RS58274B1 - Benzoksazinon amidi kao modulatori mineralokortikoidnog receptora - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Oblast tehnike se odnosi na određene derivate benzoksazinon amida (uključujući njihove farmaceutski prihvatljive soli) koji deluju kao modulatori receptora mineralokortikoida (MR) koji mogu smanjiti oksidativni stres u endotelu, i time poboljšati vaskularnu funkciju, njihovu korisnost u potencijalnom tretmanu i/ili prevenciji kliničkih stanja, uključujući kardiovaskularna i metabolička oboljenja kao što su hipertenzija, zatajenje srca, hronično oboljenje bubrega, dijabetička nefropatija, dijabetes, poremećaji očne vaskulature, na načine za njihovu potencijalnu terapeutsku upotrebu, na farmaceutske sastave koje ih sadrže, i na postupke za pripremu takvih jedinjenja.

STANJE TEHNIKE

[0002] Aldosteron, fiziološki mineralokortikoid, reguliše transport natrijuma u epitelnim tkivima, posebno distalnom nefronu i debelom crevu. Odgovor na aldosteron je posredovan nuklearnim receptorom, mineralokortikoidnim receptorom (MR; NR3C2) i uključuje negenomske i genomske efekte. Ključna uloga MR u mineralokortikoidnom odgovoru je demonstrirana kod miševa bez MR; ovi miševi pokazuju duboko mineralno kortikoidno neresponsivno trošenje soli, što je neizbežno fatalno u ranom neonatalnom periodu.

Kompromitovano mineralokortikoidno dejstvo povezano je sa poremećajima ravnoteže soli i hiperaldosteroidizam je povezan sa endotelijalnom disfunkcijom i oslabljenom vaskularnom reaktivnošću kod pacijenata sa hipertenzijom ili kongestivnim zatajenjem srca. MR antagonizam je povezan sa smanjenim oksidativnim stresom u endotelu, i time poboljšava vaskularnu funkciju.

[0003] Visoki nivoi aldosterona u cirkulaciji povezani su sa endotelijalnom disfunkcijom kod hipertenziziva i pacijenata sa kongestivnim zatajenjem srca, efektima koji su uglavnom posredovani mineralokortikoidnim receptorom. Produženi hiperaldosteronizam je takođe povezan sa fibrozom bubrega i na kraju zatajenjem (Trends Endocrinol Metab.2008, 19 (3)), 88-90). Blokada MR u ispitivanjima zatajenja srca dovela je do značajnog smanjenja mortaliteta i morbiditeta, uprkos tome što je doziranje ograničeno hiperkalemijom posredovanom sa MR (N. Engl. J. Med.1999, 341(10), 709-17). Ograničena klinička ispitivanja pokazala su korisne efekte MR antagonista i u tretmanu bolesti bubrega, uključujući dijabetičku nefropatiju (Kidnei International 2011, 79, 1051). Međutim, rizik od hiperkalemije trenutno ograničava upotrebu MR antagonista, i posebno isključuje pacijente sa dijabetesom. Novi, potentni i selektivni MR antagonisti treba da povećaju ovaj terapeutski prozor između poboljšanja endotela i hiperkalemije epitelnog porekla.

Nesteroidni MR antagonisti obelodanjeni u Bioorg. Med. Chem. Lett.2005, 15, 2553 opisuju optimizaciju 3,3-bisariloksindola kao MR antagonista za upotrebu u tretmanu kongestivnog zatajenja srca.

WO 2006/015259 se odnosi na benzoksazinone kao moćne modulatore receptora steroidnih hormona, uključujući MR za tretman raznih poremećaja koji utiču na srce, bubreg i vaskulaturu.

Opin. Ther. Pat.2007, 17, 17 razmatra polje MR antagonista. Pregled takođe uključuje dva ključna steroidna MR antagonista eplerenon i spironolakton.

Expert Opin. Ther. Patents 2014, 24(2), 177 razmatra polje MR modulatora u pregledu patenta koji pokriva prijave podnesene 2007 - 2012.

WO 2007/077961 se odnosi na fuzionisana heterociklična jedinjenja kao MR antagoniste za tretman hipertenzije, zatajenja srca i slično.

DE 102007 009 494 obelodanjuje 4-aril-1,4-dihidro-l, 6-naftiridin-3-karboksamide kao MR antagoniste za tretman hipertenzije, zatajenja srca, bolesti bubrega i drugih stanja.

WO 2007/089034 obelodanjuju biciklična jedinjenja, kao što je N-(2,2-dimetil-3-okso-4-fenil-3,4-dihidro-2).H-1,4-benzoksazin-7-il)metansulfonamid, kao veznike za MR.

WO 2008/118319 odnosi se na afinitet vezivanja MR za tretman niza stanja uključujući kardiovaskularnu i bubrežnu bolest.

WO 2008/53300 opisuje MR antagoniste za tretman niza stanja uključujući kardiovaskularne i bubrežne poremećaje.

WO 2008/126831 odnosi se na atropizomere N-(p-metilsulfonilfenil)-5-(2-trifluorometilfenil) pirol-3-karboksamida kao MR antagoniste.

WO 2009/085584 odnosi se na analoge 6H-dibenzo[b,e]oksepina kao MR antagoniste za tretman fizioloških poremećaja kao što su kongestivno zatajenje srca, hipertenzija i dijabetička nefropatija.

WO 2009/017190 otkrivaju derivate benzoksazina i hromena kao MR antagoniste korisne kao diuretike i za prevenciju i/ili tretman hipertenzije, zatajenja srca, infarkta miokarda, angine pektoris, srčane hipertrofije, fibroze miokarda, vaskularne fibroze, poremećaja baroreceptora, viška telesne tečnosti, aritmije, primarnog ili sekundarnog aldosteronizama, Addison-ove bolest, Cushing-ovog sindroma ili Bartter-ovog sindroma.

US 20100094000 se odnosi na derivate pirazola kao MR antagoniste za upotrebu za hipertenziju, zatajenje srca i slično.

WO 2010/098286 obelodanjuje (+)-1,4-dimetil-N-[4-(metilsulfonil)fenil]-5-[2-(trifluorometil)fenil]-1;H-pirol-3-karboksam kao agens za tretman dijabetičke nefropatije.

WO 2010/104721 se odnosi na specifičnu upotrebu 5-((E)-(3-fluorodibenzo[b,e] oksepin-11(6H)-iliden)metil)-1-((7R, 8aR)-heksahidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]oksazin-7-il)-1H-benzo[d]imidazol-2(3H)-ona kao MR antagonista za prevenciju bolesti, uključujući kongestivno zatajenje srca, dijabetičku nefropatiju i hroničnu bubrežnu bolest.

WO 2010/116282 se odnosi na dihidropirazole kao MR antagoniste za tretman hipertenzije.

WO 2011/141848 se odnosi na derivate morfolina kao MR antagoniste i njihovu upotrebu za tretman raznih stanja uključujući dijabetičku nefropatiju i endotelnu disfunkciju.

WO 2012/064631 opisuje piridil uree kao MR antagoniste za tretman npr. zatajenja srca.

WO 2012/008435 obelodanjuje derivate diarilamida koji inhibiraju MR za tretman niza bolesti uključujući bolesti bubrega.

J. Med. Chem.2011, 54, 8616 opisuje aktivnost strukture benzoksazin-3-ona kao MR antagonista.

J. Cardiovasc. Pharmacol. 2012, 59(5), 458 opisuje SM-368229 kao MR antagonist sa antihipertenzivnom efikasnošću kod pacova sa minimalnim efektima na nivo kalijuma u serumu.

ChemMedChem 2012, 7(8), 1385 izveštava o optimizaciji dihidropiridina za analoge dihidronaftiridina i identifikaciju BAI 94-8862.

Mol. Cell. Endocrinol. 2012, 350, 310 razmatra farmakologiju MR antagonista i opisuje svojstva BR-4628 i PF-3882845.

J. Med. Chem. 2012, 55, 7957 je pregled u oblasti nesteroidnih MR antagonista. Bioorg. Med. Chem. Lett.2013, 23, 4388 izveštava o istraživanju derivata oksazolidinona kao moćnih MR antagonista.

Bioorg. Med. Chem. Lett.2013, 23, 6239 izveštava o istraživanju arilsulfonamida kao moćnih nesteroidnih MR antagonista.

Frontiers in pharmacology 2013, 4, 115 opisuje efekte PF-03882845 u životinjskim modelima dijabetičke nefropatije, i tvrde da je smanjen rizik od hiperkalemije.

J. Med. Chem. 2014, 57 (10), 4273 opisuju napore za poboljšanje selektivnosti receptora nuklearnog hormona za PF-03882845.

[0004] Uprkos gore navedenom, još uvek postoji potreba za alternativnim/dalje poboljšanim agensima za tretman kardiovaskularnih, upalnih, metaboličkih i bubrežnih stanja, uključujući zatajenje srca, hipertenziju, hronično oboljenje bubrega, dijabetičku nefropatiju, endotelnu disfunkciju, dijabetes, poremećaje očne vaskulature koji imaju, na primer, prednost da mogu biti efikasniji, manje toksični, selektivniji, potentniji, da proizvode manje neželjenih efekata, lakše se apsorbuju i/ili imaju bolji farmakokinetički profil (npr. veća oralna bioraspoloživost i/ili niži klirens), od prethodno opisanih jedinjenja.

SAŽETAK

[0005] Cilj ovog pronalaska je da pruži jedinjenja koja deluju kao modulatori receptora mineralokortikoida (MR), njihovu upotrebu kao potencijalne lekova, farmaceutske sastave koji ih sadrže, i puteve sinteze za njihovu proizvodnju.

Prema prvom aspektu, pruženo je jedinjenje formule (I)

gde

R<1>je izabran od CONH2ili CONHCH3, i

R<2>je izabran od H, F, Cl ili Br,

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0006] Jedinjenja formule (I) su modulatori receptora mineralokortikoida (MR). Tako, jedinjenja formule (I) se mogu koristiti kao lek, naročito za poremećaje, bolesti ili stanja koja reaguju na modulaciju MR, i specifičnije kardiovaskularna, upalna, metabolička i bubrežna stanja, uključujući zatajenje srca, hipertenziju, hroničnu bubrežnu bolest, dijabetičku nefropatiju, endotelnu disfunkciju, dijabetes poremećaje očne vaskulature, u kojoj igra ulogu modulacija MR.

[0007] U drugom aspektu, pružena je farmaceutska formulacija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu jedinjenja formule (I), ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I), i farmaceutski prihvatljiv diluent, ekscipijent i/ili inertni nosač.

[0008] U sledećem otelotvorenju pružena je farmaceutska formulacija koja sadrži jedinjenje formule (I), ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I), za upotrebu u tretmanu stanja gde bi bila korisna modulacija receptora mineralokortikoida.

[0009] Prema drugom aspektu, pruženo je jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) za upotrebu u terapiji, posebno u prevenciji ili tretmanu hronične bolesti bubrega kod sisara, posebno kod ljudi.

[0010] Prema drugom aspektu, pruženo je jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) za upotrebu u terapiji, posebno u prevenciji ili tretmanu kardiovaskularnih i metaboličkih bolesti kod sisara, posebno kod ljudi.

[0011] U sledećem otelotvorenju pruženo je jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) za upotrebu u terapiji, posebno u prevenciji ili tretmanu dijabetičke nefropatije kod sisara, posebno kod ljudi.

[0012] U sledećoj varijanti pruženo je jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) za upotrebu u terapiji, naročito u prevenciji ili tretmanu metaboličkih bolesti, kao što je dijabetes, kod sisara, posebno kod ljudi.

[0013] U još daljem otelotvorenju pruženo je jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) za upotrebu u terapiji, posebno u prevenciji ili tretmanu zatajenja srca kod sisara, posebno kod ljudi.

[0014] U još daljem otelotvorenju pruženo je jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) za upotrebu u terapiji, posebno u prevenciji ili tretmanu hipertenzije kod sisara, posebno kod ljudi.

[0015] U još daljem otelotvorenju pruženo je jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) za upotrebu u terapiji, posebno u prevenciji ili tretmanu endotelne disfunkcije kod sisara, posebno kod ljudi.

[0016] U još daljem otelotvorenju pruženo je jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) za upotrebu u terapiji, posebno u prevenciji ili tretmanu upalnih bolesti kod sisara, posebno kod ljudi.

[0017] Prema drugom aspektu, pružen je postupak za dobijanje jedinjenja formule (I) ili farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule (I), i međuproizvodi koji se koriste u njihovom dobijanju.

[0018] Jedinjenja formule (I), koja su ovde prikazana kao primer, kada se testiraju u testu MR vezivanja, na primer Test A u nastavku, nadmeću se za vezivanje aldosterona u koncentracijama ispod 50 µM, poželjno sa IC50manjim od 50 µM. Jedinjenja formule (I) takođe pokazuju perspektivne farmakološke profile odvajanjem željenih i neželjenih efekata in vivo.

[0019] Ova i druga otelotvorenja su detaljnije opisane ovde u daljem tekstu, gde će sledeći aspekti biti očigledni stručnjaku iz ove oblasti, iz čitanja ove specifikacije.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0020] Slika 1 prikazuje obrazac praškaste rendgenske difrakcije za Primer 4a pripremljen prema Primeru 4a, Postupak B: 2-{(3S)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid.

DETALJAN OPIS

[0021] U ovoj specifikaciji, izraz „modulator“ se koristi za opisivanje jedinjenja koje pokazuje različit receptorski agonizam i/ili antagonizam, bilo potpun agonizma i/ili antagonizam, ili parcijalni agonizam i/ili antagonizam.

[0022] Kako bi se izbegla sumnja, podrazumeva se da kada je u ovoj specifikaciji grupa kvalifikovana kao „definisana gore", navedena grupa obuhvata prvu pojavu i najširu definiciju, kao i svaku i sve druge definicije za tu grupu.

[0023] U jednom aspektu, pružena su jedinjenja formule (I), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, gde su R<1>i R<2>definisani u formuli (I).

[0024] U jednom otelotvorenju R<1>je CONH2. i

R<2>se bira između H, F, Cl ili Br.

[0025] U daljem otelotvorenju R<1>je CONH2, i

R<2>je H.

[0026] U još daljem otelotvorenju R<1>je CONH2, i

R<2>je F.

[0027] U još daljem otelotvorenju R<1>je CONHCH3, i

R<2>se bira između H, F, Cl ili Br.

[0028] U još daljem otelotvorenju R<1>je CONHCH3, i

R<2>je H.

[0029] U još daljem otelotvorenju R<1>je CONHCH3, i

R<2>je F.

[0030] U jednom otelotvorenju, jedinjenja formule (I) su pojedinačni enantiomeri sa konfiguracijom (S).

[0031] U još jednom otelotvorenju, jedinjenja formule (I) su pojedinačni enantiomeri sa konfiguracijom (R).

[0032] U još jednom otelotvorenju, jedinjenja formule (I) su racemati ili racemične smeše.

[0033] Jedno ili više gore navedenih otelotvorenja mogu se kombinovati kako bi se pružile dodatne specifične realizacije.

[0034] U jednom otelotvorenju jedinjenje formule (I) je izabrano od:

2-{4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

N-metil-2-{4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

N-metil-2-{(3S)-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

N-metil-2-{(3R)-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{(3S)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{(3R)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid,

2-{(3,S)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid,

2-{(3R)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid,

2-{7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{(3R)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid,

2-{(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid,

2-{(3R)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid,

2-{7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{(3S)-7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{(3R)-7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid,

2-{7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid,

2-{(3,S)-7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid,

2-{(3R)-7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid, i

i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.

[0035] Treba napomenuti da se bilo koje od ovih specifičnih jedinjenja može odbaciti od bilo koje od ovde pomenutih otelotvorenja.

[0036] Sledeće otelotvorenje je proizvod koji se može dobiti bilo kojim od postupaka ili primera koji su ovde opisani.

FARMAKOLOŠKA SVOJSTVA

[0037] Za jedinjenja formule (I) ili njihove farmaceutski prihvatljive soli se veruje da su korisni u prevenciji ili tretmanu kardiovaskularnih, upalnih, metaboličkih i renalnih stanja, uključujući ali ne ograničavajući se na zatajenje srca, hipertenziju, hroničnu bubrežnu bolest, dijabetičku nefropatiju, endotelnu disfunkciju, dijabetes, poremećaje očne vaskulature, kod sisara, posebno kod ljudi.

[0038] Kako bi se izbegla sumnja, kako se ovde koristi, izraz „tretman“ uključuje terapeutski i/ili profilaktički tretman.

1

[0039] Kada se ovde opisano jedinjenje ili so primenjuju kao terapija za tretman poremećaja, „terapeutski efikasna količina“ je količina dovoljna da smanji ili potpuno ublaži simptome ili druge štetne efekte poremećaja, izleči poremećaj, obrne, potpuno prestane, ili uspori napredovanje poremećaja ili smanjiti rizik od pogoršanja poremećaja.

[0040] Ovde opisana jedinjenja su stoga naznačena kako u terapeutskom tako i/ili u profilaktičkom tretmanu ovih stanja.

[0041] Ovde opisana jedinjenja imaju prednost da mogu biti efikasnija, manje toksična, selektivnija, potentnija, da imaju manje neželjenih efekata, da se lakše apsorbuju i/ili da imaju bolji farmakokinetički profil (npr. veća oralna bioraspoloživost i/ili manji klirens), nego jedinjenja koja su poznata u stanju tehnike.

KOMBINACIONA TERAPIJA

[0042] Jedinjenja formule (I), ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, mogu se takođe primenjivati zajedno sa drugim jedinjenjima koja se koriste za tretman gore navedenih stanja.

[0043] U još jednom otelotvorenju, pružena je kombinovana terapija gde se jedinjenje formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i drugi aktivni sastojak daje istovremeno, uzastopno ili u smeši, za tretman jednog ili više gore navedenih stanja. Takva kombinacija se može koristiti u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih sastojaka.

[0044] Ovde opisana jedinjenja mogu biti korisna u tretmanu kardiovaskularne, metaboličke i bubrežne bolesti u kombinaciji sa agensima koji su

• srčane terapije,

• anti-hipertenzivi,

• diuretici,

• periferni vazodilatatori,

• agensi za modifikovanje lipida,

• anti-dijabetici,

• protiv-upalni,

• ili antikoagulant.

[0045] Primeri gore navedenih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, glikozide digitalisa, antiaritmike, antagoniste kalcijumskih kanala, ACE inhibitore, blokatore angiotenzinskih receptora, blokatore receptora endotelina, β-blokatore, tiazidne diuretike, diuretike petlje, inhibitore sinteze holesterola kao što su statini (npr. rosuvastatin), inhibitore apsorpcije holesterola, inhibitore holesterilestarskog transfernog proteina (CETP), anti-dijabetičke lekove kao što su insulin i analozi, GLP-1 analozi, sulfonamidi, inhibitori dipeptidil peptidaze 4, tiazolidindioni, inhibitori SGLT-2 i anti-upalni lekovi kao što su NSAID i CCR2 antagonisti, anti-koagulanti kao heparini, inhibitori trombina i inhibitori faktora Xa, inhibitori agregacije trombocita i P2X7 antagonisti.

[0046] Kada se koristi u kombinovanoj terapiji, smatra se da jedinjenja formule (I) ili njihove farmaceutski prihvatljive soli i drugi aktivni sastojci mogu biti davani u jednom sastavu, potpuno odvojenim sastavima, ili kombinaciji ta dva. Takođe se smatra da se aktivni sastojci mogu davati istovremeno, zajedno, uzastopno ili odvojeno. Posebni sastavi i učestalosti doziranja kombinovane terapije će zavisiti od različitih faktora, uključujući, na primer, put primene, stanje koje se leči, vrstu pacijenta, bilo kakve potencijalne interakcije između aktivnih sastojaka kada se kombinuju u jedan sastav, bilo kakve interakcije između aktivnih sastojaka kada se daju životinjskom pacijentu, i razne druge faktore poznate lekarima (u kontekstu ljudskih pacijenata), veterinarima (u kontekstu ne-ljudskih pacijenata), i drugih stručnjaka u ovoj oblasti.

FARMACEUTSKI SASTAVI

[0047] Ovde je opisan postupak lečenja stanja gde je potrebna modulacija MR, gde postupak obuhvata davanje terapeutski efikasne količine jedinjenja formule (I) osobi koja pati od takvog stanja, ili je podložna takvom stanju.

[0048] Jedinjenja formule (I) će se normalno primenjivati oralnim, topikalnim, parenteralnim, intravenskim, intramuskularnim, subkutanim putem, ili na druge načine za injektiranje, bukalnim, rektalnim, vaginalnim, transdermalnim i/ili nazalnim putem i/ili putem inhalacije, u obliku farmaceutskih preparata koji sadrže aktivni sastojak ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u farmaceutski prihvatljivom doznom obliku. U zavisnosti od poremećaja i pacijenta koji se leči i načina primene, sastavi se mogu primenjivati u različitim dozama. Konvencionalni postupci za izbor i pripremu pogodnih farmaceutskih formulacija su opisani u, na primer, Pharmaceuticals - The Science of Dosage Form Designs, M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 2nd Ed.2002.

[0049] Pogodne dnevne doze jedinjenja formule (I) u terapeutskom tretmanu ljudi su oko 0,0001-100 mg/kg telesne težine, poželjno 0,01-10 mg/kg telesne težine.

[0050] Poželjne su oralne formulacije, naročito tablete ili kapsule koje mogu biti formulisane postupcima koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti, kako bi se pružile doze aktivnog jedinjenja u opsegu od 0,007 mg do 700 mg na primer 1 mg, 3 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg i 250 mg.

[0051] Optimalna doza i učestalost primene će zavisiti od određenog stanja koje se leči i njegove ozbiljnosti; vrste pacijenta; starosti, pol, veličine i težine, ishrane i opšteg fizičkog stanja određenog pacijenta; odnosa mozga/telesne težine; drugih lekova koje pacijent uzima; puta primene; formulacije; i raznih drugih faktora poznatih lekarima i drugim stručnjacima.

[0052] Prema daljem aspektu, pružena je farmaceutska formulacija koja sadrži jedinjenje formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljivi derivate, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim adjuvantom, razblaživačem i/ili nosačem.

[0053] Jedinjenja formule (I) mogu biti prisutna u farmaceutskoj formulaciji u koncentraciji od 0,1 do 99,5%, kao što je od 0,5 do 95% težine ukupne formulacije.

PRIPREMA JEDINJENJA

[0054] Jedinjenja formule (I) i njihove soli mogu biti pripremljene u skladu sa bilo kojom od procedura sledećih šema i primera, ili bilo kog postupka za koji je poznato da je primenljiv za dobijanje hemijski srodnih jedinjenja. Stručnjaci u ovoj oblasti lako će razumeti da se poznate varijacije uslova i postupaka sledećih pripremnih postupaka mogu koristiti za pripremu ovih jedinjenja.

Jedinjenja formule (I) može biti pripremljeno pomoću sledećih procesa.

1

[0055] Jedinjenje formule (I), gde su R<1>i R<2>kao što je definisano iznad, mogu se pripremiti amidnim kuplovanjem u skladu sa Šemom 1. Stručnjak shvata da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za ovaj tip reakcije. Reakciju mogu npr. da promovišu T3P ili PCl3. Može se izvesti u prisustvu baze, npr. TEA ili DIPEA, i izvodi se na povišenim temperaturama u organskom rastvaraču, kao što su EtOAc, BuOAc, toluen ili DMA. Zaštitne grupe se mogu koristiti za osetljive funkcionalne grupe kao što je TBDPS za hidroksilne grupe ili MPM za sulfonamide.

[0056] Stručnjak u ovoj oblasti razume da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za transformaciju R<1>i R<2>formule (I). Neki od ovih postupaka su dati u nastavku.

[0057] Jedinjenje formule (Ib) može se dobiti hidrolizom estra formule (Ia) gde je R<1>definisano kao za formulu (I) i R<3>je alkil grupa. Reakcija se može izvesti upotrebom baze kao što su LiOH ili NaOH u rastvaraču kao što je THF, MeOH i H2O ili smeša takvih rastvarača na sobnoj ili povišenoj temperaturi.

[0058] Karboksilne kiseline formule (Ib) mogu se transformisati u amide formule (Ic), gde R<4>je H ili C1-4alkil, reakcijom sa odgovarajućim aminima ili aminskim solima upotrebom odgovarajućeg reagensa za kuplovanje. Stručnjak u ovoj oblasti razume da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za ovaj tip konverzije koristeći agense za spajanje. Reakcija se može promovisati pomoću, na primer, PyBOP, T3P, TBTU, reagensom za formiranje kiselog halida ili reagensom za formiranje anhidrida. Reakcija se može izvesti u prisustvu odgovarajuće baze, npr. TEA ili NMM, i može se pogodno izvesti na sobnoj temperaturi u organskom rastvaraču, kao što su EtOAc, THF, DMF ili DCM ili smeše takvih rastvarača. Alternativno, amid formule (Ic) može se dobiti iz estra formule (Ia) reakcijom sa odgovarajućim aminom u rastvaraču kao što su MeOH, EtOH, ili smešama takvih rastvarača.

[0059] Jedinjenja formule (II) mogu biti napravljena procesom opisanim u nastavku.

[0060] Jedinjenje formule (II) može se dobiti redukcijom i ciklizacijom jedinjenja formule (VI) gde su R<1>i R<2>definisani u formuli (I). Stručnjak razume da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za ovaj tip reakcije. Redukcija nitro grupe može, na primer, da se izvrši hidrogenacijom na 1-10 bara korišćenjem katalizatora kao što je paladijum na ugljeniku u rastvaraču kao što su THF, MeOH ili EtOH ili smešama takvih rastvarača. Može se koristiti kiselina kao što je AcOH.

[0061] Ciklizacija jedinjenja formule (VII) može se promovisati pomoću, na primer, reduktivne aminacije upotrebom redukcionog agensa kao što je NaBH(OAc)3. Ovo se može uraditi u rastvaraču kao što je 1,2-dihloroetan i AcOH na sobnoj temperaturi.

[0062] Stručnjak u ovoj oblasti shvata da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za dobijanje jedinjenja formule (VI). Može se, na primer, pripremiti alkilovanjem jedinjenja formule (IV) sa jedinjenjem formule (V) gde je LG pogodna odlazeća grupa kao što su Br ili Cl.

1

Alkilovanje se može obaviti korišćenjem niza baza za primer K2CO3u rastvaraču kao što su DMF ili NMP na ambijentalnoj ili povišenoj temperaturi.

[0063] Kao što je prikazano u Šemi 4, jedinjenje formule (II) može se dobiti reakcijom jedinjenja formule (X), gde su R<1>i R<2>definisani kao u formuli (I), sa organometalnim jedinjenjem formule (XI), gde je R<1>definisan u formuli (I), praćeno redukcijom srednjeg hemiaminala.

[0064] Organometalno jedinjenje može biti Grignard-ov reagens, i reakcija se može obaviti u rastvaraču kao što je THF, na niskoj do povišenoj temperaturi. Srednji hemiaminal može biti redukovan upotrebom pogodnog redukcionog sredstva kao što je NaBH4.

[0065] Alternativno, jedinjenje formule (II) može se napraviti putem Horner-Wadsworth-Emmons tipa reakcije kao što je prikazano u Šemi 4, koristeći hemiaminal formule (XII), gde je PG pogodna zaštitna grupa kao što je Boc, i jedinjenje formule (XIII) gde je R<2>definisan u formuli (I), i R<1>je izabran od CON(PG)2, CON(PG)C1-4alkil, ili C(O)2C1-4alkil, gde je PG pogodna zaštitna grupa kao što je MPM. Može se koristiti baza kao što je LiHMDS, i reakcija se može obaviti u rastvaraču kao što je THF, na niskoj do sobnoj temperaturi. Zaštitna grupa ili grupe se uklanjaju pomoću pogodnog postupka, kako bi se dobilo jedinjenje formule (II).

[0066] Jedinjenje formule (XII) može se dobiti zaštitom i redukcijom jedinjenja formule (X).

Pogodna zaštitna grupa kao što je Boc može biti vezana pomoću postupaka poznatih u literaturi. Sledeća redukcija može biti izvedena sa redukcionim sredstvom kao što je LiEt3BH u rastvaraču kao što je THF na niskoj temperaturi.

1

[0067] Jedinjenje formule (X) može se formirati redukcijom i ciklizacijom jedinjenja formule (IX). Stručnjak razume da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za ovaj tip reakcije.

Redukcija se može izvesti, na primer, sa redukcionim sredstvom kao što je gvožđe u rastvaraču kao što je AcOH na povišenoj temperaturi.

[0068] Stručnjak u ovoj oblasti shvata da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za dobijanje jedinjenja formule (IX). Može se, na primer, pripremiti kao što je prikazano u Šemi 4 alkilacijom jedinjenja formule (IV) sa jedinjenjem formule (VIII), gde je LG pogodna odlazeća grupa kao što su Br ili Cl. Alkilovanje se može obaviti korišćenjem baze kao što je K2CO3u rastvaraču kao što su DMF ili NMP, na ambijentalnoj ili povišenoj temperaturi.

[0069] Kao što je prikazano u Šemi 5, jedinjenje formule (IIb) može se dobiti redukcijom i ciklizacijom jedinjenja formule (XV) gde su R<1>i R<2>su definisani u formuli (I) i R<3>je kao u formuli (Ia).

[0070] Stručnjak razume da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za ovaj tip reakcije.

Redukcija se može izvesti, na primer, sa redukcionim agensom kao što je gvožđe u rastvaraču kao što je AcOH na povišenoj temperaturi.

[0071] Stručnjak u ovoj oblasti shvata da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za dobijanje jedinjenja formule (XV). Može se, na primer, pripremiti alkilovanjem jedinjenja formule (IV) sa jedinjenjem formule (XIV) gde je R<3>definisan kao u formuli (Ia), i LG je pogodna odlazeća grupa kao što su Br ili Cl. Alkilovanje se može obaviti korišćenjem organske ili neorganske baze kao što je i-PrEt2N, TEA, DBU ili K2CO3u rastvaraču kao što su THF, DMF ili NMP na sobnoj ili povišenoj temperaturi.

1

[0072] Jedinjenje formule (IIc) može se formirati asimetričnom redukcijom jedinjenja formule (XVIII) gde su R<1>i R<2>definisani u formuli (I) i R<3>je definisan kao u formuli (Ia) i Y = NH ili O. Redukcija se može postići hidrogenacijom na 5 - 50 bara na povišenoj temperaturi koristeći rutenijum, rodijum ili iridijum hiralne katalizatore kao što su, ali bez ograničenja, [(R)-Binap RuCl(p-cym)]Cl, (S,S)[Ph-BPE Rh COD]BF4, [Ir(COD)Cl]2/(R)-Taniafos (Ph), [Ir(COD)Cl]2/ (R)-PPhos, [Ir(COD)Cl]2/ (R)- XylPPhos, Rh(COD)2BF4/(1R,1'R,2S,2'S) Duanfos u prisustvu aditiva (Lewis ili Bronsted kiseline, ili organske baze, ili jod) kao što je prikazano na hiralnom katalizatoru (S,S)[Ph-BPE Rh COD]BF4i Zn(OTf)2u rastvaraču kao što je EtOH.

[0073] Jedinjenje formule (XVIII) može se dobiti alkilovanjem i ciklizacijom jedinjenja formule (XVI) sa jedinjenjem formule (XVII), gde je LG izlazna grupa kao što je hlor. Ovo se može uraditi pomoću baze kao što je K2CO3u rastvaraču kao što je NMP na povišenoj temperaturi ili bazom kao što je DIPEA, DBU ili TEA u rastvaraču kao što je THF ili EtOH na povišenoj temperaturi.

[0074] Jedinjenje formule (XVI) može se dobiti redukcijom jedinjenja formule (IV).

Stručnjak razume da postoji mnoštvo pogodnih postupaka za ovaj tip reakcije, na primer, korišćenjem Na2S2O4, i bazu kao što je K2CO3u vodi.

[0075] Zaštita i deprotekcija funkcionalnih grupa su opisani u Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed, T.W. Greene i P.G.M. Wuts, Wiley-Interscience (2006) i Protecting Groups, 3rd Ed, P.J. Kocienski, Georg Thieme Verlag (2005).

[0076] Dalje otelotvorenje obuhvata farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule (I).

[0077] So jedinjenja formule (I) može imati prednost zbog jednog ili više svojih hemijskih ili fizičkih svojstava, kao što je stabilnost na različitim temperaturama i vlažnostima, ili poželjna

1

rastvorljivost u H2O, ulju ili drugom rastvaraču. U nekim slučajevima, so se može koristiti za pomoć u izolaciji ili prečišćavanju jedinjenja. U nekim otelotvorenjima (posebno kada je so namenjena za primenu životinji, npr. čoveku, ili je reagens za upotrebu u dobijanju jedinjenja ili soli namenjene za primenu životinji), so je farmaceutski prihvatljiva.

[0078] Izraz „farmaceutski prihvatljiv“ se koristi da se okarakteriše deo (npr., so, dozni oblik ili ekscipijent) kao pogodan za upotrebu u skladu sa zdravom medicinskom procenom.

Uopšteno, farmaceutski prihvatljivi ostatak ima jednu ili više koristi koje prevazilaze bilo koji štetan efekat koji grupa može imati. Štetni efekti mogu uključivati, na primer, prekomernu toksičnost, iritaciju, alergijski odgovor i druge probleme i komplikacije.

[0079] Kada je jedinjenje dovoljno kiselo, farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na, so alkalnog metala, npr. Na ili K, so zemno alkalnog metala, npr. Ca ili Mg, ili so organskog amina. Kada je jedinjenje dovoljno bazično, farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na, neorganske ili organske kisele adicione soli.

[0080] Može biti više od jednog katjona ili anjona u zavisnosti od broja naelektrisanih funkcija i valence katjona ili anjona.

[0081] Za pregled pogodnih soli, pogledati Berge i dr., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19 ili Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, selection and use, P.H. Stahl, P.G. Vermuth, IUPAC, Wiley-VCH, 2002.

[0082] Kada je kiseli ili bazni ko-former čvrsta supstanca na sobnoj temperaturi, i ne postoji ili postoji samo delimični prenos protona između jedinjenja formule (I) i takvog kiselog ili banzog ko-formera, ko-kristal ko-formera jedinjenja formule (I) može rezultovati u nečemu drugom osim soli. Svi takvi ko-kristalni oblici jedinjenja formule (I) su ovde obuhvaćeni.

[0083] Takođe treba razumeti da određena jedinjenja formule (I) može postojati u solvatnom obliku, npr. hidrate, uključujući solvate farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule (I).

[0084] U sledećoj varijanti, određena jedinjenja formule (I) mogu postojati kao racemati i racemske smeše, pojedinačni enantiomeri, pojedinačni diastereomeri i diastereomerne smeše. Određena jedinjenja formule (I) mogu takođe da sadrže veze (npr. veze ugljenik-ugljenik,

1

veze ugljenik-azot veze, kao što su amidne veze) gde je rotacija veze ograničena na tu određenu vezu, npr. ograničenja koja su rezultat prisustva prstena ili dvostruke veze.

Stereoizomeri se mogu razdvojiti pomoću konvencionalnih tehnika, npr. hromatografijom ili frakcionom kristalizacijom, ili stereoizomeri mogu biti napravljeni stereoselektivnom sintezom.

[0085] U sledećoj varijanti, jedinjenja formule (I) obuhvataju bilo koje izotopski obeležene (ili „radio-obeležene“) derivate jedinjenja formule (I). Takav derivat je derivat jedinjenja formule (I) gde su jedan ili više atoma zamenjeni atomom koji ima atomsku masu ili maseni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se tipično nalazi u prirodi. Primeri radionuklida koji mogu biti uključeni uključuju<2>H (takođe se piše kao „D“ za deuterijum).

[0086] U sledećoj varijanti, jedinjenja formule (I) mogu se primenjivati u obliku proleka koji se razbija u ljudskom ili životinjskom telu kako bi se dobilo jedinjenje formule (I). Primeri prolekova uključuju in vivo hidrolizujuće estre jedinjenja formule (I).

[0087] In vivo hidrolizabilni (ili rascepljivi) estar jedinjenja formule (I) koji sadrži karboksi ili hidroksi grupu je, na primer, farmaceutski prihvatljiv estar koji se hidrolizuje u ljudskom ili životinjskom telu kako bi se proizvela matična kiselina ili alkohol. Za primere derivata esternih prolekova, pogledati: Curr. Drug. Metab.2003, 4, 461.

[0088] Različiti drugi oblici prolekova su poznati u struci. Za primere derivata proleka, pogledati: Nature Reviews Drug Discovery 2008, 7, 255 i reference koje su tamo citirane. PRIMERI

[0089] Sledeći primeri su neograničavajući primeri. Mđuproizvodi i Primeri navedeni u nastavku su imenovani upotrebom ACD/Labs 2012. U primerima, HRMS spektralni podaci su dobijeni upotrebom TOF-MS na XEVO, LCTp sistemu, od Waters, Agilent q-TOF 6530 ili Bruker micrOTOF-Q.

[0090] Maseni spektri su zabeleženi na LC-MS sistemu koji se sastoji od waters zq, w3100 ili sqd elektrospreja, koristeći LC-agilent 1100, acquity hss ili acquity beh LC sisteme.

[0091]<1>H NMR merenja su izvedena na Jeol EX270 Eclipse, Bruker 400, 500 i 600 spektrometrima, koji rade na<1>H frekvencijama od 270, 400, 500 i 600 MHz, respektivno, na

2

temperaturi okoline, osim ako nije drugačije navedeno. Hemijski pomaci su dati u ppm sa rastvaračem kao internim standardom. Hromatografske separacije su izvedene upotrebom Biotage silika gela KP-Sil Snap Cartridge ili Merck silika gel 60 (0,063-0,200 mm). Flashhromatografija je izvedena koristeći ili standardne staklene ili plastične kolone ili na Biotage SP1 ili SP4 sistemu.

[0092] Reakcije izvedene u mikrotalasnom reaktoru izvedene su u Biotage inicijatoru.

Reakcije izvedene u H-Cube® izvedene su u H-Cube® kontinualnom hidrogenacionom reaktoru od ThalesNano, koristeći pakovanje katalizatora (CatCart®). Separatori faza koji se koriste u eksperimentu su ISOLUTE Phase Separator Columns dostupni od Biotage.

[0093] HPLC separacije su izvršene na Gilson HPLC sistemima sa gradijentom Trilution LC v.1.4 Software i UV/VIS detektorom 155, koristeći ili XBridge C18 kolonu (10 µm 250 x 19 ID mm ili 10 µm 250 x 50 ID mm) i gradijentom ACN u H2O/ACN/NH395/5/0,2 puferu ili Kromasil C8 koloni (10 µm 250 x 20 ID mm ili 10 µm 250 x 50 ID mm) i gradijentom ACN u H2O/ACN/FA 95/5/0,2 puferu. Protok za manje kolone bio je 19 mL/min, i za veće kolone 100 mL/min. Alternativno je korišćen Waters Fraction Lynx Purification System sa MS pokrenutim prikupljanjem fragmenata, koristeći Sunfire Prep C18 kolonu (5 µm OBD, 19 x 150 mm) i gradijent ACN u 0,1 mM FA (pH = 3) ili Xbridge C18 kolonu (5 µm OBD, 19 x 150 mm), i gradijent ACN u 0,2% NH3 (pH = 10). Maseni spektri su zabeleženi na Waters ZQ pojedinačnom kvadropolu ili Waters 3100 pojedinačnom kvadropolu, gde su oba opremljena pneumatskim interfejsom sa elektrosprejom. Alternativno, korišćen je sistem za prečišćavanje sa vodenim faktorom (MS) koji je bio aktiviran sa MS pokrenutim fragmenatom, korišćenjem ili Phenomenex Luna Hilic kolone(5 µM 250 x 30 ID mm) ili Waters Viridis 2-EP kolone (5 µM 250 x 30 ID mm), bilo izokratske ili korišćenje gradijenta MeOH/DEA 100/0,5 u CO2, 120 bara na 40°C. Maseni spektri su zabeleženi na Waters ZQ pojedinačnom kvadropolu ili Waters 3100 pojedinačnom kvadropolu, gde su oba opremljena sa pneumatskim interfejsom sa elektrosprejom.

[0094] Analiza difrakcije X-zraka je izvedena u skladu sa standardnim postupcima, koje se mogu naći u, npr. A.I. Kitaigorodsky (1973), Molecular Crystals and Molecules, Academic Press, New York; C.W. Bunn (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, London; ili H.P. Klug i L.E. Alexander (1974), X-ray Diffraction Procedures, John Wiley & Sons, Inc., New York. Podaci rendgenske difrakcije praška su mereni sa Corundum kao unutrašnja referenca. Obrazac rendgenske difrakcije praška (koja se ovde označava kao XRPD) je određen postavljanjem uzorka na držač nulte pozadine, pojedinačni kristal silicijuma i širenje uzorka u tanki sloj. Difrakcija rendgenske difrakcije praška je zabeležena sa teta-teta PANalitical X'Pert PRO (talasna dužina X-zraka 1,5418 Å nikl-filtrirano Cu zračenje, Napon 45 kV, emisija filamenta 40 mA). Korišćene su automatske promenljive divergencije i prorezi protiv rasipanja i uzorci su rotirani tokom merenja. Uzorci su skenirani od 2 - 50°2Teta koristeći širinu koraka od 0,013° i vreme prebrojavanja od 44,37 s, zajedno sa detektorom PXCEL (aktivna dužina 3,35°2Teta). Rendgenska difrakcija praška (XRPD) je dobijena u Bragg-Brentano geometriji. Poznato je da se može dobiti obrazac rendgenske difrakcije praška koji ima jednu ili više grešaka merenja u zavisnosti od uslova merenja, kao što je upotrebljena oprema ili mašina (Jenkins, R & Snyder, R.L. Introduction to X-Ray Powder Diffractometry John Wiley & Sons 1996; Bunn, C.W. (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, London; Klug, H. P. & Alexander, L. E. (1974), X-Ray Diffraction Procedures). Stručnjaci u oblasti rendgenske difrakcije praška će shvatiti da na relativni intenzitet pikova mogu uticati, na primer, zrna veličine od 30 mikrona i ne-unitarni aspekti odnosa koji mogu uticati na analizu uzoraka. Dalje, treba razumeti da intenziteti mogu fluktuirati u zavisnosti od eksperimentalnih uslova i pripreme uzorka (npr. poželjna orijentacija). Za relativni intenzitet (%) korištene su sledeće definicije: 25 - 100%, vs (vrlo jako); 10 - 25%, s (jako); 3 - 10%, m (srednje); 1 - 3%, v (slabo). Stručnjak će takođe shvatiti da položaj refleksije može biti pod uticajem precizne visine na kojoj se uzorak nalazi u difraktometru i nulte kalibracije difraktometra. Planarnost površine uzorka može takođe imati mali efekat. Stoga prikazane podatke difrakcionog uzorka ne treba uzeti kao apsolutne vrednosti. Generalno, greška merenja difrakcionog ugla u rendgenskom difraktogramu praška može biti približno plus ili minus 0,2°2-teta, i takav stepen greške merenja treba uzeti u obzir prilikom razmatranja podataka rendgenske difrakcije praška. Optička rotacija je određena korišćenjem Perkin Elmer 341. Specifična optička rotacija je prikazana kao

(rastvarač, c = 1) gde c = 1 znači 10 mg/mL i

znači da je optička rotacija određena na 20°C korišćenjem Na linije.

Uobičajeno je da se koristi nekoliko postupaka za određivanje apsolutne konfiguracije hiralnih centara u malim organskim jedinjenjima, uključujući rendgensku difrakciju monokristala, NMR u kombinaciji sa hiralnom derivatizacijom, strukturni dokaz na osnovu sintetičkih transformacija, optičke rotacije i ECD. Skoriji postupak je VCD koja se može primeniti na većinu farmaceutskih proizvoda sa razumnom veličinom i fleksibilnošću. Ona se zasniva na upoređivanju eksperimentalnog i izračunatog spektra, gde je poslednji prosek pojedinačnih spektara svih niskoenergetskih konformera molekula prema Boltzmann-ovoj distribuciji. Postupak može biti veoma brz jer se spektri dobijaju u rastvoru. U slučajevima kada je jedan kristal težak i treba dosta vremena za njegovo dobijanje, posebno je vredan. Objavljeni su mnogi primeri koji se takođe primenjuju na jedinjenja nalik na lekove (Appl. Spectrosc. 2011, 65, 699, Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 4208, Bioorg. Med. Chem.Lett. 2013, 14, 4019, J. Med. Chem.2014, 57, 477).

SKRAĆENICE

[0095] Koriste se sledeće skraćenice

ACN

acetonitril

AcOH

sirćetna kiselina

aq.

vodeni

Boc

terc-butiloksikarbonil

br

široko

BuOAc

butil acetat

BuLi

butil litijum

C

Celzijus

Calcd

Izračunato

CV

zapremina kolone

d

dublet

dd

2

dublet dubleta

dba

1,5-difenilpenta-1,4-dien-3-on

DBU

2,3,4,6,7,8,9,10-oktahidropirimido[1,2-a]azepin DCM

dihlorometan

DIBAL-H

diizobutilaluminijum hidrid

DIPEA

N, N-diizopropiletilamin

DIPHOS

bis (difenilfosfino)etan

DMA

N, N-dimetilacetamid

DMAP

4-(dimetilamino)piridin

DMF

N, N-dimetilformamid

DMHA HCl

N, O-dimetilhidroksilamin hidrohlorid

ECD

elektronski kružni dikroizam

ee

enantiomerni višak

Et2O

dietil etar

DMSO

dimetilsulfoksid

EtOAc

etil acetat

EtOH

etanol

FA

mravlja kiselina

Fe(acac)3

tris((Z)-4-oksopent-2-en-2-iloksi)gvožđe g

gram

h

sat(i)

HPLC

hromatografija visokih performansi HRMS

masena spektrometrija visoke rezolucije Hz

Herc

J

konstanta uparivanja

LC

tečna hromatografija

LBD

domen za vezivanje liganda

LiHMDS

litijum bis(trimetilsilil)amid

m

multiplet

MCPBA

3-hlorobenzoperoksoinska kiselina MeOH

metanol

MEA

metil amin

mg

milligram

MHz

megaherc

min

2 minuti

mL

mililitar

mmol

milimol

MS

maseni spektar

MPM

4-metoksibenzil

MTBE

metil terc-butil etar

NMM

N-metilmorfolin

NMP

N-metilpirolidon

NMR

nuklearna magnetna rezonanca

OAc

acetat

PE

petroleum etar

Pd2(dba)3

tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0)

PyBOP

(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-iloksi)-tirpirolidin-1-ilfosfonijum heksafluorofosfat(V) q

kvartet

rt

sobna temperatura

s

singlet

sat.

zasićen

T3P

2

ciklični anhidrid 1-propanfosfonske kiseline

t

triplet

TBAF

tetra-n-butil amonijum fluorid

TBDPS

t-butildifenilsilil

TBPTA

t-butilfenil fosfinotioične kiseline

TBTU

O-(benzotriazol-1-il)-N,N, N', N'-tetrametiluronijum tetrafluoroborat

t-BuOH

terc butil alkohol

TFA

trifluorosirćetna kiselina

Tf

trifluorometansulfonat

THF

tetrahidrofuran

UV

ultraljubičasto

VCD

tetrahidrofuran

Xant Phos

9,9-dimetil-4,5-bis(difenilfosfino)ksanten

PRIPREMA MEĐUPROIZVODA

Međuproizvod 1

Metil (2E)-4-(2-nitrofenoksi)but-2-enoat

[0096] Metil-(2E)-4-bromobut-2-enoat (28,2 g, 0,158 mol) je dodat kapanjem do 2-nitrofenola (20 g, 0,144 mol) i K2CO3(29,8 g, 21,6 mol) u N,N-dimetilformamidi (240 mL) na sobnoj temperaturi. Rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata.

2

Smeša je rastvorena sa EtOAc (2,0 L) i oprana sa vodom (1,0 L), zasićenim vodenim Na2CO3(1,0 L) i rasolom (1,0 L). Organska faza je razdvojena, osušena preko nevodenog Na2SO4, filtrirana i isparena u vakuumu kako bi se dobio željeni proizvod (27,4 g, 80%) kao čvrsta supstanca.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 3,69 (3H, s), 5,00 (2H, dd), 6,16 (1H, td), 7,04 (1H, td), 7,16 (1H, t), 7,36 (1H, d), 7,67 (1H, ddd), 7,93 (1H, dd).

MS m/z 238 (M+H)<+>.

Međuproizvod 2

Metil 3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-ilacetat

[0097] Gvozdena prašina (28,7 g, 0,51 mol) je dodata Međuproizvodu 1 (20,3 g, 0,086 mol) u sirćetnoj kiselini (304 mL) i vodi (30,4 mL) na sobnoj temperaturi. Rezultujući rastvor suspenzije je mešan na 80°C tokom 2,5 sati. Rastvarači su uklonjeni isparavanjem u vakuumu i 500 mL EtOAc je dodato. Čvrste supstance su filtrirane i oprane sa EtOAc. Rezultujući rastvor je opran sa vodom (500 mL). Vodena faza je ekstrakovana nazad sa EtOAc (2 x 500 mL). Kombinovani organski sloj je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(500 mL) i rasolom (500 mL). Kombinovani organski sloj je osušen preko nevodenog Na2SO4, filtriran i koncentrisan rotacionim isparavanjem pod vakuumom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (17,0 g, 96%) kao žuto ulje.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 2,47-2,59 (2H, m), 3,65 (3H, s), 3,69-3,74 (1H, m), 3,87 (1H, dd), 4,12 (1H, dd), 5,80 (1H, s), 6,49 (1H, ddd), 6,62 (1H, dd), 6,67-6,70 (2H, m).

MS m/z 208 (M+H)<+>.

Međuproizvod 3

Metil {14-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat

[0098] T3P (50% rastvor u EtOAc, 61,5 g, 96,6 mmol) je dodat do 3-okso-3,4-dihidro-2H-,4-benzoksazin-6-karboksilnekiseline (10,3 g, 53,1 mmol), metil 3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-ilacetata (Međuproizvod 2, 10,0 g, 48,3 mmol) i TEA (26,8 mL, 193,2 mmol) u EtOAc (125 mL) na sobnoj temperaturi. Rezultujuća smeša je mešana na 75°C tokom 16 sati. Rezultujući rastvor je rastvoren sa 350 mL EtOAc i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3rastvorom (160 mL), 0,5 M HCl rastvorom (160 mL) i rasolom (160 mL). Organska faza je osušena preko nevodenog Na2SO4, filtrirana i isparena kako bi se dobio sirov

2

proizvod. Sirov proizvod je pročišćen re-kristaizacijom od MeOH kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (10,1 g, 55%) kao bela čvrsta supstanca.

MS m/z 383 (M+H)<+>.

Međuproizvod 4

Etil {4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat

[0099] T3P (50% rastvor u EtOAc, 132,4 g, 0,208 mol) je dodat do 3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-karboksilne kiseline (22,1 g, 0,114 mol), etil-2-(3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetata (23,0 g, 0,104 mol) i TEA (57,9 mL, 0,416 mol) u EtOAc (139 mL) na sobnoj temperaturi. Rezultujuća smeša je mešana na 75°C tokom 16 sati. Rezultujući rastvor je rastvoren sa 800 mL EtOAc i opran sa vodenim zasićenim NaHCO3rastvorom (300 mL), 0,5 M HCl rastvorom (300 mL) i rasolom (300 mL). Organska faza je osušena preko nevodenog Na2SO4, filtrirana i isparena kako bi se dobio sirov proizvod. Sirov proizvod je pročišćen re-kristaizacijom od MeOH kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (14,5 g, 35%) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 1,17 (3H, t), 2,54 (2H, d), 4,01-4,12 (2H, m), 4,35 (2H, d), 4,65 (2H, s), 4,87 (1H, t), 6,71 (1H, dt), 6,92 (2H, d), 7,01 (2H, dt), 7,09 (1H, d), 10,81 (1H, brs).

MS m/z 397 (M+H)<+>.

Međuproizvod 5

{4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetna kiselina

[0100] NaOH (2 M, 0,39 mL, 0,78 mmol) je dodat suspenziji etil {4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetata (Međuproizvod 4, 154 mg, 0,39 mmol) u smeši THF (2 mL)/voda (2 mL)/EtOH (4 mL) dajući bistar rastvor. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i zatim je 1 M HCl (10 mL) dodato i smeša je ekstrakovana sa EtOAc (3 x 10 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni provlačenjem kroz fazni razdvajač i koncentrisani do suvoće u vakuumu kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (146 mg, 102%) kao bela čvrsta supstanca koja sadrži 3% EtOAc po težini.

2

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,41 - 2,48 (m, 2H), 4,23 - 4,4 (m, 2H), 4,64 (s, 2H), 4,73 -4,84 (m, 1H), 6,72 (t, 1H), 6,89 - 6,96 (m, 3H), 6,96 - 7,07 (m, 2H), 7,08 (d, 1H), 10,85 (s, 1H), 12,45 (br s, 1H).

HRMS m/z izračunat za [C19H16N2O6+ H<+>]: 369,1086, primećeno 369,1083.

Međuproizvod 6

terc-Bulil 7-fluoro-3-okso-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat

[0101] 7-Fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-one (7,0 g, 41,9 mmol) i di-terc-butil dikarbonat (10,6 mL, 46,1 mmol) je rastvoren u THF (130 mL). DMAP (0,512 g, 4,19 mmol) je dodat. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. EtOAc (200 mL) je dodat i smeša je oprana sa HCl (0,5 M, 50 mL), zasićenim vodenim NaHCO3(100 mL) i rasolom. Smeša je osušena kroz fazni razdvajač i isparena kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (11,6 g, 104%) kao sirovo ulje.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,62 (s, 9H), 4,57 (s, 2H), 6,73 - 6,82 (m, 2H), 7,19 - 7,26 (m, 1H).

Međuproizvod 7

terc-Bulil 7-fluoro-3-hidroksi-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat

[0102] terc-Butil 7-fluoro-3-okso-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat (Međuproizvod 6, 2,22 g, 8,31 mmol) je rastvoren u THF (20 mL) i ohlađen do -78°C. DIBAL-H (1 M u toluenu, 10,8 mL, 10,8 mmol) je dodat pri stopi koja održava temperaturu reakcije ispod -70°C, i reakcija je zatim mešana na -78°C tokom 50 minuta. Hlađenje je uklonjeno i reakcija je ugašena sa NH4Cl (vodenim zasićenim 10 mL). Smeši je omogućeno da dostigne sobnu temperaturu. Reakciona smeša je rastvorena sa DCM i Rochelle-ovom soli (30% vodena, 100 mL) i ekstrakovana sa DCM (2 x 100 mL). Organske supstance su kombinovane, oprane sa rasolom, osušene preko magnezijum sulfata, filtrirane kroz fazni razdvajač i koncentrisane kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2,23 g, 100%) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,58 (s, 10H), 4,09 (dd, 1H), 4,29 (dd, 1H), 5,87 - 5,99 (m, 1H), 6,62 - 6,75 (m, 2H), 7,91 (s, 1H).

Međuproizvod 8

terc-Butil 3-(2-etoksi-2-oksoetil)-7-fluoro-23-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat

[0103]

Korak 1. Na -78°C, litijum trietilhidroborat (1 M u THF, 52,1 mL, 52,1 mmol) je dodat kapanjem ohlađenom (suvi led/aceton) rastvoru terc-butil 7-fluoro-3-okso-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilata (Međuproizvod 6, 11,6 g, 43,4 mmol) u THF (180 mL). Reakciona smeša je mešana na -78°C tokom 1,5 sati. Zasićena vodena Na2CO3(55 mL) je dodata i smeša je zagrejana do ca -20°C. H2O2(30% u voda, 55 mL) je dodat kapanjem uz održavanje niske temperature. Reakciona smeša je mešana na -10°C tokom 30 minuta. Smeša je filtrirana kroz celit, ispirajući čep sa THF.

Koncentrisana je na rotacionom isparavaču do ∼150 mL. EtOAc (200 mL) je dodat. Smeša je oprana sa rasolom, osušena kroz fazni razdvajač i isparena u vakuumu. Sirovi hemiaminal (Međuproizvod 7) je dobijen kao žuta čvrsta supstanca i korišćen je bez pročišćavanja.

Korak 2. Na 0°C, LiHMDS (1 M u THF, 87 mL, 87 mmol) je dodata polako (temperatura <5°C) etil 2-(dietoksiphosphoril)acetatu (17,4 mL, 87 mmol) u THF (60 mL). Reakciona smeša je mešana tokom 15 minuta. Gornji sirovi hemiaminal (Međuproizvod 7) je rastvoren u THF (90 mL) i dodat kapanjem ohlađenom rastvoru. Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 1 sata. Ledena kada je uklonjena i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 sati. Dodatni LiHMDS (1 M u THF, 21,7 mL, 21,7 mmol) je dodat i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Dodatni Horner-Wadsworth-Emmons-reagens je pripremljen mešanjem etil 2-(dietoksiphosphoril)acetata (4,34 mL, 21,7 mmol) i LiHMDS (1 M u THF, 21,7 mL, 21,7 mmol) u THF (20 mL) uz hlađenje na ledu. Mešano je na ledu tokom 30 minuta. Rastvor je pažljivo dodat reakcionoj smeši i mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. EtOAc (300 mL) je dodat, opran sa zasićenim vodenim Na2CO3(250 mL), zasićenim vodenim NaHCO3(100 mL), HCl (0,5 M, 100 mL) i rasolom. Organski sloj je razdvojen i osušen preko Na2SO4i isparen nakon filtracije. Ostatak je pročišćen automatizovnaom fleš hromatografijom na Biotage® KP-SIL 340g koloni. Gradijent od 5% do 25% EtOAc u heptanu preko 5 CV je korišćen kao mobilna faza. Jedinjenje iz naslova (6,69 g, prinos 45,4%) je prkupljeno koristeći talasnu dužinu 250/285 nm za detekciju.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,26 (t, 3H), 1,54 (s, 9H), 2,47 (dd, 1H), 2,57 (dd, 1H), 4,08 -4,21 (m, 3H), 4,37 (d, 1H), 5,01 (s, 1H), 6,56 - 6,69 (m, 2H), 7,79 (s, 1H).

MS m/z 340,2 (M+H)<+>.

Međuproizvod 9

1

Etil (2E)-4-(5-fluoro-2-nitrofenoksi)but-2-enoat

[0104] Smeša 3-fluoro-6-nitrofenola (200 g, 1,27 mol), nevodenog K2CO3(202 g, 1,46 mol) i NMP (1,2 L) pod atmosferom azota je mešana na 25°C tokom 30 minuta. Etil 4-bromokrotonat (80% tech., 252 mL, 1464 mmol) je dodat tokom 2-3 min dobijenoj crvenoj suspenziji i rezultujuća smeša je mešana preko noći na ambijentalnoj temperaturi. Žućkasta suspenzija je zatim sipana u led-vodu (8,0 L) pod mešanjem. Nakon mešanja tokom 1 sata čvrste supstance su filtrirane, oprane sa vodom (5 x 1,0 L), heptanom (4 x 0,50 L) i zatim osušene preko noći na 50°C u vakuumu dajući jedinjenje iz naslova (332 g, 1,20 mmol, 98% w/w, 95% prinos).

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,31 (t, 3H), 4,23 (q, 2H), 4,82 (dd, 2H), 6,31 (dt, 1H), 6,71 -6,82 (m, 2H), 7,04 (dt, 1H), 8,00 (dd, 1H)..

Međuproizvod 10

Etil (7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetat

[0105] Etil (2E)-4-(5-fluoro-2-nitrofenoksi)but-2-enoat (Međuproizvod 9, 310 g, 1,09 mol) rastvoren u AcOH (1,4 L) je dodat kapanjem tokom jednog sata suspenziji gvozdenog praška (325 mreža, 305 g, 5,47 mol) u AcOH (0,90 L) na 60°C pod atmosferom azota. Temperatura je održavana na 60 - 75°C tokom dodavanja. Nakon završetka dodavanja rezultujuća smeša je mešana na 70°C tokom 30 minuta pre nego što je ohlađena do sobne temperature. Čvrste supstance su filtrirane i oprane sa AcOH (2,5 L). Filtrat je koncentrisan do suvoće i ostatak je rastvoren u EtOAc (2,0 L). Rastvor je opran sa limunskom kiselinom (vodena, 10% w/w, 2 x 1,0 L), Na2CO3(10% w/w, 500 mL) i voda (1,5 L). Rastvor je zatim koncentrisan do suvoće i dobijeni ostatak je rastvoren u i-PrOAc (500 mL). Koncentrisanje do suvoće je još jednom dalo ostatak koji je pročišćen kolonskom hromatografijom na silicijum dioksidu koristeći heptan/EtOAc (4:1) kao eluent. Jedinjenje iz naslova (236 g, 0,986 mol, 98% w/w, 88% prinos) je dobijeno kao ulje.

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, 3H), 2,52 (d, 2H), 3,80 (qd, 1H), 3,94 (dd, 1H), 4,20 (dt, 3H), 4,33 (s, 1H), 6,47 - 6,59 (m, 3H).

Međuproizvod 10a i 10b, Postupak A

Etil [(3S ili 3R)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0106] Dva enantiomera od etil (7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetata (433 g, 1,76 mol) su razdvojena na NovaSep SFC opremljenom sa ChiralPak AD kolonom (250 x 110 mm, 20 µm veličina čestica) i EtOH/TEA 100/0,1 kao eluentom.

2

Međuproizvod 10a, Postupak A

Etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-14-benzoksazin-3-il]acetat

[0107] Prvo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 1 jedinjenja iz naslova [(201 g, 0,848 mol, 99,6% ee pomoću hiralne HPLC (Chiralpak AD 250 x 110 mm 20 µm, eluiranje sa EtOH/TEA 100/0,1 na sobnoj temperaturi, detektovanje na 270 nm) i >99,5% ee pomoću F NMR sa reagensom hilarnog pomaka ((R)-TBPPTA), 48,3% prinos,

(c 1,0, ACN)].

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, 3H), 2,52 (d, 2H), 3,81 (qd, 1H), 3,95 (dd, 1H), 4,13 -4,25 (m, 3H), 4,33 (s, 1H), 6,46 - 6,59 (m, 3H).

Međuproizvod 10b, Postupak A

Etil [(3R)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0108] Drugo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 2 jedinjenja iz naslova [(192 g, 0,802 mol, 96,6% ee pomoću hiralne HPLC (Chiralpak AD 250 x 110 mm 20 µm, eluiranje sa EtOH/TEA 100/0,1 na sobnoj temperaturi, detektovanje na 270 nm) i, 96,3% ee pomoću F NMR sa reagensom hilarnog pomaka ((R)-TBPPTA), 45,7% prinos,

(c 1,0, ACN)].

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, 3H), 2,52 (d, 2H), 3,81 (qd, 1H), 3,95 (dd, 1H), 4,14 -4,25 (m, 3H), 4,33 (s, 1H), 6,46 - 6,59 (m, 3H).

Međuproizvod 10a, Postupak B

Etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0109] (S,S) [Ph-BPE Rh COD]BF4(0,10 mol%, 1,7 g) je napunjen u hidrogenator praćeno sa Zn(OTf)2(4,0mol%, 30,6 g) i etanol (70 mL). Hidrogenator je zatim pročišćen sa azotom (3 puta). Etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetat (Međuproizvod 11, 500 g) je rastvoren u etanolu (3930 mL) na 45°C. Rezultujući rastvor je degaziran (3 x vakuum praćeno sa azotom) i napunjen u hidrogenator (N2transfer) koristeći degaziran etanol (1000 mL) kao linijsko ispiranje. Hidrogenator je pročišćen sa 5 bara azot (3 puta) zatim 10 bara vodonika (3 puta). Reakcija je zatim zagrejana na 50°C/10 bara vodonika tokom 18 sati (mešanje 1000 o/min) nakon čega je HPLC ukazao da je reakcija završena. Nakon hlađenja do sobne temperature, rastvarač je uklonjen u vakuumu i ostatak je kombinovan sa sirovim proizvodom iz tri prethodne 500 g reakcije. Kombinovan ostatak je rastvoren u EtOAc (400 mL). Heptan (1600 mL) je dodat i rastvor je stavljen na silika ploču (2 Kg) i eluiran sa 10%-30% EtOAc. Fragmenti proizvoda su uklonjeni kako bi se dobio željeni proizvod kao braon ulje (2052 g, kvantitativno).<1>H NMR je potvrdio identitet proizvoda i hiralna HPLC ukazuje na ee od 99,03%.

<1>H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 1,26 (t, 3H), 2,49 (d, 2H), 3,78 (qd, 1H), 3,91 (dd, 1H), 4,11 -4,22 (m, 3H), 4,32 (br s, 1H), 6,43 - 6,56 (m, 3H).

Ispitivanje katalizatora za konverziju etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetata (Međuproizvod 11) u etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat (Međuproizvod 10a).

(a) Rodijum katalizator:

[0110] Opšta procedura u 48-komoričnoj ploči:

Rastvor liganda (0,00044 mmol) u DCM (100 µL) je napunjen u 2 mL komoricu, praćeno sa izvorom metala (0,0004 mmol) u DCM (100 µL). Smeša je mešana tokom 10 minuta i zatim isparena. Rastvor etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetata (Međuproizvod 11, 0,02 mmol) i cink triflata (0,0008 mmol) u etanolu (667 µL) je zatim dodat komorici i rezultujuća smeša je hidrogenizovana na 155 psi pritisku i 50°C tokom 16 sati zatim analizirana sa hplc za konverziju u etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat (Međuproizvod 10a) i enantiomernu čistoću proizvoda.

4

(b) Ruzatimijum katalizatori

[0111] Opšta procedura u 48-komoričnoj ploči koristeći različit izvor metala i ligand:

Rastvor liganda (0,00044 mmol) u DMF (100 µL) je napunjen u 2 mL komoricu, praćeno sa izvorom metala (0,0002 mmol) u DMF (100 µL). Smeša je mešana tokom 30 minuta na 100°C zatim isparena. Rastvor etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetata (Međuproizvod 11, 0,02 mmol) i 85% w/w vodene fosforne kiseline (0,02 mmol) u etanolu (667 µL) su zatim dodati komorici i rezultujuća smeša je hidrogenizovana na 95-99 psi pritisku i 80-85°C tokom 16 sati zatim analizirana sa hplc za konverziju u etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat (Međuproizvod 10a) i enantiomernu čistoću proizvoda.

[0112] Opšta procedura u 48-komoričnoj ploči koristeći unapred formirani katalizator i promenljivu količinu aditiva:

Unapred formirani katalizator (0,00044 mmol) u DMF (200 µL) je napunjen u 2 mL komoricu. Smeša je mešana kako bi se rastvorila i zatim je isparena. Rastvor etil (2Z)-(7fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetata (Međuproizvod 11, 0,02 mmol) i 85% w/w vodene fosforne kiseline (promenljive količine) u etanolu (667 µL) je zatim dodat komorici i rezultujuća smeša je hidrogenizovana na 95-99 psi pritisku i 80-85°C tokom 16 sati zatim analizirana sa h.p.l.c. za konverziju u etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat (Međuproizvod 10a) i enantiomernu čistoću proizvoda.

(c) Iridijumski katalizatori:

[0113] Opšta procedura u 48-komoričnoj ploči:

Rastvor ligand (0,00044 mmol) u DCM (100 µL) je napunjen u 2mL komoricu, praćeno sa izvorom metala (0,0004 mmol za [Ir(COD)2]BF4; 0,0002 mmol za [Ir(COD)Cl]2) u DCM (100 µL). Smeša je mešana tokom 10 minuta i zatim je isparena. Rastvor etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetata (Međuproizvod 11,0,02 mmol) i joda (0,01 mmol) u toluenu (667 µL) je zatim dodat komorici i rezultujuća smeša je hidrogenizovana na 10 bar pritisku i 30°C tokom 16 sati i zatim analizirana sa h.p.l.c. za konverziju u etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat (Međuproizvod 10a) i enantiomernu čistoću proizvoda.

Međuproizvod 10c

Etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1n-3-il]acetat, 2-naftalensulfonat so

[0114] Etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetat (Međuproizvod 11, 20,0 g, 84 mmol) je napunjen u 250 mL stakleni autoklav. Autoklav je stavljen pod pritisak 5 puta do 3,5 bara sa azotom i zatim je 160 mL apsolutnog etanol (deoksigenovan sa 10 minuta azotnih mehurića) dodato pomoću šprica suprotno od protoka azota. Tj je podešen na 45°C i stopom mešanja do 800 o/min i reaktor je stavljen pod pritisak do 3,5 bara sa azotom 3 puta.

[0115] Rastvor Rh(S)-Ph-BPE(cod)BF4 (64 mg, 0,0796 mmol, 0,0009 ekvivalent) i Zn(OTf)2(1,25 g, 3,4 mmol, 0,040 ekvivalent) u 20 mL degazirang etanola je napunjen pomoću šprica suprotno od protoka azota. Autoklav je stavljen pod pritisak 3 puta do 3,5 bar sa azotom i zatim dvaput do 3 bara sa vodonikom pre stavljanja pod pritisak do 9,5 bar sa vodonikom. Tj je podešen na 50°C. Unos gasa je prestao nakon 5 sati i uzorak uzet nakon 14 sati ukazuje na 100% konverziju i 99,5% ee. Rastvor reakcije je premešten u bocu i izmeren (141,5g).

[0116] 20,56 g reakcione smeše je povučeno (odgovara do 2,92 g, 12,2 mmol proizvoda) i 2-naftalensulfonska kiselina (monohidrat) (2,85 g, 12,6 mmol) je dodata. Kompaktni talog je formiran i smeša je zagrejana do 80°C kako bi se dobio bistar tamno braon rastvor. Hlađenje do 20°C, filtriranje i ispirane sa 5 mL etanola, dali su, nakon sušenja u vakuumu na 40°C, etil 2-[(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat, 2-naftalensulfonat kao belu čvrstu supstancu (4,21 g, 77% prinos - korigovano testom).<1>H NMR (spektar zabeležen u DMSO-d6na Bruker Avance spektrometru koji radi na 500 MHz) δ(ppm): 8,70 (bs, 2H), 8,16 (bs, 1H), 8,00-7,95 (m, 1H), 7,93-7,88 (m, 1H), 7,87 (d, 1H, J=8,6 Hz), 7,72 (dd, 1H, J=8,6 Hz J=1,7 Hz), 7,55-7,50 (m, 2H), 6,69 (dd, 1H, J=8,7 Hz J=5,9 Hz), 6,64-6,55 (m, 2H), 4,18 (dd, 1H, J=10,8 Hz J=2,9 Hz), 4,1 (q, 2H, J=7,1 Hz), 3,90 (dd, 1H, J=10,8 Hz J=6,4 Hz), 3,71 (ddd,1H, J=6,7 Hz J=6,7 Hz J=2,8 Hz), 2,56 (dd, 1H, J=16,2 Hz J=6,4 Hz), 2,49 (dd, 1H, J=16,2 Hz J=6,9 Hz), 1,19 (t, 3H, J=7,1 Hz).

Međuproizvod 11, Postupak A

Etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetat

[0117] Etil 4-hloroacetoacetat (1 ekvivalent, 521,6 mL) je dodat rastvoru 2-amino-5-fluorofenola (488,2 g) u THF (4883 mL). Reakcija je zagrejana do 50°C i DIPEA (1 ekvivalent, 664,6 mL) je dodat kapanjem tokom 1 sata na 50-60°C. Rezultujuća reakciona smeša je zagrejana na 50°C tokom 6 sati.<1>H NMR analiza je potvrdila da je reakcija završena. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i podeljena sa MTBE (4883 mL)/voda (4883 mL). Faze su razdvojene i vodena je ekstrakovana sa MTBE (2 x 1220 mL).

Kombinovan organske supstance su oprane sa 20% težine rasolom (3 x 1220 mL), osušene preko MgSO4, filtrirane i uklonjene kako bi se dobio sirov proizvod kao tamno braon čvrsta supstanca. Sirov materijal je je kombinovan sa sirovim proizvodom dve dalje reakcije (obe 488,3 g razmera) i pročišćen putem silika ploče; materijal je uzet u DCM (600 mL) i MTBE (2810 mL). Silika (3 kg) je dodata, praćeno sa EtOAc (141 mL) i heptanom (2669 mL).

Rezultujuća suspenzija je sipana na silika ploču (9 kg) i eluirana sa 5% EtOAc u heptanu (11 x 10 L fragmenti). Fragmenti proizvoda su uklonjeni kako bi se dobila narandžasta čvrsta supstanca (2291 g). Proizvod je je kombinovan sa sirovim proizvodom druge reakcije (120 g ulaz) i ponovo pročišćen putem silika ploče, rastvoren u DCM (2,2 L) i stavljen na sliku (12 kg). Eluiran je sa 5% EtOAc u heptanu (17 x 10 L). Fragmenti proizvoda su uklonjeni kako bi se dobila žuta čvrsta supstanca (2290 g). Ova čvrsta supstanca je uzeta u heptanu (6870 mL) i zagrejana kako bi se rastvorila (60°C). Rastvor je ohlađen do 40°C i posejan sa čistim proizvodom od reakcije razmere međuproizvoda, i zatim je ohlađen do -5°C i mešan tokom 1 sata. Rezultujuća čvrsta supstanca je filtrirana, oprana sa hladnim heptanom (2 x 1 L) i rastvarači su uklonjeni u vakuumu. Dalje sušenje u vakuumskoj peći na 40°C dalo je željeno jedinjenje iz naslova kao krem-žutu čvrstu supstancu (2140 g, izračunat 72% prinos od kombinovanog unosa 2-amino-5-fluoro-fenola).

<1>H NMR (Jeol EX270 Eclipse, 270 MHz, CDCl3) δ ppm 1,27 (t, 3H), 4,15 (q, 2H), 4,54 (s,2 H), 4,64 (s, 1H), 6,58-6,67 (m, 2 H), 6,70-6,78 (m, 1H), 10,10 (br. S, 1H).

Međuproizvod 11, Postupak B

Etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetat

[0118] 5-Fluoro-2-nitrofenol (250 g, 1,591 mol) je napunjen u 5 L autoklav od nerđajućeg čelika. 7,5 g od 10% Pd/C (Escat 1931) je napunjeno, praćeno sa 1,50 L metanola.

Temperatura je podešen na 20°C i reaktor je stavljen pod pritisak 4 puta do 2 bara sa azotom i zatim je pritisak od 2 bara vodonika primenjen i stopa mešanja je podešena na 600 o/min. Reakcija je ostavljena tokom 15 sati (unos gasa je prekinuo nakon 200 minuta) dok je pritisak vodonika oslobođen i autoklav je pročišćen sa azotom. Reakciona smeša je filtrirana kroz K200 filter i prikupljen katalizator na filteru je ispran sa metanolom (250 mL).

[0119] Reakciona smeša je premešten u reaktor i etil-4-hloroacetoacetat (385 g, 2,368 mol, 1,5 ekvivalent) je dodat praćeno sa dodavanjem metanola (250 mL) za liniju ispiranja i Tj je podešen na 40°C. Smeša je mešana tokom 30 minuta i u tom trenutku Ti je 35°C. DIPEA (205,6 g, 1,594 mol, 1,002 ekvivalent) je napunjen tokom 45 minuta. Reakcija je mešana tokom dodatnih 10 minuta i u tom trenutku<19>F NMR analiza je pokazala 90 % proizvoda. Tj je podešen na 30°C i nakon 10 minuta Ti je 32°C. Etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetat seme (20 mg, pripremljen prema Primeru 11,Postupak A) je dodato i je smeša mešana tokom dodatnih 45 minuta. Voda (500 mL) je napunjen tokom 1 sata i zatim je Tbath podešen na 20°C. Nakon dodatnih 1,5 sati smeša je filtrirana. Kolač je opran sa 75 % vodenog metanola (750 mL) i osušen pod vakuumom na 40°C kako bi se dobio proizvod iz naslova (261 g; 68% korigovano testom prinos).

Međuproizvod 12

(2Z)-2-(7-Fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)-N-metilacetamid

[0120] Smeša etil (2Z)-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetata (Međuproizvod 11, 2,0 g; 8,4 mmol), MeOH (6,0 mL) i metilamina (7,3 mL 40% težine vodenog rastvora, 84,3 mmol) je zagrejana na metalnoj ploči do 35°C (temperatura blokiranja) i mešana tokom 16 sati. Tamno braon mutni rastvor je dobijen. LCMS analiza ukazuje na potrošnju početnog materijala i formiranje proizvoda. Smeša je podeljena između DCM (80 mL) i vode (80 mL). Organska faza je razdvojena, zatim koncentrisana u vakuumu i ostatak je pročišćen kolonskom hromatografijom na 40 g sicicikl silika kertrdiž eluiranju sa 0-10% EtOAc :

DCM, kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1,10 g, 58,9%) kao narandžasta kristalna čvrsta supstanca koja je potamnela vremenom.

<1>H NMR (Bruker Avance III 500, 500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,62 (d, 3H) 4,58 (s, 2H) 4,67 (s, 1H) 6,71-6,75 (m, 1H) 6,77-6,80 (dd, 1H) 7,04-7,06 (dd, 1H), 7,61-7,62 (m, 1H). MS m/z 223 (M+H)<+>.

Međuproizvod 13, Postupak A

2-[(3S)-7-Fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]-N-metil-acetamid

[0121] Etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat (Međuproizvod 10a, 50,0 g, 204,2 mmol) je rastvoren u MeOH (150 mL) u 500 mL obloženoj posudi na 20°C. Metilamin (127 mL 33% w/w rastvor u EtOH, 96 g, 1,02 mol) je dodata iz jednog dela i smeša mešana na 20°C preko noći. Rastvor je uzorkovan i primećeno je da nije dostigao kompletiranje pomoću HPLC analize. Reakcija je ostavljena da se meša dodatna 2 sata i zatim je dodat dodatni metilamin u EtOH (25,0 mL 33% w/w rastvor u EtOH; 18,9 g; 200,8 mmol) i rastvor mešana preko noći na 20°C. Rastvor je isparen u vakuumu do narandžastog ulja, i zatim je MeOH (300 mL) dodat i smeša je ponovo isparena dajući bež čvrstu supstancu, koja je ustinjena koristeći malter i tučak, zatim osušena u vakuumskoj peći na 40°C tokom 3 sati kako bi se dobio jedinjenje iz naslova (46,3 g, 99,2% prinos NMR test 98,1% w/w, 99,7% e.p. pomoću hiralne HPLC %).

<1>H NMR (Bruker Avance III 400, 400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,26 (d, 2 H) 2,59 (d, 3 H) 3,55 - 3,71 (m, 1 H) 3,81 (dd, 1 H) 4,12 (dq, 1 H) 5,59 (s, 1 H), 6,41 - 6,57 (m, 2 H), 6,57 -6,68 (m, 1 H), 7,87 (d, 1 H).

HRMS (Bruker micrOTOF-Q) izračunat za [C11H13FN2O2+ Na<+>]: 247,085875 ; primećeno: 247,084779.

Međuproizvod 13, Postupak B

2-[(3S)-7-Fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]-N-metil-acetamid

[0122] 2 mL reakcionoj bočici je dodati 100 µL rastvora 1,2-bis[(2S,5S)-2,5-difenilfosfolano]etan(1,5-cyclooctadiene)rodijum(I) tetrafluoroborata (0,004 M u DCM, 0,0004 mmol) i rastvarač je uklonjen primenom vakuuma. Ovo me je dodato 670 µL običnog rastvora (2Z ili 2E)-2-(7-fluoro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)-N-metilacetamida (Međuproizvod 12), 0,03 M, 0,02 mmol) koji sadrži 4 mol% Zn(OTf)2u MeOH. Posuda je stavljena pod pritisak sa vodonikom, i reakcija je puštena na 331 psi vodonika na 50°C tokom 16 sati kako bi se dobila kompletna konverzija do željenog (S)-enantiomera u >99 %ee. HRMS m/z izračunat za [C11H13FN2O2+ H]<+>: 225,1034; primećeno: 225,1045.

Međuproizvod 14

Etil {7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat

[0123] Etil (7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetat (Međuproizvod 10, 1,91 g, 8,0 mmol), 3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-karboksilna kiselina (1,70 g, 8,80 mmol) i TEA (3,33 mL, 24,0 mmol) su rastvoreni u EtOAc (10 mL). T3P (50% težine u EtOAc, 9,52 mL, 16,0 mmol) je dodat i smeša je zagrejana do refluksa preko noći. Reakciona smeša je rastvorena sa EtOAc (150 mL) i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3(2 x 100 mL), 0,5 M HCl (100 mL) i rasolom (100 mL). Organski sloj je osušen provlačenjem kroz fazni razdvajač i koncentrisan kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (2,68 g, prinos 81%) kao beličasta čvrsta supstanca koja je korišćena bez daljeg pročišćavanja.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,26 (t, 3H), 2,61 (qd, 2H), 4,15 - 4,22 (m, 2H), 4,30 (dd, 1H), 4,51 (d, 1H), 4,66 (s, 2H), 5,02 - 5,25 (m, 1H), 6,38 - 6,48 (m, 1H), 6,65 (dd, 1H), 6,73 (br s, 1H), 6,90 (d, 1H), 7 - 7,06 (m, 1H), 7,06 - 7,11 (m, 1H), 8,30 (s, 1H).

MS m/z 415,2 (M+H)<+>.

4

Međuproizvod 14a

Etil {(3S)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat

[0124] Smeša 3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-karboksilne kiseline (151 g, 0,779 mol), N-etil-N-isopropilpropan-2-amina (370 mL, 2,12 mol) i etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetata (Međuproizvod 10a, 169 g, 0,708 mol) u butil acetatu (800 mL) je mešana na ambijentu tokom 10 minuta. T3P (50% težine u EtOAc, 844 mL, 1,42 mol) je dodat tokom 10 minuta. Nakon završetka dodavanja rezultujuća smeša je mešana tokom 15 minuta na ambijentalnoj temperaturi pre nego što je temperatura povećana 105°C tokom 85 minuta (1°C/min). Nakon mešanja na 105°C tokom 40 sati reakciona smeša je ohlađena do 5°C i voda (800 mL) je pažljivo dodata. Nakon mešanja tokom 1 sata na ambijentalnoj temperaturi pH je prilagođen do otprilike 10 sa NaOH (vodena, 2,5 M, otprilike 1,5 L). Kada se pH više nije menjao faze su razdvojene. Voda (1,2 L) je dodata organskoj fazi i HCl (vodena, 2 M, otprilike 0,6 L) je dodat pod mešanjem dok pH vodene faze nije bio otprilike 4. Vodena faza je odbačena dok je organska faza oprana sa vodom (2 x 2 L), filtrirana kroz celit (Seitz filter, K200) i koncentrisan do suvoće. Dobijen ostatak je rastvoren u EtOAc (400 mL) i rastvor je koncentrisan do suvoće kako bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova (278 g, 0,671 mol, 88% w/w, 83% prinos) kao braonkasta pena.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,17 (t, 3H), 2,53 (dd, 2H), 4,06 (qdd, 2H), 4,36 (d, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,86 (t, 1H), 6,62 (td, 1H), 6,84 (dd, 1H), 6,94 (d, 2H), 7,03 (dd, 1H), 7,07 (d, 1H), 10,82 (s, 1H).

MS m/z 415,5 (M+H)<+>.

Međuproizvod 15

{7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetna kiselina

[0125] LiOH (0,208 g, 8,69 mmol) rastvoren u vodi (7,50 mL) je dodat rastvoru etil {7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetata (Međuproizvod 14, 1,2 g, 2,90 mmol) u THF (15 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1,5 sati. EtOAc (40 mL) je dodat, praćeno sa hlorovodonikom (1 M, 11,6 mL, 11,6 mmol) i vodom (20 mL). Faze su razdvojene i organski sloj je opran sa rasolom (30 mL). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i isparen pod redukovanim pritiskom. Jedinjenje iz naslova (1,19 g, 106%) je dobijeno kao čvrsta supstanca i korišćeno je bez daljeg pročišćavanja.

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 2,44 (dd, 1H), 2,51 - 2,53 (m, 1H), 4,26 - 4,4 (m, 2H), 4,64 (s, 2H), 4,76 (s, 1H), 6,64 (td, 1H), 6,83 (dd, 1H), 6,95 (d, 1H), 6,98 - 7,16 (m, 3H), 10,84 (s, 1H). Kiseli CO2H proton nije detektovan.

HRMS (ESI+) m/z izračunat za [C19H15FN2O6+ H<+>]: 387,0992, primećeno 387,0995.

Međuproizvod 16

terc-Butil 7-hloro-3-okso-23-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat

[0126] DMAP (0,158 g, 1,30 mmol) je dodat smeši 7-hloro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-on (2,38 g, 13,0 mmol) i di-terc-butil dikarbonata (3,58 mL, 15,6 mmol) u THF (70 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2,5 sata. EtOAc (100 mL) je dodat. Smeša je oprana sa HCl (0,25 M, 50 mL), zasićenim vodenim NaHCO3(50 mL) i rasolom, osušena kroz fazni razdvajač i isparena. Jedinjenje iz naslova (3,89 g, 106%) je dobijeno kao sirovo ulje i korišćeno je bez daljeg pročišćavanja.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,83 (s, 9H), 4,78 (s, 2H), 7,24 (dd, 1H), 7,27 (d, 1H), 7,39 (d, 1H).

Međuproizvod 17

terc-Butil 7-hloro-3-hidroksi-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat

[0127] 1 M rastvor litijum trietilhidroborata (13,75 mL, 13,75 mmol) u THF je dodat kapanjem rastvoru terc-butil 7-hloro-3-okso-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilaat (Međuproizvod 16,3,25 g, 11,5 mmol) u nevodenom THF (60 mL) na -78°C pod N2(g). Nakon mešanja na -78°C tokom 45 min, smeša je tretirana sa Na2CO3(zasićen vodeni, 25 mL); zatim je H2O2(35% u aq, 25 mL) polako dodat na -15°C. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, zatim filtrirana. Filtrat je koncentrisan u vakuumu i ostatak je ekstrakovan sa EtOAc (2 x 100 mL). Organska faza je oprana sa rasolom (100 mL), osušena provlačenjem kroz fazni razdvajač, i koncentrisana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (3,29 g, 101%) kao beličasta čvrsta supstanca koja je korišćena bez daljeg pročišćavanja.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,57 (s, 9H), 3,31 (br s, 1H), 4,06 (dd, 1H), 4,27 (dd, 1H), 5,91 (t, 1H), 6,91 (dd, 1H), 6,95 (d, 1H), 7,88 (d, 1H).

Međuproizvod 18

terc-Butil 7-hloro-3-(2-etoksi-2-oksoetil)-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat [0128] 1 M rastvor LiHMDS (23,0 mL, 23,0 mmol) u THF je dodat kapanjem rastvoru etil 2-(dietoksifosforil)acetata (4,57 mL, 23,0 mmol) u THF (30 mL) na 0°C pod azotom i rezultujuća smeša je mešana tokom 10 minuta, gde nakon što je terc-butil 7-hloro-3-hidroksi-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat (Međuproizvod 17, 3,29 g, 11,5 mmol) rastvoren u THF (30 mL), je dodat kapanjem na 0°C. Reakciona smeša je mešana pod azotom na sobnoj temperaturi tokom 1 sata nakon što je voda (100 mL) dodata i smeša je ekstrakovana sa EtOAc (3 x 75 mL). Kombinovani organski slojevi su oprana sa rasolom (100 mL), osušena provlačenjem kroz fazni razdvajač i koncentrisana dajući sirovo jedinjenje iz naslova (4,36 g, 106%) kao braon ulje.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,24 (t, 3H), 1,52 (s, 9H), 2,46 (dd, 1H), 2,57 (dd, 1H), 4,03 -4,2 (m, 3H), 4,34 (dd, 1H), 4,98 (t, 1H), 6,78 - 6,93 (m, 2H), 7,80 (br s, 1H).

MS m/z 356 (M+H)<+>.

Međuproizvod 19

Etil (2E ili 2Z)-(7-hloro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetat

[0129] Etil 4-hloro-3-oksobutanoat (60,1 g, 0,36 mol) je dodat dobro mešanom rastvoru 5-hloro-2-aminofenola (43,4 g, 0,30 mol) u THF (434 mL) na 20°C. Rezultujuća smeša je mešana tokom 30 minuta, zatim je TEA (36,8 g, 0,36 mol) dodata kapanjem na 50°C.

Rezultujući rastvor je mešana na ovoj temperaturi tokom 16 sati. Organski rastvarač je uklonjen u vakuumu. Sirov proizvod je pročišćen silika gel kolonskom hromatografijom sa EtOAc u PE od 0% do 1,6%. Proizvod je dalje pročišćen re-kristaizacijom u cikloheksanu. Ovo je rezultovalo jedinjenjem iz naslova (53,8 g, 70%) kao svetlo žutom čvrstom supstancom.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,20 (3H, t), 4,11 (2H, q), 4,68 (2H, s), 4,78 (1H, s), 6,97 (1H, dd), 7,00 (1H, d), 7,31 (1H, d), 10,18 (1H, s).

MS m/z 254 (M+H)<+>.

Međuproizvod 20

Etil (7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetat

[0130] Rastvor terc-butil 7-hloro-3-(2-etoksi-2-oksoetil)-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilata (Međuproizvod 18, 1,98 g, 5,56 mmol) u DCM (10 mL)/TFA (5 mL, 67,3 mmol) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 2,5 sati. Smeša je koncentrisana, rastvorena u DCM (50 mL), i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3(2 x 50 mL), zatim osušena

4

provlačenjem kroz fazni razdvajač i koncentrisan dajući 1,52 g ulja. Jedinjenje je pročišćeno preparativnom HPLC (XBridge C18 kolona (10 µm 250 x 50 ID mm), koristeći gradijent od 15-55% ACN u H2O/ACN/NH395/5/0,2 puferu tokom 20 minuta sa protokom od 100 mL/min, UV detektovanje na 240 nm). Uklanjanje rastvarača dalo je jedinjenje iz naslova (0,67 g, 47%) kao ulje.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, 3H), 2,53 (d, 2H), 3,83 (qd, 1H), 3,94 (dd, 1H), 4,15 -4,23 (m, 3H), 6,52 (d, 1H), 6,74 (dd, 1H), 6,79 (d, 1H). Spektri takođe pokazuju dva široka singleta na δ 1,61 i 4,40 označena kao H2O i NH respektivno.

MS m/z 256 (M+H)<+>.

Međuproizvod 20a i 20b, Postupak A

Etil [(3R i 3S)-7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0131] Enantiomeri od etil (7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetata (Međuproizvod 20, 13,7 g, 53,7 mmol) su razdvojeni pomoću hiralnog razdvajanja, koristeći ChiralPak AD kolonu (20 µm, 250 x 50 mm) sa mobilnom fazom od EtOH/TEA 100/0,1 na 20°C, sa protokom od 120 mL/min i detektovanjem na 270 nm.

Međuproizvod 20a, Postupak A

Etil [(3S)-7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0132] Prvo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio jedinjenje iz naslova (6,64 g, 48,4%, 99,2% ee).

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, 3H), 2,53 (d, 2H), 3,78 - 3,87 (m, 1H), 3,94 (dd, 1H), 4,16 - 4,24 (m, 3H), 4,46 (s, 1H), 6,52 (d, 1H), 6,74 (dd, 1H), 6,79 (d, 1H).

Optička rotacija

(ACN, c=1).

Međuproizvod 20b, Postupak A

Etil [(3R)-7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0133] Drugo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio jedinjenje iz naslova (6,47 g, 47,1%, 98,9% ee).

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, 3H), 2,53 (d, 2H), 3,78 - 3,88 (m, 1H), 3,94 (dd, 1H), 4,15 - 4,25 (m, 3H), 4,46 (s, 1H), 6,52 (d, 1H), 6,74 (dd, 1H), 6,79 (d, 1H).

Optička rotacija

(ACN, c=1).

[0134] Apsolutna konfiguracija je određena korišćenjem VCD tako što je prvo rastvoreno 15 mg čvrstog materijala u 140-150 µl CDCl3za svaki uzorak. Rastvori su zatim prebačeni u 0,100 mm BaF2 ćelije i VCD spektri su svi dobijeni za šest sati u BioTools ChiralIR instrumentu opremljenom sa dvostrukim izvorima i dvostrukim fotoelastičnim modulatorom. Rezolucija je bila 4 cm<-1>. Izvršena je Monte Carlo pretraga molekularne mehanike za geometriju niske energije za blago skraćene strukture (korišten je metil estar umesto etil estara) dva enantiomera, R i S. MacroModel u okviru Maestro grafičkog interfejsa (Schrodinger Inc.) je korišćen za generisanje početnih koordinata za konformere. Svi konformeri unutar 5 kcal/mol najnižih energetskih konformera su korišćeni kao polazne tačke za minimozovanje teorije funkcionalnosti gustine (DFT) u okviru Gaussian09. Optimizovane strukture, frekvencije harmonijskih vibracija/intenziteta, VCD rotacione snage i slobodne energije na STP (uključujući i energiju nulte tačke) su određene za svaki konformer. U ovim proračunima korišćeni su funkcionalni B3LYP i osnovni set 6-31G*. Simulacije infracrvenih i VCD spektara za svaku konformaciju generisane su korišćenjem interno izgrađenog programa za Lorentzian oblike linija (12 cm<-1>širina linije) do izračunatog spektra čime se omogućava direktno poređenje između simuliranih i eksperimentalnih spektara. ;Eksperimentalni VCD spektri Međuproizvoda 20a i Međuproizvoda 20b dobijeni u CDCl3su upoređeni sa simuliranim spektrima dva enantiomera. To poređenje pokazuje da je Međuproizvod 20a S enantiomer i da Međuproizvod 20b ima R konfiguraciju. Većina glavnih bendova potvrđuje ovu interpretaciju. ;Međuproizvod 20a, Postupak B ;;Etil [(3S)-7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat ;[0135] Cink trifluorometansulfonat (2,87 g, 7,91 mmol) je dodat dobro mešanom rastvoru (2E ili Z)-(7-hloro-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetat (Međuproizvod 19, 20 g, 79,1 mmol) u EtOH (150 mL, HPLC grade) na 20°C. Rezultujuća smeša je evakuisana i pročišćena sa N2za nekoliko puta, zatim je (+)-1,2-bis(2s, 5s)-2,5-difenilfosfolanol etan(1,5-cyclooctadiene) rodijum(I)tetrafluoroborat (0,51 g, 0,63 mmol) dodat na 20°C. Rezultujući rastvor je evakuisana i pročišćen sa N2za nekoliko puta again. Zatim je reakcija mešana na 60°C tokom 16 sati pod H2(15 bar pritisak). Smeša je koncentrisana. Sirov proizvod je ;;;4 ;pročišćen silika gel kolonskom hromatografijom sa EtOAc u PE od 0 do 20%. Koncentrisani su fragmenti čistog proizvoda. Ovo je rezultovalo jedinjenjem iz naslova (18,9 g, 93,6%) kao narandžasto ulje. ;<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1,28 (3H, t), 2,52 (2H, d), 3,78-3,85 (1H, m), 3,93 (1H, dd), 4,15-4,22 (3H, m), 4,44 (1H, brs), 6,50 (1H, d), 6,73 (1H, dd), 6,78 (1H, d). ;MS m/z 256 (M+H)<+>. ;;(c=0,1 g/100 mL, CH3CN, T=17°C). ;Međuproizvod 21 ;;Etil {7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat ;[0136] Etil (7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetat (Međuproizvod 20, 0,67 g, 2,62 mmol), 3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-karboksilna kiselina (0,607 g, 3,14 mmol), i TEA (1,090 mL, 7,86 mmol) su rastvoreni u EtOAc (15 mL). Zatim je T3P (50% težine u EtOAc, 3,12 mL, 5,24 mmol) dodato i smeša je zagrejana u mikrotalasnom reaktoru tokom 2 sata na 160°C. EtOAc (100 mL) je dodata i smeša je oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3(100 mL), 1 M HCl (100 mL) i rasolom (100 mL). Smeša je osušen provlačenjem kroz fazni razdvajač. Koncentrisanje pod redukovanim pritiskom dalo je 1,14 g ulja koje je pročišćeno fleš hromatografijom na silika gelu koristeći gradijent od 12% do 100% EtOAc u heptanu kao eluent. Koncentrisanje do suvoće dalo je jedinjenje iz naslova (0,530 g, 46,9%). ;<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,26 (t, 3H), 2,61 (qd, 2H), 4,13 - 4,2 (m, 2H), 4,30 (dd, 1H), 4,48 - 4,55 (m, 1H), 4,66 (s, 2H), 4,95 - 5,24 (m, 1H), 6,62 - 6,71 (m, 2H), 6,89 (d, 1H), 6,92-6,95 (m, 1H), 7,03 (dd, 1H), 7,11 (d, 1H), 8,58 (s, 1H). ;MS m/z 431 (M+H)<+>. ;Međuproizvod 21a ;;Etil {(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat ;[0137] DIPEA (12,38 mL, 71,08 mmol) i T3P (50% u butil acetat, 30,2 g, 47,4 mmol) je dodata suspenziji etil [(3S)-7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetata (Međuproizvod 20a, 6,06 g, 23,7 mmol) i 3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-karboksilne kiseline (5,418 g, 28,05 mmol) u butil acetatu (60 mL). Reakciona smeša je ;;;4 ;zagrejana u alumina bloku na 117°C tokom 16 sati. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature smeša je rastvorena sa EtOAc (150 mL) i oprana sa zasićenim vodenim Na2CO3(100 30 mL), limunskom kiselinom (1 M, 50 mL), HCl (1 M, 50 mL) i rasolom (100 mL). Organska faza je osušena preko nevodenog Na2SO4, filtrirana i koncentrisana kako bi se dobio sirov proizvod kao crveno, penasto ulje. Ostatak je pročišćen automatizovanom fleš hromatografijom na Biotage® KP-SIL 340g kolona. Gradijent od 30% do 75% EtOAc u heptanu preko 7 CV je korišćen kao mobilna faza. Proizvod je prikupljen koristeći detektovanje na talasnoj dužini 254/280 nm. Jedinjenje iz naslova (7,62 g, 74,6%) je dobijeno kao penasta čvrsta supstanca. ;<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,15 - 1,18 (m, 3H), 2,51 - 2,55 (m, 2H), 4,03 - 4,1 (m, 2H), 4,34 - 4,41 (m, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,86 (t, 1H), 6,80 (dd, 1H), 6,87 (d, 1H), 6,94 (d, 1H), 7,01 - 7,07 (m, 2H), 7,08 (d, 1H), 10,82 (s, 1H). ;MS m/z 431,1 (M+H)<+>. ;Međuproizvod 21a, Postupak B ;;Etil {(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat ;[0138] T3P (50% rastvor u EtOAc, 146 g, 230 mmol) je dodat u rastvor etil [(3S)-7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetata (Međuproizvod 20a, 29,4 g, 115 mmol) u n-BuOAc (100 mL), 3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-karboksilna kiselina (22,7 g, 118 mmol) i DIPEA (44,5 g, 345 mmol) na 20°C. Rezultujuća smeša je mešana na 140°C tokom 24 sata. Reakciona smeša je ohlađena i rastvorena sa od EtOAc (500 mL). Rezultujuća smeša je oprana sa 200 mL zasićenim natrijum bikarbonatom, 200 mL 1 M limunske kiseline i 200 mL 1 M HCl. Organska faza je osušena preko nevodenog Na2SO4, filtrirana i isparena do suvoće. Ostatak je primenjen na silika gel kolonu i eluiran sa EtOAc/PE (1/10 do 1/1). Čist fragment je koncentrisan u vakuumu kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (41 g, 83%) kao žuta čvrsta supstanca. ;<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 1,17 (3H, t), 2,50-2,58 (2H, m), 3,99-4,12 (2H, m), 4,38 (2H, s), 4,65 (2H, s), 4,87 (1H, t), 6,78-6,99 (3H, m), 7,00-7,09 (3H, m), 10,81 (1H, s). ;MS m/z 431 (M+H)<+>. ;Međuproizvod 21b ;;Etil {(3R)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat ;;;4 ;[0139] Smeša 3-okso-3,4-dihidro-2H-benzo[b][1,4]oksazin-6-karboksilne kiseline (1,68 g, 8,6 mmol), DIPEA (4,1 mL, 23,5 mmol) i etil [(3R)-7-hloro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetata (Međuproizvod 20b, 2,0 g, 7,8 mmol) u butil acetatu (9 mL) je mešana na ambijentu tokom 15 minuta. T3P (50% w/w u BuOAc, 9,3 mL, 15,6 mmol) je dodato tokom 2 minuta. Nakon završetka dodavanja rezultujuća smeša je mešana tokom 10 minuta na ambijentalnoj temperaturi pre nego što je temperatura povećana 120°C tokom 50 minuta (2°C/min). Nakon mešanja na 120°C tokom 40 sati reakciona smeša je ohlađena do 20°C i voda (20 mL) je pažljivo dodata, praćeno sa dodavanjem EtOAc (20 mL). Nakon mešanja tokom 30 minuta na ambijentalnoj temperaturi pH je prilagođen do ca 10 sa 6 % Na2CO3(vodena, otprilike 20 mL). Kada se pH više nije menjao faze su razdvojene. Organska faza je oprana sa limunskom kiselinom (10% vodena, 2 x 20 mL), NaHCO3(8% vodena, 20 mL), i rasolom (20 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana kroz silika čep i rastvor je koncentrisan do suvoće kako bi se dobio sirovo jedinjenje iz naslova (3,25 g, 0,622 mmol, 95% w/w, 80% prinos) kao braonkasta pena. ;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,27 (t, 3H), 2,54 - 2,71 (m, 2H), 4,17 (qd, 2H), 4,31 (dd, 1H), 4,53 (dd, 1H), 4,66 (s, 2H), 5,12 (t, 1H), 6,66 (dd, 2H), 6,90 (d, 1H), 6,95 (d, 1H), 7,04 (dd, 1H), 7,12 (d, 1H), 8,59 (s, 1H). ;MS m/z 431,3 (M+H)<+>. ;Međuproizvod 22 ;;{7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetna kiselina ;[0140] Smeša etil {7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetata (Međuproizvod 21, 42 mg, 0,10 mmol) i LiOH (1 M, 0,146 mL, 0,15 mmol) u THF (2 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Dodatni LiOH (1 M, 0,070 mL, 0,07 mmol) je dodat i smeša je mešana tokom 2 sata. HCl (1 M, 5 mL) je dodat i vodena faza je ekstrakovana sa DCM (3 x 5 mL). Kombinovani organski slojevi su osušen provlačenjem kroz fazni razdvajač i koncentrisani u vakuumu dajući jedinjenje iz naslova (38,0 mg, 97%) kao belu čvrstu supstancu. ;MS m/z 403,1 (M+H)<+>. ;Međuproizvod 22a ;;{(3S)7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetna kiselina ;;;4 ;[0141] LiOH (1,40 g, 58,3 mmol) je rastvoren u voda (50 mL) i dodat (S)-etil {7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetatu (Međuproizvod 21a, 5,71 g, 11,7 mmol) u THF (50 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 75 minuta i EtOAc (150 mL) je dodat. Oprana je sa HCl (1 M, 100 50 mL) i rasolom (50 mL). Organska faza je osušena preko Na2SO4i nakon filtracije rastvarači su ispareni u vakuumu kako bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova (82 mg, 107%) koje je korišćen dalje u sintezi Primera 5a. ;<1>H NMR je dobijen na čistom materijalu dobijenom od sinteze Primera 5a:<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,4 - 2,48 (m, 1H), 2,51 - 2,56 (m, 1H), 4,29 - 4,4 (m, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,71 - 4,87 (m, 1H), 6,81 (dd, 1H), 6,93 -7,03 (m, 2H), 7,03 - 7,1 (m, 3H), 10,84 (s, 1H), 12,53 (s, 1H). ;MS m/z 403,1 (M+H)<+>. ;Međuproizvod 23 ;;terc-Butil 7-bromo-3-okso-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat ;[0142] Di-terc-butil dikarbonat (919 mg, 4,21 mmol) i DMAP (42,9 mg, 0,35 mmol) su dodati rastvoru 7-bromo-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-on (800 mg, 3,51 mmol) u THF (20 mL). Mešan je na sobnoj temperaturi tokom 2,5 sati. EtOAc (100 mL) je dodat i smeša je oprana sa HCl (30 mL, 0,25 M), zasićenim vodenim Na2CO3(30 mL) i rasolom (30 mL), osušena kroz fazni razdvajač i rastvarači su ispareni kako bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova koji je korišćen direktno u sintezi Međuproizvoda 24(1,16 g, 100%). ;Međuproizvod 24 ;;terc-Bulil 7-bromo-3-(2-etoksi-2-oksoetil)-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat [0143] ;Korak 1. Litijum trietilhidroborat (1M u THF, 4,23 mL, 4,23 mmol) je dodat kapanjem rastvoru terc-butil 7-bromo-3-okso-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilata (Međuproizvod 23, 1,16 g, 3,52 mmol) u THF (20 mL) na -78°C. Smeša je mešana na -78°C tokom 1 sata i zatim je Na2CO3(zasićenim vodenim 4 mL) dodat i smeša je zagrejana do oko -20°C. H2O2(30%, 4 mL) je dodat kapanjem uz održavanje niske temperature. Smeša je mešana na oko -10°C tokom 20 minuta. ;Smeša je filtrirana kroz celit i čep je opran sa THF. EtOAc (50 mL) je dodat i smeša je oprana sa rasolom (20 mL), osušena kroz fazni razdvajač i isparena pod ;;;4 ;redukovanim pritiskom. Sirovi hemiaminal je dobijen kao žuto ulje i korišćen je bez pročišćavanja. ;Korak 2. u drugu bocu LiHMDS (7,75 mL, 7,75 mmol) je polako dodat rastvoru etil 2-(dietoksifosforil)acetata (1,55 mL, 7,75 mmol) u THF (8 mL) održavajući temperaturu ispod 5°C. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta i zatim ohlađena do 0°C. Sirovi hemiaminal iz Koraka 1 iznad je rastvoren u THF (10 mL) i dodat kapanjem na 0°C. Ledena kada je uklonjena i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. EtOAc (70 mL) je dodat i smeša je oprana sa zasićenim vodenim Na2CO3(2 x 30 mL), HCl (0,25 M, 20 mL) i rasolom, osušena kroz fazni razdvajač i isparena pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen automatizovanom fleš hromatografijom na Biotage® KP-SIL 50 g kolona. Gradijent od 5% do 25% EtOAc u heptanu preko 6CV je korišćen kao mobilna faza. Proizvod je prikupljen koristeći detektovanje na talasnoj dužini 250/285 nm. Jedinjenje iz naslova (0,556 g, 39,4%) je dobijen kao ulje nakon uklanjanja rastvarača. ;<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,26 (t, 3H), 1,54 (s, 9H), 2,48 (dd, 1H), 2,58 (dd, 1H), 4,08 -4,20 (m, 3H), 4,35 (dd, 1H), 4,99 (s, 1H), 7,02 (dd, 1H), 7,05 (d, 1H), 7,75 (s, 1H). ;Međuproizvod 25 ;;Etil (2E ili 2Z)-(7-bromo-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetat ;[0144] Etil 4-hloro-3-oksobutanoat (45 mL, 333 mmol) je dodat rastvoru 2-amino-5-bromofenola (55,7 g, 296 mmol) u THF (400 mL) na sobnoj temperaturi. Smeša je zagrejana do 50°C, i TEA (57 mL, 326 mmol) je dodat polako tokom 30 minuta. Rezultujuća smeša je mešana na ovoj temperaturi tokom 16 sati. Smeša je rastvorena sa vodom (500 mL) i ekstrakovana sa EtOAc (500 mL x 3). Kombinovan organska faza je oprana sa rasolom (500 mL x 2), osušena preko nevodenog Na2SO4, filtrirana i koncentrisan isparavanjem. ;;[0145] Ostatak je pročišćen silika hromatografijom koristeći rastvarač gradijent od 1,25% do 2% EtOAc u PE. Čist fragment je isparen do suvoće kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (47 g, 56%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca. ;<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1,29 (3H, t), 4,18 (2H, q), 4,56 (2H, s), 4,70 (1H, s), 6,70 (1H, d), 7,02-7,06 (2H, m), 10,14 (1H, brs). ;MS m/z 298 (M+H)<+>. ;Međuproizvod 26 ;Etil (2E)-4-(5-bromo-2-nitrofenoksi)but-2-enoat ;[0146] 5-Bromo-2-nitrofenol (10 g, 45,9 mmol) i K2CO3(8,24 g, 59,6 mmol) su suspendovani u NMP (81 mL) (svetlo crvena suspenzija) i etil 4-bromokrotonat (10,26 mL, 59,63 mmol) je dodat kapanjem na sobnoj temperaturi. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći (20 sati). Smeša je sipana u led/vodu (500 mL) i mešana tokom 30 minuta. Talog je prikupljen filtriranjem i oprana sa vodom (2 x 200 mL), osušen na vazduhu tokom 10 minuta i zatim opran sa heptanom (200 mL). Heptan (200 mL) je dodat do čvrstoj supstanci i mešana tokom 1 sata. Čvrsta supstanca je filtrirana, oprana sa heptanom (2 x 50 mL) i osušena u vakuumu kako bi se dobila bež čvrsta supstanca. Jedinjenje iz naslova (15,0 g, 99%) je dobijeno i korišćeno bez daljeg pročišćavanja. ;<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,32 (t, 3H), 4,24 (q, 2H), 4,84 (dd, 2H), 6,31 (dt, 1H), 7,04 (dt, 1H), 7,18 - 7,26 (m, 2H), 7,80 (d, 1H). ;MS m/z 298 (M-H)-. ;Međuproizvod 27, Postupak A ;;Etil (7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetat ;[0147] terc-Butil 7-bromo-3-(2-etoksi-2-oksoetil)-2,3-dihidro-4H-1,4-benzoksazin-4-karboksilat (Međuproizvod 24, 556 mg, 1,39 mmol) je rastvoren u hlorodovodniki u dioksanu (5,0 mL, 162,8 mmol) i smeša mešana tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. ;Rastvarač je isparen i ostatak rastvoren u EtOAc (50 mL), opran sa zasićenim vodenim Na2CO3(30 mL) i rasolom (20 mL), osušen preko Na2SO4i isparen nakon filtracije kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (399 mg, 96%) kao ulje. ;MS m/z 300 (M+H)<+>. ;Međuproizvod 27, Postupak B ;;Etil (7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetat ;[0148] Rastvor etil (2E)-4-(5-fluoro-2-nitrofenoksi)but-2-enoata (Međuproizvod 26, 15,0 g, 45,4 mmol) u sirćetnoj kiselini (125 mL) je dodat kapanjem suspenziji gvozdene prašine (10,13 g, 181,5 mmol) i sirćetne kiseline (50 mL, 873,6 mmol) na 60°C ( unutrašnja temperatura, 70°C suva kada) pod atmosferom azota i unutrašnja temperatura je održavana ispod 70°C tokom dodavanja. Rezidualni reaktant je opran sa sirćetnom kiselinom (25 mL). Reakciona smeša je zagrejana na 60°C tokom 1,5 sati. Temperatura je povećana do 70°C (unutrašnja, 80°C suva kada) i mešana tokom dodatnih 1,5 sati. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature preko noći. Smeša je rastvorena sa EtOAc ;;;1 ;(150 mL), filtrirana kroz celit, oprana sa EtOAc (2 x 100 mL) i koncentrisana u vakuumu. Sirova supstanca je rastvorena u EtOAc (200 mL) i oprana sa rastvora 1 M vodene limunske kiseline (2 x 100 mL). Organski sloj je opran sa zasićenim vodenim Na2CO3(2 x 50 mL). Organski sloj je dalje opran sa vodenom limunskom kiselinom (50 mL, 0,5M), zasićenim vodenim Na2CO3(50 mL) i rasolom (50 mL). Organski sloj je filtriran kroz fazni razdvajač i teritran sa silikom (10 g) tokom 10 minuta. Smeša je filtrirana i silika je oprana sa EtOAc (2 x 50 mL). Organski sloj je isparen kako bi se dobilo tamno braon ulje.(11 g). Ostatak je pročišćen automatizovanom fleš hromatografijom na Biotage® KP-SIL 340 g koloni. ;Gradijent od 5% do 40% EtOAc u heptanu preko 5 CV je korišćen kao mobilna faza. ;Proizvod je skupljen koristeći talasnu dužinu 254/280 nm. Jedinjenje iz naslova (10,4 g, 76%) je dobijeno kao svetlo žuto ulje. ;<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, 3H), 2,53 (d, 2H), 3,78 - 3,87 (m, 1H), 3,94 (dd, 1H), 4,16 - 4,23 (m, 3H), 4,47 (s, 1H), 6,47 (d, 1H), 6,88 (dd, 1H), 6,93 (d, 1H). ;MS m/z 300 (M+H)<+>. ;Međuproizvod 27a i 27b ;;Etil [(3R i 3S)-7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat ;[0149] Enantiomeri od etil 2-(7-bromo-3,4-dihidro-2H-benzo[b][1,4]oksazin-3-il)acetata (Međuproizvod 27, 13,73 g, 45,75 mmol) su razdvojeni pomoću hiralnog razdvajanja, koristeći ChiralPak AD kolona (20 µm, 250 x 50 mm) sa mobilnom fazom od EtOH/TEA 100/0,1 na 20°C, sa protokom od 120 mL/min i detektovanjem na 280 nm. ;Međuproizvod 27a, Postupak A ;;Etil [(3S)-7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat ;[0150] Prvo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (4,2 g, 30,6%, 99,9% ee). ;<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, 3H), 2,53 (d, 2H), 3,78 - 3,86 (m, 1H), 3,94 (dd, 1H), 4,14 - 4,24 (m, 3H), 4,47 (s, 1H), 6,47 (d, 1H), 6,87 (dd, 1H), 6,93 (d, 1H). ;Optička rotacija ;;(ACN, c=1). ;Međuproizvod 27b, Postupak A ;;;2 ;Etil [(3R)-7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat ;[0151] Drugo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (6,6 g, 33,5%, 99,4% ee). ;<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, 3H), 2,53 (d, 2H), 3,78 - 3,86 (m, 1H), 3,94 (dd, 1H), 4,14 - 4,24 (m, 3H), 4,47 (s, 1H), 6,47 (d, 1H), 6,87 (dd, 1H), 6,93 (d, 1H). ;Optička rotacija ;;(ACN, c=1). ;[0152] Apsolutne konfiguracije Međuproizvoda 27a i 27b su određivane snimanjem i upoređivanjem VCD za dva enantiomera sa onima koji su izračunati za odgovarajuće metil estre (kako bi se smanjio broj kompaktacionih konformacija). Međuproizvod 27a (16,9 mg) je rastvoren u 170 µl CDCl3. Međuproizvod 27b (14,9 mg) je rastvoren u 150 µl CDCl3. Rastvori su preneti na 0,100 mm BaF2 ćelije i VCD spektri su dobijeni za sedam sati svaki u BioTools ChiralIR instrumentu opremljenom sa dvostrukim izvorima i dvostrukim fotoelastičnim modulatorom. Rezolucija je bila 4 cm<-1>. ;;[0153] Izvršena je Monte Carlo pretraga molekularne mehanike za geometriju niske energije za blago skraćene strukture (korišten je metil estar umesto etil estara) dva enantiomera, R i S. Strukture korištene za simulacije prikazane su na Slici 3. MacroModel u okviru Maestro grafičkoj interfejsa (Schrodinger Inc.) je korišćen za generisanje početnih koordinata za konformere. Svi konformeri unutar 5 kcal/mol najnižih energetskih konformera su korišćeni kao polazne tačke za minimiziranje teorije funkcionalnosti gustine (DFT) u okviru Gaussian09. Optimizovane strukture, frekvencije harmonijskih vibracija/intenziteta, VCD rotacione snage i slobodne energije na STP (uključujući i energiju nulte tačke) su određene za svaki konformer. U ovim proračunima korišćeni su funkcionalni B3LYP i osnovni set 6-31G*. Simulacije infracrvenih i VCD spektara za svaku konformaciju su generisane korišćenjem in-house izgrađenog programa kako bi se prilagodili Lorentzianovim oblicima linija (12 cm<-1>širina linije) na izračunatim spektrima, i time omogućili direktno poređenje između simuliranih i eksperimentalnih spektara. Eksperimentalni spektri dva uzorka su upoređeni sa simuliranim spektrima dva metil estarska enantiomera. Slaganje eksperimentalnog i simuliranog spektra bilo je dobro i Međuproizvod 27a može se nedvosmisleno dodeliti kao S enantiomer i Međuproizvod 27b kao R izomer.

Međuproizvod 27a, Postupak A

Etil [(3S)-7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0154] Enantiomeri Primera 27 (1,6 g, 5,3 mmol) su razdvojeni pomoću hiralnog razdvajanja, koristeći ChiralPak AD-H (5 µm, 250 x 20 mm) sa mobilnom fazom od 40% MeOH u CO2, na 85 bara na 35°C, sa protokom od 47 mL/min (40 g/mL) i detektovanjem na 254 nm.

Drugo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 2 jedinjenja iz naslova (277 mg, 17,3%, 99,3% ee).

<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 1,27 (3H, t), 2,47-2,61 (2H, m), 3,73-3,80 (1H, m), 3,93 (1H, dd), 4,14-4,21 (3H, m), 6,53 (1H, d), 6,79-6,83 (2H, m).

MS m/z 300 (M+H)<+>.

Međuproizvod 27a, Postupak B

Etil [(3S)-7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0155] Zn(OTf)2(2,4 g, 6,63mmol) je dodat do etil (2E ili 2Z)-(7-bromo-2H-1,4-benzoksazin-3(4H)-iliden)acetat (Međuproizvod 25, 47,5 g, 160 mmol) u EtOH (HPLC grade, 500 mL) na sobnoj temperaturi pod N2-atmosferom. Smeša je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom za nekoliko puta pre nego što je (S,S)[Ph-BPE Rh COD]BF4(900 mg, 0,112 mmol) dodat. Rezultujuća smeša je evakuisana i ponovo napunjena sa vodonikom nekoliko puta. Smeša je mešana na 60°C tokom 16 sati pod vodonikom (15 bar). Nakon hlađenja do ambijentalne temperature, pritisak je oslobođen. Organski rastvarač je uklonjen isparavanjem. Sirov proizvod je pročišćen fleš hromatografijom (C18 materijal) sa eluent gradijent od 10% do 60% MeCN u vodi (koja sadrži 0,1% NH4HCO3). Čisti fragmenti su prikupljeni i ispareni do suvoće kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (44 g, 92% prinos, ee 100% (SFC analiza koristeći ChiralPak IC-3 (0,46 x 10 cm, 3µm); eluent, MeOH (0,15 DEA)/CO240/60)) kao čvrsta supstanca.

<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 1,27 (3H, t), 2,47-2,61 (2H, m), 3,73-3,80 (1H, m), 3,93 (1H, dd), 4,14-4,21 (3H, m), 6,53 (1H, d), 6,79-6,83 (2H, m).

MS m/z 300 (M+H)<+>.

Međuproizvod 28

Etil {7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat

4

[0156] TEA (0,737 mL, 5,32 mmol) i T3P (50% težine u EtOAc, 2,372 mL, 3,99 mmol) je dodat rastvoru etil (7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il)acetata (Međuproizvod 27, 399 mg, 1,33 mmol) i 3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-karboksilna kiselina (308 mg, 1,60 mmol) u EtOAc (7 mL). Reakciona smeša je zagrejana u mikrotalasni reaktor na 150°C tokom 2 sata. Dodatni T3P (50% težine u EtOAc, 1,2 mL, 2,02 mmol) i TEA (0,3 mL, 2,16 mmol) je dodat i smeša je zagrejana u mikrotalasnom reaktoru na 150°C tokom dodatna 2 sata. EtOAc (50 mL) je dodata i smeša je oprana sa zasićenim vodenim Na2CO3(2 x 30 mL), HCl (30 mL, 0,5M) i rasolom, osušena kroz fazni razdvajač i isparena. Jedinjenje je pročišćeno preparativnom HPLC (Kromasil C8 kolona (10 µm 250 x 50 ID mm) koristeći gradijent od 35-75% ACN u H2O/ACN/FA 95/5/0,2 pufer tokom 20 minuta sa protokom od 100 mL/min, UV detektovanje na 254/280 nm). Jedinjenje iz naslova (366 mg, 58%) je dobijeno nakon uklanjanja rastvarača u vakuumu.

MS m/z 475 (M+H)<+>.

Međuproizvod 28a, Postupak A

Etil 2-[3S)-7-bromo-4-(3-okso-4H-1,4-benzoksazin-6-karbonil)-2,3-dihidro-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0157] U 250 mL boci sa tri grla, etil [(3S)-7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat (Međuproizvod 27a, 4,2 g, 14,0 mmol) i 3-okso-3,4-dihidro-2H-benzo[b][1,4]oksazin-6-karboksilna kiselina (2,73 g, 14,1 mmol) su suspendovani u butil acetatu (40 mL). DIPEA (7,31 mL, 42,0 mmol) je dodat praćeno sa T3P (50% u BuOAc) (17,8 g, 28,0 mmol). Reakcija je zagrejana u alumina bloku tokom 7 sati na 117°C (unutrašnja reakcija temperatura bloka za zagrevanje je podešen na 135°C). Reakciji je omogućeno da se ohladi do sobne temperature preko noći. Sirova reakcija je rastvorena sa EtOAc (150 mL) i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3(100 30 mL), 1 M vodene limunske kiseline (50 mL), 1 M HCl (50 mL) i rasolom (100 mL), osušena preko nevodenog Na2SO4, filtrirana i koncentrisana kako bi se dobio sirov proizvod kao crveno i penasto ulje. Ostatak je pročišćen automatizovanom fleš hromatografijom na Biotage® KP-SIL 340 g koloni. Gradijent od 30% do 75% EtOAc u heptanu preko 5 CV je korišćen kao mobilna faza. Proizvod je prkupljen koristeći talasne dužine 254/280 nm. Jedinjenje iz naslova (4,23 g, 63,6%) je dobijeno kao penasta čvrsta supstanca.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,27 (t, 3H), 2,54 - 2,7 (m, 2H), 4,14 - 4,22 (m, 2H), 4,31 (dd, 1H), 4,53 (dd, 1H), 4,66 (s, 2H), 5,12 (s, 1H), 6,62 (d, 1H), 6,80 (dd, 1H), 6,90 (d, 1H), 7,04 (dd, 1H), 7,08 - 7,14 (m, 2H), 8,51 (s, 1H).

MS m/z 475 (M+H)<+>.

Međuproizvod 28a, Postupak B

Etil 2-[(3S)-7-bromo-4-(3-okso-4H-1,4-benzoksazin-6-karbonil)-23-dihidro-1,4-benzoksazin-3-il]acetat

[0158] DIPEA (46,4 g, 360 mmol) je dodat etil [(3S)-7-bromo-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetatu (Međuproizvod 27a, 36 g, 120 mmol), 3-okso-3,4-dihidro-2H-benzo[b][1,4]oksazin-6-karboksilnoj kiselini (28 g, 144 mmol) i 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioksatrifosfinan 2,4,6-trioksidu (50% rastvor u EtOAc) (152,6 g, 240 mmol) u butil acetatu (100 mL) na sobnoj temperaturi. Rezultujuća suspenzija je mešana na 140°C tokom 2 sati. Reakciona smeša je rastvorena sa EtOAc (700 mL) i oprana sa zasićenim NaHCO3(500 mL), 1 M HCl (500 mL) i rasolom (500 mL). Organski sloj je osušen preko nevodenog Na2SO4, filtriran i isparen kako bi se dobio sirov proizvod. Ostatak je pročišćen silika hromatografijom, eluent gradijent od 5% do 20% EtOAc u PE. Čist fragment je isparen do suvoće kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (33 g, 58%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1,26 (3H, t), 2,56-2,64 (2H, m), 4,16 (2H, q), 4,30 (1H, dd), 4,52 (1H, d), 4,66 (2H, s), 5,11 (1H, t), 6,61 (1H, d), 6,79 (1H, dd), 6,89 (1H, d), 7,03 (1H, dd), 7,11 (2H, dd), 8,90 (1H, brs).

MS m/z 475 (M+H)<+>.

Međuproizvod 29

{7-Bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetna kiselina

[0159] LiOH (55,3 mg, 2,31 mmol) rastvoren u vodi (3 mL) je dodat rastvoru etil {7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetata (Međuproizvod 28, 366 mg, 0,77 mmol) u THF (6,0 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1,5 sati. EtOAc (40 mL) je dodat, praćen sa 1 M HCl (3,1 mL, 3,1 mmol) i voda (20 mL). Faze su razdvojene i organski sloj je opran sa rasolom (30 mL), osušen preko Na2SO4i isparen kako bi se dobio sirovo jedinjenje iz naslova (372 mg, 108%) kao čvrsta supstanca.

MS m/z 447 (M+H)<+>.

Međuproizvod 29a

{(3,S)-7-Bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetna kiselina

[0160] Etil 2-[(3S)-7-bromo-4-(3-okso-4H-1,4-benzoksazin-6-karbonil)-2,3-dihidro-1,4-benzoksazin-3-il]acetat (Međuproizvod 28a,173 mg, 0,37 mmol) je rastvoren u THF (1,5 mL). Litijum hidroksid (52,5 mg, 2,19 mmol) rastvoren u vodi (1,50 mL) je dodat. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata pre dodavanja od EtOAc (50 mL). Organski sloj je opran sa HCl (1M, 30 mL) i rasolom (30 mL). Osušen je kroz fazni razdvajač i isparen pod redukovanim pritiskom. Jedinjenje iz naslova (160 mg, 98%) je dobijeno sirovo i korišćeno je bez daljeg pročišćavanja.

MS m/z 447,0 (M+H)<+>.

PRIMERI

Primer 1

2-{4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0161]

[0162] Etil hloroformat (0,038 mL, 0,39 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi rastvoru {4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetne kiseline (Međuproizvod 5, 132 mg, 0,36 mmol) i TEA (0,150 mL, 1,08 mmol) u suvom THF (8 mL). Nakon nekoliko sekundi, mutni talog je formiran. Nakon 30 minuta, rastvor amonijum hidroksida (1 mL, 26% NH3) je dodat i mešanje je nastavljeno tokom 1 sata. Smeša je koncentrisana pod redukovanim pritiskom i je ostatak uzet u DCM (15 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(10 mL) koristeći fazni razdvajač. Kada su faze razdvojene, proizvod se taložio od organske faze. Organska faza je koncentrisana kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (112 mg, 85%) kao bela čvrsta supstanca. Mali deo proizvoda (30 mg) je pročišćen dalje preparativnom HPLC (Sunfire C18 kolona (5 µm 150 x 19 ID mm) koristeći gradijent od 5 do 95% ACN u 0,1 M FA na pH 3) kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (16 mg, 53,3% na osnovu 30 mg povučenog uzorka).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 2,34 - 2,47 (m, 2H), 4,2 - 4,36 (m, 2H), 4,66 (s, 2H), 4,71 -4,84 (m, 1H), 6,72 - 6,78 (m, 1H), 6,92 - 7,14 (m, 7H), 7,42 (s, 1H), 10,83 (s, 1H).

HRMS izračunat za [C19H17N3O5+ H<+>]: 368,1246; primećeno: 368,12438 (M+H)<+>.

Primer 2, Postupak A

N-Metil-2-{4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0163]

[0164] Rastvor {4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetne kiseline (Međuproizvod 5, 50 mg, 0,14 mmol), metanamina (0,339 mL, 0,68 mmol, 2 M rastvor u THF), i TEA (0,056 mL, 0,41 mmol) u DMF (1 mL) je tretiran sa T3P (50% težine u EtOAc, 0,161 mL, 0,27 mmol) na sobnoj temperaturi.

Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i koncentrisana. Sirov materijal je pročišćen preparativnom HPLC (Xbridge C18 kolona (5 µm 150 x 19 ID mm), gradijent od 5-95% ACN u H2O/ACN/NH395/5/0,2 pufer) kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (40,0 mg, 77%).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 2,36 - 2,39 (m, 2H), 2,55 (d, 3H), 4,12 - 4,31 (m, 2H), 4,64 (s, 2H), 4,68 - 4,87 (m, 1H), 6,73 (t, 1H), 6,89 - 6,95 (m, 2H), 6,97 - 7,02 (m, 2H), 7,02 - 7,06 (m, 1H), 7,07 - 7,1 (m, 1H), 7,79 - 7,94 (m, 1H), 10,81 (s, 1H).

HRMS izračunat za [C20H19N3O5+ H<+>]: 382,1403; primećeno: 382,1413.

Primer 2, Postupak B

N-Metil-2-{4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0165]

[0166] Metilamin (375 mL) je dodat polako u rastvor metil-2-[4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetata (Međuproizvod 3, 12,5 g, 32,7 mmol) u MeOH (750 mL) na sobnoj temperaturi. Rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Organski rastvarač je uklonjen isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je pročišćen re-kristaizacijom od MeOH kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (12,0 g, 96%) kao bela čvrsta supstanca. Ovaj materijal je kombinovan sa tri serije pripremljen kao iznad kako bi se dobilo 5,0 g, 10,3 g i 12,0 g jedinjenja iz naslova od 5,28 g, 10,68 g i 12,5 g od Međuproizvod 3. Kombinovana serija je suspendovana u 40 mL MeOH i mešana tokom 30 minuta. Suspenzija je filtrirana i čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom kako bi se dobilo 35,7 g jedinjenja iz naslova.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2,39 (2H, d), 2,56 (3H, d), 4,25 (2H, s), 4,65 (2H, s), 4,77 (1H, t), 6,75 (1H, ddd), 6,91-7,10 (6H, m), 7,89 (1H, q), 10,78 (1H, s).

MS m/z 382 (M+H)<+>.

Primer 2, Postupak C

N-Metil-2-{4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0167]

[0168] Metilamin (370 mL) je dodat polako u rastvor etil {4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetata (Međuproizvod 4, 10,7 g, 26,9 mmol) u MeOH (640 mL) na sobnoj temperaturi. Rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Organski rastvarač je uklonjen isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je pročišćen re-kristaizacijom od MeOH kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (10,3 g, 100%) kao beli prašak.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2,39 (2H, d), 2,56 (3H, d), 4,25 (2H, s), 4,66 (2H, s), 4,77 (1H, t), 6,75 (1H, ddd), 6,91-7,10 (6H, m), 7,89 (1H, q), 10,83 (1H, s).

MS m/z 382 (M+H)<+>.

Primer 2a i 2b, Postupak D

N-Metil-2-{3S i 3R)-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0169] Enantiomeri Primera 2 (23 mg, 0,06 mmol) su razdvojeni pomoću hiralnog razdvajanja, koristeći ReproSil kolonu (8 µm, 250 x 30 mm) sa mobilnom fazom od 30% EtOH u CO2, na 150 bara na 40°C, sa protokom od 80 mL/min i detektovanjem na 250 nm.

Primer 2a, Postupak D

N-Metil-2-{3S ili 3R)-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0170]

[0171] Prvo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 1 jedinjenja iz naslova (11 mg, 43,5%, 99,4% ee).

<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 2,35 - 2,59 (m, 2H), 2,70 (s, 3H), 4,31 (dd, 1H), 4,39 (d, 1H), 4,62 (s, 2H), 5,03 (t, 1H), 6,68 (t, 1H), 6,82 (d, 1H), 6,87 - 6,96 (m, 2H), 6,97 - 7,03 (m, 1H), 7,03 - 7,08 (m, 1H), 7,11 (dd, 1H).

HRMS izračunat za [C20H19N3O5+ H<+>]: 382,1403; primećeno: 382,1406.

Primer 2b, Postupak D

N-Metil-2-{3S ili 3R)-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0172]

[0173] Drugo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 2 jedinjenja iz naslova (10 mg, 47,8%, 99,7% ee).

<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 2,42 - 2,59 (m, 2H), 2,70 (s, 3H), 4,31 (dd, 1H), 4,39 (dd, 1H), 4,62 (s, 2H), 5,03 (t, 1H), 6,63 - 6,71 (m, 1H), 6,82 (d, 1H), 6,88 - 6,97 (m, 2H), 6,97 -7,03 (m, 1H), 7,06 (d, 1H), 7,11 (dd, 1H).

HRMS izračunat za [C20H19N3O5+ H<+>]: 382,1403; primećeno: 382,1387.

Primer 3

2-{7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0174]

[0175] {7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetna kiselina (Međuproizvod 15, 293 mg, 0,76 mmol) je suspendovana u DCM (10 mL). TEA (0,631 mL, 4,55 mmol) i PyBOP (520 mg, 1,00 mmol) je dodat. Amonijum hidrohlorid (0,162 mL, 4,55 mmol) je dodat i reakcija je mešana preko noći. Suspenzija je rastvorena sa DCM, vodom i 3,8 M HCl (vodeni). Organski sloj razdvojen

1

i vodeni sloj je ekstrakovan jednom sa DCM. Kombinovane organske supstance su oprane jednom sa zasićenim vodenim NaHCO3i rasolom, filtrirane kroz fazni razdvajač i koncentrisane. Preostalo ulje je pročišćeno preparativnom HPLC (Kromasil C8 kolona (10 µm 250 x 50 ID mm), koristeći gradijent od 10-50% ACN u H2O/ACN/FA 95/5/0,2 puferu tokom 20 minuta sa protokom od 100 mL/min, UV detektovanjem na 227/254 nm).

Fragmenti koja sadrži proizvod su kombinovani, koncentrisani u vakuumu i konačno osušeni smrzavanjem kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (165 mg, 56,5%) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,37 - 2,41 (m, 2H), 4,24 - 4,31 (m, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,72 - 4,78 (m, 1H), 6,65 (td, 1H), 6,84 (dd, 1H), 6,93 - 6,99 (m, 2H), 7,05 - 7,14 (m, 3H), 7,40 (s, 1H), 10,83 (s, 1H).

MS m/z 386,5 (M+H)<+>.

Primer 3a i 3b

2-{(3S i 3R)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0176] Enantiomeri Primera 3 (165 mg, 0,43 mmol) su razdvojeni pomoću hiralnog razdvajanja, koristeći ChiralPak OJ kolonu (5 µm, 250 x 30 mm) sa mobilnom fazom od 30% EtOH u CO2, 175 bar na 40°C, sa protokom od 80 mL/min i detektovanjem na 290 nm. Primer 3a

2-{(3S ili 3R)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0177]

[0178] Prvo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 1 jedinjenja iz naslova (74 mg, 44,8%, 99,9% ee).

Optička rotacija

2

(ACN, c=1).

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2,57 (d, 2H), 4,23 - 4,32 (m, 1H), 4,45 (d, 1H), 4,58 (s, 2H), 5,08 (s, 1H), 6,38 - 6,54 (m, 2H), 6,61 - 6,89 (m, 4H), 6,96 (dd, 1H), 7,19 (d, 1H), 9,73 (s, 1H).

HRMS izračunat za [C19H16FN3O5+ H<+>]: 386,1152; primećeno: 386,1158 (M+H)<+>.

Primer 3b

2-{(3S ili 3R)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3A-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0179]

[0180] Drugo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 2 jedinjenja iz naslova (71 mg, 43,0%, 99,7% ee).

Optička rotacija

(ACN, c=1).

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2,57 (d, 2H), 4,25 - 4,32 (m, 1H), 4,45 (d, 1H), 4,59 (s, 2H), 5,04 - 5,13 (m, 1H), 6,37 - 6,49 (m, 2H), 6,61 - 6,88 (m, 4H), 6,97 (d, 1H), 7,19 (s, 1H), 9,68 (s, 1H).

HRMS izračunat za [C19H16FN3O5+ H<+>]: 386,1152; primećeno: 386,1157.

Primer 4

2-{7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0181]

[0182] Metanamin (2 M rastvor u THF, 259 µL, 0,52 mmol) je dodat mešanoj suspenziji {7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetne kiseline (Međuproizvod 15, 40 mg, 0,10 mmol) i TEA (43 µL, 0,31 mmol) u EtOAc (2 mL) na sobnoj temperaturi. Debeo beli talog je formiran. Dodavanja T3P (50% težine u EtOAc, 123 µL, 0,21 mmol) smeši rezultovala su u bistrom, bledo žutom rastvoru reakcije. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. EtOAc (10 mL) je dodat i smeša je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(5 mL), HCl (1 M, 5 mL) i rasolom (5 mL), osušena preko MgSO4i koncentrisana u vakuumu. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (koristeći 5% MeOH u DCM kao eluent), rastvoren u ACN/vodi (otprilike 5 mL, 1:4) i osušen smrzavanjem kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (19 mg, 46%) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,38 (d, 2H), 2,56 (d, 3H), 4,26 (s, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,76 (br t, 1H), 6,65 (td, 1H), 6,83 (dd, 1H), 6,96 (d, 1H), 7,03 - 7,16 (m, 3H), 7,87 (q, 1H), 10,82 (s, 1H).

HRMS izračunat za [C20H18FN3O5+ H<+>]: 400,1309; primećeno: 400,1331.

Primers 4a i 4b, Postupak A

2-{(3S i 3R)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0183] Enantiomeri Primera 4 (103 mg, 0,26 mmol) su razdvojeni pomoću hiralnog razdvajanja, koristeći ReproSil kolonu (5 µm, 250 x 30 mm) sa mobilnom fazom od 30% EtOH/DEA 100/0,5 u CO2na 175 bar i 40°C, sa protokom od 80 g/min i detektovanjem na 260 nm.

Primer 4a, Postupak A

2-{(3S)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

4

[0185] Prvo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 1 jedinjenja iz naslova (33 mg, 32%, 99,9% ee).

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,38 (d, 2H), 2,56 (d, 3H), 4,26 (s, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,71 -4,79 (m, 1H), 6,62 - 6,68 (m, 1H), 6,84 (dd, 1H), 6,96 (d, 1H), 7,03 - 7,09 (m, 2H), 7,11 (br m, 1H), 7,87 (q, 1H), 10,81 (s, 1H).

HRMS izračunat za [C20H18FN3O5+ H<+>]: 400,1309; primećeno: 400,1312.

Primer 4b, Postupak A

2-{(3R)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0186]

[0187] Drugo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 2 jedinjenja iz naslova (26 mg, 25%, 99,9% ee).

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,38 (d, 2H), 2,56 (d, 3H), 4,26 (s, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,71 -4,8 (m, 1H), 6,65 (td, 1H), 6,84 (dd, 1H), 6,96 (d, 1H), 7,07 (d, 2H), 7,11 (s, 1H), 7,87 (q, 1H), 10,82 (br s, 1H).

HRMS izračunat za [C20H18FN3O5+ H<+>]: 400,1309; primećeno: 400,1297.

Primer 4a, Postupak B

2-{(3S)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0189] Etil {(3S)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat (Međuproizvod 14a, 1648g) je uzet u metanol (10L). Metilamin u etanolu (33% težine, 20 ekvivalent, 7490 mL) je dodat na <30°C.

Rezultujući rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. LCMS analiza ukazuje da reakcija nije kompletna. Reakcija je mešana tokom dalja 4 sata na sobnoj temperaturi nakon čega je HPLC ukazuje da <1% Međuproizvod 14a i njegovog odgovarajućeg metil estara preostaju (kombinovani su). Rastvarač je uklonjen u vakuumu kako bi se dobio sirov proizvod kao tamna čvrsta supstanca (1719,2 g). Ovo je kombinovan sa 376 g sirovog proizvoda iz druge serije i kombinovan sirov proizvod (2095 g) je uzet u IPA (20950 mL) i zagrejana do refluksa. Rastvor nije dobijen. Suspenzija je uzorkovana i uzorak je ohlađen i filtrirana za XRPD analizu. Ovo ukazuje na proizvod ima željeni oblik (tip 2). HPLC analiza filtriranog materijala ukazuje na čistoću od 99,2% što potvrđuje da je pročišćavanje bilo uspešno. Suspenzija je ohlađena do sobne temperature preko noći. Čvrsta supstanca je filtrirana, oprana sa IPA (3 x 2L) i izvučena suva. Dalje sušenje u vakuumskoj peći na 60°C dalo je proizvod iz naslova kao beličastu čvrstu supstancu (1632,5 g).<1>H NMR ukazuje na čistoću od >95% (0,18% rezidualni IPA). Ovaj materijal je je kombinovan sa proizvodom od druge re-kristalizacije manje razmere (ulaz 250 g sirovog) kako bi se dobilo ukupno 1820,7 g jedinjenja iz naslova.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,31 - 2,42 (m, 2H), 2,55 (d, 3H), 4,25 (d, 2H), 4,64 (s, 2H), 4,68 - 4,8 (m, 1H), 6,64 (td, 1H), 6,82 (dd, 1H), 6,95 (d, 1H), 7,04 - 7,07 (m, 2H), 7,09 (br s, 1H), 7,77 - 7,97 (m, 1H), 10,80 (s, 1H).

HRMS izračunat za [C20H18FN3O5+ H<+>]: 400,1309; primećeno: 400,1294.

Za ostatak čvrste supstance je primećeno da je kristalni pomoću XRPD i tipičan difraktogram je prikazan na Slici 1. Karakteristični položaji vrha su navedeni ispod.

XRPD obrazac 2-Teta (°) 5,6 (s), 7,4 (vs), 9,3 (vs), 13,5 (vs), 14,8 (vs), 15,8 (vs), 16,9 (s), 18,6 (vs), 22,3 (vs), 22,6 (vs).

Primer 4a, Postupak C

2-{(3S)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0190]

[0191] 3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-karboksilna kiselina (9,58 g, 48,0 mmol) je suspendovana sa mešanjem u n-butil acetatu (48 mL). T3P u etil acetatu (52,5 mL, 87,5 mmol, 50,0 % w/w) je dodat praćen sa DIPEA (3,82 mL, 21,9 mmol). Rezultujuća suspenzija je zagrejana na 80°C preko noći.2-[(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]-N-metilacetamid (Međuproizvod 13, 10,0 g, 43,7 mmol) je dodat iz delova tokom otprilike 90 minuta i zatim držan na 80°C preko noći. Voda (100 mL) je dodata i smeša je mešana na 40°C. Organska faza je prikupljena i oprana sa vodenim natrijum bikarbonatom (100 mL, 5,25 % w/w) na 40°C. Organska faza je ohlađen do 10°C i mešana preko noći. Izopropanol (100 mL) je dodat i čvrsta supstanca je prikupljena filtriranjem i osušena pod vakuumom na 40°C. Jedinjenje iz naslova je dobijeno kao beličasta čvrsta supstanca (9,29 g, 22,3 mmol, 95,7% w/w, ee 98,4%, 50,9% prinos).

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,40 (d, 2 H) 2,57 (d, 3 H) 4,27 (s, 2 H) 4,66 (s, 2 H) 4,71 - 4,83 (m, 1 H) 6,66 (dt, 1 H) 6,84 (dd, 1 H) 6,96 (d, 1 H) 7,04 - 7,19 (m, 3 H) 7,90 (d, 1 H) 10,86 (s, 1 H).

LCMS (Agilent LC/MSD SL) izračunat za [C20H18FN3O5+ H<+>]: 400,130; primećeno:

400,200.

Primer 4a, Postupak D

2-{(3S)-7-Fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0192]

[0193] 3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-karboksilna kiselina (2,219 kg, 11,44 mol; 99,6 mass %) je napunjen u 100 L staklenu posudu praćen sa toluenom (9 L). Etil [(3S)-7-fluoro-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il]acetat (Međuproizvod 10a, 2,970 kg, 10,39 mol, 83,7% težine) je napunjen i smeša je mešana na 20°C. Rastvor T3P u 2-MetF (11,6 L, 20,8 mol, 55,7% težine) je zatim napunjen u posudu unutar 5 minuta. Toluen (3,1 L), piridin (2,5 L) i toluen (3 L) su napunjeni i rezultujuća smeša zagrejana na 80°C tokom 20 sati zatim ohlađena do 20°C i držan tokom 3 dana. Smeša je zagrejana do 50°C i oprana sa vodom (15 L). Organska faza je zadržana i razdvojena vodena faza je ekstrakovana sa toluenom (14,8 L). Kombinovan organska faza je oprana sa rastvorom vodenog natrijum bikarbonata (14,8 L, 11,3 mol, 6,00% težine) zatim vodom (15 L) na 39 - 50°C. Organska faza je ohlađena do 21°C, filtrirana kako bi se uklonile čestice, i mala količina prikupljene čvrste supstance je oprana sa toluenom (3 L). Filtrat je zatim koncentrisan do 4 relativne zapremine destilacijom pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio rastvor etil {(3S)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetata u toluenu. Organska faza je filtrirana još jednom i rastvor metilamina (33% w/w) u etanolu (13 L, 104 mol, 33,3% težine) je dodat i smeša je mešana na 20°C tokom 3 dana. Smeša je isparena do suvoće pod redukovanim pritiskom, zatim tretirana sa 2-propanolom (5 L) i ponovo je isparena. 2-propanol tretman je ponovljen još jednom; 10 Lt je korišćeno da se ispere 100 Lt posuda i ovo je dodato prikupljenom proizvodu u posudi rotacionog isparivača i smeša je isparena do suvoće. Prikupljena čvrsta supstanca je dalje osušena u vakuumskoj peći pod redukovanim pritiskom (10 mBar). Osušena čvrsta supstanca (3,985 Kg) je napunjena u čistu suvu posudu, praćeno sa 2-propanol (24,5 L), smeša je mešana i zagrejana do 80°C, držana na 80°C tokom 2 sata i zatim ohlađena do 10°C i držana na 10-11°C tokom 4 dana, i zatim je filtrirana. Proizvod kolač je opran sa 2-propanol (5 L) i zatim osušen u vakuumskoj peći na 45°C kako bi se dobio proizvod iz naslova (3,636 Kg; 99,4% w/w test, 87,1% prinos).

Primer 5a

2-{(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0194]

[0195] PyBOP (127 mg, 0,24 mmol) i TEA (0,141 mL, 1,02 mmol) je dodat rastvoru {(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetne kiseline (Međuproizvod 22a, 82 mg, 0,20 mmol) u DCM (2 mL). Zatim, NH4Cl (43,6 mg, 0,81 mmol) je dodat i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1,5 sati. EtOAc (30 mL) je dodat i smeša je oprana sa zasićenim vodenim Na2CO3(30 mL), HCl (0,5M, 20 mL) i rasolom (20 mL). Proizvod je pročišćen preparativnom HPLC (Phenomenex Luna Hilic kolona (5 µm 250 x 30 ID mm) koristeći gradijent od 10 do 45% MeOH/DEA 100/0,5 u CO2, 120 bar, preko 6 minuta na 40°C) kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (42,0 mg, 51,3%).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 2,35 - 2,41 (m, 2H), 4,29 (d, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,76 (s, 1H), 6,83 (dd, 1H), 6,93 - 7,01 (m, 2H), 7,01 - 7,12 (m, 4H), 7,39 (s, 1H), 10,83 (s, 1H). HRMS izračunat za [C19H16ClN3O5+ H<+>]: 402,0857; primećeno: 402,0840.

Primer 5b

2-{(3R)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0196]

[0197] Etil {(3R)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetat (Međuproizvod 21b, 2,00 g, 4,64 mmol) je rastvoren u amonijaku (7 M u MeOH) (49,7 mL, 348,2 mmol) zapečaćen i mešan na sobnoj temperaturi tokom 45 sati. Rastvarač je isparen i ostatak (616 mg sirovo braon ulje) je rastvoren u DMSO i MeOH. Jedinjenje je pročišćeno preparativnom HPLC na Kromasil C8 koloni (10 µm 250 x 50 ID mm) koristeći gradijent od 10-50% ACN u H2O/ACN/FA 95/5/0,2 pufer tokom 20 minuta sa protokom od 100 mL/min. Jedinjenja su detektovana pomoću UV na 253/280 nm. Čisti fragmenti su prikupljeni i većina ACN je isparena. Ostatak je podeljen između EtOAc i voda. Kombinovane organske faze su koncentrisane u vakuumu. Sa dodavanjem DMSO/ACN i vode, talog je primećen. Rastvarači su uklonjeni u vakuumu i voda je dodat ostatku, i mešana na sobnoj temperaturi preko noći, i filtrirana je kako bi se dobilo čisto jedinjenje iz naslova prema LCMS.511 mg od beličaste čvrste supstance je izolovano, prinos 27,4%.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,35 - 2,42 (m, 2H), 4,29 (s, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,77 (d, 1H), 6,82 (dd, 1H), 6,96 (t, 2H), 7,02 - 7,12 (m, 4H), 7,39 (s, 1H), 10,83 (s, 1H).

HRMS (ESI+) m/z izračunat za [C19H16ClN3O5+ H<+>]: 402,0857, primećeno 402,0864.

Primer 6, Postupak A

2-{7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0198]

[0199] Suspenzija etil {7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetata (Međuproizvod 21, 0,39 g, 0,91 mmol) u smeši MeOH (5 mL) i 33% rastvora metanamina (15 mL, 0,91 mmol) u EtOH je mešana na sobnoj temperaturi preko noći dajući čistu konverziju do amida. Reakciona smeša je koncentrisana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0,370 g, 98%) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,28 - 2,41 (m, 2H), 2,56 (d, 3H), 4,21 - 4,3 (m, 2H), 4,64 (s, 2H), 4,76 (t, 1H), 6,82 (dd, 1H), 6,95 (d, 1H), 7 - 7,1 (m, 4H), 7,66 - 7,93 (m, 1H), 10,82 (s, 1H).

MS m/z 416 (M+H)<+>.

Primer 6, Postupak B

2-{7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0200]

[0201] Smeša 2-(7-hloro-4-(3-okso-3,4-dihidro-2H-benzo[b][1,4]oksazin-6-karbonil)-3,4-dihidro-2H-benzo[b][1,4]oksazin-3-il)sirćetne kiseline (Međuproizvod 22, 38 mg, 0,09 mmol), metanamina (0,236 mL, 0,47 mmol) (2 M rastvor u THF), i TEA (0,039 mL, 0,28 mmol) u EtOAc (2 mL) je tretirana sa T3P (50% težine u EtOAc, 0,112 mL, 0,19 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i koncentrisana. Sirov proizvod je pročišćen preparativnom HPLC (Kromasil C8 kolona (10 µm 250 x 20 ID mm), koristeći gradijent od 20-60% ACN u H2O/ACN/FA 95/5/0,2 pufer, tokom 20 minuta sa protokom od 19 mL/min, UV detektovanje na 240 nm). Sušenje smrzavanjem dalo je jedinjenje iz naslova (24 mg, 61%) kao beli puder.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,34 - 2,4 (m, 2H), 2,54 (d, 3H), 4,21 - 4,32 (m, 2H), 4,64 (s, 2H), 4,76 (t, 1H), 6,82 (dd, 1H), 6,95 (d, 1H), 7,01 - 7,1 (m, 4H), 7,78 - 7,97 (m, 1H), 10,82 (s, 1H).

HRMS izračunat za [C20H18ClN3O5+ H<+>]: 416,1013; primećeno: 416,1007.

Primer 6a i 6b, Postupak A

2-{(3S i 3R)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

1

[0202] Enantiomeri Primera 6 (0,45 g, 1,08 mmol) su razdvojeni pomoću hiralnog razdvajanja, koristeći ChiralPak AD kolonu (5 µm, 250 x 30 mm) sa mobilnom fazom od 30% iPrOH u CO2, 120 bar na 40°C, sa protokom od 120 mL/min i detektovanjem na 254 nm.

Primer 6a, Postupak A

2-{(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0203]

[0204] Prvo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 1 jedinjenja iz naslova (215 mg, 48%, 99,9% ee).

<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 2,42 - 2,52 (m, 2H), 2,70 (s, 3H), 4,31 (dd, 1H), 4,39 (dd, 1H), 4,62 (s, 2H), 5,01 (t, 1H), 6,65 - 6,76 dd, 1H), 6,81 - 6,92 (m, 1H), 6,92 - 6,98 (m, 2H), 7,06 (d, 1H), 7,11 (dd, 1H).

HRMS izračunat za [C20H18ClN3O5+ H<+>]: 416,1013; primećeno: 416,1026.

Primer 6b, Postupak A

2-{(3R)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0205]

2

[0206] Drugo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 2 jedinjenja iz naslova (198 mg, 44%, 97,3% ee).

<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 2,30 - 2,57 (m, 2H), 2,71 (s, 3H), 4,32 (dd, 1H), 4,40 (dd, 1H), 4,64 (s, 2H), 5,02 (t, 1H), 6,72 (dd, 1H), 6,83 - 6,93 (m, 1H), 6,95 - 7,00 (m, 2H), 7,07 (d, 1H), 7,13 (dd, 1H).

HRMS izračunat za [C20H18ClN3O5+ H<+>]: 416,1013; primećeno: 416,1024.

Primer 6a, Postupak B

2-{(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0207]

[0208] MEA (30% rastvor u EtOH, 175 g, 1,86 mol) je dodat u rastvor etil {(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetata (Međuproizvod 21a, 40 g, 92,8 mmol) u MeOH (100 mL). Rezultujući rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 24 sata. Rezultujuća smeša je koncentrisana isparavanjem. Sirov proizvod je pročišćen re-kristaizacijom od ACN (300 mL) kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (32,7 g, 85% prinos, ee 100%) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2,38 (2H, d), 2,56 (3H, d), 4,23-4,31 (2H, m), 4,65 (2H, s), 4,77 (1H, t), 6,82 (1H, dd), 6,95 (1H, d), 7,03-7,09 (4H, m), 7,86 (1H, q), 10,71 (1H, s). HRMS m/z izračunat za [C20H18ClN3O5+ H<+>]: 416,1013, primećeno 416,0991.

Primer 7

2-{(3S)-7-Bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid

[0209]

[0210] {(3S)-7-Bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetna kiselina (Međuproizvod 29a, 160 mg, 0,36 mmol) je rastvorena u DCM (3 mL). PyBOP (223 mg, 0,43 mmol) i TEA (0,248 mL, 1,79 mmol) su dodati praćeno sa NH4Cl (77 mg, 1,43 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko vikenda. EtOAc (40 mL) je dodat. Opran je sa zasićenim vodenim Na2CO3(2 x 30 mL), HCl (0,5M, 20 mL) i rasolom (20 mL). Osušen je kroz fazni razdvajač i isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen koristeći SFC2-MS sistem i eluiran sa MeOH na Waters Viridis 2-EP koloni 5µ 30 x 250 mm. Skupljanje homogenog fragmenta i uklanjanje rastvarača u vakuumu dalo je jedinjenje iz naslova (46,1 mg, 28,9%).

<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 2,31 - 2,45 (m, 2H), 4,29 (d, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,76 (s, 1H), 6,9 - 7,04 (m, 4H), 7,08 (d, 2H), 7,17 (d, 1H), 7,40 (s, 1H), 10,83 (s, 1H).

HRMS (ESI+) m/z izračunat za [C19H16N3O5+ H<+>]: 446,0352, primećeno 446,0346.

Primer 8

2-{7-Bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0211]

[0212] TEA (0,461 mL, 3,33 mmol) i T3P (50% težine u EtOAc, 0,989 mL, 1,66 mmol) su dodati rastvoru {7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}sirćetne kiseline (Međuproizvod 29, 372 mg, 0,83 mmol) u EtOAc (5 mL). Smeša je mešana tokom 5 minuta. Metanamin u THF (1,248 mL, 2,50 mmol)

4

je dodat i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. EtOAc (50 mL) je dodat i smeša je oprana sa Na2CO3(40 mL), HCl (1 M, 30 mL) i rasolom (30 mL), osušena kroz fazni razdvajač i isparena. Jedinjenje je pročišćeno preparativnom HPLC (Kromasil C8 kolona (10 µm 250 x 50 ID mm) koristeći gradijent od 15-55% ACN u H2O/ACN/FA 95/5/0,2 pufer tokom 20 minuta sa protokom od 100 mL/min, UV detektovanje na 254/280 nm) kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (215 mg, 56%) kao bela čvrsta supstanca.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,35 - 2,42 (m, 2H), 2,56 (d, 3H), 4,21 - 4,32 (m, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,78 (t, 1H), 6,89 - 7,04 (m, 3H), 7,04 - 7,14 (m, 2H), 7,16 (d, 1H), 7,87 (d, 1H), 10,83 (s, 1H).

HRMS izračunat za [C20H18BrN3O5+H<+>]: 460,0508; primećeno: 460,0506.

Primer 8a i 8b, Postupak A

2-{(3S i 3R)-7-Bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0213] Enantiomeri Primera 8 (132 mg, 0,29 mmol) su razdvojeni pomoću hiralnog razdvajanja, koristeći ChiralPak OJ kolonu (5 µm, 250 x 30 mm) sa mobilnom fazom od 15% MeOH u CO2, 150 bara na 40°C, sa protokom od 80 mL/min i detektovanjem na 254 nm. Proizvodi su liofilizovani od t-BuOH.

Primer 8a, Postupak A

2-{(3R)-7-Bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-`benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0214]

[0215] Prvo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 1 jedinjenja iz naslova

(53,7 mg, 40,7%, 97,2% ee).

Optička rotacija

(ACN, c=1).

HRMS izračunat za [C20H18BrN3O5+H<+>]: 460,0508; primećeno: 460,0522.

Primer 8b, Postupak A

2-{(3S)-7-Bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0216]

[0217] Drugo eluirano jedinjenje je prikupljeno i ispareno kako bi se dobio IZOMER 2 jedinjenja iz naslova (53,1 mg, 40,2%, 98,9% ee).

Optička rotacija

(ACN, c=1).

HRMS izračunat za [C20H18BrN3O5+ H<+>]: 460,0508; primećeno: 460,0535.

Primer 8b, Postupak B

2-{(3S)-7-Bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid

[0218]

[0219] MEA (33% rastvor u EtOH) (53,6 g, 570 mmol) je dodat etil 2-[(3S)-7-bromo-4-(3-okso-4H-1,4-benzoksazin-6-karbonil)-2,3-dihidro-1,4-benzoksazin-3-il]acetatu (Međuproizvod 28a, 18,8 g, 39,6 mmol) u MeOH (94 mL) na sobnoj temperaturi.

Rezultujući rastvor je mešana na 25°C tokom 15 sati. Rastvarač je uklonjen u vakuumu.

Sirov proizvod je pročišćen rekristalizacijom od MeCN/MeOH (20:1) kako bi se dobilo jedinjenje iz naslova (12,5 g, 69% prinos, ee 100%) kao bela čvrsta supstanca. Ova serija je kombinovana sa tri serije pripremljene kao što je navedeno iznad, što je dalo 4,2 g, 17 g i 11,5 g jedinjenja iz naslova od 5,0 g, 16,6 g i 17,0 g početnog materijala respektivno.

Prikupljena jedinjenja iz naslova rekristalizovana od ACN/MeOH kako bi se dobio 35,09 g jedinjenje iz naslova.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2,38 (2H, d), 2,56 (3H, d), 4,27 (2H, s), 4,66 (2H, s), 4,77 (1H, t), 6,92-7,02 (3H, m), 7,06-7,09 (2H,m), 7,16 (1H, d), 7,87 (1H, q), 10,83 (1H, s).

HRMS (ESI+) m/z izračunat za [C20H18BrN3O5+ H<+>]: 460,0508, primećeno 460,0500.

FARMAKOLOŠKA AKTIVNOST

[0220] Mogu se koristiti naredne procedure testova

VEZIVANJE MINERALOKORTIKOIDA, TEST A

[0221] Kako bi se identifikovalo vezivanje za ljudski MR LBD, scintilacioni test blizine (SPA) je prilagođen 384-komoričnom formatu. MR-LBD (aminokiseline T729-K985) je izražen kao N-terminalna fuzija sa proteinom koji vezuje maltozu u Hi5 ćelijama insekata, ko-infekcijom sa rekombinantnim MBP-MR LBD i P23 bakulovirusima i sirovi protein lizat je korišćen u testu. Tritisani aldosteron se koristi kao ligand za generisanje scintilacionog signala kada se dovede u blizinu scintilacijske (SPA) perle vezivanjem za MR LBD i afinitet test jedinjenja (u IC50vrednosti) definiše se kao koncentracija koja smanjuje vezivanje aldosterona sa MR u LBD za 50%.

[0222] Ukratko, u Testu A1, test je izveden u 384-komoričnom formatu u 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA 20 mM NaMoO4, 0,1 mM DTT i 10% glicerola na sobnoj temperaturi. Jedinjenja su testirana na 7 (Test A1) ili 10 (Test A2) kriva odgovora koncentracije u rasponu od 10 nM do 10 µM (Test A1) ili 1 nM do 37 µM (Test A2).

Jedinjenja su razbacana na dnu komorica 38-komorične PE Opti-Plate, kako bi se dobile konačne koncentracije DMSO u testu od 2%. Unapred napravljen MBP-MR/P23 lizat:<3>H-aldosteronska mešavina (konačna koncentracija analize 7 ug/mL MBP-MR LBD/P23 lizata; 5 nM aldosterona) je dodata na vrh razbacanog jedinjenja i preinkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle 1 sata, u test smešu je dodata jednak zapremina anti-zečjih SPA kuglica (Test A1) ili kuglice za snimanje (Test A2) spojenih sa zečjim anti-MBP i inkubiranim 3 sata (Test A1) ili> 8 sati (Test A2). ) na sobnoj temperaturi. Inhibicija scintilacionog signala pomeranjem granice<3>H-aldosteron test jedinjenjima meri se scintilacionim brojanjem pomoću Microbeta Trilux (Vallac) ( Wallac A1) ili detekcijom CCD kamere pomoću LEADseeker (PerkinElmer) (Test A2).

TEST ĆELIJSKOG REPORTER GENA MINERALOKORTIKOIDA, TEST B [0223] Kako bi se testirala potentnost i efikasnost jedinjenja, 25000 ćelija iz sveže odmrznute serije kriokonzerviranih UAS-MR-bla HEK293 ćelija (Invitrogen, K1696), je dodato u svaku komoricu na 384-komoričnoj ploči sa korišćenjem Multidrop-a. Ćelije su uzgajane u 30 µl DMEM bez fenolnog crvenog (Invitrogen 21063-029) koji sadrži 2% fetalnog goveđeg seruma obeležnog ugljem, (Invitrogen 12676-029), Penicilin/Streptomicin, Ne-esencijalne aminokiseline i natrijum piruvat u skladu sa Invitrogen-ovim protokolom uključenim u ćelije. Posle sejanja, ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2, tokom 4 sata kako bi se omogućilo da ćelije legnu. Iz ploče koja sadrži serije razblaženja jedinjenja u DMSO, tipično u rasponu od 10 koncentracija (10 µM do krajnje koncentracije od 0,5 nM), doda se 0,6 µl jedinjenja po komorici korišćenjem Beckman FX pipetera. Ploče su inkubirane 30 minuta pre dodavanja aldosterona do konačne koncentracije od 0,25 nM (Test B1) ili 1 nM (Test B2). Posle 16-20 sati od inkubacije, aktivnost beta-laktamaze je procenjena dodavanjem 8 µl CCF4 koji sadrži supstratni pufer pripremljen prema Invitrogen-ovom protokolu koji je uključen u ćelije. Ploče su ostavljene 2 sata u mraku pre nego što je merena fluorescencija u Pherastar FS-u sa očitavanjem na dnu i filterima podešenim na pobuđivanje na 409 nm i emisiju na 460 i 530 nm. Nakon uklanjanja pozadine, odnos 460/530 je izračunat za svaku tačku analize i prosečno iz tri paralelne ploče za ispitivanje.0% inhibicije je definisano pomoću komorica koje sadrže samo aldosteron, 100% inhibicija je definisana pomoću komorica koji sadrže 120 nM spironolakton.

[0224] Koncentracija i procentualna aktivacija ispitivanog jedinjenja je ugrađena korišćenjem Sigmoidal Dose-Response Modela gde se EC50određuje kao koncentracija ispitivanog jedinjenja na sredini krive doze i odgovor. Jednačina: uklapanje = (A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))) gde, i = dno krivine, B = vrh krive, C = EC50, D = nagib (Hill koeficijent) i x = koncentracija ispitivanog jedinjenja.

REZULTATI

[0225] Jedinjenja iz Primera su testirana u Testu A1 i A2 i B1 i B2 kao što je gore opisano. Sledeća tabela prikazuje rezultate za Primere:

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (I)

   gde R<1>je izabran od CONH2ili CONHCH3; i R<2>je izabran od H, F, Cl ili Br; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde R<1>je CONHCH3; i R<2>je izabran od H, F, Cl ili Br.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde R<1>je CONHCH3; i R<2>je F.
4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, koje je izabrano iz grupe koju čine 2-{4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il} acetamid; N-metil-2-{4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; N-metil-2-{(3S)-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; N-metil-2-{(3R)-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{(3S)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{(3R)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid; 2-{(3S)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid; 2-{(3R)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid; 2-{7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{(3R)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid; 2-{(3S)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid; 2-{(3R)-7-hloro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid; 2-{7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{(3S)-7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{(3R)-7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}acetamid; 2-{7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid; 2-{(3S)-7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid; 2-{(3R)-7-bromo-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 1
5. 5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 koje je 2-{(3S)-7-fluoro-4-[(3-okso-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-6-il)karbonil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoksazin-3-il}-N-metilacetamid.
6. 6. Farmaceutska formulacija koja obuhvata jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja formule (I) prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijent ili diluent.
7. 7. Jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu u terapiji.
8. 8. Jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu u tretmanu i/ili prevenciji kardiovaskularne bolesti.
9. 9. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 8, gde je navedena kardiovaskularna bolest zatajenje srca.
10. 10. Jedinjenje formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja formule (I) prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu u tretmanu i/ili prevenciji hronične bolesti bubrega. 2