RS57549B1 - Proces za pripremu glikoziliranog interferona beta - Google Patents

Description

POLJE TEHNIKE

Ovaj pronalazak odnosi se na procese za proizvodnju rekombinantnog humanog Interferona beta u uslovima gajenja u kulturi bez sadržaja seruma.

STANJE TEHNIKE

Proteini su postali komercijalno važni kao lekovi koji su poznati i pod opštim nazivom "biološki lekovi". Jedan od velikih izazova je i razvoj ekonomičnih i efikasnih procesa za produkciju rekombinantnih proteina u komercijalnim količinama.

Industrija biotehnologije obimno koristi ćelije sisara za proizvodnju rekombinantnih glikoproteina za terapijske namene kod ljudi.

Pokazalo se da su odgovarajuće ćelije koje se široko koriste za produkciju polipeptida ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO).

Ćelije CHO prvi je uzgajao Puck (1958) iz biopsije jajnika ženke kineskog hrčka. Iz ovih originalnih ćelija izveden je veliki broj pod-linija različitih karakteristika. Jedna od tih ćelijskih linija CHO, CHO-K1, iziskuje prolin i diploid je za gen dihidrofolat reduktazu (DHFR). Druga ćelijska linija izvedena iz ove ćelijske linije je DHFR deficijentna ćelijska linija CHO (CHO DUK B11) (PNAS 77,1980,4216-4220), koja se odlikuje gubitkom funkcije DHFR kao posledice mutacije u jednom genu DHFR i posledičnom gubitku drugog gena.

Druge ćelije koje se često koriste za proizvodnju proteina čija je namena da se primenjuju kod ljudi su humane ćelijske linije kao što su ćelijska linija HT1080 humanog fibrosarkoma ili ćelijska linija 293 humanog embrionskog bubrega, ćelijska linija izvedena iz humanog embrionskog retinoblasta, kao što je npr. PER.C6, ćelijska linija izvedena iz amnionske ćelije, ili ćelijska linija izvedena iz nervne ćelije.

Ćelije iz odgovarajuće ćelijske linije stabilno se transfektuju ekspresionim vektorom koji uključuje sekvencu kodiranja za protein od interesa koji treba proizvesti, uz regulatorne sekvence kao što su promoteri, pojačivači (enhanseri), ili poliA signali koji osiguravaju stabilnu i ispravnu ekspresiju proteina od interesa. Dodatni geni koji su obično prisutni na vektorima ekspresije su markerski geni kao što su npr. pozitivni selekcioni markeri (npr. neo gen) koji prepoznaju i odabiraju stabilno transfektovane ćelije iz netransfektovanih i prolazno transfektovanih ćelija.

Geni koji se mogu umnožavati, kao što je DHFR gen koriste se za amplifikaciju sekvenci kodiranja.

Jednom kada se uspostavi klon koji eksprimira protein od interesa, mora se uspostaviti i proces proizvodnje koji počinje od tog klona i tako se omogući proizvodnja većih količina u potrebnom kvalitetu koji se traži za proteine namenjene primeni kod ljudi.

Ovakvi procesi proizvodnje po pravilu se odvijaju u bioreaktorima. Ima ih koji koriste različite načine rada. Danas su punjenje u serijama (fed-batch) i perfuzija kulture dva preovlađujuća načina industrijske metodologije za procese gajenja ćelija sisara u kulturi za koje je potrebna velika količina proteina (Hu i Aunins 1997). Za koju god da se proizvodnu tehnologiju opredelimo, razvojni napori su umereni na dobijanje proizvodnih procesa koji garantuju visoku volumetrijsku produktivnost, doslednost serija (da su sve serije iste), homogeni kvalitet proizvoda i nisku cenu.

Odluka da li da se opredelimo za punjenje u serijama (fed-batch) ili perfuziju kulture uglavnom je pod uticajem biologije klona i svojstava proizvoda, i obavlja se od slučaja do slučaja, tokom razvoja svakog novog proizvoda, odnosno leka (Kadouri i Spier 1997).

Kada se opredelimo za proces perfuzije, jedan od sistema kulture koje odabiramo je stacionarni bioreaktor sa zgusnutim ležištima (packed bed) u kojima se ćelije imobilizuju na čvrstim nosačima. Ovim sistemom se lako rukuje, i uz odgovarajuće nosače i uslove za gajenje može da se postigne veoma visoka gustina ćelija (od ~ 10<7>-10<8>ćelija-ml<-1>).

Posledica ove velike gustine ćelija je potreba da se postigne intenzivna stopa perfuzije podloge (za hranjenje i potom ubiranje) koja treba da se koristi da ćelije ostanu vijabilne i produktivne. Izgleda da je brzina perfuzije jedan od centralnih parametara takvog procesa: ona pokreće volumetrijsku produktivnost proteina, kvalitet proizvedenog proteina i ima veoma snažan uticaj na sveukupnu ekonomičnost procesa.

Za proces gajenja ćelija (kulturu), u prošlosti su podloge za kulturu bile obogaćivane serumom, koji služi kao univerzalno hranivo za rast i svih ćelijskih linija sisara koji proizvode biološki aktivne proizvode. Serum sadrži hormone, faktor rasta, noseće proteine, faktore spajanja i širenja, hranljive materije, mikroelemente, itd. Podloge za kulturu obično sadrže do 10% životinjskog seruma, kao što je serum fetusa govečeta (FBS), koji se naziva i serum fetusa teleta (FCS).

Iako se široko koristi, serum je skopčan sa mnogim ograničenjima. On sadrži visoke nivoe brojnih proteina koji utiču na ograničene količine željenog proteina od interesa koji proizvode ćelije. Ti proteini koji se izvode iz seruma moraju se odvojiti od proizvoda tokom nishodnog

procesa, kao što je prečišćavanje proteina od interesa, čime se sam proces komplikuje i povećavaju troškovi.

Pojava BSE (goveđe spongiformne encefalopatije), prenosive neurodegenerativne bolesti stoke sa dugom latencom ili inkubacionim periodom, izazvala je zabrinutost regulatornih organa zbog upotrebe seruma dobijenog od životinja u proizvodnji biološki aktivnih proizvoda.

Stoga postoji velika potražnja za razvojem alternativnih podloga za gajenje ćelija u kojima neće biti supstanci dobijenih iz životinjskih izvora da pomažu gajenje ćelija i održavanje ćelija tokom proizvodnje biološki aktivnih proizvoda.

Uopšteno govoreći, podloge za gajenje ćelija uključuju brojne komponente različitih kategorija kao što su amino kiseline, vitamini, soli, masne kiseline, druga jedinjenja:

- Amino kiseline: na primer, US 6,048,728 (Inlow et al.) otkriva da se sledeće amino kiseline mogu koristiti u podlozi za gajenje ćelija (kulturu): alanin, arginin, aspartatna kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenialanin, prolin, serin, tiptofan, tirozin, treonin, i valin.

- Vitamini: US 2003/0096414 (Ciccarone et al.) ili US 5,811,299 (Renner et al.) na primer opisuju da se sledeći vitamini mogu koristiti u podlogama za gajenje ćelija: biotin, pantotenat, holin hlorid, folna kiselina, mio-lnositol, nijacinamid, piridoksin, riboflavin, vitamin B12, tijamin, putrescin.

- Soli: Na primer, US 6,399,381 (Blum et al.) otkriva podlogu koja sadrži CaCI2, KCI, MgCI2, NaCI, natrijum fosfat jednobazni, natrijum fosfat dvobazni, natrijum selenit, CuS04, ZnCI2. Drugi primer za dokument koji otkriva neorganske soli koje mogu da se koriste u podlozi za kulturu je US 2003/0153042 (Arnold et al.), u kome se opisuje podloga koja sadrži CaCI2, KCI, MgCI2, NaCI, natrijum fosfat jednobazni, natrijum fosfat dvobazni, CuCI2.2H20, ZnCI2.

- Masne kiseline: Masne kiseline za koje se zna da se koriste u podlogama su arahidonska kiselina, linoleinska kiselina, oleinska kiselina, laurinska kiselina, miristinska kiselina, kao i m,etil-beta-ciklodekstrin, videti npr. US 5,045,468 (Darfler). Treba napomenuti i da ciklodekstrin nije po sebi lipid, ali ima sposobnost da pravi komplekse sa lipidima i tako se koristi za solubilizaciju lipida u podlozi za gajenje ćelija.

- Dodatne komponente, posebno one koje se koriste u okviru podloge za gajenje ćelija koja ne sadrži serum su jedinjenja poput glukoze, glutamina, Na-piruvata, insulina ili etanolamina (npr. EP 274445), ili zaštitnog agensa kao što je Pluronic F68.

Pluronic® F68 (poznat i kao Poloxamer 188) je jedan blok kopolimer etilen oksida (EO) i propilen oksid (PO).

Evropska aplikacija za patent EP 1482031 A opisuje podlogu bez sadržaja seruma koja uključuje HEPES, prolin, i natrijum hlorid. Međutim, nikada nije bilo otkriveno niti predloženo da se ova podloga primeni za gajenje ćelija koje proizvode humani interferon beta.

Standardne "osnovne podloge" takođe su poznate stručnjacima za ovu oblast. Ove podloge već sadrže nekoliko gore pomenutih sastojaka podloga. U primere takvih podloga koje se široko primenjuju spadaju Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), ili Hamova podloga.

Posle proizvodnje proteina od interesa u bioreaktoru, taj protein od interesa se mora prečistiti da se odvoji od ubranih ćelija iz kulture. Ove ubrane ćelija iz kulture mogu da budu npr. ćelijski ekstrakti za intracelularne proteine, ili supernatant ćelijske kulture za sekretovane proteine.

Iako sada postoje brojne metode za pripremu proteina na veliko, sirovi proizvodi, kao što su ubrane ćelije iz kulture sadrže ne samo željeni proizvod, već i nečistoće koje je teško odvojiti od željenog proizvoda.

Zdravstveni organi vlasti zahtevaju visoke standarde čistoće za proteine koji su namenjeni primeni kod ljudi. Kao dodatna teškoća, mnoge metode prečišćavanja mogu da sadrže korake koji iziskuju primenu visokog ili niskog pH, visoke koncentracije soli ili druge ekstremne uslove koji mogu da ugroze biološku aktivnost datog proteina. Prema tome, za svaki protein predstavlja izazov da se osmisli proces prečišćavanja koji će da obezbedi dovoljnu čistoću, a da istovremeno zadrži biološku aktivnost datog proteina.

Hromatografski sistemi sa jonskom izmenom široko se koriste za odvajanje proteina prvenstveno na osnovu razlike u naelektrisanju. U hromatografiji sa jonskom izmenom, naelektrisane delove na površini rastvorljivog sredstva privlači suprotno naelektrisanje vezano za hromatografsku matricu, pod uslovom da je jonska snaga okolnog pufera niska. Elucija se po pravilu postiže povećanjem jonske snage (t.j. provodljivosti) pufera da se uđe u kompeticiju rastvorljivim sredstvom za naelektrisana mesta na matrici za jonsku izmenu. Promena pH i na taj način izmena naelektrisanja rastvorljivog sredstva predstavlja drugi način da se postigne elucija rastvorljivog sredstva. Promena provodljivosti ili pH može da bude postepena (gradijentna elucija) ili stepenasta (stepenasta elucija). Smole koje se mogu koristiti u hromatografiji sa jonskom izmenom mogu da sadrže različite funkcionalne grupe: dietilaminoetil (DEAE) ili dietil-(2-hidroksi-propil)aminoetil (QAE) imaju hloridni kao kontra jon, dok karboksimetil (CM) i sulfopropil (SP) imaju, na primer, natrijum kao kontra jon.

Hromatografski sistemi koji imaju hidrofobnu stacionarnu fazu nude alternativnu osnovu za separacije i takođe se široko primenjuju u procesima prečišćavanja proteina. U ovu kategoriju spadaju hidrofobna interakcijska hromatografija (HIC) i tečna hromatografija reverzne faze (RPLC).

Fizikohemijska osnova za separaciju pomoću HIC i RPLC je hidrofobni efekat, proteini se razdvajaju na hidrofobnoj stacionarnoj fazi na osnovu njihove razlike u hidrofobnosti.

Hromatografija reverzne faze je metod za prečišćavanje proteina koji je tesno povezan sa HIC, budući da se oba baziraju na interakciji između nepolarnih grupa do kojih može da dođe rastvarač na površini biomolekula i hidrofobnih liganda matrice. Međutim, ligandi koji se koriste u hromatografiji reverzne faze u glavnom se u većoj meri zamenjuju hidrofobnim ligandima nego HIC ligandima. Iako za supstituciju adsobenata HIC može da bude potrebno negde u rasponu između 10-50 μl/mL matrice C2-C8 arilnih liganda, obično se za adsorbente za hromatografiju reverzne faze koristi nekoliko stotina μmol/mL matrice C4-C8 alkil liganda.

Izvorna kolona 30RPC je polimerna matrica reverzne faze. Bazira se na krutim perlama od polistiren/divinil benzena, iste veličine, sve su prečnika 30 mikrona. Njihove karakteristike se mogu ukratko opisati ovako: izuzetno širok raspon pH (1-12), visoka selektivnost, visok hemijski otpor, visoki kapacitet i visoka rezolucija pri velikim brzinama protoka.

Hromatografija sa isključivanjem po veličini (SEC), naziva se i gel-permeaciona hromatografija (GPC), i koristi porozne čestice da razdvoji molekule različitih veličina. Po pravilu se koristi za razdvajanje bioloških molekula i određivanje molekulskih težina i distribucije molekulskih težina polimera. Molekuli koji su manji od veličine pore mogu da uđu u čestice i tako imaju duži put i duže vreme prolaska od velikih molekula koji ne mogu da uđu u čestice. Svi molekuli veći od veličine pore se ne zadržavaju i zajedno se ispiraju. Molekuli koji mogu da uđu u pore imaće prosečno vreme zadržavanja u čestici zavisno od veličine i oblika takvog molekula. Prema tome, različiti molekuli imaju različito ukupno vreme prolaska kroz kolonu.

Blue Sepharose je hromatografija sa smolom bazirana na matrici afiniteta između boje i liganda. Ovaj ligand, Cibacron Blue F3G-A, je kovalentno kupliran sa sefarozom (sepharose™) preko hlorotrijazinskog prstena (Clonis et al., 1987).

Blue Sepharose se koristi za prečišćavanje Interferona beta (Mory et al., 1981).

Interferon beta (interferon-β ili IFN- β) je prirodno nastajući, solubilni glikoprotein koji pripada klasi citokina, interferona (IFN) ima široki spektar bioloških aktivnosti, kao što su antivirusne, antiproliferativne i imunomodulatorne.

Tri glavna interferona nazivaju se IFN-alfa, IFN-beta i IFN-gama. Ovi interferoni su inicijalno klasifikovani po ćelijama njihovog porekla (leukociti, fibroblasti ili T-ćelije). Međutim, postalo je jasno da jedna ćelija može da proizvede nekolicinu vrsta. Otuda se sada leukocitni interferon sada naziva IFN-alfa, fibroblastni interferon je IFN-betaia T-ćelijski interferon je IFNgama. Postoji i četvrti tip interferona, limfoblastoidni IFN, koji se proizvode u "Namalwa" ćelijskoj liniji (koja se izvodi iz Burkitovog limfoma), koji izgleda da proizvodi mešavinu i leukocitnih i fibroblastnih IFN.

Humani fibroblastni interferon (IFN-beta) poseduje antivirusnu aktivnost, a poznato je i da inhibira proliferaciju ćelija. To je jedan polipeptid od oko 20.000 Da indukovan virusima i dvolančanim RNK. Od ove nukleotidne sekvence gena za fibroblastni interferon, koji se klonira tehnologijom rekombinacije DNK, Derynck et al., 1980 su zaključili kako izgleda kompletna amino kiselinska sekvenca ovog proteina, čija je dužina 166 amino kiselina.

Kloniran je i interferon beta. US Patent br.5,326,859 opisuje DNK sekvencu humanog IFN-β i plazmid za njegovu rekombinantnu ekspresiju u bakterijama kao što je E. Coli. Evropski Patent br.0 287075 opisuje jednu ćelijsku liniju CHO (jajnik kineskog hrčka), transfektovanu sekvencom koja kodira interferon- β i u stanju je da proizvede rekombinantni interferon-β. Ovaj protein se opisuje kao glikozilirani sa biantenarnim (sa dve grane) oligosaharidom, koji ima samo jedan deo fukoze.

Interferon beta je eksprimiran u nekoliko ćelijskih linija, kao što su ćelije CHO, BHK 21 (ćelije bubrega novorođenih hrčaka) i LTK ćelije (mišje L-timidin kinaza negativne) (Reiser i Hauser, 1987). DHFR negativne CHO ćelije takođe su korišćene za ekspresiju interferona beta (Innis i McCormick, 1982), (Chernajovsky et al., 1984). Rodriguez et al., Biotechnol. Prog.2005, 21:22-30 opisuje jednu studiju u kojoj su ispitivana dejstva nekoliko hemijskih jedinjenja na proizvodnju IFN-β. U ovom kontekstu, opisuje se da se smanjenjem temperature kulture sa 37°C do 30°C, agregacija proteina smanjuje, a povećava volumetrijska i specifična produkcija IFN-β.

Han Kyu Oh et al., Biotechnol. Prog. 2005, 21:1154-1164 opisuje produkciju rekombinantnog humanog IFN-β. Za pojačanje produktivnosti, ćelije se gaje na 33<o>C. Ova temperatura se neposredno smanjuje sa 37°C tokom faze rasta do 33°C tokom faze proizvodnje. Nema srednje faze rasta.

Al-Fageeh et al., Biotechnology i Bioengineering, Vol.93, No.5, April 5, 2006, opisuje dejstvo subfizioloških temperatura za gajenje ćelija na produktivnost rekombinantnih proteina uopšte. Autori tvrde da se opaža pojačana produkcija rekombinantnih proteina na sniženoj temperaturi gajenja (kulture). Mehanicističko tumačenje ovog dejstva sagledava se u pojačanoj transkripciji rekombinantnog gena od interesa ili pojačanih stabilnosti mRNK tih transkripata. Međutim, smatra se i da dejstvo temperature zavisi od ćelijske linije i konkretnog ciljanog proteina.

Poznato je i da Interferoni mogu da budu glikozilirani, često sa različitim glikoformama. Na primer, pokazano je da saharidna struktura IFN-β uključuje i jednu biantenarnu strukturu, koja ima jedan saharid fukozu i terminalni sijaliaciju galaktoze (Conradt et al., 1987). Pokazano je i da je glikozilacija važna za solubilnost, budući da se IFN-β taloži posle deglikozilacije sa

glikopeptidazom F. Uz to, IFN-β koji proizvodi E. coli pokazao je probleme sa savijanjem, zbog odsustva glikozilacije u bakterijskom sistemu ekspresije.

Evropski Patent br. 0 529 300 opisuje jedan rekombinantni interferon-β koji ima specifičan model glikozilacije, konkretno glikozilaciju sa ugljenohidratnim strukturama koje imaju po jednu fukozu na svaku oligosaharidnu jedinicu. Ove ugljenohidratne strukture su biantenarni, triantenarni i tetraantenarni (odnosno imaju po dve, tri i četiri grane) oligosaharidi.

PCT zahtev br. WO 99/15193 takođe opisuje glikozilaciju rekombinantnog interferonaβ koji ima biantenarne, triantenarne i tetraantenarne oligosaharide. Oni sadrže još i monosaharide uključujući manozu, fukozu, N-acetilglukosamin, galaktozu i sijalinsku kiselinu.

Različite studije su pokazale značaj glikozilacije za stabilnost. Na primer, pokazano je da ne-glikozilirane forme rekombinantnog interferona-β imaju značajno nižu stabilnost kao i nižu biološku aktivnost (Runkel et al., 1998).

Druge studije su pokazale da rekombinantni i prirodni proteini humanog interferona-β imaju različite modele glikozilacije (Kagawa et al., 1988).

Interferon beta se koristi kao terapijski protein, takozvani biološki lek, kod velikog broja bolesti kao što su npr. multipla skleroza, kancer, ili virusne bolesti poput npr. SARS ili infekcija hepatitis C virusom.

Prema tome, postoji potreba za procesima za efikasnu produkciju i prečišćavanje interferona beta, i ćelija koje eksprimiraju interferon beta u velikim količinama.

KRATKI PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak bazira se na razvoju procesa za produkciju rekombinantnog humanog interferona beta na podlozi koja ne sadrži serum.

Prema tome, u prvom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na proces za proizvodnju glikoziliranog rekombinantnog humanog interferona-β, koji uključuje korak gajenja ćelija CHO koje proizvode interferon-β u podlozi bez sadržaja seruma, a ova podloga bez sadržaja seruma uključuje:

10 do 30 mMHEPES, preporučeno 20 mM HEPES-a;

0.5 to 3 mM Prolina, preporučeno 1 mM Prolina; i

5500 do 7000 mg/L natrijum hlorida, preporučeno 6100 mg/L natrijum hlorida, naznačeno time da ovaj proces uključuje 1. fazu rasta, 2. fazu rasta i fazu proizvodnje, naznačeno time da se 1. faza rasta obavlja na 37°C, 2. faza rasta se obavlja na 35°C, a faza produkcije se obavlja na 33°C i naznačeno time da da 2. faza rasta traje 1-2 dana.

Ovaj dokument dodatno opisuje proces za prečišćavanje rekombinantnog Interferona beta iz tečnosti, posebno iz ćelija ubranih iz kulture koje su izdvojene iz ćelija koje proizvode interferon beta.

Opisani proces za prečišćavanje rekombinantnog humanog Interferona iz tečnosti uključuje sledeće korake:

- Podvrgavanje ove tečnosti afinitetnoj hromatografiji;

- Podvrgavanje eluata afinitetne hromatografije hromatografiji katjonske izmene;

- Podvrgavanje eluata hromatografije katjonske izmene hidrofobnoj hromatografiji pomoću RP-HPLC.

Analiza interferona beta proizvedenog procesom ovog pronalaska otkriva da je ovo sastav diferencijalno glikoziliranog interferona beta, t.j. interferona beta koji ima jedinstveni model ili profil glikozilacije. Prema tome, ovaj dokument opisuje i sastav Interferona beta koji uključuje jednu oligosaharidnu strukturu koja uključuje dva ili tri fukozna saharida.

Ovde su takođe opisane i upotrebe rekombinantnog humanog interferona-β proizvedenog u skladu sa procesima ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta za lečenje tumora, multiple skleroze, virusnih infekcija i upotreba podloge za gajenje ćelija koja ne sadrži serum za proizvodnju Interferona beta.

KRATKI OPIS CRTEŽA

SL. 1 pokazuje dijagram toka ove metode koja se koristi za generisanje ćelijske linije koja će da proizvodi Interferon beta.

SL. 2 pokazuje dijagram toka novog procesa prečišćavanja IFN- β-1a.

SL. 3 pokazuje transformisane spektre serija IFN-β-1a primenom ES-MS, naznačeno time da je shematski prikaz strukture oligosaharida prikazan na vrhu.

SL. 4 pokazuje ES-MS transformisani spektar IFN-β-1a dobijen novim procesom naznačeno time da:

P= protein (IFN-p);

Fuc Biant = fukozilirani biantenarni kompleks oligosaharidnog tipa;

Fuc Triant = fukozilirani triantenarni kompleks oligosaharidnog tipa;

Fuc Tetrant = fukozilirani tetraantenarni kompleks oligosaharidnog tipa;

SA = sijalinska kiselina.

SL. 5 pokazuje oligosaharidne strukture u IFN-β-1a; naznačeno time da:

SL. 5 A pokazuje glavne oligosaharide:

I. Disijalilarani biantenarni (NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc)

II. Monosijalirani biantenarni (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc)

Sl. 5 B pokazuje manje oligosaharide, naznačeno time da:

I. Ne-sijalirani biantenarni (Hex5.HexNAc4.Fuc)

II. Mono i disijalrana triantenarna struktura ili disijalrani biantenarni sa strukturom N-acetil laktozaminskih ponovaka (NeuAc2-Hex6.HexNAc5.Fuc)

III. Trisijalirani triantenarni sa strukturom N- acetil laktozaminskih ponovaka ili Trisijalilirana tetrantenarna struktura (NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc)

Sl. 5 C pokazuje manje oligosaharide sa dva ili tri fukozna ostatka: I. Monosijalirana biantenarna struktura sa dve fukoze (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2)

II. Disijalirana biantenarna struktura sa dve fukoze (NeuAc2-Hex5.HexNAc4.FuC2)

III. Disijalirana biantenarna struktura sa tri fukoze

SL. 6 pokazuje spektar MALDi novog IFN-fi-1a sa permetiliranim glikanima.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Prvi aspekt ovog pronalaska bazira se na razvoju procesa za proizvodnju Interferona beta u uslovima gajenja ćelija bez seruma. U skladu sa ovim pronalaskom, ovaj proces za proizvodnju glikoziliranog rekombinantnog humanog interferona beta uključuje korak gajenja ćelija CHO koje proizvode interferon beta u podlozi bez sadržaja seruma, a ova podloga bez sadržaja seruma sadrži: 10 do 30 mM HEPES-a, preporučeno 20 mM HEPES-a; 0,5 to 3 mM prolina, preporučeno 1 mM prolina; i 5500 do 7000 mg/l natrijum hlorida, preporučeno 6100 mg/l natrijum hlorida, naznačeno time da ceo proces uključuje 1. fazu rasta, 2. fazu rasta, i fazu proizvodnje, naznačeno time da se 1. faza rasta obavlja na 37°C, 2. faza rasta se obavlja na 35°C, a faza proizvodnje se odvija na 33°C, i naznačeno time faza rasta traje 1-2 dana.

Ova podloga bez sadržaja seruma može npr. da uključi 9,10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 21 mM HEPES (2-(4-(2-HIDROKSIETIL)-1-PIPERAZINIL) ETANSULFONIČNA KISELINA) pufera. Može takođe da npr. uključi 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 1,1; 1,2;1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7;1,8; 1,9; 2; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7;2,8; 2,9; 3; 3;1 mM prolina,

Koncentracije natrijum hlorida u podlozi bez sadržaja seruma ovog pronalaska mogu npr. da budu oko 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600,6700,6800,6900,7000, 7100 mg/L.

U preporučenom obliku, ova podloga bez sadržaja seruma dodatno uključuje od oko 10 do oko 20, preporučeno oko 15 mg/L fenol crvenog. Koncentracije fenol crvenog mogu npr. da budu oko 9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20, 21 mg/L.

U okviru procesa predstavljenog pronalaska, gore navedene komponente se mogu koristiti u svakoj pogodnoj poznatoj podlozi bez sadržaja seruma. U primere takvih podloga bez sadržaja seruma spadaju sledeće dole navedene podloge:

Ćelija koja će se koristiti u procesu ovog pronalaska je klon CHO koji eksprimira interferon beta kao što je npr. ćelijska linija koju su opisali Reiser i Hauser (1987) ili ćelije koje su opisali Innis i McCormick (1982).

Izraz "interferon beta", u značenju u kome se ovde koristi, naziva se i IFN beta, ili IFN-β, I uključuje interferon beta koji se izvodi iz bilo koje vrste, a preporučeno je to humani interferon beta, glikoprotein sa 166 amino kiselina I molekulskom težinom od približno 22.500 daltona. Izraz "interferon beta", u značenju u kome se ovde koristi, uključuje i funkcionalne derivate, muteine, analoge, ili fragmente IFN-beta. Izraz "interferon beta 1 a" odnosi se na glikozilirani interferon beta.

Aktivnost interferona beta može npr. da se izmeri korišćenjem referentnog standarda koji se kalibriše u odnosu na prirodni interferon beta standard Svetske zdravstvene organizacije (Drugi međunarodni standard za Interferon, Human Fibroblast GB 23902531). Ova jedinica se izražava u internacionalnim jedinicama (IU) antivirusne aktivnosti na mg interferona beta-1a određeno in vitro bioesejem za citopatsko dejstvo korišćenjem WISH ćelije i virusa vezikularnog stomatitisa.

Konverziona tabela za MIU i mcg IFN-beta

"Varijante" ili "muteini", kako se koriste u okviru predstavljenog pronalaska, odnose se na analoge IFN-beta, u kojima se jedan ili više amino kiselinskih ostataka prirodnog IFN-beta zamenjuju različitim amino kiselinskim ostacima ili se brišu (delecija) ili se jedan ili više amino kiselinskih ostataka dodaju na prirodne sekvence IFN-beta, ne smanjujući značajno aktivnost dobijenog proizvoda u poređenju sa divljim tipom IFN-beta. Ovi muteini se pripremaju poznatim tehnikama sinteze i/ili mutageneze definisane na licu mesta, ili ma kojom drugom poznatom tehnikom pogodnom za te namene.

Izrazi "varijanta" ili "mutein" u skladu sa predstavljenim pronalaskom uključuju proteine enkodirane nekom nukleinskom kiselinom, kao što su DNK ili RNK, koji se hibridizuje u DNK ili RNK i enkodira IFN-beta kako je već otkriveno u npr. US 4,738,931 pod strogim uslovima. Izraz "strogi uslovi" odnosi se na hibridizaciju i potonje uslove pranja, koje stručnjaci za ovu oblast konvencionalno nazivaju "strogima". Videti Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992). Ne ograničavajući se, u primere strogih uslova spadaju uslovi pranja 12-20°C ispod izračunatog Tm hibrida koji se ispituje u, npr., 2 x SSC i 0,5% SDS tokom 5 minuta, 2 x SSC i 0,1% SDS u trajanju od 15 minuta; 0,1 x SSC i 0,5% SDS na 37°C u trajanju od 30-60 minuta i onda 0,1 x SSC i 0,5% SDS na 68°C u trajanju od 30-60 minuta.

Oni koji se razumeju u ovu oblast razumeju da uslovi strogosti zavise i od dužine DNK sekvence, oligonukleotidnih proba (kao što je 10-40 baza) ili mešovite oligonukleotide probe. Ako se koriste mešovite oligonukleotide probe, preporučuje se da se koristi tetrametil amonijum hlorid (TMAC) umesto SSC. Videti Ausubel, supra.

Identičnost oslikava odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, što se određuje upoređivanjima tih sekvenci. Po pravilu, identičnost se odnosi na tačnu korespodenciju nukleotida prema nukleotidu ili amino kiseline prema amino kiselini u dva polinukleotida ili u dve polipeptidne sekvence, u dužini u kojoj se te sekvence porede.

Za sekvence u kojima nema tačne korespodencije, može da se odredi "% identičnosti". Po pravilu, dve sekvence koje će se porediti stave se jedna pored druge da se postigne maksimalna korelacija između sekvenci. Ovo može da uključi inserciju "praznih prostora" bilo samo u jednu ili u obe sekvence, da se poveća stepen poklapanja. Procenat % identičnosti se može odrediti za celu dužinu svake od sekvenci koje se porede (takozvano globalno poklapanje), što je posebno pogodno za sekvence iste ili veoma slične dužine, ili za kraće, određene dužine (takozvano lokalno poklapanje), što je pogodnije za sekvence nejednake dužine.

Metode za poređenje identičnosti i homologiju dve ili više sekvenci dobro su poznate u struci. Tako na primer, postoje programi u paketu Wisconsin Sequence Analiysis Package, verzija 9.1 (Devereux J et al., 1984), na primer programi BESTFIT i GAP, mogu da se koriste da se utvrdi % identičnosti između dva polinukleotida i % identičnosti i % homologije između dve polipeptidne sekvence. BESTFIT koristi algoritam "lokalna homologija" (Smith i Waterman, 1981) i nalazi najbolji pojedinačni region sličnosti između dve sekvence. Drugi programi za određivanje identičnosti i/ili sličnosti između sekvenci takođe su poznati među stručnjacima, na primer porodica programa BLAST (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, može se pristupiti preko internet stranice NCBI na www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson W R, 1990).

Preporučeno je da svaka takva varijanta ili mutein ima sekvence amino kiselina koje su dovoljno slične sa IFN-beta, da kao takve imaju suštinski istu aktivnost kao i IFN-beta. Funkcionalni test da se odredi da li neka varijanta ili mutein ima aktivnost sličnu (istu) kao i IFN- beta je npr. test (esej) za merenje aktivnosti Interferona na citopatskom dejstvu virusa vezikularnog stomatitisa u WISH ćelijama, npr. kako su to opisali Youcefi et al., 1985. Prema tome, može se odrediti da li ma koji dati mutein ima suštinski istu aktivnost kao i IFN-beta tako što će se obaviti rutinski eksperiment.

Svaka takva varijanta ili mutein moraju da imaju najmanje 40% identičnosti ili homologije sa sekvencom IFN-beta kako je to otkriveno u npr. US 4,738,931. Još je bolje da ima najmanje

50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili, što bi bilo najbolje, najmanje 90% identičnosti ili homologije sa njim.

Muteini IFN-beta, koji mogu da se koriste u skladu sa predstavljenim pronalaskom, ili nukleinske kiseline koje kodiraju za njih, uključuju konačni skup supstancijalno preklapajućih sekvenci kao supstitucionih peptida ili polinukleotida koje rutinski može da dobije stručnjak za ovu oblast, bez nepotrebnog eksperimentisanja, na osnovu uputstva i smernica sadržanih ovde.

Preporučene promene muteina u skladu sa predstavljenim pronalaskom su ono što je poznato kao "konzervativne" supstitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina su IFN-beta polipeptidima mogu da uključe sinonimne amino kiseline u okviru grupe koje imaju dovoljno slična fizikohemijska svojstva da će supstitucija između članova grupe da očuva biološku funkciju molekula (Grantham, 1974). Jasno je da se mogu vršiti i insercije i delecije amino kiselina u gore definisanim sekvencama ne menjajući njihovu funkciju posebno ako te insercije i delecije, uključuju samo nekoliko amino kiselina, npr., manje od trideset, i preporučeno manje od deset, i ne uklanjaju ili izmeštaju amino kiseline koje su kritične za funkcionalnu konformaciju, npr., cisteinske ostatke. Proteini i muteini koji se proizvedu takvim delecijama i/ili insercijama spadaju u okvire predstavljenog pronalaska.

U primere supstitucija amino kiselina u proteinima koji mogu da se koriste za dobijanje muteina IFN-beta za upotrebu u predstavljenom pronalasku spadaju svi koraci metoda kao što su one predstavljene u patentima US 4,959,314; 4,588,585 i 4,737,462, na ime Mark et al; 5,116,943 na ime Koths et al., 4,965,195 na ime Namen et al; 4,879,111 na ime Chong et al; i 5,017,691 na ime Lee et al; i proteini sa supstituisanim lizinom koji su predstavljeni u patentu US No.4,904,584 (Shaw et al).

Posebna vrsta varijante interferona opisana je nedavno. Takozvani "konsenzusni interferoni" su varijante IFN koje ne nastaju prirodno (US 6,013,253). Konsenzusni interferoni se mogu proizvoditi i u skladu sa ovim pronalaskom.

Izraz "Funkcionalni derivati" IFN-beta u značenju u kome se ovde koristi obuhvata derivate koji se mogu pripremiti iz funkcionalnih grupa koje nastaju na bočnim lancima ostataka ili N- ili C-terminalnih grupa, na način poznat među stručnjacima, i oni su uključeni u ovaj pronalazak sve dok ostaju farmaceutski prihvatljivi, t.j., ne uništavaju biološku aktivnost proteina kakva je opisana gore, t.j., sposobnost da vezuju odgovarajući receptor i iniciraju receptorsku signalizaciju, i ne unose toksična svojstva u sastave koji ih sadrže. Derivati mogu da imaju hemijske delove kao što

su ugljeni hidrati ili fosfatni ostaci, pod uslovom da takvi derivati zadrže biološku aktivnost proteina i ostaju farmaceutski prihvatljivi.

Derivati Interferona beta mogu, na primer, da uključe bočne lance polietilen glikola, koji mogu da unaprede druga svojstva tog proteina, kao što su stabilnost, polu-život, biološka raspoloživost, tolerancija od strane ljudskog tela, ili imunogenost. Da se postigne ovaj cilj, IFN-beta može da se veže npr. za polietilenglikol (PEG). PEGilacija može da se sprovede poznatim metodama, koje su opisane, na primer u WO 92/13095. Posebno, PEG-IFN može da se pripremi u skladu sa uputstvima iznetim u WO 99/55377.

Jedan funkcionalni derivat IFN-beta može da uključi najmanje jedan deo pripojen za jednu ili više funkcionalnih grupa, koje se javljaju kao jedan ili više bočnih lanaca na amino kiselinskim ostacima. Izuzetno se preporučuje oblik u kome je taj deo polietilen glikol (PEG). U skladu sa predstavljenim pronalaskom, nekoliko delova PEG može da se zakači za IFN-beta.

Drugi derivati uključuju alifatične estre karboksilnih grupa, amide karboksilnih grupa reakcijom sa amonijakom ili sa primarnim ili sekundarnim aminima, N-acilnim derivatima slobodnih amino grupa amino kiselinskih ostataka formiranih sa acilnim delovima (npr. alkanoil ili karbociklične aroil grupe), ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer ostataka seril ortreonil) koji se formiraju sa acilnim delovima.

Izraz "fragment" u skladu sa predstavljenim pronalaskom odnosi se na svaki podskup IFN-beta, odnosno na jedan kraći peptid, koji zadržava željenu biološku aktivnost kao merljivu npr. u gore opisanom bioeseju. Fragmenti se mogu lako pripremiti uklanjanjem amino kiselina sa bilo kog kraja molekula i testiranjem dobijenog molekula na svojstva kao agonista receptora. Poznate su proteaze za uklanjanje po jedne amino kiselina bilo sa N-terminalnog ili sa C- terminalnog kraja polipeptida, pa se tako određivanje fragmenata koji zadržavaju željenu biološku aktivnost, može utvrditi npr. u testu koji su opisali Youcefi et al., 1985, i to podrazumeva samo rutinsko eksperimentisanje.

Proces za proizvodnju interferona beta iz ovog pronalaska uključuje 1. fazu rasta, 2. fazu rasta i fazu proizvodnje, naznačeno time da se 1. faza rasta obavlja na 37 °C, 2. faza rasta se

odvija na 35 °C, a faza proizvodnje se obavlja na 33 °C.

Određivanje kraja faza se nalazi u okvirima znanja ljudi koji su stručni za ovu oblast, i određuje se npr. na osnovu gustine ćelija, potrošnje glukoze ili ma kog drugog metaboličkog pokazatelja. Po pravilu 1. faza rasta može da potraje 10 do 12 dana. Druga faza rasta je po pravilu kraća i uglavnom služi za adaptaciju ćelija na nižu temperaturu. U skladu sa ovim pronalaskom, 2. faza traje 1 do 2 dana.

Ceo proces ovog pronalaska može da se obavi punjenjem po serijama ili procesom perfuzije. U skladu sa predstavljenim pronalaskom, prednost se daje perfuziji.

Preporučeno je da ovaj proces bude proces perfuzije sa stopom razblaženja od oko 1 do oko 10, a preporučeno od oko 1,5 do oko 7 na dan.

Izraz "stopa razblaženja (dilucije)", kako se definiše ovde odnosi se na stopu razblaženja D, koja se izračunava kao litar podloge na litar ukupne radne zapremine sistema na dan (ukupni volumen = napunjeno ležište volumen kondicionirane posude). U skladu sa predstavljenim pronalaskom, stopa razblaženja može da se kreće u rasponu od npr.0,5; 1; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8;1,9; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,1; 7,2; 7,3; 7,4; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5; 10;10,5.

Još je bolje da se stopa razblaživanja povećava u prve dve ili tri nedelje gajenja ćelija od inicijalne vrednosti od oko 1 do 2 na dan do vrednosti od oko 7 do 10 na dan, posebno tokom faze proizvodnje.

Korak gajenja ćelija u procesu ovog pronalaska može da se obavi u bilo kom pogodnom okruženju, kao što su Petrijeve šolje, T-flašice, roler posude, ali se preporučuje da se to ipak radi u posudama većih zapremina, kao što je npr. bioreaktor.

Kada se odabere recimo proces perfuzije, sistem može da bude npr. stacionarni bioreaktor sa napunjenim ležištima u kome su ćelije imobilizovane na čvrstim nosačima. Ovim se sistemom lako rukuje, i uz odgovarajuće nosače i uslove gajenja mogu da se postignu veoma velike gustine ćelija ( 10<7>-10<8>ćelija ml<-1>).

Čvrsti nosač koji može da se koristi u skladu sa predstavljenim pronalaskom može da bude npr. neki mikronosač. Mikronosači su male, čvrste čestice na kojima ćelije mogu da se gaje u suspenziji kulture. Ćelije su u stanju da prianjaju i da propagiranju na površini mikronosača. Tipično se ovi mikronosači sastoje od perli čiji je prečnik između 90 μm i 300 μm. Mikronosači se mogu praviti od različitih materijala koji su se pokazali uspešnim za prianjanje ćelija i njihovu propagaciju, kao što su npr., staklo, polistiren, polietilen, dekstran, želatin i celuloza. Uz to, površina mikronosača može da se oblaže materijalom koji podstiče prianjanje i rast ćelija kao što je, npr., npr., N,N-dietilaminoetil, staklo, kolagen ili rekombinantni proteini. Postoje i makroporozni

i neporozni mikronosači. Makroporozne površine daju ćelijama lak pristup unutrašnjosti mikronosača posle inokulacije, a kada su jednom u unutrašnjosti mikronosača, ćelije su zaštićene od sila smicanja koje se generišu mehaničkim mućkanjem i aeracijom u bioreaktoru.

Još jedan čvrsti nosač koji može da se koristi u skladu sa predstavljenim pronalaskom može da bude npr. disk, kao što je disk napravljen od poliestersko neupredenog vlakna vezanog za list polipropilenske mreže (videti, npr., U.S. patent br.5,266,476). Ovakvi diskovi se obično tretiraju elektrostatički da se olakša da suspenzija ćelije prianja za disk i zapravo bude zarobljena u sistemu vlakana, gde ostaje tokom celog procesa kultivacije. Gustina ćelija i postignuta produktivnost sa ćelijama gajenim na disku može da bude i deset puta veća nego kada se ćelije gaje na mikronosačima.

Preporučuje se da ovaj proces za proizvodnju glikoziliranog interferona beta dodatno uključi i korak ubiranja kulture ćelija sa sadržajem interferona beta.

U preporučenom obliku, ubiranje ove kulture ćelija dalje podleže procesu prečišćavanja.

Proces prečišćavanja može da bude svaki proces koji dovodi do potrebne čistoće interferona beta i može da sadrži svaku kombinaciju koraka za prečišćavanje na osnovu hromatografije ili ma koje druge tehnologije prečišćavanja kao što je frakcionisanje pomoću soli ili slično. Preporučuje se da se prečišćavanje obavlja pomoću procesa za prečišćavanje rekombinantnog interferona iz tečnosti i uključuje sledeće korake:

a) Podvrgavanje te tečnosti afinitetnoj hromatografiji;

b) Podvrgavanje eluata dobijenog afinitetnom hromatografijom hromatografiji katjonske izmene;

c) Podvrgavanje eluata dobijenog hromatografijom katjonske hidrofobnoj hromatografiji pomoću RP-HPLC.

Preporučuje se da se korak (a) obavlja na Blue Sepharose, npr. na Blue Sepharose koloni sa brzim protokom. Preporučuje se da se korak (b) obavlja na kaboksimetilnoj smoli, npr. na CM Sepharose sa brzim protokom.

Sam proces prečišćavanja uključuje, pre koraka (a), korak klarifikacije (razbistravanja) tečnosti putem mikrofiltracije.

d) Obavljanje ultrafiltracije i dijalize

e) Podvrgavanje dijalizata hromatografiji sa razdvajanjem po veličini,

f) Podvrgavanje filtraciji ovog eluata hromatografije sa razdvajanjem po veličini.

Korak (f) može da se obavi npr. i mikro- ili nanofiltracijom.

Ultrafiltracija je korisna za uklanjanje komponenti male molekulske težine u eluatima koji su dobijeni iz prethodnih hromatrografskih koraka. Ultrafiltracija npr. omogućava da se ukloni organski rastvarač, TFA i soli iz prethodnog koraka, da se uravnoteži interferon beta u potrebnom puferu, ili da se koncentriše molekul do željene koncentracije. Ovakva ultrafiltracija može npr. da se obavi na podlozi za ultrafiltraciju i isključuje komponente čija je molekulska težina manja od 5 kDa.

Ako je protein prečišćen u skladu sa gore opisanim procesom namenjen primeni kod ljudi, pogodno je i da se uključe koraci za uklanjanje virusa. Korak filtracije za uklanjanje virusa može npr. da se obavi između dva koraka (d) i (e), ili posle koraka (e). Još je bolje da ovaj proces uključi dva koraka za uklanjanje virusa.

Čistoća koja se može dobiti procesom prečišćavanja u skladu sa ovim pronalaskom iznosi po mogućstvu > 80%, još bolje > 90 % i najbolje > 98%.

Preporučuje se da sam proces prečišćavanja interferona beta dodatno uključi i korak za formulisanje prečišćenog interferona beta u farmaceutski sastav, opciono uz farmaceutski prihvatljivi nosač.

U skladu sa ovim pronalaskom, preporučuje se da se ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO), koja se označava kao DUKX-B11, i koja nema aktivnost DHFR (dihidrofolat reduktaze), koristi kao ćelija domaćin za pripremu glikoziliranog interferona beta. DNK sekvenca koja kodira humani interferon-β opisana je npr. u US patentu br.5,326,859.

Preporučeni oblik predstavljenog pronalaska odnosi se na metod za proizvodnju rekombinantnog humanog interferona-β u transfektovanim ćelijama koje su u stanju da proizvedu najmanje oko 100000 IU rekombinantnog humanog interferona-β u specifičnoj ćelijskog produktivnosti (IU/10<6>ćelija/24 časa). Preporučuje se da ove ćelije budu u stanju da proizvedu najmanje oko 200000 IU ili najmanje oko 200000 IU ili najmanje oko 300000 IU ili najmanje oko 400000 IU ili najmanje oko 500000 IU ili najmanje oko 600000 IU rekombinantnog humanog interferona beta specifične ćelijske produktivnosti.

Preporučuje se da ćelija za proizvodnju Interferona beta bude CHO ćelija koja je transfektovana konstruktom nukleinske kiseline koji uključuje najmanje jedan element kao promoter/enhancer funkcionalno povezan za humani IFN-β gen. Još je bolje da najmanje jedan

element promotera/enhancera uključi SV40 promoter/enhancer. Najbolje je ako taj konstrukt nukleinske kiseline uključuje najmanje prvu transkripcionu jedinicu koja je sastavljena od SV40 promotera/enhancera funkcionalno povezanog sa humanim IFN-β genom, da humani IFN-β gen bude funkcionalno vezan za SV40 T Ag region rane poliadenilacije. Snažno se preporučuje da taj konstrukt nukleinske kiseline dodatno uključi najmanje drugu transkripcionu jedinicu koja je sastavljena od SV40 promotera/enhancera, mišjeg DHFR gena i SV40 T Ag poliA- koji sadrži region rane poliadenilacije.

Ovaj dokument opisuje i konstrukt nukleinske kiseline koji uključuje najmanje jedan element promotera/enhancera koji je funkcionalno povezan za humani IFN-IX gen jer je transfektovan u ćelije, a odlikuje ga to što su transfektovane ćelije u stanju da proizvedu najmanje oko 100000 IU, najmanje oko 200000 IU ili najmanje oko 300000 IU ili najmanje oko 400000 IU ili najmanje oko 500000 IU ili najmanje oko 600000 IU rekombinantnog humanog interferona-β u specifičnoj ćelijskog produktivnosti (IU/10<6>ćelije / 24 časa).

Preporučuje se da najmanje jedan element promotera/enhancera uključi jedan SV40 promoter/enhancer. Još je bolje da taj konstrukt nukleinske kiseline uključi najmanje prvu transkripcionu jedinicu koja je sastavljena od SV40 promotera/enhancera funkcionalno povezanog sa humanim IFN-β genom, da humani IFN-β gen bude funkcionalno vezan za SV40 T Ag region rane poliadenilacije. Najbolje je da taj konstrukt nukleinske kiseline dodatno uključi najmanje drugu transkripcionu jedinicu koja je sastavljena od SV40 promotera/enhancera, mišjeg DHFR gena i SV40 T Ag poliA- koji sadrži region rane poliadenilacije.

Ovaj dokument dalje opisuje Interferon beta koji se može dobiti procesom u skladu sa predstavljenim pronalaskom.

Dalje se opisuje jedan sastav interferona beta koji ima jedinstveni profil glikozilacije. Preporučuje se da se takav Interferon beta proizvodi primenom procesa u skladu sa predstavljenim pronalaskom.

Ovaj glikozilirani rekombinantni humani interferon-β protein može da sadrži i jednu oligosaharidnu strukturu koja ima dva ili tri fukozna saharida. U preporučenom obliku, ova oligosaharidna struktura dalje uključuje disijalil biantenarni trifukosilirani glikan (Neu2Ac.Hex5.HexNAc4.Fuc3).

U dodatnom preporučenom obliku, ovaj jedinstveni model glikozilacije dalje uključuje ne sijaliranu biantenarnu strukturu (Hex5.HexNAc4.Fuc); disijaliranu triantenarnu strukturu ili disijaliranu biantenarnu sa N-acetil laktosaminskom strukturom ponovaka (NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc); trisijaliranu triantenarnu strukturu (NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc); trisijaliranu triantenarnu strukturu sa N-acetil laktosaminskom strukturom ponovaka ili

trisijaliranom tetrantenarnom (NeuAc3.Hex7.HexNAce.Fuc); mono sijaliranom i disijaliranom biantenarnom strukturom sa dve fukozne jedinice (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2.NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2).

Preporučuje se da ovaj jedinstveni profil glikozilacije uključi glikane koji imaju sličan nivo N-acetilneuraminske kiseline: N-Glikolil neuraminska kiselina za modele glikozilacije prirodnih humanih proteina.

U još jednom preporučenom aspektu, ovaj sastav interferona beta odlikuje se profilom sijalijacije koji uključuje oko 1 do oko 5% nesijaliranih N- glikana, oko 5 do oko 25% mono-sijaliranih glikana, oko 55 do oko 75% disijaliranih N-glikana, oko 10 do oko 25% trisijaliranih N-glikana.

Ovde se dalje opisuje upotreba interferona beta za proizvodnju medikamenta za terapiju bolesti kod ljudi, pre svega za multiplu sklerozu, kancer, ili virusne infekcije.

Multipla skleroza se može odabrati iz grupe koja se sastoji od relapsirajuće, nerelapsirajuće multiple skleroze ili multiple skleroze ranog početka.

Metoda lečenja ispitanika kome je potrebna terapija interferonom-β može da uključi davanje rekombinantnog humanog interferona-β proteina na način opisan ovde.

Preporučuje se da ovo bude za lečenje multiple skleroze. Još konkretnije, multipla skleroza može da se izabere iz grupe koja uključuje relapsirajuću, ne-relapsirajuću multiplu sklerozu ili multiplu sklerozu ranog početka.

Alternativno, terapija je anti-tumorska terapija.

Kao dodatna alternativa ova terapija može da bude anti-virusna.

Ovaj dokument dalje opisuje farmaceutski sastav koji uključuje kao aktivni sastojak izolovani, prečišćeni, rekombinantni humani interferon-β kako je opisan ovde i farmaceutski prihvatljivi nosač za primenu ovog farmaceutskog sastava. Preporučuje se da ovaj farmaceutski sastav koji ima anti-tumorsku ili anti-virusnu aktivnost, ili aktivnost protiv multiple skleroze, uključi kao aktivni sastojak izolovani, prečišćeni, rekombinantni humani interferon-β protein kako je to ovde opisano i farmaceutski prihvatljivi nosač za primenu ovog farmaceutskog sastava.

Ovde je opisan i deo posvećen proizvodnju materijala za ambalažu (pakovanje) i terapijski delotvorna količina izolovanog prečišćenog rekombinantnog interferona-β protein, naznačeno

time da materijal za pakovanje (ambalaža) sadrži nalepnicu (etiketu) ili list koji se stavlja u pakovanje koji navodi da rekombinantni humani interferon-β protein koji je ovde opisan može da se primenjuje kod ljudi za njihovo lečenje.

Preporučuje se da se ovaj izolovani, prečišćeni, rekombinantni humani interferon-β protein ili farmaceutski sastav koji je ovde opisan koristi za proizvodnju leka za terapiju relapsirajuće, ne-relapsirajuće multiple skleroze ili multiple skleroze ranog početka. Režim doziranja za pojedinačnog pacijenta lako može da odredi stručnjak za ovu oblast jer su ovi režimi doziranja dobro poznati u struci.

Ovde se pozivamo na dole navedene primere koji zajedno sa gornjim opisom ilustruju ovaj pronalazak i pri tome ga nikako ne ograničavaju.

Uopšteno govoreći, nomenklatura koja se ovde koristi i laboratorijske procedure korišćene u predstavljenom pronalasku uključuju molekularne, biohemijske, mikrobiološke i rekombinantne DNK tehnike. Te tehnike su detaljno opisane u stručnoj literaturi. Videti, na primer, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes l-lll Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley i Sons, Baltimore, Mariland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analizis: A Laboratory Manual Series", Vols.1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologije navedene u U.S. Pat. br. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 i 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes l-lll Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., i Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription i Translation" Hames, B. D., i Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells i Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) i "Methods in Enzymology" Vol.1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification i Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996).

Iako je ovaj pronalazak opisan u vezi sa njegovim specifičnim oblikom, podrazumeva se da on može da trpi i različite modifikacije. Obim ovog pronalaska definiše se zahtevima u prilogu.

PRIMERI

PRIMER 1 ■ PRIPREMA KLONA JAJNIKA KINESKOG HRČKA (CHO) ZA

PROIZVODNJU IFN-BETA U VELIKOJ KOLIČINI

Ovaj Primer opisuje kako se dobija klon CHO koji proizvodi interferon beta. Osnova procedura, posebno vezano za proizvodnju plazmida ekspresije, opisali su Mory et al.

(1981).

Pregled celog procesa generisanja klona opisan je na Sl.1. Jedan fragment DNK koji uključuje i region koji kodira humani Interferon-β izolovan je iz ćelija humane periferne krvi koja se nalazi u genomskoj biblioteci DNK. Ćelijska linija koja ne sadrži DHFR transfektovana je rekombinantnim plazmidom koji sadrži i sekvencu koja kodira humani IFN-β i mišji DHFR gen kao marker koji se može selektovati i umnožavati. Pošto se ova selekcija obavi u podlozi bez sadržaja timidina, sledi amplifikacija gena metotreksatom (MTX), i kloniranje, izoluje se ćelija koja proizvodi IFN-β-1a u velikoj količini. Ove ćelije su podvrgnute genotipskoj i fenotipskoj karakterizaciji.

Konstrukcija ekspresionog plazmida koji nosi gene hlFN-β i mDHFR

Tako je konstruisan ekspresioni vektor koji sadrži oba, i genomsku sekvencu koja kodira humani IFN-β i mišji DHFR gen rezistencije. Ovakvom konstrukcijom eliminiše se potreba ko-transfekcije ćelije domaćina CHO sa dva odvojena plazmida, jednim koji uključuje sekvencu kodiranja IFN-β i drugu koja uključuje mišju DHFR sekvencu, koja je poznata iz npr. Chernajovsky et al., 1984.

Ovaj ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu kodiranja IFN-β lišen je IFN-β 3'UTR i tako regiona poliadenilacije IFN-β.

Prema tome, ovaj ekspresioni vektor sadržao je dve transkripcione jedinice: prvu transkripcionu jedinicu IFN-β koja je sastavljena od SV40 promotera/enhancera, sekvencu kodiranja humanog IFN-β i SV40 T Ag region rane poliadenilacije, i drugu transkripcionu jedinicu DHFR koja je sastavljena od SV40 promotera/enhancera, mišjeg gena DHFR i SV40 T Ag poliA-koja sadrži region rane poliadenilacije.

Ove transkripcione jedinice praćene su sekvencama iz pBR322 plazmida koji nosi ColEI bakterijskog porekla za replikaciju i gen rezistencije na ampicilin.

Ova struktura ekspresionog vektora potvrđena je analizom restrikcione mape, i kompletnim sekvenciranjem (dvolančano, automatsko sekvenciranje). Ispravna sekvenca fragmenata korišćenih za njegovu konstrukciju potvrđena je u oba pravca.

Opis ćelija domaćina

Kao ćelija domaćina korišćena je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO), definisana kao DUKX-B11, koja nema aktivnost DHFR (dihidrofolat reduktaze). Ova ćelijska linija izolovana je iz ćelijske linije CHO-K1, i iziskuje prolin (Kao i Puck, 1968) mutagenezom pomoću etil metansulfata posle čega sledi gama zračenje. Mutanti kojima nedostaje DHFR odabrani su izlaganjem visoko specifičnoj aktivnosti [<3>H] - deoksiuridina (Urlaub i Chasin, 1980).

Da bi rasli, mutantima sa kompletnom deficijencijom su potrebni glicin, hipoksantin i timidin. Dve glavne prednosti su centralna uloga DHFR u sintezi prekursora nukleinskih kiselina, zajedno s osetljivošću DHFR-deficijentnih ćelija na analoge kao što je metotreksat (MTX). Prvo, transfekcija takvih DHFR-deficijentnih ćelija plazmidima koji sadrže DHFR gen omogućava selekciju rekombinantnih ćelija koje rastu u podlozi bez sadržaja timidina. Drugo, kulture ovih ćelija u selektivnim podlogama koje sadrže rastuće koncentracije MTX imaju za rezultat amplifikaciju DHFR gena i povezane DNK (Kaufman i Sharp 1982, i Sambrook, J., Fritsch, E.F., Molecular Cloning : A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Generisanje klona

Kao što je prikazano na Sl.1, DHFR-deficijentne CHO ćelije koje su zavisne od veze sa podlogom, transfektovane su postupkom taloženja kalcijum fosfata (Graham FL i Van Der EB, 1973; Busslinger, et al., 1981) pri čemu plazmid sadrži i sekvencu kodiranja h-IFN-β i mDHFR markerski gen koji su gore opisani. Da se amplifikuje transfektovani gen, odabrani kloni se podvrgavaju tretmanu sa MTX (metotreksatom). Ovi klonovi su izolovani posle selekcije pomoću MTX.

Transfekcija

DHFR-deficijentna ćelijska linija CHO DUKX-B11 gajena je u podlozi od Hamove hranljive mešavine F12 uz dodatak 10% FBS, na 37°C, 5% C02.

Dan pre transfekcije, ove CHO DUKX-B11 ćelije su zasejane na 5x10<6>ćelije/9 cm ploči. CaP04-DNK ko-precipitati su pripremljeni mešanjem vektorske DNK, rastvorene u 0,45 ml 10mM Tris-HCI pH 7,9; 0,1 mM EDTA, sa 0.05 ml 2,5M rastvora CaCI2.

Potom, 0,5 ml 280 mM Na2HP04, 50 mM HEPES pH 7,1 dodato je uz blago mućkanje i ova mešavina je čuvana 30-40 minuta na sobnoj temperaturi, da se omogući taloženje. Pošto se doda CaP04-DNK u ćelije tokom 30 minuta, dodato je 9 ml podloge za kulture ćelija pa su ove ćelije vraćene u inkubator da tamo provedu 4 časa. Posle toga podloga je uklonjena, a ćelije izložene osmotskom šoku sa 10% glicerola u podlozi tokom 4 minuta. Ove ćelije su potom izložene tripsinu, pa je pod-kultura u odnosu 1:4 do 1:10 gajena u selektivnoj podlozi koja se sastojala od Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) bez timidina, ali uz dodatak 150 pg/ml prolina i 10% dijalizovanog FBS. Ove kulture su čuvane na 37°C i 8% C02a selektivna podloga je menjana na svaka 3-4 dana.

Izolovane konstitutivne ćelijske linije koja proizvodi hlFN-β

Ćelije koje proizvode interferon beta izolovane su posle 10-12 dana tripsinizacijom sa papirnim diskovima od 3mm natopljenim tripsinom. Ubrano je 43 klona, pojedinačni klonovi su gajeni pa su supernatanti kulture ćelija testirani na produkciju hlFN-β primenom testa ELISA. Za amplifikaciju gena odabrana su tri klona koja su proizvodila više od 30,000 IFN-β IU/10<6>ćelije/24 časa.

Svaki od ovih klonova podvrgnut je gajenju sa niskim koncentracijama MTX. Celokupna ćelijska populacija koja je preživela ovaj tretman podvrgnuta je većim koncentracijama MTX. Subkloniranje i selekcija klona rađeni su tek posle poslednjeg stadijuma amplifikacije. Odabrani visoko produktivni proizvođači (više od 400,000 IU/10<6>ćelija /24 časa) podvrgnuti su ispitivanjima stabilnosti klona. Relativno stabilan visoko produktivni klon je odabran i sub-kloniran. Od dobijenih klona odabran je stabilni koji daje visoki prinos.

Amplifikacijom je pojačan nivo produkcije (specifična produktivnost) IFN-β-1a sa 30,000 do 500,000 IU/10<6>ćelija/24 časa, što je utvrđeno primenom testa ELISA.

Analize primenom Northern blot rađene su posle inicijalne izolacije klona koji su proizvodili veće količine IFN-β-1a. Bila je eksprimirana samo jedna hIFN-β mRNK od oko 0.9 kb, kao što je i očekivano iz ekspresionog konstrukta (podaci nisu prikazani).

Za analizu ukupne RNK iz primernih klonova primenjena je tehnika Northern blot, a blot je pripremljen na sledeći način.

20 pg ukupne RNK separirano je elektroforezom na agaroza formaldehidnim gelovima. RNK je preneta na najlonsku membranu i hibridizovana na IFN-β DNK probu. Markeri (M) veličine su 28S i 18S rRNK, što odgovara veličini od 4700, odnosno 1900 nukleotida (nije pokazano),.

Produktivnost

Produktivnost ćelija je potom testirana na sledeći način. Podloga za kulturu tkiva (rast) bila je DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium), uz dodatak prolina (150mg/l) i 10% FBS (serum fetusa govečeta) ili podloga bez sadržaja seruma, npr. Ex-Cell 302 koju proizvodi JRH.

Ćelije iz klonova koji proizvode Interferon zasejane su u bočice TC80 (2 x 10<6>ćelije/bočici) u 30 ml podloge za rast (bilo DMEM i FBS, ili podloga bez sadržaja seruma). Kada se dostigne inicijalna konfluentnost (spajanje), što se utvrđuje pregledom pod mikroskopom, podloga za rast se zamenjuje sa 20 ml sveže podloge, a kulture se inkubiraju na 32°C tokom 24 časa. Iz svake bočice uzeti su uzorci podloge za kulturu.

Nivo IFN-β-1a određen je primenom ELISA iz podloge za kulturu korišćenjem komercijalnog kompleta ELISA (na primer, Toray ELISA kit koji proizvodi Toray, Japan).

Specifična celularna produktivnost izračunata je množenjem lU/ml IFN-β-1a proizvedenog za 24 časa po zapremini TC80 bočice i podeljeno ukupnim brojem ćelija (u milionima) po bočici.

Rezultati i zaključci

Klon ćelija koje proizvode interferon beta bila je jedna stabilna ćelijska linija, velikog proizvodnog kapaciteta za rekombinantni humani interferon-β u rasponu od oko 100,000 IU izraženo u specifičnoj ćelijskoj produktivnosti (IU/10<6>ćelija/ 24 časa) do oko 600,000 IU izraženo u specifičnoj ćelijskoj produktivnosti. Srednja produktivnost nove ćelijske linije iznosila je 556,000 ± 119,000 IU/10<6>ćelija/24 čas.

Opšta ćelijska morfologija ispitivana je i faznom kontrastnom mikroskopijom jedan do 4 dana po zasejavanju. Morfologija je dokumentovana fotomikrografima (nije prikazano). Rezultati prikazuju da pri niskoj gustini (24 do 48 časa po zasejavanju) ove ćelije pokazuju zaokrugljenu, vretenastu morfologiju (rezultati nisu prikazani). Pri konfluenciji, ove ćelije formiraju guste jednoredne slojeve sastavljene od izduženih, vretenastih i manjih, zgusnutih ćelija koje liče na epitelijalne (rezultati nisu prikazani). Ispoljene morfološke ovih ćelija bile su tipične za CHO ćelije.

Određivanje DNK sekvence regiona kodiranja hlFN-β u ćelijama klona

PCR DNK proizvodi izvedeni iz hlFN-β glasničke RNK (mRNK) korišćeni su da se odredi region kodiranja nukleotidne sekvence jer mRNK sekvenca daje direktni dokaz da su transkripti RNK obrađeni kako treba.

Procedura za sekvenciranje DNK

Reakcije cDNK i PCR

Ukupna ćelijska RNK pripremljena je iz ćelija u eksponencijalnoj fazi rasta u kulturi u T-bočici (Chomczynski i Sacchi, 1987). Komplementarna DNK (cDNK) sintetizovana je iz uzoraka mRNK u reakciji koja je sadržala 2 mikrograma (μg) ukupne RNK, 0,5 μM randomnih heksamera, 2,5 mM MgCI2, 1X PCR II pufera [10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI], po 0,5 mM od dATP, dCTP, dGTP, i dTTP, 40 jedinica Inhibitora RNase, i 200 jedinica Reverzne Transkriptaze u konačnoj zapremini od 100 μl.

Matrica RNK, prajmer i voda bez sadržaja nukleaze kombinovani su i inkubirani na 65°C tokom 10 minuta i potom stavljeni u ledeno kupatilo. Potom su dodate preostale komponente i reakcija je inkubirana na 42°C tokom 60 minuta, potom 70°C tokom 15 minuta i potom neodređeno na 4°C. Proizvodi RT (cDNK) čuvani su na - 20°C do dalje upotrebe. Kao kontrola,

pripremljena je reakcija sa svim komponentama izuzev reverzne transkriptaze. Ova kontrola bez RT služi da se isključi malo verovatna mogućnost da preparat RNK bude kontaminiran sa DNK.

Amplifikacija PCR je rađena korišćenjem prajmera SRB1 AP1 i AP2 za matrice cDNK. Ovde dajemo sekvence za te prajmere:

SRB1 AP1: CCTCGGCCTCTGAGCTATTC (SEQ ID NO: 1)

SRB1 AP2: CACAAATAAAGCATTTTTTT (SEQ ID NO: 2)

Reakcije PCR sastojale su se od sledećeg: 4.0 μl reakcione mešavine cDNK , 50 pmol svakog od parova prajmera, i 25 μl HotStarTaq™ Master Mix u reakcionoj zapremini od 50 μl. Ove reakcije su zagrevane na 95°C tokom 15 minuta posle čega sledi 30-35 ciklusa: (a) 94°C tokom 30 sekundi, (b) 55°C tokom 30 sekundi, i (c) 72°C tokom 1 minuta. Završni ciklus, identičan kao i prvih 30-35, ali se vreme inkubacije na 72°C produžuje na 10 minuta.

Proizvodi PCR hlFN-β bili su prečišćeni elektroforezom na agaroza gelu niske tačke topljenja (LMP) posle čega sledi ekstrakcija primenom kompleta za ekstrakciju gela QIAquick (Qiagen).

Sekvenciranje amplifikovane DNK

Proizvodi PCR sekvencirani su direktno sa Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit sa AmpliTaq® DNK Polimerazom. Sve reakcije sekvenciranja analizirane su na 5.75% Long Ranger™ gelovima na ABI373-S automatskim sekvencerima DNK. Sirovi podaci su praćeni i analizirani primenom softvera ABD Analysis.

Rezultati

Amplifikacija PCR dovela je do generisanja približno 815 bp fragment. Nisu zabeleženi PCR proizvodi za kontrolu bez sadržaja RT, niti za druge negativne kontrole.

Kompletni podaci o sekvencama dobijeni su za region koji kodira protein za hIFN-β gen; Svi nukleotidi su očitavani na dve ili više elektroferograma (podaci nisu prikazani). Kada su sekvence upoređene sa ekspresionim vektorom, nisu utvrđene nikakve razlike (podaci nisu prikazani).

Zaključci

Podaci o sekvenciranju pokazuju da je gen hlFN-β gen integrisan u ćelije genoma klona ispravno transkribovan u hlFN-β mRNK.

Određivanje broja genskih kopija

Broj genskih kopija određivan je Southern blot analizom digesta BamHI.

Sledeći specifični prajmeri korišćeni su za analizu pravljenje proba za broj genskih kopija:

(i) 5': PR221626: ATGACCAACAAGTGTCTCCTCC (SEQ ID NO: 3)

(ii) 3': PR231217 ACTTACAGGTTACCTCCGAAAC (SEQ ID NO: 4)

Procedure za pripremu genomske DNK i Southern bloting

Genomska DNK je izolovana iz eksponencijalno rastuće kulture ćelija u T-bočicama primenom modifikovane metode precipitacije indukovane solju (salting out) (Martinez et al., 1998). Ukratko, ćelije su ponovo suspendovane u puferu Tris-NaCI-EDTA i onda podvrgnute liziranju pomoću pufera Tris-NaCI-EDTA- SDS. Ova suspenzija je preko noći tretirana proteinazom K. Posle dodavanja zasićenog rastvora soli i centrifugiranja, genomska DNK se taloži dodavanjem izopropanola u vodenu fazu. Po pranju 70% etanolom DNK pelet se ponovo suspenduje u rastvoru TE/RNase A (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM EDTA, 20 ng/ml RNaseA).

Alikvoti preparata genomske DNK podvrgavaju se digestiji sa Afllli, Bbsl, Bgll, Dral, Hindi, Pstl, i Xmnl. Standardi su pripremljeni digestijom uzorka ekspresionog vektora DNK sa istim restriktivnim endonukleazama koje se koriste za genomske uzorke. Frakcionisanje DNK po veličini obavljeno je elektroforezom u agaroza gelu, a onda preneto u 10X SSC na najlonske membrane kapilarnim dejstvom. Količina nanete genomske DNK iznosila je 0,5 pg. Bioti su pripremljeni za hibridizaciju na<32>P-obeleženi fragment hlFN-β koji je amplifikovan pomoću PCR iz plazmida korišćenjem gore navedenih prajmera. Prehibridizacija i hibridizacija su obavljani na 65°C.

Veličine su određivane na bazi migracije traka kako su vizuelno prikazane pomoću<32>P na autoradiografu. Ekspresioni vektor je korišćen kao kontrola.

Određivanje broja kopija baziralo se na relativnim nivoima<32>P u trakama, kvantifikovano na modelu 445SI Phospholmager™ (Molecular Dynamics; Sunnyvale, CA). Autoradiografi su fotografisani da se obezbedi dokumentacija za rezultate (podaci nisu prikazani).

Rezultati

Određivanje veličine fragmenata generisanih za ćelije klona koje proizvode interferon beta obezbeđeno je za sve digeste.

Enzimska digestija DNK ekstrahovane iz ćelijske linije koja proizvodi interferon beta dovela je do produkcije izrazitih traka koje odgovaraju onima koje su predviđene na osnovu ekspresionog vektora za BamHI, Bgll, Dral i Hindi digeste. Jedna veoma tanka traka (-1.77 kb) zabeležena je sa genomskim DNK digestovanim pomoću Bgll, najverovatnije kao rezultat nepotpune digestije. Ovi restriktivni enzimi nalaze se sa bočnih strana hIFN-β ekspresione jedinice i ukazuju na to da je intaktna, funkcionalna jedinica cele dužine integrisana u genom.

U preostalim digestima, zabeležene su razlike u matricama traka između ekspresionog vektora genomske DNK. Ovo nije neočekivano s obzirom na to da mora da dođe do nekih razmeštanja kada se kružni vektor integriše u genom ćelija CHO.

Nivo broja kopija određen za ćelije klona u proseku je iznosio 96105 kopija po ćeliji. Na primer, za jednu grupu ćelija, prosečan broj kopija gena (n=3) iznosio je 105, sa standardnom devijacijom od 23 i CV (%)22.

Određivanje veličine mRNK

Ukupna RNK izolovana je iz eksponencijalno rastućih ćelija koje proizvode interferon beta i netransfektovanih ćelija CHO DUKX (Chomczynski i Sacchi, 1987). Korišćene probe uključile su<32>P-obeleženu hlFN-β probu pripremljenu kako je opisano u odeljku "Određivanje broja genskih kopija" i kontrolnu probu G3PDH cDNK (Clontech; Palo Alto, CA).

Procedure

Ukupna RNK, 5 μg po liniji, frakcionisana je po veličini elektroforezom na agaroza gelovima koji su sadržali formaldehid kao denaturant. Uzorci su unošeni u duplim skupovima. RNK je preneta sa 10X SSC na najlonske membrane kapilarnim dejstvom. Prehibridizacija i hibridizacija su rađeni na 65°C u modifikovanom rastvoru koji su opisali Church i Gilbert u odeljku "Analiza mape restrikcionih endonukleaza". Blotovi su hibridizovani na<32>P-obeleženu hlFN-β probu i na kontrolnu probu G3PDH cDNK. Veličina traka procenjena je sa autoradiografa ovih blotova.

Rezultati i zaključci

Za ove ćelije opservirana je jedna glavna vrsta IFN-β mRNK. Veličina ove mRNK procenjena je na 0,9 kb mRNK. Ova veličina je u dobroj korelaciji sa mRNK počevši od mesta inicijacije transkripcije SV40 do rezultujućeg transkripta od 800 nukleotida ne uzimajući u obzir rep poliA.

Opšti zaključci i sažetak

Fenotipska i genotipska ispitivanja ćelija koje proizvode interferon beta potvrdile su identitet i konzistenciju ovih ćelija.

Hromozomska integracija gena hlFN-β u genom ćelije CHO pokazana je in-situ ispitivanjima hibridizacije.

Poređenje matrice mapiranja restriktivne endonukleaze, DNK sekvence i mRNK analize ćelije pokazalo je da nema dokaza o većem razmeštanju DNK ili tačaka mutacije hlFN-β gena.

Nivoi broja kopija hIFN-β mereni su analizom DNK ekstrahovane iz ćelije opisanog klona metodom Southern blot. Rezultati su pokazali da je nivo broja kopija gena bio u istom rasponu za sve ćelije, nezavisno od nivoa dupliranja populacija.

Northern blot analiza RNK pripremljene iz ćelije pokazala je samo jednu traku približne veličine 0.9 kb.

Analize sekvence cDNK iz ćelije potvrdile su ispravnost mRNK sekvence, dok su genomske DNK sekvence kontrolnih regiona 5' i 3' gena hlFN-β potvrdile integraciju kompletne transkripcione jedinice IFN-β.

U zaključku, pokazano je da su ćelije koje proizvode interferon beta sintetizovale hlFN-β mRNK transkripte sa ispravnim sekvencama regiona koji kodira ovaj protein, što ukazuje na to da ćelije koje proizvode interferon beta produkuju humani rekombinantni IFN-β (IFN-β-1a) sa ispravnim primarnim amino kiselinskim sekvencama.

Za genotipsku karakterizaciju, analiza restrikcione mape obavljena je na ćelijama koje proizvode interferon beta. Multipli digesti su separirani elektroforezom na agaroza gelu, prenete na najlonske membrane i hibridizovane na obeležene probe specifične za hlFN-β. Dosledni profili restrikcionih fragmenata ukazao je na integraciju intaktne funkcionalne jedinice hlFN-β u svim bankama ćelija.

Broj kopija gena hlFN-β određen je na osnovu analize DNK ekstrahovane iz ćelija koje proizvode interferon beta metodom Southern blot (podaci nisu prikazani). Rezultati pokazuju da je broj kopija gena negde oko 100 kopija po ćeliji, što je oko četiri puta više nego za klone opisane u literaturi (Chernajovsky et al., 1984).

Analizom Northern blot, jedna mRNK od oko 0,9 kb, koja kodira gen hIFN-β, identifikovana je za ćelije sa klona (podaci nisu prikazani).

Ove hlFN-IX cDNK pripremljene iz ćelijskih mRNK bile su sekvencirane, i rezultati su pokazali da za ove ćelije, sekvenca gena hlFN-β je bila 100% identična očekivanoj sekvenci. Prema tome, hlFN-β gen je ispravno transkribovan u mRNK.

Sekvence genomske DNK od 5' i 3' regiona koje bočno okružuju hlFN-β gen određene su za ćelije klona i utvrđeno je da su 100% identične odgovarajućim sekvencama ekspresionog vektora i objavljenim sekvencama hlFN-β gena.

Jedna hromozomska integracija gena hlFN-β pokazana je i fluorescentnom in-situ hibridizacijom (FISH, rezultati nisu pokazani).

Gore prikazane analize pokazale su i stabilnost proizvodne linije.

Stoga se može pretpostaviti da je transfektovani gen stabilno integrisan u genom ćelija koje proizvode interferon beta.

PRIMER 2 – PROCES ZA PROIZVODNJU INTERFERONA BETA

Sveukupni cilj ovog eksperimenta bio je da se razvije proces za proizvodnju IFN beta-1a iz klona opisanog u primeru 1 u uslovima bez sadržaja seruma.

Ovaj proces bez sadržaja seruma razvijen je u bioreaktoru veličine 75L sa interno složenim nosačima ležišta Fibra-Cel®.

Ćelije su odmrznute i ekspandirane tokom 21 dana u komercijalno dostupnoj podlozi bez sadržaja seruma uz sledeće modifikacije:

Tabela 1 Modifikacije podloge bez sadržaja seruma

30 x 10<9>ćelija zasejano je u bioreaktoru od 75L (visoko zasejavanje).

Ciklus je podeljen u sledeće faze:

- Prva faza rasta na 37°C (do 2. radnog dana ili do 4. radnog dana ili kada stopa potrošnje glukoze (GCR) bude >2.0±1.0 g.L<-1>.d<-1>)

- Druga faza rasta na 35°C (do 7. radnog dana ili GCR>8.0±0.5 g. L<-1>.d<-1>)

- Faza proizvodnje na 33°C

Ova temperaturna strategija dovela je do produktivnosti od oko 6,0 x 10<6>IU /ml bio na dan. Ova produktivnost je oko pet puta veća od produktivnosti klona opisanog u literaturi (Chemajovsky et al., 1984) u podlozi koja sadrži serum.

Dodatno je testirano da li je dodatak N-Actey-Citeina (NAC) samog ili u kombinaciji sa cinkom (NAC+Zn) imao povoljno dejstvo na produktivnost. Dodavanje NAC ili NAC Zn povećalo je proizvodnju na oko 12 x 10<s>IU /ml bio na dan na kraju ciklusa.

Testirana je i manja gustina zasejavanja ćelija od 66% (1,3.10<9>ćelija) da bi se procenio uticaj na trajanje faze rasta, metabolizam i produktivnost.

Zasejavanje manjom gustinom nije uticalo na metabolizam i produktivnost. Jedini uticaj zasejavanja manjom gustinom bio je dodavanje dva dana na fazu rasta.

Ukratko, završni uslovi koji su se koristili za proizvodnju interferona beta bili su sledeći:

PRIMER 3 - PREČIŠĆAVANJE PROIZVEDENOG PROTEINA INTERFERONA

Proces prečišćavanja IFN-β-1a iz supernatanta kulture ćelija uključio je četiri hromatografska stadijuma i četiri stadijuma filtracije, kao što je pokazano na Sl.2. Stadijumi prečišćavanja obavljani su u sledećem redosledu:

• Stadijum I: Klarifikacija ubranog materijala filtracijom

• Stadijum II: Afinitetna hromatografija na Blue Sepharose 6 u koloni sa brzim protokom (6 FF);

Stadijum III: Ultrafiltracija

• Stadijum IV: hromatografija sa katjonskom izmenom sa preporučenim korišćenjem kolone sa brzim protokom CM Sepharose FF;

• Stadijum V: Hidrofobna hromatografija RP-HPLC;

• Stadijum VI: Ultrafiltracija i dijaliza;

• Stadijum VII: Hromatografija sa isključivanjem po veličini (SE);

• Stadijum VIII: Mikrofiltracija.

Prečišćavanje aktivnog sastojka počinje bojom afinitetnom hromatografijom na koloni sa brzim protokom Blue Sepharose 6 FF (BS 6 FF), i to je glavni stadijum prečišćavanja. Količina izvedenih proteina iz ćelije domaćina kao i DNK iz prsnute ćelije CHO smanjena je za nekoliko redova veličine pa je tako IFN-β-1a u eluatu BS 6 FF bio značajno obogaćen. Pre nego što je eluat unet u narednu kolonu, obavljena je ultrafiltracija da se smanji zapremina rastvora i da se isključe materijali male molekulske težine.

Da se dobije visoko prečišćeni IFN-β-1a odabrane su tri glavne vrste separacije proteina na bazi kolone. Hromatografija jonske izmene na smoli CM-sefaroza FF uklanja nukleinsku kiselinu i proteine izvedene iz FBS/CHO. HPLC reverzne faze smanjuje pirogene, proteine

izvedene iz rezidualne ćelije domaćina i razgrađene forme IFN-β-1a. Završni stadijum gel filtracije obavljan je na smoli Sephacril S-100 HR. Ovaj eluat je podvrgnut mikrofiltraciji (0,22 μm) i čuvan na temperaturi od -70°C ili još nižoj.

Svi početni materijali korišćeni za pripremu pufera i rastvora za čišćenje bili su u skladu sa Ph. Eur. i/ili USP ili su bili analitičke čistoće, odnosno čistoće za reagense.

PRIMER 4: ANALIZA SIJALIJACIJE

Prečišćeni IFN-beta je podvrgavan analizi profila sijalijacije metodom ES-MS (Elektro sprej masena spektrometrija), sa sledećim rezultatima:

PRIMER 5 - GLIKOFORMNA ANALIZA

Da bi se dalje analizirao IFN-β-1a dobijen iz novog procesa, analizirani su glikoformi proteina. Kao što je prethodno opisano, glikozilirani proteini se često javljaju kao mešavina različitih glikoforma, ili proteina koji imaju drugačiju strukturu saharida u njihovoj glikozilaciji. Različite tehnike su korišćene za analizu ovih glikoforma, kao što je dole opisano u detalje, uključujući elektrosprej masenu spektroskopiju, FAB-MS, MALDI-MS, tandem masenu spektroskopiju (MS/MS) i GC-MS (studije veza). Sve ove različite tehnike su pokazale da od svih ispitivanih struktura saharida, jedna takva struktura je bila nova prisutna u IFN-βa dobijenom iz klona.

Određivanje distribucije glikoforma elektrosprej masenom spektroskopijom

Metod

Serije uzoraka IFN-β-1a Interferona beta dobijenog pomoću klona korišćenjem elektrosprej masene spektroskopije (ES-MS). Ovaj metod su opisali npr. Fenn, et al., (1989).

MS/MS glikana. Ova tehnika omogućava brzo praćenje distribucije glikoforma iz serija uzoraka na nivou molekulske mase. Ovaj metod su opisali npr. Domon, B. i Costello, CE (1988).

Rezultati

Rezultati su prikazani na slikama od 3-5. Za sve slike, shematski crteži različitih oligosaharida prikazani su na vrhu svake vršne vrednosti. Slike 3 i 4 pokazuju spektre transformisane pomoću ES-MS za nekoliko IFN-β-1a serija od interferona beta dobijenog novim procesom.

U svim testiranim serijama, glavni glikoformi su bile fukozilirana jezgra disijalil (vrh C) i monosijalil (vrh B) biantenarne ugljenohidratne strukture i manji glikoformi koji su odgovarali fukoziliranim jezgrima ne-sijaliranih biantenarnih (vrh A), fukoziliranim jezgrima triantenarih trisijaliranih (vrh E) i dvema drugim manjim kompleksnim strukturama sa fukoziliranim jezgrima (vrhovi D i F).

Manji signali na 22524 Da ± 0,01%, pripisani disijalilnim biantenarim difukoziliranim glikanima (NeuAc2.Hex5.HexNAc4. FUC2), otkriveni su pomoću ES-MS u uzorcima IFN-β-1a izvedenim iz interferona beta dobijenog novim procesom. Ovaj glikoform može da se definiše i kao biantenarni glikan sa sijalilnom Lewis x (Le<x>) antenom. Treba napomenuti da se Lewis x (Le<x>) glikan, koji se sastoji od Hex. HexNAc.Fuc strukture, često nalazi u glikoproteinima na površini kako limfocita (L-selektin) tako i specijalizovanih endotelnih ćelija (Cummings, 1999; Dell i Morris, 2001).

Drugi manji glikoform centriran na vrednosti srednje molekulske težine od 22670 Da ± 0,01%, sa prosečnom količinom od 4% svih glikoforma i pripisan disijalil biantenarnom trifukoziliranom glikanu (Neu2Ac.Hex5.HexNAc4.Fuc3) otkriven je pomoću ES-MS u serijama IFN-β-1a interferona beta dobijenog novim procesom, nezavisno od obima proizvodnje. Prosečna količina ovog manjeg glikoforma je 4%, sa SD od 0.90.

Zaključci

Matrica glikoforma IFN-fi-1a izvedenog iz interferona beta dobijenog novim procesom analizirana je pomoću ES-MS.

Manji signali, pripisani difukozilitanim glikanima, koji su identifikovani pomoću ES-MS u IFN-β-1a iz interferona beta dobijenog novim procesom, otkriveni su pomoću MALDI-MS. Jedan dodatni manji glikoform (prosečno 4% od ukupnih glikoforma), pripisan trifukoziliranoj strukturi, otkriven je pomoću ES-MS u proizvodu iz interferona beta takođe dobijenog novim procesom.

Analiza ugljenih hidrata pomoću FAB-MS. MALDI-MS. tandem masene spektroskopije (MS/MS) i GC-MS (studije veza)

Uzorci serija IFN-β-1a izvedeni iz interferona beta dobijenog novim procesom podvrgnuti su ekstenzivnim ispitivanjima karakterizacije ugljenih hidrata. Ugljenohidratni sastav IFN-β-1a dobijen je primenom FAB-MS, MALDI-MS, Nanosprej-MS/MS analiza i studija veza (GC-MS) permetiliranog IFN-β-1a po digestiji tripsinom i peptidnom N-glikosidazom F. Određivanje mesta glikozilacije obavljano je analizama FAB-MS himotriptičnih peptida koji su prethodno podvrgnuti digestiji tripsinom i N-glikosidazom F.

Metod

Peptidna glikopeptidna mešavina pocepana tripsinom iz IFN-β-1a tretirana je enzimom peptid-N-glikosidaza F (npr. kako su to opisali Tarentino et al.1985).

Po zaustavljanju reakcije (sušenjem zamrzavanjem), dobijeni digest je prečišćen pomoću patrone C18 Sep-pak. Ugljeni hidrati eluirani u frakciji 5% sirćetne kiseline bili su permetilirani primenom NaOH/metil jodida, kako je to opisao npr. Costello (1997).

Deo permetiliranog glikana analiziran je pozitivnim jonskim FAB-MS (dobijenim u rasponima niskih masa za fragmente jona i rasponima visokih masa za molekulske jone), kako su to opisali npr. Barber, et al. (1981) i Tailor (1983).

MALDI- masena spektrometrija je rađena kako su to opisali npr. Hillenkamp, et al.,1991.

Nanosprej- masena spektrometrija je rađena kako su to opisali npr. Wilm i Mann 1996.

Preostali permetilirani oligosaharidi korišćeni suza analizu veza gasnom tečnom hromatografijom / masenom spektrometrijom (GC/MS)- po derivatizaciji, kako je to opisao npr. Gray, 1990.

I na kraju, u cilju opservacije peptida koji sadrži potencijalno mesto glikozilacije Asn 80, tripsinski peptidi su podvrgnuti digestiji peptid N-glikosidazom F i prečišćeni pomoću Seppak. Propanolske frakcije (20%-40%) Sep-pak su potom podvrgnute sub-digestiji himotripsinom i analizirane pomoću FAB/MS.

Rezultati

MALDI i FAB-MS permetiliranih ugljenih hidrata

Sprovedena je studija na proteinu iz interferona beta dobijenog novim procesom. Na SL. 6 prikazan je jedan predstavnik spektra MALDI. Odgovarajući spisak signala m/z opserviran u permetiliranim spektrima (MALDI-MS i FAB-MS) prikazan je na Tabeli 3.

Rezultati za sve serije navedene u prisustvu predominantne disijalirane biantenarne strukture koja ima sastav NeuAc2-Hex5.HexNAc4.Fuc, i monosijalirane biantenarne strukture koje imaju sastav NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc. Ne-fukozilirani glikani nisu opservirani.

Manji signali verovatno odgovaraju sledećim oligosaharidnim strukturama, a zabeleženi su u svim serijama:

• Ne sijalirana biantenarna struktura (Hex5.HexNAc4.Fuc)

• Disijalirana triantenarna struktura ili disijalirana biantenarna sa strukturom N-acetil laktosamin ponovaka (NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc)

• Trisijalirana triantenarna struktura (NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc)

• Trisijalirana triantenarna struktura sa strukturom N- acetil laktozaminskih ponovaka ili trisijaliranom tetrantenarnom strukturom (NeuAc3.Hex7.HexNAce.Fuc)

• Mono sijalirana i disijalirana biantenarna struktura sa dve fukozne jedinice (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2.NeuAc2.Hex5.HexNAc4.FuC2)

• Manja količina trifukozilirane strukture (NeuAc2-Hex5.HexNAc4.Fuc3)

Zabeleženi su u serijama izvedenim iz interferona beta dobijenog procesom u skladu sa ovim pronalaskom ali su bili odsutni iz referentnog IFN-β-1a

• Manja količina N-glikolilneuraminske kiseline kao deo sijalinske kiseline glikana.

Relativno obilje N-glikolilneuraminske kiseline izračunato je na osnovu vršnih vrednosti signala u podacima FAB i MALDi-TOF za permetilirani N-vezani glikan.

Kao što je i očekivano IFN-β-1a glikoformi sadrže uglavnom N-acetilneuraminsku kiselinu kao i većina humanih glikoproteina.

Nanosprej MS/MS

Da bismo dalje potvrdili strukture malih količina (u tragovima) N-vezanih multifukoziliranih oligosaharidnih struktura, obavljena je MS/MS analiza na permetiliranim oligosaharidima signala na m/z 919, 1040 i 1098 što je u skladu sa trostruko naelektrisanim jonima ([M+3H]<3>*) za NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2, NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2, odnosno za NeuAc2 Hex5.HexNAc4.Fuc3. Joni tipa A zabeleženi u spektru MS/MS potvrdili su sledeće osobine ovih struktura:

Tabela 2

Analiza veze pomoću GC/MS

Kompleksni GC hromatogrami su zabeleženi za sve testirane serije Interferona beta dobijenog novim procesom sa nekim vršnim vrednostima nečistoća koje potiču od reagenasa za derivaciju. Poređenje vremena retencije (zadržavanja) pomoću GC sa standardnom mešavinom parcijalno metiliranih alditol acetatata koji su podvrgnuti GC pod istim uslovima omogućilo je provizorno dodeljivanje vršnih vrednosti sa sadržajem šećera.

Rezultati analize veze za sve uzorke bili su suštinski isti i pokazali prisustvo 4-vezanog N-acetilglukozamina (4-GlcNAc), 4,6-vezanog N-acetilglukozamina (4,6-Glc-NAc), 3,6-vezane manoze (3,6-Man), 2-vezane manoze (2-Man), terminalne galaktoze (t-Gal), 3-vezane galaktoze (3-Gal) i terminalne fukoze (t-Fuc), čime je obezbeđena snažna potvrda podataka FAB-MS. Kao manje komponente zabeleženo je i prisustvo 2,6-vezane manoze u svim uzorcima, što ukazuje na prisustvo neke triantenarne strukture. Pretpostavljene strukture većih oligosaharida zabeleženih u serijama uzoraka IFN-β-1a date su na Slici 5.

Ovi podaci govore da je glavni ugljenohidratni deo ključna fukozilirana biantenarna struktura sa jednim ili dva ostatka sijalinske kiseline.

Mesto N- glikozilacije određeno pomoću FAB-MS himotripsinskog digesta

Za sve testirane serije IFN-β-1a zabeležen je i jedan manji FAB-MS signal koji je pripisan sodiranim (pretvorenin u katjon dodavanjem jona natrijuma) peptidnim ostatacima 80-88 (D.E.T.I.V.E.N.L.L Na<+>) uz Asn-80 konvertovan u aspartičnu kiselinu po oslobađanju ugljenog hidrata sa peptidom N- glikosidaza F. Ovaj eksperiment daje dodatnu potvrdu da je Asn-80 zaista glikoziliran.

Slika 6 pokazuje MALDI spektar IFN-β-1a sa permetiliranim glikanima (spisak signala dat je na Tabeli 3). I opet, kao što je pokazano na Tabeli i pratećoj slici, IFN-β-1a dobijen procesom u skladu sa predstavljenim pronalaskom sadrži trifukoznu strukturu, NeuAc2-Hex5.HexNAc4.Fuc3 kao što je prethodno već opisano.

Tabela 3 Spisak signala u permetiliranim spektrima IFN-βa dobijenim novim procesom po digestiji tipsinom i peptid N-glikozidazom F

Zaključci

Analize MALDI-MS i FAB-MS permetiliranih N-glikana serija uzoraka IFN-β-1a dobijenih novim procesom pokazali su sledeće ugljenohidratne fukozilirane strukture jezgra (ne-fuzilirani glikani nisu opservirani):

Veći glikoformi

• Monosijalirana biantenarna struktura (NeuAc Hex5.HexNAc4.Fuc)

• Disijalirana biantenarna struktura (NeuAc2 Hex5.HexNAc4.Fuc)

Manji glikoformi:

• Ne-sijalirana biantenarna struktura (Hex5.HexNAc4.Fuc)

• Disijalirana triantenarna struktura ili disijalirana biantenarna sa strukturom N-acetil laktozaminskih ponovaka (NeuAc2.Hexe.HexNAc5.Fuc)

• Trisijalirana triantenarna struktura (NeuAc3.Hexe.HexNAc5.Fuc)

• Trisijalirana triantenarna sa strukturom N-acetil laktozaminskih ponovaka ili trisijaliranom tetrantenarnom strukturom (NeuAc3.Hex7.HexNAce.Fuc)

• Disijalirana i monosijalirana biantenarna struktura sa dve jedinice fukoze (NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2, i NeuAc2-Hex5.HexNAc4.Fuc2)

• Disijalirana biantenarna struktura sa tri jedinice fukoze (Neu AC2 - Hexs.

HexNAC4. FUC3)

Metoda nanosprej MS/MS permetiliranih glikana potvrdila je otkrivanje minimalnih (u tragovima) nivoa NeuAc2-Hex5.HexNAc4.Fuc2 oligosaharida u svim uzorcima dok su tragovi NeuAc2-Hex5.HexNAc4.Fuc3 zabeleženi samo u IFN-β-1a dobijenim procesom ovog pronalaska.

Analize veze potvrdile su očekivane monosaharide otkrivene podacima dobijenim pomoću FAB-MS.

I na kraju, u proizvodu IFN-β-1a dobijenom ovim novim procesom, detaljna analiza tripsinskih i himotripsinskih peptida dobijena pomoću FAB- MS ukazala je na prisustvo N-glikanske veze na Asn-80.

Relativno obilje N-glikolilneuraminske kiseline izračunato je na osnovu vršnih vrednosti signala u permetiliranom N-vezanom glikanu na osnovu podataka dobijenih pomoću FAB i MALDI-MS.

Odnos N-acetilneuraminska kiselina: N-glikolilneuraminska kiselina iznosio je 31,7:1,0 u uzorku i ukazao na to da je 3,1% sijalinske kiseline zapravo N-Glikolilneuraminska kiselina. Ovi rezultati su u skladu sa sličnim nivoima (5 %) dobijenim za prirodni humani interferon koji proizvode humani fibroblasti. Kao što se i očekivalo IFN-β-1a glikoformi sadrže uglavnom N-acetilneuraminsku kiselinu kao i mnogi humani glikoproteini.

LITERATURA

) Altschul S F et al, J MoI Biol, 215, 403-410,1990

) Altschul S F et al, Nucleic Acid Res., 25:389-3402,1997

) Barber, M., Bordoli, R.S., Sedgwick, R.D. i Tiler A.N. (1981) Chem.Commun., 325-327

) Morris, H.R., Panico, M. i Tailor W. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun., 117, 299-305.

) Chernajovsky et al., Efficient Constitutive Production of Human Fibroblast interferon by Hamster Cells Transformed with the IFN-β Gene Fused to an SV40 Early Promoter, DNK, vol.3, 1984, pp.297-308

) Chomczynski, P. i Sacchi, N. Anal. Biochem.162:156-159,1987

) Clonis, Y.D., Atkinson, A., Bruton, C.J., i Lowe, C.R. (1987). "Reactive Dyes in Protein i Enzyme Technology." Stockton Press, New York.

) Conradt et al., Struktura of the carbohydrate moiety of human interferon beta secreted by a recombinant Chinese hamster ovary cell line, jbc, vol 262, pp.14600-14605, 1987.

) Costello, C.E. (1997) Biophys. Chem., 68, 173-188

0) Cummings, R.D.1999. Struktura and function of the selectin ligand PSGL-1. Braz. J.

Med. Biol. Res.32: 519-528.

1) Dell A. i H. Morris 2001. Glycoprotein structure determination by mass spectrometry.

Science 291: 2351-2356

2) Derynk R. et al., Nature 285, 542-547, 1980;

3) Devereux J et al, Nucleic Acid Res, 12, 387-395,1984

4) Domon, B. i Costello, CE (1988), Biochemistry 27,1534-1543.

5) Fenn, J.B., Mann, M., Meng, C.K., Wong, S.F. i Whitehouse, C.M., (1989) Science, 246, 64-70.

6) Grantham et al., Science, Vol.185, pp.862-864 (1974)

7) Graham FL and Van Der EB AJ A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNK. Virology 52:456-467, 1973; Busslinger M, Moschonas N, i Flavell RA b<+>Thalassemia. Aberrant splicing results from a single point mutation in an intron. Ćelija 27:289-298, 1981

8) Gray, G.R., (1990) Methods Enzymol.193, 573-587.

9) Harvey D.J., (2000) J. Mass Spectrom., 35, 1178-1190

0) Hillenkamp, F., Karras, M., Beavis, R.C., Chait, B.T. (1991) Anal. Chem.63, 11931203.

) Innis MA, McCormick F. Procedures for expression, modification, i analysis of human fibroblast interferon (IFN-beta) genes in heterologous cells. Methods Enzymol.

1986;119:397-403.

) Kao, F.-T., i Puck, T.T., Genetics of Somatic mammalian cells, VII. Induction i isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 1275-1281, 1968

) Kaufman R i Sharp P. Amplification and expression of sequence cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary DNA gene. Journal of Molecular Biology 159:601-621, 1982

) Martinez G, Shaw EM, Carillo M i Zanuy S. Protein salting-out method applied to genomic DNA isolation from fish whole blood. Biotechniques 24(2): 238-239, 1998.

) Mory et al. European J. Biochem.120, 197-202 (1981)

) Puck, J.Exp,Med.108, 946, 1958

) Reiser W i Hauser H. Recombinant human interferon beta from mammalian cell lines.

Arzneimittelforschung/Drug Research 37 (I), 4,482-485 (1987)

) Runkel et al., Structural i Functional Differences Between Glycosilated and Nongycosilated Forms of Human interferon beta (IFN-beta), Pharm. Res., vol 15, 1998, pp.641-9.

) Sambrook, J., Fritsch, E.F., Molekular Cloning : A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989

) Smith and Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981.

) Tarentino, A.L., Gomez, C.M., i Plummer, T.H.Jr (1985) Biochemistry, 24, 4665-4671.

) Urlaub G i Chasin LA Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci USA 77(7):4216-4220, 1980).

) Wilm, M., Mann, M (1996), Anal. Chem.68, 1-8.

) Youcefi et al., Am J Clin Pathol.1985 Jun;83(6):735-40

LISTING SEKVENCI

<110> APPLIED RESEARCH SISTEMS ARS HOLDING N.V.

<120> PROCES ZA PRIPREMU GLIKOZILIRANOG INTERFERONA BETA <130> W0941-2

<160> 4

<170> Verzija patenta 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNK

<213> Veštačke sekvence <220>

<223> Prajmer

<400> 1

cctcggcctc tgagctattc 20 <210> 2

<211> 20

<212> DNK

<213> veštačke sekvence <220>

<223> prajmer

<400> 2

cacaaataaa gcattttttt

<210> 3 20 <211> 22

<212> DNK

<213> veštačke sekvence

<220>

<223> prajmer

<400> 3

atgaccaaca agtgtctcct cc 22 <210> 4

<211> 22

<212> DNK

<213> veštačke sekvence

<220>

<223> prajmer

<400> 4

acttacaggt tacctccgaa ac

Claims (5)

Patentni zahtevi

1) Proces za proizvodnju glikoziliranog rekombinantnog humanog interferona beta, koji uključuje korak gajenja humanog interferona beta u CHO ćelijama u podlozi bez sadržaja seruma, a ta podloga bez sadržaja seruma sadrži:

- 10 do 30 mM HEPES-a, preporučeno 20 mM HEPES-a;

- 0,5 do 3 mM prolina, preporučeno 1 mM prolina, i

- 5500 do 7000 mg/L natrijum hlorida, preporučeno 6100 mg/L natrijum hlorida, naznačeno time da ovaj proces obuhvata 1. fazu rasta, 2. fazu rasta i fazu proizvodnje, naznačeno time da se 1. faza rasta obavlja na 37<o>C, druga faza rasta na 35<o>C, a faza proizvodnje na 33<o>C, i naznačeno time da 2. faza rasta traje 1-2 dana.

2) Proces u skladu sa zahtevom 1) gde ova podloga bez sadržaja seruma dodatno sadrži 10 do 20 mg/L fenol crvenog, preporučeno 15 mg/L fenol crvenog.

3) Proces u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom naznačeno time da je ovaj proces perfuzioni proces sa stopom dilucije u rasponu od 1 do 10, preporučeno 1,5 do 7 na dan.

4) Proces u skladu sa zahtevom 3) naznačeno time da se stopa dilucije povećava u prve dve do tri nedelje gajenja ćelijske kulture od inicijalne vrednosti od 1 do 2 na dan, do vrednosti od 7 do 10 na dan.

5) Upotreba podloga za gajenje ćelija bez sadržaja seruma koja sadrži:

- 10 do 30 mM HEPES-a, preporučeno 20 mM HEPES-a;

- 0,5 do 3 mM prolina, preporučeno 1 mM prolina, i

- 5500 do 7000 mg/L natrijum hlorida, preporučeno 6100 mg/L natrijum hlorida, za gajenje CHO ćelija koje proizvode rekombinantni humani interferon beta u procesu koji uključuje 1. fazu rasta, 2. fazu rasta i fazu proizvodnje, naznačeno time da se 1. faza rasta obavlja na 37<o>C, druga faza rasta na 35<o>C, a faza proizvodnje na 33<o>C, i naznačeno time da 2. faza rasta traje 1-2 dana.