RS58696B1

RS58696B1 - Novo antitelo protiv humanog tslp receptora

Info

Publication number: RS58696B1
Application number: RS20190580A
Authority: RS
Inventors: Hiromu Sato; Daisuke Yamajuku; Kazunori Arai; Mako Ogino
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2019-06-28
Also published as: JP6380394B2; US9908941B2; BR112016002743B1; PH12016500237A1; PL3031913T3; DK3031913T3; SG11201600935SA; TW201536806A; AU2014303356A1; WO2015020193A1; ES2730978T3; RU2689528C2; PH12016500237B1; SI3031913T1; MY177098A; IL243851B; CA2920484A1; TWI635097B; RU2016107814A; US20160208005A1

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na novo antitelo protiv humanog TSLP receptora.

Stanje tehnike

[0002] Timični stromalni limfopoietin (TSLP) je citokin izvedeni iz epitelnih ćelija, koji je proizveden kao odgovor na pro-zapaljenski stimulansi. Uglavnom, TSLP pojačava alergijski zapaljenski odgovor kroz aktivaciju dendritskih ćelija i mastocita. Dendritske ćelije eksprimiraju TSLP receptor i IL-7 receptor αlanac koji su članovi hematopoietične receptor familije, a TSLP se vezuje za heterodimer koji se sastoji od TSLP receptora i IL-7 receptor α lanac, čime se aktiviraju dendritske ćelije. Dendritske ćelije aktivirane putem TSLP, eksprimiraju zapaljenski hemokine kao što je timus i aktivacijom regulisane hemokine (TARC (CCL17)), makrofaga-izvedene hemokine (MDC (CCL22)), i slično (Nat. Immunol., 2002, Vol.7, p.

673 to 680). Poznato je da su TARC i MDC Th2 hemokini i da privlače Th2 ćelije do mesta zapaljenja (Int. Immunol., 1999, Vol.11, p.81 do 88). Dalje, dendritske ćelije aktivirane putem TSLP snažno indukuju diferencijaciju naivnih T ćelija u Th2 ćelije, a Th2 ćelije proizvode IL-4, IL-5, IL-13, i TNFα, i izazivaju zapaljensku reakciju (Nat. Immunol., 2002, Vol.7, p.673 to 680).

[0003] Prijavljeno je da je aktivacija dendritskih ćelija usled TSLP kroz talav TSLP receptor uključena u patologiju bolesti, uključujući alergijske zapaljenske bolesti kao što je astma, i sistemska skleroza.

[0004] U pogledu astme, prijavljeno je da kod transgenih miševa kod kojih je TSLP ekspresija ojačana specifično u plućima, zapaljenski odgovoru disajnom putu izazvan je udruženo sa povećanjem količine IgE i Th2 citokina u plućima, a to vodi ka asmatičnoj patologiji (Nat. Immunol., 2005, Vol.6, p.1047 do 1053). Dalje, kod nokaut miševa TSLP receptor ili astma modela kojima se daje anti-TSLP receptor antitelo, supresija Th2 citokina i IgE proizvodnje u krvi, i poboljšanje respiratorne funkcije su primećeni (J. Exp. Med., 2005, Vol.202, p.829 do 839, i Clin. Immunol., 2008, Vol.129. p.202 do 210). Dodatno, kod asmatičara, prijavljeno je da se ekspresije TSLP, TARC, i MDC povećavaju u astmatičnim disajnim putevima povezano sa ozbiljnošću bolesti (J. Immunol., 2005, Vol.174, p.8183 do 8190, i J. Immunol., 2008, Vol.181, p.2790 do 2798).

[0005] U pogledu sistemske skleroze, prijavljeno je da je TSLP prekomerno eksprimiran u koži pacijenata obolelih od sistemske skleroze (Arthritis Rheum., 2013, Vol.65, p.1335 do 1346), i da je ekspresija IL-13 i IL-17 na mestu zapaljenja gotovo potpuno suzbijena, a proporcija kolagena prema histopatologije značajno je poboljšana u bleomicinom-indukovanom skleroderma modelu upotrebom TSLP receptornokaut miševa (Ann. Rheum. Dis., 2013, Vol.72, p.2018 do 2023).

[0006] Shodno tome, kada monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za humani TSLP receptor i inhibira aktivnost humanog TSLP kroz humani TSLP receptor, može biti razvijeno, očekuje se da takvo antitelo je korisno za prevenciju i lečenje raznih bolesti u kojima su humani TSLP i humani TSLP receptor uključeni u patologiju bolesti.

[0007] Kao antitela protiv humanog TSLP receptora za koja je do sada izvedeno istraživanje, prijavljena su 13H5 kao mišje monoklonalno antitelo i hu13H5 kao njegovo humanizovano antitelo (Patentni dokument 1), 1D6.C9 kao mišje monoklonalno antitelo i Nv115-3B-IgG1 i NV115-3B-IgG4 kao njegova himerna antitela (Patentni dokument 2), NV164-1 i NV163-1 kao potpuno humana antitela (Patentni dokument 3), i TSLPR-012_141 kao humanizovano monoklonalno antitelo izvedeno iz hrčka.

[0008] Kod 13H5, neutrališuća aktivnost potvrđeno je u TSLP-indukovanom proliferacionom ogled upotrebom Ba/F3 ćelija koje stabilno eksprimiraju humani TSLP receptor, ali neutrališuća aktivnost kod hu13H5 nije još uvek potvrđeno (Patentni dokument 1). Dalje, na osnovu opisa Patentnih dokumenata 2 do 4, među antitelima opisanim u ovim dokumentima, prepoznato je da TSLPR-012_141 ima najveće neutrališuća aktivnost (Patentni dokumenti 2 do 4). TSLPR-012_141 je procenjen kroz razne testove neutrališuće aktivnosti. Na primer, u TSLP-indukovanom proliferacionom ogledu upotrebom Ba/F3 ćelija koje stabilno eksprimiraju humani TSLP receptor, TSLP-indukovan TARC, MDC, i ogleda IL-8 proizvodnje upotrebom humanih iz periferne krvi-izvedenih dendritskih ćelija, ogled TSLP-indukovane Th2 citokin proizvodnje upotrebom humanih iz periferne krvi-izvedenih dendritskih ćelija i ko-uzgajivanih sistema naivnih T ćelija, i slično, potvrđeno je da TSLPR-012_141 pokazuje neutrališuću aktivnost (Patentni dokument 4). Međutim, poželjno je antitelo koje pokazuje visoko neutrališuću aktivnost za upotrebu kao antitelo leka.

[0009] Glavni faktori koji određuju efektivnu dozu antitelo leka uključuju vezujuću aktivnost i neutrališuću aktivnost antitela protiv antigena kao i količina antigena koji je prisutan u telu. Povećavanje vezujuće aktivnosti i neutrališuće aktivnosti vodi ka smanjivanju doze, a kao rezultat, vodi ka smanjivanju finansijskog tereta i medicinskih troškova pacijenata, što predstavlja izuzetno povoljno poboljšanje.

[0010] Prema tome, potrebno je obezbediti antitelo protiv humanog TSLP receptora koje ima odličnu aktivnost u poređenju sa konvencionalnim antitelom protiv humanog TSLP receptora za upotrebu za preveniranje i lečenje raznih bolesti.

Povezano stanje tehnike

Patentni dokument

[0011]

[Patentni dokument 1] WO 2009/100324

[Patentni dokument 2] WO 2007/112146

[Patentni dokument 3] WO 2008/155365

[Patentni dokument 4] WO 2012/007495

Opis pronalaska

Problemi koji se rešavaju ovim pronalaskom

[0012] Predmet ovog pronalaska je da obezbedi antitelo protiv humanog TSLP receptora koje se specifično vezuje za humani TSLP receptor i inhibira aktivnost humanog TSLP kroz humani TSLP receptor.

Sredstva za rešavanje ovih problema

[0013] Kao rezultat intenzivnog istraživanja na proizvodnje antitela protiv humanog TSLP receptora, od strane ovih pronalazača, obezbeđeno je antitelo protiv humanog TSLP receptora koje obuhvata varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 118 iz SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 108 iz SEQ ID NO: 3. Otkriveno je da antitelo protiv humanog TSLP receptora inhibira TARC mRNK ekspresiju i proizvodnju MDC proteina indukovanih od strane TSLP (Primeri 5 i 6), i suzbijaju alergijsku reakciju u majmunskom Ascaris antigen nadražajnom modelu (Primer 7), čime se kompletira ovaj pronalazak.

[0014] Tako, ovaj pronalazak uključuje sledeće

[Tačka 1] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment odabran iz (1) ili (2) ispod:

(1) antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 118 iz SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 108 iz SEQ ID NO: 3;

(2) antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment u kojem glutaminska kiselina N kraja teškog lanca antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta iz (1) modifikovana je u piroglutaminsku kiselinu.

[Tačka 2] Antitelo protiv humanog TSLP receptora prema tački 1, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 3.

[Tačka 3] Antitelo protiv humanog TSLP receptora prema tački 1, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1, u kojem glutaminska kiselina aminokiselinskog broja 1 iz SEQ ID NO: 1 modifikovana je u piroglutaminsku kiselinu i/ili lizin aminokiselinskog broja 448 iz SEQ ID NO: 1 je obrisan, i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 3.

[Tačka 4] Antitelo protiv humanog TSLP receptora prema tački 3, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 447 iz SEQ ID NO: 1 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO.3.

[Tačka 5] Polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela prema tački 1(1) i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela prema tački 1(1).

[Tačka 6] Ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela prema tački 1(1) i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela prema tački 1(1).

[Tačka 7] Ćelija domaćin odabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih (a) do (d):

(a) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora prema tački 1(1) i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela;

(b) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora prema tački 1(1) i ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela;

(c) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora prema tački 1(1); i

(d) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora prema tački 1(1),

pri čemu ta ćelija domaćin eksprimira pomenuto antitelo.

[Tačka 8] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment proizveden postupkom koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina radi eksprimiranja antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, pri čemu je ćelija domaćin ćelija domaćin prema tački 7.

[Tačka 9] Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema tački 1(1) i/ili antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema tački 1(2), i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[Tačka 10] Farmaceutska kompozicija prema tački 9, koja obuhvata antitelo protiv humanog TSLP receptora prema tački 2 i/ili antitelo protiv humanog TSLP receptora prema tački 4, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[Tačka 11] Farmaceutska kompozicija prema tački 10, koja je farmaceutska kompozicija za sprečavanje ili lečenje astme.

[0015] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment iz tačaka 1-4 i 8 uključuje fuziju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i još jednog peptida ili proteina, i modifikacija koja ima modifikujući agens vezan za nju.

Efekti ovog pronalaska

[0016] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska se vezuje za humani TSLP receptor, ima neutrališuću aktivnost protiv aktivnosti humanog TSLP kroz humani TSLP receptor, i može se primeniti kao agens za sprečavanje ili lečenje alergijskih zapaljenskih bolesti kao što je astma ili sistemska skleroza.

Kratak opis crteža

[0017]

Fig.1 pokazuje inhibitornu aktivnost potpuno humanog T7-27 na Koncentraciju Ascaris antigenspecifičnog IgE u majmunskom Ascaris antigen nadražajnom modelu. Vertikalna osa predstavlja relativnu plazma koncentraciju Ascaris antigen-specifičnog IgE respektivnih uzoraka kada je plazma koncentracija Ascaris antigen-specifičnog IgE na Dan 22 jednog pojedinca iz Grupe nosača podešena na 2000 U/mL. Prikazane su IgE koncentracija na Dan 1 Grupe nosača i grupa u kojoj se daje antitelo (pre davanja Ascaris antigen tečnosti suspendovan aluminijum hidroksid gelo), IgE koncentracija na Dan 22 Grupe nosača, i IgE koncentracija na Dan 22 grupa u kojoj se daje antitelo.

Fig.2 pokazuje inhibitornu aktivnost potpuno humanog T7-27 na Ascaris antigen-specifičnu kožnu reakciju u majmunskom Ascaris antigen nadražajnom modelu. Prikazani su rezultati davanje fosfatnog puferovanog slanog rastvora (PBS) i 100 µg/mL Ascaris antigen rastvora na Dan 22. Vertikalna osa predstavlja vrednost (delta cm) kod koje je prečnik reakcije na koži izazvane sa PBS oduzet od prečnika reakcije na koži izazvane sa Ascaris antigen rastvorom.

Fig.3 pokazuje inhibitornu aktivnost anti-TSLP receptor antitela na reakciju hiperodgovora disajnih puteva u mišjem astma modelu. Vertikalna osa predstavlja vrednost PenH upotrebljenog kao indeks respiratorne funkcija (**p < 0.01, *p < 0.05, ##p< 0.01, #p< 0.05).

Fig.4 pokazuje inhibitornu aktivnost anti-TSLP receptor antitela na infiltraciju eozinofila u mišjem astma modelu. Vertikalna osa predstavlja broj eozinofila u BALF ćelijskoj suspenziji (**p < 0.01).

Fig.5 pokazuje inhibitornu aktivnost anti-TSLP receptor antitela na ekspresiju TARC mRNK u mišjem astma modelu. Vertikalna osa predstavlja nivo ekspresije TARC mRNK.

Primeri izvođenja za izvođenje ovog pronalaska

[0018] U nastavku, sledi detaljan opis ovog pronalaska.

[0019] Postoji pet klasa IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE u antitelu, a osnovna struktura molekula antitela konfigurisana je od teških lanaca koji imaju molekulsku masu od 50000 do 70000 i lakih lanaca koji imaju molekulsku masu od 20000 do 30000 u svakoj od zajedničkih klasa. Teški lanac obično se sastoji od polipeptidnog lanca koji obuhvata približno 440 aminokiselina, ima karakterističnu strukturu za svaku od klasa, i označen je kao Igγ, Igµ, Igα, Igδ, i Igε što odgovara IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE, respektivno. Dalje, četiri podklase IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4 prisutne su u IgG, a teški lanci koji respektivno odgovaraju označeni su kao Igγ1, Igγ2, Igγ3, i Igγ4. Laki lanac obično se sastoji od polipeptidnog lanca koji obuhvata 220 aminokiselina, od kojih su dva tipa, tip L i tip K poznati, i označeni su sa Igλ i Igκ. U peptidnoj konfiguraciji osnovne strukture molekula antitela, dva homologa teških lanaca i dva homologa lakih lanaca vezani su disulfidnim vezama (S-S veza) i ne-kovalentnim vezama, a njihova molekulska masa je 150000 do 190000. Dve vrste lakih lanaca mogu se upariti sa bilo kojim teškim lancem. Respektivni molekuli antitela tipično se sastoje od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca.

[0020] U pogledu međulančanih S-S veza, četiri S-S veze prisutne su u teškom lancu (pet u Igµ i Igε) i dve su prisutne u lakom lancu; jedna petlja formira se na 100 do 110 aminokiselinskih ostataka, a ova sterična struktura slična je među petljama i označena je strukturnom jedinicom ili domenom. Domen smešteni na amino terminalnoj (N terminal) strani i kod teškog lanca i lakog lanca, čija aminokiselinska sekvenca nije konstantna čak i u slučaju uzorka iz iste klase (podklasa) iste vrste životinje označen je kao varijabilni region, a respektivni domeni označeni su sa varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL). Aminokiselinska sekvenca karboksi terminalne (C terminalne) strane iz varijabilnog regiona približno je konstantna u svakoj klasi ili podklasi i označena je kao konstantan region (svaki od domena nazvani su CH1, CH2, CH3 i CL, respektivno).

[0021] Mesto određivanja antigena antitela konfigurisano je od VHi VL, a specifičnost vezivanja zavisi od aminokiselinske sekvence ovog mesta. Sa druge strane, biološke aktivnosti kao što je vezivanje za komplemente i razne ćelije odražavaju razlike u strukturama konstantnog regiona između sveka Ig. Smatra se da je varijabilnost varijabilnih regiona lakih lanaca i teških lanaca glavnom je ograničena na tri mala prisutna hipervarijabilna regiona i kod lanaca i ovih regiona označeni su sa regionima koji određuju komplementarnost (CDR: CDR1, CDR2, i CDR3 sa N terminalne strane). Preostali deo varijabilnog regiona označen je kao region okvira (FR) i relativno je konstantan.

[0022] Dalje, razne vrste antigen-vezujući fragmenata koji obuhvataju VHi VLantitela imaju antigen vezujuću aktivnost. Na primer, fragment jedno-lančanog varijabilnog regiona (scFv), Fab, Fab', i F(ab')2prikazani su kao tipični antigen-vezujući fragmenti. Fab e monovalentni antigen-vezujući fragment koji je konstituisan sa fragmentom lakog lanca i teškog lanca uključujući VH, CH1, i delom regiona šarke. Fab' je monovalentni antigen-vezujući fragment koji je konstituisan sa fragmentom lakog lanca i teškog lanca uključujući VH, CH1, i delom regiona šarke, a cisteinski ostatci koji se sastoje od među-teško-lančanih S-S veza uključeni su u deo regiona šarke. F(ab')2je bivalentan antigen-vezujući fragment koja ima dimernu strukturu u kojem se dva Fab' fragmenta međusobno vezuju putem među-teško-lančane S-S veze u regionu šarke. scFv je monovalentan antigen-vezujući fragment koji je konstituisan sa VHi VLpovezanim peptidom linkerom.

[0023] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku je antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima sledeće karakteristike.

[0024] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 118 iz SEQ ID NO: 1, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 108 iz SEQ ID NO: 3.

[0025] Poželjno, antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku ima prethodno opisane karakteristike i dalje obuhvata konstantan region teškog lanca i konstantan region lakog lanca. Kao konstantan region, bilo koja podklasa konstantnog regiona (na primer, konstantan region Igγ1, Igγ2, Igγ3, ili Igγ4 kao konstantan region teškog lanca i konstantan region Igλ, ili Igκ kao konstantan region lakog lanca) mogu se odabrati, ali je humani Igγ1 konstantan region poželjan kao konstantan region teškog lanca, a humani Igκ konstantan region poželjan je kao konstantan region lakog lanca.

[0026] Humani Igγ1 konstantan region uključuje, na primer, humani Igγ1 konstantan region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 119 do 448 iz SEQ ID NO:1.

[0027] Humani Igκ konstantan region uključuje, na primer, humani Igκ konstantan region koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 109 do 214 iz SEQ ID NO:3.

[0028] Kao antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku, dalje je poželjno antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata prethodno opisani varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca i u kojem konstantan region teškog lanca je humani Igγ1 konstantan region, a konstantan region lakog lanca je humani Igκ konstantan region.

[0029] U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku je scFv, Fab, Fab', ili F(ab')2.

[0030] Bilo koji stručnjak iz ove oblasti može da konstruiše fuziju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i još jednog peptida ili proteina i takođe može konstruisati modifikaciju koja ima modifikujući agens vezan za nju, upotrebom poznatog postupka iz ove oblasti. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku uključuje antitelo i njegov antigen-vezujući fragment u obliku takve fuzije ili modifikacije. Na primer, antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 118 iz SEQ ID NO: 1, i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 108 iz SEQ ID NO: 3 uključuje fuziju antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragment i još jednog peptida ili proteina, i modifikaciju koja ima modifikujući agens vezan za nju. Drugi peptid ili protein upotrebljen za fuziju nije naročito ograničen, sve dok ne smanjuje vezujuću aktivnost antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta; njihovi primeri uključuju humani albumin u serumu, razne peptide za tagovanje, veštački peptid heliksoidnog motiva, maltoza-vezujući proteine, glutaion S transferazu, razne toksine, druge peptide ili proteine koji mogu da promovišu multimerizaciju, i slično. Modifikujući agens upotrebljen za modifikaciju nije naročito ograničen, sve dok ne smanjuje vezujuću aktivnost antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta; njihovi primeri uključuju polietileni glikol, lance šećera, fosfolipide, lipozome, jedinjenja male molekularne mase jedinjenja i slično.

[0031] U jednom primeru izvođenja, antitelo protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska je antitelo protiv humanog TSLP receptora koje ima sledeći karakteristike.

[0032] Antitelo protiv humanog TSLP receptora koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 3.

[0033] U slučaju gde je antitelo izraženo u ćelijama, poznato je da je antitelo modifikovano posle translacije. Primeri post-translacione modifikacije uključuju odsecanje lizina od C kraja teškog lanca karboksipeptidazom, modifikaciju u piroglutaminsku kiselinu zbog piroglutamilacije glutaminske kiseline ili glutamina N kraja teškog lanca ili lakog lanca, i slično. Poznato je da lizin C kraja teškog lanca obrisan ili je veliki deo glutamina N kraja teškog lanca modifikovan u piroglutaminsku kiselinu (Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol.97, p.2426). Dalje, takođe je poznato da modifikacija posle translacije ne utiče na aktivnost antitela iz ove oblasti (Analytical Biochemistry, 2006, Vol.348, p.24 do 39).

[0034] Antitelo ovog pronalaska uključuje antitelo modifikovano posle translacije tokom ekspresije u ćelijama kao što je antitelo koje obuhvata teški lanac kojem nedostaje lizin C kraja, antitelo u kojem je glutamin ili glutaminska kiselina N kraja teškog lanca modifikovan u piroglutaminsku kiselinu zbog piroglutamilacije, i slično pored antitela koje obuhvata punu dužinu teškog lanca. Dalje, antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku uključuje antigen-vezujući fragment modifikovan posle translacije tokom ekspresije u ćelijama kao što je antigen-vezujući fragment u kojem je glutamin ili glutaminska kiselina N kraja teškog lanca modifikovana u piroglutaminsku kiselinu zbog piroglutamilacije.

[0035] Na primer, antitelo protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska uključuje antitelo protiv humanog TSLP receptora opisan u nastavku.

[0036] Antitelo protiv humanog TSLP receptora koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1, u kojem je glutaminska kiselina aminokiselinskog broja 1 iz SEQ ID NO: 1 modifikovana u piroglutaminsku kiselinu i/ili je lizin aminokiselinskog broja 448 iz SEQ ID NO: 1 obrisan, a laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 3.

[0037] Ovaj pronalazak uključuje antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment koji ima sledeći karakteristike.

[0038] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata CDR1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 31 do 35 iz SEQ ID NO: 1, CDR2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 50 do 66 iz SEQ ID NO: 1, i CDR3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 99 do 107 iz SEQ ID NO:1, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata CDR1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 24 do 34 iz SEQ ID NO: 3, CDR2 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 50 do 56 iz SEQ ID NO: 3, i CDR3 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 89 do 97 iz SEQ ID NO:3.

[0039] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku se vezuje za humani TSLP receptor. Da li se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje za humani TSLP receptor potvrđuje se upotrebom postupak merenja vezujuće aktivnosti u povezanom stanju tehnike. Primeri postupka merenja vezujuće aktivnosti uključuju postupak enzimskog imunosorbentnog ogleda (ELISA) ili postupak površinske plazmonske rezonance (SPR). U slučaju upotrebe ELISA, u primernom postupku, fuzioni protein humanog TSLP receptora i humanog Fc (humani TSLP receptor-humani Fc fuzioni protein (koji su kodirani osnovnom sekvencom iz SEQ ID NO: 5)) imobilisan je na ELISA ploči, i test antitelo mu je dodato radi reagovanja. Posle reakcije, sekundarno antitelo, kao što je anti-IgG antitelo ili slično obeleženo enzimom kao što je Peroksidaza rena (HRP) reagovano je, i oprano, a tada je moguće potvrditi da li se test antitelo vezuje za humani TSLP receptor putem merenja aktivnosti upotrebom reagensa koji detektuje tu aktivnost (na primer, u slučaju HRP obeležavanja, BM-Chemiluminescence ELISA Substrate (POD) (Roche Diagnostics. Inc.)). U slučaju upotrebe SPR, na primer, moguće je primeniti Biacore (registrovana trgovačka marka) 2000 (GE Healthcare Japan Corporation). U primernom postupku, test antitelo imobilisano je na površini senzornog čipa, fuzioni protein humanog TSLP receptora i mišji Fc (humani TSLP receptor-mišji Fc fuzioni protein (koji su kodirani osnovnom sekvencom iz SEQ ID NO: 6)) dodati su putanju protoka. Moguće je potvrditi da li se test antitelo vezuje za humani TSLP receptor analiziranjem konstante (ka) brzine

1

vezivanja, konstante (kd) brzine disocijacije, i konstante (KD) disocijacije između antitela i humanog TSLP receptora.

[0040] Dalje, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koje se vezuje za TSLP receptor dobijen iz drugih životinja (na primer, majmunski TSLP receptor), a vezujuća aktivnost u pogledu tih receptora može se izmeriti upotrebom istog postupka.

[0041] Poželjno, antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku vezuje se za humani TSLP receptor i ima neutrališuća aktivnost u pogledu humanog TSLP receptora. Neutrališuća aktivnost u pogledu humanog TSLP receptora označava aktivnost inhibiranja bilo koje biološe aktivnosti dovedene iz humanog TSLP vezivanjem za humani TSLP receptor, i mogu se proceniti na osnovu jedne ili više bioloških aktivnosti humanog TSLP kroz humani TSLP receptor kao indeks. Primeri takve neutrališuće aktivnosti uključuju inhibitornu aktivnost na TSLP-indukovanu TARC mRNK ekspresiju i inhibitornu aktivnost na TSLP-indukovanu proizvodnju MDC proteina upotrebom mononuklearnih ćelija iz ljudske periferne krvi (PBMC), a postupci opisani u Primerima 5 i 6 u nastavku mogu se primeniti kao postupak specifične procene te aktivnosti.

[0042] Za detaljniju procenu efekata antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta prema ovom pronalasku, može se primeniti in vivo test. Na primer, kako je opisano u Primeru 7 ispod, moguće je proceniti efekte antitela protiv humanog TSLP receptora in vivo sa testom anti-alergijske reakcije upotrebom majmunskog Ascaris antigen nadražajnog modela.

[0043] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku mogu se lako proizvesti od strane stručnjaka iz ove oblasti upotrebom poznatog postupka iz ove oblasti na osnovu sekvencionih informacija o varijabilnom regionu teškog lanca i varijabilnom regionu lakog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska koje su opisane u ovoj specifikaciji. Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku nije naročito ograničen, već se može proizvesti prema postupku opisanom u delu <Postupak proizvodnje antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska> u nastavku.

[0044] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku dalje je prečišćeno po potrebi i formulisano u skladu sa konvencionalnim postupkom. Ono se može upotrebiti za prevenciju ili lečenje bolesti u kojima su humani TSLP i humani TSLP receptor uključeni u patologiju bolesti, uključujući alergijske zapaljenske bolesti kao što je astma, i sistemska skleroza.

[0045] Polinukleotid ovog pronalaska uključuje polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska.

[0046] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska je polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 118 iz SEQ ID NO: 1.

[0047] Polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca prikazana sa aminokiselinskom sekvencom aminokiselinskih brojeva 1 do 118 iz SEQ ID NO: 1 uključuje, na primer, polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu iz osnovnih brojeva 1 do 354 iz SEQ ID NO:2.

[0048] U poželjnom primeru izvođenja, polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska je polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1.

[0049] Polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1 uključuje, na primer, polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu prikazanu sa SEQ ID NO: 2.

[0050] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska je polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 108 iz SEQ ID NO: 3.

[0051] Polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 108 iz SEQ ID NO: 3 uključuje, na primer, polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu iz osnovnih brojeva 1 do 324 iz SEQ ID NO: 4.

[0052] U poželjnom primeru izvođenja, polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska je polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 3.

[0053] Polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 3 uključuje, na primer, polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu prikazanu sa SEQ ID NO: 4.

[0054] Polinukleotid ovog pronalaska može se lako proizvesti od strane stručnjaka iz ove oblasti upotrebom poznatog postupka iz ove oblasti na osnovu osnovne sekvence. Na primer, polinukleotid ovog pronalaska može se sintetizovati upotrebom poznatog postupka sinteze gena iz ove oblasti. Postupak sinteze gena uključuje, na primer, razne postupke poznate stručnjaku iz ove oblasti kao što je postupak sinteze gena antitela, opisan u WO90/07861.

[0055] Ekspresioni vektor ovog pronalaska uključuje ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i/ili polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska.

[0056] Poželjni ekspresioni vektori ovog pronalaska uključuju ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira teški lanac antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska, ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska, ili ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira teški lanac antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela.

[0057] Ekspresioni vektori upotrebljen za eksprimiranje polinukleotida ovog pronalaska nisu naročito ograničeni dokle god polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i/ili polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska može biti eksprimiran u raznim ćelijama domaćinima eukariotiskih ćelija (na primer, životinjske ćelije, ćelije insekta, biljne ćelije, i kvasac) i/ili prokariotske ćelije (na primer, Escherichia coli), a mogu se proizvesti i njima kodirani polipeptidi. Primeri ekspresionog vektora uključuju plazmid vektore, virusne vektore (na primer, adenovirus ili retrovirus), i slično. Poželjno, mogu se primeniti pEE6.4 ili pEE12.4 (Lonza, Inc.). Dalje, geni antitela mogu biti eksprimirani transferovanjem fragmenta gena varijabilnog regiona u ekspresione vektore koji obuhvataju gene humanog Ig konstantnog regiona unapred kao što je AG-γ1 ili AG-κ (na primer, videti WO94/20632).

[0058] Ekspresioni vektor ovog pronalaska može da uključuje promoter koji je funkcionalno vezan za polinukleotid ovog pronalaska. Primeri promotera za eksprimiranje polinukleotida ovog pronalaska sa životinjskim ćelijama uključuju iz virusa izveden promoter kao što je CMV, RSV, ili SV40, aktinski promoter, EF (faktor izduženja) 1α promoter, i promoter toplotnog šoka. Primeri promotera za ekspresiju putem bakterije (na primer, Escherichia) uključuju trp promoter, lac promoter, λPL promoter, i tac promoter. Dalje, primeri promotera za ekspresiju putem kvasca uključuju GAL1 promoter, GAL10 promoter, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, i ADH promoter.

[0059] Transformisana ćelija domaćin ovog pronalaska uključuje ćeliju domaćina transformisanu sa ekspresionim vektorom ovog pronalaska koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih (a) do (d):

1

(a) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela;

(b) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela;

(c) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska; i

(d) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska,

a ta ćelija domaćin eksprimira pomenuto antitelo.

[0060] U jednom primeru izvođenja, transformisana ćelija domaćin ovog pronalaska je ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom ovog pronalaska koji je odabran iz grupe koja se sastoji od sledećih (a) do (d):

(a) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira teški lanac antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela;

(b) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira teški lanac antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela;

(c) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira teški lanac antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska; i

(d) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska,

a ta ćelija domaćin eksprimira pomenuto antitelo

[0061] U slučaju upotrebe životinjske ćelije, ćelije insekta, ili kvasca kao ćelije domaćina, ekspresioni vektor ovog pronalaska može da obuhvata inicijacioni kodon i terminacioni kodon. U ovom slučaju, ekspresioni vektor ovog pronalaska može da obuhvata pojačivačku sekvencu, untranslatovan region na 5' strani i 3' strani gena koji kodira antitelo ovog pronalaska ili varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca, signalnu sekvencu lučenja, tačkusplajsovanja, mesto poliadenilacije, ili zamenska jedinica. Kada se Escherichia coli upotrebljava kao ćelija domaćin, ekspresioni vektor ovog pronalaska može da obuhvata inicijacioni kodon, terminacioni kodon, terminator region, i zamensku jedinicu. U ovom slučaju, ekspresioni vektor ovog pronalaska može da obuhvata selekcioni marker (na primer, tetraciklin rezistentni geni, ampicillin rezistentni geni, kanamicin rezistentni geni, neomicin rezistentni geni, ili geni dihidrofolatne reduktaze) koji je generalno upotrebljava po potrebi.

[0062] Poželjni primeri transformisane ćelije domaćina ovog pronalaska uključuju ćelije domaćina transformisane sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira teški lanac antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela, i ćelije domaćina transformisane sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira teški lanac antitela protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska i ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela.

[0063] Transformisana ćelija domaćin nije naročito ograničena dokle god je ta ćelija domaćin pogodna za ekspresioni vektor koji se upotrebljava, transformisana sa ekspresionim vektorom, i može da eksprimira antitelo. Primeri transformisane ćelije domaćina uključuju razne ćelije kao što su prirodne ćelije ili veštački utvrđene ćelije koje se generalno upotrebljavaju u oblasti ovog pronalaska (na primer, životinjske ćelije (na primer, CHO-K1SV ćelije), ćelije insekta (na primer, Sf9), bakterija (na primer, Escherichia), kvasac (na primer, Saccharomyces ili Pichia) ili slično). Poželjno mogu se primeniti uzgajane ćelije kao što su CHO-K1SV ćelije, CHO-DG 44 ćelije, 293 ćelije, ili NS0 ćelije.

[0064] Postupak transformisanja ćelija domaćina nije naročito ograničen, već se, na primer, može primeniti postupak kalcijum fosfata ili postupak elektroporacije.

[0065] Postupci proizvodnje antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema ovom opisu uključuju postupak proizvodnje antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji obuhvata uzgajanje transformisane ćelije domaćina ovog pronalaska radi eksprimiranja antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0066] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku uključuje antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment proizveden postupkom proizvodnje antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta prema ovom pronalasku.

1

[0067] Postupak proizvodnje antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema ovom opisu nije naročito ograničen dokle god taj postupak obuhvata uzgajanje transformisane ćelije domaćina ovog pronalaska radi eksprimiranja antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Poželjna ćelija domaćin upotrebljena u ovom postupku uključuje transformisanu ćeliju domaćina ovog pronalaska koja je prethodno opisana kao poželjan primer.

[0068] Transformisana ćelija domaćin može se uzgajati poznatim postupcima. Uslovi uzgajanja, na primer, temperatura, pH podloge za uzgajanje, i vreme uzgajanja, pogodno se biraju. U slučaju gde je ćelija domaćin životinjska ćelija, primeri podloge za uzgajanje uključuju MEM podlogu za uzgajanje dopunjenu sa približno 5% do 20% fetalnog goveđeg seruma (Science, 1959, Vol.130, No.3373, p.432 do 7), DMEM podloga za uzgajanje (Virology, 1959, Vol.8, p.396), i RPMI1640 podloga za uzgajanje (J. Am. Med. Assoc., 1967, Vol.199, p.519), 199 podloga za uzgajanje (Exp. Biol. Med., 1950, Vol.73, p.1 do 8). pH podloge za uzgajanje poželjno je približno 6 do 8, i uzgajanje se generalno izvodi na približno 30°C do 40°C tokom približno 15 sati do 72 sata uz ventiliranje i mešanje ako je potrebno. U slučaju gde je ćelija domaćin ćelija insekta, kao podloga za uzgajanje, na primer, može se primeniti Grace-ova podloga za uzgajanje (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, Vol.82, p.8404) dopunjena sa fetalnim goveđim serumom. pH podloge za uzgajanje poželjno je približno 5 do 8, a uzgajanje se generalno izvodi na približno 20°C do 40°C tokom približno 15 sati do 100 sati uz ventiliranje i mešanje ako je potrebno. U slučaju gde je ćelija domaćin Escherichia coli ili kvasac, kao podloga za uzgajanje, pogodna je na primer, tečna podloga za uzgajanje dopunjena sa zvorom nutrijenata. Poželjno je da podloga za uzgajanje sa nutrijentima uključuje izvor ugljenika, izvor neorganskog azota, ili izvor organskog azota neophodni za rast transformisane ćelije domaćina. Primeri izvora ugljenika uključuju glukozu, dekstran, rastvorivi skrob, i saharozu, a primeri izvora neorganskog azota ili izvora organskog azota uključuju soli amonijuma, soli nitrata, aminokiseline, kukuruznu tečnost, pepton, kazein, ekstrakt mesa, sojinu sačmu, i ekstrakt krompira. Drugi nutrijenti (na primer, neorganske soli (na primer, kalcijum hlorid, natrijum dihidrogen fosfat, i magnezijum hlorid), vitamini), i antibiotici (na primer, tetraciklin, neomicin, ampicillin, i kanamicin) po potrebi mogu biti uključeni. pH podloge za uzgajanje poželjno je približno 5 do 8. U slučaju gde je ćelija domaćin Escherichia coli, poželjni primeri podloge za uzgajanje uključuju LB podlogu za uzgajanje i M9 podlogu za uzgajanje (Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, Vol.3, A2.2). Uzgajanje se generalno izvodi na približno 14°C do 43°C tokom približno 3 sata do 24 sata uz ventiliranje i mešanje ako je potrebno. U slučaju gde je ćelija domaćin kvasac, kao podloga za uzgajanje, može se primeniti, na primer, Burkholder minimalna podloga (Proc. Natl. Acad, Sci, USA, 1980, Vol.77, p.4505). Uzgajanje se generalno izvodi na približno 20°C do 35°C tokom približno 14 sati do 144 sati uz ventiliranje i mešanje ako je potrebno. Izvođenjem uzgajanja na prethodno opisan način, moguće je

1

eksprimiranje antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema ovom pronalasku.

[0069] Postupak proizvodnje antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema ovom opisu može da uključi izdvajanje, poželjno izolovanje ili prečišćavanje antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta iz transformisane ćelije domaćina pored uzgajanja transformisane ćelije domaćina ovog pronalaska radi eksprimiranja antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Primeri postupaka izolovanja ili prečišćavanja uključuju postupke koji koriste rastvorivost kao što je postupak izdvajanja soli i postupak taloženja rastvarača, postupci koji koriste razliku u molekulskoj masi kao što je dijaliza, ultrafiltracija, i gel filtracija, postupci koji koriste naelektrisanje kao što je jono izmenjivačka hromatografija i hidroksilapatitna hromatografija, postupci koji koriste specifičan afinitet kao što je afinitetna hromatografija, postupci koji koriste razliku u hidrofobnosti kao što je reverzno fazna tečna hromatografija visokih performansi, i postupci koji koriste razliku u izoelektričnoj tački kao što je izoelektrična fokusirajuća foreza. Poželjno, antitelo akumulirano u supernatant kulture mogu se prečistiti raznim hromatografijama, na primer, hromatografija na koloni upotrebom Protein A kolone ili Protein G kolone.

[0070] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska uključuju farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku i farmaceutski prihvatljive ekscipijense. Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može pripremiti postupkom koji se uopšteno koristi sa ekscipijensima, koji su, ekscipijensi leka ili nosači leka koji se uopšteno koriste u ovoj oblasti. Primeri doznih oblika farmaceutskih kompozicija uključuju parenteralni lek kao što je injekcioni lek i lek za ukapavanjem infuzijom, a oni se mogu davati intravenoznim davanjem, subkutanim davanjem, ili slično. U pripremanju leka, ekscipijensi, nosači, i aditivi u skladu sa doznim oblicima mogu se primeniti u okviru farmaceutski prihvatljivog opsega.

[0071] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska moguda uključe više vrsta antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovih antigen-vezujućih fragmenata, prema ovom pronalasku. Na primer, ovaj pronalazak uključuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata antitelo u kojem je lizin C kraja teškog lanca obrisan, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa post-translacionom modifikaciju na N kraju, antitelo u kojem je lizin C kraja teškog lanca obrisan i izvedena je post-translaciona modifikacija na N kraju, i/ili antitelo koje ima lizin C kraja teškog lanca i nema post-translacionu modifikacija na N kraju.

[0072] Na primer, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska koji obuhvata antitelo protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska uključuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata dve ili više vrsta antitela protiv humanog TSLP receptora odabranih od (1) do (4) u nastavku.

1

(1) Antitelo protiv humanog TSLP receptora, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 447 iz SEQ ID NO: 1, i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 3.

(2) Antitelo protiv humanog TSLP receptora, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1 gde je glutaminska kiselina aminokiselinskog broja 1 modifikovana piroglutaminskom kiselinom i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO.3.

(3) Antitelo protiv humanog TSLP receptora, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 447 iz SEQ ID NO: 1 gde je glutaminska kiselina aminokiselinskog broja 1 modifikovana piroglutaminskom kiselinom i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO.3.

(4) Antitelo protiv humanog TSLP receptora, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO.3.

[0073] Dodavanje količine antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema ovom pronalasku u pripremanju leka varira zavisno od stepena simptoma pacijenta, starosti pacijenta, doznog oblika leka koji se koristi, vezujućeg titra antitela, ili slično, i na primer, može se primeniti količine dodavanja od približno 0.001 mg/kg do 100 mg/kg.

[0074] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može se primeniti kao farmaceutska kompozicija za sprečavanje ili lečenje bolesti kod kojih je humani TSLP i humani TSLP receptor umešan u patologiju bolesti, kao što je astma.

[0075] Ovaj pronalazak uključuje farmaceutsku kompoziciju za sprečavanje ili lečenje astme koji obuhvata antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku. Dalje, ovaj pronalazak uključuje postupak za sprečavanje ili lečenje astme, koji obuhvata davanja terapeutski efektivne količine antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigenvezujući fragment prema ovom pronalasku. Dodatno, ovaj pronalazak uključuje antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku, za upotrebu u preveniranju ili lečenju astme. Dodatno, ovaj pronalazak uključuje upotrebu antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom pronalasku za proizvodnju farmaceutske kompozicije za sprečavanje ili lečenje astme.

[0076] Ovaj pronalazak opisan je uopšteno, a obezbeđeni su specifični primeri na koje poziva radi boljeg razumevanja, uz napomenu da su to samo primeri i da ovaj pronalazak nije ograničen na njih.

[Primeri]

1

[0077] U pogledu delova koji koriste komercijalno dostupne komplete ili reagense, testovi su izvedeni u skladu sa priloženim protokolom ukoliko nije drugačije naznačeno. Dalje, praktičnosti radi, koncentracija mol/L izražena je kao M. Na primer, 1 M vodeni rastvor natrijum hidroksida označava 1 mol/L vodenog rastvora natrijum hidroksida.

(Primer 1: pribavljanje TSLP receptor-Fc fuzionog proteina)

[0078] Radi procenjivanja vezujuće aktivnosti antitela, fuzioni protein humanog TSLP receptora i humani Fc (humani TSLP receptor-humani Fc fuzioni protein), fuzioni protein humanog TSLP receptora i mišji Fc (humani TSLP receptor-mišji Fc fuzioni protein), i fuzioni protein majmunskog TSLP receptora i humani Fc (majmunski TSLP receptor-humani Fc fuzioni protein) su dobijeni. Humani TSLP receptor-humani Fc fuzioni gen (SEQ ID NO: 5), humani TSLP receptor-mišji Fc fuzioni gen (SEQ ID NO: 6), i majmunski TSLP receptor-humani Fc fuzioni gen (SEQ ID NO: 7) respektivno su rekombinovani sa ekspresionim vektorima sisarskih ćelija, GS vektorima (Lonza, Inc.) pEE12.4. Pripremljeni vektori su genski-transferovane u FreeStyle 293 ćelije (Life technologies, Inc) upotrebom reagens ya transferovanje gena 293 fektina (Life technologies, Inc), a te ćelije su uzgajane pomoću sistema uzgajanja bez seruma upotrebom FreeStyle 293 Ekspresione podloge (Life technologies, Inc) tokom jedne nedelje, a zatim su respektivno dobijeni supernatanti kulture koji obuhvataju humani TSLP receptor-humani Fc fuzioni protein, humani TSLP receptor-mišji Fc fuzioni protein, i majmunski TSLP receptor-humani Fc fuzioni protein. Respektivni TSLP receptor-Fc fuzioni proteini prečišćeni su upotrebom kolone za prečišćavanje proteina Protein G kolona (GE Healthcare Japan Corporation) od dobijenih supernatanata kulture.

(Primer 2: pribavljanje TSLP mutant-Flag proteina)

[0079] Radi procenjivanja neutrališuće aktivnosti antitela, obezbeđeni su humani TSLP mutant protein sa Flag tagom (human TSLP mutant-Flag protein) i majmunski TSLP mutant protein sa Flag tagom (majmunski TSLP mutant-Flag protein). Humani ili majmunski TSLP mutant-Flag gen (SEQ ID NO: 8 ili 9 (kako bi se sprečil da se aktivnost izgubi isecanjem kroz furin proteazu, aminokiselinske sekvence humanog ili majmunskog divljeg tipa TSLP u kojima se mutacija uvodi na mesto isecanja, respektivno su kodirane) respektivno rekombinovani GS vektorima pEE12.4. Pripremljeni vektori su genskitransferovani u FreeStyle 293 ćelije upotrebom 293 fektina, i te ćelije su uzgajane pomoću sistema uzgajanja bez seruma upotrebom FreeStyle 293 Ekspresione podloge tokom jedne nedelje, a zatim su respektivno dobijeni supernatanti kulture koji obuhvataju humane TSLP mutant-Flag proteine ili majmunske TSLP mutant-Flag proteine. Respektivni TSLP mutant-Flag proteini prečišćeni su upotrebom gela sa afinitetom prema anti-FLAG M2 antitelu (Sigma, Inc.) od dobijenih supernatanata kulture.

(Primer 3: pripremanje potpuno humanog antitela protiv humanog TSLP receptora)

1

[0080] Tehnologija "VelocImnune" za razvoj humanog monoklonalnog antitela

(VelocImmune antibody technology: Regeneron, Inc. (US Patent No.6596541) miš je imunizovan adjuvansom radi izazivanja imune reakcije, humani TSLP receptor-Fc (R&D, Inc.), i humani TSLP receptor koji eksprimira Ba/F3 ćelije (pripremljen transferovanjem vektora koji kodiraju gene humanog TSLP receptora (SEQ ID NO: 10) i gene humanog IL-7 receptora α lanca (SEQ ID NO:11) na mišje Ba/F3 ćelije (RIKEN: RCB0805)). Prema konvencionalnom postupku, jetra i limfni čvor imunizovanog miša su ekstraktovani, limfociti su sakupljeni, i fuzionisani ćelijama sa mišjim ćelijama mijeloma SP2/0 (ATCC CRL-1581), čime se priprema hibridom. Hibridom je monokloniran, a zatim uzgajan u CD hibridom podlogi za uzgajanje (Life technologies, Inc.) koja je podloga bez seruma. Antitelo je prečišćeno upotrebom kompleta za prečišćavanje antitela Protein G komplet za prečišćavanje (Proteus, Inc.) od dobijenih supernatanata kulture.

[0081] Radi procenjivanja vezujuće aktivnosti antitela, ELISA koja koristi humani TSLP receptor-humani Fc fuzioni protein i majmunski TSLP receptor-humani Fc fuzioni protein pripremljen u Primeru 1 respektivno je izvedena. Dalje, radi procenjivanja neutrališuće aktivnosti antitela, izvedeni su ogled inhibicije rasta ćelija humanog TSLP receptora koji eksprimira Ba/F3 ćelije stimulacijom majmunskih TSLP mutant-Flag proteina, pripremljen u Primeru 2 i ogled inhibicije proizvodnje MDC proteina u celok krvi majmuna stimulacijom majmunskih TSLP mutant-Flag proteina pripremljenih u Primeru 2.

[0082] Iz prethodno opisanih testova, otkriveno je da antitelo (himerno antitelo) označeno kao T7-27 had vezujuću aktivnost i neutrališuću aktivnost u pogledu humanih i majmunskih TSLP receptora.

Klonirani su geni koji kodiraju antitela teškog lanca i lakog lanca iz hibridoma koji proizvodi T7-27 i izvedene determinacije sekvenci.

[0083] U prethodno opisanom antitelu, varijabilni region je izveden iz čoveka, a konstantan region je izveden iz miša. Iz ovog razloga, ekspresioni vektori koji obuhvataju gene i teškog lanca i lakog lanca konstruisani su upotrebom GS vektora i potpuno humano antitelo je pripremljeno. Specifično, geni koji kodiraju signalne sekvence (Nigel Whittle et al., Protein Engineering 1987; 1(6): 499 do 505.) povezani su sa genima 5' strane varijabilnog regiona teškog lanca antitela T7-27, a geni konstantnog regiona (koji se sastoji od osnovne sekvence osnovnih brojeva 355 do 1344 iz SEQ ID NO: 2) humanog Igy1 povezani su sa njegovom 3' stranom, a su zatim geni teškog lanca umetnuti u GS vektor pEE6.4. Dalje, geni koji kodiraju signalne sekvence (Nigel Whittle et al., mentioned above) povezani su sa 5' stranom gena varijabilnog regiona lakog lanca antitela, a geni konstantnog regiona (koji se sastoji od osnovne sekvence osnovnih brojeva 325 do 642 iz SEQ ID NO: 4) humanog Igκ povezani su sa njegovom 3' stranom, a zatim su geni lakog lanca umetnuti u GS vektor pEE12.4.

[0084] Osnovna sekvenca koja kodira teški lanac potpuno humanog antitela pripremljenog T7-27 (potpuno human T7-27) prikazana je sa SEQ ID NO: 2, aminokiselinska sekvenca kodirana njome prikazana je sa SEQ ID NO: 1, a osnovna sekvenca koja kodira laki lanac antitela prikazana je sa SEQ ID

2

NO: 4, i aminokiselinska sekvenca kodirana njome prikazana je sa SEQ ID NO: 3. Varijabilni region teškog lanca potpuno humanog T7-27 sastoji se od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 118 iz SEQ ID NO: 1, a CDR1, CDR2, i CDR 3 teškog lanca respektivno se sastoje od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 31 do 35, 50 do 66, i 99 do 107 iz SEQ ID NO: 1. Varijabilni region lakog lanca potpuno humanog T7-27 sastoji se od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 108 iz SEQ ID NO: 3, a CDR1, CDR2, i CDR 3 lakog lanca respektivno se sastoje od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 24 do 34, 50 do 56, i 89 do 97 iz SEQ ID NO: 3.

[0085] Antitelo je eksprimirano upotrebom dve vrste postupaka tranzijentne ekspresija i konstitutivne ekspresije sa prethodno opisanim GS vektorima u koje se geni teškog lanca i lakog lanca antitela respektivno umeću. U pogledu tranzijentne ekspresija, ekspresioni vektori i teškog lanca i lakog lanca transfektuju se upotrebom 293 fektina u pogledu FreeStyle 293 ćelija uzgajanih na približno 1,000,000 ćelije/mL u FreeStyle 293 Ekspresionim podlogama, a zatim uzgajani tokom 7 dana. Alternativno, ekspresioni vektori i teškog lanca i lakog lanca opisan gore, transfektuju se upotrebom postupka elektroporacije u pogledu približno 10,000,000 CHO-K1SV ćelija (Lonza, Inc.), a zatim uzgajani u CD-CHO podlozi (Life technologies, Inc.) tokom 7 dana. Supernatanti kulture prečišćeni su upotrebom Protein A kolone ili Protein G kolone (GE Healthcare Japan Corporation) i dobijeno je prečišćeno antitelo potpuno humanog antitela. U pogledu konstitutivne ekspresije, GS vektori u koje se geni teškog lanca i lakog lanca antitela respektivno umeću, odsečeni su restikcionim enzimom za NotI i Pvul, a ligacija je izvedena upotrebom kompleta Ligation-Convenience Kit za ligaciju (NIPPONGENE, Inc.) ili reagensa za ligaciju Ligation-high (TOYOBO, Inc.), a zatim su konstruisani GS vektori u koje su umetnuti geni i teškog lanca i lakog lanca. Ekspresioni vektori kodiraju punu dužinu teškog lanca i lakog lanca, a antitelo je eksprimirano transfekcijom u CHO-K1SV ćelijama. Supernatanti kulture prečišćeni su Protein A kolonom ili Protein G kolonom (GE Healthcare Japan Corporation), i dobijeno je prečišćeno antitelo potpuno humanog antitela. Kao rezultat analiziranja aminokiseline modifikacije prečišćenog potpuno humanog T7-27, brisanja lizina teškog lanca C kraja javila su se u velikom delu prečišćenog antitela.

(Primer 4: procena vezujuće aktivnosti putem SPR analize)

[0086] Za detaljno merenje vezujuće aktivnosti potpuno humanog T7-27, izvedena je SPR analiza. U ovom primeru, antitelo protiv humanog TSLP receptora TSLPR-012_141 (Patentni dokument 4) upotrebljeno je kao uporedno antitelo.

[0087] U SPR analizi, analiza je izvedena upotrebom Biacore (registrovana trgovačka marka) 2000 (GE Healthcare Japan Corporation). Respektivna antitela protiv humanog TSLP receptora imobilizovana su na površini senzornog čipa CM5 upotrebom kompleta za hvatanje humanih antitela i kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare Japan Corporation). Humani TSLP receptor-mišji Fc fuzioni protein dobijen u Primeru 1 serijski je razblažen HBS-EP rastvorom (GE Healthcare Japan Corporation), i 100 µL rastvora dodato je toku pri brzini protoka od 50 µL/min. Ovim sistemom za merenje, izračunate su konstante (ka) brzine vezivanja, konstante (kd) brzine disocijacije, i konstante (KD) disocijacije humanog TSLP receptor-mišjeg Fc fuzionog proteina i antitelo protiv humanog TSLP receptora upotrebom softvera za analizu podataka (BIA Procena) (Tabela 1).

Tabela 1: Vezujuća aktivnost u pogledu humanog TSLP receptora pomoću SPR analize

[0088]

[Tabela 1]

[0089] Kao rezultat, postaće jasno da potpuno humano T7-27 ima približno 3 puta jaču vezujuću aktivnost u poređenju sa TSLPR-012_141.

(Primer 5: Procena inhibicije TSLP-indukovane TARC mRNK ekspresije upotrebom humanih PBMC) [0090] Radi procenjivanja neutrališuće aktivnosti potpuno humanog T7-27, procenjena je inhibicija TSLP-indukovane TARC mRNK ekspresije u mononuklearnim ćelijama iz ljudske periferne krvi (PBMC). Kako humane PBMC uključuju dendritske ćelije koje eksprimiraju TSLP receptor, humane PBMC mogu se primeniti radi procenjivanja antitela protiv humanog TSLP receptora. Kao uporedno antitelo, upotrebljeno je TSLPR-012_141. Iz rezultata Test Primera 1 opisanog u nastavku, kako je pronađena veza između poboljšanja patologije astma modela i inhibicije krvne TARC mRNK ekspresije upotrebom anti-TSLP receptor antitelo, ovaj sistem za procenu je sistem za procenu koji ukazuje na efektivnost na patologiju.

[0091] 200,000 ćelija humanog PBMC (AllCells, Inc.) po bazenčiću ploča sa 96 bazenčića (Gleiner, Inc.) zasejane su na 160 µL PRMI1640 podloge za uzgajanje (Life technologies, Inc.). Serije razblaženja (7 faza konačne koncentracije u opsegu od 0.1 ng/mL do 100 ng/mL) humanih TSLP mutant-Flag proteina pripremljenih u Primeru 2 pripremljene su u RPMI164 podlozi za uzgajanje i 20 µL te podloge dodato je rastvoru za uzgajanje, praćeno inkubacijom tokom 24 sata u CO2inkubatoru čija temperatura je podešena na 37°C. Zatim, pripremljena su respektivna antitela protiv humanog TSLP receptora u RPMI1640 podlozi tako da konačna koncentracija postane 0.3 µg/mL, i dodat rastvoru za uzgajanje u količini od 20 µL, i dalje inkubisana tokom 72 sata. Kao kontrolni uzorak, bazenčić u koji je RPMI1640 podloga za uzgajanje dodata umesto humanih TSLP mutant-Flag proteina i bazenčić u koji je RPMI1640 podloga za uzgajanje dodata umesto antitela respektivno su pripremljene.200 µL supernatanta kulture je uklonjeno, a zatim ukupna RNK ekstraktovana je sa 30 µL vodom upotrebom kompleta RNeasy 96 kit (Qiagen, Inc.) za RNK prečišćavanje. Naknadno, 10 µL RNK podvrgnuto je reakciji reverzne transkripcije upotrebom kompleta za reverznu transkripciju, High Capacity cDNK Reverse Transcription Kit (Life technologies, Inc.). Dalje, nivo ekspresije TARC mRNK izmeren je TaqMan PCR postupkom upotrebom TaqMan sonde TARC (Ccl17, Hs00171074, Life technologies, Inc), TaqMan sonde β aktina (Actb, Hs99999903, Life technologies, Inc.), Express qPCR SuperMix (A10313, Life technologies, Inc.) i 2 µL cDNK. Test je dupliran za respektivna antitela, i rezultat merenja analiziran upotrebom poredbenog CT postupka, a zatim je izračunat nivo ekspresije TARC mRNK. Naknadno, brzina inhibicije antitela u svakoj TSLP koncentraciji je izračunata. Brzina inhibicije bazenčića u kojem je RPMI1640 podloga za uzgajanje dodata umesto humanih TSLP mutant-Flag proteina podešena je na 100% i prosečna vrednost bazenčića u koji je 30 ng/ml i 100 ng/ml humanih TSLP mutant-Flag proteina respektivno dodato podešena je kao brzina inhibicije od 0%. Izračunata brzina inhibicije je analizirana, i izračunata TSLP koncentracija koja ima 50% brzine inhibicije 0.3 µg/mL antitela (Tabela 2) podešavanjem logističke krive tri parametra. Kako se povećava ova TSLP koncentracija, neutrališuća aktivnost u pogledu TSLP test antitela postaje snažnija.

Tabela 2: Aktivnost inhibicije TSLP-indukovane TARC mRNK ekspresije upotrebom humanih PBMC [0092]

[Tabela 2]

[0093] Kao rezultat, postaće jasno da potpuno humano T7-27 ima približno 12 puta veću inhibicionu aktivnost protiv humane TSLP-indukovane TARC mRNK ekspresije u poređenju sa TSLPR-012_141.

(Primer 6: Procena inhibicije TSLP-indukovane prozvodnje MDC proteina upotrebom humanih PBMC)

[0094] Inhibicija TSLP-indukovane prozvodnje MDC proteina u humanim PBMC određena je radi procenjivanja neutrališuće aktivnosti potpuno humanog T7-27. Kao uporedno antitelo, upotrebljeno je TSLPR-012_141.

[0095] Ljudska krv razblažena je u istoj količini PBS, i laminirana na istu količinu Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Japan Corporation), a zatim podvrgnuta centifugalnoj obradi pod uslovima sobne temperature, 400 x g, i tokom 30 minuta, čime se pripremaju humane PBMC. Približno 300,000 ćelija humanog PBMC po bazenčiću ploča sa 96 bazenčića (Gleiner, Inc.) zasejane su na 100 µL PRMI1640

2

podloge za uzgajanje (Life technologies, Inc.). Humani TSLP mutant-Flag protein pripremljen u Primeru 2 pripremljen je u RPMI1640 podlozi za uzgajanje tako da njegova konačna koncentracija postane 5 ng/mL, i dodat rastvoru za uzgajanje u njegovog količini od 10 µL, praćeno inkubacijom tokom 24 sata u CO2inkubatoru čija temperatura je podešena na 37°C. Zatim, pripremljene su serije razblaženja (5 faza konačne koncentracije u opsegu od 0.1 ng/mL do 10 µg/mL) respektivnih antitela protiv humanog TSLP receptora na RPMI164 podlozi za uzgajanje i 10 µL te podloge dodato je rastvoru za uzgajanje, praćeno inkubacijom tokom 5 dana. Kao kontrolni uzorak, respektivno su pripremljeni bazenčić u koji je RPMI1640 podloga za uzgajanje dodata umesto humanih TSLP mutant-Flag proteina i bazenčić u koji je RPMI1640 podloga za uzgajanje dodata umesto antitela. Naknadno, supernatanti kulture su sakupljeni i količina proizvodnje MDC procenjena je upotrebom kompleta Human CCL22/MDC Quantikine ELISA (R&D, Inc.) sa supernatantima razblaženim 20 puta putem PBS (Life technologies, Inc.). Test je dupliran za respektivna antitela, a brzina inhibicije za svaku koncentraciju antitela je izračunata. Brzina inhibicije bazenčića u koji je RPMI1640 podloga za uzgajanje dodata umesto humanih TSLP mutant-Flag proteina, podešena je na 100%, a brzina inhibicije bazenčića u koji je RPMI1640 podloga za uzgajanje dodata umesto antitela podešena je na 0%. Antitelo koncentracija koja ima 50% brzinu inhibicije, izračunata je kao IC 50 (Tabela 3) podešavanjem logističke krive tri parametra.

Tabela 3: Procena inhibicije TSLP-indukovane prozvodnje MDC proteina upotrebom humanih PBMC [0096]

[Tabela 3]

[0097] Kao rezultat, postaće jasno da potpuno humano T7-27 ima približno 9 puta veću inhibicionu aktivnost protiv TSLP-indukovane prozvodnje MDC proteina u poređenju sa TSLPR-012_141.

(Primer 7: Procena potpuno humanog T7-27 u majmunskom Ascaris antigen nadražajnom modelu)

[0098] Ascaris antigen specifično IgE indukovano je omogućavajući nadraživanje majmuna Ascaris antigenom, i reakcija na koži izazvana je kao alergijska reakcija.

[0099] Ascaris antigen tečnost (DNP-Ascaris (LSL, Inc.)) suspendovana u gelu aluminjum peroksida (u nastavku, označeno kao Alum) (0.5 mg/mL DNP-Ascaris suspendovan u PBS pri koncentraciji od 50 mg/mL Alum, u nastavku, označeno kao Ascaris antigen-Alum tečnost) data je na Dan 1, Dan 8, i Dan 15 mužijacima makaki majmuna u količini od 3.6 mL/kg intraperitonealno i u količini od 0.4 mL/kg intramuskularno radi nadraživanja. Dalje, za tretirane grupe, respektivno su postavljene Normalna grupa (ne-tretirana grupa, n=2), Grupa nosača (grupa u kojoj je rastvarač (20 mM rastvor natrijum citratnog pufera/120 mM NaCl (pH 6.0)) dat intravenozno jedan dan pre nadraživanja, n=3) i grupa u kojoj se daje antitelo (grupa u kojoj je 10 mg/kg potpuno humanog T7-27 (razblaženo rastvaračem) dato intravenozno jedan dan pre nadraživanja, n=3).

[0100] Dodatno, Alum je pripremljen sledećim postupkom.

[0101] Aluminijum sulfat (14 do 18 hidrata) (Wako, Inc.) rastvoren je u ultračistoj vodi da bi se pripremio 1M rastvor, a taj rastvor filtriran je 0.22 µm filterom, a zatim je 1M natrijum hidroksid (Nacalai Tesque) dodavan dok nije generisan beli talog. Supernatanat je uklonjen, opran ultračistom vodom 5 puta, a zatim dalje opran sa PBS (WAKO, Inc.) tri puta. Oprani beli talog fino je usitnjen homogenizatorom (CH-6010, KINEMATICA, Inc.) pod ledom, praćeno centrifugiranjem na 2000 o/min na temperaturi od 4°C tokom 5 minuta upotrebom centrifuge (himac CR21, Hitachi, Ltd.). Zatim, supernatant je uklonjen, i opran dva puta sa PBS. Dobijeni talog je suspendovan u PBS da bi se dobio Alum.

Merenje Ascaris antigen specifičnog IgE u plazmi

[0102] Krv je u kontinuitetu sakupljana od prethodno opisanih makaki majmuna na Dan 1 (pre davanja Ascaris antigen-Alum tečnosti), Dan 8, Dan 15, i Dan 22, a plazma je sakupljana posle centrifugiranja (1800 x g, 4°C, 10 minuta). Koncentracija Ascaris antigen specifičnog IgE in plazma izmerena je upotrebom sledećeg postupka.

[0103] DNP-Ascaris je pripremljen putem PBS tako da njegova koncentracija postane 100 µg/mL, i dodat u Nunc-Immuno™ MicroWell™ čvrstu ploču sa 96 bazenčića (Nunc Inc.) u količini od 100 µL, a zatim imobilizovan na sobnoj temperaturi preko noći. Blokirajući agens (Blocking One: Nacalai Tesque) dodat je u količini od 200 µL, i ostavljen na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, a rastvor je uklonjen.

Naknadno, izdvojena plazma i uzorak za krivu kalibracije respektivno su dodati u količini od 100 µL. Kao uzorak krive kalibracije, koncentracija Ascaris antigen specifičnog IgE u plazmi Grupe nosača na Dan 22 podešena je na 2000 U/mL, a serija razblaženja (2000 U/mL do 16 U/mL) je pripremljena razblaživanjem rastvora (5% Blocking One kji sadrži PBS) i upotrebljena. Inkubacija je izvedena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, praćeno pranjem pet puta u T-PBS (0.05% Tween-20 koji sadrži PBS), a zatim je HRP obeleženo humano IgE detekciono antitelo (A80-108P: Betil, Inc.) razblaženo 10000 puta u rastvoru za razblaživanje, dodato u količini od 100 µL. Dalje, inkubacija je izvedena na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, praćeno pranjem 5 puta u T-PBS. Konačno, merenje se izvodi upotrebom kompleta za razvijanje boje pomoću peroksidaze (ML-1120T: SUMILON, Inc.). Apsorbanca je izmeren upotrebom SpectraMax (Molecular Devices, Inc.). Rezultati Dana 1 i Dana 22 prikazani su na Fig.1.

Kožni test

2

[0104] Na Dan 22, PBS, 1, 10, i 100 µg/mL Ascaris antigen rastvori (rastvor u kojem je DNP-Ascaris suspendovan pomoću PBS) intradermalno su primenjeni na dva mesta respektivno (ukupno 8 mesta po jednoj životinji) na obrijani abdomen istog pojedinca Grupe nosača i grupe u kojoj se daje antitelo u količini od 100 µL. U pogledu Normalne grupe, PBS i 100 µg/mL Ascaris antigen rastvori intradermalno su primenjeni na 4 mesta respektivno (ukupno 8 mesta po jednoj životinji) na obrijani abdomen istog pojedinca u količini od 100 µL. Posle 20 minuta nadraživanja kože, reakcija na koži zapaža se merenjem prečnika upotrebom Vernier kalipera. Kod svakog pojedinca, vrednost kod koje je prečnik reakcije na koži putem PBS davanja oduzeta je od one od prečnika reakcije na koži izazvane primenom Ascaris antigen rastvora, podešena je na delta cm. Rezultati sa 100 µg/mL Ascaris antigen rastvorom prikazani su na Fig.2. Dalje, u slučaju gde je primenjen 1 i 10 µg/mL Ascaris antigen rastvor, nije formirana reakcija na koži dovoljna za procenu test antitela.

[0105] Obezbeđene su prosečna vrednost i standarna greška, a brzina inhibicije obezbeđena je podešavanjem vrednosti na Dan 1 (vrednost pre davanje Ascaris antigen-Alum tečnosti) na 100%, a Grupe nosača na Dan 22 na 0% u merenje Ascaris antigen specifičnog IgE u plazmi.

[0106] Kako je prikazano na Fig.1, potpuno humano T7-27 snizilo je (97% inhibicije) koncentraciju Ascaris antigen specifičnog IgE u majmunskom Ascaris antigen nadražajnom modelu u poređenju sa Grupom nosača.

[0107] Kako je prikazano na Fig.2, potpuno humano T7-27 snizilo je Ascaris antigen specifičnu reakciju na koži pri 100 µg/mL Ascaris antigen rastvora u majmunskom Ascaris antigen nadražajnom modelu u poređenju sa Grupom nosača.

[0108] Iz prethodno opisanih rezultata, postaće jasno da potpuno humano T7-27 suzbija alergijsku reakciju izazvanu Ascaris antigen specifičnim IgE u majmunskom Ascaris antigen nadražajnom modelu.

(Test Primer 1: Procena anti-TSLP receptor antitela u mišjem antigen grinja nadražajnom astma modelu)

[0109] Mišji antigen grinja nadražajni model poznat je kao astma model, a patološka stanja uključuju povećanu reaktinost u disajnom putu i infiltraciju eozinofila u bronhoalveolarnom ispiranju.

[0110] Nadražaj je izveden nanošenjem antigena grinja (Dp) (LSL, Inc.) intraperitonealno na NC/Nga miševe (Charles River, Inc.) u dozi od 100 µg Dp/0.5 mL fiziološkog slanog rastvora/miš na Dan 0 (u vreme početnog nadražaja) i Dan 5. Zapaljenje disajnog puta izazvano je nazalnim davanjem antigena grinja sa dozom od 100 µg Dp/50 µL fiziološkog slanog rastvora/miš na Dan 12 i Dan 19. Antimišje TSLP receptor antitelo (WAKO, Inc.) rastvoreno u PBS (WAKO, Inc.) dato je grupi u kojoj se daje antitelo subkutano u dozi (0.1,1,10 mg/kg) na Dan -1, Dan 2, Dan 5, Dan 8, Dan 11, Dan 14, i Dan 18 (dan davanja antitela) jednom dnevno. Grupa u kojoj je davan deksametazon (Dex grupa) obezbeđena je kao grupa

2

pozitivne kontrole. Deksametazon rastvoren u PBS davan je Dex grupi intraperitonealno sa dozom od 3 mg/kg od Dana 12 do Dana 19 jednom dnevno. Tretirane grupe su podešene kako seldi.

[Tretirane grupe]

[0111]

Normalna grupa (n = 10):

Ne-tretirana

Grupa u kojoj je davan slani rastvor (n = 6):

Antigen grinja intraperitonelano je primenjen na Dan 0 i Dan 5, fiziološki slani rastvor je nazalno primenjen na Dan 12 i Dan 19, i PBS je subkutano primenjen na dan davanja antitela.

PBS grupa (n = 10):

Antigen grinja intraperitonelano je primenjen na Dan 0 i Dan 5, antigen grinja je nazalno primenjen na Dan 12 i Dan 19, i PBS je subkutano primenjen na dan davanja antitela.

Grupa u kojoj se daje antitelo (0.1,1, 10 mg/kg) (n = 10 za svaku dozu):

Antigen grinja intraperitonelano je primenjen na Dan 0 i Dan 5, antigen grinja je nazalno primenjen na Dan 12 i Dan 19, i antitelo je subkutano primenjeno na dan davanja antitela.

Dex grupa (n = 10):

Antigen grinja intraperitonelano je primenjen na Dan 0 i Dan 5, antigen grinja je nazalno primenjen na Dan 12 i Dan 19, i deksametazon je intraperitonealno primenjen od Dana 12 do Dana 19.

[0112] Miš je smešten u nesputanu komoru posebnu za miševe na Dan 20. Transduktor koji koristi pneumotakograf prikačen je za komoru, i povezan sa analizatorom respiratornih funkcija BioSystem XA (Buxco, Inc.), a promena pritiska u unutrašnjosti komore u odnosu na atmosferski pritisak detektovana je transduktora. Koncentracija Acetyl-β-metil holin hlorid (Sigma, Inc.) (0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg/mL) rastvoren u fiziološkom slanom rastvoru sekvencijalno je povećavana, a zatim izložena inhalaciji upotrebom ultrasoničnog nebulizatora za ispitivanje reaktivnosti disajnog puta. PenH mehanički izračunata od promene u pritisku unutar komore, upotrebljena kao indeks respiratorne funkcije. Rezultati merenja prikazani su na Fig.3.

[0113] Dalje, posle sakupljanja krvi od miša iz šuplje vene abdomena, miš je eutanaziran ispuštanjem krvi. Kanila je intubirana u traheju, i bronhoalveolarnim ispiranjem oprana sa 0.1% fetalnog goveđeg seruma (BioWest, Inc.) koji sadrži PBS rastvor, a je zatim fluid bronhoalveolarnog ispiranja (BALF) sakupljen. BALF je centrifugiran, supernatant je uklonjen, sediment suspendovan u 500 µL fiziološkog slanog rastvora, i pripremljena je BALF ćelijska suspenzija. Broj eozinofila u BALF ćelijskoj suspenziji izmeren je upotrebom automatskog analizatora ćelija krvi na više tačaka XT-2000i (SYSMEX, Inc.). Rezultati merenja prikazani su na Fig.4.

2

[0114] Dobijen krv razblažena je 10 puta sa RPMI1640 podlogom za uzgajanje (Life technologies, Inc.). Razblažena krv zasejana je pri 1 mL u ploči (IWAKI Co. Ltd.). Mišje TSLP (R&D, Inc.) razblažena je putem PBS tako da njegova konačna koncentracija postane 0 ili 10 ng/mL, i njegovih 100 µL swe dodaje.

Inkubacija je izvedena na 37°C tokom 24 sata pod 5% CO2, a ukupna RNK ekstraktovana je sa 30 µL vode upotrebom RNeasy 96 Kompleta (Qiagen, Inc.). Zatim, 10 µL RNK podvrgnuto je reakciji reverzne transkripcije upotrebom Kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Life technologies, Inc.). Naknadno, nivo ekspresije TARC mRNK izmeren je upotrebom TaqMan PCR postupka upotrebom TaqMan sonde TARC (Ccl17, Mn01244826 g1, Life technologies, Inc.), TaqMan sonde β-aktina (Actb, Mm00607939 s1, Life technologies, Inc.), ExpressqPCR SuperMiksa (A10313, Life technologies, Inc.), i 2 µL cDNK. Nivo ekspresije je izračunat analiziranjem rezultata merenja upotrebom poredbenog CT postupka. Rezultati pri 10 ng/mL TSLP prikazani su na Fig.5.

[0115] Obezbeđene su prosečne vrednosti i standarne greške respektivnih grupe. Studentov t test upotrebljen je za ispitivanje značajne razlike test između PBS grupe i Normalne grupe, Grupe u kojoj je davan slani rastvor, i Dex grupa, respektivno. Za ispitivanje značajne razlike između PBS grupe i grupe u kojoj se daje antitelo, izvedeno je više poređenja prema Dunnett-u. U oba slučaja, značajne razlike bile su prisutne kada je p < 0.05.

[0116] Kako je prikazano na Fig.3, u grupi u kojoj se daje antitelo, primećena je inhibitorna aktivnost na hiperodgovor disajnih puteva indukovan sa 1 mg/mL acetin-β-metil holin hloridom u mišjem astma modelu u poređenju sa PBS grupom. Postaće jasno da anti-TSLP receptor antitelo poboljšava respiratornu funkciju u astma modelu.

[0117] Kako je prikazano na Fig.4, u grupi u kojoj se daje antitelo, primećena je inhibitorna aktivnost na infiltraciju eozinofila u bronhoalveolarnom ispiranju u poređenju sa PBS grupom.

[0118] Kako je prikazano na Fig.5, u grupi u kojoj se daje antitelo, primećena je inhibitorna aktivnost na ekspresiju TARC mRNK u poređenju sa PBS grupom.

[0119] Rezultatima prikazani na Fig.3 i 4, potvrđeno je da anti-TSLP receptor antitelo poboljšava patološko stanje astma modela. Dalje, veza između poboljšanja patološkog stanja i inhibicije TARC mRNK ekspresije zbog anti-TSLP receptor antitelo zapaža se iz rezultata sa Fig.3 do 5 i postaće jasno da se poboljšavajući efekti na patološk stanje mogu proceniti upotrebom inhibitornih efekata na ekspresiju TARC mRNK kao indeksa.

Industrijska primenjivost

[0120] Antitelo protiv humanog TSLP receptora ovog pronalaska korisno je za preveniranje i lečenje raznih bolesti u kojima su humani TSLP i humani TSLP receptor uključeni u patologiju bolesti. Dalje, postupci proizvodnje polinukleotida, ekspresionih vektora, i ćelije domaćina prema ovom pronalasku korisne su za proizvodnju antitela protiv humanog TSLP receptora.

2

[Slobodan tekst liste sekvenci]

[0121] U broju zaglavlja <223> liste sekvence, dat je opis "Veštačka Sekvenca". Specifično, osnovne sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4 listama sekvenci su osnovna sekvenca teškog lanca i lakog lanca potpuno humanog T7-27, respektivno, a aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 3 su aminokiselinska sekvenca teškog lanca i lakog lanca kodirana sa SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4, respektivno. Osnovne sekvence prikazane sa SEQ ID NOS: 5, 6, 7, 8, i 9 listama sekvenci je osnovna sekvenca koja kodira humani TSLP receptor-humani Fc fuzioni protein, humani TSLP receptormišji Fc fuzioni protein, majmunski TSLP receptor-humani Fc fuzioni protein, humani TSLP mutant-Flag protein, i majmunski TSLP mutant-Flag protein, respektivno.

2

�

2

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment odabrano iz (1) ili (2) u nastavku:

(1) antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment, koje obuhvata varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 118 iz SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 108 iz SEQ ID NO: 3;

(2) antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment u kojem je glutaminska kiselina N kraja teškog lanca antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta iz (1) modifikovana u piroglutaminsku kiselinu.

2. Antitelo protiv humanog TSLP receptora prema zahtevu 1, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 3.

3. Antitelo protiv humanog TSLP receptora prema zahtevu 1, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 1, u kojem je glutaminska kiselina aminokiselinskog broja 1 iz SEQ ID NO: 1 modifikovana u piroglutaminsku kiselinu i/ili je lizin aminokiselinskog broja 448 iz SEQ ID NO: 1 obrisan, i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO: 3.

4. Antitelo protiv humanog TSLP receptora prema zahtevu 3, koje obuhvata teški lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence aminokiselinskih brojeva 1 do 447 iz SEQ ID NO: 1 i laki lanac koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane sa SEQ ID NO.3.

5. Polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela prema zahtevu 1(1) i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela prema zahtevu 1(1).

6. Ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela prema zahtevu 1(1) i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela prema zahtevu 1(1).

7. Ćelija domaćin odabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih (a) do (d):

(a) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora

4

prema zahtevu 1(1) i polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela;

(b) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora prema zahtevu 1(1) i ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela;

(c) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora prema zahtevu 1(1); i

(d) ćelija domaćin transformisana sa ekspresionim vektorom koji obuhvata polinukleotid koji obuhvata osnovnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela protiv humanog TSLP receptora prema zahtevu 1(1),

pri čemu ta ćelija domaćin eksprimira pomenuto antitelo.

8. Antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigen-vezujući fragment proizvedeno postupkom koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina radi eksprimiranja antitela protiv humanog TSLP receptora ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, pri čemu je ta ćelija domaćin ćelija domaćin prema zahtevu 7.

9. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigenvezujući fragment prema zahtevu 1(1) i/ili antitelo protiv humanog TSLP receptora ili njegov antigenvezujući fragment prema zahtevu 1(2), i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

10. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9, koja obuhvata antitelo protiv humanog TSLP receptora prema zahtevu 2 i/ili antitelo protiv humanog TSLP receptora prema zahtevu 4, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10, koja je farmaceutska kompozicija za sprečavanje ili lečenje astme.