RS58244B1 - Antitelo koje vezuje linearni epitop humanog p53 i njegove dijagnostičke primene - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak spada u oblast imunodijagnostikovanja.

[0002] Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, komplet i in vitro postupke dijagnostikovanja Alchajmerove bolesti i/ili predispozicije nekog subjekta za razvoj Alchajmerove bolesti ili kognitivnog oštećenja tokom starenja.

[0003] DNK vezujući domen (DBD) humanog p53 proteina (aa 101-306) okarakterisan je konformacionom fleksibilnošću visokog stepena i sadrži jedan Zn<2+>jon koordinisan pomoću tri cisteina (ostaci 176, 238 i 242) i jednog histidina (ostatak 179). Kod izoforme divljeg tipa humanog p53 proteina, aa 282-297 linearni epitop makiran je i na taj način nemoguć za prepoznavanje nekim epitop-specifičnim antitelom.

[0004] Međutim, zbog visokog stepena fleksibilnosti njegovog DBD domena, za p53 protein može se pretpostaviti nekoliko konformacija, što takođe karakteriše njegovu biološku aktivnost.

[0005] U svojoj konformaciji divljeg tipa, p53 može vezati DNA konsensuz sekvence i transkribovati/potisnuti ekspresiju ciljanih gena. U toj kombinaciji, protein izlaže epitop koji prepoznaje komercijalno dostupno, konformaciono specifično antitelo nazvano PAb1620.

[0006] Postoji nekoliko stepeni stanja komformacione izmene p53, koji odgovaraju različito konformaciono izmenjenim izoformama. Neke mutacije u p53 genu izazivaju konformacionu promenu proteina, koji odgovara konformaciono izmenjenoj izoformi koja se može prepoznati komercijalno dostupnim, konformaciono specifičnim antitelima.

[0007] Dodatne konformaciono izmenjene izoforme takođe se mogu izvesti iz post-translacione modifikacije, kao što je su reakcije oksidacije i/ili nitriranja, koje menjaju tercijarnu strukturu proteina divljeg tipa.

[0008] I kod Buizza L. et al. ("Conformational altered p53 as an early marker of oxidative stress in Alchajmer’s disease", PlosOne 7(1):e29789) i kod Uberti D et al. ("Identification of a mutant-like conformation of p53 in fibroblasts from sporadic Alchajmer’s disease pacijenti", Neurobiology of Aging 27 (2006) 1193-1201) identifikuje se ekspresija mutiranog p53 proteina kod pacijenata sa Alchajmerovom bolešću, pri čemu takva identifikacija izvedena upotrebom anti-p53 antitela PAb240 koje vezuje kriptični epitop na aminokiselinskim ostacima 213-217 p53 proteina, nije vidljiva kod p53 proteina divljeg tipa.

[0009] Pronalazači su neočekivano pronašli antitelo protiv humanog p53 koje se pokazalo da specifično i selektivno prepozna konformaciono izmenjenu izoformu proteina koja rezultuje iz njegove posttranslacione modifikacije, u kojoj je aa 282-297 linearni epitop izložen.

[0010] Pronalazači su takođe neočekivano primetili da je izoforma p53 proteina koji prepoznaje antitelo prema ovom pronalasku naročito izražena kod subjekata sa Alchajmerovom bolešću. Određenije, konformaciono izmenjena izoforma koju prepoznaje antitelo prema ovom pronalasku izražena je u većim količinama u biološkim uzorcima – naročito u uzorcima krvnih ćelija, neuronskih ćelija ili drugih tipova ćelija vrsta, kao i u uzorcima bioloških tečnosti kao što su, na primer, krv, plazma, serum, pljuvačka, urin - pacijenata sa Alchajmerovom bolešću.

[0011] Pronalazači su dalje primetili da je takva konformaciono izmenjena izoforma koju prepoznaje antitelo prema ovom pronalasku takođe izražena u biološkim uzorcima subjekata sa Blagim kognitivnim oštećenjem (MCI).

[0012] Prema tome, antitelo prema ovom pronalasku je koristan dijagnostičke i prognostički alat, za dijagnostikovanje Alchajmerove bolesti i za određivanje predispozicije nekog subjekta sa Blagim kognitivnim oštećenjem (MCI) za razvoj Alchajmerove bolesti.

[0013] Konačno, pronalazači su primetili da ekspresija p53 proteinske izoforme pozitivne na antitelo prema ovom pronalasku na statistički značajan način u vezi je sa starošću i kognitivnim oštećenjem subjekata koji se ispituju.

[0014] Prema tome, antitelo prema ovom pronalasku takođe korisno za određivanje predispozicije nekog subjekta za razvoj kognitivnog oštećenja tokom starenja.

[0015] Prvi predmet ovog pronalaska je prema tome antitelo protiv humanog p53, okarakterisano time što prepoznaje linearni epitop sekvence RRTEEENLRKKGEPHH (SEQ ID NO:1) prisutan u DNK vezujućem domenu (DBD) humanog p53, pri čemu se taj linearni epitop pruža između aminokiselinskih položaja 282-297 aminokiselinske sekvence humanog p53.

[0016] Pripremanje antitela prema ovom pronalasku opisano je u eksperimentalnom delu koji sledi.

[0017] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku je monoklonalno antitelo.

[0018] Antitelo ovog pronalaska može se dobiti bilo kojom dobro poznatom metodologijom za pripremanje poliklonalnog ili monoklonalnog antitela. U eksperimentalnom delu koji sledi, pripremanje antitela imunizacijom životinje (miševa) antigenom koji se sastoji od peptidne sekvence CRTEEENLRKKGEPHH (SEQ ID NO:2) konjugovane sa albuminom goveđeg seruma kao nosač i tehnika hibridoma opisano je putem primera.

[0019] Kako je prethodno pomenuto, predmetno antitelo ovog pronalaska specifično prepoznaje izoformu humanog p53 proteina za koju je pokazano da je u vezi sa Alchajmerovom bolešću i razvojem kognitivnog oštećenja tokom starenja. Takvo antitelo prema tome predstavlja korisni dijagnostički i prognostički alat.

[0020] In vitro postupak određivanja izoforme konformaciono izmenjene post-translacionom modifikacijom p53 proteina izraženog kod Alchajmerove bolesti, kao i dijagnostički i prognostički postupci kakvi su definisani u priloženim patentnim zahtevima koji čine sastavni deo ovog opisa, takođe su deo ovog pronalaska.

[0021] Imunodijagnostički komplet kakav je definisan u priloženim patentnim zahtevima takođe je deo ovog pronalaska.

[0022] Kako bi se primenili postupci i komplet prema ovom pronalasku, može se primeniti bilo koje dobro poznato imunološko ispitivanje, kao što je na primer ogled imunološkog taloženja, ELISA ili RIA, imunofluorescencija, Western Blot, FACS analiza, imunocitohemija/imunohistohemija.

Primer 1

la. Imunizacija

[0023] Za imunizaciju, upotrebljeni su 6/8 nedelja stari miševi koji su bili zdravi i bez poremećaja. Upotrebljeni peptid kao antigen za proizvodnju antitela imao je sledeće karakteristike:

Sekvenca: "N-kraj" CRTEEENLRKKGEPHH "C kraj" (SEQ ID NO: 2)

Dužina: 16 aminokiselina

Molekulska masa: 1960.94

Čistoća: 96.4%

Oblik: liofilizovan prah

Konjugacija: Konjugovan sa BSA glutaraldehidnim postupkom

[0024] p53 proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 3) prikazana je na FIG.1, na kojoj je DNK vezujući domen (DBD) istaknut sivom bojom, a linearni epitop koji je prepoznat od strane 2D3A8 antitela je podvučen.

[0025] Prva injekcija izvedena je emulgovanjem antigena (50 µg) u Freund-ovom kompletnom adjuvansu (FCA). Subkutana injektovanja izvedena su na 2-3 mesta na životinji. Dodatna injektovanja izvedena su u 3-nedeljnim intervalima sa 50 µg antigena emulgovanog u Freund-ovom nekompletnom adjuvansu (FIA). Titar antitela procenjen je pomoću ELISA.

[0026] U ELISA ogledu, titar antitela prisutan u serumu 5 miševa procenjen je posle trećeg injektovanja gore opisanog peptida. Krv imunizovanih miševa sakupljena je iz njihovih kaudalnih vena. Vrednosti apsorbancije dobijene po spektrofotometrijskom čitanju obezbedila su značajne informacije o titru antitela prisutnom kod različitih miševa. Životinje su podvrgnute daljim dodatnim inkecijama kako bi titar antitela dostigao dovoljno vosik nivo. Miš sa najboljim titrom antitela odabran je za prvu fuziju.

1b. Razvoj hibridoma

[0027] Splenociti životinja fuzionisani su sa mišjim mijeloma ćelijama (SP2/O ćelijska linija). Proizvodi fuzije podvrgnuti su skriningu usmerenom na antigen kako bi se odabrali klonovi koji proizvode antitela. Nastavljeno je uzgajanje ovih klonova. Prvi skrining izveden je ELISA metodologijom. Pozitivni klonovi označeni su sa "roditeljski klonovi" i zamrznuti nakon 3 pasaže. Oblaganje antigena pripremljeno je na ELISA pločama, a supernatant fuzionog proizvoda sukcesivno je dodat. Serum imunizovanih životinua upotrebljen je kao pozitivna kontrola u ELISA (Primer 2).

Primer 2

[0028] Posle fuzije između splenocita miša sa najboljim titrom antitela i mišjih mijeloma ćelija, izveden je ELISA ogled radi procenjivanja proizvoda fuzije. Oblaganje antigenom pripremljeno je u ELISA ploči sa 96-bazenčića, a serijska razblaženja supernatanta različitih klonova dodata su u svaki bazenčić radi procene njihove proizvodnje antitela putem spektrofotometričkog čitanja. Klonovi sa najvišom optičkom gustinom pri 450 nm (OD450nm) transferovani su u ploče sa 24-bazenčića, a kada je posle njihovog uzgajanja ponovljen ELISA ogled, klonovi sa najvišom proizvodnjom antitela transferovani su u ploče sa 6-bazenčića, uzgajane i ponovo ispitane pomoću ELISA. Procedura jeponovljena i za klonove transferovane u fiole za uzgajanje. Ovu sukcesivni ogledi omogućili su identifikaciju najboljih klonova koji su ispitani poslednji put pomoću ELISA, sa ograničenim postupkom razblaženja kako bi se obezbedilo da pozitivni klonovi pokazuju stvarni odgovor na antitelo.

[0029] Validirano antitelo prečišćeno je od supernatanta klona sa najvišom OD450nmvrednošću i prema tome sa najboljim titrom antitela. To antitelo nazvano je "klon 2D3A8" radi jasnoće.

Primer 3

[0030] Ispitivanje ekspresije konformaciono izmenjene izoforme p53 proteina koja se prepoznaje od strane 2D3A8 antitela kod pacijenata sa sporadičnom i naslednom Alchajmerovom bolešću i MCI.

[0031] Kod pacijenata sa imortalizovanim B limfocitima, kojima je dijagnostikovana sporadični Alchajmer (SAD) i nasledni Alchajmer (FAD), konformaciono stanje p53 procenjeno je postupkom imunološkog taloženja, upotrebom dva konformaciono specifična antitela koja prepoznaju izoformu divljeg tipa proteina (PAb 1620) i konformaciono izmenjenu izoformu (2D3A8). Imunotaloženje zatim je vizualizovano Western Blot-om sa poliklonalnim anti-p53 antitelom (CM1). Eksperimentalni podaci izraženi su kao odnos između intenziteta trake positivne na 2D3A8 antitelo i na PAbl620 istog uzorka.

[0032] U SAD i FAD uzorcima, 2D3A8/1620 odnos bio je značajno viši u odnosu na limfocite kontrolnih pacijenata bez demencije (FIG.2).

[0033] 2D3A8 antitelo može prema tome da diskriminiše konformaciono izmenjenu izoformu p53 koja je neobično eksprimirana u imortalizovanim limfocitima pacijenata sa sporadičnim (SAD) i naslednim (FAD) Alchajmerom.

Primer 4

[0034] U uzorcima sveže krvi pacijenata kojima je dijagnostikovan Alchajmer i subjekata sa blagim kognitivnim oštećenjem, dijagnostikovano MCI, konformaciono izmenjena izoforma p53, koja je prepoznata od strane 2D3A8 antitelo (2D3A8-pozitivni p53) procenjena je pomoću ELISA. Zdravi, subjekti bez demencije iste starosti takođe su procenjeni.

[0035] 2D3A8-pozitivni p53 detektovani je i u krvnim ćelijama (PBMC) i u serumu istih pacijenata ili subjekata.2D3A8 antitelo može da prepozna sa velikim stepenom specifičnosti pacijente sa Alchajmerom. Zanimljivo, subjekti sa blagim kognitivnim oštećenjem eksprimiraju serumske nivoe 2D3A8-pozitivnog p53 koji su statistički viši od nivoa izoforme proteina prisutnih kod kontrolnih subjekata. U PBMC i u serumu pacijenata sa Alchajmerom, 2D3A8-pozitivna p53 izoforma statistički je povećana u poređenju kontrolama (FIG.3).

Primer 5

[0036] 2D3A8-pozitivna p53 izoforma u korelaciji je sa starošću.

[0037] Tokom starenja, ekspresija 2D3A8-pozitivnog p53 u krvnim ćelijama (PBMC) povećava se na statistički značajan način (FIG.4).

[0038] Štaviše, ekspresija 2D3A8-pozitivnog p53 u korelacijije sa kognitivnim statusom, kako je izmereno dobro poznatim neuropsihološkim ispitivanjem MMSE.2D3A8-pozitivna p53 izoforma povećava se sa smanjivanjem ocene dobijene u MMSE ispitivanju, tj., povećava se sa progresijom kognitivnog oštećenja (FIG.5).

�

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Antitelo protiv humanog p53, n a z n a č e n o t i m e, što se vezuje za linearni epitop humanog p53 sekvence RRTEEENLRKKGEPHH (SEQ ID NO: 1).

2. Antitelo prema zahtevu 1, koje je monoklonalno antitelo.

3. Postupak pripremanja antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 2, n a z n a č e n t i m e, što obuhvata faze:

(i) imunizovanja životinje, ne-humane, imunogenom koji obuhvata peptid humanog p53 proteina sekvence CRTEEENLRKKGEPHH (SEQ ID NO: 2), opciono konjugovan sa nosačem, pri čemu je taj nosač poželjno albumin goveđeg seruma; i

(ii) izolovanja antitela dobijenog posle imunizacije.

4. Komplet za imunološko ispitivanje, koji obuhvata najmanje antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 2 i sredstvo za detektovanje vezivanja pomenutog antitela za humani p53 protein.

5. In vitro postupak detektovanja izoforme humanog p53 proteina u uzorku, pri čemu je pomenuta izoforma konformaciono izmenjena post-translacionom modifikacijom u odnosu na humani p53 protein divljeg tipa, pri čemu je ovaj postupak n a z n a č e n t i m e, što se taj uzorak dovodi u kontakt sa najmanje jednim antitelom prema bilo kom od zahteva 1 do 2 i što se u tomk uzorku detektuje formiranje imunološkog kompleksa između humanog p53 proteina i antitela.

6. In vitro postupak dijagnostikovanja Alchajmerove bolesti kod subjekta, n a z n a č e n t i m e, što obuhvata faze:

(i) dovođenja u kontakt biološkog uzorka subjekta sa najmanje jednim antitelom protiv humanog p53 prema bilo kom od zahteva 1 do 2 pod uslovima pogodnim za formiranje imunološkog kompleksa između humanog p53 proteina i najmanje tog jednog antitela; i

(ii) detektovanja formiranja imunološkog kompleksa između humanog p53 proteina i najmanje tog jednog antitela,

pri čemu je formiranje imunološkog kompleksa pokazatelj Alchajmerove bolesti.

7. In vitro postupak određivanja predispozicije nekog subjekta sa blagim kognitivnim oštećenjem za razvoj Alchajmerove bolesti, n a z n a č e n t i m e, što obuhvata faze:

(i) dovođenja u kontakt biološkog uzorka subjekta sa najmanje jednim antitelom protiv humanog p53 prema bilo kom od zahteva 1 do 2 pod uslovima pogodnim za formiranje imunološkog kompleksa između humanog p53 proteina i najmanje tog jednog antitela; i

(ii) detektovanja formiranja imunološkog kompleksa između humanog p53 proteina i najmanje tog jednog antitela,

pri čemu je formiranje imunološkog kompleksa pokazatelj predispozicije za razvoj Alchajmerove bolesti.

8. In vitro postupak određivanja predispozicije nekog subjekta za razvoj kognitivne slabosti tokom starenja, n a z n a č e n t i m e, što obuhvata faze:

(i) dovođenja u kontakt biološkog uzorka subjekta sa najmanje jednim antitelom protiv humanog p53 prema bilo kom od zahteva 1 do 2 pod uslovima pogodnim za formiranje imunološkog kompleksa između humanog p53 proteina i najmanje tog jednog antitela; i

(ii) detektovanja formiranja imunološkog kompleksa između humanog p53 proteina i najmanje tog jednog antitela,

pri čemu je formiranje imunološkog kompleksa pokazatelj predispozicije za razvoj kognitivne slabosti tokom starenja.

9. In vitro postupak prema bilo kom od zahteva 5 do 8, u kojem biološki uzorak je krv, plazma, serum, pljuvačka, urin, neuronske ćelije, krvne ćelije ili drugi tipovi ćelija.

10. In vitro postupak prema bilo kom od zahteva 5 do 9, u kojem se detekcija izvodi tehnikom imunološkog taloženja, imunološkim ispitivanjem, poželjno ELISA ili RIA ili nekim imunofluorescentnim ogledom, Western Blot-om, FACS analizom ili imunocitohemijskim/imunohistohemijskim tehnikama.