RS57963B1 - Miševi koji eksprimiraju humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti - Google Patents

Description

Opis

SPISAK SEKVENCI

[0001] Ova specifikacija upućuje na spisak sekvenci dostavljenih u elektronskoj formi kao ascii.txt fajl pod nazivom "2010794-0424_ST25" dana 20. februara 2014. godine. txt. datoteka je generisana 20. februara 2014. godine i iznosi 8 kb.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na genetski modifikovanu ne-humanu životinju, na primer, na glodara (npr., miša ili pacova), koji eksprimira humani ili humanizovani Glavni Kompleks Histokompatibilnosti (MHC) klase I i humane ili humanizovane molekule MHC klase II. Pronalazak se takođe odnosi na genetski modifikovanu ne-humanu životinju, npr., miša ili pacova, koji eksprimira humani ili humanizovani MHC I protein (npr., MHC I α lanac) i humani ili humanizovani MHC II protein (npr., MHC II α i MHC II β lance), a dalje eksprimira humani ili humanizovani β2 mikroglobulin; kao i embrioni, tkiva i ćelije koje eksprimiraju isto. Pronalazak dalje obezbeđuje metode za genetski modifikovanu nehumanu životinju koja eksprimira humane i humanizovane proteine MHC klase I i klase II i/ili β2 mikroglobulin. Takođe su obezbeđene metode za identifikaciju i procenu peptida u kontekstu humanizovanog ćelijskog imunološkog sistema in vitro ili u genetski modifikovanoj ne-humanoj životinji, kao i metode za modifikovanje MHC lokusa ne-humane životinje, npr., miša ili pacova, da eksprimira humane ili humanizovane MHC I i humane ili humanizovane proteine MHC II.

POZADINA

[0003] U adaptivnom imunološkom odgovoru, strani antigeni su prepoznati od strane receptorskih molekula na B limfocitima (npr., imunoglobulinu) i T limfocitima (npr., T ćelijski receptor ili TCR). Ovi strani antigeni su predstavljeni na površini ćelija kao peptidni delovi specijalizovanih proteina, koji se generički nazivaju glavnim molekulima kompleksa histokompatibilnosti (MHC). MHC molekuli su kodirani pomoću višestrukih lokusa koji se nalaze kao vezani klaster gena koji se prostire oko 4 Mb. Kod miševa, MHC geni se nalaze na hromozomu 17, a iz istorijskih razloga se nazivaju geni histokompatibilnosti 2 (H-2). Kod ljudi, geni se nalaze na hromozomu 6 i nazivaju se geni humanog leukocitnog antigena (HLA). Lokus kod miševa i ljudi su poligeni; oni uključuju tri vrlo polimorfne klase MHC gena (klase I, II i III) koje pokazuju sličnu organizaciju u humanim i genomima glodara (videti Sl.2 i Sl.3, respektivno).

[0004] MHC lokusi pokazuju najviši polimorfizam u genomu; neki geni su predstavljeni sa > 300 alela (npr., humani HLA-DRβ i humani HLA-B). Svi geni MHC klase I i II mogu da predstavljaju peptidne fragmente, ali svaki gen eksprimira protein sa različitim karakteristikama vezivanja, odražavajući polimorfizme i alelne varijante. Svaki dati pojedinac ima jedinstveni raspon peptidnih fragmenata koji se mogu prikazati na površini ćelije na B i T ćelijama tokom imunološkog odgovora.

[0005] I ljudi i miševi imaju gen MHC klase I (videti Sl.2 i Sl.3). Kod ljudi, klasični geni klase I nazivaju se HLA-A, HLA-B i HLA-C, dok kod miševa to su H-2K, H-2D i H-2L. Molekuli klase I se sastoje od dva lanca: polimorfni α-lanac (ponekad se naziva teški lanac) i manji lanac koji se zove β2-mikroglobulin (poznat i kao laki lanac), koji generalno nije polimorfan (Sl. 1, levo). Ova dva lanca čine nekovalentni heterodimer na površini ćelije. α-lanac sadrži tri domena (α1, α2 i α3). Ekson 1 gena α-lanca kodira sekvencu lidera, eksoni 2 i 3 kodiraju domene α1 i α2, ekson 4 kodira domen α3, ekson 5 kodira transmembranski domen, a eksoni 6 i 7 kodiraju citoplazmatski rep. α-lanac formira peptidno-vezujući rascep koji uključuje domene α1 i α2 (koje liče na Ig domene), nakon čega sledi α3 domen, koji je sličan β2-mikroglobulinu.

[0006] β2 mikroglobulin je ne-glikozilovani protein 12 kDa; jedna od njegovih funkcija je da stabilizuje MHC klasu I α-lanac. Za razliku od α-lanca, β2 mikroglobulin ne obuhvata membranu. Humani lokus β2 mikroglobulina nalazi se na hromozomu 15, dok je lokus miša na hromozomu 2. β2 mikroglobulinski gen sastoji se od 4 eksona i 3 introna. Cirkulišući oblici β2 mikroglobulina su prisutni u serumu, urinima i drugim telesnim tečnostima; ne-kovalentno MHC I-pridruženi β2 mikroglobulin može se zameniti sa cirkulišućim β2 mikroglobulinom pod fiziološkim uslovima.

[0007] MHC molekuli klase I eksprimirani su na svim jezgrastim ćelijama, uključujući tumorske ćelije. Eksprimirani su specifično na T i B limfocitima, makrofagama, dendritičnim ćelijama i neutrofilima, između ostalih ćelija i imaju funkciju da prikazuju peptidne fragmente (tipično dužine 8-10 aminokiselina) na površini do CD8+ citotoksičnih T limfocita (CTLs). CTLs su specijalizovani za ubijanje bilo koje ćelije koja nosi MHC I-vezani peptid prepoznat od strane sopstvene TCR vezane za membranu. Kada ćelija prikazuje peptide izvedene iz ćelijskih proteina koji nisu obično prisutni (npr., virusnog, tumorskog ili drugog ne-sopstvenog porekla), takvi peptidi prepoznaju CTLs, koji se aktiviraju i ubijaju ćeliju koja prikazuje peptid.

[0008] I ljudi i miševi imaju gene MHC klase II (videti Slike 2 i 3). Kod ljudi, klasični MHC geni klase II nazivaju se HLA-DP, HLA-DQ i HLA-DR, dok kod miševa to su H-2A i H-2E (često skraćeno kao I-A i I-E, respektivno). Dodatni proteini kodirani sa genom u MHC II lokusu, HLA-DM i HLA-DO kod ljudi i H-2M i H-2O kod miševa, nisu pronađeni na površini ćelije, već se nalaze u endocitnom delu i obezbeđuju odgovarajuće opterećenje MHC II molekula sa peptidima. Molekuli klase II se sastoje od dva polipeptidna lanca: α lanac i β lanac. Vanćelijski deo α lanca sadrži dva vanćelijska domena, α1 i α2; a vanćelijski deo β lanca takođe sadrži dva vanćelijska domena, β1 i β2 (videti Sl. 1, desno). α i β lanci su nekovalentno povezani jedni sa drugima

[0009] MHC molekuli klase II se eksprimiraju na ćelijama koje predstavljaju antigen (APCs), npr., B ćelijama, makrofagima, dendritičnim ćelijama, endotelnim ćelijama u toku inflamacije itd. MHC II molekuli eksprimirani na površini APC-a tipično predstavljaju antigene generisane u intracelularnim prenosiocima CD4+ T ćelija. Da bi učestvovali u angažovanju CD4+ T ćelija, kompleks MHC klase II sa antigenom od interesa mora biti dovoljno stabilan da bi preživeo dovoljno dugo da bi uključio CD4+ T ćeliju. Kada je CD4+ T pomoćna ćelija angažovana stranim kompleksom peptida/MHC II na površini APC-a, T ćelija se aktivira da oslobodi citokine koji pomažu u imunološkom odgovoru na napadača.

[0010] Nisu svi antigeni izazvali aktivaciju T ćelija usled mehanizama tolerancije. Međutim, kod nekih bolesti (npr., kancera , autoimunih bolesti) peptidi koji se dobijaju od svojih proteina postaju meta celularne komponente imunološkog sistema, što dovodi do uništavanja ćelija koje predstavljaju takve peptide. Postignut je značajan napredak u prepoznavanju antigena koji su klinički značajni (npr., antigeni povezani sa različitim vrstama karcinoma). Međutim, u cilju poboljšanja identifikacije i selekcije peptida koji će izazvati odgovarajući odgovor u humanoj T ćeliji, posebno za peptide klinički značajnih antigena, ostaje potreba za in vivo i in vitro sistemima koji imitiraju aspekte imunološkog sistema čoveka. Prema tome, postoji potreba za biološkim sistemima (npr., genetski modifikovanim ne-humanim životinjama i ćelijama) koje mogu prikazati komponente humanog imunološkog sistema.

[0011] US 2007/209083 A1 i US 2005/066375 A1 opisuju transgenske životinje i ćelije koje sadrže nukleotide koji kodiraju humani polipeptid koji je uključen u prepoznavanje i/ili antigensku aktivaciju T ćelija i njihovo korišćenje u metodama za proučavanje imunološke modulacije.

[0012] Arnold & Hammerling, ANNUAL REVIEW OF IMMUNOLOGY, 9, 297-322, (1991) sumira transgenske modele miševa koji su uspostavljeni sa glavnim kompleksima histokompatibilnosti (MHC) klase-I.

[0013] Vitiello i dr., THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, 173, 1007-1015, (1991) opisuje konstrukciju i karakterizaciju transgenskih linija miša koji eksprimira himerne glavne histokompatibilne komplekse molekula (MHC) klase-I.

[0014] Ito i dr., THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, 183, 2635-2644, (1996) opisuje generisanje i karakterizaciju transgenih miševa radi ispitivanja razvoja autoimunih bolesti povezanih sa HLA-DR.

REZIME

[0015] Pronalazak je naveden u pratećim patentnim zahtevima. Biološki sistem za generisanje ili identifikaciju peptida koji se povezuju sa humanim MHC proteinima klase I i njegovim himerima i vezuju CD8+ T ćelije, kao i peptidi koji se povezuju sa humanim MHC proteinom klase II i njegovim himerima i vezuju se za obelodanjene CD4+ ćelije, je obelodanjen. Obelodanjene su ne-humane životinje koje sadrže ne-humane ćelije koje eksprimiraju humanizovane molekule koji funkcionišu u ćelijskom imunološkom odgovoru. Obelodanjeni su humanizovani lokusi glodara koji kodiraju humanizovane proteine MHC I i MHC II i humanizovane ćelije glodara koje eksprimiraju humanizovane MHC molekule. Sistemi in vivo i in vitro su obelodanjeni koji obuhvataju humanizovane ćelije glodara, pri čemu ćelije glodara eksprimiraju jedan ili više molekula humanizovanog imunog sistema.

[0016] Ovde se obelodanjuje ne-humana životinja koja sadrži na endogenom MHC lokusu prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani/ne-humani MHC I polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC I polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog MHC I polipeptida; druga nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/ne-humani MHC II α polipeptid, pri čemu humani deo himernog humanog/nehumanog MHC II α polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog MHC II α polipeptida; i treća nukleotidna sekvenca koja kodira humani/ne-humani himerni MHC II β polipeptid, pri čemu humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II β polipeptida čoveka obuhvata vanćelijski domen humanog MHC II β polipeptida, pri čemu ne-humane životinje eksprimiraju funkcionalne himerne humane/ne-humane MHC I i MHC II proteine iz svog endogenog ne-humanog MHC lokusa. U jednom otelotvorenju obelodanjivanja, životinja ne eksprimira funkcionalne endogene MHC I, II α i/ili II β polipeptide iz endogenog ne-humanog MHC lokusa.

[0017] U jednom otelotvorenju obelodanjivanja, prva nukleotidna sekvenca se nalazi na endogenom nehumanom MHC I lokusu, druga nukleotidna sekvenca se nalazi na endogenom ne-humanom MHC II α lokusu, a treća nukleotidna sekvenca se nalazi na endogenom ne-humanom MHC II β lokus. U jednom aspektu, prva, druga i/ili treća nukleotidna sekvenca operativno su vezane za endogene ne-humane regulatorne elemente. U jednom aspektu, prva nukleotidna sekvenca operativno je povezana sa endogenim ne-humanim MHC I promoterom i regulatornim elementima, druga nukleotidna sekvenca operativno je povezana sa endogenim ne-humanim MHC II α promoterom i regulatornim elementima, a treća nukleotidna sekvenca operativno povezan sa endogenim ne-humanim MHC II β promoterom i regulatornim elementima.

[0018] Humani deo himernog MHC I polipeptida sadrži α1, α2 i α3 domene humanog MHC I polipeptida. U jednom aspektu, ne-humani deo himernog MHC I polipeptida sadrži transmembranske i citoplazmatične domene endogenog ne-humanog MHC I polipeptida. Humani MHC I polipeptid može se odabrati iz grupe koju čine HLA-A, HLA-B i HLA-C. U jednom otelotvorenju, humani MHC I polipeptid je HLA-A2. U drugom aspektu, humani MHC I polipeptid je HLA-A3, HLA-B7, HLA-B27, HLA-Cw6 ili bilo koji drugi molekul MHC I izražen u ljudskoj populaciji. U dodatnom otelotvorenju ne-humana životinja obelodanjivanja dalje sadrži na svom endogenom ne-humanom β2 mikroglobulinskom lokusu nukleotidnoj sekvenci koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid, pri čemu životinje eksprimiraju humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid.

[0019] Kao što je ovde obelodanjeno, humani MHC II α vanćelijski domen može sadržati humane MHC II α1 i α2 domene. Kao što je ovde obelodanjeno, humani MHC II β vanćelijski domen može sadržati humane MHC II β1 i β2 domene. Ne-humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II α polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene endogenog ne-humanog MHC II α polipeptida. Ne-humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II β polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene endogenog ne-humanog MHC II β polipeptida. U jednom otelotvorenju, humani delovi himernih humanih/mišjih MHC II α i β polipeptida izvedeni su iz humanog proteina HLA klase II odabranog iz grupe koja se sastoji od HLA-DR, HLA-DK i HLA-DP. U jednom specifičnom otelotvorenju, humani delovi himernih humanih/ne-humanih MHC II α i β polipeptida izvedeni su iz humanog HLA-DR4 proteina. Alternativno, humani delovi himernih humanih/ne-humanih MHC II α i β polipeptida mogu biti izvedeni iz humanog MHC II proteina izabranog iz grupe koju čine HLA-DR2, HLA-DK2.5, HLA-DK8 ili bilo kog drugog molekula MHC II eksprimiranog u ljudskoj populaciji.

[0020] U nekim aspektima, data životinja sadrži dve kopije MHC lokusa koji sadrže prvu, drugu i treću nukleotidnu sekvencu, dok u drugim aspektima data životinja sadrži jednu kopiju MHC lokusa koja sadrži prvu, drugu i treću nukleotidnu sekvencu. Prema tome, životinja može biti homozigotna ili heterozigotna za MHC lokus koji sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju humane/ne-humane MHC I, MHC II α i MHC II β polipeptide. U nekim otelotvorenjima, genetički modifikovan MHC lokus, koji sadrži nukleotidne sekvence koji kodiraju humane/ne-humane MHC I, MHC II α i MHC II β polipeptide koji su ovde opisani, nalazi se u germinacijskoj liniji životinje koja nije čovek.

[0021] Takođe se obelodanjuje MHC lokus koji sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani/nehumani MHC I polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC I polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog MHC I polipeptida; drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/ne-humani polipeptid MHC II α, pri čemu humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II α polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog MHC II α polipeptida; i treću nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni MHC II β polipeptid, čiji humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II β polipeptida čine vanćelijski domen humanog MHC II β polipeptida. Ne-humani delovi himernih MHC I, II α i II β polipeptida sadrže transmembranske i citoplazmatične domene ne-humanih MHC I, II α i II β, respektivno.

[0022] U jednom otelotvorenju, genetski projektovana ne-humana životinja jeste glodar. U jednom otelotvorenju, glodar je pacov ili miš. U jednom otelotvorenju, glodar je miš. Tako, u jednom aspektu, prva nukleotidna sekvenca kodira himerni humani/mišiji MHC I polipeptid, a mišiji deo himernog MHC I polipeptida izveden je iz H-2K, H-2D ili H-2L. U jednom specifičnom otelotvorenju, mišiji deo himernog MHC I polipeptida izveden je iz H-2K. U jednom aspektu, druga nukleotidna sekvenca kodira himerni humani/mišiji MHC II α polipeptid, treća nukleotidna sekvenca kodira himerni humani/mišiji MHC II β polipeptid, a delovi mišijeg himernog MHC II α i β polipeptida izvedeni su iz H-2E ili H-2A. U jednom specifičnom otelotvorenju, mišiji deo himernog MHC II polipeptida izveden je iz H-2E.

[0023] Ovde se obelodanjuje genetski projektovani miš koji sadrži na endogenom MHC lokusu prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani/ne-humani MHC I polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC I polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog MHC I polipeptida; druga nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/ne-humani MHC II α polipeptid, pri čemu humani deo himernog humanog/nehumanog MHC II α polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog MHC II α polipeptida; i treća nukleotidna sekvenca koja kodira humani/ne-humani himerni MHC II β polipeptid, pri čemu humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II β polipeptida čoveka obuhvata vanćelijski domen humanog MHC II β polipeptida, pri čemu ne-humane životinje eksprimiraju funkcionalne himerne humane/ne-humane MHC I i MHC II proteine iz svog endogenog ne-humanog MHC lokusa. U jednom specifičnom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca kodira himerni HLA-A2/H-2K polipeptid, druga nukleotidna sekvenca kodira α lanac himernog polipeptida HLA-DR4/H-2E, a treća nukleotidna sekvenca kodira β lanac himernog HLA-DR4/H-2E polipeptida, a miš eksprimira funkcionalne HLA-A2/H-2K i HLA-DR4/H-2E proteine. U dodatnom otelotvorenju, miš dalje sadrži na endogenom mestu β2 mikroglobulina nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid. U jednom otelotvorenju, miš ne eksprimira funkcionalne endogene MHC polipeptide iz svog endogenog MHC lokusa.

[0024] Ovde su takođe obelodanjene metode za stvaranje genetski modifikovane životinje koja nije čovek (npr., glodar, npr., miš ili pacov) koje su ovde opisane. Tako, u jednom aspektu, opisana je metoda generisanja genetički modifikovane ne-humane životinje koja obuhvata zamenu, kod endogenog nehumanog MHC II lokusa, nukleotidne sekvence koja kodira ne-humani MHC II kompleks sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/ne-humani MHC II kompleks da generiše prvu nehumanu životinju; i zamenjuje na endogenom ne-humanom MHC I lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira ne-humani MHC I polipeptid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni polipeptid humanog/ne-humanog MHC I da generiše drugu ne-humanu životinju. U jednom aspektu, koraci zamene nukleotidnih sekvenci sadrže homolognu rekombinaciju u ne-humanim ES-ćelijama, a druga ne-humana životinja je generisana homolognom rekombinacijom u ES-ćelijama koje kodiraju nukleotidne sekvence himernog humanog/ne-humanog MHC II kompleksa. Himerni MHC II kompleks sadrži himerne humane/ne-humane MHC II α i β polipeptide.

[0025] U alternativnom otelotvorenju, opisana je metoda generisanja genetički modifikovane ne-humane životinje koja obuhvata zamenu, kod endogenog nehumanog MHC I lokusa, nukleotidne sekvence koja kodira ne-humani MHC I polipeptid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid da generiše prvu ne-humanu životinju; i zamenjuje na endogenom ne-humanom MHC II lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira ne-humani MHC II kompleks sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni kompleks humanog/ne-humanog MHC I da generiše drugu ne-humanu životinju. U jednom aspektu, koraci zamene nukleotidnih sekvenci sadrže homolognu rekombinaciju u ne-humanim ES-ćelijama, a druga ne-humana životinja je generisana homolognom rekombinacijom u ES-ćelijama koje kodiraju nukleotidne sekvence himernog humanog/ne-humanog MHC I polipeptida.

[0026] Takođe su obelodanjene ćelije, na primer, izolovane ćelije koje predstavljaju antigen, dobijene iz ne-humanih životinja (npr. glodara, npr., miševa ili pacova) koje su ovde opisane. Tkiva i embrioni dobijeni iz ne-humanih životinja koje su ovde opisane, takođe su date.

[0027] Bilo koje od otelotvorenja i aspekata opisanih ovde može se koristiti zajedno jedni sa drugima, osim ako nije drugačije naznačeno ili očigledno iz konteksta. Ostala otelotvorenja će postati očigledna stručnjacima iz pregleda detaljnog opisa koji sledi. Sledeći detaljni opis uključuje primerne prikaze različitih varijanti obelodanjivanja. Priložene slike predstavljaju deo ove specifikacije i zajedno sa opisom služe samo za ilustraciju otelotvorenja i ne da ograniče pronalazak.

KRATAK OPIS SLIKA

[0028]

Sl. 1 je šematski prikaz MHC I (levi panel) i molekula klase MHC II (desni panel) koji su eksprimirani na površini ćelije. Sivi krugovi predstavljaju peptide vezane u peptidno-vezujućim rascepima.

Sl. 2 je šematski prikaz (nije u razmeri) relativne genomske strukture humanog HLA, pokazujući gene klase I, II i III.

Sl. 3 je šematski prikaz (nije u razmeri) relativne genomske strukture humanog MHC, pokazujući gene klase I, II i III.

Sl. 4 prikazuje strategiju za generisanje humanizovanog MHC lokusa koji sadrži humanizovane MHC I i MHC II gene. U prikazanom konkretnom otelotvorenju, MHC lokus generisanog miša sadrži humane HLA-A2 i HLA-DR4 sekvence (H2-K<+/1666>MHC-II<+/1681>). Veliki ciljani vektori uvedeni u ES ćelije u svakoj fazi humanizacije su prikazani desno od strelica.

Sl. 5 (A-D) je šematska ilustracija strategije (nije u razmeri) za generisanje ciljanog vektora koji obuhvata humanizovani I-E β i I-E α (tj., H-2Eβ/HLA-OPPβ1*04 i H-2Eα/HLA-DRα*01 himer, respektivno) . Na Sl. 5C, konačna humanizovana MHC II sekvenca sa Sl. 5B je povezana između mesta PI-Scel i I-Ceul restrikcije konačnog konstrukta sa Sl. 5A, za generisanje konstrukta koji obuhvata humanizovani MHC II i ekson 1 I-Eα iz BALB/c. Pg=pseudogen; BHR=bakterijska homologna rekombinacija; CM=hloramfenikol; spec=spektinomicin; hig=higromicin; neo=neomicin; EP=elektroporacija. Trouglovi predstavljaju eksone, popunjeni trouglovi predstavljaju eksone miša iz C57BL/6 miša (izuzev ispunjeni trouglova koji predstavljaju ekson 1 I-Eα iz BALB/c miša), a otvoreni trouglovi predstavljaju ljudske eksone.

Sl. 6 prikazuje šematski prikaz, koji nije u razmeri, MHC klase II I-E i I-A gena, pokazujući lokus nokaut miša pomoću kasete higromicina, nakon čega sledi uvođenje vektora koji sadrži humanizovani I-E β i I-E α (tj., H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 i H-2Eα/HLA-DRα*01 himer, respektivno). Otvoreni trouglovi predstavljaju ljudske eksone; ispunjeni trouglovi predstavljaju eksone miša. Sonde koje se koriste za genotipizaciju su zaokružene.

Sl. 7 pokazuje šematski prikaz, koji nije u razmeri, Cre-posredovanog uklanjanja neomicinske kasete sa Sl. 6. Otvoreni trouglovi predstavljaju ljudske eksone; ispunjeni trouglovi predstavljaju eksone miša. Dve strune na vrhu predstavljaju MHC II lokuse u humanizovanom MHC II heterozigotnom mišu koji ima kasetu za selekciju neomicina, a donje dve strune predstavljaju MHC II lokuse u humanizovanom MHC II heterozigotnom mišu sa uklonjenom kasetom neomicina.

Sl. 8 je šematski dijagram ciljane strategije (nije u razmeri) koja se koristi za izradu himernog H-2K lokusa koji eksprimira vanćelijski region ljudskog HLA-A2 proteina. Mišije sekvence su predstavljene u crnoj i humane sekvence su predstavljene u beloj boji. L=lider, UTR=neprevedeni region, TM=transmembranski domen, CIT=citoplazmatski domen, HIG=higromicin.

Sl. 9 je tačkasti nacrt in vivo ekspresije HLA-A2 i HLA-DR4 u heterozigotnim miševima koji okružuju himerne HLA-A2/H-2K i HLA-DR4/H-2E lokuse. Stabilna ekspresija HLA-DR4 bila je niska ali prisutna; ova niska ekspresija se očekivala i ekspresija se ubrzava nakon aktivacije.

DETALJNI OPIS

Definicije

[0029] Ovde su prikazane genetski modifikovane ne-humane životinje (npr., miševi, pacovi, zečevi i sl.) koji eksprimiraju i humane ili humanizovane MHC I i MHC II proteine; embrioni, ćelije i tkiva koja sadrže iste; metode pravljenja istih; kao i metode korišćenja istih. Ukoliko nije drugačije definisano, svi izrazi i fraze koje se ovde koriste uključuju značenja koja su pojmovi i fraze postigli u struci, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno vidljivo iz konteksta u kojem se termin ili fraza koriste.

[0030] Termin "konzervativni", kada se koristi za opisivanje konzervativne supstancije aminokiseline, uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostacima koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., punjenjem ili hidrofobnošću). Konzervativne aminokiselinske supstitucije se mogu postići modifikovanjem nukleotidne sekvence tako da se uvede promena nukleotida koji će kodirati konzervativnu supstituciju. Generalno, zamena konzervativne aminokiseline neće bitno promeniti funkcionalne osobine od interesa za protein, na primer, sposobnost MHC I ili MHC II da predstavlja peptid koji je od interesa. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju alifatične bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izolevcin; alifatski-hidroksilne bočne lance kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance, kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; osnovne bočne lance, kao što su lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance, kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor kao što su cistein i metionin. Konzervativne supstitucione grupe aminokiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim otelotvorenjima, konzervativna supstitucija aminokiselina može biti supstitucija bilo kojih prirodnih ostataka u proteinu sa alaninom, kao što se koristi pri, na primer, mutagenezi skeniranja alaninom. U nekim otelotvorenjima se pravi konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće opisanih u Gonnet i dr. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45). U nekim otelotvorenjima supstitucija je umereno konzervativna supstitucija u kojoj supstitucija ima negativnu vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće.

[0031] Stoga je takođe obuhvaćeno obelodanjivanjem genetski modifikovana ne-humana životinja čiji genom sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humane ili humanizovane MHC I i II polipeptide, pri čemu MHC I ili MHC II polipeptid sadrži konzervativne aminokiselinske supstitucije u aminokiselinskoj sekvenci opisanoj ovde.

[0032] Jedan stručni stručnjak bi shvatio da pored ostataka nukleinske kiseline koji kodiraju humani ili humanizovani MHC I ili MHC II polipeptid koji su ovde opisani zbog degeneracije genetičkog koda, druge nukleinske kiseline mogu kodirati otkrivene polipeptide. Zbog toga, osim genetski modifikovane nehumane životinje koja sadrži u svom genomu nukleotidnu sekvencu koja kodira MHC I i MHC II polipeptide sa konzervativnim aminokiselinskim supstancijama, životinja koja nije čovek čiji genom sadrži nukleotidnu sekvencu koja se razlikuje od one opisane ovde zahvaljujući degeneraciji genetičkog koda, takođe je obezbeđeno sadašnjim obelodanjivanjem.

[0033] Termin "identitet" kada se koristi u vezi sa sekvencom uključuje identitet kao što je određeno sa više različitih algoritama poznatih u stanju tehnike koje se mogu koristiti za merenje identiteta nukleotida i/ili aminokiseline. U nekim otelotvorenjima opisanim ovde, identiteti se određuju koristeći ClustalW v.

1.83 (sporo) poravnanje koristeći kaznu otvorene rupe od 10.0, povećane kaznene rupe od 0.1, a koristeći matricu sličnosti Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci u poređenju sa identitetom sekvenci zavisiće od određenih sekvenci. U različitim otelotvorenjima, identitet se određuje upoređivanjem sekvence zrelog proteina iz njegovog N-terminala na njegov C-terminal. U različitim otelotvorenjima kada se poredi himerna humana/ne-humana sekvenca sa humanom sekvencom, ljudski deo himerne humane/ne-humane sekvence (ali ne i ne-humanog dela) se koristi za upoređivanje nivoa identiteta između ljudske sekvence i ljudskog dela himerne humane/ne-humane sekvence (npr. upoređivanje humanog ektodomena himernog humanog/mišijeg proteina sa humanim ektodomenom ljudskog proteina).

[0034] Termini "homologija" ili "homologni" u odnosu na sekvence, npr. sekvence nukleotida ili aminokiselina, označavaju dve sekvence koje su, nakon optimalnog poravnanja i poređenja, identične u najmanje oko 75% nukleotida ili aminokiselina, npr. najmanje oko 80% nukleotida ili aminokiselina, npr. najmanje oko 90-95% nukleotida ili aminokiselina, npr. više a od 97% nukleotida ili aminokiselina. Stručnjak u oblasti bi shvatio da bi za optimalno ciljanje gena ciljani konstrukt trebalo da sadrži homolognu ruku za endogene sekvence DNK (tj., "homologna ruka“); tako se može desiti homologna rekombinacija između ciljanog konstrukta i ciljane endogene sekvence.

[0035] Termin "funkcionalno povezani" odnosi se na jednakost u kojoj su tako opisane komponente u odnosima koji dozvoljavaju da funkcionišu na svoj način. Kao takva, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein može se operativno povezati sa regulatornim sekvencama (npr., promoterom, pojačivačem, prigušavajućom sekvencom itd.) kako bi zadržala odgovarajuću regulaciju transkripcije. Osim toga, različiti delovi himernog ili humanizovanog proteina mogu biti operativno povezani kako bi se zadržalo pravilno preklapanje, obrada, ciljanje, ekspresija i druga funkcionalna svojstva proteina u ćeliji. Osim ako nije drugačije naznačeno, različiti domeni himernog ili humanizovanog proteina operativno su povezani jedni sa drugima.

[0036] Termin "MHC I kompleks" ili slično, kako se ovde koristi, obuhvata kompleks između polipeptida MHC I α lanca i polipeptida β2-mikroglobulina. Termin "MHC I polipeptid" ili slično, kako se ovde koristi, uključuje samo lančani MHC I α polipeptid . Termin "MHC II kompleks", "MHC II protein" ili slično, kako se ovde koristi, obuhvata kompleks između polipeptida MHC II α polipeptida i MHC II β polipeptida. Termin "MHC II α polipeptid", "MHC II β polipeptid" ili slično, kako se ovde koristi, obuhvata kompleks između samo polipeptida MHC II α polipeptida i l samo MHC II β polipeptida, respektivno. Slično tome, termini "HLA-DR4 kompleks", "HLA-DR4 protein", "H-2E kompleks", "H-2E" protein, ili slično, odnose se na kompleks između α i β polipeptida. Tipično, termini "humani MHC" i "HLA" se koriste naizmenično.

[0037] Izraz "zamena" u odnosu na zamenu gena odnosi se na postavljanje egzogenog genetskog materijala na endogeni genetski lokus, čime se zamenjuje sve ili deo endogenog gena sa ortolognom ili homolognom sekvencom nukleinske kiseline. Kao što je prikazano u Primerima ispod, sekvenca nukleinske kiseline endogenog MHC lokusa zamenjena je nukleotidnom sekvencom koja sadrži sekvence koje kodiraju deo humanog MHC I polipeptida, konkretno, kodiranje vanćelijskog dela MHC I polipeptida; kao i dela humanog MHC II α i β polipeptida, konkretno, kodiranje vanćelijskih delova MHC II α i β polipeptida.

[0038] "Funkcionalno", kako se ovde koristi, npr., u odnosu na funkcionalni polipeptid, odnosi se na polipeptid koji zadržava barem jednu biološku aktivnost koja je normalno povezana sa prirodnim proteinima. Na primer, u nekim objavljenim otelotvorenjima, zamena kod endogenog lokusa (npr., zamena kod endogenog ne-humanog MHC lokus) rezultira lokalizacijom koja ne eksprimira funkcionalni endogeni polipeptid, npr. MHC I ili MHC II polipeptid. Isto tako, termin "funkcionalni" koji se ovde koristi u vezi sa funkcionalnim vanćelijskim domenom proteina, odnosi se na vanćelijski domen koji zadržava svoju funkcionalnost, npr., u slučaju MHC I ili MHC II, sposobnost vezivanja antigena, sposobnost vezivanja T-ćelijskog koreceptora itd. U nekim otelotvorenjima, zamena kod endogenog MHC lokusa dovodi do lokusa koji ne eksprimira vanćelijski domen (npr., funkcionalni vanćelijski domen) endogenog MHC dok eksprimira vanćelijski domen ( npr., funkcionalni vanćelijski domen) humanog MHC.

Genetski modifikovane MHC životinje

[0039] U različitim otelotvorenjima, ovde su prikazane genetski modifikovane ne-humane životinje koje sadrže u svom genomu nukleotidnu sekvencu koja kodira humane ili humanizovane MHC I i MHC II polipeptide; Stoga, životinje eksprimiraju humane ili humanizovane MHC I i MHC II polipeptide.

[0040] MHC geni su kategorisani u tri klase: klasa I, klasa II i klasa III, a svi su kodirani na humanom hromozomu 6 ili mišijem hromozomu 17. Šema relativne organizacije humanih i mišijih klasa MHC prikazane su na Sl.2 i 3, respektivno. MHC geni su među najpolimorfičnijim genomima miševa i ljudskim genomima. MHC polimorfizmi se smatraju važnim u pružanju evolucione prednosti; promene u sekvenci mogu rezultirati razlikama u vezivanju peptida koje omogućavaju bolje prikazivanje patogena na citotoksične T ćelije.

[0041] MHC klasa I proteina sadrži vanćelijski domen (koji sadrži tri domena: α1, α2, i α3), transmembranski domen i citoplazmični rep. Domeni α1i α2formiraju peptidno-vezujuću pukotinu, dok α3interaguje sa β2-mikroglobulinom.

[0042] Pored interakcije sa β2-mikroglobulinom, domen α3interaguje sa TCR koreceptorom CD8, olakšavajući antigen-specifičnu aktivaciju. Iako je vezivanje MHC klase I na CD8 oko 100 puta slabije od vezivanja TCR na MHC klasu I, vezivanje CD8 povećava afinitet TCR vezivanja. Wooldridge i dr. (2010) MHC Class I Molecules with Superenhanced CD8 Binding Properties Bypass the Requirement for Cognate TCR Recognition i Nonspecifically Activate CTLs, J. Immunol. 184:3357-3366. Interesantno, povećanje vezivanja MHC klase I za CD8 ukinutu antigensku specifičnost u CTL aktivaciji. Id.

[0043] CD8 vezivanje za molekule MHC klase I je specifično za vrstu; pokazao se da homolog CD-a, Lyt-2 vezuje H-2Dd molekule na domenu α3, ali nije vezao HLA-A molekule. Connolly i dr. (1988) The Lyt-2 Molecule Recognizes Residues in the Class I α3 Domain in Allogeneic Cytotoxic T Cell Responses, J. Exp. Med. 168:325-341. Verovatno zbog diferencijalnog vezivanja dolazi do određenih CDR-ovih determinanti (nalik CDR1 i CDR2) na CD8 koji nije bio konzerviran između ljudi i miševa. Sanders i dr. (1991) Mutations in CD8 that Affect Interactions with HLA Class I and Monoclonal Anti-CD8 Antibodies, J. Exp. Med.174:371-379; Vitiello i dr. (1991) Analysis of the HLA-restricted Influenza-specific Cytotoxic T Lymphocyte Response in Transgenic Mice Carrying a Chimeric Human-Mouse Class I Major Histocompatibility Complex, J. Exp. Med. 173:1007-1015; i , Gao i dr. (1997) Crystal structure of the complex between human CD8αα i HLA-A2, Nature 387:630-634. Prijavljeno je da CD8 vezuje HLA-A2 u konzervisanom regionu α3 domena (na poziciji 223-229). Jedna supstitucija (V245A) u HLA-A smanjuje vezivanje CD8 na HLA-A, uz istovremeno veliko smanjenje lize posredovane T ćelijama. Salter i dr. (1989), Polymorphism in the α3 domain of HLA-A molecules affects binding to CD8, Nature 338:345-348. Generalno, polimorfizam u α3 domenu HLA-A molekula takođe je utiecao na vezivanje za CD8. Id. Kod miševa, supstitucija aminokiselina na ostatku 227 u H-2D<d>uticala je na vezivanje miša Lit-2 do H-2D<d>, a ćelije transfektovane mutiranim H-2D<d>nisu bile lizirane CD8+ T ćelijama. Potter i dr. (1989) Supstitucija na ostatku 227 molekula klase I H-2 ukida prepoznavanje CD8-zavisnih, ali ne i CD8-nezavisnih, citotoksičnih T limfocita, Nature 337:73-75.

[0044] Stoga, usled specifičnosti vrste interakcije između domena αH3 klase I i CD8, kompleks MHC I koji sadrži zamenu domena H-2K α3 sa humanim HLA-A2 α3 domenom bio je nefunkcionalan u mišu (tj., in vivo ) u odsustvu humanog CD8. Kod transgenskih životinja za HLA-A2, supstitucija humane α3 domene za domen miša α3 rezultirala je obnavljanjem T ćelijskog odgovora. Irwin i dr. (1989) Vrste ograničene interakcije između CD8 i domena α3 klase I utiču na veličinu ksenogenskog odgovora, J. Exp. Med.

170:1091-1101; Vitiello i dr. (1991), supra.

[0045] Transmembranski domen i citoplazmatični rep MHC klase I proteina miševa takođe imaju važne funkcije. Jedna od funkcija MHC I transmembranskog domena je da olakša modulaciju pomoću HLA-A2 homotipske adhezije ćelija (da bi se poboljšala ili inhibirala adhezija), verovatno kao rezultat unakrsnog povezivanja (ili ligacije) površinskih MHC molekula. Wagner i dr. (1994) Ligation of MHC Class I and Class II Molecules Can Lead to Heterologous Desensitization of Signal Transduction Pathways That Regulate Homotypic Adhesion in Human Lymphocytes, J. Immunol. 152:5275-5287. Na adheziju ćelija mogu uticati mAbs koji se vezuju za različite epitope molekule HLA-A2, što ukazuje na to da postoji više lokacija na HLA-A2 impliciranom u modulisanju homotipske adhezije ćelija; zavisno od povezanosti epitopa, uticaj može biti da se poboljša ili inhibira adhezija zavisna od HLA-A2. Id.

[0046] Citoplazmatski rep, kodiran eksonima 6 i 7 MHC I gena, navodno je neophodan za pravilan izraz na površini ćelije i za LIR1-posredovanu inhibiciju NK-ćelijske citotoksičnosti. Gruda i dr. (2007) Intracellular Cysteine Residues in the Tail of MHC Class I Proteins Are Crucial for Extracellular Recognition by Leukocyte Ig-Like Receptor 1, J. Immunol.179:3655-3661. Potreban je citoplazemski rep za multimerizaton nekih molekula MHC I kroz formiranje disulfidnih veza na njegovim cisteinskim ostacima, i stoga može igrati ulogu u grupisanju i prepoznavanju NK ćelija. Lynch i dr. (2009) Novel MHC Class I Structures on Exosomes, J. Immunol.183:1884-1891.

[0047] Citoplazmatski domen HLA-A2 sadrži konstitutivno fosforilovani serinski ostatak i fosforilatabilni tirozin, iako - u molekulima HLA-A2 mutantnih HLA-A2 ćelija koje nemaju citoplazmatični domen normalno se odnose na ekspresiju, citoskeletalno udruživanje, agregaciju i endocitnu internalizaciju. Gur i dr. (1997) Structural Analysis of Class I MHC Molecules: The Cytoplasmic Domain Is Not Required for Cytoskeletal Association, Aggregation, and Internalization, Mol. Immunol. 34(2):125-132. Uokvireni HLA-A2 molekuli koji nemaju citoplazmatski domen očigledno su normalno eksprimirani i povezani sa β2 mikroglobulinom. Id.

[0048] Međutim, nekoliko studija pokazalo je da je citoplazmični rep kritičan u intracelularnoj razmeni, prezentaciji antigena sa dendritičnim ćelijama (DC) i CTL prvim slojem. Pokazano je da je potreban tirozinski ostatak kodiran eksonom 6 za MHC I koji se razmenjuje kroz endosomske pregrade, prezentaciju egzogenih antigena i prvog sloja CTL; dok je brisanje eksona 7 prouzrokovalo poboljšanje anti-virusnih CTL odgovora. Lizee i dr. (2003) Control of Dendritic Cross-Presentation by the Major Histocompatibility Complex Class I Cytoplasmic Domain, Nature Immunol. 4:1065-73; Basha i dr. (2008) MHC Class I Endosomal and Lysosomal Trafficking Coincides with Exogenous Antigen Loading in Dendritic Cells, PLoS ONE 3: e3247; i Rodriguez-Cruz i dr. (2011) Natural Splice Variant of MHC Class I Cytoplasmic Tail Enhances Dendritic Cell-Induced CD8+ T-Cell Responses and Boosts Anti-Tumor Immunity, PLoS ONE 6:e22939.

[0049] Kompleks MHC klase II sadrži dva nekovalentno povezana domena: α lanac i β lanac, takođe ovde označeni kao α polipeptid i β polipeptid (Sl. 1, desno). Protein proteže plazma membrana; tako da sadrži vanćelijski domen, transmembranski domen i citoplazmatski domen. Vanćelijski deo α lanca uključuje α1 i α2 domene, a vanćelijski deo β lanca uključuje β1 i β2 domene. Domeni α1 i β1 čine peptidno vezivanje na ćelijskoj površini. Zbog trodimenzionalne konformacije peptida vezujućeg čvora kompleksa MHC II, teoretski nema gornje granice dužine vezanog antigena, ali tipični peptidi predstavljeni od strane MHC II su dužine između 13 i 17 aminokiselina.

[0050] Pored interakcije sa peptidima antigena, peptidno-vezujući molekul MHC II interaguje sa invarijantnim lancem (li) tokom procesa formiranja kompleksa MHC II i peptida. Dimeri α/β MHC II se sastavljaju u endoplazmatičnom retikulumu i povezuju sa li lance, koji je odgovoran za kontrolu vezivanja peptida i ciljanje MHC II u endocitni put. U endozomu, podvrgnuta je proteolizi, a mali fragment li, invarijantnog lanca peptida (CLIP) povezan sa klasom II, ostaje na peptidno-vezujućoj pukotini. U endozomu, pod kontrolom HLA-DM (kod ljudi), CLIP se razmenjuje za antigene peptide.

[0051] MHC II interaguje sa T ćelijskim koreceptorima CD4 u hidrofobnoj pukotini na spoju između α2 i β2 domena. Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49. Kada se CD4 i T ćelijski receptor vezuju za isti molekul MHC II kompleksovanog sa peptidom, senzitivnost T ćelije na antigenu se povećava i zahteva 100 puta manje antigena za aktivaciju. Videti, Janeway's Immunobiology, 7th Ed., Murphy i dr. eds., Garland Science, 2008.

[0052] Predložene su brojne funkcije za transmembranske i citoplazmatične domene MHC II. U slučaju citoplazamskog domena, pokazalo se da je važno za intracelularnu signalizaciju, razmenu sa plazma membranom, i konačno, antigen prezentaciju. Na primer, pokazano je da hibridomi T ćelija slabo reaguju na ćelije koje predstavljaju antigen (APC) transfektovane sa MHC II β lancima skraćenim u citoplazmatičnom domenu, a indukovana diferencijacija B ćelija je ometana. Videti npr., Smiley i dr. (1996) Skraćivanje citoplazmatičnog domena β-lanca klase II utiče na nivo klase II/invarijantnih lančanih peptidnih kompleksa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:241-44. Skraćivanje molekula klase II čini se da ometa proizvodnju cAMP-a Pretpostavljeno je da brisanje citoplazmičnog repa MHC II utiče na intracelularnu razmenu, čime se sprečava da kompleks dođe do odgovarajućih antigena na endocitnom putu. Smiley i dr. (supra) pokazala je da skraćivanje molekula klase II u citoplazmatičnom domenu smanjuje broj kompleksa CLIP/klase II, pretpostavljajući da to utiče na sposobnost CLIP-a da efikasno reguliše prezentaciju antigena.

[0053] Pretpostavljeno je da, pošto je grupisanje MHC II važno za pokretanje T ćelijskog receptora (TCR), ako su molekuli MHC II skraćeni u citoplazmatičnom domenu sprečeni da se vezuju citoskelet i na taj način bi se smanjila prezentacija antigena na T ćelije. Ostrand-Rosenberg i dr. (1991) Abrogation of Tumorigenicity by MHC Class II Antigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule, J. Immunol. 147:2419-22. U stvari, nedavno je pokazano da se HLA-DR skraćen na citoplazmičnom domenu nije uspeo udružiti sa citoskeletom nakon oligomerizacije. EI Fakhy i dr. (2004) Delineation of the HLA-DR Region and the Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton, J. Biol. Chem. 279:18472-80. Važno je da je citoskelet aktina lokalizovana aktivnost transdukcije signala, koja može da utiče na prikaz antigena. Pored asocijacije sa citoskeletom, nedavna istraživanja su takođe pokazala da do 20% svih HLA-DR molekula konstitutivno u lipidnim APC-a, koji su mikrodomeni bogati holesterolom i glikosfingolipidima i da je takva lokalizacija važna za prikaz antigena, formiranje imunog sinapsa i signalizaciju posredovanu MHC II. Videti npr., Dolan i dr. (2004) Invariant Chain and the MHC II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of MHC Class II Molecules to Lipid Rafts in Tumor Cell-Based Vaccines, J. Immunol. 172:907-14. Dolan i dr. sugeriše da skraćivanje citoplazmatskog domena MHC II smanjuje konstitutivnu lokalizaciju MHC II u lipidne splavove.

[0054] Osim toga, citoplazmatski domen MHC II, posebno β lanca, sadrži leucinski ostatak koji je predmet ubikitinacije ubikuitin ligaze, povezan sa membranom RING-CH I (MARCH I), koji kontroliše endocitnu razmenu, internalizaciju i degradaciju MHC II; i pokazano je da ubikitinacija posredovana MARCH-om prestaje nakon sazrevanja dendritične ćelije, što dovodi do povećanja nivoa MHC II na plazmatičnoj membrani. Shin i dr. (2006) Surface expression of MHC class II in dendritic cells is controlled by regulated ubiquitination, Nature 444:115-18; De Gassart i dr. (2008) Stabilizacija MHC klase II na površini humanih dendričnih ćelija rezultat je zavisnosti od MARCH I-a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3491-96.

[0055] Transmembranski domeni α i β lanaca MHC II međusobno komuniciraju i ova interakcija je važna za pravilno sastavljanje kompleksa MHC klase II. Cosson and Bonifacino (1992) Role of Transmembrane Domain Interactions in the Assembly of Class II MHC Molecules, Nature 258:659-62. U stvari, molekuli MHC II u kojima su transmembranski domeni α i β lanaca zamenjeni α-lancem IL-2 receptora zadržani su u ER i jedva su detektovani na površini ćelije. Id. Kroz studije mutageneze utvrđeno je da su očuvani ostaci Gly u α i β transmembranskim domenima odgovorni za sastavljanje MHC II na površini ćelije. Id. Prema tome, i transmembranski i citoplazmatični domeni su presudni za pravilnu funkciju MHC II kompleksa.

[0056] U različitim otelotvorenjima, ovde prikazana genetski modifikovana ne-humana životinja, npr., glodar (npr., miš ili pacov) koja sadrži u svom genomu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani MHC I polipeptid i nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani MHC II protein. Nukleotidna sekvenca MHC I može kodirati MHC I polipeptid koji je delimično humani i delimično ne-humani, npr., himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid, a nukleotidna sekvenca MHC II može kodirati MHC II protein koji je delimično humani i delimično ne-humani, npr. himerni humani/nehumani MHC protein (npr., onaj koji obuhvata himerne humane/ne-humane MHC II α i β polipeptide). U nekim aspektima, životinja ne eksprimira endogene MHC I i II polipeptide, npr., funkcionalne endogene MHC I i II polipeptide.

[0057] Genetski modifikovana ne-humana životinja koja sadrži u svom genomu, npr., na endogenom lokusu, nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid je obelodanjena u patentnim prijavama SAD br. 13/661,159 i 13/793,812. Genetski modifikovana ne-humana životinja koja sadrži u svom genomu, npr., na endogenom lokusu, nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/nehumani MHC II polipeptid je obelodanjena u patentnim prijavama SAD br. 13/661,159 i 13/793,812. Takođe je obelodanjena genetski modifikovana ne-humana životinja koja na svom endogenom MHC lokusu sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humani/ne-humani MHC I polipeptid i himerne humane/ne-humane MHC II polipeptide. Bilo bi teško proizvesti takvu životinju jednostavnim uzgojem humanizovanih MHC I i MHC II životinja usled tesne povezanosti gena MHC I i MHC II na hromozomu 17 miševa i humanog hromozoma 6. Prema tome, predmetno obelodanjivanje takođe daje novu metodu za generisanje genetski modifikovanih ne-humanih životinja koje sadrže sekvence koje kodiraju humane ili humanizovane MHC I i MHC II polipeptide, npr., životinje u kojima sekvence koje kodiraju endogene MHC I i II polipeptide koje zamenjuju oni koji kodiraju himerne humane/ne-humane MHC I i II polipeptide.

[0058] Ovde se obelodanjuje genetski modifikovana ne-humana životinja koja sadrži na endogenom MHC lokusu prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani/ne-humani MHC I polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC I polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog MHC I polipeptida; druga nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/ne-humani MHC II α polipeptid, pri čemu humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II α polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog MHC II α polipeptida; i treća nukleotidna sekvenca koja kodira humani/ne-humani himerni MHC II β polipeptid, pri čemu humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II β polipeptida čoveka obuhvata vanćelijski domen humanog MHC II β polipeptida, pri čemu ne-humane životinje eksprimiraju funkcionalne himerne humane/nehumane MHC I i MHC II proteine iz svog endogenog ne-humanog MHC lokusa. U jednom aspektu, prva, druga i/ili treća nukleotidna sekvenca operativno su vezane za endogene ne-humane MHC lokuse. U jednom otelotvorenju, gde je ne-humana životinja miš, prve, druge i/ili treće nukleotidne sekvence se nalaze na endogenom mišijem lokusu MHC na hromozomu 17 miša. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca nalazi se na endogenom ne-humanom MHC I lokusu. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca nalazi se na endogenom ne-humanom MHC II αlokusu. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca nalazi se na endogenom ne-humanom MHC II αlokusu.

[0059] U obelodanjenim otelotvorenjima, ne-humana životinja eksprimira samo himerne humane/nehumane MHC I, MHC II α i/ili MHC β II II polipeptide i ne eksprimira endogene ne-humane MHC polipeptide (npr., funkcionalni endogeni MHC I, II α i/ili II β polipeptidi) iz endogenog ne-humanog MHC lokusa. U jednom otelotvorenju, opisana životinja eksprimira funkcionalni himerni MHC I i funkcionalni himerni MHC II na površini svojih ćelija, npr.. ćelijama koje predstavljaju antigen, itd.

[0060] U jednom otelotvorenju, himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid u svom humanom delu sadrži peptidno-vezujući domen humanog MHC I polipeptida. Humani deo himernog polipeptida sadrži α1, α2 i α3 domene humanog MHC I

[0061] Humani deo himernog MHC II α polipeptida sadrži α1 i α2 domene humanog MHC II α polipeptida. Humani deo himernog MHC II β polipeptida sadrži β1 i β2 domene humanog MHC II β polipeptida.

[0062] Humani ili humanizovani MHC I polipeptid može biti dobijen iz funkcionalnog humanog HLA molekula kodiranog od strane bilo kojeg HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F ili HLA-G lokusa. Human ili humanizovani MHC II polipeptid može biti izveden iz funkcionalnog humanog HLA molekula kodiranog od strane bilo kojeg HLA-DP, -DQ i -DR lokusa. Opisana je lista najčešće korišćenih HLA antigena i alela u Shankarkumar i dr. ((2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet.4(2):91-103). Shankarkumar i dr. takođe predstavlja kratko objašnjenje HLA nomenklature koja se koristi u stanju tehnike. Dodatne informacije o HLA nomenklaturi i različitim HLA alelima mogu se naći u Holdsworth i dr. (2009) HLA rečnik 2008: rezime HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5 i DKB1 alela i njihova asocijacija sa serološki definisanim HLA-A, -B, -C, -DR i -DQ antigenima, antigeni tkiva 73:95-170, i nedavno ažuriranje od strane Marsh i dr. (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455. Prema tome, humani ili humanizovani MHC I i/ili II polipeptidi mogu biti dobijeni iz bilo kojih funkcionalnih humanih HLA molekula opisanih u njemu.

[0063] Od posebnog interesa su humani HLA molekuli, specifični polimorfni HLA aleli, za koje se zna da su povezani sa nizom ljudskih bolesti, npr., autoimunih bolesti čoveka. U stvari, identifikovani su specifični polimorfizmi u HLA lokusima koji su u korelaciji sa razvojem reumatoidnog artritisa, dijabetesa tipa I, Hašimotovog tiroiditisa, multiple skleroze, mijastenije gravis, Gravesove bolesti, sistemskog lupus eritematozusa, ciljačne bolesti, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa i drugih autoimunih poremećaja. Videti npr., Wong and Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja and David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease i Immunity, J. Clin. Invest. 101:921-26; Bakker i dr. (2006), Mapa haplotipova HLA i SNP visoke rezolucije za studije udruživanja bolesti u proširenom humanom MHC, Nature Genetics 38:1166-72 i Dodatne informacije; i Međunarodna mreža genetike MHC i autoimmuniteta (2009) Mapiranje varijabli višestruke podložnosti u regionu MHC za 7 imunološki posredovane bolesti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85. Prema tome, humani ili humanizovani MHC I i/ili II polipeptidi mogu biti dobijeni iz humanog HLA molekula za koji se zna da je povezan sa određenom bolešću, npr., autoimunim bolestima.

[0064] U jednom specifičnom aspektu, humani ili humanizovani MHC I polipeptid dobijen je iz humanog HLA-A. U specifičnom otelotvorenju, HLA-A polipeptid je polipeptid HLA-A2 (npr., I HLA-A2.1 polipeptid). U jednom otelotvorenju, HLA-A polipeptid je polipeptid kodiran pomoću HLA-A*0201 alela, npr., alela HLA-A*02:01:01:01. HLA-A*0201 alel se najčešće koristi u populaciji Severne Amerike Iako postojeći primeri opisuju ovu specifičnu HLA sekvencu, ovde je obuhvaćena bilo koja pogodna HLA-A sekvenca, npr., polimorfne varijante HLA-A2 prikazane u ljudskoj populaciji, sekvence sa jednom ili više konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih modifikacija, sekvence nukleinske kiseline koje se razlikuju od ovde opisane sekvenci zbog degeneracije genetskog koda, itd.

[0065] U još jednom specifičnom aspektu, humani deo himernog MHC I polipeptida dobijen je iz humanog MHC I odabranog iz HLA-B i HLA-C. U jednom aspektu, dobijen je iz HLA-B, npr., HLA-B27. U drugom aspektu, dobijen je iz HLA-A3, -B7, -Cw6, itd.

[0066] U jednom specifičnom aspektu, humani delovi humanizovanih MHC II α i β polipeptida opisanih ovde su dobijeni iz humanog HLA-DR, npr., HLA-DR4. Tipično, HLA-DR α lanci su monomorfni, npr., α lanac HLA-DR kompleksa je kodiran pomoću HLA-DRA gena (npr. HLA-DRα*01 gena). Sa druge strane, HLA-DR β lanac je polimorfan. Tako HLA-DR4 sadrži α lanac kodiran sa HLA-DRA genom i β lancem kodiran sa HLA-DRB1 genom (npr. HLA-DRβ1*04 genom). Kao što je ovde opisano, poznato je da je HLA-DR4 povezan sa učestalošću broja autoimunih bolesti, npr., reumatoidnog artritisa, dijabetesa tipa I, multiple skleroze itd. U jednom otelotvorenju obelodanjivanja HLA-DRA alel je HLA-DRα*01 alel, npr., HLA-DRα*01:01:01:01. U još jednom otelotvorenju, HLA-DRB alel je HLA-DRβ1*04, npr., HLA-DRβ1*04:01:01. Iako postojeći primeri opisuju ovu specifičnu HLA sekvencu, ovde je obuhvaćena bilo koja pogodna HLA-DR sekvenca, npr., polimorfne varijante prikazane u ljudskoj populaciji, sekvence sa jednom ili više konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih modifikacija, sekvence nukleinske kiseline koje se razlikuju od ovde opisane sekvence zbog degeneracije genetskog koda, itd.

[0067] Čovekovi delovi himernog MHC II α i/ili β polipeptida mogu biti kodirani nukleotidnim sekvencama HLA alela za koje se zna da su povezani sa uobičajenim ljudskim oboljenjima. Takvi HLA aleli uključuju, ali nisu ograničeni na, HLA-DRB1*0401,-DRB1*0301, -DQA1*0501, -DQB1*0201, -DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602,-DQA1*0102, -DQA1*0201, -DQB1*0202, -DQA1*0501 i njihove kombinacije. Za rezime HLA asocijacije alela/bolesti, pogledati Bakker i dr. (2006), supra.

[0068] Ne-humani deo himernog MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptida sadrži transmembranske i citoplazmatske domene endogenog ne-humanog (npr., glodara, npr., miša, pacova, itd.) MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptida, respektivno. Tako, ne-humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC I polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene endogenog ne-humanog MHC I polipeptida. Ne-humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II α polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene endogenog ne-humanog MHC II α polipeptida. Ne-humani deo himernog humanog/ne-humanog MHC II β polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene endogenog ne-humanog MHC II β polipeptida. U jednom aspektu, ne-humana životinja je miš, a ne-humani deo himernog MHC I polipeptida dobijen je iz proteina miša H-2K. U jednom aspektu, životinja je miš, a ne-humani delovi himernih MHC II α i β polipeptida dobijeni su iz proteina miša H-2E. Prema tome, ne-humani deo himernog MHC I polipeptida može da sadrži transmembranske i citoplazmatične domene izvedene iz miša H-2K, a ne-humani delovi himernih MHC II α i β polipeptida mogu da sadrže transmembranske i citoplazmatične domene izvedene iz mišijeg H-2E proteina. Iako su specifične H-2K i H-2E sekvence posmatrane u primerima, ovde su obuhvaćene bilo koje pogodne sekvence, npr., polimorfne varijante, konzervativne/ne konzervativne supstitucije aminokiselina itd.

[0069] Himerni humani/ne-humani polipeptid može biti takav da sadrži humanu ili ne-humano lidersku (signalnu) sekvencu. U jednom otelotvorenju, himerni MHC I polipeptid obuhvata ne-humanu lidersku sekvencu endogenog MHC I polipeptida. U jednom otelotvorenju, himerni MHC II α polipeptid obuhvata ne-humanu lidersku sekvencu endogenog MHC II α polipeptida. U jednom otelotvorenju, himerni MHC II β polipeptid obuhvata ne-humanu lidersku sekvencu endogenog MHC II β polipeptida. U alternativnom otelotvorenju, himerni MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptidi sadrže sekvencu ne-humanog lidera MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptida, respektivno, od druge ne-humane životinje, npr. drugog glodara ili drugog vrste miša. Prema tome, nukleotidna sekvenca koja kodira himerni MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptid može se operativno povezati sa nukleotidnom sekvencom koja kodira ne-humanu MHC I, MHC II α i/ili MHC II β lidersku sekvencu, respektivno . U još jednom izvođenju, himerni MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptidi sadrže humanu lidersku sekvencu humanog MHC I, humanog MHC II α i/ili humanog MHC II β polipeptida, (na primer, liderska sekvenca humane HLA-A2, humane HLA-DRA i/ili humane HLA-DRβ1*04, respektivno).

[0070] Himerni humani/ne-humani MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptid mogu da u svom humanom delu sadrže kompletan ili suštinski potpuni vanćelijski domen humanog MHC I, humanog MHC II α i/ili humanog MHC II β polipeptida, respektivno. Prema tome, humani deo može sadržati najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, npr., 95% ili više aminokiselina koje kodiraju vanćelijski domen humanog MHC I, humanog MHC II α i/ili humanog MHC II β polipeptida (npr., humanog HLA-A2, humanog HLA-DRA i/ili humanog HLA-DRβ1*04). U jednom primeru, u suštini kompletan vanćelijski domen humanog MHC I, humanog MHC II α i/ili humanog MHC II β polipeptida nedostaje sekvenca ljudskog lidera. U drugom primeru, himerni humani/ne-humani MHC I, himerni humani/nehumani MHC II α i/ili himerni humani/ne-humani MHC II β polipeptid čine sekvencu humanog lidera.

[0071] Štaviše, himerni MHC I, MHC II α i/ili MHC II β polipeptid može se operativno povezati sa (npr., biti izražen pod regulatornom kontrolom) endogenog ne-humanog promotera i regulatornih elemenata, npr. mišiji MHC I, MHC II α i/ili MHC II β regulatorni elementi, respektivno. Takva postavka će omogućiti pravilnu ekspresiju himernih MHC I i/ili MHC II polipeptida kod ne-humanih životinja, npr., tokom imunološkog odgovora kod ne-humane životinje.

[0072] Genetski modifikovana ne-humana životinja može se odabrati iz grupe koju čine miš, pacov, zec, svinja, goveda (npr., krava, bik, bizon), jelen, ovca, koza, živina, mačka, pas, feretka, primat (npr., marmozet, rezuz makaki).

Za ne-humane životinje gde odgovarajuće genetski modifikovane ES ćelije nisu lako dostupne, koriste se i druge metode kako bi se životinja koja nije čovek sastojala od genetske modifikacije. Takve metode uključuju npr., modifikovanje ne-ES ćelijskog genoma (npr., fibroblasta ili indukovane pluripotentne ćelije) i primenom prenosa nuklearnih ćelija za prenos modifikovanog genoma u pogodnu ćeliju, npr., oocita i gestiranje modifikovane ćelije (npr., modifikovanog oocita) u ne-humanoj životinji pod odgovarajućim uslovima da bi se formirao embrion.

[0073] U jednom aspektu, ne-humana životinja jeste sisar. U jednom aspektu, ne-humana životinja je mali sisar, na primer, iz superfamilije Dipodoidea ili Muroidea. U jednom otelotvorenju, genetski projektovana ne-humana životinja jeste glodar. U jednom otelotvorenju, glodar je odabran iz grupe koju čine miš, pacov i hrčak. U jednom otelotvorenju, glodar je odabran iz superfamilije Muroidea. IU jednom otelotvorenju, genetski modifikovana životinja je iz porodice odabrane iz grupe koju čine Calomyscidae (npr., hrčak nalik mišu), Cricetidae (npr., hrčak, pacovi i miševi, poljski miševi), Muridae (pravi miševi i pacovi, gerbili, igličasti miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (penjaući miševi, stenoviti miševi, pacovi sa repovima, Malagasy pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr., igličasti puh) i Spalacidae (npr., krtice, bambusovi pacovi i cokori). U specifičnom otelotvorenju, genetički modifikovani glodar je izabran iz grupe koju čine pravi miš ili pacov (familije Muridae), gerbil, igličasti miš i šiljati pacov. U jednom aspektu, genetski modifikovani miš je član porodice Muridae. U jednom otelotvorenju, životinja jeste glodar. U specifičnom otelotvorenju, glodar je odabran iz grupe koju čine miš i pacov. U jednom otelotvorenju, ne-humana životinja jeste miš.

[0074] U specifičnom otelotvorenju, ne-humana životinja je glodar koji je miš C57BL odabran iz grupe koju čine C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U još jednom otelotvorenju, miš je soj 129 odabran iz grupe koju čine sojevi 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr., 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti, npr., Festing i dr. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, videti takođe, Auerbach i dr (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). U specifičnom otelotvorenju, genetski modifikovani miš je mešavina pomenutog soja 129 i pomenutog C57BL/6 soja. U još jednom specifičnom otelotvorenju, miš je mešavina pomenutih sojeva 129 ili mešavina pomenutih BL/6 sojeva. U specifičnom otelotvorenju, 129 soj mešavine je 129S6 (129/SvEvTac) soj. U još jednom otelotvorenju, miš je BALB soj, npr., BALB/c soj. U još jednom izvođenju, miš je mešavina soja BALB i još jednog od pomenutih sojeva.

[0075] U jednom otelotvorenju, ne-humana životinja jeste pacov. U jednom otelotvorenju, pacov je izabran iz grupe koju čine Wistar pacova, LEA soj, Sprague Dawley soj, Fischer soj, F344, F6 i Dark Agouti. U jednom otelotvorenju, soj pacova je mešavina dva ili više sojeva odabranih iz grupe koju čine Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.

[0076] Prema tome, u jednom otelotvorenju, obelodanjivanje se odnosi na genetski modifikovani miš koji u svom genomu sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/mišiji MHC I, drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/mišiji MHC II α i treću nukleotidnu sekvencu koja kodira himerne humane/mišije MHC II β polipeptide. Humani delovi himernih MHC I, MHC II α i MHC II β polipeptida mogu sadržati vanćelijske domene humanih MHC I, MHC II α i MHC II β, respektivno. U jednom otelotvorenju, miš eksprimira funkcionalne himerne humane/mišije MHC I, MHC II α i MHC II β polipeptide iz endogenog lokusa MHC miša. U jednom otelotvorenju miš ne eksprimira funkcionalne MHC polipeptide miša, na primer, funkcionalne MHC I, MHC II α i MHC II β polipeptide iz endogenog lokusa MHC miša.

[0077] U jednom otelotvorenju, humani deo himernog humanog/mišijeg polipeptida MHC I sadrži domen vezivanja peptida ili vanćelijski domen humanog MHC I (npr., humani HLA-A, npr., humani HLA-A2, npr., humani HLA- A2.1). U nekim otelotvorenjima miš ne eksprimira vezivanje peptida ili vanćelijski domen endogenog MHC I polipeptida iz endogenog MHC I lokusa miša. Peptidni domen za vezivanje čoveka MHC I može da sadrži domene α1 i α2. Peptidni domen za vezivanje čoveka MHC I može da sadrži domene α1,α2 i α3. U jednom aspektu, vanćelijski domen humanog MHC I sadrži vanćelijski domen humanog MHC I α lanca. U jednom otelotvorenju, endogeni mišiji MHC I lokus je H-2K (npr., H-2Kb) lokus, a deo mišijeg himernog MHC I polipeptida sadrži transmembranske i citoplazmatske domene mišijeg H-2K (npr., H- 2Kb) polipeptida. Prema tome, u jednom otelotvorenju, miš na svom endogenom mišijem MHC I lokusu sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/mišiji MHC I, pri čemu humani deo himernog polipeptida sadrži vanćelijski domen humanog HLA-A2 (npr., HLA -A2.1) polipeptida i mišiji deo obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene polipeptida H-2K (npr., H-2Kb) miša, a miš eksprimira himerni humani/mišiji HLA-A2/H-2K protein. U drugom otelotvorenju, deo mišijeg himernog MHC I polipeptida može biti izveden od drugih MHC I, npr., H-2D, H-2L itd.; a humani deo himernog MHC I polipeptida može biti izveden iz drugih humanih MHC I, npr. HLA-B, HLA-C itd. U jednom aspektu, miš ne eksprimira funkcionalni endogeni H-2K polipeptid iz svog endogenog mišijeg H-2K lokusa.

[0078] Humani deo himernog humanog/mišijeg polipeptida MHC II α sadrži humani peptidno-vezujući MHC II α ili vanćelijski domen i humani deo himernog humanog/mišijeg MHC II β polipeptida sadrži humani MHC II β peptidno-vezujući ili vanćelijski domen. U nekim otelotvorenjima, miš ne eksprimira vezivanje peptida ili vanćelijski domen endogenog miša α i/iliβ polipeptida iz endogenog lokusa miša (npr., H-2A i/ili H-2E lokus). U nekim otelotvorenjima miš sadrži genom koji nema gen koji kodira funkcionalni molekul MHC klase II koji sadrži H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, H-2Ea i njihovu kombinaciju. Vanćelijski domen humanog MHC II α polipeptida obuhvata domene α1 i α2, a vanćelijski domen humanog MHC II β polipeptida može sadržati β1 i β2 domene; stoga, vanćelijski domen himernog MHC II kompleksa može sadržati humane α1, α2, β1 i β2 domene. U jednom otelotvorenju, deo mišijeg himernog MHC II kompleksa obuhvata transmembranske i citosolične domene miša MHC II, npr., miš H-2E (npr., transmembranski i citosolni domeni mišijih H-2E α i β lanaca). Tako, u jednom otelotvorenju, miš na svom endogenom mišijem MHC II lokusu sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/mišiji MHC II, pri čemu humani deo himernog MHC II α polipeptida sadrži vanćelijski domen izveden iz α lanca humanog MHC II (npr., α lanac HLA-DR4) i deo miša obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene izvedene iz α lanca miša MHC II (npr., H-2E); i miš na svom endogenom mišijem MHC II lokusu sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni humani/mišiji MHC II β, pri čemu humani deo himernog MHC II β polipeptida sadrži vanćelijski domen izveden iz β lanca humanog MHC II ( npr. β lanac HLA-DR4) i deo miša obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene izvedene iz β lanca miša MHC II (npr., H-2E); gde miš eksprimira himerni humani/mišiji HLA-DR4/H-2E protein. U drugom otelotvorenju, deo miša himernog MHC II proteina može biti izveden iz drugog mišijeg MHC II, npr. H-2A itd .; a humani deo himernog MHC II proteina može se izvesti iz drugih humanih MHC II, npr. HLA-DQ itd. U jednom aspektu, miš ne eksprimira funkcionalne endogene polipeptide H-2A i H-2E iz svog endogenog mišijeg lokusa (npr., miš ne eksprimira H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea polipeptide).

[0079] U daljem otelotvorenju, ne-humana životinja obelodanjivanja, npr., glodar, npr., miš, sadrži na endogenom mestu β2 mikroglobulina nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulin. β2 mikroglobulin ili laki lanac kompleksa MHC klase I (takođe skraćeno "β2M") je mali (12 kDa) neglikozilovani protein, koji funkcioniše prvenstveno za stabilizaciju lanca MHC I a. Generisanje humanih ili humanizovanih životinja mikroglobulina je detaljno opisano u patentnoj prijavi SAD br.

13/661,159. Miš koji sadrži humanizovani MHC lokus kao što je opisano u prikazanom opisu i humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski lokus kao što je opisano u patentnoj prijavi SAD br.13/661,159, može biti generisan bilo kojim metodom poznatom u struci, npr. uzgojem.

[0080] Različita druga otelotvorenja genetski modifikovane životinje koja nije čovek, npr., glodar, npr., pacov ili miš, biće evidentno stručnjaku iz predmetnog obelodanjivanja i obelodanjivanja iz

patentne prijave SAD br..13/661,159 i 13/661, 116.

[0081] U različitim aspektima predmetnog obelodanjivanja, sekvenca(e) koja kodira himerne humane/mišije MHC I i MHC II polipeptide nalazi se na endogenom ne-humanom MHC lokusu (npr., mišijem H-2K i/ili H-2E lokusu ). U jednom otelotvorenju ovo rezultira zamenom endogenog MHC gena ili njegovog dela sa nukleotidnom sekvencom koja kodira humane ili humanizovane MHC I polipeptide. Pošto nukleotidne sekvence koje kodiraju MHC I, polipeptidi MHC II α i MHC II β nalaze se u blizini jedno drugog na hromozomu, kako bi se postigao najveći uspeh u humanizaciji oba MHC I i MHC II kod jedne životinje, MHC I i MHC II lokusi trebaju biti ciljani sekvencijalno. Tako su, takođe, obezbeđene ovim obelodanjivanjem, metode generisanja genetički modifikovane nehumane životinje koja sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju humane/ne-humane MHC I, MHC II α i MHC II β polipeptide kao što je ovde opisano.

[0082] U nekim otelotvorenjima, metoda koristi ciljani konstrukt napravljen pomoću VELOCIGENE® tehnologije, uvođenje konstrukta u ES-ćelije i uvođenje ciljanih ES klonova ćelija u embrion miša koristeći VELOCIMOUSE® tehnologiju, kako je opisano u Primerima.

[0083] Nukleotidni konstrukti koji se koriste za stvaranje ne-humanih životinja opisanih ovde. U jednom aspektu, nukleotidni konstrukt sadrži: 5 'i 3' ne-humanu homolognu ruku, humani DNK fragment koji sadrži humane MHC genetske sekvence (npr., humane HLA-A2 ili humane HLA-DR4 sekvence humane HLA-DR4) i kasete za selekciju na kojoj se nalaze mesta rekombinacije. U jednom otelotvorenju, humani DNK fragment je genomski fragment koji obuhvata i intron i eksone humanog MHC gena (npr., humani HLA-A2 ili HLA-DR4 gen). U jednom otelotvorenju, ne-humana homologna oružja su homologna ne-humanom MHC lokusu (npr. MHC I ili MHC II lokusu). Specifični konstrukti su opisani u dole navedenim primerima (npr., Sl.6 za konstrukciju MHC II, MAID 1680; Sl.8 za MHC I konstrukt, MAID 1665), kao i u patentnim prijavama SAD br.13/661,159 i 13/661,116.

[0084] Kaseta za selekciju je nukleotidna sekvenca umetnuta u konstrukciju ciljanja radi olakšavanja selekcije ćelija (npr., ES ćelija) koje su integrirale konstrukt interesovanja. U struci je poznato nekoliko odgovarajućih izbornih kaseta. Uobičajeno, izborna kaseta omogućava pozitivni izbor u prisustvu određenog antibiotika (npr., Neo, Hyg, Pur, CM, Spec, itd.). Pored toga, izborna kaseta može biti okrenuta mestima rekombinacije, koja omogućavaju brisanje kasete za selekciju nakon tretmana sa rekombinantnim enzimima. Najčešće korišćene lokacije za rekombinaciju su lox P i Frt, koje su priznate od strane Cre i Flp enzima, ali su druge poznate u struci. U jednom otelotvorenju, izborna kaseta se nalazi na 5‘ kraju humanog DNK fragmenta. U jednom otelotvorenju, izborna kaseta se nalazi na 3‘ kraju humanog DNK fragmenta. U jednom otelotvorenju, izborna kaseta se nalazi unutar humanog DNK fragmenta. U jednom otelotvorenju, izborna kaseta se nalazi unutar introna humanog DNK fragmenta.

[0085] U jednom otelotvorenju 5’ i 3’ ne-humana homologna oružja sadrže genomsku sekvencu na 5 'i 3' lokaciji, endogenog ne-humanog (npr., mišjeg) MHC klase I ili II klase gena (npr.5’ prve sekvence lidera i 3' α3 eksona miša MHC I gena ili uzvodno od mišijeg H-2Ab1 gena i nizvodno od mišijeg H-2Ea gena).

U jednom otelotvorenju, endogeni MHC klase I lokus je izabran iz miša H-2K, H-2D i H-2L. U specifičnom otelotvorenju, endogeni lokus MHC klase I je mišiji H-2K. U jednom otelotvorenju, endogeni MHC II lokus je izabran iz miša H-2E i H-2A. U jednom otelotvorenju, endogeni MHC II lokus dozvoljava zamenu oba mišija gena H-2E i H-2A .

[0086] Prema tome, u jednom otelotvorenju, ovde predviđeni način je stvaranje genetički projektovane nehumane životinje (npr. glodara, npr., pacova ili miša) sposobnih da eksprimiraju humanizovane proteine MHC I i II koji sadrže zamenu kod endogenog ne-humanog MHC II lokusa nukleotidna sekvenca koja kodira ne-humani MHC II kompleks sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/mišiji MHC II kompleks da generiše prvu ne-ljudsku životinju; i zamenjujući na endogenom ne-humanom MHC I lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira ne-humani MHC I polipeptid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid da generiše drugu ne-humanu životinju. U jednom otelotvorenju, koraci zamene nukleotidnih sekvenci sadrže homolognu rekombinaciju u ES ćelijama. U jednom otelotvorenju, druga životinja koja nije čovek generiše se homolognom rekombinacijom u ES ćelijama koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju himerni humani/ne-humani MHC II kompleks. Prema tome, u jednom otelotvorenju, ovde predviđeni način je stvaranje genetički projektovane ne-humane životinje (npr. glodara, npr., pacova ili miša) sposobnih da eksprimiraju humanizovane proteine MHC I i II koji sadrže zamenu kod endogenog ne-humanog MHC I lokusa nukleotidna sekvenca koja kodira nehumani MHC I kompleks sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/mišiji MHC II kompleks da generiše prvu ne-ljudsku životinju; i zamenjujući na endogenom ne-humanom MHC II lokusu nukleotidnu sekvencu koja kodira ne-humani MHC II polipeptid sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni humani/ne-humani MHC II polipeptid da generiše drugu ne-humanu životinju. U jednom otelotvorenju, druga životinja koja nije čovek generiše se homolognom rekombinacijom u ES ćelijama koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju himerni humani/ne-humani MHC I kompleks.

[0087] Po završetku ciljanja gena, ES ćelije ili genetski modifikovane ne-humane životinje se prikazuju kako bi se potvrdilo uspešno uključivanje eksogene nukleotidne sekvence od interesa ili ekspresije egzogenog polipeptida. Brojne tehnike su poznate stručnjacima i uključuju (ali se ne ograničavaju na) Southern blotovanje, dugotrajne PCR, kvantitativne PCT (npr., PCR u realnom vremenu koristeći TAQMAN®), fluorescenciju in situ hibridizacija, Northern blotovanje, protočna citometrija, Western analiza, imunocitohemija, imunohistohemija itd. U jednom primeru, ne-humane životinje (npr. miševi) sa genetskom modifikacijom od interesa mogu se identifikovati skriningom za gubitak mišijih alela i/ili dobijanje humanog alela koristeći modifikaciju testa alela opisan u Valenzuela i dr. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.

21(6):652-659. Ostali testovi koji identifikuju specifičnu sekvencu nukleotida ili aminokiselina u genetski modifikovanim životinjama su poznati stručnjacima.

[0088] U jednom aspektu, obezbeđena je ćelija koja eksprimira himerne humane/ne-humane MHC I i MHC II proteine (npr., HLA-A2/H-2K i HLA-DR4/H-2E proteine). U jednom otelotvorenju, ćelija sadrži ekspresioni vektor koji sadrži himernu sekvencu MHC klase I i himernu sekvencu MHC klase II kako je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, ćelija je izabrana iz grupe koju čine CHO, COS, 293, HeLa i retinalne ćelije koja eksprimira virusnu sekvencu nukleinske kiseline (npr., ćelijePERC.6™).

[0089] Himerni MHC II kompleks koji sadrži vanćelijski domen HLA-DR4 koji je ovde opisan može biti detektovan anti-HLA-DR antitelima. Prema tome, ćelija koja prikazuje himerni humani/ne-humani MHC II polipeptid može se detektovati i/ili odabrati koristeći anti-HLA-DR antitela. Himerni MHC I kompleks koji sadrži vanćelijski domen HLA-A2 koji je ovde opisan može biti detektovan koristeći anti-HLA-A npr., anti-HLA-A2 antitela. Prema tome, ćelija koja prikazuje himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid može se detektovati i/ili odabrati koristeći anti-HLA-A antitela. Antitela koja prepoznaju druge HLA alele su komercijalno dostupna ili mogu biti generisana i mogu se koristiti za detekciju/selekciju.

[0090] Iako sledeći primeri opisuju genetski projektovanu životinju čiji genom sadrži zamenu nukleotidne sekvence koja kodira mišiji H-2K i H-2A i H-2E protein sa nukleotidnom sekvencom koja kodira himerni HLA-A2/H- 2K i HLA-DR4/H-2E protein, shodno tome, stručnjak bi shvatio da se slična strategija može koristiti za uvođenje himera koji sadrže druge humane MHC I i II gene (druge HLA-A, HLA-B i HLA -C i drugi HLA-DR, HLA-DP i HLA-DQ gene). Takođe su obezbeđene takve životinje koje sadrže višestruke himerne humane/ne-humane (na primer, humane/glodara, na primer, humane/mišije) MHC I i MHC II gene kod endogenih MHC lokusa.

[0091] U različitim otelotvorenjima, genetski modifikovane ne-humane životinje koje su ovde opisane, čine ćelije, npr. APCs, sa humanim ili humanizovanim MHC I i II na površini ćelije, a kao rezultat toga prisutni peptidi kao epitopi za T ćelije u humanom obliku, jer su suštini sve komponente kompleksa su humane ili humanizovane. Genetski modifikovane ne-humane životinje mogu se koristiti za proučavanje funkcije humanog imunološkog sistema kod humanizovane životinje; za identifikaciju antigena i epitopa antigena koji izazivaju imunološki odgovor (npr., T ćelijski epitopi, npr., jedinstveni epitopi karcinoma čoveka), npr., za upotrebu u razvoju vakcine; za procenu kandidata za vakcinu i druge strategije vakcine; za proučavanje humane autoimunosti; za proučavanje zaraznih bolesti ljudi; i na drugi način za izradu boljih terapijskih strategija zasnovanih na humanom eksprimiraju MHC.

PRIMERI

[0092] Pronalazak će biti dodatno ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima. Ovi primeri su predstavljeni kako bi pomogli u razumevanju pronalaska. Primeri ne uključuju detaljne opise konvencionalnih metoda koje bi bile dobro poznate stručnjacima u struci (tehnike molekularnog kloniranja itd.). Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su maseni delovi, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je označena u celzijusima, a pritisak je atmosferski ili blizu njega.

Primer 1: Inženjering himernog humanog/mišijeg MHC II lokusa i generisanje himernih MHC II miševa

Primer 1.1: Brisanje endogene MHC klase II H-2A i H-2E lokusa

[0093] Vektor ciljanja za uvođenje brisanja endogenih gena MHC klase II H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea napravljen je pomoću tehnologije VELOCIGENE® genetičkog inženjeringa (videti, npr., patent SAD. No.6,586,251 i Valenzuela i dr., supra). Bakterijski veštački hromozom (BAC) RP23-458i22 (Invitrogen) DNK je modifikovan da izbriše endogene MHC klase II gena H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea.

[0094] Ukratko, uzvodno i nizvodno homologna ruka izvedena je pomoću PCR-a DNK miša BAC sa lokacija 5’ H-2Ab1 gena i 3' H-2Ea gena, respektivno. Kao što je prikazano na Sl.5, ova homologna ruka je korišćena kako bi se napravila kaseta koja je izbrisala ∼79 kb RP23-458i22 koja sadrži gene H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea lokusa MHC klase II bakterijskom homolognom rekombinacijom (BHR). Ovaj region zamenjen je kasetom za higromicin, koju su nalazile lox66 i lox71 lokacije. Konačni vektor ciljanja od 5’ do 3' uključivao je homolognu ruku od 34 kb koja sadrži genomsku sekvencu 5’ miša na H-2Ab1 genu endogenog MHC klase II lokusa, 5' lok66, hipromicinsku kasetu, 3’ lox71 site i 63 kb homolognog oružja koje sadrži genomsku sekvencu miša 3’ do H-2Ea gena endogenog lokusa MHC klase II (MAID 5111, videti Sl.6).

[0095] Vektor ciljanja DNK BAC (opisan gore) korišćen je za elektroporisanje mišijih ES ćelija za stvaranje modifikovanih ES ćelija koje sadrže uklanjanje endogenog lokusa MHC klase II. Pozitivne ES ćelije koje sadrže izbrisani endogeni lokus MHC klase II su identifikovani pomoću kvantitativnog PCR testa korišćenjem sondi TAQMAN ™ (Lie and Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). Uzročni region uklonjenog lokusa potvrdio je PCR pomoću prajmera 5111U F (CAGAACGCCAGGCTGTAAC; SEQ ID NO:1) i 5111U R (GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; SEQ ID NO:2) i sonde 5111U P (CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA; SEQ ID NO:3), dok je nizvodni region uklonjenog lokusa potvrđen korišćenjem prajmera 5111D F (GTGGGCACCATCTTCATCATTC; SEQ ID NO:4) i 5111D R (CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; SEQ ID NO:5) i sonde 5111D P (AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; SEQ ID NO:6). Prisustvo kasete higromicina iz vektora ciljanja potvrđeno je prajmerima HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO:7) i HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO:8) i sonde HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9). Nukleotidna sekvenca preko tačke brisanja uzvodno (SEQ ID NO:10) uključuje sledeće, što ukazuje na endogenu sekvencu miša u odnosu na tačku brisanja (koja je sadržana u zagradama ispod) koja je jednako povezana sa kasetnom sekvencom prisutnom na tački brisanja: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) CTCGAGTACC GTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATCCGG GTAGGGGAGG. Nukleotidna sekvenca preko nizvodne tačke brisanja (SEQ ID NO: 11) uključuje sledeće, što označava kasetnu sekvencu koja se spaja sa endogenom sekvencom miša nizvodno od tačke brisanja (sadržana u zagradama ispod): CCTCGACCTG CAGCCCTAGG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAC GGTAGAGCTC (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA). Pozitivne ES ćelije klonova su zatim korišćene za implantaciju ženskih miševa koristeći VELOCIMOUSE® metodu (opisana u nastavku) da bi se proizveli legla mladunčadi koja sadrže uklanjanje endogenog lokusa MHC klase II.

[0096] Ciljane ES ćelije opisane iznad su korišćene kao donatorske ES ćelije i uvedene u 8-ćelijski embrion miševa pomoću metode VELOCIMOUSE® (videti, npr., patent SAD. br. 7,294,754 i Poueymirou i dr. (2007) F0 generacija miševa koji su u suštini potpuno izvedeni iz ES ćelija ciljanih genoma i omogućavaju neposredne fenotipske analize, Nature Biotech.25(1):91-99). Miševi koji nose delove H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea gena u endogenom lokusu MHC klase II identifikovani su genotipizacijom pomoću modifikacije alela (Valenzuela i dr., supra koja je otkrila prisustvo kasete za higromicin i potvrdila odsustvo endogene sekvence MHC klase II.

[0097] Miševi koji nose delove H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 i H-2Ea gena u endogenom lokusu MHC klase II mogu se odgajati u soj miša Cre deletor miša (videti npr., međunarodna patentna prijava Publikacija br. WO 2009/114400) kako bi se uklonila bilo koja kaseta hipromicin kaseta uvedena od strane vektora ciljanja koji nije uklonjen, npr., na ES ćelijskoj fazi ili u embrionu. Opciono, kaseta za hidromicin se zadržava kod miševa.

Primer 1.2: Generiranje velikog vektora za ciljanje (LTVEC) koji sadrži humanizovane H-2Eb1 i H-2Ea gene

[0098] Vektor ciljanja za uvođenje humanizovanih MHC II sekvenci je dizajniran kao što je prikazano na Sl. 5. Korišćenjem tehnologije genetičkog inženjeringa VELOCIGENE®, Bakterijski veštački hromozom (BAC) RP23-458i22 DNK je modifikovan u različitim koracima kako bi: (1) se stvorio vektor koji sadrži funkcionalni I-E α ekson 1 iz BALB/c H-2Ea gena (Sl. 5A); (2) se stvorio vektor koji obuhvata zamenu eksona 2 i 3 miša I-E β gena sa humanim DRβ1*04 i zamenu eksona 2 i 3 miša I-E a sa onim humanim DRα1*01 (Sl. 5B); (3) stvoriti vektor koji nosi eksone 2 i 3 humanog DRβ1*04 među ostalim eksonima miša IE b i eksonima 2 i 3 ljudskog DRα1*01 među ostalim IE eksonima miša uključujući funkcionalni IE α ekson 1 iz BALB/c miš (korak (1) (SL.5C); i (4) ukloniti kriptičnu veznu stranicu u vektoru generisanom u (3) (Sl.5D).

[0099] Konkretno, jer je u miševima C57BI/6 I-E α gen je pseudogen zbog prisustva nefunkcionalnog eksona 1, prvo je napravljen vektor koji sadrži funkcionalni I-E α ekson 1 iz BALB/c H-2Ea gena (Sl.5A). RP23-458i22 BAC je modifikovan bakterijskom homolognom rekombinacijom (1.BHR) kako bi se zamenio gen za otpornost na hloramfenikolu sa onom spektinomicina. Rezultujući vektor je dalje modifikovan pomoću BHR-a da bi se zamenio čitav region za kodiranje I-A i I-E sa kasetom neomicina na kojoj se nalaze mesta rekombinacije (2.BHR). Još jedna runda BHR-a (3. BHR) sa konstruktom koji sadrži ekson koji kodira BALB/c I-Eα lidera (ekson 1) i hlorhamfenikol gena koji je okružen PI-Scel i I-Ceul restrikcionim mestima rezultirao je vektorom koji sadrži funkcionalni BALB/c H-2Ea ekson 1.

[0100] Nezavisno, kako bi se generisao vektor koji sadrži zamenu eksona 2 i 3 I-E β gena miša sa humanim DRβ1*04 i zamenom eksona 2 i 3 I-E α miša sa humanim DRα1*01, RP23-458i22 BAC je modifikovan kroz nekoliko homolognih koraka rekombinacije, 4. BHR - 8. BHR (FIG. 5B). Rezultirajuća sekvenca nukleinske kiseline bila je okružena restrikcionim mestima PI-SceI/I-CeuI da bi se omogućila ligacija u konstrukciji koja nosi BALB/c I-Eα ekson 1, gore pomenut (SL.5C).

[0101] Sekvenca konačnog konstrukta prikazana na Sl. 5C sadrži vezivno mesto na 3’ kraju BALB/c introna. Nekoliko koraka BHR-a (11. BHR - 12. BHR), a zatim je izvršen korak brisanja da bi se dobio konačni ciljani vektor (MAID 1680) koji je korišćen za elektroporaciju u ES ćelije (Sl.5D).

[0102] Detaljno, konačni ciljani vektor (MAID 1680), od 5’ do 3', sastojao se od 5’ mišije homologne ruke koja se sastoji od∼26 kb genomske sekvence miša koja se završava upravo od H-2Ab1 gena endogenog MHC klase II lokusa; -59 kb inserta koji sadrži humanizovani gen MHC II β lanca (humanizovani H-2Eb1 geni) i humanizovani gen MHC II lanca (humanizovani H-2Ea gen) i spojenih neomicin kaseta; i 3’ mišije homologne ruke koja se sastoji od -57 kb genomske sekvence miša koja počinje tek nizvodno od H-2Ea gena endogenog MHC klase II lokusa. Nukleotidna sekvenca preko spoja između 5’ ruke i umetka (SEQ ID NO: 12) uključuje sledeće: (TGCTGATTGG TTCCTCACTT GGGACCAACC C) TAAGCTTTA TCTATGTCGG GTGCGGAGAA AGAGGTAATG AAATGGCACA AGGAGATCAC ACACCCAAAC CAAACTCGCC, gde je kurzivna sekvenca jedinstvena PI-SceI lokacija, a genomska sekvenca miša u 5’ homologne ruke je u zagradama. Nukleotidna sekvenca preko spoja između inserta i 3’ kraka (SEQ ID NO:13) uključuje sledeće: CACATCAGTG AGGCTAGAAT AAATTAAAAT CGCTAATATG AAAATGGGG (ATTTGTACCT CTGAGTGTGA AGGCTGGGAA GACTGCTTTC AAGGGAC), gde je genomska sekvenca miša u 3’ homologne ruke u zagradama.

[0103] Unutar ∼59 kb inserta, gen H-2Eb1 je modifikovan na sledeći način: oblast od H-2Eb1 od 5136 bp, uključujući poslednje 153 bp intron1, ekson 2, intron 2, ekson 3 i prvih 122 bp intron 3, zamenjena je sa 3111 bp homolognim regionom humane HLA-DRB1*04, uključujući poslednje 148 bp introna 1, ekson 2, intron 2, ekson 3 i prvih 132 bp introna 3. U spoju između humane i mišije sekvence introna 3, ubačena je kaseta koja se sastojala od 5' lox2372 mesta, UbC promotera, gena otpornosti na neomicin i 3' lox2372 stranice. Dobijeni gen kodirao je himerni HLA-DRB1*04/H-2Eb1 protein koji je bio lider H-2Eb1 miša, humani β1 i β2 domeni iz DRB1*04, i transmembranski domen i citoplazmični rep. Nukleotidna sekvenca preko mišijeg/humanog spoja u intronu 1 (SEQ ID NO: 14) uključuje sledeće: (TCCATCACTT CACTGGGTAG CACAGCTGTA ACTGTCCAGC CTG) GGTACCGAGC TCGGATCCAC TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CTGGAATTC GCCCTTGATC GAGCTCCCTG GGCTGCAGGT GGTGGGCGTT GCGGGTGGGG CCGGTTAA, gde je kurzivna sekvenca višestruko klonirajuće mesto uvedeno tokom koraka kloniranja, a sekvence introna 1 miša su u zagradama. Nukleotidna sekvenca preko spoja između humanog introna 3 i kasete neomicina (SEQ ID NO:15) uključuje sledeće: (ATCTCCATCA GAAGGGCACC GGT) ATAACTT CGTATAAGGT ATCCTATACG AAGTTATATG CATGGCCTCC GCGCCGGGTT, gde je stranica 5' lox2372 kurzivno ispisana, a sekvenca humanog intron-a 3 je u zagradi. Nukleotidna sekvenca preko spoja između kasete neomicina i mišijeg introna 3 (SEQ ID NO:16) uključuje sledeće: ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTATCTCGAG (TGGCTTACAG GTAGGTGCGT GAAGCTTCTA CAAGCACAGT TGCCCCCTGG), gde je stranica 3' lox2372 kurzivno ispisana, a intron 3 sekvence miša je u zagradi.

[0104] Unutar ∼59 kb inserta, gen H-2Ea je modifikovan na sledeći način: 1185 bp regiona H-2Ea, uključujući i poslednje 101 bp intron1, ekson 2, intron 2, ekson 3 i prvih 66 bp introna 3, zamenjen je homolognim regionom humanog HLA-DRA1*01 , uključujući i poslednjih 104 bp introna 1, ekson 2, intron 2, ekson 3 i prvih 66 bp introna 3. Kao što je gore opisano, jer ekson 1 alela C57BL/6 H-2Ea sadrži uklanjanje koje čini nefunkcionalan gen, H-2Ea ekson 1 i ostatak introna 1 zamenjeni su sa ekvivalentnim 2616 bp regionom iz BALB/c alela H-2Ea, koji je funkcionalan. Dobijeni gen je kodirao himerni protein H-2Ea/HLA-DRA1*01 koji se sastojao od lidera H-2Ea miša iz BALB/c, domena humanih α1 i α2 iz DRA1*01, i transmembranskog domena miša i citoplazmičnog repa. Nukleotidna sekvenca preko mišijeg/humanog spoja u intronu 1 (SEQ ID NO: 17) uključuje sledeće: (CTGTTTCTTC CCTAACTCCC ATTCTATGCT CTTCCATCCC GA) CCGCGGCCCA ATCTCTCTCC ACTACTTCCT GCCTACATGT ATGTAGGT, gde je kurzivna sekvenca restrikcionog enzimskog mesta uvedenog tokom koraka kloniranja, a sekvence BALB/c intron 1 su u zagradama. Nukleotidna sekvenca preko čovek/ mišijih u intronu 3 (SEQ ID NO: 18) uključuje sledeće: CAAGGTTTCC TCCTATGATG CTTGTGTGAA ACTCGGGGCC GGCC (AGCATTTAAC AGTACAGGGA TGGGAGCACA GCTCAC), gde je kurzivna sekvenca restrikcionog enzimskog mesta uvedenog tokom koraka kloniranja, a sekvence intron 3 su u zagradama. Nukleotidna sekvenca preko C57BL) 6-BALB/spoja 5’ eksona 1 (SEQ ID NO: 19) uključuje sledeće: (GAAAGCAGTC TTCCCAGCCT TCACACTCAG AGGTACAAAT) CCCCATTTTC ATATTAGCGA TTTTAATTTA TTCTAGCCTC, gde su C57BL/6 specifične sekvence u zagradama. Nukleotidna sekvenca preko BALB) c-C57BL/spoja 3’ eksona 1 (SEQ ID NO:20) uključuje sledeće: TCTTCCCTAA CTCCCATTCT ATGCTCTTCC ATCCCGA CCG CGG (CCCAATC TCTCTCCACT ACTTCCTGCC TACATGTATG), gde je mesto za restrikciju Sacll kurzivno, a C57BL/6 sekvence su u zagradi.

Primer 1.3: Generisanje humanizovanih MHC II miševa

[0105] Pojednostavljeni dijagrami strategije za generisanje humanizovanih MHC II miševa koristeći vektor Primera 1.2 prikazani su na Sl.6.

[0106] Konkretno, DNK MAID1680 BAC (opisan gore) je korišćen za elektroporaciju MAID5111 ES ćelija za stvaranje modifikovanih ES ćelija koje sadrže zamenu endogenih lokusa miševa I-A i I-E sa genomskim fragmentom koji sadrži himerni humani lokus DR4/miša I-E. Pozitivne ES ćelije koje sadrže izbrisane endogene I-A i I-E lokuse zamenjene genomskim fragmentom koji sadrži himerni humani lokus DR4/miša I-E identifikovan pomoću kvantitativnog PCR testa korišćenjem sondi TAQMAN™ (Lie and Petropoulos, supra). Unošenje humanih sekvenci DRβ potvrđeno je PCR primenom prajmera hDRA1F (AGGCTTGGGTGCTCCACTTG; SEQ ID NO:24), hDRA1R (GACCCTGGTGATGCTGGAAAC; SEQ ID NO:25), i sonde hDRA1P (CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA; SEQ ID NO:26). Unošenje humanih sekvenci DRβ potvrđeno je PCR primenom prajmera hDRB1F (AGGCTTGGGTGCTCCACTTG; SEQ ID NO:24), hDRB1R (GACCCTGGTGATGCTGGAAAC; SEQ ID NO:25), i sonde hDRB1P (CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA; SEQ ID NO:26). Gubitak kasete hidromicina iz vektora ciljanja potvrđen je prajmerima HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO:7) i HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO:8) i sondom HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9).

[0107] Pozitivne ES ćelije klonova su zatim korišćene za implantaciju ženskih miševa korišćenjem metode VELOCIMOUSE® (supra) za generisanje legla mladunčadi koja sadrže zamenu endogenih I-A i I-E lokusa sa himernim humanim DR4/mišijim I-E lokusom. Ciljane ES ćelije opisane iznad su korišćene kao donatorske ES ćelije i uvedene u 8-ćelijski embrion miševa pomoću metode VELOCIMOUSE®. Miševi koji poseduju himerni humani DR4/mišiji lokus I-E identifikovan su genotipizacijom koristeći modifikaciju testa alela (Valenzuela i dr., supra), koji je otkrio prisustvo himernog humanog DR4/mišijeg lokusa.

[0108] Miševi koji nose himerni humani DR4/mišiji I-E lokus mogu se odgajati na mišijem soju Cre deletor (videti, npr., objavljivanje međunarodne patentne aplikacije br. WO 2009/114400) u cilju uklanjanja spojenih neomicin kaseta uvedenih od strane vektora ciljanja koji nije uklonjen, npr., u stadijumu ES ćelije ili u embrionu (videti Sl.7).

Primer 2: Inženjering himernog humanog/mišijeg MHC I lokusa i generisanje himernih MHC I miševa

[0109] H-2K gen miša humanizovan je u jednom koraku konstrukcijom jedinstvenog vektora ciljanja iz DNK pomoću VELOCIGENE® tehnologije bakterijskog veštačkog hromozoma bakterija (BAC) čoveka i miša (videti, na primer, patent SAD br. 6,586,251 i Valenzuela i dr. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. Nat. Biotech.

21(6): 652-659). DNK iz BAC klona miša RP23-173k21 (Invitrogen) modifikovan je homolognom rekombinacijom kako bi se zamenila genomska DNK koja kodira α1, α2 i α3 domene mišijeg H-2K gena sa humanom genomskom DNK koja kodira α1, α2 i α3 podjedinice humanog HLA-A gena (Sl.8).

[0110] Ukratko, genomska sekvenca koja kodira podjedinice miša α1, α2 i α3 H-2K gena zamenjene su ljudskom genomskom DNK koja kodira domene α1, α2 i α3 humanog HLA-A*0201 gena u jednom pojedinačnom cilju koristeći vektor ciljanja koji obuhvata kasetu higromicina, na kojoj se nalaze loxP lokacije sa 5’ mišijom homolognom rukom koja sadrži sekvencu 5' mišijeg H-2K lokusa, uključujući 5’ neprevedeni region (UTR; 5' homologna ruka je prikazana u SEQ ID NO:27) i 3’ miša za homolognu ruku koja sadrži genomsku sekvencu 3' sekvence kodiranja miša H-2K α3 (3’ homologna ruka navedena je u SEQ ID NO:28).

[0111] Konačni konstrukt za ciljanje endogenog lokusa H-2K gena sa 5’ na 3' uključuje (1) 5’ homolognu ruku∼200 bp genomske sekvence miša 5’ endogenog H-2K gena uključujući i 5’ UTR, (2) ∼1339 bp humane genomske sekvence uključujući HLA-A*0201 lidersku sekvencu, HLA-A*0201 lider/α1 intron, HLA-A*0201 α1 ekson, HLA-A*0201 α1-α2 intron, HLA-A*0201 α2 ekson, ∼316 bp 5' kraja α2-α3 introna, (3) 5' loxP mesto, (4) (5) 3’ loxP lokaliteta, (6) -580 bp humane genomske sekvence, uključujući -304 bp od 3' kraja introna α2-α3 HLA-A*0201 α3 eksona i ( 7) 3’ homologna ruka koja sadrži ∼200 bp genomske sekvence miša uključujući intron između miša H-2K 3 i transmembranskih kodnih sekvenci (videti Sl. 8 za šematski prikaz H-2K ciljanog vektora). Nukleotidna sekvenca 149 na spoju humane/mišije sekvence na 5’ vektora ciljanja postavljena je u SEQ ID NO: 29, a nukleotida sekvenca 159 na spoju humane/mišije sekvence na 3’ vektora ciljanja je prikazan u SEQ ID NO:30. Homologna rekombinacija sa ovim vektorskim ciljem stvorila je modifikovan lokus H-2K miša koji sadrži humanu genomsku DNK koja kodira α1, α2 i α3 domene HLA-A*0201 gena koji je operativno povezan sa endemnim H-2K transmembranskim i kodnim sekvencama kodiranja citoplazmatičnog domena koji , nakon prevođenja, dovodi do stvaranja himernog humanog /mišijeg proteina MHC klase I.

[0112] Ciljana BAC DNK je korišćena za elektroporisanje mišijih F1H4 ES ćelija za stvaranje modifikovanih ES ćelija za generisanje miševa koji eksprimiraju himerni protein MHC klase I na površini jezgrastih ćelija (npr. T i B limfociti, makrofagi, neutrofili). ES ćelije koje sadrže umetanje humanih HLA sekvenci identifikovane su pomoću kvantitativnog TAQMAN™ testa. Specifični setovi prajmera i sondi su dizajnirani za detekciju ubacivanja humanih HLA sekvencija i pridruženih selektivnih kaseta (dobitak alela, GOA) i gubitka endogenih sekvencija miša (gubitak alela, LOA). Tabela 2 identifikuje imena i lokacije otkrivene za svaku od sondi koje se koriste u kvantitativnim PCR testovima.

Tabela 2: Sonde koje se koriste za genotipizaciju

[0113] Kaseta za odabir se može ukloniti metodama poznatim od strane stručnjaka. Na primer, ES-ćelije koje nose himerni lokus MHC klase I mogu se transfektovati sa konstruktom koji eksprimira Cre, kako bi se uklonila "spojena" kaseta higromicina koja je uvedena ubacivanjem ciljanog konstrukta koji sadrži humane HLA-A*0201 gene sekvence (videti Sl. 8). Kaseta za higromicin može se opciono ukloniti uzimanjem u miševa koji eksprimiraju Cre rekombinazu. Opciono, kaseta za hidromicin se zadržava kod miševa.

[0114] Ciljane ES ćelije opisane iznad su korišćene kao donatorske ES ćelije i uvedene u 8-ćelijski embrion miševa pomoću metode VELOCIMOUSE® (videti, npr., patent SAD. br. 7,294,754 i Poueymirou i dr. (2007) F0 generacija miševa koji su u suštini potpuno izvedeni iz ES ćelija ciljanih genoma i omogućavaju neposredne fenotipske analize, Nature Biotech.25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševi koji su potpuno izvedeni iz donora ES ćelija), koji su nezavisno nosili himerni gen MHC klase I, identifikovani su genotipizacijom pomoću modifikacije alela (Valenzuela i dr., supra) koja otkriva prisustvo jedinstvene humane HLA-A*0201 genske sekvence.

Primer 3: Generisanje i karakterizacija miševa koji sadrže himerne MHC I i MHC II gene

Primer 3.1: Generisanje miševa koji sadrže himerne MHC I i II gene

[0115] Strategija generisanja miševa, koji sadrže himerne MHC I i MHC II gene, prikazana je na sl. 4. Konkretno, za elektroporaciju MAID1680 ES ćelija (ES-ćelije sa humanizovanim MHC II genom opisanim u Primeru 1) korišćene su DNK MAID1665 BAC (HLA-A2/H-2K BAC opisani gore u Primeru 2) da bi se stvorile modifikovane ES ćelije koje sadrže himerne humane/mišije MHC I i MHC II gene. Pozitivne ES ćelije koje sadrže oba himerna MHC I i II gena identifikovane su pomoću kvantitativnog PCR testa korišćenjem sondi TAQMAN™ (Lie and Petropoulos, supra) korišćenjem prajmera i sondi opisanih u Primerima 1 i 2 gore.

[0116] Izabrane kasete HYG i NEO mogu se ukloniti metodama poznatim od strane stručnjaka. Na primer, ES-ćelije koje imaju himerne MHC klase I i II lokuse MHC klase I i II mogu biti transfektovane sa konstruktom koji eksprimira Cre da bi uklonio "spojene" higromicin i neomicin kasete uvedene uvođenjem konstrukcija ciljanja (videti Sl.4, 7 i 8). Kaseta higromicina može se opciono ukloniti uzgojem miševa koji eksprimiraju Cre rekombinazu. Opciono, kaseta hidromicina se zadržava kod miševa.

[0117] Ciljane ES ćelije koje su obuhvatale i humanizovane MHC I i II opisane iznad su korišćene kao donatorske ES ćelije i uvedene u 8-ćelijski embrion miša pomoću metode VELOCIMOUSE® (videti, npr., patent SAD. br.7,294,754 i Poueymirou i dr. (2007) F0 generacija miševa koji su u suštini potpuno izvedeni iz ES ćelija ciljanih genoma i omogućavaju neposredne fenotipske analize, Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševi koji su u potpunosti dobijeni iz donorske ES ćelije) sa himernim genomom MHC klase I i klase II identifikovani su genotipizacijom pomoću modifikacije alela (Valenzuela i dr., supra).

Primer 3.2: Generisanje miševa koji sadrže himerne MHC I i II gene

[0118] Slezine iz WT ili dvostruki heterozigotni humanizovani HLA-A2/HLA-DR4 miševi ("1666HET/1681 HET" or "H-2K<+/1666>MHC-II<+/1681>“) perfuzirani su sa Collagenase D (Roche Bioscience) i eritrociti su lizirali sa ACK lizinskim pufer. Ćelijska površina humanih HLA-A2 i HLA-DR4 analizirana je pomoću FACS koristeći anti-CD3 (17A2) anti-CD19 (1D3) anti-HLA-A2 (BB7.2) i anti-HLA-DR (L243). Protočna citometrija je izvršena pomoću BD-Fortessa. Ekspresija oba humana HLA-A2 i HLA-DR4 bila je jasno detektabilna na površini CD19+ B ćelija (SI.9).

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Ne-humana životinja koja sadrži endogene MHC lokuse:

prva nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/ne-humani MHC I polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC I polipeptida sadrži α1, α2, i α3 domene humanog MHC I polipeptida, a gde je ne-humani deo himernog MHC I polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene endogenog ne-humanog MHC I polipeptida,

druga nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/ne-humani MHC II α polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC II α polipeptida sadrži α1, α2, i α3 domene humanog MHC II α polipeptida, a gde je ne-humani deo himernog MHC II α polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene endogenog ne-humanog MHC II α polipeptida, i treća nukleotidna sekvenca koja kodira himerni humani/ne-humani MHC II β polipeptid, pri čemu humani deo himernog MHC II β polipeptida sadrži MHC II β1 i β2 domene humanog MHC II β polipeptida, a gde je ne-humani deo himernog MHC II β polipeptida obuhvata transmembranske i citoplazmatične domene endogenog ne-humanog MHC II β polipeptida, i pri čemu ne-humane životinje eksprimiraju himerne humane/ne-humane MHC I i MHC II proteine iz endogenog ne-humanog MHC lokusa.

2. Životinja prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što životinja ne eksprimira funkcionalne endogene MHC I, II α i II β polipeptide iz endogenog ne-humanog MHC lokusa na površini ćelije.

3. Životinja prema patentnom zahtevu 1, kod koje se prva nukleotidna sekvenca nalazi na endogenom ne-humanom MHC I lokusu, druga nukleotidna sekvenca se nalazi na endogenom ne-humanom MHC II α lokusu, a treća nukleotidna sekvenca se nalazi na endogenom ne-humanom MHC II β lokus.

4. Životinja prema patentnom zahtevu 1, kod koje prva, druga i/ili treća nukleotidna sekvenca(e) operativno jeste vezana za endogene ne-humane regulatorne elemente.

5. Životinja prema patentnom zahtevu 1, kod koje je humani MHC I polipeptid odabrani iz grupe koju čine HLA-A, HLA-B i HLA-C.

6. Životinja prema patentnom zahtevu 1, koja dalje sadrži na mestu endogenog ne-humanog β2 mikroglobulinskog lokusa nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid, pri čemu životinja eksprimira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid.

7. Životinja prema patentnom zahtevu 4, kod koje je prva nukleotidna sekvenca operativno povezana sa endogenim ne-humanim MHC I promoterom i regulatornim elementima, druga nukleotidna sekvenca operativno je povezana sa endogenim ne-humanim MHC II α promoterom i regulatornim elementima, a treća nukleotidna sekvenca je operativno povezana sa endogenim ne-humanim MHC II β promoterom i regulatornim elementima.

8. Životinja prema patentnom zahtevu 1, gde je životinja glodar kao što je miš ili pacov.

9. Životinja prema patentnom zahtevu 8, naznačena time, što je humani deo himernog humanog/mišijeg MHC II α polipeptida kodiran humanim genom HLA klase II odabranim iz grupe koja se sastoji od bilo kog α lanca HLA-DR, HLA-DK i HLA -DP; i gde je humani deo himernog humanog/mišijeg MHC II β polipeptida kodiran humanim genom HLA klase II odabranim iz grupe koja se sastoji od bilo kog gena β lanca HLA-DR, HLA-DK i HLA-DP.

10. Glodar prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, što je glodar miš i gde prva nukleotidna sekvenca kodira himerni humani/mišiji MHC I polipeptid i gde je deo mišijeg himernog MHC I polipeptida dobijen iz H-2K, H-2D , ili H-2L.

11. Miš prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, što druga nukleotidna sekvenca kodira himerni humani/mišiji MHC II α polipeptid, treća nukleotidna sekvenca kodira himerni humani/mišiji MHC II β polipeptid, a mišiji deo himernog MHC II α polipeptida je kodiran genom mišije klase II izabranog iz grupe koja se sastoji od bilo kog gena α lanca H-2E i H-2A, a deo mišijeg himernog MHC II β polipeptida kodiran je mišijim genom klase II izabranim iz grupe koju čine bilo koji gen β lanca H-2E i H-2A.

12. Miš prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, što prva nukleotidna sekvenca kodira himerni HLA-A/H-2K polipeptid, druga nukleotidna sekvenca kodira α lanac himernog HLA-DR/H-2E polipeptida, a treća nukleotidna sekvenca kodira β lanca himernog polipeptida HLA-DR/H-2E i gde miš eksprimira HLA-A/H-2K i HLA-DR/H-2E proteine.

13. Miš prema patentnom zahtevu 8 ili 12, naznačen time, što miš dodatno sadrži na kraju endogenog β2 mikroglobulinskog lokusa nukleotidnu sekvencu koja kodira humani ili humanizovani β2 mikroglobulinski polipeptid.

14. Miš prema patentnom zahtevu 8, 12 ili 13, pri čemu miš ne eksprimira funkcionalne endogene MHC polipeptide iz endogenog MHC lokusa na površini ćelije.