RS58573B1

RS58573B1 - Antisensna nukleinska kiselina

Info

Publication number: RS58573B1
Application number: RS20190188A
Authority: RS
Inventors: Tatsushi Wakayama; Haruna Seo; Youhei Satou; Shin'ichi Takeda; Tetsuya Nagata
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd; Nat Center Neurology & Psychiatry
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2019-05-31
Also published as: JPWO2015137409A1; PH12016501761A1; US20250145997A1; AU2020200679A1; TR201901939T4; TW201945383A; HUE042283T2; RU2019130513A; US20200149040A1; RU2016139108A; BR112016020618B1; NZ724836A; PH12016501761B1; MX2016011538A; MY193708A; PT3118311T; EP3118311A4; WO2015137409A1; RU2702424C2; BR112016020618A2

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antisensni oligomer koji izaziva preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu, kao i na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži oligomer.

STANJE TEHNIKE

[0002] Dišenova mišićna distrofija (DMD) je najčešći oblik nasledne progresivne mišićne distrofije koji pogađa jednog od oko 3,500 novorođenih dečaka. Mada su motorne funkcije retko različite nego kod zdravih ljudi u ranom detinjstvu i detinjstvu, mišićna slabost se uočava kod dece od oko 4 do 5 godina starosti. Onda mišićna slabost napreduje sve do gubitka sposobnosti kretanja u starosti od oko 12 godina i smrti zbog srčane ili respiratorne insuficijencije u dvadesetim. Zato je DMD ozbiljan poremećaj. Trenutno ne postoji efektivna raspoloživa terapija za DMD i zato je veoma poželjno da se razvije novi terapeutski agens.

[0003] Poznato je da je DMD izazvana mutacijom u genu za distrofin. Gen za distrofin je lociran na X hromozomu i to je veliki gen koji se sastoji od 2.2 miliona DNK nukleotidnih parova. DNK se transkribuje u iRNK prekursore, a introni se odstranjuju spajanjem da bi se sintetisala iRNK od 11,058 baza, u kojoj je međusobno spojeno 79 egzona. Ova iRNK se translira u 3,685 aminokiselina da bi se proizveo protein distrofin. Protein distrofin je povezan sa održavanjem stabilnosti membrane u mišićnim ćelijama i neophodan je da se mišićne ćelije učine manje krhkim. Gen za distrofin kod pacijenata sa DMD sadrži mutaciju i zbog toga se protein distrofin, koji je funkcionalan u mišićnim ćelijama, retko izražava. Zbog toga se u telu pacijenata sa DMD ne može održati struktura mišićnih ćelija, što dovodi do velikog priliva kalcijumovih jona u mišićne ćelije. Zato se pojavljuje reakcija slična zapaljenju koja podstiče fibrozu, tako da se mišićne ćelije mogu regenerisati samo uz poteškoće.

[0004] Bekerova mišićna distrofija (BMD) je takođe izazvana mutacijom u genu za distrofin. Simptomi obuhvataju mišićnu slabost praćenu atrofijom mišića, ali obično blagu i sporu po napredovanju mišićne slabosti, u poređenju sa DMD. U mnogim slučajevima, ona se pojavljuje u odraslom dobu. Smatra se da se razlike u kliničkim simptomima između DMD i BMD nalaze u tome što je okvir za čitanje aminokiselina pri translaciji distrofinske iRNK u protein distrofin poremećen mutacijom ili nije (Nepatentni dokument 1). Preciznije, kod DMD, prisustvo mutacije pomera okvir za čitanje aminokiselina tako da je sprečena ekspresija funkcionalnog proteina distrofina, dok se kod BMD proizvodi protein distrofin koji funkcioniše, mada nepravilno, jer je okvir za čitanje aminokiselina sačuvan, dok je deo egzona izbrisan mutacijom.

[0005] Očekuje se da preskakanje egzona posluži kao metod za lečenje DMD. Ovaj metod obuhvata modifikaciju spajanja da bi se restaurirao okvir za čitanje aminokiselina distrofinske iRNK i da bi se indukovala ekspresija proteina distrofina koji ima delimično restauriranu funkciju (Nepatentni dokument 2). Deo aminokiselinske sekvence, koji je cilj za preskakanje egzona, biće izgubljen. Iz ovog razloga, protein distrofin koji se izražava ovim tretmanom postaje kraći od normalnog, ali pošto je okvir za čitanje aminokiselina održan, onda je funkcija stabilizacije mišićnih ćelija delimično očuvana. Shodno tome, očekuje se da će preskakanje egzona dovesti kod DMD do simptoma sličnih kao kod BMD, koja je blaža. Pristup sa preskakanjem egzona je prošao testove na životinjama uz korišćenje miševa ili pasa i sada se procenjuje u kliničkim testovima na humanim DMD pacijentima.

[0006] Preskakanje egzona se može indukovati vezivanjem antisensnih nukleinskih kiselina koje ciljaju bilo na 5’ ili 3’ mesto spajanja ili na oba mesta ili na mesta unutar egzona. Egzon će biti uključen u iRNK samo onda kada su oba njegova mesta spajanja prepoznata od strane spojnozomskog kompleksa. Shodno tome, preskakanje egzona se može indukovati ciljanjem na mesta spajanja pomoću antisensnih nukleinskih kiselina. Dalje, vezivanje SR proteina za egzonski pojačavač spajanja (engl. exonic splicing enhancer, skr. ESE) se smatra neophodnim da bi egzon bio prepoznat od strane mehanizma za spajanje. Shodno tome, preskakanje egzona se takođe može indukovati ciljanjem na ESE.

[0007] Pošto mutacija gena za distrofin može varirati u zavisnosti od DMD pacijenata, antisensne nukleinske kiseline treba da budu dizajnirane na osnovu mesta ili tipa odgovarajuće genetske mutacije. U prošlosti, antisensne nukleinske kiseline koje indukuju preskakanje egzona za svih 79 egzona su proizveli Steve Wilton, et al., University of Western Australia (Nepatentni dokument 3), dok su antisensne nukleinske kiseline koje indukuju preskakanje egzona za 39 egzona proizveli Annemieke Aartsma-Rus, et al., Netherlands (Nepatentni dokument 4).

[0008] Smatra se da se približno 13% svih DMD pacijenata može lečiti preskakanjem egzona 51 (u nastavku se naziva "egzon 51"). Prethodnih godina, mnoštvo istraživačkih organizacija je izvestilo o studijama gde je egzon 51 u genu za distrofin bio cilj za preskakanje egzona (Patentni dokumenti 1 do 7; Nepatentni dokumenti 5 do 6). Međutim, tehnika za preskakanje egzona 51 sa visokom efikasnosti još uvek nije realizovana.

[0009] WO2010/048586A1 opisuje antisensno jedinjenje koje sadrži 20-35 morfolino podjedinica za preskakanje egzona 51 humanog distrofina prethodno prerađene iRNK, dok WO2011/154427A1 opisuje A nukleinsku kiselinu koja kodira malu nuklearnu RNK (engl. small nuclear RNA, skr. snRNA) koja može da se hibridizuje sa ukrštanjima 5’ i 3’ mesta spajanja i sa najmanje jednim egzonskim pojačavačem spajanja egzona 45 ili egzona 51 distrofinske pre-iRNK.

DOKUMENT IZ STANJA TEHNIKE

Patentni dokument

[0010]

Patentni dokument 1: Međunarodna objava WO 2004/048570

Patentni dokument 2: Međunarodna objava WO 2002/024906

Patentni dokument 3: Međunarodna objava WO 2010/048586

Patentni dokument 4: Međunarodna objava WO 2010/050801

Patentni dokument 5: US 2010/0168212

Patentni dokument 6: Međunarodna objava WO2010/048586A1

Patentni dokument 7: Međunarodna objava WO2011/154427A1

[0011]

Nepatentni dokument 1: Monaco A. P. et al., Genomics 1988; 2: str.90-95 Nepatentni dokument 2: Matsuo M., Brain Dev 1996; 18: str.167-172 Nepatentni dokument 3: Wilton S. D., e t al., Molecular Therapy 2007: 15: str. 1288-96

Nepatentni dokument 4: Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77

Nepatentni dokument 5: Aoki Y., et al., Molecular therapy 2010: 18: str.1995-2005 Nepatentni dokument 6: Nakano S., et al., Pediatr Int.2011: 53: 524-429

OPIS PRONALASKA

TEHNIČKI PROBLEMI KOJI SE REŠAVAJU PRONALASKOM

[0012] Pod prethodnim uslovima bili bi poželjni antisensni oligomeri koji indukuju preskakanje egzona 51 u genu za distrofin sa visokom efikasnosti i terapeutisi za mišićnu distrofiju koji sadrže njihove oligomere.

SUŠTINA PRONALASKA

[0013] Kao rezultat detaljnih proučavanja tehničkog sadržaja gornjih dokumenata i strukture gena za distrofin, aktuelni pronalazači su utvrdili da se preskakanje egzona 51 može indukovati sa visokom efikasnosti davanjem antisensnog oligomera koji ima nukleotidne sekvence predstavljene sa SEQ ID NO:1 i 2. Na osnovu ovog otkrića, aktuelni pronalazači su ostvarili predmetni pronalazak.

[0014] To znači da je predmetni pronalazak kao što sledi.

[1] Antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (a) do (d) dole:

(a) antisensni oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1 ili 2; (b) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima deleciju, supstituciju, inserciju i/ili adiciju od 1 do 5 nukleotida u nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 ili 2, i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu;

(c) antisensni oligomer koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2 i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu; i

(d) antisensni oligomer koji se hibridizuje pod stringentnim uslovima u oligonukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2 i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu.

[2] Antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (e) do (h) dole:

(e) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 ili 2;

(f) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima deleciju, supstituciju, inserciju i/ili adiciju od 1 do 3 nukleotida u nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 ili 2, i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu;

(g) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2 i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu; i

(h) antisensni oligomer koji se hibridizuje pod stringentnim uslovima u oligonukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2 i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu.

[3] Antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (i) i (j) dole:

(i) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 ili 2; i

(j) antisensni oligomer koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2 i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu.

[4] Antisensni oligomer prema bilo kom od [1] do [3] gore, koji je oligonukleotid.

[5] Antisensni oligomer prema [4] gore, pri čemu je modifikovan šećerni radikal i/ili region za vezivanje fosfata najmanje jednog nukleotida koji obrazuje oligonukleotid.

[6] Antisensni oligomer prema [4] ili [5] gore, pri čemu je šećerni radikal najmanje jednog nukleotida koji obrazuje oligonukleotid riboza u kojoj je 2’-OH grupa zamenjena bilo čime izabranim iz grupe koja se sastoji od OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br i I (pri čemu R je alkil ili aril i R’ je alkilen).

[7] Antisensni oligomer prema bilo kom od [4] do [6] gore, pri čemu je region za vezivanje fosfata najmanje jednog nukleotida koji obrazuje oligonukleotid bilo koji izabran iz grupe koja se sastoji od fosforotioatne veze, fosforoditioatne veze, alkilfosfonatne veze, fosforamidatne veze i boranofosfatne veze.

[8] Antisensni oligomer prema bilo kom od [1] do [3] gore, koji je morfolino oligomer.

[9] Antisensni oligomer prema [8] gore, pri čemu su morfolinska prstenasta grupa, region za vezivanje fosfata, 3’-kraj i/ili 5’-kraj najmanje jednog morfolino koji obrazuje morfolino oligomer modifikovani.

[10] Antisensni oligomer prema [9] ili [10] gore, pri čemu je region za vezivanje fosfata najmanje jednog morfolino koji obrazuje morfolino oligomer bilo koji izabran između fosforodiamidatne veze, fosforotioatne veze, fosforoditioatne veze, alkilfosfonatne veze, fosforamidatne veze i boranofosfatne veze.

[11] Antisensni oligomer prema [10] gore, koji je fosforodiamidatni morfolino oligomer.

[12] Antisensni oligomer prema bilo kom od [9] do [11] gore, pri čemu je 5’ kraj bilo koja od hemijskih formula (1) do (3) dole:

[13] Farmaceutska kompozicija za lečenje mišićne distrofije, koja sadrži kao aktivni sastojak antisensni oligomer prema bilo kom od [1] do [12] gore, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat.

[14] Farmaceutska kompozicija prema [13] gore, koja sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač.

[15] Metod lečenja mišićne distrofije, koji sadrži davanje pacijentu sa mišićnom distrofijom antisensnog oligomera prema bilo kom od [1] do [12] gore ili farmaceutske kompozicije prema [13] ili [14] gore.

[16] Metod lečenja prema [15] gore, pri čemu je pacijent sa mišićnom distrofijom pacijent sa delecijama nukleotida sa egzonima 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 ili 47-50.

[17] Metod lečenja prema [15] ili [16] gore, pri čemu je pacijent čovek.

[18] Primena antisensnog oligomera prema bilo kom od [1] do [12] gore u proizvodnji farmaceutske kompozicije za lečenje mišićne distrofije.

[19] Antisensni oligomer prema bilo kom od [1] do [12] gore, za primenu u lečenju mišićne distrofije.

[20] Antisensni oligomer prema [19] gore, pri čemu je pacijent sa mišićnom distrofijom u pomenutom lečenju pacijent sa delecijama nukleotida u okviru egzona 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 ili 47-50.

[21] Antisensni oligomer prema [19] ili [20] gore, pri čemu je pacijent čovek.

EFEKTI PRONALASKA

[0015] Antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku može indukovati preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu sa visokom efikasnošću. Takođe, simptomi Dišenove mišićne distrofije se mogu efektivno ublažiti davanjem farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku.

KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0016] FIG.1 prikazuje efikasnost preskakanja egzona 51 u humanom distrofinskom genu u humanoj rabdomiosarkoma ćelijskoj liniji (RD ćelijama).

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0017] Predmetni pronalazak će biti detaljno opisan u nastavku. Dole opisani primeri izvođenja su namenjeni da budu predstavljeni isključivo kao ilustracija opisa pronalaska, ali ne i za to da on bude ograničen samo na sledeće primere izvođenja. Predmetni pronalazak može biti primenjen na različite načine bez izlaska iz okvira pronalaska.

1. Antisensni oligomer

[0018] Predmetnim pronalaskom je realizovan antisensni oligomer (u nastavku se navodi kao "antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku") koji izaziva preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu sa visokom efikasnosti.

[Egzon 51 u humanom genu za distrofin]

[0019] U predmetnom pronalasku izraz "gen" treba da označi genomski gen, a takođe obuhvata kDNK, iRNK prekursor i iRNK. Prvenstveno, gen je iRNK prekursor, tj. pre-iRNK.

[0020] U humanom genomu, humani gen za distrofin je lociran na lokusu Xp21.2. Humani gen za distrofin ima veličinu od 2.2 miliona nukleotidnih parova i on je najveći gen među poznatim humanim genima. Međutim, kodirajući regioni humanog gena za distrofin su samo 14kb, raspoređeni su kao 79 egzona i to na humanom genu za distrofin (Roberts, RG, et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)). pre-iRNK, koja je transkript humanog gena za distrofin, se podvrgava spajanju da bi se generisala zrela iRNK od 14 kb. Nukleotidna sekvenca prirodnog humanog gena za distrofin je poznata (GeneBank Accession No. NM_004006).

[0021] Nukleotidna sekvenca egzona 51 u prirodnom humanom genu za distrofin je predstavljena sa SEQ ID NO: 3.

[Antisensni oligomer]

[0022] Antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku je dizajniran tako da izazove preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu, čime se modifikuje protein kodiran DMD tipom gena za distrofin u BMD tip proteina distrofina. Shodno tome, egzon 51 u genu za distrofin, koji je cilj za preskakanje egzona pomoću antisensnog oligomera, obuhvata i prirodne, i mutirane tipove.

[0023] Antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku je specifični antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (a) do (d) dole.

(c) antisensni oligomer koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2 i ima aktivnost da izazove preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu; i

[0024] Antisensni oligomeri od (b) do (d) su naročito mutanti antisensnog oligomera (a) i namenjeni su da odgovaraju mutacijama gena za distrofin kod pacijenata, kao što je npr. polimorfizam.

[0025] Kao sledeći primer izvođenja, antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku je specifični antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (k) do (n) dole.

(k) Antisensni oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu prikazanu bilo kojom od SEQ ID NOS: 6 do 33;

(l) Antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima deleciju, supstituciju, inserciju i/ili adiciju od 1 do 5 nukleotida u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj bilo kojom od SEQ ID NOS: 6 do 33, i ima aktivnost da izazove preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu;

(m) Antisensni oligomer koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom bilo koje od SEQ ID NOS: 6 do 33 i ima aktivnost da izazove preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu; i (n) Antisensni oligomer koji se hibridizuje pod stringentnim uslovima u oligonukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom prikazanom bilo kojom od SEQ ID NOS: 6 do 33 i ima aktivnost da izazove preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu. Antisensni oligomeri od (1) do (n) su naročito mutanti antisensnog oligomera (k) i namenjeni su da odgovaraju mutacijama gena za distrofin kod pacijenata, kao što je npr. polimorfizam.

Takođe, antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku je antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (o) do (r) dole.

(o) Antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja je prikazana bilo kojom od SEQ ID NOS: 6 do 33;

(p) Antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima deleciju, supstituciju, inserciju i/ili adiciju od 1 do 3 nukleotida u nukleotidnoj sekvenci prikazanoj bilo kojom od SEQ ID NOS: 6 do 33, i ima aktivnost da izazove preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu;

(q) Antisensni oligomer koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom bilo koje od SEQ ID NOS: 6 do 33 i ima aktivnost da izazove preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu; i (r) Antisensni oligomer koji se hibridizuje pod stringentnim uslovima u oligonukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom prikazanom bilo kojom od SEQ ID NOS: 6 do 33 i ima aktivnost da izazove preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu. Dalje, antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku je antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (i) i (j) dole:

(i) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 6 do 33; ili

(j) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima najmanje 90% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom bilo koje od SEQ ID NOS: 6 do 33 i ima aktivnost da izazove preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu.

[0026] Kada se ovde koristi, izraz "antisensni oligomer koji se hibridizuje pod stringentnim uslovima" se odnosi, na primer, na antisensni oligomer dobijen hibridizacijom kolonija, hibridizacijom plaka, Southern hibridizacijom ili sličnim, korišćenjem kao uzorka celog ili dela oligonukleotida koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom sa, npr. SEQ ID NO: 1. Metod hibridizacije koji se može upotrebiti obuhvata metode opisane, na primer, u "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001“, "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997“, itd.

[0027] Kada se ovde koristi, izraz "stringentni uslovi" mogu biti bilo koji slabo stringentni uslovi, umereno stringentni uslovi ili jako stringentni uslovi. Izraz "slabo stringentni uslov" su, na primer, 5x SSC, 5x Denhartov rastvor, 0.5% SDS, 50% formamid na 32°C. Izraz "umereno stringentni uslov" su, na primer, 5x SSC, 5x Denhartov rastvor, 0.5% SDS, 50% formamid na 42°C, ili 5x SSC, 1% SDS, 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 50% formamid na 42°C. Izraz "jako stringentni uslov" su, na primer, (1) 5x SSC, 5x Denhartov rastvor, 0.5% SDS, 50% formamid na 50°C , (2) 0.2x SSC, 0.1% SDS na 60°C, (3) 0.2x SSC, 0.1% SDS na 62°C, (4) 0.2x SSC, 0.1% SDS na 65°C, ili (5) 0.1x SSC, 0.1% SDS na 65°C, ali nije ograničen na njih. Pod ovim uslovima se očekuje da se efikasno dobije antisensni oligomer sa višom homologijom na višim temperaturama, mada je više faktora uključeno u hibridizacionu stringenciju, uključujući temperaturu, koncentraciju uzorka, dužinu uzorka, jonsku jačinu, vreme, koncentraciju soli i drugo, a stručnjaci iz odgovarajuće oblasti mogu aproksimativno izabrati ove faktore da bi ostvarili sličnu stringenciju.

[0028] Kada se za hibridizaciju koriste komercijalno raspoloživi kitovi, može se upotrebiti, na primer, Alkphos Direct Labelling and Detection System (GE Healthcare). U ovom slučaju, prema priloženom protokolu, posle kultivacije sa obeleženim uzorkom preko noći, membrana se ispira primarnim puferom za ispiranje koji sadrži 0.1% (w/v) SDS na 55°C, čime se detektuje hibridizovani antisensni oligomer. Alternativno tome, kada se uzorak obeleži digoksigeninom (DIG) korišćenjem komercijalno raspoloživog reagensa (npr. PCR Labelling Mix (Roche Diagnostics), itd.) u proizvodnji uzorka baziranog na celoj ili delu komplementarne sekvence od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 3, onda se hibridizacija može detektovati DIG Nucleic Acid Detection Kit-om (Roche Diagnostics).

[0029] Pored gore opisanog antisensnog oligomera, drugi antisensni oligomer koji može biti hibridizovan obuhvata antisensne oligomere koji imaju 90% ili veću, 91% ili veću, 92% ili veću, 93% ili veću, 94% ili veću, 95% ili veću, 96% ili veću, 97% ili veću, 98% ili veću, 99% ili veću, 99.1% ili veću, 99.2% ili veću, 99.3% ili veću, 99.4% ili veću, 99.5% ili veću, 99.6% ili veću, 99.7% ili veću, 99.8% ili veću, i 99.9% ili veću identičnost sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2, što je izračunato softverom za proveru homologije, kao što su FASTA i BLAST uz korišćenje prethodno definisanih parametara.

[0030] Identičnost nukleotidnih sekvenci se može odrediti korišćenjem FASTA (Science 227 (4693): 1435-1441, (1985)) ili algoritma BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) autora Karlin i Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Razvijeni su programi pod nazivima blastn, blastx, tblastn i tblastx koji se baziraju na BLAST algoritmu (Altschul SF, et al: J. Mol. Biol.215: 403, 1990). Kada se nukleotidna sekvenca sekvencira korišćenjem blastn-a, onda su parametri, na primer, skor=100 i dužina reči=12. Kada se koriste programi BLAST i Gapped BLAST, onda se upotrebljavaju prethodno definisani parametri za svaki program.

[0031] Izraz "izaziva preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu" je namenjen za označavanje da se vezivanjem antisensnog oligomera prema predmetnom pronalasku na mesto koje odgovara egzonu 51 transkripta (npr. preiRNK) humanog gena za distrofin, na primer, nukleotidna sekvenca koja odgovara 5’ kraju egzona 53 spaja sa nukleotidnom sekvencom koja odgovara 3’ kraju egzona 50 kod DMD pacijenata sa delecijom egzona 52 kada se transkript podvrgava spajanju, što rezultuje formiranjem zrele iRNK koja nema pomeranje okvira kodona.

[0032] Ovde je izraz "vezivanje" koji je opisan gore namenjen za označavanje da je antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku pomešan sa transkriptom humanog gena za distrofin, a oba su hibridizovana pod fiziološkim uslovima da bi formirali nukleinsku kiselinu sa dvostrukim lancem. Izraz "pod fiziološkim uslovima" se odnosi na uslove koji su prilagođeni tako da imitiraju in vivo okruženje u pogledu pH, kompozicije soli i temperature. Uslovi su, na primer, 25 do 40°C, a prvenstveno 37°C, pH 5 do 8, a prvenstveno pH 7.4 i koncentracija natrijum hlorida od 150 mM.

[0033] Bilo da je preskakanje egzona 51 u humanom distrofinskom genu izazvano ili ne, ono može biti potvrđeno uvođenjem antisensnog oligomera prema predmetnom pronalasku u ćeliju za izražavanje distrofina (npr. humane rabdomiosarkoma ćelije), amplifikacijom regiona koji okružuje egzon 51 iRNK humanog gena za distrofin od celokupne RNK ćelije za izražavanje distrofina pomoću RT-PCR i izvođenjem grupne PCR ili sekventne analize na PCR amplifikovanom proizvodu.

[0034] Efikasnost preskakanja se može odrediti kao što sledi. iRNK za humani gen za distrofin se sakuplja iz testiranih ćelija; u iRNK se mere polinukleotidni nivo "A" trake gde je egzon 51 preskočen i polinukleotidni nivo "B" trake gde egzon 51 nije preskočen. Korišćenjem vrednosti ovih merenja "A" i "B“, efikasnost se izračunava pomoću sledeće jednačine:

Efikasnost preskakanja (%) = A/(A+B) x 100

[0035] Prvenstveno, antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku izaziva preskakanje egzona 51 sa efikasnosti od 10% ili većom, 20% ili većom, 30% ili većom, 40% ili većom, 50% ili većom, 60% ili većom, 70% ili većom, 80% ili većom, i 90% ili većom. Za izračunavanje efikasnosti preskakanja se može konsultovati međunarodna objava WO2012/029986.

[0036] Antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku sadrži, na primer, oligonukleotid, morfolino oligomer ili peptidnu nukleinsku kiselinu (PNA), koja ima dužinu od 16 do 35 nukleotida. Dužina je prvenstveno od 19 do 32, od 20 do 31, 21 ili 30 nukleotida, a poželjni su morfolino oligomeri.

[0037] Gore opisani oligonukleotid (u nastavku se naziva "oligonukleotid prema predmetnom pronalasku") je antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku koji sačinjavaju nukleotidi kao sastavne jedinice. Takvi nukleotidi mogu biti bilo koji od ribonukleotida, deoksiribonukleotida i modifikovanih nukleotida.

[0038] Modifikovani nukleotid se odnosi na onaj koji ima potpuno ili delimično modifikovane nukleobaze, šećerne radikale i/ili regione za vezivanje fosfata, koji obrazuju ribonukleotid ili deoksiribonukleotid.

[0039] U predmetnom pronalasku, nukleobaza obuhvata, na primer, adenin, gvanin, hipoksantin, citozin, timin, uracil, i njihove modifikovane baze. Primeri takvih modifikovanih baza obuhvataju, ali nisu ograničeni na pseudouracil, 3-metiluracil, dihidrouracil, 5-alkilcitozine (npr.5-metilcitozin), 5-alkiluracile (npr.5-etiluracil), 5-halouracile (5-bromouracil), 6-azapirimidin, 6-alkilpirimidine (6-metiluracil), 2-tiouracil, 4-tiouracil, 4-acetilcitozin, 5-(karboksihidroksimetil) uracil, 5’-karboksimetilaminometil-2-tiouracil, 5-karboksimetilaminometiluracil, 1-metiladenin, 1-metilhipoksantin, 2,2-dimetilgvanin, 3-metilcitozin, 2-metiladenin, 2-metilgvanin, N6-metiladenin, 7-metilgvanin, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, 5-metilaminometiluracil, 5-metilkarbonilmetiluracil, 5-metiloksiuracil, 5-metil-2-tiouracil, 2-metiltio-N6izopenteniladenin, uracil-5-oksisirćetnu kiselinu, 2-tiocitozin, purin, 2,6-diaminopurin, 2-aminopurin, izogvanin, indol, imidazol, ksantin, itd.

[0040] Modifikacija šećernog radikala može obuhvatati, na primer, modifikacije na 2’-poziciji riboze i modifikacije na drugim pozicijama šećera. Modifikacija na 2’-poziciji riboze obuhvata zamenu 2’-OH riboze sa OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br ili I, pri čemu R predstavlja alkil ili aril i R’ predstavlja alkilen.

[0041] Modifikacija za druge pozicije šećera obuhvata, na primer, zamenu O na 4’ poziciji riboze ili deoksiriboze sa S, premošćavanje između 2’ i 4’ pozicija šećera, npr. LNA (zatvorenu nukleinsku kiselinu, engl. locked nucleic acid) ili ENA

etilenom-premošćene nukleinske kiseline), ali nije ograničena na njih.

[0042] Modifikacija regiona za vezivanje fosfata obuhvata, na primer, modifikaciju zamene fosfodiesterske veze fosforotioatnom vezom, fosforoditioatnom vezom, alkil fosfonatnom vezom, fosforoamidatnom vezom ili boranofosfatnom vezom (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160) (upor. npr. japanske nacionalne ponovo objavljene PCT prijave br.2006/129594 i 2006/038608).

[0043] U ovom pronalasku, alkil je prvenstveno linearni ili razgranati alkil koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika. Specifični primeri obuhvataju metil, etil, n-propil, izopropil, nbutil, izobutil, sek-butil, terc-butil, n-pentil, izopentil, neopentil, terc-pentil, n-heksil i izoheksil. Alkil opciono može biti supstituisan. Primeri takvih supstituenata su halogen, alkoksi, cijano i nitro. Alkil može biti supstituisan sa 1 do 3 supstituenata.

[0044] U ovom pronalasku, cikloalkil je prvenstveno cikloalkil koji ima 5 do 12 atoma ugljenika. Specifični primeri obuhvataju ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil, ciklodecil i ciklododecil.

[0045] U ovom pronalasku, halogen obuhvata fluor, hlor, brom i jod.

[0046] Alkoksi je linearni ili razgranati alkoksi koji ima 1 do 6 atoma ugljenika, kao što su metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi, n-butoksi, izobutoksi, sek-butoksi, tercbutoksi, n-pentiloksi, izopentiloksi, n-heksiloksi, izoheksiloksi, itd. Između ostalih, poželjan je alkoksi koji ima 1 do 3 atoma ugljenika.

[0047] U ovom pronalasku, aril je prvenstveno aril koji ima 6 do 10 atoma ugljenika. Specifični primeri obuhvataju fenil, α-naftil i β-naftil. Između ostalih, poželjan je fenil. Aril opciono može biti supstituisan. Primeri takvih supstituenata su alkil, halogen, alkoksi, cijano i nitro. Aril može biti supstituisan sa jednim do tri takva supstituenta.

[0048] U ovom pronalasku, alkilen je prvenstveno linearni ili razgranati alkilen koji ima 1 do 6 atoma ugljenika. Specifični primeri obuhvataju metilen, etilen, trimetilen, tetrametilen, pentametilen, heksametilen, 2-(etil) trimetilen i 1-(metil) tetrametilen.

[0049] U ovom pronalasku, acil obuhvata linearni ili razgranati alkanoil ili aroil.

Primeri alkanoila obuhvataju formil, acetil, 2-metilacetil, 2,2-dimetilacetil, propionil, butiril, izobutiril, pentanoil, 2,2-dimetilpropionil, heksanoil, itd. Primeri aroila obuhvataju benzoil, toluoil i naftoil. Aroil opciono može biti supstituisan na pozicijama koje se mogu supstituisati i može biti supstituisan alkilom, odnosno alkilima.

[0050] Prvenstveno, oligonukleotid prema predmetnom pronalasku je antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku koji sadrži sastavnu jedinicu predstavljenu opštom formulom dole, pri čemu je -OH grupa na poziciji 2’ riboze supstituisana sa metoksi i region za vezivanje fosfata je fosforotioatna veza:

pri čemu baza predstavlja nukleobazu.

[0051] Oligonukleotid prema predmetnom pronalasku se može lako sintetizovati korišćenjem različitih automatizovanih sintetizatora (npr. AKTA oligopilota plus 10/100 (GE Healthcare)). Alternativno tome, sinteza se takođe može poveriti nekoj organizaciji kao trećoj strani (npr. Promega Inc., Takara Co., ili Japan Bio Service Co.), itd.

[0052] Morfolino oligomer prema predmetnom pronalasku je antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku koji sadrži sastavnu jedinicu predstavljenu opštom formulom dole:

pri čemu baza ima isto značenje kao što je definisano gore, i,

W predstavlja grupu prikazanu bilo kojom od sledećih grupa:

pri čemu X predstavlja -CH2R<1>, -OCH2R<1>, -S-CH2R<1>, -NR<2>R<3>ili F ;

R<1>predstavlja H ili alkil;

R<2>i R<3>, koji mogu biti isti ili različiti, pri čemu svaki predstavlja H, alkil, cikloalkil ili aril;

Y1 predstavlja O, S, CH2 ili NR<1>;

Y2 predstavlja O, S ili NR<1>;

Z predstavlja O ili S.

[0053] Prvenstveno, morfolino oligomer je oligomer koji sadrži sastavnu jedinicu predstavljenu opštom formulom dole (fosforodiamidatni morfolino oligomer (u nastavku se naziva "PMO")).

pri čemu baza, R<2>i R<3>imaju isto značenje kao što je definisano gore.

[0054] Morfolino oligomer prema predmetnom pronalasku sadrži onaj koji ima potpuno ili delimično modifikovane nukleobaze, morfolinske prstenaste radikale, regione za vezivanje fosfata, 3’-kraj i/ili 5’-kraj koji obrazuju morfolino oligomer.

[0055] Modifikacija regiona za vezivanje fosfata sadrži, na primer, modifikaciju zamene fosforodiamidatnom vezom, fosforotioatnom vezom, fosforoditioatnom vezom, alkilfosfonatnom vezom, fosforamidatnom vezom i boranofosfatnom vezom (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160) (upor. npr. japanske nacionalne ponovo objavljene PCT prijave br.2006/129594 i 2006/038608).

[0056] Morfolino oligomer se može proizvesti u skladu sa npr. WO 1991/009033 ili WO 2009/064471. Naročito se PMO može proizvesti procedurom koja je opisana u WO 2009/064471 ili proizvesti procesom koji je prikazan dole.

[Postupak za proizvodnju PMO]

[0057] Primer izvođenja PMO je, na primer, jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) dole (u nastavku PMO (I)).

pri čemu baza, R<2>i R<3>imaju isto značenje kao što je definisano gore; i,

n je dati ceo broj od 1 do 99, a prvenstveno je dati ceo broj od 24 do 34, od 27 do 31 ili od 28 do 30, a prvenstveno je 29.

[0058] PMO (I) se može proizvesti prema poznatom postupku, na primer, može se proizvesti izvođenjem procedura u sledećim koracima.

[0059] Jedinjenja i reagensi upotrebljeni u koracima dole nisu posebno ograničeni sve dok se uobičajeno koriste za pripremanje PMO.

[0060] Takođe, sledeći koraci se mogu izvesti pomoću metoda u tečnoj fazi ili pomoću metoda u čvrstoj fazi (korišćenjem uputstava ili komercijalno raspoloživih automatizovanih sintetizatora u čvrstoj fazi). Pri proizvodnji PMO pomoću metoda u čvrstoj fazi poželjno je koristiti automatizovane sintetizatore sa stanovišta jednostavnih radnih procedura i pouzdanosti sinteze.

(1) Korak A:

[0061] Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (II) dole (u nastavku se naziva Jedinjenje (II)) reaguje sa kiselinom da bi se pripremilo jedinjenje predstavljeno opštom formulom (III) dole (u nastavku se naziva Jedinjenje (III)):

pri čemu n, R<2>i R<3>imaju isto značenje kao što je definisano gore;

svaki Bnezavisno predstavlja nukleobazu koja može biti opciono zaštićena; T predstavlja tritil, monometoksitritil ili dimetoksitritil; i,

L predstavlja vodonik, acil ili grupu predstavljenu opštom formulom (IV) dole (u nastavku se naziva grupa (IV)).

[0062] "Nukleobaza" za Bobuhvata istu "nukleobazu" kao u bazi, uz uslov da amino ili hidroksi grupa u nukleobazi prikazanoj sa Bmože biti zaštićena. Takva zaštitna grupa za amino nije posebno ograničena sve dok se koristi kao zaštitna grupa za nukleinske kiseline. Specifični primeri obuhvataju benzoil, 4-metoksibenzoil, acetil, propionil, butiril, izobutiril, fenilacetil, fenoksiacetil, 4-terc-butilfenoksiacetil, 4-izopropilfenoksiacetil i (dimetilamino)metilen. Specifični primeri zaštitne grupe za hidroksi grupu obuhvataju 2-cijanoetil, 4-nitrofenetil, fenilsulfoniletil, metilsulfoniletil i trimetilsililetil, i fenil, koji može biti supstituisan sa 1 do 5 grupa koje povlače elektron na opcionim pozicijama koje mogu biti supstituisane, difenilkarbamoil, dimetilkarbamoil, dietilkarbamoil, metilfenilkarbamoil, 1-pirolidinilkarbamoil, morfolinokarbamoil, 4-(terc-butilkarboksi)benzil, 4-[(dimetilamino)karboksi]benzil i 4-(fenilkarboksi)benzil, (upor. npr. WO 2009/064471).

[0063] "Čvrsti nosač" nije posebno ograničen sve dok je to nosač koji se može upotrebiti za reakciju nukleinskih kiselina u čvrstoj fazi. Poželjno je da čvrsti nosač ima sledeća svojstva: npr. (i) da bude malo rastvorlljiv u reagensima koji se mogu upotrebiti za sintezu morfolino derivata nukleinskih kiselina (npr. dihlorometan, acetonitril, tetrazol, N-metilimidazol, piridin, anhidrid sirćetne kiseline, lutidin, trifluorosirćetna kiselina); (ii) hemijski je stabilan prema reagensima koji se mogu upotrebiti za sintezu morfolino derivata nukleinskih kiselina; (iii) može se hemijski modifikovati; (iv) na njega se mogu staviti morfolino derivati nukleinskih kiselina; (v) ima dovoljnu čvrstoću da podnese visoki pritisak tokom tretmana; i (vi) ima ujednačen opseg i raspodelu prečnika čestica. Specifično, polistiren koji može nabubriti (npr. aminometil polistirenska smola 1% divinilbenzen umrežena (200-400 meša) (2.4-3.0 mmol/g) (proizvodi firma Tokyo Chemical Industry), aminometilovana polistirenska smola HCl [divinilbenzen 1%, 100-200 meša] (proizvodi firma Peptide Institute, Inc.)), polistiren koji ne može da nabubri (npr. Primer Support (proizvodi firma GE Healthcare)), polistiren na koji je pričvršćen PEG lanac (npr. NH2-PEG smola (proizvodi firma Watanabe Chemical Co.), TentaGel smola), staklo sa kontrolisanim porama (staklo sa kontrolisanim porama; CPG) (proizvodi, npr. CPG), staklo sa oksalilom kontrolisanim porama (upor. npr. Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol.

19, 1527 (1991)), TentaGel nosač-aminopolietilen glikol-derivatizovani nosač (npr.

Wright et al., upor. Tetrahedron Letters, Vol.34, 3373 (1993)), i kopolimer od Porospolistirena/divinilbenzena.

[0064] "Linker" koji se može koristiti je poznati linker koji se generalno koristi za povezivanje nukleinskih kiselina ili morfolino derivata nukleinskih kiselina. Primeri obuhvataju 3-aminopropil, sukcinil, 2,2’-dietanolsulfonil i alkil amino dugog lanca (LCAA).

[0065] Ovaj korak se može izvesti reakcijom Jedinjenja (II) sa kiselinom.

[0066] "Kiselina" koja se može koristiti u ovom koraku obuhvata, na primer, trifluorosirćetnu kiselinu, dihlorosirćetnu kiselinu i trihlorosirćetnu kiselinu.

Upotrebljena kiselina je aproksimativno u opsegu od, na primer, 0.1 mol ekvivalenta do 1000 mol ekvivalenata bazirano na 1 mol Jedinjenja (II), a prvenstveno je u opsegu od 1 mol ekvivalenta do 100 mol ekvivalenata bazirano na 1 mol Jedinjenja (II).

[0067] Organski amin se može koristiti u kombinaciji sa gore opisanom kiselinom. Organski amin nije posebno ograničen i obuhvata, na primer, trietilamin. Podesno je da je količina upotrebljenog organskog amina u opsegu od npr.0.01 mol ekvivalenta do 10 mol ekvivalenata, a prvenstveno je u opsegu od 0.1 mol ekvivalenta do 2 mol ekvivalenata, bazirano na 1 mol kiseline.

[0068] Kada se u ovom koraku koristi so ili smeša kiseline i organskog amina, onda so ili smeša obuhvataju, na primer, so ili smešu trifluorosirćetne kiseline i trietilamina, a još specifičnije, smešu 1 ekvivalenta trietilamina i 2 ekvivalenta trifluorosirćetne kiseline.

[0069] Kiselina koja se može upotrebiti u ovom koraku takođe se može upotrebiti u obliku razređenja podesnim rastvaračem u koncentraciji od 0.1% do 30%. Rastvarač nije posebno ograničen sve dok je inertan prema reakciji i obuhvata, na primer, dihlorometan, acetonitril, alkohol (etanol, izopropanol, trifluoroetanol, itd.), vodu, ili njihovu smešu.

[0070] Reakciona temperatura u gore opisanoj reakciji je prvenstveno u opsegu od, npr. 10°C do 50°C, još poželjnije, u opsegu od 20°C do 40°C, i najpoželjnije, u opsegu od 25°C do 35°C.

[0071] Reakciono vreme može varirati u zavisnosti od vrste upotrebljene kiseline i reakcione temperature, i aproksimativno je u opsegu od 0.1 minuta do 24 sata generalno, a prvenstveno je u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

[0072] Posle završetka ovog koraka, može se dodati baza, ako je potrebno, da bi se neutralizovala kiselina koja je preostala u sistemu. "Baza" nije posebno ograničena i obuhvata, na primer, diizopropilamin. Baza se takođe može koristiti u obliku razređenja odgovarajućim rastvaračem u koncentraciji od 0.1% (v/v) do 30% (v/v).

[0073] Rastvarač upotrebljen u ovom koraku nije posebno ograničen sve dok je inertan prema reakciji i obuhvata dihlorometan, acetonitril, alkohol (etanol, izopropanol, trifluoroetanol, itd.), vodu i njihovu smešu. Reakciona temperatura je prvenstveno u opsegu od, npr.10°C do 50°C, još poželjnije, u opsegu od 20°C do 40°C, i najpoželjnije, u opsegu od 25°C do 35°C.

[0074] Reakciono vreme može varirati u zavisnosti od vrste upotrebljene baze i reakcione temperature, i aproksimativno je u opsegu od 0.1 minuta do 24 sata generalno, a prvenstveno je u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

[0075] U Jedinjenju (II), jedinjenje opšte formule (IIa) dole (u nastavku Jedinjenje (IIa)), pri čemu n jeste 1 i L je grupa (IV), može se proizvesti sledećom procedurom.

pri čemu B, T, linker i čvrsti nosač imaju isto značenje kao što je definisano gore.

Korak 1:

[0076] Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (V) reaguje sa acilujućim agensom da bi se pripremilo jedinjenje predstavljeno opštom formulom (VI) dole (u nastavku se naziva Jedinjenje (VI)).

pri čemu B, T i linker imaju isto značenje kao što je definisano gore; i,

R<4>predstavlja hidroksi, halogen, karboksil grupu ili amino.

[0077] Ovaj korak se može izvesti pomoću poznatih procedura za uvođenje linkera, korišćenjem Jedinjenja (V) kao polaznog materijala.

[0078] Posebno, jedinjenje predstavljeno opštom formulom (VIa) dole se može proizvesti izvođenjem postupka poznatog kao esterifikacija, uz korišćenje Jedinjenja (V) i anhidrida ćilibarne kiseline.

pri čemu Bi T imaju isto značenje kao što je definisano gore.

Korak 2:

[0079] Jedinjenje (VI) reaguje sa čvrstim nosačem pomoću kondenzujućeg agensa da bi se pripremilo Jedinjenje (IIa).

pri čemu B, R<4>, T, linker i čvrsti nosač imaju isto značenje kao što je definisano gore.

[0080] Ovaj korak se može izvesti korišćenjem Jedinjenja (VI) i čvrstog nosača prema procesu poznatom kao reakcija kondenzacije.

[0081] U Jedinjenju (II), jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IIa2) dole, pri čemu n jeste 2 do 99 (a prvenstveno dati ceo broj od 25 do 35, od 28 do 32, ili od 29 do 31, a prvenstveno je 30) i L je grupa predstavljena opštom formulom (IV), se može proizvesti uz korišćenje Jedinjenja (IIa) kao polaznog materijala i ponavljanje koraka A i koraka B metoda proizvodnje PMO opisanog u opisu željeni broj puta.

pri čemu B, R<2>, R<3>, T, linker i čvrsti nosač imaju isto značenje kao što je definisano gore; i,

n’ predstavlja 1 do 98 (u specifičnom primeru izvođenja, n’ je 1 do 34, 1 do 33, 1 do 32, 1 do 31, 1 do 30, 1 do 29, 1 do 28, 1 do 27, 1 do 26, 1 do 25, 1 do 24).

(2) Korak B

[0082] Jedinjenje (III) reaguje sa morfolino monomernim jedinjenjem u prisustvu baze da bi se pripremilo jedinjenje predstavljeno opštom formulom (VII) dole (u nastavku se naziva Jedinjenje (VII)):

pri čemu B, L, n, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kao što je definisano gore.

[0083] Ovaj korak se može izvesti reakcijom Jedinjenja (III) sa morfolino monomernim jedinjenjem u prisustvu baze.

[0084] Morfolino monomerno jedinjenje obuhvata, na primer, jedinjenja predstavljena opštom formulom (VIII) dole:

pri čemu B, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kao što je definisano gore.

[0085] "Baza" koja se može koristiti u ovom koraku obuhvata, na primer, diizopropilamin, trietilamin i N-etilmorfolin. Količina upotrebljene baze je aproksimativno u opsegu od 1 mol ekvivalenta do 1000 mol ekvivalenata bazirano na 1 mol Jedinjenja (III), a prvenstveno, od 10 mol ekvivalenata do 100 mol ekvivalenata bazirano na 1 mol Jedinjenja (III).

[0086] Morfolino monomerno jedinjenje i baza koja se može koristiti u ovom koraku takođe se mogu koristiti kao razređenje podesnim rastvaračem u koncentraciji od 0.1% do 30%. Rastvarač nije posebno ograničen sve dok je inertan prema reakciji, i obuhvata, na primer, N,N-dimetilimidazolidon, N-metilpiperidon, DMF, dihlorometan, acetonitril, tetrahidrofuran, ili njihovu smešu.

[0087] Reakciona temperatura je prvenstveno u opsegu od, npr.0°C do 100°C, i još poželjnije, u opsegu od 10°C do 50°C.

[0088] Reakciono vreme može varirati u zavisnosti od vrste upotrebljene baze i reakcione temperature, i aproksimativno je u opsegu od 1 minuta do 48 sati generalno, a prvenstveno je u opsegu od 30 minuta do 24 sata.

[0089] Pored toga, posle završetka ovog koraka, može biti dodat acilujući agens, ako je potrebno. "Acilujući agens" obuhvata, na primer, anhidrid sirćetne kiseline, acetil hlorid i anhidrid fenoksisirćetne kiseline. Acilujući agens se takođe može upotrebiti kao razređenje podesnim rastvaračem u koncentraciji od 0.1% do 30%. Rastvarač nije posebno ograničen sve dok je inertan prema reakciji, i obuhvata, na primer, dihlorometan, acetonitril, tetrahidrofuran, alkohol, odnosno alkohole (etanol, izopropanol, trifluoroetanol, itd.), vodu, ili njihovu smešu.

[0090] Ako je potrebno, takođe se može upotrebiti baza kao što je piridin, lutidin, kolidin, trietilamin, diizopropiletilamin, N-etilmorfolin, itd. u kombinaciji sa acilujućim agensom. Količina acilujućeg agensa je aproksimativno u opsegu od 0.1 mol ekvivalenta do 10000 mol ekvivalenata, a prvenstveno je u opsegu od 1 mol ekvivalenta do 1000 mol ekvivalenata. Količina baze je aproksimativno u opsegu od, npr. 0.1 mol ekvivalenta do 100 mol ekvivalenata, a prvenstveno je u opsegu od 1 mol ekvivalenta do 10 mol ekvivalenata, bazirano na 1 mol acilujućeg agensa.

[0091] Reakciona temperatura u ovoj reakciji je prvenstveno u opsegu od 10°C do 50°C, još poželjnije, u opsegu od 10°C do 50°C, još mnogo poželjnije, u opsegu od 20°C do 40°C, i najpoželjnije, u opsegu od 25°C do 35°C. Reakciono vreme može varirati u zavisnosti od vrste upotrebljenog acilujućeg agensa i reakcione temperature, i aproksimativno je u opsegu od 0.1 minuta do 24 sata generalno, a prvenstveno je u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

(3) Korak C:

[0092] U Jedinjenju (VII) proizvedenom u Koraku B, zaštitna grupa se odstranjuje korišćenjem agensa za deprotekciju da bi se pripremilo jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IX).

pri čemu baza, B, L, n, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kao što je definisano gore.

[0093] Ovaj korak se može izvesti reakcijom Jedinjenja (VII) sa agensom za deprotekciju.

[0094] "Agens za deprotekciju" obuhvata, npr. konc. amonijačnu vodu i metilamin. "Agens za deprotekciju" upotrebljen u ovom koraku se takođe može koristiti kao razređenje, npr. vodom, metanolom, etanolom, izopropil alkoholom, acetonitrilom, tetrahidrofuranom, DMF, N,N-dimetilimidazolidonom, N-metilpiperidonom, ili smešom ovih rastvarača. Među njima je poželjan etanol. Količina upotrebljenog agensa za deprotekciju je aproksimativno u opsegu od 1 mol ekvivalenta do 100000 mol ekvivalenata, a prvenstveno je u opsegu od 10 mol ekvivalenata do 1000 mol ekvivalenata, bazirano na 1 mol Jedinjenja (VII).

[0095] Reakciona temperatura je aproksimativno u opsegu od 15°C do 75°C, a prvenstveno, u opsegu od 40°C do 70°C, i još poželjnije, u opsegu od 50°C do 60°C. Reakciono vreme za deprotekciju može varirati u zavisnosti od vrste Jedinjenja (VII), reakcione temperature, itd. i aproksimativno je u opsegu od 10 minuta do 30 sati, a prvenstveno od 30 minuta do 24 sata, i još poželjnije u opsegu od 5 sati do 20 sati.

(4) Korak D:

[0096] PMO (I) se proizvodi reakcijom Jedinjenja (IX) proizvedenog u koraku C sa kiselinom:

pri čemu baza, n, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kao što je definisano gore.

[0097] Ovaj korak se može izvesti dodavanjem kiseline Jedinjenju (IX).

[0098] "Kiselina" koja se može koristiti u ovom koraku obuhvata, na primer, trihlorosirćetnu kiselinu, dihlorosirćetnu kiselinu, sirćetnu kiselinu, fosfornu kiselinu, hlorovodoničnu kiselinu, itd. Upotrebljena kiselina se aproksimativno koristi da bi rastvor imao pH opseg od 0.1 do 4.0, i još poželjnije, u opsegu od pH 1.0 do 3.0. Rastvarač nije posebno ograničen sve dok je inertan prema reakciji, i obuhvata, na primer, acetonitril, vodu, ili smešu ovih rastvarača.

[0099] Reakciona temperatura je aproksimativno u opsegu od 10°C do 50°C, a prvenstveno je u opsegu od 20°C do 40°C, i još poželjnije, u opsegu od 25°C do 35°C. Reakciono vreme za deprotekciju može varirati u zavisnosti od vrste Jedinjenja (IX), reakcione temperature, itd. i aproksimativno je u opsegu od 0.1 minuta do 5 sati, a prvenstveno je od 1 minuta do 1 sat, i još poželjnije u opsegu od 1 minuta do 30 minuta.

[0100] PMO (I) se može dobiti podvrgavanjem reakcione smeše dobijene u ovom koraku uobičajenim sredstvima za izdvajanje i prečišćavanje, kao što su ekstrakcija, koncentracija, neutralizacija, filtracija, centrifugalno izdvajanje, rekristalizacija, reverzno fazna kolonska hromatografija C8 do C18, katjonsko izmenjivačka kolonska hromatografija, anjonsko izmenjivačka kolonska hromatografija, gel filtraciona kolonska hromatografija, tečna hromatografija visokih performansi, dijaliza, ultrafiltracija, itd. i to samim ili njihovoj kombinaciji. Shodno tome, željeni PMO (I) se može izolovati i prečistiti (upor. npr. WO 1991/09033).

[0101] Pri prečišćavanju PMO (I) korišćenjem reverzno fazne hromatografije, npr. može se koristiti smeša rastvora od 20 mM trietil amina/acetatnog pufera i acetonitrila kao rastvarač za eluiranje.

[0102] Pri prečišćavanju PMO (I) korišćenjem jonoizmenjivačke hromatografije, kao rastvarač za eluiranje se može koristiti npr. smeša rastvora od 1 M slanog rastvora i 10 mM vodenog rastvora natrijum hidroksida.

[0103] Peptidna nukleinska kiselina je oligomer prema predmetnom pronalasku koji ima grupu predstavljenu sledećom opštom formulom kao sastavnu jedinicu:

pri čemu baza ima isto značenje kao što je definisano gore.

[0104] Peptidne nukleinske kiseline se mogu pripremiti konsultovanjem npr. sledeće literature.

1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991) 2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992) 3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T.

Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T.

Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

[0105] U oligomeru prema predmetnom pronalasku, 5’ kraj može biti bilo koja od hemijskih struktura (1) do (3) dole, a prvenstveno je (3)-OH.

[0106] U nastavku, grupe označene sa (1), (2) i (3) gore se nazivaju "Grupa (1)“, "Grupa (2)" i "Grupa (3)“, respektivno.

2. Farmaceutska kompozicija

[0107] Oligomer prema predmetnom pronalasku izaziva preskakanje egzona 51 sa višom efikasnosti u poređenju sa antisensnim oligomerima iz stanja tehnike. Zato se očekuje da stanja mišićne distrofije mogu biti ublažena sa visokom efikasnosti davanjem farmaceutske kompozicije koja sadrži oligomer prema predmetnom pronalasku DMD pacijentima koji imaju mutaciju koja se konvertuje u okviru uz preskakanje egzona 51, kao što su, na primer, pacijenti sa delecijom egzona 29-50, pacijenti sa delecijom egzona 50, pacijenti sa delecijom egzona 45-50, pacijenti sa delecijom egzona 48-50, pacijenti sa delecijom egzona 49-50, pacijenti sa delecijom egzona 52, pacijenti sa delecijom egzona 52-63, pacijenti sa delecijom egzona 13-50, pacijenti sa delecijom egzona 19-50, pacijenti sa delecijom egzona 43-50, ili pacijenti sa delecijom egzona 47-50. Na primer, kada se upotrebljava farmaceutska kompozicija koja sadrži oligomer prema predmetnom pronalasku, isti terapeutski efekti se mogu ostvariti čak i za manju dozu od oligomera iz stanja tehnike. Shodno tome, mogu biti ublažena neželjena dejstva i time je ekonomičan.

[0108] U sledećem primeru izvođenja, predmetnim pronalaskom je realizovana farmaceutska kompozicija za lečenje mišićne distrofije, koja kao aktivni sastojak sadrži oligomer prema predmetnom pronalasku, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat (u nastavku se naziva "kompozicija prema predmetnom pronalasku").

[0109] Takođe, predmetnim pronalaskom je realizovan metod lečenja mišićne distrofije, koji sadrži davanje pacijentu sa DMD oligomera prema predmetnom pronalasku.

[0110] U pomenutom metodu lečenja, oligomer prema predmetnom pronalasku se može davati kao farmaceutska kompozicija za lečenje mišićne distrofije.

[0111] Pored toga, predmetnim pronalaskom je realizovana primena oligomera prema predmetnom pronalasku u proizvodnji farmaceutske kompozicije za lečenje mišićne distrofije i oligomera prema predmetnom pronalasku primenjenog za lečenje mišićne distrofije.

[0112] Primeri farmaceutski prihvatljive soli oligomera prema predmetnom pronalasku sadržane u kompoziciji prema predmetnom pronalasku su soli alkalnih metala, kao što su soli natrijuma, kalijuma i litijuma; soli zemnoalkalnih metala, kao što su soli kalcijuma i magnezijuma; soli metala, kao što su soli aluminijuma, gvožđa, cinka, bakra, nikla, kobalta, itd; amonijumske soli; organske soli amina, kao što su soli t-oktilamina, dibenzilamina, morfolina, glukozamina, fenilglicin alkil estra, etilendiamina, N-metilglukamina, gvanidina, dietilamina, trietilamina, dicikloheksilamina, N, N’-dibenziletilendiamina, hloroprokaina, prokaina, dietanolamina, N-benzilfenetilamina, piperazina, tetrametilamonijuma, tris(hidroksimetil)aminometana; hidrohalidne soli, kao što su hidrofluoratne, hidrohloridne, hidrobromidne i hidrojodidne soli; neorganske kisele soli, kao što su nitrati, perhlorati, sulfati, fosfati, itd; niži alkan sulfonati, kao što su metansulfonati, trifluorometansulfonati i etansulfonati; arilsulfonati, kao što su benzensulfonati i ptoluensulfonati; soli organskih kiselina, kao što su acetati, malati, fumarati, sukcinati, citrati, tartarati, oksalati, maleati, itd; i, soli aminokiselina, kao što su soli glicina, lizina, arginina, ornitina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline. Ove soli se mogu proizvesti poznatim metodama. Alternativno tome, oligomer prema predmetnom pronalasku koji je sadržan u kompoziciji prema predmetnom pronalasku može biti u obliku svog hidrata.

[0113] Način administracije kompozicije prema predmetnom pronalasku nije posebno ograničen sve dok je to farmaceutski prihvatljiv način administracije, i može biti izabran u zavisnosti od metoda lečenja. Sa stanovišta lakoće isporuke u mišićno tkivo, poželjni su intravenska administracija, intraarterijska administracija, intramuskularna administracija, subkutana administracija, oralna administracija, tkivna administracija, transdermalna administracija, itd. Takođe, farmaceutski oblici koji su raspoloživi za kompoziciju prema predmetnom pronalasku nisu posebno ograničeni i obuhvataju, na primer, različite injekcije, oralne agense, kapi, inhalacije, meleme, losione, itd.

[0114] Radi administracije oligomera prema predmetnom pronalasku pacijentima sa mišićnom distrofijom, kompozicija prema predmetnom pronalasku može sadržati nosač da bi se podstakla isporuka oligomera mišićnim tkivima. Takav nosač nije posebno ograničen sve dok je farmaceutski prihvatljiv, a primeri obuhvataju katjonske nosače, kao što su katjonski lipozomi, katjonski polimeri, itd., ili nosače koji koriste omotače virusa. Katjonski lipozomi su, na primer, lipozomi koji se sastoje od 2-O(2-dietilaminoetil)karbamoil-1,3-O-dioleoilglicerola i fosfolipida kao esencijalnih sastojaka (u nastavku se naziva "lipozom A"), Oligofektamin (registrovani žig) (proizvodi firma Invitrogen Corp.), Lipofektin (registrovani žig) (proizvodi firma Invitrogen Corp.), Lipofektamin (registrovani žig) (proizvodi firma Invitrogen Corp.), Lipofektamin 2000 (registrovani žig) (proizvodi firma Invitrogen Corp.), DMRIE-C (registrovani žig) (proizvodi firma Invitrogen Corp.), GeneSilencer (registrovani žig) (proizvodi firma Gene Therapy Systems), TransMessenger (registrovani žig) (proizvodi firma QIAGEN, Inc.), TransIT TKO (registrovani žig) (proizvodi firma Mirus) i Nukleofektor II (Lonza). Između ostalih, poželjan je lipozom A. Primeri katjonskih polimera su JetSI (registrovani žig) (proizvodi firma Qbiogene, Inc.) i Jet-PEI (registrovani žig) (polietilenimin, proizvodi firma Qbiogene, Inc.). Primer nosača koji koriste omotače virusa je GenomeOne (registrovani žig) (HVJ-E lipozom, proizvodi firma Ishihara Sangyo). Alternativno tome, takođe se mogu koristiti medicinska sredstva opisana u japanskom patentu br.2924179 i katjonski nosači opisani u japanskim nacionalnim ponovo objavljenim PCT br.2006/129594 i 2008/096690.

Za druge detalje mogu se konsultovati, US patent br.4,235,871, US patent br.4,737,323, WO96/14057, "New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) strane 33-104", itd.

[0115] Koncentracija oligomera prema predmetnom pronalasku sadržanog u kompoziciji prema predmetnom pronalasku može varirati u zavisnosti od vrste nosača, itd. i aproksimativno je u opsegu od 0.1 nM do 100 μM, a prvenstveno je u opsegu od 100 nM do 10 μM. Težinski odnos oligomera prema predmetnom pronalasku sadržanom u kompoziciji prema predmetnom pronalasku i nosaču (nosač/antisensni oligomer prema predmetnom pronalasku) može varirati u zavisnosti od svojstva oligomera, tipa nosača, itd. i aproksimativno je u opsegu od 0.1 do 100, a prvenstveno je u opsegu od 0.1 do 10.

[0116] Pored oligomera prema predmetnom pronalasku i gore opisanog nosača, farmaceutski prihvatljivi aditivi takođe mogu biti opciono formulisani u kompoziciji prema predmetnom pronalasku. Primeri takvih aditiva su sredstva za poboljšanje emulgovanja (npr. masne kiseline koje imaju 6 do 22 atoma ugljenika i njihove farmaceutski prihvatljive soli, albumin i dekstran), stabilizatori (npr. holesterol i fosfatidna kiselina), sredstva za podešavanje izotoničnosti (npr. natrijum hlorid, glukoza, maltoza, laktoza, saharoza, trehaloza), i sredstva za kontrolu pH (npr. hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, sirćetna kiselina, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid i trietanolamin). Mogu se upotrebiti jedan ili više ovih aditiva. Sadržaj aditiva u kompoziciji prema predmetnom pronalasku je aproksimativno 90 tež. % ili manji, a prvenstveno 70 tež. % ili manji i još poželjnije, 50 tež. % ili manji.

[0117] Kompozicija prema predmetnom pronalasku se može pripremiti dodavanjem oligomera prema predmetnom pronalasku disperziji nosača i adekvatnim mešanjem smeše. Aditivi se mogu dodati u podesnom koraku bilo pre ili posle dodavanja oligomera prema predmetnom pronalasku. Vodeni rastvarač koji se može upotrebiti pri dodavanju oligomera prema predmetnom pronalasku nije posebno ograničen sve dok je farmaceutski prihvatljiv, a primeri su injektabilna voda ili injektabilna destilovana voda, elektrolitni fluid, kao što je fiziološki slani rastvor, itd. i šećerni fluid, kao što je glukozni fluid, maltozni fluid, itd. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti može aproksimativno izabrati uslove za pH i temperaturu za takav slučaj.

[0118] Kompozicija prema predmetnom pronalasku se može pripremiti, npr. u tečnom obliku i svom liofilizovanom preparatu. Liofilizovani preparat se može pripremiti liofilizacijom kompozicije prema predmetnom pronalasku u tečnom obliku na uobičajeni način. Liofilizacija se može izvršiti, na primer, aproksimativnom sterilizacijom kompozicije prema predmetnom pronalasku u tečnom obliku, odmeravanjem alikvota u bočicu kao kontejner, izvođenjem preliminarnog zamrzavanja tokom 2 sata pod uslovima od oko -40 do -20°C, izvođenjem primarnog sušenja na oko 0 do 10°C pod sniženim pritiskom, i onda izvođenjem sekundarnog sušenja na oko 15 do 25°C pod sniženim pritiskom. Generalno, liofilizovani preparat kompozicije prema predmetnom pronalasku se može dobiti zamenom sadržaja bočice sa gasom azotom i zatvaranjem.

[0119] Liofilizovani preparat kompozicije prema predmetnom pronalasku se može koristiti generalno posle rekonstitucije dodavanjem opciono podesnog rastvora (rekonstituciona tečnost) i ponovnim rastvaranjem preparata. Takva rekonstituciona tečnost obuhvata injektabilnu vodu, fiziološki slani rastvor i druge infuzione fluide. Zapremina rekonstitucione tečnosti može varirati u zavisnosti od ciljne namene itd, nije posebno ograničena i podesno je da bude d 0.5 do 2-struko veća od zapremine pre liofilizacije ili da ne bude veća od 500 mL.

[0120] Poželjno je kontrolisati dozu kompozicije prema predmetnom pronalasku koja treba da bude data uzimanjem u obzir sledećih faktora: tip i farmaceutski oblik sadržanog oligomera prema predmetnom pronalasku; stanja pacijenata uključujući starost, telesnu težinu, itd; način administracije; i karakteristike i stepen bolesti.

Izračunata dnevna doza kao količina antisensnog oligomera prema predmetnom pronalasku je generalno u opsegu od 0.1 mg do 10 g/čoveku, a prvenstveno je 1 mg do 1 g/čoveku. Ovaj opseg brojnih vrednosti može povremeno varirati u zavisnosti od tipa ciljne bolesti, načina administracije i ciljnog molekula. Zato manja doza od opsega može biti dovoljna u nekim slučajevima i obrnuto, veća doza od opsega može biti potrebna u nekim drugim slučajevima. Kompozicija se može davati od jednom do nekoliko puta dnevno ili u intervalima od jednog dana do nekoliko dana.

[0121] U još jednom drugom primeru izvođenja kompozicije prema predmetnom pronalasku, realizovana je farmaceutska kompozicija koja sadrži vektor koji može da izražava oligonukleotid prema predmetnom pronalasku i gore opisani nosač. Takav ekspresioni vektor može biti vektor koji može da izražava mnoštvo oligonukleotida prema predmetnom pronalasku. Kompozicija može biti formulisana sa farmaceutski prihvatljivim aditivima kao u slučaju kompozicije prema predmetnom pronalasku koja sadrži oligomer prema predmetnom pronalasku. Koncentracija ekspresionog vektora sadržanog u kompoziciji može varirati u zavisnosti tipa nosača itd. i aproksimativno je u opsegu od 0.1 nM do 100 μM, a prvenstveno je u opsegu od 100 nM do 10 μM. Težinski udeo ekspresionog vektora sadržanog u kompoziciji i nosača (nosač/ekspresioni vektor) može varirati u zavisnosti od svojstva ekspresionog vektora, tipa nosača, itd. i aproksimativno je u opsegu od 0.1 do 100, a prvenstveno je u opsegu od 0.1 do 10. Sadržaj nosača sadržanog u kompoziciji je isti kao u slučaju kompozicije prema predmetnom pronalasku koja sadrži oligomer prema predmetnom pronalasku, a metod za proizvodnju iste je takođe isti kao u slučaju kompozicije prema predmetnom pronalasku.

[0122] U nastavku će predmetni pronalazak biti opisan detaljnije na osnovu PRIMERA i TESTIRANIH PRIMERA dole, ali se ne smatra da je ograničen na njih.

PRIMERI

[REFERENTNI PRIMER 1]

4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoksi}-4-oksobuterna kiselina stavljena na amino polistirensku smolu

Korak 1: Proizvodnja 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metoksi}-4-oksobuterne kiseline

[0123] Pod atmosferom argona, 3.44 g N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida i 1.1 g 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) su bili suspendovani u 50 mL dihlorometana, pa je suspenziji bilo dodato 0.90 g anhidrida ćilibarne kiseline, što je bilo praćeno mešanjem na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakcionoj smeši je bilo dodato 10 mL metanola, pa je smeša koncentrisana pod sniženim pritiskom. Ostatak je bio ekstrahovan korišćenjem etil acetata i 0.5 M vodenog rastvora kalijum dihidrogenfosfata.

Rezultujući organski sloj je bio ispran redom sa 0.5M vodenog rastvora kalijum dihidrogenfosfata, vodom i slanim rastvorom, po navedenom redosledu. Rezultujući organski sloj je bio osušen preko natrijum sulfata, pa je koncentrisan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo 4.0 g proizvoda.

Korak 2: Proizvodnja 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobuterne kiseline stavljene na amino polistirensku smolu

[0124] Pošto je 4.0 g 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobuterne kiseline bilo rastvoreno u 200 mL piridina (dehidratisanog), rastvoru je bilo dodato 0.73 g 4-DMAP i 11.5 g 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida. Onda su smeši bili dodati 25.0 g amino polistirenske smole Primer support 200 amino (proizvođača GE Healthcare Japan Co., Ltd., 17-5214-97) i 8.5 mL trietilamina, što je bilo praćeno mućkanjem na sobnoj temperaturi tokom 4 dana. Posle završetka reakcije, smola je bila izdvojena filtriranjem. Rezultujuća smola je bila isprana sukcesivno piridinom, metanolom i dihlorometanom, po navedenom redosledu, pa je osušena pod sniženim pritiskom. Rezultujućoj smoli je bilo dodato 200 mL tetrahidrofurana (dehidrat), 15 mL anhidrida sirćetne kiseline i 15 mL 2,6-lutidina, a zatim je smeša bila mućkana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Smola je bila izdvojena filtriranjem, pa je sukcesivno bila isprana piridinom, metanolom i dihlorometanom, po navedenom redosledu, te je osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobilo 26.7 g proizvoda.

[0125] Stavljena količina proizvoda je bila određena na osnovu molske količine tritila po g smole merenjem UV apsorbanse na 409 nm korišćenjem poznatog metoda. Stavljena količina na smolu je bila 192.2 μmol/g.

Uslovi za UV merenje

[0126]

Aparat: U-2910 (Hitachi, Ltd.)

Rastvarač: metansulfonska kiselina

Talasna dužina: 265 nm

ε vrednost: 45000

[0127] Prema opisima u PRIMERIMA 1, 2 i REFERENTNOM PRIMERU 1 dole su bili sintetizovani PMO prikazani sa PMO br.1-3 u TABELI 1. Sintetizovani PMO je bio rastvoren u vodi za injekcije (proizvodi firma Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.).

[TABELA 1]

[PRIMER 1]

PMO br.1

[0128] Kolona sa filterskim vrhom je bila napunjena sa 0.2 g 4-{[(2S, 6R)-6-(4-benzamid-2-oksopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi} 4-oksobuterne kiseline stavljene na aminopolistirensku smolu (Referentni Primer 1) (26 μmοl). Onda je započeo dole prikazani sintetički ciklus korišćenjem mašine za sintezu nukleinske kiseline (AKTA Oligopilot 10 plus). U svakom ciklusu kuplovanja je bilo dodato željeno morfolino monomerno jedinjenje da bi se dobila nukleotidna sekvenca jedinjenja iz naslova (vidi Tabelu 2 dole).

[TABELA 2]

[0129] Upotrebljeni rastvor za deblokiranje je bio dihlorometanski rastvor koji sadrži 3% (w/v) trifluorosirćetne kiseline. Upotrebljeni rastvor za neutralizaciju i ispiranje je bio rastvor dobijen rastvaranjem N,N-diizopropiletilamina tako da bude 10% (v/v) i tetrahidrofurana tako da bude 5% (v/v) u dihlorometanu koji sadrži 35% (v/v) acetonitrila. Upotrebljeni rastvor za kuplovanje A je bio rastvor dobijen rastvaranjem morfolino monomernog jedinjenja u tetrahidrofuranu tako da bude 0.10 M.

Upotrebljeni rastvor za kuplovanje B je bio rastvor dobijen rastvaranjem N,N-diizopropiletilamina tako da bude 20% (v/v) i tetrahidrofurana tako da bude 10% (v/v) u acetonitrilu. Upotrebljeni rastvor za kaptiranje je bio rastvor dobijen rastvaranjem 20% (v/v) anhidrida sirćetne kiseline i 30% (v/v) 2,6-lutidina u acetonitrilu.

[0130] Aminopolistirenska smola na koju je bio stavljen gore sintetizovani PMO je bila rekuperisana iz reakcionog suda, pa je sušena na sobnoj temperaturi tokom najmanje 2 sata pod sniženim pritiskom. Osušeni PMO stavljen na aminopolistirensku smolu je bio unet u reakcioni sud, a zatim je u njega bilo dodato 5 mL 28% amonijačne vode-etanola (1/4). Smeša je bila mešana na 55°C tokom 15 sati. Aminopolistirenska smola je bila isfiltrirana, pa je isprana sa 1 mL vode-etanola (1/4). Rezultujući filtrat je bio koncentrisan pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je bio rastvoren u 10 mL smeše rastvarača od 20 mM sirćetne kiseline -trietilaminskog pufera (TEAA pufera) i 10 ml acetonitrila (4/1), pa je isfiltriran kroz membranski filter. Dobijeni filtrat je bio prečišćen reverzno faznom HPLC.

Upotrebljeni uslovi su prikazani u Tabeli 3 dole.

[TABELA 3]

[0131] Svaka frakcija je bila analizirana, a ciljni proizvod je bio rekuperisan i koncentrisan pod sniženim pritiskom. Koncentrisanom ostatku je bilo dodato 0.5 mL 2 M vodenog rastvora fosforne kiseline, pa je smeša bila mešana 15 minuta. Dalje, bilo je dodato 2 mL 2 M vodenog rastvora natrijum hidroksida da bi se smeša alkalizovala, što je bilo praćeno filtriranjem kroz membranski filter (0.45 μm).

[0132] Rezultujući vodeni rastvor koji je sadržao ciljni proizvod je bio prečišćen pomoću kolone sa anjonskom izmenjivačkom smolom. Korišćeni uslovi su prikazani u Tabeli 4 dole.

[TABELA 4]

[0133] Svaka frakcija je bila analizirana (na HPLC), a ciljni proizvod je bio dobijen kao vodeni rastvor. Rezultujućem vodenom rastvoru je bilo dodato 0.1 M fosfatnog pufera (pH 6.0) radi neutralizacije. Kao sledeće, dobijena smeša je bila demineralizovana reverzno faznom HPLC pod uslovima opisanim u Tabeli 5 dole.

[0134] Ciljni proizvod je bio sakupljen, pa je smeša bila koncentrisana pod sniženim pritiskom. Rezultujući ostatak je bio rastvoren u vodi. Dobijeni vodeni rastvor je bio osušen zamrzavanjem da bi se dobilo ciljno jedinjenje u vidu bele čvrste materije nalik pamuku.

ESI-TOF-MS Izrač: 10021.46

Utvrđeno: 10021.91

[PRIMER 2]

PMO br.2

[0135] Jedinjenje iz naslova je bilo proizvedeno u skladu sa procedurom iz PRIMERA 1.

[0136]

ESI-TOF-MS Izrač: 9916.71

Utvrđeno: 9916.43

[KOMPARATIVNI PRIMER 1]

PMO br.3

[0137] Jedinjenje iz naslova je bilo proizvedeno u skladu sa procedurom iz PRIMERA 1.

[0138]

ESI-TOF-MS Izrač: 9949.46

Utvrđeno: 9949.41

[TESTIRANI PRIMER 1]

In vitro test

[0139] Eksperimenti su bili izvršeni korišćenjem antisensnih oligomera PMO br.1 i 2 prema predmetnom pronalasku i antisensnog oligomera PMO br.3. Sekvence različitih antisensnih oligomera su date u Tabeli 6 dole.

[TABELA 6]

[0140] Korišćenjem Amaxa Cell Line Nucleofector Kit-a L na Nukleofektor-u II (Lonza), 0.3, 1, 3, 10 μM oligomera PMO br.1 i 2 prema predmetnom pronalasku i antisensni oligomer PMO br.3 su bili transfektovani sa 3.5x 10<5>RD ćelija (humana rabdomiosarkoma ćelijska linija). Bio je korišćen program T-030.

[0141] Posle transfekcije, ćelije su bile kultivisane tri dana u 2 mL Igl minimalnog esencijalnog medijuma (EMEM) (proizvodi firma Sigma, u nastavku isto) koji je sadržao 10% fetusnog telećeg seruma (FCS) (proizvodi firma Invitrogen) pod uslovima od 37°C i 5% CO2. Ćelije su bile isprane sa PBS (proizvodi firma Nissui, u nastavku isto), pa je ćelijama bilo dodato 500 μl ISOGEN-a II (proizvodi firma Nippon Gene). Pošto su ćelije bile ostavljene na sobnoj temperaturi nekoliko minuta da bi se ćelije lizirale, lizat je bio sakupljen u Ependorf epruvetu. Celokupna RNK je bila ekstrahovana prema protokolu koji je priložio ISOGEN. Koncentracija celokupne ekstrahovane RNK je bila određena korišćenjem NanoDrop ND-1000 (proizvodi firma LMS).

[0142] Jednokoračna RT-PCR je bila izvedena sa 400 ng ekstrahovane celokupne RNK korišćenjem Qiagen One Step RT-PCR Kit-a (proizvodi firma Qiagen).

Reakcioni rastvor je bio priložen u skladu sa protokolom priloženim uz kit. PTC-100 (proizvodi firma MJ Research) je bio upotrebljen kao termički ciklizator. Bio je upotrebljen RT-PCR program kao što sledi.

50°C, 30 min: reverzna transkripciona reakcija

95°C, 15 min: termička denaturacija

[94°C, 30 sekundi; 60°C, 30 sekundi; 72°C, 60 sekundi] x 35 ciklusa: PCR amplifikacija 72°C, 10 min: finalna ekstenzija

[0143] Nukleotidne sekvence direktnog prajmera i reverznog prajmera upotrebljene za RT-PCR su date dole.

Direktni prajmer: 5’- CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3’ (SEQ ID NO: 5) Reverzni prajmer: 5’- GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’ (SEQ ID NO: 6)

[0144] Reakcioni proizvod, 1 μL gornje RT-PCR je bio analiziran uz korišćenje Bioanalyzer-a (proizvodi firma Agilent Technologies, Inc.). Bili su izmereni polinukleotidni nivo "A" trake sa preskakanjem egzona 51 i polinukleotidni nivo "B" trake bez preskakanja egzona 51. Na osnovu ovih izmerenih vrednosti "A" i "B", efikasnost preskakanja je bila određena pomoću sledeće jednačine:

Efikasnost preskakanja (%) = A/(A+B) x 100

Eksperimentalni rezultati

[0145] Rezultati su prikazani na FIG.1. Ovaj eksperiment je otkrio da bi antisensni oligomeri prema predmetnom pronalasku mogli izazvati preskakanje egzona 51 sa znatno većom efikasnosti od antisensnog oligomera PMO br.3.

[Primer 3]

PMO br.4-6

[0146] Jedinjenje iz naslova je bilo proizvedeno u skladu sa procedurom iz PRIMERA 1. Sekvence različitih antisensnih oligomera su date dole.

TABELA 7

[PRIMER 4]

2’-O-metoksi-fosforotioati prikazani sa SEQ ID NOS: 9 do 33

[0147] Različiti antisensni oligomeri iz naslova su bili proizvedeni angažovanjem Japan Bio Service Co. Sekvence različitih antisensnih oligomera su date u Tabeli 8.

[TABELA 8]

INDUSTRIJSKA PRIMENLJIVOST

[0148] Eksperimentalni rezultati u TESTIRANIM PRIMERIMA pokazuju da su oligomeri prema predmetnom pronalasku izazvali preskakanje egzona 51 sa znatno većom efikasnosti u RD ćelijama. Zato su oligomeri prema predmetnom pronalasku ekstremno korisni za lečenje DMD.

LISTA SEKVENCI

[0149]

Claims

Patentni zahtevi 1. Antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (a) do (c) dole, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat: (a) antisensni oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1 ili 2; (b) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima deleciju, supstituciju, inserciju i/ili adiciju od 1 do 5 nukleotida u nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 ili 2, ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu; i (c) antisensni oligomer koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2 i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu.
2. Antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (e) do (g) dole, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat: (e) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1 ili 2; (f) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima deleciju, supstituciju, inserciju i/ili adiciju od 1 do 3 nukleotida u nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 ili 2, i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu; i (g) antisensni oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2 i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu.
3. Antisensni oligomer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od (j) dole, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata: (j) antisensni oligomer koji ima nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 1 ili 2 i ima aktivnost da izazove preskakanje 51-vog egzona u humanom distrofinskom genu.
4. Antisensni oligomer prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koji je oligonukleotid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
5. Antisensni oligomer prema zahtevu 4, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat, pri čemu je modifikovan šećerni radikal i/ili region za vezivanje fosfata najmanje jednog nukleotida koji obrazuje oligonukleotid.
6. Antisensni oligomer prema zahtevu 4 ili 5, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat, pri čemu je šećerni radikal najmanje jednog nukleotida koji obrazuje oligonukleotid riboza u kojoj je 2’-OH grupa zamenjena bilo čime izabranim iz grupe koja se sastoji od OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br i I (pri čemu je R alkil ili aril i R’ je alkilen).
7. Antisensni oligomer prema bilo kom od zahteva 4 do 6, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat, pri čemu je region za vezivanje fosfata najmanje jednog nukleotida koji obrazuje oligonukleotid bilo koji izabran iz grupe koja se sastoji od fosforotioatne veze, fosforoditioatne veze, alkilfosfonatne veze, fosforamidatne veze i boranofosfatne veze.
8. Antisensni oligomer prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koji je morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
9. Antisensni oligomer prema zahtevu 8, koji je fosforodiamidatni morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
10. Antisensni oligomer prema zahtevima 8 ili 9, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat, pri čemu je 5’ kraj bilo koja od hemijskih formula (1) do (3) dole:
11. Farmaceutska kompozicija za lečenje mišićne distrofije, koja sadrži kao aktivni sastojak antisensni oligomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat prema bilo kom od zahteva 1 do 10.
12. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11, koja sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač.
13. Antisensni oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema bilo kom od zahteva 1 do 10, za primenu u lečenju mišićne distrofije.
14. Antisensni oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat za primenu prema zahtevu 13, pri čemu je pacijent sa mišićnom distrofijom u pomenutom lečenju pacijent sa delecijama nukleotida u okviru egzona 29-50, 50, 45-50, 48-50, 49-50, 52, 52-63, 13-50, 19-50, 43-50 ili 47-50.
15. Antisensni oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat za primenu prema zahtevu 13 ili 14, pri čemu je pacijent čovek.