Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS58610B1 - Rekombinantni vektori gallid herpesvirusa 3 (mdv serotip 2) koji eksprimiraju antigene ptičjih pathogena i njihove upotrebe - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS58610B1 - Rekombinantni vektori gallid herpesvirusa 3 (mdv serotip 2) koji eksprimiraju antigene ptičjih pathogena i njihove upotrebe - Google Patents

Rekombinantni vektori gallid herpesvirusa 3 (mdv serotip 2) koji eksprimiraju antigene ptičjih pathogena i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS58610B1
RS58610B1 RS20190443A RSP20190443A RS58610B1 RS 58610 B1 RS58610 B1 RS 58610B1 RS 20190443 A RS20190443 A RS 20190443A RS P20190443 A RSP20190443 A RS P20190443A RS 58610 B1 RS58610 B1 RS 58610B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ndv
promoter
virus
vaccine
recombinant
Prior art date
Application number
RS20190443A
Other languages
English (en)
Inventor
Michel Bublot
Teshome Mebatsion
Joyce Pritchard
Perry Linz
Original Assignee
Merial Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47358292&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58610(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Merial Inc filed Critical Merial Inc
Publication of RS58610B1 publication Critical patent/RS58610B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/869—Herpesviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A61K39/255—Marek's disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • C07K14/125—Newcastle disease virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/14—Reoviridae, e.g. rotavirus, bluetongue virus, Colorado tick fever virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
    • C12N2710/16341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNA POVEZANOST SA SRODNIM PRIJAVAMA
[0001] Ova prijava zahteva prioritet od SAD privremene prijave 61/564,877 podnete 30. novembra 2011. i SAD privremene prijave 61/694,957 podnete 30. avgusta 2012.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Pronalazak se odnosi na rekombinantne virusne vektore za inserciju i ekspresiju stranih gena za upotrebu kao bezbedni nosači za imunizaciju za zaštitu od različitih patogena. Odnosi se i na multivalentnu kompoziciju ili vakcinu koja sadrži jedan ili više rekombinantnih virusnih vektora za zaštitu od različitih patogena. Ovde su opisani i postupci za pravljenje i upotrebu rekombinantnih virusnih vektora.
OSNOVA PRONALASKA
[0003] Vakcinacija živine se široko koristi za zaštitu jata živine od veoma štetnih bolesti, uključujući Njukastl bolest (ND), infektivnu burzalnu bolest (IBD), Marekovu bolest (MD), infektivni bronhitis (IB), infektivni laringotraheitis (ILT) i avijarnu influencu (AI). ND je uzrokovana ptičjim paramiksovirusom 1 (APMV-1) označenim i kao virus ND (NDV) koji pripada familiji Paramyxoviridae. MD je uzrokovana virusom Gallid herpesvirus 2 (familija Herpesviridae) označenim i kao virus MD serotip 1 (MDV1). IB je uzrokovana virusom IB (IBV) koji pripada familiji Coronaviridae, ILT je uzrokovana virusom Gallid herpesvirus 1 (familija Herpesviridae) označenim i kao virus ILT (ILTV) i AI je uzrokovana virusom AI (AIV) koji pripada familiji Orthomyxoviridae.
[0004] Predlagani su brojni rekombinantni ptičji virusni vektori sa ciljem vakcinacije ptica protiv ovih ptičjih patogena. Korišćeni virusni vektori sadrže viruse roda Avipoxvirus, posebno virus boginja živine (EP-A-0,517,292), Marekov virus, kao što su serotipovi 2 i 3 (HVT) (WO-A87/04463), ili alternativno ITLV, NDV i ptičji adenovirus. Kada se neki od ovih rekombinantnih ptičjih virusnih vektora koriste za vakcinaciju, ispoljavaju različite nivoe zaštite.
[0005] Razvijeno je i licencirano nekoliko rekombinantnih vektora na bazi herpesvirusa ćuraka (HVT, označen i kao Meleagrid herpesvirus 1 ili MDV serotip 3) koji eksprimira antigene iz različitih patogena (SAD patenti br. 5,980,906, 5,853,733, 6,183,753, 5,187,087) uključujući IBDV, NDV, ILTV i AIV. Od posebnog interesa je vektor HVT koji eksprimira zaštitni gen VP2 iz IBDV, koji je ispoljio očiglednu prednost u odnosu na vakcine na bazi IBD (Bublot et al J.Comp. Path.2007, Vol.137, S81-S84). Drugi vektori HVT od interesa su oni koji eksprimiraju zaštitni gen/gene protiv NDV (Morgan et al 1992, Avian dis. 36, 858-70) ili ILTV (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259). Jedan od praktičnih problema pri zajedničkoj upotrebi nekoliko rekombinantnih vakcina na bazi HVT je njihova interferencija. Niža zaštita je indukovana bar protiv jedne od bolesti kada se pomešaju dva rekombinanta HVT koji eksprimiraju različite antigene (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines; rad prikazan na XVII kongresu Svetskog veterinarskog živinarskog udruženja (WVPA) u Kankunu, Meksiko, 14-18. avgusta 2011; Slacum G, Hein R. and Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek’s disease vaccines, 58. Zapadna konferencija o bolesti živine, Sakramento, Kalifornija, SAD, 23-25. mart, str.84).
[0006] Kombinacija HVT i SB-1, vakcinalnog soja virusa Gallid herpesvirus 3 (MDV serotip 2 ili MDV-2), pokazala je sinergističko dejstvo u zaštiti od MD (Witter and Lee, 1984, Avian Pathology 13, 75-92). Za rešavanje problema interferencije, od interesa je procena SB-1 virusa kao vakcinalnog vektora za eksprimiranje zaštitnog/zaštitnih antigena koji bi mogao da bude kompatibilan sa vektorom HVT i da tako poboljša zaštitu od MD.
[0007] Genom SB-1 je kloniran i okarakterisan u bakterijskom veštačkom hromozomu (BAC) (Petherbridge, et al.,J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009; Singh et al., Research in Veterinary Science 89, 140-145, 2010). Sekvenca SB-1 MDV2 je nedavno dobijena i ispitana (Spatz and Schat, Virus Gene 42, 331-338, 2011). Deleciju glikoproteina E u virusu SB-1 opisao je Petherbridge et al. (J. Virol. Methods 158, 11-17, 2009). Međutim, nisu objavljena nikakva istraživanja koja koriste SB-1 kao virusni vektor koji eksprimira strane zaštitne gene.
[0008] Pokazano je da su geni za protein kinazu UL13 i glikoprotein C (UL44) pojedinačno od suštinskog značaja za horizontalno prenošenje MDV kod kokošaka (Jarosinski, et al., J. of Virology 81, 10575-10587, 2007; Jarosinski, et al., J. of Virology 84, 7911-7916, 2010). EP1298139 opisuje rekombinantne vakcine na bazi ptičjeg herpesvirusa, opisujući različite pozicije za inserciju heterologih antigena i postupke za određivanje neesencijalnih regiona. Opisan je i rekombinantni vektor koji sadrži heterologi gen za VP2 iz IBDV, koji može da se pomeša sa vakcinom koja se sastoji uglavnom od MDV-3. Međutim, EP1298139 ne opisuje upotrebu SB-1 za ekspresiju transgena NDV-F, niti medicinsku upotrebu vektora MDV-2.
[0009] Uzimajući u obzir potencijalni efekat životinjskih patogena, kao što su NDV i IBDV na veterinarsko javno zdravlje i ekonomiju, potrebne su efikasne metode prevencije infekcije i zaštite životinja. Postoji potreba za rešenjem za kombinovane efikasne vektorske vakcine i pogodnim postupkom za pravljenje vakcine koji bi mogao da ublaži problem interferencije koja je primećena između dve vektorske vakcine zasnovane na HVT.
REZIME PRONALASKA
[0010] U prvom primeru izvođenja, pronalazak je kompozicija ili vakcina za upotrebu u postupku za indukovanje imunogenog ili zaštitnog odgovora kod životinje protiv jednog ili više ptičjih patogena, gde navedena kompozicija ili vakcina sadrži rekombinantni vektor na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2), gde navedeni vektor sadrži jedan ili više heterologih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena, pri čemu heterologi polinukleotid kodira protein NDV-F virusa Njukastl bolesti, gde navedeni postupak obuhvata najmanje jednu primenu navedene kompozicije ili vakcine.
[0011] U drugom primeru izvođenja, pronalazak je rekombinantni vektor na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2) koji sadrži heterologi polinukleotid koji kodira protein NDV-F virusa Njukastl bolesti, promotor i signal za poliadenilaciju; pri čemu
(a) heterologi polinukleotid je polinukleotid NDV-F VIId divljeg tipa, promotor je mišji citomegalovirusni IE (mCMV IE) promotor i signal za poliadenilaciju je signal za poliadenilaciju Simian virusa 40 (SV40), pri čemu je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region između ORF SORF4 i ORF US10 vektora na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2); ili
(b) heterologi polinukleotid je kodon-optimizovani polinukleotid NDV-F VIId, promotor je promotor SV40 i signal za poliadenilaciju je SEQ ID NO: 13, gde je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region između ORF UL55 i ORF LORF5 u jedinstvenom dugom (UL) regionu vektora na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2); ili
(c) heterologi polinukleotid je kodon-optimizovani polinukleotid NDV-F VIId, promotor je promotor SV40 i signal za poliadenilaciju je endogen i potiče od gena za glikoprotein C (gC), gde je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region koji kodira glikoprotein C (UL44) u vektoru na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2); ili (d) heterologi polinukleotid je kodon-optimizovani polinukleotid NDV-F V (soj CA02), promotor je promotor SV40 i signal za poliadenilaciju je SEQ ID NO: 13, gde je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region između ORF UL55 i ORF LORF5 u jedinstvenom dugom (UL) regionu vektora na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2); ili
(e) heterologi polinukleotid je kodon-optimizovani polinukleotid NDV-F V (soj CA02), promotor je promotor SV40 i signal za poliadenilaciju je endogen i potiče od gena za glikoprotein C (gC), gde je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region koji kodira glikoprotein C (UL44) u vektoru na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2).
[0012] Predmetni pronalazak prvi put prikazuje rekombinantni vektor na bazi virusa Gallid herpesvirus-3 (MDV-2) koji štiti od patogena živine izvan virusa Marekove bolesti.
[0013] Predmetni pronalazak je pokazao iznenađujući rezultat pri korišćenju multivalentnih vakcina u zaštiti životinja od raznih ptičjih patogena.
[0014] Predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantni vektor na bazi virusa Gallid herpesvirus-3 (MDV-2) koji sadrži jedan ili više heterologih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena. Ovde je opisan rekombinantni vektor na bazi virusa Gallid herpesvirus-3 (MDV-2) koji sadrži mutirani gen za glikoprotein C (gC).
[0015] Ovde je opisana kompozicija ili vakcina koja sadrži jedan ili više rekombinantnih vektora na bazi virusa Gallid herpesvirus-3 (MDV- 2) koji sadrže jedan ili više heterologih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena. Ovde je dalje opisana kompozicija vakcine koja sadrži jedan ili više vektora na bazi virusa Gallid herpesvirus-3 (MDV-2) koji sadrže mutirani gen za glikoprotein C (gC).
[0016] Ovde je opisana polivalentna kompozicija ili vakcina koja sadrži: i) rekombinantni vektor na bazi virusa Gallid herpesvirus-3 (MDV- 2) koji sadrži heterologe polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena, ili koji sadrži mutirani gen za glikoprotein C (gC); i ii) najmanje jedan od: rekombinantnog vektora HVT (ili MDV- 3 ili Meleagrid herpesvirus-1) koji sadrži heterologe polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena; ili HVT (MDV-3) divljeg tipa; ili rekombinantni vektor na bazi MDV serotip 1 (tj., MDV-1, Gallid herpesvirus-2) koji sadrži heterologe polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena; ili bilo koji MDV-1 divljeg tipa.
[0017] Ovde je opisan postupak vakcinisanja životinje, ili indukovanja imunogenog ili zaštitnog odgovora kod životinje, koji obuhvata bar jednu primenu kompozicije ili vektora predmetnog pronalaska.
[0018] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje specifične lokuse za inserciju za uvođenje jednog ili više izolovanih polinukleotida u neesencijalne regione genoma SB-1.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0019] Detaljni opis koji sledi, dat kao primer, a koji nije namenjen da ograniči pronalazak na specifične primere izvođenja koji su opisani, može se razumeti u vezi sa pratećim slikama, na kojima:
Slika 1 je tabela koja prikazuje SEQ ID NO pripisan svakoj DNK i proteinskoj sekvenci. Slika 2 prikazuje šematski dijagram organizacije genoma SB-1.
Slika 3 prikazuje imunofluorescentno bojenje rekombinantnog virusa vSB 1-004 koji eksprimira NDV-F protein.
Slika 4 daje šematski prikaz mesta vezivanja prajmera.
Slika 5 prikazuje rezultate PCR za identifikovanje vSB1-004.
Slika 6 prikazuje imunofluorescentno bojenje rekombinantnog virusa vSB 1-006 virus koji eksprimira NDV-F protein.
Slika 7 daje šematski prikaz mesta vezivanja prajmera na vSB1-006.
Slika 8 prikazuje rezultate PCR za vSB 1-006.
Slika 9 prikazuje imunofluorescentno bojenje rekombinantnog virusa SB1-007 virus koji eksprimira NDV-F protein.
Slika 10 prikazuje šematski dijagram lokacije prajmera na donorskom plazmidu pSB144 cds SVOptF.
Slika 11 prikazuje rezultate PCR za vSB1-007.
Slika 12 prikazuje imunofluorescentno bojenje rekombinantnog virusa SB1-008 virus koji eksprimira NDV-F protein.
Slika 13 daje šematski prikaz mesta vezivanja prajmera.
Slika 14 prikazuje rezultate PCR za vSB1-008.
Slika 15 prikazuje analizu Western blot imunoprecipitiranog uzorka iz ćelija inficiranih sa vSB 1-009.
Slika 16 prikazuje imunoprecipitaciju i Western Blot za vHVT114.
Slika 17 prikazuje kliničku analizu (procenat ptica koje izlučuju virus kojim je izazvana veštačka infekcija) rekombinanata protiv veštačke infekcija sa CA02 i ZJ1 NDV.
Slika 18 prikazuje kliničku analizu (orofaringealno izlučivanje) rekombinanata protiv veštačke infekcija sa NDV.
Slika 19 prikazuje poravnanje sekvenci i procenat identičnosti sekvenci.
Slika 20 prikazuje sekvence DNK i proteina.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0020] Treba napomenuti da u ovom opisu, kao i u patentnim zahtevima, izrazi kao što su "sadrži", "sadržan", "koji sadrži" i slično mogu da imaju značenje koje im je pripisano u Patentnom zakonu SAD; npr., mogu da znače "uključuje", "uključeno", "uključujući", i slično; i da izrazi kao što su "koji se u suštini sastoji od" i "sastoji se u suštini od" imaju značenje koje im je pripisano u Patentnom zakonu SAD, npr., dozvoljavaju elemente koji nisu eksplicitno citirani, ali isključuju elemente koji se nalaze u prethodnom stanju tehnike ili koji utiču na osnovnu ili novu karakteristiku pronalaska.
[0021] Ako nije drugačije naznačeno, tehnički termini se koriste prema konvencionalnoj upotrebi. Definicije uobičajenih termina u molekularnoj biologiji mogu se naći u Benjamin Lewin, Genes V. izdavača Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (ured.), The Encyclopedia of Molecular Biology, izdavača Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); i Robert A. Meyers (ured.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, izdavača VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Izrazi u jednini obuhvataju množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Slično tome, reč "ili" je namenjena da uključi "i" osim ako kontekstom nije jasno naznačeno drugačije. Reč "ili" označava bilo kojeg člana određene liste i takođe uključuje bilo koju kombinaciju članova te liste.
[0022] Izraz "životinja" se ovde koristi tako da uključuje sve sisare, ptice i ribe. Životinja, u značenju koje je ovde primenjeno, može da bude izabrana iz grupe koja se sastoji od konja (npr. konj), pasa (npr. psi, vukovi, lisice, kojoti, šakali), mačaka (npr. lavovi, tigrovi, domaće mačke, divlje mačke, druge velike mačke, i druge mačke uključujući geparde i risa), goveda (npr. goveda), svinja (npr. svinja), ovaca (npr. ovce, koze, lame, bizoni), ptica (npr. kokoška, patka, guska, ćurka, prepelica, fazan, papagaj, zeba, jastreb, vrana, noj, emu i kazuar), primata (npr. polumajmun, tarzijer, majmun, gibon, bezrepi majmun), ljudi i riba. Izraz "životinja" uključuje i pojedinačnu životinju u svim fazama razvoja, uključujući i embrionalne fetalne faze.
[0023] Izrazi "polipeptid" i "protein" se ovde koriste kao sinonimi da znače polimer uzastopnih aminokiselinskih rezidua.
[0024] Izrazi "nukleinska kiselina", "nukleotid" i "polinukleotid" se koriste kao sinonimi i odnose se na RNK, DNK, cDNK, ili cRNK i njihove derivate, kao što su oni koji sadrže modifikovani skelet. Treba napomenuti da pronalazak obezbeđuje polinukleotide koji sadrže sekvence komplementarne onima koje su ovde opisane. "Polinukleotid" razmatran u ovom pronalasku uključuje i direktni lanac (5’ ka 3’) i reverzni komplementarni lanac (3’ ka 5’). Polinukleotidi prema pronalasku mogu da se pripreme na različite načine (npr. hemijskom sintezom, kloniranjem gena itd.) i mogu da imaju različite oblike (npr. linearni ili razgranati, jednolančani ili dvolančani, ili njihovi hibridi, prajmeri, probe itd.).
[0025] Izrazi "genomska DNK", ili "genom" koriste se kao sinonimi i odnose se na naslednu genetsku informaciju organizma-domaćina. Genomska DNK sadrži DNK jedra (označena i kao hromozomska DNK) ali i DNK plastida (npr., hloroplasta) i drugih ćelijskih organela (npr., mitohondrija). Genomska DNK ili genom razmatran u predmetnom pronalasku takođe se odnosi na RNK virusa. RNK može da bude RNK pozitivnog ili negativnog lanca. Izraz "genomska DNK" razmatran u predmetnom pronalasku uključuje genomsku DNK koja sadrži sekvence komplementarne onima koje su ovde opisane. Izraz "genomska DNK" odnosi se i na informacionu RNK (iRNK), komplementarnu DNK (cDNK) i komplementarnu RNK (cRNK).
[0026] Izraz "gen" se široko koristi da označi bilo koji segment polinukleotida povezan sa biološkom funkcijom. Tako, geni ili polinukleotidi uključuju introne i egzone kao u genomskoj sekvenci, ili samo kodirajuće sekvence kao u cDNK , kao što je otvoreni okvir čitanja (ORF), koji počinje start kodonom (metioninski kodon) i završava terminacionim signalom (stop kodon). Geni i polinukleotidi mogu da uključuju i regione koji regulišu njihovu ekspresiju, kao što je inicijacija transkripcije, terminacija translacije i transkripcije. Prema tome, uključeni su i promotori i regioni za vezivanje ribozoma (uopšteno ovi regulatorni elementi se nalaze približno između 60 i 250 nukleotida ushodno od start kodona kodirajuće sekvence ili gena; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), transkripcioni terminatori (uopšteno terminator je smešten unutar približno 50 nukleotida nishodno od stop kodona kodirajuće sekvence ili gena; Ward C K et al.). Gen ili polinukleotid se odnosi i na fragment nukleinske kiseline koji eksprimira iRNK ili funkcionalnu RNK, ili kodira specifični protein, i koji uključuje regulatorne sekvence.
[0027] Izraz "heterologa DNK" u značenju koje je ovde primenjeno odnosi se na DNK dobijenu iz drugačijeg organizma, kao što je drugačiji tip ćelija ili različita vrsta u odnosu na primaoca. Izraz se odnosi i na DNK ili njen fragment na istom genomu DNK domaćina pri čemu je heterologa DNK insertovana u region genoma koji je različit od originalne lokacije.
[0028] U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "antigen" ili "imunogen" označava supstancu koja indukuje specifični imunski odgovor kod životinje-domaćina. Antigen može da sadrži ceo organizam, ubijen, oslabljen ili živ; subjedinicu ili deo organizma; rekombinantni vektor koji sadrži ubačenu sekvencu sa imunogenim svojstvima; deo ili fragment DNK koji može da indukuje imunski odgovor nakon prezentovanja životinji-domaćinu; polipeptid, epitop, hapten, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Alternativno, imunogen ili antigen može da sadrži toksin ili antitoksin.
[0029] Izraz "imunogeni protein ili peptid" u značenju koje je ovde primenjeno uključuje polipeptide koji su imunološki aktivni u smislu da kada se jednom primene kod domaćina, mogu da pobude imunski odgovor humoralnog i/ili ćelijskog tipa usmeren protiv proteina. Poželjno proteinski fragment je takav da ima suštinski istu imunološku aktivnost kao ceo protein. Na taj način, proteinski fragment prema pronalasku sadrži ili se sastoji u suštini od, ili se sastoji od najmanje jednog epitopa ili antigene determinante. "Imunogeni" protein ili polipeptid, u značenju koje je ovde primenjeno, uključuje celu dužinu sekvence proteina, njegove analoge, ili njegove imunogene fragmente. Pod "imunogeni fragment" podrazumeva se fragment proteina koji uključuje jedan ili više epitopa i tako izaziva imunološki odgovor koji je gore opisan. Takvi fragmenti mogu da se identifikuju upotrebom bilo koje tehnike za mapiranje epitopa, koja je dobro poznata u stanju tehnike. Videti, npr., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, izd., 1996). Na primer, linearni epitopi mogu da se odrede npr., istovremenom sintezom velikog broja peptida na čvrstim podlogama, gde peptidi odgovaraju delovima proteinskog molekula, i reakcijom peptida sa antitelima dok su peptidi još uvek pričvršćeni za podloge. Takve tehnike su poznate u ovoj oblasti i opisane u, npr., SAD pat. br. 4,708,871. Slično, konformacioni epitopi se lako identifikuju određivanjem prostorne konformacije aminokiselina pomoću, npr., kristalografije x-zraka i 2-dimenzionalne nuklearne magnetne rezonance. Videti, npr., Epitope Mapping Protocols, gore u tekstu.
[0030] Izraz "imunogeni protein ili peptid" dalje obuhvata delecije, adicije i supstitucije sekvence, sve dok polipeptid funkcioniše tako da proizvodi imunološki odgovor kao što je ovde definisano. Izraz "konzervativna varijacija" označava zamenu aminokiselinske rezidue drugom biološki sličnom reziduom, ili zamenu nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline tako da se kodirana aminokiselinska rezidua ne menja, ili je druga biološki slična rezidua. U tom pogledu, posebno poželjne supstitucije će uopšteno biti konzervativne prirode, tj., one supstitucije koje se odigravaju unutar familije aminokiselina. Na primer, aminokiseline au uopšteno podeljene u četiri familije: (1) kisele-aspartat i glutamat; (2) bazne-lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne-alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenaelektrisane polarneglicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Fenilalanin, triptofan i tirozin su ponekad klasifikovani kao aromatične aminokiseline. Primeri konzervativnih varijacija uključuju supstituciju jedne hidrofobne rezidue drugom hidrofobnom reziduom kao što je izoleucin, valin, leucin ili metionin, ili supstituciju jedne polarne rezidue drugom polarnom reziduom, kao što je supstitucija lizina argininom, asparaginske kiseline glutaminskom kiselinom, ili asparagina glutaminom; ili slična konzervativna zamena aminokiseline strukturno srodnom aminokiselinom koja neće značajno uticati na biološku aktivnost. Proteini koji imaju suštinski istu aminokiselinsku sekvencu kao referentni molekul, ali imaju minimalne aminokiselinske supstitucije koje ne utiču suštinski na imunogenost proteina su, prema tome, u okviru definicije referentnog polipeptida. Svi polipeptidi proizvedeni ovim modifikacijama su uključeni u ovaj dokument. Izraz "konzervativna varijacija" uključuje i upotrebu supstituisane aminokiseline umesto nesupstituisane parentalne aminokiseline pod uslovom da antitela protiv supstituisanog polipeptida takođe stupaju u imunološku reakciju sa nesupstituisanim polipeptidom.
[0031] Izraz "epitop" se odnosi na mesto na antigenu ili haptenu na koje specifične B ćelije i/ili T ćelije odgovaraju. Izraz se koristi i kao sinonim za "antigenu determinantu" ili "mesto antigene determinante". Antitela koja prepoznaju isti epitop mogu da se identifikuju jednostavnim imunoesejem koji pokazuje sposobnost jednog antitela da spreči vezivanje drugog antitela za ciljni antigen.
[0032] "Imunološki odgovor" na kompoziciju ili vakcinu predstavlja razvoj ćelijskog i/ili antitelom-posredovanog imunskog odgovora u domaćinu na kompoziciju ili vakcinu od interesa. Obično, "imunološki odgovor" uključuje, ali nije ograničen na jedno ili više od sledećih dejstava: proizvodnju antitela, B ćelija, pomoćnih T ćelija, i/ili citotoksičnih T ćelija, usmerenih specifično na antigen ili antigene uključene u kompoziciju ili vakcinu od interesa. Poželjno, domaćin će ispoljiti ili terapijski ili zaštitni imunološki odgovor tako da će otpornost na novu infekciju biti pojačana i/ili će klinička težina bolesti biti smanjena. Takva zaštita će se ispoljiti kroz redukciju ili izostanak simptoma koje normalno ispoljava inficirani domaćin, bržim vremenom oporavka i/ili sniženim virusnim titrom u inficiranom domaćinu.
[0033] Izrazi "rekombinantni" i "genetički modifikovan" se koriste kao sinonimi i odnose se na bilo koju modifikaciju, izmenu ili inženjering polinukleotida ili proteina u njegovom nativnom obliku ili strukturi, ili na bilo koju modifikaciju, izmenu ili inženjering polinukleotida ili proteina u njegovoj prirodnoj sredini ili okolini. Modifikacije, izmene ili inženjering polinukleotida ili proteina mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na deleciju jednog ili više nukleotida ili aminokiselina, deleciju celog gena, optimizaciju kodona u genu, konzervativnu supstituciju aminokiselina, inserciju jednog ili više heterologih polinukleotida.
[0034] Izrazi "polivalentna vakcina ili kompozicija", "kombinovana ili kombo vakcina ili kompozicija" i "multivalentna vakcina ili kompozicija" se koriste kao sinonimi da označe kompoziciju ili vakcinu koja sadrži više od jedne kompozicije ili vakcine. Polivalentna vakcina ili kompozicija može da sadrži dve, tri, četiri ili više kompozicija ili vakcina. Polivalentna vakcina ili kompozicija može da sadrži rekombinantne virusne vektore, aktivne ili oslabljene ili ubijene viruse divljeg tipa, ili smešu rekombinantnih virusnih vektora i virusa divljeg tipa u aktivnim ili oslabljenim ili ubijenim oblicima.
[0035] U ovom tekstu je opisan rekombinantni vektor na bazi virusa Gallid herpesvirus 3 (MDV-2) koji sadrži mutirani gen za glikoprotein C (gC ili UL44). Izraz "mutirani gC gen" se odnosi na gC gen Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2) koji je izmenjen ili podvrgnut inženjeringu što rezultuje gC proteinom koji je nefunkcionalan nakon ekspresije. Izmena ili inženjering gena gC uključuje mutaciju ili deleciju segmenta gena gC koji ima suštinski značaj za ekspresiju funkcionalnog proteina gC. Izraz "mutirani gen gC" takođe uključuje deleciju celog gena gC Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2) pri čemu se protein gC ne eksprimira. U ovom tekstu je dalje opisan rekombinantni Gallid herpesvirus 3 (MDV-2) u kome je gen glikoprotein C (gC) koji kodira protein gC deletiran u nativnom (divljem tipu) genoma Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2). Izraz "gen za glikoprotein C (gC)" uključuje bilo koji gen ili polinukleotid koji kodira glikoprotein C (gC) virusa Gallid herpesvirus 3 (MDV-2), i njegove homologe, fragmente ili varijante. Gen gC može da kodira protein gC koji ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% ili 99.9% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 35, ili njegovu varijantu. Gen gC koji ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% ili 99.9% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:34 je takođe opisan u ovom tekstu.
[0036] Još jedan primer izvođenja pronalaska obezbeđuje rekombinantni virusni vektor na bazi Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2) koji sadrži jedan ili više heterologih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ili polipeptid ptičjeg patogena. Sojevi Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2 koji se koriste za rekombinantni virusni vektor mogu da budu bilo koji sojevi SB-1, uključujući, ali bez ograničenja, komercijalnu vakcinu protiv Marekove bolesti (SB-1 vakcina) (Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, USA), soj SB-1 koji ima genomsku sekvencu kao što je definisano u GenBank pristupni broj HQ840738.1. Sojevi Gallid herpesvirus 3 (MDV-2) koji se koriste za ovde opisani rekombinantni virusni vektor mogu da budu bilo koji drugi izolat Gallid herpesvirusa 3 uključujući soj HPRS24 koji ima genomsku sekvencu kao što je definisano u GenBank pristupni broj AB049735.1, ili soj HPRS24 koji ima genomsku sekvencu kao što je definisano u GenBank pristupni broj NC_002577.1. Genomi HPRS24 i SB-1 dele 98.4% identičnosti sekvence (Spatz and Schat, 2011; Virus Gene 42, 331-338). Sojevi Gallid herpesvirus 3 (MDV-2) koji se koriste za ovde opisani rekombinantni virusni vektor mogu da budu izolat 301B/1 opisan kod Witter (1987 Avian Dis 31, 752-765) ili kod Witter et al. (1987 Avian Dis 31, 829-840). Sojevi Gallid herpesvirus 3 (MDV-2) koji su ovde opisani mogu da budu bilo koji sojevi Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2) koji sadrže genomsku sekvencu koja ima bar 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa sekvencom kao što je definisano u GenBank pristupni broj HQ840738.1 (SEQ ID NO:14), AB049735.1, ili NC_002577.1.
[0037] Geni koji kodiraju ovde opisani antigen ili polipeptid mogu da budu oni koji kodiraju fuzioni protein virusa Njukastl bolesti (NDV-F), hemaglutinin neuraminidazu virusa Njukastl bolesti (NDV-HN), glikoprotein C (gC) virusa Marekove bolesti, glikoprotein B (gB) virusa Marekove bolesti, glikoprotein E (gE) virusa Marekove bolesti, glikoprotein I (gI) virusa Marekove bolesti, glikoprotein H (gH) virusa Marekove bolesti ili glikoprotein L (gL) virusa Marekove bolesti, IBDV VP2, IBDV VPX, IBDV VP3, IBDV VP4, ILTV glikoprotein B, ILTV glikoprotein I, ILTV UL32, ILTV glikoprotein D, ILTV glikoprotein E, ILTV glikoprotein C, hemaglutinin influence (HA), neuraminidazu influence (NA), zaštitne gene dobijene iz Mycoplasma gallisepticum (MG), ili Mycoplasma synoviae (MS), ili njihove kombinacije. Antigen ili polipeptid može da bude bilo koji antigen iz patogena živine odabran iz grupe koja se sastoji od ptičjeg virusa encefalomijelitisa, ptičjeg reovirusa, ptičjeg paramiksovirusa, ptičjeg metapneumovirusa, virusa avijarne influence, ptičjeg adenovirusa, virusa boginja živine, ptičjeg koronavirusa, ptičjeg rotavirusa, virusa anemije pilića, ptičjeg astrovirusa, ptičjeg parvovirusa, kokcidioza (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Pasteurella sp., Avibacterium sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium sp., i E. coli.
[0038] Osim toga, predviđeno je da homolozi gore pomenutog antigena ili polinukleotida budu u okviru obima predmetnog opisa. U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "homolozi" uključuje ortologe, analoge i paraloge. Izraz "analozi" se odnosi na dva polinukleotida ili polipeptida koji imaju istu ili sličnu funkciju, ali su evoluirali odvojeno u nesrodnim organizmima. Izraz "ortolozi" se odnosi na dva polinukleotida ili polipeptida iz različitih vrsta, ali koji su evoluirali od zajedničkog predačkog gena specijacijom. Normalno, ortolozi kodiraju polipeptide koji imaju iste ili slične funkcije. Izraz "paralozi" se odnosi na dva polinukleotida ili polipeptida koji su povezani duplikacijom u genomu. Paralozi obično imaju različite funkcije, ali ove funkcije mogu da budu povezane. Analozi, ortolozi i paralozi divljeg tipa polipeptida mogu da se razlikuju od polipeptida divljeg tipa po posttranslacionim modifikacijama, razlikama u aminokiselinskoj sekvenci, ili po oba. Konkretno, homolozi koji su ovde opisani će uopšteno ispoljiti najmanje 80-85%, 85-90%, 90-95%, ili 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sekvence sa celim sekvencama ili delom polinukleotidnih ili polipeptidnih sekvenci antigena koji su ovde opisani, i ispoljavaće sličnu funkciju.
[0039] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni virusni vektor na bazi Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) koja sadrži jedan, dva ili više heterologih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju antigen ili polipeptid NDV-F. U jednom aspektu primera izvođenja, antigen ili polipeptid NDV-F ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa polipeptidom koji ima sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:2, 9, 50, 52, ili 54, ili konzervativnu varijantu, alelnu varijantu, homolog ili imunogeni fragment koji sadrži najmanje osam ili najmanje deset uzastopnih aminokiselina jednog od ovih polipeptida, ili kombinaciju ovih polipeptida. U drugom aspektu primera izvođenja, heterologi polinukleotid koji kodira antigen ili polipeptid NDV-F ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa polipeptidom koji ima sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:2, 9, 50, 52, ili 54. U još jednom aspektu primera izvođenja, heterologi polinukleotid ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa polinukleotidom koji ima sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:1, 8, 49, 51, ili 53.
[0040] Varijante uključuju alelne varijante. Izraz "alelna varijanta" odnosi se na polinukleotid ili polipeptid koji sadrži polimorfizme koji vode promenama u aminokiselinskim sekvencama proteina i koji postoje u prirodnoj populaciji (npr., vrsta virusa ili varijetet). Takve prirodne alelne varijacije mogu tipično da rezultuju variranjem od 1- 5% u polinukleotidu ili polipeptidu. Alelne varijante mogu da budu identifikovane sekvenciranjem sekvence nukleinske kiseline od interesa u brojnim različitim vrstama, što se lako može sprovesti upotrebom hibridizacionih proba za identifikovanje genskog lokusa istog gena u ovim vrstama. Bilo koja ili sve takve varijacije nukleinske kiseline i rezultujući polimorfizmi ili varijacije aminokiselina koje su rezultat prirodne varijacije alela i koje ne menjaju funkcionalnu aktivnost gena od interesa, obuhvaćene su obimom ovog pronalaska.
[0041] Izraz "identičnost" u vezi sa sekvencama može da se odnosi na, na primer, broj pozicija sa identičnim nukleotidima ili aminokiselinama podeljen brojem nukleotida ili aminokiselina u kraćoj od dve sekvence gde se poravnanje dve sekvence može odrediti prema algoritmu Vilbura i Lipmana (Wilbur and Lipman). Identičnost sekvence ili sličnost sekvence dve aminokiselinske sekvence, ili identičnost sekvence između dve nukleotidne sekvence može se odrediti upotrebom paketa programa Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Kada se kaže da su RNK sekvence slične, ili da imaju određen stepen identičnosti ili homologije sekvence sa DNK sekvencama, timidin (T) u DNK sekvenci se smatra jednakim uracilu (U) u RNK sekvenci. Tako, RNK sekvence su obuhvaćene obimom pronalaska i mogu da se dobiju iz DNK sekvenci, smatrajući timidin (T) u DNK sekvenci jednakim uracilu (U) u RNK sekvencama.
[0042] Polinukleotidi prema opisu uključuju sekvence koje su degenerisane kao rezultat degeneracije genetskog koda, npr., upotrebe optimizovanih kodona za specifičnog domaćina. U značenju koje je ovde primenjeno, "optimizovan" se odnosi na polinukleotid koji je dobijen genetskim inženjeringom da bi se povećala njegova ekspresija u datoj vrsti. U cilju dobijanja optimizovanih polinukleotida koji kodiraju polipeptide NDV-F, DNK sekvenca gena za protein NDV-F može da se modifikuje tako da 1) sadrži kodone koji su poželjni za gene koji su visoko eksprimirani u određenoj vrsti; 2) ima takav sadržaj A+T ili G+C u kompoziciji nukleotidnih baza kakav se suštinski javlja u navedenoj vrsti; 3) obrazuje inicijacionu sekvencu navedene vrste; ili 4) eliminiše sekvence koje izazivaju destabilizaciju, neodgovarajuću poliadenilaciju, degradaciju i terminaciju RNK, ili koje obrazuju sekundarnu strukturu ukosnica ili mesta za splajsovanje RNK. Povećana ekspresija proteina NDV-F u navedenoj vrsti može da se ostvari upotrebom raspodele učestalosti upotrebe kodona kod eukariota i prokariota, ili kod konkretne vrste. Izraz "učestalost upotrebe poželjnog kodona" odnosi se na davanje prednosti određenim kodonima pri upotrebi nukleotidnih kodona za određivanje date aminokiseline koje ispoljava specifična ćelija domaćin. Postoji 20 prirodnih aminokiselina, od kojih je većina određena sa više od jednog kodona. Stoga, sve degenerisane nukleotidne sekvence su uključene u opis sve dok aminokiselinska sekvenca polipeptida NDV-F koju kodira nukleotidna sekvenca ostaje funkcionalno neizmenjena.
[0043] Ovde je dalje opisan postupak za proizvodnju rekombinantnog virusnog vektora na bazi Gallid herpesvirusa-3 ili SB-1 koji obuhvata uvođenje u genom SB-1 jednog, dva ili više izolovanih polinukleotida u neesencijalni region genoma SB-1. Ovde je dalje opisan postupak za proizvodnju rekombinantnog virusnog vektora na bazi Gallid herpesvirusa-3 ili SB-1 koji obuhvata korake izmene, inženjeringa, ili delecije gena gC iz genoma SB-1. Izraz "neesencijalni region" odnosi se na region virusnog genoma koji nije suštinski za replikaciju i propagaciju virusa u kulturi tkiva ili kod kokošaka. Bilo koji neesencijalni region ili njegov deo može da bude deletiran iz genoma SB-1 ili strana sekvenca može da bude insertovana u njega, i vijabilnost i stabilnost rekombinantnog vektora Gallid herpesvirusa-3 ili SB- 1 koji nastaje delecijom ili insercijom može da se koristi za procenu da li je deletirani region ili njegov deo zaista neesencijalan. U jednom aspektu primera izvođenja, neesencijalni regioni su smešteni u jedinstvenom dugom (UL) i jedinstvenom kratkom (US) regionu genoma SB-1 (videti Spatz et al., Virus Genes 42:331-338, 2011). UL region u SB-1 je dug oko 109744 bp do oko 109932 bp i može da se pruža od pozicija 12 209 do 121 952 u SEQ ID NO:14 (GenBank pristupni br, HQ840738.1) ili duž ekvivalentnih pozicija drugih SB1-genoma, na primer, od 11826 bp do 121 757 bp u genomu HPRS24. US region u SB-1 je dug oko 12109 bp do oko 12,910 bp može da se pruža od pozicija 143514 do 156423 u SEQ ID NO:14 (GenBank pristupni br, HQ840738.1) ili duž ekvivalentnih pozicija drugih SB1-genoma, na primer od 142681bp do 154789 bp u genomu HPRS24 (Spatz et al., 2011). Neesencijalni region koji je ovde opisan je između ORF u UL55 i ORF u LORF5 u jedinstvenom dugom (UL) regionu SB-1. Ovde opisani polinukleotid je insertovan u, ili tako da zamenjuje gen za glikoprotein C u SB-1 (označen i kao UL44). Upotreba lokusa gC može da omogući generisanje rekombinantnog virusa koji ne može da proizvede funkcionalni protein gC i koji ne može da se prenosi horizontalno. Ovde opisan neesencijalni region može da bude u intergenskim regionima između gena UL7 i UL8, između UL 21 i UL22, između UL40 i UL41, između UL50 i UL51, između UL54 i LORF4, između US10 i SORF4, ili unutar UL43, US2, US 10 ili US6 (koji kodiraju gD) (videti GenBank pristupni br, HQ840738.1). Ovde opisani neesencijalni regioni mogu da budu u regionu nukleotidnih pozicija 118057-118306 (intergenski UL55-LORF5), 98595-100031 (gC ili UL44), 25983-26038 (intergenski UL7-UL8), 49865-50033 (intergenski UL21-UL22), 75880-75948 (intergenski UL35-UL36), 93928-93990 (intergenski UL40-UL41), 109777-109847 (intergenski UL50-UL51), 116466-116571 (intergenski UL54-LORF4), 146548-146697 (intergenski US10- SORF4), 97141-98385 (UL43), 147857-148672 (US2), 145853..146548 (US10) ili 150322-151479 (gD ili US6) u SEQ ID NO:14.
[0044] Konstruisanje rekombinantnog virusa je dobro poznato u stanju tehnike kao što je opisano u, npr., SAD patentima br. 4,769,330, 4,722,848, 4,603, 112, 5,174, 993, i 5,756,103, 6,719,979. Specifično, rekombinantni virusni vektor Gallid herpesvirusa-3 (MDV- 2) može da bude konstruisan u dva koraka. Prvo, genomski regioni Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) ili SB-1 koji ograničavaju lokus insercije kloniraju se u E.coli plazmidni konstrukt; jedinstveno restrikciono mesto/mesta su smeštena između dva granična regiona (insercioni plazmid) kako bi omogućili inserciju DNK donorske ekspresione kasete. Odvojeno, ispred cDNA ili DNK genske sekvence koja treba da se insertuje ubacuje se region promotora (region početka gena) i terminatorska (ili poliadenilaciona, poli-A) sekvenca koja je specifična za vektor Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) ili SB-1 i/ili eukariotske ćelije. Cela ekspresiona kaseta (promotor-strani gen-poli-A) se zatim klonira u jedinstveno restrikciono mesto/mesta za inserciju plazmida da bi se konstruisao "donorski plazmid" koji sadrži ekspresionu kasetu ograničenu „ručicama“ Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) ili SB-1 koje ograničavaju insercioni lokus. Rezultujući konstrukt donorskog plazmida se zatim amplifikuje rastom u bakteriji E.coli i plazmidna DNK se ekstrahuje. Ovaj plazmid se zatim linearizuje upotrebom restrikcionog enzima koji seče okosnicu plazmida (van ručica Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) ili SB-1 i ekspresione kasete). Fibroblasti pilećeg embriona se zatim kotransficiraju parentalnom DNK Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) ili SB-1 i linearizovanom DNK donorskog plazmida. Rezultujuća populacija virusa se zatim klonira višestrukim koracima graničnog razblaženja pri čemu se virusi koji eksprimiraju strani gen izoluju od virusne populacije koja ga ne eksprimira. Slično, druga strana kaseta može da bude insertovana u drugi lokus insercije da bi se dobio dvostruki Gallid herpesvirus-3 (MDV-2) ili SB-1 rekombinant koji eksprimira dva gena. Druga kaseta može da bude insertovana u isti lokus. Rekombinant Gallid herpesvirusa-3 (MDV- 2) ili SB-1 se proizvodi u primarnim fibroblastima pilećeg embriona slično vakcini sa parentalnim Gallid herpesvirusom-3 (MDV-2) ili SB-1 MD. Posle inkubacije, inficirane ćelije se sakupljaju, mešaju sa medijumom za zamrzavanje koji omogućava preživljavanje inficiranih ćelija, i zamrzavaju obično u kriotubama ili staklenim ampulama i čuvaju u tečnom azotu.
[0045] Uspešna ekspresija insertovane cDNK genske sekvence modifikovanim infektivnim virusom zahteva dva uslova. Prvo, insercija mora da bude uvedena u region genoma virusa na taj način da modifikovani virus ostane vijabilan. Drugi uslov za ekspresiju insertovane cDNK je prisustvo regulatornih sekvenci koje omogućavaju ekspresiju gena u virusnom okruženju (na primer: promotor, pojačivač, donorsko i akceptorsko mesto za splajsing i intron, Kozak konsenzusnu sekvencu za inicijaciju translacije, signal za poliadenilaciju, netranslatirane elemente sekvence).
[0046] Uopšteno, korisno je koristiti snažan promotor koji funkcioniše u eukariotskim ćelijama. Promotori uključuju, ali nisu ograničeni na neposredni rani citomegalovirusni (CMV) promotor, CMV promotor zamorca, SV40 promotor, promotore Pseudorabies virusa kao što je promotor glikoproteina X, Herpes simplex virusa-1 kao što je alfa 4 promotor, promotore virusa Marekove bolesti (uključujući MDV-1, MDV-2 i HVT) kao što su oni koji pokreću ekspresiju glikoproteina gC, gB, gE, ili gI, promotore virusa infektivnog laringotraheitisa kao što su oni za gene glikoprotein gB, gE, gI, gD, ili druge promotore herpesvirusa. Kada se insercioni lokus sastoji od SB-1 gena (na primer, gena gC, gD, US2 ili US10), strani gen može da bude insertovan u vektor bez dodatne promotorske sekvence budući da će promotor deletiranog gena vektora pokretati transkripciju insertovanog stranog gena.
[0047] Ovde je opisana farmaceutska kompozicija ili vakcina koja sadrži jedan ili više rekombinantnih rivalskih vektora Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) prema predmetnom pronalasku i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens, vehikulum ili adjuvans. Sojevi Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2) koji se koriste za rekombinantni virusni vektor Gallid herpesvirusa-3 mogu da budu bilo koji sojevi SB-1, sojevi HPSR24, ili sojevi 301B/1. Sojevi Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) mogu da uključuju i one koji su opisani kod Witter et al (Avian Diseases 34, 944-957; 1990), Witter (Avian Pathology 21, 601-614, 1992) i Witter (Avian Pathology 24, 665-678, 1995): 280-5/1, 281MI/1, 287C/1, 298B/1, 301A/1, 401/1, 437A/1, 437B/1, 468A/1, 468A/2, 468B/1, 471B/1, ili HN-1/1.
[0048] U još jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju ili vakcinu koja sadrži: i) rekombinantni vektor Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) koji sadrži heterologe polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena; i ii) najmanje jedan od: rekombinantnog HVT vektora (ili MDV-3 ili Meleagrid herpesvirusa-1) koji sadrži heterologe polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena; ili MDV-3 divljeg tipa; ili rekombinantni MDV-1 vektor (ili Gallid herpesvirus-2) koji sadrži heterologe polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena; ili MDV-1 divljeg tipa. Kompozicija ili vakcina može dodatno da sadrži farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens, vehikulum ili adjuvans. Ova kompozicija može dalje da sadrži rekombinantni vektor virusa boginja živine koji sadrži heterologe polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena; ili virus boginja živine divljeg tipa.
[0049] U jednom aspektu primera izvođenja, kompozicija ili vakcina sadrži jedan (ili više) rekombinantnih vektora Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) i jedan ili više HVT (MDV-3) divljeg tipa. U još jednom aspektu, kompozicija ili vakcina sadrži jedan (ili više) rekombinantnih vektora Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) i jedan ili više rekombinantnih HVT (MDV- 3). U još jednom aspektu, kompozicija ili vakcina sadrži jedan ili više rekombinantnih vektora Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) i jedan ili više MDV-1 divljeg tipa ili genetski modifikovan MDV-1. U još jednom aspektu, kompozicija ili vakcina sadrži jedan ili više rekombinantnih vektora Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2) i jedan ili više rekombinantnih MDV-1. U još jednom aspektu, kompozicija ili vakcina sadrži jedan ili više rekombinantnih vektora Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2), jedan ili više HVT (MDV-3) divljeg tipa i jedan ili više MDV-1 divljeg tipa. U još jednom aspektu, kompozicija ili vakcina sadrži jedan ili više rekombinantnih vektora Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2), jedan ili više rekombinantnih HVT (MDV-3) i jedan ili više MDV-1 divljeg tipa. U još jednom aspektu, kompozicija ili vakcina sadrži jedan ili više rekombinantnih vektora Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2), jedan ili više HVT (MDV-3) divljeg tipa i jedan ili više rekombinantnih MDV-1. U još jednom aspektu, kompozicija ili vakcina sadrži jedan ili više rekombinantnih vektora Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2), jedan ili više rekombinantnih HVT (MDV-3) i jedan ili više rekombinantnih MDV-1. HVT (MDV-3) divljeg tipa ili MDV-1 divljeg tipa mogu da budu živi, oslabljeni ili genetski modifikovani. Heterologi polinukleotid u rekombinantnim vektorima Gallid herpesvirusa-3 (MDV-2), rekombinantnim vektorima HVT (MDV-3), i rekombinantnim vektorima MDV-1 mogu da kodiraju isti ili različite antigene iz istog ili različitih ptičjih patogena.
[0050] Farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosači ili adjuvansi ili vehikulumi ili ekscipijensi su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Na primer, farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač ili adjuvans ili vehikulum ili ekscipijens može da bude razblaživač za vakcinu protiv Marekove bolesti korišćen za MD vakcine. Drugi farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač ili adjuvans ili vehikulum ili ekscipijens koji mogu da se koriste za postupke prema ovom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, 0.9% rastvor NaCl (npr., fiziološki rastvor) ili fosfatni pufer, poli-(L-glutamat) ili polivinilpirolidon. Farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi nosač ili vehikulum ili ekscipijens može da bude bilo koje jedinjenje ili kombinacija jedinjenja koja olakšava primenu vektora (ili proteina koji je eksprimiran sa inventivnog vektora in vitro), ili olakšava transfekciju ili infekciju i/ili poboljšava konzervisanje vektora (ili proteina). Doze i zapremine doza su ovde razmatrane u opštem opisu i može takođe da ih odredi stručnjak u ovoj oblasti iz ovog opisa pročitanog uz oslanjanje na stručno znanje, bez ikakvog nepotrebnog eksperimentisanja.
[0051] Po izboru je moguće dodati druga jedinjenja kao farmaceutski ili veterinarski prihvatljive nosače ili adjuvanse ili vehikulume ili ekscipijense, uključujući, ali bez ograničenja, alum; CpG oligonukleotide (ODN), posebno ODN 2006, 2007, 2059, ili 2135 (Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103); polyApolyU, dimetildioktadecilamonijum bromid (DDA) ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", urednika Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p.03, p.157); N,N-dioktadecil-N’,N’-bis(2-hidroksietil) propandiamin (kao što je AVRIDINE<®>) (isti izvor, p.148); karbomer, hitozan (videti SAD patent br.5,980,912 kao primer).
[0052] Farmaceutske kompozicije i vakcine prema pronalasku mogu da sadrže ili da se u suštini sastoje od jednog ili više adjuvanasa. Pogodni adjuvansi za upotrebu u praktikovanju predmetnog pronalaska su (1) polimeri akrilne ili metakrilne kiseline, anhidrid maleinske kiseline i polimeri derivata alkenila, (2) imunostimulatorne sekvence (ISS), kao što su sekvence oligodeoksiribonukleotida koje imaju jednu ili više nemetilovanih CpG jedinica (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) emulzija ulje u vodi, kao što je emulzija SPT opisana na str. 147 u "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" izdavača M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, i emulzija MF59 opisana na str. 183 istog dela, (4) katjonski lipidi koji sadrže kvaternarnu amonijumovu so, npr., DDA (5) citokini, (6) aluminijum hidroksid ili aluminijum fosfat, (7) saponin ili (8) drugi adjuvansi razmatrani u bilo kom dokumentu navedenom u ovoj prijavi, ili (9) bilo koje njihove kombinacije ili smeše.
[0053] Ovde je opisan postupak za indukciju imunološkog odgovora kod životinje protiv jednog ili više antigena ili zaštitni odgovor u životinju protiv jednog ili više ptičjih patogena, pri čemu postupak obuhvata inokulaciju životinje najmanje jednom vakcinom ili farmaceutskom kompozicijom predmetnog pronalaska. Dalje je ovde opisan postupak za indukciju imunološkog odgovora kod životinje protiv jednog ili više antigena ili zaštitni odgovor u životinji protiv jednog ili više ptičjih patogena u režimu primarne primarna-buster imunizacija, koji je sačinjen od najmanje jedne primarne primene i najmanje jedne buster primene upotrebom najmanje jednog zajedničkog polipeptida, antigena, epitopa ili imunogena. Imunološka kompozicija ili vakcina korišćena u primarnoj primeni može da bude ista, može da bude različita po svojoj prirodi od onih korišćenih za buster primenu.
[0054] Ptičji patogeni mogu da budu virus Njukastl bolesti (NDV), virus infektivne burzalne bolesti (tj., IBDV ili virus bolesti Gumboro), virus Marekove bolesti (MDV), virus infektivnog laringotraheitisa (ILTV), virus ptičjeg encefalomijelitisa i drugi pikornavirusi, ptičji reovirus, ptičji paramiksovirus, ptičji metapneumovirus, virus avijarne influence, ptičji adenovirus, virus boginja živine, ptičji koronavirus, ptičji rotavirus, ptičji parvovirus, ptičji astrovirus i virus anemije pilića, kokcidioza (Eimeria sp.), Campylobacter sp., Salmonella sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella sp., Avibacterium sp., E. coli ili Clostridium sp.
[0055] Obično, jedna primena vakcine se sprovodi kod jednodnevnih pilića subkutanim ili intramuskularnim putem ili in ovo kod embriona starosti 17-19 dana. Druga primena može da se sprovede u okviru 10 dana starosti. U vreme prve primene, životinje su poželjno najmanje 17-dnevni embrioni ili jednodnevne životinje.
[0056] Mogu se koristiti različiti putevi primene kod jednodnevnih pilića kao što je subkutano ili intramuskularno, intradermalno, transdermalno. Vakcinacija in ovo može se izvesti u amnionsku kesu i/ili embrion. Za vakcinaciju mogu da se koriste komercijalno dostupni uređaji za primenu in ovo i SC.
[0057] Pronalazak će sada biti dodatno opisan pomoću sledećih neograničavajućih primera.
PRIMERI
[0058] Konstruisanje DNK inserata, plazmida i rekombinantnih virusnih vektora sprovedeno je upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije opisanih kod J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izd, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Primer 1 Konstruisanje rekombinantnog vSB1-004 koji eksprimira NDV-F
[0059] Cilj rada je konstruisanje rekombinantnog SB-1 virusa u kome je ekspresiona kaseta koja sadrži mišji citomegalovirusni (mCMV) promotor, fuzioni protein virusa Njukastl bolesti (NDV-F) i Simian virus 40 (SV40) poli-A rep insertovana u intergensko mesto između US10 i SORF4 u SB-1 virusu (Tabela 1 i Sl.2).
Tabela 1 Karakteristike vSB1-004
[0060] Fuzioni protein virusa Njukastl bolesti (NDV-F) koji odgovara sekvenci genotipa VIId (SEQ ID NO:2 kodiranoj sa SEQ ID NO:3) je hemijski sintetisan (GenScript, Piscataway, NJ, USA). Mesto sečenja F proteina ovog sintetskog gena izmenjeno je tako da odgovara lentogenoj sekvenci F mesta sečenja i rezultujuća sekvenca gena NDV-F imala je 99% nukleotidne, kao i 99% aminokiselinske identičnosti sekvence sa NDV-F sekvencom deponovanom u GenBank pod pristupnim brojem AY337464 (za DNK) odnosno AAP97877.1 (za protein).
Konstruisanje donorskog plazmida SB-1 US10mFwt SbfI
[0061] Fragment koji sadrži sintetski NDV-F gen je isečen iz plazmida pUC57 NDV-F VIId wt (sintetisan u GeneScript) upotrebom NotI i insertovan na isto mesto u plazmidu pCD046 koji sadrži mCMV promotor i SV40 poli-A rep. Rezultujući plazmid, pCD046+NDV-F wt digestiran je sa EcoRI i SalI i krajevi su mu zatupljeni Klenovim fragmentom. Fragment od 3.3 kb je ekstrahovan na gelu i spojen sa vektorom (SB1 US10SORF4 SbfI pUC57) koji je digestiran sa SmaI i defosforilisan (dejstvom CIP) i koji sadrži granične ručice. Spojeni materijal je transformisan upotrebom kompleta Top10 Oneshot (Invitrogen, CA, USA). Bakterijske kolonije su rasle u bujonu LBamp, plazmid je ekstrahovan upotrebom kompleta Qiagens MiniSpin Prep, i orjentacija inserta je proverena primenom digestije sa PstI. Ispravan donorski plazmid označen je kao SB-1 10mFwt SbfI. Kulture su gajene na velikoj skali i ekstrakcija plazmida je urađena upotrebom kompleta Qiagens Maxi Prep. Prolazna ekspresija plazmida izolovanih pomoću ovog kompleta potvrđena je upotrebom reagensa za transfekciju Fugene u fibroblastima pilećeg embriona (CEF) i sa pilećim poliklonskim serumom protiv NDV.
Generisanje rekombinanata
[0062] Standardni postupak homologe rekombinacije praćen je ko-elektroporacijom sekundarnih CEF ćelija upotrebom donorskog plazmida SB-1 US10mFwt SbfI i virusne DNK izolovane iz vakcinalnog soja SB-1 virusa. Ko-elektroporacija je izvedena upotrebom 1x107 ćelija 2° CEF u 300 µl Opti-MEM i primenom elektrošoka od 150 volti pri kapacitivnosti od 950 u kiveti za elektroporaciju od 2 mm. Transficirane ćelije su zasejane u ploču sa 96 bunarčića i inkubirane 5-7 dana. Ćelije koje su rasle u ploči sa 96 bunarčića tretirane su tripsinom i prenete u dve "sestrinske" ploče sa 96 bunarčića i inkubirane još 5 dana. Jedan set ploča sa 96 bunarčića je korišćen za IFA upotrebom pilećeg poliklonskog seruma protiv NDV-F za identifikovanje pozitivnih bunarčića koji sadrže rekombinante, a drugi set ploča sa 96 bunarčića je korišćen za izdvajanje inficiranih ćelija iz pozitivnih bunarčića.
[0063] Postupci za prečišćavanje rekombinantnih virusa izvedeni su prvo duplikacijom ploča sa 96 bunarčića i selekcijom pomoću IFA bunarčića koji sadrže najpozitivnije plake prema IFA sa najmanjom količinom negativnih plaka prema IFA. Sadržaj bunarčića koji odgovaraju ovim kriterijumima je zatim sakupljen i dopunjen do 1 ml sa DMEM+2% FBS. Iz štoka od 1ml, uklonjeno je 5-20 µl (u zavisnosti od broja vidljivih plaka) pomešano sa 1x10<7>CEF u 10 ml DMEM+2% FBS i alikvoti su raspoređeni u ploču sa 96 bunarčića da bi se dobile pojedinačne plake SB-1 po bunarčiću. Ploče sa 96 bunarčića su duplikovane posle 5 dana inkubacije i bunarčići koji su sadržali plake su ispitani na prisustvo rekombinantnog SB-1 i odsustvo parentalnog virusa pomoću metoda IFA i PCR. Ponovo je sakupljen sadržaj bunarčića za koje je izgledalo da imaju više rekombinantnog virusa, poređenjem rezultata PCR traka, dopunjen do 1 ml i alikvoti su raspoređeni u novu ploču sa 96 bunarčića. Nakon tri do pet ciklusa prečišćavanja ćelija inficiranih virusom, rekombinantni SB-1 koji eksprimira NDV-F protein je izolovan i čistoća rekombinantnog virusa je ispitana pomoću IFA i PCR da bi se potvrdilo odsustvo parentalnog virusa. Selektovani rekombinantni virus je zatim prenet iz jednog bunarčića ploče sa 96 bunarčića (P0) u 2xT-25 boce za kulturu tkiva (P1), zatim 2xT-75 boce za kulturu tkiva (P2), 2xT-175 boce za kulturu tkiva (P3), i najzad u 2x850 cm2 roler-boce (pre-MSV štok ili P4). Fiole sa alikvotima od 2 ml skladištene su u tečnom azotu. Titracije su izvedene u triplikatu na CEF i dobijen je titar od 1x105 pfu/ml za SB1-004.
Analiza ekspresije
[0064] Za imunofluorescentno ispitivanje, materijal P3 je razblažen u medijumu u odnosu 1:100. Oko 50 µl razblaženog virusa je dodato u 10 ml DMEM+2% FBS sa 1x10<7>CEF i zatim raspoređeno u alikvotima u ploču sa 96 bunarčića (100 ml/bunarčiću). Ploče su inkubirane 5 dana na 37°C+5% CO2dok virusne plake nisu postale vidljive. Ploče su fiksirane sa 95% ledeno hladnog acetona tri minuta i oprane tri puta sa PBS. Dodat je pileći anti-serum protiv virusa bolesti Njukastl (lot br. C0139, Charles Rivers Laboratory) u razblaženju od 1:1000 i ploče su inkubirane na 37°C tokom 1 časa. Posle inkubacije od jednog časa, ploče su oprane tri puta sa PBS i anti-kokošiji FITC (kat br. F8888, Sigma) je dodat u razblaženju 1:500. Ploče su ponovo inkubirane na 37°C tokom jednog časa. Posle inkubacije od jednog časa, ćelije su isprane tri puta sa PBS i vizuelizovane fluorescentnim mikroskopom upotrebom fluorescein-izotiocijanatnog (FITC) filtera. Nađeno je da sve ispitivane plake vSB1-004 eksprimiraju protein NDV-F (Sl.3).
Analiza rekombinanata pomoću PCR metode
[0065] DNK je ekstrahovana iz štoka virusa ekstrakcijom sa fenolom/hloroformom, staložena etanolom i resuspendovana u 20 mM HEPES. PCR prajmeri su dizajnirani da specifično identifikuju gen NDV-F VIId, promotor, SV40 poli-A i SB-1 granične ručice (videti Sl. 4). U analizu su bili uključeni i prajmeri specifični za HVT (soj FC126), MDV serotip 3 (MB080 MB081) da bi se proverilo da je rekombinantni virus čist u smislu odsustva parentalnog virusa SB-1. PCR je izveden upotrebom 200 µg DNK šablona zajedno sa naznačenim parovima prajmera.
[0066] PCR reakcije sa svim parovima primera rezultovale su očekivanim proizvodima PCR reakcije i obrascima rasporeda traka. Rezultati PCR pokazuju da rekombinantni virus vSB 1-004 nosi planiranu ekspresionu kasetu i da u štoku virusa nema detektabilnih količina parentalnog virusa SB-1 (Sl.5).
[0067] Nukleotidna sekvenca donorskog plazmida SB-1 US10mFwt SbfI (SEQ ID NO:41) prikazana je na SL.20.
[0068] Na osnovu ispitivanja pomoću PCR i imunofluorescentne analize, vSB 1-004 je rekombinantni SB-1 koji eksprimira gen NDVF pod kontrolom mCMV promotora. Rekombinantni vektor vSB 1-004 je bez ikakvih detektabilnih količina parentalnog virusa SB-1 ili potencijalnih kontaminanata HVT.
Primer 2 Konstruisanje rekombinantnog vSB1-006 koji eksprimira NDV-F
[0069] Cilj rada je konstruisanje rekombinantnog virusa SB-1 u kome je ekspresiona kaseta koja sadrži SV40 promotor, fuzioni protein virusa Njukastl bolesti (NDV-F), i sintetski poli-A rep insertovana između mesta UL55 i LORF5 u virusu SB-1 (Tabela 2).
Tabela 2 Karakteristike vSB1-006
[0070] Fuzioni protein virusa Njukastl bolesti (NDV-F) koji odgovara konsenzusnoj sekvenci kodon-optimizovanog genotipa VIId (SEQ ID NO:2 kodiranoj sa SEQ ID NO:1) je hemijski sintetisan (GeneArt).
Konstruisanje donorskog plazmida SB-1 UL55 SV Fopt syn tail SbfI
[0071] Sintetski SB-1 UL55-LOrf5 Sbfl plazmid koji pokriva oko 1 kb sekvence sa svake strane od mesta insercije (GenScript) digestiran je sa SbfI i defosforilisan. Sintetski SV OptF syn tail pUC57 plazmid (Genscript) digestiran je sa SbfI i fragment od 2239 baznih parova je ekstrahovan na gelu i spojen sa vektorom digestiranim sa SbfI da bi se dobio novi donorski plazmid SB1 UL55 SVFopt syn tail Sbfl.
Generisanje rekombinanta, analiza ekspresije i ispitivanje PCR metodom
[0072] Standardni postupak homologe rekombinacije praćen je ko-elektroporacijom sekundarnih CEF ćelija upotrebom donorskog plazmida SB1 UL55 SV Fopt syn tail Sbfl i virusne DNK izolovane iz vakcinalnog soja SB-1 virusa. U suštini, primenjen je postupak opisan u primeru 1 za vSB 1-004 da bi se rekombinanti stvorili, prečistile plake i okarakterisali rekombinanti pomoću metoda imunofluorescencije i PCR.
[0073] Nukleotidna sekvenca donorskog plazmida SB1 UL55 SVFopt syn tail SbfI (SEQ ID NO:42) prikazana je na SL.20.
Generisanje rekombinanta i analiza ekspresije
[0074] Genomska DNK virusa SB-1 je podvrgnuta ko-elektroporaciji sa SB-1 UL55 SV Fopt syn tail Sbfl donorskim plazmidom da bi nastao rekombinantni SB-1 upotrebom tehnike homologe rekombinacije. Rekombinantni virus je razdvojen od parentalnog virusa SB-1 selekcijom imunofluorescentno pozitivnih bunarčića i PCR skriningom u višestrukim ciklusima prečišćavanja metodom plaka. Proizvodnja rekombinantnog SB-1 virusa prečišćenog metodom plaka koji eksprimira protein NDV-F, označenog kao vSB 1-006, povećana je sa boca za kulturu tkiva na 2 x 850 cm2 roler-boce. Posle oko 72 časa od infekcije u roler-bocama, inficirane ćelije CEF su sakupljene. Alikvoti koji sadrže 10% FBS i 10% DMSO su zamrznuti u tečnom azotu. Titracije su urađene u triplikatu na ćelijama CEF i dobijen je titar od 8x10<5>pfu/ml SB1-006.
[0075] Imunofluorescencija je izvedena upotrebom pilećeg anti-seruma (lot br. C0139, Charles Rivers Laboratories), a zatim anti-kokošijeg IgG obeleženog sa FITC (kat. br. 02-24-06, KPL). Nađeno je da sve ispitivane plake vSB 1-006 eksprimiraju protein NDV-F (Sl.6).
PCR analiza vSB1-006
[0076] Čistoća rekombinantnog virusa potvrđena je PCR metodom upotrebom parova prajmera koji su specifični za granične ručice SB-1, kodon-optimizovani NDV-F VIId, SV40 promotor, kao i parova prajmera specifičnih za HVT (videti Sl.7). PCR reakcije sa svim parovima prajmera rezultovale su očekivanim proizvodima PCR reakcije i obrascima rasporeda traka. Dodatno, nije bilo dokaza o prisustvu parentalnog virusa SB-1 u vSB 1-006 (Sl.8).
[0077] Na osnovu ispitivanja pomoću PCR i imunofluorescentne analize, potvrđeno je da je vSB1-006 rekombinantni SB1 koji eksprimira kodon-optimizovani gen NDV-F pod kontrolom SV40 promotora. Rekombinantni vektor vSB 1-006 je bez ikakvih detektabilnih količina parentalnog virusa SB-1 ili potencijalnih kontaminanata HVT.
Primer 3 Konstruisanje rekombinantnog vSB1-007 koji eksprimira NDV-F
[0078] Cilj rada je konstruisanje rekombinantni virusa SB-1 u kome ekspresiona kaseta sadrži SV40 promotor, gen NDV-F koji odgovara sekvenci F genotipa VIId u NDV je korišćen za zamenu kodirajuće sekvence glikoproteina C (gC ili UL44) virusa SB-1 (Tabela 3).
Tabela 3 Karakteristike vSB1-007
[0079] Fuzioni protein virusa Njukastl bolesti (NDV-F) koji odgovara kodon-optimizovanoj konsenzusnoj sekvenci genotipa VIId (SEQ ID NO:2 kodiranoj sa SEQ ID NO:1) je hemijski sintetisan (GeneArt).
Konstruisanje donorskog plazmida pSB144 cds SVOptF
[0080] Sintetski pSB144 cds plazmid koji sadrži granične ručice stvoren je genskom sintezom (GenScript). Plazmid pSB144 cds je digestiran sa SbfI, i defosforilisan. Drugi plazmid nazvan SV-OptF-syn no poli-A rep-pUC57 je digestiran sa Sbfl i 2.1 kb fragment koji sadrži SV40 promotor i gen NDV-F je ekstrahovan na gelu, ubačen u vektor digestiran sa SbfI i transformisan upotrebom kompleta Top10 Oneshot (Invitrogen). Bakterijske kolonije su rasle u medijumu LBampicillin (100 ug/ml), i plazmidi su ekstrahovani upotrebom kompleta Qiagen Mini Spin Prep, i pretraženi za insercije digestijom sa EcoRI i NcoI. Rezultujući donorski plazmid je označen kao pSB144 cds SVOptF.
[0081] Sintetski plazmid pSB144 cds (SEQ ID NO:36 na SL. 20) može takođe da se koristi kao donorski plazmid bez dalje modifikacije (bez insertovanja ekspresione kasete NDV-F) za stvaranje rekombinantnog SB-1 kome nedostaje gen glikoprotein (gC).
Generisanje rekombinanata i analiza ekspresije
[0082] Standardni postupak homologe rekombinacije praćen je ko-elektroporacijom sekundarnih ćelija CEF upotrebom donorskog plazmida pSB1 44 cds SVOptF i virusne DNK izolovane iz vakcinalnog soja virusa SB-1. U suštini, primenjen je postupak opisan u primeru 1 za vSB 1-004 za stvaranje, prečišćavanje metodom plaka i karakterisanje rekombinanata imunofluorescencijom. Proizvodnja rekombinantnog virusa SB-1 koji eksprimira protein NDV-F prečišćenog metodom plaka, označenog kao vSB 1-007, povećana je sa boca za kulturu tkiva T-25 do 10xT-150 cm<2>boca. Inficirane ćelije CEF su sakupljene i alikvoti koji sadrže 10% FBS i 10% DMSO su zamrznuti u tečnom azotu. Titracije su izvedene u triplikatu na ćelijama CEF i dobijen je titar od 7.2x104 pfu/ml SB1-007.
[0083] Imunofluorescencija je izvedena upotrebom pilećeg anti-seruma (lot br. C0139, Charles Rivers Laboratories), a zatim anti-kokošijeg IgG obeleženog sa FITC (kat. br. 02-24-06, KPL). Nađeno je da sve ispitivane plake vSB 1-007 eksprimiraju protein NDV-F (Sl.9).
PCR analiza vSB1-007
[0084] Virusna DNK je ekstrahovana iz SB1-007 iz P.1 do P.6 pomoću kompleta QIA DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). PCR prajmeri su dizajnirani da specifično identifikuju prisustvo (kodon-optimizovanog) NDV F, SV40 promotora i graničnih ručica UL44 (videti Sl. 10). PCR amplifikacije su izvedene upotrebom 200 ng DNK šablona zajedno sa naznačenim parovima prajmera.
[0085] Slično, standardnim postupkom homologe rekombinacije upotrebom sintetskog plazmida pSB1 44 cds i virusne DNK izolovane iz vakcinalnog soja virusa SB-1 će se dobiti rekombinantni SB-1 u kome je kodirajući region gena gC gen deletiran. Dva PCR prajmera (SB1 43.F i SB1 45.R, Tabela 4) će proizvesti PCR proizvod od 103 nukleotida rekombinantnog SB-1 sa deletiranim gC nasuprot 1540 nukleotida parentalnog virusa SB-1.
[0086] Čistoća rekombinantnog virusa potvrđena je metodom PCR upotrebom parova prajmera koji su specifični za granične ručice SB-1, kodon-optimizovani NDV-F VIId, SV40 promotor, kao i parova prajmera (MB080 MB081) specifičnih za HVT. PCR reakcije sa svim parovima prajmera rezultovale su očekivanim PCR proizvodima i obrascima rasporeda traka. Pored toga, nije bilo dokaza o prisustvu parentalnog virusa SB-1 u vSB 1-007 (Tabele 4-5 i Sl.11).
Tabela 4 PCR prajmeri
Tabela 5 Očekivana veličina amplikona
[0087] Na osnovu PCR ispitivanja i imunofluorescentne analize, potvrđeno je da je vSB 1-007 rekombinantni SB1 koji eksprimira kodon-optimizovani gen NDV-F pod kontrolom SV40 promotora. NDV-F ekspresiona kaseta je uspešno upotrebljena da zameni gen gC gen u SB-1, pokazujući da gC nije neophodan za in vitro propagaciju virusa SB-1. Rekombinantni vektor vSB 1-007 je bez bilo kakvih detektabilnih količina parentalnog virusa SB-1 ili HVT.
[0088] Nukleotidna sekvenca donorskog plazmida pSB1 44 cds SVOptF (SEQ ID NO:43) prikazana je na SL.20.
Primer 4 Konstruisanje rekombinantnog vSB1-008 koji eksprimira NDV-F
[0089] Cilj rada je konstruisanje rekombinantnog virusa SB-1 u kome je ekspresiona kaseta koja sadrži SV40 promotor, gen NDV-F koji odgovara F sekvenci soja CA02 NDV i sintetski poli-A rep insertovana između mesta UL55 i LORF5 u virusu SB-1 (Tabela 6).
Tabela 6 Karakteristike vSB1-008
[0090] NDV-F koji odgovara kodon-optimizovani sekvenci (SEQ ID NO:9 kodiranoj sa SEQ ID NO:8) genotipa V (soj CA02) je hemijski sintetisan (GeneArt). Mesto sečenja F proteina u ovom sintetskom genu izmenjeno je tako da odgovara lentogenoj sekvenci F mesta sečenja i rezultujuća sekvenca gena NDV-F ima 99% aminokiselinske identičnosti sekvence sa NDV-F sekvencom deponovanom u GenBank (ABS84266).
Konstruisanje donorskog plazmida SB1 UL55 SV CaFopt syn tail SbfI
[0091] Sintetski SB-1 UL55-LOrf5 SbfI plazmid (Genscript) koji sadrži približno 1 kb sekvence sa svake strane od mesta insercije digestiran je sa SbfI i defosforilisan. Sintetski SV OptF syn tail pUC57 plazmid (Genscript) digestiran je sa SbfI i fragment od 2239 baznih prova koji sadrži rep syn je ekstrahovan na gelu i spojen sa vektorom digestiranim sa SbfI da bi se dobio novi donorski plazmid SB1 UL55 SVFopt syn tail SbfI. Ovaj donorski plazmid je zatim digestiran sa NotI, podvrgnut dejstvu CIP, i fragment od 5196 baznih prova je ekstrahovan na gelu. Sintetski NDV-F CAO2 CSmut 0813005 pVR101 donorski plazmid (GeneArt) je digestiran sa NotI i fragment od 1677 baznih prova je ekstrahovan na gelu i spojen sa UL55 vektorom digestiranim sa NotI i podvrgnut dejstvu CIP što je za rezultat imalo dobijanje donorskog plazmida SB1 UL55 SV CaFopt syn tail SbfI.
Generisanje rekombinanta i analiza ekspresije
[0092] Standardni postupak homologe rekombinacije praćen je ko-elektroporacijom sekundarnih ćelija CEF upotrebom donorskog plazmida SB-1 UL55 SV CaFopt syn tail SbfI i virusne DNK izolovane iz vakcinalnog soja virusa SB-1. Suštinski, primenjen je postupak opisan u primeru 1 za stvaranje i karakterisanja rekombinanata primenom metode imunofluorescencije i PCR.
[0093] Rekombinantni virus je razdvojen od parentalnog virusa SB-1 selekcijom bunarčića sa pozitivnom imunofluorescencijom i PCR skriningom u više ciklusa prečišćavanja metodom plaka. Proizvodnja rekombinantnog virusa SB-1 prečišćenog metodom plaka koji eksprimira NDVF protein, označenog kao vSB1-008, povećana je od boce za kulturu tkiva do 2 x 850 cm<2>roler-boca. Posle oko 72 časa nakon infekcije u roler-bocama, inficirane ćelije CEF su sakupljene. Alikvoti koji sadrže 10% FBS i 10% DMSO su zamrznuti u tečnom azotu.
[0094] Imunofluorescencija je izvedena upotrebom pilećeg anti-seruma (Charles Rivers Laboratories), a zatim anti-kokošijeg IgG obeleženog sa FITC (KPL) (Sl.12).
PCR analiza vSB1-008
[0095] Čistoća rekombinantnog virusa potvrđena je metodom PCR upotrebom parova prajmera specifičnih za SB-1 granične ručice, kodon-optimizovani NDV-F VIId, SV40 promotor (videti Sl.
13), kao i parova prajmera (MB080 MB081) specifičnih za HVT, MDV serotip 3. PCR reakcije sa svim parovima prajmera rezultovale su očekivanim PCR proizvodima i obrascima rasporeda traka. Pored toga, nije bilo dokaza o prisustvu parentalnog virusa SB-1 u vSB 1-008 (Sl.14).
[0096] Nukleotidna sekvenca donorskog plazmida SB-1 UL55 CaFopt syn tail SbfI (SEQ ID NO:44) prikazana je na Sl.20.
[0097] Na osnovu PCR ispitivanja i imunofluorescentne analize, potvrđeno je da je vSB 1-008 rekombinantni SB1 koji eksprimira kodon-optimizovani gen NDV-F pod kontrolom SV40 promotora. Rekombinantni vektor vSB 1-008 je bez bilo kakvog detektabilnog parentalnog virusa SB-1 ili HVT.
Primer 5 Konstruisanje rekombinantnih vSB1-009 i vSB1-010 koji eksprimiraju NDV-F
[0098] Cilj studije je konstruisanje rekombinantnog vektora vSB 1-009 na bazi virusa SB-1 u koji je ekspresiona kaseta koja sadrži SV40 promotor i gen za fuzioni protein virusa Njukastl bolesti (NDV-F) insertovana tako da zameni kodirajuću sekvencu UL44 (gC) iz SB-1 i konstruisanje rekombinantnog vektora vSB1-010 na bazi virusa SB-1 u koji je insertovana dodatna ekspresiona kaseta koja sadrži CMV promotor zamorca i gen NDV-F je insertovan u lokus SORF-US2 u skeletu vektora SB1-009.
Primer 5.1 Konstruisanje vSB1-009
[0099] Konstruisan je donorski plazmid pSB1 44 cds SV FCAopt koji sadrži UL44 granične ručice SB-1 virusa, SV40 promotor i kodon-optimizovanu gensku sekvencu NDV F (SEQ ID NO:8, koja kodira SEQ ID NO:9) (Tabela 7).
Tabela 7 Karakteristike vSB1-009
Generisanje rekombinantnog virusa
[0100] Standardni postupak homologe rekombinacije praćen je ko-elektroporacijom sekundarnih ćelija CEF upotrebom donorskog plazmida pSB144 cds SV FCAopt i virusne DNK izolovane iz ćelija CEF inficiranih virusom SB-1. Suštinski, primenjen je postupak opisan u primeru 1 za stvaranje, prečišćavanje metodom plaka i karakterisanje rekombinanata imunofluorescencijom.
[0101] Posle dva ciklusa prečišćavanja metodom plaka, izolovan je čist rekombinantni virus (vSB1-009) i čistoća vSB 1-009 je ispitana metodama IFA i PCR da bi se potvrdila odgovarajuća insercija, kao i da nema ostataka parentalnog virusa.
PCR analiza
[0102] Virusna DNK je ekstrahovana iz štoka pred-glavnog izvora semena virusa (pre-MSV) vSB 1-009 pomoću kompleta QIA DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). PCR prajmeri su dizajnirani da identifikuju prisustvo optimizovanog NDV F, NDV F wt, SV40 promotora, mCMV promotora, graničnih ručica UL44 virusa SB-1 i virusa HVT. PCR amplifikacije su izvedene upotrebom približno 200 ng DNK šablona zajedno sa parovima prajmera.
[0103] PCR amplifikacija sa različitim prajmerima potvrdila je da vSB1-009 ima očekivane šablone amplifikacije i amplikone.
Analiza ekspresije
[0104] Indirektni imunofluorescentni esej (IFA) je izveden na štoku vSB 1-009 pre-MSV da bi se ispitala ekspresija gena NDV F i antigena virusa SB-1. Ćelije CEF koje su inokulisane sa vSB1-009 fiksirane su ledeno hladnim 95% acetonom tri minuta na sobnoj temperaturi i osušene na vazduhu 10 minuta. Ploče su oprane sa PBS, zatim su dodata dva primarna antitela, kokošiji serum protiv virusa bolesti Njukastl (Charles Rivers Laboratories kat. br. 10100641, lot br. C0117A) u razblaženju 1:500 i Y5.9 monoklonsko antitelo protiv virusa SB-1 (Merial Select, Gainesville, GA) u razblaženju 1:3000 i ploče su inkubirane 45 min na 37°C. Posle tri pranja sa PBS, dodata su dva sekundarna antitela, kozji anti-kokošiji IgG-fluorescein (KPL) u razblaženju 1:500 i magareći anti-mišji IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe) u razblaženju 1:250. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 45 minuta i nakon toga oprane tri puta sa PBS. Pomoću fluorescentnog mikroskopa pregledani su bunarčići da bi se videle plake koje su IFA pozitivne upotrebom fluorescein izotiocijanatnih (FITC) i tetrametilrodamin izotiocijanatnih (TRITC)-filtera na invertnom mikroskopu Nikon Eclipse Ti. Slično, reaktivnost vSB1-009 sa NDV F Mat ispitana je pomoću Dual IFA upotrebom anti-MDV seruma (Charles River Laboratories (razblaženje 1/300) i anti-NDV F monoklonskog antitela (razblaženje 1/300) kao primarnog antitela. Kao sekundarna antitela korišćena su antitela kozji anti-kokošiji IgG-fluorescein (KPL) (razblaženje 1:500) i majmunski anti-mišji IgG-Alexa Fluor 568 (Molecular Probe) (razblaženje 1:250). Bunarčići su posmatrani da bi se identifikovale plake koje su IFA pozitivne pomoću fluorescentnog mikroskopa upotrebom FITC- i TRITC-filtera invertnog mikroskopa Nikon Eclipse Ti.
[0105] Rezultati IFA su ukazali na to da vSB1-009 eksprimira NDV F protein u ćelijama CEF inficiranim virusom. Izbrojano je više od 500 plaka vSB1-009 koje eksprimiraju protein NDV F kao i specifične proteine virusa SB-1 pomoću metode dualne IFA. Ekspresija proteina NDV F u potpunosti se podudarala sa ekspresijom antigena virusa SB-1 u svakoj virusnoj plaki (Tabela 8).
Tabela 8 Metod Dual IFA za vSB1-009
[0106] Reaktivnost NDV F Mat je potvrđena metodom dual IFA. Više od 200 plaka vSB 1-009 je ispitano na reaktivnost NDV F Mat, kao i na reaktivnost anti-MDV seruma. Reaktivnost sa NDV F Mat u potpunosti se podudarala sa reaktivnošću anti-MDV seruma u svakoj virusnoj plaki (Tabela 9).
Tabela 9 Reaktivnost vSB1-009 sa anti-NDV F Mat
Analiza Southern Blot
[0107] Ukupna genomska DNK je ekstrahovana iz ćelija CEF inficiranih štokom vSB1-009 pre-MSV. Genomske DNK iz vSB 1-009, virusa SB-1 (negativna kontrola), donorskog plazmida pSB1 44 cds SV FCA opt su odvojeno digestirane na 37°C restrikcionim endonukleazama EcoRI, NcoI i KpnI. Restrikcioni fragmenti su razdvojeni elektroforezom na gelu od 0.8% agaroze i preneti na pozitivno naelektrisanu najlonsku membranu. Posle prebacivanja, membrana je obrađena sa 0.4 M NaOH i zatim neutralizovana puferom 2XSSC-HCl. Membrana je zatim osušena na vazduhu i umrežena pomoću UV.
[0108] Na osnovu uputstva proizvođača kompleta North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit (Thermo Scientific kat. br. 89880), membrana je pre-hibridizovana tokom 1 časa, a zatim hibridizovana sa probom tokom noći na 55°C. Za hibridizaciju su korišćene dve probe; 1) fragment SbfI iz pSB1 44 cds SV FCA opt kao proba za NDV F kasetu, 2) fragment SmaI-EcoRI iz pUC57 SB1 44 arm (GenScript) kao proba za rekombinacionu ručicu. Posle hibridizacije tokom noći, izvedena su pranja je nekoliko pranja pod uslovima različite strogosti do smeštanja membrane u pufer za blokiranje sa dodatkom streptavidin-HRP. Posle ispiranja svog nevezanog streptavidina-HRP sa membrane, dodat je rastvor supstrata luminala i peroksida. Membrana je zatim izložena filmu osetljivom na X-zrake i film je razvijen.
[0109] Rezultati dobijeni metodom Southern blot bili su kao što je i očekivano na osnovu analize Vector NTI map. Kaseta NDV F (SV40 promotor, kodon-optimizovani gen NDV-F CA02) zamenila je kodirajuće sekvence UL44 virusa SB-1.
Analiza genoma
[0110] Genomska DNK štoka vSB1-009 pre-MSV izvedena je određivanjem nukleotidne sekvence regiona rekombinacione ručice, kao i insertovane genske kasete. Prajmeri su dizajnirani i korišćeni za amplifikaciju cele genske kasete NDV-F uključujući rekombinacione ručice.
[0111] Potvrđeno je da je sekvenca vSB1-009 (donorski plazmid pSB144 cds SV FCAopt) koja sadrži rekombinacione ručice, SV40 promotor i kodon-optimizovani gen NDV F ispravno prikazana u SEQ ID NO:37 (SL.20).
Analiza Western blot
[0112] Monosloj CEF ćelija je inficiran sa vSB1-009 pre-MSV pri MOI ∼ 0.1. Nakon petodnevne inkubacije, ćelije CEF su staložene i oprane rastvorom PBS, a zatim su lizirane puferom IP za lizu/pranje Pierce Classic IP Kit (Thermo Scientific kat. br. 26146) prema protokolima proizvođača. Lizat je prečišćen i inkubiran sa 100 ul anti-NDV F monoklonskog antitela da bi se dobio imunski kompleks. Imunski kompleks je apsorbovan na agarozi Protein A/G Plus i posle uklanjanja nevezanog imunskog kompleksa pranjem, upotrebljeno je 50 ul pufera za uzorke za eluiranje pod neredukujućim uslovima. Neinficirane ćelije CEF su uključene kao kontrola. Elektroforezom je razdvojeno 20 ul eluiranih uzoraka na 10% Bis-Tris gelovima. Posle elektroforeze, proteini razdvojeni na gelu su preneti na PVDF membranu. Komplet za detekciju proteina TMB Western Blot Kit (KPL kat. br. 54-11-50) je korišćen za detekciju NDV antigena na PVDF membrani sa pilećim anti-NDV serumom (Charles River Laboratories kat. br.
10100641, lot br. C0117A), i kozjim anti-kokošijim IgG-peroksidaza konjugatom (KPL kat. br.
14-24-06) prema uputstvima proizvođača.
[0113] Ekspresija proteina NDV F vSB1-009 potvrđena je imunodetekcijom u dva koraka. Prvo su eksprimirani proteini NDV F iz lizata CEF ćelija inficiranih sa vSB1-009 apsorbovani imunoprecipitacijom upotrebom anti-NDV F monoklonskog antitela 001C3. Zatim je primenjena analiza Western blot upotrebom anti-NDV poliklonskog seruma (Charles River Laboratories kat. br. 10100641, lot br. C0117A) za detekciju NDV F proteina u apsorbovanim uzorcima (kompleks protein NDV F - monoklonsko antitelo) (Sl. 15). Protein od oko 55 kDa u lizatima vSB 1-007 pre-MSV detektovan je pomoću anti-NDV seruma koji odgovara očekivanoj veličini fuzionog proteina NDV F1 (Sl.15).
Primer 5.2 Konstruisanje vSB1-010
Konstruisanje donorskog plazmida SB1US2 gpVIIdwtsyn
[0114] Upotrebom plazmida HVT SOrf3-US2 gpVar-Ewt Syn, gpCMV, Varient E, Syn rep je uklonjen digestijom sa SbfI. Ovaj fragment je ubačen u donorski plazmid SB1 US2. Gen Varient E je isečen enzimom NotI i zamenjen sa NDV-F VIId wt. Sintetski gen NDV-F VIId wt (SEQ ID NO:3 koja kodira SEQ ID NO:2) je isečen iz plazmida pUC57 NDV-F VIId wt (sintetisan u GeneScript) upotrebom digestije enzimom NotI. Ligatirani materijal je transformisan upotrebom kompleta Top10 Oneshot (kat. br. C404002, Invitrogen). Bakterijske kolonije su gajene u bujonu LBamp, plazmid je ekstrahovan upotrebom kompleta Qiagens MiniSpin Prep, i proverena je orjentacija inserta digestijom sa NcoI+SalI. Ispravan donorski plazmid označen je kao pSB1 US2 gpVIIdwt Syn. Tabela 10.1 prikazuje karakteristike koje su jedinstvene za konstrukt oko ekspresionih kaseta, uključujući odgovarajuće sekvence. Gajene su kulture na velikoj skali i ekstrakcija plazmida je urađena upotrebom kompleta Qiagens Maxi Prep. Prolazna ekspresija plazmida izolovanih pomoću ovog kompleta potvrđena je upotrebom reagensa za transfekciju Fugene u fibroblastima pilećeg embriona (CEF) i sa pilećim poliklonskim serumom protiv NDV-F.
Generisanje rekombinanata
[0115] Standardni postupak homologe rekombinacije praćen je ko-elektroporacijom sekundarnih ćelija CEF upotrebom pSB1 US2 gpVIIdWt Syn donorskog plazmida i virusne DNK izolovane iz vSB1-009 (vSB1-009 je već rekombinantni virus koji eksprimira CA02 F gen NDV). U suštini, postupak opisanu u primeru 1 primenjen je za stvaranje, prečišćavanje metodom plaka i karakterisanje rekombinanatnom imunofluorescencijom.
[0116] Posle pet ciklusa prečišćavanja metodom plaka, izolovan je čist rekombinantni virus (vSB1-010) i čistoća vSB1-010 je ispitana pomoću IFA i PCR za potvrđivanje ispravne insercije kao i nepostojanja parentalnog virusa.
Tabela 10.1 Karakteristike vSB1-010
[0117] Sekvenciranje regiona inserta potvrdilo je da vSB1-010 sadrži ispravne sekvence promotora CMV zamorca i gen NDV-F VIId wt, kao što je pokazano u sekvenci donorskog plazmida SB1US2 gpVIIdwtsyn (SEQ ID NO:57).
Analiza rekombinanata PCR metodom
[0118] DNK je ekstrahovana iz štoka virusa fenolno/hloroformskom ekstrakcijom, staložena etanolom, i resuspendovana u 20 mM HEPES. PCR prajmeri su dizajnirani tako da specifično identifikuju gen NDV-F VIId wt, promotor, polyA, kao i čistoću rekombinantnog virusa u smislu odsustva SB1 parentalnog virusa. PCR je izveden upotrebom 200 µg DNK šablona zajedno sa navedenim parovima prajmera navedenim u tabeli 1. Uslovi u PCR ciklusima bili su kao što sledi (osim ako nije drugačije navedeno): 94°C - 2 min; 30 ciklusa na 94°C - 30 sek, 55°C - 30 sek, 68°C - 3 min; 68°C - 5 min.
[0119] Čistoća rekombinantnog virusa potvrđena je primenom PCR upotrebom parova prajmera koji su specifični za granične ručice SB1, gpCMV promotor, gen NDV-F VIId wt i rep syn. U analizu su bili uključeni i prajmeri specifični za HVT, MDV serotip 3 (MB080+MB081). Rezultati PCR pokazuju da rekombinantni virus vSB1-010 nosi predviđenu ekspresionu kasetu i da je virusni štok bez detektabilnih količina parentalnog virusa SB1-009.
Imunofluorescentno bojenje rekombinantnog virusa vSB1-010 koji eksprimira dva proteina NDV-F
[0120] Za imunofluorescentno ispitivanje, materijal P3 je razblažen u medijumu u odnosu 1:100. Približno 50 µl razblaženog virusa je dodato u 10 ml DMEM+2% FBS sa 1x10<7>CEF, a zatim razdeljeno u alikvotima u ploču sa 96 bunarčića (100 µl/bunarčiću). Ploče su inkubirane 5 dana na 37°C+5% CO2dok virusne plake nisu postale vidljive. Ploče su fiksirane sa 95% ledeno hladnog acetona tri minuta i oprane tri puta rastvorom PBS. Dodat je pileći anti-serum protiv virusa bolesti Njukastl (lot br. C0139, Charles Rivers Laboratory) u odnosu 1:1000 i ploče su inkubirane na 37°C tokom 1 časa. Posle jednog časa inkubacije, ploče su oprane tri puta rastvorom PBS i dodata su FITC anti-kokošija antitela (kat. br. F8888, Sigma) u odnosu 1:500. Ploče su ponovo inkubirane na 37°C tokom 1 časa. Posle jednog časa inkubacije, ćelije su isprane tri puta sa PBS i vizuelizovane fluorescentnim mikroskopom upotrebom fluorescein izotiocijanatnog (FITC) filtera.
[0121] Rezultati imunofluorescentnog bojenja ukazuju da je vSB1-010 ispoljio veoma snažnu ekspresiju proteina NDVF pri upotrebi poliklonskog seruma protiv proteina CA02 i VIId F NDV.
Zaključak
[0122] Na osnovu PCR ispitivanja i imunofluorescentne analize, vSB1-010 je rekombinantni SB-1 u kome je gen VIId-F gen NDV pod kontrolom promotora gpCMV uspešno insertovan u vSB 1-009, koji već eksprimira CA02-F gen NDV. posledično, vSB1-010 nosi oba VIId i CA02 F gena NDV genotipova i nema nimalo detektabilnog parentalnog vSB 1-009.
Primer 6 Konstruisanje rekombinantnog vHVT vektora koji eksprimira NDV-F Priprema donorskog plazmida pHM103+Fopt za vHVT114
[0123] Plazmid pHM103 (Merial Limited) koji sadrži ručice Intergenic I HVT FC126, SV40 promotor i SV40 poli-A digestiran je sa NotI, defosforilisan, i fragment od 5.6 kb je ekstrahovan na gelu. Fragment od 1.7 kb ograničen sa NotI kodon-optimizovanog hemijski sintetisanog gena NDV-F genotipa VIId (SEQ ID NO:1, koja kodira SEQ ID NO:2) takođe je digestiran sa NotI i fragment od 1.7 kb je ekstrahovan na gelu. Fragmenti od 5.6 i 1.7 kb su ligatirani da bi se dobio pHM103+Fopt (Tabela 10.2).
Tabela 10.2 Karakteristike vHVT114
Generisanje rekombinantnog HVT virusnog vektora
[0124] Standardni postupak homologe rekombinacije praćen je ko-elektroporacijom sekundarnih ćelija CEF upotrebom donorskog plazmida pHM103+Fopt i virusne DNK izolovane iz soja HVT FC126 (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989). Suštinski, primenjen je postupak opisan u primeru 1 za stvaranje, prečišćavanje metodom plaka i karakterisanje rekombinanata imunofluorescencijom.
[0125] Posle pet ciklusa prečišćavanja metodom plaka, izolovan je rekombinantni virus označen kao vHVT114 i njegova čistoća je ispitana metodom IFA i PCR da bi se potvrdila ekspresija NDV-F i odsustvo parentalnog virusa.
PCR analiza rekombinantnog vHVT114
[0126] DNK je ekstrahovane iz vHVT114 fenolnom/hloroformnom ekstrakcijom, staložena etanolom, i resuspendovana u 20 mM HEPES. PCR prajmeri su dizajnirani da specifično identifikuju prisustvo kodon-optimizovanog NDV-F, SV40 promotora, kao i čistoću rekombinantnog virusa u smislu odsustva FC126 CL2 parentalnog virusa.
[0127] Rezultati PCR su pokazali da veličine proizvoda PCR posle gel-elektroforeze dobro odgovaraju očekivanim veličinama i obrascima rasporeda traka.
Analiza sekvence regiona koji je insertovan u rekombinantni vHVT114
[0128] Analiza regiona genomske DNK vHVT114 sprovedena je PCR amplifikacijom. Ukupno 10 prajmera je korišćeno za amplifikovanje cele kasete, kao i graničnih ručica BamHI-I korišćenih u donorskom plazmidu. Proizvod PCR reakcije od 4.727 kb je prečišćen na gelu i ceo fragment je sekvenciran upotrebom prajmera za sekvenciranje. Rezultat sekvenciranja je potvrdio da vHVT114 sadrži ispravan SV40 promotor, kodon-optimizovani NDV-F i SV40 polyA sekvence koje tačno odgovaraju sekvenci opisanoj za donorski plazmid pHM103+Fopt u SEQ ID NO:38 (videti Sl.20).
Western blot analiza rekombinantnog vHVT114
[0129] Približno 2x10<6>pilećih fibroblasta inficirano je pri ∼0.1 MOI sa vHVT114 Pre-MSV. Posle dva dana inkubacije na 37°C, inficirane, kao i neinficirane ćelije su sakupljene upotrebom strugača za ćelije posle uklanjanja medijuma i ispirana sa PBS. Ćelije su sakupljene sa 1ml PBS i centrifugirane. Ćelijski talozi su lizirani upotrebom kompleta Pierce Classic IP (Thermo Scientific). Za obrazovanje imunskog kompleksa upotrebljeno je 100 µl anti-NDV-F monoklonskog antitela 001C3 (Merial Limited). Uzorak antitelo/lizat je dodat agarozi Protein A/G Plus za apsorbovanje imunskog kompleksa. Imunski kompleks je opran tri puta da bi se uklonio nevezani materijal i zatim eluiran u 50 ul zapremine upotrebom elucije puferom za uzorke u neredukujućim uslovima. Posle ključanja od 5 minuta, 10 µl uzoraka je naneto na 10% akrilamidnog gela (Invitrogen). PAGE gel je sproveden u puferu MOPS (Invitrogen) na 200 volti tokom 1 časa. Nakon toga, gel je prenet na PVDF membranu.
[0130] Za prenošenje na PVDF membranu korišćen je komplet Protein Detector Western Blot Kit TMB System (KPL, kat. br. 54-11-50) upotrebom reagenasa i praćenjem uputstava proizvođača. Posle prenošenja na membranu tokom 1 časa na sobnoj temperaturi, membrana je isprana tri puta u IX puferu za pranje, svaki put tokom pet minuta, a zatim uronjena u pufer za blokiranje koji sadrži razblaženje od 1:1000 pilećeg seruma protiv NDV virusa (Lot br. C0139, Charles River Laboratories). Posle tri pranja u puferu za pranje, membrana je inkubirana sa kozjim antikokošijim IgG obeleženim peroksidazom (KPL, kat. br.14-24-06) u razblaženju od 1:2000 tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Membrana je zatim isprana tri puta po pet minuta u 1X puferu za pranje. Membrani je dodato 5 ml supstrata peroksidaze TMB i pažljivo mućkano oko 1 minut. Razvijanje reakcije je zaustavljen stavljanjem membrane u vodu.
[0131] Tehnike imunoprecipitacije i Western blot detektovale su protein od oko 55 kD u uzorku vHVT114 koji odgovara očekivanoj veličini F1 komponente proteina NDV-F (Sl.16).
Generisanje i karakterizacija ostalih HVT rekombinanata
[0132] Generisanje i karakterizacija ostalih HVT rekombinanata, kao što su vHVT039, vHVT110, vHVT111, vHVT112, vHVT113 i vHVT116 je u suštini urađeno na isti način kao za vHVT114. Tabela 11 prikazuje jedinstvena svojstva svakog konstrukta oko ekspresionih kaseta, uključujući odgovarajuće sekvence.
Tabela 11 Karakteristike ekspresionih kaseta pojedinačnih HVT rekombinanata
Primer 7 Konstruisanje dvostrukih HVT vektora koji eksprimiraju NDV-F i IBDV VP2, i dvostrukih HVT vektora koji eksprimiraju varijante IBDV VP2
Priprema donorskog plazmida pHVT US2 SV- Fopt-synPA za vHVT306
[0133] Konstruisan je donorski plazmid pHVT US2 SV- Fopt-synPA koji sadrži SV40 promotor, sintetski kodon-optimizovani gen NDV F VII, sintetski poli-A rep ograničen sekvencama ručica SORF3 i US2 HVT FC126.
Generisanje rekombinantnog virusa
[0134] Standardni postupak homologe rekombinacije praćen je ko-elektroporacijom sekundarnih ćelija CEF upotrebom donorskog plazmida pHVT US2 SV-Fopt-synPA i virusne DNK izolovane iz vHVT13 (HVT vektor koji eksprimira IBDV VP2 gen, Merial Limited). Suštinski, primenjen je postupak opisan u primeru 1 za stvaranje, prečišćavanje metodom plaka i karakterisanje rekombinanata imunofluorescencijom.
[0135] Posle dva ciklusa prečišćavanja metodom plaka, izolovan je čist rekombinantni virus (vHVT306) i čistoća vHVT306 je ispitana i potvrđena primenom IFA i PCR.
PCR analiza
[0136] Virusna DNK je ekstrahovana iz štoka vHVT306 pre-master izvora semena virusa (pre-MSV) pomoću kompleta QIA DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). PCR prajmeri su dizajnirani tako da identifikuju prisustvo optimizovanog NDV F, divljeg tipa NDV F, SV40 promotora, mCMV promotora, graničnih ručica US2 HVT virusa i virusa SB-1.
[0137] PCR amplifikacija sa različitim prajmerima je potvrdila da je vHVT306 imao očekivane obrasce amplifikacije i amplikone.
Analiza genoma
[0138] Sekvencirana je genomska DNK štoka pre-MSV vHVT306 da bi se potvrdila sekvenca regiona rekombinacione ručice kao i insertovane genske kasete.
[0139] Prajmeri su bili dizajnirani da amplifikuju celu insertovanu gensku kasetu uključujući rekombinacionu ručicu korišćenu u donorskom plazmidu. Analiza genomske DNK vHVT306 sprovedena je PCR amplifikacijom i praćena određivanjem nukleotidne sekvence.
[0140] Potvrđeno je da je vHVT306 (donorski plazmid pHVT US2 SV- Fopt-synPA) koji sadrži rekombinantne ručice, SV40 promotor i kodon-optimizovani gen NDV F ispravan, kao što je prikazano u SEQ ID NO:45 (Sl.20).
Western blot analiza
[0141] Ekspresija proteina NDV F u vHVT306 potvrđena je imunodetekcijom u dva koraka. Prvo, eksprimirani NDV F proteini iz CEF ćelija inficiranih sa vHVT306 su apsorbovani imunoprecipitacijom upotrebom anti-NDV F monoklonskog antitela 001C3 (Merial Limited). Zatim je primenjena Western blot analiza upotrebom anti-NDV poliklonskog seruma (Charles River Laboratories) za detektovanje proteina NDV F u apsorbovanim uzorcima (kompleks NDV F protein-monoklonsko antitelo). U lizatima pre-MSV vHVT306, pomoću anti-NDV seruma, detektovan je protein od 55 kDa koji odgovara očekivanoj veličini fuzionog proteina NDV F1.
Generisanje i karakterizacija drugih dvostrukih HVT rekombinanata
[0142] Generisanje i karakterizacija dvostrukih HVT rekombinanata, kao što su vHVT301, vHVT302, vHVT303, vHVT304, vHVT202 i vHVT307 suštinski je urađena na isti način kao kod vHVT306, kao što je gore opisano. Tabela 12 prikazuje svojstva jedinstvena za svaki konstrukt oko ekspresionih kaseta, uključujući odgovarajuće sekvence.
Tabela 12 Karakteristike ekspresionih kaseta dvostrukih HVT rekombinanata
Primer 8 Odsustvo horizontalnog prenošenja SB-1 mutanta sa gC delecijom
[0143] Cilj ispitivanja bio je poređenje nivoa viremije i horizontalnog prenošenja indukovanog parentalnim SB-1 sa onim kod rekombinantnog virusa SB-1 u kome je gen gC gen deletiran (videti primer 3).
[0144] Nasumično su formirane dve grupe (A i B) od po trideset jednodnevnih belih pilića Leghorn bez specifičnih patogena (SPF). Dvadeset ptica iz grupe A je vakcinisano (D0) subkutanim putem (potiljak; 0.2 ml/ptici) sa 2000 PFU parentalnog SB-1 i dvadeset iz grupe B sa 2000 PFU SB-1 mutantom sa deletiranim gC. Deset ptica je ostalo nevakcinisano u istom izolatoru kao vakcinisane ptice (grupe Ac i Bc). U starosnom dobu od 2 nedelje (D14), slezina kao i 2 pera dvadeset vakcinisanih ptica iz grupa A i B je uklonjeno posle eutanazije. U starosnom dobu od 4 nedelje (D28) slezine 10 kontaktnih ptica iz grupa Ac i Bc su takođe uklonjene za izolovanje virusa. Sakupljene su bele krvne ćelije iz leukocitno-trombocitnog sloja iz mlevenih slezina i dodate u medijum za izdvajanje limfocita i centrifugirane. Za svaku pticu, 106 leukocita je dodato u sud za kulturu tkiva od 60 mm koji je sadržao konfluentni monosloj primarnih fibroblasta pilećeg embriona (CEF) pripremljenih dan ranije. Pet dana nakon infekcije, izbrojane su plake MDV u svakom sudu i izračunat je broj pozitivnih ptica i srednja vrednost broja plaka. Za uzorke folikula pera, pulpa pera je dodata u medijum SPGA i sonifikovana 10 sekundi pre stavljanja na konfluentne monoslojeve primarnih CEF ćelija iz kojih je uklonjen medijum. Suspenzija pulpe je ostavljena da se apsorbuje 45 minuta pre dodavanja svežeg medijuma sa 1% telećeg seruma.
[0145] Rezultati virusnih izolata iz slezine i iz folikula pera vakcinisanih ptica na dan D14 prikazani su u tabeli 13. Sve ptice iz obe grupe bile su pozitivne na virusne izolate iz slezine sa sličnom srednjom vrednošću broja plaka od 142.5 i 176.0 za grupe A odnosno B. Virus je mogao da bude izolovan iz folikula pera kod svih ptica u grupi A i kod 90% ptica u grupi B.
[0146] Rezultati virusnih izolata iz slezine nevakcinisanih kontaktnih ptica na dan D28 prikazani su u tabeli 14. Sedam od deset ptica iz grupe Ac bilo je pozitivno na virusni izolat iz slezine što ukazuje na to da se parentalni SB-1 raširio horizontalno na kontaktne ptice. Virus nije mogao da se izoluje iz ptica u grupi Bc sugerišući da se mutant sa delecijom gC nije raširio na kontaktne ptice.
Tabela 13 Rezultati izolacije virusa iz leukocitno-trombocitnog sloja (BC) slezine i iz folikula pera (FF) vakcinisanih ptica iz grupa A i B na dan D14
Tabela 14 Rezultati izolacije virusa iz leukocitno-trombocitnog sloja (BC) slezine nevakcinisanih kontaktnih ptica iz grupa Ac i Bc na dan D28
[0147] Ova studija ukazuje na to da je viremija SB-1 mutanta sa deletiranim gC merena na dan D14 nakon vakcinacije bila slična onoj kod parentalnog virusa SB-1 sugerišući da delecija gC nije narušila sposobnost virusa SB-1 da se replicira u vakcinisanim pticama. Nivo virusa u folikulima pera bio je malo niži kod mutanta sa delecijom gC, budući da 2/20 ptica nisu imale detektabilnu količinu virusa. Horizontalno prenošenje je moglo da se detektuje kod 7/10 ptica u kontaktu sa vakcinisanim pticama kod parentalnog SB-1. Nasuprot tome, virus nije mogao da se detektuje kod ptica u kontaktu sa pticama koje su vakcinisane mutantom sa delecijom gC ukazujući na to da delecija gC značajno narušava horizontalno prenošenje.
Primer 9 Efikasnost protiv ND indukovana rekombinantnim SB-1, primenjenim pojedinačno, ili u kombinaciji sa vakcinom na bazi vektora HVT-IBD kod jednodnevnih SPF pilića
[0148] Cilj ovog ispitivanja bio je procena efikasnosti rekombinanta vSB1-004 koji eksprimira NDV F gen protiv veštačke infekcije virusom ND sprovedene na 4 nedelje starosti kod SPF pilića vakcinisanih sa vSB1-004 pojedinačno, ili u kombinaciji sa vakcinom na bazi vektora HVT-IBD.
[0149] Nasumično su formirane tri grupe (1, 2 i 3) od po petnaest jednodnevnih belih pilića Leghorn bez specifičnih patogena (SPF). Upotrebljene su dve vektorske vakcine: vSB1-004 koja je opisana u primeru 1 i vHVT13, sa vektorom na bazi herpesvirusa ćurke (HVT) koji eksprimira gen VP2 virusa infektivne burzalne bolesti Faragher soja 52/70 (aktivni sastojak licencirane vakcine VAXXITEK® HVT+IBD proizvođača Merial, US 5,980,906 i EP 0719 864). Ptice iz grupa 1, 2 i 3 primile su samo vHVT13 (kontrolna grupa), samo vSB1-004 i mešavinu vHVT13 i vSB1-004, respektivno (videti tabelu 6). Sve ptice su vakcinisane subkutanim putem (potiljak) sa 2000 PFU vSB1-004 i/ili vHVT13 (D0). Dvadeset sedam dana posle vakcinacije (D27), ptice iz svake grupe su izložene veštačkoj infekciji velogenim sojem NDV Mexican Chimalhuacan genotipa V (Mex V). Veštačka infekcija je izvedena intramuskularnim (IM) putem upotrebom 10<5>doza koje inficiraju 50% jaja (EID50) razblaženih u 0.2 ml fiziološke sterilne vode. Kod ptica su dnevno tokom 14 dana posle veštačke infekcije praćeni klinički znaci i mortalitet. Orofaringealni brisevi su uzeti od 10 ptica po grupi 5, 7 i 9 dana posle veštačke infekcije. Opterećenje virusnom RNK je procenjeno u ovim brisevima posle ekstrakcije RNK upotrebom kvantitativne lančane reakcije polimeraze - reverzne transkriptaze u realnom vremenu (qRT-PCR) zasnovane na genu M i opisane kod Wise et al. (2004; Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of Newcastle Disease Virus RNA in Clinical Samples; J. Clin. Microbiol.42, 328-338). Nivoi izlučivanja virusa su izraženi kao log10 doze koja inficira 50% jaja (EID50) po mL. Krv je takođe uzorkovana u vreme veštačke infekcije (D27). Serumi su ispitani metodom anti-IBD ELISA (Synbiotics ELISA ProFlok PLUS IBD) da bi se procenio uticaj vSBA-004 na anti-IBDV antitela indukovana sa vHVT13.
[0150] Rezultati zaštite i serološki rezultati su rezimirani u tabeli 15. Sve kontrolne ptice su uginule u okviru 5 dana posle veštačke infekcije sa ND. Rekombinantni virus vSB 1-004 je indukovao potpunu kliničku zaštitu, bilo sam, ili u kombinaciji sa vHVT13. Broj ptice koje izlučuju detektabilnu količinu ND virusa iz veštačke infekcije bio je veoma nizak u obe vakcinisane grupe. Srednji IBD ELISA titrovi u grupama 1 i 3 bili su gotovo identični što ukazuje na odsustvo interferencije vSB 1-004 i anti-IBDV antitela indukovanih sa vHVT13.
Tabela 15 Rezultati zaštite od ND indukovane SB-1 rekombinantima koji eksprimiraju gen NDV F kod jednodnevnih SPF pilića (15/grupi) kod kojih je primenjena veštačka infekcija na dan D27
[0151] Model veštačke infekcije ND sa velogenim NDV sojem Chimalhuacan genotipa V predstavlja veoma tešku infekciju. U ovim uslovima teške veštačke infekcije, potpuna klinička zaštita i odlična zaštita indukovana sa vSB 1-004 protiv izlučivanja virusa veštačke infekcije orofaringealnim putem. Treba napomenuti da F gen insertovan u vSB 1-004 potiče od NDV soja genotipa VIId, a soj za veštačku infekciju koji je ovde korišćen ima genotip V. To pokazuje da F gen genotipa VIId insertovan u vektor SB-1 pruža unakrsnu zaštitu ptica od veštačke infekcije genotipom V. Dodavanje vHVT13 nije narušilo zaštitu od ND indukovanu sa vSB 1-004 i vSB1-004 nije interferirao sa titrovima anti-IBD antitela indukovanih sa vHVT13, što pokazuje kompatibilnost SB-1 vektora sa HVT vektorom.
Primer 10 Rana efikasnost protiv ND indukovana rekombinantom SB-1 kod jednodnevnih SPF pilića
[0152] Cilj ovog ispitivanja bio je procena efikasnosti rekombinanta vSB1-004 koji eksprimira gen NDV F protiv rane (D14) veštačke infekcije ND virusom kod SPF pilića izvedene sa dva različita NDV soja za veštačku infekciju.
[0153] Nasumično su obrazovane dve grupe (1 i 2) od po dvadeset jednodnevnih belih pilića Leghorn bez specifičnih patogena (SPF). Ptice iz grupe 2 su vakcinisane subkutanim putem (potiljak) sa 2000 PFU vSB 1-004. Pilići iz grupe 1 nisu vakcinisani i držani su kao kontrolne ptice. Sa dve nedelje starosti, polovina ptica iz svake grupe su veštački inficirane velogenim sojem NDV Mexican Chimalhuacan genotipa V (Mex V), a druga polovina velogenim sojem NDV Malaysia 04-1 genotipa VIId (Mal VIId). Veštačka infekcija je izvedena intramuskularnim (IM) putem upotrebom 105 doza koje inficiraju 50% jaja (EID50) razblaženih u 0.2 ml fiziološke sterilne vode. Kod ptica su dnevno, tokom 14 dana posle veštačke infekcije posmatrani klinički znaci i mortalitet.
[0154] Rezultati zaštite su rezimirani u tabeli 16. Sve kontrolne ptice su uginule tokom 5 dana posle veštačkih infekcija sa ND. Rekombinantni virus vSB1-004 je indukovao delimičnu zaštitu od mortaliteta (70% i 40% zaštite posle veštačke infekcije sa Mal VIId i Mex V, respektivno) i od morbiditeta (50% i 30% zaštite posle veštačke infekcije sa Mal VIId i Mex V, respektivno) u ovim uslovima teške rane veštačke infekcije.
Tabela 16 Rezultati rane zaštite od ND indukovane rekombinantom SB-1 koji eksprimira gen NDV F kod jednodnevnih SPF pilića
[0155] Model rane veštačke infekcije sa ND koji je korišćen za procenu efikasnosti rekombinanta vSB1-004 je izabran jer vektori na bazi virusa Marekove bolesti koji eksprimiraju gen NDV F uglavnom ne pružaju potpunu zaštitu u ovom modelu. Zaista, početak imuniteta kod njih je odložen u poređenju sa živim NDV vakcinama (Morgan et al. (1993) Avian Dis 37, 1032-40; Heckert et al. (1996) Avian Dis 40, 770-777). To je, prema tome, dobar model za procenu i poređenje vakcinalnih kandidata. U ovim teškim ranim veštačkim infekcijama, rekombinantni vSB1-004 indukuje delimičnu zaštitu koja je samo neznatno veća protiv veštačke infekcije sojem Malaysian genotipa VIId nego protiv veštačke infekcije sojem Mexican Chimalhuacan genotipa V, što ukazuje na široku zaštitu protiv 2 najprevalentnija genotipa koja cirkulišu u Americi odnosno Evroaziji/Africi.
Primer 11 Efikasnost protiv ND indukovana SB-1 rekombinantom, primenjenim pojedinačno, ili u kombinaciji sa HVT-IBD vektorskom vakcinom kod jednodnevnih brojlera sa majčinskim antitelima
[0156] Cilj ispitivanja je bio da se proceni efikasnost rekombinanta vSB1-004 koji eksprimira gen NDV F protiv dve veštačke infekcije sa ND sprovedene kod brojlera starih 4 nedelje vakcinisanih sa vSB 1-004 pojedinačno, ili u kombinaciji sa HVT-IBD vektorskom vakcinom.
[0157] Nasumično je formirano šest grupa (1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b) od po dvanaest jednodnevnih brojlera (linija Hubbard JA957). Upotrebljene su dve vektorske vakcine: vSB1-004 opisana u primeru 1 i vHVT13, sa vektorom na bazi herpesvirusa ćurke (HVT) koji eksprimira gen VP2 virusa infektivne burzalne bolesti Faragher soja 52/70 (aktivni sastojak licencirane vakcine VAXXITEK® HVT+IBD proizvođača Merial). Ptice iz grupe 1 (1a i 1b) su vakcinisane samo sa vHVT13 (kontrolna grupa); one iz grupe 2 samo sa vSB1-004 i one iz grupe 3 mešavinom vHVT13 i vSB 1-004 (videti tabelu 17). Sve ptice su vakcinisane subkutanim putem (potiljak) sa 2000 PFU vSB1-004 i/ili vHVT13 (D0). Dvadeset osam dana posle vakcinacije (D28), sve ptice iz svake podgrupe "a" su veštački inficirane velogenim sojem NDV genotipa VIId Malaysia 04-1 (Mal VIId) i sve ptice iz svake podgrupe "b" velogenim sojem NDV genotipa V Mexican Chimalhuacan (Mex V). Veštačka infekcija je izvedena intramuskularnim (IM) putem upotrebom 105 doza koje inficiraju 50% jaja (EID50) razblaženih u 0.2 ml fiziološke sterilne vode. Kod ptica su dnevno, tokom 14 dana posle veštačke infekcije posmatrani klinički znaci i mortalitet. Krv je takođe uzorkovana kod 5 ptica u svakoj grupi u vreme veštačke infekcije (D28). Serumi su ispitivani sa anti-IBD ELISA (Synbiotics ELISA ProFlok PLUS IBD) za procenu uticaja vSB1-004 na anti-IBDV antitela indukovana sa vHVT13 kod brojlera.
[0158] Rezultati zaštite i serološki rezultati su rezimirani u tabeli 17. Sve kontrolne ptice su uginule tokom 5 dana posle veštačkih infekcija sa ND. Rekombinantni virus vSB 1-004 je indukovao značajan nivo kliničke zahtite kada je kombinovan, ili nije, sa vHVT13. Broj ptica koje izlučuju detektabilnu količinu virusa bio je veoma nizak u obe vakcinisane grupe. Srednje vrednosti titrova IBD antitela u grupama 2 bili su još uvek visoki (3 log10) na dan D27 što ukazuje na visok nivo IBD antitela koja potiču od majke; pa ipak, vHVT13 je indukovao jasan odgovor IBD antitela na koji nije uticalo mešanje sa vSB 1-004.
Tabela 17 Rezultati zaštite od ND indukovane SB-1 rekombinantom koji eksprimira gen NDV F kod jednodnevnih brojlera (12 po grupi osim grupe 1b: 11) veštački inficiranih na dan D28
*Standardna devijacija
[0159] Rezultati ovog ispitivanja su pokazali značajne nivoe zaštite indukovane sa vSB1-004 kod brojlera sa NDV MDA. Dodavanje vHVT13 nije imalo negativan uticaj na zaštitu od ND indukovanu sa vSB1-004 što ukazuje na nedostatak interferencije sa vHVT13. Osim toga, vSB1-004 ne interferira sa anti-IBD antitelima indukovanim sa vHVT13, što kod brojlera potvrđuje kompatibilnost između ova dva vektora.
Primer 12 Odsustvo interferencije vSB1-004 sa ranom efikasnošću protiv IBD indukovanom HVT-IBD vektorskom vakcinom kod jednodnevnih SPF pilića
[0160] Cilj ispitivanja bio je procena potencijalne interferencije rekombinanta vSB1-004 sa efikasnošću protiv IBD indukovanom HVT-IBD vektorskom vakcinom (vHVT13) kod modela rane (D14) IBD veštačke infekcije kod SPF pilića.
[0161] Nasumično su obrazovane tri grupe (1 do 3) od po deset jednodnevnih belih pilića Leghorn bez specifičnih patogena (SPF). Ptice iz grupe 1 su vakcinisane subkutanim putem (potiljak) sa 2000 PFU vSB 1-004 (kontrolne grupa). Pilići iz grupe 2 su vakcinisani sa 2000 PFU vHVT13 i ptice iz grupe 3 su vakcinisane sa 2000 PFU vHVT13 i 2000 PFU vSB 1-004. Sa 2 nedelje starosti, sve ptice iz svake grupe su veštački inficirane okularnim putem sa 50 µL koji sadrže 2.5 log10 EID50 IBDV klasičnog soja Faragher 52/70. Klinički znaci i mortalitet su dnevno praćeni kod ptica tokom 10 dana posle veštačke infekcije. Sve ptice su eutanazirane 10 dana posle veštačke infekcije i zabeležene su težina tela i Fabricijusove burze u cilju procene težinskog odnosa burza/telo. Pored toga, burze su pregledane na histološke lezije tipične za IBD. Svakoj burzi dodeljena je ocena na osnovu ozbiljnosti oštećenja kao što je prikazano u tabeli 18. Izračunat je boj pogođenih ptica (nezaštićenih) u svakoj grupi. Ptica je smatrana pogođenom ako je uginula i/ili pokazala primetne znake bolesti i/ili srednja ili ozbiljna oštećenja Fabricijusove burze (tj., histološku ocenu ≥3).
Tabela 18 Skala za ocenjivanje histoloških oštećenja Fabricijusove burze Ocena Histološko posmatranje/oštećenja
0Nema oštećenja, normalna burza
1% do 25% folikula pokazuje limfoidnu depleciju (tj., manje od 50% 1 deplecije u 1 pogođenom folikulu), priliv heterofila u oštećenjima
26% do 50% folikula pokazuje gotovo potpunu limfoidnu depleciju (tj., sa
2 više od 75% deplecije u 1 pogođenom folikulu), pogođeni folikuli pokazuju nekrotična oštećenja i ozbiljan priliv heterofila može da se detektuje 51% do 75% folikula pokazuje limfoidnu depleciju; pogođeni folikuli 3 pokazuju nekrotična oštećenja i ozbiljan priliv heterofila može da se
detektuje
76% do 100% folikula pokazuje gotovo potpunu limfoidnu depleciju;
4 hiperplazija i strukture ciste se detektuju; pogođeni folikuli pokazuju nekrotična oštećenja i ozbiljan priliv heterofila se detektuje
100% folikula pokazuje gotovo potpunu limfoidnu depleciju; potpuni 5 gubitak folikularne strukture; zadebljali i izuvijani epitel; fibroza burzalnog tkiva
[0162] Rezultati zaštite su rezimirani u tabeli 19. Sve kontrolne ptice su obolele i jedna je uginula posle veštačke infekcije, dok su sve vakcinisane ptice ostale zdrave. Težinski odnosi burza/telo grupa 2 i 3 su bili slični i značajno viši nego kod grupe 1. Svih 8 ptica koje su preživele veštačku infekciju iz grupe 1 imale su ocene oštećenja burze 4 ili 5.
Tabela 19 Rezultati rane (D14) zaštite od IBD indukovane sa vHVT13, primenjenim pojedinačno, ili u kombinaciji sa vSB 1-004 rekombinantom koji eksprimira gen NDV F kod jednodnevnih SPF pilića.
[0163] Model rane IBD veštačke infekcije koji je upotrebljen za ocenu odsustva interferencije vSB 1-004 rekombinanta sa zaštitom od IBD indukovanom sa vHVT 13 izabran je jer je veoma osetljiv u detekciji interferencije sa vHVT13 zaštitom. Rezultati dobijeni sa vSB1-004+vHVT13 ukazuju na izvrstan nivo zaštite od IBD (89%) što ukazuje na kompatibilnost između vSB 1-004 i vHVT13 čak i kada se meri u ranoj veštačkoj infekciji sa IBD.
Primer 13 Efikasnost vHVT114, vHVT116, vSB1-007, vSB1-008 (samog ili sa vHVT13) i vHVT 304 protiv veštačkih infekcija sa NDV ZJ1 (genotip VIId) i California/02 (genotip V) kod SPF pilića starosti 21 dan
[0164] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti 2 pojedinačna rekombinantna konstrukta HVT (vHVT1 14 i vHVT1 16), 2 rekombinantna konstrukta SB1 (vSB1-007 i vSB1-008) koji eksprimiraju gen NDV F i dvostrukog rekombinanta HVT (vHVT304) protiv veštačkog inficiranja izazivačem Njukastl bolesti, NDV ZJ1 (genotip VIId) i California/02 (genotip V) sprovedenog kod SPF pilića starosti 21 dan.
[0165] Karakteristike ovih 5 vakcinalnih kandidata opisane su u tabeli 20 ispod.
Tabela 20 Karakteristike vektora upotrebljenih u ispitivanju veštačke infekcije
[0166] Na D0, 158 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 6 grupa od po 24 ptice (vakcinisane) i 1 grupu od 12 ptica (nevakcinisane kontrole). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 sa 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 1000 pfu kao što je opisano u tabeli 21 ispod. Ptice su zatim razdvojene u dve podgrupe, pri čemu je svaka podgrupa veštački inficirana intramuskularnim putem na dan D21 sa 5 log10 EID50 velogenog soja NDV ZJ1 (genotip VIId) ili California/02 (genotip V).
Tabela 21 Rezultati efikasnosti
[0167] Svaka grupa je praćena pre i posle veštačke infekcije. Tehnički problemi zapaženi kod izolatora smanjili su broj ptica u grupi 2 (vHVT114: sa 24 na 14) i u grupi 3 (vHVT116: sa 24 na 20). Klinički znaci NDV su zabeleženi posle veštačke infekcije. Serum je sakupljen iz uzoraka krvi uzetih od ptica iz grupa 2 i 7 pre veštačke infekcije (D21) za serologiju NDV pomoću HI testa upotrebom svakog soja za veštačku infekciju kao antigena.
[0168] Procenti zaštite od mortalitet i morbiditet prikazani su u tabeli gore. Uočena je potpuna osetljivost kod nevakcinisane veštački inficirane kontrolne grupe G1 čime je potvrđeno da su obe veštačke infekcije veoma teške. Sve vakcine su indukovale visoke nivoe (≥75%) zaštite od obe veštačke infekcije. Potpuna klinička zaštita od obe veštačke infekcije bila je indukovanom sa vHVT114 i vSB 1-008.
[0169] Izlučivanje je procenjivano posle veštačke infekcije metodom RT-PCR u realnom vremenu u oralnim i brisevima kloake uzetim 2 i 4 dana posle veštačke infekcije. Procenti pozitivnih (Ct<40) ptica prikazani su za obe veštačke infekcije na sl.17A i 17B. Treba zapaziti da su svih 6 ptica uginule 4 dana posle veštačke infekcije u kontrolnoj grupi veštački inficiranoj izolatom CA/02 i samo jedna ptica (od 6) bila je još uvek živa 4 dana posle veštačke infekcije u kontrolnoj grupi veštački inficiranoj sa ZJ1. Izlučivanje je detektovano kod svih kontrolnih ptica. Smanjenje procenta ptica koje su pozitivne na izlučivanje zapaženo je kod svih vakcinisanih grupa.
[0170] U zaključku, rezultati ovog ispitivanja pokazali su veoma dobru zaštitu od ND u starosti od 3 nedelje indukovanu ispitivanim vektorskim vakcinama protiv Marekove bolesti.
Primer 14 Efikasnost vHVT114, vSB1-007, vSB1-009, vHVT306 i vHVT307 vakcina protiv veštačkih infekcija sojem NDV Texas GB kod SPF pilića starosti 28 dana
[0171] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti kombinacija različitih vektorskih vakcina protiv Marekove bolesti koje eksprimiraju gen NDV F i/ili IBDV VP2 gen protiv veštačke infekcije izazivačem Njukastl bolesti (soj Texas GB, genotip II) sprovedene kod SPF pilića starosti 28 dana.
[0172] Karakteristike 5 rekombinantnih vakcinalnih kandidata ispitivanih u ovoj studiji opisane su u tabeli 22 ispod.
Tabela 22 Karakteristike vektora upotrebljenih u studiji veštačke infekcije
[0173] Vakcine na bazi virusa Marekove bolesti serotip 1 (soj CVI988 (ili Rispens); Gallid herpesvirus 2) i serotip 2 (soj SB1; Gallid herpesvirus 3) korišćene su takođe u kombinaciji sa rekombinantnim virusima u nekim od grupa.
[0174] Na dan D0, 135 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 9 grupa od po 15 ptica. Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL koja sadrži ciljnu dozu od 2000 pfu za rekombinantne vakcine (vSB1-007, vSB 1-009, vHVT13, vHVT306, vHVT307, vHVT114), i 1000 pfu za parentalne sojeve vakcine protiv Marekove bolesti (SB-1 i CVI988). Plan studije prikazan je u tabeli 23 ispod. Ptice su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D28 sa 4.0 log10 EID50 velogenog soja ND Texas GB (genotip II).
Tabela 23 Rezultati efikasnosti
[0175] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Zabeleženi su klinički znaci NDV posle veštačke infekcije.
[0176] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta prikazani su u tabeli 23 gore. Uočena je potpuna osetljivost kod nevakcinisane veštački inficirane kontrolne grupe G1 čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Odličan nivo zaštite zapažen je u svim vakcinisanim grupama. Ptice iz G3, G6, G7 i G9 su bile potpuno zaštićene. Ova studija pokazuje da vSB1-ND kandidati mogu da se primenjuju zajedno sa vHVT13 i CVI988 i da i dalje pružaju veoma dobru zaštitu od ND. Slično, dvostruke vakcine HVT-IBD+ND su kompatibilne sa SB-1 i vHVT-ND (vHVT1 14) je kompatibilan sa vHVT13 i SB-1.
[0177] U zaključku, rezultati ove studije pokazali su odsustvo interferencije pri zaštiti od ND indukovanoj ispitivanim parentalnim i vektorskim vakcinama protiv Marekove bolesti.
Primer 15 Efikasnost vHVT114, vHVT307, vSB1-007 i vSB1-009 u kombinaciji sa vHVT13 protiv veštačkih infekcija sojem NDV Chimalhuacan (genotip V) kod SPF pilića na dan D28
[0178] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti jednog rekombinantnog konstrukta HVT (vHVT114) i dva rekombinantna konstrukta SB1(vSB1-007 i vSB 1-009) koji eksprimiraju gen NDV F u kombinaciji sa vHVT-IBD (vHVT13), kao i dvostrukog konstrukta HVT vHVT307 koji eksprimira i NDV F i IBDV VP2 protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti (Chimalhuacan, genotip V) sprovedene kod SPF pilića starosti 28 dana.
[0179] Karakteristike ova 4 vakcinalna kandidata opisane su u tabeli 24 ispod.
Tabela 24 Karakteristike vektora upotrebljenih u studiji veštačke infekcije
[0180] Na dan D0, 45 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 4 grupe od po 10 ptica i 1 grupu od 5 ptica (nevakcinisana kontrolna grupa). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 2000 pfu kao što je opisano u tabeli 25 ispod. Ptice su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D28 sa 5.0 log10 EID50 velogenog soja Chimalhuacan (genotip V).
Tabela 25 Plan studije i rezultati efikasnosti protiv ND
[0181] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV su zabeleženi posle veštačke infekcije. Orofaringealni brisevi su uzeti u vakcinisanim grupama 5 i 7 dana posle veštačke infekcije za procenu virusnog opterećenja metodom RT-PCR u realnom vremenu.
[0182] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta prikazani su u tabeli iznad. Uočena je potpuna osetljivost kod nevakcinisane veštački inficirane kontrolne grupe G1 čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Veoma dobra zaštita je zapažena u sve 4 vakcinisane grupe, pri čemu je potpuna klinička zaštita indukovanom sa vHVT114+vHVT13. Procenat pozitivnih ptica i srednja vrednost titra izlučenog virusa (izražena kao log 10 EID50 ekvivalenta po mL) prikazani su na sl. 18A i 18B. Iznenađujuće, nije detektovano izlučivanje virusa kod G2 što ukazuje na potpunu (protiv kliničkih znakova i izlučivanja virusa) zaštitu od ND indukovanu sa vHVT114 čak i kada se primenjuje zajedno sa vHVT13, pod ispitivanim uslovima. Nivoi izlučivanja virusa koji su detektovani u drugim vakcinisanim grupama bili su niski sa neznatno višim nivoom koji je detektovan samo kod G3 (vHVT307) 5 dana posle infekcije (pi).
[0183] U zaključku, ovaj primer dodatno ilustruje odličnu zaštitu od ND indukovanu dvostrukim rekombinantom HVT-IBD+ND ili kombinacijom SB1-ND ili HVT-ND i HVT-IBD (vHVT13) rekombinantnih virusa. Nasuprot opštem uverenju u ovoj oblasti da druga HVT vakcina (regularne HVT vakcine ili rekombinantne HVT vakcine) interferiraju sa imunitetom prema stranim genima insertovanim u prvu rekombinantnu HVT vakcinu, predmetni pronalazak je pokazao iznenađujući rezultat da vHVT114 u kombinaciji sa vHVT13 nudi odličnu zaštitu protiv NDV, a efekat interferencije nije zapažen.
Primer 16 Efikasnost vHVT306, vSB1-008 u kombinaciji sa vHVT13 primenjenih SC ili in ovo putem protiv veštačke infekcije sojem NDV Chimalhuacan (genotip V) kod SPF pilića na dan D28
[0184] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti dvostrukog konstrukta HVT vHVT306 koji eksprimira gene NDV F i IBDV VP2, i rekombinanta vSB1-008 SB1 koji eksprimira gen NDV F u kombinaciji sa vHVT-IBD (vHVT13), primenjenih in ovo ili subkutanim putem protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti (Chimalhuacan, genotip V) sprovedene u uzrastu od 28 dana kod SPF pilića.
[0185] Plan grupa prikazan je u tabeli 26. Šezdeset SPF embrionisanih jaja (posle približno 18 dana i 18 časova inkubacije; D-3) korišćeno je za primenu in ovo (20 po grupi za G1, G2 i G3). Pedeset mikrolitara vakcine koja sadrži 2000 PFU primenjeno je in ovo upotrebom uređaja IntelliLab System proizvođača AviTech LLC (Salisbury, MD, USA). Izleganje i preživljavanje posle primene in ovo je zabeleženo. Na dan D0, 20 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 2 grupe od po 10 ptica (G4 i G5). Ptice su primile subkutanu (SC) injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 2000 pfu kao što je opisano u tabeli 26 ispod. Deset ptica po grupi su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D28 sa 5.0 log10 EID50 velogenog soja Chimalhuacan (genotip V).
Tabela 26 Plan studije i rezultati efikasnosti protiv ND
[0186] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV su zabeleženi posle veštačke infekcije. Orofaringealni brisevi su uzeti u vakcinisanim grupama 5 i 7 dana posle veštačke infekcije za procenu virusnog opterećenja metodom RT-PCR u realnom vremenu.
[0187] Procenat izleganja i vijabilnost su beleženi do dana D28 (dan veštačke infekcije) za ptice iz grupa G1 i G2. Procenat izleganja u G3 bio je 85% i u ovoj grupi jedna dodatna ptica je uginula nakon izleganja. Niži procenat izleganja u toj grupi može biti posledica problema sa inkubatorom za jaja. Telesne težine mužjaka i ženki u G1, G2 i G3 bile su slične na dan D1 i D28.
[0188] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta zabeleženi su u tabeli 26. Potpuna osetljivost je zapažena u nevakcinisanoj veštački inficiranoj kontrolnoj grupi G1 čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Veoma dobra zaštita je zapažena u sve 4 vakcinisane grupe, pri čemu je potpuna klinička zaštita indukovana sa vHVT306 primenjenim na oba načina.
[0189] Procenat pozitivnih ptica i srednja vrednost titra izlučenog virusa (izražena kao log 10 EID50 ekvivalenta po mL) prikazani su u tabeli 27. Odsustvo detektabilnog izlučivanja ili veoma malo izlučivanje zapaženo je u grupama G2 i G4 vakcinisanim sa vHVT306. Nivoi izlučivanja virusa detektovani u grupama vakcinisanim sa vSB1-008+vHVT13 bili su viši, posebno posle 5 dana nakon infekcije (pi).
Tabela 27 Rezultati zaštite od izlučivanja virusa (procenat ptica sa detektabilnim izlučivanjem i srednje opterećenje virusom u log10) procenjeno na dan D5 i D7 posle veštačke infekcije sa NDV
[0190] U zaključku, ovaj primer pokazuje odličnu zaštitu od ND indukovanu sa dvostrukim HVT rekombinantom vHVT306 primenjenim in ovo ili SC putem. Učinak vSB1-008+vHVT13 je bio neznatno slabiji posebno posle primene in ovo, ali to može da bude najmanje delimično zbog problema sa inkubatorom za jaja. Zaista, in ovo ispitivanje bezbednosti drugog SB1-ND rekombinanta (vSB1-009) pri 1000 ili 4000 PFU udruženog sa 6000 PFU vHVT13 nije pokazalo nikakvu razliku u procentu izleganja i ranom preživljavanju u odnosu na grupu koja je primila samo 6000 PFU vHVT13.
Primer 17 Efikasnost vHVT304, vHVT306, vSB1-007 i vSB1-008 u kombinaciji sa vHVT13 protiv veštačke infekcije sojem NDV Chimalhuacan (genotip V) na dan D42 kod komercijalnih brojlera
[0191] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti dva dvostruka rekombinanta HVT (vHVT304 i vHVT306) koji eksprimiraju gene NDV F i IBDV VP2, i dva rekombinanata SB1(vSB1-007 i vSB 1-008) koji eksprimiraju gen NDV F u kombinaciji sa vHVT-IBD (vHVT13) protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti (Chimalhuacan, genotip V) sprovedene kod komercijalnih brojlera starih 42 dana.
[0192] Plan grupa je prikazan u tabeli 28. Na dan D0, 55 jednodnevnih komercijalnih brojlera je nasumično raspoređeno u 5 grupa od po 11 ptica. Ptice su primile subkutanu (SC) injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 2000 pfu, kao što je opisano u tabeli 28 ispod. Deset ptica po grupi su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D42 sa 5.0 log10 EID50 velogenog soja Chimalhuacan (genotip V).
Tabela 28 Plan studije i rezultati efikasnosti protiv ND
[0193] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. klinički znaci NDV su beleženi tokom 14 dana posle veštačke infekcije. Orofaringealni brisevi su uzeti u vakcinisanim grupama 5 i 7 dana posle veštačke infekcije za procenu virusnog opterećenja metodom RT-PCR u realnom vremenu.
[0194] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta prikazani su u tabeli 28. Potpuna osetljivost zapažena je u nevakcinisanim veštački inficiranim kontrolnim grupama G1 čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Veoma dobra zaštita je zapažena kod sve 4 vakcinisane grupe, pri čemu je potpuna klinička zaštita indukovanom sa vHVT306 i sa vSB1-007+vHVT13.
[0195] Procenat pozitivnih ptica i srednja vrednost titra izlučenog virusa (izražena kao log10 EID50 ekvivalenta po mL) su prikazani u tabeli 29. Najveće smanjenje izlučivanje indukovano je sa vHVT306 i vSB1-007+vHVT13, koji su takođe bili najbolji kandidati za kliničku zaštitu.
Tabela 29 Rezultati zaštite od izlučivanja (procenat ptica sa detektabilnim izlučivanjem i srednje virusno opterećenje u log10) procenjeno na dan D5 i D7 posle veštačke infekcije (pi) sa NDV
[0196] Učinak vSB1-007+vHVT13 je bio bolji nego kod vSB1-008+vHVT13. Genomska struktura vSB1-007 se razlikuje od one kod vSB1-008 u različitim aspektima: lokusu insercije, promotoru, poli-adenilacionom signalu i oridžinu F gena. Kombinacija ovih stranih sekvenci i lokusa insercije u vSB 1-007 verovatno je odgovorna za njegov bolji učinak u zaštiti od ND.
[0197] Ukratko, ovaj primer ilustruje značaj lokusa insercije i drugih regulatornih sekvenci ekspresione kasete NDV u zaštiti od ND indukovanoj vektorima HVT i MDV serotip 2.
Primer 18 Efikasnost dvostrukog HVT-ND+IBD (vHVT304 i vHVT306) ili SB1-ND (vSB1-008) u kombinaciji sa vHVT13 rekombinantnim vakcinama, protiv veštačke infekcije klasičnim izolatom IBDV na dan D14 kod SPF pilića
[0198] Cilj ispitivanja bio je procena rane efikasnosti protiv IBD dvostrukog HVT rekombinanata vHVT304 i vHVT306, kao i efikasnosti vHVT13 primenjenog zajedno sa rekombinantnim konstruktima SB1-ND (vSB1-008) protiv veštačke infekcije virusom infektivne virusne burzalne bolesti (vIBDV) (soj Faragher 52/70) sprovedene kod SPF pilića starosti 14 dana.
[0199] Na dan D0, 95 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 9 grupa od po 10 ptica i 1 grupu od 5 ptica (nevakcinisana kontrolne grupa koja nije veštački inficirana). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 300 ili 1000 pfu kao što je opisano u tabeli 30 ispod. Na dan D14, sakupljeni su uzorci krvi od 5 ptica po grupi za serološko ispitivanje pomoću kompleta Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). Ptice (10 ptica po grupi osim kod grupe 7 u kojoj je 1 ptica uginula pre veštačke infekcije) su veštački inficirane kapima za oči (0.05 mL po ptici) as 2.5 log10 EID50.
Tabela 30 Plan studije i rezultati efikasnosti protiv IBD
Grupa Vakcinacija IBD+ Broj % Srednji jednodnevnih ELISA uginulih/bolesnih2 zaštite<3>težinski pilića (doza u titar na odnos PFU) D141 burza/telo4 G1 vSB1-008 (1000) 0.2 7/10 0% 0.0013 G2 vHVT13 (300) 2.7 0/0 100% 0.0051 G3 vHVT13 (1000) 2.7 0/0 90% 0.0049 G4 vHVT13+vSB1-008 (300) 1.9 1/1 60% 0.0041 G5 vHVT13+vSB1-008 (1000) 2.4<0/0>70% 0.0041<G6>vHVT304 (300) 2.9<0/0>60% 0.0037<G7>vHVT304 (1000) 2.20/067% 0.0047G8 vHVT306 (300) 2.4 0/0 80% 0.0033 G9 vHVT306 (1000) 2.7 0/0 40% 0.0026 1 Srednji IBD+ ELISA titrovi izraženi u log10 u serumu 5 ptica po grupi uzorkovani na dan D14 pre veštačke infekcije;
2 Ptice koje su bolesne više od 2 dana ili još uvek bolesne na dan D25 smatrane su bolesnim. 3 Zaštita od kliničkih znakova i ozbiljnog oštećenja burze (ocena burze <3)
4 Težinski odnos burza/telo u nevakcinisanoj/ grupi koja nije veštački inficirana bio je 0.0047.
[0200] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci IBDV su beleženi tokom 11 dana posle veštačke infekcije (od D15 do D25). Na kraju perioda posmatranja posle veštačke infekcije (D25), sve preživele ptice su eutanazirane i urađena je nekropsija. Težine tela i burze su zabeležene. Svaka Fabricijusova burza (BF) je izmerena, a zatim pojedinačno skladištena u 4% formaldehidu za histologiju. Histološka oštećenja burze su ocenjivana prema skali predstavljenoj u tabeli 31.
Tabela 31 Skala za ocenjivanje histoloških oštećenja Fabricijusove burze* Ocena Histološko posmatranje/oštećenja
0Nema oštećenja, normalna burza
1% do 25% folikula pokazuje limfoidnu depleciju (tj., manje od 50%
1 deplecije u 1 pogođenom folikulu), priliv heterofila u oštećenjima
26% do 50% folikula pokazuje gotovo potpunu limfoidnu depleciju (tj., sa 2 više od 75% deplecije u 1 pogođenom folikulu), pogođeni folikuli pokazuju nekrotična oštećenja i ozbiljan priliv heterofila može da se detektuje
51% do 75% folikula pokazuje limfoidnu depleciju; pogođeni folikuli
3 pokazuju nekrotična oštećenja i ozbiljan priliv heterofila može da se detektuje
76% do 100% folikula pokazuje gotovo potpunu limfoidnu depleciju;
4 hiperplazija i strukture ciste se detektuju; pogođeni folikuli pokazuju nekrotična oštećenja i ozbiljan priliv heterofila se detektuje
100% folikula pokazuje gotovo potpunu limfoidnu depleciju; potpuni
5 gubitak folikularne strukture; zadebljali i izuvijani epitel; fibroza burzalnog tkiva
* iz monografije br.01/2008:0587 EU farmakopeje "Avian Infectious Bursal Disease vaccine (live) "
[0201] Ptica je smatrana pogođenom ako je uginula i/ili je pokazala očigledan znak bolesti i/ili ozbiljna oštećenja Fabricijusove burze (tj., histološku ocenu ≥3).
[0202] Srednji ELISA IBD+ titar antitela izražen u log10 pre veštačke infekcije prikazan je u tabeli 30. U svim vakcinisanim grupama detektovani su značajni titrovi koji su bili značajno viši od onih u kontrolnoj grupi G1. Serološki titar nije bio dozno-zavisan.
[0203] Ozbiljni klinički znaci su zapaženi posle veštačke infekcije kod svih ptica kontrolne grupe G1. Sedam od 10 ptica iz te grupe uginulo je tokom perioda posmatranja od 11 dana, što ukazuje na veliku ozbiljnost veštačke infekcije. Nijedna od vakcinisanih ptica nije pokazala ozbiljne kliničke znake posle veštačke infekcije osim 1 ptice iz G4 koja je uginula. Procenat zaštite od ozbiljnih oštećenja burze prikazan je u tabeli 30 iznad. Značajna zaštita od IBD zapažena je kod svih grupa, pri čemu je najbolja zaštita zapažena u grupama G2 i G3 (samo vHVT13). Zajednička primena vSB1-008+vHVT13 i dvostrukih konstrukata vHVT304 i vHVT306 indukovala je slične nivoe zaštite od IBD. Zaštita nije bila dozno-zavisna pri ispitivanim dozama. Srednji težinski odnosi burza/telo prikazani su u tabeli 30. Odnosi u svim vakcinisanim grupama bili su viši od onih u veštački inficiranoj kontrolnoj grupi.
[0204] U zaključku, ovi podaci ukazuju na to da obe kombinacije SB1-ND vektora sa pojedinačnim HVT-IBD ili dvostrukim HVT koji eksprimira i NDV-F i IBDV-VP2 indukuju IBD antitela i ranu zaštitu od IBD u modelu ozbiljne veštačke infekcije IBDV.
Primer 19 Efikasnost pojedinačnog HVT-ND (vHVT114) ili SB1-ND (vSB1-007 i vSB1-009) u kombinaciji sa rekombinantnim vakcinama vHVT13, protiv veštačke infekcije sa veoma virulentnim izolatom IBDV na dan D23 kod komercijalnih brojlera
[0205] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti protiv IBD vHVT13 primenjenog zajedno sa HVT-ND (vHVT1 14) ili SB1-ND (vSB1-007 i vSB 1-009) rekombinantnim konstruktima pri veštačkoj infekciji veoma virulentnim virusom infektivne burzalne bolesti (wIBDV) (izolat 91-168/980702) sprovedene kod komercijalnih brojlera starosti 23 dana.
[0206] Na dan D0, 90 jednodnevnih brojlera je nasumično raspoređeno u 7 grupa od po 12 ptica i 1 grupu od 6 ptica (nevakcinisana kontrolne grupa koja nije veštački inficirana). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 3000 pfu kao što je opisano u tabeli 32. Na dan D14, sakupljeni su uzorci krvi od 5 ptica po grupi za serološko ispitivanje pomoću kompleta Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). Serum dodatnih 10 jednodnevnih brojlera ispitan je na dan D0 pomoću istog kompleta za procenu nivoa majčinih IBDV antitela. Ptice (10 ptica po grupi) su veštački inficirane kapima za oči (0.05 mL po ptici) na dan D23 sa 4.3 log10 EID50 vvIBDV izolata 91-168.
[0207] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci IBDV su beleženi tokom 11 dana posle veštačke infekcije (od D23 do D33). Na kraju perioda posmatranja posle veštačke infekcije (D33), sve preživele ptice su eutanizirane i urađena je nekropsija. Težine tela i burze su zabeležene. Svaka Fabricijusova burza (BF) je izmerena, a zatim pojedinačno skladištena u 4% formaldehidu za histologiju. Histološka oštećenja burze su ocenjivana prema skali predstavljenoj u tabeli 31.
[0208] Ptica je smatrana pogođenom ako je uginula i/ili je pokazala očigledan znak bolesti i/ili ozbiljna oštećenja Fabricijusove burze (tj., histološku ocenu ≥3).
Tabela 32 Plan studije i serološki rezultati
[0209] Srednji ELISA IBD+ serološki titar na dan D0 bio je 4.36±0.01 log10 što ukazuje na veoma visok nivo majčinskog IBD antitela pri izleganju. Na dan D23, srednji ELISA IBD+ titar bio je još uvek visok (3.9) u kontroli G1. Srednji titrovi prema ELISA testu u vakcinisanim grupama nisu bili značajno različiti od onih u kontrolnoj grupi.
[0210] Ni morbiditet ni mortalitet nije zapažen u bilo kojoj grupi posle veštačke infekcije. Procenat zaštite od ozbiljnih burzalnih oštećenja prikazani su u tabeli 32 gore. Rezultat je pokazao da zajednička primena vHVT114, vSB 1-007 ili vSB1-009 ne interferira sa zaštitom od IBD indukovanom sa vHVT13 što ukazuje na odsustvo interferencije. Slično, srednji težinski odnosi burza/telo vakcinisanih grupa bili su slični i očigledno viši od onih kod kontrolne grupe, što ukazuje na zaštitu od IBD i odsustvo razlike između režima vakcinacije.
[0211] U zaključku, podaci ukazuju na kompatibilnost između vHVT114, vSB1-007 ili vSB 1-009 i vHVT13 u zaštiti od IBD.
Primer 20 Efikasnost dvostrukog HVT-ND+IBD (vHVT304 i vHVT306) udruženog, ili ne, sa SB-1 i SB1ND (vSB1-007 i vSB1-008) u kombinaciji sa vHVT13 rekombinantnim vakcinama, protiv veštačke infekcije varijantom E izolata IBDV na dan D28 kod SPF pilića
[0212] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti dva dvostruka HVT (HVT-ND+IBD: vHVT304 i vHVT306) ili dva vSB-1-NDV, u kombinaciji sa vHVT13 (vSB1-007+vHVT13, vSB1008+vHVT13) vektorskim vakcinama, primenjenih subkutano (SC) kod jednodnevnih SPF pilića i veštački inficiranih sa IBDV-Varijanta (VAR-E) 28 dana posle vakcinacije.
[0213] Na dan D0, 105 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 7 grupa od po 15 ptice uključujući grupu veštački inficiranih kontrola (G6) i kontrola koje nisu veštački inficirane (G7). Ptice iz grupa G1 do G5 su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih i/ili SB-1 vakcina od kojih svaka sadrži ciljnu dozu od 2000 pfu. Plan studije prikazan je u tabeli 33 ispod. Na dan D28, sve ptice iz grupa G1 do G6 su veštački inficirane kapanjem u oko (0.03 mL koja sadrže 3 log10 EID50 po ptici) izolata IBDV varijanta E sa primile su subkutanu injekciju u vrat na dan (SAD). Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Jedanaest dana posle veštačke infekcije, ptice su izmerene i urađena je nekropsija. Burza je sakupljena i izmerena. Izračunat je težinski odnos burza/telo (odnos težina burze/težina tela X 100).
Tabela 33 Plan studije i rezultati efikasnosti protiv IBD
[0214] Srednji težinski odnosi burza/telo prikazani su u tabeli 33. Veštački inficirane kontrolne ptice imale su tešku burzalnu atrofiju u poređenju sa onima koje nisu veštački inficirane. Vakcine vSB1-007 i vSB 1-008 nisu interferirale pri zaštiti indukovanoj sa vHVT13 (G4 i G5). Težinski odnosi burza/telo ptica vakcinisanih dvostrukim HVT (HVT-ND+IBD) bili su neznatno niži od onih kod kontrolne grupe koja nije veštački inficirana, ali su bili očigledno viši od onih kod veštački inficiranih kontrolnih grupa. Osim toga, SB-1 vakcina protiv Marekove bolesti serotip 2 nije interferirala sa zaštitom od IBD indukovanom sa vHVT304.
[0215] U zaključku, ovi podaci pokazuju da obe kombinacije SB1-ND vektora sa pojedinačnim HVT-IBD ili dvostrukim HVT koji eksprimira i NDV-F i IBDV-VP2 indukuju zaštitu od IBD u modelu veštačke infekcije IBDV varijanta E.
Primer 21 Odsustvo interferencije vHVT114, vSB1-009 i/ili SB-1 pri zaštiti od IBD indukovanoj sa vHVT13 varijanta E kod SPF pilića
[0216] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti protiv IBD vHVT13 kada se primeni SC ili in ovo putem primene istovremeno sa vHVT114, vSB 1-009 i/ili SB-1 kod SPF pilića u modelu veštačke infekcije IBDV-Varijanta (VAR-E) na dan D28.
[0217] Sedamdeset pet jednodnevnih SPF pilića i 75 SPF pilećih embriona starosti 18 do 19 dana je nasumično raspoređeno u 5 grupa (G1 do G5 i G6 to G10, respektivno) uključujući grupu veštački inficiranih kontrola (G4 odnosno G9) i kontrola koje nisu veštački inficirane (G5 odnosno G10). Ptice iz grupa G1 do G3 primile su subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL vakcina od kojih svaka sadrži ciljnu dozu od 3000 pfu osim kod SB-1 čija je ciljna doza 1000 PFU. Ptice iz G6 do G8 primile su iste doze vakcine ali u 0.05 mL zapremine putem in ovo primene 2-3 dana pre izleganja. Plan studije prikazan je u tabeli 34 ispod. Sa 28 dana starosti, sve ptice iz grupa G1 do G4 i G6 do G9 su veštački inficirane kapanjem u oko (0.03 mL koji sadrže 3 log10 EID50 po ptici) izolata IBDV varijanta E sa Univerziteta Delaver (SAD). Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Jedanaest dana posle veštačke infekcije, ptice su izmerene i urađena je nekropsija. Burza je sakupljena i izmerena. Izračunat je težinski odnos burza/telo (odnos težina burze/težina tela X 100).
Tabela 34 Plan studije i rezultati efikasnosti protiv IBD
[0218] Srednji težinski odnosi burza/telo prikazani su u tabeli 34. Veštački inficirane kontrolne ptice (G4 i G9) imale su tešku burzalnu atrofiju u poređenju sa onim koje nisu veštački inficirane. Težinski odnosi burza/telo vakcinisanih grupa (G1 do G3 i G6 do G8) bili su slični onima kod kontrolnih grupa koje nisu veštački inficirane (G5 i G10) i znatno viši od onih kod veštački inficiranih kontrolnih grupa (G4 i G9). Odsustvo interferencije vHVT114 pri zaštiti od IBD indukovanoj sa vHVT 13 nakon oba načina primene, SC ili in ovo, bilo je iznenađujuće i potvrdilo je podatke dobijene u primerima 15 i 19.
[0219] U zaključku, ovi podaci jasno ukazuju na kompatibilnost vHVT114+vSB1-009 ili SB-1 i vSB 1-009 sa vHVT13 kada se primene putem SC ili in ovo, u modelu veštačke infekcije IBDV varijanta E.
Primer 22 Efikasnost vHVT114 i vHVT13 i SB1 ili vSB1-009 vektora protiv veštačke infekcije veoma virulentnim plus virusom Marekove bolesti
[0220] Cilj ove studije bio je procena efikasnosti protiv Marekove bolesti indukovane različitim kombinacijama vakcina, uključujući vHVT114, vHVT13, SB-1 i/ili vSB1-009 primenjenih SC putem kod jednodnevnih SPF pilića koji su veštački inficirani 4 dana kasnije veoma virulentnim plus virusom Marekove bolesti (vv+MDV) izolat T-King.
[0221] Na dan D0, 100 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 5 grupa od po 20 ptica. Ptice iz grupa 1 do 3 primile su subkutanu injekciju u vrat na dan DO od 0.2 mL vakcine koja sadrži ciljnu dozu od 2000 pfu za svaku vakcinu osim za SB-1 za koju je ciljna doza bila 1000 pfu. Ptice iz grupa 4 i 5 nisu vakcinisane i korišćene su kao prividne kontrole koje su veštački inficirane (grupa 4) ili nisu veštački inficirane (grupa 5). Plan studije prikazan je u tabeli 35. Na dan D4, sve ptice iz grupa 1 do 4 su veštački inficirane sa 0.2 mL vv+MDV izolata T-King intraperitonealnim putem primene.
Tabela 35 Plan studije i rezultati zaštite od MD
[0222] Svaka grupa je posmatrana dnevno na bilo kakve neželjene reakcije pre i posle veštačke infekcije. Na dan 49, sve žive ptice su eutanazirane i urađena je nekropsija da bi se ispitala velika oštećenja povezana sa Marekovom bolešću. Pilići u svrstani kao pozitivni u smislu infekcije Marekovom bolešću ako su primećeni nervni znaci, kao što su paraliza, lokomotorni znaci koji se mogu pripisati bolesti, i teška iznurenost ili depresija, ako se smrtnost direktno pripisuje Marekovoj bolesti, ili ako se kod nekropsije primećuju velika oštećenja. Oštećenja mogu uključivati, ali se ne ograničavaju samo na sledeće: oštećenja jetre, srca, slezine, gonada, bubrega i mišića.
[0223] Rezultati zaštite prikazani su u tabeli 35 gore. Sve vakcinisane grupe (G1 do G3) delovale su podjednako, indukujući delimičnu (65%) zaštitu od MD, kao što je i očekivano u ovom modelu rane veštačke infekcije koja je veoma ozbiljna. Ovi rezultati su ukazali na to da su kandidati vektorskih vakcina zadržali svoju sposobnost zaštite od Marekove bolesti.
Primer 23 Procena efikasnosti vektora SB1-ND kombinovanog sa vektorom HVT-IBD protiv Marekove bolesti
[0224] Sinergija između parentalnog HVT i SB-1 u indukciji zaštite od Marekove bolesti je dobro poznata. Vektor SB-1 koji eksprimira strani gen može stoga da se pomeša sa parentalnim HVT ili vektorskim HVT koji eksprimira drugi strani gen u cilju dobijanja rastvora bivalentne ili trovalentne vakcine, respektivno. Primer procene efikasnosti protiv Marekove bolesti indukovane kombinacijom vSB1-009 sa vHVT114 i vHVT13 prikazan je gore u tekstu (primer 22). Efikasnost protiv Marekove bolesti (MD) pokazana je i za vektorske rekombinante Marekove bolesti, same, ili u kombinaciji u drugim modelima veštačke infekcije MD, uključujući veštačku infekciju virusom virulentne Marekove bolesti (vMD) kao što je GA22, veštačku infekciju virusom veoma virulentne Marekove bolesti (vvMD) kao što je RB1B i/ili veštačku infekciju virusom veoma virulentne plus Marekove bolesti (vv+MD) kao što je virus T. King. Jednodnevni pilići su subkutano inokulisani, ili su 18-19 dana stara embrionisana jaja inokulisana dozom od 0.2 ml ili 0.05 ml, respektivno, ispitivanih virusa. Sa pet dana starosti, vakcinisani pilići i naivne kontrole su veštački inficirane relevantnim Marekovim virusom za veštačku infekciju (v, vv, ili vv+ MDV). Veštački inficirane ptice su posmatrane do sedam nedelja starosti. Sve ptice su eutanazirane i urađena je nekropsija za praćenje krupnih vidljivih oštećenja povezanih sa Marekovom bolešću kao što je opisano u primeru 22.
Primer 24 Efikasnost vSB1-004, vSB1-006, vSB1-007, vSB1-008, SB1-vektorskih ND vakcina pojedinačno, ili zajedno sa vHVT13 HVT-vektorskom IBD vakcinom, i vHVT302 i vHVT304 vakcinama protiv veštačkih infekcija sojem NDV Texas GB kod SPF pilića starih 14 i/ili 28 dana
[0225] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti kombinacija različitih vektorskih vakcina protiv Marekove bolesti koje eksprimiraju gen NDV F i/ili IBDV VP2 protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti (soj Texas GB, genotip II) sprovedene kod SPF pilića starosti 14 i/ili 28 dana.
[0226] Karakteristike 6 NDV rekombinantnih vakcina kandidati koji su ispitivani u ovoj studiji opisani su u tabeli 36 ispod.
Tabela 36 Karakteristike 6 NDV rekombinantnih vakcinalnih kandidata ispitivanih u ovoj studiji
[0227] Na dan D0, 225 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 9 grupa od po 15 ptica (G1a do G9a veštački inficiranih na dan D14) i 6 grupa od po 15 ptica (G1b, G3b, G4b, G5b, G8b, G9b veštački inficiranih na dan D28). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL koja sadrži ciljnu dozu od 2000 pfu za rekombinantne vakcine. Plan studije prikazan je u tabeli 37 ispod. Ptice su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D14 ili D28 sa 4.3 odnosno 4.2 log10 EID50 (0.1 mL) velogenog soja ND Texas GB (genotip II).
Tabela 37 Rezultati efikasnosti protiv ND
[0228] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV posle veštačke infekcije su zabeleženi. Jedna ptica je uginula u grupama G6 i G7 pre veštačke infekcije, čime je broj ptica smanjen sa 15 na 14 u ovim grupama.
[0229] Procenti kliničke zaštite (uključujući zaštitu od mortaliteta i morbiditeta) prikazani su u tabeli 37 gore. Potpuna osetljivost je zapažena u nevakcinisanim veštački inficiranim kontrolnim grupama G1a i G1b čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Delimične zaštite u opsegu od 13.3 do 46.6% su zapažene posle veštačke infekcije na dan D14, pri čemu su najviši nivoi zaštite indukovani sa vSB1-008, vSB1-007 i vHVT304. Nivoi zaštite posle veštačke infekcije ND na dan D28 bili su mnogo viši za sve vakcinisane grupe i bili su ponovo neznatno viši od onih u grupama vakcinisanim sa vSB1-008, vSB1-007 ili vHVT304. Ovi rezultati su ukazali na to da nivoi zaštite od ND zavise od datuma veštačke infekcije i od konstrukta. Konstrukti vSB 1-008 i vSB1-007 imali su neznatno bolji učinak od vSB 1-004 i vSB 1-006, i vHVT304 je imao neznatno bolji učinak od vHVT302, što ukazuje na to da različite karakteristike konstrukata imaju ulogu u učinku vektorskih vakcina na bazi MDV.
[0230] U zaključku, rezultati ove studije pokazuju da nivoi zaštite od ND indukovane vektorima Marekove bolesti koji eksprimira gen NDV F mogu da zavise od različitih parametara uključujući vektor, lokus insercije, F gen, promotor, poli-adenilaciono mesto i uslove veštačke infekcije.
Primer 25 Efikasnost dvostrukog HVT-ND+IBD vHVT304 i vHVT306 vakcina protiv veštačkih infekcija sojem NDV Texas GB kod SPF pilića starih 14 i/ili 28 dana
[0231] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti HVT-vektorskih vakcina koje eksprimiraju gene NDV F i IBDV VP2 protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti (soj Texas GB, genotip II) sprovedene kod SPF pilića starih14 i/ili 28 dana.
[0232] Karakteristike 2 rekombinantna vakcinalna kandidata koji su ispitivani u ovoj studiji opisane su u tabeli 38 ispod.
Tabela 38 Karakteristike rekombinantnih vakcinalnih kandidata upotrebljenih u ovoj studiji
[0233] Na dan D0, 90 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 3 grupe od po 15 ptica (G1a do G3a veštački inficiranih na dan D14) i 3 grupe od po 15 ptica (G1b do G3b veštački inficiranih na dan D28). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL, koja sadrži ciljnu dozu od 2000 pfu za rekombinantne vakcine. Plan studije prikazan je u tabeli 39 ispod. Ptice su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D14 ili D28 ciljnom dozom od 4.0 log10 EID50 (0.1 mL) velogenog soja ND Texas GB (genotip II).
Tabela 39 Rezultati efikasnosti protiv ND
[0234] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV posle veštačke infekcije su zabeleženi. Jedna ptica je uginula u grupi G2b pre veštačke infekcije čime je broj ptica smanjen sa 15 na 14 u ovoj grupi.
[0235] Procenti kliničke zaštite (uključujući zaštitu od mortaliteta i morbiditeta) prikazani su u tabeli 39 iznad. potpuna osetljivost je zapažena u nevakcinisanim veštački inficiranim kontrolnim grupama G1a i G1b čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Nivoi zaštite posle veštačke infekcije na dan D14 bili su mnogo niži od onih dobijenih posle veštačke infekcije na dan D28. Ovi vakcinalni kandidati imali su istu ekspresionu kasetu NDV F insertovanu u 2 različita lokusa genoma vHVT13. Imali su podjednak učinak u smislu zaštite od ND u ispitivanim uslovima, što ukazuje na to da su oba inserciona lokusa (IG2 i SORF3-US2) podjednako pogodna za inserciju kasete NDV F.
[0236] U zaključku, rezultati ove studije pokazali su da nivoi zaštite od ND indukovane vektorima Marekove bolesti koji eksprimiraju gen NDV F zavise od različitih parametara uključujući vektor, lokus insercije, F gen, promotor, poli-adenilaciono mesto i uslove veštačke infekcije.
Primer 26 Rana efikasnost protiv ND indukovana dvostrukim HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303 i vHVT304) ili SB1-vektorima (vSB1-006 i vSB1-007) kod jednodnevnih SPF pilića protiv veštačke infekcije NDV velogenim genotipom V
[0237] Cilj ispitivanja je bio procena efikasnosti tri dvostruka HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303 i vHVT304) i dva SB1-ND vektora (vSB1-006 i vSB1-007) kod jednodnevnih SPF pilića protiv veštačke infekcije NDV velogenim genotipom V (Chimalhuacan) sprovedene na dan D14.
[0238] Karakteristike 5 rekombinantnih vakcinalnih kandidata ispitivanih u ovoj studiji opisane su u tabeli 40 ispod.
Tabela 40 Karakteristike rekombinantnih vakcinalnih kandidata upotrebljenih u ovoj studiji
[0239] Nasumično je obrazovano šest grupa (1 i 2) od po deset jednodnevnih belih pilića Leghorn bez specifičnih patogena (SPF). Ptice iz grupa 2 do 6 su vakcinisane subkutanim putem (potiljak) ciljnom dozom od 2000 PFU kao što je prikazano u tabeli 41 ispod. Pilići iz grupe 1 nisu vakcinisani i zadržani su kao kontrolne ptice. Sa 2 nedelje starosti, sve ptice su veštački inficirane velogenim sojem NDV genotip V Mexican Chimalhuacan (Mex V). Veštačka infekcija je izvedena intramuskularnim (IM) putem upotrebom 105 doza koje inficiraju 50% jaja (EID50) razblaženih u 0.2 ml fiziološke sterilne vode. Sve ptice su posmatrane do 14 dana posle veštačke infekcije. Posle veštačke infekcije, zdravstveni status svake ptice je ocenjivan dnevno kao što sledi: zdrava / sa specifičnim simptomima (raščupano perje, ispruženost, iskrivljenost vrata, tremor) / mrtva. Svaka ptica koja je pokazala specifične simptome tokom više od 2 dana ili je zapaženo da je bolesna na dan D28 uzeta je u obračun morbiditeta.
Tabela 41 Rezultati rane zaštite od ND indukovane različitim MDV vektorskim kandidatima koji eksprimiraju gen NDV F kod jednodnevnih SPF pilića
[0240] Rezultati zaštite su rezimirani u tabeli 41. Sve kontrolne ptice su uginule posle veštačke infekcije ND. Različiti nivoi zaštite od ND indukovani različitim ispitivanim vakcinama nalaze se u opsegu od 10% do 80% i od 0% i 60% u smislu zaštite od mortaliteta i morbiditeta, respektivno. Kandidat vHVT304 je indukovao bolju zaštitu od kandidata vHVT303 i vHVT302; ovo može da bude posledica egzogenog promotora SV40 smeštenog ispred gena NDV F. Učinak vSB1-007 bio je neznatno bolji od vSB 1-006. Osim toga, učinak dobijen sa vHVT304 bio je uporediv sa onim dobijenim sa vSB1-007 što ukazuje na to da različiti vektori Marekove bolesti mogu da dostignu isti nivo zaštite od ND.
[0241] U zaključku, ova studija pokazuje da oba dvostruka HVT-ND+IBD i SB1-ND vektorske vakcine mogu da dostignu značajne nivoe zaštite od ND u veoma ozbiljnom ranom modelu veštačke infekcije NDV.
Primer 27 Efikasnost protiv ND indukovana dvostrukim HVT-ND+IBD vHVT306 primenjenim in ovo ili SC putem kod jednodnevnih SPF pilića pri veštačkoj infekciji NDV velogenim genotipom V sprovedenoj na dan D28
[0242] Cilj ispitivanja je bio da se proceni efikasnost jednog dvostrukog HVT-ND+IBD (vHVT306) primenjenog in ovo ili SC putem kod SPF pilića protiv veštačke infekcije NDV velogenim genotipom V (Chimalhuacan) sprovedene u uzrastu od 28 dana.
[0243] Karakteristike rekombinantnog vakcinalnog kandidata vHVT306 ispitanog u ovoj studiji opisane su u tabeli 42 ispod. Pojedinačna HVT-IBD vektorska vakcina vHVT13 korišćena je kao kontrola.
Tabela 42 Karakteristike rekombinantnog vakcinalnog kandidata upotrebljenog u ovoj studiji
[0244] Na dan 3, 40 SPF embrionisanih jaja starosti oko 18 dana i 18 časova inkubacije nasumično je raspoređeno u 2 grupe od po 20 jaja svaka. Na dan D0, dodata je jedna grupa 12 dana starih SPF pilića. Definicija grupa je data u tabeli 43 ispod. Vakcinacija je izvedena na dan D-3 (in ovo putem) ili na dan D0 (SC putem, u zadnji deo vrata) i ciljna doza vHVT306 i vHVT13 bila je 2000PFU/ptici. Za in ovo put primene, praćen je procenat izleganja, vijabilnost (do D28) i rast ptica (između izleganja i D28).
[0245] Na dan D28, 10 ptica po grupi je veštački inficirano virulentnim ND sojem Chimalhuacan. Veštačka infekcija je izvedena intramuskularnim (IM) putem upotrebom 10<5>doza koje inficiraju 50% jaja (EID50) razblaženih u 0.2 ml fiziološke sterilne vode. Ptice su posmatrane do 14 dana posle veštačke infekcije. Zabeleženi su specifični klinički znaci i mortalitet. Svaka ptica koja je pokazala specifične simptome tokom više od 2 dana ili primećeno da je bolesna na dan D42 uzeta je u obračun za izračunavanje morbiditeta. Pet i sedam dana posle veštačke infekcije (tj. na dan D33 i D35), uzet je orofaringealni bris od svake preživele ptice. Svi brisevi su analizirani metodom qRT-PCR specifičnom za NDV.
Tabela 43 Rezultati zaštita od ND indukovane vektorskim kandidatom vHVT306 MDV koji eksprimira gene NDV F i IBDV VP2 primenjenim SC ili in ovo putem kod SPF pilića
[0246] Potpuno izleganje je zabeleženo posle in ovo vakcinacije u grupama 1 i 2 i sve ptice koje su se izlegle su preživele do dana D28. Nije detektovana razlika u telesnim težinama između dve grupe na dane D0 i D28 što potvrđuje izvrsnu bezbednost vHVT306 kada se primeni in ovo. Rezultati zaštite su rezimirani u tabeli 43. Sve kontrolne ptice vakcinisane sa vHVT13 uginule su do 4 dana posle veštačke infekcije ND. Potpuna klinička zaštita od ND bila je indukovana sa vHVT306 primenjenim na oba načina primene. Osim toga, izlučivanje virusa nije detektovano posle in ovo primene, dok je samo nekoliko ptica izlučivalo detektabilnu količinu virusa veštačke infekcije posle SC primene.
[0247] U zaključku, ova studija je pokazala da dvostruki HVT-ND+IBD vHVT306 indukuje odličan nivo zaštite od ND putem SC ili in ovo primene u modelu veoma ozbiljne heterologe veštačke infekcije NDV.
Primer 28 Efikasnost rekombinantnih vakcina na bazi dvostrukog HVT-ND+IBD (vHVT302, vHVT303 i vHVT304), protiv veštačke infekcije izazvane klasičnim izolatom IBDV na dan D15 kod SPF pilića
[0248] Cilj ispitivanja bio je procena rane efikasnosti protiv IBD dvostrukih HVT rekombinanata rekombinantnih konstrukata vHVT302, vHVT303 i vHVT304 pri veštačkoj infekciji virusom virulentne infektivne burzalne bolesti (vIBDV) (soj Faragher 52/70) sprovedenoj kod SPF pilića starosti15 dana.
[0249] Karakteristike 3 dvostruka HVT-ND+IBD rekombinantna vakcinalna kandidata koji su ispitivani u ovoj studiji opisane su u tabeli 44 ispod.
Tabela 44 Karakteristike ekspresionih kaseta dvostrukih HVT rekombinanata
[0250] Na dan D0, 40 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 4 grupe od po 10 ptica uključujući jednu kontrolnu grupu (G1) koja je vakcinisana vektorom vSB 1-004, a SB-1 koji eksprimira gen NDV F. Pet drugih SPF ptica je zadržano nevakcinisano i one nisu veštački inficirane za procenu težina burza/telo. Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 2000 pfu kao što je opisano u tabeli 45 ispod. Na dan D15, sakupljeni su uzorci krvi svih ptica po grupi (10 ptica po grupi osim za grupe 1 i 3 u kojima je 1 ptica uginula pre uzimanja uzorka krvi) za serološka ispitivanja pomoću kompleta Kit ProFLOK® plus IBD (Synbiotics Corp). Na dan D15, ptice iz sve 4 grupe su veštački inficirane kapanjem u oko (0.05 mL po ptici) sa 2.5 log10 EID50.
Tabela 45 Plan studije i rezultati efikasnosti protiv IBD
[0251] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci IBDV su beleženi tokom 11 dana posle veštačke infekcije (od D15 do D25). Na kraju perioda posmatranja posle veštačke infekcije (D25), sve preživele ptice su eutanizirane i urađena je nekropsija. Težine tela i burze su zabeležene. Svaka Fabricijusova burza (BF) je izmerena, a zatim pojedinačno skladištena u 4% formaldehidu za histologiju. Histološka oštećenja burze su ocenjivana prema skali predstavljenoj u tabeli 46.
Tabela 46 Skala za ocenjivanje histoloških oštećenja Fabricijusove burze * Ocena Histološko posmatranje/oštećenja
0Nema oštećenja, normalna burza
1% do 25% folikula pokazuje limfoidnu depleciju (tj., manje od 50% 1 deplecije u 1 pogođenom folikulu), priliv heterofila u oštećenjima
26% do 50% folikula pokazuje gotovo potpunu limfoidnu depleciju (tj., sa
2 više od 75% deplecije u 1 pogođenom folikulu), pogođeni folikuli pokazuju nekrotična oštećenja i ozbiljan priliv heterofila može da se detektuje 51% do 75% folikula pokazuje limfoidnu depleciju; pogođeni folikuli 3 pokazuju nekrotična oštećenja i ozbiljan priliv heterofila može da se detektuje
76% do 100% folikula pokazuje gotovo potpunu limfoidnu depleciju;
4 hiperplazija i strukture ciste se detektuju; pogođeni folikuli pokazuju nekrotična oštećenja i ozbiljan priliv heterofila se detektuje
100% folikula pokazuje gotovo potpunu limfoidnu depleciju; potpuni 5 gubitak folikularne strukture; zadebljali i izuvijani epitel; fibroza burzalnog tkiva
* iz monografije br.01/2008:0587 EU farmakopeje "Avian Infectious Bursal Disease vaccine (live) "
[0252] Ptica je smatrana pogođenom ako je uginula i/ili je pokazala očigledan znak bolesti i/ili ozbiljna oštećenja Fabricijusove burze (tj., histološku ocenu ≥3).
[0253] Srednji ELISA IBD+ titar antitela izražen u log 10 pre veštačke infekcije prikazan je u tabeli 45. Značajni titrovi koji su detektovani kod svih vakcinisanih grupa, bili su značajno viši od onih u kontrolnoj grupi G1. Serološki titar bio je neznatno viši u G3 (vHVT303).
[0254] Ozbiljni klinički znaci su zapaženi posle veštačke infekcije kod svih 9 ptica kontrolne grupe G1, što je vodilo uginuću 1 ptice. Samo jedna vakcinisana ptica u G2 (vHVT302) pokazala je kliničke znake posle veštačke infekcije. Procenti zaštite od ozbiljnih oštećenja burze prikazani su u tabeli 45 iznad. Značajna zaštita od IBD je zapažena u svim vakcinisanim grupama, pri čemu je potpuna zaštita primećena u G3 (vHVT303). Srednji težinski odnosi burza/telo su takođe prikazani u tabeli 45. Odnosi u svim vakcinisanim grupama bili su viši od onih u veštački inficiranoj kontrolnoj grupi G1 i nisu bili značajno drugačiji od nevakcinisane i kontrolne grupe koja nije veštački inficirana.
[0255] U zaključku, ovi podaci pokazuju da su tri dvostruka konstrukta HVT-IBD+ND ispitivana u ovoj studiji indukovala IBD antitela i ranu zaštitu od IBD u modelu ozbiljne veštačke infekcije IBDV.
Primer 29 Efikasnost pet različitih HVT-ND vakcinalnih kandidata protiv veštačkih infekcija velogenim NDV izolatom ZJ1 (genotip VIId) kod SPF pilića starih 14 dana
[0256] Cilj ispitivanja bio je procena efikasnosti 5 pojedinačnih HVT rekombinantnih konstrukata (vHVT39, vHVT110, vHVT111, vHVT112 i vHVT113) koji eksprimiraju gen NDV F protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti velogenim NDV izolatom ZJ1 (genotip VIId) sprovedene kod SPF pilića starosti 14 dana.
[0257] Karakteristike ovih 5 vakcinalnih kandidata opisane su u tabeli 47 ispod.
Tabela 47 Karakteristike rekombinantnih virusa HVT-ND upotrebljenih u studiji veštačke infekcije
[0258] Na dan D0, 72 jednodnevnih SPF pilića je nasumično raspoređeno u 5 grupa od po 12 ptica (vakcinisane) i 1 grupu od 12 ptica (nevakcinisane kontrole). Ptice su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL rekombinantnih vakcina koje sadrže ciljnu dozu od 6000 pfu kao što je opisano u tabeli 48 ispod. Ptice su veštački inficirane intramuskularnim putem na dan D14 sa 5 log 10 EID50 velogenog NDV soja ZJ1/2000 (genotip VIId).
Tabela 48 Rezultati efikasnosti protiv ND
[0259] Svaka grupa je posmatrana pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV i mortalitet su zabeleženi posle veštačke infekcije. Orofaringealni brisevi su uzeti na 2 i 4 dana posle infekcije (dpi) za procenu virusnog opterećenja metodom RT-PCR u realnom vremenu upotrebom postupka opisanog kod Wise et al. (2004; Development of a Real-Time Reverse-Transcription PCR for Detection of Newcastle Disease Virus RNA in Clinical Samples. J Clin Microbiol 42, 329-338).
[0260] Procenti zaštite od mortaliteta i morbiditeta prikazani su u tabeli 48 gore. Potpuna osetljivost je zapažena kod nevakcinisane veštački inficirane kontrolne grupe G1 čime je potvrđeno da je veštačka infekcija veoma teška. Vakcine su indukovale različite nivoe zaštite od mortaliteta (25-100%) ili od morbiditeta (8%-83%). Najbolji nivo zaštite indukovan je sa vHVT110, dok je najniži indukovan sa vHVT039, pri čemu su ostali kandidati dali intermedijarne rezultate. Rezultati orofaringealnog izlučivanja na 2 i 4 dpi su takođe prikazani u tabeli 48 gore i su u skladu sa onima za kliničku zaštitu. Ovi vakcinalni kandidati razlikuju se po svojoj promotorskoj sekvenci i sekvenci F gena. Ovi rezultati pokazuju da su oba ova parametra značajna za konstruisanje optimalnog vakcinalnog kandidata HVT-ND.
[0261] U zaključku, rezultati ove studije pokazuju značaj sekvence promotora i F gena u efikasnosti protiv ND indukovanoj HVT-vektorskim vakcinalnim kandidatima za ND.
Primer 30 Procena efikasnosti protiv Njukastl bolesti indukovane dvostrukim SB1 konstruktima koji eksprimiraju IBDV VP2 i NDV F
[0262] Cilj ispitivanja je procena efikasnosti dvostrukih SB1 konstrukata koji eksprimiraju IBDV VP2 i NDV F protiv veštačke infekcije virusom Njukastl bolesti.
[0263] Na dan D0, jednodnevni SPF pilići su nasumično raspoređeni u nekoliko grupa od po 10-20 ptica, uključujući vakcinisane i nevakcinisane grupe. Ptice iz vakcinisanih grupa su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL koja sadrži ciljnu dozu od 1000 do 5000 pfu rekombinantnih vakcina. Alternativno, ista doza u 0.05 mL može da se primeni in ovo 2 ili 3 dana pre izleganja. Ptice (najmanje jedna vakcinisana i jedna nevakcinisana grupa) su veštački inficirane intramuskularnim putem u različito vreme posle vakcinacije: na primer, D14, D28 ili D42 sa oko 4.0 log10 EID50 (0.1 mL) velogenog soja NDV kao što je soj Texas GB (genotip II), ZJ1 (genotip VIId), Chimalhuacan (genotip V).
[0264] Svaka grupa je praćena klinički pre i posle veštačke infekcije. Klinički znaci NDV (morbiditet) i mortalitet su zabeleženi posle veštačke infekcije. Izračunati su procenti kliničke zaštite u svim grupama. Najmanje 90% nevakcinisanih veštački inficiranih SPF ptica treba da ugine ili da bude ozbiljno bolesno posle veštačke infekcije da bi se potvrdila ozbiljnost veštačke infekcije. Orofaringealni i brisevi kloake mogu da se uzorkuju u različita vremena posle veštačke infekcije kao što je 3, 5, 7 i 9 dana posle veštačke infekcije i virusno opterećenje može da se proceni metodom RT-PCR u realnom vremenu. Najbolji kandidati će biti oni koji su indukovali najviši nivo kliničke zaštite i najniži nivo virusnog opterećenja u brisevima. Slična studija može da se sprovede kod brojlera koji imaju majčinska NDV antitela; međutim, ova majčinska antitela mogu potencijalno da zaštite nevakcinisane ptice ako se veštačka infekcija sprovede rano. Dvostruki SB1 konstrukt može takođe da se ispita u kombinaciji sa drugim vakcinama protiv Marekove bolesti ili vektorskim vakcinama.
Primer 31 Procena efikasnosti protiv infektivne burzalne bolesti indukovane dvostrukim SB1 konstruktima koji eksprimiraju IBDV VP2 i NDV F
[0265] Cilj ispitivanja je procena efikasnosti protiv IBD dvostrukog SB1 koji eksprimira i IBDV VP2 i NDV F.
[0266] Jednodnevni SPF pilići su nasumično raspoređeni u nekoliko grupa od po 10 do 20 ptica uključujući vakcinisane i nevakcinisane kontrole. Nevakcinisane kontrole će biti razdvojene na 2 podgrupe uključujući veštački inficirane i ptice koje nisu veštački inficirane. Ptice iz vakcinisanih grupa su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL vakcina od kojih svaka sadrži ciljnu dozu od 1000 do 5000 pfu. Alternativno, ista doza u 0.05 mL može da se primeni in ovo 2 ili 3 dana pre izleganja. U različita vremena posle vakcinacije, kao što je 14, 21, 28 ili 42 dana posle vakcinacije, sve ptice iz vakcinisanih grupa i veštački inficirane kontrole su veštački inficirane kapanjem u oko (0.03 mL koji sadrži 2 do 4 log 10 EID50 po ptici) virulentnog IBDV (kao što je soj Faragher ili SAD standardni soj), veoma virulentnim IBDV kao što je izolat 91168 ili varijantom izolata IBDV kao što je izolat SAD Delaver varijanta E. Svaka grupa je klinički praćena pre i posle veštačke infekcije. Pticama može da se uradi nekropsija 4 ili 5 dana posle veštačke infekcije za procenu krupnih oštećenja burze. Nekropsija može da bude urađen i 10 do 11 dana posle veštačke infekcije. Mogu da budu procenjena velika i/ili histološka oštećenja. Osim toga, ptice i burza se mere i težinski odnosi burza/telo (odnos težina burze/težina tela X 100) se izračunavaju u poređenju sa onima kod nevakcinisane grupe koja nije veštački inficirana. Kontrolne SPF veštački inficirane ptice moraju da pokažu kliničke znake i/ili da imaju značajne velika i/ili histološka oštećenja, i/ili da imaju težinski odnos burza/telo značajno niži nego kod vakcinisanih kontrolnih ptica koje nisu veštački inficirane da bi se potvrdila težina veštačke infekcije. Efikasnost vakcine se procenjuje poređenjem ovih parametara sa nevakcinisanim/veštački inficiranim i nevakcinisanim/veštački neinficiranim grupama. Takva studija može da se sprovede na brojlerima koji imaju majčinska IBDV antitela; međutim ova majčinska antitela mogu potencijalno da zaštite nevakcinisane ptice ako se veštačka infekcija sprovede rano. Dvostruki SB1 konstrukt može takođe da se ispita u kombinaciji sa drugim vakcinama protiv Marekove bolesti ili vektorskim vakcinama.
Primer 32 Procena efikasnosti protiv Marekove bolesti indukovane dvostrukim SB1 konstruktima koji eksprimiraju IBDV VP2 i NDV F
[0267] Cilj ispitivanja je procena efikasnosti protiv Marekove bolesti indukovane vektorima SB1 koji eksprimiraju i IBDV VP2 i NDVF.
[0268] Jednodnevni SPF pilići su nasumično raspoređeni u nekoliko grupa od po 20 do 50 ptica uključujući vakcinisane i nevakcinisane kontrole. Nevakcinisane kontrole mogu da budu razdvojene na 2 podgrupe uključujući veštački inficirane i ptice koje nisu veštački inficirane. Ptice iz vakcinisanih grupa su primile subkutanu injekciju u vrat na dan D0 od 0.2 mL vakcina od kojih svaka sadrži ciljnu dozu od 1000 do 5000 pfu. Alternativno, ista doza u 0.05 mL može da se primeni in ovo 2 ili 3 dana pre izleganja. U različita vremena posle vakcinacije, kao što je 3 do 10 dana posle vakcinacije, sve ptice iz vakcinisanih grupa i veštački inficirane kontrole su veštački inficirane intraperitonealnim putem sa 0.2 mL soja virusa Marekove bolesti (MDV). Soj MDV može da bude različitih pato-tipova kao što je virulentni MDV (vMDV) uključujući izolat JM ili GA22, veoma virulentni MDV (vvMDV) kao što je izolat RB-1B ili Md5, veoma virulentni plus (vv+MDV) kao što je izolat T-King ili 648A. Inokulum soja za veštačku infekciju MDV se priprema inficiranjem pilića, sakupljanjem i zamrzavanjem njihovih krvnih ćelija u tečnom azotu u prisustvu kriokonzervansa kao što je DMSO. Doza koja inficira 50% pilića (CID50) se uspostavlja za svaku seriju virusa za veštačku infekciju pre sprovođenja studija vakcinacije/veštačke infekcije. Svaka grupa se klinički posmatra pre i posle veštačke infekcije. Na pticama se izvodi nekropsija posle najmanje 7 nedelja posle vakcinacije i prisustvo velikih oštećenja Marekove bolesti se proverava kod svake ptice. Oštećenja mogu da uključuju, ali nisu ograničena na sledeće: oštećenja jetre, srca, slezine, gonada, bubrega, nerava i mišića. Ovakva studija može da se sprovede kod brojlera koji imaju majčinska MDV antitela. Dvostruki SB1 konstrukt može da se ispita i u kombinaciji sa drugim vakcinama protiv Marekove bolesti (na primer HVT i ili CVI988 Rispens sojevi) ili vektorskim vakcinama za MD. Veštačka infekcija MD može takođe da se izvede kontaktom između vakcinisanih ptica i nevakcinisanih SPF pilića inficiranih sa MDV.

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija ili vakcina za upotrebu u postupku za indukovanje imunogenog ili zaštitnog odgovora kod životinje protiv jednog ili više ptičjih patogena, pri čemu navedena kompozicija ili vakcina sadrži rekombinantni vektor na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2), gde navedeni vektor sadrži jedan ili više heterologih polinukleotida koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena, naznačena time što heterologi polinukleotid kodira protein NDV-F virusa Njukastl bolesti, pri čemu navedeni postupak obuhvata najmanje jednu primenu navedene kompozicije ili vakcine.
2. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, koja dalje sadrži jednu ili više kompozicija ili vakcina odabranih iz grupe koja se sastoji od rekombinantnog vektora HVT (ili MDV-3 ili Meleagrid herpesvirus-1) koji sadrži heterologe polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena, HVT (MDV-3) divljeg tipa, rekombinantnog vektora MDV-1 (ili Gallid herpesvirus-2) koji sadrži heterologe polinukleotide koji kodiraju i eksprimiraju najmanje jedan antigen ptičjeg patogena, MDV-1 divljeg tipa, i njihove kombinacije.
3. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačena time, što rekombinantni vektor HVT predstavlja vHVT13.
4. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-2, naznačena time, što sekvenca proteina NDV-F ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 2, 9, 50, 52 ili 54.
5. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema patentnim zahtevima 1-2, naznačena time, što polinukleotid koji kodira NDV-F ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1, 8, 49, 51 ili 53.
6. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačena time, što je heterologi polinukleotid u Gallid herpesvirusu 3 insertovan u region koji kodira glikoprotein c (UL44), region između ORF UL55 i ORF LORF5 u jedinstvenom dugom (UL) regionu, region između ORF SORF4 i ORF US10, ili u region US2 vektora na bazi Gallid herpesvirusa 3.
7. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačena time, što rekombinantni vektor na bazi Gallid herpesvirusa 3 sadrži promotor.
8. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačena time, što je promotor odabran iz grupe koja se sastoji od neposrednog ranog promotora CMV, promotora CMV zamorca, promotora SV40, promotora za glikoprotein X Pseudorabies virusa, promotora alfa 4 Herpes simplex virusa-1, promotora za glikoprotein A (ili gC) virusa Marekove bolesti, promotora za glikoprotein B virusa Marekove bolesti, promotora za glikoprotein E virusa Marekove bolesti, promotora za glikoprotein B virusa infektivnog laringotraheitisa, promotora za glikoprotein E virusa infektivnog laringotraheitisa, promotora za glikoprotein D virusa infektivnog laringotraheitisa ili promotora za glikoprotein I virusa infektivnog laringotraheitisa, i promotora VP8 Bovine herpesvirusa 1.1.
9. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, koja dodatno sadrži farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, ekscipijens, vehikulum ili adjuvans.
10. Rekombinantni vektor na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2) koji sadrži heterologi polinukleotid koji kodira protein NDV-F virusa Njukastl bolesti, promotor, i signal za poliadenilaciju; naznačen time, što
(a) heterologi polinukleotid je polinukleotid NDV-F VIId divljeg tipa, promotor je mišji citomegalovirusni IE (mCMV IE) promotor i signal za poliadenilaciju je signal za poliadenilaciju Simian virusa 40 (SV40), pri čemu je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region između ORF SORF4 i ORF US10 vektora na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2); ili
(b) heterologi polinukleotid je kodon-optimizovani polinukleotid NDV-F VIId, promotor je promotor SV40 i signal za poliadenilaciju je SEQ ID NO: 13, gde je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region između ORF UL55 i ORF LORF5 u jedinstvenom dugom (UL) regionu vektora na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2); ili
(c) heterologi polinukleotid je kodon-optimizovani polinukleotid NDV-F VIId, promotor je promotor SV40 i signal za poliadenilaciju je endogen i potiče od gena za glikoprotein C (gC), gde je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region koji kodira glikoprotein C (UL44) u vektoru na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2); ili (d) heterologi polinukleotid je kodon-optimizovani polinukleotid NDV-F V (soj CA02), promotor je promotor SV40 i signal za poliadenilaciju je SEQ ID NO: 13, gde je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region između ORF UL55 i ORF LORF5 u jedinstvenom dugom (UL) regionu vektora na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2); ili
(e) heterologi polinukleotid je kodon-optimizovani polinukleotid NDV-F V (soj CA02), promotor je promotor SV40 i signal za poliadenilaciju je endogen i potiče od gena za glikoprotein C (gC), gde je dalje heterologi polinukleotid koji kodira NDV-F insertovan u region koji kodira glikoprotein C (UL44) u vektoru na bazi soja SB-1 Gallid herpesvirusa 3 (MDV-2).
11. Vektor prema patentnom zahtevu 10 za upotrebu u postupku za indukovanje imunogenog ili zaštitnog odgovora kod životinje protiv jednog ili više ptičjih patogena, naznačen time, što navedeni postupak obuhvata najmanje jednu primenu navedene kompozicije ili vakcine.
12. Kompozicija ili vakcina za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9 ili vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, gde je dalje navedena kompozicija, vakcina ili vektor za upotrebu u postupku vakcinisanja životinje, pri čemu postupak obuhvata najmanje jednu primenu kompozicije, vakcine ili vektora.
13. Kompozicija, vakcina ili vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačena time, što postupak obuhvata primenu u režimu primarna-buster imunizacija.
14. Kompozicija, vakcina ili vektor za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 ili 11-13, naznačena time, što je životinja ptica.
RS20190443A 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni vektori gallid herpesvirusa 3 (mdv serotip 2) koji eksprimiraju antigene ptičjih pathogena i njihove upotrebe RS58610B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161564877P 2011-11-30 2011-11-30
US201261694957P 2012-08-30 2012-08-30
PCT/US2012/067123 WO2013082317A2 (en) 2011-11-30 2012-11-29 Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
EP12805843.5A EP2785374B2 (en) 2011-11-30 2012-11-29 Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58610B1 true RS58610B1 (sr) 2019-05-31

Family

ID=47358292

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200111A RS59892B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe
RS20200113A RS59893B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe
RS20190443A RS58610B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni vektori gallid herpesvirusa 3 (mdv serotip 2) koji eksprimiraju antigene ptičjih pathogena i njihove upotrebe

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200111A RS59892B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe
RS20200113A RS59893B1 (sr) 2011-11-30 2012-11-29 Rekombinantni hvt vektori koji eksprimiraju antigene patogena ptica i njihove upotrebe

Country Status (29)

Country Link
EP (7) EP2785373B1 (sr)
JP (1) JP6149301B2 (sr)
KR (1) KR102013135B1 (sr)
CN (3) CN104159605B (sr)
AR (2) AR089039A1 (sr)
BR (1) BR112014013276B1 (sr)
CA (1) CA2857025C (sr)
CO (1) CO7061033A2 (sr)
CY (3) CY1121528T1 (sr)
DK (3) DK3251691T3 (sr)
ES (3) ES2775218T3 (sr)
HK (1) HK1248566A1 (sr)
HR (3) HRP20190525T8 (sr)
HU (3) HUE047724T2 (sr)
IN (1) IN2014CN04833A (sr)
LT (3) LT3251691T (sr)
ME (1) ME03433B (sr)
MX (2) MX361893B (sr)
PE (1) PE20141482A1 (sr)
PH (2) PH12014501174B1 (sr)
PL (3) PL2785373T3 (sr)
PT (3) PT3251691T (sr)
RS (3) RS59892B1 (sr)
RU (1) RU2620936C2 (sr)
SI (3) SI3251691T1 (sr)
SM (3) SMT201900690T1 (sr)
UA (1) UA118651C2 (sr)
WO (2) WO2013082317A2 (sr)
ZA (1) ZA201403804B (sr)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3206983A1 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Intervet International B.V. Recombinant non-pathogenic marek's disease virus constructs encoding infectious laryngotracheitis virus and newcastle disease virus antigens
DK3251691T3 (da) 2011-11-30 2020-02-10 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Rekombinante hvt-vektorer der udtrykker antigener af fjerkræpatogener og anvendelser deraf
EP2644702A1 (en) 2012-03-30 2013-10-02 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant avian herpes virus and vaccine for immunizing avian species
AR097029A1 (es) * 2013-07-26 2016-02-17 Intervet Int Bv Aceleración de la respuesta inmune inducida por virus vectorial en aves, composición, uso, método para la vacunación y método para acelerar la respuesta inmune
EP2845904A1 (en) * 2013-09-06 2015-03-11 Ceva Sante Animale Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof
AR103245A1 (es) * 2014-12-24 2017-04-26 Intervet Int Bv Vacuna vectorial basada en hvt (herpes virus de los pavos) frente a nd (enfermedad de newcastle) - ibd (enfermedad de gumboro) mejorada
WO2017027324A1 (en) * 2015-08-10 2017-02-16 The Texas A&M University System Recombinant turkey herpesvirus vaccines and uses thereof
ES2935643T3 (es) 2016-06-17 2023-03-08 Intervet Int Bv Construcciones de virus de la enfermedad de Marek no patógeno recombinante que codifican antígenos del virus de la laringotraqueítis infecciosa y del virus de la bursitis infecciosa
JOP20190088A1 (ar) * 2016-10-21 2019-04-21 Us Agriculture نواقل مؤتلفة للتعبير عن مولدات مضاد فيروس انفلونزا الطيور و استخداماتها
CN117357641A (zh) * 2016-12-14 2024-01-09 勃林格殷格翰动物保健美国公司 表达禽病原体的多种抗原的重组hvt载体及其用途
CN106701693A (zh) * 2017-01-19 2017-05-24 北京邦卓生物科技有限公司 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用
CN106929483B (zh) * 2017-01-19 2020-09-25 北京邦卓生物科技有限公司 表达鸡新城疫病毒f基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用
EP3391903B1 (en) * 2017-04-21 2022-02-23 The Pirbright Institute Recombinant gallid herpesvirus 3 vaccines encoding heterologous avian pathogen antigens
CN107099513B (zh) * 2017-06-22 2020-07-14 北京邦卓生物科技有限公司 一种共表达ndv hn和ibdv vp2基因的hvt的构建及其应用
CN107254450A (zh) * 2017-07-20 2017-10-17 扬州大学 克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株及构建方法
CN107603958A (zh) * 2017-09-29 2018-01-19 天津农学院 融合表达TM‑1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用
JP7721269B2 (ja) * 2017-10-12 2025-08-12 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 複数の異種抗原をコードする組換え非病原性マレック病ウイルス構築物
WO2019121888A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Intervet International B.V. Improved diluent for cell-associated alphaherpesvirus vaccine
CN108543067A (zh) * 2017-12-25 2018-09-18 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 共表达h5亚型禽流感ha蛋白和传染性法氏囊vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株
CN111918660A (zh) * 2018-01-24 2020-11-10 复诺健生物科技加拿大有限公司 重组病毒疫苗
CN109468315B (zh) * 2018-12-07 2021-09-07 袁隆平农业高科技股份有限公司 水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用
JP7590329B2 (ja) 2018-12-21 2024-11-26 セヴァ サンテ アニマレ 複数の外来遺伝子を含む組換えトリヘルペスウイルス
KR102850522B1 (ko) * 2019-09-11 2025-08-26 조에티스 서비시즈 엘엘씨 조류 병원체의 항원을 발현하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 벡터 및 이의 용도
CN110872578B (zh) * 2019-11-29 2022-09-16 扬州优邦生物药品有限公司 一株变异株传染性法氏囊病毒、亚单位疫苗及其制备方法和应用
US12589147B2 (en) 2019-12-20 2026-03-31 Intervet Inc. Multivalent HVT vector vaccine
US11299517B2 (en) * 2020-04-15 2022-04-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Recombinant vaccine against Marek's disease and Newcastle disease
EP4168043A1 (en) 2020-06-17 2023-04-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Recombinant hvt vectors expressing influenza hemagglutinin and immunogenic compositions, and production and uses thereof
CN112206317B (zh) * 2020-10-12 2023-09-22 浙江省淡水水产研究所 一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法
US20230372474A1 (en) 2020-10-15 2023-11-23 Ceva Sante Animale Recombinant hvt and uses thereof
CN114317827B (zh) * 2022-01-07 2023-03-24 河南省农业科学院 一种鉴别不同血清型马立克病病毒感染与免疫的多重pcr引物、方法及应用
CN115927213A (zh) * 2022-09-30 2023-04-07 扬州大学 表达鸡新城疫病毒f基因的重组火鸡疱疹病毒及其构建方法和应用
CN116139264A (zh) * 2022-12-28 2023-05-23 中国农业科学院上海兽医研究所 重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗及其应用
JP7813825B2 (ja) * 2023-02-07 2026-02-13 株式会社微生物化学研究所 ワクチン
KR102758680B1 (ko) * 2023-07-10 2025-02-04 (주)바이오드 전염성 f낭병 및/또는 조류 인플루엔자 항원을 발현하는 키메라 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR102758682B1 (ko) * 2024-01-02 2025-02-04 (주)바이오드 전염성 f낭병 항원을 발현하는 키메라 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물
WO2025201373A2 (en) * 2024-03-27 2025-10-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica (China) Co., Ltd. Recombinant marek's disease virus
PE20260444A1 (es) 2024-06-28 2026-02-25 Farm Veterinarios S A C Gallid alphaherpesvirus 3 (mdv-2), un vector viral contra diferentes patogenos aviares: una nueva estrategia de vacunacion en la industria avicola

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
CA1247080A (en) 1983-03-08 1988-12-20 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
AU623333B2 (en) 1986-01-27 1992-05-14 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same
JP2779447B2 (ja) 1988-03-20 1998-07-23 財団法人阪大微生物病研究会 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体
EP0431668B1 (en) 1989-12-04 1995-02-15 Akzo Nobel N.V. Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
DE69233158T2 (de) 1991-03-07 2004-05-13 Connaught Technology Corp., Greenville Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe
BE1004877A3 (fr) 1991-05-27 1993-02-16 Solvay Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.
US6183753B1 (en) 1994-08-09 2001-02-06 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant chimeric virus and uses thereof
US5853733A (en) 1993-02-26 1998-12-29 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
FR2719056B1 (fr) 1994-04-20 1996-09-06 Rhone Merieux Herpesvirus transformés pour exprimer gD in vitro.
ES2360298T3 (es) * 1994-08-09 2011-06-02 Schering-Plough Ltd. Herpesvirus recombinantes de pavos y sus usos.
RU2059414C1 (ru) * 1994-12-09 1996-05-10 Государственная Курская биофабрика - Фирма "БИОК" Поливалентная вакцина для профилактики болезни марека и способ ее изготовления
FR2728795B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
JPH104956A (ja) * 1996-06-21 1998-01-13 Univ Michigan State マレク病ワクチン製造のための維持可能な細胞株の改良
FR2751225B1 (fr) * 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique aviaire
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
US5980912A (en) 1997-03-25 1999-11-09 Zonagen, Inc. Chitosan induced immunopotentiation
EP1026246B1 (en) * 1997-10-03 2006-11-29 Zeon Corporation Avian infectious herpesvirus recombinants and recombinant vaccines prepared with the use of the same
EP0974660A1 (en) 1998-06-19 2000-01-26 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays
US6299882B1 (en) 1999-04-09 2001-10-09 Schering Corporation UL54.5 of Marek's disease virus (MDV)
KR100354972B1 (ko) * 2000-04-11 2002-10-05 대한민국 닭전염성기관지염 바이러스 ｓ1 단백질을 발현하는유전자재조합 마렉바이러스 및 그의 제조방법
US6764684B2 (en) * 2001-09-28 2004-07-20 Zeon Corporation Avian herpesvirus-based recombinant infectious bursal disease vaccine
US6866852B2 (en) * 2002-01-31 2005-03-15 Zeon Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and use thereof
KR100801180B1 (ko) * 2006-09-26 2008-02-05 주식회사 고려비엔피 약독화된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 함유하는뉴캐슬병 백신
CN105567648B (zh) * 2009-04-15 2019-09-03 法国诗华大药厂 用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗
DK3251691T3 (da) 2011-11-30 2020-02-10 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Rekombinante hvt-vektorer der udtrykker antigener af fjerkræpatogener og anvendelser deraf

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013082327A1 (en) 2013-06-06
CN104159604B (zh) 2016-08-24
CA2857025A1 (en) 2013-06-06
SI2785374T1 (sl) 2019-04-30
PH12014501174A1 (en) 2014-09-08
HK1248566A1 (en) 2018-10-19
AR090401A1 (es) 2014-11-12
EP4112073A1 (en) 2023-01-04
DK3251691T3 (da) 2020-02-10
RS59892B1 (sr) 2020-03-31
KR102013135B1 (ko) 2019-08-22
DK2785373T3 (da) 2020-02-03
ES2775218T3 (es) 2020-07-24
HRP20190525T1 (hr) 2019-05-03
CY1121528T1 (el) 2020-05-29
WO2013082317A8 (en) 2014-07-10
PE20141482A1 (es) 2014-11-08
RS59893B1 (sr) 2020-03-31
SMT201900671T1 (it) 2020-01-14
PH12014501174B1 (en) 2014-09-08
HK1197175A1 (en) 2015-01-09
ES2719409T5 (es) 2022-12-07
ME03433B (me) 2020-01-20
PL2785374T3 (pl) 2019-07-31
PH12015502790A1 (en) 2017-07-10
SI2785373T1 (sl) 2020-02-28
UA118651C2 (uk) 2019-02-25
WO2013082317A2 (en) 2013-06-06
PL2785374T5 (pl) 2023-01-09
CN104159604A (zh) 2014-11-19
HK1200018A1 (en) 2015-07-31
HRP20192215T1 (hr) 2020-02-21
HUE047909T2 (hu) 2020-05-28
EP2785373B1 (en) 2019-11-20
HRP20190525T4 (hr) 2023-01-20
EP2785374B1 (en) 2019-01-09
CN105920598A (zh) 2016-09-07
WO2013082327A8 (en) 2014-07-03
WO2013082317A3 (en) 2013-08-15
LT2785374T (lt) 2019-04-25
PT3251691T (pt) 2020-01-28
PT2785374T (pt) 2019-05-09
HUE047724T2 (hu) 2020-05-28
JP2015500806A (ja) 2015-01-08
CY1122872T1 (el) 2021-05-05
CY1124618T1 (el) 2022-03-24
BR112014013276B1 (pt) 2021-07-27
MX361893B (es) 2018-12-18
EP3572092A1 (en) 2019-11-27
MX2014006361A (es) 2015-03-05
JP6149301B2 (ja) 2017-06-21
EP2785373A1 (en) 2014-10-08
MX2014006360A (es) 2015-03-05
KR20140097515A (ko) 2014-08-06
EP3251691B1 (en) 2019-11-20
CN104159605B (zh) 2019-04-19
HRP20192241T1 (hr) 2020-03-06
PL2785373T3 (pl) 2020-06-01
ES2719409T3 (es) 2019-07-10
SI3251691T1 (sl) 2020-02-28
BR112014013276A2 (pt) 2018-05-15
HUE042471T2 (hu) 2019-07-29
EP3263130A1 (en) 2018-01-03
AR089039A1 (es) 2014-07-23
CN104159605A (zh) 2014-11-19
IN2014CN04833A (sr) 2015-09-18
EP3251691A1 (en) 2017-12-06
LT2785373T (lt) 2020-02-10
MX365984B (es) 2019-06-21
RU2014126375A (ru) 2016-01-27
CO7061033A2 (es) 2014-09-19
HRP20190525T8 (hr) 2023-01-20
ZA201403804B (en) 2015-04-29
CN105920598B (zh) 2026-03-31
SMT201900188T1 (it) 2019-05-10
DK2785374T3 (en) 2019-04-08
EP3578199A1 (en) 2019-12-11
LT3251691T (lt) 2020-02-10
ES2785045T3 (es) 2020-10-05
CA2857025C (en) 2021-08-03
EP2785374A2 (en) 2014-10-08
RU2620936C2 (ru) 2017-05-30
PH12015502790B1 (en) 2019-03-13
PT2785373T (pt) 2020-01-27
SMT201900690T1 (it) 2020-01-14
HK1247832A1 (en) 2018-10-05
EP2785374B2 (en) 2022-08-17
PL3251691T3 (pl) 2020-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2785374B1 (en) Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
US9770502B2 (en) Recombinant gallid herpesvirus 3 (MDV serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
US9114108B2 (en) Recombinant HVT vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK40077732A (en) Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK1200018B (en) Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK40021345A (en) Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK1247832B (en) Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK40017399A (en) Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
HK1197175B (en) Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof