RS58761B1

RS58761B1 - Miševi sa humanizovanim lakim lancem

Info

Publication number: RS58761B1
Application number: RS20190641A
Authority: RS
Inventors: Lynn Macdonald; Cagan Gurer; Karolina A Hosiawa; Sean Stevens; Andrew J Murphy
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2012-12-17
Publication date: 2019-06-28
Also published as: US20200221675A1; JP2019047806A; LT2793567T; BR112014015238B1; IN2014DN06094A; DK2793567T3; RU2018119366A3; KR20180132938A; US20130160153A1; US12433266B2; US20140017228A1; CA2859408C; US9706759B2; CY1121638T1; EP2793567B1; AU2015238803B2; CA2859408A1; AU2012323987B2; CN104159444B; EP3527070A1

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Opisani su genetski modifikovani plodni miševi koji izražavaju humane imunoglobulinske varijabilne sekvence λ lakog lanca srodne sa humanim varijabilnim sekvencama teškog lanca. Opisani su genetski modifikovani miševi, ćelije, embrioni i tkiva koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6a koji je funkcionalan u mišjem ADAM6 lokusu, pri čemu miševi, ćelije, embrioni, i tkiva sadrže humane imunoglobulinske genske segmente lambda lakog lanca mogu da se rearanžiraju da bi se formirao funkcionalni imunoglobulinski varijabilni domen lakog lanca. Modifikacije obuhvataju humane i/ili humanizovane imunoglobulinske lokuse. Opisani su miševi koji sadrže ADAM6 funkciju, uključujući miševe koji sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein. Opisani su genetski modifikovani mužjaci miševa koji sadrže genetsku modifikaciju endogenog mišjeg imunoglobulinskog lokusa VH regiona, i koji dalje sadrže ADAM6 aktivnost, uključujući miševe koji sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja ponovo uspostavlja plodnost kod mužjaka miša.

[0002] Opisani su genetski modifikovani plodni miševi koji sadrže deleciju ili modifikaciju endogenog ADAM6 gena ili njegovog homologa ili ortologa, i koji sadrže genetsku modifikaciju koja ponovo uspostavlja funkciju ADAM6 (ili njegovog homologa ili ortologa) u celini ili delimično, pri čemu miševi izražavaju humanu imunoglobulinsku λ varijabilnu sekvencu u kontekstu konstantne sekvence κ lakog lanca.

STANJE TEHNIKE

[0003] Farmaceutske primene antitela u poslednje dve decenije su znatno stimulisale istraživanja dobijanja antitela koja su podesna za primenu u humanoj terapeutici. Rana terapeutika antitela, bazirana na mišjim antitelima, nije bila idealna kao humana terapeutika, jer je ponovljeno davanje mišjih antitela ljudima rezultovalo problemima u vezi imunogenosti koji mogu ugroziti režime dugotrajnog lečenja. Bila su razvijena rešenja bazirana na humanizovanim mišjim antitelima koja bi učinila da ona izgledaju više kao humana, a manje kao mišja. Usledili su metodi za izražavanje humanih imunoglobulinskih sekvenci za primenu u antitelima, uglavnom bazirani na in vitro ekspresiji humanih imunoglobulinskih biblioteka u fagu, bakteriji ili kvascu. Konačno, učinjeni su pokušaji da se dobiju korisna humana antitela od humanih limfocita in vitro, u miševima graftovanim sa humanim hematopoetičnim ćelijama, i u transhromozomskim ili transgenskim miševima sa onesposobljenim endogenim imunoglobulinskim lokusima. Kod transgenskih miševa, bilo je neophodno onesposobiti endogene mišje imunoglobulinske gene tako da slučajno integrisani potpuno humani transgeni funkcionišu kao izvor imunoglobulinskih sekvenci izraženih u mišu. Takvi miševi mogu praviti humana antitela podesna za primenu kao humani terapeutici, ali ove miševe odlikuju suštinski problemi u vezi njihovih imunih sistema. Ovi problemi (1) čine miševe nepraktičnim za generisanje dovoljno raznovrsnog repertoara antitela, (2) zahtevaju upotrebu opsežnih ispravki putem genetskog reinženjeringa, (3) obezbeđuju suboptimalan proces klonske selekcije, verovatno zbog nekompatibilnosti između humanih i mišjih elemenata, i (4) ovi miševi predstavljaju nepouzdan izvor velikih i raznovrsnih populacija humanih varijabilnih sekvenci koje treba da budu zaista korisne za dobijanje humanih terapeutika.

[0004] Transgenski miševi koji sadrže transgene potpuno humanih antitela sadrže slučajno umetnute transgene, koji sadrže nerearanžirane humane imunoglobulinske varijabilne sekvence teškog lanca (V, D, i J sekvence) vezane za konstantne sekvence humanog teškog lanca, i nerearanžirane humane imunoglobulinske varijabilne sekvence lakog lanca (V i J) vezane za humane konstantne sekvence lakog lanca. Zbog toga miševi generišu rearanžirane gene antitela iz lokusa koji su drugačiji od endogenih mišjih lokusa, pri čemu su rearanžirani geni antitela potpuno humani. Generalno, miševi sadrže humane sekvence teškog lanca i humane sekvence κ lakog lanca, mada je takođe bilo izveštaja o miševima sa bar nekim humanim λ sekvencama. Transgenski miševi generalno imaju oštećene i nefunkcionalne endogene imunoglobulinske lokuse ili inaktivacije (engl. knockouts) endogenih imunoglobulinskih lokusa, tako da ti miševi nisu sposobni za rearanžiranje humanih sekvenci antitela na endogenom mišjem imunoglobulinskom lokusu.

Promene kod takvih transgenskih miševa ih čine manje optimalnim za generisanje dovoljno raznovrsnog repertoara humanih antitela u miševima, verovatno bar delimično zbog suboptimalnog procesa klonske selekcije koja se suočava sa potpuno humanim molekulima antitela u okviru endogenog mišjeg selekcionog sistema.

[0005] U odgovarajućoj oblasti postoji potreba za dobijanjem poboljšanih genetski modifikovanih miševa koji su korisni za generisanje imunoglobulinskih sekvenci, uključujući humane sekvence antitela, i koji su korisni za generisanje dovoljno raznolikog repertoara humanih antitela. Takođe ostaje potreba za miševima koji mogu da rearanžiraju imunoglobulinske genske segmente da bi se formirali korisni rearanžirani imunoglobulinski geni, uključujući humane varijabilne domene teškog lanca koji su srodni humanim λ ili humanim κ varijabilnim domenima, ili koji mogu da proizvode proteine od izmenjenih imunoglobulinskih lokusa, uključujući lokuse koji sadrže dovoljno raznovrsnu selekciju humanih varijabilnih sekvenci λ i/ili humanih varijabilnih sekvenci κ lakog lanca. Postoji potreba za miševima koji mogu generisati varijabilne regione antitela i od humanih κ, i od humanih λ segmenata, pri čemu su humani κ i humani λ segmenti srodni humanim varijabilnim domenima teškog lanca. Takođe postoji potreba za povećanim korišćenjem humanih λ sekvenci u genetski modifikovanim miševima.

SUŠTINA PRONALASKA

[0006] Opisani su genetski modifikovani miševi koji sadrže modifikaciju koja eliminiše aktivnost endogenog ADAM6 gena, pri čemu ta modifikacija rezultuje gubitkom plodnosti i ti miševi dalje sadrže sekvencu koja kodira aktivnost koja nadomeštava ili očuvava izgubljenu ili smanjenu ADAM6 aktivnost (ili aktivnost homologa ili ortologa), i ti miševi dalje sadrže modifikacije koje im omogućavaju izražavanje humanih imunoglobulinskih varijabilnih regiona teškog lanca koji su srodni humanim imunoglobulinskim varijabilnim regionima λ lakog lanca. Shodno tome, realizovan je miš koji sadrži (a) jedan ili više nerearanžiranih humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više nerearanžiranih humanih Jλ genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu kapa lakog lanca miša, pri čemu imunoglobulinski lokus kapa lakog lanca sadrži mišji Cκ region: (b) jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više humanih DH genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca miša; i (c) modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu modifikacija eliminiše endogenu ADAM6 funkciju, koja je povezana sa smanjenjem plodnosti kod mužjaka miševa, i miš dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment, od kojih je svaki funkcionalan za poboljšanje pomenutog smanjenja ili ponovno uspostavljanje plodnosti kod mužjaka miša, i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6b protein, ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment, od kojih je svaki funkcionalan za poboljšanje ili ponovno uspostavljanje pomenutog smanjenja plodnosti kod mužjaka miša, pri čemu su sekvence nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 proteine, njihove ortologe, homologe, ili funkcionalne fragmente prisutne u okviru humanih genskih segmenata teškog lanca. Humani imunoglobulinski varijabilni regioni λ lakog lanca se izražavaju fuzionisani sa mišjim κ konstantnim regionima.

[0007] Prema različitim aspektima, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost je susedna sa humanom imunoglobulinskom sekvencom. Prema različitim aspektima, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost je susedna sa nehumanom imunoglobulinskom sekvencom. Sekvenca je prisutna na istom hromozomu kao endogeni nehumani imunoglobulinski lokus teškog lanca miša, koji je prisutan u okviru humanih genskih segmenata teškog lanca.

[0008] Opisani su genetski modifikovani miševi koji sadrže modifikaciju koja održava aktivnost ADAM6 gena ili njegovog homologa ili ortologa, pri čemu modifikacija obuhvata inserciju jednog ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca uzvodno od nehumanog imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, i miševi dalje sadrže modifikacije koje im omogućavaju da izražavaju humane imunoglobulinske varijabilne regione λ lakog lanca srodne sa humanim imunoglobulinskim varijabilnim regionima teškog lanca. Humani imunoglobulinski varijabilni regioni λ lakog lanca se izražavaju fuzionisani sa mišjim κ konstantnim regionima.

[0009] Ilustrativni prekidi, delecije i/ili funkcionalnosti kao utišavajuće modifikacije obuhvataju bilo koje modifikacije koje rezultuju eliminacijom aktivnosti jednog ili više ADAM6 proteina kodiranih ADAM6 genom, odnosno genima miša.

[0010] Takođe su opisani konstrukti nukleinskih kiselina, ćelije, embrioni, miševi i postupci za dobijanje miševa koji sadrže modifikaciju koja rezultuje nefunkcionalnim endogenim mišjim ADAM6 proteinom ili ADAM6 genom (npr. endogenim ADAM6 genom koji je inaktiviran ili ima deleciju), pri čemu miševi sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.

[0011] Takođe su opisani konstrukti nukleinskih kiselina, ćelije, embrioni, miševi i postupci za dobijanje miševa koji sadrže modifikaciju endogenog mišjeg imunoglobulinskog lokusa, pri čemu miševi sadrže ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. Endogeni mišji imunoglobulinski lokus je imunoglobulinski lokus teškog lanca, a modifikacija eliminiše ADAM6 aktivnost kod ćelije ili tkiva mužjaka miša.

[0012] Takođe su opisani miševi koji sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment; takođe su opisani miševi koji sadrže endogenu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment, i najmanje jednu genetsku modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca.

[0013] Takođe su opisani postupci za dobijanje miševa koji sadrže modifikaciju endogenog mišjeg imunoglobulinskog lokusa, pri čemu miševi sadrže ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.

[0014] Takođe su opisani postupci za dobijanje miševa koji sadrže genetsku modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu primena postupaka rezultuje mužjacima miševa koji sadrže modifikovani imunoglobulinski lokus teškog lanca (ili njegovu deleciju) i ti mužjaci miševa su sposobni za generisanje potomstva parenjem. U jednom primeru, mužjaci miševa su sposobni za proizvodnju sperme koja može preći iz mišje materice kroz mišji jajovod da bi oplodila mišje jajašce.

[0015] Takođe su opisani postupci za dobijanje miševa koji sadrže genetsku modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca i imunoglobulinskog lokusa lakog lanca, pri čemu primena postupaka za modifikaciju lokusa teškog lanca rezultuje mužjacima miševa koje odlikuje smanjenje plodnosti, i ti miševi sadrže genetsku modifikaciju koja ponovo uspostavlja smanjenu plodnost, u celini ili delimično. U različitim primerima izvođenja, smanjenje plodnosti je karakterisano nesposobnošću sperme mužjaka miševa da migrira iz materice miša kroz jajovod miša da bi oplodila mišje jajašce. U različitim primerima izvođenja, smanjenje plodnosti je karakterisano spermom koju odlikuje nedostatak migracije in vivo. U različitim primerima izvođenja, genetska modifikacija koja ponovo uspostavlja smanjenu plodnost, u celini ili delimično, je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.

[0016] U jednom primeru izvođenja, genetska modifikacija sadrži zamenu endogenih imunoglobulinskih varijabilnih lokusa teškog lanca sa humanim imunoglobulinskim varijabilnim lokusima teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, genetska modifikacija sadrži inserciju humanih imunoglobulinskih varijabilnih lokusa teškog lanca u endogene imunoglobulinske varijabilne lokuse teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, genetska modifikacija sadrži deleciju endogenog imunoglobulinskog varijabilnog lokusa teškog lanca u celini ili delimično, pri čemu delecija rezultuje gubitkom endogene ADAM6 funkcije. Prema specifičnom primeru izvođenja, gubitak endogene ADAM6 funkcije je povezan sa smanjenjem plodnosti kod mužjaka miševa.

[0017] Takođe je opisana genetska modifikacija koja sadrži inaktivaciju endogenog nehumanog imunoglobulinskog varijabilnog lokusa teškog lanca u celini ili delimično, pri čemu inaktivacija ne rezultuje gubitkom endogene ADAM6 funkcije. Inaktivacija može obuhvatati zamenu ili deleciju jednog ili više endogenih mišjih genskih segmenata, što rezultuje endogenim imunoglobulinskim mišjim lokusom teškog lanca koji u suštini nije sposoban za rearanžiranje da bi kodirao teški lanac antitela koji sadrži endogene mišje genske segmente. Inaktivacija može obuhvatati druge modifikacije koje rezultuju endogenim imunoglobulinskim lokusom teškog lanca koji nije sposoban za rearanžiranje da bi kodirao teški lanac antitela, pri čemu modifikacija ne obuhvata zamenu ili deleciju endogenih genskih segmenata. Primeri modifikacija obuhvataju hromozomske inverzije i/ili translokacije posredovane molekularnim tehnikama, npr. korišćenjem preciznog postavljanja mesno-specifičnih rekombinacionih mesta (npr. Cre-lox tehnologija). Druge ilustrativne modifikacije obuhvataju onemogućavanje operativne veze između mišjih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata i nehumanih imunoglobulinskih konstantnih regiona.

[0018] U jednom primeru izvođenja, genetska modifikacija sadrži umetanje u genom miša DNK fragmenta koji sadrži jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više humanih DH genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata operativno povezanih sa jednom ili više sekvenci konstantnih regiona (npr. IgM i/ili IgG genom). U jednom primeru izvođenja, DNK fragment može da bude podvrgnut rearanžiranju u genomu miša da bi se formirala sekvenca koja kodira humani varijabilni domen teškog lanca antitela.

[0019] Opisani su miševi koji sadrže modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju mišjeg ADAM6 iz endogenog ADAM6 alela, tako da mužjak miša koji ima tu modifikaciju ispoljava smanjenu plodnost (npr. veoma smanjenu sposobnost generisanja potomstva parenjem), ili je u suštini neplodan, zbog smanjenja ili eliminacije endogene ADAM6 funkcije, pri čemu miševi dalje sadrže ektopičnu ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. Modifikacija koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju mišjeg ADAM6 može biti modifikacija (npr. insercija, delecija, zamena, itd.) u mišjem imunoglobulinskom lokusu.

[0020] Opisano je da smanjenje ili gubitak ADAM6 funkcije mogu obuhvatati nesposobnost ili suštinsku nesposobnost miša da proizvodi spermu koja može prelaziti iz materice miša kroz jajovod miša da bi oplodila mišje jajašce. Najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% proizvedenih ćelija sperme u zapremini ejakulata miša može biti nesposobno za prolazak kroz jajovod in vivo posle kopulacije i za oplođenje mišjeg jajašca.

[0021] Opisano je da smanjenje ili gubitak ADAM6 funkcije obuhvata nesposobnost formiranja ili suštinsku nesposobnost formiranja kompleksa ADAM2 i/ili ADAM3 i/ili ADAM6 na površini ćelije sperme miša. U jednom primeru izvođenja, gubitak ADAM6 funkcije obuhvata suštinsku nesposobnost oplođenja mišjeg jajašca kopulacijom sa ženkom miša.

[0022] Takođe je opisan miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen, i koji sadrži protein (ili ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein) koji prenosi ADAM6 funkcionalnost na miša. Miš može biti mužjak miša, a funkcionalnost sadrži povećanu plodnost u poređenju sa mišem kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen.

[0023] Protein je kodiran genomskom sekvencom lociranom u okviru imunoglobulinskog lokusa u germinativnoj liniji miša. Imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca. Lokus teškog lanca sadrži najmanje jedan humani VH, najmanje jedan humani DH i najmanje jedan humani JH genski segment.

[0024] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži humani ili himerični humani/mišji ili himerični humani/pacovski laki lanac (npr. humani varijabilni, mišji ili pacovski konstantni) i himerični humani varijabilni/mišji ili pacovski konstantni teški lanac.

Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži transgen koji sadrži gen himeričnog humanog varijabilnog/pacovskog ili mišjeg konstantnog lakog lanca operativno povezan sa transkripcionim aktivnim promoterom, npr. ROSA26 promoterom. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, transgen himeričnog humanog/mišjeg ili pacovskog lakog lanca sadrži rearanžiranu humanu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca u germinativnoj liniji miša.

[0025] Ektopična nukleotidna sekvenca je locirana u okviru imunoglobulinskog lokusa u germinativnoj liniji miša. Imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca. Lokus teškog lanca sadrži najmanje jedan humani VH, najmanje jedan humani DH i najmanje jedan humani JH genski segment.

[0026] Takođe je opisan miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen, pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja nadomeštava gubitak mišje ADAM6 funkcije. Ektopična nukleotidna sekvenca može preneti mišu sposobnost da stvara potomstvo koja je uporediva sa onom kod odgovarajućeg miša prirodnog tipa koji sadrži funkcionalni endogeni ADAM6 gen. Sekvenca može preneti mišu sposobnost da formira kompleks ADAM2 i/ili ADAM3 i/ili ADAM6 na površini ćelije sperme miša. Sekvenca može preneti mišu sposobnost da pređe iz materice miša kroz jajovod miša do mišjeg jajašca da bi oplodio jajašce.

[0027] [Izbrisano]

[0028] [Izbrisano]

[0029] U jednom primeru izvođenja, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi prosečno najmanje oko 2-struko, 3-struko, ili 4-struko veći broj mladih po okotu u periodu odgajanja od 4 ili 6 meseci od miša kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca, i koji se odgaja tokom istog vremenskog perioda.

[0030] U jednom primeru izvođenja, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu je mužjak miša, i taj mužjak miša proizvodi spermu koju, kada se prikupi iz jajovoda oko 5-6 sati posle kopulacije, odlikuje migracija u jajovodu koja je najmanje 10-struko, najmanje 20-struko, najmanje 30-struko, najmanje 40-struko, najmanje 50-struko, najmanje 60-struko, najmanje 70-struko, najmanje 80-struko, najmanje 90-struko, 100-struko, 110-struko, ili 120-struko ili više veća nego kod miša kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca.

[0031] U jednom primeru izvođenja, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu kada kopulira sa ženkom miša generiše spermu koja može da prođe kroz matericu i da prođe kroz jajovod u toku oko 6 sati, uz efikasnost koja je jednaka spermi miša prirodnog tipa.

[0032] U jednom primeru izvođenja, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi oko 1.5-struko, oko 2-struko, oko 3-struko, ili oko 4-struko ili više okota u uporedivom vremenskom periodu od miša kome nedostaje funkcionalni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca.

[0033] Prema jednom aspektu, realizovan je miš koji, u svojoj germinativnoj liniji, sadrži nemišju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski protein, pri čemu nemišja imunoglobulinska sekvenca sadrži inserciju mišjeg ADAM6 gena ili njegovog homologa ili ortologa ili funkcionalnog fragmenta. Nemišja imunoglobulinska sekvenca sadrži humanu imunoglobulinsku sekvencu. Sekvenca sadrži jedan ili više humanih V genskih segmenata, jedan ili više humanih D genskih segmenata, i jedan ili više humanih J genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više V, D, i J genskih segmenata su nerearanžirani. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više V, D, i J genskih segmenata su rearanžirani. U jednom primeru izvođenja, posle rearanžiranja jednog ili više V, D, i J genskih segmenata miš u svom genomu sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednom primeru izvođenja, posle rearanžiranja miš u svom genomu sadrži najmanje dve sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju mišji ADAM6 gen ili njegov ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednom primeru izvođenja, posle rearanžiranja miš u svom genomu sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment u B ćeliji. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment u ne-B ćeliji.

[0034] Prema jednom aspektu, realizovani miševi izražavaju humani imunoglobulinski varijabilni region teškog lanca ili njegov funkcionalni fragment iz endogenog mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu miševi sadrže ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod mužjaka miša.

[0035] [Izbrisano]

[0036] Takođe su opisani mužjaci miševa koji sadrže ektopičnu mišju ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji kodira protein koji obezbeđuje ADAM6 funkciju.

[0037] U jednom primeru izvođenja, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment na lokaciji u mišjem genomu koja odgovara lokaciji endogenog mišjeg ADAM6 alela, npr.3’ od sekvence V genskog segmenta i 5’ od inicijalnog D genskog segmenta. U ovde opisanim primerima izvođenja poziv na "ADAM6" znači "ADAM6 i ADAM6b".

[0038] Opisani su mužjaci miševa koji sadrže ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment okružen uzvodno, nizvodno, ili uzvodno i nizvodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6 sekvence) od sekvence nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski varijabilni genski segment. Prema specifičnom primeru izvođenja, imunoglobulinski varijabilni genski segment je humani genski segment. U jednom primeru izvođenja, imunoglobulinski varijabilni genski segment je humani genski segment, a sekvenca koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod miša se nalazi između humanih V genskih segmenata; u jednom primeru izvođenja, miš sadrži dva ili više humanih V genskih segmenata, i sekvenca se nalazi na poziciji između finalnog V genskog segmenta i pretposlednjeg V genskog segmenta; u jednom primeru izvođenja, sekvenca se nalazi na poziciji koja prati finalni V genski segment i prvi D genski segment.

[0039] U jednom primeru izvođenja, mužjaci miševa sadrže ADAM6 homolog ili njegov ortolog ili funkcionalni fragment koji je lociran na poziciji u endogenom imunoglobulinskom lokusu koji je isti ili u suštini isti kao kod mužjaka miša prirodnog tipa. Prema specifičnom primeru izvođenja, endogeni lokus nije sposoban da kodira varijabilni region teškog lanca antitela, pri čemu varijabilni region sadrži endogeni mišji genski segment ili potiče od njega. Prema specifičnom primeru izvođenja, endogeni lokus je pozicioniran na lokaciji u genomu mužjaka miša koja ga čini nesposobnim da kodira varijabilni region teškog lanca antitela. Mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu lociranu na istom hromozomu kao humani imunoglobulinski genski segmenti, a ADAM6 sekvenca kodira funkcionalni ADAM6 protein.

[0040] Takođe je opisan mužjak miša koji sadrži nefunkcionalni endogeni ADAM6 gen, ili deleciju endogenog ADAM6 gena, u svojoj germinativnoj liniji; pri čemu ćelije sperme miša mogu da prođu kroz jajovod ženke miša i da oplode jajašce.

[0041] Takođe je opisan mužjak miša koji sadrži funkcionalni endogeni ADAM6 gen i modifikaciju na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. Modifikacija može biti napravljena nizvodno, ili 3’, od endogenog ADAM6 gena. Modifikacija može biti zamena jednog ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca sa jednim ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca. Modifikacija može biti insercija jednog ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca uzvodno od endogenog imunoglobulinskog genskog konstantnog regiona teškog lanca.

[0042] Takođe su opisani miševi koji sadrže genetsku modifikaciju koja smanjuje endogenu mišju ADAM6 funkciju, pri čemu miš sadrži bar neku ADAM6 funkcionalnost obezbeđenu bilo endogenim nemodifikovanim alelom koji je funkcionalan u celini ili delimično (npr. heterozigotan), ili ekspresijom ektopične sekvence koja kodira ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.

[0043] U jednom primeru izvođenja, miševi sadrže ADAM6 funkciju dovoljnu da prenese mužjacima miševa sposobnost da generišu potomstvo parenjem, u poređenju sa mužjacima miševa kojima nedostaje funkcionalni ADAM6. ADAM6 homolozi ili ortolozi ili njihovi fragmenti koji su funkcionalni kod mužjaka miša obuhvataju one koji ponovo uspostavljaju, u celini ili delimično, izgubljenu sposobnost generisanja potomstva uočenu kod mužjaka miša kome nedostaje dovoljna endogena mišja ADAM6 aktivnost, npr. izgubljenu sposobnost uočenu kod miša sa inaktiviranim ADAM6. U ovom smislu miševi sa inaktiviranim ADAM6 obuhvataju miševe koji sadrže endogeni lokus ili njegov fragment, ali koji nije funkcionalan, tj. koji uopšte ne izražava ADAM6 (ADAM6a i/ili ADAM6b), ili koji izražava ADAM6 (ADAM6a i/ili ADAM6b) na nivou koji je nedovoljan za održavanje normalne sposobnosti generisanja potomstva kod mužjaka miša prirodnog tipa.

Gubitak funkcije može biti zbog, npr. modifikacije u strukturnom genu lokusa (tj. u ADAM6a ili ADAM6b kodirajućem regionu) ili u regulatornom regionu lokusa (npr. u sekvenci 5’ prema ADAM6a genu, ili 3’ od ADAM6a ili ADAM6b kodirajućem regionu, pri čemu sekvenca kontroliše, u celini ili delimično, transkripciju ADAM6 gena, ekspresiju ADAM6 RNK, ili ekspresiju ADAM6 proteina). U različitim primerima izvođenja, ortolozi ili homolozi ili njihovi fragmenti koji su funkcionalni kod mužjaka miša su oni koji omogućavaju da sperma mužjaka miša (ili veći deo ćelija sperme u ejakulatu mužjaka miša) prođe kroz jajovod miša i oplodi mišje jajašce.

[0044] U jednom primeru izvođenja, mužjaci miševa koji izražavaju humani imunoglobulinski varijabilni region ili njegov funkcionalni fragment sadrže dovoljnu ADAM6 aktivnost za prenošenje mužjacima miševa sposobnosti generisanja potomstva parenjem sa ženkama miševa i, u jednom primeru izvođenja, mužjaci miševa ispoljavaju sposobnost generisanja potomstva kada se pare sa ženkama miševa koja je u jednom primeru izvođenja najmanje 25%, u jednom primeru izvođenja najmanje 30%, u jednom primeru izvođenja najmanje 40%, u jednom primeru izvođenja najmanje 50%, u jednom primeru izvođenja najmanje 60%, u jednom primeru izvođenja najmanje 70%, u jednom primeru izvođenja najmanje 80%, u jednom primeru izvođenja najmanje 90%, i u jednom primeru izvođenja približno ista kao kod miševa sa jednim ili dva endogena nemodifikovana ADAM6 alela.

[0045] U jednom primeru izvođenja mužjaci miševa izražavaju dovoljno ADAM6 (ili njegovog ortologa ili homologa ili funkcionalnog fragmenta) za omogućavanje da ćelija sperme mužjaka miševa prođe kroz jajovod ženke miša i oplodi mišje jajašce.

[0046] [Izbrisano]

[0047] Opisani su genetski modifikovani miševi i ćelije koje sadrže modifikaciju endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu miševi izražavaju bar deo imunoglobulinske sekvence teškog lanca, npr. bar deo humane sekvence, pri čemu miševi sadrže ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod mužjaka miša.

Modifikacija može smanjiti ili eliminisati ADAM6 aktivnost miša. Miš može biti modifikovan tako da oba alela koja kodiraju ADAM6 aktivnost budu odsutna ili da izražavaju ADAM6 koji u suštini funkcioniše tako da održava normalno parenje kod mužjaka miša. Miš može dalje sadržati ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. Modifikacija može održati ADAM6 aktivnost miša i obezbediti endogeni imunoglobulinski lokus teškog lanca koji nije sposoban da kodira varijabilni region teškog lanca antitela. Modifikacija može obuhvatati hromozomske inverzije i ili translokacije koje obezbeđuju endogene imunoglobulinske varijabilne genske segmente teškog lanca koji ne mogu da se rearanžiraju da bi kodirali varijabilni region teškog lanca antitela koji je operativno povezan sa konstantnim regionom teškog lanca.

[0048] Opisani su modifikovani miševi i ćelije koje sadrže modifikaciju endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu modifikacija smanjuje ili eliminiše ADAM6 aktivnost izraženu ADAM6 sekvencom lokusa, i pri čemu miševi sadrže ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. ADAM6 protein ili njegov fragment mogu biti kodirani ektopičnom ADAM6 sekvencom. ADAM6 protein ili njegov fragment mogu biti izraženi endogenim ADAM6 alelom. Miš može sadržati prvi imunoglobulinski alel teškog lanca koji sadrži prvu modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju funkcionalnog ADAM6 od prvog imunoglobulinskog alela teškog lanca, i miš može sadržati drugi imunoglobulinski alel teškog lanca koji sadrži drugu modifikaciju koja u suštini ne smanjuje ili ne eliminiše ekspresiju funkcionalnog ADAM6 od drugog imunoglobulinskog alela teškog lanca.

[0049] Modifikacija može biti insercija jednog ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca uzvodno, ili 5’, od endogenog imunoglobulinskog genskog konstantnog regiona teškog lanca. Modifikacija može zadržati endogeni ADAM6 gen lociran na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca.

[0050] Druga modifikacija može biti locirana 3’ (u odnosu na smer transkripcije mišjeg V genskog segmenta) od finalnog mišjeg V genskog segmenta i može biti locirana 5’ (u odnosu na smer transkripcije konstantne sekvence) od teškog lanca mišjeg (ili himeričnog humanog/mišjeg) konstantnog imunoglobulinskog gena ili njegovog fragmenta (npr. sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani i/ili mišji: CH1 i/ili zglob i/ili CH2 i/ili CH3).

[0051] Modifikacija može biti na prvom imunoglobulinskom alelu teškog lanca na prvom lokusu koji kodira prvi ADAM6 alel, i ADAM6 funkcija nastaje ekspresijom endogenog ADAM6 na drugom imunoglobulinskom alelu teškog lanca na drugom lokusu koja kodira funkcionalni ADAM6, pri čemu imunoglobulinski drugi alel teškog lanca sadrži najmanje jednu modifikaciju V, D, i/ili J genskog segmenta. Najmanje jedna modifikacija V, D, i ili J genskog segmenta može biti delecija, zamena sa humanim V, D, i/ili J genskim segmentom, zamena sa kamilizovanim V, D, i/ili J genskim segmentom, zamena sa humanizovanim ili kamilizovanim V, D, i/ili J genskim segmentom, zamena sekvence teškog lanca sa sekvencom lakog lanca, i njihova kombinacija. Najmanje jedna modifikacija može biti delecija jednog ili više V, D, i/ili J genskih segmenata teškog lanca i zamena sa jednim ili više V i/ili J genskih segmenata lakog lanca (npr. humanim V i/ili J genskim segmentom lakog lanca) na lokusu teškog lanca.

[0052] [Izbrisano]

[0053] [Izbrisano]

[0054] U jednom primeru izvođenja, modifikacija je na prvom imunoglobulinskom alelu teškog lanca na prvom lokusu i drugom imunoglobulinskom alelu teškog lanca na drugom lokusu, a ADAM6 funkcija nastaje ekspresijom ektopične ADAM6 sekvence na prvom imunoglobulinskom alelu teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, modifikacija na prvom imunoglobulinskom alelu teškog lanca je na prvom lokusu, a na drugom imunoglobulinskom alelu teškog lanca je na drugom lokusu, dok ADAM6 funkcija ili aktivnost nastaje ekspresijom ektopičnog ADAM6 na drugom imunoglobulinskom alelu teškog lanca.

[0055] Opisan je miš koji sadrži heterozigotno ili homozigotno inaktivirani ADAM6. Miš može dalje sadržati modifikovanu imunoglobulinsku sekvencu, to jest humanu ili humanizovanu imunoglobulinsku sekvencu, ili kamilju ili kamilizovanu humanu ili mišju imunoglobulinsku sekvencu. Modifikovana imunoglobulinska sekvenca može biti prisutna na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. Modifikovana imunoglobulinska sekvenca može sadržati sekvencu humanog varijabilnog gena teškog lanca na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. Sekvenca humanog varijabilnog genskog teškog lanca može zameniti endogenu varijabilnu sekvencu teškog lanca na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca.

[0056] Takođe je opisan miš koji ne može da izražava funkcionalni endogeni mišji ADAM6 od endogenog mišjeg ADAM6 lokusa. Miš može sadržati ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6, ili njegov funkcionalni fragment, koji je funkcionalan kod miša. Ektopična sekvenca nukleinske kiseline može kodirati protein koji sprečava gubitak sposobnosti generisanja potomstva koji ispoljava mužjak miša koji je homozigotan za inaktivaciju ADAM6. Ektopična sekvenca nukleinske kiseline može kodirati mišji ADAM6 protein.

[0057] Opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, i koji sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja obezbeđuje mišju ADAM6 funkciju. Sekvenca nukleinske kiseline može sadržati endogenu mišju ADAM6 sekvencu ili njen funkcionalni fragment. Endogena mišja ADAM6 sekvenca sadrži ADAM6a i ADAM6b kodirajuću sekvencu koja je locirana u mišu prirodnog tipa između 3’-najbližeg mišjeg imunoglobulinskog V genskog segmenta (VH) teškog lanca i 5’-najbližeg mišjeg imunoglobulinskog D genskog segmenta (DH) teškog lanca.

[0058] Opisana je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6a ili njegov funkcionalni fragment i/ili sekvenca koja kodira mišji ADAM6b ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu su ADAM6a i/ili ADAM6b ili njihov funkcionalni fragment, odnosno fragmenti operativno povezani sa promoterom. Promoter može biti humani promoter. Promoter može biti mišji ADAM6 promoter. ADAM6 promoter sadrži sekvencu koja može biti locirana između prvog kodona prvog ADAM6 gena najbližeg 5’-najbližem mišjem DH genskom segmentu i rekombinantne signalne sekvence 5’-najbližeg DH genskog segmenta, pri čemu je 5’ označeno u odnosu na smer transkripcije mišjih imunoglobulinskih gena. Promoter može biti virusni promoter. Virusni promoter može biti citomegalovirusni (CMV) promoter. Promoter može biti ubikvitinski promoter.

[0059] Promoter može biti induktibilni promoter. Induktibilni promoter može regulisati ekspresiju u nereproduktivnim tkivima. Induktibilni promoter može regulisati ekspresiju u reproduktivnim tkivima. Ekspresija mišjih ADAM6a i/ili ADAM6b sekvenci ili njihovog funkcionalnog fragmenta, odnosno fragmenata može biti razvojno regulisana induktibilnim promoterom u reproduktivnim tkivima.

[0060] U jednom primeru izvođenja, mišji ADAM6a i/ili ADAM6b su izabrani između ADAM6a sa SEQ ID NO:1 i/ili ADAM6b sekvence SEQ ID NO:2. U jednom primeru izvođenja, mišji ADAM6 promoter je promoter sa SEQ ID NO:3. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji ADAM6 promoter sadrži sekvencu nukleinske kiseline sa SEQ ID NO:3 direktno uzvodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6a) od prvog kodona ADAM6a i ona se pruža do kraja SEQ ID NO:3 uzvodno od ADAM6 kodirajućeg regiona. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, ADAM6 promoter je fragment koji se pruža u okviru od oko 5 do oko 20 nukleotida uzvodno od start kodona ADAM6a do oko 0.5kb, 1kb, 2kb, ili 3kb ili više uzvodno od start kodona ADAM6a.

[0061] U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO:3 ili njen fragment koji kada se umetnu u miša koji je neplodan ili koji ima nisku plodnost zbog nedostatka ADAM6, poboljšavaju plodnost ili ponovo uspostavljaju plodnost kao što je plodnost kod prirodnog tipa. U jednom primeru izvođenja, SEQ ID NO:3 ili njen fragment obezbeđuju mužjaku miša sposobnost da proizvodi ćeliju sperme koja može da prođe kroz jajovod ženke miša da bi oplodio mišje jajašce.

[0062] U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline je bilo koja sekvenca koja kodira ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment i koja kada se umetne u miša ili zadrži u njemu obezbeđuje nivo plodnosti koji je isti ili uporediv sa mišem prirodnog tipa. Ilustrativni nivo plodnosti može biti demonstriran sposobnošću mužjaka miša da proizvodi ćeliju sperme koja može da prođe kroz jajovod ženke miša da bi oplodila mišje jajašce.

[0063] Takođe je opisan miš koji sadrži deleciju endogene nukleotidne sekvence koja kodira ADAM6 protein, zamenu endogenog mišjeg VH genskog segmenta sa humanim VH genskim segmentom, i ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.

[0064] U jednom primeru, miš sadrži imunoglobulinski lokus teškog lanca koji sadrži deleciju endogenog imunoglobulinskog lokusa nukleotidne sekvence koji sadrži endogeni ADAM6 gen, sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata, i pri čemu se ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein nalazi u okviru nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata ili je direktno susedna sa njom.

[0065] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih endogenih VH genskih segmenata sa nukleotidnom sekvencom koja kodira jedan ili više humanih VH genskih segmenata, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein se nalazi u okviru nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više humanih VH genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži zamenu jednog ili više endogenih DH genskih segmenata sa jednim ili više humanih DH genskih segmenata na endogenom genskom lokusu DH. U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži zamenu jednog ili više endogenih JH genskih segmenata sa jednim ili više humanih JH genskih segmenata na endogenom genskom lokusu JH. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih endogenih VH, DH, i JH genskih segmenata i zamenu na endogenim genskim lokusima VH, DH, i JH sa humanim VH, DH, i JH genskim segmentima, pri čemu miš sadrži ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži inserciju humanih VH, DH i JH genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca, pri čemu miš sadrži ADAM6 gen koji je funkcionalan kod miša. Prema specifičnom primeru izvođenja, ektopična sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je smeštena između pretposlednjeg 3’-najbližeg VH genskog segmenta od prisutnih humanih VH genskih segmenata, i poslednjeg 3’ VH genskog segmenta od prisutnih humanih VH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži deleciju svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata, i zamenu sa svim ili u suštini svim humanim VH genskim segmentima, a ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je smeštena nizvodno od humanog genskog segmenta VH1-2 i uzvodno od humanog genskog segmenta VH6-1.

[0066] Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu svih ili u suštini svih endogenih VH genskih segmenata sa nukleotidnom sekvencom koja kodira jedan ili više humanih VH genskih segmenata, a ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein se nalazi u okviru nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više humanih VH genskih segmenata.

[0067] [Izbrisano]

[0068] Opisan je miš koji sadrži modifikaciju endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu miš izražava B ćeliju koja sadrži rearanžiranu imunoglobulinsku sekvencu operativno povezanu sa genskom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca, i B ćelija sadrži u svom genomu (npr. na hromozomu B ćelija) gen koja kodira ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. Rearanžirana imunoglobulinska sekvenca može biti operativno povezana sa genskom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca koja sadrži humanu V, D, i/ili J sekvencu teškog lanca; mišju V, D, i/ili J sekvencu teškog lanca; humanu ili mišju V i/ili J sekvencu lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, genska sekvenca konstantnog regiona teškog lanca sadrži humanu ili mišju sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od CH1, zgloba, CH2, a CH3, i njihove kombinacije.

[0069] Prema jednom aspektu, realizovani miš sadrži funkcionalno utišani endogeni varijabilni imunoglobulinski genski lokus teškog lanca, pri čemu je u mišu zadržana ADAM6 funkcija, i dalje sadrži inserciju jednog ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata uzvodno ili 5’ od jednog ili više mišjih konstantnih regiona teškog lanca. Jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata obuhvataju jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više humanih DH genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš dalje sadrži funkcionalno utišani endogeni lokus lakog lanca, pri čemu miš sadrži ADAM6 aktivnost koja je ista ili uporediva sa mišem prirodnog tipa, i dalje sadrži inserciju jednog ili više humanih genskih segmenata λ lakog lanca uzvodno ili 5’ od mišjeg konstantnog regiona lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, humani genski segmenti λ lakog lanca sadrže 12 humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, humani genski segmenti λ lakog lanca sadrže 12 humanih Vλ genskih segmenata i četiri humana Jλ genska segmenta. U jednom primeru izvođenja, humani genski segmenti λ lakog lanca sadrže 28 humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, humani genski segmenti λ lakog lanca sadrže 28 humanih Vλ genskih segmenata i četiri humana Jλ genska segmenta. U jednom primeru izvođenja, humani genski segmenti λ lakog lanca sadrže 40 humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, humani genski segmenti λ lakog lanca sadrže 40 humanih Vλ genskih segmenata i četiri humana Jλ genska segmenta. U različitim primerima izvođenja, četiri humana Jλ genska segmenta obuhvataju Jλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7. Mišji konstantni region lakog lanca je mišji CK.

[0070] Prema jednom aspektu, realizovan je genetski modifikovani miš, pri čemu taj miš sadrži funkcionalno utišani imunoglobulinski gen lakog lanca, i dalje sadrži zamenu jednog ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca sa jednim ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca, pri čemu mišu nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, i pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja izražava mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.

[0071] Prema jednom aspektu, realizovanom mišu nedostaje funkcionalni endogeni mišji ADAM6 lokus ili sekvenca i sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 lokus ili funkcionalni fragment mišjeg ADAM6 lokusa ili sekvence, pri čemu miš može da se pari sa mišem suprotnog pola da bi proizveo potomstvo koje sadrži ektopični ADAM6 lokus ili sekvencu. U jednom primeru izvođenja, miš je mužjak. U jednom primeru izvođenja, miš je ženka.

[0072] Prema jednom aspektu, genetski modifikovani realizovani miš sadrži humani imunoglobulinski genski segment varijabilnog regiona teškog lanca na endogenom mišjem imunoglobulinskom genskom lokusu varijabilnog regiona teškog lanca, pri čemu tom mišu nedostaje endogena funkcionalna ADAM6 sekvenca na endogenom mišjem imunoglobulinskom genskom lokusu varijabilnog regiona teškog lanca, i pri čemu miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja izražava mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.

[0073] [Izbrisano] U jednom primeru izvođenja, ektopična nukleotidna sekvenca koja izražava mišji ADAM6 protein je integrisana na jednom ili više lokusa u genomu miša koji je imunoglobulinski lokus teškog lanca.

[0074] Opisan je miš koji izražava imunoglobulinsku sekvencu teškog lanca modifikovanog endogenog mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu teški lanac potiče od humanog V genskog segmenta, D genskog segmenta, i J genskog segmenta, pri čemu miš sadrži ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša.

[0075] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži mnoštvo humanih V genskih segmenata, mnoštvo humanih D genskih segmenata, i mnoštvo humanih J genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži humanizovanu sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, pri čemu humanizacija sadrži zamenu sekvence izabrane između CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. Prema specifičnom primeru izvođenja, teški lanac potiče od humanog V genskog segmenta, humanog D genskog segmenta, humanog J genskog segmenta, humane CH1 sekvence, humane ili mišje zglobne sekvence, mišje CH2 sekvence, i mišje CH3 sekvence. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, miš dalje sadrži humanu konstantnu sekvencu lakog lanca.

[0076] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži ADAM6 gen koji je okružen sa 5’ i 3’ endogenim imunoglobulinskim genskim segmentima teškog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, endogeni imunoglobulinskim genski segmenti teškog lanca nisu sposobni da kodiraju teški lanac antitela.

[0077] U jednom primeru izvođenja, V genski segment je okružen sa 5’ (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša.

[0078] U jednom primeru izvođenja, V genski segment je okružen sa 3’ (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša.

[0079] U jednom primeru izvođenja, D genski segment je okružen sa 5’ (u odnosu na smer transkripcije D genskog segmenta) sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša.

[0080] U jednom primeru izvođenja, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša nastaje ekspresijom nukleotidne sekvence locirane kod 5’ od 5’-najbližeg D genskog segmenta i 3’ od 3’-najbližeg V genskog segmenta (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) modifikovanog endogenog mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca.

[0081] U jednom primeru izvođenja, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša nastaje ekspresijom nukleotidne sekvence locirane između dva humana V genska segmenta u modifikovanom endogenom mišjem imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, dva humana V genska segmenta su humani VH1-2 genski segment i VH6-1 genski segment.

[0082] Nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu izabranu između mišje ADAM6b sekvence ili njenog funkcionalnog fragmenta i mišje ADAM6a sekvence ili njenog funkcionalnog fragmenta.

[0083] U jednom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca između dva humana V genska segmenta je smeštena u suprotnom smeru transkripcije u odnosu na humane V genske segmente. Prema specifičnom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca kodira, od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije ADAM6 gena, i ADAM6a sekvencu praćenu ADAM6b sekvencom.

[0084] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu sekvence humanog ADAM6 pseudogena između humanih V genskih segmenata VH1-2 i VH6-1 sa mišjom ADAM6 sekvencom ili njenim funkcionalnim fragmentom.

[0085] U jednom primeru izvođenja, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna kod miša je mišja ADAM6 sekvenca ili njen funkcionalni fragment.

[0086] Opisan je miš koji sadrži endogeni mišji DFL16.1 genski segment (npr. kod miša koji je heterozigotan za modifikovani endogeni mišji imunoglobulinski lokus teškog lanca), ili humani DH1-1 genski segment. Imunoglobulinski D genski segment teškog lanca izražen od strane miša može poticati od endogenog mišjeg DFL16.1 genskog segmenta ili humanog DH1-1 genskog segmenta.

[0087] Opisan je miš koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) u ćeliji koja nosi DNK iz loze nerearanžiranih B ćelija, ali koji ne sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) u B ćeliji koja sadrži rearanžirane imunoglobulinske lokuse, pri čemu se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) pojavljuje u genomu na poziciji koja je različita od pozicije na kojoj se mišji ADAM6 gen pojavljuje kod miša prirodnog tipa. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) može biti prisutna u svim ili u suštini svim ćelijama koje nose DNK koje nisu iz loze rearanžiranih B ćelija; sekvenca nukleinske kiseline može biti prisutna u germinativnoj liniji ćelija miša, ali ne u hromozomu rearanžirane B ćelije.

[0088] Opisan je miš koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) u svim ili u suštini svim ćelijama koje nose DNK, uključujući B ćelije koje sadrže rearanžirane imunoglobulinske lokuse, pri čemu se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) pojavljuje u genomu na poziciji koja je različita od pozicije na kojoj se mišji ADAM6 gen pojavljuje kod miša prirodnog tipa. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili njegov funkcionalni fragment) može biti nukleinska kiselina koja je susedna sa rearanžiranim imunoglobulinskim lokusom. Nukleinska kiselina koja može biti susedna sa rearanžiranim imunoglobulinskim lokusom je hromozom. Hromozom može biti hromozom koji se nalazi u mišu prirodnog tipa i hromozom sadrži modifikaciju mišjeg imunoglobulinskog lokusa.

[0089] Opisan je genetski modifikovani miš, pri čemu miš sadrži B ćeliju koja sadrži u svom genomu ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog. ADAM6 sekvenca ili njen ortolog ili homolog mogu biti na imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. ADAM6 sekvenca ili njen ortolog ili homolog mogu biti na lokusu koji nije imunoglobulinski lokus. ADAM6 sekvenca može biti na transgenu koji aktivira heterologi promoter. Heterologi promoter može biti neimunoglobulinski promoter. Opisana je B ćelija koja ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog.

[0090] 90% ili više B ćelija miša može sadržati gen koji kodira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod miša. Miš može biti mužjak miša.

[0091] Opisan je genom B ćelije koji sadrži prvi alel i drugi alel koji sadrži ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog. Genom B ćelije može sadržati prvi alel, ali ne i drugi alel koji sadrži ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog.

[0092] Opisan je miš koji sadrži modifikaciju na jednom ili više endogenih imunoglobulinskih alela teškog lanca, pri čemu modifikacija zadržava jedan ili više endogenih ADAM6 alela i miš dalje sadrži inserciju jednog ili više humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata uzvodno od mišjeg konstantnog regiona lakog lanca. Mišji konstantni region lakog lanca je mišji Cκ.

[0093] Modifikacija može obezbediti miša koji ne može da izražava funkcionalni teški lanac koji sadrži genske segmente rearanžiranog endogenog teškog lanca najmanje jednog alela teškog lanca i zadržava endogeni ADAM6 alel lociran u okviru najmanje jednog endogenog imunoglobulinskog alela teškog lanca.

[0094] Miševi mogu biti nesposobni za izražavanje funkcionalnog teškog lanca koji sadrži genske segmente rearanžiranog endogenog teškog lanca od najmanje jednog od endogenih imunoglobulinskih alela teškog lanca, i miševi izražavaju i ADAM6 protein od endogenog ADAM6 alela. Miševi mogu biti nesposobni za izražavanje funkcionalnog teškog lanca koji sadrži genske segmente rearanžiranog endogenog teškog lanca od dva endogena imunoglobulinska alela teškog lanca, i miševi mogu da izražavaju ADAM6 protein od jednog ili više endogenih ADAM6 alela.

[0095] Miševi mogu biti nesposobni za izražavanje funkcionalnog teškog lanca od svakog endogenog alela teškog lanca, i miševi sadrže funkcionalni ADAM6 alel lociran u okviru 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ili 120 ili više Mbp uzvodno (u odnosu na smer transkripcije mišjeg lokusa teškog lanca) mišje imunoglobulinske sekvence konstantnog regiona teškog lanca. Funkcionalni ADAM6 alel je lociran na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca (npr. u intergenskom V-D regionu, između dva V genska segmenta, između V i D genskog segmenta, između D i J genskog segmenta, itd.). Prema specifičnom primeru izvođenja, funkcionalni ADAM6 alel je lociran u okviru od 90 do 100 kb intergenske sekvence između finalnog mišjeg V genskog segmenta i prvog mišjeg D genskog segmenta.

[0096] Opisan je miš koji sadrži modifikaciju na jednom ili više endogenih ADAM6 alela.

[0097] Modifikacija može obezbediti miša koji ne može da izražava funkcionalni ADAM6 protein bar jednog od jednog ili više endogenih ADAM6 alela. Miš može biti nesposoban za izražavanje funkcionalnog ADAM6 proteina od svakog od endogenih ADAM6 alela.

[0098] Miševi mogu biti nesposobni za izražavanje funkcionalnog ADAM6 proteina od svakog endogenog ADAM6 alela, i miševi sadrže ektopičnu ADAM6 sekvencu.

[0099] Miševi mogu biti nesposobni za izražavanje funkcionalnog ADAM6 proteina od svakog endogenog ADAM6 alela, i miševi sadrže ektopičnu ADAM6 sekvencu lociranu u okviru 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ili 120 ili više kb uzvodno (u odnosu na smer transkripcije mišjeg lokusa teškog lanca) mišje imunoglobulinske sekvence konstantnog regiona teškog lanca. Ektopična ADAM6 sekvenca može biti na endogenom lokusu teškog lanca (npr. u intergenskom V-D regionu, između dva V genska segmenta, između V i D genskog segmenta, između D i J genskog segmenta, itd.). Ektopična ADAM6 sekvenca može biti locirana u okviru od 90 do 100 kb intergenske sekvence između finalnog mišjeg V genskog segmenta i prvog mišjeg D genskog segmenta. Endogena 90 do 100 kb intergenska V-D sekvenca može biti odstranjena, a ektopična ADAM6 sekvenca postavljena između finalnog V i prvog D genskog segmenta.

[0100] Opisan je neplodni mužjak miša, pri čemu miš sadrži deleciju dva ili više endogenih ADAM6 alela. Takođe je opisana ženka miša koja nosi osobinu neplodnosti mužjaka, pri čemu ženka miša sadrži u svojoj germinativnoj liniji nefunkcionalni ADAM6 alel ili inaktivirani endogeni ADAM6 alel.

[0101] Opisan je miš koji sadrži endogeni imunoglobulinski V, D, i ili J genski segment teškog lanca koji ne može da se rearanžira da bi kodirao teški lanac antitela, pri čemu većina B ćelija miša sadrži funkcionalni ADAM6 gen. Većina B ćelija miša može dalje sadržati jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata uzvodno od mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca. Mišji imunoglobulinski konstantni region lakog lanca je mišji CK.

[0102] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži intaktne endogene imunoglobulinske V, D, i J genske segmente teškog lanca koji nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali funkcionalni teški lanac antitela. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži najmanje jedan i do 89 V genskih segmenata, najmanje jedan i do 13 D genskih segmenata, najmanje jedan i do četiri J genska segmenta, i njihovu kombinaciju; pri čemu najmanje jedan i do 89 V genskih segmenata, najmanje jedan i do 13 D genskih segmenata, najmanje jedan i do četiri J genska segmenta nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali varijabilni region teškog lanca antitela. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži funkcionalni ADAM6 gen lociran u okviru intaktnih endogenih imunoglobulinskih V, D, i J genskih segmenata teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži endogeni lokus teškog lanca koji sadrži endogeni ADAM6 lokus, pri čemu endogeni lokus teškog lanca sadrži 89 V genskih segmenata, 13 D genskih segmenata, i četiri J genska segmenta, pri čemu endogeni genski segmenti teškog lanca nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali varijabilni region teškog lanca antitela i ADAM6 lokus kodira ADAM6 protein koji je funkcionalan kod miša.

[0103] Opisan je miš kome nedostaje endogeni imunoglobulinski V, D, i J genski segment teškog lanca, pri čemu većina B ćelija miša sadrži ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog. Većina B ćelija miša može izražavati imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani lambda varijabilni domen i endogeni imunoglobulinski konstantni region lakog lanca.

[0104] U jednom primeru izvođenja, mišu nedostaju endogeni imunoglobulinski genski segmenti teškog lanca izabrani između dva ili više V genskih segmenata, dva ili više D genskih segmenata, dva ili više J genskih segmenata, i njihove kombinacije. U jednom primeru izvođenja, mišu nedostaju imunoglobulinski genski segmenti teškog lanca izabrani između najmanje jednog i do 89 V genskih segmenata, najmanje jednog i do 13 D genskih segmenata, najmanje jednog i do četiri J genska segmenta, i njihove kombinacije. U jednom primeru izvođenja, mišu nedostaje genomski DNK fragment iz hromozoma 12 koji sadrži oko tri megabaze endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišu nedostaju svi funkcionalni endogeni V, D, i J genski segmenti teškog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišu nedostaje 89 VH genskih segmenata, 13 DH genskih segmenata i četiri JH genska segmenta.

[0105] Opisan je miš, pri čemu miš u germinativnoj liniji ima genom koji sadrži modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu modifikacija imunoglobulinskog lokusa teškog lanca sadrži zamenu jedne ili više sekvenci mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog regiona sa jednom ili više sekvenci humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona, i pri čemu miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 protein. DH i JH sekvence i najmanje 3, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 40, najmanje 60, ili najmanje 80 VH sekvenci imunoglobulinskog lokusa teškog lanca mogu biti zamenjene sekvencama humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona. DH, JH, i sve VH sekvence imunoglobulinskog lokusa teškog lanca mogu biti zamenjene sekvencama humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona. Sekvence humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona mogu biti nerearanžirane. Sekvence humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona mogu sadržati kompletne nerearanžirane DH i JH regione i najmanje 3, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 40, najmanje 60, ili najmanje 80 nerearanžiranih VH sekvenci koje su humane. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, sekvence nemišjeg imunoglobulinskog varijabilnog regiona sadrže kompletni humani varijabilni region, uključujući sve VH, DH, i JH regione.

[0106] Opisan je miš koji izražava antitelo koje sadrži najmanje jedan humani varijabilni domen/nehumani konstantni domen imunoglobulinskog polipeptida, pri čemu miš izražava mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog iz lokusa drugačijeg od imunoglobulinskog lokusa.

[0107] ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog mogu biti izraženi u B ćeliji miša, pri čemu B ćelija sadrži rearanžiranu imunoglobulinsku sekvencu koja sadrži humanu varijabilnu sekvencu i nehumanu konstantnu sekvencu.

[0108] U jednom primeru izvođenja, nehumana konstantna sekvenca je glodarska sekvenca. U jednom primeru izvođenja, glodar je izabran između miša, pacova i hrčka.

[0109] Opisan je metod za dobijanje neplodnog mužjaka miša, koji sadrži činjenje endogenog ADAM6 alela donorskih ES ćelija nefunkcionalnim (ili inaktivaciju pomenutog alela), uvođenje donorskih ES ćelija u embrion domaćin, gestaciju embriona domaćina u surogat majku, i omogućavanje surogat majci da rodi potomstvo koje potiče u celini ili delimično od donorskih ES ćelija. Ovaj metod dalje može sadržati ukrštanje potomstva da bi se dobio neplodni mužjak miša.

[0110] Opisan je metod za dobijanje miša sa genetskom modifikacijom od interesa, pri čemu je miš neplodan, pri čemu taj metod sadrži korake (a) pravljenja genetske modifikacije od interesa u genomu; (b) modifikaciju genoma u inaktivirani endogeni ADAM6 alel, ili činjenje endogenog ADAM6 alela nefunkcionalnim; i, (c) korišćenje genoma za dobijanje miša. Genom može biti od ES ćelije ili se može upotrebiti u eksperimentu transfera nukleusa.

[0111] Opisan je miš napravljen korišćenjem ciljajućeg vektora, nukleotidnog konstrukta, ili ćelije kao što je ovde opisano.

[0112] Opisano je potomstvo dobijeno parenjem ovde opisanog miša sa drugim mišem koji je miš prirodnog tipa ili je genetski modifikovan.

[0113] Opisan je metod za održavanje soja miševa, pri čemu soj miševa sadrži zamenu mišje imunoglobulinske sekvence teškog lanca sa jednom ili više heterologih imunoglobulinskih sekvenci teškog lanca koje su humane imunoglobulinske sekvence teškog lanca.

[0114] U jednom primeru izvođenja, soj miševa sadrži deleciju jednog ili više mišjih VH, DH, i/ili JH genskih segmenata. Miš dalje sadrži jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i/ili jedan ili više humanih JH genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži najmanje 3, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 40, najmanje 60, ili najmanje 80 humanih VH segmenata, najmanje 27 humanih DH genskih segmenata, i najmanje šest JH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži najmanje 3, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 40, najmanje 60, ili najmanje 80 humanih VH segmenata, najmanje 27 humanih DH genskih segmenata, i najmanje šest JH genskih segmenata koji su operativno povezani sa genom konstantnog regiona. U jednom primeru izvođenja, gen konstantnog regiona je mišji gen konstantnog regiona. U jednom primeru izvođenja, gen konstantnog regiona sadrži sekvencu mišjeg gena konstantnog regiona izabranu između CH1, zgloba, CH2, CH3, i/ili CH4 ili njihove kombinacije.

[0115] Opisan je metod koji sadrži generisanje mužjaka miša heterozigotnog za zamenu mišje imunoglobulinske sekvence teškog lanca, i ukrštanje heterozigotnog mužjaka miša sa ženkom miša prirodnog tipa ili ženkom miša koja je homozigotna ili heterozigotna za humanu sekvencu teškog lanca. Metod može sadržati održavanje soja ponovljenim ukrštanjem heterozigotnih mužjaka sa ženkama koje su prirodnog tipa ili su homozigotne ili heterozigotne za humanu sekvencu teškog lanca.

[0116] Metod može sadržati dobijanje ćelija mužjaka ili ženki miševa homozigotnih ili heterozigotnih za humanu sekvencu teškog lanca, i korišćenje tih ćelija kao donorskih ćelija ili nukleusa iz njih kao donorskih nukleusa, i upotrebu ćelija ili nukleusa za dobijanje genetski modifikovanih životinja korišćenjem ćelija domaćina i/ili gestacijom ćelija i/ili nukleusa u surogat majkama.

[0117] [Izbrisano]

[0118] U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži zamenu varijabilne sekvence λ i/ili κ lakog lanca na endogenom imunoglobulinskom lokusu lakog lanca sa heterologim imunoglobulinskim sekvencama lakog lanca. Heterologe imunoglobulinske sekvence lakog lanca su humane imunoglobulinske varijabilne sekvence λ lakog lanca i takođe mogu sadržati varijabilne sekvence κ lakog lanca.

[0119] [Izbrisano]

[0120] Opisan je konstrukt nukleinske kiseline, koji sadrži uzvodni homologi krak i nizvodni homologi krak, pri čemu uzvodni homologi krak sadrži sekvencu koja je identična ili je u suštini identična sekvenci humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca, dok nizvodni homologi krak sadrži sekvencu koja je identična ili je u suštini identična sa sekvencom humanog ili mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog regiona, a između uzvodnog i nizvodnog homologog kraka je smeštena sekvenca koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein.

Sekvenca koja može kodirati mišji ADAM6 gen je operativno povezana sa mišjim promoterom sa kojim je mišji ADAM6 povezan kod miša prirodnog tipa.

[0121] Opisan je ciljajući vektor, koji sadrži (a) nukleotidnu sekvencu koja je identična ili je u suštini identična sa nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona humanog genskog segmenta; i, (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod miša.

[0122] Ciljajući vektor može dalje sadržati promoter operativno povezan sa sekvencom koja kodira mišji ADAM6. Prema specifičnom primeru izvođenja, promoter je mišji ADAM6 promoter.

[0123] Opisan je je nukleotidni konstrukt za modifikaciju mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog lokusa teškog lanca, pri čemu taj konstrukt sadrži najmanje jedno mesno specifično mesto za prepoznavanje rekombinaze i sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod miša.

[0124] Prema jednom aspektu realizovani su mišje ćelije i mišji embrioni, uključujući, ali bez ograničavanja na ES ćelije, pluripotentne ćelije, i indukovane pluripotentne ćelije, koje sadrže genetske modifikacije koje su ovde opisane. Realizovane su ćelije koje su XX i ćelije koje su XY. Takođe su realizovane ćelije koje sadrže nukleus koji sadrži modifikaciju koja je ovde opisana, npr. modifikaciju koja je uvedena u ćeliju pronuklearnom injekcijom. Takođe su opisani ćelije, embrioni, i miševi koji sadrže virusno uvedeni ADAM6 gen, npr. takođe su opisani ćelije, embrioni, i miševi koji sadrže transdukcioni konstrukt koji sadrži ADAM6 gen koji je funkcionalan kod miša.

[0125] Opisana je genetski modifikovana mišja ćelija, pri čemu toj ćeliji nedostaje funkcionalni endogeni mišji ADAM6 lokus, i ćelija sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. Ćelija može dalje sadržati modifikaciju sekvence endogenog imunoglobulinskog varijabilnog gena teškog lanca. Modifikacija sekvence endogenog imunoglobulinskog varijabilnog gena teškog lanca može obuhvatati deleciju izabranu između delecije mišjeg VH genskog segmenta, delecije mišjeg DH genskog segmenta, delecije mišjeg JH genskog segmenta, i njihove kombinacije. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu jedne ili više mišjih imunoglobulinskih VH, DH, i/ili JH sekvenci sa humanom imunoglobulinskom sekvencom. Humana imunoglobulinska sekvenca može biti izabrana između humane VH, humane VL, humane DH, humane JH, humane JL, i njihove kombinacije.

[0126] U jednom primeru izvođenja, ćelija je totipotentna ćelija, pluripotentna ćelija, ili indukovana pluripotentna ćelija. Prema specifičnom primeru izvođenja, ćelija je mišja ES ćelija.

[0127] Prema jednom aspektu, realizovana je mišja B ćelija, pri čemu je realizovana B ćelija izolovana iz miša, gde mišja B ćelija sadrži rearanžirani imunoglobulinski gen teškog lanca, pri čemu B ćelija sadrži na hromozomu B ćelije sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. U jednom primeru izvođenja, mišja B ćelija sadrži dva alela sekvence nukleinske kiseline.

[0128] U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline se nalazi na molekulu nukleinske kiseline (npr. hromozomu B ćelije) koji je susedan sa rearanžiranim mišjim imunoglobulinskim lokusom teškog lanca.

[0129] [Izbrisano]

[0130] U jednom primeru izvođenja, mišja B ćelija sadrži sekvencu rearanžiranog nemišjeg imunoglobulinskog varijabilnog gena operativno povezanu sa genom mišjeg ili humanog imunoglobulinskog konstantnog regiona, pri čemu B ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša.

[0131] Prema jednom aspektu, realizovana je somatska mišja ćelija, pri čemu je ta ćelija izolovana iz realizovanog miša, a ta ćelija sadrži hromozom koji je modifikovani imunoglobulinski lokus teškog lanca, i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša. Sekvenca nukleinske kiseline je na istom hromozomu kao modifikovani imunoglobulinski lokus teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, somatska ćelija sadrži samo jednu kopiju sekvence nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, somatska ćelija sadrži najmanje dve kopije sekvence nukleinske kiseline. Prema specifičnom primeru izvođenja, somatska ćelija je B ćelija. Prema specifičnom primeru izvođenja, ćelija je germinativna ćelija. Prema specifičnom primeru izvođenja, ćelija je matična ćelija.

[0132] Prema jednom aspektu, realizovana je mišja germinativna ćelija, gde je realizovana ćelija izolovana iz miša, pri čemu ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) na hromozomu germinativne ćelije, pri čemu se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) nalazi na poziciji u hromozomu koja je različita od pozicije u hromozomu germinativne ćelije miša prirodnog tipa. Sekvenca nukleinske kiseline se nalazi na mišjem imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, mišji imunoglobulinski lokus sadrži zamenu najmanje jedne mišje imunoglobulinske sekvence sa najmanje jednom humanom imunoglobulinskom sekvencom.

[0133] Prema jednom aspektu, realizovana je pluripotentna, indukovana pluripotentna, ili totipotentna ćelija koja potiče od miša koji je ovde opisan. Prema specifičnom primeru izvođenja, ćelija je mišja embrionska matična (engl. embryonic stem, skr. ES) ćelija.

[0134] Prema jednom aspektu, realizovani su ćelija ili tkivo koji potiču od miša koji je ovde opisan. U jednom primeru izvođenja, ćelija ili tkivo potiču od slezine, limfnog čvora ili koštane srži miša koji je ovde opisan. U jednom primeru izvođenja, ćelija je B ćelija. U jednom primeru izvođenja ćelija je embrionska matična ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija je germinativna ćelija.

[0135] U jednom primeru izvođenja, tkivo je izabrano između vezivnog, mišićnog, nervnog i epitelnog tkiva. Prema specifičnom primeru izvođenja, tkivo je reproduktivno tkivo.

[0136] U jednom primeru izvođenja, ćelija i/ili tkivo koji potiču od miša koji je ovde opisan se izoluju radi primene u jednom ili više ex vivo testova. U različitim primerima izvođenja, jedan ili više ex vivo testova obuhvataju merenja fizičkih, termičkih, električnih, mehaničkih ili optičkih svojstava, hiruršku proceduru, merenja interakcija različitih tipova tkiva, razvoj tehnika snimanja, ili njihovu kombinaciju.

[0137] Prema jednom aspektu, realizovana je primena ćelije ili tkiva koji potiču od miša koji je ovde opisan za dobijanje antitela. Prema jednom aspektu, realizovana je primena ćelije ili tkiva od miša koji su ovde opisani za dobijanje hibridoma ili kvadroma.

[0138] Prema jednom aspektu, mišja ćelija sadrži hromozom ili fragment miša koji je ovde opisan. U jednom primeru izvođenja, mišja ćelija sadrži nukleus miša koji je ovde opisan. U jednom primeru izvođenja, mišja ćelija sadrži hromozom ili njegov fragment kao rezultat transfera nukleusa.

[0139] Opisan je nukleus koji potiče od miša koji je ovde opisan. Nukleus može biti od diploidne ćelije koja nije B ćelija.

[0140] Opisana je nukleotidna sekvenca koja kodira imunoglobulinski varijabilni region napravljen u mišu koji je opisan.

[0141] Opisana je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca ili imunoglobulinskog lakog lanca antitela napravljena u mišu koji je ovde opisan.

[0142] Opisana je nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca ili imunoglobulinskog lakog lanca koja kodira varijabilni region antitela napravljen u mišu koji je ovde opisan.

[0143] Opisano je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (npr. Fab, F(ab)2, scFv) napravljen u mišu koji je ovde opisan.

[0144] Opisan je metod za dobijanje genetski modifikovanog miša, koji sadrži zamenu jednog ili više imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca uzvodno (u odnosu na transkripciju imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca) endogenog ADAM6 lokusa miša sa jednim ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca, i zamenu jednog ili više imunoglobulinskih genskih segmenata nizvodno (u odnosu na transkripciju imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca) d ADAM6 lokusa miša sa jednim ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca ili lakog lanca. Jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata uzvodno od endogenog ADAM6 lokusa miša mogu sadržati V genske segmente. Humani imunoglobulinski genski segmenti koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata uzvodno od endogenog ADAM6 lokusa miša mogu sadržati V i D genske segmente. Jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji mogu zameniti jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nizvodno od endogenog ADAM6 lokusa miša sadrže J genske segmente. Jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji mogu zameniti jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nizvodno od endogenog ADAM6 lokusa miša sadrže D i J genske segmente. Jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji mogu zameniti jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nizvodno od endogenog ADAM6 lokusa miša sadrže V, D i J genske segmente.

[0145] Jedan ili više imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca uzvodno i/ili nizvodno od ADAM6 gena u pluripotentnoj, indukovanoj pluripotentnoj, ili totipotentnoj ćeliji mogu biti zamenjeni da bi se formirala genetski modifikovana progenitorska ćelija; genetski modifikovana progenitorska ćelija se uvodi u domaćina; i, domaćin koji sadrži genetski modifikovanu progenitorsku ćeliju zatrudni da bi se formirao miš koji sadrži genom koji potiče od genetski modifikovane progenitorske ćelije. U jednom primeru izvođenja, domaćin je embrion. Domaćin može biti izabran između mišje pre-morule (npr. stadijuma sa 8 ili 4 ćelije), tetraploidnog embriona, agregata embrionskih ćelija, ili blastocista.

[0146] Opisan je metod za dobijanje genetski modifikovanog miša, koji sadrži zamenu mišje nukleotidne sekvence koja sadrži mišji imunoglobulinski genski segment i mišju ADAM6 (ili njen ortolog ili homolog ili fragment koji su funkcionalni kod mužjaka miša) nukleotidnu sekvencu sa sekvencom koja sadrži humani imunoglobulinski genski segment da bi se formirao prvi himerični lokus, a onda umetanje sekvence koja sadrži sekvencu koja kodira mišji ADAM6 (ili sekvence koja kodira njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment) u sekvencu koja sadrži humani imunoglobulinski genski segment da bi se formirao drugi himerični lokus.

[0147] Drugi himerični lokus može sadržati humani imunoglobulinski varijabilni (VH) genski segment teškog lanca. Drugi himerični lokus može sadržati humani imunoglobulinski varijabilni (VL) genski segment lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, drugi himerični lokus sadrži humani VH genski segment ili humani VL genski segment operativno povezan sa humanim DH genskim segmentom i humanim JH genskim segmentom. Drugi himerični lokus može biti operativno povezan sa trećim himeričnim lokusom koji sadrži humanu CH1 sekvencu, ili humanu CH1 i sekvencu humanog zgloba, fuzionisane sa mišjom CH2 CH3 sekvencom.

[0148] Opisana je primena miša koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži mišji ADAM6 lokus ili sekvencu da bi se dobio plodni mužjak miša, pri čemu primena sadrži parenje miša koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži mišji ADAM6 lokus ili sekvencu sa mišem kome nedostaje funkcionalni endogeni mišji ADAM6 lokus ili sekvenca, i dobijanje potomstva koje je žensko, a sposobno je za dobijanje potomstva koje ima ektopični ADAM6 lokus ili sekvencu ili koje je muško, a koje sadrži ektopični ADAM6 lokus ili sekvencu, i mužjaka odlikuje plodnost koja je približno ista kao plodnost koja odlikuje mužjaka miša prirodnog tipa.

[0149] Prema jednom aspektu, realizovana je primena ovde opisanog miša za dobijanje nukleotidne sekvence imunoglobulinskog varijabilnog regiona.

[0150] Prema jednom aspektu, realizovana je primena ovde opisanog miša za dobijanje potpuno humanog Fab ili potpuno humanog F(ab)2.

[0151] Opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje imortalizovane ćelijske linije.

[0152] Opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje hibridoma ili kvadroma.

[0153] Opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje biblioteke faga koja sadrži humane varijabilne regione teškog lanca i humane varijabilne regione lakog lanca.

[0154] Prema jednom aspektu, realizovana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona za dobijanje humanog antitela, koja sadrži (a) imunizaciju miša koji je ovde opisan sa antigenom od interesa, (b) izolaciju limfocita iz imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje limfocita jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju limfocita koji je sposoban za vezivanje za antigen od interesa, i (e) amplifikaciju jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona iz limfocita čime se generiše sekvenca varijabilnog regiona.

[0155] U jednom primeru izvođenja, limfocit potiče iz slezine miša. U jednom primeru izvođenja, limfocit potiče iz limfnog čvora miša. U jednom primeru izvođenja, limfocit potiče iz koštane srži miša.

[0156] U jednom primeru izvođenja, obeleženo antitelo je antitelo konjugovano sa fluoroforom. U jednom primeru izvođenja, jedno ili više antitela konjugovanih sa fluoroforom su izabrana između IgM, IgG, i/ili njihove kombinacije.

[0157] U jednom primeru izvođenja, limfocit je B ćelija.

[0158] U jednom primeru izvođenja, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca je sekvenca imunoglobulinskog varijabilnog regiona κ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca.

[0159] U jednom primeru izvođenja, realizovana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela koja sadrži (a) imunizaciju miša koji je ovde opisan sa antigenom od interesa, (b) izolaciju iz slezine imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz slezine jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju B limfocita iz (c) koji je sposoban za vezivanje za antigen od interesa, i (e) amplifikaciju sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se generišu sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca.

[0160] U jednom primeru izvođenja, realizovana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja sadrži (a) imunizaciju miša koji je ovde opisan sa antigenom od interesa, (b) izolaciju jednog ili više limfnih čvorova iz imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz jednog ili više limfnih čvorova jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju B limfocita iz (c) koji je sposoban za vezivanje za antigen od interesa, i (e) amplifikaciju sekvence varijabilnog regiona teškog lanca nukleinske kiseline i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se generišu sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca.

[0161] U jednom primeru izvođenja, realizovana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja sadrži (a) imunizaciju miša koji je ovde opisan sa antigenom od interesa, (b) izolaciju koštane srži iz imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz koštane srži jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju B limfocita iz (c) koji je sposoban za vezivanje za antigen od interesa, i (e) amplifikaciju sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca i sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se generišu sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i κ lakog lanca. U različitim primerima izvođenja, jedno ili više obeleženih antitela su izabrani između IgM, IgG, i/ili njihove kombinacije.

[0162] U različitim primerima izvođenja, realizovana je primena ovde opisanog miša za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i κ lakog lanca za dobijanje humanog antitela, koja dalje sadrži fuzionisanje amplifikovanih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca sa humanim sekvencama konstantnog regiona teških i lakih lanaca, koje izražavaju fuzionisane sekvence teškog i lakog lanca u ćeliji, i rekuperaciju izraženih sekvenci teškog i lakog lanca čime se generiše humano antitelo.

[0163] U različitim primerima izvođenja, humani konstantni regioni teškog lanca su izabrani između IgM, IgD, IgA, IgE i IgG. U različitim specifičnim primerima izvođenja, IgG je izabran između IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U različitim primerima izvođenja, humani konstantni region teškog lanca sadrži CH1, zglob, CH2, CH3, CH4, ili njihovu kombinaciju. U različitim primerima izvođenja, konstantni region lakog lanca je imunoglobulinski κ konstantni region. U različitim primerima izvođenja, ćelija je izabrana između HeLa ćelije, DU145 ćelije, Lncap ćelije, MCF-7 ćelije, MDA-MB-438 ćelije, PC3 ćelije, T47D ćelije, THP-1 ćelije, U87 ćelije, SHSY5Y (humane neuroblastoma) ćelije, Saos-2 ćelije, Vero ćelije, CHO ćelije, GH3 ćelije, PC12 ćelije, humane retinalne ćelije (npr. PER.C6™ ćelije), i MC3T3 ćelije. Prema specifičnom primeru izvođenja, ćelija je CHO ćelija.

[0164] Prema jednom aspektu, realizovan je metod za generisanje reverznohimeričnog glodarsko-humanog antitela specifičnog protiv antigena od interesa, koji sadrži korake imunizacije miša koji je ovde opisan sa antigenom, izolaciju najmanje jedne ćelije iz miša koji proizvodi reverzno-himerično mišje-humano antitelo specifično protiv antigena, kultivaciju najmanje jedne ćelije koja proizvodi reverznohimerično mišje-humano antitelo specifično protiv antigena, i dobijanje pomenutog antitela.

[0165] U jednom primeru izvođenja, reverzno-himerično mišje-humano antitelo sadrži humani varijabilni domen teškog lanca fuzionisan sa konstantnim genom mišjeg ili pacovskog teškog lanca, i humani varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa mišjim ili pacovskim humanim konstantnim genom lakog lanca.

[0166] U jednom primeru izvođenja, kultivacija najmanje jedne ćelije koja proizvodi reverzno-himerično glodarsko-humano antitelo specifično protiv antigena se vrši na najmanje jednoj hibridoma ćeliji generisanoj od najmanje jedne ćelije izolovane iz miša.

[0167] Prema jednom aspektu, realizovan je metod za generisanje potpuno humanog antitela specifičnog protiv antigena od interesa, koji sadrži korake imunizacije miša koji je ovde opisan sa antigenom, izolaciju najmanje jedne od ćelija iz miša koja proizvodi reverzno-himerično glodarsko-humano antitelo specifično protiv antigena, generisanje najmanje jedne ćelije koja proizvodi potpuno humano antitelo koje potiče od reverzno-himerično glodarskog-humanog antitela specifičnog protiv antigena, i kultivaciju najmanje jedne ćelije koja proizvodi potpuno humano antitelo, i dobijanje pomenutog potpuno humanog antitela.

[0168] U različitim primerima izvođenja, najmanje jedna ćelija koja je izolovana iz miša koji proizvodi reverzno-himerično glodarsko-humano antitelo specifično protiv antigena je splenocit ili B ćelija.

[0169] U različitim primerima izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo.

[0170] U različitim primerima izvođenja, imunizacija sa antigenom od interesa se izvodi sa proteinom, DNK, kombinacijom DNK i proteina, ili ćelijama koje izražavaju antigen.

[0171] Prema jednom aspektu, realizovana je primena ovde opisanog miša za dobijanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski varijabilni region ili njegov fragment. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline se upotrebljava za dobijanje humanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U jednom primeru izvođenja, miš se upotrebljava za dobijanje antigen-vezujućeg proteina izabranog između antitela, multi-specifičnog antitela (npr. bi-specifičnog antitela), scFv, bi-specifičnog scFv, dijatela, trijatela, tetratela, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD (tj. dualnog varijabilnog domenskog antigen-vezujućeg proteina), SVD (tj. jednostrukog varijabilnog domenskog antigen-vezujućeg proteina), ili bispecifičnog zahvatača T-ćelija (BiTE).

[0172] Opisana je primena ovde opisanog miša za uvođenje ektopične ADAM6 sekvence u miša kome nedostaje funkcionalna endogena mišja ADAM6 sekvenca, pri čemu ta primena sadrži parenje miša koji je ovde opisan sa mišem kome nedostaje funkcionalna endogena mišja ADAM6 sekvenca.

[0173] Opisana je primena genetskog materijala iz miša koji je ovde opisan za dobijanje miša koji ima ektopičnu ADAM6 sekvencu. Primena može sadržati transfer nukleusa uz korišćenje nukleusa ćelije miša koji je ovde opisan. Primena može sadržati kloniranje ćelije ovde opisanog miša za dobijanje životinje koja potiče od te ćelije. Primena može sadržati korišćenje sperme ili jajašca ovde opisanog miša u procesu dobijanja miša koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu.

[0174] Opisan je metod za dobijanje plodnog mužjaka miša koji sadrži modifikovani imunoglobulinski lokus teškog lanca, koji sadrži oplođavanje prve mišje germinativne ćelije koja sadrži modifikaciju endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca sa drugom mišjom germinativnom ćelijom koja sadrži ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša; formiranje oplođene ćelije; omogućavanje da se oplođena ćelija razvije u embrion; i, gestaciju embriona u surogat da bi se dobio miš.

[0175] Oplođenje se može izvršiti parenjem mužjaka miša i ženke miša. Ženka miša može sadržati ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili fragment. Mužjak miša može sadržati ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili fragment.

[0176] Opisana je primena sekvence nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 protein ili njen ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment odgovarajućeg ADAM6 proteina za ponovno uspostavljanje ili poboljšanje plodnosti miša koji ima genom koji sadrži modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu ta modifikacija smanjuje ili eliminiše endogenu ADAM6 funkciju.

[0177] Sekvenca nukleinske kiseline je integrisana u genom miša na endogenom imunoglobulinskom lokusu koji je lokus teškog lanca.

[0178] Ovde je opisana primena ovde opisanog miša za proizvodnju leka (npr. antigen-vezujućeg proteina), ili za proizvodnju sekvence koja kodira varijabilnu sekvencu leka (npr. antigen-vezujući protein), za lečenje humane bolesti ili poremećaja.

[0179] Opisana je genetski modifikovana mišja ćelija, pri čemu ta ćelija nije sposobna za izražavanje teškog lanca koji sadrži rearanžirane endogene imunoglobulinske genske segmente teškog lanca, i ćelija sadrži funkcionalni ADAM6 gen koji kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. Ćelija može dalje sadržati inserciju humanih imunoglobulinskih genskih segmenata. Humani imunoglobulinski genski segmenti mogu biti genski segmenti teškog lanca koji su operativno povezani sa mišjim konstantnim regionima teškog lanca takvim da posle rearanžiranja kodiraju funkcionalni teški lanac antitela koji sadrži humani varijabilni region.

[0180] Opisani su genetski miševi, embrioni, ćelije, tkiva, kao i konstrukti nukleinskih kiselina za modifikaciju miševa, i metode i kompozicije za dobijanje i njihova primena. Takođe su opisani miševi i ćelije koji generišu lambda (λ) varijabilne regione (humane ili nehumane) u kontekstu kapa (κ) lakog lanca, pri čemu miševi i ćelije sadrže modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca koja eliminiše ili smanjuje aktivnost ADAM6 proteina ili njegovog homologa ili ortologa, pri čemu miševi dalje sadrže genetsku modifikaciju koja ponovo uspostavlja ADAM6 aktivnost (ili aktivnost njegovog homologa ili ortologa), u celini ili delimično. Takođe su opisani miševi koji su plodni i izražavaju humani λ varijabilni domen srodan sa humanim varijabilnim domenom teškog lanca, pri čemu se humani λ varijabilni domen izražava u mišu susedno sa mišjim κ konstantnim regionom, a u različitim primerima izvođenja κ konstantni region je endogeni (mišji) konstantni region. Takođe su opisani miševi i ćelije koje generišu humane λ varijabilne regione u kontekstu mišjeg κ lakog lanca, npr. od mišjeg endogenog lokusa lakog lanca. Takođe su opisani metodi za dobijanje antitela koja sadrže lambda varijabilne regione. Takođe su opisani metodi za selekciju teških lanaca koji se izražavaju sa srodnim lambda varijabilnim regionima.

[0181] Opisani su himerični i humani antigen-vezujući proteini (npr. antitela), i nukleinske kiseline koje ih kodiraju, a koje sadrže somatski mutirane varijabilne regione, uključujući antitela koja imaju lake lance koji sadrže varijabilni domen koji potiče od humanog Vλ i humanog Jλ genskog segmenta fuzionisanog sa konstantnim domenom mišjeg κ lakog lanca.

[0182] Opisan je miš koji izražava humanu λ sekvencu varijabilnog regiona na lakom lancu koji sadrži κ konstantni region. Opisan je miš koji izražava laki lanac koji sadrži humanu λ sekvencu varijabilnog regiona od mišjeg endogenog lokusa lakog lanca. Opisan je miš koji sadrži gen rearanžiranog lakog lanca koji sadrži humanu λ varijabilnu sekvencu povezanu sa mišjom κ konstantnom sekvencom.

[0183] Opisan je genetski modifikovani miš, pri čemu miš sadrži nerearanžirani humani varijabilni genski segment (hVλ) λ lakog lanca i humani λ spojni genski segment (hJλ). Nerearanžirani hVλ i hJλ su smešteni na mišjem lokusu κ lakog lanca. Miš može biti sposoban da pravi imunoglobulin koji sadrži laki lanac koji potiče od nerearanžirane hVλ sekvence i hJλ sekvence i sekvence nukleinske kiseline konstantnog regiona (Cκ) mišjeg κ lakog lanca. Takođe su opisani metodi i kompozicije za dobijanje i korišćenje genetski modifikovanih miševa. Opisana su antitela koja sadrže (a) humani varijabilni domen teškog lanca (hVH) fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca, i (b) humani VL fuzionisan sa mišjim Cκ domenom; uključujući ona u kojima su jedan ili više varijabilnih domena somatski mutirani, npr. u toku selekcije antitela ili imune ćelije u mišu prema pronalasku.

Nerearanžirani hVλ i nerearanžirani hJλ su operativno povezani sa mišjim κ konstantnim regionom (CK).

[0184] Opisan je miš koji sadrži u svojoj germinativnoj liniji, na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca, sekvencu humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca, pri čemu se humana lambda sekvenca varijabilnog regiona izražava u lakom lancu koji sadrži gensku sekvencu mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona κ lakog lanca.

[0185] [Izbrisano]

[0186] U jednom primeru izvođenja, mišu nedostaje endogena varijabilna sekvenca lakog lanca na endogenom mišjem lokusu lakog lanca.

[0187] U jednom primeru izvođenja, svi ili u suštini svi mišji endogeni genski segmenti varijabilnog regiona lakog lanca su zamenjeni sa jednim ili više genskih segmenata humanog λ varijabilnog regiona.

[0188] U jednom primeru izvođenja, sekvenca humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca sadrži humanu Jλ sekvencu. U jednom primeru izvođenja, humana Jλ sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, i njihove kombinacije.

[0189] U jednom primeru izvođenja, sekvenca humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca sadrži fragment klastera A humanog lokusa lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, fragment klastera A humanog lokusa λ lakog lanca se pruža od hVλ3-27 do hVλ3-1.

[0190] U jednom primeru izvođenja, sekvenca humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca sadrži fragment klastera B humanog lokusa lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, fragment klastera B humanog lokusa λ lakog lanca se pruža od hVλ5-52 do hVλ1-40.

[0191] U jednom primeru izvođenja, sekvenca humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca sadrži genomski fragment klastera A i genomski fragment klastera B. U jednom primeru izvođenja, sekvenca humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca sadrži najmanje jedan genski segment klastera A i najmanje jedan genski segment klastera B.

[0192] U jednom primeru izvođenja, više od 10% repertoara naivnog lakog lanca miša potiče od najmanje dva hVλ genska segmenta izabrana između 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom primeru izvođenja, više od 20% repertoara naivnog lakog lanca miša potiče od najmanje tri hVλ genska segmenta izabrana između 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom primeru izvođenja, više od 30% repertoara naivnog lakog lanca miša potiče od najmanje četiri hVλ genska segmenta izabrana između 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49.

[0193] Opisan je miš koji izražava imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humanu λ varijabilnu sekvencu fuzionisanu sa mišjim κ konstantnim regionom, pri čemu miš ispoljava odnos korišćenja κ prema korišćenju λ od oko 1:1.

[0194] Imunoglobulinski laki lanac je izražen iz mišjeg endogenog lokusa lakog lanca.

[0195] Opisan je miš koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona (Vλ) λ lakog lanca i najmanje jednu J sekvencu (J), susednu sa sekvencom konstantnog regiona mišjeg κ lakog lanca.

[0196] Mišu može nedostajati funkcionalni mišji Vκ i/ili mišji Jκ genski segment.

[0197] Vλ je humani Vλ (hVλ), i J je humani Jλ (hJλ). hVλ i hJλ su nerearanžirani genski segmenti.

[0198] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži mnoštvo nerearanžiranih humanih hVλ genskih segmenata i najmanje jedan humani hJλ genski segment. Prema specifičnom primeru izvođenja, mnoštvo nerearanžiranih hVλ genskih segmenata su najmanje 12 genskih segmenata, najmanje 28 genskih segmenata, ili najmanje 40 genskih segmenata.

[0199] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan hJλ genski segment je izabran iz grupe koja se sastoji od Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, i njihove kombinacije.

[0200] U jednom primeru izvođenja, endogeni lokus mišjeg λ lakog lanca je izbrisan u celini ili delimično.

[0201] Sekvenca konstantnog regiona mišjeg κ lakog lanca je endogeni lokus mišjeg κ lakog lanca.

[0202] U jednom primeru izvođenja, oko 10% do oko 45% B ćelija miša izražavaju antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži humani varijabilni (Vλ) domen λ lakog lanca i mišji konstantni (Cκ) domen κ lakog lanca.

[0203] U jednom primeru izvođenja, humani λ varijabilni domen potiče od rearanžirane hVλ/hJλ sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 i 1-51/1.

[0204] U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži humani Vκ-Jκ intergenski region iz humanog lokusa κ lakog lanca, pri čemu je humani Vκ-Jκ intergenski region susedan sa Vλ sekvencom i J sekvencom. Prema specifičnom primeru izvođenja, humani Vκ-Jκ intergenski region je smešten između Vλ sekvence i J sekvence.

[0205] Opisan je miš koji sadrži (a) najmanje 12 do najmanje 40 nerearanžiranih genskih segmenata humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca i najmanje jedan humani Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu lakog lanca; (b) humanu Vκ-Jκ intergensku sekvencu lociranu između najmanje 12 do najmanje 40 genskih segmenata humanog varijabilnog regiona lakog lanca i najmanje jednu humanu Jλ sekvencu; pri čemu miš izražava antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži humani Vλ domen i mišji Cκ domen.

[0206] Opisan je miš koji izražava antitelo koje sadrži laki lanac koji λ varijabilnu sekvencu i mišju κ konstantnu sekvencu.

[0207] U jednom primeru izvođenja, miš ispoljava odnos korišćenja κ prema korišćenju λ od oko 1:1.

[0208] U jednom primeru izvođenja, populacija nezrelih B ćelija dobijenih iz koštane srži miša ispoljava odnos korišćenja κ prema odnosu korišćenja λ od oko 1:1.

[0209] Opisan je genetski modifikovani miš, pri čemu miš sadrži nerearanžirani imunoglobulinski Vλ i Jλ genski segment operativno povezan sa lokusom mišjeg κ lakog lanca koji sadrži mišji Cκ gen.

[0210] Vλ i Jλ genski segmenti su humani genski segmenti.

[0211] Mišji endogeni lokus lakog lanca je lokus κ lakog lanca.

[0212] Nerearanžirani Vλ i Jλ genski segmenti su na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca.

[0213] [Izbrisano]

[0214] U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži zamenu jednog ili više V, D, i/ili J genskih segmenata teškog lanca sa jednim ili više humanih V, D, i/ili J genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom mišjem lokusu teškog lanca.

[0215] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži nerearanžirani imunoglobulinski Vλ i Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca koji sadrži mišji Cκ gen.

[0216] U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži nerearanžirani humani imunoglobulinski varijabilni genski segment (Vλ) λ lakog lanca i λ spojeni genski segment (Jλ) na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca koji sadrži mišji Cλ gen.

[0217] Varijabilni genski lokus lakog lanca ("VL lokus") sadrži najmanje jedan humani Vλ (hVλ) genski segment. VL lokus sadrži najmanje jedan humani Jλ (hJλ) genski segment. U sledećem primeru izvođenja, VL lokus sadrži do četiri hJλ genska segmenta. U jednom primeru izvođenja, VL lokus sadrži susednu sekvencu koja sadrži humanu λ i humanu κ genomsku sekvencu.

[0218] Varijabilni genski lokus κ lakog lanca ("κ lokus") sadrži najmanje jedan humani Vλ (hVλ) genski segment. κ lokus sadrži najmanje jedan humani Jλ (hJλ) genski segment. U jednom primeru izvođenja, κ lokus sadrži do četiri hJλ genska segmenta. U jednom primeru izvođenja, κ lokus sadrži najmanje jedan humani hVλ i najmanje jedan humani hJλ, i nedostaje mu ili mu u suštini nedostaje funkcionalni genski segment Vκ regiona i nedostaje mu ili mu u suštini nedostaje funkcionalni genski segment Jκ regiona. U jednom primeru izvođenja, miš ne sadrži funkcionalni genski segment Vκ regiona. U jednom primeru izvođenja, miš ne sadrži funkcionalni genski segment Jκ regiona.

[0219] U jednom primeru izvođenja, varijabilni genski lokus λ lakog lanca ("λ lokus") sadrži najmanje jedan hVλ genski segment. U jednom primeru izvođenja, λ lokus sadrži najmanje jedan humani Jλ (hJλ) genski segment. U sledećem primeru izvođenja, λ lokus sadrži do četiri hJλ genska segmenta.

[0220] U jednom primeru izvođenja, VL lokus sadrži mnoštvo hVλs. U jednom primeru izvođenja, mnoštvo hVλs je izabrano tako da rezultuje ekspresijom repertoara varijabilnog regiona λ lakog lanca koji odražava oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, ili oko 90% ili više korišćenja Vλ uočenog kod čoveka. U jednom primeru izvođenja, VL lokus sadrži genske segmente hVλ 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, i njihovu kombinaciju.

[0221] U jednom primeru izvođenja, hVλs obuhvataju 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus sadrži susednu sekvencu humanog lokusa λ lakog lanca koja se pruža od Vλ3-12 do Vλ3-1. U jednom primeru izvođenja, VL lokus sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 hVλs. Prema specifičnom primeru izvođenja, hVλs obuhvataju 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus sadrži susednu sekvencu humanog λ lokusa koja se pruža od Vλ3-12 do Vλ3-1. U jednom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom κ lokusu. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom κ lokusu i endogeni lokus λ lakog lanca je izbrisan delimično ili kompletno. U jednom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom λ lokusu. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom λ lokusu i endogeni κ lokus je izbrisan delimično ili kompletno.

[0222] U jednom primeru izvođenja, VL lokus sadrži 13 do 28 ili više hVλs. Prema specifičnom primeru izvođenja, hVλs obuhvataju 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, i 3-27. Prema specifičnom primeru izvođenja, κ lokus sadrži susednu sekvencu humanog λ lokusa koja se pruža od Vλ3-27 do Vλ3-1. U jednom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom κ lokusu. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom κ lokusu, a endogeni lokus λ lakog lanca je izbrisan delimično ili kompletno. U sledećem primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom λ lokusu. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom λ lokusu, a endogeni κ lokus je izbrisan delimično ili kompletno.

[0223] U jednom primeru izvođenja, VL lokus sadrži 29 do 40 hVλs. Prema specifičnom primeru izvođenja, κ lokus sadrži susednu sekvencu humanog λ lokusa koja se pruža od Vλ3-29 do Vλ3-1, i susednu sekvencu humanog λ lokusa koja se pruža od Vλ5-52 do Vλ1-40. Prema specifičnom primeru izvođenja, cela ili u suštini cela sekvenca između hVλ1-40 i hVλ3-29 u genetski modifikovanom mišu se sastoji u suštini od humane λ sekvence od približno 959 bp pronađene u prirodi (npr. u humanoj populaciji) nizvodno od hVλ1-40 genskog segmenta (nizvodno od 3’ netransliranog dela), restrikcionog enzimskog mesta (npr. PI-SceI), praćenog humanom λ sekvencom od približno 3,431 bp uzvodno od hVλ3-29 genskog segmenta pronađenog u prirodi. U jednom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom mišjem κ lokusu. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom mišjem κ lokusu, a endogeni lokus mišjeg λ lakog lanca je izbrisan delimično ili kompletno. U sledećem primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom mišjem λ lokusu. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom mišjem λ lokusu, a endogeni mišji κ lokus je izbrisan delimično ili kompletno.

[0224] VL lokus sadrži najmanje jedan hJλ. U jednom primeru izvođenja, VL lokus sadrži mnoštvo hJλs. U jednom primeru izvođenja, VL lokus sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 hJλ. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus sadrži četiri hJλ. Prema specifičnom primeru izvođenja, četiri hJλs su hJλ1, hJλ2, hJλ3, i hJλ7. U jednom primeru izvođenja, VL lokus je κ lokus. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom κ lokusu, a endogeni lokus λ lakog lanca je izbrisan delimično ili kompletno. U jednom primeru izvođenja, VL lokus sadrži jedan hJλ. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan hJλ je hJλ1. U jednom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom κ lokusu. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom κ lokusu, a endogeni lokus λ lakog lanca je izbrisan delimično ili kompletno. U sledećem primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom λ lokusu.

Prema specifičnom primeru izvođenja, VL lokus je na endogenom λ lokusu, a endogeni κ lokus je izbrisan delimično ili kompletno.

[0225] Vκ lokus sadrži najmanje jedan hVλ, najmanje jedan hJλ, i mišji Cκ gen.

[0226] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu na endogenom mišjem κ lokusu endogenih mišjih Vκ genskih segmenata sa jednim ili više hVλ genskih segmenata, pri čemu su hVλ genski segmenti operativno povezani sa endogenim genom mišjeg Cκ regiona, tako da taj miš rearanžira humane Vλ genske segmente i izražava reverzno himerični imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani Vλ domen i mišji Cκ. U jednom primeru izvođenja, 90-100% nerearanžiranih mišjih Vκ genskih segmenata je zamenjeno sa najmanje jednim nerearanžiranim hVλ genskim segmentom. Prema specifičnom primeru izvođenja, svi ili u suštini svi endogeni mišji Vκ genski segmenti su zamenjeni sa najmanje jednim nerearanžiranim hVλ genskim segmentom. U jednom primeru izvođenja, zamena je sa najmanje 12, najmanje 28, ili najmanje 40 nerearanžiranih hVλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, zamena je sa najmanje 7 funkcionalnih nerearanžiranih hVλ genskih segmenata, najmanje 16 funkcionalnih nerearanžiranih hVλ genskih segmenata, ili najmanje 27 funkcionalnih nerearanžiranih hVλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu svih mišjih Jκ genskih segmenata sa najmanje jednim nerearanžiranim hJλ genskim segmentom. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan nerearanžirani hJλ genski segment je izabran između Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7, i njihove kombinacije. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više hVλ genskih segmenata je izabran između 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52 hVλ genskih segmenata, i njihove kombinacije. Prema specifičnom primeru izvođenja, najmanje jedan nerearanžirani hJλ genski segment je izabran između Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, i njihove kombinacije.

[0227] U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži zamenu endogenih mišjih Vλ genskih segmenata na endogenom mišjem λ lokusu sa jednim ili više humanih Vλ genskih segmenata na endogenom mišjem λ lokusu, pri čemu su hVλ genski segmenti operativno povezani sa genom mišjeg Cλ regiona, tako da taj miš rearanžira hVλ genske segmente i izražava reverzno himerični imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen i mišji Cλ. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ gen je Cλ2. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ gen je najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa mišjim Cλ2. U jednom primeru izvođenja, 90-100% nerearanžiranih mišjih Vλ genskih segmenata je zamenjeno sa najmanje jednim nerearanžiranim hVλ genskim segmentom. Prema specifičnom primeru izvođenja, svi ili u suštini svi endogeni mišji Vλ genski segmenti su zamenjeni sa najmanje jednim nerearanžiranim hVλ genskim segmentom. U jednom primeru izvođenja, zamena je sa najmanje 12, najmanje 28, ili najmanje 40 nerearanžiranih hVλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, zamena je sa najmanje 7 funkcionalnih nerearanžiranih hVλ genskih segmenata, najmanje 16 funkcionalnih nerearanžiranih hVλ genskih segmenata, ili najmanje 27 funkcionalnih nerearanžiranih hVλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu svih mišjih Jλ genskih segmenata sa najmanje jednim nerearanžiranim hJλ genskim segmentom. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan nerearanžirani hJλ genski segment je izabran između Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7, i njihove kombinacije. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više hVλ genskih segmenata su izabrani između 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52 hVλ genskih segmenata, i njihove kombinacije. Prema specifičnom primeru izvođenja, najmanje jedan nerearanžirani hJλ genski segment je izabran između Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, i njihove kombinacije.

[0228] Prema jednom aspektu, realizovan je genetski modifikovani miš koji sadrži humanu sekvencu Vκ-Jκ intergenskog regiona lociranu na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca.

[0229] U jednom primeru izvođenja, sekvenca humanog Vκ-Jκ intergenskog regiona je endogeni lokus κ lakog lanca miša koji sadrži hVλ i hJλ genski segment, a sekvenca humanog Vκ-Jκ intergenskog regiona je smeštena između hVλ i hJλ genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, hVλ i hJλ genski segmenti su sposobni za rekombinaciju da bi se formirao funkcionalni humani varijabilni domen λ lakog lanca kod miša.

[0230] U jednom primeru izvođenja, realizovan je miš koji sadrži mnoštvo hVλ’s i jedan ili više hJλ’s, dok je sekvenca humanog Vκ-Jκ intergenskog regiona smeštena, u odnosu na transkripciju, nizvodno od bliže ili 3’-najbliže hVλ sekvence i uzvodno ili 5’ od prve hJλ sekvence.

[0231] U jednom primeru izvođenja, humani Vκ-Jκ intergenski region je region lociran oko 130 bp nizvodno ili 3’ od humanog Vκ4-1 genskog segmenta, oko 130 bp nizvodno od 3’ netransliranog regiona humanog Vκ4-1 genskog segmenta, i pruža se do oko 600 bp uzvodno ili 5’ od humanog Jκ1 genskog segmenta. Prema specifičnom primeru izvođenja, humani Vκ-Jκ intergenski region je veličine od oko 22.8 kb. U jednom primeru izvođenja, Vκ-Jκ intergenski region je oko 90% ili više, 91% ili više, 92% ili više, 93% ili više, 94% ili više, ili oko 95% ili više identičan sa humanim Vκ-Jκ intergenskim regionom koji se pruža od kraja 3’ netransliranog regiona humanog Vκ4-1 genskog segmenta do oko 600 bp uzvodno od humanog Jκ1 genskog segmenta. U jednom primeru izvođenja, Vκ-Jκ intergenski region sadrži SEQ ID NO:158. Prema specifičnom primeru izvođenja, Vκ-Jκ intergenski region sadrži funkcionalni fragment sa SEQ ID NO:158. Prema specifičnom primeru izvođenja, Vκ-Jκ intergenski region je SEQ ID NO:158.

[0232] Opisana je nehumana životinja, nehumana ćelija (npr. ES ćelija ili pluripotentna ćelija), nehumani embrion, ili nehumano tkivo koji sadrže navedenu sekvencu humanog Vκ-Jκ intergenskog regiona, pri čemu je sekvenca intergenskog regiona ektopična. Ektopična sekvenca može biti smeštena na humanizovanom endogenom nehumanom imunoglobulinskom lokusu. Nehumana životinja je miš.

[0233] Opisan je izolovani konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži navedenu sekvencu humanog Vκ-Jκ intergenskog regiona. Konstrukt nukleinske kiseline može sadržati ciljajuće krake za ciljanje sekvence humanog Vκ-Jκ intergenskog regiona na mišjem lokusu lakog lanca. Mišji lokus lakog lanca može biti κ lokus. Ciljajući kraci mogu ciljati humani Vκ-Jκ intergenski region na modifikovanom endogenom mišjem κ lokusu, pri čemu je ciljanje na poziciju između hVλ sekvence i hJλ sekvence.

[0234] Opisan je genetski modifikovani miš, pri čemu miš ne sadrži više od dva alela lakog lanca, pri čemu aleli lakog lanca sadrže (a) nerearanžirani imunoglobulinski humani Vλ i Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca koji sadrži mišji Cκ gen; i, (b) nerearanžirani imunoglobulinski VL i JL genski segment na endogenom mišjem lokusu lakog lanca koji sadrži mišji CL gen.

[0235] U sledećem primeru izvođenja, mišji endogeni lokus lakog lanca koji sadrži mišji CL gen je λ lokus.

[0236] Ne više od dva alela lakog lanca mogu biti izabrana između κ alela i λ alela, dva κ alela, i dva λ alela. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan od dva alela lakog lanca je λ alel koji sadrži Cλ2 gen.

[0237] Miš može sadržati jedan funkcionalni imunoglobulinski lokus lakog lanca i jedan nefunkcionalni lokus lakog lanca, pri čemu funkcionalni lokus lakog lanca sadrži nerearanžirani imunoglobulinski humani Vλ i Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca koji sadrži mišji Cκ gen.

[0238] Takođe je opisan miš koji sadrži jedan funkcionalni imunoglobulinski lokus lakog lanca i jedan lokus nefunkcionalnog lakog lanca, pri čemu funkcionalni lokus lakog lanca sadrži nerearanžirani imunoglobulinski humani Vλ i Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca koji sadrži mišji Cλ gen. Cλ gen može biti Cλ2. Mišji Cλ gen može biti najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa mišjim Cλ2.

[0239] Miš dalje sadrži najmanje jedan imunoglobulinski alel teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan imunoglobulinski alel teškog lanca sadrži humani VH genski segment, humani DH genski segment, i humani JH genski segment na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji sadrži humani gen teškog lanca koji izražava humani/mišji teški lanac. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži dva imunoglobulinska alela teškog lanca, i miš izražava humani/mišji teški lanac.

[0240] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži prvi alel lakog lanca koji sadrži nerearanžirani hVκ i nerearanžirani hJκ, na endogenom mišjem κ lokusu koji sadrži endogeni Cκ gen; i drugi alel lakog lanca koji sadrži nerearanžirani hVλ i nerearanžirani hJλ, na endogenom mišjem κ lokusu koji sadrži endogeni Cκ gen. Prema specifičnom primeru izvođenja, prvi i drugi alel lakog lanca su jedini funkcionalni aleli lakog lanca genetski modifikovanog miša. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži nefunkcionalni λ lokus. U jednom primeru izvođenja, genetski modifikovani miš ne izražava laki lanac koji sadrži λ konstantni region.

[0241] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži prvi alel lakog lanca koji sadrži nerearanžirani hVκ i nerearanžirani hJκ, na endogenom mišjem κ lokusu koji sadrži endogeni Cκ gen; i drugi alel lakog lanca koji sadrži nerearanžirani hVλ i nerearanžirani hJλ, na endogenom mišjem λ lokusu koji sadrži endogeni Cλ gen. Prema specifičnom primeru izvođenja, prvi i drugi aleli lakog lanca su jedini funkcionalni aleli lakog lanca genetski modifikovanog miša. U jednom primeru izvođenja, endogeni Cλ gen je Cλ2. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ gen je najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa mišjim Cλ2.

[0242] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži šest imunoglobulinskih alela, pri čemu prvi alel sadrži nerearanžirani imunoglobulinski Vλ i Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca koji sadrži mišji Cκ gen, drugi sadrži nerearanžirani imunoglobulinski Vκ i Jκ genski segment na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca koji sadrži mišji Cκ gen, treći sadrži nerearanžirani imunoglobulinski Vλ i Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca koji sadrži mišji Cλ gen, četvrti i peti, svaki nezavisno, sadrže nerearanžirani VH i DH i JH genski segment na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji sadrži mišji gen teškog lanca, i šesti sadrži bilo (a) nerearanžirani imunoglobulinski Vλ i Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca koji sadrži mišji Cλ gen, (b) λ lokus koji je nefunkcionalan, ili (c) deleciju λ lokusa u celini ili delimično.

[0243] U jednom primeru izvođenja, prvi alel sadrži nerearanžirani hVλ i hJλ. U jednom primeru izvođenja, drugi alel sadrži nerearanžirani hVκ i hJκ. U jednom primeru izvođenja, treći alel sadrži nerearanžirani hVλ i hJλ. U jednom primeru izvođenja, četvrti i peti, svaki nezavisno, sadrže nerearanžirani hVH i hDH i hJH. U jednom primeru izvođenja, šesti alel sadrži endogeni mišji λ lokus koji je izbrisan u celini ili delimično.

[0244] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži šest imunoglobulinskih alela, pri čemu prvi alel sadrži nerearanžirani imunoglobulinski Vλ i Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca koji sadrži mišji Cλ gen, drugi sadrži nerearanžirani imunoglobulinski Vλ i Jλ genski segment na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca koji sadrži mišji Cλ gen treći sadrži nerearanžirani imunoglobulinski Vκ i Jκ genski segment na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca koji mišji Cκ gen, četvrti i peti, svaki nezavisno, sadrže nerearanžirani VH i DH i JH genski segment na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji sadrži mišji gen teškog lanca, i šesti sadrži bilo (a) nerearanžirani imunoglobulinski Vκ i Jκ genski segment na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca koji sadrži mišji Cκ gen, (b) κ lokus koji je nefunkcionalan, ili (c) deleciju jednog ili više elemenata κ lokusa.

[0245] U jednom primeru izvođenja, prvi alel sadrži nerearanžirani hVλ i hJλ genski segment. U jednom primeru izvođenja, drugi alel sadrži nerearanžirani hVλ i hJλ genski segment. U jednom primeru izvođenja, treći alel sadrži nerearanžirani hVκ i hJκ genski segment. U jednom primeru izvođenja, četvrti i peti, svaki nezavisno, sadrže nerearanžirani hVH i hDH i hJH genski segment. U jednom primeru izvođenja, šesti alel sadrži endogeni mišji κ lokus koji je funkcionalno utišan.

[0246] U jednom primeru izvođenja, genetski modifikovani miš sadrži B ćeliju koja sadrži rearanžirani gen antitela koji sadrži rearanžirani hVλ domen koji je operativno povezan sa mišjim CL domenom. U jednom primeru izvođenja, mišji CL domen je izabran između mišjeg Cκ i mišjeg Cλ domena. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ domen potiče od Cλ2 gena. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ domen potiče od Cλ domena koji je najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa mišjim Cλ2.

[0247] Opisan je genetski modifikovani miš koji izražava Vλ region na CL koji je Cκ. Opisan je genetski modifikovani miš koji izražava hVλ region na CL izabranom između humanog Cκ, humanog Cλ, ili mišjeg Cκ. Opisan je genetski modifikovani miš koji izražava hVλ region na mišjem Cκ.

[0248] U jednom primeru izvođenja, oko 10-50% splenocita miša su B ćelije (tj.

CD19-pozitivne), ili one koje oko 9-28% izražavaju imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom.

[0249] Prema specifičnom primeru izvođenja, oko 23-34% splenocita miša su B ćelije (tj. CD19-pozitivne), ili one koje oko 9-11% izražavaju imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom.

[0250] Prema specifičnom primeru izvođenja, oko 19-31% splenocita miša su B ćelije (tj. CD19-pozitivne), ili one koje oko 9-17% izražavaju imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom.

[0251] Prema specifičnom primeru izvođenja, oko 21-38% splenocita miša su B ćelije (tj. CD19-pozitivne), ili one koje oko 24-27% izražavaju imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom.

[0252] Prema specifičnom primeru izvođenja, oko 10-14% splenocita miša su B ćelije (tj. CD19-pozitivne), ili one koje oko 9-13% izražavaju imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom.

[0253] Prema specifičnom primeru izvođenja, oko 31-48% splenocita miša su B ćelije (tj. CD19-pozitivne), ili one koje oko 15-21% izražavaju imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom. Prema specifičnom primeru izvođenja, oko 30-38% splenocita miša su B ćelije (tj. CD19-pozitivne), od kojih oko 33-48% izražavaju imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom.

[0254] U jednom primeru izvođenja, oko 52-70% koštane srži miša su B ćelije (tj. CD19-pozitivne), ili oko 31-47% nezrelih B ćelija (tj. CD19-pozitivne/B220-intermedijerno pozitivne/IgM-pozitivne) izražava imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom.

[0255] U jednom primeru izvođenja, oko 60% koštane srži miša su B ćelije (tj. CD19-pozitivne), ili oko 38.3% nezrelih B ćelija (tj. CD19-pozitivne/B220-intermedijerno pozitivne/IgM-pozitivne) izražava imunoglobulinski laki lanac koji sadrži hVλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom.

[0256] U jednom primeru izvođenja, miš izražava antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži varijabilni domen koji potiče od humanog V i humanog J genskog segmenta, i konstantni domen koji potiče od gena mišjeg konstantnog regiona. U jednom primeru izvođenja, gen mišjeg konstantnog regiona je Cκ gen. U sledećem primeru izvođenja, gen mišjeg konstantnog regiona je Cλ gen. Prema specifičnom primeru izvođenja, Cλ region je Cλ2. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ gen potiče od Cλ gena koji je najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa mišjim Cλ2. Prema specifičnom primeru izvođenja, antitelo dalje sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni domen koji potiče od humanog V, humanog D i humanog J genskog segmenta, a konstantni domen teškog lanca potiče od mišjeg gena konstantnog regiona teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca sadrži zglobnu-CH2-CH3 sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U sledećem primeru izvođenja, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-zglobnu-CH2-CH3 sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U sledećem primeru izvođenja, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-CH2-CH3-CH4 sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U sledećem primeru izvođenja, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH2-CH3-CH4 sekvencu konstantnog domena teškog lanca.

[0257] U jednom primeru izvođenja, miš izražava antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži rearanžiranu humanu Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cκ sekvencu. U jednom primeru izvođenja, rearanžirana humana Vλ-Jλ sekvenca potiče od rearanžiranja hVλ genskih segmenata izabranih između 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-14, 3-19, 2-23, 3-25, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 9-49, i 1-51 genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, rearanžirana humana Vλ-Jλ sekvenca potiče od rearanžiranja hJλ genskih segmenata izabranih između Jλ1, Jλ2, Jλ3, i Jλ7 genskih segmenata.

[0258] U jednom primeru izvođenja, miš izražava antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži rearanžirani imunoglobulinski varijabilni region λ lakog lanca koji sadrži humanu Vλ/Jλ sekvencu izabranu između 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 i 1-51/1. Prema specifičnom primeru izvođenja, B ćelija izražava antitelo koje sadrži humani imunoglobulinski varijabilni domen teškog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim domenom teškog lanca, i humanim imunoglobulinskim varijabilnim domenom λ lakog lanca fuzionisanim sa mišjim konstantnim domenom κ lakog lanca.

[0259] Opisan je miš koji izražava antitelo koje sadrži (a) teški lanac koji sadrži varijabilni domen teškog lanca koji potiče od nerearanžiranog genskog segmenta humanog varijabilnog regiona teškog lanca, pri čemu je varijabilni domen teškog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim (CH) regionom teškog lanca; i, (b) laki lanac koji sadrži varijabilni domen lakog lanca koji potiče od nerearanžiranih hVλ i hJλ, pri čemu je varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa mišjim CL regionom.

[0260] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži (i) lokus teškog lanca koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih funkcionalnih endogenih mišjih V, D i J genskih segmenata sa svim ili u suštini svim funkcionalnim humanim V, D, i J genskim segmentima, mišji CH gen, (ii) prvi lokus κ lakog lanca koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih funkcionalnih endogenih mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata sa svim, u suštini svim, ili mnoštvom funkcionalnih hVλ i hJλ genskih segmenata, i mišji C| gen, (iii) drugi lokus κ lakog lanca koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih funkcionalnih endogenih mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata sa svim, u suštini svim, ili mnoštvom funkcionalnih hVκ i hJκ genskih segmenata, i mišji Cκ gen. U jednom primeru izvođenja, miš ne izražava antitelo koje sadrži Cλ region. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži deleciju Cλ gena i/ili Vλ i/ili Jλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži nefunkcionalni lokus λ lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, lokus λ lakog lanca je izbrisan u celini ili delimično.

[0261] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži (i) lokus teškog lanca koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih funkcionalnih endogenih mišjih V, D i J genskih segmenata sa svim ili u suštini svim funkcionalnim humanim V, D, i J genskim segmentima, i mišji CH gen, (ii) prvi lokus λ lakog lanca koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih funkcionalnih endogenih mišjih Vλ i Jλ genskih segmenata sa svim, u suštini svim, ili mnoštvom funkcionalnih hVλ i hJλ genskih segmenata, i mišji Cλ gen, (iii) drugi lokus λ lakog lanca koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih funkcionalnih endogenih mišjih Vλ i Jλ genskih segmenata sa svim, u suštini svim, ili mnoštvom, funkcionalnih hVλ i hJλ genskih segmenata, i mišji Cλ gen. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ gen je Cλ2. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ gen potiče od Cλ gena koji je najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa mišjim Cλ2.

[0262] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži deleciju Cκ gena i/ili Vκ i/ili Jκ genskog segmenta. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži nefunkcionalni lokus κ lakog lanca.

[0263] Opisan je genetski modifikovani miš koji izražava antitelo, pri čemu više od 10%, više od 15%, više od 20%, više od 25%, više od 30%, više od 35%, više od 40%, više od 60%, više od 70%, više od 80%, ili više od 90% ukupno proizvedenog IgG antitela od strane miša sadrži varijabilni domen koji potiče od λ, i pri čemu miš izražava antitela koja sadrže varijabilni domen koji potiče od κ fuzionisan sa mišjim Cκ regionom. Oko 15-40%, 20-40%, 25-40%, 30-40%, ili 35-40% antitela ukupno proizvedenog od strane miša može sadržati varijabilni domen koji potiče od λ.

[0264] Varijabilni domen koji potiče od λ potiče od hVλ i hJλ. Varijabilni domen koji potiče od λ je laki lanac koji sadrži mišji Cκ region. U jednom primeru izvođenja, varijabilni domen koji potiče od κ potiče od hVκ i hJκ, a prema specifičnom primeru izvođenja je u lakom lancu koji sadrži mišji Cκ region.

[0265] Opisan je izolovani DNK konstrukt koji sadrži uzvodni homologi krak i nizvodni homologi krak, pri čemu uzvodni i nizvodni homologi kraci ciljaju konstrukt na mišjem κ lokusu, i konstrukt sadrži funkcionalni nerearanžirani hVλ segment i funkcionalni nerearanžirani hJλ segment, i selekcionu ili markersku sekvencu.

[0266] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži, od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišje λ sekvence uzvodno od mišjeg Vλ2, selekcionu kasetu okruženu 5’ i 3’ sa mestima za prepoznavanje rekombinaze , i ciljajući krak za ciljanje mišje λ sekvence 3’ mišjeg Jλ2. U jednom primeru izvođenja, selekciona kaseta je Frt’ed Hyg-TK kaseta.3’ ciljajući krak može sadržati mišji Cλ2. Jλ4, Cλ4, i mišji pojačavač 2.4.

[0267] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži, od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u odnosu na Vλ1, selekcionu kasetu okruženu 5’ i 3’ sa mestima za prepoznavanje rekombinaze, i 3’ ciljajućim krakom za ciljanje mišje λ sekvence 3’ u odnosu na mišji Cλ1. Selekciona kaseta može biti lox-ovana neomicinska kaseta.3’ ciljajući krak može sadržati mišji λ 3’ pojačavač i mišji λ 3’ pojačavač 3.1.

[0268] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u odnosu na Vλ2, selekcionu kasetu okruženu 5’ i 3’ sa mestima za prepoznavanje rekombinaze, i 3’ ciljajući krak za ciljanje mišje λ sekvence 3’ u odnosu na mišji Jλ2 i 5’ u odnosu na mišji Cλ2. selekciona kaseta može biti Frt’ed higromicin-TK kaseta.3’ ciljajući krak može sadržati mišje Cλ2-Jλ4-Cλ4 genske segmente i mišji λ pojačavač 2.4.

[0269] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži, od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u odnosu na Vλ2, selekcionu kasetu okruženu 5’ i 3’ sa mestima za prepoznavanje rekombinaze, humani genomski fragment koji sadrži susedni region humanog lokusa λ lakog lanca od hVλ3-12 nizvodno prema kraju hJλ1, i 3’ ciljajući krak za ciljanje mišje λ sekvence 3’ u odnosu na mišji Jλ2. Selekciona kaseta je Frt’ed neomicinska kaseta.3’ ciljajući krak sadrži mišje Cλ2-Jλ4-Cλ4 genske segmente i mišji λ pojačavač 2.4.

[0270] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži susedni region humanog lokusa λ lakog lanca od hVλ3-12 nizvodno prema kraju hJλ1.

[0271] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u odnosu na Vλ2, selekcionu kasetu okruženu 5’ i 3’ sa mestima za prepoznavanje rekombinaze i humani genomski fragment koji sadrži susedni region humanog lokusa λ lakog lanca od hVλ3-27 nizvodno do kraja hVλ2-8. Selekciona kaseta može biti Frt’ed higromicinska kaseta. Humani genomski fragment može sadržati 3’ ciljajući krak.3’ ciljajući krak može sadržati oko 53 kb humanog lokusa λ lakog lanca od hVλ3-12 nizvodno do kraja hVλ2-8.

[0272] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži susedni region humanog lokusa λ lakog lanca od hVλ3-27 nizvodno do kraja hVλ3-12.

[0273] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u odnosu na Vλ2, selekcionu kasetu okruženu 5’ i 3’ sa mestima za prepoznavanje rekombinaze, prvi humani genomski fragment koji sadrži susedni region humanog lokusa λ lakog lanca od hVλ5-52 nizvodno do kraja hVλ1-40, restrikciono enzimsko mesto, i drugi humani genomski fragment koji sadrži susedni region humanog lokusa λ lakog lanca od hVλ3-29 nizvodno do kraja hVλ82K. Selekciona kaseta može biti Frt’ed neomicinska kaseta. Restrikciono enzimsko mesto može biti mesto za navođenje endonukleaze. Navođenje endonukleaze može biti PI-SceI. Drugi humani genomski fragment može biti 3’ ciljajući krak.3’ ciljajući krak može sadržati oko 27 kb humanog lokusa λ lakog lanca od hVλ3-29 nizvodno do kraja hVλ82K.

[0274] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži susedni region humanog lokusa λ lakog lanca od hVλ5-52 nizvodno do kraja hVλ1-40.

[0275] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg κ lokusa 5’ u odnosu na endogene Vκ genske segmente, dva mesta za prepoznavanje rekombinaze smeštena jedno uz drugo, selekcionu kasetu 3’ za mesta za prepoznavanje rekombinaze postavljena jedno uz drugo, i 3’ ciljajući krak za ciljanje mišje κ sekvence 5’ u odnosu na varijabilne genske segmente κ lakog lanca. Mesta za prepoznavanje rekombinaze postavljena jedno uz drugo mogu biti u suprotnom smeru jedno u odnosu na drugo.

Mesta za prepoznavanje rekombinaze mogu biti različita. Mesta za prepoznavanje rekombinaze mogu biti loxP mesto i lox511 mesto. Selekciona kaseta može biti neomicinska kaseta.

[0276] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg κ lokusa 5’ u odnosu na mišje Jκ genske segmente, selekcionu kasetu, mesto za prepoznavanje rekombinaze 3’ za selekcionu kasetu, i 3’ ciljajući krak za ciljanje mišje κ sekvence 3’ u odnosu na mišje Jκ genske segmente i 5’ za mišji κ intronski pojačavač. Selekciona kaseta može biti higromicin-TK kaseta. Mesto za prepoznavanje rekombinaze može biti u istom smeru u odnosu na transkripciju kao selekciona kaseta. Mesto za prepoznavanje rekombinaze može biti loxP mesto.

[0277] Opisan je izolovani DNK konstrukt, koji sadrži od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije, prvi mišji genomski fragment koji sadrži sekvencu 5’ endogenih mišjih Vκ genskih segmenata, prvo mesto za prepoznavanje rekombinaze, drugo mesto za prepoznavanje rekombinaze, i drugi mišji genomski fragment koji sadrži sekvencu 3’ endogenih mišjih Jκ genskih segmenata i 5’ mišji κ intronski pojačavač.

[0278] Opisan je genetski modifikovani miš, pri čemu genetska modifikacija sadrži modifikaciju sa jednim ili više DNK konstrukata opisanih gore ili ovde.

[0279] Opisana je primena izolovanog DNK konstrukta za dobijanje miša koji je ovde opisan. Opisana je primena izolovanog DNK konstrukta koji je ovde opisan u metodu za dobijanje antigen-vezujućeg proteina.

[0280] Opisana je nehumana matična ćelija koja sadrži ciljajući vektor koji sadrži DNK konstrukt koji je opisan gore i ovde. Prema jednom aspektu, realizovana je nehumana matična ćelija, pri čemu nehumana matična ćelija potiče od ovde opisanog miša.

[0281] U jednom primeru izvođenja, nehumana matična ćelija je embrionska matična (ES) ćelija. Prema specifičnom primeru izvođenja, ES ćelija je mišja ES ćelija.

[0282] Opisana je primena nehumane matične ćelije koja je ovde opisana za dobijanje miša koji je ovde opisan. Opisana je primena nehumane matične ćelije koja je ovde opisana za dobijanje antigen-vezujućeg proteina.

[0283] Prema jednom aspektu, realizovan je mišji embrion, pri čemu mišji embrion sadrži genetsku modifikaciju koja je ovde realizovana. U jednom primeru izvođenja, realizovan je mišji embrion domaćin koji sadrži donorsku ES ćeliju, pri čemu donorska ES ćelija sadrži genetsku modifikaciju koja je ovde opisana. U jednom primeru izvođenja, mišji embrion je embrion u stadijumu premorule. Prema specifičnom primeru izvođenja, embrion u stadijumu premorule je embrion u stadijumu od 4-ćelije ili embrion u stadijumu od 8-ćelija. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, mišji embrion je blastocist.

[0284] Opisana je primena mišjeg embriona koji je ovde opisan za dobijanje miša koji je ovde opisan. Opisana je primena mišjeg embriona koji je ovde opisan za dobijanje antigen-vezujućeg proteina.

[0285] Opisana je nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija sadrži rearanžiranu imunoglobulinsku gensku sekvencu lakog lanca koja potiče od genetski modifikovanog miša koji je ovde opisan. Ćelija može biti B ćelija. Ćelija može biti hibridoma. Ćelija može kodirati imunoglobulinski varijabilni domen lakog lanca i/ili imunoglobulinski varijabilni domen teškog lanca koji je somatski mutiran.

[0286] Opisana je nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija sadrži rearanžiranu imunoglobulinsku gensku sekvencu lakog lanca koji potiče od genetski modifikovanog miša koji je ovde opisan. Ćelija može biti B ćelija. Ćelija može biti hibridoma. Ćelija može kodirati imunoglobulinski varijabilni domen lakog lanca i/ili imunoglobulinski varijabilni domen teškog lanca koji je somatski mutiran.

[0287] Opisana je primena nehumane ćelije koja je ovde opisana za dobijanje nehumane životinje kao što je ovde opisano. Opisana je primena nehumane ćelije koja je ovde opisana za dobijanje antigen-vezujućeg proteina. Nehumana životinja je miš.

[0288] Opisana je mišja B ćelija koja izražava imunoglobulinski laki lanac koji sadrži (a) varijabilni region koji potiče od hVλ genskog segmenta i hJλ genskog segmenta; i, (b) mišji Cκ gen. Mišja B ćelija može dalje izražavati srodni teški lanac koji sadrži (c) varijabilni region koji potiče od hVH, hDH, i (d) hJH segment. U jednom primeru izvođenja, B ćelija ne sadrži rearanžirani λ gen. B ćelija ne mora sadržati rearanžirani κ gen.

[0289] Opisan je metod za dobijanje antitela u genetski modifikovanoj nehumanoj životinji, koji sadrži: (a) izlaganje genetski modifikovane nehumane životinje antigenu, pri čemu životinja ima genom koji sadrži najmanje jedan hVλ i najmanje jedan hJλ na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca, pri čemu endogeni lokus κ lakog lanca sadrži mišji Cκ gen; (b) dopuštanje genetski modifikovanoj životinji da razvije imunu reakciju na antigen; i, (c) izolaciju iz životinje iz (b) antitela koje specifično prepoznaje antigen, ili izolaciju iz životinje iz (b) ćelije koja sadrži imunoglobulinski domen koji specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji potiče od hVλ, hJλ i mišji Cκ gen. Nehumana životinja je miš.

[0290] Opisan je metod za dobijanje antitela u genetski modifikovanoj nehumanoj životinji, koji sadrži: (a) izlaganje genetski modifikovane životinje antigenu, pri čemu životinja ima genom koji sadrži najmanje jedan hVλ na endogenom κ lokusu i najmanje jedan hJλ na κ lokusu, pri čemu κ lokus sadrži mišji Cκ gen; (b) dopuštanje genetski modifikovanoj životinji da razvije imunu reakciju na antigen; i, (c) izolaciju iz životinje iz (b) antitela koje specifično prepoznaje antigen, ili izolaciju iz miša iz (b) ćelije koja sadrži imunoglobulinski domen koji specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji potiče od hVλ, hJλ i mišji CK gen.

[0291] [Izbrisano].

[0292] Opisan je metod za dobijanje antitela u genetski modifikovanoj nehumanoj životinji, koji sadrži: (a) izlaganje genetski modifikovane nehumane životinje antigenu, pri čemu ta životinja ima genom koji sadrži najmanje jedan hVλ na lokusu λ lakog lanca i najmanje jedan Jλ na lokusu λ lakog lanca, pri čemu lokus λ lakog lanca sadrži nehumani CA gen; (b) dopuštanje da genetski modifikovana životinja razvije imunu reakciju na antigen; i, (c) izolaciju iz životinje iz (b) antitela koje specifično prepoznaje antigen, ili izolaciju iz životinje iz (b) ćelije koja sadrži imunoglobulinski domen koji specifično prepoznaje antigen, ili identifikaciju u životinji B sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje antigen, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji potiče od hVλ, hJλ i nehumani Cλ gen. Nehumana životinja je miš.

[0293] Konstantni gen λ lakog lanca može biti izabran između humanog Cλ gena i nehumanog Cλ gena. Konstantni gen λ lakog lanca može biti humani Cλ gen.

Humani Cλ gen može biti izabran između Cλ1, Cλ2, Cλ3 i Cλ7. Konstantni gen λ lakog lanca može biti mišji ili pacovski Cλ gen. Mišji Cλ gen može biti izabran između Cλ1, Cλ2 i Cλ3. Mišji Cλ gen može biti Cλ2. Mišji Cλ gen može poticati od Cλ gena koji je najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa mišjim Cλ2.

[0294] Opisan je metod za dobijanje rearanžiranog gena antitela u genetski modifikovanom mišu, koji sadrži: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija sadrži hVλ i hJλ na endogenom lokusu κ lakog lanca, pri čemu endogeni lokus κ lakog lanca sadrži mišji Cκ gen ili njegov funkcionalni fragment; i, (b) identifikaciju rearanžiranog imunoglobulinskog gena u pomenutom mišu, pri čemu rearanžirani imunoglobulinski gen sadrži genski segment varijabilnog regiona λ lakog lanca i mišji Cκ gen ili njegov funkcionalni fragment.

[0295] Metod može dalje sadržati kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je varijabilni region teškog i/ili lakog lanca iz antitela koje sadrži humani Vλ i mišji Cκ.

[0296] [Izbrisano].

[0297] Opisan je metod za dobijanje rearanžiranog gena antitela u genetski modifikovanom mišu, koji sadrži: (a) izlaganje genetskog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija sadrži hVλ i hJλ na lokusu κ lakog lanca, pri čemu lokus κ lakog lanca sadrži mišji Cκ gen ili njegov funkcionalni fragment; i, (b) identifikaciju rearanžiranog imunoglobulinskog gena u pomenutom mišu, pri čemu rearanžirani imunoglobulinski gen sadrži genski segment varijabilnog regiona λ lakog lanca i mišji Cκ gen ili njegov funkcionalni fragment.

[0298] [Izbrisano].

[0299] Metod može dalje sadržati kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region teškog i/ili lakog lanca od miša, pri čemu je varijabilni region teškog i/ili lakog lanca od antitela koje sadrži humani Vλ i mišji Cκ.

[0300] Opisan je metod za dobijanje rearanžiranog gena antitela u genetski modifikovanom mišu, koji sadrži: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija sadrži hVλ i hJλ na lokusu nehumanog λ lakog lanca, pri čemu lokus λ lakog lanca sadrži nehumani Cλ gen ili njegov funkcionalni fragment; i, (b) identifikaciju rearanžiranog imunoglobulinskog gena u pomenutom mišu, pri čemu rearanžirani imunoglobulinski gen sadrži genski segment varijabilnog regiona λ lakog lanca i Cλ gen ili njegov funkcionalni fragment.

[0301] Konstantni gen λ lakog lanca ili njegov funkcionalni fragment mogu biti izabrani između humanog Cλ gena i mišjeg ili pacovskog Cλ gena, ili njegovog funkcionalnog fragmenta. Konstantni gen λ lakog lanca može biti mišji ili pacovski Cλ gen, ili njegov funkcionalni fragment.

[0302] Metod može dalje sadržati kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region teškog i/ili lakog lanca miša, pri čemu je varijabilni region teškog i/ili lakog lanca od antitela koje sadrži humani Vλ i nehumani (npr. mišji ili pacovski) Cλ.

[0303] Prema jednom aspektu, realizovan je metod za dobijanje antitela, koji sadrži izlaganje miša koji je ovde opisan antigenu, dopuštanje mišu da razvije imunu reakciju koja sadrži stvaranje antitela koje specifično vezuje antigen, identifikaciju rearanžirane sekvence nukleinske kiseline u mišu koja kodira teški lanac i rearanžirane sekvence nukleinske kiseline u mišu koja kodira srodnu sekvencu varijabilnog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline varijabilnih domena teškog i lakog lanca fuzionisanih sa humanim konstantnim domenima da bi se dobilo željeno antitelo, pri čemu željeno antitelo sadrži laki lanac koji sadrži Vλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ domenom.

[0304] U jednom primeru izvođenja, realizovan je metod za dobijanje antitela, koji sadrži izlaganje miša koji je ovde opisan antigenu, dopuštanje mišu da razvije imunu reakciju koja sadrži stvaranje antitela koje specifično vezuje antigen, identifikaciju rearanžirane sekvence nukleinske kiseline u mišu koja kodira teški lanac i rearanžirane sekvence nukleinske kiseline u mišu koja kodira srodnu sekvencu varijabilnog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline varijabilnih domena teškog i lakog lanca fuzionisanih sa sekvencama nukleinske kiseline humanih konstantnih domena za dobijanje željenog antitela, pri čemu željeno antitelo sadrži laki lanac koji sadrži Vλ domen fuzionisan sa Cκ domenom.

[0305] U jednom primeru izvođenja, realizovan je metod za dobijanje antitela, koji sadrži izlaganje miša koji je ovde opisan antigenu, dopuštanje mišu da razvije imunu reakciju koja sadrži stvaranje antitela koje specifično vezuje antigen, identifikaciju rearanžirane sekvence nukleinske kiseline u mišu koja kodira varijabilni domen teškog lanca i rearanžirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira srodnu sekvencu varijabilnog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline fuzionisanih sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju konstantni domen humanog teškog lanca i konstantni domen humanog lakog lanca za dobijanje antitela koje potiče od humanih sekvenci, pri čemu antitelo koje specifično vezuje antigen sadrži laki lanac koji sadrži humani Vλ domen fuzionisan sa nehumanim (npr. mišjim ili pacovskim) Cλ regionom.

[0306] U jednom primeru izvođenja, Cλ region je mišji, a u jednom primeru izvođenja je izabran između Cλ1, Cλ2 i Cλ3. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ region je Cλ2.

[0307] Prema jednom aspektu, realizovan je metod za dobijanje rearanžirane genske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela, koji sadrži (a) izlaganje miša koji je ovde opisan antigenu; (b) dopuštanje mišu da razvije imunu reakciju; (c) identifikaciju ćelije u mišu koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira rearanžiranu sekvencu humanog Vλ domena fuzionisanu sa mišjim Cκ domenom, pri čemu ćelija takođe kodira srodni teški lanac koji sadrži humani VH domen i nehumani CH domen, i pri čemu ćelija izražava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani Vλ domen i sekvence nukleinske kiseline koja kodira srodni humani VH domen; i, (e) korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani Vλ domen i klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira srodni humani VH domen za dobijanje potpuno humanog antitela.

[0308] U jednom primeru izvođenja, realizovan je metod za dobijanje rearanžirane genske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela, koji sadrži (a) izlaganje miša koji je opisan u ovom otkrivanju antigenu; (b) dopuštanje mišu da razvije imunu reakciju; (c) identifikaciju ćelije u mišu koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira rearanžiranu sekvencu humanog Vλ domena susedno na istom molekulu nukleinske kiseline sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira Cκ domen miša, pri čemu ćelija takođe kodira srodni teški lanac koji sadrži humani VH domen i CH domen miša, i pri čemu ćelija izražava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani Vλ domen i sekvence nukleinske kiseline koja kodira srodni humani VH domen; i, (e) korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani Vλ domen i klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira srodni humani VH domen za dobijanje potpuno humanog antitela.

[0309] U jednom primeru izvođenja, realizovan je metod za dobijanje rearanžirane genske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela, koji sadrži (a) izlaganje miša koji je ovde opisan antigenu; (b) dopuštanje da miš razvije imunu reakciju na antigen; (c) identifikaciju ćelije u mišu koja sadrži DNK koji kodira rearanžiranu sekvencu humanog Vλ domena fuzionisanu sa nehumanim Cλ domenom miša, pri čemu ćelija takođe kodira srodni teški lanac koji sadrži humani VH domen i nehumani CH domen miša, i pri čemu ćelija izražava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira rearanžirani humani Vλ domen i sekvence nukleinske kiseline koja kodira srodni humani VH domen; i, (e) primenu klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani Vλ domen i klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira srodni humani VH domen za dobijanje potpuno humanog antitela. U jednom primeru izvođenja, nehumana životinja je miš, a Cλ domen je mišji Cλ2. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ domen potiče od Cλ gena koji je najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa mišjim Cλ2.

[0310] Opisana je genetski modifikovana nehumana životinja koja izražava humani laki lanac koji potiče od λ fuzionisan sa endogenim konstantnim regionom (CL) lakog lanca, pri čemu životinja, posle imunizacije sa antigenom, pravi antitelo koje sadrži humani Vλ domen fuzionisan sa nehumanim CL domenom životinje. Nehumani CL domen može biti izabran između Cκ domena i Cλ domena. CL domen može biti Cκ domen. Životinja je miš. Mišji CL domen može biti Cλ domen. Cλ domen može biti Cλ2. Mišji Cλ domen može poticati od Cλ gena koji je najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identičan sa mišjim Cλ2.

[0311] Opisana je genetski modifikovana nehumana životinja koja sadrži modifikovani endogeni lokus κ lakog lanca kao što je ovde opisano koji izražava mnoštvo imunoglobulinskih λ lakih lanaca povezanih sa mnoštvom imunoglobulinskih teških lanaca. Teški lanac može sadržati humanu sekvencu. Humana sekvenca može biti izabrana između varijabilne sekvence, CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. Mnoštvo imunoglobulinskih λ lakih lanaca može sadržati humanu sekvencu. Humana sekvenca može biti izabrana između varijabilne sekvence, konstantne sekvence, i njihove kombinacije. Životinja može sadržati onesposobljeni endogeni imunoglobulinski lokus i izražavati teški lanac i/ili λ laki lanac transgena ili ekstrahromozomskog epizoma. Životinja može sadržati zamenu na endogenom (nehumanom) lokusu nekih ili svih endogenih humanih negenskih segmenata teškog lanca (tj. V, D, J), i/ili nekih ili svih endogenih nehumanih konstantnih sekvenci teškog lanca (npr. CH1, zglob, CH2, CH3, ili njihova kombinacija), i/ili nekih ili svih endogenih nehumanih sekvenci lakog lanca (npr. V, J, konstantnog, ili njihove kombinacije), sa jednom ili više humanih imunoglobulinskih sekvenci. Nehumana životinja je miš.

[0312] Opisana je nehumana životinja koja je podesna za dobijanje antitela koja imaju humani laki lanac koji potiče od λ, pri čemu su sva ili u suštini sva antitela napravljena u nehumanoj životinji izražena sa humanim lakim lancem koji potiče od λ. Humani laki lanac koji potiče od λ može biti izražen iz endogenog lokusa lakog lanca. Endogeni lokus lakog lanca može biti lokus κ lakog lanca. Životinja je miš, a lokus κ lakog lanca može biti lokus mišjeg κ lakog lanca.

[0313] Prema jednom aspektu, realizovan je metod za dobijanje lakog lanca koji potiče od λ za humano antitelo, koji sadrži dobijanje iz miša koji je ovde opisan sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca, i korišćenje sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca za dobijanje humanog antitela.

[0314] Prema jednom aspektu, realizovan metod za dobijanje antigen-vezujućeg proteina, koji sadrži izlaganje miša koji je ovde opisan antigenu; dopuštanje mišu da razvije imunu reakciju; i dobijanje od miša antigen-vezujućeg proteina koji vezuje antigen, ili dobijanje iz miša sekvence koja treba da se koristi za dobijanje antigenvezujućeg proteina koji vezuje antigen.

[0315] Prema jednom aspektu, realizovana je ćelija koja potiče od miša koji je ovde opisan. U jednom primeru izvođenja, ćelija je izabrana između embrionske matične ćelije, pluripotentne ćelije, indukovane pluripotentne ćelije, B ćelije, i hibridoma.

[0316] Prema jednom aspektu, realizovana je ćelija koja sadrži genetsku modifikaciju koja je ovde opisana. U jednom primeru izvođenja, ćelija je mišja ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija je izabrana između hibridoma i kvadroma. U jednom primeru izvođenja, ćelija izražava imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humanu λ varijabilnu sekvencu fuzionisanu sa mišjom κ konstantnom sekvencom. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišja konstantna sekvenca je mišja κ konstantna sekvenca.

[0317] Prema jednom aspektu, realizovano je tkivo koje potiče od miša koji je ovde opisan.

[0318] Prema jednom aspektu, realizovana je primena miša ili ćelije koji su ovde opisani za dobijanje antigen-vezujućeg proteina. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein je humani protein. U jednom primeru izvođenja, humani protein je humano antitelo.

[0319] Opisan je antigen-vezujući protein koji pravi mišja životinja, ćelija, tkivo, ili metod koji su ovde opisani. Antigen-vezujući protein može biti humani protein.

Humani protein može biti humano antitelo.

[0320] Bilo koji primeri izvođenja i aspekti koji su ovde opisani mogu se koristiti povezani jedni sa drugima, osim ako nije drugačije navedeno ili očigledno iz konteksta. Stručnjacima iz odgovarajuće oblasti će na osnovu pregleda aktuelnog opisa biti očigledni drugi primeri izvođenja.

KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0321]

FIG. 1A prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, direktne genomske zamene od oko tri megabaze (Mb) mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca (zatvoreni simboli) sa oko jednom megabazom (Mb) humanog imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca (otvoreni simboli). FIG. 1B prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, direktne genomske zamene od oko tri megabaze (Mb) varijabilnog mišjeg imunoglobulinskog genskog lokusa κ lakog lanca (zatvoreni simboli) sa oko 0.5 megabaza (Mb) prvog ili bližeg od dva skoro identična ponavljanja humanog imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa κ lakog lanca (otvoreni simboli).

FIG. 2A prikazuje detaljni prikaz, koji nije u srazmeri, tri inicijalna koraka (A-C) za direktnu genomsku zamenu mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca, što rezultuje delecijom svih mišjih VH, DH i JH genskih segmenata i zamenom sa tri humana VH, svim humanim DH i JH genskim segmentima. Prikazan je ciljajući vektor za prvu inserciju humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca (3hVH BACvec) sa 67 kb 5’ mišjim homologim krakom, selekcionom kasetom (otvoreni pravougaonik), mesno-specifičnim rekombinacionim mestom (otvoreni trougao), 145 kb humanim genomskim fragmentom i 8 kb 3’ mišjim homologim krakom. Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) imunoglobulinski genski segmenti, dodatne selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) i mesno-specifična rekombinaciona mesta (otvoreni trouglovi) umetnuti iz narednih ciljajućih vektora.

FIG. 2B prikazuje detaljni prikaz, koji nije u srazmeri, šest dodatnih koraka (D-I) za direktnu genomsku zamenu mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca, što rezultuje insercijom 77 dodatnih humanih VH genskih segmenata i odstranjivanjem finalne selekcione kasete. Prikazan je ciljajući vektor za inserciju dodatnih humanih VH genskih segmenata (18hVH BACvec) u inicijalnoj inserciji humanih genskih segmenata teškog lanca (3hVH-CRE Hybrid Alel) sa 20 kb 5’ mišjim homologim krakom, selekcionom kasetom (otvoreni pravougaonik), 196 kb humanim genomskim fragmentom i 62 kb humanim homologim krakom koji se preklapa sa 5’ krajem inicijalne insercije humanih genskih segmenata teškog lanca koji su prikazani sa mesno-specifičnim rekombinacionim mestom (otvoreni trougao) lociranim 5’ ka humanim genskim segmentima. Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) imunoglobulinski genski segmenti i dodatne selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) umetnute narednim ciljajućim vektorima.

FIG. 2C prikazuje detaljni prikaz, koji nije u srazmeri, tri inicijalna koraka (A-C) za direktnu genomsku zamenu mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa κ lakog lanca, što rezultuje delecijom svih mišjih Vκ, i Jκ genskih segmenata (Igκ-CRE Hybrid Alel). Prikazane su selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) i mesno-specifična rekombinaciona mesta (otvoreni trouglovi) umetnuti iz ciljajućih vektora.

FIG. 2D prikazuje detaljni prikaz, koji nije u srazmeri, pet dodatnih koraka (D-H) za direktnu genomsku zamenu mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa κ lakog lanca, što rezultuje insercijom svih humanih Vκ i Jκ genskih segmenata u bližem ponavljanju i delecijom finalne selekcione kasete (40hVκdHyg Hybrid Alel). Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) imunoglobulinski genski segmenti i dodatne selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) umetnuti narednim ciljajućim vektorima.

FIG. 3A prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, strategije skrininga koja obuhvata lokacije kvantitativnog PCR (qPCR) prajmera/probe za detekciju insercije genskih sekvenci humanog teškog lanca i gubitak mišjih genskih sekvenci teškog lanca u ciljanim embrionskim matičnim (ES) ćelijama. Prikazana je strategija skrininga u ES ćelijama i miševima za inserciju prvog humanog teškog gena sa setovima qPCR prajmera/proba za izbrisani region ("gubitak" proba C i D), umetnutim regionom ("hlgH" probe G i H) i bočnim regionima ("retencione" probe A, B, E i F) na nemodifikovanom mišjem hromozomu (gore) i korektnom ciljanom hromozomu (dole).

FIG. 3B prikazuje reprezentativni proračun broja uočenih kopija proba u roditeljskim i modifikovanim ES ćelijama za prvu inserciju humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca. Broj uočenih kopija za probe A do F je bio izračunat kao 2/2ΔΔCt. ΔΔCt je izračunat kao ave[ΔCt(uzorak) -medΔCt(kontrola)], gde je ΔCt razlika u Ct između testiranih i referentnih proba (između 4 i 6 referentnih proba u zavisnosti od testa). Izraz medΔCt(kontrola) je medijana ΔCt sadržatelja više (>60) ne-ciljanih DNK uzoraka roditeljskih ES ćelija. Svaki klon modifikovanih ES ćelija je bio testiran u šestoplikatu. Da bi se izračunao broj kopija IgH proba G i H u roditeljskim ES ćelijama, bilo je pretpostavljeno da ove probe imaju broj kopija 1 u modifikovanim ES ćelijama, a bilo je korišćeno maksimalno Ct od 35 čak i kada nije bila uočena amplifikacija. FIG. 3C prikazuje reprezentativni proračun broja kopija za četiri miša, čiji genotip je bio izračunat korišćenjem samo proba D i H. Miševi prirodnog tipa: WT miševi; miševi heterozigotni za prvu inserciju humanih imunoglobulinskih genskih segmenata: HET miševi; miševi homozigotni za prvu inserciju humanih imunoglobulinskih genskih segmenata: Homo miševi.

FIG. 4A prikazuje detaljni prikaz, koji nije u srazmeri, tri koraka korišćena za konstrukciju 3hVH BACvec pomoću bakterijske homologe rekombinacije (BHR). Prikazani su humani (otvoreni simboli) i mišji (zatvoreni simboli) imunoglobulinski genski segmenti, selekcione kasete (otvoreni pravougaonici) i mesno-specifična rekombinaciona mesta (otvoreni trouglovi) umetnuti iz ciljajućih vektora.

FIG. 4B prikazuje gel elektroforezu sa pulsirajućim poljem (PFGE) za tri BAC klona (B1, B2 i B3) posle Notl digestije. Markeri M1, M2 i M3 su markeri niskog opsega, srednjeg opsega i PFG markeri sa lambda lestvicama, respektivno (New England BioLabs, Ipswich, MA).

FIG. 5A prikazuje šematski prikaz, koji nije u srazmeri, sekvencijalnih modifikacija mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca sa rastućim količinama humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca. Homozigotni miševi su bili dobijeni iz svakog od tri različita stadijuma humanizacije teškog lanca. Otvoreni simboli prikazuju humanu sekvencu; zatvoreni simboli prikazuju mišju sekvencu.

FIG. 5B prikazuje šematski prikaz, koji nije u srazmeri, sekvencijalnih modifikacija mišjeg imunoglobulinskog lokusa κ lakog lanca sa rastućim količinama humanih imunoglobulinskih genskih segmenata κ lakog lanca. Homozigotni miševi su bili dobijeni iz svakog od tri različita stadijuma humanizacije κ lakog lanca. Otvoreni simboli prikazuju humanu sekvencu; zatvoreni simboli prikazuju mišju sekvencu.

FIG. 6 prikazuje FACS dot grafike populacija B ćelija u miševima prirodnog tipa i VELOCIMMUNE® humanizovanim miševima. Ćelije iz slezine (gornji red, treći red odozgo i donji red) ili ingvinalnog, odn. bedrenog limfnog čvora (red odozgo) prirodnog tipa (wt), VELOCIMMUNE® 1 (V1), VELOCIMMUNE® 2 (V2) ili VELOCIMMUNE® 3 (V3) miševa su bile obojene za B ćelije koje izražavaju površinski IgM (gornji red, i drugi red odozgo), površinski imunoglobulin koji sadrži bilo κ ili λ laki lanac (treći red odozgo) ili specifične haplotipove površinskog IgM (vonji red), i populacije razdvojene pomoću FACS.

FIG. 7A prikazuje reprezentativne CDR3 sekvence teškog lanca slučajno izabranih VELOCIMMUNE® antitela oko VH-DH-JH (CDR3) spoja, koje demonstriraju raznovrsnost spajanja i nukleotidne adicije. CDR3 sekvence teškog lanca su grupisane u skladu sa primenom DH genskog segmenta, čija germinativna linija je iznad svake grupe podebljana. VH genski segmenti za svaku CDR3 sekvencu teškog lanca su navedeni između zagrada na 5’ kraju svake sekvence (npr.3-72 je humani VH3-72). JH genski segmenti za svaki CDR3 teškog lanca su navedeni između zagrada na 3’ kraju svake sekvence (npr.3 je humani JH3). SEQ ID NOs za svaku prikazanu sekvencu su kao što sledi idući odozgo nadole: SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39.

FIG. 7B prikazuje reprezentativne CDR3 sekvence lakog lanca slučajno izabranih VELOCIMMUNE® antitela oko Vκ-Jκ (CDR3) spoja, koje demonstriraju raznovrsnost spajanja i nukleotidnih adicija. Vκ genski segmenti za svaku CDR3 sekvencu lakog lanca su navedeni između zagrada na 5’ kraju svake sekvence (npr. 1-6 je humani Vκ1-6). Jκ genski segmenti za svaki CDR3 lakog lanca su navedeni između zagrada na 3’ kraju svake sekvence (npr.1 je humani Jκ1). SEQ ID NOs za svaku prikazanu sekvencu su kao što sledi idući odozgo nadole: SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:51; SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:53; SEQ ID NO:54; SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:58.

FIG. 8 prikazuje učestanost somatskih hipermutacija teških i lakih lanaca VELOCIMMUNE® antitela ocenjenih (posle poravnanja radi podudaranja sekvenci germinativnih linija) kao procenat sekvenci promenjenih na poziciji svakog nukleotida (NT; levi stubac) ili aminokiseline (AA; desni stubac) iz grupa od 38 (neimunizovani IgM), 28 (neimunizovani IgG), 32 (neimunizovani Igκ iz IgG), 36 (imunizovani IgG) ili 36 (imunizovani Igκ iz IgG) sekvenci. Zasenčeni stupci označavaju lokacije CDRs.

FIG. 9A prikazuje nivoe serumskog imunoglobulina za IgM i IgG izotipove u miševima prirodnog tipa (otvoreni stupci) ili VELOCIMMUNE® miševima (zatvoreni stupci).

FIG. 9B prikazuje nivoe serumskog imunoglobulina za IgA izotip u miševima prirodnog tipa (otvoreni stupci) ili VELOCIMMUNE® miševima (zatvoreni stupci).

FIG. 9C prikazuje nivoe serumskog imunoglobulina za IgE izotip u miševima prirodnog tipa (otvoreni stupci) ili VELOCIMMUNE® miševima (zatvoreni stupci).

FIG. 10A prikazuje titre antigen-specifičnog IgG protiv interleukin-6 receptora (IL-6R) iz seruma sedam VELOCIMMUNE ® (VI) i pet miševa prirodnog tipa (WT) posle dva (puštanje krvi 1) ili tri (puštanje krvi 2) kruga imunizacije sa ektodomenom od IL-6R.

FIG. 10B prikazuje izotipski-specifične titre IL-6R-specifičnog IgG za sedam VELOCIMMUNE® (VI) i pet miševa prirodnog tipa (WT).

FIG. 11A prikazuje distribuciju afiniteta anti-interleukin-6 receptorskog monoklonskog antitela generisanog u VELOCIMMUNE ® miševima.

FIG. 11B prikazuje antigen-specifično blokiranje anti-interleukin-6 receptorskog monoklonskog antitela generisanog u VELOCIMMUNE® (VI) i miševima prirodnog tipa (WT).

FIG. 12 prikazuje šematski prikaz, koji nije u srazmeri, mišjih ADAM6a i ADAM6b gena u mišjem imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. Prikazan je ciljajući vektor (mADAM6 ciljajući vektor) koji je korišćen za inserciju mišjih ADAM6a i ADAM6b u humanizovani endogeni lokus teškog lanca sa selekcionom kasetom (HYG: higromicin) okruženom sa mesno-specifičnim rekombinacionim mestima (Frt) uključujući inženjeringom dobijena restrikciona mesta na 5’ i 3’ krajevima.

FIG. 13 prikazuje šematski prikaz, koji nije u srazmeri, humanog ADAM6 pseudogena (hADAM6ψ) lociranog između varijabilnih genskih segmenata humanog teškog lanca 1-2 (VH1-2) i 6-1 (VH6-1). Prikazan je ciljajući vektor za bakterijsku homologu rekombinaciju (hADAM6ψ ciljajući vektor) radi brisanja humanog ADAM6 pseudogena i umetanje jedinstvenih restrikcionih mesta u humani lokus teškog lanca sa selekcionom kasetom (NEO: neomicin) okruženom mesno-specifičnim rekombinacionim mestima (loxP) uključujući inženjeringom dobijena restrikciona mesta na 5’ i 3’ krajevima. Prikazan je prikaz, koji nije u srazmeri, rezultujućeg ciljanog lokusa humanizovanog teškog lanca koji sadrži genomski fragment koji kodira mišje ADAM6a i ADAM6b gene koji sadrže selekcionu kasetu okruženu mesno-specifičnim rekombinacionim mestima.

FIG. 14A prikazuje FACS konturne grafikone limfocita gejtovane na singletima radi površinske ekspresije IgM i B220 u koštanoj srži za miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse (H<+/+>κ<+/+>) humanog teškog i humanog κ lakog lanca i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju umetnut mišji genomski fragment koji sadrži mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Procenat nezrelih (B220<int>IgM<+>) i zrelih (B220<high>IgM<+>) B ćelija je naveden na svakom konturnom grafikonu.

FIG. 14B prikazuje ukupan broj nezrelih (B220<int>IgM<+>) i zrelih (B220<high>IgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanoj iz femura miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>).

FIG. 15A prikazuje FACS konturne grafikone CD19<+>-gejtovanih B ćelija za površinsku ekspresiju c-kit i CD43 u koštanoj srži miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (W<+/+>A6<res>κ<+/+>). U gornjem desnom i donjem levom kvadrantu, respektivno, svakog konturnog grafikona je naveden procenat pro-B (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i pre-B (CD19<+>CD43-ckit-) ćelija.

FIG. 15B prikazuje ukupni broj pro-B ćelija (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i pre-B ćelija (CD19<+>CD43-ckit-) u koštanoj srži izolovanoj iz femura miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse (H<+/+>κ<+/+>) humanog teškog i humanog κ lakog lanca i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji sadrži mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>).

FIG. 16A prikazuje FACS konturne grafikone limfocita gejtovanih na singletima radi površinske ekspresije CD19 i CD43 u koštanoj srži miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Na svakom konturnom grafikonu je naveden procenat nezrelih B (CD19<+>CD43-), pre-B (CD19<+>CD43<int>) i pro-B (CD19<+>CD43<+>) ćelija. FIG. 16B prikazuje histograme nezrelih B (CD19<+>CD43-) i pre-B (CD19<+>CD43<int>) ćelija u koštanoj srži miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>).

FIG. 17A prikazuje FACS konturne grafikone limfocita gejtovanih na singletima radi površinske ekspresije CD19 i CD3 u splenocitima miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Na svakom konturnom grafikonu je naveden procenat B (CD19<+>CD3-) i T (CD19-CD3<+>) ćelija.

FIG. 17B prikazuje FACs konturne grafikone za CD19<+>-gejtovane B ćelije radi površinske ekspresije Igλ i Igκ lakog lanca u slezini miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševe homozigotne za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Na svakom konturnom grafikonu je naveden procenat Igλ<+>(gornji levi kvadrant) i (donji desni kvadrant) B ćelija.

FIG. 17C prikazuje ukupni broj CD19<+>B ćelija u slezinama miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>).

FIG. 18A prikazuje FACs konturne grafikone CD19<+>-gejtovanih B ćelija radi površinske ekspresije IgD i IgM u slezinama miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>). Procenat zrelih B ćelija (CD19<+>IgD<high>IgM<int>) je naveden za svaki konturni grafikon. Strelica na desnom konturnom grafikonu prikazuje proces sazrevanja B ćelija u odnosu na površinsku ekspresiju IgM i IgD.

FIG. 18B prikazuje ukupni broj B ćelija u slezinama miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H<+/+>κ<+/+>) i miševa homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca koji imaju ektopični mišji genomski fragment koji kodira mišje ADAM6 gene (H<+/+>A6<res>κ<+/+>) tokom sazrevanja od CD19<+>IgM<high>IgD<int>u CD19<+>IgM<int>IgD<high>.

FIG. 19 prikazuje detaljni prikaz, koji nije u srazmeri, lokusa humanog λ lakog lanca koji sadrži klastere Vλ genskih segmenata (A, B i C) i parove Jλ i Cλ regiona (J-C parovi)

FIG. 20 prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, strategije ciljanja primenjene za inaktivaciju endogenog mišjeg lokusa λ lakog lanca.

FIG. 21 prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, strategije ciljanja primenjene za inaktivaciju endogenog mišjeg lokusa κ lakog lanca.

FIG. 22A prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, inicijalnog ciljajućeg vektora za ciljanje endogenog mišjeg lokusa λ lakog lanca sa humanim sekvencama λ lakog lanca koji sadrži 12 hVλ genske segmente i hJλ1 genski segment (12/1-λ ciljajući vektor).

FIG. 22B prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, četiri inicijalna ciljajuća vektora za ciljanje endogenog lokusa mišjeg κ lakog lanca sa humanim sekvencama λ lakog lanca koji sadrže 12 hVλ genskih segmenata i hJλ1 genski segment (12/1-κ ciljajući vektor), 12 hVλ genskih segmenata i hJλ1, 2, 3 i 7 genskih segmenata (12/4-κ ciljajući vektor), 12 hVλ genskih segmenata, humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu i hJλ1 genski segment (12(κ)1-κ ciljajući vektor) i 12 hVλ genskih segmenata, humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu i hJλ1, 2, 3 i 7 genskih segmenata (12(κ)4-κ ciljajući vektor).

FIG. 23A prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, strategije ciljanja za progresivnu inserciju 40 hVλ genskih segmenata i samo jednog hJλ genskog segmenta u lokus mišjeg λ lakog lanca.

FIG. 23B prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, strategije ciljanja za progresivnu inserciju 40 hVλ genskih segmenata i samo jednog hJλ genskog segmenta u mišji κ lokus.

FIG. 24 prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, koraka ciljanja i molekularnog inženjeringa primenjenih za dobijanje jedinstvenih humanih λ-κ hibridnih ciljajućih vektora za konstrukciju lokusa hibridnog lakog lanca koji sadrži humanu κ intergensku sekvencu, više hJλ genskih segmenata ili oba.

FIG. 25A prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, strukture lokusa za modifikovani lokus mišjeg λ lakog lanca koji sadrži 40 hVλ genskih segmenata i samo jedan hJλ genski segment operativno povezan sa endogenim Cλ2 genom.

FIG. 25B prikazuje opšti prikaz, koji nije u srazmeri, strukture lokusa za četiri nezavisna, modifikovana lokusa mišjeg κ lakog lanca koji sadrže 40 hVλ genskih segmenata i jedan ili četiri hJλ genska segmenta sa ili bez susedne humane Vκ-Jκ genomske sekvence operativno povezane sa endogenim Cκ genom.

FIG. 26A prikazuje konturne grafikone Igλ<+>i Igκ<+>splenocita gejtovanih na CD19<+>iz miševa prirodnog tipa (WT), miša homozigotnog za 12 hVλ i četiri hJλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (12hVλ-VκJκ-4hJλ) i miša homozigotnog za 40 hVλ i jedan hJλ genski segment (40hVλ-1hJλ).

FIG. 26B prikazuje ukupni broj CD19<+>B ćelija u sakupljenim slezinama iz miševa prirodnog tipa (WT), miševa homozigotnih za 12 hVλ i četiri hJλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (12hVλ-VκJκ-4hJλ) i miševa homozigotnih za 40 hVλ, i jedan hJλ genski segment (40hVλ-1hJλ).

FIG. 27A, u gornjem panelu, prikazuje konturne grafikone splenocita gejtovanih na singletima i obojenih za B i T ćelije (CD19<+>i CD3<+>, respektivno) iz miševa prirodnog tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ, i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Donji panel prikazuje konturne grafikone splenocita gejtovanih na CD19<+>i obojenih za Igλ<+>i Igκ<+>ekspresiju iz miša prirodnog tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ, i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).

FIG. 27B prikazuje ukupni broj CD19<+>, CD19<+>Igκ<+>i CD19+Igλ+ B ćelija u slezinama sakupljenim iz miševa prirodnog tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ, i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).

FIG. 27C prikazuje konturne grafikone splenocita gejtovanih na CD19<+>i obojenih za imunoglobulin D (IgD) i imunoglobulin M (IgM) iz miša prirodnog tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ, i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Na svakom konturnom grafikonu su naznačene zrele (72 za WT, 51 za 40hVλ-VκJκ-4hJλ) i prelazne (13 za WT, 22 za 40hVλ-VκJκ-4hJλ) B ćelije.

FIG. 27D prikazuje ukupni broj CD19<+>B ćelija, prelaznih B ćelija (CD19<+>IgM<hi>IgD<lo>) i zrele B ćelije (CD19<+>IgM<lo>IgD<hi>) u slezinama sakupljenim iz miševa prirodnog tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ, i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).

FIG. 28A, na gornjem panelu, prikazuje konturne grafikone koštane srži obojene za B i T ćelije (CD19<+ i>CD3<+>, respektivno) iz miša prirodnog tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ, i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Donji panel prikazuje konturne grafikone koštane srži gejtovane na CD19<+>i obojene za ckit<+>i CD43<+>iz miša prirodnog tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ, i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Na svakom konturnom grafikonu donjeg panela su naznačene Pro i Pre B ćelije.

FIG. 28B prikazuje broj Pro (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i Pre (CD19<+>CD43-ckit-) B ćelija u koštanoj srži sakupljenoj iz femura miševa prirodnog tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ, i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).

FIG. 28C prikazuje konturne grafikone koštane srži gejtovane na singletima obojene za imunoglobulin M (IgM) i B220 iz miša prirodnog tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ, i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Na svakom od konturnih grafikona su naznačene nezrele, zrele i pro/pre B ćelije.

FIG. 28D prikazuje ukupni broj nezrelih (B220<int>IgM<+>) i zrelih (B220<hi>IgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanoj iz femura miševa prirodnog tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).

FIG. 28E prikazuje konturne grafikone koštane srži gejtovane na nezrelim (B220<int>IgM<+>) i zrelim (B220<hi>IgM<+>) B ćelijama obojenim za Igλ i Igκ ekspresiju izolovanim iz femura miša prirodnog tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).

FIG. 29 prikazuje poravnanje nukleotidnih sekvenci Vλ-Jλ-Cκ spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova amplifikovanih iz splenocitne RNK miševa koji nose humane genske sekvence λ lakog lanca na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca. A6 = SEQ ID NO:115; B6 = SEQ ID NO:116; F6 = SEQ ID NO:117; B7 = SEQ ID NO:118; E7 = SEQ ID NO:119; F7 = SEQ ID NO:120; C8 = SEQ ID NO:121; E12 = SEQ ID NO:122; 1-4 = SEQ ID NO:123; 1-20 = SEQ ID NO:124; 3B43 = SEQ ID NO:125; 5-8 = SEQ ID NO:126; 5-19 = SEQ ID NO:127; 1010 = SEQ ID NO:128; 11A1 = SEQ ID NO:129; 7A8 = SEQ ID NO:130; 3A3 = SEQ ID NO:131; 2-7 = SEQ ID NO:132. Baze napisane malim slovima ukazuju na baze negerminativne linije koje su nastale bilo mutacijom i/ili N adicijom u toku rekombinacije. Konsenzusne aminokiseline unutar Okvirnog regiona 4 (FWR4) koje su kodirane nukleotidnom sekvencom hJλ1 i mišjeg Cκ su naznačene na dnu poravnanja sekvenci.

FIG. 30 prikazuje poravnanje nukleotidnih sekvenci Vλ-Jλ-Cκ spoja dvadeset nezavisnih RT-PCR klonova amplifikovanih iz splenocitne RNK miševa koji nose humane genske sekvence λ lakog lanca uključujući susednu humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca.5-2 = SEQ ID

NO:145; 2-5 = SEQ ID NO:146; 1-3 = SEQ ID NO:147; 4B-1 = SEQ ID NO:148;

3B-5 = SEQ ID NO:149; 7A-1 = SEQ ID NO:150; 5-1 = SEQ ID NO:151; 4A-1 =

SEQ ID NO:152; 11A-1 = SEQ ID NO:153; 5-7 = SEQ ID NO:154; 5-4 = SEQ ID

NO:155; 2-3 = SEQ ID NO:156. Baze napisane malim slovima ukazuju na baze negerminativne linije koje su nastale bilo mutacijom i/ili N adicijom u toku rekombinacije. Konsenzusne aminokiseline unutar Okvirnog regiona 4 (FWR4) koje su kodirane nukleotidnom sekvencom svakog humanog Jλ i mišjeg Cκ su naznačene na dnu poravnanja sekvenci.

FIG. 31 prikazuje poravnanje nukleotidnih sekvenci Vλ-Jλ-Cλ spoja tri nezavisna RT-PCR klona amplifikovana iz splenocitne RNK miševa koji nose humane genske sekvence λ lakog lanca na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca.2D1 = SEQ ID NO:159; 2D9 = SEQ ID NO:160; 3E15 = SEQ ID NO:161. Baze napisane malim slovima ukazuju na baze negerminativne linije koje su nastale bilo mutacijom i/ili N adicijom u toku rekombinacije. Konsenzusne aminokiseline unutar Okvirnog 4 regiona (FWR4) koje su kodirane nukleotidnom sekvencom hJλ1 i mišjeg Cλ2 su naznačene na dnu poravnanja sekvenci.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0322] Ovo otkrivanje nije ograničeno na specifične opisane metode i eksperimentalne uslove, pošto takvi metodi i uslovi mogu varirati. Takođe se podrazumeva da je ovde korišćena terminologija namenjena samo za svrhe opisivanja specifičnih primera izvođenja, a da nije namenjena da bude ograničavajuća, pošto je obim predmetnog pronalaska definisan patentnim

zahtevima.

[0323] Ukoliko nije drugačije definisano, svi izrazi i fraze koji se ovde koriste imaju značenja koja se tim izrazima i frazama pripisuju u odgovarajućoj oblasti, osim ako suprotno nije jasno naglašeno ili je jasno očigledno iz konteksta u kome se taj izraz ili fraza upotrebljavaju. Mada se bilo u izvođenju ili testiranju predmetnog pronalaska mogu upotrebiti koji metodi i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, sada će biti opisani poželjni metodi i materijali.

[0324] Fraza "suštinski" ili "u suštini", kada se koristi, se odnosi na količinu genskih segmenata (npr. "u suštini sve" V genske segmente) obuhvata i funkcionalne, i nefunkcionalne genske segmente i obuhvata, u različitim primerima izvođenja, npr.

80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, ili 99% ili više od svih genskih segmenata; u različitim primerima izvođenja, "u suštini svi" genski segmenti obuhvata, npr. najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% funkcionalnih (tj. nepseudogenskih) genskih segmenata.

[0325] Izraz "zamena" obuhvata postavljanje DNK sekvence u genom ćelije tako da zameni sekvencu u okviru genoma sa heterologom sekvencom (npr. humanom sekvencom u mišu) na lokusu genomske sekvence. Tako postavljena DNK sekvenca može sadržati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvora DNK upotrebljenog za dobijanje tako postavljene sekvence (npr. promoteri, pojačavači, 5’-ili 3’-netranslirani regioni, podesne rekombinacione signalne sekvence, itd.). Na primer, u različitim primerima izvođenja, zamena je zamena endogene sekvence heterologom sekvencom koja rezultuje proizvodnjom genskog proizvoda od DNK sekvence koja je tako postavljena (koja sadrži heterologu sekvencu), ali ne i ekspresijom endogene sekvence; zamena je endogena genomska sekvenca sa DNK sekvencom koja kodira protein koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom genomskom sekvencom (npr. endogena genomska sekvenca kodira imunoglobulinski gen ili domen, a DNK fragment kodira jedan ili više humanih imunoglobulinskih gena ili domena). U različitim primerima izvođenja, endogeni gen ili njegov fragment se zamenjuje sa odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog, homolog, ili je u suštini identičan ili isti po strukturi i/ili funkciji, kao endogeni gen ili njegov fragment koji se zamenjuje.

[0326] Izraz "susedno" obuhvata karakteristiku pojavljivanja na istom molekulu nukleinske kiseline, npr. dve sekvence nukleinske kiseline su "susedne" ako se one pojavljuju na istom molekulu nukleinske kiseline, ali su razdvojene drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, rearanžirana V(D)J sekvenca je "susedna" sa genskom sekvencom konstantnog regiona, mada finalni kodon V(D)J sekvence nije neposredno praćen prvim kodonom sekvence konstantnog regiona. U sledećem primeru, sekvence dva V genska segmenta su "susedne" ako se one nalaze na istom genomskom fragmentu, mada one mogu biti razdvojene sekvencom koja ne kodira kodon V regiona, npr. one mogu biti razdvojene regulatornom sekvencom, npr. promoterom ili drugom nekodirajućom sekvencom. U jednom primeru izvođenja, susedna sekvenca sadrži genomski fragment koji sadrži genomske sekvence raspoređene kao da se nalaze u genomu prirodnog tipa.

[0327] Fraza "potiče od" kada se koristi za varijabilni region "koji potiče od" navedenog gena ili genskog segmenta obuhvata sposobnost praćenja sekvence nazad do specifičnog nerearanžiranog genskog segmenta ili genskih segmenata koji su bili rearanžirani da bi se formirao gen koji izražava varijabilni domen (što se odnosi, tamo gde je primenljivo, na splajsne razlike i somatske mutacije).

[0328] Fraza "funkcionalni" kada se koristi za varijabilni region genskog segmenta ili spojeni genski segment se odnosi na korišćenje u repertoaru izraženog antitela; npr. kod ljudi Vλ genski segmenti 3-1, 4-3, 2-8, itd. su funkcionalni, dok su Vλ genski segmenti 3-2, 3-4, 2-5, itd. nefunkcionalni.

[0329] "Lokus teškog lanca" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr. mišjem hromozomu, pri čemu se kod miša prirodnog tipa nalaze varijabilni region teškog lanca (VH), region raznovrsnosti teškog lanca (DH), spojni region teškog lanca (JH), i konstantni region teškog lanca (CH) DNK sekvence.

[0330] "κ lokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr. mišjem hromozomu, pri čemu se kod miša prirodnog tipa nalaze κ varijabilni region (Vκ), κ spojni region (JK), i κ konstantni region (CK) DNK sekvence.

[0331] "λ lokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr. mišjem hromozomu, pri čemu se kod miša prirodnog tipa λ nalaze varijabilni region (Vλ), λ spojni region (Jλ), i λ konstantni region (Cλ) DNK sekvence.

[0332] Izraz "ćelija," kada se koristi u vezi izražavanja sekvence obuhvata bilo koju ćeliju koja je podesna za izražavanje rekombinantne sekvence nukleinske kiseline. Ćelije obuhvataju one od prokariota i eukariota (jednoćelijskih ili višećelijskih), bakterijske ćelije (npr. sojeve E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.), mikobakterijske ćelije, gljivične ćelije, kvaščeve ćelije (npr. S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, insektne ćelije (npr. SF-9, SF-21, baculovirusom-inficirane insektne ćelije, Trichoplusia ni, itd.), nehumane životinjske ćelije, humane ćelije, B ćelije, ili fuzije ćelija, kao što su, na primer, hibridoma ili kvadroma. U nekim primerima izvođenja, ćelija je ljudska, majmunska, primatska, hrčkova, pacovska, ili mišja ćelija. U nekim primerima izvođenja, ćelija je eukariotska i izabrana je između sledećih ćelija: CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), retinalna ćelija, Vero, CV1, bubrežna (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr. BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalna), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, mijeloma ćelija, tumorska ćelija, i ćelijska linija koja potiče od gore navedene ćelije. U nekim primerima izvođenja, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. retinalna ćelija koja izražava virusni gen (npr. PER.C6™ ćelija).

[0333] Fraza "region koji određuje komplementarnost" ili izraz "CDR," obuhvata aminokiselinsku sekvencu kodiranu sekvencom nukleinske kiseline imunoglobulinskih gena organizma koji se normalno (tj. u životinji prirodnog tipa) pojavljuju između dva okvirna regiona u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca imunoglobulinskog molekula (npr. antitelo ili receptor T ćelija). CDR može biti kodiran, na primer, sekvencom germinativne linije ili rearanžiranom ili nerearanžiranom sekvencom, i, na primer, pomoću naivne ili zrele B ćelije ili T ćelije. Pod nekim okolnostima (npr. za CDR3), CDRs mogu biti kodirani pomoću dve ili više sekvenci (npr. sekvenci germinativne linije) koje nisu susedne (npr. u nerearanžiranoj sekvenci nukleinske kiseline), ali su susedne u sekvenci nukleinske kiseline B ćelije, npr. kao rezultat splajsovanja ili spajanja sekvenci (npr. V-D-J rekombinacija da bi se formirao teški lanac CDR3).

[0334] Fraza "genski segment," ili "segment" se odnosi na V (laki ili teški) ili D ili J (laki ili teški) imunoglobulinski genski segment, koji sadrži nerearanžirane sekvence na imunoglobulinskim lokusima (npr. kod ljudi i miševa) koje mogu učestvovati u rearanžiranju (posredovanom, npr. endogenim rekombinazama) da bi se formirala rearanžirana V/J ili V/D/J sekvenca. Osim ako nije drugačije naglašeno, V, D, i J segmenti sadrže rekombinacione signalne sekvence (RSS) koje omogućavaju V/J rekombinaciju ili V/D/J rekombinaciju prema pravilu 12/23. Osim ako nije drugačije naglašeno, segmenti dalje sadrže sekvence sa kojima su povezani u prirodi ili njihove funkcionalne ekvivalente (npr. za V segmente promoter, odnosno promotere i lider, odnosno lidere).

[0335] Izraz "nerearanžirani" obuhvata stanje imunoglobulinskog lokusa u kome se V genski segmenti i J genski segmenti (za teške lance, takođe i D genski segmenti) održavaju odvojeno, ali su sposobni za spajanje da bi se formirao rearanžirani V(D)J gen koji sadrži samo jedan V,(D),J od V(D)J repertoara.

[0336] Fraza "mikromolski opseg" treba da označava 1-999 mikromola; fraza "nanomolski opseg" treba da označava 1-999 nanomola; fraza "pikomolski opseg" treba da označava 1-999 pikomola.

[0337] Izraz "nehumane životinje" treba da obuhvati bilo koje nehumane životinje kao što su kolouste, košljoribe, hrskavičave ribe, kao što su ajkule i raže, vodozemce, gmizavce, sisare i ptice. Podesne nehumane životinje obuhvataju sisare. Podesni sisari obuhvataju nehumane primate, koze, ovce, svinje, pse, krave i glodare.

Podesne nehumane životinje su izabrane iz porodice glodara, uključujući pacova i miša. Nehumane životinje dobijene pronalaskom su miševi.

[0338] Miš kao genetski model je znatno poboljšan tehnologijama transgena i inaktivacije, koje su omogućile proučavanje efekata usmerene prekomerne ekspresije ili delecije specifičnih gena. Uprkos svim svojim prednostima, miš još uvek postavlja genetske prepreke koje rezultuju nesavršenim modelom za humane bolesti i nesavršenom platformom za testiranje ili dobijanje humanih terapeutika. Prvo, mada oko 99% humanih gena ima mišji homolog (Waterston, R.H. et al. (2002) Initial sequencing and comparative analysis of mouse genome. Nature 420, 520-562.), potencijalni terapeutici često ne reaguju unakrsno, ili neadekvatno reaguju unakrsno, sa mišjim ortolozima ciljanih humanih ciljeva. Da bi se rešio ovaj problem, izabrani ciljani geni se mogu "humanizovati", to jest mišji gen može biti eliminisan i zamenjen odgovarajućom humanom ortologom genskom sekvencom (npr. US 6,586,251, US 6,596,541 i US 7,105,348). Inicijalno, napori da se humanizuju mišji geni strategijom "inaktivacija-plus-transgeni" zahtevala je ukrštanje miša koji nosi deleciju (tj. inaktivaciju) endogenog gena sa mišem koji nosi slučajno integrisan humani transgen (vidi, npr. Bril, W.S. et al. (2006) Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution. Thromb Haemost 95, 341-347; Homanics, G.E. et al. (2006) Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease. BMC Med Genet 7, 33; Jamsai, D. et al. (2006) A humanizovani BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia. Genomics 88(3):309-15; Pan, Q. et al.

(2006) Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (pritdR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective pritdR function in CD3gamma- i CD3gammadelta-deficient mice. Mol Imunol 43, 1741-1750). Ali ovi napori su bili osujećeni ograničenjima veličine; uobičajene tehnologije inaktivacije nisu bile dovoljne za direktnu zamenu velikih mišjih gena sa njihovim velikim humanim genomskim parnjacima. Neposredan pristup sa direktnom homologom zamenom, prema kome se endogeni mišji gen direktno zamenjuje humanim genom parnjakom na istoj preciznoj genetskoj lokaciji mišjeg gena (tj. na endogenom mišjem lokusu), retko je pokušavan, zbog tehničkih poteškoća. Sve do sada, napori na direktnoj zameni su uključivali složene i teške procedure, što je ograničavalo dužinu genetskog materijala kojim se moglo rukovati i preciznost kojom se njime moglo manipulisati.

[0339] Egzogeno uvedeni humani imunoglobulinski transgeni se rearanžiraju u prekursorskim B-ćelijama u miševima (Alt, F.W., Blackwell, T.K., i Yancopoulos, G.D. (1985). Immunoglobulin genes in transgenic mice. Trends Genet 1, 231-236). Ovo otkriće je bilo iskorišćeno za genetski inženjering miševa korišćenjem „inaktivacijaplus-transgeni“ pristupa za izražavanje humanih antitela (Green, L.L. et al. (1994) Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat Genet 7, 13-21; Lonberg, N. (2005). Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol 23, 1117-1125; Lonberg, N. et al. (1994) Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368, 856-859; Jakobovits, A. et al. (2007) From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice. Nat Biotechnol 25, 1134-1143). Endogeni mišji imunoglobulinski lokusi teškog lanca i κ lakog lanca su bili inaktivirani u ovim miševima ciljanom delecijom malih, ali kritičnih delova svakog endogenog lokusa, praćenom uvođenjem humanih imunoglobulinskih genskih lokusa kao slučajno integrisanih transgena, kao što je opisano gore, ili minihromozoma (Tomizuka, K. et al. (2000) Double transchromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 722-727). Takvi miševi su predstavljali važan napredak u genetskom inženjerstvu; potpuno humana monoklonska antitela izolovana iz njih su pokazala obećavajući terapeutski potencijal za lečenje različitih humanih bolesti (Gibson, T.B. et al. (2006) Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer 6, 29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim, Y.H. et al. (2007) Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma. Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005;

Maker, A.V. et al. (2005) Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T limfocit-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study. Ann Surg Oncol 12, 1005-1016; McClung, M.R., Lewiecki, E.M. et al. (2006) Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density. N Engl J Med 354, 821-831). Ali kao što je razmotreno gore, ove miševe odlikuje kompromitovani razvoj B ćelija i imune deficijencije u poređenju sa miševima prirodnog tipa. Takvi problemi potencijalno ograničavaju sposobnost miševa da podrže snažnu humoralnu reakciju i, sledstveno, da generišu potpuno humana antitela protiv nekih antigena. Deficijencije mogu biti usled: (1) neefikasne funkcionalnosti zbog slučajnog uvođenja humanih imunoglobulinskih transgena i rezultujuće nekorektne ekspresije usled nedostatka uzvodnih i nizvodnih kontrolnih elemenata (Garrett, F.E. et al. (2005) Chromatin architecture near a potential 3’ end of the igh locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites. Mol Cell Biol 25, 1511-1525; Manis, J.P. et al. (2003) Elucidation of a downstream boundary of the 3’ IgH regulatory region. Mol Imunol 39, 753-760;

Pawlitzky, I. et al. (2006) Identification of a candidate regulatory element within the 5’ flanking region of the mouse Igh locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, i E2A. J Imunol 176, 6839-6851); (2) neefikasnih interakcija između vrsta, između humanih konstantnih domena i mišjih komponenata signalizacionog kompleksa receptora B-ćelija na ćelijskoj površini, koje mogu pogoršati procese signalizacije potrebne za normalno sazrevanje, proliferaciju i preživljavanje B ćelija (Hombach, J. et al. (1990) Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class. Nature 343, 760-762); i (3) neefikasnih interakcija između vrsta između rastvorljivih humanih imunoglobulina i mišjih Fc receptora koje bi mogle smanjiti selekciju afiniteta (Rao, S.P. et al. (2002) Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells. J Imunol 169, 1859-1868) i koncentracije imunoglobulina u serumu (Brambell, F.W. et al. (1964). A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism. Nature 203, 1352-1354; Junghans, R.P., i Anderson, C.L. (1996). The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm, F. et al. (2006) Antibody-mediated regulation of the immune response. Scand J Imunol 64, 177-184; Nimmerjahn, F., i Ravitdh, J.V. (2007). Fc receptors as regulators of immunity. Adv Imunol 96, 179-204). Ove deficijencije se mogu korigovati pomoću in situ humanizacije samo varijabilnih regiona mišjih imunoglobulinskih lokusa u okviru njihovih prirodnih lokacija na endogenim lokusima teških i lakih lanaca. Ovo bi moglo efektivno rezultovati miševima koji proizvode "reverzno himerična" (tj. humana V: mišja C) antitela koja bi mogla biti sposobna za normalne interakcije i selekciju sa mišjim okruženjem na bazi zadržavanja mišjih konstantnih regiona. Dalje, takva reverzno himerična antitela se mogu lako reformatirati u potpuno humana antitela za terapeutske svrhe.

[0340] Genetski modifikovane životinje koje sadrže zamenu na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca sa heterologim (npr. od neke druge vrste) imunoglobulinskim sekvencama mogu biti dobijene zajedno sa zamenama na endogenim imunoglobulinskim lokusima lakog lanca ili zajedno sa transgenima za lake lance imunoglobulina (npr. transgenima za himerične lake lance imunoglobulina ili potpuno humane potpuno mišje itd.). Vrste od kojih heterologe imunoglobulinske sekvence teškog lanca potiču mogu jako varirati; kao i imunoglobulinske sekvence lakog lanca upotrebljene u zamenama imunoglobulinske sekvence lakog lanca ili transgenima za lake lance imunoglobulina.

[0341] Imunoglobulinske sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona, npr. V, D, i/ili J segmenti, dobijaju se od humane ili nehumane životinje. Nehumane životinje koje su podesne za obezbeđivanje V, D, i/ili J segmenata obuhvataju, na primer, košljoribe, hrskavičave ribe, kao što su ajkule i raže, vodozemce, gmizavce, sisare, ptice (npr. piliće). Nehumane životinje obuhvataju, na primer, sisare. Sisari obuhvataju, na primer, nehumane primate, koze, ovce, svinje, pse, goveda (npr. kravu, bivola, bizona), jelene, kamile, feretke i glodare i nehumane primate (npr. šimpanze, orangutane, gorile, marmozete, rezus majmune, pavijane). Podesne nehumane životinje su izabrane iz porodice glodara, koja obuhvata pacove, miševe, i hrčkove. U jednom primeru izvođenja, nehumane životinje su miševi. Kao što je jasno iz konteksta, različite nehumane životinje se mogu koristiti kao izvori genskih segmenata varijabilnih domena ili varijabilnih regiona (npr. ajkule, raže, sisari (npr. kamile, glodari kao što su miševi i pacovi).

[0342] U skladu sa kontekstom, nehumane životinje se takođe upotrebljavaju kao izvori sekvenci konstantnog regiona koje treba da budu korišćene zajedno sa varijabilnim sekvencama ili segmentima, na primer, glodarske konstantne sekvence se mogu koristiti u transgenima operativno povezane sa humanim ili nehumanim varijabilnim sekvencama (npr. humane ili nehumane primatske varijabilne sekvence operativno povezane, npr. sa konstantnim sekvencama glodara, npr. miša ili pacova ili hrčka). Shodno tome, u različitim primerima izvođenja, humani V, D, i/ili J segmenti su operativno povezani sa glodarskim (npr. mišjim ili pacovskim ili hrčkovim) genskim sekvencama konstantnog regiona. U nekim primerima izvođenja, humani V, D, i/ili J segmenti (ili jedan ili više rearanžiranih VDJ ili VJ gena) su operativno povezani ili fuzionisani sa mišjom, pacovskom ili hrčkovom genskom sekvencom konstantnog regiona, npr. u transgenu integrisanom na lokusu koji nije endogeni imunoglobulinski lokus.

[0343] Takođe je opisan miš koji sadrži zamenu VH, DH, i JH genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca sa jednim ili više humanih VH, DH, i JH segmenata, pri čemu su jedan ili više humanih VH, DH, i JH segmenata operativno povezani sa endogenim imunoglobulinskim konstantnim genom teškog lanca; pri čemu miš sadrži transgen na različitom lokusu od endogenog imunoglobulinskog lokusa, pri čemu transgen sadrži nerearanžirani ili rearanžirani humani VL i humani JL segment operativno povezan sa mišjim ili pacovskim ili humanim konstantnim regionom.

[0344] Prema specifičnom primeru izvođenja, realizovan je miš koji sadrži inserciju jednog ili više humanih VH, DH i JH genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, insercija je uzvodno od endogenog imunoglobulinskog konstantnog gena teškog lanca; u jednom primeru izvođenja, insercija je nizvodno od endogenog varijabilnog (V) genskog segmenta; u jednom primeru izvođenja, insercija je nizvodno od endogenog diverzitetnog (D) genskog segmenta; u jednom primeru izvođenja, insercija je nizvodno od endogenog spojnog (J) genskog segmenta. U različitim primerima izvođenja, insercija je takva da su jedan ili više humanih VH, DH i JH genskih segmenata postavljeni u operativnoj vezi sa jednim ili više endogenih konstantnih gena teškog lanca.

[0345] Opisan je metod za veliku in situ genetsku zamenu imunoglobulinskih varijabilnih genskih lokusa mišje germinativne linije sa imunoglobulinskim varijabilnim genskim lokusima humane germinativne linije uz zadržavanje sposobnosti miševa da generišu potomstvo. Specifično, opisana je precizna zamena šest megabaza mišjih imunoglobulinskih varijabilnih genskih lokusa teškog lanca i κ lakog lanca sa njihovim humanim parnjacima, pri čemu mišji konstantni regioni ostaju intaktni. Kao rezultat ovoga, stvoreni su miševi koji imaju preciznu zamenu svog celog imunoglobulinskog varijabilnog repertoara germinativne linije sa ekvivalentnim imunoglobulinskim varijabilnim sekvencama humane germinativne linije, dok su zadržani mišji konstantni regioni. Humani varijabilni regioni su povezani sa mišjim konstantnim regionima da bi se formirali himerični humani-mišji imunoglobulinski lokusi koji se rearanžiraju i izražavaju na fiziološki podesnim nivoima. Izražena antitela su "reverzne himere" tj. ona sadrže sekvence humanog varijabilnog regiona i sekvence mišjeg konstantnog regiona. Ovi miševi koji imaju humanizovane imunoglobulinske varijabilne regione koji izražavaju antitela koja imaju humane varijabilne regione i mišje konstantne regione se zovu VELCOIMMUNE® miševi.

[0346] VELOCIMMUNE® humanizovane miševe odlikuje potpuno funkcionalni humoralni imuni sistem koji se u suštini ne razlikuje od onog kod miševa prirodnog tipa. Njih odlikuju normalne ćelijske populacije u svim stadijumima razvoja B ćelija. Njih odlikuje normalna morfologija limfoidnih organa. Sekvence antitela VELOCIMMUNE® miševa odlikuje normalno V(D)J rearanžiranje i normalne učestanosti somatskih hipermutacija. Populacije antitela kod ovih miševa odražavaju raspodele izotipova koje rezultuju od normalne promene klasa (npr. normalna promena cis-izotipa). Imunizacija VELOCIMMUNE® miševa rezultuje robusnim humoralnim imunim reakcijama koje generišu velike, raznovrsne repertoare antitela koji imaju humane imunoglobulinske varijabilne domene koji su podesni kao terapeutski kandidati. Ova platforma obezbeđuje izdašan izvor prirodnih afinitetno sazrelih sekvenci humanih imunoglobulinskih varijabilnih regiona za dobijanje farmaceutski prihvatljivih antitela i drugih antigen-vezujućih proteina.

[0347] To je precizna zamena mišjih imunoglobulinskih varijabilnih sekvenci sa humanim imunoglobulinskim varijabilnim sekvencama koja omogućava dobijanje VELOCIMMUNE® miševa. Još preciznija zamena endogenih mišjih imunoglobulinskih sekvenci na lokusima teškog i lakog lanca sa ekvivalentnim humanim imunoglobulinskim sekvencama, sekvencijalnim rekombinovanjem veoma velikih raspona/dužina humanih imunoglobulinskih sekvenci, može predstavljati izvesne izazove zbog divergentne evolucije imunoglobulinskih lokusa između miša i čoveka. Na primer, intergenske sekvence koje se nalaze u okviru imunoglobulinskih lokusa nisu identične kod miševa i ljudi i, pod izvesnim okolnostima, ne moraju biti funkcionalno ekvivalentne. Razlike između miševa i ljudi u pogledu njihovih imunoglobulinskih lokusa još mogu rezultovati abnormalnostima kod humanizovanih miševa, a naročito kada se humanizuju ili se manipuliše izvesnim delovima endogenih imunoglobulinskih mišjih lokusa teškog lanca. Neke modifikacije na mišjim imunoglobulinskim lokusima teškog lanca su štetne. Štetne modifikacije mogu obuhvatati, na primer, gubitak sposobnosti modifikovanih miševa da se pare i proizvode potomstvo. U različitim primerima izvođenja, genetski inženjering humanih imunoglobulinskih sekvenci u genomu miša obuhvata metode koje održavaju endogene sekvence za koje je štetno da budu odsutne u modifikovanim sojevima miševa. Primeri štetnih efekata mogu obuhvatati nesposobnost razmnožavanja modifikovanih sojeva, gubitak funkcije bitnih gena, nesposobnost izražavanja polipeptida, itd. Takvi štetni efekti mogu biti direktno ili indirektno povezani sa modifikacijom genetskim inženjeringom u genomu miša.

[0348] Bila je izvršena precizna, u velikim razmerama, in situ zamena šest megabaza lokusa mišjih imunoglobulinskih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (VH-DH-JH i Vκ-Jκ) sa odgovarajućih 1.4 megabaza humanih genomskih sekvenci, dok su susedne mišje sekvence ostale intaktne i funkcionalne u okviru hibridnih lokusa, uključujući sve gene mišjeg konstantnog lanca i lokusa transkripcionih kontrolnih regiona (FIG.1A i FIG.1B). Konkretno, humane VH, DH, JH, Vκ i Jκ genske sekvence su bile uvedene putem postepene insercije 13 himeričnih BAC ciljajućih vektora koji su unosili preklapajuće varijabilne lokuse fragmenata humane germinativne linije u mišje ES ćelije korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjeringa (vidi, npr. US pat. br.6,586,251 i Valenzuela, D.M. et al. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659).

[0349] Humanizacija mišjih imunoglobulinskih gena predstavlja najveću genetsku modifikaciju mišjeg genoma do danas. Dok su prethodni napori sa slučajno integrisanim humanim imunoglobulinskim transgenima imali izvesnog uspeha (razmotreno gore), direktna zamena mišjih imunoglobulinskih gena njihovim humanim parnjacima dramatično povećava efikasnost sa kojom se potpuno-humana antitela mogu efikasno generisati kod inače normalnih miševa. Dalje, takve miševe odlikuje dramatično povećana raznovrsnost potpuno-humanih antitela koja se mogu dobiti posle imunizacije sa praktično bilo kojim antigenom, u poređenju sa miševima koji nose onesposobljene endogene lokuse i transgene potpuno humanih antitela.

Više verzija zamenjenih, humanizovanih lokusa odlikuju potpuno normalni nivoi zrelih i nezrelih B ćelija, za razliku od miševa sa slučajno integrisanim humanim transgenima, koje odlikuju značajno smanjene populacije B ćelija u različitim stadijumima diferencijacije. Dok su napori na povećanju broja humanih genskih segmenata u humanim transgenskim miševima smanjili takve defekte, prošireni imunoglobulinski repertoari nisu potpuno korigovali smanjenje populacija B ćelija u poređenju sa miševima prirodnog tipa.

[0350] Uprkos humoralnoj imunoj funkciji skoro prirodnog tipa koja je uočena kod miševa sa zamenjenim imunoglobulinskim lokusima (tj. VELOCIMMUNE® miševa), postoje drugi izazovi koji se pojavljuju kada se koristi direktna zamena imunoglobulina koji se ne pojavljuju kod nekih pristupa koji koriste slučajno integrisane transgene. Razlike u genetskoj kompoziciji imunoglobulinskih lokusa između miševa i ljudi su dovele do otkrića sekvenci koje su korisne za razmnožavanje miševa sa zamenjenim imunoglobulinskim genskim segmentima. Konkretno, optimalno je da mišji ADAM geni locirani u okviru endogenog imunoglobulinskog lokusa budu prisutni kod miševa sa zamenjenim imunoglobulinskim lokusima, zbog njihove uloge u plodnosti.

Genomska lokacija i funkcija mišjeg ADAM6

[0351] Mužjake miševa kojima nedostaje sposobnost da izražavaju bilo koji funkcionalni ADAM6 protein kao iznenađujuće odlikuje nedostatak sposobnosti miševa da se pare i da generišu potomstvo. Miševima nedostaje sposobnost da izražavaju funkcionalni ADAM6 protein zahvaljujući zameni svih ili u suštini svih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog regiona sa genskim segmentima humanog varijabilnog regiona. Gubitak ADAM6 funkcije nastaje jer je ADAM6 lokus lociran u okviru regiona genskog lokusa endogenog mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca, bližeg 3’ kraju lokusa VH genskog segmenta koji je uzvodno od DH genskih segmenata. Da bi se ukrštali miševi koji su homozigotni za zamenu svih ili u suštini svih mišjih endogenih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca sa humanim varijabilnim genskim segmentima teškog lanca, generalno je složen pristup pripreme mužjaka i ženki koji su homozigotni za zamenu i očekivanja da se produktivno pare. Uspešni okoti su mali po učestanosti i veličini. Umesto toga se koriste mužjaci koji su heterozigotni za zamenu za parenje sa ženkama koje su homozigotne za zamenu da bi se generisalo potomstvo koje je heterozigotno za zamenu, a onda se od njih odgaja homozigotni miš. Pronalazači su otkrili da je verovatan razlog za gubitak plodnosti kod mužjaka miševa odsustvo funkcionalnog ADAM6 proteina kod homozigotnih mužjaka miševa.

[0352] Prema različitim aspektima, mužjake miševa koji sadrže oštećeni (tj. nefunkcionalni ili marginalno funkcionalni) ADAM6 gen odlikuje smanjenje ili eliminacija plodnosti. Pošto je kod miševa (i drugih glodara) ADAM6 gen lociran u imunoglobulinskom lokusu teškog lanca, pronalazači su utvrdili da se u cilju razmnožavanja miševa, ili stvaranja i održavanja soja miševa, koji sadrže zamenjeni imunoglobulinski lokus teškog lanca, koriste različiti planovi ukrštanja ili razmnožavanja. Niska plodnost ili neplodnost mužjaka miševa homozigotnih za zamenu endogenog varijabilnog imunoglobulinskog genskog lokusa teškog lanca čini održavanje takve modifikacije u soju miševa teškim. Održavanje soja uključuje izbegavanje problema neplodnosti koji odlikuju mužjake miševa koji su homozigotni za zamenu.

[0353] Opisan je metod za održavanje soja miševa koji je ovde opisan. Soj miševa ne mora da sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu, a u različitim primerima izvođenja soj miševa je homozigotan ili heterozigotan za inaktivaciju (npr. funkcionalnu inaktivaciju) ADAM6.

[0354] Soj miševa može sadržati modifikaciju endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca koja rezultuje smanjenjem ili gubitkom plodnosti kod mužjaka miša. Modifikacija može obuhvatati deleciju regulatornog regiona i/ili kodirajućeg regiona ADAM6 gena. Modifikacija može obuhvatati modifikaciju endogenog ADAM6 gena (regulatornog i/ili kodirajućeg regiona) koja smanjuje ili eliminiše plodnost kod mužjaka miša koji sadrži modifikaciju; modifikacija može smanjiti ili eliminisati plodnost mužjaka miša koji je homozigotan za modifikaciju.

[0355] Soj miševa može biti homozigotan ili heterozigotan za inaktivaciju (npr. funkcionalnu inaktivaciju) ili deleciju ADAM6 gena.

[0356] Soj miševa se može održavati izolacijom ćelije iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju, i korišćenjem donorske ćelije u embrionu domaćinu, i gestacijom embriona domaćina i donorske ćelije u surogat majci, i dobijanjem od surogat majke potomstva koje sadrži genetsku modifikaciju. U jednom primeru izvođenja, donorska ćelija je ES ćelija. Donorska ćelija može biti pluripotentna ćelija, npr. indukovana pluripotentna ćelija.

[0357] Soj miševa se može održavati izolacijom iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju sekvence nukleinske kiseline koja sadrži modifikaciju, i uvođenjem sekvence nukleinske kiseline u nukleus domaćina, i gestacijom ćelije koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline i nukleusa domaćina u podesnoj životinji.

Sekvenca nukleinske kiseline može biti uvedena u oocit embriona domaćina.

[0358] Soj miševa se može održavati izolacijom iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju nukleusa, i uvođenjem nukleusa u ćeliju domaćina, i gestacijom nukleusa i ćelije domaćina u podesnoj životinji da bi se dobilo potomstvo koje je homozigotno ili heterozigotno za modifikaciju.

[0359] Soj miševa se može održavati korišćenjem in vitro fertilizacije (IVF) ženke miša (prirodnog tipa, homozigotne za modifikaciju, ili heterozigotne za modifikaciju) korišćenjem sperme mužjaka miša koji sadrži genetsku modifikaciju. Mužjak miša može biti heterozigotan za genetsku modifikaciju. Mužjak miša može biti homozigotan za genetsku modifikaciju.

[0360] Soj miševa se može održavati ukrštanjem mužjaka miša koji je heterozigotan za genetsku modifikaciju sa ženkom miša da bi se dobilo potomstvo koje sadrži genetsku modifikaciju, identifikacijom muškog i ženskog potomstva koje sadrži genetsku modifikaciju, i korišćenjem mužjaka koji je heterozigotan za genetsku modifikaciju za ukrštanje sa ženkom koja je prirodnog tipa, homozigotna, ili heterozigotna za genetsku modifikaciju da bi se dobilo potomstvo koje sadrži genetsku modifikaciju. Korak ukrštanja mužjaka koji je heterozigotan za genetsku modifikaciju sa ženkom prirodnog tipa, ženkom koja je heterozigotna za genetsku modifikaciju, ili ženkom koja je homozigotna za genetsku modifikaciju se može ponavljati da bi se održala genetska modifikacija u soju miševa.

[0361] Opisan je metod za održavanje soja miševa koji sadrži zamenu endogenog varijabilnog imunoglobulinskog genskog lokusa teškog lanca sa jednim ili više humanih imunoglobulinskih sekvenci teškog lanca, koji sadrži odgajanje soja miševa tako da se generišu heterozigotni mužjaci miševa, pri čemu se odgajaju heterozigotni mužjaci miševa da bi se održala genetska modifikacija u soju. Soj ne mora da se održava bilo kakvim ukrštanjem homozigotnog mužjaka sa ženkom prirodnog tipa, ili ženkom koja je homozigotna ili heterozigotna za genetsku modifikaciju.

[0362] ADAM6 protein je član ADAM familije proteina, gde je ADAM akronim od A Disintegrin And Metalloprotease (prev. dezintegrin i metaloproteaza). ADAM familija proteina je velika i raznovrsna, sa raznovrsnim funkcijama koje obuhvataju ćelijsku adheziju. Neki članovi ADAM familije su uključeni u spermatogenezu i oplođenje. Na primer, ADAM2 kodira podjedinicu proteina fertilijan, koji je uključen u interakcije sperma-jajašce. Izgleda da je ADAM3 ili ciritestin neophodan za vezivanje sperme za zonu pelucida. Odsustvo ADAM2 ili ADAM3 rezultuje neplodnošću. Pretpostavljeno je da ADAM2, ADAM3, i ADAM6 formiraju kompleks na površini ćelije mišje sperme.

[0363] Humani ADAM6 gen, koji se normalno nalazi između humanih VH genskih segmenata VH1-2 i VH6-1, izgleda da je pseudogen (Fig.12). Kod miševa, postoje dva ADAM6 gena-ADAM6a i ADAM6b-koji se nalaze u intergenskom regionu između mišjih VH i DH genskih segmenata, a u mišu su ADAM6a i ADAM6b geni orijentisani u suprotnoj transkripcionoj orijentaciji od one kod okolnih imunoglobulinskih genskih segmenata (FIG.12). Kod miševa, funkcionalni ADAM6 lokus je očigledno neophodan za normalnu fertilizaciju. Funkcionalni ADAM6 lokus ili sekvenca se onda odnosi na ADAM6 lokus ili sekvencu koja može da nadomeštava, ili očuva drastično smanjenu plodnost koja odlikuje mužjake miševa sa nedostajućim ili nefunkcionalnim endogenim ADAM6 lokusima.

[0364] Pozicija intergenske sekvence kod miševa koja kodira ADAM6a i ADAM6b čini intergensku sekvencu podložnom modifikaciji kada se modifikuje endogeni mišji teški lanac. Kada su VH genski segmenti izbrisani ili zamenjeni, ili kada su DH genski segmenti izbrisani ili zamenjeni postoji visoka verovatnoća da će rezultujućeg miša odlikovati ozbiljan deficit plodnosti. Da bi se kompenzovao taj deficit, miš se modifikuje tako da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji će nadomestiti gubitak ADAM6 aktivnosti zbog modifikacije endogenog mišjeg ADAM6 lokusa. U različitim primerima izvođenja, nadomeštavajuća nukleotidna sekvenca je ona koja kodira mišji ADAM6a, mišji ADAM6b, ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji sprečava deficit plodnosti. Takođe su opisani metodi za očuvanje endogenog ADAM6 lokusa, dok se endogene imunoglobulinske sekvence teškog lanca koje okružuju mišji ADAM6 lokus čine nesposobnim za rearanžiranje da bi kodirale funkcionalni endogeni varijabilni region teškog lanca. Ilustrativni alternativni metodi obuhvataju manipulaciju velikim delovima mišjih hromozoma koji pozicioniraju endogene imunoglobulinske lokuse varijabilnog regiona teškog lanca, tako da oni nisu sposobni za rearanžiranje da bi kodirali funkcionalni varijabilni region teškog lanca koji je operativno povezan sa endogenim konstantnim genom teškog lanca. Metodi mogu obuhvatati inverzije i/ili translokacije mišjih hromozomskih fragmenata koji sadrže endogene imunoglobulinske genske segmente teškog lanca.

[0365] [Izbrisano]

[0366] Nukleotidna sekvenca koja obezbeđuje plodnost se može kuplovati sa induktibilnim promoterom tako da se olakša optimalna ekspresija u podesnim ćelijama i/ili tkivima, npr. reproduktivnim tkivima. Ilustrativni induktibilni promoteri obuhvataju promotere aktivirane fizičkim (npr. promoter toplotnog šoka) i/ili hemijskim sredstvima (npr. IPTG ili tetraciklin). Dalje, ekspresija nukleotidne sekvence može biti povezana sa drugim genima tako da se ostvari ekspresija u specifičnim stadijumima razvoja ili u okviru specifičnog tkiva. Takva ekspresija se može ostvariti postavljanjem nukleotidne sekvence u operativnu vezu sa promoterom gena izraženog u specifičnom stadijumu razvoja. Na primer, imunoglobulinske sekvence jedne vrste inženjeringom ubačene u genom vrste domaćina se stavljaju u operativnu vezu sa sekvencom promotera CD19 gena (gena specifičnog za B ćeliju) vrste domaćina. Ostvarena je ekspresija specifična za B ćeliju u preciznim stadijumima razvoja kada se izražavaju imunoglobulini.

[0367] Dalje, ekspresija nukleotidne sekvence može biti povezana sa drugim genima tako da se ostvari ekspresija u specifičnim stadijumima razvoja ili u okviru specifičnog tkiva. Takva ekspresija se može ostvariti stavljanjem nukleotidne sekvence u operativnu vezu sa promoterom gena izraženim u specifičnom stadijumu razvoja. Na primer, imunoglobulinske sekvence jedne vrste inženjeringom ubačene u genom vrste domaćina se stavljaju u operativnu vezu sa sekvencom promotera CD19 gena (gena specifičnog za B ćeliju) od vrste domaćina. Ostvarena je ekspresija specifična za B ćeliju u preciznim stadijumima razvoja kada se izražavaju imunoglobulini.

[0368] Jedan drugi metod za ostvarivanje robusne ekspresije umetnute nukleotidne sekvence je korišćenje konstitutivnog promotera. Ilustrativni konstitutivni promoteri obuhvataju SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK i CAGG. Na sličan način, željena nukleotidna sekvenca se postavlja u operativnu vezu sa izabranim konstitutivnim promoterom, koji obezbeđuje visoki nivo ekspresije jednog, odn. više proteina kodiranih nukleotidnom sekvencom.

[0369] Izraz "ektopična" treba da obuhvati premeštanje, ili postavljanje na poziciji koja se normalno ne pojavljuje u prirodi (npr. postavljanje sekvence nukleinske kiseline na poziciji koja nije ista pozicija kao ona na kojoj se sekvenca nukleinske kiseline nalazi kod miša prirodnog tipa). Izraz se upotrebljava u smislu da se njegov objekat nalazi izvan svoje normalne, ili prave pozicije. Na primer, fraza " ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira ..." se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja se pojavljuje na poziciji na kojoj se normalno ne pojavljuje kod miša. Na primer, u slučaju ektopične nukleotidne sekvence koja kodira mišji ADAM6 protein (ili njegov ortolog ili homolog ili fragment koji obezbeđuje istu ili sličnu korist za plodnost kod mužjaka miševa), sekvenca može biti postavljena na drugačiju poziciju u mišjem genomu od one koja se normalno nalazi kod miša prirodnog tipa. U takvim slučajevima novi sekventni spojevi mišje sekvence će biti stvoreni stavljanjem sekvence na drugačije pozicije u mišjem genomu nego kod miša prirodnog tipa. Funkcionalni homolog ili ortolog mišjeg ADAM6 je sekvenca koja obezbeđuje očuvanje od gubitka plodnosti (npr. gubitka sposobnosti mužjaka miša da generiše potomstvo parenjem) koja je uočena kod ADAM6<-/->miša. Funkcionalni homolozi ili ortolozi sadrže proteine koji imaju najmanje oko 89% identičnosti ili više, npr. do 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom ADAM6a i/ili aminokiselinskom sekvencom ADAM6b, i koja može da nadomesti ili očuva sposobnost uspešnog parenja kod miša koji ima genotip koji sadrži deleciju ili inaktivaciju ADAM6a i/ili ADAM6b.

[0370] Ektopična pozicija može biti bilo gde (npr. kod slučajne insercije transgena koji sadrži mišju ADAM6 sekvencu), ili može biti, npr. na poziciji koja približno odgovara (ali koja nije precizno potpuno ista) njenoj lokaciji kod miša prirodnog tipa (npr. u modifikovanom endogenom mišjem imunoglobulinskom lokusu, već je uzvodno ili nizvodno od njene prirodne pozicije, npr. u okviru modifikovanog imunoglobulinskog lokusa, ali između drugačijih genskih segmenata, ili na drugačijoj poziciji u mišjoj V-D intergenskoj sekvenci). Jedan primer ektopičnog postavljanja je zadržavanje pozicije koja se normalno nalazi kod miševa prirodnog tipa unutar endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, dok okolni endogeni genski segmenti teškog lanca koji mogu da se rearanžiraju da bi kodirali funkcionalni teški lanac koji sadrži endogenog konstantnog regiona. U ovom primeru, ovo može biti ostvareno inverzijom hromozomskog fragmenta koji sadrži endogene imunoglobulinske varijabilne lokuse teškog lanca, npr. korišćenjem mesno-specifičnih rekombinacionih mesta inženjeringom postavljenih na pozicije koje okružuju lokus varijabilnog regiona. Shodno tome, posle rekombinacije endogeni lokusi varijabilnog regiona teškog lanca su postavljeni na velikom rastojanju od endogenih genskih konstantnih regiona teškog lanca, čime je sprečeno rearanžiranje radi kodiranja funkcionalnog teškog lanca koji sadrži endogeni konstantni region teškog lanca. Drugi ilustrativni metodi za ostvarivanje funkcionalnog utišavanja endogenog imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca, uz zadržavanje funkcionalnog ADAM6 lokusa će biti očigledni stručnjacima posle čitanja ovog otkrivanja i/ili u kombinaciji sa metodima koji su poznati iz odgovarajuće oblasti.

Takvim postavljanjem endogenog lokusa teškog lanca se zadržavaju endogeni ADAM6 geni, a endogeni imunoglobulinski lokus teškog lanca je funkcionalno utišan.

[0371] Sledeći primer ektopičnog postavljanja je postavljanje unutar humanizovanog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca. Na primer, miš koji sadrži zamenu jednog ili više endogenih VH genskih segmenata sa humanim VH genskim segmentima, pri čemu zamena odstranjuje endogenu ADAM6 sekvencu, može biti genetski izmenjen tako da ima mišju ADAM6 sekvencu lociranu unutar sekvence koja sadrži humane VH genske segmente. Rezultujuća modifikacija bi generisala (ektopičnu) mišju ADAM6 sekvencu u okviru humane genske sekvence, a (ektopično) stavljanje mišje ADAM6 sekvence unutar humane genske sekvence može približno odgovarati poziciji humanog ADAM6 pseudogena (tj. između dva V segmenta) ili može približno odgovarati poziciji mišje ADAM6 sekvence (tj. u okviru V-D intergenskog regiona). Rezultujući spojevi sekvenci nastali spajanjem (ektopične) mišje ADAM6 sekvence u okviru ili susedno humanoj genskoj sekvenci (npr. imunoglobulinskoj genskoj sekvenci) u okviru germinativne linije miša bi bilo novo u poređenju sa istom ili sličnom pozicijom u genomu miša prirodnog tipa.

[0372] Opisani su miševi kojima nedostaje ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog, pri čemu taj nedostatak čini miševe neplodnim, ili u suštini smanjuje plodnost miševa. Nedostatak ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa može biti usled modifikacije endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca. Suštinsko smanjenje plodnosti je npr. smanjenje plodnosti (npr. učestanost parenja, broj mladunaca po okotu, broj legala po godini, itd.) od oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 95% ili veće. U suštini delimično očuvanje plodnosti je, npr. ponovno uspostavljanje plodnosti takvo da miša odlikuje plodnost koja je najmanje 70%, 80%, ili 90% ili veća u poređenju sa nemodifikovanim lokusom teškog lanca (tj. životinja bez modifikacije ADAM6 gena ili njegovog ortologa ili homologa).

[0373] Kod miša gubitak ADAM6 funkcije može biti očuvan dodavanjem mišjeg ADAM6 gena. U jednom primeru izvođenja, gubitak ADAM6 funkcije kod miša je očuvan dodavanjem ortologa ili homologa blisko srodne vrste u odnosu na miša, npr. glodara, npr. miša drugačijeg soja ili vrste, pacova bilo koje vrste, glodara; pri čemu dodavanje ortologa ili homologa mišu sprečava gubitak plodnosti usled gubitka ADAM6 funkcije ili gubitka ADAM6 gena. Ortolozi i homolozi od drugih vrsta, u različitim primerima izvođenja, izabrani su između filogenetski srodnih vrsta i, u različitim primerima izvođenja, odlikuje ih procentualna identičnost sa endogenim ADAM6 (ili ortologom) koja je oko 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, ili 97% ili veća; i koja sprečava sa ADAM6-povezani ili (kod nemiša) sa ADAM6 ortologom povezani gubitak plodnosti. Na primer, kod genetski modifikovanog mužjaka pacova kome nedostaje ADAM6 funkcija (npr. pacova sa endogenim imunoglobulinskim varijabilnim regionom teškog lanca zamenjenim sa humanim imunoglobulinskim varijabilnim regionom teškog lanca, ili inaktiviranim u pacovskom imunoglobulinskom regionu teškog lanca), gubitak plodnosti kod pacova je sprečen dodavanjem pacovskog ADAM6 ili, u nekim primerima izvođenja, ortologa pacovskog ADAM6 (npr. ADAM6 ortologa od drugog soja ili vrste pacova, ili, u jednom primeru izvođenja, od miša).

[0374] Opisani su genetski modifikovani miševi koje odlikuje neplodnost ili smanjenje plodnosti zbog modifikacije sekvence nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein (ili njegov ortolog ili homolog) ili regulatornog regiona operativno povezanog sa sekvencom nukleinske kiseline, koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja nadomešćuje gubitak plodnosti, ili je ponovo uspostavlja, gde je sekvenca nukleinske kiseline koja nadomešćuje gubitak plodnosti ili je ponovo uspostavlja od drugačijeg soja iste vrste ili od filogenetski srodne vrste. Nadomeštavajuća sekvenca nukleinske kiseline može biti ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment.

Nadomeštavajući ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment može biti od nehumane životinje koja je blisko srodna genetski modifikovanom mišu koji ima defekat plodnosti. Na primer, kada je genetski modifikovana životinja miš specifičnog soja, onda se ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment mogu dobiti od miša različitog soja, ili miša srodne vrste. U jednom primeru izvođenja, kada je genetski modifikovana životinja koja ima nedostatak plodnosti miš i zato pripada redu Rodentia, onda je ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment od druge životinje iz reda Rodentia.

[0375] [Izbrisano]

[0376] U jednom primeru izvođenja, genetski modifikovani miš je član porodice Muridae, a ADAM6 ortolog ili homolog je od drugačije vrste iz porodice Muridae. Prema specifičnom primeru izvođenja, ADAM6 ortolog ili homolog je od pacova, gerbila, ježolikog miša, ili grivastog pacova iz porodice Muridae.

[0377] Opisani su jedan ili više glodarskih ADAM6 ortologa ili homologa ili njegovih funkcionalnih fragmenata glodara iz porodice koji ponovo uspostavljaju plodnost kod genetski modifikovanog glodara iz iste porodice kome nedostaje ADAM6 ortolog ili homolog (npr. Cricetidae (npr. hrčkovi, američki pacovi i miševi, voluharice); Muridae (npr. pravi miševi i pacovi, gerbili, ježoliki miševi, grivasti pacovi)).

[0378] ADAM6 ortolozi, homolozi, i njihovi fragmenti se mogu proceniti u pogledu funkcionalnosti određivanjem da li ortolog, homolog, ili fragment ponovo uspostavlja plodnost kod genetski modifikovanog mužjaka miša kome nedostaje ADAM6 aktivnost (koji sadrži inaktivaciju ADAM6 ili njegovog ortologa). U različitim primerima izvođenja, funkcionalnost je definisana kao sposobnost sperme genetski modifikovanog miša kome nedostaje endogeni ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog da prođe kroz jajovod i oplodi jajašce iste vrste genetski modifikovane životinje.

[0379] Prema različitim aspektima, miševi koji sadrže delecije ili zamene endogenih lokusa varijabilnog regiona teškog lanca ili njihovih delova mogu se napraviti tako da sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji doprinosi sličnim koristima za plodnost kao mišji ADAM6 (npr. njegov ortolog ili homolog ili fragment koji je funkcionalan kod mužjaka miša). Ektopična nukleotidna sekvenca može obuhvatati nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji je ADAM6 homolog ili ortolog (ili njegov fragment) različitog soja miševa ili drugačije vrste, npr. drugačije vrste glodara, i koji je doprinosi koristi za plodnost, npr. povećanju broja okota u toku specifikovanog vremenskog perioda, i/ili povećanju broja mladunaca po okotu, i/ili sposobnosti ćelije sperme mužjaka miša da prođe kroz mišji jajovod da bi oplodila mišje jajašce.

[0380] U jednom primeru izvođenja, ADAM6 je homolog ili ortolog koji je najmanje 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6 proteinom (npr. najmanje 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6a ili mišjim ADAM6b). U jednom primeru izvođenja, ektopična nukleotidna sekvenca kodira jedan ili više proteina nezavisno izabranih između proteina koji je najmanje 89% identičan sa mišjim ADAM6a, proteina koji je najmanje 89% identičan sa mišjim ADAM6b, i njihove kombinacije. U jednom primeru izvođenja, homolog ili ortolog je pacovski, hrčkov, mišji, ili zamorčetov protein ili je modifikovan tako da bude oko 89% ili više identičan sa mišjim ADAM6a i/ili mišjim ADAM6b. U jednom primeru izvođenja, homolog ili ortolog je identičan sa mišjim ADAM6a i/ili mišjim ADAM6b ili je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa njim.

[0381] Prema jednom aspektu, realizovani su miševi, pri čemu ti miševi sadrže (a) inserciju jednog ili više humanih Vλ i Jλ genskih segmenata uzvodno od mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona κ lakog lanca, (b) inserciju jednog ili više humanih VH, jednog ili više humanih DH i jednog ili više humanih JH genskih segmenata uzvodno od nehumanog imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, i (c) nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. U jednom primeru izvođenja, nehumani konstantni regioni teškog i/ili lakog lanca su glodarski konstantni regioni (npr. izabrani između mišjih, pacovskih ili hrčkovih konstantnih regiona).

[0382] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži najmanje 12 do najmanje 40 humanih Vλ genskih segmenata i najmanje jedan humani Jλ genski segment. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži 12 humanih Vλ genskih segmenata i najmanje jedan humani Jλ genski segment. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži 28 humanih Vλ genskih segmenata i najmanje jedan humani Jλ genski segment. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži 40 humanih Vλ genskih segmenata i najmanje jedan humani Jλ genski segment. U različitim primerima izvođenja, najmanje jedan humani Jλ genski segment je izabran između Jλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži najmanje četiri humana Jλ genska segmenta. U jednom primeru izvođenja, najmanje četiri humana Jλ genska segmenta obuhvataju bar Jλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7.

[0383] U jednom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment je ektopična kod miša. U jednom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment (koji je funkcionalan kod miša) je prisutna na istoj lokaciji u poređenju sa nehumanim ADAM6 lokusom prirodnog tipa. U jednom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment i prisutna je na ektopičnoj lokaciji u genomu miša. Nukleotidna sekvenca kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment i prisutna je u okviru imunoglobulinskih genskih segmenata koji su humani genski segmenti teškog lanca.

[0384] U jednom primeru izvođenja, mišu nedostaje endogeni imunoglobulinski VL i/ili JL genski segment na endogenom imunoglobulinskom lokusu lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži endogene imunoglobulinske VL i/ili JL genske segmente koji nisu sposobni za rearanžiranja da bi formirali imunoglobulinski VL domen u nehumanoj životinji. U jednom primeru izvođenja, svi ili u suštini svi endogeni imunoglobulinski Vκ i Jκ genski segmenti su zamenjeni sa jednim ili više humanih Vλ i Jλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, svi ili u suštini svi endogeni imunoglobulinski Vλ i Jλ genski segmenti su zamenjeni sa jednim ili više humanih Vλ i Jλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, svi ili u suštini svi endogeni imunoglobulinski VL i JL genski segmenti su intaktni u nehumanoj životinji i nehumana životinja sadrži jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata umetnutih između endogenih imunoglobulinskih VL i/ili JL genskih segmenata i endogenog imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, intaktni endogeni imunoglobulinski VL i JL genski segmenti su onesposobljeni za rearanžiranje da bi formirali VL domen antitela u mišu. U različitim primerima izvođenja, endogeni imunoglobulinski lokus lakog lanca miša je imunoglobulinski lokus κ lakog lanca. U različitim primerima izvođenja, endogeni imunoglobulinski lokus lakog lanca miša je imunoglobulinski lokus λ lakog lanca. U različitim primerima izvođenja, endogeni imunoglobulinski VL i JL genski segmenti su Vκ i Jκ genski segmenti. U različitim primerima izvođenja, endogeni imunoglobulinski VL i JL genski segmenti su Vλ i Jλ genski segmenti.

[0385] U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži humani Vκ-Jκ intergenski region iz humanog lokusa κ lakog lanca, pri čemu je humani Vκ-Jκ intergenski region susedan sa jednim ili više humanih Vλ i Jλ genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, humani Vκ-Jκ intergenski region je smešten između humanog Vλ genskog segmenta i humanog Jλ genskog segmenta.

[0386] Opisani su ćelije i/ili tkiva koji potiču od miševa koji su ovde opisani, pri čemu ćelije i/ili tkiva sadrže (a) inserciju jednog ili više humanih Vλ i Jλ genskih segmenata uzvodno od nehumanog imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca, (b) inserciju jednog ili više humanih VH, jednog ili više humanih DH i jednog ili više humanih JH genskih segmenata uzvodno od nehumanog imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, i (c) nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. Nehumani konstantni regioni teškog i/ili lakog lanca mogu biti mišji konstantni regioni. Nehumani konstantni regioni teškog i/ili lakog lanca mogu biti pacovski konstantni regioni. Nehumani konstantni regioni teškog i/ili lakog lanca mogu biti hrčkovi konstantni regioni.

[0387] U jednom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment je ektopična u ćeliji i/ili tkivu. U jednom primeru izvođenja mišja ćelija i/ili tkivo potiču od miša i nukleotidna sekvenca kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment i prisutna je na ektopičnoj lokaciji. U mišjoj ćeliji i/ili tkivu potiču od miša i nukleotidna sekvenca kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment i prisutna je u okviru imunoglobulinskih genskih segmenata. Imunoglobulinski genski segmenti su genski segmenti teškog lanca.

[0388] Opisana je primena ovde opisanog miša za dobijanje antigen-vezujućeg proteina, pri čemu miš izražava (a) antitelo koje sadrži (i) imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani Vλ domen i konstantni region mišjeg κ lakog lanca i (ii) imunoglobulinski teški lanac koji sadrži humani VH domen i nehumani konstantni region; i (b) ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. Antigen-vezujući protein može biti humani. Nehumani konstantni regioni su glodarski konstantni regioni.

[0389] Prema jednom aspektu, realizovani su mišja ćelija ili tkivo koji potiču od miša koji je ovde opisan. U jednom primeru izvođenja, mišja ćelija ili tkivo sadrže jedan ili više humanih imunoglobulinskih Vλ genskih segmenata i najmanje jedan humani imunoglobulinski Jλ genski segment koji su susedni sa genom mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona κ lakog lanca i jedan ili više humanih VH, jedan ili više humanih DH i jedan ili više humanih JH genskih segmenata koji su susedni sa genom nehumanog imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, pri čemu ćelija ili tkivo izražava ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. U jednom primeru izvođenja, gen nehumanog konstantnog regiona lakog lanca je mišji Cκ ili mišji Cλ.

[0390] U jednom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment je ektopična. U različitim primerima izvođenja, mišja ćelija je mišja B ćelija. U različitim primerima izvođenja, nehumana ćelija je embrionska matična ćelija.

[0391] U jednom primeru izvođenja, tkivo potiče iz slezine, koštane srži ili limfnog čvora miša.

[0392] Prema jednom aspektu, realizovana je primena ćelije ili tkiva koji potiču od miša koji je ovde opisan za dobijanje hibridoma ili kvadroma.

[0393] Prema jednom aspektu, realizovana je mišja ćelija koja sadrži modifikovani genom kao što je ovde opisano, pri čemu je mišja ćelija oocit, embrion domaćin, ili fuzija ćelije miša koji je ovde opisan i ćelije drugačijeg miša.

[0394] Prema jednom aspektu, realizovani su ćelija ili tkivo koji potiču od miša koji je ovde opisan za dobijanje potpuno humanog antitela. U jednom primeru izvođenja, potpuno humano antitelo sadrži humani VH domen i humani Vλ domen izolovane iz nehumane životinje kao što je ovde opisano.

[0395] Prema jednom aspektu, realizovan je metod za dobijanje antitela koje se vezuje za antigen od interesa, pri čemu metod sadrži (a) izlaganje miša koji je ovde opisan antigenu od interesa, (b) izolaciju jednog ili više B limfocita miša, pri čemu jedan ili više B limfocita izražavaju antitelo koje se vezuje za antigen od interesa, i (c) identifikaciju sekvence nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski laki lanac antitela koje vezuje antigen od interesa, pri čemu imunoglobulinski laki lanac sadrži humani Vλ domen i nehumani konstantni domen lakog lanca, i (d) korišćenje sekvence nukleinske kiseline iz (c) sa sekvencom nukleinske kiseline humanog imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca za dobijanje humanog antitela koje vezuje antigen od interesa.

[0396] U jednom primeru izvođenja, nehumani konstantni domen lakog lanca je mišji Cκ. U jednom primeru izvođenja, nehumani konstantni domen lakog lanca je mišji Cλ.

[0397] Prema jednom aspektu, realizovan je plodni mužjak miša koji sadrži modifikaciju na imunoglobulinskom lokusu teškog lanca, pri čemu plodni mužjak miša sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja je funkcionalna u mužjaku miša.

Ektopični ADAM6 u miševima sa humanizovanim teškim lancem

[0398] Razvoj u ciljanju gena, npr. razvoj bakterijskih veštačkih hromozoma (BACs), sada omogućava rekombinaciju relativno velikih genomskih fragmenata. BAC inženjering je omogućio sposobnost pravljenja velikih delecija, i velikih insercija, u mišjim ES ćelijama.

[0399] Miševi koji proizvode humana antitela sada se već neko vreme nalaze na raspolaganju. Mada oni predstavljaju važan napredak u razvoju humanih terapeutskih antitela, ovi miševi ispoljavaju više značajnih abnormalnosti koje ograničavaju njihovu upotrebljivost. Na primer, njih odlikuje kompromitovani razvoj B ćelija. Kompromitovani razvoj može biti uzrokovan mnoštvom razlika između transgenskih miševa i miševa prirodnog tipa.

[0400] Humana antitela možda ne mogu optimalno sadejstvovati sa receptorima mišjih pre B ćelija ili B ćelija na površini mišjih ćelija koji signaliziraju sazrevanje, proliferaciju, ili preživljavanje u toku klonske selekcije. Potpuno humana antitela možda ne mogu optimalno sadejstvovati sa mišjim Fc receptorskim sistemom; miševi izražavaju Fc receptore koje ne odlikuje odgovaranje jedan-prema-jedan sa humanim Fc receptorima. Konačno, različiti miševi koji prave potpuno humana antitela ne sadrže sve originalne mišje sekvence, npr. nizvodne pojačavačke elemente i druge kontrolne elemente lokusa, koji mogu biti potrebni za razvoj B ćelija prirodnog tipa.

[0401] Miševi koji proizvode potpuno humana antitela generalno sadrže endogene imunoglobulinske lokuse, koji su na neki način onesposobljeni, i humane transgene koji sadrže varijabilne i konstantne imunoglobulinske genske segmente se uvode na slučajnu lokaciju u mišjem genomu. Sve dok je endogeni lokus dovoljno onesposobljen tako da ne rearanžira genske segmente tako da formiraju funkcionalni imunoglobulinski gen, cilj proizvodnje potpuno humanih antitela u takvom mišu se može ostvariti-čak i uz kompromitovan razvoj B ćelija.

[0402] Mada je prinuđen da pravi potpuno humana antitela iz humanog transgenskog lokusa, generisanje humanih antitela u mišu je očigledno nepovoljan proces. Kod nekih miševa, proces je toliko nepovoljan da rezultuje formiranjem himeričnih humanih varijabilnih/mišjih konstantnih teških lanaca (ali ne lakih lanaca) pomoću mehanizma trans-promene. Pomoću ovog mehanizma, transkripti koji kodiraju potpuno humana antitela se podvrgavaju promeni izotipa u trans od humanog izotipa u mišji izotip. Proces je u trans, jer je potpuno humani transgen lociran odvojeno od endogenog lokusa koji sadržava neoštećenu kopiju mišjeg gena konstantnog regiona teškog lanca. Mada je kod takvih miševa trans-promena lako uočljiv fenomen, on je ipak nedovoljan za očuvanje razvoja B ćelija, koje ostaje jako poremećeno. U svakom slučaju, trans-promenjena antitela koja su napravljena u takvim miševima zadržavaju potpuno humane lake lance, pošto se fenomen trans-promene očigledno ne pojavljuje u vezi lakih lanaca; pretpostavlja se da se trans-promena oslanja na promenu sekvenci u upotrebljenim endogenim lokusima (mada različito) u normalnom izotipskoj promeni u cis. Shodno tome, čak i kada su miševi podvrgnuti genetskom inženjeringu da bi pravili potpuno humana antitela izborom mehanizma trans-promene za pravljenje antitela sa mišjim konstantnim regionima, ta strategija je još uvek bila nedovoljna za očuvanje normalnog razvoja B ćelija.

[0403] Primarni interes pri pravljenju humanih terapeutika baziranih na antitelu je pravljenje dovoljno velike raznovrsnosti sekvenci humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona da bi se identifikovali korisni varijabilni domeni koji specifično prepoznaju specifične epitope i vezuju se za njih sa željenim afinitetom, obično-ali ne uvek-sa visokim afinitetom. Pre razvoja VELOCIMMUNE® miševa (ovde opisanih), nije bilo indikacije da bi miševi koji izražavaju humane varijabilne regione sa mišjim konstantnim regionima mogli da ispolje bilo kakve značajne razlike u odnosu na miševe koji prave humana antitela iz transgena. Međutim, ta pretpostavka nije bila tačna.

[0404] VELOCIMMUNE® miševi, koji sadrže preciznu zamenu mišjih imunoglobulinskih varijabilnih regiona sa humanim imunoglobulinskim varijabilnim regionima na endogenim mišjim lokusima, ispoljavaju iznenađujuću i značajnu sličnost sa miševima prirodnog tipa u pogledu razvoja B ćelija. Kao iznenađujući i izuzetan razvoj, VELOCIMMUNE® miševi su ispoljili u suštini normalnu reakciju prirodnog tipa na imunizaciju, koja se razlikovala samo po jednoj značajnoj karakteristici od miševa prirodnog tipa-varijabilni regioni generisani u reakciji na imunizaciju su potpuno humani.

[0405] VELOCIMMUNE® miševi sadrže preciznu, u velikim razmerama, zamenu varijabilnih regiona germinativne linije mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca (IgH) i imunoglobulinskog lakog lanca (npr. κ lakog lanca, Igκ) sa odgovarajućim humanim imunoglobulinskim varijabilnim regionima, na endogenim lokusima. Ukupno, oko šest megabaza mišjih lokusa je zamenjeno sa oko 1.5 megabaza humane genomske sekvence. Ova precizna zamena rezultuje mišem sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima koji prave teške i lake lance koji imaju humane varijabilne regione i mišji konstantni region. Precizna zamena mišjih VH-DH-JH i VK-JK segmenata ostavlja okolne mišje sekvence intaktnim i funkcionalnim na hibridnim imunoglobulinskim lokusima. Funkcije humoralnog imunog sistema miša su slične onima kod miša prirodnog tipa. Razvoj B ćelija nije poremećen ni u jednom značajnom pogledu, a u mišu se generiše velika raznovrsnost humanih varijabilnih regiona posle testa sa antigenom.

[0406] VELOCIMMUNE® miševi su mogući, jer se imunoglobulinski genski segmenti za teške i κ lake lance rearanžiraju slično kod ljudi i miševa, što ne znači da kažemo da su njihovi lokusi isti ili čak skoro takvi-jasno je da nisu. Međutim, lokusi su dovoljno slični da humanizacija varijabilnog genskog lokusa teškog lanca može da se ostvari zamenom oko tri miliona parova baza susedne mišje sekvence koja sadrži sve VH, DH, i JH genske segmente sa oko jednim milionom baza susedne humane genomske sekvence koja pokriva u osnovi ekvivalentnu sekvencu humanog imunoglobulinskog lokusa.

[0407] U nekim primerima izvođenja, dalja zamena izvesnih genskih sekvenci mišjeg konstantnog regiona sa humanim genskim sekvencama (npr. zamena mišje CH1 sekvence sa humanom CH1 sekvencom, i zamena mišje CL sekvence sa humanom CL sekvencom) rezultuje miševima sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima koji prave antitela koja imaju humane varijabilne regione i delimično humane konstantne regione, podesna, npr. za pravljenje fragmenata potpuno humanog antitela, npr. potpuno humanih Fab’s. Miševe sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima odlikuje normalno rearanžiranje varijabilnog genskog segmenta, normalna somatska hipermutacija, i normalna promena klase. Ove miševe odlikuje humoralni imuni sistem koji se ne može razlikovati od onog kod miševa prirodnog tipa, i odlikuju ih normalne populacije ćelija u svim stadijumima razvoja B ćelija i normalne strukture limfoidnog organa-čak i kada miševima nedostaje kompletan repertoar genskih segmenata humanog varijabilnog regiona. Imunizacija ovih miševa rezultuje robusnim humoralnim reakcijama koje ispoljavaju veliku raznovrsnost primene varijabilnih genskih segmenata.

[0408] Precizna zamena genskih segmenata varijabilnog regiona mišje germinativne linije omogućava dobijanje miševa koji imaju delimično humane imunoglobulinske lokuse. Pošto se delimično humani imunoglobulinski lokusi rearanžiraju, hipermutiraju, i menjaju klasu normalno, delimično humani imunoglobulinski lokusi u mišu generišu antitela koja sadrže humane varijabilne regione. Nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione se mogu identifikovati i klonirati, a zatim fuzionisati (npr. u in vitro sistemu) sa bilo kojim izabranim sekvencama, npr. bilo koji izotip imunoglobulina koji je podesan za specifičnu primenu, što rezultuje antitelom ili antigen-vezujućim proteinom koji potiču u potpunosti od humanih sekvenci.

[0409] Humanizacija u velikim razmerama metodama rekombinacionog inženjeringa je bila upotrebljena za modifikaciju mišjih embrionskih matičnih (ES) ćelija za preciznu zamenu do tri megabaze mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca koji sadrži u suštini sve mišje VH, DH, i JH genske segmente sa ekvivalentnim humanim genskim segmentima sa do jedne megabaze humane genomske sekvence koja sadrži neke ili u suštini sve humane VH, DH, i JH genske segmente. Segment od do jedne polovine megabaze humanog genoma koji sadrži jedno od dva ponavljanja koji kodira u suštini sve humane Vκ i Jκ genske segmente bio je upotrebljen za zamenu segmenta od tri megabaze mišjeg imunoglobulinskog lokusa κ lakog lanca koji sadrži u suštini sve mišje VK i JK genske segmente.

[0410] Miševi sa tako zamenjenim imunoglobulinskim lokusima mogu sadržati prekid ili deleciju endogenog mišjeg ADAM6 lokusa, koji se normalno nalazi između 3’-najbližeg VH genskog segmenta i 5’-najbližeg DH genskog segmenta na mišjem imunoglobulinskom lokusu teškog lanca. Prekid u ovom regionu može dovesti do smanjenja ili eliminacije funkcionalnosti endogenog mišjeg ADAM6 lokusa. Ako se u zameni upotrebljavaju 3’-najbliži humani VH genski segmenti repertoara teškog lanca, onda je izgleda intergenski region koji sadrži pseudogen humani ADAM6 pseudogen koji je prisutan između ovih VH genskih segmenata, tj. između humanih VH1-2 i VH1-6. Međutim, mužjake miševa koji sadrže ovu humanu intergensku sekvencu odlikuje smanjenje plodnosti.

[0411] Opisani su miševi koji sadrže zamenjene lokuse kao što je gore opisano, a takođe sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6, gde miševe odlikuje u suštini normalna plodnost. Ektopična sekvenca nukleinske kiseline može sadržati mišju ADAM6a i/ili mišju ADAM6b sekvencu ili njihove funkcionalne fragmente koji su smešteni između humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog VH6-1 genskog segmenta na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca.

Ektopična sekvenca nukleinske kiseline može biti SEQ ID NO:3, smeštena između humanog VH1-2 i VH1-6 na modifikovanom lokusu endogenog teškog lanca. Smer transkripcije ADAM6 gena sa SEQ ID NO:3 je suprotan u odnosu na smer transkripcije okolnih humanih VH genskih segmenata. Mada primeri ovde pokazuju očuvanje plodnosti stavljanjem ektopične sekvence između naznačenih humanih VH genskih segmenata, stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da se može očekivati da će stavljanje ektopične sekvence na bilo kom transkripciono-mogućem lokusu u mišjem genomu (ili čak ekstrahromozomski) na sličan način očuvati plodnost kod mužjaka miša.

[0412] Fenomen nadomeštavanja miša kome nedostaje funkcionalni ADAM6 lokus sa ektopičnom sekvencom koja sadrži mišji ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment je opšti metod koji se može primeniti za očuvanje miševa sa nefunkcionalnim ili minimalno funkcionalnim endogenim ADAM6 lokusima. Shodno tome, veliko mnoštvo miševa koji sadrže modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca koja prekida ADAM6 može biti očuvano kompozicijama i metodama prema pronalasku. Shodno tome, pronalazak sadrži miševe sa širokim spektrom modifikacija imunoglobulinskih lokusa teškog lanca koje kompromituju endogenu ADAM6 funkciju. Neki (neograničavajući) primeri su dati u ovom opisu. Pored opisanih VELOCIMMUNE® miševa, kompozicije i metode koje su povezane sa ADAM6 se mogu koristiti u veoma brojnim primenama, npr. kada se modifikuje lokus teškog lanca na veliko mnoštvo različitih načina.

[0413] Opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment), zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VH genskih segmenata, zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH genskih segmenata i JH genskih segmenata sa humanim DH i humanim JH genskim segmentima; pri čemu mišu nedostaje CH1 i/ili zglobni region. U jednom primeru izvođenja, miš pravi protein koji se vezuje za samo jedan varijabilni domen koji je dimer imunoglobulinskih lanaca izabran između: (a) humani VH - mišji CH1 - mišji CH2 - mišji CH3; (b) humani VH -mišji zglobni - mišji CH2 - mišji CH3; i, (c) humani VH - mišji CH2 - mišji CH3.

[0414] Prema jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja očuvava plodnost je smeštena u okviru sekvence humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca (npr. između humanih VH1-2 i VH1-6 genskih segmenata) u mišu koji ima zamenu jednog ili više varijabilnih mišjih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca (mVH’s, mDH’s, i/ili mJH’s) sa jednim ili više varijabilnih humanih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca (hVH’s, hDH’s, i/ili hJH’s), i miš dalje sadrži zamenu jednog ili više varijabilnih mišjih imunoglobulinskih genskih segmenata κ lakog lanca (mVκ’s i/ili mJκ’s) sa jednim ili više varijabilnih humanih imunoglobulinskih genskih segmenata κ lakog lanca (hVκ’s i/ili hJκ’s). U jednom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca je smeštena između humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog VH1-6 genskog segmenta u VELOCIMMUNE® mišu (US 6,596,541 i US 7,105,348). U jednom primeru izvođenja, tako modifikovani VELOCIMMUNE® miš sadrži zamenu sa svim ili u suštini svim humanim imunoglobulinskim varijabilnim genskim segmentima teškog lanca (svi hVH’s, hDH’s, i hJH’s) i svim ili u suštini svim humanim imunoglobulinskim varijabilnim genskim segmentima κ lakog lanca (hVκ’s i hJK’s).

[0415] U jednom primeru izvođenja, jedan ili više mišjih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca sadrži oko tri megabaze mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više mišjih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca sadrži najmanje 89 VH genskih segmenata, najmanje 13 DH genskih segmenata, najmanje četiri JH genska segmenta ili njihovu kombinaciju mišjih imunoglobulinskih lokusa teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više humanih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca sadrži oko jedne megabaze humanog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više humanih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca sadrži najmanje 80 VH genskih segmenata, najmanje 27 DH genskih segmenata, najmanje šest JH genskih segmenata ili njihovu kombinaciju humanih imunoglobulinskih lokusa teškog lanca.

[0416] U jednom primeru izvođenja, jedan ili više varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca sadrži oko tri megabaze mišjeg imunoglobulinskog lokusa mišjeg imunoglobulinskog κ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više mišjih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca sadrži najmanje 137 Vκ genskih segmenata, najmanje pet Jκ genskih segmenata ili njihovu kombinaciju mišjih imunoglobulinskih lokusa κ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više humanih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca sadrži oko jedne polovine megabaze humanog imunoglobulinskog lokusa κ lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više humanih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca sadrže bliže ponavljanje (u odnosu na imunoglobulinski κ konstantni region) humanog imunoglobulinskog lokusa κ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više humanih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca sadrži najmanje 40Vκ genskih segmenata, najmanje pet Jκ genskih segmenata ili njihovu kombinaciju humanog imunoglobulinskog lokusa κ lakog lanca.

[0417] Nukleotidna sekvenca je smeštena između dva humana imunoglobulinska genska segmenta koji su humani genski segmenti teškog lanca.

[0418] Opisan je onaj funkcionalni mišji ADAM6 lokus (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment) koji je prisutan u sredini mišjih genskih segmenata koji su prisutni na mišjem endogenom lokusu varijabilnog regiona teškog lanca, pri čemu pomenuti lokus nije sposoban za rearanžiranje da bi kodirao funkcionalni teški lanac koji sadrži endogeni konstantni region teškog lanca. Endogeni mišji lokus teškog lanca može sadržati najmanje jedan i do 89 VH genskih segmenata, najmanje jedan i do 13 DH genskih segmenata, najmanje jedan i do četiri JH genska segmenta i njihovu kombinaciju. Funkcionalni mišji ADAM6 lokus (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment) može kodirati jedan ili više ADAM6 proteina koji su funkcionalni kod miša, pri čemu jedan ili više ADAM6 proteina sadrže SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 i/ili njihovu kombinaciju.

[0419] Prema jednom aspektu, funkcionalni mišji ADAM6 lokus (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment) je prisutan u sredini humanih VH genskih segmenata koji zamenjuju endogene mišje VH genske segmente. U jednom primeru izvođenja, uklonjeno je najmanje 89 mišjih VH genskih segmenata i zamenjeno je sa jednim ili više humanih VH genskih segmenata, a mišji ADAM6 lokus je prisutan neposredno pored 3’ kraja humanih VH genskih segmenata, ili između dva humana VH genska segmenta. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji ADAM6 lokus je prisutan između dva VH genska segmenta u okviru oko 20 kilo baza (kb) do oko 40 kilo baza (kb) 3’ terminusa umetnutih humanih VH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji ADAM6 lokus je prisutan između dva VH genska segmenta u okviru oko 29 kb do oko 31 kb od 3’ terminusa umetnutih humanih VH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji ADAM6 lokus je prisutan u okviru oko 30 kb od 3’ terminusa umetnutih humanih VH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji ADAM6 lokus je prisutan u okviru oko 30,184 bp od 3’ terminusa umetnutih humanih VH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, zamena obuhvata humane VH genske segmente VH1-2 i VH6-1, a mišji ADAM6 lokus je prisutan nizvodno od VH1-2 genskog segmenta i uzvodno od VH6-1 genskog segmenta. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji ADAM6 lokus je prisutan između humanog VH1-2 genskog segmenta i humanog VH6-1 genskog segmenta, pri čemu je 5’ kraj mišjeg ADAM6 lokusa oko 13,848 bp od 3’ terminusa humanog VH1-2 genskog segmenta i 3’ kraj ADAM6 lokusa je oko 29,737 bp 5’ od humanog VH6-1 genskog segmenta. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji ADAM6 lokus sadrži SEQ ID NO:3 ili njegov fragment koji obezbeđuje ADAM6 funkciju u okviru ćelije miša. Prema specifičnom primeru izvođenja, raspored humanih VH genskih segmenata je onda sledeći (od uzvodnog prema nizvodnom u odnosu na smer transkripcije humanih VH genskih segmenata): humani VH1-2 - mišji ADAM6 lokus - humani VH6-1. Prema specifičnom primeru izvođenja, ADAM6 pseudogen između humanog VH1-2 i humanog VH6-1 je zamenjen mišjim ADAM6 lokusom. U jednom primeru izvođenja, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b od mišjeg ADAM6 lokusa je suprotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VH genskih segmenata. Alternativno tome, mišji ADAM6 lokus je prisutan u intergenskom regionu između 3’najbližeg humanog VH genskog segmenta i 5’-najbližeg DH genskog segmenta. Ovo može biti slučaj bilo da je 5’-najbliži DH segment mišji ili humani.

[0420] Slično tome, miš modifikovan sa jednim ili više humanih VL genskih segmenata (npr. Vκ ili Vλ segmentima) koji zamenjuju sve ili u suštini sve endogene mišje VH genske segmente može biti modifikovan tako da zadržava endogeni mišji ADAM6 lokus, kao što je opisano gore, npr. korišćenjem ciljajućeg vektora koji ima nizvodno homologi krak koji sadrži mišji ADAM6 lokus ili njegov funkcionalni fragment, ili zamenom oštećenog mišjeg ADAM6 lokusa ektopičnom sekvencom smeštenom između dva humana VL genska segmenta ili između humanih VL genskih segmenata i DH genskog segmenta ili J genskog segmenta. Zamena obuhvata dva ili više humanih VL genskih segmenata, a mišji ADAM6 lokus ili njegov funkcionalni fragment su prisutni između dva 3’-najbliža VL genska segmenta. Raspored humanih VL genskih segmenata onda može biti sledeći (od uzvodnog prema nizvodnom u odnosu na smer transkripcije humanih genskih segmenata): humani VL3’-1 - mišji ADAM6 lokus - humani VL3’. Orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b od mišjeg ADAM6 lokusa može biti suprotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VL genskih segmenata. Alternativno tome, mišji ADAM6 lokus je prisutan u intergenskom regionu između 3’-najbližeg humanog VL genskog segmenta i 5’-najbližeg DH genskog segmenta. Ovo može biti slučaj bilo da je 5’-najbliži DH segment mišji ili humani.

[0421] Opisan je miš sa zamenom jednog ili više endogenih mišjih VH genskih segmenata, i koji sadrži najmanje jedan endogeni mišji DH genski segment. Kod takvog miša, modifikacija endogenih mišjih VH genskih segmenata može obuhvatati modifikaciju jednog ili više 3’-najbližih VH genskih segmenata, ali ne i 5’-najbližeg DH genskog segmenta, gde se vodi računa da modifikacija jednog ili više 3’-najbližih VH genskih segmenata ne poremeti ili ne učini endogeni mišji ADAM6 lokus nefunkcionalnim. Na primer, miš može sadržati zamenu svih ili u suštini svih endogenih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VH genskih segmenata, i miš sadrži jedan ili više endogenih DH genskih segmenata i funkcionalni endogeni mišji ADAM6 lokus.

[0422] [Izbrisano]

[0423] Upotreba miševa koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni homolog je korisna kada modifikacije poremete funkciju endogenog mišjeg ADAM6. Verovatnoća remećenja endogene mišje ADAM6 funkcije je visoka kada se vrše modifikacije na mišjim imunoglobulinskim lokusima, a naročito kada se modifikuju mišji imunoglobulinski varijabilni regioni teškog lanca i okolne sekvence. Zbog toga su takvi miševi posebno korisni kada se dobijaju miševi sa imunoglobulinskim lokusima teškog lanca koji su izbrisani u celini ili delimično, koji su humanizovani u celini ili delimično, ili su zamenjeni (npr. sa Vκ ili Vλ sekvencama) u celini ili delimično. Metodi za dobijanje opisanih genetskih modifikacija kod miševa opisanih u nastavku su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti.

[0424] Miševi koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein, ili u suštini identičan ili sličan protein koji obezbeđuje koristi u vezi plodnosti mišjem ADAM6 proteinu, posebno su korisni u vezi modifikacija mišjeg imunoglobulinskog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca koje remete ili brišu endogenu mišju ADAM6 sekvencu. Mada su primarno opisani u vezi miševa koji izražavaju antitela sa humanim varijabilnim regionima i mišjim konstantnim regionima, takvi miševi su korisni u vezi bilo kakvih genetskih modifikacija koje remete endogene mišje ADAM6 gene. Stručnjaci će shvatiti da ovo obuhvata široki spektar genetski modifikovanih miševa koji sadrže modifikacije mišjih imunoglobulinskih varijabilnih genskih lokusa teškog lanca. Ovo obuhvata, na primer, miševe sa delecijom ili zamenom svih ili dela mišjih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca, bez obzira na druge modifikacije.

[0425] Opisani su genetski modifikovani miševi koji sadrže ektopični mišji, glodarski, ili neki drugi ADAM6 gen (ili ortolog ili homolog ili fragment) funkcionalan u mišu, i jedan ili više genskih segmenata humanih imunoglobulinskih varijabilnih i/ili konstantnih regiona. Drugi ortolozi ili homolozi ili funkcionalni fragmenti ADAM6 gena u mišu mogu sadržati sekvence od goveda, pasa, primata, zečeva ili druge nehumane sekvence.

[0426] Opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein, zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VH genskih segmenata; zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH genskih segmenata sa jednim ili više humanih DH genskih segmenata; i zamenu svih ili u suštini svih mišjih JH genskih segmenata sa jednim ili više humanih JH genskih segmenata.

[0427] U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži zamenu mišje CH1 nukleotidne sekvence sa humanom CH1 nukleotidnom sekvencom. U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži zamenu mišje zglobne nukleotidne sekvence sa humanom zglobnom nukleotidnom sekvencom. U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži zamenu imunoglobulinskog varijabilnog lokusa (VL i JL) lakog lanca sa humanim imunoglobulinskim varijabilnim lokusom lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži zamenu nukleotidne sekvence mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca sa nukleotidnom sekvencom humanog imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL, JL, i CL su imunoglobulinske sekvence κ lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži mišju CH2 i mišju CH3 sekvencu imunoglobulinskog konstantnog regiona fuzionisanu sa humanim zglobnom i humanom CH1 sekvencom, tako da se takvi mišji imunoglobulinski lokusi rearanžiraju da bi formirali gen koji kodira vezujući protein koji sadrži (a) teški lanac koji ima humani varijabilni region, humani CH1 region, humani zglobni region, i mišji CH2 i mišji CH3 region; i (b) gen koji kodira imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani varijabilni domen i humani konstantni region.

[0428] Prema jednom aspektu, realizovani miš sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein, zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VL genskih segmenata, i opciono zamenu svih ili u suštini svih DH genskih segmenata i/ili JH genskih segmenata sa jednim ili više humanih DH genskih segmenata i/ili humanih JH genskih segmenata, ili opciono zamenu svih ili u suštini svih DH genskih segmenata i JH genskih segmenata sa jednim ili više humanih JL genskih segmenata.

[0429] Miš može sadržati zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH, DH, i JH genskih segmenata sa jednim ili više VL, jednim ili više DH, i jednim ili više J genskih segmenata (npr. Jκ ili Jλ), pri čemu su genski segmenti operativno povezani sa endogenim mišjim zglobnim regionom, pri čemu miš formira rearanžirani gen imunoglobulinskog lanca koji sadrži, od 5’ do 3’ u smeru transkripcije, humani VL -humani ili mišji DH - humani ili mišji J - mišji zglobni - mišji CH2 - mišji CH3. U jednom primeru izvođenja, J region je humani Jκ region. J region može biti humani JH region. J region je humani Jλ region. humani VL region može biti izabran između humanog Vλ regiona i humanog Vκ regiona.

[0430] Miš može izražavati samo jedan varijabilni domen antitela koje ima mišji ili humani konstantni region i varijabilni region koji potiče od humanog Vκ, humanog DH i humanog Jκ; humanog Vκ, humanog DH, i humanog JH; humanog Vλ, humanog DH, i humanog Jλ; humanog Vλ, humanog DH, i humanog JH; humanog Vκ, humanog DH, i humanog Jλ; humanog Vλ, humanog DH, i humanog Jκ. Rekombinacione prepoznajuće sekvence mogu biti modifikovane tako da omoguće da se izvrše produktivna rearanžiranja između navedenih V, D, i J genskih segmenata ili između navedenih V i J genskih segmenata.

[0431] Opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment), zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VL genskih segmenata, zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH genskih segmenata i JH genskih segmenata sa humanim JL genskim segmentima; pri čemu mišu nedostaje CH1 i/ili zglobni region.

[0432] U jednom primeru izvođenja, mišu nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen. U jednom primeru izvođenja, mišu nedostaje sekvenca koja kodira zglobni region. U jednom primeru izvođenja, mišu nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen i zglobni region.

[0433] Prema specifičnom primeru izvođenja, miš izražava vezujući protein koji sadrži humani imunoglobulinski varijabilni domen (λ ili κ) lakog lanca fuzionisan sa mišjim CH2 domenom koji je pričvršćen za mišji CH3 domen.

[0434] Opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein (ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment), zamenu svih ili u suštini svih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VL genskih segmenata, zamenu svih ili u suštini svih mišjih DH i JH genskih segmenata sa humanim JL genskim segmentima.

[0435] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži deleciju imunoglobulinske genske sekvence konstantnog regiona teškog lanca koja kodira CH1 region, zglobni region, CH1 i zglobni region, ili CH1 region i zglobni region i CH2 region.

[0436] U jednom primeru izvođenja, miš proizvodi samo jedan protein koji se vezuje za varijabilni domen koji sadrži homodimer izabran između sledećih: (a) humani VL -mišji CH1 - mišji CH2 - mišji CH3; (b) humani VL - mišji zglobni - mišji CH2 - mišji CH3; (c) humani VL - mišji CH2 - mišji CH3.

[0437] Opisan je miš sa onesposobljenim endogenim imunoglobulinskim lokusom teškog lanca, koji sadrži onesposobljeni ili izbrisani endogeni mišji ADAM6 lokus, pri čemu miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja izražava humano ili mišje ili humano/mišje ili neko drugo himerično antitelo.

[0438] U jednom primeru izvođenja, miš dalje sadrži onesposobljeni endogeni imunoglobulinski lokus lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, endogeni imunoglobulinski lokus lakog lanca je izabran između lokusa kapa (κ) i lambda (λ) lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži onesposobljeni endogeni lokus κ lakog lanca i onesposobljeni lokus λ lakog lanca, pri čemu miš izražava antitelo koje sadrži humani imunoglobulinski varijabilni domen teškog lanca i humani imunoglobulinski domen lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, humani imunoglobulinski domen lakog lanca je izabran između humanog domena κ lakog lanca i humanog domena λ lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, miš sadrži onesposobljeni endogeni lokus κ lakog lanca, pri čemu miš izražava antitelo koje sadrži humani/mišji (tj. humani varijabilni/mišji konstantni) imunoglobulinski teški lanac i humani/mišji imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani Vλ domen. U jednom primeru izvođenja, humani/mišji imunoglobulinski laki lanac sadrži mišji Cκ. U jednom primeru izvođenja, humani/mišji imunoglobulinski laki lanac sadrži mišji Cλ. Prema specifičnom primeru izvođenja, mišji Cλ je Cλ2.

[0439] Opisana je genetski modifikovana životinja koja izražava himerično antitelo i izražava ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog koji je funkcionalan u genetski modifikovanoj životinji.

[0440] Genetski modifikovana životinja je miš. U jednom primeru izvođenja, genetski modifikovana životinja je miš, a ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog je iz soja miševa koji je drugačijeg soja od genetski modifikovane životinje.

[0441] Himerično antitelo može sadržati humani varijabilni domen i sekvencu konstantnog regiona glodara. Glodar može biti izabran između glodara iz porodice Cricetidae i glodara iz porodice Muridae. Glodar koji može biti iz porodice Cricetidae i iz porodice Muridae je miš. Glodar koji može biti iz porodice Cricetidae i porodice Muridae je pacov. Himerično antitelo može sadržati humani varijabilni domen i konstantni domen životinje izabrane između miša ili pacova; miš ili pacov mogu biti izabrani iz porodice Cricetidae i porodice Muridae. Himerično antitelo može sadržati humani varijabilni domen teškog lanca, humani varijabilni domen lakog lanca i sekvencu konstantnog regiona koja potiče od glodara izabranog između miša i pacova, pri čemu su humani varijabilni domen teškog lanca i humani laki lanac srodni. Srodni znači da su humani teški lanac i humani varijabilni domeni lakog lanca iz samo jedne B ćelije koja zajedno izražava humani varijabilni domen lakog lanca i humani varijabilni domen teškog lanca i da su varijabilni domeni zajedno prisutni na površini individualne B ćelije.

[0442] Himerično antitelo može biti izraženo iz imunoglobulinskog lokusa. Varijabilni domen teškog lanca himeričnog antitela se izražava iz rearanžiranog endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca. Varijabilni domen lakog lanca himeričnog antitela može biti izražen iz rearanžiranog endogenog imunoglobulinskog lokusa lakog lanca.

[0443] [Izbrisano]

[0444] Opisan je miš koji sadrži humanizovani imunoglobulinski lokus teškog lanca, pri čemu humanizovani imunoglobulinski lokus teškog lanca sadrži nehumanu ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog.

[0445] Nehumana životinja može biti glodar izabran između miša, pacova, i hrčka.

[0446] Nehumani ADAM6 ortolog ili homolog može biti sekvenca koja je ortologa i/ili homologa sa mišjom ADAM6 sekvencom, pri čemu je ortolog ili homolog funkcionalan kod miša.

[0447] Prema specifičnom primeru izvođenja, ADAM6 ortolog ili homolog je od životinje koja je izabrana između različitih vrsta miševa, pacova i hrčka.

[0448] Prema specifičnom primeru izvođenja, ADAM6 sekvenca je životinja izabrana između glodara iz nadporodice Dipodoidea i glodara iz nadporodice Muroidea.

Prema specifičnom primeru izvođenja, miš je iz nadporodice Muroidea, a ADAM6 ortolog ili homolog je od miša ili pacova ili hrčka iz nadporodice Muroidea.

[0449] Humanizovani lokus teškog lanca sadrži jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više humanih DH genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više humanih DH genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata su operativno povezani sa jednim ili više humanih, himeričnih i/ili glodarskih (npr. mišjim ili pacovskim) gena konstantnog regiona. U jednom primeru izvođenja, geni konstantnog regiona su mišji. U jednom primeru izvođenja, geni konstantnog regiona su pacovski. U jednom primeru izvođenja, geni konstantnog regiona su hrčkovi. U jednom primeru izvođenja, geni konstantnog regiona sadrže sekvencu izabranu između sekvenci zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U specifičnom primeru izvođenja, geni konstantnog regiona sadrže sekvencu zgloba, CH2 i CH3 sekvencu.

[0450] U jednom primeru izvođenja, nehumana ADAM6 sekvenca je susedna sa humanom imunoglobulinskom sekvencom teškog lanca. Nehumana ADAM6 sekvenca je smeštena u okviru humane imunoglobulinske sekvence teškog lanca. Humana imunoglobulinska sekvenca teškog lanca sadrži V, D i J genski segment.

[0451] U jednom primeru izvođenja, nehumana ADAM6 sekvenca je postavljena pored V genskog segmenta. U jednom primeru izvođenja, nehumana ADAM6 sekvenca je postavljena između dva V genska segmenta. U jednom primeru izvođenja, nehumana ADAM6 sekvenca je postavljena između V i D genskog segmenta. U jednom primeru izvođenja, mišja ADAM6 sekvenca je postavljena između V i J genskog segmenta. U jednom primeru izvođenja, mišja ADAM6 sekvenca je postavljena između D i J genskog segmenta.

[0452] Opisana je genetski modifikovana nehumana životinja, koja sadrži B ćeliju koja izražava humani VH domen srodan sa humanim VL domenom iz imunoglobulinskog lokusa, pri čemu nehumana životinja izražava neimunoglobulinski nehumani protein iz imunoglobulinskog lokusa.

[0453] [Izbrisano]

[0454] Neimunoglobulinski nehumani protein može biti glodarski protein, na primer, porodice Muridae.

[0455] [Izbrisano]

[0456] [Izbrisano]

[0457] [Izbrisano]

[0458] Humana imunoglobulinska sekvenca sadrži jedan ili više VH genskih segmenata, jedan ili više DH genskih segmenata i jedan ili više JH genskih segmenata.

[0459] U jednom primeru izvođenja, imunoglobulinska sekvenca sadrži jedan ili više VH genskih segmenata koji imaju visoku učestanost u prirodnim humanim repertoarima. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više VH genskih segmenata sadrže ne više od dva VH genska segmenta, ne više od tri VH genskih segmenata, ne više od četiri VH genska segmenta, ne više od pet VH genskih segmenata, ne više od šest VH genskih segmenata, ne više od sedam VH genskih segmenata, ne više od osam VH genskih segmenata, ne više devet VH genskih segmenata, ne više od 10 VH genskih segmenata, ne više od 11 VH genskih segmenata, ne više od 12 VH genskih segmenata, ne više od 13 VH genskih segmenata, ne više od 14 VH genskih segmenata, ne više od 15 VH genskih segmenata, ne više od 16 VH genskih segmenata, ne više od 17 VH genskih segmenata, ne više od 18 VH genskih segmenata, ne više od 19 VH genskih segmenata, ne više od 20 VH genskih segmenata, ne više od 21 VH genskih segmenata, ne više od 22 VH genska segmenta ili ne više od 23 VH genskih segmenata.

[0460] Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više VH genskih segmenata sadrže pet VH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više VH genskih segmenata sadrže 10 VH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više VH genskih segmenata sadrže 15 VH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više VH genskih segmenata sadrže 20 VH genskih segmenata.

[0461] U različitim primerima izvođenja, VH genski segmenti su izabrani između VH6-1, VH1-2, VH1-3, VH2-5, VH3-7, VH1-8, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH1-18, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH1-24, VH2-26, VH4-28, VH3-30, VH4-31, VH3-33, VH4-34, VH3-35, VH3-38, VH4-39, VH3-43, VH1-45, VH1-46, VH3-48, VH3-49, VH5-51, VH3-53, VH1-58, VH4-59, VH4-61, VH3-64, VH3-66, VH1-69, VH2-70, VH3-72, VH3-73 i VH3-74. U različitim primerima izvođenja, VH genski segmenti su izabrani između VH1-2, VH1-8, VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 i VH6-1. U različitim primerima izvođenja, VH genski segmenti su izabrani između VH1-18, VH1-46, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH4-34, VH4-39, VH4-59 i VH5-51. U različitim primerima izvođenja, VH genski segmenti su izabrani između VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-43, VH3-48, VH4-39, VH4-59 i VH5-51. U različitim primerima izvođenja, VH genski segmenti su izabrani između VH1-18, VH3-11, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH4-39 i VH4-59. U različitim primerima izvođenja, VH genski segmenti su izabrani između VH1-18, VH3-21, VH3-23, VH3-30 i VH4-39. U različitim primerima izvođenja, VH genski segmenti su izabrani između VH1-18, VH3-23 i VH4-39. U različitim primerima izvođenja, VH genski segmenti su izabrani između VH3-21, VH3-23 i VH3-30. U različitim primerima izvođenja, VH genski segmenti su izabrani između VH3-23, VH3-30 i VH4-39.

[0462] Prema specifičnom primeru izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca sadrži najmanje 18 VH genskih segmenata, 27 DH genskih segmenata i šest JH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca sadrži najmanje 39 VH genskih segmenata, 27 DH genskih segmenata i šest JH genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca sadrži najmanje 80 VH genskih segmenata, 27 DH genskih segmenata i šest JH genskih segmenata.

[0463] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu endogenih mišjih VH genskih segmenata sa jednim ili više humanih VH genskih segmenata, pri čemu su humani VH genski segmenti operativno povezani sa genom mišjeg CH regiona, tako da taj miš rearanžira humane VH genske segmente i izražava reverzno himerični imunoglobulinski teški lanac koji sadrži humani VH domen i mišji CH. U jednom primeru izvođenja, 90-100% nerearanžiranih mišjih VH genskih segmenata je zamenjeno sa najmanje jednim nerearanžiranim humanim VH genskim segmentom. Prema specifičnom primeru izvođenja, svi ili u suštini svi endogeni mišji VH genski segmenti su zamenjeni sa najmanje jednim nerearanžiranim humanim VH genskim segmentom. U jednom primeru izvođenja, zamena je sa najmanje 19, najmanje 39, ili najmanje 80 ili 81 nerearanžiranih humanih VH genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, zamena je sa najmanje 12 funkcionalnih nerearanžiranih humanih VH genskih segmenata, najmanje 25 funkcionalnih nerearanžiranih humanih VH genskih segmenata, ili najmanje 43 funkcionalna nerearanžirana humana VH genska segmenta. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži zamenu svih mišjih DH i JH segmenata sa najmanje jednim nerearanžiranim humanim DH segmentom i najmanje jednim nerearanžiranim humanim JH segmentom. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan nerearanžirani humani DH segment je izabran između 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, i njihove kombinacije. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan nerearanžirani humani JH segment je izabran između 1, 2, 3, 4, 5, 6, i njihove kombinacije. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više humanih VH genskih segmenata je izabrano između 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 humanih VH genskih segmenata, i njihove kombinacije.

[0464] U različitim primerima izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca je u operativnoj vezi sa konstantnim regionom u germinativnoj liniji miša. U jednom primeru izvođenja, konstantni region je humani, himerični humani/mišji ili himerični humani/pacovski ili himerični humani/hrčkov, mišji, pacovski, ili hrčkov konstantni region. U jednom primeru izvođenja, konstantni region je glodarski (npr. mišji ili pacovski ili hrčkov) konstantni region. Prema specifičnom primeru izvođenja, glodar je miš ili pacov. U različitim primerima izvođenja, konstantni region sadrži bar CH2 domen i CH3 domen.

[0465] Humana imunoglobulinska sekvenca teškog lanca je locirana na imunoglobulinskom lokusu teškog lanca u germinativnoj liniji miša.

[0466] Miš dalje sadrži humanu imunoglobulinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži jednu ili više nerearanžiranih V i J sekvenci lakog lanca u germinativnoj liniji miša. Imunoglobulinska sekvenca lakog lanca je imunoglobulinska sekvenca λ lakog lanca. Humana imunoglobulinska sekvenca lakog lanca sadrži jedan ili više Vλ genskih segmenata i jedan ili više Jλ genskih segmenata.

[0467] Prema specifičnom primeru izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca lakog lanca sadrži najmanje 12 Vλ genskih segmenata i jedan Jλ genski segmenti. Prema specifičnom primeru izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca lakog lanca sadrži najmanje 12 Vλ genskih segmenata i četiri Jλ genska segmenta.

[0468] Prema specifičnom primeru izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca lakog lanca sadrži najmanje 28 Vλ genskih segmenata i jedan Jλ genski segment. Prema specifičnom primeru izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca lakog lanca sadrži najmanje 28 Vλ genskih segmenata i četiri Jλ genska segmenta.

[0469] Prema specifičnom primeru izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca lakog lanca sadrži najmanje 40 Vλ genskih segmenata i jedan Jλ genski segment. Prema specifičnom primeru izvođenja, humana imunoglobulinska sekvenca lakog lanca sadrži najmanje 40 Vλ genskih segmenata i četiri Jλ genska segmenta.

[0470] Humana imunoglobulinska sekvenca lakog lanca je u operativnoj vezi sa konstantnim regionom u germinativnoj liniji nehumane životinje (npr. glodara, npr. miša ili pacova ili hrčka). Konstantni region je mišji κ konstantni (mCκ) region.

[0471] Humana imunoglobulinska sekvenca lakog lanca je locirana na imunoglobulinskom lokusu lakog lanca u germinativnoj liniji miša. Imunoglobulinski lokus lakog lanca u germinativnoj liniji miša je imunoglobulinski lokus κ lakog lanca.

[0472] Opisan je metod za dobijanje humanog antitela, pri čemu humano antitelo sadrži varijabilne domene koji potiču od jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona kodiranih u ćeliji nehumane životinje kao što je ovde opisano.

[0473] Opisana je farmaceutska kompozicija, koja sadrži polipeptid koji sadrži antitelo ili fragment antitela koji potiče od jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona izolovanih iz miša koji je ovde opisan. Polipeptid može biti antitelo. Polipeptid može biti samo teški lanac antitela. Polipeptid može biti jednolančani varijabilni fragment (npr. scFv).

[0474] Prema jednom aspektu, realizovana je primena ovde opisanog miša za dobijanje antitela. U različitim primerima izvođenja, antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena koji potiču od jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona izolovanih iz miša. Prema specifičnom primeru izvođenja, sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrže imunoglobulinske genske segmente teškog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, sekvence varijabilnog regiona nukleinske kiseline sadrže imunoglobulinske genske segmente lakog lanca.

Miševi koji izražavaju humane λ varijabilne domene

[0475] Genetski modifikovani miševi koji sadrže modifikaciju koja smanjuje plodnost zbog gubitka aktivnosti ADAM proteina (npr. ADAM6-zavisne) mogu se ukrštati sa miševima koji su ovde opisani i sadrže humane λ varijabilne sekvence na endogenim mišjim konstantnim lakim genima. Na primer, miševi koji sadrže oštećeni ADAM6 gen (ili izbrisani ADAM6 gen), npr. životinje sa humanizovanim imunoglobulinskim lokusima teškog lanca, se kombinuju sa miševima koji sadrže lokus lakog lanca (endogeni ili transgenski) koji sadrži humane λ segmente i Jλ segmente povezane sa genima mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona κ lakog lanca, pri čemu nehumane životinje sadrže aktivnost koja ponovo uspostavlja ADAM-zavisnu plodnost. Genetska modifikacija koja ponovo uspostavlja ADAM-zavisnu plodnost može biti u mišu sa humanizovanim teškim lancem, ili u mišu sa humanizovanim λ varijabilnim segmentima. Potomstvo sadrži gene koji formiraju lokus humanizovanog teškog lanca (tj. što rezultuje ekspresijom humanog varijabilnog domena teškog lanca) i humanizovanog lakog lanca (tj. što rezultuje ekspresijom humanog varijabilnog domena λ lakog lanca, fuzionisanim sa mišjim κ regionom), pri čemu životinje odlikuje plodnost koja je povećana u poređenju sa mišem kome nedostaje ADAM6 aktivnost ili aktivnost ortologa ili homologa ADAM6.

[0476] VELOCIMMUNE® miševi dobijeni genetskim inženjeringom sadrže zamenu nerearanžiranih V(D)J genskih segmenata na endogenim mišjim lokusima sa humanim V(D)J genskim segmentima. VELOCIMMUNE® miševi izražavaju himerična antitela koja imaju humane varijabilne domene i mišje konstantne domene (vidi, npr. US pat. br.7,605,237). Većina drugih izveštaja se odnosi na miševe koji izražavaju potpuno humana antitela od potpuno humanih transgena u miševima koji imaju onesposobljene endogene imunoglobulinske lokuse.

[0477] Laki lanci antitela su kodirani jednim od dva posebna lokusa: kapa (κ) i lambda (λ). Laki lanci mišjeg antitela su primarno κ tipa. Miševe koji stvaraju mišja antitela, i modifikovane miševe koji stvaraju potpuno humana ili himerična humanamišja antitela, odlikuje pristrasnost u korišćenju lakog lanca. Ljude takođe odlikuje pristrasnost za laki lanac, ali ne tako izražena kao kod miševa; odnos κ lakih lanaca prema λ lakim lancima kod miševa je oko 95:5, dok je kod ljudi taj odnos oko 60:40. Smatra se da izraženija pristrasnost kod miševa ne utiče jako na raznovrsnost antitela, jer kod miševa λ varijabilni lokus nije tako raznovrsan u prvom slučaju. Ovo nije slučaj kod ljudi. Humani lokus λ lakog lanca je veoma raznovrstan.

[0478] Humani lokus λ lakog lanca se pruža duž 1,000 kb i sadrži preko 80 gena koji kodiraju varijabilne (V) ili spojne (J) segmente (FIG.19). U okviru humanog lokusa λ lakog lanca, preko polovine svih uočenih Vλ domena su kodirani genskim segmentima 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, i 3-21. Generalno, smatra se da je oko 30 ili približno toliko humanih Vλ genskih segmenata funkcionalno. Postoji sedam Jλ genskih segmenata, od kojih se smatra da su samo četiri generalno funkcionalni Jλ genski segmenti: Jλ1, Jλ2, Jλ3, i Jλ7.

[0479] Lokus λ lakog lanca kod ljudi je po strukturi sličan λ lokusu i kod miševa, i kod ljudi po tome što lokus humanog λ lakog lanca ima nekoliko genskih segmenata varijabilnog regiona koji su sposobni za rekombinaciju da bi formirali funkcionalni laki lanac proteina. Humani lokus λ lakog lanca sadrži približno 70 V genskih segmenata i 7 parova Jλ-Cλ genskih segmenata. Izgleda da su samo četiri od ovih parova Jλ-Cλ genskih segmenata funkcionalna. U nekim alelima je peti par Jλ-Cλ genskih segmenata navodno pseudo gen (Cλ6). Izgleda da 70 Vλ genski segmenti sadrže 38 funkcionalnih genskih segmenata. 70 Vλ sekvence su raspoređene u tri klastera, od kojih svaki sadrži različite članove karakterističnih grupa porodice V gena (klasteri A, B i C; FIG.19). Ovo je potencijalno bogat izvor relativno neograničene raznovrsnosti za generisanje antitela sa humanim V regionima u nehumanim životinjama.

[0480] Kao veliki kontrast, lokus mišjeg λ lakog lanca sadrži samo dva ili tri (zavisno od soja) genska segmenta mišjeg Vλ regiona (FIG.20). Bar iz ovog razloga se veruje da velika κ pristrasnost kod miševa nije posebno škodljiva za ukupnu raznovrsnost antitela.

[0481] Prema publikovanim mapama lokusa mišjeg λ lakog lanca, taj lokus se sastoji u suštini od dva klastera genskih segmenata u okviru raspona od približno 200 kb (FIG. 20). Dva klastera sadrže dve grupe V, J, i C gena koje su sposobne za nezavisno rearanžiranje: Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 i Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1. Mada je otkriveno da se Vλ2 rekombinuje sa svim Jλ genskim segmentima, izgleda da se Vλ1 rekombinuje isključivo sa Cλ1. Veruje se da je Cλ4 pseudo gen sa defektnim mestima splajsovanja.

[0482] Lokus mišjeg κ lakog lanca je upadljivo drugačiji. Struktura i broj genskih segmenata koji učestvuju u rekombinacionim događajima dovode do toga da je funkcionalni protein lakog lanca iz mišjeg κ lokusa mnogo kompleksniji (FIG.21). Shodno tome, mišji λ laki lanci ne doprinose značajnije raznovrsnosti populacije antitela kod tipičnog miša.

[0483] Ispitivanje velike raznovrsnosti humanog lokusa λ lakog lanca kod miševa bi verovatno rezultovalo, između ostalog, izvorom potpunijeg repertoara humanog V domena lakog lanca. Prethodni pokušaji da se poboljša ova raznovrsnost su koristili humane transgene koji su sadržali komade humanog lokusa λ lakog lanca slučajno ugrađene u mišji genom (vidi, npr. US 6,998,514 i US 7,435,871). Miševi koji sadrže ove slučajno integrisane transgene navodno izražavaju potpuno humane λ lake lance, međutim, u nekim slučajevima, jedan ili oba endogena lokusa lakog lanca ostaju intaktni. Ova situacija nije poželjna, pošto se humane sekvence λ lakog lanca nadmeću sa mišjim lakim lancem (κ ili λ) u izraženom repertoaru antitela miša.

[0484] Nasuprot tome, pronalazači opisuju genetski modifikovane miševe koji su sposobni za izražavanje jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline λ lakog lanca direktno iz lokusa mišjeg κ lakog lanca, uključujući zamenu na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca. Genetski modifikovani miševi koji su sposobni za izražavanje humanih sekvenci λ lakog lanca iz endogenog lokusa se mogu dalje ukrštati sa miševima koji sadrže humani lokus teškog lanca i shodno tome koristiti za izražavanje antitela koja sadrže V regione (teški i laki) koji su potpuno humani. U različitim primerima izvođenja, V regioni se izražavaju sa mišjim konstantnim regionima. U različitim primerima izvođenja, nisu prisutni nikakvi endogeni mišji imunoglobulinski genski segmenti i V regioni se izražavaju sa humanim konstantnim regionima. Ova antitela bi se pokazala korisnim u brojnim primenama, kako dijagnostičkim, tako i terapeutskim.

[0485] Mnoge prednosti se mogu ostvariti za različite primere izvođenja izražavanja vezujućih proteina koji potiču od humanih Vλ i Jλ genskih segmenata kod miševa. Prednosti se mogu realizovati postavljanjem humanih λ sekvenci na endogeni lokus lakog lanca, na primer, mišji κ ili λ lokus. Antitela napravljena od strane takvih miševa mogu imati lake lance koji sadrže humane Vλ domene fuzionisane sa mišjim CL regionom, konkretno sa mišjim Cκ ili Cλ regionom. Miševi će takođe izražavati humane Vλ domene koji su podesni za identifikaciju i kloniranje za korišćenje sa humanim CL regionima, konkretno sa Cκ i/ili Cλ regionima. Pošto je razvoj B ćelija kod takvih miševa inače normalan, onda je moguće da se generišu uporedivi Vλ domeni (uključujući somatski mutirane Vλ domene) u kontekstu Cλ ili Cκ regiona.

[0486] Opisani su genetski modifikovani miševi koji sadrže nerearanžirani Vλ genski segment na imunoglobulinskom lokusu κ lakog lanca. Opisani su miševi koji izražavaju antitela koja sadrže laki lanac koji ima humani Vλ domen fuzionisan sa mišjim Cκ regionom.

[0487] Opisan je genetski modifikovani miš koji sadrži (1) jedan ili više nerearanžiranih humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više nerearanžiranih humanih Jλ genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu lakog lanca nehumane životinje, (2) jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više humanih DH genskih segmenata, i jedan ili više humanih JH genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca nehumane životinje, pri čemu je miš sposoban da izražava ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment, pri čemu je ADAM6 protein funkcionalan kod mužjaka nehumane životinje. Opisan je genetski modifikovani miš koji izražava antitela koja sadrže teške lance koji sadrže humane VH domene i konstantne regione nehumanih teškog lanca i lake lance koji sadrže humane Vλ domene i konstantne regione mišjeg κ lakog lanca, pri čemu su miševi sposobni da izražavaju ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment.

[0488] U jednom primeru izvođenja, ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment su kodirani ektopičnom sekvencom u germinativnoj liniji miša. U jednom primeru izvođenja, ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment su kodirani endogenom sekvencom miša.

[0489] Mišji endogeni lokus lakog lanca je imunoglobulinski lokus κ lakog lanca.

[0490] U jednom primeru izvođenja, mišu nedostaje endogeni VL i/ili JL genski segment na endogenom lokusu lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL i/ili JL genski segment su Vκ i/ili Jκ genski segment. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL i/ili JL genski segment su Vλ i/ili Jλ genski segment.

[0491] U jednom primeru izvođenja, VL i JL genski segmenti miša su zamenjeni sa jednim ili više humanih Vλ i jednim ili više humanih Jλ genskih segmenata. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL i JL genski segmenti miša su κ genski segmenti. Prema specifičnom primeru izvođenja, VL i JL genski segmenti miša su λ genski segmenti.

[0492] U jednom primeru izvođenja, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata su od fragmenta klastera A humanog imunoglobulinskog lokusa λ lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, fragment klastera A se pruža od humanog Vλ3-27 do humanog Vλ3-1. Prema specifičnom primeru izvođenja, fragment klastera A se pruža od humanog Vλ3-12 do humanog Jλ1. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata su od fragmenta klastera B humanog imunoglobulinskog lokusa λ lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, fragment klastera B se pruža od humanog Vλ5-52 do humanog Vλ1-40. Prema specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata su od fragmenta klastera A i od fragmenta klastera B humanog imunoglobulinskog lokusa λ lakog lanca kao što je ovde opisano.

[0493] U jednom primeru izvođenja, miš sadrži najmanje 12 humanih Vλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži najmanje 28 humanih Vλ genskih segmenata. U jednom primeru izvođenja, miš sadrži najmanje 40 humanih Vλ genskih segmenata.

[0494] U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan humani Jλ genski segment je izabran iz grupe koja se sastoji od Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, i njihove kombinacije.

[0495] Opisan je plodni miš, pri čemu plodna nehumana životinja izražava (1) imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani Vλ domen ili humani Vκ domen, i (2) imunoglobulinski teški lanac koji sadrži humani VH domen, pri čemu mužjak miša sadrži modifikovani lokus varijabilnog regiona teškog lanca i ektopični ADAM6 gen koji je funkcionalan kod mužjaka miša.

[0496] Prema jednom aspektu, realizovana je primena ovde opisanog miša za dobijanje antigen-vezujućeg proteina. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein je humani. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein je antitelo. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein sadrži humani VH domen i/ili humani Vλ domen koji potiču od miša koji je ovde opisan.

[0497] Prema jednom aspektu, realizovani su ćelija ili tkivo koji potiču od miša koji je ovde opisan. U jednom primeru izvođenja, tkivo potiče od slezine, koštane srži ili limfnog čvora. U jednom primeru izvođenja, ćelija je B ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija je embrionska matična (ES) ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija je germinativna ćelija.

[0498] Takođe je opisan oocit koji sadrži diploidni genom genetski modifikovanog miša koji je ovde opisan.

Sterilni transkripti imunoglobulinskog lokusa κ lakog lanca

[0499] Varijacije na temu izražavanja humanih imunoglobulinskih λ sekvenci kod miševa se odražavaju u različitim primerima izvođenja genetski modifikovanih miševa koji su sposobni za takvu ekspresiju. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, genetski modifikovani miševi sadrže izvesnu nekodirajuću sekvencu, odnosno sekvence iz humanog lokusa. U jednom primeru izvođenja, genetski modifikovani miš sadrži humane Vλ i Jλ genske segmente na endogenom lokusu κ lakog lanca, i dalje sadrži humani genomski fragment κ lakog lanca. Prema specifičnom primeru izvođenja, humani genomski fragment κ lakog lanca je nekodirajuća sekvenca koja se prirodno nalazi između humanog Vκ genskog segmenta i humanog Jκ genskog segmenta.

[0500] Humani i mišji lokusi κ lakog lanca sadrže sekvence koje kodiraju sterilne transkripte kojima nedostaje start kodon ili otvoreni okvir za čitanje, a koji se smatraju elementima koji regulišu transkripciju lokusa lakog lanca. Ovi sterilni transkripti potiču od intergenske sekvence locirane nizvodno ili 3’ od najbližeg Vκ genskog segmenta i uzvodno ili 5’ od intronskog pojačavača (Eκi) κ lakog lanca koji je uzvodno od genskog konstantnog regiona κ lakog lanca (Cκ). Sterilni transkripti potiču od rearanžiranja intergenske sekvence da bi se formirao VκJκ1 segment fuzionisan sa Cκ.

[0501] Zamena lokusa κ lakog lanca uzvodno od Cκ gena bi odstranila intergenski region koji kodira sterilne transkripte. Zbog toga bi, u različitim primerima izvođenja, zamena sekvence mišjeg κ lakog lanca uzvodno od mišjeg Cκ gena sa humanim genskim segmentima λ lakog lanca rezultovala lokusom humanizovanog mišjeg κ lakog lanca koji sadrži humane Vλ i Jλ genske segmente, ali ne i intergenski region κ lakog lanca koja kodira sterilne transkripte.

[0502] Kao što je ovde opisano, humanizacija endogenog mišjeg lokusa κ lakog lanca sa humanim genskim segmentima λ lakog lanca, pri čemu se humanizacijom odstranjuje intergenski region, rezultuje izuzetnim padom korišćenja lokusa κ lakog lanca, kuplovanog sa značajnim povećanjem korišćenja λ lakog lanca. Zbog toga, mada je humanizovani miš kome nedostaje intergenski region koristan zato što može da proizvodi antitela sa humanim varijabilnim domenom lakog lanca (npr. humanim λ ili κ domenima), korišćenje lokusa se smanjuje.

[0503] Takođe je opisana humanizacija endogenog lokusa mišjeg κ lakog lanca sa humanim Vλ i Jλ genskim segmentima kuplovanim sa insercijom humanog κ intergenskog regiona da bi se stvorio Vλ lokus koji sadrži, u odnosu na transkripciju, između finalnog humanog Vλ genskog segmenta i prvog humanog Jλ genskog segmenta, κ intergenski region; koji odlikuje populacija B ćelija sa većom ekspresijom od lokusa kome nedostaje κ intergenski region. Ovo zapažanje je konzistentno sa hipotezom da intergenski region direktno pomoću sterilnog transkripta, ili indirektno sprečava korišćenje endogenog lokusa λ lakog lanca. Prema takvoj hipotezi, sledi to da bi intergenski region rezultovao smanjenjem korišćenja endogenog lokusa λ lakog lanca, ostavljajući mišu ograničen izbor, ali korišćenje modifikovanog (λ u κ) lokusa za generisanje antitela.

[0504] U različitim primerima izvođenja, zamena sekvence mišjeg κ lakog lanca uzvodno od mišjeg Cκ gena sa humanom sekvencom λ lakog lanca dalje sadrži humani intergenski region κ lakog lanca koji je smešten, u odnosu na transkripciju, između 3’ netransliranog regiona 3’ najbližeg Vλ genskog segmenta i 5’ najbližeg prvog humanog Jλ genskog segmenta. Alternativno tome, takav intergenski region može biti izostavljen iz zamenjenog endogenog lokusa κ lakog lanca (uzvodno od mišjeg Cκ gena) pravljenjem delecije u endogenom lokusu λ lakog lanca. Isto tako, u okviru ovog primera izvođenja, miš generiše antitela od endogenog lokusa κ lakog lanca koji sadrži humane sekvence λ lakog lanca.

Pristupi inženjeringu miševa da bi izražavali humane Vλ domene

[0505] Opisani su različiti pristupi dobijanju genetski modifikovanih miševa koji stvaraju antitela koja sadrže laki lanac koji ima humani Vλ domen fuzionisan sa endogenim Cκ regionom. Opisane su genetske modifikacije koje, u različitim primerima izvođenja, sadrže deleciju jednog ili oba endogena lokusa lakog lanca. Na primer, da bi se eliminisali mišji λ laki lanci iz repertoara endogenog antitela može biti napravljena delecija prvog klastera Vλ-Jλ-Cλ gena i zamena, u celini ili delimično, Vλ-Jλ genskih segmenata sa drugim klasterom gena sa humanim Vλ-Jλ genskim segmentima. Takođe su realizovani genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljajući konstrukti za dobijanje miševa, mišjih embriona, i ćelija.

[0506] Delecija jednog endogenog klastera Vλ-Jλ-Cλ gena i zamena Vλ-Jλ genskih segmenata drugim endogenim klasterom Vλ-Jλ-Cλ gena koristi relativno minimalni prekid u asocijaciji i funkciji konstantnog regiona prirodnog antitela u životinju, u različitim primerima izvođenja, jer su endogeni Cλ geni ostali intaktni i zato zadržavaju normalnu funkcionalnost i sposobnost da se povežu sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca. Shodno tome, u takvim primerima izvođenja modifikacija ne utiče na druge endogene konstantne regione teškog lanca zavisne od funkcionalnih konstantnih regiona lakog lanca za sastavljanje funkcionalnog molekula antitela koji sadrži dva teška lanca i dva laka lanca. Dalje, u različitim primerima izvođenja modifikacija ne utiče na sastavljanje funkcionalnog molekula antitela vezanog za membranu koji sadrži endogeni teški lanac i laki lanac, npr. hVλ domen povezan sa mišjim Cλ regionom. Zato što je najmanje jedan funkcionalni Cλ gen zadržan na endogenom lokusu, životinje koje sadrže zamenu Vλ-Jλ genskih segmenata endogenog klastera Vλ-Jλ-Cλ gena sa humanim Vλ-Jλ genskim segmentima bi trebalo da budu sposobne da proizvode normalne λ lake lance koji su sposobni za vezivanje antigena u toku imune reakcije pomoću humanih Vλ-Jλ genskih segmenata koji su prisutni u izraženom repertoaru antitela ovih životinja.

[0507] Šematski prikaz (koji nije u srazmeri) izbrisanog endogenog klastera mišjih Vλ-Jλ-Cλ gena je prikazan na FIG.20. Kao što je prikazano, lokus mišjeg λ lakog lanca je organizovan u dva klastera gena, od kojih svaki sadrži funkcionalne genske segmente koji su sposobni za rekombinaciju da bi se formirao funkcionalni mišji λ laki lanac. Endogeni klaster mišjeg Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 gena je izbrisan ciljajućim konstruktom (ciljajući vektor 1) sa neomicinskom kasetom okruženom rekombinacionim mestima. Drugi endogeni klaster gena (Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4) je izbrisan delimično pomoću ciljajućeg konstrukta (ciljajući vektor 2) sa higromicintimidin kinaznom kasetom okruženom rekombinacionim mestima. U ovom drugom ciljajućem događaju se zadržavaju Cλ2-Jλ4-Cλ4 endogeni genski segmenti. Drugi ciljajući konstrukt (ciljajući vektor 2) je konstruisan korišćenjem rekombinacionih mesta koja su drugačija od onih u prvom ciljajućem konstruktu (ciljajući vektor 1), čime je omogućena selektivna delecija selekcione kasete posle ostvarivanja uspešnog ciljanja. Rezultujući dvostruko ciljani lokus je funkcionalno utišan, tako da ne može proizvoditi endogeni λ laki lanac. Ovaj modifikovani lokus se može koristiti za inserciju humanih Vλ i Jλ genskih segmenata da bi se stvorio endogeni mišji λ lokus koji sadrži humane Vλ i Jλ genske segmente, zahvaljujući čemu, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu, životinja proizvodi λ lake lance koji sadrže rearanžirane humane Vλ i Jλ genske segmente povezane sa endogenim mišjim Cλ genskim segmentom.

[0508] Genetička modifikacija miša da bi se endogeni λ genski segmenti učinili nefunkcionalnim, u različitim primerima izvođenja, rezultuje mišem koga odlikuju isključivo κ laki lanci u njegovom repertoaru antitela, što miša čini korisnim za određivanje uloga λ lakih lanaca u imunoj reakciji, i korisnim za dobijanje repertoara antitela koja sadrže Vκ domene, ali ne i Vλ domene.

[0509] Genetski modifikovani miš koji izražava hVλ povezan sa mišjim Cλ genom koji je rekombinovan na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca može biti dobijen bilo kojim metodom koji je poznat iz odgovarajuće oblasti. Šematski prikaz (koji nije u srazmeri) zamene endogenih mišjih Vλ2-Vλ3-Jλ2 genskih segmenata sa humanim Vλ i Jλ genskim segmentima je dat na FIG.22A. Kao što je prikazano, endogeni lokus mišjeg λ lakog lanca koji je učinjen nefunkcionalnim je zamenjen ciljajućim konstruktom (12/1-λ ciljajući vektor) koji sadrži neomicinsku kasetu okruženu rekombinacionim mestima. Vλ2-Vλ3-Jλ2 genski segmenti su zamenjeni sa genomskim fragmentom koji sadrži humanu λ sekvencu koja sadrži 12 hVλ genskih segmenata i samo jedan hJλ genski segment.

[0510] Shodno tome, ovaj prvi pristup postavlja jedan ili više hVλ genskih segmenata na endogeni lokus λ lakog lanca susedno sa samo jednim hJλ genskim segmentom (FIG. 22A).

[0511] Dalje modifikacije modifikovanog endogenog lokusa λ lakog lanca se mogu realizovati korišćenjem sličnih tehnika za umetanje više hVλ genskih segmenata. Na primer, šematski prikazi dva dodatna ciljajuća konstrukta (+16-λ i 12-λ ciljajući vektori) koji se koriste za progresivnu inserciju dodatnih humanih hVλ genskih segmenata su dati na FIG.23A. Kao što je prikazano, dodatni genomski fragmenti koji sadrže specifično humane hVλ genske segmente su umetnuti u modifikovani endogeni lokus λ lakog lanca u sukcesivnim koracima korišćenjem homologije obezbeđene prethodnom insercijom humanih sekvenci λ lakog lanca. Posle rekombinacije sa svakim prikazanim ciljajućim konstruktom, na sukcesivan način, 28 dodatnih hVλ genskih segmenata je umetnuto u modifikovani endogeni lokus λ lakog lanca. Ovo stvara himerični lokus koji proizvodi protein λ lakog lanca koji sadrži humane Vλ□Jλ genske segmente povezane sa mišjim Cλ genom.

[0512] Gornji pristupi za umetanje humanih genskih segmenata λ lakog lanca na mišji λ lokus zadržavaju pojačavače smeštene nizvodno od Cλ2-Jλ4-Cλ4 genskih segmenata (označeni sa Enh 2.4, Enh i Enh 3.1 FIG.22A i FIG.23A). Ovaj pristup rezultuje samo jednim modifikovanim alelom na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca (FIG.25A).

[0513] Realizovane su kompozicije i metodi za dobijanje miša koji izražava laki lanac koji sadrži hVλ i Jλ genske segmente koji su operativno povezani sa mišjim Cλ genskim segmentom, uključujući kompozicije i metode za dobijanje miša koji izražava takve gene iz endogenog lokusa mišjeg λ lakog lanca. Metodi obuhvataju selektivno činjenje jednog endogenog klastera mišjih Vλ-Jλ-Cλ gena nefunkcionalnim (npr. ciljanom delecijom), i korišćenje hVλ i Jλ genskih segmenata na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca za izražavanje hVλ domena u mišu.

[0514] Alternativno tome, u drugom pristupu, humani genski segmenti λ lakog lanca mogu biti smešteni na endogenom lokusu κ lakog lanca. Genetska modifikacija, u različitim primerima izvođenja, sadrži deleciju endogenog lokusa κ lakog lanca. Na primer, da bi se eliminisali mišji κ laki lanci iz repertoara endogenih antitela može se napraviti delecija mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata. Takođe su realizovani genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljajući konstrukti za dobijanje miševa, mišjih embriona, i ćelija.

[0515] Iz gore navedenih razloga delecija mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata koristi relativno minimalni prekid. Šematski prikaz (koji nije u srazmeri) izbrisanih mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata je dat na FIG.21. Endogeni mišji Vκ i Jκ genski segmenti su izbrisani pomoću rekombinazom-posredovane delecije pozicije mišjih sekvenci između dva precizno postavljena ciljajuća vektora, od kojih svaki koristi mesnospecifična rekombinaciona mesta. Prvi ciljajući vektor (Jκ ciljajući vektor) se koristi u prvom ciljajućem događaju za brisanje mišjih Jκ genskih segmenata. Drugi ciljajući vektor (Vκ ciljajući vektor) se koristi u drugom, sukcesivnom ciljajućem događaju za brisanje sekvence locirane 5’ od najudaljenijeg mišjeg Vκ genskog segmenta. Oba ciljajuća vektora sadrže mesno-specifična rekombinaciona mesta, što omogućava da bude ostvarena selektivna delecija obe selekcione kasete i svih intervenišućih sekvenci mišjeg κ lakog lanca posle uspešnog ciljanja. Rezultujući izbrisani lokus je funkcionalno utišan, tako da ne može da proizvede endogeni κ laki lanac. Ovaj modifikovani lokus se može koristiti za inserciju hVλ i Jλ genskih segmenata da bi se stvorio endogeni mišji κ lokus koji sadrži hVλ i Jλ genske segmente, zahvaljujući čemu, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu, životinja proizvodi λ lake lance koji sadrže rearanžirane hVλ i Jλ genske segmente operativno povezane sa endogenim mišjim Cκ genskim segmentom. Različiti ciljajući vektori koji sadrže humane sekvence λ lakog lanca se mogu koristiti u vezi sa brisanjem mišjeg κ lokusa da bi se stvorio hibridni lokus lakog lanca koji sadrži humane λ genske segmente koji su operativno povezani sa mišjim Cκ regionom.

[0516] Shodno tome, drugim pristupom se postavlja jedan ili više humanih Vλ genskih segmenata tako da budu smešteni na mišjem lokusu κ lakog lanca susedno sa samo jednim humanim Jλ genskim segmentom (12/1-κ ciljajući vektor, FIG.22B).

[0517] U različitim primerima izvođenja se mogu izvršiti modifikacije ovog pristupa da bi se dodali genski segmenti i/ili regulatorne sekvence radi optimizacije korišćenja humanih sekvenci λ lakog lanca iz mišjeg κ lokusa u okviru repertoara mišjih antitela.

[0518] U trećem pristupu, jedan ili više hVλ genskih segmenata se postavljaju na mišjem lokusu κ lakog lanca susedno sa četiri hJλ genske sekvence (12/4-κ ciljajući vektor FIG.22B).

[0519] U trećem pristupu, jedan ili više hVλ genskih segmenata se postavljaju na mišjem lokusu κ lakog lanca susedno sa humanom κ intergenskom sekvencom i samo jednom hJλ genskom sekvencom (12(κ)1-κ ciljajući vektor, FIG.22B).

[0520] U četvrtom pristupu, jedan ili više hVλ genskih segmenata se postavljaju na mišjem lokusu κ lakog lanca susedno sa humanom κ intergenskom sekvencom četiri hJλ genske sekvence (12(κ)4-κ ciljajući vektor FIG.22B).

[0521] Svi gornji pristupi umetanja humanih genskih segmenata λ lakog lanca na mišji κ lokus, zadržavaju κ intronski pojačavački element uzvodno od Cκ gena (označen sa Eκi, FIG.22B i FIG.23B) i 3’ κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (označenog sa Eκ3’, FIG.22B i FIG.23B). Ovi pristupi rezultuju sa četiri posebna modifikovana alela na endogenom mišjem lokusu κ lakog lanca (FIG.25B).

[0522] U različitim primerima izvođenja, genetski modifikovani miš sadrži inaktivirani endogeni lokus mišjeg λ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, lokus λ lakog lanca je inaktiviran strategijom koja briše region koji se pruža od Vλ2 do Jλ2, i region koji se pruža od Vλ1 do Cλ1 (FIG.20). Bilo kakva strategija koja smanjuje ili eliminiše sposobnost endogenog lokusa λ lakog lanca da izražava endogene λ domene je podesna za primenu sa primerima izvođenja iz ovog otkrivanja.

Lambda domen antitela genetski modifikovanih miševa

[0523] Miševi koji sadrže humane λ sekvence na mišjem lokusu κ ili λ lakog lanca će izražavati laki lanac koji sadrži hVλ region fuzionisan sa mišjim CL (Cκ ili Cλ) regionom. Oni se prvenstveno ukrštaju sa miševima koji (a) sadrže funkcionalno utišan lokus lakog lanca (npr. inaktiviran endogeni lokus mišjeg κ ili λ lakog lanca); (b) sadrže endogeni lokus mišjeg λ lakog lanca koji sadrži hV i hJ genske segmente operativno povezan sa endogenim mišjim Cλ genom; (c) sadrže endogeni lokus mišjeg κ lakog lanca koji sadrži hVκ i hJκ genske segmente operativno povezan sa endogenim mišjim Cκ genom; i, (d) miš kod koga jedan κ alel sadrži hVκs i hJκs; drugi κ alel sadrži hVλs i hJλs; jedan λ alel sadrži hVλs i hJλs i jedan λ alel koji je utišan ili inaktiviran, ili oba λ alela sadrže hVλs i hJλs; i, dva alela teškog lanca od kojih svaki sadrži hVHs, hDHs, i hJHs.

[0524] Antitela koja sadrže hVλ domene izražene u kontekstu Cκ ili Cλ se primenjuju za dobijanje potpuno humanih antitela kloniranjem nukleinskih kiselina koje kodiraju hVλ domene u ekspresionim konstruktima koji nose gene koji kodiraju humani Cλ. Rezultujući ekspresioni konstrukti se transfektuju u podesne ćelije domaćine radi izražavanja antitela koja ispunjavaju kompletni hVλ domen fuzionisan sa hCλ.

PRIMERI

[0525] Sledeći primeri su obezbeđeni za opisivanje kako se prave i primenjuju metode i kompozicije prema pronalasku, a nisu namenjeni za ograničavanje obima onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Osim ako nije drugačije naglašeno, temperatura je navedena u Celzijusima, a pritisak je atmosferski ili blizak njemu.

Primer 1. Humanizacija mišjih imunoglobulinskih gena

[0526] Humani i mišji bakterijski veštački hromozomi (BACs) su bili upotrebljeni za inženjering 13 različitih BAC ciljajućih vektora (BACvecs) za humanizaciju mišjih imunoglobulinskih lokusa teškog lanca i κ lakog lanca. Tabele 1 i 2 daju detaljne opise koraka izvršenih radi konstrukcije svih BACvecs upotrebljenih za humanizaciju mišjih imunoglobulinskih lokusa teškog lanca i κ lakog lanca, respektivno.

[0527] Identifikacija humanih i mišjih BACs. Mišji BACs koji se pružaju između 5’ i 3’ krajeva imunoglobulinskog lokusa teškog lanca i κ lakog lanca su bili identifikovani hibridizacijom filtera prošaranih BAC bibliotekom ili pomoću PCR skrininga mišje BAC biblioteke DNK pulova. Filteri su bili hibridizovani pod standardnim uslovima uz korišćenje proba koje odgovaraju regionima od interesa. Biblioteke pulova su bile podvrgnute skriningu pomoću PCR korišćenjem jedinstvenih parova prajmera koji okružuju ciljani region od interesa. Bila je izvedena dodatna PCR uz korišćenje istih prajmera da bi se dekonvoluirao dati bunarčić i izolovao odgovarajući BAC od interesa. I BAC filteri i biblioteke pulova su bili generisani od 129 SvJ mišjih ES ćelija (Incyte Genomics/Invitrogen). Bili su identifikovani humani BACs koji pokrivaju celokupne imunoglobulinske lokuse teškog lanca i κ lakog lanca, bilo hibridizacijom filtera prošaranih sa BAC bibliotekom (Caltech B, C, ili D biblioteke & RPCI-11 biblioteka, Research Genetics/Invitrogen) putem skrininga humanih BAC biblioteka pulova (Caltech library, Invitrogen) pomoću metoda baziranog na PCR ili korišćenjem baze podataka o BAC krajnjim sekvencama (Caltech D biblioteka, TIGR).

[0528] Konstrukcija BACvecs bakterijskom homologom rekombinacijom i ligacijom. Bakterijska homologa rekombinacija (BHR) je bila izvedena kao što je opisano (Valenzuela et al., 2003; Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J.P., i Stewart, A.F. (1998). A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat Genet 20, 123-128). U većini slućajeva, linearni fragmenti su bili generisani ligacijom homologih kutija dobijenih pomoću PCR sa kloniranim kasetama, praćenim izolacijom proizvoda ligacije na gelu i elektroporiranjem u BHR-kompetentnim bakterijama koje su sadržale ciljajući BAC. Posle selekcije na podesnim antibiotskim petrijevim šoljama, korektno rekombinovani BACs su bili identifikovani pomoću PCR u pogledu novih spojeva, praćenih restrikcionom analizom na gelovima sa pulsirajućim poljem (Schwartz, D.C., i Cantor, C.R. (1984). Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell 37, 67-75) i proverom tačaka pomoću PCR korišćenjem prajmera raspodeljenih po humanim sekvencama.

[0529] 3hVH BACvec je bio konstruisan korišćenjem tri sukcesivna BHR koraka za inicijalni korak humanizacije imunoglobulinskog lokusa teškog lanca (FIG.4A i Tabela 1). U prvom koraku (Korak 1), kaseta je uvedena u humani roditeljski BAC uzvodno od humanog VH1-3 genskog segmenta koji sadrži region homologije mišjeg imunoglobulinskog lokusa teškog lanca (HB1), gen koji prenosi otpornost na kanamicin u bakterijama i G418 otpornost na životinje ćelije (kanR) i mesnospecifično rekombinaciono mesto (npr. loxP). U drugom koraku (Korak 2) je uvedena druga kaseta neposredno nizvodno od poslednjeg JH segmenta koji sadrži drugi region homologije na mišjem imunoglobulinskom lokusu teškog lanca (HB2) i gen koji prenosi otpornost u bakterijama na spektinomicin (specR). Ovaj drugi korak je sadržao brisanje sekvence humanog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca nizvodno od JH6 i gena BAC vektora otpornosti na hloramfenikol (cmR). U trećem koraku (Korak 3) se zatim linearizuje dvostruko modifikovani humani BAC (B1) korišćenjem I-CeuI mesta koje je bilo dodato u toku prva dva koraka i integrisano u mišji BAC (B2) pomoću BHR preko dva regiona homologije (HB1 i HB2). Selekcije lekova za prvi (cm/kan), drugi (spec/kan) i treći (cm/kan) korak su bile izabrane tako da budu specifične za željene proizvode. Modifikovani BAC klonovi su bili analizirani pomoću elektroforeze na gelu sa pulsnim poljem (PFGE) posle digestije sa restrikcionim enzimima da bi se odredila podesna konstrukcija (FIG.4B).

[0530] Na sličan način, 12 dodatnih BACvecs je bilo dobijeno inženjeringom za humanizaciju lokusa teškog lanca i κ lakog lanca. U nekim slučajevima bila je izvedena BAC ligacija u miljeu BHR da bi se spojila dva velika BACs putem uvođenja retkih restrikcionih mesta u oba roditeljska BACvecs pomoću BHR zajedno sa pažljivim postavljanjem selektabilnih markera. Ovo je omogućilo preživljavanje željenog proizvoda ligacije posle selekcije sa specifičnim kombinacijama lekova kao markerom. Rekombinantni BACs dobijeni ligacijom posle digestije sa retkim restrikcionim enzimima su bili identifikovani i podvrgnuti skriningu na sličan način kao i oni koji su bili dobijeni pomoću BHR (kao što je opisano).

TABELA 1

TABELA 2

[0531] Modifikacija embrionskih matičnih (ES) ćelija i generisanje miševa. Ciljanje ES ćelija (F1H4) je bilo izvedeno korišćenjem VELOCIGENE® metoda genetskog inženjeringa kao što je opisano (Valenzuela et al., 2003). Bila je izvršena derivacija miševa od modifikovanih ES ćelija, bilo blastocistom (Valenzuela et al., 2003) ili injekcijom 8-ćelija (Poueymirou et al., 2007) kao što je opisano. Ciljane ES ćelije i miševi su bili potvrđeni skriningom DNK iz ES ćelija ili miševa sa jedinstvenim setovima proba i prajmera u testu baziranom na PCR (npr. FIG.3A, 3B i 3C). Sve studije na miševima je nadzirao i odobravao Regeneron’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

[0532] Analiza kariotipa i fluorescentna in situ hibridizacija (FISH). Analizu kariotipa je izvršio Coriell Cell Repositories (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ). FISH je bio izveden na ciljanim ES ćelijama kao što je opisano (Valenzuela et al., 2003). Probe koje su odgovarale bilo mišjem BAC DNK ili humanom BAC DNK su bile obeležene translacijom zarezivanjem (Invitrogen) sa fluorescentno obeleženim dUTP nukleotidima narandžastog spektra ili zelenog spektra (Vysis).

[0533] Varijabilni genski imunoglobulinski lokus teškog lanca. Humanizacija lokusa varijabilnog regiona teškog lanca je bila izvedena u devet uzastopnih koraka putem direktne zamene oko tri miliona parova baza (Mb) susedne mišje genomske sekvence koja je sadržala sve VH, DH i JH genske segmente sa oko jednim Mb susedne humane genomske sekvence koja sadrži ekvivalentne humane genske segmente (FIG.1A i Tabela 1) korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjeringa (vidi, npr. US pat. br.6,586,251 i Valenzuela et al., 2003).

[0534] Intron između JH genskih segmenata i gena konstantnog regiona (J-C intron) sadrži transkripcioni pojačavač (Neuberger, M.S. (1983). Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells. Embo J 2, 1373-1378) praćen region sa jednostavnim ponavljanjima potrebnim za rekombinaciju u toku promene izotipa (Kataoka, T., Kawakami, T., Takahashi, N., i Honjo, T. (1980). Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavychain class switch. Proc Natl Acad Sci U S A 77, 919-923). Spoj između humanog VH-DH-JH regiona i mišjeg CH regiona (bliži spoj) je bio izabran za zadržavanje mišjeg intronskog pojačavača teškog lanca i promenu domena da bi se sačuvali i efikasna ekspresija, i promena klase humanizovanog lokusa teškog lanca unutar miša. Tačna nukleotidna pozicija ovog i sledećih spojeva u svim zamenama je bila omogućena korišćenjem VELOCIGENE® metoda genetskog inženjeringa (supra), koji je koristio bakterijsku homologu rekombinaciju pokrenutu sintetizovanim oligonukleotidima. Shodno tome, bliži spoj je bio smešten oko 200 bp nizvodno od poslednjeg JH genskog segmenta, dok je udaljeniji spoj bio smešten nekoliko stotina uzvodno od 5’-najbližeg VH genskog segmenta humanog lokusa i oko 9 kb nizvodno od mišjeg VH1-86 genskog segmenta, takođe poznatog kao J558.55. Mišji VH1-86 (J558.55) genski segment je najudaljeniji varijabilni genski segment teškog lanca, koji navodno predstavlja pseudogen kod C57BL/6 miševa, ali potencijalno aktivan, mada sa slabom RSS sekvencom, u ciljanom 129 alelu. Udaljeniji kraj mišjeg lokusa teškog lanca navodno može sadržati kontrolne elemente koji regulišu ekspresiju i/ili rearanžiranje lokusa (Pawlitzky et al., 2006).

[0535] Prva insercija humane imunoglobulinske DNK sekvence u miša je bila ostvarena korišćenjem 144 kb bližeg kraja humanog lokusa teškog lanca koji je sadržao 3 VH, svih 27 DH i 9 JH humanih genskih segmenata umetnutih u bliži kraj mišjeg IgH lokusa, sa istovremenom delecijom 16.6 kb mišje genomske sekvence, uz korišćenje oko 75 kb mišjih homologih krakova (Korak A, FIG.2A; Tabele 1 i 3, 3hVH). Ova velika insercija od 144kb i njoj pridružena delecija od 16.6 kb su bile izvedene u jednom koraku (Korak A), a događale su se sa učestanošću od 0.2% (Tabela 3). Ispravno ciljane ES ćelije su bile procenjene testom gubitka-prirodnogalela (LONA) (Valenzuela et al., 2003) uz korišćenje proba unutar i oko izbrisane mišje sekvence i unutar umetnute humane sekvence, a integritet velikog humanog inserta je bio verifikovan korišćenjem više proba koje su se pružale preko cele insercije (FIG.3A, 3B i 3C). Pošto je bilo anticipirano mnogo sukcesivnih ciklusa ciljanja ES ćelija, ciljanja klonova ES ćelija u ovom i svim sukcesivnim, koraci su bili podvrgnuti analizi kariotipa (supra), a samo oni klonovi koje su odlikovali normalni kariotipovi u 17 od 20 razmaza bili su korišćeni u narednim koracima.

[0536] Ciljane ES ćelije iz koraka A su bile ponovo ciljane sa BACvec koji je bio proizveden delecijom od 19 kb na udaljenijem kraju lokusa teškog lanca (Korak B, FIG. 2A). BACvec iz Koraka B je sadržao gen otpornosti na higromicin (hyg) za razliku od gena otpornosti na neomicin (neo) sadržanog u BACvec iz Koraka A. Geni otpornosti iz dva BACvecs su bili projektovani tako da su, posle uspešnog ciljanja na isti hromozom, približno tri Mb mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca koji sadrži sve mišje VH genske segmente drugačije od VH1-86 i sve DH genske segmente drugačije od DQ52, kao i dva gena otpornosti, bili su okruženi loxP mestima; DQ52 i svi genski segmenti mišjeg JH lanca su bili izbrisani u Koraku A. Klonovi ES ćelija koji su bili dvostruko ciljani na istom hromozomu bili su identifikovani usmeravanjem 3hVH bliže kasete u homozigotnost u visokom G418 (Mortensen, R.M. et al. (1992) Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct. Mol Cell Biol 12, 2391-2395) i praćenjem sudbine udaljenije hyg kasete. Mišji segmenti veličine do četiri Mb, koji su bili modifikovani tako što su okruženi loxP mestima, bili su uspešno izbrisani iz ES ćelija prolaznom ekspresijom CRE rekombinaze sa visokim efikasnostima (do ≈11%) čak i u odsustvu selekcije lekom (Zheng, B. et al. (2000) Engineering mouse chromosomes with CreloxP: range, efficiency, and somatic applications. Mol Cell Biol 20, 648-655). Na sličan način, pronalazači su ostvarili tri Mb delecije u 8% klonova ES ćelija posle prolazne CRE ekspresije (Korak C, FIG.2A; Tabela 3). Delecija je bila ocenjena pomoću LONA testa korišćenjem proba na oba kraja izbrisane mišje sekvence, kao i gubitka neo i hyg i pojave PCR proizvoda preko tačke delecije koja je sadržala samo preostalo loxP mesto. Dalje, delecija je bila potvrđena fluorescentnom in situ hibridizacijom (podaci nisu prikazani).

[0537] Ostatak humanog varijabilnog regiona teškog lanca je bio dodat 3hVH alelu u nizu od 5 koraka uz korišćenje VELOCIGENE® metoda genetskog inženjeringa (Koraci E-H, FIG.2B), pri čemu je svaki korak obuhvatao preciznu inserciju do 210 kb humanih genskih sekvenci. Za svaki korak je bilo projektovano da se bliži kraj svakog novog BACvec preklapa sa najudaljenijim humanim sekvencama iz prethodnog koraka i da udaljeniji kraj svakog novog BACvec bude sadržan u istom udaljenijem regionu mišje homologije koja je bila korišćena u Koraku A. BACvecs iz koraka D, F i H su sadržali neo selekcione kasete, dok su oni iz koraka E i G sadržali hyg selekcione kasete, shodno tome, selekcije su bile naizmenično između G418 i higromicina. Ciljanje u Koraku D je bilo testirano gubitkom jedinstvenog PCR proizvoda preko udaljenijeg loxP mesta 3hVH hibridnog alela. Ciljanje za Korake E do I je bilo testirano gubitkom prethodne selekcione kasete. U finalnom koraku (Korak I, FIG. 2B), neo selekciona kaseta, okružena sa Frt mestima (McLeod, M. et al. (1986) Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle. Mol Cell Biol 6, 3357-3367), bila je odstranjena prolaznom FLPe ekspresijom (Buchholz, F. et al. (1998) Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat Biotechnol 16, 657-662). Humane sekvence BACvecs za Korake D, E i G su poticale od po dva roditeljska humana BACs, dok su one iz Koraka F i H bile od samo jednog BACs. Retencija humanih sekvenci je bila potvrđena u svakom koraku korišćenjem više proba koje su premošćavale umetnute humane sekvence (kao što je opisano gore, npr. FIG.3A, 3B i 3C). Samo oni klonovi sa normalnim kariotipom i potencijalom germinativne linije su nastavljali dalje u svakom koraku. ES ćelije iz finalnog koraka su još uvek bile sposobne da daju germinativnu liniju posle devet sukcesivnih manipulacija (Tabela 3). Miševi homozigotni za svaki od alela teškog lanca su bili vijabilni, izgledali su zdravo i ispoljili su u suštini humoralni imuni sistem kao kod prirodnog tipa (vidi Primer 3).

TABELA 3

[0538] Imunoglobulinski varijabilni genski lokus κ lakog lanca. Varijabilni region κ lakog lanca je bio humanizovan u osam sukcesivnih koraka direktnom zamenom od oko tri Mb mišje sekvence koja sadrži sve Vκ i Jκ genske segmente sa oko 0.5 Mb humane sekvence koja sadrži bliže humane Vκ i Jκ genske segmente na način sličan onome kod teškog lanca (FIG.1B; Tabele 2 i 4).

[0539] Humani varijabilni region lokusa κ lakog lanca sadrži dva skoro identična ponavljanja od 400 kb razdvojena spejserom od 800 kb (Weichhold, G.M. et al.

(1993) The human immunoglobulin kappa locus consists of two copies that are organized in opposite polarity. Genomics 16, 503-511). Pošto su ponavljanja tako slična, skoro sva raznovrsnost lokusa se može reprodukovati u miševima uz korišćenje bližeg ponavljanja. Dalje, bilo je izveštaja o prirodnom humanom alelu lokusa κ lakog lanca kome nedostaje udaljenije ponavljanje (Schaible, G. et al.

(1993) The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals. Hum Genet 91, 261-267). Pronalazači su zamenili oko tri Mb varijabilne genske sekvence mišjeg κ lakog lanca sa oko 0.5 Mb humane varijabilne genske sekvence κ lakog lanca da bi efektivno zamenili sve mišje Vκ i Jκ genske segmente sa bližim humanim Vκ i svim humanim Jκ genskim segmentima (FIG. 2C i 2D; Tabele 2 i 4). Za razliku od metoda opisanog u Primeru 1 za lokus teškog lanca, ceo mišji Vκ genski region, koji sadrži sve Vκ i Jκ genske segmente, bio je izbrisan u procesu od tri koraka pre nego što je bila dodata bilo kakva humana sekvenca. Prvo je bila uvedena neo kaseta na bližem kraju varijabilnog regiona (Korak A, FIG.2C). Kao sledeće, bila je umetnuta hyg kaseta na udaljeniji kraj κ lokusa (Korak B, FIG.2C). LoxP mesta su bila ponovo smeštena unutar svake selekcione kasete, kao što je CRE tretmanom indukovana delecija preostalih 3 Mb mišjeg Vκ regiona zajedno sa oba gena otpornosti (Korak C, FIG.2C).

[0540] Humani genomski fragment veličine od oko 480 kb koji sadrži ceo imunoglobulinski varijabilni region κ lakog lanca je bio umetnut u četiri sukcesivna koraka (FIG.2D; Tabele 2 i 4), pri čemu je humana imunoglobulinska sekvenca κ lakog lanca od do 150 kb umetnuta u jednom koraku, uz korišćenje metoda sličnih onima koje su korišćene za teški lanac (vidi Primer 1). Finalni gen otpornosti na higromicin je bio odstranjen prolaznom FLPe ekspresijom. Kao i kod teškog lanca, ciljni klonovi ES ćelija su bili ocenjeni u pogledu integriteta celog humanog inserta, normalnosti kariotipa i potencijala germinativne linije posle svakog koraka. Bili su generisani homozigotni miševi za svaki od alela κ lakog lanca i utvrđeno je da su zdravi i normalnog izgleda.

TABELA 4

Primer 2. Generisanje potpuno humanizovanih miševa kombinacijom više humanizovanih imunoglobulinskih alela

[0541] U nekoliko trenutaka, ES ćelije koje su nosile deo humanih imunoglobulinskih varijabilnih repertoara teškog lanca ili κ lakog lanca kao što je opisano u Primeru 1 su bile mikroinjektirane, a rezultujući miševi ukrštani da bi se stvorilo više verzija VELOCIMMUNE® miševa sa progresivno većim udelima imunoglobulinskog repertoara humane germinativne linije (Tabela 5; FIG.5A i 5B). VELOCIMMUNE® 1 (V1) miševi poseduju 18 humanih VH genskih segmenata i sve humane DH i JH genske segmente kombinovane sa 16 humanih Vκ genskih segmenata i svim humanim Jκ genskim segmentima. VELOCIMMUNE® 2 (V2) i VELOCIMMUNE® (V3) miševi imaju povećane varijabilne repertoare koji nose ukupno 39 VH i 30 Vκ, i 80 VH i 40 Vκ, respektivno. Pošto su genomski regioni koji kodiraju mišje VH, DH i JH genske segmente, i Vκ i Jκ genske segmente, bili potpuno zamenjeni, antitela koja proizvodi bilo koja verzija VELOCIMMUNE® miševa sadrže humane varijabilne regione povezane sa mišjim konstantnim regionima. Lokusi mišjeg λ lakog lanca ostaju intaktni u svim verzijama VELOCIMMUNE® miševa i služe kao komparator za efikasnost ekspresije različitih VELOCIMMUNE ® lokusa κ lakog lanca.

[0542] Miševi koji su dvostruko homozigotni za humanizacije i imunoglobulinskog teškog lanca, i κ lakog lanca bili su generisani iz podskupa alela opisanih u Primeru 1. Svi uočeni genotipovi u toku ukrštanja da bi se generisali dvostruko homozigotni miševi su se nalazili približno u Mendelovskim udelima. Muško potomstvo homozigotno za svaki od humanih alela teškog lanca je odlikovala smanjena plodnost. Smanjena plodnost je bila posledica gubitka mišje ADAM6 aktivnosti. Mišji varijabilni genski lokus teškog lanca sadrži dva ugrađena funkcionalna ADAM6 gena (ADAM6a i ADAM6b). U toku humanizacije mišjeg varijabilnog genskog lokusa teškog lanca, umetnuta humana genomska sekvenca je sadržala ADAM6 pseudogen. Mišji ADAM6 može biti potreban za plodnost, a shodno tome, nedostatak mišjih ADAM6 gena u varijabilnim genskim lokusima humanizovanog teškog lanca bi mogao dovesti do smanjene plodnosti kod ovih miševa bez obzira na prisustvo humanog pseudogena. Primeri 7-9 precizno opisuju zamenu izbrisanih mišjih ADAM6 gena nazad u varijabilnom genskom lokusu humanizovanog teškog lanca, i ponovno uspostavljanje nivoa plodnosti prirodnog tipa kod miševa sa humanizovanim imunoglobulinskim lokusom teškog lanca.

TABELA 5

Primer 3. Populacije limfocita u miševima sa humanizovanim imunoglobulinskim genima

[0543] Populacije zrelih B ćelija u tri različite verzije VELOCIMMUNE® miševa su bile određene protočnom citometrijom.

[0544] Ukratko, suspenzije ćelija iz koštane srži, slezine i timusa su bile napravljene korišćenjem standardnih metoda. Ćelije su bile resuspendovane sa 5x10<5>ćelija/mL u BD Pharmingen FACS puferu za bojenje, pa su blokirane sa anti-mišjim CD16/32 (BD Pharmingen), te su obojene sa podesnim koktelom antitela i fiksirane su sa BD Cytofix™, sve u skladu sa instrukcijama proizvođača. Finalne ćelijske pelete su bile resuspendovane u 0.5 mL pufera za bojenje, pa su analizirane korišćenjem BD FACSCALIBUR ™ i BD CELLQUEST PRO™ softvera. Sva antitela (BD Pharmingen) su bila pripremljena u masovnom razređenju/koktelu, te su dodata do finalne koncentracije od 0.5 mg/10<5>ćelija. Kokteli antitela za bojenje koštane srži (A-D) su bili kao što sledi: A: anti-mišji IgM-FITC, anti-mišji IgM<a>-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; B: anti-mišji CD43(S7)-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; C: anti-mišji CD24(HSA)-PE; anti-mišji CD45R(B220)-APC; D: anti-mišji BP-1-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC. Kokteli antitela za bojenje slezine i ingvinalnog limfnog čvora (E-H) su bili kao što sledi: E: anti-mišji IgM-FITC, anti-mišji IgM<a>-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; F: anti-mišji Ig, a1, a2, a3 Laki lanac-FITC, anti-mišji Igκ laki lanac-PE, anti-mišji CD45R(B220)-APC; G: anti-mišji Ly6G/C-FITC, anti-mišji CD49b(DX5)-PE, anti-mišji CD11b-APC; H: anti-mišji CD4(L3T4)-FITC, anti-mišji CD45R(B220)-PE, anti-mišji CD8a-APC. Rezultati su prikazani na FIG.6.

[0545] Limfociti izolovani iz slezine ili limfnog čvora homozigotnih VELOCIMMUNE® miševa su bilo obojeni radi površinske ekspresije markera B220 i IgM, pa su analizirani korišćenjem protočne citometrije (FIG.6). Veličine B220<+>IgM<+>populacija zrelih B ćelija u svim testiranim verzijama VELOCIMMUNE® miševa su bile praktično identične sa onima kod miševa prirodnog tipa, bez obzira na broj VH genskih segmenata koje su sadržali. Pored toga, miševi koji su sadržali homozigotne hibridne humanizovane imunoglobulinske lokuse teškog lanca, čak i oni sa samo 3 VH genska segmenta, ali sa normalnim mišjim imunoglobulinskim lokusima κ lakog lanca ili miševi koji sadrže homozigotne hibridne lokuse humanizovanog κ lakog lanca sa normalnim mišjim imunoglobulinskim lokusima teškog lanca, takođe su imali normalne brojeve B220<+>IgM<+>ćelija u svojim perifernim odeljcima (nije prikazano). Ovi rezultati ukazuju da himerični lokusi sa humanim varijabilnim genskim segmentima i mišjim konstantnim regionima mogu potpuno popuniti odeljak zrelih B ćelija. Dalje, broj varijabilnih genskih segmenata bilo na lokusima teškog lanca ili κ lakog lanca, a shodno tome i teorijska raznovrsnost repertoara antitela, nisu u korelaciji sa sposobnosti generisanja populacija zrelih B ćelija prirodnog tipa. Nasuprot tome, miševi sa slučajno integrisanim potpuno-humanim imunoglobulinskim transgenima i inaktiviranim mišjim imunoglobulinskim lokusima imaju smanjen broj B ćelija u ovim odeljcima, pri čemu stepen deficita zavisi od broja varijabilnih genskih segmenata uključenih u transgen (Green, L.L., i Jakobovits, A. (1998). Regulation of B cells development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes. J Exp Med 188, 483-495). Ovo pokazuje da strategija "in situ genetske humanizacije" rezultuje fundamentalno drugačijim funkcionalnim ishodom od slučajne integracije transgena ostvarene "inaktivacija-plus-transgeni" pristupom.

[0546] Alelska ekskluzija i izbor lokusa. Sposobnost zadržavanja alelske ekskluzije je bila ispitana kod miševa heterozigotnih za različite verzije humanizovanog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca.

[0547] Humanizacija imunoglobulinskih lokusa je bila izvedena na F1 ES liniji (F1H4 (Valenzuela et al., 2003)), koja potiče od 129S6/SvEvTac i C57BL/6NTac heterozigotnih embriona. Humane varijabilne genske sekvence teškog lanca germinativne linije su usmerene na 129S6 alel, koji nosi IgM<a>haplotip, dok nemodifikovani mišji C576BL/6N alel nosi IgMhaplotip. Ove alelske forme IgM se mogu karakterisati protočnom citometrijom uz korišćenje antitela specifičnih za polimorfizme koji su nađeni u IgM<a>ili IgMalelima. Kao što je prikazano na FIG.6 (donji red), B ćelije identifikovane u miševima heterozigotnim za svaku verziju humanizovanog lokusa teškog lanca izražavaju samo jedan alel, bilo IgM<a>(humanizovani alel) ili IgM(alel prirodnog tipa). Ovo pokazuje da su mehanizmi uključeni u alelsku ekskluziju intaktni kod VELOCIMMUNE® miševa. Pored toga, relativni broj B ćelija pozitivnih za humanizovani alel (IgM<a>) je približno proporcionalan broju prisutnih VH genskih segmenata. Humanizovani imunoglobulinski lokus je izražen u približno 30% B ćelija u VELOCIMMUNE® 1 heterozigotnih miševa, koji imaju 18 humanih VH genskih segmenata, i u 50% B ćelija u VELOCIMMUNE® 2 i 3 (nije prikazano) heterozigotnih miševa, sa 39 i 80 humanih VH genskih segmenata, respektivno. Značajno je da je odnos ćelija koje izražavaju humanizovani prema mišjem alelu prirodnog tipa (0.5 za VELOCIMMUNE® 1 miševe i 0.9 za VELOCIMMUNE® 2 miševe) veći od odnosa broja varijabilnih genskih segmenata sadržanih u humanizovanim lokusima prema onima prirodnog tipa (0.2 za VELOCIMMUNE® 1 miševe i 0.4 za VELOCIMMUNE® 2 miševe). Ovo može ukazivati da je verovatnoća izbora alela intermedijer između slučajnog izbora jednog ili drugog hromozoma i slučajnog izbora bilo kog specifičnog V segmenta RSS. Dalje, može postojati frakcija B-ćelija, ali ne sve, u kojima jedan alel postaje dostupan za rekombinaciju, izvodi proces i prekida rekombinaciju pre nego što drugi alel postane dostupan. Pored toga, podjednaka raspodela ćelija koje imaju površinski IgM (sIgM) potiče bilo od hibridnog humanizovanog lokusa teškog lanca ili lokusa teškog lanca miša prirodnog tipa je dokaz da hibridni lokus funkcioniše na normalnom nivou.

Nasuprot tome, slučajno integrisani humani imunoglobulinski transgeni se slabo nadmeću sa imunoglobulinskim lokusima miševa prirodnog tipa (Bruggemann, M. et al. (1989) A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice. PNAS 86, 6709-6713; Green et al., 1994; Tuaillon, N. et al. (1993) Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in mu i gamma transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 3720-3724). Ovo dalje pokazuje da su imunoglobulini proizvedeni od strane VELOCIMMUNE® miševa funkcionalno različiti od onih koji su proizvedeni pomoću slučajno integrisanih transgena u miševima napravljenim pristupima "inaktivacijaplus-transgeni".

[0548] Polimorfizni Cκ regiona nisu raspoloživi u 129S6 ili C57BL/6N da bi se ispitala alelska ekskluzija humanizovanog prema nehumanizovanom lokusu κ lakog lanca. Međutim, svi VELOCIMMUNE® miševi poseduju prirodni tip lokusa mišjeg λ lakog lanca, zbog čega je moguće uočiti da li rearanžiranje i ekspresija lokusa humanizovanog κ lakog lanca mogu sprečiti ekspresiju mišjeg λ lakog lanca. Odnos broja ćelija koje izražavaju humanizovani κ laki lanac u odnosu na broj ćelija koje izražavaju mišji λ laki lanac je bio relativno nepromenjen kod VELOCIMMUNE® miševa u poređenju sa miševima prirodnog tipa, bez obzira na broj umetnutih humanih Vκ genskih segmenata na lokusu κ lakog lanca (FIG.6, treći red odozgo). Pored toga, nema povećanja broja dvostruko pozitivnih (κ plus λ) ćelija, što ukazuje da produktivna rekombinacija na hibridnim lokusima κ lakog lanca rezultuje odgovarajućim sprečavanjem rekombinacije lokusa mišjeg λ lakog lanca. Nasuprot tome, miševe koji sadrže slučajno integrisane transgene κ lakog lanca sa inaktiviranim lokusima mišjeg κ lakog lanca, ali lokuse mišjeg λ lakog lanca prirodnog tipa odlikuje dramatično povećanje λ/κ odnosa (Jakobovits, 1998), što ukazuje da uvedeni transgeni κ lakog lanca ne funkcionišu dobro u takvim miševima. Ovo dalje pokazuje drugačije funkcionalne ishode uočene kod imunoglobulina napravljenih od strane VELOCIMMUNE® miševa u poređenju sa onima napravljenim od strane "inaktivacija-plus-transgeni" miševa.

[0549] Razvoj B ćelija. Pošto populacije zrelih B ćelija u VELOCIMMUNE® miševima liče na one kod miševa prirodnog tipa (opisane gore), moguće je da su defekti u ranoj diferencijaciji B ćelija kompenzovani ekspanzijom populacija zrelih B ćelija. Različiti stadijumi diferencijacije B ćelija su bili ispitani analizom populacija B ćelija korišćenjem protočne citometrije. Tabela 6 prikazuje odnos udela ćelija svake B ćelijske loze definisane pomoću FACs, uz korišćenje specifičnih ćelijskih površinskih markera, kod VELOCIMMUNE® miševa u poređenju sa parnjacima iz okota prirodnog tipa.

[0550] Rani razvoj B ćelija se odvija u koštanoj srži, a različiti stadijumi diferencijacije B ćelija su karakterisani promenama tipova i vrednošću ekspresije ćelijskog površinskog markera. Ove razlike u površinskoj ekspresiji korelišu sa molekulskim promenama koje se odvijaju na imunoglobulinskim lokusima unutar ćelije. Tranzicija pro-B do pre-B ćelija zahteva uspešno rearanžiranje i ekspresiju proteina funkcionalnog teškog lanca, dok tranzicijom od pre-B u zreli B stadijum upravlja pravilno rearanžiranje i ekspresija κ ili λ lakog lanca. Shodno tome, neefikasna tranzicija između stadijuma diferencijacije B ćelija može biti detektovana promenama relativnih populacija B ćelija u datom stadijumu.

TABELA 6

[0551] Nisu bili uočeni veći defekti u diferencijaciji B ćelija u bilo kom od VELOCIMMUNE® miševa. Izgleda da uvođenje humanih genskih segmenata teškog lanca ne utiče na tranziciju pro-B u pre-B, i da uvođenje humanih genskih segmenata κ lakog lanca ne utiče na tranziciju pre-B u B tranziciju kod VELOCIMMUNE® miševa. Ovo dokazuje da "reverzno himerični" imunoglobulinski molekuli koji poseduju humane varijabilne regione i mišje konstante funkcionišu normalno u kontekstu signalizacije B ćelija i ko-receptorskih molekula, što dovodi do odgovarajuće diferencijacije B ćelija u mišjem okruženju. Nasuprot tome, ravnoteža između različitih populacija u toku diferencijacije B ćelija je poremećena do različitih stepena u miševima koji sadrže slučajno integrisane imunoglobulinske transgene i inaktivirane endogene lokuse teškog lanca ili κ lakog lanca (Green i Jakobovits, 1998).

Primer 4. Varijabilni genski repertoar kod humanizovanih imunoglobulinskih miševa

[0552] Korišćenje humanih varijabilnih genskih segmenata u repertoaru humanizovanih antitela VELOCIMMUNE® miševa bilo je analizirano pomoću lančane reakcije polimeraze sa reverznom transkriptazom (RT-PCR) humanih varijabilnih regiona iz više izvora uključujući splenocite i hibridoma ćelije. Bili su određeni sekvenca varijabilnog regiona, korišćenje genskog segmenta, somatska hipermutacija, i raznovrsnost spajanja rearanžiranih genskih segmenata varijabilnog regiona.

[0553] Ukratko, celokupna RNK je bila ekstrahovana iz 1 x 10<7>-2 x 10<7>splenocita ili oko 10<4>-10<5>hibridoma ćelija uz korišćenje TRIZOL™ (Invitrogen) ili Qiagen RNEASY™ Mini Kita (Qiagen), pa je izvršeno prajmiranje sa prajmerima specifičnim za mišji konstantni region uz korišćenje SUPERSCRIPT™ III One-Step RT-PCR sistema (Invitrogen). Reakcije su bile izvedene sa 2-5 μL RNK iz svakog uzorka uz korišćenje gore navedenih 3’ konstantnih specifičnih prajmera uparenih sa objedinjenim liderskim prajmerima za svaku porodicu humanih varijabilnih regiona i za teški lanac, i za κ laki lanac, posebno. Zapremine reagenasa i prajmera, i RT-PCR/PCR uslovi su bili izvedeni u skladu sa instrukcijama proizvođača. Sekvence prajmera su bile bazirane na više izvora (Wang, X. i Stollar, B.D. (2000) Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR. J Imunol Methods 244:217-225; Ig-primer sets, Novagen). Tamo gde je bilo podesno, ubačene sekundarne PCR reakcije su bile izvedene sa objedinjenim prajmerima sa okvirima specifičnim za familije, a isti mišji 3’ imunoglobulinski konstantni-specifični prajmer je korišćen u primarnoj reakciji. Alikvoti (5 μL) iz svake reakcije su bili analizirani agaroznom elektroforezom, a proizvodi reakcije su bili prečišćeni iz agaroze korišćenjem MONTAGE™ Gel Extraction Kit-a (Millipore). Prečišćeni proizvodi su bili klonirani korišćenjem TOPO™ TA sistema za kloniranje (Invitrogen) i transformisani su u DH10β E.coli ćelijama elektroporacijom. Pojedinačni klonovi su bili izabrani iz svake reakcije transformacije, pa su gajeni u 2 mL LB bujonskih kultura sa selekcijom antibiotikom preko noći na 37°C. Plazmidna DNK je bila prečišćena iz bakterijskih kultura pristupom baziranim na kitu (Qiagen).

[0554] Korišćenje imunoglobulinskih varijabilnih gena. Plazmidne DNK i teškog lanca, i κ lakog lanca klonova su bile sekvencirane sa T7 ili M13 reverznim prajmerima na ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Sirovi podaci o sekvencama su bili učitani u SEQUENCHER™ (v4.5, Gen Codes). Svaka sekvenca je bila sastavljena u kontizima (tj. preklapajućim sekvencama) i poravnata je sa humanim imunoglobulinskim sekvencama uz korišćenje IMGT V-Quest (Brochet, X., Lefranc, M.P., i Giudicelli, V. (2008). IMGT/VQUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Res 36, W503-508) da bi se pronašla funkcija za identifikaciju korišćenja humanih VH, DH, JH i Vκ, Jκ segmenata. Sekvence su bile upoređene sa sekvencama germinativnih linija u pogledu somatske hipermutacije i analize rekombinacije spojeva.

[0555] Miševi su bili generisani od ES ćelija koje su sadržale inicijalnu modifikaciju teškog lanca (3hVH-CRE hibridni alel, donja strana na FIG.2A) pomoću RAG nadomeštavanja (Chen, J. et al. (1993) RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 4528-4532), a kDNK je bila pripremljena od RNK iz splenocita. kDNK je bila amplifikovana uz korišćenje setova prajmera (opisanih gore) specifičnih za iRNK predviđenog himeričnog teškog lanca koja bi se dobila V(D)J rekombinacijom u okviru umetnutih humanih genskih segmenata i sledstvenog splajsovanja mišjih IgM ili IgG konstantnih domena. Sekvence dobijene iz ovih kDNK klonova (nisu prikazane) su pokazale da je pošto do adekvatne V(D)J rekombinacije u okviru humanih varijabilnih genskih sekvenci, da su rearanžirani humani V(D)J genski segmenti bili adekvatno splajsovani unutar okvira mišjih konstantnih domena i da je došlo do rekombinacije sa promenom klase. Dalje je bila izvršena sekventna analiza iRNK proizvoda sledstvenih hibridnih imunoglobulinskih lokusa.

[0556] U sličnom eksperimentu, B ćelije iz neimunizovanih miševa prirodnog tipa i VELOCIMMUNE® miševa su bile izdvojene protočnom citometrijom baziranoj na površinskoj ekspresiji B220 i IgM ili IgG. B220<+>IgM<+>ili površinske IgG<+>(sIgG<+>) ćelije su bile objedinjene, a VH i Vκ sekvence su bile dobijene posle RT-PCR amplifikacije i kloniranja (opisanih gore). Bilo je zabeleženo reprezentativno korišćenje gena u setu RT-PCR amplifikovanih kDNKs iz neimunizovanih VELOCIMMUNE® 1 miševa (Tabela 7) i VELOCIMMUNE® 3 miševa (Tabela 8) (*defektno RSS; †nedostajuće ili pseudogen).

[0557] Kao što je prikazano u Tabelama 7 i 8, upotrebljeni su skoro svi funkcionalni humani VH, DH, JH, Vκ i Jκ genski segmenti. Od funkcionalnih varijabilnih genskih segmenata opisanih, ali ne i detektovanih u VELOCIMMUNE® miševima u ovom eksperimentu, za nekoliko je bilo navedeno da poseduju defektne sekvence rekombinacionog signala (RSS) i, shodno tome, ne bi se očekivalo da budu izražene (Feeney, A.J. (2000) Factors that influence formation of B cell repertoire. Imunol Res 21, 195-202). Analiza nekoliko drugih setova imunoglobulinskih sekvenci od različitih VELOCIMMUNE® miševa, izolovanih i iz naivnih, i iz imunizovanih repertoara, pokazala je korišćenje ovih genskih segmenata, mada sa manjim učestanostima (podaci nisu prikazani). Agregatni podaci o korišćenju gena su pokazali da su svi funkcionalni humani VH, DH, JH, Vκ, i Jκ genski segmenti sadržani u VELOCIMMUNE® miševima bili uočeni u različitim naivnim i imunizovanim repertoarima (podaci nisu prikazani). Mada je humani VH7-81 genski segment bio identifikovan u analizi sekvence humanog lokusa teškog lanca (Matsuda, F. et al. (1998) The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. J Exp Med 188, 2151-2162), on nije bio prisutan u VELOCIMMUNE® miševima, što je potvrđeno resekvenciranjem celog VELOCIMMUNE® 3 mišjeg genoma.

[0558] Poznato je da sekvence teških i lakih lanaca antitela pokazuju izuzetnu varijabilnost, a naročito u kratkim polipeptidnim segmentima u okviru rearanžiranog varijabilnog domena. Ovi regioni, poznati kao hipervarijabilni regioni ili regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) stvaraju mesto vezivanja za antigen u strukturi molekula antitela. Intervenišuće sekvence se nazivaju regioni okvira (FRs). Postoje po tri CDRs (CDR1, CDR2, CDR3) i po 4 FRs (FR1, FR2, FR3, FR4) i u teškom, i u lakom lancu. Jedan CDR, CDR3, je jedinstven po tome što je ovaj CDR stvoren rekombinacijom i VH, DH i JH i Vκ i Jκ genskih segmenata i on generiše značajnu količinu raznovrsnosti repertoara pre susreta sa antigenom. Ovo spajanje je neprecizno i zbog nukleotidne delecije putem egzonukleazne aktivnosti, i nešematski kodiranih adicija putem terminalne deoksinukleotidil transferaze (TdT) i, shodno tome, omogućava da iz procesa rekombinacije nastanu nove sekvence. Mada FRs mogu ispoljiti suštinsku somatsku mutaciju zbog visoke mutabilnosti varijabilnog regiona kao celine, varijabilnost, međutim, nije ravnomerno raspoređena duž varijabilnog regiona. CDRs su koncentrisani i lokalizovani regioni sa visokom varijabilnosti površine molekula antitela koja omogućava vezivanje antigena.

Sekvence teškog lanca i lakog lanca izabranog antitela iz VELOCIMMUNE® miševa oko CDR3 spoja koje ispoljavaju raznovrsnost spajanja su prikazane na FIG.7A i 7B, respektivno.

[0559] Kao što je prikazano na FIG.7A, nešematski kodirane nukleotidne adicije (N-adicije) su bile uočene u VH-DH i DH-JH spojevima u antitelima iz VELOCIMMUNE® miševa, što ukazuje na adekvatnu funkciju TdT sa humanim segmentima. Krajnje tačke VH, DH i JH segmenata u odnosu na parnjake iz njihovih germinativnih linija ukazuju da je takođe došlo i do egzonukleazne aktivnosti. Za razliku od lokusa teškog lanca, rearanžiranja humanog κ lakog lanca ispoljavaju malo ili nimalo TdT adicija na CDR3, koji je formiran rekombinacijom Vκ i Jκ segmenata (FIG.7B). Ovo je očekivano zbog nedostatka TdT ekspresije u miševima u toku rearanžiranja lakog lanca pri prelasku pre-B u B ćelije. Raznovrsnost uočena kod CDR3 rearanžiranih humanih Vκ regiona je uvedena uglavnom zahvaljujući egzonukleaznoj aktivnosti u toku procesa rekombinacije.

[0560] Somatska hipermutacija. Dodatna raznovrsnost je dodata varijabilnim regionima rearanžiranih imunoglobulinskih gena u toku germinalne centralne reakcije pomoću procesa koji se naziva somatska hipermutacija. B ćelije koje izražavaju somatski mutirane varijabilne regione se nadmeću sa drugim B ćelijama za pristup antigenu prezentovanog folikularnim dendritskim ćelijama. One B ćelije sa većim afinitetom za antigen će dalje ekspandovati i biti podvrgnute promeni klase pre nego što izađu na periferiju. Shodno tome, B ćelije koje izražavaju promenjene izotipove obično imaju presretnuti antigen i podvrgnute su germinalnim centralnim reakcijama i imaće povećani broj mutacija u odnosu na naivne B ćelije. Dalje, očekivalo bi se da sekvence varijabilnog regiona iz preovladavajuće naivnih sIgM<+>B ćelija imaju relativno manje mutacija od varijabilnih sekvenci iz sIgG<+>B ćelija koje su bile podvrgnute antigenskoj selekciji.

[0561] Sekvence iz slučajnih VH ili Vκ klonova od sIgM<+>ili sIgG<+>B ćelija iz neimunizovanih VELOCIMMUNE® miševa ili sIgG<+>B ćelije iz imunizovanih miševa su bile upoređene sa varijabilnim genskim segmentima svojih germinativnih linija i zabeležene su promene u odnosu na sekvencu germinativne linije. Rezultujuće nukleotidne sekvence su bile translirane in silico, a takođe su zabeležene mutacije koje su dovele do promene aminokiselina. Bili su sravnjeni podaci iz svih varijabilnih regiona, pa je bila izračunata procentualna promena na datoj poziciji (FIG.8).

[0562] Kao što je prikazano na FIG.8, humane varijabilne regione teškog lanca dobijene iz sIgG<+>B ćelija iz neimunizovanih VELOCIMMUNE® miševa odlikuje mnogo više nukleotida u odnosu na sIgM<+>B ćelije iz istih pulova splenocita, a varijabilne regione teškog lanca koji potiču iz imunizovanih miševa odlikuje čak još više promena. Broj promena se povećao u regionima koji određuju komplementarnost (CDRs) u odnosu na regione okvira, što ukazuje na antigensku selekciju. Odgovarajuće aminokiselinske sekvence iz humanih varijabilnih regiona teškog lanca takođe odlikuju znatno veći brojevi mutacija u IgG prema IgM i čak još više u imunizovanom IgG. Ponovo izgleda da su ove mutacije češće u CDRs u poređenju sa sekvencama okvira, što sugeriše da su antitela bila antigenskiselekcionisana in vivo. Slično povećanje broja mutacija na nukleotidima i aminokiselinama je viđeno u Vκ sekvencama koje potiču od IgG<+>B ćelija iz imunizovanih miševa.

[0563] Korišćenje gena i somatska hipermutacija uočene kod VELOCIMMUNE® miševa pokazuju da su u suštini svi prisutni genski segmenti bili sposobni za rearanžiranje da bi formirali potpuno funkcionalna reverzna himerična antitela u ovim miševima. Dalje, VELOCIMMUNE® antitela u okviru mišjeg imunog sistema u potpunosti učestvuju u podvrgavanju afinitetnoj selekciji i sazrevanju da bi se stvorila potpuno zrela humana antitela koja mogu efektivno da neutralizuju svoj ciljani antigen. VELOCIMMUNE® miševi su sposobni za stvaranje robusnih imunih reakcija protiv više klasa antigena, što rezultuje korišćenjem širokog spektra humanih antitela koja imaju i visoki afinitet, i podesna su za terapeutsku primenu (podaci nisu prikazani).

Primer 5. Analiza limfoidne strukture i serumskih izotipova

[0564] Ukupna struktura slezine, ingvinalnih limfnih čvorova, Peyer-ove ploče i timusa iz uzoraka tkiva od miševa prirodnog tipa ili VELOCIMMUNE® miševa dobijenih sa H&E je bila ispitana svetlosnom mikroskopijom. Nivoi imunoglobulinskih izotipova u serumu sakupljenom iz miševa prirodnog tipa i VELOCIMMUNE® miševa su bili analizirani korišćenjem LUMINEX™ tehnologije.

[0565] Struktura limfoidnih organa. Struktura i funkcija limfoidnih tkiva su delimično zavisne od adekvatnog razvoja hematopoetičnih ćelija. Defekt u razvoju B ćelija ili funkciji može biti ispoljen kao promena u strukturi limfoidnih tkiva. Posle analize obojenih sekcija tkiva, nisu bile identifikovane značajne razlike u izgledu sekundarnih limfoidnih organa između miševa prirodnog tipa i VELOCIMMUNE® miševa (podaci nisu prikazani).

[0566] Serumski imunoglobulinski nivoi. Nivo ekspresije svakog izotipa je sličan u miševima prirodnog tipa i VELOCIMMUNE ® miševima (FIG.9A, 9B i 9C). Ovo pokazuje da humanizacija varijabilnih genskih segmenata nije imala očigledan negativni efekat na promenu klase ili ekspresiju i sekreciju imunoglobulina i da su zato očigledno zadržane sve endogene mišje sekvence koje su neophodne za ove funkcije.

Primer 6. Imunizacija i proizvodnja antitela u humanizovanim imunoglobulinskim miševima

[0567] Različite verzije VELOCIMMUNE® miševa su bile imunizovane sa antigenom da bi se ispitala humoralna reakcija na test sa stranim antigenom.

[0568] Imunizacija i razvoj hibridoma. VELOCIMMUNE® i miševi prirodnog tipa mogu biti imunizovani sa antigenom u obliku proteina, DNK, kombinacije DNK i proteina, ili ćelija koje izražavaju antigen. Životinje su obično pojačavane svake tri nedelje dodatnih dva do tri puta. Posle svakog pojačanja antigena, uzimani su uzorci seruma od svake životinje, pa su analizirani u pogledu antigen-specifičnih reakcija antitela određivanjem serumskog titra. Pre fuzije, miševi su primili finalno pre-fuziono pojačanje od 5 μg proteina ili DNK, kako je bilo poželjno, intra-peritonealnim i/ili intravenskim injekcijama. Splenociti su sakupljeni i fuzionisani sa Ag8.653 mijeloma ćelijama u komori za elektrofuziju u skladu sa sugerisanim protokolom proizvođača (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD). Posle deset dana kultivacije, izvršen je skrining hibridoma u pogledu specifičnosti za antigen uz korišćenje ELISA testa (Harlow, E. i Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, New York). Alternativno tome, antigen specifične B ćelije su izolovane direktno iz imunizovanih VELOCIMMUNE® miševa, pa je izvršen njihov skrining korišćenjem standardnih tehnika, uključujući i one koje su ovde opisane, da bi se dobila humana antitela specifična za antigen od interesa.

[0569] Određivanje serumskog titra. Da bi se pratila anti-antigen serumska reakcija životinja, uzorci seruma su bili uzeti oko 10 dana posle svakog pojačanja, pa su određeni titri korišćenjem antigen specifične ELISE. Ukratko, Nunc MAXISORP™ ploče sa 96 bunarčića su bile obložene sa 2 μg/mL antigena preko noći na 4° C, pa su bile blokirane goveđim serumskim albuminom (Sigma, St. Louis, MO). Uzorcima seruma u serijskim 3-strukim razređivanjima je bilo dopušteno da se vežu za ploče tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Ploče su onda bile isprane sa PBS koji je sadržao 0.05% Tween-20, pa je vezani IgG bio detektovan korišćenjem HRP-konjugovanog kozijeg anti-mišjeg Fc (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) u pogledu ukupnog IgG titra, ili biotinom-obeleženih poliklonskih antitela specifičnih za izotip ili laki lanac (SouthernBiotech Inc.) za izotipski specifične titre, respektivno. Za biotinom-obeležena antitela, posle ispiranja ploče, bio je dodat HRP-konjugovani streptavidin (Pierce, Rockford, IL). Sve ploče su bile razvijene uz korišćenje kolorimetrijskih supstrata, kao što je BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Pošto je reakcija zaustavljena sa 1 M fosforne kiseline, snimljene su optičke apsorpcije na 450 nm, a podaci su bili analizirani uz korišćenje PRISM™ softvera firme Graph Pad. Razređenja potrebna za dobijanje dvostrukog u odnosu na pozadinski signal su bila definisana kao titar.

[0570] U jednom eksperimentu, VELOCIMMUNE® miševi su bili imunizovani sa humanim interleukinskim-6 receptorom (hIL-6R). Reprezentativni set serumskih titara za VELOCIMMUNE® miševe i miševe prirodnog tipa imunizovane sa hIL-6R je prikazan na FIG.10A i 10B.

[0571] VELOCIMMUNE® miševi i miševi prirodnog tipa su razvili jake reakcije na IL-6R sa sličnim opsezima titara (FIG.10A). Nekoliko miševa iz grupa VELOCIMMUNE® i prirodnog tipa je dostiglo maksimalnu reakciju posle jednog jedinog pojačanja antigenom. Ovi rezultati ukazuju da su jačina i kinetika imunih reakcija na ovaj antigen bile slične i kod VELOCIMMUNE® miševa, i kod miševa prirodnog tipa miševa. Ove antigen-specifične reakcije antitela su bile dalje analizirane da bi se ispitali specifični izotipovi antigen-specifičnih antitela pronađenih u serumima. I VELOCIMMUNE® grupe, i grupe prirodnog tipa su preovladavajuće pobudile IgG1 reakciju (FIG.10B), što sugeriše da je promena klase u toku humoralne reakcije slična kod miševa svakog tipa.

[0572] Određivanje afiniteta antitela koje vezuje antigen u rastvoru. Kompetitivni test u rastvoru baziran na ELISI je osmišljen tipično za određivanje afiniteta vezivanja antitela za antigen.

[0573] Ukratko, antitela u kondicioniranom medijumu su prethodno pomešana sa serijskim razređenjima antigenog proteina u opsegu od 0 do 10 mg/mL. Rastvori smeše antitela i antigena su onda bili inkubirani od dva do četiri sata na sobnoj temperaturi da bi se dostigla ravnoteža vezivanja. Količine slobodnog antitela u smešama su onda izmerene korišćenjem kvantitativne sendvič ELISE. Ploče MAXISORB™ sa 96 bunarčića (VWR, West Chester, PA) su obložene sa 1 μg/mL antigenog proteina u PBS rastvoru preko noći na 4°C, što je bilo praćeno BSA nespecifičnim blokiranjem. Rastvori sa smešom antitelo-antigen su onda preneti u ove ploče, što je bilo praćeno jednosatnom inkubacijom. Ploče su onda bile isprane puferom za ispiranje, pa su antitela vezana na ploče bila detektovana sa HRP-konjugovanim kozijim anti-mišjim IgG poliklonskim antitelom kao reagensom (Jackson Imuno Research Lab) i razvijena su korišćenjem kolorimetrijskog supstrata kao što je BD OPTEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Pošto je reakcija zaustavljena sa 1 M fosforne kiseline, zabeležene su optičke apsorpcije na 450 nm, pa su podaci bili analizirani korišćenjem PRISM™ softvera firme Graph Pad. Zavisnosti signala od koncentracija antigena u rastvoru su bile analizirane 4-parametarskom fitujućom analizom i bile su prezentovane kao IC50, koncentracija antigena potrebna za ostvarivanje 50% smanjenja signala od uzoraka antitela bez prisustva antigena u rastvoru.

[0574] U jednom eksperimentu, VELOCIMMUNE® miševi su bili imunizovani sa hIL-6R (kao što je opisano gore). FIG.11A i 11B prikazuju reprezentativni set merenja afiniteta za anti-hIL6R antitela iz VELOCIMMUNE® miševa i miševa prirodnog tipa.

[0575] Pošto su imunizovani miševi primili treće pojačanje antigena, serumski titri su bili određeni pomoću ELISE. Splenociti su izolovani iz izabranih grupa miševa prirodnog tipa i VELOCIMMUNE® miševa, pa su fuzionisani sa Ag8.653 mijeloma ćelijama da bi formirali hibridome i bili gajeni uz selekciju (kao što je opisano gore). Od ukupno proizvedenog 671 anti-IL-6R hibridoma, za 236 je bilo utvrđeno da izražavaju antigen-specifična antitela. Medijumi sakupljeni iz antigen-pozitivnih bunarčića su bili upotrebljeni za određivanje afiniteta vezivanja antitela za antigen uz korišćenje kompetitivne ELISE u rastvoru. Antitela koja potiču od VELOCIMMUNE® miševa ispoljavaju široki spektar afiniteta vezivanja antigena u rastvoru (FIG.11A). Pored toga, za 49 od 236 anti-IL-6R hibridoma je bilo utvrđeno da blokiraju vezivanje IL-6 za receptor u in vitro biotestu (podaci nisu prikazani). Dalje, ovih 49 anti-IL-6R blokirajućih antitela je ispoljilo spektar visokih afiniteta u rastvoru sličan onome za blokirajuća antitela koja potiču od paralelne imunizacije prirodnog tipa miševa (FIG.

11B).

Primer 7. Konstrukcija mišjeg ADAM6 ciljajućeg vektora

[0576] Ciljajući vektor za inserciju mišjih ADAM6a i ADAM6b gena u humanizovani lokus teškog lanca bio je konstruisan korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjeringa (supra) da bi se modifikovao bakterijski veštački hromozom (BAC) 929d24 dobijen od Dr. Fred Alt-a (Harvard University).929d24 BAC DNK je bio dobijen inženjeringom tako da sadrži genomske fragmente koji su sadržali mišje ADAM6a i ADAM6b gene i higromicinsku kasetu za ciljanu deleciju humanog ADAM6 pseudogena (hADAM6ψ) lociranog između humanih VH1-2 i VH6-1 genskih segmenata humanizovanog lokusa teškog lanca (FIG.12).

[0577] Prvo je genomski fragment koji je sadržao mišji ADAM6b gen, -800 bp uzvodno od (5’) sekvence i -4800 bp nizvodno (3’) od sekvence bio subkloniran iz 929d24 BAC klona. Drugi genomski fragment koji je sadržao mišji ADAM6a gen, -300 bp uzvodno od (5’) sekvence i -3400 bp nizvodno od (3’) sekvence, bio je posebno subkloniran iz 929d24 BAC klona. Dva genomska fragmenta koja su sadržala mišje ADAM6b i ADAM6a gene su bila ligatirana na higromicinsku kasetu okruženu Frt rekombinacionim mestima da bi se stvorio ciljajući vektor (mišji ADAM6 ciljajući vektor, Fig.20; SEQ ID NO:3). Različita restrikciona enzimska mesta su bila dobijena inženjeringom na 5’ kraju ciljajućeg vektora posle mišjeg ADAM6b gena i na 3’ kraju posle mišjeg ADAM6a gena (donja strana FIG.12) za ligaciju u humanizovanom lokusu teškog lanca.

[0578] Posebna modifikacija je bila napravljena na BAC klonu koji je sadržao zamenu mišjeg lokusa teškog lanca sa humanim lokusom teškog lanca, koji je sadržao humani ADAM6 pseudogen lociran između humanih VH1-2 i VH6-1 genskih segmenata humanizovanog lokusa radi sledstvene ligacije mišjeg ADAM6 ciljajućeg vektora (FIG.13).

[0579] Ukratko, neomicinska kaseta okružena loxP rekombinacionim mestima je bila dobijena inženjeringom tako da sadrži homologe krakove koji su sadržali humanu genomsku sekvencu na pozicijama 3’ humanog VH1-2 genskog segmenta (5’ u odnosu na hADAM64ψ) i 5’ humanog VH6-1 genskog segmenta (3’ u odnosu na hADAM6ψ; vidi sredinu na FIG.13). Lokacija mesta insercije ovog ciljajućeg konstrukta je bila oko 1.3 kb 5’ i ∼350 bp 3’ od humanog ADAM6 pseudogena.

Ciljajući konstrukt je takođe sadržao ista mesta restrikcije kao mišji ADAM6 ciljajući vektor da bi se omogućila sledstvena BAC ligacija između modifikovanog BAC klona koji je sadržao deleciju humanog ADAM6 pseudogena i mišjeg ADAM6 ciljajućeg vektora.

[0580] Posle digestije BAC DNK koja je poticala od oba konstrukta, genomski fragmenti su bili zajedno ligatirani na konstrukt genetskim inženjeringom dobijenog BAC klona koji je sadržao humanizovani lokus teškog lanca koji je sadržao ektopično postavljenu genomsku sekvencu koja sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b nukleotidne sekvence. Finalni ciljajući konstrukt za deleciju humanog ADAM6 gena u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca i inserciju mišjih ADAM6a i ADAM6b sekvenci u ES ćelije sadržao je, od 5’ do 3’, 5’ genomski fragment koji je sadržao ∼13 kb humane genomske sekvence 3’ humanog VH1-2 genskog segmenta, -800 bp mišje genomske sekvence nizvodno od mišjeg ADAM6b gena, mišji ADAM6b gen, ∼4800 bp genomske sekvence uzvodno od mišjeg ADAM6b gena, 5’ Frt mesto, higromicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, -300 bp mišje genomske sekvence nizvodno od mišjeg ADAM6a gena, mišji ADAM6a gen, ∼3400 bp mišje genomske sekvence uzvodno od mišjeg ADAM6a gena, i 3’ genomski fragment koji je sadržao -30 kb humane genomske sekvence 5’ od humanog VH6-1 genskog segmenta (donja strana FIG. 13).

[0581] Inženjeringom dobijeni BAC klon (opisan gore) je bio upotrebljen za elektroporaciju mišjih ES ćelija koje su sadržale humanizovani lokus teškog lanca da bi se stvorile modifikovane ES ćelije koje sadrže mišju genomsku sekvencu ektopično postavljenu tako da sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca. Pozitivne ES ćelije koje su sadržale ektopični mišji genomski fragment u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca su bile identifikovane kvantitativnim PCR testom uz korišćenje TAQMAN™ proba (Lie, Y.S. i Petropoulos, C.J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5’nuclease assays. Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48). Uzvodni i nizvodni regioni izvan modifikovanog dela humanizovanog lokusa teškog lanca su bili potvrđeni pomoću PCR korišćenjem prajmera i proba lociranih u okviru modifikovanog regiona da bi se potvrdilo prisustvo ektopične mišje genomske sekvence u okviru humanizovanog lokusa teškog lanca, kao i higromicinske kasete. Nukleotidna sekvenca kod uzvodnog mesta insercije sadržala je sledeće, što ukazuje da su humana genomska sekvenca teškog lanca uzvodno od mesta insercije i I-Ceu I restrikciono mesto (sadržano dole unutar zagrada) susedno povezani sa mišjom genomskom sekvencom prisutnom na mestu insercije: (CCAGCTTCAT TAGTAATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGAAGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG ACTGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEQ ID NO:4). Nukleotidna sekvenca kod nizvodnog mesta insercije na 3’ kraju ciljanog regiona sadržala je sledeće, što ukazuje da su mišja genomska sekvenca i PI-Sce I restrikciono mesto (sadržano dole unutar zagrada) susedno povezani sa humanom genomskom sekvencom teškog lanca nizvodno od mesta insercije:

[0582] Gore opisane ciljane ES ćelije su bile upotrebljene kao donorske ES ćelije i uvedene su u mišji embrion u stadijumu od 8-ćelija pomoću VELOCIMOUSE® metoda inženjeringa miševa (vidi, npr. US pat. br.7,6598,442, 7,576,259, 7,294,754). Miševi koji nose humanizovani lokus teškog lanca koji je sadržao ektopičnu mišju genomsku sekvencu koja je sadržala mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence bili su identifikovani genotipizacijom uz korišćenje testa modifikacije alela (Valenzuela et al., 2003) koji je detektovao prisustvo mišjih ADAM6a i ADAM6b gena okviru humanizovanog lokusa teškog lanca.

[0583] Miševi koji su nosili humanizovani lokus teškog lanca koji sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b gene su ukrštani sa FLPe deletorskim sojem miševa (vidi, npr. Rodriguez, C.I. et al. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25:139-140) da bi se odstranila bilo koja Frt’ed higromicinska kaseta uvedena pomoću ciljajućeg vektora koja nije bila odstranjena, npr. u stadijumu ES ćelija ili u embrionu. Opciono, higromicinska kaseta se zadržava u miševima.

[0584] Mladunci su genotipizirani, a mladunac heterozigotan za humanizovani lokus teškog lanca koji je sadržao ektopični mišji genomski fragment koji sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence je izabran za karakterizaciju ekspresije i plodnosti mišjeg ADAM6 gena.

Primer 8. Karakterizacija miševa sa očuvanim ADAM6

[0585] Protočna citometrija. Tri miša starosti od 25 nedelja, homozigotnih za varijabilne genske lokuse humanog teškog i humanog κ lakog lanca (H/κ) i tri miša starosti od 18-20 nedelja, homozigotna za humani teški i humani κ laki lanac koja su imala ektopični mišji genomski fragment koja kodira mišje ADAM6a i ADAM6b gene u okviru oba alela humanog lokusa teškog lanca (H/κ-A6) su bili usmrćeni radi identifikacije i analize populacije limfocitnih ćelija pomoću FACs na BD LSR II sistemu (BD Bioscience). Limfociti su bili gejtovani u pogledu specifičnih ćelijskih linija, te su analizirani u pogledu progresije kroz različite stadijume razvoja B ćelija. Tkiva koja su sakupljena od životinja su obuhvatala krv, slezinu i koštanu srž. Krv je bila uzeta u BD mikrotejner epruvete sa EDTA (BD Biosciences). Koštana srž je bila uzeta iz femura ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom kome su bili dodati fetusni teleći serum, natrijum piruvat, HEPES, 2- merkaptoetanol, neesencijalne aminokiseline, i gentamicin. Crvene krvne ćelije iz preparata krvi, slezine i koštane srži su bile lizirane puferom za lizu na bazi amonijum hlorida (npr. ACK pufer za lizu), što je bilo praćeno ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom.

[0586] Za bojenje populacija ćelija, 1 x 10<6>ćelija iz različitih izvora tkiva je bilo inkubirano sa anti-mišjim CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu tokom 10 minuta, što je bilo praćeno obeležavanjem sa jednog ili kombinacijom sledećih koktela antitela tokom 30 min na ledu.

[0587] Koštana srž: anti-mišji FITC-CD43 (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience), A700-CD19 (1D3, BD Biosciences).

[0588] Periferna krv i slezina: anti-mišji FiTC-κ (187.1, BD Biosciences), PE-λ (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (145-2C11, BD), A700-CD19 (1D3, BD), APC-eFluor780-B220 (RA3-6B2, eBioscience). Posle inkubacije sa obeleženim antitelima, ćelije su bile isprane i fiksirane u 2% formaldehida. Prikupljanje podataka je bilo izvršeno na LSRII protočnom citometru, a analizirani su sa FlowJo. Rezultati za reprezentativne H/κ i H/κ-A6 miševe su prikazani na FIG.14 - 18.

[0589] Rezultati pokazuju da B ćelije H/κ-A6 miševa napreduju kroz stadijume razvoja B ćelija na sličan način kao kod H/κ miševa u koštanoj srži i perifernim odeljcima, i da pokazuju normalne šeme sazrevanja kada jednom uđu u periferiju. H/κ-A6 miševi su pokazali povećanje populacije CD43<int>CD19<+>ćelija u poređenju sa H/κ miševima (FIG.16B). Ovo može ukazivati na ubrzanu IgM ekspresiju iz humanizovanog lokusa teškog lanca koji je sadržao ektopični mišji genomski fragment koji je sadržao mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence u H/κ-A6 miševima. Na periferiji, populacije B i T ćelija H/κ-A6 miševa su izgledale normalno i slično kao kod H/κ miševa.

[0590] Morfologija testisa i karakterizacija sperme. Da bi se odredilo da li je neplodnost kod miševa koji imaju humanizovane imunoglobulinske varijabilne lokuse teškog lanca zbog testisa i/ili defekata proizvodnje sperme, bili su ispitani morfologija testisa i sadržaj sperme u epididimisu.

[0591] Ukratko, testisi iz dve grupe od pet miševa po grupi (Grupa 1: miševi homozigotni za humane varijabilne genske lokuse teškog i κ lakog lanca, mADAM6<-/->; Grupa 2: miševi heterozigotni za humane varijabilne genske lokuse teškog lanca i homozigotni za varijabilne genske lokuse κ lakog lanca, mADAM6<+/->) su bili disektovani sa intaktnim epididimisom i izmereni. Uzorci su onda bili fiksirani, smešteni u parafin, secirani i obojeni sa hematoksilinskom i eozinskom (HE) bojom. Sekcije testisa (2 testisa po mišu, ukupno 20) su bile ispitane u pogledu defekata u morfologiji i dokaza o proizvodnji sperme, dok su sekcije epididimisa bile ispitane u pogledu prisustva sperme.

[0592] U ovom eksperimentu nije bila uočena razlika u težini ili morfologiji testisa između mADAM6<-/->miševa i mADAM6<+/->miševa. Sperma je bila uočena kod svih genotipova, i u testisima, i u epididimisu. Ovi rezultati potvrđuju da odsustvo mišjih ADAM6a i ADAM6b gena ne dovodi do detektabilnih promena u morfologiji testisa, a da se u miševima proizvodi sperma i u prisustvu, i u odsustvu ova dva gena.

Nedostaci plodnosti kod mužjaka ADAM6<-/->miševa zato verovatno nisu izazvani malom proizvodnjom sperme.

[0593] Pokretljivost i migracija sperme. Miševi kojima nedostaju drugi članovi familije ADAM gena su neplodni zbog defekata u pokretljivosti ili migraciji sperme.

Migracija sperme je definisana kao sposobnost sperme da prolazi kroz matericu u jajovod, i normalno je neophodna za fertilizaciju miševa. Da bi se odredilo da li delecija mišjih ADAM6a i ADAM6b utiče na ovaj proces, bila je određena migracija sperme kod mADAM6<-/->miševa. Takođe je bila ispitana pokretljivost sperme.

[0594] Ukratko, sperma je bila dobijena iz testisa (1) miševa heterozigotnih za humane varijabilne genske lokuse teškog lanca i homozigotne za humane varijabilne genske lokuse κ lakog lanca (ADAM6<+/->); (2) miševa homozigotnih za humane varijabilne genske lokuse teškog lanca i homozigotne za humane varijabilne genske lokuse κ lakog lanca (ADAM6<-/->); (3) miševa homozigotnih za humane varijabilne genske lokuse teškog lanca i homozigotne za κ laki lanac prirodnog tipa (ADAM6<-/->mκ); i, (4) C57 BL/6 miševa prirodnog tipa (WT). Nisu bile uočene značajne abnormalnosti u broju spermatozoida ili opšte pokretljivosti sperme inspekcijom. Za sve miševe, bilo je uočeno razbacivanje kumulusa, što je ukazivalo da je svaki uzorak bio sposoban da prodre u kumulus ćelije i da se veže za zonu pelucida in vitro. Ovi rezultati pokazuju da ADAM6<-/->miševi imaju spermu koja je sposobna da prodre u kumulus i da se veže za zonu pelucida.

[0595] Oplođenje mišjih jajašaca in vitro (IVF) je bilo izvršeno korišćenjem sperme miševa kao što je opisano gore. Neznatno manji broj razdvojenih embriona bio je prisutan za ADAM6<-/->na dan posle IVF, kao i smanjeni broj spermatozoida vezanih za jajašce. Ovi rezultati pokazuju da sperma ADAM6<-/->miševa, kada joj je izloženo jajašce, može da prodre u kumulus i da se veže za zonu pelucida.

[0596] U sledećem eksperimentu je bila određena sposobnost sperme ADAM6<-/->miševa da migrira iz materice i kroz jajovod u testu migracije sperme.

[0597] Ukratko, prva grupa od pet superovulirajućih ženki miševa je bila stavljena sa pet ADAM6<-/->mužjaka. Druga grupa od pet superovulirajućih ženki miševa je bila stavljena sa pet ADAM6<-/->mužjaka. Parovi za parenje su bili posmatrani u pogledu kopulacije, a pet do šest sati posle kopulacije materica i za nju pričvršćeni jajovodi su bili odstranjeni iz svih ženki i isprani radi analize. Rastvori za ispiranje su bili provereni u pogledu jajašaca da bi se potvrdila ovulacija i odredio broj spermatozoida. Migracija sperme je bila određena na dva različita načina. Prvo, oba jajovoda su bila odstranjena sa materice, pa su isprana slanim rastvorom i onda su prebrojani svi identifikovani spermatozoidi. Prisustvo jajašaca je takođe bilo zabeleženo kao dokaz ovulacije. Drugo, jajovodi su ostali pričvršćeni za matericu, pa su oba tkiva bila fiksirana, smeštena u parafin, secirana i obojena (kao što je opisano gore). Sekcije su bile ispitane u pogledu prisustva sperme, i u materici i u oba jajovoda.

[0598] Za pet ženki sparenih sa pet ADAM6<-/->mužjaka, nađeno je veoma malo sperme u rastvoru kojim je ispiran jajovod. Rastvori kojima su ispirani jajovodi pet ženki sparenih sa pet ADAM6<+/->mužjaka su se odlikovali nivoima sperme od oko 25-do 30-struko višim (pros, n = 10 jajovoda) od onih koji su bili prisutni u rastvorima kojima su ispirani jajovodi pet ženki sparenih sa pet ADAM6<-/->mužjaka.

[0599] Bile su pripremljene histološke sekcije materice i jajovoda. Sekcije su bile ispitane u pogledu prisustva sperme u materici i jajovodu (colliculus tubarius).

Inspekcija histoloških sekcija jajovoda i materice je otkrila da je za ženke miševa sparene sa ADAM6<-/->miševima, sperma bila nađena u materici, ali ne u jajovodu. Dalje, sekcije ženki sparenih sa ADAM6<-/->miševima su otkrile da sperma nije bila nađena u materično-jajovodnom spoju (UTJ). U sekcijama ženki sparenih sa ADAM6<+/->miševima, sperma je bila identifikovana i u UTJ, i u jajovodu.

[0600] Ovi rezultati su pokazali da miševi kojima nedostaju ADAM6a i ADAM6b geni prave spermu koju odlikuje in vivo defekat migracije. U svim slučajevima, sperma je bila uočena u okviru materice, što je ukazivalo da su se kopulacija i oslobađanje sperme dogodili kao što je normalno, ali malo ili nimalo sperme je bilo uočeno u okviru jajovoda posle kopulacije, što je bilo izmereno brojanjem spermatozoida ili histološkim opservacijama. Ovi rezultati su pokazali da miševi kojima nedostaju ADAM6a i ADAM6b geni proizvode spermu koju odlikuje nesposobnost migracije iz materice u jajovod. Ovaj nedostatak očigledno dovodi do neplodnosti, jer sperma nije sposobna da prođe kroz materično-jajovodni spoj u jajovod, gde se oplođavaju jajašca. Uzeti zajedno, svi ovi rezultati konvergiraju podršci hipoteze da mišji ADAM6 geni pomažu direktno spermi sa normalnom pokretljivošću da migrira iz materice, kroz materično-jajovodni spoj i jajovod, i shodno tome da pristupi jajašcu da bi se ostvarilo oplođenje. Mehanizam kojim ovo ostvaruje ADAM6 može biti direktno dejstvo ADAM6 proteina, ili putem koordinatne ekspresije sa drugim proteinima, npr. drugim ADAM proteinima, u ćelijama sperme, kao što je opisano dole.

[0601] Ekspresija familije ADAM gena. Poznato je da je kompleks ADAM proteina prisutan kao kompleks na površini sperme koja sazreva. Miševi kojima nedostaju drugi članovi familije ADAM gena gube ovaj kompleks kada sperma sazreva, i odlikuje ih smanjenje više ADAM proteina u zreloj spermi. Da bi se odredilo da li nedostatak ADAM6a i ADAM6b gena utiče na druge ADAM proteine na sličan način, bili su analizirani Vestern blotovi proteinskih ekstrakata iz testisa (nezrela sperma) i epididimisa (sperma koja sazreva) da bi se odredili nivoi ekspresije drugih članova familije ADAM gena.

[0602] U ovom eksperimentu su bili analizirani proteinski ekstrakti iz četiri ADAM6<-/->i četiri ADAM6<+/->miša. Rezultati su pokazali da nije bilo uticaja na ekspresiju ADAM2 i ADAM3 u ekstraktima testisa. Međutim, i ADAM2, i ADAM3 su bili dramatično smanjeni u ekstraktima epididimisa. Ovo pokazuje da odsustvo ADAM6a i ADAM6b u spermi ADAM6<-/->miševa može imati direktan uticaj na ekspresiju i možda funkciju drugih ADAM proteina kako sperma sazreva (npr. ADAM2 i ADAM3). Ovo sugeriše da su ADAM6a i ADAM6b deo ADAM proteinskog kompleksa na površini sperme, koji bi mogli biti kritični za adekvatnu migraciju sperme.

Primer 9. Korišćenje humanog varijabilnog gena teškog lanca u miševima sa očuvanim ADAM6

[0603] Korišćenje izabranog humanog varijabilnog gena teškog lanca je bilo određeno za miševe homozigotne za humane varijabilne genske lokuse teškog i κ lakog lanca kojima su nedostajali mišji ADAM6a i ADAM6b geni (mADAM6<-/->) ili koji su sadržali ektopični genomski fragment koji kodira mišje ADAM6a i ADAM6b gene (ADAM6<+/+>; vidi Primer 1) pomoću kvantitativnog PCR testa korišćenjem TAQMAN™ proba (kao što je opisano gore).

[0604] Ukratko, CD19<+>B ćelije su bile prečišćene iz slezina mADAM6<-/->i ADAM6<+/+>miševa korišćenjem mišjih CD19 Microbeads (Miltenyi Biotec), a ukupna RNK je bila prečišćena korišćenjem RNEASY™ Mini kita (Qiagen). Genomska RNK je bila odstranjena korišćenjem tretmana RNase-free DNase on-column (Qiagen). Oko 200 ng iRNK je bilo reverzno-transkribovano u kDNK korišćenjem the First Stand cDNA Synthesis kita (Invitrogen), pa je onda amplifikovano sa TAQMAN™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) uz korišćenje ABI 7900 Sequence Detection System-a (Applied Biosystems). Relativna ekspresija svakog gena je bila normalizovana prema mišjem κ konstantnom (mCκ). Tabela 9 prikazuje kombinacije sensnih/antisensnih/TAQMAN™ MGB proba upotrebljenih u ovom eksperimentu.

TABELA 9

[0605] U ovom eksperimentu je bila analizirana ekspresija sva četiri humana VH gena uočena u uzorcima. Dalje, nivoi ekspresija između mADAM6<-/->i ADAM6<+/+>miševa su bili uporedivi. Ovi rezultati pokazuju da su svi humani VH geni koji su bili udaljeniji od mesta modifikacije (VH3-23 i VH1-69) i bliži mestu modifikacije (VH1-2 i VH6-1) bili sposobni za rekombinaciju da bi formirali funkcionalno izraženi humani teški lanac. Ovi rezultati pokazuju da ektopični genomski fragmenti koji sadrže mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence umetnute u humanu genomsku sekvencu teškog lanca ne utiče na V(D)J rekombinaciju humanih genskih segmenata teškog lanca u okviru lokusa, i da su ovi miševi sposobni za rekombinaciju humanih genskih segmenata teškog lanca na normalan način da bi proizvodili funkcionalne imunoglobulinske proteine teškog lanca.

Primer 10. Delecija mišjih imunoglobulinskih lokusa lakog lanca

[0606] Različiti ciljajući konstrukti su bili napravljeni korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (vidi, npr. US pat. br.6,586,251 i Valenzuela et al. (2003) Highthroughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.21(6):652-659) da bi se modifikovale mišje biblioteke genomskih bakterijskih veštačkih hromozoma (BAC) da bi se inaktivirali lokusi mišjeg κ i λ lakog lanca.

[0607] Delecija lokusa mišjeg λ lakog lanca. DNK iz mišjeg BAC klona RP23-135k15 (Invitrogen) je bila modifikovana homologom rekombinacijom radi inaktivacije endogenog lokusa mišjeg λ lakog lanca putem ciljane delecije klastera Yλ-Jλ-Cλ gena (FIG.20).

[0608] Ukratko, ceo bliži klaster koji sadrži Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 genske segmente je bio izbrisan u samo jednom ciljajućem događaju korišćenjem ciljajućeg vektora koji sadrži neomicinsku kasetu okruženu sa loxP mestima sa 5’ mišjim homologim krakom koji sadrži sekvencu 5’ Vλ1 genskog segmenta i 3’ mišjeg homologog kraka koji sadrži sekvencu 3’ Cλ1 genskog segmenta (FIG.20, ciljajući vektor 1).

[0609] Bio je pripremljen drugi ciljajući konstrukt za precizno brisanje udaljenijeg endogenog mišjeg klastera λ gena koji sadrži Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 izuzev što je ciljajući konstrukt sadržao 5’ mišji homologi krak koji je sadržao sekvencu 5’ Vλ2 genskog segmenta i 3’ mišjeg homologog kraka koji je sadržao sekvencu 5’ do endogenog Cλ2 genskog segmenta (FIG.20, ciljajući vektor 2). Shodno tome, drugi ciljajući konstrukt je precizno izbrisao Vλ2-Jλ2, dok je ostavio Cλ2-Jλ4-Cλ4 intaktan na endogenom mišjem λ lokusu. ES ćelije koje su sadržale inaktivirani endogeni λ lokus (kao što je opisano gore) su bile potvrđene metodama kariotipizacije i skrininga (npr. TAQMAN®) koje su poznate iz odgovarajuće oblasti. onda je iz modifikovanih ES ćelija bila izolovana DNK, pa je podvrgnuta tretmanu sa CRE rekombinazom, čime je posredovana delecija bliže ciljane kasete koja je sadržala neomicinski markerski gen, ostavljajući samo jedno loxP mesto na mestu delecije (FIG.20, dole).

[0610] Delecija lokusa mišjeg κ lakog lanca. Bilo je napravljeno nekoliko ciljajućih konstrukata korišćenjem metoda sličnih onima koji su opisani gore za modifikaciju DNK iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04 (Invitrogen) homologom rekombinacijom da bi se inaktivirao lokus mišjeg κ lakog lanca u procesu od dva koraka (FIG.21).

[0611] Ukratko, Jκ genski segmenti (1-5) endogenog mišjeg lokusa κ lakog lanca su bili izbrisani u samo jednom ciljajućem događaju korišćenjem ciljajućeg vektora koji je sadržao higromicin-timidin kinaznu (hyg-TK) kasetu koja je sadržala samo jedno loxP mesto 3’ do hyg-TK kasete (FIG.21, Jκ ciljajući vektor). Homologi krakovi upotrebljeni za pravljenje ovog ciljajućeg vektora su sadržali mišju genomsku sekvencu 5’ i 3’ endogenih mišjih Jκ genskih segmenata. U drugom ciljajućem događaju je bio pripremljen drugi ciljajući vektor za brisanje dela mišje genomske sekvence uzvodno (5’) od najudaljenijeg endogenog mišjeg Vκ genskog segmenta (FIG. 21, Vκ ciljajući vektor). Ovaj ciljajući vektor je sadržao invertovano lox511 mesto, loxP mesto i neomicinsku kasetu. Homologi krakovi upotrebljeni za dobijanje ovog ciljajućeg vektora su sadržali mišju genomsku sekvencu uzvodno od najudaljenijeg mišjeg Vκ genskog segmenta. Ciljajući vektori su bili upotrebljeni na sukcesivan način (tj. Jκ pa onda Vκ) da bi ciljali na DNK u ES ćelijama. ES koje su nosile dvostruko-ciljani hromozom (tj. samo jedan endogeni mišji κ lokus ciljan sa oba ciljajuća vektora) su bile potvrđene metodama kariotipizacije i skrininga (npr.

TAQMAN™) koje su poznate iz odgovarajuće oblasti. DNK je onda bila izolovana iz modifikovanih ES ćelija, pa je podvrgnuta tretmanu sa Cre rekombinazom, čime je posredovana delecija endogenih mišjih Vκ genskih segmenata i obe selekcione kasete, dok su ostala dva lox mesta smeštena jedno uz drugo u suprotnom smeru jedno u odnosu na drugo (FIG.21, dole; SEQ ID NO:59).

[0612] Shodno tome, bila su kreirana dva modifikovana endogena lokusa lakog lanca (κ i λ) koja sadrže intaktne pojačavačke i konstantne regione za progresivnu inserciju nerearanžiranih genskih segmenata humane λ germinativne linije na precizan način korišćenjem dole opisanih ciljajućih vektora.

Primer 11. Zamena mišjeg lokusa lakog lanca sa humanim mini-lokusom λ lakog lanca

[0613] Više ciljajućih vektora je bilo genetski modifikovano radi progresivne insercije humanih λ genskih segmenata u endogenim lokusima mišjeg κ i λ lakog lanca korišćenjem sličnih metoda kao što je opisano gore. Više nezavisnih inicijalnih modifikacija je bilo izvršeno na endogenim lokusima lakog lanca od kojih je svaki proizvodio himerični lokus lakog lanca koji je sadržao hVλ i Jλ genske segmente operativno povezane sa mišjim konstantnim genima lakog lanca i pojačavačima.

[0614] Humani λ mini-lokus koji sadrži 12 humanih Yλ i jedan humani Jλ genski segment. Niz inicijalnih ciljajućih vektora je bio dobijen inženjeringom tako da sadrži prvih 12 uzastopnih humanih Vλ genskih segmenata iz klastera A i hJλ1 genski segment ili četiri hJλ genska segmenta korišćenjem humanog BAC klona nazvanog RP11 -729g4 (Invitrogen). FIG.22A i 22B prikazuju ciljajuće vektore koji su bili konstruisani za dobijanje inicijalne insercije humanih genskih segmenata λ lakog lanca na lokusima mišjeg λ i κ lakog lanca, respektivno.

[0615] Za prvi set inicijalnih ciljajućih vektora, 124,125 bp DNK fragment iz 729g4 BAC klona koji je sadržao 12 hVλ genskih segmenata i hJλ1 genski segment je bio dobijen inženjeringom tako da sadrži PI-SceI mesto 996 bp nizvodno (3’) od hJλ1 genskog segmenta za ligaciju 3’ mišjeg homologog kraka. Dva različita seta homologih krakova su bila upotrebljena za ligaciju sa ovim humanim fragmentom; jedan set homologih krakova je sadržao endogene mišje λ sekvence iz 135k15 BAC klona (FIG.22A), a drugi set je sadržao endogenu κ sekvencu 5’ i 3’ od mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04, respektivno (FIG.22B).

[0616] Za 12/1-λ ciljajući vektor (FIG.22A) je inženjeringom dobijeno PI-SceI mesto na 5’ kraju od 27,847 bp DNK fragmenta koji je sadržao mišji Cλ2-Jλ4-Cλ4 i pojačavač 2.4 od modifikovanog mišjeg λ lokusa opisanog u Primeru 10. -28 kb mišji fragment je bio upotrebljen kao 3’ homologi krak ligacijom na ∼124 kb humanom λ fragmentu, koji je napravio 3’ spoj koji je sadržao, od 5’ do 3’, hJλ1 genski segment, 996 bp humane λ sekvence 3’ hJλ□ genskog segmenta, 1229 bp mišje λ sekvence 5’ do mišjeg Cλ2 gena, mišji Cλ2 gen i preostali deo ∼28 kb mišji fragment. Uzvodno (5’) od humanog Vλ3-12 genskog segmenta je bila dodatna 1456 bp humana λ sekvenca pre početka 5’ mišjeg homologog kraka, koji je sadržao 23,792 bp mišje genomske DNK koja je odgovarala sekvenci 5’ endogenog mišjeg λ lokusa. Između 5’ homologog kraka i početka humane λ sekvence bila je neomicinska kaseta okružena sa Frt mestima.

[0617] Shodno tome, 12/1-λ ciljajući vektor je obuhvatao, od 5’ do 3’, 5’ homologi krak koji je sadržao ∼24 kb mišje λ genomske sekvence 5’ endogenog λ lokusa, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, ∼123 kb humane genomske λ sekvence koja je sadržala prvih 12 uzastopnih hVλ genskih segmenata i hJλ1 genski segment, PI-SceI mesto, i 3’ homologi krak koji je sadržao ∼28 kb mišje genomske sekvence koja je sadržala endogene Cλ2-Jλ4-Cλ4 genske segmente, mišju sekvencu pojačavača 2.4 i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3’) od pojačavača 2.4 (FIG. 22A).

[0618] Na sličan način, 12/1-κ ciljajući vektor (FIG.22B) koji je koristio isti ∼124 humani λ fragment uz izuzetak onih mišjih homologih krakova koji su sadržali mišju κ sekvencu bio je upotrebljen tako da bi se ciljanjem na endogeni κ lokus mogla ostvariti homologa rekombinacija. Shodno tome, 12/1-κ ciljajući vektor je sadržao, od 5’ do 3’, 5’ homologi krak koji je sadržao ∼23 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog κ lokusa, I-Ceul mesto, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, ∼124 kb humane genomske λ sekvence koja je sadržala prvih 12 uzastopnih hVλ genskih segmenata i hJλ1 genski segment, PI-SceI mesto, i 3’ homologi krak koji je sadržao ∼28 kb mišje genomske sekvence koja je sadržala endogeni mišji Cκ gen, Eκi i Eκ3’ i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3’) od Eκ3’ (FIG.22B, 12/1-κ ciljajući vektor).

[0619] Homologa rekombinacija sa bilo kojim od ova dva inicijalna ciljajuća vektora je stvorila modifikovani mišji lokus lakog lanca (κ ili λ) koji je sadržao 12 hVλ genskih segmenata i hJλ1 genski segment operativno povezane sa mišjim endogenim konstantnim genom lakog lanca i pojačavačkim genom (Cκ ili Cλ2 i Eκi/Eκ3’ ili Enh 2.4/Enh 3.1) što, posle rekombinacije, dovodi do formiranja himeričnog λ lakog lanca.

[0620] Humani λ mini-lokus sa 12 humanih Yλ i četiri humana Jλ genska segmenta. U sledećem pristupu za dodavanje raznovrsnosti himeričnom lokusu λ lakog lanca, treći inicijalni ciljajući vektor je bio dobijen inženjeringom da bi se umetnulo prvih 12 uzastopnih humanih Vλ genskih segmenata iz klastera A i hJλ1, 2, 3 i 7 genski segmenti u mišji lokus κ lakog lanca (FIG.22B, 12/4-κ ciljajući vektor). DNK segment koji je sadržao hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 genske segmente je bio napravljen de novo DNK sintezom (Integrated DNA Technologies) tako da je sadržao svaki Jλ genski segment i humanu genomsku sekvencu od ∼100 bp od oba bliska 5’ i 3’ regiona svakog Jλ genskog segmenta. PI-SceI mesto je bilo dobijeno inženjeringom u 3’ kraju ovog ∼1 kb DNK fragmenta i ligatirano je na hloramfenikolsku kasetu.

Homologi krakovi su bili PCR amplifikovani od humane λ sekvence na 5’ i 3’ pozicijama u odnosu na hJλ1 genski segment humanog BAC klona 729g4.

Homologa rekombinacija sa ovim intermedijernim ciljajućim vektorom je bila izvedena na modifikovanom 729g4 BAC klonu koji je bio prethodno ciljan uzvodno (5’) od humanog υλ3□□2 genskog segmenta sa neomicinskom kasetom okruženom sa Frt mestima, koji je takođe sadržao I-CeuI mesto 5’ do 5’ Frt mesta. Dvostruko-ciljani 729g4 BAC klon je sadržao od 5’ do 3’ I-CeuI mesto, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, ∼123 kb fragment koji je sadržao prvih 12 hVλ genskih segmenata, ∼1 kb fragment koji je sadržao humane Jλ1, 2, 3 i 7 genske segmente, PI-SceI mesto, i hloramfenikolsku kasetu. Ovaj intermedijerni ciljajući vektor je bio digestiran zajedno sa I-CeuI i PI-SceI i posle toga je ligatiran u modifikovani mišji BAC klon (opisan gore) da bi se stvorio treći ciljajući vektor.

[0621] Ova ligacija je rezultovala trećim ciljajućim vektorom za inserciju humanih λ sekvenci u endogeni lokus κ lakog lanca, koji je sadržao, od 5’ do 3’, 5’ mišji homologi krak koji je sadržao ∼23 kb genomske sekvence 5’ endogenog mišjeg κ lokusa, I-CeuI mesto, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, ∼123 kb fragment koji je sadržao prvih 12 hVλ genskih segmenata, ∼1 kb fragment koji je sadržao hJλ1, 2, 3 i 7 genskih segmenata, PI-SceI mesto i 3’ homologi krak koji je sadržao ∼28 kb mišje genomske sekvence koja je sadržala endogeni mišji Cκ gen, Eκi i Eκ3’ i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3’) od Eκ3’ (FIG.22B, 12/4-κ ciljajući vektor). Homologa rekombinacija sa ovim trećim ciljajućim vektorom je stvorila modifikovani lokus mišjeg κ lakog lanca koji je sadržao 12 hVλ genskih segmenata i četiri hJλ genska segmenta operativno povezana sa endogenim mišjim Cκ genom koji, posle rekombinacije, dovodi do formiranja himeričnog humanog λ/mišjeg κ lakog lanca.

[0622] Humani λ mini-lokus sa integrisanom humanom sekvencom κ lakog lanca. Na sličan način, dva dodatna ciljajuća vektora slična onima dobijenim inženjeringom za pravljenje inicijalne insercije humanih λ genskih segmenata u endogeni lokus κ lakog lanca (FIG.22B, 12/1-κ i 12/4-κ ciljajući vektori) su bila dobijena inženjeringom radi progresivnog umetanja humanih genskih segmenata λ lakog lanca uz korišćenje jedinstveno konstruisanih ciljajućih vektora koji su sadržali susedne humane λ i κ genomske sekvence. Ovi ciljajući vektori su bili konstruisani tako da sadrže ∼ 23 kb humane κ genomske sekvence koja je prirodno locirana između humanih Vκ4-1 i Jκ1 genskih segmenata. Ova humana κ genomska sekvenca je bila specifično smeštena u ova dva dodatna ciljajuća vektora između humanih Vλ i humanih Jλ genskih segmenata (FIG.22B, 12(κ)1-κ i 12(κ)4-κ ciljajući vektori).

[0623] Oba ciljajuća vektora koja su sadržala humanu κ genomsku sekvencu su bila napravljena korišćenjem modifikovanog RP11-729g4 BAC klona opisanog gore (FIG.

24). Ovaj modifikovani BAC klon je bio ciljan spektinomicinskom selekcionom kasetom okruženom sa Notl i AsiSI restrikcionim mestima (FIG.24, gore levo).

Homologa rekombinacija sa spektinomicinskom kasetom je rezultovala dvostrukociljanim 729g4 BAC klonom koji je sadržao, od 5’ do 3’, I-CeuI mesto, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, ∼123 kb fragment koji je sadržao prvih 12 hVλ genskih segmenata, Notl mesto oko 200 bp nizvodno (3’) do bliže sekvence hVλ3-1 genskog segmenta, spektinomicinsku kasetu i AsiSI mesto. Poseban humani BAC klon koji je sadržao humanu κ sekvencu (CTD-2366j12) imao je ciljanje dva nezavisna puta da bi se inženjeringom napravila restrikciona mesta na lokacijama između hVκ4-1 i hJκ1 genskih segmenata da bi se omogućilo sledstveno kloniranje ∼23 kb fragmenta za ligaciju sa hVλ genskim segmentima sadržanim u dvostruko ciljanom modifikovanom 729g4 BAC klonu (FIG.24, gore desno).

[0624] Ukratko, 2366j12 BAC klon ima veličinu od oko 132 kb i sadrži hVκ genske segmente 1-6, 1-5, 2-4, 7-3, 5-2, 4-1, humanu κ genomsku sekvencu nizvodno od Vκ genskih segmenata, hJκ genske segmente 1-5, hCκ i oko 20 kb dodatne genomske sekvence humanog κ lokusa. Ovaj klon je bio prvi ciljan ciljajućim vektorom koji je sadržao higromicinsku kasetu okruženu sa Frt mestima i Notl mesto nizvodno (3’) od 3’ Frt mesta. Homologi krakovi za ovaj ciljajući vektor su sadržali humanu genomsku sekvencu 5’ i 3’ Vκ genskih segmenata u okviru BAC klona takvu da su posle homologe rekombinacije sa ovim ciljajućim vektorom Vκ genski segmenti bili izbrisani i Notl mesto je bilo dobijeno inženjeringom ∼133 bp nizvodno od hVκ4-1 genskog segmenta (FIG.24, gore desno). Ovaj modifikovani 2366j12 BAC klon je bio ciljan nezavisno sa dva ciljajuća vektora na 3’ kraju da bi se izbrisali hJκ genski segmenti sa hloramfenikolskom kasetom koji su takođe sadržali hJλ1 genski segment, PI-SceI mesto i AsiSI mesto ili humani λ genomski fragment koji je sadržao četiri hJλ genska segmenta (supra), PI-SceI mesto i AsiSI mesto (FIG.24, gore desno). Homologi krakovi za ova dva slična ciljajuća vektora su sadržali sekvencu 5’ i 3’ hJκ genskih segmenata. Homologa rekombinacija sa ova druga dva ciljajuća vektora i modifikovanim 2366j12 BAC klonom je dala dvostruko-ciljani 2366j12 klon koji je sadržao, od 5’ do 3’, 5’ Frt mesto, higromicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, Notl mesto, 22,800 bp genomski fragment humanog κ lokusa koji je sadržao intergenski region između Vκ4-1 i Jκ1 genskih segmenata, bilo hJλ1 genski segment ili humani λ genomski fragment koji je sadržao hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7, PI-SceI mesto i hloramfenikolsku kasetu (FIG.24, gore desno). Dva finalna ciljajuća vektora za dobijanje dve dodatne modifikacije su bila realizovana pomoću dva koraka ligacije uz korišćenje dvostruko-ciljanih 729g4 i 2366j12 klonova.

[0625] Dvostruko ciljani 729g4 i 2366j12 klonovi su bili digestirani sa Notl i AsiSI, što je dalo jedan fragment koji je sadržao neomicinsku kasetu i hVλ genske segmente i sledeći fragment koji je sadržao ∼23 kb genomski fragment humanog κ lokusa koji je sadržao intergenski region između Vκ4-1 i Jκ1 genskih segmenata, bilo hJλ1 genski segment ili genomski fragment koji je sadržao hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 genske segmente, PI-SceI mesto i hloramfenikolsku kasetu, respektivno. Ligacija ovih fragmenata je generisala dva jedinstvena BAC klona koja su sadržala od 5’ do 3’ hVλ genske segmente, humanu κ genomsku sekvencu između Vκ4-1 i Jκ1 genskih segmenata, bilo hJλ1 genski segment ili genomski fragment koji je sadržao hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 genske segmente, PI-SceI mesto i hloramfenikolsku kasetu (FIG.24, dole). Ovi novi BAC klonovi su bili digestirani sa I-Ceul i PI-SceI da bi se oslobodili jedinstveni fragmenti koji su sadržali uzvodno neomicinsku kasetu i susedne humane λ i κ sekvence i ligatirali u modifikovani mišji BAC klon 302g12 koji je sadržao od 5’ do 3’ mišju genomsku sekvencu 5’ endogenog κ lokusa, I-CeuI mesto, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto, hVλ genske segmente (3-12 do 3-1), Notl mesto ∼200 bp nizvodno od Vλ3-1, ∼23 kb humane κ sekvence koja se prirodno nalazi između humanih Vκ4-1 i Jκ1 genskih segmenata, bilo hJλ1 genski segment ili genomski fragment koji je sadržao hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 genske segmente, mišji Eκi, mišji Cκ gen i Eκ3’ (FIG.22, 12hVλ-VκJκ-hJλ1 i 12hVλ-VκJκ-4hJλ ciljajuće vektore). Homologa rekombinacija sa oba ova ciljajuća vektora je stvorila dva posebna modifikovana lokusa mišjeg κ lakog lanca koji su sadržali 12 hVλ genskih segmenata, humanu κ genomsku sekvencu, i jedan ili četiri hJλ genska segmenta operativno povezana sa endogenim mišjim Cκ genom koji, posle rekombinacije, dovodi do formiranja himeričnog humanog λ/mišjeg κ lakog lanca.

Primer 12. Dobijanje inženjeringom dodatnih humanih Yλ genskih segmenata u humanom mini-lokusu λ lakog lanca

[0626] Dodatni hVλ genski segmenti su bili nezavisno dodati svakom od inicijalnih modifikacija opisanih u Primeru 11 uz korišćenje sličnih ciljajućih vektora i metoda (FIG. 23A, 16-λ ciljajući vektor i FIG.23B, 16-κ ciljajući vektor).

[0627] Uvođenje 16 dodatnih humanih Yλ genskih segmenata. Uzvodni (5’) homologi kraci su korišćeni u konstrukciji ciljajućih vektora za dodavanje 16 dodatnih hVλ genskih segmenata modifikovanim lokusima lakog lanca opisanim u Primeru 11 koji su sadržali mišju genomsku sekvencu 5’ bilo kog od endogenih lokusa κ ili λ lakog lanca.3’ homologi kraci su bili isti za sve ciljajuće vektore i sadržali su humanu genomsku sekvencu koja se preklapala sa 5’ krajem humane λ sekvence modifikacija kao što je opisano u Primeru 11.

[0628] Ukratko, dva ciljajuća vektora su bila dobijena inženjeringom radi uvođenja 16 dodatnih hVλ genskih segmenata u modifikovane mišje lokuse lakog lanca opisane u Primeru 11 (FIG.23A i 5B, 16-λ ili 16-κ ciljajući vektor). ∼172 kb DNK fragment iz humanog BAC klona RP11-761113 (Invitrogen) koji je sadržao 21 uzastopni hVλ genski segment iz klastera A je bio dobijen inženjeringom sa 5’ homologim krakom koji je sadržao mišju genomsku sekvencu 5’ bilo sa endogenim lokusom κ ili λ lakog lanca i 3’ homologim krakom koji je sadržao humanu genomsku λ sekvencu.5’ mišji κ ili λ homologi kraci korišćeni u ovim ciljajućim konstruktima su bili isti 5’ homologi kraci koji su opisani u Primeru 11 (FIG.23A i 23B).3’ homologi krak je sadržao 53,057 bp preklapanje humane genomske λ sekvence koje je bilo ekvivalentno 5’ kraju ∼123 kb fragmenta humane genomske λ sekvence opisane u Primeru 11. Ova dva ciljajuća vektora su sadržala, od 5’ do 3’, 5’ mišji homologi krak koji je sadržao bilo ∼23 kb genomske sekvence 5’ endogenog mišjeg lokusa κ lakog lanca ili ∼24 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog lokusa λ lakog lanca, 5’ Frt mesto, higromicinsku kasetu, 3’ Frt mesto i 171,457 bp humane genomske λ sekvence koja je sadržala 21 uzastopna hVλ genska segmenta, ∼53 kb koji se preklapaju sa 5’ krajem humane λ sekvence opisane u Primeru 12 i služi kao 3’ homologi krak za ovaj ciljajući konstrukt (FIG.23A i 23B, 16-λ ili 16-κ ciljajući vektori). Homologa rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima stvorila je nezavisno modifikovane lokuse mišjeg κ i λ lakog lanca, od kojih je svaki sadržao 28 hVλ genskih segmenata i hJλ1 genski segment operativno povezane sa endogenim mišjim konstantnim genima (Cκ ili Cλ2), što, posle rekombinacije, dovodi do formiranja himeričnog lakog lanca.

[0629] Na sličan način, 16-κ ciljajući vektor je bio takođe upotrebljen za uvođenje 16 dodatnih hVλ genskih segmenata u druge inicijalne modifikacije opisane u Primeru 11 koje su inkorporirale više hJλ genskih segmenata sa i bez integrisane humane κ sekvence (FIG.22B). Homologa rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjem κ lokusu koji je sadržao druge inicijalne modifikacije je stvorila lokuse mišjeg κ lakog lanca koji su sadržali 28 hVλ genskih segmenata i hJλ1, 2, 3 i 7 genskih segmenata sa i bez humane Vκ-Jκ genomske sekvence operativno povezane sa endogenim mišjim Cκ genom što, posle rekombinacije, dovodi do formiranja himeričnog λ-κ lakog lanca.

[0630] Uvođenje 12 dodatnih humanih Vλ genskih segmenata. Dodatni hVλ genski segmenti su bili dodati nezavisno od svake modifikacije kao što je opisano gore korišćenjem sličnih ciljajućih vektora i metoda. Strukture finalnih lokusa koje su rezultovale iz homologe rekombinacije sa ciljajućim vektorima koja je sadržala dodatne hVλ genske segmente su prikazane na FIG.25A i 25B.

[0631] Ukratko, ciljajući vektor je bio dobijen inženjeringom radi uvođenja 12 dodatnih hVλ genskih segmenata na gore opisane modifikovane lokuse mišjeg κ i λ lakog lanca (FIG.23A i 23B, 12-λ ili 12-κ ciljajući vektori).93,674 bp DNK fragmenta iz humanog BAC klona RP11-22118 (Invitrogen) koji je sadržao 12 uzastopnih hVλ genskih segmenata iz klastera B je bilo dobijeno inženjeringom sa 5’ homologim krakom koji je sadržao mišju genomsku sekvencu 5’ na endogenim lokusima mišjeg κ ili λ lakog lanca i 3’ homologi krak koji je sadržao humanu genomsku λ sekvencu.5’ homologi kraci upotrebljeni u ovom ciljajućem konstruktu su bili isti 5’ homologi kraci koji su korišćeni za adiciju gore opisanih 16 hVλ genskih segmenata (FIG.23A i 23B). 3’ homologi krak je bio napravljen inženjeringom PI-SceI mesta ∼3431 bp 5’ na humanom Vλ3-29P genskom segmentu koji je bio sadržan u 27,468 bp genomskom fragmentu humane λ sekvence iz BAC klona RP11-761113. Ovo PI-SceI mesto je služilo kao mesto ligacije za povezivanje -94 kb fragmenta dodatne humane λ sekvence, od kojih se ∼27 kb fragment humane λ sekvence preklapa sa 5’ krajem humane λ sekvence u prethodnoj modifikaciji korišćenjem 16- λ ili 16-κ ciljajućih vektora (FIG.23A i 23B). Ova dva ciljajuća vektora su sadržala, od 5’ do 3’, 5’ homologi krak koji je sadržao bilo ∼23 kb mišje genomske sekvence 5’ od endogenog lokusa κ lakog lanca ili ∼24 kb mišje genomske sekvence 5’ od endogenog lokusa λ lakog lanca, 5’ Frt mesto, neomicinsku kasetu, 3’ Frt mesto i 121,188 bp humane genomske λ sekvence koja je sadržala 16 hVλ genskih segmenata i PI-SceI mesto, od kojih se ∼27 kb preklapa sa 5’ krajem humane λ sekvence iz insercije za dodavanje 16 hVλ genskih segmenata i služi kao 3’ homologi krak za ovaj ciljajući konstrukt (FIG.23A i 23B, 12-λ ili 12-κ ciljajući vektori). Homologa rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima je nezavisno stvorila modifikovane lokuse mišjeg κ i λ lakog lanca koji su sadržali 40 hVλ genskih segmenata i humani Ja1 operativno povezane sa endogenim mišjim konstantnim genima (Cκ ili Cλ2) što, posle rekombinacije, dovodi do formiranja himeričnog lakog lanca (donji deo na FIG.23A i 23B).

[0632] Na sličan način, 12-κ ciljajući vektor je takođe bio upotrebljen za uvođenje 12 dodatnih hVλ genskih segmenata na drugim inicijalnim modifikacijama koje su inkorporirale više hJλ genskih segmenata sa i bez integrisane humane κ sekvence (FIG. 22B). Homologa rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjem κ lokusu koji je sadržao druge modifikacije je stvorila mišji lokus κ lakog lanca koji je sadržao 40 hVλ genskih segmenata i hJλ1, 2, 3 i 7 genske segmente sa i bez humane Vκ-Jκ genomske sekvence operativno povezane sa endogenim mišjim Cκ genom što, posle rekombinacije, dovodi do formiranja himeričnog λ-κ lakog lanca.

Primer 13. Identifikacija ciljanih ES ćelija koje nose humane genske segmente λ lakog lanca

[0633] Ciljana BAC DNK napravljena prema gore navedenim Primerima je bila upotrebljena za elektroporaciju mišjih ES ćelija da bi se stvorile modifikovane ES ćelije za generisanje himeričnih miševa koji izražavaju humane genske segmente λ lakog lanca. ES ćelije koje sadrže inserciju nerearanžiranih humanih genskih segmenata λ lakog lanca bile su identifikovane kvantitativnim TAQMAN® testom. Specifični setovi prajmera i proba su bili projektovani za inserciju humanih λ sekvenci i pridruženih selekcionih kaseta (dobitak alela, GOA), gubitak endogenih mišjih sekvenci i bilo kojih selekcionih kaseta (gubitak alela, LOA) i retenciju, odnosno zadržavanje okružujućih mišjih sekvenci (alelska retencija, AR). Za svaku dodatnu inserciju humanih λ sekvenci, bili su upotrebljeni dodatni setovi prajmera i proba za potvrđivanje prisustva dodatnih humanih λ sekvenci, kao i prethodnih setova prajmera i proba upotrebljenih za potvrđivanje retencije prethodno ciljanih humanih sekvenci. Tabela 10 prikazuje prajmere i pridružene probe upotrebljene u kvantitativnim PCR testovima. Tabela 11 prikazuje kombinacije upotrebljene za potvrđivanje insercije svake sekcije humanih genskih segmenata λ lakog lanca u klonovima ES ćelija.

[0634] ES ćelije koje nose humane genske segmente λ lakog lanca su opciono transfektovane sa konstruktom koji izražava FLP u cilju da se odstrani Frt’ed neomicinska kaseta uvedena insercijom ciljajućeg konstrukta koji sadrži humane Vλ5-52 - Vλ1-40 genske segmente (FIG.23A i 23B). Neomicinska kaseta može opciono biti odstranjena ukrštanjem sa miševima koji izražavaju FLP rekombinazu (npr. US 6,774,279). Opciono, neomicinska kaseta se zadržava u miševima.

TABELA 10

TABELA 11

Primer 14. Generisanje miševa koji izražavaju humani λ laki lanac iz endogenog lokusa lakog lanca

[0635] Ciljane ES ćelije koje su gore opisane su bile upotrebljene kao donorske ES ćelije i uvedene su u mišji embrion u stadijumu sa 8-ćelija pomoću VELOCIMOUSE® metoda (vidi, npr. US pat. br.7,294,754 i Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1):91-99. VELOCIMICE® (F0 miševi koji su potpuno poticali od donorskih ES ćelija) koji su nezavisno nosili humane λ genske segmente bili su identifikovani genotipizacijom korišćenjem modifikacije alelskog testa (Valenzuela et al., supra) koji je detektovao prisustvo jedinstvenih humanih λ genskih segmenata (supra).

[0636] Korišćenje κ:λ lakog lanca miševa koji nose humane genske segmente λ lakog lanca. Miševi homozigotni za svaku od tri sukcesivne insercije hVλ genskih segmenata sa samo jednim hJλ genskim segmentom (FIG.23B) i miševi homozigotni za prvu inserciju hVλ genskih segmenata bilo sa samo jednim hJλ genskim segmentom ili četiri humana Jλ genska segmenta koja sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu (FIG.22B) bili su analizirani u pogledu ekspresije κ i λ lakog lanca ekspresija u splenocitima korišćenjem protočne citometrije.

[0637] Ukratko, slezine su bile uzete od grupe miševa (u rasponu od tri do sedam životinja po grupi) i samlevene su korišćenjem staklenih slajdova (tankih pločica). Posle lize crvenih krvnih ćelija (RBCs) ACK puferom za lizu (Lonza Walkersville), splenociti su bili obojeni antitelima konjugovanim sa fluorescentnom bojom specifičnom za mišji CD19 (Clone 1D3; BD Biosciences), mišji CD3 (17A2;

Biolegend), mišji Igκ (187.1; BD Biosciences) i mišji Igλ (RML-42; Biolegend). Podaci su prikupljeni korišćenjem BD™ LSR II protočnog citometra (BD Biosciences), a analizirani su korišćenjem FLOWJO™ softvera (Tree Star, Inc.). Tabela 12 prikazuje prosečne procentualne vrednosti za ekspresiju B ćelija (CD19<+>), κ lakog lanca (CD19<+>Igκ<+>Igλ-), i λ lakog lanca (CD19<+>Igκ<->Igλ<+>) uočenu u splenocitima iz grupa životinja koje su nosile svaku genetsku modifikaciju.

[0638] U sličnom eksperimentu bio je analiziran sadržaj B ćelija slezinskog odeljka miševa homozigotnih za prvu inserciju 12 hVλ i četiri hJλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu operativno povezanu sa mišjim Cκ genom (donji deo na FIG.22B) i miševa homozigotnih za 40 hVλ i jedan hJλ genski segment (donji deo na FIG.23B ili gornji deo na FIG.25B) u pogledu Igκ i Igλ ekspresije korišćenjem protočne citometrije (kao što je opisano gore). FIG.26A prikazuje Igλ i Igκ ekspresiju u CD19<+>B ćelijama za reprezentativnog miša iz svake grupe. Takođe je bio zabeležen broj CD19<+>B ćelija po slezini za svakog miša (FIG.

26B).

[0639] U sledećem eksperimentu, bili su analizirani sadržaji B ćelija odeljaka slezine i koštane srži miševa homozigotnih za 40 hVλ, i četiri hJλ, genska segmenta koji su sadržali humane Vκ-Jκ genomske sekvence operativno povezane sa mišjim Cκ genom (donja strana na FIG.26B) u pogledu progresije, preko razvoja B ćelija korišćenjem protočne citometrije različitih ćelijskih površinskih markera.

[0640] Ukratko, dve grupe (N=3 svaka, 9-12 nedelja stari, mužjaci i ženke) miševa prirodnog tipa i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri hJλ genska segmenta koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu operativno povezanu sa mišjim Cκ genom su bile usmrćene, pa su im uzete i slezine, i koštana srž. Koštana srž je bila uzeta iz femura ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom (RPMI medijum kome su bili dodati fetusni teleći serum, natrijum piruvat, Hepes, 2-merkaptoetanol, neesencijalne aminokiseline, i gentamicin). Preparati RBCs iz slezine i koštane srži su bili lizirani ACK puferom za lizu (Lonza Walkersville), što je bilo praćeno ispiranjem sa kompletnim RPMI medijumom.1x10<6>ćelija je bilo inkubirano sa antimišjim CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu tokom 10 minuta, što je bilo praćeno obeležavanjem sa izabranim panelom antitela tokom 30 min na ledu.

[0641] Panel koštane srži: anti-mišji FITC-CD43 (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD) i Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend).

[0642] Panel koštane srži i slezine: anti-mišji FITC-Igκ (187.1, BD), PE-Igλ, (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, ebioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend), APC- B220, (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD).

[0643] Posle bojenja, ćelije su bile isprane i fiksirane u 2% formaldehida. Prikupljanje podataka je bilo izvršeno na FACSCANTOII™ protočnom citometru (BD Biosciences), a analizirani su sa FLOWJO™ softverom (Tree Star, Inc.). FIG.27A -27D prikazuju rezultate za odeljak slezine jednog reprezentativnog miša iz svake grupe. FIG.28A - 28E prikazuju rezultate za odeljak koštane srži jednog reprezentativnog miša iz svake grupe. Tabela 13 prikazuje prosečne procentualne vrednosti za ekspresiju B ćelija (CD19<+>), κ lakog lanca (CD19<+>Igκ<+>Igλ-), i λ lakog lanca (CD19<+>Igκ-Igλ<+>) uočene u splenocitima iz grupa životinja koje su nosile različite genetske modifikacije. Tabela 14 prikazuje prosečne procentualne vrednosti za ekspresiju B ćelija (CD19<+>), zrelih B ćelija (B220<hi>IgM<+>), nezrelih B ćelija (B220<int>IgM<+>), nezrelih B ćelija koje izražavaju κ laki lanac (B220<int>IgM<+>Igκ<+>) i nezrelih B ćelija koje izražavaju λ laki lanac (B220<int>IgM<+>Igλ<+>) uočene u koštanoj srži miševa prirodnog tipa i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri hJλ, genske segmente koji sadrže humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu operativno povezanu sa mišjim Cκ genom. Ovaj eksperiment je bio ponovljen sa dodatnim grupama gore opisanih miševa i pokazao je slične rezultate (podaci nisu prikazani).

TABELA 12

TABELA 13

TABELA 14

[0644] Korišćenje humanog Vλ gena u miševima koji nose humane genske segmente λ lakog lanca. Miševi heterozigotni za prvu inserciju humanih λ sekvenci (hVλ3-12 - hVλ3-1 i hJλ1, FIG.23B) i homozigotni za treću inserciju humanih λ sekvenci (hVλ5-52 - hVλ3-1 i hJλ1, FIG.23B) su bili analizirani u pogledu korišćenja humanih gena λ lakog lanca pomoću lančane reakcije polimeraze sa reverznom transkriptazom (RT-PCR) uz korišćenje RNK izolovane iz splenocita.

[0645] Ukratko, bile su uzete slezine i perfuzionisane su sa 10 mL RPMI-1640 (Sigma) sa 5% HI-FBS u sterilnim kesama za jednokratnu upotrebu. Svaka kesa, koja je sadržala samo jednu slezinu, onda je bila stavljena u STOMACHER™ (Seward) i homogenizovana je sa srednjim podešavanjima 30 sekundi.

Homogenizovane slezine su bile isfiltrirane uz korišćenje filtera za ćelije od 0.7μm, a onda su peletirane sa centrifugom (1000 rpm tokom 10 minuta) i RBCs su bila lizirana u BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) tokom tri minuta. Splenociti su bili razređeni sa RPMI-1640 i centrifugirani su ponovo, što je bilo praćeno resuspendovanjem u 1 mL PBS (Irvine Scientific). RNK je bila izolovana iz peletiranih splenocita korišćenjem standardnih tehnika poznatih iz odgovarajuće oblasti.

[0646] RT-PCR je bila izvedena na RNK splenocita uz korišćenje prajmera specifičnih za humane hVλ genske segmente i mišji Cκ gen (Tabela 15). PCR proizvodi su bili prečišćeni na gelu, pa su klonirani u pCR2.1-TOPO TA vektor (Invitrogen) i sekvencirani sa prajmerima M13 Direktnim (GTAAAACGAC GGCCAG; SEQ ID NO:113) i M13 Reverznim (CAGGAAACAG CTATGAC; SEQ ID NO:114) lociranim u okviru vektora na lokacijama koje su okruživale mesto kloniranja. Ukupno su bila sekvencionirana osamdesetčetiri klona koji su poticali od prve i treće insercije humanih λ sekvenci da bi se odredilo korišćenje hVλ gena (Tabela 16). Nukleotidna sekvenca hVλ-hJλ1-mCκ spoja za selekcionisane RT-PCR klonove je prikazana na FIG. 29.

[0647] Na sličan način, miševi homozigotni za treću inserciju humanih genskih sekvenci λ lakog lanca (tj.40 hVλ genskih segmenata i četiri hJλ genska segmenta uključujući humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu, donji deo FIG.25B) operativno povezanih sa endogenim mišjim Cκ genom, su bili analizirani u pogledu korišćenja humanih gena λ lakog lanca pomoću RT-PCR uz korišćenje RNK izolovane iz splenocita (kao što je opisano gore). Korišćenje humanog genskog segmenta λ lakog lanca za 26 selekcionisanih RT-PCR klonova je prikazano u Tabeli 17. Nukleotidna sekvenca hVλ-hJλ-mCκ spoja za selekcionisane RT-PCR klonove je prikazana na FIG. 30.

[0648] Na sličan način, miševi homozigotni za prvu inserciju humanih genskih segmenata λ lakog lanca (12 hVλ genskih segmenata i hJλ1, FIG.22A & FIG.23A) operativno povezanih sa endogenim mišjim Cλ2 genom su bili analizirani u pogledu korišćenja humanog gena λ lakog lanca pomoću RT-PCR uz korišćenje RNK izolovane iz splenocita (kao što je opisano gore). Prajmeri specifični za hVλ genske segmente (Tabela 15) su bili upareni sa jednim od dva prajmera specifična za mišji Cλ2 gen; Cλ2-1 (SEQ ID NO:162) ili Cλ2-2 (SEQ ID NO:163).

[0649] Bilo je posmatrano više hVλ genskih segmenata rearanžiranih na hλ1 među RT-PCR klonovima miševa koji su nosili humane genske segmente λ lakog lanca na endogenom mišjem lokusu λ lakog lanca. Nukleotidna sekvenca hVλ- hJλ-mCλ2 spoja za selekcionisane RT-PCR klonove je prikazana na FIG.31.

TABELA 15

TABELA 16

TABELA 17

[0650] FIG.29 prikazuje sekvencu hVλ-hJλ1-mCκ spoja za RT-PCR klonove miševa koji su nosili prvu i treću inserciju hVλ genskih segmenata sa samo jednim hJλ genskim segmentom. Sekvence prikazane na FIG.29 prikazuju jedinstvena rearanžiranja koja obuhvataju različite hVλ genske segmente sa hJλ1 rekombinovane sa mišjim Cκ genom. Heterozigotni miševi koji nose samo jedan modifikovani endogeni κ lokus koji sadržao 12 hVλ genskih segmenata i hJλ1 i homozigotni miševi koji nose dva modifikovana endogena κ lokusa koji sadrže 40 hVλ genskih segmenata i hJλ1 su bili sposobni i da proizvode humane λ genske segmente operativno povezane sa mišjim Cκ genom i da proizvode B ćelije koje izražavaju humane λ lake lance. Ova rearanžiranja pokazuju da su himerični lokusi bili sposobni da nezavisno rearanžiraju humane λ genske segmente u više nezavisnih B ćelija u ovim miševima. Dalje, ove modifikacije endogenog lokusa κ lakog lanca nisu učinile nijedan od hVλ genskih segmenata nefunkcionalnim ili sprečile himerični lokus da rekombinuje više hVλ i hJλ (Jλ1) genskih segmenata u toku razvoja B ćelija, što je dokazano sa 16 različitih hVλ genskih segmenata za koje je bilo uočeno da se rearanžiraju sa hJλ1 (Tabela 16). Dalje, ovi miševi su stvarali funkcionalna antitela koja su sadržala rearanžirane humane Vλ-Jλ genske segmente operativno povezane sa mišjim Cκ genima kao deo repertoara endogenog imunoglobulinskog lakog lanca.

[0651] FIG.30 prikazuje sekvencu hVλ-hJλ-mCκ spoja za izabrane RT-PCR klonove od miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri hJλ genska segmenta koji su sadržali humanu Vκ-Jκ genomsku sekvencu. Sekvence prikazane na FIG.30 ilustruju dodatna jedinstvena rearanžiranja koja obuhvataju više različitih hVλ genskih segmenata, koji se pružaju preko celog himeričnog lokusa, sa više različitih hJλ genskih segmenata rearanžiranih i operativno povezanih sa mišjim Cκ genom.

Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogene κ lokuse koji sadrže 40 hVλ i četiri hJλ genska segmenta su takođe bili sposobni da proizvode humane λ genske segmente operativno povezane sa mišjim Cκ genom i da proizvode B ćelije koje izražavaju humane λ lake lance. Ova rearanžiranja dalje pokazuju da su svi stadijumi himeričnih lokusa bili sposobni da nezavisno rearanžiraju humane λ genske segmente u više nezavisnih B ćelija u ovim miševima. Dalje, ove dodatne modifikacije endogenog lokusa κ lakog lanca pokazuju da svaka insercija humanih λ genskih segmenata nije učinila nijedan od hVλ i/ili Jλ genskih segmenata nefunkcionalnim ili sprečila da himerični lokus rekombinuje hVλ i Jλ genske segmente u toku razvoja B ćelija, što je dokazano sa 12 različitih hVλ genskih segmenata za koje je bilo uočeno da se rearanžiraju sa sva četiri hJλ genska segmenta (Tabela 17) iz 26 izabranih RT-PCR klonova. Dalje, ovi miševi su dobro stvarali funkcionalna antitela koja su sadržala humane Vλ-Jλ genske segmente operativno povezane sa mišjim Cκ regionima kao deo repertoara endogenog imunoglobulinskog lakog lanca.

[0652] FIG.31 prikazuje sekvencu hVλ-hJλ-mCλ2 spoja za tri pojedinačna RT-PCR klona od miševa homozigotnih za 12 hVλ genske segmente i hJλ1. Sekvence prikazane na FIG.31 ilustruju dodatna jedinstvena rearanžiranja koja obuhvataju različite hVλ genske segmente, koji se pružaju preko dužine prve insercije, sa hJλ1 rearanžiranim i operativno povezanim sa mišjim Cλ2 genom (2D1 = Vλ2-8Jλ1; 2D9 = Vλ3-10Jλ1; 3E15 = Vλ3-1Jλ1). Jedan klon je demonstrirao neproduktivno rearanžiranje zbog N adicija na hVλ-hJλ spoju (2D1, FIG.31). Ovo nije neuobičajeno kod V(D)J rekombinacije, pošto se pokazalo da su genski segmenti spojeni u toku rekombinacije bili neprecizni. Mada ovaj klon predstavlja neproduktivni rekombinant koji je prisutan u repertoaru lakog lanca ovih miševa, ovo pokazuje da genetski mehanizam koji doprinosi raznovrsnosti vezivanja između gena antitela funkcioniše normalno u ovim miševima i da dovodi do repertoara antitela koja sadrže lake lance veće raznovrsnosti.

[0653] Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogene λ lokuse koji sadrže 12 hVλ genskih segmenata i hJλ1 su takođe bili sposobni da proizvode humane λ genske segmente operativno povezane sa endogenim mišjim Cλ genom, i da proizvode B ćelije koje izražavaju reverzno himerične λ lake lance koji sadrže hVλ regione povezane sa mišjim Cλ regionima. Ova rearanžiranja dalje pokazuju da su humani genski segmenti λ lakog lanca postavljeni na drugom lokusu lakog lanca (tj. λ lokusu) bili sposobni da nezavisno rearanžiraju humane λ genske segmente u višestrukim, nezavisnim B ćelijama u ovim miševima. Dalje, modifikacije endogenog lokusa λ lakog lanca pokazuju da insercija humanih λ genskih segmenata nije učinila nefunkcionalnim nijedan od hVλ i/ili hJλ1 genskih segmenata ili sprečila da himerični lokus rekombinuje hVλ i hJλ1 genske segmente u toku razvoja B ćelija. Dalje, ovi miševi su takođe stvarali funkcionalna antitela koja sadrže humane Vλ-Jλ genske segmente operativno povezane sa mišjim Cλ regionom kao deo repertoara endogenog imunoglobulinskog lakog lanca.

[0654] Kao što je prikazano u ovom Primeru, miševi koji nose humane genske segmente λ lakog lanca na endogenim lokusima κ i λ lakog lanca su sposobni da rearanžiraju humane genske segmente λ lakog lanca i da ih izražavaju u kontekstu mišjeg Cκ i/ili Cλ regiona kao deo normalnog repertoara antitela miša, jer je funkcionalni laki lanac potreban u različitim kontrolnim tačkama u razvoju B ćelija, i u slezini, i u koštanoj srži. Dalje, rani podskupovi B ćelija (npr. pre-, pro- i prolazne B ćelije) pokazuju normalni fenotip u ovim miševa u poređenju sa njihovim parnjacima iz okota prirodnog tipa (FIG.27D, 28A i 28B). Bio je uočen mali deficit u populacijama u koštanoj srži i perifernim B ćelijama, koji se može pripisati deleciji podskupa autoreaktivnih nezrelih B ćelija i/ili suboptimalnoj asocijaciji humanog λ lakog lanca sa mišjim teškim lancem. Međutim, korišćenje Igκ/Igλ uočeno u ovim miševima pokazuje situaciju koja više nalikuje ekspresiji humanog lakog lanca nego onoj koja je uočena kod miševa.

Primer 15. Ukrštanje miševa koji izražavaju humane λ lake lance iz endogenog lokusa lakog lanca

[0655] Da bi se optimizovalo korišćenje humanih λ genskih segmenata na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, miševi koji nose nerearanžirane humane λ genske segmente su ukrštani sa drugim mišem koji sadrži deleciju u naspramnom endogenom lokusu lakog lanca (bilo κ ili λ). Na primer, humani λ genski segmenti smešteni na endogenom κ lokusu bi bili jedini funkcionalni genski segmenti lakog lanca prisutni u mišu koji takođe nosi deleciju u endogenom lokusu λ lakog lanca. Na ovaj način, dobijeno potomstvo bi izražavalo samo humane λ lake lance kao što je opisano u gore navedenim primerima. Ukrštanje je izvedeno standardnim tehnikama koje su poznate iz odgovarajuće oblasti i, alternativno tome, od strane komercijalnih kompanija, kao što je, npr. The Jackson Laboratory. Mišji sojevi koji su nosili humane genske segmente λ lakog lanca na endogenom κ lokusu i deleciju endogenog lokusa λ lakog lanca su bili podvrgnuti skriningu u vezi prisustva jedinstvenih reverznohimeričnih (humano-mišjih) λ lakih lanaca i odsustva endogenih mišjih λ lakih lanaca.

[0656] Miševi koji nose nerearanžirani humani lokus λ lakog lanca su takođe ukrštani sa miševima koji sadrže zamenu mišjeg endogenog varijabilnog genskog lokusa teškog lanca sa humanim varijabilnim genskim lokusom teškog lanca (vidi US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® genetskim inženjeringom dobijeni miš). VELOCIMMUNE® miš sadrži, delimično, genom koji sadrži humane varijabilne regione teškog lanca operativno povezane sa endogenim mišjim lokusima konstantnog regiona tako da taj miš proizvodi antitela koja sadrže humani varijabilni region teškog lanca i mišji konstantni region teškog lanca kao reakciju na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških lanaca antitela može biti izolovana i operativno povezana sa DNK koja kodira humane konstantne regione teškog lanca. DNK onda može biti izražena u ćeliji koja može da izražava potpuno humani teški lanac antitela. Posle podesnog plana ukrštanja, dobijen je miš koji nosi zamenu mišjeg endogenog lokusa teškog lanca sa humanim lokusom teškog lanca i nerearanžiranim humanim lokusom λ lakog lanca na endogenom lokusu κ lakog lanca. Antitela koja sadrže somatski mutirane humane varijabilne regione teškog lanca i humane varijabilne regione λ lakog lanca mogu biti izolovana posle imunizacije antigenom od interesa.

Primer 16. Generacija antitela od strane miševa koji izražavaju humane teške lance i humane λ lake lance

[0657] Posle ukrštanja miševa koji sadrže nerearanžirani humani lokus λ lakog lanca različitih željenih sojeva koji sadrže modifikacije i delecije drugih endogenih Ig lokusa (kao što je gore opisano), izabrani miševi su imunizovani antigenom od interesa.

[0658] Generalno, VELOCIMMUNE® mišu koji sadrži jedan od pojedinačnih rearanžiranih regiona lakog lanca humane germinativne linije je dat antigen, pa su limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) sakupljene iz seruma životinja. Limfatične ćelije mogu biti fuzionisane sa mijeloma ćelijskom linijom da bi se pripremile obesmrćene hibridoma ćelijske linije, pa su takve hibridoma ćelijske linije podvrgnute skriningu i selekcionisane da bi se identifikovale hibridoma ćelijske linije koje proizvode antitela koja sadrže humani teški lanac i humani λ laki lanac koji su specifični za antigen upotrebljen za imunizaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških lanaca i λ lakih lanaca može biti izolovana i povezana sa željenim izotipskim konstantnim regionima teškog lanca i lakog lanca. Zbog prisustva dodatnih hVλ genskih segmenata u poređenju sa endogenim mišjim λ lokusom, raznovrsnost repertoara lakog lanca je dramatično povećana i prenosi veću raznovrsnost na antigen-specifični repertoar posle imunizacije. Rezultujuće sekvence kloniranog antitela mogu se zatim proizvesti u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno tome, DNK koja kodira antigen-specifična himerična antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može biti izolovana direktno iz antigen-specifičnih limfocita (npr. B ćelija).

[0659] Inicijalno su izolovana visoko afinitetna himerična antitela koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao što je opisano gore, antitela su karakterisana i selekcionisana u pogledu poželjnih karakteristika, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisalo potpuno humano antitelo koje sadrži somatski mutirani humani teški lanac i humani λ laki lanac koji potiču od nerearanžiranog humanog lokusa λ lakog lanca prema pronalasku. Podesni humani konstantni regioni obuhvataju, na primer, prirodni tip ili modifikovani IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4.

Primer 17. Ukrštanje ADAM6 miševa i humanih λ varijabilnih miševa

[0660] Bilo koji od ovde opisanih miševa koji sadrži modifikaciju endogenog ADAM6 gena ili njegovog ortologa ili homologa, i koji dalje sadrži gen koji prenosi ADAM6 funkciju mišu, ukršta se sa mišem koji sadrži modifikaciju koja sadrži humani λ varijabilni segment (npr. V i J segment) operativno povezan sa humanim ili mišjim λ ili κ konstantnim genom. Miš koji sadrži humani λ varijabilni segment može imati varijabilni segment koji je prisutan na modifikovanom endogenom λ ili κ lokusu, ili na transgenu. Miševi se ukrštaju, pa se potomstvo dalje ukršta u srodstvu, ako je potrebno, i onda se vrši skrining potomstva da bi se pronašli plodni miševi koje odlikuje ADAM6 funkcija i koji takođe izražavaju humanu λ sekvencu u kontekstu humanog ili mišjeg λ ili κ konstantnog regiona, zavisno od slučaja.

[0661] Miš koji sadrži humanizovani varijabilni lokus teškog lanca (humane V, D, i J segmente koji zamenjuju sve ili u suštini sve mišje V, D, i J segmente), koji dalje sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu (ili sekvencu ortologa ili homologa ADAM6 koja prenosi ADAM6 funkciju na miša) se ukršta sa mišem koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih V i J segmenata lakog lanca sa V i J segmentom humanom λ lakog lanca na mišjem λ lokusu i/ili mišjem κ lokusu. Potomstvo se dalje ukršta, ako je potrebno, pa se identifikuju miševi koji izražavaju antitelo koje sadrži humani VH fuzionisan sa konstantnom sekvencom teškog lanca, i srodan humani λ VL fuzionisan sa konstantnom sekvencom λ ili κ lakog lanca.

[0662] Miševi su bili izloženi antigenu od interesa i dopušteno je da generišu imunu reakciju. Identifikovana su antitela specifična za antigen od interesa, i identifikovane su humane VH sekvence i humane λ varijabilne sekvence (koje sadrže humane λ varijabilne sekvence povezane sa mišjim κ konstantnim regionima) i korišćene su za dobijanje humanog antitela inženjeringom sekvenci varijabilnog domena u kombinaciji sa humanim genima konstantnog regiona.

[0663] U jednom primeru, ukrštanjem je stvoren miš koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih mišjih V, D, i J segmenata teškog lanca sa humanim V, D, i J segmentima na endogenom mišjem lokusu teškog lanca, i koji sadrži alel lakog lanca koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih varijabilnih sekvenci λ lakog lanca sa jednom ili više humanih λ varijabilnih sekvenci na endogenom mišjem λ lokusu operativno povezan sa λ konstantnom sekvencom, i koji sadrži alel lakog lanca koji sadrži zamenu svih ili u suštini svih varijabilnih sekvenci κ lakog lanca na endogenom κ lokusu sa jednom ili više humanih λ varijabilnih sekvenci. Životinja je izložena antigenu od interesa i dopušteno je da razvije imunu reakciju. Identifikovana su antitela koja vezuju antigen od interesa, a koja sadrže humane varijabilne domene teškog lanca srodne sa identifikovanim humanim λ varijabilnim domenima na mišjem λ ili mišjem κ konstantnom regionu. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne domene su upotrebljene za dobijanje potpuno humanog antitela inženjeringom varijabilnih sekvenci u kombinaciji sa humanim sekvencama konstantnog regiona.

[0664] Miševi koji su opisani u ovom primeru sadrže jedan ili više Vκ-Jκ intergenskih regiona opisanih ovde u tekstu i na slikama.

Claims

Patentni zahtevi

1. Miš koji sadrži:

(a) jedan ili više nerearanžiranih humanih Vλ genskih segmenata i jedan ili više nerearanžiranih humanih Jλ genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu kapa lakog lanca miša, pri čemu imunoglobulinski lokus kapa lakog lanca sadrži mišji Cκ region;

(b) jedan ili više humanih VH genskih segmenata, jedan ili više humanih DH genskih segmenata i jedan ili više humanih JH genskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca miša; i

(c) modifikaciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, pri čemu modifikacija eliminiše endogenu ADAM6 funkciju, koja je povezana sa smanjenjem plodnosti kod mužjaka miševa, pri čemu miš dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment, od kojih je svaki funkcionalan za poboljšanje pomenutog smanjenja ili ponovno uspostavljanje plodnosti kod mužjaka miša, i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6b protein, ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment, od kojih je svaki funkcionalan za poboljšanje pomenutog smanjenja ili ponovno uspostavljanje plodnosti kod mužjaka miša, pri čemu su sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju ADAM6 proteine, njihove ortologe, homologe, ili funkcionalne fragmente prisutne u okviru humanih genskih segmenata teškog lanca.

2. Miš prema prethodnom zahtevu, pri čemu taj miš sadrži 12 do 40 humanih Vλ genskih segmenata i najmanje jedan humani Jλ genski segment.

3. Miš prema zahtevu 2, pri čemu:

(a) miš sadrži 12 humanih Vλ genskih segmenata i najmanje jedan humani Jλ genski segment;

(b) miš sadrži 28 humanih Vλ genskih segmenata i najmanje jedan humani Jλ genski segment; ili

(c) miš sadrži 40 humanih Vλ genskih segmenata i najmanje jedan humani Jλ genski segment.

4. Miš prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu:

(a) najmanje jedan humani Jλ genski segment je izabran između Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7 i njihove kombinacije; i/ili

(b) miš sadrži najmanje četiri humana Jλ genska segmenta.

5. Miš prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu mišu nedostaje endogeni varijabilni region kapa lakog lanca na endogenom imunoglobulinskom lokusu kapa lakog lanca.

6. Miš prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji dalje sadrži humani Vκ-Jκ intergenski region iz humanog lokusa κ lakog lanca, pri čemu je humani Vκ-Jκ intergenski region susedan sa jednim ili više nerearanžiranih Vλ genskih segmenata i sa jednim ili više nerearanžiranih Jλ genskih segmenata, a pri čemu je humani Vκ-Jκ intergenski region prvenstveno smešten između Vλ genskog segmenta i Jλ genskog segmenta, i pri čemu humani Vκ-Jκ intergenski region sadrži SEQ ID NO: 158.

7. Miš prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji je mužjak miša.

8. Izolovana ćelija ili tkivo iz miša prema bilo kom od prethodnih zahteva.

9. Primena miša prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za dobijanje:

(i) reverzno himeričnog antitela;

(ii) potpuno humanog antitela;

(iii) potpuno humanog Fab fragmenta; ili

(iv) potpuno humanog F(ab)2 fragmenta.

10. Postupak za dobijanje antitela, pri čemu postupak sadrži:

(a) izlaganje miša prema bilo kom od zahteva 1 do 7 antigenu;

(b) dopuštanje mišu da razvije imunu reakciju na antigen; i

(c) izolaciju iz miša iz (b) antitela koje specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji potiče od hVλ, hJλ i mišjeg Cκ regiona, ili izolaciju iz miša (b) ćelije koja sadrži imunoglobulinski domen koji specifično prepoznaje antigen, ili identifikaciju u mišu iz (b) sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje antigen.

11. Postupak za dobijanje humanog antitela, pri čemu postupak sadrži izlaganje miša prema bilo kom od zahteva 1 do 7 antigenu, dopuštanje mišu da razvije imunu reakciju koja sadrži stvaranje antitela koje specifično vezuje antigen, identifikaciju u B ćeliji iz miša rearanžirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen teškog lanca i rearanžirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira srodnu humanu sekvencu varijabilnog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje antigen, i korišćenje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju humani varijabilni domen teškog lanca i humani varijabilni domen lakog lanca povezanih, respektivno, sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira humani konstantni domen teškog lanca, i sekvencom nukleinske kiseline koja kodira humani konstantni domen lakog lanca radi dobijanja željenog antitela.

12. Postupak za dobijanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca koji sadrži:

(a) izlaganje miša prema bilo kom od zahteva 1 do 7 antigenu;

(b) identifikaciju u B ćeliji iz miša:

(i) rearanžiranog imunoglobulinskog gena lakog lanca, pri čemu rearanžirani imunoglobulinski gen lakog lanca sadrži bar humani genski segment varijabilnog regiona λ lakog lanca vezan za mišji Cκ region; ili

(ii) rearanžiranog imunoglobulinskog gena lakog lanca iz (b)(i) i rearanžiranog imunoglobulinskog gena teškog lanca, pri čemu rearanžirani imunoglobulinski gen teškog lanca kodira teški lanac koji je uparen sa lakim lancem kodiranim rearanžiranim imunoglobulinskim genom lakog lanca iz (b)(i); i

(c) kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca iz B ćelije miša, pri čemu je varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca iz antitela koje sadrži humani Vλ i mišji Cκ.