RS57214B1

RS57214B1 - Upotreba derivata hemijski modifikovanog heparina za bolest srpastih ćelija

Info

Publication number: RS57214B1
Application number: RS20180574A
Authority: RS
Inventors: Hans-Peter Ekre; Anna Leitgeb; Mats Wahlgren; Dagmar Pikas
Original assignee: Modus Therapeutics Ab
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2018-07-31
Also published as: RS57213B1; SI2794667T1; CA2856918C; EP2794666A4; HUE037554T2; TN2014000236A1; DK2794666T3; AU2012354226A1; EP2794667A4; EP2794666A1; NO2794667T3; HUE037555T2; US20150031638A1; MX358439B; SMT201800218T1; BR112014014673A8; MX2014006956A; NO2794666T3; HRP20180726T1; AU2012354226B2

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na nove hemijski modifikovane heparine sa niskom antikoagulantnom aktivnošdu, njihovu upotrebu u lečenju bolesti, kao što je bolest srpastih delija.

Stanje tehnike

[0002] Heparin je prirodni GAG (glucozaminoglikan) koji se sintetiše i čuva intracelularno u tzv. mastocitima kod ljudi i životinja. Industrijski dobijen iz sluzokože svinjskog creva, heparin je modan antikoagulant i klinički se koristi ved više od 60 godina kao prioritetni lek za profilaksu i lečenje tromboembolijskih poremedaja. Najvedi potencijalni štetni efekti lečenja heparinom su komplikacije krvarenja prouzrokovane njegovim antikoaugulantnim svojstvima. Heparin je visoko polidisperzivan i sastoji se od heterogene familije polisaharida sa molekulskim masama u rasponu od 5 do 40 kDa, pri čemu je prosek približno 15 do 18 kDa.

[0003] Heparini niske molekulske mase (LMWH) prema Evropskoj farmakopeji 6.0 se definišu kao "soli sulfatovanih GAG-a koji imaju prosečnu molekulsku masu manju od 8 i od kojih najmanje 60 procenata od ukupne mase ima molekulsku masu manju od 8 kDa." "Heparini niske molekulske mase pokazuju različite hemijske strukture na redukujudem ili neredukujudem kraju polisaharidnih lanaca." "Snaga nije manja od 70 IU aktivnosti antifaktora Xa po miligramu izračunato u odnosu na osušenu supstancu. Odnos aktivnosti antifaktora Xa prema aktivnosti anti-faktora IIa nije manji od 1,5." Klinički korišdeni LMWH-i imaju molekulske mase u rasponu od 3 do 15 kDa sa prosekom približno od 4 do 7 kDa. Prizvedeni kontrolisanom depolimerizacijom/frakcionisanjem heparina, LMWH-i pokazuju povoljnije farmakološke i farmakokinetičke osobine, uključujudi i nižu tendenciju da izazovu krvarenje, povedanu bioraspoloživost i produžen poluživot nakon subkutanog ubrizgavanja. Heparin vrši svoju antikoagulantnu aktivnost pre svega putem visoko afinitetnog vezivanja i aktivacijom inhibitora serin proteinaze, antitrombina (AT). Vezivanje je posredovano specifičnom pentasaharidnom sekvencom. AT, važan fiziološki inhibitor koagulacije krvi, neutrališe aktivirane faktore koagulacije formiranjem stabilnog kompleksa sa ovim faktorima. Vezivanje heparina izaziva conformacionu promenu u AT koja dramatično povedava stopu inhibicije faktora koagulacije, čime se smanjuje koagulacija krvi i formiranje krvnih ugrušaka.

[0004] Bolest srpastih delija (SCD) je nasledni poremedaj zbog homozigotnosti za abnormalni hemoglobin, hemoglobin S (HbS). Ovaj abnormalni HbS je uzrokovan supstitucijom jedne baze u genu koja kodira humanu β-globin podjedinicu. On je globalno rasprostranjen, ali pretežno oboljevaju ljudi koji pate od malarije, prvenstveno u ekvatorijalnoj Africi, ali i na Mediteranu-, Indiji, i Bliskom Istoku. Vazo-okluzivni fenomeni i hemoliza su klinički znaci SCD-a. Vazo-okluzija dovodi do recidivnih bolnih epizoda (ponekad nazvanih krizom srpastih delija) i raznih ozbiljnih komplikacija sistema organa kao što su sekundarne infekcije, akutni grudni sindrom, moždani udar, i sekvestacija slezine. Vazo-okluzija objašnjava 90% bolničkog smeštaja kod dece sa SCD, i može na kraju da dovede do doživotne nesposobnosti i/ili rane smrti. Na molekulskom nivou, P-selektin je jedna od nekoliko meta koje su se pokazale kao važni receptori u posredovanju adhezije krvnih delija na zidove sudova kao deo događaja koji dovodi do vazo-okluzije.

[0005] Trenutno dominantna terapija u lečenju SCD-a uključuje upotrebu hidroksiurea (Ware i ost. American Society of Hematology, 2009, pp 62-65Međutim, ovaj tretman ima ograničenu efikasnost i uključuje brojne neželjene efekte kod pacijenata. Chaplin i ost. (vidi East Afr Med J.1989; 66(9):574-84) izveo je pilot probu sa dnevnom profilaktičkom dozom heparina na četiri pacijenta sa krizom srpastih delija i uspešno demonstrirao smanjenje bolova i nekoliko dana kradi boravak u bolnici. Qari i ost. (Thromb. Haemost, 2007, 98, 392-6) opisuju kliničku studiju u kojoj je korišden derivat heparina niske molekulske mase, tinzaparin, izveštavajudi o korisnim efektima lečenja, ali takođe i o nekoliko slučajeva krvarenja.

[0006] WO 03/088980 predlaže oralni tretman sa heparinom ili heparinskim podfrakcijama za tretman vazo-okluzije (VOC) kod SCD.

Opis pronalaska

[0007] Predmetni pronalazak se odnosi na hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija. U kontekstu predmetnog pronalaska, antikoagulantna aktivnost heparina se odnosi na kliničku funkciju potencijalne inhibicije koagulacije faktora Xa i IIa (trombin) pomodu AT. Ostali termini de biti definisani u relevantnim kontekstima u daljem opisu.

[0008] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija, koji ima aktivnost antifaktora IIa manju od 10 IU/mg, aktivnost antifaktora Xa do10 IU/mg i prosečnu molekulsku masu od oko 6,5 do oko 9,5 kDa, gde polisaharidni lanci:

(i) zadržavaju najmanje 90 %, sulfatnih grupa od odgovarajudeg nativnog heparina;

(ii) imaju smanjenje hemijski neoštedenih saharidnih sekvenci koje obezbeđuju antitrombinom posredovani antikoagulantni efekat, u poređenju sa polisaharidnim lancima nativnog heparina; i

(iii) imaju smanjenje nesulfatovanih jedinica iduronske i /ili glukuroinske kiseline u poređenju sa nativnim heparinom;

gde je preovladavajudi disaharid polisaharida disaharid koji ima hemijsku strukturu:

gde je R’ treonatni ostatak; i n je ceo broj od 2 do 25, tako da sadrži od 2 do 25 disaharidnih jedinica koje odgovaraju molekulskim masama od 1,2 do 15 kDa; i gde hemijski modifikovan heparin ima, u 1HNMR spektru, neidentifikovane signale u opsegu 0,10-2,00 ppm, 2,10-3,10 ppm i 5,70-8,00 ppm vede od 4 procenata kada se poredi sa visinom signala prisutnog u nativnom heparinu na 5,42 ppm.

[0009] Hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija ima od 2 do 25 disaharidnih jedinica koje odgovaraju molekulskim masama od oko 1,2 do oko 15 kDa. Hemijski modifikovan heparin ima polisaharidne lance sa redukcijom u hemijski intaktnim pentasaharidnim sekvencama odgovornim za anti-trombinom (AT) posredovani antikoagulantni efekat, kada se poredi sa lancima nativnog heparina i ima polisaharidne lance sa redukcijom u ostacima nesulfatovane iduronske i glukuronske kiseline kada se poredi sa nativnim heparinom.

[0010] Hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija ima pretežnu pojavu polisaharidnih lanaca sa između 6 i 16 disaharidnih jedinica sa molekulskom masom između 3,6 i 9,6 kDa. Izraz "preovladava" u ovom kontekstu ima značenje "najčešde prisutni" polisaharidni lanci.

[0011] Jedan aspekt pronalaska je hemijski modifikovan heparin koji ima najmanje 30 % polisaharidnih lanaca sa molekulskom masom od najmanje 8 kDa.

[0012] Hemijski modifikovani heparini prema pronalasku obuhvataju lance koji se završavaju treonatnim ostacima. Treonatni ostatak je prikazan ispod kao terminalna grupa.

[0013] U aspektu pronalaska, od 3 do 15 % polisaharidnih lanaca hemijski modifikovanog heparina ima molekulsku masu od najmanje 15kDa.

[0014] U aspektu pronalaska, od 25 do 47 % polisaharidnih lanaca hemijski modifikovanog heparina ima molekulsku masu od najmanje 9 kDa.

[0015] U aspektu pronalaska, od 40 do 60 % polisaharidnih lanaca hemijski modifikovanog heparina ima molekulsku masu od najmanje 7 kDa.

[0016] U aspektu pronalaska, od 60 do 80 % polisaharidnih lanaca hemijski modifikovanog heparina ima molekulsku masu od najmanje 5 kDa.

[0017] U aspektu pronalaska, 85 % polisaharidnih lanaca hemijski modifikovanog heparina ima molekulsku masu od najmanje 3 kDa.

[0018] U aspektu pronalaska, 95 % polisaharidnih lanaca hemijski modifikovanog heparina ima molekulsku masu od najmanje 2 kDa.

[0019] U još jednom aspektu, hemijski modifikovan heparin iz pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija ima raspodelu polisaharida i njihove odgovarajude molekulske mase izražene kao kumulativne % mase prema tabeli:

[0020] U još jednom aspektu, hemijski modifikovan heparin iz pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija ima raspodelu polisaharida i njihove odgovarajude molekulske mase izražene kao kumulativne % mase prema tabeli:

[0021] Hemijski modifikovani heparini za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija imaju polisaharidne lance sa disaharidom prikazanim dole kao dominantnom strukturom sa terminalnim treonatnim ostatkom. Preovladavajudi disaharid ima molekulsku masu od oko 600 Da. (n je ceo broj od 2-25).

[0022] Prema još jednom aspektu pronalaska, hemijski modifikovani heparini za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija sadrže glikolno razdvojene ostatke sa hemijskom strukturom:

[0023] Glikolno razdvojeni ostaci se pojavljuju u polisaharidnim lancima hemijski modifikovanih heparina, kao rezultat procesa oksidacije i redukcije, kao što je ranije razmatrano u kontekstu sa postupkom i specifičnim korakom hidrolize. Oni se takođe mogu smatrati indikacijom efikasnosti prethodno opisanog koraka depolimerizacije (hidrolize). To se dalje odnosi na US patent 4,990,502 za hemijsku referencu o nastanku glikolno razdvojenih ostataka. Prikazan glikolno razdvojen ostatak dolazi od oksidacije i redukcije nesulfatovane iduronske kiseline i glukuronske kiseline.

[0024] Hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija ima<1>H-NMR spektar u opsegu od 5,0 do 6,5 ppm što se slaže sa<1>H-NMR spektrom od nativnog heparina zbog odsustva protonskih signala sa magnitudom iznad 0,1 (mol) %.

[0025] Hemijski modifikovani heparini za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija u skladu su sa sadašnjim prihvadenim standardima za heparin tako što imaju<1>H-NMR spektar koji ispunjava kriterijum za prihvatanje heparina koji je odredio EDQM, Savet Evrope, 2012, na primer bez ikakvih neidentifikovanih signala vedih od 4 procenta u poređenju sa visinom signala heparina na 5,42 ppm u opsegu 0,10-2,00 ppm, 2,10-3,10 ppm i 5,70-8,00 ppm.

[0026] Hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija ima polisaharidne lance koji zadržavaju najmanje 90 % sulfatnih grupa od odgovarajudeg nativnog heparina. Drugim rečima hemijski modifikovani heparini prema pronalasku imaju gubitak sulfatnih grupa od oko jedne sulfatne grupe po jedinici disaharida od 100 jedinica disaharida, što odgovara gubitku sulfatnih grupa od manje od 1 % od ukupnog sadržaja sulfata, kada se predpostavlja da heparin sadrži u proseku 2,4 sulfatne grupe po disaharidnoj jedinici i da postoji jedna sulfatna grupa po iduronskoj kiselini, I2S i 2 sulfatne grupe za preovldavajudu glukozaminsku varijantu, GlcNS.

[0027] U jednom aspektu pronalaska, hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija može da bude koristan za terapije koje su ranije otkrivene kao povezane sa drugim delovima heparina od onih koji su mesta vezivanja za AT. Primeri uključuju, ali se ne ograničavaju, na takve oblasti kao što su lečenje upale, lečenje neurodegenerativnih bolesti, obnavljanje tkiva, moždani udar, prevencija i lečenje šoka, naročito septičnog šoka i prevenciju razvoja metastaza.

[0028] Aspekt pronalaska je hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolnih kriza kod bolesti srpastih delija (vazo-okluzivne krize). Hemijski modifikovani heparini kao što je ovde otkriveno, mogu da budu korisni u prevenciji ili lečenju okluzivnih efekata od srpastih krvnih delija, izazvanim abnormalnim adhezivnim efektima u krvi. Hemijski modifikovani heparini prema pronalasku imaju afinitet vezivanja prema P-selektinu uporedivom sa heparinom.

[0029] Aspekt pronalaska je hemijski modifikovan heparin kao što je ovde otkriveno, kao dodatna terapija za upravljanje bolovima i terapija sa hidroksiureom.

[0030] U još jednom aspektu pronalaska, hemijski modifikovan heparin kako je ovde opisano može da se daje istovremeno, ili uzastopno, u smislu dodatnog lečenja sa lekovima koji su efikasni protiv bolesti srpastih delija ili komplikacija od bolesti srpastih delija.

[0031] Ovde je opisan, postupak za lečenje bolesti srpastih delija, koji obuhvata davanje pacijentu kome je potreban takav tretman, terapeutski efektivne količine hemijski modifikovanog heparina kao što je ovde opisano. U jednom aspektu postupak obuhvata tretman vazo-okluzivne krize.

[0032] Još jedan aspekt pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži hemijski modifikovan heparin kao što je ovde opisano, zajedno sa farmaceutski i farmakološki prihvatljivim nosačem. U još jednom aspektu pronalaska, farmaceutska kompozicija kao što je ovde opisana, može da se daje sistemski parenteralnim davanjem, kao što je subkutano ili intravensko ubrizgavanje. U još jednom aspektu, farmaceutska kompozicija kao što je ovde opisana, može da se daje oralno. Za parenteralno davanje, aktivna jedinjenja mogu biti sjedinjena u rastvoru ili suspenziji, koji takođe sadrže jedan ili više ađuvanata kao što su sterilni razblaživači kao što je voda za injektiranje, slani rastvor, fiksna ulja, polietilen glikol, glicerol, propilen glikol ili drugi sintetički rastvarači, antibakterijska sredstva, antioksidansi, helatna sredstva, puferi i sredstva za podešavanje osmolalnosti. Parenteralni preparat može da se isporuči u ampulama, bočicama, napunjenim ili špricevima za jednokratnu upotrebu takođe za samodavanje, ili kao infuziono pripremljeni, kao što je za intravensku ili subkutanu infuziju. Hemijski modifikovani heparini prema pronalasku mogu da se daju subkutano i sa pogodnim alatima za samodavanje, kao što su injektori.

[0033] Farmaceutske kompozicije koje sadrže hemijski modifikovan heparin kao što je ovde opisano, mogu da sadrže kombinacije jednog ili nekoliko uobičajenih farmaceutski prihvatljivih nosača. Nosači ili ekscipijenti mogu biti čvrsti, polučvrsti ili tečni materijali koji mogu da posluže kao nosač za aktivnu supstancu. Kompozicije se mogu davati u pojedinačnoj dozi svakih 24 h u periodu od 1-30, poželjno 1-10 dana. Doza može biti između 0,5-6 mg/kg telesne mase davana, bilo intravenozno svakih 6 ili 8 sati, ili 1-4 puta dnevno davana subkutano. Procenjena pojedinačna doza je 25-100 mg/d modifikovanog GAG-a, ali može da bude do 1 g ili više. Doza se odnosi na oblik primene. Opisane farmaceutske kompozicije mogu dalje da sadrže dodatna sredstva pogodna za lečenje malarije sa sa dodatnim ili komplementarnim terapijama kao što je opisano u prethodnom delu.

[0034] Specifčna terapijska upotreba hemijski modifikovanih heparina prema predmetnom pronalasku je lečenje SCD. Hemijski modifikovani heparini iz pronalaska de sprečiti ili lečiti okluzivne efekte od SCD-a uzrokovane abnormalnim adhezivnim efektima u krvi. Takođe u lečenju SCD-a, terapija koja obuhvata inventivne heparine može da se kombinuje sa drugim terapijama pogodnim za lečenje SCD-a, ili se istovremeno daje ili daje dodatak hemijski modifikovanim heparinima. Komplementarne terapije poželjno ublažavaju SCD ili njegove sekundarne komplikacije pomodu drugačijih mehanizama u odnosu na hemijski modifikovane heparine i mogu da uključe davanje agenasa koji se uobičajeno koriste u lečenju SCD-a.

[0035] Pronalazakse dalje proširuje na svaku upotrebu za proizvodnju sredstva za lečenje SCD sa opisanim hemijski modifikovanim heparinima.

[0036] Ukratko, pronalazak generalno proizilazi iz shvatanja da bi modifikovan heparin trebao da zadrži dovoljnu količinu sulfatnih grupa uključenih u nativni oblik, kako bi se izvršila terapeutska aktivnost koja nije povezana sa antikoagulantnim efektima, na primer inhibicija selektina kao i drugi biološki efekti koji zavise od heparina.

Detaljan i primerni opis pronalaska

[0037] Jedan aspekt pronalaska je hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija koji ima Međunarodno nezaštideno ime (INN) sevuparin natrijum, koji je takođe poznat kao DF02. Ovi izrazi se koriste zamenljivo i imade isto značenje.

Opis slika nacrta

[0038]

Slika 1 pokazuje reprezentativni primerak sekvence heparina

Slika 2 pokazuje strukturu pentasaharidne jedinice u heparinu potrebne za njeno vezivanje za AT.

Slika.3 pokazuje šemu sinteze hemijski modifikovanog heparina DF02 prema pronalasku.

Slika 4 pokazuje pretežnu strukturu DF02.

Slika 5 pokazuje kako derivat heparina prema pronalasku može da inhibira atheziju SS RBC na endotelne delije tretirane sa IL-13 i histaminom.

Slika 6A i 6B prikazuju grafikone uzoraka adhezionih događaja kvantifikovanih kod višestrukih naprezanja na smicanje.

Slika 7 prikazuje inhibiciju adhezionih događaja tretmanom sa DF02 prema predmetnom pronalasku.

Slika 8A i 8B pokazuje poređenje inhibicije adhezionih događaja tretmanom sa DF02 prema predmetnom pronalasku, i komercijalnim LMWH tinzaparinom.

Slika 9 prikazuju grafikone uzoraka efekta nakon tretmana sa DF02 prema predmetnom pronalasku, u poređenju sa LMWH tinzaparinom.

Primer 1

[0039] I heparin I LMWH su izgrađeni od ponavljajudih jedinica disaharida koje sadrže jedan ostatak uronske kiseline (Dglukuronska ili L-iduronska kiselina, UA) i jedan D-glukozaminski deo (GlcN) koji je ili N-sulfatovan ili N-acetilovan. Ovi ostaci ugljenih hidrata mogu biti dalje O-sulfatovani, na C-6 i C-3 pozicijama u slučaju glukozamina i na C-2 poziciji kod UA. Struktura heparina je promenljiva u pogledu raspodele UA i sulfatnih ostataka; reprezentativna parcijalna sekvenca je prikazana na slici 1 (koja takođe ilustruje način numerisanja atoma ugljenika u monosaharidnom ostatku). Slika 2 pokazuje jedinstvenu, pentasaharidnu sekvencu koja se distribuira u polimerima heparina koja je bitna za vezivanje za AT. Nekoliko strukturnih karakteristika ove sekvence pokazalo se da su ključne za interakciju heparina sa AT. Naročito, jedan od dva UA ostatka prisutan u ovoj pentasaharidnoj sekvenci je dosledno sulfatovan na položaju C-2; dok su hidroksilne grupe na oba C-2 i C-3 drugog uronskog dela nesupstituisane.

Detaljan opis proizvodnog procesa hemijski modifikovanih heparina prema pronalasku

[0040] Slika 3 šematski prikazuje proizvodnju hemijski modifikovanog heparina prema predmetnom pronalasku, dalje označen DF02, dok slededi delovi opisuju korake proizvodnje.

[0041] Supstanca je pripremljena iz heparin natrijuma. Pripremanje uključuje selektivnu oksidaciju ostataka nesulfatovane uronske kiseline u heparinu pomodu perjodata, uključujudi deo glukuronske kiseline u pentasaharidnoj sekvenci koji vezuje AT. Raskidanje strukture ovih ostataka uništava interakciju visokog afiniteta sa AT i, posledično, antikoagulantni efekat (meren kao-FXa ili-FIIa, videti tabelu 4 i 5). Naknadna redukcija i tretman kiselinom rezultuje cepanjem polimera na mestima koja su bila oksidovana pomodu perjodata. Zajedno, ove manipulacije dovode do gubitka antikoagulantne aktivnosti uz adekvatnu depolimerizaciju heparinskog lanca.

[0042] Posele toga, aditivi, nečistode i sporedni proizvodi se uklanjaju ponovnim taloženjem sa etanolom, filtracijom i centrifugiranjem. Nakon toga se supstanca dobija u obliku praha sušenjem u vakuumu i zagrevanjem. Supstanca leka DF02 je rastvorena u sterilnom vodenom puferu da bi se dobio proizvod kao lek, koji je namenjen za intravenozno ili subkutano davanje.

Oksidacija glukuronske i iduronske kiseline (ostataka), brisanje antikoagulantne aktivnosti

[0043] Količina od oko 3000 grama heparina je rastvorena u prečišdenoj vodi kako bi se dobio 10-20 % mas/v rastvor. pH ovog rastvora je podešen na 4,5-5,5. Natrijum metaperjodat (NaIO4) je naknadno dodat u procesni rastvor;, količina perjodata je 15-25% od mase heparina. pH je ponovo podešena na 4,5-5,5. Reaktor je pokriven kako bi zaštitio reakciju od svetlosti. Procesni rastvor je reagovao tokom 22 - 26 sati uz stalno mešanje i održavanje temperature na 13 - 17 °C. pH je na kraju reakcionog perioda izmerena i zapisana.

Završetak reakcije oksidacije i uklanjanje jedinjenja koja sadrže jod

[0044] Etanol (95-99,5%) se dodaje u reakcionu smešu tokom perioda od 0,5 -1 sat, uz pažljivo mešanje i na temperaturi od 20 -25 °C. Zapremina etanola koji treba da se doda je u rasponu 1-2 zapremine etanola po zapremini procesnog rastvora. Oksidovanom heparinu se tada dozvoljava da se taloži i obrazuje sloj tokom 15 -20 sati, posle čega se matični rastvor dekantuje i ispušta.

[0045] Sledede, istaloženi sloj se rastvara u prečišdenoj vodi da se dobije 15-30% mas/v procesnog rastvora. Zatim se dodaje NaCl da se dobije koncentracija od 0,15-0,30 mol/litar u procesnom rastvoru. Mešanje se nastavlja još za 0,5 -1 sat dok se temperatura održava na 20 -25 °C. Naknadno se dodaje 1,0-2,0 zapremine etanola (95-99,5%) po zapremini procesnog rastvora u rastvor uz pažljivo mešanje, toko perioda od 0,5 -1 sat. Ovo taloži proizvod iz rastvora. Ovo taloženje nastavlja se >1 sat.

Redukcija oksidovane glukuronske/iduronske liseline

[0046] Nakon što se matični rastvor dekantuje i ispušta, istaloženi sloj se rastvara dodavanjem prečišdene vode sve dok se ne dobije koncentracija procesnog rastvora od 15-30% mas/v. Dok se održava temperatura na 13-17 °C, pH rastvora je podešena na 5,5-6,5. Količina od 130-150 grama natrijum borhidrida se zatim dodaje u rastvor i rastvara, pH de odmah da poraste na pH od 10-11, i reakcija se nastavlja tokom 14-20 sati. Zapisuje se pH rastvora, i pre i posle reakcionog perioda. Posle ovog vremena reakcije, polako se dodaje razblažena kiselina da bi se podesila pH na vrednost od 4, ovo degradira preostali natrijum borhidrid. Nakon održavanja pH na 4 tokom 45 - 60 minuta, pH rastvora se podešava na 7 sa razblaženim rastvorom NaOH.

Kisela hidroliza za postizanje depolimerizacije polisaharidnih lanaca

[0047] Razblažena kiselina se dodaje u rastvor dok se ne dobije pH od 3,5 (prihvatljiv opseg 3,2-3,8). Temperatura se drži na 50-55°C dok se rastvor meša tokom 3 sata /-10 minuta. Razblaženi rastvor NaOH se zatim dodaje dok se ne dobije pH of 7,0 i reakcioni rastvor ohladi na temperaturu od13-17 °C. Zatim se dodaje natrijum hlorid (NaCl) dok se ne dobije koncentracija od 0,2-0,3 mol/litar.

Prečišdavanje proizvoda Uklanjanje procesnih aditiva i nečistoda, dodavanje suprotnih jona i filtracija

[0048] Jedna zapremina procesnog rastvora se zatim dodaje u 1,5-2,5 zapremina etanola (95-99,5%) nakon čega sledi centrifugiranje >2000 G, i na <20°C tokom 20 - 30 minuta, nakon čega se supernatant dekantuje i odbacuje.

[0049] Nastali proizvod u obliku paste dobijen centrifugiranjem zatim se rastvara u prečišdenoj vodi da bi se dobila koncentracija proizvoda 10-20% mas/v. Zatim se dodaje NaCl da se dobije koncentracija od 0,20-0,35 mol/litar. Dalje, dodaje se 1,5-2,5 zapremine etanola (95-99,5%) po zapremini procesnog rastvora kojitaloži proizvod iz rastvora. Sledi centrifugiranje na >2000 G, i na <20°C tokom 20 -30 minuta nakon čega se supernatant dekantuje i odbaci.

[0050] Zatim se preostaloj pasti dodaje prečišdena voda da se rastvori. Koncentracija proizvoda bi sada bila u rasponu od 10-20% mas/v. pH rastvora proizvoda je sada podešena na 6,5-7,5. Rastvor se zatim filtrira da bi se uklonile čestice. Zatim, u jednu zapreminu procesnog rastvora se dodaje 1,5-2,5 zapremina etanola (95-99,5%). Sledi centrifugiranje na >2000 G, i nat <20°C tokom 20 -30 minuta nakon čega se supernatant dekantuje i odbaci.

Smanjenje veličine i sadržaja vode u istaloženoj pasti

[0051] Zatim se stakleni reaktor napuni etanolom, zapremine 2 litra. Dok se meša etanol, dodaje se istaložena pasta. Mehaničko mešanje učvršduje pastu i zamenjuje prisutnu vodu sa etanolom dajudi homogenu suspenziju čestica. Mešanje se prekida nakon 1-2 sata nakon čega se česticama dozvoljava da istalože, zatim se matični rastvor dekantuje. Ovaj postupak se ponavlja dva puta. Talog je izolovan na filteru od polipropilena (PP). Ovaj postupak se ponavlja još dva puta. Nakon uklanjanja prekomerne tečnosti, čestice prolaze kroz sito da bi se dobila čestice manje i jednake veličine.

Vakuum sušenje

[0052] Proizvod se ravnomerno raspoređuje na dve prethodno izmerene tacne, i stavlja u vakuum orman. Pritisak se smanjuje pomodu vakuum pumpe, stvarno dobijen pritisak se beleži, i tacne se zagrevaju na 35 -40°C, uz stalno beleženje temperature. Struja azota prolazi kroz sušač i za to vreme i održava se nizak pritisak u sušaču. Kada se dobije konstantna masa, tj. Ne primeduje se dalje isparavanje, sušenje se smatra završenim. Suv proizvod se raspoređuje, pakuje i štiti od vlage. Skladištenje se vrši u suvom prostoru na temperaturi od 20-25°C.

[0053] Tako proizveden proizvod može da bude pripremljen kao proizvod za lek uobičajenim aseptičnim postupkom, kao što je rastvor koji sadrži 150 mg/mL aktivnog sredstva hemijski

1

modifikovanog heparina i Na fosfata do 15 mM, pH 6-8. Tako dobijen preparat za lek je namenjen za intravensko ili subkutano davanje. Dobijeni hemijski modifikovan heparin, DF02, je depolimerizovani oblik heparina sa projektovanom prosečnom molekulskom masom od 6,5-9,5 kDa i bez suštinski antikoagulantne aktivnosti.

[0054] DF02 ima raspodelu veličine polisaharidnih polimera, sa opsegom za n od 2-25 koja odgovara molekulskim masama od 1,2-15 kDa. Pretežna veličina je 6-16 disaharidnih jedinica koje odgovaraju molekulskim masama od 3,6-9,6 kDa.

[0055] Praktičnim testiranjem može da se zaključi da reakcija oksidovanog preparata heparina u alkalnom rastvoru dovodi do lanaca koji su prekratki, ili nedostaje odgovarajudi stepen sulfatacije, za optimalnu farmaceutsku funkciju nastalog heparina. Daljim praktičnim testovima, može da se pokaže da tretman preparata heparina u rastvoru manjem od pH 1, vodi do desulfatacije proizvoda, i time dovodi do hemijski modifikovanog heparina sa manjim farmaceutskim efektom od optimalnog.

Tabela 1. Raspodela polisaharida i njihove odgovarajude molekulske mase u DF02 (nekoliko šarži) kao kumulativni % mase

[0056] Odgovarajuda vrednost za prosečnu molekulsku masu, Mw pada u opseg 6,5-9,5 kDa.

Tabela 2 Raspodela polisaharida i njihove odgovarajude molekulske mase u DF02 kao kumulativni % mase za pojedinačnu šaržu.

[0057] Odgovarajuda vrednost za prosečnu molekulsku masu, Mw je 7,4 kDa.

Primer 2

[0058] Primer 2 predstavlja modifikovanu verziju proizvodnog procesa prema primeru 1. Određeni parametri procesa su modifikovani, kao što su procesne temperature, u cilju sprečavanja bilo koje nespecifične depolimerizacije u početnom delu procesa.

[0059] Količina od oko 3000 grama heparina se rastvara u prečišdenoj vodi da se dobije 10-20 % mas/v rastvor. pH ovog rastvora je podešen na 4,5-5,5. Natrijum metaperjodat (NaIO4) se naknadno dodaje u procesni rastvor; količina perjodata je 15-25% od mase heparina. pH se ponovo podešava na 4,5-5,5. Reaktor je pokriven kako bi zaštitio reakciju od svetlosti. Procesni rastvor je reagovao tokom 22 -26 sata uz stalno mešanje i održavanje temperature na 13 -17 °C, dok se temperatura spušta u poslednja dva sata na oko 5 °C. pH na kraju reakcionog perioda je izmerena i zapisana.

Završetak reakcije oksidacije i uklanjanje jedinjenja koja sadrže jod

[0060] Etanol (95-99,5%) se dodaje u reakcionu smešu tokom perioda od 0,5 -1 sat, uz pažljivo mešanje i na temperaturi od oko 5 °C. Zapremina etanola koji treba da se doda je u rasponu 1-2 zapremine etanola po zapremini procesnog rastvora. Oksidovanom heparinu se tada dozvoljava da se taloži i obrazuje sloj tokom 15 -20 sati, posle čega se matični rastvor dekantuje i ispušta.

[0061] Sledede, istaloženi sloj se rastvara u prečišdenoj vodi da se dobije 15-30% mas/v procesnog rastvora. Zatim se dodaje NaCl da se dobije koncentracija od 0,15-0,30 mol/litar u procesnom rastvoru. Mešanje se nastavlja još za 0,5 -1 sat dok se temperatura održava na oko 5 °C. Naknadno se dodaje 1,0-2,0 zapremine etanola (95-99,5%) po zapremini procesnog rastvora u rastvor uz pažljivo mešanje, tokom perioda od 0,5 -1 sat. Ovo taloži proizvod iz rastvora. Ovo taloženje nastavlja se >1 sat.

Redukcija oksidovane glukuronske/iduronske kiseline

[0062] Ovaj korak je napravljen u skladu sa primerom 1.

Kisela hidroliza za postizanje depolimerizacije polisaharidnih lanaca

[0063] Ovaj korak se izvodi u skladu sa primerom 1 uz razliku da vreme procesa može da se produži za oko dva sata pre nego što se pH poveda na 7,0 sa NaOH.

[0064] Dalji procesni koraci ka proizvodu za lek sadrže na primer 150 mg/ml aktivnog sredstva hemijski modifikovanog heparina identično koracima opisanim u primeru 1.

[0065] Izvođenjem procesnih koraka u skladu sa primerom 2, dobija se hemijski modifikovan heparin sa raspodelom molekulske mase polisaharida koja je prikazana u tabeli 1 u primeru 1.

Primer 3

[0066] Primer 3 predstavlja drugi postupak za proizvodnju hemijski modifikovanih heparina prema pronalasku, modifikovanim direktnim izlaganjem jakom redukcionom sredstvu procesnog rastvora koji dolazi od koraka oksidacije, pre nego što se uvede bilo koji korak taloženja.

[0067] Količina od oko 3000 grama heparina je rastvorena u prečišdenoj vodi kako bi se dobio 10-20 % mas/v rastvor. pH ovog rastvora je podešen na 4,5-5,5. Natrijum metaperjodat (NaIO4) je naknadno dodat u procesni rastvor;, količina perjodata je 15-25% od mase heparina. pH je ponovo podešena na 4,5-5,5. Reaktor je pokriven kako bi zaštitio reakciju od svetlosti. Procesni rastvor je reagovao tokom 22 - 26 sati uz stalno mešanje i održavanje temperature na 13 - 17 °C. pH je na kraju reakcionog perioda izmerena i zapisana.

Redukcija oksidovane glukuronske/iduronske liseline i uklanjanje jedinjenja koja sadrže oksidovani jod

[0068] Dok se temperatura održava na 13-17 °C, pH rastvora je podešena na 5,5-6,5. Količina od 130-150 grama natrijum borhidrida se zatim dodaje u rastvor i rastvara, pH de odmah da poraste na pH od 10-11, i reakcija se nastavlja tokom 14-20 sati. Zapisuje se pH rastvora, i pre i posle reakcionog perioda. Posle ovog vremena reakcije, polako se dodaje razblažena kiselina da bi se podesila pH na vrednost od 4, ovo degradira/neutrališe preostali natrijum borhidrid. Nakon održavanja pH na 4 tokom 45 - 60 minuta, pH rastvora se podešava na 7 sa razblaženim rastvorom NaOH.

Uklanjanje jedinjenja koja sadrže jod

[0069] Etanol (95-99,5%) se dodaje u reakcionu smešu tokom perioda od 0,5 -1 sat, uz pažljivo mešanje i na temperaturi od 20 -25 °C. Zapremina etanola koji treba da se doda je u rasponu 1-2 zapremine etanola po zapremini procesnog rastvora. Oksidovanom heparinu se tada dozvoljava da se taloži i obrazuje sloj tokom 15 -20 sati, posle čega se matični rastvor dekantuje i ispušta.

1

[0070] Sledede, istaloženi sloj se rastvara u prečišdenoj vodi da se dobije 15-30% mas/v procesnog rastvora. Zatim se dodaje NaCl da se dobije koncentracija od 0,15-0,30 mol/litar u procesnom rastvoru. Mešanje se nastavlja još za 0,5 -1 sat dok se temperatura održava na 20 -25 °C. Naknadno se dodaje 1,0-2,0 zapremine etanola (95-99,5%) po zapremini procesnog rastvora u rastvor uz pažljivo mešanje, toko perioda od 0,5 -1 sat. Ovo taloži proizvod iz rastvora. Ovo taloženje nastavlja se >1 sat.

Kisela hidroliza za postizanje depolimerizacije polisaharidnih lanaca

[0071] Nakon što se matični rastvor dekantuje i ispušta, istaloženi sloj se rastvara dodavanjem prečišdene vode sve dok se ne dobije koncentracija procesnog rastvora od 15-30% mas/v.

[0072] Razblažena kiselina se dodaje u rastvor sve dok se ne dobije pH 3,0. Temperatura se drži na 50-55°C dok se rastvor meša tokom 5 do 10 sati. Napredak depolimerizacije može da bude praden pomodu procesnih analiza molekulske mase, pomodu GPC-HPLC-a kako bi se odredilo stvarno vreme potrebno za reakciju. Zatim se dodaje razblažen rastvor NaOH dok se ne dobije pH 7,0 i reakcioni rastvor ohladi na temperaturu od 13-17 °C. Zatim se dodaje natrijum hlorid NaCl do se ne dobije koncentracija od 0,2-0,3 mol/litar. Alternativno, da bi se na sličan način kontrolisala prosečna molekulska masa, može da se doda razblažena kiselina da se dobije pH 3,5, ali da bi se izveoo uporedivi nivo hidrolize procesno vreme je prošireno sa 5 na 8 do 9 sati, oba alternativna prinosa, prosečna molekulska masa se drži u rasponu specifikacija od 6,5 i 9,5 kDa.

[0073] Preostali proizvodni procesi ka proizvodu za lek sadrže na primer 150 mg/ml aktivnog sredstva hemijski modifikovanog heparina identično koracima opisanim u primeru 1.

[0074] Izvođenjem procesnih koraka prema primeru 3, dobija se hemijski modifikovan heparin sa raspodelom molekulske mase polisaharida koja je prikazana u tabeli 1 u primeru 1.

Tabela 3. Intenzitet signala prisutnih u<1>H-NMR spectru u poređenju sa heparinom u opsegu od 5 do

65 m

[0075] Tabela 3 je rezultat upoređivanja studija<1>H-NMR spektra u rasponu od 5,0 do 6,5 ppm, hemijski modifikovanih heparina proizvedenih prema primerima 1 do 3.

[0076] Tabela 3 potvrđuje da henijski modifikovan heparin koji je proizveden postupkom prema primeru 3 rezultuje<1>H-NMR spectrom bez prisustva neočekivanih signala u opsegu 5,90 ppm do 6,14 ppm što je ekvivalentno heparinu. Ovi signali pokazuju korelaciju sa delimično nezasidenim, strukturama sa dvostrukim vezama koje sadrže glukozamine, koje mogu biti podložne daljim hemijskim modifikacijama i doprineti obezbojavanju proizvoda. Drugim rečima, proces prema primeru 3, ne rezultuje neidentifikovanim ostacima ili strukturama koje su neočekivane u protonskim spektrima od uobičajenih heparina ili heparina niske molekulske mase.

[0077] Kako bi se potvrdilo da postupci prema pronalasku doprinose očuvanju željenog nivoa sulfatovanih lanaca polisaharida, izvedeni su testovi sa sulfatnom elektrodom za merenje na uzorcima procesne tečnosti iz koraka kisele hidrolize, t.j. uzorcima iz procesne tečnosti koji nisu podvrgnuti neposrednim narednim koracima obrade i prečišdavanja do proizvoda hemijski modifikovanog heparina. Rezultati pokazuju nivoe oslobođenih (izgubljenih) sulfata iz polisaharida uglavnom ispod 1500 ppm. Drugim rečima testovi potvrđuju da inventivni postupci izazivaju gubitak sulfatnih grupa koje ne prelaze jednu sulfatnu grupu po jedinici disaharida od 100 jedinica disaharida. Hemijski modifikovani heparini prema pronalasku sadrže jednu sulfatnu grupu po iduronskoj kiselini, I2S i 2 sulfatne grupe za preovladavajudu varijantu glukozamina, GlcNS. Shodno tome, hemijski modifikovani heparini prema pronalasku zadržavaju najmanje 90 % sulfatnih grupa koje odgovaraju heparinu.

[0078] Hemijski modifikovan heparin proizveden u skladu sa postupcima iz primera 3 i koji je izrađen do proizvoda pokazuje vrlo nisku apsorbancu na 400 nm (10% rastvor). Vrednosti apsorbance variraju između 0,02 AU i 0,04 AU za proizvod kada se podvrgne procesu uključujudi hidrolizu na pH 3,5 ili 3,0 respektivno. Niske vrednosti apsorbance potvrđuju da su efekti iz bilo koje nespecifične depolimerizacije u vezi sa obezbojavanjem od sporednih reakcija tipa Majlard (mereno kao apsorbanca na 400 nm) minimizirani i da se očekuje odgovarajuda stabilnost proizvoda hemijski modifikovanog heparina prema pronalasku.

Primer 4

Antihemostatski i antikoagulantni efekti

[0079] Studije o efektima na parametre koagulacije i na krvarenje DF02 izvedene su kod muških, odraslih i mladih, Sprague-Dawley pacova. Heparin i preparat LMWH (Fragmin) su takođe proučavani za poređenje. Osnovne procedure ispitivanja bile su sledede:

Petnaest minuta nakon i.v. doziranja testiranog proizvoda pacovima se pravi uzdužni rez dorzalno na srednjem delu repa. Rez je dugačak 9 mm i dubok 1 mm i standardizovan pomodu šablonskog uređaja. Krv je upijana iz reza sve dok krvarenje nije prestalo. Vreme tokom kojeg je vidljivo krvarenje može da se smatra merenjem, tokom do 25 minuta. Što je duže vreme krvarenja, to su izraženiji antikoagulantni efekti davanog sredstva.

Odrastao pacov

[0080] Četrdeset minuta nakon doziranja, pacovi su žrtvovani pomodu punog krvarenja. Citratom stabilizovana plazma je pripremljena iz krvi. Plazma se čuva u alikvotima od 1 ili 0,5 mL na - 70 °C do analiziranja na APTT i PT.

[0081] Slededa jedinjenja i doze su testirani (svaka u grupama od 8 pacova) kod odraslih pacova:

1

• Fiziološki rastvor: (Negativna kontrola)

• Heparin: 0,7, 1,5, 3,5, i 7,0 mg/kg

• Fragmin: 1,5, 3,5, 7,0 i 35 mg/kg

• DF02: 3,5, 7,0, 35, 70, 105, 210, 350 i 700 mg/kg

Mladi pacov

[0082] Slededa jedinjenja i doze su testirani (svaka u grupama od 8 pacova) kod mladih pacova starosti od 14 ±1 dan:

2. Fiziološki rastvor: (Negativna kontrola)

3. DF02: 7,0, 35, 70 i 105 mg/kg

[0083] Vreme krvarenja i parametri koagulacije kao što su mereni kod odraslih životinja otkrili su da DF02 ima smanjen antikoagulantni efekat kod pacova (vidi tabelu ispod). Snaga DF02 bila je manja nego kod antikoagulanata heparina i Fragmina, gde su oba imala efekte duboko povezane sa dozom na sve parametre koji su istraživani. Međutim, efekat DF02 na PT je bio suviše slab da dozvoli komparativnu procenu sa drugim tretmanima.

[0084] Utvrđeno vreme krvarenja i parametri koagulacije kod mladih životinja, ukazuju da DF02 ima smanjen antikoagulantni efekat i kod mladih pacova. Promena vremena krvarenja i parametara koagulacije kod mladih pacova je iste veličine kao i kod odraslih pacova. Kao i kod odraslih, efekat DF02 na PT takođe je bio slab i kod mladih pacova.

[0085] Procenjene ekvipotentne doze u odnosu na efekte na vreme krvarenja i APTT, normalizovane u odnosu na heparin, prikazane su u tabeli 3, ispod.

Tabela 3

[0086] Tabela 4 i 5 prikazuju podatke kako bi se pokazala prirodna aktivnost DF02 na parametre antikoagulacije u supstancama leka i proizvodu leka, resppektivno. Proizvod leka je formulacija DF02 u 150mg/ml u fosfatnom puferu; za kliničku upotrebu.

[0087] Izmerene vrednosti na proizvedenom DF02 za aktivnosti antifaktora IIa i antifaktora Xa pokazuju da je aktivnost manja od 10 IU/mg.

Tabela 4

1

[0088] Tabela 5 u nastavku pokazuje specifične antikoagulantne aktivnosti DF02 pomodu analiza antifaktora Xa i antifaktora IIa.

Tabela 5

[0089] Za poređenje, odgovarajuda vrednost za nefrakcionisani heparin (UFH) je najmanje 180 IU/mg.

Primer 5

Vezivanje DF02 za P-selektin, analizirano pomodu optičkog biosenzora

[0090] Cilj ove studije je bio da ispita vezujuda svojstva DF02 na humani P-selektin, rađene prema primeru 1. Vezujuda svojstva DF02 su upoređena sa onima od LMWH tinzaparina i od UFH. Tinzaparin je posebno izabran za ovo poređenje, jer je studija dvostruko slepe kontrole po principu slučajnog izbora za tinzaparin u srpastim VOC (Quari i ost 2007) pokazala da je značajno skratila vreme hospitalizacije isto kao i vreme trajanja najtežih bolnih pokazatelja.

Postupak

[0091] Šarža 342 nisko antikoagulantnog heparina DF02, je proizvedena pod GMP statusom dok su so heparin natrijuma (šarža 1035-0753farmaceutski kvalitet) i Tinzaparin natrium (Innohep®, 10, 000 anti-Xa IE/ml.) kupljeni. Derivati heparina su desalinizovani i prebačeni u radni pufer upotrebom desalinizujudih kolona. Molarne koncentracije eluata su određene pomodu analize sadržaja UA (mg/ml) koristedi fenilfenol postupak (Blumenkrantz i ost. 1973 Anal Biochem 54, 484-9). Prosečnu molekulsku masu (Mw) za DF02 je utvrdio Nacionalni institut za biološke standarde i kontrolu, UK, upotrebom gel propusne hromatografije (GPC-HPLC, Ph. Eur.) da bude 7,4 kDa (Mn=4,1 kDa, Mp=3,4 kDa). Mw za tinzaparin je određen i nađeno je da bude Mw=6,4 kDa (Mn=5,1 kDa, Mp=6,5 kDa). Najčešde korišdena vrednost za molekulsku masu heparina je 15 kDa iako nije mogude da se odredi pomodu metode GPC-HPLC. Ovaj broj se koristi da se izračuna približna molarna koncentracija UFH. Biomolekularne interakcije u realnom vremenu su analizirane pomodu tehnologije površinske plazmonske rezonance upotrebom instrumenta Biacore 2000 i Biacore 2000 softvera za kontrolu verzija 3.1.1. Podaci su analizirani pomodu BIA softvera za evaluaciju, verzija 3. Da bi se pripremio biosenzorski test, afinitet hvatanja prečišdenog kozjeg anti humanog IgG Fc antitela je imobilizovan na delu karboksimetil dekstran. Antitelo je injektirano u koncentraciji od 50 mg/ml u 50 mM natrijum acetatnom puferu, pH 5,0 tokom 12 min pri 20 ml/min, što dovodi do finalnog odgovora od približno 16,200 jedinica odgovora (RU) u protočnoj deliji 1 i 13,400 RU u protočnoj deliji 2. Preostale aktivirane grupe su blokirane ubrizgavanjem etanolamin-HCl. Himera P-selektin/Fc je uhvaden na površinu antitela u protočnoj deliji 2 (Bachelet L. i ost. 2009, Biochim et Biophys Acta 1790,1416), injektiranjem molekula pri koncentraciji od 35 ug/mL, koristedi radni pufer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0,005% Tween-20, pH 7,4, filtriran 0,02 mm) u mobilnoj fazi. Tipično, ovo je

1

rezultiralo odgovorom od oko 2000 RU. Vezivanje različitih derivata heparina za P-selektin je analizirano korišdenjem radnog pufera sa 20 ml/min. Nakon faze asocijacije i disocijacije svakog uzorka, regeneracija površine izvedena je korišdenjem radnog pufera koji sadrži 0,8 M NaCl. Podaci sa referentne površine su oduzeti od podataka sa površine P-selektina. Stabilnost površine P-selektina je potvrđena merenjem odgovora od injekcija od 0,1 mg/mL heparina na početku i na kraju svakog eksperimenta.

Rezultati

[0092] Podaci o odgovoru u stabilnom stanju prikazani su u odnosu na koncentraciju (podaci nisu prikazani). Podaci su analizirani korišdenjem nelinearne regresije, pod pretpostavkom vezivanja 1:1. Ova pretpostavka daje očigledne vrednosti KD od 0,7 mM za DF02, 4 mM za tinzaparin i 0,2 mM za heparin. Maksimalna vrednost (Mp) je korišdena umesto (više) Mw vrednosti kada se računala molarna koncentracija UFH. Ovo dovodi do precenjivanja molarnih koncentracija koje su korišdene u eksperimentu kao i do precenjivanja vrednosti KD za UFH.

[0093] U zaključku, DF02, isto kao i UFH i LMWH tinzaparin, vezuje se za human P-selektin in vitro. Očigledne vrednosti KD su bile redom tinzaparin>DF02>UFH. Podaci sugerišu da veda prosečna molekulska masa derivata heparina rezultuje višim vidljivim afinitetom(ili aviditetom) na površinu P-selektina, i da vezivanje ne zavisi od antikoagulantne aktivnosti heparina.

Primer 6

Adhezija srpastih crvednih krvnih zrnaca in vitro

[0094] Da bi se utvrdila terapeutska efikasnost kod SCD, in vitro je ispitivana sposobnost DF02 da inhibira adheziju srpastih crvenih delija (SS RBC) za delije endotela. Aktivnost DF02 je upoređena sa inhibitorna monoklonalna antitela P-selektina kao i sa LMWH tinzaparinom. Tinzaparin je specjalno odabran kao studija dvostruko slepe kontrole po principu slučajnog izbora za tinzaparin u srpastim VOC pokazala da je značajno skradeno vreme hospitalizacije isto kao i vreme trajanja najtežih bolnih pokazatelja.

Postupak

[0095] Primarni HUVEC-i (samo pasus 4) su kultivisani za konfluenciju na mikroskopskim pločicama obloženim želatinom u Eagle bazalnom medijumu 2 (EBM2; Clonetics, Walkersville, MD) dopunjenom sa medijumom endotelnog rasta 2 (EGM2; Clonetics, Walkersville, MD). Za svaki ogled, mikroskopska pločica obložena želatinom sa HUVEC-om poraslim do pokrivenosti je postavljena unutar visoko graduisanih protočnih komora. Mikroskopske pločice i netretirane i stimulisane IL-13/histaminom su početno proučavane sa svakim uzorkom SS RBC. Kasniji eksperimenti zatim upoređuju adheziju sa i bez potencijalnih inhibitora adhezije. Pored toga, tinzaparin je korišden za poređenje anti adhezivne aktivnosti DF02 i blokirajuda i neblokirajuda antitela za P-selektin su korišdena kao kontrole za potvrđivanje adhezije SS RBC na P-selektin.

[0096] Uzorci humane krvi kod pacijenata koji su homozigotni za hemoglobin S sakupljeni su u citratne kivete. SS RBC-i su odvojeni od tankog sloja na koagulumu pomodu gravitacije na 4°C tokom najmanje 2 sata, i SS RBC-i su zatim oprani 4 puta u sterilnoj PBS sa 1,26 mM Ca2+ i 0,9 mM Mg2+

1

(pH 7,4). Pakovani SS RBC-i su fluorescentno obeleženi za studije adhezije kao što je prethodno opisano (Zennadi i ost 2004).

Sistem testiranja: Metodologija protočne komore

[0097] In vitro studije adhezije delija koje su izložene uslovima tečenja predstavljaju događaje in vivo, u poređenju sa testovima adhezije u kojima se delijama jednostavno dozvoljava da inkubiraju prekrivene na hemijskom ili delijskom supstratu (npr. laminin ili endotelne delije) i zatim ih operu bilo nekotrolisanim silama (npr. pranje pipetama) ili kontrolisanim silama (npr. uređaji rotacionog kretanja). Protočne komore mogu da proizvode bilo konstantno naprezanje na smicanje kroz komoru ili promenljivo naprezanje na smicanje, proizveden stvaranjem promenljive visine za komoru.

Potvrda ekspresije P-selektina pomodu endotelnih delija nakon stimulacije sa IL-13 i histaminom, upotrebom indirektne imunofluorescencije i analizama protočne citometrije.

[0098] Površinska ekspresija P-selektina na IL-13 i histaminom stimulisane i nestimulisane endotelne delije (HU-VECs) testirana je protočnom citometrijom. Merenje sposobnosti SS RBC da prijanja za ove endotelne delije je fršeno u protočnim komorama. Eksperimenti negativne kontrole uključivali su netretirane endotelne delije, tako da se može uporediti adhezija SS RBC na tretirane i netretirane delije. Uopšteno, najmanje 5 uzoraka SS RBC-a od pacijenata je testirano u svakom setu uslova, koristedi različita razblaženja DF02, sa kontrolnim eksperimentima kao što je gore opisano.

Stimulacija ekspresije P-selektina pomodu humanih endotelnih delija umbilikalne vene

[0099] Sprovedeni su eksperimenti za pronalaženje višestrukih doza. Zavisnost adhezije SS RBC na P-selektin takođe je pokazana korišdenjem monoklonalnog anti P-selektin antitela 9E1 za inhibiciju adhezije SS RBC na IL-13+histamin stimulisani HUVEC-e.

Rezultati

[0100] Sveobuhvatno, DF02 je bio sposoban da inhibira adheziju SS RBC na endotelne delije trtirane sa IL-13 i histaminom, i ova inhibicija pokazuje skroman odnos doza - odgovor (slika 5). Adhezija na HUVEC-e stimulisane sa IL-13 i histaminom bila je veda od adhezije slično stimulisanim HUVEC-ima prethodno tretiranim sa DF02 od 100, 200, 400 i 600 mg/ml (p = 0,047, 0,031, 0,094, 0,065) respektivno, upotrebom uparenog t-testa u kome je svaki uzorak pacijenta bio upoređen samo sa sobom pre tretmana sa DF02. U sličnoj analizi, 7,5 mg/ml funkcionalnog P-selektin blokirajudeg monoklonalnog antitela 9E10 takođe je značajno smanjilo adheziju (p=0,038, slika 5).

[0101] Kao što je ilustrovano na slici 6A, gde su prikazani grafici uzoraka, događaji adhezije su kvantifikovani kod višestrukih naprezanja na smicanje. Pošto osnovna adhezija različitih SS RBC-a kod pacijenata veoma varira, najvažnije je upoređivanje SS RBC-a svakog pacijenta na različitim nivoima naprezanja na smicanje i pre i posle tretmana sa DF02. Inhibicija je bila izraženija kod vedih doza DF02 i kod pacijenata sa vedom osnovnom adhezijom (slika 6B). Ako se podele na visoke i niske grupe adhezije onda je statistički značajna razlika u koncentraciji od 100 mg/ml DF02 (p = 0,02), pri čemu se visoka adheziona grupa bolje odazvala na tretman. U takvim analizama, 100 mg/ml DF02 takođe je pokazalo da inhibira adheziju isto koliko to čine i više koncentracije (slika 6B).

1

[0102] DF02 je inhibirao adheziju SS RBC kao što je detaljno prikazano na slici.7. Iako je bilo manje adhezivnih događaja pri višim naprezanjima na smicanje, efekat DF02 je bio sličan (podaci nisu prikazani). Ipak, mali efekat je primeden kada je DF02 korišden pri 10 i 50 mg/ml, dok je efekat od 100 mg/ml bio lako primetan.

[0103] DF02 je takođe upoređivan sa tinzaparinom zbog njegove sposobnosti da inhibira adheziju SS RBC na delije endotela. Uopšte, tinzaparin je bio prilično efikasan u smanjenju adhezije SS RBC. Za vedinu uzoraka, DF02 od 400 mg/ml je bio ekvivalentan istoj koncentraciji tinzaparina (vidi slike 8A i B, sa slikom 7).

Zaključak

[0104] Ukratko, DF02 je aktivan kao inhibitor adhezije SS RBC na delije endotela najverovatnije preko P-selektina. Izvor varijabilnosti mogle bi da budu delije pacijenata, pošto njihove ekspresije liganada za različite receptore adhezije endotelnih delija endothelial cell adhesion receptors, uključujudi P-selektin i αvβ3, mogu da variraju. Pored toga, stanje aktivacije receptora adhezije eritroida može da varira među pacijentima. Ipak, skoro svi uzorci pacijenata okazuju manje adhezije u prisustvu DF02, i stepen inhibicije adhezije je generalno izraženiji kod uzoraka kojisadrže visoko adherentne delije. DF02 je sredstvo protiv adhezije korisno kod SCD, kako za smanjenje adhezije RBC-a tako i za potencijalno smanjenje adhezije leukocita, za koje je takođe pokazano da je bar delimično zavisna od selektina.

Primer 7

In vivo funkcionalan vazo-okluzioni model

[0105] Da bi se verifikovali podaci u prethodno predstavljenim in vitro primerima, DF02 je procenjen korišdenjem životinjskog modela vazo-okluzije srpastih delija. Cilj istraživanja je bio da se istraži aktivnost DF02 u blokiranju adhezije srpastih crvenih delija i vazo-okluzije srpastih delija koristedi in vivo oglede adhezije srpastih crvenih delija (SS RBC) na endotel, sa ili bez infuzije DF02, ili pozitivne ili negativne kontrole, u vazo-okluzionom modelu golih miševa sa prozorskim komorama.

Postupak

[0106] Ovi eksperimenti koriste ranije opisan životinjski model (Zennadi i ost. Blood 2007), u kojem se prozorske komore prvo implantiraju u bokove golih miševa. Tri do pet dana kasnije, ljudske normalne ili srpaste crvene delije su ubrizgane u miša (obično kroz repnu venu) prethodno tretirane sa TNF-α (da se izazove upala i povedanje odgovora na ekspresiju Pselektina); miševi tretirani samo sa nosačem mogu da budu proučavani kao kontrole. Ženke miševa (nu-/nu-) starosti 8-12 nedelja od Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, korišdene su za izvođenje opisanih eksperimenata.

[0107] RBC-i koje treba infuzirati su prethodno obeležene sa fluorescentnom bojom. Athezija delija se zatim može posmatrati u subdermalnim krvnim sudovima vidljivim kroz prethodno implantirane prozorske komore. Da bi se utvrdila sposobnost DF02 da inhibira adheziju RBC, miševi tretirani saTNF-α su primili putem infuzije DF02 ili kontrolnim reagensom pre infuzije sa SS ili normalnim RBC-ima. Dodatno, u nekim od ovih eksperimenata, uzorci krvi su uzimani tokom perioda posmatranja kako bi se kvantifikovale specifične varijable, kao što je preživljavanje delija. Ovaj model ima velike prednosti tako što obezbeđuje direktnu vizuelizaciju delija u kontekstu celokupne krvi i

2

omogudavanja cirkulacije pretočenih delija pod normalnim cirkulacionim pritiscima. Osim toga, mi smo prethodno pokazali da humane srpaste crvene delije koje prijanjaju za endotel, indukuju adheziju leukocita, i izazivaju vazo-okluziju u ovom modelu. Na kraju, pokazali smo da nema primetljivog imunog klirensa humanih crvenih delija kod ovih nu/nu miševa.

Rezultati

[0108] Ispitivanja efekta DF02 na vazo-okluziju proučavana su injektiranjem DF02 i pre i posle indukcije vazo-okluzije. U ovom modelu sistema, zauzetost prilepljenih SS-RBC-a može da se kvantifikuje kao i protok krvi. The model shows inhibition and reversal of adhered SS-RBC by DF02 and a partial normalization of the blood flow.

[0109] Zauzetost krvnih sudova; mera SS-RBC sposobnosti da se veže na zid krvnog suda, smanjena je za 50% pomodu injektiranja DF02, u poređenju sa injekcijom fiziološkog rastvora (slika .9A).

[0110] Osim toga, kada se kvantifikuje broj krvnih sudova koji su dostigli normalizovan protok krvi otkriven je efekat zavisan od doze kada se životinje tretiraju sa DF02 (slika 9B).

Claims

Patentni zahtevi 1. Hemijski modifikovan heparin za upotrebu u lečenju bolesti srpastih delija, gde hemijski modifikovan heparin ima aktivnost antifaktora IIa manju od 10 IU/mg, aktivnost antifaktora Xa do 10 IU/mg i prosečnu molekulsku masu od 6,5 do 9,5 kDa, gde polisaharidni lanci: (i) zadržavaju najmanje 90%, sulfatnih grupa odgovarajudeg nativnog heparina; (ii) imaju redukciju u hemijski intaktnim pentasaharidnim sekvencama obezbeđujudi antikoagulantni efekat posredovan antitrombinom, kada se porede sa polisaharidnim lancima nativnog heparina; (iii) imaju redukciju u jedinicama nesulfatovane iduronske i/ili glukuronske kiseline kada se porede sa nativnim heparinom; gde je preovladavajudi disaharid polisaharida disaharid koji ima hemijsku strukturu:

gde je R’ treonatni ostatak; i n je ceo broj od 2 do 25, tako da sadrži 2 do 25 disaharidnih jedinica koje odgovaraju molekulskim masama od 1,2 do 15 kDa; i gde hemijski modifikovan heparin nema, u<1>H-NMR spektru, neidentifikovane signale u opsegu 0,10-2,00 ppm, 2,10-3,10 ppm i 5,70-8,00 ppm vede od 4 procenta kada se poredi sa visinom signala prisutnog u nativnom heparinu na 5,42 ppm.
2. Hemijski modifikovan heparin prema zahtevu 1, gde pretežno zastupljeni polisaharidni lanci imaju od 6 do 16 disaharidnih jedinica sa molekulskom masom od 3,6 do 9,6 kDa.
3. Hemijski modifikovan heparin prema zahtevima 1 ili 2, gde najmanje 30% polisaharidnih lanaca ima molekulsku masu od najmanje 8 kDa.
4. Hemijski modifikovan heparin prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koji sadrži glikolnopodeljene ostatke hemijske strukture:
5. Hemijski modifikovan heparin prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde 3-15% polisaharidnih lanaca ima molekulsku masu od najmanje 15 kDa.
6. Hemijski modifikovan heparin prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde od 25-47% polisaharidnih lanaca ima molekulsku masu od najmanje 9 kDa.
7 Hemijski modifikovan heparin prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde od 40-60% polisaharidnih lanaca ima molekulsku masu od najmanje 7 kDa.
8. Hemijski modifikovan heparin prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde od 60-80% polisaharidnih lanaca ima molekulsku masu od najmanje 5 kDa.
9. Hemijski modifikovan heparin prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde najmanje 85% polisaharidnih lanaca ima molekulsku masu od najmanje 3 kDa.
10. Hemijski modifikovan heparin prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde najmanje 95% polisaharidnih lanaca ima molekulsku masu od najmanje 2 kDa.
11. Hemijski modifikovan heparin za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 10, gde bolest srpastih delija sadrži vazo-okluzivnu krizu.