RS58421B2 - Prevencija i lečenje sinukleinopatske i amiloidogene bolesti - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Patologija mozga koja obuhvata alfa-sinuklein (alfaSN) je uočljiva karakteristika kod nekoliko neurodegenerativnih bolesti, uključujući Parkinsonovu bolest (PD), demenciju sa Levijevim telima (DLB), varijantu Alchajmerove bolesti koja obuhvata Levijeva tela (LBVAD), atrofiju višestrukih sistema (MSA), i neurodegeneraciju mozga sa nakupljanjem gvožđa tipa-1 (NBIA-1). Svim ovim bolestima, koje se zovu sinukleinopatije, zajedničke karakteristike predstavljaju proteinske nerastvorljive inkluzije u neuronima i gliji koje se primarno sastoje iz alfaSN.

[0002] Levijeva tela i Levijevi neuriti su intraneuronske inkluzije koje se primarno sastoje iz alfaSN. Levijeva tela i Levijevi neuriti su neuropatološke karakteristike Parkinskonove bolesti (PD). PD i druge sinukleinopatske bolesti se kolektivno nazivaju bolestima Levijevih tela (LBD). LBD se karakteriše degeneracijom dopaminergičkih neurona, motoričkim izmenama, narušavanjem kognitivnitivnog sistema, i obrazovanjem Levijevih tela (LBs). (McKeith et al., Clinical and pathological diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): Report of the CDLB International Workshop, Neurology (1996) 47:1113-24). Druge bolesti koje sadrže LB uključuju bolest difuznih Levijevih tela (DLBD), varijantu Alchajmerove bolesti sa Levijevim telima (LBVAD), kombinovanom PD i Alzhajmerovom bolesti (AD), i atrofijom višestrukih sistema. Demencija sa Levijevim telima (DLB) je termin koji je napravljen da bi se pomirile razlike u terminologiji bolesti koje sadrže LB.

[0003] Poremećaji koji obuhvataju LB-tela su i dalje zajednički uzročnik poremećaja u kretanju i kognitivnog pogoršanja u populaciji koja stari (Galasko et al., Clinical-neuropathological correlations in Alzheimer’s disease and related dementias. Arch. Neurol. (1994) 51:888-95). Pored toga što njihova učestalost nastavlja da se povećava, čime se dobija ozbiljan javni zdravstveni problem, do danas ovi poremećaji nisu izlečivi i ne može da se izvrši njihova prevencija, i za razumevanje uzročnika i patogeneze PD, kritično je razvijanje novih tretmana (Tanner et al., Epidemiology of Parkinson’s disease and akinetic syndromes, Curr. Opin. Neurol. (2000) 13:427-30). Uzročnik PD je kontroverzan i predloženi su višestruki faktori koji imaju ulogu, uključujući različite neurotoksine i faktore genetičke podložnosti.

[0004] U poslednjih nekoliko godina, pojavila se nova nada za razumevanje patogeneze PD. Specifično, nekoliko studija su pokazale da sinaptički protein alfa-SN ima centralnu ulogu u patogenezi PD s obzirom da: (1) se ovaj protein nakuplja u LB-a (Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., AM.J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8), (2) mutacije u genu koji kodira za alfa-SN ko-segregiraju sa retkim familijarnim oblicima parkinsonizma (Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos MH, et al., Science (1997) 276:2045-7) i, (3) njegova prekomerna ekspresija u transgenim miševima (Masliah et al., Science (2000) 287:1265-9) i Drosophila (Feany et al., Nature (2000) 404:394-8) imitira nekoliko patoloških aspekata PD. Prema tome, činjenica je da nakupljanje alfa-SN u mozgu povezano sa sličnim morfološkim i neurološkim izmenama u raznolikim vrstama kao što su ljudi, miševi, i mušice ukazuje na to da ovaj molekul doprinosi razvijanju PD.

[0005] Fragment alfa-SN, koji je prethodno određen da bude sastavni deo AD amiloidnih plakova, je nazvan neamiloidna-beta (ne-Aβ) komponenta AD amiloida (NAC) (Iwai A., Biochim. Biophys. Acta (2000) 1502:95-109); Masliah et al., AM. J. Pathol (1996) 148:201-10; Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:11282-6). Pored toga što nije poznata tačna funkcija NAC, može da ima kritičnu ulogu u sinaptičkim događajima, kao što je nervna plastičnost tokom razvoja, i učenja i degeneracija nervnih završetaka pod patološkim uslovima u LBD, AD, i drugim poremećajima (Hasimoto et al., Alpha-Synuclein in Lewy body disease and Alzheimer’s disease, Brain Pathol (1999) 9:707-20; Masliah, et al., (2000). Masliah et al. (2005) Neuron 46:857-68 opisuje imunizaciju alfa-sinukleinom u u mišjem modelu Parkinsonove bolesti.

[0006] AD, PD, i demecija sa Levijevim telima (DLB) su najčešće prisutni neurodegenerativni poremećaji kod starije populacije. Iako njihova učestalost nastavlja da se povećava, stvarajući javni zdravstveni problem, do danas ovi poremećaji ne mogu da se izleče niti može da se izvrši njihova preventiva. Nedavne epidemiološke studije su pokazale blisku kliničku vezu između AD i PD, gde oko 30% pacijenata sa Alchajmerovom bolesti takođe imaju PD. U poređenju sa ostatkom populacije koja stari, pacijenti koji imaju AD se prema tome nalaze u većoj verovatnoći da razviju prateći PD. Dalje, pacijenti sa PD koji razviju demenciju obično razvijaju klasični AD. Pored toga što svaka neurodegenerativna bolest deluje da ima sklonost prema specifičim regionima u mozgu i ćelijskim populacijama, što ima za rezultat različite patološke karakteristike, PD, AD, DLB i LBD takođe dele zajedničke patološke karakteristike. Pacijenti sa familijarnim AD, Daunovim sindromom, ili sporadičnim AD razvijaju LB-a u amigdali, što su klasične neuropatološke oznake PD. Dodatno, svaka bolest je povezana sa degeneracijom neurona, interneuronalnim sinaptičkim vezama i mogućom ćelijskom smrti, trošenjem neurotransmitera, i abnormalnim nakupljanjem pogrešno savijenih proteina, prekursora koji učestvuju u funkciji normalnog centralnog nervnog sistema. Biohemijske studije su potvrdile vezu između AD, PD i DLB.

[0007] Neuritski plakovi koji su klasična patološla oznaka AD koji sadrži beta amiloidni (Aβ) peptid i komponentu ne-beta amiloidnog peptida (NAC). Aβ se dobija iz većeg prekursorskog proteina koji se zove amiloidni prekursorski protein (APP). NAC se dobija iz većeg prekursora proteina koji se naziva ne-beta amiloidna komponenta APP, sada poznatiji pod imenom alfa-SN. NAC sadrži ostatke aminokiselina 60-87 ili 61-95 alfa-SN. Oba Aβ i NAC su prvo identifikovani u amiloidnim plakovima kao proteolitički fragmenti njihovih proteina u punoj dužini, za koje su identifikovani i klonirani cDNK molekuli u punoj dužini.

[0008] Alfa-SN je deo velike familije proteina uključujući beta- i gama- sinuklein i sinoretin. Alfa-SN se eksprimira u normalnom stanju i povezan je sa sinapsama i veruje se da ima ulogu u neuralnoj plastičnosti, učenju i memoriji. Identifikovane su mutacije u humanom (h) alfa-SN koje pojačavaju nakupljanje alfa-SN (Ala30Pro i Ala53Thr) i koje su povezane sa retkim oblicima autozomalno dominantnih oblika PD. Nisu poznati mehanizmi pomoću kojih ove mutacije povećavaju sklonost za nakupljanje alfa-SN.

[0009] Pored toga što brojne mutacije mogu da se nađu u u populaciji APP i alfa-SN, većina slučajeva AD i PD su sporadični. Najčešći sporadični oblici ovih bolesti su povezani sa abnormalnim nakupljanjem redom, Aβ i alfa-SN. Međutim, razlog za prekomerno nakupljanje ovih proteina nije poznat. Aβ se sekretuje iz neurona i nakuplja se u vanćelijskim amiloidnim plakovima. Pored toga, Aβ može da se detektuje unutar neurona. Nakupine Alfa-SN u intraneuralnim inkluzijama se zovu LB-a. Iako se dva proteina obično nalaze zajedno u vanćelijskim neuritskim AD plakovima, takođe se povremeno mogu naći zajedno u unutarćelijskim inkluzijama.

[0010] Nisu jasni mehanizmi pomoću kojih nakupljanje alfa-SN vodi do neurodegeneracije i karakterističnih simptoma PD. Međutim, identifikovanje uloge faktora koji promovišu i/ili blokiraju nakupljanje alfa-SN je kritično za razumevanje patogeneze LBD i razvoja novih tretmana za njegove udružene poremećaje. Istraživanje kojim se identifikuje tretman je usmereno prema potrazi za jedinjenjima koja smanjuju nakupljanje alfa-SN (Hashimoto, et al.) ili ispitivanje faktora rasta koji će promovisati regeneraciju i/ili preživljavanje dopaminergičkih neurona, koji su ćelije koje su primarno pogođene (Djaldetti et al., New therapies for Parkinson’s disease, J. Neurol (2001) 248:357-62; Kirik et al., Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson’s model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system, J. Neurosci (2000) 20:4686-4700). Nedavne studije u transgenom mišjem modelu AD su pokazale da antitela koja su specifična prema Aβ 1-42 olakšavaju i stimulišu uklanjanje amiloida iz mozga, poboljšavaju patologiju koja je slična sa AD i dovode do unapređenih kognitivnih performansi (Schenk et al., Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in PDAPP mouse, Nature (1999) 408:173-177; Morgan et al., A-beta peptide vaccination prevents memory loss in an animal model of Alzheimer’s disease, Nature (2000) 408:982-985; Janus et al., A-beta peptide immunization reduces behavioral impairment and plaques in a model of Alzheimer’s disease, Nature (2000) 408:979-82). Suprotno vanćelijskim amiloidnim plakovima koji se mogu naći u mozgovima pacijenata sa Alzhajmerovom bolesti, Levijeva tela se nalaze unutar ćelija, i antitela obično ne ulaze u ćeliju.

[0011] Iznenađujuće, s obzirom na unutarćelijsku prirodu LB-a u tkivu mozga, autori su uspeli da smanje broj inkluzija kod transgenih miševa koji su imunizovani sa sinukleinom. Predmetni prikaz je usmeren između ostalog na lečenje PD i drugih bolesti koje su povezane sa LB-a davanjem pacijentu, sinukleina, fragmenata sinukleina, antigena koji imitiraju sinuklein ili njegovih fragmenata, ili antitela koja su specifična za određene epitope sinukleina pod uslovima u kojima nastaje koristan imunski odgovor kod pacijenta. Autori su takođe iznenađujuće uspeli da smanje broj inkluzija kod transgenih miševa koji su imunizovani sa Aβ. Predmetni prikaz je usmeren, između ostalog, na lečenje PD i drugih bolesti koje su povezane sa LB-a davanjem pacijentu, Aβ, fragmenta Aβ, antigena koji imitiraju Aβ ili njihove fragmente, ili antitela koja su specifična za određene epitope Aβ od uslovima u kojima nastaje koristan imunski odgovor kod pacijenta. Prikaz, prema tome, ispunjava dugogodišnju potrebu za terapeutskim režimima za sprečavanje ili ublažavanje neuropatologije i, kod nekih pacijenata, kognitivno narušavanje koje je povezano sa PD i drugim bolestima koje su povezane sa LB-a.

KRATKA SUŠTINA PRONALASKA

[0012] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-10 humanog alfa-sinukleina, gde su ostaci obeleženi prema SEQ ID NO: 1, za upotrebu u sprovođenju profilakse ili lečenju bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupljanjem alfasinukleina u mozgu.

Pronalazak dalje obezbeđuje prvo antitelo koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-10 humanog alfasinukleina, i drugo antitelo koje se specifično vezuje za epitop koji se nalazi unutar ostataka 70-140 humanog alfa-sinukleina, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO: 1, za upotrebu u sprovođenju profilakse ili lečenju bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupljanjem alfasinukleina u mozgu.

Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži himerno ili humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-10 alfa-sinukleina, gde su ostaci obeleženi prema SEQ ID NO: 1, i farmaceutski nosač, za upotrebu u sprovođenju profilakse ili lečenju bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupljanjem alfa-sinukleina u mozgu.

Pronalazak dalje obezbeđuje polipeptid koji se sastoji iz imunogenog fragmenta alfa-sinukleina koji je efikasan da indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop koji se nalazi unutar ostataka 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, i 1-10 humanog alfa-sinukleina, gde su ostaci obeleženi prema SEQ ID NO: 1, za upotrebu u sprovođenju profilakse ili lečenje bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupljanjem alfa-sinukleina u mozgu.

Ovde su prikazani postupci prevencije ili lečenja bolesti koja se karakteriše prisustvom Levijevih tela ili nakupina alfa-SN u mozgu. Takvi postupci podrazumevaju, indukovanje imunskog odgovora prema alfa-SN. Takva indukcija može da se postigne aktivno davanjem imunogena ili pasivno davanjem antitela ili derivata antitela koje je specifično za sinuklein. U nekim postupcima, pacijent je asimptomatski. U nekim postupcima, pacijent ima bolest i asimptomatski je. U nekim postupcima pacijent ima faktor rizika za bolest i asimptomatski je. U nekim postupcima, bolest je Parkinsonova bolest. U nekim postupcima, bolest je parkinonova bolest, i davanje sredstva poboljšava motoričke karakteristike kod pacijenta. U nekim postupcima, bolest je Parkinsonova bolest gde davanje sredstva sprečava pogoršanje motoričkih karakteristika pacijenta. U nekim postupcima, pacijent nema Alchajmerovu bolest.

[0013] Za lečenje pacijenata koji pate od Levijevih tela ili nakupljanjem alfa-SN u mozgu, jedan režim tretmana podrazumeva davanje pacijentu doze alfa-SN ili njegovog aktivnog fragmenta da bi se indukovao imunski odgovor. U nekim postupcima, alfa-SN ili njegov aktivni fragment se daje u višestrukim dozama tokom perioda od najmanje šest meseci. Alfa-SN ili njegov aktivni fragment može da se daje, na primer, periferno, intraperitonealno, oralno, subkutano, intrakranijalno, intramuskularno, topikalno, intranazalno ili intravenozno. U nekim postupcima, alfa-SN ili njegov aktivni fragment se daju sa adjuvansom koji pojačava imunski odgovor koji je usmeren prema alfa-SN ili njegovom aktivnom fragmentu. U nekom postupku, imunogeni odgovor sadrži antitela koja su specifična prema alfa-SN ili njegovom aktivnom fragmentu.

[0014] U nekim postupcima, sredstvo je od aminokiselina 35-65 alfa-SN. U nekim postupcima, sredstvo sadrži aminokiseline 130-140 alfa-SN i ukupno ima manje od 40 aminokiselina. U nekim postupcima, sredstvo sadrži amino kiseline 130-136 alfa-SN i ukupno ima manje od 40 aminokiselina. U nekim postupcima, C-terminalne amino kiseline sredstva su C-terminalna amino kiselina alfa-SN. U nekim od gore navedenih postupaka, alfa-SN ili aktivni fragment je vezan za nosač na N-kraju alfa-SN ili aktivnog fragmenta. U nekim postupcima, sredstvo sadrži aminokiseline 1-10 alfa-SN i ukupno ima manje od 40 aminokiselina. U nekim postupcima, N-terminalne amino kiseline sredstva je N-terminalna amino kiselina alfa-SN. U nekim od gore navedenih postupaka, alfa-SN ili aktivi fragment je vezan sa nosačem na C-kraju alfa-SN ili aktivnog fragmenta. U nekim od gore navedenih postupaka, alfa-SN ili aktivni fragment je vezan sa molekulom nosača da obrazuje konjugat. U nekim postupcima, sredstvo se daje pacijentu davanjem polinukleotida koji kodira polipeptid koji sadrži fragment alfa-SN.

[0015] Za tretman pacijenata koji pate od Levijevih tela ili nakupljanja alfa-SN u telu, jedan režim tretmana podrazumeva davanje pacijentu doze antitela koje je specifično za alfa-SN ili njegovog aktivnog fragmenta da bi se indukovao imunski odgovor. Antitelo koje se koristi može da bude humano, humanizovano, himerno, ili poliklonsko i može da bude monoklonsko ili poliklonsko. U nekim postupcima izotip antitela je humano IgG1. U nekim postupcima, antitelo se priprema od čoveka koji je imunizovan sa peptidom alfa-SN i čovek može da bude pacijent koji treba da se leči sa antitelom. U nekim postupcima, antitelo se vezuje za spoljašnu površinu ćelija neurona koje imaju Levijeva tela čime se rasturaju Levijeva tela. U nekim postupcima, antitelo se internalizuje unutar neuronskih ćelija koje imaju Levijeva tela čime se razlažu Levijeva tela.

[0016] U nekim postupcima, antitelo se daje zajedno sa farmaceutskim nosačem u obliku farmaceutske kompozicije. U nekim postupcima, antitelo se daje u dozi od 0,0001 do 100 mg/kg, poželjno, najmanje 1 mg/kg antitela po kilogramu telesne težine. U nekim postupcima, antitelo se daje u višestrukim dozama u produženom periodu, na primer, najmanje šest meseci. U nekim postupcima, antitela mogu da se daju u kompoziciji sa produženim oslobađanjem. Antitelo može da se daje, na primer, periferno, intraperitonealno, oralno, subkutano, intrakranijalno, intramuskularno, topikalno, intranazalno ili intravenozno. U nekim postupcima, pacijent se prati za nivo antitela koje je je primenjeno u krvi pacijenta.

[0017] U nekim postupcima, antitelo se daje pacijentu davanjem polinukleotida koji kodira najmanje jedan lanac antitela. Polinukleotid se eksprimira da bi se lanac antitela proizveo u pacijentu. Opciono, polinukleotid kodira teške i lake lance antitela i polinukleotid se eksprimira da bi se teški i laki lanci proizveli u pacijentu.

[0018] Ovaj prikaz dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koje od antitela koje je specifično za alfa-SN koje se u ovoj prijavi opisuje i farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0019] Prikaz takođe obezbeđuje postupke za prevenciju ili lečenje bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupljanjem alfa-SN u mozgu koji obuhvataju davanje sredstva koje indukuje imunogeni odgovor koji je usmeren prema alfa-SN, i dalje obuhvata davanje pacijentu drugog sredstva koje indukuje imunogeni odgovor koji je usmeren prema Aβ. U nekim postupcima, sredstvo je Aβ ili njegov aktivni fragment. U nekim postupcima, sredstvo je antitelo koje je specifično za Aβ.

[0020] Prikaz takođe obezbeđuje postupke za prevenciju ili lečenje bolesti koja se karakteriše Levijem telima ili nakupljanjem alfa-SN u mozgu koji obuhvataju davanje pacijentu sredstva koje indukuje imunogeni odgovor prema Aβ. U nekim postupcima, sredstvo je Aβ ili njegov aktivni fragment. U nekim postupcima, sredstvo je antitelo koje je specifično za Aβ. U nekim postupcima bolest je Parkinsonova bolest. U nekim postupcima, pacijent nema Alchajmerovu bolest i nema faktore rizika za razvijanje bolesti. U nekim postupcima, koji dalje sadrže praćenje karakterisika ili simptoma Parkinsonove bolesti kod pacijenta. U nekim postupcima, bolest je Parkinsonova bolest i davanjem sredstva se dobija se dobija poboljšanje u karakteristikama ili simptomima Parkinsonove bolesti.

[0020] Prikaz takođe obezbeđuje postupke za prevenciju ili lečenje bolesti koja se karakteriše sa prisustvom Levijevih tela ili nakupljanjem alfa-SN u mozgu koje obuhvata davanje pacijentu sredstva koje indukuje imunogeni odgovor prema Aβ. U nekim postupcima, sredstvo je Aβ ili njegov aktivni fragment. U nekim postupcima, sredstvo je antitelo koje je specifično za Aβ. U nekim postupcima bolest je Parkinsonova bolest. U nekim postupcima, pacijent nema Alzhajmerovu bolest niti ima faktore rizika za razvijanje bolesti. U nekim postupcima, dalje obuhvataju praćenje znaka ili simptoma Parkinsonove bolesti kod pacijenta. U nekim postupcima, bolest je Parkinsonova bolest i davanje sredstva dovodi do poboljšanja u znaku ili simptomu Parkinsonove bolesti.

[0021] Ovaj prikaz takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže sredstvo koje je efikasno da indukuje imunogeni odgovor prema komponenti u Levijevom telu kod pacijenta, kao što se gore opisuje, i farmaceutski prihvatljivi adjuvans. U neki jedinjenjima, sredstvo je alfa-SN ili aktivni fragment, na primer, NAC, ili bilo koji od c-terminalnih fragmenata koji se opisuju u prijavi. Prikaz takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo koje je specifično za komponentu u Levijevom telu.

[0022] Ovaj prikaz takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže sredstvo koje je efikasno da pokrene imunski odgovor prema sinukleinkoj-NAC komponenti amiloidnog plaka kod pacijenta. U nekim jedinjenjima, sredstvo je alfa-SN ili aktivni fragment, na primer, NAC, ili bilo koji od C-terminalnih fragmenata alfa sinukleina koji se opisuju u ovoj prijavi, i, opciono, adjuvans. U drugim jedinjenjima, sredstvo je antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje alfa-SN ili njegov fragment, i, opciono, farmaceutski nosač.

[0023] Prikaz takođe obezbeđuje postupke za skrining antitela za aktivnost u prevenciji ili lečenju bolesti koja je povezana sa Levijevim telima. Takvi postupci zahtevaju, dovođenje u kontakt neuronske ćelije koja eksprimira sinuklein sa antitelom. Zatim se određuje da li dovođenje u kontakt smanjuje depozite sinukleina u ćelijama u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje se ne dovode u kontakt sa antitelom.

[0024] Prikaz takođe obezbeđuje postupke za skrining antitela za aktivnost u lečenju ili prevenciji bolesti koja obuhvata Levijeva tela u mozgu pacijenta. Takvi postupci zahtevaju dovođenje u kontakt antitela sa polipeptidom koji se sastoji iz najmanje pet susednih aminokiselina alfa-SN. Zatim se određuje da li se antitelo specifično vezuje za polipeptid, pri čemu specifično vezivanje obezbeđuje indikaciju da antitelo ima aktivnost u lečenju bolesti. Prikaz dalje obezbeđuje postupke za sprovođenje profilakse ili lečenja bolesti koja se karakteiše sa Levijevim telima ili nakupinama alfa-sinukleina u mozgu. Postupak obuhvata davanje polipeptida koji sadrži imunogeni fragment alfa-sinukleina, pacijentu koji ima ili se nalazi u riziku od razvijanja bolesti koji je efikasan dovoljno sa indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1, čime se sprovodi profilaksa ili lečenje bolesti.

[0025] Opciono, imunogeni fragment alfa-sinukleina je oslobođen od ostataka 1-69 u alfa-sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni odgovor sadrži antitela koja se specifično vezuju za humani alfa sinuklein unutar epitopa koj se bira iz grupe koja se sastoji iz SN83-101, SN107-125, SN110-128 i SN124-140, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni odovor je oslobođen od antitela koja se specifično vezuju za ostatke u humanom alfa sinukleinu koji se nalaze izvan odabranog epitopa. Opciono, imunogeni fragment ima od 5-20 susednih aminokiselina između položaja 70-140 u alfa sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni fragment ima od 5-20 susednih aminokiselina od između položaja 120-140 u alfa sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni fragment sadrži segment humanog alfa sinukleina koji se bira iz grupe koja se sastoji iz SN87-97, SN111-121, SN114-124 i SN128-136, i koja sadrži ne više od 40 susednih ostataka u ukupnom alfa sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni fragment sadrži SN125-140 i sadrži ne više od 40 susednih ostataka u ukupnom alfa sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni fragment sadrži SN130-140 i sadrži ne više od 40 susednih ostataka u ukupnom alfa sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni fragment sadrži SN83-140, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

[0026] Opciono, imunogeni fragment se bira iz grupe koja se sastoji iz SN124-140, SN125-140, SN126-140, SN127-140, SN128-140, SN 129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140, SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN 129-139, SN130-139, SN131-139, SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138, SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN 129-138, SN130-138, SN131-138, SN132-138, SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137, SN128-137, SN 129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137, SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN 129-136, SN130-136, SN131-136, SN132-136, SN133-136, i SN134-136, pri čemu su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

[0027] Opciono, imunogeni odgovor sadrži antitela koja se specifično vezuju za humani alfa-sinuklein unutar epitopa koji se bira iz grupe koja se sastoji iz SN1-20, SN2-21, SN2-23 i SN1-40, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni odgovor je oslobođen od antitela koja se specifično vezuju za ostatke humanog alfa-sinukleina unutar regiona SN25-69, SN25-140, SN40-69, SN40-140, ili SN70-140. Opciono, imunogeni fragment ima od 5-20 susednih aminokiselina između položaja 1-40 alfa-sinukleina, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni fragment ima oko 5-20 susednih aminokiselina između položaja 1 i 20 i od 5-20 susednih aminokiselina između položaja 120 i 140 alfa-sinukleina, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni fragment sadrži ne više od 40 susednih ostataka u ukupnom alfa-sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

[0028] Opciono, imunogeni odgovor sadrži antitela koja se specifično vezuju za humani alfa-sinuklein unutar epitopa sa ostacima 1-20 humanog alfa-sinukleina i unutar epitopa sa ostacima 70-140 humanog alfa-sinukleina. Opciono, imunogeni odgovor sadrži antitela koja se specifično vezuju za humani alfa-sinuklein unutar epitopa unutar ostataka 1-20 humanog alfa-sinukleina i unutar epitopa sa ostacima 120-140 humanog alfa-sinukleina. Opciono, imunogeni odgovor ne sadrži antitela koja se specifično vezuju za humani alfa-sinuklein unutar epitopa sa ostacima 41 i 119 humanog alfasinukleina.

[0029] Opciono, imunogeni fragment je povezan sa nosačem da bi se obrazovao konjugat. Opciono, polipeptid sadrži imunogeni fragment koji je spojen sa nosačem. Opciono, imunogeni fragment je povezan sa molekulom nosača na C-kraju fragmenta alfa-sinukleina. Opciono, višestruke kopije fragmenta su međusobno povezane sa višestrukim kopijama nosača. Opciono, imunogeni fragment se daje sa adjuvansom. Opciono, korak davanja utiče najmanje delom na uklanjanje Levijevih tela. Opciono, korak davanja razdvaja Levijeva tela u delove. Opciono, korak davanja smanjuje nivoe oligomera alfa sinukleina u sinapsama. Opciono, korak davanja uklanja sinuklein preko aktivacije lizozomskog puta.

[0030] Opciono imunogeni odgovor se indukuje davanjem jednog polipeptida ili kombinovanog proteina. Opciono imunogeni odgovor se indukuje davanjem više od jednog polipeptida (npr., dva polipeptida). Opciono imunogeni odgovor se indukuje davanjem prvog polipeptida koji sadrži prvi imunogeni fragment alfa-sinukleina koji je efikasan da indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop koji se nalazi unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu, i davanjem polipeptida koji sadrži drugi imunogeni fragment alfa-sinukleina koji je efikasan da indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 70-140, i poželjno ostataka 120-140, u humanom alfa-sinukleinu.

[0031] Opciono, imunogeni odgovor se indukuje kombinovanim davanjem dva ili više polipeptida. Opcino dva ili više polipeptida se istovremeno daju i/ili istovremeno formulišu.

[0032] Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja se sastoji iz prvog polipeptida koji sadrži prvi imunogeni fragment alfa-sinukleina i drugog polipeptida koji sadrži drugi imunogeni fragment alfasinukleina, gde je prvi imunogeni fragment efikasan da indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu i drugi imunogeni fragment alfa-sinukleina je efikasan da indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 120-140 u humanom alfa-sinukleinu. Opciono kompozicija je slobodna od imunogenog fragmenta alfa-sinukleina koji sadrži ostatke 25-69 alfa-sinukleina. Prvi i drugi imunogeni fragmenti mogu fizički da budu povezani (npr., kao konjugat ili kombinovani protein). Prvi i drugi imunogeni fragmenti mogu da budu istovremeno formulisani.

[0033] Takođe su opisani postupci profilaktičkog delovanja ili lečenja bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupinama alfa-sinukleina u mozgu. U jednom izvođenju postupci obuhvataju davanje efikasnog režima antitela pacijentu koji ima ili se nalazi u riziku od dobijanja bolesti koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. U drugom izvođenju postupci obuhvataju davanje pacijentu koji ima ili se nalazi u riziku dobijanja bolesti efikasnog režima antitela koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-40 u humanom alfa-sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. U još drugom izvođenju postupci obuhvataju davanje pacijentu koji ima ili se nalazi u riziku od dobijanja bolesti efikasnog režima prvog anitela koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-4 u humanom alfa-sinukleinu i drugog antitela koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

[0034] Kada se antitelo specifično veže za epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu, gde su ostaci koji su numerisani prema SEQ ID NO:1, opciono, antitelo se specifično veže za epitop unutar ostataka 83-140 u humanom alfa sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, antitelo se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 120-140 u humanom alfa sinukleinu. Opciono, antitelo se specifično vezuje za epitop koji se nalazi unutar segmenta u humanom alfa sinukleinu koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz SN83-101, SN107-125, SN110-128 i SN124-140, gdr su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

[0035] Kada se antitelo specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-40 u humanom alfa-sinukleinu, gde su ostaci koji su numerisani prema SEQ ID NO:1, opciono antitelo se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-20, ili unutar ostataka 1-10, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

[0036] Kada prvo antitelo koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-40 u humanom alfasinukleinu i drugo antitelo koje se specifčno vezuje epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfasinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1, opciono drugo antitelo koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 120-140 u humanom alfa-sinukleinu. Opciono prvo antitelo i drugo antitelo se daju istovremeno. Opciono prvo antitelo i drugo antitelo se primenjuju u istoj kuri lečenja.

[0037] Opciono, antitelo je monoklonsko antitelo. Opciono, antitelo je populacija poliklonskih antitela kojima nedostaje specifično vezivanje za ostatke alfa sinukleina izvan epitopa. Opciono, antitelo je humanizovano antitelo. Opciono, antitelo je humano antitelo. Opciono, antitelo je antitelo humani IgG1 izotipa. Opciono, antitelo se daje sa farmaceutskim nosačem kao farmaceutska kompozicija. Opciono, antitelo se daje u dozi 0,0001 do 100 mg/kg, poželjno, najmanje 1 mg antitela/kg telesne težine. Opciono, antitelo se daje u višestrukim dozama tokom poslednjih šest meseci. Opciono, antitelo se daje kao kompozicija sa produženim oslobađanjem. Opciono, antitelo se daje intraperitonealno, oralno, subkutano, intrakranijalno, intramuskularno, topikalno, intranazalno ili intravenozno. Opciono, antitelo se internalizuje unutar ćelija neurona koje imaju Levijeva tela pri čemu dolazi do razlaganja Levijevih tela. Opciono, antitelo se vezuje za spoljašnju površinu nervnih ćelija koje imaju Levijeva tela pri čemu dolazi dolazi do razlaganja Levijevih tela. Opciono, antitelo se vezuje za alfa sinuklein na spoljnoj površini neuronskih ćelija pri čemu se promoviše unakrsno povezivanje alfa sinukleina. U kojima korak davanja razdvaja Levijeva tela. Opciono, korak davanja smanjuje nivoe oligomera humanog alfa sinukleina u sinapsama. Opciono, korak davanja uklanja humani alfa sinuklein aktivacijom lizozomalnog puta. U nekim postupcima, bolest je Parkinsonova bolest. Opciono, antitelo se specifično vezuje za denaturisani humani alfasinuklein kao što se određuje imunoblotom. Opciono, antitelo se specifično vezuje za denaturisani humani alfa-sinuklein sa afinitetom najmanje 10<9>M<-1>. Opciono, antitelo se specifično vezuje za sinapse što se određuje imunocitohemijski.

[0038] Prikaz takođe obezbeđuje kompoziciju za profilaksu ili lečenje bolesti koja se karakteriše prisustvom Levijevih tela ili nakupina alfa-sinukleina u mozgu, koja se sastoji iz prvog monoklonskog antitela koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu i drugog monoklonskog antitela koje se specifično vezuje za epitop koji se nalazi unutar ostatka 70-140 (i poželjno ostataka 120-140) u humanom alfa-sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

1

[0039] Prikaz takođe obezbeđuje kit za profilaksu ili lečenje bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupinama alfa-sinukleina u mozgu, koji obuhvata prvi kontejner koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu i drugi kontejner koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za epitop unutar ostataka 70-140 (i poželjno ostataka 120-140) u humanom alfa-sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

[0040] Prikaz dalje obezbeđuje postupke sprovođenja profilakse ili lečenja bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupinama alfa-sinukleina u mozgu. Postupci davanja efikasnog režima sredstva pacijentu koji ima ili se nalazi u riziku dobijanja bolesti koje indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1., pri čemu se sprovodi profilaksa ili lečenje bolesti. Opciono, imunogeni odgovor je slobodan od antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-69 u humanom alfa sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. Opciono, imunogeni odgovor sadrži antitela koja se specifično vezuju unutar segmenta humanog alfa sinukleina koji su odabrani iz grupe koja se sastoji iz SN83-101, SN107-125, SN110-128 i SN124-140, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

[0041] Prikaz dalje obezbeđuje postupke za skrining sredstva koje ima aktivnost koja je korisna u lečenju bolesti koja se karakteriše Levijevim telima. Potupci obuhvataju dovođenje u kontakt sredstva sa transgenom nehumanom životinjom kojim se raspolaže da bi se sa sredstvom razvila karakteristika bolesti koje sadrže Levijeva tela; i određivanja da li sredstvo utiče na obim ili brzinu razvijanja karakteristika u odnosu na kontrolnu transgenu nehumanu životinju. Sredstvo je (i) fragment alfa sinukleina koji indukuje antitela koja se specifično vezuju za najmanje jedan epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa sinukleinu ili (ii) antitelo koje se specifično vezuje za epitop sa ostacima 70-140 u humanom alfa sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1.

[0042] Opciono, transgena nehumana životinja sadrži transgen koji eksprimira humani alfa-sinuklein. Opciono, postupak dalje sadrži skrining mnoštva testiranih antitela za vezivanje za denaturisani humani alfa sinuklein, i odabiranjem antitela sa najvećim svojstvom vezivanja kao sredstva. Opciono, postupak dalje sadrži imunocitohemijski skrining mnoštva testiranih antitela za vezivanje sa depozitima sinukleina u preseku tkiva, i odabiranjem antitela kao sredstva sa najvećim svojstvom vezivanja.

[0043] Prikaz dalje obezbeđuje postupak humanizovanja monoklonkih antitela 8A5 ili 6H7, koji sadrži: određivanje sekvence aminokiselina u CDR regionu monoklonskog antitela; odabir akceptorskog antitela; i proizvodnju humanizovanog antitela koje sadrži CDR-e iz monoklonskog antitela i okvire čitanja varijabilnog regiona iz akceptorskog antitela.

[0044] Prikaz dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju himernog oblika monoklonskog antitela 8A5 ili 6H7 koji obuhvata: određivanje sekvence aminokiseline lakog i teškog lanca varijabilnih regiona monoklonkog antitela; odabir konstantnog regiona teškog i lakog lanca; proizvodnju himernog antitela koji sadrži laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji se kombinuje sa konstantnim regionom lakog lanca, i teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji se kombinuje sa konstantnim regionom teškog lanca.

KRATAK OPIS SLIKA

[0045]

SL.1 pokazuje sekvencu aminokiselina alfa-SN (SEQ ID: 1) redom u poravnanju sa dve sekvence NAC aminokiselina, SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3.

SL. 2 pokazuje bojene imunohisto preseke mozga iz netransgenih miševa (paneli A, E, i I), alfa-SN transgeni miševi imunizovani samo sa adjuvansom (paneli B, F, J), i alfa-SN transgeni miševi imunizovani sa alfa-SN koji razvijaju niske titre (paneli C, G, i K) i visoke titre (paneli D, H, i I) antitela koja su specifična prema alfa-SN. Preseci su izloženi bojenju sa anti-alfa-sinukleinskim antitelom da bi se detektovali nivoi sinukleina (paneli A-D), anti-IgG antitelom da bi se odredili ukupni nivoi IgG koji su prisutni u presecima (paneli E-H), i za glijalni fibrilni kiseli protein (GFAP), marker astroglijalnih ćelija.

SL.3 pokazuje efekte anti-mSYN poliklonkog antitela na nakupljanje sinukleina u transfektovanim GT1-7 ćelijama kao što se vidi svetlosnom mikroskopijom.

SL.4 je prikaz Western blota za nivoe sinukleina u citoplazmi (C) i membranama (P) GT1-7 α-sin ćelija koje su tretirane sa preimunskim serumom i sa 67-10 antitelom na koncentraciji (1:50) 48 sati pre analize.

SL. 5 pokazuje rezultate ispitivanja efekta Aβ1-42 imunizacije amiloidnih depozita u mozgovima netransgenih, SYN, APP i SYN/APP transgenih miševa. Detektabilni amiloidni nivoi koji se mogu videti u APP i SIN/APP miševima su smanjeni pomoću imunizacije Aβ1-42.

SL.6 pokazuje rezultate ispitivanja efekta Aβ1-42 imunizacije nakon obrazovanja inkluzije sinukleina u mozgovima netransgenih, SIN, APP i SIN/APP transgenih miševa. Inkluzije Sinukleina koje se detektuju u SIN i SIN/APP miševima su smanjene pomoću Aβ1-42 imunizacije.

SL.7 pokazuje direktne i indirektne mehanizme pomoću kojih antitela blokiraju nakupljanje alfa-SN.

SL. 8 pokazuje mapiranje epitopa antitela. Antitela iz miševa koja ispoljavaju visoke titre i visoko afinitetna anti-humana α-sinukleinska antitela se mapiraju upotrebom ELISA postupka. Kod većine anti-serumskih uzoraka iz vakcinisanih miševa, prepoznati epitopi se nalaze u okviru C-terminalnog regiona humanog α-sinukleina. U serumu iz CFA tretiranih kontrola, epitopi nisu uočeni.

SL. 9 pokazuje analizu slike u nivou imunoreaktivnosti humanog α-sinukleina i drugih markera neurodegeneracije. (A) Srednji broj hα-sinuklein pozitivnih inkluzija u temporalnom korteksu. Vakcinacija sa humanim α-sinukleinom dovodi do značajnog smanjenja u broju inkluzija u poređenju sa kontrolama. Ovaj efekat je bio izraženiji kod miševa iz grupe II u poređenju sa grupom I. (B) Procenat površine okupirane neutrofilima pomoću sinaptofizin-imunoreaktivnih krajeva u frontalnom korteksu. U transgenim (tg) miševima koji su tretirani samo sa CFA, broj krajeva koji su imuno-obeleženi sinaptofizinom se smanjuje za 20%, pri čemu je nivo imunoreaktivnosti sinaptofizina po sinapsi nepromenjen. (C) Nivoi imunorekativnosti CD45 (mikroglijalnog markera) u temporalnom kortekstu su značajno veći u mozgovima miševa koji su vaksinisani sa humanim α-sinukleinom. (D) Procenat površine okupirane neutrofilima pomoću humanih α-sinukleinkih imunoreaktivnih krajeva u temporalnom kortekstu. U tg miševima koji su vakcinisani sa humanim α-sinukleinom, postoji smanjenje u nakupljanju α-sinukleina u sinaptofizin-imunoreaktivnim krajevima. * = značajna razlika u poređenju sa humanim α-sinukleinskim tg miševima koji su tretirani samo sa CFA (p<0,05, Studentov T test).

SL. 10 pokazuje Western blot analizu nivoa imunoreaktivnosti humanog α-sinukleina i sinaptofizina kod vakcinisanih životinja. U poređenju sa miševima tg miševa koji su tretirani samo sa CFA (linije 1-3), kod hα-sinuklein vakcinisanih tg miševa (linije 4-6), nivoi oba oligomera humanog α-sinukleina i monomera su smanjeni (gornji panel), gde su nivoi imunoreaktivnosti sinaptofizina povećani u kasnijoj grupi (donji panel).

SL. 11 pokazuje analizu intraneuralnih nakupina α-sinukleina posle intracerebralne injekcije anti-αsinukleinskih antitela. C-terminalno antitelo 8A5 i N-terminalno antitelo 6H7 je imao efekat uklanjanja. IgG1, IgG2a, i IgG2b su izotipke kontrole. Horizontalni stubovi predstavljaju srednju vrednost.

SL. 12 pokazuje preseke kontralateralne strane (levi panel; kružne braon tačke unutar preseka su nakupine α-sinukleina) i ipsilateralne strane (desni panel) mišje kome je injecirano monoklonsko antitelo 8A5. Imunobojenje se izvodi sa poliklonskim antitelom koje je specifično za α-sinuklein. Intraneuronalne nakupine α-sinukleina na kontralateralnoj strani su zaokružene.

DEFINICIJE

[0046] Termin "u suštini identičan" označava da dve peptidne sekvence, kada se optimalno porevnaju, kao što je upotrebom programa GAP ili BESTFIT korišćenjem podešenih „gap weights“, dele najmanje 65 procenta identičnosti u sekvenci, poželjno najmanje 80 ili 90 procenta identičnosti u sekvenci, poželjnije najmanje 95 procenta identičnosti u sekvenci ili više (npr., 99 procenta identičnosti u sekvenci ili više). Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični se razlikuju konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.

[0047] Za poređenje sekvenci, obično jedna sekvenca deluje kao referentna sekvenca, sa kojom se upoređuju sekvence koje se ispituju. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, sekvence koje se ispituju i referentne sekvence se unose u kompjuter, naznačene su koordinate podsekvenci, ukoliko je potrebno, i parametri algoritma programa sekvenci su naznačeni. Algoritam poređenja sekvenci zatim računa procenat identičnosti sekvence za sekvencu(e) koja se ispituje u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu naznačenih parametara programa.

[0048] Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može da se izvede, npr., algoritmom lokalne homologije od strane Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmom poravnanja homologije od strane Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), postupkom pretraživanja sličnosti pomoću Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili vizuelnim pregledom (videti genealrno Ausubel et al., supra). Jedan primer algoritma koji je pogodan za određivanje procenta

1

identičnosti sekvence i sličnosti sekvence je BLAST algoritam, koji je opisan u Altschul et al., J. Mol. Biol.

215:403-410 (1990). Softver za izvođenje BLAST analiza je javno dostupan na internet sajtu Nacionalnog centra za Biotehnološku informaciju (NCBI). Obično, podrazumevani parametri programa mogu da se koriste za izvođenje poređenja sekvenci, iako takođe prilagođeni parametri mogu da se koriste. Za sekvence aminokiselina, BLASTP program koristi podrazumevane parametre dužinu reči (W) od 3, očekivanje (E) od 10, i BLOSUM62 matricu bodovanja (videti Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)).

[0049] Za svrhe klasifikovanja supstitucija aminokiselina kao konzervativnih ili ne-konzervativnih, aminokiseline su grupisane prema sledećim: Grupa I (hidrofobni bočni lanci): norleucin, met, ala, val, leu, ile; Grupa II (neutralni hidrofilni bočni lanci): cys, ser, thr; Grupa III (kiseli bočni lanci): asp, glu; Grupa IV (bazni bočni lanci): asn, gln, his, lys, arg; Grupa V (ostaci koji utiču na orijentaciju lanca): gly, pro; i Grupa VI (aromatični bočni lanci): trp, tyr, phe. Konzervativne supstitucije uključuju supstitucije između aminokiselina u istoj klasi. Ne-konzervativne supstitucije predstavljaju zamenu člana jedne od ovih klasa za član druge.

[0050] Terapeutska sredstva i pronalaska su obično u suštini čista od neželjenih kontaminanata. To znači da je sredstvo obično najmanje oko 50% mas/mas čistoće, kao i da je u suštini oslobođena interferirajućih proteina i kontaminanata. Nekada su sredstva najmanje oko 80% mas/mas i, poželjnije najmanje 90 ili oko 95% mas/mas čistoće. Međutim, upotrebom konvencionalnih postupaka za prečišćavanje proteina, mogu da se dobiju homogeni peptidi od najmanje 99% mas/mas.

[0051] Fraza da se molekul "specifično vezuje" za ciljni molekul se odnosi na reakciju vezivanja koja je odlučujuća za prisustvo molekula u prisustvu heterogene populacije drugih bioloških molekula. Prema tome, pod naznačenim uslovima imunotesta, specifični molekul se preferencijalno vezuje za određenu metu i ne vezuje se u značajnoj količini za druge biološke molekule koji se nalaze u uzorku. Specifično vezivanje antitela za metu pod takvim uslovima zahteva da antitelo bude odabrano zbog njegove specifičnosti prema meti. Različiti formati imunotesta mogu da se koriste za selekciju antitela koji su specifično imunoreaktivni sa određenim proteinom. Na primer, ELISA imunotestovi na čvrstoj fazi se rutinski koriste za selekciju monoklonskih antitela koji su specifično imunoreaktivni sa proteinom. Videti, npr., Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, za opis formata imunotesta i uslova koji mogu da se koriste kako bi se odredila specifična imunoreaktivnost. Specifično vezivanje između dva entiteta označava afinitet od najmanje 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>M<-1>, ili 10<10>M<-1>. Poželjni su afiniteti koji su veći od 10<8>M<-1>.

[0052] Termin "antitelo" ili "imunoglobulin" se koristi da uključi intaktna antitela i njihove vezujuće fragmente. Obično, fragmenti se nalaze u kompeticiji sa intaktnim antitelom iz kojeg se dobijaju za specifično vezivanje sa antigenom. Fragmenti uključuju razdvojene teške lance, lake lance, Fab, Fab’ F(ab’)2, Fabc, i Fv. Fragmenti se proizvode postupcima rekombinovane DNK, ili enzimskim ili hemijskim razdvajanjem intaktnih imunoglobulina. Termin "antitelo" takođe uključuje jedan ili više imunoglobulinskih lanaca koji u hemijski konjugovani sa, ili eksprimirani kao, kombinovani proteini sa drugim proteinima. Termin "antitelo" takođe uključuje bispecifično antitelo. Bispecifično ili bifunkcionlano antitelo je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teškog/lakog lanca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela mogu da se proizvedu pomoću različitih postupaka uključujući kombinovane hibridome ili povezivanje Fab’ fragmenata. Videti, npr., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol.79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol.148, 1547-1553 (1992).

Termin "antitelo" takođe uključuje jedno-lančana antitela u kojima su varijabilni domeni teškog i lakog lanca spojeni pomoću grupe za povezivanje.

[0053] APP<695>, APP<751>, i APP<770>se redom, odnosi na 695, 751, i 770 duge aminokiselinske ostatke polipeptida koji su kodirani od strane humanog APP gena. Videti Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525 (1988); and Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). Aminokiselinama unutar humanog amiloidnog prekursornog proteina (APP) su dodeljeni brojevi prema sekvenci izoforme APP770. Termini kao što su Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 i Aβ43 se odnose na Aβ peptid koji sadrži ostatke aminokiselina 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 i 1-43.

[0054] "Antigen" je entitet za koji se antitelo specifično vezuje.

[0055] Termin "epitop" ili "antigena determinanta" se odnosi na mesto na antigenu na kome odgovaraju B i/ili T ćelije. B-ćelijski epitopi mogu da se obrazuju i iz susednih aminokiselina ili nesusednih aminokiselina koje su suprostavljene tercijernim savijanjem proteina. Epitopi koji se obrazuju iz susednih aminokiselina se tipično zadržavaju nakon izlaganja denaturišućim rastvaračima pri čemu epitopi koji se obrazuju tercijarnim savijanjem se obično izgube nakon tretmana sa denaturišućim rastvaračima. Epitop obično uključuje najmanje 3, i običnije, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci za određivanje prostorne konformacije epitopa uključuju, na primer, kristalografiju x-zraka i 2-dimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonanciju. Videti, npr., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Antitela koja prepoznaju isti epitop mogu da se identifikuju u jednostavnom imunotestu koji pokazuje sposobnot jednog antitela da blokira vezivanje drugog antitela za ciljni antigen. T-ćelije prepoznaju susedne epitope oko devet aminokiselina za CD8 ćelije ili oko 13-15 aminokiselina za CD4 ćelije. T ćelije koje prepoznaju epitop mogu da se identifikuju in vitro testovima kojima se meri proliferacija koja zavisi od antigena, kao što je određeno inkorporacijom<3>H-timidina od strane prajmovanih T ćelija u odgovoru na epitop (Burke et al., J. Inf. Dis.170, 1110-19 (1994)), pomoću antigen-zavisnog ubijanja (cytotoxic T lymphocyte assay, Tigges et al., J. Immunol.156, 3901-3910) ili sekrecijom citokina.

[0056] Termin "imunološki" ili "imunski" odgovor je razvijanje korisnog humoralnog (poredovanog antitelima) i/ili ćelijskog (posredovanog antigen-specifičnim T ćelijama ili njihovim proizvodima sekrecije) odgovora koji je usmeren prema amiloidnom peptidu kod recipijenta pacijenta. Takav odgovor može da bude aktivan odgovor koji se indukuje davanjem imunogena ili pasivni odgovor koji se indukuje davanjem antitela ili prajmovanih T-ćelija. Ćelijski imunski odgovor se pokreće prezentovanjem epitopa polipeptida zajedno sa klasom I ili klasom II molekula MHC kako bi se aktivirale antigen-specifične CD4+ T pomoćničke ćelije i/ili CD8+ citotoksične T ćelije. Odgovor može takođe da uključi aktivaciju monocita, makrofaga, NK ćelija, bazofila, dendritičnih ćelija, astrocita, ćelija mikroglije, eozinofile ili druge komponente urođenog imuniteta. Prisustvo ćelijski posredovanog imunskog odgovora može da se odredi pomoću testova kojim se ispituje proliferacija (CD4+ T ćelije) ili CTL (citotoksični T limfocit) (videti Burke, supra; Tigges, supra). Relativni doprinosi humoralnih i ćelijskih odgovora prema zaštitnom ili terapeutskom efektu imunogena mogu da se izdvoje posebnim izolovanjem antitela i T-ćelija iz imunizovane singene životinje i merenjem zaštitnog ili terapeutskog efekta kod drugog subjekta.

1

[0057] "Imunogeno sredstvo" ili "imunogen" je spooban da indukuje imunološki odogovor prema samom sebi nakon davanja sisaru, opciono zajedno sa adjuvansom.

[0058] Termin "Sve-D" se odnosi na peptide koji imaju ≥ 75%, ≥ 80%, ≥ 85%, ≥ 90%, ≥ 95%, i 100% D-konfiguraciju aminokiselina.

[0059] Termin "goli polinukleotid" se odnosi na polinukleotid koji se ne nalazi u kompleksu sa koloidnim materijalima. Goli polinukleoitidi se nekada kloniraju u plazmidnom vektoru.

[0060] Izraz "adjuvans" se odnosi na jedinjenje koje kada se daje zajedno sa antigenom pojačava imunski odgovor prema antigenu, ali kada se daje samostalno ne generiše imunski odgovor prema antigenu. Adjuvansi mogu da povećaju imunski odgovor pomoću nekoliko mehanizama uključujući regrutovanje limfocita, stimulaciju B i/ili T ćelija, i stimulaciju makrofaga.

[0061] Termin "pacijent" uključuje humane i druge sisarske subjekte koji dobijaju ili profilaktički ili terapeutski tretman.

[0062] Kompeticija između antitela se određuje pomoću testa u kome imunoglobulin pod testom inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za poznati antigen, kao što je alfa-SN. Poznati su brojni testovi za kompetitivno vezivanje, na primer: direktni ili indirektni radioimunotest na čvrstoj fazi (RIA), direktni ili indirektni enzimski imunotest na čvrstoj fazi (EIA), sendvič test kompeticije (videti Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); direktna biotin-avidin EIA na čvrstoj fazi (videti Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); direktno obeleženi test na čvrstoj fazi, direktno obeleženi sendvič test na čvrstoj fazi (videti Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); direktno obeležena RIA na čvrstoj fazi upotrebom 1-125 obeleživača (videti Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); direktna biotin-avidin EIA na čvrstoj fazi (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); i direktno obeležena RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol.32:77-82 (1990)). Obično, takav test uključuje upotrebu prečišćenog antigena koji je vezan za čvrstu površinu ili za ćelije koje nose bilo koje od ovih, neobleženi imunoglobulin koji se koji se koristi za ispitivanje i obeleženi referentni imunoglobulin. Kompetitivna inhibicija se meri određivanjem količine vezanog obeleživača na čvrstoj površini ili ćeliji u prisustvu imunoglobulina koji se ispituje. Obično se imunoglobulin koji se ispituje nalazi u višku. Antitela koja se identifikuju kompetitivni testom (antitelima koji se nalaze u u kompeticiji) uključuju antitela koja se vezuju za isti epitop kao referentno antitelo i antitela koja se vezuju za susedni epitop koji je dovoljno blizu epitopa za koje je vezano referentno antitelo kako bi se pojavila prostorna prepreka. Obično, kada antitelo koje se nalazi u kompeticiji u višku, ono će inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen za najmanje 50% ili 75%.

[0063] Termin "simptom" ili "klinički simptom" se odnosi na subjektivni dokaz bolesti, kao što je izmenjeni hod, onako kako vidi pacijent. "znak" se odnosi na objektivni dokaz bolesti kako je uočeno od strane lekara.

[0064] Fraza "u kombinaciji," kada se odnosi na davanje dva ili više anti-humana alfa-sinukleinska antitela (tj., svaki koji prepoznaje različiti epitop) ili davanje dva ili više polipeptida ili imunogena koji indukuju odgovor antitela prema humanom alfa-sinukleinu, uključuje istovremeno davanje i davanje u

1

istoj kuri lečenja. Davanje sredstava u istoj kuri lečenja obuvata davanje sredstava kao kombinovanog proteina ili konjugata (npr., fizički povezanih jedan sa drugim), ko-formulacija (npr., u kojoj su sredstva kombinovana ili složena u doznom obliku, npr., sa produženim oslobađanjem ili depot formulacijom), davanjem razdvojenih kompozicija unutar nekoliko minuta ili dva sata jedan od drugog (istovremeno davanje), ili davanje u razdvojenim kompozicijama u istom danu. Davanje tokom istog trajanja tretmana označava da se oba sredstva daju pacijentu za lečenje ili profilaksu istog stanja. Svako sredstvo može da se daje jednom ili više puta. Na primer, jedno sredstvo može da se daje prvo i drugo sredstvo može da se daje sledećeg dana ili sledeće nedelje. Slično, mogu svaki da se daju više od jednom, npr., tokom sledećih dana, naizmeničnim danima, naimeničnim nedeljama, ili u skladu sa drugim rasporedima (na primer, tako da je korist za pacijenta očekivana da se premaši kada se svako sredstvo daje zasebno).

[0065] Fragment koji je naznačen u obliku SNx-y označava fragment alfa sinukleina koji počinje na amiokiselini X i završava se na aminokiselini Y. Takav fragment može da bude povean sa heterolognim polipeptidom ali ne sa drugim aminokiselinama u humanom alfa sinukleinu tako da fragment počinje pre X ili se završava posle Y.

[0066] Ostaci u alfa-sinukleinu ili njegovom fragmentu su numerisani prema SEQ ID NO:1 kada je alfasinuklein ili fragment u maksimalnom poravnanju sa SEQ ID NO:1 kao što se gore opisuje upotrebom zadatih parametara.

[0067] Kompozicije postupka "koje sadrže" jedan ili više od navedenih elemenata mogu da uključe druge elementa koji nisu specifično navedeni. Na primer, kompozicija koja sadrži alfa-SN peptid obuhvata i izolovani alfa-SN peptid i alfa-SN peptid kao komponentu veće polipeptidne sekvence.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

I. Opšte

[0068] Pronalazak obezbeđuje antitela za upotrebu u postupcima prevencije ili lečenja nekoliko bolesti i stanja koja se karakterišu prisustvom depozita alfa-SN peptida koji je nakupljen u nerastvorljivoj masi u mozgu pacijenta, u obliku Levijevih tela. Takve bolesti se kolektivno nazivaju bolestima Levijevih tela (LBD) i uključuju Parkinsonovu bolest (PD). Takve bolesti se karakterišu nakupinama alf-SN koji ima strukturu β-nabranih ploča i boji se sa tioflavin-S i Kongo-crvenim (videti Hasimoto, Ibid). Postupci prevencije ili lečenja takvih bolesti koriste sredstvo kojim može da se dobije imunogeni odgovor koji je specifičan prema alfa-SN. Imunogeni odgovor deluje da spreči obrazovanje, ili čišćenje, sinukleinskih depozita unutar ćelija u mozgu. Pored toga što razumevanje mehanizma nije ključno u praksi pronalaska, imunogeni odgovor može da indukuje čišćenje kao rezultat antitela koja su specifična za sinuklein koja su zasebno internalizovana u ćeliji ili sa alfa sinukleinom. Rezultati koji su predstavljeni u Primerima pokazuju da se antitela koja su specifična prema alfa sinukleinu daju periferno prolaze kroz krvno-moždanu barijeru, i internalizuju se, ili zasebno ili sa alfa sinukleinom, unutar ćelija koje sadrže depozite alfa sinukleina. Internalizovana antitela mogu da promovišu degradiranje alfa sinukleina preko aktiviranja lizozomalnih puteva. Internalizovana antitela sa afinitetom prema alfa sinukleinu u denaturisanom obliku mogu takođe da stabilizuju molekul u obliku koji nije nakupljen.

1

Alternativno ili dodatno, antitela mogu da interferiraju sa nakupljanjem sinukleina na spoljašnjoj površini ćelija. Na primer, antitela koja u specifična prema alfa-sinukleinu mogu da prepoznaju i unakrsno povežu proteine sa abnormalnom konformacijom na površini ćelija neurona. U nekim postupcima, odgovor uklanjanja se može barem delimično postići fagocitozom koja je posredovana preko Fc receptora. Imunizacija sa sinukleinom može da redukuje nakupljanje sinukleina na sinapsama i u telima ćelija neurona u mozgu. Pored toga što razumevanje meanizama nije sušinski važno za praksu pronalaska, ovaj rezultat može da se objasni pomoću antitela koja su specifična za sinuklein koja su preuzeta od strane neuronskih ćelija (npr. pomoću sinaptičkih vezikula).

[0069] Opciono, sredstva kojima se generiše imunski odgovor prema alfa-SN može da se koristi u kombinaciji sa sredstvima kojima se generiše imunogeni odgovor prema Aβ. Imunogeni odgovor je koristan u uklanjanju depozita Aβ kod individua koje imaju takve depozite (npr., individua koji imaju i Alzhajmerovu i Parkinsonovu bolest); međutim, imunogeni odgovor takođe ima aktivnost u uklanjanju sinukleinskih depozita. Prema tome, predmetni pronalazak koristi takva sredstva zasebno, ili kombinovano sa sredstvima kojima se generiše imunogeni odgovor prema alfa-SN kod individua sa LBD ali koje nemaju ili se ne nalaze u riziku od razvijanja Alzhajmerove bolesti.

[0070] Prikaz dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije i postupke za prevenciju i lečenje amiloidogene bolesti. Pokazano je da su alfa- i beta sinuklein uključeni u nukleaciju amiloidnih depozita kod određenih amiloidogenih bolesti, posebno Alzhajmerove bolesti. (Clayton, D.F., et al., TINS 21(6): 249-255, 1998). Određenije, fragment NAC domena alfa- i beta-sinukleina (ostaci 61-95) je izolovan iz amiloidnih plakova kod pacijenata koji imaju Alchajmerovu bolest; u suštini ovaj fragment sadrži oko 10% plaka koji ostaje u nerastvorljivom obliku posle solubilizacije sa natrijum dodecil sulfatom (SDS). (George, J.M., et al. Neurosci. News 1: 12-17, 1995). Dalje, prijavljeno je da oba alfa-SN pune dužine i njegov NAC fragment ubrzavaju in vitro nakupljanje β-amiloidpeptida u nerastvorljivi amiloid. (Clayton, supra). NAC komponenta amiloidnih plakova služi kao meta za imunološki-zasnovane tremane iz predmetnog pronalaska, kao što se detaljno navodi u tekstu ispod. Prema jednom aspektu, prikaz uključuje farmaceutske kompozicije koje sadrže sredstva koja su efikasna da pokrenu imunski odgovor prema sinukleinskoj-NAC komponenti amiloidnog plaka kod pacijenta. Takve kompozicije mogu da budu efikane u prevenciji, odlaganju, ili smanjenju nakupljanja plaka kod amiloidne bolesti.

II. SREDSTVA KOJA DOVODE DO IMUNOGENOG ODGOVORA PREMA ALFA SINUKLEINU

[0071] Imunogeni odgovor može da bude aktivan, kada se imunogen daje kako bi se indukovala antitela koja su reaktivna prema alfa-SN kod pacijenta, ili pasivan, kada se antitelo daje kako bi se samo vezalo za alfa-SN kod pacijenta.

1. Sredstva koja indukuju aktivan imunski odgovor

[0072] Terapeutska sredstva indukuju imunogeni odgovor koji je specifično usmeren prema određenim epitopima koji se nalae u alfa-SN peptidu. Poželjna sredstva su samo alfa-SN peptid i njegovi fragmenti. U.S. prijava br.60/471,929 koja je podneta 19 maja, 2003, i PCT objava patenta WO 05/013889 prikazuje nove alfa-sinukleinske fragmente koji mogu da se koriste kao terpeutska sredstva, opciono, kombinovano sa adjuvansom. Takođe mogu da se koriste varijante takvih fragmenata, analoga i sredstva koja imitiraju prirodni alfa-SN peptid koji indukuje i/ili unakrsno reaguje sa

1

antitelima koja su specifična prema poželjnom epitopu alfa-SN peptida. U.S. Prijava br. 60/471,929 koja je podneta 19 maja, 2003, i PCT objava patenta WO 05/013889 obezbeđuje nove alfa-sinukleinske fragmente koji su korisni u postupcima za prevenciju i lečenje sinukleinopatske i amiloidogene bolesti. Opciono, ovi fragmenti mogu da se koriste kombinovano sa adjuvansom.

[0073] Alfa sinuklein je prvobitno identifikovan u humanim mozgovima kao prekursorski protein neβ-amiloidne komponente (NAC) AD plakova. (Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (23):11282-11286 (1993). Alfa-SN, koji se takođe naziva prekursorom ne-Aβ komponentom AD amiloida (NACP), je peptid od 140 aminokiselina. Alfa-SN ima sekvencu aminokiselina:

(Ueda et al., Ibid.; GenBank accession number: P37840).

[0074] Ne-Aβ komponenta AD amiloida (NAC) se izvodi iz alfa-SN. NAC, visoko hidrofobni domen koji se nalazi unuar alfa sinukleina, je pepid koji se sastoji iz najmanje 28 ostataka aminokiselina (ostaci 60-87) (SEQ ID NO: 3) i opcino 35 ostataka amiokiselina (ostaci 61-95) (SEQ ID NO: 2). Videti Sl. 1. NAC prikazuje sklonost ka obrazovanju strukture beta ploče (Iwai, et al., Biochemistry, 34:10139-10145). Jensen et al. su prijavili da NAC ima sekvencu aminokiselina:

EQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFV (SEQ ID NO: 2)

(Jensen et al., Biochem. J.310 (Pt 1): 91-94 (1995); GenBank pristupni broj S56746).

[0075] Ueda et al. Su prijavili da NAC ima sekvencu aminokiselina:

KEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGS (SEQ ID NO: 3)

(Ueda et al., PNAS USA 90:11282-11286 (1993).

[0076] Razdvojeni alfa-SN ili njegovi fragmenti, uključujući NAC, označava monomerne peptidne jedinice. Razdvojeni alfa-SN ili njegovi fragmenti su generalno rastvorljivi, i sposobni su za samonakupljanje kako bi se obrazovali rastvorljivi oligomeri. Oligomeri alfa-SN i njihovi fragmenti su obično rastvorljivi i pretežno postoje u obliku alfa heliksa. Monomerni alfa-SN može da se in vitro pripremi sonifikacijom rastvaranjem liofilizovanog peptida u čistom DMSO. Dobijeni rastvor se centrifugira da bi se uklonile bilo koje nerastvorljive čestice. Nakupljeni alfa-SN ili njegovi fragmenti, uključujući NAC, označava oligomere alfa-SN ili njegove fragmente koji su se udružili u nerastvorljive nakupine betaploča. Nakupljeni alfa-SN ili njegovi fragmenti, uključujući NAC, takođe označavaju fibrilne polimere. Fibrili su obično nerastvorljivi. Neka antitela vezuju ili rastvorljivi alfa-SN ili njegove fragmente ili nakupljeni alfa-SN ili njegove fragmente. Neka antitela se vezuju za oligomere alfa-sinukleina snažnije nego za monomerne oblike fibrilnih oblika. Neka antitela se vezuju i za rastvorljivi i nakupljeni alfa-SN ili njegove fragmente, i opciono takođe za oligomerne oblike.

[0077] Alfa-SN, glavna komponenta Levijevih tela karakterističnih za PD, i njegovih epitopskih fragmenata, kao što su, na primer, NAC, ili fragmenti koji nisu NAC, mogu da se koriste za indukovanje imunogenog odgovora. Poželjno, takvi fragmenti se sastoje iz četiri ili više aminokiselina alfa-SN ili njegovog analoga. Neki aktivni fragmenti uključuju epitope koji se nalaze na ili blizu C-kraja alfa-SN

1

(npr., unutar aminokiselina 70-140, 100-140, 120-140, 130-140, ili 135-140). U nekim aktivnim fragmentima, C terminalni ostatak epitopa je C - terminalni ostatak alfa-SN. Druge komponente Levijevih tela, na primer, sinfilin-1, Parkin, ubikvitin, neurofilament, beta-kristalin, i njihovi epitopski fragmenti mogu takođe da se koriste za indukovanje imunogenog odgovora.

[0078] Kao što je navedno, određeni poželjni fragmenti alfa sinukleina su iz C-terminalnog molekula. Takvim fragmentima nedostaju ostaci 1-69 iz humanog alfa-sinukleina. Imunizacijom sa takvim fragmentima se dobija imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja su specifična prema jednom ili više epitopa unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu. Imunogeni C-terminalni fragmenti uključuju SN85-99, SN109-123, SN112-126 i SN126-138, kao što je prikazano na Sl.8, i drugi fragmenti koji se razlikuju od jednog od ovih do dve dodatne ili manje aminokiseline na svakom kraju. Drugi poželjni fragment SN83-140, koji uključuje svaki od ovih epitopa. Neki fragmenti alfa sinukleina stvaraju antitela koja se speciifčno vezuju za epitop unutar jednog ili više od: SN83-101, SN107-125, SN110-128 i SN 124-140 humanog alfa sinukleina. Neki fragmenti stvaraju antitela koja se isključivo specifično vezuju unutar jednog od gore navedenih četiri fragmenata. Na primer, fragment SN83-101 počinje na ostatku 83 i završava se na ostacima 101 alfa-sinukleina i dobijaju se antitela koja se specifično vezuju za SN83-101.

[0079] Neki fragmenti nemaju više od 40 susednih ostataka ukupno od alfa sinukleina. Neki od tih fragmenata sadrže SN 125-140, SN130-140, SNS87,97, SN111-121, SN114-124 ili SN128-136. Neki fragmenti imaju ukupno 5-20 susednih aminokiselina ukupno sa C-terminalnom polovinom alfa sinukleina (tj., ostaci 70-140). Neki fragmenti imaju 5-20 susednih aminokiselina od između položaja 120-140 alfa sinukleina. Posebno poželjni fragmenti uključuju SN124-140, SN125-140, SN126-140, SN127-140, SN128-140, SN 129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140, SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN 129-139, SN130-139, SN131-139, SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138, SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN 129-138, SN130-138, SN131-138, SN132-138, SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, S SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137, SN128-137, SN 129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137, SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN 129-136, SN130-136, SN131-136, SN132-136, SN133-136, i SN134-136.

[0080] Drugi fragmenti alfa sinukleina koji su korisni za sprovođenje profilakse ili lečenja bolesti koja se karakteriše prisustvom Levijevih tela ili nakupljanjem alfa-sinukleina u mozgu (npr., Parkinsonove bolesti) su iz N-terminalnog regiona molekula. Imunizacijom sa fragmentima se dobija imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja su specifična prema jednom ili više epitopa unutar ostataka 1-20 ili, u nekim slučajevima, jednom ili više epitopa unutar ostataka 1-10. Kao što je prikazano u Primeru IX, davanje 6H7, antitela koje prepoznaje amino kraj alfa-sinukleina, izgleda da uklanja nakupljanje alfasinukleina u mozgu transgenih miševa koji prekomerno eksprimiraju humani alfa-sinuklein. Očekuje se da imunizacija sa fragmentima alfa-sinukleina koji sadrže amino terminalni region alfasinukleina slično dovodi do uklanjanja nakupina i/ili sprečavanja obrazovanja nakupina.

[0081] Prema tome, prikaz obezbeđuje postupak sprovođenja profilakse ili lečenja bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupljanjem alfa-sinukleina u mozgu davanjem pacijentu koji ima ili se

2

nalazi u riziku da dobije bolest polipeptida koji sadrži imunogeni fragment alfa sinukleina koji je efikasan da indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-40, ostataka 1-20 ili ostataka 1-10 humanog alfa-sinukleina, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO:1. U jednom izvođenju imunogeni fragment alfa-sinukleina je bez ostataka 70-140 u alfa sinukleinu. U jednom izvođenju imunogeni fragment je oslobođen ostataka 41-140 alfa-sinukleina. U jednom izvođenju imunogeni fragment je oslobođen ostataka 25-140 alfa-sinukleina.

[0082] Pogodni imunogeni za sprovođenje profilakse ili lečenje bolesti koje se karakterišu Levijevim telima ili nakupljanjem alfasinukleina u mozgu uključuju, ali bez ograničenja, fragmente koji sadrže od 5 do 20 susednih ostataka aminokiselina iz amino kraja alfa sinukleina. U poželjnom izvođenju fragment sadrži prvi (amino-terminalni) ostatak alfa sinukleina. Prema tome, primeri fragmenata uključuju sekvencu ostataka 1 do NaSEQ ID NO.: 1, gde Naje 5 do 20 (npr., MDVFMKGLSKAKE GVVAAAE; MDVFMKG LSKAKEGWAAA; MDVFMKGLSKAKEGVVAA; MDVFMKGLSKAKE GVVA; MDVFMKGLSKAKEGVV; MDVFMKGLSKAKEGV; MDVFMKGLSKAKEG; MDVFMKGLSKAK; MDVFMKGLSKA; MDVFMKGLSK; MDVFMKGLS; MDVFMKGL; MDVFMKG; MDVFMK; i MDVFM. U drugim poželjnim izvođenjima, fragment ne sadrži amino-terminalni ostatak alfa sinukleina već sadrži na drugom i/ili trećem ostatku alfa sinukleina. Prema tome, primeri fragmenata imaju sekvencu ostataka 2 do Nb, i 3 do NcSEQ ID NO.: 1, gde Nbje 6 do 21 i Ncje 7 do 22 (npr., DVFM KGLSKAKEGVVAAAEK; DVFM KGLSKAKEGVVAAAE; DVFMKGLSKAKEGVVAAA; DVFMKGLSKAKEGVVAA; DVFMKGLSKAKEGVVA; DVFMKGLSKAKEGVV; DVFMKGLSKAKEGV; DVFMKGLSKAKEG; DVFMKGLSKAK; DVFMKGLSKA; DVFMKGLSK; DVFMKGLS; DVFMKGL; DVFMKG; DVFMK, VFMKGLSKAKEGVVAAAEKT; VFMKGLSKAKEGWAAAEK; VFMKGLSKAKEGWAAAE; VFMKGL SKAKEGVVAAA; VFMKGLSKAKEGVVAA; VFMKGLSKAKEGVVA; VFMKGLSKAKEGVV; VFMKGLSKAKEGV; VFMKGLSKAKEG; VFMKGLSKAK; VFMKGLSKA; VFMKGLSK; VFMKGLS; VFMKGL; i VFMKG). Kao što se razmatra u tekstu ispod, prethodno pomenuti fragmenti mogu da budu povezani sa molekulom nosačem (npr., konjugatom ili kombinovanim proteinom, videti Odelj. II(3)). Alternativno, kao što se navodi u tekstu ispod, prethodno pomenuti fragment može da se daje vakcinisanjem subjekta sa nukleinskom kiselinom koja kodira fragment (videti Odelj. II(4)).

[0083] Referenca prema alfa-SN uključuje prirodne humane sekvence aminokiselina koje su gore navedene kao i analoge uključujući varijante alela, vrsta i indukovane varijante, oblike punih dužina i njihove imunogene fragmente. U svim izvođenjima je poželjan humani alfa sinuklein, koji označava protein koji ima istu sekvencu aminokiselina prema SEQ ID NO:1 ili njihove alelske varijante. Analozi se obično razlikuju od peptida koji se pojavljuju u prirodi na jednom, dva ili nekoliko položaja, često na osnovu konzervativnih supstitucija. Analozi obično ispoljavaju 80 ili 90% identičnosti sekvence sa prirodnim peptidima. Položajima aminokiselina u analozima prirodnog alfa sinukleina su dodeljeni brojevi odgovarajućih aminokiselina u prirodnom alfa sinukleinu kada su analog i prirodni alfa sinuklein maksimalno poravnani. Neki analozi takođe uključuju neprirodne aminokiseline ili modifikacije N ili C terminalnih aminokiselina na jednom, dva ili više položaja. Na primer, prirodni ostatak glutaminske kiseline na položaju 139 alfa-SN može da se zameni sa izo-asparaginskom kiselinom. Primeri neprirodnih aminokiselina su D, alfa, alfa-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina, 4-hidroksiprolin, gama-karboksiglutamat, epsilon-N,N,N-trimetillizin, epsilon-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, omega-N-metilarginin, beta-alanin, ornitin, norleucin, norvalin, hidroksiprolin, tiroksin, gama-amino buterna kiselina, homoserin, citrulin, i izoasparaginska kiselina. Terapeutska sredstva takođe uključuju analoge fragmenata alfa-SN. Neka terapeutska sredstva su sva-D peptidi, npr., sve-D alfa-SN ili sve-D NAC, i svi od sve-D peptidnih analoga. Analozi se specifično vezuju za poliklonsku populaciju antitela specifičnih za prirodni humani alfa sinuklein. Fragmenti i analozi mogu da se ispitaju za profilaktičku ili terapeutsku efikasnost u modelima transgenih životinja u poređenju sa netretiranim ili placebo kontrolama kao što se opisuje u tekstu ispod.

[0084] Alfa-SN, njegovi fragmenti, i analozi mogu da se sintetišu sintezom peptida na čvrstoj fazi ili rekombinovanoj ekspresiji, ili mogu da se dobiju iz prirodnih izvora. Automatski sintetizatori peptida su komercijalno dostupni od komercijalnih dobavljača, poput Applied Biosystems, Foster City, California. Rekombinovana ekspresija može da bude u bakterijama, kao što su E. coli, kvasac, ćelije insekata ili sisarske ćelije. Postupci rekombinovane ekspresije su opisani u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989). Neki oblici alfa-SN peptida su takođe komercijalno dostupni, na primer, u BACHEM i American Peptide Company, Inc.

[0085] Terapeutska sredstva takođe uključuju duže polipeptide koji uključuju, na primer, aktivni fragment alfa-SN peptida, zajedno sa drugim aminokiselinama. Na primer, poželjna sredstva uključuju kombinovane proteine koji sadrže segment alfa-SN koji je spojen sa heterologonom aminokiselinskom sekvencom koja indukuje odgovor pomoćničkih T-ćelija protiv heterolognih sekvenci aminokiselina i prema tome B-ćelijski odgovor prema segmentu alfa-SN. Takvi polipeptidi mogu da se pretraže za profilaktičku ili terapeutsku efikasnost u životinjskim modelima u poređenju sa netretiranim ili placebo kontrolama kao što se opisuje u tekstu ispod. Alfa-SN peptid, analog, aktivni fragment ili drugi polipeptid mogu da se daju u udruženom ili multimernom obliku ili u disosovanom obliku terapeutskih sredstava koji takođe uključuje multimere monomernih imunogenih sredstava. Terapeutska sredstva mogu da uključe polilizinske sekvence.

[0086] U daljoj varijaciji, imunogeni peptid, kao što je fragment alfa-SN, može da se predstavi virusom ili bakterijom kao delom imunogene kompozicije. Nukleinska kiselina koja kodira imunogeni peptid je inkorporisana u genom ili epizom virusa ili bakterija. Opciono, nukleinska kiselina je inkorporisana na takav način gde se imunogeni peptid eksprimira u u sekretovanom proteinu ili kao kombinovani protein sa spoljašnjim proteinom omotača virusa ili transmembranskim proteinom bakterije tako da je peptid prikazan. Virusi ili bakterije koji se koriste u takvim postupcima treba da budu nepatogeni ili atenuisani. Pogodni virusi uključuju adenovirus, HSV, virus Venezuelanskog encefalitisa konja i drugih alfa virusa, virus vezikularnog stomatitisa, i drugi rabdo virusi, vakacinija i virus boginja peradi. Pogodne bakterije uključuju Salmonella i Shigella. Posebno je pogodno kombinovanje imunogenog peptida sa HBsAg od HBV.

[0087] Terapeutska sredstva takođe uključuju peptide i druga jedinjenja koja ne moraju nužno da imaju značajnu sličnost u aminokiselinama sa alfa-SN ali ipak služe kao imitatori alfa-SN i indukuju sličan imunski odgovor. Na primer, bilo koji peptidi i proteini koji obrazuju beta-nabrane ploče mogu da se pregledaju za pogodnost. Takođe mogu da se koriste antiidiotipska antitela koja su specifična prema monoklonskim antitelima za alfa-SN ili drugim komponentama Levijevog tela. Takva Anti-Id antitela imitiraju antigen i generišu imunski odgovor prema njemu (videti Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 6th ed., p. 181). Sredstva koja nisu alfa-SN treba da indukuju imunogeni odgovor prema jednom ili više od poželjnih segmenata alfa-SN koji se navode gore u tekstu (npr., NAC). Poželjno, takva sredstva indukuju imunogeni odgovor koji je specifično usmeren prema jednom od ovih segmenata bez da je usmeren prema drugim segmentima alfa-SN.

[0088] Slučajne biblioteke peptida ili drugih jedinjenja mogu takođe da se pretraže za pogodnost. Kombinovane biblioteke mogu da se proizvedu za mnoge tipove jedinjenja koji mogu da se sintetišu načinon korak-po-korak. Takva jedinjenja uključuju polipeptide, beta-nabrane imitatore, polisaharide, fosfolipide, hormone, prostaglandine, steroide, aromatična jedinjenja, heterociklična jedinjenja, benzodiazepine, oligomerne N-supstituisane glicine i oligokarbamate. Velike kombinovane biblioteke jedinjenja mogu da budu konstruisane pomoću postupka kodiranih sintetičkih biblioteka (ESL) koji se opisuje u Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Univerzitet Kolumbija WO 94/08051, Farmakopeja, WO 95/35503 i Scripps, WO 95/30642. Peptidne biblioteke takođe mogu da se generišu postupcima fagnog prikaza. Videti, npr., Devlin, WO 91/18980.

[0089] Kombinovane biblioteke i druga jedinjenja su inicijalno pretražena za pogodnost određivanjem njihovog kapaciteta za vezivanje sa antitelima ili limfocitima (B ili T) koji su poznati kao specifični za alfa-SN ili druge komponente Levijevog tela. Na primer, početni skrininzi mogu da se izvode sa bilo kojim poliklonskim serumom ili monoklonskim antitelom koje je specifično prema alfa-SN ili njegovom fragmentu. Biblioteke se poželjno pretražuju za kapacitet za vezivanje sa antitelima koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20 ili 70-140 u humanom alfa-sinukleinu. Zatim mogu da se pretraže jedinjenja koja se specifično vezuju sa specifičnim epitopom unutar alfa-SN (npr., SN 1-20, SN 83-101, SN107-125, SN110-128 i SN124-140). Jedinjenja mogu da se testiraju istim postupcima koji se opisuju za mapiranje specifičnosti epitopa antitela. Jedinjenja koja su identifikovana takvim pretraživanjima se zatim dalje analiziraju za njihov kapacitet da indukuju antitela ili reaktivne limfocite prema alfa-SN ili njihovim fragmentima. Na primer, višestruko razblaženi serumi mogu da se testiraju na mikrotitarskim pločama koje su pre toga obložene sa alfa-SN ili njegovim fragmentom i standarna ELISA može da se izvodi za ispitivanje reaktivnosti antitela prema alfa-SN ili fragmentu. Jedinjenja mogu zatim da se testiraju za profilaktičku i terapeutsku efikasnost kod transgenih životinja koje su predisponirane za bolest koja je povezana sa prisustvom Levijevog tela, kao što se opisuje u Primerima. Takve životinje uključuju, na primer, transgene miševe koji prekomerno eksprimiraju alfa-SN ili njegov mutant (npr., supstituciju alanin u treonin na položaju 53) kao što se opisuje, npr., u WO 98/59050, Masliah, et al., Science 287: 1265-1269 (2000), and van der Putter, et al., J. Neuroscience 20: 6025-6029 (2000), ili takve transgene miševe koji takođe prekomerno eksprimiraju APP ili njegov mutant. Posebno su poželjni takvi sinukleinski transgeni miševi koji nose 717 mutaciju APP koja je opisana od strane Games et al., Nature 373, 523 (1995) i miševi koji nose 670/671 švedsku mutaciju APP kako se opisuje u u McConlogue et al., US 5,612,486 and Hsiao et al., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997)). Primeri takvih sinukleinskih/APP transgenih životinja su obezbeđeni u WO 01/60794. Dodatni životinjski modeli PD uključuju 6-hidroksidopamin, rotenon, i 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) životinjske modele (M. Flint Beal, Nature Reviews Neuroscience 2:325-334 (2001)). Isti pristup skrininga može da se koristi na drugim potencijalnim analozima alfa-SN i dužim peptidima uključujući fragmente alfa-SN, koji su gore opisani i druge komponente Levijevih tela i analoge ili njegove fragmente.

i. Aktivna imunizacija za indukovanje imunskog odgovora prema epitopima na oba kraja alfa-sinkleina

2

[0090] Kao što se ovde opisuje, davanje antitela koja prepoznaju epitope u regionima amino kraja i kraboksi kraja alfa-sinukleina (tj., 8A5 i 6H7) redukuje nakupljanja alfa-sinukleina u mozgovima transgenih miševa koji prekomerno eksprimiraju humani alfa-sinuklein (videti, npr., Primer IX). Delom zasnovano na ovom otkriću, razmotra se da indukovanje imunskog odgovora prema epitopima koji se nalaze na oba kraja alfa-sinukleina ima prednosti u profilaksi i terapiji. Prema tome, u jednom aspektu, prikaz obezbeđuje postupak za profilaksu ili lečenje bolesti koje su karakterisane Levijevim telima ili nakupinama alfa-sinukleina u mozgu indukovanjem imunogenog odgovora koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20, ili alternativno ostataka 1-10, humanog alfasinukleina i epitopa unutar ostataka 70-140 humanog alfa sinukleina. U poželjnom izvođenju imunogeni odgovor sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20 humanog alfa-sinukleina i ostataka 120-140 humanog alfa-sinukleina. Imunski ogovor koji sadrži antitela specifična prema epitopima na oba terminalna regiona proteina može da se nazove "dualni" imunski odgovor. Dualni imunski odgovor može da se indukuje na različite načine i predmetni prikaz nije ograničen bilo kojim posebnim postupkom kojim se inicira takav odgovor.

[0091] Dualni imunski odgovor može da se indukuje vakcinisanjem sa jednim polipeptidom koji je efikasan da indukuje imunogeni odgovor koji uključuje antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu i antitelima koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu. U poželjnim izvođenjima antitela se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-10 i/ili unutar ostataka 120-140 u humanom alfa-sinukleinu. Polipeptid kome nedostaju najmanje ostaci 25-69 u humanom alfa-sinukleinu, najmanje ostaci 30-110 u humanom alfasinukleinu, ili najmanje ostaci 21-119 u humanom alfa-sinukleinu mogu da se koriste. Kada se koriste takvi polipeptidi imunogeni odgovor ne uključuje antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 25-69 u humanom alfa-sinukleinu.

[0092] Dualni imunski odgovor može takođe da se indukuje vakcinisanjem u kombinaciji dva (ili više) polipeptida pri čemu jedan polipeptid indukuje imunogeni odgovor uključujući antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu i antitelima koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu. U poželjnim izvođenjima antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-10 i/ili unutar ostataka 120-140 u humanom alfa-sinukleinu. Prema tome, tretman ili profilaksa može da se postigne davanjem prvog imunogenog fragmenta alfa-sinukleina koji indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20 humanog alfa-sinukleina i drugog imunogenog fragmenta koji indukuje imunogeni odgovor koji sadrži antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 70-140 (ili 120-140) u humanom alfa-sinukleinu. Fragmenti humanog alfa-sinukleina mogu kombinovano da se daju, kao što se razmatra gore u tekstu (npr., davanjem kao kombinovani protein ili konjugat, u ko-formulaciji, ili u istoj kuri lečenja).

ii. Kompozicije i kitovi

[0093] Prikaz obezbeđuje kompozicije korisne u inicijaciji imunskog odgovora prema epitopima sa oba kraja alfa-sinukleina. Kompozicije uključuju dozne oblike i formulacije koje sadrže dva ili više polipeptida, kao što se gore opisuje, gde jedan polipeptid indukuje imunogeni odgovor uključujući antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu i antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu. U poželjnim izvođenjima polipeptidi indukuju antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-10 i/ili unutar ostataka 120-140 u humanom alfa-sinukleinu. Primeri formulacija (pogodnih za ko-formulisane polipeptide) su poznati u oblasti tehnike i uključuju one koje se opisuju u tekstu ispod u Odeljku VII ("Režimi lečenja").

[0094] Prikaz takođe obezbeđuje kitove za inicijaciju imunskog odgovora prema epitopima sa oba kraja alfasinukleina. Kitovi uključuju dva ili više sredstva koja indukuju imunogeni odgovor uključujući antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu i antitela koja se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu. Sredstva mogu da se kombinuju u jednom preparatu za istovremenu upotrebu. Sredstva mogu da se nalaze u razdvojenim kontejnerima (npr., bočicama, špricevima, tubama, ili slično) svaki sadrži različiti polipeptid za istovremenu, uzastopnu ili odvojenu upotrebu. Ova sredstva mogu opciono da se daju u kombinaciji sa drugim sredstvima koja su najmanje delom efikasna u lečenju bolesti koje obuvataju Levijeva tela. Kitovi mogu takođe da uključe sredstva koja povećavaju prolaz sredstava kroz krvnomoždanu barijeru, drugih adjuvanasa i materijala za davanje pacijentu.

2. Sredstva za pasivan imunski odgovor

[0095] Terapeutska sredstva iz prikaza takođe uključuju antitela koja se specifično vezuju za alfa-SN ili druge komponente Levijevih tela. Ovaj prikaz takođe obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za sinuklein-NAC komponentu u amiloidnom plaku. Poznata su antitela koja su imunoreaktivna za alfa-SN (videti, na primer, Arima, et al., Brian Res.808: 93-100 (1998); Crowther et al., Neuroscience Lett.292: 128-130 (2000); Spillantini, et al. Nature 388: 839-840 (1997). Takva antitela mogu da budu monoklonska ili poliklonska. Neka takva antitela se specifično vezuju za nerastvorljive nakupine alfa-SN bez specifičnog vezivanja za rastvorljivi monomerni oblik. Neka se specifično vezuju specifično za rastvorljivi monomerni oblik bez vezivanja za nerastvorljivi nakupljeni oblik. Neka se specifično vezuju i za nakupljene i rastvorljive monomerne oblike. Neka takva antitela se specifično vezuju za kratke oblike alfa-SN koji se prirodno pojavljuju (npr., NAC) bez vezivanja za alfa-SN koji se prirodno pojavljuje. Neka takva antitela se specifično vezuju za dugi oblik bez vezivanja za kratki oblik. Neka antitela se specifično vezuju za alfa-SN bez vezivanja za druge komponente LB-a. Neka antitela se specifično vezuju za alfa-SN bez specifičnog vezivanja za druge komponente amiloidnih plakova. Videti PCT objavu patenta WO 05/0138889 i U.S. prijavu br.60/471,929 koja je podneta 19 maja, 2003, koja obezbeđuje antitela specifična za kraj koja se specifično vezuju za alfa-sinuklein bez per se specifičnog vezivanja za intaktni alfa-sinuklein. Ova antitela su korisna u postupcima prevencije i lečenja sinukleinopatske i amiloidogene bolesti.

[0096] U eksperimentima koji se izvode da bi se podržao ovaj pronalazak, ex vivo test koji predviđa (Primer VII) se koristi za ispitivanje uklanjanja antitela koje se specifično vezuje za sinuklein-NAC. Antitelo specifično za NAC se dovodi u kontakt sa uzorkom tkiva mozga koji sadrži amiloidne plakove i mikroglijalne ćelije. Kao kontrola se koristi zečji serum. Naknadno praćenje pokazuje značajno smanjenje i broju i veličini plakova što ukazuje na aktivnost uklanjanja antitelom.

[0097] Iz ovih podataka, očigledno je da opterećenje amiloidnim plakom koje je povezano sa Alzhajmerovom bolesti i drugim amiloidnim bolestima može značajno da se smanji davanjem imunskih reagenasa koji su usmereni prema epitopima NAC, koji su efikasni za smanjenje opterećenja

2

amiloidnim plakom. Dalje se podrazumeva da, u takvim kompozicijama, može da se korsiti širok spektar antitela. Kao što se gore razmatra, U.S. prijava br. 60/471,929 koja je podneta 19 maja, 2003, obezbeđuje antitela koja su specifična za kraj koja se specifično vezuju za krajeve alfa-sinukleina bez per se specifičnog vezivanja za intaktni alfa-sinuklein.

[0098] Antitela koja se koriste u terapeutskim postupcima obično imaju intaktni konstantni region ili najmanje dovoljno konstantnog regiona da interaguje sa Fc receptorom. Humani izotip IgG1 je poželjan zbog toga što ima najveći afinitet od humanih izotipova za FcRI receptor na ćelijama fagocitima. Takođe mogu da se koriste bispecifični Fab fragmenti, gde kome je jedan krak antitela specifičan za alfa-SN, i drugi za Fc receptor. Neka antitela se vezuju za alfa-SN, opciono u denaturisanom obliku, kada se tretira sa SDS, sa afinitetom vezivanja koji je veći od ili jednak sa oko 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, ili 10<10>M<-1>. Neka antitela pronalaska specifično se vezuju za humani alfa sinuklein u sinapsama ili telima nervnih ćelija kao što se određuje imunocitohemijom.

[0099] Poliklonski serum obično sadrži pomešane populacije antitela koja se vezuju za nekoliko epitopa zajedno sa dužinom alfa-SN. Međutim, poliklonski serum može da bude specifičan prema određenom segmentu alfa-SN, kao što je NAC. Poliklonski serum koji je specifičan za određeni segment sadrži antitela koja se specifično vezuju za taj segment i ne sadrži antitela koja se specifično vezuju za druge segmente alfa-SN. Monoklonska antitela se vezuju za specifični epitop unuter alfa-SN koji može da bude konformacioni ili nekonformacioni epitop. Nekonformacioni epitopi ostaju prisutni kada se alfa-SN denaturiše sa SDS. Profilaktička i terapeutska efikasnost antitela može da se ispita upotrebom transgenog životinjskog modela postupcima koji se opisuju u Primerima. Neka monoklonska antitela se vezuju za epitop koji se nalazi u NAC. U nekim postupcima, koriste se višestruka monoklonska antitela koja se specifično vezuju za različite epitope. Takva antitela mogu da se primenjuju sekvencijalno ili istovremeno. Pored alfa-SN, takođe mogu da se koriste antitela koja su specifična prema komponentama Levijevog tela. Na primer, antitela mogu da budu usmerena prema neurofilamentu, ubikvitinu, ili sinfilinu. Terapeutska sredstva takođe uključuju antitela koja su dobijena prema analozima alfa-SN i njihovim fragmentima. Neka terapeutska sredstva su sva-D peptidi, npr., sva-D alfa-SN ili sva-D NAC.

[0100] Kada se kaže da se antitelo vezuje za epitop koji se nalazi unutar određenih ostataka, kao što je alfa-SN 1-5, na primer, što podrazumeva da antitelo koje specifično vezuje polipeptid koji sadrži specifične ostatke (tj., alfa-SN 1-5 ovde kao primer). Takvo antitelo ne mora nužno da bude u kontaktu sa svakim ostatkom unuter alfa-SN 1-5. Niti svaka supstitucija aminokiselina ili delecija unutar alfa-SN1-5 nužno značajno ne pogađa afinitet vezivanja. Epitopska specifičnost antitela može da se odredi, na primer, obrazovanjem biblioteke fagnog prikaza u kome različiti članovi prikazuju različite podsekvence alfa-SN. Biblioteka fagnog prikaza se zatim selektuje za članove koji se specifično vezuju za antitelo koje se testira. Izoluje se familija sekvenci. Obično, takva familija sadrži zajedničku sekvencu jezgra, i različite dužine bočnih sekvenci u različitim članovima. Najkraća sekvenca jezgra koja se specifično vezuje za antitelo definiše epitop koji je vezan antitelom. Antitela takođe mogu da se ispitaju za epitopsku specifičnost u kompetitivnom testu sa antitelom čija je epitopska specifičnost već određena.

2

[0101] Neka antitela se specifično vezuju za epitop unutar NAC. Neka antitela se specifično vezuju za epitop unutar glikozilovanog oblika sinukleina od 22-kilodaltona, npr., P22-sinukleinu (H. Shimura et al., Science 2001 Jul 13:293(5528):224-5).

[0102] Neka antitela se vezuju za epitop na N-kraju alfa-SN (na primer, epitop unutar aminokiselina 1-20 ili aminokiselina 1-10 alfa-sinukleina kao što je numerisano prema SEQ ID NO:1). Neka anitela se vezuju za epitop u kome N-terminalni ostatak epitopa je N-terminalni ostatak alfa-SN pune dužine. Takva antitela se ne vezuju za mutirane molekule alfa sinukleina sa delecijom gde nedostaje ostatak 1. Neka takva antitela se ne vezuju za alfa sinuklein u punoj dužini u kome je N-terminalna aminokiselina spojena sa heterolognim polipeptidom. Neka antitela se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-69 ili ostataka 1-20 u humanom alfa sinukleinu. Neka antitela se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu. Neka antitela se specifično vezuju za epitop sa segmentom humanog alfa-sinukleina koji se bira od ostataka 1 do NaSEQ ID NO.: 1, gde Naje 5 do 20; ostataka 2 do NbSEQ ID NO.: 1, gde Nbje 6 do 21; ili ostataka 3- NcSEQ ID NO.: 1 gde Ncje 7 do 22. Neka antitela se vezuju za epitop unutar segmenta humanog alfa sinukleina koji se bira iz grupe koja se sastoji od SN1-5, SN1-6, SN1-7, SN1-8, SN1-9, SN1-10, SN1-11, SN1-12, SN1-13, SN1-14 SN1-15, SN1-16, SN1-17, SN1-18, SN1-19, i SN1-20.

[0103] Neka antitela se vezuju za epitop na ili blizu C-kraja alfa-SN (npr., unutar aminokiselina 70-140, 100-140, 120-140, 130-140 or 135-140). Neka antitela se vezuju za epitop u kome C-terminalni ostatak epitopa je C-terminalni ostatak (pune dužine) alfa-SN. Takva antitela se ne vezuju za mutirane molekule alfa sinukleina koji imaju delecije u kojima nedostaje ostatak 140. Neka takva antitela se ne vezuju za alfa-sinuklein pune dužine u kome je aminokiselina na C-kraju spojena sa heterolognim polipeptidom. U nekim postupcima, antitelo se specifično vezuje za NAC bez vezivanja za alfa-SN pune dužine.

[0104] Neka antitela se specifično vezuju za epitop koji se nalazi unutar ostataka 70-140 ili 83-140 u humanom alfa sinukleinu. Neka antitela se specifično vezuju za epitop unutar ostataka 120-140 u humanom alfa sinukleinu. Neka antitela se specifično vezuju za epitop sa segmentom humanog alfasinukleina koji je odabran od 83-101, 107-125, 110-128 i 124-140. Neka antitela se vezuju za epitop unutar segmenta humanog alfa sinukleina koji se bira iz grupe koja se sastoji iz SN124-140, SN125-140, SN126-140, SN127-140, SN128-140, SN 129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140, SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN 129-139, SN130-139, SN131-139, SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138, SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN 129-138, SN130-138, SN131-138, SN132-138, SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137, SN128-137, SN 129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137, SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN 129-136, SN130-136, SN131-136, SN132-136, SN133-136, i SN134-136.

[0105] Monoklonska antitela koja se vezuju za C-terminalne epitope poželjno se vezuju sa visokim afinitetom npr., najmanje 10<8>, 10<9>ili 10<10>M<-1>za humani alfa sinuklein.

[0106] Monoklonska ili poliklonska antitela koja se specifično vezuju za poželjni segment alfa-SN bez specifičnog vezivanja za druge regione alfa-SN imaju brojne prednosti u odnosu na monoklonska

2

antitela koja se vezuju za druge regione ili poliklonski serum u intaktnom alfa-SN. Prvo, za jednake masene doze, doze antitela koja se specifično vezuju za poželjne segmente sadrže veću molarnu dozu antitela koja su efikasna u uklanjanju amiloidnih plakova. Drugo, antitela koja se specifično vezuju za poželjne segmente mogu da indukuju odgovor uklanjanja prema LB-a bez indukovanja odgovora uklanjanja prema intaktnom alfa-SN, čime se smanjuje potencijal za nepoželjne efekte.

[0107] Opciono, antitela mogu da se pretraže za profilaktičku ili terapeutsku efikasnost kod transgenih životinja koje imaju bolest koja obuhvata LB kao što se opisuje gore u tekstu. Opciono, kolekcija antitela se prethodno pretraži za relativno vezivanje za denaturisani humani alfa sinuklein ili njegov fragment. Relativni afiniteti vezivanja mogu da se procene iz relativnih intenziteta signala u imunblotu. Antitelo koje ima relativni afinitet vezivanja iznad srednje vrednosti, ili poželjno antitelo koje ima najveći afinitet vezivanja koji se ispituje se odabira za dalji skrining kod transgenih životinja. Slično, preskrining može da se izvede kako bi se antitela ispitala za vezivanje za nakupine alfa-sinukleina u tkivnim presecima pomoću imunocitohemije. Tkivni preseci mogu da se dobiju iz mozga bolesnih pacijenata ili od transgenog životinjskog modela.

[0108] U jednom izvođenju, za pasivnu imunizaciju se koristi antitelo naznačeno sa 6H7, ili antitelo koje se nalazi u kompeticiji sa 6H7 za specifično vezivanje prema alfa sinukleinu. U jednom izvođenju antitelo naznačeno 8A5, ili antitelo koje se nalazi u kompeticiji sa 8A5 za specifično vezivanje za alfa sinuklein se koristi za pasivnu imunizaciju. U nekim izvođenjima 6H7 ili 8A5 se koriste kombinovano jedan sa drugim ili sa drugim anti-alfa sinukleinskim antitelima.

i. Aktivna imunizacija za indukovanje imunskog odgovora prema epitopima na oba kraja alfa-sinukleina

[0109] Kao što se ovde opisuje, davanje antitela koja prepoznaju epitope u amino kraju i karboksi terminalnim regionima alfa-sinukleina (tj., 8A5 i 6H7) smanjuju nakupine alfa-sinukleina u mozgovima transgenih miševa koji prekomerno eksprimiraju humani alfa-sinuklein (videti, npr., Primer IX). Delom zasnovano na ovom otkriću, razmatra se da će davanje u kombinaciji antitela koja prepoznaju aN-terminalni epitop (npr., kao što se gore opisuje) i antitela koja prepoznaju C-terminalni epitop (npr., kao što se gore opisuje) posebno biti efikasno u profilaksi i terapiji. Prema tome, postupak se opisuje za profilaksu ili lečenje bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupljanjem alfa-sinukleina u mozgu davanjem u kombinaciji pacijentu koji ima ili se nalazi u riziku dobijanja bolesti efikasnog režima prvog antitela koje se specifično vezuje za epitope unutar ostataka 1-20 u humanom alfa-sinukleinu, gde su ostaci numerisani prema SEQ ID NO: 1 i davanje drugog antitela koje se specifično vezuje za epitope unutar ostataka 70-140 u humanom alfa-sinukleinu. Poželjno prvo antitelo se vezuje za epitop alfa-sinukleina unutar sekvence ostataka 1 do NaSEQ ID NO.: 1, gde Na je 5 do 20; unutar sekvence ostataka 2 do Nb SEQ ID NO.: 1, gde Nbje 6 do 21; i/ili unutar sekvence ostataka 3 do Nc SEQ ID NO.: 1, i Ncje 7 do 22. Poželjno drugo antitelo se specifično vezuje za epitope unutar ostataka 120-140 u humanom alfa-sinukleinu. Prva i druga antitela mogu da se daju istovremeno (npr., koformulisano), istog dana, istog meseca i/ili kao deo iste kure lečenja.

ii. Kompozicije i kitovi

[0110] Kompozicije se opisuju za profilaksu ili lečenje bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupljanjima alfa-sinukleina u mozgu koje sadrže jedno ili više antitela koje se vezuje za terminalni

2

region alfa-sinukleina, npr., ima specifičnost kao što se gore opisuje. Kompozicije uključuju dozne oblike i formulacije koje sadrže dva ili više antitela. Primeri formulacija (koje su pogodne za koformulisanje antitela) su poznate u oblasti tehnike i uključuju one koji se opisuju u tekstu ispod u Odeljku VII ("Režimi davanja tretmana").

[0111] Prikaz takođe obezbeđuje kitove za profilaksu ili lečenje bolesti koja se karakteriše Levijevim telima ili nakupinama alfa-sinukleina u mozgu. Kitovi uključuju dva (ili više) antitela gde se prvo antitelo vezuje za epitop na N-kraju humanog alfa-sinukleina i drugo antitelo se vezuje za epitop na C-kraju humanog alfa-sinukleina. Antitela mogu da se kombinuju u jednom preparatu ili kitu za istovremenu upotrebu. Alternativno, antitela mogu da zauzimaju različite kontejnere (npr., bočice, špriceve, tube, ili slično) u kitu za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu. Ova antitela opciono mogu da se daju kombinovano sa drugim sredstvima koja su najmanje delom efikasna u lečenju bolesti Levijevih tela. Kitovi mogu da takođe uključe sredstva koja pojačavaju prolazak antitela kroz krvno-moždanu barijeru, druge adjuvanse i materijale za davanje pacijentu.

iii. Opšte karakteristike imunoglobilina

[0112] Poznato je da osnovna strukturna jedinica antitela sadrži tetramer subjedinica. Svaki tetramer se sastoji iz dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalna porcija svakog lanca uključuje varijabilni region oko 100 do 110 ili više aminokiselina koje su primerno odgovorne za prepoznavanje antigena. Karboksiterminalna porcija svakog lanca definiše konstantni region koji je primarno odgovoran za efektorsku funkciju.

[0113] Laki lanci se klasifikuju ili kao kapa ili lambda. Teški lanci se klasifikuju kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela redom prema IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. U svakom lakom i teškom lancu, varijabilni i konstantni regioni su spojeni preko "J" regiona oko 12 ili više aminokiselina, sa teškim lancem koji takođe uključuje "D" region oko 10 ili više aminokiselina. (Videti opšte, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch.7.

[0114] Varijabilni regioni svakog para lakog/teškog lanca obrazuju mesto vezivanja u antitelu. Prema tome, intaktno antitelo ima dva mesta vezivanja. Osim kod bifunkcionalnih ili bispecifičnih antitela, dva mesta vezivanja su ista. Svi lanci ispoljavaju istu opštu strukturu relativno konzervisanih okvirnih regiona (FR) koji su spojeni sa tri hipervarijabilna regiona, koja su takođe poznata pod imenom regioni koji određuju komplementarnost ili CDR-i. CDR-i iz dva lanca svakog para se ravnaju pomoću regiona okvira čitanja, pri čemu je omogućeno vezivanje za specifični epitop. Od N-kraja do C-kraja, i laki i teški lanci sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama prema Kabatu, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); ili Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

iv. Proizvodnja nehumanih antitela

[0115] Himerna i humanizovana antitela imaju istu ili sličnu specifičnost vezivanja i afinitet kao mišje ili drugo nehumano antitelo koje obezbeđuje polazni materijal za konstrukciju himernog ili

2

humanizovanog antitela. Himerna antitela su antitela čiji su geni koji kodiraju laki i teški lanac konstruisani, obično genetskim inženjeringom, iz segmenata imunoglobulinskih gena koji pripadaju različitim vrstama. Na primer, varijabilni (V) segmenti gena iz mišjeg monoklonskog antitela mogu da budu spojeni sa humanim konstantnim (C) segmentima, kao što su IgG1 i IgG4. Poželjan je izotip humanog IgG1. U nekim postupcima, izotip antitela je humani IgG1. U nekim postpcima takođe mogu da se koriste IgM antitela. Tipično himerno antitelo je prema tome hibridni protein koji se sastoji iz V ili antigen-vezujućeg domena iz mišjeg antitela i C ili efektorskog domena humanog antitela.

[0116] Humanizovana antitela imaju ostatke u okviru čitanja u varijabilnom regionu u suštini iz humanog antitela (koje se naziva akceptorsko antitelo) i regione koji određuju komplementarnost u suštini iz mišjeg antitela, (koje se naziva donorski imunoglobulin). Videti, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), WO 90/07861, US 5,693,762, US 5,693,761, US 5,585,089, US 5,530,101, i Winter, US 5,225,539. Konstantni region(i), ukoliko su prisutni, su takođe u suštini ili ukupno iz humanog imunoglobulina. Humani varijabilni domeni se obično biraju iz humanih antitela čije sekvence okvira čitanja imaju visok stepen identičnosti sekvence sa mišjim domenima varijabilnih regiona iz kojih su izvedeni CDR-i. Ostaci okvira čitanja varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mogu da se izvedu iz istih ili različitih sekvenci humanih antitela. Sekvence humanog antitela mogu da budu sekvence aminokiselina antitela koja nalaze u prirodi ili mogu da budu konsenzusne sekvence iz nekoliko humanih antitela. Videti Carter et al., WO 92/22653. Određene aminokiseline iz ostataka okvira čitanja varijabilnog regiona humanog antitela se biraju za supstituciju na osnovu njihovog mogućeg uticaja na konformaciju CDR i/ili vezivanje sa antigenom. Ispitivanje takvih mogućih uticaja se vrši modelovanjem, ispitivanjem karakteristika aminokiselina na određenim položajima, ili empirijskim posmatranjam efekata supstitucije ili mutageneze određenih aminokiselina.

[0117] Na primer, kada se aminokiselina razlikuje između ostatka u okviru čitanja mišjeg varijabilnog regiona i odabranog ostatka u humanom varijabilnom regionu, aminokiselina iz humanog okvira čitanja obično treba da bude supstituisana sa ekvivalentnom aminokiselinom iz okvira čitanja iz mišjeg antitela kada se sa razlogom očekuje da aminokiselina:

(1) nekovalentno direktno vezuje antigen,

(2) blizu je CDR regiona,

(3) na drugi način interaguje sa CDR regionom (npr. koji je unutar oko 6 A ili CDR regionu), ili (4) učestvuje u interfejsu VL-VH.

[0118] Drugi kandidati za supstituciju su aminokiseline akceptora iz humanog okvira regiona čitanja koje su neuobičajene za humani immunoglobulin na tom položaju. Ove aminokiseline mogu da budu supstituisane sa aminokiselinama iz ekvivalentnog položaja mišjeg donorskog antitela ili iz ekvivalentnih položaja uobičajenih imunoglobulina. Drugi kandidati za supstituciju su aminokiseline iz akceptorskog humanog okvira regiona koje nisu uobičajene za humane imunoglobuline na tom položaju. Okviri čitanja varijabilnog regiona humanizovanih imunoglobulina obično pokazuju najmanje 85% identičnost u sekvenci sa humanom sekvencom iz okvira čitanja varijabilnog regiona ili konsenzusom takvih sekvenci.

[0119] Neka humanizovana antitela sadrže sekvence regiona koji određuju komplementarnost (CDR-i) koje se izvode iz mišjeg monoklonskog antitela mAb 6H7 ili mišjeg monoklonskog antitela mAb 8A5.

Ćelijska linija koja je naznačena sa JH17.6H7.1.54.28 proizvodi antitelo 6H7 ima ATCC pristupni broj_i deponovana je pod provizijom Budampeštanskog ugovora sa American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA 20108) 4 avgusta, 2005. Ćelijska linija koja je naznačena JH4.8A5.25.7.36 poizvodi antitelo 8A5 ima ATCC pristupni br _deponovana je 4 avgusta, 2005.

[0120] Kao što je gore navedeno, poznati su brojni postupci za proizvodnju himernih i humanizovanih antitela upotrebom ćelijske linije koja eksprimira antitelo (npr., hibridom). Na primer, varijabilni regioni imunoglobulina mišjeg 8A5 i/ili 6H7 antitela mogu da se kloniraju i sekvenciraju preko dobro poznatih postupaka. U jednom postupku, za svrhu ilustracijie ali bez ograničenja, varijabili VH region teškog lanca se klonira pomoću RT-PCR upotrebom iRNK koja se dobija iz hibridoma ćelija. Konsenzusni prajmeri se koriste u VH regionu peptidnog vodiča koji obuhvata kodon inicijacije translacije kao 5’ prajmer i g2b konstantne regione specifičnog 3’ prajmera. Primeri prajmera su opisani u U.S. objavi patenta US 2005/0009150 od Schenk et al. (ovde navedno, "Schenk"). Sekvence iz višestrukih, nezavisno izvedenih klonova, mogu da se porede da bi se osiguralo da se tokom umnožavanja ne uvode promene. Sekvenca VH regiona može takođe da se odredi ili potvrdi sekvenciranjem fragmenta VH koji se dobija metodologijom 5’ RACE RT-PCR i 3’ g2b specifičnim prajmerom.

[0121] Varijabilni VL region lakog lanca 8A5 ili 6H73 D6 može analognim načinom da se klonira kao VH region. U jednom pristupu, skup konseznusnog prajmera dizajniranog za umnožavanje mišjih VL regiona je dizajniran da hibridizuje sa VL regionom koji obuhvata kodone za inicijaciju translacije, i 3’ prajmer koji je specifičan za Ck region nishodno od regiona spajanja V-J. U drugom pristupu, metodologija 5’RACE RT-PCR se koristi za kloniranje cDNK koja kodira VL. Primeri prajmera se opisuju u Schenk. Klonirane sekvence se zatim kombinuju sa sekvencama koje kodiraju humane konstantne regione.

[0122] U jednom pristupu, varijabilni regioni teškog i lakog lanca se ponovo konstruišu da kodiraju isečene donorske sekvence nishodno od odgovarajućih spojeva VDJ ili VJ, i kloniraju se u sisarski ekspresioni vektor, kao što je pCMV- hγ1 za teški lanac, i pCMV-hκ1 za laki lanac. Ovi vektori kodiraju humane γ1 i Ck konstantne regione kao fragmente egzona nishodno od insertovane kasete varijabilnog regiona. Posle verifikacije sekvence, ekspresioni vektori teškog i lakog lanca mogu da se ko-transfektuju u COS ćelije da bi se proizvela himerna antitela. Kondicionirani medijum se sakuplja 48 sati posle transfekcije i ispituje se analizom Western blot za proizvodnju antitela ili ELISA testom za vezivanje antigena. Himerna antitela su humanizovana kao što se opisuje gore u tekstu.

v. Humana antitela

[0123] Humana antitela koja su specifična prema alfa-SN obezbeđena su različitim postupcima koji se opsuju u tekstu ispod. Neka humana antitela se selektuju eksperimentima kompetitivnog vezivanja, ili drugačije, da imaju istu epitopsku specifičnost kao određeno mišje antitelo, kao jedno od mišjih monoklonskih antitela koja se opisuju u Primeru XI. Humana antitela takođe mogu da budu pretražena za određenu epitopsku specifičnost korišćenjem samo fragmenta alfa-SN kao imunogena, i/ili pretraživanjem antitela prema kolekciji delecionih mutanata alfa-SN. Humana antitela poželjno imaju izotipsku specifičnost humanog IgG1.

1

(1) Metodologija trioma

[0124] Osnovni pristup i primer partnera za spajanje ćelija, SPAZ-4, za upotrebu u ovom pristupu se opisuje od strane Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, US Patent br.4,634,664; and Engleman et al., US Patent 4,634,666. Ćelijske linije koje proizvode antitelo koje se dobijaju ovim postupkom se zovu triomi, zbog toga što su potomci iz tri ćelija-dva čoveka i jednog miša. Inicijalno, mišja linija mijeloma se spaja sa humanim B-limfocitom da bi se dobila ksenogena hibridna ćelija koja ne proizvodi antitela, kao što je SPAZ-4 ćelijska linija koja je opisana od strane Oestberg, supra. Ksenogena ćelija se zatim spaja sa imunizovanim humanim B-limfocitom da se dobije ćelijska linija trioma koja proizvodi antitelo. Pronađeno je da triomi stabilnije proizvode antitelo u odnosu na obične hibridome koji se dobijaju iz humanih ćelija.

[0125] Imunizovani B-limfociti se dobijaju iz krvi, slezine, limfnih čvorova ili koštane srži humanog donora. Ukoliko su poželjna antitela koja su specifična prema specifičnom antigenu ili epitopu, poželjno je koristiti njihov antigen ili epitop za imunizaciju. Imunizacija može da bude ili in vivo ili in vitro. Za in vivo imunizaciju, B ćelije se obično izoluju iz čoveka koji je imunizovan sa alfa-SN, njegovim fragmentom, većim polipeptidom koji sadrži alfa-SN ili fragment, ili anti-idiotipsko antitelo koje je specifično za antitelo prema alfa-SN. U nekim postupcima, B ćelije su izolovane iz istog pacijenta kome se na kraju daje terapija antitelima. Za in vitro imunizaciju, B-limfociti se obično izlažu antigenu u periodu 7-14 dana u medijumu kao što je RPMI-1640 (videti Engleman, supra) koji je dopunjen sa 10% humanom plazmom.

[0126] Imunizovani B-limfociti se spajaju sa ksenogenom hibridnom ćelijom kao što je SPAZ-4 dobro poznatim postupcima. Na primer, ćelije se tretiraju sa 40-50% polietilen glikolom MW 1000-4000, na oko 37 stepeni C, oko 5-10 min. Ćelije se razdvajaju iz spojene smeše i propagiraju u medijumu koji je selektivan za poželjne hibride (npr., HAT ili AH). Klonovi koji sekretuju antitela sa željenom specifičnosti vezivanja se identifikuju ispitivanjem medijuma kulture trioma za sposobnost vezivanja za alfa-SN ili njegov fragment. Triomi koji proizvode humana antitela koji imaju željenu specifičnost se podkloniraju postupkom ograničenog razblaženja i in vitro rastom u medijumu u kulturi. Dobijene ćelijske linije trioma se zatim ispituju za sposobnost da vežu alfa-SN ili njegov fragment.

[0127] Iako su triomi genetički stabilni oni ne proizvode antitela na veoma visokim nivoima. Ekspresioni nivoi mogu da se povećaju kloniranjem gena koji kodiraju antitela iz trioma u jedan ili više ekspresionih vektora, i transformisanjem vektora u standardne sisarske, bakterijske ili kvaščeve ćelijske linije.

(2) Transgeni ne-humani sisari

[0128] Humana antitela koja su specifična prema alfa-SN mogu takođe da se proizvedu iz ne-humanih transgenih sisara koji imaju transgene koji najmanje kodiraju segment humanog imunoglobulinskog lokusa. Obično, endogeni imunoglobulinski lokus takvih transgenih sisara je funkcionalno inaktivnisan. Poželjno, segment humanog imunoglobulinskog lokusa uključuje nerearanžirane sekvence komponenata teškog i lakog lanca. Obe inaktivacije endogenih imunoglobulinskih gena i uvođenja egzogenih imunoglobulisnkih gena mogu da se postignu ciljanom homolognom rekombinacijom, ili uvođenjem YAC hromozoma. Transgeni sisari koji nastaju u ovom postupku mogu funkcionalno da rearanžiraju imunoglobulinske komponente sekvenci, i eksprimiraju repertoar antitela različitih izotipova koji su kodirani humanim imunoglobulinskim genima, bez eksprimiranja endogenih

2

imunoglobulinskih gena. Proizvodnja i svojstva sisara koji imaju ove karakterstike se detaljno opisuju u, npr., Lonberg et al., WO93/1222, US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741. Posebno su pogodni transgeni miševi. Anti-alfa-SN antitela se dobijaju imunizacijom transgenog nehumanog sisara, kao što je opisano u Lonberg or Kucherlapati, supra, sa alfa-SN ili njegovim fragmentom. Monoklonska antitela se pripremaju pomoću, npr., spajanjem B-ćelija iz takvih sisara sa pogodnim ćelijskim linijama mlijeloma upotrebom konvencijalne Kohler-Milstein tehnologije. Humana poliklonska antitela mogu takođe da se obezbede u obliku seruma iz ljudi koji su imunizovani sa imunogenim sredstvom. Opciono, takva poliklonska antitela mogu da se koncentruju afinitetnim prečišćavanjem upotrebom alfa-SN ili drugim amiloidnim peptidom kao afinitetnim reagensom.

(3) Postupci fagnog prikaza

[0129] Dalji pristup za dobijanje humanih anti-alfa-SN antitela je izvođenje skrininga DNK biblioteka iz humanih B ćelija u skladu da generalnim protokolom koji se navodi u u Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Kao što se opisuje za metodologiju trioma, takve B ćelije mogu da se dobiju iz čoveka koji je imunizovan sa alfa-SN, fragmentima, dužim polipeptidima koji sadrže alfa-SN ili fragmente ili antiidiotipska antitela. Opciono, takve B ćelije se dobijaju iz pacijenta koji na kraju treba da primi tretman antitelom. Biraju se antitela koja se vezuju za alfa-SN ili njegov fragment. Sekvence koje kodiraju takva antitela (ili vezujuće fragmente) se zatim kloniraju i umnožavaju. Protokol koje opisuje Huse je efikasniji kombinovano sa tehnologijom prikazivanja faga. Videti, npr., Dower et al., WO 91/17271 and Mc-Cafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 i US 5,565,332. U ovim postupcima, biblioteke faga se proizvode pri čemu članovi prikazuju različita antitela na njihovim spoljašnjim površinama. Antitela se obično prikazuju kao fragmenti Fv ili Fab. Fagi koji prikazuju antitela sa željenom specifičnošću se biraju afinitetnim obogaćenjem prema alfa-SN peptidu ili njegovim fragmentom.

[0130] U varijaciji postupka prikazivanja faga, mogu da se proizvedu humana antitela koja imaju specifičnost vezivanja prema odabranom mišjem antitelu. Videti Winter, WO 92/20791. U ovom postupku, varijabilni region ili lakog ili teškog lanca odabranog mišejg antitela se koristi kao polazni materijal. Ukoliko na primer, se za polazni material odabere varijabilni region lakog lanca, konstruiše se fagna biblioteka u kojoj članovi prikazuju isti varijabilni region lakog lanca (tj., mišji polazni materijal) i različiti varijabilni region teškog lanca. Varijabilni regioni teškog lanca se dobijaju iz biblioteke rearanžiranih varijabilnih regiona humanog teškog lanca. Odabran je fag koji pokazuje jako specifično vezivanje za alfa-SN (npr., najmanje 108 i poželjno najmanje 109 M-1). Varijabilni region humanog teškog lanca iz ovog faga zatim dalje služi kao polazni materijal za konstruisanje fagne biblioteke. U ovoj biblioteci, svaki fag prikazuje isti varijabilni region teškog lanca (tj., region koji se identifikuje iz prve biblioteke prikazivanja) i varijabilni region različitog lakog lanca. Varijabilni regioni lakog lanca se dobijaju iz biblioteke rearanžiranih varijabilnih regiona humanih lakih lanaca. Ponovo, bira se fag koji prikazuje jako specifično vezivanje za alfa-SN. Ovoj fag prikazuje varijabilne regione kompletno humanih anti-alfa-SN antitela. Ova antitela obično imaju istu ili sličnu epitopsku specifičnost kao mišji polazni materijal.

vi. Selekcija konstantnog regiona

[0131] Varijabilni regioni teškog i lakog lanca himernih, humanizovanih, ili humanih antitela mogu da budu povezani sa najmanje delom humanog kontantnog regiona. Izbor konstantnog regiona zavisi, delom, da li je poželjna toksičnost komplementom koja je posredovana antitelima i/ili toksičnost koja je posredovana ćelijama. Na primer, izotipovi IgG1 i IgG3 imaju aktivnost komplementa i izotipovi IgG2 i IgG4 nemaju. Izbor izotipa može takođe da utiče na prolazak antitela u mozak. Poželjan je izotip humanog IgG1. Konstantni regioni lakog lanca mogu da budu lambda ili kapa. Antitela mogu da se eksprimiraju kao tetrameri koji sadrže dva laka i dva teška lanca, kao razdvojeni teški lanci, laki lanci, kao Fab, Fab’ F(ab’)2, i Fv, ili kao jednolančana antitela gde su varijabilni domeni teškog i lakog lanca povezani pomoću grupe za povezivanje.

vii. Ekspresija rekombinovanih antitela

[0132] Himerna, humanizovana i humana antitela se obično proizvode rekombinovanom eskspresijom. Konstrukti rekombinovanih polinukleotida obično uključuju ekspresionu kontrolnu sekvencu koja je operativno povezana sa kodirajućim sekvencama lanaca antitela, uključujući prirodno povezane ili heterologne regione promotera. Poželjno, ekspresione kontrolne sekvence si eukariotski promoterski sistemi u vektorima koji mogu da transformišu ili transfektuju eukariotske ćelije domaćina. Jednom kada je vektor inkorporisan u odgovarajućeg domaćina, domaćin se održava pod uslovima koji su odgovarajući za visok nivo ekspresije nukleotidnih sekvenci, i sakupljanje I prečišćavanje antitela sa unakrsnom aktivnošću.

[0133] Ovi ekspresioni vektori se obično repliciraju u organizmima domaćina ili kao epizomi ili kao sastavni delovi hromozomske DNK domaćina. Uglavnom, ekspresioni vektori sadrže markere selekcije, npr., rezistentnost za ampicilin ili rezistentnost za higromicin, da se omogući detekcija onih ćelija koje su transformisane sa željenim DNK sekvencama.

[0134] E. coli je jedan prokariotski domaćin koji je posebno koristan za kloniranje sekvenci DNK iz predmetnog prikaza. Za eskpresiju su takođe korisni mikrobi, kao što je kvasac. Saccharomyces je poželjni kvasac domaćin, sa pogodnim vektorima koji eksprimiraju kontrolne sekvence, početak replikacije, sekvence za terminaciju i slično po potrebi. Tipični promotori uključuju 3-fosfoglicerat kinazu i druge glukolitičke enzime. Inducibilni kvaščev promotor uključuje, između ostalih, promotore alkohol dehidrogenaze, izocitohroma C, i enzima koji su odgovorni za upotrebu maltoze i galaktoze.

[0135] Sisarske ćelije su poželjni domaćini za eksprimiranje nukleotidnih segmenata koji kodiraju imunoglobuline ili njihove fragmente. Videti Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). U oblasti tehnike su razvijene su brojne pogodne ćelijske linije domaćina koje mogu da sekretuju intaktne heterologne proteine, i uključuju CHO ćelijske linije, različite COS ćelijske linije, HeLa ćelije, L ćelije, humane embrionske ćelije bubrega, i ćelijske linije mijeloma. Poželjno, ćelije su nehumane. Ekspresioni vektori za ove ćelije mogu da uključe ekspresione kontrolne sekvence, kao što je početak replikacije, promotor, pojačivač (Queen et al., Immunol. Rev.89:49 (1986)), i neophodna informaciona mesta za obradu, kao što su mesta za vezivanje ribozoma, mesta isecanja RNK, mesta poliadenilacije, i sekvence za terminaciju transkripcije. Poželjne ekspresione kontrolne sekvence su promotori koji se izvode iz endogenih gena, citomegalovirusa, SV40, adenovirusa, papilaomavirusa govečeta, i slično. Videti Co et al., J. Immunol.148:1149 (1992).

4

[0136] Alternativno, sekvence koje kodiraju antitela mogu da se inkorporišu u transgene za uvođenje u genom transgene životinje i naknadno eksprimiraju u mleku transgene životinje (videti, npr., US 5,741,957, US 5,304,489, US 5,849,992). Pogodni transgeni uključuju kodirajuće sekvence za lake i/ili teške lance u operativnoj vezi sa promoterom i pojačivačem iz gena koji je specifičan za sisarske žlezde, kao što je kazein ili beta laktoglobulin.

[0137] Vektori koji sadrže segmente DNK od interesa mogu da se prenesu u ćeliju domaćina dobro poznatim postupcima, u zavisnosti od tipa ćelijskog domaćina. Na primer, transfekcija kalcijum hloridom se obično koristi za prokariotske ćelije, dok tretman kalcijum fosfatom, elektroporacija, lipofekcija, genski pištolj ili virusom-zasnovana transfekcija može da se koristi za druge ćelijske domaćine. Drugi postupci koji se koriste za transformaciju sisarskih ćelija uključuju upotrebu polibrena, spajanje protoplasta, lipozome, elektroporaciju, i mikroinjekciju (videti opšte, Sambrook et al., supra). Za proizvodnju transgenih životinja, transgeni mogu da se mikroinjeciraju u fertilizovane oocite, ili mogu da se uključe u genom ili embrionske stem ćelije, i nukleusi takvih ćelija se prenose u oocite bez nukleusa.

[0138] Jednom kada se eksprimiraju, antitela mogu da se prečiste u skladu sa standardnim postupcima iz oblasti tehnike, uključujući HPLC prečišćavanje, hromatografiju na koloni, gel elektroforezu i slično (videti opšte, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

3. Konjugati

[0139] Neka sredstva za indukovanje imunskog odgovora sadrže odgovarajući epitop kojim se indukuje imunski odgovor prema LB-a ali su previše mala da bi bila imunogena. U ovoj situaciji, peptidni imunogen može da bude povezan sa pogodnim nosačem molekulom sa obrazuje konjugat koji pomaže da se indukuje imunski odgovor. Pogodni nosači uključuju albumin iz seruma, KHL (eng. Keyhole Limpet Hemocyanin), molekul imunoglobulina, tiroglobulin, ovalbumin, tetanusni toksoid, ili toksoid iz drugih patogenih bakterija, kao što je difteria, E. coli, kolera, ili H. pylori, ili derivate atenuiranog toksina. T ćelijski epitopi su takođe pogodni molekuli nosači. Neki konjugati mogu da se obrazuju spajanjem sredstava iz pronalaska sa imunosimulatornim polimernim molekulom (npr., tripalmitoil-S-glicerin cistein (Pam3Cys), manan (manozni polimer), ili glukan (beta 1→2 polimer)), citokinima (npr., IL-1, IL-1 alfa i beta peptidi, IL-2, gama-INF, IL-10, GM-CSF), i hemokinima (npr., MIPlalfa ai beta, i RANTES). Imunogena sredsva mogu takođe da budu povezana sa sredstvima koja povećavaju transport kroz tkiva, kao što se opisuje u O’Mahony, WO 97/17613 and WO 97/17614. Imunogeni mogu da budu povezani sa nosačima sa ili bez grupa aminokiselina koje povezuju (npr., gly-gly).

[0140] Neki konjugati mogu da se obrazuju povezivanjem sredstava iz pronalaska sa najmanje jednim T ćelijskim epitopom. Neki T ćelijski epitopi su promiskuitetni dok su drugi T ćelijski epitopi univerzalni. Promiskuitetni T ćelijski epitopi mogu da pojačaju indukciju T ćelijskog imuniteta kod brojnih subjekata koji ispoljavaju različite HLA tipove. Za razliku od promiskuitetnih T ćelijskih epitopa, univerzalni T ćelijski epitopi mogu da pojačaju indukciju T ćelijskog imuniteta u velikom procentu, npr., najmanje 75%, subjekata koji ispoljavaju različite HLA molekule koji se kodiraju od strane različitih HLA-DR alela.

[0141] Postoji veliki broj prirodnih T-ćelijskih epitopa, kao što su, tetanusni toksoid (npr., P2 i P30 epitopi), površinski epitopi Hepatitisa B, pertussis, toksoid, F protein virusa boginja, glavni protein spoljašnje membrane Chlamydia trachomitis, toksoid difterije, Plasmodium falciparum cirkumsporozit T, Plasmodium falciparum CS antigen, Schistosoma mansoni trioza fosfat izomeraza, Escherichia coli TraT, i hemaglutinin virusa gripa (HA). Imunogeni peptidi mogu takođe da budu konjugovani sa T-ćelijskim epitopima koji se opisuju u Sinigaglia F. et al., Nature, 336:778-780 (1988); Chicz R.M. et al., J. Exp. Med., 178:27-47 (1993); Hammer J. et al., Cell 74:197-203 (1993); Falk K. et al., Immunogenetics, 39:230-242 (1994); WO 98/23635; and, Southwood S. et al. J. Immunology, 160:3363-3373 (1998). Dalji primeri uključuju:

Hemaglutinin virusa gripa: HA307-319PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 4)

Malaria CS: T3 epitop EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 5)

Površinski antigen hepatitisa B : HBsAg19-28FFLLTRILTI (SEQ ID NO: 6)

Protein toplotnog šoka 65: hsp65153-171DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO: 7)

bacil Calmette-Guerin QVHFQPLPPAVVKL(SEQ ID NO: 8)

Tetanusni toksoid: TT830-844QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 9)

Tetanusni toksoid: TT947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 10)

HIV gp120 T1: KQIINMWQEVGKAMYA (SEQ ID NO: 11)

[0142] Alternativno, konjugati mogu da se obrazuju povezivanjem sredstava iz pronalaska sa najmanje jednim veštačkim T-ćelijskim epitopom koji može da veže veliku porciju MHC molekula klase II, kao što je pan DR epitop ("PADRE"). PADRE se opisuje u US 5,736,142, WO 95/07707, and Alexander J et al., Immunity, 1:751-761 (1994). Poželjni PADRE peptid je AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 12), (zajednički opšti ostaci su podebljani) gde je X poželjno cikloheksilalanin, tirozin ili fenilalanin, pri čemu je cikloheksilalanin najpoželjniji.

[0143] Imunogena sredstva mogu da se povežu sa nosačima pomoću hemijskog unakrsnog vezivanja. Postupci za povezivanje imunogena sa nosačem uključuju obrazovanje diulfidnih veza upotrebom N-sukcinimidil-3-(2-piridil-tio) propionata (SPDP) i sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilata (SMCC) (ukoliko peptidu nedostaje sulfhidril grupa, može da se obezbedi dodavanjem ostatka cisteina). Ovi reagensi stvaraju disulfidnu vezu među sobom i peptidnim ostacima cisteina na jednom proteinu i amidnom vezom preko epsilon-amino na lizinu, ili drugoj slobodnoj amino grupi u drugim aminokiselinama. Takvi brojni disulfidni/amidni-obrazujući agensi se opisuju u Immun. Rev.62, 185 (1982). Drugi bifunkcionalni agensi za spajanje pre obrazuju tioetarsku vezu od disulfidne veze. Mnogi od ovih tio-etar-obrazujućih agenasa su komercijalno dostupni i uključuju reaktivne estre 6-maleimidokapronske kiseline, 2-bromosirćetne kiseline, i 2-jodosirćetne kiseline, 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilne kiseline. Karboksilne grupe mogu da se aktiviraju kombinovanjem sa sukcinimidom ili natrijumove soli 1-hidroksil-2-nitro-4-sulfonske kiseline.

[0144] Imunogenost može da se poboljša dodavanjem ostataka koji razdvajaju (npr., Gly-Gly) između Thepitopa i peptidnog imunogena pronalaska. Pored fizičklog odvajanja Thepitopa iz B ćelijskog epitopa (tj., peptidnog imunogena), ostaci glicina mogu da naruše bilo koje veštačke sekundarne strukture koje se dobijaju spajanjem Thepitopa sa peptidnim imunogenom, i prema tome eliminišu interferenciju između T i/ili B ćelijskih odgovora. Konformaciono razdvajanje između pomoćnog epitopa i domena anitela za elicitaciju prema tome omogućava efikasniju interakciju između prezentovanog imunogena i odgovarajućih Thi B ćelija.

[0145] Da bi se pojačala indukcija T ćelijskog imuniteta kod velikog procenta subjekata koji prikazuju različite tipove HLA sredstvu iz predmetnog pronalaska, može da se pripremi smeša konjugata sa različitim epitopima Thćelija. Smeša može da sadrži smešu najmanje dva konjugata sa različitim Thćelijskim epitopima, smešu najmanje tri konjugata sa različitim epitopima Thćelija, ili smešu najmanje četiri konjugata sa različitim epitopima Thćelija. Smeša može da se daje zajedno sa adjuvansom.

[0146] Imunogeni peptidi mogu takođe da se eksprimiraju kao kombinovani protein sa nosačima (tj. heterolognim peptidima). Imunogeni peptid može da se vezuje sa nosačem sa njegovim amino krajem, njegovim karboksi krajem, ili sa oba. Opciono, višestruki ponovci imunogenog peptida mogu da se nađu u kombinovanom proteinu. Opcino, imunogeni peptid može da se spoji sa višestrukim kopijama heterolognog peptida, na primer, na oba N i C kraja peptida. Neki peptidni nosači služe da indukuju odgovor pomoćničkih T-ćelija prema peptidnom nosaču. Indukovane pomoćničke T-ćelije nako toga indukuju B-ćelijski odgovor prema imunogenom peptidu koji je spojen sa peptidnim nosačem.

[0147] Neka sredstva sadrže kombinovani protein u kome je N-terminalni fragment alfa-SN povezan sa njegovim C-krajem sa peptidnim nosačem. Kod takvih sredstava, N-terminalni ostatak fragmenta alfa-SN čini N-terminalni ostatak kombinovanog proteina. Prema tome, takvi kombinovani proteini su efikasni u indukovanju antitela koja se vezuju za epitop koje zahteva da N-terminalni ostatak alfa-SN bude u slobodnom obliku. Neka sredstva sadrže brojne ponovke NAC koji su spojeni sa C-krajem za jednu ili više kopija peptidog nosača. Neki kombinovani proteini sadrže različite segmente alfa-SN u tandemu.

[0148] Neka sredstva sadrže kombinovani protein u kome je C -terminalni fragment alfa-SN povezan sa njegovim N-krajem sa peptidnim nosačem. Kod takvih sredstava, C-terminalni ostatak fragmenta alfa-SN sadrži C-terminalni ostatak kombinovanog proteina. Prema tome, takvi kombinovani proteini su efikasni u indukovanju antitela koja se vezuju za epitop koji zahteva da C-terminalni ostatak alfa-SN bude u slobodnom obliku. Neka sredstva sadrže veliki broj ponovaka na C- terminalnom peptidu, kao što je SN125-140 povezan na N-terminusu sa jednom ili više kopija peptidnog nosača. Neki kombinovani proteini sadrže različite segmente alfa-SN u tandemu.

[0149] U nekim kombinovanim proteinima, NAC je spojen na njegovom N-terminalom kraju sa heterolognim peptidnim nosačem. NAC može da se koristi u C-terminalnim spajanjima. Neki kombinovani proteini sadrže heterologni peptid koji je spojen sa N-krajem ili C-krajem NAC, koji je zauzvrat povezan sa jednim ili više dodatnih NAC segmenata alfa-SN u tandemu. Neki kombinovani proteini sadrže višestruke kopije C-terminalnog alfa sinukleinskog peptida, kao što se gore navodi, i višestruke kopije heterolognih peptida koje su međuobno povezane jedna sa drugim.

[0150] Neki primeri kombinovanih proteina se prikazuju u tekstu ispod. Neki od ovih kombinovanih proteina sadrže segmente alfa-SN (uključujući bilo koje fragmente koji se opisuju gore u tekstu) koji su povezani sa epitopima tetanusnog toksoida kao što se opisuje u US 5,196,512, EP 378,881 i EP 427,347. Neki kombinovani proteini sadrže segmente alfa-SN koji su povezani sa najmanje jednim PADRE. Neki heterologni pepidi su promiskuitetni T-ćelijski epitopi, dok su drugi heterologni peptidi univerzalni Tćelijski epitopi. U nekim postupcima, sredstvo za davanje je jednostavno jedan kombinovani protein sa alfa-SN segmentom koji je povezan sa heterolognim segmentom u linearnoj konfiguraciji. Terapeutska sredstva mogu da se predstave formulom. Na primer, u nekim postupcima, sredstvo je multimer kombinovanih proteina koje je predstavljen formulom 2x, gde x je ceo broj od 1-5. Poželjno x je 1, 2, ili 3, pri čemu je 2 najpoželjniji. Kada je x dva, takav multimer ima četiri kombinovana proteina koja su spojena u poželjnoj konfiguraciji koja je poznata pod imenom MAP4 (videti US 5,229,490).

[0151] Konfiguracija MAP4 se prikazuje u tekstu ispod gde su razgranate strukure proizvedene iniciranjem sinteze pepida na oba, N kraju i aminima lizina u bočnom lancu. U zavisnosti od broja gde je lizin uključen u sekvencu i gde je omogućeno grananje, dobijena struktura će predstavljati brojne N krajeve. U ovom primeru, četiri indetična N kraja se proizvode u jezgru koji sadrži razgranati lizin. Takvo umnožavanje značajno pojačava responsivnost srodnih B ćelija.

[0152] Z se odnosi sa NAC peptid, fragment NAC peptida, ili drugi aktivni fragment alfa-SN kao što se opisuje u odeljku I.2 gore u tekstu. Z može da predstavlja više od jednog akivnog fragmenta, na primer:

Z = alfa-SN 60-72 (NAC region) peptid = NH2-KEQVTNVCGGAVVT-COOH (SEQ ID NO: 13) Z = alfa-SN 73-84 (NAC region) peptid = NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH (SEQ ID NO: 14) Z = alfa-SN 102-112 peptid = NH2-C-amino-heptanska kiselina-KNEEGAPCQEG-COOH (SEQ ID NO: 15) alfa-SN 128-140 peptid

[0153] Drugi primeri kombinovani proteina uključuju:

Z-Tetanusni toksoid 830-844 u MAP4 konfiguraciji:

Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 16)

Z-Tetanusni toksoid 947-967 u MAP4 konfiguraciji:

Z-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 17)

Z-Tetanusni toksoid830-844u MAP4 konfiguraciji:

Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 18)

Z-Tetanusni toksoid830-844+ Tetanusni toksoid 947-967 u linearnoj konfiguraciji:

Z-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 19)

[0154] PADRE peptid (svi u linearnim konfiguracijama), gde X je poželjno cikloheksilalanin, tirozin ili fenilalanin, pri čemu je cikloheksilalanin najpoželjniji-Z:

AKXVAAWTLKAAA-Z (SEQ ID NO: 20)

3Z-PADRE peptid:

Z-Z-Z-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 21)

[0155] Dalji primeri kombinovanih proteina uključuju:

AKXVAAWTLKAAA-Z-Z-Z-Z (SEQ ID NO: 22)

Z-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 23)

Z-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 24)

PKYVKQNTLKLAT-Z-Z-Z (SEQ ID NO: 25)

Z-PKYVKQNTLKLAT-Z (SEQ ID NO: 26)

Z-Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 27)

Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 28)

Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 31) na 2 razgranate smole:

EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 32)

(Sinukleinski fragment kombinovanog proteina u MAP-4 konfiguraciji)

[0156] Isti ili slični proteinski nosači i postupci povezivanja mogu da se koriste za dobijanje imunogena koji će se koristiti u dobijanju antitela koja su specifična prema alfa-SN za upotrebu u pasivnoj imunizaciji. Na primer, alfa-SN ili fragment koji je povezan sa nosačem može da se daje laboratorijskoj životinji u proizvodnji monoklonkih antitela koja su specifična prema alfa-SN.

4. Nukleinska kiselina koja kodira terapeutska sredstva

[0157] Imunski odgovori koji su specifični prema Levijevim telima mogu takođe da se indukuju davanjem nukleinkih kiselina koje kodiraju fragmente alfa-SN peptida, i njihovih fragmenata, drugi pepidnih imunogena, ili antitela i njihovih komponenti lanaca koje se koriste za pasivnu imunizaciju. Takve nukleinske kiseline mogu da budu DNK ili RNK. Segment nukleinske kiseline koja kodira imunogen je obično povezan sa regulatornim elementima, kao što je promotor i pojačivač koji omogućavaju ekspresiju DNK segmenta u namenjenim ciljnim ćelijama pacijenta. Za ekspresiju u ćelijama krvi, što je poželjno za indukciju imunskog odgovora, promotor i elementi pojačivača iz imunoglobulinskih gena teškog i lakog lanca ili glavnog trentunog ranog promotora CMV i pojačivača su pogodni za direktnu ekspresiju. Povezani regulatorni elementi i kodirajuće sekvence se često kloniraju u vektor. Za davanje dvolančanih-antitela, dva lanca mogu da se kloniraju u iste ili odvojene vekore. Nukleinska kiselina koja kodira terapeutska sredstva može takođe da kodira najmanje jedan T ćelijski epitop. Ovde navedeni prikaz koji se odnosi na upotrebu adjuvanasa i upotreba primenjuje “mutatis mutandis” za njihovu upotrebu sa nukelinskom kiselinom koja kodira terapeutska sredstva.

[0158] Dostupni su brojni virusni vektorski sistemi, uključujući retrovirusne sisteme (videti, npr., Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop.3, 102-109 (1993)); adenovirusne vektore (videti, npr., Bett et al., J. Virol.67, 5911 (1993)); adeno-vezane virusne vektore (videti, npr., Zhou et al., J. Exp. Med.179, 1867 (1994)), virusne vektore iz familije boginja uključujući vaccinia virus i viruse ptičjih boginja, virusne vektore iz roda alfa virusa kao što su oni koji su izvedeni iz Sindbis i Semliki Forest Virusa (videti, npr., Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), virus venecuelanskog encefalitisa konja (videti US 5,643,576) i rabdovirusi, kao što je vezikularni virus stomatitisa (videti WO 96/34625) i papilomavirusi (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et al., WO 94/12629 and Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res.24, 2630-2622 (1996)).

[0159] DNK koja kodira imunogen, ili vektor koji sadrži isti, može da se spakuje u lipozomima. Pogodni lipidi i povezani analozi se opisuju u US 5,208,036, US 5,264,618, US 5,279,833, i US 5,283,185. Vektori i DNK koja kodira imunogen mogu takođe da se apsorbuju ili vezuju sa nosačima čestica, primeri koji uključuju polimetil metakrilatne polimere i polilaktide i poli(laktid-ko-glikolide), (videti, npr., McGee et al., J. Micro Encap.1996).

[0160] Vektori genske terapije ili gole DNK mogu da se in vivo isporuče davanjem individualnom pacijentu, obično sistemskim davanjem (npr., intravenozno, intraperitonealno, nazalno, preko želuca, intradermalno, intramuskularno, subdermalno, ili intrakranijalnom infuzijom) ili topikalnom primenom (videti npr., US 5,399,346). Takvi vektori dalje mogu da uključe sredstva za olakšavanje kao što je bupivacin (videti npr., US 5,593,970). DNK može takođe da se daje upotrebom genskog pištolja. See Xiao & Brandsma, supra. DNK koja kodira imunogen se taloži na površini mikroskopskih metalnih kuglica. Mikroprojektili se ubrzavaju talasnim šokom ili širenjem helijumovog gasa, i prolaze u dubinu tkiva od nekoliko ćelijskih slojeva. Na primer, pogodan je The AccelTM uređaj za isporuku gena koji je napravljen od strane Agacetus, Inc. Middleton, WI. Alternativno, gola DNK može da prođe kroz kožu i u krvotok jednostavno ukapavanjem DNK na kožu sa hemijskom ili mehaničkom iritacijom (videti WO 95/05853).

[0161] U daljoj varijaciji, vektori koji kodiraju imunogene mogu ex vivo da se isporuče u ćelije, kao što su ćelije koje se uklanjaju iz individualnog pacijenta (npr., limfociti, aspirati iz koštane srži, i biopsije tkiva) ili univerzalne donorske hematopoetičke stem ćelije, nakon čega sledi ponovna implantacija ćelija u pacijenta, obično posle selekcije ćelija koje su inkorporisale vektor.

III. SREDSTVA ZA INDUKOVANJE IMUNOGENOG ODGOVORA PREMA Aβ

[0162] Aβ, koji je takođe poznat pod imenom β-amiloidni peptid, ili A4 peptid (videti US 4,666,829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), je peptid od 39-43 aminokiselina, koji je glavna komponenta karakteritičnih plakova u Alzhajmerovoj bolesti. Aβ se dobija obradom većeg proteina APP sa dva enzima, koja se zovu β i γ sekretaze (videti Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Poznate mutacije u APP koje su povezane sa Alzajmerovom bolesti se pojavljuju blizu mesta delovanja β ili γ sekretaze, ili unutar Aβ. Na primer, položaj 717 je blizu mesta isecanja APP γsekretazom tokom njegove obrade do Aβ, i položaji 670/671 su blizu mesta isecanja β-sekretazom. Veruje se da mutacije uzrokuju AD interakcijom sa mestima isecanja pomoću kojih se obrazuje Aβ tako da se poveća količina 42/43 oblika aminokiselina u dobijenom Aβ.

[0163] Aβ ima neobično svojstvo da može da se veže i aktivira i klasične i alternativne kaskade komplementa. Posebno, se vezuje za Clq i na kraju za C3bi. Ovo udruživanje olakšava vezivanje za makrofage koje dovodi do aktivacije B ćelija. Dodatno, C3bi se dalje odvaja i nakon toga se vezuje za

4

CR2 na B ćelijama na način koji zavisi od T ćelija što vodi do 10,000 povećanja u aktivaciji ovih ćelija. Ovaj mehanizam dovodi do toga da Aβ razvija imunski odgovor u višku u odnosu na druge antigene.

[0164] Aβ ima nekoliko prirodnih oblika. Humani oblici Aβ su poznati pod imenom Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 i Aβ43. Sekvence ovih peptida i njihova veza sa APP prekursorom su predstavljene na Sl.1 prema Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Na primer, Aβ42 ima sekvencu:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT (SEQ ID NO: 33)

[0165] Aβ41, Aβ40 i Aβ39 se razlikuju od Aβ42 izostavljanjem Ala, Ala-Ile, i Ala-Ile-Val redom iz C-terminalnog kraja. Aβ43 se razlikuje od Aβ42 prisustvom Thr ostatka na C-kraju.

[0166] Analogna sredstva sa onima koja se gore opisuju za alfa-SN se prethodno opisuju za Aβ (videti WO 98/25386 i WO 00/72880). Ova sredstva uključuju Aβ i njegove aktivne fragmente, konjugate Aβ, i konjugate aktivnih fragmenata Aβ, antitela koja su specifična prema Aβ i njihovi aktivni fragmenti (npr., mišja, humanizovana, humana, i himerna antitela), i nukleinske kiseline koje kodiraju lance antitela. Poželjni su aktivni fragmenti iz N-terminalne polovine Aβ. Poželjni imunogeni fragmenti uključuju Aβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, i 1-4. Oznaka Aβ1-5 na primer, ukazuje na fragment koji uključuje ostatke 1-5 Aβ i kome nedostaju drugi ostaci Aβ. Posebno su poželjini fragmenti koji počinju na ostacima 1-3 Aβ i završavaju se na ostacima 7-11 Aβ.

[0167] Ovde navedeni prikazi koji se odnose na sredstva za indukovanje aktivnog imunskog odgovora, sredstva za indukovanje pasivnog imunskog odgovora, konjugate, i nukleinske kiseline koje kodiraju terapeutska sredstva (videti Odeljke II.1, 2, 3, i 4, gore) primenjuju “mutatis mutandis” za upotrebu Aβ i njegovih fragmenata. Ovde navedeni prikazi koji se odnose na sredstva za indukovanje aktivnog imunskog odgovora, sredstva za indukovanje pasivnog imunskog odgovora, konjugate, i nukleinske kiseline koje kodiraju terapeutska sredstva (videti Odeljke II. 1, 2, 3, i 4, gore) primenjuju “mutatis mutandis” za upotrebu Aβ i njegovih fragmenata. Ovde navedeni prikazi koji se odnose na pacijente koji mogu da se prilagode terapiji, i režimima tremana (videti Odeljke IV i V, ispod) primenjuju “mutatis mutandis” za upotrebu Aβ i njegovih fragmenata.

[0168] Razdvojeni Aβ ili njegovi fragmenti označavaju monomerne peptidne jedinice. Razdvojeni Aβ ili njegovi fragmenti su generalno rastvorljivi, i sposobni su za samo-nakupljanje da bi se obrazovali rastvorljivi oligomeri. Oligomeri Aβ i njegovi fragmenti su uglavnom rastvorljivi i predominantno se nalaze u obliku alfa-heliksa ili su slučajno uvijeni. Nakupljeni Aβ ili njegovi fragmenti, označavaju oligomere alfa-SN ili njegovih fragmenata koji su se udružili u nerastvorljive nakupine beta-ploča. Nakupljeni Aβ ili njegovi fragmenti, takođe označavaju fibrilne polimere. Fibrili su obično nerastvorljivi. Neka antitela vezuju ili rastvorljivi Aβ ili njegove fragmente ili nakupljeni Aβ ili njegove fragmente. Neka antitela vezuju i rastvorljivi Aβ ili njegove fragmente i nakupljeni Aβ ili njegove fragmente. Neki primeri konjugata uključuju:

AN90549 (Aβ1-7-Tetanusni toksoid 830-844 u MAP4 konfiguraciji): (SEQ ID NO: 34) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL

AN90550 (Aβ 1-7-Tetanusni toksoid 947-967 u MAP4 konfiguraciji):

DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 35)

AN90542 (Aβ 1-7-Tetanusni toksoid 830-844 947-967 u linearnoj konfiguraciji): DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 36)

AN90576: (Aβ3-9)-Tetanusni toksoid 830-844 u MAP4 konfiguraciji):

EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 37)

[0169] PADRE peptid (svi u linearnim konfiguracijama), gde je X poželjno cikloheksilalanin, tirozin ili fenilalanin, gde je najpoželjniji cikloheksilalanin:

AN90562 (PADRE-Aβ1-7): AKXVAAWTLAAA-DAEFRHD (SEQ ID NO: 38)

AN90543 (3 PADRE-Aβ1-7): DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 39)

[0170] Drugi primeri kombinovanih proteina (imunogeni epitop Aβ je podebljan) uključuju:

AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 40)

DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 41)

DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 42)

FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 43)

EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 44)

PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 45)

DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO: 46)

DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 47)

DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 48)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 51)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO: 52)

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 53) na 2 razgranate smole.

[0171] Poželjna monoklonska antitela se vezuju za epitope koji se nalazi unutar ostataka 1-10 Aβ (sa prvim N terminalnim ostatkom prirodnog Aβ koji je naznačen 1). Neka poželjna monoklonska antitela se vezuju za epitop unutar aminokiselina 1-5, i neka za epitop unutar 5-10. Neka poželjna antitela se vezuju za epitope koji se nalaze unutar aminokiselina 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 ili 3-7. Neka poželjna antitela se vezuju za epitop koji počinje na ostacima 1-3 i završava se na ostacima 7-11 Aβ. Druga antitela uključuju ona koja se vezuju za epitope koji se nalaze unutar ostataka 13-280 (npr., monoklonsko antitelo 266). Poželjna anitela su humanog IgG1 izotipa.

IV. SKRINING ANTITELA ZA AKTIVNOST UKLANJANJA

[0172] Prikaz obezbeđuje postupke skrininga antitela koja imaju aktivnost u uklanjanju Levijevog tela ili bilo kojeg drugog anigena, ili je povezana sa biološkim entitetom, za kojeg je poželjna aktivnost uklanjanja. Da bi se ispitala akivnost prema Levijevom telu, uzorak tkiva iz mozga pacijenta sa PD ili životinjskim modelom koji ima karakteristike Parkinsonove patologije se dovodi u kontakt sa fagocitnim ćelijama koje imaju Fc receptor, kao što su mikroglijalne ćelije, i antitelo koje se ispituje u medijumu in vitro. Fagocitne ćelije mogu da budu iz primarne kulture ili ćelijske linije, kao što je BV-2, C8-B4, ili THP-1. U nekim postupcima, komponente se kombinuju na mikroskopskoj pločici da bi se olakšalo praćenje pod mikroskopom. U nekim postupcima, brojne reakcije se izvode paralelno u bunarićima mikrotitarske posude. U takvom formatu, odvojena minijaturna mikrokopska ploča može da se montira u odvojenim bunarićima, ili u nemikroskopskom formatu za detekciju, pri čemu može da se koristi ELISA detekcija alfa-SN. Poželjno, izvode se serije merenja količine Levijevog tela u vitro reakcionoj smeši, sa početkom od osnovnog nivoa pre nastavljanja reakcije, i jedne ili više ispitivane vrednosti tokom reakcije. Antigen može da se detektuje bojenjem, na primer, sa fluorescentno obeleženim antitelom koje je specifično za alfa-SN ili druge komponente LB-a. Antitelo koje se koristi za bojenje može ili ne mora da bude isto kao antitelo koje se ispituje za akivnost uklanjanja. Smanjenje u odnosu na osnovni nivo tokom reakcije LB-a ukazuje da antitelo koje se ispituje ima aktivnost uklanjanja. Takva antitela su verovatno korisna u prevenciji ili lečenju PD i drugih LBD.

[0173] Analogni postupci mogu da se koriste za skrining antitela za aktivnost u uklanjanju drugih bioloških entiteta. Test može da se korsti za detekciju akivnosti uklanjanja prema bilo kom biološkom entitetu. Obično, biološki entitet ima neku ulogu u životinjskog ili humanoj bolesti. Biološki entitet može da se obezbedi kao uzorak tkiva ili u izolovanom obliku. Ukoliko je obezbeđen kao uzorak tkiva, uzorak tkiva poželjno nije fiksiran da bi se omogućio brzi pristup komponentama u tkivnom uzorku i da bi se izbeglo ometanje konformacije komponenata koje proizilazi iz fiksiranja. Primeri uzoraka tkiva koji mogu da se ispituju u ovom tekstu uključuju kancerozno tkivo, prekancerozno tkivo, tkivo koje sadrži benigni rast kao što su bradavice ili mladeži, tkivo koje je inficirano sa patogenim mikroorganizmima, tkivo koje je infiltrirano sa ćelijama koje su dominantne kod zapaljenja, tkivo koje ima patološke matrikse između ćelija (npr., fibrinozni perikarditis), tkivo koje nosi aberantne antigene, i tkivo ožiljka. Primeri izolovanih biološki entiteta koji mogu da se korite uključuju alfa-SN, virusne antigene ili viruse, proteoglikane, antigene drugih patogenih mikroorganizama, tumorske antigene, i

4

adhezione molekule. Takvi antigeni mogu da se dobiju iz prirodnih izvora, rekombinovanom ekspresijom ili hemijskom sintezom, između drugih sredstava. Tkivni uzorak ili drugi izolovani biološki entitet se dovodi u kontakt sa fagocitnim ćelijama koje imaju Fc receptore, kao što su monociti ili mikroglijalne ćelije, i antitelom koje treba da se testira u medijumu. Antitelpo može da bude usmereno prema biološkom entitetu koji se ispituje ili prema antigen koji je povezan sa entitetom. U zadnjoj situaciji, cilj je da se ispita da li se biološki entitet posredno fagocituje sa antigenom. Obično, iako nije neopodno, antitelo i biološki entitet (nekada sa povezanim antigenom) semeđusobno dovode u kontakt pre dodavanja fagocitnih ćelija. Koncentracija biološkog eniteta i/ili povezanog antigena, ukoliko postoji, ostaje u medijumu i zatim se prati. Smanjenje u količini ili koncentraciji antigena ili povezanog biološkog entiteta u medijumu ukazuje na to da antitelo ima odgovor uklanjanja prema antigenu i/ili povezanom biološkom entitetu zajedno sa fagocinim ćelijama.

[0174] Antitela ili druga sredstva mogu takođe da se ispitaju za aktivnost uklanjanja Levijevih tela upotrebom in vitro testa koji se opisuje u Primeru II. Nervne ćelije koje su transfektovane sa ekspresionim vektorom koji eksprimira sinukleinski oblik sinukleinskih inkluzija koje mogu mikroskopski da se vizuelizuju. Aktivnost antitela ili drugog sredstva u uklanjanju takvih inkuzija može da se odredi poređenjem pojavljivanja ili nivoa sinukleina u transfektovanim ćelijama koje se tretiraju sa agensom sa pojavljivanjem ili nivoom sinukleina u kontrolnim ćelijama koje se ne tretiraju sa sredstvom. Smanjenje u veličini ili intenzitetu sinukleinskih inkluzija ili smanjenje u nivou sinukleina signalizira aktivnost uklanjanja sinukleina. Aktivnost može da se prati ili pomoću mikroskopa vizuelizovanjem sinukleinkih inkluzija ili izvođenjem ćelijski ekstrakta na gelu i vizuelizovanjem sinukleinske trake. Kao što je navedeno u Primeru 1, odeljku 2, promena u nivou sinukleina je najizraženija ukoliko su ekstrakti frakcionisani u citoplazmine i membranske frakcije, i kada se analizira membranska frakcija.

[0175] Antitela ili druga sredstva mogu takođe da se ispitaju za aktivnost u uklanjanju Levijevih tela upotrebom in vivo testa koji se opisuje u Primeru IX. Ukratko, antitelo koje se ispituje se injekcijom ubacuje u neokortekst transgenih miševa koji u višku eksprimiraju humani α-sinuklein i imaju intranervne nakupine α-sinukleina. U jednom pristupu, životinje koje se koriste u starosti 4 do 8 meseci heterozigoni transgeni miševi koji u višku eksprimiraju humani α-sinuklein divljeg tipa u mozgu pod transkripcionom kontrolom PDGF promotora (videti Maliah, 2000, Science 287:1265-69). Antitelo koje se ispituje i kontrole (npr., irelevantna, kontrolna antitela sa izotipom koji se poklapa) se rastvore u odgovarajućem rastvoru (npr., sterilni slain rastvor koji je puferisan fosfatom) za injekciju u miševe. Za svakog miša, 2 µl od 2 mg/ml rastvora antitela se stereotaktički ubrizgava pod anestezijom u duboke slojeve parietalnog neokorteksta u desnoj polovini mozga (ipsilateralna strana). Leve hemisfere (kontralateralna strana) ima ulogu osnovne kontrole za svakog miša. Mesta ubrizgavanja se zatvaraju i miševi se prate dok se ne oporave od anestezije. Dve nedelje posle injekcije, miševi se eutanizuju, njihovi mozgovi se uklanjaju i fiksiraju u 4% paraformaldehidu 48 h, i koronalno seku u debljini od 40 µm. Preseci oko mesta injekcije se boje sa α-sinukleinkim antielom (npr., ELADW-47, koje prepoznaje α-sinukleinske aminokiseline 115-122). Za svaki presek, intraneuronalne nakupine α-sinukleina se broje u 4 mikroskopska polja (uveličanje 20x) oko mesta injekcije u ipsilateralnoj polovini, i u 4 polja koja odgovraraju poljima u kontralateralnoj kontrolnoj polovini. Za svaku životinju, brojevi nakupina αsinukleina za dva preseka se sabiraju i razlika između ukupnog broja nakupljenog α-sinukleina između dve polovine je da se odredi efekat antitela koje se ispituje na uklanjanje nakupljanja za svakog individualnog miša. Smanjenje u ukupnom broju nakupljanja α-sinukleina u tretiranoj polovini ukazuje da antitela ili drugo sredstvo ima aktivnost u uklanjanju Levijevih tela. Poželjno se uočava smanjenje od najmanje 10%. Poželjnije se uočava smanjenje od najmanje 20%, najmanje 40%, najmanje 60% ili najmanje 80%.

V. PACIJENTI KOJI SU PODLOŽNI REŽIMIMA TRETMANA SA KOMONENTOM ANTI-LEVIJEVOG TELA

[0176] Pacijenti koji su podložni tretmanu uključuju individue koje se nalaze u riziku sinukelinopatske bolesti ali ne pokazuju simptome, kao i pacijente koji trenutno pokazuju simptome. Pacijenti koji su podložni tretmanu takođe uključuju individue koje se nalaze u riziku bolesti LBD ali ne pokazuju simptome, kao i pacijenti koji trenutno pokazuju simptome. Takve bolesi uključuju Parkinsonovu bolest (uključujući idiopatsku Parkinsonovu bolest), DLB, DLBD, LBVAD, čisti autonomni pad, disfagiju Levijevih tela, sporedni LBD, nasledni LBD (npr., mutacije u alfa-SN genu, PARK3 i PARK4) I arofiju višestrukih sistema (npr., olivopontocereberalna atrofija, striatonigralna degeneracija i Shy-Drager sindrom). Prema tome, predmetni postupci mogu da se primene profilaktički na individue koje imaju poznati genetki rizik LBD. Takve individue uključuju one koje imaju rođake koji su imali ovu bolest, I one kod kojih se rizik određuje analizom genetičkih ili biohemijskih markera. Genetički marker rizika prema PD uključuju mutacije prema u genima koji kodiraju za sinuklein ili Parkin, UCHLI, i CYP2D6; posebno mutacije na položaju 53 gena koji kodira sinuklein. Individue koje su trenutno obolele od Parkinsonove bolesti mogu da se prepoznaju prema njihovim klinički ispoljenim karakteristikama uključujući tremor u mirovanju, mišićnu rigidnost, bradikineziju i posturalnu nestabilnost.

[0177] U nekim postupcima, nema kliničkih simptoma, znakova i/ili faktora rizika bilo koje amiloidogene bolesti i oboljevanja od najmanje jedne sinukleinopatske bolesti. U nekim postupcima, pacijent ne ispoljava kliničke simptome, karakteristične znakove i/ili faktore rizika bilo koje bolesti koja se karakteriše vanćelijskim amiloidnim depozitima. U nekim postupcima, pacijent nema bolesti koje se karakterišu amiloidnim depozitima Aβ peptida. U nekim postupcima, pacijent nema kliničke simptome, znakove i/ili faktore rizika Alchajmerove bolesti. U nekim postupcima, pacijent nema kliničke simptome, znakove i/ili faktore rizika Alchajmerove bolesti, narušavanja u kognitivnom sistemu, blagog kognitivnog narušavanja i Daunovog sindroma. U nekim postupcima, pacijent istovremeno ima Alchajmerovu bolest i bolest koja se karakteriše Levijevim telima. U nekim postupcima, pacijent istovremeno ima Alchajmerovu bolest i bolest koja se karakteriše nakupljanjem sinukleina. U nekim postupcima, pacijent istovremeno ima Alchajmerovu bolest i Parkinsonovu bolest.

[0178] Kod asimptomatskih pacijenata, tretman može da počne u bilo kom starosnom dobu (npr., 10, 20, ili 30). Obično, međutim, nije neophodno započinjanje sa tretmanom dok pacijent ne dostigne 40, 50, 60, ili 70. Tretman obično podrazumeva višestruke doze u vremenskom periodu. Tretman može da se prati ispitivanjem antitela, ili aktiviranjem T-ćelijskih ili B-ćelijskih odgovora prema terapeutskom sredstvu (npr., alfa-SN peptid ili Aβ, ili oba) tokom vremena. Ukoliko ne dođe do odgovora, nagovešteno je dodatno doziranje (engl. booster).

[0179] Opciono, prisustvo ili odsustvo simptoma, znakova ili faktora rizika bolesti se određuje pre početka tretmana.

VI. PACIJENTI KOJI SU PODLOŽNI REŽIMIMA TRETMANA ANTI-AMILOIDOM KOMPONENTOM

4

[0180] Pacijenti koji su podložni tretmanu uključuju individue koje se nalaze u riziku od razvijanja bolesti ali nemaju simptome, kao i pacijenti koji trenutno pokazuju simptome amiloidoze. U slučaju Alhajmerove bolesti, skoro svako se nalazi u riziku dobijanja Alzhajmerove bolesti ukoliko on ili ona živi dovoljno dugo. Prema tome, postupci iz prikaza mogu da se daju profilaktički generalnoj populaciji bez potrebe za procenjivanjem bilo kojeg rizika kod subjekta pacijenta. Predmetni postupci u naročito korisni za individue koje imaju poznati genetski rizik od razvijanja Alzhajmerove bolesti ili bilo koje druge nasledne amiloidne bolesti. Takve individue uključuju one koji imaju rođake koji su imali bolest, i kod kojih se rizik određuje analizom genetičkih ili biohemijskih markera. Genetički marker rizika prema Alzhajmerovoj bolesti uključuju mutacije u APP genu, posebno mutacije na položaju 717 i položaju 670 i 671 na koje se poziva kao na odgovarajuće Hardijeve i švedske mutacije (videti Hardy, TINS, supra). Drugi marker rizika su mutacije u genima koji kodiraju presenilin, PS1 i PS2, i ApoE4, porodična istorija AD, hiperholesterolemija ili arteroskleroza. Individuje koje su trenutno obolele od Alzhajmerove bolesti mogu da se prepoznaju prema karakterističnoj demenciji, i prisustvom faktora rizika koji se gore opisuju. Dodatno, brojni dijagnostički testovi su dostupni za identifikovanje individua koje imaju AD. Oni uključuju merenje nivoa CSF tau i Aβ42. Povišeni tau i smanjeni Aβ42 nivoi označavaju prisustvo AD. Individue koje su obolele od Alchajmerove bolesti mogu takođe da se dijagnostifikuju sa MMSE ili ADRDA kriterijumom kao što se razmatra u odeljku Primera. Kod asimptomatskih pacijenata, tretman može da počne u bilo kom dobu (npr., 10, 20, 30). Obično, međutim, nije neopodno sa se počne sa tretmanom pre nego što pacijent napuni 40, 50, 60 ili 70. Tretman obično podrazumeva višestruke doze u vremenskom periodu. Tretman može da se prati ispitivanjem antitela, ili aktiviranih T-ćelijskih ili B-ćelijskih odgovora prema terapeutskom sredstvu (npr., NAC) tokom vremena, zajedno sa redovima koji se opisuju u VII Postupcima za praćenje i dijagnozu, u tekstu ispod. Ukoliko ne dođe do odgovora, naznačena je dodatna doza.

VII. REŽIMI TRETMANA

[0181] Generalno režimi tretmana uključuju davanje sredstva koje je efikasno za indukovanje imunogenog odgovora prema alfa-SN i/ili sredstva koje je efikasno za indukovanje imunogenog odgovora prema Aβ kod pacijenta. U profilaktičkim primenama, farmaceuske kompozicije ili medicinska sredstva se daju pacijentu koji je podložan, ili se na drugi način nalazi u riziku razvijanja LBD ili druge sinukleopatske bolesti u režimu koji obuvata količinu i učestalost davanja kompozicije ili medicinskog sredstva koje je dovoljno da eliminiše ili smanji rizik, umanji ozbiljnost simptoma, ili odloži početak razvijanja bolesti, uključujući fiziološke, biohemijske, histološke i/ili ponašajne simptome bolesti, njihove komplikacije i intermedijarne patološke fenotipove koji su prisutni tokom razvijanja bolesti. U terapeutskim primenama, kompozicije ili lekovi se daju pacijentu koji je podložan, ili već ima bolest u režimu koji sadrži količinu i učestalost davanja kompozicije koja je dovoljna da izleči, ili najmanje delom zaustavi, simptome bolesti (fiziološke, biohemijske, histološke i/ili ponašajne), uključujući njihove komplikacije i intermedijarne patološke fenotipove koji su prisutni tokom razvijanja bolesti. Na primer, u nekim postupcima lečenje pogađa najmanje delom uklanjanje Levijevih tela, ili najmanje delom razlaganje Levijevih tela i/ili smanjuje nivoe oligomera alfa-sinukleina u sinapsama. Količina koja je dovoljna da bi se postigao terapeutski ili profilaktički tretman se definiše kao terapeutska ili profilaktički efikasna doza. Kombinovanje količine i učestalosti doze koja je adekvatna da se postigne terapeutski ili profilakički tretman se defininiše kao terapeutski ili profilaktički efikasan režim. U oba, profilaktičkim i terapeutskim režimima, sredstva se obično daju u nekoliko doza dok se

4

ne postigne odgovarajući imunski odgovor. Obično, imunski odgovor se prati i ponovljene doze se daju ukoliko imunski odgovor počne da slabi.

[0182] U nekim postupcima, davanje sredstva dovodi do smanjenja intraćelijskih nivoa u nakupljenom sinukleinu. U nekim postupcima, davanje sredstva dovodi do poboljšanja u kliničkom simptomu LBD, kao što je motorička funkcija u slučaju Parkinsonove bolesti. U nekim postupcima, smanjenje u intraćelijskim nivoima nakupljenog sinukleina ili unapređenje u kliničkom simptomu bolesti se prati u intervalima posle davanja sredstva.

[0183] Efikasne doze kompozicija predmetnog pronalaska, za lečenje gore opisanih stanja se razlikuju u zavisnosti od mnogih različitih faktora, uključujući načine davanja, ciljnog mesta, fiziološkog stanja pacijenta, od toga da li je pacijent čovek ili životinja, drugih medicinskih sredstava koja se daju, i od toga da li je tretman profilaktički ili terapeutski. Obično, pacijent je čovek ali takođe mogu da se tretiraju nehumani sisari uključujući transgene sisare. Doze tretmana moraju da se titriraju kako bi se optimizovala bezbednost i efikasnost. Količina imunogena zavisi od toga da li se takođe daje adjuvans, pri čemu su u odsustvu adjuvansa potrebne veće doze. Količina imunogena za davanje se nekad razlikuje od 1-500 µg po pacijentu i obično od 5-500 µg po injekciji za davanje čoveku. Povremeno, se koristi veća doza od 1-2 µg po injekciji. Obično oko 10, 20, 50 ili 100 µg se koristi za svaku humanu injekciju. Masa imunogena takođe zavisi od mase odnosa imunogenog epitopa unutar imunogena prema masi ukupnog imunogena. Obično, 10-3 do 10-5 mikromola imunogenog peptida se koristi za mikrogram imunogena. Vreme davanja injekcija može značajno da se razlikuje od jednom dnevno, do jednom godišnje, do jednom u deset godina. U bilo kom datom danu u kome se doza imunogena daje, doza je veća od 1 µg/pacijentu i obično veća od 10 µg/pacijentu ako se adjuvans takođe daje, i veća od 10 µg/pacijentu i obično veća od 100 µg/pacijentu u odsustvu adjuvansa. Tipičan režim se sastoji od imunizacije koju prate dodatne (engl. booster) injekcije u vremenskim intervalima, kao što su intervali od 6 nedelja. Drugi režim se sastoji iz imunizacije koju prate dodatne injekcije 1, 2 i 12 meseci kasnije. Drugi režim podrazumeva doživotno davanje injekcije na svaka dva meseca. Alternativno, dodatno injekcije mogu da budu na neregularnoj osnovi kao što je pokazano praćenjem imunskog odgovora.

[0184] Za pasivnu imunizaciju sa antitelom, opsezi doza su od 0,0001 do 100 mg/kg, i običnije 0,01 do 5 mg/kg, telesne težine domaćina. Na primer doze mogu da budu 1 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili unutar opsega 1-10 mg/kg ili, drugim rečima, 70 mg-a ili 700 mg-a ili unuar opsega 70-700 mg-a, redom, za pacijenta koji ima 70 kg. Primer režima tretmana podrazumeva davanje jednom na svake dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom svakih 3 do 6 meseci. U nekim postupcima, dva ili više monoklonskih antitela sa različitim specifičnostima vezivanja se daju istovremeno, gde se doza svakog antitela koje se daje nalazi unutar navedenih opsega. Antitelo se obično daje u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu da budu nedeljni, mesečni ili godišnji. Intervali takođe mogu da budu nepravilni kao što je indikovano merenjem u krvi pacijenta nivoa antitela koje je specifično za alfa-SN. U nekim postupcima, doza je podešena da se postigne koncentracija antitela u plazmi 1-1000 ug/ml i u nekim posupcima 25 - 300 ug/ml. Alternativno, antitelo može da se daje kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u slučaju gde je potrebno manje često davanje. Doza i učestalost se razlikuju u zavisnosti od polu-života antitela u pacijentu. Generalno, humana antitela pokazuju najduži polu-život, zatim slede humanizovana antitela, himerna antitela, i nehumana antitela. Doza i učestalost davanja može da se razlikuje u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapeutski. U profilaktičkim primenama, relativno niska doza se daje u relativno retkim intervalima u dužem

4

vremenskom periodu. Neki pacijenti nastavljaju da dobijaju tretman do kraja njihovih života. U terapeutskim primenama, relativno visoka doza u relativno kratkim intervalima je nekada potrebna, dok je napredovanje bolesti smanjeno ili ograničeno, i poželjno dok pacijent pokazuje delimično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu može da se daje profilaktički režim.

[0185] Doze za nukleinske kiseline koje kodiraju imunogene imaju opseg od oko 10 ng do 1 g, 100 ng do 100 mg, 1 µg do 10 mg, ili 30-300 µg DNK po pacijentu. Doze za infektivne virusne vektore variraju od 10-100, ili više, viriona po dozi.

[0186] Sredstva za indukovanje imunkog odgovora mogu da se daju parenteralnim, topikalnim, intravenoznim, oralni, subutanim, intraarterialnim, intrakranijalnim, intratekalnim, intraperitonealnim, intranazalnim ili intramuskularnim načinima davanja za profilaktički i/ili terapeutski tretman. Najuobičajeniji način davanja imnogenog sredstva je subkutani, pored toga što drugi načini davanja mogu da budu jednako efikasni. Sledeći uobičajeni način davanja je davanje intramuskularne injekcije. Ovaj tip injekcije se najčešče izvodi u mišićima ruke ili noge. U nekim postupcima, sredstva se injeciraju u određeno tkivo u kome su depoziti, na primer intrakranijalna injekcija. Za davanje antitela je poželjna intramuskularna injekcija ili intravenozna infuzija. U nekim posupcima, posebna terapeutska antitela se injekcijom daju direktno u kranijum. U nekim postupcima, antitela se daju kao kompozicije sa produženim oslobađanjem ili pomoću uređaja, kao što je MedipadTM uređaj.

[0187] Kao što je gore navedeno, sredstva koja indukuju imunski odgovor prema alfa-SN i Aβ redom mogu kombinovano da se daju. Sredstva mogu da se kombinuju u jednom preparatu ili kitu za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu. Sredstva mogu da zauzimaju različite bočice u preparatu ili kitu ili mogu da se kombinuju u jednoj bočici. Ova sredstva mogu po potrebi da se daju sa drugim sredstvima koja su najmanje delom efikasna u lečenju LBD. U slučaju Parkinsonove bolesti i Daunovog sindroma, u kojima se LB-a pojavljuju u mozgu, sredstva iz pronalaska mogu takođe da se daju zajedno sa drugim sredstvima koja povećavaju prolaz sredstava iz pronalaska kroz krvno-moždanu barijeru.

[0188] Imunogena sredstva, kao što su peptidi, se nekada daju kombinovano sa adjuvansom. Niz adjuvanasa mogu da se koriste kombinovano sa peptidima, kao što je alfa-SN, da bi se stimulisao imunski odgovor. Poželjni adjuvansi uvećavaju unutrašnji odgovor prema imunogenu bez uzrokovanja konformacionih promena u imunogenu koji deluju na kvalitativni oblik odgovora. Poželjni adjuvansi uključuju aluminijum hidroksid i aluminijum fosfat, 3 De-O-acilovani monofosforil lipid A (MPLTM) (videti GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, sada deo Corixa). StimulonTM QS-21 je triterpen glikozid ili saponin koji je izolovan iz kore Quillaja Saponaria Molina drveta koje se nalazi u Južnoj Americi (videti Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US Patent No. 5,057,540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Drugi adjuvansi su emulzije ulja u vodi (kao što je skvalen ili ulje kikirikija), opciono kombinovano sa imunskim stimulansima, kao što je monofosforil lipid A (videti Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)), pluronski polimeri, i ubijene mikobakterije. Drugi adjuvans je CpG (WO 98/40100). Alternativno, alfa-SN ili Aβ mogu da budu spojeni sa adjuvansom. Međutim, takvo spajanje ne treba u suštini da izmeni konformaciju alfa-SN tako da još utiče na prirodu

4

imunskog odgovora. Adjuvansi mogu da se daju kao komponenta terapeutske kompozicije sa aktivnim sredstvom ili mogu da se daju odvojeno, pre, istovremeno sa, ili posle davanja terapeutskog sredstva.

[0189] Poželjna klasa adjuvanasa su soli aluminijuma (alum), kao što je alum hidroksid, alum fosfat, alum sulfat. Takvi adjuvansi mogu da se koriste sa ili bez drugih specifičnih imunostimulirajućih sredstava kao što su MPL ili 3-DMP, QS-21, polimerne ili monomerne aminokiseline kao što je poliglutaminska kiselina ili polilizin. Druga klasa adjuvanasa su is emulzije formulacija ulja-u-vodi. Takvi adjuvansi mogu da se koriste sa ili bez drugih specifičnih imunostimulirajućih sredstava kao što su muramil peptidi (npr., N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izo-glutamin (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2- 2’dipalmitoilsn-glicero-3-hidroksi-fosforiloksi)-etilamin (MTP-PE), N-acetilglukzaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoksi propilamid (DTP-DPP) teramidTM), ili druge komponente bakterijskog ćelijskog zida. Emulzije ulja-u vodi uključuju (a) MF59 (WO 90/14837), koji sadrži 5% Skvalen, 0,5% Tween 80, i 0,5% Span 85 (koji opciono sadrži različite količine MTP- PE) koje su formulisane u podmikronske čestice upotrebom mikrofluidizera kao što je Model 110Y mikrofluidizer (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, koji sadrži 10% Skvalen, 0,4% Tween 80, 5% pluronki-blokatorski polimer L<121>, i thr-MDP, ili mikrofluidiziran u podmikronskoj emulziji ili vorteksovan da se dobije emulzija sa većom veličinom čestica, i (c) RibiTM sistemom adjuvansa (RAS), (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT) koji sadrži 2% skvalen, 0.2% Tween 80, i jednu ili više komponenti bakterijskog ćelijskog zida iz grupe koja se sastoji od monofosforillipida A (MPL), trehaloza dimikolata (TDM), i skeleta ćelijskog zida (CWS), poželjno MPL CWS (DetoksTM).

[0190] Druga klasa poželjnih adjuvanasa u saponski adjuvansi, kao što je StimulonTM (QS-21, Aquila, Framingham, MA) ili čestice koje se od njih dobijaju kao što su ISCOMs (imunostimulišući kompleksi) i ISCOMATRIX. Drugi adjuvansi uključuju RC-529, GM-CSF i kompletni Frojndov adjuvans (CFA) i nekompletni Frojndov adjuvans (IFA). Drugi adjuvansi uključuju citokine, kao što su interleukini (npr., IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL13, i IL-15), i faktor koji stimuliše kolonije makrofaga (M-CSF), faktor koji stimuliše kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), i faktor nekroze tumora (TNF). Druga klasa adjuvanasa su glikolipidni analozi uključujući N-glikozilamide, N-glikoziluree i N- glikoilkarbamate, gde svaki ima supstituciju na ostatku šećera sa aminokiselinom, kao imuno-modulatorima ili adjuvansima (videti US Pat. No.4,855,283). Proteini toplotnog šoka, npr., HSP70 i HSP90, mogu takođe da se koriste kao adjuvansi.

[0191] Adjuvans može da se daje sa imunogenom u jednoj kompoziciji, ili može da se daje pre, istovremeno sa ili posle davanja imunogena. Imunogen i adjuvans mogu da se pakuju i dostave u istoj bočici ili mogu da se pakuju u odvojenim bočicama i mešaju pre uporebe. Imunogen i adjuvans se obično pakuju sa oznakom koja ukazuje na namenjenu terapeutsku primenu. Ukoliko se imunogen I adjuvans pakuju odvojeno, pakovanje obično uključuje instrukcije za mešanje pre upotrebe. Izbor adjuvansa i/ili nosača zavisi od stabilnosti imunogene formulacije koja sadrži adjuvans, načina davanja, rasporeda davanja doza, efikasnosti adjuvansa kod vrsta koje se vakcinišu, i, kod ljudi, farmaceutki prihvatljivi adjuvans je onaj koji je odobren ili je dozvoljena primena na ljudima od strane odgovarajućih regulatornih tela. Na primer, kompleti Frojndov adjuvans nije pogodan za davanje ljudima. Alum, MPL i QS-21 su poželjni. Opciono, dva ili više različiti adjuvanasa mogu istovremeno da se koriste. Poželjne kombinacije uključuju alum sa MPL, alum sa QS-21, MPL sa QS-21, MPL ili RC-529 sa GM-CSF, i alum, QS-21 i MPL zajedno. Takođe, može da se koristi nekompletni Frojndov adjuvans

4

(Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), po potrebi kombinovano sa bilo kojim od alum, QS-21, i MPL i svim njihovim kombinacijama.

[0192] Agensi se često daju kao farmaceutke kompozicije koje sadrže aktivno terapeusko sredstvo, tj., i niz drugih farmaceutki prihvatljivih komponenata. Videti Remington’s Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). Prema tome, bilo koje sredstvo (npr., fragment alfa sinukleina ili antitelo koje se specifično vezuje za alfa sinuklein) može da se koristi u dobijanju leka za lečenje sinukleinopatske bolesti. Poželjni oblik zavisi od namenjenog načina davanja i terapeutske primene. Kompozicije mogu takođe da uključe, u zavisnosti od željene formulacije, farmaceutski-prihvatljive, ne-toksične nosače ili rastvarače, koji se definišu kao nosači koji se uobičajeno koriste u formulisanju farmaceutkih kompozicija za davanje životinjama ili ljudima. Rastvarač se bira na način da ne utiče na biološku aktivnost kombinacije. Primeri takvih rastvarača u destilovana voda, fiziološki slani rastvor koji je puferisan fosfatom, Ringerovi rastvori, rastvor detroze, i Henkov rastvor. Dodatno, farmaceutska kompozicija formulacije može takođe da uključi druge nosače, adjuvanse, ili netoksične, neterapeutske, neimunogene stabilizatore i slično.

[0193] Farmaceutske kompozicije takođe mogu da uključe velike, makromolekule koji sporo metabolišu kao što su proteini, polisaharidi kao što je hitozan, polimlečne kiseline, poliglikolne kiseline i kopolimere (kao što je lateksom fukcionalizovana sefaroza(TM), agaroza, celuloza, i slično), polimerne aminokiseline, kopolimere aminokiselina, i. lipidne agregati (kao što su uljane kapice ili lipozomi). Dodatno, ovi nosači mogu da funkcionišu kao imunostimulirajuća sredstva (tj., adjuvansi).

[0194] Za parenteralno davanje, sredstva mogu da se daju kao injektabilne doze rastvora ili suspenzije supstance u fiziološki prihvatljivom rastvaraču sa farmaceutskim nosačem koji može da bude sterilna tečnost kao što su vodena ulja, rastvor soli, glicerol, ili etanol. Dodatno, pomoćne supstance, kao što su sredstva za vlaženje ili emulgovanje, surfaktante, supstance za puferovanje pH i slično mogu da se nalaze u kompozicijama. Druge komponente farmaceutskih kompozicija su poput petroleuma, životinjskog, biljnog, ili sintetičkog porekla, na primer, ulje kikirikija, sojino ulje, i mineralno ulje. Generalno, glikoli kao što su propilen glikol ili polietilen glikol su poželjni tečni nosači, posebno za rastvore koji se daju injekcijom. Antitela mogu da se daju u obliku depot injekcije ili implant preparata koji može da se formuliše na takav način da omogući odloženo oslobađanje aktivnog sastojka. Primer kompozicije sadrži monoklonsko antitelo u koncentraciji 5 mg/mL, koje je formulisano u vodenom puferu koji se sastoji iz 50 mM L-histidina, 150 mM NaCl, podešenog do pH 6,0 sa HCl. Kompozicije za parentralno davanje su obično u suštini sterilne, u suštini izotonične i dobijaju se pod GMP uslovima FDA ili sličnog tela. Na primer, kompozicije koje sadrže biološka sredstva se obično sterilizuju sterilizacijom na filteru. Kompozicije mogu da budu formulisane za pojedinačno dozno davanje.

[0195] Obično, kompozicije su pripremljene kao injekcije, ili kao tečni rastvori ili suspenzije; takođe mogu da se pripreme čvrsti oblici koji su pogodni za rastvaranje u, ili suspenziju u, tečnim nosačima pre injekcije. Preparat takođe može da bude emulgovan ili inkapsuliran u lipozomima ili mikro česticama kao što je polilaktid, poliglikolid, ili kopolimer za pojačan efekat adjuvansa, kao što se razmatra gore u tekstu (videti Langer, Science 249, 1527 (1990) and Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Sredstva mogu da se daju u obliku depot injekcije ili implant preparata koji može da se formuliše na takav način da omogući produženo ili pulsno oslobađanje aktivnog sastojka.

Kompozicije mogu da se formulišu u jediničnom doznom obliku (tj., formulacija sadrži dovoljno aktivnog sastojka za jednu dozu za jednog pacijenta).

[0196] Dodatne formulacije koje su pogodne za druge načine davanja uključuju oralne, intranazalne, I pulmonarne formulacije, supozitorije, i transdermalne načine davanja.

[0197] Za supozitorije, sredstva za povezivanje i nosači uključuju, na primer, polialkilen glikole ili trigliceride; takve supozitorije mogu da se obrazuju iz smeša koje sadrže aktivni sastojak u opsegu od 0,5% do 10%, poželjno 1%-2%. Oralne formulacije uključuju ekscipijense, kao što su farmaceutske klase manitola, laktozu, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celulozu, i magnezijum karbonat. Ove kompozicije imaju oblik rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, formulacija sa praškovima i sadrže 10%-95% aktivnog sastojka, poželjno 25%-70%.

[0198] Topikalna primena može da dovede do transdermalne ili intradermalne isporuke. Topikalno davanje moće da se olakša istovremenim davanjem sredstva sa toksinom kolere ili detoksifikovanim derivatima ili njihovih subjedinica ili drugih sličnih bakterijskih toksina (Videti Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). Istovremeno davanje može da se postigne upotrebom komponenata kao smeše ili kao povezanih molekula koji se dobijaju hemijskim unakrsnim povezivanjem ili ekspresijom kombinovanog proteina.

[0199] Alternativno, transdermalna isporuka može da se postigne upotrebom flastera za kožu ili upotrebom transferozoma (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).

VIII. POSTUPCI PRAĆENJA I POSTUPCI ODREĐIVANJA DIJAGNOZE

[0200] Prikaz obebeđuje potupke za detekciju imunskog odgovora prema alfa-SN peptidu i/ili Aβ peptidu kod pacijenta koji ima ili je podložan da dobije LBD. Postupci su posebno korisni za praćenje kure lečenja koja se daje pacijentu. Postupci mogu da se koriste za praćenje i terapeutskog tretmana kod pacijetnata koji imaju simptome i profilaktičkog tretmana kod asimptomatskim pacijentima. Postupci mogu da budu korisni za praćenje i aktivne imunizacije (npr., antitela koje se proizvede u odgovoru na davanje imunogena) i pasivne imunizacije (npr., merenja nivoa antitela koje se daje).

1. Aktivna imunizacija

[0201] Neki postupci podrazumevaju određivanje osnovne vrednosti imunskog odgovora kod pacijenta pre davanja doze sredstva, i poređenje sa vrednostima imunskog odgovora posle tretmana. Značajno povećanje (tj., koje je veće od uobičajene granice eksperimentalne greške u ponovljenim merenjima istog uzorka, koje je izraženo kao jedna standardna devijacija iz srednje vrednosti takvih merenja) gde vrednost imunskog odogovora signalizira pozitivni ishod tretmana (tj., davanje sredstva postiže ili pojačava imunski odgovor). Ukoliko se vrednost za imunski odgovor ne menja značajno, ili smanjuje, indikovan je negativni ishod tretmana. Generalno, očekuje se da pacijenti koji prolaze kroz početnu kuru lečenja sa imunogenim sredstvom pokažu povećanje u imunskom odgovoru sa uzastopnim dozama, koje na kraju dostiže plato. Davanje sredstva se generalno nastavlja dok se imunski odgovor

1

povećava. Postizanje platoa je indikator da davanje tretmana može da bude prekinuto ili smanjeno u dozi i učestalosti.

[0202] U drugim postupcima, kontrolna vrednost (tj., srednja vrednost i standardna devijacija) imunskog odgovora se određuje za kontrolnu populaciju. Obično individue u kontrolnoj populaciji pretodno nisu primile tretman. Izmerene vrednosti imunskog odgovora kod pacijenta posle davanja terapeutskog sredstva se zatim porede sa kontrolnim vrednostima. Značajno povećanje u odnosu na kontrolnu vrednost (npr., koje je veće od jedne standardne devijacije srednje vrednosti) signalizira pozitivni ishod tretmana. Nedostatak značajnog povećanja ili smanjenje signalizira negativni ishod tretmana. Davanje sredstva se generalno nastavlja dok se imunski odgovor povećava u odnosu na kontrolnu vrednost. Kao prethodno, postizanje platoa u odnosu na kontrolne vrednosti je indikator da davanje tretmana može da bude prekinuto ili smanjeno u dozi i učestalosti.

[0203] U drugim postupcima, kontrolna vrednost imunskog odgovora (tj., srednja vrednost i standardna devijacija) se određuje iz kontrolne populacije individua koji se nalaze u tretmanu sa terapeuskim sredstvom, i čiji su imunski odgovori dostigli plato u odgovoru na tretman. Izmerene vrednosti imunskog odgovora kod pacijenta se porede sa kontrolnom vrednosti. Ukoliko izmereni nivo kod pacijenta nije značajno drugačiji (npr., više od jedne standardne devijacije) od kontrolne vrednosti, tretman može da se prekine. Ukoliko je nivo kod pacijenta značajno ispod kontrolne vrednosti, dalja primena sredstva je opravdana. Ukoliko je nivo kod pacijenta i dalje ispod kontrolne vrednosti, onda promena u režimu tretmana, na primer, upotreba različitog adjuvansa može da bude indikovana.

[0204] U drugim postupcima, pacijent koji trenutno ne dobija tretman ali je prošao prehodnu kuru lečenja se prati za imunski odgovor da bi se odredilo da li je potrebno nastaviti lečenje. Izmerena vrednost imunskog odgovora kod pacijenta može da se poredi sa vrednostima imunskog odgovora koji je prethodno postignut kod pacijenta posle prethodne kure lečenja. Značajno smanjenje u odnosu na prethodno merenje (tj., veće od tipične granice greške u ponovljenim merenjima istog uzorka) je indikacija da tretman treba da se nastavi. Alternativno, vrednost izmerena kod pacijenta može da se poredi sa kontrolnom vrednosti (srednja vrednost plus standardna devijacija) određena u populaciji pacijenata posle prolaska kroz kuru lečenja. Alternativno, izmerena vrednost kod pacijenta može da se poredi sa kontrolnom vrednosti u populacijama profilaktički tretiranih pacijenata koji ostaju bez simptoma bolesti, ili populacijama terapeutski tretiranih pacijenata koji pokazuju poboljšanje karakteristika bolesti. U svim takvim slučajevima, značajno smanjenje u odnosu na kontrolne nivoe (tj., više od jedne standardne devijacije) je indikator da tretman pacijenta treba da se nastavi.

[0205] Tkivni uzorak za analizu je obično krv, plama, serum, mukus ili cerebrospinalna tečnost iz pacijenta. Uzorak se analizira za indikaciju imunskog odgovora prema bilo kom alfa-SN, obično NAC, ili Aβ. Imunski odogovor može da se odredi na osnovu prisustva, npr., antitela ili T-ćelija koje se specifično vezuju za alfa-SN ili AB. ELISA postupci za detekciju antitela koja su specifična za alfa-SN se opisuju u odeljku Primeri. Postupci za detekciju reaktivnih T-ćelija u opisani u tekstu iznad (videti Definicije). U nekim postupcima, imunski odgovor se određuje uporebom testa za uklanjanje, kao što se opisuje u Odeljku III gore u tekstu. U takvim postupcima, tkivo ili uzorak krvi iz pacijenta koji se testira se dovodi u kontakt sa LB-a (npr., iz sinuklein/hAPP transgenih miševa) i fagocitnih ćelija koje imaju Fc receptore. Zatim se prati naknadno uklanjanje LB-a. Postojanje i obim odgovora uklanjanja obezbeđuje indikaciju

2

postojanja i nivoa antitela koji su efikasni za uklanjanje alfa-SN u tkivnom uzorku pacijenta koji se ispituje.

2. Pasivna imunizacija

[0206] Generalno, postupci za praćenje pasivne imunizacije su slični sa onima za praćenje aktivne imunizacije koja se opisuje gore u tekstu. Međutim, profil antitela koji prati pasivnu imunizaciju obično pkazuje trenutnu maksimalnu vrednost u koncentraciji antitela nakon čega sledi eksponencijalno opadanje. Bez dalje doze, opadanje se približava nivoima predtretmana u periodu dana do meseci u zavisnosti od polu-života antitela koje se daje. Na primer polu-život nekih humanih antitela je reda 20 dana.

[0207] U nekim postupcima, osnovna merenja antitela koje je specifično za alfa-SN kod pacijenta se izvode pre davanja, drugo merenje se izvodi ubrzo nakon toga da bi se odredila maksimalna vrednost nivoa antitela, i jedno ili više drugih merenja se izvode u intervalima da se prati opadanje nivoa anitela. Kada se nivo antitela smanji na osnovnu vrednost ili prethodno određeni procenat maksimalne vrednosi manje osnovne linije (npr., 50%, 25% ili 10%), primenjuje se davanje dalje doze antitela. U nekim postupcima, maksimalna vrednost ili naknadno izmereni nivoi manje pozadine se porede sa referentnim nivoima za koje je prethodno određeno da čine koristan profilaktički ili terapeutski režim tretmana kod drugih pacijenata. Ukoliko je izmereni nivo anitela značajno manji od referentnog nivoa (npr. manji od srednje vrednosti minus jedne standardne devijacije referentne vrednosti u populaciji pacijenata koji imaju korist od tretmana), indikuje se davanje dodatne doze antitela.

3. Dijagnostički kitovi

[0208] Prikaz dalje obezbeđuje dijagnostičke kitove za izvođenje dijagnostičkih postupaka koji se opisuju gore u tekstu. Obično, takvi kitovi sadrže sredstvo koje se specifično vezuje za antitela koja su specifična za alfa-SN. Sredstva mogu takođe da uključe obeleživač. Za detekciju antitela koja su specifična za alfa-SN, obelživač se obično nalazi u obliku obeleženih anti-idiotipskih antitela. Za detekciju anitela, može da bude obezbeđeno sredstvo koje se prethodno vezalo za čvrstu fazu, kao što su bunarići mikrotitarske ploče. Kitovi takođe obično sadrže uputstva koja obezbeđuju obeležavanje za upotrebu kita. Obeležavanje može takođe da uključi grafikon ili drugi pogodni režim koji dovodi u vezu izmereni obeleživač sa nivoima antitela koja su specifična za alfa-SN. Termin obleležavanje se odnosi na bilo koji napisani ili snimljeni materijal koji je vezan za, ili je na drugačiji način pridružen kitu u bilo kom vremenu tokom njegovog dobijanja, transporta, prodaje ili upotrebe. Na primer, termin obeležavanje obuhvata reklamne letke i brošure, spakovane materijale, instrukcije, audio ili video kasete, kompjuterske diskove, kao i pisanje koje je utisnuto direktno na kitove.

[0209] Prikaz takođe obezbeđuje dijagnostičke kitove za izvođenje in vivo snimanja. Takvi kitovi obično sadrže antitelo koje se vezuje za epitop alfa-SN, poželjno unutar NAC. Poželjno, antitelo je obeleženo ili je u kit uključeno sekundarno obeleženo sredstvo. Poželjno, kit je obeležen sa instrukcijama za izvođenje testa in vivo snimanja.

X. IN VIVO SLIKANJE

[0210] Prikaz obezbeđuje postupke in vivo slikanja LB-a kod pacijenta. Takvi postupci su korisni za dijagnozu ili potvrđuju dijagnozu PD, ili druge bolesti koja je povezana sa prisustvom LB-a u mozgu, ili je osetljiva na njih. Na primer, postupci mogu da se koriste na pacijentima koji imaju simptome demencije. Ukoliko pacijent ima LB-a, onda pacijent verovatno ima, npr. PD. Postupci mogu takođe da se koriste kod asimptomatskih pacijenata. Prisustvo abnormalnih depozita amiloida ukazuje na oseljivost na buduću simptomastku bolest. Postupci su takođe korisni za praćenje napredovanja bolesti i/ili odgovora na tretman kod pacijenata kojima je prethodno dijagnostifikovana Parkinsonova bolest.

[0211] Postupci deluju davanjem reagensa, kao što je antitelo koje se vezuje za alfa-SN u pacijentu i detektovanjem sredstva nakon njegovog vezivanja. Poželjna antitela se vezuju za depozite alfa-SN kod pacijenta bez vezivanja za NACP polipepid pune dužine. Posebno su poželjna antitela koja se vezuju za epitop alfa-SN NAC. Ukoliko je poželjno, korak uklanjanja može da se izbegne upotrebom fragmenata antitela kojima nedostaje kontantni region pune dužine, kao što su Fab-ovi. U nekim postupcima, isto antitelo može da služi i kao tretman i kao dijagnostički reagens. Generalno, antitela koja se vezuju za epitope N-kraja alfa-SN ne pokazuju jaki signal kao antitela koja se vezuju za C-kraj, verovatno zbog toga što N-terminalni epitopi nisu dostupni u LB-a (Spillantini et al PNAS, 1998). Prema tome, takva antitela su manje poželjna.

[0212] Dijagnostički regensi mogu da se daju intravenzonom injekcijom u telu pacijenta, ili direktno u mozak intrakranijalnom injekcijom ili bušenjem rupe kroz lobanju. Doza reagensa treba da bude u istim opsezima kao postupci tretmana. Obično, reagens je obeležen, iako u nekim postupcima, primarni reagens sa afinitetom prema alfa-SN nije obeležen i sekundarno sredstvo za obeležavanje se koristi za vezivanje sa primarnim reagensom. Izbor obeleživača zavisi od sredstva za detekciju. Na primer, fluorescentni obeleživač je pogodan za optičku detekciju. Upotreba paramagnetskih obeleživača je pogodna za tomografsku detekciju bez hirurške intervencije. Radioaktivni obeleživači mogu takođe da se detektuju upotrebom PET ili SPECT.

[0213] Dijagnoza se izvodi poređenjem broja, veličine i/ili intenziteta obeleženih lokusa sa odgovarajućim vrednostima osnovnog nivoa. Vrednosti osnovnog nivoa mogu da predstavljaju srednje nivoe u populaciji individua koji nemaju bolest. Vrednosti osnovnog nivoa mogu takođe da predstavljaju prehodne nivoe koji su određeni kod istog pacijenta. Na primer, vrednosti osnovnog nivoa mogu da se odrede kod pacijenta pre početka tretmana, i izmerene vrednosti se zatim porede sa vrednostima osnovnog nivoa. Smanjenje u vrednostima u odnosu na osnovni nivo daje signal pozitivnog odgovora na tretman.

PRIMERI

Primer I. Imunizacija Humanih Alfa-Sinukleinkih Transgenih Miševa sa Humanim Alfa-Sinukleinom dovodi do proizvodnje visokog titra Anti-Alfa-Sinukleinkih Antitela koji prolaze kroz krvno-moždanu barijeru

4

[0214] Rekombinovani alfa-SN pune dužine se resuspenduje u koncentraciji 1mg/ml u IX fosfatom puferovanom rastvoru soli (PBS). Za svaku injekciju, koristi se 50µl alfa-SN; pri čemu se dobija finalna koncentracija od 50µg po injekciji u koju se dodaje 150µl 1X PBS. Zatim se dodaje kompletni Frojndov adjuvans (CFA) u razmeri 1:1 u ili alfa-SN ili sam PBS (kontrola), vorteksuje se i sonifikuje da bi se kompletno resuspendovao u emulziji. Za polazne injekcije, osam D linija humanih alfa-SN transgenih (tg) pojedinačno transgenih miševa starosti 4-7 meseci (Masliah, et al. Science 287:1265-1269 (2000) su dobili injekcije humanog alfa-SN u CFA i, kao kontrole, četiri D linije humanih alfa-SN tg miševa su primile injekcije PBS u CFA. Miševi su ukupno primili 6 injekcija. Tri injekcije se primenjuju u dvonedeljnim intervalima i 3 injekcije se izvode u intervalima u jednom mesecu. Životinje se žrtvuju u skladu sa NIH Vodičima za humani tretman životinja 5 meseci posle početka eksperimenta. Nakon što su krvni uzorci sakupljeni za određivanje titra antitela, mozgovi se fiksiraju u imerziji 4 dana u 4% paraformaldehidu u PBS-u. Nivoi antitela prema humanom alfa-SN koji se određuju ELISA testom su prikazani na Tabeli 1. Tretirani miševi su prema titru podeljeni u dve grupe. Prva grupa razvija umereni titar koji iznosi 2-8,000. Druga grupa razvija visoki titar koji iznosi 12000-30000. U kontrolnim miševima titar nije pronađen. Neuropatološka analiza je pokazala da miševi koji proizvode visoke titre imaju značajno smanjenje u veličini sinukleinskih inkluzija. Miševi koji proizvode umerene titre pokazuju manje smanjenje. Sl. 2 (paneli a-d) pokazuju sinukleinske inkluzije (a) u netransgenom mišu, (b) transgenom mišu koji se tretira samo sa CFA, (c) transgenom mišu koji je imunizovan samo sa alfa sinukleinom i CFA koji razvija umereni titar i (d) transgenom mišu koji je imunizovan sa alfa sinukleinom i CFA koji razvija visok titar. Uzorci se vizualizuju imunobojenjem sa anti-humanim alfa-SN antitelom. Sl. 2 pokazuje sinukleinske inkluzije u panelu (b) ali ne u panelu (a). U panelu (c), tretiranih miševa, umereni titri, inkluzije su na neki način smanjenje u intenzitetu. U panelu (d) inkluzije su značajno smanjene u intenzitetu. Paneli (e)-(h) pokazuju nivoe anti-IgG u mozgovima ii četiri miševa kao paneli (a) do (d) redom. Može da se uoči da se IgG nalazi u panelima (g) i u većoj meri u panelu (h). Podaci pokazuju da periferno administrirana anitela koja su specifična prema alfa-SN prolaze kroz krvnomoždanu barijeru i dolaze u mozak. Paneli (i) do (1) pokazuju bojenje GAP, markera astroglijalnih ćelija, ponovo za ista četiri miša kao u prva dva reda na slici. Može se uočiti da paneli (k) i (1) pokazuju umereno povećano bojenje u poređenju sa (i) i (j). Ovi podaci pokazuju da je uklanjanje sinukleinskih depozita povezano sa blagom astroglijalnom ili mikroglijalnom reakcijom.

Tabela 1

Primer II. In Vitro skrining antitela koja uklanjaju sinukleinske inkluzije

[0215] GT1-7 nervne ćelije (Hsue et al. Am. J. Pathol.157:401-410 (2000)) se transfektuju sa pCR3.1-T ekspresionim vektorom (Invitrogen, Carlsbad, CA) koji eksprimira mišji alfa-SN i porede se sa ćelijama koje se tranfektuju samo sa ekspresionim vektorom (Slika. 3, paneli B i A redom). Ćelije koje se transfektuju samo sa vektorom (panel A) imaju fibroblatični izgled dok su ćelije koje se transfektuju sa alfa-SN zaobljene, sa inkluzionim telima na ćelijskoj površini koja je vidljiva i pomoću svetlosne i konfokalne skenirajuće mikroskopije. Transfektovane ćelije se zatim tretiraju sa zečjim preimunkim serumom (panel C) ili 67-10, afinitetno prečišćenim zečjim poliklonskim antitelom prema mišjim alfa-SN C terminalnim ostacima 131-140 (Iwai, et al., Neuron 14:467 (1995) (panel D). Može se videti da se inkluziona tela boje manje jako u panelu D nego u panelu C što ukazuje da je antitelo prema alfa sinukleinu efikasno u uklanjanju ili prevenciji razvijanja inkluzija. Sl.4 pokazuje analizu čestica na gelu i citoplazmatskih frakcija GT1-7 transfektovanih ćelija koje su tretirane sa zečjim preimunskim serumom i 67-10 poliklonskim antitelom. Uočava se da su nivoi sinukleina u citoplazmatskoj frakciji uglavnom nepromenjeni tretmanom sa preimunskim serumom ili antitelom koje je specifično za alfa-SN. Međutim, traka alfa-SN nestaje u membranskoj frakciji GT1-7 ćelija koje su tretirane sa antitelom koje je specifično za alfa-SN. Ovi podaci ukazuju na to da aktivnost alfa-sinukleinskog antitela dovodi do uklanjanja sinukleina koji je povezan sa ćelijskom membranom.

[0216] Transfekovane GT1-7 ćelije mogu da se koriste za skrining antitela za određivanje akivnosti u uklanjanju sinukleinskih inkluzija sa detekcijom ili histohemijskom analizom, svetlosnim mikroskopom kao na Sl.3 ili gel analizom kao na Sl.4.

Primer III. Profikatička i terapeutska efikasnost imunizacije sa alfa-sinukleinom

i. Imunizacija humanih alfa-sinukleinskih tg miševa

[0217] Za ovo ispitivanje, koriste se heterozigotni humani alfa-SN transgeni (tg) miševi (Linija D) (Masliah et al., 2000, Science 286:1265-69) i netransgene (nontg) kontrole. Eksperimentalne životinje su podeljene u tri grupe. Za grupu I, preventivni efekti rane imunizacije imunizovanjem miša 8 meseci počev od 2 meseca starosti se ispituju. Za grupu II, mladi adultni miševi se vakcinišu 8 meseci počev od starosti 6 meseci da se odredi da li imunizacija može da smanji napredovanje bolesti jednom kada se uspostavi umerena patologija. Za grupu III, stariji miševi se imunizuju 4 meseci počev od starosti 12 meseci da se odredi da li imunizacija može da smanji ozbiljnost simptoma jednom kada se uspostavi ozbiljna patologija. Za sve grupe, miševi se imunizuju ili sa rekombinovanim humanim alfa-SN plus CFA ili samim CFA, i za svaki eksperiment se koristi 20 tg i 10 nontg miševa. Od njih, 10 tg miševa se imunizuju sa humanim alfa-SN+CFA i drugih 10 tg samo sa CFA. Slično, 5 nontg miševa se imunizuju sa alfa-SN+CFA i drugih 5 samo sa CFA. Ukratko, prototkol imunizacije se sastoji iz početne injekcije sa prečišćenim rekombinovanim humanim alfa-SN (2 μg/ml) u CFA, nakon čega se daje ponovo injekcijom 1 mesec kasnije sa humanim alfa-SN kombinovano sa IFA. Miševima se zatim ova smeša ponovo daje injekcijom jednom mesečno. U malom podsetu humanog alfa-SN tg (n=3/svaki; 6-meseci starosti) i nontg (n=3/svaki; 6-meseci starosti) miševa, izvode se dodatni eksperimenti koji se sastoje iz imunizacije sa mišjim (m) alfa-SN, humanim beta sinukleinom ili mutiranim (A53T) humanim alfa-SN.

[0218] Nivoi alfa-SN antitela se određuju upotrebom mikrotitarskih ploča sa 96-bunarića koji su obloženi sa 0,4 μg po bunariću prečišćenim alfa-SN pune dužine inkubacijom preko noći na 4°C u natrijum karbonatnom puferu, pH 9,6. Bunarići se ispiraju 4X sa 200µL svaki PBS koji sadrži 0,1% Tween i zatim blokiraju 1 sat u PBS-1% BSA na 37°C. Uzorci seruma se serijski razblažuju "u bunariću", 1:3, počev od reda A, sa opsegom razblaženja 1:150 do 1:328,050. Za kontrolne eksperimente, uzorak mišjeg monoklonskog antitela se izvodi prema alfa-SN, bez proteina, i blankovima koji samo sadrže pufer. Uzorci se inkubiraju preko noći na 4°C nakon čega sledi 2-satna inkubacija sa kozjim anti-mišjem IgG alkalnom fosfatazom konjugovanim-antitelom (1:7500, Promega, Madison, WI). Atto-phos® alkalna fosfataza fluorescentni supstrat se zatim dodaje 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploča se čita i pobuđena je talasna dužina 450 nm i emisiona talasna dužina 550 nm. Rezultati se prikazuju na polulog grafikonu sa jedinicama relativne fluorescencije na ordinati i razblaženjem seruma na apscisi. Titar antitela se definiše kao razblaženje u kome je 50% smanjenje od maksimalnog vezivanja antitela.

[0219] Za svaku grupu, na kraju tretmana, miševi prolaze kroz motoričku procenu u roirajućem valjku, kao što se opisuje (Masliah, et al. (2000)). Posle analize, miševi se eutanizuju i mozgovi se uklanjaju za detaljnu neurohemijsku i neuropatološku analizu kao što se opisuje u tekstu ispod. Ukratko, desna polovina mozga se zamrzava i homogenizuje za određivanje imunoreaktivnosti nakupljenog i nenakupljenog alfa-SN pomoću Western blota (Masliah, et al. (2000)). Leva polovina mozga se fiksira u 4% paraformaldehidu, serijski seče u vibratomu za imunocitohemijsku i ultrastrukturnu analizu.

ii. Imunocitohemijska i neuropatološka analiza.

[0220] Da bi se odredilo da li se imunizacija smanjuje, preseci nakupljenog humanog alfa-SN se imunoboje sa zečjim poliklonskim antitelom prema humanim alfa-SN (1:500). Posle prekonoćne inkubacije na 4°C, preseci se inkubiraju sa biotinilovanim anti-zečjim sekundarnim antitelom nakon čega sledi Avidin D-preoksidaza rena (HRP) kompleks (1:200, ABC Elite, Vector). Preseci se takođe imunoboje sa biotinilovanim anti-zečjim, mišjim ili samo sa humanim sekundarnim. Eksperimenti sa anti-mišjim sekundarnim određuju da li antitela koja su specifična prema alfa-SN prolaze u mozak. Reakcija se vizuelizuje sa 0,1% 3,3,-diaminobenzidin tetrahidrohloridom (DAB) u 50mM Tris-HCl (pH 7,4) sa 0,001% H2O2 i preseci se zatim montiraju na kliznu površinu Entellan. Nivoi imunoreaktivnosti se polukvantitativno procenjuju optičkom denzitometrijom upotrebom Quantimet 570C. Ovi preseci se takođe ispituju analizom slike da se odrede brojevi imunorekativnih inkluzija alfa-SN i ova pouzdana mera nakupljenih alfa-SN deluje kao značajni indeks efekta anti-nakupljanja kojise dobija vakcinacijom (Masliah, et al. (2000)).

[0221] Analiza obrazaca neurodegeneracije se postiže analizom simpatičkih i dendritskih gustina u hipokampusu, frontalnom korteksu, temporalnom kortekstu i bazalnoj gangliji korišćenjem preseka dobijenih na vibratomu koji su dvostruko imunoobeleženi za sinaptofizin i protein 2 koji je povezan sa mikrotubulama (MAP2) i vizuelizuje se pomoću LSCM. Dodatna analiza neurodegeneracije se postiže određivanjem imunoreaktivnosti tirozin hidroksilaze (TH) u kaudaputamenu i crnoj supstanciji (SN) kako se prethodno opisuje (Masliah, et al. (2000)). Preseci se slikaju sa LSCM i svaka individualna slika se interaktivno baždari tako da se uključuju TH-imunoreaktivni krajevi koji ispoljavaju intenzitet piksela unutar linearnog opsega. Skala se podešava da se dobije odnos piksela prema μm. Zatim, ova informacija se koristi da se izračuna % površine neuropila koji je pokriven sa TH-imunoreaktivnim krajevima. Ovi isti preseci se takođe koriste da se odrede brojevi TH neurona u SN.

[0222] Da bi se procenio imunski odgovor prema imunizaciji, izvodi se imunocitohemijska i ultrastrukturna analiza sa antitelima koja su specifična za humani GFAP, MCH klasu II, Mac 1, TNF-alfa, IL1beta i IL6 u presecima mozga nontg i alfa-SN tg miševa koji su imunizovani sa rekombinovanim humanim alfa-SN i kontrolnim imunogenima.

iii. Bihejvioralna analiza.

[0223] Za lokomotornu aktivnost miševi se analiziraju 2 dana u rotirajućem valjku (San Diego) Instruments, San Diego, CA), kao što se prethodno opisuje (Masliah, et al. (2000)). U prvom danu miševi se treniraju u 5 ispitivanja: prvi na 10oum, drugi na 20oum i treći do petof na 40oum. Drugog dana, miševi se testiraju za 7 ispitivanja na 40oum svaki. Miševi se individualno postavljaju na cilindar i brzina rotiranja se povećava od 0 do 40 oum tokom perioda od 240 sek. Dužina vremena gde miševi ostaju navaljku (kašnjene pada) se snima I koristi kao mera motorne funkcije.

Primer IV. Imunizacija sa fragmentima Alfa-Sinukleina

[0224] Humani alfa-SN transgeni miševi starosti 10-13 meseci se imunizuju sa 9 različitih regiona alfa-SN da se odredi koji epitopi prenose efikasan odgovor. Ubrizgavaju se 9 raličitih imunogena i jedna kontrola i.p. kao što se opisuje gore u tekstu. Imunogeni uključuju četiri konjugata humanih alfa-SN peptida, svi spojeni sa ovčijim anti-mišjim IgG preko veze sa cistinom. Alfa-SN i PBS se redom koriste kao pozitivne i negativne kontrole. Titri se prate kao što se gore navodi i miševi se eutanizuju na kraju 3-12 meseci nakon davanja injekcija. Nakon smrti se izvode histohemija, nivoi alfa-SN, i toksikološka analiza.

i. Priprema imunogena

[0225] Priprema spojenih alfa-SN peptida: H alfa-SN peptidni konjugati se pripremaju spajanjem kroz veštački cistein koji se dodaje alfa-SN peptidu upotrebom reagensa sulfo-EMCS za ukršteno povezivanje. Derivati alfa-SN peptida se sintetišu sa sledećim konačnim sekvencama aminokiselina. U svakom slučaju, položaj insertovanog ostatka cisteina je naznačen podvlačenjem.

alfa-sinuklein 60-72 (NAC region) peptid:

NH2-KEQVTNVCGGAVVT-COOH (SEQ ID NO: 54)

alfa- sinuklein 73-84 (NAC region) peptid:

NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH (SEQ ID NO: 55)

alfa- sinuklein 102-112 peptid:

NH2-C-amino-heptanska kiselina- KNEEGAPCQEG-COOH (SEQ ID NO: 56) alfa- sinuklein 128-140 peptid:

Ac-NH-PSEEGYQDYEPECA-COOH (SEQ ID NO: 57)

[0226] Da bi se pripremili za reakciju spajanja, deset μg kozjeg anti-mišjeg IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) se dijalizira preko noći prema 10 mM natrijum boratnom puferu, pH 8,5. Dijalizirano antitelo se zatim koncentruje do zapremine 2 mL upotrebom Amicon Centriprep tube. Deset μg sulfo-EMCS [N (ε-maleimidokuproiloksi) sukcinimida] (Molecular Sciences Co.) se rastvara u jednom mL dejonizovane vode.40-struki molarni višak sulfo-EMCS se dodaje u kapima uz mešanje u ovčje anti-mišje IgG I zatim se rastvor meša dodatnih deset minuta. Aktivirano kozje anti-mišje IgG je prečišćeno I puferom izmenjeno prolaskom kroz 10 mL gel filtracionu kolonu (Pierce Presto Column, dobijena od Pierce Chemicals) koja je ekvilibrisana sa 0,1 M NaPO4, 5 mM EDTA, pH 6,5. Frakcije koje sadrže antitela, koje se identifikuju apsorbancijom na 280 nm, se sakupljaju i razblažuju do koncentracije od približno 1 μg/mL, upotrebom 1,4 mg po OD kao ekstinkcionim koeficijentom. 40-struki molarni višak alfa-SN peptida je rastvoren u 20 mL od 10 mM NaPO4, pH 8,0, sa izuzetkom alfa-SN peptida za kog je 10 μg prvo rastvoreno u 0,5 mL DMSO I zatim razblaženo do 20 mL sa 10 mM NaPO4puferom. Peptidni rastvori se svaki dodaju u 10 mL aktiviranog ovčjeg anti-mišjeg IgG i mešaju se ljuljanjem na sobnoj temperaturi 4 hr. Dobijeni konjugati se koncentruju do konačne zapremine koja je manja od 10 mL upotrebom Amicon Centriprep tube i zatim dijalizuju prema PBS do izmene puferom i uklanjanja slobodnog peptida. Konjugati prolaze kroz filtere veličine pore 0,22 μm za sterilizaciju i zatim se alikvotuju u frakcije 1 μg i skladište zamrznuti na -20°C. Koncentracije konjugata se određuju upotrebom BCA proteinskog testa (Pierce Chemicals) sa konjskim IgG za standardnu krivu. Konjugacija se dokumentuje povećanjem molekulske mase konjugovanih peptida u odnosu na aktiviran ovčiji antimišji iIgG.

Primer V. Pasivna imunizacija sa antitelima prema Alfa-Sinukleinu

[0227] Humani alfa-SN miševi su svaki ubrizgani injekcijom sa po 0,5 mg u PBS monoklonskih anti-alfa-SN kao što se prikazuje u tekstu ispod. Svi preparati antitela su prečišćeni tako da imaju niže nivoe endotoksina. Monoklonska mogu da se pripreme prema fragmentu injeciranjem fragmenta ili dužeg oblika alfa-SN u miša, pripremom hibridoma i skriningom hibridoma za antitelo koje se specifično vezuje za željeni fragment alfa-SN bez vezivanja za druge nepreklapajuće fragmente alfa-SN.

[0228] Miševima je se ip ubrizgava što je potrebno tokom 4 mesečnog perioda da se održi koncentracija antitela u krvi kao što se meri ELISA titrom koji je veći od 1:1000 definisano ELISA testom prema alfa-SN ili drugom imunogenu. Titri se prate kao što se gore navodi i miševi se eutanizuju na kraju 6 meseci od dobijanja injekcija. Nakon smrti, izvode se histohemija, nivoi alfa-SN i toksikološka analiza.

Primer VI. Aβ Imunizacija Syn/APP transgenih miševa

[0229] Ovaj eksperiment upoređuje efekte Aβ imunizacije kod tri tipa transgenih miševa: transgenih miševa sa alfa sinukleinskim transgenom (SYN), APP miševa sa APP transgenom (Games et al.) i dvostruko transgenih SYN/APP miševa koji se proizvode ukrštanjem pojedinačnih transgenih. Dvostruko transgeni miševi se opisuju u Masliah et al., PNAS USA 98:12245-12250 (2001). Ovi miševi predstavljaju model individua koje imaju i Alzhajmerovu i Parkinsonovu bolest. Tabela 2 pokazuje različite grupe, starosti miševa koji se koriste u ovom ispitivanju, postupak tretmana i titar antitela koja su specifična prema Aβ. Može da se uoči da značajan titar nastaje kod sva tri tipa miševa. Sl.5 pokazuje % površine koji je pokriven sa amiloidnim plakovima Aβ u mozgu koji se određuje mikroskopskim ispitivanjem preseka mozga iz tretiranih subjekata. Značajni depoziti se nakupljaju u APP i SYN/APP miševima ali ne kod SYN miševa ili netransgenih kontrola. Depoziti su veći kod SYN/APP dvostruko transgenih miševa. Imunizacija sa Aβ1-42 smanjuje depozite kod oba APP i SYN/APP miševa. Sl. 6 pokazuje sinukleinske depozite u različitim grupama miševa kao što se detektuje konfokalnom laserskom skenirajućom i svetlosnom mikroskopijom. Sinukleinski depoziti se nakupljaju u SYN i SYN/APP miševima koji se tretiraju samo sa CFA. Međutim, kod istih tipova miševa koji se tretiraju sa Aβ1-42 i CFA postoji značajno smanjenje u nivou depozita sinukleina. Ovi podaci ukazuju da je tretman sa Aβ efikasan ne samo u uklanjanju Aβ depozita već takođe u uklanjanju depozita sinukleina. Prema tome, tretman sa Aβ ili njegim antitelima je koristan u lečenju ne samo Alzhajmerove bolesti već kombinovane Alchajmerove i Parkinsonove bolesti, i Parkinsonove bolesti kod pacijenata koji nemaju Alchajmerovu bolest. Titar antiAβ antitela kod SYN/APP miševa se nalazi u korelaciji sa smanjenim obrazovanjem sinukleinskih inkluzija (r=-0,71, p < 0,01).

Tabela 2

Primer VII. Ex Vivo Skrining test za aktivnost antitela prema amiloidnim depozitima

[0230] Da bi se ispitao efekat antitela na uklanjanje plaka, uspostavili smo ex vivo test u kome se primarne mikroglijalne ćelije gaje u kulturi sa nefiksiranim kriostatskim presecima ili PDAPP miša ili humanih AD mozgova. Mikroglijalne ćelije se dobijaju iz cerebralnih korteksta tek rođenih DBA/2N miševa (1-3 dana). Korteksi se mehanički razlažu u HBSS-- (Henkovom balansiranom slanom rastvoru, Sigma) sa 50 μg/ml DNaze I (Sigma). Razdvojene ćelije se cede sa 100 μm ćelijskim sitom (Falcon), i centrifugiraju na 1000 oum 5 minuta. Pelet se resuspenduje u medijumu koji omogućava rast (visoki sadržaj glukoze DMEM, 10%FBS, 25ng/ml rmGM-CSF), i ćelije se sade u gustini 2 mozgda po T- 75 plastičnom balonu za gajenje u kulturi. Posle 7-9 dana, baloni se rotiraju na orbitalnoj mućkalici na 200 oum 2h na 37°C. Ćelijska suspenzija se centrifugira na 1000oum i resuspenduje u test medijumu.

[0231] Kriostatski preseci debljine 10- μm PDAPP miša ili humanih AD mozgova (interval posle smrti < 3hr) se otapaju i nanose na poli-lizinom obložene okrugle staklene pokrovne pločice i postavljaju se u ploče za gajenje tkiva u kulturi koje sadrže 24-bunarića. Pokrovne pločice se dva puta ispiraju sa medijumom koji se koristi u testu koji se sastoji iz H-SFM (Hibridoma-serum slobodni medijum, Gibco BRL) sa 1% FBS, glutamina, penicilina/streptomicina, i 5ng/ml rmGM-CSF (R&D). Kontrolna ili anti-AB antitela se dodaju u koncentraciji 2x (5 μg/ml konačno) 1 sat. Mikroglijalne ćelije se zatim sade u gustini od 0,8x 106 ćelija/ml medijuma testa. Kulture se održavaju u vlažnom inkubatoru (37°C, 5%CO2) 24hr ili više. Na kraju inkubacije, kulture se fiksiraju sa 4% paraformaldehidom i permeabilizuju sa 0,1% Triton-X100. Preseci se boje sa biotinilovanim 3D6 zatim sa streptavidin / Cy3 konjugatom (Jackson ImmunoResearch). Egzogene mikroglijalne ćelije se vizuelizuju bojenjem jezgra (DAPI). Kulture se posmatraju sa invertovanim fluorescentnim mikroskopom (Nikon, TE300) i fotomikrografije se prave pomoću SPOT digitalne kamere upotrebom SPOT softvera (Diagnostićki instrumenti). Za Western blot analizu, kulture se ekstrahuju u 8M urei, razblažuju 1:1 redukujućem uzorku tricin pufera i dodaju na 16% tricin gel (Novex). Posle prenosa na imobilon, blotovi se izlažu 5 μg/ml pabAβ42 nakon čega se dodaje HRP-konjugovano anti-mišje antitelo, i razvija se sa ECL (Amersham).

[0232] Kada se test izvodi sa PDAPP presecima mozga u prisustvu antitela koje je specifično prema NAC uočava se značajno smanjenje u broju i veličini plakova što je indicator aktivnosti uklanjanja antitela. Antitelo koje je specifično prema NAC se dovodi u kontakt sa uzorkom tkiva mozga koji sadrži amiloidne plakove i mikroglijalne ćelije, kao što se razmatra gore u tekstu. Serum zeca se koristi kao kontrola.

[0233] Isti test se izvodi sa PDAPP presecima mozga u prisustvu nekoliko antitela koja su specifična za Aβ. Poredi se sposobnost antitela da indukuje fagocitozu u ex vivo testu i da smanji in vivo opterećenje plakom kod ispitivanja pasivnog transfera. Ovi rezultati pokazuju da je in vivo efikasnost moguća zbog is direktnog antitelima posredovanog uklanjanja plaka unutar CNS-a, i da ex vivo test predviđa in vivo efikasnost. (Videti Tabele 16 i 17 iz Primera XIV WO 00/72880; i, Primer XIV, Tabela 16, WO 0072876)

Primer VIII: Aktivna imunizacija sa Alfa-Sinukleinom

A. Materijali i postupci

[0234] Vakcinacija hα-sinukleinskih tg miševa. Za ovo ispitivanje, koriste se heterozigotni tg miševi (Linija D) koji eksprimiraju hα-sinuklein pod regulatornom kontrolom promotora faktora rasta-β koji je poreklom iz trombocita (PDGFβ) (Maliah, 2000, Science 287:1265-69). Ove životinje se biraju zbog toga one razvijaju hα-sinukleinske imunoreaktivne inkluzije u mozgu kao i neurodegenerativne i motorne deficite koji imitiraju određene aspekte LBD. Eksperimentalne životinje se dele u dve grupe. Za prvu grupu, ukupno 20 mladih (starosti 3 meseca) tg miševa se 8 meseci imunizuju sa rekombinovanim hαsinukleinom (n=10) ili samo sa adjuvansom (n=10). Za drugu grupu, ukupno 20 mladih adultnih (starosti 6 meseci) tg miševa se 8 meseci imunizuju sa rekombinovanim hα-sinukleinom (n=10) ili smo sa adjuvansom (n=10). Protokol imunizacije prvo sadrži ubrizgavanje injekcije rekombinovanog hαsinukleina (80 μg/ml; 100 μl) sa kompletnim Frojndovim adjuvansom (CFA). Dve nedelje kasnije miševi dobijaju injekciju hα-sinukleina (80 μg/ml; 100 μl) u kompletnom FA, nakon čega sledi ponovno davanje injekcije jednom mesečno (narednih 7 meseci) sa hα-sinukleinom (80 μg/ml; 100 μl) u fosfatnopuferovanom slanom rastvoru. Rekombinovani hα-sinuklein se priprema i prečišćava kao što se opisuje u Masliah et al., 2005, Neuron 46:857-68, i ispituje za prisustvo endotoksina.

[0235] Određivanje titra antitela i relativnog afiniteta prema hα-sinukleinu. Nivoi hα-Sinukleinskog antitela u plazmi se određuju upotrebom mikrotitarskih ploča sa 96-bunarića koje su obložene sa 0,4 μg po bunariću pećišćenog α-sinukleina u punoj dužini. Uzorci se inkubiraju preko noći na 4°C nakon čega sledi ispiranje i inkubacija sa kozjim anti-mišjim IgG antitelom koje je konjugovano sa alkalnom fosfatazom, (1:7500, Promega, Madison, WI). Ploča se čita na pobuđenoj talasnoj dužini 450 nm i emituje se talasna dužina na 550 nm. Rezultati se prikazuju na polu-log grafiku sa jednicama relativne fluorescencije na ordinati i razblaženjem seruma na apscisi. Titar antitela se određuje kao rastvor u kome se nalazi 50% smanjenje od maksimalnog vezivanja antitela.

1

[0236] Da bi se odredio relativni afinitet za hα-sinuklein pomoću antitela koja nastaju kod vakcinisanih miševa, izvode se dva seta eksperimenata. Kod prvog, homogenate mozga iz ne-imunizovanih hαsinuklein tg miševa se dodaju na minigelu, multikanalskog aparata (Invitrogen, Carlsbad, CA). Svaki kanal se inkubira sa razblaženim serumom iz svakog od miševa, blotuje na nitroceluloznu membranu i inkubira sa sekundarnim zečjim anti-mišjim antitelo nakon čega se dodaje I125 obeleženi protein A (Alford et al., J. Histochem. Cytochem 42:283-287 (1994)). Blotovi se slikaju i analiziraju sa PhosphorImager (Molecular Dynamics, Piscataway, NJ). Imunoreaktivna traka se kvantifikuje upotrebom ImageQuant softvera (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Za drugi set eksperimenta, serijski preseci vibratoma iz ne-imunizovanih hα-sinukleinskih tg miševa se inkubiraju u razblaženom serumu iz svakog od tretiranih miševa zatim se dodaje biotinilovani konjski anti-mišji IgG (1:100, Vector), Avidin D-perosksidaza rena (HRP, 1:200, ABC Elite, Vector), i reaguje sa diaminobenzidin tetrahidrohloridom (DAB) koji sadrži 0,001% H2O2. Posle mikroskopskog ispitivanja, preseci se boduju u skladu sa obeleženim ćelijskim kompartmentom (tela nervnih ćelija, sinapse i inkluzije) i stepenu imunoreaktivnosti (0= nijedan; 1= veoma blago, 2= blago, 3= umereno, 4= intenzivno).

[0237] Mapiranje epitopa hα-sinukleinskih antitela. Epitopi koje prepoznaju hα-sinukleinska antitela se određuju pomoću ELISA testa koji meri vezivanje antitela sa preklapajućim linearnim peptidima koji pokrivaju celu hα-sinukleinsku sekvencu. C-terminalno biotinilovani peptidi sa sekvencama hαsinukleina (Mimotopes, San Diego, CA) se pripremaju kao peptide dužine 15 aminokiselina (ak) sa preklapanjem u 12 ostataka i korakom od 3 ostataka po peptidu. Ukupno 43 peptida se koriste da se prođe cela sekvenca 140 ak hα-sinukleina gde poslednji peptid ima preklapanje od 13 ak i korak od 2 ak. Dodatno, poslednja 3 peptida se ponavljaju, ali sa biotinilacijom koja se dešava na N-kraju peptida. Ovo je urađeno da se poboljša pristup C-kraja peptida antitelima i da se omogući identifikovanje slobodnih antitela koja su specifična za C-kraj. Dalje, druge karakteristike se dodaju ovom testu da se omogući detaljnije ispitivanje interakcija između antitela i neamiloidne β (Aβ) komponente (NAC) regiona (61-95) hα-sinukleina. S obzirom da 21-i peptid u ovom testu već sadrži slobodan N-kraj NAC regiona, jedan dodatni N-terminalno biotinilovani peptid koji sadrži slobodan C-kraj NAC regiona se dodaje da se test završi sa ukupno 47 peptida.

[0238] Da bi se izveo test, ovi biotinilovani peptidi se oblažu preko noći na 5nM na ELISA pločama koje se prethodno oblažu sa streptavidinom (Pierce, Rockford, IL). Ploče se zatim ispiraju i uzorci seruma, se razblažuju do titra koji je ekvivaletan 6, se dodaju za inkubaciju od 1-sata. Uzorci seruma sa titrima koji su niži od 5,000 se razblažu u razmeri 1:1000 za ovu inkubaciju. Posle još jednog koraka ispiranja, vezana antitela se detektuju upotrebom sekundarnih antitela koja su specifična za vrstu koja su konjugovana sa HRP u kolorimetrijskom ELISA formatu.

[0239] Obrada tkiva. Miševi se eutanizuju i mozgovi se uklanjaju za detaljnu neurohemijsku i neuropatološku analizu kao što se opisuje dole u tekstu. Ukratko, desna polovina mozga je zamrznuta homogenizovana za određivanje imunoreaktivnosti nakupljenog i nenakupljenog hα-sinukleina Western blot analizom (Masliah et al., 2000, supra). Leva polovina mozga se fiksira u 4% paraformaldehidu (PFA) i serijski seče pomoću vibritoma (Leica, Wetzlar, Germany) za imunocitohemijsku (ICC) i ultrastrukturnu analizu.

[0240] Sinaptozomalni preparati i imunoblot analiza. Da bi se ispitali efekti vakcinacije na nakupljanje α-sinukleina u mozgovima tg miševa, pripremaju se sinaptozomalne frakcije upotrebom gradijenata

2

saharoze i analiziraju pomoću SDS-PAGE na 10% tris-acetatnom poliakrilamidnom gelu (NuPAGETM, Invitrogen). Imunoblotovi se ispituju probom sa primarnim anitelima koja su specifična prema hαsinukleinu (LB509, 1:1000, Transduction Laboratories, San Diego, CA) i sinaptofizinu (1:20, Chemicon, Temecula, CA) i sekundarnim kozjim anti-mišjim IgG obeleženim sa HRP (1:5000, SantaCruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) i vizuelizuju sa pojačanom hemiluminiscencijom i analiziraju sa Versadoc XL aparatom za slikanje (BioRad, Hercules, CA).

[0241] Neuropatološka i imunocitohemijska analiza. Ukratko, kao što je prethodno opisano (Masliah et al., 2000), supra, da bi se ispitali efekti vakcinacije na nakupljanje hα-sinukleina, serijski podeljene, nevezane, slepo kodirani preseci vibratoma se inkubiraju preko noći na 4°C sa afinitetno prečišćenim antitelom koje je specifično za anti-hasinuklein (72-10, zečje poliklonsko, 1:500) koje se priprema kao što se pretodno opisuje (Masliah et al., 2000, supra) imunizovanjem zečeva sa sintetičkim hαsinukleinskim peptidima koji se sastoje od aa 101-124. Nakon inkubacije sa primarnim antitelom sledi biotinilovano kozje anti-zečje IgG (1:100, Vector), Avidin D-HRP (1:200, ABC Elite, Vector), i reaguje sa DAB tetrahidrohloridom koji sadrži 0,001% H2O2. Preseci se analiziraju sa Quantimet 570C (Leica) da bi se odredio broj hα-sinukleinskih imunoreaktivnih inkluzija u neokorteksu. Za svaki slučaj, analiziraju se tri preseka i rezulati su usrednjeni i ekprimiraju se kao broj po kvadratnom mm. Dalja imunocitohemijska analiza se izvodi imunoreagovanjem preseka sa antitelima koja su specifična prema glijalnim markerima uključujući CD45 (1:1000, DakoCytomation, Carpinteria, CA) i glijalnom fibrilnom kiselom proteinu (GFAP, 1:500, Chemicon).

[0242] Dvostruka imunocitohemijska analiza se izvodi kao što se pretodno opisuje (Hashimoto et al., Neuron 32:213-223 (2001) da bi se odredili efekti vakcinacije na terminalnu gustinu nerva i nakupljanje hα-sinukleina u sinapsama. Za ovu svrhu, preseci vibratoma se dvostruko obeležavaju sa poliklonskim antitelima koja su specifična za hα-sinuklein (1:1000) i sa monoklonskim antitelom prema sinaptofizinu (Chemicon). hα-Sinuklein se detekuje sa Tiramid Crvenim (1:2000, Roche) i sinaptofizin sa konjskim anti-mišjem IgG koji je obeležen sa fluorescein izotiocijanatom (FITC). A svaki slučaj, preseci su imunoobeleženi u duplikatu i analiziraju se sa laserskim skenirajućim konfokalnim mikroskopom (LSCM) i NIH Image 1.43 softverom da se izračuna procenat površine koja je pokrivena neuropilom pomoću sinaptofizinskih-imunoreaktivnih završetaka u neokorteksu (Mucke et al., J. Neurosci 20:4050-4058 (2000)) i proporcijom sinaptofizinskih-imunoreaktivnih završetaka koji su pozitivni za hαsinuklein. Da se potvrdi specifičnost primarnih antitela, izvode se kontrolni eksperimenti gde se preseci inkubiraju preko noći u odsustvu primarnog antitela (uklonjeno), sa primarnim antitelom koje se pretodno apsorbuje 48 hrs sa 20-strukim viškom odgovarajućeg peptida ili preimunskim serumom.

[0243] Svi preseci se obrađuju istovremeno pod itsim uslovima i eksperimenti se dva puta izvode da bi se procenila reproducibilnost rezultata. Preseci se slikaju Zeiss 63X (N.A.1.4) objektivom na Axiovert 35 mikroskopu (Zeiss, Germany) sa vezanim MRC1024 LSCM sistemom (BioRad, Wattford, UK) (Masliah et al., 2000, supra).

[0244] Statistička analiza. Statisička poređenja između grupa se izvode upotrebom neparnog Studentovog t-testa sa dva kraja. Analiza linearne regresije se izvodi da bi se utvrdila veza između varijabli. Bonferroni korekcija se primenjuje za obračun višestrukih poređenja.

B. Rezultati

Karakterizacija titara antitela, afiniteta i mapiranje epitopa

[0245] Titri antitela se analiziraju u 3 vremenske tačke (2 nedelje, 6 meseci i 9 meseci posle vakcinacije) u obe eksperimentalne grupe. Titri antitela se značajno razlikuju između miševa, kod životinja koje pripadaju grupi I, titri antitela između miševa koji su imunizovani sa hα-sinukleinom imaju opseg od 200 do 20,000 (Tabela 3).

Tabela 3. Pregled α-sinukleinskih titrova i afiniteta određenog imunoblotom (ispravljeno za titar).

[0246] U ovoj grupi srednja vrednost titara se polako tokom vremena povećava. Slično, za grupu II, životinje koje se imunizuju sa hα-sinukleinom pokazuju titre koji imaju opseg od 200 do 13,000 (Tabela 3). Međutim, srednji nivoi titra su veći u prvom određivanju i zatim se smanjuju tokom vremena. Analize imunoblotovanja takođe pokazuju značajnu varijabilnost od miđa do miša u njhovoj sposobnosti da prepoznaju hα-sinuklein. Sveukupno, nivo relativnog afiniteta antitela je veći kod miševa iz grupe II u poređenju sa imunizovanim miševima iz grupe I (Tabela 4).

4

Tabela 4. Sažetak korelacija između afiniteta koji je određen imunoblotom, neuropatologije i titra.

Prema ICC, serumi iz miševa koji su vaksinisani sa hα-sinukleinom pokazuju obeležene neurone, intraneuronske inkluzije i presinaptičke krajeve. Suprotno, miševi koji su tretirani samo sa adjuvansom pokazuju difuzno i ne specifično blago bojenje ćelijskih tela). Serumi iz miševa koji pripadaju grupi II pokazuju veći afinitet u prepoznavanju hα-sinukleina u sinapsama i neuronima kod tg miševa u poređenju sa imunizovanim miševima iz grupe I (Tabela 4).

[0247] Ispitivanja mapiranja epitopa pokazuju da kod miševa koji su vakcinisani sa hα-sinukleinom, antitela najčešće prepoznaju peptidne epitope unutar C-kraja regiona hα-sinukleina (Slika 8). Dodatno, često se prepoznaju antitela prema dodatnim epitopima. Nasuprot tome, ni reaktinvnost ni epitopi antitela se ne uočavaju sa serumom miševa koji se tretiraju samo sa CFA.

Imunizacija smanjuje nakupljanja hα-sinukleina i čuva sinaptičku gustinu u mozgovima tg miševa

[0248] Da bi se odredili efekti imunoterapije na nakupljanje hα-sinukleina, preseci se obeležavaju sa antitelima prema hα-sinukleinu i analiziraju u svetlom polju mikroskopa ili pomoću LSCM. Kod tg miševa, uočava se obilna imunorekativnost hα-sinukleina u neuropilu ka oi u intranervnim inkluzijama. U poređenju sa tg miševima koji se tretiraju samo sa CFA, miševi iz obe imunizovane grupe pokazuju poredivo smanjenje (približno 25%) u broju inkluzija u temporalnom kortekstu (Slika 9A). Osim toga, imunizacija dovodi do smanjenja u hα-sinukleinskoj imunoreaktivnosti u neutropilu. Kada se poredi sa tg miševima koji se tretiraju samo sa CFA, ovaj efekat je veći kod miševa iz grupe II nego kod miševa iz grupe I (Slika 9A). Da bi se odredilo da li su efekti imunizacije zaista povezani sa sposobnostima antitela da redukuju nakupljanje hα-sinukleina u neuronima ili za maskiranje efekata, izvode se kontrolni eksperimenti poređenjem nivoa imunoreaktivnosti β sinukleina između samog CFA i tg miševa koji su vakcinisani sa hα-sinukleinom. U skladu sa poznatom distribucijom β sinukleina, bliskog homologa αsinukleina (Iwai et al., Neuron 14:467-475 (1994)), obilna imunoreaktivnost β-sinukleina se uočava u neutropilu zajedno sa presinaptičkim krajevima i blago imunoobeležavanje se uočava u ćelijskim telima neurona, ali ne u inkluzijama. U poređenju sa tg miševima koji se tretiraju samo sa CFA, ne uočavaju se razlike u obrascima i nivoima β-sinukleina kod miševa koji su imunizovani sa hα-sinukleinom. Da bi se dalje ispitala specifičnost efekata hα-sinukleinskih antitela, nivoi mišje (m) imunoreaktivnosti α sinukleina se porede između samog CFA i tg miševa koji su vaksinisani sa hα-sinukleinom. Slično hα sinuklinu, mα sinukleinska imunoreaktivnost je obilna u neutropilu zajedno sa nervnim krajevima ali odsustvuje u ćelijskim telima neurona i u inkluzijama. Kod oba, CFA i hα-sinukleinom imunizovanih miševa, obrasci i nivoi mα sinukleina mogu da se uporede. Uzumajući zajedno, ova ispitivanja sugerišu da vakcinacija specifično utiče na hα-sinuklein ali ne na druge povezan sinaptičke molekule.

[0249] Da bi se dalje utvrdili efekti imunoterapije na integritet neuropila, preseci se imunoboje sa antitelom koje je specifično prema sinaptofizinu ili elektronskom mikroskopijom. U poređenju sa netransgenim (nontg) miševima, tg miševi koji se tretiraju samo sa CFA pokazuju srednju vrednost 20% smanjenja u broju sinaptofizinom imunoobeleženih krajeva, i brojevi imunoreaktivnosti sinaptofizina po sinapsi ostaju nepromenjeni (Slika 9B). Suprotno, imunizovani miševi iz obe grupe pokazuju nivoe imunoreaktivnosti sinaptofizina koji se porede sa nontg kontrolama (9B). Dalja imunocitohemijska analiza sa antitelima prema glijalnim markerima kao što su GFAP i CD45 pokazuje trend prema povećanoj imunoreaktivnosti u mozgovima tg miševa koji su vakcinisani sa hα-sinukleinom (Slika 9C). U skladu sa ovim nalazima, ultrastrukturna analiza pokazuje da u mozgovima tg miševa koji su imunizovani sa hα-sinukleinom, neutropil je dobro očuvan, sa intaktnim presinaptičkim krajevima i dendriti i nervni krajevi sadrže mnoštvo jasnih vezikula i obrazuju postsinaptičke gustine. Samo povremene elektroguste nakupine mogu da se identifikuju u neuritskim procesima i svekupune mitohondrije i mijelin su dobro očuvani.

[0250] Da bi se bolje karakterisali efekti vakcinacije na nakupljanje hα-sinukleina u sinapsama, izvodi se dvostruka imunocitohemijska i Western blot analiza sa sinaptozomalnim preparatima. U fiziološkim uslovima hα-sinuklein je lokalizova primarno do presinaptičkih stopala (Iwai et al., 1994, supra) i u LBD i kod tg miševa, povećano nakupljanje hα-sinukleina u sinapsama se povezuje sa funkcionalnim deficitima i gubitkom sinapse (Hashimoto et al., 2001, supra). Da bi se utvrdili efekti vakcinacije na nakupljanje hα-sinukleina u nervnim krajevima, izvode se dvostruka ispitivanja imunoobeležavanjem sa antitelima prema presinaptičkim terminalnim markerom sinaptofizinom i hα-sinukleinom i WB analiza sa sinaptozomalnim preparatima. Konfokalno slikanje dvostruko obeleženih preseka pokazuje da u poređenju sa hα-sinukleinom tg miševi koji su vakcinisani samo sa CFA (Slika 9D), oni kojima se ubrizgava hα-sinuklein ispoljavaju smanjeno nakupljanje hα-sinukleina u sinaptofizin-imunoreaktivnim nervnim krajevima u neokortekstu (Slika 9D).

[0251] U skladu sa imunocitohemijskim ispitivanjima, analiza imunoblotom pokazuje da kod tg miševa koji se tretiraju samo sa CFA, postoji više traka većih molekulskih masa, što moguće odražava nakupljanje hα-sinukleinskih imunoreaktivnih inkluzija u sinapsama (Slika 10). U imunizovanom mišu postoji značajno smanjenje u nakupljanju traka koje sadrže hα-sinuklein sa većom molekulskom masom i prirodne trake, ali efekti se ne uočavaju za nivoe mα-sinukleina. Dalje, u poređenju sa tg miševima koji se tretiraju samo sa CFA, nivoi imuoreaktinvosti sinaptofizina su veći kod sinaptozomalnih preparata iz imunizovanih miševa (Slika 10). Uzimajući zajedno u obzir, ovi rezultati ukazuju da imunoterapija može da ublaži nervno oštećenje u mozgovima tg miševa smanjenjem nakupljanja potencijalno toksičnih oligomera hα-sinukleina u sinapsama.

Efekti imunizacije zavise od relativnog afiniteta antitela u prepoznavanju sinaptičkih krajeva

[0252] Da bi bilo jasnije koji faktori predviđaju efikasnost terapije, izvodi se analiza linearne regresije između neuropatoloških markera nakupljanja hα-sinukleina i titara antitela i afiniteta. Ova analiza pokazuje značajnu korelaciju između relativnog afiniteta antitela određenog imunoblotom i nivoa imunoreaktivnosti hα-sinukeina u sinapsama ali ne sa brojevima inkluzija u neuronima. Slično, relativni afinitet antitela da prepozna sinapse pomoću ICC se nalazi u obrnutoj korelaciji sa nivoima hαsinukleina u sinapsama i u direktnoj korelaciji sa procentom površine koju zauzimaju sinaptofizinomobeleženi nervni krajevi, ali ne sa brojevima inkluzija u neuronu. Nivoi reaktivnosti antitela koja se određuje imunoblotom ili ICC se nalaze u snažnoj korelaciji sa titrima antitela kao što se određuje ELISA testom. Titri antitela se nalaze u korelaciji sa procentom površine neutropila koji je obeležen sa antihasinukleinskim antitelom ali ne sa brojevima inkluzija u neuronima (Tabela 4). Uzimajući zajedno u obzir, ovi rezultati sugerišu da relativna reaktivnost koja se dobija imunoblotovanjem anti-humanih αsinukleinskih antitela i do nekog obima antitela iz ELISA titata se nalaze u korelaciji sa smanjenjem nakupljanja humanog α-sinukleina u neuronima.

Anti-humana α-sinukleinska antitela se internalizuju i vezuju za sinapse i neurone koji sadrže inkluzije kod tg miševa

[0253] Da bi se odredilo da li pokretna antitela prepoznaju karakteristična nervna mesta gde se nakuplja humani α-sinuklein u mozgovima tg miševa, izvodi se jednostruka i dvostruka imunocitohemijska analiza sa konjskim anti-mišjim IgG antitelima. Ova antitela navodno prepoznaju anti-humani α-sinuklein koji se dobija kod imunizovanih životinja ali ne kod CFA kontrola. Digitalna mikroskopija sa svetlim poljem imunski-obeleženih preseka pokazuje da miševi koji su imunizovani sa hα-sinukleinom, bitinilovana anti-mišja IgG difuzno obeležavaju ćelijska tela neurona i neuritske procese u neutropilu. Kod tg životinja koje se tretiraju samo sa CFA postoji blago obeležavanje krvnih sudova i povremeno ćelija koje podsećaju na mikrogliju. Dvostruki eksperimenti imunobojenja potvrđuju da kod vakcinisanih miševa, tela nervnih ćelija koja su obeležena sa FITC označenim antimišjim IgG ispoljavaju hα-sinukleinsku imunoreaktivnost. U poređenju sa miševima koji se tretiraju samo sa CFA, kod miševa koji su vakcinisani sa hα-sinukeinom, u nekim neuronima, anti-mišje IgG i imunoreaktivnost hα-sinukleina se kolokalizuju na periferiji ćelijskih tela, u drugim oblastima se uočavaju dva obeleživača u neuritskim procesima i sinapsama. Osim toga, u nekoliko neurona koji sadrže humani α-sinuklein dva markera se detektuju u granularnim podćelijskim strukturama sa srednjom veličinom 0,4-0,8 μm u prečniku. Dodatni eksperimenti dvostrukog obeležavanja pokazuju da ove granularne strukture prikazuju imunoreaktivnost katepsina D, što ukazuje da internalizovana anti-humana α-sinukelinska antitela reaguju sa sinukelinom u lizozomima. U skladu sa ovim otkrićem, ultrastrukturna analiza pokazuje da u nekim neuronima miševa koji su vakcinisani sa humanim αsinukleinom, identifikovane elektroguste laminirane strukture koje ukazuju na lizozome i fagolizozome. Uzimajući u obzir, ovi rezultati ukazuju da vakcinacija sa humanim α-sinukleinom moze da promoviše degradaciju ovog molekula preko aktivacije lizozomskog puta.

PRIMER IX. Uklanjanje α-Sinukleinskih nakupina In Vivo davanjem antitela koja su specifična za α-Sinuklein

[0254] Ovaj primer pokazuje uklanjanje intranervnih α-sinukleinskih nakupina upotrebom monoklonskih anti-α-sinukleinskih antitela koja prepoznaju α-sinukleinski kraj. Monoklonska antitela se daju injekcijom u neokorteksts transgenih miševa koji prekomerno eksprimiraju humani α-sinuklein i imaju intranervne α-sinukleinske nakupine. Dva antitela, jedno antitelo koje je usmereno prema N-kraju i drugo koje je usmereno prema C-kraju α-sinukleina, smanjuje broj intranervnih α-sinukleinskih nakupina do 80% u poređenju sa irelevantnim kontrolnim antitelima (Sl.11).

[0255] Postupci. Monoklonska antitela koja prepoznaju različite epitope α-sinukleinskog molekula i irelevantna, kontrolna antitela sa izotipom koji se poklapa se rastvaraju u sterilnom slanom rastvoru koji je puferisan fosfatom (Tabela 5) za ubrizgavanje injekcijom u miševe. Životinje koje se koriste su 4 do 8 meseci-stari heterozigotni transgeni miševi koji prekomerno eksprimiraju humani α- sinuklein divljeg tipa u mozgu pod transkripcionom kontrolom PDGF promotora. Za svako od antitela se koristi 4 do 6 različitih transgenih miševa.

Tabela 5. α-Sinukleinska antitela i kontrole koje se koriste za intracerebralnu injekciju u transgenom modelu nervne sinukleopatije.

[0256] Za svakog miša, 2 μl od 2 mg/ml rastvora antitela se stereotaktički ubrizgava pod anestezijom u duboke slojeve parijetalnog neokorteksta desne polovine mozga (ipsilateralna strana). Leve hemisfere (kontralateralna strana) služe kao osnovna kontrola za svakog miša. Mesta ubrigavanja se zatvore i miševi se prate sve dok se ne oporave od anestezije. Istraživač koji sprovodi ubrizgavanja je slep u odnosu na to koje antitelo svaki put ubrizgava. Dva nedelje nakon injekcije, miševi se eutanizuju u skladu sa uputstvima institucije. Njihovi mozgvoi se uklanjaju, fiksiraju u 4% paraformaldehidu 48 h, i seku koronalano u debljini od 40 μm koriščenjem Leica vibratoma. Dva preseka po životinji (oko mesta ubrizgavanja) se boje sa imunoperoksidaznim bojenjem sa poliklonskim α-sinukleinskim antitelom (ELADW-47, koje prepoznaje α-sinukelinske aminokisleine 115-122). Za svaki presek, intraneuronska nakupljanja α-sinukelina se broje na 4 mikroskopska polja (uveličanje 20x) oko mesta u ispilateralnoj polovini, i u 4 polja koja odgovraju poljima u kontralateralnoj kontrolnoj polovini. Brojevi nakupina αsinukeina za dva preseka se sabiraju za svaku hemisferu. Konačno, za svaku životinju razlika između broja ukupno nakupljenog α-sinukeina between između dve polovine se računa i izražava kao % razlike između kontralaterlane i ipsilateralne polovine, prema tome obezbeđuje meru efekta α-sinukelinskih antitela na uklanjanje nakupina za svakog individualnog miša. Preseci su slepo-kodirani i kod se otkriva kada je analiza kompletna.

[0257] Miševi mogu da se kategorišu u tri grupe na osnovu antitela koja se daju injekcijom:

Grupa 1: Miševi koji su dobili injekciju 11A5, 8A5 ili IgG1kontrolu.

Grupa 2: Miševi koji su dobili injekciju 9G5, 23E8, 6H7, ili IgG1kontrolu.

Grupa 3: Miševi koji su dobili injekciju 4B1, 5C12, IgG2aili IgG2bkontrolu.

[0258] Rezultati. Rezultati ovog ispitivanja se prikazuju na Slikama 11 i 12. Intraneuronske nakupine αsinukleina se uklanjaju sa dva monoklonska antitela: 8A5 (takođe poznato pod imenom JH4.8A5) i 6H7 (takođe poznato pod imenom JH17.6H7), pri čemu su oba opisana u PCT objavi patenta WO 05047860A2 ("Antibodies to Alpha-Synuclein" filed May 26, 2005) i u tekućij prijavi patenta Br.

10/984192. MAb 6H7 se dobija prema rekombinovanom humanom α-sinukleinu koji se eksprimira u E. coli i prepoznaje amino kraj humanih i mišjih α-sinukleina. Prepoznaje epitope koji uključuje prve tri aminokiseline α-sinukelina. MAb 6H7 može da prepozna kombinovane proteine sinukleina kod kojih je tag protein obeleživač spojen sa N-krajem sinukelina, što ukazuje na to da N kraj nije potreban (iako može da bude poželjan). MAb 8A5 se dobija prema prečišćenim goveđim sinukleinima (smeša α i β) i prepoznaje epitope karboksi kraju humanih i mišjih α-sinukelina. MAb 8A5 može da veže prekinuti sinuklein koji se zavrđava na aminokiselini 139. Preliminarni eksperimenti sugerišu da 8A5 ima 4-5 struku preferenciju za sinuklein sa slobodnim C-krajem u poređenju sa C-krajem koji je konjugovan za biotin. Oba mAb 6H7 i mAb 8A5 takođe prepoznaju beta-sinukelin. MAb 4B1 prepoznaje C-terminalni region sinukleina i vezuje sinukelin na western blotovima, ali ne prepoznaje sinuklein u rastvoru (tj., mAb 4B1 ne imunoprecipituje sinuklein). Slika 12 pokazuje preseke kontralateralne strane (levi panel; okrugle branon tačkice unutar preseka su nakupine α-sinukleina) i ipsilateralna strana (desni panel) iša koji je injeciran sa 8A5. Razlika između 8A5-injeciranog miša i IgG1-injeciranih kontrola je statstički značajna (p<0,05 neparametrijskim Kruskall-Wallis zatim sa Dunn’s post-hoc testom). Ovi rezultati ukazuju da je ciljanje C-kraja α-sinukleina i/ili N-kraja terapeutski korisno u sinukleopatijama kao što su PD i DLB. Davanje drugih ispitanih anti-α-sinukleinskih antitela (Tabela 5, Sl. 11) nije rezultovala uklanjanjem nakupina.

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje se specifično veže za epitop unutar ostataka 1-10 humanog alfa-sinukleina, ostaci su numerisani prema SEQ ID NO: 1, za upotrebu u profilaksi ili lečenju bolesti koja je naznačena sa Levijevim telima ili nakupljanjem alfa-sinukleina u mozgu.

2. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 1, koje je monoklonsko antitelo.

3. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 2, koje je himerno antitelo.

4. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 2, koje je humano antitelo.

5. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 2, koje je humanizovano antitelo.

6. Antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, koje je IgG1 izotip humanog antitela.

7. Antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, koje je davano sa farmaceutskim nosačem kao farmaceutska kompozicija.

8. Antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, koje je davano u dozi od 1 do 10 mg /kg telesne težine.

9. Antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, koje je davano u višestrukim dozama tokom najmanje šest meseci.

10. Antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, koje je davano intraperitonealno, oralno, subkutanozno, intrakranijalno, intramuskularno, lokalno, intranazalno ili intravenozno.

11. Prvo antitelo koje se specifično veže za epitop unutar ostataka 1-10 humanog alfa-sinukleina, i drugo antitelo koje se specifično veže za epitop unutar ostataka 70-140 humanog alfa-sinukleina, ostaci su numerisani prema SEQ ID NO: 1, za upotrebu u profilaksi ili lečenju bolesti koja je naznačena sa Levijevim telima ili nakupljanjem alfa-sinukleina u mozgu.

12. Prvo antitelo i drugo antitelo za upotrebu prema zahtevu 11, pri čemu se drugo antitelo specifično veže za epitope unutar ostataka 120-140 humanog alfa-sinukleina.

13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži himerno ili humanizovano antitelo koje se specifično veže za epitop unutar ostataka 1-10 alfa-sinukleina, ostaci su numerisani prema SEQ ID NO: 1, i farmaceutski nosač, za upotrebu u profilaksi ili lečenju bolesti koja je naznačena sa Levijevim telima ili nakupljanjem alfa-sinukleina u mozgu.

14. Polipeptid koji sadrži imunogeni fragment alfa-sinukleina efikasan da indukuje imunogeni odgovor koji obuhvata antitela koja se specifično vežu za epitope unutar ostataka 1-10 humanog alfa-sinukleina, pri čemu je imunogeni fragment izabran iz grupe koja se sastoji iz ostataka 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, i 1-10 alfa sinukleina, ostaci su numerisani prema SEQ ID NO: 1, za upotrebu u profilaksi ili lečenju bolesti koja je naznačena sa Levijevim telima ili nakupljanjem alfa-sinukleina u mozgu.

15. Polipeptid za upotrebu prema zahtevu 14, gde je imunogeni fragment povezan sa nosačem da se obrazuje konjugat.

16. Antitelo za upotrebu prema zahtevima 1 do 10, prvo antitelo i drugo antitelo za upotrebu prema zahtevima 11 i 12, farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, polipeptid za upotrebu prema zahtevima 14 i 15 pri čemu je bolest Parkinsonova bolest.