ili 3 mg/kg DOI dat subkutano, a nakon toga smešteni u providne komore od akrilnog stakla za praćenje. Pet minuta nakon primene DOI ili vehikuluma broj vidljivo uočenih drhtanja glave ispoljenih kod svakog pojedinačnog miša se broji u toku 15 minuta. Rezultati su analizirani pomoću ANOVA i post-hoc Dunnet-ovog Testa. Jedinjenje iz Primera 3 je testirano u osnovi kako je opisano i nađeno je da 100% inhibira odgovor drhtanja glave indukovanog sa DOI u količini od 10 mg/kg.

[0050] Praćenje spavanja i ponašanja pacova: Jedinjenje iz ovog pronalaska je testirano na pacovima na sposobnost da poveća količinu spavanja ili smanji prekid spavanja ili oba bez neželjenih efekata kao što su inhibicija REM sna, umanjena spoznaja nakon buđenja i/ili ponavljajuća nesanica. Test životinje su kontinuirano praćene elektroencefalogramima (EEG), elektromiogramima (EMG) i načinom za merenje kumulativnog nonREM sna, kumulativnog ukupnog sna, prosečnog trajanja sna, najduže trajanje sna, ponavljajuće nesanice, inhibicije REM sna i intenzitet lokomotorne aktivnosti u toku budnog stanja. Postupci za ovakve studije su poznati u tehnici (videti na primer postupke opisane u Edgar DM, Seidel WF. Modafinil induces wakefulness without intensifying motor activity or subsequent rebound hypersomnolence in the rat. J Pharmacology & Experimental Therapeutics 1997; 283: 757-769; van Gelder RN, Edgar DM, Dement WC. Real-time automated sleep scoring: validation of a microcomputer-based system for mice. Sleep 1991, 14: 48-55; i Gross BA, Walsh CM, Turakhia AA, Booth V, Mashour GA, Poe GR. Open-source logic-based automated sleep scoring software using electrophysiological recordings in rats. J Neurosci Methods.2009; 184(1):10-8.) Studije su izvedene na sledeći način:

Priprema životinja. Odrasli mužjaci Wistar pacova (približno 270-300 g u vreme operacije) su hirurški pripremljeni za trajno beleženje EEG, EMG, i kretanja kako sledi: pacovima je hirurški ugrađen kranijalni implant koji se sastoji od četiri zavrtnja od nerđajućeg čelika za beleženje EEG (dva frontalno [3.9 mm ispred bregme i ±2.0 mm mediolateralno] i dva ocipitalno [6.4 mm iza bregme, ±5.5 mm mediolateralno) i sa dve žice od nerđajućeg čelika obložene teflonom za beleženje EMG (postavljene ispod potiljačnih trapezoidnih mišića). Svi završeci su zalemljeni za minijaturni konektor (Microtech, Boothwyn, PA) pre operacije. Kompletan implant je pričvršen za lobanju kombinacijom zavrtnja od nerđajućeg čelika za beleženje EEG, cijanoakrilata nanetog između konektora implanta i lobanje i zubarskog akrila. Lokomotorna aktivnost je

1

praćena preko minijaturnog prijemnika (Minimitter PDT4000G, Philips Respironics, Bend, OR) hirurški smeštenog u abdomen. Najmanje 3 nedelje je ostavljeno za oporavak.

[0051] Registrovanje sredine. Svaki pacov je pojedinačno smešten unutar mikroizolovanog kaveza modifikovanog sa ubačenim polikarbonatnim pokretljivim filter poklopcem da se omogući više vertikalnog prostora. Fleksibilni kabl koji minimalno ograničava kretanje je na jednom kraju vezan za komutator fiksiran na vrhu kaveza a drugim krajem za kranijalni implant životinje. Svaki kavez je smešten u odvojeni, ventilirani deo komore od nerđajućeg čelika u kojoj se beleži stanje spavanja-budnosti. Hrana i voda su raspoloživi po želji a temperatura sredine se održava na približno 23±1°C. U toku cele studije se održava 24-časovni ciklus svetlo-mrak (LD 12:12) koristeći fluorescentno svetlo. Prosečna relativna vlažnost je približno 50%. Životinje se ne uznemiravaju najmanje 3 h pre i nakon svakog tretmana.

[0052] Oblikovanje studije i doziranje. Vehikulum (placebo, metilceluloza 15 centipoaza 0.25% u vodi) ili jedna od vrednosti doze test jedinjenja se primenjuju oralno u količini od 1 mL/kg po pseudo-slučajnom uzorku tako da ni jedan pacov ne primi isti tretman dva puta i da ni jedan pacov ne primi više od dva od 8 tretmana u bilo kojoj studiji. Svaki pacov se pomeri iz svog kaveza približno jedan minut da se izmeri i tretira. Ostavi se period od najmanje 6 dana za "skidanje" pre i nakon svakog tretmana.

[0053] Uzimanje rezultata. Razlika između spavanja i budnog stanja može automatski da se registruje (na primer, Van Gelder i saradnici, 1991 (kao gore); Edgar i saradnici, 1997 (kao gore); Winrow CJ, i saradnici,, Neuropharmacology 2010; 58(1):185-94.; i Gross i saradnici,, 2009 (kao gore). EEG je pojačan i filtriran (X10,000, zvučni talas 1-30 Hz), EMG je pojačan i integrisan (propusni opseg 10-100 Hz, RMS integracija), a ne-specifična lokomotorna aktivnost (LMA) je merena simultano. Stanja uzbuđenosti su klasifikovana u vremenskom razdoblju od 10 sekundi kao non-REM san, REM san, nesanica, ili teta dominantna nesanica. Lokomotorna aktivnost (LMA) se beleži kao brojanje po minutu i detektuje se komercijalno raspoloživim telemetrijskim risiverima (ER4000, Minimitter, Bend, OR).

[0054] Statističke analize. Sve životinje koje imaju najmanje jedan rezultat su uključene u zbirne rezultate (na primer, uključeni su odgovarajući rezultati za tretiranu životinju za koju su telemetrijski rezultati upotrebljivi ali EEG rezultati nisu). Period posmatranja nakon tretmana je podeljen u intervale post-doziranja koji odgovaraju svakom rezultatu, gde se

2

vreme doziranja definiše kao početak sata = 0, a rezultati su sumirani u periodu posmatranja izračunavanjem ili prosečnog sata ili kumulativne vrednosti u toku svakog perioda (videti legendu u Tabeli 1 za preciznu definiciju svakog rezultata). Periodi spavanja su analizirani na logaritamskoj skali zbog stabilizacije varijacija, sve druge promenljive su analizirane na linearnoj skali. Svaki rezultat u svakom periodu je analiziran ispitivanjem kovarijanci koristeći tretiranu grupu i rezultate tretmana kao faktore a odgovarajući interval pre tretmana, 24 h ranije, kao kovarijancu. Podešene srednje vrednosti i promene nastale od vehikuluma i njihove odgovarajuće standardne greške su sumirani za svaku tretiranu grupu. Rezultati analizirani na logaritamskoj skali su ponovo transformisani da se dobije geometrijska sredina i rezultati prosečnog odnosa prema vehikulumu.

[0055] Jedinjenje iz Primera 3 je u osnovi testirano kako je opisano. Nađeno je da jedinjenje iz Primera 3 značajno povećava vreme kumulativnog NREM sna i kumulativno vreme ukupnog sna bez značajne ponovljene nesanice, inhibicije REM sna ili inhibicije lokomotornog intenziteta (LMI) u količini od 3 mg/kg. (Videti profil sna i intenzitet lokomotorne aktivnosti u Tabeli 2.).

Tabela 2 Jedinjenje iz Primera 3

Efikasnost varijabila Neželjena dejstva varijabila Kumulativni NREM san Povratna nesanica

Doza N Prilagođeni SE N Prilagođeni LCL

m /k PO rosek rosek

Kumulativni ukupan san REM inhibicija Doza N Prilagođeni SE N Prilagođeni LCL m/k PO rosek rosek

Prosečno trajanje sna Intenzitet lokomotorne aktivnosti Doza N Prilagođeni SE N Prilagođeni LCL m/k PO rosek rosek

Najduže trajanje sna

Doza (mg/kg PO) N Prilagođeni prosek SE

Tabela 2. Statistički rezultati: skraćenice: N = veličina uzorka; Pril. prosek = prilagođena prosečna vrednost grupe u odnosu na kontrole sa vehikulumom; SE = standardna greška proseka; LCL = granica pouzdanosti manja od 95%; NREM = non-REM, to jest, sve vrste sna izuzev REM sna. Veličina uzorka u paralelnoj referentnoj grupi sa vehikulumom je N=27.

[0056] Definicije i jedinice - proseci su prilagođene razlike od kontrola sa vehikulumom:

• Kumulativni san: odnosi se na prvih 6 h nakon tretmana, u minutima (ukupan san označava NREM san REM san).

• Prosečno trajanje sna: prosečno trajanje sna u satima u toku prvih 6 h nakon tretmana, izražava se kao n-puta povećanje u odnosu na kontrolu sa vehikulumom.

• Najduže trajanje sna u prvih 6 h nakon tretmana, izraženo kao n-puta povećanje u odnosu na kontrolu sa vehikulumom.

• Povratna nesanica: zbirni minuti NREM+REM sna u toku prva 3 h u periodu svetlosti, to jest, 7-og, 8-og i 9-og sata nakon tretmana.

• REM inhibicija: zbirni minuti REM sna u toku prvih 12 h nakon tretmana.

• Intenzitet lokomotorne aktivnosti (LMA): izražava se kao broj LMA po minutu EEG-definisane nesanice, uprosečen u toku prvih 6 h nakon tretmana.

[0057] Određivanje efikasnosti. Prag efikasnosti za svaku od četiri promenljive efikasnosti je izračunat nanošenjem povećanja svake promenljive u odnosu na kontrole sa vehikulumom u

2

toku perioda od 6 h nakon tretmana u odnosu na log(doze). Prag efikasnosti za svaku promenljivu je ona doza, utvrđena logaritamskom nelinearnom regresijom sa 4 parametra, koja daje vrednost definisanog praga efikasnosti; 30 min. dodatnog akumuliranog non-REM sna, 25 min. dodatnog akumuliranog ukupnog sna, 1.75x povećanje u prosečnom trajanju sna i 1.5x povećanje u najdužem trajanju sna. Nađeno je da jedinjenje iz primera 3 ima prag efikasnosti doza kako je pokazano u Tabeli 3.

Doza (mg / kg)

Doza (mg / kg)

[0058] Određivanje neželjenih efekata . Svaka promenljiva kao rezultat ’neželjenog efekta’ (videti legendu Tabele 2 za definicije), je naneta u odnosu na log(dose). Vrednost praga za REM inhibiciju se definiše kao kumulativno smanjenje REM sna od -10 minuta. Početna vrednost za ponavljajuću nesanicu se definiše kao -20 min. Početna vrednost za smanjenu LMI se definiše kao -5 brojeva lokomotorne aktivnosti po minutu EEG definisane nesanice. Smatra se da se značajan neželjeni efekat dešava kada niža granica pouzdanosti ide ispod početne vrednosti za bilo koju dozu za ili ispod 10 puta prosečne efikasne doze, a trend odgovora na dozu je evidentan za doze iznad početne efikasne doze. Za jedinjenje iz Primera 3, nisu uočena neželjena dešavanja REM inhibicije, ponavljajuće nesanice, ili smanjenja LMI u dozama do najmanje 1.2 mg/Kg (1.2 mg/Kg je 10 puta najveće konzervatine efikasne doze od 0.12 mg/kg [Tabela 3]). Negativne vrednosti pokazuju REM inhibiciju, ponavljajuću nesanicu i smanjenje LMI, tim redom.

[0059] U narednim studijama, jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se primene zajedno sa selektivnim inhibitorima ponovnog preuzimanja serotonina da se pokaže potncijal njihovog efekta na fazu sna bez brzog kretanja očiju (NREM san) i održavanje sna. Jedinjenje iz Primera 3 je primenjeno zajedno sa citalopramom u studijama sna na pacovima u osnovi kako

2

je prethodno opisano za samo jedinjenje, i nađeno je da značajno povećava NREM san u značajno manjim dozama.

[0060] Izlučivanje preko plazme: Za jedinjenje korisno za lečenje poremećaja sna kao što je nesanica je važno da se adekvatno izluči iz organizma pogodnom brzinom izlučivanja kako bi se izbegli neželjeni efekti kao što je prolongirana pospanost izvan željenog perioda sna, pospanost u toku dana, umanjena spoznaja nakon buđenja, itd. Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenja sa poboljšanom brzinom izlučivanja. Brzina izlučivanja može u osnovi da se ispita kako je oposano u daljem tekstu.

[0061] Mužjaci Sprague Dawley pacova (telesna težina u rasponu od 250-320 g) sa ugrađenom kanilom u femoralnoj arteriji su nabavljeni od Charles River, Wilmington, MA 01887, USA. Test jedinjenje je primenjeno intravenozno u rastvoru (1 mL/kg) 20% Captizol® u 22.5 mM fosfatnog pufera, pH 2, u finalnoj koncentraciji leka od 1.0 mg/mL (ekvivalentno sa slobodnom bazom). Uzorci krvi su uzeti preko ugrađene kanile u toku 24 h. Uzorci plazme su dobijeni centrifugiranjem i čuvani zamrznuti (-20°C), na suvom ledu, pre analize.

[0062] Mužjaci bigl pasa (telesne težine u rasponu 10-12 kg) su nabavljeni od Marshall Bioresources, USA. Test jedinjenje je primenjeno intravenozno u rastvoru (1 mL/kg) 20% Captizol® u 22.5 mM fosfatnog pufera, pH 2, u finalnoj koncentraciji leka od 1.0 mg/mL (ekvivalentno sa slobodnom bazom). Uzorci krvi su dobijeni iz jugularne veze u toku 24 h. Uzorci plazme su dobijeni centrifugiranjem i čuvani zamrznuti (-20°C) pre analize.

[0063] Zamrznuti uzorci plazme se otope na sobnu temperaturu za bioanalize koncentracije test jedinjenja. Odgovarajuće jedinjenje kao interni standard se u smeši acetonitril/ metanol (1:1, v/v) doda u sve uzorke plazme (1:1, v/v). Uzorci se centrifugiraju da se pre analize ukloni istaloženi protein. Supernatanti se analiziraju injektovanjem i rapidnom eluacijom gradijenta na Javelin Betasil C18 koloni (20 x 2.1 mm kartridž, Mobilna faza A: voda/ 1 M NH4HCO3, 2000:10 v/v, Mobilna faza B: MeOH/ 1 M NH4HCO3, 2000:10 v/v). Eluirani analiti se detektuju pomoću LC-MS-MS analiza koristeći Sciex API 4000 trostruki četvoropolni maseni spektrometar. Koncentracije jedinjenja se određuju iz pripremljenih standarda i analiziraju pod identičnim uslovima. Klirens se izračunava pomoću nonkompartmentalnih analiza u Watson 7.4, Thermo Fisher Scientific, Inc.

2

[0064] Jedinjenja iz Primera 1 i 3 su podvrgnuti ispitivanju u osnovi kako je opisano i nađeno je da imaju povoljne profile klirensa:

[0065] Mada je moguće da se jedinjenja iz ovog pronalaska primenjuju direktno bez bilo kakve formulacije, jedinjenja se obično primenjuju u obliku farmaceutskih kompozicija koje uključuju jedinjenje, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kao aktivni sastojak i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač i/ili ekscipijent. Ove kompozicije mogu da se primene različitim načinima, uključujući oralno, sublingvalno, nazalno, subkutano, intravenozno i intramuskularno. Ovakve farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, Remington: The Science i Practice of Pharmacy (University of the Sciences in Philadelphia, ed., 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins Co., 2005).

[0066] Kompozicije su preferirano formulisane u obliku jedinične doze, pri čemu svaka doza sadrži od približno 0.1 do približno 60 mg, mnogo češće 0.5 do približno 30 mg, kao što je na primer između približno 1 i približno 10 mg aktivnog sastojka. Naziv "jedinični dozni oblik" se odnosi na fizički odvojene jedinice pogodne za jedno doziranje za humane subjekte i druge sisare, pri čemu svaka jedinica sadrži prethodno odmerenu količinu aktivnog materijala izračunatog da dovede do željenog terapeutskog efekta, zajedno sa najmanje jednim pogodnim farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem i/ili ekscipijentom.

[0067] Jedinjenja Formule I su generalno efikasna u širokom opsegu doze. Na primer, dnevna doza je noramlno u okviru od približno 0.002 do približno 1.0 mg/kg, mnogo češće od približno 0.008 do 0.5 mg/kg, a kao primer između 0.015 i 0.15 mg/kg telesne težine. U nekim slučajevima vrednosti doze ispod donjeg limita prethodno pomenutog opsega mogu da budu više nego adekvatne, dok u drugim slučajevima čak i veće doze mogu da se primene bez izazivanja bilo kog neželjenog sporednog efekta, i zbog toga prethodno navedeni dozni opsezi nemaju za cilj da ograniče okvir pronalaska na bilo koji način. Jasno je da količinu jedinjenja koja se trenutno primenjuje određuje lekar, u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući stanje

2

koje se tretira, izabrani način primene, određeno jedinjenje ili jedinjenja koja se primenjuju, starost, težinu i odgovor pojedinačnog pacijenta i ozbiljnosti simptoma kod pacijenta.

2

Claims (8)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to HCl so.
3. 3. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijentom.
4. 4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
5. 5. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu nesanice.
6. 6. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačeno time što se nesanica karakteriše otežanim početkom sna ili održavanjem sna ili sa oba.
7. 7. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu ili sa patentnim zahtevom 5 ili 6, naznačeno time što je za upotrebu na ljudima. 2
8. 8. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, ekscipijentom ili razblaživačem i drugim terapeutskim sastojkom koji je selektivni inhibitor ponovnog preuzimanja serotonina. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5