Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS58080B1 - Terapeutske vakcine protiv hpv16 - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS58080B1 - Terapeutske vakcine protiv hpv16 - Google Patents

Terapeutske vakcine protiv hpv16

Info

Publication number
RS58080B1
RS58080B1 RS20181369A RSP20181369A RS58080B1 RS 58080 B1 RS58080 B1 RS 58080B1 RS 20181369 A RS20181369 A RS 20181369A RS P20181369 A RSP20181369 A RS P20181369A RS 58080 B1 RS58080 B1 RS 58080B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
vector
polypeptide
nucleic acid
vaccine
hpv
Prior art date
Application number
RS20181369A
Other languages
English (en)
Inventor
Evelien M Bunnik
Jerôme H H V Custers
Gerrit Ch Scheper
Koen Oosterhuis
Taco Gilles Uil
Selina Khan
Original Assignee
Janssen Vaccines & Prevention Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52020908&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58080(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Janssen Vaccines & Prevention Bv filed Critical Janssen Vaccines & Prevention Bv
Publication of RS58080B1 publication Critical patent/RS58080B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na tehničku oblast iz medicine, a naročito na konstrukte nukleinske kiseline i na polipeptid koji mogu da se koriste u terapeutskim vakcinama protiv humanog papiloma-virusa tipa 16.
Pozadina pronalaska
[0002] Porodica humanih papiloma-virusa (HPV) obuhvata više od 100 tipova (takođe označenih kao pod-tipovi) koji mogu da inficiraju keratinocite kože ili sluzokože. Preko 40 tipova HPV se tipično prenose preko seksualnog kontakta, a HPV-infekcije anogenitalnog regiona su veoma rasprostranjene kod muškaraca i žena. Neki seksualno prenosivi HPV tipovi mogu da uzrokuju genitalne bradavice. Uporne infekcije sa HPV tipovima "visokogrizika" (na primer, tipovi 16, 18, 31, 45) – koji su različiti od onih koji uzrokuju kožne bradavice – mogu da se pretvore u pre-kancerozne lezije i invazivne tipove raka, na primer rak vrata materice, vulve, vagine, penisa, orofarinksa i anusa. Većina HPV infekcija se spontano izgubi tokom jedne do dve godine nakon infekcije. Kod zdravih pojedinaca Th1- i Th2-tip CD4+ T-ćelije, koje cirkuliraju i koje su specifične za viralne rane belančevine E2, E6 i E7 iz HPV-16 kao i E6-specifične CD8+ T-ćelije, migriraju u kožu nakon izazova sa antigenom, koje pokazuje da je uspešna odbrana protiv HPV-16 infekcija uobičajeno povezana sa odgovorom sistemskih efektorskih T-ćelija protiv pomenutih viralnih ranih antigena. Kod malog broja (∼1%) inficiranih pojedinaca, HPV infekcija je uporna, a to na kraju dovede do pojave genitalnih neoplastičnih lezija. Među visoko-rizičnim tipovima HPV, HPV16 i HPV18 predstavljaju glavni uzrok raka vrata materice, a zajedno uzrokuju oko 70% slučajeva, uz to šta ova dva tipa takođe igraju glavnu ulogu kod ostalih tipova raka koji su indukovani sa HPV poput raka anusa i orofaringealnog raka. Širom sveta, HPV je jedan od najvažnijih infektivnih agenasa koji uzrokuju rak.
[0003] Vakcinacija (pelcovanje) protiv HPV se smatra izvodljivom strategijom koja smanjuje incidenciju ili utiče na infekciju sa HPV (van der Burg & Melief, 2011, Curr Opinion Imunol 23: 252-257).
[0004] Profilaktičke HPV-vakcine na bazi čestica sličnih virusu (VLP), formiranih uz pomoć (omotač) belančevine L1 iz HPV tipa 16 i 18, su veoma efikasne kod prevencije upornih infekcija i povezanih bolesti uzrokovanih sa HPV16 i HPV18. Veruje se da ove vakcine obezbeđuju sterilnu imunost zbog indukcije neutralizujućih antitela protiv L1-belančevina. Dodavanje VLP na bazi L1 iz dodatnih visoko-rizičnih HPV tipova može dodatno da poveća opseg zaštite koju donose takve vakcine.
[0005] Međutim, dok takve vakcine mogu da spreče inicijalnu infekciju (tj., dovode do profilakse), nema dokaza o korisnom efektu na uspostavljenim genitalnim lezijama uzrokovanim uz pomoć HPV16 i HPV18 pa se pomenute ne smatraju terapeutskim vakcinama protiv HPV (Hildesheim et al., 2007, JAMA 298: 743-53).
[0006] Unatoč uvođenju pomenutih profilaktičkih vakcina, veliki broj ljudi je već zaražen sa ili pokazuje rizik od zaraze sa visoko-rizičnim HPV infekcijama pa su, prema tome, izloženi riziku dobijanja raka. Terapeutske vakcine namenjene iskorenjivanju uspostavljenih HPV-infekcija i povezanih bolesti su hitno potrebne u medicini.
[0007] Neki pokušaji da se ova potreba zadovolji su već opisani. Na primer, klinička ispitivanja su provedena primenom brojnih strategija vakcinacije, poput fuzione-belančevine koja se sastoji od belančevine toplotnog šoka (heat shock, Hsp) iz Mycobacterium bovis i E7 iz HPV-16 ili se sastoje od fuzione-belančevine E6, E7 i L2 iz HPV-16 i HPV-18, himernih L1-E7 VLP, rekombinantnih vaccinia-virusa koji eksprimiraju E6 i E7 iz HPV-16 i HPV-18 ili kravljeg papiloma-virusa E2, DNA vakcina koje eksprimiraju CTL-epitope iz E6 i E7 iz HPV-16 i HPV-18, živih-usporenih monocitogena iz roda Listeria (Lm) koji izlučuju E7-antigen iz HPV-16, i sintetičkih dugih-peptida (SLP) koji obuhvataju E6- i E7-peptid iz HPV-16. Dok neki od ovih pristupa pokazuju nekakvu, ali ograničenu, kliničku efikasnost, najveći deo njih je propao, koje pokazuje da je poboljšanje sadašnjih strategija potrebno.
[0008] Integracija ranih HPV-belančevina, E6 i E7, je neophodan korak na putu od infekcije do raka, a kontinuirana ekspresija E6 i E7 je potrebna za održavanje neoplastičnog fenotipa tumorskih ćelija vrata materice. E6 i E7 se, prema tome, smatraju dobrim metama za terapeutsku vakcinaciju. Kao šta je već pomenuto, neke studije su pokazale da terapeutska vakcinacija žena inficiranih sa visoko-rizičnim HPV može da indukuje regresiju postojećih lezija. Kenter et al. su pokazali trajnu i potpunu regresiju kod 47% pacijentica koje boluju od vaginalne intraepitelne neoplazije (VIN) primenom SLP izvedenih iz E6 i E7 belančevina iz HPV16 i dodatka (terapeutska vakcina; Kenter et al., 2009, N Engl J Med 361: 1838-47). Slično, jedna studija u kojoj je vakcina na bazi belančevina (TA-CIN, koja se sastoji od fuzione-belančevine iz E6, E7 i L2 iz HPV16) bila kombinovana sa lokalnom imunomodulacijom u 2/3 pacijenata sa VIN je dovela do potpune regresije kod 63% pacijentica (Daayana et al., 2010, Br J Cancer 102: 1129-36). Mogući nedostaci sintetičkih dugih-peptida koji se koriste kao vakcina uključuju (ne)mogućnost proizvodnje na industrijskoj skali i troškove povezane sa tom proizvodnjom, potrebu za potencijalno reaktogenim dodatkom i pripadajuće nus-pojave zbog imunizacije (posebno bol i oticanje). Zbog visokog nivoa neugodnosti nije verovatno da će se SLP koristiti u ranoj fazi bolesti kada se zna da je stopa spontanog gubitka infekcije visoka. Slično, zbog potrebe lokalnog tretmana sa imikvimodom u slučaju primene TA-CIN tretmana, tolerabilnost je značajan stavak kod većine žena koje su doživele lokalne i sistemske nus-pojave koje su trajale tokom primene tretmana sa imikvimodom, koje može da utiče na dnevne aktivnosti.
[0009] Moguća alternativa je primena vakcinacije na bazi nukleinskih kiselina poput DNA-vakcina ili viralnih vakcina koje kodiraju E6 i/ili E7 belančevinu iz HPV.
[0010] Međutim, pomenute E6 i E7 belančevine iz HPV imaju onkogeni potencijal pa tako vakcinacija sa vakcinama koje sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju pomenute belančevine donosi rizik izazivanja ćelijske transformacije zbog mogućnosti produžene ekspresije samih antigena.
[0011] Prema tome, u slučaju genetičke vakcinacije, ne-onkogene/detoksificirane verzije E6 i/ili E7 mogu da se koriste sa ciljem da se isključi bilo koji rizik ćelijske transformacije usled vakcinacije. Gubitak onkogenog potencijala divljeg-tipa E6 i E7 se uobičajeno postiže uz pomoć delecije i/ili supstitucije ostataka za koje se zna da su važni za funkcioniranje pomenutih belančevina (na primer, Smahel et al., 2001, Virology 281:231-38; Yan et al., 2009, Vaccine 27: 431-40; Wieking et al., 2012, Cancer Gene Ther 19: 667-74; dokument WO 2009/106362). Međutim, nedostatak ovih pristupa je taj šta nose rizik od odstranjivanja važnih epitopa i/ili unose nove i nepoželjne epitope u pomenute belančevine koje prepoznaju T-ćelije, pa prema tome ne moraju da dovedu do željenog imuno-odgovora.
[0012] U jednoj alternativnoj strategiji za odstranjivanje onkogenog potencijala E6 i E7 iz HPV16 su konstruirane ispremeštane verzije (tj. polipeptid u kojima su fragmenti divljeg-tipa belančevina drugačije raspoređeni) E6 i E7 belančevina (na primer, Öhlschläger et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93; Oosterhuis et al., 2011, Int J Cancer 129: 397-406; Oosterhuis et al., 2012, Hum Gen Ther 23: 1301-12). Međutim, ovi pristupi još uvek zahtevaju proizvodnju, formulaciju i administriranje više molekula kako bi se obezbedilo uključivanje svih mogućih epitopa iz E6 i E7 belančevina, koje rezultuje pod-optimalnom logistikom i relativno visokim troškovima, a štaviše opisane strategije uvode potencijalno snažne ne-prirodne epitope koji nisu prisutni u E6 i E7, a budući da imuno-odgovori mogu da se dobiju na osnovu relevantnih E6/E7-epitopa u odnosu na pomenute ne-prirodne epitope, opisani konstrukti ne mogu da poseduju optimalne imunološke karakteristike.
[0013] Tako, stanje tehnike ima potrebu od razvijanja terapeutskih vakcina protiv HPV, koje preferirano pokazuju manje nedostataka u odnosu na malopre opisane pristupe.
Rezime pronalaska
[0014] Ovaj pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptid koji sadrže praktično (tj. u suštini) sve moguće epitope za onko-belančevine E6 i E7 iz HPV16 koje mogu da prepoznaju T-ćelije, ali bez obzira na to poseduju značajno smanjenu (u odnosu na divlji-tip E6 i E7), do tačke ispod detektabilnosti, transformacionu aktivnost, tako da sadrže fragmente iz E6 i E7 belančevina koji su ispremeštani, uz to da istovremeno sadrže minimalan broj neželjenih novih epitopa. Ovo je suprotno onom šta nude molekuli koji su prethodno opisani od drugih.
[0015] Ovaj pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji obuhvata sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID Br.: 1.
[0016] Kodirani polipeptid može dodatno da sadrži i vodeću(leader)-sekvencu.
[0017] U nekim izvedbama, kodirani polipeptid dodatno sadrži najmanje jedan epitop iz E2 belančevine iz humanog papiloma-virusa (HPV), na primer E2 belančevina iz HPV16. Pomenuta E2 belančevina može da bude mutirana sa ciljem da se smanji DNA vezanje, na primer, uz pomoć delecije ili mutacije(a) u njenom domenu koji veže DNA. U nekim izvedbama, kodirani polipeptid obuhvata sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID Br.: 3 ili SEQ ID Br.: 5.
[0018] U nekim izvedbama, pomenuta sekvenca nukleinske kiseline je kodon-optimizovana, na primer tako da može da se eksprimira u ljudskim ćelijama.
[0019] U drugim izvedbama, pomenuta sekvenca nukleinske kiseline obuhvata sekvencu koja je prikazana u SEQ ID Br.: 2, SEQ ID Br.: 4 , ili SEQ ID BR.: 6.
[0020] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom, u kojem pomenuta sekvenca koja kodira polipeptid je operativno spojena na neki promotor.
[0021] U nekim izvedbama, pomenuti vektor je DNA-vektor poput nekog plazmida. U drugim izvedbama, pomenuti vektor je neki viralni vektor, poput MVA-vektor ili neki rekombinantni adenoviralni vektor. U nekim preferiranim izvedbama, pomenuti vektor je neki rekombinantni adenovirus.
[0022] U nekim izvedbama, pomenuti promotor u vektoru je operativno spojen sa represoroperatorsku sekvencu, na koju može da se veže represorska belančevina sa ciljem da zaustavi ekspresiju promotora u prisustvu pomenute represorske belančevine. U drugim izvedbama, pomenuta represor-operatorska sekvenca je TetO-sekvenca ili CuO-sekvenca.
[0023] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa ovim pronalaskom, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.
[0024] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje vakcinu u skladu sa ovim pronalaskom namenjenu za upotrebu kod izazivanja imuno-odgovora protiv HPV, a naročito protiv HPV16, u nekom subjektu. U nekim izvedbama, pomenuta vakcina se administrira pomenutom subjektu više puta.
[0025] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje vakcinu u skladu sa ovim pronalaskom namenjenu za upotrebu u tretmanu: uporne HPV-infekcije (naročito uporne HPV16-infekcije), vaginalne intraepitelne neoplazije (VIN), cervikalne intraepitelne neoplazije (CIN), vaginalne intraepitelne neoplazije (VaIN), analne intraepitelne neoplazije (AIN), raka vrata materice (poput karcinoma skvamoznih ćelija vrata materice (SCC), orofaringealnog raka, raka penisa, raka vagine ili raka anusa u nekom subjektu.
[0026] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid koji ima sekvencu koja je navedena u SEQ ID Br.: 1, SEQ ID Br.: 3, ili SEQ ID Br.: 5.
Kratki opis Slika
[0027]
Sl. 1. Ekspresija fuzionih-belančevina E6 i E7 iz HPV16. HEK-293T ćelije su prolazno transfektovane sa DNA-vektorima koji eksprimiraju transgene koji su navedeni na slici. 24 h nakon transfekcije, ćelije su sakupljene, a ćelijski ekstrakti su analizirani primenom SDS-PAGE i western-blotinga uz pomoć antitela protiv E7 iz HPV16 (gornji panel). Kontrola nanošenja koja pokazuje NF-kB (donji panel) potvrđuje slično nanošenje ćelijskih lizata u svim linijama. Marker za molekularnu masu je prikazan na levoj strani. Očekivane veličine fuzionih-belančevina: E6E7SH pribl. 38 kDa; E2E6E7SH i E6E7E2SH pribl.75 kDa, LSE2E6E7SH pribl.78 kDa.
Sl. 2. Formiranje kolonija u mekom agaru. A) Shematski prikaz dizajna ogleda sa mekim agarom. B) Reprezentativne mikroskopske slike (kod povećanja od 40x) ćelija u agaru šest sedmica nakon kultiviranja. Bele strelice pokazuju kolonije koje su primećene kod ćelija koje su bile transfektovane sa E7wt. C) Kvantifikovanje kolonija šest sedmica nakon kultiviranja u agaru primenom Gelcount™ i pripadajućeg programa. *: p<0.05 (model Poisson-ove regresije); **: neinferiornost (generalizovani linearni model sa marginama neinferiornosti od 5%).
Sl. 3. E6E7SH je izgubila aktivnosti E6 i E7. A) Reprezentativan western-blot koji pokazuje odsutnost degradacije p53 uz pomoć E6E7SH. Humane p53-null NCIH1299 ćelije kao šta su bile ko-transfektovane sa plazmidom koji eksprimira p53 zajedno sa plazmidom koji eksprimira divlji-tip E6 iz HPV16, E6E7SH ili sa praznim vektorom. Ne-TF ukazuje na ne-transfektovane ćelije. Ćelijski lizati su pripremljeni 24 h nakon transfekcije, a 30 µg ukupnih belančevina je naneseno na gel. Gornji panel – p53 bojanje, srednji panel – E6 bojanje, donji panel – NF-kB bojanje (kontrola nanošenja). (B) Kvantifikovanje nivoa p53 u četiri nezavisna ogleda. p53-signal je normalizovan prema NF-κB signalu. C) Western-blot koji pokazuje odsustvo degradacije pRb od strane E6E7SH. pRb-null Saos-2 ćelije su transfektovane sa plazmidom koji eksprimira pRb zajedno sa plazmidom koji eksprimira divlji-tip E7 iz HPV16, E6E7SH ili sa praznim vektorom. Ne-TF ukazuje na ne-transfektovane ćelije. Ćelijski lizati su pripremljeni 24 h nakon transfekcije, a 10 µg ukupnih belančevina je naneseno na gel. Gornji panel – pRb bojanje, srednji panel – E7 bojanje, donji panel – NF-κB bojanje (kontrola nanošenja). D) Kvantifikovanje nivoa pRb u četiri nezavisna ogleda. pRb-signal je normalizovan prema NF-κB signalu. *: p<0.05 (ANOVA modeli); **: neinferiornost (testiranje na bazi 95% CI izvedenog iz ANOVA modela. margine neinferiornosti su bile podešene na 75%).
Sl. 4. E6E7SH ne imortalizuje primarne humane epidermalne keratinocite.
Primarni humani epidermalni keratinociti su transdukovani sa lentivirusima koji kodiraju divlji-tip E6 i E7 koji kodiraju otvoreni okvir čitanja iz HPV16 (E6E7wt), E6E7SH sekvencu ili eGFP. Ne-transdukovane donorske ćelije su korišćene kao kontrola. Samo ekspresija E6E7wt indukuje imortalizovanje primarnih keratinocita kao šta je indikativno iz produženog životnog veka i hTERT aktivisanja tokom dana 200 (nije prikazano). Simbol sa krstom ukazuje da su ćelije umrle od ćelijske starosti pa ne mogu da se dalje kultivišu. Za detalje vidi primer 2. Slični rezultati su dobiveni u dva dodatna donora (nije prikazano).
Sl. 5. Imuno-odgovor indukovan uz pomoć E6E7SH nakon DNA-imunizacije – Analiza IFNγ ELISPOT. A. Shema imunizacije. Miševi soja CB6F1 su imunizovani uz pomoć DNA-plazmida koji eksprimira E6E7SH ili plazmida koji ne eksprimira transgen (kontrola). Dve sedmice nakon imunizacija miševi su žrtvovani, a izolovane ćelije slezine (splinociti) su stimulisane preko noći sa 15-mernim peptidnim zalihama koje odgovaraju E7. B. E7-specifični imuno-odgovori u pojedinačnim miševima kao šta je izmereno primenom ogleda IFNγ ELISPOT su predstavljeni kao jedinice koje formiraju mrlje (spot forming units, SFU) po 10<6>splinocita.
Sl. 6. Imunogenost E6E7SH – Analiza IFNγ ELISPOT. (A). Shema imunizacije. Miševi su imunizovani sa adeno-vektorima sa navedenim insertima. E7-specifični odgovori u periodu od dve sedmice (B) i osam sedmica (C) su analizirani primenom IFNγ ELISPOT (predstavljeno kao jedinice koje formiraju mrlje (SFU) po 10<6>splinocita). Zatvoreni krugovi predstavljaju miševe koji su bili imunizovani sa dozom od 1*10<10>vp, a otvoreni krugovi miševe koji su bili imunizovani sa 5*10<9>vp. Crna traka predstavlja geometrijsku sredinu odgovora. Isprekidana linija ukazuje na najniže ograničenje detekcije u ogledu ELISPOT. ANOVA Post-hoc Bonferroni-eva statistička analiza je provedena na log-transformiranim podacima. *: p<0.05. Za detalje vidi primer 3.
Sl. 7. Imunogenost E2E6E7SH – Bojanje E7-tetramera. (A). Shema imunizacije. Miševi soja CB6F1 su imunizovani sa 1*10<10>vp adeno-vektora koji eksprimiraju navedene transgene. Dve sedmice nakon imunizacije, miševi su žrtvovani, a izolovani splinociti su analizirani sa ciljem pronalaženja CD8+ ćelija koje su sposobne da interreaguju sa E749-57-H2-Db tetramerima (B). Procenat CD8+ T-ćelija koje su bile pozitivne na E7-tetramer je naveden na y-osi. ANOVA Post-hoc Bonferroni-eva statistička analiza je provedena na log-transformiranim podacima, a razlike između različitih E6E7SH varijanata nisu bile statistički značajne.
Sl. 8. Imunogenost E2E6E7SH – Analiza IFNγ ELISPOT. (A). Shema imunizacije. Miševi soja CB6F1 su imunizovani sa adeno-vektorima koji eksprimiraju transgene koji su navedeni ispod panela B i C. Dve sedmice nakon imunizacije, miševi su žrtvovani, a izolovani splinociti su stimulisani tokom noći sa 15-mernim peptidnim zalihama koje odgovaraju E2 (B), E6 (nije prikazano) ili E7 (C). Odgovori su predstavljeni kao SFU na 10<6>splinocita. ANOVA Post-hoc Bonferroni-eva statistička analiza je provedena na log-transformiranim podacima. E2-odgovor uzrokovan adeno-vektorima koji kodiraju samo E2 je veći od odgovora koji uzrokuju polipeptidi iz ovoga pronalaska koje uključuje E6 i E7 fragmente. Razlika je značajna za E2 naspram E2E6E7SH i E2 naspram E6E7E2SH (*: p<0.05). ANOVA Post-hoc Bonferroni-eva statistička analiza je provedena na log-transformiranim podacima.
Sl. 9. Odgođeni odgovori u imunizovanim miševima. (A) Shema imunizacije. Miševi soja CB6F1 su imunizovani sa 1*10<10>vp Ad35-vektorima koji eksprimiraju varijante LSE2E6E7SH, E2E6E7SH, E6E7SH, ili sa adeno-vektorom koji ne eksprimira transgen (Prazan tj. Empty). Krvni primerci su uzimani svake dve sedmice sa ciljem da se odredi procenat E7-specifičnih CD8+ T-ćelija uz pomoć bojanja tetramera. (B) Imuno-odgovori u periodu od dve sedmice nakon imunizacije. Vektor koji sadrži vodeću-sekvencu je uzrokovao najjači odgovor ako se uporedi sa vektorima bez vodeće-sekvence; LSE2E6E7SH naspram E2E6E7SH (*: p<0.05). (C) Kinetika odgovora. ANOVA Post-hoc Bonferroni-eva statistička analiza je provedena na log-transformiranim podacima iz grupe podataka za period od jedne sedmice. E7-odgovor uzrokovan sa molekulima koji sadrže E2 je uglavnom veći od onog kod molekula bez E2, mada rezultati nisu bili statistički značajni.
Sl. 10. Upotreba različitih adenoviralnih vektora sa ciljem da se pojačaju imunoodgovori. (A). Shema imunizacije. Miševi soja CB6F1 su imunizovani sa Ad26-vektorom koji eksprimira HPV16 E2E6E7SH (HPV16-Tx) ili sa Ad26-vektorom koji ne eksprimira transgen (prazan). Dve sedmice kasnije, imunizacije su ponovljene sa vektorima na bazi Ad35 kao šta je navedeno ispod slike. Četiri sedmice nakon druge imunizacije, miševi su žrtvovani, a krvni primerci su korišćeni sa ciljem da se odredi procenat E7-specifičnih CD8+ T-ćelija uz pomoć bojanja tetramera (B). * pokazuje uporedbu Ad26.HPV16-Tx/Ad35.HPV16-Tx naspram Ad26.HPV16-Tx/Ad35.Empty, p<0.05 (Student-ov t-test na log-transformiranim podacima, sa alfa = 0.01 za multiple uporedbe).
Sl. 11. Ćelijska imunogenost E2E6E7SH u rezuz makaki (Macaca mulatta). (A) Shema imunizacije. Rezuz makaki su imunizovani tokom dana 0: Osam životinja je primilo Ad26.HPV16-E2E6E7SH, a dve kontrolne životinje su primile Ad26.Empty primenom intramišićne imunizacije (i.m). pojačana-imunizacija je dana (Ad26.HPV16-E2E6E7SH ili Ad26.Empty) tokom perioda od 8 sedmica. Tokom perioda od 16 sedmica, životinje su primile drugu pojačanu-imunizaciju sa Ad35-vektorima koji eksprimiraju isti E2E6E7SH, dok su kontrolne životinje primile Ad35.Empty. Doza adeno-vektora je bila 1*10<11>vp po imunizaciji. Krvni razmazi su provedeni tokom nekoliko vremenskih tačaka. (B) Ćelijski imuno-odgovori u PBMC
1
su izmereni primenom IFNγ ELISPOT. PBMC su stimulisani sa peptidnim zalihama koje odgovaraju HPV16 E2, E6 ili E7, a prikazan je broj jedinica koje formiraju mrlje (SFU) u 1*10<6>PBMC. Prazna kontrolna životinja (n=2) nije pokazala bilo kakav detektabilan odgovor. Za detalje vidi primer 4.
Sl. 12. Terapeutski efekt adeno-vektora koji eksprimiraju HPV16-E2E6E7SH.
(A) TC-1 injekcija i shema imunizacije. Miševi soja CB6F1 su injektirani supkutano sa 1*10<5>TC-1 ćelija tokom dana 0. Nakon šest dana, kada su tumori mogli da se opipaju, miševi su imunizovani sa dva SLP koja pokrivaju E6 i E7 imuno-dominantne epitope iz HPV16 (tj., HPV16 E6, aa41-65 (KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN; SEQ ID Br.: 18) i HPV16 E7, aa43-77 (GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR; SEQ ID Br.: 19)) kod 150 µg finalnog volumena od 200 µl 0.9% slanog rastvora koji je bio obogaćen sa 5 nmol ODN1826-CpG (B) ili Ad26.HPV16-E2E6E7SH (C). Kontrolni miševi su primili samo CpG (D) ili Ad26.Empty (E). Svi miševi su primili pojačanu-imunizaciju tokom dana 20. Miševi koji su primili Ad26-vektore u primarnoj imunizaciji su naknadno imunizovani sa odgovarajućim Ad35-vektorima. Ostali miševi su primili SLP obogaćen sa CpG ili samo sa CpG kao i u primarnim imunizacijama. (BE) Merenje tumora kod TC-1 injektiranih miševa. Volumen tumora je izračunat kao (širina<2>* duljina)/2. Miševi su žrtvovani kada su volumeni tumora prešli 1000 mm<3>. Dva miša su morala biti žrtvovana zbog gubitka težine od više od 20% (označeno sa zvezdama). (F-G) Zatvaranje panela B i C za prvih 35 dana. (H) Preživljenje nakon TC-1 injekcije. Preživljenje miševa tretiranih sa Ad.HPV16-E2E6E7SH je značajno povećano ako se uporedi sa miševima imunizovanim sa SLP i CpG (Log-rank test p<0.05). Tri miša imunizovana sa Ad.HPV16-E2E6E7SH nisu imala tumore na kraju eksperimenta (tokom dana 92).
Sl. 13. Adenoviralni vektori koji nose transgene koji kodiraju HPV Ag ili LSE2E6E7SH pokazuju povećane viralne prinose u ćelijama koje mogu da zaustave transgenu ekspresiju. A) Ogled viralnog prinosa za Ad35-vektore. PER.C6, PER.C6/CymR, i PER.C6/TetR ćelije su inficirane sa Ad35-vektorima koji nose transgene koji kodiraju GFP-Luc ili HPVAg. Ovi transgeni su pod kontrolom CMV-promotora koji sadrže CuO ili TetO. Viralni prinosi su određeni četiri dana nakon infekcije primenom Ad35 hekson-specifičnog postupka na bazi qPCR. B) Ogled viralnog prinosa za Ad26-vektore. PER.C6 i PER.C6/TetR ćelije su inficirane sa Ad26-vektorima koji nose transgene koji kodiraju GFP-Luc, HPVAg, ili LSE2E6E7SH, koji su pod kontrolom CMV-promotora koji sadrži TetO. Viralni prinosi su određeni tri dana nakon infekcije primenom Ad26 hekson-specifičnog postupka na bazi qPCR. Za detalje vidi Primer 6.
Sl. 14. Primena represorskog sistema sa ciljem zaustavljanja ekspresije transgena tokom proizvodnje vektora onemogućava nestabilnost transgene kasete u adeno-viralnom vektoru koji nosi transgen koji kodira HPVAg. Ad35-vektor koji eksprimira HPVAg pod kontrolom CMVCuO je spašen primenom DNA-transfekcije u ćelijskoj liniji PER.C6 ili PER.C6/CymR. Nastali viralni plakovi su sakupljeni – pet po ćelijskoj liniji – pa su korišćeni za konsekutivne runde inficiranja odgovarajućih ćelijskih linija. A) Analiza integriteta vektorskog regiona sa transgenom kasetom uz pomoć PCR nakon 10 viralnih pasaža. PCR-produkti dobiveni iz viralnih izolata pasažiranih u ćelijskim linijama PER.C6 i PER.C6/CymR su prikazani u srednjem i desnom panelu. PCR-produkti pune duljine koji su dobiveni za PER.C6-pasažirane viralne izolate 1, 2, 4, i 5, i oni primećeni za PER.C6/CymR-pasažirane izolate 1 do 5 su analizirani primenom Sanger-ove metode DNA-sekvenciranja. Analiza hromatogramskih tragova (nije prikazano) je otkrila da su svi izolati uzgojeni na PER.C6, ali ne i oni uzgojeni na PER.C6/CymR, sadržavali male delecije pomaka okvira čitanja ili mutacije preuranjenog zaustavljanja unutar kodirajuće sekvence HPVAg. B) Analiza sposobnosti vektora da eksprimiraju HPVAg nakon sedam viralnih pasaža. A549-ćelije su transdukovane sa viralnim izolatima uzgojenim u ćelijskim linijama PER.C6 i PER.C6/CymR, a HPVAgekspresija je analizirana primenom western-blot analize uz korišćenje antitela koje je bilo specifično za E7 iz HPV16. Predviđena veličina HPVAg je 83 kDa. Za detalje vidi Primer 6.
Detaljan opis pronalaska
[0028] Ovaj pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji obuhvata SEQ ID Br.: 1. Pomenuti polipeptid je fuzioni polipeptid, a ponekad je ovde označen kao polipeptid iz ovoga pronalaska, ili fuzioni polipeptid iz ovoga pronalaska. Ovaj polipeptid je namenjen izazivanju imuno-odgovora protiv E6 i E7 belančevina iz HPV16, pa prema tome pomenuti molekul nukleinske kiseline može da se koristi kao terapeutska vakcina sa ciljem da se spreči uporna HPV16 infekcija, i bolesti povezane sa njom.
[0029] Polipeptid iz ovoga pronalaska je pažljivo dizajnirani molekul koji sadrži praktično kompletne amino-kiselinske sekvence E6 i E7 iz HPV16 (nedostaje im samo jedna aminokiselina sa C-terminusa iz nativne E6 belančevine iz HPV16) u formi fragmenata koji su preuređeni i delimično se preklapaju tako da su (praktično) prisutni svi epitopi E6 i E7 belančevina iz HPV16 koje mogu da prepoznaju T-ćelije. Raniji molekuli sa nekim potencijalom HPV-vakcina su opisani od drugih autora (na primer, Kenter et al., 2009, N Engl J Med 361: 1838-47; Daayana et al., 2010, Br J Cancer 102: 1129-36; Smahel et al., 2001, Virology 281: 231-38; Yan et al., 2009, Vaccine 27: 431-40; Öhlschläger et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93; Oosterhuis et al., 2011, Int J Cancer 129: 397-406; EP1183368, dokument WO 2013/083287), ali svaki od pomenutih molekula ima jedan ili više nedostataka. Dizajnirani polipeptidni molekuli iz ovoga pronalaska donose prednost u barem jednom, a tipično u nekoliko aspekata ako se uporede sa ranije opisanim pristupima. Naročito, prednosti molekula i/ili vektora iz ovoga pronalaska uključuju: (i) poseduju željeni bezbednosni profil, jer nukleinska kiselina pokazuje snažno smanjenu (ako se uporedi sa nativnim E6 i E7 belančevinama), do tačke nemogućnosti detektovanja, aktivnost transformiranja; (ii) to su pojedinačni molekuli nukleinske kiseline, koji mogu da se lako proizvedu na industrijskoj skali i ekonomično, pri čemu proizvodnja ne podrazumeva logističke izazove kao šta jer to slučaj kod pristupa sa multiplim molekulima; (iii) kodirani polipeptidi sadrže praktično sve epitope nativnih E6 i E7 belančevina iz HPV16 koje mogu da prepoznaju T-ćelije; (iv) dizajn kodiranih polipeptida je onemogućio uvođenje neželjenih potencijalno snažnih novih epitopa (tj. epitopa koji nisu prisutni u nativnim E6 i E7 belančevinama); i (v) u nekim izvedbama, nisu zavisni o visoko reaktogenim dodacima koji omogućavaju željeni imuno-odgovor. Tako, molekuli iz ovoga pronalaska predstavljaju veliki napredak jer kombinuju razne napredne karakteristike u jednom dizajnu, pri čemu su izvrsni kandidati namenjeni primarno za terapeutsku vakcinaciju protiv HPV16. Ovi molekuli mogu takođe (moguće) da se koriste kao profilaktičke vakcine protiv HPV16, koje znači da je verovatno da mogu da spreče uporne infekcije sa HPV16 kod vakciniranih subjekata.
[0030] U nekim izvedbama, uz pomoć pažljivog dizajna brojni novi epitopi, koji su duži od devet amino-kiselina sa predviđenim vezinim afinitetom <50 nM za 20 najčešćih HLA-A, 20 najčešćih HLA-B i 20 najčešćih HLA-C alela, su svedeni na samo 1. Ovo je značajno
1
poboljšanje u odnosu na konstrukte koje su opisali drugi autori, gde je za jednu preuređenu E6-belančevinu već bilo prisutno više od 30 takvih novih epitopa, zbog čega će takvi konstrukti verovatno sadržavati još nekoliko novih epitopa u sekvencama koje su pridodane pomenutim konstruktima kako bi se sprečio gubitak epitopa (Öhlschläger et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93). Tako, konstrukti iz ovoga pronalaska imaju značajno poboljšani imunološki profil jer su promene već izmenjenog imuno-odgovora, upoređeno sa nativnim E6 i E7, svedene na minimalan u molekulima iz ovoga pronalaska, ako se uporedi sa pristupima koje su opisali drugi autori.
[0031] Stručnjak primenom rutinskih tehnika može da izvrši nukleotidne supstitucije koje ne utiču na sekvencu polipeptida koja je kodirana sa polinukleotidima za koje se zna da odražavaju upotrebu kodona bilo kojeg domaćina u kojem se pomenuti polipeptidi eksprimiraju. Prema tome, osim ako je drugačije navedeno, "nukleotidna sekvenca koja kodira neku amino-kiselinsku sekvencu" uključuje sve nukleotidne sekvence koje su degenerativne verzije svake pomenute sekvence i koje kodiraju istu amino-kiselinsku sekvencu. Nukleotidne sekvence koje kodiraju belančevine i RNA mogu da sadrže introne.
[0032] U jednoj preferiranoj izvedbi, nukleinska kiselina koja kodira polipeptid u skladu sa ovim pronalaskom je kodon-optimizovana za ekspresiju u ćelijama sisara, preferirano u ljudskim ćelijama. Postupci za kodon-optimizovanje su poznati i već su opisani (na primer, dokument WO 96/09378). Sekvenca se smatra kodon-optimizovanom ako je barem jedan nepreferirani kodon, upoređeno sa sekvencom divljeg-tipa, zamenjen sa kodonom koji je preferiran. Ovde, ne-preferirani kodon je kodon koji se koristi ređe u nekom organizmu u odnosu na neki drugi kodon koji kodira istu amino-kiselinu, a kodon koji je više preferiran je onaj kodon koji se koristi češće u nekom organizmu u odnosu na ne-preferirani kodon. Frekvencija upotrebe kodona za neki specifični organizam može da se pronađe u tablicama sa kodonskim frekvencijama, poput stranice http://www.kazusa.or.jp/kodon. Preferirano, više od jednog ne-preferiranog kodona, na primer više od 10%, 40%, 60%, 80% ne-preferiranih kodona, preferirano najveći deo (na primer, barem 90%) ili svi ne-preferirani kodoni, su zamenjeni sa kodonima koji su više preferirani. Preferirano, u kodon-optimizovanoj sekvenci se koriste oni kodoni koji su najčešće korišćeni u nekom organizmu. Zamena sa preferiranim kodonima generalno omogućava snažniju ekspresiju.
[0033] Sekvence nukleinske kiseline mogu da se kloniraju primenom rutinskih tehnika molekularne biologije, ili mogu da se generišu de novo uz pomoć sinteze DNA, koje može da se izvede primenom rutinskih procedura od strane komercijalnih servisa koji posluju na tržištu sinteze DNA i/ili molekularnog kloniranja (na primer, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
[0034] Podrazumeva se da promene mogu da se uvedu u belančevinu, na primer, uz pomoć amino-kiselinskih supstitucija, delecija, adicija, itd., na primer, uz korišćenje rutinskih procedura molekularne biologije. Generalno, konzervativne amino-kiselinske supstitucije mogu da se primene bez da se uzrokuje gubitak funkcije ili imunogenost polipeptida. Pomenuto može da se proveri u skladu sa rutinskim procedurama koji su dobro poznati stručnjacima.
[0035] U nekim izvedbama, kodirani polipeptid u skladu sa ovim pronalaskom dodatno sadrži i vodeću-sekvencu, koja se takođe označava kao signalna sekvenca ili signalni peptid. To je kratki peptid (tipično, 5-30 amino-kiselina) koji se nalazi na N-terminusu većine novosintetizovanih belančevina koje imaju destinaciju prema sekretornim putevima. Prisutnost takve sekvence može da dovede do pojačane ekspresije i imunogenosti. Ne-ograničavajući primeri koji mogu da se koriste su IgE vodeći-peptid (vidi, na primer, dokument US 6,733,994; na primer sekvencu MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID Br.: 7)) ili HAVT20 vodeći-peptid (na primer, sekvenca MACPGFLWALVISTCLEFSMA (SEQ ID Br.: 9)). Jedan od pomenutih može opciono da se doda na N-terminus polipeptida iz ovoga pronalaska. U drugim izvedbama, polipeptid u skladu sa ovim pronalaskom ne sadrži vodećusekvencu.
[0036] Postoje različiti tipovi HPV (preko 120 tipova je identifikovano, a označeni su sa brojevima), a generalno za svaki tip koji treba da bude pokriven sa vakcinom u samoj vakcini možda treba da budu uključeni tip-specifični antigeni, mada za neke antigene može da postoji određena unakrsna reaktivnost. Tipovi 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, i 82 su karcinogeni "visoko-rizični" polovo-prenosivi HPV i mogu da uzrokuju pojavu cervikalne intraepitelne neoplazije (CIN), vulvalne intraepitelne neoplazije (VIN), vaginalne intraepitelne neoplazije (VaIN), intraepitelne neoplazije penisa (PIN), i/ili analne intraepitelne neoplazije (AIN). HPV u skladu sa ovim pronalaskom (tj. HPV iz kojeg potiču E6 i E7 fragmenti u kodiranom polipeptidu) je HPV16. Namenjen je subjektima koji su
1
inficirani sa HPV16. U nekim izvedbama takođe može prikladno da bude kombinovan sa vakcinama protiv drugih HPV tipova. U nekim izvedbama, ova kombinacija se odnosi na vakcinu protiv HPV visoko-rizičnog tipa, koji je identifikovan iznad, na primer na vakcinu protiv HPV18. U drugim izvedbama, vakcina iz ovoga pronalaska je kombinovana sa vakcinom protiv jednog ili više tipova poput HPV-18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, - 59, -68, -73, ili -82. Takve kombinacije mogu, na primer, da budu korisne kada tačan tip HPV-infekcije još nije poznat, ili ako je poželjan imuno-odgovor sa profilaktičkim efektom protiv više od jednog tipa HPV. Takođe, predviđene su kombinacije vakcina iz ovoga pronalaska sa vakcinama protiv tipova HPV koji uzrokuju genitalne bradavice, poput HPV6 i/ili HPV11. Sekvence ovih tipova HPV i kodirane belančevine (na primer, E6, E7, E2) su dostupne stručnjacima preko javnih baza podataka, poput baze sa sekvencama GenBank koju održava National Center of Technology Information (NCBI).
[0037] Polipeptid u skladu sa ovim pronalaskom obuhvata SEQ ID Br.: 1, a u jednoj izvedbi, molekul nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom obuhvata SEQ ID Br.: 2.
[0038] Sekvence u ovom opisu su obezbeđene u 5'-3' smeru ili od N- do C-terminusa, kao šta je uobičajeno u stanju tehnike.
[0039] Polipeptid u skladu sa ovim pronalaskom sadrži epitope E6 i E7 belančevina iz HPV16. U nekim izvedbama, polipeptid u skladu sa ovim pronalaskom dodatno sadrži (pa tako i nukleinska kiselina koja kodira polipeptid dodatno kodira) barem jedan dodatan antigen ili epitop(e) takvog dodatnog antigena. Takav dodatan antigen preferirano je neki HPV antigen, preferirano iz istog tipa HPV kao i E6 i E7 belančevine u polipeptidu, tj. HPV16. Takav dodatan antigen može tako da bude neka HPV belančevina ili neki njen imunogeni fragment, a u nekim izvedbama sadrži E2 belančevinu ili neki njen fragment koji obuhvata najmanje jedan epitop E2 iz HPV, preferirano iz HPV16. Takvi dodatni antigeni ili epitopi mogu da budu smešteni interno između dva fragmenta iz E6 i/ili E7 u polipeptidu koji obuhvata SEQ ID Br.: 1, ali, preferirano, pomenuti su fuzionisani N-terminalno ili C-terminalno na E6/E7 polipeptid koji obuhvata SEQ ID Br.: 1. Alternativno ili dodatno, mogu da budu prisutne i amino-kiselinske sekvence koje stimulišu imuno-odgovor. Tako, u nekim izvedbama ovaj pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom, koji kodiraju polipeptid koji obuhvata SEQ ID Br.: 1, pri čemu pomenuti polipeptid dodatno sadrži barem jedan drugi antigen, na primer, E2 belančevinu iz HPV ili
1
barem jedan njen epitop, ali preferirano više njenih epitopa. Jedna prednost dodavanja E2-antigena za ovaj instant-pronalazak je ta šta se za E2 zna da se eksprimira rano tokom infekcije u lezijama niskog stepena kada/gde je ekspresija E6 i E7 još uvek veoma niskog intenziteta. Tokom napredovanja prema cervikalnom raku, E2-ekspresija nestaje koje dovodi do porasta nivoa E6 i E7 (Yugawa & Kiyono, 2009, Rev Med Virol 19: 97-113). Kombinovanje epitopa iz E2, E6 i E7 u jednoj vakcini daje mogućnost razvoja tretmana namenjenog široj grupi ciljnih pacijenata, od onih koji imaju upornu infekciju do onih koji imaju invazivni cervikalni rak (ili drugih tipova raka uzrokovanih sa HPV16). U nekim izvedbama, E2 belančevina je divlji-tip E2 belančevine. U nekim drugim izvedbama, E2 belančevina sadrži deleciju ili jednu ili više mutacija u svojem domenu koji veže DNA (ako se uporedi sa divljim-tipom E2 belančevine). Sekvenca E2 belančevine iz HPV16 (NP_041328.1) može da se pronađe u NCBI-bazi belančevina (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) pod brojem NP_041328.1. Za nekoliko promena pojedinačnih amino-kiselina u E2, poput G293V, K299M, ili C300R u C-terminalnom delu same belančevine, je poznato da narušavaju vezanje DNA. Prednost korišćenja varijante ili fragmenta E2 kojem nedostaje DNA-vezni kapacitet je ta šta mogu da se spreći nepredvidive transkripcione promene usled direktnog vezanja na DNA ćelije-domaćina u ćelijama gde se pomenuta eksprimira. E2 belančevina ili neki njen deo ili varijanta mogu da se dodaju interno, ali preferirano je da se dodajnu na N-terminus ili C-terminus polipeptida iz ovoga pronalaska koji obuhvata SEQ ID Br.: 1. U jednoj izvedbi, molekul nukleinske kiseline iz ovoga pronalaska kodira polipeptid koji obuhvata SEQ ID Br.: 3. U jednoj izvedbi, molekul nukleinske kiseline iz ovoga pronalaska obuhvata SEQ ID Br.: 4. U drugoj izvedbi, molekul nukleinske kiseline iz ovoga pronalaska kodira polipeptid koji obuhvata SEQ ID Br.: 5. U jednoj izvedbi, molekul nukleinske kiseline iz ovoga pronalaska obuhvata SEQ ID Br.: 6.
[0040] Takođe je moguće da se dodaju dodatne fuzije na dizajnirane polipeptide iz ovoga pronalaska sa drugim belančevinama, na primer, takozvane belančevine-prenosnici, poput kalretikulina, belančevina toplotnog šoka iz Mycobacterium tuberculosis (belančevina-70, IP10) ili fragmenta C iz toksina tetanusa (za više primera vidi Oosterhuis et al., Human Gene Ther, 2012, supra) koje može dodatno da pojača imuno-odgovor na epitope E6 i E7 (i opciono E2) iz HPV. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje takve dodatne fuzione-belančevine, i nukleinske kiseline koje ih kodiraju.
1
[0041] U nekim izvedbama, molekul nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom je ugrađen u neki vektor. Pojam "vektor", kao šta se ovde koristi, tipično predstavlja prenosnik koji može veštačkim putem da prenese strani genetički materijal u drugu ćeliju, gde pomenuti genetički materijal može da se replicira i/ili eksprimira, a u skladu sa ovim pronalaskom može da bude bilo koji molekul nukleinske kiseline koji ugrađuje neki molekul nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom. Pomenuti može da se pripremi u skladu sa rutinskim tehnikama molekularne biologije poput kloniranja. Tipično, takvi vektori mogu da se pripreme u barem jednom tipu prikladnih domaćina poput bakterije, kvasca, ćelija insekata, ćelija sisara, i slično. Četiri glavna tipa vektora su plazmidi, viralni vektori, kozmidi, i veštački hromosomi. Sam vektor generalno je neka DNA sekvenca koja sadrži neki insert (transgen; u ovom pronalasku je to nukleinska kiselina koja kodira fuzioni polipeptid iz ovoga pronalaska) uz sekvencu koja služi kao "okosnica" vektora. Svrha vektora koji prenosi genetičku informaciju u drugu ćeliju je, tipično, mogućnost izolacije, umnožavanja, ili ekspresije inserta u ciljnoj ćeliji. Preferirano, sekvenca koja kodira polipeptid je operativno spojena na neki promotor u vektoru. Termin "operativno spojena" označava da je nukleotidna sekvenca od interesa spojena na promotor na način da omogućava ekspresiju pomenute nukleotidne sekvence (na primer, u ćeliji domaćina kada je vektor uveden u ćeliju-domaćin). Sekvence koje regulišu ekspresiju mogu operativno da budu spojene na transgen. U nekim izvedbama, vektori su dizajnirani za ekspresiju transgena u ciljnoj ćeliji, a generalno poseduju promotorsku sekvencu koja omogućava ekspresiju pomenutog transgena. U nekim izvedbama mogu da budu prisutni jedan ili više rutinski korišćenih vektorskih elemenata poput sekvenca koje terminiraju transkripciju, sekvenca za poliadenilaciju repa, Kozaksekvenca, raznih UTR, početaka replikacije, mesta za multiplo kloniranje, genetičkih markera, sekvenca za rezistenciju na antibiotike, i drugih sekvenca, a stručnjak može da dizajnira vektor koji poseduje željene karakteristike, na primer mogućnost da se replicira u određenim ćelijama zbog propagacije i umnožavanja samog vektora, pri čemu se eksprimira i sam transgen iz vektora u ciljnim ćelijama u koje je vektor uveden. Vektori koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira fuzioni polipeptid u skladu sa ovim pronalaskom, preferirano dizajnirani za ekspresiju u ćelijama sisara, su prikladni kao vakcine u skladu sa ovim pronalaskom. U nekim izvedbama, vektor u skladu sa ovim pronalaskom je plazmid, kozmid, kvašćev veštački hromosom, bakterijski veštački hromosom, viralni vektor, i slično. Podrazumeva se mogu da se koriste razni promotori sa ciljem postizanja ekspresije nekog gena u ćeliji domaćina. Neki dobro poznati i veoma korišćeni promotori za ekspresiju u eukariotskim ćelijama sadrže promotore izvedene iz virusa, poput adenovirusa, na primer
1
E1A-promotor, promotore izvedene iz citomegalovirusa (CMV), poput neposrednog ranog (immediate early, IE) CMV-promotora (ovde označenog kao CMV-promotor) (može da se dobije, na primer, iz pcDNA, Invitrogen), promotore izvedene iz Simijan virusa 40 (SV40) (na primer, može da se dobije iz pIRES, kat. br. 631605, BD Sciences), i slično. Prikladni promotori mogu takođe da se izvedu iz eukariotskih ćelija, poput metalotioneinskih (MT) promotora, promotora elongacijskog faktora 1α (EF-1α), promotora ubikvitina C ili UB6, aktinskog promotora, imunoglobulinskog promotora, promotora toplotnog šoka, i slično (vidi, na primer, dokument WO 2006/048459). Ne-ograničavajući primer prikladnog promotora koji omogućava ekspresiju u eukariotskim ćelijama je CMV-promotor (dokument US 5,385,839), na primer neposredni rani CMV-promotor, koji na primer obuhvata nt. -735 do 95 iz neposrednog ranog CMV-promotora/promotora za rani gen, na primer CMV-promotor koji je ovde obezbeđen u sekvenci koja je predstavljena u SEQ ID br.: 13. Signal za poliadenilaciju, na primer, poliA-signal za goveđi hormon rasta (dokument US 5,122,458), može da bude prisutan iza transgena.
[0042] Takođe mogu da se dodaju i dodatne regulatorne sekvence. Termin "regulatorna sekvenca" ovde se koristi kao sinonim sa terminom "regulatorni element", a odnosi se na neki segment nukleinske kiseline, ali koji tipično nije ograničen na DNA, koji modulira transkripciju sekvence nukleinske kiseline na koju je operativno spojen i na taj način deluje kao transkripcioni modulator. Regulatorna sekvenca često obuhvata sekvence nukleinske kiseline koje su transkripcioni vezni domeni koje prepoznaju domeni iz transkripcionih belančevina koje mogu da vežu nukleinsku kiselinu i/ili transkripcioni faktori, pojačivači i represori itd. Na primer, moguće je da se neka represorska sekvenca operativno spoji na neki promotor, pri čemu pomenuta represorska sekvenca može da bude prepoznata od strane represorske belančevine koja se na nju veže i smanjuje ili sprečava ekspresiju transgena u proizvodnoj ćelijskoj liniji koja eksprimira pomenutu represorsku belančevinu. Ovo može da poboljša genetičku stabilnost i/ili nivoe ekspresije molekula nukleinske kiseline nakon pasažiranja i/ili kada je proizvodnja u proizvodnoj ćelijskoj liniji obilna. Takvi sistemi su već opisani u stanju tehnike. Na primer, regulatorna sekvenca može da obuhvata jednu ili više operatorskih sekvenca tetraciklinskog operona (tetO), tako da je ekspresija inhibirana u prisutnosti belančevine koja može da reprimira (zaustavi) tetraciklinski operon (tetR). U odsutnosti tetraciklina, tetR-belančevina može da se veže na tetO-mesta i da reprimira transkripciju nekog gena koji je operativno spojen na tetO-mesta. U prisutnosti tetraciklina, međutim, konformaciona promena unutar tetR-belančevine sprečava pomenutu da se veže na
1
operatorske sekvence, omogućavajući transkripciju operativno spojenih gena. U nekim izvedbama, molekul nukleinske kiseline, na primer, kada se nalazi u nekom rekombinantnom adenovirusnom vektoru iz ovoga pronalaska, može opciono da obuhvata tetO-sekvencu operativno spojenu na neki promotor, tako da ekspresija jednog ili više transgena može da bude inhibirana u rekombinantnim adenovirusima koji se proizvode u proizvodnoj ćelijskoj liniji u kojoj se eksprimira tetR-belančevina. Međutim, ekspresija neće biti inhibirana ako je rekombinantni adenovirus uveden u subjekt ili u ćelije koje ne eksprimiraju tetR-belančevinu (na primer, internacionalna patentna prijava WO 07/ 073513). U nekim izvedbama, molekul nukleinske kiseline iz ovoga pronalaska, na primer kada je prisutan u nekom rekombinantnom adenovirusu, može opciono da uključuje cumate-sistem za kontrolu gena u kojem je regulacija ekspresije posredovana uz pomoć vezanja represora (CymR) na operatorsko mesto (CuO), koje se nalazi nizvodno od promotora (na primer, Mullick et al. BMC Biotechnol. 2006 6:43). Kao šta se ovde koristi, termin "represor" se odnosi na entitete (na primer, belančevine ili drugi molekuli) koji poseduju kapacitet da inhibiraju, interferišu, retardiraju i/ili reprimiraju proizvodnju heterolognih belančevina (produkata) rekombinantnog ekspresionog vektora. Na primer, uz pomoć interferiranja sa veznim mestom na odgovarajućoj lokaciji duž ekspresionog vektora, poput na primer ekspresione kasete. Primeri represora uključuju tetR, CymR, lac-represor, trp-represor, gal-represor, lambdarepresor, i druge odgovarajuće represore poznate stanju tehnike. Ovde su obezbeđeni primeri za primenu tetO/tetR operator/represorskog sistema i CuO/CymR operator/represorskog sistema. Represija ekspresije transgena iz nekog vektora tokom umnožavanja vektora može da spreči nestabilnost transgena, i može da poveća prinose vektora koji sadrže transgen iz ovoga pronalaska tokom proizvodnje. Tako, u nekim izvedbama, vektori iz ovoga pronalaska sadrže promotor koji može da se reprimira nakon vezanja represorske belančevine, na primer, posedovanjem promotora koji je operativno spojen na represor-operatorsku sekvencu (na primer, u ne-ograničavajućim izvedbama, sekvenca koja sadrži TetO, na primer ona koja je predstavljena u SEQ ID Br.: 11, ili sekvenca koja sadrži CuO, na primer ona koja je predstavljena u SEQ ID Br.: 12), a na koju može da se veže represorska belančevina (na primer, TetR-belančevina, na primer koja ima amino-kiselinsku sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID Br.: 15, ili CymR-belančevina, na primer amino-sekvenca koja je predstavljena u SEQ ID Br.: 17).
2
[0043] U nekim izvedbama, vektor je molekul plazmidne DNA, ili neki njegov fragment. Pomenuti mogu da se koriste za DNA-vakcinaciju. Kao vektori mogu da se koriste i druge platforme, na primer živi-atenuirani dvostruko-deletirani sojevi Listeria monocytogenes.
[0044] U drugim izvedbama, vektor je neki rekombinantni viralni vektor, koji može da bude replikaciono kompetentan ili replikaciono dificijentan. U nekim izvedbama, viralni vektor ima rekombinantan DNA-genom. U nekim izvedbama, vektor u skladu sa ovim pronalaskom je, na primer, neki rekombinantni adenovirus, rekombinantni retrovirus, rekombinantni poksvirus poput vaccinia-virusa (na primer, modifikovani vaccinia ankara (MVA)), rekombinantni alfavirus poput semliki forest virus, rekombinantni paramiksovirus, poput rekombinantnog virusa boginja, ili nekog drugog rekombinantnog virusa. U nekim izvedbama, vektor u skladu sa ovim pronalaskom je MVA-vektor.
[0045] U preferiranim izvedbama, vektor u skladu sa ovim pronalaskom je rekombinantni adenovirus. Prednosti korišćenja adenovirusa kao vakcine uključuju laku manipulaciju, mogućnost proizvodnje na industrijskoj skali, i izvrstan bezbednosni profil koji se bazira na dugogodišnjem iskustvu u istraživanju, razvoju, proizvodnji i objavljenim kliničkim ispitivanjima sa brojnim adenoviralnim vektorima. Adenoviralni vektori koji se koriste kao vakcine generalno omogućavaju dobar imuno-odgovor prema belančevini koja je kodirana sa transgenom, uključujući ćelijski imuno-odgovor. Adenoviralni vektor u skladu sa ovim pronalaskom može da se bazira na bilo kojem tipu adenovirusa, a u nekim izvedbama je to ljudski adenovirus, bilo kojeg serotipa. U drugim izvedbama, to je simijan-adenovirus, poput adenovirusa iz šimpanza i gorila, bilo kojeg serotipa. U nekim izvedbama, vektor u skladu sa ovim pronalaskom je ljudski adenovirus serotipa 5, 26 ili 35. Priprema rekombinantnih adenoviralnih vektora je dobro poznata stanju tehnike. U nekim izvedbama, adenoviralni vektor u skladu sa ovim pronalaskom je dificijentan u barem jednom esencijalnom genu iz E1-regiona, na primer E1a-region i/ili E1b-region, iz adenoviralnog genoma koji je neophodan za viralnu replikaciju. U nekim izvedbama, adenoviralni vektor u skladu sa ovim pronalaskom je dificijentan barem delomično u ne-esencijalnom E3-regionu. U nekim izvedbama, pomenuti vektor je dificijentan u barem jednom esencijalnom genu iz E1-regiona i barem delomično u ne-esencijalnom E3-regionu.
[0046] Adenoviralni vektori, postupci za njihovu konstrukciju i postupci za njihovu proizvodnju su dobro poznati stanju tehnike, a opisani su, na primer, u dokumentima U.S.
Pat. Br.. 5,559,099, 5,837,511, 5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191, i 6,113,913, i kod autora Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", poglavlja 67 i 68, u Virology, B. N. Fields et al., ur., 3. izd., Raven Press, Ltd., New York (1996), i u drugim ovde pomenutim referencama. Tipično, konstrukcija adenoviralnih vektora podrazumeva primenu standardnih tehnika molekularne biologije, poput onih opisanih u, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. izd., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2. izd., Scientific American Books (1992), i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), i u drugim ovde pomenutim referencama.
[0047] Naročito preferirani serotipi rekombinantnih adenovirusa su ljudski serotip 35 ili ljudski serotip 26. Priprema rAd26-vektora je opisana, na primer, u dokumentu WO 2007/104792 i kod autora Abbink et al., 2007 Virology 81: 4654-63. Genomske sekvence Ad26 koje mogu da se navedu se nalaze u GenBank Accession EF 153474 i u SEQ ID Br.: 1 iz dokumenta WO 2007/104792. Priprema rAd35-vektora je opisana, na primer, u US patentnom br. 7,270,811, u dokumentu WO 00/70071, i kod autora Vogels et al., 2003, J Virol 77: 8263-71. Genomske sekvence Ad35 koje mogu da se navedu se nalaze u GenBank Accession AC_000019 i na Sl.6 iz dokumenta WO 00/70071.
[0048] U nekim izvedbama, adenovirus je replikaciono dificijentan, na primer zbog toga šta poseduje deleciju u E1-regionu genoma. Kao šta je poznato stručnjacima, kada adenoviralni genom sadrži delecije u esencijalnim regionima, funkcije koje kodiraju pomenuti regioni su obezbeđeni trans, preferirano od strane proizvodne ćelije, tj. kada su delovi ili celi E1-, E2-i/ili E4-regiona deletirani, pomenuti moraju da budu prisutni u proizvodnoj ćeliji, na primer tako da su integrirani u njenom genomu, ili u formi takozvanih helper-adenovirusa ili helperplazmida. Adenovirus može takođe da poseduje deleciju u E3-regionu, koja ne utiče na replikaciju, pa prema tome takva delecija ne mora da bude nadomeštana.
[0049] Proizvodna ćelija (ponekad, takođe, u stanju tehnike kao i ovde označena kao 'ćelija za pakovanje' ili 'ćelija za dopunjavanje') koja se koristi može da bude bilo koja proizvodna ćelija u kojom željeni adenovirus može da se propagira. Na primer, proizvodnja rekombinantnih adenovirusnih vektora se provodi u proizvodnim ćelijama koje nadopunjuju nedostatke samog adenovirusa. Takve proizvodne ćelije preferirano u svojim genomima sadrže barem jednu adenovirusnu E1-sekvencu, pa su prema tome sposobne da nadopunjuju (komplementiraju) rekombinantne adenoviruse koji sadrži deleciju u E1-regionu. Može da se koristi bilo koja proizvodnja ćelija koja je E1-komplementirajuća, poput ćelija ljudske retine koje su imortalizovane uz pomoć E1, na primer ćelije 911 ili PER.C6 (vidi US patent 5,994,128), E1-transformirani amniociti (vidi EP patent 1230354), E1-transformirane A549-ćelije (vidi, na primer, dokument WO 98/39411 i US patent 5,891,690), GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Hum Gene Ther 11: 213-19), 293, i slično. U nekim izvedbama, proizvodne ćelije su, na primer, HEK293-ćelije, ili PER.C6-ćelije, ili 911-ćelije, ili IT293SF-ćelije, i slično. Proizvodnja adenoviralnih vektora u proizvodnim ćelijama je opisana kod autora Kovesdi et al., 2010, Viruses 2: 1681-703.
[0050] U nekim izvedbama, E1-dificijentan adenovirus obuhvata sekvencu koja kodira E4-orf6 iz adenovirusa iz podgrupe C poput Ad5. To omogućava proizvodnju ovih adenovirusa u dobro poznatim komplementirajućim ćelijskim linijama koje eksprimiraju E1-gene iz Ad5, poput na primer 293-ćelija ili PER.C6-ćelija (vidi, na primer, Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; dokument WO 03/104467, koji su ovde uključeni u celosti uz pomoć reference).
[0051] "Heterologna nukleinska kiselina" (takođe ovde označena kao 'transgen') u vektorima iz ovoga pronalaska je nukleinska kiselina koja nije prirodno prisutna u vektoru, a u skladu sa ovim pronalaskom pomenuta nukleinska kiselina koja kodira fuzioni polipeptid iz ovoga pronalaska se smatra heterolognom nukleinskom kiselinom kada je prisutna u vektoru. U vektor se uvodi, na primer, primenom standardnih tehnika molekularne biologije. Može da bude, na primer, klonirana u deletirani E1- ili E3-region adenoviralnog vektora, ili u regionu između E4-regiona i rITR. Transgen je generalno operativno spojen na sekvence koje kontrolišu ekspresiju. U preferiranim izvedbama, pomenuti transgen je kloniran u E1-region adenoviralnog vektora.
[0052] Proizvodnja vektora poput DNA-vektora, ili rekombinantnih adenovirusnih vektora, može da se provede u skladu sa raznim postupcima koji su poznati stručnjacima. Generalno, proizvodnja podrazumeva umnožavanje u kultiviranim ćelijama sa ciljem da se proizvede dovoljna količina vektorskog materijala, nakon čega sledi izolovanje vektora iz ćelijske kulture, koje je tipično praćeno sa dodatnim prečišćavanjem vektora sa ciljem da se odstrane druge supstancije i da se dobiju prečišćeni vektori koji mogu da se formulišu u farmaceutske
2
kompozicije (na primer, Hoganson et al., 2002, BioProcessing J 1: 43-8; Evans et al., 2004, J Pharm Sci 93:2458-75). Na primer, postupci za izolaciju adenovirusa iz kulture proizvodnih ćelija su, na primer, detaljno objašnjeni u dokumentu WO 2005/080556. Na primer, dokumenti WO 2010/060719 i WO 2011/098592, oba ovde uključena referencom, opisuju prikladne postupke za dobijanje i prečišćavanje velikih količina rekombinantnih adenovirusa.
[0053] U nekim aspektima, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid koji je kodiran uz pomoć nekog molekula nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom. Takav polipeptid obuhvata SEQ ID Br. 1. U nekim izvedbama, takav polipeptid može da obuhvata SEQ ID Br.: 3 ili SEQ ID Br.: 5. Karakteristike takvog polipeptida su opisane iznad. Takav polipeptid može, na primer, da se koristi direktno kao vakcina protiv HPV.
[0054] Ovaj pronalazak dodatno obezbeđuje vakcine koje sadrže molekule nukleinske kiseline, vektore ili polipeptid u skladu sa ovim pronalaskom, pri čemu izvedbe svakog od ovih aspekata mogu da uključuju pomenute kao šta je opisano iznad. U preferiranim izvedbama, vakcina u skladu sa ovim pronalaskom sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom. U dodatnim preferiranim izvedbama, pomenuta vakcina sadrži vektor u skladu sa ovim pronalaskom, preferirano DNA-vektor, MVA-vektor, ili rekombinantni adenovirusni vektor.
[0055] U nekim izvedbama, vakcina u skladu sa ovim pronalaskom sadrži dodatne aktivne sastojke, na primer nukleinsku kiselinu koja kodira barem jedan epitop E6 i/ili E7 belančevina iz najmanje jednog HPV tipa koji nije HPV16, na primer, visoko-rizični HPV tip poput HPV18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68, -73, ili -82.
[0056] Termin "vakcina" se odnosi na agens ili na kompoziciju koja sadrži aktivnu komponentu koja može da indukuje profilaktički i/ili terapeutski stepen imunosti u nekom subjektu protiv određenog patogena ili bolesti, a u ovom slučaju terapeutski protiv HPV. Pomenuta vakcina tipično sadrži molekul nukleinske kiseline, ili vektor, u skladu sa ovim pronalaskom, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent. Nakon administriranja nekom subjektu, polipeptid koji je kodiran sa pomenutim molekulom nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom će se eksprimirati u pomenutom subjektu, koje dovodi do pojave imunoodgovora prema E6 i/ili E7 antigenim fragmenatima koji su prisutni u samom polipeptidu. Prednost ovih instant molekula je ta šta su prisutni gotovo svi epitopi, koje prepoznaju Tćelije, iz E6 i E7 iz HPV16 pa odgovor T-ćelija prema bilo kojem epitopu prisutnom u divljem-tipu E6 ili E7 može da se uvede u vakcinu. Nadalje, pomenuta vakcina poseduje sve prednosti koje se tiču bezbednosti i efikasnosti, kao šta je već opisano iznad, kada se govori o molekulima nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom.
[0057] Za potrebe administriranja ljudima, ovaj pronalazak može da koristi farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenuti vektor i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac ili ekscipijent. U ovom kontekstu, termin "farmaceutski prihvatljiv" označava da pomenuti nosilac ili ekscipijent, u primenjivanim dozama i koncentracijama, neće da izazove bilo kakve neželjene ili štetne efekte u subjektima kojima je administriran. Takvi farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti su dobro poznati stanju tehnike (vidi Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, A. R. Gennaro, Ur., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulacija Development of Peptids and Proteins, S. Frokjaer & L. Hovgaard, Ur., Taylor & Francis [2000]; i Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. izdanje, A. Kibbe, Ur., Pharmaceutical Press [2000]). Ekscipijent je generalno farmakološki neaktivna supstanca koja je formulisana sa aktivnim sastojkom samog leka. Ekscipijenti se uobičajeno koriste sa ciljem da bulk up formulacije koje sadrže potentne aktivne sastojke (tako, često se označavaju kao "agensi za raspršivanje", "fileri", ili "razređivači") koje omogućava prikladnu ili pravilnu raspodelu supstancije leka tokom proizvodnje same dozne forme. Pomenuti mogu, takođe, da zadovoljavaju razne terapeutsko-pojačivačke potrebe, poput ubrzanja aprospcije leka ili rastvorljivosti, ili zbog nekih drugih farmakokinetičkih razloga. Ekscipijenti mogu, takođe, da budu korisni kod procesa proizvodnje, sa ciljem da omoguće rukovanje sa aktivnom supstancijom poput olakšavanja protoka praha ili pojačavanja ne-lepljivosti, osim poboljšanja in vitro stabilnosti poput prevencije denaturacije tokom očekivanog roka trajanja. Izbor odgovarajućih ekscipijenata takođe zavisi o ruti administriranja i o doznoj formi, kao i o samom aktivnom sastojku i drugim faktorima.
[0058] Prečišćeni molekul nukleinske kiseline, vektor ili polipeptid preferirano su formulisani i se administriraju u formi sterilnog rastvora mada je takođe moguće da se koriste liofilizovani preparati. Sterilni rastvori se pripremaju primenom sterilne filtracije ili uz pomoć drugih postupaka koji su poznati stanju tehnike per se. Rastvori se tada liofilizuju ili pune u farmaceutske dozne kontejnere. pH rastvora generalno se kreće u rasponu od pH 3.0 do 9.5, na primer, pH 5.0 do 7.5. Pomenuti molekul nukleinske kiseline ili vektor ili polipeptid tipično se nalazi u rastvoru u prikladnom puferu, a rastvor vektora može takođe da sadrži so.
2
Opciono, može da bude prisutan i agens za stabilizovanje, poput albumina. U nekim izvedbama se dodaje deterdžent. U nekim izvedbama, vakcina može da se formuliše u nekom preparatu za injektiranje. Ove formulacije sadrže efektivne količine molekula nukleinske kiseline, vektora ili polipeptida i sterilne tečne rastvore, tečne suspenzije ili liofilizovane verzije i opciono sadrže stabilizere ili ekscipijente.
[0059] Na primer, rekombinantni adenovirusni vektor može da se skladišti u puferu koji se takođe koristi za Adenovirus World Standard (Hoganson et al., 2002, Bioprocessing J 1: 43-8): 20 mM Tris pH 8, 25 mM NaCl, 2.5% glicerol. Druga korisna formulacija za prikladni pufer namenjen za administriranje ljudima je: 20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 25 mM NaCl, saharoza 10% w/v, polisorbat-800.02% w/v. Druga formulacija za pufer koji je prikladan za rekombinantni adenovirus obuhvata 10-25 mM citratni pufer, pH 5.9-6.2, 4-6% (w/w) hidroksipropil-beta-ciklodekstrin (HBCD), 70-100 mM NaCl, 0.018-0.035% (w/w) polisorbat-80, i opciono 0.3-0.45% (w/w) etanol. Očito, mnogi drugi puferi mogu da se koriste, a poznato je nekoliko primera prikladnih formulacija za skladištenje i za farmaceutsko administriranje prečišćenih vektora.
[0060] U nekim izvedbama, kompozicija koja sadrži vektor dodatno sadrži i jedan ili više dodataka. Stanju tehnike je poznato da dodaci dodatno pojačavaju imuno-odgovor na primenjeni antigeni determinant. Termini "dodatak" i "imuno-stimulans" ovde se koriste kao sinonimi, a definisani su kao jedna ili više supstancija koje stimulišu imuno-sistem. U tom kontekstu, dodatak se koristi sa ciljem da se pojača imuno-odgovor na polipeptid kodiran sa molekulima nukleinske kiseline u vektorima ovoga pronalaska. Primeri za prikladne dodatke uključuju soli aluminijuma poput aluminijum hidroksida i/ili aluminijum fosfata i/ili aluminijum kalijum fosfata; kompozicije sa uljanim emulzijama (ili kompozicije ulje-u-vodi), uključujući skvalen-vodene emulzije, poput MF59 (vidi, na primer, dokument WO 90/14837); saponinske formulacije, poput, na primer, QS21 i imuno-stimulirajućih kompleksa (ISCOMS) (vidi, na primer, dokumente US 5,057,540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); bakterijske ili mikrobne derivate, a primeri za pomenute su monofosforil lipid A (MPL), 3-O-deacilovani MPL (3dMPL), CpG-motiv koji sadrži oligonukleotide, ADP-ribozilirajuće bakterijske toksine ili njihove mutante, poput termo-labilnog enterotoksina LT iz E. coli, kolera-toksina CT, i slično. Takođe je moguće da se koristi dodatak koji je kodiran sa vektorom, na primer uz pomoć primene heterologne nukleinske kiseline koja kodira fuzioni konstrukt između oligomerizacionog domena C4-
2
vezne belančevine (C4bp) i antigena od interesta (na primer, Solabomi et al., 2008, Infect Immun 76: 3817-23), ili uz pomoć korišćenja vektora koji kodira transgen od interesa i TLR-3 protiv takve heterologne dsRNA (na primer, dokument WO 2007/100908), i slično.
[0061] U drugim izvedbama, kompozicije iz ovoga pronalaska ne sadrže dodatke.
[0062] Farmaceutske kompozicije mogu da se administriraju nekom subjektu, na primer, nekom ljudskom subjektu. Totalna doza aktivne komponente iz vakcine, koja se daje subjektu tokom jednog pokušaja administriranja, može da varira kao šta je poznato stručnjacima, a za adenovirus se generalno kreće između 1x10<7>viralnih čestica (viral particles, vp) i 1x10<12>vp, preferirano između 1x10<8>vp i 1x10<11>vp, na primer između 3x10<8>i 5x10<10>vp, na primer između 10<9>i 3x10<10>vp. Za DNA-vakcinu, ukupne količine DNA po pokušaju administriranja mogu, na primer, da se kreću između 1 µg i 10 mg. Ako se koristi genski pištolj za administriranje, tipično se primenjuju male količine, na primer 10 µg. Za intramišićnu injekciju, tipično se koriste veće količine, na primer do 5 mg.
[0063] Administriranje farmaceutskih kompozicija može da se provede uz pomoć korišćenja standardnih ruta za administriranje. Ne-ograničavajuće izvedbe uključuju parenteralno administriranje, poput injekcije, na primer intradermalne, intramišićne, itd., ili supkutane ili transkutane, ili administriranje kroz sluzokožu, na primer intranazalno, oralno, intravaginalno, rektalno, i slično. U jednoj izvedbi, kompozicija se administrira primenom intramišićne injekcije, na primer u deltoidni mišić ruke, ili u mišić vastus lateralis iz bedra. U nekim izvedbama, pomenuta vakcina je DNA-vakcina koja može, na primer, da se administrira intradermalno, na primer uz pomoć DNA-tetoviranja (vidi, na primer, Oosterhuis et al., 2012, Curr Top Microbiol Imunol 351: 221-50). Ova ruta je takođe prikladna za adenoviralne vektore. U nekim izvedbama, kompozicija u skladu sa ovim pronalaskom sadrži adenoviralni vektor i se administrira primenom intramišićne injekcije. Stručnjak poznaje brojne mogućnosti i načine administriranja neke kompozicije, poput vakcine sa ciljem da se indukuje imuno-odgovor na neki(e) antigen(i) u pomenutoj vakcini.
[0064] Subjekt, kao šta se ovde koristi, preferirano se odnosi na sisara, na primer glodara, na primer miša, ili na nekog primata koji nije čovek, ili na čoveka. Preferirano, pomenuti subjekt je ljudski subjekt.
2
[0065] Vakcine iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za tretman pacijenata koji boluju od raznih faza bolesti uzrokovanih sa HPV (naročito, tip 16), štiteći ih od incidentnih infektivnih situacija i od upornih HPV infekcija kao takvih (na primer, detektovanih uz pomoć testiranja na HPV DNA), pre no se formiraju (pre-)kancerozne lezije, kao i cervikalna intraepitelna neoplazija (CIN; takođe poznata kao cervikalna displazija i cervikalna intersticijalna neoplazija, koje su potencijalno pre-maligne transformacije i abnormalan rast (displazija) skvamoznih ćelija na površini vrata materice), uključujući i cervikalni rak (poput karcinoma cervikalnih skvamoznih ćelija (SCC). Osim toga, druge HPV-indukovane neoplazije, poput vulvalne intraepitelne neoplazije (VIN), vaginalne intraepitelne neoplazije (VaIN), intraepitelne neoplazije penisa (PIN), analne intraepitelne neoplazije (AIN) takođe mogu da budu meta za tretman kao i napredniji stepeni orofaringealnog raka (takođe poznat kao rak glave i vrata), raka penisa, vagine, vulve i anusa. Vakcine iz ovoga pronalaska tako mogu da ciljaju široki raspon HPV-indukovanih lezija, a verovatno su naročito efektive u prekanceroznim fazama HPV-indukovane bolesti, na primer (uporna) infekcija i/ili faze neoplazije, gde je ekspresija E2, E6 i/ili E7 snažnija. Takođe je moguće da se kombinuje tretman koji primenjuje vakcinu iz ovoga pronalaska sa jedinjenjima koja se suprotstavljaju ili mogu da prevaziđu mehanizme izbegavanja imuno-odgovora u naprednim ćelijama raka, na primer, antitela protiv PD1/PD-L1, antitela protiv CTLA-4 poput ipilimumaba, antitela protiv LAG-3, antitela protiv CD25, IDO-inhibitora, CD40 agonističkih antitela, CD137 agonističkih antitela, itd. (vidi, na primer, Hamid & Carvajal, 2013, Expert Opinion Biol Ther 13: 847-861; Mellman et al., 2011, Nature Rev 480: 480-89). Postupak terapeutske vakcinacije, u principu, takođe može da se koristi za tretman spoljnih genitalnih bradavica ili njihovih prekursora u slučaju da vakcina dodatno sadrži (sekvence koje kodiraju) E6 i/ili E7 iz HPV tipa koji uzrokuje spoljne genitalne bradavice i se administrira subjektu koji je inficiran sa takvim tipom HPV.
[0066] Kao šta se ovde koristi, 'tretiranje' označava administriranje pomenute vakcine sa ciljem da se indukuje terapeutski imuno-odgovor protiv ćelija koje eksprimiraju (epitope iz) E6 i/ili E7 iz HPV16 u ćelijama pacijenta, koje barem dovodi do smanjivanja nivoa i preferirano potpunog nestanka HPV16 infekcije, koje rezultuje barem sa usporavanjem i preferirano zaustavljanjem napredovanja HPV16-uzrokovane bolesti poput raznih neoplazija i/ili njihovih simptoma. Preferirano, tretman sa pomenutom vakcinom takođe rezultuje remisijom naprednih faza HPV-indukovanih tumora. Preferirano je da se administriranje pomenute vakcine primenjuje na pacijentima koji pate od HPV infekcije koja je tipizirana
2
tako da se obezbedi da se administrira ona vakcina koja kodira polipeptid iz odgovarajućeg HPV-tipa. Kada to nije moguće, pomenuta vakcina takođe može da se administrira jednom delu populacije za koji se zna da pokazuje sklonost da bude inficiran sa HPV, tj. kod seksualno aktivnih ljudi. Takođe je moguće da se neka vakcina iz ovoga pronalaska administrira subjektima koji nisu inficirani sa HPV16, na primer, u profilaktičke svrhe, moguće zajedno sa nekom vakcinom protiv nekog drugog tipa HPV sa kojim je pacijent već inficiran, ili alternativno ne-inficiranim subjektima. Vakcina iz ovoga pronalaska takođe može da se administrira nekom subjektu koji je podvrgnut dodatnom različitom tretmanu, na primer, operaciji (odstranjivanje lezije uzrokovane infekcijom sa HPV16), ili tretmanu sa imikvimodom (koji sadrži agnoist TLR-7/8; vidi, na primer, Dayaana et al., 2010, Br J Cancer 102: 1129 - 36). Efekt ovog tretmana može da se izmeri primenom citologije ili testiranja HPV.
[0067] Pomenuta vakcinacija podrazumeva administriranje vakcine iz ovoga pronalaska nekom subjektu ili pacijent barem jednom. Takođe je moguće da se obezbede jedno ili više booster (pojačivač)-administriranja sa jednom ili više dodatnih vakcina. Ako se provodi pojačana-vakcinacija, tipično, takva pojačana-vakcinacija se administrira istom subjektu u razdoblju između jedne sedmice i jedne godine, preferirano između dve sedmice i četiri meseca, nakon šta je subjekt primio imunogenu kompoziciju sa istim antigenom po prvi pita (koje se tada označava kao 'primarna vakcinacija'). Kod alternativnih pojačanih-režima, takođe je moguće da se administriraju različiti vektori, na primer, jedan ili više adenovirusa različitog serotipa, ili drugi vektori poput MVA, ili DNA, ili belančevina, subjektu kao primarna- ili pojačana-vakcinacija. U nekim izvedbama, ista forma vakcine iz ovoga pronalaska se administrira barem dva puta istom pacijentu tokom primarnog pojačanogrežima, na primer, sa istim rekombinantnim adenovirusom (poput Ad26) u skladu sa ovim pronalaskom. U nekim izvedbama, vakcina iz ovoga pronalaska se administrira najmanje dva puta tokom primarnog pojačanog-režima, ali je vektor vakcine različit, na primer, koriste se dva različita serotipa adenoviralnih vektora, na primer, primarno vakciniranje sa rekombinantnim Ad26 i pojačano-vakciniranje sa rekombinantnim Ad35, ili vice versa; ili primarno-vakciniranje sa DNA i pojačano-vakciniranje sa adenoviralnim vektorom, ili vice versa; ili primarno-vakciniranje sa adenoviralnim vektorom i pojačano-vakciniranje sa MVA-vektorom, ili vice versa. U nekim izvedbama, vakcina u skladu sa ovim pronalaskom se administrira najmanje tri puta, preko primarnog-pojačano-pojačano režima. Dodatna pojačana-administriranja takođe mogu da se uključe u režim.
2
[0068] Takođe, jedan od aspekata ovog pronalaska je da indukuje CTL-odgovor protiv HPV16 u nekom subjektu, koje podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa ovim pronalaskom nekom subjektu.
[0069] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje sledeće ne-ograničavajuće izvedbe:
1) nukleinska kiselina koja kodira polipeptid koji obuhvata SEQ ID Br.: 1;
2) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 1, pri čemu pomenuti polipeptid dodatno obuhvata barem deo E2 belančevine iz HPV;
3) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 2, pri čemu barem deo E2 belančevine iz HPV dolazi iz E2 belančevine iz HPV16;
4) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 2, pri čemu pomenuti polipeptid obuhvata barem deo E2 belančevine koji je fuzionisan na N-terminalni deo polipeptida sa SEQ ID Br.: 1;
5) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 2, pri čemu pomenuti polipeptid obuhvata barem deo E2 belančevine koji je fuzionisan na C-terminalni deo polipeptida sa SEQ ID Br.: 1;
6) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 3, pri čemu pomenuti polipeptid obuhvata barem deo E2 belančevine koji je fuzionisan na N-terminalni deo polipeptida sa SEQ ID Br.: 1;
7) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 3, pri čemu pomenuti polipeptid obuhvata barem deo E2 belančevine koji je fuzionisan na C-terminalni deo pomenutog polipeptida sa SEQ ID Br.: 1;
8) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 2, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost vezanja E2 na DNA;
9) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 3, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu iz E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost vezanja E2 na DNA;
10) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 4, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost vezanja E2 na DNA;
) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 5, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost vezanja E2 na DNA;
) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 6, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost vezanja E2 na DNA;
) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 7, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijanta E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost vezanja E2 na DNA;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 1, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 2, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 3, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 4, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 5, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 6, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 7, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 8, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 9, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 10, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 11, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 12, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
1
) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 13, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor u skladu sa izvedbom 14, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 15, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 16, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 17, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 18, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 19, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 20, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 21, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 22, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 23, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 24, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 25, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 26, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 27, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 28, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 29, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 30, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 31, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 32, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 33, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 34, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 35, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
2
) vektor u skladu sa izvedbom 36, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 37, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 38, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 39, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 28, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 29, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 30, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 31, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 32, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 33, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 34, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 35, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 36, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 37, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 38, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 39, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 14, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 15, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 16, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 17, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 18, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 19, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 20, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 21, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 22, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 23, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 24, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 25, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 26, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 27, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 28, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 29, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 30, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 31, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
4
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 32, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 33, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 34, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 35, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 36, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 37, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 38, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 39, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 40, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 41, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 42, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 43, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 44, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 45, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 46, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 47, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 48, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 49, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 50, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 51, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 52, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 53, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 54, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 55, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 56, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 57, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 58, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 59, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 60, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 61, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 62, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 63, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 64, i neki farmaceutski prihvatljivi nosilac;
) postupak za indukovanje imuno-odgovora protiv HPV u nekom subjektu, koji podrazumeva administriranje pomenutom subjektu kompoziciju za vakcinu u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115;
) postupak za tretiranje uporne infekcije sa HPV (tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od uporne HPV-infekcije;
) postupak za tretiranje vulvalne intraepitelne neoplazije (VIN) (praćene infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od VIN;
) postupak za tretiranje raka vulve (praćenog infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od raka vulve;
) postupak za tretiranje cervikalne intraepitelne neoplazije (CIN) (praćene infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od CIN;
) postupak za tretiranje raka vrata materice (praćenog infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od raka vrata materice;
) postupak za tretiranje orofaringealnog raka (praćenog infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od orofaringealnog raka;
) postupak za tretiranje intraepitelne neoplazije penisa (PIN) (praćene infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od PIN;
) postupak za tretiranje raka penisa (praćenog infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od raka penisa;
) postupak za tretiranje vaginalne intraepitelne neoplazije (VaIN) (praćene infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od VaIN;
) postupak za tretiranje raka vagine (praćenog infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od raka vagine;
) postupak za tretiranje analne intraepitelne neoplazije (AIN) (praćene infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od AIN;
) postupak za tretiranje raka anusa (praćenog infekcijom sa HPV tip 16), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 65-115 nekom subjektu koji pati od raka anusa;
) polipeptid koji obuhvata SEQ ID Br.: 1;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 129, pri čemu pomenuti polipeptid dodatno obuhvata barem deo E2 belančevine iz HPV;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 130, pri čemu barem deo E2 belančevine iz HPV dolazi iz E2 belančevine iz HPV16;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 130, pri čemu barem deo E2 belančevine je fuzionisan na N-terminalni deo polipeptida sa SEQ ID Br.: 1;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 130, pri čemu barem deo E2 belančevine je fuzionisan na C-terminalni deo polipeptida sa SEQ ID Br.: 1;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 131, pri čemu barem deo E2 belančevine je fuzionisan na N-terminalni deo polipeptida sa SEQ ID Br.: 1;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 131, pri čemu barem deo E2 belančevine je fuzionisan na C-terminalni deo polipeptida sa SEQ ID Br.: 1;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 130, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost E2 da veže DNA;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 131, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost E2 da veže DNA;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 132, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost E2 da veže DNA;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 133, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost E2 da veže DNA;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 134, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost E2 da veže DNA;
) polipeptid u skladu sa izvedbom 135, pri čemu barem deo E2 belančevine obuhvata neku varijantu E2 belančevine sa mutacijom koja onemogućava sposobnost E2 da veže DNA;
) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 3, koja kodira polipeptid u skladu sa SEQ ID Br.: 3;
) nukleinska kiselina u skladu sa izvedbom 3, koja kodira polipeptid u skladu sa SEQ ID Br.: 5;
) vektor koja kodira nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 142, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor koja kodira nukleinsku kiselinu u skladu sa izvedbom 143, pri čemu je sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid operativno spojena na neki promotor;
) vektor u skladu sa izvedbom 144, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 145, pri čemu pomenuti vektor je neki adenovirus;
) vektor u skladu sa izvedbom 146, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 147, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 26;
) vektor u skladu sa izvedbom 146, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) vektor u skladu sa izvedbom 147, pri čemu pomenuti adenovirus je ljudski adenovirus serotipa 35;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 144, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 145, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 146, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 147, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 148, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 149, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 150, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent;
) kompozicija za vakcinu koja sadrži vektor u skladu sa izvedbom 151, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent;
) postupak za indukovanje imuno-odgovora protiv HPV u nekom subjektu, koji podrazumeva administriranje pomenutom subjektu kompoziciju za vakcinu u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159;
) postupak za tretiranje vulvalne intraepitelne neoplazije (VIN), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od VIN;
) postupak za tretiranje raka vulve, koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od raka vulve; ) postupak za tretiranje cervikalne intraepitelne neoplazije (CIN), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od CIN;
) postupak za tretiranje raka vrata materice, koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od raka vrata materice;
) postupak za tretiranje orofaringealnog raka, koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od orofaringealnog raka;
) postupak za tretiranje intraepitelne neoplazije penisa (PIN), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od PIN;
) postupak za tretiranje raka penisa, koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od raka penisa; ) postupak za tretiranje vaginalne intraepitelne neoplazije (VaIN), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od VaIN;
) postupak za tretiranje raka vagine, koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od raka vagine;
4
170) postupak za tretiranje analne intraepitelne neoplazije (AIN), koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od AIN;
171) postupak za tretiranje raka anusa, koji podrazumeva administriranje vakcine u skladu sa bilo kojom izvedbom od 152-159 nekom subjektu koji pati od raka anusa.
[0070] Praktikovanje ovog pronalaska podrazumeva primenu, osim ako je drugačije navedeno, konvencionalnih tehnika imunologije, molekularne biologije, mikrobiologije, ćelijske biologije, i tehnologije rekombinantne DNA, koje su poznate stanju tehnike. Vidi, na primer, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al., ur., 1987; serije Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, ur., 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane, ur., 1988.
[0071] Ovaj pronalazak je dodatno objašnjen uz pomoć sledećih primera. Pomenuti primeri ne ograničavaju pronalazak na bilo koji način. Njihova namena je da pojasne sam pronalazak.
PRIMERI
Primer 1: konstrukcija dizajniranog polipeptida koji sadrži praktično sve CTL-epitope iz E6 i E7 iz HPV16
[0072] Mi smo dizajnirali novi, ne-tumorigeni polipeptid (i nukleinsku kiselinu koja ga kodira) koji sadrži praktično (suštinski) sve CTL-epitope E6 i E7 belančevina iz HPV16, pri čemu poseduje minimalan broj naslućenih/predviđenih snažnih novih epitopa (novi epitopi su oni epitopi koji ne postoje u divljem-tipu E6 i E7 belančevina iz HPV16). Polipeptid iz ovoga pronalaska (takođe, ovde ponekad označen kao 'E6E7SH') obuhvata sekvencu koja je obezbeđena u SEQ ID Br.: 1. Kodon-optimizovana nukleinska kiselina koja kodira pomenuti polipeptid je obezbeđena u SEQ ID Br.: 2.
[0073] Molekuli iz ovoga pronalaska su pojedinačni molekuli, koji donose proizvodne prednosti u odnosu na strategije gde se koristi više molekula. Osim toga, polipeptid iz ovoga pronalaska obuhvata praktično sve prirodne CTL-epitope koji su prisutni u divljem-tipu E6 i E7 iz HPV16, a istovremeno poseduje minimalan broj naslućenih/predviđenih snažnih novih epitopa koji mogu potencijalno da budu imuno-dominanti zbog čega mogu da otklone imunoodgovor sa relevantnih CTL-epitopa divljeg-tipa. Tako, konstrukti iz ovoga pronalaska su imunološki favorizovaniji od molekula koje su opisali drugi autori kojima ili nedostaju mogući CTL-epitopi i/ili sadrže veći broj ili snažnije nove epitope.
[0074] Na primer, konstrukt iz SEQ ID Br.: 1 sadrži samo jedan novi epitop koji sadrži devet amino-kiselina sa predviđenim veznim afinitetom od <50 nM za 20 najčešćih HLA-A, 20 najčešćih HLA-B i 20 najčešćih HLA-C alela (HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, HLA-A*02:03, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*23:01, HLA-A*24:02, HLA-A*26:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*30:02, HLA-A*31:01, HLA-A*32:01, HLA-A*33:01, HLA-A*33:03, HLA-A*34:01, HLA-A*68:01, HLA-A*68:02, HLA-B*07:02, HLA-B*07:04, HLA-B*08:01, HLA-B*13:01, HLA-B*15:01, HLA-B*18:01, HLA-B*35:01, HLA-B*37:01, HLA-B*39:01, HLA-B*40:01, HLA-B*40:02, HLA-B*40:06, HLA-B*44:02, HLA-B*44:03, HL-B*46:01, HLA-B*48:01, HLA-B*51:01, HLA-B*52:01, HLA-B*53:01, HLA-B*58:01, HLA-C*07:02, HLA-C*04:01, HLA-C*03:04, HLA-C*01:02, HLA-C*07:01, HLA-C*06:02, HLA-C*03:03, HLA-C*08:01, HLA-C*15:02, HLA-C*12:02, HLA-C*02:02, HLA-C*05:01, HLA-C*14:02, HLA-C*03:02, HLA-C*16:01, HLA-C*08:02, HLA-C*12:03, HLA-C*04:03, HLA-C*17:01, HLA-C*14:03), kao šta je određeno primenom postupaka ANN (Lundegaard et al., 2008, Nucl Acids Res 36: W509-12) i SMM (Peters et al., 2003, Bioinformatics 19: 1765-72) za HLA-A i HLA-B i NetMHCpan postupka (Hoof et al., 2009, Immunogenetics 61: 1-13) za HLA-C iz kompleta za predviđanje 'Peptide binding to MHC class I molecules' na IEDB stranici (http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc binding.html, verzija 2009-09-01B).
[0075] Kao ne-ograničavajući primer, uz primenu SMM kompleta za predviđanje sa IEDB stranice, izmešane sekvence E6 i E7, kao šta je opisano od autora Oosterhuis et al., 2011, Int J Cancer 129: 397-406 i Öhlschläger et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93, sadrže (svaka od njih) devet potencijalnih snažnih jedinstvenih novih epitopa (IC50za ANN ili SMM <50 nM) za 20 najčešćih HLA-A i -B, u svojem središnjem delu. To čak isključuje dodatke koji se koriste kod primene ovog pristupa (prema kojim dodaci bi dodatno doprineli pojavi novih epitopa, a mogu da ispuste prirodnije MHC II epitope zbog ograničene dužine 'preklapanja'). Uistinu, u dokumentu WO 2013/083287 je opisan poboljšani molekul koji sadrži varijantu sa izmešanim E6 i E7 belančevinama, i koji sadrži 22 jedinstvena nova epitopa doga devet amino-kiselina sa predviđenim IC50<50 nM (ANN, SMM ili NetMHCPan) za 20 najčešćih HLA-A, 20 najčešćih HLA-B i 20 najčešćih HLA-C alela.
[0076] Tako, željeni dizajnirani molekuli iz ovoga pronalaska očito su favorizovani jer poseduju znatno niži broj predviđenih novih epitopa ako se uporedi sa drugim objavljenim pristupima u kojima su E6 i E7 izmešane sa ciljem da se odstrani funkcionalnost.
[0077] Sintetizovana je nukleinska kiselina koja kodira naš tako dizajniran E6E7SH molekul iz HPV16 (tj. polipeptid koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je obezbeđena u SEQ ID Br.: 1), pri čemu pomenuta sekvenca nukleinske kiseline obuhvata SEQ ID Br.: 2, i je okružena sa Hind III mestom i Kozak-sekvencom na 5'-kraju i Xba I mestom na 3'-kraju (naručena sinteza i standardno molekularno kloniranje kod Invitrogen Life Technologies, Nemačka).
[0078] Sintetizovani fragmenti su klonirani uz pomoć Hind III i Xba I mesta u standardni vektor za ekspresiju, pCDNA2004.Neo, koji je sadržavao marker za bakterijsku rezistenciju (ampicilin) i marker za rezistenciju stanica sisara (neomicin), sa ciljem da se dobiju plazmidni vektori koji kodiraju molekul iz ovoga pronalaska, na primer za potrebe eksperimenata na bazi (prolazne) transfekcije.
[0079] Pomenuti molekuli mogu da se koriste kao takvi, ali takođe i kao baza za dodatne molekule koji sadrže dodatne karakteristike. Kao ne-ograničavajući primeri, pripremljene su dodatne varijante kao šta je opisano ispod.
[0080] Sekvenca E6E7SH fuzione-belančevine iz HPV16 može da se kombinuje sa sekvencama iz drugih ranih belančevina iz HPV16 za potrebe ciljanja pojedinaca koji pate od uporne infekcije i kako bi se proširio imuno-repertoar kod imunizovanih pojedinaca. Za imuno-odgovore protiv E2 se smatra da igraju važnu ulogu u eliminiranju HPV16 infekcija (de Jong et al., 2002, Cancer Res 62: 472-479). Fuzionisanje E2 na E6E7SH omogućava vakcinu koja sadrži antigene protiv raznih faza raka povezanog sa HPV od uporne infekcije do invazivnog raka ili povratne/uporne bolesti nakon LEEP operacije. Prema tome, kao neograničavajući primer takvih izvedaba, mi smo pripremili sekvencu koja kodira fuzionu belančevinu E6E7SH sa E2 na njenom N-terminusu. U E2-sekvenci modifikacije mogu da se uvedu sa ciljem onemoguće aktivnost vezanja DNA koje može da utiče na gensku ekspresiju
4
u ćelijama koje eksprimiraju pomenutu fuzionu belančevinu. Mi smo mutirali glicin na poziciji 293, lizin na poziciji 299 i cistein na poziciji 300 iz divljeg-tipa E2-belančevina iz HPV16 u valin, metionin i arginin. Svaka od pomenutih mutacija sa svoje strane potpuno onemogućava vezanje E2 na DNA sekvence koje sadrže E2 vezne domene (Prakash et al., 1992, Genes Dev 6: 105-16).
[0081] Nastao polipeptid je označen kao HPV16 E2E6E7SH i obuhvata SEQ ID Br.: 3. Pripremljena je kodon-optimizovana sekvenca koja kodira ovaj polipeptid, a obezbeđena je u SEQ ID Br.: 4.
[0082] Mi smo takođe konstruirali varijantu u kojoj je ista mutirana E2-belančevina bila fuzionisana na C-terminus E6E7SH fuzionog polipeptida iz HPV16, koje daje polipeptid koji je označen kao HPV16 E6E7E2SH, i koji obuhvata SEQ ID Br.: 5. Sekvenca koja kodira ovaj konstrukt je obezbeđena u SEQ ID Br.: 6.
[0083] Kao kontrolu, mi smo takođe konstruirali sekvence koje kodiraju polipeptid koji sadrži divlji-tip sekvence za punu dužinu E6 i E7 iz HPV16 u formi fuzione belančevine (E6 od aa 1 do 158 direktno fuzionisano na E7 od aa 1 do 98, a ovde označena kao E6E7wt).
[0084] Mi smo takođe testirali efekt dodavanja vodeće-sekvence na pomenuti polipeptid. Kao ne-ograničavajući primer, sekvenca koja kodira IgE vodeću-sekvencu (vidi, na primer, dokument US 6,733,994) [ova sekvenca vodećeg-peptida je obezbeđena u SEQ ID Br.: 7] je fuzionisana na N-terminus nekih konstrukata, na primer, u E6E7wt konstruktu, koji daje LSE6E7wt, i u E2E6E7SH konstruktu, koji daje LSE2E6E7SH. Sam efekt je signifikantno (p< 0.05) pojačao imunogenost ako se uporedi sa istim antigenom bez LS-sekvence kao šta je izmereno analizom E7-tetramera u imunizovanim miševima (kao šta može, na primer, da se vidi na Sl.9).
[0085] Sekvence koje kodiraju E6E7SH polipeptide iz ovoga pronalaska, sa ili bez E2, mogu, na primer, da se eksprimiraju iz DNA-konstrukata, iz RNA ili iz viralnih vektora. Sl. 1 prikazuje ekspresiju u HEK-293T ćelijama nakon prolazne transfekcije sa DNA vektorima koji eksprimiraju pomenute transgene kao šta je opisano iznad. Nakon transfekcije, ćelije su sakupljene, a ćelijski ekstrakti su analizirani primenom SDS-PAGE i western-blotinga sa antitelom protiv E7 iz HPV16. Ovaj eksperiment pokazuje ekspresiju očekivanih fuzionih belančevina odgovarajuće dužine nakon transfekcije sa vektorima za ekspresiju.
[0086] Adenoviralni vektori mogu da se koriste sa ciljem da se eksprimira E6E7, sa ili bez E2, i sa ili bez dodatnih sekvenca kako bi se povećala imunogenost kodirane fuzione belančevine.
[0087] Pomenuti geni, koji kodiraju divlji-tip-kontrolne E6E7 iz HPV16 ili HPV dizajnirane sekvence, koje su opisane iznad, su optimizovani za ekspresiju i ljudskim ćelijama pa su sintetizovani primenom Geneart. Kozak-sekvenca (5'-GCCACC-3') je uključena direktno ispred ATG-start kodona, a dva stop-kodona (5'-TGATAA-3') su dodana na kraj odgovarajuće kodirajuće sekvence. Ovi geni su ugrađeni u plazmid pAdApt35BSU i u plazmid pAdApt26 plazmid (Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87, 2135-43) uz pomoć Hind III i Xba I mesta.
[0088] Svi adenovirusi su generisani u PER.C6 ćelijama primenom pojedinačne homologne rekombinacije i proizvedeni kao šta je ranije opisano (za rAd35: Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; za rAd26: Abbink et al., 2007, J Virol 81: 4654-63). PER.C6 ćelije (Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-17) su uzgajane u Dulbecco-vom modifikovanom Eagle-medijumu (DMEM) sa 10% kravljim fetalnim serumom (FBS), i obogaćen sa 10 mM MgCl2.
[0089] Ukratko, PER.C6 ćelije su transfektovane sa Ad-vektorskim plazmidima uz korišćenje lipofektamina u skladu sa instrukcijama proizvođača (Life Technologies). Ćelije su sakupljene jedan dan nakon pojave punog citopatskog efekta (CPE), smrznute-odmrznute, centrifugovane tokom 5 min na 3,000 rpm, i uskladištene na -20° C. Virusi su prečišćeni iz plakova i umnoženi u PER.C6 ćelijama koje su bile uzgajane u jednoj komorici na pločici za kulturu tkiva (multiwell 24). Dodatna amplifikacija je provedena u PER.C6 ćelijama koje su bile kultivirane u boci za kulturu tkiva (T25), a nakon toga u drugu bocu za kulturu tkiva (T175). Iz sirovog, lizata koji je bio pripremljen nakon kultiviranja u boci T175, 3 do 5 ml je korišćeno da se inokulira 24 boca T1000 sa peto-slojnom kulturom tkiva koja je sadržavala 70% konfluentne slojeve PER.C6 ćelija. Virus je prečišćen uz pomoć CsCl-postupka od dva koraka. Konačno, virus je uskladišten u alikvotima na -85° C.
4
[0090] Ad35.HPV16-E6E7wt, i Ad35.HPV16-E6E7SH predstavljaju vektore rekombinantnog adenovirusa serotipa 35 (Ad35) koji sadrže kodon-optimizovane nukleotidne sekvence za ekspresiju fuzione belančevine divljeg-tipa E6 i E7 iz HPV16 (E6E7wt), i dizajnirane fuzione belančevine i to varijanta koja je opisana iznad (E6E7SH, koja ima amino-kiselinsku sekvencu obezbeđenu u SEQ ID Br.: 1). Spojene E6 i E7 sekvence su stavljene pod kontrolu CMV-promotora u E1-regionu iz genoma adenovirusa koji nije sadržavao E1, E3. Ad26.HPV16-E6E7wt, i Ad26.HPV16-E6E7SH su ekvivalentni vektori na bazi rekombinantnog adenovirusa serotipa 26.
[0091] Slično, rekombinantni adenoviralni vektori na bazi Ad26 i Ad35 su proizvedeni tako da kodiraju E2E6E7SH varijantu iz HPV16 (SEQ ID Br.: 3). Takođe su proizvedeni Ad26 i Ad35 koji kodiraju E6E7E2SH varijantu iz HPV16 (SEQ ID Br.: 5). Takođe je proizveden Ad35-vektor koji kodira E2E6E7SH fuzionu belančevinu sa IgE vodećom-sekvencom na N-terminusu, a nazvan je Ad35.HPV16-LSE2E6E7SH. Takođe je proizveden kontrolni adenovirus sa E6E7wt koji je fuzionisan na IgE vodećom-sekvencu na N-terminusu.
[0092] Rekombinantni adenovirusi su proizvedeni u PER.C6 ćelijama pa su prečišćeni uz pomoć centrifugovanja u gradijentu cezijum hlorida.
Dodatni primeri za konstrukte iz ovoga pronalaska koji su spojeni na represorske sisteme su obezbeđeni u drugom primeru ispod.
Primer 2. Nedostatak aktivnosti transformiranja dizajniranih konstrukata
[0093] Divlji-tip E6 i E7 belančevine iz HPV16 poseduju tumorogeni potencijal, koji je vidljiv kao aktivnost transformiranja u nekim ogledima, poput formiranja kolonija u ogledu sa mekim agarom (Massimi & Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). E6E7SH-polipeptid kao šta je opisan u primeru 1 obuhvata fragmente iz E6 i E7 belančevina koji su preuređeni. Zbog toga će očekivano da se odstrani tumorogeni potencijal, kao šta može da se izmeri, na primer, uz pomoć signifikantno smanjene aktivnosti transformiranja ako se uporedi sa E6 i E7 belančevinama divljeg-tipa u istim ogledima.
[0094] Drugi autori su takođe opisali da gensko-reorganizovane varijante E6 i E7 iz HPV16 uistinu gube svoj onkogeni potencijal (Öhlschläger et al., 2006, Vaccine 24: 2880-93; Henken et al., 2012, Vaccine 30: 4259-66), koje pokazuje da takav rearanžman uništava funkcije E6 i E7 belančevina divljeg-tipa.
4
[0095] Sa ciljem da se proceni gubitak tumorogenih karakteristika, mi smo procenili sposobnost naših E6E7SH-konstrukata da omogućavaju rast u mekom agaru u NIH 3T3 ćelijama (kao šta je, na primer, opisano od autora Massimi & Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Transfekcija NIH3T3 ćelija sa plazmidom koji eksprimira divlji-tip E7 iz HPV16 konzistentno rezultuje nastankom kolonija. U ovim ogledima, ekspresija (samo) divljeg-tipa E6 iz HPV16 ne dovodi do pojave kolonija (barem ne iznad pozadine). To je u skladu sa objavljenim rezultatima da je E7wt puno efikasniji od E6wt u ovom ogledu (Sedman et al., 1991, J Virol 65: 4860-66). Transfekcija sa našim E6E7SH-konstruktom ne dovodi do rasta kolonija u mekom agaru (Sl. 2) kroz četiri nezavisna eksperimenta, koje pokazuje da su nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid iz ovoga pronalaska, E6E7SH, izgubile kapacitet za transformaciju koji je povezan sa E7.
[0096] Tumorogeni potencijal E6 i E7 je povezan sa njihovom sposobnosti da smanje nivoe celularnih belančevina p53 i pRb. Ogledi degradacije p53 i pRb su provedeni sa ciljem da se pokaže da nukleinska kiselina koja kodira polipeptid iz ovoga pronalaska, E6E7SH-konstrukt, ne poseduje biološku aktivnost povezanu sa divljim-tipom E6 i E7 na molekularnom nivou. Ukratko, E6wt iz HPV16 i naš E6E7SH-konstrukt su eksprimirani u NCI-H1299 ćelijama kojima nedostaju endogeni p53 za potrebe ogleda degradacije p53. Za potrebe ogleda degradacije pRb, E7wt iz HPV16 i E6E7SH-konstrukt su eksprimiranu u pRbnull Saos-2 ćelijama. Kao šta može da se vidi na Sl.3, ko-ekspresija p53 sa E6wt, ali ne i sa E6E7SH, dovodi do smanjenih nivoa p53 (paneli A i B). Takođe, paneli 3C i 3D pokazuju da ko-ekspresija pRb sa E7wt, ali ne i sa E6E7SH, dovodi do smanjenih nivoa pRB. Ovi podaci pokazuju da nukleinska kiselina koja kodira polipeptid iz ovoga pronalaska nema sposobnost da formira kolonije u mekom agaru i da ne poseduje glavne biološke aktivnosti E6 i E7 polipeptida divljeg-tipa, naime inaktivisanje p53 i pRb.
[0097] Sa ciljem da se dodatno demonstrira bezbednost konstrukata nukleinske kiseline koja kodira polipeptid iz ovoga pronalaska, mi smo koristili primarne keratinocite ljudskog prepucijuma koje su prirodne ćelije-mete za HPV-posredovanu transformaciju. Imortalizovanje primarnih ljudskih keratinocita zahteva delovanje obe belančevine divljegtipa, E6 i E7 (Munger et al., 1989, J Virol 63: 4417-21). Ovaj ogled je u stvari fiziološki najvažniji in vitro ogled koji demonstrira bezbednost naših konstrukata (Massimi & Banks, 2005, Methods Mol Med 119: 381-395). Ćelije koje su bile transdukovane sa lentivirusima
4
koji eksprimiraju divlji-tip E6 i E7 iz HPV16 (E6E7wt) indukuju imortalizovanost u primarnim keratinocitima kao šta pokazuje njihov životni vek ako se uporedi sa netransdukovanim kontrolnim ćelijama (Sl. 4) i aktivisanje hTERT, katalitičke podjedinice telomeraze (podaci nisu prikazani). Ekspresija polipeptida iz ovoga pronalaska (E6E7SH) ne može da produži životni vek ako se uporedi sa GFP-transdukovanim ili ne-transdukovanim keratinocitima. Sličan rezultat je dobiven u dva dodatna nezavisna donora (podaci nisu prikazani). Uzeti zajedno, ovi podaci demonstriraju da su naši konstrukti izgubili sposobnost da uzrokuju imortalizovanje u primarnim ljudskim keratinocitima, za koje se smatra da predstavljaju visoko-fiziološki model.
[0098] Drugi konstrukt u kojem su fragmenti E6 i E7 iz HPV16 rekombinirani u drugačijem redosledu je takođe nesposoban da imortalizuje primarne keratinocite ljudskog prepucijuma. Međutim, kod ovog konstrukta je primećen produženi životni vek od približno 120-150 dana. To ukazuje na određenu nepredvidljivost ovog tehničkog polja, i demonstrira superiornost dizajniranih molekula u skladu sa ovim pronalaskom šta se tiče aspekta bezbednosti.
[0099] Uzeto sve zajedno, eksperimenti iz ovoga primera obezbeđuju snažnu spoznaju izostanka aktivnosti transformiranja nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide u skladu sa ovim pronalaskom, a time i snažno poboljšanu bezbednost u odnosu na E6 i E7 konstrukte divljeg-tipa iz HPV16.
Primer 3. Imuno-odgovori na dizajnirane konstrukte E6E7SH
[0100] Mi smo pripremili DNA-vektore i adenoviralne vektore, kao šta je opisano u primeru 1.
[0101] Mi smo koristili mišji soj CB6F1 za merenje imuno-odgovora na bazi inicijalnih eksperimenata u kojima su miševi imunizovani sa DNA-plazmidima koji kodiraju divlji-tip E2, ili E6 ili E7, a imunizacija sa E2, E6 i E7 antigenima iz HPV16 indukuje širi celularni imuno-odgovor u CB6F1 ako se uporedi sa miševima C57BL/6 ili Balb/c. U odvojenom eksperimentu, miševi su imunizovani sa DNA-vektorima koji kodiraju molekule iz ovoga pronalaska nakon čega su izmereni celularni imuno-odgovori. HPV16 E7-specifični imunoodgovori mogu da se izmere u miševima imunizovanim sa DNA-plazmidima koji eksprimiraju E6E7SH (Sl.5).
4
[0102] Sledeći podaci prikazani u primeru potiču iz eksperimenata na miševima koji su provedeni sa adenoviralnim vektorima.
[0103] Sa ciljem da se evaluira imunogenost indukovana sa vakcinom, miševi soja CB6F1 su bili imunizovani sa adeno-vektorima (Ad35) koji eksprimiraju E6E7wt, LSE6E7wt, E6E7SH ili adeno-vektorima koji ne kodiraju transgen (prazni). Dve doze su testirane tokom administracije miševa: 5x10<9>viralnih čestica (vp) i 1x10<10>vp. Dve do osam sedmica nakon imunizacije, miševi su žrtvovani, a izolovani splinociti su stimulisani tokom noći sa zalihom 15-mernog peptida E7 iz HPV16. E7-specifični odgovori u periodima od dve sedmice i osam sedmica su analizirani primenom IFNγ ELISPOT. Podaci su prikazani na Sl.6.
[0104] To pokazuje da imunizacija miševa sa Ad35.HPV16-E6E7SH indukuje E7-specifične imuno-odgovore kao šta je izmereno tokom ELISPOT-analiza. Osim toga, rezultati na Sl. 6 upravo pokazuju mogućnost da se pojača imuno-odgovor protiv adenoviralno-eksprimiranog transgena uz pomoć dodavanja N-terminalne vodeće-sekvenca pomenutom transgenu.
[0105] Sledeće, testiran je efekt dodavanja E2 na E6E7SH polipeptid u odnosu na imunogenost. Ad35-vektori kodiraju polipeptide koji sadrže E2 koji je fuzionisan na N-terminus (E2E6E7SH) ili na C-terminus (E6E7E2SH). Miševi soja CB6F1 su imunizovani sa dozom od 1x10<10>vp. Sl.7 (bojanje E7-tetramera) i Sl.8 (Panel C, IFNγ ELISPOT) prikazuju imuno-odgovore protiv E7, koji su, šta se tiče dizajniranih konstrukata uključujući i E2, veći ako se uporedi sa konstruktom bez E2, mada razlike nisu bile statistički značajne. Odgovor protiv E2 je veći kod adenoviralnih vektora koji kodiraju samo E2 u odnosu na odgovor kod adenoviralnih vektora koji sadrže E2 koji je fuzionisan na E6E7SH dizajnirani polipeptid (Sl.
8B), pri čemu su razlike značajne za oba slučaja, E2 naspram E2E6E7SH i E2 naspram E6E7E2SH (p-vrednost: <0.05).
[0106] Zaključeno je da dizajnirani konstrukti, koji dodatno uključuju E2, mogu još uvek da obezbede imuno-odgovor protiv E7, a osim toga takođe obezbeđuju i imuno-odgovor protiv E2, koje povećava širinu samog imuno-odgovor protiv pomenutih konstrukata koji ne uključuje E2.
[0107] Zna se da dodavanje vodeće-sekvence rezultuje većim E7-specifičnim odgovorima kada je fuzionisana na N-terminusu fuzione belančevine divljeg-tipa E6 i E7 (Sl.6C). Slično,
4
određen je efekt vodeće-sekvence na imunogenost E2E6E7SH fuzione belančevine. Prema tome, Ad35-vektori koji kodiraju dizajnirani polipeptid, sa ili bez N-terminalnog E2 i Ad35-vektor koji kodira LSE2E6E7SH su korišćeni za imunizaciju miševa, a krvni primerci su uzeti u intervalima od dve sedmice sa ciljem da se izmere E7-specifični imuno-odgovori (Sl.
9). Kao šta je prikazano na Sl. 7 i 8, prisutnost E2 na N- ili C-terminusu pri čemu je fuzionisan na E6E7SH povećava imuno-odgovore. Dodavanje IgE vodeće-sekvence je dodatno povećalo E7-specifični odgovor (Sl.9B). Tokom vremena su primećeni i neprekidni imuno-odgovori za sva tri adenoviralna vektora koji su kodirali dizajnirane molekule u skladu sa ovim pronalaskom, a najveći odgovor nakon imunizacije je odgovarao najvećim odgovorima tokom trajanja eksperimenta.
[0108] Zaključeno je da odgovori koji su indukovani uz pomoć dizajniranog konstrukta koji dodatno uključuje N-terminalni E2 mogu da se povećaju dodavanjem specifičnih sekvenca, na primer, IgE vodeća-sekvenca, koja cilja kodiranu belančevinu na specifične celularne kompartimente.
[0109] Celularni imuno-odgovor protiv peptida iz ovoga pronalaska može da se indukuje uz pomoć različitih tipova adenoviralnih vektora. U prethodnom eksperimentu mi smo koristili Ad35-vektore, dok u eksperimentu iz Sl. 10 miševi su bili imunizovani sa Ad26 adenoviralnim vektorom koji eksprimira E2E6E7SH. Podaci pokazuju takođe da imunizacija sa vakcinom na bazi Ad26 indukuje E7-specifične T-ćelije. Osim toga, rezultati pokazuju da je druga imunizacija sa Ad35 adenoviralnim vektorom koji eksprimira E2E6E7SH dodatno pojačala celularne imuno-odgovore (Sl.10).
Primer 4. Imunogenost dizajniranih konstrukata u rezuz makaki.
[0110] Sa ciljem da se proceni sposobnost adenoviralnih vektora, koji eksprimiraju dizajniranu sekvencu iz ovoga pronalaska, da indukuju imuno-odgovore u primatima koji nosu ljudi, rezuz makaki su imunizovani primenom intramišićne injekcije sa adeno-vektorima (Ad26) koji eksprimiraju E2E6E7SH ili sa adeno-vektorima koji ne kodiraju transgen (prazan) sa dozom od 1x10<11>vp. Osam sedmica nakon imunizacije, imuno-odgovori su pojačani imunizacijom sa Ad26-vektorima koji eksprimiraju isti antigen. Tokom sedmice 16., životinje su primile još jednu injekciju sa Ad35-vektorima koji eksprimiraju isti antigen. Krvni primerci su uzimani tokom nekoliko vremenskih tačaka pa su izolovane bele krvne ćelije stimulisane preko noći uz pomoć zalihe peptida koji odgovara E2, E6 ili E7 iz HPV16.
Specifični odgovori su izmereni primenom IFNγ ELISPOT. Podaci su prikazani na Sl. 11. Osim toga, tokom sedmice 10. i sedmice 18. nakon primarne imunizacije, procenjen je celularni imuno-odgovor specifičan za peptide koji sadrže nova peptidna spajanja iz pronalaska. U svim životinjama, indukcija IFNγ-odgovora je bila ispod ograničenja za detektovanje od < 50 SFU na 1x10<6>PBMC (podaci nisu prikazani).
[0111] Podaci pokazuju da imunizacija primata koji nisu ljudi sa Ad26.HPV 16-E2E6E7SH dovodi do celularnih imuno-odgovora protiv sve tri belančevine iz HPV16 koje su prisutne u kodiranom transgenu, ali ne i protiv novih spajanja. Odgovori mogu da se pojačaju uz pomoć dodatne imunizacije sa Ad26.HPV16-E2E6E7SH i dodatnog pojačanja tokom sedmice 16. primenom odgovarajućeg Ad35-vektora koje dodatno pojačava HPV16 E2, E6 i E7-specifične imuno-odgovore.
[0112] Poslednje administriranje imunološkog pojačanja tokom sedmice 72. uz pomoć Ad26.HPV16-E2E6E7SH je ponovo dovelo do povećanog celularnog imuno-odgovora protiv HPV16, koji je nakon nekoliko sedmica opao (nije prikazano).
[0113] U odvojenom eksperimentu (nije prikazano), jedinke rezuz makaki su imunizovane uz pomoć intravaginalnog administriranja kombinacije dva adenoviralna vektora, jedan koji eksprimira HPV16 E6E7SH, a drugi koji eksprimira L1-belančevinu iz HPV16. Slabi, ali merljivi celularni odgovori su primećeni u perifernim mononuklearnim krvnim ćelijama protiv obe belančevine, E6 i E7. U ovim eksperimentima, snažni celularni imuno-odgovori su primećeni protiv L1.
Primer 5. Terapeutska efikasnost u modelu mišjeg tumora.
[0114] Polipeptid iz ovog pronalaska je sposoban da indukuje HPV16-specifični celularni imuno-odgovor u životinjama, koje može da uspostavi terapeutski efekt prema ćelijama koje eksprimiraju E6 i/ili E7 protiv HPV16. Terapeutska imunizacija, tj. imunizacija nakon početka rasta tumora, može da se koristi sa ciljem da se demonstrira efikasnost moguće terapeutske vakcine protiv HPV. Terapeutski efekt Ad26- i Ad35-vektora je testiran u miševima koji su primili TC-1 ćelije (mišje ćelije koje eksprimiraju E6 i E7 iz HPV16) (Lin et al., 1996, Cancer Res 56: 21-6). TC-1 ćelije formiraju čvrsti tumor unutar nekoliko dana do nekoliko sedmica nakon trenutka kada su miševi primili supkutanu injekciju. Bez vakcine
1
tumori rastu i dosežu zadanu veličinu od 1000 mm<3>unutar 30 dana (paneli D i E). Nakon dosezanja ove veličine, miševi su bili žrtvovani zbog etičkih razloga.
[0115] Nakon primarne pojačane imunizacije sa SLP (korišćeni kao pozitivna kontrola; Kenter et al., 2009, N Engl J Med 361:1838-47; Zwaveling et al., 2002, J Imunol 169:350-8) ili adenoviralnim vektorima koji eksprimiraju HPV16-E2E6E7SH je primećeno značajno smanjenje rasta TC-1-indukovanih tumora (Sl. 12, paneli B i C). Pažljivija provera prvih 30 dana nakon primarnih imunizacija (paneli F i G) pokazuje da imunizacija sa adeno-vektorima koji eksprimiraju E2E6E7SH dovodi do značajno većeg uticaja na rast tumora ako se uporedi sa imunizacijom sa SLP. Inicijalna stopa rasta je značajno niža, a u najvećem broju slučajeva se tumori smanje. U 3 od 11 miševa imunizovanih sa adenoviralnim vektorima, tumori su potpuno nestali, koje se vidi na prikazu preživljenja (panel H).
[0116] Zaključno, imunizacija sa adenoviralnim vektorima koji eksprimiraju polipeptid iz ovoga pronalaska značajno smanjuje rast tumora ili potpuno eliminira uspostavljene tumore u dobro razvijenom modelu izazivanja HPV16-indukovanog raka.
Primer 6: Primena represorskih sistema sa ciljem poboljšanja produktivnosti i genetičke stabilnosti adenoviralnih vektora koji eksprimiraju HPV-izvedene antigene [0117] Prethodno je objavljeno da transgeni ugrađeni u adenovirusne vektore pod kontrolom snažnih konstitutivno aktivnih promotora mogu, u zavisnosti o karakteristikama transgenog produkta, negativno da utiču na proizvodnju vektora (Yoshida & Yamada, 1997, Biochem Biophys Res Commun 230:426-30; Rubinchik et al., 2000, Gene Ther 7:875-85; Matthews et al., 1999, J Gen Virol 80:345-53; Edholm et al., 2001, J Virol 75:9579-84; Gall et al., 2007, Mol Biotechnol 35:263-73). Primeri za transgeno-zavisnu produktivnost vektora uključuju neadekvatno spašavanje i umnožavanje vektora, niski konačni prinosi vektora, i, u nekoliko slučajeva, brzo prerastanje viralnih mutanata sa defektnim transgenim kasetama. Brojne studije su ispitivale mogućnost utišavanja ekspresije vektorskog transgena tokom replikacije vektora u proizvodnim ćelijama sa ciljem da se reše ovi problemi (Matthews et al., 1999, J Gen Virol 80:345-53; Edholm et al., 2001, J Virol 75:9579-84; Gall et al., 2007, Mol Biotechnol 35:263-73; Cottingham et al., 2012, Biotechnol Bioeng 109:719-28; Gilbert et al., 2014, J Virol Methods 208:177-88). U tom smislu, u prošlosti su bili implementirani različiti represorski sistemi u kontekstu Ad-vektora pri čemu se pokazalo da se poboljšava vektorska
2
produktivnost i genetička stabilnost vektora koji kodiraju različite tipove (inhibitornih) transgena.
[0118] Primećeno je da neki adenovirusni vektori koji su ovde opisani, kao i neki drugi adenoviralni vektori koji kodiraju određene varijante antigena HPV, pate od iznad opisanih problema proizvodnje transgen-zavisnog vektora, pa prema tome moguće je da mogu da se dodatno poboljšaju u tom pogledu. Mi smo prema tome odlučili da ispitamo da li upotreba sistema koji suprimiraju ekspresiju vektorskog transgena mogu da poboljšaju karakteristike proizvodnje Ad-vektora koji eksprimiraju HPV-izvedene antigene poput onih koji su ovde opisani. Za tu svrhu, mi smo implementirali dva postojeća represorsko-operatorska sistema, tj. TetR/TetO (Yao & Eriksson, 1999, Hum Gene Ther 10:419-22, EP0990041B1) i CymR/CuO (Mullick et al., 2006, BMC Biotechnol 6:43) u našu adenovirusnu vektorsku platformu. Oba sistema, TetR/TetO i CymR/CuO, su prethodno korišćena od strane drugih istraživača sa ciljem da poboljšaju produktivnost adenovirusnog vektora uz pomoć utišavanja vektorskog transgena tokom replikacije vektora (Gall et al., 2007, Mol Biotechnol 35:263-73; Cottingham et al., 2012, Biotechnol Bioeng 109:719-28; Gilbert et al., 2014, J Virol Methods s 208:177-88). Implementacija ova dva sistema podrazumeva generisanje adenoviralnih vektora koji eksprimiraju gene od interesa pod kontrolom CMV-promotora koji sadrži sekvence TetO ili CuO. Dodatno, implementacija podrazumeva generisanje ćelijskih linija koje stabilno eksprimiraju odgovarajuće srodne represorske belančevine (tj. TetR ili CymR).
[0119] Nekoliko vektora na bazi Ad26 i Ad35 koji ne sadrže E1 je generisano pri čemu su njihove sekvence koje kodiraju heterologne polipeptide operativno spojene na CMV-promotor koji sadrži operatorske sekvence TetO ili CuO. Prvo, određene sekvence koje sadrže TetO ili CuO (SEQ ID Br.: 11 i SEQ ID Br.: 12) su ugrađene blizu mesta za početak transkripcije (TSS) iz CMV-promotora (SEQ ID Br.: 13) iz pAdapt26 i pAdapt35.Bsu plazmida (Abbink et al., 2007, J Virol 81:4654-63; Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87:2135-43). Sekvence koje sadrže operator su ugrađene precizno u istim pozicijama CMV-promotora kao šta je prethodno opisano za oba pomenuta sistema (Yao & Eriksson, 1999, Human Gene Ther 10:419-22; EP0990041B1; Mullick et al., 2006, BMC Biotechnol 6:43; EP1385946B1). Specifično, u odnosu na TSS (kao šta je originalno označeno; Stenberg et al., 1984, J. Virol. 49: 190-9), sekvence koje sadrže TetO i CuO su ugrađene direktno nizvodno od pozicija -20 i 7. U SEQ ID Br.: 13 ove dve pozicije odgovaraju pozicijama 716 i 742. Nastali CMV-promotori koji sadrže operator su nazvani CMVTetO i CMVCuO. Sledeće, različiti transgeni su ugrađeni nizvodno od (modifikovanih) CMV-promotora nastalih konstrukata u mesta Hind III i Xba I. Ovi transgeni uključuju gene koji kodiraju fuzionu belančevinu koja obuhvata zelenu fluorescentnu belančevinu i luciferazu (GFP-Luc), LSE2E6E7SH iz ovog pronalaska, i drugi polipeptid koji je sličan sa LSE2E6E7SH (konstrukt ovde označen kao 'HPVAg'). HPVAg obuhvata istu vodeću-sekvencu kao i ona koja se nalazi u LSE2E6E7SH, kao i sekvence E2, E6, i E7 iz HPV16. Primenom ovde opisanih postupaka, nastali modifikovani pAdapt26 i pAdapt35.Bsu plazmidi su korišćeni za proizvodnju adenoviralnih vektora koji eksprimiraju iznad pomenuti reporter i HPV-transgene pod kontrolom CMVTetO- ili CMVCuO-promotora.
[0120] Ćelijske linije koje eksprimiraju TetR ili CymR su generisane primenom stabilne transfekcije PER.C6<®>ćelija uz korišćenje plazmida pcDNA™6/TR (LifeTechnologies, V1025-20) i derivata pcDNA™6/TR u kojem je sekvenca koja kodira TetR (SEQ ID Br.: 14, koja kodira polipeptid SEQ ID Br.: 15) zamenjena sa kodon-optimizovanom sekvencom koja kodira CymR (SEQ ID Br.: 16, koja kodira polipeptid SEQ ID Br.: 17). Proizvodnja stabilne ćelijske linije je privedena uglavnom kao šta je opisano od strane proizvođača pcDNA™6/TR uz korišćenje ogleda na bazi prolazne transfekcije sa ciljem da se traže ćelijske kolonije koje su sposobne da reprimiraju ekspresiju gena pod kontrolom CMVTetO ili CMVCuO. Nastale ćelijske linije PER.C6/TetR i PER.C6/CymR su analizirane da se proveri da li reprimiraju ekspresiju transgena tokom replikacije vektora u pomenutim ćelijama. Eksperimenti koji su provedeni sa vektorima koji eksprimiraju GFP-Luc pod kontrolom CMV-promotora koji sadrže operator su pokazali barem 10-puta smanjenu ekspresiju gena za luciferazu tokom kompletnog ciklusa replikacije virusa u ćelijskim linijama koje eksprimiraju represor u skladu sa odgovarajućim operatorskim sekvencama (podaci nisu prikazani). To potvrđuje da su ćelijske linije PER.C6/TetR i PER.C6/CymR sposobne da represiraju ekspresiju vektorskog transgena u kontekstu replicirajućih adenovirusnih vektora.
[0121] Efekt TetR- i CymR-posredovane represije ekspresije adeno-vektorskog transgena na prinos vektora je ispitivan kod vektora na bazi Ad35 koji su eksprimirali HPVAg (Sl. 13A). Sa tim ciljem, ćelijske linije PER.C6, PER.C6/TetR, i PER.C6/CymR, posejane u gustini od 3*10<5>ćelija po komorici u pločici sa 24-komorica, su podvrgnute četvorostrukim infekcijama – 1000 virusnih čestica po ćeliji i tokom tri sata – uz pomoć vektora koji eksprimiraju HPVAg kod kontrolom CMVTetO ili CMVCuO. Kao kontrole, paralelne infekcije su provedene sa odgovarajućim vektorima koji eksprimiraju GFP-Luc umesto HPVAg. Četiri
4
dana nakon infekcije, sirovi viralni lizati su pripremljeni podvrgavanjem sadržaja komorica (tj. inficiranih ćelija u medijumu) dvama ciklusima smrzavanja-odmrzavanja. Adenovektorski titari su nakon toga određeni uz pomoć protokola na bazi kvantitativnog PCR uz korišćenje Ad35-heksonske sekvence pri čemu se koristi prečišćeni Ad35-vektor sa tutarom poznate virusne čestice kao standardom. Rezultat je pokazao da oba Ad35-vektora koji kodiraju HPVAg koji sadrži TetO i CuO, upoređeno sa kontrolnim vektorom koji eksprimira GFP-Luc, pokazuju smanjeni prinos vektora u normalnim PER.C6 ćelijama. Suprotno, kada se proizvode u ćelijama koje eksprimiraju njihove srodne represore (tj. TetR i CymR), pomenuti vektori daju prinose kao i oni koji su dobiveni sa kontrolnim vektorima. Ovi podaci pokazuju da represija ekspresije transgena tokom proizvodnje vektora u proizvodnim ćelijama može da bude korisna za produktivnost Ad35-vektora koji nose HPVAg kao transgen.
[0122] Efekt kojeg represija ekspresije adeno-vektorskog transgena može da uspostavi na vektorske prinose je takođe ispitivan kod vektora koji su izvedeni iz adenovirusnog serotipa 26 (Ad26) (Sl. 13B). U ogledu koji je proveden uglavnom kao šta je opisano kod Ad35-vektora, Ad26-vektori koji sadrže transgene pod kontrolom CMVTetO-promotora koji kodiraju GFP-Luc, HPVAg, ili LSE2E6E7SH su korišćeni za inficiranje PER.C6 i PER.C6/TetR ćelija sa 1500 virusnih čestica po ćeliji. Tri dana kasnije, infekcije su sakupljene, a titari virusnih čestica su određeni primenom postupka na bazi kvantitativnog PCR uz korišćenje Ad26-heksonske sekvence. Ovi rezultati pokazuju da su u PER.C6-ćelijama prinosi vektora koja kodiraju HPVAg i LSE2E6E7SH niži od onih koji su dobiveni sa kontrolnim vektorom koja kodira GFP-Luc. Suprotno, u PER.C6/TetR ćelijama, oba ova vektora su pokazala titare koji su visoki kao i oni koji su dobiveni kod kontrolnog vektora. Zajedno sa rezultatima iznad (za Ad35-vektore), ovi podaci pokazuju da represija ekspresije transgena tokom proizvodnje adeno-vektora povećava prinose vektora koji eksprimiraju HPVAg i LSE2E6E7SH.
[0123] Mi smo primetili važne fenomene koji se tiču genetičke stabilnosti adeno-virusnog vektora koji sadrži transgen za HPVAg pod kontrolom CMV-promotora. Na primer, bilo je primećeno da se nakon nekoliko pasažnih rundi ovoga vektora u PER.C6 ćelijama glavnina vektorske populacije sastojala od mutiranog vektora koji je sadržavao veliku deleciju u sekvenci koja kodira HPVAg (podaci nisu pokazani).
[0124] Mi smo zaključili da primena represornog sistema ekspresije transgena, poput jednog od oba opisana iznad, može da otkloni probleme genetičke stabilnosti koji su povezani sa transgenima, poput HPVAg koji inhibiraju umnožavanje vektora. Kako bi ovo testirali, ekspresija HPVAg pod kontrolom CMVCuO-promotora u vektoru na bazi Ad35 je ispitana sa ciljem da se proceni stabilnosti kasete transgena nakon umnožavanja vektora u ćelijama PER.C6 ili PER.C6/CymR (Sl.14). Ukratko, vektorska DNA je transfektovana u dve različite ćelijske linije, a nastali viralni plakovi su ostavljeni da rastu ispod agaroznog sloja. Iz svake transfekcije je izolovano pet viralnih plakova pa su odvojeno pasažirani dodatno u istoj ćelijskoj liniji (tj. kao ona koja je korišćena za transfekciju) tokom deset uzastopnih viralnih pasaža. Integritet transgena je procenjen primenom PCR-amplifikacije transgene kasete kod viralne pasaže broj deset (VPN10), a naknadna analiza nastalih PCR-produkata je provedena uz pomoć gel-elektroforeze i sekvenciranja po Sangeru. Osim toga, kod VPN7, pasažiranim viralnim klonovima je procenjena sposobnost da eksprimiraju HPVAg. To je provedeno uz pomoć korišćenja pasažiranih viralnih izolata kako bi se inficirale A549-ćelije sa 1000 virusnih čestica po ćeliji, liziranja ćelija nakon 48 h nakon infekcije, i naknadne analize ekspresije HPVAg uz pomoć western-blotinga uz korišćenje monoklonskog antitela koje je usmereno protiv HPV16 E7 (Santa-Cruz Biotechnology). Rezultati gel-elektroforeze i analize sekvenciranja pokazuju da je svih pet viralnih izolata, koji su bili pasažirani u PER.C6, u transgenoj kaseti sadržavalo male delecije koje su uzrokovale pomak okvira čitanja ili mutacije koje su uvodile signale za preuranjeno zaustavljanje transkripcije. Suprotno, takve delecije ili mutacije nisu bile detektovane u bilo kojem vektorskom izolatu koji je bio pasažiran u ćelijskoj liniji koja eksprimira CymR (PER.C6/CymR). U skladu sa ovim podacima, svi vektorski izolati propagirani u PER.C6/CymR su bili sposobni da eksprimiraju HPVAg, dok svi vektori uzgojeni u PER.C6 su potpuno izgubili ovu svoju sposobnost, koje sugeriše defektne transgene kasete kod ovih vektora. Suprotno, naši podaci pokazuju da je primena represorskog sistema, kao na primer CymR/CuO-sistema, sa ciljem da se suprimira ekspresija vektorskog transgena tokom proizvodnje vektora efektivan način koji sprečava ozbiljne nestabilnosti transgene kasete, poput onih koji su primećeni kod vektora koji sadrže transgen koji eksprimira HPVAg.
Reference
[0125]
Abbink P, Lemckert AA, Ewald BA, Lynch DM, Denholtz M, Smits S, Holterman L, Damen I, Vogels R, Thorner AR, O'Brien KL, Carville A, Mansfield KG, Goudsmit J, Havenga MJ, Barouch DH (2007) Comparative seroprevalence and immunogenicity of six rare serotype recombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups B and D. J Virol 81:4654-4663
Ausubel FM (1995) Short protocols in molecular biology: a compendium of methods from Current protocols in molecular biology. Wiley, [Chichester]
Cottingham MG, Carroll F, Morris SJ, Turner AV, Vaughan AM, Kapulu MC, Colloca S, Siani L, Gilbert SC, Hill AV (2012) Preventing spontaneous genetic rearrangements in the transgene cassettes of adenovirus vectors. Biotechnol Bioeng 109:719-728
Daayana S, Elkord E, Winters U, Pawlita M, Roden R, Stern PL, Kitchener HC (2010) Phase II trial of imiquimod and HPV therapeutic vaccination in patients with vulval intraepithelial neoplasia. Br J Cancer 102:1129-1136
de Jong A, van der Burg SH, Kwappenberg KM, van der Hulst JM, Franken KL, Geluk A, van Meijgaarden KE, Drijfhout JW, Kenter G, Vermeij P, Melief CJ, Offringa R (2002) Frequent detection of human papillomavirus 16 E2-specific T-helper immunity in healthy subjects. Cancer Res 62:472-479
Edholm D, Molin M, Bajak E, Akusjarvi G (2001) Adenovirus vector designed for expression of toxic proteins. J Virol 75:9579-9584
Evans RK, Nawrocki DK, Isopi LA, Williams DM, Casimiro DR, Chin S, Chen M, Zhu DM, Shiver JW, Volkin DB (2004) Development of stable liquid formulations for adenovirus-based vaccines. J Pharm Sci 93:2458-2475
Fallaux FJ, Bout A, van der Velde I, van den Wollenberg DJ, Hehir KM, Keegan J, Auger C, Cramer SJ, van Ormondt H, van der Eb AJ, Valerio D, Hoeben RC (1998) New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses. Hum Gene Ther 9:1909-1917 Frøkjær S, Hovgaard L (2000) Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins. Taylor & Francis, London
Gall JG, Lizonova A, EttyReddy D, McVey D, Zuber M, Kovesdi I, Aughtman B, King CR, Brough DE (2007) Rescue and production of vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressing inhibitory transgenes. Mol Biotechnol 35:263-273 Gao GP, Engdahl RK, Wilson JM (2000) A cell line for high-yield production of E1-deleted adenovirus vectors without the emergence of replication-competent virus. Hum Gene Ther 11:213-219
Gennaro AR (1990) Remington's pharmaceutical sciences. Mack
Gilbert R, Guilbault C, Gagnon D, Bernier A, Bourget L, Elahi SM, Kamen A, Massie B (2014) Establishment and validation of new complementing cells for production of E1-deleted adenovirus vectors in serum-free suspension culture. J Virol Methods 208:177-188
Hamid O, Carvajal RD (2013) Anti-programmed death-1 and anti-programmed deathligand 1 antibodies in cancer therapy. Expert Opin Biol Ther 13:847-861
Harlow E, Lane D (1988) Antibodies : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York
Havenga M, Vogels R, Zuijdgeest D, Radosevic K, Mueller S, Sieuwerts M, Weichold F, Damen I, Kaspers J, Lemckert A, van Meerendonk M, van der Vlugt R, Holterman L, Hone D, Skeiky Y, Mintardjo R, Gillissen G, Barouch D, Sadoff J, Goudsmit J (2006) Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells. J Gen Virol 87:2135-2143
Henken FE, Oosterhuis K, Ohlschlager P, Bosch L, Hooijberg E, Haanen JB, Steenbergen RD (2012) Preclinical safety evaluation of DNA vaccines encoding modified HPV16 E6 and E7. Vaccine 30:4259-4266
Hildesheim A, Herrero R, Wacholder S, Rodriguez AC, Solomon D, Bratti MC, Schiller JT, Gonzalez P, Dubin G, Porras C, Jimenez SE, Lowy DR (2007) Effect of human papillomavirus 16/18 L1 viruslike particle vaccine among young women with preexisting infection: a randomized trial. JAMA 298:743-753
Hoganson DK, Ma JC, Asato L, Ong M, Printz MA, Huyghe BG, Sosnowshi BA, D'Andrea MJ (2002) Development of a stable adenoviral vector formulation.
Bioprocess J 1:43-48
Hoof I, Peters B, Sidney J, Pedersen LE, Sette A, Lund O, Buus S, Nielsen M (2009) NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans.
Immunogenetics 61:1-13
Horwitz MS (1996) Adenoviruses. In: Fields BN, Knipe DM, Baines JD (eds) Virology. Raven Press Ltd, New York
Kenter GG, Welters MJ, Valentijn AR, Lowik MJ, Berends-van der Meer DM, Vloon AP, Essahsah F, Fathers LM, Offringa R, Drijfhout JW, Wafelman AR, Oostendorp J, Fleuren GJ, van der Burg SH, Melief CJ (2009) Vaccination against HPV-16 oncoproteins for vulvar intraepithelial neoplasia. N Engl J Med 361:1838-1847 Kibbe AH (2000) Handbook of pharmaceutical excipients. Pharmaceutical Press, London
Kovesdi I, Hedley SJ (2010) Adenoviral producer cells. Viruses 2:1681-1703 Lin KY, Guarnieri FG, Staveley-O'Carroll KF, Levitsky HI, August JT, Pardoll DM, Wu TC (1996) Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Cancer Res 56:21-26 Lundegaard C, Lamberth K, Harndahl M, Buus S, Lund O, Nielsen M (2008) NetMHC-3.0: accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11. Nucleic Acids Res 36:W509-512 Massimi P, Banks L (2005) Transformation Assays for HPV Oncoproteins. In: Davy C, Doorbar J (eds) Human Papillomaviruses : Methods and Protocols. Vol 119:
Methods in Molecular Medicine Springer, Berlin, pp 381-395
Matthews DA, Cummings D, Evelegh C, Graham FL, Prevec L (1999) Development and use of a 293 cell line expressing lac repressor for the rescue of recombinant adenoviruses expressing high levels of rabies virus glycoprotein. J Gen Virol 80 (Pt 2):345-353
McPherson MJ, Hames BD, Taylor GR (1995) PCR 2 : a practical approach. IRL Press at Oxford University Press, Oxford
Mellman I, Coukos G, Dranoff G (2011) Cancer immunotherapy comes of age.
Nature 480:480-489
Mullick A, Xu Y, Warren R, Koutroumanis M, Guilbault C, Broussau S, Malenfant F, Bourget L, Lamoureux L, Lo R, Caron AW, Pilotte A, Massie B (2006) The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol 6:43
Munger K, Phelps WC, Bubb V, Howley PM, Schlegel R (1989) The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes. J Virol 63:4417-4421
Ogun SA, Dumon-Seignovert L, Marchand JB, Holder AA, Hill F (2008) The oligomerization domain of C4-binding protein (C4bp) acts as an adjuvant, and the fusion protein comprised of the 19-kilodalton merozoite surface protein 1 fused with the murine C4bp domain protects mice against malaria. Infect Immun 76:3817-3823 Oosterhuis K, Aleyd E, Vrijland K, Schumacher TN, Haanen JB (2012a) Rational Design of DNA Vaccines for the Induction of Human Papillomavirus Type 16 E6-and E7-Specific Cytotoxic T-Cell Responses. Hum Gene Ther 23:1301-1312 Oosterhuis K, Ohlschlager P, van den Berg JH, Toebes M, Gomez R, Schumacher TN, Haanen JB (2011) Preclinical development of highly effective and safe DNA vaccines directed against HPV 16 E6 and E7. Int J Cancer 129:397-406 Oosterhuis K, van den Berg JH, Schumacher TN, Haanen JB (2012b) DNA vaccines and intradermal vaccination by DNA tattooing. Curr Top Microbiol Immunol 351:221-250
Peters B, Tong W, Sidney J, Sette A, Weng Z (2003) Examining the independent binding assumption for binding of peptide epitopes to MHC-I molecules.
Bioinformatics 19:1765-1772
Prakash SS, Grossman SR, Pepinsky RB, Laimins LA, Androphy EJ (1992) Amino acids necessary for DNA contact and dimerization imply novel motifs in the papillomavirus E2 trans-activator. Genes Dev 6:105-116
Rubinchik S, Ding R, Qiu AJ, Zhang F, Dong J (2000) Adenoviral vector which delivers FasL-GFP fusion protein regulated by the tet-inducible expression system. Gene Ther 7:875-885
Sambrook JFEFMT (1989) Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Sedman SA, Barbosa MS, Vass WC, Hubbert NL, Haas JA, Lowy DR, Schiller JT (1991) The full-length E6 protein of human papillomavirus type 16 has transforming and trans-activating activities and cooperates with E7 to immortalize keratinocytes in culture. J Virol 65:4860-4866
Shenk T (1996) Adenoviridae and their Replication. In: Fields BN, Knipe DM, Baines JD (eds) Virology. Raven Press Ltd, New York
Smahel M, Sima P, Ludvikova V, Vonka V (2001) Modified HPV16 E7 Genes as DNA Vaccine against E7-Containing Oncogenic Cells. Virology 281:231-238 van der Burg SH, Melief CJ (2011) Therapeutic vaccination against human papilloma virus induced malignancies. Curr Opin Immunol 23:252-257
Watson JD (1992) Recombinant DNA. Scientific American Books, New York Wieking BG, Vermeer DW, Spanos WC, Lee KM, Vermeer P, Lee WT, Xu Y, Gabitzsch ES, Balcaitis S, Balint JP, Jr., Jones FR, Lee JH (2012) A non-oncogenic HPV 16 E6/E7 vaccine enhances treatment of HPV expressing tumors. Cancer Gene Ther 19:667-674
Yan J, Reichenbach DK, Corbitt N, Hokey DA, Ramanathan MP, McKinney KA, Weiner DB, Sewell D (2009) Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen. Vaccine 27:431-440
Yao F, Eriksson E (1999) A novel tetracycline-inducible viral replication switch. Hum Gene Ther 10:419-427
Yoshida Y, Hamada H (1997) Adenovirus-mediated inducible gene expression through tetracycline-controllable transactivator with nuclear localization signal.
Biochem Biophys Res Commun 230:426-430
Yugawa T, Kiyono T (2009) Molecular mechanisms of cervical carcinogenesis by high-risk human papillomaviruses: novel functions of E6 and E7 oncoproteins. Rev Med Virol 19:97-113
Zwaveling S, Ferreira Mota SC, Nouta J, Johnson M, Lipford GB, Offringa R, van der Burg SH, Melief CJ (2002) Established human papillomavirus type 16-expressing tumors are effectively eradicated following vaccination with long peptides. J Immunol 169:350-358
Tabela I. Sekvence.
SEQ ID Br.: 1 (HPV16-E6E7SH, amino-kiselinska sekvenca HPV16 E6/E7 dizajniranog polipeptida)
1
2
SEQ ID Br.: 5 (HPV16 E6E7E2SH, amino-kiselinska sekvenca koja kodira HPV16 E6/E7/E2 dizajniranog polipeptida)
4
SEQ ID Br.: 8 (nukleotidna sekvenca koja kodira IgE vodeći-peptid)
ATGGACTGGACCTGGATCCTGTTCCTGGTGGCTGCCGCAACCCGGGTGCACAGC
SEQ ID Br.: 14 (TetR, nukleotidna sekvenca koja kodira amino-kiselinsku sekvencu TetR-polipeptida koji je eksprimiran u pcDNA™6/TR)
SEQ ID Br.: 15 (TetR, amino-kiselinska sekvenca TetR-polipeptida koji je eksprimiran u pcDNA™6/TR)
1
2
�
1
2
4

Claims (20)

Patentni zahtevi
1. Molekul nukleinske kiseline, naznačen time, što kodira polipeptid koji obuhvata SEQ ID Br.: 1.
2. Molekul nukleinske kiseline u skladu sa to zahtevom 1, naznačen time, što pomenuti kodirani polipeptid dodatno sadrži vodeću-sekvencu.
3. Molekul nukleinske kiseline u skladu sa bilo kojim od prethodnih zahteva, naznačen time, što pomenuti kodirani polipeptid dodatno obuhvata barem jedan epitop E2-belančevine iz ljudskog papiloma-virusa (HPV).
4. Molekul nukleinske kiseline u skladu sa zahtevom 3, naznačen time, što pomenuti kodirani polipeptid obuhvata E2-belančevinu iz HPV16 koja sadrži deleciju ili mutaciju u svom DNA-veznom domenu.
5. Molekul nukleinske kiseline u skladu sa zahtevom 4, naznačen time, što pomenuti kodirani polipeptid obuhvata SEQ ID Br.: 3 ili SEQ ID Br.: 5.
6. Molekul nukleinske kiseline u skladu sa bilo kojim od prethodnih zahteva, naznačen time, što pomenuta sekvenca nukleinske kiseline je kodon-optimizovana.
7. Molekul nukleinske kiseline u skladu sa bilo kojim od prethodnih zahteva, naznačen time, što obuhvata SEQ ID Br.: 2.
8. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline u skladu sa bilo kojim od prethodnih zahteva, naznačen time, što sekvenca koja kodira pomenuti polipeptid je operativno spojena na neki promotor.
9. Vektor u skladu sa zahtevom 8, naznačen time, što pomenuti vektor je rekombinantni adenovirus.
10. Vektor u skladu sa zahtevom 8, naznačen time, što pomenuti vektor je modifikovani vektor Vaccinia Ankara (MVA).
11. Vektor u skladu sa zahtevom 8 ili 9, naznačen time, što pomenuti promotor je operativno spojen na neku represorsko-operatorsku sekvencu, na koju može da se veže represorska belančevina sa ciljem da reprimira ekspresiju promotora u prisutnosti pomenute represorske belančevine.
12. Kompozicija za vakcinu, naznačena time, što sadrži vektor u skladu sa bilo kojem od zahteva od 8-11, i neki farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.
13. Kompozicija za vakcinu u skladu sa zahtevom 12, naznačena time, što je namenjena poticanju imuno-odgovora protiv HPV u nekom subjektu.
14. Kompozicija za vakcinu u skladu sa zahtevom 12 za upotrebu u sklad sa zahtevom 13, naznačena time, što se kompozicija za vakcinu u skladu sa zahtevom 12 administrira pomenutom subjektu više puta.
15. Kompozicija za vakcinu u skladu sa zahtevom 12, naznačena time, što je namenjena primarnoj pojačanoj-vakcinaciji sa ciljem da potakne imuno-odgovor protiv HPV u nekom subjektu, pri čemu u primarnoj vakcini vektor je neki adenoviralni vektor, a vektor pojačane-vakcine je MVA-vektor, ili vice versa.
16. Kompozicija za vakcinu u skladu sa zahtevom 12, naznačena time, što je namenjena tretmanu uporne HPV-infekcije, vulvale intraepitelne neoplazije (VIN), cervikalne intraepitelne neoplazije (CIN), vaginalne intraepitelne neoplazije (VaIN), analne intraepitelne neoplazije (AIN), raka vrata materice (poput karcinoma skvamoznih ćelija vrata materice – SCC), orofaringealnog raka, raka penisa, raka vagine ili raka anusa u nekom subjektu.
17. Kompozicija za vakcinu u skladu sa zahtevom 12 za upotrebu u skladu sa zahtevom 16, naznačena time, što je namenjena tretiranju uporne HPV-infekcije.
18. Kompozicija za vakcinu u skladu sa zahtevom 12 za upotrebu u skladu sa zahtevom 16, naznačena time, što je namenjena za tretiranje CIN.
19. Polipeptid, naznačen time, što obuhvata SEQ ID Br.: 1.
20. Polipeptid u skladu sa zahtevom 19, naznačen time, što obuhvata SEQ ID Br.: 3 ili SEQ ID Br.: 5.
RS20181369A 2014-11-04 2015-11-03 Terapeutske vakcine protiv hpv16 RS58080B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14191660 2014-11-04
PCT/EP2015/075516 WO2016071306A1 (en) 2014-11-04 2015-11-03 Therapeutic hpv16 vaccines
EP15791556.2A EP3215187B1 (en) 2014-11-04 2015-11-03 Therapeutic hpv16 vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58080B1 true RS58080B1 (sr) 2019-02-28

Family

ID=52020908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181369A RS58080B1 (sr) 2014-11-04 2015-11-03 Terapeutske vakcine protiv hpv16

Country Status (34)

Country Link
US (4) US9701721B2 (sr)
EP (2) EP3421046A1 (sr)
JP (2) JP6325751B2 (sr)
KR (1) KR20170083562A (sr)
CN (1) CN107075521B (sr)
AR (1) AR102527A1 (sr)
AU (2) AU2015341926B2 (sr)
BR (1) BR112017009177A2 (sr)
CA (1) CA2965562C (sr)
CL (1) CL2017001089A1 (sr)
CO (1) CO2017004838A2 (sr)
CY (1) CY1121377T1 (sr)
DK (1) DK3215187T3 (sr)
EA (1) EA035461B1 (sr)
ES (1) ES2697903T3 (sr)
HR (1) HRP20181895T1 (sr)
HU (1) HUE040440T2 (sr)
IL (1) IL251895B (sr)
LT (1) LT3215187T (sr)
MA (2) MA40902B1 (sr)
MD (1) MD3215187T2 (sr)
MX (1) MX379069B (sr)
MY (1) MY181175A (sr)
NZ (1) NZ730802A (sr)
PL (1) PL3215187T3 (sr)
PT (1) PT3215187T (sr)
RS (1) RS58080B1 (sr)
SA (1) SA517381457B1 (sr)
SG (1) SG11201702997YA (sr)
SI (1) SI3215187T1 (sr)
SM (1) SMT201800602T1 (sr)
TW (2) TWI731654B (sr)
WO (1) WO2016071306A1 (sr)
ZA (1) ZA201703055B (sr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS58080B1 (sr) 2014-11-04 2019-02-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Terapeutske vakcine protiv hpv16
JP6470872B2 (ja) 2015-08-20 2019-02-13 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 治療用ｈｐｖ１８ワクチン
JP7053491B2 (ja) * 2016-05-02 2022-04-12 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 治療用ｈｐｖワクチン組み合わせ
CN106632694B (zh) * 2017-01-24 2021-02-12 南京益康生物医药有限公司 一种重组蛋白及药物组合物与应用
CA3058807A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Biontech Us Inc. Protein antigens and uses thereof
MX2020003071A (es) 2017-09-23 2020-07-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sistema de expresion de paramyxoviridae.
WO2019164970A1 (en) * 2018-02-20 2019-08-29 Emory University Hpv proteins, antibodies, and uses in managing abnormal epithelial cell growth
AU2019234549B2 (en) * 2018-03-12 2026-02-12 Sqz Biotechnologies Company Methods for treating HPV-associated diseases
EP3810277A1 (en) * 2018-07-20 2021-04-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenoviral vector expressing zika antigen with improved productivity
CN108939064B (zh) * 2018-08-06 2021-12-10 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
CN108992665B (zh) * 2018-08-06 2021-11-19 南京颂悦生物科技有限公司 基于重组减毒单增李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
EP3935581A4 (en) 2019-03-04 2022-11-30 Iocurrents, Inc. DATA COMPRESSION AND COMMUNICATION USING MACHINE LEARNING
US20230405105A1 (en) 2019-09-20 2023-12-21 Transgene Sa Combination of a poxvirus encoding hpv polypeptides with an anti-pd-l1 antibody
WO2021202949A2 (en) * 2020-04-02 2021-10-07 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating vulvar dysplasia
WO2021209897A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
US20210353744A1 (en) * 2020-05-12 2021-11-18 Janssen Vaccines Prevention B.V. Administration of homologous adenoviral vectors
CA3200064A1 (en) * 2020-11-24 2022-06-02 Ma, Muchou Joe Dna vaccine for human palillomavirus and method for using the same
JP2024539188A (ja) * 2021-10-22 2024-10-28 イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 肛門高悪性度扁平上皮内病変（ｈｓｉｌ）を治療するための組成物及び方法
WO2025092908A1 (zh) * 2023-11-01 2025-05-08 仁景(苏州)生物科技有限公司 治疗HPV感染相关疾病的mRNA疫苗
CN120607593A (zh) * 2024-03-06 2025-09-09 诺未生物技术(无锡)有限公司 治疗hpv感染相关疾病的药物
CN118344491B (zh) * 2024-05-03 2025-02-14 华中科技大学同济医学院附属同济医院 一种hpv16/18治疗性疫苗、制备方法和应用

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
NZ230747A (en) 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
ATE336587T1 (de) 1994-06-10 2006-09-15 Genvec Inc Adenoviren-vektor systeme und zelllinien
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5559099A (en) 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5965541A (en) 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
IL160406A0 (en) 1995-06-15 2004-07-25 Crucell Holland Bv A cell harbouring nucleic acid encoding adenoritus e1a and e1b gene products
US5837511A (en) 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
US5891690A (en) 1996-04-26 1999-04-06 Massie; Bernard Adenovirus E1-complementing cell lines
CA2283253A1 (en) 1997-03-04 1998-09-11 Baxter International Inc. Adenovirus e1-complementing cell lines
US6020191A (en) 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US5972650A (en) 1997-06-26 1999-10-26 Brigham And Women's Hospital Tetracycline repressor regulated mammalian cell transcription and viral replication switch
US5981225A (en) 1998-04-16 1999-11-09 Baylor College Of Medicine Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same
US6113913A (en) 1998-06-26 2000-09-05 Genvec, Inc. Recombinant adenovirus
ES2372823T3 (es) 1999-05-17 2012-01-26 Crucell Holland B.V. Adenovirus recombinante del serotipo ad11.
WO2003104467A1 (en) 2002-04-25 2003-12-18 Crucell Holland B.V. Means and methods for the production of adenovirus vectors
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
FR2794370B1 (fr) 1999-06-03 2003-10-17 Biovector Therapeutics Fragments proteiques polyepitopiques, leur obtention et leurs utilisations notamment en vaccination
CA2384987A1 (en) * 1999-09-16 2001-03-22 Zycos Inc. Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides
DE19955558C2 (de) 1999-11-18 2003-03-20 Stefan Kochanek Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren
AU2002211490A1 (en) 2000-10-04 2002-04-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of using capsid protein from flaviviruses and pestiviruses
UA76731C2 (uk) 2000-11-23 2006-09-15 Баваріан Нордік А/С Штам mva-bn модифікованого вірусу коров'ячої віспи ankara, фармацевтична композиція, вакцина, застосування mva-bn для приготування лікарського препарату та для приготування вакцини, спосіб введення гомологічної і/або гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в клітини-мішені in vitro, спосіб одержання пептиду або білка, спосіб одержання mva-bn, клітина, набір для основної/бустерної імунізації
WO2002088346A2 (en) 2001-05-01 2002-11-07 National Research Council Of Canada A system for inducible expression in eukaryotic cells
SE0202110D0 (sv) 2002-07-05 2002-07-05 Isconova Ab Iscom preparation and use thereof
SE0301998D0 (sv) 2003-07-07 2003-07-07 Isconova Ab Quil A fraction with low toxicity and use thereof
AU2005222776A1 (en) * 2003-12-31 2005-09-29 Genimmune N.V. Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
US20070207461A1 (en) 2004-02-23 2007-09-06 Crucell Holland B.V. Virus Purification Methods
KR101271884B1 (ko) 2004-11-08 2013-06-05 크로마제닉스 비.브이. 고수준으로 단백질을 발현하는 숙주세포의 선택
WO2007073513A2 (en) 2005-11-10 2007-06-28 Genvec, Inc. Method for propagating adenoviral vectors encoding inhibitory gene products
CN103122360A (zh) 2006-02-28 2013-05-29 瓦克萨特公司 嵌合腺病毒载体
WO2007104792A2 (en) 2006-03-16 2007-09-20 Crucell Holland B.V. Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof
CL2008000249A1 (es) * 2007-01-30 2008-05-30 Transgene Sa Uso de una molecula de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido e2 del papilomavirus, un vector o una particula virica infecciosa que la comprenda para tratar una infeccion permanente por papilomavirus causada por al menos un papilomavirus
DE102008010954A1 (de) * 2008-02-25 2009-08-27 Cichon, Günter, Prof.Dr. DNA-Vakzine zur Therapie und Prophylaxe von Gebärmutterhalskrebs und seinen prämalignen Vorstufen
US10041049B2 (en) 2008-11-03 2018-08-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method for the production of adenoviral vectors
GB0823497D0 (en) 2008-12-24 2009-01-28 Isis Innovation Immunogenic composition and use thereof
MX2012007936A (es) 2010-02-15 2012-11-22 Crucell Holland Bv Metodo para la produccion de vectores adenovirales del serotipo 26 del adenovirus.
PL2604629T3 (pl) * 2010-08-13 2018-08-31 Genexine, Inc. Kompozycja do zapobiegania lub leczenia raka szyjki macicy ze wzmacniaczem odporności przeciwko wirusowi brodawczaka ludzkiego
US20130122038A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
EP2601968A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-12 Deutsches Krebsforschungszentrum HPV derived polynucleic acids for therapy
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
EP3188752A2 (en) 2014-09-03 2017-07-12 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) filovirus vaccine
RS58080B1 (sr) 2014-11-04 2019-02-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Terapeutske vakcine protiv hpv16
JP6470872B2 (ja) * 2015-08-20 2019-02-13 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 治療用ｈｐｖ１８ワクチン
JP7053491B2 (ja) * 2016-05-02 2022-04-12 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 治療用ｈｐｖワクチン組み合わせ

Also Published As

Publication number Publication date
LT3215187T (lt) 2018-12-27
AU2015341926A1 (en) 2017-04-27
ES2697903T3 (es) 2019-01-29
SG11201702997YA (en) 2017-05-30
CA2965562A1 (en) 2016-05-12
HUE040440T2 (hu) 2019-03-28
CN107075521A (zh) 2017-08-18
WO2016071306A1 (en) 2016-05-12
PT3215187T (pt) 2018-11-27
EA201790976A1 (ru) 2017-09-29
CO2017004838A2 (es) 2017-07-28
BR112017009177A2 (pt) 2018-12-11
US20180344841A1 (en) 2018-12-06
JP6606571B2 (ja) 2019-11-13
JP2018148890A (ja) 2018-09-27
TW202043476A (zh) 2020-12-01
EP3421046A1 (en) 2019-01-02
MA46378A (fr) 2019-08-07
US20170281747A1 (en) 2017-10-05
TWI694147B (zh) 2020-05-21
US10071151B2 (en) 2018-09-11
SMT201800602T1 (it) 2019-01-11
EA035461B1 (ru) 2020-06-19
US20160122396A1 (en) 2016-05-05
ZA201703055B (en) 2019-11-27
MY181175A (en) 2020-12-21
MX379069B (es) 2025-03-10
IL251895A0 (en) 2017-06-29
MA40902B1 (fr) 2018-12-31
EP3215187A1 (en) 2017-09-13
AR102527A1 (es) 2017-03-08
MA40902A (fr) 2017-09-13
JP6325751B2 (ja) 2018-05-16
SI3215187T1 (sl) 2019-02-28
CN107075521B (zh) 2021-06-08
US9701721B2 (en) 2017-07-11
KR20170083562A (ko) 2017-07-18
MD3215187T2 (ro) 2019-02-28
NZ730802A (en) 2021-12-24
AU2015341926B2 (en) 2018-09-27
TW201617450A (zh) 2016-05-16
CL2017001089A1 (es) 2017-12-29
AU2018282463B2 (en) 2020-09-10
JP2017534286A (ja) 2017-11-24
EP3215187B1 (en) 2018-08-29
US20200164057A1 (en) 2020-05-28
SA517381457B1 (ar) 2021-03-11
CA2965562C (en) 2023-11-21
US11040096B2 (en) 2021-06-22
TWI731654B (zh) 2021-06-21
DK3215187T3 (en) 2018-12-10
IL251895B (en) 2019-08-29
HRP20181895T1 (hr) 2019-01-11
PL3215187T3 (pl) 2019-04-30
US10555996B2 (en) 2020-02-11
CY1121377T1 (el) 2020-05-29
AU2018282463A1 (en) 2019-01-24
MX2017005788A (es) 2017-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11040096B2 (en) Therapeutic HPV16 vaccines
US10844096B2 (en) Therapeutic HPV18 vaccines
US10517944B2 (en) Therapeutic HPV vaccine combinations
HK1236108A1 (en) Therapeutic hpv16 vaccines
HK1236108B (en) Therapeutic hpv16 vaccines