Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS58173B1 - Konjugat anti-trop2 antitelo-lek - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS58173B1 - Konjugat anti-trop2 antitelo-lek - Google Patents

Konjugat anti-trop2 antitelo-lek

Info

Publication number
RS58173B1
RS58173B1 RS20181597A RSP20181597A RS58173B1 RS 58173 B1 RS58173 B1 RS 58173B1 RS 20181597 A RS20181597 A RS 20181597A RS P20181597 A RSP20181597 A RS P20181597A RS 58173 B1 RS58173 B1 RS 58173B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
amino acid
ch2ch2
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20181597A
Other languages
English (en)
Inventor
Toshinori Agatsuma
Shu Takahashi
Jun Hasegawa
Daisuke Okajima
Hirofumi Hamada
Miki Yamaguchi
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Univ Sapporo Medical
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53477995&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58173(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd, Univ Sapporo Medical filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
Publication of RS58173B1 publication Critical patent/RS58173B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na konjugat antitelo-lek koji ima antitumorski lek koji je konjugovan za anti-TROP2 antitelo preko segmenta strukture veznika, pri čemu je konjugat koristan kao antitumorski lek.
Stanje tehnike
[0002] Konjugat antitelo-lek (antibody-drug conjugate - ADC) koji ima lek sa citotoksičnošću konjugovan za antitelo, čiji antigen je eksprimiran na površini kancerskih ćelija i koji se takođe vezuje za antigen sposoban za ćelijsku internalizaciju, i stoga može isporučiti lek selektivno kancerskim ćelijama i prema tome je očekivano da uzrokuje akumulaciju leka unutar kancerskih ćelija i da ubije kancerske ćelije (videti, Nepatentne Literature 1 do 3). Kao ADC, Mylotarg (Gemtuzumab ozogamicin (registrovani žig)) u kome je kaliheamicin konjugovan za anti-CD33 antitelo je odobren kao terapijski agens za akutnu mijeloidnu leukemiju. Dalje, Adcetris (Brentuksimab vedotin (registrovani žig)), u kome auristatin E je konjugovan za anti-CD30 antitelo, je nedavno odobren kao terapijski agens za Hočkinov limfom i anaplastični krupnoćelijski limfom (videti, Nepatentnu Literaturu 4). Lekovi sadržani u ADC konjugatima koji su odobreni do sada ciljaju DNK ili tubulin.
[0003] Što se tiče antitumorskog, jedinjenja male molekulske mase, derivati kamptotecina, jedinjenja koja inhibiraju topoizomerazu I kako bi ispoljila antitumorski efekat, su poznata. Među njima, antitumorsko jedinjenje predstavljeno formulom ispod
(eksatekan, hemijski naziv: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-10,13(9H,15H)-dion) je derivat kamptotecina rastvoran u vodi (Patentna Literatura 1 i 2). Za razliku od irinotekana trenutno korišćenog u kliničkim postavkama, ovo jedinjenje ne zahteva aktivaciju pomoću enzima za ispoljavanje antitumorskog efekta. Dalje, inhibitorna aktivnost na topoizomerazu I je viša od SN-38 koji je glavna farmaceutski aktivna supstanca irinotekana i topotekana takođe korišćenih u kliničkim postavkama, i više in vitro citocidno delovanje je dobijeno na raznim kancerskim ćelijama. Naročito, ispoljava efekat na kancerskim ćelijama koje su rezistentne na SN-38 ili slično usled ekspresije P-glikoproteina. Dalje, u mišjem modelu subkutano transplantiranog humanog tumora, ispoljilo je potentni antitumorski efekat, i stoga je podvrgnuto kliničkim studijama, ali još nije stavljeno na tržište (videti, Nepatentne Literature 5 do 10). ostaje nejasno da li ili ne eksatekan deluje efikasno kao ADC.
[0004] DE-310 je kompleks u kome je eksatekan konjugovan za biodegradabilni polimer karboksimetildekstran polialkohola preko GGFG peptidnog razdvojnika (Patentna Literatura 3 i Nepatentne Literature 30 i 31). Peptidni razdvojnici koji uključuju GGFG tetrapeptid su razmotreni u Nepatentnoj Literaturi 32. Konvertovanjem eksatekana u oblik polimernog proleka, svojstvo visokog zadržavanja u krvi može može biti održano i takođe svojstvo mogućnosti visokog ciljanja za oblast tumora je pasivno povećano korišćenjem povećane permeabilnosti novoformiranih krvnih sudova unutar tumora i svojstva zadržavanja u tumorskim tkivima. Sa DE-310, putem cepanja peptidnog razdvojnika pomoću enzima, eksatekan i eksatekan sa glicinom vezanim za amino grupu su kontinuirano oslobađani kao glavna aktivna supstanca. Kao rezultat, farmakokinetika je poboljšana. Pronađeno je da DE-310 ima višu efikasnost nego eksatekan administriran sam čak iako je ukupna količina eksatekana sadržanog u tome niža nego slučaj administracije eksatekana samog u skladu sa raznim modelima za evaluaciju tumora u nekliničkim studijama. Klinička studija je sprovedena za DE-310, i takođe su efikasni slučajevi potvrđeni, u kojima je prisutan izveštaj koji ukazuje na to da se glavna aktivna supstanca akumulira u tumorskim nego u normalnim tkivima, međutim, postoji takođe izveštaj koji ukazuje na to da akumulacija DE-310 i glavne aktivne supstance u tumorskim nije mnogo drugačija od akumulacije u normalnim tkivima kod ljudi, i prema tome nije opaženo pasivno ciljanje kod ljudi (videti, Nepatentne Literature 11 do 14). Kao rezultat, DE-310 nije takođe komercijalizovan, i ostaje nejasno da li ili ne efikasno deluje kao lek usmeren na takvo ciljanje.
[0005] Kao jedinjenje koje se odnosi na DE-310, kompleks u kome je strukturni segment predstavljen pomoću -NH-(CH2)4-C(=O)- je insertovan između -GGFG-razdvojnika i eksatekana da bi se formirao -GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- korišćen kao struktura razdvojnika je takođe poznat (Patentna Literatura 4). Međutim, antitumorski efekat pomenutog kompleksa nije poznat uopšte.
[0006] Humani TROP2 (TACSTD2: tumor-povezani transduktor kalcijumskog kanala 2, GA733-1, EGP-1, M1S1; u daljem tekstu, pod nazivom hTROP2) je transmembranski protein tipa 1 koji jednom prolazi kroz ćelijsku membranu koji se sastoji od 323 aminokiselinska ostatka. Dok je prisustvo proteina ćelijske membrane uključenog u imunsku rezistentnost, koji je zajednički za trofoblaste i kancerske ćelije (Nepatentna Literatura 15), bilo prethodno predloženo, molekul antigena prepoznat pomoću monoklonskog antitela (162-25.3 ili 162-46.2) za protein ćelijske membrane u humanoj ćelijskoj liniji horiokarcinoma je identifiikovan i označen kao TROP2 kao jedan od molekula eksprimiranih u humanim trofoblastima (Nepatentna Literatura 16). Ovaj molekul je takođe pronađen kasnije od strane drugih istraživača i takođe označen kao tumorski antigen GA733-1 prepoznat od strane mišjeg monoklonskog antitela GA733 (Nepatentna Literatura 17) dobijenog imunizacijom sa ćelijskom linijom kancera želuca ili epitelni glikoprotein (EGP-1; Nepatentna Literatura 18) prepoznat pomoću mišjeg monoklonskog antitela RS7-3G11 koji je dobijen imunizacijom sa ćelijama nesitnoćelijskog kancera pluća. U 1995, međutim, TROP2 gen je kloniran, i potvrđeno je da su svi ovi molekuli identični molekuli (Nepatentna Literatura 19). DNK sekvenca i aminokiselinska sekvenca za hTROP2 su dostupne u javnoj bazi podataka i mogu biti navedene na primer, pod Pristupnim brojevima NM_002353 i NP_002344 (NCBI).
[0007] hTROP2 gen čini TACSTD gensku familiju, zajedno sa genom humanog TROP-1
(EpCAM, EGP-2, TACSTD1) koji ima oko 50% homologije (Nepatentna Literatura 21). hTROP2 protein je sačinjen od signalne sekvence koja se sastoji od N-terminalnih 26 aminokiselinskih ostataka, vanćelijskog domena koji se sastoji od 248 aminokiselinskih ostataka, transmembranskog domena koji se sastoji od 23 aminokiselinska ostatka, i unutarćelijskog domena koji se sastoji od 26 aminokiselinskih ostataka. Vanćelijski domen ima četiri N-vezana mesta glikozilacije i takođe je poznato da ima očiglednu molekulsku masu od 10 kD plus teorijski izračunatu vrednost 35 kD (Nepatentna Literatura 19).
[0008] Niti je identifikovan fiziološki ligand za hTROP2, niti su do sada otkrivene njegove fiziološke funkcije. Pronađeno je da hTROP2 transdukuje kalcijumske signale u tumorskim ćelijama (Nepatentna Literatura 20). Dodatno, hTROP2 je fosforilisan na unutarćelijskom ostatku serin 3030 pomoću protein kinaze C, koja je Ca<2+>-zavisna kinaza (Nepatentna Literatura 18), i ima PIP2-vezujuću sekvencu u unutarćelijskom domenu, ukazujući na signalne funkcije u tumorskim ćelijama (Nepatentna Literatura 22).
[0009] U imunohistohemijskoj analizi koja koristi kliničke uzorke, pronađeno je da je hTROP2 prekomerno eksprimiran u raznim karcinomima epitelnih ćelija i da je eksprimiran u epitelnim ćelijama u ograničenim tipovima normalnih tkiva na niskom nivou ekspresije u poređenju sa tumorskim tkivima (Nepatentne Literature 23 do 27). Takođe, opisano je da je ekspresija hTROP2 u korelaciji sa lošom prognozom za kolorektalni kancer (Nepatentna Literatura 23), kancer želuca (Nepatentna Literatura 24), kancer pankreasa (Nepatentna Literatura 25), oralni kancer (Nepatentna Literatura 26), i gliom (Nepatentna Literatura 27).
[0010] Iz modela koji koriste kolorektalne kancerske ćelije, dalje je opisano da ekspresija hTROP2 je uključena u ćelijski rast tumorskih ćelija nezavisan od skele i tumorigenezu u imunodeficijentnim miševima (Nepatentna Literatura 28).
[0011] Nepatentna Literatura 29 i Patentna Literatura 10 stavljaju na uvid javnosti konjugate antitelo-lek koji sadrže anti-TROP2 antitelo (hRS7) konjugovano za lek (SN-38). Patentna Literatura 13 stavlja na uvid javnosti konjugate od EPG-1 (anti-TROP2) antitela, uključujući antitelo hRS7, sa antitumorskim agensima, uključujući kamptotecin, za primenu protiv kancera. Patentna Literatura 14 stavlja na uvid javnosti dodatne konjugate od hRS7 i SN38. Nepatentna Literatura 6 opisuje pripremu kamptotecin eksatekana (DX-8951) i njegovu korisnost kao antikancerskog agensa i ukazuje na to da je potentniji od SN-38.
[0012] Kao odgovor na takve informacije koje ukazuju na vezu sa kancerom, do sada je uspostavljeno mnoštvo anti-hTROP2 antitela i proučeno za svoje antitumorske efekte. Među tim antitelima, ovde je stavljeno na uvid javnosti, na primer, nekonjuguvano antitelo koje pokazuje samo po sebi antitumorsku aktivnost u ksenograft modelima „golog“ („nude“) miša
(Patentne Literature 5 do 8) kao i antitelo koja pokazuje antitumorsku aktivnost kao ADC sa citotoksičnim lekom (Patentne Literature 9 do 12). Međutim, jačina ili pokrivenost njihove aktivnosti još uvek nije dovoljna, i postoje nezadovoljene medicinske potrebe za hTROP2 kao terapijskom metom.
Lista referenci
Patentna literatura
[0013]
Patentna Literatura 1: Objavljen (laid-open) japanski patent br.5-59061 Patentna Literatura 2: Objavljen (laid-open) japanski patent br.8-337584 Patentna Literatura 3: Međunarodna objava br. WO 1997/46260
Patentna Literatura 4: Međunarodna objava br. WO 2000/25825
Patentna Literatura 5: Međunarodna objava br. WO 2008/144891
Patentna Literatura 6: Međunarodna objava br. WO 2011/145744
Patentna Literatura 7: Međunarodna objava br. WO 2011/155579
Patentna Literatura 8: Međunarodna objava br. WO 2013/077458
Patentna Literatura 9: Međunarodna objava br. WO 2003/074566
Patentna Literatura 10: Međunarodna objava br. WO 2011/068845
Patentna Literatura 11: Međunarodna objava br. WO 2013/068946
Patentna Literatura 12: Američki patent br.7999083
Patentna Literatura 13: U.S. 2008/131363 A1
Patentna Literatura 14: U.S. 2011/293513 A1
Nepatentna literatura
[0014]
Nepatentna Literatura 1: Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.
Nepatentna Literatura 2: Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.
Nepatentna Literatura 3: Damle N.K., Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452. Nepatentna Literatura 4: Senter s. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
Nepatentna Literatura 5: Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.
Nepatentna Literatura 6: Mitsui, I., et al., Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-782. Nepatentna Literatura 7: Takiguchi, S., et al., Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769. Nepatentna Literatura 8: Joto, N. et al., Int J Cancer (1997) 72, 680-686.
Nepatentna Literatura 9: Kumazawa, E. et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.
Nepatentna Literatura 10: De Jager, R., et al., Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.
Nepatentna Literatura 11: Inoue, K. et al., Polymer Drugs in the Clinical Stage, Uređeno od strane Maeda et al. (2003), 145-153.
Nepatentna Literatura 12: Kumazawa, E. et al., Cancer Sci (2004) 95, 168-175.
Nepatentna Literatura 13: Soepenberg, O. et al., Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.
Nepatentna Literatura 14: Wente M. N. et al., Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.
Nepatentna Literatura 15: Faulk WP, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.75(4), 1947-1951 (1978).
Nepatentna Literatura 16: Lipinski M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.78(8), 5147-5150 (1981).
Nepatentna Literatura 17: Linnenbach A J, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86(1), 27-31 (1989).
Nepatentna Literatura 18: Basu A, et al., Int. J. Cancer, 62(4), 472-479 (1995).
Nepatentna Literatura 19: Fornaro M, et al., Int. J. Cancer, 62(5), 610-618 (1995). Nepatentna Literatura 20: Ripani E, et al., Int. J. Cancer, 76(5), 671-676 (1998). Nepatentna Literatura 21: Calabrese G, et al., Cytogenet. Cell Genet., 92(1-2), 164-165 (2001).
Nepatentna Literatura 22: El Sewedy T, et al., Int. J. Cancer, 75(2), 324-330 (1998). Nepatentna Literatura 23: Ohmachi T, et al., Clin. Cancer Res., 12(10), 3057-3063 (2006).
Nepatentna Literatura 24: Muhlmann G, et al., J. Clin. Pathol., 62(2), 152-158 (2009).
Nepatentna Literatura 25: Fong D, et al., Br. J. Cancer, 99(8), 1290-1295 (2008). Nepatentna Literatura 26: Fong D, et al., Mod. Pathol., 21(2), 186-191 (2008).
Nepatentna Literatura 27: Ning S, et al., Neurol. Sci., 34(10), 1745-1750 (2013).
Nepatentna Literatura 28: Wang J, et al., Mol. Cancer Ther., 7(2), 280-285 (2008).
Nepatentna Literatura 29: Cardillo T M, et al., Clin. Cancer Res., 17(10); 3157-3169
(2011).
Nepatentna Literatura 30: Ochi Y, et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 554): 323-332 (2005).
Nepatentna Literatura 31: Wente M N, et al., Investigational New Drugs, 23(4), 339-347 (2005).
Nepatentna Literatura 32: Shiose Y, et al, Bioconjugate Chem., 20(1), 60-70 (2009).
Rezime pronalaska
Tehnički problem
[0015] Što se tiče lečenja tumora pomoću antitela, nedovoljni antitumorski efekat može biti opažen čak kada antitelo prepoznaje antigen kako bi se vezalo za tumorske ćelije, i postoji slučaj u kome je potrebno efikasnije antitumorsko antitelo. Dalje, mnoga antitumorska jedinjenja male molekulske mase imaju problem bezbednosti kao što su sporedni efekat i toksičnost čak i kada jedinjenja imaju odličan antitumorski efekat, ostaje kao tema da se postigne superiorni terapijski efekat pomoću daljeg poboljšavanja bezbednosti. Prema tome, cilj predmetnog pronalaska je da se dobije antitumorski lek koji ima odličan terapijski efekat, koji je odličan u smislu antitumorskog efekta i bezbednosti.
[0016] Pronalazači misle da, kada je antitumorsko jedinjenje eksatekan konvertovano u konjugat antitelo-lek, preko segmenta strukture veznika, pomoću konjugacije za anti-TROP2 antitelo, koje je sposobno za ciljanje tumorskih ćelija, odnosno koje ima svojstvo da je sposobno za prepoznavanje tumorskih ćelija, svojstvo da je sposobno za vezivanje za tumorske ćelije, svojstvo internalizacije unutar tumorskih ćelija, ili slično, citocidalno delovanje bazirano na antitelu može biti stečeno, antitumorsko jedinjenje može se sigurnije isporučiti tumorskim ćelijama kako bi se specifično ispoljio antitumorski efekat jedinjenja u tumorskim ćelijama, i prema tome antitumorski efekat može biti sigurno ispoljen, i doza antitumorskog jedinjenja može biti smanjenja u poređenju sa slučajem administriranja jedinjenja samog, i tako uticaj antitumorskog jedinjenja na normalne ćelije može se ublažiti tako da se može postići veća sigurnost.
[0017] U vezi sa ovim, pronalazači su kreirali veznik sa specifičnom strukturom i uspeli su u dobijanju konjugata antitelo-lek u kome anti-TROP2 antitelo i eksatekan su konjugovani jedan za drugi preko veznika, i potvrdili odličan antitumorski efekat ispoljen pomoću konjugata da bi se time upotpunio predmetni pronalazak.
[0018] Specifično, predmetni pronalazak odnosi se na ono što sledi.
[1] Konjugat antitelo-lek gde antitumorsko jedinjenje predstavljeno pomoću formule koja sledi:
je konjugovano za anti-TROP2 antitelo pomoću tioetarske veze koja je formirana na segmentu disulfidne veze prisutnom u zglobnom delu anti-TROP2 antitela preko veznika koji ima strukturu predstavljenu pomoću formule koja sledi:
-L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-gde anti-TROP2 antitelo je vezano za kraj od L<1>, antitumorsko jedinjenje je vezano za karbonil grupu -(CH2)n<2>-C(=O)- segmenta sa azotovim atomom amino grupe na poziciji 1 kao poziciji vezivanja,
gde
n<1>predstavlja ceo broj od 0 do 6,
n<2>predstavlja ceo broj od 0 do 5,
L<1>predstavlja -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(=O)-,
gde n<3>predstavlja ceo broj od 2 do 8,
L<2>predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu,
gde n<4>predstavlja ceo broj od 1 do 6,
L<P>predstavlja tetrapeptidni ostatak od -GGFG-,
L<a>predstavlja -O- ili jednostruku vezu, i
-(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu predstavljenu pomoću formule koja sledi:
koja je vezana za anti-TROP2 antitelo na svojoj poziciji 3 i vezana je za metilen grupu u strukturi veznika koji sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1,
gde anti-TROP2 antitelo sadrži CDRH1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 23, CDRH2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 24 i CDRH3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BR: 25 u njegovom varijabilnom regionu teškog lanca i CDRL1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BR: 26, CDRL2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BR: 27 i CDRL3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence sa SEK ID BR: 28 u njegovom varijabilnom regionu lakog lanca.
[2] Konjugat antitelo-lek u skladu sa [1], gde segment strukture lek-veznik koja ima lek vezan za -L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- je jedna struktura lek-veznik odabrana od sledeće grupe:
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), i
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX);
o gde -(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu predstavljenu pomoću formule koja sledi:
koja je vezana za anti-TROP2 antitelo na svojoj poziciji 3 i vezana je za metilen grupu u strukturi veznika koja sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1,
o (NH-DX) predstavlja grupu predstavljenu pomoću formule koja sledi:
o gde azotov atom iz amino grupe na poziciji 1 je pozicija vezivanja, i
o GGFG- predstavlja tetrapeptidni ostatak od -Gly-Gly-Phe-Gly-.
[3] Konjugat antitelo-lek u skladu sa [2], gde segment strukture lek-veznik je jedna struktura lek-veznik odabrana od sledeće grupe:
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), i
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[4] Konjugat antitelo-lek u skladu sa [3], gde segment strukture lek-veznik je:
o (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[5] Konjugat antitelo-lek u skladu sa [3], gde segment strukture lek-veznik je: (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[6] Konjugat antitelo-lek u skladu sa [3], gde segment strukture lek-veznik je:
(Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[7] Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od [1] do [6], gde anti-TROP2 antitelo sadrži teški lanac i laki lanac odabran iz grupe;
varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 140 iz SEK ID BR: 12 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 iz SEK ID BR: 18,
varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 140 iz SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 SEK ID BR: 18,
varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 140 iz SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 iz SEK ID BR: 20, i
varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 140 iz SEK ID BR: 16 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 iz SEK ID BR: 22.
[8] Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od [1] do [6], gde anti-TROP2 antitelo sadrži teški lanac i laki lanac odabran iz grupe;
teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 12 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 18,
teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 14 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 18,
teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 14 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 20, i
teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 16 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 22.
[9] Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od [1] do [6], gde anti-TROP2 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 140 iz SEK ID BR: 12 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 iz SEK ID BR: 18.
[10] Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od [1] do [6], gde anti-TROP2 antitelo sadrži teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 12 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 18.
[11] Konjugat antitelo-lek u skladu sa [8], gde anti-TROP2 antitelu nedostaje lizin ostatak na karboksil terminusu teškog lanca.
[12] Konjugat antitelo-lek u skladu sa [10], gde anti-TROP2 antitelu nedostaje lizin ostatak na karboksil terminusu teškog lanca.
[13] Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od [1] do [12], gde prosečan broj jedinica odabrane strukture lek-veznik konjugovane po antitelu je u opsegu od 2 do 8.
[14] Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od [1] do [12], gde prosečni broj jedinica odabrane strukture lek-veznik konjugovane po antitelu je u opsegu od 3 do 8.
[15] Lek koji sadrži konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od [1] do [14], njegovu so, ili njegov hidrat.
[16] Antitumorski lek i/ili antikancerski lek koji sadrži konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od [1] do [14], njegovu so, ili njegov hidrat.
[17] Antitumorski lek i/ili antikancerski lek u skladu sa [16], za primenu u metodi za lečenje kancera pluća, kancera bubrega, urotelijalnog kancera, kolorektalnog kancera, kancera prostate, glioblastoma multiforme, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera dojke, melanoma, kancera jetre, kancera bešike, kancera želuca, cervikalnog kancera, kancera glave i vrata, ili kancera jednjaka.
[18] Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od [1] do [14], njegovu so, ili njegov hidrat kao aktivnu komponentu, i komponentu farmaceutski prihvatljive formulacije.
[19] Farmaceutska kompozicija u skladu sa [18], za primenu u metodi za lečenje kancera pluća, kancera bubrega, urotelijalnog kancera, kolorektalnog kancera, kancera prostate, glioblastoma multiforme, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera dojke, melanoma, kancera jetre, kancera bešike, kancera želuca, cervikalnog kancera, kancera glave i vrata, ili kancera jednjaka.
Povoljni efekti pronalaska
[0019] Sa anti-TROP2 antitelo-lek konjugatom koji ima antitumorsko jedinjenje eksatekan konjugovano preko veznika sa specifičnom strukturom, odličan antitumorski efekat i bezbednost mogu biti postignuti.
Kratak opis nacrta
[0020]
[Slika 1] Slika 1 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEK ID BR: 7) i aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 8) teškog lanca cTINA1 antitela.
[Slika 2] Slika 2 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEK ID BR: 9) i aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 10) lakog lanca cTINA1 antitela.
[Slika 3] Slika 3 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEK ID BR: 11) i aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 12) hTINA1-H1 teškog lanca.
[Slika 4] Slika 4 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEK ID BR: 13) i aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 14) hTINA1-H2 teškog lanca.
[Slika 5] Slika 5 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEK ID BR: 15) i aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 16) hTINA1-H3 teškog lanca.
[Slika 6] Slika 6 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEK ID BR: 17) i aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 18) hTINA1-L1 lakog lanca.
[Slika 7] Slika 7 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEK ID BR: 19) i aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 20) hTINA1-L2 lakog lanca.
[Slika 8] Slika 8 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEK ID BR: 21) i aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 22) hTINA1-L3 lakog lanca.
[Slika 9] Slika 9 prikazuje aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 23) CDRH1 TINA1 antitela, aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 24) njegovog CDRH2, aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 25) njegovog CDRH3, aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 26) njegovog CDRL1, aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 27) njegovog CDRL2, i aminokiselinsku sekvencu (SEK ID BR: 28) njegovog CDRL3.
[Slika 10] Slika 10 prikazuje sposobnost ćelijske internalizacije anti-CD9 antitela, anti-CD46 antitela, anti-CD55 antitela, anti-CD59 antitela, anti-CD71 antitela, anti-CD73 antitela, anti-CD147 antitela, anti-CD276 antitela, anti-EpCAM antitela, anti-EGFR antitela, i anti-TROP2 antitela (TINA1 antitela).
[Slika 11] Slika 11 prikazuje sposobnost ćelijske internalizacije anti-CD59 antitela, anti-CD71 antitela, anti-EGFR antitela, anti-EpCAM antitela, i anti-TROP2 antitela (TINA1 antitela).
[Slika 12] Slika 12 prikazuje sposobnost ćelijske internalizacije raznih anti-TROP2 antitela.
[Slika 13] Slika 13 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (1), (6), ili (12) humane ćelijske linije kolorektalnog kancera COLO205 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 14] Slika 14 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (1), (6), ili (12) na humanoj ćelijskoj liniji adenokarcinoma pankreasa BxPC-3 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 15] Slika 15 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (1), (6), ili (12) na humanoj ćelijskoj liniji adenokarcinoma pankreasa Capan-1 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 16] Slika 16 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (2), (5), (7), ili (10) na humanoj ćelijskoj liniji kolorektalnog kancera COLO205 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 17] Slika 17 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (2), (5), (7), ili (10) na humanoj ćelijskoj liniji adenokarcinoma pankreasa BxPC-3 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 18] Slika 18 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (3), (4), (8), ili (9) na humanoj ćelijskoj liniji kolorektalnog kancera COLO205 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 19] Slika 19 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (3), (4), (8), ili (9) na humanoj ćelijskoj liniji adenokarcinoma pankreasa BxPC-3 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 20] Slika 20 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (3), (4), (8), ili (9) na humanoj ćelijskoj liniji kancera jajnika NIH:OVCAR-3 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 21] Slika 21 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (3), (4), (8), ili (9) na humanoj ćelijskoj liniji kancera želuca NCI-N87 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 22] Slika 22 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (3), (4), (8), ili (9)na humanoj ćelijskoj liniji kancera pluća NCI-H292 subkutano transplantiranoj u BALB/cnu/nu miševe.
[Slika 23] Slika 23 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (3), (4), (8), ili (9) na humanoj ćelijskoj liniji kancera grla FaDu subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 24] Slika 24 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (3), (4), (8), ili (9) na humanoj ćelijskoj liniji adenokarcinoma pankreasa CFPAC-1 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 25] Slika 25 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (8) ili (13) na humanoj ćelijskoj liniji adenokarcinoma pankreasa CFPAC-1 subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 26] Slika 26 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (8) ili (13) na humanoj ćelijskoj liniji adenokarcinoma pankreasa HPAC subkutano transplantiranoj u BALB/c-nu/nu miševe.
[Slika 27] Slika 27 prikazuje antitumorski efekat konjugata antitelo-lek (8) ili (13) na humanim tkivima kancera jednjaka subkutano transplantiranim u NOD-scid miševe.
Opis tehničkih rešenja
[0021] U daljem tekstu, poželjni načini za izvođenje predmetnog pronalaska će biti opisani pozivanjem na nacrte. Tehnička rešenja opisana ispod su data kao tipični primeri tehničkih rešenja predmetnog pronalaska i ne bi trebalo da ograniče obim predmetnog pronalaska.
[0022] Anti-TROP2 konjugat antitelo-lek predmetnog pronalaska je antitumorski lek u kome je anti-TROP2 antitelo konjugovano za antitumorsko jedinjenje preko segmenta strukture veznika i objašnjeno je detaljno ovde ispod.
[Antitelo]
[0023] Anti-TROP2 antitelo korišćeno u konjugatu anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska može biti izvedeno iz bilo koje vrste, i poželjni primeri vrsta mogu da uključe ljude, pacove, miševe, i zečeve. U slučaju kada je izvedeno iz vrste koja nije ljudska, poželjno je himerizovano ili humanizovano korišćenjem dobro poznate tehnike. Antitelo predmetnog pronalaska može biti poliklonsko antitelo ili monoklonsko antitelo i poželjno je monoklonsko antitelo.
[0024] Anti-TROP2 antitelo je sposobno za ciljanje tumorskih ćelija, odnosno, ima svojstvo da je sposobno za prepoznavanje tumorskih ćelija, svojstvo da je sposobno za vezivanje za tumorsku ćeliju, svojstvo internalizacije u tumorskoj ćeliji, ili slično, i može biti konvertovano u konjugat antitelo-lek konjugovanjem za jedinjenje koje ima antitumorsku aktivnost preko veznika.
[0025] Aktivnost vezivanja antitela za tumorske ćelije može biti potvrđena korišćenjem protočne citometrije. Primeri metode za potvrđivanje internalizacije antitela u tumorskim ćelijama mogu da obuhvate (1) test vizuelizacije antitela inkorporiranog u ćelije pod fluorescentnim mikroskopom korišćenjem vezivanja sekundarnog antitela (fluorescentno obeleženog) za terapijsko antitelo (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) test za merenje intenziteta fluorescencije inkorporirane u ćelije korišćenjem vezivanja sekundarnog antitela (fluorescentno obeleženog) za terapijsko antitelo (Molecular Biology of the Cell, tom 15, 5268-5282, Decembar 2004), ili (3) Mab-ZAP test koji koristi vezivanje imunotoksina za terapijsko antitelo gde je toksin oslobođen po inkorporaciji u ćelije da bi se inhibirao ćelijski rast (Bio Techniques 28: 162-165, Januar 2000). Protein rekombinantnog kompleksa katalitičkog regiona difterijskog toksina i protein G mogu biti korišćeni kao imunotoksin.
[0026] Pošto lek konjugovan u konjugatu antitelo-lek vrši antitumorski efekat, poželjno je ali nije neophodno da antitelo samo treba da ima antitumorski efekat. U svrhu specifičnog i selektivnog vršenja citocidnog delovanja antitumorskog jedinjenja na tumorskim ćelijama, važno je i takođe poželjno da antitelo treba da ima svojstvo internalizacije kako bi migriralo u tumorske ćelije.
[0027] Anti-TROP2 antitelo može biti dobijeno korišćenjem metode koja se obično koristi u oblasti, što uključuje imunizovanje životinja sa antigeničnim polipeptidom i sakupljanje i prečišćavanje antitela proizvedenih in vivo. Poreklo antigena nije ograničeno na ljude, i životinje mogu biti imunizovane sa antigenom izvedenim iz ne-humane životinje kao što je miš, pacov i slično. U ovom slučaju, unakrsna-reaktivnost vezivanja antitela za dobijeni heterologni antigen sa humanim antigenima može biti testirana da bi se ispitalo antitelo koje se može primeniti na humanu bolest.
[0028] Alternativno, antitelo-produkujuće ćelije koje proizvode antitela za antigen su fuzionisane sa ćelijama mijeloma u skladu sa metodom poznatom u oblasti (npr., Kohler i Milstein, Nature (1975) 256, str.495-497; i Kennet, R. izd., Monoclonal Antibodies, str.365-367, Plenum Press, Njujork (1980)) da bi se uspostavili hibridomi, iz kojih monoklonska antitela mogu zauzvrat biti dobijena.
[0029] Antigen može biti dobijen genetičkim inženjeringom ćelija domaćina da bi se proizveo gen koji kodira antigenični protein. Specifično, vektori koji dozvoljavaju ekspresiju gena antigena su pripremljeni i prenešeni u ćelije domaćina tako da je gen eksprimiran. Antigen tako eksprimiran može biti prečišćen. Antitelo može takođe biti dobijeno korišćenjem metode za imunizaciju životinja sa gore-opisanim genetički projektovanim antigen-eksprimirajućim ćelijama ili ćelijskom linijom koja eksprimira antigen.
[0030] Anti-TROP2 antitelo može biti dobijeno pomoću procedure koja je poznata u oblasti.
[0031] Anti-TROP2 antitelo koje može biti korišćeno u predmetnom pronalasku nije posebno ograničeno, i, na primer, ona određena aminokiselinskim sekvencama prikazanim u Listi sekvenci predmetne prijave mogu biti poželjno korišćena. Anti-TROP2 antitelo korišćeno u predmetnom pronalasku poželjno ima svojstva kao što je opisano ispod.
(1) Antitelo koje ima sledeća svojstva:
(a) specifično vezivanje za TROP2, i
(b) koje ima aktivnost inetrnalizacije u TROP2-ekprimirajuće ćelije pomoću vezivanja za TROP2.
(2) Antitelo u skladu sa (1), gde TROP2 je humani TROP2.
(3) Antitelo u skladu sa (1) ili (2), gde antitelo ima CDRH1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 23, CDRH2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 24, i CDRH3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 25 kao regione koji određuju komplementarnost teškog lanaca, i CDRL1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 26, CDRL2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 27, i CDRL3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 28 kao regione koji određuju komplementarnost lakog lanaca.
(4) Antitelo u skladu sa bilo kojim od (1) do (3), gde njegov konstantni region je konstantni region poreklom iz čoveka.
(5) Antitelo u skladu sa bilo kojim od (1) do (4), gde antitelo je humanizovano antitelo.
(6) Antitelo u skladu sa (5), gde antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od (a) aminokiselinske sekvence opisane u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 12, (b) aminokiselinske sekvence opisane u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 14, (c) aminokiselinske sekvence opisane u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 16,
(d) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 95% ili više homologije sa bilo kojom od sekvenci (a) do (c), i (e) aminokiselinske sekvence izvedene iz bilo koje od sekvenci (a) do
(c) pomoću delecija, zamena, ili adicija najmanje jedne aminokiseline, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od (f) aminokiselinske sekvence opisane u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 18,
(g) aminokiselinske sekvence opisane u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 20, (h) aminokiselinske sekvence opisane u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 22, (i) aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 95% ili više homologije sa bilo kojom od sekvenci (f) do (h), i (j) aminokiselinske sekvence izvedene iz bilo koje od sekvenci (f) do (h) pomoću delecija, zamena, ili adicija najmanje jedne aminokiseline.
(7) Antitelo u skladu sa (6), gde antitelo ima varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 12 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 18, varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 12 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 20, varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 12 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 22, varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 18, varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 20, varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 22, varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 16 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 18, varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 16 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 20, i varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 16 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 22.
(8) Antitelo u skladu sa (7), gde antitelo ima varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca odabrane iz grupe koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 12 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 18, varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 18, varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 20, i varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 140 u SEK ID BR: 16 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 129 u SEK ID BR: 22.
(9) Antitelo u skladu sa (6) ili (7), gde antitelo sadrži teški lanac i laki lanac odabran iz grupe koja se sastoji od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 18, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 20, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 22, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 18, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 20, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 22, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 18, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 20, i teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 22.
(10) Antitelo u skladu sa (6) ili (7), gde antitelo sadrži teški lanac i laki lanac odabrane iz grupe koja se sastoji od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 18, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 20, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 22, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 18, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 20, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 22, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 18, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 20, i teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 22.
(11) Antitelo u skladu sa (8), gde antitelo sadrži teški lanac i laki lanac odabrane iz grupe koja se sastoji od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 18, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 18, teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 20, i teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 20 do 470 u SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu opisanu u pozicijama aminokiselina 21 do 234 u SEK ID BR: 22.
(12) Antitelo u skladu sa bilo kojim od (1) do (11), gde antitelu nedostaje lizin ostatak na karboksil terminusu teškog lanca.
(13) Antitelo dobijeno pomoću metode za proizvodnju antitela u skladu sa bilo kojim od (1) do (12), metoda koja sadrži korake: kultivisanja ćelije domaćina transformisane sa ekspresionim vektorom koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo; i sakupljanje antitela od interesa iz kultura dobijenih u prethodnom koraku.
[0032] U daljem tekstu, anti-TROP2 antitelo korišćeno u prolasku je opisano.
[0033] Termini "kancer" i "tumor" kako su korišćeni ovde su korišćeni sa istim značenjem.
[0034] Termin "gen" kao što je ovde korišćeno obuhvata ne samo DNK; već i iRNK istog, cDNK istog, i cRNK istog.
[0035] Termin "polinukleotid" kao što je ovde korišćeno je korišćen sa istim značenjem kao nukleinska kiselina i takođe obuhvata DNK, RNK, probe, oligonukleotide, i prajmere.
[0036] Termini "polipeptid" i "protein" kao što je ovde korišćeno su korišćeni bez razlike.
[0037] Termin "ćelija" kao što je ovde korišćeno takođe obuhvata ćelije u životinjskom pojedincu i kultivisanim ćelijama.
[0038] Termin "TROP2" kao što je ovde korišćeno je korišćen sa istim značenjem kao TROP2 protein.
[0039] Termin "CDR" kao što je ovde korišćeno odnosi se na region koji određuje komplementarnost (complementarity determining region - CDR). Poznato je da svaki teški i laki lanac molekula antitela ima tri regiona koji određuju komplementarnost (coplementarity determining regions - CDRs). CDR se takođe naziva hipervarijabilni domen, i prisutan je u varijabilnom regionu svakog teškog i lakog lanca antitela. To je mesto koje ima neobično visoku varijabilnost u njegovoj primarnoj strukturi, i postoje tri odvojena CDR regiona u primarnoj strukturi svakog teškog i lakog polipeptidnog lanca. U ovoj specifikaciji, kao za CDR regione antitela, CDR regioni teškog lanca su predstavljeni pomoću CDRH1, CDRH2, i CDRH3 od amino-terminalne strane aminokiselinske sekvence teškog lanca, i CDR regioni lakog lanca su predstavljeni pomoću CDRL1, CDRL2, i CDRL3 sa amino-terminalne strane aminokiselinske sekvence lakog lanca. Ova mesta su blizu jedna drugom u tercijarnoj strukturi i određuju specifičnost za antigen za koji se antitelo vezuje.
[0040] Fraza "hibridizacija je izvedena pod strogim uslovima" kao što je ovde korišćeno odnosi se na proces u kome je hibridizacija izvedena pod uslovima pod kojim se identifikacija može postići izvođenjem hibridizacije na 68°C u komercijalno dostupnom rastvoru za hibridizacju ExpressHyb (proizvedenom od strane Clontech, Inc.) ili izvođenjem hibridizacije na 68°C u prisustvu 0.7 do 1.0 M NaCl korišćenjem filtera koji ima DNK imobilisanu na njemu, praćeno izvođenjem ispiranja na 68°C korišćenjem 0.1 do 2 x SSC rastvora (1 x SSC rastvor se sastoji od 150 mM NaCl i 15 mM natrijum citrata) ili pod uslovima koji su jednaki tome.
1. TROP2
[0041] TROP2 je član TACSTD familije eksprimiran u humanim trofoblastima i on je transmembranski protein tipa 1 koji jednom prolazi kroz ćelijsku membranu uključen u imunsku rezistentnost, koja je zajednička za humane trofoblaste i kancerske ćelije.
[0042] Kao za TROP2 protein koji se koristi u pronalasku, TROP2 protein može biti direktno prečišćen iz TROP2-eksprimirajućih ćelija humanog ili ne-humanog sisara (kao što je pacov ili miš) i korišćen, ili frakcija ćelijske membrane gore-opisanih ćelija može biti pripremljena i korišćena. Dalje, TROP2 može biti dobijen in vitro sintezom istog ili proizvodnjom istog u ćeliji domaćina putem genetičkog inženjeringa. U genetičkom inženjeringu, specifično, nakon što je TROP2 cDNK integrisana u vektor sposoban da eksprimira TROP2 cDNK, TROP2 protein može biti dobijen sintetisanjem u rastvoru koji sadrži enzim, supstrat i energetsku supstancu neophodnu za transkripciju i translaciju, ili eksprimiranjem TROP2 u drugoj prokariotskoj ili eukariotskoj transformisanoj ćeliji domaćina. Alternativno, gore opisane genetički projektovane TROP2-eksprimirajuće ćelije ili ćelijska linija koja eksprimira TROP2 mogu biti korišćeni kao TROP2 protein.
[0043] DNK sekvenca i aminokiselinska sekvenca za TROP2 su dostupne u javnoj bazi podataka i mogu biti navedene, na primer, pod Pristupnim brojevima NM_002353 i NP_002344 (NCBI).
[0044] Dalje, protein koji se sastoji od aminokiselinske sekvence gde jedna ili više aminokiselina su suptituisane, deletirane i/ili dodate u bilo kojoj od gore-opisanih aminokiselinskih sekvenci za TROP2 i takođe ima biološku aktivnost ekivavalentnu onoj od proteina je takođe uključen u TROP2.
[0045] Humani TROP2 protein je konstituisan pomoću signalne sekvence koja se sastoji od N-terminalnih 26 aminokiselinskih ostataka, vanćelijskog domena koji se sastoji od 248 aminokiselinskih ostataka, transmembanskog domena koji se sastoji od 23 aminokiselinska ostatka, i unutarćelijskog domena koji se sastoji od 26 aminokiselinskih ostataka.
2. Proizvodnja anti-TROP2 antitela
[0046] Antitelo za TROP2 pronalaska može biti dobijeno korišćenjem metode koja se obično izvodi u oblasti, koja uključuje imunizovanje životinje sa TROP2 ili proizvoljnim poplipeptidom odabranim od aminokiselinske sekvence za TROP2, i sakupljanjem i prečišćavanjem antitela proizvedenog in vivo. Biološka vrsta od TROP2 koja se koristi kao antigen nije ograničena na ljudsku, i životinja može biti imunizovana sa TROP2 izvedenim iz životinje pored ljudi kao što je miš ili pacov. U ovom slučaju, ispitivanjem unakrsne reaktivnosti između vezivanja antitela za dobijeni heterologni TROP2 i humani TROP2, antitelo koje je primenljivo na humanu bolest može biti odabrano.
[0047] Dalje, monoklonsko antitelo može biti dobijeno iz hibridoma uspostavljenog fuzionisanjem antitelo-produkujućih ćelija koje proizvode antitelo za TROP2 sa ćelijama mijeloma u skladu sa poznatom metodom (na primer, Kohler i Milstein, Nature, (1975) 256, str. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, str. 365-367, Plenum Press, Njujork
(1980)).
[0048] TROP2 koji se koristi kao antigen može biti dobijen eksprimiranjem TROP2 gena u ćeliji domaćina korišćenjem genetičkog inženjeringa.
[0049] Specifično, vektor sposoban da eksprimira TROP2 gen je proizveden, i rezultujući vektor je transfektovan u ćeliju domaćina da bi se eksprimirao gen, i zatim, eksprimiran TROP2 je prečišćen.
[0050] Alternativno, gore-opisane genetički projektovane TROP2-eksprimirajuće ćelije ili ćelijska linija koja eksprimira TROP2 mogu biti korišćeni kao TROP2 protein. U daljem tekstu, metoda za dobijanje antitela za TROP2 je specifično opisana.
(1) Pripremanje antigena
[0051] Primeri antigena koji treba da se koristi za proizvodnju anti-TROP2 antitela uključuje TROP2, ili polipeptid koji se sastoji od delimične aminokiselinske sekvence koja se sastoji od najmanje 6 uzastopnih aminokiselina od TROP2, ili derivat koji je dobijen dodavanjem date aminokiselinske sekvence ili nosača tome.
[0052] TROP2 može biti prečišćen direktno iz humanih tumorskih tkiva ili tumorskih ćelija i korišćen. Dalje, TROP2 može biti dobijen sintetisanjem njega in vitro ili proizvodnjom njega u ćeliji domaćina pomoću genetičkog inženjeringa.
[0053] U pogledu genetičkog inženjeringa, specifično, nakon što je TROP2 cDNK integrisana u vektor sposoban za eksprimiranje TROP2 cDNK, antigen može biti dobijen sintetisanjem njega u rastvoru koji sadrži enzim, supstrat i energetsku supstancu neophodnu za transkripciju i translaciju, ili eksprimiranjem TROP2 u drugoj prokariotskoj ili eukariotskoj transformisanoj ćeliji domaćina.
[0054] Dalje, antigen može biti takođe dobijen kao sekretorni protein eksprimiranjem fuzionog proteina dobijenog ligiranjem vanćelijskog domena od TROP2, koji je membranski protein, u konstantni region antitela u odgovarajućem sistemu domaćin-vektor.
[0055] TROP2 cDNK može biti dobijena pomoću, na primer, takozvane PCR metode u kojoj polimerazna lančana reakcija (polymerase chain reaction, u daljem tekstu pod nazivom "PCR"; videti Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, str.487-489) je izvedena korišćenjem biblioteke cDNK koja eksprimira TROP2 cDNK kao šablon i prajmera koji specifično amplifikuju TROP2 cDNK.
[0056] Kao in vitro sinteza polipeptida, na primer, Sistem brze translacije (Rapid Translation System - RTS) proizveden od strane Roche Diagnostics, Inc. može služiti kao primer, ali nije ograničena na to.
[0057] Primeri prokariotskih ćelija domaćina uključuju Escherichia coli i Bacillus subtilis. Da bi se transformisale ćelije domaćina sa ciljnim genom, ćelije domaćina su transformisane pomoću plazmidnog vektora koji sadrži replikon, tj. početak replikacije izveden iz vrste kompatibilne sa domaćinom, i regulatornu sekvencu. Dalje, vektor poželjno ima sekvencu sposobnu da nametne fenotipsku selektivnost na transformisanu ćeliju.
[0058] Primeri eukariotskih ćelija domaćina uključuju ćelije kičmenjaka, i ćelije kvasca. Kao ćelije kičmenjaka, na primer, COS ćelije majmuna (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, str. 175-182, ATCC CRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection), murinski fibroblasti NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), i sojevi deficijentni u dihidrofolat reduktazi (Urlaub, G. i Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, str. 4126-4220) ćelija ovarijuma kineskog hrčka (Chinese hamster ovarian cells - CHO ćelije; ATCC: CCL-61); i slično su često korišćene, međutim, ćelije nisu ograničene na to.
[0059] Tako dobijeni transformant može biti kultivisan u skladu sa metodom koja je obično izvođena u oblasti, i kultivisanjem transformanta, ciljni polipeptid je proizveden unutarćelijski ili vanćelijski.
[0060] Pogodni medijum koji se koristi za kultivisanje može biti odabran od strane prosečnih poznavalaca oblasti od raznih uobičajeno korišćenih medijuma za kulture u zavisnosti od upotebljenih ćelija domaćina. Ako je Escherichia coli upotrebljena, na primer, LB medijum obogaćen sa antibiotikom kao što je ampicillin ili IPMG po potrebi se može koristiti.
[0061] Rekombinantni protein proizveden unutarćelijski ili vanćelijski pomoću transformanta kroz takvo kultivisanje može biti odvojen i prečišćen pomoću bilo koje od raznih metoda za odvajanje korišćenjem fizičkih i hemijskih osobina proteina.
[0062] Specifični primeri metoda obuhvataju tretman sa uobičajenim proteinskim precipitantom, ultrafiltraciju, razne tipove tečne hromatografije kao što su hromatografija sa molekularnim sitom (gel filtracija), adsorpciona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, i afinitetna hromatografija, dijaliza, i njihova kombinacija.
[0063] Dalje, kačenjem oznake od šest histidinskih ostataka za rekombinantni protein koji se eksprimira, protein može biti efikasno prečišćen pomoću afinitetne kolone od nikla. Alternativno, kačenjem IgG Fc regiona za rekombinantni protein koji se eksprimira, protein može biti efikasno prečišćen sa protein A kolonom.
[0063] Kombinovanjem gore-opisanih metoda, velika količina ciljnog polipeptida može biti lako proizvedena u visokom prinosu i visokoj čistoći.
[0065] Gore-opisani transformant sam može biti takođe korišćen kao antigen. Alternativno, ćelijska linija koja eksprimira TROP2 može biti korišćena kao antigen. Primeri takve ćelijske linije mogu da uključe humane linije kancera pluća NCI-H322, PC14, NCIH-H2122, i LCAM1, humanu liniju kancera prostate PC3, humane linije kancera pankreasa BxPC-3, Capan-1, i PK-1, humanu liniju kancera ovarijuma SKOV3, i humanu liniju kolorektalnog kancera COLO205, mada ćelijska linija u skladu sa predmetnim pronalaskom nije ograničena na ove ćelijske linije sve dok eksprimira TROP2.
(2) Proizvodnja anti-TROP2 monoklonskog antitela
[0066] Primeri antitela koje se specifično vezuje za TROP2 obuhvataju monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za TROP2, i metoda dobijanja takvog antitela je kao što je opisano ispod.
[0067] Proizvodnja monoklonskog antitela generalno zahteva sledeće operativne korake:
(a) prečišćavanja biopolimera koji se koristi kao antigen, ili pripremanja antigeneksprimirajućih ćelija;
(b) pripremanja ćelija koje proizvode antitelo imunizovanjem životinje ubrizgavanjem antigena, sakupljanjem krvi, testiranjem titra njenog antitela da bi se odredilo kada je slezina isečena;
(c) pripremanja mijelomskih ćelija (u daljem tekstu pod nazivom "mijelom");
(d) fuzionisanja ćelija koje proizvode antitelo sa mijelomom;
(e) ispitivanja grupe hibridoma koji proizvode željeno antitelo;
(f) deljenja hibridoma u klonove pojedinačnih ćelija (kloniranje);
(g) opciono, kultivisanja hibridoma ili gajenja životinje implantirane sa hibridomom za proizvodnju velike količine monoklonskog antitela;
(h) ispitivanja tako proizvedenog monoklonskog antitela na biološku aktivnost i specifičnost vezivanja, ili testiranja istog na svojstva kao obeleženog reagensa; i slično.
[0068] U daljem tekstu, metoda za proizvodnju monoklonskog antitela će biti opisana detaljno nakon koraka iznad, međutim, metoda nije ograničena na to, i, na primer, ćelije koje proizvode antitelo osim ćelija slezine i mijeloma mogu biti korišćene.
(a) Prečišćavanje antigena
[0069] Kao antigen, TROP2 pripremljen pomoću metode kao što je opisano iznad ili njegov parcijalni peptid može biti korišćen.
[0070] Dalje, membranska frakcija pripremljena od rekombinantnih ćelija koje eksprimiraju TROP2 ili rekombinantnih ćelija koje eksprimiraju TROP2 same, i takođe parcijalni peptid proteina pronalaska hemijski sintetisan pomoću metode poznate prosečnim poznavaocima oblasti mogu takođe biti korišćeni kao antigen.
[0071] Dalje, ćelijska linija koja eksprimira TROP2 može takođe biti korišćena kao antigen.
(b) Pripremanje ćelija koje proizvode antitelo
[0072] Antigen dobijen u koraku (a) je izmešan sa adjuvansom kao što je Frojndov kompletni ili nekompletni adjuvans ili pomoćni agens kao što je aluminijum kalijum sulfat i dobijena smeša je korišćena kao imunogen da bi se imunizovala eksperimentalna životinja. U alternativnoj metodi, eksperimentalna životinja je imunizovana sa antigen-eksprimirajućim ćelijama kao imunogenom. Kao eksperimentalna životinja, bilo koja životinja korišćena u poznatoj metodi za proizvodnju hibridoma može biti korišćena bez smetnje. Specifično, na primer, miš, pacov, koza, ovca, govedo, konj, ili slično može biti korišćen. Međutim, sa gledišta lakoće dostupnosti mijelomskih ćelija da se fuzionišu sa ekstrahovanim ćelijama koje proizvode antitelo, miš ili pacov je poželjno korišćen kao životinja koja se imunizuje.
[0073] Dalje, soj miša ili pacova koji se koristi nije posebno ograničen, i u slučaju miša, na primer, razni sojevi kao A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, i 129 i slično se mogu koristiti, i u slučaju pacova, na primer, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer i slično mogu se koristiti.
[0074] Ovi miševi i pacovi mogu biti dobijeni od odgajivača/distributera eksperimentalnih životinja, na primer, CLEA Japan, Inc. i Charles River Laboratories Japan, Inc.
[0075] Uzimajući u obzir kompatibilnost fuzionisanja sa ćelijama mijeloma opisanim ispod, u slučaju miša, BALB/c soj, i u slučaju pacova, Wistar i Low sojevi su posebno poželjni kao životinja koja se imunizuje.
[0076] Dalje, uzimajući u obzir antigeničnu homologiju između ljudi i miševa, takođe je poželjno da se koristi miš koji ima smanjenu biološku funkciju da ukloni auto-antitela, to jest, miš sa autoimunom bolešću.
[0077] Starost miša ili pacova u vreme imunizacije je poželjno 5 do 12 nedelja starosti, još poželjnije 6 do 8 nedelja starosti.
[0078] Da bi se imunizovala životinja sa TROP2 ili njegovim rekombinantom, na primer, poznata metoda opisana detaljno u, na primer, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology tom I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oksford (1987); Kabat, E. A. i Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Ilinois (1964) ili slično se može koristiti.
[0079] Među ovim metodama za imunizaciju, poželjna specifična metoda u predmetnom pronalasku je, na primer, kao što sledi.
[0080] To jest, prvo, frakcija membranskog proteina koja služi kao antigen ili ćelije uzrokovane da eksprimiraju antigen je/su intradermalno ili intraperitonealno administrirane životinji. Međutim, kombinacija oba puta administracije je poželjna za povećavanje efikasnosti imunizacije, i kada je intradermalna imunizacija izvedena u drugoj polovini ili samo pri poslednjem doziranju, efikasnost imunizacije može biti posebno povećana.
[0081] Raspored administracije antigena varira u zavisnosti od tipa životinje koja se imunizuje, pojedinačne razlike ili slično. Međutim, generalno, raspored administracije u kome učestalost administracije antigena je 3 do 6 puta i interval doziranja je 2 do 4 nedelja je poželjniji.
[0082] Dalje, doza antigena varira u zavisnosti od tipa životinje, pojedinačnih razlika ili slično, međutim, doza je generalno podešena na 0.05 do 5 mg, poželjno oko 0.1 do 0.5 mg.
[0083] Buster imunizacija je izvedena 1 do 6 nedelja, poželjno 1 do 4 nedelja, poželjnije 1 do 3 nedelja nakon administracije antigena kao što je opisano iznad. Kada imunogen je ćelija, 1 × 10<6>do 1 × 10<7>ćelija je upotrebljeno.
[0084] Doza antigena u vreme izvođenja buster imunizacije varira u zavisnosti od tipa ili veličine životinje ili slično, međutim, u slučaju, na primer, miša, doza je generalno podešena na 0.05 do 5 mg, poželjno 0.1 do 0.5 mg, poželjnije oko 0.1 do 0.2 mg. Kada imunogen je ćelija, 1 × 10<6>do 1 × 10<7>ćelija je upotrebljeno.
[0085] Ćelije slezine ili limfociti koji uključuju ćelije koje proizvode antitelo su aseptički uklonjene iz imunizovane životinje nakon 1 do 10 dana, poželjno 2 do 5 dana, poželjnije 2 do 3 dana od buster imunizacije. U ovo vreme, titar antitela je izmeren, i ako životinja koja ima dovoljno povećani titar antitela je korišćena kao izvor snabdevanja ćelija koje proizvode antitelo, naredna procedura se može izvesti efikasnije.
[0086] Primeri metode za merenje titra antitela koja se koristi ovde uključuje RIA metodu i ELISA metodu, ali metoda nije ograničena na to. Na primer, ako je ELISA metoda upotrebljena, merenje titra antitela u pronalasku može biti izvedeno u skladu sa procedurama kao što je opisano ispod.
[0087] Prvo, prečišćen ili delimično prečišćen antigen je adsorbovan na površini čvrste faze kao što je ploča sa 96 bunarića za ELISA, i površina čvrste faze koja nema antigen adsorbovan tu je pokrivena sa proteinom koji nije povezan sa antigenom kao što je goveđi serum albumin (bovine serum albumim -BSA). Nakon ispiranja površine, površina se dovodi u kontakt sa serijski-razblaženim uzorkom (na primer, mišjim serumom) kao primarnim antitelom da bi se dozvolilo antitelu u uzorku da se veže za antigen.
[0088] Dalje, kao sekundarno antitelo, antitelo obeleženo sa enzimom za mišje antitelo je dodato i ostavljeno da se veže za mišje antitelo. Nakon ispiranja, supstrat za enzim je dodat i promena u apsorbanci koja se dešava usled razvijanja boje pomoću degradacije supstrata ili slično je izmerena i titar antitela je izračunat na osnovu merenja.
[0089] Razdvajanje ćelija koje proizvode antitelo i ćelija slezine ili limfocita imunizovane životinje može biti izvedeno u skladu sa poznatom metodom (na primer, Kohler et al., Nature (1975), 256, s. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, s. 511; Milstein et al., Nature
(1977), 266, s. 550; Walsh, Nature (1977), 266, s. 495). Na primer, u slučaju ćelija slezine, opšta metoda u kojoj ćelije koje proizvode antitelo su razdvojene homogenizovanjem slezine da bi se dobile ćelije kroz filtraciju sa mrežom od nerđajućeg čelika i suspendovanjem ćelija u Iglovom minimalnom esencijalnom medijumu (MEM) može biti upotrebljena.
(c) Pripremanje mijelomskih ćelija (u daljem tekstu pod nazivom "mijelom")
[0090] Mijelomske ćelije koje će se koristiti za ćelijsku fuziju nisu posebno ograničene i pogodne ćelije mogu biti odabrane od poznatih ćelijskih linija. Međutim, uzimajući u obzir pogodnost kada je hibridom odabran od fuzionisanih ćelija, poželjno je da se koristi soj deficijentan u HGPRT (hipoksantin-guanin fosforibozil transferazi) čija procedura selekcije je uspostavljena.
[0091] Specifičnije, primeri HGPRT-deficijentnog soja uključuju X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, i BU.1 izvedene iz miševa; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) izveden iz pacova; i U266AR(SKO-007), GM1500·GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) i 8226AR/NIP4-1(NP41) izveden iz ljudi. Ovi HGPRT-deficijentni sojevi su dostupni od, na primer, ATCC ili slično.
[0092] Ovi ćelijski sojevi su subkultivisani u odgovarajućem medijumu kao što je 8-azaguanin medijum (medijum dobijen dodavanjem 8-azaguanina u RPMI 1640 medijum obogaćen sa glutaminom, 2-merkaptoetanolom, gentamicinom, i fetalnim telećim serumom
(fetal calf serum, u daljem tekstu pod nazivom "FBS")), Iscove-ovom modifikovanom Dulbekovom medijumu (IMDM), ili Dulbekovom modifikovanom Igl medijumu (DMEM). U ovom slučaju, 3 do 4 dana pre izvođenja ćelijske fuzije, ćelije su subkultivisane u normalnom medijumu (na primer, ASF104 medijum (proizveden od strane Ajinomoto Co., Ltd.) koji sadrži 10% FCS) da bi se osiguralo ne manje od 2 x 10<7>ćelija na dan ćelijske fuzije.
(d) Ćelijska fuzija
[0093] Fuzija između ćelija koje proizvode antitelo i mijelomskih ćelija može biti odgovarajuće izvedena u skladu sa poznatom metodom (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology tom I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oksford (1987); Kabat, E. A. i Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Ilinois (1964), itd.), pod uslovima takvim da stopa preživljavanja ćelija nije preterano smanjena.
[0094] Kao takva metoda, na primer, hemijska metoda u kojoj su ćelije koje proizvode antitelo i mijelomske ćelije izmešane u rastvoru koji sadrži polimer kao što je polietilen glikol u visokoj koncentraciji, fizička metoda koja koristi električnu stimulaciju, ili slično može biti korišćena. Među ovim metodama, specifičan primer hemijske metode je kao što je opisano ispod.
[0095] To jest, u slučaju kada je politilen glikol korišćen u rastvoru koji sadrži polimer u visokoj koncentraciji, ćelije koje proizvode antitelo i mijelomske ćelije su izmešane u rastvoru polietilen glikola koji ima molekulsku masu od 1500 do 6000, poželjnije 2000 do 4000 na temperaturi od 30 do 40°C, poželjno od 35 do 38°C tokom 1 do 10 minuta, poželjno 5 do 8 minuta.
e) Odabiranje grupe hibridoma
[0096] Metoda za odabiranje hibridoma dobijenih gore-opisanom ćelijskom fuzijom nije posebno ograničena. Obično, HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin) metoda odabiranja
(Kohler et al., Nature (1975), 256, s. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, s. 550) je korišćena.
[0097] Ova metoda je efikasna kada su dobijeni hibridomi korišćenjem mijelomskih ćelija HGPRT-deficijentnog soja koje ne mogu da prežive u prisustvu aminopterina. To jest, kultivisanjem nefuzionisanih ćelija i hibridoma u HAT medijumu, samo hibridomi rezistentni na aminopterin su selektivno pušteni da prežive i proliferišu.
(f) Deoba u pojedinačni ćelijski klon (kloniranje)
[0098] Kao metoda za kloniranje hibridoma, poznata metoda kao što je metoda sa metilcelulozom, metoda sa mekim agarom, ili metoda sa ograničavajućim razblaženjem može biti korišćena (videti, na primer, Barbara, B. M. i Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman i Company, San Francisko (1980)). Među ovim metodama, posebno, metoda tro-dimenzionalne kulture kao što je metoda sa metilcelulozom je poželjna. Na primer, grupa hibridoma proizvedenih ćelijskom fuzijom je suspendovana u metilceluloznom medijumu kao što je medijum za selekciju ClonaCell-HY Selection medijum D (proizveden od strane StemCell Technologies, Inc., #03804) i kultivisana. Zatim, formirane kolonije hibridoma su sakupljene, pri čemu monoklonski hibridomi mogu biti dobijeni. Sakupljene odgovarajuće kolonije hibridoma su kultivisane, i hibridom koji je potvrđen da ima stabilni titar antitela u dobijenom supernatantu kulture hibridoma je odabran kao soj hibridoma koji prozvodi TROP2 monoklonsko antitelo.
[0099] Primeri tako uspostavljenog soja hibridoma uključuju TROP2 hibridom TINA1. U ovoj specifikaciji, antitelo proizvedeno pomoću TROP2 hibridoma TINA1 je nazvano "TINA1 antitelo" ili jednostavno "TINA1".
[0100] Varijabilni region teškog lanca TINA1 antitela ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 2 u Listi sekvenci. Dalje, varijabilni region lakog lanca TINA1 antitela ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEK ID BR: 4 u Listi sekvenci.
(g) Pripremanje monoklonskog antitela kultivisanjem hibridoma
[0101] Kultivisanjem tako odabranog hibridoma, monoklonsko antitelo može biti efikasno dobijeno. Međutim, pre kultivisanja, poželjno je da se izvede testiranje hibridoma koji proizvodi ciljno monoklonsko antitelo.
[0102] U takvom skriningu, poznata metoda može biti upotrebljena.
[0103] Merenje titra antitela u pronalasku može biti izvedeno pomoću, na primer, ELISA metode objašnjene u stavci (b) opisanoj iznad.
[0104] Hibridom dobijen pomoću metode opisane iznad može biti sačuvan u zamrznutom stanju u tečnom azotu ili u zamrzivaču na -80°C ili ispod.
[0105] Nakon završetka kloniranja, medijum je promenjen od HT medijuma u normalni medijum, i hibridom je kultivisan.
[0106] Kultura velikih razmera je izvedena rotiranjem kulture korišćenjem velike boce za kulturu ili pomoću „spinner“ kulture. Iz supernatanta dobijenog pomoću kulture velikih razmera, monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za protein pronalaska može biti dobijeno prečišćavanjem korišćenjem metode poznate prosečnim poznavaocima oblasti kao što je gel filtracija.
[0107] Dalje, hibridom je ubrizgan u abdominalnu šupljinu miša istog soja kao hibridom (na primer, gore-opisani BALB/c) ili Nu/Nu miša da bi proliferisao hibridom, pri čemu asciti koji sadrže veliku količinu monoklonskog antitela pronalaska mogu biti dobijeni.
[0108] U slučaju gde hibridom je administriran u abdominalnu šupljinu, ako je mineralno ulje kao što je 2,6,10,14-tetrametil pentadekan (pristan) administrirano 3 do 7 dana pre toga, velika količina ascita može biti dobijena.
[0109] Na primer, imunosupresiv je prethodno ubrizgan u abdominalnu šupljinu miša istog soja kao hibridom da bi se inaktivisale T ćelije. 20 dana nakon toga, 10<6>do 10<7>ćelija hibridomskog klona je suspendovano u medijumu bez seruma (0.5 ml), i suspenzija je administrirana u abdominalnu šupljinu miša. Generalno, kada je abdomen proširen i ispunjen ascitima, asciti su sakupljeni iz miša. Ovom metodom, monoklonsko antitelo može biti dobijeno u koncentraciji koja je oko 100 puta ili više viša od one u rastvoru za kulturu.
[0110] Monoklonsko antitelo dobijeno gore-opisanom metodom može biti prečišćeno pomoću metode opisane u, na primer, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology tom I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oksford (1978).
[0111] Tako dobijeno monoklonsko antitelo ima visoku antigeničnu specifičnost za TROP2.
(h) Test za monoklonsko antitelo
[0112] Izotip i podklasa tako dobijenog monoklonskog antitela mogu biti određeni kao što sledi.
[0113] Prvo, primeri metode za identifikaciju uključuju Ouchterlony metodu, ELISA metodu, i RIA metodu.
[0114] Ouchterlony metoda je jednostavna, ali kada je koncentracija monoklonskog antitela niska, potreban je proces kondenzacije.
[0115] Sa druge strane, kada ELISA metoda ili RIA metoda je korišćena, direktnim reagovanjem supernatanta kulture sa antigen-adsorbovanom čvrstom fazom i korišćenjem antitela koja odgovaraju raznim vrstama imunoglobulinskih izotipova i podklasa kao sekundarna antitela, izotip i podklasa monoklonskog antitela mogu biti identifikovani.
[0116] Dodatno, kao jednostavnija metoda, komercijalno dostupan komplet za identifikaciju,
(na primer, Mouse Typer komplet proizveden od strane Bio-Rad Laboratories, Inc.) ili slično može takođe biti korišćen.
[0117] Dalje, kvantitativno određivanje proteina može biti izvedeno pomoću Folin Lorijeve metode i metode izračunavanja zasnovane na apsorbanciji na 280 nm (1.4 (OD 280) = Imunoglobulin 1 mg/ml).
[0118] Dalje, čak i kada je monoklonsko antitelo odvojeno i nezavisno dobijeno pomoću izvođenja ponovo koraka (a) do (h) u (2), moguće je da se dobije antitelo koje ima citotoksično delovanje ekvivalentno onom od TINA1 antitela. Kao jedan primer takvog antitela, antitelo koje se vezuje za isti epitop kao TINA1 antitelo može služiti kao primer. Ako se novo proizvedeno antitelo vezuje za parcijalni peptid ili parcijalnu tercijarnu strukturu za koju se TINA1 antitelo vezuje, može se utvrditi da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao TINA1 antitelo. Dalje, potvrđivanjem da monoklonsko antitelo kompetira sa TINA1 antitelom za vezivanje za TROP2 (to jest, monoklonsko antitelo inhibira vezivanje između TINA1 antitela i TROP2), može biti utvrđeno da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao anti-TROP2 antitelo čak i kada specifična epitopska sekvenca ili struktura nije određena. Kada je potvrđeno da se monoklonsko antitelo vezuje za isti epitop kao anti-TROP2 antitelo, vrlo se očekuje da monoklonsko antitelo ima afinitet vezivanja za antigen i biološku aktivnost ekvivalentnu onoj od TINA1 antitela.
(3) Druga antitela
[0119] Antitelo pronalaska uključuje ne samo gore-opisano monoklonsko antitelo za TROP2 već i rekombinantno antitelo dobijeno veštačkom modifikacijom u svrhu smanjivanja heterologne antigeničnosti sa ljudima kao što je himerno antitelo, humanizovano antitelo i humano antitelo. Ova antitela mogu biti proizvedena korišćenjem poznate metode.
[0120] Kao himerno antitelo, antitelo u kome su varijabilni i konstantni regioni antitela izvedeni iz različitih vrsta, na primer, himerno antitelo u kome je varijabilni region antitela izvedenog iz miša ili pacova vezan za konstantni region antitela izvedenog iz čoveka može služiti kao primer (videti Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)).
[0121] Kao humanizovano antitelo, antitelo dobijeno integrisanjem samo regiona koji određuje komplementarnost (CDR) u antitelo izvedeno iz čoveka (videti Nature (1986) 321, str. 522-525), i antitelo dobijeno graftovanjem dela aminokiselinskih ostataka okvira kao i CDR sekvence za humano antitelo pomoću metode za graftovanje CDR (Međunarodna objava br. WO 90/07861) može služiti kao primer.
[0122] Međutim, humanizovano antitelo izvedeno iz TINA1 antitela nije ograničeno na specifično humanizovano antitelo sve dok humanizovano antitelo ima svih 6 tipova CDR sekvenci TINA1 antitela. Varijabilni region teškog lanca TINA1 antitela ima CDRH1 (TAGMQ) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEK ID BR: 23 u Listi sekvenci, CDRH2 (WINTHSGVPKYAEDFKG) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEK ID BR: 24 u Listi sekvenci, i CDRH3 (SGFGSSYWYFDV) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEK ID BR: 25 u Listi sekvenci. Dalje, varijabilni region lakog lanca TINA1 antitela ima CDRL1 (KASQDVSTAVA) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEK ID BR: 26 u Listi sekvenci, CDRL2 (SASYRYT) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEK ID BR: 27 u Listi sekvenci, i CDRL3 (QQHYITPLT) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence predstavljene pomoću SEK ID BR: 28 u Listi sekvenci.
[0123] Kao primer za humanizovano antitelo mišjeg antitela TINA1, proizvoljna kombinacija teškog lanca koja sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od bilo koje od (1) aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 140 iz SEK ID BR: 12, 14, ili 16 u Listi sekvenci, (2) aminokiselinske sekvence koja ima homologiju od najmanje 95% ili više sa aminokiselinskom sekvencom (1) opisanom iznad, i (3) aminokiselinske sekvence gde jedna ili nekoliko aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci (1) opisanoj iznad su deletirane, supstituisane ili dodate i lakog lanca koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od bilo koje od (4) aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 129 iz SEK ID BR: 18, 20, ili 22 u Listi sekvenci, (5) aminokiselinske sekvence koja ima homologiju od najmanje 95% ili više sa aminokiselinskom sekvencom (4) opisanom iznad, i (6) aminokiselinske sekvenca gde jedna ili nekoliko aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci (4) opisanoj iznad su deletirane, supstituisane ili dodate može služiti kao primer.
[0124] Termin "nekoliko" kao što je ovde korišćeno odnosi se na 1 do 10, 1 do 9, 1 do 8, 1 do 7, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3, ili 1 ili 2.
[0125] Kao aminokiselinska supstitucija u ovoj specifikaciji, konzervativna aminokiselinska supstitucija je poželjna. Konzervativna aminokiselinska supstitucija odnosi se na supstituciju koja se javlja unutar grupe aminokiselina koje se odnose na bočne lance aminokiselina. Poželjne grupe aminokiselina su kao što sledi: kisela grupa (asparaginska kiselina i glutaminska kiselina); bazna grupa (lizin, arginin, i histidin); nepolarna grupa (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, i triptofan); i nenaelektrisana polarna familija (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, i tirozin). Poželjnije grupe aminokiselina su kao što sledi: alifatična hidroksi grupa (serin i treonin); grupa koja sadrži amid (asparagin i glutamin); alifatična grupa (alanin, valin, leucin, i izoleucin); i aromatična grupa (fenilalanin, triptofan, i tirozin). Takva aminokiselinska supstitucija je poželjno izvedena unutar opsega koji ne pogoršava svojstva supstance koja ima originalnu aminokiselinsku sekvencu.
[0126] Kao antitelo koje ima poželjno kombinaciju teškog i lakog lanca opisanih iznad, antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 140 iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 129 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 140 iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 129 iz SEK ID BR: 20; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 140 iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 129 iz SEK ID BR: 22; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 140 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 129 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 140 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 129 iz SEK ID BR: 20; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 140 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 129 iz SEK ID BR: 22; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 140 iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 129 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 140 iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 129 iz SEK ID BR: 20; i antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 140 iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 129 iz SEK ID BR: 22 može služiti kao primer.
[0127] Dalje, kao antitelo koje ima poželjniju kombinaciju teškog i lakog lanca opisanih iznad, antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 20; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 22; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 20; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 22; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 20; i antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 22 može služiti kao primer.
[0128] Kao antitelo koje ima superiornu poželjnu kombinaciju teškog i lakog lanca opisanih iznad, antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 140 iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 129 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 140 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 129 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 140 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 129 iz SEK ID BR: 20; i antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 140 iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji sadrži varijabilni region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 129 iz SEK ID BR: 22 može služiti kao primer.
[0129] Osim toga, antitelo koje ima još jednu poželjniju kombinaciju teškog i lakog lanca opisanih iznad, antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 20; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 22; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 20; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 22; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 20; i antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 22 može služiti kao primer.
[0130] Kao antitelo koje ima superiornu poželjnu kombinaciju teškog i lakog lanca opisanih iznad, antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 20; i antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 470 iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 22 može služiti kao primer.
[0131] Dalje, kao antitelo koje ima superiorniju poželjnu kombinaciju teškog i lakog lanca opisanih iznad, antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 469 iz SEK ID BR: 12 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 469 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 18; antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 469 iz SEK ID BR: 14 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 20; i antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 20 do 469 iz SEK ID BR: 16 i lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se sastoji od pozicija aminokiselina 21 do 234 iz SEK ID BR: 22 može služiti kao primer.
[0132] Kombinovanjem sekvence koja ima visoku homologiju sa gore-opisanom aminokiselinskom sekvencom teškog lanca sa sekvencom koja ima viosku homologiju sa gore-opisanom aminokiselinskom sekvencom lakog lanca, moguće je odabrati antitelo koje ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj od svakog od gore-opisanih antitela. Takva homologija je generalno homologija od 80% ili više, poželjno homologija od 90% ili više, poželjnije homologija od 95% ili više, najpoželjnije homologija od 99% ili više. Dalje, kombinovanjem aminokiselinske sekvence gde jedan do nekoliko aminokiselinskih ostataka su supstituisani, deletirani ili dodati u aminokiselinskoj sekvenci teškog lanca ili lakog lanca, takođe je moguće da se odabere antitelo koje ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj od svakog od gore-opisanih antitela.
[0133] Homologija između dve aminokiselinske sekvence može biti određena korišćenjem podrazumevanih parametara korišćenjem Blast algoritma verzije 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, i David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST i PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Blast algoritam može biti korišćen takođe preko Interneta pristupanjem sajtu www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
[0134] U aminokiselinskoj sekvenci teškog lanca predstavljenoj pomoću SEK ID BR: 12, 14 ili 16 u Listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 19 je signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 140 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 141 do 470 je konstantni region. Sekvenca iz SEK ID BR: 12, 14 i 16 su prikazane na Sl.3, 4 i 5 redom.
[0135] Dalje, u aminokiselinskoj sekvenci lakog lanca predstavljenoj pomoću SEK ID BR: 18, 20 ili 22 u Listi sekvenci, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 20 je signalna sekvenca, aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 129 je varijabilni region, i aminokiselinska sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 130 do 234 je konstantni region. Sekvenca iz SEK ID BR: 18, 20 i 22 su prikazane na Sl.6, 7 i 8 redom.
[0136] Dalje, antitelo pronalaska uključuje humano antitelo koje se vezuje za TROP2. Anti-TROP2 humano antitelo odnosi se na humano antitelo koje ima samo sekvencu antitela izvedenog iz humanog hromozoma. Anti-TROP2 humano antitelo može biti dobijeno pomoću metode korišćenjem miša koji proizvodi humano antitelo koje ima fragment humanog hromozoma koji sadrži gene teškog i lakog lanca humanog antitela (videti Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, str.133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, str. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic i Applied Aspects tom 10, str. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. i Iijima, S. izd.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, str. 722-727, etc.).
[0137] Takav miš koji proizvodi humano antitelo može biti kreiran specifično kao što sledi. Genetički modifikovana životinja u kojoj genski lokusi teškog i lakog lanca endogenog imunoglobulina su poremećeni, i umesto toga, genski lokusi teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina su uvedeni putem vektora veštačkog hromozoma kvasca (yeast artificial chromosome - YAC) ili slično je kreirana proizvodnjom nokaut životinje i transgene životinje i parenjem ovih životinja.
[0138] Dalje, u skladu sa tehnikom rekombinantne DNK, korišćenjem cDNK koje kodiraju svaki od teškog lanca i lakog lanca humanog antitela, i poželjno vektora koji sadrži takve cDNK, eukariotske ćelije su transformisane, i ćelija transformanta koja proizvodi rekombinantno humano monoklonsko antitelo je kultivisana, pri čemu antitelo takođe može biti dobijeno iz supernatanta kulture.
[0139] Ovde, kao domaćin, na primer, eukariotske ćelije, poželjno ćelije sisara kao što su CHO ćelije, limfociti ili mijelomske ćelije mogu biti korišćene.
[0140] Dalje, metoda za dobijanje humanog antitela izvedenog iz fagnog displeja odabranog iz biblioteke humanih antitela (videti Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), str. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics i Proteomics (2002), 1 (2), str. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology
(2002) 109 (3), str.427-431, itd.) je takođe poznata.
[0141] Na primer, metoda fagnog displeja u kojoj je varijabilni region humanog antitela eksprimiran na površini faga kao jednolančano antitelo (single-chain antibody - scFv), i fag koji se vezuje za antigen je odabran (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), str. 1105-1116) može biti korišćena.
[0142] Analiziranjem gena iz faga koji je odabran na osnovu vezivanja za antigen, DNK sekvenca koja kodira varijabilni region humanog antitela koje se vezuje za antigen može biti određena.
[0143] Ako DNK sekvenca od scFv koji se vezuje za antigen je određena, humano antitelo takođe može biti dobijeno pripremanjem ekspresionog vektora koji sadrži sekvencu i uvođenjem vektora u odgovarajućeg domaćina da bi ga eksprimirao (Međunarodna objava br. WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, str. 433-455; Nature Biotechnology (2005) 23 (9), str.1105-1116) .
[0144] Ako se novo proizvedeno humano antitelo vezuje za parcijalni peptid ili parcijalnu tercijarnu strukturu za koju se TINA1 antitelo vezuje, može biti utvrđeno da se humano antitelo vezuje za isti epitop kao TINA1 antitelo. Dalje, potvrđivanjem da humano antitelo kompetira sa TINA1 antitelom za vezivanje za TROP2 (to jest, humano antitelo inhibira vezivanje između TINA1 antitela i TROP2), može biti utvrđeno da se humano antitelo vezuje za isti epitop kao TINA1 antitelo čak i ako specifična epitopska sekvenca ili struktura nije utvrđena. Kada se potvrdi da se humano antitelo vezuje za isti epitop kao TINA1 antitelo vrlo se očekuje da humano antitelo ima biološku aktivnost ekvivalentnu onoj od TINA1 antitela.
[0145] Himerna antitela, humanizovana antitela, ili humana antitela dobijena gore-opisanom metodom su procenjena na svojstvo vezivanja za antigen pomoću poznate metode ili slično, i poželjno antitelo može biti odabrano.
[0146] Kao jedan primer drugog indikatora za primenu u poređenju svojstava antitela, stabilnost antitela može služiti kao primer. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija
(differential scanning calorimetry - DSC) je uređaj sposoban za brzo i tačno merenje srednje temperature termalne denaturacije (Tm) koja se koristi kao pogodan indikator relativne konformacijske stabilnosti proteina. Merenjem Tm vrednosti korišćenjem DSC i poređenjem vrednosti, razlika u termalnoj stabilnosti može biti upoređena. Poznato je da stabilnost čuvanja anitela pokazuje neku korelaciju sa termalnom stabilnošću antitela (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development i Technology (2007) 12, str. 265-273), i poželjno antitelo može biti odabrano korišćenjem termalne stabilnosti kao indikatora. Primeri drugih indikatora za selekciju antitela uključuju sledeće karakteristike: prinos u odgovarajućoj ćeliji domaćina je visok; i agregabilnost u vodenom rastvoru je niska. Na primer, antitelo koje pokazuje najviši prinos ne pokazuje uvek najvišu termalnu stabilnost, i stoga, neophodno je odabrati antitelo najprikladnije za administraciju ljudima praveći obimnu procenu zasnovanu na gore-opisanim indikatorima.
[0147] U predmetnom pronalasku, modifikovana varijanta antitela je takođe uključena. Modifikovana varijanta se odnosi na varijantu dobijenu podvrgavanjem antitela predmetnog pronalaska hemijskoj ili biološkoj modifikaciji. Primeri hemijski moodifikovane varijante uključuju varijante koje su hemijski modifikovane vezivanjem hemijskog segmenta za aminokiselinski skelet, varijante koje su hemijski modifikovane sa N-vezanim ili O-vezanim ugljovodoničnim lancem, itd. Primeri za biološki modifikovanu varijantu uključuju varijante dobijene post-translacionim modifikacijama (kao što su N-vezana ili O-vezana glikozilacija, N- ili C-terminalna obrada, deamidacija, izomerizacija asparaginske kiseline, ili oksidacija metionina), i varijante u kojima je metioninski ostatak dodat na N terminus tako što je eksprimiran u prokariotskoj ćeliji domaćina.
[0148] Dalje, antitelo obeleženo tako da omogućava detekciju ili izolaciju antitela ili antigena pronalaska, na primer, antitelo obeleženo enzimom, antitelo obeleženo fluorescencijom, antitelo obeleženo afinitetom su takođe uključeni u značenje modifikovane varijante. Takva modifikovana varijanta antitela pronalaska je korisna za poboljšavanje stabilnosti i zadržavanja u krvi antitela, smanjivanje antigeničnosti istog, detektovanje ili izolovanje antitela ili antigena, i tako dalje.
[0149] Dalje, regulisanjem modifikacije glikana koji je vezan za antitelo pronalaska
(glikozilacija, defukozilacija, itd.), moguće je poboljšati ćelijsko citotoksično delovanje zavisno od antitela. Kao tehnika za regulisanje modifikacije glikana antitela, Međunarodna objava br. WO 1999/54342, WO 2000/61739, WO 2002/31140, itd. su poznate. Međutim, tehnika nije ograničena na to. U antitelu predmetnog pronalaska, antitelo u kome modifikacija glikana je regulisana je takođe uključena.
[0150] U slučaju gde je antitelo proizvedeno pomoću prvo izolovanja gena antitela i zatim uvođenjem gena u odgovarajućeg domaćina, kombinacija odgovarajućeg domaćina i odgovarajućeg ekspresionog vektora može biti korišćena. Specifični primeri gena antitela uključuju kombinaciju gena koji kodira sekvencu teškog lanca antitela opisanog u ovoj specifikaciji i gena koji kodira sekvencu njegovog lakog lanca. Kada je ćelija domaćina transformisana, moguće je insertovati gen za sekvencu teškog lanca i gen za sekvencu lakog lanca u isti ekspresioni vektor, i takođe u različite ekspresione vektore odvojeno.
[0151] U slučaju gde su eukariotske ćelije upotrebljene kao domaćin, ćelije životinja, ćelije biljaka i eukariotski mikroorganizmi mogu biti korišćeni. Kao ćelije životinja, ćelije sisara, na primer COS ćelije majmuna (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, str. 175-182, ATCC CRL-1650), murinski fibroblasti NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), i sojevi deficijentni u dihidrofolat reduktazi (Urlaub, G. i Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, str.
4126-4220) ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije; ATCC: CCL-61) mogu služiti kao primer.
[0152] U slučaju gde su korišćene prokariotske ćelije, na primer, Escherichia coli i Bacillus subtilis mogu služiti kao primer.
[0153] Uvođenjem željenog gena antitela u ove ćelije putem transformacije, i kultivisanjem tako transformisanih ćelija in vitro, antitelo može biti dobijeno. U gore-opisanoj metodi za kulturu, prinos može nekada da varira u zavisnosti od sekvence antitela, i stoga, moguće je odabrati antitelo koje je lako proizvedeno kao farmaceutska supstanca korišćenjem prinosa kao indikatora među antitelima koja imaju ekvivalentnu aktivnost vezivanja. Stoga, u antitelu predmetnog pronalaska, antitelo dobijeno metodom za proizvodnju antitela, okarakterisanom uključivanjem koraka kultivacije transformisane ćelije domaćina i koraka sakupljanja željenog antitela iz kultivisanog proizvoda dobijenog u koraku kultivisanja je takođe uključeno.
[0154] Poznato je da lizinski ostatak na karboksil terminusu teškog lanca antitela proizvedenog u kultivisanoj ćeliji sisara je deletiran (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), i takođe je poznato da dva aminokiselinska ostatka (glicin i lizin) na karboksil terminusu teškog lanca antitela proizvedenog u kultivisanoj ćeliji sisara su deletirana i prolinski ostatak nedavno smešten na karboksil terminus je amidovan (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Međutim, takva delecija i modifikacija sekvence teškog lanca ne utiču na afinitet za vezivanje antigena i efektorsku funkciju (aktivacija komplementa, ćelijska citotoksičnost zavisna od komplementa, itd.) antitela. Stoga, u antitelu u skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo podvrgnuto takvoj modifikaciji i funkcionalni fragment antitela su takođe uključeni, i deleciona varijanta u kojoj jedna ili više aminokiselina su deletirane na karboksil terminusu teškog lanca, varijanta dobijena amidacijom delecione varijante (na primer, teški lanac u kome prolinski ostatak na karboksil terminusu je amidovan), i slično su takođe obuhvaćene. Tip delecione varijante koja ima deleciju na karboksil terminusu teškog lanca antitela u skladu sa pronalaskom nije ograničena na gornje varijante sve dok afinitet za vezivanje antigena i efektorska funkcija su konzervirani. Dva teška lanca koja koja formiraju antitelo u skladu sa pronalaskom mogu biti tipa koji je odabran iz grupe koja se sastoji od teškog lanca u punoj dužini i gore-opisane delecione varijante, ili mogu biti od dva tipa u kombinaciji odabranoj odatle. Odnos količine svake delecione varijante može biti pod uticajem tipa kultivisanih ćelija sisara koje proizvode antitelo u skladu sa pronalaskom i uslovima u kulturi, međutim, slučaj gde jedan aminokiselinski ostatak na karboksil terminusu je deletiran u oba od dva teška lanca koji su sadržani kao glavne komponente u antitelu u skladu sa pronalaskom može služiti kao primer.
[0155] Izotip antitela pronalaska, na primer, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) može služiti kao primer, i IgG1 ili IgG2 može služiti kao primer poželjno.
[0156] Kao biološka aktivnost antitela, generalno aktivnost vezivanja antigena, aktivnost internalizacije u ćelije eksprimiranjem antigena pomoću vezivanja za antigen, aktivnost neutralizacije aktivnosti antigena, aktivnost poboljšavanja aktivnosti antigena, aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), i aktivnost ćelijski-posredovane fagocitoze zavisne od antitela (ADCP) mogu služiti kao primer. Funkcija antitela predmetnog pronalaska je aktivnost vezivanja za TROP2, poželjno aktivnost internalizacije u TROP2-eksprimirajuće ćelije vezivanjem za TROP2. Dalje, antitelo predmetnog pronalaska može da ima ADCC aktivnost, CDC aktivnost, i/ili ADCP aktivnost pored aktivnosti ćelijske internalizacije.
[0157] Dobijeno antitelo može biti prečišćeno do homogenosti. Separacija i prečišćavanje antitela može biti izvedeno upotrebljavanjem konvencionalne metode za separaciju proteina i prečišćavanje. Na primer, antitelo može biti izdvojeno i prečišćeno odgovarajućim odabiranjem i kombinovanjem kolonske hromatografije, filter filtracije, ultrafiltracije, precipitacije uz pomoć soli, dijalize, preparativne poliakrilamidne gel elektroforeze, elektroforeze sa izoelektričnim fokusiranjem, i slično (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow i David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), ali metoda nije ograničena na to.
[0158] Primeri takve hromatografije uključuju afinitetnu hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju, gel filtracionu hromatografiju, hromatografiju na reverznoj fazi, i adsorpcionu hromatografiju.
[0159] Takva hromatografija može biti izvedena upotrebljavanjem tečne hromatografije kao što je HPLC ili FPLC.
[0160] Kao kolona koja se koristi u afinitetnoj hromatografiji, Protein A kolona i Protein G kolona mogu služiti kao primer. Na primer, kao kolona koja koristi Protein A kolonu, Hyper D, POROS, Sefaroza FF (Pharmacia) i slično može služiti kao primer.
[0161] Dalje, korišćenjem nosača koji ima antigen imobilisan za njega, antitelo može biti prečišćeno korišćenjem svojstva vezivanja antitela za antigen.
[Antitumorsko jedinjenje]
[0162] Antitumorsko jedinjenje koje treba da se konjuguje za konjugat anti-TROP2 antitelolek predmetnog pronalaska je objašnjeno. Antitumorsko jedinjenje korišćeno u predmetnom pronalasku nije posebno ograničeno ako je to jedinjenje koje ima antitumorski efekat i substituentna grupa ili parcijalna struktura koja dozvoljava povezivanje za strukturu veznika. Kada deo ili ceo veznik je iscepan u tumorskim ćelijama, segment antitumorskog jedinjenja je oslobođen da ispolji antitumorski efekat antitumorskog jedinjenja. Kad je veznik iscepan na poziciji vezivanja za lek, antitumorsko jedinjenje je oslobođeno u njegovoj nemodifikovanoj strukturi kako bi se ispoljio njegov unutrašnji antitumorski efekat.
[0163] Kao antitumorsko jedinjenje korišćeno u predmetnom pronalasku, eksatekan (((1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-10,13(9H,15H)-dion; prikazan u formuli koja sledi), jedan od derivata kamptotecina, može biti poželjno korišćen.
[0164] Iako ima odličan antitumorski efekat, eksatekan nije komercijalizovan kao antitumorski lek. Jedinjenje može biti lako dobijeno pomoću poznate metode i amino grupa na poziciji 1 može biti poželjno korišćena kao pozicija vezivanja za strukturu veznika. Dalje, iako eksatekan može takođe biti oslobođen u tumorskim ćelijama dok je deo veznika još uvek zakačen tu, to je odlično jedinjenje koje ispoljava odličan antitumorski efekat čak i u takvoj strukturi.
[0165] Pošto eksatekan ima strukturu kamptotecina, poznato je da se ravnoteža pomera ka strukturi sa zatvorenim laktonskim prstenom (zatvoreni prsten) u vodenom kiselom medijumu (na primer, pH 3 ili približno) ali se pomera do strukture sa otvorenim laktonskim prstenom (otvoreni prsten) u vodenom baznom medijumu (na primer, pH 10 ili približno). Konjugat leka koji je uveden sa eksatekanskim ostatkom koji odgovara strukturi zatvorenog prstena i strukturi otvorenog prstena je takođe očekivan da ima isti antitumorski efekat i nepotrebno je reći da je bilo koje od ovih stanja unutar obima predmetnog pronalaska.
[0166] Drugi primeri antitumorskog jedinjenja mogu da uključe doksorubicin, daunorubicin, mitomicin C, bleomicin, ciklocitidin, vinkristin, vinblastin, metotreksat, antitumorski agens zasnovan na platini (cisplatin ili njegovi derivati), taksol ili njegove derivate, i kamptotecin ili ili njegove derivate (antitumorski agens opisan u Objavljenom (laid-open) Japanskom patentu br. 6-87746) .
[0167] Što se tiče konjugata antitelo-lek, broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela je ključni faktor koji ima uticaj na efikasnost i bezbednost. Proizvodnja konjugata antitelo-lek je izvedena definisanjem uslova reakcije koji uključuju količine primene sirovih materijala i reagenasa za reakciju tako da se ima konstantan broj konjugovanih molekula leka, i konjugat antitelo-lek je generalno dobijen kao smeša koja sadrži različite brojeve konjugovanih molekula leka, za razliku od hemijske reakcije jedinjenja sa niskom molekulskom masom. Broj lekova konjugovanih u molekulu antitela je eksprimiran ili određen pomoću prosečne vrednosti, to jest, prosečnog broja konjugovanih molekula leka. Osim ako nije specifično opisano drugačije kao princip, broj konjugovanih molekula leka označava prosečnu vrednost osim u slučaju kada on predstavlja konjugat antitelo-lek koji ima specifičan broj konjugovanih molekula leka koji je uključen u smešu konjugata antitelo-lek koja ima različiti broj konjugovanih molekula leka. Broj molekula eksatekana konjugovanih za molekul antitela se može kontrolisati, i prosečan broj konjugovanih molekula leka po antitelu, oko 1 do 10 eksatekana može biti povezan. Poželjno, to je 2 do 8, i poželjnije 3 do 8. Istovremeno, prosečan poznavalac oblasti može da dizajnira reakciju za konjugovanje potrebnog broja molekula leka za molekul antitela na osnovu opisa iz Primera predmetne prijave i može dobiti konjugat antitelo-lek sa kontrolisanim brojem molekula eksatekana.
[Struktura veznika]
[0168] Što se tiče anti-TROP2 antitelo-lek konjugata predmetnog pronalaska, struktura veznika za konjugovanje za antitumorsko jedinjenje sa anti-TROP2 antitelom je objašnjena. Veznik ima strukturu sa sledećom formulom:
-L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(O)-Antitelo je vezano za kraj od L<1>(kraj nasuprot veze sa L<2>), i antitumorsko jedinjenje je vezano za karbonil grupu -L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- segmenta.
n<1>predstavlja ceo broj od 0 do 6 i je poželjno ceo broj od 1 do 5, i poželjnije 1 do 3.
1. L<1>
[0169] L<1>je predstavljen pomoću strukture od
-(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(O)-.
[0170] U gorenavedenom, n<3>je ceo broj od 2 do 8, i "-(Sukcinimid-3-il-N)-" ima strukturu predstavljenu pomoću formule koja sledi:
[0171] Pozicija 3 gornje parcijalne strukture je pozicija vezivanja za anti-TROP2 antitelo. Veza za anti-TROP2 antitelo na poziciji 3 je okarakterisana vezivanjem sa tioetarskom formacijom. Azotov atom na poziciji 1 strukturnog segmenta je vezan za ugljenikov atom metilena koji je prisutan unutar veznika uključujući strukturu. Specifično, -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(=O)-L<2>- je struktura predstavljena pomoću formule koja sledi (ovde, "antitelo-S-" potiče od antitela).
[0172] U formuli, n<3>je ceo broj od 2 do 8, i poželjno 2 do 5.
[0173] Specifični primeri za L<1>mogu da uključe
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
2. L<2>
[0174] L<2>je veznik predstavljen pomoću strukture koja sledi:
-NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)-,
L<2>ne mora biti prisutan, i u takvom slučaju, L<2>je jednostruka veza. U gorenavedenom, n<4>je ceo broj od 1 do 6, i poželjno 2 do 4. L<2>je vezan za L<1>na njegovoj terminalnoj amino grupi i vezan je za L<P>na njegovoj karbonil grupi na drugom kraju.
[0175] Specifični primeri za L<2>mogu da uključe
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-
CH2CH2-C(=O)-.
3. L<P>
[0176] L<P>je tetrapeptidni ostatak od -GGFG- (gde G = glicin (Gly); F = fenilalanin (Phe)).
4. L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-[0177] L<a>u L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- je struktura od -O- ili jednostruka veza. n<2>je ceo broj od 0 do 5, poželjnije 0 do 3, poželjnije 0 ili 1.
[0178] Primeri za L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- mogu da uključe one koji imaju strukture koje slede: -O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-,
-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
Od njih,
-O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-, ili
slučaj u kome L<a>je jednostruka veza, i n<2>je 0 je poželjan.
[0179] Specifični primeri strukture predstavljene pomoću -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- u vezniku mogu da uključe
-NH-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
[0180] -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, ili
-NH-CH2CH2-O-C(=O)
je poželjnija.
[0181] U vezniku, lanac dužine -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- je poželjno lanac dužine od 4 do 7 atoma, i poželjnije lanac dužine od 5 ili 6 atoma.
[0182] Što se tiče anti-TROP2 antitelo-lek konjugata predmetnog pronalaska, smatra se da kada je anti-TROP2 antitelo-lek konjugat prenešen u tumorske ćelije, segment veznika je iscepan i derivat leka koji ima strukturu predstavljenu pomoću NH2-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-(NH-DX) je oslobođen da bi se eksprimiralo antitumorsko dejstvo. Primeri antitumorskog derivata koji ispoljava antitumorski efekat oslobađanjem iz konjugata antitelolek predmetnog pronalaska uključuju antitumorski derivat koji ima strukturni segment u kome struktura predstavljena pomoću -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-veznika ima terminalnu amino grupu, i posebno poželjno uključuju one koji slede.
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0183] Istovremeno, u slučaju NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), potvrđeno je da, kako aminalna struktura u molekulu nije stabilna, on ponovo prolazi kroz samo-degradaciju da bi se oslobodilo sledeće HO-CH2-C(=O)-(NH-DX). Ta jedinjenja mogu takođe biti korišćena kao intermedijer u proizvodnji konjugata antitelo-lek predmetnog pronalaska.
[0184] Za konjugat antitelo-lek predmetnog pronalaska u kome je eksatekan korišćen kao lek, poželjno je da segment strukture lek-veznik [-L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-(NH-DX)] koji ima sledeću strukturu je vezan za antitelo. Prosečan konjugovani broj pomenutog segmenta strukture lek-veznik po antitelu može biti 1 do 10. Poželjno, to je 2 do 8, i poželjnije 3 do 8.
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0185] Među njima, poželjniji su oni što slede.
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0186] Posebno su poželjni oni koji slede.
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(O)-(NH-DX).
[0187] Što se tiče strukture veznika za konjugovanje anti-TROP2 antitela i leka u konjugatu antitelo-lek predmetnog pronalaska, poželjni veznik može biti izgrađen povezivanjem poželjnih struktura prikazanih za svaki deo veznika kao što je objašnjeno iznad. Kao za strukturu veznika, oni sa sledećeom strukturom mogu biti poželjno korišćeni. Istovremeno, levi kraj strukture je pozicija vezivanja sa antitelom i desni kraj je pozicija vezivanja sa lekom.
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[0188] Među njima, poželjniji su oni što slede.
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[0189] Posebno poželjni uključuju one koji slede.
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
• (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(O)-.
[Metoda za proizvodnju]
[0190] Potom, objašnjenja su data za reprezentativnu metodu za proizvodnju konjugata antitelo-lek predmetnog pronalaska ili proizvodnju njegovog intermedijera. Istovremeno, jedinjenja su ovde ispod opisana sa brojem jedinjenja prikazanim u svakoj reakcionoj formuli. Specifično, ona su pod nazivom "jedinjenje sa formulom (1)", "jedinjenje (1)", ili slično. Jedinjenja sa brojevima osim tih su takođe opisana slično.
1. Metoda za proizvodnju 1
[0191] Konjugat antitelo-lek predstavljen formulom (1) koji je vezan za strukturu lek-veznik preko tioetra može biti proizveden pomoću metode koja sledi, na primer.
[0192] [U formuli, AB predstavlja antitelo koje ima sulfhidril grupu, i L<1'>predstavlja L<1>strukturu veznika u kome je kraj veznika maleimidil grupa (formula prikazana ispod)
(u formuli, azotov atom je vezujuća pozicija),
i specifično predstavlja grupu u kojoj -(Sukcinimid-3-il-N)- segment u -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(=O)- od L<1>je maleimidil grupa. Dalje, -(NH-DX) predstavlja strukturu predstavljenu pomoću formule koja sledi:
i ona predstavlja grupu koja je izvedena uklanjanjem jednog vodonikovog atoma amino grupe na poziciji 1 eksatekana.]
[0193] Dalje, jedinjenje sa formulom (1) u gornjoj reakcionoj formuli se tumači kao struktura u kojoj se jedan strukturni ostatak koji se proteže od leka do kraja veznika vezuje za jedno antitelo. Međutim, samo je opis dat radi pogodnosti, i postoji zapravo mnogo slučajeva u kojima je više strukturnih segmenata povezano sa jednim molekulom antitela. Isto važi i za objašnjenje metode za proizvodnju opisanu ispod.
[0194] Konjugat antitelo-lek (1) može biti proizveden reagovanjem jedinjenja (2), koje se može dobiti pomoću metode opisane ispod, sa antitelom (3a) koje ima sulfhidril grupu.
[0195] Antitelo (3a) koje ima sulfhidril grupu može biti dobijeno pomoću metode dobro poznate u oblasti (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, str. 56-136, str. 456-493, Academic Press (1996)). Primeri uključuju: Traut-ov reagens je reagovao sa amino grupom antitela; N-sukcinimidil S-acetiltioalkanoati su reagovali sa amino grupom antitela praćeno reakcijom sa hidroksilaminom; nakon reagovanja sa N-sukcinimidil 3-
(piridilditio)propionatom, antitelo je reagovalo sa redukujućim agensom; antitelo je reagovalo sa redukujućim agensom kao što je ditiotreitol, 2-merkaptoetanol, i tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid (TCEP) da bi se redukovala disulfidna veza u zglobnom delu u antitelu da bi se formirala sulfhidrilna grupa, ali nije ograničen na to.
[0196] Specifično, korišćenjem 0.3 do 3 molarnih ekvivalenata od TCEP kao redukujućeg agensa po disulfidu u zglobnom regionu u antitelu i reagovanjem sa antitelom u puferskom rastvoru koji sadrži helirajući agens, antitelo sa parcijalno ili kompletno redukovanim disulfidom u zglobnom delu u antitelu može biti dobijeno. Primeri helirajućeg agensa uključuju etilendiamin tetrasirćetnu kiselinu (ethylenediamine tetraacetic acid - EDTA) i dietilentriamin pentasirćetnu kiselinu (dietilenetriamine acetic acid - DTPA). Može biti korišćen u koncentraciji od 1 mM do 20 mM. Primeri puferskog rastvora koji može biti korišćen uključuju rastvor natrijum fosfata, natrijum borata, ili natrijum acetata. Specifično, reagovanjem antitela sa TCEP na 4°C do 37°C tokom 1 do 4 sata, antitelo (3a) koje ima parcijalno ili kompletno redukovanu sulfhidril grupu može biti dobijeno.
[0197] Istovremeno, sprovođenjem reakcije za dodavanje sulfhidril grupe lek-veznik segmentu, lek-veznik segment može biti konjugovan za tioetarsku vezu.
[0198] Korišćenjem 2 do 20 molarnih ekivavalenata jedinjenja (2) po antitelu (3a) koje ima sulfhidril grupu, konjugat antitelo-lek (1) u kome 2 do 8 molekula leka su konjugovani po antitelu može biti proizveden. Specifično, dovoljno je da je rastvor koji sadrži jedinjenje (2) rastvoreno u njemu dodat u puferski rastvor koji sadrži antitelo (3a) koje ima sulfhidril grupu radi reakcije. Ovde, primeri puferskog rastvora koji može biti korišćen uključuju rastvor natrijum acetata, natrijum fosfat, i natrijum borat. pH za reakciju je 5 do 9, i poželjnije reakcija je izvedena blizu pH 7. Primeri rastvarača za rastvaranje jedinjenja (2) uključuju organski rastvarač kao što je dimetil sulfoksid (DMSO), dimetilformamid (DMF), dimetil acetamid (DMA), i N-metil-2-piridon (NMP).
[0199] Dovoljno je da je rastvor organskog rastvarača koji sadrži jedinjenje (2) rastvoreno u njemu dodat pri 1 do 20% v/v u puferski rastvor koji sadrži antitelo (3a) koje ima sulfhidril grupu radi reakcije. Temperatura reakcije je 0 do 37°C, poželjnije 10 do 25°C, i vreme reakcije je 0.5 do 2 sati. Reakcija može biti završena deaktiviranjem reaktivnosti neizreagovanog jedinjenja (2) sa reagensom koji sadrži tiol. Primeri reagensa koji sadrži tiol uključuje cistein i N-acetil-L-cistein (NAC). Specifičnije, 1 do 2 molarna ekvivalenta od NAC su dodata u jedinjenje (2) korišćeno i, inkubiranjem na sobnoj temperaturi tokom 10 do 30 minuta, reakcija može biti završena.
[0200] Proizvedeni konjugat antitelo-lek (1) može biti podvrgnut, nakon koncentracije, puferske izmene, prečišćavanja, i merenja koncentracije antitela i prosečnog broja konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u skladu sa opštim procedurama opisanim ispod, identifikaciji konjugata antitelo-lek (1) .
Opšta procedura A: Koncentracija vodenog rastvora antitela ili konjugata antitelo-lek [0201] U Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation) sud, rastvor antitela ili konjugata antitelo-lek je dodat i rastvor antitela ili konjugata antitelo-lek je koncentrovan centrifugiranjem (centrifuga tokom 5 do 20 minuta na 2000 G do 3800 G) korišćenjem centrifuge (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.).
Opšta procedura B: Merenje koncentracije antitela
[0202] Korišćenjem UV detektora (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), merenje koncentracije antitela je izvedeno u skladu sa metodom definisanom od strane proizvođača. U to vreme, apsorpcioni koeficijent na 280 nm različit za svako antitelo je korišćen (1.3 mLmg<-1>cm<-1>do 1.8 mLmg<-1>cm<-1>).
Opšta procedura C-1: Izmena pufera za antitelo
[0203] NAP-25 kolona (Kat. br.17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) korišćenjem Sephadex G-25 nosača je ekvilibrisana sa fosfatnim puferom (10 mM, pH 6.0; on je pod nazivom PBS6.0/EDTA u specifikaciji) koji sadrži natrijum hlorid (137 mM) i etilen diamin tetrasirćetnu kiselinu (EDTA, 5 mM) u skladu sa metodom definisanom od strane proizvođača. Vodeni rastvor antitela je primenjen u količini od 2.5 mL za jednu NAP-25 kolonu, i zatim frakcija (3.5 mL) eluirana sa 3.5 mL PBS6.0/EDTA je sakupljena. Rezultujuća frakcija je koncentrovana pomoću Opšte procedure A. Nakon merenja koncentracije antitela korišćenjem Opšte procedure B, koncentracija antitela je podešena na 10 mg/mL korišćenjem PBS6.0/EDTA.
Opšta procedura C-2: Izmena pufera za antitelo
[0204] NAP-25 kolona (Kat. br.17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) korišćenjem Sephadex G-25 nosača je ekvilibrisana sa fosfatnim puferom (50 mM, pH 6.5; on je pod nazivom PBS6.5/EDTA u specifikaciji) koji sadrži natrijum hlorid (50 mM) i EDTA (2 mM) u skladu sa metodom definisanom od strane proizvođača. Vodeni rastvor antitela je primenjen u količini od 2.5 mL za jednu NAP-25 kolonu, i zatim frakcija (3.5 mL) eluirana sa 3.5 mL PBS6.5/EDTA je sakupljena. Rezultujuća frakcija je koncentrovana pomoću Opšte procedure A. Nakon merenja koncentracije antitela korišćenjem Opšte procedure B, koncentracija antitela je podešena na 20 mg/mL korišćenjem PBS6.5/EDTA.
Opšta procedura D: Prečišćavanje konjugata antitelo-lek
[0205] NAP-25 kolona je ekvilibrisana sa bilo kojim puferom odabranim od komercijalno dostupnog fosfatnog pufera (PBS7.4, Kat. br. 10010-023, Invitrogen), natrijum fosfatnog pufera (10 mM, pH 6.0; on je pod nazivom PBS6.0) koji sadrži natrijum hlorid (137 mM), i acetatnog pufera koji sadrži sorbitol (5%) (10 mM, pH 5.5; on je pod nazivom ABS u specifikaciji). Vodeni rastvor reakcije konjugat antitelo-lek je primenjen u količini od oko 1.5 mL na NAP-25 kolonu, i zatim eluiran sa puferom u količini definisanoj od strane proizvođača da bi se sakupila frakcija antitela. Sakupljena frakcija je ponovo primenjena na NAP-25 kolonu i, ponavljanjem u celosti 2 do 3 puta gel fitracionog prečišćavajućeg procesa za eluiranje sa puferom, konjugat antitelo-lek koji isključuje ne-konjugovani veznik leka i jedinjenje male molekulske mase (tris(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid (TCEP), N-acetil-L-cistein (NAC), i dimetil sulfoksid) je dobijen. Opšta procedura E: Merenje koncentracije antitela u konjugatu antitelo-lek i prosečnog broja konjugovanih molekula leka po molekulu antitela (1).
[0206] Koncentracija konjugovanog leka u konjugatu antitelo-lek može biti izračunata merenjem UV apsorbance vodenog rastvora konjugata antitelo-lek na dva talasne dužine od 280 nm i 370 nm, praćeno izvođenjem izračunavanja prikazanog ispod.
[0207] Pošto je ukupna apsorbanca na bilo kojoj talasnoj dužini jednaka zbiru apsorbance svake hemijske vrste koja apsorbuje svetlo koja je prisutna u sistemu (aditivnost apsorbance), kada molarni apsorpcioni koeficijenti antitela i leka ostaju isti pre i posle konjugacije između antitela i leka, koncentracija antitela i koncentracija leka u konjugatu antitelo-lek su izraženi sa jednačinama koje slede.
[0208] U gorenavedenom, A280predstavlja apsorbancu vodenog rastvora konjugata antitelolek na 280 nm, A370predstavlja apsorbancu vodenog rastvora konjugata antitelo-lek na 370 nm, AA,280predstavlja apsorbancu antitela na 280 nm, AA,370predstavlja apsorbancu antitela na 370 nm, AD,280predstavlja apsorbancu prekursora konjugata na 280 nm, AD,370predstavlja apsorbancu prekursora konjugata na 370 nm, εA,280predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent antitela na 280 nm, εA,370predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent antitela na 370 nm, εD,280predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent prekursora konjugata na 280 nm, εD,370predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent prekursora konjugata na 370 nm, CApredstavlja koncentracija antitela u konjugatu antitelo-lek, i CDpredstavlja koncentracija leka u konjugatu antitelo-lek.
[0209] Kao za εA,280, εA,370, εD,280, i εD,370u gorenavedenom, prethodno pripremljene vrednosti
(procenjena vrednost zasnovana na izračunavanju ili merna vrednost dobijena UV merenjem jedinjenja) su korišćene. Na primer, εA,280može biti procenjena iz aminokiselinske sekvence antitela korišćenjem poznate metode za izračunavanje (Protein Science, 1995, tom 4, 2411-2423). εA,370je generalno nula. εD,280i εD,370mogu biti dobijene na osnovu Lambert-Beerovog zakona (Apsorbanca = molarna koncentracija × molarni apsorpcioni koeficijent × dužina ćelijske putanje) merenjem apsorbance rastvora u kome prekursor konjugata koji se koristi je rastvoren u određenoj molarnoj koncentraciji. Merenjem A280i vodenog rastvora konjugata antitelo-lek i rešavanjem istovremenih jednačina (I) i (II) primenom vrednosti, CAi CDmogu biti dobijene. Dalje deljenjem CDsa CA, prosečan broj konjugovanog leka po antitelu može biti dobijen.
[0210] Opšta procedura F: Merenje prosečnog broja konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u konjugatu antitelo-lek - (2).
[0211] Prosečan broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u konjugatu antitelolek može takođe biti određen analizom tečnom hromatografijom visokih performansi (highperformance liquid chromatography - HPLC) korišćenjem metode opisane ispod, dodatno na gore-pomenutu Opštu proceduru E.
[F-1. Pripremanje uzoka za HPLC analizu (redukcija konjugata antitelo-lek)]
[0212] Rastvor konjugata antitelo-lek (oko 1 mg/mL, 60 µL) je izmešan sa vodenim rastvorom ditiotreitola (DTT) (100 mM, 15 µL). Smeša je inkubirana na 37°C tokom 30 minuta da bi se iscepala disulfidna veza između L lanca i H lanca konjugata antitelo-lek. Rezultujući uzorak je korišćen u HPLC analizi.
[F-2. HPLC analiza]
[0213] HPLC analiza je izvedena u sledećim uslovima za merenje:
HPLC sistem: Agilent 1290 HPLC sistem (Agilent Technologies, Inc.) Detektor: UV apsorpcioni spektrometar (talasna dužina merenja: 280 nm) Kolona: PLRP-S (2.1 × 50 mm, 8 µm, 1000 angstroma; Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)
Temperatura kolone: 80°C
Mobilna faza A: 0.04% vodeni rastvor trifluorosirćetne kiseline (TFA)
Mobilna faza B: rastvor acetonitrila koji sadrži 0.04% TFA
Program gradijenta: 29%-36% (0 min-12.5 min), 36%-42% (12.5-15 min), 42%-29% (15 min-15.1 min), 29%-29% (15.1 min-25 min)
Zapremina uzorka koji se ubrizgava: 15 µL
[F-3. Analiza podataka]
[0214]
[F-3-1] U poređenju sa L lancem (L0) i H lancem (H0) ne-konjugovanog antitela, L lanac konjugovan za lek (L lanac vezan za jedan molekul leka: L1) i H lanci (H lanac vezan za jedan molekul leka: H1, H lanac vezan za dva molekula leka: H2, H lanac vezan za tri molekula leka: H3) ispoljavaju višu hidrofobnost proporcionalno broju konjugovanih molekula leka i prema tome imaju veće retenciono vreme. Ovi lanci su stoga eluirani po redosledu L0i L1ili H0, H1, H2, i H3. Pikovi detekcije mogu biti dodeljeni bilo kome od L0, L1, H0, H1, H2, i H3poređenjem retencionih vremena sa L0i H0.
[F-3-2] Pošto veznik leka ima UV apsorpciju, vrednosti oblasti pika su korigovane kao odgovor na broj konjugovanih molekula veznika leka u skladu sa sledećim izrazom korišćenjem molarnih apsorpcionih koeficijenata L lanca, H lanca, i veznika leka.
[0215] Ovde, što se tiče molarnog ekstrinkcionog koeficijenta (280 nm) L lanca ili H lanca svakog antitela, vrednost procenjena iz aminokiselinske sekvence L lanca ili H lanca svakog antitela pomoću poznate metode izračunavanja (Protein Science, 1995, tom 4, 2411-2423) može biti procenjena. U slučaju hTINA, molarni ekstinkcioni koeficijent od 34690 i molarni ekstinkcioni koeficijent od 95000 su korišćeni kao procenjene vrednosti za L lanac i H lanac, redom, u skladu sa njegovom aminokiselinskom sekvencom. Što se tiče molarnog ekstinkcionog koeficijenta (280 nm) veznika leka, izmereni molarni ekstinkcioni koeficijent
(280 nm) jedinjenja u kome je maleimid grupa konvertovana u sukcinimid tioetar reakcijom svakog veznika leka sa merkaptoetanolom ili N-acetilcisteinom je korišćen.
[F-3-3] Odnos oblasti pika (%) svakog lanca je izračunata za zbir korigovanih vrednosti oblasti pikova u skladu sa izrazom koji sledi.
ALi, AHi: Korigovane vrednosti odgovarajućih oblasti pikova od Lii Hi
[F-3-4] Prosečan broj konjugovanih molekula leka po molekulu antitela u konjugatu antitelolek je izračunat u skladu sa izrazom koji sledi.
[0216] Prosečan broj konjugovanih molekula leka = (odnos oblasti pika L0× 0 odnos oblasti pika L0× 1 odnos oblasti pika H0× 0 odnos oblasti pika H1× 1 odnos oblasti pika H2× 2 odnos oblasti pika H3× 3) / 100 × 2
[0217] Jedinjenje predstavljeno formulom (2) u Metodi za proizvodnju 1 je jedinjenje predstavljeno pomoću formule koja sledi:
(maleimid-N-il)-(CH2)n<3>-C(=O)-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-(NH-DX) [0218] U formuli,
n<3>predstavlja ceo broj od 2 do 8,
L<2>predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu,
gde n<4>predstavlja ceo broj od 1 do 6,
L<P>predstavlja tetrapeptidni ostatak od -GGFG-n<1>predstavlja ceo broj od 0 do 6,
n<2>predstavlja ceo broj od 0 do 5,
L<a>predstavlja -O- ili jednostruku vezu,
(maleimid-N-il)- je maleimidil grupa (2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il grupa) predstavljena pomoću formule koja sledi:
gde azotov atom je pozicija vezivanja, -(NH-DX) je grupa predstavljena pomoću formule koja sledi:
gde azotov atom iz amino grupe na poziciji 1 je pozicija vezivanja.
[0219] Kada L<2>je jednostruka veza ili -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)-, jedinjenje u kome n<4>je ceo broj od 2 do 4 je poželjno kao intermedijer u proizvodnji.
[0220] Dalje, što se tiče -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-, jedinjenje koje ima -NH-CH2CH2-,-NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili-NH-CH2CH2-O-CH2- je poželjno kao intermedijer u proizvodnji. Jedinjenje koje ima -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2je poželjnije.
[0221] Dalje, u jedinjenju predstavljenom formulom (2), jedinjenje u kome n<3>je ceo broj od 2 do 5, L<2>je jednostruka veza, i -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>- je -NH-CH2CH2-,-NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- je poželjno kao intermedijer u proizvodnji. Jedinjenje u kome -NH-
(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>- je -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- je poželjnije. Jedinjenje u kome n<3>je ceo broj 2 ili 5 je dalje poželjno.
[0222] Dalje, u jedinjenju predstavljenom formulom (2), jedinjenje u kome n<3>je ceo broj od 2 do 5, L<2>je -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)-, n<4>je ceo broj od 2 do 4, i -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>- je -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- je poželjno kao intermedijer u proizvodnji. Jedinjenje u kome n<4>je ceo broj 2 ili 4 je poželjnije. Jedinjenje u kome -NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>- je -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ili -NH-CH2CH2-O-CH2- je dalje poželjno.
[0223] Kao takvi poželjni intermedijeri korisni u proizvodnji jedinjenja predmetnog pronalaska, oni koji slede mogu služiti kao primer.
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0224] Anti-TROP2 antitelo-lek konjugat predmetnog pronalaska može biti proizveden reagovanjem lek-veznik jedinjenja odabranog iz gore-opisane grupe intermedijernih jedinjenja proizvodnje sa anti-TROP2 antitelom ili njegovim reaktivnim derivatom i formiranjem tioetarske veze na mestu disulfidne veze u zglobnom delu anti-TROP2 antitela. U ovom slučaju, reaktivni derivat anti-TROP2 antitela je poželjno korišćen. Naročito, reaktivni derivat dobijen redukovanjem anti-TROP2 antitela je poželjan.
[0225] Ono što sledi su jedinjenja poželjna kao intermedijeri u proizvodnji.
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[0226] Među intermedijernim jedinjenjima u iznad-opisanoj grupi, jedinjenje predstavljeno pomoću formule koja sledi:
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), ili
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
je dalje poželjno jedinjenje.
[0227] Kako bi se osigurala količina konjugata, više konjugata dobijenih pod sličnim uslovima proizvodnje koji bi imali ekvivalentan broj lekova (npr., oko ± 1) mogu se mešati kako bi se pripremile nove količine. U ovom slučaju, prosečan broj lekova pada između prosečnih brojeva lekova u konjugatima pre mešanja.
2. Metoda za proizvodnju 2
[0228] Jedinjenje predstavljeno formulom (2) kao intermedijer korišćen u prethodnoj metodi za proizvodnju i njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu biti proizvedeni pomoću metode koja sledi, na primer.
[0229] U formuli, L<1'>predstavlja maleimidil grupu, i P<1>, P<2>, i P<3>svaki predstavlja zaštitnu grupu.
[0230] Jedinjenje (6) može biti proizvedeno derivatizacijom karboksilne kiseline (5) u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, halid kiseline, ili slično i reagovanjem sa NH2-DX (4) ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli u prisustvu baze. NH2-DX (4) predstavlja eksatekan (hemijski naziv: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroksi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-10,13(9H,15H)-dion).
[0231] Reakcioni reagensi i uslovi koji su uobičajeno korišćeni za sintezu peptida mogu biti korišćeni za reakciju. Postoje razne vrste aktivnog estra. Na primer, on može biti proizveden reagovanjem fenola kao što su p-nitrofenol, N-hidroksi benzotriazol, N-hidroksi sukcinimid, ili slično, sa karboksilnom kiselinom (5) korišćenjem agensa za kondenzaciju kao što je N,N'-dicikloheksilkarbodiimid ili 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid. Dalje, aktivni estar može takođe biti proizveden reakcijom karboksilne kiseline (5) sa pentafluorofenil trifluoroacetatom ili slično; reakcijom karboksilne kiseline (5) sa 1-benzotriazolil oksitripirolidinofosfonijum heksafluorofosfitom; reakcijom karboksilne kiseline (5) sa dietil cijanofosfonatom (metoda usoljavanja – „salting-in“); reakcijom karboksilne kiseline (5) sa trifenilfosfinom i 2,2'-dipiridil disulfidom (Mukaiyama-ova metoda); reakcijom karboksilne kiseline(5) sa triazin derivatom kao što je 4-(4,6-dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinijum hlorid (DMTMM); ili slično. Dalje, reakcija može takođe biti izvedena pomoću, npr., metode sa halidom kiseline pomoću koje karboksilna kiselina (5) je tretirana sa halidom kiseline kao što je tionil hlorid i oksalil hlorid u prisustvu baze.
[0232] Reagovanjem aktivnog estra, mešovitog anhidrida kiseline ili kiselog halida karboksilne kiseline (5) dobijenog kao iznad sa jedinjenjem (4) u prisustvu pogodne baze u inertnom rastvaraču na reakcionoj temperaturi od -78°C do 150°C, jedinjenje (6) može biti proizvedeno. Istovremeno, "inertni rastvarač" označava rastvarač koji ne inhibira ciljnu reakciju za koju je rastvarač upotrebljen.
[0233] Specifični primeri baze upotrebljene za svaki korak opisan iznad mogu da uključe karbonat, alkoksid, hidroksid, ili hidrid alkalnog metala ili zemnoalkalnog metala uključujući natrijum karbonat, kalijum karbonat, natrijum etoksid, kalijum butoksid, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, natrijum hidrid, i kalijum hidrid, organometalnu bazu predstavljenu pomoću alkil litijuma uključujući n-butil litijum, dialkilamino litijum uključujući litijum diizopropilamid; organometalnu bazu bisililamin uključujući litijum bis(trimetilsilil)amid; i organsku bazu uključujući tercijarni amin ili heterociklično jedinjenje koje sadrži azot kao što je piridin, 2,6-lutidin, kolidin, 4-dimetilaminopiridin, trietilamin, N-metilmorfolin, diizopropiletilamin, i diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (DBU).
[0234] Primeri inertnog rastvarača koji je korišćen za reakciju predmetnog pronalaska uključuje halogenovani ugljovodonični rastvarač kao što je dihlorometan, hloroform, i ugljenik tetrahlorid; etarski rastvarač kao što su tetrahidrofuran, 1,2-dimetoksietan, i dioksan; aromatični ugljovodonični rastvarač kao što su benzen i toluen; i amidni rastvarač kao što su N,N-dimetilformamid, N,N-dimetilacetamid, i N-metilpirolidin-2-on. Pored njih, sulfoksidni rastvarač kao što su dimetil sulfoksid i sulfolan; ketonski rastvarač kao što su aceton i metil etil keton; i alkoholni rastvarač kao što su metanol i etanol mogu biti korišćeni u nekom slučaju. Dalje, ovi rastvarači mogu biti pomešani za primenu.
[0235] Što se tiče zaštitne grupe P<1>za terminalnu amino grupu jedinjenja (6), zaštitna grupa za amino grupu koja je generalno korišćena za sintezu peptida, na primer, terc-butiloksi karbonil grupa, 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa, i benziloksi karbonil grupa, može biti korišćena. Primeri druge zaštitne grupe za amino grupu mogu da uključe alkanoil grupu kao što je acetil grupa; alkoksikarbonil grupu kao što su metoksikarbonil grupa i etoksikarbonil grupa; arilmetoksi karbonil grupu kao što je parametoksibenziloksi karbonil grupa, i para (ili orto)nitroibenziloksi karbonil grupa; arilmetil grupu kao što su benzil grupa i trifenil metil grupa; aroil grupu kao što je benzoil grupa; i aril sulfonil grupu kao što su 2,4-dinitrobenzen sulfonil grupa i ortonitrobenzen sulfonil grupa. Zaštitna grupa P<1>može biti odabrana u zavisnosti od, npr., svojstava jedinjenja koje ima amino grupu koja se zaštićuje.
[0236] Uklanjanjem zaštitne grupe P<1>za terminalnu amino grupu dobijenog jedinjenja (6), jedinjenje (7) može biti proizvedeno. Za ovo uklanjanje zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0237] Jedinjenje (9) može biti proizvedeno derivatizacijom peptidne karboksilne kiseline (8) koja ima N kraj zaštićen sa P<2>u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (7). Reakcioni uslovi, reagensi, baza i inertni rastvarač korišćen za formiranje peptidne veze između peptidne karboksilne kiseline (8) i jedinjenja (7) mogu biti pogodno odabrani i korišćeni od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<2>može biti pogodno odabrana i korišćena od onih opisanih za zaštitnu grupu jedinjenja (6), i selekcija može biti načinjena na osnovu, npr., svojstava jedinjenja koje ima amino grupu koja se zaštićuje. Kao što se generalno koristi za peptidnu sintezu, ponavljanjem sekvencijalno reakcije i deprotekcije aminokiseline ili peptida koji formiraju peptidnu karboksilnu kiselinu (8) za elongaciju, jedinjenje (9) može takođe biti proizvedeno.
[0238] Uklanjanjem zaštitne grupe P<2>za amino grupu dobijenog jedinjenja (9), jedinjenje
(10) može biti proizvedeno. Za ovo uklanjanje zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0239] Moguće je proizvesti jedinjenje (2) derivatizacijom karboksilne kiseline (11) u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, halid kiseline, ili slično i reagovanjem sa dobijenim jedinjenjem (10). Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između karboksilne kiseline (11) i jedinjenja (10) mogu biti pogodno odabrani i korišćeni od onih koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0240] Jedinjenje (9) može takođe biti proizvedeno pomoću metode koja sledi, na primer.
[0241] Jedinjenje (13) može biti proizvedeno derivatizacijom peptidne karboksilne kiseline
(8) koja ima N kraj zaštićen sa P<2>u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, ili slično i reagovanjem u prisustvu baze sa aminskim jedinjenjem (12) koje ima karboksi grupu zaštićenu sa P<3>. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između peptidne karboksilne kiseline (8) i jedinjenja (12) mogu biti pogodno odabrani i korišćeni od onih koji su opisani za sintezu jedinjenja (6).
[0242] Zaštitna grupa P<2>za amino grupu jedinjenja (13) može biti zaštićena sa zaštitnom grupom koja je obično korišćena.
[0243] Specifično, primeri zaštitne grupe za hidroksil grupu uključuju alkoksimetil grupu kao što je metoksimetil grupa; arilmetil grupu kao što je benzil grupa, 4-metoksibenzil grupa, i trifenilmetil grupa; alkanoil grupu kao što je acetil grupa; aroil grupu kao što je benzoil grupa; i silil grupu kao što je terc-butil difenilsilil grupa. Karboksi grupa može biti zaštićena, npr., kao estar sa alkil grupom kao što je metil grupa, etil grupa, i terc-butil grupa, alil grupa, ili arilmetil grupa kao što je benzil grupa. Primeri zaštitne grupe za amino grupu uključuju, na primer, alkiloksi karbonil grupu kao što je terc-butiloksi karbonil grupa, metoksikarbonil grupa, i etoksikarbonil grupa; aliloksikarbonil grupu, ili arilmetoksi karbonil grupu kao što je 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa, benziloksi karbonil grupa, parametoksibenziloksi karbonil grupa, i para (ili orto)nitroibenziloksi karbonil grupa; alkanoil grupu kao što je acetil grupa; arilmetil grupu kao što je benzil grupa i trifenil metil grupa; aroil grupu kao što je benzoil grupa; i aril sulfonil grupu kao što je 2,4-dinitrobenzen sulfonil grupa ili ortonitrobenzen sulfonil grupa.
[0244] Što se tiče zaštitne grupe P<3>za karboksi grupu, zaštitna grupa obično korišćena kao zaštitna grupa za karboksi grupu u organskoj sintetičkoj hemiji, naročito, peptidnoj sintezi, može biti korišćena. Specifični primeri uključuju estre sa alkil grupom kao što je metil grupa, etil grupa, ili terc-butil, alil estre, i benzil estre, i zaštitna grupa može biti pogodno odabrana od gore-opisanih zaštitinih grupa. U takvom slučaju, poželjno je da zaštitna grupa za amino grupu i zaštitna grupa za karboksi grupu mogu biti one poželjno uklonjene pomoću različite metode ili različitih uslova. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<2>je terc-butiloksi karbonil grupa i P<3>je benzil grupa. Zaštitne grupe mogu biti odabrane od onih koje su prethodno opisane u zavisnosti od, npr., svojstava jedinjenja koje ima amino grupu i karboksi grupu koje se zaštićuju. Za uklanjanje zaštitnih grupa, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0245] Uklanjanjem zaštitne grupe P<3>za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (13), jedinjenje (14) može biti proizvedeno. Za ovo uklanjanje zaštite, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0246] Jedinjenje (9) može biti proizvedeno derivatizacijom jedinjenja (14) dobijenog u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji su generalno korišćeni za sintezu peptida mogu takođe biti korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni restvarač mogu biti pogodno odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6).
[0247] Jedinjenje (2) može takođe biti proizvedeno pomoću metode koja sledi, na primer.
[0248] Uklanjanjem zaštitne grupe P<2>za amino grupu jedinjenja (13), jedinjenje (15) može biti proizvedeno. Za ovo uklanjanje zaštite, reagensi i uslovi mogu biti odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0249] Jedinjenje (16) može biti proizvedeno derivatizacijom derivata karboksilne kiseline (11) u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, halid kiseline, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (15) dobijenim u prisustvu baze. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje amidne veze između peptidne karboksilne kiseline (11) i jedinjenja (15) mogu pogodno biti odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6).
[0250] Uklanjanjem zaštitne grupe za karboksi grupi dobijenog jedinjenja (16), jedinjenje (17) može biti proizvedeno. Ovo uklanjanje zaštite može biti izvedenu slično uklanjanju zaštite na karboksi grupi za proizvodnju jedinjenja (14).
[0251] Jedinjenje (2) može biti proizvedeno derivatizacijom jedinjenja (17) u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, halid kiseline, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) u prisustvu baze. Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji su generalno korišćeni za sintezu peptida mogu takođe biti korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za reakciju mogu pogodno biti odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6) .
3. Metoda za proizvodnju 3
[0252] Jedinjenje predstavljeno formulom (2) intermedijera može takođe biti proizvedeno pomoću metode koja sledi.
[0253] U formuli, L<1'>odgovara L<1>koji ima strukturu u kojoj kraj je konvertovan u maleimidil grupu, i P<4>predstavlja zaštitnu grupu.
[0254] Jedinjenje (19) može biti proizvedeno derivatizacijom jedinjenja (11) u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, ili slično i reagovanjem u prisustvu baze sa peptidom karboksilne kiseline (18) koji ima C kraj zaštićen sa P<4>. Reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za formiranje peptidne veze između peptidne karboksilne kiseline (18) i jedinjenja (11) mogu pogodno biti odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6). Zaštitna grupa P<4>za karboksi grupu jedinjenja (18) može biti pogodno odabrana od zaštitne grupe opisane iznad.
[0255] Uklanjanjem zaštitne grupe za karboksi grupu dobijenog jedinjenja (19), jedinjenje
(20) može biti proizvedeno. Ovo uklanjanje zaštite može biti izvedeno uklanjanjem zaštite karboksi grupe za proizvodnju jedinjenja (14).
[0256] Jedinjenje (2) može biti proizvedeno derivatizacijom jedinjenja (20) dobijenog u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (7). Za reakciju, reakcioni reagensi i uslovi koji su generalno korišćeni za sintezu peptida mogu biti takođe korišćeni, i reakcioni uslovi, reagensi, baza, i inertni rastvarač korišćeni za reakciju mogu pogodno biti odabrani od onih opisanih za sintezu jedinjenja (6).
4. Metoda za proizvodnju 4
[0257] Ovde ispod, metoda za pripremanje jedinjenja (10b) koje ima n<1>= 1, L<a>= O u proizvodnom intermedijeru (10) opisanom u Metodi za proizvodnju 2 je opisana detaljno.
Jedinjenje predstavljeno formulom (10b), njegova so ili solvat mogu biti proizvedeni u skladu sa metodom koja sledi, na primer.
[0258] U formuli, L<P>je kao što je definisano iznad, L predstavlja acil grupu koja je alkanoil grupa kao što je acetil grupa ili „alloy“ grupa kao što je benzoil grupa, vodonični atom, ili slično, X i Y svaki predstavlja oligopeptid koji se sastoji od 1 do 3 aminokiselina, P<5>i P<7>svaki predstavlja zaštitnu grupu za amino grupu, i P<6>predstavlja zaštitnu grupu za karboksi grupu.
[0259] Jedinjenje predstavljeno formulom (21) može biti proizvedeno korišćenjem ili primenjivanjem metode opisane u Objavljenom (laid-open) Japanskom patentu br. 2002-60351 ili literaturi (J. Org. Chem., tom 51, strana 3196, 1986), i, izvođenjem uklanjanja zaštitnih grupa ili modifikacije funkcionalnih grupa, ako je neophodno. Alternativno, može takođe biti dobijeno tretiranjem aminokiseline sa zaštićenom terminalnom amino grupom ili kiselim amidom oligopeptida sa zaštićenom amino grupom sa aldehidom ili ketonom.
[0260] Reagovanjem jedinjenja (21) sa jedinjenjem (22) koje ima hidroksil grupu na temperaturi koja je u opsegu od temperaturnih uslova hlađenja do sobne temperature u inertnom rastvaraču u prisustvu kiseline ili baze, jedinjenje (23) može biti proizvedeno.
[0261] Primeri kiseline koja može biti korišćena ovde mogu da uključe neorgansku kiselinu kao što su fluorovodonična kiselina, hlorovodonik, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, i borna kiselina; organsku kiselinu kao što su sirćetna kiselina, limunska kiselina, paratoluen sulfonska kiselina, i metansulfonska kiselina ; i Lusiovu kiselinu kao što su tetrafluoroborat, cink hlorid, kalaj hlorid, aluminijum hlorid, i gvožđe hlorid. Među njima, sulfonske kiseline, naročito, paratoluen sulfonska kiselina je poželjna. Što se tiče baze, bilo koja od prethodno pomenute baze može biti pogodno odabrana i upotrebljena. Poželjni primeri iste uključuju alkoksid alkalnog metala kao što je kalijum terc-butoksid; hidroksid alkalnog metala kao što su natrijum hidroksid i kalijum hidroksid; hidrid alkalnog metala kao što su natrijum hidrid i kalijum hidrid; organometalnu bazu predstavljenu dialkilamino litijumom kao što je litijum diizopropilamidom; i organometalnu bazu bisililamina kao što je litijum bis(trimetilsilil)amid. Primeri rastvarača koji se koristi za reakciju uključuju etarski rastvarač kao što je tetrahidrofuran i 1,4-dioksan; i aromatični ugljovodonični rastvarač kao što su benzen i toluen. Ti rastvarači mogu biti pripremljeni kao smeša sa vodom. Dalje, zaštitna grupa za amino grupu kao što je predstavljeno pomoću P<5>nije posebno ograničena ako je grupa obično korišćena za protekciju amino grupe. Reprezentativni primeri uključuju zaštitne grupe za amino grupu koji su opisani u Metodi za proizvodnju 2. Međutim, u ovoj reakciji, može postojati slučaj u kome zaštitna grupa za amino grupu kao što je predstavljeno pomoću P<5>je iscepana. U takvom slučaju, neophodno je izvesti reakciju sa pogodnim reagensom za zaštitu amino grupe kao što može biti potrebno da bi se uvela zaštitna grupa ponovo.
[0262] Jedinjenje (24) može biti proizvedeno uklanjanjem zaštitne grupe P<6>jedinjenja (23). Ovde, reprezentativni primeri zaštitne grupe za karboksi grupu kao što je predstavljeno pomoću P<6>su opisani u Metodi za proizvodnju 2, i pogodno može biti izabrano od njih. U jedinjenju (23), poželjno je da zaštitna grupa P<5>za amino grupu i zaštitnu grupu P<6>za karboksi grupu su zaštitne grupe koje mogu biti uklonjene pomoću različite metode ili različitih uslova. Na primer, reprezentativni primer uključuje kombinaciju u kojoj P<5>je 9-fluorenilmetiloksi karbonil grupa i P<6>je benzil grupa. Zaštitne grupe mogu biti odabrane u zavisnosti od, npr., svojstava jedinjenja koje ima amino grupu i karboksi grupu koje se zaštićuju. Za uklanjanje zaštitnih grupa, reagensi i uslovi su odabrani u zavisnosti od zaštitne grupe.
[0263] Jedinjenje (26) može biti proizvedeno derivatizacijom karboksilne kiseline (24) u aktivni estar, mešoviti anhidrid kiseline, halid kiseline, ili slično i reagovanjem sa jedinjenjem (4) ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli da bi se proizvelo jedinjenje
(25) praćeno sa uklanjanjem zaštitne grupe P<5>dobijenog jedinjenja (25). Za reakciju između jedinjenja (4) i karboksilne kiseline (24) i reakciju za uklanjanje zaštitne grupe P<6>, isti reagensi i reakcioni uslovi kao oni opisani za Metodu za proizvodnju 2 mogu biti korišćeni.
[0264] Jedinjenje (10b) može biti proizvedeno reagovanjem jedinjenja (26) sa amino kiselinom koja ima zaštićenu terminalnu amino grupu ili oligopeptid (27) koji ima zaštićenu amino grupu da bi se proizvelo jedinjenje (9b) i uklanjanjem zaštitne grupe P<7>jedinjenja (9b) koje je dobijeno. Zaštitna grupa za amino grupu kao što je predstavljeno pomoću P<7>nije posebno ograničena ako je generalno korišćena za zaštitu amino grupe. Reprezentativni primeri iste uključuju zaštitne grupe za amino grupu koje su opisane u Metodi za proizvodnju 2. Za uklanjanje zaštitne grupe, reagensi i uslovi su idabrani u zavisnosti od zaštitne grupe. Za reakciju između jedinjenja (26) i jedinjenja (27), reakcioni reagensi i uslovi koji su obično korišćeni za sintezu peptida mogu biti upotrebljeni. Jedinjenje (10b) proizvedeno pomoću prethodno pomenute metode može biti derivatizovano u jedinjenje (1) predmetnog pronalaska u skladu sa metodom opisanom iznad.
[0265] Konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska, kada je ostavljen na vazduhu ili je ponovo kristalisao, na primer, za prečišćavanje, može da apsorbuje vlagu da bi imao vodu koja se adsorbovala ili da se pretvori u hidrat, i takvo jedinjenje i so koji sadrže vodu su takođe uključeni u predmetni pronalazak.
[0266] Jedinjenje obeleženo sa raznim radioaktivnim ili ne-radioaktivnim izotopima je takođe uključeno u predmetni pronalazak. Jedan ili više atoma koji formiraju konjugat antitelo-lek predmetnog pronalaska mogu da sadrže atomski izotop u ne-prirodnom odnosu. Primeri atomskog izotopa uključuju deuterijum (<2>H), tricijum (<3>H), jod-125 (<125>I), i ugljenik-14 (<14>C). Dalje, jedinjenje predmetnog pronalaska može biti radioaktivno-obeleženo sa radioaktivnim izotopom kao što je tricijum (<3>H), jod-125 (<125>I), ugljenik-14 (<14>C), bakar-64 (<64>Cu), cirkonijum-89 (<89>Zr), jod-124 (<124>I), fluor-18 (<18>F), indijum-111 (<111>I), ugljenik-11 (<11>C) i jod-131 (<131>I). Jedinjenje obeleženo sa radioaktivnim izotopom je korisno kao terapijski ili profilaktički agens, reagens za istraživanje kao što je reagens za test i agens za dijagnozu kao što je in vivo dijagnostički imidžing agens. Bez povezanosti sa radioaktivnošću, bilo koji tip izotopske varijante konjugata antitelo-lek predmetnog pronalaska je unutar obima predmetnog pronalaska.
[Lekovi]
[0267] Konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska ispoljava citotoksično delovanje na kancerske ćelije, i prema tome, može biti korišćen kao lek, naročito kao terapijski agens i/ili profilaktički agens za kancer.
[0268] Naročito, konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska može biti selektivno korišćen kao lek za hemoterapiju, koja je glavna metoda za lečenje kancera, i kao rezultat, može da uspori razvoj kancerskih ćelija, inhibira njihov rast, i dalje ubije kancerske ćelije. Ovo može da omogući pacijentima obolelim od kancera da budu oslobođeni simptoma uzrokovanih kancerom ili da dostignu poboljšanje u QOL pacijenata sa kancerom i postignu terapijski efekat održavajući živote pacijenata sa kancerom. Čak ako konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska ne ostvaruje ubijanje kancerskih ćelija, može da dostigne viši QOL pacijenata sa kancerom dok postižu svoje dugoročnije preživljavanje, inhibiranjem ili kontrolisanjem rasta ćelija kancera.
[0269] U takvoj terapiji lekom, on može biti korišćen kao lek sam kao i lek u kombinaciji sa dodatnom terapijom u adjuvantnoj terapiji i može biti kombinovan sa hiruškom operacijom, radioterapijom, hormonskom terapijom, ili slično. Osim toga, može biti takođe korišćen kao lek za terapiju lekom u neoadjuvantnoj terapiji.
[0270] Dodatno na terapijsku primenu kao što je opisano iznad, efekat suprimiranja rasta minutnih metastatskih kancerskih ćelija i dalje ubijanje njih pomoću vezivanja za ove kancerske ćelije može takođe biti očekivano na osnovu svojstva vezivanja antitela za antigen. Naročito, kada je ekspresija TROP2 potvrđena u primarnim kancerskim ćelijama, inhibicija kancerskog metastaziranja ili profilaktičkog efekta može biti očekivana pomoću administriranja konjugata anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska. Na primer, efekat inhibiranja i ubijanja kancerskih ćelija u telesnoj tečnosti tokom metastaziranja ili efekta, na primer, inhibiranja ubijanja minutnih ćelija kancera odmah nakon implantacije u bilo kom tkivu može se očekivati. Dalje, može se očekivati inhibicija metastaziranja kancera ili profilaktički efekat, posebno, nakon hirurškog uklanjanja kancera. Shodno tome, efekat inhibiranja kancerskog metastaziranja može biti očekivan.
[0271] Može se očekivati da konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska vrši terapijski efekat pomoću administracije kao sistemske terapije pacijentima, i dodatno, pomoću lokalne administracije u kancerska tkiva.
[0272] Primeri vrste kancera na koju konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska može biti primenjen uključuju kancer pluća, kancer bubrega, urotelijalni kancer, kolorektalni kancer, kancer prostate, glioblastoma multiforme, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer dojke, melanom, kancer jetre, kancer bešike, kancer želuca, cervikalni kancer, kancer glave i vrata, ili kancer jednjaka, međutim, nije ograničena na njih sve dok je to kancerska ćelija koja eksprimira, u kancerskoj ćeliji kao predmetu koji je tretira, protein koji antitelo unutar konjugata antitelo-lek može da prepozna.
[0273] Konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska može biti poželjno administriran sisaru, ali je poželjnije administriran čoveku.
[0274] Supstance korišćene u farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska mogu biti pogodno odabrane i primenjene iz aditiva formulacija ili slično koji su generalno korišćeni u oblasti, u pogledu doze ili koncentracije koja se administrira.
[0275] Konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska može biti administriran kao farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedan farmaceutski pogodan sastojak. Na primer, farmaceutska kompozicija iznad tipično sadrži najmanje jedan farmaceutski nosač (na primer, sterilisanu tečnost). Ovde, tečnost uključuje, na primer, vodu i ulje (petrolej ulje i ulje životinjskog porekla, biljnog porekla, ili sintetičkog porekla). Ulje može biti, na primer, ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, ili susamovo ulje. Voda je tipičniji nosač kada je farmaceutska kompozicija gorepomenuta intravenski administrirana. Fiziološki rastvor, vodeni rastvor dekstroze, i vodeni rastvor glicerola mogu biti takođe korišćeni kao tečni nosač, posebno, za rastvor za injekcije. Pogodni farmaceutski nosač je poznat u oblasti. Ako je poželjno, kompozicija iznad može takođe da sadrži količinu u tragovima agensa za vlaženje, agensa za emulzifikaciju, ili agensa sa puferisanje pH. Primeri pogodnog farmaceutskog nosača su stavljeni na uvid javnosti u "Remington's Pharmaceutical Sciences" od E. W. Martin. Formulacije odgovaraju načinu administracije.
[0276] Razni sistemi isporuke su poznati i oni mogu biti korišćeni za administriranje konjugata anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska. Primeri puta za administraciju uključuju intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, i subkutane puteve, ali bez oganičenja na to. Administracija može biti načinjena pomoći injekcije ili bolus injekcije, na primer. U skladu sa specifičnim poželjnim tehničkim rešenjem, administracija konjugata antitelo-lek je izvedena pomoću injekcije. Parenterala administracija je poželjno put administracije.
[0277] U skladu sa reprezentativnim tehničkim rešenjem, farmaceutska kompozicija je propisana, kao farmaceutska kompozicija pogodna za intravensku administraciju čoveku, u skladu sa konvencionalnim procedurama. Kompozicija za intravensku administraciju je tipično rastvor u sterilnom i izotoničnom puferskom rastvoru. Ako je neophodno, lek može da sadrži agens za solubilizaciju i lokalne anestetike da bi se ublažio bol na mestu ubrizgavanja (na primer, lignokain). Generalno, sastojak iznad je obezbeđen zasebno kao bilo koji od liofilizovanog praha ili anhidrovanog koncentrata sadržanog u kontejneru koji je dobijen zatvaranjem u ampulu ili kesicu koji ima količinu aktivnog agensa ili kao smeša u jediničnom doznom obliku. Kada je lek u obliku za administraciju injekcijom, može biti administriran iz bočice za injekciju koja sadrži vodu ili fiziološki rastvor sterilnog farmaceutskog stepena. Kada se lek administrira injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode ili fiziološkog rastvora za injekciju tako da se pomenuti sastojci pre administracije pomešaju jedni sa drugima.
[0278] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti farmaceutska kompozicija koja sadrži samo konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetne prijave ili farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat anti-TROP2 antitelo-lek i najmanje jedan agens za lečenje kancera pored konjugata. Konjugat anti-TROP2 antitelo-lek predmetnog pronalaska može biti administriran sa drugim agensom za lečenje kancera. Anti-kancerski efekat može biti poboljšan u skladu sa tim. Drugi anti-kancerski agens korišćen za takvu svrhu može biti administriran pojedincu istovremeno sa, odvojeno od, ili nakon konjugata antitelo-lek, i može biti administriran dok varira interval administracije za svaki. Primeri agensa za lečenje kancera uključuju abraksan, paklitaksel, cisplatin, gemcitabin, irinotekan
(CPT-11), paklitaksel, pemetreksed, sorafenib, vinorelbin, lekove opisane u Međunarodnoj objavi br. WO 2003/038043, LH-RH analoge (leuprorelin, goserelin, ili slično), estramustin fosfat, estrogen antagonist (tamoksifen, raloksifen, ili slično), i inhibitor aromataze
(anastrozol, letrozol, eksemestan, ili slično), ali nije ograničen sve dok je to lek koji ima antitumorsku aktivnost.
[0279] Farmaceutska kompozicija može biti formulisana u formulaciju za liofilizaciju ili tečnu formulaciju kao formulacija koja ima željenu kompoziciju i potrebnu čistoću. Kada je formulisana kao formulacija za liofilizaciju, to može biti formulacija koja sadrži pogodne aditive formulacije koji su korišćeni u oblasti. Takođe za tečnu formulaciju, može biti formulisana kao tečna formulacija koja sadrži razne aditive formulacije koji su korišćeni u oblasti.
[0280] Kompozicija i koncentracija farmaceutske kompozicije mogu varirati u zavisnosti od metode administraciije. Međutim, konjugat anti-TROP2 antitelo-lek sadržan u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska može da ispolji farmaceutski efekat čak pri maloj dozi kada konjugat antitelo-lek ima viši afinitet za antigen, odnosno, viši afinitet (= niža Kd vrednost) u pogledu konstantne disocijacije (to jest, Kd vrednosti) za antigen. Prema tome, za određivanje doze konjugata antitelo-lek, doza može biti određena s obzirom na situaciju koja se odnosi na afinitet između konjugata antitelo-lek i antigena. Kada je konjugat antitelo-lek predmetnog pronalaska administriran čoveku, na primer, oko 0.001 do 100 mg/kg može biti administrirano jednom ili administrirano nekoliko puta sa intervalom jednog puta od 1 do 180 dana.
Primeri
[0281] Predmetni pronalazak je specifično opisan u pogledu primera prikazanih ispod. Međutim, predmetni pronalazak nije ograničen na njih. Dalje, to se nikako ne tumači na ograničen način. Dalje, osim ako nije drugačije opisano, reagens, rastvarač, i početni materijal opisan u specifikaciji može se lako dobiti od komercijalnog snabdevača.
[Primer 1: Imunizacija miša i dobijanje hibridoma]
1-1) Pripremanje ćelije koja će se koristiti u imunizaciji miša
[0282] 5 × 10<6>NCI-H322 ćelija (humana ćelijska linija nesitnoćelijskog kancera pluća, ATCC CRL-5806; ATCC: American Type Culture Collection – Američka kolekcija kultura sojeva) su kultivisane u RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) medijumu (10 ml) tokom 5 dana, zatim oporavljene, oprane sa PBS-om (fosfatom-puferisan fiziološki rastvor) dva puta, i resuspendovane u PBS (500 µl).
1-2) Imunizacija miša
[0283] Za prvu imunizaciju, svaki BALB/c miš (6 nedelja star) je intraperitonealno imunizovan sa NCI-H322 ćelijama (1 × 10<7>ćelije). Za imunizacije od druge do pete, miš je intraperitonealno imunizovan sa 1 × 10<6>NCI-H322 ćelijama u 1-nedeljnim intervalima. Za šestu (finalnu) imunizaciju, miš je imunizovan kroz repnu venu i intraperitonealno sa NCI-H322 ćelijama pri 1 × 10<6>ćelija/200 µl PBS za svaki put. Ćelije slezine su odstranjene 3 dana nakon finalne imunizacije.
1-3) Pripremanje ćelije slezine imunizovanog miša
[0284] Slezina imunizovanog miša je odstranjena, zatim samlevena, i suspendovana u RPMI 1640 10% FBS (fetalni goveđi serum)(+) medijumu. Ćelijska suspenzija je propuštena kroz sito za ćelije (100 µm, BD Falcon) i zatim centrifugirana na 1500 rpm na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta, i supernatant je odbačen. Tris-NH4Cl rastvor (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.83% NH4Cl; 10 mL) je dodat u ostatak, praćeno sa tretmanom na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. RPMI 1640 FBS(+) medijum (10 ml) je dodat u ćelijsku suspenziju, i smeša je propuštena kroz sito za ćelije i zatim centrifugirana na 1500 rpm na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Supernatant je odbačen, i ćelije slezine su resuspendovane u RPMI 1640 FBS(-) medijumu (10 ml).
1-4) Pripremanje mijelomske ćelije
[0285] P3U1 ćelije (mišja ćelijska linija mijeloma) su oporavljene i centrifugirane na 1500 rpm na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. EDTA (0.02%) rastvor (10 ml) je dodat u P3U1 ćelije, praćeno sa tretmanom na 37°C tokom 5 minuta. P3U1 ćelijska suspenzija je centrifugirana na 1500 rpm na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Supernatant je odbačen i resuspendovan u RPMI 1640 FBS(-) medijumu (10 ml).
1-5) Ćelijska fuzija
[0286] Ćelije slezine i mijelomske ćelije su pomešane u odnosu od 5:1 i centrifugirane (1200 rpm, 5 minuta). Dobijene ćelije u precipitiranoj frakciji su dobro odvojene, i polietilen glikol-4000 (PEG-4000; 1 mL) je zatim postepeno dodat u to tokom oko 1 minuta uz mešanje. Zatim, RPMI medijum (1 mL) je dodat u fluid koji sadrži ćeliju nekoliko puta sa intervalom od 1 minuta, RPMI medijum je zatim dodat u to da bi se podesila ukupna količina do 50 mL. Ćelijska suspenzija je centrifugirana (900 rpm, 5 minuta), i dobijene ćelije u precipitiranoj frakciji su blago odvojene i zatim nežno suspendovane u HAT medijumu (PRMI 1640 medijum obogaćen sa 10% fetalnim goveđim serumom i suplementom za HAT medijume; 100 mL). Suspenzija je raspodeljena u 200 µL/bunariću u ploči sa 96 bunarića za kulturu i kultivisana do 50% konfluentnosti u inkubatoru sa 5% CO2na 37°C.
1-6) Isptitivanje hibridoma korišćenjem adenovirusa varijante FZ33
[0287] NCI-H322 ćelije su zasađene u 5 × 10<3>ćelija/bunariću u ploču sa 96 bunarića i kultivisane na 37°C tokom 48 sati. Ćelije su oprane sa 150 µl/bunariću PBS-a dva puta, i svaki supernatant kulture hibridoma (50 µl) je dodat u svaki bunarić i reagovao je na 4°C tokom 1 sata. Ćelije su oprane sa 150 µl/bunariću PBS-a dva puta. Adenovirus Ax3CAZ3-FZ33 (β-galaktozidaza-eksprimirajući adenovirus modifikovan sa Z33 vlaknom tako da se vezuje za antitelo (videti Objavu Američke patentne prijave br. 2012/0237518)) je razblažen sa RPMI1640(-) medijumom do koncentracije od 3 × 10<6>vp/100 µl (1 × 10<3>vp/ćeliji), i ovaj razblaženi rastvor je dodat tome u 100 µl/bunariću. Nakon reakcije na 4°C tokom 1 sata, ćelije su oprane sa 150 µl/bunariću PBS-a dva puta. RPMI1640 FBS(+) medijum je dodat tome pri 100 µl/bunariću, i ćelije su kultivisane na 37°C tokom 24 sata. NCI-H322 ćelije tretirane sa testom za β-Gal reporter gen korišćenjem test sistema za reporter gen Galacto-Light Plus (Applied Biosystems, Inc.) su oprane sa 200 µl/bunariću PBS-a. Rastvor za lizu je dodat tome u 50 µl/bunariću, i smeša je ostavljena na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Ovaj ćelijski lizat (10 µL) je razblažen 100-puta sa reakcionim puferskim razblaživačem Galacton-Plus Galacto, zatim je dodat u bele ploče sa 96 mikrobunarića White microwell SH
(Nunc/Thermo Fisher Scientific, Inc.), i reagovao je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Akcelerator II je dodat tome pri 150 µl/bunariću. Hemiluminescencija je izmerena tokom 5 sekundi korišćenjem brojača sa više oznaka Wallac 1420 ARVOsx (PerkinElmer, Inc.), i infektivna doza virusa u NCI-H322 ćelijama je označena sa prosečnom vrednošću po sekundi kao RLU (količina luminescencija). U ispitivanju grupe hibridoma tako izvedenom, klon čija je vrednost merenja (RLU) bila 5000 RLU ili više je odabran iz cele grupe (minimum: 1383 RLU, prosek: 10914 RLU, maksimum: 78746 RLU). Prvo, kao primarno ispitivanje, 81 pozitivni bunarić je odabran od 960 hibridomskih bunarića pomoću jedne ćelijske fuzije. Kao ispitivanje validacije, test je dalje sproveden u duplikatu istim pristupom kao u primarnom ispitivanju. Kada je bunarić koji je ispoljio vrednost merenja od 5000 RLU ili više u oba testa bio smatran kao pozitivan, 52 pozitivna bunarića su odabrana od 81 bunarića dobijenog u primarnom ispitivanju. Odabrani klonovi su subklonirani 2 do 4 puta da bi se uspostavile 44 monoklonske hibridomske ćelijske linije.
[Primer 2: Prečišćavanje antitela iz hibridoma]
[0288] Pristan (2,6,10,14-tetrametilpentadekan; 0.5 ml) je intraperitonealno administriran unapred svakom 8- do 10-nedelja starom mišu ili golom („nude“) mišu, koji je zatim odgajan tokom 2 nedelje. Svaki hibridom koji proizvodi monoklonsko antitelo dobijen u Primeru 1 je intraperitonealno ubrizgan u miša. Nakon 10 do 21 dana, hibridom je ostavljen da izazove ascitičnu kanceraciju, i asciti su zatim sakupljeni. Dobijeni asciti su centrifugirani da bi se uklonila čvrsta materija. Zatim, antitela su prečišćena isoljavanjem sa 40 do 50% amonijum sulfatom, metodom precipitacije sa kaprilnom kiselinom, DEAE-Sefaroza kolonom, i protein G kolonom, i IgG ili IgM frakcije su sakupljene i korišćene kao prečišćena monoklonska antitela.
[Primer 3: Identifikacija antigena za koje se antitelo proizvedeno pomoću hibridoma vezuje] [0289] Antigen je identifikovan za TINA1, antitelo proizvedeno pomoću hibridoma pripremljenog u Primeru 2.
3-1) Imunoprecipitacija biotin-obeleženog ćelijskog površinskog proteina korišćenjem TINA1 antitela
[0290] 5 × 10<6>NCI-H322 ćelije su oporavljene i oprane sa PBS-om tri puta. EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Inc.) je suspendovan u PBS-u u koncentraciji od 0.1 mg/ml. NCI-H322 ćelije su rotirane na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta u biotin/PBS rastvoru, zatim oprane sa 100 mM glicin/PBS rastvorom (25 ml) dva puta, i zatim oprane sa PBS-om (25 ml) tri puta. Ćelije tako oprane su resuspendovane u puferu za lizu
(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40 Proteazni inhibitor, 1 tableta/50 ml Complete bez EDTA (Hoffmann-La Roche Ltd.); 2 ml) i tretirane na 4°C tokom 30 minuta. Protein G Sefaroza/pufer za lizu (50% gusta masa; 30 µl) dobijen zamenjivanjem pufera Protein G Sefaroze (Protein G Sefaroza 4 Fast Flow (GE Healthcare Japan Corporation)) sa puferom za lizu je dodat u ćelijski lizat, i smeša je rotirana na 4°C tokom 1 sata i zatim centrifugirana na 4°C tokom 5 minuta da bi se oporavio supernatant. TINA1 antitelo (3 µg) je dodato u supernatant, i smeša je rotirana na 4°C tokom 1 sata. Zatim, Protein G Sefaroza/pufer za lizu (50% gusta masa; 60 µl) je dodat tome, i smeša je rotirana na 4°C tokom 2 sata. Protein G Sefaroza je oprana sa puferom za lizu (1 ml) šest puta i zatim resuspendovana u 1 × SDS pufer za uzorak/5% 2-ME (2-merkaptoetanol) pufer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 na 25°C), 2% (m/v) SDS, 10% glicerol, i 0.01% (m/v) fenol crveno). Suspenzija je tretirana na 100°C tokom 5 minuta, i rastvor je zatim oporavljen i korišćen kao uzorak za SDS-PAGE (poliakrilamidna gel elektroforeza).
3-2) SDS-PAGE i Western blotovanje
[0291] SDS-PAGE uzorak pripremljen u 3-1) je podvrgnut elektroforezi na 20 mA korišćenjem gelova Ready Gels J 5-20% (Bio-Rad Laboratories, Inc.) i zatim blotovan na 0.1 mA/cm<2>sa gela na membranu. Membrana je oprana sa PBS-T (PBS(-)-0.05% Tween 20) tokom 5 minuta i zatim blokirana tokom 1 sata. Membrana je oprana sa PBS-T tokom 5 minuta tri puta i zatim je reagovala sa konjugatom streptavidin-peroksidaza rena (Amersham Biosciences Corp.; razblažen 2000-puta sa PBS-T za primenu) tokom 1 sata. Membrana je oprana sa PBS-T tokom 10 minuta četiri puta, i ciljna traka je zatim detektovana korišćenjem reagenasa za detekciju za western blot - ECL western blotting detection reagents (Amersham Biosciences Corp.) i Hyperfilm ECL (Amersham Biosciences Corp.). NCI-H322 ćelije biotin-obeležene pomoću procedura iz Primera 3-1) su podvrgnute imunoprecipitaciji sa KCI7A3 antitelom čiji antigen je već nađen da je TROP2 pomoću masene spektrometrije, ili TINA1 antitelo, i dobijeni imunoprecipitovani proizvodi su analizirani pomoću SDS-PAGE i Western blotovanja u prisustvu ili odsustvu DTT. U svakom slučaju korišćenja KCI7A3 antitela ili TINA1 antitela, traka je detektovana pri molekulskoj masi od 46 kDa u odsustvu DTT, i traka je detektovana pri molekulskoj masi od 37 kDa u uzorcima obogaćenim sa DTT.
3-3) FACS analiza
[0292] Pošto je predviđeno da antigen za TINA1 antitelo je TROP2 sa šablona trake, analiza prekomerne ekspresije pomoću genskog transfera od cDNK je izvedena bez masene spektrometrije. Kao rezultat FACS analize, TINA1 antitelo je ispoljilo jak pozitivan odgovor u CHOK1 ćelijama koje eksprimiraju humani TROP2, ukazujući na to da antigen TINA1 antitela je TROP2. Slična FACS analiza je izvedena korišćenjem ćelijske linije kancera pluća PC14, ćelijske linije kancera pluća NCI-H322, ćelijske linije kancera pluća NCI-H2122, ćelijske linije kancera pluća LCAM1, ćelijske linije kancera pluća LC2/ad, ćelijske linije kancera pankreasa MIAPaCa2, ćelijske linije kancera pankreasa PK-1, ćelijske linije kancera prostate PC3, ćelijske linije kolorektalnog kancera HCT116, ćelijske linije melanoma A375, ćelijske linije kancera jajnika SKOV3, hematopoetske tumorske ćelijske linije RPMI8226, hematopoetske tumorske ćelijske linije K562, PBMC (humane mononuklearne ćelije periferne krvi - peripheral blood mononuclear ćelije), i humanih trombocita. Sve ispitane ćelijske linije kancera pluća su bile TROP2-pozitivne, i PC3, PK1, i SKOV3 su bile pozitivne kao ćelijske linije osim one kancera pluća. Sa druge strane, sve normalne krvne ćelije su bile negativne.
[Primer 4: Merenje aktivnosti internalizacije antitela]
4-1) Sistem procene aktivnosti internalizacije antitela
[0293] Rekombinantni fuzioni protein DT3C je proizveden u svrhu merenja aktivnosti internalizacije i aktivnosti imunotoksina antitela. Ovaj DT3C je protein koji ima katalitički domen difterija toksina (DT) i tri antitelo-vezujuća regiona proteina G. DT3C se specifično vezuje za Fc segment antitela, stabilan je, i indukuje ćelijsku smrt inhibiranjem sinteze proteina kada se preuzme u ćelije. Korišćenjem ovog sistema, efekat internalizacije antitela i citocidni efekat istog od strane imunotoksina mogu biti opaženi istovremeno (Yamaguchi, M., Hamada, H., et al., Biochemical i Biophysical Research Communications 454 (2014) 600-603).
4-2) Procena aktivnosti internalizacije i aktivnosti imunotoksina korišćenjem DT3C
[0294] 4 µg/mL DT3C je dodato pri 5 µL/bunariću u ploču sa 96 bunarića, dalje supernatanti kultura 11 hibridoma dobijeni pomoću metode iz Primera 1 ili metode ekvivalentne tome su svaki dodat pri 25 µL/bunariću u ploču, i ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Antigeni prepoznati pomoću antitela proizvedenih pomoću hiibridoma pored hibridoma koji proizvode TINA1 antitelo su potvrđeni unapred da su CD9, CD46, CD55, CD59, CD71, CD73, CD147, CD276, EpCAM, ili EGFR. 2 × 10<4>ćelija/mL (RPMI1640 medijum obogaćen sa 20% FBS sa niskim IgG ) NCI-H322 ćelije su zasađene u to pri 50 µL/bunariću. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, ćelije su kultivisane tokom 3 dana u CO2inkubatoru na 37°C. Nakon kulture, supernatant je uklonjen, i 10% WST-10%FBS-RPMI1640 je dodat pri 100 µL/bunariću u ploču. Nakon inkubacije tokom 1 sata u CO2inkubatoru na 37°C, broj živih ćelija je izmeren korišćenjem čitača mikroploča (OD450do OD640, infinite 200, Tecan Trading AG). Među supernatantima kultura procenjenih hibridomskih ćelija, antitela za CD59, CD71, EGFR, EpCAM, ili TROP2 su potvrđena da imaju jaku aktivnost internalizacije i aktivnost imunotoksina (Slika 10).
4-3) Razlika u aktivnosti internalizacije i aktivnosti imunotoksina među antitelima na CD59, CD71, EGFR, EpCAM, ili TROP2
[0295] Svaki razblaženi rastvor DT3C (0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, ili 40 µg/mL) je dodat pri 25 µL/bunariću u ploču sa 96 bunarića, zatim svako antitelo (40 µg/mL) je dodato pri 25 µL/bunariću u ploču, i ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Dalje, 2 × 10<4>ćelija/mL (RPMI1640 medijum obogaćen sa 20% FBS sa niskim IgG) NCI-H322 ćelija su zasađene u to pri 50 µL/bunariću. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, ćelije su kultivisane tokom 3 dana u CO2inkubatoru na 37°C. Nakon kulture, supernatant je uklonjen, i 10% WST-1-10% FBS-RPMI1640 je dodat pri 100 µL/bunariću u ploču. Nakon inkubacije tokom 1 sata u CO2inkubatoru na 37°C, broj živih ćelija je izmeren korišćenjem čitača ploča (OD450do OD640). Među procenjenim antitelima, TINA1, antitelo za TROP2, ima najjaču aktivnost internalizacije i aktivnost imunotoksina (Slika 11).
4-4) Razlika u aktivnosti internalizacije i aktivnosti imunotoksina među klonovima anti-TROP2 antitela
[0296] Anti-TROP2 antitela TINA1 (imunogen: linija kancera pluća NCI-H322), KCL7A3 i KCL2D6 (imunogen: ćelijska linija kancera pankreasa KCL-MOH1), Pr1E11 i Pr8H10 (imunogen: ćelijska linija kancera prostate Pc-1), i NY16 i NY17 (imunogen: ćelijska linija kancera pankreasa PK-1) dobijena pomoću metode iz Primera 1 ili metode ekvivaletne tome, i komercijalno dostupan 77220 (R&D Systems Inc.) su procenjeni za njihovu aktivnost internalizacije i aktivnost imunotoksina na isti način kao u Primeru 4-3). Kao rezultat, među 8 anti-TROP2 antitela, TINA1 antitelo je imalo najjaču aktivnost (Slika 12).
[Primer 5: Određivanje nukleotidne sekvence cDNK koja kodira varijabilni region gena TINA1 antitela i proizvodnja himernog TINA1 (u daljem tekstu, pod nazivom cTINA1) antitela]
5-1) Određivanje nukleotidne sekvence cDNK koja kodira varijabilni region gena TINA1 antitela 5-1-1) Pripremanje iRNK iz hibridoma koji proizvodi TINA1 antitelo [0297] Da bi se amplifikovale cDNK koje kodiraju varijabilne regione TINA1 antitela, iRNK je pripremljena iz hibridoma koji proizvodi TINA1 antitelo korišćenjem kompleta za izolaciju iRNK (Roche Applied Science).
5-1-2) Sinteza cDNK (5'-RACE-Ready cDNK) cDNK (5'-RACE-Ready cDNK) je sintetisana korišćenjem iRNK (100 ng) pripremljene u 5-1-1), i SMARTer RACE cDNK kompleta za amplifikaciju (Clontech Laboratories, Inc.).
5-1-3) Amplifikacija cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca TINA1 antitela pomoću 5'-RACE PCR, i određivanje sekvence
[0298] UPM (Universal Primer A mix - mešavina univerzalnog prajmera A: uključena u SMARTer RACE cDNK komplet za amplifikaciju) i oligonukleotid koji ima sekvencu od 5'-AGAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAGG-3' (SEK ID BR: 33: prajmer mG2aVR2) su korišćeni kao prajmeri za amplifikaciju cDNK varijabilnog regiona gena teškog lanca pomoću PCR-a. UPM uključen u SMARTer RACE cDNK komplet za amplifikaciju
(Clontech Laboratories, Inc.) je korišćen, i mG2aVR2 je dizajniran od sekvence za konstantni region teškog lanca (IgG2a) miša iz baze podataka.
[0299] cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca TINA1 antitela je amplifikovana pomoću 5'-RACE PCR korišćenjem ovog seta prajmera i cDNK (5'-RACE-Ready cDNK) sintetisane u Primeru 5-1-2) kao šablona. Ovaj PCR je izveden u skladu sa uputstvom za SMARTer RACE cDNK Komplet za amplifikaciju (Clontech Laboratories, Inc.) na „touchdown“ PCR programu korišćenjem KOD-plus (Toyobo Co., Ltd.) kao polimeraze.
[0300] cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca amplifikovana pomoću 5'-RACE PCR je prečišćena korišćenjem MinElute PCR kompleta za prečišćavanje (QIAGEN N.V.) i zatim klonirana korišćenjem Zero Blunt TOPO PCR kompleta za kloniranje (Invitrogen Corp.). Nukleotidna sekvenca klonirane cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca je analizirana sekvenciranjem. Prajmeri za sekvenciranje su korišćeni za gore-opisani prajmer mG2aVR2 dizajniran iz sekvence konstantnog regiona teškog lanca miša iz baze podataka, i NUP („Nested“ univerzalni prajmer A: uključen u SMARTer RACE cDNK komplet za amplifikaciju).
[0301] Analiza sekvenciranjem je izvedena korišćenjem aparata za analizu genske sekvence
("ABI PRISM 3700 DNK Analyzer" ili "Applied Biosystems 3730xl Analyzer", Applied Biosystems, Inc.), i reakcije sekvenciranja koja je upotrebljena Gene Amp 9700 (Applied Biosystems, Inc.).
[0302] Određena nukleotidna sekvenca za cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca TINA1 antitela je prikazana u SEK ID BR: 1 u Listi sekvenci, i aminokiselinska sekvenca kodirana time je prikazana u SEK ID BR: 2.
5-1-4) Amplifikacija cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca TINA1 antitela pomoću 5'-RACE PCR, i određivanje sekvence
[0303] UPM (Universal Primer A mix - mešavina univerzalnog prajmera A: uključen u SMARTer RACE cDNK Komplet za amplifikaciju) i oligonukleotid koji ima sekvencu od 5'-AGTCCAACTGTTCAGGACGCCATTTTGTCG-3' (SEK ID BR: 34: prajmer mKVR2) su korišćeni kao prajmeri za amplifikovanje cDNK varijabilnog regiona gena lakog lanca TINA1 antitela pomoću PCR-a. UPM uključen u SMARTer RACE cDNK Komplet za amplifikaciju (Clontech Laboratories, Inc.) je korišćen, i mKVR2 je dizajniran iz sekvence konstantnog regiona lakog lanca miša iz baze podataka.
[0304] cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca TINA1 antitela je amplifikovana pomoću 5'-RACE PCR korišćenjem ovog seta prajmera i cDNK (5'-RACE-Ready cDNK) sintetisane u Primeru 5-1-2) kao šablona. Ovaj PCR je izveden u skladu sa uputstvom za SMARTer RACE cDNK Kompleta za amplifikaciju (Clontech Laboratories, Inc.) na „touchdown“ PCR programu korišćenjem KOD-plus- (Toyobo Co., Ltd.) kao polimeraze.
[0305] cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca amplifikovana pomoću 5'-RACE PCR je prečišćena korišćenjem MinElute PCR kompleta za prečišćavanje (QIAGEN N.V.) i zatim klonirana korišćenjem Zero Blunt TOPO PCR kompleta za kloniranje (Invitrogen Corp.). Nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca je analizirana sekvenciranjem.
[0306] Prajmeri za sekvenciranje koji su korišćeni su gore-opisani prajmer mKVR2 dizajniran od sekvence konstantnog regiona lakog lanca miša iz baze podataka, i NUP.
[0307] Analiza sekvenciranjem i reakcija sekvenciranja su koristile gore-opisani aparat.
[0308] Određena nukleotidna sekvenca za cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca TINA1 antitela je prikazana u SEK ID BR: 3 Liste sekvenci, i aminokiselinska sekvenca kodirana time je prikazana u SEK ID BR: 4.
5-2) Proizvodnja cTINA1 antitela
5-2-1) Konstrukcija ekspresionog vektora pCMA-LK lakog lanca himernog i humanizovanog antitela
[0309] Fragment od oko 5.4 kb dobijen digestijom plazmida pcDNK3.3-TOPO/LacZ
(Invitrogen Corp.) sa restrikcionim enzimima XbaI i PmeI, i DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira sekretorni signal humanog human κ lanca i konstanti region humanog κ lanca prikazani u SEK ID BR: 5 su ligirani korišćenjem In-Fusion Advantage PCR kompleta za kloniranje (Clontech Laboratories, Inc.) da bi se proizveo pcDNK3.3/LK.
[0310] pcDNK3.3/LK je korišćen kao šablon u PCR-u korišćenjem seta prajmera opisanog ispod. Dobijeni fragment od oko 3.8 kb je fosforilisan i zatim samo-ligiran da bi se konstruisao ekspresioni vektor pCMA-LK lakog lanca himernog i humanizovanog antitela koji ima signalnu sekvencu, mesto kloniranja, i gen konstantnog regiona humanog κ lanca nizvodno od CMV pomotera. Set prajmera
5'-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3' (SEK ID BR: 35: prajmer 3.3-F1)
5'-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3' (SEK ID BR: 36: prajmer 3.3-R1)
[0311] 5-2-2) Konstrukcija ekspresionog vektora pCMA-G1 IgG1-tipa teškog lanca himernog i humanizovanog antitela
[0312] DNK fragment od pCMA-LK kome nedostaje DNK sekvenca koja kodira sekretorni signal humanog κ lanca i konstantni region humanog κ lanca digestijom sa XbaI i PmeI, i DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira aminokiseline signalne sekvence humanog teškog lanca i konstantnog regiona humanog IgG1 prikazane u SEK ID BR: 6 su ligirani korišćenjem In-Fusion Advantage PCR kompleta za kloniranje (Clontech Laboratories, Inc.) kako bi se konstruisao ekspresioni vektor pCMA-G1 teškog lanca IgG1-tipa himernog i humanizovanog antitela koji ima signalnu sekvencu, mesto kloniranja, i gen konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1 nizvodno od CMV promotera.
5-2-3) Konstrukcija ekspresionog vektora teškog lanca cTINA1 antitela
[0313] DNK fragment koji sadrži cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca TINA1 antitela je amplifikovan korišćenjem cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca dobijen u Primeru 5-1-3) kao šablon, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), i seta prajmera opisanog ispod, i insertovan je na mesto iscepano restrikcionim enzimom BlpI ekspresionog vektora pCMA-G1 himernog i humanizovanog IgG1-tipa teškog lanca korišćenjem In-Fusion HD PCR kompleta za kloniranje (Clontech Laboratories, Inc.) kako bi se konstruisao ekspresioni vektor teškog lanca cTINA1 antitela. Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-G1/cTINA1". Nukleotidna sekvenca teškog lanca cTINA1 antitela je prikazana u SEK ID BR: 7, i aminokiselinska sekvenca kodirana time je prikazana u SEK ID BR: 8. Nukleotidna sekvenca iz SEK ID BR: 7 i aminokiselinska sekvenca iz SEK ID BR: 8 su takođe opisane na Slici 1.
Set prajmera za teški lanaca cTINA1 antitela
5'-CCAGATGGGTGCTGAGCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAG-3'
(SEK ID BR: 37: prajmerTINA1H-F)
5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACGGTGACCGCGGTCCCTGCGCCCCAGAC-3' (SEK ID BR: 38: prajmer TINA1H-R)
5-2-4) Konstrukcija ekspresionog vektora lakog lanca cTINA1 antitela
[0314] DNK fragment koji sadrži cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca TINA1 antitela je amplifikovan korišćenjem cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca dobijene u Primeru 5-1-4) kao šablon, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), i seta prajmera opisanog ispod, i insertovan je na mesto iscepano restrikcionim enzimom BsiWI ekspresionog vektora pCMA-LK za opštu svrhu lakog lanca himernog i humanizovanog antitela korišćenjem In-Fusion HD PCR kompleta za kloniranje (Clontech Laboratories, Inc.) kako bi se konstruisao ekspresioni vektor lakog lanca cTINA1 antitela. Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-LK/cTINA1". Nukleotidna sekvenca lakog lanca cTINA1 antitela je prikazana u SEK ID BR: 9, i aminokiselinska sekvenca kodirana time je prikazana u SEK ID BR: 10. Nukleotidna sekvenca iz SEK ID BR: 9 i aminokiselinska sekvenca iz SEK ID BR: 10 su takođe opisane na Slici 2.
Set prajmera za laki lanac cTINA1 antitela
5'-ATCTCCGGCGCGTACGGCGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTC-
3' (SEK ID BR: 39: prajmer TINA1L-F)
5'-GGAGGGGGCGGCCACAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGC-3'
(SEK ID BR: 40: prajmer TINA1L-R)
5-2-5) Proizvodnja malih razmera cTINA1 antitela
[0315] FreeStyle 293F ćelije (Invitrogen Corp.) su subkultivisane i kultivisane u skladu sa uputstvom.
[0316] 1 × 10<7>FreeStyle 293F ćelije (Invitrogen Corp.) u logaritamskoj fazi rasta su razblažene sa FreeStyle 293 ekspresionim medijumom (Invitrogen Corp.) do 9.6 mL, zatim zasađene u kvadratnoj boci za čuvanje od 30 mL (Nalgene/Thermo Fisher Scientific, Inc.), i zatim kultivisane uz šejkiranje na 90 rpm tokom 1 sata u 8% CO2inkubatoru na 37°C. Polietilenimin (Polyscience #24765; 30 µg) je rastvoren u Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 200 µL). Zatim, ekspresioni vektor lakog lanca (6 µg) i ekspresioni vektor teškog lanca (4 µg) pripremljeni korišćenjem PureLink HiPure Plasmid kompleta (Invitrogen Corp.) su dodati u Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 200 µL). Ekspresioni vektor/Opti-Pro SFM mešoviti rastvor (200 µL) je dodat u polietilenimin/Opti-Pro SFM mešoviti rastvor (200 µL), i smeša je nežno promešana, dalje ostavljena tokom 5 minuta, i zatim dodata u FreeStyle 293F ćelije. Supernatant kulture dobijen šejkiranjem kulture na 90 rpm tokom 7 dana u 8% CO2inkubatoru na 37°C je filtriran kroz Minisart-Plus filter (Sartorius AG) i korišćen kao uzorak za procenu.
[0317] Humano himerno TINA1 antitelo dobijeno kombinacijom pCMA-G1/cTINA1 i pCMA-LK/cTINA1 je označeno kao "cTINA1 antitelo".
[Primer 6: Dizajn humanizovanog antitela mišjeg anti-TROP2 monoklonskog antitela]
6-1) Dizajn humanizovane verzije TINA1
6-1-1) Molekularno modelovanje varijabilnog regiona od TINA1
[0318] Molekularno modelovanje varijabilnih regiona od TINA1 je izvedeno pomoću metode poznate u oblasti kao homologijsko modelovanje (Methods in Enzymology, 203, 121-153 (1991)). Varijabilni regioni od TINA1 određeni iznad su upoređeni sa primarnim sekvencama (trodimenzionalne strukture izvedene iz rendgenskih kristalnih struktura su dostupne) varijabilnih regiona humanog imunoglobulina registrovanih u Banci podataka proteina -Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)). Kao rezultat, 1ZEA je odabran kao onaj koji ima najvišu homologiju sekvenci sa varijabilnim regionom teškog lanca od TINA1 među antitelima koja slično imaju deleciju u njihovim okvirima. Takođe, 3IU4 je odabran kao onaj koji ima najvišu homologiju sekvence sa varijabilni regionom lakog lanca od TINA1. Trodimenzionalne strukture okvirnih regiona su pripremljene kao „model okvira“ kombinovanjem koordinata za 1ZEA i 3IU4 koje odgovaraju teškom lancu i lakom lancu od TINA1. Posle toga, tipična konformacija svakog CDR je inkorporirana u model okvira.
[0319] Konačno, izračunavanje koje se odnosi na energiju za isključivanje nepovoljnog međuatomskog kontakta je izvedeno kako bi se dobili mogući molekularni modeli TINA1 varijabilnih regiona u pogledu energije. Ove procedure su izvedene korišćenjem komercijalno dostupnog programa za predviđanje tro-dimenzionalne strukture proteina Discovery Studio
(Accelrys, Inc.).
6-1-2) Dizajn aminokiselinske sekvence za humanizovano TINA1
[0320] Humanizovano TINA1 antitelo je kontsruisano pomoću metode poznate u oblasti kao CDR graftovanje (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Akceptorsko antitelo je odabrano na osnovu homologije aminokiselina u okvirnim regionima. Sekvence okvirnih regiona od TINA1 su upoređene sa sekvencama svih humanih okvirnih regiona registrovanih u Kabatovoj bazi podataka (Nuc. Acid Res., 29, 205-206 (2001)) aminokiselinskih sekvenci antitela. Kao rezultat, HuPR1A3 antitelo je odabrano kao akceptor usled njegove 74% homologije sekvence sa okvirnim regionima. Aminokiselinski ostaci okvirnih regiona u HuPR1A3 su poravnati sa aminokiselinskim ostacima okvirnih regiona od TINA1 kako bi se identifikovale pozicije aminokiselina koje se nisu sparile između njih. Pozicije ovih ostatka su analizirane korišćenjem tro-dimenzionalnog modela TINA1 konstruisanog iznad. Zatim, ostaci donora koji se graftuju na akceptor su odabrani u skladu sa kriterijumima obezbeđenim od strane Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Neki ostaci donora tako odabrani su prenešeni na antitelo akceptora kako bi se kontruisala sekvenca humanizovanog TINA1 kao što je opisano u Primerima ispod.
6-2) Humanizacija TINA1 teškog lanca
6-2-1) Teški lanac hTINA1-H1-tipa:
[0321] Teški lanac humanizovanog TINA1 dizajniran uključivanjem zamene pozicije aminokiseline 21 (izoleucin) sa valinom pozicije aminokiseline 28 (prolin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 30 (leucin) sa valinom, pozicije aminokiseline 35 (glutaminska kiselina) sa alaninom, pozicije aminokiseline 36 (treonin) sa serinom, pozicije aminokiseline 38 (arginin) sa lizinom, pozicije aminokiseline 39 (izoleucin) sa valinom, pozicije aminokiseline 57 (glutamin) sa argininom, pozicije aminokiseline 58 (lizin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 59 (metionin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 62 (lizin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 65 (lizin) sa glutaminskom kiselinom, pozicije aminokiseline 67 (izoleucin) sa metioninom, pozicije aminokiseline 87 (fenilalanin) sa valinom, pozicije aminokiseline 88 (alanin) sa treoninom, pozicije aminokiseline 89
(fenilalanin) sa izoleucinom, pozicije aminokiseline 91 (leucin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 92 (glutaminska kiselina) sa asparaginskom kiselinom, pozicije aminokiseline 95 (alanin) sa treoninom, pozicije aminokiseline 102 (izoleucin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 104 (asparagin) sa serinom, pozicije aminokiseline 107 (asparagin) sa serinom, pozicije aminokiseline 111 (treonin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 112 (treonin) sa valinom, pozicije aminokiseline 114 (fenilalanin) sa tirozinom, pozicije aminokiseline 132
(alanin) sa glutaminom, i pozicije aminokiseline 135 (alanin) sa leucinom u odnosu na TINA1 teški lanac prikazan u SEK ID BR: 8 Liste sekvenci je označen kao "teški lanac hTINA1-H1-tipa".
[0322] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca hTINA1-H1-tipa je opisana u SEK ID BR: 12 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 19, sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 140, i sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 141 do 470 u aminokiselinskoj sekvenci iz SEK ID BR: 12 odgovaraju signalnoj sekvenci, varijabilnom regionu teškog lanca, i konstantnom regionu teškog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 12 je opisana u SEK ID BR: 11 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od nukleotida 1 do 57, sekvenca koja se sastoji od nukleotida 58 do 420, i sekvenca koja se sastoji od nukleotida 421 do 1410 u nukleotidnoj sekvenci iz SEK ID BR: 11 kodiraju signalnu sekvencu, sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, i sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca iz SEK ID BR: 11 i aminokiselinska sekvenca iz SEK ID BR: 12 su takođe opisane na Slici 3.
6-2-2) Teški lanac hTINA1-H2-tipa:
[0323] Teški lanac humanizovanog TINA1 dizajniran uključivanjem zamene pozicije aminokiseline 21 (izoleucin) sa valinom, pozicije aminokiseline 28 (prolin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 30 (leucin) sa valinom, pozicije aminokiseline 35 (glutaminska kiselina) sa alaninom, pozicije aminokiseline 36 (treonin) sa serinom, pozicije aminokiseline 38 (arginin) sa lizinom, pozicije aminokiseline 39 (izoleucin) sa valinom, pozicije aminokiseline 57 (glutamin) sa argininom, pozicije aminokiseline 58 (lizin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 59 (metionin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 62 (lizin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 65 (lizin) sa glutaminskom kiselinom, pozicije aminokiseline 67 (izoleucin) sa metioninom, pozicije aminokiseline 87 (fenilalanin) sa valinom, pozicije aminokiseline 88 (alanin) sa treoninom, pozicije aminokiseline 89 (fenilalanin) sa izoleucinom, pozicije aminokiseline 92 (glutaminska kiselina) sa asparaginskom kiselinom, pozicije aminokiseline 95 (alanin) sa treoninom, pozicije aminokiseline 102 (izoleucin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 104 (asparagin) sa serinom, pozicije aminokiseline 107 (asparagin) sa serinom, pozicije aminokiseline 111 (treonin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 112 (treonin) sa valinom, pozicije aminokiseline 114 (fenilalanin) sa tirozinom, pozicije aminokiseline 132 (alanin) sa glutaminom, i pozicije aminokiseline 135 (alanin) sa leucinom u odnosu na TINA1 teški lanac prikazan u SEK ID BR: 8 Liste sekvenci je označen kao "teški lanac hTINA1-H2-tipa".
[0324] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca hTINA1-H2-tipa je opisana u SEK ID BR: 14 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 19, sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 140, i sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 141 do 470 u aminokiselinskoj sekvenci iz SEK ID BR: 14 odgovaraju seignalnoj sekvenci, varijabilnom regionu teškog lanca, i konstantnom regionu teškog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 14 je opisana u SEK ID BR: 13 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od nukleotida 1 do 57, sekvenca koja se sastoji od nukleotida 58 do 420, i sekvenca koja se sastoji od nukleotida 421 do 1410 u nukleotidnoj sekvenci iz SEK ID BR: 13 kodiraju signalnu sekvencu, sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, i sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca iz SEK ID BR: 13 i aminokiselinska sekvenca iz SEK ID BR: 14 su takođe opisane na Slici 4.
6-2-3) Teški lanac hTINA1-H3-tipa:
[0325] Teški lanac humanizovanog TINA1 dizajniran uključivanjem zamene pozicije aminokiseline 28 (prolin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 30 (leucin) sa valinom, pozicije aminokiseline 36 (treonin) sa serinom, pozicije aminokiseline 38 (arginin) sa lizinom, pozicije aminokiseline 39 (izoleucin) sa valinom, pozicije aminokiseline 58 (lizin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 65 (lizin) sa glutaminskom kiselinom, pozicije aminokiseline 67 (izoleucin) sa metioninom, pozicije aminokiseline 87 (fenilalanin) sa valinom, pozicije aminokiseline 88 (alanin) sa treoninom, pozicije aminokiseline 92 (glutaminska kiselina) sa asparaginskom kiselinom, pozicije aminokiseline 95 (alanin) sa treoninom, pozicije aminokiseline 102 (izoleucin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 104 (asparagin) sa serinom, pozicije aminokiseline 107 (asparagin) sa serinom, pozicije aminokiseline 111 (treonin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 112 (treonin) sa valinom, pozicije aminokiseline 114 (fenilalanin) sa tirozinom, pozicije aminokiseline 132 (alanin) sa glutaminom, i pozicije aminokiseline 135 (alanin) sa leucinom u odnosu na TINA1 teški lanac prikazan u SEK ID BR: 8 Liste sekvenci je označen kao "teški lanac hTINA1-H3-tipa".
[0326] Aminokiselinska sekvenca teškog lanca hTINA1-H3-tipa je opisana u SEK ID BR: 16 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 19, sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 20 do 140, i sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 141 do 470 u aminokiselinskoj sekvenci iz SEK ID BR: 16 odgovaraju seignalnoj sekvenci, varijabilnom regionu teškog lanca, i konstantnom regionu teškog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 16 je opisana u SEK ID BR: 15 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od nukleotida 1 do 57, sekvenca koja se sastoji od nukleotida 58 do 420, i sekvenca koja se sastoji od nukleotida 421 do 1410 u nukleotidnoj sekvenci iz SEK ID BR: 15 kodiraju signalnu sekvencu, sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca, i sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca iz SEK ID BR: 15 i aminokiselinska sekvenca iz SEK ID BR: 16 su takođe opisane na Slici 5.
6-3) Humanizacija TINA1 lakog lanca
6-3-1) Laki lanac hTINA1-L1-tipa:
[0327] Laki lanac humanizovanog TINA1 dizajniran uključivanjem zamene pozicije aminokiseline 23 (valin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 28 (histidin) sa prolinom, pozicije aminokiseline 29 (lizin) sa serinom, pozicije aminokiseline 30 (fenilalanin) sa serinom, pozicije aminokiseline 31 (metionin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 33
(treonin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 40 (serin) sa treoninom, pozicije aminokiseline 62 (glutamin) sa lizinom, pozicije aminokiseline 63 (serin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 80 (asparaginska kiselina) sa serinom, pozicije aminokiseline 83 (treonin) sa serinom, pozicije aminokiseline 90 (alanin) sa asparaginskom kiselinom, pozicije aminokiseline 93 (fenilalanin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 98 (valin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 100 (alanin) sa prolinom, pozicije aminokiseline 103 (leucin) sa fenilalaninom, pozicije aminokiseline 120 (alanin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 126 (leucin) sa izoleucinom, i pozicije aminokiseline 129 (alanin) sa treoninom u odnosu na TINA1 laki lanac prikazan u SEK ID BR: 10 Liste sekvenci je označen kao "laki lanac hTINA1-L1-tipa".
[0328] Aminokiselinska sekvenca lakog lanca hTINA1-L1-tipa je opisana u SEK ID BR: 18 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 20, sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 129, i sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 130 do 234 u aminokiselinskoj sekvenci iz SEK ID BR: 18 odgovaraju signalnoj sekvenci, varijabilnom regionu lakog lanca, i konstantom regionu lakog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 18 je opisana u SEK ID BR: 17 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od nukleotida 1 do 60, sekvenca koja se sastoji od nukleotida 61 do 387, i sekvenca koja se sastoji od nukleotida 388 do 702 u nukleotidnoj sekvenci iz SEK ID BR: 17 kodiraju signalnu sekvencu, sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, i sekvencu konstantnog regiona lakog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca iz SEK ID BR: 17 i aminokiselinska sekvenca iz SEK ID BR: 18 su takođe opisane na Slici 6.
6-3-2) Laki lanac hTINA1-L2-tipa:
[0329] Laki lanac humanizovanog TINA1 dizajniran uključivanjem zamene pozicije aminokiseline 28 (histidin) sa prolinom, pozicije aminokiseline 29 (lizin) sa serinom, pozicije aminokiseline 30 (fenilalanin) sa serinom, pozicije aminokiseline 31 (metionin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 33 (treonin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 40 (serin) sa treoninom, pozicije aminokiseline 62 (glutamin) sa lizinom, pozicije aminokiseline 63 (serin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 80 (asparaginska kiselina) sa serinom, pozicije aminokiseline 83 (treonin) sa serinom, pozicije aminokiseline 90 (alanin) sa asparaginskom kiselinom, pozicije aminokiseline 93 (fenilalanin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 98
(valin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 100 (alanin) sa prolinom, pozicije aminokiseline 103 (leucin) sa fenilalaninom, pozicije aminokiseline 120 (alanin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 126 (leucin) sa izoleucinom, i pozicije aminokiseline 129 (alanin) sa treoninom u odnosu na TINA1 laki lanac prikazan u SEK ID BR: 10 Liste sekvenci je označen kao "laki lanac hTINA1-L2-tipa".
[0330] Aminokiselinska sekvenca lakog lanca hTINA1-L2-tipa je opisana u SEK ID BR: 20 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 20, sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 129, i sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 130 do 234 u aminokiselinskoj sekvenci iz SEK ID BR: 20 odgovaraju signalnoj sekvenci, varijabilnom regionu lakog lanca, i konstantom regionu lakog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 20 je opisana u SEK ID BR: 19 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od nukleotida 1 do 60, sekvenca koja se sastoji od nukleotida 61 do 387, i sekvenca koja se sastoji od nukleotida 388 do 702 u nukleotidnoj sekvenci iz SEK ID BR: 19 kodiraju signalnu sekvencu, sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, i sekvencu konstantnog regiona lakog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca iz SEK ID BR: 19 i aminokiselinska sekvenca iz SEK ID BR: 20 su takođe opisane na Slici 7.
6-3-3) Laki lanac hTINA1-L3-tipa:
[0331] Laki lanac humanizovanog TINA1 dizajniran uključivanjem zamene pozicije aminokiseline 28 (histidin) sa prolinom, pozicije aminokiseline 29 (lizin) sa serinom, pozicije aminokiseline 30 (fenilalanin) sa serinom, pozicije aminokiseline 31 (metionin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 33 (treonin) sa alaninom, pozicije aminokiseline 40 (serin) sa treoninom, pozicije aminokiseline 62 (glutamin) sa lizinom, pozicije aminokiseline 63 (serin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 80 (asparaginska kiselina) sa serinom, pozicije aminokiseline 83 (treonin) sa serinom, pozicije aminokiseline 90 (alanin) sa asparaginskom kiselinom, pozicije aminokiseline 93 (fenilalanin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 98
(valin) sa leucinom, pozicije aminokiseline 100 (alanin) sa prolinom, pozicije aminokiseline 103 (leucin) sa fenilalaninom, pozicije aminokiseline 120 (alanin) sa glutaminom, pozicije aminokiseline 126 (leucin) sa izoleucinom, i pozicije aminokiseline 129 (alanin) sa treoninom u odnosu na TINA1 laki lanac prikazan u SEK ID BR: 10 Liste sekvenci je označen kao "laki lanac hTINA1-L3-tipa".
[0332] Aminokiselinska sekvenca lakog lanca hTINA1-L3-tipa je opisana u SEK ID BR: 22 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1 do 20, sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 21 do 129, i sekvenca koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 130 do 234 u aminokiselinskoj sekvenci iz SEK ID BR: 22 odgovaraju signalnoj sekvenci, varijabilnom regionu lakog lanca, i konstantom regionu lakog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 22 je opisana u SEK ID BR: 21 Liste sekvenci. Sekvenca koja se sastoji od nukleotida 1 do 60, sekvenca koja se sastoji od nukleotida 61 do 387, i sekvenca koja se sastoji od nukleotida 388 do 702 u nukleotidnoj sekvenci iz SEK ID BR: 21 kodiraju signalnu sekvencu, sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, i sekvencu konstantnog regiona lakog lanca, redom. Nukleotidna sekvenca iz SEK ID BR: 21 i aminokiselinska sekvenca iz SEK ID BR: 22 su takođe opisane na Slici 8.
[Primer 7: Konstrukcija ekspresionog vektora hTINA1 antitela i proizvodnja antitela] 7-1) Konstrukcija ekspresionog vektora hTINA1 teškog lanca
7-1-1) Konstrukcija hTINA1-H1 ekspresionog vektora
[0333] DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira hTINA1-H1 varijabilni region prikazan u nukleotidnim pozicijama 36 do 437 nukleotidne sekvence hTINA1-H1 predstavljene pomoću SEK ID BR: 11 Liste sekvenci je sintetisan (usluga sinteze veštačkog gena GeneArt). DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira varijabilni region od hTINA1-H1 je amplifikovan korišćenjem sintetisanog DNK fragmenta kao šablona, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), i seta prajmera opisanog ispod, i insertovan je na mesto iscepano restrikcionim enzimom BlpI ekspresionog vektora pCMA-G1 teškog lanca IgG1-tipa korišćenjem In-Fusion HD PCR kompleta za kloniranje (Clontech Laboratories, Inc.) kako bi se konstruisao hTINA1-H1 ekspresioni vektor. Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-G1/hTINA1-H1".
Set prajmera
5'-agctcccagatgggtgctgagc-3' (SEK ID BR: 41: prajmer EG-Inf-F)
5'-gggcccttggtggaggctgagc-3' (SEK ID BR: 42: prajmer EG1-Inf-R)
7-1-2) Konstrukcija hTINA1-H2 ekspresionog vektora
[0334] DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu hTINA1-H2 varijabilnog regiona prikazanu u nukleotidnim pozicijama 36 do 437 nukleotidne sekvence hTINA1-H2 predstavljene pomoću SEK ID BR: 13 Liste sekvenci je sintetisan (usluga sinteze veštačkog gena GeneArt), i hTINA1-H2 ekspresioni vektor je konstruisan na isti način kao u Primeru 7-1-1). Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-G1/hTINA1-H2".
7-1-3) Konstrukcija hTINA1-H3 ekspresionog vektora
[0335] DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira hTINA1-H3 varijabilni region prikazanu u nukleotidnim pozicijama 36 do 437 nukleotidne sekvence hTINA1-H3 predstavljene pomoću SEK ID BR: 15 Liste sekvenci je sintetisan (usluga sinteze veštačkog gena GeneArt), i hTINA1-H3 ekspresioni vektor je konstruisan na isti način kao u Primeru 7-1-1). Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-G1/hTINA1-H3".
7-2) Konstrukcija ekspresionog vektora hTINA1 lakog lanca
7-2-1) Konstrukcija hTINA1-L1 ekspresionog vektora
[0336] DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira hTINA1-L1 varijabilni region prikazanu u nukleotidnim pozicijama 38 do 402 nukleotidne sekvence hTINA1-L1 predstavljene pomoću SEK ID BR: 17 Liste sekvenci je sintetisan (usluga sinteze veštačkog gena GeneArt). DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira varijabilni region hTINA1-L1 je amplifikovan korišćenjem sintetisanog DNK fragmenta kao šablona, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.), i seta prajmera opisanog ispod, i insertovan je na mesto iscepano restrikcionim enzimom BsiWl ekspresionog vektora pCMA-LK lakog lanca himernog i humanizovanog antitela korišćenjem In-Fusion HD PCR kompleta za kloniranje (Clontech Laboratories, Inc.) kako bi se konstruisao hTINA1-L1 ekspresioni vektor. Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-LK/hTINA1-L1".
Set prajmera
5'-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3' (SEK ID BR: 43: prajmer CM-LKF)
5'-ggagggggcggccaccgtacg-3' (SEK ID BR: 44: prajmer KCL-Inf-R)
7-2-2) Konstrukcija ekspresionog vektora hTINA1-L2
[0337] DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira hTINA1-L2 varijabilni region prikazanu u nukleotidnim pozicijama 38 do 402 nukleotidne sekvence hTINA1-L2 predstavljene pomoću SEK ID BR: 19 Liste sekvenci je sintetisan (usluga sinteze veštačkog gena GeneArt), i hTINA1-L2 ekspresioni vektor je konstruisan na isti način kao u Primeru 7-2-1). Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-LK/hTINA1-L2".
7-2-3) Konstrukcija ekspresionog vektora hTINA1-L3
[0338] DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira hTINA1-L3 varijabilni region prikazanu u nukleotidnim pozicijama 38 do 402 nukleotidne sekvence hTINA1-L3 predstavljene pomoću SEK ID BR: 21 Liste sekvenci je sintetisan (usluga sinteze veštačkog gena GeneArt), i hTINA1-L3 ekspresioni vektor je konstruisan na isti način kao u Primeru 7-2-1). Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-LK/hTINA1-L3".
7-3) Proizvodnja i prečišćavanje hTINA1 antitela
7-3-1) Proizvodnja malih razmera hTINA1 antitela
[0339] Svako antitelo je proizvedeno na isti način kao u Primeru 5-2-5).
[0340] hTINA1 antitelo dobijeno kombinacijom pCMA-G1/hTINA1-H1 i pCMA-LK/hTINA1-L1 je označeno kao "hTINA1-H1L1"; hTINA1 antitelo dobijeno kombinacijom pCMA-G1/hTINA1-H2 i pCMA-LK/hTINA1-L1 je označeno kao "hTINA1-H2L1"; hTINA1 antitelo dobijeno kombinacijom pCMA-G1/hTINA1-H2 i pCMA-LK/hTINA1-L2 je označeno kao "hTINA1-H2L2"; i hTINA1 antitelo dobijeno kombinacijom pCMA-G1/hTINA1-H3 i pCMA-LK/hTINA1-L3 je označeno kao "hTINA1-H3L3".
7-3-2) Proizvodnja hTINA1 antitela
[0341] hTINA1-H1L1, hTINA1-H2L1, hTINA1-H2L2, i hTINA1-H3L3 su proizvedeni pomoću metode koja sledi.
[0342] FreeStyle 293F ćelije (Invitrogen Corp.) su subkultivisane i kultivisane u skladu sa uputstvom. 1.2 × 10<9>FreeStyle 293F ćelije (Invitrogen Corp.) u logaritamskoj fazi rasta su zasađene u Fernbach erlenmajer posudu od 3 L (Corning Inc.), zatim razblažene sa FreeStyle 293 ekspresionim medijumom (Invitrogen Corp.) do 1.0 × 10<6>ćelija/ml, i zatim kultivisane uz šejkiranje na 90 rpm tokom 1 sata u inkubatoru sa 8% CO2na 37°C. Polietilenimin (Polyscience #24765; 3.6 mg) je rastvoren u Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 20 ml). Zatim, ekspresioni vektor lakog lanca (0.8 mg) i ekspresioni vektor teškog lanca (0.4 mg) pripremljeni korišćenjem PureLink HiPure Plasmid kompleta (Invitrogen Corp.) su dodati u Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.; 20 ml). Ekspresioni vektor/Opti-Pro SFM mešoviti rastvor (20 ml) je dodat u polietilenimin/Opti-Pro SFM mešoviti rastvor (20 ml), i smeša je nežno mešana, dalje ostavljena tokom 5 minuta, i zatim dodata u FreeStyle 293F ćelije. Supernatant kulture dobijen šejkiranjem kulture na 90 rpm tokom 7 dana u 8% CO2inkubatoru na 37°C je filtriran kroz filter sa kapsulom za jednokratnu upotrebu (ADVANTEC #CCS-045-E1H).
7-3-3) Prečišćavanje hTINA1 antitela
[0343] Svako antitelo je prečišćeno iz supernatanta kulture dobijenog u 7-3-2) gore pomoću dva koraka korišćenjem rProtein A afinitetne hromatografije (4 do 6°C) i keramičkog hidroksiapatita (sobna temperatura). Koraci zamene pufera posle prečišćavanja rProtein A afinitetnom hromatografijom i posle prečišćavanja na keramičkom hidroksiapatitu su izvedeni na 4 do 6°C. Prvo, supernatant kulture je primenjen na MabSelect SuRe (proizveden od strane GE Healthcare Japan Corporation, HiTrap kolona) ekvilibrisanu sa PBS-om. Nakon ulaska celog supernatanta kulture u kolonu, kolona je oprana sa PBS-om u količini od najmanje dva puta zapremine kolone. Zatim, frakcije koje sadrže antitelo su sakupljene eluiranjem sa 2 M rastvorom arginin hidrohlorida (pH 4.0). Frakcijama je zamenjen pufer sa PBS-om pomoću dijalize (Thermo Fisher Scientific, Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) i zatim su razblažene 5-ostruko sa puferom od 5 mM natrijum fosfata i 50 mM MES (pH 7.0). Rezultujući rastvor antitela je primenjen na koloni sa keramičkim hidroksiapatitom (Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT Type-I Hidroksiapatite Kolona) ekvilibrisanoj sa puferom od 5 mM NaPi, 50 mM MES, i 30 mM NaCl (pH 7.0). Frakcije koje sadrže antitelo su sakupljene eluiranjem pomoću linearnog gradijenta koncentracije korišćenjem natrijum hlorida. Frakcijama je zamenjen pufer sa HBSor (25 mM histidin/5% sorbitol, pH 6.0) pomoću dijalize (Thermo Fisher Scientific, Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette). Konačno, frakcije su koncentrovane i podešene na koncentraciju IgG od 20 mg/ml ili više korišćenjem centrifugalnog UF filter uređaja - Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (granična vrednost molekulske mase: UF10K, Sartorius AG, 4°C), i korišćene kao prečišćen uzorak.
[Referentni Primer 1: Proizvodnja ekspresionog vektora hRS7 antitela i proizvodnja antitela] [0344] hRS7 antitelo je proizvedeno na osnovu aminokiselinskih sekvenci lakog lanca i teškog lanca opisanih u Međunarodnoj objavi br.WO 2003/074566.
1-1) Konstrukcija ekspresionog vektora teškog lanca hRS7 antitela
[0345] DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca hRS7 antitela prikazanu u nukleotidnim pozicijama 36 do 437 nukleotidne sekvence teškog lanca hRS7 antitela predstavljene pomoću SEK ID BR: 29 Liste sekvenci je sintetisan (usluga sinteze veštačkog gena GeneArt), i ekspresioni vektor teškog lanca hRS7 antitela je konstruisan na isti način kao u Primeru 7-1-1). Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-G1/hRS7". Aminokiselinska sekvenca teškog lanca hRS7 antitela je prikazana u SEK ID BR: 30 Liste sekvenci.
1-2) Konstrukcija ekspresionog vektora lakog lanca hRS7 antitela
[0346] DNK fragment koji sadrži DNK sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca hRS7 antitela prikazanu u nukleotidnim pozicijama 38 do 402 nukleotidne sekvence lakog lanca hRS7 antitela predstavljene pomoću SEK ID BR: 31 Liste sekvenci je sintetisan (usluga sinteze veštačkog gena GeneArt), i ekspresioni vektor lakog lanca hRS7 antitela je konstruisan na isti način kao u Primeru 7-2-1). Dobijeni ekspresioni vektor je označen kao "pCMA-LK/hRS7". Aminokiselinska sekvenca teškog lanca hRS7 antitela je prikazana u SEK ID BR: 32 Liste sekvenci.
1-3) Proizvodnja i prečišćavanje hRS7 antitela
1-3-1) Proizvodnja hRS7 antitela
[0347] hRS7 antitelo je proizvedeno na isti način kao u Primeru 7-3-2) kombinacijom pCMA-G1/hRS7 i pCMA-LK/hRS7.
1-3-2) Prečišćavanje hRS7 antitela
[0348] Antitelo je prečišćeno iz supernatanta kulture dobijenog u 1-3-1) na isti način kao u Primeru 7-3-3).
[Primer 8: Merenje afiniteta za vezivanje antigena hTINA1 antitela i hRS7 antitela]
8-1) Merenje afiniteta za vezivanje antigena korišćenjem antitela (supernatant kulture) proizvedenog u maloj razmeri
[0349] Svako antitelo je ispitano za svoju konstantu disocijacije za antigen (himera Fc rekombinantnog humanog TROP-2) korišćenjem Biacore 3000 (GE Healthcare Japan Corporation) pomoću metode hvatanja hvatanjem antitela kao liganda na imobilisanom antitelu na humani IgG (Fab) i testiranjem antigena kao analita. Oko 2000 RU antitela na humani IgG (Fab) (komplet za hvatanje humanog Fab, GE Healthcare Japan Corporation) je kovalentno vezano za senzorski čip CM5 (BIAcore, Inc.) pomoću metode aminskog kuplovanja. Slično, ovo antitelo je imobilisano na referentnoj protočnoj ćeliji. Radni pufer koji je korišćen je HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfaktant P20). Supernatant kulture koji sadrži antitelo je dodavan tokom 80 sekundi na imobilisani čip sa antitelom na humani IgG (Fab), i zatim, serijska razblaženja (1 do 1000 nM) antigena su svako dodato tome pri stopi protoka od 30 µL/min tokom 300 sekundi. Nakon toga, faza disocijacije je praćena tokom 600 sekundi. 10 mM Gly-HCl (pH 1.5) koji sadrži 20% DMSO je dodat tome kao rastvor za regeneraciju pri stopi protoka od 10 µl/min tokom 60 sekundi. Podaci su analizirani korišćenjem modela bivalentnog vezivanja analitičkog softvera (BIAevaluation softver, verzija 4.1) kako bi se izračunala konstantna stope asocijacije kon, konstanta stope disocijacije koff, i konstantna disocijacije (KD; KD = koff/kon).
[Tabela 1]
Aktivnost vezivanja korišćenjem supernatanta kulture kao uzorka antitela
[0350] 8-2) Merenje afiniteta vezivanja za antigen korišćenjem prečišćenog antitela [0351] Svako antitelo je ispitano za svoju konstantu disocijacije za antigen (himera Fc rekombinantnog humanog TROP-2) korišćenjem Biacore 3000 (GE Healthcare Japan Corporation) pomoću metode hvatanja hvatanjem antitela kao liganda na imobilisanom antitelu na humani IgG (Fab) i testiranjem antigena kao analita. Oko 2000 RU antitela na humani IgG (Fab) (komplet za hvatanje humanog Fab, GE Healthcare Japan Corporation) je kovalentno vezano za senzorski čip CM5 (BIAcore, Inc.) pomoću metode aminskog kuplovanja. Slično, ovo antitelo je imobilisano na referentnoj protočnoj ćeliji. Radni pufer koji je korišćen je bio HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfaktant P20). Antitelo je dodato tokom 1 minuta na imobilisani čip sa antitelom na humani IgG (Fab), i zatim, serijska razblaženja (1 do 1000 nM) antigena su svako dodato tome pri stopi protoka od 30 µL/min tokom 300 sekundi. Nakon toga, faza disocijacije je praćena tokom 600 sekundi. 25 mM NaOH razblažen sa radnim puferom je dodat dva puta tome kao rastvor za regeneraciju pri stopi protoka od 100 µl/min tokom 3 sekunde. Podaci su analizirani na isti način kao iznad.
[Tabela 2]
Merenje aktivnosti vezivanja korišćenjem prečišćenog antitela kao uzorka antitela
[Primer 9: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (1)]
[0352]
Proces 1: terc-Butil (4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)karbamat
[0353] 4-(terc-Butoksikarbonilamino)butanska kiselina (0.237 g, 1.13 mmol) je rastvorena u dihlormetanu (10 mL), N-hidroksisukcinimid (0.130 g, 1.13 mmol) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid (0.216 g, 1.13 mmol) su dodati, i mešano je tokom 1 sata. Reakcioni rastvor je dodat u kapima u rastvor N,N-dimetilformamida (10 mL) dopunjen sa eksatekan mezilatom (0.500 g, 0.94 mmol) i trietilaminom (0.157 mL, 1.13 mmol), i mešan je na sobnoj temperaturi tokom 1 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostatak je prečišćen silika gel kolonskom hromatografijom [hloroform -hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (0.595 g, kvantitativan).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31 (9H, s), 1.58 (1H, t, J=7.2 Hz), 1.66 (2H, t, J=7.2 Hz), 1.89-1.82 (2H, m), 2.12-2.21 (3H, m), 2.39 (3H, s), 2.92 (2H, t, J=6.5 Hz), 3.17 (2H, s), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.59-5.55 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.30 (1H, s), 7.79 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.40
(1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 621 (M+H)<+>.
Proces 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]butanamid trifluoroacetat
[0354] Jedinjenje (0.388 g, 0.61 mmol) dobijeno u Procesu 1 iznad je rastvoreno u dihlorometanu (9 mL). Trifluorosirćetna kiselina (9 mL) je dodata i mešano je tokom 4 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i ostaci koji su dobijeni su prečišćeni silika gel kolonskom hromatografijom [hloroform - podeljen organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (0.343 g, kvantitativan).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.79-1.92 (4H, m), 2.10-2.17 (2H, m), 2.27 (2H, t, J=7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.80-2.86 (2H, m), 3.15-3.20 (2H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.54-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.72 (3H, brs), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 521 (M+H)<+>.
Proces 3: N-(terc-Butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid [0355] N-(terc-Butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicin (0.081 g, 0.19 mmol) je rastvoren u dihlormetanu (3 mL), N-hidroksisukcinimid (0.021 g, 0.19 mol) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid (0.036 g, 0.19 mmol) su dodati i zatim mešani tokom 3.5 sati. Reakcioni rastvor je dodat u kapima u rastvor N,N-dimetilformamida (1.5 mL) dopunjen sa jedinjenjem (0.080 g, 0.15 mmol) dobijenim u Procesu 2 iznad, i mešan na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i ostaci koji su dobijeni su prečišćeni silika gel kolonskom hromatografijom [hloroform - hloroform : metanol = 8 : 2 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (0.106 g, 73%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.36 (9H, s), 1.71 (2H, m), 1.86 (2H, t, J=7.8 Hz), 2.15-2.19 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.77 (1H, dd, J=12.7, 8.8 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 4.7 Hz), 3.08-3.11 (2H, m), 3.16-3.19 (2H, m), 3.54 (2H, d, J=5.9 Hz), 3.57-3.77 (4H, m), 4.46-4.48 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.00 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.17-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t, J=5.7 Hz), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.92 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.15 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.2 Hz).
MS (APCI) m/z: 939 (M+H)<+>.
Proces 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid trifluoroacetat
[0356] Jedinjenje (1.97 g, 2.10 mmol) dobijeno u Procesu 3 iznad je rastvoreno u dihlormetanu (7 mL). Nakon dodavanja trifluorosirćetne kiseline (7 mL), mešano je tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom, i dopunjen je sa toluenom za azeotropnu destilaciju. Ostaci koji su dobijeni su prečišćeni silika gel kolonskom hromatografijom [hloroform - podeljen organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova (1.97 g, 99%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.71-1.73 (2H, m), 1.82-1.90 (2H, m), 2.12-2.20 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.4 Hz), 3.03-3.09 (3H, m), 3.18-3.19 (2H, m), 3.58-3.60 (2H, m), 3.64 (1H, d, J=5.9 Hz), 3.69 (1H, d, J=5.9 Hz), 3.72 (1H, d, J=5.5 Hz), 3.87 (1H, dd, J=16.8, 5.9 Hz), 4.50-4.56 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 7.17-7.27 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.78-7.81 (2H, m), 7.95-7.97 (3H, m), 8.33-8.35 (2H, m), 8.48-8.51 (2H, m).
MS (APCI) m/z: 839 (M+H)<+>.
Proces 5: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanoil]amino}etoksi)etoksi]propanoil}glicilglicil -L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-4-oksobutil)glicinamid [0357] U N,N-dimetilformamidski (1.20 mL) rastvor jedinjenja (100 mg, 0.119 mmol) dobijenog u Procesu 4 iznad, diizopropiletilamin (20.8 µL, 0.119 mmol) i N-sukcinimidil 3-(2-(2-(3-maleinimidpropanamid)etoksi)etoksi)propanoat (50.7 mg, 0.119 mmol) su dodati i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i ostaci koji su dobijeni su prečišćeni silika gel kolonskom hromatografijom [hloroform - hloroform : metanol = 5 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (66.5 mg, 48%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J = 7.4 Hz), 1.65-1.74 (2H, m), 1.77-1.90 (2H, m), 2.07-2.19 (4H, m), 2.30 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.33-2.36 (2H, m), 2.38 (3H, s), 2.76 (1H, dd, J = 13.7, 9.8 Hz), 2.96-3.18 (9H, m), 3.42-3.44 (4H, m), 3.53-3.76 (10H, m), 4.43 (1H, td, J = 8.6, 4.7 Hz), 5.14 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J = 18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.42 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.98 (2H, s), 7.12-7.17 (1H, m), 7.18-7.25 (4H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J = 5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J = 11.3 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.11 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.16 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.44 (1H, d, J = 9.0 Hz).
MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)<+>.
Proces 6: Konjugat antitelo-lek (1)
[0358] Redukcija antitela: hTINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno da bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (10.0 mL) je sakupljen u epruvetu od 50 mL i dopunjen je sa vodenim rastvorom od 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.317 mL; 4.6 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.500 mL). Nakon potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu u antitelu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0359] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon inkubiranja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na sobnoj temperaturi, dimetil sulfoksid (0.567 mL) je dodat tome. Nakom toga, rastvor dimetil sulfoksida koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u gorepomenutom Procesu 5 (0.635 mL; 9.2 ekvivalenata po molekulu antitela) je dodat tome i mešano je korišćenjem rotatora za epruvete (MTR-103, proizveden od strane AS ONE Corporation) za konjugovanje veznika leka za antitelo na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Zatim, vodeni rastvor (0.127 mL; 18.4 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešano je da bi se prekinula reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom još 20 minuta.
[0360] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 35.0 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opšte procedure E opisane u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 4964 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 18982 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0361] Koncentracija antitela: 2.70 mg/mL, prinos antitela: 94.5 mg (95%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 6.6.
[Primer 10: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (2)]
[0362]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (2)
[0363] Redukcija antitela: hTINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (2.00 mL) je sakupljen u epruvetu od 4 mL i dopunjen sa vodenim rastvorom od 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0690 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata
(Nacalai Tesque, Inc.; 0.100 mL). Nakon potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0364] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon inkubiranja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na 15°C, rastvor dimetil sulfoksida (0.127 mL; 9.2 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu 5 iz Primera 9 je dodato tome i inkubirano je zbog konjugacije veznika leka za antitelo u vodenom kupatilu na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.0190 mL; 13.8 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešano je korišćenjem rotatora za epruvete da bi se prekinula reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.
[0365] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 9.00 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opšte procedure E opisane u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 4964 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 18982 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0366] Koncentracija antitela: 2.08 mg/mL, prinos antitela: 18.7 mg (94%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 6.1.
[Primer 11: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (3)]
[0367]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (3)
[0368] Redukcija antitela: hTINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (5.0 mL) je sakupljen u posudu od 15 mL, dopunjen sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0813 mL) uz mešanje, i zatim mešan na 37°C tokom 10 minuta. Nakon dodavanja u to vodenog rastvora od 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0745 mL; 2.3 ekvivalenata po molekulu antitela) uz mešanje i zatim potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana mešanjem na 37°C tokom 1 sata.
[0369] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon mešanja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na 15°C, rastvor dimetil sulfoksida (0.162 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu 5 iz Primera 9 je postepeno dodavan u kapima u to i mešan zbog konjugacije veznika leka za antitelo u vodenom kupatilu na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.0418 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) od100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešan kako bi se prekinula reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.
[0370] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 21.0 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opštih procedura E i F opisanih u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 4964 (izmerena prosečna vrednost), i ED,370= 18982 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0371] Koncentracija antitela: 2.19 mg/mL, prinos antitela: 46.0 mg (92%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 3.6, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren pomoću Opšte procedure F: 3.6.
[Primer 12: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (4)]
[0372]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (4)
[0373] Redukcija antitela: hTINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10.0 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (5.00 mL) je sakupljen u posudu od 15 mL, dopunjen sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0813 mL) uz mešanje, i zatim mešan na 37°C tokom 10 minuta. Nakon dodavanja tome vodenog rastvora 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.162 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) uz mešanje i zatim potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana mešanjem na 37°C tokom 1 sata.
[0374] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon mešanja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na 15°C, rastvor dimetil sulfoksida (0.389 mL; 12.0 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu iz Primera 9 je postepeno dodat u kapima u to i mešan zbog konjugacije veznika leka za antitelo u vodenom kupatilu na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.0418 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešan kako bi se zaustavila reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.
[0375] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 21.0 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opštih procedura E i F opisanih u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 4964 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 18982 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0376] Koncentracija antitela: 2.19 mg/mL, prinos antitela: 46.0 mg (92%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 7.0, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren pomoću Opšte procedure F: 7.0.
[Referentni Primer 13: Proizvodnja hRS7 ADC (5)]
[0377]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (5)
[0378] Redukcija antitela: hRS7 proizveden u Referentnom Primeru 1 je pripremljen kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.56 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (2.0 mL) je sakupljen u epruvetu od 4 mL dopunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0690 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.100 mL). Nakon potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0379] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon inkubiranja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na 15°C, rastvor dimetil sulfoksida (0.127 mL; 9.2 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu iz Primera 9 je dodat tome i inkubiran zbog konjugacije veznika leka za antitelo u vodenom kupatilu na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.0190 mL; 13.8 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešan korišćenjem rotatora za epruvete da bi se prekinula reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.
[0380] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 9.00 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opšte procedure E opisane u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 4964 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 18982 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0381] Koncentracija antitela: 2.04 mg/mL, prinos antitela: 18.4 mg (92%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 6.2.
[Primer 14: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (6)]
[0382]
Proces 1: ({N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metil acetat
[0383] U smešu koja sadrži N-9-fluorenilmetoksikarbonilglicilglicin (4.33 g, 12.2 mmol), tetrahidrofuran (120 ml), i toluen (40.0 ml), piridin (1.16 ml, 14.7 mmol) i olovo tetraacetat (6.84 g, 14.7 mmol) su dodati i zagrejani pod refluksom tokom 5 sati. Nakon što je reakcioni rastvor ohlađen do sobne temperature, nerastvorljive materije su uklonjene filtracijom kroz Celit, i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Ostaci koji su odbijeni su rastvoreni u etil acetatu i oprani sa vodom i zasićenim slanim rastvorom, i zatim organski sloj je osušen preko anhidrovanog magnezijum sulfata. Nakon što je rastvarač uklonjen pod smanjenim pritiskom, dobijeni ostaci su prečišćeni silika gel kolonskom hromatografijom [heksan : etil acetat = 9 : 1 (v/v) - etil acetat] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (3.00 g, 67%).
<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.07 (3H, s), 3.90 (2H, d, J=5.1 Hz), 4.23 (1H, t, J=7.0 Hz), 4.46 (2H, d, J=6.6 Hz), 5.26 (2H, d, J=7.0 Hz), 5.32 (1H, brs), 6.96 (1H, brs), 7.32 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.41 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J=7.3 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.3 Hz).
Proces 2: Benzil [({N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metoksi]acetat [0384] U tetrahidrofuranski (40.0 mL) rastvor jedinjenja (3.68 g, 10.0 mmol) dobijenog u Procesu 1 iznad i benzil glikolata (4.99 g, 30.0 mmol), kalijum terc-buoksid (2.24 g, 20.0 mmol) je dodat na 0°C i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Reakcioni rastvor je dopunjen sa etil acetatom i vodom na 0°C i ekstrahovan sa etil acetatom i hloroformom. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom. Ostaci koji su dobijeni su rastvoreni u dioksanu (40.0 mL) i vodi (10.0 mL), dopunjeni sa natrijum hidrogen karbonatom (1.01 g, 12.0 mmol) i 9-fluorenilmetil hloroformatom (2.59 g, 10.0 mmol), i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakcioni rastvor je dopunjen sa vodom i ekstrahovan sa etil acetatom. Dobijeni organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i filtriran. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i ostaci koji su dobijeni su prečišćeni silika gel kolonskom hromatografijom [heksan : etil acetat = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] da se dobije jedinjenje iz naslova u vidu bezbojne uljane supstance (1.88 g, 40%).
<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.84 (2H, d, J=5.5 Hz), 4.24 (3H, t, J=6.5 Hz), 4.49 (2H, d, J=6.7 Hz), 4.88 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.15-5.27 (1H, m), 5.19 (2H, s), 6.74 (1H, brs), 7.31-7.39 (7H, m), 7.43 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.61 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.79 (2H, d, J=7.4 Hz).
Proces 3: [({N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicil}amino)metoksi]sirćetna kiselina [0385] Jedinjenje (1.88 g, 3.96 mmol) dobijeno u Procesu 2 iznad je rastvoreno u etanolu (40.0 mL) i etil acetatu (20.0 ml). Nakon dodavanja katalizatora paladijuma na ugljeniku (376 mg), mešano je u atmosferi vodonika na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Nerastvorljive materije su uklonjene filtracijom kroz Celit, i rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom da se dobije jedinjenje iz naslova kao bezbojna čvrsta supstanca (1.52 g, kvantitativan).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3.62 (2H, d, J=6.3 Hz), 3.97 (2H, s), 4.18-4.32 (3H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 7.29-7.46 (4H, m), 7.58 (1H, t, J=5.9 Hz), 7.72 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.90 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.71 (1H, t, J=6.5 Hz).
Proces 4: 9H-Fluoren-9-ilmetil(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]amino}-2-oksoetil)karbamat
[0386] Tokom hlađenja pod ledom, u N,N-dimetilformamidski (10.0 mL) rastvor eksatekan mezilata (0.283 g, 0.533 mmol), N-hidroksisukcinimida (61.4 mg, 0.533 mmol), i jedinjenja
(0.205 g, 0.533 mmol) dobijenog u Procesu 3 iznad, N,N-diizopropiletilamin (92.9 µL, 0.533 mmol) i N,N'-dicikloheksilkarbodiimid (0.143 g, 0.693 mmol) su dodati i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni silika gel kolonskom hromatografijom [hloroform - podeljen organski sloj hloroform : metanol : voda = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo braon čvrsta supstanca (0.352 g, 82%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.81 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.73-1.87 (2H, m), 2.06-2.20 (2H, m), 2.34 (3H, s), 3.01-3.23 (2H, m), 3.58 (2H, d, J=6.7 Hz), 3.98 (2H, s), 4.13-4.25 (3H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.09-5.22 (2H, m), 5.32-5.42 (2H, m), 5.50-5.59 (1H, m), 6.49 (1H, s), 7.24-7.30 (3H, m), 7.36 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.53 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.66 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.75 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.84 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz), 8.77 (1H, t, J=6.7 Hz).
MS (ESI) m/z: 802 (M+H)<+>.
Proces 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0387] U N,N-dimetilformamidski (11.0 mL) rastvor jedinjenja (0.881 g, 1.10 mmol) dobijenog u Procesu 4 iznad, piperidin (1.1 mL) je dodat i mešano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom da se dobije smeša koja sadrži jedinjenje iz naslova. Smeša je korišćena za sledeću reakciju bez daljeg prečišćavanja.
Proces 6: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid [0388] Tokom hlađenja pod ledom, u N,N-dimetilformamidski (50.0 mL) rastvor smeše
(0.439 mmol) dobijene u Procesu 5 iznad, N-hidroksisukcinimid (0.101 g, 0.878 mmol), i N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]glicilglicil-L-fenilalanin (Objavljen (laid-open) Japanski patent br. 2002-60351; 0.440 g, 0.878 mmol), N,N'-dicikloheksilkarbodiimid (0.181 g, 0.878 mmol) je dodat i mešan na sobnoj temperaturi tokom 4 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni silika gel kolonskom hromatografijom [hloroform - hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo narandžasta čvrsta supstanca (0.269 g, 58%).
MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)<+>.
Proces 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0389] U N,N-dimetilformamidski (4.00 mL) rastvor jedinjenja (0.269 g, 0.253 mmol) dobijenog u Procesu 6 iznad, piperidin (0.251 mL, 2.53 mmol) je dodat i mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom da se dobije smeša koja sadrži jedinjenje iz naslova. Smeša je korišćena za sledeću reakciju bez daljeg prečišćavanja.
Proces 8: N-[6-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)metil]glicinamid
[0390] U N,N-dimetilformamidski (10.0 mL) rastvor jedinjenja (0.253 mmol) dobijenog u Procesu 7 iznad, N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoat (0.156 g, 0.506 mmol) je dodat i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Rastvarač je uklonjen pod smanjenim pritiskom i dobijeni ostaci su prečišćeni silika gel kolonskom hromatografijom [hloroform -hloroform : metanol = 9 : 1 (v/v)] da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.100 g, 38%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.83 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.09-1.21 (2H, m), 1.33-1.47 (4H, m), 1.75-1.90 (2H, m), 2.00-2.23 (4H, m), 2.36 (3H, s), 2.69-2.81 (1H, m), 2.94-3.03 (1H, m), 3.06-3.22 (2H, m), 3.23-3.74 (8H, m), 3.98 (2H, s), 4.39-4.50 (1H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.17 (2H, s), 5.39 (2H, s), 5.53-5.61 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.96 (2H, s), 7.11-7.24 (5H, m), 7.28 (1H, s), 7.75 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.97 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.09 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J=6.5 Hz), 8.48 (1H, d, J=9.0 Hz), 8.60 (1H, t, J=6.5 Hz). MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)<+>.
Proces 9: Konjugat antitelo-lek (6)
[0391] Redukcija antitela: hTINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (10.0 mL) je sakupljen u epruvetu od 50 mL i dopunjen sa vodenim rastvorom od 10 mM TCEP(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.317 mL; 4.6 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.500 mL). Nakon potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0392] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon inkubiranja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na uobičajenoj temperaturi, dimetil sulfoksid (0.567 mL) je dodat u to. Nakon toga, rastvor dimetil sulfoksida koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u gorepomenutom Procesu 8 (0.635 mL; 9.2 ekvivalenata po molekulu antitela) je dodat tome i mešano je korišćenjem rotatora za epruvete zbog konjugacije veznika leka za antitelo na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Zatim, vodeni rastvor (0.127 mL; 18.4 ekvivalenata po molekulu antitela) 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešano je kako bi se zaustavila reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom još 20 minuta.
[0393] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 35.0 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opšte procedure E opisane u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 5178 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 20217 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0394] Koncentracija antitela: 2.70 mg/mL, prinos antitela: 94.5 mg (95%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 6.4.
[Primer 15: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (7)]
[0395]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (7)
[0396] Redukcija antitela: TINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (2.0 mL) je sakupljen u epruveti od 4 mL i dopunjen sa vodenim rastvorom od 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0690 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0299 mL). Nakon potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0397] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon inkubiranja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na 15°C, rastvor dimetil sulfoksida (0.127 mL; 9.2 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu 8 iz Primera 14 je dodat tome i inkubiran zbog konjugacije veznika leka za antitelo u vodenom kupatilu na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.0190 mL; 13.8 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešan korišćenjem rotatora za epruvete da bi se prekinula reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.
[0398] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 9.00 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opšte procedure E opisane u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 5178 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 20217 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0399] Koncentracija antitela: 2.04 mg/mL, prinos antitela: 18.4 mg (92%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 5.7.
[Primer 16: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (8)]
[0400]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (8)
[0401] Redukcija antitela: hTINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (30.0 mL) je sakupljen u posudu od 100 mL, dopunjen sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.4875 mL) uz mešanje, i zatim je mešano na 37°C tokom 10 minuta. Nakon dodavanja u to vodenog rastvora od 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.9721 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) uz mešanje i zatim potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana mešanjem na 37°C tokom 1 sata.
[0402] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon mešanja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na 15°C, rastvor dimetil sulfoksida (2.33 mL; 12.0 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu 8 iz Primera 14 je postepeno dodat u kapima tome i mešano je zbog konjugacije veznika leka za antitelo u vodenom kupatilu na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.251 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešan kako bi se zaustavila reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.
[0403] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 98.0 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Zatim, rastvor je koncentrovan u skladu sa Opštom procedurom A opisanom u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 17.5 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova.
[0404] Fizičkohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opštih procedura E i F opisanih u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 5178 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 20217
(izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene. Koncentracija antitela: 14.6 mg/mL, prinos antitela: 256 mg (85%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 6.7, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren je pomoću Opšte procedure F: 7.0.
[Primer 17: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (9)]
[0405]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (9)
[0406] Redukcija antitela: hTINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšta procedura C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (5.0 mL) je sakupljen u posudu od 15 mL, dopunjen sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0813 mL) uz mešanje, i zatim mešan na 37°C tokom 10 minuta. Nakon dodavanja tome vodenog rastvora od 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0778 mL; 2.4 ekvivalenata po molekulu antitela) uz mešanje i zatim potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana mešanjem na 37°C tokom 1 sata.
[0407] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon mešanja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na 15°C, rastvor dimetil sulfoksida (0.162 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu 8 iz Primera 14 je postepeno dodat u kapima u to i mešano je zbog konjugacije veznika leka za antitelo u vodenom kupatilu na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.0418 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešano je kako bi se zaustavila reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.
[0408] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 21.0 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opštih procedura E i F opisanih u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 5178 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 20217 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0409] Koncentracija antitela: 2.26 mg/mL, prinos antitela: 47.5 mg (95%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 3.5, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren je pomoću Opšte procedure F: 3.6.
[Referentni Primer 18: Proizvodnja hRS7 ADC (10)]
[0410]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (10)
[0411] Redukcija antitela: hRS7 proizvedeno u Referentnom Primeru 1 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.56 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (2.0 mL) je sakupljen u epruveti od 4 mL i dopunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0690 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0299 mL). Nakon potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0412] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon inkubiranja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na 15°C, rastvor dimetil sulfoksida (0.1269 mL; 9.2 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu 8 iz Primera 14 je dodat tome i inkubiran zbog konjugacije veznika leka za antitelo u vodenom kupatilu na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.0190 mL; 13.8 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešan korišćenjem rotatora za epruvete da bi se prekinula reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.
[0413] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 9.00 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opšte procedure E opisane u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 5178 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 20217 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0414] Koncentracija antitela: 2.07 mg/mL, prinos antitela: 18.6 mg (93%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 5.6.
[Primer 19: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (11)]
[0415]
Proces 1: terc-Butil [2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)etil]karbamat
[0416] Eksatekan mezilat (3.10 g, 5.47 mol) je reagovao na isti način kao Proces 1 iz Primera 1 korišćenjem {2-[(terc-Butoksikarbonil)amino]etoksi}sirćetne kiseline (J. Med. Chem., 1992, tom 35, s. 2928; 1.55 g, 6.01 mmol) umesto 4-(terc-Butoksikarbonilamino)butanske kiseline da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (2.56 g, 73%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.26 (9H, s), 1.81-1.91 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 3.08-3.26 (4H, m), 3.43-3.53 (2H, m), 4.00 (1H, d, J = 15.1 Hz), 4.05 (1H, d, J = 15.1 Hz), 5.14 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.22 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J = 16.6 Hz), 5.44 (1H, d, J = 16.6 Hz), 5.59-5.66 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.86 (1H, t, J = 5.4 Hz), 7.31 (1H, s), 7.79 (1H, d, J = 10.9 Hz), 8.49 (1H, d, J = 9.1 Hz).
MS (APCI) m/z: 637 (M+H)<+>.
Proces 2: 2-(2-Aminoetoksi)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]acetamid trifluoroacetat
[0417] Jedinjenje (1.50 g, 2.36 mol) dobijeno u Procesu 1 iznad je reagovalo na isti način kao Proces 2 iz Primera 1 da se dobije jedinjenje iz naslova kao bledo žuta čvrsta supstanca (1.50 g, kvantitativan).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J = 7.5 Hz), 1.81-1.92 (2H, m), 2.15-2.23 (2H, m), 2.41 (3H, s), 3.05 (2H, t, J = 5.1 Hz), 3.15-3.23 (2H, m), 3.71 (2H, t, J = 5.1 Hz), 4.10 (2H, s), 5.19 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.43 (2H, s), 5.58-5.66 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.33 (1H, s), 7.73-7.84 (4H, m), 8.55 (1H, d, J = 9.1 Hz).
MS (APCI) m/z: 537 (M+H)<+>.
Proces 3: N-(terc-Butoksikarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)etil]glicinamid [0418] Jedinjenje (554 mg, 0.85 mmol) dobijeno u Procesu 2 iznad je reagovalo na isti način kao Proces 3 iz Primera 1 da se dobije jedinjenje iz naslova (775 mg, 95%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.36 (9H, s), 1.78-1.89 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J = 13.4, 9.8 Hz), 2.95 (1H, dd, J = 13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.23-3.32 (2H, m), 3.40-3.62 (8H, m), 3.73 (1H, dd, J = 16.5, 5.5 Hz), 4.03 (2H, s), 4.39-4.47 (1H, m), 5.17 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J = 16.8 Hz), 5.45 (1H, d, J = 16.8 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.54 (1H, s), 6.99
(1H, t, J = 5.8 Hz), 7.13-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.76-7.82 (2H, m), 7.90 (1H, t, J = 5.2 Hz), 8.13 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.27 (1H, t, J = 5.8 Hz), 8.49 (1H, d, J = 8.5 Hz).
MS (APCI) m/z: 955 (M+H)<+>.
Proces 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10,13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)etil]glicinamid trifluoroacetat
[0419] Jedinjenje (630 mg, 0.659 mmol) dobijeno u Procesu 3 iznad je reagovalo na isti način kao Proces 4 iz Primera 1 da se dobije jedinjenje iz naslova (588 mg, 92%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.79-1.90 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J = 13.4, 10.1 Hz), 2.99 (1H, dd, J = 13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.24-3.32 (3H, m), 3.41-3.71 (7H, m), 3.86 (1H, dd, J = 16.8, 5.8 Hz), 4.04 (2H, s), 4.52 (1H, td, J = 9.0, 4.1 Hz), 5.17 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J = 16.5 Hz), 5.45 (1H, d, J = 16.5 Hz), 5.56-5.65 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.13-7.26 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J = 11.0 Hz), 7.87-8.01 (4H, m), 8.29-8.36 (2H, m), 8.46-8.55 (2H, m).
MS (APCI) m/z: 855 (M+H)<+>.
Proces 5: N-[6-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroksi-4-metil-10, 13-diokso-2,3,9,10,13,15-heksahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-1-il]amino}-2-oksoetoksi)etil]glicinamid
[0420] Jedinjenje (240 mg, 0.247 mmol) dobijeno u Procesu 4 iznad je reagovalo na isti način kao Proces 5 iz Primera 1 korišćenjem trietilamina (31.4 µL, 0.22 mmol) umesto diizopropiletilamina i N-sukcinimidil 6-maleimid heksanoata (95.3 mg, 0.31 mmol) umesto N-sukcinimidil 3-(2-(2-(3-maleinimidepropanamid)etoksi)etoksi)propanoata da se dobije jedinjenje iz naslova (162 mg, 62%).
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J = 7.6 Hz), 1.13-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 (4H, m), 1.78-1.90 (2H, m), 2.09 (2H, t, J = 7.6 Hz), 2.14-2.21 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.74 (1H, dd, J = 13.6, 9.7 Hz), 2.96 (1H, dd, J = 13.6, 4.5 Hz), 3.08-3.24 (1H, m), 3.24-3.30 (1H, m), 3.33-3.40 (4H, m), 3.47-3.68 (7H, m), 3.72 (1H, dd, J = 16.6, 5.7 Hz), 4.03 (2H, s), 4.42 (1H, td, J = 8.6, 4.2 Hz), 5.17 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.25 (1H, d, J = 18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.44 (1H, d, J = 17.2 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.25 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.81 (2H, m), 7.99 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.03-8.11 (2H, m), 8.22 (1H, t, J = 5.7 Hz), 8.47 (1H, d, J = 9.1 Hz).
MS (APCI) m/z: 1048 (M+H)<+>.
Proces 6: Konjugat antitelo-lek (11)
[0421] Redukcija antitela: hTINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B
(kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (3.0 mL) je sakupljen u posudu od 15 mL, dopunjen sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0488 mL) uz mešanje, i zatim mešan na 37°C tokom 10 minuta. Nakon dodavanja tome vodenog rastvora od 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0972 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) uz mešanje i zatim potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.0 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana mešanjem na 37°C tokom 1 sata.
[0422] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon mešanja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na 15°C, rastvor dimetil sulfoksida (0.2333 mL; 12.0 ekvivalenata po molekulu antitela) koji sadrži 10 mM jedinjenja dobijenog u Procesu 8 iz Primera 11 je postepeno dodat u kapima tome i mešan zbog konjugacije veznika leka za antitelo u vodenom kupatilu na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.0251 mL; 12.9 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešan kako bi se zaustavila reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta.
[0423] Prečišćavanje: Gorepomenuti rastvor je podvrgnut prečišćavanju korišćenjem Opšte procedure D opisane u Metodi za proizvodnju 1 da se dobije 14 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opštih procedura E i F opisane u Metodi za proizvodnju 1 (εD,280= 5193 (izmerena prosečna vrednost), i εD,370= 20347 (izmerena prosečna vrednost) su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0424] Koncentracija antitela: 1.93 mg/mL, prinos antitela: 27.0 mg (90%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 7.1, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure F: 7.0.
[Referentni Primer 2: Proizvodnja hRS7-CL2A-SN38 (12)]
[0425]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (12)
[0426] Redukcija antitela: hRS7 proizvedeno u Referentnom Primeru 1 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšte procedure C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (10.0 mL) je sakupljen u epruvetu od 50 mLi dopunjen sa vodenim rastvorom 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.317 mL; 4.6 ekvivalenata po molekulu antitela) i vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (Nacalai Tesque, Inc.; 0.500 mL). Nakon potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.4 ± 0.1, disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 1 sata.
[0427] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon inkubiranja gorepomenutog rastvora tokom 10 minuta u vodenom kupatilu na uobičajenoj temperaturi, dimetil sulfoksid (0.567 mL) je dodat u to. Nakon toga, rastvor dimetil sulfoksida koji sadrži 10 mM od CL2A-SN38 sintetisan u skladu sa objavom Američke patentne prijave br. 2011/0293513 (0.635 mL; 9.2 ekvivalenata po molekulu antitela) je dodat tome i mešan korišćenjem rotatora za epruvete zbog konjugacije veznika leka za antitelo na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta. Zatim, vodeni rastvor (0.127 mL; 18.4 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC
(Sigma-Aldrich Co. LLC) je dodat tome i mešano je kako bi se zaustavila reakcija veznika leka na sobnoj temperaturi tokom još 20 minuta.
[0428] Prečišćavanje: Gorepomenuti reakcioni rastvor je povrgnut repetitivno dva puta gel filtraciji i prečišćavanju opisanom u Opštoj proceduri D iz Metode za proizvodnju i nakon toga podvrgnut slično gel filtraciji prečišćavanjem sa NAP-25 kolonom korišćenjem 25 mM rastvor trehaloze koji sadrži polisorbat 80 (0.01%). Zatim, dobijeni eluat (35 mL) je osušen zamrzavanjem. Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opšte procedure E opisane u Metodi za proizvodnju 1 za eluat pre sušenja zamrzavanjem, sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0429] Koncentracija antitela: 2.78 mg/mL, prinos antitela: 97.3 mg (97%), i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela: 5.6.
[Primer 20: Proizvodnja hTINA1-H1L1 ADC (13)]
[0430]
Proces 1: Konjugat antitelo-lek (13)
[0431] Redukcija antitela: hTINA1-H1L1 proizvedeno u Primeru 7 je pripremljeno kako bi se dobila koncentracija antitela od 10 mg/mL zamenjivanjem medijuma sa PBS6.0/EDTA korišćenjem Opšte procedure B (kao apsorpcioni koeficijent na 280 nm, 1.54 je korišćen) i Opšta procedura C opisane u Metodi za proizvodnju 1. Rastvor (100 mL) je postavljen u polikarbonatni erlenmajer sud od 250 mL, dopunjen sa vodenim rastvorom 1 M dikalijum hidrogen fosfata (1.4 mL) na sobnoj temperaturi uz mešanje korišćenjem magnetne mešalice, i zatim dopunjen sa vodenim rastvorom od 10 mM TCEP(1.62 mL; 2.5 ekvivalenata po molekulu antitela). Nakon potvrđivanja da rastvor ima pH od 7.0 ± 0.1, mešanje je prekinuto, i disulfidna veza na zglobnom delu je redukovana inkubiranjem na 37°C tokom 2 sata.
[0432] Konjugacija između antitela i veznika leka: Nakon hlađenja gorepomenutog rastvora na 15°C, DMSO (3.24 mL) je postepeno dodat u kapima tome uz mešanje. Nakon toga, DMSO rastvor koji sadrži 10 mM jedinjenje dobijeno u Procesu 8 iz Primera 14 (1.76 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) je postepeno dodato u kapima u to. Ovaj rastvor je mešan zbog konjugacije veznika leka za antitelo na 15°C tokom 1 sata. Zatim, vodeni rastvor (0.324 mL; 5.0 ekvivalenata po molekulu antitela) od 100 mM NAC je dodat tome uz mešanje i inkubirano je kako bi se prekinula reakcija neizreagovanog veznika leka na sobnoj temperaturi tokom još 20 minuta.
[0433] Prečišćavanje: 20% vodeni rastvor sirćetne kiseline (oko 0.52 mL) i ABS (100 mL) su postepeno dodati u gorepomenuti rastvor uz mešanje da bi se podesio pH rastvora na 5.5 ± 0.1. Ovaj rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (0.45 µm, PVDF membrane) za uklanjanje bele zamućenosti i dajući oko 200 mL filtrata. Ovaj filtrat je podvrgnut prečišćavanju ultrafiltracijom korišćenjem aparata za ultrafiltraciju sačinjenog od ultrafiltracione membrane
(Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Ultracell 30 KDa), crevne pumpe (Cole-Parmer International, model pumpe MasterFlex 77521-40, model glave pumpe 7518-00), i creva
(Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifično, dok je ABS dodavan u kapima (ukupno 1600 mL) kao puferski rastvor za prečišćavanje u reakcioni rastvor, prečišćavanje ultrafiltracijom je izvedeno za uklanjanje veznika nekonjugovanog leka i drugih reagenasa male molekulske mase, takođe zamenjujući puferski rastvor sa ABS, i dalj koncentrujući rastvor. Dobijeni prečišćen rastvor je podvrgnut mikrofiltraciji (0.22 µm, PVDF membrane) da se dobije 88 mL rastvora koji sadrži konjugat antitelo-lek iz naslova.
[0434] Fizikohemijska karakterizacija: Korišćenjem Opšte procedure E i Opšte procedure F (εD,280= 5178, i εD,370= 20217 su korišćeni), sledeće karakteristične vrednosti su dobijene.
[0435] Koncentracija antitela: 9.96 mg/mL, prinos antitela: 876 mg (88%), prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmereni su pomoću Opšte procedure E: 3.8, i prosečan broj konjugovanih molekula leka (n) po molekulu antitela izmeren pomoću Opšte procedure F: 3.8.
[Primer 21: Procena antitumorskog efekta od ADC] 21-a) Antitumorski efekat od ADC - (1)
[0436] Miš: 5- do 6-nedelja-stare ženke BALB/c-nu/nu miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.) su aklimatizovane tokom 4 do 7 dana u SFR uslovima pre primene u eksperimentu. Miševi su hranjeni sterilisanom čvrstom hranom (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) i davana im je sterilisana voda iz česme (pripremljena dodavanjem 5 do 15 ppm rastvora natrijum hipohlorita).
[0437] Test i formula za izračunavanje: U svim studijama, glavna osa i sporedna osa tumora su izmerene dva puta nedeljno korišćenjem elektronskog digitalnog kalipera (CD-15C, Mitutoyo Corp.), i zapremina tumora (mm<3>) je izračunata. Izraz za izračunavanje je prikazan ispod.
[0438] Svi konjugati antitelo-lek su razblaženi sa fiziološkim slanim rastvorom (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) i korišćeni u zapremini od 10 mL/kg za intravensku administraciju u rep svakog miša. Humana ćelijska linija kolorektalnog kancera COLO205 je kupljena od ATCC i suspendovana u fiziološkom slanom rastvoru. 2 × 10<6>ćelija iz suspenzije je subkutano transplantirano u desni deo abdomena svake ženke BALB/c-nu/nu miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 7. Konjugat antitelo-lek (1), (6), ili
(12) je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u rep svakog miša na Dane 7, 14, i 21. Ne-konjugovano hTINA1-H1L1 antitelo i hRS7 antitelo je svako administrirano kao negativna kontrola u dozi od 25 mg/kg preko istog puta kao iznad. Administracija konjugata antitelo-lek (1) ili (6) značajno je smanjila zapreminu tumora u poređenju sa administracijom konjugata antitelo-lek (12), i oba konjugata antitelo-lek su ispoljila inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 13). Na nacrtu, apscisa prikazuje broj dana, a ordinata prikazuje zapreminu tumora.
21-b) Antitumorski efekat od ADC - (2)
[0439] Humana ćelijska linija adenokarcinoma pankreasa Bx-PC3 kupljena od ATCC transplantirana je svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša i dalje pasažirana kao graft solidnog tumora. Ovaj tumorski graft je subkutano transplantiran u desni deo abdomena svake ženke BALB/c-nu/nu miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 16. Konjugat antitelolek (1), (6), ili (12) je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u rep svakog miša na Dane 16, 23, i 30. Ne-konjugovano hTINA1-H1L1 antitelo i hRS7 antitelo su svako administrirano kao negativna kontrola u dozi od 25 mg/kg preko istog puta kao iznad.
Administracija konjugata antitelo-lek (1) ili (6) značajno je smanjila zapreminu tumora u poređenju sa administracijom konjugata antitelo-lek (12), i oba konjugata antitelo-lek su ispoljila inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 14).
21-c) Antitumorski efekat od ADC - (3)
[0440] Humana ćelijska linija adenokarcinoma pankreasa Capan-1 kupljena od ATCC transplantirana je svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša i dalje pasažirana kao graft solidnog tumora. Ovaj tumorski graft je subkutano transplantiran u desni deo abdomena svake ženke BALB/c-nu/nu miš (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 18. Konjugat antitelolek (1), (6), ili (12) je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u rep svakog miša na Dane 18, 25, i 32. Ne-konjugovano hTINA1-H1L1 antitelo i hRS7 antitelo su svako administrirano kao negativna kontrola u dozi od 25 mg/kg preko istog puta kao iznad. Administracija konjugata antitelo-lek (1) ili (6) značajno je smanjila zapreminu tumora u poređenju sa administracijom konjugata antitelo-lek (12), i oba konjugata antitelo-lek su ispoljila inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 15).
21-d) Antitumorski efekat od ADC - (4)
[0441] COLO205 je subkutano transplantiran svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša na isti način kao u Primeru 21-a) (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 11. Konjugat antitelolek (2) ili (5) u dozi od 10 mg/kg i konjugat antitelo-lek (7) ili (10) u dozi od 3 mg/kg su intravenski administrirani, redom, u rep svakog miša na Dane 11, 18, i 25. Svi konjugati antitelo-lek (2), (5), (7), i (10) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 16).
21-e) Antitumorski efekat od ADC - (5)
[0442] Bx-PC3 je subkutano transplantiran svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša na isti način kao u Primeru 21-b) (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 25. Konjugat antitelolek (2), (5), (7), ili (10) je intravenski administriran u dozi od 3 mg/kg u rep svakog miša na Dane 25 i 32. Svi konjugati antitelo-lek (2), (5), (7), i (10) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 17).
21-f) Antitumorski efekat od ADC - (6)
[0443] COLO205 je subkutano transplantiran svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša na isti način kao u Primeru 21-a) (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 9. Konjugat antitelolek (3), (4), (8), ili (9) je intravenski administriran u dozi od 10 mg/kg u rep svakog miša na Dane 9 i 16. Svi konjugati antitelo-lek (3), (4), (8), i (9) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 18).
21-g) Antitumorski efekat od ADC - (7)
[0444] Bx-PC3 je subkutano transplantiran svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša na isti način kao u Primeru 21-b) (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 21. Konjugat antitelolek (3), (4), (8), ili (9) je intravenski administriran u dozi od 3 mg/kg u rep svakog miša na Dane 21 i 28. Svi konjugati antitelo-lek (3), (4), (8), i (9) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 19).
21-h) Antitumorski efekat od ADC - (8)
[0445] 8 × 10<6>ćelija humane ćelijske linije kancera jajnika NIH:OVCAR-3 kupljene od ATCC je suspendovano u Matrigelu (Becton, Dickinson i Company) i subkutano transplantirane svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 25. Konjugat antitelo-lek (3), (4), (8), ili (9) je intravenski administriran u dozi od 3 mg/kg u rep svakog miša na Dan 25. Svi konjugati antitelo-lek (3), (4), (8), i (9) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 20).
21-i) Antitumorski efekat od ADC - (9)
[0446] 1 × 10<7>ćelija humane ćelijske linije kancera želuca NCI-N87 kupljene od ATCC je suspendovano u fiziološkom slanom rastvoru i subkutano transplantirano svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 6. Konjugat antitelolek (3), (4), (8), ili (9) je intravenski administriran u dozi od 3 mg/kg u rep svakog miša na Dan 6. Svi konjugati antitelo-lek (3), (4), (8), i (9) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 21).
21-j) Antitumorski efekat od ADC - (10)
[0447] 5 × 10<6>ćelija humane ćelijske linije kancera pluća NCI-H292 kupljene od ATCC je suspendovano u fiziološkom slanom rastvoru i subkutano transplantirano svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 9. Konjugat antitelolek (3), (4), (8), ili (9) je intravenski administriran u dozi od 3 mg/kg u rep svakog miša na Dan 9. Svi konjugati antitelo-lek (3), (4), (8), i (9) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 22).
21-k) Antitumorski efekat od ADC - (11)
[0448] 3 × 10<6>ćelija humane ćelijske linije kancera grla FaDu kupljene od ATCC je suspendovano u fiziološkom slanom rastvoru i subkutano transplantirano svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 11. Konjugat antitelolek (3), (4), (8), ili (9) je intravenski administriran u dozi od 3 mg/kg u rep svakog miša na Dan 11. Svi konjugati antitelo-lek (3), (4), (8), i (9) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 23).
21-l) Antitumorski efekat od ADC - (12)
[0449] 4 × 10<6>ćelija humane ćelijske linije adenokarcinoma pankreasa CFPAC-1 kupljene od ATCC je suspendovano u fiziološkom slanom rastvoru i subkutano transplantirano svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 14. Konjugat antitelo-lek (3), (4), (8), ili (9) je intravenski administriran u dozi od 3 mg/kg u rep svakog mišaat Dan 14. Svi konjugati antitelo-lek (3), (4), (8), i (9) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 24).
21-m) Antitumorski efekat od ADC - (13)
[0450] CFPAC-1 je subkutano transplantirana svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša na isti način kao u Primeru 21-1 (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 14. Konjugat antitelolek (8) ili (13) je intravenski administriran u dozi od 1 mg/kg u rep svakog miša na Dan 14. Svi konjugati antitelo-lek (8) ili (13) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 25).
21-n) Antitumorski efekat od ADC - (14)
[0451] 3 × 10<6>ćelija humane ćelijske linije adenokarcinoma pankreasa HPAC kupljene od ATCC je suspendovano u fiziološkom slanom rastvoru i subkutano transplantirano svakoj ženki BALB/c-nu/nu miša (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 12. Konjugat antitelo-lek (8) ili (13) je intravenski administriran u dozi od 3 mg/kg u rep svakog miša na Dan 12. Svi konjugati antitelo-lek (8) ili (13) koji su administrirani su ispoljili inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 26).
21-o) Antitumorski efekat od ADC - (15)
[0452] Humana tkiva kancera jednjaka dobijena od Japanske fondacije nauka o zdravlju -Japan Health Sciences Foundation su subkutano transplantirana u svakog NOG miša (Centralni instituta za eksperimentalne životinje) i ostavljena da rastu. Dobijeni tumorski graft je dalje subkutano transplantiran u svaku ženku NOD-scid miša (Charles River Laboratories Japan, Inc.) (Dan 0), i miševi su nasumično grupisani na Dan 27. Konjugat antitelo-lek (8) ili (13) je intravenski administriran u dozi od 3 mg/kg u rep svakog miša na Dan 27. Oba konjugata antitelo-lek (8) i (13) koji su administrirani ispoljili su inhibitorni efekat na rast tumora (Slika 27).
[Primer 22: Procena inhibitornog efekta ćelijskog rasta od ADC]
[0453] BxPC3, NCI-H292, NIH:OVCAR-3, CFPAC-1, FaDu, humana ćelijska linija adenokarcinoma pluća Calu-3 (ATCC), i humana ćelijska linija kancera jajnika CaOV3 (ATCC) kao TROP2 antigen-pozitivne ćelijske linije, i humana ćelijska linija kancera pluća Calu-6 (ATCC) i humana ćelijska linija kutanog melanoma A375 (ATCC) kao TROP2 antigen-negativne ćelijske linije su korišćene u proceni inhibitornog efekta ćelijskog rasta svakog ADC. BxPC3 i NCI-H292 su pripremljene sa RPMI1640 medijumom (Gibco) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (Moregate Biotech), NIH:OVCAR-3 je pripremljena sa RPMI1640 medijumom koji sadrži 20% fetalni goveđi serum i 0.01 mg/mL insulina (Invitrogen Corp.), CFPAC-1 je pripremljen sa Iscove-ovim Modifikovanim Dulbekovim medijumom (Gibco) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum, FaDu, Calu-3, i Calu-6 su pripremljene sa Iglovim Minimalnim Esencijalnim medijumom (ATCC) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum, i CaOV3 i A375 su pripremljene sa Dulbekovim Modifikovanim Igl medijumom (Gibco) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum, da bi svaki imao 2.2 × 10<6>ćelija/mL. Svaka ćelijska suspenzija je zasađena u 90 µL/bunariću u mikroploču sa 96 bunarića za ćelijsku kulturu. Konjugat antitelo-lek (4) ili (8) razblažen sa RPMI1640 medijumom do 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM, 0.032 nM, ili 0.0064 nM, ili RPMI1640 medijumom za poređenje je dodat tome u 10 µL/bunariću, i ćelije su kultivisane pod 5% CO2na 37°C tokom 6 dana. Nakon kulture, mikroploča je izvađena iz inkubatora i ostavljena da odstoji na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Rastvor za kulturu je dopunjen sa jednakom količinom CellTiter-Glo luminescentnog testa za vijabilnost ćelija (Promega) i mešan je tokom 10 minuta korišćenjem mešalice za ploče. Nakon ćelijske lize, intenzitet luminescencije je izmeren korišćenjem čitača ploča.
[0454] Stopa inhibicije ćelijskog rasta nakon kulture tokom 6 dana je izračunata u skladu sa sledećom jednačinom:
a: Prosečna vrednost iz bunarića obogaćenih uzorkom nakon kulture tokom 6 dana -Prosečna vrednost iz bunarića koji nisu obogaćeni uzorkom na početku kulture
b: Prosečna vrednost iz bunarića obogaćenih medijumom nakon kulture tokom 6 dana - Prosečna vrednost iz bunarića koji nisu obogaćeni medijumom na početku kulture [0455] GI50vrednost je izračunata u skladu sa sledećom jednačinom:
c: Koncentracija uzorka c
d: Koncentracija uzorka d
e: Stopa inhibicije ćelijskog rasta pri koncentraciji uzorka c
f: Stopa inhibicije ćelijskog rasta pri koncentraciji uzorka d
[0456] Koncentracije c i d uspostavljaju odnos c > d koji prelazi 50% stopu inhibije ćelijskog rasta.
[0457] Konjugati antitelo-lek (4) i (8) pokazuju efekat inhibicije ćelijskog rasta od GI50< 1 (nM) na TROP2 antigen-pozitivnim ćelijskim linijama BxPC3, NCI-H292, NIH:OVCAR-3, CFPAC-1, FaDu, Calu-3, i CaOV3. Sa druge strane, ovi konjugati antitelo-lek ne pokazuju efekat inhibicije ćelijskog rasta (> 100 (nM)) na TROP2 antigen-negativnim ćelijskim linijama Calu-6 i A375.
Slobodan tekst liste sekvenci
[0458]
SEK ID BR: 1: Nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira varijabilni region teškog lanca TINA1 antitela
SEK ID BR: 2: Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca TINA1 antitela
SEK ID BR: 3: Nukleotidna sekvenca cDNK koja kodira varijabilni region lakog lanca TINA1 antitela
SEK ID BR: 4: Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca TINA1 antitela
SEK ID BR: 5: Nukleotidna sekvenca koja kodira sekretorni signal humanog κ lanca i konstantni region humanog κ lanca
SEK ID BR: 6: Nukleotidna sekvenca koja kodira sekretorni signal humanog teškog lanca i konstantni region humanog IgG1
SEK ID BR: 7: Nukleotidna sekvenca teškog lanca cTINA1 antitela
SEK ID BR: 8: Aminokiselinska sekvenca teškog lanca cTINA1 antitela
SEK ID BR: 9: Nukleotidna sekvenca lakog lanca cTINA1 antitela
SEK ID BR: 10: Aminokiselinska sekvenca lakog lanca cTINA1 antitela
SEK ID BR: 11: Nukleotidna sekvenca od hTINA1-H1
SEK ID BR: 12: Aminokiselinska sekvenca od hTINA1-H1
SEK ID BR: 13: Nukleotidna sekvenca od hTINA1-H2
SEK ID BR: 14: Aminokiselinska sekvenca od hTINA1-H2
SEK ID BR: 15: Nukleotidna sekvenca od hTINA1-H3
SEK ID BR: 16: Aminokiselinska sekvenca od hTINA1-H3
SEK ID BR: 17: Nukleotidna sekvenca od hTINA1-L1
SEK ID BR: 18: Aminokiselinska sekvenca od hTINA1-L1
SEK ID BR: 19: Nukleotidna sekvenca od hTINA1-L2
SEK ID BR: 20: Aminokiselinska sekvenca od hTINA1-L2
SEK ID BR: 21: Nukleotidna sekvenca od hTINA1-L3
SEK ID BR: 22: Aminokiselinska sekvenca od hTINA1-L3
SEK ID BR: 23: Aminokiselinska sekvenca od CDRH1 TINA1 antitela SEK ID BR: 24: Aminokiselinska sekvenca od CDRH2 TINA1 antitela SEK ID BR: 25: Aminokiselinska sekvenca od CDRH3 TINA1 antitela SEK ID BR: 26: Aminokiselinska sekvenca od CDRL1 TINA1 antitela SEK ID BR: 27: Aminokiselinska sekvenca od CDRL2 TINA1 antitela SEK ID BR: 28: Aminokiselinska sekvenca od CDRL3 TINA1 antitela SEK ID BR: 29: Nukleotidna sekvenca teškog lanca hRS7 antitela SEK ID BR: 30: Aminokiselinska sekvenca teškog lanca hRS7 antitela SEK ID BR: 31: Nukleotidna sekvenca lakog lanca hRS7 antitela SEK ID BR: 32: Aminokiselinska sekvenca lakog lanca hRS7 antitela SEK ID BR: 33: Prajmer mG2aVR2
SEK ID BR: 34: Prajmer mKVR2
SEK ID BR: 35: Prajmer 3.3-F1
SEK ID BR: 36: Prajmer 3.3-R1
SEK ID BR: 37: Prajmer TINA1H-F
SEK ID BR: 38: Prajmer TINA1H-R
SEK ID BR: 39: Prajmer TINA1L-F
SEK ID BR: 40: Prajmer TINA1L-R
SEK ID BR: 41: Prajmer EG-Inf-F
SEK ID BR: 42: Prajmer EG1-Inf-R
SEK ID BR: 43: Prajmer CM-LKF
SEK ID BR: 44: Prajmer KCL-Inf-R
SEK ID BR: 45: Aminokiselinska sekvenca AspGlyGlyPhe
SEK ID BR: 46: Aminokiselinska sekvenca GluGlyGlyPhe
SEK ID BR: 47: Aminokiselinska sekvenca GlyGlyPheGly
SEK ID BR: 48: Aminokiselinska sekvenca SerGlyGlyPhe
SEK ID BR: 49: Aminokiselinska sekvenca LysGlyGlyPhe
SEK ID BR: 50: Aminokiselinska sekvenca AspGlyGlyPheGly SEK ID BR: 51: Aminokiselinska sekvenca GlyGlyPheGlyGly SEK ID BR: 52: Aminokiselinska sekvenca AspAspGlyGlyPheGly SEK ID BR: 53: Aminokiselinska sekvenca LysAspGlyGlyPheGly SEK ID BR: 54: Aminokiselinska sekvenca GlyGlyPheGlyGlyGlyPhe LISTA SEKVENCI [0459]

Claims (19)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Konjugat antitelo-lek gde je antitumorsko jedinjenje predstavljeno pomoću formule koja sledi:
    je konjugovan za anti-TROP2 antitelo pomoću tioetarske veze koja je formirana na segmentu disulfidne veze koji je prisutan u zglobnom delu anti-TROP2 antitela preko veznika koji ima strukturu predstavljenu pomoću formule koja sledi: -L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)-gde anti-TROP2 antitelo je vezano za kraj od L<1>, antitumorsko jedinjenje je vezano za karbonil grupu -(CH2)n<2>-C(=O)- segmenta sa azotovim atomom iz amino grupe na poziciji 1 kao poziciji vezivanja, gde n<1>predstavlja ceo broj od 0 do 6, n<2>predstavlja ceo broj od 0 do 5, L<1>predstavlja -(Sukcinimid-3-il-N)-(CH2)n<3>-C(=O)-, gde n<3>predstavlja ceo broj od 2 do 8, L<2>predstavlja -NH-(CH2CH2-O)n<4>-CH2CH2-C(=O)- ili jednostruku vezu, gde n<4>predstavlja ceo broj od 1 do 6, L<P>predstavlja tetrapeptidni ostatak od -GGFG-, L<a>predstavlja -O- ili jednostruku vezu, i -(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu predstavljenu pomoću formule koja sledi:
    koja je vezana za anti-TROP2 antitelo na svojoj poziciji 3 i vezana je za metilen grupu u strukturi veznika koji sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1, gde anti-TROP2 antitelo sadrži CDRH1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 23, CDRH2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 24 i CDRH3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 25 u varijabilnom regionu njegovog teškog lanca i CDRL1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 26, CDRL2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 27 i CDRL3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz SEK ID BR: 28 u varijabilnom regionu njegovog lakog lanca.
  2. 2. Konjugat antitelo-lek u skladu sa patentnim zahtevom 1, gde segment strukture lekveznik koji ima lek vezan za -L<1>-L<2>-L<P>-NH-(CH2)n<1>-L<a>-(CH2)n<2>-C(=O)- je jedna struktura lek-veznik odabrana od sledeće grupe: - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-D X), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(N H-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(= O)-(NH-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2C H2CH2-C(=O)-(NH-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C H2-C(=O)-(NH-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), i - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX); gde -(Sukcinimid-3-il-N)- ima strukturu predstavljenu pomoću formule koja sledi:
    koja je vezana za anti-TROP2 antitelo na svojoj poziciji 3 i vezana je za metilen grupu u strukturi veznika koji sadrži ovu strukturu na atomu azota na poziciji 1, - (NH-DX) predstavlja grupu predstavljenu pomoću formule koja sledi:
    gde azotov atom iz amino grupe na poziciji 1 je pozicija vezivanja, i - GGFG- predstavlja tetrapeptidni ostatak od -Gly-Gly-Phe-Gly-.
  3. 3. Konjugat antitelo-lek u skladu sa patentnim zahtevom 2, gde segment strukture lekveznik je jedna struktura lek-veznik odabrana od sledeće grupe: - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C H2-C(=O)-(NH-DX), i - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
  4. 4. Konjugat antitelo-lek u skladu sa patentnim zahtevom 3, gde segment strukture lekveznik je: - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
  5. 5. Konjugat antitelo-lek u skladu sa patentnim zahtevom 3, gde segment strukture lekveznik je: - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-C H2-C(=O)-(NH-DX).
  6. 6. Konjugat antitelo-lek u skladu sa patentnim zahtevom 3, gde segment strukture lekveznik je: - (Sukcinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
  7. 7. Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 6, gde anti-TROP2 antitelo sadrži teški lanac i laki lanac odabran iz grupe; varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 140 iz SEK ID BR: 12 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 iz SEK ID BR: 18, varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 140 iz SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 SEK ID BR: 18, varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija od 20 do 140 iz SEK ID BR: 14 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 iz SEK ID BR: 20, i varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 140 iz SEK ID BR: 16 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 iz SEK ID BR: 22.
  8. 8. Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 6, gde anti-TROP2 antitelo sadrži teški lanac i laki lanac odabran iz grupe; teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 12 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 18, teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 14 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 18, teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 14 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 20, i teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 16 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 22.
  9. 9. Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 6, gde anti-TROP2 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 140 iz SEK ID BR: 12 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 129 iz SEK ID BR: 18.
  10. 10. Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 6, gde anti-TROP2 antitelo sadrži teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 20 do 470 iz SEK ID BR: 12 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence pozicija 21 do 234 iz SEK ID BR: 18.
  11. 11. Konjugat antitelo-lek u skladu sa patentnim zahtevom 8, gde anti-TROP2 antitelu nedostaje lizin ostatak na karboksil terminusu teškog lanca.
  12. 12. Konjugat antitelo-lek u skladu sa patentnim zahtevom 10, gde anti-TROP2 antitelu nedostaje lizin ostatak na karboksil terminusu teškog lanca.
  13. 13. Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 12, gde prosečan broj jedinica odabrane strukture lek-veznik konjugovane po antitelu je u opsegu od 2 do 8.
  14. 14. Konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 12, gde prosečan broj jedinica odabrane strukture lek-veznik konjugovane po antitelu je u opsegu od 3 do 8.
  15. 15. Lek koji sadrži konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 14, njegovu so, ili njegov hidrat.
  16. 16. Antitumorski lek i/ili antikancerski lek koji sadrži konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 14, njegovu so, ili njegov hidrat.
  17. 17. Antitumorski lek i/ili antikancerski lek u skladu sa patentnim zahtevom 16, za primenu u metodi za lečenje kancera pluća, kancera bubrega, urotelijalnog kancera, kolorektalnog kancera, kancera prostate, glioblastoma multiforme, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera dojke, melanoma, kancera jetre, kancera bešike, kancera želuca, cervikalnog kancera, kancera glave i vrata, ili kancera jednjaka.
  18. 18. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat antitelo-lek u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 14, njegovu so, ili njegov hidrat kao aktivnu komponentu, i komponentu farmaceutski prihvatljive formulacije.
  19. 19. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 18, za primenu u metodi za lečenje kancera pluća, kancera bubrega, urotelijalnog kancera, kolorektalnog kancera, kancera prostate, glioblastoma multiforme, kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera dojke, melanoma, kancera jetre, kancera bešike, kancera želuca, cervikalnog kancera, kancera glave i vrata, ili kancera jednjaka.
RS20181597A 2013-12-25 2014-12-24 Konjugat anti-trop2 antitelo-lek RS58173B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013267548 2013-12-25
PCT/JP2014/006421 WO2015098099A1 (ja) 2013-12-25 2014-12-24 抗ｔｒｏｐ２抗体－薬物コンジュゲート
EP14874745.4A EP3088419B1 (en) 2013-12-25 2014-12-24 Anti-trop2 antibody-drug conjugate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58173B1 true RS58173B1 (sr) 2019-03-29

Family

ID=53477995

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181597A RS58173B1 (sr) 2013-12-25 2014-12-24 Konjugat anti-trop2 antitelo-lek
RS20250560A RS66909B1 (sr) 2013-12-25 2014-12-24 Postupak za proizvodnju konjugata anti-trop2 antitelo-lek

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250560A RS66909B1 (sr) 2013-12-25 2014-12-24 Postupak za proizvodnju konjugata anti-trop2 antitelo-lek

Country Status (31)

Country Link
US (5) US9850312B2 (sr)
EP (3) EP3424955B1 (sr)
JP (7) JP6130517B2 (sr)
KR (11) KR101941758B1 (sr)
CN (3) CN105849126B (sr)
AU (4) AU2014371934B2 (sr)
CA (1) CA2933666C (sr)
CY (1) CY1121246T1 (sr)
DK (2) DK3424955T3 (sr)
ES (2) ES2703903T3 (sr)
FI (2) FI3424955T3 (sr)
FR (1) FR25C1038I1 (sr)
HR (2) HRP20250673T1 (sr)
HU (3) HUE042512T2 (sr)
IL (4) IL320281A (sr)
LT (2) LT3424955T (sr)
MX (3) MX375928B (sr)
MY (2) MY208703A (sr)
NL (1) NL301345I2 (sr)
NO (1) NO2025042I1 (sr)
PH (2) PH12016501233A1 (sr)
PL (2) PL3424955T3 (sr)
PT (2) PT3088419T (sr)
RS (2) RS58173B1 (sr)
RU (1) RU2743077C2 (sr)
SG (2) SG10201902571VA (sr)
SI (2) SI3424955T1 (sr)
SM (2) SMT201900006T1 (sr)
TR (1) TR201900176T4 (sr)
TW (6) TWI712423B (sr)
WO (1) WO2015098099A1 (sr)

Families Citing this family (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014371934B2 (en) * 2013-12-25 2020-01-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-TROP2 antibody-drug conjugate
IL310627B2 (en) 2014-01-31 2026-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-HER2 antibody-drug conjugates, compositions containing them and uses thereof
EP3130608B1 (en) * 2014-04-10 2019-09-04 Daiichi Sankyo Co., Ltd. (anti-her2 antibody)-drug conjugate
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
CN116059395A (zh) 2015-06-29 2023-05-05 第一三共株式会社 用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法
CN109843327B (zh) 2016-07-07 2022-05-13 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗体佐剂缀合物
CN108066772B (zh) * 2016-11-14 2021-07-13 中国科学院上海药物研究所 靶向tacstd2的抗体与药物偶联体(adc)分子
US11273155B2 (en) 2016-12-12 2022-03-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and immune checkpoint inhibitor
JP6679762B2 (ja) 2017-01-17 2020-04-15 第一三共株式会社 抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体−薬物コンジュゲート
TW202532104A (zh) * 2017-05-15 2025-08-16 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物及其用途
CN107446050A (zh) * 2017-08-11 2017-12-08 百奥泰生物科技(广州)有限公司 Trop2阳性疾病治疗的化合物及方法
AU2018320470B2 (en) 2017-08-23 2025-04-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate preparation and lyophilization for same
IL324591A (en) * 2017-08-31 2026-01-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Improved antibody-drug conjugate production methods
CA3074208C (en) 2017-08-31 2023-10-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel method for producing antibody-drug conjugate
NZ762505A (en) 2017-09-29 2026-03-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
SG11202010496WA (en) 2018-05-18 2020-12-30 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-muc1 antibody-drug conjugate
EP3821005A4 (en) * 2018-07-09 2022-10-26 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. AGAINST TROPHOBLAST ANTIGEN 2 (TROP2) SPECIFIC ANTIBODIES
SG11202100653YA (en) 2018-07-25 2021-02-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
WO2020022475A1 (ja) 2018-07-27 2020-01-30 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質
CA3108044A1 (en) * 2018-07-31 2020-02-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of metastatic brain tumor by administration of antibody-drug conjugate
EA202190471A1 (ru) * 2018-08-06 2021-05-24 Дайити Санкио Компани, Лимитед Комбинация конъюгата антитела-лекарственного средства и ингибитора тубулина
CN112739826A (zh) * 2018-08-23 2021-04-30 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物的敏感性标志物
CN113260384A (zh) 2018-11-05 2021-08-13 西纳福克斯股份有限公司 用于靶向表达trop-2的肿瘤的抗体缀合物
SG11202104993SA (en) 2018-11-14 2021-06-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-cdh6 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
KR102905497B1 (ko) 2018-12-11 2025-12-30 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 컨쥬게이트와 parp 저해제의 조합
US20220040324A1 (en) * 2018-12-21 2022-02-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
US11478553B2 (en) 2019-02-15 2022-10-25 Wuxi Biologies Ireland Limited Process for preparing antibody-drug conjugates with improved homogeneity
US12109273B2 (en) 2019-02-15 2024-10-08 Wuxi Xdc Singapore Private Limited Process for preparing antibody-drug conjugates with improved homogeneity
WO2020190725A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting her2
US12458818B2 (en) 2019-03-19 2025-11-04 CSPC Megalith Biopharmaceutical Co., Ltd. Anti-trophoblast cell surface antigen 2 (TROP2) antibodies and antibody drug conjugates comprising same
CN113631229B (zh) 2019-03-25 2025-09-23 第一三共株式会社 抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物
CA3139180A1 (en) 2019-03-27 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate and parp inhibitor
MX2021011812A (es) 2019-03-29 2021-10-22 Medimmune Ltd Compuestos y conjugados de estos.
SG11202110922QA (en) 2019-04-26 2021-10-28 Immunogen Inc Camptothecin derivatives
IL288485B2 (en) * 2019-05-29 2026-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-TROP2 antibody conjugates - a drug for use in cancer treatment
WO2020249063A1 (en) * 2019-06-13 2020-12-17 Bio-Thera Solutions, Ltd. Methods for the treatment of trop2 positive diseases
WO2021027851A1 (zh) * 2019-08-12 2021-02-18 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种trop2抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN112646038B (zh) * 2019-10-11 2025-06-03 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人Trop-2抗体及其应用
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
US20230101266A1 (en) * 2019-12-31 2023-03-30 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Anti-trop2 antibodies, antibody-drug conjugates, and application of the same
CN115175917A (zh) * 2019-12-31 2022-10-11 启德医药科技（苏州）有限公司 药物缀合物及其应用
WO2021143741A1 (zh) * 2020-01-15 2021-07-22 北京海步医药科技有限公司 靶向多肽-药物缀合物及其用途
JP7781064B2 (ja) * 2020-01-22 2025-12-05 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 抗ｔｒｏｐ－２抗体－エキサテカン類似体複合体及びその医薬用途
IL296124A (en) 2020-03-06 2022-11-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Antibody-drug conjugate including novel cyclic dinucleotide derivative
AU2021240037A1 (en) 2020-03-20 2022-09-22 Immunomedics, Inc. Biomarkers for sacituzumab govitecan therapy
CN115298220B (zh) * 2020-03-24 2024-12-20 上海翰森生物医药科技有限公司 抗体-药物偶联物及其医药用途
CN113527496B (zh) * 2020-04-16 2022-03-04 上海洛启生物医药技术有限公司 抗Trop2纳米抗体及其应用
US20230293716A1 (en) 2020-05-08 2023-09-21 Bolt Biotherapeutics, Inc. Elastase-substrate, peptide linker immunoconjugates, and uses thereof
CN116589587A (zh) * 2020-06-22 2023-08-15 四川百利药业有限责任公司 一种抗trop2抗体
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
US20230256110A1 (en) 2020-06-24 2023-08-17 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atm inhibitor
EP4171654A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 AstraZeneca UK Limited Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
IL299368A (en) 2020-06-24 2023-02-01 Astrazeneca Uk Ltd A combination of an antibody-drug conjugate and an ATR inhibitor
CN115515644A (zh) * 2020-06-28 2022-12-23 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种抗体-药物偶联物，其制备方法及应用
IL299803A (en) 2020-07-17 2023-03-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Production method for antibody-drug conjugate
IL300316A (en) 2020-08-13 2023-04-01 Bolt Biotherapeutics Inc Immune conjugates of pyrazolozapines and their uses
JP2023545096A (ja) 2020-10-09 2023-10-26 アストラゼネカ ユーケー リミテッド 抗体－薬物コンジュゲート及びｐａｒｐ１選択的阻害薬の組み合わせ
CN112321715B (zh) * 2020-11-03 2022-05-10 博奥信生物技术（南京）有限公司 抗trop2纳米抗体及其制备方法和应用
EP4240367A4 (en) * 2020-11-04 2024-10-16 Myeloid Therapeutics, Inc. MODIFIED CHIMERIC FUSION PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
AU2021378152A1 (en) 2020-11-11 2023-06-22 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF AN ANTIBODY-DRUG CONJUGATE WITH ANTI-SIRPα ANTIBODY
CN116615250A (zh) 2020-11-12 2023-08-18 第一三共株式会社 通过施用抗b7-h3抗体-药物缀合物的间皮瘤治疗
EP4265275A4 (en) * 2020-12-18 2024-03-20 Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. ANTIBODY-DRUG CONJUGATE TARGETING TROP2, PREPARATION METHOD AND USE THEREOF
MX2023008285A (es) 2021-01-13 2023-09-12 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Conjugado de anticuerpo anti-dll3-farmaco.
WO2022152308A1 (en) * 2021-01-18 2022-07-21 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Engineered anti-trop2 antibody and antibody-drug conjugate thereof
KR20230147105A (ko) 2021-01-28 2023-10-20 진콴텀 헬스케어 (쑤저우) 씨오., 엘티디. 리가제 융합 단백질 및 그 응용
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
US20240279364A1 (en) 2021-03-12 2024-08-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Glycan, and method for producing medicine containing glycan
WO2022197949A2 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof
CN117940168A (zh) 2021-03-26 2024-04-26 博尔特生物治疗药物有限公司 2-氨基-4-甲酰胺-苯并氮杂䓬免疫缀合物及其用途
CN117769439A (zh) 2021-03-26 2024-03-26 博尔特生物治疗药物有限公司 2-氨基-4-甲酰胺-苯并氮杂卓免疫缀合物及其用途
TW202308700A (zh) * 2021-04-29 2023-03-01 大陸商上海匯連生物醫藥有限公司 抗體偶聯藥物的製備方法及應用
BR112023023642A2 (pt) 2021-05-11 2024-01-30 Myeloid Therapeutics Inc Métodos e composições para integração genômica
CN117295524A (zh) 2021-06-02 2023-12-26 百奥泰生物制药股份有限公司 药物偶联物及其用途
US11931424B2 (en) 2021-06-11 2024-03-19 Gilead Sciences, Inc. Combination MCL-1 inhibitors with anti-body drug conjugates
TWI910028B (zh) 2021-06-11 2025-12-21 美商基利科學股份有限公司 Mcl-1抑制劑與抗癌劑之組合
CN115558026A (zh) * 2021-07-02 2023-01-03 和迈生物科技有限公司 抗trop2单域抗体及其应用
CA3225598A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition containing anti-trop2 antibody drug conjugate and its application
MX2024003277A (es) 2021-09-15 2024-04-04 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de anticuerpo-farmaco para usarse en metodos de tratamiento del cancer resistente a la quimioterapia.
KR20240099178A9 (ko) 2021-10-18 2025-12-10 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 cd37 항체-약물 콘주게이트
AU2022375782B2 (en) 2021-10-28 2026-02-26 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
JP2024539993A (ja) 2021-10-29 2024-10-31 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド システイン変異抗体を含むｔｌｒアゴニスト免疫複合体、及びその使用
JP7787991B2 (ja) 2021-10-29 2025-12-17 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｃｄ７３化合物
WO2023083381A1 (zh) 2021-11-15 2023-05-19 成都百利多特生物药业有限责任公司 双特异性抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途
AU2022392822A1 (en) 2021-11-18 2024-05-02 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
IL312728A (en) 2021-11-30 2024-07-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Protease-cleavable masked antibodies
WO2023098889A1 (zh) 2021-12-03 2023-06-08 成都百利多特生物药业有限责任公司 抗人Trop2抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途
US20250034275A1 (en) * 2021-12-07 2025-01-30 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Anti-trop-2 antibody or antigen-binding fragment thereof
CA3241157A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Wei Zhou Camptothecin compound and conjugate thereof
US12122764B2 (en) 2021-12-22 2024-10-22 Gilead Sciences, Inc. IKAROS zinc finger family degraders and uses thereof
KR20240123836A (ko) 2021-12-22 2024-08-14 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 이카로스 아연 핑거 패밀리 분해제 및 이의 용도
EP4456899A1 (en) 2021-12-28 2024-11-06 AstraZeneca UK Limited Combination of antibody-drug conjugate and rasg12c inhibitor
CA3240724A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atr inhibitor
EP4469485A4 (en) * 2022-01-26 2026-04-08 Biocytogen Pharmaceuticals Beijing Co Ltd ANTI-HER2/TROP2 ANTIBODIES AND THEIR USES
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
TW202342106A (zh) 2022-02-09 2023-11-01 日商第一三共股份有限公司 環境應答性遮蔽抗體及其利用
CN118804983A (zh) 2022-03-02 2024-10-18 第一三共株式会社 含Fc分子的制造方法
CN118891525A (zh) * 2022-03-16 2024-11-01 阿斯利康(英国)有限公司 用于抗trop2抗体-药物缀合物疗法的评分方法
WO2023178181A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
IL315366A (en) 2022-03-23 2024-11-01 Synaffix Bv Antibody pairs for targeting PTK7-expressing tumors
CA3253220A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Synaffix B.V. ANTIBODIES CONJUGATED FOR TARGETING TUMORS EXPRESSING TROP-2
WO2023194800A1 (en) * 2022-04-06 2023-10-12 Legochem Biosciences, Inc. Antibody-drug conjugate comprising antibody against human trop2 and use thereof
CA3256048A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Arcus Biosciences, Inc. POLYTHERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCERS EXPRESSING A TUMOR ANTIGEN
JP2025512384A (ja) 2022-04-13 2025-04-17 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｔｒｏｐ－２発現がんを治療するための併用療法
CR20240451A (es) 2022-04-21 2024-12-04 Gilead Sciences Inc Compuestos de modulación de kras g12d
EP4514391A1 (en) 2022-04-27 2025-03-05 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate with ezh1 and/or ezh2 inhibitor
CN119403829A (zh) 2022-05-11 2025-02-07 第一三共株式会社 对于肿瘤抗原特异性的抗体和cd47抑制剂的组合
CN119255825A (zh) 2022-05-24 2025-01-03 第一三共株式会社 抗-cdh6抗体-药物缀合物的剂量方案
CA3258344A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Actinium Pharmaceuticals, Inc. CHELETARIANS AND BIFUNCTIONAL CONJUGATES
US20250381283A1 (en) 2022-06-27 2025-12-18 Bio-Thera Solutions, Ltd. Method for treating solid tumor
KR20250028371A (ko) 2022-07-01 2025-02-28 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Cd73 화합물
WO2024207177A1 (en) * 2023-04-04 2024-10-10 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Antibody, linkers, payload, conjugates and applications thereof
IL318296A (en) 2022-07-15 2025-03-01 Genequantum Healthcare Suzhou Co Ltd Anti-TROP2 antibody and its conjugate
TW202412859A (zh) 2022-07-28 2024-04-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及雙特異性檢查點抑制劑之組合
WO2024050031A2 (en) * 2022-08-31 2024-03-07 Bionecure Therapeutics Inc Novel camptothecin derivatves as antibody-drug conjugates (adc) payloads
KR20240032207A (ko) 2022-08-31 2024-03-12 경북대학교 산학협력단 Trop2에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
KR20250064682A (ko) 2022-09-09 2025-05-09 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 신규 올리고당, 그 올리고당의 제조 중간체, 및 그것들의 제조 방법
WO2024083162A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Multitude Therapeutics Inc. Antibodies, antibody-drug conjugates, preparations and uses thereof
KR20250089539A (ko) 2022-10-19 2025-06-18 멀티튜드 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 항체-약물 접합체, 그의 제조 방법 및 그의 항-종양 용도
WO2024097812A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Gilead Sciences, Inc. Therapy for treating bladder cancer
WO2024102693A2 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Xencor, Inc. Il-18-fc fusion proteins
TW202440169A (zh) 2022-11-30 2024-10-16 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與dnmt抑制劑之組合
AU2023409398A1 (en) 2022-12-22 2025-06-05 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2024173384A1 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
WO2024186626A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-bicyclic sting agonist immunoconjugates, and uses thereof
WO2024190815A1 (ja) 2023-03-14 2024-09-19 第一三共株式会社 抗ｃｄｈ６抗体－薬物コンジュゲートとｖｅｇｆ阻害剤の組み合わせ
KR20250161636A (ko) * 2023-03-27 2025-11-17 오비아이 파머 인코퍼레이티드 Trop2 접합된 생물학적 분자, 제약 조성물 및 방법
WO2024199343A1 (zh) * 2023-03-28 2024-10-03 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗trop2抗体联合靶向trop2的药物治疗癌症的用途
TW202444760A (zh) 2023-03-29 2024-11-16 日商第一三共股份有限公司 抗ｃｄ２５抗體及抗ｃｄ２５抗體－藥物複合體
AU2024248799A1 (en) 2023-03-31 2025-10-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of anti-CDH6 antibody-drug conjugate and HIF-2alpha inhibitor
TW202506190A (zh) 2023-04-05 2025-02-16 日商第一三共股份有限公司 利用抗ｍｕｃ１抗體－藥物結合物投予的藥劑低敏感性癌之治療方法
JPWO2024214685A1 (sr) 2023-04-10 2024-10-17
AU2024252725A1 (en) 2023-04-11 2025-11-06 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
KR20260027874A (ko) 2023-04-13 2026-03-03 진콴텀 헬스케어 (쑤저우) 씨오., 엘티디. 항체-약물 접합체와 항-pd-1 항체의 조합물 및 이의 용도
EP4699622A1 (en) 2023-04-19 2026-02-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and other medicine
CR20250446A (es) 2023-04-21 2025-12-02 Gilead Sciences Inc Inhibidores de prmt5 y usos de los mismos
EP4701667A1 (en) 2023-04-24 2026-03-04 Merck Sharp & Dohme LLC Trop2 binders and conjugates thereof
KR20260020468A (ko) 2023-06-05 2026-02-11 장쑤 맵웰 헬스 파마수티컬 알앤디 컴퍼니, 리미티드 항-b7-h3 항체 또는 그 단편 및 b7-h3를 표적으로 하는 항체 약물 접합체(anti-b7-h3 antibody or fragment thereof, and antibody drug conjugate targeting b7-h3)
AU2024306338A1 (en) 2023-06-30 2026-01-08 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
EP4737483A1 (en) 2023-06-30 2026-05-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate production method including purification step using activated carbon material
KR20260046403A (ko) 2023-07-26 2026-04-07 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Parp7 저해제
CN121620513A (zh) 2023-07-26 2026-03-06 吉利德科学公司 Parp7抑制剂
WO2025042953A1 (en) * 2023-08-22 2025-02-27 The Research Foundation For The State University Of New York Antibody-drug complexes with topoisomerase inhibitors
WO2025047983A1 (ja) 2023-08-31 2025-03-06 国立大学法人 東京大学 がん特異的酵素活性を標的とした新規プロドラッグ型抗がん剤
US20250101042A1 (en) 2023-09-08 2025-03-27 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
US20250109147A1 (en) 2023-09-08 2025-04-03 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
WO2025088496A1 (en) 2023-10-24 2025-05-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and anti-pd-1/tim-3 bispecific binding protein
US20250154172A1 (en) 2023-11-03 2025-05-15 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
TW202535479A (zh) 2023-12-05 2025-09-16 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體藥物結合物與血腦屏障穿透性ｐａｒｐ１選擇性抑制劑之組合
WO2025137640A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
WO2025145034A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 T.O.A.D. Oncology Sa Anti-psma conjugates and methods of using the same
WO2025146173A1 (zh) * 2024-01-05 2025-07-10 信达生物制药(苏州)有限公司 抗体以及包含其与tlr7/8激动剂的免疫偶联物及其用途
WO2025149014A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Pharmaceutical composition
WO2025152920A1 (zh) * 2024-01-15 2025-07-24 石药集团巨石生物制药有限公司 结合trop2的抗体或抗体片段及包含其的药物偶联物
WO2025155626A1 (en) * 2024-01-16 2025-07-24 Obi Pharma, Inc. Method for antibody-drug conjugate quality improvement
KR20250161438A (ko) 2024-05-07 2025-11-17 국민대학교산학협력단 Trop2에 대한 인간항체 및 이의 용도
WO2025238587A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate and androgen receptor signaling inhibitor
WO2025245003A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2025250825A1 (en) * 2024-05-30 2025-12-04 Sutro Biopharma, Inc. Anti-trop2 antibodies, compositions comprising anti-trop2 antibodies and methods of making and using anti-trop2 antibodies
WO2026015418A1 (en) * 2024-07-10 2026-01-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Trop2 targeting trispecific protein for treatment of cancer
US20260098049A1 (en) 2024-08-12 2026-04-09 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
WO2026055185A1 (en) 2024-09-04 2026-03-12 Bolt Biotherapeutics, Inc. Sting agonist immunoconjugates and uses thereof
WO2026052764A1 (en) 2024-09-06 2026-03-12 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody drug conjugate therapy
CN121154845A (zh) * 2025-10-29 2025-12-19 赣南医科大学 Immu-132与iacs010759联用在制备抗食管鳞癌药物中的应用及相关药物

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JP3008226B2 (ja) 1991-01-16 2000-02-14 第一製薬株式会社 六環性化合物
US5658920A (en) 1991-01-16 1997-08-19 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Substituted 1H,12H-benz-[DE]pyrano[3',4':6,7] indolizino[1,2-B]quinoline-10,13(9H,15H)-dione compound
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
CA2131151A1 (en) 1992-03-24 1994-09-30 Kevin S. Johnson Methods for producing members of specific binding pairs
JP3359955B2 (ja) 1992-07-16 2002-12-24 第一製薬株式会社 抗腫瘍剤
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
JPH08337584A (ja) 1995-04-10 1996-12-24 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 縮合六環式アミノ化合物、これを含有する医薬及びその製法
US6504029B1 (en) 1995-04-10 2003-01-07 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Condensed-hexacyclic compounds and a process therefor
SG50747A1 (en) 1995-08-02 1998-07-20 Tanabe Seiyaku Co Comptothecin derivatives
JPH1095802A (ja) 1995-12-28 1998-04-14 Tanabe Seiyaku Co Ltd カンプトテシン誘導体
CA2192725C (en) 1995-12-28 2004-04-20 Kenji Tsujihara Camptothecin derivatives
TW409058B (en) 1996-06-06 2000-10-21 Daiichi Seiyaku Co Method for preparation of a drug complex
TW527183B (en) 1996-06-06 2003-04-11 Daiichi Seiyaku Co Drug complex
JPH1171280A (ja) 1997-06-26 1999-03-16 Tanabe Seiyaku Co Ltd 医薬組成物
JPH1192405A (ja) 1997-09-19 1999-04-06 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 薬物複合体
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
EA003398B1 (ru) 1998-05-22 2003-04-24 Дайити Фармасьютикал Ко., Лтд. Лекарственный комплекс c полимерным носителем
CN1191093C (zh) * 1998-10-30 2005-03-02 第一制药株式会社 Dds化合物及其测定方法
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US7312318B2 (en) * 2002-03-01 2007-12-25 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-CD74 antibodies and methods of use
BR0012196A (pt) 1999-06-25 2002-03-19 Genentech Inc Método de tratamento de um tumor em mamìferos através do uso de conjugados de maitansinóide e anticorpo receptor anti-erbb e artigo industrializado
JP2002060351A (ja) 2000-03-22 2002-02-26 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 水酸基を有する薬物を含むｄｄｓ化合物
US20030166513A1 (en) 2000-06-29 2003-09-04 Akihiro Imura Dds compound and process for the preparation thereof
AU2001271037A1 (en) 2000-07-13 2002-01-30 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical compositions containing dds compounds
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
KR100573565B1 (ko) 2001-08-29 2006-04-25 주식회사 포스코 요철부가 형성된 실린더 링과 이 실린더 링이 결합된 맨드릴
IL161686A0 (en) 2001-11-01 2004-09-27 Uab Research Foundation Combinations of antibodies selective for a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor and other therapeutic agents
CA2467242A1 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
CA2478047C (en) * 2002-03-01 2014-01-21 Immunomedics, Inc. Rs7 antibodies
US9745380B2 (en) * 2002-03-01 2017-08-29 Immunomedics, Inc. RS7 antibodies
CA2508831C (en) 2002-12-13 2012-05-01 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US20040202666A1 (en) * 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
JP4942643B2 (ja) 2004-03-02 2012-05-30 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 部分的に付加された抗体およびそれらの結合体化方法
JP4806680B2 (ja) 2004-05-19 2011-11-02 メダレックス インコーポレイテッド 自己犠牲リンカー及び薬剤複合体
NZ579482A (en) 2004-06-01 2011-02-25 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
DK1771482T3 (da) 2004-07-22 2014-10-20 Genentech Inc HER2-antistofsammensætning
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
JP2008521828A (ja) * 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
CN102580084B (zh) 2005-01-21 2016-11-23 健泰科生物技术公司 Her抗体的固定剂量给药
DE102005009084A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Anthrazyklin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
DE102005009099A1 (de) 2005-02-28 2006-08-31 Ktb Tumorforschungsgesellschaft Mbh Proteinbindende Camptothecin-Peptid-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
US20080131428A1 (en) 2006-02-24 2008-06-05 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
CN101490087B (zh) 2006-05-30 2013-11-06 健泰科生物技术公司 抗体和免疫偶联物及其用途
EP2032606B1 (en) * 2006-05-30 2013-11-27 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
US7780340B2 (en) * 2006-11-30 2010-08-24 Advanced Process Technologies, Inc. Cheese vat having fluid accessible seal assembly
NZ610239A (en) 2008-04-30 2014-11-28 Immunogen Inc Cross-linkers and their uses
WO2009140242A1 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Genentech, Inc. Analysis of antibody drug conjugates by bead-based affinity capture and mass spectrometry
WO2010059315A1 (en) 2008-11-18 2010-05-27 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
CA2750038C (en) * 2009-02-05 2016-10-04 Oncoxx S.R.L. Anti-trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof in the treatment and diagnosis of tumors
ES3000111T3 (en) 2009-02-13 2025-02-27 Immunomedics Inc Intermediates for preparing conjugates with an intracellularly-cleavable linkage
US20120171201A1 (en) 2009-07-22 2012-07-05 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating her2 positive cancer with her2 receptor antagonist in combination with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin
CA2770847A1 (en) 2009-08-18 2011-02-24 Baker Hughes Incorporated Methods of forming polycrystalline diamond elements, polycrystalline diamond elements, and earth-boring tools carrying such polycrystalline diamond elements
JP2013505944A (ja) 2009-09-24 2013-02-21 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド Ｄｒ５リガンド薬物結合体
ES2978177T3 (es) 2009-12-02 2024-09-06 Immunomedics Inc Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer
MX2012013001A (es) * 2010-05-13 2013-02-26 Univ Indiana Res & Tech Corp Peptidos de la superfamilia de glucagon que presentan actividad del receptor nuclear de hormonas.
EA201500220A1 (ru) 2010-05-17 2015-10-30 Ливтех, Инк. Антитело против trop-2 человека, обладающее противоопухолевой активностью in vivo
US20110300150A1 (en) 2010-05-18 2011-12-08 Scott Eliasof Compositions and methods for treatment of autoimmune and other disease
WO2011155579A1 (ja) 2010-06-10 2011-12-15 北海道公立大学法人札幌医科大学 抗Ｔｒｏｐ－２抗体
RU2012157167A (ru) 2010-07-12 2014-08-20 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Полифункциональные антительные конъюгаты
US20120121615A1 (en) * 2010-11-17 2012-05-17 Flygare John A Alaninyl maytansinol antibody conjugates
TWI495644B (zh) 2011-11-11 2015-08-11 Rinat Neuroscience Corp 營養層細胞表面抗原（Ｔｒｏｐ－２）之專一性抗體類及彼等之用途
US9427464B2 (en) 2011-11-22 2016-08-30 Chiome Bioscience Inc. Anti-human TROP-2 antibody having an antitumor activity in vivo
SG11201403085PA (en) 2011-12-14 2014-10-30 Seattle Genetics Inc Fgfr antibody drug conjugates (adcs) and the use thereof
US20130280282A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Dr5 ligand drug conjugates
CN104619350A (zh) 2012-06-14 2015-05-13 Ambrx公司 结合到核受体配体多肽的抗psma抗体
ES2773710T3 (es) 2012-10-11 2020-07-14 Daiichi Sankyo Co Ltd Enlazadores para conjugados de anticuerpo - fármaco
WO2014061277A1 (ja) * 2012-10-19 2014-04-24 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体－薬物コンジュゲート
EP2927227A4 (en) 2013-01-03 2015-12-30 Celltrion Inc ANTIBODY CONCENTRATOR REMEDY CONJUGATE, METHOD OF MANUFACTURING THEREOF, AND ANTIBODY TOGETHER THEREWITH
AU2014371934B2 (en) * 2013-12-25 2020-01-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-TROP2 antibody-drug conjugate
IL310627B2 (en) * 2014-01-31 2026-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-HER2 antibody-drug conjugates, compositions containing them and uses thereof
KR102445502B1 (ko) * 2014-04-10 2022-09-21 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항her3 항체-약물 콘주게이트

Also Published As

Publication number Publication date
US20160297890A1 (en) 2016-10-13
RU2705367C2 (ru) 2019-11-07
TWI910725B (zh) 2026-01-01
RU2016130095A3 (sr) 2018-09-03
CN111228510B (zh) 2024-06-18
CY1121246T1 (el) 2020-05-29
LT3424955T (lt) 2025-06-25
US20180094073A1 (en) 2018-04-05
AU2023200883B2 (en) 2025-12-18
JP7259104B2 (ja) 2023-04-17
CN105849126B (zh) 2020-02-18
JP6130517B2 (ja) 2017-05-17
RU2019134399A (ru) 2019-11-22
PH12016501233B1 (en) 2016-08-15
TWI712423B (zh) 2020-12-11
SI3088419T1 (sl) 2019-01-31
EP4538372A3 (en) 2025-06-25
KR20190006087A (ko) 2019-01-16
KR102088169B1 (ko) 2020-03-12
FI3424955T3 (fi) 2025-07-01
TW202108181A (zh) 2021-03-01
TW202344273A (zh) 2023-11-16
HUE072129T2 (hu) 2025-10-28
HRP20190056T1 (hr) 2019-02-22
NO2025042I1 (no) 2025-09-10
JPWO2015098099A1 (ja) 2017-03-23
JP2020188801A (ja) 2020-11-26
AU2023200883A1 (en) 2023-03-16
TW201609151A (zh) 2016-03-16
SG11201605215YA (en) 2016-08-30
PL3424955T3 (pl) 2025-07-07
NL301345I2 (nl) 2025-11-05
RU2019134399A3 (sr) 2020-02-26
MX2020009970A (es) 2020-10-12
TWI779386B (zh) 2022-10-01
SI3424955T1 (sl) 2025-08-29
IL246361B (en) 2019-07-31
FIC20250031I1 (fi) 2025-09-15
EP3088419B1 (en) 2018-10-10
IL246361A0 (en) 2016-08-31
KR20220068269A (ko) 2022-05-25
AU2014371934A1 (en) 2016-07-07
TWI812438B (zh) 2023-08-11
JP2025038022A (ja) 2025-03-18
FR25C1038I1 (fr) 2025-11-21
KR102444529B1 (ko) 2022-09-19
SMT202500227T1 (it) 2025-09-12
EP3088419A4 (en) 2017-06-07
KR20210041105A (ko) 2021-04-14
CN116987193A (zh) 2023-11-03
US10227417B2 (en) 2019-03-12
RU2743077C2 (ru) 2021-02-15
SMT201900006T1 (it) 2019-02-28
TR201900176T4 (tr) 2019-02-21
NZ721213A (en) 2022-12-23
US20190144559A1 (en) 2019-05-16
TWI852695B (zh) 2024-08-11
KR20160101915A (ko) 2016-08-26
KR20250156860A (ko) 2025-11-03
US20250257146A1 (en) 2025-08-14
ES2703903T3 (es) 2019-03-13
CA2933666C (en) 2021-08-03
HUS2500038I1 (hu) 2025-10-28
EP3424955A1 (en) 2019-01-09
EP4538372A2 (en) 2025-04-16
PH12016501233A1 (en) 2016-08-15
CN105849126A (zh) 2016-08-10
KR20220132020A (ko) 2022-09-29
KR20230018530A (ko) 2023-02-07
TWI633893B (zh) 2018-09-01
PH12020551943A1 (en) 2021-06-07
IL267618A (en) 2019-08-29
KR102351164B1 (ko) 2022-01-13
RS66909B1 (sr) 2025-07-31
US9850312B2 (en) 2017-12-26
KR102535900B1 (ko) 2023-05-26
MY208703A (en) 2025-05-25
HUE042512T2 (hu) 2019-07-29
IL320281A (en) 2025-06-01
HRP20250673T1 (hr) 2025-08-01
KR101941758B1 (ko) 2019-01-24
RU2016130095A (ru) 2018-01-30
IL291446A (en) 2022-05-01
KR20210100207A (ko) 2021-08-13
LT3088419T (lt) 2018-12-27
AU2020202305A1 (en) 2020-04-23
TW201840340A (zh) 2018-11-16
CN111228510A (zh) 2020-06-05
AU2020202305B2 (en) 2023-04-13
EP3088419A1 (en) 2016-11-02
JP6449366B2 (ja) 2019-01-09
IL267618B (en) 2022-04-01
CA2933666A1 (en) 2015-07-02
KR102237803B1 (ko) 2021-04-09
TW202310879A (zh) 2023-03-16
JP2022084608A (ja) 2022-06-07
MX375928B (es) 2025-03-07
JP2019069951A (ja) 2019-05-09
DK3088419T3 (en) 2019-01-28
IL291446B1 (en) 2025-05-01
KR20220009500A (ko) 2022-01-24
DK3424955T3 (da) 2025-06-16
EP3424955B1 (en) 2025-04-09
JP6832907B2 (ja) 2021-02-24
IL291446B2 (en) 2025-09-01
TW202508640A (zh) 2025-03-01
PT3424955T (pt) 2025-06-16
US11008398B2 (en) 2021-05-18
MX2020009971A (es) 2020-10-12
AU2014371934B2 (en) 2020-01-23
KR102491710B1 (ko) 2023-01-26
KR102399141B1 (ko) 2022-05-18
KR20230078820A (ko) 2023-06-02
KR20200028047A (ko) 2020-03-13
BR112016013704A2 (sr) 2017-10-03
PT3088419T (pt) 2019-01-11
JP7030909B2 (ja) 2022-03-07
AU2026201915A1 (en) 2026-04-02
ES3030494T3 (en) 2025-06-30
JP2017197523A (ja) 2017-11-02
KR102879156B1 (ko) 2025-10-30
US20210238303A1 (en) 2021-08-05
MX2016008192A (es) 2017-02-27
SG10201902571VA (en) 2019-04-29
PL3088419T3 (pl) 2019-03-29
BR112016013704A8 (pt) 2018-04-17
MY195162A (en) 2023-01-11
WO2015098099A1 (ja) 2015-07-02
JP2023085465A (ja) 2023-06-20
KR102288093B1 (ko) 2021-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2023200883B2 (en) Anti-trop2 antibody-drug conjugate
TW201620553A (zh) 抗ｃｄ９８抗體－藥物結合物
HK40002989B (en) Method for producing an anti-trop2 antibody-drug conjugate
HK40122796A (en) Anti-trop2 antibody
HK40002989A (en) Method for producing an anti-trop2 antibody-drug conjugate
HK1229817B (en) Anti-trop2 antibody-drug conjugate
HK1229817A1 (en) Anti-trop2 antibody-drug conjugate
BR112016013704B1 (pt) Conjugado de anticorpo-fármaco anti-trop2,fármaco antitumor e/ou anticâncer,composição farmacêutica e uso dos mesmos.