RS58340B1 - Antitelo na adrenomedulin (adm) ili fragment antitela na adm ili struktura antitela na adm bez ig za regulisanje ravnoteže tečnosti u pacijentu koji ima hroničnu ili akutnu bolest - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Oblast u koju spada predmetni pronalazak je antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin ili struktura antitela na adrenomedulin bez Ig za regulisanje ravnoteže tečnosta u pacijentu koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje.

Pozadina pronalaska

[0002] Peptid adrenomedulin (ADM) je prvi put opisan 1993. (Kitamura, K., et al., "Adrenomedullin: A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma", Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 192 (2), str. 553-560 (1993)) kao novi hipotenzivni peptid koji sadrži 52 aminokiseline i koji je izolovan iz humanog feohromocitoma; SEQ ID No.: 21. Iste godine, opisane su i cDNA koja kodira prekursorski peptid koji sadrži 185 aminokiselina i kompletna aminokiselinska sekvenca ovog prekursorskog peptida. O prekursorskom peptidu, koji sadrži, između ostalog, signalnu sekvencu od 21 aminokiseline na N kraju, se govori kao o "preproadrenomedulin" (preproADM). U predmetnom opisu, sve specifikovane pozicije aminokiselina se obično odnose na pre-proADM koji sadrži 185 aminokiselina. Peptid adrenomedulin (ADM) je peptid koji sadrži 52 aminokiseline (SEQ ID NO: 21) i koji sadrži aminokiseline 95 do 146 pre-proADM-a, iz kojih je formiran proteolitičkim cepanjem. Do danas, suštinski samo nekoliko peptidnih fragmenata formiranih cepanjem pre-proADM je tačnije okarakterisano, konkretno, fiziološki aktivni peptidi adrenomedulin (ADM) i "PAMP", peptid koji sadrži 20 aminokiselina (22-41) koje slede iza 21 aminokiseline signalnog peptida u pre-proADM. Otkriće i karakterizacija ADM u 1993-oj su trigerovali intenzivnu istraživačku aktivnost, čiji su rezultati sumirani u raznim preglednim člancima, u kontekstu predmetnog opisa, naročito sa referencom na članke koji se mogu naći u broju "Peptides" posebno posvećenom ADM (Editorial, Takahashi, K., "Adrenomedullin: from a pheochromocytoma to the eyes", Peptides, Vol.22, p.1691 (2001)) i (Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, Vol.22, str.1693-1711 (2001)). Još jedan pregledni rad je (Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, Vol.21(2), str.

138-167 (2000)). U naučnim ispitivnjima do danas, nađeno je, između ostalog, da se ADM može smatrati poifunkcionalnim regulatornim peptidom. On se pušta u cirkulaciju u neaktivnom obliku koji je produžen za glicin (Kitamura, K., et al., "The intermediate form of glycine-extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma", Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.244(2), str.551-555 (1998). Samo apstrakt). Postoji i vezujući protein (Pio, R., et al., "Complement Factor H is a Serum-binding Protein for adrenomedullin, and the Resulting Complex Modulates the Bioactivities of Both Partners", The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276(15), str. 12292-12300 (2001)) koji je specifičan za ADM i verovatno takođe moduliše efekat ADM-a. Ti fiziološki efekti ADM, kao i PAMP, koji su od primarne važnosti u ispitivanjima do danas, su efekti koji utiču na krvni pritisak.

[0003] Prema tome, ADM je efektivan vazodilatator i na taj način je moguće pridružiti hipotenzivan efekat određenim peptidnim segmentima na C kraju ADM. Dalje je nađeno da gorepomenuti fiziološki aktivan peptid, PAMP formiran iz pre-proADM, takođe ispoljava hipotenzivan efekat, čak iako izgleda da ima mehanizam dejstva različit od onoga koji ima ADM (uporediti, kao dodatak gorepomenutim preglednim člancima (Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, Vol. 22, str.

1693-1711 (2001)) i (Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, Vol.21(2), str.138-167 (2000)) i (Kuwasako, K., et al., "Purification and characterization of PAMP-12 (PAMP-20) in porcine adrenal medulla as a major endogenous biologically active peptide", FEBS Lett, Vol. 414(1), str. 105-110 (1997). Samo apstrakt), (Kuwasaki, K., et al., "Increased plasma proadrenomedullin N-terminal 20 peptide in patients with essential hypertension", Ann. Clin. Biochem., Vol.36 (Pt.5), str. 622-628 (1999). Samo apstrakt) ili (Tsuruda, T., et al., "Secretion of proadrenomedullin N-terminal 20 peptide from cultured neonatal rat cardiac cells", Life Sci., Vol.69(2), str.239-245 (2001). Samo apstrakt) i EP-A2 0 622 458). Pored toga je nađeno da su koncentracije ADM, koje se mogu meriti u cirkulaciji i drugim biološkim tečnostima, u nizu patoloških stanja, značajno iznad koncentracija koje se nalaze kod zdravih kontrolnih osoba. Prema tome, nivo ADM kod pacijenata sa kongestivnom srčanom insuficijencijom, infarktom miyokarda, bolestima bubrega, hipertenzivnim poremećajima, dijabetesom melitusom, u akutnoj fazi šoka i u sepsi i septičkom šoku je značajno povećan, iako u različitoj meri. Koncentracije PAMP su takođe povećane u nekim od navedenih patoloških stanja, ali su nivoi u plazmi sniženi u odnosu na ADM ((Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, Vol.22, str.1693-1711 (2001)); strana 1702). Štaviše, zna se da se neobično visoke koncentracije ADM vide u sepsi, a najviše koncentracije septičkom šoku (cf. (Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, Vol. 22, str. 1693-1711 (2001)) i (Hirata, et al., "Increased Circulating Adrenomedullin, a Novel Vasodilatory Peptide, in Sepsis", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol.81(4), str.1449-1453 (1996)), (Ehlenz, K., et al., "High levels of circulating adrenomedullin in severe illness: Correlation with C-reactive protein and evidence against the adrenal medulla as site of origin", Exp Clin Endocrinol Diabetes, Vol.

105, str.156-162 (1997)), (Tomoda, Y., et al., " Regulation of adrenomedullin secretion from cultured cells ", Peptides, Vol.22, str.1783-1794 (2001)), (Ueda, S., et al., "Increased Plasma Levels of Adrenomedullin in Patients with Systemic Inflammatory Response Syndrome", Am. J. Respir. Crit. Care Med., Vol. 160, str. 132-136 (1999)) and (Wang, P., "Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis", Peptides, Vol.22, str.1835-1840 (2001))).

[0004] Adrenomedulin se može koristiti u terapiji, jer je pokazano da predtretman adrenomedulinom štiti od cerebralnog edema izazvanog ishemijom/reperfuzijom (Kondoh, et al., "Pre-treatment of adrenomedullin suppresses cerebral edema caused by transient focal cerebral ischemia in rats detected by magnetic resonance imaging", Brain Research Bulletin, Vol. 84, str.69-74 (2011)).

[0005] U struci je dalje poznat metod za identifikovanje adrenomedulinske imunoreaktivnosti u biološkim tečnostima u dijagnostičke svrhe, a naročito u okviru dijagnoze sepse, kardiološke dijagnoze i dijagnoze kancera. Prema ovoj prijavi, parcijalni peptid u srednjem regionu proadrenomedulina, koji sadrži aminokiseline 45-92 celog preproadrenomedulina, je konkretno meren pomoću imunoeseja koji radi sa bar jednim obeleženim antitelom koje specifično prepoznaje sekvencu mid-proADM ( WO2004/090546).

[0006] WO-A1 2004/097423 opisuje upotrebu antitela na adrenomedulin za dijagnozu, prognozu i tretman kardiovaskularnih poremećaja. Tretman bolesti blokiranjem ADM receptora je takođe opisan u struci, (npr. WO-A1 2006/027147, WO-A1 2007/062676) gde navedene bolesti mogu biti sepsa, septički šok, kardiovaskularne bolesti, infekcije, dermatološke bolesti, endokrinološke bolesti, metaboličke bolesti, gastroenterološke bolesti, kancer, inflamacija, hematološke bolesti, respiratorne bolesti, mišićno-skeletne bolesti, neurološke bolesti, urološke bolesti.

[0007] Objavljeno je za ranu fazu sepse da ADM poboljšava srčanu funkciju i snabdevanje krvlju jetre, slezine, bubrega i tankog creva. Antitela koja neutrališu ADM, neutrališu ranije pomenute efekte tokom rane faze sepse (Wang, P., "Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis", Peptides, Vol. 22, str. 1835-1840 (2001) Wang, P., et al., "The Pivotal role of adrenomedullin in producing hyperdynamic circulation during early stage of sepsis", Archives of Surgery, Vol.133, str.1298-1304 (1998)).

[0008] U kasnijoj fazi sepse, hipodinamičkoj fazi sepse, ADM nosi faktor rizika koji je čvrsto povezan sa mortalitetom pacijenata u septičkom šoku. (Schütz et al., "Circulating Precursor levels of endothelin-1 and adrenomedullin, two endothelium-derived, counteracting substances, in sepsis", Endothelium, 14:345-351, (2007)). Metodi za dijagnozu i tretman kritično bolesnih pacijenata, npr. u vrlo kasnim fazama sepse, i upotreba endotelina i agonista endotelina sa vazokonstriktornim dejstvom za dobijanje lekova za tretman kritično bolesnih pacijenata su opisani u WO-A12007/062676. Dalje je opisano u WO-A1 2007/062676 da se koriste, umesto endotelina i/ili agonista endotelina, ili u kombinaciji sa njima, antagonisti adrenomedulina, tj. molekuli koji sprečavaju ili ublažavaju vazodilatirajuće dejstvo adrenomedulina, npr. blokiranjem njegovih relevantnih receptora, ili supstance koje sprečavaju vezivanje adrenomedulina za njegov receptor (npr. specifična veziva, kao što su, npr., antitela koja se vezuju za adrenomedulin i koja blokiraju njegova mesta vezivanja za receptor; "imunološka neutralizacija"). Takva upotreba, ili kombinovana upotreba, uključujući sledeću ili prethodnu odvojenu upotrebu, je opisana u određenim slučajevima kao željena, na primer, za poboljšanje terapijske uspešnosti, ili da bi se izbegao neželjen fiziološki stres ili bočni efekti. Prema tome, objavljeno je da antitela koja neutrališu ADM mogu da se koriste za lečenje sepse u kasnom stadijumu.

[0009] Administracija ADM u kombinaciji sa proteinom-1 vezivanja ADM je opisana u stanju tehnike za lečenje sepse i septičkog šoka. Smatra se da lečenje životija sa sepsom pomoću ADM i proteina-1 vezivanja ADM sprečava prelaz u kasnu fazu sepse. Mora se napomenuti da je u živom organizmu protein vezivanja ADM (faktor komplementa H) prisutan u cirkulaciji navedenog organizma u visokim koncentracijama (Pio et al.: Identification, characterization, and physiological actions of factor H as an Adrenomedullin binding Protein present in Human Plasma; Microscopy Res. and Technique, 55:23-27 (2002) i Martinez et al.; Mapping of the Adrenomedullin-Binding domains in Human Complement factor H; Hypertens Res Vol.26, Suppl (2003), S56-59).

[0010] U skladu sa ovom prijavom, o proteinu-1 vezivanja ADM se može govoriti i kao o proteinu-1 vezivanja ADM (faktor komplementa H).

[0011] Pacijenti koji imaju hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje, posebno pacijenti u ICU (jedinica za intenzivnu negu), mogu imati neravnotežu tečnosti. Ovo može da izazove teške neželjene događaje kao što su bubrežna insuficijencija i mortalitet.

[0012] Predmet ovog pronalaska je bio da se obezbedi lek za regulisanje ravnoteže tečnosti i/ili poboljšanje ravnoteža tečnosti kod takvih pacijenata.

[0013] Rešenje je antitelo na adrenomedulin (ADM) i fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili struktura antitela na ADM bez Ig za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta koji pati od neravnoteže tečnosti i gde se navedeno antitelo ili fragment antitela ili struktura bez Ig vezuje za region od bar 4 aminokiseline u okviru sekvence aa 1-21 zrelog humanog ADM:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC

(SEQ ID No.23).

[0014] Pronalazak je definisan pridruženim patentnim zahtevima.

[0015] Izraz "regulisanje ravnoteže tečnosti" u kontekstu predmetnog pronalaska znači bilo kakvo popravljanje manifestovane - neravnoteže - pacijentove ravnoteže tečnosti usled postojeće hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja. Navedeno popravljanje je u smeru ponovnog uspostavljanja normalnog krvnog pritiska kod navedenog pacijenta. Stručnjak je potpuno svestan da je krvni pritisak uopšteno, kao i hiper- i hipotenzija, usko vezan za ravnotežu tečnosti pacijenta. Ravnoteža tečnosti je ravnoteža ulaza i izlaza tečnosti u telo da bi se omogućilo funkcionisanje metaboličkih procesa. Dehidratacija je definisana kao 1% ili veći gubitak telesne mase kao rezultat gubitka tečnosti. Tri elementa za procenu ravnoteže tečnosti i statusa hidratacije su: klinička procena, telesna težina i izlaz urina; praćenje dijagrama ravnoteže tečnosti i praćenje hemije krvi. Sve ovo je dobro poznato stručnjaku (Alison Shepherd, Nursing Tomes 19.07.11/Vol 107 No 28, strane 12 do 16).

[0016] Prema tome, u jednom rešenju, osoba kojoj je potrebno regulisanje ravnoteže tečnosti i/ili poboljšanje ravnoteže tečnosti kod takvih pacijenata je osoba koja ima 1% ili veći gubitak telesne mase kao rezultat gubitka tečnosti. Ravnoteža tečnosti se može proceniti prema radu Scales-a i Pilsworth-a (2008), Nursing Standard 22:47, 50-57. Na primer, normalno izlučivanje urina je u opsegu od 0,5 do 2 ml/kg telesne težine na sat. Minimalna prihvatljiva izlučena količina urina za pacijenta sa normalnom renalnom funkcijom je 0,5 ml/kg na sat. Svi ovi standardi mogu da se koriste da se proceni da li je pacijentu potrebno regulisanje ravnoteže tečnosti i/ili poboljšanje ravnoteže tečnosti.

[0017] U celom opisu, "antitela" ili "fragmenti antitela" ili "strukture bez Ig" prema pronalasku, su sposobne da se vežu za ADM i time su usmerene na ADM i zato se mogu nazivati "antitela na ADM", "fragmenti antitela na ADM", ili "anti-ADM strukture bez Ig".

[0018] U jednom drugom rešenju pronalaska, anti-ADM antitela, anti-ADM fragmenti antitela ili anti-ADM strukture bez Ig, u skladu sa pronalaskom, su sposobne da se vežu za cirkulišući ADM i time su usmerene na cirkulišući ADM.

[0019] U jednom drugom rešenju pronalaska, anti-adrenomedulinsko (ADM) antitelo, ili njegov anti-ADM fragment ili i anti-ADM struktura bez Ig, je namenjeno za upotrebu u kombinaciji sa tečnostima koje se administriraju intravenozno, gde se navedena kombinacija koristi u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, za regulaciju ravnoteže tečnosti.

[0020] U jednom drugom rešenju pronalaska, anti-adrenomedulinsko (ADM) antitelo ili njegov anti-ADM fragment ili i anti-ADM struktura bez Ig, je namenjeno za upotrebu u kombinaciji sa vazopresorskim agensima, npr. kateholaminom, gde se navedena kombinacija koristi u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, za regulaciju ravnoteže tečnosti.

[0021] Predmet ovog pronalaska je anti-adrenomedulinsko (ADM) antitelo ili anti-ADM fragment antitela ili anti-ADM struktura bez Ig za regulisanje ravnoteže tečnosti u pacijentu koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje.

[0022] Predmet ovog pronalaska je metod za regulisanje ravnoteže tečnosti u pacijentu koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje. U skladu sa pronalaskom, navedeni pacijent je pacijent kome je potrebno regulisanje ravnoteže tečnosti.

[0023] Predmet ovog pronalaska je antitelo na ADM ili anti-ADM fragment antitela ili struktura bez Ig za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, za regulisanje ravnoteže tečnosti.

[0024] Antitelo na adrenomedulin (ADM) je antitelo koje se specifično vezuje za ADM, fragment antitela na adrenomedulin je fragment anti-ADM antitela, gde se navedeni fragment specifično vezuje za ADM. Anti-ADM struktura bez Ig je struktura bez Ig koja se specifično vezuje za ADM.

[0025] Specifično vezivanje za ADM dozvoljava i vezivanje za druge antigene. To znači da ova specifičnost ne bi isključila unakrsno reagovanje antitela sa drugim polipeptidima na koje je podignuto.

[0026] Pacijent u statusu neravnoteže tečnosti može da dobije tečnost koja se administrira intravenozno kao standardnu meru nege, pogotovo u ICU okruženju. Poželjno je, međutim, da se smanji ili izbegne dodatna administracija tečnosti zbog komplikacija koje mogu da nastanu, kao, npr., pojava edema (edem ekstremiteta). Edem znači otok izazvan tečnošću u telesnim tkivima. On može da se pojavi u stopalima i nogama, ali može da uključi celo telo i može da uključi organe, kao što su npr. pluća, srce, oko. Prema tome, antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, se može davati u vremenskoj tačci kad je pacijentu potrebno davanje tečnosti. U skladu sa pronalaskom, navedeni pacijent je pacijent kome je potrebno regulisanje ravnoteže tečnosti.

[0027] Prema tome, predmet ovog pronalaska je i antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, za regulisanje ravnoteže tečnosti, koja uključuje, ali nije ograničena na sprečavanje ili smanjenje edema, gde navedeni pacijent pati od neravnoteže tečnosti i gde se navedeno antitelo ili fragment antitela ili struktura bez Ig vezuje za region od bar 4 aminokiseline unutar sekvence aa 1-21 prirodnog humanog ADM:

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC

(SEQ ID No.23).

[0028] Antitelo na ADM ili fragment antitela na ADM, ili anti-ADM struktura bez Ig, se može davati i preventivno pre nego što pacijent ispolji bilo kakve znake neravnoteže tečnosti. To može biti slučaj ako pacijent ima hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje u kom se mogu očekivati problemi neravnoteže tečnosti, npr. koji sadrži teške infekcije, kao što su npr. meningitis, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), sepsa; druge bolesti kao što su dijabetes, kancer, akutne i hronične vaskularne bolesti kao što su npr. srčana insuficijencija, infarkt miokarda, moždani udar, ateroskleroza; šok kao što su npr. septički šok i disfunkcija organa kao što su npr. disfunkcija bubrega, disfunkcija jetre, opekotine, operacija, fizičke traume, trovanje, oštećenja hemoterapijom. Naročito je korisno antitelo ili fragment ili struktura u skladu sa predmetnim pronalaskom za smanjenje rizika od mortaliteta tokom sepse i septičkog šoka, tj. kasne faze sepse.

[0029] U kliničkim kriterijumima za SIRS, sepsu, tešku sepsu, biće definisan septički šok.

1) Sistemski inflamatorni odgovor domaćina (SIRS), okarakterisan pomoću bar dva od sledećih simptoma

[0030]

• pacijenti ispoljavaju hipotenziju (srednji arterijski pritisak je < 65 mm Hg)

• povišen serumski nivo laktata na > 4 mmol/L

• glukoza u krvi > 7,7 mmol/L (u odsustvu dijabetesa)

• centralni venski pritisak nije u opsegu od 8-12 mm Hg

• izlučen urin je < 0,5 mL po kg na sat

• centralna venska (gornja šuplja vena) saturacija kiseonika je < 70% ili mešana venska < 65%

• srčani puls je > 90 udara/min

• temperatura < 36°C ili > 38°C

• respiratorna brzina > 20/min

• broj belih krvnih zrnaca < 4 ili > 12 x 10<9>/L (leukocita); > 10% nezrelih neutrofila

2) Sepsa

[0031] Posle bar dva od simptoma pomenutih pod 1) i dodatne kliničke sumnje na novu infekciju, koja može biti:

• kašalj/sputum/bol u grudima

• bol u abdomenu /distenzija/dijareja

• infekcija preko linije

• endokarditis

• disurija

• glavobolja sa ukočenošću vrata

• celulitis/rana/infekcija zgloba

• pozitivna mikrobiologija na bilo koju infekciju

3) Teška sepsa

[0032] Uz uslov da je sepsa manifestovana u pacijentu i da postoji dodatna klinička sumnja na bilo kakvu disfunkciju organa, koja može biti:

• krvni pritisak sistolni < 90/srednji; < 65mmHG

• laktat > 2 mmol/L

• bilirubin > 34µmol/L

• izlučen urin < 0,5 mL/kg/h za 2h

• kreatinin > 177 µmol/L

• pločice < 100x10<9>/L

• SpO2> 90% ako nije dat O2

4) Septički šok

[0033] Bar jedan znak disfunkcije organa kao što je pomenuto pod 3) je manifestovan. Septički šok je indikovan, ako postoji refraktorna hipotenzija koja ne odgovara na tretman i ako samo intravenozna administracija tečnosti nije dovoljna da se održi pacijentov krvni pritisak od spuštanja u hipotenziju, takođe se obezbeđuje davanje antitela na ADM ili fragmenta antitela na ADM ili anti-ADM strukture bez Ig u skladu sa predmetnim pronalaskom.

[0034] Prema tome, akutne bolesti ili akutna stanja mogu biti odabrana iz grupe, ali nisu ograničena na grupu koja sadrži teške infekcije, kao što su npr. meningitis, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), ili sepsa; druge bolesti, kao što su dijabetes, kancer, akutne i hronične vaskularne bolesti, kao što su npr. srčana insuficijencija, infarkt miokarda, moždani udar, ateroskleroza; šok, kao što je, npr. septički šok i disfunkcija organa, kao što su npr. disfunkcija bubrega, disfunkcija jetre, opekotine, operacija, fizičke traume, trovanje, oštećenja indukovana hemoterapijom. Naročito je korisno antitelo ili fragment ili struktura u skladu sa predmetnim pronalaskom za smanjenje rizika od mortaliteta tokom sepse i septičkog šoka, tj. kasnih faza sepse.

[0035] U jednom rešenju predmetnog pronalaska, pacijent ne pati od SIRS, teške infekcije, sepse, šoka, kao što je npr. septički šok. Navedena teška infekcija se odnosi na, npr. meningitis, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), sepsu, tešku sepsu i šok, kao što je, npr., septički šok. U tom smislu, teška sepsa se odlikuje time što se sepsa manifestuje kod navedenog pacijenta i dodatno je prisutna klinička sumnja na bilo kakvu disfunkciju organa, koja može biti:

• krvni pritisak sistolni < 90/srednji; < 65mmHG

• laktat > 2 mmol/L

• bilirubin > 34µmol/L

• izlučen urin < 0,5 mL/kg/h za 2h

• kreatinin > 177 µmol/L

• pločice < 100x10<9>/L

• SpO2> 90% ako nije dat O2

[0036] U jednom drugom rešenju, navedene akutne bolesti ili akutna stanja nisu sepsa, ili nije teška sepsa, ili nije SIRS, ili nije šok, ili nije septički šok.

[0037] U jednom drugom rešenju, navedene akutne bolesti ili akutna stanja nisu sepsa.

[0038] U još jednom rešenju, navedene akutne bolesti ili akutna stanja su odabrana iz grupe koja sadrži meningitis, dijabetes, kancer, akutne i hronične vaskularne bolesti, kao što su npr. srčana insuficijencija, infarkt miokarda, moždani udar, ateroskleroza; šok, kao što su npr. septički šok i disfunkcija organa, kao što su npr. disfunkcija bubrega, disfunkcija jetre, opekotine, operacija, fizičke traume, trovanje, oštećenja indukovana hemoterapijom.

Ravnoteža tečnosti/ terapija tečnošću

[0039] U okruženju bolničke intenzivne nege, koje može biti npr. okruženje u ICU, obično, kliničko osoblje pažljivo prati ravnotežu tečnosti, pošto to daje određenu informaciju o pacijentovom aktuelnom stanju hidratacije i time o renalnoj i kardiovaskularnoj funkciji.

[0040] Ako je, međutim, akutan gubitak tečnosti veći od dobitka tečnosti, smatra se da je pacijent u negativnoj ravnoteži tečnosti. U tom slučaju, fiziološka tečnost se često daje intravenozno od strane lekara da bi se kompenzovao taj gubitak.

[0041] Nasuprot tome, pozitivna ravnoteža tečnosti, gde je dobitak tečnosti veći od gubitka tečnosti, može da da informaciju o problemu ili u renalnom, ili u kardiovaskularnom sistemu.

[0042] Ovo konkretno znači, u kontekstu npr. SIRS, sepse, teške sepse i septičkog šoka, da je i krvni pritisak nizak (obično se to naziva hipotenzija) i brzina filtracije u bubrezima će se smanjiti, što će izazvati manju reapsorpciju i manje izlučivanje urina.

[0043] Termin "terapija tečnošću" uopšteno označava terapijsko davanje tečnosti (kao što je fiziološki slani rastvor ili voda za injekcije (WFI)) pacijentu kao terapiju ili preventivnu meru. Može se davati intravenskim, intraperitonealnim, intraosealnim, subkutanim i oralnim putem.

[0044] Terapija tečnošću je indikovana bilo kad postoji gubitak tečnosti, bilo kad postoji rizik od gubitka tečnosti zbog postojeće bolesti ili stanja. Težina gubitka tečnosti i odeljak iz kog je izgubljena utiču na izbor tečnosti i brzine kojom ona treba da se daje. Ako se terapija tečnošću izvodi kao lečenje, onda je neophodno dijagnostikovati i lečiti postojeću bolest ili stanje. Terapija tečnošću je rutinski indikovana u slučaju hipotenzije, hipovolemije, metaboličkih poremećaja, smanjenog snabdevanja kiseonikom, SIRS, sepse, teške sepse, šoka i septičkog šoka.

[0045] Međutim, treba naglasiti da su lekovi koje obezbeđuje predmetni pronalazak, pošto su anti-ADM antitela, fragmenti antitela na ADM, ili anti-ADM strukture bez Ig, namenjena samo za upotrebu u cilju regulisanja ravnoteže tečnosti i time nisu ni za kakve metode primarnog lečenja same hronične ili akutne bolesti ili stanja. To znači da predmetni pronalazak ne obezbeđuje terapiju isceljenja/lečenja npr. meningitisa, sindroma sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS) ili sepse ili teške sepse; drugih bolesti, kao što su dijabetes, kancer, akutne i hronične vaskularne bolesti, kao što su npr. srčana insuficijencija, infarkt miokarda, moždani udar, ateroskleroza; šoka, kao što je, npr. septički šok i disfunkcija organa, kao što su npr. disfunkcija bubrega, disfunkcija jetre, opekotine, operacija, fizičke traume, trovanje, oštećenja indukovana hemoterapijom, u okviru pronalaska.

[0046] Efekat regulisanja tečnosti koji ima antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, time podržava primarnu terapiju navedene hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja. U slučaju hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja, kao što su teške infekcije, kao što je npr. meningitis, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), sepsa ili slično, primarna terapija bi bila, npr., administracija antibiotika. Antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, bi regulisalo ravnotežu tečnosti i pomoglo da se spreči pogoršanje kritičnog stanja navedenog pacijenta dok npr. administracija antibiotika ne počne da deluje. Kao što je ranije pomenuto, antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, se može davati na preventivan način ili na terapijski način, što znači da bi se sprečili problemi neravnoteže tečnosti ili da bi se smanjila neravnoteža tečnosti kad su prisutni problemi neravnoteže tečnosti kod navedenog pacijenta. Edem je uključen u termin problemi neravnoteže tečnosti.

[0047] Treba naglasiti da, u skladu sa pronalaskom, pacijenti mogu da imaju hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje kao primarnu ili postojeću bolest, kao što je, npr., kancer, ili dijabetes melitus. Međutim, te primarne ili postojeće bolesti nisu meta prima facie terapijskog tretmana prema pronalasku. Naprotiv, terapijski tretman prema pronalasku je samo usmeren na akutne simptome koji su dijagnostikovani ili indikovani za terapiju tečnošću.

[0048] Prema tome, pronalazak ne obezbeđuje primarnu terapiju za kancer, dijabetes melitus, meningitis, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), sepsu ili slično, nego za terapiju pacijenata koji pate od neravnoteže tečnosti usled akutne bolesti ili akutnog stanja, i zato im je potrebna administracija tečnosti.

[0049] U jednom rešenju pronalaska, antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, treba da se koristi u kombinaciji sa tečnostima administriranim intravenozno, gde je navedena kombinacija za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta za regulaciju ravnoteže tečnosti navedenog pacijenta.

[0050] U jednom rešenju pronalaska, navedeni pacijent koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili stanje, kome je potrebna regulaciju ravnoteže tečnosti, se odlikuje potrebom navedenog pacijenta da dobije intravenozne tečnosti. U jednom drugom rešenju pronalaska, navedeni pacijent koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili stanje, kome je potrebna regulacija ravnoteže tečnosti, se odlikuje rizikom da navedeni pacijent dobije edem ili prisustvom edema u navedenom pacijentu.

[0051] Predmet ovog pronalaska u jednom specifičnom rešenju je, dakle, antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin (ADM) ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji pacijenta kome su potrebne intravenozne tečnosti ili za upotrebu u terapiji pacijenta koji nosi rizik da dobije edem ili koji već ima edem.

[0052] U jednom drugom rešenju pronalaska, antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin (ADM) ili anti-ADM struktura bez Ig, je namenjeno za upotrebu u kombinaciji sa sa vazopresorskim agensima, npr. kateholaminom, gde se navedena kombinacija koristi u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, za regulaciju ravnoteže tečnosti.

[0053] U jednom rešenju pronalaska, navedeni pacijent koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili stanje, kome je potrebna regulacija ravnoteže tečnosti, se odlikuje potrebom da navedeni pacijent dobije vazopresorske agense, npr. kateholamin.

[0054] Predmet ovog pronalaska u jednom specifičnom rešenju je, dakle, antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji pacijenta kome je potreban tretman vazopresorskim agensom, npr. kateholaminom.

[0055] Pacijent kome je potrebno poboljšanje ravnoteže tečnosti se može odlikovati kapilarnim curenjem i može imati lučenje urina </= 0,5 - 1 cc/kg na sat.

[0056] Štaviše, u jednom rešenju pronalaska, antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, je monospecifično. Monospecifično antitelo na adrenomedulin (ADM), ili monospecifičfragment antitela na adrenomedulin ili monospecifična anti-ADM struktura bez Ig, znači da se navedeno antitelo, ili fragment antitela ili struktura bez Ig, vezuje za jedan specifičan region koji obuhvata bar 5 aminokiselina unutar ciljnog ADM. Monospecifično antitelo na adrenomedulin (ADM), ili monospecifičfragment antitela na adrenomedulin ili monospecifična anti-ADM struktura bez

1

Ig, su antitela na adrenomedulin (ADM), ili fragmenti antitela na adrenomedulin ili anti-ADM strukture bez Ig, koja sva imaju afinititet za isti antigen.

[0057] U jednom specifičnom i poželjnom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje monospecifično antitelo na adrenomedulin (ADM), ili monospecifičfragment antitela na adrenomedulin ili monospecifičnu anti-ADM strukturu bez Ig, koje se odlikuje time što se navedeno antitelo ili fragment antitela ili struktura bez Ig vezuje za jedan specifičan region koji obuhvata bar 4 aminokiseline unutar ciljnog ADM.

[0058] U jednom drugom specifičnom rešenju, antitelo na ADM ili fragment antitela koji se vezuje za ADM je monospecifično antitelo. Monospecifično znači da se navedeno antitelo ili fragment antitela vezuje za jedan specifičan region koji poželjno obuhvata bar 4, ili bar 5 aminokiselina unutar ciljnog ADM. Monospecifična antitela ili fragmenti su antitela ili fragmenti koji svi imaju afinititet za isti antigen. Monoklonska antitela su monospecifična, ali monospecifična antitela se mogu proizvoditi i drugim sredstvima osim proizvodnje iz uobičajenih embrionskih ćelija.

[0059] Antitelo prema predmetnom pronalasku je protein koji uključuje jedan ili više polipeptida, suštinski kodiran imunoglobulinskim genima, koji specifično vezuje antigen. Prepoznati imunoglobulinski geni uključuju gene za konstantne regione kapa, lambda, alfa (IgA), gama (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta (IgD), epsilon (IgE) i mi (IgM), kao i mnoštvo imunoglobulinskih gena za varijabilne regione. Imunoglobulinski laki lanci pune dužine su obično oko 25 Kd ili 214 aminokiselina u dužini. Imunoglobulinski teški lanci pune dužine su obično oko 50 Kd ili 446 aminokiselina u dužini. Lake lance kodira gen za varijabilne regione na NH2-terminusu (oko 110 aminokiselina u dužini) i kapa ili lambda gen za konstantni region na COOH-terminusu. Teške lance slično kodira gen za varijabilne regione (oko 116 aminokiselina u dužini) i jedan od ostalih gena za konstantne regione.

[0060] Osnovna strukturna jedinica antitela je obično tetramer koji se sastoji od dva identična para imunoglobulinskih lanaca, gde svaki par ima jedan lak i jedan težak lanac. U svakom paru, varijabilni regioni lakog i teškog lanca se vezuju za antigen, a konstantni regioni posreduju u efektorskim funkcijama. Imunoglobulini postoje i u nizu drugih oblika uključujući, na primer, Fv, Fab, i (Fab')2, kao i bifunkcionalna hibridna antitela i jednostruke lance (npr., Lanzavecchia et al., Eur. J. Imunol. 17:105,1987; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883, 1988; Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed., 1984; Hunkapiller and Hood, Nature 323:15-16,1986). Imunoglobulinski varijabilni region lakog ili teškog lanca uključuje okvirni region u koji su umetnuta tri hipervarijabilna regiona, koji se zovu i regioni koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) (videti, Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Kao što je gore primećeno, CDR-ovi su prvenstveno odgovorni za vezivanje za epitop antigena. Imuni kompleks je antitelo, kao što je monoklonsko antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo ili humano antitelo, ili funkcionalni fragment antitela, specifično vezano za antigen. Himerna antitela su antitela čiji su geni za lak i težak lanac konstruisani, tipično genetičkim inženjeringom, iz imunoglobulinskih gena za varijabilne i konstantne regione koji pripadaju različitim vrstama. Na primer, varijabilni segmenti gena iz mišjeg monoklonskog antitela može da se spoji sa humanim konstantnim segmentima, kao što su kapa i gama 1 ili gama 3. U jednom primeru, terapijsko himerno antitelo je, dakle, hibridni protein sastavljen od varijabilnog ili antigen-vezujućeg domena iz mišjeg antitela i konstantnog ili efektorskog domena iz humanog antitela, iako se mogu koristiti i druge sisarske vrste, ili se varijabilni region može napraviti molekulskim tehnikama. Metodi pravljenja himernih antitela su dobro poznati u struci, npr., videti U.S. Patent No. 5,807,715. "Humanizovani" imunoglobulin je imunoglobulin koji uključuje humani okvirni region i jedan ili više CDR-ova iz ne-humanog imunoglobulina (kao što je mišji, pacovski ili sintetički). Imunoglobulin koji nije humani i koji obezbeđuje CDR-ove se naziva "donor", a humani imunoglobulin koji obezbeđuje okvir se naziva "akceptor." U jednom rešenju, svi CDR-ovi su iz donorskog imunoglobulina u humanizovanom imunoglobulinu. Konstantni regioni ne moraju da budu prisutni, ali ako jesu, oni moraju biti suštinski identični sa humanim imunoglobulinskim konstantnim regionima, tj., bar oko 85-90%, kao što je oko 95% ili više identični. Odatle, svi delovi humanizovanog imunoglobulina, osim možda CDR-ova, su suštinski identični sa odgovarajućim delovima prirodnih humanih imunoglobulinskih sekvenci. "Humanizovano antitelo" je antitelo koje sadrži imunoglobulinski humanizovan lak lanac i humanizovan težak lanac. Humanizovano antitelo vezuje isti antigen kao donorsko antitelo koje obezbeđuje CDR-ove. Akceptorski okvir humanizovanog imunoglobulina ili antitela može da ima ograničen broj supstitucija aminokiselinama uzetim iz donorskog okvira. Humanizovana ili druga monoklonska antitela mogu da imaju dodatne konzervativne supstitucije aminokiselina koje suštinski nemaju nikakav efekat na vezivanje antigena ili na druge funkcije imunoglobulina. Primeri konzervativnih supstitucija su one kao što je gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg i phe, tyr. Humanizovani imunoglobulini se mogu konstruisati sredstvima genetičkog inženjerstva (npr., videti U.S. Patent No. 5,585,089). Humano antitelo je antitelo u kom su geni za lak i težak lanac humanog porekla. Humana antitela se mogu praviti korišćenjem metoda poznatih u struci. Humana antitela se mogu proizvoditi imortalizovanjem humane B ćelije koja sekretuje antitelo od interesa. Imortalizacija se može postići, na primer, EBV infekcijom ili fuzionisanjem humane B ćelije sa ćelijom mijeloma ili hibridoma da se napravi ćelija trioma. Humana antitela se mogu proizvoditi i metodima eksponiranja na fazima (phage display) (videti, npr., Dower et al., PCT Publikacija br. WO91/17271; McCafferty et al., PCT Publikacija br. WO92/001047; i Winter, PCT Publikacija br. WO92/20791), ili se mogu izabrati iz kombinovane biblioteke humanih monoklonskih antitela (videti vebsajt Morphosys). Humana antitela se mogu dobijati korišćenjem transgenih životinja koje nose gen za humani imunoglobulin (na primer, videti Lonberg et al., PCT Publikacija br. WO93/12227; i Kucherlapati, PCT Publikacija br. WO91/10741).

[0061] Prema tome, antitelo na ADM može da ima formate poznate u struci. Primeri su humana antitela, monoklonska antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, antitela sa nakalemljenim CDR. U jednom poželjnom rešenju, antitela prema predmetnom pronalasku su rekombinantno proizvedena antitela, kao što je, npr., IgG, tipičan imunoglobulin pune dužine, ili fragmenti antitela koji sadrže bar F-varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca kao što su, npr., hemijski kuplovana antitela (vezivanje antigena fragmentom) uključujući, ali bez ograničenja, Fab-fragmente, uključujući Fab minitela, jednolančano Fab antitelo, monovalentno Fab antitelo sa epitopskim oznakama, npr. Fab-V5Sx2; bivalentno Fab (miniantitelo) dimerizovano sa CH3 domenom; bivalentno Fab ili multivalentno Fab, npr. formirano multimerizacijom uz pomoć heterolognog domena, npr. putem dimerizacije dHLX domena, npr. Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-fragmenata, scFv-fragmenata, multimerizovani multivalentni ili/i multispecifični scFv-fragmenti, bivalentna i/ili bispecifična dijatela, BITE® (bispecifičan T-ćelijski "angažer" (engager)), trifunkcionalna antitela, polivalentna antitela, npr. iz različite klase od G; jednodomenska antitela, npr. nanotela izvedena iz kamiljih ili ribljih imunoglobulina i mnoga druga.

[0062] Pored antitela na ADM, i druge biopolimerne strukture ("skele") za kompleksiranje ciljnog molekula su dobro poznate u struci i korišćene su za generisanje biopolimera visoko specifičnih za određene ciljeve. Primeri su aptameri, spigelmeri, antikalini i konotoksini. Za ilustraciju formata antitela, molimo da vidite Sl.1a, 1b i 1c.

[0063] U jednom poželjnom rešenju, format antitela na ADM je odabran iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, (Fab)2 fragment i scFv-Fc fuzioni protein. U jednom drugom poželjnom rešenju, format antitela je odabran iz grupe koja sadrži scFab fragment, Fab fragment, scFv fragment i njihove konjugate optimizovane na biodostupnost, kao što su PEGilovani fragmenti. Jedan od najpoželjnijih formata je scFab format.

[0064] Strukture bez Ig mogu biti proteinske "skele" i mogu se koristiti kao mimici antitela, jer su sposobne da se vežu za ligande ili antigene. Strukture bez Ig mogu biti odabrane iz grupe koja sadrži strukture bez Ig na bazi tetranektina (npr., opisane u US 2010/0028995), fibronektinske skele (npr., opisane u EP 1266 025;skele na bazi lipokalina (npr., opisane u WO 2011/154420); ubikvitinske skele (npr. opisane u WO 2011/073214), prenosne skele (npr. opisane u US 2004/0023334), skele od proteina A (npr. opisane u EP 2231860), skele na bazi ankirinskih ponovaka (npr. opisane u WO 2010/060748), mikroproteinske skele (poželjno od mikroproteina koji formiraju cistinski "čvor") (npr. opisane u EP 2314308), skele na bazi Fyn SH3 domena (npr. opisane u WO 2011/023685) skele na bazi EGFR-A-domena (npr. opisane u WO 2005/040229) i skele na bazi Kunitz domena (npr. opisane u EP 1941867).

[0065] U jednom rešenju pronalaska, antitela prema predmetnom pronalasku se mogu proizvoditi na sledeći način: Balb/c miš je imunizovan konjugatom ADM-100µg peptid-BSA nultog i 14. dana (emulzifikovanim u 100 µl kompletnog Freund-ovog adjuvanta) i 50 µg 21. i 28. dana (u 100 µl nekompletnog Freund-ovog adjuvanta). Tri dana pre nego što je izveden eksperiment sa fuzijom, životinja je primila 50 µg konjugata rastvorenog u 100 µl slanog rastvora, datog u vidu jedne intraperitonealne i jedne intravenske injekcije.

[0066] Splenociti iz imunizovanog miša i ćelije iz mijelomske ćelijske linije SP2/0 su fuzionisani pomoću 1 ml 50% polietileni glikola 30s na 37°C. Posle pranja, ćelije su zasejane u ploče za kulturu sa 96 udubljenja. Hibridni klonovi su odabrani gajenjem u HAT medijumu [RPMI 1640 medijum za kulture, obogaćen 20%-nim fetalnim telećim serumom i HAT-suplementom]. Posle dve nedelje, HAT medijum je zamenjen HT medijumom za tri pasaže, posle čega je vraćen normalan medijum za ćelijsku kulturu.

[0067] Supernatanti ćelijskih kultura su primarno skrinovani na IgG antitela specifična za antigen tri nedelje posle fuzije. Mikrokulture koje su bile pozitivne na testu su prebačene na ploče sa 24 udubljenja za propagaciju. Posle ponovnog testiranja, izabrane kulture su klonirane i ponovo klonirane primenom tehnike ograničenog razblaživanja i određeni su izotipovi (videti i Lane, R.D. (1985). A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. J. Immunol. Meth.

81: 223-228; Ziegler, B. et al. (1996) Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibodymediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies, Horm. Metab. Res.28: 11-15).

[0068] Antitela se mogu proizvoditi pomoću eksponiranja na fazima u skladu sa sledećom procedurom: biblioteke gena za humana naivna antitela HAL7/8 su korišćene za izolovanje rekombinantnih jednolančanih F-varijabilnih domena (scFv) protiv adrenomedulinskog peptida. Biblioteke gena za antitela su pretražene strategijom ispiranja koja obuhvata upotrebu

1

peptida koji sadrže biotin vezan preko dva različita spejsera za sekvencu adrenomedulinskog peptida. Mešavina tura ispiranja uz upotrebu nespecifično vezanog antigena i antigena vezanog za streptavidin je korišćena da se minimizira fon od nespecifičnog vezivanja. Eluirani fazi iz treće runde ispiranja su korišćeni za generisanje E.coli sojeva koji eksprimiraju monoklonske scFv. Supernatant iz kultivacije ovih klonskih sojeva je direktno korišćen za ELISA testiranje antigena (videti Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rülker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schütte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dübel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I.,Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dübel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625).

[0069] Humanizacija mišjih antitela se može sprovoditi prema sledećoj proceduri: za humanizaciju antitela mišjeg porekla, sekvenca antitela se analizira na strukturnu interakciju okvirnih regiona (FR) sa regionima koji određuju komplementarnost (CDR) i antigenom. Na osnovu strukturnog modelovanja, izabere se odgovarajući FR humanog porekla i mišje CDR sekvence se presade u humani FR. Varijacije u aminokiselinskoj sekvenci CDR-ova ili FR-ovi se mogu uvesti da bi se obnovile strukturne interakcije, koje su prekinute zamenom FR sekvenci iz različitih vrsta. Ovaj oporavak strukturnih interakcija se može postići nasumičnim pristupom pomoću biblioteka eksponiranih na fazima ili direktnim pristupom vođenim molekulskim modelovanjem (videti Almagro JC, Fransson J., 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-33).

[0070] U jednom poželjnom rešenju, format antitela na ADM se bira iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, F(ab)2fragment i scFv-Fc fuzioni protein. U jednom drugom poželjnom rešenju, format antitela se bira iz grupe koja sadrži scFab fragment, Fab fragment, scFv fragment i njihove konjugate optimizovane na biodostupnost, kao što su PEGilovani fragmenti. Jedan od najpoželjnijih formata je scFab format.

[0071] U jednom drugom poželjnom rešenju, antitelo na ADM, fragment antitela na ADM, ili anti-ADM struktura bez Ig, je antitelo pune dužine, fragment antitela, ili struktura bez Ig.

[0072] U jednom poželjnom rešenju, antitelo na ADM ili fragment antitela na adrenomedulin, ili anti-ADM struktura bez Ig, se usmerava na i može da se veže za epitop od bar 5 aminokiselina u dužini koje se sadrže u aa 1-21 zrelog humanog ADM.

[0073] U jednom još poželjnijem rešenju, antitelo na ADM ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig se usmerava na i može da se veže za epitop od bar 4 aminokiseline u dužini koje se sadrže u aa 1-21 zrelog humanog ADM.

[0074] U jednom specifičnom rešenju pronalaska, antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, je obezbeđeno za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktutra (skela) nije protein-1 vezivanja ADM (faktor komplementa H).

[0075] U jednom specifičnom rešenju pronalaska, antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, je obezbeđeno za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, gde se navedeno antitelo ili fragment ili skela vezuje za region od poželjno bar 4 ili bar 5 aminokiselina unutar sekvence aa 1-21 zrelog humanog ADM:

SEQ ID No 23

YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC.

[0076] U jednom poželjnom rešenju predmetnog pronalaska, navedeno antitelo na ADM, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, se vezuje za region ADM od poželjno bar 4 ili bar 5 aminokiselina koji je lociran na N-terminalnom delu (aa 1-21) adrenomedulina (videti Sl.2).

[0077] U jednom poželjnijem rešenju, antitelo na adrenomedulin, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-adrenomedulinska struktura bez Ig, se usmerava na i može da se veže za epitop od bar 4 aminokiseline u dužini koje se sadrže u aa 1-21 zrelog humanog ADM.

[0078] U jednom drugom poželjnom rešenju, navedeno antitelo na ADM, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prepoznaje i vezuje se za N-terminalni kraj (aa 1) adrenomedulina. N-terminalni kraj znači da aminokiselina 1, koja je "Y" u SEQ ID No.

21 ili 23; je obavezna za vezivanje antitela. Navedeno antitelo, ili fragment ili skela, se ne bi vezalo ni za adrenomedulin koji je produžen na N-terminusu, ni za adrenomedulin modifikovan na N-terminusu, ni adrenomedulin kome je razgrađen N-terminus.

[0079] U jednom drugom specifičnom rešenju prema pronalasku, ovde obezbeđeno antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, se ne vezuje za C-terminalni deo ADM, tj. aa 43 - 52 ADM-a (SEQ ID NO: 25):

PRSKISPQGY-NH2

(SEQ ID NO:25)

[0080] U jednom specifičnom rešenju, poželjno je da se koristi antitelo na ADM ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, u skladu sa predmetnim pronalaskom, gde je navedeno antitelo na adrenomedulin, ili navedeni fragment antitela na adrenomedulin ili struktura bez Ig, je antitelo koje stabilizuje ADM, ili fragment antitela koji stabilizuje ADM, ili struktura bez Ig koja stabilizuje ADM, koje povećava poluživot (t1/2; pola retencionog vremena) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi za bar 10 %, poželjno za bar 50 %, još poželjnije za >50 %, najpoželjnije za >100%.

[0081] Poluživot (pola retencionog vremena) ADM može da se odredi u humanoj plazmi u odsustvu i u prisustvu antitela koje stabilizuje ADM, ili fragmenta antitela koji stabilizuje adrenomedulin ili strukture bez Ig koja stabilizuje adrenomedulin, respektivno, primenom imunoeseja za kvantifikaciju ADM.

[0082] Mogu se sprovoditi sledeći koraci:

- ADM se može razblažiti u humanoj citratnoj plazmi u odsustvu i u prisustvu antitela koje stabilizuje ADM, ili fragmenta antitela koji stabilizuje adrenomedulin ili strukture bez Ig koja stabilizuje adrenomedulin, respektivno, i može se inkubirati na 24 °C

- alikvoti se uzimaju u odabranim vremenskim tačkama (npr. u okviru 24 sata) i može se zaustaviti degradacija ADM u navedenim alikvotima zamrzavanjem na -20 °C

- količina ADM se može odrediti pomoću hADM imunoeseja direktno, ako na izabrani esej ne utiče stabilišuće antitelo. Alternativno, alikvot se može tretirati sredstvima za

1

denaturaciju (kao HCl) i, posle izbistravanja uzorka (npr. centrifugiranjem), pH se može neutralisati i kvantifikovati ADM pomoću ADM imunoeseja. Alternativno, tehnologije različite od imunoeseja (npr. rpHPLC) se mogu koristiti za kvantifikaciju ADM

- poluživot ADM se računa za ADM inkubiran u odsustvu i u prisustvu antitela koje stabilizuje ADM, ili fragmenta antitela koji stabilizuje adrenomedulin ili strukture bez Ig koja stabilizuje adrenomedulin, respektivno

- povećanje poluživota se računa za stabilisan ADM u poređenju sa ADM koji je inkubiran u odsustvu antitela koje stabilizuje ADM, ili fragmenta antitela koji stabilizuje adrenomedulin ili strukture bez Ig koja stabilizuje adrenomedulin.

[0083] Dvostruko povećanje poluživota ADM je povećanje poluživota za 100%.

[0084] Poluživot (pola retencionog vremena) se definiše kao period tokom kog koncentracija specifikovane hemikalije ili leka padne na pola svoje početne koncentracije u specifikovanoj tečnosti ili krvi.

[0085] Esej koji se može koristiti za određivanje poluživota (pola retencionog vremena) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi, je opisan u Primeru 3.

[0086] Za neke bolesti, blokiranje ADM može da bude pogodno do određene mere. Međutim, to može biti i štetno ako se ADM potpuno neutrališe, jer određena količina ADM može biti potrebna za nekoliko fizioloških funkcija. U mnogim izveštajima je naglašeno da administracija ADM može biti blagotvorna u određenim bolestima. Nasuprot tome, u drugim izveštajima objavljeno je da ADM ugrožava život kad se daje u određenim stanjima.

[0087] U jednom specifičnom rešenju, navedeno antitelo na ADM, fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, je antitelo, fragment ili struktura bez Ig, koje ne neutrališe. Antitelo na ADM, fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, koje neutrališe bi blokiralo bioaktivnost ADM skoro 100%, bar više od 90%, poželjno bar više od 95%.

[0088] Nasuprot tome, antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, koje ne neutrališe, blokira bioaktivnost ADM manje od 100%, poželjno manje od 95%, poželjno manje od 90%, poželjnije manje od 80 %, a čak još poželjnije manje od 50 %. To znači da bi zaostala bioaktivnost ADM vezanog za antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM strukturu bez Ig, koje ne neutrališe, bila viša od 0%, poželjno viša od 5 %, poželjno viša od 10 %, poželjnije viša od 20 %, još poželjnije viša od 50 %.

[0089] U ovom kontekstu molekul, bilo da je to antitelo, ili fragment antitela ili struktura bez Ig, sa "ne-neutrališućom anti-ADM aktivnošću", kolektivno ovde nazvani zbog jednostavnosti "ne-neutrališuće" antitelo na ADM, fragment antitela, ili struktura bez Ig, koji, npr., blokira bioaktivnost ADM manje od 80 %, se definiše kao

- molekul ili molekuli koji se vezuju za ADM, koji, po dodavanju u kulturu eukariotske ćelijske linije, koja eksprimira funkcionalni humani rekombinantni ADM receptor sastavljen od CRLR (receptor nalik kalcitoninskom receptoru) i RAMP3 (protein 3 koji modifikuje aktivnost receptora), smanjuje količinu cAMP koju je proizvela ćelijska linija kroz dejstvo paralelno dodatog humanog sintetičkog ADM peptida, gde navedeni dodati humani sintetički ADM je dodat u količini koja, u odsustvu ne-neutrališućeg antitela koje treba analizirati, dovodi do polovine maksimalne stimulacije sinteze cAMP, gde se smanjenje cAMP pomoću navedenih molekula koji vezuju ADM dešava u meri, koja nije

1

veća od 80%, čak i kad se ne-neutrališući molekul koji vezuje ADM koji treba analizirati doda u količini, koja je 10 puta veća od količine, koja je potrebna da se dobije maksimalno smanjenje sinteze cAMP koje se može dobiti uz ne-neutrališuće antitelo koje se analizira.

[0090] Ista definicija važi i za druge opsege; 95%, 90%, 50% itd.

[0091] U jednom specifičnom rešenju prema pronalasku, koristi se antitelo na ADM ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, gde navedeno antitelo, ili fragment antitela na adrenomedulin blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50% (od početnih vrednosti). To je u smislu blokiranja cirkulišući ADM do ne više od 80% ili ne više od 50%, respektivno.

[0092] Podrazumeva se da se navedeno ograničeno blokiranje bioaktivnosti ADM javlja u višku koncentracije antitela, fragmenta ili strukture, što znači višak antitela, fragmenta ili strukture u odnosu na ADM. Navedeno ograničeno blokiranje je intrinsična osobina samog ADM veziva. To znači da navedeno antitelo, fragment ili struktura, ima maksimalnu inhibiciju od 80% ili 50%, respektivno. U jednom poželjnom rešenju, navedeno antitelo na ADM, fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, bi blokiralo bioaktivnost ADM do bar 5 %.

[0093] Ovo gore rečeno znači da približno 20% ili 50% ili čak 95% zaostale bioaktivnosti ADM ostaje prisutno, respektivno.

[0094] Prema tome, u skladu sa predmetnim pronalaskom, obezbeđena anti-ADM antitela, fragmenti antitela na ADM i anti-ADM strukture bez Ig ne neutrališu respektivnu bioaktivnost cirkulišućeg ADM.

[0095] Bioaktivnost se definiše kao efekat koji supstanca ima na živi organizam ili tkivo ili organ ili funkcionalnu jedinicu in vivo ili in vitro (npr. u eseju) posle njihove interakctije. U slučaju bioaktivnosti ADM, to može da bude efekat ADM u funkcionalnom eseju na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor pomoću cAMP. Prema tome, u skladu sa predmetnim pronalaskom, bioaktivnost se definiše preko funkcionalnog eseja na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor pomoću cAMP. Mogu se izvesti sledeći koraci da bi se odredila bioaktivnost ADM u takvom eseju.

- Konstruišu se krive doza - odgovor sa ADM u navedenom funkcionalnom eseju na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor pomoću cAMP.

- Može se izračunati koncentracija ADM na polovini maksimalne stimulacije cAMP.

- Pri konstantnoj polovini maksimalne stimulacije cAMP, konstruišu se krive doza -odgovor koncentracije ADM (i do konačne koncentracije 100µg/ml) pomoću antitela koje stabilizuje ADM ili fragmenta antitela koji stabilizuje adrenomedulin ili strukture bez Ig koja stabilizuje adrenomedulin, respektivno.

[0096] Maksimalna inhibicija u navedenom bioeseju sa ADM od 50% znači da navedeno antitelo na ADM ili navedeni fragment antitela na adrenomedulin ili navedeni antiadrenomedulinska struktura bez Ig, respektivno, blokira bioaktivnost do 50% od početnih vrednosti. Maksimalna inhibicija u navedenom bioeseju sa ADM od 80% znači da navedeno antitelo na ADM ili navedeni fragment antitela na adrenomedulin ili navedena antiadrenomedulinska struktura bez Ig, respektivno, blokira bioaktivnost ADM do 80%. Ovo je u

1

smislu da blokiranje bioaktivnosti ADM ne ide više od 80%. To znači da približno 20% zaostale bioaktivnosti ADM ostaje prisutno.

Međutim, u predmetnoj specifikaciji i u gornjem kontekstu, izraz "blokira bioaktivnost ADM" u odnosu na ovde opisana anti-ADM antitela, fragmente antitela na ADM, i anti-ADM strukture bez Ig, bi trebalo razumeti kao čisto smanjenje bioaktivnosti ADM, poželjno smanjenje bioaktivnosti cirkulišućeg ADM sa 100% do 20% zaostale bioaktivnosti ADM na maksimumu, poželjno smanjenje bioaktivnosti od 100% do 50% zaostale bioaktivnosti ADM; ali, u svakom slučaju, postoji zaostala bioaktivnost ADM koja se može odrediti kako što je gore dato detaljno.

[0097] Bioaktivnost ADM se može odrediti u funkcionalnom eseju na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor pomoću cAMP (adrenomedulinski esej) prema Primeru 2.

[0098] U jednom poželjnom rešenju, modulatorsko antitelo na ADM, ili modulatorski anti-ADM fragment antitela ili modulatorska anti-ADM struktura bez Ig, se koristi u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta za regulaciju ravnoteže tečnosti.

[0099] Takvo modulatorsko antitelo na ADM ili modulatorski anti-ADM fragment antitela ili modulatorska anti-ADM struktura bez Ig, može da bude naročito korisno u lečenju sepse. Modulatorsko antitelo na ADM ili modulatorski anti-ADM fragment antitela ili modulatorska anti-adrenomedulinska struktura bez Ig, pojačava bioaktivnost ADM u ranoj fazi sepse i smanjuje štetne efekte ADM u kasnoj fazi sepse.

[0100] "Modulatorsko" antitelo ili modulatorski fragment antitela na adrenomedulin ili struktura bez Ig koja moduliše adrenomedulin, je antitelo, ili fragment antitela na adrenomedulin ili struktura bez Ig, koja povećava poluživot (t1/2pola retencionog vremena) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi za bar 10 %, poželjno bar 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije >100% i blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50 %. Ove vrednosti vezane za poluživot i blokiranje bioaktivnosti treba da se razumeju u vezi sa ranije pomenutim testovima i definicijama da bi se odredile ove vrednosti.

[0101] Treba istaći da blokiranje bioaktivnosti ADM je u smislu da ne bude veće od 80% i time ostaje 20% rezidualne bioaktivnosti ADM. Isto se odnosi na blokiranje bioaktivnosti ADM, da ne bude veće od 50% i time ostaje 50% rezidualne bioaktivnosti ADM.

[0102] Takvo modulatorsko antitelo na ADM ili modulatorski anti-ADM fragment antitela ili modulatorska anti-adrenomedulinska struktura bez Ig, pruža prednost da olakšava doziranje administracije. Kombinacija delimičnog blokiranja ili delimičnog smanjenja bioaktivnosti adrenomedulina i povećanje in vivo poluživota (povećanje bioaktivnosti adrenomedulina) dovodi do pogodnog pojednostavljenja doziranja anti-adrenomedulinskog antitela, ili fragmenta antitela na adrenomedulin ili anti-adrenomedulinske strukture bez Ig. U situaciji viška endogenog adrenomedulina (maksimalna stimulacija, kasna faza sepse, šok, hipodinamična faza), efekat snižavanja aktivnosti je glavni impakt antitela, ili fragmenta ili strukture, koji ograničava (negativan) efekat adrenomedulina. U slučaju niskih ili normalnih koncentracija endogenog adrenomedulina, biološki efekat anti-adrenomedulinskog antitela, ili fragmenta antitela na adrenomedulin ili anti-ADM strukture bez Ig, je kombinacija snižavanja (delimičnim blokiranjem) i povećavanja povećanjem poluživota adrenomedulina. Ako je efekat poluživota jači od efekta blokiranja, neto biološka aktivnost endogenog adrenomedulina je povoljno povećana u ranim fazama sepse (nizak adrenomedulin, hiperdynamična faza). Prema tome, ne-neutrališućr i modulatorsko antitelo na adrenomedulin,

1

ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-adrenomedulinska struktura bez Ig, deluje kao pufer bioaktivnosti ADM, da bi održavalo bioaktivnost ADM u okviru određenog fiziološkog opsega.

[0103] Prema tome, doziranje anti-ADM antitela/fragmenta/strukture u, npr., sepsi, može da se odabere od koncentracije u višku, zato što obe faze sepse (rana i kasna) imaju korist od lečenja viškom antitela na ADM, ili fragmenta antitela na adrenomedulin ili anti-ADM strukture bez Ig, u slučaju efekta modulacije. Višak znači: koncentracija antitela na adrenomedulin, ili fragmenta antitela na adrenomedulin ili anti-ADM strukture bez Ig, je veća od one endogenog adrenomedulina tokom kasne faze (šok) npr. sepse. To znači, u slučaju modulatorskog antitela na ADM, ili modulatorskog fragmenta antitela na ADM ili modulatorske anti-ADM strukture, doziranje u sepsi može da bude sledeće:

Koncentracija adrenomedulina u septičkom šoku je 226±66 fmol/ml (Nishio et al., "Increased plasma concentrations of adrenomedullin correlate with relaxation of vascular tone in patients with septic shock.", Crit Care Med. 1997, 25(6):953-7), ekvimolarna koncentracija antitela ili fragmenta ili strukture je 42,5µg/l krvi, (na osnovu 61 zapremine krvi / 80kg telesne težine) 3,2µg/kg telesne težine. Višak znači bar dvostruka (srednja) koncentracija adrenomedulina u septičkom šoku, bar > 3µg antitela na adrenomedulin, ili fragmenta antitela na adrenomedulin ili anti-ADM strukture bez Ig na kg telesne težine, poželjno bar 6,4µg antitela na adrenomedulin, ili fragmenta antitela na adrenomedulin ili anti-ADM strukture bez Ig, na kg telesne težine. Poželjno > 10µg / kg, poželjnije >20µg/kg, najpoželjnije >100ug antitela na adrenomedulin, ili fragmenta antitela na adrenomedulin ili anti-ADM strukture bez Ig na kg telesne težine. Ovo se može primeniti i na druga teška i akutna stanja pored septičkog šoka.

[0104] U jednom specifičnom rešenju pronalaska, antitelo na ADM je monoklonsko antitelo ili fragment antitela na ADM. U jednom rešenju pronalaska, antitelo na ADM ili fragment antitela na ADM, je humano ili humanizovano antitelo ili je iz njega izvedeno. U jednom specifičnom rešenju, jedan ili više (mišjih) CDR je "nakalemljeno" na humano antitelo ili fragment antitela.

Predmet ovog pronalaska u jednom aspektu je humano antitelo sa nakalemljenim CD ili fragment tog antitela koji se vezuje za aa 1-21 zrelog humanog ADM, gde humano antitelo sa nakalemljenim CD ili fragment tog antitela sadrži težak lanac antitela (H lanac) koji sadrži

SEQ ID NO:1

GYTFSRYW SEQ ID NO: 2

ILPGSGST

i/ili

SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

i/ili još sadrži lak lanac antitela (L lanac) koji sadrži:

SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY SEQ ID NO: 5

RVS

i/ili

SEQ ID NO: 6

FQGSHIPYT.

1

[0105] U jednom specifičnom rešenju pronalaska, sadržaj predmetnog pronalaska je humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za aa 1-21 zrelog humanog ADM ili fragment tog antitela gde težak lanac obuhvata bar jedan CDR odabran iz grupe koja sadrži:

SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW SEQ ID NO: 2

ILPGSGST SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

i gde lak lanac obuhvata bar jedan CDR odabran iz grupe koja sadrži:

SEQ ID No: 4

QSIVYSNGNTY SEQ ID NO: 5

RVS SEQ ID NO: 6

FQGSHIPYT.

[0106] U jednom specifičnijem rešenju pronalaska, sadržaj pronalaska je humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za aa 1-21 zrelog humanog ADM ili fragment takvog antitela gde težak lanac obuhvata sekvence

SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW SEQ ID NO: 2

ILPGSGST SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

i gde lak lanac obuhvata sekvence

SEQ ID NO: 4

QSIVYSNGNTY SEQ ID NO: 5

RVS SEQ ID NO: 6

FQGSHIPYT.

[0107] U jednom vrlo specifičnom rešenju, antitelo na ADM ima sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži: SEQ ID NO 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 i 14.

[0108] Antitelo na ADM, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema predmetnom pronalasku, ispoljava afinitet prema humanom ADM na takav način da je konstanta afiniteta veća od 10<-7>M, poželjno 10<-8>M, poželjno je afinitet veći od 10<-9>M, najpoželjnije veći od 10<-10>M. Stručnjak zna da se može smatrati da se niži afinitet kompenzuje primenom veće doze jedinjenja i ta mera ne bi dovela do ispadanja iz opsega pronalaska. Konstante afiniteta se mogu određivati prema metod koji je opisan u Primeru 1.

2

[0109] U jednom poželjnom rešenju, antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, se koristi za smanjenje rizika od smrtnosti tokom navedene hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta.

[0110] Hronična ili akutna bolest ili akutno stanje prema predmetnom pronalasku može biti bolest ili stanje odabrano iz grupe koja sadrži teške infekcije, kao što su, npr., meningitis, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), sepsa; druge bolesti kao što su dijabetes, kancer, akutne i hronične vaskularne bolesti, kao što su, npr., srčana insuficijencija, infarkt miokarda, moždani udar, arterioskleroza; šok, kao što su, npr., septički šok i disfunkcija organa, kao što su, npr., disfunkcija bubrega, disfunkcija jetre ili kapilarno curenje, trauma, trovanje, operacija. Naročito je korisno antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig, prema predmetnom pronalasku, za smanjenje rizika od smrtnosti tokom sepse i septičkog šoka, tj. kasnih faza sepse.

[0111] Uz to, treba naglasiti da pacijent može da ima hroničnu ili akutnu bolest ili stanje kao primarnu i osnovnu bolest kao štoje istaknuto u gornjem paragrafu; međutim, antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili anti-ADM struktura bez Ig prema pronalasku, nije namenjeno za primarnu terapiju navedenin bolesti, nego pre za regulisanje ravnoteže tečnosti pacijenta kome je potrebna administracija tečnosti, što se, dakle, može smatrati akutnom bolešću ili akutnim stanjem pored primarne bolesti. Štaviše, navedena potreba za administracijom tečnosti može da bude vezana za primarnu osnovnu bolest, ali nije obavezno u okviru opsega ovog pronalaska.

[0112] Prema tome, u jednom rešenju, antitelo na ADM, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, se koristi u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema predmetnom pronalasku, gde je navedeni pacijent pacijent u jedinici za intenzivnu negu. U jednom drugom rešenju, antitelo na ADM, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, se koristi u terapiji akutne bolesti pacijenta prema predmetnom pronalasku, gde je navedeni pacijent kritično bolestan. Kritično bolestan znači da pacijent ima bolest ili stanje u kom je smrt moguća ili predstoji.

[0113] Predmet ovog pronalaska je dalje antitelo na ADM, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji akutne bolesti pacijenta prema predmetnom pronalasku, gde je navedeno antitelo ili fragment namenjen za upotrebu u kombinaciji sa proteinom koji vezuje ADM. Protein koji vezuje ADM je prirodno prisutan i u cirkulaciji navedenog pacijenta.

[0114] Treba naglasiti da termin proteinom koji vezuje ADM označava i protein-1 vezivanja ADM (faktor komplementa H), koji, međutim, nije ne-neutrališuće i modulatorsko antitelo na ADM, fragment antitela na ADM, ili anti-ADM struktura bez Ig, što je u skladu sa pronalaskom.

[0115] Predmet ovog pronalaska je dalje antitelo na ADM, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema predmetnom pronalasku, gde je navedeno antitelo, ili fragment ili struktura, namenjeno za upotrebu u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojcima.

[0116] Predmet ovog pronalaska je i antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, namenjeno za upotrebu u kombinaciji sa primarnim lekom, gde je navedena kombinacija namenjena za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, za regulisanje ravnoteže tečnosti navedenog pacijenta.

[0117] Primarni lek znači lek koji deluje na primarni uzrok navedene bolesti ili stanja. Navedeni primarni lek može da bude antibiotik u slučaju infekcija.

[0118] Treba naglasiti da je navedeni primarni uzrok vezan za primarnu i osnovnu bolest ili stanje, i nije vezan za akutnu bolest ili akutno stanje koje je povezano sa neravnotežom tečnosti pacijenta, za koju je ovde obezbeđena terapija za regulisanje ravnoteže tečnosti.

[0119] U jednom specifičnom rešenju ranije pomenutih kombinacija, navedene kombinacije su namenjene za upotrebu u kombinaciji sa vazopresorima, npr., kateholaminom, gde je navedena dalja kombinacija namenjena za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, za regulisanje ravnoteže tečnosti.

[0120] U jednom rešenju pronalaska, navedeni pacijent koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili hronično stanje, kome je potrebno regulisanje ravnoteže tečnosti, se odlikuje potrebom pacijenta da dobije administraciju vazopresora, npr., kateholamina.

[0121] Treba naglasiti da navedeni pacijent ima hroničnu ili akutnu bolest ili hronično stanje kao što je kancer ili dijabetes, i time se ovo može smatrati kao primarna, osnovna bolest, ali pored toga, navedeni pacijent ima akutnu potrebu za regulisanjem ravnoteže tečnosti, koja možda potiče od neke druge akutne bolesti ili akutnog stanja, kao što je npr. SIRS, sepsa, teška sepsa, ili šok, ili septički šok.

[0122] Predmet ovog pronalaska u jednom specifičnom rešenju je, dakle, antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, koje treba koristiti u kombinaciji sa proteinom koji vezuje ADM i/ili sa drugim aktivnim sastojcima, za upotrebu u terapiji pacijenta kome je potrebno lečenje vazopresorima, npr., lečenje kateholaminom.

[0123] U jednom specifičnom rešenju gorepomenutih kombinacija, navedene kombinacije treba koristiti u kombinaciji sa tečnostima administriranim intravenozno, gde je navedena kombinacija za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili stanja pacijenta, za regulisanje ravnoteže tečnosti.

[0124] U jednom rešenju pronalaska, navedeni pacijent koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje, kome je potrebno regulisanje ravnoteže tečnosti, se odlikuje potrebom pacijenta da dobije tečnosti intravenozno.

[0125] Predmet ovog pronalaska u jednom specifičnom rešenju je, dakle, antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig u kombinaciji sa proteinom koji vezuje ADM i/ili sa drugim aktivnim sastojcima, za upotrebu u terapiji pacijenta kome su potrebne tečnosti intravenozno.

[0126] Navedeno antitelo na ADM, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig ili njihove kombinacije sa proteinom koji vezuje ADM i/ili sa drugim aktivnim sastojcima, se može koristiti u kombinaciji sa vazopresorima, npr., kateholaminom i/ili sa tečnostima administriranim intravenozno, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, za regulisanje ravnoteže tečnosti.

[0127] Predmet ovog pronalaska je i antitelo na ADM, ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema predmetnom pronalasku, za upotrebu u kombinaciji sa antitelima na TNF-alfa. Antitela na TNF-alfa su komercijalno dostupna za lečenje pacijenata.

[0128] Predmet ovog pronalaska je dalje farmaceutska formulacija koji sadrži antitelo na ADM, ili fragment antitela na ADM ili antitelo na anti-ADM strukture prema predmetnom pronalasku.

[0129] Predmet ovog pronalaska je dalje farmaceutska formulacija prema predmetnom pronalasku, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.

[0130] Navedena farmaceutska formulacija se može davati intramuskularno. Navedena farmaceutska formulacija se može davati intravaskularno. Navedena farmaceutska formulacija se može davati preko infuzije.

[0131] Treba naglasiti da farmaceutska formulacija u skladu sa pronalaskom koja se može davati intramuskularno, intravaskularno, ili putem infuzije, se poželjno daje pacijentu za regulisanje sistemske ravnoteže tečnosti uz uslov da navedeni pacijent ima potrebu za regulisanjem ravnoteže tečnosti.

[0132] Prema tome, u jednom drugom rešenju predmetnog pronalaska, farmaceutska formulacija prema predmetnom pronalasku je namenjena za davanje pacijentu za regulisanje sistemske ravnoteže tečnosti uz uslov da navedeni pacijent ima potrebu za regulisanjem ravnoteže tečnosti.

[0133] Izraz "regulisanje ravnoteža tečnosti", u kontekstu ovog pronalaska, se odnosi na bilo kakvo popravljanje pacijentove manifestovane neravnoteže tečnosti zbog osnovne hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja. Navedeno popravljanje je u smeru ponovnog uspostavljanja normalnog krvnog pritiska kod navedenih pacijenata. Stručnjak je potpuno svestan da je krvni pritisak uopšteno, kao i hiper- i hipotenzija, usko vezan za ravnotežu tečnosti pacijenta. Ravnoteža tečnosti je ravnoteža ulaza i izlaza tečnosti u telo da bi se omogućilo funkcionisanje metaboličkih procesa. Dehidratacija je definisana kao 1% ili veći gubitak telesne mase kao rezultat gubitka tečnosti. Tri elementa za procenu ravnoteže tečnosti i statusa hidratacije su: klinička procena, telesna težina i izlaz urina; praćenje dijagrama ravnoteže tečnosti i praćenje hemije krvi. Sve ovo je dobro poznato stručnjaku (Alison Shepherd, Nursing Tomes 19.07.11/Vol 107 No 28, strane 12 do 16).

[0134] Prema tome, u jednom rešenju, osoba kojoj je potrebno regulsanje ravnoteže tečnosti i/ili poboljšanje ravnoteže tečnosti takvih pacijenata je osoba koja ima 1 % ili veći gubitak telesne mase kao rezultat gubitka tečnosti. Ravnoteža tečnosti se može proceniti prema radu Scales-a i Pilsworth-a (2008), Nursing Standard 22:47, 50-57. Na primer, normalan izlaz urina je u opsegu od 0,5 do 2 ml/kg telesne težine na sat. Minimalan prihvatljiv izlaz urina za pacijenta sa normalnom renalnom funkcijom je 0,5 ml/kg na sat. Svi ovi standardi se mogu koristiti za procenu da li je pacijentu potrebno regulisanje ravnoteže tečnosti i/ili poboljšanje ravnoteže tečnosti.

2

[0135] U jednom drugom rešenju, predmet ovog pronalaska je dalje farmaceutska formulacija prema predmetnom pronalasku, gde je navedena farmaceutska formulacija u suvom stanju, koju treba rekonstituisati pre upotrebe.

[0136] U jednom drugom rešenju, predmet ovog pronalaska je dalje farmaceutska formulacija prema predmetnom pronalasku, gde je navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.

[0137] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta za regulaciju ravnoteže tečnosti.

2. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin prema zahtevu 1, gde je format antitela odabran iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, (Fab)2 fragment i scFv-Fc fuzioni protein.

3. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin prema zahtevu 1 ili 2 gde navedeno antitelo ili fragment vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

4. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 to 3, gde navedeno antitelo ili fragment prepoznaje i vezuje se za N-terminalni deo (aa1) adrenomedulina.

5. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde je navedeno antitelo ili fragment antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment antitela koji stabilizuje ADM koji povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije >100 %.

6. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde navedeno antitelo ili fragment blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

7. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži sepsu, dijabetes, kancer, srčanu insuficijenciju, šok i disfunkciju bubrega.

8. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde je navedeni pacijent pacijent u jedinici za intenzivnu negu.

9. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 to 7, gde je navedeno antitelo ili fragment modulatorsko antitelo ili fragment koji povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije >100 % i koji blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

10. Farmaceutska formulacija koji sadrži antitelo ili fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

11. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 10, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.

12. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 10, gde navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.

13. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 10 to 11, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intramuskularno.

14. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 10 to 11, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intravaskularno.

15. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 14, gde se navedena farmaceutska formulacija daje putem infuzije.

[0138] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta za regulaciju ravnoteže tečnosti.

2. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema zahtevu 1, gde je navedeno antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, neneutrališuće antitelo na ADM ili ne-neutrališući fragment antitela na adrenomedulin ili neneutrališuća anti-ADM struktura bez Ig.

3. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja prema zahtevu 1 ili 2, za sprečavanje ili smanjivanje edema kod navedenog pacijenta. 4. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde je format antitela odabran iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, (Fab)2 fragment i scFv-Fc fuzioni protein.

5. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde se navedeno antitelo ili fragment ili struktura vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

6. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura prepoznaje i vezuje se za N-terminalni deo (aa1) adrenomedulina.

7. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde je navedeno antitelo ili

2

fragment ili struktura, antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment antitela koji stabilizuje ADM ili anti-ADM struktura bez Ig koja stabilizuje ADM, koje povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije >100 %.

8. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde navedeno antitelo ili fragment blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

9. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži SIRS, sepsu, dijabetes, kancer, srčanu insuficijenciju, šok i disfunkciju bubrega.

10. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je navedeno antitelo ili fragment humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela, gde težak lanac sadrži sekvence

SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW SEQ ID NO: 2

ILPGSGST SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

a gde lak lanac sadrži sekvence

SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY SEQ ID NO: 5

RVS SEQ ID NO: 6

FQGSHIPYT.

11. Humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela prema zahtevu 10, gde navedeno antitelo ili fragment sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži :

2

2

12. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je navedeni pacijent pacijent u jedinici za intenzivnu negu.

13. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 12, gde je navedeno antitelo, ili fragment ili struktura, modulatorsko antitelo ili fragment ili struktura, koje povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije >100 % i koje blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

14. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 13, za upotrebu u kombinaciji sa kateholaminom i/ ili tečnostima administriranim intravenozno.

15. Antitelo na ADM ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 13, ili kombinacija prema zahtevu 12, za upotrebu u kombinaciji sa proteinom koji vezuje ADM i/ili sa drugim aktivnim sastojcima.

16. Farmaceutska formulacija koji sadrži antitelo ili fragment ili strukturu prema bilo kom od zahteva 1 do 15.

17. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 16, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.

18. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 16 gde je navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.

19. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 16 do 17, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intramuskularno.

2

20. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 16 do 17, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intravaskularno.

21. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 20, gde se navedena farmaceutska formulacija daje putem infuzije.

[0139] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta za stabilizovanje cirkulacije.

2. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema zahtevu 1, gde navedeno antitelo ili fragment smanjuje potrebu za kateholaminom navedenog pacijenta.

3. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin prema zahtevu 1 ili 2, gde je format antitela odabran iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, (Fab)2 fragment i scFv-Fc fuzioni protein.

4. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde se navedeno antitelo ili fragment vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

5. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde navedeno antitelo ili fragment prepoznaje i vezuje se za N-terminalni deo (aa1) adrenomedulina.

6. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde je navedeno antitelo ili fragment antitelo koje stabilizuje ADM, koje povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije > 50 %, najpoželjnije >100 %.

7. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde navedeno antitelo ili fragment blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50 %.

8. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde je navedeno antitelo ili fragment modulatorsko Antitelo na ADM ili modulatorski fragment antitela na adrenomedulin, koje povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije > 50 %, najpoželjnije >100 % i koje blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50 %:

9. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži sepsu, dijabetes, kancer, akutne i hronične vaskularne bolesti kao što je, npr., srčana insuficijencija, šok kao što su, npr., septički šok i disfunkcija organa kao što je, npr., disfunkcija bubrega.

10. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

2

11. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 10, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.

12. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 10, gde je navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.

13. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 10 do 11, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intramuskularno.

14. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 10 do 11, gde se navedena farmaceutska formulacija se daje intravaskularno.

15. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 14, gde se navedena farmaceutska formulacija daje putem infuzije.

[0140] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti ili stanja pacijenta, za stabilizovanje cirkulacije.

2. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema zahtevu 1, gde navedeno, antitelo ili fragment ili struktura, smanjuje potrebu za vazopresorom, npr., potrebu za kateholaminom, navedenog pacijenta.

3. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema zahtevu 1 ili 2, gde navedeno antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, je neneutrališuće anti-Antitelo na ADM ili ne-neutrališući fragment antitela na adrenomedulin ili ne-neutrališuća anti-ADM struktura bez Ig.

4. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde je format antitela odabran iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, (Fab)2 fragment i scFv-Fc fuzioni protein.

5. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde se navedeno antitelo ili fragment ili struktura vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

6. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura prepoznaje i vezuje se za N-terminalni deo (aa1) adrenomedulina.

7. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura je antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment ili struktura, koje povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije > 50 %, najpoželjnije >100 %.

8. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50 %.

9. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je navedeno antitelo ili fragment ili struktura modulatorsko antitelo na ADM ili modulatorski fragment antitela na adrenomedulin ili struktura, koje povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije > 50 %, najpoželjnije >100 % i koje blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50 %:

10. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je navedeno antitelo ili fragment humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela, gde težak lanac sadrži sekvence

SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW SEQ ID NO: 2

ILPGSGST SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

a gde lak lanac sadrži sekvence

SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY SEQ ID NO: 5

RVS SEQ ID NO: 6

FQGSHIPYT.

11. Humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela prema zahtevu 10, gde navedeno antitelo ili fragment sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži:

1

2

12. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 11, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži SIRS, sepsu, dijabetes, kancer, akutne i hronične vaskularne bolesti kao što su, npr., srčana insuficijencija, šok, kao što je, npr., septički šok i disfunkcija organa, kao što je, npr., disfunkcija bubrega.

13. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 12, za upotrebu u kombinaciji sa kateholaminom i/ ili tečnostima administriranim intravenozno.

14. Antitelo na ADM ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 13 ili kombinacija prema zahtevu 10, za upotrebu u kombinaciji sa proteinom koji vezuje ADM i/ili drugim aktivnim sastojcima.

15. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo ili fragment ili strukturu bez Ig prema bilo kom od zahteva 1 do 14.

16. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 15, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.

17. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 15, gde je navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.

18. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 15 do 16, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intramuskularno.

19. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 14 do 16, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intravaskularno.

20. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 16, gde se navedena farmaceutska formulacija dajem putem infuzije.

[0141] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, gde je navedeno antitelo ili navedeni fragment antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment koje povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije 100 % i/ili gde navedeno antitelo blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno do manje od 50 %.

2) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, gde je navedeno antitelo ili navedeni fragment modulatorsko antitelo na ADM ili fragment koji povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije 100 % i koji blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno do manje od 50 %.

3) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti prema zahtevu 1 ili 2, gde se navedeno antitelo ili fragment vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

4) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, gde se navedeno antitelo ili navedeni fragment prema zahtevu 3 vezuje za N-terminalni deo adrenomedulina.

5) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde je navedeno antitelo ili navedeni fragment antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment koji povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije 100 %.

6) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde navedeno antitelo ili navedeni fragment blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno do manje od 50 %.

7) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 6, za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži SIRS, sepsu, septički šok, dijabetes, kancer, srčanu insuficijenciju, šok, insuficijenciju organa, disfunkciju bubrega, akutnu neravnotežu tečnosti i nizak krvni pritisak.

8) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, gde je navedena bolest septički šok ili sepsa.

9) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde navedeno antitelo ili fragment reguliše ravnotežu tečnosti navedenog pacijenta.

4

10) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde se navedeno antitelo ili fragment koristi za prevenciju disfunkcije organa ili insuficijencije organa.

11) Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti, prema zahtevu 10, gde se navedeno antitelo ili fragment koristi za prevenciju disfunkcije bubrega ili insuficijencije bubrega.

12) Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti u pacijentu prema zahtevima 1 do 11, gde se navedeno antitelo ili fragment koristi za stabilizovanje cirkulacije.

13) Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti u pacijentu prema zahtevu 12, gde navedeno antitelo ili fragment smanjuje potrebu za kateholaminom kod navedenog pacijenta.

14) Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti u pacijentu prema bilo kom od zahteva 1 do 13, za smanjenje rizika od smrtnosti navedenog pacijenta.

15) Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti u pacijentu prema bilo kom od zahteva 1 do 14, gde se navedeno antitelo ili fragment može davati u dozi od bar 3 µg / kg telesne težine.

16) Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 15.

[0142] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, gde je navedeno antitelo ili navedeni fragment ili struktura neneutrališuće antitelo.

2. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, gde je navedeno antitelo, ili navedeni fragment ili struktura antitelo ili fragment ili struktura, koje stabilizuje ADM, koje povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije 100 % i/ili gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno do manje od 50 %.

3. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig gde navedeno antitelo ili navedeni fragment je modulatorsko antitelo na ADM, ili fragment ili struktura, koje povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije 100 % i koje blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno do manje od 50 %.

4. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema zahtevu 1 ili 2, gde se navedeno antitelo ili fragment ili struktura vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

5. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, gde se navedeno antitelo ili navedeni fragment ili struktura prema zahtevu 3 vezuje za N-terminalni deo adrenomedulina.

6. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde je navedeno antitelo ili navedeni fragment ili navedena struktura antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment koji povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije 100 %.

7. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 6, zaupotrebu kao aktivna farmaceutska supstanca.

8. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 7, za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja, gde je navedena bolest ili stanje odabrano iz grupe koja sadrži teške infekcije, kao što su, npr., meningitis, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), sepsa; druge bolesti kao što su dijabetes, kancer, akutne i hronične vaskularne bolesti, kao što su, npr., srčana insuficijencija, infarkt miokarda, moždani udar, ateroskleroza; šok, kao što je, npr., septički šok i disfunkcija organa, kao što su, npr., disfunkcija bubrega, disfunkcija jetre, opekotine, operacija, fizičke traume.

9. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 8, za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja, gde je navedena bolest septički šok ili sepsa.

10. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je navedeno antitelo ili fragment humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela, gde težak lanac sadrži bar jednu od sekvenci:

SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW SEQ ID NO: 2

ILPGSGST SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

i/ili gde lak lanac sadrži bar jednu od sekvenci

SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY SEQ ID NO: 5

RVS SEQ ID NO: 6

FQGSHIPYT.

11. Humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela prema zahtevu 10, gde navedeno antitelo ili fragment sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži:

12. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 11, za regulisanje ravnoteže tečnosti u pacijentu koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje.

13. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 11, za sprečavanje ili smanjivanje disfunkcije organa ili insuficijencije organa u pacijentu koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje.

14. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema zahtevu 10, gde je organ bubreg ili jetra.

15. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema zahtevima 1 do 14, za stabilizovanje cirkulacije u pacijentu koji ima hroničnu ili akutnu bolest ili akutno stanje.

16. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti kod pacijenta prema zahtevu 15, gde navedeno antitelo ili fragment smanjuje potrebu za kateholaminom kod navedenog pacijenta.

17. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 16, za upotrebu u kombinaciji sa vazopresorima, npr. kateholaminom.

18. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 17, za upotrebu u kombinaciji sa intravenoznom administracijom tečnosti.

19. Antitelo na adrenomedulin ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 18, za upotrebu u kombinaciji sa antitelom na TNF-alfa.

20. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 19, za upotrebu u lečenju pacijenta kome je to potrebno, gde se navedeno antitelo ili fragment može davati u dozi od bar 3 µg / kg telesne težine.

21. Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili fragment ili strukturu prema bilo kom od zahteva 1 do 20.

22. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 20, za upotrebu u lečenju hronične ili akutne bolesti ili hroničnog stanja.

23. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili struktura bez Ig, prema zahtevu 22, gde je navedena bolest sepsa.

[0143] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u terapiji teške hronične ili akutne bolesti pacijenta, za smanjivanje rizika od smrtnosti navedenog pacijenta.

2. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin, prema zahtevu 1, gde je format antitela odabran iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, (Fab)2 fragment i scFv-Fc fuzioni protein.

3. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema zahtevu 1 ili 2, gde se navedeno antitelo ili fragment vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

4. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde navedeno antitelo ili fragment prepoznaje i vezuje se za N-terminalni deo (aa1) adrenomedulina.

5. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde je navedeno antitelo ili fragment antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment koji povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije > 50 %, najpoželjnije > 100 %.

6. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde navedeno antitelo ili fragment blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

7. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži sepsu, dijabetes, kancer, srčanu insuficijenciju, šok i disfunkciju bubrega.

8. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde je navedeni pacijent pacijent u jedinici za intenzivnu negu.

9. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je rizik od smrtnosti smanjen sprečavanjem neželjenog događaja, gde je ovaj drugi odabran iz grupe koja sadrži SIRS, sepsu, septički šok, insuficijenciju organa, insuficijenciju bubrega, neravnotežu tečnosti i nizak krvni pritisak.

10. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde se navedeno antitelo ili fragment koristi u kombinaciji proteina koji vezuje ADM.

11. Farmaceutska formulacija koji sadrži antitelo ili fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 10.

12. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 11, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.

13. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 11, gde je navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.

14. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 11 do 12, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intramuskularno.

15. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 11 do 12, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intravaskularno.

16. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 15, gde se navedena farmaceutska formulacija daje putem infuzije.

[0144] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji teške hronične ili akutne bolesti ili akutnog

4

stanja pacijenta, za smanjenje rizika od smrtnosti za navedenog pacijenta, gde je navedeno antitelo, ili fragment ili struktura, ne-neutrališuće antitelo na ADM ili ne-neutrališući fragment antitela na adrenomedulin ili ne-neutrališuća anti-ADM struktura bez Ig.

2. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema zahtevu 1, gde je format antitela odabran iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, (Fab)2 fragment i scFv-Fc fuzioni protein.

3. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig prema zahtevu 1 ili 2, gde se navedeno antitelo ili fragment ili struktura vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

4. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura prepoznaje i vezuje se za N-terminalni deo (aa1) adrenomedulina.

5. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde je navedeno antitelo ili fragment ili struktura antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment ili struktura fragment koji povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije > 50 %, najpoželjnije > 100 %.

6. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

7. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži teške infekcije, kao što su, npr., meningitis, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS,) sepsa; druge bolesti, kao što su dijabetes, kancer, akutne i hronične vaskularne bolesti kao što su, npr., srčana insuficijencija, infarkt miokarda, moždani udar, ateroskleroza; šok kao što je, npr., septički šok i disfunkcija organa kao što su, npr., disfunkcija bubrega, disfunkcija jetre; opekotine, operacija, fizičke traume.

8. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži SIRS, tešku infekciju, sepsu, šok, npr., septički šok.

9. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je navedeni pacijent pacijent u jedinici za intenzivnu negu. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili an anti-ADM struktura bez Ig za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je smanjen rizik od smrtnosti sprečavanjem neželjenog događaja, gde je ovaj drugi odabran iz grupe koja sadrži SIRS, sepsu, šok kao što je, npr., septički šok, akutne i hronične vaskularne bolesti kao što su, npr., akutna srčana insuficijencija, infarkt miokarda, moždani udar; insuficijencije organa kao što su, npr., insuficijencija bubrega, insuficijencija jetre, neravnotežu tečnosti i nizak krvni pritisak.

10. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je navedeno antitelo ili fragment humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela, gde težak lanac sadrži sekvence

SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW SEQ ID NO: 2

ILPGSGST SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

i gde lak lanac sadrži sekvence

SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY SEQ ID NO: 5

RVS SEQ ID NO: 6

FQGSHIPYT.

12. Humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela, prema zahtevu 10, gde navedeno antitelo ili fragment sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži:

4

13. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 12, za upotrebu u kombinaciji sa vazopresorima, npr., kateholaminom i/ ili tečnostima administriranim intravenozno.

14. Antitelo na ADM ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 13, ili kombinacija prema zahtevu 10, za upotrebu u kombinaciji sa proteinom koji vezuje ADM i/ili drugim aktivnim sastojcima.

15. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo ili fragment ili strukturu prema bilo kom od zahteva 1 do 14.

16. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 15, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.

17. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 15, gde je navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.

18. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 15 do 16, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intramuskularno.

19. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 15 do 16, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intravaskularno.

20. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 19, gde se navedena farmaceutska formulacija daje putem infuzije.

21. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, gde se navedeno antitelo ili fragment ili struktura vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina, poželjno humanog ADM.

22. Antitelo ili fragment ili struktura prema zahtevu 2, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura prepoznaje i vezuje se za N-terminalni deo (aa 1) adrenomedulina.

[0145] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, za sprečavanje disfunkcije organa ili insuficijencije organa.

2. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti, prema zahtevu 1, gde je navedeni organ bubreg.

3. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema zahtevu 1, gde je format antitela odabran iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, (Fab)2 fragment i scFv-Fc fuzioni protein.

4. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde se navedeno antitelo ili fragment vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

5. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde navedeno antitelo ili fragment prepoznaje i vezuje se za N-terminalni deo (aa1) adrenomedulina.

6. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde je navedeno antitelo ili navedeni fragment antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment koji povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije >100%.

7. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde navedeno antitelo blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

8. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži sepsu, dijabetes, kancer, srčanu insuficijenciju i šok.

9. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je navedeni pacijent pacijent u jedinici za intenzivnu negu.

10. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je navedeno antitelo ili fragment modulatorsko antitelo ili fragment koji povećava t1/2poluvreme retencije adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije >100% i koji blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

11. Farmaceutska formulacija koji sadrži antitelo ili fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 10.

12. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 11, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.

13. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 11 gde je navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.

14. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 11 do 12, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intramuskularno.

4

15. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 11 do 12, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intravaskularno.

16. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 15, gde se navedena farmaceutska formulacija daje putem infuzije.

[0146] Sledeća rešenja su samo ilustracija opisa i ne definišu pronalazak:

1. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta za sprečavanje ili smanjivanje disfunkcije organa ili sprečavanje insuficijencije organa kod navedenog pacijenta.

2. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti, prema zahtevu 1, gde je naveden organ bubreg ili jetra.

3. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema zahtevu 1 ili 2, gde je navedeno antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, neneutrališuće antitelo na ADM ili ne-neutrališući fragment antitela na adrenomedulin ili neneutrališuća anti-ADM struktura bez Ig.

4. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 ili 3, gde je format antitela odabran iz grupe koja sadrži Fv fragment, scFv fragment, Fab fragment, scFab fragment, (Fab)2 fragment i scFv-Fc fuzioni protein.

5. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde se navedeno antitelo ili fragment ili struktura vezuje za N-terminalni deo (aa 1-21) adrenomedulina.

6. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura prepoznaje i vezuje se za N-terminalni deo (aa1) adrenomedulina.

7. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde je navedeno antitelo ili navedeni fragment ili struktura antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment ili struktura koja povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije >100%.

8. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

9. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja

4

pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je navedena bolest odabrana iz grupe koja sadrži sepsu, dijabetes, kancer, srčana insuficijenciju i šok.

10. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin, prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je navedeno antitelo ili fragment humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela, gde težak lanac sadrži sekvence

SEQ ID NO: 1

GYTFSRYW SEQ ID NO: 2

ILPGSGST SEQ ID NO: 3

TEGYEYDGFDY

i gde lak lanac sadrži sekvence

SEQ ID NO:4

QSIVYSNGNTY SEQ ID NO: 5

RVS SEQ ID NO: 6

FQGSHIPYT.

11. Humano monoklonsko antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM ili fragment antitela prema zahtevu 10, gde navedeno antitelo ili fragment sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži:

4

4

12. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 11, gde je navedeno antitelo ili fragment ili struktura modulatorsko antitelo ili fragment ili struktura koja povećava poluživot (t1/2poluvreme retencije) adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije >50 %, najpoželjnije >100% i koja blokira bioaktivnost ADM do manje od 80 %, poželjno manje od 50%.

13. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji of a hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 12, za upotrebu u kombinaciji sa vazopresorima, npr. kateholaminom i/ ili tečnostima administriranim intravenozno.

14. Antitelo na ADM ili fragment antitela na adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig, za upotrebu u terapiji hronične ili akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta, prema bilo kom od zahteva 1 do 13, ili kombinacija prema zahtevu 13 za upotrebu u kombinaciji sa proteinom koji vezuje ADM i/ili sa drugim aktivnim sastojcima.

15. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo ili fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 13.

16. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 14, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.

17. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 14, gde je navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.

18. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 14 to 15, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intramuskularno.

19. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od zahteva 14 to 15, gde se navedena farmaceutska formulacija daje intravaskularno.

20. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 18, gde se navedena farmaceutska formulacija daje putem infuzije.

PRIMERI

[0147] Treba naglasiti da se antitela, fragmenti antitela i strukture bez Ig, iz dela sa primerima prema pronalasku, vezuju za ADM i time bi ih trebalo smatrati za anti-ADM antitela/ fragmente antitela /strukture bez Ig.

Primer 1

4

Pravljenje antitela i određivanje njihovih konstante afiniteta

[0148] Proizvedeno je nekoliko humanih i mišjih antitela i određene su njihove konstante afiniteta (videti tabele 1 i 2).

Peptidi/ konjugati za imunizaciju:

[0149] Peptidi za imunizaciju su sintetisani, videti Tabela 1, (JPT Technologies, Berlin, Germany) sa dodatnim N-terminalnim cisteinskim ostatkom (ako cistein nije prisutan unutar izabrane ADM-sekvence) za konjugaciju peptida sa goveđim serumskim albuminom (BSA). Peptidi su kovalentno vezani sa BSA pomoću gela Sulfolink Coupling (Perbio-science, Bonn, Germany). Procedura kuplovanja je izvedena prema priručniku Perbio.

[0150] Mišja antitela su napravljena prema sledećem metodu:

Balb/c miš je imunizovan pomoću 100 µg peptid-BSA-konjugata nultog i 14. dana (emulzifikovan u 100 µl kompletnog Freund-ovog adjuvanta) i 50 µg 21. i 28. dana (u 100 µl nekompletnog Freund-ovog adjuvanta). Tri dana pre nego što je izveden eksperiment sa fuzijom, životinja je primila 50 µg konjugata rastvorenog u 100 µl slanog rastvora, datog u vidu jedne intraperitonealne i jedne intravenske injekcije.

[0151] Splenociti iz imunizovanog miša i ćelije iz mijelomske ćelijske linije SP2/0 su fuzionisani sa 1 ml 50% polietileni glikola 30s na 37°C. Posle pranja, ćelije su zasejane na ploče za kulturu sa 96 udubljenja. Hibridni klonovi su odabrani gajenjem u HAT medijumu [RPMI 1640 medijum za kulture, obogaćen 20%-nim fetalnim telećim serumom i HAT-suplementom]. Posle dve nedelje, HAT medijum je zamenjen HT medijumom za tri pasaže, posle čega je vraćen normalan medijum za ćelijsku kulturu.

[0152] Supernatanti ćelijskih kultura su prvo pregledani na IgG antitela specifična za antigen tri nedelje posle fuzije. Mikrokulture koje su bile pozitivne na testu su prebačene na ploče sa 24 udubljenja za propagaciju. Posle ponovnog testiranja, izabrane kulture su klonirane i ponovo klonirane primenom tehnike ograničenog razblaživanja i određeni su izotipovi (videti i Lane, R.D. "A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas", J. Immunol. Meth. 81: 223-228; (1985), Ziegler, B. et al. "Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horm. Metab. Res.28: 11-15, (1996)).

Proizvodnja mišjih monoklonskih antitela:

[0153] Antitela su napravljena standardnim metodima za proizvodnju antitela (Marx et al, Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121, 1997) i prečišćena pomoću Proteina A. Čistoće antitela su bile > 95% na osnovu analize SDS gel elektroforezom.

Humana antitela

[0154] Humana antitela su napravljena pomoću eksponiranja na fazima u skladu sa sledećom procedurom:

Biblioteke gena za humana naivna antitela HAL7/8 su korišćene za izolovanje rekombinantnih jednolančanih F-varijabilnih domena (scFv) protiv adrenomedulinskog peptida. Biblioteke gena za antitela su pretražene sa strategijom ispiranja koja obuhvata upotrebu peptida koji sadrže biotinsku oznaku vezanu preko dva različita spejsera za sekvencu adrenomedulinskog peptida. Mešavina tura ispiranja uz upotrebu nespecifično vezanog antigena i antigena vezanog za streptavidin je korišćena da se minimizira fon od nespecifičnih vezivanja. Eluirani fazi iz treće runde ispiranja su korišćeni za generisanje E.coli sojeva koji eksprimiraju monoklonske scFv. Supernatant iz kultivacije ovih klonskih sojeva je direktno korišćen za ELISA testiranje antigena (videti i Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rülker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schütte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dübel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I.,Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dübel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625).

[0155] Pozitivni klonovi su izabrani na osnovu pozitivnog ELISA signala za antigen i negativnog za mikrotitatrske ploče obložene streptavidinom. Za dalje karakterizacije, otvoreni okvir čitanja scFv je kloniran u ekspresioni plazmid pOPE107 (Hust et al., J. Biotechn.2011), uhvaćen iz supernatanta kulture afinitetnom hromatografijom sa imobilisanim jonom metala (IMAC) i prečišćen hromatografijom razdvajanja po veličini (SEC).

Konstante afiniteta

[0156] Da bi se odredio afinitet antitela za adrenomedulin, kinetika vezivanja adrenomedulina za imobilisano antitelo je određena pomoću površinske plazmonske rezonance bez obeleživača korišćenjem Biacore 2000 sistema (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany). Reverzibilna imobilizacija antitela je izvedena korišćenjem anti-mišjeg Fc antitela kovalentno kuplovanog, pri velikoj gustini, sa površinom CM5 senzora prema uputstvima proizvođača (komplet za hvatanje mišjeg antitela; GE Healthcare). (Lorenz et al.,"Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy"; Antimicrob Agents Chemother. 2011 January; 55(1): 165-173.)

[0157] Monoklonska antitela su podignuta na regione ADM humanog i mišjeg ADM, respektivno, pokazane niže. Sledeća tabela prikazuje izbor dobijenih antitela koja su dalje korišćena u eksperimentima. Izbor je zasnovan na ciljnom regionu:

Tabela 1:

[0158] Sledi lista dalje dobijenih monoklonskih antitela:

1

Lista anti-ADM-antitela

[0159]

Tabela 2:

2

Pravljenje fragmenata antitela enzimskom digestijom:

[0160] Pravljenje Fab i F(ab)2fragmenata je urađeno enzimskom digestijom pune dužine mišjeg antitela NT-M. Antitelo NT-M je digestirano pomoću a) Kompleta za dobijanje F(ab)2na bazi pepsina (Pierce 44988) i b) Kompleta za dobijanje Fab na bazi papaina (Pierce 44985). Procedure fragmentacije su izvedene prema uputstvima koja je obezbedio snabdevač. Digestija je izvođena u slučaju F(ab)2-fragmentacije 8h na 37°C. Digestija Fab- fragmentacije je izvođena 16h.

Procedura za dobijanje i prečišćavanje Fab:

[0161] Imobilisan papain je uravnotežen pranjem smole pomoću 0,5 ml digestionog pufera i centrifugiranjem kolone na 5000 x g 1 minut. Pufer je posle toga bačen. Kolona za ekstrakciju soli je dobijena uklanjanjem rastvora u kom je čuvana i pranjem digestionim puferom, a zatim centrifugiranjem svaki put na 1000 x g 2 minuta.0,5ml pripremljenog uzorka IgG je dodato u epruvetu sa centrifugiranom kolonom koja sadrži uravnotežen imobilisan papain. Inkubacija reakcije digestije je urađena za 16h na stonoj mućkalici na 37°C. Kolona je centrifugirana na 5000 × g 1 minut da bi se odvojio proizvod digestije od imobilisanog papaina. Posle toga je smola oprana pomoću 0,5ml PBS i centrifugirana na 5000 × g 1 minut. Frakcija pranja je dodata u digestirano antitelo tako da zapremina celog uzorka bude 1,0 ml. NAb Protein A kolona je uravnotežena PBS-om i IgG puferom za eluiranje na sobnoj temperaturi. Kolona je centrifugirana 1 minut da se ukloni rastvor u kom je čuvana (sadrži 0,02% natrijum azida) i uravnotežena dodavanjem 2ml PBS, centrifugirana ponovo 1 minut i odbačen je proboj kolone. Uzorak je stavljen na kolonu i ponovo suspendovan inverzijom. Inkubacija je urađena na sobnoj temperaturi uz rotaciono mešanje od 10 minuta. Kolona je centrifugirana 1 minut i sačuvan je proboj kolone sa Fab fragmentima.

[0162] (Reference: Coulter, A. i Harris, R. (1983). J. Immunol. Meth.59, 199-203.; Lindner I. et al. (2010) {alpha}2-Macroglobulin inhibits the malignant properties of astrocytoma cells by impeding {beta}-catenin signaling. Cancer Res. 70, 277-87.; Kaufmann B. et al. (2010) Neutralization of West Nile virus by cross-linking of its surface proteins with Fab fragments of the human monoclonal antibody CR4354. PNAS. 107, 18950-5.; Chen X. et al. (2010) Requirement of open headpiece conformation for activation of leukocyte integrin αxβ2. PNAS. 107, 14727-32.; Uysal H. et al. (2009) Structure and pathogenicity of antibodies specific for citrullinated collagen type II in experimental arthritis. J. Exp. Med.206, 449-62.; Thomas G. M. et al. (2009) Cancer cell-derived microparticles bearing P-selectin glycoprotein ligand 1 accelerate thrombus formation in vivo. J. Exp. Med. 206, 1913-27.; Kong F. et al.

(2009) Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. J. Cell Biol. 185, 1275-84.)

Procedura za dobijanje i prečišćavanje F(ab')2fragmenata:

[0163] Imobilisan pepsin je uravnotežen pranjem smole pomoću 0,5 ml digestionog pufera i centrifugiranjem kolone na 5000 x g 1 minut. Pufer je posle toga bačen. Kolona za ekstrakciju soli je dobijena uklanjanjem rastvora u kom je čuvana i pranjem digestionim puferom, a zatim centrifugiranjem svaki put na 1000 x g 2 minuta. 0,5ml pripremljenog uzorka IgG je dodato u u epruvetu sa centrifugiranom kolonom koja sadrži uravnotežen imobilisan papain. Inkubacija reakcije digestije je urađena za 16h na stonoj mućkalici na 37°C. Kolona je centrifugirana na 5000 × g 1 minut da bi se odvojio proizvod digestije od imobilisanog papaina. Posle toga je smola oprana pomoću 0,5ml PBS i centrifugirana na 5000 × g 1 minut. Frakcija pranja je dodata digestiranom antitelu tako da zapremina celog uzorka bude 1,0 ml. NAb Protein A kolona je uravnotežena PBS-om i IgG puferom za eluiranje na sobnoj temperaturi. Kolona je centrifugirana 1 minut da se ukloni rastvor u kom je čuvana (sadrži 0,02% natrijum azida) i uravnotežena dodavanjem 2ml PBS, centrifugirana ponovo 1 minut i odbačen je proboj kolone. Uzorak je stavljen na kolonu i ponovo suspendovan inverzijom. Inkubacija je urađena na sobnoj temperaturi uz rotaciono mešanje 10 minuta. Kolona je centrifugirana 1 minut i sačuvan je proboj kolone sa Fab fragmentima.

[0164] (Reference: Mariani, M., et al. (1991). A new enzymatic method to obtain high-yield F(ab')2 suitable for clinical use from mouse IgG1. Mol.Immunol. 28: 69-77.;Beale, D. (1987). Molecular fragmentation: Some applications in immunology. Exp Comp Immunol 11:287-96.; Ellerson, J.R., et al. (1972). A fragment corresponding to the CH2 region of immunoglobulin G (IgG) with complement fixing activity. FEBS Letters 24(3):318-22.; Kerbel, R.S. and Elliot, B.E. (1983). Detection of Fc receptors. Meth Enzymol 93:113-147.; Kulkarni, P.N., et al. (1985). Conjugation of methotrexate to IgG antibodies and their F(ab')2 fragments and the effect of conjugated methotrexate on tumor growth in vivo. Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4.; Lamoyi, E. (1986). Preparation of F(ab')2 Fragments from mouse IgG of various subclasses. Meth Enzymol 121:652-663.; Parham, P., et al. (1982). Monoclonal antibodies: purification, fragmentation and application to structural and functional studies of class I MHC antigens. J Immunol Meth 53:133-73.; Raychaudhuri, G., et al. (1985). Human IgG1 and its Fc fragment bind with different affinities to the Fc receptors on the human U937, HL-60 and ML-1 cell lines. Mol Immunol 22(9):1009-19.; Rousseaux, J., et al. (1980). The differential enzyme sensitivity of rat immunoglobulin G subclasses to papain an pepsin. Mol Immunol 17:469-82.; Rousseaux, J., et al. (1983). Optimal condition for the preparation of Fab and F(ab')2 fragments from monoclonal IgG of different rat IgG subclasses. J Immunol Meth 64:141-6.; Wilson, K.M., et al. (1991). Rapid whole blood assay for HIV-1 seropositivity using an Fab-peptide conjugate. J Immunol Meth 138:111-9.)

Humanizacija NT-H-fragmenta antitela

[0165] Fragment antitela je humanizovan metodom kalemljenja CDR (Jones, P. T., Dear, P. H., Foote, J., Neuberger, M. S., and Winter, G. (1986) Replacing the complementaritydetermining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321, 522-525).

Napravljeni su sledeći koraci da bi se dobila humanizovana sekvenca:

[0166]

4

Ekstrakcija cele RNK: Cela RNK je ekstrahovana iz NT-H hibridoma pomoću kompleta Qiagen.

Prva runda RT-PCR: korišćen je komplet QIAGEN® OneStep RT-PCR (Cat No.

210210). RT-PCR je izvedena uz setove prajmera specifičnih za teške i lake lance. Za svaki uzorak RNK, 12 RT-PCR reakcija sa pojedinačnim teškim lancima i 11 sa lakim lancima je urađeno korišćenjem smesa degenerisanih prajmera za kodirajući lanac koje pokrivaju čeone sekvence varijabilnih regiona. Reverzni prajmeri su locirani u konstantnim regionima teških i lakih lanaca. Restrikciona mesta nisu inženjerisana u prajmere.

Postavka reakcije: 5x QIAGEN® OneStep RT-PCR pufer 5,0 µl, mešavina dNTP (koja sadrži po 10 mM svakog dNTP) 0,8 µl, set prajmera 0,5 µl, QIAGEN® OneStep RT-PCR mešavina enzima 0,8 µl, RNK-matrica 2,0 µl, voda bez RNaze do 20,0 µl, ukupna zapremina 20,0 µl.

Uslovi za PCR: Reverzna transkripcija: 50°C, 30 min; početna PCR aktivacija: 95°C, 15 min

Ciklusi: 20 ciklusa na 94°C, 25 sec; 54°C, 30 sec; 72°C, 30 sec; konačno produženje: 72°C, 10 min

Druga runda "poluugnježđen" (semi-nested) PCR: Proizvodi RT-PCR iz reakcija prve runde su dalje amplifikovani u drugoj rundi PCR. 12 RT-PCR reakcija sa pojedinačnim teškim lancima i 11 sa lakim lancima je postavljeno korišćenjem "poluugnježđen" setova prajmera specifičnih za varijabilne regione antitela.

Postavka reakcije: 2x PCR smesa 10 µl; set prajmera 2 µl; proizvod PCR prve runde 8 µl; Ukupna zapremina 20 µl; izveštaj kloniranja hibridomskog antitela

Uslovi za PCR: početno denaturisanje od 5 min na 95°C; 25 ciklusa na 95°C 25 sec, na 57°C 30 sec, na 68°C 30 sec; konačno produženje je 10 min na 68°C.

[0167] Pošto je PCR završena, razdvojiti uzorke PCR reakcije na agaroznom gelu da bi se vizualizovali umnoženi fragmenti DNK. Posle sekvenciranja više od 15 kloniranih fragmenata DNK umnoženih pomoću ugnježđen RT-PCR, nekoliko teških i lakih lanaca mišjeg antitela je klonirano i izgledaju korektno. Poravnanje proteinskih sekvenci i CDR analiza identifikuju jedan težak lanac i jedan lak lanac. Posle poravnanja sa homolognim humanim okvirnim sekvencama, dobijena humanizovana sekvenca za varijabilni težak lanac je sledeća: videti sliku 6 (pošto su aminokiseline na pozicijama 26, 40 i 55 u varijabilnom teškom lancu i aminokiselina na poziciji 40 u varijabilnom lakom lancu kritične za osobine vezivanja, one se mogu vratiti u mišji original. Dobijeni kandidati su predstavljeni niže) (Padlan, E. A. (1991) A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol. Immunol. 28, 489-498.; Harris, L. and Bajorath, J. (1995) Profiles for the analysis of immunoglobulin sequences: Comparison of V gene subgroups. Protein Sci.4, 306-310.).

[0168] Anotacija za sekvence fragmenta antitela (SEQ ID NO: 7-14): bold i podvučeni su CDR 1, 2, 3 u hronološkom redu; italikom su dati konstantni regioni; zglobni regioni su dati masnim slovima (bold) i histidinski obeleživač bold i italik slovima; okvirne tačkaste mutacije imaju sivu pozadinu slova.

Primer 2

Efekat izabranih anti-ADM-antitela na anti-ADM-bioaktivnost

[0169] Efekat izabranih ADM-antitela na ADM-bioaktivnost je testirana funkcionalnim esejem na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor (adrenomedulinski bioesej) pomoću cAMP.

Testiranje antitela koja ciljaju humani ili mišji adrenomedulin u funkcionalnom eseju na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor (adrenomedulinski bioesej) pomoću cAMP Materijali:

[0170]

Ćelijska linija: CHO-K1

Receptor: adrenomedulin (CRLR RAMP3)

Ćelijska linija sa receptorskim pristupnim brojem: CRLR: U17473; RAMP3: AJ001016

[0171] CHO-K1 ćelije, koje eksprimiraju humani rekombinantni adrenomedulinski receptor (FAST-027C) su gajene pre testiranja u medijumu bez antibiotika, su odlepljene blagim ispiranjem pomoću PBS-EDTA (5 mM EDTA), sakupljene centrifugiranjem i ponovo suspendovane u puferu za esej (KRH: 5 mM KCl, 1,25 mM MgSO4, 124 mM NaCl, 25 mM HEPES, 13,3 mM glukoza, 1,25 mM KH2PO4, 1,45 mM CaC12, 0,5 g/l BSA).

[0172] Krive doza - odgovor su konstruisane paralelno sa referentnim agonistima (hADM ili mADM).

Test antagonista (96 udubljenja):

[0173] Za testiranje antagonista, 6 µl referentnog agonista (humani (5,63nM) ili mišji (0,67nM) adrenomedulin) je pomešan sa 6 µl testiranih uzoraka pri različitim razblaženjima antagonista; ili sa 6 µl pufera. Posle inkubacije od 60 min na sobnoj temperaturi, dodato je 12 µl ćelija (2,500 ćelije/udubljenje). Ploče su inkubirane 30 min na sobnoj temperaturi. Posle dodavanja pufera za lizu, proceniće se procenat DeltaF, prema specifikaciji proizvođača, gde je komplet HTRF od Cis-Bio International (kat br. 62AM2 PEB). hADM 22-52 je korišćen referentni antagonist.

Esej sa cAMP-HTRF za testiranje antitela

[0174] Anti-h-ADM antitela (NT-H, MR-H, CT-H) su testirana na aktivnost antagonista u funkcionalnom eseju na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor pomoću cAMP (FAST-027C) u prisustvu 5,63 nM humanog ADM 1-52, pri sledećim konačnim koncentracijama antitela: 100 µg/ml, 20 µg/ml, 4 µg/ml, 0,8 µg/ml, 0,16 µg/ml.

[0175] Anti-m-ADM antitela (NT-M, MR-M, CT-M) su testirana na aktivnost antagonista u funkcionalnom eseju na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor pomoću cAMP (FAST-027C) u prisustvu 0,67nM mišjeg ADM 1-50, pri sledećim konačnim koncentracijama antitela: 100 µg/ml, 20 µg/ml, 4 µ/ml, 0,8 µg/ml, 0,16 µg/ml. Podaci su prikazani grafički kao relativna inhibicija prema koncentraciji antagonista (videti sl. 3a do 3l). Maksimalna inhibicija pojedinačnim antitelima je data u tabeli 3.

Tabela 3:

Primer 3

Podaci za stabilizaciju hADM pomoću antitela na ADM

[0176] Stabilišući efekat humanog ADM humanim antitelom na ADM je testiran korišćenjem hADM imunoeseja.

Imunoesej za kvantifikaciju humanog adrenomedulina

[0177] Tehnologija koja je primenjena je sendvič luminiscentni imunoesej na osnovu obeležavanja akridinijum estrom.

[0178] Obeleženo jedinjenje (obeleživač): 100 µg (100 ul) CT-H (1mg/ml u PBS, pH 7,4, AdrenoMed AG Germany) je pomešan sa 10 µl akridinijum NHS-estra (1mg/ ml u acetonitrilu, InVent GmbH, Germany) (EP 0353971) i inkubiran 20 min na sobnoj temperaturi. Obeležen CT-H je prečišćen gel-filtracionom HPLC na Bio-Sil® SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) Prečišćen CT-H je razblažen u (300 mmol/L kalijum fosfat, 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Na-EDTA, 5 g/L goveđi serumski albumin, pH 7,0). Konačna koncentracija je bila pribl. 800000 relativnih svetlosnih jedinica (RLU) obeleženog jedinjenja (pribl. 20 ng obeleženog antitela) na 200 µL. Hemiluminiscencija sa akridinijum estrom je merena pomoću AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

[0179] Čvrsta faza: Polistirenske epruvete (Greiner Bio-One International AG, Austria) su obložene (18h na sobnoj temperaturi) pomoću MR-H (AdrenoMed AG, Germany) (1,5 µg MR-H/0,3 mL 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L TRIS/HCl, pH 7,8). Posle blokiranja pomoću 5% goveđeg serumskog albumina, epruvete su oprane PBS-om, pH 7,4 i osušene na vakuumu.

Kalibracija:

[0180] Test je kalibrisan korišćenjem razblaživanja hADM (BACHEM AG, Switzerland) u 250 mmol/L NaCl, 2 g/L Triton X-100, 50 g/L goveđi serumski albumin, 20 tabs/L koktela inhibitora proteaze (Protease Inhibitor Cocktail, Roche Diagnostics AG, Switzerland)) hADM imunoesej:

[0181] 50 µl uzorka (ili kalibratora) je pipetirano u obložene epruvete, posle dodavanja obeleženog CT-H (200µl), epruvete su inkubirane 4h na 4°C. Nevezan obeleživač je uklonjen pranjem 5 puta (po 1 ml) rastvorom za pranje (20 mM PBS, pH 7,4, 0,1 % Triton X-100). Hemiluminiscencija vezana za epruvete je merena pomoću LB 953

[0182] Slika 4 pokazuje tipičnu krivu doza hADM / signal i krivu doza hADM / signal u prisustvu 100 µg/mL antitela NT-H.

NT-H nije uticao na opisan hADM imunoesej.

Stabilnost humanog adrenomedulina:

[0183] Humani ADM je razblažen u humanoj citratnoj plazmi (konačna koncentracija 10 nM) i inkubiran na 24 °C. U izabranim vremenskim tačkama, raspad hADM je zaustavljen zamrzavanjem na -20 °C. Inkubacija je rađena u odsustvu i prisustvu NT-H (100 µg/ml). Preostali hADM je kvantifikovan pomoću hADM imunoeseja opisanog gore.

[0184] Slika 5 prikazuje stabilnost hADM u humanoj plazmi (citratnoj) u odsustvu i u prisustvu NT-H antitela. Poluživot samog hADM je bio 7,8 h i u pridsustvu NT-H, poluživot je bio 18,3 h (2,3 puta veća stabilnost).

Primer 4

Smrtnost od sepse (rano lečenje)

Životinjski model

[0185] Mužjaci C57B1/6 miša (Charles River Laboratories, Germany) stari 12-15 nedelja su korišćeni za studiju. Peritonitis je hirurški indukovan u slaboj izofluranskoj anesteziji. Incizije su napravljene u levom gornjem kvadrantu peritonealne šupljine (normalna lokacija cekuma). Cekum je izložen i čvrsta ligatura je postavljena oko cekuma sa suturama distalno od insercije tankog creva. Jedna ubodna rana je napravljena iglom 24 u cekum i male količine cekalnog sadržaja su izražene kroz ranu. Cekum je vraćen u peritonealnu šupljinu i laparotomsko mesto je zatvoreno. Konačno, životinje su vraćene u svoje kaveze sa slobodnim pristupom hrani i vodi. 500 µl slanog rastvora je dato s.c. kao zamena za tečnost.

Primena i doziranje jedinjenja (NT-M, MR-M, CT-M)

[0186] Miševi su tretirani odmah posle CLP (rani tretman). CLP je skraćenica za cekalna ligacija i punkcija (CLP).

Studijske grupe

[0187] Tri jedinjenja su testirana u odnosu na: tretman nosačem i tretman kontrolnim jedinjenju. Svaka grupa je sadržala 5 miševa za uzimanje krvi posle 1 dana za određivanje BUN (test na azot iz uree u serumu krvi). Još deset miševa po svakoj grupi je praćeno tokom perioda od 4 dana.

[0188] Doza za grupni tretman (10µl/ g telesne težine) / praćenje:

1 NT-M, 0,2 mg/ml, preživljavanje tokom 4 dana

2 MR-M, 0,2 mg/ml, preživljavanje tokom 4 dana

3 CT-M, 0,2 mg/ml, preživljavanje tokom 4 dana

4 nespecifičan mišji IgG, 0,2 mg/ml, preživljavanje tokom 4 dana

5 kontrola - PBS 10 µl/g telesne težine, preživljavanje tokom 4 dana

Klinička hemija

[0189] Koncentracije azota iz uree krvi (BUN) za renalnu funkciju su merene osnovne i 1. dana posle CLP. Uzorci krvi su dobijeni iz kavernoznog sinusa kapilarom u slaboj etarskoj anesteziji. Merenja su rađena pomoću AU 400 Olympus Multianalyser-a. Smrtnost tokom 4 dana je data u tabeli 4. Prosečne koncentracije BUN su date u tabeli 5.

Tabela 4:

Tabela 5:

[0190] Iz Tabele 4 se može videti da je NT-M antitelo znatno smanjilo smrtnost. Posle 4 dana 70 % miševa je preživelo kad je tretirano NT-M antitelom. Kad je tretirano MR-M antitelom, 30 % životinja je preživelo, a kad je tretirano CT-M antitelom, 10 % životinja je preživelo posle 4 dana. Nasuprot tome, svi miševi su bili mrtvi posle 4 dana kad su tretirani nespecifičnim mišjim IgG. Isti rezultat je dobijen u kontrolnoj grupi gde je PBS (fosfatno puferisan slani rastvor) dat miševima.

[0191] Azot iz uree krvi ili BUN test je korišćen za procenu funkcije bubrega, da se pomogne dijagnozi bubrežnih bolesti i za praćenje pacijenata sa akutnom ili hroničnom disfunkcijom ili insuficijencijom bubrega.

[0192] Rezultati S-BUN testa su otkrili da je NT-M antitelo najefektivnije u zaštiti bubrega. Smrtnost od sepse (rano lečenje)

Životinjski model

[0193] Mužjaci C57B1/6 miša (Charles River Laboratories, Germany) stari 12-15 nedelja su korišćeni za studiju. Peritonitis je hirurški indukovan u slaboj izofluranskoj anesteziji. Incizije su napravljene u levom gornjem kvadrantu peritonealne šupljine (normalna lokacija cekuma). Cekum je izložen i čvrsta ligatura je postavljena oko cekuma sa suturama distalno od insercije tankog creva. Jedna ubodna rana je napravljena iglom 24 u cekum i male količine cekalnog sadržaja su izražene kroz ranu. Cekum je vraćen u peritonealnu šupljinu i laparotomsko mesto je zatvoreno. Konačno, životinje su vraćene u svoje kaveze sa slobodnim pristupom hrani i vodi. 500 µl slanog rastvora je dato s.c. kao zamena za tečnost.

Primena i doziranje jedinjenja (NT-M FAB2)

[0194] NT-M FAB2 je testiran u odnosu na: tretman nosačem prema kontrolnim jedinjenju. Tretman je rađen posle punog razvoja sepse, 6 sati posle CLP (kasni tretman). Svaka grupa je sadržala 4 miša i praćeni su tokom perioda od 4 dana.

[0195] Doza za grupni tretman (10µl/ g telesne težine) / praćenje:

Studijske grupe

[0196]

1 NT-M, FAB2 0,2 mg/ml, preživljavanje tokom 4 dana

2 kontrola: nespecifičan mišji IgG, 0,2 mg/ml, preživljavanje tokom 4 dana

3 nosač: - PBS 10 µl/g telesne težine, preživljavanje tokom 4 dana

Tabela 6:

[0197] Iz Tabele 6 se može videti da je NT-M FAB 2 antitelo znatno smanjilo smrtnost. Posle 4 dana, 75 % miševa je preživelo kad je tretirano NT-M FAB 2 antitelom. Kad je tretirano MR-M antitelom, 30 % životinja je preživelo, a kad je tretirano CT-M antitelom, 10 %

1

životinja je preživelo posle 4 dana. Nasuprot tome, svi miševi su bili mrtvi posle 4 dana kad su tretirani nespecifičnim mišjim IgG. Isti rezultat je dobijen u kontrolnoj grupi gde je PBS (fosfatno puferisan slani rastvor) dat miševima.

Primer 5

[0198] Rastući efekat antitela na ADM u životinjama kojima je rađen CLP pored antibiotskog tretmana i stabilizacija cirkulacije putem kateholamina, kao i regulacija ravnoteže tečnosti.

Životinjski model

[0199] U ovoj studiji su korišćeni mužjaci C57B1/6 miševa (8-12 nedelja, 22-30 g). Polimikrobna sepsa indukovana cekalnom ligacijom i punkcijom (CLP) je korišćena kao model za proučavanje septičkog šoka ((Albuszies G, et al: Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory blood flow, oxygenation, and metabolism in hyperdynamic murine septic shock. Crit Care Med 2005;33:2332-8), (Albuszies G, et al: The effect of iNOS deletion on hepatic gluconeogenesis in hyperdynamic murine septic shock. Intensive Care Med 2007;33:1094-101), (Barth E, et al: Role of iNOS in the reduced responsiveness of the myocardium to catecholamines in a hyperdynamic, murine model of septic shock. Crit Care Med 2006;34:307-13), (Baumgart K, et al: Effect of SOD-1 overexpression on myocardial function during resuscitated murine septic shock. Intensive Care Med 2009;35:344-9),

[0200] (Baumgart K, et al: Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled H2S in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med 2010;38:588-95), (Simkova V, et al: The effect of SOD-1 over-expression on hepatic gluconeogenesis and whole-body glucose oxidation during resuscitated, normotensive murine septic shock. Shock 2008;30:578-84), (Wagner F, et al.: Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock, im Druck), (Wagner F, et al: Effects of intravenous H2S after murine blunt chest trauma: a prospective, randomized controlled trial. Crit Care 2011, podneseno za objavljivanje)).

[0201] Posle merenja težine, miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom od 120 µg/g ketamina, 1,25 µg/g midazolama i 0,25 µg/g fentanila. Tokom hirurške procedure, telesna temperatura je držana na 37-38°C. Urađen je rez od 1cm na sredini abdomena da bi se pristupilo cekumu. Cekum je zatim ligiran pomoću svilenog konca 3-0 blizu dna i urađena je jedna punkcija iglom 18. Cekum je vraćen i incizija je ponovo zatvorena (konac 4-0). Za nadoknađivanje perioperativnog gubitka tečnosti, 0,5 ml laktatnog Ringerovog rastvora sa 1 µg/g Buprenorfina kao analgetika je ubrizgano subkutano u dorsalni dermis. Za antibiozu, miševi su primili Ceftriaxon 30µg/g i Clindamycin 30µg/g subkutano u donje ekstremitete. Posle CLP operacije, životinja je držana u adekvatno zagrejanom okruženju sa vodom i hranom ad libitum.

[0202] Pokrivenost potrebe za tečnošću je osigurana dorsalnim subkutanim injekcijama sa 0,5 ml laktatnog Ringerovog rastvora sa 4 µg/g glukoze 1 µg/g Buprenorfina, koje su davane u 8-satnom ciklusu, posle kratkotrajne anestezije izofluranom. Pored toga, antibioza je održavana subkutanim injekcijama Ceftriaxon-a 30µg/g i Clindamycin-a 30µg/g u donje ekstremitete.

Doziranje testiranih supstanci

2

Rani tretman

[0203] Odmah posle operacija i zatvaranja incizije, antitelo NT-M sa testiranom supstancom je dato u koncentraciji od 500 µg/ml u fosfatno puferisanom slanom rastvoru (PBS) putem injekcije u penisnu venu za dozu od 2mg po kg telesne težine (zapremina doze 88-120 µl) (5 životinja).

Kasni tretman

[0204] Posle punog razvoja sepse, 15,5 sati posle CLP operacije, životinje su anestezirane kao što je opisano gore i NT-M je dato u koncentraciji od 500 µg/ml u fosfatno puferisanom slanom rastvoru (PBS) putem injekcije u penisnu venu za dozu od 2mg po kg telesne težine (zapremina doze 88-120 µl) (3 životinje).

[0205] Kontrolna grupa (6 životinja) su primile odgovarajuću količinu PBS rastvora kao nosača, bez antitela (4µl/g, 88-120 µl) odmah posle CLP operacije.

Studijske grupe i eksperimentalna postavka

[0206] Model mišjeg septičkog šoka pod praćenjem na intenzivnoj nezi:

Praćene su tri grupe sa 3, 5 i 6 životinja. Grupa 1 (5 životinja) je primila antitelo NT-M 15,5 sati posle CLP, grupa 2 je primila antitelo NT-M odmah posle CLP operacije i grupa 3 je primila uporedljivu količinu PBS (4µl/g). 16 sati inkubacije posle CLP (da bi se dozvolilo polimikrobnoj sepsi da uznapreduje), eksperiment je nastavljen uz praćenje i intervencije uporedljive sa režimom intenzivne medicinske nege. Prema tome, posle merenja težine životinje su anestezirane kao što je opisano u delu sa CLP operacijom (osim životinja na kasnom tretmanu, koje su anestezirane pre tretmana). Telesna temperatura je držana na 37-38°C do kraja eksperimenta. Posle traheotomije i intubacije, respiracija je praćena i podržavana laboratorijskim plućnim ventilatorom za životinje Flexivent®, (Emka Technologies, FiO2 0,5, PEEP 10 H2O, VT 8 (µl/g, I:E 1:1,5, AF 70-140 u zavisnosti od temperature).

[0207] Anestezija je održavana kroz ceo eksperiment kroz kanulisanu venu jugularis externa dextra sa kontinualnom infuzijom ketamina 30 µg/gxh i fentanila 0,3 µg/gxh. Štaviše, desna zajednička karotidna arterija je kanulisana zbog kontinualnog praćenja srčanog pulsa i srednjeg arterijskog pritiska (MAP). Srednji arterijski pritisak je održavan na MAP > 65 mmHg putem intravenske (V. jugularis) infuzije koloida (80 µL/gxh, Hextend®) i, po potrebi, noradrenalina rastvorenog u koloidima kao vazopresor. Uzorci krvi (120 µl) su uzimani preko kanulisane A. carotis 0. i 4. sata za određivanje kreatinina. Bešika je punktirana i urin je sakupljan kateterom iz bešike. Eksperiment je završen ili posle 6 sati ili pre ovoga, ako MAP > 65 mmHg (V. jugularis) nije mogao da se održi doziranjem vazopresora.

Mereni parametri

[0208] Sledeći parametri su mereni i analizirani: ukupno trošenje noradrenalina (µg NA/g), brzina trošenja noradrenalina (µg NA/g/h), ukupna zapremina urina sakupljenog tokom eksperimenta, koncentracija kreatinina (µg/mL) na kraju eksperimenta i srednji klirens kreatinina (µL/min).

Tabela 7:

[0209] Potreba za kateholaminom je merena posle administracije ili nespecifičnog mišjeg IgG u svih 6 miševa u kontrolnoj grupi, NT-mišjeg antitela grupi od 5 miševa odmah posle CLP (rani tretman) ili NT- mišjeg antitela grupi od 3 miša 15,5 sati posle CLP (kasni tretman).

[0210] Smanjenje potrebe za kateholaminom je mera stabilizacije cirkulacija. Prema tome, podaci pokazuju da antitelo na ADM, naročito NT-M antitelo, dovodi do znatne stabilizacije cirkulacije i do znatnog smanjenja potrebe za kateholaminom. Efekat stabilizacije cirkulacije je dat u ranom tretmanu (odmah posle CLP) i tretmanu posle punog razvoja sepse (kasni tretman) (videti sl.7).

Regulacija ravnoteže tečnosti

[0211] Pozitivnija ravnoteža tečnosti i rano u resuscitaciji i kumulativno tokom 4 dana je povezana sa povećanim rizikom od smrtnosti u septičkom šoku. Kontrola ravnoteže tečnosti je od najveće važnosti za tok bolesti pacijenata koji imaju sepsu. (v. Boyd et al, 2011). Kontrolisanje ravnoteže tečnosti kod kritički bolesnih pacijenata ostaje suštinski izazov u medicini intenzivne nege. Kao što se može videti u tabeli 8, tretman miševa posle CLP (za eksperimentalne procedure videti "Životinjski model") pomoću NT-M antitela dovodi do povećanja ukupne zapremine izlučenog urina. izlučenog urin je bio pribl. tri puta veći kod životinja tretiranih NT-M u poređenju sa netretiranim miševima. Pozitivan efekat tretmana je dat u ranom i u kasnom tretmanu. Ravnoteža tečnosti je poboljšana za oko 20-30%, i u ranom i u kasnom tretmanu. Prema tome, podaci pokazuju da je upotreba antitela na ADM, pogotovo upotreba NT antitela na ADM, povoljna za regulisanje ravnoteže tečnosti kod pacijenata, (videti tabelu 8 i slike 8 i 9).

Tabela 8

4

Poboljšanje bubrežne funkcije

[0212] Kombinacija akutne renalne insuficijencije i sepse je povezana sa 70 % smrtnošću, u poređenju sa 45 % smrtnosti među pacijentima sa samom akutnom renalnom insuficijencijom. (Schrier i Wang, "Mechanisms of Disease Acute Renal Failure and Sepsis"; The New England Journal of Medicine; 351:159-69; 2004). Koncentracija kreatinina i klirens kreatinina su standardni laboratorijski parametri za praćenje bubrežne (dis)funkcije (Jacob, "Acute Renal Failure", Indian J. Anaesth.; 47 (5): 367-372; 2003). Podaci o kreatininu i klirensu kreatinina iz gore opisanog eksperimenta na životinjama (rani tretman) su dati u Tabeli 9.

Tabela 9

[0213] U poređenju sa kontrolnim životinjama sa sepsom, koncentracija kreatinina je snižena za 42% i klirens kreatinina je poboljšan za više od 100% kao rezultat NT-M tretmana (Tabela 9). Podaci pokazuju da administracija antitela na ADM, pogotovo NT-M, dovodi do poboljšanja bubrežne funkcije.

Poboljšanje statusa inflamacije jetre

[0214] Tkivo jetre kontrolnih i rano tretiranih životinja je homogenizovano i lizirano u puferu za lizu. Za pripremu ćelijskog ekstrakta, ćelije su ponovo suspendovane, lizirane na ledu i centrifugirane. Supernatant (proteinski ekstrakt) je ostavljen na -80 °C. Aktivacija pojačivača za gen za jedarni faktor kapa lakog lanca u B ćelijama (NF-κB) je određen kao pto je prethodno opisano, primenom testa promenjene elektroforetske pokretljivosti (EMSA)1,2. Ćelijski ekstrakti (10 µg) su inkubirani na ledu sa poli-dezoksi-inozinski-dezoksi-citidinskom kiselinom (poli-dI-dC) i dvolančanim oligonukleotidom obeleženim pomoću 32P (Biomers, Ulm, Germany) koji sadrži NF-κB (HIV κBsite) (5'-GGATCCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGGCCA-3'). Kompleksi su razdvojeni na nativnim poliakrilamidnim gelovima, osušeni i izloženi filmovima sa X-zracima. Fosforimidžer i softver za analizu slike (AIDA Image Analyzer; Raytest) su korišćeni za kvantifikaciju radioaktivno obeleženog NF-κB denzitometrijom. Za poređenje pojedinačnih gelova, intenzitet svake trake je vezan za onaj istovremeno nanetih životinja koje nisu prošle hiruršku intervenciju i CLP. Prema tome, podaci sa EMSA-e su izraženi kao koliko puta je povećano u odnosu na kontrolne vrednosti. Statistika: Svi podaci su predstavljeni kao medijane (opseg) ako nije rečeno drukčije; razlike između dve grupe su analizirane Mann-Whitney testom sume rangova za nesparene uzorke. Rezultati: životinje tretirane NT-M-om su imale značajno smanjenu aktvaciju NF-κB u tkivu jetre (2,27 (1,97-2,53)) u poređenju sa životinjama na nosaču (2,92 (2,50-3,81)) (p<0,001) (videti sliku 10).

Reference:

1. Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knöferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V: Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35(4):396-402

2. Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knöferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Möller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K: Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71(6):1659-67

Primer 6

Određivanje in vivo bočnih efekata antitela NT-M

[0216] Mužjaci C57B1/6 miša (Charles River Laboratories, Germany) stari 12-15 nedelja su korišćeni za studiju.6 miševa je tretirano (10 ul/ g telesne težine) dozom NT-M od 0,2 mg/ml. Kao kontrola, 6 miševa je tretirano with (10 µl/g telesne težine) PBS. Preživljavanje i fizičko stanje su praćeni 14 dana. Smrtnost je bila 0 u obe grupe, nije bilo razlika u fizičkom stanju između NT-M i kontrolne grupe.

Primer 7

Nefrotoksičnost indukovana gentamicinom

[0217] Ustanovljen je model neseptične akutne povrede bubrega, koji koristi nefrotoksičnost indukovanu gentamicinom (Chiu PJS. Models used to assess renal functions. Drug Develop Res 32:247-255, 1994.). Ovaj model je korišćen za procenu da li tretman antitelom na adrenomedulin može da poboljša funkciju bubrega.

[0218] Eksperiment je izveden na sledeći način:

[0219] Korišćene su grupe od po 8 mužjaka Sprague-Dawley pacova, teških po 250 ± 20 g. Životinje su izazivane gentamicinom pri 120 mg/kg i.m. sedam uzastponih dana (Grupe 1 i 2). Testirano jedinjenje (antitelo na adrenomedulin NT-M) i nosač (fosfatno puferisan slani rastvor) su injektirani intravenski 5 min pre gentamicina 0. dana, praćeni injekcijama 2., 4. i 6. dana. Telesne težine i klinički znaci su praćeni svaki dan. Dvadesetčetvoročasovna (24) skupljanja urina na ledu su urađena 0., 2. i 6. dana. Uzorci urina su testirani na koncentracije Na+ i K+ i kreatinina. Uzorci krvi za kliničku hemiju su uzeti 1. (pre gentamicina), 3. (pre gentamicina) i 7. dana. Serumski elektroliti (Na+ i K+), kreatinin i BUN su bili primarni analiti koji su praćeni za procenu renalne funkcije. Uzorci plazme su skupljani u epruvete sa EDTA (1. i 3. dana: 100 µl; 7.:120 µl). Klirens kreatinina je izračunat. Zapremina urina, urinararni elektroliti i kreatinin su izraženi kao izlučena količina na 100 g telesne težine životinje. Sve životinje su žrtvovane 7. dana. Merena je težina bubrega.

[0220] Skupljanje urina. Životinje su stavljene u pojedinačne kaveze gde je skupljan urin 24 h 0., 2. i 6. dana. Zapremina urina, urinarni Na+, K+ i kreatinin su mereni.

[0221] Endogeni klirens kreatinina je računat na sledeći način:

24-hr urinarno lučenje natrijuma (Na+) je izračunat na sledeći način:

24-hr urinarno lučenje NAG i NGAL je računato na sličan način.

[0222] Frakciono lučenje Na<+>(FENa), ili procenat profiltriranog natrijuma koji je izlučen u konačni urin, je mera Na<+>reapsorptivne funkcije tubula. Izračunat je na sledeći način:

Tretman antitelom na adrenomedulin je 7. dana poboljšalo nekoliko mera bubrežne funkcije u poređenju sa nosačem: serumski kreatinin 1,01 mg/dL (NT-M) prema 1,55 mg/dL (nosač) (Sl.

11), BUN 32,08 mg/dL(NT-M) vs. 52,41 mg/dL (nosač) (Sl. 12), endogeni klirens kreatinina 934,43 mL/24 h (NT-M) vs.613,34 mL/24 h (nosač) (Sl.13), fractional secretion of Na<+>0,98 % (NT-M) vs.1,75 % (nosač) (Sl.14).

Primer 8

[0223] Ispitan je CLP model u miševima opisan gore, efekat tretmana antitelom na adrenomedulin NT-M na nekoliko parametara bubrežne funkcije.

[0224] NT-M je izazvao tri i dva puta veću diurezu i klirens kreatinina, respektivno, konačno dovevši do nižih koncentracija kreatinina, uree i NGAL u krvi na kraju eksperimenta (videti Tabelu 10). Štaviše, koncentracije hemokina (KC) izvedenih iz keratinocita u bubregu su bile značajno snižene tretmanom NT-M (Sl.15).

Tabela 10: Parametri bubrežne funkcije u životinjama tretiranim nosačem (n=11) i NT-M-om (n=9). Koncentracije u krvi su merene u uzorcima na kraju eksperimenta. NGAL = lipokalin vezan za neutrofilnu želatinazu. Svi podaci su medijane (kvartili).

[0225] Eksperimenti su izvedeni na sledeći način:

Kreatinin, urea i lipokalin vezan za neutrofilnu želatinazu (NGAL)

[0226] Koncentracije NGAL u krvi su merene kommercijalnom ELISA-om (mišji NGAL, RUO 042, BioPorto Diagnostics A/S, Denmark, Gentofte). Koncentracije uree i kreatinina su merene pomoću sistema za gasnu hromatografiju/masenu spektrometriju (Agilent 5890/5970, Böblingen, Germany) sa kapilarnom kolonom (Optima-5MS, Macherey-Nagel, Düren, Germany) uz<2>H3-kreatinin (CDN isotopes, Pointe-Claire, QU, Canada) i metil-ureu (FlukaChemikalien, Buchs, Switzerland) kao interne standarde. Posle deproteinizacije acetonitrilom, centrifugiranja i uparavanja do suva, supernatant je rekonstituisan u mravljoj kiselini i ekstrahovan na anjonoizmenjivačkoj koloni sa slabim anjonom (WCX, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany). Acetonitril plus N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamid i N-(tercbutildimetilsilil)-N-metiltrifluoroacetamid su dozvolili formiranje derivata terc-butildimetilsilil i kreatinin trimetilsilil uree, respektivno. Joni m/z 231 i 245 i m/z 329 i 332 su praćeni za analite uree i kreatinina i internane standarde, respektivno. Iz izlaza urina i koncentracija kreatinina u plazmi i urinu, izračunat je klirens kreatinina pomoću standardne formule.

Priprema uzoraka

[0227] Bubreg, koji je čuvan na -80°C, je usitnjen u homogenizatoru u PBS i liziran pomoću 2 puta koncentrovanog pufera za lizate celih ćelija (100 mM Tris pH 7,6; 500 mM NaCl; 6 mM EDTA; 6 mM EGTA; 1 % Triton-X-100; 0,5 % NP 40; 10 % glicerol; inhibitori proteaze (β-glicerolfosfat 2 mM; DTT 4 mM; leupeptin 20 µM; natrijumortovanadat 0,2 mM)), a zatim centrifugiran. Lizat celih ćelija je dobijen iz supernatanta; talog, koji se sastojao od ostataka ćelija je odbačen. Količina proteina je određena fotometrijski pomoću komercijalno dostupnog testa za proteine (Bio-Rad, Hercules, CA) i uzorci su prilagođeni tako da konačna koncentracija proteina bude 4 µg/µl. Uzorci za Multiplex- i EMSA analize su razblaženi 1:1 EMSA puferom (10 mM Hepes; 50 mM KCl; 10 % glicerol; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT), uzorci za imuno blotove 1:12 puta puferom za uzorke (2 % SDS; 125 mM Tris-HCL (pH 6,8 at 25°C); 10 % glicerol; 50 mM DTT; 0,01 % bromofenol plavo).

[0228] Nivoi koncentracija hemokina izvedenih iz keratinocita (KC) su određeni pomoću multipleks kompleta za mišji citokin (Bio-Plex Pro Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, CA), test je izveden korišćenjem Bio-plex suspension array sistema prema uputstvima proizvođača (videti i Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knöferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; i Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knöferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Möller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667). Ukratko, odgovarajući standardi za citokine i uzorci su dodati na filter ploču. Uzorci su inkubirani sa antitelima hemijski pričvršćenim za fluorescentno obeležene mikro kuglice. Posle toga, prethodno promešana antitela za detekciju su dodata u svako udubljenje, a zatim je dodat streptavidin-fikoeritrin. Kuglice su zatim ponovo suspendovane i reakctiona smesa citokina je kvantifikovana pomoću Bio-Plex protein array čitača. Podaci su automatski obrađeni i analizirani softverom Bio-Plex Manager Software 4.1, uz upotrebu standardne krive napravljene na standardima za rekombinantni citokin. Nivoi ispod granice detekcije testa su podešeni na nulu u statističke svrhe.

Primer 9

[0229] U mišjem modelu sa CLP opisanom gore, ispitivan je efekat tretmana antitelom NT-M na adrenomedulin na jetru.

[0230] NT-M je izazvao značajno smanjenje koncentracija hemokina izvedenih iz keratinocita (KC) u jetri (Sl.16).

[0231] Merenje hemokina izvedenog iz keratinocita (KC) je rađeno analogno onom iz primera 8 (bubreg).

Primer 10

[0232] U mišjem modelu sa CLP opisanom gore, ispitivan je efekat tretmana antitelom NT-M na adrenomedulin na nekoliko citokina i hemokinezin u cirkulaciji krvi (plazme).

Koncentracije citokina i hemokina

[0233] Nivoi koncentracija faktora nekroze tumora (TNF)-α, interleukina (IL)-6, monocitnog hemotaksičnog proteina 1 (MCP)-1 i hemokina izvedenog iz keratinocita (KC) u plazmi su određeni korišćenjem multipleks kompleta za mišji citokin (Bio-Plex Pro Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, CA), test je izveden pomoću Bio-plex suspension array sistema prema uputstvima proizvođača (videti i Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knöferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; i Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knöferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Möller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667). Ukratko, odgovarajući standardi za citokine i uzorci su dodati na filter ploču. Uzorci su inkubirani sa antitelima hemijski pričvršćenim za fluorescentno obeležene mikro kuglice. Posle toga, prethodno promešana antitela za detekciju su dodata u svako udubljenje, a zatim je dodat streptavidin-fikoeritrin. Kuglice su zatim ponovo suspendovane i reakciona smesa citokina je kvantifikovana pomoću Bio-Plex protein array čitača. Podaci su automatski obrađeni i analizirani softverom Bio-Plex Manager Software 4.1, uz upotrebu standardne krive napravljene na standardima za rekombinantni citokin. Nivoi ispod granice detekcije testa su podešeni na nulu u statističke svrhe.

[0234] Nivoi koncentracija faktora nekroze tumora (TNF)-α, interleukina (IL)-6 i IL-10, monocitnog hemotaksičnog proteina 1 (MCP)-1 u plazmi tkivu bubrega, i hemokina izvedenog iz keratinocita (KC) su određeni komercijalno dostupnim "Multiplex Cytokine Kit" (Bio-Plex Pro Precision Pro Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, CA), koji omogućava da se sakupi nekoliko parametara iz samo jednog uzorka. Pojedinačni radni koraci testa su izvedeni prema uputstvima proizvođača (videti i Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knöferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402; i Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knöferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabó C, Möller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667).

Ukratko, fluorescentno obeležene mikrosfere ("perle") su dodate na ploču sa 96 udubljenja, usledila su dva koraka pranja, dodavanje internnih standarda i dodavanje uzoraka homogenata plazme i bubrega. Tokom naredne inkubacije, pojedinačni citokini se vezuju za antitela spojena sa polistirenskim perlama. Posle dodavanja antitela specifičnih za citokine i obeleženih biotinom, koja služe za detekciju pojedinačnih citokina i dodatnog inkubacionog vremena, dodat je streptavidin obeležen fikoeritrinom. Posle dodatnog inkubacionog vremena, perle su ponovo suspendovane i ploče su mogle da se mere specifičnim protočnim citometrom (Bio-Plex suspension array system, Bio-Rad, Hercules, CA). Podaci su automatski obrađeni i analizirani softverom Bio-Plex Manager Software 4.1, uz upotrebu standardne krive napravljene na standardima za rekombinantni citokin. Za nivoe u plazmi, koncentracija je data u pg * mL<-1>, koncentracije bubrežnih homogenata su pretvorene u odgovarajuće koncentracije proteina i date u pg * mg<-1>proteina.

[0235] NT-M je izazvao značajno smanjenje koncentracija u plazmiu IL-6 (Sl.17), IL-10 (Sl.

18), hemokina izvedenog iz keratinocita (KC) (Sl.19), monocitnog hemotaksičnog proteina-1 (MCP-1) (Sl.20), TNF-alfa (Sl.21).

Primer 11

Akutna povreda bubrega indukovana ishemijom/reperfuzijom

[0236] Ustanovljen je još jedan model neseptičke akutne povrede bubrega, gde je akutna povreda bubrega indukovana ishemijom/reperfuzijom (Nakamoto M, Shapiro JI, Shanley PF, Chan L, and Schrier RW. In vitro and in vivo protective effect of atriopeptin III on ischemic acute renal failure. J Clin Invest 80:698-705, 1987., Chintala MS, Bernardino V, and Chiu PJS. Cyclic GMP but not cyclic AMP prevents renal platelet accumulation following ischemia-reperfusion in anesthetized rats. J Pharmacol ExpTher 271:1203-1208, 1994). Ovaj model je korišćen za procenu da li tretman antitelom na adrenomedulin može da poboljša bubrežnu funkciju.

[0237] Eksperiment je izveden na sledeći način:

Efekat NT-M na akutnu povredu bubrega indukovanu ishemijom/reperfuzijom u pacovima

Dizajn studije:

Grupa Testirani artikl Put Konc. mg/ml Doza ml/kg mg/kg Pacovi (mužjaci) 1 I-R nosač<a>IV 5 NA x 3 8

2 I-R NT-M IV 5 x 3<b>8

<a>nosač; injektiran intravenski (i.v.) 5 min pre reperfuzije 0. dana, a zatim injekcije 1. i 2. dana.<b>NT-M u dozi od 4 mg/kg je injektiran intravenski (i.v.) 5 min pre reperfuzije 0. dana, a zatim 2 mg/kg i.v. svakog od 1. i 2. dana.

<c>Skupljanje urina -1., 0., 1. i 2. dana, sa hemijom krvi i analizom urina 0., 1., 2. i 3. dana, respektivno. Uzorci plazme su sakupljeni u epruvete sa EDTA (dana 0 (neposredno pre operacije), 1 i 2: 100 µl, pre nosača ili TA; dana 3:120 µl.

[0239] Klinička posmatranja: svaki dan pre operacije, posle operacije i tokom celog tretmana.

[0240] Korišćene su grupe od po 8 mužjaka Sprague-Dawley pacova, težine 250 do 280 g. Životinje su držane u 12-časovnom ciklusu svetlost/tama i na standardnoj dijeti sa destilovanom ledenom vodom ad libitum. Životinje su dobijale tečne suplemente (0,9% NaCl i 5% dekstrozu/1:1, 10 ml/kg p.o.) 30 min pre operacije (0. dana). Pacovi su anestezirani pentobarbitalom (50 mg/kg, i.p.). Abdominalna šupljina je izložena putem reza na sredini, za čim je usledila intravenozna administracija heparina (100 U/kg, i.v.) i obe renalne arterije su okludovane 45 min pomoću vaskularnih klema. Odmah posle uklanjanja renalnih štipaljki, bubrezi su posmatrani još 1 min da bi se osigurala promena boje koja ukazuje na reperfuziju krvi. Testirano jedinjenje (NT-M) i nosač (fosfatno puferisan slani rastvor) su injektirani intravenozno 5 min pre reperfuzije, za čim je usledila dnevna injekcija 1. i 2. dana.

[0241] Skupljanje urina. 24-časovno skupljanje urina na ledu je započeto 24h pre ishemije/reperfuzije -1. dana (-24h do 0h) i 0. dana (0-24h), 1. dana (24-48h) i 2. dana (48-72h) posle reperfuzije.

Skupljanje krvi: 0,4 ml krvi je uzeto iz repne vene u tail vein epruvete sa EDTA ut 0h (pre I RI operacije), 24h (pre nosača ili TA), 48h (pre nosača ili TA) i 72h za određivanje plazmatskog kreatinina/Na+/K+ i BUN; 2 ml krvi je uzeto iz velike šuplje vene terminalno.

[0242] Životinje su stavljene u pojedinačne kaveze gde im je skupljan urin 24 h -1. dana (-24h-0h), 0. dana (0-24h), 1. dana (24-48h) i 2. dana (48-72h) posle reperfuzije 0. dana. Zapremina urina, urinarni Na+, K+ i kreatinin su izmereni.

[0243] Klirens kreatinina (CCr) je izračunat na sledeći način:

[0244] 24-časovno urinarno izlučivanje natrijuma (Na+) je izračunato na sledeći način:

[0245] Frakciona ekskrecija Na+ (FENa), ili procenat profiltriranog natrijuma koji je izlučen u konačni urin, je mera Na<+>-reapsorptivne funkcije tubula. Izračunata je na sledeći način:

1

[0246] Tretman antitelom na adrenomedulin je popravio nekoliko mera bubrežne funkcije:

azot iz uree u krvi (BUN) je pokazao veliki rast u grupi sa nosačem (0 h: 17,49 mg/dL, 24 h: 98,85 mg/dL, 48 h: 109,84 mg/dL, 72 h: 91,88 mg/dL), koji je bio manje izražen u NT-M tretmanu (0 h: 16,33 mg/dL, 24 h: 84,2 mg/dL, 48 h: 82,61 mg/dL, 72 h: 64,54 mg/dL) (Sl.

22).

[0247] Serumski kreatinin se slično razvijao: grupa sa nosačem (0 h: 0,61 mg/dL, 24 h: 3,3 mg/dL, 48 h: 3,16 mg/dL, 72 h: 2,31 mg/dL), NT-M grupa: (0 h: 0,59 mg/dL, 24 h: 2,96 mg/dL, 48 h: 2,31 mg/dL, 72 h: 1,8 mg/dL) (Sl.23).

[0248] Klirens endogenog kreatinina je izrazito pao 1. dana i od tad se više popravljao u NT-M grupi nego u grupi sa nosačem. Grupa sa nosačem: (0 h: 65,17 mL/h, 24 h: 3,5 mL/h, 48 h: 12,61 mL/h, 72 h: 20,88 mL/h), NT-M grupa:(0 h: 70,11 mL/h, 24 h: 5,84 mL/h, 48 h: 21,23 mL/h, 72 h: 26,61 mL/h) (Sl.24).

OPIS SLIKA

[0249]

Sl. 1a: Ilustracija formata antitela - Fv i scFv-varijante

Sl 1b: Ilustracija formata antitela – heterologne fuzije i bifunkcionalna antitela

Sl 1c: Ilustracija formata antitela - bivalentna antitela i bispecifična antitela

Sl. 2:

hADM 1-52 (SEQ ID No.21)

mADM 1-50 (SEQ ID No.22)

aa 1-21 humanog ADM (SEQ ID No.23)

aa 1-42 humanog ADM (SEQ ID No.24)

aa 43-52 humanog ADM (SEQ ID No.25)

aa 1-14 humanog ADM (SEQ ID NO: 26)

aa 1-10 humanog ADM (SEQ ID NO: 27)

aa 1-6 humanog ADM (SEQ ID NO: 28)

aa 1-32 zrelog humanog ADM (SEQ ID NO: 29)

aa 1-40 zrelog mišjeg ADM (SEQ ID NO: 30)

aa 1-31 zrelog mišjeg ADM (SEQ ID NO: 31)

Sl. 3:

a: Kriva doza/odgovor humanog ADM. Maksimalna stimulacija cAMP-om je podešena na 100%-nu aktivaciju

b: Kriva doza/ inhibicija humanog ADM 22-52 (antagonist ADM-receptora) u prisustvu 5,63 nM hADM.

c: Kriva doza/ inhibicija CT-H u prisustvu 5,63 nM hADM.

d: Kriva doza/ inhibicija MR-H u prisustvu 5,63 nM hADM.

e: Kriva doza/ inhibicija NT-H u prisustvu 5,63 nM hADM.

f: Kriva doza/odgovor mišjeg ADM. Maksimalna stimulacija cAMP-om je podešena na 100%-nu aktivaciju

2

g: Kriva doza/inhibicija humanog ADM 22-52 (antagonist ADM-receptora) u prisustvu 0,67 nM mADM.

h: Kriva doza/ inhibicija CT-M u prisustvu 0,67 nM mADM.

i: Kriva doza/ inhibicija MR-M u prisustvu 0,67 nM mADM.

j: Kriva doza/ inhibicija NT-M u prisustvu 0,67 nM mADM.

k: pokazuje inhibiciju ADM pomoću F(ab)2 NT-M i pomoću Fab NT-M

l: pokazuje inhibiciju ADM pomoću F(ab)2 NT-M i pomoću Fab NT-M

Sl. 4: Ova slika prikazuje tipičnu krivu doza/ signal hADM i krivu doza/ signal hADM u prisustvu 100 µg/mL antitela NT-H.

Sl. 5: Ova slika prikazuje stabilnost hADM u humanoj plazmi (citratnoj) u odsustvu i u prisustvu NT-H antitela.

Sl. 6: Poravnanje Fab sa homologim humanim okvirnim sekvencama

Sl. 7: Ova slika prikazuje potrebe za noradrenalinom u ranom i kasnom tretmanu pomoću NT-M

Sl. 8: Ova slika prikazuje stvaranje urina posle ranog i kasnog tretmana pomoću NT-M Sl. 9: Ova slika prikazuje ravnotežu tečnosti posle ranog i kasnog tretmana pomoću NT-M Sl. 10: Aktivacija pojačivača za gen za jedarni faktor kapa lakog lanca u B ćelijama (NF-κB) tkiva jetre, analiziran testom promenjene elektroforetske pokretljivosti (EMSA). # označava p<0,001 u odnosu na nosač.

Sl. 11: Razvoj serumskog kreatinina u vremenu. Prikazane su srednje vrednosti /- SEM. Sl. 12: Razvoj azota iz uree u krvi (BUN) u vremenu. Prikazane su srednje vrednosti /-SEM.

Sl. 13: Razvoj endogenog klirensa kreatinina u vremenu. Prikazane su srednje vrednosti /- SEM.

Sl. 14: Razvoj frakcione ekskrecije Na<+>u vremenu. Prikazane su srednje vrednosti /-SEM.

Sl. 15: Nivoi hemokina izvedenog iz keratinocita (KC) određeni u odnosu na ukupan protein ekstrahovan iz bubrega. Beli "boks plot" prikazuje rezultate dobijene sa nosačem, sivi "boks plot" prikazuje rezultate dobijene posle tretmana NT-M-om.

Sl. 16: Nivoi hemokina izvedenog iz keratinocita (KC) određeni u odnosu na ukupan protein ekstrahovan iz jetre. Beli "boks plot" prikazuje rezultate dobijene sa nosačem, sivi "boks plot" prikazuje rezultate dobijene posle tretmana NT-M-om.

Sl. 17: Nivoi IL-6 u plazmi. Beli "boks plot" prikazuje rezultate dobijene sa nosačem, sivi "boks plot" prikazuje rezultate dobijene posle tretmana NT-M-om.

Sl. 18: Nivoi IL-10 u plazmi. Beli "boks plot" prikazuje rezultate dobijene sa nosačem, sivi "boks plot" prikazuje rezultate dobijene posle tretmana NT-M-om.

Sl. 19: Nivoi hemokina izvedenog iz keratinocita (KC) u plazmi. Beli "boks plot" prikazuje rezultate dobijene sa nosačem, sivi "boks plot" prikazuje rezultate dobijene posle tretmana NT-M-om.

Sl. 20: Nivoi monocitnog hemotaksičnog proteina-1 (MCP-1) u plazmi. Beli "boks plot" prikazuje rezultate dobijene sa nosačem, sivi "boks plot" prikazuje rezultate dobijene posle tretmana NT-M-om.

Sl. 21: Nivoi TNF-alfa u plazmi. Beli "boks plot" prikazuje rezultate dobijene sa nosačem, sivi "boks plot" prikazuje rezultate dobijene posle tretmana NT-M-om.

Sl. 22: Razvoj azota iz uree u krvi (BUN) u vremenu. Prikazane su srednje vrednosti /-SEM.

Sl. 23: Razvoj serumskog kreatinina u vremenu. Prikazane su srednje vrednosti /- SEM. Sl. 24: Razvoj endogenog klirensa kreatinina u vremenu. Prikazane su srednje vrednosti /- SEM.

4

Claims (21)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta koji pati od neravnoteže tečnosti i gde se navedeno antitelo ili fragment antitela ili struktura bez Ig vezuje za region od bar 4 aminokiseline unutar sekvence aa 1-21 zrelog humanog ADM: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID No.23).
2. 2. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema zahtevu 1, gde je navedeni pacijent pacijent kome je potrebno regulisanje ravnoteže tečnosti.
3. 3. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 2, za sprečavanje ili smanjenje edema kod navedenog pacijenta.
4. 4. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde je navedeno antitelo ili fragment antitela ili struktura bez Ig, monospecifično.
5. 5. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koje se dalje odlikuje time što navedeno antitelo ili fragment ili struktura ispoljava afinitet vezivanja za ADM od bar 10<-7>M, gde je navedeni afinitet vezivanja određen prema Primeru 1.
6. 6. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura nije Protein-1 vezivanja ADM, faktor komplementa H.
7. 7. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde navedeno antitelo ili fragment ili struktura prepoznaje i vezuje se za epitop koji sadrži N-terminalni deo aminokiseline 1 zrelog humanog ADM i gde navedeno antitelo, ili fragment ili struktura, ne bi vezalo ni adrenomedulin produžen na N-kraju, ni adrenomedulin modifikovan na N-kraju, ni adrenomedulin razgrađen na N-kraju.
8. 8. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde je navedeno antitelo, ili fragment ili struktura, antitelo koje stabilizuje ADM ili fragment antitela koji stabilizuje ADM ili struktura bez Ig koja stabilizuje ADM, koje povećava poluživot, t1⁄2 retenciono poluvreme, adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi, bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije > 50 %, najpoželjnije > 100 %.
9. 9. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde navedeno antitelo, ili fragment ili struktura, blokira bioaktivnost cirkulišućeg ADM ne više od 80 %, poželjno ne više od 50 %, gde se bioaktivnost ADM određuje u funkcionalnom eseju na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor pomoću cAMP prema Primeru 2.
10. 10. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde navedeni pacijent pati od bolesti koja je odabrana iz grupe koja sadrži SIRS, sepsu, dijabetes, kancer, srčanu insuficijenciju, šok i disfunkciju bubrega.
11. 11. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 10, gde je navedeno antitelo ili fragment antitelo ili fragment koji se vezuje za ADM, gde težak lanac sadrži sekvence: SEQ ID NO: 1 GYTFSRYW SEQ ID NO: 2 ILPGSGST SEQ ID NO: 3 TEGYEYDGFDY, i gde lak lanac sadrži sekvence: SEQ ID NO: 4 QSIVYSNGNTY SEQ ID NO: 5 RVS SEQ ID NO: 6 FQGSHIPYT.
12. 12. Humano monospecifično antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema zahtevu 11, gde navedeno antitelo ili fragment obuhvata sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži: SEQ ID NO: 7 (AM-VH-C)
13. 13. Antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 12, gde je navedeno antitelo ili fragment ili struktura modulatorsko antitelo ili modulatorski fragment ili modulatorska struktura, koje povećava poluživot, t1⁄2 retenciono poluvreme, adrenomedulina u serumu, krvi, plazmi, bar za 10 %, poželjno bar za 50 %, poželjnije > 50 %, najpoželjnije > 100 % i koji blokira bioaktivnost ADM ne više od 80 %, poželjno ne više od 50 %, kad je bioaktivnost ADM određena u funkcionalnom eseju na humani rekombinantni adrenomedulinski receptor pomoću cAMP prema Primeru 2.
14. 14. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 13, koje se dalje odlikuje time što se navedeno antitelo, fragment antitela ili struktura bez Ig, ne vezuje za C-terminni deo ADM, koji je aa 43-52 ADM: PRSKISPQGY-NH2 (SEQ ID NO:25).
15. 15. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 14 to be used u kombinaciji sa kateholamin i/ili tečnosts administriranim intravenozno.
16. 16. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 1 do 14, ili kombinacija za upotrebu prema zahtevu 15, za upotrebu u kombinaciji sa proteinom koji vezuje ADM i/ili drugim aktivnim sastojcima.
17. 17. Antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM struktura bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta koji pati od neravnoteže tečnosti, prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje se odlikuje time što navedena terapija nije metod primarnog tretmana za navedenu akutnu bolest ili akutno stanje.
18. 18. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM strukturu bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, prema bilo kom od zahteva 1 do 17 za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta koji pati od neravnoteže tečnosti.
19. 19. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM strukturu bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema zahtevu 18, gde je navedena farmaceutska formulacija rastvor, poželjno rastvor spreman za upotrebu.
20. 20. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo na adrenomedulin (ADM), ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM strukturu bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema zahtevu 19, gde je navedena farmaceutska formulacija u liofilizovanom stanju.
21. 21. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo na adrenomedulin (ADM) ili fragment antitela na ADM koji se vezuje za adrenomedulin ili anti-ADM strukturu bez Ig koja se vezuje za adrenomedulin, za upotrebu u terapiji akutne bolesti ili akutnog stanja pacijenta prema bilo kom od zahteva 18 do 20, gde je navedena farmaceutska formulacija namenjena da se daje pacijentu koji pati od neravnoteže tečnosti, uz uslov da je navedenom pacijentu potrebno regulisanje ravnoteže tečnosti.