RS57626B1 - Hipoalergen - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na mutantne polipeptide koji su korisni kao hipoalergeni. Konkretnije predmetni pronalazak se odnosi na specifične mutantne Bet v 1 polipeptide. Pored toga, pronalazak se odnosi na formulacije vakcina koje obuhvataju takve polipeptide; takođe je opisana upotreba takvih formulacija u vakcinaciji.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Alergije su izazvane imunom reakcijom na najčešće bezopasne proteine, alergene. Alergijske bolesti dostižu epidemijske razmere širom sveta. Više od 25% populacije u industrijalizovanim zemljama boluje od tipa I alergije i taj broj je u stalnom porastu. Alergije na polen breze je veoma čest oblik tipa I alergije. Bet v 1 je glavni alergen polena breze. Više<informacija o Bet v 1 alergenu, njegovim izoalergenima i varijantama, se mogu pronaći na sajtu WHO>www.allergen.org<.>

[0003] Tip I alergije se zasniva na formaciji imunoglobulinskih E (IgE) antitela. Simptomi se pojavljuju kada se alergenski molekul veže za dva IgE antitela vezana za receptore na mastocitu ili bazofilnoj površini i indukuje unakrsno povezivanje IgE-FcεRI kompleksa. Ovo izaziva degranulaciju bioloških medijatora, kao što su histaminski i lipidni medijatori, što dovodi do inflamatornih reakcija i simptoma, kao što je alergijska astma, rinitis, alergija na hranu i kožu, i čak anafilaksija.

[0004] IgE je veliki molekul koji se sastoji od dva identična laka i teška lanca. Postoji pet domena u teškom lancu IgE: VH, Cε1, Cε2, Cε3 i Cε4. Veličina kompletnog IgE molekula je oko 200 kDa. Određene su kristalne strukture Cε2-Cε4 fragmenta vezane za svoj FcεRI receptor i Cε2-Cε4 fragment. (Garman et al., Nature 2000(406):259-266, and Wan et al., Nature Immunology, 2002(3):681-686).

[0005] U poslednjih nekoliko godina, određene su trodimenzionalne strukture za veliki broj različitih alergena. Strukturalno, ovi alergeni značajno variraju, i nije identifikovan zajednički strukturalni motiv koji bi mogao objasniti sposobnost alergena za izazivanje stvaranja IgE antitela. Ipak, postoje istraživanja koja impliciraju da je alergenost ograničena na svega nekoliko proteinskih familija, time doprinoseći dokazu da bi strukturne osobine proteina takođe mogle imati ulogu u alergenosti (Jenkins et al., J Allergy Clin. Immunol. 2005(115):163-170; Raudauer et al., J Allergy

Clin Immunol.2008(121):847-852; Rouvinen et al., PloS ONE 2010(5):e9037).

[0006] Suštinsko pitanje prilikom proučavanja alergenosti uključuje takozvani B-ćelijski epitop, mesto vezivanja IgE antitela alergena. Nažalost, ipak, ovaj B-ćelijski epitop se ne može direktno izvesti iz trodimenzionalne strukture alergena. Dodatno, postoje razlike u epitopima definisanog alergena koji je rekognizovan od strane pojedinačnog IgE pacijenta. Zbog toga su B-ćelijski epitopi traženi korišćenjem različitih tehnika i različitih osnova, kao što je analiziranjem alergenih fragmenata ili peptida, koji reaguju sa poliklonalnim IgE serumskim fondom od alergijskih pacijenata, mutagenezom alergena usmerenom na lokaciju, korišćenjem epitopskih mimika (mimotopa) i studija bioinformatičkog modeliranja. Ipak, za sada, ne postoje opšte mape dominantnih epitopa za bilo koji alergen.

[0007] Sa osvrtom na polen breze, na primer, Holm et al. (The Journal of Immunology 2004 (173): 5258-5267) je proizveo Bet v 1 mutante koji sadrže 4 i 9 tačka mutanata u cilju manipulacije površinskom topologijom u “izabranim oblastima”. Rad ne opisuje kako je ovaj “izbor” napravljen. Mutanti sa četiri aminokiselinske supstitucije su predstavljali tri različite oblasti na molekularnoj površini a mutanti sa devet aminokiselinskih supstitucija su predstavljali pet različitih oblasti na molekularnoj površini. Ovi Bet v 1 mutanti su u nekim slučajevima imali smanjen kapacitet za vezivanje serumskog IgE kod ljudi i za izazivanje ljudskog bazofilnog oslobađanja histamina. Takođe su bili u mogućnosti da indukuju IgG antitela protiv nemutiranog Bet v 1.

[0008] Prijavljeni su dalji modifikovani rekombinantni alergeni:

Međunarodne patentne publikacije WO 02/40676 i WO 03/096869 otkrivaju brojne mutantne forme Bet v 1 alergena polena breze. Ovi mutanti su proizvedeni uvođenjem nasumičnih mutacija na pretpostavljeno IgE mesto vezivanja, na osnovu analize sekvence konzerviranih površinskih struktura Bet v 1 polipeptida. WO 03/096869 otkriva upotrebu četiri primarne mutacije nad različitim “malim grupama” na površini alergena.

[0009] Međunarodna patentna publikacija WO 2007/073907 otkriva Bet v 1 polipeptid koji sadrži tri amino kiselinske supstitucije ili delecije na aminokiselinskim lokacijama 54, 115 ili 123. Ne postoje dokazi da su ovi mutanti smanjili kapacitet oslobađanja histamina.

[0010] Međunarodna patentna publikacija WO 2009/024208 otkriva Bet v mutanta koji ima najmanje četiri mutacije u oblasti amino kiselina 100-125. Ipak, usled mutacija je izgubljena trodimenzionalna struktura polipeptida i nema prijavljene aktivnosti oslobađanja histamina.

[0011] Međunarodna patentna publikacija WO 2008/092992 otkriva metod blokiranja tipa i površinske interakcije alergenskih supstanci modifikovanjem amino kiselinskih ostataka na alergenskim epitopima koji nisu neprekidni, tj, na planarnoj površini sa oblašću 600-900 Å na alergenskoj supstanci i predlaže da se hipoalergenski proteini polena breze mogu pripremati u skladu sa tim.

[0012] Niemi et al., Structure 2007(15): 1413-21, otkriva pristup u potrazi za specifičnim alergenskim epitopima u skladu sa otkrićem Laver et al., Cell 1990(61):553-556, koji navodi da jedini racionalni metod kojim se utvrđuje kompletan epitop bilo kog alergena obuhvata merenje kristalne strukture alergena u kompleksu sa IgE antitelom. Niemi et al. otkriva kristalnu strukturu IgE Fab fragmenta u kompleksu sa β-laktoglobulinom (BLG). Oni takođe pokazuju kako dva IgE/Fab molekula vezuju dimerni BLG i da je IgE epitop različit u odnosu na poznate strukture IgG epitopa, time što je “ravna” površina koja se nalazi u regionu β strane.

[0013] Rouvinen et al., PloS ONE 2010(5):e9037 je ispitivao ulogu dimeričnih struktura alergena korišćenjem bioinformatskih metoda kombinovanih sa nativnom masenom spektrometrijom. (Electrospray Ionization Fourier Transform Ion Cyclotron Mass Spectrometry, ESI FT-ICR-MS). ESI-MS merenja 55 poznatih kristalnih struktura alergena su pokazala da 80% njih postoji u simetričnim dimerima ili oligomerima u kristalima i da su većina prolazni dimeri koji se formiraju pri visokim proteinskim koncentracijama. Moguća povezanost između dimerične strukture i alergenosti je proučavana sa rekombinantnim alergenom iz kravljeg mleka, β-laktoglobulin (rBos d 5 B), koji se javlja kao dimer, i njegovog mutantnog H146P, koji se uglavnom javlja kao monomer. Primećen je nešto smanjen kapacitet oslobađanja histamina sa monomernim rBos d 5 B mutantnim H146P u poređenju sa nativnim Bos d 5 B i rekombinantnim Bos d 5 B. Iako autori zaključuju da bi dimerizacija mogla biti vrlo česta i suštinska osobina alergena i generalno sugerišu da bi priprema čisto monomernih varijanti alergena mogla otvoriti nove mogućnosti za specifičnu imunoterapiju, krajnja uloga strukturnih osobina alergenosti ostaje nepoznata. Ne mogu se izvući direktni zaključci iz in vitro kristalne analize o tome kako se molekuli alergena ponašaju u ljuskom telu, na primer in vivo.

[0014] U današnje vreme trend u lečenju svih alergijskih simptoma je prema aktivnoj indukciji tolerancije korišćenjem alergenski-specifičnih desenzitizacija umesto izbegavanja alergena, što često nije moguće, ili samo tretiranjem simptoma. Trenutna desenzitizaciona terapija se zasniva na alergenima prečišćenim iz prirodnih izvora, pri čemu varijacije od serije do serije mogu dovesti do problema povezanih sa pronalaženjem i održavanjem prave doze i efikasnosti lečenja. Ovi problemi mogu dovesti do potencijalnog rizika od anafilaktičkih neželjenih efekata i senzibilizacije na nove alergene.

[0015] Korišćene rekombinantnih alergena za desenzitivisanje bi uklonilo nedostatke povezane sa varijacijama od serije do serije, i prvi rekombinantni alergeni su u kliničkim ispitivanjima (Valenta et al., Annu Rev Immunol 2010(28):211-41). Ostaje da se vidi efikanost takvih alergena na kliničkom lečenju.

[0016] Postoji prepoznata i velika potreba za sigurnim i efikasnim vakcinama i terapijskim proizvodima kako bi se zadovoljio sve veći zdravstveni problem alergije. Tržište sigurnih i efikasnih terapija alergije je trenutno nerazvijeno.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0017] Predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantni hipoalergeni Bet v 1 polipeptid polena breze, koji se zasniva na divljem tipu šablona aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEK ID BR: 3 ili bilo kom njegovom drugom Bet v 1 divljem tipu izoforme izabranom iz grupe koja se sastoji od sekvencionih identifikacionih brojeva: 4-38, pomenuti polipeptid obuhvata

(1) prvu aminokiselinsku supstituciju na poziciji E101, pri čemu prva aminokiselinska supstitucija je E101K, i

(2) drugo aminokiselinsku supstituciju na poziciji N28, pri čemu druga aminokiselinska supstitucija je N28K.

[0018] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na hipoalergeni polipeptid koji je definisan u prethodnom tekstu za korišćenje kao vakcina za desenzitizovanje protiv polena breze.

[0019] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju vakcine koja sadrži najmanje jedan hipoalergeni polipeptid koji je definisan u prethodnom tekstu i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ađuvans. U jednoj izvedbi predmetnog pronalaska pomenuta vakcina je za sublingvalnu primenu.

[0020] Hipoalergeni polipeptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom imaju kapacitet oslobađanja histamina koji je najmanje 20 puta umanjen u poređenju sa kapacitetom oslobađanja histamina Bet v 1 divljeg tipa. U jednoj izvedbi, polipeptidi imaju kapacitet oslobađanja histamina koji je smanjen najmanje 100 puta.

KRATAK OPIS SLIKA

[0021] U daljem tekstu pronalazak će biti detaljnije opisan pomoću poželjnih izvedbi uz pozivanje na priložene crteže, kod kojih

Slika 1 ilustruje putativne IgE epitopske ostatke Bet v1 (ostaci crveni) i putativne ostatke uključene u dimerizaciju Bet v 1(ostaci ljubičasti) dobijene u Primeru 1;

Slika 2 je šematska prezentacija bakterijskih ekspresionih jedinica za proizvodnju rekombinantnih alergena, pri čemu Ptac je promoter, PelB je signalna sekvenca povezana za kodirajući region rekombinantnih alergena a zvezde ilustruju aminokiselinske supstitucione lokacije;

Slika 3 je poravnavanje aminokiselinske sekvence od 36 izoforma Bet v 1;

Slika 4 prikazuje sekvence nukleinske kiseline Bet v 1 divljeg tipa polipeptida (A, SEK ID BR: 1) i N28K-E101K polipeptida (B, SEK ID BR: 2) koje su korišćene u Primeru 2;

Slika 5 prikazuje kompetitivnu inhibiciju serumskog IgE koji se vezuje za Bet v 1 sa rekombinantnim Bet v 1 i Bet v 1 N28K-E101K polipeptidima; i

Slika 6 prikazuje rezultate eksperimenata oslobađanja histamina sa rekombinantnim Bet v 1 i Bet v 1 N28K-E101K polipeptidima.

Slika 7 prikazuje nativni ESI FT-ICR maseni spektar rekombinantnog Bet v 1 divljeg tipa i rekombinantnog Bet v 1 mutantnog N28K-E101K pri koncentracijama od 3 mM.

DETALJAN OPIS

[0022] U sledećem opisu, korišćeni su primeri i patentni zahtevi i troslovni i jednoslovni kodovi za amino kiseline. Videti, na primer, IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature. Nomenclature and Symbolism

for Amino Acids and Peptides. Eur. J. Biochem.138:9-37(1984).

[0023] Denominacija aminokiselinskih lokacija u polipeptidima u skladu sa predmetnim pronalaskom je ilustrovana kao što sledi: N28 znači da postoji asparaginski ostatak na poziciji 28, pri čemu N28K znači da je asparaginski ostatak na poziciji 28 zamenjen sa lizinskim ostatkom. U skladu sa tim, E101 znači da postoji ostatak glutaminske kiseline na poziciji 101, pri čemu E101K znači da je ostatak glutaminske kiseline na poziciji 101 zamenjen sa lizinskim ostatkom, itd.

[0024] Alergija na polen breze je veoma uobičajen oblik alergije i polen bele breze (Bela breza) je jedan od glavnih uzroka alergijskih reakcija tipa I u Evropi i Severnoj Americi. Procenjuje se da oko 10-15% populacije može patiti od alergije na polen breze. Pored toga, drugi alergeni, kao što su jabučiji alergeni, unakrsno reaguju sa specifičnim IgE polena breze izazivajući alergijske reakcije čak i kada subjekat nije izložen polenu.

[0025] Bet v 1 je glavni alergen polena breze i odgovoran je za vezivanje IgE kod više od 95% alergijskih subjekata polena breze. Bet v 1 je protein koji ima molekularnu težinu od 17 kD. Aminokiselinska sekvenca Bet v 1 divljeg tipa je data u SEK ID<BR: 3. Sajt alergena WHO (>www.allergen.org<) navodi trideset i šest (36) izoformi Bet v 1, koji su sekventno poravnati na>slici 3. Poravnanje pokazuje da je Bet v 1 visoko konzerviran. Šablon izoforma korišćen kao Bet v 1 divlji tip u predmetnom pronalasku je od izoforma Bet v 1a (Bet v 1.0101), ali bilo koji od ovih izoalergena može biti korišćen, po potrebi, kako bi se obezbedila hipoalergenska polipeptidna varijanta u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0026] Aminokiselinske sekvence svih 36 Bet v 1 izoforma su otkrivene u listi sekvenci, kao što sledi: 1.0101 (SEK ID BR: 3), 1.0102 (SEK ID BR: 4), 1.0103 (SEK ID BR: 5), 1.2501 (SEK ID BR: 6), 1.1501 (SEK ID BR: 7), 1.1502 (SEK ID BR: 8), 1.2801 (SEK ID BR: 9), 1.3001 (SEK ID BR: 10), 1.2901 (SEK ID BR: 11), 1.2301 (SEK ID BR: 12), 1.0501 (SEK ID BR: 13), 1.0601 (SEK ID BR: 14), 1.0602 (SEK ID BR: 15), 1.0801 (SEK ID BR: 16), 1.1701 (SEK ID BR: 17), 1.0401 (SEK ID BR: 18), 1.0402 (SEK ID BR: 19), 1.0701 (SEK ID BR: 20), 1.1001 (SEK ID BR: 21), 1.2401 (SEK ID BR: 22), 1.2601 (SEK ID BR: 23), 1.2701 (SEK ID BR: 24), 1.2201 (SEK ID BR: 25), 1.0201 (SEK ID BR: 26), 1.0901 (SEK ID BR: 27), 1.0301 (SEK ID BR: 28), 1.1401 (SEK ID BR: 29), 1.1402 (SEK ID BR: 30), 1.1901 (SEK ID BR: 31), 1.2001 (SEK ID BR: 32), 1.1801 (SEK ID BR: 33), 1.1101 (SEK ID BR: 34), 1.1201 (SEK ID BR: 35), 1.1601 (SEK ID BR: 36), 1.2101 (SEK ID BR: 37), and 1.1301 (SEK ID BR: 38), respektivno.

[0027] Izoforme Bet v 1 uključuju varijante koje imaju različit alergenski potencijal. Izoforme Bet v 1 su najmanje 94% identične sa Bet v 1 divlji tip aminokiselinskom sekvencom SEK ID BR: 3. Na primer, izoformi Bet v 1.0401sa 96% identičnosti aminokiselinskog ostatka i Bet 1.1001 sa 94% identičnosti ostatka sa Bet v 1.0101 su identifikovani kao prirodni hipoalergeni, zato što su bili slabi induktori oslobađanja medijatora. U poređenju sa Bet v 1.0101, Bet v 1.1001 sadrži, na primer, N28K mutaciju. Takođe se smatraju da ispunjavaju kriterijume za predstavljanje odličnih vakcinskih kandidata. (Wag-ner et al., J. Allergy Clin Immunol 2008;121:725-735). Ipak, nisu dostupni nikakvi naučni, eksperimentalni ili klinički podaci.

[0028] Predmetni pronalazak obezbeđuje mutirane hipoalergenske polipeptidne varijante Bet v 1, koje su korisne kao vakcine za imuniziranje subjekata kojima je to potrebno i na taj način sprečava i/ili ublažava alergiju i desenzitivizaciju subjekata koji pate od alergije na polen breze.

[0029] Rekombinantni Bet v 1 polipeptidi polena breze u skladu sa predmetnim pronalaskom imaju divlji tip aminokiselinske sekvence, ali sadrže mutacije na izabranim aminokiselinskim pozicijama kako bi se umanjila ili u potpunosti smanjila njihova sposobnost da indukuju proizvodnju IgE ali da sadže svoj kapacitet za indukovanje proizvodnje zaštitnih IgG antitela, tj, oni su hipoalergeni.

[0030] Konkretno, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantni hipoalergenski Bet v 1 polipeptid polena breze kao što je definisano u patentnom zahtevu 1. Takođe je otkriven rekombinantni hipoalergenski Bet v 1 polipeptid polena breze na bazi šablona divljeg tipa aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEK ID BR: 3 ili bilo kom njegovom izoformu Bet v 1 divljeg tipa, pomenuti polipeptid ili prirodno ili mutacijom obuhvata

(1) najmanje jednu prvu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka E101, K80, N82, S84, S99, S117 i K119 i

(2) najmanje jednu drugu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka N28, D25, N43, G46, N47 i Y158.

[0031] U jednoj izvedbi, polipeptid predmetnog pronalaska ima šablon divljeg tipa aminokiselinske sekvence kao što je naznačeno u SEK ID BR: 3. U sledećoj izvedbi, polipeptid predmetnog pronalaska ima šablon divljeg tipa aminokiselinske sekvence izabranog iz grupe koja se sastoji od sekvencionih identifikacionih brojeva: 4-38.

[0032] U jednoj izvedbi pronalaska, rekombinantni hipoalergenski Bet v 1 polipeptid polena breze je predstavljen aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEK ID BR: 39, pri čemu aminokiselinska supstitucija na poziciji 28 je K i aminokiselinska supstitucija na poziciji 101 je K. Sekvencioni identifikacioni broj: 39 otkriva Bet 1 v polipeptidnu sekvencu sa pozicijama za aminokiselinske supstitucije (aminokiselinske pozicije 25, 28, 43, 46, 47, 80, 82, 84, 99, 101, 117, 119, 158) i takođe otkriva amino kiseline divljeg tipa na ovim pozicijama.

[0033] Bilo koja kombinacija prvih i drugih supstitucija na bilo kojim prikazanim pozicijama rezultira hipoalergenskim polipeptidom. U jednom aspektu otkrića, polipeptid obuhvata sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvencionih identifikacionih brojeva: 41-47, i najmanje jedne druge aminokiselinske supstitucije na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka N28, D25, N43, G46, N47 i Y158, ili njihovog izoforma. Poželjno, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od sekvencionih identifikacionih brojeva: 41-47, i najmanje jednu drugu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka N28, D25, N43, G46, N47 i Y158, ili njihovog izoforma. U drugoj izvedbi pronalaska, polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 41, pri čemu amino kiselina 101 je K, SEK ID BR: 42, pri čemu amino kiselina 80 je Y, SEK ID BR: 43, pri čemu amino kiselina 82 je K, SEK ID BR: 44, pri čemu amino kiselina 84 je K, SEK ID BR: 45, pri čemu amino kiselina 99 je K, SEK ID BR: 46, pri čemu amino kiselina 117 je K i SEK ID BR: 47, pri čemu amino kiselina 119 je E; i najmanje jednu drugu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka N28, D25, N43, G46, N47 i Y158. Poželjno polipeptid ima sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 41, pri čemu amino kiselina 101 je K, SEK ID BR: 42, pri čemu amino kiselina 80 je Y, SEK ID BR: 43, pri čemu amino kiselina 82 je K, SEK ID BR: 44, pri čemu amino kiselina 84 je K, SEK ID BR: 45, pri čemu amino kiselina 99 je K, SEK ID BR: 46, pri čemu amino kiselina 117 je K i SEK ID BR: 47, pri čemu amino kiselina 119 je E; i najmanje jednu drugu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka N28, D25, N43, G46, N47 i Y158. Sekvencioni identifikacioni broj: 41 otkriva Bet v 1 polipeptidnu sekvencu, pri čemu amino kiselina na poziciji 101 je supstitucija a nije divlji tip amino kiseline E. Slično, SEK ID BRevi: 42-47 prikazuju Bet v 1 polipeptide, pri čemu su amino kiseline na pozicijama 80, 82, 84, 99, 117 i 119, respektivno, supstitucije a nisu amino kiseline divljeg tipa.

[0034] U jednom aspektu otkrića, pomenuta najmanje jedna prva aminokiselinska supstitucija je na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka E101 i S99, i pomenuta najmanje jedna druga aminokiselinska supstitucija je na poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka N28 i D25.

[0035] U još jednoj poželjnoj izvedbi pronalaska pomenuta najmanje jedna prva aminokiselinska supstitucija je na poziciji E101 a pomenuta najmanje jedna druga aminokiselinska supstitucija je na poziciji N28. U jednoj poželjnoj izvedbi pronalaska, rekombinantni hipoalergeni Bet v 1 polipeptid polena breze je predstavljen aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEK ID BR: 40. Sekvencioni identifikacioni broj: 40 prikazuje Bet v 1 polipeptidnu sekvencu sa supstitucijama na pozicijama 28 i 101, dok su amino kiseline na ovim pozicijama lizini (K).

[0036] Hipoalergene polipeptidne varijante predmetnog otkrića obuhvataju takođe varijante, koje sadrže više od jedne prve i druge supstitucije. Pojmovi “najmanje jedna prva supstitucija” i “najmanje jedna druga supstitucija” znače da pomenute prve i druge supstitucije mogu svaka obuhvatati jednu, dve, tri ili četiri ili više supstitucija, i bilo koje kombinacije prve i druge supstitucije su moguće, sve dok je zadržana sposobnost hipoalergenog Bet v 1 polipeptida da indukuje odgovor zaštitnog antitela. Prema tome u jednom poželjnom aspektu otkrića prva aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji E101, a pomenute druge aminokiselinske supstitucije su na pozicijama N28 i D25 ili na pozicijama N28, D25 i Y158. U drugom poželjnom aspektu otkrića prva aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na pozicijama E101 i S99 a pomenuta druga aminokiselinska supstitucija je na poziciji N28. U još jednom poželjnom aspektu otkrića pomenute prve aminokiselinske supstitucije su na pozicijama E101 i S99 a pomenute druge aminokiselinske supstitucije su na pozicijama N28 i D25.

[0037] U sledećem poželjnom aspektu otkrića, supstitucije Bet v 1 su barem E101 i N28, E101 i D25, E101 i N43, E101 i G46, E101 i N47, E101 i Y158, K80 i N28, K80 i D25, K80 i N43, K80 i G46, K80 i N47, K80 i Y158, N82 i N28, N82 i D25, N82 i N43, N82 i G46, N82 i N47, N82 i Y158, S84 i N28, S84 i D25, S84 i N43, S84 i G46, S84 i N47, S84 i Y158, S99 i N28, S99 i D25, S99 i N43, S99 i G46, S99 i N47, S99 i Y158, S117 i N28, S117 i D25, S117 i N43, S117 i G46, S117 i N47, S117 i Y158, K119 i N28, K119 i D25, K119 i N43, K119 i G46, K119 i N47 ili K119 i Y158. U sledećem poželjnom aspektu otkrića, supstitucije su jedne od ovih kombinacija.

[0038] U jednoj poželjnoj izvedbi pronalaska, ima ukupno najmanje dve, tri ili četiri aminokiselinske supstitucije. Poželjno, polipeptid pronalaska ima dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset supstitucija. Poželjnije, polipeptid ima dve, tri ili četiri supstitucije. Jedna od prednosti pronalaska je da je samo mali broj supstitucija (najmanje dve) potreban za željena dejstva.

[0039] Polipeptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom su hipoalergeni i pokazuju kapacitet oslobađanja histamina koji je najmanje 20 puta, poželjno 100 puta, redukovan u poređenju sa kapacitetom oslobađanja histamina odgovarajućeg nemutiranog Bet v 1 divljeg tipa.

[0040] Hipoalergeni polipeptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom su korisni kao vakcine protiv alergije, posebno alergije na polen breze. Vakcine koje sadrže polipeptide u skladu sa predmetnim pronalaskom su formulisane prema standardnim farmaceutskim procedurama koje su poznate stručnjacima. Vakcine u skladu sa predmetnim pronalaskom su posebno pogodne za sublingvalnu primenu.

[0041] Hipoalergene varijante u skladu sa predmetnim pronalaskom su dobijene mutiranjem izabranih specifičnih aminokiselinskih ostataka, na primer, ostataka sa glomaznim bočnim lancima, lociranim na epitopnim površinama Bet v 1. Izabrani aminokiselinski ostaci su oni, čiji bočni lanci pokazuju spolja ka rastvaraču. Mutiranje takvih ostataka dovodi do minimalne promene na bazičnoj trodimenzionalnoj strukturi alergena. Poželjno, ipak, mutageneza modifikuje površinu epitopa do te mere da je vezivanje i unakrsno povezivanje IgE antitela na površini mastocita sprečeno ili jako smanjeno, dok je celokupna struktura varijante još uvek veoma slična onoj kod alergena divljeg tipa.Takva mutacija favorizuje indukciju IgG i drugih protektivnih antitela, koja imaju sposobnost vezivanja za alergen divljeg tipa kao i za mutirani varijantni alergen. Efekat mutacije je utvrđen kao niži afinitet IgE antitela specifičnog za alergen prema modifikovanom Bet v 1 alergenu. Poželjno mutacija smanjuje afinitet specifičnog IgE antitela najmanje deset puta, poželjno najmanje 20 puta i još poželjnije 20 do 100 puta a najpoželjnije više od 100 puta. Nastali modifikovan Bet v 1alergen se može koristiti za izazivanje tolerancije protiv polena breze kod alergijskih pacijenata.

[0042] Hipoalergenski varijantni polipeptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom, korisni kod alergen-specifične desenzitizacije, poseduju dve osobine: 1) sposobnost da snažno smanje reakciju posredovanu sa IgE; i (2) zadržan divlji tip 3D savijanja i time mogućnost indukovanja proizvodnje IgG-antitela sposobnih za vezivanje alergena divljeg tipa.

[0043] Poznavanje strukture IgE vezujućeg epitopa bi u velikoj meri pojednostavilo projektovanje hipoalergenskih varijanti, kao što je pomenuto u prethodnom tekstu. Ipak, struktura Bet v 1 kompleksovana sa IgE antitelom nažalost nije dostupna. Nije poznato koliko postoji razlika u epitopima definisanog alergena rekognizovanog od strane pojedinačnog pacijentovog IgE. Upotreba peptida u skeniranju epitopa je takođe nepouzdana i zapravo korisna samo kod skeniranja linearnih epitopa (Niemi et al., Structure 2007(15): 1413-21). Konformacija kao i fizička svojstva, na primer, rastvorljivost jednog peptida se može značajno razlikovati od onih od odgovarajućeg dela polipeptidnog lanca koji formira deo nativne proteinske strukture. Iz tog razloga, kreacija mutantih Bet v 1 alergena se zasnivala na analizi molekularne površine korišćenjem molekularnih grafičkih programa, kao što je PyMOL, kako bi se objasnila struktura epitopa i testirali potencijalni pogodci pripremanjem i testiranjem mutanata. Dodatno, sposobnost dimerizacije Bet v 1 je uzeta u obzir u projektovanju.

[0044] Kristalna struktura Bet v 1 (šifra u proteinskoj banci podataka 1BV1) je korišćena kako bi se definisala kvartarna struktura Bet v 1. PDBePISA internet server je korišćen za stvaranje koordinata za simetrični dimer Bet v 1. Procenjeno je da je razdaljina između IgE antitela u grupi na površini mastocita oko 5 nm (Knol, EF; Mol.Nutr.Res. 50(2006):620). Proučavanjem molekularne površine Bet v 1 dimera oko dvostruke simetrijske ose na udaljenosti od 2,5 nm od simetrijske ose, identifikovana su dva putativna epitopa na molekularnoj površini Bet v 1 (Slika 1).

[0045] Putativni epitop je sačinjen od aminokiselinskih ostataka V2-E6; R70-D75; N78-S84; E96-K103; i K115- H121, pri čemu monomer-monomer interfejsa Bet v 1 dimera sačinjen od aminokiselinskih ostataka K20-K32; S39-P50;

V74-H76; i D156-N159.

[0046] Ovi putativni epitopi su pažljivo analizirani, kako bi se identifikovali aminokiselinski ostaci, koji bi mogli poslužiti kao tačke mutacije. Poželjne tačke mutacija bi trebalo da poseduju sposobnost da umanje vezivanje alergena za IgE antitela ali da ipak održe trodimenzionalnu strukturu alergena divljeg tipa. Putativni epitop uključuje aminokiselinske ostatke K80, N82, S84, S99, E101, S117, i K119. Monomer-monomer interfejs uključuje ostatke D25, N28, N43, G46, N47, i Y158. Ostaci E101 i N28 su smatrani kao najinteresantnije tačke mutacije, s obzirom na to da se nalaze u centru putativnog epitopa i na strateškoj poziciji na monomer-monomer interfejsu, respektivno. U predmetnom pronalasku prva aminokiselinska supstitucija(e) je(su) u oblasti epitopa a druga aminokiselinska supstitucija(e) je(su) u monomer-monomer interfejsu.

[0047] Ova dva ostatka su visoko konzervirana u svih 36 izoformi Bet v 1. Ne postoji prirodna varijacija u ostatku 101. Prirodne varijacije su pronađene u ostatku 28, koji postoji kao asparagin (u 31 izoformi), lizin (u 2 izoforme) ili tirozinu (u 3 izoforme). Ostaci D25, N43, G46, N47, K80, S84, K119, i Y158 su konzervirani, pri čemu ostaci N82, S99 i S117 blago variraju, kao što je prikazano na Slici 3.

[0048] Sledeći korak je bio odabrati odgovarajuću mutaciju za svaki ostatak. Kao primer, S99 je mali hidrofilni i neutralni aminokiselinski ostatak. Mutacija koja bi ometala vezivanje IgE bi stoga bila “suprotne” prirode, tj, velika i/ili naelektrisana, na primer Ser u Liz, Arg, Asp, Tir, i Val. Slično tome, E101 i N28 se mogu zameniti sa ostatkom sa suprotnim naelektrisanjem (Liz, Arg) ili sa hidrofobnim ostatkom (Tir, Ile ili Trp). Supstitucije kod ostataka D25, N43, G46, N47, K80, N82, S84, S117 i K119 se mogu projektovati na odgovarajući način. Tabela 1 prikazuje potencijalne supstitucije, što bi dalo Bet v 1 hipoalergenske mutante u skladu sa predmetnim otkrićem navedenim u SEK ID BR: 39.

Tabela 1. Mutanti Bet v 1 wt

[0049] Modifikovani Bet v 1 hipoalergeni su u skladu sa predmetnim pronalaskom korisni kao vakcine. Konvencionalna alergijska vakcinacija se obično sprovodi kao višestruke subkutane imunizacije tokom dužeg vremenskog perioda, na primer, jedne do dve godine. Kako bi se minimalizovao rizik od anafilaktičkih reakcija, imunizaciona šema se primenjuje u dve faze, početna faza povećavanja doze i faza održavanja. Faza povećavanja doze počinje sa minutnim dozama, koje se zatim lagano povećavaju, obično tokom perioda od 16 nedelja sve dok se ne dostigne doza održavanja. Faza održavanja obično obuhvata ubrizgavanja svake šeste nedelje. Takav vakcinacioni režim je naporan za pacijenta jer zahteva dugoročnu obavezu. Štaviše, značajno utiče na stabilnost vakcine, u smislu sigurnosti i reproduktivnosti. Pacijenti moraju biti strogo nadgledani, često hospitalizovani, nakon svake injekcije.

[0050] Hipoalergenski kapacitet oslobađanja histamina u skladu sa predmetnim pronalaskom je suštinski smanjen, faza povećavanja doze bi mogla biti značajno kraća u odnosu na onu kod konvencionalne alergijske vakcinacije ili u najboljem slučaju ne bi bila potrebna šema doziranja. Modifikovani, rekombinantni hipoalergeni u skladu sa predmetnim pronalaskom ne predstavljaju bilo koju varijaciju od seerije do serije. Samim tim, nije potrebno blisko praćenje doznog odgovora i mogućih neželjenih reakcija.

[0051] Shodno tome, predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu hipoalergenih Bet v 1 polipeptida, koji su detaljno opisani u prethodnom tekstu, kao vakcine i na vakcinsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedan rekombinantni hipoalergeni Bet v 1 polipeptid pronalaska i najmanje jedan farmaceutsko prihvatljivi rastvarač ili adjuvans, kao što je salin, bafer, aluminijum hidroksid i slični. Predmetno otkriće se dalje odnosi na metod vakcinisanja protiv alergije na polen breze, pomenuti metod obuhvata primenu nad subjektom, koji boluje od alergije na polen breze, hipoalergenog polipeptida ili vakcinske kompozicije kao što je definisano u prethodnom tekstu u količini i korišćenjem vakcinacionog rasporeda efikasnog za indukovanje proizvodnje zaštitnih antitela protiv polena breze.

[0052] “Subjekat” vakcinacije je čovek (odrasla osoba, dete ili adolescent) ili životinja. Poželjno, životinja je bilo koja domaća životinja kao što je pas, mačka, konj, krava, ovca ili svinja.

[0053] Na primer, prema predmetnom pronalasku hipoalergen je formulisan kao konvencionalne vakcinske formulacije, kao što su aluminijum-hidroksid-adsorbirane vakcine, korišćenjem metoda koji su dobro poznati nauci (Niederberger et al., PNAS, 101(2):14677-82, 2004). Alternativno i poželjno, međutim, hipoalergeni u skladu sa predmetnim pronalaskom se mogu primenjivati putem drugih pogodnih puteva i šema vakcinacije, kao što je oromukozna ili sublingvalna primena, korišćenjem metoda i formulacija koje su poznate u nauci. Videti, na primer, Evropsku patentnu publikaciju EP 1812059.

[0054] Modifikovani Bet v 1 hipoalergeni bi mogli biti korišćeni u koncentracijama od, na primer, mg/ml, 5 mg/ml ili 50 mg/ml. Primerne doze mogu varirati između 0.05 mg i 2 mg tokom moguće faze povećavanja doze i između 3-15 mg tokom faze održavanja, poželjno 5-15 mg, najpoželjnije oko 10 mg, u zavisnosti od težine alergije, uzrasta i medicinske istorije pacijenta. Odgovarajuća doza se lako određuje od strane kliničara koji je upoznat sa lečenjem i sprečavanjem alergije.

[0055] Međunarodna patentna publikacija WO04/047794 otkriva čvrst brzo-disperzujuć dozni oblik za sublingvalnu primenu alergijske vakcine, a US patentna aplikacija 2009/0297564 otkriva formulaciju tečne vakcine za oromukozalnu primenu.

[0056] Modifikovani Bet v 1 hipoalergeni u skladu sa predmetnim pronalaskom su naročito pogodni za sublingvalnu primenu korišćenjem sublingvalnih kapi. Za ovu namenu hipoalergenski polipeptidi su obezbeđeni u salinu. Bezbedni i efikasni dozni opseg za primenu polipeptida, kao i režim doziranja sposoban da izazove željeni imuni odgovor je utvrđen tokom kliničkog razvoja vakcinskih kandidata u skladu sa predmetnim pronalaskom, upotrebom metoda i šema koje su poznate u nauci.

[0057] Maksimalna tolerisana pojedinačna doza hipoalergena u skladu sa predmetnim pronalaskom je utvrđena u ispitivanju kod alergijskih muškim i ženskih subjekata, koji su izloženi povećavajućim sublingvalnim dozama. Kada je maksimalna tolerisana doza predefinisane doze dostignuta, studija je prilagođena studiji variranja doze sa dnevnim doziranjem, gde se nivoi doze razlikuju sa faktorom 2 do 4. Početna doza je u opsegu 10-100 mg, a ispitivanje obezbeđuje makismalnu tolerisanu sublingvalnu dozu, koja može biti do 20 mg.

[0058] Nakon toga su proučavane dozne eksalacije i raspon doziranja preko širokog opsega doziranja koji se primenjuje dnevno ili nedeljno.Bezbednost vakcinacionog doznog opsega je preliminarno testirana sa Skin Prick testom pre primenjivanja višestrukih doza. Ova ispitivanja pružaju primarno imunološke parametre, a sekundarno, eventualnu efikasnost nakon izazova sa polenom breze.

[0059] Hipoalergenske polipeptidne vakcine u skladu sa pronalaskom bi trebalo da izazovu T-ćelijski odgovor uočljiv kao promena iz TH2- u TH1 tip. Proizvodnja IgG antitela bi trebala da bude dokaziva pre otpočinjanja testiranja alergenskog izazova.

[0060] Konačno, studija kod alergijskih pacijenata je sprovedena, kao duplo zasenčeno, randomizovana placebo kontrolisana desenzitizaciona studija kod alergijskih muških i ženskih subjekata izloženih brojnim sublingvalnim dozama tokom 3-6 meseci, uz inicijalno praćenje za 12 meseci. Subjekti će biti podvrgnuti izazovu alergena pre početka ispitivanja kao i na svakih šest meseci nakon toga na način duplog zasenčenja.

[0061] Studija će prikazati statistički i klinički značajne razlike između grupa koje primaju placebo i hipoalergensku vakcinu u skladu sa predmetnim pronalaskom, kada su podvrgnuti izazovu nativnog alergena.

PRIMERI

[0062] Dati su sledeći primeri.

Primer 1. Projektovanje Bet v 1 mutacija

[0063] Cilj u konstrukciji hipoalergena je da se dođe do mutantnog alergena čija je sposobnost da vezuje i unakrsno spaja IgE antitela na površini mastocita značajno smanjena ali koji i dalje održava veoma sličnu strukturu kao alergen divljeg tipa. To bi favorizovalo indukciju IgG i drugih antitela koja bi imala sposobnost da se vezuju kako za alergen divljeg tipa tako i za mutantni alergen.

[0064] Znanje o IgE epitopu bi u velikoj meri pojednostavilo projektovanje. Ipak, struktura Bet v 1 kompleksovana sa IgE antitelom nije dostupna. Upotreba peptida u skeniranju epitopa je takođe nepouzdana (Niemi et al., Structure (15): 1413-21, 2007). Jedini metod za predlaganje epitopa jeste proučavanje molekularne površine Bet v 1 alergena i testiranje mogućeg pogotka pripremanjem mutanata. Prvo, identifikovali smo putativni epitop (Slika 1) na molekularnoj površini na Bet v 1. Drugo, izabrali smo takve ostatke na ovom putativnom epitopu koji će kao mutirani održavati trodimenzionalnu strukturu sličnu alergenu divljeg tipa a uz to još uvek imati sposobnost da smanje vezivanje za IgE antitela. Putativni epitop uključuje aminokiselinske ostatke K80, N82, S84, S99, E101, S117 i K119.

[0065] Treći korak je izabrati mutaciju za svaki ostatak. Kao primer, S99 je mali hidrofilni i neutralni ostatak, serin. Mutacija koja bi ometala IgE vezivanje bi time bila “suprotna”, tj, velika i/ili naelektrisana, na primer S99K (serin u lizin), S99R (serin u arginin), S99D (serin u asparaginsku kiselinu), S99Y (serin u tirozin) i S99V (serin u valin). U slučaju E101, mutacije koje ometaju IgE vezivanje bi mogle uključiti korišćenje ostataka sa suprotnim naelektrisanjem (Liz, Arg) ili korišćenje hidrofobnih ostataka (Tir, Ile, Trp).

[0066] Najzad, za uvođenje karakteristike zabranjivanja dimerizacije u polipeptidnim varijantama monomera pronalaska, korišćeno je mutaciono projektovanje, zasnovano na kristalnoj strukturi Bet v 1 (PDB šifra 1BV1). Model za Bet v 1 dimer je napravljen sa PISA serverom. Monomer-monomer interfejs je izučavan upotrebom molekularnog grafičkog programa. Mutanti su projektovani na ovom interfejsu korišćenjem istog principa kao što je korišćeno kod epitopnih mutanata. Kao primer, N28 na monomer-monomer interfejsu je hidrofilni ostatak srednje veličine. Mutacija, koja ometa formaciju dimera, bi stoga bila sa veoma velikim naelektrisanjem (lizin, arginin) ili hidrofobni ostatak (tirozin, izoleuzin, triptofan).

Primer 2. Kloniranje rekombinantnih Bet v 1 molekula

[0067] Kako bi se proizveo divlji tip (wt) i mutant rekombinantnih Bet v 1 molekula (rBet v 1) cDNK koje kodiraju ove određene proteine su klonirane u bakterijski ekspresioni plazmid (Slika 2). Prvo, rBet v 1 cDNK projektovane u Primeru 1, sa kodonskom optimizacijom za proizvodnju Escherichia coli u vektoru pUC57 (divlji tip i N28KE101K) su naručeni od GenScript Corporation (USA). cDNK koje su sadržale Ncol restrikcionu lokaciju na 5’kraju i HindIII na 3’ kraju. cDNK su klonirane kao NcoI-HindIII fragmenti u bakterijski ekspresioni vektor pKKtac koji kodira Ervinia carotovora’s pektatna lijaza (pelB) signalnu sekvencu (Takkinen et al., Protein Eng. (4): 837-841, 1991) i ekspresioni plazmidi su transformisani u E. coli XL-1 plavi lanac. DNK sekvence od rBet v 1 i N28K-E101K mutanta su verifikovane sa DNK sekvenciranjem (ABI 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) i ovde su prikazane kao SEK ID BRevi: 1-2.

Primer 3. Proizvodnja rekombinantnih Bet v 1 molekula

[0068] Ekspresioni vektor rBet v 1 divljeg tipa je transformisan u E. coli BL21 DE lanac a ekspresioni vektor Bet v 1 N28K-E101K mutanta u E. coli RV308 lanac radi bakterijske ekspresije. Pojedinačne kolonije rBet v 1 wt i Bet v 1 N28K-E101K mutanta su inokulisane u 5 ml SB ili TB, 100mg/ml ampicilina i 1% glukoze, respektivno, i kultivisane tokom 16 sati na 37 °C uz 220 rpm trešenja. Kultivacije su razređene 1:50 u 3 x 300 ml SB ili TB sa 100mg/ml

ampicilina i kultivisane na 37°C sve dok OD600 nije dostiglo 4. Proteinske ekspresije su indukovane dodavanjem IPTG finalnoj koncentraciji od 1mM i ćelije su kultivisane tokom 16 sati na sobnoj temperaturi uz 170 rpm trešenje. Ćelije su sakupljane centrifugacijom tokom 15 minuta pri 5000g na 4°C i periplazmična frakcija ćelija je izolovana osmoza-šok metodom opisanom od strane Boer et al. (Protein Expression & Purification, 2007(51): 216-226). Ćelijski pelet ekvivalenta 900 ml kulture je ponovo suspendovan u 300ml, 30mM Tris/HCI, 20 % sukroze, pH 8,0, i 1mM EDTA i inkubiran tokom 20 minuta pod uslovima trešenja na ledu. Suspenzija je centrifugirana tokom 20 minuta pri 8000g na 4°C. Nakon toga, pelet je ponovo suspendovan u 75ml ledenog 5mM MgSO4i trešen tokom 20 minuta na 4°C na ledu, i tečnost osmotskog šoka je prikupljena centrifugacijom pri 8000g tokom 20 minuta na 4°C.

Primer 4. Prečišćavanje rBet v 1 molekula

[0069] Periplazmične frakcije rBet v 1 divljeg tipa i N28K-E101K mutanta su dopunjene sa 1M NaCl i prvi korak hromatografskog prečišćavanja za oba eksprimirana proteina je sproveden sa fenil-sefaroza kolonom (GE Healthcare) sa 20mM NaH2PO4, 1M NaCl, pH 5,0 buferom koristeći protok od 2 ml/minutu. Elucija je sprovedena sa linearnim gradijentom od 20mM Tris-HCI, pH 9,3, sa 7,5% izopropanola. Frakcije koje sadrže rekombinantni divlji tip Bet v 1 ili N28K-E101K mutant su udružene i koncentrovane. Divlji tip Bet v 1 je dodatno prečišćen sa Bio-Gel P60 kolonom ekskluzione hromatografije sa ležajem visine 460 mm i 1x PBS buferom sa protokom od 0,3 ml/minuti. U slučaju rBet v 1 N28K-E101K mutanta dodatni amiloza resin hromatografski korak je bio zahtevan kako bi se oslobodili kontaminacije E.coli maltoznog vezujućeg proteina pre ekskluzione hromatografije.

[0070] Proteinska koncentracija združenih rBet v 1 frakcija je utvrđena na 280 nm.

Primer 5. Analiza rBet v 1 i N28K-E101K mutanta pomoću masene spektrometrije

[0071] Maseno-spektrometrijski eksperimenti su sprovođeni sa 4.7 T Bruker BioAPEX-II ESI FT-ICR masenim spektrometrom (Bruker Daltonics, Billerica, Massachusetts, USA) opremljenim sa konvencionalnim ESI izvorom (Apollo-IITM). Nativni maseni spektri: uzorci alergena očišćeni od soli pri koncentraciji od 3 mM u 10 mM amonijum acetatnog bufera (pH 6,9) su direktno uliveni pri protoku od 1,5 mL/min sa suvim azotom koji je služio kao sušeći (200°C, 6 mbar) i nebulizujući gas. Svi instrumentalni parametri su optimizovani kako bi se održale nekovalentne interakcije u gasnoj fazi i kako bi se maksimizovala jonska transmisija pri m/z 2000-3000. Ista podešavanja instrumentalnog parametra su primenjena u celini kako bi se izbegao bilo kakav loš uticaj između različitih uzoraka. Obično, 500-1000 zajedno dodatih 128-kword vreme-domenskih tranzijenata je zabeleženo i obrađeno u 512-kword podataka pre brze Fourier transformacije i magnitudnog izračunavanja. Masena kalibracija je izvršena eksterno u odnosu na jone ES Tuning Mix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Denaturirani spektri su obično mereni u rastvoru acetonitril/voda/acetatna kiselina. Svi podaci su dobijeni i obrađeni upotrebom Bruker XMASS 7.0.8 softvera. Nativni ESI FT-ICR maseni spektri pokazuju da se rekombinantni Bet v 1 mutant N28K-E101K preklapa slično kao rekombinantni divlji tip Bet v 1 (Slika 7).

Primer 6. Inhibicija serumskog IgE vezivanja za rekombinantne Bet v 1 i Bet v 1 N28K-E101K polipeptide analizirana pomoću kompetitivnog ELISA

[0072] Vezivanje IgE serumskog uzorka polena breze alergične osobe (E3) za biotinilovani rBet v 1 imobilizovan na streptavidin izvorima je inhibirano povećanjem količina rBet v 1 i rBet v 1 N28K-E101K mutanata. Prvo, komercijalno dostupan rBet v 1 (divlji tip, Biomay) je biotinilovan korišćenjem Sul-fo-NHS-LC-biotin (Pierce) u skladu sa protokolom proizvođača. Biotinilovan rBet v 1 (0,5 mg/po izvoru je imobilizovan na streptavidin (SA) izvorima(Roche Diagnostics Gmbh) što je praćeno korakom ispiranja i dodavanjem E3 seruma (1:6 razređivanje). Nakon dvočasovne inkubacije na sobnom temperaturi u mućkalici i koraka ispiranja, različite količine (4, 1, 0,25, 0,0625, 0,0156 i 0,0039 mg) rBet v 1 su dodate i inkubirane tokom 2 sata na sobnoj temperaturi u mućkalici. Nakon koraka ispiranja, detekcija vezanih IgE molekula je sprovedena korišćenjem 1:1000 razređivanja AFOS-konjugovanog anti-ljudskog IgE antitela (Southern Biotech Associates Inc.) sa inkubacijom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u mućkalici. Najzad, supstratni rastvor, p-nitrofenilfosfat (Sigma), je dodat i izmerene su vrednosti apsorbancije pri 405 nm (Varioscan, Thermo Electron Corporation).

[0073] Rezultat serumskog IgE vezivanja za r Bet v 1 polipeptide koji je analiziran pomoću kompetativne ELISA je prikazan na Slici 5. rBet v 1 polipeptidi, wt i N28-E101K mutant, su korišćeni za kompetovanje vezivanja serumskog Bet v 1 alergične osobe (E3) za imobilizovan rBet v 1 (Biomay). Oba rBet v 1 divlji tip molekula (komercijalni od Biomay i sopstveni proizvod) su inhibirala IgE vezivanje za imobilizovani Bet v 1. Bet v 1 mutant N28K-E101K je prikazao smanjenu inhibiciju u poređenju sa rBet v 1 kontrolnima, što ukazuje na to da mutacije E101K i N28K utiču na IgE epitop i dimerizaciju Bet v 1.

Primer 7. Analiza oslobađanja histamina

[0074] Biološka aktivnost prečišćenih rekombinantnih Bet v 1 polipeptida je analizirana pomoću metoda pasivne senzitizacije uklonjenih bazo-fila i kasnijeg izazova sa molekulima alergena. Analiza oslobađanja histamina je sprovedena kao prepuštena usluga u RefLab ApS, Kopenhagen, Danska, koja ima akreditovan metod analize oslobađanja histamina. Izmerena je indukcija in vitro oslobađanja histamina iz bazofilskih leukocita pomoću komercijalnog rekombinantnog Bet v 1 (Biomay, Austrija) i dva rekombinantna Bet v 1 proteina, divljeg tipa i N28K-E101K. Svaki od tri alergena je testiran u testu pasivnog transfera kao studija doznog odgovora sa opsegom koncentracije od: 20-0,06 ng/ u duplikatima sa serumom Bet v 1 alergične osobe (E3).

[0075] Rezultat analize oslobađanja histamina je prikazan na Slici 6. rBet v 1N28k-E101K je bio 100 puta manje biološki aktivan u poređenju sa referencom, komercijalnim rekombinantnim Bet v 1 (Biomay) i rBet v 1 divljeg tipa.

[0076] Stručnoj osobi iz nauke će biti očigledno da, kako tehnologija napreduje, inventivni koncept može biti implementiran na različite načine. Pronalazak i njegove izvedbe nisu ograničeni na primere navedene u prethodnom tekstu ali mogu varirati unutar opsega patentnih zahteva.

Primer 8. Test kože na alergiju

[0077] Testovi kože na alergiju (SPT) sa tri volontera od kojih je kod dvoje dijagnostikovana alergija na polen breze i sa jednom neatopičnom osobom su sprovedeni sa rekombinantnim Bet v 1 polipeptidima i relevantnim kontrolama nakon odobrenja etičkog komiteta Helsinške univerzitetske centralne bolnice. Endotoksini rekombinantnih Bet v 1 polipeptidnih preparata su uklonjeni pomoću Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel (Termo: kataloški broj 20344) dok je nakon toga sadržaj endotoksina analiziran posredstvom ToxinSensor Endotoxin Detection System (GenScript: kataloški broj L00350C). Rekombinantni Bet v 1 polipeptidni preparati su filter sterilisani pomoću Costar SPIN-X (kataloški broj 8160) i skladišteni u alikvotima na -20°C.

[0078] SPT je sprovedena korišćenjem rekombinantnog divljeg tipa Bet v 1a (Biomay) i N28K-E101K mutanta pri koncentracijama od 50 i 5 mg/ml i komercijalnog ekstrakta polena breze (AlkAbello). Natrijum hlorid (0,9%) i histaminski dihidrohlorid (AlkAbello) su služili kao negativne i pozitivne kontrole, respektivno. Pre bockanja kože, lancete su postavljene u cevima koje sadrže reagense za test kože na alergiju. Odgovori su izmereni nakon 15 minuta i nakon 6 i 20 sati. Prečnik odgovora kože na histaminski dihidrohlorid kod svakog testiranog pojedinca je bio 5 mm nakon 15 minuta i ova vrednost je izabrana kao pozitivni (+) odgovor (Tabela 2). Neposredne reakcije kože indukovane posredstvom Bet v 1 mutanta N28K-E101K sa koncentracijom od mg/ml su bile blaže u poređenju sa reakcijama indukovanim posredstvom divljeg tipa Bet v 1 pri istoj koncentraciji. Reakcije kože indukovane posredstvom divljeg tipa Bet v 1 i N28K-E101K mutanta sa koncentracijom od 5 mg/ml su bile uporedive. Izuzetno u slučaju kod oba alergijska pacijenta, reakcije kože indukovane sa Bet v 1 N28K-E101K mutantom su nestale u znatno kraćem roku nego u poređenju sa divljim tipom Bet v 1.

Tabela 2. Rezultati testa kože na alergiju

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantni hipoalergenskii Bet v 1 polipeptid polena breze, zasnovan na divljem tipu aminokiselinske sekvence šablona kako je prikazano u SEK ID BR: 3 ili bilo koji drugi Bet v 1 divlji tip izoform od njega, izabrano iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 4-38, i pomenuti polipeptid obuhvata

(1) prvu aminokiselinsku supstituciju na poziciji aminokiselinskog ostatka E101, pri čemu je prva aminokiselinska supstitucija jE101K, i

(2) drugu aminokiselinsku supstituciju na poziciji aminokiselinskog ostatka N28, pri čemu je druga aminokiselinska supstitucija N28K.

2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je šablon divljeg tipa aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEK ID BR: 3.

3. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEK ID BR: 39, i pri čemu aminokiselinska supstitucija na poziciji 28 jeste K i aminokiselinska supstitucija na poziciji 101 jeste K.

4. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 41, i pri čemu aminokiselinska supstitucija na poziciji E101 jeste K i aminokiselinska supstitucija na poziciji N28 jeste K.

5. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4, pri čemu polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEK ID BR: 40.

6. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, koji ima kapacitet oslobadjanja histamina, koji je najmanje 20 puta smanjen kada se poredi sa kapacitetom Bet v 1 divljeg tipa, za oslobadjanje histamina.

7. Polipeptid prema patentnom zahtevu 6, koji ima kapacitet oslobadjanja histamina koji je najmanje 100 puta smanjen kada se poredi sa kapacitetom Bet v 1 divljeg tipa, za oslobadjanje histamina.

8. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu sve zajedno postoje najmanje dve, tri ili četiri aminokiselinske supstitucije.

9. Kompozicija vakcine, koja obuhvata najmanje jedan hipoalergeni polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 i farmaceutski prihvatljiv rastvarač ili adjuvans.

10. Kompozicija vakcine prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je vakcina za sublingvalnu administraciju.

11. Rekombinantni Bet v 1 polipeptid polena breze, zasnovan na divljem tipu aminokiselinske sekvence šablona kao što je prikazano u SEK ID BR: 3 ili bilo koji drugi Bet v 1 divlji tip izoform od njega, izabrano iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 4-38, i pomenuti polipeptid, bilo prirodno ili mutacijom, obuhvata

(1) prvu aminokiselinsku supstituciju na poziciji aminokiselinskog ostatka E101, pri čemu je prva aminokiselinska supstitucija E101K, i

(2) drugu aminokiselinsku supstituciju na poziciji aminokiselinskog ostatka N28, pri čemu je druga aminokiselinska supstitucija N28K,

za upotrebu kao vakcina.