RS58006B1 - Postupci i sistemi za prečišćavanje nekompleksiranog botulinskog neurotoksina - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ova prijava traži priznanje prava prvenstva iz U.S. provizorne prijave br. 61/253,810, podneta 21. oktobra 2009.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Ovaj se pronalazak odnosi generalno na hromatografske postupke i sisteme za prečišćavanje bez botulinskog neurotoksina iz kultura ćelije da bi se proizveo proizvod visoke čistoće, visoke jačine.

STANJE TEHNIKE

[0003] Botulinski toksin je neurotoksični protein proizveden putem bakterije Clostridium botulinum, kao i druge Clostridial vrste, kao što je Clostridium butyricum, i Clostridium baraffi. Toksin blokira neuromišićni prenos i prouzokuje neuro-paralitičku bolest kod ljudi i životinja, poznatih kao botulizam. C. botulinum i njihove spore se obično javljaju u zemljištu i životinjska trupla u raspadu i mogu da porastu u nepropisno sterilizovanim ili nepropisno zaptivenim posudama za hranu, koji su uzrok brojnih slučajeva botulzima. Simptomi botulizma mogu obuhvatiti teškoće sa hodom, gutanjem, govorom, i mogu napredovati do paralize mišića disajnih organa i najzad smrti.

[0004] Botulinski toksin tipa A je za čoveka najsmrtonosnija poznata supstanca. Pored serotipa A, šest drugih generalno imunološki distinktivnih botulinum toksina je moguće prepoznati, naime botulinski toksin serotipovi B, C1, D, E, F, i G. Različite serotipove je moguće razlikovati prema neutralizaciji sa antitelima specifičnog tipa i variraju po ozbiljnosti paralize koju izazivaju i životinjskim vrstama na koje uglavnom utiču. Molekularna težina molekula proteina botulinum toksina, za svaki od poznatih serotipova botulinum toksina, je oko 150 kD, čini od oko 100 kD teškog lanca spojenog na oko 50 kD lakog lanca. Pored toga, te botulinum toksine otpuštajuClostridial bakterije kao kompleksi 150 kD toksina sa jednim ili više netoksinski proteina. Na primer, botulinski toksin tipa A postoji u kompleksima 900 kD, 500 kD i 300 kD (približne molekularne težine).

[0005] Uprkos poznatim toksičnim dejstvima, Botulinski toksin tip A se klinički koristi za lečenje raznovrsnih indikacija, uključujući, npr., neuromišićne poremećaje koje karakteriše hiperaktivnost mišića skeleta. Na primer, BOTOX® je zaštitni znak botulinum toksina tip A, kompleks je dostupan komercijalno od kalifornijske kompanije Allergan, Inc., Irvine, Calif. Botulinski toksin tip A nalazi upotrebu, na primer, u lečenju osnovnih blefarospazama, strabizma, distonije vrata (neurološki poremećaj vrata), i bora na licu u liniji između obrva i iznad nosa (tzv. glabelarnih bora). Drugi serotipovi se takođe koriste klinički. Botulinski toksin tip B, na primer, je naznačen za upotrebu za lečenje distonije vrata. Veruje se da se botulinski botulinumtoksini vežu sa visokim afinitetom na presinaptičku membranu motornih nurona, translociraju u neuron, i posle toga blokiraju presinaptičko otpuštanje acetilholina.

[0006] Taj botulinum botulinski toksin za kliničku upotrebu je obično izolovan iz kulture ćelija i obično se koriste različiti pristupi prečišćavanja. Istorijski, toksin se prečišćava u obliku kompleksa putem niza taloženja i koraka filtracije tangencijalnim protokom. Videti, npr., Schantz E. J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine (Karakteristike i upotreba botulinskog toksina i drugih mikrobnih neurotoksina u medicni), Microbiol Rev 1992 March 56(1):80-99. Takvi pristupi su obezbedili reltativno male prinose, međutim, obično manje od oko 10%. Drugi pristupi koriste ekskluziju prema veličini, jonsku izmenu, i/ili hromatografiju prema afinitetu. Videti, npr., Schmidt J. J., et al., Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography (Prečišćavanje tipa E botulinskog neurotoksina putem jonizmenjivačke hromatografije visokih performansi), Anal. Biochem. 1986 July; 156(1):213-219; Simpson L. L., et al., Isolation and characterization of the botulinum neurotoxins (Izolacija i karakterizacija botulinskih neurotoksina), Harsman S, ed. Methods in Enzymology. Vol.

165, Microbial Toxins: Tools in Enzymology San Diego, Calif.: Academic Press; vol 165: pages 76-85 (1988); Kannan K., et al., Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc (botulinum toxin type B)(Metode razvoja za biohemijsku procenu neurobloka (botulinski toksin tip B), Mov Disord 2000; 15(Suppl 2):20 (2000); Wang Y.C., The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and its clinical use (Dobijanje i kvalitet botulinskog toksina tip A za ubrizgavanje (BTXA), Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002; 58 (2002); i U.S. Pat. Appl. Publ. No.2003/0008367.

[0007] Još neki pristupi su se usredsredili na samo jedan od teških ili lakih lanaca toksina, pre nego na kompletan i biološki aktivan protein botulinum toksina. Na primer, jedan od lanaca je individualno sintetisan rekombinantnim sredstvima. Videti, npr., Zhou L., et al., Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain (Ekspresija i prečišćavanje lakog lanca botulinskog neurotoksina A: Jedna mutacija zabranjuje svoje cepanje SNAP-25 i neurotoksičnost posle rekonstitucije sa teškim lancem), Biochemistry 1995; 34(46):15175-81 (1995);and Johnson S. K.,et al.,Scale-up of the fermentation and purification of the recombination heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pichia pastoris (Razmera fermentacije i prečišćavanja rekombinacije fragmenta C teškog lanca serotIpa F botulinskog neurotoksina, izrađeno u soju proteina Pichia pastoris, Protein Expr and Purif 2003; 32:1-9 (2003). Ovi pristupi, međutim, zahtevaju dodatne korake da bi se reformisao kompletan i biološki aktivan protein botulinskog toksina.

[0008] Mnogo noviji pristup obuhvata upotrebu hromatografije hidrofobnom interakcijom (HIC), kombinovani režim, i/ili hromatografiju sa jonskom izmenom da bi se prečistio botulinski toksin kao kompleks. Videti, npr., U.S. Pat. Nos. 7,452,697 i 7,354,740. Gessler, Journal of Biotechnology, 119 (2005) 204-211, opisuju postupak određivanja prema razmeri za prečišćavanje botulinskog neurotoksina tipa E.

US 2006/0228780 A1, objavljeno 12. oktobra 2006, opisuje hromatografske procese i sisteme za prečišćavanje kompleksa botulinskog toksina iz fermentacione podloge bez proteina životinjskog porekla.

[0009] S tim u skladu, postoji potreba u ovoj oblasti za poboljšanim postupcima za izolovanje kompletnih proteina botulinum toksina A u stablne, biološki aktivne ali oblike koji nisu u kompleksu. Samim tim cilj ovog pronalaska je da se obezbede supstance i postupci za dobijanje ovih i druge potrebe.

[0010] Gore opisana diskusija je predstavljena isključivo da bi se obezbedilo bolje razumevanje prirode problema sa kojima se ova oblast susreće kao sa izazovima i ne treba ih tumačiti ni na koji drugi način kao priznanje prethodnog stanja tehnike niti citiranje bilo koje ovde navedene reference treba tumačiti kao pristup da takva referenca čini "prethodno stanje" za ovu ovde prijavu.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0011] Ovaj se pronalazak odnosi na sisteme i postupke za prečišćavanje nekompleksiranog botulinum toksina tipa A (botulinski toksin A). U jednom izvođenju, ovaj postupak obuhvata prečišćavanje sirovih nekompleksiranog botulinum toksina A da bi se dobio nekompleksirani botulinski toksin A. U ovom izvođenju, taj postupak obuhvata punjenje kolone za anjonsku izmenu sa sirovim nekompleksiranim botulinum toksinom A da bi se uhvatio nekompleksirani botulinski toksin na koloni za anjonsku izmenu; eluiranje nekompleksiranog botulinum toksina A sa puferskim sredstvom da bi se dobio eluent koji obuhvata nekompleksirani botulinski toksin A; punjenje kolone za katjonsku izmenu sa eluentom iz anjonske izmene u kolonu da bi se omogućilo hvatanje nekompleksiranog botulinum toksina A; i eluiranje nekompleksiranog botulinum toksina A sa drugim puferom da bi se dobio eluent, čime se dobija prečišćen nekompleksiran botulinski toksin A.

[0012] Kod izvesnih izvođenja, kompleks botulinskog toksina A se sam po sebi dobija putem nekih hromatografskih koraka. Kod nekih izvođenja, postupak za dobijanje kompleksa botulinskog toksina A obuhvata dobijanje uzorka koji obuhvata botulinski toksin A kompleks; punjenje stuba za hidrofobnu interakciju sa uzorkom da bi se dozvolilo hvatanje toksina, pri čemu uhvaćeni botulinski toksin A obuhvata kompleksirani botulinski toksin A; i eluiranje komplesiranog botulinskog toksina A. Nekompleksirani botulinski toksin A se zatim razdružuje iz kompleksa i nekompleksirani botulinski toksin A se prečišćava prema gore opisanom postupku. Kod nekih izvođenja, uzorak se dobija izlaganjem fermentacione kulture koja obuhvata botulinski toksin A kiselini da bi se dobio talog kiseline, koji je moguće izložiti koracima dodatnog prehromatografskog prečišćavanja, za koje neograničavjaući primeri obuhvataju filtraciju tangencijalnog protoka da bi se koncentrisao nerastvorljiv materijal tog taloga, razgradnju nukleaze, razbistrujuće centrifugiranje i/ili filtraciju.

[0013] Kod nekih izvođenja, uzorak je izložen razgradnji nukleaze, pre punjenja kolone za hidrofobnu interakciju. Preporučljivo, ta nukleaza je izvedena u postupku bez prisustva proizvoda životinje, još preporučljivije ceo postupak prečišćavanja je bez prisustva proizvoda životinje ili barem pretežno bez prisustva proizvoda životinje.

[0014] Kod nekih izvođenja, uzorak koji treba koristiti u hromatografskim odvajanjima je preporučljivo supernatant ili frakcija filtrata.

[0015] Kod nekih preporučenih izvođenja, prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin A je barem 98% čist; i/ili ima aktivnost od barem 200 LD50jedinica/ng. Kod nekih izvođenja, postupak proizvodi prinos od barem oko 2 mg/L kulture fermentacije. Kod drugih izvođenja, taj postupak proizvodi prinos od oko 1 do oko 2 mg/L kulture fermentacije.

[0016] Ova i druga varijantna rešenja ovog pronalaska će biti jasnija sa pozivom na sledeći detaljan opis ovog pronalaska.

KRATAK OPIS SLIKA

[0017] Slika 1 je sažet grafikon protoka koji poedi jedno izvođenje postupka prema ovom pronalasku za direktno prečišćavanje nekompleksiranog botulinskog toksina (Slika 1A) sa postupkom za prečišćavanje kompleksiranog botulinskog toksina (Slika 1B).

DETALJAN OPIS

[0018] Ovaj se postupak odnosi na sisteme i postupke za prečišćavanje nekompleksiranog botulinskog toksina A. Kod izvesnih izvođenja, postupak obuhvata prečišćavanje sirovog nekompleksiranog botulinskog toksina A punjenjem kolone sa anjonskom izmenom sirovim nekompleksiranim botulinskim toksinom A da bi se dozvolilo hvatanje nekompleksiranog botulinskog toksina A putem kolone sa anjonskom izmenom. Nekompleksirani botulinski toksin A je zatim eluiran sa puferom da bi se dobio eluent koji obuhvata nekompleksirani botulinski toksin A. Ovaj eluent iz ajonske kolone se puni na katjonizmenjivačkoj koloni da bi omogućio hvatanje nekompleksiranog botulinskog toksina A i prečišćen nekompleksiran botulinum toksin A se eluira sa puferom, pri čemu se dobija prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin A.

[0019] Kod nekih izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje prečišćavanje nekompleksiranog botulinskog toksina A u relativno malom broju koraka da bi se proizveo proizvod koji ima visok prinos, visoku čistoću, i visoku jačinu. Postupke i sisteme obuhvaćen obimom ovog pronalaska moguće je koristiti da se efikasno proizvede stabilan ali nekompleksiran botulinski toksin A iz kultura fermentacije. Kod drugih izvođenja, taj postupak još obuhvata obezbeđivanje uzorka koji obuhvata botulinski toksin A kompleks i punjenje kolone za hidrofobnu interakciju sa uzorkom tako da se omogući hvatanje kompleksa botulinskog toksina A putem kolone za hidrofobnu interakciju. Kompleks botulinskogtoksina A se zatim eluira iz kolone sa puferskim sredstvom. Sirovi nekompleksirani botulinski toksin A se razgrađuje iz kompleksa botulinskogtoksina A da bi se dobila mešavina koja obuhvata sirov nekompleksiran botulinski toksin A. U ovom izvođenju, ta mešavina koja obuhvata sirovi nekompleksirani botulinski toksin A se prečišćava da bi se dobio čist ili pretežno čist botulinski toksin A prema gore opisanom postupku.

[0020] Jedno varijantno rešenje ovog pronalaska je uviđanje da farmaceutska supstanca koja obuhvata nekompleksirani botulinski toksin kao aktivni sastojak može obezbediti veću čistoću u poređenju sa onom koja obuhvata kompleksirani oblik. Netoksinski proteini obično se povezuju sa kompleksom botulinskog toksina mogu činiti oko 90% težine tog kompleksa. Dakle, dobijanje botulinskog toksina kao kompleksa neizostavno obuhvata barem oko 90% težine nečistoća. Drugim rečima, barem oko 80 do oko 90% težine farmaceutske supstance će obuhvatiti nečistoće izvedene iz ćelije koje nisu deo aktivnog molekula niti su neophodne za njegovu biološku aktivnost. Takve nečistoće, međutim, predstavljaju materijale izvedene iz ćelije koji kada se isporuče pacijentu mogu povećati rizik od neželjenih imunoloških reakcija na lek, mogu povećati rizik od neželjenih pratećih efekata; i /ili mogu povećati rizik od prenosa patogenih agenasa. Nasuprot tome, visoka čistoća nekompleksiranog proizvoda, koju je moguće dobiti ovde opisanim postupcima i sistemima, smanjuje količinu nečistoća ćelije domaćina koje mogu ostati u farmaceutskoj supstanci, čime se smanjuju prolazni rizici od neželjenih reakcija i/ili pretvaranja. S tim u skladu, postupci i sistemi opisani ovde mogu obezbediti botulinski toksin u obliku koji je pogodniji za dobijanje bezbednijih, čistijih farmaceutskih supstanci.

[0021] Pored toga, za razliku od kompleksiranih oblika, slobodan botulinski toksin dobijen u skladu sa ovde opisanim postupkom ne zahteva da bude obavezno stabilizovan za skladitenje u proizvodima izvedenim iz krvi. Kompleks Botulinskog toksina tip A, na primer, je obično stabilizovan u ekscipijentu koji obuhvata albumin, koji je izveden iz ljudske krvi. Na primer, BOTOX® obuhvata prečišćen kompleks botulinskog toksina tipa A, humani serum albumin, i natrijum hlorid spakovan u obliku koji je vakuumski isušen. Isto važi za Disport (Dysport) i Kseomin (Xeomin). Kako provere smanjuju verovatnoću kontaminacije sa patogenim agensima, upotreba humane krvi u farmaceutskim preparatima generalno povećava rizik od neželjenog prenosa izvesnih patogenih agenasa, npr., agensi koji niisu ili ne mogu još uvek da budu provereni. Nasuprot tome, slobodan botulinski toksin dobijen prema ovom pronalasku moguće je stabilno čuvati, kako se ovde objašnjava, u amonijak sulfatu. Pored toga, kod nekih preporučenih izvođenja, postupci i sistemi iz ovog pronalaska su pretežno, ili u suštini, ili u celini bez prisustva proizvoda životinje, kako se ovde razmatra. Sposobnost da se takođe stabilno čuva proizvod toksina pretežno, u suštini, ili u celini bez prisustva proizvoda životinje, još smanjuje potencijalne rizike povezane sa proizvodima izvedenim iz životinje. S tim u skladu, procesi i sistemi opisani ovde obezbeđuju botulinski toksin u obliku pretežno pogodnom za farmaceutske primene u smislu bezbednosti, npr., pri čemu ta farmaceutska supstanca može da se dobije i čuva pretežno, u suštini, ili u celini bez prisustva proizvoda životinje.

[0022] Kod izvesnih preporučenih izvođenja, ti procesi i sistemi opisani ovde su u razmeri i/ili cGMP usaglašeni. S tim u skladu, postupci i sistemi opisani ovde mogu biti korišćeni na komercijalnom, industrijskom obimu proizvodnje, da bi se proizveo nekompleksirani botulinski toksin za upotrebu, npr., u farmaceutskim supstancama. Postupak ili sistem usklađen sa cGMP se odnosi na onaj koji može da se usaglasi sa zakonskim propisima trenutne dobre proizvodne prakse, kao što propisuje Savezni zakon SAD-a (U.S. Code of Federal Regulations). Kod nekih preporučenih izvođenja, nekompleksirani botulinski toksin A proizvod je posebno pogodan za proizvodnju velikih razmera zbog lakoće skladištenja i iskoristivosti, visoke aktivnosti, visoke čistoće, stabilnosti, i/ili poboljšane bezbednosti.

[0023] Kako se ovde koristi "Botulinum toksin" se odnosi na molekul proteina neurotoksina koji je moguće proizvesti putem bakterije Clostridial bacterium, kao i iz nje rekombinantno proizvedenih oblika. Rekombinantni botulinski toksin može imati laki lanac i/ili teški lanac proteina toksina sintetisanog preko rekombinantnih tehnika, npr., putem rekombinantnih klosridijalnih (Clostridial) i/ili neklostridijalnih (non-Clostridial) vrsta. Ovde se potpuno ravnopravno koristi i "botulinski toksin" sa povezanim izrazima "botulinski neurotoksin," "neurotoksin" ili jednostavno "toksin." "Botulinski toksin" obuhvata bilo koji od serotipova botulinskog toksina, A, B, C1, D, E, F i G, i takođe obuhvata i kompleksirane i nekompleksirane oblike.

[0024] Pod "komplesirani oblik" se podrazumeva kompleks botulinskog toksina koji obuhvata protein boltulinskog toksina (t.j., molekul toksina sa molekularnom težinom od oko 150 kD) kao i barem jedan povezan prirodni netoksinski protein. Netoksinski proteini koji čine komplekse obično obuhvataju netoksinski protein hemaglutinina i netoksinski protein nehemaglutinina. Dakle kompleksni oblici mogu obuhvatiti molekul botulinskog toksina (neurotoksična komponenta) i jedan ili više netoksinskih proteina hemaglutinina i/ili jedan ili više netoksinskih proteina nehemaglutinina. Kod izvesnih izvođenja, molekularna težina kompleksa je veća od oko 150 kD. Na primer, kompleksirani oblici botulinskog toksina tip A mogu imati molekularne težine od oko 900 kD, oko 500 kD ili oko 300 kD. Kompleksni oblici botulinskog toksina tipovi B i C1mogu imati molekularnu težinu od 500 kD. Kompleksni oblici botulinskog toksina tip D mogu imati molekularnu težinu od oko 300 kD ili oko 500 kD. Najzad, kompleksni oblici botulinskog toksina tipovi E i F mogu imati molekularnu težinu od oko 300 kD.

[0025] "Nekompleksirani" botulinski toksin se odnosi na izolovan, ili u suštini ili pretežno izolovan, protein botulinskog toksina koji ima molekularnu težinu od oko 150 kD. To znači, "nekompleksirani" oblici isključuju netoksinske proteine, kao što su proteini netoksinskog hemaglutinina i netoksinskog nehemaglutinina, normalno povezani sa kompleksiranim oblikom. "Nekompleksiran" botulinski toksin se koristi ravnopravno ovde sa "slobodnim" botulinskim toksinom. Svi serotipovi botulinskog toksina napravljeni prirodnim bakterijama klostridijum botulinom (Clostridium botulinum) se sintetišu kao neaktivni proteini pojedinačnog lanca koji se zatim cepaju ili prekidaju (nik) proteazama da bi postale neuroaktivni. Taj protein obuhvata oko 100 kD teškog lanca spojenog disulfidnom vezom na oko 50 kD lakog lanca.

[0026] Kompleksi botulinskog toksina mogu biti razdruženi u proteine toksina i netoksina putem različitih sredstava, uključujući, na primer, podizanje pH do oko 7,0, tretiranje kompleksa sa crvenim krvnim ćelijama na pH od oko 7,3, i/ili izlaganje tog kompleksa postupku separacije, kao što je hromatografija na stubu u pogodnom puferu na pH od oko 7 do oko 8.

[0027] Ovaj pronalazak obuhvata postupke koji omogućavaju prečišćavanje nekompleksiranog botulinskog toksina A, bez pridruženih proteina netoksina standardno smatranim neophodnim tokom postupka prečišćavanja da bi se održala stabilnost. Kod preporučenih izvođenja, ti ovde opisani postupci olakšavaju prečišćavanje slobodnog botulinskog toksina A bez gubitaka stabilnosti. Pod "stabilnost" ili "stabilno" se podrazumeva da molekul proteina botulinskog toksina zadržava i oko 100 kD teškog lanca i oko 50 kD lakog lanca, spojene jedan na drugi disulfidnom vezom, i u skladu sa dozvoljenom biološkom aktivnošću.

[0028] Kod nekih izvođenja, specifičan sistem funkcioniše u vezi sa specifičnim postupkom obuhvaćenim obimom ovog pronalaska. Korišćeni sistem obuhvaćen obimom ovog pronalaska može obuhvatiti više (poželjno uzastopnih nizova) kolona hromatografske analize za upotrebu sa odgovarajućim višestrukim (poželjno uzastopnim nizovima) koraka hromatogafske analize. Pored toga, korišćen sistem obuhvaćen obimom ovog pronalaska može obuhvatiti više (preporučljivo uzastopnih nizova) nehromatograskih uređaja, kao što je aparat za filtraciju i/ili centrifugiranje, za upotrebu sa odgovarajućim višestrukim (poželjno uzastopnim nizom) nehromatografskih koraka, npr., kao prethromatogafske korake.

[0029] U preporučenim izvođenjima, postupak obuhvaćen obimom ovog pronalaska obuhvata dobijanje uzorka koji obuhvata botulinski toksin A iz neke kulture fermentacije, njegovo izlaganje nekim prethromatografskim prečišćavajima; i zatim provlačenje kroz više hromatografskih kolona da bi se dobio visokoprečišćen, nekompleksiran botulinski toksin A visoke jačine. Takav prečišćen slobodan botulinski toksin A nalazi upotrebu u dobijanju farmaceutskih supstanci koje obuhvataju slobodan botulinski toksin A kao aktivni sastojak.

[0030] Svi koraci i za prethomatografske i hromatografske postupke za neka preporučena izvođenja iz ovog pronalaska su ilustrovani na Slici 1A. Poređenja radi, Slika 1B pokazuje uobičajeni postupak za dobijanje prečišćenog kompleksa botulinskog toksina. Ukratko, Slika 1B prikazuje postupak koji obuhvata filtraciju u dubinu neke kulture fermentacije, posle čega sledi filtracija tangencijalnim protokom filtrata dobijenog (korišćenjem 300kD ultramikrofiltracija); posle čega sledi razbistravanje u koraku centrifugiranja. Pelet (nerastvorljiva frakcija) koji nastaje iz koraka centrifugiranja se zatim vraća u suspenziju u natrijum hloridu, i puni u kolonu za hidrofobnu interakciju ili jonsku izmenu. Korak hromatografskog prečišćavanja se ponavlja barem tri puta da bi se dobio finalni eluent koji obuhvata 900 kD kompleks botulinskog toksina tip A.

Fermentacija i taloženje kiseline

[0031] Kako ilustruje Slika 1A, nekompleksirani botulinski toksin je generalno prečišćen iz kulture fermentacije. Kultura "fermentacije" kako se ovde koristi se odnosi na kulturu ili podlogu koja obuhvata ćelije, i/ili njihove komponente, koje sintetizuju i/ili su sintetizovale barem jedan botulinski toksin. Na primer, Clostridial bakterija, kao što je Clostridium botulinum, može biti kultivisana na agarnim pločama u okruženju koje je provodljivo za rast bakterija, kao što je topla anaerobna atmosfera. Taj korak kulture obično dozvoljava da se dobiju kolonije Clostridial sa željenom morfologijom i drugim karakteristikama. Izabrane kultivisane kolonije Clostridial zatim mogu da fermentiraju u pogodnoj podlozi kao kultura fermentacije. Kultivisane ćelije mogu da obuhvate non-Clostridial vrste kao što su ćelije domaćini, kao što je E. coli ili ćelije kvasca, koje se učine sposobnim za biosintetisanje botulinskog toksina rekombinantnom tehnologijom. Pogodni uslovi za kulturu fermentacije mogu zavisiti od korišćenih ćelija domaćina i generalno su poznati u ovoj oblasti.

[0032] U preporučenim izvođenjima, fermentacija može da bude ostavljena da napreduje do završetka, tako da su ćelije zrele i biosintetisale su botulinum toksin. Rast Clostridium botulinum kultura je obično završen oko 24 do oko 36 sati. Posle izvesnog dodatnog perioda vremena, bakterije se obično lizuju i otpuštaju u podlogu sintetisanog kompleksa botulinskog toksina u kompleksiranom obliku. Na primer, tokom fermentacije od oko 60 do oko 96 sati, većina ćelija Clostridium botulinum prolazi lizu i otpušta kompleks botulinskog toksina tip A.

[0033] Kod nekih izvođenja, kultura fermentacije može obuhvatiti jedan ili više proizvoda poreklom od životinja, kao što su proteini životinje, korišćeni u uobičajenim postupcima kulture fermentacije. Na primer, botulinski toksin je moguće proizvesti anaerobnom fermentacijom Clostridium botulinum korišćenjem modifikovane verzije dobro poznatog Šanc-ovog (Schantz) postupka (videti npr. Schantz E. J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine (Svojstva i upotreba botulinskog toksina i drugih mikrobnih neurotoksina u medicini), Microbiol Rev 1992 March; 56(1):80-99; Schantz E. J., et al., Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (Dobijanje i karakterizacija botulinskog toksina tip A za lečenje ljudi), chapter 3 in Jankovic J, ed. Neurological Disease and Therapy. Therapy with botulinum toxin (Neurološko oboljenje i lečenje. Terapija sa botulinskim toksinom) (1994), New York, Marcel Dekker; 1994, pages 41-49, and; Schantz E. J., et al., Use of crystalline type A botulinum toxin in medical research (Upotreba kristalnog tipa A botulinskog toksina u medicinskom istraživanju), in: Lewis G E Jr, ed. Biomedical Aspects of Botulism (1981) New York, Academic Press, pages 143-50). I Šanc-ov postupak i modifikovan Šanc-ov postupak za dobijanje botulinum toksina koriste proizvode poreklom od životinja, uključujući iz životinje izvedenu podlogu Bacto-Cooked Meat u bočici od kulture, i kazein u podlozi fermentacije. Dodatno, prečišćavanje Šanc (Schantz) toksina omogućava upotrebu DNaze i RNaze iz poreklom iz govedine da bi se hidrolizovale nukleinske kiseline prisutne u kulturi fermentacije.

[0034] Međutim, isporuka leka koji obuhvata aktivni sastojak koji je prečišćen korišćenjem postupka koji obuhvata proizvode izvedene iz životinja može izložiti pacijenta potencijalnom riziku od toga da primi različite patogene agense. Na primer, prioni mogu biti prisutni u farmaceutskoj supstanci koja obuhvata kontaminiranje proizvoda izvedenih iz životinje, kao što je prion odgovoran za Krojcfild-Jakobovu (Creutzfeldt-Jacob) bolest. Kao drugi primer, postoji rizik od prenošenja spongiformne (sunđerast) encefalopatije (TSE), kao što je goveđa spongiformna (sunđerast) encefalopatija (BSE) kada se proizvodi poreklom iz životinja koriste u postupku pravljenja farmaceutske supstance. Upotreba botulinskog toksina dobijenog preko postupka bez proizvoda poreklom iz životinja, međutim, smanjuje takve rizike. Samim tim, kod nekih preporučenih izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak koji nema proizvode poreklom iz životinja, ili u suštini ili pretežno proizvod neanimalnog porekla (APF). "Neanimalni proizvod", "u suštini neanimalni proizvod", ili "pretežno neanimalni proizvod" obuhvata, prema opisanom redosledu, "neanimalni protein", "u suštini neanimalni protein", ili "pretežno neanimalni protein" i pretežno znači odsustvo, u suštini odsustvo, ili pretežno odsustvo, proizvoda izvedenih iz životinja, čiji neograničavajući primeri obuhvataju proizvode izvedene iz krvi ili sakupljene krvi. "Životinja" se ovde koristi da bi se uputilo na sisara (kao što je čovek), ptica, reptil, amfibija, riba, insekt, pauk ili druga vrsta životinje, ali isključuje mikroorganizme, kao što su bakterije i kvasci.

[0035] Postupak bez prisustva proizvoda životinje (ili pretežno ili u suštini postupak bez animalnog porekla) se odnosi na postupak koji je u celini, pretežno, ili u suštini bez proizvoda izvedenih iz životinje, reagenasa izvedenih iz životinje, proteina izvedenih iz životinje, kao što su imunoglobulini, drugi proizvodi krvi, nusproizvodi, ili razgradnje; mesni proizovdi; nusproizvodi od mesa, razgradnja mesa; i mleko ili mlečni proizvodi, nusproizvodi ili razradnje. S tim u skladu, primer postupka kulture fermentacije neanimalnog proizvoda je postupak fermentacije, kao što je kultivisanje bakterije, koje isključuje krv, mesto, i mlečne proizvode, nusproizvode, i razgradnje. Neanimalni postupak fermentacije za dobijanje nekompleksiranog botulinskog toksina smanjuje mogućnost kontaminacije sa virusima, prionima ili drugim neželjenim agensima, koji mogu zatim da slede toksin kada se isporučuje ljudima.

[0036] Kulture koje koriste postupke fermentacije bez prisustva proizvoda životinje Clostridium su opisane, npr., u U.S. Pat. Nos. 7,452,697 i 7,354,740. Na primer, podloga za rast za proizvodnju botulinskog toksina može obuhvatiti proizvode na bazi biljke, umesto proizvode izvedene iz životinja, kao što su proizvodi na bazi soje i/ili odgorčeno seme Lupinus campestris.

1

Podloga fermentacije na bazi soje za upotrebu u neanimalnoj kulturi ferementacije, na primer, može obuhvatiti proizvod na bazi soje, izvor ugljenika kao što je glukoza, soli kao što je NaCl i KCl, sastojci koji sadrže fosfat kao što je Na2HPO4i KH2PO4, dvovalentni katjoni kao što je gvožđe i magnezijum, prah gvožđa, aminokiseline kao što je L-cistein i L-tirozin, i slične. Preporučljivo, soja je hidrolizovana soja i hidrolizacija je izvedena korišćenjem enzima koji nisu izvedeni iz životinja. Izvori hidrolizovane soje obuhvataju ali se ne ograničavaju na Hy-Soy (Quest International), Soy pepton (Gibco) Bac-soyton (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, N.Y.), i SE50MK (DMV).

[0037] Kao što ilustruje Slika 1A, u izvesnim izvođenjima uzorak koji obuhvata botulinski toksin A je dobijen iz kulture fermentacije. Na primer, posle izvesnog perioda fermentacije, u bilo kom neanimalnom proizvodu ili podlozi neanimalnog proizvoda, kompleks botulinskog toksina A se otpušta u podlogu i može biti prikuljen putem taloženja. Na primer, kod nekih izvođenja, kao u poznatom postupku Šanc (Schantz), ta podloga fermentacije obuhvata botulinum toksin A može da bude izložena taloženju kiseline da bi se ohrabrili kompleksi botulinskog toksina da se povežu sa krhotinom ćelije i formiraju talog kiseline. Kod nekih specifično preporučenih izvođenja, oko 3 M rastvora sumporne kiseline moguće je dodati u kulturu fermentacije da bi se formirao talog kiselline. Preporučljivo, pH je redukovana na oko 3 do oko 4, još preporučljivije do oko 3,2 do oko 3,8, i još preporučljivije oko 3,5. Kod nekih izvođenja, temperatura kulture je takođe smanjena, npr., do oko ispod 25°C, 24°C, 23°C, 22°C, 21°C, ili 20°C. Ovi uslovi još pospešuju udruživanje kompleksa botulinskog toksina sa krhotinom ćelije. Formirani talog kiseline će obuhvatiti vezane komplekse botulinskog toksina i može biti korišćen kao početni materijal za dalje korake prečišćavanja, kao što su koraci razbistravanja; pri čemu se filtrat odbacuje.

[0038] Nasuprot tome, uobičajeni postupak prikazan na Slici 1B ne obuhvata korak taloženja kiseline. To znači, kako postupak prečišćavanja takođe počinje sa kulturom fermentacije koja obuhvata kompleks botulinskog toksina, podloga kulture se izlaže dubokoj filtraciji, i taj filtrat, pre nego krhotina ćelije, se koristi za naknadne korake prečišćavanja. U postupku sa Slike 1B, odbacuje se krhotina ćelije, pre nego filtrat, pri čemu se, kako je ilustrovano na Slici 1A, taj filtrat odbacuje i krhotina ćelije (talog ćelije) se koristi za dalje korake prečišćavanja, npr., u dole razmatranim prethromatografskim prečišćavanjima.

Prethromatografka prečišćavanja

[0039] Kod nekih izvođenja, uzorak dobijen iz podloge za fermentaciju se izlaže jednom ili više prethromatografskih prečišćavanja. Prethromatografska prečišćavanja mogu obuhvatiti barem jednu filtraciju tangencijalnog protoka, razgradnje nukleaze, i razbistravanja centrifuigranjem i/ili filtracijom. Neograničavajući primer procesnog toka koji obuhvata prethromatografsko prečišćavanje koje se razmatra ovim pronalaskom je dato na Slici 1A. Kako je gore napomenuto, u preporučenim izvođenjima, prethromatografski postupci se izvode na talogu (ili nerastvorljivoj frakciji) kulture fermentacije koja obuhvata botulinski toksin A, pre nego sama kultura fermentacije ili iz nje izveden filtrat, kao što je ilustrovano u postupku na Slici 1B. To znači, u preporučenim izvođenjima ovog pronalaska, prethromatografski (razbistravanje) koraci počinju sa kiselim talogom (nerastvorljiva frakcija).

[0040] Kod nekih izvođenja, uzorak (talog kiseline ili nerastvorljiva frakcija) obuhvata botulinski toksin A se izlaže filtraciji tangencijalnog protoka. Filtracija tangencijalnog protoka je postupak koji se obično koristi da se razbistre, koncentruju, i/ili prečiste proteini. Nasuprot filtraciji normalnog protoka, gde se fluid pomera direktno prema membrani filtera pod primenjenim pritiskom, u filtraciji tangencijalnog protoka, fluid se pomera tangencijalno duž, ili paralelno na, površinu membrane. Primenjeni pritisak služi da deo fluida silom prođe kroz membranu filtera, na stranu filtrata, pri čemu se zadržavaju čestice i makromolekuli previše veliki da bi prošli kroz pore membrane. Za razliku od filtracije normalnog protoka, međutim, zadržane komponente se ne skupljaju na površini membrane već se speru duž tangencijalnog protoka fluida. Kod izvesnih preporučenih izvođenja, filtracija tangencijalnog protoka se koristi da se koncentriše nerastvorljivi materijal (krhotine ćelije) sa kojima se povezuje botulinum kompleks, pri čemu se dozvoljava filtratu da prođe kroz pore membrane. (Videti, npr., Slika 1A.) Parametre filtracije tangencijalnog protoka, kao što su veličine pore, protok dovoda, primenjeni pritisak, i slično, može izabrati stručnjak u ovoj oblasti da bi koncentrovao krhotinu ćelije i proizveo koncentrovaniji uzorak koji obuhvata kompleks botulinskog toksina A. Kod nekih specifično preporučenih izvođenja, na primer, moguće je koristiti filtraciju tangencijalnog protoka sa filterima koji imaju veličinu pora od oko 0,1 µm.

[0041] Kod nekih izvođenja, taj uzorak koji obuhvata botulinski toksin A se izlaže razgradnji nukleaze se podvrgava razgradnji nukleaze. Razgradnja nukleaze može olakšati uklanjanje komponenata nukleinske kiseline sa kojom kompleksi botulinskog toksina pokazuju nastojanje da se udruže. Kod izvesnih izvođenja, razgradnja nukleaze sledi filtraciju tangencijalnog protoka i izvodi se na iz nje dobijenoj koncentrovanoj krhotini ćelije . (Videti, npr., Slika 1A.) Na primer, uzorak koncentrovane krhotine ćelije može imati pH podešenu da omogući aktivnost nukleaze i može biti inkubirana sa jednom ili više pogodnih nukleaza, kao što su DNaze i/ili RNaze koje razgrađuju (hidrolizuju) DNK i/ili RNK, prema opisanom redosledu. Zavisno od korišćenog enzima nukleaze, pogodna pH može da bude oko 5 do oko 7, preporučljivo oko 6. Kod nekih izvođenja, benzamidin se koristi kao inhibitor proteaze da bi sprečio proteolizu toksina tokom koraka razgradnje nukleaze. Korišćena nukleaza može biti izvedena iz bilo kog pogodnog porekla (izvora), uključujući animalno poreklo i/ili neanmalno poreklo.

[0042] Kod preporučenijih izvođenja, nukleaza se dobija iz neanimalnog izvora, da bi se obezbedila nukleaza bez prisustva proizvoda životinje i postupak bez prisustva proizvoda životinje. Sa tim u skladu, ovaj pronalazak obuhvata postupke bez prisustva proizvoda životinje (ili pretežno ili u suštini postupke bez prisustva proizvoda životinje) za prečišćavanje botulinskog toksina koji obuhvataju upotrebu nukleaze. Nukleaza bez prisustva proizvoda životinje može da bude napravljena rekombinantno, npr., korišćenjem rekombinantnih bakterija, kvasaca, ili drugih pogodnih mikroorganizama, koji su transformisani da izraze DNazu i/ili RNazu za upotrebu u koraku razgradnje prema ovde opisanom postupku. Razgradnja nukleaze obično smanjuje sadržaj nukleinske kiseline u tom uzorku, jer se nukleinske kiselne ćelije domaćina razgrađuju i njihovo uklanjanje se olakšava. Na primer, hidrolizovane nukleinske kiseline i njihove nečistoće male molekularne težine mogu biti uklonjene daljim koracima prečišćavanja.

[0043] Kod izvesnih izvođenja, uzorak koji obuhvata botulinski toksin A je moguće izložiti razbistravanju putem centrifugiranja i/ili filtracije. Razbistravanje centrifugiranjem ili filtracijom se odnosi na korake centrifugiranja ili filtracije korišćene da se uklone bruto elementi, kao što su cele i lizovane ćelije i krhotina ćeija, iz uzorka, što daje kao rezultat merljivo bistriji uzorak. Kod izvesnih izvođenja, centrifugiranje se izvodi na oko 10.000xg do oko 30.000xg, još poželjnije na oko 15.000xg do oko 20.000xg, i najpoželjnije na oko 17.700xg. Razbistrujuća filtracija će občno obuhvatiti filtraciju normalnog protoka, takođe se zove filtracija "mrtvog kraja", pri čemu se fluid pomera direktno prema podlozi za filter pod primenjenim pritiskom, i čestice prevelike da prođu kroz pore filtera se akumuliraju na površini ili unutar same podloge, pri čemu manji molekuli prolaze kroz filtrat. Kod nekih posebno preporučenih izvođenja, uzorak se meša sa amonijak sulfatom i filtracija normalnog protoka se izvodi korišćenjem filtera sa veličinom pora od oko 0,1 do oko 0,3 µm, i još preporučljivije veličina pora od oko 0,2 µm. (Videti, npr., Slika 1A.) Kod izvesnih specifično preporučenih izvođenja, jedan ili više koraka razbistravanja slede korak razgradnje nukleaze. Kod izvesnih i dalje preporučenijih izvođenja, jedan ili više koraka razbistravanja neposredno prethodi prečišćavanje korišćenjem hromatografije.

[0044] Prvenstveno, u preporučenim izvođenjima, razbistreni supernatant ili filtrat obezbeđuje botulinum toksin koji sadrži uzorak A za upotrebu u daljim koracima prečišćavanja, kao što su koraci hromatografskog prečišćavanja, pre nego nerastvorljivu frakciju, koja se odbacuje. Ovo je suprotno postupku prikazanom na Slici 1B, gde je kompleks botulinskog toksina sadržan u nerastvorljivoj frakciji iz prethromatografskih koraka koji ne obuhvataju taloženje kiseline, kao što je, npr., kao što je pelet centrifugiranja, dobijen iz prethromatogafskog centrifugiranja, i supernatant se odbacuje.

[0045] Pored toga, i ponovo nasuprot postupku iznetom na Slici 1B, prethromatografski koraci kod nekih izvođenja iz ovog pronalaska ne zahtevaju korak filtracije tangencijalnog protoka filtrata dobijenog iz kulture fermentacije. To znači, da uzorak korišćen za hromatografsko prečišćavanje kod nekih izvođenja iz ovog pronalaska nije dobijen podvrgavanjem rastvorljive frakcije kulture fermentacije filtraciji tangencijalnog protoka. Preciznije, kod izvesnih izvođenja, ovaj pronalasak koristi nerastvorljvi materijal (kao što je talog kiseline), koji eliminiše bilo koji korak gde se filtrat kulture fermentacije izlaže filtraciji tangencijalnog protoka u pokušaju da se koncentruju rastvorljivi

1

kompleksi botulinskog toksina. Dakle, kod preporučenih izvođenja, prethromatografski koraci iz ovog pronalaska potrebni za bilo koji takav korak, putem umesto korišćenja kiseline za taloženje željenih kompleksa toksina sa drugim nerastvorljivim materijalom (krhotinom ćelije).

Koraci hromatografskog prečišćavanja

[0046] Slika 1A takođe ilustruje korake hromatografskog prečišćavanja prema izvesnim izvođenjima iz ovog pronalaska. Prema jednom izvođenju ovog pronalaska, hromatoggrafski postupci za prečišćavanja nekompleksiranog botulinskog toksina A obuhvataju provlačenje uzorka koji obuhvata botulinski toksin A kroz više hromatografskih kolona da bi se dobio visoko prečišćen, visoke jačine nekompleksirani oblik neurotoksina.

[0047] Kod izvesnih izvođenja, kompleksirani botulinski toksin A se odvaja od drugih ćelijskih komponenata korišćenjem kolone za hidrofobnu interakciju (videti npr., Slika 1A). Kolona hvata botulinski toksin u kompleksiranom obliku, a istovremeno dozvoljava nečistoćama da teku kroz kolonu. Korišćena kolona može da bude bilo koja od poznatih u ovoj oblasti kolona za hidrofobnu interakciju pogodnih za takvu namenu, kao što je Butyl Sepharose Fast Flow (butil sefarozna kolona sa brzim protokom) ili Phenyl Sepharose HP (fenil sefarozna visoke jačine) kolona, koje su komercijalno dostupne iz GE Healthcare Life Sciences. Kod nekih izvođenja, ovaj postupak još obuhvata pripremu uzorka za hromatografiju sa hidrofobnom interakcijom pre punjenja u kolonu. Na primer, za upotrebu u Phenyl Sepharose HP (fenilsefaroznoj koloni visoke jačine), uzorak je moguće kombinovati sa 0,5 M rastvora amonijak sulfata na pH 6, i 50 mM fosfata pre punjenja. Druge kolone, puferi i pH uslovi koje je moguće koristiti obuhvataju kolone kao što je Phenyl Sepharose Fast Flow high substitution (visokosupstituciona fenilsefarozna kolona sa brzim protokom), Phenyl Sepharose Fast Flow low substitution (niskosupstituciona fenilsefarozna kolona sa brzim protokom, Butyl Sepharose (butil sefarozna), i Octyl Sepharose (oktil sefarozna); puferi kao što je acetat, citrat, MES, histidin, piperazin, i malonat, svaki u pH opsegu od oko 4,0 do oko 7,0, još preporučljivije oko 4,5 do oko 6,5, i još preporučljivije oko 5,5. Drugo pufersko sredstvo i pH stanja mogu biti određeni da bi se optimizovao prinos iz specifične korišćene kolone, kako je poznato u ovoj oblasti, na osnovu ovde datih objašnjenja. Bez želje da se ograničimo na teoriju, veruje se da odvajanje obuhvata vezivanje kompleksa toksina na smolu na pH ispod 7, da bi se izbegla razdruživanje u ovom koraku, pri čemu se dozvoljava mnogim nečistoćama izvedenim iz ćelija da proteku, kao što je, npr., manji proteini, nukleinske kiseline, i slično.

[0048] Za eluiranje uhvaćenog (vezanog) toksina iz kolone za hidrofobnu interakciju, moguće je koristiti pogodan pufer, kao što je poznato u ovoj oblasti. Kod nekih specifično preporučenih izvođenja, koristi se opadajući gradijent amonijak sulfata. Opseg koncentracije opadajućeg gradijenta može biti od oko 0,6 M do oko 0,0 M, oko 0,5 M do oko 0,0 M, ili oko 0,4 M do oko 0,0 M. Drugi eluirajući puferi koje je moguće koristiti obuhvataju, na primer opadajuće gradijente natrijum sulfata (Na2SO4); natrijum hlorida (NaCl); kalijum hlorida (KCl); amonijak acetata (NH4OAc); i slične. Frakciju(e) koja obuhvata vršnu vrednost proizvoda je moguće identifikovati, kako je poznato u ovoj oblasti. Vršna vrednost frakcije je obično nađena, npr., kada korišćenje amonijak sulfata, u opsegu koncentracije od oko 0,4 M do oko 0,0 M; još poželjnije oko 0,3 M do oko 0,0 M; i još poželjnije oko 0,25 M do oko 0,0 M amonijak sulfata, dok se pH čuva na oko 6 da bi se održao kompleks. To znači, frakcija(e) koje obuhvataju eluiran kompleks botulinskog toksina A moguće je identifikovati i koristiti u naknadnim koracima prečišćavanja.

[0049] U preporučenim izvođenjima, dobijeni kompleks botulinskog toksina A se dovodi u situaciju da se razgradi da bi dao nekompleksirani oblik. Kod izvesnih izvođenja, korak disocijacije se izvodi posle hromatografskog koraka hidrofobne interakcije i/ili pre naknadnih hromatografskih koraka (npr., videti Slika 1A). Prema tome, kod nekih preporučenih izvođenja, ovaj pronalazak obuhvata postupke gde se hromatografski ciljni molekul razlikuje od jednog do drugog hromatografskog koraka. To znači, u početnom hromatografskom koraku, cilj obuhvata kompleks botulinskog toksina A, pri čemu u naknadnim hromatografskim koracima, cilj obuhvata slobodan botulinski toksin A, razgrađen od netoksinskih proteina kao što je hemaglutinin i proteina nehemaglutina. Nasuprot tome, postupci prikazani na Slici 1B obuhvataju hromatografske korake koji su svi projektovani da prečiste komplekse botulinskog toksina.

[0050] Razdruživanje kompleksa botulinskog toksina A da se proizvede nekompleksirani botulinski toksin A može biti postignuto na nekoliko načina, npr., kao što je poznato u oblasti i/ili opisano ovde. Na primer, razdruživanje je moguće postići podizanjem pH do oko 7,0; ili, kod izvođenja kod kojih nije obavezno da je prečišćavanje bez proteina životinje, tretiranje kompleksa crvenim ćeljama krvi na pH od oko 7,3.

[0051] Kod preporučenog izvođenja i da bi se dobio toksin koji nije životinjskog porekla, kompleks se izlaže postupku separacije posle podešavanja pH vrednosti tog kompleksa u pogodnom puferu. Pogodni puferi obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, katjonske pufere, preporučljivo katjonske pufere koji neće reagovati međusobno ili neće pretežno reagovati sa kolonom za anjonsku izmenu. Pogodni katjonski puferi obuhvataju, npr., Tris, bis-Tris, trietanolamin, N-metil dietanolamin. pH od između oko 7 do oko 8,4; još poželjnije između oko 7,4 do oko 8,2; i najpoželjnije pH od oko 7,8 je obično pogodna za razdruživanje tog kompleksa da bi se otpustio nekompleksirani botulinski toksin. Kod nekih specifično preporučenih izvođenja, na primer, pH vrednost eluenta kolone za hidrofobnu interakciju se podiže na oko 7,5, oko 7.8, ili poželjno do oko 8,0. Na primer, kod nekih izvođenja, eluent može da bude razblažen u Tris pufer koji ima pH od oko 7,8 da bi prouzrokovao da se kompleks razdruži u pojedinačne komponente, uključujući oko 150 kD nekompleksiranog proteina botulinskog toksina A. Mešavina dobijena kao rezultat koja obuhvata razdružene komponente može zatim da bude izložena jednom ili više dodatnih koraka hromatografskog prečišćavanja, kao što su koraci hromatografije sa jonskom izmenom predviđeni da uhvate i dodatno prečiste nekompleksirani toksin.

1

[0052] Kod izvesnih izvođenja prema ovom pronalasku, nekompleksirani botulinski toksin A moguće je prečistiti korišćenjem jednog ili više hromatografskih koraka jonske izmene, (npr., videti Slika 1A). Hromatografija sa jonskom izmenom postiže frakcinaciju na osnovu alektrostatičkog naelektrisanja. Nivo do kog se dati protein veže na matricu kolone je funkcija neto naelektrisanja tog proteina, na osnovu njegovog individualnog sastava amino kseline i naelektrisanja matrice kolone. Kolone sa katjonskom izmenom jona imaju matricu neto pozitivnog naelektrisanja pri čemu kolone sa anjonskom izmenom jona imaju neto negativnu matricu naelektrisanja. OVezane proteine je moguće selektivno eluirati iz kolone korišćenjem rastvarača (eluent) koji obuhvata naelektrisanu supstancu, kao što su joni soli, koji se takmiče sa naelektrisanom potporom matrice za vezivanje na naelektrisane proteine. Vezani proteini mogu dakle da budu frakcionisani na bazi jačine njihovog naelektrisanja. Alternativno, proteini mogu da budu eluirani podešenom pH vrednošću koja može da promeni neto naelektrisanje proteina čime se menja njegov afinitet u naelektrisanu matricu.

[0053] Prema nekim preporučenim izvođenjima ovog pronalaska, mešavina koja obuhvata nekompleksiran botulinski toksin A se puni u kolonu sa anjonskom izmenom (npr., videti Sliku 1A). Značajno, ova kolona hvata botulinski toksin u nekompleksiranom obliku, tako da taj protein toksina i razdruženi proteini netoksina mogu da budu eluirani u odvojenim frakcijama. Korišćena kolona može biti bilo koja kolona anjona poznata u ovoj oblasti pogodna za odvajanje naelektrisanih proteina, čiji neograničavajući primeri obuhvataju Q Sepharose HP (QSHP), Q Sepharose Fast Flow (QSFF), ili Q XL Sepharose (QSXL), komercijalno dostupne iz GE Healthcare Life Sciences. Kod nekih specifično preporučenih izvođenja, koristi se Q XL Sepharose kolona. Kod nekih izvođenja, taj postupak još obuhvata kondicioniranje mešavine koja obuhvata nekompleksirani botulinski toksin A za hromatografiju sa anjonskom izmenom pre punjenja u kolonu. Na primer, pufer i pH uslovi mogu da budu određeni da bi se optimizovao prinos iz specifične korišćene kolone, kako je poznato u ovoj oblasti, na osnovu ovde datih objašnjenja. Za punjenje i upotrebu u koloni, npr., pogodni puferi obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, katjonske pufere, preporučljivo katjonske pufere koji neće reagovati međusobno ili neće u većoj meri reagovati sa kolonom sa anjonskom izmenom. Pogodni katjonski puferi obuhvataju, npr., Tris, bis-Tris, trietanolamin, N-metil dietanolamin. Za punjenje i izjednačenje te kolone, moguće je koristiti pH od između oko 7,2 do oko 8,6; još poželjnije između oko 7,4 do oko 8,2; i najpoželjnije pH od oko 7,8.

[0054] Za eluiranje uhvaćenog (vezanog) toksina i drugih razgrađenih komponenata iz kolone sa jonskom izmenom, moguće je koristiti pogodan pufer, kako je pogodno u ovoj oblasti. Primeri pogodnih pufera obuhvataju, na primer, natrijum hlorid (NaCl); i kalijum hlorid (KCl). Kod nekih specifično preporučenih izvođenja, koristi se rastući gradijent natrijum hlorida. Na primer, moguće je koristiti natrijum hlorid pufersko sredstvo koje ima opseg koncentracije od oko 0,0 M do oko 0,4 M NaCl, još poželjnije od oko 0,0 M do oko 0,5 M NaCl, i još poželjnije oko 0,0 M do oko 0,6 M

1

NaCl. Nečistoće odvojene u različitim frakcijama mogu obuhvatatiti, npr., jedan ili više proteina netoksina tog razdruženog kompleksa, kao što je, protein netoksinski hemaglutinin i/ili protein netoksinski nehemaglutinin. Frakcija(e) koje sadrže vršnu vrednost proizvoda je moguće utvrditi, kao što je poznato u ovoj oblasti. Vršna vrednost može nastati, na primer, na oko 8 mSem do oko 22 mSem na pH između oko 7,4 do oko 8,4, i preporučljivo na oko 7,8, što odgovara do oko 0,08 M do oko 0,18 M NaCl. Nasuprot tome, druge nečistoće mogu da se eluiraju na oko 30 do oko 45 mSem, što odgovara do oko 0,25 M do oko 0,35 M NaCl.

[0055] Tu frakciju(e) koja obuhvata eluirani nekompleksirani botulinski toksin A moguće je identifikovati da bi se obezbedio eluent koji obuhvata nekompleksirani botulinski toksin A. Vršnu vrednost je moguće identifikovati postupcima poznatim u ovoj oblasti, npr., korišćenjem HPLC, vestern blot analize, ELISA, neredukovane SDS-PAGE, i sličnog. SDS-PAGE pod neredukujućim uslovima, na primer, može identifikovati oko 150 kDa veze toksina, pri čemu će se druge nečistoće pojaviti na vezama koje odgovaraju manjim molekulima. Ovaj eluent obuhvata nekompleksirani oblik koji zatim može da bude podvrgnut koracima daljeg hromatografskog prečišćavanja.

[0056] Kod jednog specifično preporučenog izvođenja, čistoća toksina se procenjuje pomoću SDS-PAGE. Kako će stručnjak u ovoj oblasti razumeti, SDS-PAGE analizu je moguće izvesi u odsustvu ili prisustvu agenasa koji dele disulfidne veze prisutne u proteinu (t.j., neredukujući ili redukujući uslovi, prema opisanom redosledu). Na primer, u vezi sa botulinskim toksinom tip A, zreli i aktivni oblik molekula proteina botulinskog toksina tip A obuhvata dva lanca polipeptida od 100 kD i 50 kD, prema opisanom redosledu, koje međusobno drže nekovalentne interakcije kao i disulfidna veza. Kada se botulinski toksin tip A proizveden ovim novim postupkom koristi za proveru korišćenjem neredukujućih uslova, molekuli proteina botulinskog toksina tip A se premeštaju kao veza jednog proteina sa približno 150 kD i izmerena čistoća je obično veća od 98%. Kada se nastoji da količina proteina botulinskog toksina tip A napunjena po koloni gela bude unutar dinamičnog opsega denzitometra, onda ima malo, ako uopšte ima, detektibilnih veza nečistoće koji daju kao rezutlat izmerenu čistoću od 100%. Kada se prepuni botulinski toksin tip A tako da je glavna veza toksina iznad dinamičkog opsega denzitometra, onda neke manje veze nečistoće mogu biti detektovane (i do 1-2%).

[0057] Međutim, kada se izvede SDS-PAGE analiza botulinskog toksina tip A pod redukujućim uslovima, onda se disulfidna veza botulinskog toksina cepa i protein botulinskog toksina tip A se seli kao dve komponente koje imaju molekularne težine od 100 kD i 50 kD, prema opisanom redosledu. Kada se protein botulinsokg toksina tip A puni tako da su glavne vrste iznad dinamičkog opsega denzitometra i SDS-strana se provlači pod uslovima redukcije onda je mnogo lakše detektovati manje vrste nečistoća. Na primer, pri ovim uslovima može biti čak 5% od 150 kD vrsta prisutnih usled nepotpune proteolitske prerade tokom postupka fermentacije i oporavka. Pod ovim uslovima inventivni postupak daje kao prinos proizvod toksina (koji obuhvata aktivni,

1

iscepan 100 kD i 50 kD lanac polipeptida) koji je obično veći od 90% ukupnog proteina i mnogo verovatniji veći od 95% ukupnog proteina. Dakle, prijavljena izmerena čistoća toksina zavisi od detalja korišćenog SDS-PAGE postupka, kako je ovde opisano. Pored toga, kako se gore navedeni primer tiče botulinskog toksina tip A, stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da je ovde opisanu SDS-PAGE analizu lako moguće prilagoditi za procenu čistoće drugih serotipova botulinskog toksina.

[0058] Kod izvesnih izvođenja, eluent iz anjonske kolone obuhvata nekompleksirani botulinski toksin A napunjen u kolonu sa katjonskom izmenom (videti, npr. Slika 1A). Značajno, ova kolona hvata botulinski toksin u nekompleksiranom obliku, tako da taj protein toksina i razdruženi proteini netoksina mogu da budu eluirani u odvojenim frakcijama. Korišćena kolona može da bude bilo koja kolona sa katjonskom izmenom u ovoj oblasti pogodna za odvajanje proteina, čiji neograničavajući primeri obuhvataju SPSepharose kolonu, uključujući SP Sepharose HP ili SP Sepharose Fast Flow; Mono S kolonu; ili Source-S kolonu, kao što je kolona Source-30S, ili poželjno kolona Source-15S, obe su komercijalno dostupne od GE Healthcare Life Sciences. Kod nekih izovđenja, taj postupak još obuhvata kondicioniranje eluenta iz kolona sa anjonskom izmenom koji obuhvata nekompleksirani botulinski toksin A za hromatografiju sa katjonskom izmenom pre sipanja u tu kolonu. Kod nekih preporučenih izvođenja, pH se podešava tako da pH eluenta koji se puni u tu kolonu omogućava efikasno vezivanje slobodnog toksina na kolonu. Na primer, pH je moguće održavati u okviru opsega vrednosti od oko 4 do oko 8, preporučljivo od oko 5 do oko 7,5, još poželjnije od oko 6 do oko 7, i najpoželjnije na oko 7. Dalje, kod nekih izvođenja, eluent iz kolone sa anjonskom izmenom je moguće tretirati da bi se smanjila provodljivost pre sipanja u kolonu sa katjonskom izmenom, npr., koristi se kao pufer natrijum fosfat, čiji je neograničavajući primer natrijum fosfat pufer od oko 20 mM NaH2PO4. Na primer, eluent iz kolone sa anjonskom izmenom može obuhvatiti čak i oko 0,15 M NaCl, tako da razblaživanje u oko 20 mM NaH2PO4pufera smanjuje provodljivost. Kod nekih specifičnih izvođenja, provodljivost se smanjuje od oko 12 mSem do oko 3,3 mSem. Razblaženje u puferu, dijaliza ili drugi postupci poznati u ovoj oblasti takođe mogu biti korišćeni da bi se smanjila provodljivost.

[0059] Za sipanje i upotrebu u koloni, npr., pogodni puferi obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, anjonske pufere, poželjno anjonske pufere koji neće reagovati sa ili neće u većoj meri reagovati sa kolonom za katjonsku izmenu. Pogodni anjonski puferi obuhvataju, npr., kao MES, HEPES, i slične, i preporučljivo natrijum fosfatni pufer. Za punjenje i izjednačenje te kolone, moguće je koristiti pH od između oko 4 do oko 8; preporučljivo između oko 5 do oko 7,5; još preporučljivije od oko 6 do oko 7; i najpreporučljivije pH od oko 6,8 do oko 7.

[0060] Za eluiranje uhvaćenog (vezanog) toksina iz kolone sa katjonskom izmenom nezavisno od drugih razdruženih proteina netoksina i drugih nečistoća, kao što je poznato u ovoj oblasti, moguće je koristiti pogodan pufer. Kod nekih specifično preporučenih izvođenja, koristi se

1

opadajući gradijent natrijum hlorida. Pogodan opseg koncentracije za gradijent natrijum hlorida može da bude od oko 0,0 M do oko 1 M NaCl. Druge soli koje je moguće koristiti obuhvataju, npr., kalijum hlorid, koji je moguće koristiti u koncentraciji gradijenta od oko 0,0 M do oko 0,5 M KCl. Frakcija(e) koje sadrže vršnu vrednost proizvoda je moguće utvrditi, kao što je poznato u ovoj oblasti. Vršna vrednost se može javiti, na primer od oko 18 do oko 25 mSem, što odgovara sa oko 0,3 M do oko 0,4 M NaCl, na pH od oko 6,7. To znači, da frakcije koje obuhvataju eluirani nekompleksirani botulinski toksin mogu biti identifikovane da obezbede eluent iz kolone sa katjonskom izmenom koja obuhvata nekompleksirani botulinski toksin. Kod specifično preporučenih izvođenja, eluent iz kolone sa katjonskom izmenom predstavlja nekompleksirani botulinski toksin A visoke čistoće, u visokom prinosu i ima visoku aktivnost. Nasuprot tome, postupak prikazan na Slici 1B obezbeđuje 900 kD kompleks botulinskog toksina tip A u finalnom eluentu.

Prečišćeni nekompleksirani proizvod botulinskog toksina

[0061] Ovde opisani postupci i sistemi su korisni da se obezbedi nekompleksirani botulinski toksin visoke čistoće, u visokom prinosu, i ima visoku aktivnost. Videti Primer 1 dole. Proizvod je takođe lako stabilizovan i vrlo pogodno korišćen za dobijanje bezbednih farmaceutskih supstanci.

[0062] Kod nekih preporučenih izvođenja, prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin A je barem oko 80% čist, poželjno barem oko 90% čist, još poželjnije barem oko 95% čist, i još poželjnije barem oko 98% čist, i najpoželjnije barem oko 99% čist, ili čak oko 100% čist. "Prečišćeni nekompleksirani botulinum toksin" se odnosi na nevezani molekul proteina botulinskog toksina koji je izolovan, ili pretežno izolovan, iz drugih protena i nečistoća, koje inače prate nekompleksirani botulinski toksin jer je dobijen iz kulture ili postupka fermentacije. Prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin koji je, na primer, "80% čist" se odnosi na izolovan ili ptretežno izolovan nekompleksirani protein botulinskog toksina pri čemu taj protein toksina obuhvata 80% ukupnog proteina prisutnog kako je određeno putem ili drugim pogodnom analitičkom metodologijom, čiji neograničavajući primeri obuhvataju SDS-PAGE, CE, i HPLC. Na primer, kod nekih preporučenih izvođenja, eluent kolone sa katjonskom izmenom obuhvata nekompleksirani botulinski toksin A je barem oko 99% čist, i obuhvata manje od oko 1% protena ćelije domaćina koje nisu približno 150 kD botulinski toksin koji je originalno prisutan.

[0063] Kod nekih preporučenih izvođenja, prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin A ima aktivnost od barem oko 150 LD50jedinica/ng, preporučljivo barem oko 180 LD50jedinica/ng, još preporučljivije barem oko 200 LD50jedinica/ng, i još preporučljivije barem oko 210 LD50jedinica/ng, i najpreporučjivije barem oko 220 LD50jedinica/ng. Jedna jedinica botulinskog toksina se definiše kao LD50posle intraperitonog ubrizgavanja ženkama miševa švajcarski Vebster, svaka težine 18-20 grama. Drugim rečima, jedna jedinica botulinskog toksina je količina botulinskog

1

toksina koja ubija 50% grupe ženki miševa švajcarski Vebster. "Aktivnost" je korišćena ovde ravnopravno sa povezanim izrazima "biološka aktivnost", "potentnost" i "toksičnost" sa opisanom aktivnošću botulinskog toksina.

[0064] U preporučenim izvođenjima, nekompleksirani botulinski toksin A koji je moguće dobiti postupcima i sistemima opisanim ovde pokazuje biološku aktivnost. To znači, u preporučenim izvođenjima, biološka aktivnost ili toksičnost tog proizvoda se ne gubi posle prečišćavanja u skladu sa preporučenim izvođenjima iz ovog pronalaska, iako proteini netoksina koji su prirodno povezani sa proteinom toksina uklonjeni tokom prečišćavanja. U još preporučenijim izvođenjima, jačina dobijena korišćenjem datog niza postupaka i parametara obuhvaćena obimom ovog pronalaska je usklađena i/ili reproduktibilna. Na primer, merenje jačine je moguće izvesti sa manje od oko 40% promenljivosti, preporučljivo manje od oko 35% raznovrsnosti, još poželjnije manje od oko 30% raznovrsnosti, i još preporučljivije manje od oko 25% raznovrsnosti, i najpreporučljivije manje od oko 20% promenljivosti.

[0065] Kod nekih preporučenih izvođenja, postupak prečišćavanja obezbeđuje nekompleksiran botulinski toksin A u visokom prinosu. Na primer, prinos dobijen iz 30 L kulture fermentacije može da bude barem oko 30 mg, preporučljivo barem oko 40 mg, još preporučljivije barem oko 70 mg, i još preporučljivije barem oko 80 mg, i najpreporučljivije barem oko 90 mg, što odgovara prinosu od barem oko 1 mg/L, preporučljivo barem oko 1,3 mg/L, još preporučljivije barem oko 2,3 mg/L, i još preporučljivije barem oko 2,7 mg/L, i najpreporučljivije barem oko 3 mg/L, prema opisanom redosledu. U još preporučenijim izvođenjima, moguće je reprodukovati prinos dobijen korišćenjem datog niza postupaka i parametara obuhvaćen obimom ovog pronalaska . Na primer, prinos je moguće izmeriti sa manje od oko 40% raznovrsnosti, preporučljivo manje od oko 35% raznovrsnosti, još preporučljivije manje od oko 30% raznovrsnosti, i još preporučljivije manje od oko 25% raznovrsnosti, i najpreporučljivije manje od oko 20% raznovrsnosti.

[0066] Kod nekih specifično preporučenih izvođenja, prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin A je stabilan tokom prečišćavanja korišćenjem ovde opisanih postupaka i sistema. Veruje se da uklanjanje povezanih proteina netoksina iz kompleksa botulinskog toksina, kao što je kompleks botulinskog toksina tip A, daje kao rezultat značajno nestabilan proizvod botulinskog toksina. Ovaj pronalazak, međutim, obezbeđuje postupke koji mogu stabilno da izoluju nevezani botulinski toksin, bez priruženih proteina netoksina koji su standardno smatrani neophodnim tokom postupka prečišćavanja da bi se održala stabilnost, kako je gore razmatrano.

[0067] Kod nekih preproučenih izvođenja, ovde opisani postupci obezbeđuju nekompleksirani botulinski toksin A koji zahteva veoma malo post-hromatografskih koraka, npr., u smislu održavanja stabilnosti tokom skladištenja, i u smislu primenljivosti za farmaceutske upotrebe. Na primer, kao što je poznato u ovoj oblasti, amonijak sulfat je moguće dodati u nevezani botulinski toksin da bi se dobila suspenzija amonijak sulfata za skladištenje. Ta supstanca obuhvata nevezani botulinski toksin i amonijak sulfat može biti tako gotova skladištena u frižideru i kasnije

2

može biti takva ponovo vraćena za upotrebu u farmaceutskim primenama. Svakako, stabilnost, visok prinos i čistoća, i visoka i dosledna jačina toksina koji je moguće dobiti ovde opisanim postupcima olakšavaju farmaceutsku upotrebu prečišćenog proizvoda, kako je detaljnije opisano dole u tekstu.

Upotrebe prečišćenog nekompleksiranog botulinskog toksina

[0068] Taj nekompleksirani botulinski toksin A prečišćen prema ovom pronalasku moguće je koristiti za dobijanje farmaceutskih supstanci koje obuhvataju toksin kao aktivni sastojak za isporuku bilo kom subjektu koji bi osetio poboljšanje od takvih farmaceutskih supstanci. Kod preporučenih izvođenja, pacijenti koje treba lečiti su sisari, preporučljivo ljudi. "Farmaceutska supstanca" kako se ovde koristi se odnosi na formulaciju u kojoj aktivni sastojak može da bude botulinum toksin. Ta formulacija će sadržati barem jedan dodatni sastojak i biće pogodna za dijagnostičku, terapijsku, i/ili ili kozmetičku isporuku pacijetnu, kao što je humani pacijent. Farmaceutska supstanca može biti tečna ili čvrsta; i može biti jednokomponentni ili višekomponentni sistem, na primer liofilisana supstanca rekonstituisana sa razblaživačem kao što je fiziološki rastvor.

[0069] Još jedno varijantno rešenje ovog opisa obezbeđuje isporuku prečićenog molekula botulinskog toksina pacijentu. "Isporuka" kako se ovde koristi se odnosi na obezbeđivanje farmaceutske supstance ispitaniku ili pacijentu. Farmaceutsku supstancu je moguće isporučiti, bilo kojim poznatim postupkom u ovoj oblasti, uključujući npr., intramuskularnu (i.m.), intradermalnu, intranazalnu, ili potkožnu isporuku, intrakranijalnu, intraperiotonealnu (i.p.) isporuku, ili topikalnu (transdermalnu) i implantacionu (npr., uređaja sa sporim otpuštanjem) rutu isporuke. Kod izvesnih preporučenih varijantnih rešenja, prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin se isporučuje topikalno ili ubrizgavanjem supstanci kako je opisano u američkim prijavama patenata (U.S. Patent Application Nos.) 09/910,432; 10/793,138; 11/072,026; 11/073,307, 11/824,393, i 12/154,982.

[0070] Kod izvesnih izvođenja, supstance koje obuhvataju nekompleksirani botulinski toksin u suspenziji amonijak sulfata moguće je lako formirati sjediniti u farmaceutsku supstancu. Na primer, suspenziju amonijak sulfata obuhvata nekompleksirani protein botulinskog toksina moguće je lako centrifugirati da bi se oporavio protein i taj protein je moguće ponovo rastvoriti, razblažiti, i sjediniti sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Kod izvesnih izvođenja, farmaceutska supstnca može obuhvatiti nekompleksirani botulinski toksin kao aktivni farmaceutski sastojak, i može još da obuhvata jedan ili više pufera, nosača, stabilizatora, konzervanasa i/ili punilaca. Farmaceutske supstance mogu biti liofilisane u prah za skladištenje, i rekonstituisane za dalju upotrebu. Prema tome, ovde opisani postupci i sistemi mogu da daju botulinski toksin u obliku posebno pogodnom za kada je reč o farmaceutskim primenama lakoću dobijanja.

[0071] Farmaceutska supstanca može biti korišćena za terapijsko, dijagnostičko, istraživanje i/ili kozmetičke primene. Na primer, kako se gore razmatra, botulinski toksin tip A se klinički koristi za tretiranje neuromaskularnih poremećaja koje karakteriše hiperaktivnost mišića skeleta, kao što je blefarospazam, strabizmi, distonija vrata, i bore glabelarne linije lica. Pored toga, kod izvesnih primena, nekompleksiran (oko 150 kD) botulinski toksin je preporučeni oblik za lečenje ljudi. Videti, npr., Kohl A., et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox®) with the highlypurified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test (Poređenje dejstva botulinskog toksina A (Botox®) sa visokoprečišćenim neurotoksinom (NT 201) u testu mišića kratkog ispužača prstiju (EDB)), Mov Disord 2000; 15(Suppl 3):165. Prema tome, izvesne farmaceutske supstance botulinskog toksina se preporučljivo dobijaju korišćenjem nekompleksiranog botulinskog toksina, kao suprotstavljenom kompleksu botulinskog toksina.

PRIMERI

Primer 1: Poređenje novog postupka sa modifikovanim Šanc-ovim (Schantz) postupkom

[0072] Prečišćavanja nekompleksiranog botulinskog toksina tip A korišćenjem postupaka obuhvaćen obimom ovog pronalaska (’novi postupak") su direktno poređeni sa prečišćavanjima na osnovu tradicionalnog Šanc-ovog (Schantz) pristupa, su dodatno modifikovani dodavanjem hromatografskih koraka da bi se dobio nekompleksirani oblik (Modifikovani Šanc (Schantz) postupak"). Ukratko, bakterije Clostridium botulinum su kultivisane i ostavljene da rastu sve dok fermentacija nije bila završena (obično oko 72 do oko 120 sati od inokulacije do prikupljanja). Količina od 30 L kulture fermentacije je zatim korišćena u svakom od sledećih postupaka prečišćavanja.

[0073] Modifikovani Šancov-ov (Schantz) postupak koji je korišćen je obuhvatio uobičajenu acidifikaciju kulture fermentacije da bi se nataložio toksin, posle čega je usledila ultramikrofiltracija (UF) i diafiltracija (DF) da bi se koncentrovao sirovi toksin. DNaze i RNaze su dodate u prikupljeni toksin da bi se razložile (hidrolizovale) nukleinske kiseline, koje su zatim uklonjene dodatnim korakom ultrafiltracije (UF), korišćenjem filtracije tangencijalnog protoka (300kD UF). Toksin je sledeći ekstrahovan sa fosfatnim puferom, posle čega tri sekvencijalna koraka taloženja: taloženje hladnog etanola; taloženje hlorovodonične kiseline, i taloženje amonijak sulfata, pri čemu su supernatanti svaki put normalno odbačeni. Ovaj postupak je dat 900 kD kompleks botulinski toksin tip A, koje je zatim izložena dodatnim koracima hromatografije da bi se obezbedio nevezani toksin. Specifično, kompleks toksina je ponovo rastvoren i izložen negativnoj adsorpciji serije na DEAE smoli. Eluent je zatim provučen kroz kolonu sa anjonskom izmenom sa protokom gravitacije (DEAE-Sepharose), posle kolone sa katjonskom izmenom sa protokom gravitacije (CM-Sepharose). Utvrđen je prinos, vremensko trajanje tog postupka je registrovano (ne računajući period fermentacije), i prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin tip A je izmeren za čistoću putem SDS-PAGE analize i nije testiran za jačinu, npr., tehnikama poznatim stručnjaku u ovoj oblasti. Ceo modifikovan Šanc (Schantz) postupak je ponovljen za tri različite partije, brojevi partija 1, 2 i 3, i rezultati su registrovani u Tabeli 1 dole.

[0074] Ovaj novi inovativni postupak je korišćen sa tri različite partije, brojevi partija 4, 5 i 6, u skladu sa sistemima i postupcima opisanim ovde. Ukratko, kultura fermentacije je izložena taloženju kiseline korišćenjem 3M sumporne kiseline da bi se smanjila pH do 3,5, na temperaturi ispod 25°C. Kiseli talog je zatim izložen 0,1 µm filtraciji tangencijalnog protoka da bi se koncentrovala masa ćelije. Ta pH vrednost je zatim podešena na 6 i nukleaze su dodate da bi se smanjio sadržaj nukleinske kiseline ćelije domaćina, posle čega je usledilo razbistravanje da bi se uklonila krhotina ćelije i filtracija mrtvog kraja na 0,2 µm sa dodatim amonijak sulfatom. Filtrat je zatim direktno sipan u kolonu za hidrofobnu interakciju, Phenyl Sepharose HP (fenil sefaroznu visoke jačine) (GE Life Sciences)), eluiran sa smanjenim gradijentom amonijak sulfata, i izolovana je vršna vrednost proizvoda. Eluent je zatim razblažen u Tris pufer pH 7,8 da bi razdružio kompleks toksina, koji je zatim sipan na kolonu sa anjonskom izmenom Q XL Sepharose (GE Lifesciences), eluiran sa rastućim gradijentom natrijum hlorida, i ponovo je priklupljena vršna vrednost proizvoda. Ovaj eluent je zatim razblažen u natrijum fosfatnom puferu (da bi se smanjila provodljivost) i da bi se sipao na bilo kolonu sa anjonskom izmenom, Q XL Sepharose (za partije # 4 i 5), ili kolonu sa katjonskom izmenom, Source-S (GE Life Sciences) (za partiju #6), ponovo je Eluiran sa ulaznim gradijentom natrijum hlorida, i finalna vršna vrednost proizvoda je prikupljena i sačuvana. Ovaj postupak je dao kao prinos nekompleksiran botulinski toksin tip A. Prinos je utvrđen, dužina postupka je zabeležena (ne računajući period fermentacije), i toksin je izmeren za čistoću putem SDS-PAGE analize i ispitan na jačinu, npr., primenom tehnika poznatih stručnjaku u ovoj oblasti. Rezultati su takođe registrovani u Tabeli 1 dole.

Tabela 1

[0075] Kako Tabela 1 pokazuje došlo je do oštećenja partije u vezi sa partijom #2 u modifikovanom Šanc-ovom (Schantz) postupku. Cela partija je oštećena i dala je prinos nula. Takođe došlo je do delimičnog oštećenja partije na partiji #3. To oštećenje je nastalo u koraku taloženja hlorovodonične kiseline, ali nešto proizvoda je spašeno od supernatanta koji se

2

normalno baca. Spašeni proizvod je ponovo prerađen sa korakom odstupanja, koji je obuhvatio primećeni smanjeni prinos u poređenju sa partijom #1 (4 mg u poređenju sa 11 mg) i primećenu smanjenu jačinu u poređenju sa partijom #1 (173 LD50jedinica/ng u poređenju sa 255 LD50jedinica/ng).

[0076] U vezi sa partijama korišćenim sa ovim inovativnim potupkom, partija #4 je pokazala smanjeni prinos, u poređenju sa partijom #5 na primer (43 mg u poređenju sa 99 mg) usled otkaza na hromatografskom sistemu, obuhvatajući visok stepen ispiranja soli kolone. Sa tim otkazom, došlo je do preuranjene eluacije dela toksina, što daje kao rezultat primećen smanjeni prinos, ali takođe i primećenu višu čistoću (98,6 % čistoća u poređenju sa 95,3% čistoćom).

[0077] Partija #6 predstavlja rezultate visoko preporučenog izvođenja iz trenutnih inovativnih postupaka i sistema, pri čemu je kolona sa katjonskom izmenom korišćena u trećem koraku hromatografije. Kako Tabela 1 pokazuje, ovo izvođenje je kao rezultat dalo poboljšanu čistoću u poređenju sa partijom #5 na primer (100% čistoće u poređenju sa 95,3% čistoće), pri čemu su održavani visok prinos (89 mg upoređenju sa 99 mg) i vsoka jačina (250 LD50jedinica/ng u poređenju sa 252 LD50jedinica/ng).

[0078] Kao što Tabela 1 takođe nagoveštava, ukupna dužina prečišćavanja može biti skraćena na preporučena izvođenja ovog pronalaska. Na primer, partija #6 je prečišćena u roku od samo 4 dana, u poređenju sa 10 dana koliko je bilo potrebno da se prečisti nekompleksiran botulinski toksin korišćenjem modifikovane Šanc-ove (Schantz) metode koja obuhvata tri dodatna hromatografska koraka posle uobičajene Šanc-ove (Schantz) metode.

[0079] Rezultat ukazuje da ti postupci i sistemi koji se ovde objašnjavaju mogu biti korišćeni da se dobiju visoki prinosi nekompleksiranog botulinskog toksina, uz veliku jačinu i čistoću, i nagoveštava da ti postupci i sistemi opisani ovde mogu da pronađu upotrebu u efikasnom prečišćavanju velikih razmera nekompleksiranog botulinskog toksina pogodnog za upotrebu, npr., kao aktivan sastojak u farmaceutskim supstancama.

Claims (25)

Patentni zahtevi

1. Postupak za prečišćavanje nekompleksiranog botulinskog toksina tipa A (botulinski toksin A), taj postupak obuhvata:

(i) dobijanje mešavine koja obuhvata sirovi nekompleksirani botulinski toksin A, pri čemu je sirovi nekompleksirani botulinum toksin A razdružen od prirodnih, netoksičnih proteina; (ii) punjenje sirovog nekompleksiranog botulinskog toksina A u kolonu sa anjonskom izmenom da bi se dozvolilo hvatanje nekompleksiranog botulinskog toksina A putem kolone sa anjonskom izmenom;

(iii) eluiranje nekompleksiranog botulinskog toksina A iz kolone sa anjonskom izmenom da bi se dobio eluent koji obuhvata nekompleksirani botulinski toksin A;

(iv) punjenje kolone sa katjonskom izmenom sa eluentom iz kolone sa anjonskom izmenom tako da se dozvoli hvatanje nekompleksiranog botulinskog toksina A putem kolone sa katjonskom izmenom; i

(v) eluiranje prečišćenog nekompleksiranog botulinskog toksina A iz kolone sa katjonskom izmenom.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu sirovi nekompleksirani botulinski toksin A je dobijen dobijanjem uzorka koji obuhvata kompleks botulinskog toksina A;

punjenje kolone za hidrofobnu interakciju sa uzorkom tako da se dozvoli hvatanje kompleksa botulinskog toksina A putem kolone sa hidrofobnom interakcijom;

eluiranje kompleksa botulinskog toksina A iz hromatografske kolone sa hidrofobnom interakcijom; i

razdruživanje kompleksa botulinskog toksina A da bi se dobila mešavina koja obuhvata sirovi nekompleksirani botulinski toksin A.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, pri čemu:

(a) uzorak je supernatant ćelija ili filtrat ćelija koji obuhvata kompleks botulinskog toksina A; ili

(b) uzorak koji obuhvata kompleks botulinskog toksina A se izlaže razgradnji nukleaze pre punjenja kolone sa hidrofobnom interakcijom, i opciono pri čemu se nukleaza izvodi iz postupka bez prisustva proizvoda životinje.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 2, pri čemu taj uzorak obuhvata kompleks botulinskog toksina A dobijen putem:

2

izlaganja kulture fermentacije koja obuhvata botulinski toksin A taloženju kiseline da bi se dobio talog kiseline; i

izvođenje filtracije sa tangencijalnim protokom na talogu da bi se koncentrovao talog.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 2, pri čemu taj uzorak obuhvata kompleks botulinskog toksina A dobijen putem izlaganja nerastvorljive frakcije kulture fermentacije filtraciji tangecijalnog protoka.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu:

(a) taj postupak je pretežno bez prisustva proizvoda životinje, ili

(b) postupak proizvodi prinos od barem oko 2 mg/ L kulture fermentacije.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu:

(a) prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin A je barem 95% čistoće; ili

(b) prečišćeni nekompleksirani botulinski toksin A ima aktivnost od barem 200 LD50jedinica/ng.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 1 pri čemu je anjonska kolona izabrana iz grupe koja obuhvata Q Sepharose HP, Q Sepharose Fast Flow, i Q XL Sepharose kolonu, i pri čemu je katjonska kolona izabrana iz grupe koja obuhvata SP Sepharose, SP Sepharose HP, SP Sepharose Fast Flow, Mono S, Source-S, Source-30S, i Source-15S kolonu.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 1 pri čemu se pufer za punjenje sirovog nekompleksiranog botulinskog toksina A na anjonsku kolonu bira iz grupe koja obuhvata Tris, bis-Tris, trietanolamin, i N-metil dietanolamin, i opciono pri čemu se taj pufer koristi pri pH od 7,4 do 8,2.

10. Postupak prema patentnom zahtevu 1 pri čemu taj pufer za punjenje sirovog nekompleksiranog botulinskog toksina A na katjonsku kolonu iz grupe koja obuhvata natrijum fosfat, MES, i HEPES, i opciono pri čemu se taj pufer koristi pri pH od 6,0 do 7,0

11. Postupak prema patentnom zahtevu 1 pri čemu pH anjonske kolone jeste od 7,4 do 8,2.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 1 pri čemu je pH katjonske kolone od 6,0 do 7,0.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 1 pri čemu se gradijent za eluiranje nekompleksiranog botulinskog toksina A iz kolone sa anjonskom izmenom bira iz grupe koja obuhvata rastući gradijent koncentracije natrijum hlorida i rastući gradijent koncentracije kalijum hlorida, i opciono pri čemu se kolona sa anjonskom izmenom eluira na pH od 7,4 do 8,4.

14. Postupak prema patentnom zahtevu 1 pri čemu se gradijent za eluiranje nekompleksiranog botulinskog toksina A iz kolone sa katjonskom izmenom bira iz grupe koja obuhvata rastući gradijent koncentracije natrijum hlorida i rastući gradijent koncentracije kalijum hlorida, i opciono pri čemu se kolona sa katjonskom izmenom eluira na pH vrednost od 6,0 do 7,0.

15. Postupak za prečišćavanje nekompleksiranog botulinskog toksina tip A (botulinski toksin A), pri čemu taj postupak obuhvata:

(a) obezbeđivanje mešavine koja obuhvata sirovi nekompleksirani botulinski toksin A, u kom je pomenuti sirovi nekompleksirani botulinski toksin A razdružen iz prirodnih proteina netoksina; pri čemu je pomenuta mešavina dobijena putem:

(i) izlaganja kulture fermentacije botulinskog toksina A taloženju kiseline da bi se proizveo nerastvorljivi talog kiseline;

(ii) koncentrovanje tog taloga kiseline iz koraka (i) da bi se proizveo koncentrovani uzorak;

(iii) izlaganje uzorka razgradnji nukleaze pod uslovima koji smanjuju sadržaj nukleinske kiseline ćelije domaćina i koji održava kompleks proteina botulinskog toksina A i proteina netoksina;

(iv) uklanjanje krhotine ćelije iz uzorka koraka (iii) da bi se proizveo razbistreni uzorak;

(v) punjenje kolone sa hidrofobnom interakcijom sa razbistrenim uzorkom iz koraka (iv) pod uslovima da se dozvoli hvatanje kompleksa botulinskog toksina A pod kolonom sa hidrofobnom interakcijom i da nečistoće proteku kroz tu kolonu;

(vi) eluiranje kompleksa botulinskog toksina A iz kolone sa hidrofobnom interakcijom iz koraka (iv); i

(vii) razdruživanje kompleksa botulinskog toksina A dobijenog iz koraka (vi) pod uslovima koji ometaju kompleks i proizvode mešavinu koja obuhvata sirovi nekompleksirani botulinski toksin A razdružen iz proteina prirodnih netoksina;

(b) punjenje mešavine koja obuhvata sirovi nekompleksirani botulinski toksin A razdružen iz prirodnih netoksičnih proteina iz koraka (a) u kolonu sa anjonskom izmenom pri uslovima koji dozvoljavaju hvatanje nekompleksiranog botulinskog toksina A pod kolonom sa

2

anjonskom izmenom;

(c) eluiranje nekompleksiranog botulinskog toksina A iz kolone sa anjonskom izmenom iz koraka (b) da bi se dobio eluent koji obuhvata nekompleksirani botulinski toksin A;

(d) punjenje kolone sa katjonskom izmenom sa eluentom iz kolone sa anjonskom izmenom iz koraka (c) pod uslovima koji omogućavaju hvatanje nekompleksiranog botulinskog toksina A putem kolone sa katjonskom izmenom; i

(e) eluiranje prečišćenog nekompleksiranog botulinskog toksina A iz kolone sa katjonskom izmenom iz koraka (d).

16. Postupak prema patentnom zahtevu 15, pri čemu je, u koraku (i), kultura fermentacije koja obuhvata botulinski toksin A talog kiseline sa oko 3M sumporne kiseline.

17. Postupak prema patentnom zahtevu 15, pri čemu se koncentrovani uzorak iz koraka (ii) dobija izvođenjem filtracije tangencijalnog protoka na talogu kiseline da bi se koncentrovao taj talog.

18. Postupak prema patentnom zahtevu 15, pri čemu se uzorak iz koraka (iii) izlaže razgradnji nukleaze na pH od 5 do 7.

19. Postupak prema patentnom zahtevu 18, pri čemu se ta nukleza izvodi iz neanimalnog izvora.

20. Postupak prema patentnom zahtevu 19, pri čemu se, u koraku (iv), krhotina ćelije uklanja centrifugiranjem i/ili filtracijom da bi se proizveo razbistreni uzorak.

21. Postupak prema patentnom zahtevu 20, pri čemu se razbistreni uzorak iz koraka (iv) kombinuje sa puferom koji obuhvata amonijak sulfat pre punjenja kolone sa hidrofobnom interakcijom u koraku (v).

22. Postupak prema patentnom zahtevu 21, pri čemu se razbistreni uzorak iz koraka (iv) kombinuje sa 0,5 M rastvora amonijak sulfata na pH 6 i 50 mM fosfata pre punjenja kolone sa hidrofobnom interakcijom u koraku (v).

23. Postupak prema patentnom zahtevu 15, pri čemu se, u koraku (vii), taj kompleks botulinskog toksina A razdružuje u puferu koji ima vrednost pH od 7,0 do 8,4 da bi se dobila mešavina koja obuhvata sirovi nekompleksirani botulinski toksin A razdružen iz prirodnih netoksin proteina.

2

24. Postupak prema patentnom zahtevu 23, pri čemu je kompleks botulinskog toksina A razdružen u Tris puferu na pH 7,8.

25. Postupak prema patentnom zahtevu 24, pri čemu je taj postupak pretežno oslobođen prisustva proizvoda životinjskog porekla.

2