RS57215B1 - Humanizovana antitela koja ciljaju ec1 domen kadherina-11 i kompozicije i postupci koji su u vezi sa njima - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Pacijenti sa uznapredovalom hroničnom inflamacijom zglobova pate od propadanja zglobova sa ozbiljnim simptomima uključujudi destrukciju kosti i hrskavice, što dovodi do dugotrajnog bola, deformiteta, gubitka funkcije zgloba, smanjene pokretljivosti i skradenog životnog veka. Inflamacija zgloba je povezana sa povedanim brojem delija i inflamatornih supstanci u zglobu, što prouzrokuje iritaciju, trošenje hrskavice i oticanje delija koje oblažu zglob. Poznato je da nekoliko različitih autoimunskih poremedaja pokrede neodgovarajudu ili pogrešno usmerenu inflamaciju u zglobu, što vodi do hronične inflamacije u zglobovima individua koje pate od ovih poremedaja. Uobičajeni inflamatorni poremedaji zglobova uključuju reumatoidni artritis, psorijazni artritis, Rejterov sindrom i ankilozirajudi spondilitis.

[0002] Reumatoidni artritis (RA) je najuobičajenija forma inflamatornog artritisa i procenjeno je da pogađa približno 1 procenat U.S. populacije, ili oko 2,1 miliona amerikanaca. RA je hronična bolest koja se karakteriše inflamacijom sloja delija koji oblažu zglobove, ili sinovijuma, zglobova, i tokom vremena mogu da dovedu do značajnog oštedenja kostiju i hrskavice. RA je više zastupljen kod žena nego kod muškaraca i koliko 3% žena može da razvije reumatoidni artritis tokom vremena. Trenutno, uzročnik RA nije poznat.

[0003] RA može da dovede do tajnog oštedenja zgloba, što ima za rezultat hroničan bol, gubitak funkcije i invaliditet. Dodatno, nedavna istraživanja ukazuju na to da ljudi sa RA, posebno oni čija bolest nije dobro kontrolisana, mogu da imaju vedi rizik od oboljenja srca, srčanog udara i razvoja fibroze, posebno fibroze pluda.

[0004] Fibroza pluda, uključujudi idopatsku pludnu fibrozu i fibrozu koja je indukovana zračenjem, kao i fibrozu koja je prouzrokovana konzumiranjem cigareta, izlaganjem hemijskim supstancama, skleroderma, sarkoidoza, terapeutsko zračenje, RA, ili lupus, pogađa 5,000,000 pacijenata širom sveta, i preko 500,000 individua u U.S. 5-godišnja smrtnost od idiopatske pulmonarne fibroze je približno 80%, uzimajudi u obzir 40,000 smrti godišnje samo u U.S. Trenutno ne postoji odobrena terapija za idiopatsku pulmonarnu fibrozu u U.S. ili u Evropi.

[0005] Prema tome, fibroza i hronična inflamacija zgloba prouzrokovana od strane RA i drugih inflamatornih stanja su međunarodna zdravstvena opteredenja. Postoji potreba za razvijanjem novih sredstava za sprečavanje i lečenje ovih i drugih poremedaja.

[0006] US 2009/0253200 A1 prikazuje antagoniste Kadherina-11 i kompozicije koje sadrže antagoniste Kadherina-11, i njihovu upotrebu za lečenje inflamatornih poremedaja zglobova kod sisarskog subjekta.

SUŠTINA PRONALASKA

[0007] Predmeta pronalaska je prikazan u izloženim zahtevima.

[0008] Pronalazak se odnosi na humanizovnao antitelo koje specifično vezuje EC 1 domen sisarskog proteina Kadherina-11, koje obuhvata varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO:69 i varijabilni region lakog lanca antitela koj sadrži SEQ ID NO:71. Humanizovano antitelo antagonizuje sisarski protein Kadherin-11.

[0009] Predmetni pronalazak obezbeđuje nova sredstva i terapije koje imaju poboljšanu efikasnost u lečenju inflamacije i drugih stanja koja su povezana sa Kadherinom-11 kod ljudi.

KRATAK OPIS SLIKA

[0010] Patent ili patentna prijava sadrži najmanje jednu sliku u boji. Kopije ovog patenta ili objave patentne prijave sa slikom(a) u boji de biti obezbeđene od Zavoda po zahtevu i izvršenoj uplati neophodne takse.

SL.1A je Western blot koji prikazuje Kadherin-11 -EC1-5 -Fc fuzionog proteina upotrebom anti-Cad-11 antitela 23C6, 13C2 i 27F3 (vidi čvrste strelice). Ova antitela ne prepoznaju Kadherin-11-EC1-Fc i Kadherin-11-EC1/2-Fc fuzione proteine koji su takođe prisutni na membrani (vidi otvorene strelice za pozicije Kadherina-11-EC1-Fc i Kadherina-11-EC1/2-Fc proteina na blotu).

SL. 1B je grafik koji predstavlja vezivanje dostupnih Kadherin-11 antitela 13C2, 23C6 i 5F82 za humani Cad-11-EC1-5-Fc fuzioni protein, ali ne za Cad-11-EC1-Fc fuzioni protein, kao što se određuje ELISA testom. Suprotno, EC1 antitelo H1M1 vezuje oba i Cad-11-EC1-Fc fuzioni protein i Cad-11-EC1-5-Fc fuzioni protein.

SL.2 je poravnanje sekvence aminokiselina prvih 34 aminokisleina EC1 domena humanog Cad-11 (SEQID NO:3), MN-Cad (SEQ ID NO:4), i Cad-8 (SEQ ID NO:5) koje su uključene u vezivanju kadherina. Donorske sekvence koje sadrže ostatke koji ulaze u džep receptora kadherina su podvučene na levoj polovini sekvence i ostaci sekvence iz džepa su podvučeni na desnoj polovini sekvence kod SEQ ID NO:3.

SL. 3 je grafik koji predstavlja vezivanje Fab Kadherina-11 za humani peptid Cad-11 EC1 domena kao i za Cad-11-EC1-Fc fuzioni protein, ali ne za Cad-8 ili MN-Cad EC1 peptide domena, kao što se određuje ELISA testom. Klon 7 pokazuje značano vezivanje za Cad-11 EC1 peptid domena i fuzioni protein, ali ne za peptide MN-Cad ili Cad-8 EC1 domena.

SL. 4 je grafik koji predstavlja podatke iz in vitro testa nakupljanja delija koje posredovano sa Cad-11. U medijum se dodaju antagonisti Cad-11, tako da Fab koji nastaje iz anti-Cad-11 antitela 13C2, ili različitih koncentracija anti-Kadherin-11EC1 Fab usmerenog prema prvih 35 aminokiselinama EC1 domena Kadherina-11 (naznačeno EC1 Fab klon 7), blokira nakupljanje delija 431D posredovano sa Cad-11. Anti-Kadherin-11 EC1 Fab (klon 7) inhibira nakupljanje delija A-431-D-11 epidermoidnih karcinoma na svim koncentracijama koje se testiraju u opsegu 0,3 µg/ml do 10 µg/ml. Suprotno, Fab koji nastaje od 13C2 anti-Kadherin-11 antitela inhibira nakupljanje delija samo na koncentraciji od 10 µg/ml.

SL. 5 je grafik koji predstavlja podatke iz drugog in vitro testa nakupljanja delija koje posredovano sa Cad-11. Procenat nakupljanja 431-D-11 delija je prikazan na 40 min. nakon dodavanja ili SME medijuma (naznačena kontrola), različitih koncentracija fuzionog proteina koji sadrži EC1 domen Cad-11 koji je fuzionisan sa humanim IgG2 zglobom, CH2 i CH3 domenima (naznačenim Cad-11-EC1-Fc), različitim koncentracijama anti-Cadherin-11 EC1 Fab koji je usmeren prema prvih 35 aminokiselina EC1 domena Kadherina-11 (naznačenim Cad-11 EC1 Fab) ili različitim koncentracijama kontrolnog antizelenog fluorescentnog proteina (anti-GFP) Fab (naznačeno GFP fAb). Anti-Kadherin-11 EC1 Fab (klon 7) inhibira nakupljanje 431D delija koje eksprimiraju Cad-11 u koncentacijama 3 µg/ml, 1 µg/ml i 0,1 µg/ml. EC1- Fc fuzioni protein inhibira nakupljanje 431-D-11 delija u koncentracijama 3 µg/ml. Suprotno, anti-GFP Fab značajno ne inhibira nakupljanje delija na bilo kojim ispitivanim koncentrcijama.

SL. 6 je grafik koji predstavlja inhibiciju nakupljanja delija koja je posredovana sa Cad-11 pomodu različitih anti-Cadherin-11 EC1 Fab-a koji imaju specifičnost vezivanja samo za Cad-11 (EC1 fAb klon 7 i klon 4), Cad-11 i Cad-8 (EC1 fAb klon 6), ili Cad-11 i MN-Cad (EC1 fAb klon 5), upotrebom in vitro testa delijskog nakupljanja. Svi testirani Fab-i inhibiraju nakupljanje 431-D-11 delija u odnosu na kontrolu (D-11 SME; levi stubid).

SL. 7 je grafik koji predstavlja inhibiciju nakupljanja delija koja je posredovana sa Cad-11 pomodu anti-Cad-11 Fab-a koji imaju specifičnost vezivanja samo za Cad-11 (EC1 fAt klon 7), ili Cad-11 i MN-Cad (EC1 fAt klon 8), upotrebom in vitro testa delijskog nakupljanja. Specifičnost ispitanih Fab-a je prikazana u zagradama pored svake znaznake za Fab. Oba Fab-a koji su specifični za kadherin inhibiraju nakupljanje delije (srednji i desni stubidi) u odnosu na kontrolni Fab koji je speficičan za GFP (desni stubid).

SL. 8 pokazuje nukleotidnu (DNK) sekvencu (SEQ ID NO:6) humanog Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1 fuzionog proteina (Cad-11-EC1-Fc). Sekvenca humanog ekstradelijskog domena Kadherina-11 je prikazana kosim slovima, sekvenca kodirana sa BglII mestom je podvučena, i sekvenca koja kodira humani IgG2-Fc1 region je prikazana tamnim slovima.

SL.9 pokazuje sekvencu aminokiselina (SEQ ID NO:7) humanog Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1 fuzionog proteina (Cad-11-EC1-Fc). Sekvenca humanog ektradelijskog domena Kadherina-11 je prikazana kosim slovima, sekvenca kodirana sa BglII mestom je podvučena, i sekvenca humanog IgG2-Fc1 regiona je prikazana tamnim slovima.

SL. 10 je prikaz SDS poliakrilamidnog gela koji je obojen sa Coomassie Blue, koji pokazuje intenzivne trake koje odgovaraju monomernom obliku prečišdenih Cad-11-EC1-hIgGz-Fc1 (srednja linija) i Cad-11-EC1/2-hIgG2-Fc1 (desna linija) fuzionih proteina, redom, nakon čega sledi prečišdavanje iz medijuma delijske kulture upotrebom kolone koja sadrži protein A. Standardi molekulskih masa su prikazani u levoj liniji.

SL.11 je Western blot koji pokazuje detekciju humanih Cad-11-EC1-hIgG2-Fc1 (srednja linija) i Cad-11-EC1/2-hIgG2-Fc1 (desna linija) fuzionih proteina upotrebom anti-humanog IgG antitela konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP). Glavna uočena traka u svakoj liniji odgovara položaju monomernih oblika fuzionih proteina. Takođe je vidljiv položaj dimernih oblika fuzionih proteina (vidi manje intenzivne trake sa vedom molekulskom masom), zbog nekompletnih uslova redukcije. Standardi molekulskih masa su prikazani u levoj liniji.

SL. 12 je grafik koji predstavlja da Cad-11-EC1-Fc fuzioni protein i mišje anti-Cad-11 antitelo, 13C2, inhibira invaziju humanih sinoviocita sličnih fibroblastu koji ekprimiraju Cad-11 u čep od matrigela i naznačene koncentracije u poređenju sa netretiranim delijama, obeleženo sa Invazija. Podaci su obuhvadeni iz dva nezavisna ekperimenta.

SL-e. 13A i B su grafici koji predstavljaju podatke dva in vitro testa nakupljanja delija posredovanog Cad-11. Procenat nakupljanja 431D delija koje ekprimiraju Cad-11 je prikazan na 40 min. nakon dodavanja ili SME medijuma (naznačena kontola) ili Cad-11 fuzinog proteina. SL.

13A pokazuje inhibiciju nakupljanja u prisustvu različitih koncentracija fuzionog proteina koji sadrži 5 ekstradelijskih domena Cad-11 fuzionisanog sa humanim IgG2 zglobom, CH2 i CH3 domenima (naznačeno sa Cad-11-EC1-5-Fc). SL. 13B pokazuje inhibiciju nakupljanja na različitim koncentracijama fuzionog proteina koji sadrži ili N-terminalni ekstradelijski domen (EC1 domen) Cad-11 koji je fuzionisan sa humanim IgG2 zglobom, CH2 i CH3 domenima (naznačenim sa Cad-11-EC1-Fc) ili Cad-11-EC1-5-Fc.

FIGS. 14A-C pokazuje kDNK sekvencu humanog Kadherina-11 (SEQ ID NO:1; vidi Genbank pristupni broj NM001797).

SL. 15 pokazuje proteinsku ekvencu humanog Kadherin-11 (SEQ ID NO:2; vidi Genbank pristupni broj NP001788).

SL.16 je grafik koji predstavlja nivo vezivanja antitela u medijumu peptida 4 hibridoma (HL), ili medijuma kontrolnog hibridoma (Media), za proteine koji sadrže EC1-2 domene Cad-11, Cad-8 ili MN-Cad, kao što se određuje ELISA testom.

FIGS. 17A-C su reprezentativni grafici intenziteta delijskog bojenja (MFI; srednja vrednost intenziteta fluorescencije) kao mere vezivanja H14 a antitela za 431-D delije koje ekprimiraju Cad-11.

FIGS.17D-F su reprezentativni grafici koji predstavljaju odsustvo 431-D delijskog bojenja (MFI; srednja vrednost intenziteta fluorescencije) u odnosu na SL-e. 17A-C, što ukazuje na nedostatak vezivanja H14 antitela za delije koje ne ekprimiraju Cad-11.

SL-e. 17G-I su reprezentativni grafici intenziteta delijskog bojenja (MFI; srednja vrednost intenziteta fluorescencije) kao mere vezivanja H1M1 antitela za 431-D delije koje ekprimiraju Cad-11.

SL. 18A je grafik koji predstavlja vezivanje H14 antitela za delije koje eksprimiraju Cad-11, i odsustvo vezivanja H14 za kontrolne delije koje ne ekprimiraju Cad-11, na različitim koncentracijama antitela, kao što se meri intenzitetom delijskog bojenja (MFI; srednja vrednost intenziteta fluorescencije).

SL. 18B je grafik koji predstavlja vezivanje H1M1 antitela za delije koje eksprimiraju Cad-11, i odsustvo vezivanja H1M1 za kontrolne delije koje ne ekprimiraju Cad-11, na različitim koncentracijama antitela, kao što se meri intenzitetom delijskog bojenja (MFI; srednja vrednost intenziteta fluorescencije).

SL. 19A je grafik koji predstavlja stepen vezivanja H14 anti-Cad-11 antitela za Cad-11 i Cad-8 peptide EC1 domena na različitim koncentracijama, kao što se određuje testom ELISA.

SL. 19B je grafik koji prikazuje odsustvo vezivanja H14 anti-Cad-11 antitela za EC1 peptide domena Cad7, MNCad, Cad9, Cad18, Cad20 ili Cad24 EC1 na različitim koncentracijama, kao što se određuje testom ELISA.

SL. 20 je grafik koji predstavlja vezivanje H1M1 anti-Cad-11 antitela za EC1 domene Cad-11, Cad-8, Cad-7, MN-Cad, Cad-9, Cad-18, Cad-20 i Cad-24 peptida na različitim koncentracijama, kao što se određuje testom ELISA.

SL. 21A je grafik koji predstavlja stepen vezivanja H1M1 anti-Cad-11 antitela za različite EC1 domene Cad-11 peptidnih imunogena (PEP1, PEP2, PEP3 i PEP4), kao i Cad-11 EC1 domen fuzionog proteina (EFL) i humane IgG kontrole (Fc blok), kao što se određuje testom ELISA.

SL. 21B je grafik koji predstavlja stepen vezivanja H14 anti-Cad-11 antitela za različite EC1 domene Cad-11 peptidnih imunogena (PEP1, PEP2, PEP3 i PEP4), kao i Cad-11 EC1 domen fuzionog proteina (EFL) i humane IgG kontrole (Fc blok), kao što se određuje testom ELISA.

SL. 22 je šematski dijagram koji predstavlja sekvencu prvih 37 aminokiselina EC1 domena humanog Kadherina-11 i delovi ove sekvence su obuhvadeni svaki sa peptidima 1-4. Ostaci aminokiselina koje dele peptidi 2 i 4 su uzvodno od Peptida 3 i naznačeni su okvirom. Aminokiseline koje su direktno uključene u vezivanje Cad-11 sa Cad-11 su podvučene.

SL. 23A je fotografija koja prdstavlja velike mase nakupljenih delija koje ekprimiraju Cad-11 koje su tretirane kontrolom izotipskog antitela.

SL.23B je fotografija koja pokazuje male nakupine H1M1-tretiranih delija koje ekprimiraju Cad-11 koje dalje ne obrazuju vede mase koje se uočavaju kod SL.23A.

SL.23C je fotografija koja pokazuje da netretirane parentalne delije koje ne ekprimiraju Cad-11 ostaju kao grupe pojedinačnih ili dvostrukih delija.

SL.24A je fotografija koja predstavlja kulturu delija koje ekprimiraju Cad-11 sa velikim masama nakupljenih delija.

SL. 24B je fotografija koja predstavlja kulturu delija koje eksprimiraju Cad-11 sa prvenstveno pojedinačnim delijama sa malim i retkim klusterima delija u odnosu na prikazane u SL. 24A nakon tretmana sa H14 Cad-11 antitelom specifičnim za EC1.

SL. 25 je grafik koji pokazuje inhibiciju oticanja zgloba u vezi sa artritisom kod miševa koji su tretirani sa rastudim dozama H1M1 anti-Cad-11 antitela u odnosu na netretirane kontrolne miševe.

SL. 26 je grafik koji pokazuje inhibiciju oticanja zgloba u vezi sa artritisom kod miševa koji su tretirani sa 0,3 µg ili H14 ili H1M1 anti-Cad-11 antitelima svaki drugi dan u odnosu na netretirane kontrolne miševe.

SL. 27 je grafik koji pokazuje da tretman sa 0,3 µg ili H1M1 ili H14 antitelom odlaže početak razvoja artritisa u mišjem modelu u poređenju sa netretiranom kontrolom.

SL. 28 je grafik koji prikazuje stepen vezivanja medijuma koji sadrži antitelo iz peptid 3 hibridoma (HL), ili medijuma kontrolnog hibriodma (Media), za EC1-2 domene Cad-11, Cad-8, i MN-Kadherin, ili Cad-11 EC1-Fc fuzini protein.

SL. 29 je grafik koji prikazuje stepen vezivanja anti-Cad-11 antitela iz peptid 3 hibridoma za delije koje ekprimiraju humani Cad-11 protein (vidi strelicu) i kontrolne delije koje ne ekprimiraju Cad-11 ved eksprimiraju Neos.

SL.30A je fotgrafija koja predstavlja sinoviocite slične fibroblastima (FLS) koje su inkubirane sa medijumom. Uočavaju se nakupljene delije i delije koje se udružuju tokom delijskih procesa.

SL. 30B je fotografija koja predstavlja FLS koji je inkubiran sa 30 µg/ml kontrolnim antitelom. Uočavaju se nakupljene delije i delije koje se udružuju tokom delijskih procesa.

SL. 30C je fotografija koja predstavlja FLS inkubiran sa 30 μg/ml H1M1 antitela. Nekoliko nakupina delija i delijski procesi su vidljivi.

SL. 31 je grafik koji predstavlja inhibiciju invazije FLS u membranu obloženu sa matrigelom nakon kontakta sa H1M1 antitelim u odnosu na kontrole, uključujudi druga Cad-11 antitela koja se vezuju izvan EC1 regiona.

SL.32 je grafik koji predstavlja inhibiciju oticanja zgloba u KBN mišjem modelu artritisa nakon davanja H1M1 antitela u odnosu na kontrolu.

SL. 33 predstavlja nukleotidne i u skladu sa tim izvedene sekvence aminokiselina varijabilnog lakog lanca H1M1. CDR definicije i obležavanje proteinskih sekvenci je prema Kabat-u. CDR Nukleotidne i proteinske sekvence CDR su naznačene sivom bojom.

SL. 34 predstavlja nukleotidne i u skladu sa tim izvedene sekvence aminokiselina varijabilnog lakog lanca H1M1. CDR definicije i obležavanje proteinskih sekvenci je prema Kabat-u. Nukleotidne i proteinske sekvence CDR su naznačene sivom bojom.

SL-e. 35A-H predstavljaju nukleotidne i sekvence aminokiselina 5 VH lanaca (A-E) (SEQ ID Nos.:60-69) i 3 VK lanaca (F-H) (SEQ ID Nos.:70-75) koje se koriste za dizajn H1M1/SYN0012 humanizovanih varijanti anti-Cad-11 antitela. CDR definicije i obležavanje proteinskih sekvenci je prema Kabat-u. Nukleotidne i proteinske sekvence CDR su naznačene crveno.

SL. 36 je vektorski dijagram koji pokazuje pANTVK i pANTVhG4 vektore. Oba pANTVK i pANTVhG4 vektora sadrže fragmente genomske DNK koji uključuju introne i poli A sekvence. Ekpresija oba lanca se pokrede sa CMV promotera. DHFR mini gen na vektoru za teški lanac se koristi za odabir.

SL.37 predstavlja Coomassie Blue-obojeni SDS-PAGE gel anitela prečišdenih sa proteinom A, (a) himerno anti-Cad-11 EC1 IgG4 (SYN0014); (b) Humanizovane varijante anti-Cad-11 antitela (SDP011-SDP151). Marker za veličinu je prethodno obojeni standard proteina Fermentas PageRuler (Cat. No. SM1811). Napomena: SDP111 nije pušten.

SL-e. 38A-C su grafici koji predstavljaju rezultate anti-Cad-11 kompetitivnog ELISA testa. Serije razblaženja humanizovanig anti-Cad-11 EC1 antitela (SDP011 do SDP151) se ispituju u odnosu na određenu koncentraciju biotinilovanog mišjeg SYN0012 antitela za vezivanje za rekombinantni humani Cad-11 fuzini protein. Vezivanje biotinilovanog antitela opada sa povedanjem količina antitela koja se ispituju i kontrolnih antitela. A: SDP011 do SDP051; B: SDP061 to SDP101; C: SDP111 do SDP151.

SL-e. 39A-O su grafici koji predstavljaju titraciju humanizovanih anti-Cad-11 antitela i u testu ukrštene rekativnosti kadherina sa peptidima koji sadrže imunogen Cad-11 peptid (crvena linija na svakoj krivi) i odgovarajude homologe sekvence iz Kadherina -7, -8, -9, -11, -18, -20, i -24. Koncentracija peptida u sloju je 500 ng/ml. A: SDP011; B: SDP021; C: SDP031; D: SDP041; E: SDP051; F: SDP061; G: SDP071; H: SDP081; I: SDP091; J: SDP101; K: SDP111; L: SDP121; M: SDP131; N: SDP141; i O: SDP151.

SL-e. 40A-D predstavljaju sekvence aminokiselina domena varijabilnog regiona lakog i teškog lanca humanizovanih anti-Cad-11 antitela (A) SDP031 (SEQ ID Nos.:71,65), (B) SDP051 (SEQ ID Nos.:71,69), (C) SDP061 (SEQ ID Nos.:73,61), (D), SDP071 (SEQ ID Nos.:73,63).

SL. 41A je grafik koji predstavlja titraciju SDP051 u testu ukrštene rekativnosti kadherina sa peptidima koji sadrže Cad-11 peptid imunogen (crveno) i odgovarajude homologe sekvence iz Kadherina -7, -8, -9, -11, -18, -20, and -24. Koncentracija peptida u sloju je 500 ng/ml.

SL. 41B je grafik koji predstavlja titraciju SDP051 u testu ukrštene rekativnosti kadherina sa peptidima koji sadrže Cad-11 peptid imunogen (crveno) ili odgovarajude homologe sekvence iz Kadherina-8 i -18. Koncentracija peptida u sloju je 50 ng/ml.

SL.42 je grafik senzitivnosti vezivanja SDP051 za rekombinovani humani Cad-11 (rhCad-11).

SL. 43 je grafik koji predstavlja koncentraciju antitela koja zavisi od vezivanja humanizovanih anti-Cad-11 EC1 antitela SDP051 i SDP071 za 431D delije koje eksprimiraju Cad-11 kao što se meri sa FACS (Srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI)). Takođe je prikazano odsustvo vezivanja za 431D delije koje ne eksprimiraju Cad-11.

SL-e.44A-C su grafici koji predstavljaju specifičnost SDP051 antitela za Cad-11 upotrebom testa za merenje efekata peptida koji sadrži Cad-11 antigen na sposobnost antitela SDP051 da se veže za delije koje eksprimiraju Cad-11 u odnosu na peptide koji sadrže srodne Cad-20 ili Cad-24 (SL. 44A), Cad-7 ili Cad-18 (SL. 44B), ili Cad-8 ili Cad-9 (SL. 44C) antigene, na sposobnost SDP051 antitela da se veže za delije koje ekprimiraju Cad-11, kao što se meri sa FACS (Srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI)).

SL-e.45A i B su grafici koji predstavljaju imunogenost (A) mišjeg/humanog himernog anti-Cad-11 EC1 antitela SYN0014 i (B) humanizovanog anti-Cad-11 EC1 antitela SDP051 kao što se određuje T delijskim testom određivanja imunogenosti tokom vremena upotrebom PBMC iz 25 donora. Rezultati svakog uzorka u triplikatu su usrednjeni i normalizovnani konverzijom za indeks stimulacije (SI). Prikazan je SI za svaku vremensku tačku svakog donora. Granična vrednost za određivanje pozitivnih odgovora sa SI ≥ 2,0 je obeležena crvenom linijom i značajni odgovori (p<0,05 u Studntovom t-testu) su naznačeni (*).

SL. 46 je grafik koji pokazuje da SDP-051 pri dozi od 0.3 µg/ml inhibira invaziju FLS za 50% u poređenju sa 3 µg/ml doze izotipske kontrole antitela (AC1-P).

SL. 47 je grafik koji pokazuje da SDP-051 pri dozi od 0.3 µg/ml inhibira ekpresiju MMP u poređenju sa 3 µg/ml doze izotipske kontrole antitela (AC1-P).

SL. 48 je grafik koji ilustruje 47% smanjenje u oticanju zgloba kod miševa koji su tretirani sa SDP051 u poređenju sa miševima koji su tretirani sa AC1-P kontrolnim antitelom.

SL.49 je grafik koji predstavlja nivoe SDP051 antitela u serumu nakon davanja miševima (KBN model artritisa).

SL.50 je grafik koji predstavlja promene u zadebljanju članka kod miševa tretiranih sa različitim dozama SDP051 antitela u odnosu na miševe koji su tretirani sa AC3-1P kontrolnim antitelom (mišji KBN model artritisa; KBN024 Studija).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Definicije

[0011] Kao što se ovde koristi, termini "Kadherin-11," "Cad-11,"i "OB-Kadherin" se odnose na protein Kadherin-11 koji se prirodno pojavljuje ili endogeni (npr., sisarski, na primer čoveka) protein, i na proteine koji imaju sekvencu aminokiselina koja je ista kao kod proteina koji se prirodno pojavljuje ili kod endogenog proteina Kadherina-11 (npr., rekombinovani proteini, sintetički proteini). Prema tome, termini "Kadherin-11," "Cad-11," i "OB-Kadherin," koji se ovde koriste naizmenično, uključuju polimorfe ili varijante alela i druge izoforme proteina Kadherina-11 (npr., sisarskog, čoveka) koji su dobijeni, npr., alternativnim splajsovanjem ili drugim delijskim procesima, koji se prirodno nalaze kod sisara (npr., ljudi, ne-čovekolikih primata). Poželjno, protein Kadherin-11 je humani protein koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:2 (vidi, Genbank pristupni br. NP001788 i SL.15).

[0012] Kao što se ovde definiše, "antagonist Kadherina-11" je humanizovano antitelo koje specifično vezuje EC1 domen sisarskog proteina Kadherina-11 i antagonizuje pomenuti sisarski protein Kadherin-11, koji sadrži varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 69 i varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 71. Poželjno, antitelo inhibira (npr., smanjuje, sprečava) jednu ili više aktivnosti koje su povezane sa Kadherinom-11 u deliji. Aktivnosti koje su povezane sa Kadherinom-11 uključuju, ali bez ograničenja, vezivanje proteina Kadherina-11 za jedan ili više drugih proteina Kadherina-11 na homotipski način, nakupljanjem delija koje eksprimiraju Kadherin-11, indukiju enzima (npr., kolegenaze, serin proteaza, MMP1, MMP3, MMP13) ekspresiju iil aktivnost, i indukciju citokina (npr., inflamatronih citokina) ili faktora rasta (npr., IL-6, IL-8 ili RANKL ili TRANCE), migraciju delija koje eksprimiraju Kadherin-11 i destrukciju hrskavice delijama koje eksprimiraju Kadherin-11. U jednom izvođenju, antagonist Kadherina-11 može da inhibira vezivanje proteina Kadherina-11 za jedan iliviše drugih proteina Kadherina-11 pomodu, na primer, blokiranja interakcije između donorskih sekvenci u EC1 domenu Cad-11 proteina (npr., Cad-11 protein koji je eksprimiran na površini delije) sa džepnom sekvencom u EC1 domenu jednog ili više drugih Cad-11 proteina (npr., jedan ili više proteina Cad-11 koji su eksprimirani na površini drugih delija).

[0013] Kao što se ovde koristi, antagonist Kadherina-11 koji „specifično vezuje“ EC1 domen proteina Kadherina-11 se odnosi na antagonist Kadherina-11 koji vezuje (npr., u fiiziološkim uslovima) EC1 domen proteina Kadherina-11 sa afinitetom (npr., afinitetom vezivanja) koji je najmanje 5 puta, poželjno najmanje oko 10 puta, vedi od afiniteta sa kojim antagonist Kadherina-11 vezuje EC1 domen drugog proteina kadherina (npr., MN-Kadherina, Kadherina-8). U posebnom izvođenju, antagonist Kadherina-11 koji specifično vezuje EC1 domen proteina Kadherina-11 vezuje epitop koji se nalazi u SEQ ID NO:3, N-terminalni deo EC1 domena humanog Kadherina-11, sa afinitetom koji je najmanje oko 5 puta, poželjnije najmanje oko 10 puta, vedi od afiniteta sa kojim antagonist Kadherina-11 vezuje epitop koji se nalazi u SEQ ID NO:4, N-terminalni deo EC1 domena humanog MN-Kadherina, i afinitet sa kojim antagonist Kadherina-11 vezuje epitop koji se nalazi u SEQ ID NO:5, N-terminalni deo EC1 domena humanog Kadherina-8.

[0014] Kao što se ovde koristi, termin "antitelo" je namenjen da obuhvati i cela antitela i fragmente antitela (npr., fragmente antitela za vezivanje antigena, na primer, Fv, Fc, Fd, Fab, Fab’, F(ab’), i dAb fragmenti). "Antitelo" se odnosi i na poliklonska i monoklonska antitela i uključuje antitela koja se prirodno pojavljuju i antitela koja se dobijaju genetskim inžinjeringom. (Vidi npr., Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

[0015] Termin "epitop" se odnosi na strukturnu jedinicu koja je konvencionalno vezana imunoglobulinskim VH/VLparom. Epitop definiše minimum mesta vezivanja za antitelo, i prema tome predstavlja ciljno mesto specifičnosti antitela.

[0016] Termin "fuzioni protein" se odnosi na jedan molekul proteina koji se prirodno pojavljuje, koji je sintetički, polu-sintetički ili koji je rekombinovani koji sadrži sve ili deo dva ili više heterolognih polipeptida.

[0017] Termin "polipeptid" se odnosi na polimer aminokisleina, i ne na specifičnu dužinu; prema tome, peptidi, oligopeptidi i proteini su uključeni okvirom definicije polipeptida.

[0018] Kao što se ovde koristi, termin "peptid" se odnosi na jedinjenje koje se sastoji od oko 2 do oko 100 ostataka aminokiselina gde je amino grupa jedne aminokiseline povezana sa karboksilnom grupom druge amino kiseline pomodu peptidne veze. Takvi peptidi obično imaju manje od oko 100 ostataka aminokiselina u dužini i poželjno imaju oko 10, oko 20, oko 30, oko 40 oko 50 ostataka.

[0019] Kao što se ovde koristi, termin "peptidomimetički" se odnosi na molekule koji nisu peptidi ili proteini, ali imitiraju aspekte njihovih struktura. Peptidomimetički antagonisti mogu da se dobiju konvencionalnim hemijskim postupcima (vidi npr., Damewood J.R. "Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry" in Reviews in Computational Biology, 2007, Vol. 9, pp. 1-80, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1996; Kazmierski W.K., "Methods of Molecular Medicine: Peptidomimetic Protocols," Humana Press, New Jersey, 1999).

[0020] Kao što se ovde definiše, "terapija" je davanje posebnog terapeutskog ili profilaktičkog sredstva subjektu koji je sisar, kao što je čovek, što dovodi do željenog terapeutskog ili korisnog efekta subjektu.

[0021] Kao što se ovde definiše "režim tretmana" je režim u kome se jedan ili više terapeutskih ili profilaktički sredstava daju sisarskom subjektu u određenoj dozi (npr., nivou, količini, kvantitetu) i u određenom rasporedu ili određenim intervalima (npr., minutima, danima, nedeljama, mesecima).

1

[0022] Kao što se ovde definiše, "terapeutski efikasna količina" je količina dovoljna da se postigne željeni terapeutski ili profilktički efekat u uslovima davanja, kao što su, ali bez ograničenja, količina dovoljna da se inhibira (tj., smanjuje, sprečava) inflamacija u zglobu (npr., inhibicijom nakupljanja delija, na primer sinviocita, koje eksprimiraju Kadherin-11) ili obrazovanje, rasta ili metastaze tumora. Efikasnost terapije (npr., smanjenje inflamacije u zglobu i/ili sprečavanja inflamacije u zglobu) može da se odredi odgovarajučim postupcima (npr., postupcima snimanja, ako što su MRI, NMR, CT).

Kadherini

[0023] Kadherini pripadaju velikoj familiji adhezionih molekula zavisnih od Ca<2+>koji posreduju delijskoj adheziji vezivanjem sa drugim kadherinima na homotipski način (MJ Wheelock and KR Johnson, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 19: 207-235 (2003). Klasični kadherini su transmembranski proteini koji prolaze jednom kroz membranu koji sadrže pet ekstradelijskih (EC) domena kadherina, svaki ima dužinu približno 110 aminokiselina, transmembranski region i konzervirani citoplazmatski domen. Kadherini su podeljeni u kadherine ili tipa I ili tipa II na osnovu stepena homologije između EC domena. Kadherini tipa II uključuju humane Kadherine-5, -6, -8, -11, i -12, i MN-kadherin. Nije jasna relativna važnost svakog ekstracelularnog domena u posredovanju inter-celularnog vezivanja.

Aktivnost Kadherina-11 kod sinoviocita

[0024] Kadherin-11 posreduje u međusobnom vezivanju sinoviocita u sinovijalnom sloju spojenih zglobova (Valencia et al., J. Exp. Med. 200(12):1673-1679 (2004); Kiener and Brenner, Arthritis Res Ther. 7(2):49-54 (2005)). Fuzioni protein koji sadrži svih pet ekstradelijskih domena kadherina humanog Kadherina-11, koji je fuzionisan sa domenom -CH2-CH3 zgloba humanog IgG2, inhibira in vitro obrazovanje sloja sinoviocita (Kiener et al., Am. J. Pathol.168 (2006)). Dodatno, antagonistička anti-Kadherin-11 antitela i fuzioni protein koji sadrži EC1-5 mišjeg Kadherina-11, koji je fuzionisan sa domenima -CH2-CH3 zgloba mišjeg IgG2a, inhibira inflamaciju i oticanje zgloba u mišjim modelima reumatoidnog artritisa (Lee et al., Science 315:1006-1010 (2007)).

Antagonisti Kadherina-11

[0025] Antagonist Kadherina-11 pronalaska može da bude bilo koje sredstvo koje specifično vezuje EC1 domen proteina Kadherina- 11 i inhibira (npr., smanjuje, sprečava) jednu ili više aktivnosti koje su posredovane Kadherinom-11 u deliji. Aktivnosti koje su posredovane Kadherinom-11 uključuju, ali bez ograničenja, nakupljanje delija koje eksprimiraju Kadherin-11 na delijskoj površini, i ekpresiju i proizvodnju faktora kao što je, na primer, kolagenaza, serin proteaze, MMP1, MMP3, IL-6, IL-8 ili RANKL/TRANCE. Sredstvo je humanizovano antitelo prema pronalasku.

Antitela specifična za Kadherin-11

[0026] Kao što se ovde opisuje, antitela koja vezuju epitop u N-terminalnom delu EC1 domena humanog Kadherina-11 koja sadrže donorske sekvence i udubljenje (Džep) Cad-11 za vezivanje kadherina (npr., SEQ ID NO:3), blokiraju aktivnost Kadherina-11 in vitro efikasnije u odnosu na antitela koja vezuju epitope u drugim regionima ovog proteina (Vidi Primere 1 i 2).

[0027] Prema tome, u jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji veže, specifično veže epitop koji se nalazi na N-terminalnom delu EC1 domena proteina Kadherina-11 koji sadrži donorske sekvence i udubljenje (Džep) Cad-11 za vezivanje kadherina. Termin "antitelo" je namenjen da obuhvati sve tipove poliklonskih i monoklonskih antitela i fragmenata antitela za vezivanje antigena (npr., Fv, Fc, Fd, Fab, Fab’, F(ab’), dAb). (Vidi npr., Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Cad-11 antitelo specifično za EC1 domen je humanizovano antitelo. Cad-11 antitela specifična za EC1 domen takođe mogu direktno ili indirektno da budu povezana sa citotoksičnim sredstvom.

[0028] Druga antitela ili fragmenti antitela koji se specifično vezuju za N-terminalni deo EC1 domena proteina Cad-11 i inhibiraju aktivnost proteina Cad-11 mogu takođe da se proizvedu, naprave, dobiju genetičkim inžinjerstvom i/ili izoluju konvencionalnim postupcima ili drugim pogodnim postupcima. Na primer, antitela koja su specifična za EC1 domen proteina Kadherina-11 mogu da se dobiju tako da budu specifična za odgovarajudi imunogen, kao što je rekombinantni sisarski (npr., humani) EC1 domein peptida Kadherina-11 (e.g., SEQ ID NO:3) ili njegov deo (uključujudi sintetičke molekule, npr., sintetičke peptide). Opisani su različiti postupci (vidi npr., Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) and Eur. J. Immunol.6: 511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski et al., U.S. Patent No. 4,172,124; Harlow, E. and D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer ’94), Ausubel, F.M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11, (1991)). Antitela takođe mogu da se dobiju imunizacijom odgovarajudeg domadina (npr., miša) sa delijama koje eksprimiraju EC1 domen Kadherina-11 (npr., kancer delije/delijske linije) ili delije koje su manipulisane da eksprimiraju EC1 domen Kadherina-11 (npr., delije koje su izložene postupku transfekcije). (Vidi npr., Chuntharapai et al., J. Immunol., 152:1783-1789 (1994); Chuntharapai et al. U.S. Patent No. 5,440, 021). Za dobijanje monoklonskih antitela, hibridom može da se dobije fuzionisanjem odgovarajude besmrtne delijske linije (npr., delijska linija mijeloma kao što je SP2/0 ili P3X63Ag8.653) sa delijama koje proizvode antitela. Delije koje proizvode antitela mogu da se dobiju iz periferne krvi, ili poželjno, slezine ili limfnih čvorova, ljudi ili drugih pogodnih životinja koje su imunizovane sa antigenom od interesa. Fuzionosane delije (hibridomi) mogu da se izoluju upotrebom selektivnih uslova za gajenje u kulturi, i kloniraju ograničenim razblaženjem. Delije koje proizvode antitela željenih specifičnosti mogu da se odaberu upotrebom odgovarajudeg testa (npr., ELISA).

[0029] Fragmenti antitela mogu da se proizvedu enzimskim isecanjem ili upotrebom rekombinantnih postupaka. Na primer, cepanjem papainom ili pepsinom mogu da se dobiju Fab ili F(ab’)2fragmenti, redom. Druge proteaze sa potrebnom specifičnosti za supstrat mogu takođe da se koriste da se dobiju Fab ili F(ab’)2 fragmenti. Antitela mogu takođe da se proizvedu u brojnim prekinutim oblicima upotrebom gena koji kodiraju za antitela gde je jedan ili više stop kodona uveden ushodno od od prirodnog stop položaja. Na primer, himerni gen koji kodira F(ab’)2deo teškog lanca može da bude dizajniran da uključi DNA sekvence koje kodiraju CH1 domen i region zgloba teškog lanca. Humanizovana antitela su obuhvadena predmetnim pronalaskom i terminom "antitelo". Brojni delovi ovih antitela mogu hemijski zajedno da se spoje upotrebom konvencionalnih postupaka, ili mogu da se dobiju kao kontinuirani protein upotrebom postupaka genetičkog inženjerstva. Na primer, nuklenska kiselina koja kodira humanizovnai lanac može da bude eksprimirana da proizvede kontinuirani protein. Vidi, npr., Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Cabilly et al., European Patent No. 0,125,023 B1; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397; Boss et al., European Patent No.

0,120,694 B1; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., European Patent No.

0,194,276 B1; Winter, U.S. Patent No.5,225,539; Winter, European Patent No.0,239,400 B1; Queen et al., European Patent No. 0 451 216 B1; and Padlan, E.A. et al., EP 0 519 596 A1. Vidi takođe, Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), u vezi sa primatizovanim antitelom, iLadner et al., U.S. Patent No. 4,946,778 and Bird, R.E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)) u vezi sa jednolančanim antitelima.

[0030] Humanizovana antitela mogu da budu proizvedena upotrebom sintetičke ili rekombinantne DNK tehnologije upotrebom standardnih postupaka ili drugih pogodnih postupaka. Sekvence nukleinske kiseline (npr., cDNK) koje kodiraju za humanizovane varijabilne regione mogu takođe da se konstruišu upotrebom postupaka PCR mutageneze za izmenu DNK sekvenci koje kodiraju humani ili humanizovani lanac, kao što je DNK matrica iz prethodno humanizovnaog varijabilnog regiona (vidi e.g., Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); and Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). Upotrebom ovih i drugih pogodnih postupaka, varijante takođe mogu brzo da se dobiju. U jednom izvođenju, klonirani varijabilni regioni (npr., dAbs) mogu da budu mutirani, i mogu da se odaberu sekvence koje kodiraju varijante sa željenom specifičnošdu (npr., iz bibilioteke faga; vidi npr., Krebber et al., U.S. 5,514,548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, objavljeno 1 aprila, 1993).

[0031] Mogu da se koriste drugi pogodni postupci dobijanja ili izolovanja antitela potrebne specifičnosti, uključujudi, na primer, postupke kojima se bira rekombinantno antitelo ili fragment antitela za vezivanje (e.g., dAbs) iz biblioteke (npr., biblioteke prikaza faga), ili sa oslanjanjem na imunizaciju transgenih životinja (npr., miševa). U oblasti tehnike su dobro poznate transgene životinje koje mogu da proizvode repertoar humanih anitela (npr., Ksenomiš ®(Abgenix, Fremont, CA)) i mogu da se proizvode upotrebom pogodnih postupaka (vidi npr., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Lonberg et al., U.S. Patent No.5,545,806; Surani et al., U.S. Patent No.5,545,807; Lonberg et al., WO 97/13852).

Identifikacija antagonista Kadherina-11

[0032] Mogu da se identifikuju antitela koja specifično vezuju EC1 domen humanog Kadherina-11, na primer, pretraživanjem komercijalno dostupnih kombinatornih biblioteka antitela (Dyax Corp., MorphoSys AG). Pogodne kombinatorne biblioteke antitela i standardni postupci pretraživanja ovih biblioteka su opisani u Hoet et al., Nature Biotechnology 23(3):344-348 (2005)and Rauchenberger et al., J. Biol. Chem. 278(40):38194-38205 (2003). Takve biblioteke ili kolekcije molekula mogu takođe da se dobiju upotrebom dobro poznatih hemijskih postupaka.

[0033] Alternativno mogu da se identifikuju mišja antitela koja specifično vezuju EC1 domen humanog Kadherina-11, na primer, imunizacija miševa sa EC1 domenima proteina ili EC1 peptidima zajedno sa adjuvansom da se prekine tolerancija prema antigenu. Ova antitela mogu da se pretraže za željenu specifičnost i aktivnost i nakon toga da se humanizuju upotrebom poznatih postupaka za dobijanje pogodnih sredstava za lečenje humane bolesti.

[0034] Sredstva koja vezuju Kadherin-11 mogu dalje da se procene za antagoniste Kadherina-11. Na primer, kompozicija koja sadrži protein Kadherin-11 može da se koristi za pretraživanje ili test vezivanja za detekciju i /ili identifikaciju sredstava koj vezuju i antagonizuju protein Kadherin-11. Pogodne kompozicije za upotrebu uključuju, na primer, delije koje prirodnno eksprimiraju protein Kadherin-11 (npr., sinoviocita), ekstrakte takvih delija, i rekombinantni protein Kadherin-11.

1

[0035] Sredstvo koje vezuje protein Kadherin-11 može da se identifikuje u testu kompetitivnog vezivanja, na primer, gde se testira sposobnost sredstva da inhibira vezivanje Kadherina-11 za referentno sredstvo. Referentno sredstvo može da bude Cad-11 protein pune dužine ili njegov deo koji sadrži EC1 domen. Referentno sredstvo može da bude na odgovarajudi način obeleženo (npr., radioizotopski, obeleživačem za epitop, afinitenim obeleživačem (npr., biotinom i avidinom ili streptavadinom), spin obeleživačem, enzimom, fluorescentnom grupom, hemiluminescentnom grupom, bojom, metalom (npr., zlatom, srebrom), magnetnim kuglicama) i količinom obeleženog referentnog sredstva koje je neophodno da u testu može da se odredi zasideni protein Kadherin-11. Specifičnost obrazovanja kompleksa između proteina Kadherina-11 i sredstva koje se ispituje može da se odredi upotrebom odgovarajude kontrole (npr., neobeleženog sredstva, samog obeleživača).

[0036] Kapacitet sredstava koje se ispituje da inhibira kompleks između referentnog sredstva i proteina Kadherina-11 može da se odredi kao koncentracija sredstva koje se ispituje koja je neophodna za dostizanje 50% inhibicije (IC50vrednost) specifičnog vezivanja obeleženog referentog sredstva. Specifično vezivanje se poželjno definiše kao ukupno vezivnaje (npr., ukupni obeleženo u kompleksu) minus ne-specifično vezivanje. Ne-specifično vezivanje se poželjno definiše kao količina obleživača koja još može da se detektuje u kompleksima koji se obrazuju prisustvu viška neobeleženog referentnog sredstva. Referentna sredstva pogodna za upotrebu u postupku uključuju molekule i jedinjenja koji se specifično vezuju za Kadherin-11, npr., antitelo koje vezuje Kadherin-11.

[0037] Sredstvo koje antagonizuje protein Kadherin-11 može da se identifikuje pretraživanjem sredstava koja imaju sposobnost da antagonizuju (smanje, spreče, inhibiraju) jednu ili više aktivnosti Kadherina-11, kao što je, na primer, aktivnost vezivanja (npr., homotipskog Cad-11 vezivanja). Takve aktivnosti mogu da se procene upotrebom odgovarajudih in vitro ili in vivo testova. Prethodno su opisani primeri testova za aktivnost Kadherina-11 (Patel, SD, et al., Cell 124: 255-1268 (2006); Lee et al., Science 375:1006-1010 (2007)).

[0038] Jednom kada se antagonist Kadherina-11 identifikuje, može da se proceni sposobnost antagonista Kadherina-11 da interferira sa (npr., smanji, inhibira, spreči) jednu ili više bioloških funkcija ili svojstava koja su povezana sa aktivnošdu Kadherina-11 u deliji, na primer, upotrebom testa koji se zasniva na delijama koji je dizajniran da se izmeri određena biološka funkcija ili svojstvo koje je povezano sa Kadherinom-11. Biološke funkcije i svojstva koja su povezana sa ekspresijom Kadherina-11 i/ili aktivnosti uključuju, ali bez ograničenja, adheziju delija, delijsku migraciju, delijsku invaziju, sortiranje delija, kondenzaciju delija, preraspodelu delija, održavanje integriteta i arhitekture tkiva, kontaktnu inhibiciju proliferacije delija i malignu transformaciju delija (npr., tumor) kancera (Kiener and Brenner, Arthritis Res Ther.7(2):49-54 (2005)). Dodatno, ovde je pokazano da antagonisti Cad-11 inhibiraju produkciju aktivnih MMP-a od sinoviocita. Poznati su pogodni testovi za ispitivanje jedne ili više biološke funkcije kadherina koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike (videti, npr., Patel, SD, et al., Cell 124: 1255-1268 (2006)) i uključuju, na primer, test nakupljanja delija koji se ovde opisuje (vidi odeljak sa primerima, materijalima i postupcima).

Terapija

[0039] Bez vezivanja za bilo koju teoriju, veruje se da oko prvih 35 aminokiselina (npr., oko 33 do oko 37 aminokiselina) EC1 domena Cad-11 su neophodni za homotipsko vezivanje kadherina i da sredstva koja specifično vezuju ovaj region Cad-11 mogu efikasno da inhibiraju vezivanje između Cad-11 molekula. Prema tome, takva sredstva su korisna u lečenju i prevenciji poremedaja (npr., inflamatornih premedaja, fibroze, kancera) koji se povezan sa ekspresijom Cad-11 ili aktivnosti u delijama (npr., sinoviocitima). Ovde je prikazan antagonist Kadherina-11 za upotrebu u lečenju poremedaja koji su posredovani Kadherinom-11 kod sisarskog subjekta koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antagonista Kadherina-11 koji vezuje EC1 domen peptida humanog Kadherina-11 (SEQ ID NO:3).

[0040] Kao što se ovde koristi, "Poremedaj koji je povezan sa Kadherinom-11" se odnosi na bolest, premedaj ili stanje koje uključuje, ili je posredovano sa (npr., prouzrokovano od strane), delija koje eksprimiraju protein Kadherin-11. Poremedaji koji su povezani sa Kadherinom-11 mogu da se leče sa humanizovanim antitelima pronalaska uključuju, ali bez ograničenja, inflamatornih premedaja (npr., inflamatornih poremedaja zglobova), fibroznih poremedaja (npr., dermalne fibroze, pulmonarne fibroze) i kancera.

[0041] Upotrebom antitela pronalaska, poremedaj koji je povezan sa Kadherinom-11 kod sisara (npr., čoveka) može da se leči davanjem antitela u količini koja je dovoljna da se obezbedi terapeutski koristan efekat, na primer, inhibiranjem nakupljanja delija, ili inhibiranjem migracije delija, ili inhibiranjem ekspresije aktivnih proteaza inflamatornih molekula od strane delija, koje eksprimiraju Kadherin-11 (NPR., sinoviociti, fibroblasti, tumorske delije).

[0042] Prema tome, jedan aspekt pronalaska se odnosi na humanizovano antitelo koje se ovde definiše za upotrebu u lečenju autoimunskog poremedaja kod sisarskog subjekta. Inflamatorni poremedaji se generalno karakterišu ekpresijom pro-inflamatornih molekula (npr., inflamatornih citokina i faktora rasta) i aktivacijom imunskih delija (npr., makrofaga, monocita, limfocita, plazma delija, leukocita, fibroblasta, neutrofila, T delija). Inflamatorni poremedaji uključuju, na primer, inflamatorne poremedaje zglobova, inflamatornu bolest creva (npr., Kronovu bolest, ulcerativni kolitis), psorijazu, dermatitis (npr., ekcem), renalnu amiloidozu, glomeluralni nefritis, vaskulitis, inflamatornu bolest pelvisa, hronični prostatitis, Gravesova oftalmopatija. U posebnom izvođenju, inflamatroni pormedaj je autoimunski poremedaj.

[0043] U posebnom izvođenju, pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo koje se ovde definiše za upotrebu u lečenju inflamatornog poremedaja zglobova kod sisarskog subjekta. Inflamatorni pormedaj zglobova može da bude bilo koji poremedaj koji je u vezi sa ili se karakteriše ekspresijom Kadherina-11 u delijama spojeni zglobova (npr., sinoviocitama). Primeri inflamatornog poremedaja zglobova koji mogu da se leče predmetnim pronalaskom uključuju, ali bez ograničenja, reumatoidni artritis, psorijazni artritis, Riterov sindrom, ankilozirajudi spondilitis, juvenilni hronični artritis, hroničnu Lajmsku bolest i artritis zglobova koji je u vezi sa sistemskim lupusom eritematozusom. U posebnom izvođenju, inflamatorna bolest zglobova je reumatoidni artritis.

[0044] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na humanizovana antitela koja se ovde definišu za upotrebu u lečenju fibroze kod sisarskog subjekta. Kao što se ovde koristi, termin "fibroza" se odnosi na obrazovanje ili razvoj viška fibroznog konektivnog tkiva u organu ili tkivu kao reparativni ii reaktivni proces. Primeri fibroze uključuju, ali bez ograničenja vaskularnu fibrozu (npr., vaskularna fibroza koja je u vezi sa pludnom hipertenzijom), fibroza bubrega, fibroza jetre (npr., ciroza), kožna/dermalna fibroza (npr., skleroderma), pludna/pulmonarna fibroza (npr., idiopatska pulmonarna fibroza), mijelofibroza, endomiokardijalna fibroza, fibroza zglobova, fibroza mezotelijuma, fibroza očiju, fibroza želudca i fibroza intersticijuma. U posebnom izvođenju, fibroza je pulmonarna ili fibroza pluda. U drugom izvođenju, fibroza je dermalna ili fibroza kože.

1

[0045] Bez vezivanja za određenu teoriju, veruje se da određeni tipovi tumorskih delija eksprimiraju Kadherin-11, koji može da promoviše metastazu tumora. Prema tome, antagonist Cad-11 pronalaska može da se koristi za inhibiranje obrazovanja tumora, rasta i/ili metastastaze kod subjekta. Prema tome, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na humanizovano antitelo koje se ovde definiše za upotrebu u lečenju kancera koji se karakteriše delijama koje eksprimiraju Cad-11 kod sisarskog subjekta. Kanceri koji uključuju delije koje eksprimiraju Cad-11 protein mog da uključe, na primer, leukemiju (npr., AML, CLL, prolimfocitičnu leukemiju), kancer pluda (npr., kancer pluda sitnih delija i ne-sitnih delija), kancer ezofagusa, gastrični kancer, kolorektalni kancer, kancer mozga (npr., astrocitom, gliom, glioblastom, meduloblastom, meningiom, neuroblastom), kancer bešike, kancer grudi, cervikalni kancer, epitelni kancer, nazofaringealni kancer (npr., oralni ili karcinom laringealnih skvamoznih delija), limfom (npr., folikularni limfom), kancer uterusa (npr., maligni fibrozni histiocitom), kancer jetre (npr., hepatocelularni karcinom), kancer glave i vrata (npr., karcinom skvamoznih delija glave i vrata), renalni kancer, tumori muških germinativnih delija, maligni mezoteliom, mijelodisplastični sindrom, kancer ovarijuma, pankreasni ili kancer žučnih puteva, kancer prostate, kancer tiroidee (npr., sporadični folikularni tiroidni tumori), i urotelijalni kancer.

[0046] U jednom aspektu, terapeutski efikasna količina antagonista Kadherina-11 se daje pacijentu kome je to potrebno. Lekar može da odredi količinu antagonista Kadherina-11 koja se daje (npr., terapeutski efikasnu količina) upotrebom smernica koje su ovde obezbeđene i drugim postupcima koji su poznati iz oblasti tehnike i zavisi od nekoliko faktora uključujudi, na primer, posebno odabrano sredstvo, starosnu dob subjekta, osetljivost, podnošljivost lekova i sveukupno opšte stanje. Na priemr, pogodne doze za antagoniste Cad-11 koji su antitela mogu da budu od oko 0,01 mg/kg do oko 300 mg/kg telesne mase po tretmanu i poželjno od oko 0,01 mg/kg do oko 100 mg/kg, od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg telesne mase po tretmanu. Pogodne doze za male molekule antagoniste Cad-11 mogu da budu od oko 0,001 mg/kg do oko 100 mg/kg, od oko 0,01 mg/kg do oko 100 mg/kg, od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 0,01 mg/kg do oko 1 mg/kg telesne mase po tretmanu. Određivanjem doze za posebno sredstvo, pacijenti kancer su obuhvadeni sposobnostima stručnjaka. Poželjno, doza ne prouzrokuje, ili poizvodi minimalne, nepoželjne sporedne efekte (npr., imunogeni odgovor, mučninu, vrtoglavicu, uznemirenje želudca, sindromi u vezi sa hiperviskoznošdu, kongestivna srčana insuficijencija, srčani udar, pludni edem).

[0047] Terapeutski efikasna količina antagonista Kadherina-11 može da se daje zasebno, ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskim sredstvima (npr., anti-inflamatornim sredstvima, hemoterapeutskim sredstvima). Pogodna anti-inflamatorna sredstva koja su korisna za lečenje inflamatornih poremedaja zglobova, posebno RA, koja mogu da se daju u kombinaciji sa antagonistima Cad-11 pronalaska, uključuju, ali bez ograničenja, (i) ne-steroidne anti-inflamatorne lekove (NSAIDi; npr., detoprofen, diklofenak, diflunisal, etodolak, fenoprofen, flurbiprofen, ibuprofen, indometacin, ketoprofen, meklofenameat, mefenaminska kiselina, meloksikam, nabumeon, natrijum-naproksen, oksaprozin, piroksikam, sulindak, tolmetin, celekoksib, rofekoksib, aspirin, holin salicilat, salsalt, i natrijumimagnezijum salicilat); (ii) steroide (npr., kortizon, deksametazon, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon, prednizon, triamcinolon); (iii) DMARDs, tj., antireumatske lekove koji modifikuju bolest (npr., ciklosporin, azatioprin, metotreksat, leflunomid, ciklofosfamid, hidroksihlorohin, sulfasalazin, D-penicilamin, minociklin, i zlato); ili (iv) rekombinantne proteine (npr., ENBREL® (etanercept, rastvorljivi TNF receptor), REMICADE® (infliksimab, himerno moniklonsko anti-TNF antitelo), ORENCIA® (abatabacept, rastvorljivi CTLA4

1

receptor), ACTEMRA® (Tocilizumab, monoklonsko antitleo specifično za IL-6 receptor), i RITUXAN® (rituksimab, monoklonsko antitelo specifično za CD20).

[0048] Prema tome, antagonist Kadherina-11 može da se daje kao deo kombinovane terapije (npr., sa jednim ili više drugih terapeutskim sredstvima). Antagonist Cad-11 može da se daje pre, posle ili istovremeno sa jednim ili više drugih terapeutskim sredstvima. U nekim izvođenjima, antagonist Kadherina-11 i drugo terapeutsko sredstvo mogu da daju zajedno simultano (npr., istovremeno) ili kao odvojene formulacije ii u obliku spojene formulacije. Alternativno, sredstva mogu da se daju sekvencijalno kao odvojene kompozicije, u odgovarajudem vremenskom okviru kao što se određuje od strane lekara (npr., vreme koje je dovoljno da se omogudi preklapanje farmaceutskih efekata terapija). Antagonisti Kadherina-11 i jedan ili više drugih terapeutskih sredstava mogu da se daju kao jedna doza ili u višestrukim dozama, redom i određenim rasporedom da se postigne željeni terapeutski efekat (npr., smanjenje i/ili inhibicija inflamacije zgloba). Pogodne doze i režimi davanja mogu da budu određeni od strane lekara i zavise od izabranih sredst(a)va, farmaceutske formulacije i načina davnja, različitih faktora koji su u vezi sa pacijentom i faktorima koji se razmatraju.

[0049] Efikasnost terapije (npr., smanjenje ili eliminacija inflamacije zgloba i/ili sprečavanje ili inhibicija inflamacije zgloba) može da se odredi bilo kojim pogodnim postupkom (npr., snimanjem (MRI, NMR)).

[0050] Prema pronalasku, terapeutski efikasna količina humanizovanog antitela se daje sisarskom subjektu za upotrebu u lečenju inflamatornog poremedaja zgloba. Termin "sisarski subjekt" se ovde definiše da uključi sisare kao što su primati (npr., ljudi) krave, ovce, koze, konje, pse, mačke, zečeve, zamorčide, pacove, miševe ili druge vrste govečeta, ovaca, konja, pasa, mačaka, pacova i miševa.

[0051] Sredstva koja su antagonisti Cad-11 mogu da se daju sisarskom subjektu na različitim načinima. Na primer, sredstvo se daje bilo kojim pogodnim parenteralnim ili neparenteralnim načinom, uključujudi, na primer, topikalni (npr., krema, mast), ili nazalno (npr., rastvor, suspenzija). Parenteralno davanje može da uključi, na primer, intraartikularno, intramuskularno, intravenozno, intraventrikularno, intraarterialno, intratekalno, subkutano, iliintraperitonelano davanje. Sredsto takođe može da se daje oralno (npr., u kapsulama, suspenzijama, tabletama ili dijetetski), transdermalno, intradermalno, topikalno, inhalacijom (npr., intrabronhijalno, intranazalno, oralnom inhalacijom ili intranazalnim kapima), transmukozno ili rektalno. Davanje može da bude lokalno ili sistemsko po potrebi, i istovremeno može da se koristi više od jedan način davanja, ukoliko je potrebno. Lokalizovano davanje antagonista Cad-11 može da se postigne intraartikularnom injekcijom (npr., direktna injekcija sredstva u zglob). Poželjni način davanja može da se razlikuje u zavisnosti od odabranog sredstva. Međutim, za antitela je poželjno sistemsko intravenozno ili subkutano davanje.

[0052] Davanje može da bude injekcijom u mozak ili telesnu šupljinu pacijenta ili upotrebom matriksnog sistema za isporuku postepenog oslobađanja ili odloženog oslobađanja, ili davanjem na mestu pomodu micela, gelova i lipozoma. Nebulizatori, sprave za inhaliranje prahova, i rastvora aerosoli predstavljaju postupke koji mogu da se koriste za davanje takvih preparata u respiratorni trakt. Isporuka može da bude in vitro, in vivo, ili ex vivo.

[0053] Sredstva koja su antagonisti Kadherina-11 mogu da se daju sisarskom subjektu kao deo farmaceutske ili fiziološke kompozicije, na primer, kao deo farmaceutkse kompozicije koja sadrži

1

antagonist Kadherina-11 i farmaceutski prihvatljivi nosač. Formulacije ili kompozicije koje sadrže antagonist Kadherina-11 ili kompozicije koje sadrže antagonist Kadherina-11 i jedan ili više drugih terapeutskih sredstava (npr., anti-inflamatorno sredstvo) de se razlikovati u skladu sa odabranim načinom davanja (npr., rastvor, emulzija ili kapsula). Pogodni farmaceutski nosači mogu da sadrže inertne sastojke koji ne interaguju sa antagonistom Kadherina-11. Tehnike standardne farmaceutske formulacije mogu da se upotrebe, kao što su one koje su opisane u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Pogodni farmaceutski nosači za parenteralno davanje uključuju, na primer, sterilnu vodu, fiziološki rastvor soli, bakteriostatski rastvor soli (rastvor soli koji sadrži oko 0,9% mg/ml benzil alkohola), rastvor soli sa fosfatnim puferom, Henkov rastvor, Ringerov laktat i slično. Formulacije takođe mogu da uključe male količine supstanci koje pojačavaju efikasnost aktivnog sastojka (npr., sredstvaza emulgovanje, sredstva za rastvaranje, sredstva za podešavanje vrednosti pH, sredstva za vlaženje). U oblasti tehnike su poznati postupci inkapsuliranja kompozicija (kao što su oblaganje čvrstim želatinom ili ciklodekstranom). Za inhalaciju, sredstvo može da bude rastvoreno i napunjeno u pogodan dispenser za davanje (npr., atomizer ili nebulizer ili dispenzer aerosoli pod pritiskom).

[0054] Predmetni pronalazak de sada biti ilustrovan slededim Primerima, koji nisu ograničavajudi na bilo koji način.

Davanje primera

Referentni Primer1: Identifikacija Fab-a koji imaju specifičnost vezivanja za epitop koji se nalazi unutar N-terminalnih 35 aminokisleina EC1 domena huamnog Kadherina-11.

Materijali i Postupci

Western blot

[0055] Proteini su razdvojeni pomodu SDS-PAGE i preneti na nitroceluloznu membranu (NC) upotrebom standardnih postupaka. Ukratko NC membrana se ispira sa rastvorom soli koji sadrži tristween (TBST) (8,8 g/L NaCl, 0,2g/L KCl, 3g/L Tris baze, 500ul/L Tween-20, pH do 7,4). Membrana se blokira sa 4% BSA koji je rastvoren u TBST jedan sat na 22°C. NC membrana se ispira 3X 5 min svaka sa TBST. Mišje anti-humano antitelo specifično za Cad-11 se rastvara do 0,5 μg/ml u TBST i NC se inkubira 1 sat na 22°C. NC membrana se ispira 3X 5 minuta svaka u TBST. Kozje anti-mišje Ig antitelo konjugovano sa peroksidazom rena (HRP) se rastvara do 1 μg/ml u TBST i NC membrana se inkubira u sekundarnom rastvoru za minimalno vreme od 1 čas @ sobnoj temperaturi (RT) na 22°C. NC membrana se ispira 3X 5 min svaka u TBST. Signal se razvija upotrebom standardnog HRP postupka.

ELISA

[0056] Antigen (ili 5 mg/ml ili 50 mg Cad-11-EC-1-Fc or 5 mg/ml peptida Kadherina) se rastvara u puferu i koristi za oblaganje ploča preko nodi 4°C. Ploče se ispiraju i zatim blokiraju sa 1,5% BSA, 5% mlekom u prahu sa niskim sadržajem masti u puferu za rastvaranje koji sadrži PBS: 1,5 %BSA, 2,5% mleka u prahu sa niskim sadržajem masti, 0,1% Tween-20 u PBS-u. Ploče se zatim inkubiraju sa bakterijskim lizatom koji sadrži anti-Cad-11 humana fAb-a ili prečišdenim anti-Cad-11 humanim fAb-a u trajanju od 1 h. Nakon ispiranja, sekundarno antitelo (Cy5-konjugovano a-hu-Fab razblaženo 1/100) se primenjuje 25 min. Ploče se nakon toga ispiraju i fluorecenca koja se dobija se čita.

1

Rezultati

[0057] Tri seta prethodno prijavljenih antitela koja su specifična za Kadherin-11 se ispituju za sposobnost vezivanja EC1 domena humanog Kadherina-11. Ova antitela uključujudi antitela koja se gaje prema imunogenu mišjeg Kadherin-11-Fc fuzionog proteina u miševima sa izbačenim genom za Kadherin-11 ili deficijentnim miševim (Lee et al., Science 315:1006-1010 (2007)), antitela koja se dobijaju u miševima sa divljim tipom za Kadherin-11 prema humanom imunogenu Kadherin-11-Fc fuzinim proteinom koji se proizvodi u CHO delijama (Valencia et al., J. Exp. Med. 200(12):1673-1679 (2004)), i antitela koja se dobijaju u miševima sa divljim tipom za Kadherin-11 prema proteinu koji proizvode bakterije koji sadrži EC1-3 domene humanog Kadherina-11. Ova antitela se ispituju Western analizom za mogudnost vezivanja fuzionih proteina koji sadrže samo EC1 domen humanog Cad-11 (Kadherin-11-EC1-Fc), EC1 i EC2 domene Cad-11 (Cad-11-EC1/2-Fc) ili sve 5 EC domene Cad-11 (Kadherin-11-EC1-5-Fc). Nijedno od ispitivanih antitela prepoznaje EC1-Fc ili EC1-2- Fc fuzione proteine na Western blotu (SL.1A). Međutim, ispitivana su antitela za prepoznavanje humanog Cad-11-Fc fuzionog proteina iz svakog od tri seta koji uključuje ekstradelijske domene 1 kroz 5 (SL.1B). Ovi rezultati ukazuju na to da se ispitivana antitela ne vezuju za EC1 ili EC2 domene humanog Cad-11, ali prepoznaju epitope na nekom drugom položaju u ekstradelijskom regionu ovog proteina.

[0058] Dostupna objavljena anti-Cad-11 antitela koja se vezuju za delij ekoje eksprimiraju Cad-11, 13C2, 23C6, 5F82 (Lifespan Science) i 283416 (R&D Systems), kao i H1M1 antitelo koje se vezuje za Cad-11 EC1, i kontrolno antitelo, MOPC, su ispitani ELISA postupkom za sposobnost vezivanja za fuzione proteine koji sadrže samo EC1 domen humanog Cad-11 (Kadherin-11-EC1-Fc) ili sve 5 EC domene Cad-11 (Kadherin-11-EC1-5-Fc). Nijedno ispitano od dostupnih objavljenih anti-Cad-11 antitela prepoznaje EC1-Fc (SL. 1B, otvoreni stubovi) (podaci za 283416 ovde nisu prikazani). Međutim, H1M1 antitelo koje se vezuje za Cad-11 EC1 vezuje i Kadherin-11-EC1-Fc i Kadherin-11-EC1-5-Fc (SL. 1B zatvoreni stub). Kontrolno MOPC antitelo ne vezuje ni fuzioni protein. Ovi rezultati ukazuju na to da dostupna objavljena anti-Cad-11 antitela ne vezuju EC1 domen humanog Cad-11, ali prepoznaju epitope na nekom drugom položaju u ekstradelijskom regionu ovog proteina.

[0059] Da bi se dobilo antitelo koje je specifično za epitop koji se nalazi unutar N-terminalnog 35 aminokiselina EC1 domena humanog Kadherina-11, pretražuje se bibilioteka prikaza faga (MorphoSys AG) koji kodiraju huamne Fab-e. Kandidati Fab-a se identifikuju upotrebom dva kriterijuma za odabir – pozitivno odabiranje za vezivanje za peptid koje uključuje prvih 35 aminokiselina humanog Kadherin-11 EC1 domena, i negativnu selekciju za vezivanje sa odgovarajudim peptidima iz EC1 domena dva blisko povezana i visoko homologa kadherina, Kadherina-8 i MN-Kadherina (SL.2). ELISA se koristi za procenjivnjae vezivanja.

[0060] Izvode se dva pretraživanja. U prvom pretraživanju, 96 Fab klonova koji vezuju EC1 peptid Kadherina-11 su identifikovnai pomodu ELISA postupka. Sedam (7) Fabs kandidata vezuju Cad-11 EC-1 peptid; međutim, samo dva od ovih vezuju i za EC-1 peptid i EC1-2-Fc fuzioni protein. Jedan od ovih dva Fab-a se takođe vezuje za MN-Cad peptid. Prema tome, samo jedan od sedam klonova Fab se specifično vezuju za EC1-Fc fuzini protein, ali se ne vezuju zajedno za MN-Cad i peptide EC1 domena Kadherina-8. U drugom pretraživanju, uočavaju se slični rezultati, kako samo jedan od 1 od 96 Fabs (klon F9) pokazuju specifičnost za EC1 peptid Kadherina-11 i EC1-2-Fc fuzioni protein, ne uspevaju da se vežu za MN-Cad i peptide EC1 domena Kadherina-8 EC1 (SL.3). Vedina testiranih Cad-11 EC1 Fabs

1

koji se vezuju za domen pokazuje unakrsnu reaktivnost sa MN-Cad peptidom, koji sadrži EEY CAR sekvencu koja se preklapa sa EEY CAR sekvencom Cad-11.

Referentni primer 2: Fab koji se vezuje za EC1 domen Kadherina-11 inhibira nakupljanje delija koje je posredovano sa Cad-11 u in vitro testu

Materijali i Postupci

In vitro test nakupljanja posredovan Kadherinom-11

[0061] 431-D delije rastu u suspenziji i normalno ne eksprimiraju bilo koje kadherine i nemaju osobinu nakupljanja.431-D-11 delije su genetički modifikovane da eksprimiraju Cad-11. Kada se 431-D-11 delije inkubiraju samo u medijumu one počinju da se nakupljaju tokom 40 min i nakupine delija padaju na dno posude i preostali ostatak delija u suspenziji koje nisu u nakupljnom obliku može da se izmeri i može da se izračuna procenat nakupljenih delija 431-D-11. Za test nakupljanja, 431-D-11 delije (D-11 delije) se gaje do sub-konfluentnosti u balonu i nakon toga se uklanjaju iz balona upotrebom 0,05% Tripsina plus 0,53 mM EDTA. Približno 2 x 10<6>431-D-11 delija se dodaje u 2 ml SME medijuma (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-visokog sadržaja glukoze, 0,1M Hepes pH 7,4 i 5U/ml DNAze) i prethodno se inkubira 15 min na ledu, ili u odsustvu ili prisustvu stedstva koje se ispituje (npr., antitelo, Fab, fuzioni protein). Nakon pre-inkubacije sa sredstvom koje se ispituje, delije se prebacuju u posudu sa okruglim dnom na ploču sa 24 bunariča i inkubiraju na 37°C rotirajudi se 130 oum na kružnoj mešalici. Kako se delije nakupljaju one padaju na dno bunarida. Na 0 min i 40 min, iz bunarida se uklanja 200 ml iz sredine uzorka i meša se sa 25 μl of 8% glutaraldehidom da bi se delije fiksirale.200 ml fiksiranog uzorka delija se dodaje u 9,8 ml Coulter Counter izotoničnog rastvora soli i brojanje se vrši upotrebom Coulter Counter sa pragom od 8 µm do 24 μm. Snimaju se 3 delijska brojanja po uzorku. Procenat delija opada ili izračunato je nakupljanje delija u 40 min. u poređenju sa procentom u vremenskoj tački 0 min.

Resultati

[0062] Kandidat Fab (klon F9) koji ima specifičnost vezivanja za epitop koji se nalazi u N-terminalnim 35 aminokiselina EC1 domena Kadherina-11, koji se ne vezuje za EC1 domene MN-Cad ili Cad-8, se ispituje za mogudnost inhibicije nakupljanja delija koje je posredovano sa Cad-11 upotrebom in vitro testa za ispitivanje nakupljanja delija posredovanog Kadherinom-11. Kandidat Fab značajno inhibira nakupljanje delija koje je posredovano Kadherinom-11 na koncentracijama od 1 mg/ml ili niže (SL-e.4 i 5). Suprotno, Fab koji se dobija od 13C2 antitela koje se vezuje za epitop koji se nalazi u ekstradelijskom regionu Cad-11 izvan EC1/2 domena inibira nakupljanje delija koje je posredovano Kadherinom-11 samo na koncentracijama od 10 mg/ml, što ukazuje na to da F9 Fab inhibira Cad-11 aktivnost efektivnije na nižim koncentracijama nego antitela koja se vezuju za druge delove ekstradelijskog domena Cad-11.

[0063] Nakupljanje delija koje je posredovano sa Cad-11 je takođe inbibirano različitim Fab-ima anti-Kadherin-11-EC1 domena kojji su ili specifčni samo za Cad-11, Cad-11 i Cad-8, Cad-11 i MN-Cad, ili Cad-11, Cad-8 i MN-Cad (SL-e.6 i 7). Si Fab-i koji su pecifični za EC1-domen kadherina koji su ispitani, inhibiraju nakupljanje delija in vitro u odnosu na kontrolne uzorke (npr., SME medijum (SL. 6), Fab specifičan za GFP (SL.7).

2

Referentni Primer 3: Dobijanje Kadherin-11/Imunoglobulin Fuzionih proteina koji sadrže EC1 domen humanog Kadherina-11.

[0064] EC1 region Kadherina-11 EC1 se dobija od vektora koji kodira kDNK pune dužine humanog Kadherina-11 (humani Cad-11 je kloniran u Not1 i Kpn-1 mesta Invitrogen pCEP4® vektora) upotrebom lančane reakcije polimeraze (PCR) koja se izvodi pod standardnim uslovima upotrebom slededih oligonukleotidnih fragmenata za uvođenje EcoR1 i BglII mesta (vidi podvučene sekvence u prednjim i reverznim prajmerima, redom) u umnoženom proizvodu:

Prednji prajmer:

tttttttttgaattcatgaaggagaactactgtttacaagc (SEQ ID NO:8)

EcoR1

Reverzni prajmer:

tttttttttagatctctggaccttgacaatgaattccgacgg (SEQ ID NO:9)

BglII

[0065] Umnoženi proizvod se iseca restrikcionim enzimima EcoR1 i BglII, i proizvodi digestije se izoluju i izvodi se ligacija u pFUSE-hIgG2e1-Fc1 vektor (InvivoGen) upotrebom odgovarajudih EcoR1 i BglII mesta. TOP10 kompetentnih bakterija (Invitrogen) se transformišu kao što se opisuje od strane proizvođača sa proizvodom ligacije i bakterijom koja ima Kadherin-11-EC1-Fc plazmid se biraju sa zeomicinom. Plazmid Kadherin-11-EC1-Fc se izoluje, sekvencira i zatim koristi za prolaznu transfekciju 293F delija. Kondicionirani medijum se sakuplja i Kadherin-11-EC1-Fc fuzioni protein (SEQ ID NO:9) se prečišdava upotrebom ceđenja sa tangencijalnim protokom nakon čega sledi izolacija na koloni sa odnosom 50/50 pomešanog proteina A/proteina G koja je uravnotežena na 20 mM HEPES pH 7,4, 137mM NaCl, 3mM KCl i 1mMCaCl2. Prečišdeni Kadherin-11-EC1-Fc fuzioni protein se ispira sa kolone upotrebom 0,1 M Glicina (pH 3) i 1 mM CaCl2i u epruvete koje sadrže 200 ml 1M Tris pH 7,4, i 1mM CaCl2. Ostaci nakon ispiranja sa Cad-11 fuzionim proteinom su zatim dijalizovani prema 20 mM Hepes (pH 7,4), 137 mM NaCl, 3 mM KCl i 1 mM CaCl2. Veličina proteina se potvrđuje upotrebom postupka SDS PAGE (SL. 10) i identitet se potvrđuje upotrebom Western analize korišdenjem antitela koje prepoznaje humani Fc region (SL. 11) i sekvenciranjem N kraja (nije prikazano). Cad-11-EC1-2-Fc se proizodi upotrebom postupaka i stanja koja su slična onima koja se opisuju u tektu iznad.

Referentni Primer 4: Fuzioni protein Cad-11-EC1-Fc imunoglobulina inhibira nakupljanje delija posredovano sa Cad-11 u in vitro testu

Materiali i Postupci

Delijska invazija/migracija u komad matrigela

[0066] Migratorna aktivnost sinoviocita sličnih fibroblastu (FLS) se ispituje u Matrigel ECM-obloženim transbunaridima u FLS medijumu (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-sa visokim sadržajem glukoze *Sigma #D7777+, 10% serumom iz fetusa govečeta *Benchmark #100-106], 1% Pencilin-Streptomicinom [Gibco 315140-122], 1% L-Glutaminom [Gibco #25030], 0,5% Gentamicinom [Gibco #15710-064]. Humane suspenzije FLS delija u FLS medijumu koji sadrži 1x10<4>delija se dodaju u kontrolni umetak ili set umetaka obloženih matrigelom u bunarid ploče koja sadrži 24 bunarida koja sadrži 0,750 mL FLS medijuma. Ploče se zatim inkubiraju u vlažnom inkubatoru za kulture tkiva na 37°C, atmosferi koja sadrži 5% CO2u trajanju od 22 časova.

[0067] Da bi se izračunao broj delija koje su migrirale, delije koje ne vrše invaziju se uklanjaju sa gornje poršine membrane kontrolnih umetaka upotrebom pamučnog brisanja. Drugo brisanje upotrebom pamučnog brisanja ovlaženog sa FLS medijumom se ponavlja. Kontrolni umetci se nakon toga fiksiraju i boje upotrebom različitih kitova za bojenje *Fisher #122-911]. Umetci se ostavljaju da se osuše i delije se broje u 4 kvandranta kontrolnog umetka upotrebom mikroskopa sa objektivom koji uveličava 10x. Broje se triplikati umetaka i zatim se nalazi ukupna srednja vrednost.

[0068] Da bi se izračunao broj delija koje vrše invaziju na umetke matigela, delije koje ne vrše invaziju se nežno uklanjaju sa površine umetka matrigela upotrebom pamučnog brisanja. Drugo brisanje upotrebom pamučnog brisanja ovlaženog sa FLS medijumom se ponavlja. Umetci se nakon toga fiksiraju i boje upotrebom različitih kitova za bojenje *Fisher #122-911]. Umetci se ostavljaju da se osuše i delije se broje u 4 kvandranta kontrolnog umetka upotrebom mikroskopa sa objektivom koji uveličava 10x. Broje se triplikati umetaka i zatim se nalazi ukupna srednja vrednost.

Rezultati

[0069] Cad-11-EC1-Fc značajno inhibira nakupljanje delija na koncentraciji od 3 µg/ml, Cad-11-EC1-5-Fc protein pune dužine koji sadrži svih 5 EC domena humanog Cad-11 inhibira nakupljanje posredovano sa Cad-11 na koncentraciji od 100 µg/ml (SL.13). Ovi podaci pokazuj da fuzioni protein Cad-11-EC1-Fc imunoglobulina efikasno inhibira nakupljanje delija posredovano Cad-11 u in vitro testu.

[0070] Dodatno, sposobnost fuzionog proteina Cad-11-EC1-Fc imunoglobulina da inhibira invaziju humanih sinoviocita sličnih fibroblastu (FLS) u matrigel umetak se testira in vitro. Invazija FLS u matrigel je kompleksni proces koji uključuje ekpresiju MMP1, MMP-3, MMP-13, serin proteaza, i drugih proteina od strane FLS za degradiranje matrigela kao i migraciju FLS u matrigel. U odvojenom testu mi smo videli da ne postoji inhibicija migracije FLS kroz normalni umetak vlakna. Ovo ukazuje na to da je uticaj EC-Fc ili 13C2 mAb u inhibiranju degradiranja matrigela (surogat zamena za hrskavicu zgloba). Oba Cad-11-EC1-Fc i mišje anti-Cad-11 mAb 13C2 inhibiraju invaziju FLS u matrigel umetak u dva nezavisna eksperimenta.

Referentni primer 5: Dobijanje antitela koja su specifična za EC 1 domen peptida humanog Kadherina-11

Materijali i Postupci

[0071] Balb/c miševi su imunnizovani dve nedelje u stopalo devet puta u periodu od jednog meseca sa 0,01 mg peptida koji odgovara prvim 33 amino kiselinama humanog EC1 domena Cad-11 (GWVWN QFFVI EEYTG PDPVL VGRLH SDIDS GDG (SEQ ID NO:10)), koje su u kovalentnoj vezi sa BSA. Ovaj peptid je ode naznačen kao Peptid 4. Iz imunizovanih miševa su izolovane slezine i fuzionisane sa mišjim fuzionim partnerom, P3X63-Ag8.653, da se dobiju hibridomi koji proizvode antitela. Hibridomi su prošireni i subklonirani na ili 10, 3 ili 0,5 delija/bunaridu, i medijumi koji sadrže anti-Cad-11 antitelo iz hibridoma su ispitani upotrebom ELISA za sposobnost da specifično vežu protein koji sadrži EC1-2 domen Cad-11 koji se proizvodi u bakterijama. Medijumi koji sadrže anti-Cad-11 antitelo iz ovih hibridoma Peptida 4 su istovremeno ispitani za odsustvo vezivanja za proteine koji obuhvataju EC1-2 domene humanog Cad-8 i MN-Kadherina. EIA ploče sa 96 bunarida su obložene preko nodi na 4°C sa 0,05 ml od 0,0 do 0,3 mg/ml svakog od EC1-2 Cad proteina i zatim nekoliko puta isprane sa slanim puferom. Ploče su zatim blokirane sa 0,25 ml kazein-PBS puferom i isprane nekoliko puta sa slanim puferom. Medijumi hibridoma koji sadrže anti-Cad-11 antitelo su inkubirani sa čistim reagensima u svakom bunaridu 1 hr na 22°C i zatim dva puta isprani sa PBS-Tween (0,05%). 100 µl razblaženog 1/1000 kojzeg anti-mišjeg IgG sekundarnog antitela je dodato u svaki bunarid, inkubirano 30 min na 22°C, i zatim dva puta isprano sa PBS-Tween (0,05%). Dodato je 100 µl/bunaridu na sobnoj temperaturi TMB (3, 3’, 5, 5’-tetrametilbenzidin) reagensa u svaki bunarid i omogudeno je da se razvije boja 5 min na 22°C. Reakcija je stopirana sa dodavanjem 100 µl na sobnoj temperaturi 2N sumporne kiseline i ploča se očitava na 450 nm na Wallac 1420 čitaču mikroploča.

[0072] Specifičnost H1M1 i H14 anti-Cad-11 antitela se dalje ispituje upotrebom ELISA prema prvim 33 aminokiselinama EC1 domena Cad-11, Cad-7, Cad-8, Cad-20, Cad-24, Cad-9, Cad-18, i MN-Cad. Peptidi koji odgovaraju regionu Cad-7, Cad-8, Cad-20, Cad-24, Cad-9, Cad-18, MN-Cad koji se preklapaju sa G1-G33 regionom Cad-11 EC1 domena se sintetišu i konjuguju sa biotinom. 100 µl 30 ng/ml rastora svakog od ovih peptida u PBS-Tween (0,05%) su inkubirani u svakom bunaridu Netravidin ploče koja sadrži 96 bunarida 2-3 h na 4°C i nakon toga da puta isprani sa PBS-Tween (0,05%). Različite koncentracije anti-Cad-11 antitela su inkubirane u svakom bunaridu 1 hr na 22°Ci zatim isprane dva puta sa PBS-Tween (0,05%). 100 µl 1/1000 razblaženog kozjeg antimišjeg IgG sekundarnog antitela je dodato u svaki bunarid, inkubirano 30 min na 22°C, i zatim isprano dva puta sa PBS-Tween (0,05%). Dodato je na sobnoj temperaturi 100 µl/bunaridu TMB-a (3, 3’, 5, 5’-tetrametilbenzidina) reagensa u svaki bunarid i omogudeno je da se razvije boja 5 min na 22°C. Reakcija je stopirana na sobnoj temperaturi sa 100 µl 2N sumpornom kiselinom i ploča se očitava na 450 nm na Wallac 1420 čitaču mikroploča.

[0073] Medijumi iz bunarida koji sadrže hibridome pozitivne na anti-Cad-11 antitelo se ispituju za sposobnost vezivanja za delije koje eksprimiraju Cad-11. Zamrznute 431D delije koje ekprimiraju Cad-11 su odrznute i isprane da puta u Henkovom ranotežnom rastvoru soli (HBSS) koji sadrži Ca<2+>(0,137 M NaCl, 5,4 mM, KCl 0,25, mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4i 4,2 mM NaHCO) i zatim resuspendovane u koncentraciji od 10<6>delija/ml u HBSS-u koji sadrži Ca<2+>. 10<5>delija/bunaridu se boje ili sa 50% ili 16% medijumom anti-Cad-11 antitela tokom 45 min na ledu, ispiraju dva puta u HBSS koji sadrži Ca<2+>, boje sa sekundarnim kozjim anti-mišjim IgG antitelom konjugovanim sa fitoeritrinom (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) na koncentraciji 1% tokom 45 na ledu i zatim ponovo da puta ispiraju u HBSS koji sadrži Ca<2+>. Delije se zatim resuspenduju u 400 μl HBSS koji sadrži Ca<2+>i 1% formaldehid i nakon toga analiziraju upotrebom FACScalibur (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ) za PE pozitivne delije.

Rezultati

[0074] Medijum sadrži anti-Cad-11 antitelo iz hibridoma Peptida 4 hibridoma vezano za Cad-11 EC1-2 protein (SL.16, HL vs Cad-11), ali ne proteine koji sadrže EC1-2 domene Cad-8 i MN-Cad (SL.16, HL vs Cad8 i HL vs MNCad, redom). Kontrolni medijum hibridoma se ne vezuje za bilo koji od proteina kadherina koji se ispituju (SL. 16, Medijum vs Cad-11, Medijum vs Cad8, i Medijum vs MNCad). Ovi podaci ukazuju na prisustvo antitela koja su specifična za Cad-11 u Peptidu 4 u hibridomima.

2

[0075] Dva hibridoma Peptida 4, koja su su naznačena kao H1M1 i H14, se vezuju za delije koje ekprimiraju Cad-11 protein (SL-e. 17A-C i 17G-I), ali ne za ne-Cad-11 kontrolne 431-D delije (SL-e.

17D-17F). Delijska linija hibridoma naznačena sa H1M1 ima A.T.C.C. naznaku deponovanog patenta PTA-9699, pošto je deponovan 8 januara, 2009. Delijska linija hibridoma naznačena sa H14 ima A.T.C.C. ATCC naznaku deponovanog patenta PTA-9701, pošto je deponovan 9 januara, 2009. Ovi hibridomi sadrže anti-Cad-11 antitela koja prepoznaju i Peptid 4 i delije koje eksprmiraju Cad-11 in vitro. Vezivanje ovih antitela za delije koje ekprimiraju Cad-11 je pokazano da titrira sa količinom antitela specifičnog za Peptid 4 koje se koristi, kao što se prikazuje na graficima titracije H1M1 (SL.

18A) i H14 (SL. 18B) u odnosu na intenzitet delijskog bojenja iz srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI).

[0076] H1M1 i H14 Peptid 4 anti-Cad-11 antitela pokazuju >100-puta vede vezivanje sa Cad-11 u odnosu na bilo koje druge kadherine koji se ispituju, što uključuje Cad-7, Cad-8, Cad-20, Cad-24, Cad-9, Cad-18, i MN-Cad. U vedini slučajeva, nije uočeno vezivanje H1M1 i H14 anti-Cad-11 antitela za druge kadherine. Anti-Cad-11 antitelo H14 pokazuje jako vezivanje sa Cad-11 (SL. 19A), sa 468-puta nižim vezivanjem sa Cad-8 (SL.19A), i skoro bez vezivanja sa Cad-7, MN-Cad, Cad-9, Cad-18, Cad-20 ili Cad-24 (SL.19B). Slično, anti-Cad-11 antitelo pokazuje jako vezivanje sa Cad-11 (SL.20), sa 1500-puta nižim vezivanjem sa Cad-8, i skoro bez vezivanja sa Cad-7, MN-Cad, Cad-9, Cad-18, Cad-20 ili Cad-24 (SL.20).

Referentni Primer 6: anti-Cad-11 antitela H1M1 i H14 specifična za EC1 domen vezuju epitope u EC1 domenu Cad-11 koji uključuje sekvencu aminokiselina GPDP

Materijali i Postupci

[0077] Da bi se odredio epitop unutar EC1 domena Cad-11 za koji se antitela specifična za EC1 H1M1 i H14 Peptida 4 vezuju, četiri različita peptida koja obuhvataju prvih 37 aminokiselina EC1 regiona (vidi SL. 22) su imobilizovana na ELISA formatu i određuje se sposobnost H1M1 i H14 antitela da se vežu za svaki od četiri peptida. Reactibind ploče sa 96 bunarida se oblažu preko nodi na 4°C sa 0,3 ng/bunaridu Peptida 1 (aminokiseline G1-P18 od Cad-11 EC1 domena), 0,3 ng/bunaridu Peptida 2 (aminokiseline G15-N34 od Cad-11 EC1 domena), 0,3 ng/bunaridu Peptida 3 (aminokiseline V19-Y37 od Cad-11 EC1 domena), 0,3 ng/bunaridu imunogena Peptida 4 (aminokiseline G1-G33 od Cad-11 EC1 domena), 20 ng fuzionog proteina uključujudi ceo EC1 domen (EFL), ili 20 ng kontrolnog humanog Ig (Fc-blok). Bunaridi se ispiraju dva puta sa PBS-Tween (0,05%), blokiraju s kazeinom u dH20 tokom 3 h na 22°C i zatim ispiraju dva puta sa PBS-Tween (0,05%). Različita razblaženja različitih antitela specifičnih za EC1 domen Peptida 4 Cad-11 se prenose na bunaride koji su obloženi peptidom- ili proteinom, inkubiraju 45 min na 22°C i zatim ispiraju dva puta sa PBS-Tween (0,05%). U svaki bunarid se dodaje 100 µl 1/1000 razblaženog kozjeg anti-mišjeg IgG sekundarnog anitela (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), inkubira 30 min na 22°C i zatim ispira dva puta sa PBS-Tween (0,05%). Dodaje se na sobnoj temperaturi 100 µl/bunaridu TMB reagensa u svaki bunarid i omogudava se razvijanje boje 5 min na 22°C. Reakcija se stopira na sobnoj temperaturi sa 100 µl 2 N sumporne kiseline i ploča se čita na talasnoj dužini od 450 nm na Wallac 1420 čitaču mikroploča.

Rezultati

[0078] Peptid 4 anti-Cad-11 antitela H1M1 na 1:11 (SL. 21A) i H14 na 1:23 (SL. 21B) oba vezuju imunogen Peptid 4 (PEP4), kao i EC1 domen fuzionog proteina (EFL), u ELISA kao što je naznačeno povedanim OD450 očitavanjima ploče u odnosu na kontrolu. Nijedno od ovih antitela se vezuje za humanu IgG kontrolu (Fc blok). Dodatno, oba antitela vezuju Peptid 2 (PEP2), ali ne Peptid 1 (PEP1) ili Peptid 3 (PEP3), u ELISA testu (SL-e.21A i 21B).

[0079] Ovi rezultati ukazuju na to da antitela specifična za anti-Cad-11 EC1 domena H1M1 i H14 vezuju zajednički epitop u Peptidima 2 i 4 koji nije prisutan u preklapajudem Peptidu 3. Aminokiseline koje dele Peptidi 2 i 4 se nalaze uzvodno od Peptida 3 su posvetljeni u regionima prikazanim na SL.

22. Oih četiri aminokiselina, GPDP (SEQ ID NO:11), počevši od G15 EC1 domena Cad-11 EC1, su najverovatnije deo epitopa koji prepoznaju H1M1 i H14 antitela.

Referentni Primer 7: Anti-Cad-11 antitela specifična za EC1 domen H1M1 i H14 inhibiraju nakupljanje delija koje eksprimirjau Cad-11 in vitro

Materijali i Postupci

[0080] Da bi se procenila sposobnost antitela specifičnih za Cad-11 da inhibiraju nakupljanje delija posredovano Cad-11, 30 µg/ml H1M1 Peptid 4 antitela se postavlja u kulturu sa 75,000 Cad-11 epidermoidnim delijama karcinoma koje eksprimiraju A-431-D u 0,5 ml DMEM-sa visokim sadržajem glukoze, 20mM Hepes pH 7,4, 10% FCS i 10U/ml DNAze u polipropilensku ploču sa 24 bunarida sa okruglim dnom. Ploča sa 24 bunarida se postalja na rotirajudu platformu na približno 60 oum ai inkubira sa 5% CO2preko nodi na 37°C. Slededi dan, nakupljanje delija se procenjuje fotografisanjem sa uveličanjem na 100x (za H1M1 eksperiment) ili 40x (za H14 eksperiment).

Rezutati

[0081] U prisustvu kontrolnog izotipskog antitela (30 µg/ml), delije koje eksprimiraju Cad-11 obrazuju velike mase (SL. 23A), dok parentalne delije negativne za Cad-11 ostaju kao pojedinačne ili udvostručene grupe delija (SL. 23C). Cad-11 delije tretirane sa H1M1 ostaju u obliku malih nakupina delija (SL.23B) koje dalje ne obrazuju velike mase koje se dobijaju upotrebom kontrolnih antitela.

[0082] Upotrebom istog testa, anti-Cad-11 antitelo H14 takođe pokazuje da inhibira nakupljanje delija posredovano Cad-11. Dok parentalne delije koje eksprimiraju Cad-11 obrazuju velike klastere nakupljenih delija (SL. 24A), H14 antitelo (SL. 24B) inhibira nakupljanje na koncentraciji od 30 µg/ml, jer su klasteri delija bili mali i retki. Ovi rezultati ukazuju na to da anti-Cad-11 antitela H1M1 i H14 inhibiraju nakupljanje delija posredovano Cad-11 in vitro.

Referentni Primer 8: anti-Cad-11 antitela specifična za EC1 domen, H1M1 i H14, inhibiraju oticanje zgloba koje je u vezi sa artritiso in vivo u mišjem modelu reumatoidnog artritisa

Materijali i Postupci

[0083] Studija 1 - C57/B16 miševi muškog pola starosti šest nedelja su dobili injekciju 150 µl KBN seruma u danu 0 i danu 2. Miševi tretirani sa KBN su dobili ili injekcije rastvora soli (SL. 25, prazni trouglovi) ili su tretirani sa različitim dozama H1M1 anti-Cad-11 EC1 antitela. Režimi tretmana uključuju doziranje u danu 0 sa 0,5 mg antitela/mišu i svakog drugog dana (q2d) zatim sa 0,1 mg antitela/mišu (0,5 mg+0,1 mg) (SL. 25, popunjeni trouglovi); doziranje u danu 0 sa 0,5 mg antitela/mišu (0,5 mg) (SL. 25, dijamanti); doziranje svakog drugog dana (q2d) sa 0,1 mg antitela/mišu (0,1 mg+0,1 mg) (SL. 25, kvadrati); ili doziranje svakog drugog dana (q2d) sa 0,3 mg

2

antitela/mišu (0,3 mg+0.3 mg) (SL. 25, krugovi). Kontrolna grupa se sastoji od 5 miševa i tretman grupa se sastoji iz 7 miševa. Oticanje zglobova povezano sa artritisom se određuje merenjem korišdenjem šublera koje se izvodi svakog drugog dana.

[0084] Studija 2 - C57/B16 miševi muškog pola starosti šest nedelja su dobili injekciju 150 µl KBN seruma u danu 0 i danu 2, i zatim su tretirani ili sa rastvorom soli svakog drugog dana (q2d) (SL. 26, trouglovi), jednom sa anti-Cad-11 antitelima, H1M1 (SL. 26, kvadrati) ili H14 (SL. 26, krugovi), na 0,3 mg/dozi q2d. Kontrolna grupa se sastoji iz 5 miševa i tretman grupa se sastoji iz 7 miševa. Oticanje zgloba povezano sa artritisom se određuje merenjem korišdenjem šublera koje se izvodi svakog drugog dana.

Rezultati

[0085] Studija 1 - H1M1 anti-Cad-11 antitelo inhibira oticanje zgloba uodnosu na kontrolne miševe. Najveda inhbicija oticanja zgloba koje je u vezi sa artritisom se uočava doziranjem miševa tretiranih sa KBN sa 0,3 mg H1M1 antitelom svakog drugog dana (SL.25, krugovi).

[0086] Studija 2 - Oba anti-Cad-11 antitela inhibiraju oticanje zgloba u odnosu na kontrolu. U ovoj studiji, H14 antitelo značajno odlaže početak artritisa u poređenju sa kontrolnim životinjama (SL.27). Svi miševi u kontrolnoj grupi razvijaju artritis do dana 3, dok je miševima koji su tretrani sa H14 potrebno 6 dana pre nego što sve životinje razviju artritis.

[0087] Ove studije ukazuju na to da antitela specifična prema EC1 domenu humanog Cad-11 mogu da inhibiraju razvoj i ozbiljnost simptoma artritisa in vivo.

Referentni Primer 9: Dobijanje antitela koja su specifična prema drugom peptidu EC1 domena humanog Kadherina-11

Materijali i Postupci

[0088] Balb/c miševi su imunizovani tokom dve nedelje u stopalo devet puta tokom perioda od 1 meseca sa 0.01 mg peptida V19-Y37 (VL VGRLH SDIDS GDGNI KY (SEQ ID NO:12)), koji odgovara 19 aminokiselinama humanog EC1 domena Cad-11, koji je u kovalentnoj vezi sa BSA. Ovaj petid je ode naznačen kao Peptid 3. Iz imunizovanih miševa su pokupljene slezine i fuionisane sa mišjim fuzonim partnerom P3X63-Ag8.653, da se dobij hibridomi koji proizvode antitela. Ovi hibridomi su prošireni i medijumi koji sadrže anti-Cad-11 antitelo iz hibridoma se pretražuju za sposobnost vezivanja proteina koji odgovara EC1-2 domenu Cad-11, koji se proizvodi u bakterijama. Medijumi koji sadrže anti-Cad-11 antitelo iz ovih Peptid 3 hibridoma se istovremeno pretražuju za odsustvo pretraživanja proteina koji obuhataju EC1-2 domene Cad-8 i MN-Kadherina. EIA ploče sa 96 bunarida su obložene preko nodi na 4°C sa 0,05 ml od 0 do 300 mg/ml od jednog od svakog EC1-2 Cad proteina, ili CHO delija koje prozvode EC1-Fc fuzioni protein, i zatim se nekoliko puta ispiraju sa slanim puferom. Ploče se nakon toga blokiraju upotrebom 0.25 ml kazein-PBS pufera i zatim ispiraju nekoliko puta sa slanim puferom. Medijumi hibridoma koji sadrži Peptid 3 anti-Cad-11 antitela su inkubirani sa čistim reagensima u svakom bunaridu 1 hr na 22°C i nakon toga ispiraju dva puta sa PBS-Tween (0,05%). 100 µl 1/1000 razblaženog kozjeg anti-mišjeg IgG sekundarnog antitela se dodaju u svaki bunarid, inkubiraju 30 min na 22°C, i zatim ispiraju dva puta sa PBS-Tween (0,05%). U svaki bunarid se dodaje 100 µl/bunaridu na sobnoj temperaturi TMB (3, 3’, 5, 5’-tetrametilbenzidin) reagensa i omogudeno je da se razvije boja 5

2

min na 22°C. Reakcija se prekida na sobnoj temperature sa 100 µl 2N sumpornom kiselinom i ploča se čita na 450 nm na Wallac 1420 čitaču mikroploča.

[0089] Medijumi iz hibridoma Peptida 3 se takođe testiraju za sposobnost vezivanja za humani Cad-11 protein koji je eksprimiran na delijma. Zamrznute 431D delije koje eksprimiraju Cad-11 su otopljene i isprane dva puta u HBSS sa Ca<2+>i zatim resuspendovane u koncentraciji od 10<6>delija/ml u HBSS koji sadrži Ca<2+.>10<5>delija/bunaridu se boje ili sa 50% ili 16% medijumom anti-Cad-11 antitela 45 min na ledu, ispiraju dva puta u HBSS koji sadrži Ca<2+>, a zatim boje sa sekundarnim kozjim anti-mišjim IgG antitelom konjugovanim sa fitoeritrinom na koncentraciji od 1% 45 na ledu i zatim ponovo ispiraju dva puta u HBSS koji sadrži Ca<2+>. Delije se zatim resuspenduju u 400 ml HBSS koji sadrži Ca2+ i 1% formaldehidom i zatim analiziraju na FACScalibur za PE pozitivne delije.

Rezultati

[0090] Medijum koji sadrži anti-Cad-11 antitelo iz Peptid 3 hibridoma se vezuje za Cad-11 EC1-2 protein i EC1-Fc fuzioni protein (SL. 28, HL vs Cad-11 i HL vs Cad-11-EC1, redom), ali se ne vezuje za proteine koji sadrže EC1-2 domene Cad-8 i MN-Cad (SL. 28, HL vs Cad8 i HL vs MNCad, redom). Medijum kontrolnog hibridoma ne vezuje bilo koje od proteina kadherina (SL. 28, Medijum vs Cad-11, Medijum vs Cad8, i Medijum vs MNCad).

[0091] Anti-Cad-11 antitela iz Peptid 3 hibridoma se takođe vezuju za delije koje eksprimiraju humani Cad-11 protein (SL. 29, vidi strelicu), ali ne za kontrolne delije koje ne eksprimiraju Cad-11 ved ekprimiraju Neos. Ovaj rezultat potvrđuje prisustvo anti-Cad-11 antitela u hibridomima koji prepoznaju zajedno delije koje in vitro eksprimiraju i Peptid 3 i Cad-11.

Referentni Primer 10: Anti-Cad-11 antitelo specifično za EC1 domen, H1M1, sprečava nakupljanje humanih primarnih fibroblasta sličnih sinoviocitima in vitro.

Materijali i Postupci

Test nakupljanja

[0092] U ovom testu, humane linije sinoviocita slične fibroblastima (FLS) se gaje u kulturi u FLS medijumu (DMEM, 10% FCS, 1% Penicilin-Streptomicin, 1% L-Glutamin, 0,05% Gentamicin, 1% HEPES) do konfluentnosti od 90-100%. U danu izvođenja testa, medijum se uklanja iz FLS i delije se uklanjaju iz balona upotrebom 0,05% Tripsin-EDTA, ispiraju sa MM medijumom (DMEM, 10% FCS, 1% Penicilin-Streptomicin, 1% L-Glutamin, 0,05% Gentamicin, 1% HEPES) i zatim da puta ispiraju sa HBS koji sadrži kalcijum (0,137 M NaCl, 5,4 mM, KCl 0,25, mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4i 4,2 mM NaHCO). Tripsonizovane FLS se resuspenduju u MM medijumu do koncentracije 4x10<4>delija/ml, i 2x10<4>delija/bunaridu se postavljaju na ploču sa 24 bunarida koja sadži ili samo medijum, izotipsku kontrolu antitela ili različita anti-Cad-11 antitela na 30 µg/ml. Ploča se inkubira 24 h na 5% CO2u inkubatoru i slededi dan se bunaridi ispituju svetlosnim mikroskopom i fotografišu.

Test invazije FLS

[0093] Za ispitivanje sposobnosti H1M1 antitela da inhibira invaziju FLS u matrigel, koji se sastoji iz razčiitih ekstradelijskih proteina matriksa, koristi se test invazije upotebom sistema bunarida sa

2

podeljenim matrigelom. Ovaj in vitro model bilogije FLS imitira sposobnost FLS da degradiraju i probijaju ljudsku hrskavicu u spojenim zglobovima. U ovom testu, humane FLS linije se postavljaju u kulturu u FLS MM medijumu do konfluentnosti 90-100%. Dan pre nego što testiranje počinje, FLS su ostavljene bez seruma 24 h u FLS medijumu bez seruma. U danu izvođenja testa, medijum se uklanja iz FLS delija koje su bile bez seruma i delije su uklonjene iz balona upotrebom 0,05% Tripsin-EDTA, isprane sa MM medijumom i zatim isprane 2x sa HBS koji sadrži kalcijum. Tripsonizovane FLS se resuspenduju u MM medijumu do 4x10<5>delija/ml. Dobijeni čepovi koji su obloženi matrigelom se postavljaju na ploču sa 24 bunarida koja sadrži MM medijum sa FCS, koji deluje kao mitogen za FLS. Na drugoj strani komore, 50 µl MM medijuma koji ne sadrži antitelo ili dva puta radne koncentracije tretman antitela, u koje se dodaje 50 µl delijske suspenzije koncentracije 4x10<5>delija/ml, se ubacuje u svaki bunarid. Komore sa FLS i antitelima se inkubiraju 18 h na 37 °C u inkubatoru.

[0094] Nakon 24 h, čepovi sa delijama se fiksiraju u metanolu, FLS koje se nalaze izvan membrane obložene matrigelom se uklanjaju upotrebom pamučnog brisanja, i membrane se suše i zatim boje upotrebom propidijum jodida (PI) 30 min u mraku na sobnoj temperaturi. Boja PI se uklanja i čepovi se ispiraju sa D-glukozom (1 mg/ml) i zatim se suše u mraku. Membrane se seku i slikaju na slajdovima upotrebom fluorescentnog mikroskopa i kavantifikuje se broj FLS delija koje su migrirale u membranu.

Rezultati

[0095] FLS koje su inkubirane ili sa medijumom ili kontrolnim antitelom obrazuju nakupine delija i široka mreža ovih delija koja se udružuje kroz delijske procese (SL-e.30A i B). Suprotno, delije koje su tretirane sa anti-Cad-11 antitelima, H1M1, formiraju manje delijskih nakupina i manje ostvarenih veza (SL.30C).

[0096] U serijama testova FLS invazije sa različitim primarnim humanim FLS, 30 µg/ml H1M1 antitela konzistentno inhibira invaziju FLS u membranu. Specifično, H1M1 u dozi od 30 µg/ml inhibira FLS invaziju za 80% u poređenju sa kontrolnim antitelom. Ova aktivnost je bila veda u odnosu na onu koja se uočava sa Cad-11 antitelima koji se vezuju izvan EC1 regiona, uključujudi 13C2 antitelo (SL.31).

Referentni Primer 11: H1M1 antitela inhibiraju oticanje zgloba u KBN modelu artritisa kod miša

Materijali i Postupci

[0097] Anti-Cad-11 antitelo, H1M1, se ispituje u KBN modelu artritisa gde se bolest indukuje davanjem 2 doze od 75 µl KBN seruma koje se daju u danima 0 i 2. Grupe od 7 C57BL/6 miševa muškog pola dobijaju 10 mg/kg H1M1 intraperitonealno svakog drugog dana sa početkom od dana 0 i na dnevnom nivou se prati oticanje zgloba kod miševa. Oticanje zgloba, ili zadebljanje članka, se meri na malleoli sa zglobom koji se nalazi u potpunosti savijenom položaju, upotrebom šublera sa opteredenjem (Long Island Indicator Service, Hauppauge, NY).

Rezultati

[0098] H1M1 antitelo suprimira oticanje zgloba za 53% (p<0,001) u poređenju sa kontrolnom grupom (SL.32).

2

Referentni Primer 12: Sekvenciranje H1M1 Varijabilnih domena i Regiona koi određuju komplementarnost

Materijali i Postupci

[0099] RNK je ekstrahovana iz 3 klonova delija hibridoma koje proizvode H1M1 (H1, H17 i H27). RT-PCR se izvodi upotrebom pulova degenerativnih prajmera za mišje signalne sekvence sa prajmerima konstantnog regiona za svaki od IgGVH, IgMVH, IgκVL i IGλVL. RNK (V)-regiona teškog i lakog lanca se umnožava upotrebom seta koji sadrži pul od šest degnerativnih prajmera (HA do HF) i iRNK V-regiona lakog lanca se umnožava upotrebom seta koji sadrži pul od sedam degenerativnih prajmera za κ kluster (κA do κG) i jedan degenerativni prajmer za λ kluster (vidi Tabela 1).

[0100] Za sve uzorke RNK, proizvodi umnožavanja iz teškog lanca se dobijaju iz reverzno transkribovane RNK sa IgGVH prajmerom za reverznu transkripciju koji se kombinuje sa pulovima prajmera teškog lanca B i E. Proizvodi umnožavanja se dobijaju iz IgKVL prajmera reverzne transkripcije i sa pulovima prajmera za κ laki lanac, kao što su B, C i G. PCR proizvodi iz svakog od gore navedenih pulova su prečišdeni i klonirani, i sekvencirano je najmanje četiri klonova za svaki proizvod.

[0101] Za H1M1 klonove koji proizvode H1, H17 i H27, sekvence V-regiona jednog funkcionalnog teškog i lakog lanca se identifikuju za svaki uzorak i pronađeno je da su tri antitela identična (Tabela 2). V-sekvence teškog i lakog lanca, i njihove CDR sekvence, su prikazane na SL-a.33 i 34, redom.

[0102] V-regioni teškog i lakog lanca iz tri klonova H1M1 hibridoma pokazuju dobru homologiju sa njihovim najbližim humanim germinativnim sekvencama (64% i 82%, redom) i individualne sekvence okvira imaju bliske homologe sa humanom germinativnom bazom podataka (Tabela 2). Ovaj visok stepen homologije smanjuje verovatnodu potrebe za ekstenzivnim inženjerstvom za dobijanje uspešnog humanizovanog antitela.

2

Tabela 1. Prajmeri koji se koriste za sekvencioniranje varijabilnih domena H1M1 i regiona koji određuju komplementarnost

Tabela 2: Analiza sekvenci H1M1 hibridoma klonova HI, H17 i H27

1

Primer 13: Dobijanje humanizovanih Anti-Cad-11 Antitela

Dizajn sekvenci varijabilnog regiona Humanizovanog Anti-Cad-11 Antitela

[0103] Strukturni modeli varijabilnog regiona (V) antitela mišjeg H1M1 monoklonskog antitela koje se ovde prikazuje, koje se takođe naziva SYN0012 antitelo, se proizvode upotrebom Swiss protein baze podatka i analiziraju da bi se identifikovale "ograničavajude" aminokiseline u V regionima koje su predviđene da budu esencijalne za svojstva vezivanja SYN0012/H1M1 antitela. Ostaci koji se nalaze unutar CDR-a (upotrebom i Kabat i Chothia definicija) zajedno sa brojem ostataka iz okvira se smatraju važnim. Obe VH i VK sekvence SYN0012/H1M1 antitela sadrže tipične ostatke okvira čitanja i CDR 1, 2 i 3 motivi su poređeni sa brojnim mišjim antitelima.

[0104] Iz analize koja se navodi gore u tekstu, smatra se da kompozitne humane sekvence SYN0012/H1M1 antitela mogu da se dobiju velikim brojem alternativa izvan CDR-a ali samo sa uskim odabirom mogudi ostataka unutar CDR sekvenci. Preliminarna analiza ukazuje na to da odgovarajudi segmenti sekvence iz nekolko humanih antitela mogu da se kombinuju da se dobiju CDR-i koji su sličnični ili identični sa onima u mišjim sekvencama SYN0012/H1M1 antitela. Za regione koji se nalaze izvan i koji ograničavaju CDR-e, identifikuje se širok odabir segmenata humanih sekvenci kao mogudih komponenata V regiona humanizovanih anti-Cad-11 antitela.

Dizajn varijanti

[0105] Na osnovu gore navedenih analiza, veliki preliminarni set segmenata sekvenci koji može da se koristi za dobijanje SYN0012 humanizovani anti-Cad-11 varijanti antitela se bira i analizira za in silico analizu vezivanja petida za alele MHC klase II (Perry et al 2009), i upotrebom TCEDTM (T Cell Epitope Database of Antitope LLC, Cambridge UK) poznate sekvence antitela u vezi sa T delijskim epitopima (Bryson C, Jones TD and Baker MP. Prediction of immunogenicity of therapeutic proteins: validity of computational tools. Biodrugs 2010, 24(1): 1-8). Segmenti sekvence koji se identifikuju kao značajni ne-humani germninatini koji vezuju MHC klasu II ili koji imju značajne rezultate TCEDTM se odbacuju. Ovo dovodi do redukovanog seta segmenata, i njihove kombinacije se ponovo testiraju, kao gore u tekstu, da se osigura da veze između segmenata ne sadrže potencijalne T delijske epitope. Odbrani segmenti se zatim kombinuju da se dobiju sekvence V regiona lakog i teškog lanca za sintezu. Za SYN0012 humanizovane anti-Cad-11 varijante antitela, 5 VH lanci (VH1-VH5; SEQ ID Nos:61, 63, 65, 67, 69) i tri VK lanaca (Vκ1- VK3; SEQ ID Nos:71, 73, 75) se dizjaniraju sa sekvencama kao što se navodi u SL-a.35A-35H.

Dobijanje kompozitnih varijanti humanog antitela

[0106] Sve varijante kompozitnih gena VH i VK regiona humanog antitela za SYN0012/H1M1 se sintetišu upotrebom serija preklapajudih oligonukleotida koji su razdvojeni, gde je izvršena ligacija i umnoženi PCR-om da se dobiju sintetički V regioni pune dužine. Sklopljene VH variante su klonirane upotrebom Mlu I i Hind III mesta, i sklopljene Vκ variante su klonirane upotrebom Bss HII i Bam H1 restrikcionih mesta direktno u pANT sistem ekspresionog vektora (Antitope, Cambridge UK) za IgG4 (S241P) VH lance i Vκ lance (sL.36). Svi konstrukti su potvrđeni sekvencioniranjem.

2

Konstrukcija, ekspresija i prečišdavanje antitela

[0107] Svih 15 kombinacija kompozitnog humanizovanog IgG4(S241P) VH i Vκ lanaca je stablno transfecirano u NS0 delije upotrebom elektroporacije i odabrano upotrebom 200nM metotreksata (Sigma Cat. No. M8407, Sigma Aldrich, UK). Kolonije koje su otporne na metoreksat za svaki konstrukt se ispituju za nivoe ekspresije IgG upotrebom IgG4 ELISA, i linije sa najboljom ekspresijom se biraju, proširuju i zamrzavaju u tečnom azotu. Delije koje ekprimiraju svaku od 15 varijanti humanizovanog antitela se uspešno dobijaju.

[0108] Petnaest humanizovanih IgG4 (S241P) kompozitnih varijanti SYN0012, naznačenih SDP011 (Vκ1/VH1), SDP021 (Vκ1/VH2), SDP031 (Vκ1/VH3), SDP041 (Vκ1/VH4), SDP051 (Vκ1/VH5), SDP061 (Vκ2/VH1), SDP071 (Vκ2/VH2), SDP081 (Vκ2/VH3), SDP091 (Vκ2/VH4), SDP101 (Vκ2/VH5), SDP111 (Vκ3/VH1), SDP121 (Vκ3/VH2), SDP131 (Vκ3/VH3), SDP141 (Vκ3/VH4), i SDP151 (Vκ3/VH5), se prečišduju iz NS0 supernatanta delijske kulture na koloni koja sadrži Protein A sefaroze (GE Healthcare Cat. No. 110034-93) i antitelo se kvantifikuje OD280nm upotrebom ekstincionog koeficijenta (Ec(0,1%) = 1,51) na osnovu predviđene sekvence aminokiselina. Primeduje se da tokom prečišdavanja mišjeg IgGI anti-Cad-11 EC1 antitela (SYN0011) dolazi do nakupljanja antitlea u obliku flokulata na pH od oko 7,5; prema tome sva antitela su neutralizovana nakon elucije kiselinom sa pH oko 6,5 i izmenjena puferom u 10 mM natrijum acetanom puferu pH 5,5 (1,4 mM sirdetna kiselina, 8,6 mM natrijum acetat). Svako humanizovana varijanta anti-Cad-11 antitela se prečišdava i analizira redukujudom SDS-PAGE. Uzorci se pune na NuPage 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen Cat. No. NP0322BOX) i puštaju na200 V 30 min. Trake koje odgovaraju predviđenim vrednostima za VH i VK lance se uočavaju bez dokaza kontaminacije proteinima (SL.37).

Primer 14: Karakterizacija vezivanja humanizovanih Anti-Cad-11 Antitela za Cad-11 Proteine

Materijali i postupci

Vezivanje prečišdenih antitela za rekombinovani humani Cad-11 EC1

[0109] Vezivanje prečišdenih humanih kompozitnih varijanti antitela (SDP011 do SDP151) za rekombinantni humani Cad-11 EC1 IgG1 fuzini protein se procenjuje ELISA testom sa kompetitivnim vezivnajem. Serije razblaženja od 5 µg/ml do 0,0022 µg/ml humanizoanih ili kontrolnih (SYN0012/H1M1) antitela se prethodno mešaju sa konstantnom koncentracijom biotinilovanom koncentracijom mišjeg anti-Cad-11 antitela, SYN0012/H1M1 (0,1 µg/ml, finalna koncentracija), pre inkubiranja 1 sat na sobnoj temperaturi na Nunc Immuno MaxiSorp mikrotitarskoj ploči sa sa 96 bunarida sa ravnim dnom (Fisher Cat. No. DIS-971-030J) koja je prethodno obložena sa 0,25 µg/ml rekombinantnim humanim Cad-11 EC1 (R&D Systems Cat. No.1790-CA-050) koji je rastvoren u PBS-u. Vezivanje biotinilovanog mAt-a se detektuje sa streptavidin-HRP (Sigma Cat. No. S5512) i tetrametilbenzidin (TMB) substratom (Invitrogen Cat. No.00-2023).

ELISA test ukrštene reaktivnosti Kadherina-Peptida

[0110] Za procenjivanje koje od humanizovanih anti-Cad-11 antitela pokazuje najvedu specifičnost za Cad-11, humanizovana antitela se testiraju u ELISA formatu za sposonost vezivanja za 37-mer peptide koji su u vezi sa BSA koji obuhvata Cad-11 imunogen ili odgovarajude sekvence od 6 najbližih sekvenci sa Cad-11 imunogenom, koji se uzima od Kadherina-7, -8, -9, -18, -20, i -24.

[0111] Ploče koje su aktivirane vezivanjem (ThermoScientific) su obložene sa 500ng/ml BSA koji je u vezi sa 37-mer peptidom kadherina (NE peptid) Koji odgovara Kadherinima-7, -8, -9, -11, -18, -20, i-24 u 0,05% Tween (EMD, kod proizvoda 9480) u PBS (pH 7,2) (Gibco(Invitrogen), #20012) na 100 µl zapremine/bunaridu preko nodi na 4°C. Rastvor koji sadrži peptid se uklanja iz bunarida i ploča se blokira sa 2% albuminom iz seruma govečeta (BSA) u PBS, 200 µl zapremine/bunaridu, 2h na 22°C. Ploča se zatim ispira dva puta sa 200 µl/bunaridu sa PBS-Tween 0,05% na 22°C i suši. Serija razblaženja od 5 µg/ml do 8 ng/ml u zapremini od 100µl/bunaridu od svog humanizovanog anti-Cad-11 antitela se inkubira u bunaridima obloženim peptidom na 22°C tokom 1hr. Rastvor antitela se uklanja iz bunarida i ploča se ispira dva puta sa 200 µl/bunaridu sa 0,05% Tween-PBS na 22°C i suši. Kozje-anti mišje IgG (Pierce # 31432) se dodaje u svaki bunarid na ploči u odnosu 1:1000 razblaženja, 100 µl/po bunaridu i inkubira 22°C tokom 30 min. Rastvor sekundarnog antitela se uklanja i ploča se ispira dva puta sa 200 µl/po bunaridu sa 0,05% Tween-PBS na 22°C i suši. Reakcija se razvija dodavanjem 100µl/po bunaridu tetrametilbenzidina (TMB) reagensa IgG (Pierce # 34022, 1 korak Turbo TMB-ELISA) u ploču i razvija se na 22°C 5 min. Reakcija se prekida upotrebom 100 µl RT 2N Sumporne kiseline i ploča se očitava na 450nm na čitaču mikroploča (Wallac 1420).

Vezivnanje Cad-11 na Površinoskoj plazmon rezonanciji (SPR)

[0112] Za određivanje afiniteta SDP051 za rekominatno his-obeleženo humano Cad-11, rhCad-11 (R&D Systems) se imobilizuje na čip u jednoj koncentraciji, određuju se kinetike visoke rezolucje za SDP051, i model vezianja reakcije sa kinetikom 2 reda se uspešno slaže da kinetičkim podacima.

[0113] Kinetičkipodaci se dobijaju sa niskim protokom 40 mL/min za smanjenje bilo kog potencijalnog efekta prebacivanja mase. Serije koncentracija analita sa opsegom od 12,5 nM do 0,195 nM se dobijaju serijskim razblaživanjem. Dva ponavljanja blanka (bez mAt) i 3,125 nM (prvi i poslednji ciklus) koncentracije analita su programirani u kinetička puštanja da bi se proverila stabilnost i površine i analita tokom kinetičkih ciklusa. SDP051 daje preko Fcs tokom 360 sekundi, dovoljno dugo da se uoči kriva u fazi asocijacije.

Cad-11 delijski test vezianja

[0114] Zamrznute 431D delije koje ekprimiraju Cad-11 (K. Johnson, U. Nebraska, Omaha) ili 431D delije koje ne ekprimiraju Cad-11 (K. Johnson, U. Nebraska, Omaha) su otopljene, isprane i resuspenduju se 2x10<6>delja/ml i u svaki bunarid se dodaje 50µl. Delije se zatim boje na ledu 45 minuta sa rastudim koncentracijma humanizovanih SDP051 ili SDP071 antitela od 1ng/ml do 30µg/ml. Nakon bojenja delije se ispiraju dva puta sa Henkoim ranotežnim rastvorom soli (HBSS) sa 1% rastvorom seruma fetusa (FBS), resuspenduju i boje sa mišjim anti-humanim IgG4-PE (100x razblaženje) na ledu 45’ zaštideno od svetlosti. Nakon bojenja delija sa sekundarnim sredstvom, delije se dva puta ispiraju sa HBSS sa 1% FBS, resuspenduju u 200 µl 2% formaldehidu u HBSS sa 1% FBS i zatim analiziraju sa BD FACSCalibur.

FACS Test ukrštene reaktivnosti Kadherina-Peptida

[0115] Zamrznute 431D delije koje eksprimiraju Cad-11 ili parentalne 431D delije koje ne ekprimiraju Cad-11 su otopljene isprane i resuspendovane pri koncentraciji 2x10<6>delija/ml dodato je 100,000

4

delija u svaki bunarid. Delije se boje na ledu 45 minuta sa koncentracijom koja raste ili 37-mer Cad-11 peptida ili Cad-7, Cad-8, Cad-9, Cad-18, Cad-20, ili Cad-24 peptida sa 0,5µg/ml SDP051. Nako bojenja delije se ispiraju dva puta sa Henkovim ranotežnim rastvorom soli (HBSS) koji sadrži 1% rastvor fetusa govečeta (FBS), resuspenduje i zatim boji sa 100µl kozjeg anti-mišjeg IgG-PE (100x razblaženje) na ledu 30’ i zaštideno od svetlosti. Nakon bojenja delija sa sekundarnim sredstvom, delije se ispiraju dva puta sa HBSS sa 1% FBS, resuspenduju i fiksiraju u 200 µl 2% formaldehidu u HBSS sa 1% FBS i zatim analiziraju sa BD FACSCalibur.

Rezultati

[0116] Svako od humanizovanih anti-Cad-11 antitela se efikasno nalazi u kompeticiji sa SYN0012 za vezivanje Cad-11 fuzionog proteina (SL-e. 38A do C). Ovo ukazuje na to da vezuju isti epitop kao SYN0012 ili preklapajudi epitop na Cad-11 i da vezuju najmanje jednako dobro ili bolje kao SYN0012 za rekombinantni humani Cad-11. Koriste se krive za izračunavanje IC50 vrednosti za svako antitelo i one se normalizuju sa vrednostima IC50 od SYN0012, koji je uključen na svakoj ELISA ploči tako da između ploča mogu da se izvedu poređenja (Tabela 3). Takođe su prikazani nivoi ekspresije za svaku delijsku liniju i izračnunata izoelektrična tačka (pI) svakog antitela (Tabela 3).

[0117] SDP051, Vκ1/VH5 antitelo, vezuje Cad-11 sa najvedom specifičnošdu, pokazujudi preko 100-puta vede vezivanje sa Cad-11 antigenom u odnosu na srodne antigene iz drugih kadherina (SL-e.

39A-O). Najveda ukrštena rekativnost se uočava prema Cad-8. SDP031, SDP061 i SDP071 takođe pokazuju značajnu specifičnost za Cad-11, pokazujudi preko 20-puta vede vezivanje za Cad-11 antigen u odnosu na srodne antigene iz drugih kadherina. Sekvence aminokiselina teškog i lakog lanca za SDP031, SDP051, SDP061 i SDP071 su prikazane na SL-a.40A-40D.

Tabela 3: Karakterizacija kompozitnih humanih anti-Cad-11 antitela.

Relativna vrednost IC50 se računa deljenjem vrednosti za antitelo koje se ispituje sa vrednost za SYN0012. Dati nivoi ekspresije antitela su za statične kulture u T balonima. PI vrednosti se računaju.

[0118] U početnom skriningu humanizovanih anti-Cad-11 antitela prema Cad-11 antigenu i Cad-7, -8, -9, -11, -18, -20, -24 antigena na sloju od 500ng/ml (SL.41A), SDP051 pokazuje značajno vede vezivanje za Cad-11 u odnosu na bilo koji drugi kadherin. Najvedi stepen ukrštene reaktivnosti se uočava kod Cad-8 antigena. Ovaj test se ponavlja sa Cad-11, Cad-8 i Cad-18 antigenima sa nižom koncentracijom sloja antigena 50ng/ml i vedim serijama razblaženja SDP051 antitela (SL. 41B). U ovom testu, SDP051 ima EC50od 6,8 ng/ml za Cad-11 i EC50od 1421 ng/ml od Cad-8, razlika u vezivanju preko 200-puta. Vrednost EC50za Cad-18 nije mogla da se uspostavi zbog uočenog niskog niova vezivanja. Ovi rezultati potvrđuju da je SDP051 visoko specifičan za Cad-11. BLAST pretraživanje sa sekvencom EC1 domena Cad-11 EC1 ukazuje da su najbliža preklapanja između Cad-7, -8, -9, -11, -18, -20, i -24 antigenima. BLAST pretraživanje sa jasnim heksapeptidom SDP051 vezujudeg epitopa u EC1 domenu Cad-11 ukazuje na to da nijedan drugi humani protein ne sadrži ovu sekencu.

[0119] SDP051 ima sub-nanomolarni afinitet za rhCad-11 protein sa ranotežnom konstantom disocijacije (KD) od 0,37 nM (Tabela 4).

Tabela 4: Fizička svojstva SDP051.

mAb

ka1 (1/Ms) 6,13x105

kd1 (1/s) 0,004301

ka2 (1/s) 0,01160

kd2 (1/s) 6,618 x10<-4>

KD (M) 3,787 x10<-10>

Chi2 0,194

[0120] Karakterizacija i kontrolni eksperimenti za površinu čipa ukazuju na to da je rhCad-11 koji je imobilizovan na jednoj gustini pogodan za određivanje kinetičkih vrednosti interakcija za anti-Cad-11 antitelo.

[0121] Za kinetičku analizu, koisti se model reakcije 2 reda (Jednačina 1, SL.42) na osnovu kontrolnih rezultata povezane reakcije, što ukazuje da se drugi događaj koji je vremenski zavisan pojavljuje, jednom kada se antitelo veže za antigen. Kako je rhCad-11 homodimer i prema tome sadrži dva identična epitopa za vezivanje, verovatno je da individualni molekuli mAt-a postaju sekvencijalno vezani kroz prvo mesto vezivanja i nakon toga kroz oba mesta vezivanja.

Jednačina 1: Jednačina drugog reda:

[0122] U testovima vezivanja delija, SDP051 i SDP071 pokazuju dozno zavisno vezivanje za delije koje eksprimiraju Cad-11 i odustvo vezivanja za parentalnu delijsku liniju koja ne eksprimira Cad-11 (SL.

43).

[0123] Alternativni način za određianje specifičnosti SDP051 za Cad-11 je merenje sposobnosti različitih kadherina da blokiraju vezivanje SDP051 za delije koje ekprimiraju Cad-11. Ovo se izvodi za svaki od Kadherina-7, -8, -9, -18, -20, -24 ili -MN. Samo Cad-11 peptid značajno blokira vezivanje SDP051 za delije koje su Cad-11+. Rezultati analize su prikazani na SL-a.44A-C.

Primer 15: SDP051, humanizovano Anti-Cad-11 Antitelo specifično za EC1, ispoljava slabu imunogenost u testovima gde se koriste humane delije

Materijali i Postupci

Prečišdavanje antitela

[0124] SDP051 se prečišdava iz 5L kultura delija koje ekprimiraju antitela koje se gaje do zasidenja. Supernatanti se razdvajaju od delija i debrisa, podešavaju do pH 7,4, sterilizuju ceđenjem i puštaju kroz afinitetne kolone koje sadrže 5 ml Hi-Trap Mab Select Sure protein A (GE Healthcare, Amersham, UK), koje su prethodno sanirane sa 0,5M NaOH, na brzini protoka 5 ml/min. Kolona se ispira sa 100ml PBS pH 7,4. Antitelo se ispira u frakcijama od 5 ml sa 0,1M natrijum citratom pH 3,0 i svaka frakcija se odmah neutrališe sa 0,25 ml 1M Tris-HCl. Sadržaj proteina svake frakcije se prati UV apsorpcijom na 280 nm i frakcije koje sadrže protein se pokupe, razmene puferom u 10 mM natrijum acetatu pH 5,5 i koncentruju. Antitelo se dalje prečišdava hromatografijom ekskluzionom za veličinu čestica upotrebom 16/60 Sephacryl S200 kolone (GE Healthcare, Amersham, UK). Glavne frakcije sa maksimalnim vrednostima se pokupe, objedine, sterilizuju ceđenjem i testiraju za nivoe endotoksina upotrebom Endosafe®-PTSTM (Charles River, Margate, UK). Prečišdeno antitelo se čuva na 4°C. Konačne koncentracije se određuju UV apsorpcijom računanjem molarnih ekstincionih koeficijenata, gde je A2801,0 = 1.51 mg/ml. Svako antitelo se zatim razblažuje do 100 µg/ml u medijumu za kulturu AIMV (Invitrogen, Paisley, UK).

Test imunogenosti

[0125] PBMC se izoluju iz beličastih slojeva zdravih donora (iz kri koja se uzima tokom 24 časova) koja se dobija iz Nacionalnog centra za transfuziju krvi (Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK). PBMC se izoluju iz beličastih slojeva upotrebom Lymphoprep® (Axis-Shield, Dundee, UK) i centrifugiranjem gustine, i CD8+ T delije su iscrpljene upotrebom CD8+ RosetteSep® (StemCell Technologies Inc., London, UK). Donori se karakterišu identifikacijom HLA-DR haplotipova upotrebom Biotest SSP-PCR kita za tipizaciju tkiva (Biotest, Landsteinerstraße, Denmark) i određivanjem T delijskih odgovora ’reproducibilnost’ kontrolnog antigena (KLH: Pierce, Cramlington, UK). PBMC se zatim zamrzavaju i čuvaju u tečnom azotu do ponovne upotrebe.

[0126] PBMCs iz svakog donora su otopljene, vrši se brojanje i procena vijabilnosti. Delije se oživljavaju na sobnoj temperaturi u AIMV medijumu za kulturu delija (Invitrogen, Paisley, UK) i resuspenduju u AIMV do 4-6x10<6>PBMC/ml. Za svakog donora, se uspostavljaju mase kultura gde se u ploču sa 24 bunarida dodaje ukupno 1ml štoka proliferišudih delija. Ukupno 1ml svako razblaženost test uzorka se dodaje u PBMC da se dobije finalna koncentracija od 50µg/ml po uzorku. Za svakog donora, je takođe uključena pozitivna kontrola (delije inkubirane sa 100µg/ml KLH) i negativna kontrola (delije inkubirane samo u medijumu za kuturu delija). Za prih 4 donora, takođe je ukljudena dodatna kontrola za ispitivanjem modulacije T delijskih odgovora sa test uzorcima, gde se test uzorak i KLH oba dodaju u PBMC. Poređenje oih uzoraka samo sa KLH može da se koristi za procenjivanje efekata uzoraka koji se ispituju nproces proliferacije.

[0127] Kulture s inkubiraju ukupno 8 dana na 37°C sa 5% CO2. U danima 5, 6, 7 i 8, delije u svakom bunaridu se nežno resuspenduju i 3 x 100µl alikvota se prebaci u individualne bunaride sa okruglim dnom na ploču sa 96 bunarida 96. Kulture su pulsiraju sa 1µCi *<3>H]-Timidinom (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, USA) u 100µl AIMV medijumu za kulturu i dalje inkubiraju 18 časova pre nanošenja na filter matove (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, USA) upotrebom TomTec® Mach III instrumenta za prikupljanje delija. Cpm za svaki bunarid se određuje pomodu Meltilex™ (Perkin Elmer®, Waltham, Massachusetts, USA) scintilacionog brojanja na beta brojaču mikroploča u paraluksu, sa načinom brojanja uz nisku pozadinu.

Testovi proliferacije delija

[0128] Za testove proliferacije, emprijska granična vrednost od SI jednaka ili veda sa 2 (SI≥2,0) je prethodno uspostavljena gde uzorci koji indukuju proliferativne odgovore iznad ove granične vrednosti deluju pozitivno (gde je uključeno, granična linija SIs ≥1,90 su naznačene). Ekstenzivni razvoj testa i prethodna ispitivanja su pokazala da je ovo minimalni signal buke praga koji omogudava maksimalnu senzitivnost bez detekcije velikih brojeva lažnih pozitini rezultata. Za setove podataka proliferacije (n=3), pozitivni odgovori se definišu statističkim i empirijskim graničnim vrednostima:

1. Značaj (p<0,05) odgovora poređenjem cpm vrednosti test bunarida sa kontrolnim bunaridima koji sadrže medijum upotrebom neparnog studentovog t-testa da uzorka.

2. SI jednako ili vede sa 2 (SI≥2,0).

Rezultati

[0129] Za dalje procenjivanje potencijalne imunogenosti, humanizovano anti-Cad-11 EC1 antitelo SDP051 se testira na njen potencijal da indukuje proliferaciju CD8 depletovanog PBMC (CD4 T delije) iz 25 različitih humanih donora T delija u testu koji traje 8 dana. Dok himerno SYN0014 antitelo, koje je mišja-humana IgG4 Fc himerna verzija parentalnog mišjeg H1M1/SYN0012 antitela, indukuje proliferaciju kod 28% donora, SDP051 antitelo ne indukuje proliferaciju bilo kojih T delija donora. Ovi rezultati podržavaju prethodo in silico otkride da SDP051 ima niski profil imunogenosti.

[0130] Rezultati is testa proliferacije za imunogenočnost tokom vremena sa kontrolnim himernim SYN0014 antitelom i humanizovanim SDP051 antitelom su prikazani na SL-a. 45A i B, redom. Mišjehumano himerno SYN0014 antitelo stimuliše odgovore u 7 od 25 donora (28% donora) sa jednim odgovorom donora koji je na granici (1,98 za donora 16) ali i dalje značajno različit od pozadine (p<0,05, SL. 45A). Humanizovano antitelo SDP051 ne stimuliše bilo koje odgovore u bilo kom od donora (0 od 25 ili 0% donora) ukazujudi na niski potencijal imunogenosti.

Primer 16: SDP051, Humanizovano Anti-Cad-11 EC1 Antitelo, inhibira invaziju sinoviocita i MMP3 ekspresiju

Materijali i Postupci

Test Invazije FLS

[0131] Primarne humane FLS linije su kultivisane u FLS MM medijumu (DMEM, 10% FCS, 1% Penicilin-Streptomicin, 1% L-Glutamin, 0,05% Gentamicin, 1% HEPES) do postizanja 90-100% konfluentnosti. Dan pre početka testa, FLS su izgladnjivanje 24h u FLS medijumu bez prosustva seruma. U danu izvođenja testa, medijum je uklonjen iz FLS koje su izgladnjivanje u odsustvu seruma i delije su uklonjene iz balona upotrebom 0,05% Tripsin-EDTA i zatim isprane 2x sa HBS koji sadrži kalcijum. Tripsinizovane FLS su resuspendovane u MM medijumu do 4x10<5>delija/ml. Dobijeni čepoviobloženi matrigelom su postavljeni na ploču sa 24 bunarida koja sadrži MM medijum sa 5% serumom fetusa govečeta (FCS) koji deluje kao hemoatraktant za FLS. Sa druge strane komore je postavljeno 50µl MM medijuma koji sadrži ili 6µg/ml ili 06µg/ml SDP051 (dva puta radne koncentracije) ili 6µg/ml kontrolnog AC1-P antitela, u koji se dodaje 50 µl 4x10<5>delija/ml delijske suspenzije u svaki bunarid. Komore sa FLS i antitelima se inkubiraju 18h na 37C u inkubatoru.

[0132] Nakon 24 časova, čepovi sa delijama se fiksiraju u 100% metanolu u trajanju od 30’ na - 20°C i FLS koji ne vrše invaziju se drže za unutrašnji deo membrane obložene matrigelom i uklanjanju se pamučnim brisanjem. Membrane se suše i zatim boje sa propidijum jodidom (PI) 30min u mraku na sobnoj temperaturi. PI boja se uklanja i čepovi se ispiraju sa D-glukozom (1mg/ml) i nakon toga se suše u mraku. Membrane se seku i slikaju na slajdovima upotrebom fluorescentnog mikroskopa i kvantifikuje se broj FLS koje su migrirale kroz membranu.

Rezultati

[0133] Cad-11 je kritičan kadherin koji je neophodan za biologiju FLS. Kao rezultat, očekuje se da antagonisti Cad-11 inhibiraju sposobnost humanih primarnih FLS da degradiraju i vrše invaziju u sloj matrigela, koji razdvaja dva bunarida. Matrigel se sastoji iz različitih proteina ekstradelijskog matriksa. Ovaj in vitro model biologije FLS replicira aspekte FLS biologije ugljučujudi njihovu sposobnost da vrše degradiranje i ulaze u hrskavicu.

[0134] SDP051 značajno inhibira ED FLS invaziju u matrigel.0,3 µg/ml SDP051 antitela je dovoljno da inhibira 50% invazije primarnih humanih FLS u membranu matrigela u poređenju sa kontrolom izotipskog antitela (SL.46).

[0135] FLS eksprimira MMP3, za koji se smatra da je jedan od enzma kojisu uključeni u degradiranje hrskavice in vivo i matrigela u in vitro test invazije. Supernatanti iz testa invazije su pokupljeni pre fiksacije delija i zamrznuti na -80° C. Ovi supernatanti su odmrznuti i ispitani za prisustvo MMP3 u medijumu kulture. Nivoi MMP3 su zančajno povedani u bunaridu koji sadrži FSL tretirane sa kontrolnim antitelom (AC1-P) koje su stimulisane da migriraju sa FCS (SL. 47). Nivoi MMP3 su značajno smanjeni kod FSL tretiranih sa SDP051 stimulisanih sa FCS. Nivoi su smanjeni oko 50% u poređenju sa delijama koje su tretirane kontrolnim antitelima.

Primer 17: SDP051, humanizovano Anti-Cad-11 EC1 Antitelo, Inhibira inflamaciju zgloba u animalnom modelu artritisa

[0136] Da bi se ispitalo SDP051 antitelo u životinjskom modelu artritisa, odabran je K/BxN serum transfer model artritisa koji je razvijen od strane od strane D. Mathis i C. Benoist (Korganow AS, Ji H, Mangialaio S, Duchatelle V, Pelanda R, Martin T, et al. From systemic T cell self-reactivity to organspecific autoimmune disease via immunoglobulins. Immunity 1999;10:451-61). Ovaj model predstavlja ekstenzivni sinovitis i prema tome je dobar test za anti-inflamatorna i zaštitna svojstva SDP051 antitela.

[0137] C57B1/6 miševi starosti šest do osam nedelja su dobili intraperitonealno injekciju (IP) sa 75ml KBN serumom (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) oba u danu 0 i danu 2. Miševi su dozirani IP sa ili 10 mg/kg SDP051 ili kontrolom (AC1-P) u danima -1, 0, 1, 2, 4 i 6. Oticanje zgloba, ili zadebljane članka se meri, na malleoli na oba zadnja gležnja svakog miša koji drže članak u potpuno opruženom položaju u danima 0, 2, 4, 6, 8, i 10 ispitivanjima, upotrebom šublera sa oprugom (Mitutoyo model zadebljanja gage model 7308, Long Island Indicator Service, Hauppauge, NY). Određena je razlika u zadebljanju zgloba u danu 0 i danu merenja. Promene u zadebljanju članka tokom trajanja studije su predstavljeni grafikom na Slici 48. Razlike u rezultatima zadebljanja članka su značajne u danima 6, 8 i 10. U danu 10, oticanje članka u SDP051 grupi je 47% niže u odnosu na oticanje kod kontrolne grupe.

[0138] U danu 10, serum je sakupljen iz terminalne krvi svakog miša koji je deo studije. Serum je zamrznut na suvom ledu i skladišten na -80°C. Nivoi SDP051 u serumu se određuju testiranjem seruma potrebom ELISA korišdenjem Cad-11 peptida kao reagensa za hvatanje, i zatim detekcije SDP051 sa anti-humanim IgG. SDP051 može brzo da se detektuje u serumu miševa (SL.49).

[0139] Članci su pokupljeni u danu 10 i procenjena je histopatologija. Ozbiljnost oštedenja hrskavice, erozija kosti i inflamacija (delijski infiltrat) su procenjeni u rasponu od 0-5 od strane kvalifikovanog tehničara koji je slep za grupe koje se ispituju. Rezultati histopatologije u danu 10 su prikazani u Tabeli 5. Životinje koje su tretirane sa SDP051 pokazuju 35% smanjenje u eroziji hrskavice, 27% smanjenje u eroziji kosti i 25% smanjenje u rezultatu u vezi sa inflamacijom.

Tabela 5. Histopatološki rezulati u danu 10 (KBN013)

Primer 18: SDP051 Dozni odgovor kod KBN modela artritisa

[0140] Miševi su dozirani sa KBN serumom u danima 0 i 2. Miševi su doznirani IP sa 10, 3, ili 1 mg/kg SDP051 ili kontrolom AC3-1-P u danima 0, 2, 4 i 6. Promene u debljini članka su prikazane na SL 50. Trend smanjenje u debljni članka se uočava kod miševa koji su tretirani sa 3 ili 10 mg/kg SDP051. Smanjenje u oticanju članaka u grupi sa 10 mg/kg je značajno u danima 6, 8 i 10. U danu 10, oticanje članaka u ovoj grupi je 44% niže u odnosu na oticanje u kontrolnoj grupi. Tokom serija ispitivanja, 10mg/kg SDP051 zančano smanjuje oticanje članka. Pri 3mg/kg se uočava trend smanjenja oticanja članka.

Primer 19. SDP051 redukuje citokine uključene u patologiju reumatoidnog artritisa

[0141] Miševi su dozirani u venu repa IV sa 10mg/kg SDP051 ili AC3-1-P kontrolnim antitelom u danima 0, 1, 2, 4 i 6. U danu 6, SDP051 grupa pokazuje 33% manje oticanje zgloba nego kontrolna grupa (Tabela 6). Analiza citokona se izvodi na člancima koji su pokupljeni u danu 7 od ovih miševa prema slededem: Zglobovi članaka se skupljaju, koža i krzno se uklanjaju i zglobovi se brzo zmrzavaju u tečnom azotu. Zglobovi se nakon toga rastvaraju u puferu za homogenizaciju (Affymetrix pufer za homogenizaciju tkiva (deo# PC6002), dopunjuju sa 2 mM PMSF (Sigma part# P7626) i 1X koktelom za inhibiranje proteaze (Sigma deo #P8340), 0,1M indometacin) i centrifugiraju, i dobijeni supernatanti se ispituju za nivoe različitih citokina i hemokina u multipleks testovima (OceanRidge Biosciences).

[0142] Grupa koja je tretirana sa SDP051 pokazuje 29% do 51% smanjenje u nivoima faktora diferencijacije osteoklasta, rastvorljivog receptora aktivatora liganda nuklearnog faktora kapa-B

4

(sRANKL), osteoklasnog/limfoidnog hemokina, Inflamatornog Proteina-1 makrofaga (MIP1α), monocitnog hemokina Monocita hemotaktičkog Proteina-1 (MCP1), Faktora stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF), i hemokina leukocita, regulacijom nakon aktivacije, Normalno eksprimiranog od strane T delija i sekretovanog (RANTES) (Table 6). U nivoima IL-6 ili TNFα se uočava malo ili skoro da nema uočljivog efekta. Umereno povedanje se uočava kod vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) dok IL-23 ne može da se detektuje u grupama koje se ispituju.

[0143] Predloženi mehanizam delovanja SDP051 je da se antitelo vezuje za Cad-11 na sinoviocitima koje su slične fibroblastima u zglobu miša što dovodi do smanjene ekspresije pro-inflamatornih citokina i hemokina. Zaista, kod miševa koji su tretirani sa SDP051, uočava se smanjenje kod nekoliko hemokina leukocita za koje se smatra da su uključeni u FLS biologiju, uključujudi MCP-1, RANTES i MIP1α, u zglobovima pacijenata koji imaju RA (Garcia-Vicuna R, Gomez-Gaviro M, Dominguez-Luis M, Pec M, Gonzalez-Alvaro M, Alvaro-Gracia M and Diaz-Gonzalez F, 2004 Arth & Rheum, 50, pp3866-3877) (Tabela 6). Dodatno, sRANKL je važan medijator razvoja osteoblasta i ekpresija RANKL se indukuje na FLS različitim inflamatornim citokinima (Hashizume M, Hayakawa N and Mihara M, 2008, Rheumatology 47 pp.1635-1640). Miševi koji su tretirani sa SDP051 pokazuju smanjenje u nivoima sRANKL u njihovim zglobovima (Tabela 6). Dok su ovi efekti umereni, efekti ovih promena na lokalnom regionu mogu da se umnože.

Tabela 6. Rezultati citokina dana 7 iz studije KBN018

[0144] Iako je ovaj pronalazak posebno prikazan i opisan sa pozivanjem na primere njegovog izvođenja, stručnjacima iz oblasti tehnike de bit jasno da različite promene u obliku i detaljima mogu da se naprave bez odstupanja od obima pronalaska koji je obuhvaden priloženim zahtevima.

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Humanizovano antitelo koje specifično vezuje EC1 domen sisarskog proteina kadherina-11 i antagonizuje pomenuti sisarski protein kadherin-11, koje sadrži varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 69 i varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 71.

2. Humanizovano antitelo prema zahtevu 1, gde je antitelo celo antitelo.

3. Humanizovano antitelo prema zahtevu 1, gde antitelo inhibira jednu ili više aktivnosti koje su povezane sa proteinom kadherinom-11 koje se biraju iz grupe koja se sastoji od vezivanja sisarskog proteina kadherina-11 za jedan ili više drugih proteina kadherina-11, nakupljanja delija koje eksprimiraju sisarski protein kadherin-11, indukcije ekspresije enzima, indukcije ekspresije citokina, indukcije ekspresije faktora rasta, migracije delija koje eksprimiraju sisarski protein kadherin-11 i destrukcije hrskavice.

4. Humanizovano antitelo prema zahtevu 1, gde je antitelo fragment antitela, poželjno gde se fragment antitela bira iz grupe koja se sastoji od Fab, Fab’, F(ab’)2i scFv.

5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za EC1 domen sisarskog proteina kadherina-11 i antagonizuje pomenuti sisarski protein kadherin-11, i farmaceutski prihvatljivi nosač, gde antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 69 i varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 71.

6. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 5, gde antitelo inhibira nakupljanje delija koje eksprimiraju pomenuti sisarski kadherin-11, ili gde je antitelo celo antitelo, ili gde je antitelo fragment antitela.

7. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 5, koja dalje sadrži anti-reumatski lek koji modifikuje bolest, poželjno, gde anti-reumatski lek koji modifikuje bolest je metotreksat.

8. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 5, koja dalje sadrži anti-inflamatorno sredstvo, poželjno gde je anti-inflamatorno sredstvo NSAID ili steroid.

9. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira humanizovano antitelo prema Zahtevu 1.

10. Izolovana nukleinska kiselina prema zahtevu 9, gde se pomenuta nukleinska kiselina nalazi u vektoru.

11. Izolovana delija koja eksprimira humanizovano antitelo prema Zahtevu 1.

12. Humanizovano antitelo koje specifično vezuje EC1 domen sisarskog proteina kadherina-11, gde antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 69 i varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 71 i gde antitelo antagonizuje pomenuti sisarski protein kadherin-11 za upotrebu u lečenju poremedaja koji je povezan sa proteinom kadherinom-11 koji se bira iz grupe koja obuhvata inflamatorni poremedaj, fibrozu i kancer kod sisarskog subjekta kome je potrebno.

13. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 12, gde je nakupljanje delija koje eksprimiraju sisarski protein kadherin-11 inhibirano u jednom ili više zglobova pomenutog subjekta, ili gde je antitelo celo antitelo, ili gde je antitelo fragment antitela, ili gde je poremedaj koji je povezan sa proteinom kadherinom-11 poremedaj inflamacije zglobova koji se bira iz grupe koja obuhvata reumatoidni artritis, psorijazni artritis, Reiterov sindrom, ankilozirajudi spondilitis, juvenilni hronični artritis, hroničnu Lajmsku bolest i artritis zglobova koji je povezan sa sistemskim lupusom eritematozusom, ili gde je sisarski subjekt čovek, ili gde se antitelo daje sistemski, ili gde se antitelo daje intravenozno, ili gde se antitelo daje direktnom injekcijom u zglob, ili gde antitelo inhibira migraciju, adheziju, invaziju u hrskavicu, ili intradelijske signalne puteve u delijama koje eksprimiraju pomenuti sisarski protein kadherin-11 u jednom ili više zglobova pomenutog subjekta, ili gde antitelo inhibira indukciju ekspresije ili aktivnost enzima koji se bira iz grupe koja obuhvata kolagenazu, serin proteazu, i matriksnu metaloproteinazu u delijama koje eksprimiraju pomenuti sisarski protein kadherin-11 u jednom ili više zglobova pomenutog subjekta, ili gde antitelo inhibira indukciju ekspresije ili aktivnosti citokina ili faktora rasta koji se bira iz grupe koja se sastoji od IL-6, IL-8, RANKL i TRANCE u delijama koje eksprimiraju pomenuti sisarski protein kadherin-11 u jednom ili više zglobova pomenutog subjekta, ili gde se antitelo daje u kombinaciji sa najmanje jednim sredstvom koje se bira iz grupe koja obuhvata anti-reumatski lek koji modifikuje bolest i antiinflamatorno sredstvo.

14. Upotreba humanizovanog antitela za dobijanje leka za lečenje poremedaja koji se povezan sa proteinom kadherinom-11 koji se bira iz grupe koja obuhvata inflamatorni poremedaj, fibrozu i kancer kod sisarskog subjekta kome je to potrebno, gde antitelo specifično vezuje EC1 domen sisarksog proteina kadherina-11 i sadrži varijabilni region teškog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 69, i varijabilni region lakog lanca antitela koji sadrži SEQ ID NO: 71.

15. Upotreba prema zahtevu 14 ili antitelo za upotrebu prema zahtevu 12, gde je poremedaj koji povezan sa proteinom kadherinom-11 inflamatorni poremedaj, poželjno gde je inflamatorni poremedaj inflamatorni poremedaj zglobova, kao što gde je inflamatorni poremedaj zglobova reumatoidni artritis.

4

16. Upotreba prema zahtevu 14 ili antitelo prema zahtevu 12, gde je poremedaj koji je povezan sa proteinom kadherinom-11 fibroza, ili gde je poremedaj koji povezan sa proteinom kadherinom-11 kancer.