RS58042B1

RS58042B1 - Neintegrišući lentivirusni vektori

Info

Publication number: RS58042B1
Application number: RS20181505A
Authority: RS
Inventors: James M Allen; Hoeven Neal S Van; jin zhong Li; Derek D Sloan; Thomas W Dubensky Jr
Original assignee: Immune Design Corp
Priority date: 2009-07-24
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2019-02-28
Also published as: US20120039932A1; SI2770061T1; TR201819229T4; AU2010276194B2; CY1121159T1; DK2770061T3; SG177744A1; EP2456786B1; CA2768938A1; HUE043032T2; HRP20140327T1; PT2456786E; IL217679A; DK2456786T3; SI2456786T2; US8187872B2; EA032403B1; US20160076055A1; JP6701280B2; JP2013500015A

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ova prijava patenta generalno se odnosi na ciljanu dostavu gena, a posebno na upotrebu pseudotipiziranog lentivirusa koji obuhvata omotač koji cilja dendritske ćelije pa može da se koristi za vakcinaciju dendritskim ćelijama.

POZADINA

[0002] Dendritske ćelije (DC) su esencijalne ćelije koje izlažu antigene za inicijaciju i kontrolu imunih odgovora. DC mogu da uhvate i procesiraju antigene, migriraju sa periferije u neki limfoidni organ, i da izlože antigene na restriktivan način mirujućim T-ćelijama u glavni histokompatibilnom kompleksu (MHC). Ove ćelije nastaju u koštanoj srži (BM) i pokazuju dendritsku morfologiju i visoku pokretljivost. Otkriće DC kao specijalizovanih ćelija koje izlažu antigen (APC) pokrenulo je pokušaje razvijanja strategija za imunizaciju/vakcinaciju na bazi DC koje uključuju davanje DC sa specifičnim antigenima in vitro (Banchereau & Palucka, A. K.2005. Nat. Rev. Immunol. 5:296-306; Figdor, et al.2004. Nat. Med.10:475-480). Međutim, svi ovi pokušaji uključuju zahtevnu pripremu terapije koja je specifična za nekog pacijenta i koja uključuje uvođenje specifičnih antigena u autologne DC ex vivo, koje se tada daju pacijentu.

[0003] Alternativna strategija je da se koriste vektori koji se baziraju na rekombinantnim virusima kao mehanizam za direktnu dostavu nekog gena koji kodira određeni antigen(e) u ćelijama domaćinima. U ovom slučaju, preko indukovanja željenog adaptivnog imunog odgovora, eksprimirani genski proizvod obezbeđuje terapeutsku korist. Međutim, brojni su izazovi koji se moraju rešiti da bi se postigao bezbedan i efektivan sistem. Neki od pomenutih izazova uključuju dizajniranje vektora koji cilja željenu grupu ćelija domaćina, obezbeđivanje prikladnog sistema za dostavu, eksprimiranje željenog antigena sa ciljem da se podstakne efektivan imuni odgovor i konzistentna proizvodnja dovoljno visoko-titrirane farmaceutske kombinacije sa virusnim vektorom rekombinantnog virusa sa ciljem da se postigne široka primena kod većeg broja humanih subjekata. Ovo poslednje je poseban izazov za razvijanje sistema u laboratorijskom obimu u proizvode koji se mogu proizvesti od strane farmaceutske industrije.

[0004] U laboratoriji, mnogi lentivirusni vektori su pseudotipizirani preko VSV-G proteina omotača. Ovo se široko primenjuje kao model sistema zbog toga što su VSV proteini omotača sposobni da ciljaju mnoge tipove ćelija ("pantropni" omotač), a sistemi za proizvodnju, opšte uzeto, obezbeđuju visok titar.

[0005] Glikoproteini omotača Sindbis virusa i drugih alfavirusa ovde opisanih, inkorporiraju se u lipidni dvosloj membrane virusne čestice. Tipično, virusna membrana (omotač) uključuje višestruke kopije trimera dva glikoproteinska heterodimera, E1 i E2, koji nastaju cepanjem pojedinačnog proteinskog prekursora. Ovaj proteinski prekursor obuhvata, gledano od njegovog N- ka C-terminalu, proteine E3, E2, 6K i E1. Mali E3 glikoprotein služi kao signalna sekvenca za translokaciju E2 proteina u membranu, a nastaje cepanjem iz E2 pomoću furina ili neke druge Ca<2+>-zavisne serinske proteinaze.6K protein služi kao signalna sekvenca za translokaciju E1 proteina u membranu i tada se cepa iz proteinskog prekursora.

[0006] E1 i E2 proteini poseduju trans-membranske regione; E2 ima citoplazmatski domen od oko 33 ostatka dok je citoplazmatski rep E1 veoma kratak (oko 2 ostatka). I E1 i E2 imaju palmitinske kiseline koje su spojene na trans-membranskim regionima ili blizu njih.

[0007] Izolati Sindbis virusa koji su opisani u stanju tehnike smatra se da inficiraju ćelije preko interakcije sa heparanskim sulfatom (HS). U dokumentu WO 2008/011636 je opisan sistem pakovanja lentivirusa u kojem E3/E2 fuzioni protein omotača (nazvan SVGmu) sadrži brojne modifikacije, što ima za namenu da smanji vezivanje pomenutog proteina za HS, ali da se pri tome zadrži mogućnost vezivanja i inficiranja DC, preko DC-SIGN površinskog molekula. U dokumentu WO 2008/011636 je dobijena cDNK za divlji-tip SVG iz laboratorije Dr. J. H. Strauss laboratory pri California Institute of Technology pa je klonirana u pcDNK3 vektoru (Invitrogen) pomoću PCR sa ciljem da se dobije plazmid pSVG. U E2 protein je uvedena sekvenca sa petljom od deset ostataka između aminokiselina 71 i 74 pomoću PCR-mutageneze koja razara HS-vezno mesto. Dodatna delecija je uvedena u E3 glikoprotein iz SVG sa ciljem da se odstrane aminokiseline 61-64. Ovako modifikovani SVG je označen kao SVGmu (SEQ ID NO: 11 iz dokumenta WO2008/011636). cDNK za SVGmu je klonirana posle CMV-promotera u pcDNK3 vektoru (označen kao pSVGmu, SEQ ID NO: 3 iz dokumenta WO2008/011636).

NEKI PRIMERI IZVOĐENJA OVOG PRONALASKA

[0008] Mada su SVGmu pseudotipizirane virusne čestice bile sposobne da selektivno prodru u ćelije koje eksprimiraju DC-SIGN antigen, nekoliko aspekata čini ovaj sistem neprikladnim za terapeutsku upotrebu. Na primer, E3/E2 fuzioni protein prikazuje antigenski epitop za hemaglutinin iz influence, virusni genom se ugrađuje u hromozom domaćina, što može da aktivira štetne gene iz domaćina, a ovi pronalazači su pronašli da su titri virusa niski u odnosu na titre čestica koje su pseudotipizirane sa VSV-G omotača. Značajno, sojevi Sindbis virusa sa mutacijom koja sprečava tačno procesiranje E3 iz E2 glikoproteina (takozvani "pE2 mutanti"), kao što je SVGmu, rastu sporo u permisivnim ćelijskim linijama i značajno su atenuisani u mišijoj patogenosti.

[0009] Poravnavanje SVGmu E3-E2 proteina koje je korišćeno u dokumentu WO2008/011636 sa ciljem da se pseudotipizira lentivirusni vektor sa tri ogledne E proteinske varijante iz ovoga pronalaska, je prikazano na Slici 1. Numerisanje navedeno na Slici 1 odnosi se na proteine omotača HR soja Sindbis virusa. Osim ako je drugačije navedeno, numerisanje koje se ovde koristi odnosi se na ovaj soj Sindbis virusa. Ovi pronalazači su modifikovali SVGmu protein sa ciljem da se obezbedi poboljšani sistem za proizvodnju lentivirusa. Virusne čestice iz ovoga pronalaska proizvode se sa značajno višim titrom u odnosu na one koji koriste SVGmu, a takođe stimulišu jači imuni odgovor. Dodatno, pseudotipizirane lentivirusne čestice pokazuju poboljšani titar i poboljšanu infektivnost uz istovremeno zadržavanje selektivnosti za DC.

[0010] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje retrovirusnu, kao što je lentivirusna vektorska čestica, koje obuhvata: (a) omotač koji obuhvata E2 glikoprotein iz SEQ ID NO: 1 Sindbis virusa, u kojem nedostaje 160X ili ne-kiselu aminokiselinu, ili varijantu SEQ ID NO: 1 sposobnu da inficira dendritske ćelije; pri čemu pomnenuti E2 glikoprotein ili njegova varijanta nisu fuzionisani sa E3; i (b) genom lentivirusa koji obuhvata sekvencu od interesa.

[0011] Ta varijanta može da bude sposobna da veže DC-SIGN. Poželjno, takođe može da pokazuje smanjeno vezivanje na heparanski sulfat u poređenju sa referentnim proteinom iz HR soja. E2 protein iz HR soja je prikazan kao SEQ ID NO: 18.

[0012] Poželjno, 160X je jedna od malih ili alifatičnih aminokiselina, uključujući glicin, alanin, valin, leucin ili izoleucin. U jednom aspektu, 160X nedostaje ili je glicin, valin, leucin ili izoleucin. U jednom primeru izvođenja, X je glicin.

[0013] Varijanta SEQ ID NO: 1 je definisana kao da sadrži sekvencu koja obuhvata najmanje 80% sekvencijalne identičnosti, ili najmanje 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% ili 98% sekvencijalne identičnosti sa SEQ ID NO: 1 u kojoj 160X je zadržana i kao što je ranije definisano. Ova varijanta može da ima jedan ili više lizina i arginina u regionu koji premošćuje ostatke 50 do 180, nezavisno deleciranih ili supstituisanih nekom ne-baznom aminokiselinom. U jednom primeru izvođenja, ne-bazna aminokiselina je glutaminska kiselina ili asparaginska kiselina.

[0014] U jednom aspektu, ostatak X je izabran iz delecije glicina, valina, leucina ili izoleucina, a jedan ili više lizina i arginina, u regionu koji premošćuje ostatke 50 do 180, su nezavisno delecirani ili supstituisani ne-baznom aminokiselinom.

[0015] U drugom aspektu, X je izabran iz delecije glicina, alanina, valina, leucina ili izoleucina, a jedan ili više lizina i arginina, u regionu koji premošćuje ostatke 50 do 180, poželjno uključujući barem poziciju 159, su nezavisno delecirani ili supstituisani glutaminskom kiselinom ili asparaginskom kiselinom.

[0016] Kandidati pozitivno naelektrisanih aminokiselina, koji mogu da budu supstituisan ili delecirani uključuju lizine na ostacima 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149 i 159 i arginin na ostacima 65, 92, 128, 137, 157, 170 i 172 (numerisanje se odnosi na SEQ ID NO: 1). Kada su supstituisane, supstitucija može da bude nezavisno izabrana iz glutaminske kiseline ili asparaginske kiseline.

[0017] U posebnim primerima izvođenja, jedan ili više lizinskih ostataka 70, 76 i 159 delecirani su ili supstituisani. Kada su supstituisani, supstitucije mogu da budu nezavisno izabrane iz glutaminske kiseline ili asparaginske kiseline.

[0018] Kako Sindbis virus ima RNK genom, varijacije – uključujući supstitucije, umetanja ili delecije – pored onih prethodno pomenutih, mogu da budu načinjene od delova E2 sekvence SEQ ID NO: 1, unutar procenta homologije sa SEQ ID NO: 1 koji je prethodno definisan. Na primer, postoje varijante SEQ ID NO: 1 u kojima pozicija 3 je T ili V, 23 je V, 209 je R, 264 je G, a 393 je H. Jedna ili više od ovih promena, ili druge varijacije u odnosu na SEQ ID NO: 1 mogu da se načine, pod uslovom da pomenuta varijanta zadržava sposobnost da inficira DC.

[0019] U jednom primeru izvođenja, varijante ne sadrže nikakva umetanja u regionu između ostataka 70 i 76 iz SEQ ID NO: 1. U ovom primeru izvođenja sekvenca ostataka 71-75 iz SEQ ID NO: 1 može da ostane nepromenjena, ili može da obuhvata jednu ili dve supstitucije koje ne deluju na sposobnost da ta varijanta inficira DC.

[0020] U nekim slučajevima, E2 proteina se prvo eksprimira kao poli-protein koji je u fuziji sa najmanje E3 ili u fuziji sa vodećom sekvencom. U određenim primerima izvođenja, E2 je eksprimiran kao deo E3-E2-6K-E1 poli-proteina. Sindbis virus prirodno eksprimira E2 kao deo poli-proteina, a regioni spajanja za E3/E2, E2/6K i 6K/E1 imaju sekvence koje mogu da budu prepoznate i pocepane sa endopeptidazama. Sekvenca E3/E2 poli-proteina prikazana je kao SEQ ID NO: 20. Normalno, E3/E2 spajanje cepa se furinom ili serinskom endopeptidazom koja je slična furinu između ostataka 65 i 66 E3/E2 poli-proteina. Furin pokazuje specifičnost za sparene argininske ostatke koji su razdvojeni dvema aminokiselinama. Radi održavanja E3/E2 cepanja furinom, ostaci 62-66 (RSKRS; SEQ ID NO: 26) treba da zadrže dva argininska ostatka pomoću razdvajanja dvema aminokiselinama i serinski ostatak.

[0021] U jednom primeru izvođenja ovoga pronalaska, poli-protein obuhvata E3 sekvencu koja odgovara ostacima 1-65 iz SEQ ID NO: 20, ili neku njenu varijantu koja ima najmanje 80% sekvencijalne identičnosti, ili najmanje 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% ili 98% sekvencijalne identičnosti sa ostacima 1-65 iz SEQ ID NO: 20, pri čemu su ostaci 62-65 RSKR (SEQ ID NO: 27), i ta varijanta je sposobna da se ugradi u pseudotipizirani virusni omotač. Poželjno, E2 deo poli-proteina je bilo koji primer izvođenja kao što je prethodno definisano.

[0022] Alternativno, može da se koristi različita sekvenca za cepanje umesto sekvence E3/E2 koja se cepa furinom ili bilo koja od ostalih sekvenci za cepanje. Mogu da se ugrade mesta prepoznavanja i cepanja za endopeptidaze, uključujući, bez ograničenja, aspartičke endopeptidaze (na primer, katepsin D, himozin, HIV proteaza), cisteinske endopeptidaze (bromelaini, papain, kalpain), metaloendopeptidaze (na primer, kolagenaza, termolizin), serinske endopeptidaze (na primer, himotripsin, faktor IXa, faktor X, trombin, tripsin), streptokinaze. Mesta prepoznavanje i cepanje sekvenci za ove enzime dobro su poznata.

[0023] Kada se koristi to mesto za cepanje, ono može da uvede u E3 poli-protein koji obuhvata najmanje ostatke 1-60, kao što su ostaci 1-61 ili 1-62 iz SEQ ID NO: 20 ili u neke njene varijante koja ima najmanje 80% sekvencijalne identičnosti, ili najmanje 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% ili 98% sekvencijalne identičnosti sa odgovarajućim brojem ostataka iz SEQ ID NO: 20, spojenih direktno na C-terminalu pomenute sekvence cepanj koja je sa druge strane fuzionisana sa E2 delom poli-proteina. Poželjno, E2 deo poli-proteina je bilo koji od primera izvođenja kakvi su ovde definisani.

[0024] E2 proteinske sekvence prema ovom pronalasku uključuju varijante SEQ ID NO: 1 u kojima je 160X je kao što je definisano u sledećoj Tabeli, a protein je kao u SEQ ID NO: 1 pored sledećih ostataka 70, 76 i 159 i 160, koji su kako sledi:

[0025] Opciono, svaka od gornjih sekvenci može da obuhvati jednu ili više promena u SEQ ID NO: 1, ali poseduje ostatke 71-75 iz SEQ ID NO: 1 koji nisu promenjeni, ili može da ima jednu ili dve supstitucije koje ne utiču na sposobnost te varijante da inficira DC, ali ne menjaju broj aminokiselina u ovom regionu.

[0026] Dodatno, sekvence E2 proteina prema ovom pronalasku obuhvataju SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ili SEQ ID NO: 15 u kojima ostatak 160 predstavlja Ala, Ile, Leu ili Val umesto Gly. Takve varijante mogu takođe da obuhvate ostatke 71-75 iz SEQ ID NO: 1 koji nisu promenjeni, ili mogu da imaju jednu ili dve supstitucije koje ne utiču na sposobnost te varijante da inficira DC, ali ne menjaju broj aminokiselina u regionu.

[0027] Opciono, E2 sekvenca iz SEQ ID NO: 3-15, ili dodatne varijante koje su opisane u prethodna dva paragrafa, mogu da se promene na drugim pozicijama sa ciljem da se obezbedi E2 sekvenca koja ima najmanje 80% sekvencijalne identičnosti sa SEQ ID NO: 1. "Najmanje 80% sekvencijalne identičnosti" uključuje bilo koju od najmanje 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% ili 98% sekvencijalne identičnosti.

[0028] U gornjim primerima izvođenja, prvi E2 ostatak, koji odgovara poziciji 66 iz SEQ ID NO: 20, može da bude Ser.

[0029] Kao što je ovde navedeno, E2 sekvence prema ovom pronalasku, uključujući bilo koju SEQ ID NO: 3-15 i njihove varijante koje su opisane u prethodna tri paragrafa, mogu da budu eksprimirane iz poli-proteina koji obuhvata najmanje jednu E3/E2 sekvencu, a poželjno sekvencu iz poli-proteina E3/E2/6K/E1 iz Sindbis-a. Sekvenca E3 poli-proteina u svakom od primera izvođenja može da bude ona sa ostacima 1-65 iz SEQ ID NO: 20 ili bilo koja njena varijanta koja je već opisana, uključujući varijante sa ne-nativnim mestom cepanja.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0030] Ovaj pronalazak izložen je u pratećim patentnim zahtevima.

[0031] Ova prijava patenta je usmerena na pseudotipizirane lentivirusne vektore koji obuhvataju omotač koji obuhvata glikoprotein nekog arbovirusa, pri čemu čestica obuhvata nefunkcionalnu integrazu, i vektorski genom lentivirusa koji obuhvata mutaciju ili deleciju 3' LTR-bližeg polipurinskog niza (PPT) koja čini taj PPT nefunkcionalnim. Glikoprotein iz arbovirusa može da bude iz Sindbis virusa, Denga virusa i virusa venecuelanskog encefalitisa konja. Posebno, kada je glikoprotein E2 protein iz Sindbis virusa, E2 protein ima najmanje jednu promenjenu aminokiselinu na ostatku 160 u poređenju sa SEQ ID NO: 1. Ova promena aminokiseline može da bude delecija ili aminokiselina koja je različita od glutaminske kiseline. E2 glikoprotein može alternativno da bude varijantni protein koji ima najmanje 80% sekvencijalne identičnosti sa SEQ ID NO: 1. a takođe ima promenu na ostatku 160 koji je ili delecija ili aminokiselina koja je različita od glutaminske kiseline. Ovaj glikoprotein omogućava infekciju dentritnih ćelija. U svim slučajevima, E2 glikoprotein nije deo fuzionog proteina sa E3 iz Sindbis virusa. U nekim primerima izvođenja, E2 glikoprotein ili varijanta vezuje DC-SIGN. Ovaj lentivirusni vektor takođe obuhvata lentivirusni genom koji obuhvata neku sekvencu od interesa.

[0032] U nekim primerima izvođenja, ostatak 160 nedostaje ili je glicin, alanin, valin, leucin ili izoleucin. U jednom primeru izvođenja, ostatak 160 je glicin. Dodatno, druge promene E2 glikoproteina mogu da se pojave u kombinaciji sa već pomenutim promenama ostatka 160. Jedna takva promena je promena aminokiseline sa ciljem da se smanji neto pozitivni naboj u E2. Jedan način da se smanji neto pozitivni naboj je da se promeni jedan od lizina u neku aminokiselinu koja nije bazna. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više od lizina 70, lizina 76 ili lizina 159 se menja. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više od pomenutih lizina se menja u glutaminsku kiselinu ili asparaginsku kiselinu. U specifičnim primerima izvođenja, E2 glikoprotein jedan od SEQ ID NO: 3-16. Primeri kombinacija promena uključuju, ali bez ograničenja, promenu glutaminske kiseline na poziciji 160, i promenu jednog ili više od lizina 70, lizina 76 ili lizina 159 u neki ne-bazni ostatak. Druge promene mogu takođe da se uvedu zajedno sa promenom ostatka 160 i opciono bilo kojom drugom promenom koja je ovde opisana. Na primer, bilo koji od prethodno pomenutih E2 proteina može opciono da obuhvati jednu ili više dodatnih supstitucija, umetanja ili delecija. Kao jedan specifičan primer, mesto cepanja proteina između E2 i E3 može da bude nativna sekvenca ili neka promenjena sekvenca koju cepa neka druga endopeptidaza. U drugim primerima izvođenja, koji mogu da se kombinuju sa bilo kojim prethodnim, sekvenca ostataka 71-75 iz SEQ ID NO: 1 nije promenjena ili ima jednu ili dve aminokiselinske supstitucije koje ne utiču na sposobnost ove varijante da inficira DC.

[0033] U nekim primerima izvođenja, genom lentivirusnog vektora iz već pomenutih virusnih čestica sadrži sekvencu od interesa koja kodira tumor-specifičan antigen ili antigen iz virusa, kao što je antigen iz HIV ili SIV. U nekim primerima izvođenja, bilo koja vektorska čestica koja je ovde opisana se proizvodi u titru od najmanje 10<5>/mL IU.

[0034] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje sistem pakovanja lentivirusa sa ciljem da se stvori neintegrišuća vektorska čestica lentivirusa pseudotipa kakva je navedena u patentnim zahtevima, koji obuhvata ćeliju pakovanja koja obuhvata (a) nukleinsku kiselinu koja kodira nefunkcionalnu integrazu; (b) vektorski genom lentivirusa koji obuhvata mutaciju ili deleciju polipurisnkog niza (PPT) što čini taj PPT nefunkcionalnim; i (c) ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji kodira glikoprotein omotača arbovirusa. Ovde je takođe opisan sistem pakovanja lentivirusa za proizvodnju vektorske čestice lentivirusa pseudotipa, koji obuhvata obuhvata: prvi molekul nukleinske kiseline koji kodira E2 glikoprotein iz Sindbis

1

virusa sa SEQ ID NO: 1 u kojoj je ostatak 160 odsutan ili je aminokiselina koja je različita od glutaminske kiseline, ili neku njegovu varijantu koja je sposobna da inficira dentritne ćelije koja ima najmanje 80% sekvencijalne identičnosti sa SEQ ID NO: 1 i gde je ostatak 160 odsutan ili je aminokiselina koja nije glutaminska kiselina, drugi molekul nukleinske kiseline koji kodira gag i pol protein; treći molekul nukleinske kiseline koji kodira rev; i genom lentivirusnog vektora koji sadrži sekvencu od interesa. E2 glikoprotein ili varijanta iz pomenutog sistema za pakovanje ima aminokiselinsku sekvenca kao što je definisana u bilo kojem od već pomenutih primera izvođenja. Pol protein ima nefunkcionalnu integrazu. U posebnom primeru izvođenja, nefunkcionalna integraza ima D64V mutaciju. U nekim primerima izvođenja, drugi molekul nukleinske kiseline je lentivirusni genom koji ne može da se integriše. U posebnim primerima izvođenja, mesto att je mutirano ili delecirano. PPT mesto je mutirano ili delecirano što čini taj PPT nefunkcionalnim. U nekim primerima izvođenja att mesto je mutirano ili delecirano pored PPT mesta koje je mutirano ili delecirano (što čini taj PPT nefunkcionalnim). Lentivirusni genom koji ne može da se integriše može da se koristi u kombinaciji sa nefunkcionalnom integrazom i u kombinaciji sa bilo kojim od E2 proteina ili varijanati. Poželjno je da se čestice lentivirusnog vektora proizvode u titru od najmanje 10<5>IU/mL. U nekim slučajevima, ćelija se transfektuje prvim i četvrtim molekulom nukleinske kiseline koji su ovde opisani. Ćelija može već da sadrži drugi i treći molekul nukleinske kiseline u stabilnoj transformaciji.

[0035] Obezbeđen je izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira glikoprotein kao što je prethodno opisano ili E3/E2 glikoprotein opciono u formi E3/E2/6K/E1 poli-proteina iz Sindbis-a, ili E3/E2 glikoprotein pri čemu E3 sekvenca odgovara ostacima 1-65 iz SEQ ID NO: 20, ili njenoj varijanti koja ima najmanje 80% sekvencijalne identičnosti sa ostacima 1-65 iz SEQ ID NO: 20, pri čemu su ostaci 62-65 RSKR (SEQ ID NO: 27), a varijanta je sposobna da se inkorporira u pseudotipozirani virusni omotač, pri čemu je opciono ostatak 1 iz E2 poli-proteina Ser. E2 glikoprotein može da bude bilo koja od prethodno oposanih varijanati, uključujući kombinacije promena. Dodatno, obezbeđen je ekspresioni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline, kao što je ćelija domaćin koja obuhvata taj ekspresioni vektor.

[0036] Obezbeđen je postupak za proizvodnju čestice lentivirusnog vektora bilo koje varijante ili kombinacije koja je već pomenuta, koji obuhvata ekspresiju u ćeliji prvog molekula nukleinske kiseline koji kodira E2 glikoprotein iz Sindbis virusa sa sekvencom SEQ ID NO: 1 u kojoj je ostatak 160 različit od glutaminske kiseline, ili njegovu varijantu koja je sposobna da inficira dentritne ćelije i koja ima najmanje 80% sekvencijalne identičnosti sa SEQ ID NO: 1, a gde ostatak 160 nedostaje ili je aminokiselina koja je različita od glutaminske kiseline, i; (ii) drugi molekul nukleinske kiseline gde drugi molekul nukleinske kiseline može biti tnaskribovan, a transkript sklopljen u pseudotipiziranu česticu lentivirusnog vektora.

[0037] Bilo koja čestica lentivirusnog vektora može da se koristi u postupku za tretman čoveka ili životinje. Taj tretman može da bude vakcina za imunizaciju, gde je pomenuta vakcina profilaktička ili terapeutska. Vakcina obuhvata česticu lentivirusnog vektora sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. Alternativno, čestice lentivirusnog vektora mogu da se daju ćelijama in vitro, što obuhvata mešanje tih ćelija sa bilo kojom od već pomenutih čestica lentivirusnog vektora.

[0038] Ovi i drugi aspekti ovog pronalaska postaće vidljivi posle pozivanja na sledeći detaljan opis i priložen nacrt.

KRATAK OPIS NACRTA

[0039] Slika 1 je sekvenciono poravnavanje proteina omotača iz četiri Sindbis virusa, SVGmu, SIN-Var1, SIN-Var2 i SIN-Var3. Poravnavanje je prikazano u odnosu na SVGmu, prethodno opisanog omotača iz Sindbis-a. Glavne razlike u odnosu na SVGmu uključuju obnavljanje mesta cepanja proteaze slične furinu (RSKR; SEQ ID NO: 27) između E3 i E2, odstranjivanje petlje HA-epitopa, i seriju supstitucija lizina sa ciljem smanjivanja heparinskog vezivanja.

Slika 2 je šematski prikaz primera vektora koji se koriste za pakovanje virusnih čestica.

Slika 3 predstavlja grafikone grubih titara supernatanta iz preparata čestica lentivirusnog vektora u kojima je genom vektora pseudotipiziran sa tri različita proteina omotača Sindbis virusa, SVGmu i SIN-HR. Supernatanti virusa dobijeni su pomoću prolazne transfekcije koristeći standardne postupke, a sakupljeni su 48 sati posle transfekcije. Titri su određeni na 293T ćelijama koje eksprimiraju humani DC-SIGN (293T-DC-SIGN). Titri su izraženi kao broj GFP-ekspresionih jedinica po ml supernatanta i predstavljaju tri nezavisne transfekcije. Stubići greške predstavljaju standardnu devijaciju od srednjr vrednosti.

Slike 4A, 4B i 4C su grafikoni koji prikazuju imunološke odgovore T-ćelija kod miševa posle davanja pseudotipiziranih čestica lentivirusnog vektora. (A) C57BL/6 miševi imunizovani su subkutano jednom od dve doze (označene kao ng p24) lentivirusnog vektora koji ne može da se integriše i koji kodira OVA. Broj i funkcija OVA257-specifičnih CD8 T-ćelija u slezini određeni su tokom 9. dana bojenjem MHC-I/peptidnog multimera i intraćelijskog citokina. (B) C57BL/6 miševi imunizovani su subkutano doznim rasponom lentivirusnog vektora koji ne može da se integriše i koji kodira OVA. Procenat OVA257-specifičnih CD8 T-ćelija u slezini određen je tokom 11. dana bojenjem MHC-I/peptidnog multimera. (C) C57BL/6 miševi imunizovani su subkutano doznim rasponom lentivirusnog vektora koji ne može da se integriše i koji kodira OVA. Procenat OVA257-specifičnih CD8 T-ćelija u slezini određen je tokom 9. dana bojenjem intraćelijskog citokina.

Slika 5A predstavlja crteže lentivirusnih genoma. Slika 5B predstavlja sekvencu U3-regiona iz tri vektorska konstrukta. (A) Elementi koji se nalaze u svim lentivirusnim vektorima su prikazani u oglednom vektorskom genomu na vrhu. Promoteri koji se koriste uključuju humani Ubikvitin-C promoter (UbiC), neposredni rani promoter iz citomegalovirusa (CMV), ili promoter iz virusa Rouzovog sarkoma (RSV). Osim standardnog SIN U3 regiona, prikazane su serije proširenih delecija. Sekvenciona poravnavanja U3-regiona iz sva 3 vektora prikazana su na (B). Prikazana sekvenca uključuje polipurinski deo (PPT), koji je deleciran u konstruktu 704, i produženu U3 deleciju koja je prisutna u oba konstrukta, 703 i 704.

Slike 6A i 6B prikazuju GFP ekspresiju lentivirusnog vektora posle transdukcije 293T-ćelija. Na Slici 6A, GFP je operativno spojen na UbiC promoter, a na Slici 6B, GFP je operativno spojen na CMV promoter. Nivoi GFP ekspresije su određeni u lentivirusnim vektorima koji nemaju integrazu 48h posle transdukcije 293T-ćelija koje eksprimiraju DC-SIGN. GFP ekspresija u transdukovanim ćelijama određena je pomoću standardnih postupaka protočne citometrije; ukupno 50.000 događaja je sakupljeno iz svake grupe ćelija koje su bile transfektovane sa ciljem da se odredi srednji nivo ekspresije.

Slika 7 prikazuje broj GFP pozitivnih ćelija tokom pet pasaža. Ćelije su transdukovane različitim vektorskim preparatima i pasažirane svaka 72 h. Određeni su relativni GFP titri u kulturama 293T-ćelija koje su bile transdukovane različitim NILV konstruktima. Vektori su pakovani pomoću divljeg-tipa integraze (IN+) ili D64V mutirane integraze (IN-), pa su korišćeni da se transdukuju 293-ćelije koje eksprimiraju DC-SIGN. Kulture sa transdukovanim ćelijama su tada pasažirane svaka 72 sata tokom 15 dana. Kod svake pasaže,

1

broj GFP<+>ćelija u kulturi određen je pomoću standardnih postupaka protočne citometrije. Gubitak GFP ekspresije pasažom pokazuje gubitak tokom vremena vektorskih epizoma. Slika 8 prikazuje CD8 T-ćelijski odgovor posle davanja integrišućeg (Int<wt>) ili neintegrišućeg (Int<D64V>) lentivirusnog vektora. C57BL/6 miševi imunizovani su subkutano sa 2,5x10<10>genoma integrišućeg (Int<wt>) ili neintegrišućeg (Int<D64V>) lentivirusnog vektora koji kodira Gag antigen iz Simijan virusa imunodeficijencije (SIV). Broj antigen-specifičnih T-ćelija u slezini i njihov profil sekrecije citokina, određen je tokom 10. dana bojenjem intraćelijskog citokina. Slika 9 predstavlja grafikone koji prikazuju veličinu tumora kod miševa koji su primili ili samo prenosnik ili virusne čestice koje kodiraju tumorski antigen (levi grafikon) i procenat preživljavanja (desni grafikon). BALB/c miševi su injektirani subkutano sa 2x10<4>ćelija CT26 karcinoma debelog creva. Jedan dan kasnije, miševi su bili tretirani subkutano ili prenosnikom ili sa 3,2 µg (p24 kapsid) neintegrišućeg lentivirusnog vektora koji cilja DC (DC-NILV) i koji kodira AH1A5 peptid (SPSYAYHQF; SEQ ID NO: 25), modifikovani epitop CT26 CD8 T-ćelija. Prikazan je početni rast tumora i dugotrajno preživljavanje vakcinisanih u odnosu na kontrolne miševe.

DETALJAN OPIS

[0040] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke i kombinacije za ciljanje dentritnih ćelija (DC) pomoću čestica lentivirusnog vektora (npr., virion, lentivirusna čestica) sa ciljem da se dostavi sekvenca od interesa u DC. Čestica lentivirusnog vektora sadrži varijantu glikoproteina omotača koja je izvedena iz Sindbis virusa E2, i genom koji obuhvata pomenutu sekvencu od interesa, i opciono druge komponente. Ta varijanta glikoproteina pokazuje smanjeno vezivanje na heparanski sulfat kada se uporedi sa HR, referentnim sojem Sindbis virusa. Taj glikoprotein omotača omogućava infekciju dentritnih ćelija pomoću čestica lentivirusnog vektora. "Omogućava" infekciju, kao šta se ovde koristi, je isto kao i omogućava transdukciju i odnosi se na ulogu glikoproteina omotača, koji deluje sam ili zajedno sa drugim molekulima, tokom promovisanja ili širenja receptorom posredovanog ulaza pseudotipiziranog retrovirusa ili čestice lentivirusa u ciljanu ćeliju.

[0041] Opšte uzeto, čestice lentivirusnog vektora se proizvode pomoću ćelijske linije koja sadrži jedan ili više plazmidnih vektora i/ili integrisanih elemenata koji zajedno kodiraju komponente koje su neophodne da generišu funkcionalne vektorske čestice. Ove čestice lentivirusnog vektora su tipično nesposobne za replikaciju, tj., sposobne su samo za jednu rundu infekcije. Najčešće se koriste multipli plazmidni vektori ili pojedinačne kasete za ekspresiju koje su stabilno integrisane u hromozomu proizvodnih ćelija sa ciljem da se odvoje različite genetske komponente koje generišu čestice lentivirusnog vektora, međutim, može da se koristi i pojedinačni plazmidni vektor koji sadrži sve lentivirusne komponente. U jednom primeru, ćelijska linija za pakovanje transfektovana je jednim ili više plazmida koji sadrže genom virusnog vektora, uključujući LTR, cis-delujuća sekvenca za pakovanje, i sekvenca(e) od interesa, najmanje jedan plazmid koji kodira virusne enzimske i strukturne komponente (npr., gag i pol), i najmanje jedan plazmid koji kodira glikoprotein omotača Arbovirusa. Virusne čestice izlaze kroz ćelijsku membranu i sadrže jezgro koje uključuje tipično dva RNK-genoma koja sadrže sekvencu od interesa i glikoprotein omotača Arbovirusa koji cilja dentritne ćelije. Kada je glikoprotein iz Arbovirusa E2 glikoprotein iz Sindbis virusa, taj glikoprotein se priprema tako da ima smanjeno vezivanje heparanskog sulfata u odnosu na referentni soj HR. Ovo obično uključuje najmanje jednu aminokiselinsku promenu u odnosu na sekvencu HR E2 glikoproteina.

[0042] Bez vezivanja za teoriju, veruje se da vezivanje virusne čestice na površinu ćelije indukuje endocitozu, dovođenjem virusa u endozom, koj iizaziva fuziju membrane, što omogućava virusnom jezgru da uđe u citosol. Za neke primere izvođenja koji koriste integracione čestice lentivirusnog vektora, posle reverzne transkripcije i migracije proizvoda u jezgro, genom virusa se integriše u genom ciljane ćelije, ugrađujući sekvencu(e) od interesa u genom ciljne ćelije. Sa ciljem da se smanji šansa mutageneze usled ugradnje i da se promoviše privremena ekspresija određenih antigena, drugi primeri izvođenja koriste neintegrišuće čestice lentivirusnog vektora, koje se ne integrišu u genom ciljne ćelije, već umesto toga eksprimiraju sekvencu(e) od interesa iz nekog epizoma. Bilo kako bilo, inficirana DC tada eksprimira sekvencu(e) od interesa, na primer, neki antigen, stimulatorni molekul. Antigen tada može da se procesira u dendritnim ćelijama i da se izloži na T- i B-ćelije, što generiše antigen-specifični imuni odgovor. Specifičan put koji je prethodno opisan nije potreban sve dok je dendritna ćelija sposobna da stimuliše antigen-specifičan imuni odgovor.

[0043] Virusne čestice mogu da se daju subjektu sa ciljem da se obezbedi profilaktički ili terapeutski efekt. Proizvod pomenute sekvence od interesa je tipično neki antigen iz agensa koji uzrokuje bolest ili iz obolele ćelije (npr., tumorska ćelija). Posle infekcije dentritnih

1

ćelija i ekspresije proizvoda, generiše se imuni odgovor na proizvod. Ovaj imuni odgovor može da bude humoralni ili ćelijski ili odgovor oba tipa.

A. Omotač virusnog vektora

[0044] Virusi koji nose zglavkari (Arbovirusi) su virusi koji se prenose na nekog domaćina, kao što su ljudi, konji ili ptice vektorom inficiranih zglavkara kao što je komarac. Arbovirusi se dodatno dele u podfamilije virusa uključujući alfaviruse i flaviviruse, koji imaju genom od jedno-lančane RNK sa pozitivnom polarnosti i omotač koji sadrži glikoprotein. Na primer, virus denga groznice, virus žute groznice i virus Zapadnog Nila pripadaju familiji flavivirusa, a Sindbis virus, virus iz šume Semliki i virus venecuelanskog encefalitisa konja su članovi familije alfavirusa (Wang et al. J. Virol. 66, 4992 (1992)). Omotač Sindbis virusa uključuje dva transmembranska glikoproteina (Mukhopadhyay et al. Nature Rev. Microbio. 3, 13 (2005)): E1, za koji se veruje da je odgovoran za fuziju, i E2, za koji se veruje da je odgovoran za vezivanje za ćeliju. Glikoproteini omotača Sindbis virusa poznato je da pseudotipiziraju druge retroviruse, uključujući onkoretroviruse i lentiviruse.

[0045] Kao što je ovde već diskutovano, glikoproteina omotača arbovirusa može da se koristi za pseudotipiziranje genoma lentivirusnog vektora. "Pseudotipizirani" lentivirus je lentivirusna čestica koja ima jednu ili više proteina omotača koje su kodirane sa virusom koji je različit od lentivirusnog genoma. Glikoproteina omotača može da se modifikuje, mutira ili izmeni kao što je opisano ovde.

[0046] Omotač Sindbis virusa i drugih alfavirusa se uključuje u lipidni dvosloj membrane virusne čestice, i tipično sadrži više kopija oba glikoproteina, E1 i E2. Svaki glikoprotein ima regione koji se protežu kroz membranu; E2 ima citoplazmatski domen od oko 33 ostataka dok je citoplazmatski rep od E1 veoma kratak (oko 2 ostatka). Oba E1 i E2 imaju palmitinske kiseline spojene na ili blizu regiona koji premošćuju membrane. E2 se inicijalno sintetizuje kao proteina-prekursor koja se cepa preko furina ili drugih Ca<2+>-zavisnih serinskih proteinaza u E2 i jednu mali glikoprotein koji se zove E3. Između sekvenci koje kodiraju E2 i E1 je sekvenca koja kodira protein koji se zove 6K. E3 i 6K su signalne sekvence koje služe da se translociraju E2 i E1 glikoproteine u membranu. U genomu Sindbis virusa, kodirajući region za glikoproteine omotača Sindbis virusa uključuje sekvencu koja kodira E3, E2, 6K i E1. Kao šta se ovde koristi, "omotač" nekog arbovirusa uključuje najmanje E2, i može da takođe

1

uključi E1, 6K i E3. Primer sekvence za protein omotača Sindbis virusa, soj HR, je predstavljen u SEQ ID NO. 17. Sekvence glikoproteina omotača za druge arboviruse mogu da se pronađu u na primer GenBank. Na primer, sekvenca koja kodira protein iz Denga virusa mogu da se pronađu u Accession GQ252677 (među drugima iz GenBank) i u bazama podataka sa varijacijama na NCBI, a sekvenca koja kodira glikoproteine omotača venecuelanskog encefalitisa konja u Accession NP 040824.

[0047] Mada ćelijski receptor(i) na dendritske ćelijema za alfaviruse, a posebno za Sindbis virus, nisu definitivno identifikovani, jedan receptor se čini da je DC-SIGN (Klimstra et al., J Virol 77: 12022, 2003). Termini "spajanje", "vezivanje", "ciljanje" i slično se koriste kao sinonimi i ne treba da ukazuju na mehanizam interakcije između glikoproteina omotača Sindbis virusa i ćelijske komponente. DC-SIGN (Dendritske ćelijec Cell Specific ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin; takođe poznat kao CD209) je C-tip lektinski receptor koji je sposoban za brzo vezivanje i endocitozu materijala (Geijtenbeek, T. B., et al. Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 2004). E2 se čini da cilja virus na dendritna ćelija preko DC-SIGN. Kao što je ovde pokazano, ćelije koje eksprimiraju DC-SIGN se bolje transdukuju sa česticama virusnog vektora koji je pseudotipiziran sa E2 iz Sindbis virusa (najmanje 2-puta, najmanje 3-puta, najmanje 4-puta, najmanje 5-puta, najmanje 6-puta, najmanje 7-puta, najmanje 8-puta, najmanje 9-puta ili najbolje najmanje 10-puta) nego izogenične ćelije koje ne eksprimiraju DC-SIGN. Mehanizam kako E2 glikoproteina omogućava virusnu infekciju se čini da uključuje DC-SIGN, moguće preko direktnog vezivanja na DC-SIGN ili uzrokovanjem promene u konformaciji ili preko nekog drugog mehanizma. Bez razlike na aktualni mehanizam, ciljanje sa E2 je preferencijalno za ćelije koje eksprimiraju DC-SIGN, naime dendritske ćelije.

[0048] Sindbis virus se takođe čini da se veže na ćelije preko heparanskog sulfata (Klimstra et al., J Virol 72: 7357, 1998; Burmes & Griffin, J Virol 72: 7349, 1998). Budući da se heparanski sulfat i drugi glikozaminoglikani na površini ćelije nalaze i na površinama najvećeg broja drugih ćelija, poželjno je da se smanji interakcija između heparanskog sulfata i glikoproteina omotača Sindbis virusa. Ovo može da se postigne pomoću smanjivanje vezivanja omotača Sindbis virusa na heparanski sulfat ili povećanja vezivanja, na primer, povećan afinitet, omotača Sindbis virusa za dentritne ćelije ili oboje. Kao rezultat, nespecifično vezivanje za druge molekule, koje može da se izrazi preko drugih tipova ćelija i

1

koje može da se javi čak i kada je omotač specifičan za DC-SIGN, se smanjuje, a poboljšana specifičnost može da služi da se izbegnu nepoželjne pojave, kao što su nus-pojave koje smanjuju željeni imuni odgovor, ili nus-pojave koje su povezane sa promašenom transdukcijom drugih tipova ćelija. Alternativno ili dodatno u odnosu na napredak relativno specifične transdukcije ćelija koje eksprimiraju DC-SIGN, virusne čestice koje su pseudotipizirane sa E2 glikoproteinom iz omotača Sindbis virusa mogu da ponude druge prednosti u odnosu na virusne čestice koje su pseudotipizirane sa glikoproteinom kao što su VSVG. Primeri takvih iskoraka uključuju smanjenu lizu pomoću komplementa i/ili smanjeno ciljanje neuronskih ćelija, pri čemu se za oba efekta veruje da su povezani sa administracijom VSV-G pseudotipiziranih virusnih čestica.

[0049] U brojnim primerima, čestice lentivirusnog vektora specifično se vežu na ćelije koje eksprimiraju DC-SIGN i imaju smanjeno ili narušeno vezivanje na heparanski sulfat. Odnosno, E2 glikoprotein omotača Sindbis virusa može da se modifikuje tako da preferencijalno usmerava virus na dentritne ćelije koje eksprimiraju DC-SIGN u odnosu na druge tipove ćelija. Na osnovi informacija dobijenih iz strukturnih studija i između ostalog studija molekularnog modeliranja, varijante sekvenci proteina omotača, posebno E2 i E1 glikoproteini, su dizajnirane i proizvedene tako da glikoproteini zadržavaju svoje funkcije kao proteini omotača, ali imaju željenu veznu specifičnost, afinitet, ili nivo vezivanja. Sekvence varijanata-kandidata mogu da se stvore za svaki glikoprotein i da se testiraju pomoću postupaka koji su opisani ispod, ili drugih postupaka koji su poznati stanju tehnike, sa ciljem da se identifikuju glikoproteini omotača sa najpoželjnijim karakteristikama.

[0050] Određene sekvence-varijante za E2 iz Sindbis imaju najmanje jednu aminokiselinu promenjenu u ostatku 160 kada ih se uporedi sa SEQ ID NO: 1. Ostatak 160 je deleciran ili promenjen u aminokiselinu koja je različita od glutaminske kiseline. Promena je najčešće neka supstitucija od najmanje jedne aminokiseline, ali alternativno može da se radi i o adiciji ili deleciji jedne ili više aminokiselina. Poželjno, broj bilo koje dodatne aminokiselina je mali i ne sadrži antigenski epitop (npr., hemaglutininsku sekvencu za petlja), koji može da kompromitira bezbednost. Kada se radi o dve ili više promena, sve mogu da budu istoga tipa (npr., supstitucija) ili različitih tipova (npr., supstitucija ili delecija). Višestruke promene mogu da budu raspršene ili locirane kontinuirano u sekvenci proteina.

1

[0051] U prvoj instanci, varijanta sekvence obuhvata najmanje jednu promenu aminokiseline u regionu od ostatka 50 do ostatka 180. Unutar ovog regiona su aminokiseline koje su uključene u vezivanje na heparanski sulfat. Pomoću smanjivanja neto pozitivnog naboja u E2, elektrostatske interakcije sa heparanskim sulfatom mogu da se smanje, šta rezultuje u smanjeno vezivanje na heparanski sulfat. Kandidati pozitivno naelektrisane aminokiseline u ovom regionu uključuju lizine u ostacima 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149, 159 i arginine u ostacima 65, 92, 128, 137, 157, 170, 172 (Bear et al., Virology 347: 183-190, 2006). Najmanje nekoliko ovih aminokiselina je direktno uključeno u vezivanje E2 na heparanski sulfat. Neto pozitivni naboj može da se smanji pomoću delecije lizina ili arginina ili supstitucije lizina ili arginina sa neutralnom ili negativno nabijenom aminokiselinom. Na primer, jedan ili više od ovih lizina i arginina može da se zameni sa glutaminskom ili asparaginskom kiselinom. Određene primeri izvođenja imaju najmanje jednu supstituciju lizina 70, 76 ili 159. U slučaju kada se E2 eksprimira kao poli-protein sa E3, lizin lociran odmah do prirodnog mesta cepanja E3/E2 se održava - odnosno, sekvenca za prepoznavanje i mesto za cepanje ostaju nepromenjeni. Alternativno, nativna sekvenca za cepanje endopeptidaze je zamenjena sa sekvencom za prepoznavanje neke druge endopeptidaze.

[0052] Određene varijante E2 su takođe modifikovane tako da pozitivno utiču na vezivanje za dendrit. Promena glutaminske kiseline iz ostatka 160 u referentnoj HR sekvenci može da poboljša vezivanje na dendritna ćelija (vidi Gardner et al., J Virol 74, 11849, 2000, koji je inkorporisani u celosti). Promene, kao što su delecije ostatka 160 ili supstitucija ostatka 160 su prisutne u nekim varijantama. U posebnim varijantama, aminokiselina koja nije nabijena je zamenjena sa Glu, a u drugim varijantama, aminokiselina koja nije kisela je zamenjena sa Glu. Tipično, Glu160 je zamenjen sa jednom od malih ili alifatičnih aminokiselina, uključujući glicin, alanin, valin, leucin ili izoleucin.

[0053] Druge varijante obuhvataju dve ili više aminokiselinske promene. Tipično u ovim varijantama jedna od promena je Glu160, a ostale promene su promene jednog ili više lizina i arginina u regionu koji se proteže na ostatke od oko 50 do oko 180. Određene varijante obuhvataju promenu Glu160 u neki ostatak koji nije kiseo ili deleciju i jednu ili više promena lizina 70, lizina 76 ili lizina 159 sa nekom ne-baznom aminokiselinom. Neke specifične varijante obuhvataju promenu Glu160 u Gly, Lys 70 u Glu i Lys 159 u Glu; Glu 160 u Gly,

1

Lys 70, 76 i 159 u Glu; deleciju Glu 160 i Lys 70 i 159 u Glu; i deleciju Glu 160 i Lys 70, 76 i 159 u Glu.

[0054] U nekim slučajevima, E2 protein se najpre eksprimira kao poli-protein koji je fuzionisan na najmanje E3 ili na vodeću sekvencu. Bez razlike da li je vodeća sekvenca E3 ili neka druga sekvenca, E2 u virusnom omotaču treba da bude oslobođena od E3 ili neke druge vodeće sekvence. Drugim rečima, E2 poželjno nije E3/E2 fuzioni protein (npr., E3/E2 fuzion protein koji se naziva SVGmu). U nekim primerima izvođenja, E2 se eksprimira kao deo E3-E2-6K-E1 poli-protein. Sindbis virus prirodno eksprimira E2 kao deo poli-protein, a regioni spajanja za E3/E2, E2/6K i 6K/E1 poseduju sekvence koje mogu da budu prepoznate i pocepane sa endopeptidazama. Normalno, E3/E2 spajanje može da se pocepa sa furinom ili serinskom endopeptidazom koja je slična furinu između ostataka 65 i 66. Furin je specifičan za sparene argininske ostatke koji su odvojeni sa dve aminokiseline. Kako bi se održavalo funkcionalno cepanje E3/E2 sa furinom, ostaci 62-66 (RSKRS; SEQ ID NO: 26) treba da sadrže dva argininska ostatka koji su odvojeni sa dve aminokiseline i serinski ostatak. Alternativno, može da se koristi drugačija sekvenca za cepanje umesto E3/E2 furinska sekvenca ili bilo koja od drugih sekvenca za cepanje. Mogu da se ugrade mesta za prepoznavanje i cepanje endopeptidaza, uključujući, ali bez ograničenja, aspartičke endopeptidaze (npr., katepsin D, himozin, HIV proteaza), cisteinske endopeptidaze (bromelaini, papain, kalpain), metaloendopeptidaze, (npr., kolagenaza, termolizin), serinske endopeptidaze (npr., himotripsin, faktor IXa, faktor X, trombin, tripsin), streptokinaze. Sekvence za mesta prepoznavanja i cepanja pomenutih enzima su dobro poznate.

[0055] Aminokiseline u E2, drugačije od već pomenutih koje su promenjene, mogu takođe da se promene. Opšte uzeto, varijanta E2 sekvence će imati najmanje 80% identičnih aminokiselina u odnosu na referentnu E2 sekvencu, ili može da ima najmanje 82%, najmanje 85%, najmanje 87%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 95% ili najmanje 98% sekvencijalne identičnosti. Varijanta glikoproteina treba da pokazuje biološku funkciju, kao što su sposobnosti da omogućava infekciju dentritnih ćelija pomoću virusne čestice koja ima omotač koji sadrži E2. Eksperimenti su identifikovali regione iz glikoproteina omotača koji se smatra da imaju važnu ulogu u brojnim aspektima virusnog sklapanja, spajanja za ćelijsku površinu i infekcije. Kada se proizvode varijante, sledeće informacije mogu da se koriste kao upute. Citoplazmatski rep iz E2 – približno ostaci 408 do 415 – je važan za sklapanje virusa

2

(West et al. J Virol 80: 4458-4468, 2006, koji je inkorporisani u celosti). Drugi regioni su uključeni u formiranju sekundarne strukture (približno ostaci 33-53); i uključeni su u transport i stabilnost proteina (približno ostaci 86-119) (Navaratmarajah et al., J Virol 363: 124-147, 2007, koji je inkorporisani u celosti). Pomenuta varijanta može da zadrži hidrofobni karakter regiona koji se proteže kroz membranu, približno ostaci 370-380. Pomenuta varijanta može da zadrži jedno ili više N-spojenih mesta za glikozilaciju u ostacima NIT (ostaci 196-198) i NFT (ostaci 318-320) i može da zadrži jedno ili više mesta koja su palmitoilovana (C-396, C416 i C417) (Strauss & Strauss Microbiol Rev 58, 491-562, 1994; str. 499-509, inkorporisan). Sa druge strane, mnogi regioni iz E2 mogu da budu promenjeni bez da se uvode delecije. Na primer, umetanje transpozona u mnoge različite lokacije u E2 još uvek omogućavaju stvaranje vijabilnog virusa (Navaratmarajah, ibid).

[0056] U nekim primerima izvođenja, peptid-petlja može da se ugradi u E3, 6K ili E1 proteini. Za neke ciljeve, petlja može da se ugradi u E2, ali petlja nije poželjan za upotrebu u proizvodu koji je namenjen administriranju u ljudske pacijente. Peptid-petlja, koji je kratka sekvenca (npr., 5-30 aminokiselina), može da se koristi sa ciljem da ubrza detekciju ekspresije omotača i njegovu prisutnost u virusnim česticama. Za detekcijske svrhe, sekvenca petlja će tipično da se detektuje pomoću antitela ili hemikalija. Druga namena petlje je da ubrza purifikovanje virusnih čestica. Supstrat koji sadrži vezni partner za petlja može da se koristi sa ciljem da apsorbira virus. Elucija virusa može da se postigne pomoću tretmana sa ostatkom koji zamenjuje petlja sa veznog partnera ili kada je sekvenca-petlja spojena sa sekvencom, koja može da se pocepa, tretman sa odgovarajućom endopeptidazom će prikladno da oslobodi virus. (vidi, na primer, katalog od Qiagen, Factor Xa Protease System). Odstranjivanje peptida-petlje je opšte uzeto poželjno zbog bezbednosti virusnih čestica koji se koriste u životinjskom subjektu. Ako se petlja ne odstrani, može da se pojavi imuni odgovor na sam petlja.

[0057] Prikladne petlje uključuju, bez ograničenja, FLAG (DYKDDDDK) (U.S. Patent Br.

4,703,004, koji je inkorporisani u celosti), za koji su antitela komercijalno dostupna, protein koji veuije hitin, protein koja se vezuje maltozu, glutation-S-transferazu, poli(His) (U.S. Patent Br. 4,569,794, koji je inkorporisani u celosti), tioredoksiin, HA (hemaglutinin)-petlja, među drugima. Poli(His) može da se apsorbira na afinitetni medijum koji sadrži vezane metalne jone, npr., nikla ili kobalta, i može da se eluira u medijumu sa niskim pH.

[0058] Virusne čestice mogu da se procene sa ciljem da se odredi specifičnost glikoproteina iz omotača koja je ugrađena u virus koji cilja dentritne ćelije. Na primer, mešana populacija ćelija iz koštane srži može da se uzme iz pacijenta i kultivira in vitro. Alternativno, mogu da se dobiju i koriste izogene ćelijske linije koje eksprimiraju ili ne eksprimiraju DC-SIGN. Rekombinantni virus može da se administrira u mešanu populaciju ćelija iz koštane srži ili u izogene ćelijske linije, a ekspresija reporter-gena koji je ugrađen u virus može da se testira u kultiviranim ćelijama. Određene primeri izvođenja mogu da koriste analizu ograničenog razređenja, u kojoj se mešana populacija ćelija podeli u odvojene delove, koje se tada posebno inkubiraju sa opadajućim količinama virusa (npr., 2-puta, 5-puta, 10-puta manje virusa u svakom delu). U nekim primerima izvođenja, najmanje oko 50%, poželjno najmanje oko 60%, 70%, 80% ili 90%, još bolje najmanje oko 95% inficiranih ćelija u mešanoj populaciji ćelija su dendritske ćelije koji eksprimiraju DC-SIGN. U nekim primerima izvođenja, omer inficiranih dentritnih ćelija u odnosu na inficirane ćelije koje nisu dendritske ćelije (ili ćelije koje ne eksprimiraju DC-SIGN) je najmanje oko 2:1, najmanje oko 3:1, najmanje oko 4:1, najmanje oko 5:1, najmanje oko 6:1, najmanje oko 7:1, najmanje oko 8:1, najmanje oko 9:1, najmanje oko 10:1, najmanje oko 20:1, najmanje oko 30:1, najmanje oko 40:1, najmanje oko 50:1, najmanje oko 100:1, najmanje oko 200:1, najmanje oko 500:1, najmanje oko 1000:1, najmanje oko 5000:1, najmanje oko 10,000:1 ili više. Kod ograničavajućeg razređenja, veća selektivnost je tipično primećena kod većih razređenja (tj., manjih količina) dodanog virusa.

[0059] Delovanje pseudotipiziranih čestica može da se odredi pomoću brojnih tehnika. Na primer, preferirani postupak koji meri efikasnost infektivnosti (IU, infektivne jedinice) je pomoću administriranja virusnih čestica u ćelije i merenje ekspresije proizvoda koji je kodiran u vektorskom genomu. Bilo koji proizvod koji može da se testira može da se koristi. Jedan prikladan tip proizvoda je fluorescentni protein, kao što su zeleni fluorescentni proteini (GFP). GFP i test su prikazani u Primerima, odnosno u Primeru 3. Drugi proizvodi koji mogu da se koriste uključuju proteini koji se eksprimiraju na površini ćelije (npr., detektovanje pomoću vezivanja antitela), enzime i slično. Ako je proizvod neki antigen, a ćelije su dendritske ćelije, infektivnost/delovanje može da se proceni pomoću određivanja imunih odgovora. Dodatno, moguće je da se procene i nus-pojave kod sisara. Sposobnost da se specifično ciljaju dendritske ćelije takođe može da se testira direktno, na primer, u kulturi ćelija kao što je opisano.

[0060] Virusne čestice mogu takođe da se pripreme i testiraju na njihovu selektivnost i/ili sposobnost da omogućavaju penetraciju membrane ciljane ćelije. Virusne čestice koje imaju omotač sa nemodifikovanim glikoproteinima mogu da se koriste kao kontrole za upoređivanje. Ukratko, ćelije koje eksprimiraju receptor za glikoproteine omotača su inficirane sa virusom pomoću standardnog testa infekcije. Posle određenog vremena, na primer 48 h post-infekcije, ćelije mogu da se sakupe, a procenat inficiranih ćelija sa virusom može da se odredi pomoću protočne citometrije, na primer. Selektivnost može da se odredi pomoću izračunavanja procenta ćelija inficiranih sa virusom. Slično, efekat glikoproteinevarijante iz omotača na virusni titar može da se kvantifikuje pomoću deljenja procenta ćelija inficiranih sa virusom koji sadrži pomenutu varijantu iz omotača sa procentom ćelija koje su inficirane sa virusom koji sadrži odgovarajući divlji tip glikoproteine (nemodifikovanu) iz omotača. Posebno prikladna varijanta će imati najbolju kombinaciju selektivnosti i infekcijskog titra. Jednom kada se varijanta selektira, mogu da se primene testovi virusne koncentracije sa ciljem da se odredi dali ovi virusi mogu da se koncentrišu bez da se naruši delovanje. Supernatanti virusa se sakupljaju i koncentrišu pomoću ultracentrifuge. Titri virusa mogu da se odrede pomoću ograničenog razređenja osnovnog virusnog rastvora i infekcije ćelija koje eksprimiraju receptor za glikoprotein omotača, uz merenje ekspresije proizvoda koji se eksprimira od strane virusa kao što je ovde opisano.

[0061] Ulazak čestice lentivirusnog vektora u ciljanu ćeliju je drugi tip evaluacije delovanja. BlaM-Vpr (beta-laktamaza Vpr) fuzioni proteini se koristi da se proceni HIV-1 virusna penetracija; fuzija BlaM i glikoprotein omotača Sindbis virusa, kao što su E1 ili E2/E1 fuzion protein može da se koristi sa ciljem da se proceni efikasnost proteina omotača da omogućava fuziju i penetraciju u ciljanu ćeliju. Virusne čestice mogu da se pripreme, na primer, pomoću privremene transfekcije ćelija za pakovanje sa jednim ili više vektora koji sadrže virusne elemente BlaM-Vpr, i varijante od interesa iz omotača (i jedan afinitetni molekul ako je prikladno). Nastali virusi mogu da se koriste sa ciljem da se inficiraju ćelije koje eksprimiraju molekul za ciljanje (ili afinitetni molekul) koji se specifično veže u odsutnosti ili u prisutnosti slobodnog inhibitora vezivanja (kao što su nekog antitela). Ćelije se tada plakne sa CO2-nezavisnim medijumom i nabijaju bojom CCF2 (Aurora Bioscience). Posle inkubacije na

2

sobnoj temperaturi sa ciljem da se omogući kompletovanje reakcije cepanja, ćelije mogu da se fiksiraju pomoću paraformaldehida i analiziraju pomoću protočne citometrije i mikroskopije. Procenat plavih ćelija pokazuje penetraciju virusa u citoplazmu; očekuje se manje plavih ćelija kada se dodano blokirajuće antitelo (Cavrois et al. Nat Biotechnol 20: 1151-1154, 2002; koji je inkorporisani u celosti).

[0062] Sa ciljem da se istraži dali penetracija zavisi o niskom pH, i da se identifikuju glikoproteini omotača sa željenom zavisnosti o pH, NH4Cl ili drugo jedinjenje koje menja pH može da se doda tokom koraka infekcije (NH4Cl će neutralisati kisele kompartimente endozoma). U slučaju NH4Cl, nestanak plavih ćelija će da pokaže da je penetracija virusa zavisna o niskom pH. Dodatno, sa ciljem da se potvrdi da je delovanje zavisno o pH, mogu da se dodaju lizosomotropni agensi, kao što su amonijum hlorida, hlorokina, konkanamicina, bafilomicina A1, monenzina, nigericina itd., u pufer za inkubaciju. Ovi agensi povećavaju pH unutar endozomalnih kompartimenata (na primer, Drose & Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997). Inhibitorni efekat pomenutih agenasa će otkriti ulogu pH tokom virusne fuzije i ulaska. Različite kinetike ulaska među virusima koji imaju različite fuzogeničke molekule može da se uporedi, a najprikladniji se izabere za određenu primenu.

[0063] Testovi ulaska koji se baziraju na PCR-u mogu da se koriste sa ciljem da se prati reverzna transkripcija i izmeri kinetika virusne DNK sinteze kao indikacija za kinetiku virusnog ulaska. Na primer, virusne čestice koje obuhvataju određeni molekul proteina omotača se inkubiraju sa ciljanim ćelijama, kao što su 293T ćelija, DC ili bilo kojih drugih ćelija koje su pripremljene da eksprimiraju, ili koje prirodno eksprimiraju, odgovarajući vezni partner (receptor) za molekul proteina omotača. Nevezani virusi su odmah ili posle određenog vremena (sa ciljem da se omogući infekcija) odstranjeni, a alikvoti ćelija su analizirani na virusne nukleinske kiseline. DNK je izolovana iz pomenutih alikvota pa je podvrgnuta amplifikacijskoj analizi, opšte uzeto kroz neki polu-kvantitativni test, pomoću LTR-specifičnih prajmera. Pojava LTR-specifičnih DNK proizvoda pokazuje uspeh virusnog ulaska.

B. Genom lentivirusnog vektora

[0064] Čestice virusnog vektora sadrže genom, koji obuhvata sekvencu(e) od interesa. Druge sekvence mogu da se uključe, kao što su sekvenca koje omogućavaju genomu da se pakuje u virusnu česticu i sekvenca koje promovišu ekspresiju sekvence(a) od interesa posle transdukcije ciljane ćelije. Pomenuti genom može da se izvede iz velikog broja prikladnih, dostupnih vektora čija je osnova lentivirusni genom, uključujući one koji su identifikovani za primenu u genskoj terapiji kod ljudi, kao što su onih koji su opisani od Pfeifer & Verma (Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211, 2001). Zbog jednostavnosti, pomenuti genom se takođe naziva "genom virusnog vektora" ili "genom vektora".

1. Okosnica

[0065] Prikladni genomi lentivirusnog vektora uključuju one koji se baziraju na virusu humane imunodeficijencije (HIV-1), HIV-2, virusu imunodeficijencije mačaka (FIV), virusu infektivne anemije konja, virusu imunoideficijencije Simijana (SIV) i virusu midi/visna. Poželjna karakteristika lentivirusa je ta što su sposobni da inficiraju ćelije koje se dele i one koje se ne dele, a nije neophodno da se ciljana ćelija deli (ili da ih se stimuliše da se dele). Opšte uzeto, pomenuti genom i glikoproteini omotača će se bazirati na različitim virusima, tako da je nastala čestica virusnog vektora pseudotipizirana. Bezbednosne karakteristike vektorskog genoma su poželjno uključene. Bezbednosne karakteristike uključuju samoneaktivirajući LTR i ne-integrirajući genom. Primeri za vektore su razotkriveni dodatno u Primeru 5 na Slici 5, a takvi vektori mogu da se koriste u primerima izvođenja iz ovoga pronalaska za ekspresiju antigena od interesa.

[0066] U nekim primernim primerima izvođenja, genom virusnog vektora obuhvata sekvence iz genoma lentivirusa, kao što su genoma HIV-1 ili genoma SIV. Pomenuti konstrukti virusnog genoma mogu da obuhvate sekvence sa 5' i 3' LTR iz lentivirusa, a posebno mogu da obuhvate R- i U5-sekvence iz 5' LTR iz lentivirusa i jedan inaktivisani ili samoinaktivirajući 3' LTR iz lentivirusa. LTR-sekvence mogu da budu LTR-sekvence iz bilo kojeg lentivirusa iz bilo koje vrste. Na primer, mogu da budu LTR-sekvence iz HIV, SIV, FIV ili BIV. Tipično, LTR-sekvence su HIV LTR-sekvence.

[0067] Genom vektora može da obuhvata neki inaktivisani ili samo-inaktivirajući 3' LTR (Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998; od kojih su oba inkorporisani u celosti). Samo-inaktivirajući vektor, opšte uzeto, ima delecirani pojačivač i promoter iz 3'-dugog terminalnog ponavljanja (LTR), koja se kopira u 5' LTR tokom integracije vektora. U jednoj instanci, U3-element iz 3' LTR sadrži deleciju sekvence

2

pojačivača, TATA-kutiju, Sp1 i NF-kapa B mesta. Kao rezultat samo-inaktivisanja 3' LTR, provirus koji nastaje posle ulaska i reverzne transkripcije će sadržavati inaktivisani 5' LTR. Ovo se radi zbog poboljšanja bezbednosti preko smanjivanja rizika od mobiliziranja genoma pomenutog vektora i uticaja LTR na bliske ćelijske promotere. Samo-inaktivirajući 3' LTR može da se konstruira pomoću bilo kojeg postupka koji je poznat stanju tehnike.

[0068] Opciono, U3-sekvenca iz lentivirusnog 5' LTR može da bude zamenjena sa promoterom u virusnom konstruktu, kao što su neke sekvence nekog heterolognog promotera. Ovo može da poveća titar virusa koji se dobija iz ćelijske linije za pakovanje. Takođe može da bude uključena i sekvenca nekog pojačivača. Bilo koja kombinacija pojačivač/promoter koja povećava ekspresiju virusnog RNK genoma u ćelijskoj liniji za pakovanje može da se koristi. U jednom primeru se koristi sekvenca CMV pojačivaća/promotera (US 5385839 i US 5168062, od kojih su oba inkorporisani u celosti).

[0069] U nekim primerima izvođenja, rizik od insercijske mutageneze je minimizovan pomoću konstruisanja genoma lentivirusnog vektora koji ne može da se integriše. Brojni pristupi mogu da se provode sa ciljem da se proizvede ne-integrirajući vektorski genom. Ovi pristupi podrazumevaju uvođenje mutacije(a) u komponentu gena pol za enzim integraza, kao što su oni koje kodiraju protein neaktivnom integrazom. Pomenuti vektorski genom sam za sebe može da se modifikuje sa ciljem da se spreći integracija pomoću, na primer, mutiranja ili brisanja jednog ili više mesta spajanja. Kako je navedeno u patentnim zahtevima, narušavanje funkcionalnosti polipurinskog trakta proksimalno od 3' LTR-a (PPT) izvedeno je preko brisanja ili modifikacije. Dodatno, ne-genetički pristupi su takođe dostupni; oni uključuju farmakološke agense koji inhibiraju jednu ili više funkcija integraze. Pomenuti pristupi nisu međusobno isključivi, odnosno, može da se istovremeno koristi više njih. Na primer, integraza i mesta spajanja mogu da budu nefunkcionalna ili integraza i PPT-mesto mogu da budu nefunkcionalni, ili mesta spajanja i PPT-mesto mogu da budu nefunkcionalni, ili svi od pomenutih mogu da budu nefunkcionalni.

[0070] Kao što je ovde navedeno, jedan pristup je da se proizvede i koristi nefunkcionalna integraza. Integraza je uključena u cepanju virusne dvo-lančane DNK sa tupim krajevima i spajanju krajeva na 5'-fosfate u dva lanca iz hromosomskog ciljanog mesta. Integraza ima tri funkcionalna domena: N-terminalni domen, koji sadrži cink-vezni motiv (HHCC), srž

2

centralnog domena, koji sadrži katalitičku srž i konzervisani DD35E motiv (D64, D116, E152 u HIV-1), i C-terminalni domen, koji ima DNK-vezne karakteristike. Tačkaste mutacije uvedene u integrazu su dovoljne da razore normalnu funkciju. Mnoge mutacije integraze su konstruirane i karakterizovane (vidi, Philpott & Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Apolonia, Disertacija predana University College London, April 2009, str., 82-97; Engelman et al. J Virol 69: 2729, 1995; Nightingale et al. Mol Therapy, 13: 1121, 2006; od kojih su oba inkorporisani u celosti). Sekvenca koja kodira proteine integraze može da se deletira ili mutira sa ciljem da se dobije neaktivan protein, poželjno bez da značajno utiče na aktivnost reverzne transkriptaze ili na nuklearno ciljanje, a samo sprečava integraciju provirusa u genom ciljane ćelije. Prihvatljive mutacije mogu da smanje katalizu sa integrazom, prenos lanca, vezivanje na att-mesta, vezivanje na hromosomsku DNK iz domaćina i druge funkcije. Na primer, supstitucija pojedinačne asparaginske kiseline u asparagin kod ostatka 35 u integrazi iz HIV ili SIV kompletno ukida integrisanje virusne DNK. Delecije integraze će, opšte uzeto, da se odnose na C-terminalni domen. Delecija kodirajuće sekvence za ostatke 235-288 rezultuje sa korisnom nefunkcionalnom integrazom (Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995). Kao dodatni primeri, mutacije mogu da se generišu kod, na primer, Asp64 (brojevi ostatka su prikazani za HIV-1, a odgovarajući brojevi ostatke u integrazi iz drugih lentivirusa ili retrovirusa mogu da se lako odrede od strane stručnjaka) (npr., pseuditipizirani lentivirusni D64V), Asp116 (npr., D116N), Asn120 (npr., N120K), Glu152, Gln148 (npr., Q148A), Lys156, Lys159, Trp235 (npr., W235E), Lys264 (npr., K264R), Lys266 (npr., K266R), Lys273 (npr., K273R). Druge mutacije mogu da se konstruišu i testiraju na delovanje na integraciju, ekspresiju transgena, i na bilo koje druge poželjne parametre. Testovi za ove funkcije su dobro poznati. Mutacije mogu da se generišu pomoću brojnih tehnika, uključujući mesto-usmerenu mutagenezu i hemijsku sintezu sekvence nukleinske kiseline. U integrazi može da se proizvede jedna mutacija ili može da se proizvede više od pomenutih mutacija. Na primer, integraza može da ima mutacije u dve aminokiseline, tri aminokiseline, četiri aminokiseline itd.

[0071] Alternativno ili u zajedno sa upotrebom mutanata integraze, mesta spajanja (att) u U3 i U5 mogu takođe da budu mutirana. Integraza se veže na ova mesta, a 3'-terminalni dinukleotid je pocepan na oba kraja vektorskog genoma. CA dinukleotid je lociran na skraćenom 3'-kraju; CA je potreban za procesiranje, pa mutiranje nukleotida blokira integraciju u hromozom domaćina. A iz CA dinukleotida je najkritičniji nukleotid za

2

integraciju, a mutacije na oba kraja genoma daju najbolje rezultate (Brown et al J Virol 73:9011 (1999). U jednom primeru, CA na svakom kraju je promenjen u TG. U drugim primerima, CA na svakom kraju je promenjen u TG na jednom kraju i u GT na drugom kraju. U drugom primeru, CA na svakom kraju je deleciran; u drugim primerima, A iz CA je deleciran na svakom kraju.

[0072] Integracija može takođe da se inhibira pomoću mutacije ili delecije polipurinskog trakta (PPT) (WO 2009/076524), koji se nalazi proksimalno od 3' LTR. PPT je polipurinska sekvenca od oko 15 nukelotida koja služi kao vezno mesto za prajmer za sintezu plus-lanca DNK. U ovom slučaju, mutacije ili delecije u PPT ciljaju proces reverzne transkripcije. Bez da se vezujemo za mehanizam, mutiranjem ili delicijom PPT, proizvodnja linearne DNK je radikalno smanjena i, u stvari, se proizvode samo DNK krugovi sa 1-LTR. Integracija zahteva postojanje vektora sa linearnim dvo-lančanim DNK genomom, a bez toga je integracija esencijalno eliminisana. Kao što je pomenuto, PPT može da se učini nefunkcionalnim pomoću mutacije ili delecije. Tipično se deletira svih 15 nt u PPT-u, mada se u nekim primerima izvođenja uvode kraće delecije, od 14 nt, 13, nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt i 2 nt. Kada se uvode mutacije, obično se uvode multiple mutacije, posebno na 5'-delu PPT (McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003), mada pojedinačne ili dvostruke mutacije u prve četiri baze takođe smanjuju transkripciju. Mutacije koje su uvedene u 3'-kraj PPT, opšte uzeto, imaju snažniji efekat (Powell & Levin J Virol 70:5288, 1996).

[0073] Ovi različiti pristupi za proizvodnju vektora sa genomom koji ne može da se integriše mogu da se koriste pojedinačno ili kombinovano. Primena više od jednog pristupa može da se koristi sa ciljem da se stvori vektor potpune bezbednosti koja je garantovana sa više mehanizama. Tako, PPT mutacije ili delecije mogu da se kombinuju sa mutacijama ili delecijama att-mesta ili sa mutacijama Integraze ili PPT mutacije ili delecije mogu da se kombinuju istovremeno sa mutacijama ili delecijama att-mesta i mutacijama Integraze. Slično, mutacije ili delecije att-mesta i mutacije Integraze mogu da se kombinuju jedni sa drugima ili sa mutacijama ili delecijama PPT.

2. Regulacioni elementi

2

[0074] Kao što je ovde opisano, genom virusnog vektora obuhvata sekvencu od interesa koja je poželjna za ekspresiju u ciljanoj ćeliji. Tipično, sekvenca od interesa je locirana među sekvence 5' LTR i 3' LTR. Dodatno, pomenuta sekvenca od interesa je poželjno u funkcionalnom odnosu sa drugim genetičkim elementima, na primer sekvencama za regulaciju transkripcije uključujući promotere ili pojačivače, sa ciljem da se reguliše ekspresija pomenute sekvence od interesa na neki određeni način. U nekim slučajevima, korisne regulacione sekvence za transkripciju su one koje su visoko regulisane u odnosu na delovanje, privremeno ili udaljeno (spatijalno). Elementi koji kontrolišu ekspresiju i koji mogu da budu korisni za regulisanje ekspresije pomenutih komponenti su poznati stanju tehnike i uključuju, ali bez ograničenja, inducibilne promotere, konstitutivne promotere, signale za sekreciju, pojačivače i druge regulacione elemente.

[0075] Pomenuta sekvenca od interesa i bilo koja druga sekvenca koja može da se eksprimira je tipično u funkcionalnom odnosu sa internom regulacionom sekvencom, promoter/pojačivač. "Interni" promoter/pojačivač je onaj koji je lociran između sekvence 5' LTR i 3' LTR u konstruktu virusnog vektora i je operativno vezan za sekvencu od interesa. Pomenuti interni promoter/pojačivač može da bude bilo koji promoter, pojačivač ili kombinacija promoter/pojačivač za koju se zna da pojačava ekspresiju gena sa kojim je u funkcionalnom odnosu. "Funkcionalni odnos" i "operativno spojen" znači, bez ograničenja, da se pomenuta sekvenca nalazi na pravoj lokaciji i u pravoj orijentaciji u odnosu na promoter i/ili pojačivač tako da se sekvenca od interesa eksprimira kada je pomenuti promoter i/ili pojačivač kontaktiran sa odgovarajućim molekulima.

[0076] Izbor internog promotera/pojačivača se bazira na željenom ekspresijskom obrascu sekvence od interesa i specifičnih karakteristika poznatih promotera/pojačivača. Tako, interni promoter može da bude konstitutivno aktivan. Ne-ograničavajući primeri za konstitutivne promotere koji mogu da se koriste uključuju promoter za ubikvitin (US 5510474; WO 98/32869), CMV (Thomsen et al., PNAS 81:659, 1984; US 5168062, ), beta-aktin (Gunning et al.1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835) i pgk (vidi, na primer, Adra et al.1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et al.1984 Gene 32:409-417; i Dobson et al.1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637).

2

[0077] Alternativno, promoter može da bude tkivno-specifični promoter. U nekim preferiranim primerima izvođenja, pomenuti promoter je neki promoter koji je specifičan za ciljnu ćeliju. Na primer, promoter može da dolazi iz bilo kojeg proizvoda koji se eksprimira u dendritske ćelijema, uključujući CD11c, CD103, TLR, DC-SIGN, BDCA-3, DEC-205, DCIR2, manoza-receptor, Dektin-1, Clec9A, MHC klasa II. Dodatno, promoteri mogu da se selektiraju sa ciljem da dozvoljavaju inducibilnu ekspresiju sekvence od interesa. Brojni sistemi za inducibilnu ekspresiju su poznati stanju tehnike, uključujući sistem tetraciklinskog odgovora, sistem sa lac-operator/represorom, kao i promoteri koji odgovaraju na brojne promene u okolišu i u fiziologiji, uključujući toplotni-šok, metalne jone, kao što su metalotioneinskog promotera, interferone, hipoksiju, steroide, kao što su progesterona ili promotera za glukokortikoidni receptor, radijaciju, kao što su VEGF-promotera. Kombinacija promotera takođe može da se koristi sa ciljem da se dobije željena ekspresija gena od interesa. Stručnjak u polju je sposoban da izabere promoter koji se bazira na željeni ekspresioni obrazac pomenutog gena u organizmu ili ciljnoj ćeliji od interesa.

[0078] Virusni genom može da obuhvata najmanje jedan promoter koji odgovara na RNK Polimerazu II ili III. Ovaj promoter može da se operativno spoji na sekvencu od interesa i može takođe da se spoji na terminacijsku sekvencu. Dodatno, više od jednog promotera za RNK Polimerazu II ili III može da se ugradi. Promoteri za RNK polimerazu II i III su dobro poznati stručnjacima u polju. Prikladan raspon promotera za RNK polimerazu III može da se pronađe, na primer, kod Paule & White, Nucleic Acids Research., Vol. 28, str. 1283-1298 (2000). Promoteri za RNK polimerazu II ili III takođe uključuju sintetički ili promenjen DNK fragment koji može da usmeri RNK polimerazu II ili III da transkribira nizvodnu RNK kodirajuću sekvencu. Nadalje, promoter ili promoteri RNK polimeraze II ili III (Pol II ili III) koji se ovde koriste kao deo genoma virusnog vektora mogu takođe da budu inducibilni. Bilo koji prikladni inducibilan promoter za Pol II ili III može da se koristi sa postupcima za ovaj pronalazak. Posebno prikladni promoteri za Pol II ili III uključuju promotere koji odgovaraju na tetraciklin, a koji su obezbeđeni od Ohkawa & Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, str.

577-585 (2000) i od Meissner et al. Nucleic Acids Research, Vol.29, str. 1672-1682 (2001).

[0079] Interni pojačivač može takođe da bude prisutan u virusnom konstruktu sa ciljem da poveća ekspresiju gena od interesa. Na primer, može da se koristi CMV-pojačivač (Boshart et al. Cell, 41:521, 1985). Karakterizovani su brojni pojačivači u virusnim genomima, kao što su HIV, CMV, a identifikovani i karakterizovani su i u genomima sisara (vidi GenBank). Pojačivač može da se koristi u kombinaciji sa heterolognim promoterom. Stručnjak u polju je sposoban da izabere odgovarajući pojačivač na bazi željenog ekspresijskog obrasca.

[0080] Genom virusnog vektora obično sadrži promoter kojeg prepoznaje ciljana ćelija i koji je operativno spojen na sekvencu od interesa, virusne komponente i druge sekvence o kojima se ovde diskutovalo. Promoter je element koji kontroliše ekspresiju, sastoji se od sekvence nukleinske kiseline koja omogućava vezivanje RNK-polimeraze i ostvarivanje transkripcije. Promoteri mogu da budu inducibilni, konstitutivni, privremeno aktivni ili tkivno-specifični. Delovanje inducibilnih promotera je potaknuto u prisustvu ili odsustvu biotičkih ili abiotičkih faktora. Inducibilni promoteri mogu da budu korisni alati u genetičkom inženjerstvu zbog toga šta ekspresija gena na koje su operativno spojeni može da se pali i gasi u tačno određenim fazama razvoja organizma, proizvodnje, ili u određenom tkivu. Inducibilni promoteri mogu da se grupišu u dve grupe, hemijski-regulisani promoteri i fizički-regulisani promoteri. Tipični hemijski-regulisani promoteri uključuju, ali bez ograničenja, promotere koji su regulisani alkoholom (npr., promoter gena alkohol dehidrogenaze I (alcA)), promotere koji su regulisani tetraciklinom (npr., promoter koji odgovara na tetraciklin), promoter koji je regulisan steroidom (npr., promoter na bazi glukokortikoidnog receptora (GR) iz pacova, promoter na bazi ljudskog estrogenskog receptora (ER), promoter na bazi ekdizonskog receptora iz moljca, i promoteri na bazi steroidne/retinoidne/tiroidne receptorske superfamilije), promotere koji su regulisani metalom (npr., promoteri na bazi metalotioneinskog gena), i promotere povezane sa patogenezom (npr., promoteri na bazi proteina iz Arabidopsis i oni koji su povezani sa patogenima iz kukuruza (PR)). Tipični fizički-regulisani promoteri uključuju, ali bez ograničenja, promotere koji su regulisani temperaturom (npr., promoteri toplotnog šoka), i promotere koji su regulisani svetlom (npr., SSU-promoter iz soje). Drugi primeri za promotere su opisni u na drugim mestima, na primer, u " Promoters used to regulate gene expression" na Patent Lens web-stranici, pristup od 18 maja 2009.

[0081] Stručnjak u polju je sposoban da izabere odgovarajući promoter na bazi specifičnih okolnosti. Brojni različiti promoteri su dobro poznati stanju tehnike, kao i postupci za operativno spajanje promotera na gene koji će se eksprimirati. Mogu da se koriste nativne promoterske sekvence i brojni heterologni promoteri sa ciljem usmeravanja ekspresije u

1

ćelijama za pakovanje i ciljnim ćelijama. Heterologni promoteri su preferirani, međutim, jer oni, opšte uzeto, dozvoljavaju snažniju transkripciju i veće prinose željenog proteina u poređenju sa nativnim promoterom.

[0082] Pomenuti promoter može da se dobije, na primer, iz genoma virusa kao što su polioma virusa, fowlpox virusa, adenovirusa, kravljeg papiloma virusa, ptičijeg sarkom virusa, citomegalovirusa, retrovirusa, virusa hepatitisa B i Simian virusa 40 (SV40). Promoter može takođe da bude, na primer, heterologni promoter sisara, npr, aktinski promoter ili neki imunoglobulinski promoter, promoter toplotnog šoka, ili promoter koji je prirodno spojen sa nativnom sekvencom, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa ciljanom ćelijom. U jednom primeru izvođenja, pomenuti promoter je virusni promoter koji se javlja prirodno u nekom virusnom ekspresijskom sistemu. U nekim primerima izvođenja, pomenuti promoter je takav da je specifičan za dendrit. Promoter koji je specifičan za dendritna ćelija može da bude, na primer, CD11 c-promoter.

[0083] Transkripcija može da se poveća pomoću ubacivanja sekvence pojačivaća u pomenuti vektor(e). Pojačivači su tipično cis-delujući elementi DNK, obično oko 10 do 300 bp u dužini, koji deluju na promoter sa ciljem da pojačaju njegovu transkripciju. Mnoge sekvence pojačivača su poznate za gene iz sisara (globin, elastaza, albumin, alfa-fetoprotein i insulin) i iz virusa eukariotske ćelije. Primeri uključuju SV40-pojačivač na kasnoj strani replikacijskog početka (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, polioma-pojačivač na kasnoj strani replikacijskog početka i pojačivače iz adenovirusa. Pojačivač može da bude ubačen u vektor na poziciji 5' ili 3' u odnosu na antigen-specifičnu polinukleotidnu sekvencu, ali je poželjno lociran na 5'-strani od samog promotera.

[0084] Ekspresioni vektori mogu takođe da sadrže sekvence koje su neophodne za terminaciju transkripcije i za stabilizovanje mRNK. Ove sekvence se često nalaze na 5' i, opciono na 3', netranslatiranim regionima eukariotske ili virusne DNK ili cDNK i su dobro poznati stanju tehnike.

[0085] Genom virusnog vektora može takođe da sadrži dodatne genetičke elemente. Tipovi elemenata koji mogu da budu uključeni u pomenuti konstrukt nisu ograničeni na bilo koji način i mogu da budu izabrani sa ciljem postizanja tačno određenih rezultata. Na primer,

2

signal koji omogućava nuklearni ulazak virusnog genoma u ciljanu ćeliju može takođe da se uvede. Primer takvog signala je flap-signal iz HIV-1. Dodatno, mogu da se uključe elementi koji omogućavaju karakterizovanje mesta provirusne integracije u ciljanoj ćeliji. Na primer, tRNK-amber supresorska sekvenca može da se uvede u konstrukt. Izolatorna sekvenca iz na primer, kokošijeg β-globina može da se uključi u konstrukt sa virusnim genomom. Ovaj element smanjuje šansu utišavanja integrisanog provirusa u ciljanoj ćeliji zbog metilacije i efekata heterohromatinizacije. Dodatno, izolator može da zaštiti interni pojačivač, promoter i egzogeni gen od pozitivnih ili negativnih pozicionih efekata od susedne DNK na mestu integracije u hromosomu. Dodatno, genom vektora može da sadrži jedan ili više genetičkih elemenata koji su predviđeni da pojačavaju ekspresiju gena od interesa. Na primer, u konstrukt može da se postavi element koji odgovara na virus hepatitisa mrmota (WRE) (Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-3681; Deglon et al. 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-190).

[0086] Genom virusnog vektora je tipično konstruisan u plazmidu iz kojeg može da se transfektuje u ćelijsku liniju za pakovanje ili za proizvodnju. Plazmid, opšte uzeto, sadrži sekvence koje su korisne za replikaciju samog plazmida u bakteriji. Takvi plazmidi su dobro poznati stanju tehnike. Dodatno, vektori koji uključuju prokariotski početak replikacije mogu takođe da uključe gen čija ekspresija daje detektabilan ili selektivan marker kao što su rezistencije na neku supstancu. Tipični proizvodi bakterijske rezistencije na neku supstancu su oni koji stvaraju rezistenciju na ampicilin ili tetraciklin.

[0087] Plazmidi koji sadrže jednu ili više od ovde opisanih komponenti lako mogu da se konstruišu pomoću standardnih tehnika koje su dobro poznate stanju tehnike. Za analizu sa ciljem da se potvrde tačne sekvence u konstruisanim plazmidima, pomenuti plazmid može da se replicira u E. coli, purifikuje i analizira pomoću cepanja sa restrikcijskim endonukleazama ili njegova DNK sekvenca može da se odredi pomoću konvencionalnih postupaka.

[0088] Vektori koji su konstruisani za privremenu ekspresiju u ćelijama sisara takođe mogu da se koriste. Privremena ekspresija uključuje upotrebu ekspresijskog vektora koji je sposoban da se efikasno replicira u ćeliji domaćina, na način da ćelija domaćin akumuliše mnogo kopija ekspresijskog vektora i, zauzvrat, sintetizuje visoke nivoe polipeptida koji je kodiran sa antigen-specifičnim polinukleotidom u pomenutom ekspresijskom vektoru. Vidi Sambrook et al., supra, str. 16.17-16.22. Drugi vektori i postupci koji su prikladni za adaptaciju ekspresije polipeptida su dobro poznati stanju tehnike i mogu da se jednostavno adaptiraju na specifične uslove.

[0089] Pomoću tehnika koje su ovde obezbeđene, stručnjak u polju može da prepozna da efikasnost pojedinog ekspresijskog sistema može da se testira pomoću transfektovanja ćelija za pakovanje sa vektorom koji obuhvata gen koji kodira reporter-protein i uz merenje ekspresije koristeći prikladnu tehniku, na primer, merenje fluorescencije iz konjugata zelenog fluorescentnog proteina. Prikladni reporter-geni su dobro poznati stanju tehnike.

3. Tipovi sekvenca od interesa

[0090] Sekvenca od interesa nije ograničena na bilo koji način i uključuje bilo koju nukleinsku kiselinu koja stručnjak želi da ugradi, transkribira i eksprimira u nekoj ciljanoj ćeliji. Proizvod može da bude protein ili nukleinska kiselina. Pomenuta sekvenca od interesa može da kodira molekul proteina ili nukleinske kiseline, uključujući siRNK, mikroRNK, samo-komplementarnu dvolančanu RNK u kojoj je komplementarni region veći od oko 20 ribonukleotida u dužini, ili RNK koja je komplementarna sa mRNK, gde vezivanje pomenute komplementarne (antisens) RNK u odnosu na mRNK blokira njenu sposobnost da se translatira u protein. U nekim slučajevima, pomenuta sekvenca od interesa može da kodira neki antigen protiv kojeg je poželjan imuni odgovor. Posebno su poželjni tumorski antigeni i antigeni za infektivne bolesti kao što su HIV, HSV, HCV, HPV, malarije ili tuberkuloze.

[0091] U nekim slučajevima, pomenuta sekvenca od interesa može da bude gen koji kodira malu inhibirajuću RNK (siRNK) ili mikroRNK (miRNK) od interesa koja negativno reguliše ekspresiju nekog molekula. Na primer, pomenuti gen koji kodira siRNK ili mikroRNK može da se koristi da negativno reguliše ekspresiju negativnih regulatora u ćeliji, uključujući one koji inhibiraju aktivisanje ili sazrevanje dentritnih ćelija. siRNK i mikroRNK su dobro poznati stanju tehnike (Fire et al., Nature 391:806, 1998; vidi takođe "The RNA Interference Resource" od Applied Biosystems, Trang et al., Oncogene Suppl 2:S52, 2008; Taganov, K., et al. 2007. Immunity 26:133-137; Dahlberg, J. E. & E. Lund. 2007. Sci. STKE 387:pe25; Tiemann & Rossi, EMBO Mol Med 1: 142, 2009). Alternativno, sekvenca od interesa može da kodira samo-komplementarnu dvolančanu RNK u kojoj je komplementaran region veći od oko 20 ribonukleotida u dužini, ili antisens-RNK koja je veća od oko 20 ribonukleotida u

4

dužini. Stručnjaci će razumeti da siRNK, miRNK, dsRNK i antisens-RNK molekuli mogu da se eksprimiraju iz promotera RNK polimeraze III, ili, alternativno, mogu da budu komponenta ne-kodirajuće RNK koja se transkribira iz promotera RNK polimeraze II.

[0092] Dodatno, pomenuta sekvenca od interesa može da kodira više od jednog proizvoda. U nekim konfiguracijama, pomenuta sekvenca koje treba da se dostavi može da obuhvata više gena koji kodiraju najmanje jedan protein, najmanje jednu siRNK, najmanje jednu mikroRNK, najmanje jednu dsRNK ili najmanje jednu antisens-RNK ili bilo koju kombinaciju od pomenutih. Na primer, pomenuta sekvenca koja treba da se dostavi može da uključuje jedan ili više gena koji kodiraju jedan ili više antigena protiv koji je poželjan imuni odgovor. Pomenuti jedan li više antigena mogu da budu povezani sa jednom bolesti ili poremećajem, ili mogu da budu povezani sa više bolesti i/ili poremećaja. U nekim slučajevima, gen koji kodira imuno-regulacion protein može da bude uključen zajedno sa genom koji kodira neki antigen protiv kojeg je poželjan imuni odgovor, a pomenuta kombinacija može da izazove i reguliše pomenuti imuni odgovor u željenom smeru i sa željenom jačinom. U drugim slučajevima, sekvenca koja kodira siRNK, mikroRNK, dsRNK ili antisens-RNK molekul može da se konstruiše zajedno sa genom koji kodira neki antigen protiv kojeg je poželjan imuni odgovor, a pomenuta kombinacija može da reguliše okvir pomenutog imunih odgovora. Pomenuti proizvodi mogu da se proizvedu kao inicijalni fuzioni proizvod u kojem kodirajuća sekvenca se nalazi u funkcionalnom odnosu sa jednim promoterom. Alternativno, proizvodi mogu da budu kodirani odvojeno, a svaka kodirajuća sekvenca je u funkcionalnom odnosu sa nekim promoterom. Promoteri mogu da budu isti ili različiti.

[0093] U nekim konfiguracijama, vektori sadrže polinukleotidnu sekvencu koja kodira faktore za sazrevanje/stimulisanje dentritnih ćelija. Primeri za stimulatorne molekule uključuju GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21; IL-23, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40 ligand (CD40L), CD40 (iCD40) koji može da se indukuje sa nekom hemikalijom i slično. Ovi polinukleotidi su tipično pod kontrolom jednog ili više regulacionih elemenata koji usmeravaju ekspresiju kodirajuće sekvence u dendritske ćelijema. Sazrevanje dentritnih ćelija doprinosi uspešnoj vakcinaciji (Banchereau, J & Palucka, A. K. Nat. Rev. Immunol.

5:296-306 (2005); Schuler, G. et al. Curr. Opin. Immunol. 15:138-147 (2003); Figdor, C. G. et al. Nat. Med. 10:475-480 (2004)). Sazrevanje može da transformiše DC od ćelija koje su aktivno uključene u zarobljavanju antigena u ćelije koje su specijalizovane primarne T-ćelije. Na primer, uključivanje CD40 preko CD40L na CD4-helper T-ćelija je kritični signal za sazrevanje DC, šta dovodi do snažno aktivisanja CD8 T-ćelija. Takvi stimulatorni molekuli su takođe poznati kao faktori sazrevanja ili faktori koji stimulišu sazrevanje. Imuno-kontrolne tačke su značajne barijere aktivisanju funkcionalnog ćelijskog imuniteta kod raka, a antagonistička antitela koja su specifična za inhibitorne ligande na T-ćelijama, uključujući CTLA4 i programiranu smrt-1 (PD-1), su primeri za ciljane agente koji su klinički evaluirani. Značajni mehanizam tolerancije kod hroničnih infekcija i raka je funkcionalno iscrpljivanje Ag-specifičnih T-ćelija koji eksprimiraju PD-1 u velikim nivoima. Budući je pokazano da je potencija terapeutskog imunizovanja značajno pojačana pomoću kombinovanja sa kontrolom imunih kontrolnih tačaka, kao ne-ograničavajući primer, stručnjaci u polju će razumeti da alternativan pristup inhibiranju imuno-kontrolnih tačaka je da se inhibira ekspresija liganada za programiranu smrt (PD), jednog i drugog (PD-L1/L2). Jedan način da se postigne inhibicija je pomoću ekspresije RNK molekula kao što su onih koji su ovde opisani, koji suprimiraju ekspresiju PD-L1/L2 u DC koje su transdukovane sa lentivirusnim vektorom koji kodira jednu ili više pomenutih RNK molekula. Sazrevanje DC ili ekspresija posebnih elemenata kao što su imuno-kontrolnih tačaka, na primer PD-1 liganada, može da se karakterizuje pomoću analize sa protočnom citometrijom povećanog regulisanja površinskog markera kao što su MHC II, a pomoću profila ekspresije hemokina i citokina.

[0094] Sekvenca koja kodira detektabilni proizvod, obično protein, može da se uključi sa ciljem omogućavanja identifikacije ćelija koje eksprimiraju željeni proizvod. Na primer, protein koji je fluorescentan marker, kao što je zeleni fluorescentni protein (GFP), se ugrađuje u pomenuti konstrukt zajedno sa sekvencom od interesa (na primer, kodira neki antigen). Drugim rečima, pomenuti protein može da se detektuje pomoću antitela ili pomenuti protein može da bude enzim koji deluje na nekom supstratu sa ciljem da se dobije detektabilan proizvod, ili proizvod koji dozvoljava selekciju transfektovane ili transdukovane ciljne ćelije, na primer omogućava rezistenciju na neki lek, kao što su rezistencije na higromicin. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji omogućavaju rezistenciju na antibiotike ili druge toksine koji su prikladni za upotrebu u eukariotskoj ćeliji, npr., neomicin, metotreksat, blasticidin, među drugima koji su poznati stanju tehnike, ili komplementiraju auksotrofne nedostatke, ili stvaraju kritične nutriente koji nisu dodani u medijum. Selektivni marker opciono može da bude prisutan na odvojenom plazmidu i može da se uvede pomoću ko-transfekcije.

[0095] Jedna ili više multicistronskih ekspresijska jedinica može da se koristi, a pomenute uključuju dva ili više elemenata (npr., sekvenca od interesa, molekul omotača, faktora za sazrevanje DC) koji su neophodni za proizvodnju željenog virusa u ćelijama za pakovanje. Upotreba multicistronskih vektora smanjuje ukupan broj molekula nukleinskih kiselina koji su potrebni i tako izbegava moguće poteškoće povezane sa koordinacijom ekspresije iz multivektorskih genoma. U multicistronskom vektoru različiti elementi koji treba da se eksprimiraju su operativno spojeni na jedan ili više promotera (a potrebni su i drugi elementi koji kontrolišu ekspresiju). U nekim konfiguracijama, multicistronski vektor obuhvata sekvencu od interesa, sekvencu koja kodira reporter-proizvod i virusne elemente. Pomenuta sekvenca od interesa tipično kodira antigen i, opciono, faktor za sazrevanje DC. Opciono, multicistronski vektor obuhvata gen koji kodira antigen, gene koji kodira faktor za sazrevanje DC i virusne elemente.

[0096] Svaka komponenta koja treba da se eksprimira u multicistronskom ekspresijskom vektoru može da bude odvojena, na primer, pomoću elementa sa internim mestom za ulazak ribozoma (IRES) ili virusnog 2A elementa, sa ciljem da se omogući odvojena ekspresija različitih proteina iz istog promotera. IRES-elementi i 2A-elementi su poznati stanju tehnike (U.S. Pat. Br. 4,937,190; de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626). U jednom primeru izvođenja, oligonukleotidi koji kodiraju sekvencu za cepanje sa furinom (RAKR) (Fang et al.

2005. Nat. Biotech 23: 584-590, spojenu sa 2A-sličnom sekvencom iz virusa slinavke i šapa (FMDV), virusa konjskog rinitisa A (ERAV), i virusa Thosea asigna (TaV) (Szymczak et al.

2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594) se koriste da se odvoje genetički elementi u multicistronskom vektoru. Efikasnost pojedinog multicistronskog vektora može da se jednostavno testira pomoću detektovanja ekspresije svakog od pomenutih gena koristeći standardne protokole.

[0097] U specifičnom primeru, genom virusnog vektora obuhvata: sekvencu pojačivaća/promotera iz citomegalovirusa (CMV); R- i U5-sekvence iz HIV 5' LTR; sekvencu za pakovanje (ψ); HIV-1 flap-signal; interni pojačivač; interni promoter; gen od interesa; element koji odgovara na virus hepatitisa mrmotau; tRNK-amber supresorsku sekvencu; U3-element sa delecijom svoje sekvence za pojačivač; izolator iz kokošijeg βglobina; i R- i U5-sekvence iz 3' HIV LTR. U nekim primerima, vektorski genom uključuje intaktni lentivirusni 5' LTR i samo-inaktivirajući 3' LTR. (Iwakuma et al. Virology 15:120, 1999).

[0098] Konstrukcija vektorskog genoma može da se postigne pomoću bilo koje prikladne tehnike genetičkog inženjerstva koja je poznata stanju tehnike, uključujući, bez ograničenja, standardne tehnike cepanja sa restrikcijskim endonukleazama, ligacije, transformacije, purifikacije plazmida i DNK-sekvenciranja, na primer kao što je opisano u Sambrook et al. (1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) i "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000).

4. Proizvodnja virusnih čestica

[0099] Bilo koji od brojnih postupak koji su već poznati stanju tehnike mogu da se koriste sa ciljem da se proizvedu infektivne lentivirusne čestice čiji genom obuhvata RNK kopiju virusnog vektorskog genoma. U jednom postupku, virusni vektorski genom je uveden u ćelijsku liniju za pakovanje koja sadrži sve komponente koje su bile neophodne za pakovanje virusne genomske RNK, transkribirane iz virusnog vektorskog genoma, u virusne čestice. Alternativno, virusni vektorski genom može da obuhvata jedan ili više gena koji kodiraju virusne komponente zajedno sa jednom ili više sekvenci od interesa. Sa ciljem da se spreći replikacija genoma u ciljnoj ćeliji, međutim, endogeni virusni geni koji su potrebni za replikaciju će obično da se odstrane, ali će biti obezbeđeni odvojeno u ćelijskoj liniji za pakovanje.

[0100] Opšte uzeto, lentivirusne vektorske čestice se proizvode u ćelijskoj liniji koja je transfektovana sa jednim ili više plazmidnih vektora koji sadrže komponente koje su neophodne da se stvore pomenute čestice. Ove lentivirusne vektorske čestice su tipično nekompetentne za replikaciju, tj., sposobni su da izvrše samo jednu rundu infekcije. Najčešće se koriste multipli plazmidni vektori sa ciljem da se odvoje različite genetičke komponente koje generišu čestice lentivirusnog vektora, uglavnom sa ciljem da se smanji šansa rekombinacijskih događaja koji mogu da na drugi način stvore viruse koji su kompetentni za replikaciju. Međutim, vektor sa jednim plazmidom koji sadrži sve lentivirusne komponente takođe može da se koristi ako je poželjno. Kao jedan primer za sistem koji koristi vektore sa više plazmida: transfektuje se ćelijska linija sa najmanje jednim plazmidom koji sadrži genom virusnog vektora (tj., plazmid sa genomom vektora), uključujući LTR, cis-delujuću sekvencu za pakovanje, i sekvencu(e) od interesa, koje su često operativno vezane za heterologni promoter, najmanje jedan plazmid koji kodira virusne enzimske i strukturne komponente (tj., plazmid za pakovanje koji kodira komponente kao što su, Gag i Pol), i najmanje jedan plazmid za omotač koji kodira glikoprotein omotača Arbovirusa. Dodatni plazmidi mogu da se koriste sa ciljem da se pojača proizvodnja čestica retrovirusa, npr., Revekspresioni plazmidi, kao što je opisno ovde i poznato stanju tehnike. Virusne čestice izlaze kroz ćelijske membrane i stvaraju srž koja uključuje genom koji sadrži sekvencu od interesa i glikoprotein omotača Arbovirusa koja cilja dentritne ćelije. Kada je glikoproteina iz Arbovirusa E2-glikoproteina iz Sindbis virusa, pomenuta glikoproteina je izmenjena tako da pokazuje smanjeno vezivanje na heparanski sulfat u poređenju sa referentnim sojem HR.

[0101] Transfekcija ćelijske linije za pakovanje sa plazmidnim vektorima iz ovoga pronalaska može da se postigne pomoću dobro poznatih postupak, a postupak koji se koristi nije ograničen na bilo koji način. Stanju tehnike su poznati brojni ne virusni sistemi za dostavu, uključujući na primer, elektroporaciju, sisteme za dostavu na bazi lipida uključujući liposome, dostavu "gole" DNK, i dostavu koja koristi policiklodekstrinska jedinjenja, kao što su onih koji su opisani kod Schatzlein AG. (2001. Non virus Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses. Anticancer Drugs). Postupci sa katijonskim lipidom ili tretman sa solima se tipično koriste, vidi, na primer, Graham et al. (1973. Virol. 52:456; Wigler et al. (1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76),. Najčešće se koristi i postupak precipitacije sa kalcijum fosfatom. Međutim, drugi postupci za uvođenje vektora u ćelije takođe mogu da se koriste, uključujući nuklearnu mikroinjekciju i fuziju bakterijskih protoplasta.

[0102] Ćelijska linija za pakovanje obezbeđuje pomenute komponente, uključujući virusne regulacione i strukturni proteini, koje su potrebne da budu u trans-konfiguraciji za pakovanje virusne genomske RNK u čestice lentivirusnog vektora. Ćelijska linija za pakovanje može da bude bilo koja ćelijska linija koja je sposobna da eksprimira lentivirusne proteine i da proizvodi funkcionalne čestice lentivirusnog vektora. Neke prikladne ćelijske linije za pakovanje uključuju 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) i Cf2Th (ATCC CRL 1430) ćelije. Ćelijske linije za pakovanje mogu da stabilno eksprimiraju potrebne virusne proteine. Takve ćelijske linije za pakovanje su opisane, na primer, u U.S. Pat. Br. 6,218,181. Alternativno, ćelijska linija za pakovanje može da bude privremeno transfektovana sa molekulima nukleinske kiseline koji kodiraju jedu ili više neophodnih virusnih proteina zajedno sa genomom virusnog vektora. Nastale virusne čestice se sakupljaju i koriste za inficiranje ciljane ćelije. Gen(i) koji kodiraju glikoprotein(e) iz omotača su obično klonirani u neki vektor za ekspresiju, kao što su pcDNK3 (Invitrogen, CA SAD). Ekspresioni vektori za eukariotsku ćeliju su dobro poznati stanju tehnike i su dostupni iz brojnih komercijalnih izvora. Ćelije za pakovanje, kao što su 293T-ćelija se tada ko-transfektiraju sa genomom virusnog vektora koji kodira sekvencu od interesa (tipično, kodira neki antigen), najmanje sa jednim plazmidom koji kodira komponente za pakovanje virusa, i sa vektorom za ekspresiju ciljanog molekula. Omotač se eksprimira na membrani ćelije za pakovanje pa se ugrađuje u virusni vektor.

[0103] U jednom scenariju, jedan ili više vektora se koristi sa ciljem da se uvede polinukleotidne sekvence u ćelijsku liniju za pakovanje sa ciljem da se proizvode čestice lentivirusnog vektora koje su pseudotipizirane glikoproteinom omotača Sikndbis virusa, kao što je E2, kao što je ovde opisano. Vektori mogu da sadrže polinukleotidnu sekvencu koja kodira brojne komponente virusa uključujući omotač Sindbis virusa, sekvencu(e) od interesa (tipično, kodira neki antigen), i bilo koju drugu komponentu koja je neophodna za proizvodnju pomenutog virusa koja nije obezbeđena u ćeliji za pakovanje.

[0104] U drugim scenarijima, ćelije za pakovanje su ko-transfektovane sa genomom virusnog vektora koji kodira neki antigen i sa jednim ili više dodatnih vektora. Na primer, osim virusnog vektora koji kodira antigen, drugi vektor poželjno nosi gene koje kodiraju modifikovani (takođe nazvan varijanta) omotač iz Sindbis virusa. U nekim situacijama, genom virusnog vektora koji kodira neki antigen takođe uključuje polinukleotidnu sekvencu koja kodira izabran imuno-modulirajući faktor, uključujući ne-ograničavajuće primere za hemokin, citokin, faktor za sazrevanje DC, ili faktor koji reguliše mehanizme imunokontrolnih tačaka. U drugim situacijama, polinukleotidna sekvenca koja kodira izabrani imuno-modulirajući faktor sadrži treći vektor koji je ko-transfektovan zajedno sa virusnim

4

vektorom koji kodira neki antigen i sa jednim ili više dodatnih vektora i ćelijama za pakovanje.

[0105] Proizvodnja virusa se meri kao što je ovde opisano, a izražava se kao IU po volumenu. IU označava infektivnu jedinicu, ili alternativno transdukcijsku jedinicu (TU); IU i TU mogu da se koriste kao sinonimi za kvantitativnu meru titra za pripremu čestica virusnog vektora. Kao što je ovde opisano, proizvodi se takav virus u kojem genom može da eksprimira proizvod koji može jednostavno da se meri. Preferiran je fluorescentni protein, zeleni fluorescentni protein. Lentivirusni vektor je tipično ne-integrirajući. Virus se tada administrira u ciljane ćelije, pa se određuje broj ciljanih ćelija koje eksprimiraju GFP, na primer sa protočnom citometrijom (vodi Primer 3). Titar se tada izračunava. Titar je poželjno visok koliko je moguće, ali najmanje 1x10<5>IU/mL, najmanje 3x10<5>IU/mL, najmanje 1x10<6>IU/mL, najmanje 3x10<6>IU/mL ili najmanje 1x10<7>IU/mL ćelijskog supernatanta (pre bilo kakvog koncentrisanja). Alternativno, titar je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 100% od titra istog lentivirusnog vektora koji je pseudotipiziran u istoj ćeliji pomoću omotača VSV-G.

C. Dostava virusa

[0106] Virus može da se dostavi u ciljanu ćeliju na bilo koji način koji dozvoljava pomenutom virusa da kontaktira ciljane dentritne ćelije (DC) pri čemu je poželjna dostava polinukleotida od interesa. Opciono, prikladna količina virusa može da bude uvedena u ljude ili životinje direktno (in vivo), npr., pomoću injekcije u telo. Prikladne životinje uključuju, bez ograničenja, konje, pse, mačke, stoku, svinje, ovce, zečeve, kokoši ili druge ptice. Virusne čestice mogu da se injektiraju preko brojnih ruta, kao što su intravenozne, intradermalne, supkutane, intranodalne rute, intra-peritonealne šupljine, ili mukozalno. Virus može da se dostavi pomoću supdermalne naprave za injektiranje kao što su naprava koje su opisane u U.S. Pat. Br. 7,241,275, 7,115,108, 7,108,679, 7,083,599, 7,083,592, 7,047,070, 6,971,999, 6,808,506, 6,780,171, 6,776,776, 6,689,118, 6,670,349, 6,569,143, 6,494,865, 5,997,501, 5,848,991, 5,328,483, 5,279,552, 4,886,499,. Druge lokacije za injekciju su takođe dostupne, kao što su direktno u organe koje sadrže ciljane ćelije. Na primer injekcija u intralimfalni čvor, injekcija u slezinu, ili injekcija u kost takođe mogu da se koriste sa ciljem da se dostavi pomenuti virus u limfni čvor, slezinu i koštanu srž. U zavisnosti o posebnim prilikama i prirodi ciljanih ćelija, uvođenje može da se provodi preko drugih sredstava, na primer, inhalacije, ili preko direktnog kontakt sa epitelijalnim tkivom, na primer onog u očima, ustima ili koži.

[0107] Alternativno, ciljane ćelije mogu da se obezbede i kontaktiraju sa virusom u uslovima in vitro, kao što su na primer u pločama za kulturu. Ciljane ćelije su tipično populacije ćelija koje obuhvataju dentritne ćelije dobijene iz zdravog subjekta ili subjekta koji ima potrebu od tretmana ili kod kojeg je poželjno da se stimuliše imuni odgovor na neki antigen. Postupci za dobivanje ćelija iz nekog subjekta su dobro poznati stanju tehnike i uključuju flebotomije, hirurške zahvate i biopsije. Ljudski DC mogu takođe da se dobiju pomoću dobivanja CD34α+ humanih hematopoetskih progenitora i uz korišćenje in vitro kulture kao što je opisano na drugim mestima (npr., Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001)).

[0108] Virus može da se suspenduje u medijumu i doda u rupice pločice za kulturu, tubu ili neki drugi kontejner. Medijum koji sadrži virus može da se doda pre uzgoja ćelija ili posle što su ćelije bile uzgojene. Ćelije se tipično inkubiraju u nekoj prikladnoj količini medijuma sa ciljem da se obezbedi vijabilnost i da se omoguće prikladne koncentracije virusa u medijumu kao što su takvih koji omogućavaju da se dogodi transdukcija ćelija domaćina. Ćelije se poželjno inkubiraju sa virusom sa ciljem da se ostavi dovoljno vremena da virus može da inficira ćelije. Poželjno, ćelije se inkubiraju sa virusom tokom najmanje 1 h, najmanje 5 h ili najmanje 10 h.

[0109] Tokom dostava in vivo i in vitro, može da se koristi alikvot virusnih čestica koji sadrži dovoljan broj čestica da može da se inficiraju željene ciljane ćelije. Kada ciljane ćelije treba da se kultiviraju, koncentracija virusnih čestica je, opšte uzeto, najmanje 1 IU/µL, bolje najmanje 10 IU/µl, još bolje najmanje 300 IU/µL, čak još bolje najmanje 1x10<4>IU/µL, još bolje najmanje 1x10<5>IU/µL, još bolje najmanje 1x10<6>IU/µL, ili još bolje najmanje 1x10<7>IU/µL

[0110] Posle infekcije sa virusom in vitro, ciljane ćelije mogu da se uvedu (ili vrate) u telo čoveka ili druge životinje. Ćelije mogu da se uvedu u kožu, ispod kože, ili u periferni krvotok. Ćelije koje su uvedene u neku životinju su poželjno ćelije koje su dobijene iz te životinje, sa ciljem da se izbegne nepovoljan imuni odgovor. Ćelije koje su dobijene iz nekog donora koji ima sličnu imuno-podlogu mogu takođe da se koriste. Druge ćelije koje mogu takođe da se koriste uključuju one koje su predviđene da izbegnu nepovoljan imunološki odgovor.

[0111] Ciljane ćelije mogu da se analiziraju za integraciju, transkripciju i/ili ekspresiju sekvenca ili gen(a) od interesa, za broj kopija integriranog gena, i lokaciju same integracije, na primer. Takve analize mogu da se provode bilo kada i mogu da se provode sa bilo kojim postupkom koji je poznat stanju tehnike.

[0112] Subjekti kojima je administriran virus ili kojima su administrirani dendritske ćelije inficirani sa virusom mogu da budu analizirani sa ciljem da se proveri lokacija inficiranih ćelija, ekspresija polinukleotida koji se dostavlja sa virusom ili gena od interesa, stimulacija imunih odgovora, i sa ciljem da se prate simptomi koji su povezani sa nekom bolesti ili poremećaja pomoću bilo kojeg postupka koji je poznat stanju tehnike.

[0113] Postupci za inficiranje ćelija koji su ovde razotkriveni ne zavise o individualnim specifičnim karakteristikama ćelije. Kao rezultat, mogu da se koriste kod više životinjskih vrsta. U nekim slučajevima, virusne čestice se dostavljaju čoveku ili ljudskim dendritske ćelijema, a u drugim slučajevima pomenute se dostavljaju životinji kao što su miša, konja, psa, mačke ili miša ili ptice. Kao što je ovde opisano, genom iz virusnog vektora je pseudotipiziran sa ciljem da se omogući pristup širem krugu domaćina tako da se ostvari specifičnost za ciljane ćelije. Stručnjak u polju će takođe da bude svestan postojanja određenih internih promotera i drugih elemenata sa ciljem ostvarivanja željene ekspresije sekvence od interesa u nekoj određenoj životinjskoj vrsti. Tako, stručnjak će biti sposoban da modifikuje pomenuti postupak inficiranja dentritnih ćelija iz bilo koje vrste.

D. Terapeutske i profilaktičke imunizacije

[0114] Dendritske ćelije mogu da budu inficirani sa česticama lentivirusnog vektora kao što je ovde opisano sa ciljem prevencije ili tretmana bolesti ili poremećaja, posebno onih kod kojih je aktivisanje imunih odgovora u pacijenta korisno. Mnoge takve bolesti su dobro poznate. Na primer, bolesti ili poremećaji koji su prikladni za tretman ili prevenciju pomoću postupaka iz ovoga pronalaska uključuju, bez ograničenja, razne tipove raka, autoimune bolesti i infekcije, uključujući virusne, bakterijske, gljivične i parazitske infekcije. U jednom postupku, određena bolest se tretira pomoću virusnih čestica koje su ovde opisane sa ciljem

4

da se dostavi sekvenca od interesa u dendrit, gde ekspresija pomenute sekvence od interesa stvara antigen koji je specifičan za pomenutu bolest i dovodi do stimulacije antigenspecifičnih ćelijskih imunih odgovora i humoralnih imunih odgovora. Opšte uzeto, pomenuta sekvenca od interesa kodira neki antigen protiv kojeg je poželjan imuni odgovor, ali koji se normalno ne eksprimira u dendritnim ćelijama. Pomenuti antigen se eksprimira i izlaže na dendritnim ćelijama. Genom virusnog vektora može dodatno da kodira i neki faktor za sazrevanje DC.

[0115] U tipičnoj upotrebi, virusne čestice dendritnim ćelijama dostavljaju sekvence koje kodiraju neki antigen protiv kojeg je poželjan imuni odgovor. Dostava može da se ostvari pomoću kontaktiranja dentritnih ćelija sa pomenutim virusom in vitro, a posle toga se inficirane ćelije uvode u pacijenta. U drugim slučajevima, dostava može da se ostvari pomoću uvođenja virusa u subjekt sa ciljem inficiranja dentritnih ćelija in vivo. Pomenuti dendritske ćelije tada stimulišu antigen-specifične T-ćelije ili B-ćelije u pacijenta sa ciljem indukovanja ćelijskih ili humoralnih imunih odgovora na eksprimirani antigen. Na taj način, pacijent koji boluje od neke bolesti ili poremećaja se tretira pomoću generisanja imuno-ćelija sa željenom specifičnosti.

[0116] Bilo koji antigen koji je povezan sa nekom bolešću ili poremećajem može da se dostavi u dentritne ćelije pomoću korišćenja virusnih čestica kao što je ovde opisano. Antigen koji je povezan sa pomenutom bolešću ili poremećajem se identifikuje sa ciljem proizvodnje virusne čestice koja cilja dentritne ćelije. Antigeni koji su povezani sa brojnim bolestima i poremećajima su dobro poznati stanju tehnike. Antigen može da bude poznat od pre da se povezuje sa određenom bolešću ili poremećajem, ili može da se identifikuje pomoću bilo kojeg postupka koji je poznat stanju tehnike. Na primer, antigen za neki tip raka od kojeg pati neki pacijent može da bude poznat od pre, kao što su antigena povezanog sa tumorom ili može da se identifikuje na osnovu samog tumora pomoću brojnih postupa poznatih stanju tehnike.

[0117] Antigeni koji su povezani sa tumorima su poznati za brojne tipove raka uključujući, na primer, karcinom bubrežnih ćelija, rak prostate, melanom i rak dojke. Kod nekih tipova raka dojke, na primer, Her-2 receptor je prekomerno eksprimiran na površini kancerogene ćelije. Primeri tumorskih antigena uključuju, ali bez ograničenja, MAGE, BAGE, RAGE i NY-ESO-1, koji nisu mutirani antigeni koji se eksprimiraju u imuno-privilegovanim delovima testisa kod brojnih tumorskih ćelija; tumorske antigene koji su specifični za određenu liniju kao što su antigena MART-1/Melan-A iz linija melanocitnog melanoma, gp100, gp75, mda-7, tirozinazu i protein koji je povezan sa tirozinazom, karcinom bubrežnih ćelija - 5T4, SM22-alfa, karbonske anhidraze I i IX (takođe poznata kao G250), faktore koji se mogu indukovati tokom hipoksije (npr., HIF-1alfa i HIF-2alfa), VEGF ili membranski antigen koji je specifičan za prostatu (PSMA), antigen koji je specifičan za prostatu (PSA), kisele fosfate iz prostate, i šest-transmembranskih epoihelijalnih antigena iz prostate (STEAP), NKX3.1, koji su antigeni koji se eksprimiraju u normalnim i neoplastičnim ćelijama koje su dobijene iz istog tkiva; epitopni proteini/peptidi koji su dobijeni iz gena koji su mutirani u tumorskim ćelijama ili gena transkribovanih na različitim nivoima u tumoru u poređenju sa normalnim ćelijama, kao što su enzima telomeraza, survivina, mezotelina, mutiranog ras-a, bcr/abl rearanžmana, Her2/neu, mutiranog ili divljeg-tipa p53, citohroma P450 1B1, i nenormalno eksprimiranih intronskih sekvenca kao što su N-acetilglukozaminiltransferaza-V; klonskih rearanžmana imunoglobulinskih gena koji generišu jedinstvene idiotipove u mijelomu i limfomima B-ćelija; epitopni proteini/peptidi koji su dobijeni tokom onkovirusnih procesa, kao što su proteini E6 i E7 iz humanog papiloma virusa; nemutirani onkofetalni proteini sa tumor-selektivnom ekspresijom, kao što su karcinoembrionskog antigena i alfa-fetoprotein. Brojni antigeni koji su povezani sa tumorom su poznati (vidi, na primer, "Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes," Boon T, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review Of Immunology 12: 337-365, 1994; "A listing of human tumor antigens recognized by T cells," Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 MAR 2001.)

[0118] Pomenuti antigen takođe može da bude neki antigen koji je povezan sa nekom infektivnom bolesti, kao što su, na primer, HIV/AIDS. Antigen može da bude, na primer, gp120 (Klimstra, W. B., et al. 2003. J Virol 77:12022-12032; Bernard, K. A., et al. 2000. Virology 276:93-103; Byrnes, A. P., et al. 1998. J Virol 72: 7349-7356,). Drugi primeri za antigene uključuju, ali bez ograničenja: gag, pol, env, tat, nef i rev (Lieberman, J. et al.1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13(5): 383-392; Menendez-Arias, L. et al.1998. Virus Immunol 11(4): 167-181,).

4

[0119] Primeri virusnih antigena uključuju, ali bez ograničenja, adenovirusne polipeptide, alfavirusne polipeptide, kalicivirusne polipeptide, npr., antigen iz kapsida kalicivirusa, koronavirusne polipeptide, polipeptide iz distemper virusa, polipeptide iz Ebola virusa, enterovirusne polipeptide, flavivirusne polipeptide, polipeptide iz virusa hepatitisa (AE), npr., antigen iz srži ili površine hepatitisa B, ili glikoproteini E1 ili E2 iz virusa hepatitisa C, proteini srži, ili ne-strukturni proteini, herpesvirusne polipeptide, npr., glikoprotein iz virusa herpesa (herpes-simplex) ili virusa zostera (varicella-zoster), polipeptide iz virusa imunodeficijencije, npr., omotač ili proteaza virusa humane imunodeficijencije, polipeptide iz virusa infektivnog peritonitisa, polipeptide iz virusa influence, npr., A hemaglutinin iz influence, neuraminidazu, ili nukleoprotein, polipeptide iz virusa leukemije, polipeptide iz Marburg virusa, ortomiksovirusne polipeptide, polipeptide iz papiloma virusa, polipeptide iz virusa parainfluence, npr., hemaglutinin/neuraminidaza, paramiksovirusne polipeptide, parvovirusne polipeptide, pestivirusne polipeptide, polipeptide iz pikorna virusa, npr., polipeptid iz kapsida poliovirusa, polipeptide iz pox virusa, npr., polipeptid iz vaccinia virusa, polipeptide iz virusa besnila, npr., glikoproteina G iz virusa besnila, reovirusne polipeptide, retrovirusne polipeptide i rotavirusne polipeptide.

[0120] Primeri bakterijskih antigena uključuju, ali bez ograničenja, polipeptide iz roda Actinomyces, polipeptide iz roda Bacillus, polipeptide iz roda Bacteroides, polipeptide iz roda Bordetella, polipeptide iz roda Bartonella, polipeptide iz roda Borrelia, npr., OspA iz B. burgdorferi, polipeptide iz roda Brucella, polipeptide iz roda Campilobacter, polipeptide iz roda Capnocytophaga, polipeptide iz roda Chlamydia, polipeptide iz roda Clostridium, polipeptide iz roda Corynebacterium, polipeptide iz roda Coxiella, polipeptide iz roda Dermatophilus, polipeptide iz roda Enterococcus, polipeptide iz roda Ehrlichia, polipeptide iz roda Escherichia, polipeptide iz roda Francisella, polipeptide iz roda Fusobacterium, polipeptide iz roda Haemobartonella, polipeptide iz roda Haemophilus, npr., protein tipa b iz spoljne membrane H. influenzae, polipeptide iz roda Helicobacter, polipeptide iz roda Klebsiella, L-forma bakterijskih polipeptida, polipeptide iz roda Leptospira, polipeptide iz roda Listeria, polipeptide iz roda Mycobacteria, polipeptide iz roda Mycoplasma, polipeptide iz roda Neisseria, polipeptide iz roda Neorickettsia, polipeptide iz roda Nocardia, polipeptide iz roda Pasteurella, polipeptide iz roda Peptococcus, polipeptide iz roda Peptostreptococcus, polipeptide iz roda Pneumococcus, polipeptide iz roda Proteus, polipeptide iz roda Pseudomonas, polipeptide iz roda Rickettsia, polipeptide iz roda Rochalimaea, polipeptide iz

4

roda Salmonella, polipeptide iz roda Shigella, polipeptide iz roda Staphilococcus, polipeptide iz roda Streptococcus, npr., M protein iz S. pyogenes, polipeptide iz roda Treponema, i polipeptide iz roda Yersinia, npr., F1 i V antigeni iz Y. pestis.

[0121] Primeri gljivičnih antigena uključuju, ali bez ograničenja, polipeptide iz roda Absidia, polipeptide iz roda Acremonium, polipeptide iz roda Alternaria, polipeptide iz roda Aspergillus, polipeptide iz roda Basidiobolus, polipeptide iz roda Bipolaris, polipeptide iz roda Blastomyces, polipeptide iz roda Candida, polipeptide iz roda Coccidioides, polipeptide iz roda Conidiobolus, polipeptide iz roda Cryptococcus, polipeptide iz roda Curvalaria, polipeptide iz roda Epidermophyton, polipeptide iz roda Exophiala, polipeptide iz roda Geotrichum, polipeptide iz roda Histoplasma, polipeptide iz roda Madurella, polipeptide iz roda Malassezia, polipeptide iz roda Microsporum, polipeptide iz roda Moniliella, polipeptide iz roda Mortierella, polipeptide iz roda Mucor, polipeptide iz roda Paecilomyces, polipeptide iz roda Penicillium, polipeptide iz roda Phialemonium, polipeptide iz roda Phialophora, polipeptide iz roda Prototheca, polipeptide iz roda Pseudallescheria, polipeptide iz roda Pseudomicrodochium, polipeptide iz roda Pythium, polipeptide iz roda Rhinosporidium, polipeptide iz roda Rhizopus, polipeptide iz roda Scolecobasidium, polipeptide iz roda Sporothrix, polipeptide iz roda Stemphilium, polipeptide iz roda Trichophyton, polipeptide iz roda Trichosporon, i polipeptide iz roda Xilohypha.

[0122] Primeri antigena iz parazitskih praživotinja uključuju, ali bez ograničenja, polipeptide iz roda Babesia, polipeptide iz roda Balantidium, polipeptide iz roda Besnoitia, polipeptide iz roda Cryptosporidium, polipeptide iz roda Eimeria, polipeptide iz roda Encephalitozoon, polipeptide iz roda Entamoeba, polipeptide iz roda Giardia, polipeptide iz roda Hammondia, polipeptide iz roda Hepatozoon, polipeptide iz roda Isospora, polipeptide iz roda Leishmania, polipeptide iz roda Microsporidia, polipeptide iz roda Neospora, polipeptide iz roda Nosema, polipeptide iz roda Pentatrichomonas, Plasmodium, npr. cirkumsporozoitni protein (PfCSP) iz P. falciparum, sporozoitni površinsk protein 2 (PfSSP2), karboksilni terminus iz jetrinog antigena 1 (PfLSA1 c-term), i izvezen protein 1 (PfExp-1), polipeptide iz roda Pneumocystis, polipeptide iz roda Sarcocystis, polipeptide iz roda Schistosoma, polipeptide iz roda Theileria, polipeptide iz roda Toxoplasma, i polipeptide iz roda Trypanosoma.

4

[0123] Primeri antigena iz parazitskih nematoda uključuju, ali bez ograničenja, polipeptide iz roda Acanthocheilonema, polipeptide iz roda Aelurostrongilus, polipeptide iz roda Ancilostoma, polipeptide iz roda Angiostrongilus, polipeptide iz roda Ascaris, polipeptide iz roda Brugia, polipeptide iz roda Bunostomum, polipeptide iz roda Capillaria, polipeptide iz roda Chabertia, polipeptide iz roda Cooperia, polipeptide iz roda Crenosoma, polipeptide iz roda Dictyocaulus, polipeptide iz roda Dioctophyme, polipeptide iz roda Dipetalonema, polipeptide iz roda Diphillobothrium, polipeptide iz roda Diplydium, polipeptide iz roda Dirofilaria, polipeptide iz roda Dracunculus, polipeptide iz roda Enterobius, polipeptide iz roda Filaroides, polipeptide iz roda Haemonchus, polipeptide iz roda Lagochilascaris, polipeptide iz roda Loa, polipeptide iz roda Mansonella, polipeptide iz roda Muellerius, polipeptide iz roda Nanophyetus, polipeptide iz roda Necator, polipeptide iz roda Nematodirus, polipeptide iz roda Oesophagostomum, polipeptide iz roda Onchocerca, polipeptide iz roda Opisthorchis, polipeptide iz roda Ostertagia, polipeptide iz roda Parafilaria, polipeptide iz roda Paragonimus, polipeptide iz roda Parascaris, polipeptide iz roda Physaloptera, polipeptide iz roda Protostrongilus, polipeptide iz roda Setaria, polipeptide iz roda Spirocerca, polipeptide iz roda Spirometra, polipeptide iz roda Stephanofilaria, polipeptide iz roda Strongiloides, polipeptide iz roda Strongilus, polipeptide iz roda Thelazia, polipeptide iz roda Toxascaris, polipeptide iz roda Toxocara, polipeptide iz roda Trichinella, polipeptide iz roda Trichostrongilus, polipeptide iz roda Trichuris, polipeptide iz roda Uncinaria, i polipeptide iz roda Wuchereria.

[0124] Primeri ektoparazitnih antigena uključuju, ali bez ograničenja, polipeptide (uključujući zaštitne antigene kao i alergene) iz buva; krpelja, uključujući krpelje iz familije Ixodidae (tvrdi) i iz familije Argasidae (meki); dvokrilaca (muva), kao što su malih muva iz podreda Nematocera, komaraca, peščanih muva, crnih muva iz familije Simuliidae, muva iz familije Tabanidae (obadi), štalska muva, muva iz roda Chrysops, cece muva, muva pecara, muva koje uzrokuju mijazu i malih muva iz podreda Nematocera koje grizu; mrave; pauke, vaške; grinje; i riličare (Hemiptera), kao što su stenica iz familije Cimicidae i stenica iz podfamilije Triatomina.

[0125] Jednom kada se neki antigen identifikuje i izoluje, nastoji se identifikovati sekvenca koja kodira pomenuti antigen. Poželjno, pomenuta sekvenca obuhvata cDNK. Posle virusne infekcije, pomenuta sekvenca od interesa (npr., ona koja kodira antigen) se eksprimira u

4

ciljanom dendritnim ćelijama. Ako se kontakt obavlja ex vivo, ciljani dendritske ćelije se tada prenose nazad u pacijenta, na primer preko injekcije, gde pomenuti reaguju sa imunoćelijama koje su sposobne da generišu imuni odgovor protiv željenog antigena. U preferiranim primerima izvođenja, rekombinantni virus se injektira u pacijenta gde transdukcijom uđe u ciljane dentritne ćelije in situ. Dendritske ćelije tada eksprimiraju tačno određeni antigen koji je povezan sa nekom bolesti ili poremećajem koji treba da se tretira, a pacijent je sposoban da stvori efektivan imuni odgovor protiv pomenute bolesti ili poremećaja.

[0126] Genom virusnog vektora može da sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira više od jednog antigena, a posle transdukcije ciljanih dentritnih ćelija, generiše imuni odgovore na više antigena koji su dostavljeni u ćeliju. U nekim primerima izvođenja, pomenuti antigeni su povezani sa pojedinačnom bolesti ili poremećajem. U drugim primerima izvođenja, pomenuti antigeni su povezani sa više bolesti ili poremećaja.

[0127] U nekim od pomenutih virusa, faktori sazrevanja DC koji aktivišu i/ili stimulišu sazrevanje DC se dostavljaju zajedno sa sekvencom od interesa. U alternativama, DC se aktivišu pomoću dostave faktora sazrevanja DC pre, simultano, ili posle dostave samog virusa. Faktori sazrevanja DC mogu da se obezbede odvojeno od davanja samog virusa.

[0128] Kao što je ovde opisano, jedan ili više faktora za imuno-modulaciju ili sazrevanje DC mogu da budu kodirani sa jednim ili više sekvenca koje se nalaze u pomenutom virusnom genomu i se eksprimiraju posle šta virus inficira dentritne ćelije. Pomenute sekvence koje kodiraju faktore za imuno-modulaciju mogu takođe da se obezbede u odvojenom vektoru koji se ko-transfektira sa virusnim vektorom koji kodira jedan ili više antigena u ćelijskoj liniji koja služi za pakovanje.

[0129] Postupci koji su ovde opisani mogu da se koriste za adaptivnu imuno-terapiju nekog pacijenta. Kao što je prethodno opisano, najpre se identifikuje neki antigen protiv kojeg je poželjan imuni odgovor. Dobiva se polinukleotid koji kodira željeni antigen koji se pakuje u rekombinantni virus. Ciljani dendritske ćelije se dobijaju iz pacijenta pa se transduciraju sa rekombinantnim virusom koji sadrži polinukleotid koji kodira željeni antigen. Dendritske ćelije se tada vraćaju nazad u pacijenta.

4

[0130] Pomenute virusne čestice mogu da budu injektirane in vivo, posle čega inficiraju DC i dostavljaju sekvencu od interesa, koja tipično kodira neki antigen. Količina virusnih čestica je najmanje 3x10<6>IU, a može da bude najmanje 1x10<7>IU, najmanje 3x10<7>IU, najmanje 1x10<8>IU, najmanje 3x10<8>IU, najmanje 1x10<9>IU, ili najmanje 3x10<9>IU. Tokom izabranih intervala, DC iz limfoidnih organa recipijenta mogu da se koriste sa ciljem da se izmeri ekspresija, na primer, pomoću merenja ekspresije markera, kao što su GFP ili luciferaze. Tehnike za posmatranje nukleinskih kiselina i merenje aktivnosti reverzne transkriptaze (RT) takođe mogu da se koriste sa ciljem da se analizira biodistribucija virusnih čestica. T-ćelije iz mononuklearnih ćelija iz periferne krvi, limfnih čvorova, slezine, ili malignih tkiva ili tkiva koja su inficirana sa ciljanim patogenom iz recipijenata koji su tretirani sa česticama lentivirusnog vektora mogu da se izmere na osnovu veličine i trajanja odgovora na stimulaciju sa antigenom. Tkivne ćelije koje nisu DC, kao što su epitelijalnih ćelija i limfoidnih ćelija, mogu da se analiziraju na specifičnost dostave gena in vivo.

[0131] Često se argumentuje da je najefektivniji potencijalni postupak da se zaustavi epidemija SIDA (i drugih virusnih bolesti) efektivna preventivna vakcina. Do sada, niti jedan postupak vakcinacije protiv HIV nije uspešno prošao fazu III iz postupka provere. Tako, postoji hitna potreba za novim, efektivnim strategijama vakcinacije. Jedna strategija je vakcinacija DC. U ovoj implementaciji, sekvenca koja kodira virusni protein, kao što su onih koje su ovde opisane, se klonira u virusni vektor. Pacijenti se inficiraju sa virusima koji su konstruisani kao što je ovde opisano. U nekom životinjskom modelu, mogu da se koriste molekularno klonirani HIV-reporter virusi (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS) i klinički izolati sa ciljem da se provere životinje tokom injekcije u repnu venu. Dokaz infekcije može da se posmatra tokom vremena u ćelijama slezine, limfnim čvorovima, i u perifernoj krvi. Amplifikacija HIV-gag proteina pomoću PCR-a i protočna citometrija za HAS u reporter virusima može da se koristi sa ciljem da se testira virusna integracija i replikacija. Proizvodivna in situ DC vakcinacija može da poveća rezistenciju na HIV napad.

[0132] Vakcine često sadrže i neki dodatak. Čestice lentivirusnog vektora koje su ovde opisane mogu takođe da se daju zajedno sa nekim dodatkom. Ovaj dodatak može da se administrira zajedno sa česticama rekombinantnog virusa, pre čestica rekombinantnog virusa, ili posle čestica rekombinantnog virusa. Ako se administrira sa virusnim česticama, poželjni dodaci ne narušavaju značajno integritet samih virusnih čestica, kao što su razaranja virusne membrane koja sadrži glikoproteine omotača.

[0133] Brojni dodaci mogu da se koriste zajedno sa pomenutim virusom sa ciljem da se postigne imuni odgovor na neki antigen koji je kodiran preko genoma virusnog vektora. Preferirani dodaci pojačavaju pravi odgovor na neki antigen bez da uzrokuju konformacijske promene u samom antigenu koje kvalitativno utiču na sam odgovor. Preferirani dodaci uključuju stipsu (alaun), 3 De-O-acilovani monofosforil lipid A (MPL) (vidi dokument GB 2220211). QS21 je triterpenski glikozid ili saponin izolovan iz kore drveta Quillaja saponaria molina koje raste u Južnoj Americi (vidi Kensil et al., u Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (ur. Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995); U.S. Pat. Br. 5,057,540). Drugi dodaci su emulzije ulja u vodi (kao što su skvalena ili ulja od kikirikija), opciono zajedno sa imuno-stimulansima, kao što su monofosforil lipida A (vidi Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Drugi dodatak je CpG (Bioworld Today, 15 novembar, 1998). Alternativno, Aβ može da se spoji sa nekim dodatkom. Na primer, lipopeptidna verzija Aβ može da se pripremi pomoću spajanja palmitinske kiseline ili drugih lipida direktno na N-terminus Aβ kao što je opisno za vakcinaciju sa antigenom za hepatitis B (Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997)). Međutim, takvo spajanje ne sme značajno da promeni konformaciju Aβ tako da pomenuta deluje na prirodu imunih odgovora. Dodaci mogu da se daju kao komponenta terapeutske kombinacije sa nekim aktivnim agensom ili mogu da se daju odvojeno, pre, konkurentno sa, ili posle davanja terapeutskog agensa.

[0134] Jedna klasa dodataka su aluminijumske soli (alaun), kao što su aluminijum hidroksida, aluminijum fosfata, aluminijum sulfata. Takvi dodaci mogu da se koriste sa ili bez drugih specifičnih imunostimulatornih agenasa kao što su MPL ili 3-DMP, QS21, polimernih ili monomernih aminokiselina kao što su poliglutamske kiseline ili polilizina. Druga klasa dodataka su formulacije sa emulzijama ulje-u-vodi. Takvi dodaci mogu da se koriste sa ili bez drugih specifičnih imunostimulatornih agenasa kao što su muramil peptida (npr., N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroksifosforiloksi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglukozaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoksi propilamida (DTP-DPP) theramid.TM.), ili drugih komponenti bakterijskog ćelijskog zida. Emulzije ulje-u-vodi uključuju (a) MF59

1

(WO 90/14837), koji sadrži 5% Skvalen, 0.5% Tween 80, i 0.5% Span 85 (opciono sadrži različite količine MTP-PE) koji je formulisan u supmikronske čestice pomoću mikrofluidizera kao što su Model 110Y microfluidizer (Microfluidics, Newton Mass.), (b) SAF, koji sadrži 10% Skvalana, 0.4% Tween 80, 5% pluronski-blokiranog polimera L121, i thr-MDP, koji je mikrofluidizovan u supmikronsku emulziju ili je vorteksovan sa ciljem da se dobije emulzija sa većim česticama, i (c) Ribi adjuvant system (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.) koji sadrži 2% skvalena, 0.2% Tween 80, i jednu ili više komponenti iz bakterijskog ćelijskog zida iz grupe koja se sastoji od monofosforilipida A (MPL), trehaloza dimikolata (TDM), i skeleta ćelijskog zida (CWS), poželjno MPL+CWS (Detox™). Druga klasa dodataka su saponinski dodaci, kao što su Stimulon.TM. (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) ili čestica koje su generisane iz, na primer, ISCOM (imunostimulirajući kompleksi) i ISCOMATRIX. Drugi dodaci uključuju Complete Freund's Adjuvant (CFA) i Incomplete Freund's Adjuvant (IFA). Drugi dodaci uključuju citokine, kao što su interleukina (IL-1, IL-2 i IL-12), faktora koji stimuliše kolonije makrofaga (M-CSF), faktora nekroze tumora (TNF).

[0135] Drugi dodatak koji može da se koristi sa pomenutom kombinacijama je identifikovan pomoću hemijske formule (I):

gde ostaci A1 i A2 su nezavisno izabrani iz grupe koja obuhvata vodonik, fosfat, i fosfatne soli. Natrijum i kalijum su primeri kontra-jona za fosfatne soli. Ostaci R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>i R<6>su nezavisno izabrani iz grupe ugljovodonika koji imaju 3 do 23 atoma ugljenika, i koji su predstavljeni sa C3-C23. Radi dodatne jasnoće će biti objašnjeno da kada je neki ostatak "nezavisno izabran iz" neke grupe koja ima više članova, treba da se razume da ostatak koji je izabran kao prvi ne utiče na bilo koji način ili ograničava izbor drugog ostataka kao drugi član. Atomi ugljenika na koje su spojeni R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su asimetrični, pa tako mogu da

2

postoje u R ili S stereohemiji. U jednom primeru izvođenja svi pomenuti atomi ugljenika su u R stereohemiju, dok u drugom primeru izvođenja svi pomenuti atomi ugljenika su u S stereohemiji.

[0136] "Ugljovodonik" se odnosi na hemijski ostatak koji je potpuno formiran od atoma vodonika i ugljenika, pri čemu aranžman atoma ugljenika može da bude ravan ili razgranat lanac, neciklički ili ciklički, a veze između susednih atoma ugljenika mogu da budu potpuno pojedinačne veze, tj., mogu da obezbeđuju zasićeni ugljovodonik, ili mogu da postoje dvostruke ili trostruke veze između dva susedna atoma ugljenika, tj., mogu da obezbeđuju nezasićeni ugljovodonik, a broj atoma ugljenika u ugljovodoničkoj grupi se kreće među 3 i 24 atoma ugljenika. Pomenuti ugljovodonik može da bude alkil, pri čemu reprezentativni alkili sa ravnim lancem uključuju metil, etil, n-propil, n-butil, n-pentil, n-heksil, i slično, uključujući undecil, dodecil, tridecil, tetradecil, pentadecil, heksadecil, heptadecil, oktadecil, itd.; dok razgranati alkili uključuju izopropil, sek-butil, izobutil, tert-butil, izopentil, i slično. Reprezentativni zasićeni ciklički ugljovodonici uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, i slično; dok nezasićeni ciklički ugljovodonici uključuju ciklopentenil i cikloheksenil, i slično. Nezasićeni ugljovodonici sadrže najmanje jednu dvostruku ili trostruku vežu između susednih atoma ugljenika (označene kao "alkenil" ili "alkinil", ako pomenuti ugljovodonik nije ciklički, a cikloalkenil i cikloalkinil, ako pomenuti ugljovodonik je barem delomično cikličan). Reprezentativni alkenili sa ravnim lancem i razgranatim lancem uključuju etilenil, propilenil, 1-butenil, 2-butenil, izobutilenil, 1-pentenil, 2-pentenil, 3-metil-1-butenil, 2-metil-2-butenil, 2,3-dimetil-2-butenil, i slično; dok reprezentativni alkinili sa ravnim lancem i razgranatim lancem uključuju acetilenil, propinil, 1-butinil, 2-butinil, 1-pentinil, 2-pentinil, 3-metil-1-butinil, i slično.

[0137] Dodatak sa formulom (I) može da se dobije pomoću sintetičkih postupaka koji su poznati stanju tehnike, na primer, sintetička metodologija koja je opisana u PCT Međunarodnoj Publikaciji Br. WO 2009/035528 kao i u publikacijama koje su identifikovane u dokumentu WO 2009/035528. Određeni dodaci mogu takođe da se nabave komercijalno. Preferirani dodatak je Proizvod Br. 699800 kao što je identifikovan u katalogu Avanti Polar Lipids, Alabaster AL, vidi E1 zajedno sa E10, ispod.

[0138] U brojnim primerima izvođenja ovoga pronalaska, pomenuti dodatak ima hemijsku strukturu sa formulom (I) ali ostaci A1, A2, R1, R2, R3, R4, R5 i R6 su izabrani iz pod-grupe opcija koje su obezbeđene za ove ostatke, gde pomenute pod-grupe su identifikovane ispod pomoću E1, E2, itd.

E1: A1je fosfat ili fosfatna so, a A2je vodonik.

E2: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C3-C21alkil; a R<2>i R<4>su C5-C23hidrokarbil.

E3: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C5-C17alkil; a R<2>i R<4>su C7-C19hidrokarbil.

E4: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C7-C15alkil; a R<2>i R<4>su C9-C17hidrokarbil.

E5: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C9-C13alkil; a R<2>i R<4>su C11-C15hidrokarbil.

E6: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C9-C15alkil; a R<2>i R<4>su C11-C17hidrokarbil.

E7: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C7-C13alkil; a R<2>i R<4>su C9-C15hidrokarbil.

E8: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; a R<2>i R<4>su C12-C20hidrokarbil.

E9: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C13hidrokarbil.

E10: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su undecil, a R<2>i R<4>su tridecil.

[0139] U nekim opcijama, svaka opcija od E2 pa do E10 je kombinovana sa izvedbom E1, i/ili ugljovodoničke grupe iz E2 pa do E9 su alkilne grupe, poželjno ravno-lančane alkilne grupe.

[0140] Dodatak sa formulom (I) može da se formuliše u neku farmaceutsku kombinaciju, opciono sa nekim ko-dodatkom, a svaki je diskutovan ispod. U tom pogledu je navedena referenca na US Patentnu Publikaciju Br. 2008/0131466 koja obezbeđuje formulacije, npr., vodenu formulaciju (AF) i prikladne emulzijske formulacije (SE) za dodatak GLA, pri čemu ove formulacije mogu da se koriste za bilo koji dodatak sa formulom (I).

[0141] Dodatak može da se administrira sa virusom iz ovog pronalaska kao pojedinačna kombinacija, ili može da se administrira pre, konkurentno sa ili posle davanja rekombinantnog virusa iz ovoga pronalaska. Imunogen i dodatak mogu da se pakuju i obezbede u istom kontejneru ili mogu da se pakuju u različitim kontejnerima, ali tada se neposredno pre upotrebe pomešaju. Imunogen i dodatak su tipično pakovani sa nalepnicom koja pokazuje predviđenu terapeutsku primenu. Ako su imunogen i dodatak spakovani odvojeno, pakovanje tipično uključuje instrukcije za mešanje neposredno pre upotrebe. Izbor dodatka i/ili nosioca zavisi o stabilnosti vakcine koja sadrži dodatak, rute davanja, doznog

4

rasporeda, efikasnosti dodatka kod vrste koja se vakcinira, a kod ljudi, farmaceutski prihvatljiv dodatak je onaj koji je odobren ili je bezbedan za humanu administraciju od strane odgovarajućih regulatornih ustanova. Na primer, Complete Freund's adjuvant nije prikladan za humanu administraciju. Alaun, MPL i QS21 se preferiraju. Opciono, dva ili više različitih dodataka mogu da se koriste istovremeno, kao što su alaun sa MPL, alaun sa QS21, MPL sa QS21, i alaun, QS21 i MPL zajedno. Takođe, može da se koristi Incomplete Freund's adjuvant (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opciono zajedno sa bilo kojim od alauna, QS21 i MPL i sve njihove kombinacije.

E. Farmaceutske kombinacije i kompleti hemikalija

[0142] Takođe su ovde predviđene farmaceutske kombinacije i kompleti hemikalija koji sadrže virus koji je ovde obezbeđen i jednu ili više komponenti. Farmaceutske kombinacije mogu da uključe čestice virusnog vektora kao što je ovde obezbeđeno i neki farmaceutski nosilac. Kompleti hemikalija uključuju farmaceutske kombinacije i/ili kombinacije koje su ovde obezbeđene, i jednu ili više komponenti, kao što su instrukcija za korišćenje, napravu za administriranje jedinjenja nekom subjektu.

[0143] Ovde su obezbeđene farmaceutske kombinacije koje sadrže virusne čestice kao što je ovde obezbeđeno i neki prikladni farmaceutski nosilac. Farmaceutske kombinacije koje su ovde obezbeđene mogu da budu u različitim formama, npr., u krutoj, tečnoj, puderskoj, vodenoj ili liofilizovanoj formi. Primeri prikladnih farmaceutskih nosioca su već poznati stanju tehnike. Takvi nosioci i/ili dodaci mogu da se formulišu pomoću konvencionalnih postupaka i mogu da se daju nekom subjektu u nekoj prikladnoj dozi. Agensi za stabilizovanje kao što su lipida, inhibitora nukleaze, polimera i agenasa za heliranje mogu da štite pomenute kombinacije od raspadanja u telu.

[0144] Čestice virusnog vektora koje su ovde obezbeđene mogu da budu pakovane kao kompleti hemikalija. Kompleti hemikalija opciono mogu da uključuju jednu ili više komponenti kao što su instrukcija za korišćenje, naprava, i dodatnih reagenasa, i komponente, kao što su tuba, kontejnera i šprica za praktikovanje pomenutih postupaka. Primeri za komplete hemikalija mogu da uključuju viruse koji su ovde obezbeđeni, a opciono mogu da uključuju instrukcije za korišćenje, napravu za detektovanje virusa u subjektu, napravu za administriranje virusa nekom subjektu, i napravu za administriranje jedinjenja nekom subjektu.

[0145] Kompleti hemikalija koji obuhvataju polinukleotide koji kodiraju gen od interesa (tipično neki antigen) su takođe ovde razmatrani. Pomenuti komplet hemikalija može da uključuje najmanje jedan plazmid koji kodira komponente za pakovanje virusa i vektor koji kodira varijantu E2 glikoproteine iz Sindbis virusa. Neki kompleti hemikalija sadrže najmanje jedan plazmid koji kodira komponente za pakovanje virusa, vektor koji kodira varijantu E2 glikoproteine iz Sindbis virusa, i vektor koji kodira najmanje jedan faktor za sazrevanje DC.

[0146] Kompleti hemikalija koji sadrže virusni vektor koji kodira sekvencu od interesa (tipično neki antigen) i opciono, polinukleotidnu sekvencu koja kodira faktor za sazrevanje DC su takođe razmatrani ovde. U nekim kompletima hemikalija, pomenuti komplet hemikalija uključuje najmanje jedan plazmid koji kodira komponente za pakovanje virusa i vektor koji kodira varijantu E2 glikoproteine iz Sindbis virusa.

[0147] Komplet hemikalija takođe sadrži instrukcije. Instrukcije tipično uključuju opipljiv izraz koji opisuje virus i, opciono, druge komponente koje su uključene u samom kompletu hemikalija, i postupke za administriranje, uključujući postupke za određivanje odgovarajućeg stanja samog subjekta, odgovarajuće dozne količine, i odgovarajućeg postupka za administriranje virusa. Instrukcije mogu takođe da uključe upute za posmatranje subjekta tokom perioda trajanja samog tretmana.

[0148] Kompleti hemikalija koji su ovde obezbeđeni mogu da uključuju napravu za administriranje virusa nekom subjektu. Brojne naprave za administriranje lekova ili vakcina koje su poznate stanju tehnike mogu da se uključe u komplete hemikalija koji su ovde obezbeđeni. Primeri za pomenute naprave uključuju, ali bez ograničenja, hipodermičku iglu, intravenoznu iglu, kateter, naprava za injektiranje bez igle, inhaler i dispenzer za tečnost, kao što su kapalice za oči. Tipično, pomenuta naprava za administriranje virusa iz kompleta hemikalija će biti kompatibilna sa virusom iz kompleta hemikalija; na primer, naprava za injektiranje bez igle kao što su naprava za injektiranje pod visokim pritiskom može da bude uključena u kompletima hemikalija sa virusima koji ne mogu da se oštete tokom injektiranja pod visokim pritiskom, ali tipično nije uključena u kompletima hemikalija sa virusima koji mogu da se oštete tokom injektiranja pod visokim pritiskom.

[0149] Kompleti hemikalija koji su ovde obezbeđeni mogu takođe da uključuju napravu za administriranje jedinjenja, kao što su aktivatora ili stimulatora DC, nekom subjektu. Brojne naprave za administriranje lekova nekom subjektu su poznate stanju tehnike, i mogu da budu uključene u kompletima hemikalija koji su ovde obezbeđeni. Primeri za pomenute naprave uključuju hipodermičku iglu, intravenoznu iglu, kateter, napravu za injektiranje bez igle, ali nisu ograničeni na hipodermičku iglu, intravenoznu iglu, kateter, napravu za injektiranje bez igle, inhaler, i dispenzer tečnosti kao što su kapalice za oči. Tipično pomenuta naprava za administriranje jedinjenja iz kompleta hemikalija će biti kompatibilna sa željenim postupkom za administraciju pomenutog jedinjenja.

[0150] Sledeći primeri su prikazani kao ilustracija, a ne kako ograničenje.

PRIMERI PRIMER 1

KONSTRUISANJE VARIJANTE OMOTAČA SINDBIS VIRUSA

[0151] Sindbis virus (SV) – član roda Alfavirusa i familije Togaviridae – je sposoban da inficira DC, verovatno preko DC-SIGN (Klimstra, W. B., et al. 2003. J. Virol. 77: 12022-12032,). Kanonički virusni receptor za laboratorijske sojeve SV, međutim, je heparan sulfat (HS) sa površine ćelije, koji dolazi u više tipova ćelija (Strauss, J. H., et al.1994. Arch. Virol.

9: 473-484; Byrnes, A. P., & D. E. Griffin. 1998. J. Virol. 72: 7349-7356). Sa ciljem da se smanji vezivanje heparan sulfata, konstruisan je mutirani E2 omotač (nazvan SVGmu) od strane autora Wang et al. (US 2008/0019998). Jedan deo njihove strategije je uključivao delecija četiri aminokiselina na mestu spajanja E3/E2 pro-protein i delecija dve aminokiseline uz dodavanje sekvence od 10 aminokiselina iz hemaglutinina (vidi Slike 1A i 1B). Nastali E2 protein je eksprimiran kao fuzija E3 i E2 (takođe poznata kao pE2) zbog toga šta je prirodna sekvenca za cepanje bila razorena, a takođe prikazuje i strani epitop (hemaglutinin). Kao što je pokazano ispod, SVGmu se slabo eksprimira, a pokazuje i druge probleme.

[0152] Koristeći različitu strategiju, ovi pronalazači su promenili E2 glikoprotein iz Sindbis virusa tako da joj smanje vezivanje na heparanski sulfat, povećaju specifičnost za dentritne ćelije, i poboljšaju ekspresiju. Opšti pristup koji je doveo do ovih karakteristika je povećavanje infektivnosti dentritnih ćelija preko menjanja ostatka 160 iz E2 (ostaci 233 na Slici 1) sa ne-kiselom aminokiselinom, posebno nekom aminokiselinom koja je različita od alanina, ili brisanja pomenutog ostatka, sa ciljem da se smanji heparinsko vezivanje preko smanjenja neto-pozitivnog naboja samog proteina, odstranjivanja HA (hemaglutinin) epitopa, i obnavljanja mesta cepanja na N-terminusu E2, pri čemu se tu radi o furinskom mestu cepanja. Kao deo virusnog omotača, pomenute E2 glikoproteini su sposobni da omoguće infekciju DC, ali i to da smanje ili ukinu infekciju drugih tipova ćelija.

[0153] Sledeći ove principe, bilo je dizajnirano nekoliko varijanata sekvence E2, a pomenute su prikazane u sledećoj tabeli. Masno štampana slova pokazuju promenu u odnosu na sekvencu omotača iz HR-soja Sindbis virusa (GenBank NC 001547.1).

[0154] Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju neke od pomenutih varijanata su bile sintetizovane (takođe vidi Sliku 1), uključujući sekvence nukleinske kiseline koje su kodonoptimizovane za ljude. DNK pomenutih varijanata je klonirana u ekspresioni vektor, kao što su pcDNK3.

PRIMER 2

PRIPREMA ČESTICA VIRUSNOG VEKTORA KOJE OBUHVATAJU VARIJANTU GLIKOPROTEINE E2 IZ OMOTAČA SINDBIS VIRUSA

[0155] Pseudotipizirani omotač iz Sindbis virusa se priprema pomoću standardne privremene transfekcije 293T ćelija, koja je potpomognuta sa kalcijum fosfatom, sa lentivirusnim vektorom, kao što su FUGW ili njegovih derivata, plazmida za pakovanje koji kodiraju gag, pol i rev, i sekvencu varijante omotača iz Sindbis virusa. FUGW je samo-inaktivirajući lentivirusni vektor koji sadrži humani promoter za ubikvitin-C sa ciljem da se omogući ekspresija GFP-reporter gena (Lois, C., et al. 2002. Science 295: 868-872). Pomenuti lentivirusni vektori za prenos (FUGW i njegovi derivati) su treća generacija HIV-baziranih lentivirusnih vektora (vidi, Cockrell & Kafri Mol. Biotechnol. 36: 184, 2007), u kojima je najveći deo U3-regiona sa 3' LTR deleciran, što rezultuje u samo-inaktivirajućem 3'-LTR.

[0156] Proizvodnja rekombinantnih lentivirusnih vektora je postignuta pomoću privremene transfekcije 293T ćelija koja je bila potpomognuta sa kalcijum fosfatom (CaPO4) (293LTV ćelijska linija; CELL BIOLABS INC, LTV-100). 293T ćelije su transfektovane sa četiri plazmida koja su zajedno precipitovana pomoću CaPO4. Sledeća četiri plazmida su korišćena sa ciljem da se stvori lentivirusni vektor, a njihova priprema je prikazana šematski na Slici 3 šta odgovara sledećem: i) lentivirusni vektor; ii) plazmid koji kodira Rev iz HIV; iii) plazmid koji kodira Gag/Pol iz HIV; i, iv) plazmid koji kodira omotač. Lentivirusni vektori mogu da kodiraju željene antigene ili imuno-modulatorne elemente, i da sadrže posebne ciljane delecije sa ciljem da se spreči integracija u hromozom domaćina (inficirana ćelija). Dodatni primeri alternativnih plazmida koji mogu da se koriste za prenos uključuju one koji kodiraju holoenzim Polimeraza koji sadrži mutaciju u svojoj integrazi šta ju čini defektnom, kao što su D64V-mutacije koja je ovde već opisana. Za neke svrhe, plazmid koji kodira omotač može da kodira pantropni omotač koji cilja ćelije koje nisu DC, kao što su VSV-G.

[0157] Za eksperimente koji su ovde opisani, CaPO4precipitacije sadrže 120 µg vektora i 60 µg svakog od plazmida za Gag/Pol i Rev i 240 µg plazmida sa omotačem koji su bili filtrirani kroz filter sa porama veličine 0.45 µm pa su dodane u približno 6x10<7>293T ćelija koje su rasle u okruglim bocama koje su sadržavale 75 mL medijuma DMEM koji je sadržavao 10% fetalni teleći serum. 6 h posle transfekcije, medijum je bio zamenjen sa 100 mL svežeg medijuma koji je bio sakupljen 36 h posle transfekcije. Supernatanti iz kultura su centrifugovani kod niske brzine (1200 rpm) sa ciljem da se utalože ćelijski ostaci, a posle toga je sve filtrirano kroz filtere od 0.45 µm. Filtrat koji je sadržavao lentivirusni vektor je opciono koncentrisan pomoću centrifugovanja kod 17,700x g tokom 5 h na 20° C. Utaloženi lentivirusni vektor je tada ponovo suspendovan u PBS u željenom volumenu. Ovaj proces tipično daje prinos od ≥5x10<5>IU/mL kada se koristi glikoproteina omotača Sindbis virusa koja je ovde opisana, ili totalno 5x10<7>IU za svaku kulturi iz okruglih boca. Još tipičnije ovaj proces daje prinos od najmanje 1x10<8>IU (totalno) za svaku kulturu iz okruglih boca.

[0158] Detaljnije, tokom dana -4, 150 mL medijuma za ćelijsku kulturu je dodan u okrugle boce (Roller Bottles; RB) koje su držane u inkubatoru za takve boce (0.2 rpm) na 37° C tokom ∼1 h. U svaku RB se nalazi konfluentan sadržaj od 15 cm. Tokom dana -2, medijum je isisan iz RB i zamenjen sa 100 mL medijuma koji je bio ugrejan. Tokom dana -1, ćelije su posejane u preparat za transfekciju. RB su ugrejane sa 100 mL medijuma za ćelijsku kulturu tokom ∼1 h. Medijum je isisan pa je dodano 10-12 mL PBS. RB su postavljene bočno i rotirane dva puta oko svoje osi sa ciljem da ćelije omotaju zid boca. PBS je isisan pa je dodano 10-12 mL rastvora tripsina. RB su ponovo postavljene bočno i rotirane dva puta oko svoje osi sa ciljem da ćelije omotaju zidove boca. Rastvor tripsina je isisan pa su RB ostavljene u inkubatoru tokom 5 min. U RB je dodano 10 mL ugrejanog medijuma, a RB su jednom snažno rotirane oko svoje osi sa ciljem da se ćelije odlepe od zidova. Koristeći 10 mL pipeta, ćelije su pipetirane primjerice 10 puta sa ciljem da se obezbedi suspenzija sa pojedinačnim ćelijama. Ćelije su odstranjene u novi kontejner i razređene sa medijumom (40 mL medijuma po RB). Ćelije su izbrojane i posejane u nove RB u koncentraciji od 7x10<7>/mL) pa su držane u inkubatoru tokom noći.

[0159] Tokom dana 0, približno 22 h posle sejanja, pripremljen je rastvor plazmida na sledeći način. Za svaku RB, pomešaj plazmidni rastvor (120 µg vektora, 60 µg Gag/Pol, 60 µg Rev, 60 µg omotača), 2.5 mL 1.25 M CaCl2, i filtriranu-sterilnu vodu do konačnog volumena od 12.5 mL. Dodaj 2.7 ml 2xHBS (50 mM HEPES, 10 mM KCI, 12 mM dekstroza, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7.0, sterilno filtriran) pufer u tubu od 50 ml (jedna tuba/RB). Kap po kap dodaj mešavinu 12.7 mL voda-CaCl2-DNK u 12.7 mL 2xHBS uz vorteksovanje na srednjoj brzini. Zatvori tubu i nastavi s vorteksovanjem (maksimalna brzina) tokom 5-10 s. Odstrani 25 ml medijuma iz RB i dodaj precipitat (25 ml) u RB. Inkubiraj 6 h, a tada isiši medijum i dodaj 100 ml svežeg, od pre ugrejanog medijuma za kulturu. Stavi sve u inkubator na 37° C.

[0160] Tokom 36 do 48 h posle transfekcije, supernatanti iz RB su sakupljeni u konusne boce od 250 mL i obrađene kako sledi. Supernatante obradi centrifugom tokom 10 min na 2000 rpm. Filtriraj supernatante kroz filter od 0.45 μm. Centrifugiraj supernatante u tubu od 500 ml tokom 5 h na 10,000 rpm na 20° C. Ponovo suspenduj vektor u PBS ili HBSS do željene koncentracije i skladišti na -80° C.

[0161] Dobijeni pseudotipizirani virusni vektori se od sada nazivaju FUGW/V1, FUGW/V2 itd. Genomi virusnih vektora koji su zamotani sa VSV-G glikoproteinom od sada se nazivaju FUGW/VSV-G.

PRIMER 3

PROIZVODNJA ČESTICA LENTIVIRUSNOG VEKTORA KOJE SADRŽE GLIKOPROTEINE OMOTAČA SINDBIS VIRUSA

[0162] U ovom primeru, određeni su titri za lentivirusne vektore koji su pseudotipizirani različitim omotačima iz Sindbis virusa. E2 glikoproteini koje su korišćene su SIN-Var1 (SEQ ID NO.3), SIN-Var2 (SEQ ID NO.4), SIN-Var3 (SEQ ID NO.5), SVGmu (SEQ ID NO.2), HR (SEQ ID NO.18).

[0163] Čestice lentivirusnog vektora pseudotipizirane sa glikoproteinom iz Sindbis virusa su generisane preko transfekcije 293T-ćelija kao što je opisano u Primeru 2. Grubi supernatanti su sakupljeni 48 h posle transfekcije i su korišćeni sa ciljem da se transdukcijom uvedu u 293T-ćelije koje eksprimiraju humani DC-SIGN (293-DCSIGN) koje su bile uzgajane prethodnog dana u posudama sa 6 rupica kod koncentracije od 2E5 ćelija/rupici. Titar određen je posle inkubacije tokom 72 h na 37° C pomoću analiziranja transdukovanih ćelija na citometru tipa Guava Easy-Cyte (Millipore). Ukupno 25,000 događaja je izbrojano sa ciljem da se odredi procenat transdukovanih ćelija koje su bile GFP<+>, šta je posle toga korišćeno da se izračuna GFP-titar (IU, infektivna jedinica) za svaki virus.

1

[0164] Sa ciljem da se ubrza studija ciljane transdukcije, konstruisane su ćelijske linije koje eksprimiraju humani DC-SIGN. Pomenute ćelijske linije su generisane pomoću stabilne transdukcije parentalnih 293T-ćelija sa VSVG-pseudotipiziranim lentivektorom koji je sadržavao sekvencu koja kodira humani DC-SIGN. cDNK humanog DC-SIGN je amplifikovana iz plazmida pUNO-hDCSIGN1Aa (InvivoGene) pa je klonirana posle od promotera za humani ubikvitin-C u lentivirusnanom plazmidu FUW sa ciljem da se stvori FUW-hDCSIGN. Alternativno, ćelijske linije su generisane pomoću stabilne transdukcije parentalnih 293T-ćelija sa VSVG-pseudotipiziranim amfotrofnim (ne-lentivirusni) vektorom koji je sadržavao sekvencu koja kodira DC-SIGN, sa ciljem poboljšavanja analize transdukcije sa česticama lentivirusnog vektora pomoću nizvodne nukleinske kiseline. Lentivektori ili amfotrofni vektori se tada pseudotipiziraju sa VSVG pa se koriste za transdukciju 293T-ćelija. Alternativno, ćelijske linije su generisane pomoću stabilne transdukcije parentalnih 293T-ćelija sa plazmidom koji kodira humani DC-SIGN. Nastale ćelije se tada boje pomoću antitela (antitelo protiv humanog DC-SIGN (BD Biosciences) pa se sortiraju sa ciljem da se dobije uniformna populacija ćelijskih linija DC-SIGN<+>.

[0165] U tri nezavisna eksperimenta, lentivirusni vektor koji je pseudotipiziran sa omotačem SIN-Var1 pokazuje približno 10-puta veći titar kada se uporedi sa onim koji su pseudotipizirani sa SVGmu ili sa HR-sojem Sindbis virusa (Slika 3, gornji grafikon). U naknadnoj studiji je upoređena proizvodivnost tri varijante omotača Sindbisa. Prikazan je reprezentativan rezultat. Omotači Sin-Var1, Sin-Var2 i SIN-Var3 stvaraju čestice lentivirusnog vektora sa sličnim ukupnim titrom.

[0166] Specifičnost čestica virusnog vektora koji sadrži varijantu E2 glikoproteine iz Sindbis virusa je procenjena pomoću transdukcije 293T.hDC-SIGN ili parentalnih 293T-ćelija i merenja ekspresije vidljivog markera (npr., GFP) u ćelijskim linijama.

[0167] Ciljane ćelije (293T.hDC-SIGN ili 293T-ćelije) su posejane u posudu za kulturu sa 24 rupica (0.2x10<6>ćelija po rupici) pa su transdukovane sa virusnim supernatantima (1 ml po rupici) pomoću centrifugovanja posuda na 2,500 rpm i na 30° C tokom 90 min. Posle toga, supernatanti su zamenjeni sa svežim medijumom za kulturu pa su inkubirani tokom 3 dana na 37° C. Procenat ćelija koje eksprimiraju pomenuti marker se meri pomoću protočne citometrije.

2

[0168] Kao što je prikazano u tabeli ispod, obe E2 varijanta 1 i E2 varijanta 3 preferencijalno ciljaju ćelije (specifične su za ćelije) koje su eksprimirale hDC-SIGN.

PRIMER 4

IMUNOGENOST ČESTICA LENTIVIRUSNOG VEKTORA KOJE SADRŽE GLIKOPROTEINE OMOTAČA SINDBIS VIRUSA

[0169] U ovom Primeru određen jea imunogenost lentivirusnih vektora pseudotipiziranih različitim omotačima iz Sindbis virusa. Specifičnije, određena je količina antigen-specifičnih CD8 T-ćelija i njihovi profili lučenja citokina. Korišćeni E2 glikoproteini bili su SIN-Var1 (SEQ ID NO. 3), SIN-Var2 (SEQ ID NO. 4), SIN-Var3 (SEQ ID NO. 5), SVGmu (SEQ ID NO. 2).

[0170] Virusni genom obuhvata sekvencu koja kodira Ovalbumin (OVA). Čestice lentivirusnog vektora su generisane pomoću transfekcije 293T-ćelija kao što je opisano u Primeru 2. Sakupljeni su spernatanti, a količina p24 određen jea pomoću kompleta hemikalija ELISA (Advanced Bioscience Labs, Kensington MD). Ovaj protein p24 je protein iz srži HIV koja dolazi u više pseudotipiziranih varijacija i je proizvod gag gena. Miševi soja C57BL/6 (5 miševa po grupi) imunizovani su posle toga sa lentivektorom koji ne može da se integrira i koji kodira OVA. Određeni su broj i funkcija OVA257 (SIINFEKL) (SEQ ID NO 24) peptid-specifičnih CD8 T-ćelija i profili sekrecije citokina u slezini tokom dana 9 pomoću MHC-I/peptidnog multimera i bojenja intracelularnog citokina.

[0171] Ukratko, slezine su ekstrahovane i homogenizovane pomoću propuštanja kroz najlonski filter od 70 µM. Crvene krvne ćelije su lizirane pomoću hipotoničnog šoka kratkim izlaganjem destilovanoj vodi pa su odmah obnovljene u izotoničnoj sredini pomoću dodavanja 10x PBS. Približno 5x10<6>ćelija iz slezine po primerku je obojeno sa PE-označenim H-2Kb/OVA257 pentamerom (Prolmmune) na 25° C u PBS sa 2% FCS i 2 mM EDTA (FACS pufer). Ćelije su tada isprane dva puta pa su obojene sa bojom za žive ćelije LIVE/DEAD Near-Infrared (L/D NIR; Invitrogen) i sa sledećim antitelima označenim sa fluorohromom: CD44 FITC, CD19 PerCP-Cy5.5 i CD8 Pacific Blue (eBioscience) na 4° C. Podaci su sakupljeni na protočnom citometru tipa BD LSR II (50,000 CD8<+>događaji) pa su analizirani sa programom FlowJo (TreeStar). Osnovna strategija za identifikovanje CD8 T-ćelija je bila kako sledi: limfociti (prema napred raspršeno lo-med, bočno raspršeno lo), pojedinačne ćelije (bočno raspršeni areal = bočno raspršeno u visini), žive ćelije (L/D NIR-), CD8 T-ćelije (CD8<+>CD19-). Procenat ćelija koje eksprimiraju IFN-γ u CD8<+>-ulazu određen je i prikazan na Slikama 4A i 4B. Horizontalna linija prikazuje srednje vrednosti. Nespecifično IFN-γ bojanje određen jeo kod ćelija slezine miševa koji su primili (injekcijom) prenosnik (HBSS) i kod kojih su ćelije bile stimulisane in vitro sa peptidom. IFN-γ bojanje je ispod 0.2% za sve primerke koji su kultivirani bez peptida (nije prikazano). Osim frakcije CD8 T-ćelija koje proizvode IFN-γ, prikazana je frakcija IFN-γ<+>ćelija koje takođe proizvode TNFα i/ili IL-2, kao što je navedeno u legendi.

[0172] U jednom setu eksperimenata, količina korišćenih virusa je sadržavala ili 2500 ng ili 125ng p24. Slika 4A ilustruje da lentivektori pseudotipizirani sa varijantom omotača iz Sindbisa imaju sličnu aktivnost in vivo. Kao što je prikazano u lijevom panelu, srednja vrednost za antigen-specifične CD8 T-ćelije je gotovo ista kod dve različite dozne količine. Dodatno, srednja vrednost procenta IFN-γ ćelija je takođe slična. Obrasci sekrecije citokina, specifično frakcija IFN-gama pozitivnih ćelija koje takođe eksprimiraju IL-2 ili TNF-alfa, je takođe slična, sa najvećim procentom I IFN-γ ćelija negativnih za IL-2 i TNF-α.

4

[0173] U drugom setu eksperimenata, grupe od po 5 miševa su primile serijski razređenu dozu virusa ili prenosnika. Virus je pseudotipizovan sa SinVar1 ili SVGmu. Procenat ćelija sa fenotipom CD44hi H-2Kb/OVA257 pentamer<+>je prikazan na Slici 4B. Linija koja povezuje prikazuje srednje vrednosti. Kao što je prikazano na Slici 4B, SinVar1-pseudotipizirani LV je indukovao značajno veću ekspanziju antigen-specifičnih CD8 T-ćelija u odnosu na sa SVGmu. Štaviše, SinVar1-pseudotipizirani lentivektori indukuju veći funkcionalni odgovor CD8 T-ćelija u odnosu na sa SVGmu (Slika 4C). Ne-specifično IFN-γ bojanje određen jeo u miševima koji su primili HBSS (prenosnik) i koji su bili ponovo stimulisani sa peptidom. IFN-γ bojanje je ispod 0.2% za sve primerke koji su kultivirani bez peptida (nije prikazano).

PRIMER 5

KONSTRUKCIJA LENTIVIRUSNIH VEKTORA KOJI NE MOGU DA SE INTEGRIŠU (N I LV)

[0174] Konstruisani su brojni lentivirusni vektori koji ne mogu da se integrišu. Šeme primera lentivirusnih vektora su prikazane na Slici 5A. Gornji crtež prikazuje vektor u formi provirusa. Svi vektori sadrže donor za splajsovanje, signal za pakovanje (psi), element koji odgovara na Rev (RRE), donor za splajsovanje, akceptor za splajsovanje, centralni polipurinski trakt (cPPT) i WPRE element. Dodatno, svi vektorski konstrukti sadrže promoter za ekspresiju u ćelijama sisara, i sekvencu od interesa, koja je označena kao "antigen" u primeru samog konstrukta. Promoteri koji se koriste u Primerima uključuju promoter za humani ubikvitin C (UbiC), neposredni rani promoter iz citomegalovirusa (CMV), i promoter iz virusa Rousovog sarkoma (RSV).

[0175] Povećani pogled na U3-region je prikazan kao otvorena kutija sa sekvencom PPT (polipurinski trakt) odmah uzvodno. Ispod su prikazana tri različita U3-regiona u šematskoj formi; njihove sekvence su prikazane na Slici 5B i u SEQ ID NO: 21-23. Konstrukti sadrže delecije u U3-regionima. SIN-konstrukt ima deleciju od oko 130 nukleotida u U3 (Miyoshi, et al. J Virol 72: 8150, 1998; Yu et al. PNAS 83: 3194, 1986), koja otklanja TATA-kutiju, šta ukida aktivnost LTR-promotera. Delecije u konstruktima 703 i 704 povećavaju ekspresiju iz lentivirusnih vektora (Bayer et al. Mol Therapy 16: 1968, 2008). Dodatno, konstrukt 704 sadrži deleciju 3' PPT, koja smanjuje integraciju vektora (WO 2009/076524). Sekvence U3regiona iz svih konstrukata su prikazane na Slici 5B.3' PPT započinje na poziciji 3, a takođe su prikazane proširene delecije u odnosu na SIN-delecirani vektor.

PRIMER 6

EKSPRESIJA U DENDRITSKE ĆELIJEMA POSLE TRANSDUKCIJE SA ČESTICAMA LENTIVIRUSNOG VEKTORA

[0176] Ovaj Primer prikazuje nivo GFP (zeleni fluorescentni protein) ekspresije u dendritske ćelijema koja dolazi iz vektora sa proširenim U3 delecijama.

[0177] Serije virusa su proizvedene pomoću transfekcije 293T-ćelija kao što je ovde opisano. Svi virusi su sadržavali SIN-Var1 omotač, vektorski genom koji sadrži UbiC- ili CMV-promoter koji je operativno spojen sa GFP transgenom, i nisu sadržavali integrazu zbog toga što su imali D64V mutaciju. Grubi supernatanti su sakupljeni 48 h posle transdukcije, a ekvivalentni volumeni svakog supernatanta su korišćeni da se transdukuju 293T-DCSIGN-ćelije. GFP ekspresija određen jea 72 h posle transdukcije koristeći protočni citometar tipa GUAVA Easy-Cyte. Ukupno 50,000 događaja je izbrojano za svaku transdukovanu ćelijsku populaciju. Podaci su analizirani pomoću programa za citometrijsku analizu FlowJo.

[0178] Slični rezultati su dobijeni za oba promotera, UbiC (Slika 6, panel A) i CMV (Slika 6, panel B). Lentivirusni vektori koji sadrže proširene U3-delecije (703 i 704) pokazuju veću ukupnu ekspresiju transgena u odnosu na SIN-delecirane vektore. Delecija PPT u konstruktu 704 je malo smanjila ekspresiju u odnosu na konstrukt 703.

PRIMER 7

VEKTORI SA VELIKIM DELECIJAMA U U3 NE MOGU DA SE INTEGRIŠU [0179] Ovaj primer pokazuje relativnu efikasnost integracije SIN-Var1 pseudotipiziranih vektora koji sadrže kombinacije različitih vektorskih delecija bez integraze ili sa integrazom divljeg-tipa posle transdukcije 293-DC-SIGN-ćelija.

[0180] Vektorski stokovi su generisani pomoću brojnih različitih kombinacija gena za Integrazu i U3-delecija. Vektori sa U3-delecijama (vidi Slike 5A i 5B), SIN, 703 i 704 su transfektovani kao što je opisano sa divljim-tipom gena za integrazu ili sa mutiranim genom za integrazu. Vektori u ovim eksperimentima sadrže GFP-2A-Neo transgen koji omogućava rezistenciju na GFP i G418. Okviri čitanja su spojeni preko 2A samo-cepajućeg peptida sa ciljem da se generišu individualne proteine. GFP titri za sve vektorske stokove su određeni pomoću standardnih postupaka protočne citometrije. Vektorski stokovi su tada korišćeni da se inficiraju 293-DC-SIGN ćelije koje su bile uzgajane od prethodnog dana u posudama sa 6 rupica u koncentraciji od 5x10<5>ćelija/po rupici. Posle transdukcije, ćelije su tretirane sa tripsinom svaka 72 h. Tokom svake pasaže, 2x10<5>ćelija je bilo ponovo posađeno u posude sa 6 rupica u 2 mL DMEM 10% FBS. Preostale ćelije su korišćene da se odredi broj GFP<+>ćelije pomoću protočne citometrije.

[0181] Na Slici 7, relativni GFP titar je predstavljen kao frakcija titra koji je primećen u prvoj pasaži. Gubitak GFP ekspresije reflektuje gubitak GFP transgena, šta je posledica nedostatka integracije tokom inicijalnog koraka transdukcije. Kao što je očekivano, svi virusi koji sadrže D64V-mutiranu integrazu (IN-) nisu mogli da se integrišu. Dodatno, virusi koji sadrže PPT-deleciju (704) ne mogu da se integrišu čak i u prisutnosti divljeg-tipa IN gena. Ovo pokazuje da delecija 3' PPT obezbeđuje višestruki mehanizam bezbednosti kombinovan sa mutacijom integraze.

PRIMER 8

LENTIVIRUSNI VEKTORI KOJI MOGU I KOJI NE MOGU DA SE INTEGRIŠU POKAZUJU EKVIVALANTNU IMUNOGENOST

[0182] U ovom Primeru odgovori CD8 T-ćelija su procenjeni posle imunizacije pomoću virusa koji mogu ili koji ne mogu da se integrišu.

[0183] Miševi soja C57BL/6 imunizovani su subkutano sa 2.5x10<10>genoma lentivektora koji može da se integriše (Int<wt>) ili koji ne može da se integriše (Int<D64V>) i koji kodira Gag antigen iz virusa imunodeficijencije simian-primata (SIV). Broj i funkcija SIV Gag-specifičnih CD8 T-ćelija u slezini su određeni tokom 10. dana bojenjem citokina, kao što je ovde opisano, uz iznimku da je za ponovno stimulisanje korišćen SIV Gag-derivisani peptid AAVKNWMTQTL. Slika 8 ilustruje da lentivektori koji ne mogu da se integrišu potiču odgovor CD8 T-ćelija koji je ekvivalentan sa onim kod lentivektora koji mogu da se integrišu. Štaviše, obrazac ekspresije citokina je sličan.

PRIMER 9

IMUNIZACIJA SA DC-NILV OBEZBEĐUJE TERAPEUTSKI EFEKAT

[0184] U ovom Primeru, miševi koji su primili tumorske ćelije su tretirani pomoću imunizovanja sa DC-NILV koji eksprimiraju tumorski antigen.

[0185] BALB/c miševi su injektirani subkutano sa 2x10<4>CT26-ćelija karcinoma kolona. Jedan dan kasnije, miševi su tretirani subkutano sa prenosnikom ili sa preparatom SINvar1 pseudotipiziranih čestica lentivirusnog vektora koji je sadržavao 3.2 µg p24-kapsidnog proteina. Omotač virusnog vektora obuhvata varijantu E2 iz Sindbis virusa kao što je ovde opisano, pri čemu vektor ne može da se integriše i kodira AH1A5 peptid (SPSYAYHQF;SEQ ID NO. 25), modifikovani omotač MMTV gp70 CD8 T-ćelija koji je antigen odbacivanja važan za CT26-tumorske ćelije. Prikazan je početni tumorski rast kao i dugotrajno preživljavanje imunizovanih miševa u odnosu na kontrolne. Slika 9 pokazuje da tumor raste sporije kod miševa koji su primili DC-NILV i dodatno, rata preživljavanja (merena tokom 75 dana) je značajno bolja (60% preživljavanja u odnosu na 20%). Prema tome, lentivektori koji ciljaju DC i koji ne mogu da se integrišu (DC-NILV) su efektivni u terapeutskom tretmanu tumora.

[0186] Primeri izvođenja ovog pronalaska, uključuju, ali se ne ograničavaju na sledeće.

1. Retrovirusna, npr., lentivirusna, vektorska čestica koja obuhvata:

(a) omotač koji obuhvata E2 glikoproteine iz Sindbis virusa sa SEQ ID NO:1 u kojoj nema 160X ili je neka amino kiselina različita od glutaminske kiseline, ili njena varijanta iz SEQ ID NO:1 sposobna da inficira dendritske ćelije sa sa najmanje sekvencionim 80% identitetu sa SEQ ID NO:1; gde pomenuta E2 glikoproteine ili njena varijanta nije fuzionisana sa E3; i

(b) lentivirusni genom koji obuhvata sekvencu od interesa.

2. Vektorska čestica retrovirusa prema primeru izvođenja 1, gde se E2 glikoproteine ili varijanta vezuje za DC-SIGN.

3. Vektorska čestica retrovirusa prema primeru izvođenja 1 ili primeru izvođenja 2, gde nema160X ili je glicin, alanin, valin, leucin ili izoleucin, kao što je odabran od glicina, valina, leucina ili izoleucina.

4. Vektorska čestica retrovirusa prema primeru izvođenja 1 ili primeru izvođenja 2, gde nema160X glicina.

5. Vektorska čestica retrovirusa prema primeru izvođenja 1, 2, 3 ili 4, gde varijanta E2 glikoproteina ima najmanje jednu aminokiselinu izmenjenu radi smanjivanja njenog neto pozitivnog naelektrisanja.

6. Vektorska čestica retrovirusa prema primeru izvođenja 5, gde su izmenjene aminokiseline odabrane iz grupe koju čine lizin 70, lizin 76, ili lizin 159 iz SEQ ID NO:1, a supstitucije su opciono nezavisno odabrane od glutaminske kiseline ili asparaginska kiselina.

7. Vektorska čestica retrovirusa prema primeru izvođenja 1, 2, 3, 4, 5 ili 6, gde E2 sekvenciona varijanta je SEQ ID No.2, 3, ili 4; (varijante 1, 2, i 3), koja opciono obuhvata jednu ili više daljih supstitucija, umetanja ili brisanja.

8. Vektorska čestica retrovirusa prema primeru izvođenja 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7, koja je varijanta u kojoj je sekvenca ostataka 71-75 iz SEQ ID NO:1 neizmenjena ili ima jednu ili dve supstitucije koje ne utiču na sposobnost varijante da inficira DC-e, ali ne menjaju broj aminokiselina u ovom regionu.

[0187] Ovim pronalaskom razmatrana je bilo koja kombinacija gornjih primera izvođenja, kako je izneto u neograničavajućim kombinacijama koje slede, u kojima ">" označava pozivanje na prethodno numerisan primer izvođenja: 4>2>1; 5>4>1; 5>4>2>1; 5>3>1;

5>3>2>1; 6>5>4>1; 6>5>4>2>1; 6>5>3>2>1; 6>4>2>1;

6>3>2>1;6>5>3>1;7>6>5>4>1;7>6>5>4>2>1;7>6>5>3>1;7>6>5>3>2>1; 7>6>4>2>1; 7>5>4>1; 7>5>4>2>1; 7>5>3>1; 7>5>3>2>1; 7>4>2>1; 7>3>2>1; 7>6>4>1; 7>6>4>2>1; 7>6>3>1; 7>6>3>2>1; 7>6>2>1; 8>4>2>1; 8>5>4>1; 8>5>4>2>1; 8>5>3>1; 8>5>3>2>1; 8>6>5>4>1; 8>6>5>4>2>1; 8>6>5>3>2>1;

8>6>4>2>1;8>6>3>2>1;8>6>5>3>1;8>7>6>5>4>1;8>7>6>5>4>2>1;

8>7>6>5>3>1;8>7>6>5>3>2>1;8>7>6>4>2>1;8>7>5>4>1;8>7>5>4>2>1;

8>7>5>3>1;8>7>5>3>2>1;8>7>4>2>1;8>7>3>2>1;8>7>6>4>1;8>7>6>3>1;

8>7>6>3>2>1;8>7>6>2>1.

Dalje primeri izvođenja ovog pronalaska, uključuju:

9. Vektorska čestica retrovirusa prema bilo kojoj od prethodnih primera izvođenja, gde sekvenca od interesa kodira tumor-specifičan antigen ili iz viruza izveden antigen, kao što je HIV ili SIV antigen.

10. Retrovirusni, npr., lentivirusni, vektorski genom pseudotipiziran u omotaču koji obuhvata E2 glikoproteine iz varijante Sindbis virusa, pri čemu taj genom obuhvata sekvencu od interesa,

gde Varijanta E2 glikoproteine olakšava infekciju dendritskih ćelija retrovirusnom vektorskom česticom; i gde varijanta E2 glikoproteine ima aminokiselinsku sekvencu kakva je definisana u bilo kom od primera izvođenja 1 do 9.

11. Retrovirusni vektorski sistem pakovanja za proizvodnju pseudotipiziranih retrovirusnih vektorskih čestica, koji obuhvata:

(i) prvi molekul nukleinske kiseline koji kodira E2 glikoproteine iz Sindbis virusa sa SEQ ID NO:1 u kojoj nema 60X ili je aminokiselina različita od glutaminske kiseline, ili njena varijanta sposobna da inficira dendritske ćelije sa najmanje sekvencionim 80% identitetom sa SEQ ID NO:1, i;

(ii) drugi molekul nukleinske kiseline pri čemu taj drugi molekul nkleinske kiseline može biti transkribovan, a transkript složen u pseudotipiziranu retrovirusnu vektorsku česticu.

12. Sistem pakovanja prema primeru izvođenja 11, gde E2 glikoproteina ima aminokiselinsku sekvencu kakva je definisana prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 9.

13. Sistem pakovanja prema primeru izvođenja 11 ili 12, gde prvi molekul nukleinske kiseline kodira E3/E2 glikoproteine, opciono u obliku Sindbis virusnog E3/E2/6K/E1 poliprotein.

14. Sistem pakovanja prema primeru izvođenja 13, gde E3 sekvenca odgovara ostacima 1-65 iz SEQ ID NO:20, ili njenoj varijanti sa najmanje 80% sekvencionog identiteta sa ostacima 1-65 iz SEQ ID NO:20, gde ostaci 62-65 predstavljaju RSKR (SEQ ID NO: 27), a varijanta može da se inkorporira u pseudotipizirani virusni omotač, gde opciono ostatak 1 iz E2 poliprotein dalje predstavlja Ser.

15. Sistem pakovanja prema primeru izvođenja 11, 12, 13 ili 14, koji dalje obuhvata treći molekul nukleinske kiseline koji kodira gag i pol proteine.

16. Sistem pakovanja prema bilo kom od primera izvođenja 11 do 15, gde drugi molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu od interesa.

17. Ćelija transfektovana sa prvim i drugim molekulom nukleinske kiseline prema bilo kom od primera izvođenja 11 do 16.

18. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira protein prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 9, ili E3/E2 glikoproteine definisane primerima izvođenja 13 ili 14.

19. Ekspresioni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema primeru izvođenja 18.

20. Ćelija domaćin koja obuhvata ekspresioni vektor prema primeru izvođenja 19.

21. Postupak pripremanja retrovirusne vektorske čestice prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 10, koji obuhvata eksprimiranje u ćeliji

(i) prvi molekul nukleinske kiseline koji kodira E2 glikoproteine iz Sindbis virusa sa SEQ ID NO:1 u kojoj je 160X koji je različit od glutaminske kiseline, ili njena varijanta sposobna da inficira dendritske ćelije sa najmanje sekvencionim 80% identitetom sa SEQ ID NO:1, i;

(ii) drugi molekul nukleinske kiseline pri čemu taj drugi molekul nukleinske kiseline može bii transkribovan, a taj transkript složen u pseudotipiziranu retrovirusnu vektorsku česticu.

22. Vektorska čestica retrovirusa prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 10 za upotrebu u postupku lečenja čoveka ili životinje.

23. Postupak in vitro dostave retrovirusnih vektorskih čestica u ćelije, koji obuhvata mešanje ćelija sa retrovirusnim vektorskim česticama prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 10.

24. Terapeutska vakcina koja obuhvata retrovirusne vektorske čestice prema bilo kom od primera izvođenja 1 do 10 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa koji obuhvata omotač koji obuhvata glikoproteine nekog arbovirusa, pri čemu ta čestica obuhvata:

(a) nefunkcionalnu integrazu, i

(b) vektorski genom lentivirusa, koji obuhvata mutaciju ili deleciju 3’ LTR-bližeg polipurinskog niza (PPT) koja čini taj PPT nefunkcionalnim.

2. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa prema zahtevu 1, gde je pomenuti glikoprotein omotača iz Sindbis virusa, Denga virusa, virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa.

3. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa prema zahtevu 1 ili 2, gde:

(a) nefunkcionalna integraza obuhvata mutaciju koja je odabrana iz grupe koju čine D64E, D64V, D116N, N120K, Q148A, W235E, K264R, K266R, K273R, i njhove kombinacije, a

(b) 3’ LTR-bliži polipurinski niz obuhvata (i) deleciju polipurinskog niza koja čini taj PPT nefunkcionalnim ili (ii) jednu ili više mutacija u 5' polovini polipurinskog niza koja čini taj PPT nefunkcionalnim i/ili (iii) mutaciju na 3’ kraju polipurinskog niza koja čini taj PPT nefunkcionalnim.

4. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa prema bilo kom od zahteva 1-3, gde integraza ima D64V mutaciju, a PPT je deleciran.

5. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa prema bilo kom od zahteva 1-4, gde vektorski genom lentivirusa obuhvata najmanje jedan od sledećeg:

(a) sekvencu iz 5' LTR, opciono R sekvencu i/ili U5 sekvencu,

(b) inaktiviran ili samoinaktivirajući 3' LTR, koji opciono obuhvata deleciju sekvence pojačivača i/ili sekvence promotera,

(c) 3' LTR U3 sekvencu koja obuhvata deleciju sekvence pojačivača, TATA-kutije, Sp1 i NF-kapa B mesta, i

(d) 5' LTR U3 sekvencu koja obuhvata heterolognu promoter sekvencu, opciono u kombinaciji sa sekvencom pojačivačem, i

(e) jedan ili više genetskih elemenata koji su odabrani iz grupe koju čine tRNK-amber supresorska sekvenca, izolator sekvenca iz kokošijeg beta globulina, i element koji odgovara na virus hepatitisa mrmota.

6. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa prema bilo kom od zahteva 1-5, gde je vektorski genom lentivirusa odabran iz grupe koju čine virus humane imunodeficijencije (HIV-1), HIV-2, virus imunodeficijencije mačaka (FIV), virus infektivne anemije konja, virus Simijan Imunoideficijencije (SIV), i virus midi/visna.

7. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa prema bilo kom od zahteva 1-6, gde vektorski genom lentivirusa obuhvata sekvencu od interesa koja ispoljava proizvod koji je antigen agensa koji izaziva bolest ili obolela ćelija.

8. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa prema zahtevu 7, gde sekvenca od interesa kodira tumorspecifični antigen, opciono NY-ESO-1, MAGE, MART-1/Melan-A, BAGE, RAGE, antigen iz linije melanocitnog melanoma, kao što su gp100, gp75, mda-7, tirozinaze ili tirozinaza povezanog proteina; antigen iz karcinoma bubrežnih ćelija, 5T4, SM22-alfa, karbonsku anhidrazu I, karbonsku anhidrazu IX (takođe poznatu kao G250), faktore koji se mogu indukovati hipoksijom (opciono, HIF-1 alfa ili HIF-2alfa), VEGF ili membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA), antigen specifičan za prostatu (PSA), fosfati prostatne kiseline, šest-transmembranski epitelijalni antigen iz prostate (STEAP), NKX3.1, epitop proteina/peptida koji su dobijeni iz gena koji su mutirali u tumorskim ćelijama ili gena transkribovanih na različitim nivoima u tumoru u odnosu na normalne ćelije, kao što su enzima telomeraze, survivina, mezotelina, mutiranog ras, bcr/abl rearanžmana, Her2/neu, mutiranog ili divljeg-tipa p53, citohroma P4501B1, nenormalno eksprimiranih intronskih sekvenci kao što su N-acetilglukozaminiltransferaze-V; klonalni rearanžmani imunoglobulinskih gena koji generišu jedinstvene idiotipove u mijelom ili limfom B-ćelijama; epitop proteina/peptida koji su dobijeni tokom onkovirusnih procesa, kao što su proteina E6 ili E7 iz humanog papiloma virusa; nemutirane onkofetalne proteine sa tumor-selektivnom ekspresijom, kao što su karcinoembrionskog antigena ili alfa-fetoproteina, antigen izveden iz virusa, kao što su antigena iz HIV ili SIV, polipeptida adenovirusa, polipeptida alfavirusa, polipeptida kalicivirusa, npr., antigen iz kapsida kalicivirusa, polipeptida koronavirusa, polipeptida distemper virusa, polipeptida Ebola virusa, polipeptida enterovirusa, polipeptida flavivirusa, polipeptida hepatitis virusa (AE), npr., antigen iz srži ili površine

1

hepatitisa B, ili glikoproteini E1 ili E2 iz virusa hepatitisa C, srž, ili ne-strukturni proteini, polipeptida herpesvirusa, npr., glikoprotein iz herpes-simpleks virusa ili virusa varicella-zoster, polipeptida virusa imunodeficijencije, npr., omotač ili proteaza virusa humane imunodeficijencije, polipeptida virusa infektivnog peritonitisa, polipeptida virusa influence, npr., hemaglutinin, neuraminidaza influence A; ili nukleoprotein polipeptida virusa leukemije, polipeptida Marburg virusa, polipeptida ortomiksovirusa, polipeptida papiloma virusa, polipeptida virusa parainfluence, npr., hemaglutinin/neuraminidaza, polipeptida paramiksovirusa, polipeptida parvovirusa, polipeptida pestivirusa, polipeptida pikorna virusa, npr., polipeptida kapsida poliovirusa, polipeptida virusa boginja, npr., polipeptida vakcinija virusa, polipeptida virusa besnila, npr., glikoprotein G virusa besnila, polipeptida reovirusa, polipeptida retrovirusa, ili polipeptida rotavirusa.

9. Kombinacija koja obuhvata vektorsku česticu lentivirusa pseudotipa prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu ta kombinacija ima IU od najmanje 10<5>/mL.

10. Sistem pakovanja vektora lentivirusa za proizvodnju neintegrišuće vektorske čestice lentivirusa pseudotipa prema bilo kom od zahteva 1-8, koji obuhvata ćeliju za pakovanje koja obuhvata (a) nukleinsku kiselinu koja kodira nefunkcionalnu integrazu; (b) vektorski genom lentivirusa koji obuhvata mutaciju ili deleciju 3’ LTR-bližeg polipurinskog niza (PPT) koja čini taj PPT nefunkcionalnim; i (c) ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji kodira glikoprotein omotača nekog arbovirusa.

11. Sistem pakovanja vektora lentivirusa prema zahtevu 10, gde:

(a) nukleinska kiselina koja kodira nefunkcionalnu integrazu obuhvata mutaciju koja je odabrana iz grupe koju čine D64E, D64V, D116N, N120K, Q148A, W235E, K264R, K266R, K273R, i njhove kombinacije, a

(b) 3’ LTR-bliži polipurinski niz koji obuhvata (i) deleciju polipurinskog niza koja čini taj PPT nefunkcionalnim ili (ii) jednu ili više mutacija u 5' polovini polipurinskog niza koja čini taj PPT nefunkcionalnim i/ili (iii) mutaciju na 3’ kraju polipurinskog niza koja čini taj PPT nefunkcionalnim.

12. Sistem pakovanja vektora lentivirusa prema zahtevu 10 ili 11, gde nukleinska kiselina koja kodira nefunkcionalnu integrazu obuhvata D64V mutaciju, a vektorski genom lentivirusa obuhvata deleciju 3’ LTR-bližeg polipurinskog niza (PPT).

1

13. Postupak za pripremanje vektorske čestice lentivirusa pseudotipa prema bilo kom od zahteva 1-8, ili kombinacije prema zahtevu 9, koji obuhvata uzgajanje ćelije za pakovanje prema zahtevu 10.

14. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa prema bilo kom od zahteva 7 ili 8 za upotrebu u lečenju čoveka ili životinje.

15. Vektorska čestica lentivirusa pseudotipa ili kombinacija za upotrebu prema zahtevu 14 za indukovanje antigen-specifičnog imunog odgovora, opciono humoralnog odgovora i/ili ćelijskog odgovora, ili za lečenje tumora.

16. Terapeutska ili profilaktička vakcina koja obuhvata vektorsku česticu lentivirusa pseudotipa prema bilo kom od zahteva 7 ili 8 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

1