RS57954B1

RS57954B1 - Postupci i čvrsti nosači za pripremanje uzoraka upotrebom transpozoma

Info

Publication number: RS57954B1
Application number: RS20181343A
Authority: RS
Inventors: Niall Anthony Gormley; Geoffrey Paul Smith
Original assignee: Illumina Cambridge Ltd
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2019-01-31
Also published as: EP2943589B1; CN104968805A; CN106701715A; JP2019068824A; KR102602143B1; US20140194324A1; EP3486331B1; EP4417692A3; SI2943589T1; JP2021118730A; KR20150109356A; WO2014108810A8; US20240301401A1; CA2895260A1; BR112015016005A2; KR20220093268A; WO2014108810A2; SMT201800582T1; HK1216776A1; HRP20181725T1

Description

Opis

POZADINA

[0001] Postoje različiti postupci i primene za koje je poželjno generisati biblioteku fragmentovanih i tagovanih DNK molekula od dvolančanih DNK (dsDNK) ciljanih molekula. Često, cilj je da se generišu manji DNK molekuli (npr., DNK fragmenti) od većih dsDNK molekula za upotrebu kao šablona u DNK reakcionim sekvenciranjima.

[0002] Mnogi od postupaka koji se trenutno koriste za fragmentaciju i tagovanje dvolančane DNK za upotrebu u sekvenciranju sledeće generacije rasipaju DNK, zahtevaju skupe instrumente za fragmentaciju, i procedure za fragmentaciju, tagovanje i izolovanje tagovanih DNK fragmenata su teški, monotoni, zahtevni, dugotrajni, neefikasni, skupi, zahtevaju relativno velike količine uzoraka nukleinske kiseline. Pored toga, mnogi od ovih postupaka generišu tagovane DNK fragmente koji nisu u potpunosti predstavnici sekvence sadržane u uzorku nukleinske kiseline iz koje se generišu. Tako, ono što je potrebno u stanju tehnike su postupci koji obezbeđuju brzu i laku upotrebu tokom generisanja biblioteka tagovanih DNK fragmenata iz ciljane DNK, a koji se mogu lako primeniti na postupke analiziranja kao što su postupci sekvenciranja i amplifikacije sledeće generacije.

[0003] WO 2012/1106546 A2 opisuje postupke koji uključuju tretiranje ciljane DNK sekvence sa transpozazom što rezultuje kao jedna ili više fragmentacija ili umetanja; dodavanje ili umetanje jednog ili više sekvenci prepoznavanja ciljanoj DNK sekvenci (i) tokom transpozaza tretmana (ii) tokom naknadne amplifikacije; sekvenciranje tretirane DNK; i hvatanje susedne informacije identifikovanjem ciljanih DNK sekvenci ili sekvenci prepoznavanja kao zajedničke osobine.

[0004] WO 2010/048605 A1 opisuje postupke, kombinacije i komplete za upotrebu transpozaze i transpozon kraja za generisanje opširne fragmentacije i 5'-tagovanja dvolančane ciljane DNK in vitro, zatim za upotrebu DNK polimeraze za generisanje 5'- i 3'-tagovanih jednolančanih DNK fragmenata bez izvođenja PCR reakcije amplifikacije, gde prvi tag na 5'-krajevima ispoljava sekvencu transferovanog transpozon kraja i opciono, dodatne proizvoljne sekvence, a druga tag na 3'-krajevima ispoljava različitu sekvencu od sekvence ispoljene prvim tagom.

[0005] WO 2012/103545 A1 opisuje postupak za dodavanje jedne ili više tagova dvolančanom proizvodu reakcije tagmentacije. Taj postupak uključuje obezbeđivanje dvolančane ciljane nukleinske kiseline i transpozoma sa transpozazom sa dve krajnje sekvence transpozona: "transferovan lanac" i "netransferovan lanac". Transpozom cepa ciljanu nukleinsku kiselinu na fragmente dok kovalentno transferuje transferovan lanac u prvi lanac fragmenta; netransferovan lanac transpozoma ostaje hibridizovan za transferovani lanac.

[0006] Adey et al. opisuju ultra-nisko-ulazni, na tagmentaciji baziran celo genomni bisulfitni postuopak sekvenciranja u Genome Research, 22:1139-1143, 2012.

[0007] US 2012/0530630 A1 opisuje postupak za sekvenciranje polinukleotidnih molekula. Postupak uključuje faze obezbeđivanja više polinukleotidnih molekula vezanih za površinu, gde je prvi deo svakog polinukleotidnog molekula vezan za prvu lokaciju površine, a drugi deo svakog polinukleotidnog molekula je vezan za drugu lokaciju površine, pri čemu je relativna udaljenost prve i druge lokacije u vezi sa verovatnoćom da su prvi i drugi deo upareni, odvajajući prvi i drugi deo polinukleotidnih molekula na površini, određivajući sekvence prvog i drugog dela polinukleotidnih molekula i poređući relativne blizine i sekvence radi određivanje koji prvi i drugi deo su upareni i radi određivanja sekvence ciljanih polinukleotidnih molekula.

SUŠTINA

[0008] Ovde su opisani postupci i kombinacije za pripremanje uzorka nukleinske kiseline na čvrstom nosaču. Ti postupci i kombinacije naročito se odnose na postupke i kombinacije za fragmentovanje i tagovanje DNK upotrebom transpozon kombinacije imobilizovane na čvrstom nosaču. Ti postupci i kombinacije koji su ovde opisani korisni su, na primer, za generisanje biblioteka tagovanih DNK fragmenata za upotrebu, npr., u postupcima sekvenciranja sledeće generacije, i slično. U nekim poželjnim primerima izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na pripremanje lineranih ssDNK fragmenata na čvrstom nosaču od ciljane DNK koja obuhvata bilo koju dsDNK od interesa (uključujući dvolančanu cDNK pripremljenu od RNK), iz bilo kog izvora, za genomsku, podgenomsku, transkriptomičnu, ili metagenomsku analizu, ili analizu RNK ekspresije.

[0009] Ovaj pronalazak definisan je priloženim patentnim zahtevima. Shodno tome, ovde su opisani postupci kakvi su definisani u patentnim zahtevima pripremanja imobilizovane biblioteke tagovanih DNK fragmenata koji obuhvata: (a) obezbeđivanje čvrstog nosača sa transpozom kompleksima koji su na njemu imobilizovani, gde transpozom kompleksi obuhvataju transpozazu vezanu za prvi polinukleotid, pri čemu taj prvi polinukleotid obuhvata (i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i (ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga; i (b) nanošenje ciljane DNK na čvrsti nosač pod uslovima u kojima je ciljana DNK fragmentovana transpozom kompleksima, a 3’ krajnja sekvenca transpozona prvog polinukleotida transferovana je na 5' kraj najmanje jednog lanca fragmenata; čime se proizvodi imobilizovana biblioteka dvolančanih fragmenata gde je najmanje jedan lanac 5'- tagovan prvim tagom. Transpozom kompleksi obuhvataju drugi polinukleotid koji obuhvata region komplementaran pomenutoj krajnjoj sekvenci transpozona. Ovi postupci mogu dalje da obuhvataju (c) obezbeđivanje transpozom kompleksa u rastvoru i dovođenje u kontakt transpozom kompleksa sa imobilizovanim fragmentima pod uslovima u kojima je ciljana DNK fragmentovana transpozom kompleksima u rastvoru; čime se dobijaju imobilizovani fragmenti nukleinske kiseline sa jednim krajem u rastvoru. U nekim primerima izvođenja, transpozom kompleksi u rastvoru mogu da obuhvataju drugi tag, tako da postupak generiše imibilizovane fragmente nukleinske kiseline sa drugim tagom, tim drugim tagom u rastvoru. Prvi i drugi tagovi mogu se razlikovati ili biti isti.

[0010] Ovde su takođe opisani čvrsti nosači kakvi su definisani u patentnim zahtevima sa bibliotekom tagovanih DNK fragmenata koji su na njemu imobilizovani pripremljeni prema gornjim postupcima ili drugim postupcima. Na primer, ovde su opisani čvrsti nosači sa transpozom kompleksima koji su na njemu imobilizovani, gde transpozom kompleksi obuhvataju transpozazu vezanu za prvi polinukleotid, pri čemu taj polinukleotid obuhvata (i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i (ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga.

[0011] Ovde su takođe opisani postupci generisanja protočne ćelije, koji obuhvataju imibilizovanje više transpozom kompleksa na čvrstom nosaču, pri čemu ti transpozom kompleksi obuhvataju transpozazu vezanu za prvi polinukleotid, pri čemu taj prvi polinukleotid obuhvata (i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i (ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga.

[0012] Ovi postupci mogu dalje da obuhvataju obezbeđivanje čvrstog nosača sa više prvih polinukleotida koji su na njemu imobilizovani, i dovođenje u kontakt čvrstog nosača sa transpozaza holoenzimom i drugim polinukleotidom, pri čemu taj drugi polinukleotid obuhvata region komplementaran krajnjoj sekvenci transpozona. U nekim postupcima, imibilizovanje obuhvata (a) obezbeđivanje čvrstog nosača sa amplifikacionim prajmerima kuplovanim sa njim; (b) hibridizovanje drugog polinukleotida za jedan od amplifikacionih prajmera, pri čemu drugi oligonukleotid obuhvata region komplementaran krajnjoj sekvenci transpozona i region komplementaran prvom tagu; (c) širenje amplifikacionog prajmera upotrebom polimeraze radi generisanja dupleksa koji obuhvata prvi polinukleotid hibridizovan za drugi polinukleotid, pri čemu je prvi polinukleotid imobilizovan direktno na čvrsti nosač; i (d) dovođenje u kontakt čvrstog nosača sa transpozaza holoenzimom, čime se slaže transpozom kompleks na čvrstom nosaču.

[0013] Ovde je takođe opisana populacija mikročestica sa transpozom kompleksima imobilizovanim na njoj, pri čemu transpozom kompleksi obuhvataju transpozaza vezanu za prvi polinukleotid i drugi polinukleotid; gde prvi polinukleotid je imobilizovan na svom 5' kraju ka površini mikročestice, a drugi polinukleotid hibridizovan je za 3' kraj prvog polinukleotida; i gde prvi polinukleotid obuhvata: (i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i (ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga. Ovde su takođe opisani postupci proizvodnje imobilizovanih biblioteka tagovanih DNK fragmenata koji obuhvataju dovođenje u kontakt ciljane DNK sa gornjom populacijom mikročestica radi generisanja imobilizovanih tagovanih DNK fragmenata.

[0014] Ovde su takođe opisani postupci generisanja biblioteke tagovanih DNK fragmenata za indeksom usmereno slaganje u duže sekvenciono čitanje, koji postupak obuhvata: obezbeđivanje populacije mikročestica sa transpozom kompleksima imobilizovanim na njima, pri čemu transpozom kompleksi obuhvataju transpozazu vezanu za taj prvi polinukleotid koji obuhvata indeks domen povezan sa mikročesticom i drugim polinukleotidom; nanošenje ciljane DNK na populaciju mikročestica, čime se generišu imobilizovani DNK fragmenti koji su tagovani indeks domenom. U gornjim postupcima, prvi polinukleotid može biti imobilizovan na svom 5' kraju ka površini mikročestice, a drugi polinukleotid može biti hibridizovan za 3’ kraj prvog polinukleotida; i gde prvi polinukleotid obuhvata: (i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i (ii) indeks domen; i gde populacija mikročestica obuhvata najmanje više indeks domena, i gde prvi polinukleotidi na pojedinačnoj mikročestici dele isti indeks domen.

Ovde je takođe opisan postupak za sekvenciranje više ciljanih DNK molekula, koji obuhvata: nanošenje više ciljanih DNK na čvrsti nosač sa transpozom kompleksima imobilizovanim na njemu pod uslovima u kojima je ciljana DNK fragmentovana transpozom kompleksima; čime se proizvodi imobilizovana biblioteka dvolančanih fragmenata, gde je prvi deo svake ciljane DNK pričvršćen za pomenuti čvrsti nosač na prvoj lokaciji na pomenutom čvrstom nosaču, a drugi deo svake ciljane DNK pričvršćen je za pomenuti čvrsti nosač na drugoj lokaciji na pomenutom čvrstom nosaču; i mapiranje pomenute imobilizovane biblioteke dvolančanih fragmenata radi generisanja seta lokacija koje su linkovane svakom ciljanom DNK; određivanje sekvenci pomenutog prvog i drugog dela ciljane DNK; i korelacija pomenutog seta lokacija radi određivanja koji je prvi i drugi deo vezan pomenutom ciljanom DNK i radi određivanja sekvence ciljanih DNK molekula.

[0015] U nekim primerima izvođenja ovde opisanih postupaka i kombinacija, transpozom kompleksi prisutni su na čvrstom nosaču u gustini od najmanje 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>kompleksa po mm<2>. U nekim primerima izvođenja, transpozom kompleks obuhvata hiperaktivnu transpozazu, kao što je Tn5 transpozaza.

[0016] U nekim primerima izvođenja ovde opisanih postupaka i kombinacija, domen taga može da obuhvata, na primer, region za amplifikaciju klastera. U nekim primerima izvođenja, domen taga može da obuhvata region za prajming reakcije sekvenciranja.

[0017] U nekim primerima izvođenja ovde opisanih postupaka i kombinacija, čvrsti nosač može da obuhvata, na primer, mikročestice, šablonizovanu površinu, bazenčiće i slično. U nekim primerima izvođenja, transpozom kompleksi nasumično su distribuirani na čvrstom nosaču. U nekim primerima izvođenja, transpozom kompleksi distribuirani su na šablonizovanoj površini.

[0018] Detalji jednog ili više primera izvođenja navedeni su u pratećem nacrtu i opisu. Druge karakteristike, ciljevi, i prednsoti postaće jasne iz opisa i crteža, kao i iz patentnih zahteva.

KRATAK OPIS NACRTA

[0019]

FIG.1a prikazuje opšti koncept prema jednom primeru izvođenja. FIG.1b prikazuje opšti koncept prema jednom primeru izvođenja.

FIG.2a je šematski izgled koji prikazuje reakciju tagmentacije.

FIG.2b je šematski izgled sa dobijenim preklapanjem mostova kako bi se razjasnila priroda dobijenog mosta.

FIG.3a prikazuje primer izvođenja u kojem su dva oblika transpozoma složena na površini protočne ćelije. Dodavanje DNK protočnoj ćeliji rezultuje u tagmentaciji i kuplovanju DNK za transpozome. Takođe su prikazane na FIG.3a različite vrste rezultujućih klastera: P7:P7, P5:P5, i P5:P7 klasteri.3b prikazuje primer izvođenja u kojem su dva oblika transpozoma složena na površini protočne ćelije.

FIG.4a prikazuje još jedan primer izvođenja. Na FIG.4a, samo jedan oblik na površini vezanog transpozoma (npr. P5 transpozom) je prisutan, dajući mostove sa istom obeleživačkom sekvencom na svakom kraju. Dodatni transpozomi dodaju se radi daljeg fragmentisanja struktura mostova i uključivanja dodatnih obeleživačkih sekvenci (P7).

FIG.4b prikazuje amplifikaciju radi generisanja parova klastera koji su rezultat svakog transpozom okrajka koji predstavlja dva susedna fragmenta u originalnom netaknutom DNK uzorku (FIG.4b).

FIG.5a, 5b, 5c i 5d prikazuju različite postupke za slaganje na površini vezanih transpozom kompleksa. FIG.5a prikazuje jedan primer izvođenja ovog postupka za slaganje na površini vezanih transpozom kompleksa. FIG.5b prikazuje da su transpozom kompleksi složeni u rastvoru i da imibilizovanje obuhvata dalju fazu ligacije prvog polinukleotida za vezni oligonukleotid kuplovan sa čvrstim nosačem. FIG.5c prikazuje da je transpozom dimer složen hibridizovanjem petljastog oligonukleotida za imibilizovani prvi polinukleotid. FIG.5d prikazuje transpozom komplekse koji mogu biti složeni na uobičajenoj uparenoj krajnoj protočnoj ćeliji sa amplifikacionim prajmerima imobilizovanim na njoj.

FIG.6a utvrđuje dizajn za eksperiment naveden kao Primer 1. FIG.6b utvrđuje dizajn za eksperiment naveden kao Primer 1.

FIG.7 utvrđuje reprezentativne podatke dobijene u eksperimentu sprovedenom u skladu sa dizajnom navedenim u Primeru 1.

FIG.8 utvrđuje reprezentativne podatke dobijene u eksperimentu sprovedenom u skladu sa dizajnom navedenim u Primeru 1.

FIG.9 je izgled skupa perlicama vezanih transpozoma i naknadna tagmentacija prema jednom primeru izvođenja.

FIG.10 je izgled skupa perlicama vezanih transpozoma i naknadna tagmentacija prema jednom primeru izvođenja.

FIG.11 je izgled skupa perlicama vezanih transpozoma i naknadna tagmentacija prema jednom primeru izvođenja.

FIG.12 je izgled skupa perlicama vezanih transpozoma i naknadna tagmentacija prema jednom primeru izvođenja.

FIG.13 je izgled na površini vezanih transpozoma prema jednom primeru izvođenja.

FIG.14 je izgled tagmentacije izvedene na perlicama vezanim transpozomima prema jednom primeru izvođenja.

FIG.15 je izgled tagmentacije i barkodovanje pod-fragmenata izvedenih na perlicama vezanim transpozomima prema jednom primeru izvođenja.

FIG.16 je izgled tagmentacije i barkodovanje pod-fragmenata izvedenih na perlicama vezanim transpozomima prema jednom primeru izvođenja.

FIG.17 je izgled transpozom skupa kao što je opisano u Primeru 3.

FIG.18a je izgled transpozom skupa kao što je opisano u Primeru 3.

FIG.18b utvrđuje rezultate upotrebom transpozom skupa kao što je opisano u Primeru 3.

DETALJAN OPIS

[0020] Trenutni protokoli za sekvenciranje uzoraka nukleinske kiseline rutinski upošljavaju postupak pripremanja uzorka koji konvertuje DNK ili RNK u biblioteku šablona. Ovi postupci mogu da rezultuju u gubitku DNK uzorka i često zahtevaju skupe instrumente za fragmentaciju. Pored toga, postupci za pripremanje uzoraka često su teški, komplikovani, i neefikasni.

[0021] U standardnim postupcima za pripremanje uzoraka, svaki šablon sadrži adapter na bilo kom kraju umetka i često su potrebne brojne faze i za modifikovanje DNK ili RNK i za prečišćavanje željenih proizvoda modifikacionih reakcija. Ove faze izvode se u rastvoru pre dodavanja prilagođenih fragmenata protočnoj ćeliji gde se kupluju na površini reakcijom širenja prajmera koja kopira hibridizovan fragment na kraj prajmera kovalentno vezanog za površinu. Ovi šabloni „zasejavanja“ zatim daju povećanje monoklonalnim klasterima kopiranih šablona kroz nekoliko ciklusa amplifikacije.

[0022] Broj faza koje su potrebne za transformaciju DNK u adapter-modifikovane šablone u rastvoru spremne za formiranje klastera i sekvenciranje može se minimizovati upotrebom transpozazom posredovane fragmentacije i tagovanja. Ovaj postupak, koji je ovde onačen kao 'tagmentacija,' često uključuje modifikaciju DNK transpozom kompleksom koji obuhvata transpozaza enzim kompleksovan sa adapterima koji obuhvataju krajnju sekvencu transpozona. Tagmentacija rezultuje u simultanoj fragmentaciji DNK i vezivanju adaptera na 5’ krajevima oba lanca fragmenata dupleksa. Posle faze prečišćavanja za uklanjanje transpozaza enzima, dodatne sekvence dodaju se krajevima prilagođenih fragmenata putem PCR.

[0023] Tagmentacija na bazi rastvaranja ima nedostatke i zahteva nekoliko faza napornog rada.

Dodatno, sklonost se može uvesti tokom faza PCR amplifikacije. Ovde opisani postupci i kombinacije prevazilaze te nedostatke i omogućavaju pripremanje nepristrasnih uzoraka, formiranje klastera i sekvenciranje koji se odvijaju na jednom čvrstom nosaču sa minimalnim zahtevima za upravljanje uzorcima ili transfer.

[0024] Ovaj opis odnosi se na začuđujuće otkriće da transpozom kompleksi pred-kuplovani za površinu protočne ćelije mogu efikasno da fragmentuju, označe i imobilišu netaknutu DNK unutar protočne ćelije. U specifičnim primerima izvođenja, jedan ili više lanaca koji obuhvataju transpozom adaptere pričvršćeni su za površinu protočne ćelije putem njegovog 5’ kraja. Kada je netaknuta DNK napumpana na protočnoj ćeliji, reakcija tagmentacije javlja se na isti način kao što se javlja u reakcijama tagmentacije na bazi rastvaranja, ali su rezultujući prozvodni fragmenti fizički pričvršćeni za površinu protočne ćelije svojim krajevima. Transpozom adapter sekvence mogu da sadrže sekvence koje omogućavaju naknadno generisanje klastera i sekvenciranje.

[0025] Ovde opisani postupci i kombinacije obezbeđuju nekoliko prednosti u odnosu na postupke tagmentacije na bazi rastvaranja. Na primer, prečišćeni, delimično prečišćeni ili čak neprečišćeni netaknuti DNK šablon može se uvesti direktno na protočnu ćeliju radi generisanja klastera, bez prethodnog pripremanja uzorka. Pored toga, bliskost sekvencione informacije u originalnoj netaknutoj DNK može se fizički sačuvati jukstapozicioniranjem tagmentovanih fragmenata na površini protočne ćelije. Kao dalja prednost, DNK je fizički linkovana za površinu protočne ćelije tako da se prečišćavanje reagenasa praćeno daljom manipulacijom DNK može postići proticanjem kroz pufersku izmenu u kanalu protočne ćelije.

Tagmentacija na čvrstom nosaču

[0026] U skladu sa prethodnim, ovde su opisani postupci kakvi su definisani u patentnim zahtevima za pripremanje imobilizovanih biblioteka tagovanih DNK fragmenata. Ovi postupci obuhvataju: (a) obezbeđivanje čvrstog nosača sa transpozom kompleksima koji su na njemu imobilizovani, gde transpozom kompleksi obuhvataju transpozazu vezanu za prvi polinukleotid, pri čemu taj prvi polinukleotid obuhvata (i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i (ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga; i (b) nanošenje ciljane DNK na čvrsti nosač pod uslovima u kojima je ciljana DNK fragmentovana transpozom kompleksima, a 3’ krajnja sekvenca transpozona prvog polinukleotida transferovana je na 5' kraj najmanje jednog lanca fragmenata; čime se proizvodi imobilizovana biblioteka dvolančanih fragmenata gde je najmanje jedan lanac 5'- tagovan prvim tagom.

[0027] Kako se ovde koristi, izraz "transpozom kompleks" odnosi se generalno na transpozaza enzim nekovalentno vezan za dvolančanu nukleinsku kiselinu. Na primer, kompleks može biti transpozaza enzim predinkubisan sa dvolančanom transpozon DNK pod uslovima koji podržavaju nekovalentno formiranje kompleksa. Dvolančana transpozon DNK može da uključi, bez ograničenja, Tn5 DNK, deo Tn5 DNK, krajnju transpozon kombinaciju, mešavinu krajnje transpozon kombinacije ili druge dvolančane DNK sposobne da uđu u reakciju sa transpozazom kao što hiperaktivna Tn5 transpozaza.

[0028] "Transpozaza" označava enzim koji je sposoban za formiranje funkcionalnog kompleksa sa kombinacijom koja sadrži transpozon kraj (npr., transpozoni, transpozon krajevi, kombinacije transpozon kraja) i koji katalizuje umetanje ili premeštanje kombinacije koja sadži transpozon kraj u dvolančanoj ciljanoj DNK sa kojom se inkubiše, na primer, u in vitro reakciji premeštanja. Transpozaza kakva je ovde opisana takođe može da uključi integraze iz retrotranspozona i retrovirusa. Transpozaze, transpozomi i transpozom kompleksi generalno su poznati stručnjaku iz ove oblasti, što je predstavljeno opisom US 2010/0120098. Iako se mnogi ovde opisani primeri izvođenja odnose na Tn5 transpozazu i/ili hiperaktivnu Tn5 transpozazu, biće cenjeno da se može koristiti bilo koji sistem za premeštanje koji je sposoban za umetanje transpozon kraja uz dovoljnu efikasnost prema 5'-oznaci i fragmentu ciljane DNK za njegovu namenjenu svrhu. U određenim primerima izvođenja, poželjan sistem premeštanja sposoban je za umetanje transpozon kraja na nasumičan ili skoro nasumučan način u odnosu na 5'-tag i fragment ciljane DNK.

[0029] Izraz "transpozon kraj" odnosi se na dvolančanu nukleinsku kiselinu DNK koja ispoljava samo nukleotidne sekvence ("transpozon krajnje sekvence") koje su potrebne za obrazovanje kompleksa sa transpozaza ili integraza enzimom koji je funkcionalan u in vitro reakciji premeštanja. U nekim primerima izvođenja, transpozon kraj sposoban je za formiranje funkcionalnog kompleksa sa transpozazom u reakciji premeštanja. Kao neograničavajući primeri, transpozon krajevi mogu da uključe 19-bp spoljni krajnji ("OE") transpozon kraj, unutrašnji krajnji ("IE") transpozon kraj, ili "mozaični krajnji" ("ME") transpozon kraj koji prepoznaje divlji-tip ili mutant Tn5 transpozaza, ili R1 i R2 transpozon kraj kako je navedeno u opisu US 2010/0120098. Transpozon krajevi mogu da obuhvataju bilo koju nukleinsku kiselinu ili analog nukleinske kiseline pogodan za formiranje funkcionalnog kompleksa sa transpozaza ili integraza enzimom u in vitro reakciji premeštanja. Na primer, transpozon kraj može da obuhvata DNK, RNK, modifikovane baze, ne-prirodne baze, modifikovanu kičmu, i može da obuhvata useke u jednom ili oba lanca. Iako se izraz "DNK" koristi kroz ovaj opisa u vezi sa kombinacijom transpozon krajeva, podrazumeva se da se bilo koja pogodna nukleinska kiselina ili analog nukleinske kiseline može upotrebiti u transpozon kraju.

[0030] Izraz "transferovan lanac" odnosi se na transferovani deo oba transpozon kraja. Slično, izraz "netransferovan lanac" odnosi se na netransferovan deo oba "transpozon kraja." 3'-kraj transferovanog lanca spojen je ili transferovan u ciljanu DNK u in vitro reakciji premeštanja. Netransferovan lanac, koji ispoljava krajnju sekvencu transpozona koja je komplementarna sa transferovanom krajnjom sekvencom transpozona, nije spojena ili transferovana u ciljanu DNK u in vitro reakciji premeštanja.

[0031] U nekim primerima izvođenja, transferovan lanac i netransferovan lanac kovalentno su spojeni. Na primer, u nekim primerima izvođenja, sekvence transferovanog i netransferovanog lanca su obezbeđene na jednom oligonukleotidu, npr., u konfiguraciji oblika ukosnice. Kao takav, iako slobodan kraj netransferovanog lanca nije spojen sa ciljanom DNK direktno reakcijom premeštanja, netransferovan lanac postaje pričvršćen zaDNK fragment indirektno, budući da je netransferovan lanac linkovan za transferovani lanac petljom strukture oblika ukosnice. Dodatni primeri transpozom strukture i postupci pripremanja i upotrebe transpozoma mogu se naži u opisu US 2010/0120098.

[0032] Izrazi "tag" i "domen taga" kako se ovde koriste odnose se na deo ili domen polinukleotida koji ispoljava sekvencu za željenu namenjenu svrhu ili primenu. Neki ovde opisani primeri izvođenja, uključuju transpozom kompleks koji obuhvata polinukleotid sa 3’ delom koji obuhvata krajnju sekvencu

1

transpozona, i tag koji obuhvata domen taga. Domeni tagova mogu da obuhvataju bilo koju sekvencu obezbeđenu za bilo koju željenu svrhu. Na primer, u nekim primerima izvođenja, domen taga obuhvata jedno ili više mesta prepoznavanja restrikcione endonukleaze. U nekim primerima izvođenja, domen taga obuhvata jedan ili više regiona pogodna za hibridizaciju sa prajmerom radi amplifikacije klaster reakcije. U nekim primerima izvođenja, domen taga obuhvata jedan ili više regiona pogodna za hibridizaciju sa prajmerom za reakcije sekvenciranja. Biće cenjeno da se bilo koja druga pogodna karakteristika može inkoporisati u domen taga. U nekim primerima izvođenja, domen taga obuhvata sekvencu dužine između 5 i 200 bp. U nekim primerima izvođenja, domen taga obuhvata sekvencu dužine između 10 i 100 bp. U nekim primerima izvođenja, domen taga obuhvata sekvencu dužine između 20 i 50 bp. U nekim primerima izvođenja, domen taga obuhvata sekvencu dužine između 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 i 200 bp.

[0033] U ovde opisanim postupcima i kombinacijama, transpozom kompleksi imobilizovani su na čvrsti nosač. U nekim primerima izvođenja, transpozom kompleksi imobilizovani su za nosač putem jednog ili više polinukleotida, kao što je polinukleotid koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona. U nekim primerima izvođenja, transpozom kompleks može biti imobilizovan putem linker molekularnog kuplovanja transpozaza enzima na čvrsti nosač. U nekim primerima izvođenja, i transpozaza enzim i polinukleotid su imobilizovani na čvrsti nosač. Kada se govori o imobilizaciji molekula (npr. nukleinske kiseline) na čvrstom nosaču, izrazi "imobilizovan" i "pričvršćen" koriste se naizmenično i oba izraza su namenjena da obuhvate direktno ili indirektno, kovalentno ili nekovalentno vezivanje, ukoliko nije drugačije naznačeno, ili eksplicitno ili kontekstom. U određenim primerima izvođenja ovog pronalaska kovalentno vezivanje može biti poželjno, ali generalno sve što je potrebno je da molekuli (npr. nukleinske kiseline) ostanu imobilizovani ili pričvršćeni za nosač pod uslovima u kojima je namenjeno da se koristi ova nosača, na primer u primenama koje zahtevaju amplifikaciju i/ili sekvenciranje nukleinske kiseline.

[0034] Određeni primeri izvođenja ovog pronalaska mogu primeniti čvrste nosače koji se sastoje od inertnog supstrata ili matrice (npr. staklene pločice, polimerne perlice itd.) koji su funkcionalizovani, na primer nanošenjem sloja ili premaza međumaterijala koji obuhvata reaktivne grupe koje omogućavaju kovalentno vezivanje za biomolekule, kao što su polinukleotidi. Primeri takvih nosača uključuju, ali nisu ograničeni na, poliakrilamidne hidrogelove nanete na inertni supstrat kao što je staklo, naročito poliakrilamidne hidrogelove kakvi su opisani u WO 2005/065814 i US 2008/0280773. U takvim primerima izvođenja, biomolekuli (npr. polinukleotidi) mogu biti direktno kovalentno pričvršćeni za međumaterijal (npr. hidrogel), ali sam međumaterijal je nekovalentno pričvršćen zasupstrat ili matricu (npr. stakleni supstrat). Izraz "kovalentno vezivanje za čvrsti nosač" koristi se tako da obuhvata ovu vrstu vezivanja.

[0035] Izrazi "čvrsta površina," "čvrsti nosač" i drugi gramatički ekvivalenti ovde se odnose na bilo koji materijal koji je pogodan za ili se može modifikovati za pogodno vezivanje transpozom kompleksa. Kao što će biti cenjeno od strane stručnjaka iz ove oblasti, broj mogućih supstrata je veoma velik. Mogući supstrati uključuju, ali nisu ograničeni na, staklo i modifikovano ili funkcionalizovano staklo, plastike (uključujući akrilike, polistiren i kopolimere stirena i druge materijale, polipropilen, polietilen, polibutilen, poliuretane, Teflon™, itd.), polisaharide, najlon ili nitrocelulozu, keramike, smole, siliku ili materijale na bazi silike uključujući silikon i modifikovan silikon, ugljenik, metale, neorganska stakla, plastike, snopove optičkih vlakana, i razne druge polimere. Naročito korisni čvrsti nosači i čvrste površine za neke primere izvođenja smešteni su unutar aparata protočnih ćelija. Primerne protočne ćelije detaljnije su navedene u nastavku.

[0036] U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosač obuhvata šablonizovanu površinu pogodnu za imobilizaciju transpozom kompleksa u uređenom šablonu. "Šablonizovana površina" odnosi se na raspored različitih regiona u ili na izloženom sloju čvrstog nosača. Na primer, jedan ili više regiona može biti istaknuti kada je prisutan jedan ili više transpozom kompleksa. Te odlike mogu biti odvojene intersticijalnim regionima u kojima transpozom kompleksi nisu prisutni. U nekim primerima izvođenja, šablon može biti x-y format osobina koje su u redovima i kolonama. U nekim primerima izvođenja, šablon može biti ponavljajući raspored osobina i/ili intersticijalnih regiona. U nekim primerima izvođenja, šablon može biti nasumičan raspored osobina i/ili intersticijalnih regiona. U nekim primerima izvođenja, transpozom kompleksi nasumično su distribuirani na čvrstom nosaču. U nekim primerima izvođenja, transpozom kompleksi distribuirani su na šablonizovanoj površini. Primerne šablonizovane površine koje se mogu koristiti u ovim postupcima i kombinacijama koji su ovde navedeni, opisane su u US Ser. Br.13/661,524 ili US Pat. Prij. Br.2012/0316086 A1.

[0037] U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosač obuhvata niz bazenčića ili udubljenja na površini. To se može proizvesti na način opšte poznat u struci upotrebom raznih tehnika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fotolitografiju, tehnike štampe, tehnike oblikovanja i tehnike mikrograviranja. Kao što će biti cenjeno od strane stručnjaka iz ove oblasti, tehnika koja će se koristiti zavisiće od kombinacije i oblika niza supstrata.

[0038] Kombinacija i geometrija čvrstog nosača mogu da variraju u zavisnosti od upotrebe. U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosač ravne strukture kao što je pločica, čip, mikročip i/ili niz. Kao takva, površina supstrata može biti u obliku ravnog sloja. U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosač obuhvata jednu ili više površina protočne ćelije. Izraz "protočna ćelija" kako se ovde koristi odnosi se na komoru koja obuhvata čvrstu površinu kroz koju mogu da protiču jedan ili više tokova reagenasa. Primeri protočnih ćelija i povezanih fluidnih sistema i detekcionih platformi koji se mogu lako primeniti postupcima ovog pronalaska opisani su, na primer, u Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, i US 2008/0108082.

[0039] U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosač ili njegova površina je neravna, kao što unutrašnja ili spoljašnja površina cevi ili suda. U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosač obuhvata mikrosfere ili perlice. Pod "mikrosfere" ili "perlice" ili "čestice" ili gramatičkim ekvivalentima ovde se misli na male diskretne čestice. Pogodne kombinacije perlica uključuju, ali nisu ograničeni na, plastike, keramike, staklo, polistiren, metilstiren, akrilne polimere, paramagnetne materijale, sol torijum dioksida, ugljenični grafit, titanijum dioksid, lateks ili umrežene dekstrane kao što je sefaroza, celuloza, najlon, umrežene micele i teflon, kao i bilo koji drugi materijali koji su ovde navedeni za čvrste nosače. "Microsphere Detekciju Guide" od Bangs Laboratories, Fishers Ind. je korisno uputstvo. U određenim primerima izvođenja, mikrosfere su magnetne mikrosfere ili perlice.

[0040] Perlice ne moraju biti sferične; mogu se koristiti i nepravilne čestice. Alternativno ili dodatno, perlice mogu biti porozne. Veličine čestica kreću se od nanometara, tj.100 nm, do millimetara, tj.1 mm, pri čemu su perlice od oko 0.2 mikrona do oko 200 mikrona poželjne, a od oko 0.5 do oko 5 mikrona naročito poželjne, iako se u nekim primerima izvođenja mogu koristiti manje ili veće perlice.

[0041] FIG.1a i 1b generalno prikazuju postupak prema jednom primeru izvođenja. Prikazani čvrsti nosač obložen kalemljenim oligonukleotidi, od kojih neki sadrže ME sekvence, obrazovaće aktivne transpozom komplekse koji su fizički kuplovani sa čvrstim nosačem u prisustvu Tn5. Gustina ovih na površini vezanih transpozoma može biti modulisano variranjem gustine kalemljenih oligonukleotida koji sadrže ME sekvencu ili količinom transpozaze dodate na čvrsti nosač. Na primer, u nekim primerima izvođenja, transpozom kompleksi prisutni su na čvrstom nosaču u gustini od najmanje 10<3>, 10<4>, 10<5>, ili najmanje 10<6>kompleksa po mm<2>.

[0042] Kada je dvolančana DNK dodata na čvrsti nosač, transpozom kompleksi tagmentovaće dodatu DNA, čime se generišu ds fragmenti kuplovani na oba kraja za površinu. U nekim primerima izvođenja, dužina premošćenih fragmenata može se varirati menjanjem gustine transpozom kompleksa na površini. U određenim primerima izvođenja, dužina rezultujućih premošćenih fragmenata je manja od

1

100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 1100 bp, 1200 bp, 1300 bp, 1400 bp, 1500 bp, 1600 bp, 1700 bp, 1800 bp, 1900 bp, 2000 bp, 2100 bp, 2200 bp, 2300 bp, 2400 bp, 2500 bp, 2600 bp, 2700 bp, 2800 bp, 2900 bp, 3000 bp, 3100 bp, 3200 bp, 3300 bp, 3400 bp, 3500 bp, 3600 bp, 3700 bp, 3800 bp, 3900 bp, 4000 bp, 4100 bp, 4200 bp, 4300 bp, 4400 bp, 4500 bp, 4600 bp, 4700 bp, 4800 bp, 4900 bp, 5000 bp, 10000 bp, 30000 bp ili manja od 100,000 bp. U takvim primerima izvođenja, premošćeni fragmenti mogu tada biti amplifikovani u klastere upotrebom standardne klaster hemije, data kao primer u opisu US Patent Br.7,985,565 i 7,115,400.

[0043] U nekim primerima izvođenja, dužina šablona duža je od one koja se može pogodno amplifikovati upotrebom standardne klaster hemije. Na primer, u nekim primerima izvođenja, dužina šablona je duža od 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 1100 bp, 1200 bp, 1300 bp, 1400 bp, 1500 bp, 1600 bp, 1700 bp, 1800 bp, 1900 bp, 2000 bp, 2100 bp, 2200 bp, 2300 bp, 2400 bp, 2500 bp, 2600 bp, 2700 bp, 2800 bp, 2900 bp, 3000 bp, 3100 bp, 3200 bp, 3300 bp, 3400 bp, 3500 bp, 3600 bp, 3700 bp, 3800 bp, 3900 bp, 4000 bp, 4100 bp, 4200 bp, 4300 bp, 4400 bp, 4500 bp, 4600 bp, 4700 bp, 4800 bp, 4900 bp, 5000 bp, 10000 bp, 30000 bp ili duža od 100,000 bp. U takvim primerima izvođenja, zatim se može izvesti druga reakcija tagmentacije dodavanjem transpozoma iz rastvora što dalje fragmentuje mostove, kako je prikazano, na primer, na FIG.4a. Druga reakcija tagmentacije tako može ukloniti unutrašnji raspon mostova, ostavljajući krakte okrajke prikačene za površinu koji se mogu konvertovati u klastere spremne za dalje faze sekvenciranja. U određenim primerima izvođenja, dužina šablona može biti unutar opsega definisanog gornjim i donjim ograničenjem odabrani iz onih prethodno datih kao primer.

[0044] Pre klaster generisanja, DNK imobilizovana površinskom tagmentacijom može se uslikati. Na primer, imobilizovana DNK može biti obojena with an interhelirajućom bojom i usnimljena kako bi se sačuvalo zapis položaja kičme DNK molekula na površini. Po klaster generisanju i sekvenciranju, koordinate klastera mogu se povezati sa njihovim položajem na originalnoj kičmi, čime se učestvuje u poravnanju ćitanja duž molekulskog i genomskog slaganja.

[0045] Faza nanošenja ciljane DNK može da obuhvata dodavanje biološkog uzorka za pomenuti čvrsti nosač. Taj biološki uzorak može biti bilo koja vrsta koja obuhvata DNK i koja se može deponovati na čvrstu površinu za tagmentaciju. Na primer, uzorak može da obuhvata DNK u raznim stanjima prečišćavanja, uključujući prečišćenu DNK. Međutim, uzorak ne mora biti potpuno prečišćen, i može da obuhvata, na primer, DNK pomešan sa proteinom, drugim vrstama nukleinske kiseline, drugim ćelijskim komponentama i/ili bilo kojim drugim zagađivačem. Kako je pokazano u primeru 2 ispod, biološki uzorak obuhvata mešavinu DNK, proteina, drugih vrsta nukleinske kiseline, drugih ćelijskih komponenti i/ili bilo kog drugog zagađivača prisutnog u približno istoj srazmeri kakva je in vivo. Na primer komponente se mogu naći u istoj srazmeri kakva je u netaknutoj ćeliji. Biološki uzorak može imati 260/280 odnos od manje od 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, ili manje od 0.60. Biološki uzorak može imati 260/280 odnos od najmanje 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, ili najmanje 0.60. Iz razloga što ovde obezbeđeni postupci omogućavaju da se DNK veže za čvrsti nosač, drugi zagađivači se mogu ukloniti samo pranjem čvrstog nosača nakon javljanja na površini vezane tagmentacije. Biološki uzorak može da obuhvata, na primer, sirovi ćelijski lizat ili cele ćelije. Na primer, sirovi ćelijski lizat koji se nanoci na čvrsti nosač i prethodno navedenom postupku, nije morao da se podvrgne jednoj ili više separacionim faza koje se uobičajeno koriste za izolovanje nukleinske kiseline od drugih ćelijskih komponenti. Primerne faze separacije navedene su u Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, i Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.

[0046] Tako, biološki uzorak može da obuhvata, na primer, krv, plazmu, serum, limfu, sluz, ispljuvak, urin, sperma, cerebrospinalna tečnost, bronhijalni aspirat, fekalije, i isušeno tkivo, ili njihov lizat, ili bilo koji biološki primerak koji obuhvata DNK. Jedna prednost ovde opisanih postupaka i kombinacija je da se biološki uzorak može dodati protočnoj ćeliji, a naknadna lizija i faze prečišćavanja mogu se javiti u protočnoj ćeliji bez faza transfera ili rukovanja, jednostavno protokom potrebnih reagenasa u protočnoj ćeliji. Primeri 1 i 2 ispod pokazuju uspešnu primenu sirovih ćelijskih lizata u ovde obezbeđenim postupcima i kombinacijama.

[0047] FIG.2a i 2b dalje prikazuju reakciju tagmentacije prema jednom primeru izvođenja. Kako je prikazano na FIG.2a, transpozomi obuhvataju dimer Tn5 sa svakim monomerom koji se vezuje za dvolančani molekul, tj. ME adapter. Jedan lanac ME adaptera je kovalentno pričvršćen za površinu protočne ćelije. Transpozomi vezuju ciljanu DNK i generišu dva useka u DNK kičmi, 9 baza razdvojenih na bilo kom lancu. Iako FIG.2a prikazuje 9 bp razmak između useka, u drugim primerima izvođenja, transpozom može da generiše razmak od 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 bp između useka. Samo jedan od dva lanca svakog ME adaptera privezan je za 5' lanac na svakom položaju useka. Ovajlanac 'transferovan lanac' kalemljen je za površinu protočne ćelije putem njegovog 5' kraja. Rezultujući most površine tagmentacije prekrojen je na FIG.2b kako bi se razjasnila priroda dobijenog mosta.

[0048] FIG.3a i 3b prikazuju jedan primer ovog pronalaska smešten u praksu. Dva oblika transpozoma složena su na površinu protočne ćelije. Prvi oblik obuhvata P7 transpozom u kojem 'transfer lanac' ME adaptera obuhvata proširenu oligonukleotidnu sekvencu koja linkuje transpozom za površinu uključujući amplifikacioni domen (P7) i prajmer sekvenciranja (S2). Drugi oblik obuhvata P5 transpozom u kojem 'transfer lanac' ME adaptera obuhvata proširenu oligonukleotidnu sekvencu koja linkuje transpozom za

1

površinu uključujući amplifikacioni domen (P5) i prajmer sekvenciranja (S1). Dodavanje DNK protočnoj ćeliji rezultuje u tagmentaciji i kuplovanju DNK za transpozome. Tri vrste mostova rezultuju: P5-P5, P7-P7 i P5-P7. Sledeći klaster formiranje i linearizaciju (FIG.3b), ili P5-P5 ili P7-P7 klasteri se uklanjaju (zavisno od linearizacije). Kako je prikazano na FIG.3b, ukoliko se linearizacija dogodi putem P5, tada samo P5-P7 i P7-P7 mostovi ostaju. P7-P7 klasteri se ne linearizuju ovom reakcijom i prema tome e se sekvencirati. P7-P7 klasteri naknadno su uklonjeni tokom linearizacije Čitanja 2 za sekvenciranje.

[0049] Ovde opisani postupak može dalje da obuhvata dodatnu fazu obezbeđivanja transpozom kompleksa u rastvoru i dovođenje u kontakt rastvor-faza transpozom kompleksa sa imobilizovanim fragmentima pod uslovima u kojima je ciljana DNK fragmentovana rastvorom transpozom kompleka; čime se dobijaju imobilizovani fragmenti nukleinske kiseline sa jednim krajem u rastvoru. U nekim primerima izvođenja, transpozom kompleksi u rastvoru mogu da obuhvataju drugi tag, tako da postupak generiše imibilizovane fragmente nukleinske kiseline sa drugim tagom, tim drugim tagom u rastvoru. Prvi i drugi tagovi mogu se razlikovati ili biti isti.

[0050] U nekim primerima izvođenja, jedan oblik na površini vezan transpozom predominantno je prisutan na čvrstom nosaču. Na primer, u nekim primerima izvođenja, najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% tagova prisutnih na pomenutom čvrstom nosaču obuhvata isti domen taga. U takvim primerima izvođenja, nakon inicijalne reakcije tagmentacije sa na površini vezanim transpozomima, najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% većine struktura obuhvata isti domen taga na svakom kraju mosta. Druga reakcija tagmentacije može se izvesti dodavanjem transpozoma iz rastvora što dalje fragmentuje mostove. U nekim primerima izvođenja, most ili svi transpozomi rastvora faze obuhvataju domen tag koji se razlikuje od domena taga prisutnih na premošćenim strukturama generisanim u prvom reakciji tagmentacije. Na primer, u nekim primerima izvođenja, najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% tagova prisutno u rastvor faza transpozomima obuhvata domen taga koji se razlikuje od domena taga prisutan na premošćenim strukturama generisanim u prvoj reakciji tagmentacije.

[0051] FIG.4a i 4b prikazuju ovaj primer izvođenja. Čvrsti nosač prikazan na FIG.4a obuhvata samo na površini vezan transpozom koji obuhvata jednu vrstu tagovane sekvence (npr. P5 transpozom). U ovom slučaju, svi tagmentovan mostovi su P5-P5 mostovi. P7 transpozom dodat je iz rastvora i tagmentovan u mostove čineći sve na površini vezane molekule P5-P7 šablonima. Na površini vezani fragmenti mogu se naknadno konvertovati u klasteri (videti, na primer, FIG.4b). Dalje, par klastera rezultuje iz svakog

1

transpozom okrajka koji predstavlja dva bliska fragmenta u originalnom netaknutom DNK uzorku (FIG.

4b).

[0052] Ovde su takođe opisani čvrsti nosači sa bibliotekom tagovanih DNK fragmenata koji su na njemu imobilizovani pripremljeni prema gornjim postupcima.

Fizičke mape imobilizovanih polinukleotidnih molekula (kao referenca)

[0053] Ovde su takođe opisani postupci generisanja fizičke mape imobilizovanih polinukleotida. Ovi postupci mogu se pogodno eksploatisati za identifikovanje klastera koji verovatno sadrže linkovane sekvence (tj., prvi i drugi deo iz istog ciljanog polinukleotidnog molekula). Relativna udaljenost bilo koja dva klastera koji rezultuju iz imobilizovanog polinukleotida tako obezbeđuje informaciju korisnu za poravnanje sekvencione informacije dobijene od ova dva klastera. Specifično, rastojanje između bilo koja dva data klastera na čvrstoj površini je pozitivno povezano sa verovatnoćom da su ta dva klastera iz istog ciljanog polinukleotidnog molekula, što je detaljnije opisano u WO 2012/025250.

[0054] Kao jedan primer, dugi dsDNK molekuli koji se pružaju površinom protočne ćelije mogu biti tagmentovan in situ, dajući liniju povezanih dsDNK mostova kroz površinu protočne ćelije. Dalje, fizička mapa imobilizovane DNK tada može biti generisana. Ta fizička mapa tako je u vezi sa fizičkom vezom klastera nakon amplifikovanja imobilizovane DNK. Specifično, ta fizička mapa koristi se za izračunavanje verovatnoće da su sekvencioni podaci dobijeni od bilo koja dva klastera linkovani, kako je opisano u WO 2012/025250.

[0055] Fizička mapa može biti generisana snimanjem DNK kako bi se utvrdila lokacija imobilizovanih DNK molekula kroz čvrstu površinu. Imobilizovana DNK može biti snimljena dodavanjem agensa za snimanje na čvrsti nosač i detektovanjem signala iz agensa za snimanje. Agens za snimanje može biti detektabilna oznaka. Pogodne detektabilne oznake, uključuju, ali nisu ograničene na, protone, haptene, radionuklide, enzime, fluorescentne oznake, hemiluminescentne oznake, i/ili hromogene agense. Na primer, agens za snimanje može biti interkalirajuća boja ili ne- interkalirajući DNK vezujući agens. Bilo koja pogodna interkalirajuća boja ili ne-interkalirajući DNK vezujući agens kakvi su poznati u struci mogu se koristiti, uključujući, ali ne ograničavajući se na one navedene u U.S.2012/0282617.

[0056] U nekim primerima izvođenja, imobilizovani dvolančani fragmenti dalje su fragmentovani radi oslobađanja slobodnog kraja (videti FIG.4a) pre klaster generisanja (FIG.4b). Cepanje premošćene strukture može se izvesti upotrebom bilo koje metode kakva je poznata u struci, data kao primer u WO 2012/025250. Na primer, cepanje se može javiti inkorpotisanjem modifikovanog nukleotida, kao što je

1

uracil kakav je opisan u WO 2012/025250, inkorporiranjem restrikcionog endonukleaza mesta, ili nanošenjem rastvor-faza transpozom kompleksa na premošćene DNK strukture, kako je ovde već opisano.

[0057] Više ciljanih DNK molekula može se proteći na protočnoj ćeliji koja obuhvata više nano-kanala, pri čemu je nano-kanal sa više transpozom kompleksa imobilizovana u njoj. Kako se ovde koristi, izraz nano-kanal odnosi se na suženi kanal u koji protiče dugi linearni DNK molekul. U nekim primerima izvođenja, ne više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 6070, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ili ne više od 1000 pojedinačnih dugih lanaca ciljanih DNK protiče u svaki nano-kanal. Pojedinačni nano-kanali mogu se razdvojiti fizičkom barijerom koja sprečava da pojedinačne duge lance ciljanih DNK od međusobnog reagovanja sa više nano-kanala. Čvrsti nosač može da obuhvata najmanje 10, 50, 100, 200, 500, 1000, 3000, 5000, 10000, 30000, 50000, 80000 ili najmanje 100000 nano-kanala. Transpozomi vezani za površina nano-kanala tagmentuju DNK. Susedno mapiranje zatim može biti izvedeno, na primer, sledeći klastere na dole dužinom jednog od ovih kanala. U nekim primerima izvođenja, dug lanac ciljanih DNK može biti najmanje 0.1kb, 1kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 15kb, 20kb, 25kb, 30kb, 35kb, 40kb, 45kb, 50kb, 55kb, 60kb, 65kb, 70kb, 75kb, 80kb, 85kb, 90kb, 95kb, 100kb, 150kb, 200kb, 250kb, 300kb, 350kb, 400kb, 450kb, 500kb, 550kb, 600kb, 650kb, 700kb, 750kb, 800kb, 850kb, 900kb, 950kb, 1000kb, 5000kb, 10000kb, 20000kb, 30000kb, ili najmanje 50000kb u dužini. Dug lanac ciljanih DNK može biti ne više od 0.1kb, 1kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 15kb, 20kb, 25kb, 30kb, 35kb, 40kb, 45kb, 50kb, 55kb, 60kb, 65kb, 70kb, 75kb, 80kb, 85kb, 90kb, 95kb, 100kb, 150kb, 200kb, 250kb, 300kb, 350kb, 400kb, 450kb, 500kb, 550kb, 600kb, 650kb, 700kb, 750kb, 800kb, 850kb, 900kb, 950kb, ili ne više od 1000kb u dužini. Kao jedan primer, protočna ćelija sa 1000 ili više nano-kanala sa mapiranim imobilizovanim proizvodima tagmentacije u nano-kanalima može se koristiti za sekvenciranje genoma organizma sa kratkim 'pozicioniranim' čitanjima. Mapirani imobilizovani proizvodi tagmentacije u nano-kanalima mogu se koristiti da rastvore haplovrste. Mapirani imobilizovani proizvodi tagmentacije u nano-kanalima mogu se koristiti da rastvore pitanja faziranja.

Amplifikacija i sekvenciranje imobilizovanih DNK fragmenata

[0058] Amplifikacija. Ovaj opis dalje se odnosi na amplifikaciju imobilizovanih DNK fragmenata proizvedenih prema ovde obezbeđenim postupcima. Imobilizovani DNK fragmenti proizvedeni tagmentacijom posredovanom na površini vezanim transpozomima mogu se amplifikovati prema bilo kom pogodnom metodu amplifikacije poznatim u struci. U nekim primerima izvođenja, imobilizovani DNK fragmenti amplifikovani su na čvrstom nosaču. U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosač je isti čvrsti nosač na kome se javlja na površini vezana tagmentacija. U takvim primerima izvođenja, ovde

1

obezbeđeni postupci i kombinacije omogućavaju da pripremljeni uzorak nastavi na istom čvrstom nosaču od inicijalne faze uvođenja uzorka kroz fazu amplifikacije i opciono kroz fazu sekvenciranja.

[0059] Na primer, u nekim primerima izvođenja, imobilizovani DNK fragmenti amplifikovani su upotrebom metode amplifikacije klastera date kao primer u opisima US Patent Br.7,985,565 i 7,115,400. US Patent Br.7,985,565 i 7,115,400 opisuju postupke amplifikacije čvrsto-fazne nukleinske kiseline koji omogućavaju da se proizvodi amplifikacije imobilizuju na čvrstom nosaču radi formiranja nizova sastavljenih od klastera ili "kolonija" imobilizovanih molekula nukleinske kiseline. Svaki klaster ili kolonija na takvom nizi formira se od više identičnih imobilizovanih polinukleotidnih lanaca i više identičnih imobilizovanih komplementarnih polinukleotidnih lanaca. Ti tako formirani nizovi generalno se nazivaju "klasterovani nizovi". Proizvodi čvrste-fazne reakcije amplifikacije kao što su oni opisani u US Patentu Br.7,985,565 i 7,115,400 su takozvane "premošćene" strukture formirane poravnavanjem parova imobilizovanih polinukleotidnih lanaca i imobilizovanih komplementarnih lanaca, pri čemu su oba lanca imobilizovana na čvrstom nosaču na 5’ kraju, poželjno kovalentnim vezivanjem. Metode amplifikacije klastera su primeri postupaka gde se šablon imobilizovane nukleinske kiseline koristi za proizvodnju imobilizovanih amplikona. Druge pogodne metode se takođe mogu primeniti za proizvodnju imobilizovanih amplikona od imobilizovanih DNK fragmenata proizvedenih prema ovde obezbeđenim postupcima. Na primer jedan ili više klastera ili kolonija može biti formirano putem čvrsto-fazne PCR bilo da je jedan ili oba prajmera svakog para amplifikacionih prajmera imobilizovan.

[0060] Imobilizovani DNK fragmenti mogu se amplifikovati u rastvoru. Na primer, imobilizovani DNK fragmenti mogu biti pocepani ili drugačije oslobođen od čvrstog nosača, a amplifikacioni prajmeri su zatim hibridizovani u rastvoru u oslobođene molekule. Amplifikacioni prajmeri mogu biti hibridizovani u imobilizovane DNK fragmente tokom jednog ili više inicijalnih faza amplifikacije, praćeno naknadnim fazama amplifikacije u rastvoru. Na taj način, šablon imobilizovane nukleinske kiseline može se primeniti za proizvodnju rastvor-faza amplikona.

[0061] Biće cenjeno da se bilo koja ovde opisana metoda amplifikacije ili generalno poznata u struci može upotrebiti sa univerzalnim ili ciljano-specifičnim prajmerima radi amplifikovanja imobilizovanih DNK fragmenata. Pogodni postupci za amplifikovanje uključuju, ali nisu ograničeni na, lančana reakcija polimeraze (PCR), amplifikacija izmeštanja lanaca (SDA), transkripcijom posredovana amplifikacija (TMA) i amplifikacija na bazi sekvence nukleinske kiseline (NASBA), kakvi su opisani u U.S. Patentu br.

8,003,354. Gornji postupci amplifikacije mogu se uposliti radi amplifikovanja jede ili više nukleinskih kiselina od interesa. Na primer, PCR, uključujući multipleks PCR, SDA, TMA, NASBA i slično može se

1

upotrebiti radi amplifikovanja imobilizovanih DNK fragmenata. U nekim primerima izvođenja, prajmeri usmereni specifično na nukleinsku kiselinu od interesa uključeni su u reakciju amplifikacije.

[0062] Drugi pogodni postupci za amplifikovanje nukleinskih kiselina mogu da uključe tehnologije kao oligonukleotidno produžavanje i vezivanje, amplifikaciju kružnog kruga (RCA) (Lizardi et al., Nat. Genet.

19:225-232 (1998)) i ogled oligonukleotidnog vezivanja (OLA) (Videti generalno U.S. Pat. Br.7,582,420, 5,185,243, 5,679,524 i 5,573,907; EP 0320308 B1; EP 0336731 B1; EP 0439182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; i WO 89/0983). Biće cenjeno da ove metode amplifikacije mogu biti dizajnirani radi amplifikovanja imobilizovanih DNK fragmenata. Na primer, postupak amplifikacije može da uključi reakcije amplifikacije vezujuće sonde ili ogleda oligonukleotidnog vezivanja (OLA) koje sadrže prajmere usmerene specifično na nukleinsku kiselinu od interesa. Postupak amplifikacije može da uključi reakciju prajmer produženja-vezivanja koja sadrži prajmere usmerene specifično na nukleinsku kiselinu od interesa. Kao neograničavajući primer prajmer produženja i vezujućih prajmera koji mogu biti specifično dizajnirani radi amplifikovanja nukleinske kiseline od interesa, amplifikacija može da uključi prajmere koji se koriste za GoldenGate oled (Illumina, Inc., San Diego, CA) dat kao primer u U.S. Pat. br.7,582,420 i 7,611,869.

[0063] Primerni izotermičkih postupci amplifikacije koji se mogu primeniti u postupku ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, amplifikaciju višestrukog izmeštanja (MDA) data kao primer u, na primer Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002) ili amplifikaciju izmeštanja izotermičkih lanaca nukleinske kiseline date kao primeru, na primer U.S. Pat. br.6,214,587. Drugi postupci koji nisu bazirani na PCR koji se mogu primeniti u ovom pronalasku uključuju, na primer, amplifikaciju izmeštanja lanaca (SDA) koja je opisana u, na primer Walker et al., Molecular Methods for Virus Detekciju, Academic Press, Inc., 1995; U.S. Pat. Br.5,455,166, i 5,130,238, i Walker et al., Nucl. Acids Res.20:1691-96 (1992) ili amplifikaciju izmeštanja hiperrazgranatih lanaca koja je opisana u, na primer Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003). Izotermičkih postupci amplifikacije mogu se primeniti sa lanacizmeštajućom Phi 29 polimerazom ili Bst DNK polimeraza velikim fragmentom, 5'->3' egzo<->za nasumičnu prajmer amplifikaciju genomske DNK. Upotreba ovih polimeraza prednjači zbog svoje visoke procesivnosti i aktivnosti izmeštanja lanca. Visoka procesivnost omogućava da polimeraze proizvedu fragmente koji su 10-20 kb u dužini. Kako je prethodno navedeno, manji fragmenti mogu biti proizvedeni pod izotermičkim uslovima upotrebom polimeraza sa niskom procesivnosti i aktivnosti izmeštanja lanca kao što je Klenow polimeraza. Dodatni opis reakcije amplifikacije, uslova i komponenti navedeni su detaljnije u opisu U.S. Patent br.7,670,810.

[0064] Još jedan postupak amplifikacije nukleinske kiseline koji je koristan u ovom opisu je Tagovana

2

PCR koja koristi populaciju dvo-domenskih prajmera sa konstantnim 5' regionom praćeno nasumičnim 3' regionom kako je opisano u, na primer, Grothues ct al. Nicleic Acids Res.21(5):1321-2 (1993). Prvi krugovi amplifikacije izvedeni su kako bi se omogućilo mnošto inicijacija na toplotom denaturisanoj DNK na osnovu pojedinačne hibridizacije iz nasumično-sintetizovanog 3' regiona. Zbog prirode 3' regiona, mesta inicijacije su razmatrana da budu nasumična kroz čitav genom. Posle toga, nevezani prajmeri mogu se ukloniti, a dalje replikacija može se izvesti upotrebom prajmera komplementarnih konstantnom 5' regionu.

[0065] Sekvenciranje. (kao referenca) Ovaj opis dalje se odnosi na sekvenciranje imobilizovanih DNK fragmenata proizvedenih prema ovde obezbeđenim postupcima. Imobilizovani DNK fragmenti proizvedeni tagmentacijom posredovanom na površini vezanim transpozomima mogu se sekvencirati prema bilo kom pogodnom metodu sekvenciranja, kao što je direktno sekvenciranje, uključujući sekvenciranje sintezom, sekvenciranje vezivanjem, sekvenciranje hibridizacijom, sekvenciranje nanoporama i slično. Imobilizovani DNK fragmenti mogu se sekvencirati na čvrstom nosaču. Čvrsti nosač za sekvenciranje može biti isti čvrsti nosač na kome se javlja na površini vezana tagmentacija. Čvrsti nosač za sekvenciranje može biti isti čvrsti nosač na kome se javlja amplifikacija.

[0066] Jedan poželjan postupak sekvenciranja je sekvenciranje-pomoću-sinteze (SBS). Kod SBS, produženje prajmera nukleinske kiseline duž šablona nukleinske kiseline (npr. ciljana nukleinska kiselina ili njen amplikon) prati se radi određivanja sekvence nukleotida u šablonu. Osnovni hemijski proces može biti polimerizacija (npr. kao katalizovana polimeraza enzinom). U određenom polimerazabaziranom SBS primeru izvođenja, fluorescentno obeleženi nukleotidi dodaju se na prajmer (čime se produžava taj prajmer) na šablon zavistan način tako da detekcija reda i vrste nukeotida dodatog prajmeru može biti primenjena za određivanje šablona sekvence.

[0067] Protočne ćelije obezbeđuju pogodan čvrsti nosač za smeštanje amplifikovanih DNK fragmenata proizvedenih postupcima ovog pronalaska. Jedan ili više amplifikovanih DNK fragmenata u takvom formatu mogu biti podvrgnuti SBS ili drugom tehnikom detekcije koja uključuje ponovljenu dostavu reagenasa u ciklusima. Na primer, kako bi se započeo prvi SBS ciklus, jedan ili više obeleženih nukleotida, DNK polimeraza, itd., mogu se proteći u/kroz protočnu ćeliju koja smešta jedan ili više amplifikovanih molekula nukleinske kiseline. Ta mesta u kojima prajmer širenje izaziva da obeležen nukleotid koji se inkorporira može biti detektovan. Opciono, nukleotidi mogu dalje da uključuju reverzibilnu terminacionu osobinu kora prekida dalje prajmer širenje kada se nukleotid doda prajmeru. Na primer, analog nukleotida sa reverzibilnom prekidajućom grupom može biti dodat prajmeru tako da se naknadno produženje ne može dogoditi dok se ne dostavi deblokirajući agens radi uklanjanja te grupe. Tako, za primere izvođenja kori koriste reverzibilnu terminaciju, deblokirajući reagens može se dostaviti u protočnu ćeliju (pre ili nakon javljanja detekcije). Pranja se mogu izvesti između raznih faza dostave. Taj ciklus zatim može biti ponovljen n puta radi produženja prajmera n nukleotidima, čime se detektuje sekvenca dužine n. Primerne SBS procedure, fluidni sistemi i detekcione platforme koji se mogu lako adaptirati za upotrebu sa amplikonima proizvedenim postupcima ovog pronalaska, opisani su, na primer, u Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, i US 2008/0108082.

[0068] Druge procedure sekvenciranja koje koriste ciklične reakcije mogu se koristiti, kao što je pirosekvenciranje. Pirosekvenciranje detektuje oslobađanje neorganskog pirofosfata (PPi) kako se određeni nukleotidi inkorporišu u novorođeni lanac nukleinske kiseline (Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res.11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998); US 6,210,891; US 6,258,568 i US.6,274,320). U pirosekvenciranju, oslobođen PPi može biti detektovan trenutnim konvertovanjem u adenozin trifosfat (ATP) ATP sulfurilazom, a nivo ATP generisan može se detektovati putem luciferaza-proizvedenih fotona. Tako, reakcije sekvenciranja mogu se pratiti putem sistema luminescencione detekcije. Izvori pobuđivanja radijacije koji se koriste za fluorescenciju na bazi sistema detekcije nisu neophodni za procedure pirosekvenciranja. Korisni fluidni sistemi, detektori i procedure koji se mogu prilagoditi za primenu pirosekvenciranja za amplikone proizvedene prema ovom pronalasku, na primer, u WIPO Pat. App. Ser. br. PCT/US11/57111, US 2005/0191698 A1, US 7,595,883, i US 7,244,559.

[0069] Mogu se koristiti postupci koji uključuju praćenje u realnom vremenu DNK polimeraza aktivnosti. Na primer, nukleotidne inkorporacije mogu se detektovati kroz interakcije fluorescentno rezonantnog transfera energija (FRET) između fluorofor-noseće polimeraze i γ-fosfat-obeleženih nukleotida, ili sa talasovodima nultog moda (ZMW). Tehnike i reagensi za FRET-bazirano sekvenciranje opisani su, na primer, u Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett.33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc. Natl. 'Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008).

[0070] Neki SBS postupci uključuju detekciju protona oslobođenog nakon inkorporiranja nukleotida u proizvod produženja. Na primer, sekvenciranje bazirano na detekciji oslobođenih protona može se upotrebiti kao električni detektor i povezane tehnike koje su komercijalno dostupne od Ion Torrent (Guilford, CT, podružnica Life Technologies-a) ili postupci i sistemi sekvenciranja opisani u US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; ili US 2010/0282617 A1. Postupci navedeni ovde za amplifikovanje ciljane nukleinske kiseline upotrebom kinetičke ekskluzije može se lako primeniti na supstrate koji se koriste za detektovanje protona. Određenije, ovde navedeni postupci mogu se primeniti za proizvodnju klonalnih polulacija amplikona koji se koriste za detektovanje protona.

[0071] Još jedna korisna tehnika sekvenciranja je sekvenciranje nanoporama (videti, na primer, Deamer et al. Trends Biotechnol.18, 147-151 (2000); Deamer et al. Acc. Chem. Res.35:817-825 (2002); Li et al. Nat. Mater.2:611-615 (2003)). U nekim postupcima koji koriste nanopore, ciljana nukleinska kiselina ili pojedinačni nukleotidi uklanjaju se iz ciljane nukleinske kiseline prolazeći kroz nanoporu. Kako nukleinska kiselina ili nukleotid prolaze kroz nanoporu, svaki tip nukleotida može se identifikovati merenjem fluktuacija u električnoj provodljivosti pore. (U.S. Patent br.7,001,792; Soni et al. Clin. Chem.

53, 1996-2001 (2007); Healy, Nanomed.2, 459-481 (2007); Cockroft et al. J. Am. Chem. Soc.130, 818-820 (2008)).

[0072] Primerni postupci za na nizu baziranoj ekspresiji i analizu genotipizacije koji se mogu primeniti za detekciju prema ovom pronalasku opisani su US Pat. Br.7,582,420; 6,890,741; 6,913,884 ili 6,355,431 ili US Pat. Pub. Br.2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 ili US 2005/0181440 A1.

[0073] Prednost ovde navedenih postupaka je u tome što oni obezbeđuju rapidnu i efikasnu detekciju više ciljanih nukleinskih kiselina paralelno. Shodno tome ovaj opis obezbeđuje integrisane sisteme sposobne za pripremanje i detektovanje nukleinske kiseline upotrebom tehnika poznatih u struci kao što one prethodno navedene kao primer. Na taj način, integrisani sistem ovog opisa može da uključi fluidne komponente sposobne za dostavljanje amplifikacionih reagenasa i/ili sekvencirajućih reagenasa do jednog ili više imobilizovanih DNK fragmenata, pri čemu taj sistem obuhvata komponente kao što su pumpe, ventili, rezervoari, fluidne linije i slično. Protočna ćelija može biti konfigurisana i/ili se može koristiti u integrisanom sistemu za detekciju ciljanih nukleinskih kiselina. Primerne protočne ćelije su opisani, na primer, u US 2010/0111768 A1 i US Ser. br.13/273,666. Kao primer protočne ćelije, jedna ili više fluidnih komponenti integrisanog sistema može se koristiti za postupak amplifikacije i za postupak detekcije. Uzimajući postupak sekvenciranja nukleinske kiseline kao jedan primer, jedan ili više fluidnih komponenti integrisanih sistema može se koristiti za postupak amplifikacije naveden ovde i za dostavu sekvencirajućih reagenasa u postupku sekvenciranja kao što su oni navedeni ovde. Alternativno, integrisani sistem može da uključi odvojene fluidne sisteme za izvođenje postupaka amplifikacije i za izvođenje postupaka detekcije. Primeri integrisanih sistema sekvenciranja koji su sposobni za stvaranje amplifikovanih nukleinskih kiselina i takođe za određivanje sekvenci nukleinskih kiselina uključuju, bez ograničenja, MiSeq™ platformu (Illumina, Inc., San Diego, CA) i uređaje opisane u US Ser. br.

13/273,666.

2

Čvrsti nosači sa imobilizovanim transpozomima i postupci pripremanja

[0074] Ostali ovde opisani primeri izvođenja uključuju čvrste nosače, kao što su protočne ćelije, sa transpozom kompleksima koji su na njemu imobilizovani. U određenim primerima izvođenja, transpozom kompleksi obuhvataju transpozazu vezanu za prvi polinukleotid, tpri čemu taj polinukleotid obuhvata (i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i (ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga. Gustina ovih na površini vezanih transpozoma može da varira. Na primer, u nekim primerima izvođenja, transpozom kompleksi prisutni su na čvrstom nosaču u gustini od najmanje 10<3>, 10<4>, 10<5>, ili najmanje 10<6>kompleksa po mm<2>.

[0075] Ovde su takođe opisani postupci genrisanja protočne ćelije za tagmentaciju. Ovi postupci mogu da obuhvataju, na primer, imibilizovanje više transpozom kompleksa na čvrstom nosaču, transpozom kompleksa koji obuhvataju transpozazu vezanu za prvi polinukleotid, pri čemu taj prvi polinukleotid obuhvata (i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i (ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga.

[0076] Transpozom kompleksi mogu biti imobilizovani na čvrstom nosaču u raznim postupcima, što će stručnjak iz ove oblasti ceniti. U jednom primeru izvođenja, postupak obuhvata obezbeđivanje čvrstog nosača sa više prvih polinukleotida koji su na njemu imobilizovani, i dovođenje u kontakt čvrstog nosača sa transpozaza holoenzimom i drugim polinukleotidom, pri čemu taj drugi polinukleotid obuhvata region komplementaran krajnjoj sekvenci transpozona. U nekim primerima izvođenja, drugi polinukleotid je hibridizovan u imobilizovani prvi polinukleotid pre dodavanja transpozaza holoenzima. U nekim primerima izvođenja, drugi polinukleotid i transpozaza holoenzim su obezbeđeni zajedno. FIG.5a prikazuje jedan primer izvođenja ovog postupka za slaganje na površini vezanih transpozom kompleksa. U jednom postupku, transpozaza holoenzim dodat je zajedno sa netransferovanim lancem ME adaptera protočnoj ćeliji koja sadrži oligonukleotide koji obuhvataju ode 5' površine kalemljenog kraja: klaster amplifikacioni prajmer (A.pr) i prajmer sekvenciranja (S.pr) i ME sekvencu (FIG.5a). Alternativno, netransferovan ME' lanac može se hibridizovati za površinu kalemljenog ME lanca prvo, a zatim se dodaje transpozaza protočnoj ćeliji.

[0077] Transpozom kompleksi mogu se složiti u rastvoru i imibilizovanje može da obuhvata dalju fazu ligacije prvog polinukleotida za vezni oligonukleotid kuplovan sa čvrstim nosačem. To je prikazano na FIG.5b. Vezni oligonukleotid može biti proširen upotrebom polimeraze pre javljanja faze ligacije.

[0078] Transpozom dimer može biti složen hibridizovanjem petljastog oligonukleotida za imibilizovani prvi polinukleotid. Na primer, petljasti oligonukleotid može da obuhvata prvi kraj i drugi kraj, pri čemu je prvi kraj komplementaran krajnjoj sekvenci transpozona prvog polinukleotida. Drugi kraj petljastog oligonukleotida može biti komplementaran drugoj krajnjoj sekvenci transpozona. Druga krajnja sekvenca transpozona može biti, na primer, deo rastvor-faznog prvog polinukleotida. Imobilizovani prvi polinukleotid i rastvor-fazni prvi polinukleotid mogu da obuhvataju različite transpozon krajnje sekvence ili njihove komplemente. Petljasti oligonukleotid može da obuhvata sekvence komplementarne svakoj različitoj transpozon krajnjoj sekvenci na prvom i drugom kraju. Ilustracija toga prikazana je na FIG.5c. Kako je prikazano na FIG.5c, susedni adapter par generisan je hibridizovanjem dva oligonukleotida za na površini vezani oligonukleotid. To se može postići upošljavanjem dve različite transpozon krajnje sekvence (ME1 i ME2). Dodavanje transpozaza holoenzima rekonstituiše aktivni 'petljasti' transpozom kompleks, gde je samo jedan od dva adaptera svakog transpozoma kuplovan za površinu FIG.5c.

[0079] Transpozom kompleksi mogu biti složeni na uobičajenoj uparenoj krajnoj protočnoj ćeliji sa amplifikacionim prajmerima imobilizovanim na njoj (npr. HiSeq protočna ćelija ili MiSeq protočna ćelija koja se prodaje kod Illumina Inc, San Diego, CA). To se može postići, na primer, hibridizacijom 'veznog' oligonukleotida koji očvršćavaju na jednoj ili obe vrste na površini kalemljenih amplifikacionih prajmera. Ta veza deluje kao šablon da bi se tada proširio na površini kalemljeni prajmer sa polimerazom i dNTP radi obrazovanja oligonukleotidnog dupleksa koji sadrži površinski amplifikacioni prajmer, prajmer sekvenciranja i transpozon krajnje sekvence transpozaze. Dodavanje transpozaze slaže transpozom površine. Ovaj primer izvođenja prikazan je na na FIG.5d.

[0080] U bilo kom od ovde obezbeđenih primera izvođenja, transpozom kompleksi mogu biti homodimeri, ili heterodimeri. Na primer, kako je prikazano na FIG.11, homodimerni transpozom obuhvata dva P5-ME adaptera na oba mesta ili alternativno, dva P7-ME adaptera. Slično, heterodimerni transpozom kompleks bi obuhvatao oba P5-ME i P7-ME adaptera, kako je prikazano na FIG.11.

Tagmentacija upotrebom transpozom perlica

[0081] Jedan ovde opisano primer izvođenja je populacija mikročestica sa transpozom kompleksima imobilizovanim na njima. Upotreba čvrstih nosača kao što su perlice mogu obezbediti nekoliko prednosti u odnosu na tagmentaciju na bazi rastvaranja. Na primer, u standardnoj tagmentaciji na bazi rastvaranja, teško je kontrolisati krajnju veličinu fragmenta reakcije tagmentacije. Veličina fragmenta je funkcija odnosa transpozoma prema količini i veličini DNK i prema trajanju reakcije. Čak iako se ovi parametri kontrolišu, frakcionacija po odabiru veličine često je potrebna kao dodatna faza radi uklanjanja viška malih fragmenata kraćih od kombinovanih upareno-očitanih dužina. Ovde obezbeđeni postupci zaobilaze ove nedostatke. Specifično, na perlicama imobilizovani transpozomi omogućavaju odabir krajnje veličine fragmenta kao funkcije prostornog odvajanja vezanih transpozoma, nezavisno od

2

kvantiteta transpozom perlica dodatih reakciji tagmentacije. Dodatna ograničenja tagmentacije na bazi rastvaranja je da je ona uobičajeno potrebna nekom obliku prečišćavanja proizvoda reakcije tagmentacije i pre i nakon PCR amplifikacije. To obično zahteva neki transfer reakcija iz cevi u cev.

Nausprot tome, proizvodi tagmentacije na perlicama baziranim transpozomima mogu se oprati i kasnij osloboditi za amplifikovanje ili drugu nishodnu obradu, čime se zaobilazi potreba za transferovanjem uzorka. Na primer, kada su transpozomi složeni na paramagnetnim perlicama, prečišćavanje proizvoda reakcije tagmentacije lako se postiže imibilizovanjem perlica sa magnetima i pranjem. Tako, tagmentacija i druge nishodne obrade kao što je PCR amplifikacija mogu se izvesti u jednoj cevi, sudu, kapljici ili nekom drugom kontejneru. Tagmentacija i nishodna obrada uzoraka može se izvesti na uređaju na bazi mikrofluidnih kapljica, kako je dato kao primer u opisu U.S. Prijave Ser. br.13/670,318, podnete Novembra 6, 2012 pod nazivom "INTEGRATED SEQUENCING APPARATUSES AND METHODS OF USE". Na primer, u uređaju baziranom na mikrofluidnim kapljicama, kapljica koja sadrži ciljanu nukleinsku kiselinu, pufer za pranje ili drugi reagensi mogu se provući preko površine koja obuhvata imobilizovane transpozom komplekse. Slično tome, kapljica koja obuhvata perlice sa transpozomima koji su na njoj imobilizovani, može se dovesti u kontakt sa ciljanom nukleinskom kiselinom, puferom za pranje ili drugim reagensima u uređaju baziranom na mikrofluidnim kapljicama.

[0082] U nekim primerima izvođenja, imobilizovani transpozom kompleksi obuhvataju transpozazu vezanu za prvi polinukleotid i drugi polinukleotid; gde je prvi polinukleotid imobilizovan na svom 5' kraju ka površini mikročestice, a drugi polinukleotid hibridizovan je za 3' kraj prvog polinukleotida; a gde prvi polinukleotid obuhvata: (i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i (ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga.

[0083] FIG.9-12 obezbeđuju prikaz transpozoma složenih na površinu paramagnetnih perlica. FIG.9 prikazuje površinu perlica sa dva različita prva polinukleotida imobilizovanih na njima. Prvi polinukleotidi koji su prikazani obuhvataju krajnju sekvencu transpozona (ME). Jedan od prvih pokazanih polinukleotida obuhvata domen taga koji obuhvata amplifikacionu prajmer sekvencu (P5) i prajmer sekvencu sekvenciranja (Čitanje 1). Drugi polinukleotid prikazan na FIG.9 obuhvata različite amplifikacionu prajmer sekvenca (P7) i prajmer sekvencu sekvenciranja (Čitanje 2). Prvi polinukleotidi takođe mogu da obuhvataju indeks tag. Indeks tag može biti jedinstven za perlicu, ili može biti zajednički za jednu ili više ostalih perlica u populaciji. Jedna perlica može imati samo jedan indeks tagova imobilizovan na njoj, ili može imati više indeks tagova imobilizovanih na njoj.

[0084] FIG.10 prikazuje drugi polinukleotid hibridizovan na svaki prvi polinukleotid. Drugi polinukleotid obuhvata region komplementaran krajnjoj sekvenci transpozona prvog polinukleotida. Drugi

2

polinukleotid može biti 15 bp u dužini. Drugi polinukleotid može biti približno 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 bp ili više od 20 bp u dužini. Drugi polinukleotid može biti fosforilovan na svom 5’ kraj.

[0085] FIG.11 prikazuje slaganje transpozoma na površini perlica, gde se transpozaza enzim dovodi u kontakt sa imobilizovanim oligonukleotidima. Kako je prikazano na FIG.11, kada se traanspozaza dodaje perlicama, tri vrste transpozom kompleksa se formiraju:P5:P5, a P7:P7, i P5:P7 kompleks (FIG.11).

[0086] Kada se transpozom perlice dodaju rastvoru ciljanih DNK u tagmentacioni pufer, tagmentacija se odvija, vezujući DNK za površinu perlica. Generisane su imobilizovane biblioteke tagovanih DNK.

[0087] FIG.12 prikazuje jedan primer izvođenja u kojima sukcesivna tagmentacija u DNK rezultuje u premošćenim molekulima između transpozoma. U kojima tri vrste transpozoma su prisutne (kao na FIG.

11), tri vrste premošćenih kompleksa daju: P5:P5, P7:P7 i P5:P7 kompleks u odnosu 25:25:50, respektivno.

[0088] Dužina premošćenih fragmenata može se diktirati gustinom transpozoma na površini perlica. Ova gustina se može podešavati putem količine oligonukleotida na površini, količine dupleksa transpozon krajnih kompleksa na površini i količine transpozaza enzima dodatog tokom slaganja transpozona. Kada je tagmentacija završena, P5:P7 proizvodi tagmentacije mogu se osloboditi sa površine perlica upotrebom bilo kog pogodnog postupka. Proizvodi tagmentacije mogu se osloboditi od perlica upotrebom postupka amplifikacije kao što je supresiona PCR, izlazna PCR i slično. Proizvodi tagmentacije mogu se osloboditi od perlica cepanjem. Cepanje može biti, na primer, hemijsko, enzimatsko, fotohemijsko ili njihova kombinacija. Biće cenjeno da se u ovde obezbeđenim postupcima može primeniti bilo koji pogodni postupak za oslobađanje jednog ili više proizvoda tagmentacije od čvrstog nosača.

[0089] DNK se može efikasno dovesti u kontakt sa na površini vezanim transpozomima upotrebom bilo kog pogodnog postupka za povećavanje verovatnoće kontakta. Na primer, taloženje DNK na čvrstu površinu može se upotrebiti kako bi se povećao kontakt između ciljane DNK i transpozom kompleksa na toj čvrstoj površini. Bilo koji od brojnih postupaka koji su poznati u struci za dovođenje u kontakt DNK sa čvrstim nosačem, može se upotrebiti, kao na primer onaj dat u opisu WO 2010/115122. Kako će biti cenjeno od strane stručnjaka iz ove oblasti, DNK se može istaložiti na čvrstom nosaču dodavanjem PEG, etanola ili bilo kog od raznih drugih agenasa poznatih za taloženje DNK na površinama, uključujući, na primer, bilo koji od brojnih pufera koji se koriste u tehnologiji reverzibilne imobilizacije na čvrstoj fazi (SPRI).

2

[0090] Populacija perlica koje nose imobilizovane transpozom komplekse može se pomešati sa viškom perlica koje ne nose transpozome ili oligonukleotide, čime se smanjuje verovatnoća tagmentacije kroz dve ili više različitih perlica. Još jedan postupak za smanjivanje verovatnoće tagmentacije kroz dve ili više različitih perlice uključuje imibilizovanje perlica tako da je kontakt između perlica minimizovan.

Imobilizacija perlica može se postići bilo kojom od brojnih tehnika poznatih u struci, uključujući, na primer, imibilizovanje perlica putem magnetizma na bočnim čvrstim površinama kao što je microcentrifugalna cev, ili bilo koja tehnika imobilizacije data kao primer u WO 2010/115122.

[0091] Transpozom perlice mogu se upotrebiti za izolovanje i identifikaciju nukleinske kiseline iz jedne ćelije, kao što je prokariotska ili eukariotska ćelija. Na primer, čestice kao što su perlice mogu biti obložene with indeksovanim transpozomima koji dele isti indeks (svi od transpozoma prisutni na određenim perlicama nose isti indeks, koji se razikuje od indeksa prisutnog na drugoj perlici). Perlice zatim mogu biti smeštene unutar ćelija kroz bilo koji od raznih metodologija poznatih u struci. Na primer, postupci za dostavljanje perlica unutar ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na genske pištolje, fototermička nanosečiva (Wu et al. Anal Chem. (2011) 4:1321-7), i peptide koji se koriste u konjukciji sa supstancama ćelijske permeabilizacije (Nitin et al Ann Biomed Eng. (2009) 37:2018-2027) i slično. Biće cenjeno da se u odbe opisanim postupcima može primeniti bilo koji pogodan postupak za pridruživanje DNK iz jedne ćelije sa česticom koja nosi indeksovane transpozome.

[0092] Transpozomi mogu biti kovalentno pričvršćeni za perlice kakve su ovde detaljno opisane.

Dodatno ili alternativno, transpozomi se mogu osloboditi od perlica nakon primene hemijskog ili fizičkog stimulusa. Neki primeri stimulusa mogu da budu okidači oslobađanja transpozoma od čvrstog nosača uključuju svetlosne i/ili temperaturne promene. Transpozomi se mogu osloboditi od čvrstog nosača upotrebom aktivnosti enzima kao što je restrikciona endonukleaza. Transpozomi se mogu otkačiti od perlica i slobodno kretati unutar ćelije. Kada perlice (ili alternativno, oslobođeni transpozomi) dođu u kontakt sa hromatinom ili DNK, tagmentacija se može odvijati. Podrazumkeva se da u eukariotskim i prokariotskim sistemima, neće uvek sve genomske DNK biti uvek pristupačne i/ili dostupne za tagmentaciju. Čak do 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% ili više od 99% ukupne DNK u ćeliji može biti tagmentovano transpozomima. Upotreba jedinstveno tagovanih perlica omogućava identifikovanje čitanja iz iste ćelije zajedničkim grupisanjem koje dele isti indekse. Ova čitanja smatraju se izvedenim iz istih perlica (a prema tome iz isti ćelije). Dodatno ili alternativno, faza umrežavanja može se izvesti za umrežavanje ćelijske DNK dok je još uvek unutar ćelijskog jezgra. Takva faza omogućava da se DNK iz jedne drži zajedno. Nakon ekstrakstovanja DNK iz ćelija, ona se može

2

pomešati sa indeksovanim perlicama i podvrgnuti tagmentaciji kakva je ovde detaljnije opisana.

Dodatno ili alternativno, varijacije postupka uključuju tagmentaciju hromozoma sortiranih tokom. Hromozomi sortirani tokom mogu se pomešati sa ovde opisanim indeksovanim perlicama. Određeni hromozom će se prilepiti za jednu perlicu, a fragmenti generisani kroz tagmentaciju sadržaće isti indeks. To bi moglo da omogući faziranje SNP od celih hromozoma (haplotipizacija).

[0093] Ukupan broj indeksa može biti veći od ukupnog broja ćelija koje su uspešno tagmentovani. Pristup dvostrukog indeksa može se implementirati, na primer, kao način da se poveća broj mogućih kombinacija indeksa. Kao jedan primer, upotreba dva 8 baznih indeksa dala bi teoretski broj kombinacija od 4<8>X 4<8>= 4.3X10<9>.

[0094] Može se primeniti još jedan pristup kako bi se obezbedilo da pojedinačna ćelija nije tagmentovana sa više perlica. Na primer, jedan pristup je da se primene perlice veličine koja je slična veličini ćelije. To bi moglo da osigura da ćelija ne može da smesti više perlica. Dodatno ili alternativno, još jedan pristup je da se upotrebi odnos ćelija prema perlici koji favorizuje jedno ćelijsko ciljanje. Na primer, ukoliko ima značajno više ćelija od perlica, tada poasonova distribucija perlica unutar ćelija označava da ćelije koje su preuzele jednu perlicu značajno premašuju ćelije koje su uzeče dve ili više perlica.

[0095] Jedan ćelijski pristup opisan gore može se upotrebiti radi određivanja da li je dva SNP (ili strukturni preuređenja) prisutno u istoj ćeliji. Na primer, u slučaju heterogene populacije kancer ćelija, saznanje da je dva SNP prisutna u istoj ćeliji ili u različitim ćelijama može pomoći u implementiranju pravilne kancer terapije.

[0096] Jedan gore opisan ćelijski pristup može se upotrebiti za ispitivanje RNK. Na primer, oblaganjem perlica pogodnim enzimima (tj. reverzna transkriptaza) i oligonukleotidima za fazu reverzne transkripcije, može se analizirati genska ekspresija na jedno ćelijskom nivou. Nakon uvođenja perlica obloženih reverznom transkriptazom, oligonukleotidima i transpozomima, citoplazmična RNK može biti konvertovana u cDNK, tagovana i pripremljena unutar ćelija.

Postupci slaganja dugih čitanja upotrebom barkodova na imobilizovanim transpozomima (kao referenca)

[0097] Barkod-pomognuto slaganje DNK fragmenata omogućava izolovanje pojedinačnih dugih DNK molekula unutar populacije DNK molekula i konverziju svakog molekula u unikatno barkodovanoj subfragment biblioteci. Kada je cela populacija sub-fragmentovanih DNK molekula sekvencirana,

2

subfragmenti mogu se složiti nazad u svoj originalni dug molekul po referencama barkodova koje sadrže.

[0098] Poznati su razni postupci barkodovanja pojedinačnih DNK molekula. Na primer, 'postupak razblaživanja,' izoluje pojedinačne duge molekule ekstremnim razblaživanjem i alikvotiranjem u odvojene odeljke (npr., bazenčići ploče), tako da svaki bazenčić sadrži samo jedan ili samo nekoliko molekula DNK. Kako je svaki bazenčić fizički odvojen, pripremanje biblioteke može se izvesti u svakom bazenčiću sa jedinstvenim barkodom. Posle toga, sadržaji bazenčića grupišu se i sekvenciraju. Još jedan postupak upošljava emulziju u kojoj svaka kapljica sadrži duge DNK molekule, reagense za pripremanje biblioteke i barkod jedinstven svakoj kapljici. Još jedan pristup koristi veliku biblioteku indeksovanih petljastih transpozom kompleksa ta umetanje više blizanačkih barkodova dužinom DNK sadržavajući netaknutost molekula. Naknadno cepanje između barkodnih 'blizanaca' daje fragmente koji se mogu sekvencirati i presložiti poklapanjem blizanaćkih barkodova. Svaki od gore pomenutih postupaka barkodovanja sa sobom nose nedostatke koji se prevazilaze ovde opisanim postupcima barkodovanja.

[0099] Ovde su opisani alternativni postupci na gore opisane načine izolovanjem i barkodovanjem pojedinačnih dugih molekula. Ti ovde opisani postupci dostižu prednosti fizičke izolacije slične postupku emulziranja bez upotrebe emulziranja, i u isto vreme obezbeđuju kompleksnost koja je veća od one obezbeđene velikim brojem 'bazenčića' koji se koriste u postupku razblaživanja. Jedinstveni barkodovi ovih postupaka su na neki način analogni 'bazenčićima' postupka razblaživanja osim što broj perlica u postupku baziranom na perlicama često može biti značajno veći od broja bazenčića u postupku razblaživanja. Dodatna prednost tokom postupaka emulziranja je ta da u postupku baziranom na perlicama, barkodovi su distribuirani deterministički (tj., jedan barkod po perlici) a ne nasumično (tj. Poisson distribuirane). Ti ovde opisani postupci takođe postižu isto inicijalno očuvanje molekulske netaknutosti i susednosti, ali bez potrebe za petljastim transpozom kompleksima koji se koriste u nekim drugim postupcima. Dodatno, ti ovde opisani postupci ne zahtevaju toliko veliki kodni prostor kakav se koristi u nekim drugim postupcima.

[0100] Shodno tome, postupak barkodovanja može da obuhvati obezbeđivanje populacije mikročestica sa transpozom kompleksima imobilizovanim na njima, pri čemu transpozom kompleksi obuhvataju transpozaza vezanu za prvi polinukleotid i drugi polinukleotid. Prvi polinukleotid može da obuhvata indeks domen povezan sa mikročesticama. Indeks domen može biti jedinstven mikročesticama.

Populacija mikročestica može da obuhvata najmanje nekoliko indeksa domena. Indeks domen može biti prisutan na više od jedne mikročestice u populaciji mikročestica. Mikročestica u populaciji mikročestica može da obuhvata više od jednog indeks domena.

[0101] Postupci barkodovanja koji su ovde opisani dalje obuhvataju nanošenje ciljane DNK na populaciju mikročestica, čime se generišu imobilizovani DNK fragmenti koji su tagovani indeks domenom. DNK može biti efikasno doveden u kontakt sa na površini vezanim transpozomima upotrebom bilo kog pogodnog postupka za povećavanje verovatnoće kontakta kako je ovde razmatrano, dato kao primer u WO 2010/115122.

[0102] Ovi postupci mogu se izvesti upotrebom bilo kojeg od raznih poznatih formata, na primer, sa kombinacijom reagenasa tagmentacije i niza perlica za pripremanje biblioteke, praćeno radom indeksovanog sekvencioniranja i analizom poručenih podataka. Bilo koji pogodni postupak koji održava perlice u statičkom odvajanju jedna od druge može se upotrebiti za površinsku tagmentaciju i indeksovanje uzoraka. Na primer, fizičke konfiguracije kao što su bazenčići ili mala udubljenja u supstratu koji može da zadržava perlice, tako da mikrosfera može da miruje u bazenčiću, ili upotreba drugih sila (magnetnih ili pritisnih), ili hemijski izmenjenih ili aktivnih mesta, kao što su hemijski funkcionalizovana mesta, elektrostatistički izmenjena mesta, hidrofobno i/ili hidrofilno funkcionalizovana mesta, ili tačke adheziva.

[0103] Mikrosfere mogu biti nekovalentno pridružene u bazenčićima, iako bazenčići mogu dodatno biti hemjski funkcionalizovani kako je generelano opisano u nastavku, agesni umrežavanja mogu se primeniti, ili se može upotrebiti fizička barijera, npr., film ili membrana preko perlica.

[0104] Površina supstrata može biti modifikovana da sadrži hemijski modifikovana mesta koja se mogu primeniti da pričvrste, ili kovalentno ili nekovalentno, mikrosfere ovog pronalaska za diskretna mesta ili lokacije na supstratu. "Hemijski modifikovana mesta" u ovom kontekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na, dodavanje šablona hemijski funkcionalnih grupa uključujući amino grupe, karboksi grupe, okso grupe i tiol grupe, oje se mogu upotrebiti da kovalentno pričvrste mikrosfere, koje generalno takođe sadrže odgovarajuće reaktivne funkcionalne grupe; dodavanje šablona adheziva koji se može primeniti za vezivanje mikrosfera (ili pre hemijske funkcionalizacije za dodavanje adheziva ili direktnog dodavanja adheziva); dodavanje šablona naelektrisanih grupa (slično hemijskim funkcionalnostima) za elektrostatično vezivanje mikrosfera, npr., kada mikrosfere obuhvataju naelektrisane grupe naspram mesta; dodavanje šablona hemijski funkcionalnih grupa koje daju mesta različito hidrofobna ili hidrofilna, tako da dodavanje slično hidrofobnih ili hidrofilnih mikrosfera pod pogodnim eksperimentalnim uslovima rezultuju u vezi sa mikrosferama prema mestima na bazi hidroafiniteta. Na primer, upotreba hidrofobnih mesta sa hidrofobnim perlicama, u vodenom sistemu, vozi povezanu perlicu preferencijalno na ta mesta. Kako je prethodno navedeno, "šablon" u ovom smislu uključuje

1

upotrebu uniformnog tretiranja površine radi omogućavanja vezivanja perlica na diskretnim mestima, kao i tretiranje površine dajući diskretna mesta. Kao što će biti cenjeno od strane stručnjaka iz ove oblasti, to se može postići na razne načine.

[0105] Mnoštvo perlica koje obuhvataju na površini vezane transpozomi može biti generisano, gde svaka perlica sadrži mnogo transpozoma, ali svi transpozomi na datoj perlici svi sadrže isti barkod. Generisanje populacije monoklonalnim barkodiranim transpozom oligonukleotidma na perlicama može se izvesti prema bilo kojoj od brojnih tehnika koje su poznate u struci, date kao primer u opisu U.S. 5,604,097.

[0106] FIG.13 prikazuje jedan primer izvođenja, u kojem na površini vezan transpozom sadrži duge oligonukleotide pričvršćen za površinu putem njenog 5’ kraja. Kako je navedeno na FIG.13, 3' kraj oligonukleotida obuhvata Mosaik kraj (METS) sekvence Tn5 transpozaza enzima. Ushodno ovoj sekvenci (bliže na 5’ kraju) je barkod sekvenca tipično 6-8 baza u dužini. Dalje ushodno je prajmer sekvenca. Dodatno, oligonukleotid može dalje da obuhvata mesto cepanja kako bi se omogućilo da se oligonukleotid pocepa sa površine: njegovo prisustvo na oligonukleotidu opciono je u odnosu na ceo postupak. Drugi kratak oligonukleotid ( netransferovan lanac, MENTS) hibridizovan je za METS sekvencu na 3' kraju duge površine kalemljenog oligonukleotida. Konačno, transpozaza dimer je složen na 3' kraj oligonukleotida radi formiranja funkcionalnog transpozoma.

[0107] FIG.14 prikazuje barkodovanje na perlicama u nizu bazenčića. Kako je prikazano na FIG.14, kada se dugi molekuli dsDNK dodaju na niz perlica-imobilizovanih transpozoma, dati molekul broji perlice i biva tagmentovan mnogo puta transpozomima na perlicama. Svaki fragment postaje imobilizovana na perlici i tagovan barkodom povezanim sa tom perlicom. U određenom primeru izvođenja prikazanom na FIG.14, fizičko odvajanje perlica u nizu čipova sprečava da DNK molekul dođe između dve perlice. U drugim primerima izvođenja, perlice su u bliskom kontaktu i jedan ili više DNK molekula mogu se pružati između dve ili više perlice. U nekim primerima izvođenja, više od jednog DNK molekula može biti tagmentovan po perlici. Verovatnoća dve alele koje su tagmentovane na istoj perlici je mala i predstavlja funkciju koncentracije dodate DNK, broja perlica i broja barkodova. Na primer, kako bi se izbeglo da se dve alele jave u istom bazenčiću, 0.1x haplom ekvivalenti (50,000 genomskih ekvivalenata) trebalo bi da se uvedu u 1 milion perlica svaka sa jedinstvenim barkodom.

[0108] FIG.15 prikazuje transfer barkodovanih tagovanih molekula u reakciju sekvenciranja. Kako je prikazano na FIG.15, kada je tagmentacija završena, DNK se transferuje sa površine perlica u rastvor tako da pojedinačni fragmenti mogu biti grupisani i pripremljeni za sekvenciranje. Sekvenciranje i

2

slaganje pozivanjem na barkodove omogućava da se sekvenca originalnih dugih tagmentovanih DNK molekula ponovo kreira, čime se omogućavaju duga ili pseudo-duga čitanja i faziranje SNP.

[0109] Oslobađanje barkodovanih na površini tagmentovanih fragmenata u rastvore može se postići upotrebom bilo koje metode kakva je poznata u struci. Na primer, u nekim primerima izvođenja, tagmentovani molekuli mogu se pocepati sa površine perlica cepajućom grupom prisutnom na 5’ kraju na površini vezanih oligonukleotida (videti FIG.13). Cepajuća grupa može biti bilo koja grupa pogodna za cepanje lanca nukleinske kiseline sa čvrstog nosača. Primeri postupaka koji koriste cepajuću grupu uključuju, ali nisu ograničeni na, restrikciono endonukleaza cepanje, hemijsko cepanje, RNaza cepanje, fotohemijsko cepanje, i slično, uključujući one postupke cepanja i cepajuće grupe navedene u WO 2006/064199.

[0110] Cepanje upotrebom cepajuće grupe daje molekul sledećeg formata: 5' - Prajmer - Barkod - ME -Umetak - ME - Barkod - Prajmer - 3'

[0111] "Prajmer" regioni mogu se upotrebiti kao hibridizacione tačke za hibridizovanje PCR izlaznih prajmera koji omogućavaju dodatne sekvence da se dodaju kao što su prajmeri amplifikacije i sekvenciranja. Na primer, amplifikacioni prajmeri P5 i P7 mogu biti dodati. Kada se dodaju, može se primeniti supresiona PCR, na primer, kako bi se obogatili molekuli koji imaju P5 adaptere na jednom kraju i P7 na drugom kraju.

[0112] Amplifikacija može se izvesti direktno off perlice with izlazni prajmeri that add P5 i P7 adapter sekvence by suppression PCR. U još jednom primeru izvođenja, svaka perlica može imati dve vrste na površini kalemljenih oligonukleotida u kojima prajmer sekvenca (kao na FIG.13) predstavlja ili P5-Čitanje1 prajmer sekvenciranja ili P7-Čitanje 2 prajmer sekvenciranja. To rezultuje u pomešanim P5-P7 transpozomima. Oni mogu biti pocepani sa perlica i praćeni supresionom PCR kako bi se obogatili P5/P7 molekuli ili amplifikovali direktno sa perlica, kako je prethodno opisano.

[0113] Jedna transpozom vrsta (npr. P5-Čitanje 1-barkod) može biti prisutna na površini perlice. Kada je površinska tagmentacija završena, drugi transpozom koji nosi različit prajmer amplifikacije i/ili sekvenciranja može se dodati rastvoru radi cepanja premošćenih molekula. To daje sve molekule sa istim adapter formatom koji može ili je pocepan ili amplifikovan sa površine perlica. Dodatni uzorakspecifičan barkod može se dodati rastvoru transpozoma tako da se više uzoraka može grupisati ovim postupkom. FIG.16 je izgled ovog primera izvođenja. Kako je prikazano na FIG.16, rastvor-fazni transpozomi koji nose P7 amplifikacionu prajmer sekvencu dodaju se na perlice sa imobilizovanim premošćenim proizvodima tagmentacije. Imobilizovani fragmenti tagovani su polinukleotidnom sekvencom koja obuhvata P5 amplifikacionu prajmer sekvencu i barkod indeks tagova (i9) koji je jedinstven toj perlici. Kako je prikazano na FIG.16, nakon druge reakcije tagmentacije, svaki fragment ima slobodan kraj koji nosi P7 prajmer sekvencu i imobilizovani kraj koji nosi P5 prajmer sekvencu.

PRIMER 1

Površina tagmentacija na protočnoj ćeliji

[0114] Ovaj primer opisuje eksperiment koji potvrđuje primer izvođenja prikazan na FIG.4a i 4b (površinska tagmentacija praćena tagmentacijom u rastvoru).

[0115] Eksperiment na 8 traka protočne ćelije izveden je upotrebom liste uslova i kontrola kakve su prikazane na FIG.6a i 6b. Traka 6 pokazuje potpunu ekspoziciju kraj ka kraju postupka: nefragmentovana E. coli genomska DNK dodata je protočnoj ćeliji nakon čega je tagmentovana na površini vezanim transpozomima. Zatim je primenjeno zagrevanje na protočnoj ćeliji kako bi se selektivno dehibridizovale nage ME sekvence čime se ukidaju kao ciljane za drugu reakciju tagmentacije kada je nakon toga dodat transpozom iz rastvora. Sledeći drugu reakciju tagmentacije, klasteri su generisani i izvodi se sekvencirani 'uparen-kraj' (2x36 bazna čitanja). Metrike sekvenciranja date su u slajdu 7 koji pokazuje da je u traci 6, 73.14% klastera provučeno kroz filtere, a 74.69 ovih je poravnato. To obezbeđuje dovoljno podataka za dobijanje površine veličine razmaka umetaka i procena različitosti biblioteka (videti FIG.8).

[0116] Druge trake uključuju kontrole koje su navedene ispod:

Traka 1 obuhvata PhiX DNK kao pozitivna kontrola kako bi se obezbedilo da je sve upumpano kako treba i da klaster generisanje i sekvenciranje radi kako j očekivano.

Traka 2 je još jedna kontrolna traka i prikazuje tagmentaciju u na površini vezanim transpozomima bez ciljane DNK. Protočna ćelija (FC) obuhvata standardno uparen kraj FC na koji je oligonukleotid koji sadrži tagmentacionu prajmer sekvencu i ME' sekvencu (netransferovan ME' lanac) hibridizovan na P7 površinskom oligonukleotidu. Taj oligonukleotid dodaje se pri zasićenoj koncentraciji. Prvo produženje rezultat je dvolančanog transpozona sa ME krajevima. P5 transpozom je složen u rastvoru i protečen na FC (6.25 nM/traka). P5 transpozom tagmentuje dvolančane na površini vezane transpozome. Proizvodi tagmentacije naknadno su konvertovani u klastere.

Traka 3 prikazuje tagmentacija u na površini vezanim transpozomima bez ciljane DNK, samo u ovom slučaju FC je zagrejana do 75°C radi konvertovanja ds na površini vezanih transpozoma u jednolančane oligonukleotide pre dodavanja P5 transpozoma iz rastvora radi sprečavanja tagmentacije u ovim konstruktima, budući da se ona meša sa tagmentacijom ciljane DNK.

4

Traka 4 prikazuje dodavanje na površini vezanog transpozoma uslovima trake 3. U ovoj traci oligonukleotid koji sadrži tagmentacionu prajmer sekvencu i ME' sekvencu hibridizovan je na P7 površinskom oligonukleotidu. Prvo produženje rezultuje u dvolančanom transpozomu sa ME krajevima. Sledeći ovo, P7 transpozom slaže se na površinu FC dodavanjem Tn5 enzima traci na 50X koncentracije i inkubiše na 30°C tokom 30 minuta. FC je zatim zagrejan do 75°C pre dodavanje P5 transpozoma iz rastvora.

Traka 5 obuhvata iste uslove kao traka 4, samo u ovom slučaju umesto dodavanja P5 transpozoma iz rastvora, E. coli 900 bp biblioteka (sa P5/P7 krajevima) dodata je radi određivanja da li P7 na površini vezan transpozom ostaje aktivan nakon faze zagrevanja.

Traka 6 prikazuje jedan primer ovog pronalaska stavljen u praksu. U ovom slučaju FC obuhvata standardni uparen kraj FC na koji je oligonukleotid koji sadrži tagmentacionu prajmer sekvencu i ME' sekvencu, hibridizovan za P7 površinu oligonukleotid. Prvo produženje rezultuje u dvolančanim transpozomima sa ME krajevima. P7 transpozomi složeni su na površini FC dodavanjem Tn5 enzima traci na 50X koncentraciji i inkubisani na 30°C tokom 30 minuta. Ciljana DNK (300ng nefragmentovane E. coli genomske DNK) dodata je na FC traku i faza inkubacije od 15 min na 55°C izvedena je radi započinjanja tagmentacije. P7 na površini vezan transpozom spran je upotrebom PBI (Qiagen) i FC je zatim zagrejana do 75°C pre dodavanje P5 transpozoma iz rastvora. Sledeći dodavanje P5 transpozoma iz rastvora i fazu inkubacije od 15 min na 55°C, reakcija produženja izmeštanja postolja izvedena je radi ispunjavanja 9-bp razmaka generisanih u DNK kičmi reakcijom premeštanja. Reakcija produženja izmeštanja postolja obuhvata dodavanje Bst i dNTP miksa i inkubaciju na 65°C tokom 5 min. P5 transpozom spran je u konačnoj fazi. U tom trenutku svi na površini vezani molekuli trebalo bi da su P5-P7 šabloni i te prema tome mogu biti konvertovani u klastere.

Traka 7 obuhvata iste uslove kao traka 6, samo u ovom slučaju faza zagrevanja je izostavljena radi podvlačenja efekta zagrevanja na broj klastera i % poravnanja.

Traka 8 obuhvata negativnu kontrolu u kojoj je P7 transpozom složen na površini pri 50X koncentraciji u prisustvu zasićene koncentracije ds na površini vezanih transpozoma, međutim, nije dodata nikakva ciljana DNK. To omogućava određivanja da li je na površini vezani P7 transpozom tagmentovan u svoje susedne ds na površini vezane transpozome.

PRIMER 2

Pripremanje na površini vezanih uzoraka iz strugotina E. coli

[0117] E. coli uzorak (5mm sa 2mm strugotina sa travnjaka na agar ploči) sastrugan je i resuspendovan je u cevi kojasadrži vodu i staklene perlice. Suspendovane ćelije umešane su upotrebom vorteks mešalice kako bi se razbile ćelije, a zatim centrifugirale u peletni čelijski debris. Supernatant (koji sadrži ćelijski lizat, uključujući proteine i nukleinske kiseline) je uklonjen i dodat Genome Analyzer protočnoj ćeliji (Illumina, Inc., San Diego, CA) sa imobilizovanim transpozomima prema protokolu opisanom u primeru 1.

[0118] Klaster generisanje izvedeno je na protočnoj ćeliji upotrebom Cluster Station uređaja za pripremanje uzoraka (Illumina, Inc., San Diego, CA). Nakon generisanja klastera, izvedeno je sprovođenje sekvenciranja uparenog-kraja sa čitanjima od 36 baza u svakom pravcu.

[0119] Za Čitanje 1, 58.99% klastera prošlo je kroz filtere, a 92.16 ovih je poravnato. Za Čitanje 2, 58.99% klastera kroz filtere, a 55.08 ovih je poravnato. Ovi podaci potvrđuju da neprečišćeni ćelijski lizati mogu da se dodaju direktno protočnoj ćeliji sa imobilizovanim transpozomima sa začuđujuće robustnim sekvencionim rezultatima.

PRIMER 3

[0120] Ovaj primer opisuje postupke zaobilaženja na površini vezanih oligonukleotidnih dupleksa kada se rastvor fazni transpozomi dodaju protočnoj ćeliji.

[0121] Jedan postupak za slaganje transpozoma na površini protočne ćelije je da se uzme standardna uparenog kraja protočna ćelija, hibridizuje vezni oligonukleotid na P5 i/ili P7 površini kalemljenim oligonukleotidima formirajući produžavajući prepust koji može biti proširen sa polimerazom kako bi se izradio dupleks koji sadrži dvolančanu ME sekvenca. U toj fazi transpozaza enzim može biti dodat kako bi se formirao funkcionalni na površini vezan transpozom (FIG.5d). Ukoliko samo deo dupleksa formira transpozon, preostali 'goli' ME dupleksi mogu naknadno postati mete za tagmentaciju putem ili blizu na površini vezanih transpozoma ili transpozoma dodatih iz rastvora. Dalje, potpuno složeni na površini transpozomi sadrže dsDNK delove ushodno od ME sekvenci koje takođe mogu da postanu mete za tagmentaciju susednim na površini vezanim transpozomima ili transpozomima dodatim iz rastvora. Ova neželjena tagmentacija sama se manifestuje u smanjenju procenta klastera koji prolaze filtrere prečišćavanja koji se poravnavaju sa ciljanim genomom.

[0122] Jedan primer ovog efekta može se videti poređenjem traka 4 i 5 naspram traka 6 i 7 na FIG.18b. U trakama 6 i 7 transpozomi su složeni kako je gore opisano sa dugim veznim oligonukleotidima koji, nakon produženja i slaganje transpozona, proizvode na površini vezane dupleke koji imaju najmanje 50 dvolančanih baza. Nakon upotrebe u površinskoj reakciji tagmentacije (FIG.18a) i naknadnom sekvenciranju, samo 22.59 i 15.52% klastera poravnato je sa ciljanom E.coli respektivno (FIG.18b).

[0123] kako bi se zaobišlo proizvođenje populacije klastera koja sadrži sekvence koje se ne poravnavaju sa ciljanom genomskom DNK, slaganje transpozona izvedeno je kako je prikazano na FIG.17. Vezni oligonukleotid prvi je hibridizovan prema P5 i/ili P7 na površini kalemljenim oligonukleotidima koji formiraju proširujući prepust koji bi mogao da se proširi sa polimerazom kako bi se napravio dupleks koji sadrži dvolančanu ME sekvencu. Dalje, vezni oligonukleotid uklonjen je deporavnavanjem i spiranjem, a zatim je zamenjen hibridizovanjem kraćeg oligonukleotida malog poput 12 baza dužine, ali poželjno 16 baza dužine za 3’ kraj na površini pričvršćenog ME oligonukleotida. Transpozaza je dodat je radi slaganja transpozoma koji ne sadrži bilo koju izloženu dsDNK. Bilo koji 'goli' dupleksi koji ne sadrže vezan transpozazu, uklonjeni su inkubisanjem protočne ćelije na 60°C i pranjem pod uslovima protoka radi selektivnog de-poravnavanja i uklanjanja kratkog dupleksa DNK.

[0124] Dobrobitni efekti ovog pristupa za slaganje transpozoma može se videti na trakama 4 i 5 gde su na površini vezani transpozomi složeni ovim postupkom i korišćeni u površinskoj reakciji tagmentacije (FIG.18a). Procenat klastera koji se poravnava sa E.coli povećava se od 22.59 i 15.52% za trake 6 i 7 respektivno, do 96.47 i 96.41 za trake 4 i 5 respektivno (FIG.18b).

[0125] Izraz obuhvata ovde je namenjen da bude otvorenih krajeva, uključujući ne samo navedene elemente, već obuhvatajući dalje bilo koje dodatne elemente.

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak pripremanja imobilizovane biblioteke tagovanih DNK fragmenata, koji obuhvata:

(a) obezbeđivanje čvrstog nosača sa više transpozom kompleksa koji su na njemu imobilizovan, gde pomenuti transpozom kompleksi svaki obuhvata:

transpozazu nekovalentno vezanu za prvi polinukleotid dvolančane nukleinske kiseline koja obuhvata prvi i drugi polinukleotid, gde je pomenuti prvi polinukleotid imobilizovan za pomenuti čvrsti nosač, i gde pomenuti prvi polinukleotid obuhvata

(i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i

(ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga;

i gde pomenuti drugi polinukleotid obuhvata region komplementaran pomenutoj krajnjoj sekvenci transpozona;

i gde su transpozom kompleksi homodimeri, pri čemu ti homodimeri koji obuhvataju prvo mnoštvo homodimera koji obuhvataju prvi tag prve sekvence i drugo mnoštvo homodimera koji obuhvataju prvi tag druge sekvence;

(b) nanošenje ciljane dvolančane DNK na čvrsti nosač pod uslovima u kojima je ciljana DNK fragmentovana transpozom kompleksima, a 3’ krajnja sekvenca transpozona prvog polinukleotida transferovana je na 5' kraj najmanje jednog lanca fragmenata; čime se proizvodi imobilizovana biblioteka dvolančanih fragmenata gde je najmanje jedan lanac 5'-tagovan prvim tagom prve sekvence, a najmanje jedan lanac je 5'-tagovan prvim tagom druge sekvence.

2. Postupak prema zahtevu 1, gde je 3’ krajnja sekvenca transpozona prvog polinukleotida transferovana na 5’ krajeve oba lanca fragmentovane ciljane dvolančane DNK.

3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, koji dalje obuhvata pranje čvrstog nosača radi uklanjanja bilo koje nevezane nukleinske kiseline.

4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-3, gde su transpozom kompleksi prisutni na čvrstom nosaču u gustini od najmanje 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>kompleksa po mm<2>, ili gde pomenuti transpozom kompleks obuhvata hiperaktivnu Tn5 transpozazu.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-4, gde su dužine dvolančanih fragmenata u pomenutoj imobilizovanoj biblioteci podešene povećavanjem ili smanjivanjem gustine transpozom kompleksa prisutnih na pomenutom čvrstom nosaču.

6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-5, gde najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% tagova prisutnih na pomenutom čvrstom nosaču obuhvata isti domen taga.

7. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-6, koji dalje obuhvata:

(c) obezbeđivanje transpozom kompleksa u rastvoru i dovođenje u kontakt pomenutih transpozom kompleksa u rastvoru sa imobilizovanim fragmentima pod uslovima u kojima je ciljana DNK dalje fragmentovana transpozom kompleksima u rastvoru; čime se dobijaju imobilizovani fragmenti nukleinske kiseline sa jednim krajem u rastvoru.

8. Postupak prema zahtevu 7, gde transpozom kompleksi u rastvoru obuhvataju drugi tag, čime se generišu imobilizovani fragmenti nukleinske kiseline sa drugim tagom u rastvoru.

9. Postupak prema zahtevu 8, gde su prvi i drugi tagovi različiti.

10. Postupak prema bilo kom od zahteva 7-9, gde najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% pomenutih transpozom kompleksa u rastvoru obuhvata drugi tag koji obuhvata drugi domen taga.

11. Postupak prema zahtevu 8, koji dalje obuhvata amplifikovanje fragmenata na pomenutoj čvrstoj površini obezbeđivanjem polimeraze i amplifikacionog prajmera koji odgovara delu prvog polinukleotida.

12. Postupak prema zahtevu 1, gde pomenuti domen taga obuhvata region za amplifikaciju klastera, ili region za prajming reakcije sekvenciranja.

13. Postupak prema zahtevu 1, gde čvrsti nosač obuhvata mikročestice, ili šablonizovanu površinu, ili bazenčiće.

14. Čvrsti nosač sa bibliotekom tagovanih DNK fragmenata koji su na njemu imobilizovani i pripremljeni postupkom prema bilo kom od zahteva 1-13.

15. Čvrsti nosač sa transpozom kompleksima koji su na njemu imobilizovani, pri čemu svaki transpozom kompleks obuhvata transpozazu nekovalentno vezanu za prvi polinukleotid dvolančane nukleinske kiseline koja obuhvata prvi i drugi polinukleotid, gde je pomenuti prvi polinukleotid imobilizovan za pomenuti čvrsti nosač, i gde pomenuti prvi polinukleotid obuhvata

(i) 3’ deo koji obuhvata krajnju sekvencu transpozona, i

(ii) prvi tag koji obuhvata domen prvog taga;

i gde su transpozom kompleksi homodimeri, ri čemu ti homodimeri obuhvataju prvo mnoštvo homodimera koji obuhvataju prvi polinukleotid prve sekvence i drugo mnoštvo homodimera koji obuhvataju prvi polinukleotid druge sekvence.

4